(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４６のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼのフザリウム毒素切断ポリペプチド変異体であって、前記ポリペプチド変異体は、Ｎ末端において４７アミノ酸切断されたアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は、配列番号４６のアミノ酸配列セクション４８〜５４０に少なくとも９４％の配列同一性を有することを特徴とし、前記ポリペプチド変異体は、配列番号１のポリペプチドと比較して温度安定性（Ｔ（５０％））の相対的な増加を有し、
前記ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、位置１０、３３、６６、１０７、１４０、１４４、１４９、１５１、１５７、１９９、２６６、２６７、２７０、２７２、２７５、２８０、２８４、２８６、２９３、３０２、３１２、３２９、３３２、３６０、３６３、３６４、３６５、３６７、３７１、３７２、３７７、３８９、３９１、３９４、４１８、４１９、４２４、４２７、４２９、４３０、４３６、４４０、４４３、４４７、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６３、４６４、４６５、４６９、４７３、４７８、４８７および４９０からなる群から選択される、配列番号１の番号付けに従った位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
位置１０および４５６におけるアミノ酸置換は、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、ＫおよびＲから選択され、位置３３、１０７、２９３および３３２におけるアミノ酸置換は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＮから選択され、位置６６、４６３および４７８におけるアミノ酸置換は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＲから選択され、位置１４０および４９０におけるアミノ酸置換は、Ｐ、Ａ、ＳおよびＮから選択され、位置１４４および３６７におけるアミノ酸置換は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置１４９、２７０、３１２、３２９および３７２におけるアミノ酸置換は、Ｆ、Ｙ、ＷおよびＨから選択され、位置１５１および４５３におけるアミノ酸置換は、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択され、位置１５７および４６２におけるアミノ酸置換は、Ｆ、Ｈ、ＷおよびＹから選択され、位置１９９、３０２、３６５および４６４におけるアミノ酸置換は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置２６６および４５５におけるアミノ酸置換は、Ａ、ＳおよびＴから選択され、位置２６７、３９４および４２９におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｎ、ＰおよびＳから選択され、位置２７２におけるアミノ酸置換は、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＳから選択され、位置２７５におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され、位置２８０におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され、位置２８４におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置２８６におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＲおよびＳから選択され、位置３６０、３７７、３９１、４１９および４２７におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｉ、Ｌ  Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３６３、４４３および４５７におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３６４におけるアミノ酸置換は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＶから選択され、位置３７１におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３８９におけるアミノ酸置換は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置４１８、４３０、４４７および４７３におけるアミノ酸置換は、Ａ、ＧおよびＳから選択され、位置４２４におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、ＲおよびＳから選択され、位置４３６におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴから選択され、位置４４０におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴから選択され、位置４６５におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択され、位置４６９におけるアミノ酸置換は、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択され、ならびに／または、位置４８７におけるアミノ酸置換は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、ＨおよびＳから選択される、ポリペプチド変異体。
【請求項２】
アミノ酸置換が、１０Ｑ、６６Ｄ、１４４Ｍ、１５１Ｒ、１９９Ｉ、２６６Ｓ、２６７Ｐ、２７２Ｈ、２７５Ｅ、２７５Ａ、２８０Ｄ、２８４Ｔ、２８６Ｐ、２８６Ｒ、２９３Ｅ、３０２Ｉ、３６０Ｖ、３６３Ｔ、３６４Ｈ、３６４Ｌ、３６５Ｉ、３６７Ｈ、３７１Ｖ、３７１Ｍ、３７２Ｆ、３７７Ｖ、３８９Ｌ、３９１Ｖ、３９４Ｐ、４１８Ａ、４１９Ｖ、４２４Ａ、４２４Ｋ、４２７Ｖ、４２９Ｐ、４３０Ａ、４３６Ａ、４３６Ｓ、４４０Ｇ、４４０Ｓ、４４３Ｔ、４４７Ａ、４５３Ｒ、４５５Ｓ、４５６Ｑ、４５７Ｔ、４６２Ｙ、４６３Ｄ、４６４Ｉ、４６５Ｈ、４６５Ｓ、４６５Ｇ、４６９Ｋ、４７３Ａ、４７８Ｄ、４８７Ｎおよび４９０Ｐからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド変異体。
【請求項３】
６６、１９９、３０２、３７７、３９４、４２４、４３０および４６３からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド変異体。
【請求項４】
アミノ酸置換が、６６Ｄ、１９９Ｉ、３０２Ｉ、３７７Ｖ、３９４Ｐ、４２４Ａ、４３０Ａおよび４６３Ｄからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１、２および３のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体。
【請求項５】
１０、３３、６６、１０７、１４０、１４４、１４９、１５１、１５７、１９９、２６６、２６７、２７０、２７２、２７５、２８０、２８４、２８６、２９３、３０２、３１２、３２９、３３２、３６０、３６３、３６４、３６５、３６７、３７１、３７２、３７７、３８９、３９１、３９４、４１８、４１９、４２４、４２７、４２９、４３０、４３６、４４０、４４３、４４７、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６３、４６４、４６５、４６９、４７３、４７８、４８７および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも２つ、特に３つの位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、１０Ｑ、６６Ｄ、１４４Ｍ、１５１Ｒ、１９９Ｉ、２６６Ｓ、２６７Ｐ、２７２Ｈ、２７５Ｅ、２７５Ａ、２８０Ｄ、２８４Ｔ、２８６Ｐ、２８６Ｒ、２９３Ｅ、３０２Ｉ、３６０Ｖ、３６３Ｔ、３６４Ｈ、３６４Ｌ、３６５Ｉ、３６７Ｈ、３７１Ｖ、３７１Ｍ、３７２Ｆ、３７７Ｖ、３８９Ｌ、３９１Ｖ、３９４Ｐ、４１８Ａ、４１９Ｖ、４２４Ａ、４２４Ｋ、４２７Ｖ、４２９Ｐ、４３０Ａ、４３６Ａ、４３６Ｓ、４４０Ｇ、４４０Ｓ、４４３Ｔ、４４７Ａ、４５３Ｒ、４５５Ｓ、４５６Ｑ、４５７Ｔ、４６２Ｙ、４６３Ｄ、４６４Ｉ、４６５Ｈ、４６５Ｓ、４６５Ｇ、４６９Ｋ、４７３Ａ、４７８Ｄ、４８７Ｎおよび４９０Ｐからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド変異体。
【請求項６】
アミノ酸配列が、幾つかのアミノ酸置換の組み合わせを含み、この位置の組み合わせが、
６６／１９９／３０２／３９４／４２４／４３０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１４４／１９９／３０２／３６０／３７２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４３／４６３、
１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４、
６６／１９９／３０２／３６４／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４７／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４１８／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３６／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３６４／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４９０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６９、
６６／１９９／３０２／３７７／３８９／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６４、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４５７／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４３６／４６３、
６６／１９９／３０２／３６３／３７１／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４７／４５３／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４５６／４６２／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３６５／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４８７、および
６６／１９９／３０２／３７１／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４８７
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド変異体。
【請求項７】
アミノ酸配列が、配列番号２から２９からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド変異体。
【請求項８】
アミノ酸配列が、幾つかのアミノ酸置換の組み合わせを含み、この位置の組み合わせが、
６６／９９／３０２／３６４／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６３／３６４／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６３／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６４／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３６３／３６７／３７１／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４９０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４０／４４７／４６３、６６／１９９／３０２／３７７／３８９／３９４／４２４／４３０／４５７／４６３／４６４／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６３／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４０／４４７／４５７／４６３／４６４／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４４７／４９０／４６９／４６５、６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４９０／４６９／４６５／４１９／４２７／３７１／４８７、
６６／１９９／３０２／３７１／３７７／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４５３／４６３／４６５／４６９／４８７／４９０、
６６／１９９／３０２／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４２９／４３０／４３６／４４０／４４７／４５７／４６３／４６４／４６５／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４７／４５３／４５６／４６２／４６３／４６５／４６９／４９０／４８７、および
６６／１９９／３０２／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４２９／４３０／４３６／４４０／４４７／４５３／４５６／４５７／４６２／４６３／４６４／４６５／４６９／４８７／４９０
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド変異体。
【請求項９】
アミノ酸配列が、配列番号３０から４５からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載のポリペプチド変異体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチド変異体、および任意選択により少なくとも１種の補助物質を含むことを特徴とする、フザリウム毒素切断添加物。
【請求項１２】
補助物質が、不活性担体、ビタミン、ミネラル、植物性物質、マイコトキシンを解毒するための酵素および他の成分、例えばマイコトキシン分解酵素、特に、アフラトキシンオキシダーゼ、エルゴタミンヒドラーゼ、エルゴタミンアミダーゼ、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、ゼアラレノンヒドラーゼ、オクラトキシンアミダーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミノオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼ、デオキシニバレノールデヒドロゲナーゼ、デオキシニバレノールオキシダーゼ、トリコテセンデヒドロゲナーゼ、トリコテセンオキシダーゼ；マイコトキシン分解性微生物；ならびにマイコトキシン結合物質、例えば微生物細胞壁または無機物質、例えばベントナイトからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の添加物。
【請求項１３】
特にペレット化された、食品または飼料製品、特にブタ、家禽、ウシ、ウマ、魚または水産養殖品中の少なくとも１種のフザリウム毒素を切断するための、請求項１１または１２に記載の添加物の使用。
【請求項１４】
少なくとも１種のフザリウム毒素を、特に食品または飼料製品の製造または加工のために、処理中で、特に少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも７０℃の温度で、切断するための、請求項１１または１２に記載の添加物の使用。
【請求項１５】
フザリウム毒素マイコトキシン症の予防および／または治療のための調製物に使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチド変異体の使用。
【請求項１６】
少なくとも１種のフザリウム毒素を、請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチド変異体、または請求項１１または１２に記載の少なくとも１種の添加物と接触させること、前記ポリペプチド変異体とフザリウム毒素との混合物を少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも７０℃の温度に供すること、および前記混合物を、温度処理の間またはその後のいずれかにおいて加水分解切断に十分な量の水分と接触させることを特徴とする、少なくとも１種のフザリウム毒素を加水分解的に切断する方法。
【請求項１７】
ポリペプチド変異体または添加物が、少なくとも１種のフザリウム毒素で汚染された飼料または食品製品と混合され、温度処理が任意選択によりペレット化工程の間に行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチド変異体が、飼料または食品製品１キログラム当たり、５Ｕから５００Ｕ、好ましくは１０Ｕから３００Ｕ、およびより好ましくは１５Ｕから１００Ｕの濃度範囲で添加されることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フザリウム毒素切断ポリペプチド変異体、これを含有する添加物、および前記ポリペプチド変異体および／または前記添加物の使用、ならびに前記ポリペプチド変異体および／または前記ポリペプチド変異体を含有する前記添加物によるフザリウム毒素の切断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシンは、植物系農産物に非常に頻繁に発生し、マイコトキシンの種類および濃度に応じて、特に農産物から生産された食品および飼料ならびにこのような食品および飼料で栄養を与えられたヒトおよび動物に重大な経済的損失をもたらし、このような被害は極めて多様である。動物およびヒトの栄養、動物育種、飼料および食品生産物の加工などの分野においてマイコトキシンによって引き起こされるいかなる損失をも大きく防ぐために、マイコトキシンの無害化、即ち解毒または分解を試みる多くの方法が既に開発されている。
【０００３】
マイコトキシンの顕著な群としては、フザリウム毒素が挙げられ、「フザリウム毒素」または「フザリウム毒素類」という用語は同等であり、それぞれが、カビ菌フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属によって産生されるフモニシンならびにこれらの誘導体および分解産物の少なくとも１種もしくは数種、または全体、特に、フモニシンＡ１−２（ＦＡ１−２）、フモニシンＢ１−４（ＦＢ１−４）、フモニシンＣ１、２、４（ＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ４）およびＨＦＣ１ならびに部分的に加水分解されたフモニシンＦＡ１−２、ＦＢ１−４、ＦＣ１−２、ＦＣ４およびＨＦＣ１を指す。部分的に加水分解されたフモニシンは、ただ１つのトリカルバリル酸残基を含み、ＦＡ１−２、ＦＢ１−４、ＦＣ１−２、ＦＣ４およびＨＦＣ１は、２つのトリカルバリル酸残基を含む。さらに、構造的に類似したトマトアルターナリア茎枯病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）（ＡＡＬ）毒素もフザリウム毒素の群に包含され、ＡＡＬ毒素は、ＡＡＬ−ＴＡ１（ＣＡＳ番号７９３６７−５２−５）、ＡＡＬ−ＴＡ２（ＣＡＳ番号７９３６７−５１−４）、ＡＡＬ−ＴＢ１（ＣＡＳ番号１７６５９０−３２−２）およびＡＡＬ−ＴＢ２（ＣＡＳ番号１７６７０５−５１−４）にさらに細分化される。ＦＡ１−２、ＦＢ１−４、ＦＣ１−２、ＦＣ４、ＨＦＣ１は以下の構造式を有する：
【０００４】
【化１】
0006506857.tif 000002
【０００５】
【表１】
0006506857.tif 000003
【０００６】
ＦＢ１は、フザリウム毒素の群のうち最も頻繁に出現する毒素であるが、ヒトおよび動物において同様に毒性作用を有する多くの誘導体および関連分子が知られている。ヒトまたは動物においてマイコトキシンの摂取によって引き起こされる疾患は、マイコトキシン症（ｍｙｃｏｔｏｘｉｃｏｓｅｓ）と呼ばれ、さらにフザリウム毒素の場合にはフザリウム毒素マイコトキシン症（ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｘｉｎ  ｍｙｃｏｔｏｘｉｃｏｓｅｓ）と呼ばれる。従って、フザリウム毒素は、酵素セラミドシンターゼと相互作用することによってスフィンゴ脂質代謝を損なうことが知られている。スフィンゴ脂質は、細胞膜の構成要素であるだけでなく、炎症過程または細胞内輸送過程において、細胞成長、細胞遊走および細胞結合などの多くの基本的細胞過程においてシグナル分子およびメッセンジャー分子として重要な役割を果たす。スフィンゴ脂質代謝の障害のために、フザリウム毒素は、さまざまな動物種およびさらにヒトに対する毒性作用の原因となっている。従って、フザリウム毒素が、げっ歯類において発癌性に作用する免疫抑制効果を有し、疫学的データによりヒトの食道癌および神経管欠損に関連していることが実証され得る。フザリウム毒素は、さまざまな動物種、例えばブタの肺水腫によって引き起こされる典型的な中毒症の原因となっている。フザリウム毒素マイコトキシン症の例には、フモニシン中毒によって引き起こされるウマの白質脳軟化症またはブタの肺水腫などの神経毒性疾患が含まれる。フザリウム毒素による汚染は、さまざまな穀物、特にトウモロコシ、ナッツおよび野菜にほとんど偏在しているため、ヒトおよび動物の健康に対するこれらの強い悪影響は無視してはならない。
【０００７】
フモニシンの微生物分解は、ＥＰ−Ａ１  ８６０  ９５４に既に記載されており、これによれば、フモニシンの解毒のために精密に規定された菌株から選択された解毒性細菌または酵母を飼料に添加することによって、フモニシンおよびフモニシン誘導体を解毒するために微生物が使用される。
【０００８】
フモニシンおよびこれを担う遺伝子および酵素の生物学的分解のための異化代謝経路も既に記載されている。従って、例えば、ＥＰ０  ９８８  ３８３は、フモニシン解毒組成物および方法を記載しており、使用されるフモニシン分解酵素は、酵素活性に分子状酸素を必要とするアミンオキシダーゼを使用してフモニシンの解毒がもたらされるトランスジェニック植物においてとりわけ産生される。
【０００９】
さらに、ＷＯ２００４／０８５６２４には、トランスアミナーゼ、デアミナーゼおよびアミノムターゼ、ならびにアミノ化毒素、例えばフモニシンの酵素による解毒方法が記載されている。これに関連して、デアミナーゼ活性を有するポリペプチドが解毒に使用される。
【００１０】
上記の生成物または方法は、マイコトキシンの解毒のために分子状酸素および必要に応じて補因子を必要とし、特に、引用されたアミノオキシダーゼは、酸素が存在しない反応条件下では全く効果を示さないという欠点を伴う。
【００１１】
ＥＰ−Ａ２  ３２６  ７１３は、酸素非依存性で補因子が存在しない酵素反応においてフモニシンを分解できる添加物およびこの調製方法に関する。しかし、主に解毒を担う該明細書に記載の酵素、即ちカルボキシルエステラーゼの温度安定性は低く、従って、添加物、つまり配列番号４６のカルボキシルエステラーゼは、昇温における適用に適していない。
【００１２】
食品産業および飼料産業では、衛生製品の生産および微生物負荷の低減のための熱処理が極めて重要である。この点に関して、流動性を高め、粉塵形成を減少させ、微生物負荷、特にサルモネラ菌を低下させるなどの複数の理由のために、飼料のペレット化は特に広範に広がり、既に標準化された工程を構成している。ペレット化工程の間、商品は通常熱蒸気処理により湿らせられ、加熱され、続いて加圧下で型によりプレスされる。食品または飼料をペレット化するための添加物としてのポリペプチドまたは酵素の使用は、通例酵素またはポリペプチドが昇温に感受性であるため、技術的課題となる。酵素またはポリペプチドの熱処理は、これらの比活性の低下および／または不可逆的変性をもたらし得る。これに対抗する方法は、例えばＷＯ９２／１２６４５に記載のようなタンパク質のカプセル化またはコーティングである。これによって、熱の影響からタンパク質を保護することが可能であるが、このアプローチは、タンパク質が口腔胃腸系において十分迅速に放出されず、従って、緩慢すぎるか、または全く効果を発揮しないというリスクを伴う。温度安定性の低さのために、フザリウム毒素を解毒するためのこれまで知られているポリペプチドは、事前カプセル化または事前コーティングしなければペレット化される飼料または食品に混合することができない。
【００１３】
昇温におけるフザリウム毒素の解毒が必須である技術的工程としては、パスタおよびポレンタ、ポップコーン、コーンフレーク、トウモロコシパンまたはトルティーヤなどの他のトウモロコシ製品の製造、デンプン液化工程、糖化工程または発酵工程、特にバイオエタノールの生産におけるマッシングまたは発酵工程などが挙げられる。この点に関して、このような工程によって製造される食品または飼料が、有害な量のフザリウム毒素を含まないことを確実にすることが重要である。現在知られているポリペプチドは、問題の工程温度においてこれらの活性が最小限であるかまたは存在しないために、このような工程で使用することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第１８６０９５４号明細書
【特許文献２】欧州特許第０９８８３８３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０８５６２４号
【特許文献４】欧州特許第２３２６７１３号明細書
【特許文献５】国際公開第９２／１２６４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、酵素反応が酸素も補因子も必要とせず、さらに酵素またはポリペプチドが、昇温において技術的工程に使用可能な十分な温度安定性および十分な温度活性を示す、フザリウム毒素の特異的で安全で信頼性のある切断、特に解毒のための酵素および／またはポリペプチドの必要性が存在する。
【００１６】
従って、本発明は、酸素非依存性および補因子が存在しない様式で少なくとも１種のフザリウム毒素を非毒性または低毒性産物に切断でき、配列番号４６のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して、温度安定性の増加および温度活性の増加を有する、配列番号４６のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼのフザリウム毒素切断ポリペプチド変異体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的を解決するために、本発明は、ポリペプチド変異体の各々がＮ末端において４７アミノ酸切断されたアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列が、配列番号４６のアミノ酸配列セクション４８から５４０と少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは１００％の配列同一性、即ち配列番号１を共有すること、配列番号４６のポリペプチドの温度安定性（Ｔ（５０％）は、４２℃であると決定されること、配列番号１のポリペプチド変異体または配列番号１の親酵素と比較したＴ（５０％）の相対的な増加を有する配列番号１の改変体の温度安定性は、４５℃であると決定されること、１０、３３、６６、１０７、１４０、１４４、１４９、１５１、１５７、１９９、２６６、２６７、２７０、２７２、２７５、２８０、２８４、２８６、２９３、３０２、３１２、３２９、３３２、３６０、３６３、３６４、３６５、３６７、３７１、３７２、３７７、３８９、３９１、３９４、４１８、４１９、４２４、４２７、４２９、４３０、４３６、４４０、４４３、４４７、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６３、４６４、４６５、４６９、４７３、４７８、４８７および４９０からなる群から選択される少なくとも１つの位置において、アミノ酸置換が、改変として含まれること、位置１０および４５６におけるアミノ酸置換は、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、ＫおよびＲから選択され、位置３３、１０７、２９３および３３２におけるアミノ酸置換は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＮから選択され、位置６６、４６３および４７８におけるアミノ酸置換は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＲから選択され、位置１４０および４９０におけるアミノ酸置換は、Ｐ、Ａ、ＳおよびＮから選択され、位置１４４および３６７におけるアミノ酸置換は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置１４９、２７０、３１２、３２９および３７２におけるアミノ酸置換は、Ｆ、Ｙ、ＷおよびＨから選択され、位置１５１および４５３におけるアミノ酸置換は、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択され、位置１５７および４６２におけるアミノ酸置換は、Ｆ、Ｈ、ＷおよびＹから選択され、位置１９９、３０２、３６５および４６４におけるアミノ酸置換は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置２６６および４５５におけるアミノ酸置換は、Ａ、ＳおよびＴから選択され、位置２６７、３９４および４２９におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｎ、ＰおよびＳから選択され、位置２７２におけるアミノ酸置換は、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＳから選択され、位置２７５におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され、位置２８０におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され、位置２８４におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置２８６におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＲおよびＳから選択され、位置３６０、３７７、３９１、４１９および４２７におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｉ、Ｌ  Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３６３、４４３および４５７におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３６４におけるアミノ酸置換は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＶから選択され、位置３７１におけるアミノ酸置換���、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３８９におけるアミノ酸置換は、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置４１８、４３０、４４７および４７３におけるアミノ酸置換は、Ａ、ＧおよびＳから選択され、位置４２４におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、ＲおよびＳから選択され、位置４３６におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴから選択され、位置４４０におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴから選択され、位置４６５におけるアミノ酸置換は、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択され、位置４６９におけるアミノ酸置換は、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択され、ならびに／または、位置４８７におけるアミノ酸置換は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、ＨおよびＳから選択されること、を特徴とする、配列番号４６のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼのフザリウム毒素切断ポリペプチド変異体によって本質的に特徴付けられる。驚くべきことに、配列番号４６に対して４７アミノ酸切断されたアミノ酸配列は、前記配列よりも有意に活性が高く、前記配列と比較して温度安定性の増加を有することが判明した。
【００１８】
配列番号１のポリペプチド変異体、特に配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有し、１０、３３、６６、１０７、１４０、１４４、１４９、１５１、１５７、１９９、２６６、２６７、２７０、２７２、２７５、２８０、２８４、２８６、２９３、３０２、３１２、３２９、３３２、３６０、３６３、３６４、３６５、３６７、３７１、３７２、３７７、３８９、３９１、３９４、４１８、４１９、４２４、４２７、４２９、４３０、４３６、４４０、４４３、４４７、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６３、４６４、４６５、４６９、４７３、４７８、４８７および４９０からなる群から選択される少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換を含むポリペプチド変異体を形成することにより、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼの温度安定性と比較して少なくとも４％の温度安定性の増加が達成される。フザリウム毒素切断特性を有するこのようなポリペプチド変異体の使用は、例えば技術的工程の間に昇温においてフザリウム毒素の解毒を可能にした。これは、特に、温度安定性に加えて温度活性も強化されることによって可能になる。特に、この結果として、例えばコンテナ内での輸送中にも起こり得るような昇温ストレスにおいても、ポリペプチド変異体の酵素活性の維持が守られる。
【００１９】
本発明によれば、位置１０および４５６におけるアミノ酸置換が、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｈ、ＫおよびＲから選択され、位置３３、１０７、２９３および３３２におけるアミノ酸置換が、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｋ、ＲおよびＮから選択され、位置６６、４６３および４７８におけるアミノ酸置換が、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、ＱおよびＲから選択され、位置１４０および４９０におけるアミノ酸置換が、Ｐ、Ａ、ＳおよびＮから選択され、位置１４４および３６７におけるアミノ酸置換が、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置１４９、２７０、３１２、３２９および３７２におけるアミノ酸置換が、Ｆ、Ｙ、ＷおよびＨから選択され、位置１５１および４５３におけるアミノ酸置換が、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択され、位置１５７および４６２におけるアミノ酸置換が、Ｆ、Ｈ、ＷおよびＹから選択され、位置１９９、３０２、３６５および４６４におけるアミノ酸置換が、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置２６６および４５５におけるアミノ酸置換が、Ａ、ＳおよびＴから選択され、位置２６７、３９４および４２９におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｎ、ＰおよびＳから選択され、位置２７２におけるアミノ酸置換が、Ｈ、Ｎ、ＱおよびＳから選択され、位置２７５におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され、位置２８０におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、ＲおよびＳから選択され、位置２８４におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置２８６におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、ＲおよびＳから選択され、位置３６０、３７７、３９１、４１９および４２７におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｉ、Ｌ  Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３６３、４４３および４５７におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３６４におけるアミノ酸置換が、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＶから選択され、位置３７１におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴおよびＶから選択され、位置３８９におけるアミノ酸置換が、Ｉ、Ｌ、ＭおよびＶから選択され、位置４１８、４３０、４４７および４７３におけるアミノ酸置換が、Ａ、ＧおよびＳから選択され、位置４２４におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｋ、ＲおよびＳから選択され、位置４３６におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴから選択され、位置４４０におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｇ、ＳおよびＴから選択され、位置４６５におけるアミノ酸置換が、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴから選択され、位置４６９におけるアミノ酸置換が、Ｄ、Ｅ、ＫおよびＲから選択され、ならびに／または、位置４８７におけるアミノ酸置換が、Ｎ、Ｄ、Ｑ、ＨおよびＳから選択されると、特に強力な温度安定性の増加が達成され、ここで、引用された位置に元から存在するアミノ酸はいずれの場合も置換されている。
【００２０】
用語「カルボキシルエステラーゼ」は、水を用いてカルボン酸エステル化合物をそれぞれのアルコール化合物およびカルボン酸化合物に切断することができる任意の酵素、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体を指す。用語「フザリウム毒素カルボキシルエステラーゼ」は、少なくとも１つのトリカルバリル酸（プロパン−１，２，３−トリカルボン酸）を加水分解的に切断することによって、少なくとも１つのフザリウム毒素を加水分解できる任意の酵素、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体を指す。本明細書に記載の「フザリウム毒素切断特性」は、少なくとも１つのフザリウム毒素から、特にＦＡ１−２、ＦＢ１−４、ＦＣ１−２、ＦＣ４、ＨＦＣ１、ＡＡＬ−ＴＡ１−２およびＡＡＬ−ＴＢ１−２またはこれらの誘導体または分解生成物から、少なくとも１つのトリカルバリル酸残基を加水分解的に切断する能力を指す。
【００２１】
以下に使用する用語は、技術用語から引用したものであり、特に明記しない限り、それぞれ従来の意味で使用される。従って、用語「ポリヌクレオチド」は、調節エレメント、構造エレメント、遺伝子、プラスミド、全ゲノムの群およびこれらの断片を含む一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ分子などの任意の長さおよび配列の任意の種類の遺伝物質を指す。用語「ポリペプチド」は、ペプチドインヒビター、タンパク質ドメインなどの５００個までのアミノ酸を有する酵素、抗体およびポリペプチドなどのタンパク質、さらには受容体、リガンド、ペプチドホルモン、タグなどの配列長が短い、例えば、アミノ酸１０個未満の短鎖ポリペプチドを含む。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける用語「位置」は、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列中の単一の特定の塩基またはアミノ酸をそれぞれ指す。アミノ酸の名称は、当業者によく知られている１文字または３文字のコードで略記される。
【００２２】
「単位」または「Ｕ」という用語は、酵素、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体の触媒活性の尺度を指し、規定された条件下で１分間に反応または切断される基質、即ちこの場合フモニシンＢ１のマイクロモル（μｍｏｌ）の数として定義される。従って、少なくとも１つのトリカルバリル酸残基が１５分以内に６０μｍｏｌのＦＢ１から切断される場合、これは４単位の触媒活性に相当する。ＦＢ１切断のために、反応条件を以下のように定義する：反応は、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で３０℃の温度において３０分間実施する。反応中の基質濃度は１００μＭのＦＢ１である。
【００２３】
酵素またはポリペプチド溶液またはポリペプチド変異体の溶液の「触媒活性」、「触媒酵素活性」または「活性」により、酵素またはポリペプチド溶液またはポリペプチド変異体の溶液の酵素濃度が定義され、単位／溶液１ミリリットルが示される。
【００２４】
用語「比活性」は、酵素、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体１ミリグラム当たりの触媒活性として定義され、酵素溶液の触媒活性と前記溶液中の酵素の質量濃度（質量／単位体積）との比から計算される。例えば酵素溶液の触媒活性が５０Ｕ／ｍｌおよび質量濃度が１ｍｇ／ｍｌの場合、この比活性は５０Ｕ／ｍｇである。
【００２５】
用語「温度安定性」は、酵素、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体が一時的に昇温に曝された（プレインキュベーション）後の触媒活性を維持する特性を指す。温度安定性は、酵素またはポリペプチド溶液またはポリペプチド変異体の溶液の活性を、同一の定義された条件で５分間の熱処理後と非熱処理とで測定し、比較することによって決定される。従って、温度安定性は、一時的な熱曝露に対する酵素の耐性の尺度である。非熱処理の１００％対照と比較して、熱処理酵素の残留活性が５０％である温度が温度安定性の尺度であり、Ｔ（５０％）と略記される。例えば、酵素溶液の活性がプレインキュベーションなしで５０Ｕ／ｍｌであり、５０℃において５分間のプレインキュベーション後に２５Ｕ／ｍｌである場合、該酵素の温度安定性は５０℃であるか、または該酵素は５０℃まで温度安定である。配列番号１の親ポリペプチドに対するポリペプチド変異体のＴ（５０％）の増加は、温度安定性の増加の尺度として定義され、パーセンテージ値として相対的に、または摂氏で絶対的に示すことができる。
【００２６】
用語「温度活性」は、酵素、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体が最も高い活性を示す温度として定義され、触媒活性は３０分間にわたって測定される。
【００２７】
用語「ポリペプチド変異体」または「変異体」は、特に、配列番号４６と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、酵素機能、即ちフザリウム毒素切断特性が維持されたままであるポリペプチド配列を指す。さらに、「ポリペプチド変異体」は、配列番号４６のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸の挿入または欠失、特にＣまたはＮ末端が伸長または切断された配列をさらに含み得る。酵素反応の機序が不変のままである場合、即ちフザリウム毒素が同じ部位において加水分解され、変異体の比活性が、元の配列番号４６の親ポリペプチドに基づいて、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に＞１００％である場合、酵素機能は実質的に維持される。
【００２８】
規定された位置におけるアミノ酸置換は、以下の命名法によって表される：元のアミノ酸；位置；新しいアミノ酸。例えば、グリシンが１３４位のプロリンを置換する場合、これはＰｒｏ１３４ＧｌｙまたはＰ１３４Ｇによって示される。複数の変異は、プラス記号またはスラッシュで区切られる。例えば、プロリンが１３４位においてグリシンにより置換され、アルギニンが１３６位においてリジンにより置換されている場合、これはそれぞれＰｒｏ１３４Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１３６ＬｙｓもしくはＰｒｏ１３４Ｇｌｙ／Ａｒｇ１３６ＬｙｓまたはＰ１３４Ｇ＋Ｒ１３６ＫもしくはＰ１３４Ｇ／Ｒ１３６Ｋによって示される。アミノ酸が１つの位置で２または数種の代替アミノ酸によって置換される場合、代替アミノ酸はコンマまたはスラッシュで区切られる。例えば、プロリンが１３４位においてグリシンだけでなくセリン、バリンおよびメチオニンによっても置換される場合、これはＰｒｏ１３４Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｖａｌ，ＭｅｔもしくはＰｒｏ１３４Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ／ＭｅｔまたはＰ１３４Ｇ，Ｓ，Ｖ，ＭもしくはＰ１３４Ｇ／Ｓ／Ｖ／Ｍによって示される。例えば、規定された位置におけるアミノ酸の置換または交換が詳細に定義されていない場合、これは前記アミノ酸が任意の他のアミノ酸によって置換され得ると解釈すべきである。例えば、１３４位のプロリンの変異が詳細に定義されていない場合、プロリンは以下のアミノ酸：Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹまたはＶのうちの１つによって置換され得る。
【００２９】
用語「配列同一性」は、パーセント配列同一性を指す。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関しては、配列同一性は視覚的に決定することができ、さらに好ましくはコンピュータプログラムによって計算することができる。配列番号１の配列を有するアミノ酸配列は、参照配列として定義される。配列比較はまた、配列セクション内で行われ、セクションは参照配列の連続配列を意味する。通常、ヌクレオチド配列の配列セクションの長さは、１８から６００、好ましくは４５から２００、より好ましくは１００から１５０ヌクレオチドである。通常、ペプチド配列の配列セクションの長さは、３から２００、より好ましくは１５から６５、最も好ましくは３０から５０アミノ酸である。相同性の決定に使用することができ、常に更新される購入可能または費用をかけずに利用可能な複数のバイオインフォマティクスプログラムが存在する。例としては、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）またはＢＬＡＳＴ  ２（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ｕｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ  １９９９年）が挙げられる。これらのアルゴリズムの調整オプションの違いにより、同じ入力配列で異なる結果が出力されることが起こり得る。従って、検索アルゴリズムとそれぞれの設定を定義する必要がある。本件の場合、配列同一性は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、特にポリペプチドにはＢＬＡＳＴＰおよびポリヌクレオチドにはＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて評価し、これらは、米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイト（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で利用可能である。これにより、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）のアルゴリズムに従って、２つまたは数個の配列を互いに比較することが可能である。本件の場合、２０１４年８月１２日のプログラムバージョンを使用した。プログラム設定として基本設定を、詳細にはアミノ酸比較のためには：「ｍａｘ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ」＝１００；「ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」＝１０；「ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ」＝３；「ｍａｔｒｉｘ」＝ＢＬＯＳＯＭ６２；「ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ」＝「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１；Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」；「ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」＝「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」；ならびにヌクレオチド配列比較のためには：Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ：１１；Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ：１０；Ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝５、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝２；Ｆｉｌｔｅｒ＝ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ；Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ：２，−３；Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇ：Ｌ；ｍを適用した。
【００３０】
本発明の好ましいさらなる発展形態によれば、アミノ酸置換は、１０Ｑ、３３Ｅ、６６Ｄ、１０７Ｅ、１４０Ｐ、１４４Ｍ、１４９Ｆ、１５１Ｒ、１５７Ｙ、１９９Ｉ、２６６Ｓ、２６７Ｐ、２７０Ｆ、２７２Ｈ、２７５Ｅ、２７５Ａ、２８０Ｄ、２８０Ｐ、２８４Ｔ、２８４Ｐ、２８６Ｐ、２８６Ｒ、２９３Ｅ、３０２Ｉ、３１２Ｆ、３２９Ｆ、３３２Ｅ、３６０Ｖ、３６３Ｔ、３６４Ｈ、３６４Ｌ、３６５Ｉ、３６７Ｈ、３７１Ｖ、３７１Ｍ、３７２Ｆ、３７７Ｖ、３８９Ｌ、３９１Ｖ、３９４Ｐ、４１８Ａ、４１９Ｖ、４２４Ａ、４２４Ｋ、４２７Ｖ、４２９Ｐ、４３０Ａ、４３６Ａ、４３６Ｓ、４４０Ｇ、４４０Ｓ、４４３Ｔ、４４７Ａ、４５３Ｒ、４５５Ｓ、４５６Ｑ、４５７Ｔ、４６２Ｙ、４６３Ｄ、４６４Ｉ、４６５Ｈ、４６５Ｓ、４６５Ｇ、４６９Ｋ、４７３Ａ、４７８Ｄ、４８７Ｎおよび４９０Ｐからなる群から選択される。ポリペプチド変異体が少なくとも１つのこのような置換を含むと、温度安定性および温度活性をさらにより選択的に増強することができ、比活性、ｐＨ安定性またはｐＨ活性などの他の酵素パラメータも同様に改善することができ、少なくとも配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼの値を示す。
【００３１】
本発明のさらなる発展形態によれば、ポリペプチド変異体は、６６、１９９、３０２、３７７、３９４、４２４、４３０および４６３からなる群から選択される少なくとも１つの位置にそれぞれアミノ酸置換を含み、温度安定性は、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して少なくとも６％増加される。このようなポリペプチド変異体は、昇温における技術的工程の間、例えば、パスタおよびポレンタ、ポップコーン、コーンフレーク、トウモロコシパンまたはトルティーヤなどの他のトウモロコシ製品の製造、デンプン液化工程、糖化工程または発酵工程、特にバイオエタノールの生産におけるマッシングまたは発酵工程などの間に、フザリウム毒素の切断が可能である。
【００３２】
本発明の好ましいさらなる発展形態によれば、アミノ酸置換は、６６Ｄ、１９９Ｉ、３０２Ｉ、３７７Ｖ、３９４Ｐ、４２４Ａ、４３０Ａおよび４６３Ｄからなる群から選択される。このような置換は、ポリペプチド変異体の温度安定性および温度活性を、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して少なくとも３℃増加させることが可能である。
【００３３】
本発明のさらなる発展形態によれば、ポリペプチド変異体は、１０、３３、６６、１０７、１４０、１４４、１４９、１５１、１５７、１９９、２６６、２６７、２７０、２７２、２７５、２８０、２８４、２８６、２９３、３０２、３１２、３２９、３３２、３６０、３６３、３６４、３６５、３６７、３７１、３７２、３７７、３８９、３９１、３９４、４１８、４１９、４２４、４２７、４２９、４３０、４３６、４４０、４４３、４４７、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６３、４６４、４６５、４６９、４７３、４７８、４８７および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも２つ、特に３つの位置においてそれぞれアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、１０Ｑ、６６Ｄ、１４４Ｍ、１５１Ｒ、１９９Ｉ、２６６Ｓ、２６７Ｐ、２７２Ｈ、２７５Ｅ、２７５Ａ、２８０Ｄ、２８４Ｔ、２８６Ｐ、２８６Ｒ、２９３Ｅ、３０２Ｉ、３６０Ｖ、３６３Ｔ、３６４Ｈ、３６４Ｌ、３６５Ｉ、３６７Ｈ、３７１Ｖ、３７１Ｍ、３７２Ｆ、３７７Ｖ、３８９Ｌ、３９１Ｖ、３９４Ｐ、４１８Ａ、４１９Ｖ、４２４Ａ、４２４Ｋ、４２７Ｖ、４２９Ｐ、４３０Ａ、４３６Ａ、４３６Ｓ、４４０Ｇ、４４０Ｓ、４４３Ｔ、４４７Ａ、４５３Ｒ、４５５Ｓ、４５６Ｑ、４５７Ｔ、４６２Ｙ、４６３Ｄ、４６４Ｉ、４６５Ｈ、４６５Ｓ、４６５Ｇ、４６９Ｋ、４７３Ａ、４７８Ｄ、４８７Ｎおよび４９０Ｐからなる群から選択され、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して少なくとも１５％温度安定性を増加させる。驚くべきことに、幾つかのアミノ酸を置換することにより、温度安定性へのこれらの有益な効果はほぼ付加的であり、温度安定性は、配列中に元から存在するアミノ酸とは異なる少なくとも３つのアミノ酸を挿入することによって７℃超増加される。このような増加は、例えばバイオエタノールの製造において５５℃でのマッシュ休止、または約６５から７０℃の中程度の温度での飼料ペレット化のための酵素の使用に十分である。
【００３４】
本発明のさらなる発展形態によれば、ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は幾つかのアミノ酸置換の組み合わせを含み、この位置の組み合わせは、
６６／１９９／３０２／３９４／４２４／４３０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１４４／１９９／３０２／３６０／３７２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４３／４６３、
１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４、
６６／１９９／３０２／３６４／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４７／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４１８／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３６／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３６４／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４９０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６９、
６６／１９９／３０２／３７７／３８９／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６４、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４５７／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４３６／４６３、
６６／１９９／３０２／３６３／３７１／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４４７／４５３／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４５６／４６２／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４６３、
６６／１９９／３０２／３６５／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４８７、および
６６／１９９／３０２／３７１／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４８７
からなる群から選択される。このように置換されたポリペプチド変異体は、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して少なくとも２５％の温度安定性の増加を示す。このような置換の組み合わせは、ポリペプチド変異体の温度安定性だけでなく、温度活性のさらなる増加を可能にする。
【００３５】
本発明の好ましいさらなる発展形態によれば、ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、配列番号２から２９からなる群から選択される。このようなポリペプチド変異体は、配列番号１の酵素と比較して、少なくとも１１℃、好ましくは少なくとも１３℃、さらにより好ましくは少なくとも１５℃の温度安定性の増加を有し、個々のポリペプチドの活性および、従って、昇温負荷での技術的工程、例えば、バイオエタノールの生産における６５℃でのマッシュ休止または約７５から８０℃の温度でのペレット化の間またはその後のフザリウム毒素の解毒を保証する。
【００３６】
本発明のさらなる発展形態によれば、ポリペプチド変異体のアミノ酸配列はそれぞれ幾つかのアミノ酸置換の組み合わせを含み、この位置の組み合わせは、
６６／９９／３０２／３６４／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６３／３６４／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６３／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６４／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４０／４４７／４６３／４６４／４６５／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３６３／３６７／３７１／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４９０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４０／４４７／４６３、
６６／１９９／３０２／３７７／３８９／３９４／４２４／４３０／４５７／４６３／４６４／４６５／４６９、
６６／１９９／３０２／３６３／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４０／４４７／４５７／４６３／４６４／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４４７／４９０／４６９／４６５、
６６／１９９／３０２／３７７／３９４／４２４／４３０／４６３／４９０／４６９／４６５／４１９／４２７／３７１／４８７、
６６／１９９／３０２／３７１／３７７／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４４７／４５３／４６３／４６５／４６９／４８７／４９０、
６６／１９９／３０２／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４２９／４３０／４３６／４４０／４４７／４５７／４６３／４６４／４６５／４６９／４９０、
６６／１９９／３０２／３７１／３７７／３８９／３９４／４１９／４２４／４２７／４３０／４３６／４４７／４５３／４５６／４６２／４６３／４６５／４６９／４９０／４８７、および
６６／１９９／３０２／３６７／３７１／３７７／３８９／３９４／４１８／４１９／４２４／４２７／４２９／４３０／４３６／４４０／４４７／４５３／４５６／４５７／４６２／４６３／４６４／４６５／４６９／４８７／４９０
からなる群から選択される。これらのポリペプチド変異体は、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して、少なくとも４０％の温度安定性の増加、および温度活性の増加を示し、昇温を必要とする複数の方法に使用可能である。
【００３７】
本発明の好ましいさらなる発展形態によれば、ポリペプチド変異体のアミノ酸配列は、配列番号３０から４５からなる群から選択される。このようなポリペプチド変異体は、配列番号１の酵素と比較して、少なくとも１８％、好ましくは少なくとも２２℃、より好ましくは少なくとも２７℃の温度安定性の増加を示し、ポリペプチドの活性および、従って、高温負荷での技術的工程、例えば、８０℃超、特に８５から９０℃超の温度でのペレット化の間またはその後のフザリウム毒素の解毒を確実にする。約９０℃の高温でのペレット化は、特に飼料のサルモネラ負荷の満足できる低減を確実にするために、養鶏産業において非常に重要である。
【００３８】
用語「保存的変異」は、当業者によって保存されているとみなされる、即ち同様の特異的性質を有するとみなされる、またはアミノ酸の特性が維持される、即ち保存される、他のアミノ酸によるアミノ酸の置換のことを指す。アミノ酸の特異的性質は、例えば、これらのサイズ、極性、疎水性、電荷またはｐＫａ値である。アミノ酸は、これらの特性に基づいてグループに分類することができ、グループは、ベン図で例示することができる。同じグループ由来のアミノ酸、好ましくは同じサブグループ由来のアミノ酸は、互いに置換されてもよい。グループおよびサブグループの特性：疎水性、極性およびサイズによるアミノ酸の分類は、Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）から得ることができる。保存的または保存された変異により、例えば、酸性アミノ酸と別の酸性アミノ酸との置換、塩基性アミノ酸と別の塩基性アミノ酸との置換、極性アミノ酸と別の極性アミノ酸との置換などが考えられる。ポリペプチド変異体は、特に、少なくとも１つの位置に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換をさらに含んでよく、前記保存的アミノ酸置換は、ＧとＡとの、ＡとＧ／Ｓとの、ＶとＩ／Ｌ／Ａ／Ｔ／Ｓとの、ＩとＶ／Ｌ／Ｍとの、ＬとＩ／Ｍ／Ｖとの、ＭとＬ／Ｉ／Ｖとの、ＰとＡ／Ｓ／Ｎとの、ＦとＹ／Ｗ／Ｈとの、ＹとＦ／Ｗ／Ｈとの、ＷとＹ／Ｆ／Ｈとの、ＲとＫ／Ｅ／Ｄとの、ＫとＲ／Ｅ／Ｄとの、ＨとＱ／Ｎ／Ｓの、ＤとＮ／Ｅ／Ｋ／Ｒ／Ｑとの、ＥとＱ／Ｄ／Ｋ／Ｒ／Ｎとの、ＳとＴ／Ａとの、ＴとＳ／Ｖ／Ａとの、ＣとＳ／Ｔ／Ａとの、ＮとＤ／Ｑ／Ｈ／Ｓとの、およびＱとＥ／Ｎ／Ｈ／Ｋ／Ｒとの置換からなる群から選択される。
【００３９】
規定された位置における本発明によるポリペプチド変異体中の置換が、例えば、Ａｓｐのような極性アミノ酸がＡｌａのような疎水性アミノ酸によって置換されているという結果になる場合、保存された変異には、この位置における別の疎水性アミノ酸（例えば、グリシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン）をもたらす任意の変異も含まれる。別の保存された変異を含むこのようなさらなるポリペプチド変異体も同様に包含される。
【００４０】
さらに本発明は、酸素非依存性および補因子が存在しない様式で少なくとも１種のフザリウム毒素を非毒性または低毒性生成物に切断でき、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して、温度安定性の増加を示す、配列番号１のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼのフザリウム毒素切断ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【００４１】
この目的を解決するために、本発明は、ポリヌクレオチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有するフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼのフザリウム毒素切断ポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチド変異体が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み、該ポリペプチド変異体が、１０、３３、６６、１０７、１４０、１４４、１４９、１５１、１５７、１９９、２６６、２６７、２７０、２７２、２７５、２８０、２８４、２８６、２９３、３０２、３１２、３２９、３３２、３６０、３６３、３６４、３６５、３６７、３７１、３７２、３７７、３８９、３９１、３９４、４１８、４１９、４２４、４２７、４２９、４３０、４３６、４４０、４４３、４４７、４５３、４５５、４５６、４５７、４６２、４６３、４６４、４６５、４６９、４７３、４７８、４８７からなる群から選択される少なくとも１つの位置においてアミノ酸置換、特に、１０Ｑ、３３Ｅ、６６Ｄ、１０７Ｅ、１４０Ｐ、１４４Ｍ、１４９Ｆ、１５１Ｒ、１５７Ｙ、１９９Ｉ、２６６Ｓ、２６７Ｐ、２７０Ｆ、２７２Ｈ、２７５Ｅ、２７５Ａ、２８０Ｄ、２８０Ｐ、２８４Ｔ、２８４Ｐ、２８６Ｐ、２８６Ｒ、２９３Ｅ、３０２Ｉ、３１２Ｆ、３２９Ｆ、３３２Ｅ、３６０Ｖ、３６３Ｔ、３６４Ｈ、３６４Ｌ、３６５Ｉ、３６７Ｈ、３７１Ｖ、３７１Ｍ、３７２Ｆ、３７７Ｖ、３８９Ｌ、３９１Ｖ、３９４Ｐ、４１８Ａ、４１９Ｖ、４２４Ａ、４２４Ｋ、４２７Ｖ、４２９Ｐ、４３０Ａ、４３６Ａ、４３６Ｓ、４４０Ｇ、４４０Ｓ、４４３Ｔ、４４７Ａ、４５３Ｒ、４５５Ｓ、４５６Ｑ、４５７Ｔ、４６２Ｙ、４６３Ｄ、４６４Ｉ、４６５Ｈ、４６５Ｓ、４６５Ｇ、４６９Ｋ、４７３Ａ、４７８Ｄ、４８７Ｎおよび４９０Ｐまたはこれらの組み合わせの置換を含むことを特徴とする。このような単離されたポリヌクレオチドは、発現ベクターを使用することにより、本発明によるポリペプチド変異体の産生のためのトランスジェニック宿主細胞の生成を可能にする。
【００４２】
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロで遺伝子を発現できるＤＮＡ構築体を指す。特に、発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ゲノムに組み込まれるか、または染色体外空間に自由に位置するように、ならびにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞内に発現し、任意選択により該ポリペプチドを細胞外に輸送するように、宿主細胞内に移入するために適したＤＮＡ構築体を包含する。
【００４３】
用語「宿主細胞」は、発現されるヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含み、本発明による酵素またはポリペプチドを産生することができる任意の細胞を指す。特に、これは原核細胞および／または真核細胞、好ましくはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンセズラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞および／またはバチルス属、トリコデルマ属もしくはアスペルギルス属の胞子を意味する。本明細書で使用するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓ）という名称は、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）という名称と同義語であり、ピキア・パストリスは古いものであり、コマガタエラ・パストリスは体系的に新しい名称である（Ｙａｍａｄａら、１９９５）。
【００４４】
さらに本発明は、個々のポリペプチド変異体が、酸素非依存性および補因子が存在しない様式で少なくとも１種のフザリウム毒素を非毒性または低毒性生成物に切断して、配列番号４６のフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼと比較して、温度安定性の増加を有する、配列番号４６のアミノ酸配列を有するフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼの少なくとも１種のフザリウム毒素切断ポリペプチド変異体を含むフザリウム毒素切断添加物を提供することを目的とする。
【００４５】
この目的を解決するために、本発明は、該フザリウム毒素切断添加物が、本発明によるフザリウム毒素カルボキシルエステラーゼの少なくとも１種のポリペプチド変異体、および任意選択により少なくとも１種の補充物質を含むことを特徴とする。このような添加物をフザリウム毒素汚染飼料に添加することにより、フザリウム毒素の解毒が可能になり、解毒は、該添加物を与えられた対象の血漿および／または腎臓および／または肺および／または肝臓においてスフィンガニン対スフィンゴシン比の減少によって明確に測定することが可能である。
【００４６】
動物のさまざまな臓器および血漿中のスフィンガニン対スフィンゴシン比は、フザリウム毒素、特にＦＢ１の毒性作用のための一般的に承認され、感度の高いバイオマーカーである。フザリウム毒素によって引き起こされるスフィンゴ脂質代謝の障害は、とりわけ、ウマの脳疾患またはブタの肺水腫に関連する。バイオマーカーとしてのスフィンガニン対スフィンゴシン比の関連性およびこの分析測定は、Ｇｒｅｎｉｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｖｏｌ．８３（２０１２）ｐ．１４６５−１４７３）およびＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１４；１２（５）：３６６７）に記載されている。
【００４７】
本発明のさらなる発展形態によれば、添加物は、補助物質が、不活性担体、ビタミン、ミネラル、植物性物質、マイコトキシンを解毒するための酵素および他の成分、例えばマイコトキシン分解酵素、特に、アフラトキシンオキシダーゼ、エルゴタミンヒドラーゼ、エルゴタミンアミダーゼ、ゼアラレノンエステラーゼ、ゼアラレノンラクトナーゼ、ゼアラレノンヒドラーゼ、オクラトキシンアミダーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノ−ポリオールアミノオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼ、デオキシニバレノールデヒドロゲナーゼ、デオキシニバレノールオキシダーゼ、トリコテセンデヒドロゲナーゼ、トリコテセンオキシダーゼ；マイコトキシン分解性微生物；ならびにマイコトキシン結合物質、例えば微生物細胞壁または無機物質、例えばベントナイトからなる群から選択されるように形成される。このような添加物の、例えば飼料または食品製品における使用により、含有され得る量のフザリウム毒素が、このような飼料または食品製品を摂取する対象生物へのいかなる有害作用も防止する程度に、確実に切断、特に解毒される。
【００４８】
本発明のさらなる適用分野としては、本発明による少なくとも１種のポリペプチド変異体に加えて、少なくとも１種の酵素、例えばタンパク質の分解に関与するプロテアーゼなどの酵素、またはデンプンもしくは繊維もしくは脂肪もしくはグリコーゲンの代謝に関与するアミラーゼ、セルロースもしくはグルカナーゼなどの酵素、ならびに例えば、ヒドラーゼ、脂肪分解酵素、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、フィターゼもしくはキシラナーゼを含む添加物が挙げられる。
【００４９】
さらに、本発明は、食品または飼料製品の製造または加工のために、工程中、特に少なくとも５０℃の温度で少なくとも１種のフザリウム毒素を切断するための本発明による添加物の使用を目的とする。このような添加物の使用は、昇温における処理が重要な食品の技術的工程、例えば、トウモロコシまたは穀物の加工、デンプン液化工程、糖化工程、または発酵工程、例えば、特にバイオエタノール生産におけるマッシングまたは発酵工程の間のフザリウム毒素の解毒を確実にする。これによって、このような工程による任意の製品、例えば、飼料ペレット、パスタ、ポレンタ、ポップコーン、コーンフレーク、トウモロコシパン、トルティーヤ、ＤＤＧＳまたはデンプン中に、フザリウム毒素の関連する量、特に健康を害する量はそのまま残らないことが保証される。
【００５０】
本発明はさらに、フザリウム毒素マイコトキシン症の予防および／または治療のための調製物に使用するためのポリペプチド変異体を提供することを目的とする。予防の場合、このようなポリペプチド変異体または添加物の使用により、フザリウム毒素を摂取したとしても、ヒトおよび動物の健康状態をフザリウム毒素を経口摂取しない、または経口摂取が少なかった健康状態に対応するレベルに実質的に維持することができるようになった。フザリウム毒素マイコトキシン症の治療に関しては、このような疾患の症状を緩和することが可能となり、特に臓器および／または血漿中のスフィンガニン対スフィンゴシン比を有意に改善できるようになった。さらに、このような使用により、家畜の能力、特に飼料変換率および体重増加、ならびに死亡率の低下を促進することができるであろう。
【００５１】
さらに、本発明は、少なくとも１種のフザリウム毒素を、ポリペプチドによって酸素非依存的、特異的、安全で信頼できる様式で、温度処理の間またはその後のいずれかで、非毒性または低毒性生成物に加水分解的に切断する、少なくとも１種のフザリウム毒素を酵素的に切断する方法を提供することを目的とする。
【００５２】
この目的を解決するために、本方法は、本発明によるポリペプチド変異体または本発明による添加物によって、少なくとも１種のトリカルバリル酸がフザリウム毒素から加水分解的に切断されるように実施される。この際、少なくとも１種のフザリウム毒素は、本発明による少なくとも１種のポリペプチド変異体または本発明による少なくとも１種の添加物と混合され、少なくとも１種のポリペプチド変異体は、少なくとも１種のトリカルバリル酸を少なくとも１種のフザリウム毒素から加水分解的に切断し、従ってフザリウム毒素を解毒し、個々のポリペプチド変異体とフザリウム毒素との混合物は少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも７０℃の温度処理に供され、加水分解切断は、温度処理の間またはその後に実施される。
【００５３】
本発明の好ましいさらなる発展形態において、本方法は、ポリペプチド変異体または添加物が少なくとも１種のフザリウム毒素で汚染された飼料または食品製品と混合され、温度処理が任意選択によりペレット化工程によって行われるように実施される。これにより、汚染され、任意選択によりペレット化された飼料または食品製品中に含まれるフザリウム毒素は、ポリペプチド変異体とフザリウム毒素との混合物が水分と接触するとすぐに切断されることが確実である。マッシュまたはパルプのような湿った飼料または食品では、フザリウム毒素の加水分解は、経口摂取前の湿った飼料または食品中で起こる。これにより、ヒトおよび動物に対するフザリウム毒素の有害作用が、大幅に排除されるか、少なくとも低減されることが確実である。水分としては、水または水含有液体の存在が考えられるが、これには唾液または消化管に存在する他の液体も含まれる。消化管は、口腔、咽頭（咽喉）、食道および胃腸管またはこれらの同等物を含むと定義され、異なる名称が動物で見出されることもあり、または個々の成分が動物の消化管に存在しないこともある。
【００５４】
本発明の好ましいさらなる発展形態において、本方法は、ポリペプチド変異体が、飼料または食品１キログラム当たり５Ｕから５００Ｕ、好ましくは１０Ｕから３００Ｕ、より好ましくは１５Ｕから１００Ｕの濃度範囲で使用されるように実施される。このような量のポリペプチド変異体を添加することにより、フザリウム毒素の濃度に応じて、食物または飼料製品、特にＤＤＧＳ中のフザリウム毒素を切断し、これにより、少なくとも１種のフザリウム毒素の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％が切断される程度にフザリウム毒素を解毒することが可能になった。
【００５５】
他に特定されない限り、「ａ」または「ｔｈｅ」のような単数の表記は、例として理解されるべきであり、複数の選択肢を含むものとする。例えば、「遺伝子（ａ  ｇｅｎｅ）」、「酵素（ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ）」または「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」と呼ばれる場合、これは常に複数形を包含する。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００５７】
ポリペプチド変異体
［実施例１］
フザリウム毒素切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変、クローニングおよび発現
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用したＰＣＲを用いたヌクレオチド配列の変異によって、指示書に従ってアミノ酸置換、挿入または欠失を行った。または、完全なヌクレオチド配列も合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。ＰＣＲ突然変異誘発により生成されたヌクレオチド配列およびＧｅｎｅＡｒｔから得られたヌクレオチド配列を、大腸菌またはＰ．パストリスにおける発現のための発現ベクターに標準的方法により組み込み、大腸菌またはＰ．パストリスにおいて形質転換し、それぞれ、大腸菌またはＰ．パストリスにおいて発現させた（Ｊ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ，Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ−１０：１５８８２９４２９３，２００７；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）が、他の任意の適切な宿主細胞もまた、この作業のために使用可能である。
【００５８】
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロで遺伝子を発現することができるＤＮＡ構築体を指す。特に、発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ゲノムに組み込まれるか、または染色体外空間に自由に位置するように、ならびにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞内に発現し、任意選択により該ポリペプチドを細胞外に輸送するように、宿主細胞内に移入するために適したＤＮＡ構築体を包含する。用語「宿主細胞」は、発現されるヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含み、本発明による酵素またはポリペプチドを産生することができる任意の細胞を指す。特に、これは原核細胞および／または真核細胞、好ましくはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンセズラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞および／またはバチルス属、トリコデルマ属またはアスペルギルス属の胞子を意味する。大腸菌の場合は可溶性細胞溶解物およびＰ．パストリスの場合は培養上清を用いて、それぞれポリペプチド変異体の触媒特性を決定した。
【００５９】
［実施例２］
フザリウム毒素分解ポリペプチドの触媒活性および比活性の決定
フザリウム毒素分解ポリペプチドをコードする対応する遺伝子を、標準的な方法を用いて大腸菌にクローン化し、細胞内で発現させ、続いて超音波処理によって溶解し、遠心分離した。透明な上清を０．１ｍｇ／ｌのウシ血清アルブミン（約１０−３から１０−５）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、分解混合物中に含まれるＦＢ１の量の１０％から９０％がポリペプチドにより分解されるようにＦＢ１分解混合液に使用した。
【００６０】
触媒酵素活性を決定するために、０．１ｍｇ／ｌのウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で温度３０℃において３０分間、フモニシンＢ１（ＦＢ１）の加水分解切断試験を行った。さらに、混合物は、基質濃度１００μＭのＦＢ１（Ｂｉｏｐｕｒｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｚｓｕｂｓｔａｎｚｅｎ  ＧｍｂＨ  Ｔｕｌｌｎ、Ａｕｓｔｒｉａ、ＢＲＭ  ００１００７）および被験ポリペプチドの１つを含んだ。３０分間のインキュベーションの後、混合物を９９℃において５分間熱不活性化し、反応を停止させた。
【００６１】
飼料サンプルの酵素活性を決定するために、試験の前に飼料サンプルからフザリウム毒素形質転換ポリペプチド変異体を抽出しなければならない。この目的のために、１０ｇの飼料を０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに溶解し、１５０ｒｐｍにおいて１時間、２０℃で振盪した。この後、サンプルを４０００ｇで１５分間遠心分離し、透明上清を必要に応じて希釈し（１０−２から１０−３）、ＦＢ１溶液に使用した。
【００６２】
ＦＢ１の定量は、Ｈｅｉｎｌらの方法（Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１４５，ｐｐ．１２０−１２９，２．６．３．「Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」）に従ってＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー―質量分析法」）により実施した。この目的のために、完全な１３Ｃ標識された内部ＦＢ１標準（Ｂｉｏｐｕｒｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｚｓｕｂｓｔａｎｚｅｎ  ＧｍｂＨ  Ｔｕｌｌｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）をさらに含むＦＢ１標準による較正を行った。Ｈｅｉｎｌら（２０１０年）とは対照的に、ＦＢ１の分解のみを測定し、使用したポリペプチド溶液の触媒酵素活性を決定した。使用したポリペプチド溶液の触媒酵素活性は、単位／ｍｌで示し、１「単位」を、試験において上記の反応条件下で１μｍｏｌのＦＢ１の減少／分として定義する。
【００６３】
比活性を決定するために、定量的ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって酵素濃度を決定した。比酵素活性は、酵素の使用量を基準とした活性（単位）により算出し、単位／ｍｇで示した。
【００６４】
［実施例３］
フザリウム毒素分解ポリペプチドの温度安定性
フザリウム毒素分解ポリペプチドの発現および定量は、実施例１および２に記載のように実施した。活性の決定に先立って、細胞溶解物の量を幾つかの部分（それぞれ６０μｌ）に分けた。市販のＰＣＲサイクラー（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）で、２から１０の部分を５分間の熱処理に供し、各部分を異なる温度でインキュベートした。一方、もう１つの細胞溶解物部分、１００％対照を氷上でインキュベートした。熱処理後、全てのサンプル／試験混合物を１０℃において１分間インキュベートして温度を等しくした。熱処理したサンプルおよび１００％対照の両方の酵素活性を、実施例２に記載したように決定した。熱処理後に残った活性を残留活性と称する。非熱処理の１００％対照と比較して残留活性が５０％である温度をＴ（５０％）と略記し、ポリペプチドの温度安定性の尺度とする。
【００６５】
配列番号４６または配列番号１のポリペプチドに対するポリペプチド変異体のＴ（５０％）（摂氏で示される。）の増加は、それぞれ、温度安定性の増加の尺度である。Ｔ（５０％）値の増加は、親ポリペプチドのＴ（５０％）値と比較して、℃で、さらにはパーセントで示すことができる。以下の例は例示としてのものである：親酵素が、氷上で５分間インキュベートした後に５０Ｕ／ｍｌの触媒活性を有し、４８℃で５分間インキュベートした後に２５Ｕ／ｍｌの触媒活性を有する場合、Ｔ（５０％）の値は４８℃である。ポリペプチド変異体が５１℃のＴ（５０％）値を有する場合、温度安定性（Ｔ（５０％））の相対的増加は６．２５である。これは、２つのＴ（５０％）値の間の３℃の差を、親出発酵素のＴ（５０％）値である４８℃で割って１００を乗じた値から生じる。
【００６６】
触媒活性の代わりに、比活性を使用して、温度安定性を決定することもできる。
【００６７】
温度安定性の決定は、代替の酵素アッセイによって、ＦＢ１反応の触媒活性を決定しなくても実施することができる。これに関して重要なことは、等量の熱処理ポリペプチドおよび１００％対照の使用であり、これは、例えば、等体積の細胞溶解物の使用によって確保される。
【００６８】
触媒活性の代わりに、酵素分解アッセイの測定シグナル（例えば、ＭＳシグナル、消光など）もまた、温度安定性を決定するために使用することができる。測定シグナルが酵素活性（例えば、反応したＦＢ１のピーク表面）に直接比例する場合、ポリペプチドのＴ（５０％）値は、熱処理されたポリペプチドの測定シグナルの値が、ポリペプチドの１００％対照の測定シグナルの値の５０％を含む温度である。
【００６９】
配列番号４６のポリペプチドの温度安定性（Ｔ（５０％））は４２℃であり、配列番号１のポリペプチドの温度安定性は４５℃であると決定された。従って、Ｎ末端配列を切断することによって達成され得る温度安定性の相対的増加は、約７％であった。さらに、配列番号４６の親ポリペプチドに対する配列番号１のポリペプチドの酵素活性の増加もまた決定することができた。
【００７０】
配列番号１のポリペプチドの温度安定性は、個々のアミノ酸の選択的置換によってさらに増加させることができた。配列番号１の親ポリペプチドと比較したこれらのポリペプチド変異体の温度安定性の相対的増加を表１に示す。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
［実施例４］
フザリウム毒素分解ポリペプチドの温度依存性活性（温度活性）
温度依存性活性について試験されるべきフザリウム毒素分解ポリペプチド変異体を、試験実施の前に精製した。この目的のために、ポリペプチド変異体を、アニオン交換クロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを使用する２段階工程で発酵上清から精製した。ポリペプチド変異体を１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、反応体積１ｍｌ中１０−５から１０−６の希釈率で反応混合物に使用した。活性の決定を、ＦＢ１の加水分解およびその後のＬＣ−ＭＳによるＦＢ１の定量による実施例３に記載の試験を異なる温度で行って、活性の決定を行った。インキュベーションは、２つの加熱ブロック（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ）を使用して、１０℃、２０℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃および７０℃の温度において実施した。熱曝露の開始から３０分後、１００μｌの反応混合物をそれぞれ採取し、９９℃で５分間加熱不活性化した。加熱ブロックにおいて３０℃で行った試験は、１００％対照として機能した。例示的な結果を表２に示す。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
［実施例５］
フザリウム毒素分解ポリペプチドのペレット化安定性の決定
選択されたポリペプチド変異体を、制御された好気性条件下で標準的な方法を用いてバイオリアクター内でピキア・パストリスにクローン化し、細胞外分泌させた。透明上清をバイオマスから分離し、担体物質（マルトデキストリン）を添加し、噴霧乾燥機を用いてペレット化可能な粉末に加工した。パウダー形態で存在するフザリウム毒素分解ポリペプチド変異体をそれぞれ１００Ｕ／ｋｇの同じ濃度で子豚飼育飼料に混合し、制御された工程で飼料ペレットを加工した。ペレット化工程の間、飼料を熱蒸気処理によって湿らせ、正確に規定された温度（５℃ステップで７５から９５℃）で個々のバッチにおいて加熱した。この調製段階に続いて、適切なペレット化工程が行われた。ペレットに含まれるフザリウム毒素分解ポリペプチド変異体の残留活性を、個々のフザリウム毒素分解ポリペプチド変異体を含有する非ペレット化飼料を１００％対照として機能させ、実施例２に記載のように決定した。従って、ペレット化工程の後に残る酵素活性を残留活性として定義する。値を表３に示す。
【００７５】
【表４】
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【配列表】
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