(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粗製のフィダキソマイシンの分取カラムクロマトグラフィーを行い、メタノール：水：ギ酸の体積比＝（６０−７０）：（４０−３０）：０.１、又はアセトニトリル：水：ギ酸の体積比＝（５０−６０）：（５０−４０）：０.１を含む溶液を用いて溶出し、フィダキソマイシンが含まれる溶出液を収集して混合する段階（１）と、
段階（１）から得られた溶出液を分離して、フィダキソマイシンの精製品を獲得する段階（２）とを、含むことを特徴とするフィダキソマイシンの精製方法であって、
段階（１）に記載の分取カラム充填剤は、Ｃ８充填剤であり、
フィダキソマイシンが、アクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）ＨＳ−１６−２０により産生され、当該菌株の受託番号はＣＧＭＣＣ ＮＯ.７２９４であり、
段階（１）に記載の粗製のフィダキソマイシンを、以下の方法にて調整する、フィダキソマイシンの精製方法；
フィダキソマイシンが含まれる発酵ブロスに対して前処理して、フィダキソマイシンを含む溶液を獲得する段階（ａ）、
段階（ａ）から得られたフィダキソマイシンの溶液に対してナノろ過濃縮を行って、フィダキソマイシンを含む濃縮液を獲得する段階（ｂ）、及び
段階（ｂ）から得られた濃縮液を分離して、粗製のフィダキソマイシンを獲得する段階（ｃ）。
【請求項２】
段階（ａ）において、前記前処理は、
フィダキソマイシンを含む発酵ブロスを固液分離して、菌糸体を獲得し、続いて、菌糸体を有機溶媒に浸してから、ろ過することによりフィダキソマイシンを含む溶液を獲得することを含むことを特徴とする請求項１に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項３】
段階（ａ）に記載の前記前処理において、
前記有機溶媒は、メタノール又はエタノールであることを特徴とする請求項２に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項４】
段階（ａ）に記載のフィダキソマイシンを含む発酵ブロスの調製方法には、
フィダキソマイシンを生産するアクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）ＨＳ−１６−２０をプレート培地に接種して培養して、菌糸を成熟させて、フィダキソマイシンのバクテリアコロニーを獲得する段階（１）と、
段階（１）から得られたフィダキソマイシンを生産するアクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）ＨＳ−１６−２０を振とうフラスコ種培地に接種して培養することで、振とうフラスコ種液を獲得する段階（２）と、
段階（２）から得られた振とうフラスコ種液を、種タンクの種培地に接種して培養することで、種タンク培養液を獲得する段階（３）と、
段階（３）で調製された種タンク培養液を発酵培地に接種して培養することで、フィダキソマイシンを含む発酵ブロスを獲得する段階（４）とを含む、請求項１ないし３の何れか１項に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項５】
段階（ｂ）に記載のフィダキソマイシンを含む濃縮液において、フィダキソマイシンの単位≧１００００ｍｇ/Ｌであることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項６】
段階（ｃ）において、段階（ｂ）から得られた濃縮液に逆溶剤を加えてから、分離することにより粗製のフィダキソマイシンを獲得することを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項７】
前記逆溶剤は、水であり、前記水の添加量は、濃縮液の中で有機溶媒の体積濃度が３５％より小さくし、前記百分率とは、水を添加した後の濃縮液の中において、水を添加した後の濃縮液の全体積に占める、有機溶媒の体積の百分率であることを特徴とする請求項６に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項８】
段階（１）において、フィダキソマイシンＨＰＬＣの純度≧９９.５％の溶出液を収集して混合することを特徴とする請求項１ないし７の何れか１項に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項９】
段階（１）から得られた溶出液に逆溶剤を添加して、段階（１）から得られた溶出液から分離してフィダキソマイシンの精製品を獲得することを特徴とする請求項１ないし８の何れか１項に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【請求項１０】
前記段階（１）から得られた溶出液に添加した逆溶剤は水であり、前記水の添加量と段階（１）で収集された溶出液の体積比は、（１−２）：１であることを特徴とする請求項１ないし９何れか一項に記載のフィダキソマイシンの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、出願日が２０１４年７月９日であり、出願番号がＣＮ２０１４１０３２４０１８．７の中国特許出願の優先権を主張する。本願発明は、上記の中国特許出願の全文を引用する。
【０００２】
本発明は、医薬技術分野に属し、具体的には、抗生物質フィダキソマイシンの精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
フィダキソマイシン（ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）は、近年にＯｐ−ｔｉｍｅｒ製薬会社により研究開発された新型狭スペクトルのマクロライド系抗菌薬である。２０１１年５月２７日にＦＤＡによりアメリカの上場を承認され、製品名はＤｉｆｉｃｉｄである。前記薬物は、主にディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、またクロストリジウム・ディフィシルとも称する。）関連下痢症（ＣＤＡＤ）に利用されている。
【０００４】
フィダキソマイシンの構造式は、以下のようである。
【０００５】
【化１】
0006592500.tif 000002
【０００６】
現在、開示されているフィダキソマイシンの分離精製方法は、主に下述のような方法がある。
【０００７】
ＣＮ１０３２７５１５２Ａでは、高純度のフィダキソマイシンの調製方法を開示し、前記方法において、フィダキソマイシンの発酵ブロスをろ過して菌糸体を得てから、菌糸体を極性溶剤に浸し、固液分離してフィダキソマイシンエキスを得て、エキスに水を添加して希釈した後、マクロポーラス脱色樹脂を導入して脱色液を得て、また脱色液は、マクロポーラス吸着樹脂を導入して、吸着飽和の後、分割剤を用いてグラジエント溶出を行い、濃縮、抽出、干燥の後に粗製のフィダキソマイシンを獲得し、粗製のフィダキソマイシンを極性溶剤で溶けてから、ポリマーマイクロスフェアのカラムクロマトグラフィーを注入し、溶出剤によって、グラジエント溶出を行い、溶出液を収集し、ＨＰＬＣで測定したフィダキソマイシンの含有量が９５％より大きい溶出液を混合し、濃縮、干燥後、ＨＰＬＣ含有量が９７.１％に達することができるフィダキソマイシンを得る。
【０００８】
ＣＮ１０１６６３３１２Ａでは、フィダキソマイシンの調製方法に関して開示し、前記方法において、発酵ブロス培地に吸着剤樹脂を添加して、発酵終了後、発酵ブロスから固体物質（吸着剤樹脂を含む）を分離し、有機溶媒で、例えば、酢酸エチルで固体物質を溶出させてから、減圧濃縮によって粗製のフィダキソマイシンを得る。Ｂｉｏｔａｇｅ ＫＰ−Ｃ１８−ＨＳを含むシリカカラムを用いて精製してから、濃縮、結晶化、干燥して純度が７８％−９４.７％のフィダキソマイシンを得る。
【０００９】
ＣＮ１０２９９３２５１Ａでは、高速液体クロマトグラフィーによるフィダキソマイシンの精製方法に関して開示し、前記方法において、純度が７８％である粗製のフィダキソマイシンに対してＵｎｉ３０ＢＰＣ精製を二回行って、純度が９８％であるフィダキソマイシンの溶出液を得る。
【００１０】
ＷＯ２０１１１４６６２１Ａ２では、フィダキソマイシンの調製方法に関して開示し、前記方法において、液相で調整して、純度が９３％程度のフィダキソマイシンを得た。
【００１１】
以上の方法で調製したフィダキソマイシンの純度は、全て９９％以下であり、依然として医薬品の生産要件を満足することができないので、医薬品の生産要件に満足するように、高純度のフィダキソマイシンの調製方法が急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、環境にやさしく、プロセスの簡単なフィダキソマイシンの精製方法を提供することで、本発明の目的は、以下のような技術方案によって実現することができる。
【００１３】
フィダキソマイシンの精製方法は、
【００１４】
粗製のフィダキソマイシンの分取カラムクロマトグラフィーを行い、有機溶媒を含む水性酸溶液を用いて溶出し、フィダキソマイシンが含まれる溶出液を収集して混合する段階（１）と、
【００１５】
段階（１）から得られた溶出液を分離して、フィダキソマイシンの精製品を獲得する段階（２）とを含む。
【００１６】
ここで、段階（１）に記載の分取カラムは、本技術分野においての従来の分取カラムであることができ、一般的には、逆相カラムであって、本発明においては、北京創新通恒科技有限公司製のＤＡＣ２００型の分取カラム（２００×２５０ｍｍ）を使用することが好ましい。前記分取カラムの充填剤は、本技術分野においての従来の充填剤であってもいいし、より好ましくは、Ｃ８充填剤であり、前記Ｃ８充填剤はオクチルシラン結合シリカゲルであり、一般的には、本技術分野においての従来の市販されているもので獲得でき、通常、その粒径は１０μｍであり、華譜（ＡＣＣＨＲＯＭ）Ｃ８充填剤、納微（Ｎａｎｏ−Ｍｉｃｒｏ）Ｃ８充填剤、艾杰尓（ａｇｅｌａ）Ｃ８充填剤又はｋｒｏｍａｓｉｌＣ８充填剤から選んで使うことができて、好ましくは、ｋｒｏｍａｓｉｌＣ８充填剤である。
【００１７】
ここで、段階（１）に記載の有機溶媒は、本技術分野においての従来の有機溶媒でもいいし、好ましくは、メタノール又はアセトニトリルであり、前記酸性水溶液は、ギ酸の水溶液である。好ましくは、段階（１）に記載の有機溶媒を含む酸性水溶液は、メタノール：水：ギ酸＝（５５−７５）：（４５−２５）：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）、又はアセトニトリル：水：ギ酸＝（４５−６５）：（５５−３５）：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）の溶液であり、より好ましくは、メタノール：水：ギ酸＝（６０−７０）：（４０−３０）：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）、又はアセトニトリル：水：ギ酸＝（５０−６０）：（５０−４０）：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）の溶液であり、最も好ましくは、メタノール：水：ギ酸＝６５：３５：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）、又はアセトニトリル：水：ギ酸＝５５：４５：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）の溶液である。以上のＶ：Ｖ：Ｖは体積比である。
【００１８】
前記分取カラムクロマトグラフィーの方法において、他のクロマトグラフィー条件は、本技術分野においての従来のクロマトグラフィーの条件でもいいし、好ましくは、本発明は、以下のようなクロマトグラフィー条件である。高速液体クロマトグラフィーは、本技術分野においての従来のクロマトグラフでいいし、好ましくは、津島会社のＬＣ２０１０ＨＴモデルの高速液体クロマトグラフィーである。カラム温度は、本技術分野においての従来のカラム温度でもいいし、好ましくは、２０〜３０℃である。測定波長は、一般に、２５０ｎｍである。流速は、一般に１.０ｍＬ/ｍｉｎである。注入体積は、一般に１０ｕＬである。
【００１９】
ここで、段階（１）において、フィダキソマイシンＨＰＬＣ純度≧９９.５％でる溶出液を収集して混合する。
【００２０】
ここで、段階（１）に記載の前記粗製のフィダキソマイシンは、本技術分野においての従来の調製方法によって調製することができ、一般的には、粗製のフィダキソマイシンのＨＰＬＣ純度が７０％以上であることが要求され、例えば、７２.６％、７０.９％、７２％又は７３.５％であればいい。本発明において、前記粗製のフィダキソマイシンは、
【００２１】
フィダキソマイシンが含まれる発酵ブロスに対して前処理して、フィダキソマイシンを含む溶液を獲得する段階（ａ）と、
【００２２】
段階（ａ）から得られたフィダキソマイシンの溶液に対してナノろ過濃縮を行って、フィダキソマイシンを含む濃縮液を獲得する段階（ｂ）と、及び
【００２３】
段階（ｂ）から得られた濃縮液を分離して、粗製のフィダキソマイシンを獲得する段階（ｃ）とを含む方法によって調製される。
【００２４】
ここで、段階（ａ）において、前記フィダキソマイシンを含む発酵ブロスは、本技術分野においての従来の調製方法によって調整することができる。本発明のにおいて、好ましくは、フィダキソマイシンを含む発酵ブロスは、
【００２５】
フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアをプレート培地に接種して培養して、菌糸を成熟させて、フィダキソマイシンのバクテリアコロニーを獲得する段階（１）と、
【００２６】
段階（１）から得られたフィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアを振とうフラスコ種培地に接種して培養することで、振とうフラスコ種液を獲得する段階（２）と、
【００２７】
段階（２）から得られた振とうフラスコ種液を、種タンクの種培地に接種して培養することで、種タンク培養液を獲得する段階（３）と、
【００２８】
段階（３）で調製された種タンク培養液を発酵培地に接種して培養することで、フィダキソマイシンを含む発酵ブロスを獲得する段階（４）とを含む。
【００２９】
段階（１）において、前記フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアは、一般的には、発酵培養を経てから、フィダキソマイシンが生成することができるバイオバクテリアであり、本発明においては、アクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）ＨＳ−１６−２０が好ましく、それは、既に２０１３年３月１１日に中国バイオバクテリア種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託されていて、寄託アドレス：北京市朝陽区北辰西路１号院、中国科学院微生物研究所、菌株受託番号は、ＧＭＣＣ ＮＯ.７２９４であり、アクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）と分類命名され、登録され、生存していることを証明する。前記プレート培地は、本技術分野においての従来のプレート培地でいいし、好ましくは、IＳＰ２培地である。前記IＳＰ２培地は、好ましくは、４ｇ/Ｌのグルコース、４ｇ/Ｌの酵母エキス、１０ｇ/Ｌのモルトエキス、１５ｇ/Ｌの寒天であり、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの培地の中の各成分の質量を指す。前記IＳＰ２培地においてのｐＨは７.３であることが好ましい。前記プレート培地は、一般的には、使用前に滅菌処理を行う。前記滅菌の方法は、本技術分野においての従来の方法でいい。前記滅菌の圧力は、１.０５ｋｇ/ｃｍ２であることが好ましい。前記滅菌時間は、２０ｍｉｎであることが好ましい。前記培養温度は、本技術分野においての従来の温度でいいし、好ましくは、２７〜２９℃であり、より好ましくは、２８℃である。前記培養時間は、本技術分野においての従来の時間でいいし、フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリア菌糸の成熟を保証することができればいいし、好ましくは、８日間である。
【００３０】
段階（２）において、前記振とうフラスコ種培地は、本技術分野においての従来の振とうフラスコ種培地でいいし、好ましくは、２ｇ/Ｌのスクロース、３ｇ/Ｌのソルビトール、３ｇ/Ｌのコットンシードミール、１.５ｇ/Ｌのピーナッツパウダー、０.６ｇ/ＬのＣａＣＯ３、０.３ｇ/ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが含まれて、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの種培地の中の各成分の質量を指す。前記振とうフラスコ種培地のｐＨ値は７.２であることが好ましい。前記振とうフラスコ種培地は、一般的には、使用前に滅菌処理を行う。前記滅菌の方法は、本技術分野においての従来のの方法でることができる。前記滅菌温度は１２１℃であることが好ましい。前記滅菌時間は３０ｍｉｎであることが好ましい。前記フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアコロニーの接種量は、本技術分野においての従来の接種量であることができ、好ましくは、1ミリリットルあたり（ｍＬ）の振とうフラスコ種培地に、フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアの接種量が１０５〜１０６ｃ.ｆ.ｕであることができる。前記培養温度は、本技術分野においての従来の温度であることができ、好ましくは、２７〜２９℃であり、より好ましくは、２８℃である。前記培養方式は、本技術分野においての従来の方式であることができ、好ましくは、振とう培養である。前記培養回転速度は２５０ｒｐｍであることが好ましい。前記培養時間は、本技術分野においての従来の培養時間であることができ、好ましくは、２８時間である。培養が終了後、得られた振とうフラスコ種液のｐＨ値は、一般的には、６.８〜７.０の間である。前記振とうフラスコ種液においてのフィダキソマイシンを生産するバイオバクテリア菌糸濃度は、一般的には、２５％〜３０％であり、前記百分率は、フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリア菌糸の体積が振とうフラスコ種液の体積の百分率である。
【００３１】
段階（３）において、前記種タンク種培地は、本技術分野においての従来の種タンク種培地であることができ、好ましくは、１０ｇ/Ｌのスクロース、２ｇ/Ｌのソルビトール、３ｇ/Ｌの可溶性デンプン、０.５ｇ/Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ/Ｌのビーフエキス、１ｇ/Ｌのピーナッツパウダー、０.０４ｇ/ＬのＫＨ２ＰＯ４が含まれて、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの種タンク培地の中の各成分の質量を指す。前記種タンク種培地は、一般的には、使用前に滅菌処理を行う。前記滅菌の方法は、本技術分野においての従来のの方法であることができ、好ましくは、蒸気滅菌である。前記蒸気滅菌の温度は、本技術分野においての従来の温度であることができ、好ましくは、１２１℃である。前記蒸気滅菌の時間は、本技術分野においての従来の時間であることができ、好ましくは、３０ｍｉｎである。前記振とうフラスコ種液の接種量は、本技術分野においての従来の接種量であることができ、前記振とうフラスコ種液の接種量と前記種タンク種培地の体積比は、０.０１：１である。前記培養温度は、本技術分野においての従来の温度であることができ、好ましくは、２７〜２９℃であり、より好ましくは、２８℃である。前記培養方式は、本技術分野においての従来の方式であることができる。前記培養の回転速度は、２００ｒｐｍであることが好ましい。前記培養時の通気（空気）量は、１ｖｖｍであることが好ましい。前記培養時間は、本技術分野においての従来の培養時間であることができ、好ましくは、２４時間である。培養が終了後、得られた種タンク培養液のｐＨ値は、一般的には、６.８〜７.０の間である。前記種タンク培養液の中のフィダキソマイシンを生産するバイオバクテリア菌糸濃度は、一般的には、２５％〜３０％であり、前記百分率は、フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリア菌糸の体積が、種タンク発酵ブロスの体積を占める百分率である。
【００３２】
段階（４）において、前記発酵培地は、本技術分野においての従来の発酵培地であることができ、好ましくは、１０ｇ/Ｌのスクロース、２ｇ/Ｌのソルビトール、３ｇ/Ｌの可溶性デンプン、０.５ｇ/Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ/Ｌのビーフエキス、１ｇ/Ｌのピーナッツパウダー、０.０４ｇ/ＬのＫＨ２ＰＯ４が含まれて、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの発酵培地の中の各成分の質量を指す。前記発酵培地の中には、さらに消泡剤が含まれ、前記消泡剤は、本技術分野においての従来の消泡剤であることができ、好ましくは、ＰＰＧである。前記消泡剤の使用量は、本技術分野においての従来の使用量であることができ、好ましくは、それが発酵培地質量の１％である。前記発酵培地は、一般的には、使用前に滅菌処理を行う。前記滅菌の方法は、本技術分野においての従来のの方法であることができ、好ましくは、蒸気滅菌である。前記蒸気滅菌の温度は、本技術分野においての従来の温度であることができ、好ましくは、１２１℃である。前記蒸気滅菌の時間は、本技術分野においての従来の時間であることができ、好ましくは、２０ｍｉｎである。前記培養温度は、本技術分野においての従来の温度であることができ、好ましくは、２７〜２９℃であり、より好ましくは、２８℃である。前記培養の方式は、本技術分野においての従来の方式であることができる。前記培養の回転速度は、２００ｒｐｍ〜３００ｒｐｍであることが好ましい。前記培養時の通気量は、０.８〜１.０ｖｖｍであることが好ましい。前記培養の時間は、本技術分野においての従来の培養時間であることができ、好ましくは、８時間である。
【００３３】
前記調製方法によって得られたフィダキソマイシンが含まれる発酵ブロスにおいて、フィダキソマイシンの単位は、一般的には、２０００ｍｇ/Ｌ以上であり、好ましくは、２８００ｍｇ/Ｌ〜３２００ｍｇ/Ｌの間である。
【００３４】
本発明は、またフィダキソマイシンを含む発酵ブロスを提供し、それは培養フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアで調整され、前記フィダキソマイシンを含む発酵ブロスの中に、フィダキソマイシンの単位は、２０００ｍｇ/Ｌ以上であり、好ましくは、２８００ｍｇ/Ｌ〜３２００ｍｇ/Ｌの間である。前記フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリアは、アクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）ＨＳ−１６−２０であることが好ましく、菌株受託番号は、ＣＧＭＣＣ ＮＯ.７２９４である。
【００３５】
ここで、段階（ａ）に記載の前処理は、フィダキソマイシンを含む発酵ブロスを固液分離して、菌糸体を獲得し、続いて、菌糸体を有機溶媒に浸し、好ましくは、前記有機溶媒は、本技術分野において、フィダキソマイシンを生産するバイオバクテリア菌糸体を浸すための従来の有機溶媒であることができ、好ましくは、メタノール又は者エタノールであり、より好ましくは、エタノールであり、その後、ろ過してフィダキソマイシンを含む溶液を獲得する。前記有機溶媒の使用量は、本技術分野においての従来の使用量であることができ、好ましくは、前記有機溶媒と前記菌糸体の体積質量比が２.５〜３.５Ｌ/ｋｇであり、より好ましくは、２.９〜３.０Ｌ/ｋｇ（例えば、２２Ｌ/７.４ｋｇ、２１Ｌ/７.１ｋｇ、２４Ｌ/８.４ｋｇ、２３Ｌ/７.８ｋｇ）である。
【００３６】
ここで、段階（ｂ）に記載のナノろ過濃縮で使用されるナノろ過膜は、本技術分野においての従来のナノろ過膜であることができ、好ましくは、ＤＫ又はＤＬナノろ過膜であり、より好ましくは、ＤＬナノろ過膜である。好ましくは、ナノろ過濃縮を経由したに得られた濃縮液の中、フィダキソマイシンの単位≧１００００ｍｇ/Ｌである。
【００３７】
ここで、本技術分野においての公知の方法を用いて、段階（ｂ）から得られた濃縮液から分離して粗製のフィダキソマイシンを獲得することができる。具体的な実施例において、逆溶剤を添加することができ、好ましくは、水であり、ナノろ過膜濃縮液に水を添加した後、濃縮液に（水を添加した後の濃縮液の中）有機溶媒の体積濃度が３５％より小さく、好ましくは、２５％−３０％であり、前記百分率は、水を添加した後の濃縮液の中に、有機溶媒の体積が水を添加した後の濃縮液の全体積に占める百分率である。
【００３８】
ここで、本技術分野においての公知の方法を用いて、段階（１）から得られた溶出液から分離してフィダキソマイシン精制品を獲得することができる。具体的な実施例において、逆溶剤を添加することができ、好ましくは、水であり、水の添加量と段階（１）から収集された溶出液の体積比は、（１−２）：１であり、好ましくは、（１.４−１.６）：１である。
【００３９】
本発明の利点は、
【００４０】
本発明は、粗製のフィダキソマイシンの調製過程で、フィダキソマイシンを含む発酵前処理液を、ナノろ過膜を用いて濃縮することで、発酵ブロスの中のほとんどの無機塩類と色素類物質を除去することができ、最後に、Ｃ８充填剤の分取カラムを選らんで、不純物とフィダキソマイシンが有効的に分離することができ、最終的に、フィダキソマイシンＨＰＬＣ純度≧９９.５％、収率≧５０％が獲得することできる。なお、本発明で使用された有機溶媒は、回収して、重複使用が可能であり、廃ガス、廃水、固体廃棄物の排出量が少なく、環境にやさしく、現在の製薬生産の傾向と要件に非常に適合する。
【００４１】
生物材料の寄託情報
【００４２】
本発明で使用されるアクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）ＨＳ−１６−２０菌株は、既に２０１３年３月１１日に、中国バイオバクテリア種寄託管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託されていて、寄託アドレス：北京市朝陽区北辰西路１号院、中国科学院微生物研究所、郵便番号：１００１０１、菌株受託番号は、ＣＧＭＣＣ ＮＯ.７２９４であり、アクチノプラネス属放線菌（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ.）と分類命名され、登録され、生存していることを証明する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例１においてのフィダキソマイシン発酵ブロスＨＰＬＣスペクトログラムを示す図である。
【図２】実施例１から調製された粗製のフィダキソマイシンの沈殿物のＨＰＬＣスペクトログラムを示す図である。
【図３】実施例１から調製されたフィダキソマイシンの精制品のＨＰＬＣスペクトログラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明の発酵培養に使用されるアクチノプラネス属放線菌は、既に２０１３年３月１１日に、中国バイオバクテリア種寄託管理委員会普通微生物センターに寄託されていて、受託番号は、ＣＧＭＣＣ ＮＯ.７２９４であり、具体的には、出願日が２０１３年１０月１６日である中国特許出願ＣＮ２０１３１０５０１３８９.３を参照し、これにおいて、本出願は、前記中国特許出願の全体を引用する。ゼネラル・エレクトリック（ＧＥ）製のナノろ過膜と、北京創新通恒科技有限公司製の分取カラムと、華譜新創科技有限公司及びＡｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌ  Ｎ．Ｖ製のＣ８充填剤と、島津ＬＣ２０１０ＨＴの高速液体クロマトグラフィーが使用され、フィダキソマイシン菌糸体に添加したエタノール、メタノールは、市販の工業級であり、調製用メタノール、アセトニトリルは、市販のクロマトグラフィー級であり、ギ酸は、市販の試薬級である。下述の実施例にクロマトグラフィー純度は、全てＨＰＬＣ純度を指し、通気は通入空気である。
【００４５】
本発明の発酵ブロス培養プロセスは、以下のようである。
【００４６】
（１）プレートコロニーの調製と培養
【００４７】
プレートは、IＳＰ２培地を利用し、IＳＰ２培地のレシピとして、４ｇ/Ｌのグルコースと、４ｇ/Ｌの酵母エキスと、１０ｇ/Ｌのモルトエキスと、１５ｇ/Ｌの寒天とがふくまれていて、蒸留水は１０００ｍＬまで定容し、ｐＨは７.３であり、ここで、ｇ/Ｌは、１ＬのIＳＰ２培地の中の各成分の質量を指す。使用前に滅菌処理を行い、滅菌圧力は１.０５ｋｇ/ｃｍ２であり、滅菌時間は２０ｍｉｎであり、５０−６０℃まで冷却した後、プレートに注ぎ、アクチノプラネス属放線菌（ＣＧＭＣＣ ＮＯ.７２９４）菌体を接種させて、２８±１℃下で８日間培養を行ってから、菌糸が成熟すると、アクチノプラネス属放線菌コロニーが獲得される。
【００４８】
（２）振とうフラスコ種液の調製と培養
【００４９】
種培地レシピとして、２ｇ/Ｌのスクロースと、３ｇ/Ｌのソルビトールと、３ｇ/Ｌのコットンシードミールと、１.５ｇ/Ｌのピーナッツパウダーと、０.６ｇ/ＬのＣａＣＯ３と、０.３ｇ/ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとがふくまれていて、ｐＨ７.２であり、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの種培地の中の各成分の質量を指す。振とうフラスコ液量は、２５ｍＬ/２５０ｍＬであり、即ち、２５０ｍＬの振とうフラスコに２５ｍＬの種培地を加えることである。種培地は、使用前に、１２１℃で３０分間滅菌する。その後、段階（１）から得られたアクチノプラネス属放線菌を種培地に接種させ、接種量は、１０５−１０６ｃ.ｆ.ｕ./ｍＬであり、培養温度は２８±１℃で、２５０ｒｐｍで振とう培養を２８時間行い、この時培養液のｐＨは、６.８−７.０であり、（アクチノプラネス属放線菌）菌糸濃度は２５−３０％（体積百分率）である。
【００５０】
（３）種タンク培養液の調製。
【００５１】
１５Ｌの種タンクに、１０Ｌの種培地（種タンク培地レシピとして、１０ｇ/Ｌのスクロースと、２ｇ/Ｌのソルビトールと、３ｇ/Ｌの可溶性デンプンと、０.５ｇ/Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４と、２ｇ/Ｌのビーフエキスと、１ｇ/Ｌのピーナッツパウダーと、０.０４ｇ/ＬのＫＨ２ＰＯ４とが含まれていて、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの種タンク培地の中の各成分の質量を指す。）において、滅菌は蒸気滅菌を利用し、１２１℃の条件下で３０分間行う。冷却後、１００ｍＬの振とうフラスコ種液に接種させ、２８±１℃の培養温度、２００ｒｐｍの攪拌回転速度、１ｖｖｍの通気量で、２４時間培養を行って、この時培養液のｐＨは６.８−７.０であり、（アクチノプラネス属放線菌）菌糸濃度は２５−３０％（ｖ/ｖ）である。
【００５２】
（４）発酵タンク培地の調製と培養
【００５３】
発酵培地のレシピとして、１０ｇ/Ｌのスクロースと、２ｇ/Ｌのソルビトールと、３ｇ/Ｌの可溶性デンプンと、０.５ｇ/Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４と、２ｇ/Ｌのビーフエキスと、１ｇ/Ｌのピーナッツパウダーと、０.０４ｇ/ＬのＫＨ２ＰＯ４とがふくまれていて、残量は水であり、ここで、ｇ/Ｌは、１Ｌの発酵培地の中の各成分の質量を指す。前記発酵培地に、消泡剤として、１％のＰＰＧ（ポリプロピレングリコール）を添加する。送料体積は、３５Ｌ（即ち、発酵培地は３５Ｌである）であり、ｐＨ７.０で、１２１℃の条件下で蒸気滅菌を２０分間行い、冷却後、約３.５Ｌの種タンク培養液に接種させ、２８±１℃の発酵温度、２００−３００ｒｐｍの攪拌回転速度、０.８−１.０ｖｖｍの通気量で、８日間発酵培養を行う。
【００５４】
実施例１
【００５５】
３０Ｌのフィダキソマイシン発酵単位が３０２６ｍｇ/Ｌである発酵ブロス（液相のスペクトログラムを示す図は、図１を参照する）を、ろ過させて、７.４ｋｇの菌糸体を獲得し、菌糸体を２２Ｌのエタノールに投入して浸した後、ろ過して、浸すろ液を収集し、ＤＫ型ナノろ過膜でフィダキソマイシン単位が１００００ｍｇ/Ｌより大きい程度になるまでナノろ過濃縮を行って、エタノール濃度が３０％になるように、精製水を濃縮液に加えて、３０ｍｉｎ攪拌を続き、ろ過して粗製のフィダキソマイシン（液相のスペクトログラムを示す図は、図２を参照する）を獲得し、クロマトグラフィー純度は７２.６％である。
【００５６】
華譜製のＣ８充填剤を入れたＤＡＣ２００分取カラムと、アセトニトリル：水：ギ酸＝５５：４５：０.１ （Ｖ：Ｖ：Ｖ）である移動相とを用いて、前記粗品に対して精製を行い、ＨＰＬＣ純度≧９９.５％の留分を収集して、純度≧９９.５％の留分を混合させ、攪拌しながら１.５倍の体積の精製水を添加し、ろ過、干燥を経て、４７.７ｇのフィダキソマイシン乾燥粉末を獲得し、クロマトグラフィー純度は９９.６７％（液相のスペクトログラムを示す図は、図３を参照する）であり、抽出の総生産率は５２.５％である。
【００５７】
実施例２
【００５８】
３０Ｌのフィダキソマイシン発酵単位が２９６３ｍｇ/Ｌである発酵ブロスをろ過させてから、７.１ｋｇの菌糸体を獲得し、菌糸体を２１Ｌのメタノールに投入して浸した後、ろ過して、浸すろ液を収集し、ＤＫ型ナノろ過膜でフィダキソマイシン単位が１００００ｍｇ/Ｌより大きい程度になるまでナノろ過濃縮を行って、メタノール濃度が３０％になるように、精製水を濃縮液に加えて、３０ｍｉｎ攪拌を続き、ろ過して粗製のフィダキソマイシンを獲得し、クロマトグラフィー純度は７０.９％である。
【００５９】
華譜製のＣ８充填剤を入れたＤＡＣ２００分取カラムと、メタノール：水：ギ酸＝６５：３５：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）である移動相とを用いて、前記粗品に対して精製を行い、ＨＰＬＣ純度≧９９.５％の留分を収集して、純度≧９９.５％の留分を混合させ、攪拌しながら１.５倍の体積の精製水を添加し、ろ過、干燥を経て、４５.６ｇのフィダキソマイシン乾燥粉末を獲得し、クロマトグラフィー純度は９９.５８％であり、抽出の総生産率は５１.３％である。
【００６０】
実施例３
【００６１】
３０Ｌのフィダキソマイシン発酵単位が３０７９ｍｇ/Ｌである発酵ブロスを、ろ過させて、８.１ｋｇの菌糸体を獲得し、菌糸体を２４Ｌのエタノールに投入して浸した後、ろ過して、浸すろ液を収集し、ＤＬ型ナノろ過膜でフィダキソマイシン単位が１００００ｍｇ/Ｌより大きい程度になるまでナノろ過濃縮を行って、エタノール濃度が３０％になるように、精製水を濃縮液に加えて、３０ｍｉｎ攪拌を続き、ろ過して粗製のフィダキソマイシンを獲得し、クロマトグラフィー純度は７２.０％である。
【００６２】
ｋｒｏｍａｓｉｌ製のＣ８充填剤を入れたＤＡＣ２００分取カラムと、アセトニトリル：水：ギ酸＝５５：４５：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）である移動相とを用いて、前記粗品に対して精製を行い、ＨＰＬＣ純度≧９９.５％の留分を収集して、純度≧９９.５％の留分を混合させ、攪拌しながら１.５倍の体積の精製水を添加し、ろ過、干燥を経て、４８.１ｇのフィダキソマイシン乾燥粉末を獲得し、クロマトグラフィー純度は９９.６２％であり、抽出の総生産率は５２.１％である。
【００６３】
実施例４
【００６４】
３０Ｌのフィダキソマイシン発酵単位が３１０２ｍｇ/Ｌである発酵ブロスを、ろ過させて、７.８ｋｇの菌糸体を獲得し、菌糸体を２３Ｌのエタノールに投入して浸した後、ろ過して、浸すろ液を収集し、ＤＬ型ナノろ過膜でフィダキソマイシン単位が１００００ｍｇ/Ｌより大きい程度になるまでナノろ過濃縮を行って、エタノール濃度が３０％になるように、精製水を濃縮液に加えて、３０ｍｉｎ攪拌を続き、ろ過して粗製のフィダキソマイシンを獲得し、クロマトグラフィー純度は７３.５％である。
【００６５】
ｋｒｏｍａｓｉｌ製のＣ８充填剤を入れたＤＡＣ２００分取カラムと、メタノール：水：ギ酸＝６５：３５：０.１（Ｖ：Ｖ：Ｖ）である移動相とを用いて、前記粗品に対して精製を行い、ＨＰＬＣ純度≧９９.５％の留分を収集して、純度≧９９.５％の留分を混合させ、攪拌しながら１.５倍の体積の精製水を添加し、ろ過、干燥を経て、４９.０ｇのフィダキソマイシン乾燥粉末を獲得し、クロマトグラフィー純度は９９.６８％であり、抽出の総生産率は５２.７％である。
【００６６】
以上、本発明の具体的な実施形態に関して記述したが、当業者にとっては、これらは例示して説明するためのものに過ぎなく、本発明の原理と実質を逸脱しない前提で、これらの実施形態に対して、多種の変更又は修正を行うことができる。したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲によって限定される。
【図１】
0006592500.tif 000003
【図２】
0006592500.tif 000004
【図３】
0006592500.tif 000005