(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイズが１．６ｍｍ〜２．０ｍｍのイネの葯特異的にプロモーター活性を有し、配列番号：１及び配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
サイズが１．２ｍｍ〜１．５ｍｍのイネの葯特異的にプロモーター活性を有し、配列番号：２及び配列番号：３のいずれかで表わされる塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１から２のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１から２のいずれかに記載のＤＮＡの下流に自己攻撃遺伝子が結合されている請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３から４のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする形質転換植物細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換植物細胞を含むことを特徴とする形質転換植物体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換植物体の子孫（ただし、請求項１から２のいずれかに記載のＤＮＡを含むものに限る）及びクローンのいずれかであることを特徴とする形質転換植物体。
【請求項８】
請求項６から７のいずれかに記載の形質転換植物体から得られることを特徴とする繁殖材料（ただし、請求項１から２のいずれかに記載のＤＮＡを含むものに限る）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雄性不稔化に有効な葯特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、及び該形質転換植物体から得られる繁殖材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘテロシス利用育種の実用化においては、Ｆ１雑種種子を効率的に採集することが鍵を握ることが多い。１果あたりの種子数の多いメロンやトマトなどの果菜類等では、人工交配によってＦ１種子を採集（以下、「Ｆ１採種」と称することがある。）すればよいが、穀物などの１果あたりの種子数が少ない作物では、何らかの工夫が必要となる。
Ｆ１雑種品種の種子を効率的に生産する主要な方法として、自家不和合性を利用する方法と、雄性不稔性を利用する方法とがある。自家不和合性の制御は環境要因等の影響を受けやすく、一般に不安定性であることから、自家不和合性を利用したＦ１採種による種子が栽培に用いられているアブラナ科野菜等では、商業Ｆ１品種中に自殖種子が混入しやすい欠点があり、一般に、雄性不稔性を利用する方法の方が採種システムの完成度が高いと考えられている。
【０００３】
雄性不稔性を利用する方法としては、細胞質雄性不稔（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、以下、「ＣＭＳ」と称することがある。）を用いた方法が古くから用いられて来た。
また近年、本来その自殖での維持が不可能であることから、Ｆ１採種への利用には不向きと考えられて来た核支配劣性の雄性不稔を、その相補遺伝子によって維持する方法として、ＳＰＴプロセスが米国デュポンパイオニア社によって開発・利用されるようになった。なお、前記ＳＰＴプロセスを実現するためのＳＰＴ維持系統は、導入遺伝子を有する花粉のみを不活化しているが、それそのものは雄性不稔ではない。
また後述するが、北米のセイヨウナタネのＦ１採種では、葯特異的な発現プロモーター配列で自己攻撃遺伝子（以下、「自殺遺伝子」と称することもある。）をドライブすることで生じる組換え技術によって生じる雄性不稔（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ、以下、「ＴＭＳ」と称することがある。）が利用されている。
【０００４】
一方、雄性不稔性を、Ｆ１採種にとどまらず、育種における交配作業の効率化に利用する試みも、古くから提案されて来た。
【０００５】
イネ、コムギ、トウモロコシは世界の三大作物と言われている。このうち、イネ、コムギ単収は１９６０年代〜１９９０年代前半頃まで飛躍的な向上を見せたが、近年、収量増加速度の鈍化が顕著となっている。
その一方、もう１つの三大作物であるトウモロコシ育種はその他殖性を活かした循環選抜と呼ばれるタイプの異なる複数のゲノム断片を“混ぜ合わせる”育種により、持続的に収量を増加させている。
このようなゲノム断片の“混ぜ合わせ”は、近縁度の高い２品種を交雑し、その後代を固定・選抜する自殖性作物の通常の育種ではほとんど期待できない。自殖性作物でも“ゲノムの混ぜ合わせ”を効率的に進め、高い育種パフォーマンスを得るために、雄性不稔等を利用して大規模に他殖させる（交配する）育種法の確立が期待される。
【０００６】
自殖性植物を効率的に他殖させ、ゲノムシャッフリングによる循環選抜を実現するには核雄性不稔性を用いることが効果的であり、この目的を達成する方法として、ＭＳＦＲＳ（Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｆａｃｉ１ｉｔａｔｅｄ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法が考案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。ＭＳＦＲＳ法は、１）雄性不稔が分離する集団から不稔と可稔の個体を選抜して相互交配させＦ１を養成、２）Ｆ２世代で次の選抜サイクルを行うための集団を作成、３）新たな遺伝資源は各サイクルで雄性不稔個体に交配することにより集団に導入、４）選抜サイクルを繰り返すことにより、効率的なゲノムシャッフリングを基礎とする循環選抜を実現し、高い育種の効果を得ることを目指した方法である。
【０００７】
しかし、ＭＳＦＲＳ法においては開花期に雄性不稔個体と雄性不稔でない個体を選別する必要があり、大集団で効率的に循環選抜を実施することが難しい。この点を改善するために、雄性不稔に連鎖する種子形質などを形質マーカーとして利用する方法も考案されているが、雄性不稔遺伝子とマーカー遺伝子とが密接に連鎖している必要があり、普遍的な方法にはなり得ないことに加え、両者の間に遺伝的組換えが生じて連鎖関係が崩壊してしまう問題点があった。
【０００８】
一方、トランスジェニック手法において、葯やその内部特異的プロモーターとＲＮＡ分解酵素等の自己攻撃遺伝子を用いることで、優性の雄性不稔個体を得る方法がある（例えば、特許文献１、非特許文献３及び４参照）。また、同時に除草剤等の薬剤耐性マーカー遺伝子を同一コンストラクトにて導入することにより、優性の雄性不稔個体を芽生え段階で選抜することができる。得られる形質転換体の優性の雄性不稔と除草剤耐性は相引で極めて強い連鎖関係になる。この方法は、北米のセイヨウナタネのＦ１採種において、使用されている。
【０００９】
通常効率的に他殖させることが難しいイネやコムギ等の自殖性植物において、ＭＳＦＲＳ法で必要な開花期の雄性不稔個体と雄性不稔でない個体を選別なしに、その大規模な集団を効率的に他殖させる効率的な循環選抜育種システムを実現するために、生育初期（幼苗段階まで）に、ポジティブ／ネガティブ選抜可能な優性の雄性不稔を遺伝子組換え技術によって作出し、利用する方法が提案されている（例えば、特許文献２及び３、非特許文献５及び６参照）。
【００１０】
葯特異的に発現する遺伝子は数多く知られているので、そこから類推される発現プロモーターも数多い。しかしこれらのプロモーターの全てが、自殺遺伝子との組合せることで雄性不稔の作出に有効な訳ではない。雄性不稔化のためには、花粉粒の分化を完全に阻害するか、若しくは分化した全ての花粉を完全に不活化する必要があり、葯の外壁や花糸、また分化後の花粉のうち導入遺伝子をもつ半数の花粉のみで発現するだけでは雄性不稔は実現できないことは自明であり、加えて組織特異的に十分な発現量を実現できる必要がある。このため、雄性不稔化を引き起すことができるプロモーターの獲得には、単に葯特異的に発現するだけでなく、実際に自殺遺伝子との組合せで組換え体を作出し、その効果を確認する必要がある。
【００１１】
植物を雄性不稔化できるプロモーターはブロッコリー由来のＡ９（例えば、非特許文献７参照）、タバコ由来のＰＴＡ２９（例えば、非特許文献３及び４参照）、イネ由来のＰＴ７２、ＰＴ４２（例えば、特許文献４参照）などが知られている。このうちブロッコリー由来のＡ９プロモーターは、イネの雄性不稔化に有効な例が報告されている（例えば、非特許文献７参照）。これらを用いれば、イネを雄性不稔化が可能になり、放任授粉によってゲノムを混ぜあわせる育種が原理的に可能である。
【００１２】
しかし、例えば、開頴時間が極めて短いイネでは、単なる雄性不稔では効率的に他殖種子を得るのがままならないことが多い。イネの雄性不稔利用したＦ１採種では、開花特性の優れた雄性不稔系統の獲得が成功の鍵を握っている。即ち、イネの雄性不稔系統の開頴率は低く、また、１日における開頴する時間帯が野生型より遅くなるなどの特性を伴い、採種効率の大幅な低下に繋がる。これは、突然変異によって生じた雄性不稔も組換え技術によって作出される雄性不稔も同様である。組換え技術によって作出される雄性不稔を用いた循環選抜への利用を含め、雄性不稔イネと非組換えイネ間で効率的に他殖させるためには、雄性不稔の確実さに加え、優れた開花特性（開頴率が高く、開頴する時間帯が野生型（非遺伝子組換えイネ）と違わないこと等）が、他殖に有利な雄性不稔作物の作出に不可欠である。
【００１３】
上述のように、自己攻撃遺伝子と葯特異的発現プロモーターとの組合せにより、確実な雄性不稔性作物得ることは比較的容易である。また、突然変異処理により正常な花粉を生産するのに必要な遺伝子を破壊することによって、多数の雄性不稔系統を得ることができる。
しかし、それらの多くは、必ずしも優れた開花特性を有する訳ではない。事実、我々の研究グループでは、ブロッコリー由来のＡ９を用いて、安定してイネを雄性不稔化できることは確認したが、開花時間の同期化等の課題が残された。
【００１４】
したがって、組換え技術による雄性不稔により、効率的な他殖種子を獲得するためには、優れた開花特性を有する優性の雄性不稔作物を作出できる葯特異的発現プロモーターの獲得が必要であるが、そのようなプロモーターは未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６５０９５１６号明細書
【特許文献２】特許第４２５１３７５号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１／００９９６５４号明細書
【特許文献４】特表平８−５２５３９７号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｒａｍａｇｅ，  Ｒ．  Ｔ．  （１９７５）  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｂａｒｌｅｙ．  Ｂａｒｌｅｙ  Ｎｅｗｓｌ．１８：６２−６５．
【非特許文献２】Ｅｓｌｉｃｋ，  Ｒ．  Ｆ．  （１９７７）  Ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ．  Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｃｅｒｅａｌｓ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ（Ｂａｒｌｅｙ）．Ｖｏ１．ＩＩ．８４−９１．
【非特許文献３】Ｍａｒｉａｎｉ，  Ｃ．，  Ｍ．  Ｄｅ  Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ，  Ｊ．  Ｔｒｕｅｔｔｖｅｒ，  Ｊ．  Ｌｅｅｍａｎｓ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  （１９９０）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍａｅｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｇｅｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４７：  ７３７−７４１．
【非特許文献４】Ｍａｒｉａｎｉ，  Ｃ．，  Ｖ．  Ｇｏｓｓｅｌｅ，  Ｍ．  Ｄｅ  Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ，  Ｍ．  Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ，  Ｒ．  Ｂ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｗ．  Ｄｅ  Ｇｒｅｅｆ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｌｅｅｍａｎｓ．  １９９２．  Ａ  ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）．  ３５７：  ３８４−３８７．
【非特許文献５】Ｔａｎａｋａ，  Ｊ．  （２０１０）  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｏｇａｍｏｕｓ  ｃｒｏｐｓ．  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：  １１２４−１１２７．
【非特許文献６】田中淳一，  田部井豊（２０１４）  ＮＢＴによる生殖制御によって育種効率を高めようとする取り組み  −  ＳＰＴ（ｓｅｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）プロセス，リバースブリーディング，果樹の早期開花，自殖性作物のＴＭＳ循環選抜．  生物の科学  遺伝  ６８：  １１７−１２４．
【非特許文献７】田部井豊，  七里吉彦，  小長谷賢一，  津田麻衣，  奥崎文子，  加藤浩，  田中淳一  （２０１２）  ｂａｒｎａｓｅのタペート組織特異的発現による優性の雄性不稔イネの開発  −  遺伝的組換え頻度を飛躍的に高める育種法の開発に向けて．  育種学研究１４（別１）：  ６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、高い雄性不稔化率を有し、また、開花特性に優れ、効率的に他殖させることが可能な植物体を得ることができる葯特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、及び該形質転換植物体から得られる繁殖材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  葯特異的にプロモーター活性を有することを特徴とする下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされた塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ
＜２＞  前記＜１＞に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜３＞  前記＜２＞に記載のベクターを含むことを特徴とする形質転換植物細胞である。
＜４＞  前記＜３＞に記載の形質転換植物細胞を含むことを特徴とする形質転換植物体である。
＜５＞  前記＜４＞に記載の形質転換植物体の子孫及びクローンのいずれかであることを特徴とする形質転換植物体である。
＜６＞  前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の形質転換植物体から得られることを特徴とする繁殖材料である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によると、従来における前記問題を解決することができ、高い雄性不稔化率を有し、また、開花特性に優れ、効率的に他殖させることが可能な植物体を得ることができる葯特異的にプロモーター活性を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、及び該形質転換植物体から得られる繁殖材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、製造例２−１〜２−６、比較製造例２−１〜２−２１において、バイナリーベクターｐＺＨ２Ｂ上に構築したコンストラクトを説明する図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２において、日本晴（コントロール）を観察した結果の一例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２において、製造例２−２のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察した結果の一例を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、試験例２において、製造例２−４のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察した結果の一例を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、試験例２において、製造例２−５のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察した結果の一例を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、試験例２において、製造例２−６のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察した結果の一例を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３において、製造例２−１のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察した結果の一例を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３において、製造例２−３のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察した結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（ＤＮＡ）
本発明のＤＮＡは、葯特異的にプロモーター活性を有する下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされた塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ
【００２２】
＜配列番号：１で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：１で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０５ｇ０１８１２００、アクセッション番号がＡＫ１０５５１９の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域の１つである（以下、「ＡＳＰ１０８−２」と称することがある。）。
【００２３】
＜配列番号：４で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：４で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０５ｇ０１８１２００、アクセッション番号がＡＫ１０５５１９の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域の他の１つである（以下、「ＡＳＰ１０８−１」と称することがある。）。
【００２４】
＜配列番号：２で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：２で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０３ｇ０６８３５００、アクセッション番号がＣＩ５０７６７４の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域である（以下、「ＡＳＰ２０８」と称することがある。）。
【００２５】
＜配列番号：３で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：３で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０５ｇ０２８９１００、アクセッション番号がＣＩ５１６４８１の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域である（以下、「ＡＳＰ３０４」と称することがある。）。
【００２６】
＜配列番号：５で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：５で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０２ｇ０１２０５００、アクセッション番号がＡＫ１０６７６１の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域である（以下、「ＡＳＰ０４」と称することがある。）。
【００２７】
＜配列番号：６で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：６で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０６ｇ０５７４９００、アクセッション番号がＡＫ１０９２１８の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域である（以下、「ＡＳＰ２０４」と称することがある。）
【００２８】
＜配列番号：７で表わされる塩基配列＞
前記配列番号：７で表わされる塩基配列は、Ｌｏｃｕｓ  ＩＤがＯｓ０４ｇ０５２８２００、アクセッション番号がＡＫ０６４６９３の葯特異的に発現する遺伝子のプロモーター領域である（以下、「ＡＳＰ２０７」と称することがある。）。
【００２９】
＜配列同一性＞
前記配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列との配列同一性としては、８５％以上であり、かつ葯特異的にプロモーター活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上が特に好ましい。
塩基配列の同一性は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ，  Ｓ．  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−２２６８、Ｋａｒｌｉｎ，  Ｓ．  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：  ５８７３）を用いて決定することができる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えば、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とするなどが挙げられる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３０】
＜置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれか＞
前記ＤＮＡは、葯特異的にプロモーター活性を有する限り、配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされたものであってもよい。
前記複数とは、２塩基〜１０塩基程度をいう。
【００３１】
＜ストリンジェントな条件＞
前記ＤＮＡは、葯特異的にプロモーター活性を有する限り、配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであってもよい。
前記ストリンジェントな条件としては、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６７℃の条件が挙げられ、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、７４℃のよりストリンジェンシーが高い条件が好ましい。
【００３２】
前記ＤＮＡの中でも、より安定した雄性不稔形質を示す植物体を得ることができ、また、前記植物体が、開花特性に優れ、より効率良く他殖させることができる点で、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされた塩基配列を含むＤＮＡ、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡが好ましく、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされた塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：１〜配列番号：４のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡがより好ましく、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡが特に好ましい。
【００３３】
前記配列番号：１で表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列の具体例としては、配列番号：８で表わされる塩基配列（配列同一性：９９％以上）が挙げられる。
【００３４】
前記ＤＮＡの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単子葉植物由来が好ましく、イネ科植物由来がより好ましく、イネ由来が特に好ましい。
【００３５】
前記ＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション技術を用いる方法、ＰＣＲ技術を用いる方法、人工遺伝子合成により合成する方法などが挙げられる。
【００３６】
前記ハイブリダイゼーション技術を用いる方法では、例えば、前記配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列若しくはその一部をプローブとして、イネや他の植物から前記配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と高い相同性を有するＤＮＡを単離することができる。
前記ハイブリダイゼーション反応の条件は、ストリンジェントな条件が好ましい。前記ストリンジェントな条件としては、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、６７℃の条件が挙げられる。また、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣ、７４℃の条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。
【００３７】
前記ＰＣＲ技術を用いる方法では、例えば、イネ品種「日本晴」のＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより調製する方法が挙げられる。
【００３８】
また、配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡや、配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされた塩基配列を含むＤＮＡの調製方法としては、例えば、前記配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列に対して、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により変異を導入する方法などが挙げられる。
【００３９】
前記ＤＮＡが葯特異的にプロモーター活性を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、レポーター遺伝子を用いたレポーターアッセイなどが挙げられる。
前記レポーター遺伝子としては、特に制限はなく、公知のレポーター遺伝子を適宜選択することができ、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子などが挙げられる。
【００４０】
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明のＤＮＡを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【００４１】
＜ＤＮＡ＞
前記ＤＮＡは、上記ＤＮＡの項目に記載したものである。
【００４２】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自己攻撃遺伝子、植物体内で遺伝子を発現させるためのプロモーター、前記自己攻撃遺伝子の活性を阻害する遺伝子、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。これらの中でも、自己攻撃遺伝子、植物体内で遺伝子を発現させるためのプロモーター、及び前記自己攻撃遺伝子の活性を阻害する遺伝子を含むことが好ましい。
【００４３】
−自己攻撃遺伝子−
前記自己攻撃遺伝子は、前記ＤＮＡの下流に結合される。前記自己攻撃遺伝子は、前記ＤＮＡの活性化に応答して発現することが可能な状態で結合しており、葯特異的に発現し得る。
前記自己攻撃遺伝子としては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができ、例えば、タンパク質分解酵素遺伝子、ＲＮＡ分解酵素遺伝子などが挙げられる。また、花粉を不活化させる場合であれば、デンプン分解遺伝子なども挙げられる。
前記ＲＮＡ分解酵素遺伝子の具体例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＲＮＡ分解酵素遺伝子バルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）などが挙げられる。
【００４４】
前記ベクターは、翻訳エンハンサーを含んでもよい。
前記翻訳エンハンサーを前記自己攻撃遺伝子に連結することにより、前記自己攻撃遺伝子の組織特異性を変化させることなく、その発現量を高めることができる。
前記翻訳エンハンサーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネアルコールデヒドロゲナーゼ５’非翻訳領域（「Ｓｕｇｉｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｔｈｅ  ５’-ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０５：  ３００-３０２．」）などが挙げられる。
【００４５】
−植物体内で遺伝子を発現させるためのプロモーター−
前記植物体内で遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターなどが挙げられる。
前記カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの下流に後述する前記自己攻撃遺伝子の活性を阻害する遺伝子を結合し、該プロモーターの活性化に応答して前記自己攻撃遺伝子の活性を阻害する遺伝子を発現させることにより、葯以外の組織で漏出的に発現する前記自己攻撃遺伝子の悪影響を排除することができる。
【００４６】
−自己攻撃遺伝子の活性を阻害する遺伝子−
前記自己攻撃遺伝子の活性を阻害する遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バルスター（Ｂａｒｓｔａｒ）などが挙げられる。
【００４７】
−ターミネーター配列−
前記ターミネーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子及び３５Ｓ遺伝子由来ダブルターミネーターなどが挙げられる。
【００４８】
−薬剤耐性遺伝子−
前記薬剤耐性遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００４９】
前記ベクターは、雄性不稔化を生育初期までに判別可能なポジティブマーカー形質、及びネガティブマーカー形質を実現する遺伝子を含んでもよい。
前記ポジティブマーカー形質を実現する遺伝子の具体例としては、除草剤耐性遺伝子（例えば、恒常発現プロモーターで除草剤遺伝子をドライブし、ＮＯＳターミネーターを繋げた構造）などが挙げられる。
前記ネガティブマーカー形質を実現する遺伝子の具体例としては、ヒートショック致死遺伝子（例えば、ヒートショックタンパク質のプロモーターなどの誘導プロモーターで自殺遺伝子をドライブし、ＮＯＳターミネーターを繋げた構造）などが挙げられる。
【００５０】
また、前記ベクターは、雄性不稔化を生育初期までに判別可能なビジブルマーカー形質を実現する遺伝子を含んでもよい。
前記ビジブルマーカー形質を実現する遺伝子の具体例としては、デュポンパイオニアが開発したＳＰＴプロセスで利用されている胚乳特異的発現プロモーター（例えば、グルテリン遺伝子のプロモーター）で蛍光タンパク（例えば、ＧＦＰ）遺伝子をドライブすることなどが挙げられる。
【００５１】
前記その他の構成は、例えば、「Ｍａｒｉａｎｉ，  Ｃ．，  Ｍ．  Ｄｅ  Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ，  Ｊ．  Ｔｒｕｅｔｔｖｅｒ，  Ｊ．  Ｌｅｅｍａｎｓ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  （１９９０）  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｅ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍａｅｉｃ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｇｅｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３４７：  ７３７−７４１．」に記載のものと同様とすることができる。
【００５２】
前記ＤＮＡ、及び前記その他の構成を導入するベクターとしては、特に制限はなく、公知のベクターを適宜選択することができ、例えば、バイナリーベクターｐＺＨ２Ｂ（Ｋｕｒｏｄａ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｋｉｍｉｚｕ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍｉｋａｍｉ  （２０１０）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７４（１１）：  ２３４８−２３５１．）などが挙げられる。
【００５３】
前記ベクターの好ましい態様としては、図１に示す態様が挙げられる。
【００５４】
前記ベクターを構築する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００５５】
後述する試験例に示すように、本発明のＤＮＡを含むベクターを導入することにより、雄性不稔形質を示す形質転換植物体を得ることができ、また、前記形質転換植物体は、優れた開花特性を有し、他殖効率に優れる。したがって、本発明は、前記ＤＮＡ、及び前記ベクターの少なくともいずれかを含む雄性不稔形質誘導剤、特に、他殖用の形質転換植物体の作出用雄性不稔形質誘導剤にも関する。
【００５６】
（形質転換植物細胞）
本発明の形質転換植物細胞は、本発明のベクターを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【００５７】
＜ベクター＞
前記ベクターは、上記ベクターの項目に記載したものである。
【００５８】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
前記植物細胞とは、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
前記植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単子葉植物が好ましく、イネ科植物がより好ましく、イネが特に好ましい。
【００６０】
前記形質転換植物細胞は、前記ベクターを前記植物細胞に導入することにより、製造することができる。
前記ベクターの前記植物細胞への導入方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法などが挙げられる。
【００６１】
（形質転換植物体）
本発明の形質転換植物体は、本発明の形質転換植物細胞を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記形質転換植物体は、その子孫及びクローンのいずれかであってもよい。
【００６２】
＜形質転換植物細胞＞
前記形質転換植物細胞は、上記形質転換植物細胞の項目に記載したものである。
【００６３】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６４】
前記植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、単子葉植物が好ましく、イネ科植物がより好ましく、イネが特に好ましい。
【００６５】
前記形質転換植物体は、前記形質転換植物細胞から公知の方法により植物体を再生することにより、製造することができる。
例えば、イネにおいては、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，  Ｓ．Ｋ．  （１９９５）  Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）  ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １００：  １５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９：  ９５７−９６２．）、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６：  ２７１−２８２）などが挙げられる。
【００６６】
本発明の形質転換植物体は、後述する試験例に示すように、雄性不稔形質を示し、また、開花特性に優れる（開花率が高く、開花時間及び開花日が原品種に近い）ため、高い他殖率が実現できる。そのため、他殖用の形質転換植物体として好適である。
また、本発明は、前記ベクターを前記植物細胞へ導入し、形質転換植物細胞を得る工程と、前記形質転換植物細胞を再生し、形質転換植物体を得る工程とを含む雄性不稔形質を示す他殖用の形質転換植物体の製造方法にも関する。
【００６７】
（繁殖材料）
本発明の繁殖材料は、本発明の形質転換植物体から得られる。
【００６８】
＜形質転換植物体＞
前記形質転換植物体は、上記形質転換植物体の項目に記載したものである。
【００６９】
前記繁殖材料とは、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどが挙げられる。
前記繁殖材料は、公知の方法により、前記形質転換植物体から調製することができる。
前記繁殖材料は、本発明のＤＮＡ及びベクターのいずれかを保持する。
【実施例】
【００７０】
以下、試験例、製造例、及び比較製造例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例、及び製造例に何ら限定されるものではない。
【００７１】
（試験例１：葯特異的発現プロモーターの候補配列の選定）
独立行政法人生物資源研究所が提供するイネの遺伝子発現データベースＲｉｃｅＸＰｒｏ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅｘｐｒｏ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）のデータを用いて、葯特異的に発現する遺伝子を抽出した。具体的にはＲｉｃｅＸＰｒｏのＲＸＰ０００１データセットを選択し、該Ｗｅｂサイト中のＡｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓにより、葯と、柱頭等の他の組織との発現量の差が顕著な遺伝子を抽出し、それらの遺伝子の発現プロファイルを目視にて確認し、葯のみで発現している遺伝子を抽出した。
【００７２】
また、葯特異的発現プロモーター候補配列の選定には、葯の生育ステージの中で、どのステージで発現が高まるかについても注目し、可能な限り発現の高まる生育ステージ及び遺伝子が発現するステージのプロファイルの多様性にも留意した。
【００７３】
これらの遺伝子の上流域をＲｉｃｅ  ＴＯＧＯ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｇｒｉ−ｔｒａｉｔ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）及びＲＡＰ−ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）にて、遺伝子構造及び周辺の遺伝子の配置を確認し、選択した遺伝子と隣接する遺伝子の間が８００ベース以上あり、プロモーター領域の配列に制限酵素サイトやＧＣリッチなものが少ないもの等を考慮し、それらの遺伝子上約２ｋｂｐを抽出し、葯特異的発現プロモーターの候補配列とした。前記候補配列の概要を表１に示す。
【００７４】
【表１】
0006506065.tif 000002
【００７５】
表１の「イネにおける発現ステージ」の欄の記載は、以下のとおりである。
２  ：  サイズが、０．７ｍｍ〜１．０ｍｍの葯にて発現する。
３  ：  サイズが、１．２ｍｍ〜１．５ｍｍの葯にて発現する。
４  ：  サイズが、１．６ｍｍ〜２．０ｍｍの葯にて発現する。
【００７６】
（製造例１−１〜１−６、比較製造例１−１〜１−２１：実験用プロモーターＤＮＡの調製）
＜製造例１−１：ＡＳＰ１０８−１の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
イネ品種「日本晴」のＤＮＡを、成葉から珪藻土とスピンフィルターを用いる方法（Ｔａｎａｋａ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｉｋｅｄａ  （２００２）．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｒｏｍ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐｌａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉａｔｏｍａｃｅｏｕｓ  ｅａｒｔｈ  ａｎｄ  ａ  ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ．  Ｂｒｅｅｄ．  Ｓｃｉ．  ５２：  １５１−１５５．）、又はＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ，  Ｖｅｎｌｏ，  Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）を用いて抽出した。
【００７７】
前記「日本晴」のＤＮＡを鋳型とし、下記プライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（ＴａＫａＲａ，  Ｓｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）又はＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲを行い、ＡＳＰ１０８−１の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：４）を調製した。
また、前記プライマーの５’末端側に制限酵素ＸｂａＩサイトを、３’末端側にＢａｍＨＩサイトを付加することで、以降のコンストラクションに使用した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１０８Ｆｗ０１  ：  ５’−ｃｃｃｔｃｔａｇａｔｔｇａｇａｔａａａａｔｃａｔａａｇａａｇａａｔｃｃａａａｇｇｃｔａ−３’（配列番号：９）
ＡＳＰ１０８Ｒｖ０１  ：  ５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｇａｇｇａａｇｃｔｃａｇｃａａｇｇｃｇｃｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｔａ−３’（配列番号：１０）
【００７８】
＜製造例１−２：ＡＳＰ２０８の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０８の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：２）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０８ＡＦｗ０１  ：  ５’−ｔｃｇｃａｔｔｔａｃａｔｔｔｇｔｇｃａａｔｔｔａｔａｔｔｔｃｔａｇａｇａｃａｔａｃｔ−３’（配列番号：１１）
ＡＳＰ２０８ＢＲｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇｃｃｔｃｔｇｃａｔｔｇｃａａｇａｇａｇｇｃｇａｔｔｔｔｔ−３’（配列番号：１２）
【００７９】
＜製造例１−３：ＡＳＰ３０４の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０４の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：３）を調製した。
−増幅用プライマー−
−−１ｓｔ  ＰＣＲ−−
ＡＳＰ３０４Ｏｕ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｃｃｇｇｇｃａｃｃａｔｔｇｔｔｇａａａｔｔｇａｇｔａ−３’（配列番号：１３）
ＡＳＰ３０４Ｏｕ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｔｔｃａｃｃａｔｃｇａｃｔｔｃａｇａｇｃａｔｔｃｔｔｔｔｔｃ−３’（配列番号：１４）
−−２ｎｄ  ＰＣＲ−−
ＡＳＰ３０４Ｆｗ０１  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａａｔａｔｇａｇｔｇｔｃａａａｃｃｃｇｔｃｇｇ  ｔｇａｃ−３’（配列番号：１５）
ＡＳＰ３０４Ｒｖ０１１  ：  ５’−ｇｃｇｇｇａｔｃｃｇ  ａｃｇａｔｇｔｔｔｃｔｃｃｔｃｃｇｔｃｃｔｃｃａ−３’（配列番号：１６）
【００８０】
＜製造例１−４：ＡＳＰ０４の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ０４の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：５）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ０４Ｆ０１  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａａａｔｔｇａａａｇｔｔａｇｇａｃｔｃｃｃａａ  ｇａ−３’（配列番号：１７）
ＡＳＰ０４Ｒ０１  ：  ５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｇｔｇｇｔｇａｔｃａｃｃｃｔｔｇｃｃｃｔａｇ  ｃ−３’（配列番号：１８）
【００８１】
＜製造例１−５：ＡＳＰ２０４の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０４の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：６）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０４Ｆｗ０２  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａａａｃｃｔｔｃａａｔｔｇｃｃａａａａａｃａｃｃａｇａａａａｃ−３’（配列番号：１９）
ＡＳＰ２０４ＣＲｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃａａｇｇｇｃｔｔｇａｇｔａａｇｃｔａａａａｇ  ａｇｇｃｔｔｇａｇｔ−３’（配列番号：２０）
【００８２】
＜製造例１−６：ＡＳＰ２０７の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０７の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：７）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０７Ｆｗ０１  ：  ５’−ａａｔｃｔａｇｇｃａｔａｃａｔａｔｇｔｇｔｃｔａｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｔｃｔａｔａｔｇ−３’（配列番号：２１）
ＡＳＰ２０７Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇａｇｔｔｃｔｃａｔｇｔｇａａｔａｃｔｇｔｔａｃｃｃｔｃｔｔａｔａｔａｇｇ−３’（配列番号：２２）
【００８３】
＜比較製造例１−１：ＡＳＰ２３の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２３の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：２４）を調製した。なお、配列番号：２４で表わされる塩基配列は、配列番号：２３で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：２３で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＩＦ＿ＡＳＰ２３ＡＦｗ  ：  ５’−ｇｃａｇｇｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｃｔｃｇａｇｔｇａｇｃｇｃｇ  ｃｇｃｃｔｔｔｃｔｔ−３’（配列番号：２５）
ＩＦ＿ＡＳＰ２３ＤＲｖ  ：  ５’−ｃｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃｃｇｃｔｇｇａｔｃｇａｃｇｃ  ｃｇａｇｔａｃｇ−３’（配列番号：２６）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ２３Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｇａａｔｃｔａｇｃｔｔａｔａａａｔａｔａａａｔａｔｇｇ−３’（配列番号：２７）
ＡＳＰ２３Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｔｔａｔａａｇｃｔａｇａｔｔｃａｔｔａｇｔａｔｃａ−３’（配列番号：２８）
【００８４】
＜比較製造例１−２：ＡＳＰ１０２の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
長鎖ＤＮＡ合成（人工遺伝子合成）サービスによってＡＳＰ１０２の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：３０）を調製した。なお、配列番号：３０で表わされる塩基配列は、配列番号：２９で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：２９で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
【００８５】
＜比較製造例１−３：ＡＳＰ１０３の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１０３の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：３１）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１０３Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｔｔｇｇｃｃａｃｔｇｇａｇｃａｔｔｃｔａｃｃａｔｇｇｔｃｔａｇａｔｔｔ−３’（配列番号：３２）
ＡＳＰ１０３Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔｃａｃｇｃｇｃｃｇｔｇａｔｔｔｔｃｔｔｔｔｔ−３’（配列番号：３３）
【００８６】
＜比較製造例１−４：ＡＳＰ１０４の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１０４の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：３５）を調製した。なお、配列番号：３５で表わされる塩基配列は、配列番号：３４で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：３４で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１０４Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｃｇｔｃａｇｇｔｔｃａｇｇｔｃｃｇｃｃｃｃｇｃａｃｔｃ−３’（配列番号：３６）
ＡＳＰ１０４Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇａｔｃｃｇｇｃｇｇｔｇａｃｇｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｇｇｃｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｃ−３’（配列番号：３７）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ１０４Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｇａｔａｔｇａａｔｃｃａａａａｃａｃｇｃａｇａｇｃｃａｔｇｃｇａｔ−３’（配列番号：３８）
ＡＳＰ１０４Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｔｔｔｔｇｇａｔｔｃａｔａｔｃｃｃａｔｔａｇｃｔｔａｔｃｇｃｃｇｔ−３’（配列番号：３９）
【００８７】
＜比較製造例１−５：ＡＳＰ１０５の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１０５の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：４０）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１０５Ｆｗ０１  ：  ５’−ｃｃｃｔｃｔａｇａａｃｃａｇｇｃｃｃｃｇｃｇｔｔｔｇｃｔｇｃｔｔｃｃｇｃｔｇａａａａａｃａ−３’（配列番号：４１）
ＡＳＰ１０５Ｒｖ０１  ：  ５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｃｔｇｔｔｔｇｔｔｃｃｔａｃｔｇｃｔａｇｃｔａｇｃｇｔｔｔｃｔｇａｔｔｔｃｔ−３’（配列番号：４２）
【００８８】
＜比較製造例１−６：ＡＳＰ１０７の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１０７の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：４３）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１０７Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｇｔｃｔａｇａａｃｇａｔａａａａａａｔｔｃａａｇａｇｔａａａｇｔｇｔａｃｇｇｇｃａｇｔｃ−３’（配列番号：４４）
ＡＳＰ１０７Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇｇａｔｃｃｃｔｇａａａｇｃｔｃｃｔｃｇｇｔｔｇａｃｇｇｔｇｇａａｇｇｔｇｔａａｃｔｃ−３’（配列番号：４５）
【００８９】
＜比較製造例１−７：ＡＳＰ１０９の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１０９の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：４７）を調製した。なお、配列番号：４７で表わされる塩基配列は、配列番号：４６で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：４６で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１０９Ｆｗ０４  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａｔａｔｔｃａｃｇｃａｃｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｃｔａａａｔｇ−３’（配列番号：４８）
ＡＳＰ１０９Ｒｖ０３  ：  ５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｔｇｃｃａａｃａｃｔａｃａｃｃｇａｔｃａｇｇｃｔｔａｇ−３’（配列番号：４９）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ１０９Ｍｔ０２Ｆｗ  ：  ５’−ａｔｃｃｇｇｇｔｔｃｃａｔａｇｃｃａｔｔｇｃｔａａｇ−３’（配列番号：５０）
ＡＳＰ１０９Ｍｔ０２Ｒｖ  ：  ５’−ｃｔａｔｇｇａａｃｃｃｇｇａｔｇａｇｔｃｇｇａｇｇ−３’（配列番号：５１）
【００９０】
＜比較製造例１−８：ＡＳＰ１１０の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１１０の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：５２）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１１０ＡＦｗ０１  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａｔｇｇａｇｇａａｃｃａａａｇｔｔａｃａｔｇａａｔｇａｔａｔｃｇｃ−３’（配列番号：５３）
ＡＳＰ１１０ＢＲｖ０１  ：  ５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｇｇｃａｃａａａａｇｇｔｔｇａａｇｔａｔｔｇａｇｇｃａｇｃ−３’（配列番号：５４）
【００９１】
＜比較製造例１−９：ＡＳＰ１１１の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ１１１の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：５５）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ１１１Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｇｔｃｔａｇａａｔａｔａｔｇｃｇｃａｇａｇｇｃｔａａｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｇｔｇ−３’（配列番号：５６）
ＡＳＰ１１１Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇｇａｔｃｃｇｃａｃｇｇｇｔｔｇｔａｃｇｔｇｔｔｇｔａａｇｇｃａａｇｃ−３’（配列番号：５７）
【００９２】
＜比較製造例１−１０：ＡＳＰ１１４の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
長鎖ＤＮＡ合成（人工遺伝子合成）サービスによってＡＳＰ１１４の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：５９）を調製した。なお、配列番号：５９で表わされる塩基配列は、配列番号：５８で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：５８で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
【００９３】
＜比較製造例１−１１：ＡＳＰ２０１の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０１の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：６１）を調製した。なお、配列番号：６１で表わされる塩基配列は、配列番号：６０で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：６０で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
なお、ＡＳＰ２０１は、特表平８−５２５３９７号公報（特許文献４）に記載のＰＴ４２である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０１ＡＦｗ０１  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｇｔｔｃｔｔｃｇｃｔｇｔａｇｇａｇｇｃａｔｃｔｃｇｃｇｔｇ−３’（配列番号：６２）
ＡＳＰ２０１ＢＲｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇｇｃｇａｇｃｇａｇａｇｇｇｔｔｔａｔｇｔａｇｇｇｔｇａｔｃｃｇａｔｇ−３’（配列番号：６３）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ２０１Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｇｇｃｔｇｇａｇｃｃａｃａｇｔａａｇａａａｃａｇｔｃ−３’（配列番号：６４）
ＡＳＰ２０１Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ａｃｔｇｔｇｇｃｔｃｃａｇｃｃｃａｃｃａｇａｔａｔｇ−３’（配列番号：６５）
【００９４】
＜比較製造例１−１２：ＡＳＰ２０２の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０２の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：６６）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０２ＡＦｗ０１  ：  ５’−ｇａｃａｔａｔａｔａｔｃｔａｔｃｔａｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｔｃａａｔａｔｇａ−３’（配列番号：６７）
ＡＳＰ２０２ＢＲｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇｇｃａｃｇｔａｇｃｔｃｔｔｇｇｇｃａｇｇａｇａｔｃｇａｔｃｇａａｔ−３’（配列番号：６８）
【００９５】
＜比較製造例１−１３：ＡＳＰ２０５の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０５の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：７０）を調製した。なお、配列番号：７０で表わされる塩基配列は、配列番号：６９で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：６９で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０５Ｆｗ０３  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｔａｃｇａｔｇｔｔｇａａｇａａａａｇａａａｇａｃｃｃａｔｇａａ−３’（配列番号：７１）
ＡＳＰ２０５ＢＲｖ０１  ：  ５’−ａａｇｇｇａｔｃｃａｇａｇａｇａｇａｇａｇａｃｇｇｇｇｃｇｃａｇｃｃｇａｔｔｔｃｔｃｇｃｃｇｇａｇ−３’（配列番号：７２）
【００９６】
＜比較製造例１−１４：ＡＳＰ２０６の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ２０６の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：７４）を調製した。なお、配列番号：７４で表わされる塩基配列は、配列番号：７３で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：７３で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ２０６Ｆｗ０３  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａａｃｔｔａｇｇｔｃｔｔｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｔ  ｔｔｃｔｔｃｔｇ−３’（配列番号：７５）
ＡＳＰ２０６ＢＲｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇｇａｔｃｃｇｔｇｇｔａｇｃａａｇａｇｇｔａｃｔａｇｃｔｃａｇａｔｃｔｔｇｔａｔｔｇｔ−３’（配列番号：７６）
【００９７】
＜比較製造例１−１５：ＡＳＰ３０１の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０１の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：７８）を調製した。なお、配列番号：７８で表わされる塩基配列は、配列番号：７７で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：７７で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０１Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｃａｃａｃｇｃｔｃｃｔｔｔｔｃｃａａａａｔａａａｔｃａａｔ  ａｃ−３’（配列番号：７９）
ＡＳＰ３０１Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇａｇｇａｇｇｃａａｔｔｇａｔｃｇａａｃａｃ  ｇｔｃ−３’（配列番号：８０）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ３０１Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ａｔｃｃｃｃｇｇｔｔｃｃｃｃｃｔｃｃｃｇａｔｃｇａｔｃ−３’（配列番号：８１）
ＡＳＰ３０１Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｇｇｇｇｇａａｃｃｇｇｇｇａｔａｔｇｔａｇａｇａｇ−３’（配列番号：８２）
【００９８】
＜比較製造例１−１６：ＡＳＰ３０２の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０２の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：８４）を調製した。なお、配列番号：８４で表わされる塩基配列は、配列番号：８３で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：８３で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０２Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｇｃａｃｔｇｇｃｇａｃａｇａａｇａｃａａａｔａｃａａｇｃｔａ−３’（配列番号：８５）
ＡＳＰ３０２Ｒｖ０１  ：  ５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｃａａｇａｇｇｃｔｃｃａｇａｇｃｇａａｃａｔｔｔａａａａｃ−３’（配列番号：８６）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ３０２Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｔｇａａｔｃｃｇｃａｇａｇｔａａａｔｔｔｔａｔｃｔｔａ−３’（配列番号：８７）
ＡＳＰ３０２Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｔａｃｔｃｔｇｃｇｇａｔｔｃａｃｔｔｇａｔｔｔｔｔｔｔａ−３’（配列番号：８８）
【００９９】
＜比較製造例１−１７：ＡＳＰ３０３の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０３の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：９０）を調製した。なお、配列番号：９０で表わされる塩基配列は、配列番号：８９で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：８９で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０３Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｇｔａｔｔｇａａａｇｔｔｇａｇｇｇｔｇａａｇｇａａｇｔｔｔｇｇ−３’（配列番号：９１）
ＡＳＰ３０３Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｔｔｃｇｔｃｇｔｇｇｔｇａａｃｔｇｇｔａａｃｇｔａｇｇ−３’（配列番号：９２）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ３０３Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｔｃｃａｇｇａｔａａｔｃｃｔｃａｃａｇｃｇｔｔｇｇｃａｇ−３’（配列番号：９３）
ＡＳＰ３０３Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｇａｇｇａｔｔａｔｃｃｔｇｇａｇｃａｇａｃａｃｃａ−３’（配列番号：９４）
【０１００】
＜比較製造例１−１８：ＡＳＰ３０５の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０５の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：９５）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０５Ｆｗ０１  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａｃｔｔｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｃｔａｇｔｇｃｔａｔｃｃ−３’（配列番号：９６）
ＡＳＰ３０５Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇｔｇｇｔａｇｇｔｇａｃｃｔｔｇｃｃｇｔｇｃｔａｃ−３’（配列番号：９７）
【０１０１】
＜比較製造例１−１９：ＡＳＰ３０７の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０７の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：９８）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０７Ｆｗ０１  ：  ５’−ｃｃｔｃｔａｇａａｔａｃｇｇｃｃｇｃｇｔａｔａｔａｃａｔｇｇａａａａａｃａａ−３’（配列番号：９９）
ＡＳＰ３０７Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇａａｇａｇｇｇａｇａｇｃａｔｃａｃｇｇａｃａｇａｃ−３’（配列番号：１００）
【０１０２】
＜比較製造例１−２０：ＡＳＰ３０８の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０８の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：１０１）を調製した。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０８Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｔｔｇａｔｔｃａｇａａｔｔｃｇｇａｔｇｔｃｇｃｔｔａｔｔｔｇ−３’（配列番号：１０２）
ＡＳＰ３０８Ｒｖ０１  ：  ５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｃａｇｃｔａａａｃａｔｇｔｃｔｇｃａｃａａｔｃｃａｇａａｇ−３’（配列番号：１０３）
【０１０３】
＜比較製造例１−２１：ＡＳＰ３０９の実験用プロモーターＤＮＡの調製＞
製造例１−１において、プライマーを下記プライマーに代えてＰＣＲを行った以外は同様にして、ＡＳＰ３０９の実験用プロモーターＤＮＡ（配列番号：１０５）を調製した。なお、配列番号：１０５で表わされる塩基配列は、配列番号：１０４で表わされる塩基配列において、制限酵素認識部位の破壊又は作出のための改変を行ったものであり、配列番号：１０４で表わされる塩基配列との配列同一性は、９９％以上である。
−増幅用プライマー−
ＡＳＰ３０９Ｆｗ０１  ：  ５’−ｇｇｔｃｔａｇａｇｃａｇｃａｔｃｔｔｇｔｔｇｔｃｔｔｔａａｃｃｔｔｇａｔｇｇ−３’（配列番号：１０６）
ＡＳＰ３０９Ｒｖ０１  ：  ５’−ｇｇｇｇａｔｃｃｇｇａｃｇｇｔｇｔｔｃｔｔｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｔａｇ−３’（配列番号：１０７）
−突然変異誘発用プライマー−
ＡＳＰ３０９Ｍｔ０１Ｆｗ  ：  ５’−ｔｔｔｔｔｃｃｇｃａｔｔｔｃｃｔｇｃａａａｔｔｔｔａｇ−３’（配列番号：１０８）
ＡＳＰ３０９Ｍｔ０１Ｒｖ  ：  ５’−ｇｇａａａｔｇｃｇｇａａａａａａａａｔｇａｇａａｃａｇ−３’（配列番号：１０９）
【０１０４】
（製造例２−１〜２−６、比較製造例２−１〜２−２１：ベクターの製造）
バイナリーベクターｐＺＨ２Ｂ（Ｋｕｒｏｄａ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｋｉｍｉｚｕ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍｉｋａｍｉ  （２０１０）  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７４（１１）：  ２３４８−２３５１．）上に、図１に示すコンストラクトを構築した。
具体的には、前記葯特異的発現プロモーターの候補配列でドライブされる自己攻撃遺伝子として、細菌のＲＮＡ分解酵素遺伝子として知られるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＲＮＡ分解酵素遺伝子Ｂａｒｎａｓｅ（図１における「Ｉｎｔｒｏｎ−ｂａｒｎａｓｅ」）を用いた。また、葯以外の組織で漏出的に発現するＢａｒｎａｓｅ遺伝子の悪影響を排除するために、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（図１における「Ｐ−３５Ｓ」）で、Ｂａｒｎａｓｅタンパクの活性を特異的に阻害するタンパクであるＢａｒｓｔａｒ（図１における「ｂａｒｓｔａｒ」）を発現させる遺伝子カセットを挿入した。
なお、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターは、植物体内において、ほとんどの組織で遺伝子を強発現させるが、生殖細胞ではその発現レベルが極めて低いことが知られている。なお、同ベクターにはこれ以外に、形質転換した植物細胞選抜用にハイグロマイシン耐性遺伝子（図１における「ｍＨＰＴ」：変異型ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）が挿入されている。
【０１０５】
前記ベクターのＢａｒｎａｓｅ遺伝子の上流に、前記製造例１−１〜１−６、比較製造例１−１〜１−２１で調製した葯特異的発現プロモーター候補配列をそれぞれ挿入し、製造例２−１〜２−６、比較製造例２−１〜２−２１のベクターを得た。
なお、図１中、「ＡＳＰ」は葯特異的発現プロモーターの候補配列を示し、「ａａｄＡ」はスペクチノマイシン耐性遺伝子を示し、「Ｔ−ｎｏｓ」はノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターを示し、「ＤＴ」はノパリン合成酵素遺伝子及び３５Ｓ遺伝子由来ダブルターミネーターを示し、「ＬＢ」は植物移行配列左側ボーダー配列を示し、「ＲＢ」は植物移行配列右側ボーダー配列を示す。
【０１０６】
（試験例２：形質転換体の作出）
前記製造例２−１〜２−６、比較製造例２−１〜２−２１のベクターを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いたエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムＥＨＡ１０５に導入し、Ｏｚａｗａ，  Ｋ．（２００９）  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １７６：  ５２２−５２７．の方法に準じて形質転換体を作出した。再分化個体数は、１つのコンストラクトにつき２０個体を目途にした。
【０１０７】
その結果、比較製造例２−１０（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１１４）、及び比較製造例２−１９（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０７）のベクターを用いた場合では、ハイグロマイシン耐性カルスから再分化個体が得られなかった。
【０１０８】
得られた形質転換個体は、ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｏｒｏｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｓＢＢＳ）（田中淳一，林武司  （２０１３）  インキュベーターを利用した胚救出と分けつ除去を要しない簡易なイネの世代促進システムｓＢＢＳ（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｏｒｏｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）．  育種学研究  １５（別１），４９；温度条件２７℃／２５℃、１０ｈｒ明条件／１４ｈｒ暗条件、二酸化炭素濃度６００ｐｐｍ、以下、「ｓＢＢＳ環境」と称することがある。）で生育させた。
【０１０９】
その結果、比較製造例２−３（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０３）、比較製造例２−６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０７）、及び比較製造例２−１７（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０３）のベクターを用いた場合では、ハイグロマイシン耐性カルス、シュートは発生したものの、馴化・鉢上げ前後に枯死し、出穂するまで生育するには至らなかった。
【０１１０】
一方で、製造例２−１〜２−６のベクター、及び比較製造例２−１、２−２、２−４、２−５、２−７、２−８、２−９、２−１１、２−１２、２−１３、２−１４、２−１５、２−１６、２−１８、２−２０、２−２１のベクターを用いた場合では、順調な生育及び出穂に至る個体が生じた。中でも、製造例２−１（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０８−１）、製造例２−２（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０８）、製造例２−３（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０４）、製造例２−４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ０４）、製造例２−５（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０４）、及び製造例２−６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０７）のベクターを用いた組換え体は、正常に生育した個体が鉢上げした個体のうち４分の３以上であった。
【０１１１】
各組換え体の生育（以下、「組換え体の正常な生育」と称することがある。）について、以下の基準で評価した結果を後述の表２に示す。
◎  ：  正常な生育を示した個体が５０％以上あり、かつ、不稔であった。
○  ：  正常な生育を示した個体が５０％以上あった。
△  ：  正常な生育を示した個体が２５％〜５０％程度にとどまった。
×  ：  正常な生育を示した個体が得られなかった。
【０１１２】
＜頴花の形態及び葯の形態の観察＞
生育後、出穂後数日が経過した穂より複数の穎花をサンプリングし、アレキサンダー法（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｍ．−Ｐ．  （１９６９）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｂｏｒｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎａｂｏｒｔｅｄ  ｐｏｌｌｅｎ．  Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ４４：  １１７−１２２．）により染色して葯の形態を観察した。観察にはＣＣＤカメラ  ＲＥＴＩＧＡ  ２０００Ｒ  ＦＡＳＴ１３９４（ＩＭＡＧＩＣＡ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を連結した蛍光顕微鏡ＭＩＣＲＯＰＨＯＴ−ＦＸＡ  ＥＰＩ−ＦＬ３（Ｎｉｃｏｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用い、花粉の有無、染色程度等を調査した。
【０１１３】
その結果、製造例２−２（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０８）、製造例２−４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ０４）、製造例２−５（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０４）、製造例２−６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０７）、比較製造例２−１４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０６）、及び比較製造例２−１６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０２）のベクターを用いて作出されたイネにおいて、葯が白色で退化する雄性不稔イネ特有の表現型が誘導された。また、顕微鏡観察の結果、これらの遺伝子組換え個体の葯内に花粉粒は確認できなかった。
図２Ａ〜図２Ｅに観察結果の一例を示す（左側：頴花の形態、右側：葯（アレキサンダー染色済）の形態）。図２Ａは日本晴（コントロール）を観察したものであり、図２Ｂは製造例２−２（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０８）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察したものであり、図２Ｃは製造例２−４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ０４）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察したものであり、図２Ｄは製造例２−５（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０４）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察したものであり、図２Ｅは製造例２−６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０７）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察したものである。
【０１１４】
（試験例３：不稔の判定）
＜自殖による不稔性の確認＞
各個体の主稈穂について稔実種子数を確認し、稔実種子が２粒未満の個体を不稔と判定した。インキュベーター内は常に材料が混み合っており、他個体の花粉による稔実が想定されるためである。
【０１１５】
不稔形質が得られ、安定した生育を示すと判断したコンストラクトによる個体の一部について切り戻しを行い、前記と同様のｓＢＢＳ環境下、もしくは閉鎖系温室で栽培し、穂に紙袋で覆い、稔実のないことで不稔性を確認した。結果を後述の表２に示す。
【０１１６】
その結果、花粉粒が確認できない表現型が誘導された、製造例２−２（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０８）、製造例２−４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ０４）、製造例２−５（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０４）、製造例２−６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０７）、比較製造例２−１４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０６）、及び比較製造例２−１６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０２）のベクターを用いて作出されたイネは不稔であった。
【０１１７】
また、製造例２−１（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０８−１）、製造例２−３（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０４）、比較製造例２−７（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０９）、及び比較製造例２−１５（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０１）のベクターを用いて作出されたイネについても不稔性の確認実験を行ったところ、これらのイネでは花粉粒が確認されたにもかかわらず、大半の個体が不稔性を示すことを確認した。
【０１１８】
図３Ａ及び図３Ｂに、前記試験例１と同様にして、頴花の形態及び葯の形態を観察した結果の一例を示す（左側：頴花の形態、右側：葯（アレキサンダー染色済）の形態）。図３Ａは製造例２−１（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０８−１）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察したものであり、図３Ｂは製造例２−３（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０４）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体を観察したものである。
【０１１９】
（試験例４：交配実験による雌性稔性の確認）
製造例２−１（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ１０８−１）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体、製造例２−２（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０８）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体、製造例２−４（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ０４）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体、及び製造例２−６（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０７）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体の交配実験による雌性稔性の確認は、出穂直後に穎花を切穎した後、花粉親である非形質転換体の「日本晴」の同時期に出穂した穂を同居させる形で紙袋をかけ、交配は２日間行い、１１時３０分〜１４時３０分の間で、ｓＢＢＳ栽培環境下では３０分おき、閉鎖系温室栽培環境下では１時間おきに袋を揺する方法で行った。
【０１２０】
その個体の穂のみを袋掛けした場合には稔実が見られず、花粉稔性のある野生型品種「日本晴」と同居させた場合のみ稔実が得られる、つまり雌性側の稔性が認められる個体を「雄性不稔」と判定した。
【０１２１】
また、グロースチャンバーで生育させた、製造例２−５（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ２０４）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体、及び製造例２−３（葯特異的発現プロモーター候補配列：ＡＳＰ３０４）のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体について、同様の交配を行い、稔実を調査した結果、調査したすべての個体で種子の結実を確認した。
結果を後述の表２に示す。
【０１２２】
（試験例５：開花特性評価）
製造例２−１〜製造例２−６のベクターを用いて得られた遺伝子組換え個体について、開頴率、出穂後の開花までの日数、開頴時刻について達観調査を行い、開花特性を以下の評価基準で評価した。なお、対照区としてブロッコリー由来のＡ９プロモーターを用いた同一コンストラクトによって作出した組換え体を用いた。
２  ：  組換え個体の開花特性がＡ９プロモーターよりも劣る。
３  ：  組換え個体の開花特性がＡ９プロモーターを用いた場合と同等程度である。
４  ：  組換え個体の開花特性がＡ９プロモーターよりも若干優れる。
５  ：  組換え個体の開花特性がＡ９プロモーターよりも明らかに優れる。
【０１２３】
本試験例の結果、葯特異的発現プロモーター候補配列として、ＡＳＰ１０８−１、ＡＳＰ２０８、及びＡＳＰ３０４を用いた個体では、Ａ９プロモーターを用いた個体に比べて開花率が高く、開花時間、開花日が原品種である日本晴に近い組換え体を得ることができ、高い他殖率が実現できる葯特異的プロモーターとして特に有望であった。また、開花日の遅れが少ない個体ほど、開花時刻も原品種と同期する傾向が観察された。
ＡＳＰ１０８−１を用いた個体では、開頴率が高く、さらに開頴時間が１１時３０分〜１３時３０分にピークを示した。これは日本晴と同様であり、従来の開頴時間が遅れるという問題を解決している。
ＡＳＰ２０８を用いた個体では、全般に開頴時刻は不安定なものの、開頴率が高いことが観察された。
ＡＳＰ３０４を用いた個体では、全般に開頴時刻が日本晴に近く、開頴率が高いことが観察された。
以上の結果から、葯の成熟過程における発現フェイズが遅い（ＲｉｃｅＸＰｒｏで「３」または「４」に相当）ものが、花粉粒も認められるものの開花特性が優れるものと考察した。
【０１２４】
【表２】
0006506065.tif 000003
【０１２５】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  葯特異的にプロモーター活性を有することを特徴とする下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列において、１又は複数の塩基が、置換、欠失、挿入及び付加の少なくともいずれかがされた塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号：１〜配列番号：７のいずれかで表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ
＜２＞  配列番号：４、配列番号：２、及び配列番号：３のいずれかで表わされる塩基配列からなるＤＮＡである前記＜１＞に記載のＤＮＡである。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＤＮＡの下流に自己攻撃遺伝子が結合されている前記＜３＞に記載のベクターである。
＜５＞  前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする形質転換植物細胞である。
＜６＞  前記＜５＞に記載の形質転換植物細胞を含むことを特徴とする形質転換植物体である。
＜７＞  前記＜６＞に記載の形質転換植物体の子孫及びクローンのいずれかであることを特徴とする形質転換植物体である。
＜８＞  前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の形質転換植物体から得られることを特徴とする繁殖材料である。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明のＤＮＡを用いることにより、効率的に他殖できる雄性不稔が実現できる。そのため、本発明は、例えば、雄性不稔性を用いた効率的なＦ１雑種種子の獲得や、イネ等の自殖性作物における効率的循環選抜育種システムに好適に利用可能である。
【図１】
0006506065.tif 000004
【図２Ａ】
0006506065.tif 000005
【図２Ｂ】
0006506065.tif 000006
【図２Ｃ】
0006506065.tif 000007
【図２Ｄ】
0006506065.tif 000008
【図２Ｅ】
0006506065.tif 000009
【図３Ａ】
0006506065.tif 000010
【図３Ｂ】
0006506065.tif 000011
【配列表】
0006506065000001.app