(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えたことを特徴とするヒト精子の凍結融解方法。
（ａ）採取された少なくとも１つのヒト精子を、キャピラリーを用いて、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の生理的水溶液中に注入し、当該滴状の生理的水溶液で洗浄する工程；
（ｂ）工程（ａ）で洗浄したヒト精子を、キャピラリーを用いて、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の細胞凍結保存液中に注入する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製したヒト精子含有細胞凍結保存液を凍結する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で凍結したヒト精子含有細胞凍結保存液を融解し、当該ヒト精子を、キャピラリーを用いて、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の生理的水溶液中に注入し、当該滴状の生理的水溶液で洗浄する工程；
【請求項２】
油がミネラルオイルであることを特徴とする請求項１に記載の凍結融解方法。
【請求項３】
顕微鏡観察用容器の形状がシャーレ形状であることを特徴とする請求項１又は２に記載の凍結融解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト精子の凍結融解方法や、かかる凍結融解方法により凍結融解したヒト精子を用いた受精卵の作製方法や、ヒト精子の凍結融解に用いるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
日本においては、晩婚化や晩産化の影響により、４組に１組の夫婦が不妊の問題を抱えているといわれている。このため、人工授精（ＡＩＨ）による一般的な不妊治療の他、体外受精（ＩＶＦ）、顕微授精（ＩＣＳＩ）等の高度不妊治療（ＡＲＴ）の実施が増加傾向にある。
【０００３】
ＷＨＯ（世界保健機関）によると、不妊原因のうち、「男性のみ」に原因がある場合が２４％であり、男女双方に原因がある場合を加えると、約５０％のケースで男性が関係している。男性不妊症患者の症例には、精子欠乏症（Oligozoospermia）のように射出精液中にも数匹の精子しか発見できない症例や、精巣内精子を採取しても極少数の精子しか確保できない症例がある。このような症例の男性不妊患者に対して不妊治療を行う場合、特に、患者の妻から卵子を採取し、複数回の不妊治療を行うときには、数匹の精子をさらに小分けにして凍結する必要があるため、数が極めて少ない精子（極少精子）を凍結保存する技術が必要不可欠となる。
【０００４】
精子は、一般的に、凍結保存液に懸濁し、凍結保存用チューブやストロー中で凍結保存され、不妊治療に使用する際には、凍結した精子を融解し、遠心処理により凍結保存液を除去したり、洗浄液で洗浄することが行われる（特許文献１）。遠心処理は、ある程度の精子が溶液中に存在する場合には問題にはならないが、極少精子の場合には、遠心処理により精子の回収率が低下し、また、物理的にダメージを受ける精子が生じることにより、運動性を有する生存精子をほとんど回収できないことが問題とされている。
【０００５】
最近、少数の精子を凍結保存する試みが行われており、クライオトップ（Cryotop；登録商標）と呼ばれる卵子凍結用のデバイスを用いて精子を凍結保存する方法（クライオトップ法）や、セルスリーパー（Cell Sleeper；登録商標）を用いて精子を凍結保存する方法（セルスリーパー法）が開発された（非特許文献１、２）。クライオトップ法は、クライオトップ先端に調製した滴状の精子含有凍結保存液を、直接液体窒素に接触させて凍結する方法である。この方法は、精子含有凍結保存液を直接液体窒素に接触させるため、ウイルスや細菌等の異物が混入（コンタミネーション）するリスクがぬぐい去れない点に問題がある。また、セルスリーパー法は、トレイ上に滴状の凍結保存液を接触させ、精子をかかる滴状の凍結保存液に注入した後、トレイを密閉可能なチューブに入れた状態で液体窒素により凍結する方法である。かかる方法は、精子をのせたトレイを密閉可能なチューブに入れた状態で液体窒素により凍結することにより、クライオトップ法における上記問題点を解決しているが、一方で、滴状の凍結保存液は少量であるため、凍結前又は融解後に乾燥するリスクを回避する観点から、凍結融解操作を短時間で行う必要があり、簡便性に問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０００−５０７９２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Endo, et al., Fertil. Steril. 98; 1423-1427, 2012
【非特許文献２】藤井等  日本臨床エンブリオロジスト学会雑誌  第１３号  ２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、簡便性に優れ、ウイルスや細菌等の異物混入のリスクが極めて低く、且つ、凍結融解後に運動性を有したヒト精子を回収できるヒト精子の凍結融解方法や、かかる凍結融解方法により凍結融解したヒト精子を用いて受精卵を作製する方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、ヒト精子の凍結融解処理を、顕微鏡下で確認しながら、油で被覆した滴状の細胞凍結保存液中で行うとともに、凍結前後におけるヒト精子の洗浄処理を、顕微鏡下で確認しながら、油で被覆した滴状の生理的水溶液中で行うと、異物が混入することなく、凍結融解処理後の運動性を有したヒト精子１匹を、確実に回収できることを見いだした。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の工程（ａ）〜（ｄ）を備えたことを特徴とするヒト精子の凍結融解方法、
（ａ）採取された少なくとも１つのヒト精子を、キャピラリーを用いて、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の生理的水溶液中に注入し、当該滴状の生理的水溶液で洗浄する工程；
（ｂ）工程（ａ）で洗浄したヒト精子を、キャピラリーを用いて、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の細胞凍結保存液中に注入する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で調製したヒト精子含有細胞凍結保存液を凍結する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で凍結したヒト精子含有細胞凍結保存液を融解し、当該ヒト精子を、キャピラリーを用いて、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の生理的水溶液中に注入し、当該滴状の生理的水溶液で洗浄する工程；
（２）油がミネラルオイルであることを特徴とする上記（１）に記載の凍結融解方法、
（３）顕微鏡観察用容器の形状がシャーレ形状であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の凍結融解方法、
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の凍結融解方法を用いて凍結融解したヒト精子を、キャピラリーを用いて、採取されたヒト卵子に注入することを特徴とする受精卵の作製方法、
（５）顕微鏡観察用容器、生理的水溶液、滴状の生理的水溶液用の油からなる被覆材、細胞凍結保存液、滴状の細胞凍結保存液用の油からなる被覆材、及びキャピラリーを備えたことを特徴とするヒト精子の凍結融解に用いるためのキット、
（６）油がミネラルオイルであることを特徴とする上記（５）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のヒト精子の凍結融解方法を用いると、ヒト精子の凍結融解処理を、顕微鏡下で、油で被覆した滴状の細胞凍結保存液中で行うとともに、凍結前後におけるヒト精子の洗浄処理を、油で被覆した滴状の生理的水溶液中で行うため、細胞凍結保存液や生理的水溶液の乾燥を防ぐとともに、ウイルスや細菌等の異物の混入を防ぐことができる。また、本発明のヒト精子の凍結融解方法の各工程は、顕微鏡による観察が可能な容器上で行うため、運動性を有したヒト精子が１匹であっても、その存在を顕微鏡で確認（観察）しながら確実に回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ミネラルオイルで被覆された滴状のヒト精子含有セルバンカー細胞凍結保存液が載置した顕微授精用ディッシュを、−３０℃で凍結したときの写真である。
【図２】ミネラルオイルで被覆された滴状のヒト精子含有セルバンカー細胞凍結保存液が載置した顕微授精用ディッシュを、−３０℃で凍結保存したときの写真である。
【図３】ミネラルオイルで被覆された滴状のヒト精子含有セルバンカー細胞凍結保存液が載置した顕微授精用ディッシュを、−３０℃で凍結保存した後、液体窒素に浸したときの写真である。
【図４】液体窒素で凍結保存した、ミネラルオイルで被覆された滴状のヒト精子含有セルバンカー細胞凍結保存液が載置した顕微授精用ディッシュを、温水中に保持したときの写真である。
【図５】凍結融解後のヒト精子を、顕微鏡下でキャピラリーを用いて確認し、洗浄しているときの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のヒト精子の凍結融解方法としては、採取された少なくとも１つのヒト精子を、キャピラリー内に吸引し、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴（ドロップ）状の生理的水溶液（以下、「本件滴状の洗浄液１」ということがある）中に前記ヒト精子を注入し、本件滴状の洗浄液１で洗浄する工程（ａ）、かかる工程（ａ）で洗浄したヒト精子を、キャピラリー内に吸引し、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の細胞凍結保存液（以下、「本件滴状の細胞凍結保存液」ということがある）中に前記ヒト精子を注入する工程（ｂ）、かかる工程（ｂ）で調製した滴状のヒト精子含有細胞凍結保存液を凍結する工程（ｃ）、及びかかる工程（ｃ）で凍結した滴状のヒト精子含有細胞凍結保存液を融解し、当該ヒト精子を、キャピラリー内に吸引し、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の生理的水溶液（以下、「本件滴状の洗浄液２」ということがある）中に前記ヒト精子を注入し、本件滴状の洗浄液２で洗浄する工程（ｄ）の工程（ａ）〜（ｄ）を順次備えた方法（以下、「本発明の凍結融解方法」ということがある）であれば特に制限されず、ここで本件滴状の洗浄液２として、通常、本件滴状の洗浄液１と別の新たな洗浄液を用いる。
【００１４】
また、本発明の受精卵の作製方法としては、インビトロで、本発明の凍結融解方法を用いて凍結融解したヒト精子を、キャピラリー内に吸引し、採取されたヒト卵子に注入する工程を含む方法であれば特に制限されず、例えば、受精の確認のために、インビトロで、その後受精卵を培養する工程も含まれるが、受精卵を女性の子宮に着床させる工程等のいわゆる医師による医療行為は含まれない。上記採取されたヒト卵子は、その周りの顆粒膜細胞を除去するため、通常ヒアルロニターゼで処理したものを用いる。
【００１５】
また、本発明のヒト精子の凍結融解に用いるためのキットとしては、顕微鏡観察用容器、生理的水溶液、滴状の生理的水溶液に用いるための油からなる被覆材、細胞凍結保存液、滴状の細胞凍結保存液に用いるための油からなる被覆材、及びキャピラリーを備えた、ヒト精子の凍結融解方法に用いるためのキット（以下、「本発明のキット」ということがある）であれば特に制限されず、本発明のキットは、ヒト精子の凍結融解用キットとしての用途に限定されるものである。そして、このキットには、一般にこの種の検出キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、ヒト精子の凍結融解方法についての説明書等の添付文書が通常含まれる。
【００１６】
上記油としては、動物、植物、鉱物等から単離され、常温で液体であり、且つ水と相分離する疎水性の物質であればよく、具体的には、ミネラルオイル（鉱物油）、シリコーンオイル、サラダ油、ココナッツ油を挙げることができ、これらの中でもミネラルオイルを好適に例示することができる。また、上記油として、以下の実施例で用いたミネラルオイル（９３６２１、北里バイオファルマ社製）の他に、ミネラルオイル（シグマ社製）、シリコーンオイルＡＲ２００（シグマアルドリッチジャパン社製）等の市販品を挙げることもできる。
【００１７】
上記細胞凍結保存液としては、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ケラチン加水分解物、加水分解ゼラチン、血清、血清アルブミン等の凍結保護剤を適量（通常０．１〜５０％、好ましくは１〜３０％）含む上記生理的水溶液を挙げることができる。また、上記細胞凍結保存液として、セルバンカー（登録商標）１、セルバンカー１プラス、セルバンカー２、セルバンカー３（すべて日本全薬工業社製）、ＴＣプロテクター（DSファーマバイオメディカル社製）、バンバンカーｈＲＭ（日本ジェネティックス社製）、Freezing Medium for human ES/iPS Cells（リプロセル社製）、クライオスカーレスDMSOフリー（バイオベルデ社製）、ステムセルキープ（バイオベルデ社製）等の市販品を挙げることもできる。
【００１８】
上記生理的水溶液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムやカリウムなどによって塩や糖濃度等調整した等張水溶液であれば特に制限されず、具体的には、血清含有又は無血清培養液、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水、リンゲル液（乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等）、５％グルコース水溶液を挙げることができる。かかる血清含有培養液としては、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の血清（ウシ胎児血清［Fetal bovine serum；ＦＢＳ］、子牛血清［Calf bovine serum；ＣＳ］等）を含有する動物細胞培養用培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、αＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９、ＡＩＭ−Ｖ等）を挙げることができ、また、上記無血清培養液としては、市販のＢ２７サプリメント（−インスリン）（Life Technologies社製）、Ｎ２サプリメント（Life Technologies社製）、Ｂ２７サプリメント（Life Technologies社製）、Knockout Serum Replacement（Invitrogen社製）等の血清代替物を適量（例えば、１〜３０％）添加した上記動物細胞培養用培養液などを挙げることができる。
【００１９】
上記顕微鏡観察用容器としては、その一部又は全部が透明性に優れ、位相差顕微鏡による観察が可能な素材からなる容器であれば特に制限されず、具体的には、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、フッ素樹脂、シリコン等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体又はその複合体を素材とする容器や、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類又はその複合体を素材とする容器を挙げることができる。また、上記顕微鏡観察用容器として、以下の実施例で用いた顕微授精用ディッシュ（１００６、Falcon社製）の他に、ガラスボトムディッシュ（MatTek社製）、ガラスボトムディッシュ（アステック社製）、１０ｃｍディッシュ（Falcon社製）等の市販品を挙げることもできる。
【００２０】
上記顕微鏡観察用容器の形状としては、滴状の液体を接触することができ、かつ接触させた滴状の液体を油で被覆することが可能な形状であればよく、具体的には、フィルム（シート）形状、シャーレ（ディッシュ）形状、ウェルプレート形状、トレイ形状を挙げることができ、これらの中でもシャーレ（ディッシュ）形状を好適に例示することができる。
【００２１】
上記滴状の細胞凍結保存液における滴の体積や、上記滴状の生理的水溶液における滴の体積は、通常１．０μＬ以上であり、好ましくは２．０μＬ以上、より好ましくは３．０μＬ以上であり、また、極少精子を滴状の細胞凍結保存液に注入した場合に、精子の存在を顕微鏡下で確認しやすくするという観点から、通常１００μＬ以下、好ましくは３０μＬ以下、より好ましくは１０μＬ以下、さらに好ましくは７．０μＬ以下である。したがって、上記滴状の細胞凍結保存液における滴の体積や、上記滴状の生理的水溶液における滴の体積としては、通常１．０〜１００μＬの範囲内であり、好ましくは２．０〜３０μＬの範囲内であり、より好ましくは３．０〜１０μＬの範囲内であり、さらに好ましくは３．０〜７．０μＬの範囲内である。
【００２２】
本発明において、「少なくとも１つのヒト精子」とは、ヒト精子の数が１以上であることを意味し、１つのヒト精子の他に、例えば、数が１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜５０、１〜１００等の範囲内のヒト精子も含まれる。
【００２３】
上記キャピラリーとしては、ヒト精子の吸引が可能な内径を有する、ガラス製や合成樹脂製等の毛細管であれば特に制限されず、かかるキャピラリーの内径は、精子頭部の直径が４〜５μｍであることを考慮すると、通常５．０μｍ以上であり、好ましくは５．５μｍ以上であり、より好ましくは６．０μｍ以上であり、また、極少精子をキャピラリー内に吸引した場合に、精子の存在を顕微鏡下で確認しやすくするという観点から、通常１００μｍ以下であり、好ましくは３０μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以下である。したがって、上記キャピラリーの内径としては、通常５．０〜１００μｍの範囲内であり、好ましくは５．５〜３０μｍの範囲内であり、より好ましくは６．０〜１０μｍの範囲内である。また、上記キャピラリーとして、以下の実施例で用いたガラスキャピラリー（先端が６μｍ程度の直径；ＰＩＮＵ０６−２０ＦＴ、プライムテック株式会社製）の他に、２０μＬガラスキャピラリー（HIRSCHMANN LABORGERATE社製）、ガラスキャピラリー（SUTTER社製）、ＩＣＳＩインジェクションピペット（北里バイオファルマ社製、プライムテック社製、メディーコンインターナショナル社製）、ホールディングピペット（北里バイオファルマ社製）等の市販品を挙げることもできる。
【００２４】
上記工程（ａ）及び（ｄ）において、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の生理的水溶液は、例えば、滴状の生理的水溶液を、キャピラリーやピペットマン等を用いて顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させ、かかる滴状の生理的水溶液を油で被覆する方法や、油を顕微鏡観察用容器上に滴下し、滴状の生理的水溶液を、上記キャピラリーやピペットマン等を用いて前記油内で顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させる方法により調製することができる。なお、油で被覆された滴状の生理的水溶液は、顕微鏡観察用容器において、透明性に優れ、位相差顕微鏡による観察が可能な素材の容器部分の上に載置又は接触される。
【００２５】
上記工程（ａ）及び（ｄ）において、ヒト精子を滴状の生理的水溶液で洗浄する回数としては、少なくとも１回であればよく、１回の他、必要に応じて、複数回（２、３、４回等）であってもよい。すなわち、複数回洗浄する場合は、その回数に応じた数の滴状の生理的水溶液を用意する。また、上記工程（ａ）及び（ｄ）において、ヒト精子を滴状の生理的水溶液で洗浄する時間は、通常１５秒〜１５分の範囲内である。
【００２６】
上記工程（ｂ）において、顕微鏡観察用容器における油で被覆された滴状の細胞凍結保存液は、例えば、滴状の細胞凍結保存液を、キャピラリーやピペットマン等を用いて顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させ、かかる滴状の細胞凍結保存液を油で被覆する方法や、油を顕微鏡観察用容器上に滴下し、滴状の細胞凍結保存液を、上記キャピラリーやピペットマン等を用いて前記油内の顕微鏡観察用容器上に載置又は接触させる方法により調製することができる。なお、油で被覆された滴状の細胞凍結保存液は、顕微鏡観察用容器において、透明性に優れ、位相差顕微鏡による観察が可能な素材の容器部分の上に載置又は接触される。
【００２７】
上記工程（ｃ）において、ヒト精子含有細胞凍結保存液の凍結は、通常、油で被覆された滴状のヒト精子含有細胞凍結保存液が載置又は接触した顕微鏡観察用容器を、−２０〜−８０℃のフリーザーに移すことにより行われる。ヒト精子を数日（２〜３日）以上保存する場合、凍結したヒト精子含有細胞凍結保存液は、前記容器の側面が液体窒素から１．０ｃｍ以内の位置となるように、好ましくは液体窒素に触れた状態となるように保存する。
【００２８】
上記工程（ｄ）において、凍結したヒト精子含有細胞凍結保存液の融解は、通常１５〜４０℃の範囲内で行われ、好ましくは３５〜３８℃の恒温槽内で行われる。
【００２９】
工程（ａ）における、本件滴状の洗浄液１が載置又は接触した顕微鏡観察用容器や、工程（ｂ）における、本件滴状の細胞凍結保存液が載置又は接触した顕微鏡観察用容器や、工程（ｄ）における、本件滴状の洗浄液２が載置又は接触した顕微鏡観察用容器は、それぞれ別々の顕微鏡観察用容器の上に、本件滴状の洗浄液１及び２や、本件滴状の細胞凍結保存液を載置又は接触させたものであっても、共通の顕微鏡観察用容器の上に、本件滴状の洗浄液１及び２や、本件滴状の細胞凍結保存液を載置又は接触させたものであってもよい。
【００３０】
本発明の凍結融解方法における洗浄や注入の操作は、顕微鏡観察用容器上で運動性を有するヒト精子の存在を顕微鏡下で確認（観察）しながら行うことができる。また、本発明の凍結融解方法における洗浄や注入の操作は、通常加温（約３７℃）で行う。
【００３１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
１．方法
以下の工程〔１〕〜［５］の手順にしたがって凍結保存・融解したヒト精子の受精能を、マウス卵子に注入することにより確認した。
〔１〕３枚の顕微授精用ディッシュ（１００６、Falcon社製）の上に、滴（ドロップ）状のセルバンカー（登録商標）１細胞凍結保存液（日本全薬工業社製）（５μＬ／１滴）と、滴状の洗浄液Quinn’s Advantage medium with HEPES（１０２３、SAGE社製）（５μＬ／１滴）を、それぞれ５滴ずつのせ、その上をミネラルオイルで覆った。
〔２〕新しく用意した顕微授精用ディッシュ（１００６、Falcon社製）上に、滴状の洗浄液Hepes-Cleavage medium（５μＬ／１滴）をのせ、その上をミネラルオイル（９３６２１、北里バイオファルマ社製）で覆った。
〔３〕工程〔２〕で調製した滴状の洗浄液Hepes-Cleavage medium中にヒト精子を複数入れ、倒立型位相差顕微鏡（ＩＸ７３、オリンパス社製）下で運動精子１匹を選別し、顕微授精用のガラスキャピラリー（先端が６μｍ程度の直径；ＰＩＮＵ０６−２０ＦＴ、プライムテック株式会社製）で吸引し、工程〔１〕で調製した滴状のセルバンカー細胞凍結保存液中に入れた（３枚の顕微授精用ディッシュ×５滴のセルバンカー細胞凍結保存液中に精子１匹ずつ＝合計１５匹の精子）後、ただちに−３０℃のフリーザー中で凍結した（図１参照）。
〔４〕−３０℃で２４時間保存し、滴状の精子含有セルバンカー細胞凍結保存液の他、ミネラルオイルも固形化したことを確認した後（図２参照）、液体窒素に浸し保存した。なお、液体窒素に浸した際にミネラルオイルにヒビは入ったが、滴状の精子含有セルバンカー細胞凍結保存液の形態は維持されていた（図３参照）。
〔５〕液体窒素中に保存したディッシュを取り出し、温水（約３７℃）中に最長で２分間インキュベートすることにより凍結した滴状の精子含有セルバンカー細胞凍結保存液を融解した後（図４）、倒立型位相差顕微鏡のステージにディッシュを置き、顕微授精用のガラスキャピラリーで精子を確認し（図５参照）、滴状の洗浄液Quinn’s Advantage medium with HEPES中で精子をよく洗浄し、そのまま顕微授精に用いた。なお、コントロールとして非凍結精子を顕微授精に用いた。
【００３３】
２．結果
上記工程〔１〕〜［５］の手順にしたがってヒト精子を凍結保存・融解することにより、精子１５匹をすべて回収することができた（回収率１００％）。また、凍結保存・融解後の精子の受精率は６８％であり、非凍結の精子を用いた場合の受精率６８％と同等の高い成績が得られた。
【００３４】
３．考察
本発明の凍結融解方法を用いると、運動精子１匹を凍結し、洗浄過程後にも確実に回収できることが示された。したがって、精液中に多数の精子が含まれる場合はもちろん、極少数の精子しか含まれない場合であっても、本発明の方法を用いることにより確実に顕微受精を行うことができる。
また、本発明の凍結融解方法における一連の手順は、倒立顕微鏡下で行うことができるため、あらかじめ選別しておいた精子をすぐに顕微授精に使用することができ、また、卵子の採卵数に応じて、凍結精子の数を調整できる。
【００３５】
４．結論
精子欠乏症（Oligozoospermia）等の症状を有する男性不妊患者においては、射出精液中にも数匹の精子しか発見できないため、精子１匹の有無で不妊治療の成否を分けるケースがある。このため、本発明の凍結融解方法を用いて、運動性を有した精子１匹を凍結保存し、融解後に確実に回収することにより、不妊治療、特に男性不妊治療に資するものである。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、不妊治療、特に男性不妊治療に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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