(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞において発現するように改変された合成ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結した、植物細胞において機能的であるプロモーターを含む植物発現カセットを含む単離された核酸分子であって、
前記ポリヌクレオチドが、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）と５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を含むキメラポリペプチドをコードし、前記ＥＰＳＰＳが配列番号１、配列番号６７、配列番号６８または配列番号１４５と少なくとも９０％同一であり、
前記ＥＰＳＰＳが植物細胞にグリホサート耐性を付与する、核酸分子。
【請求項２】
前記ＥＰＳＰＳが、配列番号１、配列番号６７または配列番号６８と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＥＰＳＰＳが、配列番号１、配列番号６７、配列番号６８または配列番号１４５のアミノ酸配列における第１のメチオニンに続くアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ＥＰＳＰＳが、配列番号１、配列番号６７または配列番号６８のアミノ酸配列における第１のメチオニンに続くアミノ酸と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記ＣＴＰが、配列番号１７６〜１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記ＣＴＰが、配列番号１７６〜１８４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記キメラポリペプチドが、配列番号１８５〜１９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記キメラポリペプチドが、配列番号１８５〜１９３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ＥＰＳＰＳをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号２〜２４および１４４のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ＣＴＰをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号３３〜４１のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号４２、４３、７９〜８４および１４３のヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子がベクターである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
ゲノム内に請求項１に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック植物細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物材料であって、植物、植物の一部、植物器官または植物種子であり、同種の野生型植物材料と比較した場合に、グリホサートに対して耐性である、植物材料。
【請求項１５】
請求項１に記載の核酸分子をゲノム核酸分子として含む再生可能な植物細胞の組織培養物であって、
葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、葯、花、茎および鞘からなる群から選択される組織種から製造される、組織培養物。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸分子を含むプロトプラスト。
【請求項１７】
前記植物材料がグリホサート抵抗性植物である、請求項１４に記載のトランスジェニック植物材料。
【請求項１８】
グリホサート抵抗性トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、
植物細胞を、請求項１に記載の核酸分子を用いて形質転換すること
を含む、方法。
【請求項１９】
前記植物細胞が植物、植物の一部、植物器官、植物種子、植物細胞培養物または植物組織培養物に含まれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載のグリホサート抵抗性トランスジェニック植物を含有する耕作区域において雑草を防除する方法であって、
前記トランスジェニック植物に大幅に影響を及ぼすことなく、耕作区域において雑草を防除するのに十分な量のグリホサートを耕作区域に適用すること
を含む、方法。
【請求項２１】
前記トランスジェニック植物が、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ−１（ＡＡＤ−１）またはα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ−１２（ＡＡＤ−１２）をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記トランスジェニック植物に大幅に影響を及ぼすことなく、耕作区域において雑草を防除するのに十分な量のフェノキシオーキシン除草剤を耕作区域に適用することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
グリホサート抵抗性トランスジェニック植物を前記トランスジェニック植物細胞から再生させること
をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ダイズ植物体である、請求項１７に記載のグリホサート抵抗性トランスジェニック植物。
【請求項２４】
トウモロコシ植物体である、請求項１７に記載のグリホサート抵抗性トランスジェニック植物。
【請求項２５】
コムギ、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、ビロードキビ、イネ、アワ、オオムギ、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ、アルファルファ、ワタ、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ、レタス、ホウレンソウ、ペチュニア、バラ、キク、シバクサ、マツ、モミ、トウヒ、重金属蓄積植物、ヒマワリ、ベニバナ、ナタネおよびアラビドプシス属（Arabidopsis）からなる群から選択される、請求項１７に記載のグリホサート抵抗性トランスジェニック植物。
【請求項２６】
アスパラガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、ビロードキビ属（Brachiaria）、アブラナ属（Brassica）、シトラス属（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、ダイズ属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、オオムギ属（Hordeum）、ヒマワリ属（Helianthus）、アキノノゲシ属（Lactuca）、ドクムギ属（Lolium）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、イネ属（Oryza）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、ソルガム属（Sorghum）、コムギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）およびトウモロコシ属（Zea）からなる群から選択される種である、請求項１７に記載のグリホサート抵抗性トランスジェニック植物。
【請求項２７】
請求項７に記載の核酸分子を含む、グリホサート抵抗性トランスジェニック植物細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載のトランスジェニック植物細胞を含む、グリホサート抵抗性トランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子、植物細胞培養物または植物組織培養物。
【請求項２９】
請求項２７に記載のトランスジェニック植物細胞を含む、グリホサート抵抗性トランスジェニック植物。
【請求項３０】
グリホサート抵抗性トランスジェニック植物細胞を作製する方法であって、
前記植物細胞を請求項７に記載の核酸分子で形質転換することを含む、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載のグリホサート抵抗性トランスジェニック植物を含有する耕作区域において雑草を防除する方法であって、
前記トランスジェニック植物に大幅に影響を及ぼすことなく、耕作区域において雑草を防除するのに十分な量のグリホサートを耕作区域に適用すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２０１２年２月１日に出願された米国特許仮出願番号第６１／５９３，５５５号および２０１２年４月１７日に出願された米国特許仮出願番号第６１／６２５，２２２号の利益を主張する。
【０００２】
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）または（ｅ）に従う声明−ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された配列表
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§  １．８２１（ｃ）または（ｅ）に準拠して、配列表のＡＳＣＩＩテキスト版を含有するファイルが、本願とともに提出されている。
【０００３】
本開示は、植物バイオテクノロジーに関する。いくつかの実施形態は、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの代謝に関与する新規ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする核酸およびそれを同定する方法に関する。特定の実施形態は、前記ポリペプチドおよび／または核酸を含む植物、植物の部分および植物細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
雑草種は、耕作地において長く問題であった。雑草防除は、労働集約的作業であり得るが、効率的な雑草除去用化学除草剤を利用できることによって、より容易になった。除草剤の広範な使用は、改良された作物の多様性および肥料とともに、農業における「緑の革命」に大きく貢献してきた。特に有用な除草剤は、広範囲の除草剤活性を有するものである。残念なことに、広範囲の除草剤は、通常、その除草剤に曝露された作物に対して有害な効果を有する。この問題を克服するための１つの方法は、広範囲の除草剤に対して耐性である作物を製造することである。
【０００５】
広範囲の除草剤の１つの例として、グリホサートとしても知られるＮ−ホスホノメチル−グリシンがある。グリホサートは、例えば、不耕起栽培において、作物の植え付けの前に雑草を防除するために、世界中で農業家によって大々的に使用されてきた。さらに、グリホサートは、生産サイクルまたは輪作の間に雑草および自生植物を防除するための効率的な手段である。グリホサートは、使用後に土壌中を汚染せず、最も環境的に安全であり、農業において使用するために利用可能な広く有効な化学除草剤の１つであると広く考えられている。
【０００６】
グリホサートは、シキミ酸経路を阻害することによって植物を死滅させる。この経路は、アミノ酸、ビタミンおよび植物ホルモンを含めた芳香族化合物の生合成につながる。グリホサートは、「ＥＰＳＰシンターゼ」および「ＥＰＳＰＳ」と通常呼ばれる、酵素５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼと結合することおよびその活性を阻害することによって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）および３−ホスホシキミ酸の５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への縮合を遮断する。
【０００７】
残念なことに、グリホサートに対して天然に耐性であると知られている作物はなく、したがって、栽培作物における雑草防除のためのこの除草剤の有用性は、限定されてきた。グリホサート耐性作物を製造するための１つの方法は、遺伝子工学の技術を使用して、ＥＰＳＰＳ遺伝子の異種グリホサート耐性形態をコードする遺伝子を、作物に導入することである。化学的突然変異誘発を使用して、細菌においてＥＰＳＰＳのグリホサート耐性形態が製造され、異種遺伝子が植物に導入され、グリホサート耐性植物が製造された。例えば、Comai et al. (1983) Science 221:370-71を参照のこと。所望のレベルの耐性を得るために、異種ＥＰＳＰＳ遺伝子が作物において過剰発現され得る。
【０００８】
ＥＰＳＰＳは、各々、βαβαββフォールディング単位の３コピーを含む、２つの同様のドメインにフォールディングする（Stallings et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5046-50）。Ｌｙｓ−２２、Ａｒｇ−１２４、Ａｓｐ−３１３、Ａｒｇ−３４４、Ａｒｇ−３８６およびＬｙｓ−４１１は、大腸菌（E. coli）に由来するＥＰＳＰＳの保存された残基である（Schonbrunn et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1376-80）。ＥＰＳＰＳ活性のために重要な保存された残基として、Ａｒｇ−１００、Ａｓｐ−２４２およびＡｓｐ−３８４が挙げられる（Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374:253-6）。Ａｒｇ−２７は、Ｓ３Ｐと結合する（Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302）。
【０００９】
グリホサート耐性である野生型ＥＰＳＰＳの変異体が、ＥＰＳＰＳアミノ酸コード配列の変更の結果として単離されている（Kishore and Shah (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:627-63; Wang et al. (2003) J. Plant Res. 116:455-60; Eschenburg et al. (2002) Planta 216:129-35）。He et al. (2001) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6)は、突然変異誘発ならびに大腸菌（E. coli）およびサルモネラ・チフミリウム（Salmonella typhimurium）ＥＰＳＰＳ遺伝子間の組換えによってグリホサート耐性が高められたＥＰＳＰＳ酵素を開発し、４２位（Ｔ４２Ｍ）および２３０位（Ｑ２３０Ｋ）での突然変異が、観察される抵抗性に関与している可能性が高いということを示唆する。その後の研究（He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67:1405-9）によって、Ｔ４２Ｍ突然変異（トレオニンからメチオニンへ）が、大腸菌（E. coli）およびＳ・チフミリウム（S. typhimurium）酵素両方の耐性を改善するのに十分であるということが示されている。
【００１０】
現在、当技術分野で公知であるＥＰＳＰＳの３つの主なクラス：クラスＩ（グリホサート感受性）；クラスＩＩ（ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ２００６／０１２０８０  Ａ２；Liang et al. (2009) J. Biotechnol. 144(4):330-6）；およびクラスＩＩＩ（ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ２００７／００８２２６９  Ａ２；米国特許公開番号ＵＳ２０１０／０１４４５３０  Ａ１）がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
関連する技術分野の前記の例およびそれに関連する制限は、例示的なものであり、排他的なものではないよう意図される。関連する技術分野のその他の制限は、本明細書を読んだ際に当業者に明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
酵素が、保存されたアミノ酸配列モチーフ（一次構造）ならびに二次および三次構造要素の両方によって同定可能である新規クラスのＥＰＳＰＳ酵素が、本明細書において記載されている。これらの新規ＥＰＳＰＳ酵素は、本明細書において「クラスＩＶ」ＥＰＳＰＳ酵素と呼ばれる。いくつかの実施形態によれば、これらの酵素の構造は、酵素（複数可）を異種発現する細胞または生物におけるグリホサートの代謝に影響を及ぼすよう、例えば、細胞または生物においてグリホサート耐性を提供するよう、本明細書において例示されるように変更され得る。特定の実施形態では、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳ酵素の保存された構造要素は、トランスジェニック生物（例えば、植物）にグリホサート耐性を付与し得るさらなるＥＰＳＰＳ酵素を同定するために利用される。
【００１３】
したがって、いくつかの実施形態は、配列番号１、６７、６８、６９、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の同一性を有する単離されたポリペプチドならびに／または配列番号１７０〜１７３を含む単離されたポリペプチド含む。
【００１４】
いくつかの実施形態は、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸ならびに／または配列番号１７０〜１７３を含むＥＰＳＰＳ酵素をコードする核酸を含む。いくつかの例では、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸ならびに／または配列番号１７０〜１７３を含むＥＰＳＰＳ酵素をコードする核酸は、配列番号１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７および１６９からなる群から選択される少なくとも１種のヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％の同一性（例えば、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％および少なくとも約９９．９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態は、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする異種核酸を含む植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞を含む。いくつかの実施形態は、配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドをコードする異種核酸を含む植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞を含む。
【００１６】
さらなる実施形態では、本開示は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする核酸を用いて、植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞を形質転換することと、核酸を発現させて、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳを製造することとを含む、グリホサートに対して抵抗性である、植物、植物の部分、植物器官、植物種子および／または植物細胞を生成する方法に関する。特定の実施形態は、異種クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳを発現するグリホサート耐性植物および植物細胞を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする核酸を含むベクターを含む。特定の例は、配列番号１７０〜１７３を含むＥＰＳＰＳ酵素をコードする核酸を含むベクターを含む。例えば、ベクターは、配列番号２または配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含み得る。
【００１８】
さらなる実施形態は、グリホサート抵抗性植物を含有する耕作地または耕作区域において雑草を防除する方法を含み、このような方法は、耕作地または耕作区域に異種クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする核酸を含む植物または植物種子を植え付けること；耕作地または耕作区域に、十分な量のグリホサートを適用して、植物に大幅に影響を及ぼすことなく、この耕作地において雑草を防除することを含み得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本開示は、グリホサートに対して抵抗性である植物の組織培養において使用するための再生可能な細胞に関する。このような組織培養は、前記のグリホサート抵抗性植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を、またグリホサート抵抗性植物と実質的に同一の遺伝子型を有する植物を再生できる可能性がある。このような組織培養中の再生可能な細胞は、例えば、胚、プロトプラスト、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、鞘および茎であり得る。特定の実施形態は、前記の組織培養物から再生した植物に関する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば、グリホサートに対して抵抗性である植物細胞株の製造において使用するための、植物体を生成するよう再生可能ではない細胞に関する。その他の実施形態では、本開示は、幾分かこのような細胞を含む植物に関する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示は、耕作区域に植え付けられた作物への複数の除草剤の適用に関する。複数の除草剤に加えたグリホサートの過度の適用は、異なる除草剤特性が生かされ、その結果、順応性および経済性の改善された組合せを有する雑草防除が提供される。例えば、個々の除草剤は、耕作区域において異なる寿命を有し得る；すなわち、いくつかの除草剤は、その区域に適用された後、比較的長時間持続し、有効であり得るが、その他の除草剤は、その他の、および／または非活性化合物に迅速に分解され得る。特定の実施形態に従う改善された除草剤適用システムは、栽培者が、特定の状況において使用するための特定の除草剤の選択を目的に合わせることができるよう、グリホサートおよび複数の除草剤の使用を可能にする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示は、以下に記載される除草剤または除草剤のクラスもしくはサブクラスのうち２種以上に対して耐性である植物を作製し、使用するための方法および組成物に関する。特定の実施形態では、グリホサートと、その他の除草剤（または除草剤のクラスまたはサブクラス）または化学物質（または化学物質のクラスまたはサブクラス）（例えば、殺真菌剤、殺虫剤、植物成長調節物質など）のうちの少なくとも１種の両方に対して耐性である植物が提供される。このような植物は、例えば、複数の除草剤を用いる作物の処置を含む方法において用途があり得る。したがって、本開示は、除草剤または除草剤の組合せ（各々、異なる除草剤活性の様式によって作用する除草剤の組合せを含めた）を用いる処置に対して耐性であるか、または少なくとも１種の除草剤および少なくとも１種のその他の化学物質の組合せを用いる処置に対して耐性である除草剤抵抗性植物を提供する。このようにして、本開示は、雑草が選択的に防除される、作物を栽培する改善された方法を記載する。
【００２３】
いくつかの実施形態による除草剤抵抗性植物は、グリホサートに対する耐性を付与する異種ポリペプチドをコードする核酸分子および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子を含み得る。前記段落によれば、植物に、除草剤耐性形質、昆虫抵抗性形質、農学的形質、疾患抵抗性形質、改変された脂肪酸形質および減少したフィチン酸形質からなる群から選択される形質を与えるポリペプチドをコードする少なくとも第３の核酸分子を含む植物が、提供される。
【００２４】
いくつかの例では、除草剤抵抗性植物は、グリホサートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする異種核酸分子およびグルホシネートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。いくつかの例は、植物に、除草剤耐性形質、昆虫抵抗性形質、農学的形質、疾患抵抗性形質、改変された脂肪酸形質および減少したフィチン酸形質からなる群から選択される形質を与えるポリペプチドをコードする核酸分子を含む除草剤抵抗性植物を含む。
【００２５】
特定の例では、除草剤抵抗性植物は、グリホサートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする異種核酸分子およびアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）酵素（Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449）としても知られるアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）（Lee et al. (1988) EMBOJ. 7:1241）を阻害する除草剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸分子を含む。いくつかの例は、植物に、除草剤耐性形質、昆虫抵抗性形質、農学的形質、疾患抵抗性形質、改変された脂肪酸形質および減少したフィチン酸形質からなる群から選択される形質を与えるポリペプチドをコードする核酸分子を含む除草剤抵抗性植物を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、核酸は、植物において、例えば、制限するものではないが、グリホサートまたは別の除草剤に対するさらなる抵抗性または耐性を提供するために、選定された昆虫または疾患に対する抵抗性を提供するために、栄養強化を提供するために、改善された農学的特徴を提供するために、ならびにタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途および／もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供するために、任意のその他の核酸分子と組み合わされ（または「積み重ねられ」）得る。例として、植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸のスタッキングが挙げられる。このような「遺伝子スタック」は、２以上の事象、対象とする配列を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した標的組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。このようなスタックの特定の例は、以下の組合せを含み得る：ｄｇｔ−２８核酸；ｄｇｔ−３１核酸；ｄｇｔ−３２核酸；ｄｇｔ−３３核酸；Ｃｒｙ３４Ａｂ１核酸；Ｃｒｙ３５Ａｂ１核酸；Ｃｒｙ１Ｆ核酸；Ｃｒｙ１Ａｃ核酸；ａａｄ−１２核酸；ａａｄ−１核酸；ｐａｔ核酸；およびＤＳＭ−２核酸。
【００２７】
上記の例示的態様および実施形態に加えて、以下の記載の研究によってさらなる態様および実施形態が明らかとなる。
【００２８】
配列表では、１７種の例示的クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（ａ〜ｇ）上記される３クラスのＥＰＳＰＳ酵素（例えば、グリホサート感受性ａｒｏＡ）と、例示的なクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳ酵素（例えば、ＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３）（配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、および１６８）とを比較する複数の配列アラインメントを示す図である。保存されたモチーフをアラインメントの下に赤で示す。
【図２】例示的なＤＧＴ酵素（すなわち、ＤＧＴ−１、ＤＧＴ−３、およびＤＧＴ−７）のアラインメントを示す図である。グリシンからアラニンに変更された突然変異したアミノ酸残基の位置は、第１のアスタリスクで示されている。トレオニンからイソロイシンに変更された第２の突然変異したアミノ酸残基の位置は、第２のアスタリスクで示されている。プロリンからセリンに変更された第３の突然変異したアミノ酸残基の位置は、第３のアスタリスクで示されている。
【図３】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７５２７（図３）。
【図４】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０５５３０（図４）。
【図５】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０５５３１（図５）。
【図６】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０５５３２（図６）。
【図７】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０５５３３（図７）。
【図８】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０５５３４（図８）。
【図９】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ４１０４（図９）。
【図１０】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２７１５（図１０）。
【図１１】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７５３２（図１１）。
【図１２】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７５３４（図１２）。
【図１３】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２７８５（図１３）。
【図１４】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１００４４５（図１４）。
【図１５】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２９４６（図１５）。
【図１６】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１００４６９（図１６）。
【図１７】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０２８（図１７）。
【図１８】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０２９（図１８）。
【図１９】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０３２（図１９）。
【図２０】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０３４（図２０）。
【図２１】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１００４２９（図２１）。
【図２２】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１００４４２（図２２）。
【図２３】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１００４３０（図２３）。
【図２４】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０３６（図２４）。
【図２５】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０３８（図２５）。
【図２６】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０４０（図２６）。
【図２７】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２０４２（図２７）。
【図２８】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７７１２（図２８）。
【図２９】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７７１３（図２９）。
【図３０】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７７１４（図３０）。
【図３１】１ｍＭのＰＥＰを用いて、ＤＧＴ−１（Ａ）およびＤＧＴ−７（Ｂ）内の様々な突然変異の導入後に得られたＩＣ５０値を示す図である。図３１（Ａ）と図３１（Ｂ）のＩＣ５０曲線の両方について、黒三角は野生型を表し、黒丸はＧＡ突然変異体を表し、白四角はＧＡＰＳ突然変異体を表し、黒四角はＴＩＰＳ突然変異体を表す。
【図３２】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２７１９（図３２）。
【図３３】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２７１８（図３３）。
【図３４】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７６６３（図３４）。
【図３５】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７６６４（図３５）。
【図３６】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７６６５（図３６）。
【図３７】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７６６６（図３７）。
【図３８】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０９８１２（図３８）。
【図３９】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０１５５６（図３９）。
【図４０】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０７６９８（図４０）。
【図４１】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０８３８４（図４１）。
【図４２】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０８３８５（図４２）。
【図４３】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０８３８６（図４３）。
【図４４】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０８３８７（図４４）。
【図４５】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２７１６（図４５）。
【図４６】様々な例示的なプラスミドのマップを示す図である：ｐＤＡＢ１０２７１７（図４６）。
【図５５】ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼの高解像度モデルの全体構造のリボン表示を示す図である。２つのリガンド（Ｓ３Ｐおよびグリホサート）はファンデルワールス球として示されている。Ａｌａ−８４を保有する内部ヘリックスを青で示す。
【図５６】クラスＩＶ耐性酵素を定義する相違を強調している大腸菌（E. coli）とＳ．スビセウス（S. sviceus）ＥＳＰＳシンターゼの活性部位の拡大図を示す図である。ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼにおいて、Ａｌａ−８４を保有する内部ヘリックス（除草剤に対する主要な抵抗性決定因子）は、このリガンドの結合を妨げる、グリホサート結合ポケット内にさらに押し込まれることに留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．概要
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの代謝に関与している新規ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードする核酸が、本明細書において開示される。いくつかの例では、このようなポリペプチドは、ポリペプチドが、例えば、ＥＰＳＰシンターゼの、その天然基質、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）との結合に悪影響を及ぼさずに異種性に発現される植物細胞において、グリホサートに対する耐性を付与する（または増大する）。
【００３１】
ＩＩ．用語
本開示の広さをさらに明確にするために、以下の特定の定義、用語および略語を提供する。
【００３２】
他に具体的に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。それが現れる文脈から明確ではない限り、単一形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むと理解される。したがって、要素または成分に先行して使用される不定冠詞「ａ（１つの）」および「ａｎ（１つの）」は、要素または成分の例（すなわち、出現）の数に関して非制限的である。数値の範囲が、本明細書において提供されている場合には（例えば、「約Ｘ未満」、「Ｘ未満」および「例えば、Ｘ１…およびＸ２」）、範囲は、提供された範囲内に含まれるすべての値および範囲を、これらの含まれる値および範囲が明確に記載されたように含むと理解される。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」および「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」およびそれらの変形は、制約がない（すなわち、非排他的である）。例えば、要素のリストを含む組成物または方法は、必ずしもそれらの要素のみに制限されない。このような組成物または方法は、明確に列挙されないか、または組成物または方法に固有のその他の要素を含む場合もある（または含まない場合もある）。さらに、反対に明確に記載されない限り、「または」は、包括的（排他的ではない）意味で使用される。例えば、条件「ＡまたはＢ」は、以下のいずれによっても満たされる：Ａが真であり（または存在し）、Ｂは偽である（または存在しない）；Ａが偽であり（または存在しない）、Ｂは真である（または存在する）；ならびにＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００３４】
植物：本明細書において使用される場合、用語「植物」は、全植物体および植物の任意の子孫、細胞、組織または一部を含む。用語「植物の部分」は、例えば、限定するものではないが：種子（成熟種子および未熟種子を含む）；植物を切り取ったもの；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、シュート、葉、根、茎および外植片）を含めた植物の任意の部分（複数可）を含む。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルスまたは構造的もしくは機能的単位に組織されている植物細胞の任意のその他の群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織が得られた植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生できるもの、またその植物と実質的に同一の遺伝子型を有する植物を再生できるものであり得る。対照的に、一部の植物細胞は、植物体を生成するよう再生され得ない。植物細胞または組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、トウモロコシの毛、花、穀粒、穂、トウモロコシの穂軸、外皮または柄であり得る。
【００３５】
植物の部分は、後代植物の増殖に有用な収穫可能な部分（単数または複数）を含む。増殖に有用な植物の部分として、例えば、限定するものではないが、種子、果実、切り取ったもの、実生、塊茎および台木が挙げられる。植物の収穫可能な部分は、例えば、限定するものではないが、花、花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子および根を含めた植物の任意の有用な部分であり得る。
【００３６】
植物細胞は、植物の構造的および生理学的単位であり、プロトプラストおよび細胞壁を含む。植物細胞は、単離された単細胞または細胞の凝集体（例えば、もろいカルスおよび培養細胞）の形態であり得、また、高度に組織化された単位（例えば、植物組織、植物器官および植物体）の一部であり得る。したがって、植物細胞は、全植物体に再生できるプロトプラスト、生殖体生成細胞、または細胞もしくは細胞の集合であり得る。そのようなものとして、複数の植物細胞を含み、全植物体に再生できる種子が、本明細書における実施形態において「植物細胞」と考えられる。
【００３７】
除草剤抵抗性／耐性：グリホサートに対して抵抗性であるか、または耐性である植物に言及する場合に、植物に対する一定量のグリホサートの適用が、植物に大きな影響を及ぼさないか、または死滅させないということ意味し、ここで、同種の野生型植物は、その量のグリホサートの適用によって大きく影響を受け、および／または死滅する。植物は、特定の除草剤に対して天然に耐性であり得るか、または植物は、例えば、選択育種、遺伝子形質転換および／または植物のゲノム内の導入遺伝子の導入などの遺伝子工学の結果として除草剤耐性を付与され得る。「グリホサート抵抗性植物」とは、それを発現する異種植物またはその他の生物に提供されると除草剤耐性を付与する（すなわち、植物またはその他の生物を除草剤耐性にする）ポリペプチドまたは核酸分子を含有する植物を指す。
【００３８】
グリホサートに対して抵抗性であるか、または耐性である植物は、植物へのグリホサートの適用から幾分かの最少の影響を示すこともある。例えば、正常な成長および植物の発達において変更があることがあり、これでは、植物は、ストレスまたは疾患と関連している徴候または症状を示し得る。グリホサートに対して抵抗性であるか、または耐性である植物へのグリホサートの適用に起因するこのような最少の影響は、グリホサートに対して感受性である植物へのグリホサートの適用に起因する悪影響に対して対照的なものである。当業者ならば、グリホサートに対して抵抗性である植物とグリホサートに対して感受性である植物間を区別できる。グリホサート耐性を付与する核酸を含む植物へのグリホサートの適用は、グリホサートに対する耐性を付与する核酸分子を含まない同種の植物への同量のグリホサートの適用より大幅に少ない影響しかもたらさない。
【００３９】
除草剤またはその他の化学物質に対して耐性である植物は、適当な対照植物と比較して改善された耐性を示す。除草剤またはその他の化学物質処置に起因する損傷は、植物成長または健全の任意のパラメータを評価することによって評価され得る。このようなパラメータは、当業者には公知であり、それらの選択は、当業者の裁量の範囲内である。植物損傷は、個々の植物または植物の群（複数可）における植物成長または健全の１種または複数の適したパラメータの、目視検査によって、および／または統計分析によって評価され得る。したがって、損傷は、例えば、限定するものではないが、草丈、植物重量、葉色、葉長、開花、稔性、シルキング、収量および種子生成を含めたパラメータを評価することによって評価され得る。損傷はまた、特定の発達段階（例えば、シルキング、開花および花粉落下）までに経過した時間または植物が特定の化学物質および／または除草剤を用いる処置から回復するまでに経過した時間を評価することによって評価され得る。
【００４０】
損傷評価を行うにあたって、統計分析または定量的比較が行われ得るよう、特定の損傷度に値が割り当てられ得る。特定の損傷度を説明するための、値の範囲の使用は、当技術分野で公知であり、任意の適した範囲または規模が使用され得る。例えば、除草剤傷害スコア（耐性スコアとも呼ばれる）が割り当てられ得る。したがって、除草剤耐性はまた、このスケールにおいてその他の評点によって示されることもあり、これでは、適当な対照植物（または対照植物の群）は、対象植物の群よりも、除草剤処置に応じた規模で統計的に低いスコアを示す。
【００４１】
除草剤またはその他の化学物質によって引き起こされる損傷は、植物が除草剤を用いて処置された後に種々の時点で評価され得る。損傷は、対照植物が最大損傷を示すおよその時間で評価されることが多い。時には、損傷は、除草剤またはその他の化学物質を用いて処置されなかった対照植物が、測定可能に成長および／または発達した期間の後に、処置が施された大きさまたは段階と比較して評価される。損傷は、対象植物が除草剤を用いて処置された後、多数の適した時間で、例えば、１２時間で；１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および／または１４日で、３および／または４週間またはそれより長期間で評価され得る。試験および対照植物の処置に応じた相違の検出を可能にする限り、任意の評価の時間が適している。
【００４２】
除草剤は、植物に対して効果を有さない場合に、植物に対して幾分かの効果を有し、それから、植物が後に回復する場合に、または植物に対して、有害であるが、例えば、雑草に対する特定の除草剤影響によって相殺するものである効果を有する場合に、植物に対して「大幅に影響を及ぼ」さない。したがって、例えば、作物は、植物が、適当な対照植物（例えば、同種の未処置植物）と比較して、植物の健康および／または生産性を示す少なくとも１種の適したパラメータにおいて、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の低減を示す場合に、「大幅に影響を受け」ない場合もある。特定の実施形態では、植物は、適当な対照植物と比較して、対照植物によって示される損傷よりも、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％またはそれ以上少ない損傷を示す場合に、除草剤またはその他の化学物質に対して耐性である。除草剤またはその他の処置によって大幅に影響を受けない作物は、少なくとも１種のパラメータにおいて低減を示し得るが、低減は、実際には一時的なものであり、植物は、例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間または約６週間内に十分に回復する。特定の実施形態では、除草剤またはその他の化学物質に対して耐性である植物は、植物が、除草剤またはその他の化学物質の適用によって大幅には影響を受けないという事実によって特徴づけられ得る。
【００４３】
植物の健康および／または生産性を示す適したパラメータとして、例えば、限定するものではないが、草丈、植物重量、葉長、特定の発達段階までに経過した時間、開花、収量および種子生成が挙げられる。パラメータの評価は、パラメータの目視検査によって、および／または統計分析によって実施され得る。対象植物および対照植物において評価されると、比較が行われ、対象植物が除草剤またはその他の処置によって大幅に影響を受けるかどうかが決定され得る。
【００４４】
除草剤（またはその他の化学物質）に対する抵抗性を決定するために使用され得る適当な対照植物として、推定異種除草剤耐性核酸および／またはポリペプチドを含まない同種の植物および推定異種除草剤耐性核酸および／またはポリペプチドを含むが、除草剤を用いて処置されていない植物が挙げられる。
【００４５】
除草剤：「除草剤」は、植物に一時的または永久的傷害を引き起こす化学物質である。除草剤の限定されない例は、本明細書において別の場所に列挙され、さらに詳細に論じられている。除草剤は、植物またはその細胞中に組み込まれ得るが、または組み込まれることなく植物もしくは細胞に対して作用し得る。「有効成分」は、製剤の殺草性に関与している除草剤製剤中の化学物質である。市販の除草剤製剤中の有効成分は、通常、製品ラベルで有効成分として同定される。製品ラベル情報は、米国環境保護局（U.S. Environmental Protection Agency）から入手可能であり、ｏａｓｐｕｂ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｌａｂｌ／ｐｐｌｓ．ｏｗｎで、オンラインでアップデートされている。製品ラベル情報はまた、ｗｗｗ．ｃｄｍｓ．ｎｅｔでオンラインで入手可能である。
【００４６】
用語「酸当量」とは、除草剤に関して使用される場合には、除草剤活性親酸としての比率または量を指す。
【００４７】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸またはポリペプチドなど）は、成分が天然に生じる生物の細胞中のその他の生物学的成分（すなわち、その他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡおよびタンパク質）と、成分において化学的または機能的変更を達成しながら、実質的に分離しているか、それから離れて製造されているか、またはそれから離れて精製されている（例えば、核酸は、核酸を染色体中の残りのＤＮＡと接続している化学結合を破壊することによって、染色体から単離され得る）。「単離されている」核酸分子およびタンパク質として、標準精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質が挙げられる。この用語はまた、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸およびタンパクならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質およびペプチドを包含する。
【００４８】
核酸：用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書において同義的に使用され、単数形の核酸、複数形の核酸、核酸断片、その変異体または誘導体および核酸構築物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））を包含する。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非翻訳５’および／または３’配列およびコード配列（複数可）を含む全長ｃＤＮＡ配列またはその断片のヌクレオチド配列を含有し得る。ポリヌクレオチドまたは核酸は、非修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含み得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり得る。例えば、ポリヌクレオチドまたは核酸は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡからなり得る。ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子は、一本鎖、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る。前記の用語はまた、ポリヌクレオチドまたは核酸の、化学的に、酵素によって、または代謝によって修飾された形態も含む。
【００４９】
特定のＤＮＡとは、配列が、デオキシリボヌクレオチド塩基対合のルールに従って決定されるその相補体も指すと理解される。
【００５０】
本明細書において使用される場合、用語「遺伝子」とは、機能的生成物（ＲＮＡまたはポリペプチド／タンパク質）をコードする核酸を指す。遺伝子は、機能的生成物をコードする配列に先行する調節配列（５’非コード配列）、および／またはそれに続く調節配列（３’非コード配列）を含み得る。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。「調節配列」とは、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を及ぼす、コード配列の上流に（例えば、５’非コード配列）、その中に、または下流に（例えば、３’非コード配列）位置するヌクレオチド配列を指す。調節配列として、例えば、限定するものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が挙げられる。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさずに、特定のヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号における重複性を指す。各コドンは、３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４種の特定の塩基に限定されているので、６４種のヌクレオチドの可能性ある組み合わせがあり、そのうち６１種が、アミノ酸をコードする（残りの３種のコドンは、翻訳を終結するシグナルをコードする）。結果として、多数のアミノ酸が、２種以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４種のトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは、６種によってコードされるが、トリプトファンおよびメチオニンは、ただ１種のトリプレットによってコードされる。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」は、当技術分野でよく知られている。それにおける縮重によって、ＤＮＡの塩基が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変更することなく広範に変わることが可能となる。
【００５３】
本明細書におけるいくつかの実施形態では、宿主細胞における改善された発現のためにコード配列を設計する場合には、遺伝子は、それにおけるコドン使用の頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくよう設計される。したがって、用語「コドン最適化された」とは、遺伝子またはコード配列中のコドンが、核酸によってコードされるポリペプチドを変更することなく宿主生物の通常のコドン使用を反映するよう変更されている、種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸のコード配列を指す。複数の例では、このような最適化は、遺伝子またはコード配列中のコドンの少なくとも１種、２種以上、相当な数および／またはすべてを、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１種または複数のコドンと置換することを含む。
【００５４】
多数の生物は、増大するペプチド鎖中に特定のアミノ酸を挿入するためにコードする特定のコドンの使用についてバイアスを示す。コドン優先度またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用の相違は、遺伝暗号の縮重によって提供され、多数の生物の中で十分に実証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、これは、順に、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に応じて変わると考えられている。細胞において選択されるｔＲＮＡの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適遺伝子発現のために目的に合わせられるか、または設計され得る。
【００５５】
様々な動物、植物および微生物種にとって利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用の相対頻度を算出することが可能である。コドン使用表は、例えば、ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／でインターネットで入手可能な「コドン使用データベース（Codon Usage Database）」で容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応され得る。Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28:292を参照のこと。コドン使用表を利用することによって、当業者は、所与の種に対応する頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用して、ポリペプチドをコードするが、その種に最適なコドンを使用する、コドン最適化されたコーディング領域の合成核酸断片を設計および製造することができる。
【００５６】
コドンバイアスは、タンパク質コーディング領域の平均塩基組成に反映される。例えば、比較的低いＧ＋Ｃ含量を有するゲノムを有する生物は、同義のコドンの３番目の位置にＡまたはＴを有するコドンをより多く利用するが、より高いＧ＋Ｃ含量を有するものは、３番目の位置にＧまたはＣを有するより多くのコドンを利用する。さらに、ｍＲＮＡ内の「少数の」コドンの存在は、特に、少数のコドンに対応する荷電ｔＲＮＡの相対量が低い場合に、そのｍＲＮＡの絶対翻訳速度を低減し得ると考えられる。この推論の拡張は、個々の少数のコドンによる翻訳速度の低下は、複数の少数のコドンの少なくとも付加的なものとなるということである。したがって、少数のコドンの高い相対含量を有するｍＲＮＡは、相当に低い翻訳速度を有する。この速度は、コードされるタンパク質の相応に低いレベルによって反映され得る。
【００５７】
コドンバイアスは、すべてのアミノ酸のコドンに対して単一コドンが使用される頻度として算出され得る。あるいは、コドンバイアスは、特定のアミノ酸をコードするために単一のコドンが使用される、そのアミノ酸のすべてのその他のコドン（同義のコドン）に対する頻度として算出され得る。
【００５８】
用語「同一性パーセント」（または「同一性％」）とは、配列を比較することによって決定されるような、２種以上のポリペプチド配列（またはポリヌクレオチド配列）間の関係を指す。同一性パーセントは、一続きのこのような配列間のマッチによって決定され得るような、ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）配列間の配列関連性の程度を表し得る。一般に、同一性とは、それぞれ、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸一致を指す。２種の配列の同一性パーセントは、核酸であるか、アミノ酸配列であるかにかかわらず、２種のアラインされた配列間の正確なマッチの数を短い方の配列の長さで除し、１００を乗じたものである。Russell and Barton (1994) J. Mol. Biol. 244:332-50を参照のこと。
【００５９】
核酸およびアミノ酸配列をアラインし、同一性を決定する技術は、当技術分野で公知であり、例えば、限定するものではないが、Computational Molecular Biology (1988) (Lesk、A. M., Ed.) Oxford University, NY; Biocomputing: Informatics and Genome Projects (1993) (Smith、D. W., Ed.) Academic, NY; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (1994) (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania, NJ; Sequence Analysis in Molecular Biology (1987) (von Heinje, G., Ed.) Academic, NY; and Sequence Analysis Primer (1991) (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton, NYにおいて提供されるものが挙げられる。２種の配列間の同一性パーセントを決定する技術は、ｍＲＮＡまたは遺伝子のヌクレオチド配列を提供することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を推測することならびに第２のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列に対して配列（複数可）を比較することを含み得る。ゲノム配列にまた、このようにして決定および比較され得る。
【００６０】
さらに、核酸およびアミノ酸配列をアラインし、同一性を決定する方法は、種々の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムに組み込まれている。配列アラインメントおよび同一性パーセント算出は、例えば、ベクターＮＴＩ（登録商標）一式のＡｌｉｇｎＸ（商標）プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）バイオインフォマティクスコンピューティング一式のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して実施され得る。配列のマルチプルアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ（商標）ＶおよびＣｌｕｓｔａｌ（商標）Ｗを含めた、アラインメントアルゴリズムのいくつかの変法を包含するＣｌｕｓｔａｌ（商標）法（Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3;Higgins et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-91）を使用して実施され得る。Ｃｌｕｓｔａｌ（商標）Ｖにおけるマルチプルアラインメントのために、使用され得るデフォルト値は、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０を含む。Ｃｌｕｓｔａｌ（商標）Ｗにおけるマルチプルアラインメントのためのデフォルトパラメータは、（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）を含む。Ｃｌｕｓｔａｌ（商標）法において使用され得るタンパク質配列間のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの算出のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。Ｃｌｕｓｔａｌ（商標）プログラムを使用する配列のアラインメント後、同一プログラム中の「配列距離」表を見ることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、限定するものではないが、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％の配列同一性（参照ポリペプチド；例えば、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳと比較した場合に）を有するポリペプチドをコードし、参照ポリペプチドと同一または同様の機能を有する。したがって、例えば、５５％〜１００％、例えば、限定するものではないが、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％の同一性の任意の整数パーセンテージは、本明細書において特定の核酸の説明において有用であり得る。特定の核酸断片は前記の配列同一性を有するだけでなく、例えば、限定するものではないが、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸および少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードし得る。特定の実施形態は、配列番号２または３に対して少なくとも約８０％の同一性（例えば、少なくとも７９％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８１％の同一性、少なくとも約８２％の同一性、少なくとも約８３％の同一性、少なくとも約８４％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約８６％の同一性、少なくとも約８７％の同一性、少なくとも約８８％の同一性、少なくとも約８９％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性および少なくとも約９９．５％の同一性）を有する核酸を含む。
【００６２】
用語「配列解析ソフトウェア」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析にとって有用であるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す「配列解析ソフトウェア」は、市販のものである場合も、独立に開発されたものである場合もある。配列解析ソフトウェアの限定されない例として、ＧＣＧ一式のプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；ＢＬＡＳＴＰ（商標）、ＢＬＡＳＴＮ（商標）およびＢＬＡＳＴＸ（商標）（Altschul et al. (1990) J.Mol. Biol. 215:403-10）；ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ（商標），Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）；およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡ（商標）プログラム（Pearson (1994) Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.], Meeting Date 1992 (Suhai and Sandor, Eds.), Plenum: New York, NY, pp.111-20）が挙げられる。本明細書においてヌクレオチドまたはアミノ酸配列を解析するために配列解析ソフトウェアが使用された場合には、示される解析の結果は、特に断りのない限り、参照されるプログラムのデフォルト値を使用して作製されている。本明細書において使用される場合、用語「デフォルト値」とは、最初に初期化される際に配列解析ソフトウェアとともに元々ロードされる一連の値またはパラメータを指す。
【００６３】
ハイブリダイゼーション：ヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む核酸が、プローブ配列に対して相当な量の配列同一性を有する、クローニングされたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片の集団（例えば、選択された生物から得られたゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在するヌクレオチド配列と選択的に「ハイブリダイズする」プローブとして使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、プラスミドＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチドであり得、プローブは、検出可能な基（例えば、３２Ｐ）または任意のその他の検出可能なマーカーで標識され得る。したがって、例えば、限定するものではないが、ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書における核酸（例えば、配列番号１に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸）と特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。ハイブリダイゼーションのプローブを調製する方法およびｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを構築する方法は、当技術分野で公知である。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドが、Sambrook et al. (1989)、前掲；およびAusubel et al. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, Wiley, NY, New York, pp. 2-40に見出される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、サンプル中のトランスジェニック事象の存在を同定するために核酸ハイブリダイゼーション（例えば、増幅されたＤＮＡに対する）が使用され得る。核酸分子またはその断片は、特定の状況下で別の核酸分子と「特異的にハイブリダイズ」できる。いくつかの例では、核酸は、ストリンジェントな条件下で、標的核酸と特異的にハイブリダイズする。本明細書において使用される場合、２種の核酸分子は、２種の分子が、ストリンジェントな（例えば、高ストリンジェンシー）条件下で、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成できる場合に、互いに特異的にハイブリダイズすると言われる。
【００６５】
核酸は、２種の核酸分子が、完全な配列相補性を示す場合に、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書において使用される場合、核酸は、分子の一方のどのヌクレオチドも、もう一方のヌクレオチドと相補的である場合に「完全な相補性」を示すといわれる。完全な相補性を示す分子は、一般に、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で、十分な安定性をもって互いにハイブリダイズし、互いにアニーリングされたままであることを可能にする。従来の高ストリンジェンシー条件は、Sambrook et al. (1989)、前掲によって記載されている。
【００６６】
２種の分子は、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で、十分な安定性をもって互いにハイブリダイズでき、互いにアニーリングされたままであることを可能にする場合に「最少の相補性」を示すといわれる。従来の低ストリンジェンシー条件は、Sambrook et al. (1989)、前掲によって記載されている。核酸分子について、プライマーまたはプローブとして働くためには、使用される特定の溶媒および塩濃度下で、安定な二本鎖構造を形成できるよう配列の最少の相補性示すことのみが必要である。
【００６７】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、これとして、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度ならびに有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド）の濃度が挙げられる。当業者には公知であるように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、高温、低イオン強度および低溶媒濃度によって増大される。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加でも達成され得る。
【００６８】
用語「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェンシー条件」は、Sambrook et al. (1989)、前掲において（９．５２〜９．５５で）論じられた特定のハイブリダイゼーション手順による、ある核酸の、別の標的核酸との（すなわち、対象とする特定のヌクレオチド配列を含む核酸分子との）ハイブリダイゼーションに関して定義される。９．４７〜９．５２および９．５６〜９．５８のSambrook et al. (1989)も参照のこと。
【００６９】
多数の適用における特異性は、ハイブリダイゼーション後洗浄の条件に関し、これでは、因子は、イオン強度および洗浄溶液の温度を含む。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、融解点（Ｔｍ）は、方程式：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ、          （１）
（式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは、塩基対でのハイブリッドの長さである）
から概算され得る。Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-84。
【００７０】
Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度である（特定のイオン強度およびｐＨ下で）。Ｔｍは、ミスマッチの各１％について約１℃低下する。したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、ハイブリダイズする所望の同一性の配列のために調整され得る。例えば、９０％の同一性を有する配列のハイブリダイゼーションが求められる場合には、Ｔｍは、１０℃低下され得る（特定のイオン強度およびｐＨ下で）。ストリンジェントな条件は、例えば、定義されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列およびその相補体の融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低いものであるよう選択され得る。しかし、激しくストリンジェントな条件は、Ｔｍより１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６、７、８、９または１０低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき；低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１〜２０℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。
【００７１】
いくつかの例では、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ  Ｎａ＋（例えば、約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａ＋）未満であり、温度が、短い核酸（例えば、１０〜５０ヌクレオチド長）に対して少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド長）に対して少なくとも約６０℃であるものである。例示的な低ストリンジェンシー条件として、３７℃の、３０〜３５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のバッファー溶液を用いるハイブリダイゼーションおよび５０〜５５℃の、１Ｘ〜２Ｘ  ＳＳＣ（２０Ｘ  ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム）での洗浄が挙げられる。例示的な中程度のストリンジェンシー条件として、３７℃の、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび５５℃〜６０℃の０．５Ｘ〜１Ｘ  ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。例示的高ストリンジェンシー条件として、約３７℃の、約５０％ホルムアミド、約１．０Ｍ  Ｎａ塩、約０．１％  ＳＤＳでのハイブリダイゼーションおよび約６０〜６５℃の約０．１Ｘ  ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数形のポリペプチド、複数形のポリペプチドおよびその断片を含む。この用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結しているモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸の任意の鎖（単数または複数）を指すものであって、特定の長さまたは大きさの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖および２個以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意のその他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、前記の用語は、本明細書において「ポリペプチド」と同義的に使用される。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源から単離されても、組換え技術によって製造されてもよいが、特定のポリペプチドは、必ずしも特定の核酸から翻訳されない。ポリペプチドは、例えば、限定するものではないが、化学物質合成によって、任意の適した方法で作製され得る。
【００７３】
内因性および異種性：本明細書において使用される場合、用語「天然」とは、存在する場合には、その自身の調節配列とともに天然に見られるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの形態を指す。用語「内因性」とは、生物においてその天然の位置に、または生物のゲノム中にあるポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドの天然形態を指す。
【００７４】
対照的に、用語「異種性」とは、参照（宿主）生物においてその位置に普通は見られないポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを指す。例えば、異種核酸は、異なるゲノム位置で参照生物において普通見られる核酸であり得る。さらなる例として、異種核酸は、参照生物において普通見られない核酸であり得る。異種ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを含む宿主生物は、異種ポリヌクレオチド、遺伝子またはポリペプチドを、宿主生物に導入することによって製造され得る。特定の例では、異種ポリヌクレオチドは、対応する天然ポリヌクレオチドとは異なる形態で、供給源生物中に再導入される天然コード配列またはその一部を含む。特定の例では、異種遺伝子は、対応する天然遺伝子とは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然コード配列またはその一部を含む。例えば、異種遺伝子は、天然宿主中に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード配列を含み得る。特定の例では、異種ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドとは異なる形態で供給源生物中に再導入される天然ポリペプチドである。
【００７５】
異種遺伝子またはポリペプチドは、キメラもしくは融合ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子を生成するよう、別の遺伝子もしくはポリペプチドと融合している、機能的ポリペプチドまたは機能的ポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子またはポリペプチドであり得る。特定の実施形態の遺伝子およびタンパク質は、具体的に例示された全長配列およびこれらの配列の部分、セグメント、断片（連続断片および全長分子と比較して内部および／または末端欠失を含む）、変異体、突然変異体、キメラおよび融合物を含む。
【００７６】
修飾：本明細書において使用される場合、用語「修飾」は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの低減された、実質的に排除された、または排除された活性をもたらす特定の参照ポリヌクレオチドにおける変化を指し得る。修飾はまた、参照ポリペプチドの低減された、実質的に排除された、または排除された活性をもたらす参照ポリペプチドにおける変化も指し得る。あるいは、用語「修飾」は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの増大または増強された活性をもたらす参照ポリヌクレオチドにおける変化ならびに参照ポリペプチドの増大または増強された活性をもたらす参照ポリペプチドにおける変化を指し得る。前記のものなどの変化は、例えば、限定するものではないが、参照分子の一部を欠失すること、参照分子を突然変異させること（例えば、自発性突然変異誘発によって、ランダム突然変異誘発によって、変異誘発遺伝子によって引き起こされる変異原性によって、トランスポゾン突然変異誘発によって）、参照分子の一部を置換すること、参照分子中に要素を挿入すること、参照分子の発現を下方制御すること、参照分子の細胞位置を変更すること、参照分子の状態を変更すること（例えば、参照ポリヌクレオチドのメチル化によって、および参照ポリペプチドのリン酸化またはユビキチン化によって）、参照分子の補因子を除去すること、参照分子をターゲッティングするアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、参照分子をターゲッティングする干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、参照分子の化学物質修飾、参照分子の共有結合修飾、ＵＶ照射またはＸ線を用いる参照分子の照射、参照分子を変更する相同組換え、参照分子を変更する有糸分裂組換え、参照分子のプロモーターの置換および／または前記のいずれかの組み合わせを含めた、当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって行われ得る。
【００７７】
特定の例において、どのヌクレオチドまたはアミノ酸残基が修飾され得るかを決定することにおける指針は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を、相同（例えば、相同酵母または細菌）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのものと比較することおよび高相同性の領域（保存された領域）またはコンセンサス配列において行われる修飾の数を最大化することによって見出され得る。
【００７８】
誘導体および変異体：本明細書において使用される場合、用語「誘導体」とは、本明細書における例示的配列の修飾を指す。このような修飾は、作物種におけるコード配列の機能を保存するか、わずかに変更するか、または増大する、本明細書におけるコード配列の１個または複数の塩基の置換、挿入および／または欠失を含む。このような誘導体は、例えば、限定するものではないが、配列構造を予測し、最適化するためにコンピュータモデリング技術を使用することによって当業者によって容易に決定され得る。したがって、用語「誘導体」はまた、本明細書における例示的配列と、実質的な配列同一性を有する配列を含む異種核酸を含み、その結果、作物においてクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳの発現において使用するために、同一の、わずかに変更された、または増大された機能を有し得る。
【００７９】
本明細書において使用される場合、用語「変異体」とは、例えば、限定するものではないが、組換えＤＮＡ技術を使用して導入され得るような、アミノ酸挿入、欠失、突然変異および／または置換によって、本明細書における例示的ポリペプチドと異なっているポリペプチドを指す。参照アミノ酸配列内のどのアミノ酸残基が、置換、付加または欠失され得るかを決定することにおける指針は、特定の参照ポリペプチドの配列を、相同ポリペプチドのものと比較することおよび高相同性の領域（保存された領域）において行われるアミノ酸配列変化の数を最少化することによって、またはアミノ酸をコンセンサス配列と置換することによって見出され得る。変異体ポリペプチドは、置換アミノ酸を有し得るが、参照ポリペプチドの機能活性を保持し得る。「変異体」遺伝子は、参照遺伝子と同一ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと同等もしくは同様の活性を有する同等のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、変異体遺伝子を使用して、変異体タンパク質を製造でき、組換え宿主を使用して、変異体タンパク質を製造できる。例えば、本明細書における任意の例示された配列の連続残基（アミノ酸またはヌクレオチド）を含む変異体遺伝子およびタンパク質が構築され得る。変異体遺伝子またはタンパク質は、例えば、限定するものではないが、例示された配列中の（同一の大きさの）セグメントに対応する３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、および２９３個の連続残基（アミノ酸またはヌクレオチド）を有し得る。同様の大きさのセグメント、特に保存された領域のものはまた、プローブおよび／またはプライマーとして使用され得る。
【００８１】
参照ポリペプチドと同一または同様の機能または活性を有するポリペプチド（例えば、その他の種に由来する）の同定では、多数のレベルの配列同一性が有用であるということは、当業者によって理解される。いくつかの実施形態では、例えば、限定するものではないが、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％および少なくとも約９５％の配列同一性（参照ポリペプチド、例えば、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳと比較した場合に）を有する変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと同一または同様の機能を有する。
【００８２】
特定の分子の連続残基を含む変異体遺伝子およびタンパク質を設計および構築するための戦略は、対象とするタンパク質の構造（例えば、結晶構造および／または分子モデルから得た原子の３−Ｄ（３次元）座標）を得ることおよび調べることによって決定され得る。いくつかの例では、戦略は、タンパク質フォールディングおよび必要不可欠な３−Ｄ構造的完全性と関与している、表面に露出したセグメントおよび内部ではないセグメントなどの修飾にとって理想的であるタンパク質の特定のセグメントに向けられ得る。米国特許第５，６０５，７９３号は、例えば、ランダムまたは集中断片化後のＤＮＡ再構築を使用して、さらなる分子多様性を作成する方法に関する。これは、遺伝子「シャッフリング」と呼ばれることもあり、通常、２種以上の異なるＤＮＡ分子の断片（所望の大きさの）を混合することと、それに、再生の反復ラウンドを続けることを含む。このプロセスは、対象遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を改善し得る。結果は、活性が改善された、基質特異性が変更された、酵素安定性が増大された、立体特異性が変更された、またはその他の特徴を有するキメラタンパク質であり得る。
【００８３】
アミノ酸「置換」は、参照配列中のあるアミノ酸を、同様の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置換すること（すなわち、保存的アミノ酸置換）の結果であり得るか、または、参照配列中のあるアミノ酸を、異なる構造的および／または化学的特性を有するアミノ酸と置換すること（すなわち、非保存的アミノ酸置換）の結果であり得る。アミノ酸は、以下の構造的および／または化学的クラス：非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に入れることができる。したがって「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性または両親媒性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；無電荷（中性）極性アミノ酸として、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；正に荷電している（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられ；負に荷電している（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。あるいは、「非保存的」アミノ酸置換は、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性または両親媒性において相違を選択することによって行うことができる。「挿入」または「欠失」は、組換えタンパク質によって構造的または機能的に許容されるような変動の範囲内にあり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、参照の、全長タンパク質に関して「末端切断型」である。いくつかの例では、末端切断型タンパク質は、参照タンパク質の機能活性を保持する。「末端切断型」タンパク質によって、例えば、切断後に残りの末端切断型タンパク質が、所望の活性を保持し、示しながら、タンパク質の一部が切除され得ることを意味する。切断は、種々のプロテアーゼのいずれかによって達成され得る。さらに、効率的に切断されたタンパク質は、分子生物学の技術を使用して製造でき、これでは、タンパク質の一部をコードするＤＮＡ塩基が、制限エンドヌクレアーゼでの消化または当業者によって利用可能なその他の技術のいずれかによって、コード配列から除去されている。末端切断型タンパク質は、異種システム、例えば、大腸菌（E. coli）、バキュロウイルス、植物ベースのウイルスシステムおよび酵母において発現され得る。除草剤耐性を付与する末端切断型タンパク質は、本明細書において記載されるものなどの除草剤耐性バイオアッセイにおいてタンパク質を発現する異種システムを使用することによって確認され得る。末端切断型タンパク質は、それらが、全長参照タンパク質の機能活性を保持するよう成功裏に製造され得るということは、当技術分野で周知である。例えば、Ｂｔタンパク質は、末端切断型（コアタンパク質）形態で使用され得る。例えば、Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53(2):242-55;およびAdang et al. (1985) Gene 36:289-300。
【００８５】
いくつかの場合には、特に、植物における発現にとって、末端切断型タンパク質を発現する末端切断型遺伝子を使用することは有利であり得る。末端切断型遺伝子は、全長タンパク質の、例えば、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％からなるポリペプチドをコードし得る。
【００８６】
そこから設計された参照配列の機能を保持する変異体遺伝子およびタンパク質は、例えば、活性について組換え変異体をアッセイすることによって当業者によって決定され得る。このような活性アッセイが公知であり特徴づけられている場合には、機能的変異体の決定には、日常的な実験法のみが必要であるだけである。
【００８７】
酵素の「活性部位」への特定の変更を行って、活性または立体特異性に関してその固有の機能に影響を及ぼすことができる。Muller et. al. (2006) Protein Sci. 15(6):1356-68を参照のこと。例えば、公知のｔａｕＤ構造が、その固有の基質、タウリンと結合されながら、活性部位残基を決定するためのモデルジオキシゲナーゼとして使用されてきた。Elkins et al. (2002) Biochemistry 41(16):5185-92を参照のこと。酵素活性部位の配列最適化および設計性に関するさらなる情報は、Chakrabarti et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(34):12035-40に見出すことができる。
【００８８】
タンパク質の種々の構造的特性および三次元特徴は、タンパク質の活性／機能に悪影響を及ぼすことなく変更され得る。分子の活性および／または三次元立体配置に悪影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換（「許容される」置換）が行われ得る。参照タンパク質と配列レベルで異なっているが、同一または同様の全体的に必要不可欠な三次元構造、表面電荷分布などを保持する変異体タンパク質もまた、設計され得る。例えば、米国特許第７，０５８，５１５号；Larson et al. (2002) Protein Sci. 11:2804-13;Crameri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-8;Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51;Stemmer (1994) Nature 370:389-91;Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-53;Crameri et al. (1996) Nat. Med. 2:100-3;およびCrameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-9を参照のこと。
【００８９】
発現構築物（例えば、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳ発現構築物）において使用するために適している５’または３’ＵＴＲ（例えば、合成ヘアピン）のコンピュータによる設計が実施され得、本明細書におけるいくつかの実施形態の核酸内の要素を設計するために使用され得る。５’および３’ＵＴＲ誘導体を予測／評価することにおいて使用するための、コンピュータモデリングおよびＵＴＲおよびコンピュータモデリング技術として、例えば、限定するものではないが、ＭＦｏＬｄ（商標）バージョン３．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能;Zucker et al. 「Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide」, in RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43、J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999;Zucker et al. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-40;Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, and R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, 2000中、Zucker et al. 「RNA Secondary Structure Prediction」）；およびウェブサイト、ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｅｄｄｙ／ｓｏｆｔｗｅａ／にアクセスすることによって、ソースコードとして無料配布され、ダウンロードされ得る、ＣＯＶＥ（商標）（共分散モデルを使用するＲＮＡ構造解析（確率文脈自由文法））ｖ．２．４．２（Eddy and Durbin (1994) Nucl. Acids Res. 22:2079-88）；および同様に、ウェブサイト、ｆｏｌｄａｌｉｇｎ．ｋｕ．ｄｋ／ｓｏｆｔｗｅｒｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで無料配布され、ダウンロードのために利用可能な、ＦＯＬＤＡＬＩＧＮ（商標）（Gorodkin et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(18):3724-32およびGorodkin et al. (1997) Proceedings International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5:120-123）が挙げられる。
【００９０】
プロモーター：用語「プロモーター」とは、核酸コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。複数の例では、制御されるコード配列は、プロモーター配列の３’に位置する。プロモーターは、全体として、天然遺伝子に由来し得るか、プロモーターは、天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなり得るかまたはプロモーターは、合成ＤＮＡセグメントをさらに含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞種における、または異なる発達段階での、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に応じた遺伝子の発現に向けることができるということは当業者によって理解される。前記のプロモーターのすべての例は、当技術分野で公知であり、異種核酸の発現を制御するために使用される。ほとんどの時点でのほとんどの細胞種における遺伝子の発現に向けるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。さらに、当業者は、調節配列の正確な境界を描写しようと試みており（多くの場合には、不成功に）、種々の長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有し得るということが理解されるようになった。特定の核酸のプロモーター活性は、当業者に精通している技術を使用してアッセイされ得る。
【００９１】
作動可能に連結された：用語「作動可能に連結された」とは、一方の核酸配列の機能が別のものによって影響を受ける、単一の核酸での核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、プロモーターが、そのコード配列の発現を達成できる（例えば、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合に、コード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列と作動可能に連結され得る。
【００９２】
発現：用語「発現」は、本明細書において使用される場合、ＤＮＡに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指し得る。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。本明細書において使用される場合、用語「過剰発現」とは、同一遺伝子または関連遺伝子の内因性発現よりも高い発現を指す。したがって、異種遺伝子は、その発現が、匹敵する内因性遺伝子のものよりも高い場合に「過剰発現」される。
【００９３】
形質転換：本明細書において使用される場合、用語「形質転換」とは、遺伝的に安定な継承をもたらす、宿主生物への核酸またはその断片転移および組込みを指す。形質転換核酸を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。形質転換の既知方法として、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）媒介性形質転換、リン酸カルシウム形質転換、ポリブレン形質転換、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、超音波法（例えば、ソノポレーション）、リポソーム形質転換、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡを用いる形質転換、プラスミドベクターを用いる形質転換、ウイルスベクターを用いる形質転換、微粒子銃形質転換（微粒子銃）、シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性形質転換、エアゾールビーミングおよびＰＥＧ媒介性形質転換が挙げられる。
【００９４】
導入された：本明細書において使用される場合、用語「導入された」（細胞へ核酸を導入することとの関連で）は、細胞の形質転換ならびに従来の植物育種技術を利用して実施され得るような、第２の植物が核酸を含有するよう、核酸を含む植物を、第２の植物を交配することを含む。このような育種技術は、当技術分野で公知である。植物育種技術の考察については、Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, AVI Publication Co., Westport CTを参照のこと。
【００９５】
戻し交配法を使用して、植物に核酸を導入してもよい。この技術は、植物に形質を導入するために数十年使用されてきた。戻し交配（およびその他の植物育種方法論）の説明の一例は、例えば、Poelman (1995)、前掲；およびJensen (1988) Plamt Breeding Methodology, Wiley, New York, NYに見出すことができる。例示的戻し交雑プロトコールでは、対象とする元の植物（「反復親」）を、導入されるべき核酸を保持する第２の植物（「非反復親」）と交配する。この交配種から得られた後代を、次いで、反復親と再度交配し、変換された植物が得られるまでこのプロセスを反復し、これでは、非反復親から得られた核酸に加えて、反復親の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的にすべてが、変換された植物中において回収される。
【００９６】
プラスミド／ベクター：用語「プラスミド」および「ベクター」とは、本明細書において、細胞の中央代謝の一部ではない１種または複数の遺伝子を保持し得る染色体外要素を指す。プラスミドおよびベクターは、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子である。しかし、プラスミドおよびベクターは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖または環状核酸である場合もあり、任意の供給源に由来し得、これでは、いくつかのヌクレオチド配列が、任意の適当な３’非翻訳配列とともにプロモーター断片およびコーディングＤＮＡ配列を細胞に導入できる独特の構造に結合または組み換えられている。複数の例では、プラスミドおよびベクターは、自立複製配列、ゲノム組込み配列および／またはファージまたはヌクレオチド配列を含み得る。
【００９７】
ＩＩＩ．クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする配列
本明細書におけるいくつかの実施形態は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質（例えば、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８）に対して少なくとも約９０％の同一性（例えば、８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性）を有する単離ポリペプチドを提供する。本明細書におけるいくつかの実施形態は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質をその他の酵素と区別する、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質における特徴的な保存された構造要素である配列番号１７０〜１７３を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００９８】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質に対して少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。したがって、いくつかの実施形態は、配列番号１７０〜１７３を含む単離されたポリペプチドをコードする核酸を含む。このような核酸は、植物細胞において修飾されたグリホサート代謝が望まれる様々な適用（例えば、グリホサート抵抗性を導入すること）のいずれにおいても有用であり得る。したがって、いくつかの実施形態は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする天然核酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％および少なくとも９９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書において例示目的で提供されるクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳ核酸の特定の例は、配列番号２および３（ｄｇｔ−２８）である。ｄｇｔ−２８核酸の特定の例は、ストリンジェント（例えば、高度にストリンジェント）な条件下で、配列番号２または配列番号３を有する核酸と特異的にハイブリダイズする核酸を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、コドン最適化されたクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする核酸が提供される。例えば、植物における異種遺伝子の高発現を得るために、植物の細胞においてより効率的に発現されるよう、遺伝子を設計および再設計することが望ましい場合がある。細菌遺伝子が、植物細胞において発現されることが望まれる状況では、この戦略が、特に望ましい場合がある。
【０１００】
したがって、本明細書におけるいくつかの例は、双子葉または単子葉植物において最適に発現され得るＤＮＡ配列を生成するよう、植物に最適化されたクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする遺伝子およびそれを設計する方法を提供し、これでは、配列修飾は、翻訳または転写を妨げない。単子葉および双子葉植物両方における、同一クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質の発現について最適化されたクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子の設計が、最適発現のためにｄｇｔ−２８のタンパク質コーディング領域を再設計することを用いて本明細書に例示されている。本明細書における、例示的な植物に最適化されたｄｇｔ−２８核酸は、配列番号２および配列番号３を含む。
【０１０１】
双子葉または単子葉植物（例えば、ワタ、セイヨウアブラナ、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、コムギおよびイネ）における発現のための、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質をコードする遺伝子の操作では、予定される宿主植物（複数可）のコドンバイアスが、例えば、植物ゲノムまたは種々の植物遺伝子のタンパク質コーディング領域のコドン分布に関する情報を見出すために公的に入手可能なＤＮＡ配列データベースを使用することによって決定され得る。
【０１０２】
植物発現のための核酸中のコーディング領域の設計では、植物によって好まれる主要な（「第一選択」）コドンが決定されなければならず、複数の選択が存在する場合には、好ましいコドンの第２、第３、第４などの選択が同様であり得る。次いで、同一ペプチド（例えば、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質）のアミノ酸配列をコードする新規ＤＮＡ配列が設計され得るが、新規ＤＮＡ配列は、元のＤＮＡ配列とは、アミノ酸配列内の各位置でアミノ酸を特定する植物の（第１に好ましい、第２に好ましい、第３に好ましい、または第４に好ましいなど）コドンの置換によって異なる。
【０１０３】
次いで、新規配列は、修飾によって作製された可能性がある制限酵素部位について分析され得る。同定された部位は、コドンを、第１、第２、第３、第４選択の好ましいコドンと置換することによってさらに修飾され得る。対象とする遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る、配列中のその他の部位として、ステム−ループ構造、エクソン：イントロン接合部（５’または３’）、ポリＡ付加シグナルおよびＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルがあり；これらの部位は、植物コドンの置換によって除去され得る。配列は、ＴＡまたはＣＧの対を低減するよう、さらに分析および修飾され得る。これらの対に加えて、同一である約６個を超える残基を有するＧまたはＣ配列ブロックは、配列の転写または翻訳に影響を及ぼし得る。したがって、これらのブロックは、第１または第２選択のコドンを、次に好ましい選択のコドンと置換することによって修飾され得る。
【０１０４】
配列番号２（ｄｇｔ−２８（ｖ５））を、双子葉植物における発現のために最適化した。配列番号３（ｄｇｔ−２８（ｖ６））は、単子葉植物における発現のために最適化した。これらの合成配列中のコドン使用は、好ましいコドン使用に基づいて選択した；すなわち、各々の発現生成物は、単子葉植物または双子葉植物使用のいずれかに向けたバイアスを有するコドンによってコードされ、有害な配列および過剰な制限部位は、ＤＧＴ−２８ポリペプチドの転写／翻訳の効率を高めるために、またＤＮＡ操作ステップを容易にするために除去された。
【０１０５】
同様に、配列番号４（ｄｇｔ−２８（ｖ１））の核酸分子を、大腸菌（Echerichia coli）における発現を改善するために最適化した。配列番号４におけるコドン使用は、好ましい大腸菌（E. coli）コドン使用に基づいて選択し；発現されたタンパク質は、大腸菌（E. coli）使用に向けたバイアスを有するコドンによってコードされる。再設計の際に、有害な配列および過剰な制限部位は、ＤＧＴ−２８コード配列の転写／翻訳の効率を高めるために、またＤＮＡ操作ステップを容易にするために除去された。したがって、大腸菌（E. coli）における、配列番号４を含む核酸からのＤＧＴ−２８の発現は、例えば、ＤＧＴ−２８の酵素的特性決定のための頑強なタンパク質発現をもたらし得る。
【０１０６】
最適化された（例えば、植物に最適化された）ＤＮＡ配列が、書類上で、またはコンピュータで設計されると、設計された配列と正確に配列において対応するよう、実際のＤＮＡ分子が実験室で合成され得る。このような合成核酸分子分子は、クローニングされてもよく、そうではなく、天然のまたは生来の供給源に由来するかのように正確に操作されてもよい。
【０１０７】
本明細書における核酸は、複製および／または発現のための原核細胞または真核細胞への形質転換のためにベクター中にクローニングされ得る。ベクターは、原核生物ベクター、例えば、プラスミドまたはシャトルベクター、昆虫ベクターまたは真核生物ベクターであり得る。本明細書において核酸は、例えば、植物細胞への投与のために発現ベクター中にクローニングされ得る。特定の適用では、大腸菌（E. coli）において機能的であるベクターを有することが好ましいことであり得る（例えば、抗体を作製するためのタンパク質の製造、ＤＮＡ配列分析、インサートの構築、核酸の量を獲得すること）。
【０１０８】
細胞においてクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質を発現させるために、通常、タンパク質をコードする核酸を、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングする。適した細菌および真核細胞プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001);Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 前掲)に記載されている。本明細書における核酸を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス属種（Bacillus sp.）およびサルモネラ（salmonella）において入手可能である（Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)）。このような発現系のキットは、市販されている。哺乳類細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当業者には周知であり、同様に市販されている。
【０１０９】
遺伝情報を細胞中に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質の意図される使用（例えば、植物、動物、細菌、真菌および原虫における発現）に関して選択される。標準細菌および動物発現ベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許公開２００５００６４４７４Ａ１および国際特許公報ＷＯ０５／０８４１９０、ＷＯ０５／０１４７９１およびＷＯ０３／０８０８０９に詳細に記載されている。多量のタンパク質を発現する細菌細胞株を製造するために、標準トランスフェクション法が使用され得、次いで、それは、標準技術を使用して精製され得る。
【０１１０】
本明細書における核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターの選択は、個々の適用に応じて変わる。植物における遺伝子の発現を指示するいくつかのプロモーターは、本明細書における実施形態において使用され得る。このようなプロモーターは、構成的プロモーター、化学調節性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよび種子優先（seed-preferred）プロモーターから選択され得る。例えば、宿主細胞に適している強力な構成的プロモーターが、ＤＧＴ−２８タンパク質の発現および精製のために使用され得る。植物プロモーターの限定されない例として、シロイヌナズナ（A.thaliana）ユビキチン−１０（ubi-10）（Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493）；Ａ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）マンノピンシンターゼ（Δmas）（Petolino et al.、米国特許第６，７３０，８２４号）；および／またはキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）（Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139）に由来するプロモーター配列が挙げられる。
【０１１１】
構成的プロモーターとして、例えば、コアカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-812）；イネアクチンプロモーター（McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171）；トウモロコシユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号;Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632およびChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）；ｐＥＭＵプロモーター（Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）；トウモロコシヒストンプロモーター（Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)）などが挙げられる。
【０１１２】
利用可能な植物適合プロモーターの範囲は、組織特異的および誘導性プロモーターを含む。誘導性調節エレメントは、誘導物質に応じて１種または複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的または間接的に活性化できるものである。誘導物質の不在下で、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導物質は、熱、冷温、塩または毒性要素によって直接的に、またはウイルスなどの病原体もしくは病因物質の作用によって間接的に課せられる、タンパク質、代謝生成物、成長調節物質、除草剤またはフェノール系化合物などの化学物質または生理学的ストレスであり得る。通常、誘導性調節エレメントと特異的に結合して、転写を活性化するタンパク質因子は、不活性形態で存在し、これは、次いで、誘導物質によって、直接的または間接的に活性形態に変換される。誘導性調節エレメントを含有する植物細胞は、噴霧、灌水、加熱または同様の方法によってなど、細胞または植物に誘導物質を外的に適用することによって誘導物質に曝露され得る。
【０１１３】
本明細書における実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993)を参照のこと。誘導プロモーターとして、例えば、限定するものではないが、エクジソン受容体プロモーター（米国特許第６，５０４，０８２号）；銅に反応するＡＣＥ１系に由来するプロモーター（Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)）；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に反応するトウモロコシ由来のＩｎ２−１およびＩｎ２−２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号；Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991)およびGatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)）；Ｔｎ１０由来のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)；転写活性が糖質コルチコステロイドホルモンによって誘導される、ステロイドホルモン遺伝子に由来するプロモーター、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991)およびMcNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257；発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（米国特許第５，９６５，３８７号および国際特許出願公開番号ＷＯ９３／００１２９４）；およびサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーター（Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System", Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9):1796-800）が挙げられる。その他の化学物質によって調節される対象とするプロモーターとして、テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237および米国特許第５，８１４，６１８号および同５，７８９，１５６号を参照のこと）が挙げられる。
【０１１４】
対象とするその他の調節可能なプロモーターとして、転写が、それぞれ、冷温または熱に対する曝露に応じて達成され得る、冷温反応性調節エレメントまたは熱ショック調節エレメント（Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992）；嫌気性条件によって誘導可能な、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982);Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)）；エンドウマメｒｂｃＳ遺伝子またはエンドウマメｐｓａＤｂ遺伝子に由来する光誘導性プロモーター（Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265）；光誘導性調節エレメント（Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991;Lam and Chua, Science 248:471, 1990;Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590;Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138）；植物ホルモン誘導性調節エレメント（Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990）などが挙げられる。誘導性調節エレメントはまた、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に応答するトウモロコシＩｎ２−１またはＩｎ２−２遺伝子のプロモーター（Hershey et al., Mol. Gen. Gene 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994）およびトランスポゾンＴｎ１０のＴｅｔレプレッサー（Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991）であり得る。
【０１１５】
ストレス誘導性プロモーターとして、Ｐ５ＣＳなどの塩／水ストレス誘導性プロモーター（Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89）；ｃｏｒ１５ａなどの冷温誘導性プロモーター（Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252）、ｃｏｒ１５ｂ（Wilhelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077）、ｗｓｃ１２０（Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328）、ｃｉ７（Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909）およびｃｉ２１Ａ（Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45）；Ｔｒｇ−３１（Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57）およびｒｄ２９（Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291）などの乾燥誘導性プロモーター；Ｒａｂ１７などの浸透圧誘導性プロモーター（Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93）およびオスモチン（Raghothama et al. (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28）；熱ショックタンパク質などの熱誘導性プロモーター（Barros et al. (1992) Plant Mol. 19:665-75;Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41）、ｓｍＨＳＰ（Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338）；およびパセリユビキチンプロモーターに由来する熱ショック誘導性エレメント（ＷＯ０３／１０２１９８）が挙げられる。その他のストレス誘導性プロモーターとして、ｒｉｐ２（米国特許第５，３３２，８０８号および米国特許公開第２００３／０２１７３９３号）およびｒｄ２９ａ（Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340）が挙げられる。アグロバクテリウムｐＭＡＳプロモーター（Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505）およびアグロバクテリウムＯＲＦ１３プロモーター（Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343）を含めた特定のプロモーターは、創傷によって誘導可能である。
【０１１６】
組織優先プロモーターは、特定の植物組織内での増強された転写および／または発現を標的とするために利用され得る。これらの種のプロモーターの例として、ファゼオリンプロモーターによって提供されるものなどの種子優先発現（Bustos et al. 1989. The Plant Cell Vol. 1, 839-853）およびトウモロコシグロブリン−１遺伝子、Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972が挙げられる。双子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、マメβ−ファゼオリン、ナピン（napin）、β−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物について、種子優先プロモーターとして、それだけには限らないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤゼイン、２７ｋＤａゼイン、γ−ゼイン、ワキシー（waxy）、シュランケン（shrunken）１、シュランケン（shrunken）２、グロブリン１などが挙げられる。種子優先プロモーターとしてまた、例えば、γ−ゼインの胚乳優先プロモーターなどの種子内の特定の組織に遺伝子発現を主に向けるプロモーター、タバコ由来の隠れた（cryptic）プロモーター（Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577）、トウモロコシ由来のＰ遺伝子プロモーター（Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteinss with C-terminal replacements.Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell.1997, 1:109）、トウモロコシ由来のグロブリン−１プロモーター（Belenger and Kriz.1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972）および種子皮またはトウモロコシ穀粒の殻に発現を向けるプロモーター、例えば、果皮特異的グルタミンシンセターゼプロモーター（Muhitch et al., 2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872）が挙げられる。
【０１１７】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、原核生物または真核生物いずれかの宿主細胞における核酸の発現に必要なさらなる要素のすべてを含有する転写単位または発現カセットを含有する。したがって、通常の発現カセットは、例えば、タンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結されたプロモーターおよび例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結に必要なシグナルを含有する。カセットのさらなる要素は、例えば、エンハンサーおよび異種スプライシングシグナルを含み得る。
【０１１８】
ベクターのその他の成分はまた、遺伝子の意図される用途に応じて含まれ得る。例として、選択マーカー、ターゲッティングまたは調節配列、最適化された輸送ペプチド配列などの輸送ペプチド配列（米国特許第５，５１０，４７１号を参照のこと）ＲＢ７  ＭＡＲなどの安定化配列（Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692およびＷＯ９７２７２０７を参照のこと）またはリーダー配列、イントロンなどが挙げられる。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子の一般的な説明および例は、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)中のGruber, et al., "Vectors for Plant Transformation"に見出すことができる。
【０１１９】
適当な発現ベクターの選択は、宿主および発現ベクターを宿主に導入する方法に応じて変わる。発現カセットは、対象とする異種ヌクレオチド配列の３’末端に、植物において機能的である転写および翻訳終結領域を含み得る。終結領域は、対象とするＤＮＡ配列に関して天然である場合も、別の供給源に由来する場合もある。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ（nos）終結領域などの好都合な終結領域は、Ａ．ツメファシエンス（tumefaciens）のＴｉプラスミドから入手可能である（Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982)およびShaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)）;Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991);Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991);Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991);Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272 (1990);Munroe et al. Gene 91:151-158 (1990);Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)も参照のこと。
【０１２０】
発現カセットは、５’リーダー配列を含有し得る。このようなリーダー配列は、翻訳を増強するよう作用し得る。翻訳リーダーは、当技術分野で公知であり、例として、ピコルナウイルスリーダー、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コーディング領域）、Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス）Carrington and Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990)、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Allison et al.、Virology 154:9-20 (1986)；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991)；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ  ４）、Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987)；タバコモザイクウイルスリーダー（TMV）、Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA、237-256頁；およびトウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（Maize chlorotic mottle virus leader）（ＭＣＭＶ）Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991)が挙げられる。Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987)も参照のこと。
【０１２１】
構築物はまた、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列を含有し得る。１種のこのようなイントロンの例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンがある。Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992)。
【０１２２】
特定のオルガネラ、特に、プラスチド、アミロプラストに、または小胞体に向けられるか、または細胞の表面もしくは細胞外に分泌される異種核酸配列の発現生成物を有することが望ましい場合には、発現カセットは、輸送ペプチドのコード配列をさらに含み得る。このような輸送ペプチドは、当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、アシル担体タンパク質の輸送ペプチド、ＲＵＢＩＳＣＯ、植物ＥＰＳＰシンターゼおよびヒマワリ（Helianthus annuus）の小サブユニット（Lebrun et al.米国特許第５，５１０，４１７号）、トウモロコシＢｒｉｔｔｌｅ−１葉緑体輸送ペプチド（Nelson et al. Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al.Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004）などが挙げられる。さらに、最適化された輸送ペプチドなどのキメラ葉緑体輸送ペプチドは、当技術分野で公知である（米国特許第５，５１０，４７１号を参照のこと）。さらなる葉緑体輸送ペプチドが、米国特許第５，７１７，０８４号、同５，７２８，９２５号において、これまでに記載されている。当業者ならば、特定のオルガネラへ産物を発現させることにおいて利用可能な多数の選択肢を容易に理解する。例えば、オオムギアルファアミラーゼ配列は、発現を小胞体に向けるために使用されることが多い。Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)。
【０１２３】
当業者には、組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率および翻訳後修飾の効率を操作することによって、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を改善し得るということは理解される。さらに、プロモーター配列は、天然プロモーターと比較して、発現のレベルを改善するよう遺伝子操作され得る。核酸分子の発現の制御に有用な組換え技術として、それだけには限らないが、１種または複数の宿主細胞染色体中への核酸分子の安定な組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するための核酸分子の修飾および転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられる。
【０１２４】
形質転換された細胞または組織または植物部分または植物の選択のためのリポーターまたはマーカー遺伝子が、形質転換ベクター中に含まれ得る。選択マーカーの例として、除草剤または抗生物質などの代謝拮抗剤に対する抵抗性を付与するもの、例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994;Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983;Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991）；アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシンおよびパロマイシン（paromycin）に対する抵抗性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983およびFraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)）；ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Marsh, Gene 32:481-485, 1984;Waldron et al.. Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985;Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995も参照のこと）；細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988）；細胞がマンノースを利用することを可能にするマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）；オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する抵抗性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ（DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.）；およびブラストサイジンＳに対する抵抗性を付与する、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995）が挙げられる。
【０１２５】
さらなる選択マーカーとして、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を付与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ（Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988）、アトラジンに対する抵抗性を付与する突然変異体ｐｓｂＡ（Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993）または突然変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号を参照のこと）またはグルホシネートなどの除草剤に対する抵抗性を付与するその他のマーカーが挙げられる。適した選択マーカー遺伝子の例として、それだけには限らないが、クロラムフェニコール（Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983）；ストレプトマイシン（Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996）；ブレオマイシン（Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990）；スルホンアミド（Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990）；ブロモキシニル（Stalker et al., Science 242:419-423, 1988）；グリホサート（Shaw et al., Science 233:478-481, 1986）；ホスフィノトリシン（DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987）に対する抵抗性をコードする遺伝子などが挙げられる。
【０１２６】
選択遺伝子の使用のための１つの選択肢は、グルホシネート抵抗性をコードするＤＮＡであり、一実施形態では、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーターの制御下の、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｔ）、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子である。これらの遺伝子は、ビアラホスに対する抵抗性を付与する（Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37);Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya et al., Biotechnology 11:835, 1993;White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062、1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990；およびAnzai et al.、Mol. Gen. Gen. 219:492、1989を参照のこと）を参照。ｐａｔ遺伝子の１つのバージョンとして、トウモロコシ最適化ｐａｔ遺伝子があり、米国特許第６，０９６，９４７号に記載されている。
【０１２７】
さらに、ポリヌクレオチドをコードするマーカーを含有する植物細胞の同定を容易にするマーカーが使用され得る。配列の存在が、測定可能な産物をもたらし、植物細胞の破壊を伴わずに産物をもたらし得る場合には、スコア化可能なまたはスクリーニング可能なマーカーは有用である。例として、種々の発色基質が公知である酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３号および同５，５９９，６７０号）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907）；およびアルカリホスファターゼが挙げられる。好ましい実施形態では、使用されるマーカーは、ベータ−カロテンまたはプロビタミンＡ（Ye et al., Science 287:303-305-(2000)）である。この遺伝子は、イネの栄養を増強するために使用されてきたが、この例では、代わりに、スクリーニング可能なマーカーとしてとして使用され、対象とする遺伝子と連結している遺伝子の存在は、提供される金色によって検出される。遺伝子が、植物へのその栄養的な貢献のために使用される状況とは異なり、マーキング目的には、少量のタンパク質で十分である。その他のスクリーニング可能なマーカーとして、例えば、中でも、植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の製造を調節する生成物をコードする、Ｒ−遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)）；トウモロコシＣ１遺伝子（Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179;Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48）およびトウモロコシＣ２（Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207）などのフラボノイド色素の生合成を制御する遺伝子；Ｂ遺伝子（Chandler et al., Plant Cell(1989) 1:1175-1183）、ｐ１遺伝子（Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591;Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553;Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19）；ｂｒｏｎｚｅ遺伝子座遺伝子（Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197;Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049）を含めた、全般的に、アントシアニン／フラボノイド遺伝子が挙げられる（Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127での考察を参照のこと）。
【０１２８】
適したマーカーのさらなる例として、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54およびKato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ製のＰＨＩＹＦＰ（商標）；Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54を参照のこと）；ルシフェラーゼをコードし、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光光度測定、微光ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェルルミノメトリーを使用してその存在が検出され得る、ｌｕｘ遺伝子（Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84）；およびマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞が、赤色であり、したがって、視覚的に選択可能である、ＤｓＲｅｄ２（Dietrich et al. (2002) Biotechnologys 2(2):286-293）が挙げられる。さらなる例として、種々の発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）が公知である酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737）；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101）；α−アミラーゼ遺伝子（Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241）およびチロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化でき、順に、これが縮合して、容易に検出可能な化合物メラニンを形成する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703）が挙げられる。明確に、多数のこのようなマーカーが利用可能であり、当業者に公知である。
【０１２９】
ＩＶ．クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳを含む細胞および生物
いくつかの実施形態では、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドを含む細胞および／または生物（例えば、植物細胞または植物）が提供される。特定の実施形態では、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞および／または生物が提供される。いくつかの実施形態は、配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞および／または生物を含む。いくつかの実施形態は、配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドを含む細胞および／または生物を含む。
【０１３０】
植物細胞、植物の一部および／または植物体は、当技術分野で公知の異種分子を導入するいくつかの方法のいずれかによって、異種ポリペプチド（例えば、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳ）および／または異種核酸（例えば、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする核酸）を含むよう遺伝的に修飾され得る。本明細書における特定の実施形態では、異種分子は、例えば、限定するものではないが、形質転換および選択育種（例えば、戻し交雑育種）から選択された方法によって植物細胞、植物の部分および／または植物中に導入される。
【０１３１】
任意の植物種または植物細胞が、本明細書にける異種ポリペプチドおよび／または核酸を含むよう遺伝的に修飾され得る。いくつかの実施形態では、そのように遺伝的に修飾される植物細胞は、植物体を生成するよう再生できない。いくつかの実施形態では、本開示に従って遺伝的に修飾される植物（例えば、植物宿主細胞）として、それだけには限らないが、高等植物、双子葉植物、単子葉植物、消費できる植物、作物およびそのオイルのために利用される植物（例えば、オイル種子植物）が挙げられる。このような植物として、例えば、限定するものではないが、アルファルファ、ダイズ、ワタ、ナタネ（セイヨウアブラナ）、亜麻仁、トウモロコシ、イネ、ビロードキビ、コムギ、ベニバナ、ソルガム、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコおよびイネ科草本（例えば、芝草）が挙げられる。特定の例では、本明細書において、遺伝的に修飾される植物細胞または植物体として、例えば、限定するものではないが、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、カラシナ（ブラシカ・ジュンセア（Brassica juncea））；エチオピアンマスタード（Ethiopian mustard）（ブラシカ・カリナタ（Brassica carinata））；カブ（ブラシカ・ラパ（Brassica rapa））；キャベツ（ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea））；ダイズ（Glycine max）；アマ（Linum usitatissimum）；トウモロコシ（Zea mays）；カルサムス・チンクトリウス（Carthamus tinctorius）；ヒマワリ（Helianthus annuus）；タバコ（Nicotiana tabacum）；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ブラジル・ナッツ（バーソレチア・エクセルサ（Betholettia excelsa）；トウゴマ（リシナス・コミュニス（Riccinus communisRicinus communis））；ココナッツ（ココス・ヌシフェラ（Cocus nucifera））；コリアンダー（コリアンドラム・サティバム（Coriandrum sativum））；ワタ（ゴシピウム属種（Gossypium spp.）；ラッカセイ（アラキス・ヒポゲア（Arachis Hypogaea））；ホホバ（シモンドシダ・キネンシス（Simmondsia chinensis））；アブラヤシ（エライズ・グイネーイス（Elaeis guineeis））；オリーブ（オレア・ユーパエア（Olea eurpaea））；イネ（Oryza sativa）；カボチャ（squash）（ククルビタ・マキシマ（Cucurbita maxima））；オオムギ（ホルデウム・ウルガレ（Hordeum vulgare））；サトウキビ（サッカルム・オフィシナルム（Saccharum officinarum））；コムギ属種（Triticum spp.）（トリチカム・デュラム（Triticum durum）およびトリチカム・アスティバム（Triticum aestivum）を含む）およびダックウィード（レムナセアエ属種（Lemnaceae sp.））が挙げられる。いくつかの実施形態では、エリート栽培品種、野生型栽培品種および商業的に区別できる変種について、植物は、特定の遺伝的背景を有し得る。
【０１３２】
植物細胞中に導入される核酸は、所望の形質を、本質的に任意の植物に付与するために使用され得る。様々な植物および植物細胞系が、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする核酸および種々の形質転換法を使用して、本明細書に記載される所望の生理学的および農学的特徴のために操作され得る。本明細書における実施形態は、当技術分野で公知である植物の形質転換（および遺伝的に修飾された植物の製造）のために多数の方法のいずれかを使用し得る。双子葉植物および単子葉植物のための植物形質転換のために、生物学的および物理的形質転換プロトコールを含めた多数の方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:282-6;Miki et al. (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (Glick, B. R. and Thompson、J. E.、Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 67-88）。さらに、細胞および組織形質転換および植物体の再生のためのベクターおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養方法は、例えば、Gruber et al. (1993)、前掲中、pp.89-119に記載されている。
【０１３３】
核酸を植物宿主細胞中に導入するために利用可能な植物形質転換技術として、例えば、限定するものではないが、形質転換剤としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはＡ．リゾゲネス（rhizogenes）を使用する武装解除したＴ−ＤＮＡを用いる形質転換；リン酸カルシウムトランスフェクション；ポリブレン形質転換；プロトプラスト融合；エレクトロポレーション（D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-505）；超音波法（例えば、ソノポレーション）；リポソーム形質転換；マイクロインジェクション；裸のＤＮＡとの接触；プラスミドベクターとの接触；ウイルスベクターとの接触；微粒子銃（例えば、ＤＮＡ粒子銃（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327:70-3）および微粒子銃（Sanford et al. (1987) Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford (1988) Trends Biotech. 6:299、Sanford (1990) Physiol. Plant 79:206；およびKlein et al. (1992) Biotechnology 10:268）；シリコンカーバイドＷＨＩＳＫＥＲＳ媒介性形質転換（Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:415-8）；ナノ粒子形質転換（例えば、米国特許公開ＵＳ２００９／０１０４７００Ａ１）；エアゾールビーミング；およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性取り込みが挙げられる。特定の例では、異種核酸は、植物細胞のゲノムＤＮＡに直接的に導入され得る。
【０１３４】
発現ベクターを植物中に導入するために利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換システムに基づいている。Horsch et al. (1985) Science 227:1229。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換するのに有用であることが知られている植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を保持する。Kado (1991) Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム媒介性遺伝子導入のための方法に関する詳細はまた、例えば、Gruber et al., 前掲、Miki et al., 前掲、Moloney et al. (1989) Plant Cell Reports 8:238および米国特許第４，９４０，８３８号および同５，４６４，７６３号において入手可能である。
【０１３５】
形質転換にアグロバクテリウムが使用される場合には、挿入されるべきＤＮＡは、通常、特定のプラスミドに、中間体ベクターまたはバイナリーベクターのいずれかにクローニングされる。中間体ベクターは、アグロバクテリウム中では自身で複製できない。中間体ベクターは、ヘルパープラスミド（コンジュゲーション）によってＡ．ツメファシエンス（A.tumefaciens）中に転移され得る。日本たばこスーパーバイナリー系は、このような系の一例である（Komari et al. (2006) Methods in Molecular Biology (K. Wang、ed.) No. 343; Agrobacterium Protocols, 2nd Edition, Vol. 1,Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.15-41；およびKomori et al. (2007) Plant Physiol. 145:1155-60に総説されている）。バイナリーベクターは、大腸菌（e. coli）およびアグロバクテリウムの両方において自身を複製できる。バイナリーベクターは、右および左のＴ−ＤＮＡ境界領域によって囲まれている、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。それらは、アグロバクテリウム中に直接、形質転換され得る（Holsters、1978）。アグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を保持するプラスミドを含む。ＴｉまたはＲｉプラスミドはまた、Ｔ−ＤＮＡの転移に必要なｖｉｒ領域を含む。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの、植物細胞への転移にとって必要である。さらなるＴ−ＤＮＡが含有される場合もある。
【０１３６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主の病原性機能は、細胞が、バイナリーＴ  ＤＮＡベクター（Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-21）または同時培養手順（Horsch et al. (1985) Science 227:1229-31）を使用して細菌に感染すると、構築物および隣接するマーカーを含有するＴ−鎖の、植物細胞ＤＮＡへの挿入を指示する。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は、双子葉植物を操作するために使用される。Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-84;Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-41。アグロバクテリウム形質転換系はまた、単子葉植物および植物細胞を形質転換するため、ならびに単子葉植物および植物細胞に核酸を転移するために使用され得る。米国特許第５，５９１，６１６号；Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-41;Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-4; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-9;Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40；およびGould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-34を参照のこと。
【０１３７】
本明細書における組換え宿主の遺伝子操作は、標準遺伝子技術およびスクリーニングを使用して実施され得、遺伝子操作に適している任意の宿主細胞において実施され得る。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、遺伝子修飾および／または組換え遺伝子発現に適した、任意の生物または微生物宿主であり得る。いくつかの実施形態では、組換え宿主は、植物であり得る。本明細書において使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、例えば、限定するものではないが、Sambrook et al. (1989)、前掲；Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；およびAusubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York, NYに記載されている。
【０１３８】
核酸の植物細胞への導入後に、植物細胞を成長させてもよく、シュートおよび根などの組織の分化が出現すると、成熟した植物が生成され得る。いくつかの実施形態では、複数の植物が生成され得る。植物を再生するための方法論は、当業者に公知であり、例えば、Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishersにおいて、およびPlant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press)において見出すことができる。一般に、本明細書において記載される修飾された植物は、発酵培地において培養し、土壌などの適した培地において成長させてもよい。いくつかの実施形態では、高等植物の適した成長培地は、それだけには限らないが、土壌、砂、根成長または水耕培養を支持する任意のその他の粒状培地（例えば、バーミキュライト、パーライトなど）ならびに高等植物の成長を促進する適した光、水および栄養補助物質を含めた、植物のための任意の成長培地であり得る。
【０１３９】
上記の形質転換技術のいずれかによって製造される形質転換された植物細胞を、培養して、形質転換された遺伝子型、ひいては、所望の表現型を有する全植物体を再生できる。このような再生技術は、組織培養成長培地中の特定の植物ホルモンの操作に頼るものであり、通常、所望のヌクレオチド配列と一緒に導入されている殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans, et al., "Protoplast Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983；およびBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚またはその一部からも得られ得る。このような再生技術は、Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486に全般的に記載されている。
【０１４０】
その他の実施形態では、形質転換されている植物細胞は、植物体を生成するよう再生できない。このような細胞は、例えば、関連表現型、例えば、除草剤抵抗性を有する植物細胞株の開発において使用され得る。
【０１４１】
形質転換された植物細胞、カルス、組織または植物は、操作された植物材料を、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について選択またはスクリーニングすることによって同定および単離され得る。例えば、選択は、形質転換遺伝子構築物がそれに対する抵抗性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含有する培地で、操作された植物材料を成長させることによって実施され得る。さらに、形質転換された植物および植物細胞はまた、組換え核酸構築物上に存在し得る、任意の目に見えるマーカー遺伝子（例えば、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはｇｆｐ遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって同定され得る。このような選択およびスクリーニング方法論は、当業者には周知である。
【０１４２】
本明細書における異種分子を含有するトランスジェニック植物は、選択育種によって、例えば、分子を含む第１の親植物および第２の親植物を、雌雄を掛け合わせ、それによって、複数の第１の後代植物を製造することによって製造され得る。次いで、選択マーカー（例えば、グリホサート、それに対する抵抗性は、本明細書における異種分子によって後代植物に付与され得る）に対して抵抗性である第１の後代植物が選択され得る。次いで、第１の後代植物は、自家受粉され、それによって、複数の第２の後代植物が製造され得る。次いで、選択マーカーに対して抵抗性である第２の後代植物が選択され得る。これらのステップは、第１の後代植物または第２の後代植物を、第２の親植物または第３の親植物物と戻し交雑することをさらに含み得る。
【０１４３】
２種の異なるトランスジェニック植物も、２種の独立に分離する、付加された外因性遺伝子を含有する子孫を製造するために交配され得るということは理解されるべきである。適当な後代の自家受粉は、付加された、外因性遺伝子の両方についてホモ接合体である植物をもたらす。栄養繁殖と同様に、親植物に戻し交雑すること非トランスジェニック植物と外交配することも考慮される。異なる形質および作物のために一般に使用されるその他の育種方法は、当技術分野で公知である。戻し交雑育種は、単純に遺伝される、高度に遺伝性の形質について、反復親である望ましいホモ接合体栽培品種または近交系に遺伝子を転移させるために使用されてきた。得られた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の特質およびドナー親から転移された望ましい形質を有すると予測される。最初の交配後、ドナー親の表現型を有する個体が、選択され、反復親に反復して交配される（戻し交雑）。得られた親は、反復親（例えば、栽培品種）の特質およびドナー親から転移された望ましい形質を有すると予測される。
【０１４４】
核酸はまた、相同組換えによって、植物ゲノムの所定の領域中に導入され得る。相同組換えによって、植物細胞の特定の染色体部位内にポリヌクレオチド配列を安定に組み込むための方法は、当技術分野内で記載されている。例えば、米国特許出願公開番号第２００９／０１１１１８８  Ａ１号に記載されるような部位特異的組込みは、ドナーポリヌクレオチド配列の染色体標的への導入を媒介するための、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を含む。さらに、国際特許公開番号ＷＯ２００８／０２１２０７には、１種または複数のドナーポリヌクレオチド配列をゲノムの特定の位置内に安定に組み込むためのジンクフィンガー媒介性相同組換えが記載されている。米国特許第６，７２０，４７５号に記載されるようなＦＬＰ／ＦＲＴまたは米国特許第５，６５８，７７２号に記載されるようなＣＲＥ／ＬＯＸなどのリコンビナーゼの使用が、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体部位に安定に組み込むために利用され得る。最後に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体位置へターゲッティングするためのメガヌクレアーゼの使用は、Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060)に記載されている。
【０１４５】
植物細胞内の部位特異的組込みのためのその他の種々の方法は、一般に、公知であり、適用可能である（Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159）。さらに、いくつかの原核生物および下等真核生物において同定されている部位特異的組換え系は、植物における使用に適用され得る。このような系の例として、それだけには限らないが、酵母ザイゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミドに由来するＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203）およびファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176）が挙げられる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳは、所望により、宿主細胞および／または生物中で別の核酸と組み合わされ得る。例えば、特定の実施形態では、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする異種核酸は、グリホサートもしくは別の除草剤に対するさらなる抵抗性もしくは耐性を提供する別のものと、および／または選定された昆虫または疾患に対する抵抗性および／もしくは栄養強化および／もしくは改善された農学的特徴を提供する別のもの、および／またはタンパク質もしくは食餌、食物、工業的用途、医薬的用途もしくはその他の用途において有用なその他の生成物を提供する別のものと組み合わされ、または「積み重ねられ」得る。植物ゲノム内の対象とする２種以上の核酸配列の「スタッキング」は、例えば、２以上の事象、核酸を含有する構築物を用いる植物の形質転換、トランスジェニック植物トランスジェニック植物の再形質転換または相同組換えを介した標的組込みによる新規形質の付加を使用する従来の植物育種によって達成され得る。
【０１４７】
クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする異種核酸を用いて「積み重ねられ」得る核酸として、例えば、限定するものではないが以下が挙げられる。
【０１４８】
有害生物または疾患に対して抵抗性を付与する遺伝子またはコード配列（例えば、ｉＲＮＡ）
（Ａ）植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の疾患抵抗性遺伝子（Ｒ）の生成物と、病原体中の対応する病原性（Ａｖｒ）遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化されることが多い。ある植物の種類が、クローニングされた抵抗性遺伝子を用いて形質転換され、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に操作できる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvu）に対する抵抗性のための、トマトＣｆ−９遺伝子（Jones et al., 1994 Science 266:789）、トマト斑葉細菌病に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードする、トマトＰｔｏ遺伝子（Martin et al., 1993 Science 262:1432）およびシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のための、アラビドプシス属（Arabidopsis）ＲＳＳＰ２遺伝子（Mindrinos et al.、1994 Cell 78:1089）が挙げられる。
【０１４９】
（Ｂ）Ｂｔ  δ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチド配列などの、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体またはそれをモデルにした合成ポリペプチド（Geiser et al., 1986 Gene 48:109）および栄養型殺虫性（ＶＩＰ）遺伝子（例えば、Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94を参照のこと）。さらに、δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）からＡＴＣＣ受託番号４００９８、６７１３６、３１９９５および３１９９８の下で購入できる。
【０１５０】
（Ｃ）いくつかのクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列などの、レクチン（Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825）。
【０１５１】
（Ｄ）昆虫有害生物に対する殺うじ剤として有用であるアビジンおよびアビジン相同体などの、ビタミン結合タンパク質。米国特許第５，６５９，０２６号を参照のこと。
【０１５２】
（Ｅ）酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。
このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤（Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793）、タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ（Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985）およびα−アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243）が挙げられる。
【０１５３】
（Ｆ）昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、例えば、エクジステロイドおよび幼若ホルモンその変異体、それをベースとしたミメティックまたはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト、例えば、クローニングされた幼若ホルモンエステラーゼのバキュロウイルス発現、幼若ホルモンの不活化（Hammock et al., 1990 Nature 344:458）。
【０１５４】
（Ｇ）発現すると、影響を受ける有害生物の生理学を撹乱する、昆虫特異的ペプチドまたはニューロペプチド（J. Biol. Chem. 269:9）。このような遺伝子の例として、昆虫利尿ホルモン受容体（Regan, 1994）、ディプロプテラ・プンクタータ（Diploptera punctata）において同定されたアロスタチン（allostatin）（Pratt,1989）および昆虫特異的、麻痺性神経毒（米国特許第５，２６６，３６１号）が挙げられる。
【０１５５】
（Ｈ）蛇、スズメバチなどによって天然に産生される昆虫特異的毒液、例えば、サソリ昆虫毒ペプチド（Pang, 1992 Gene 116:165）。
【０１５６】
（Ｉ）モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度集積に関与している酵素
【０１５７】
（Ｊ）生物学的に活性な分子の翻訳後修飾を含めた、修飾に関与している酵素、例えば、天然または合成にかかわらず、解糖酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼおよびエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼおよびグルカナーゼ。このような遺伝子の例として、ｃａｌｌａｓ遺伝子（ＰＣＴ公開出願ＷＯ９３／０２１９７）、キチナーゼをコードする配列（例えば、ＡＴＣＣから受託番号３９９９６３７および６７１５２の下で入手できる）、タバコ鉤虫キチナーゼ（Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691）およびパセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子（Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673）が挙げられる。
【０１５８】
（Ｋ）シグナル変換をシミュレートする分子。このような分子の例として、リョクトウカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757）およびトウモロコシカルモジュリンｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467）が挙げられる。
【０１５９】
（Ｌ）疎水性モーメントペプチド。米国特許第５，６５９，０２６号および同５，６０７，９１４号を参照のこと；後者は、疾患抵抗性を付与する合成抗菌ペプチドを教示している。
【０１６０】
（Ｍ）膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤、例えば、トランスジェニックタバコ植物をシュードモナス・ソラナセアラム（Pseudomonas solanacearum）に対して抵抗性にする、セクロピン−ベータ溶菌性ペプチド類似体（Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43）。
【０１６１】
（Ｎ）ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、ウイルス感染および／またはコートタンパク質遺伝子が由来するウイルスによって、ならびに関連ウイルスによって達成される疾患発生に対する抵抗性を与える。アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチウイルス、タバコ茎えそウイルスおよびタバコモザイクウイルスに対して、コートタンパク質媒介性抵抗性が形質転換植物に付与されている。例えば、Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451を参照のこと。
【０１６２】
（Ｏ）昆虫特異的抗体またはそれに由来する免疫毒素。したがって、昆虫腸において重大な代謝機能にターゲッティングされる抗体は、影響を受ける酵素を不活化し、昆虫を死滅させる。例えば、Taylor et al. (1994) Abstract #497、Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactionsは、一本鎖抗体断片の製造によるトランスジェニックタバコにおける酵素性不活性化を示す。
【０１６３】
（Ｐ）ウイルス特異的抗体。例えば、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ウイルス攻撃から保護されるということを示すTavladoraki et al. (1993) Nature 266:469を参照のこと。
【０１６４】
（Ｑ）病原体または寄生生物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質。したがって、真菌エンドα−１，４−Ｄポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼを可溶化することによって、真菌コロニー形成および植物栄養放出を促進する(Lamb et al., 1992) Biotechnology 10:1436。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害性タンパク質をコードする遺伝子のクローニングおよび特性決定が、Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367)に記載されている。
【０１６５】
（Ｒ）植物によって天然に生成される発達遅延性タンパク質、例えば、真菌疾患に対する増大した抵抗性を提供するオオムギリボソーム不活化遺伝子(Longemann et al., 1992). Biotechnology 10:3305。
【０１６６】
（Ｓ）ＲＮＡ分子が、標的遺伝子の発現を阻害するために使用される、ＲＮＡ干渉。一例では、ＲＮＡ分子は、部分的または完全に二本鎖であり、サイレンシング反応を引き起こし、ｄｓＲＮＡの低分子干渉ＲＮＡへの切断をもたらし、次いで、これが、相同ｍＲＮＡを破壊するターゲッティング複合体中に組み込まれる。例えば、Fire et al.、米国特許第６，５０６，５５９号；Graham et al.同６，５７３，０９９号を参照のこと。
【０１６７】
除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子
（Ａ）成長点または分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダザリノン（imidazalinone）、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体ＡＬＳ酵素をコードし（Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241）、これは、ＡＨＡＳ酵素としても知られている（Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449）。
【０１６８】
（Ｂ）突然変異体ＥＰＳＰシンターゼおよびａｒｏＡ遺伝子によって、またはＧＡＴ（グリホサートアセチルトランスフェラーゼ）もしくはＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）などの遺伝子およびグルホシネート（ｐａｔおよびｂａｒ遺伝子；ＤＳＭ−２）などのその他のホスホノ化合物ならびにアリールオキシフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキサンジオン（ＡＣＣアーゼ阻害剤をコードする遺伝子）による代謝不活性化によって与えられる、グリホサートに対する抵抗性または耐性をコードする１種または複数のさらなる遺伝子。例えば、グリホサート抵抗性を付与できるＥＰＳＰの形態のヌクレオチド配列を開示する米国特許第４，９４０，８３５号を参照のこと。突然変異体ａｒｏＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号３９２５６の下で得ることができ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，７６９，０６１号に開示されている。欧州特許出願番号０３３３０３３および米国特許第４，９７５，３７４号には、Ｌ−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する抵抗性を付与するグルタミンシンセターゼ遺伝子のヌクレオチド配列が開示されている。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、欧州特許出願０２４２２４６に提供されている。De Greef et al. (1989) Biotechnology 7:61には、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性のためにキメラｂａｒ遺伝子コーディングを発現するトランスジェニック植物の製造が記載されている。アリールオキシフェノキシプロピオン酸およびセトキシジムおよびハロキシフォップなどのシクロヘキサンジオンに対する抵抗性を付与する遺伝子の例示的なものとして、Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435に記載される、Ａｃｃｌ−Ｓ１、Ａｃｃｌ−Ｓ２およびＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子がある。
【０１６９】
（Ｃ）光合成を阻害する除草剤、例えば、トリアジンに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（ｐｓｂＡおよびｇｓ＋遺伝子）およびベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）。Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169には、クラミドモナス（Chlamydomonas）を形質転換するための突然変異体ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドの使用が記載されている。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１および６７４４２の下で入手可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＤＮＡコーディングのクローニングおよび発現は、Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173に記載されている。
【０１７０】
（Ｄ）ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、パラ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に形質転換される反応を触媒する酵素と結合する除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。これは、イソキサゾール（ＥＰ４１８１７５、ＥＰ４７０８５６、ＥＰ４８７３５２、ＥＰ５２７０３６、ＥＰ５６０４８２、ＥＰ６８２６５９、米国特許第５，４２４，２７６号）、特に、トウモロコシの選択的除草剤であるイソキサフルトール、ジケトニトリル（ＥＰ４９６６３０、ＥＰ４９６６３１）、特に、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−ＣＦ３フェニル）プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−ＳＯ２ＣＨ３−４−２，３Ｃｌ２フェニル）プロパン−１，３−ジオン、トリケトン（ＥＰ６２５５０５、ＥＰ６２５５０８、米国特許第５，５０６，１９５号）、特に、スルコトリオンおよびピラゾリネートなどの除草剤を含む。例えば、米国特許第６，２６８，５４９号および同６，２４５，９６８号および米国特許出願公開第２００３００６６１０２号に記載される遺伝子を含めた、植物において過剰量のＨＰＰＤを生成する遺伝子は、このような除草剤に対する耐性または抵抗性を提供し得る。
【０１７１】
（Ｅ）フェノキシオーキシン除草剤、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する抵抗性または耐性をコードし、アリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤に対する抵抗性または耐性も付与する遺伝子。このような遺伝子の例として、米国特許第７，８３８，７３３号に記載される、α−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素（ａａｄ−１）遺伝子が挙げられる。
【０１７２】
（Ｆ）２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのフェノキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性をコードし、フルロキシピルまたはトリクロピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する抵抗性または耐性も付与し得る遺伝子。このような遺伝子の例として、ＷＯ２００７／０５３４８２  Ａ２に記載されるα−ケトグルタレート依存性ジオキシゲナーゼ酵素遺伝子（ａａｄ−１２）が挙げられる。
【０１７３】
（Ｇ）ジカンバに対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子（例えば、米国特許公開第２００３０１３５８７９号を参照のこと）。
【０１７４】
（Ｈ）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を阻害する除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子（米国特許第５，７６７，３７３号を参照のこと）。
【０１７５】
（Ｉ）光化学系ＩＩ反応中心（ＰＳ  ＩＩ）のコアタンパク質と結合する、トリアジン除草剤（アトラジンなど）および尿素誘導体（ジウロンなど）除草剤に対する抵抗性または耐性を提供する遺伝子(Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245を参照のこと。
【０１７６】
価値が付加された形質を付与するか、またはそれに貢献する遺伝子
（Ａ）植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ＡＣＰ不飽和化酵素を用いて、トウモロコシまたはアブラナ属（Brassica）を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
【０１７７】
（Ｂ）減少したフィチン酸含量
（１）クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入（Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87）は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
（２）フィチン酸含量を低下させる遺伝子は、導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体と関連している単一の対立遺伝子と関連しているＤＮＡを再導入することによって達成され得る（Raboy et al., 1990 Maydica 35:383）。
【０１７８】
（Ｃ）例えば、植物を、デンプンの分岐パターンを変更する酵素の遺伝子コーディングを用いて形質転換することによって達成される修飾された炭水化物組成物。このような酵素の例として、ストレプトコッカス・ミューカス（Streptococcus mucus）フルクトース転移酵素遺伝子(Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）レバンスクラーゼ遺伝子（Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genet. 200:220）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ（Pen et al., 1992 Biotechnology 10:292）、トマトインベルターゼ遺伝子（Elliot et al.、1993）、オオムギアミラーゼ遺伝子（Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480）およびトウモロコシ胚乳デンプン分岐酵素ＩＩ（Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450）が挙げられる。
【０１７９】
種々のアッセイが、本開示の特定の実施形態の核酸分子に関して使用され得る。以下の技術は、様々な状況において有用であり、一実施形態では、植物細胞においてコードされる核酸分子および／またはポリペプチドの存在を検出することにおいて有用である。例えば、分子の存在は、配列のプライマーまたはプローブを使用すること、コードされるタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ、タンパク質を検出するためのウエスタンブロットまたはＲＮＡもしくはＤＮＡを検出するためのノーザンもしくはサザンブロットを含め、様々な方法で決定され得る。酵素ＤＧＴ−２８を検出するために酵素アッセイが使用され得る。さらに、ＤＧＴ−２８タンパク質の存在を検出できる抗体が、当技術分野で認識される手順を使用して生成され得る。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などのさらなる技術も、特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出するために使用され得る。導入遺伝子は、植物のいくつかの組織において、またはいくつかの発達段階で選択的に発現されることもあり、または導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織において、実質的にその全生活環に沿って発現されることもある。しかし、任意のコンビナトリアル発現様式も適用可能である。
【０１８０】
サザン分析は、よく使用される検出法であり、これでは、ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され、アガロースゲル上で分画されて、ＤＮＡが分子量によって分離され、次いで、ナイロンメンブランにトランスファーされる。次いで、３２Ｐ（またはその他のプローブ標識）で放射標識されたプローブ断片とハイブリダイズされ、ＳＤＳ溶液で洗浄される。
【０１８１】
同様に、ノーザン分析は、同様のプロトコールを展開し、これでは、ＲＮＡが制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され、アガロースゲル上で分画されて、ＲＮＡが分子量によって分離され、次いで、ナイロンメンブランにトランスファーされる。次いで、３２Ｐ（またはその他のプローブ標識）で放射標識されたプローブ断片とハイブリダイズされ、ＳＤＳ溶液で洗浄される。対象とする組織から単離されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分析は、相対発現レベルを示し得る。通常、ｍＲＮＡが存在するか、ｍＲＮＡの量が増大した場合には、対応する導入遺伝子が発現されていると想定され得る。ノーザン分析またはその他のｍＲＮＡ分析プロトコールは、導入された導入遺伝子または天然遺伝子の発現レベルを決定するために使用され得る。
【０１８２】
ウエスタン分析では、ＤＮＡ／ＲＮＡを単離する代わりに、対象とするタンパク質が抽出され、アクリルアミドゲル上に置かれる。次いで、タンパク質がメンブレンにブロッティングされ、標識物質と接触させられる。例えば、Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification" Molecular Breeding 3:291-306 (1997);Towbin et al. (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications" Proc Natl Acad Sci USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera:  a method for studying antibody specificity and antigen structure" Proc Natl Acad Sci USA 76(7):3116-3120。
【０１８３】
本明細書において核酸またそのセグメントは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーを設計するために使用され得る。ＰＣＲ増幅の実施では、プライマーおよび鋳型間で特定のミスマッチ度が許容され得る。当技術分野に公知の方法によって、所与のプライマー中に突然変異誘発、挿入および欠失が生じ得る。
【０１８４】
検出方法の別の例として、Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)によって記載されるピロシーケンス技術がある。この方法では、隣接するゲノムＤＮＡおよび挿入部分ＤＮＡ接合部分と重なるオリゴヌクレオチドが、設計される。オリゴヌクレオチドは、対象とする領域に由来する一本鎖ＰＣＲ産物（挿入された配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）とハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰが個別に添加され、組込みが光シグナルをもたらし、これが測定される。光シグナルは、成功した増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一または複数塩基伸長によって、導入遺伝子挿入部分／それぞれの両端に位置する配列の存在を示す。
【０１８５】
分子ビーコン（Molecular Beacons）は、配列検出における使用のために記載されている。手短には、それぞれの両端に位置するゲノムおよび挿入部分ＤＮＡ接合部分と重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが、設計される。ＦＲＥＴプローブの独特の構造が、蛍光および消光部分を極近接して維持する二次構造を含有するものをもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。成功したＰＣＲ増幅後、ＦＲＥＴプローブ（複数可）の標的配列とのハイブリダイゼーションは、プローブ二次構造の除去および蛍光および消光部分の空間的分離をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置するゲノム／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。
【０１８６】
加水分解プローブアッセイは、別に、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（Life Technologies、Foster City、Calif.）としても知られる、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。手短には、事象特異的検出のために導入遺伝子内に１つのオリゴおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中に１つを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入部分ＤＮＡ配列中の１種のプライマーおよびそれぞれの両端に位置するゲノム配列中の１種）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環される。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションが、ＦＲＥＴプローブ上の消光部分から蛍光部分の切断および放出をもたらす。蛍光シグナルは、成功した増幅およびハイブリダイゼーションによって、それぞれの両端に位置する／導入遺伝子挿入部分配列の存在を示す。
【０１８７】
ＥＬＩＳＡまたは酵素結合免疫測定法は、１９７１年から知られている。一般に、バッファー中に可溶化された抗原が、プラスチック表面上にコーティングされる。血清が添加されると、抗体は、固相上の抗原と結合し得る。これらの抗体の有無は、酵素とコンジュゲートされると実証され得る。適当な基質を添加することで、定量され得る結合しているコンジュゲートの量が検出される。一般的なＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化抗（タンパク質）ポリクローナル抗体およびアルカリホスファターゼコンジュゲートを使用するものである。例えば、ラッカーゼレベルの定量的測定のために使用されるＥＬＩＳＡは、商業的に得られるポリクローナルウサギ抗体を利用する抗体サンドイッチアッセイであり得る。抗体は、検出のためにアルカリホスファターゼにコンジュゲートされる。別の例では、トリプシンまたはトリプシノーゲンを検出するＥＬＩＳＡアッセイは、ビオチン化抗トリプシンまたは抗トリプシノーゲンポリクローナル抗体およびストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを使用する。
【０１８８】
特定の実施形態は、少なくとも一方の親として、本開示の一実施形態の植物を使用して交雑種を作製するプロセスに関する。例えば、特定の実施形態は、一方または両方の親として、本明細書に例示される植物のいずれかを有するＦ１ハイブリッド植物に関し、その他の実施形態では、このようなＦ１ハイブリッドによって生成される種子に関する。さらにその他の実施形態は、例示された植物を、異なる（例えば、近交系親）植物を交雑させ、得られたハイブリッド種子を回収することによって、Ｆ１ハイブリッド種子を生成する方法に関する。その他の実施形態は、雌親または雄親のいずれかである例示された植物に関する。得られた植物の特徴は、親植物を注意深く考慮することによって改善され得る。
【０１８９】
Ｖ．クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳ酵素によって媒介されるグリホサート耐性
配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドは、ＥＰＳＰＳ酵素活性を有し得る。したがって、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドならびに配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチド（例えば、配列番号２〜４）をコードする核酸が、いくつかの実施形態では、グリホサート耐性を細胞または生物（例えば、植物細胞または植物）に付与するために使用され得る。グリホサート除草剤製剤に対して抵抗性である植物または植物細胞を提供することは、このような抵抗性を有する植物細胞が、耕作区域において少なくとも幾分かの雑草を防除するために使用される十分な量のグリホサートに対する曝露を許容し得る様々な適用において有用であり得る。
【０１９０】
グリホサート、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを含む組成物は、除草剤において広く使用されている成分である。グリホサートは、通常、水性液濃縮物中の塩、固体濃縮物、エマルジョンまたはマイクロエマルジョンとして製剤される。グリホサートは、発芽から植物発達の種々の段階まで、植物の上面に適用され得る。
【０１９１】
グリホサート除草剤製剤と組み合わせて使用されるグリホサート耐性植物変種は、米国および世界中での作物生産における雑草管理の標準プログラムとなった。グリホサート耐性形質を使用することにおける栽培者にとっての主な利点は、優れた作物安全性を有し、植え付け前除草剤適用に対する依存が少ない、不要な植物およびイネ科草本（すなわち、「雑草」）を防除するための、グリホサート、広範囲の、発芽後除草剤の簡単な好都合な適用を可能にするということである。その他の恩恵は、無耕農業および作付体系の減少に良好に適合することを含む。グリホサート耐性作物は、雑草管理の選択肢を広げ、雑草防除の実施をかなり容易に、費用のあまりかからない、より柔軟性のあるものにした。栽培者は、除草剤を適用するために田畑中をより少なく動き回るようになったことおよびより少なく耕して回るようになったことを報告し、これによって、燃料が温存され、土壌侵食が低減される。グリホサート耐性作物は、したがって、除草剤によってもたらされる環境リスクを低減し、一方で、同時に、必要な化学物質雑草防除の有効性を高める。
【０１９２】
したがって、本明細書におけるいくつかの実施形態は、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドならびに／または配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドをコードする核酸を含む植物を含有する耕作区域において雑草を選択的に防除することを提供し、これでは、植物は、ポリペプチドおよび／または核酸（複数可）を含まない同一種の植物と比較した場合に、増大したグリホサート耐性を有する。いくつかの例では、本明細書において提供される方法は、雑草の成長を防除するために作物の葉および雑草に十分な量の除草剤グリホサートを適用することを含む。
【０１９３】
本明細書における特定の実施形態は、作物（例えば、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドならびに／または配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドおよび配列番号１７０〜１７３を含むポリペプチドをコードする核酸を含む植物）を含有する耕作区域において、雑草または不要の植生を死滅させるか、または防除する方法を提供する。いくつかの例では、方法は、作物および／または耕作区域にグリホサートを適用すること、例えば、作物の葉に、同時に、このような植物と極近接して成長する雑草に一定量のグリホサートを適用することを含み、これでは、量は、雑草または不要な植生の防除をもたらし、一方で、作物を実質的に無傷で残すのに十分である。
【０１９４】
グリホサート組成物は、所望の生物学的結果、例えば、グリホサート耐性作物に大幅に影響を及ぼすことなく、雑草成長の防除をもたらすのに十分な適用比率で植物に適用され得る。これらの適用比率は、普通、処理される単位面積あたりのグリホサートの量として表される。例えば、ヘクタールあたりのグラム（ｇ／ｈａ）。「相当な効果」を構成するものは、組成物を調査し、開発し、市販し、使用するものの標準および実施ならびに組成物にとって大幅に有効である適用比率の選択にしたがって変わり、当業者の技術の範囲内である。
【０１９５】
特定の例では、成長低減または死滅率によって測定されるような、雑草種の８５％の防除をもたらすための単位面積あたりに適用されるグリホサート組成物の量が、適用比率を規定するために使用される。耕作区域において雑草を防除するのに十分ないくつかのグリホサート除草剤適用比率の選択は、通常の農業科学者の技術の範囲内である。当業者ならば、同様に、個々の植物状態、天候および成長条件ならびに組成物中の特定の有効成分およびその重量比が、特定の適用における除草剤有効性の程度に影響を及ぼし得るということは認識する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、水性グリホサート組成物は、植物の葉組織に、水性グリホサート組成物を適用することによって、一年生および多年生イネ科草本および広葉雑草種を含めた様々な不要な植物を死滅させ、その成長を防除するために植物の葉組織に適用され得る。考慮される除草剤組成物（例えば、粒状土壌濃縮物、液体濃縮物、すぐに使える組成物およびタンク混合組成物）中に存在するグリホサートの相対量は、例えば、防除される雑草種および適用方法を含めた多数の因子に応じて変わり得る。しかし、一般的に言えば、グリホサートおよび任意選択で、界面活性剤および／または除草剤組成物において使用されるいくつかのその他のアジュバントまたは添加物（本明細書において別の場所に記載されるような）の濃度は、耕作区域内の雑草を防除するのに十分である。
【０１９７】
除草剤噴霧組成物は、組成物が適用の準備が整って製造されるかどうか、液体グリホサート濃縮物のさらなる希釈または粒状固体グリホサート濃縮物への水の添加から得られるかどうかにかかわらず、水溶液または分散物として適用され得る。しかし、用語「水性」とは、本明細書において、存在する主な溶媒が水である限り、幾分か少量の非水性溶媒を含む組成物を含む。除草剤噴霧組成物は、空中散布および地上散布技術（例えば、地上ブーム式、手動噴霧器およびロープウィック（ｒｏｐｅ−ｗｉｃｋ））を含めた、当業者に周知である適当な方法のいずれかによって、処置されるべき植物の葉に適用され得る。
【０１９８】
いくつかの例では、液体濃縮物組成物は、１リットルあたり少なくとも約５０グラム、少なくとも約７５グラムまたは少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０または７００グラム（酸当量またはａ．ｅ．）またはそれ以上の濃度でグリホサートを含むよう製剤される。グリホサート濃度範囲は、例えば、１リットルあたり約５０〜約６８０グラム（ａ．ｅ．）（ｇｐｌ）、約１００〜約６００ｇｐｌ、約２５０〜約６００ｇｐｌおよび約３６０〜約５４０ｇｐｌであり得る。
【０１９９】
グリホサート濃縮物の総重量に基づいた重量パーセンテージとして表される場合には、液体濃縮物は、例えば、少なくとも約１０重量％のグリホサート（ａ．ｅ．）、少なくとも約１５重量％、および少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、または６８重量％またはそれ以上を含み得る。グリホサート濃度範囲は、例えば、約１０重量％〜約７０重量％  ａ．ｅ．、約２０重量％〜約６８重量％または約２５重量％〜約４５重量％であり得る。
【０２００】
グリホサートが、すぐに使える組成物として適用される場合には、グリホサート濃度は、例えば、約１重量％〜約３重量％  ａ．ｅ．および約１重量％〜約２重量％であり得る。
【０２０１】
噴霧組成物は、例えば、１エーカーあたり少なくとも約１ガロン（３．７８リットル）の噴霧組成物、１エーカーあたり、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ガロン（７５．７リットル）およびそれ以上の適用のために製剤され得る。噴霧組成物の噴霧容量は、例えば、空中散布のために、１エーカーあたり約１ガロン（３．７８リットル）〜約１００ガロン（３７８．５リットル）、１エーカーあたり約２ガロン（７．５７リットル）〜約４０ガロン（１５１．４１リットル）および１エーカーあたり約２ガロン（７．５７リットル）〜約５ガロン（１８．９２リットル）、また地上散布のために、１エーカーあたり約５ガロン（１８．９２リットル）〜約２０ガロン（７５．７リットル）の範囲であり得る。
【０２０２】
いくつかの例では、グリホサートが、主に塩の形態で存在する水相および任意選択で、比較的水に不溶性である第２の除草剤有効成分を含有する非水相を有する液体濃縮物製剤が使用され得る。このような製剤は、例えば、エマルジョン（マクロエマルジョンおよびミクロエマルジョン、油中水、水中油および水中油中水の種類を含む）、懸濁液およびサスポエマルジョンを含み得る。非水相は、特定の例では、マイクロカプセル化した成分（例えば、マイクロカプセル化した除草剤）を含み得る。非水相を有する製剤では、組成物中のグリホサートａ．ｅ．の濃度は、全体として、それにもかかわらず、水性濃縮物製剤について本明細書に列挙される特定の例示的範囲内であり得る。
【０２０３】
製剤のいずれかに従って使用され得るグリホサートの適した塩形態として、例えば、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウムおよびカリウム塩、アンモニウム塩、ジメチルアンモニウムなどのジアンモニウム塩、アルキルアミン塩、例えば、ジメチルアミンおよびイソプロピルアミン塩、アルカノールアミン塩、例えば、エタノールアミン塩、アルキルスルホニウム塩、例えば、トリメチルスルホニウム塩、スルホキソニウム塩およびそれらの混合物または組み合わせが挙げられる。グリホサートの市販の製剤の例として、制限するものではないが、ＧＬＹＰＨＯＭＡＸ（商標）、ＧＬＹＰＨＯＭＡＺ（商標）ＸＲＴ、ＧＬＹＰＨＯＭＡＸ（商標）ＰＬＵＳ、ＤＵＲＡＮＧＯ（商標）、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＵＬＴＲＡＭＡＫ、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＣＴ、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＢＩＯＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯ（商標）、ＰＯＬＡＲＩＳ（商標）、ＳＰＡＲＫ（商標）、ＡＣＣＯＲＤ（商標）ＳＰ、ＡＣＣＯＲＤ（商標）ＸＲＴおよびＡＣＣＯＲＤ（商標）ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＥが挙げられ、そのすべては、グリホサートをそのイソプロピルアンモニウム塩（ＩＰＡ）として含有する；グリホサートをそのアンモニウム塩として含有する、ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＤＲＹおよびＲＩＶＡＬ（商標）；ＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＧＥＯＦＯＲＣＥ、ナトリウムグリホサート製剤；ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ（商標）、グリホサートトリメシウム塩製剤、ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ（商標）ＩＱ、グリホサートジアンモニウム塩製剤、ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ（商標）ＴＯＴＡＬ  ＩＱ、カリウムグリホサート製剤およびＲＯＵＮＤＵＰ（商標）ＷＥＡＴＨＥＲＭＡＸ、カリウムグリホサート製剤が挙げられる。グリホサート製剤は、薬剤軽減剤（safening agent）、界面活性剤および／またはアジュバントを含み得る。
【０２０４】
必要に応じて、ユーザーは、適用のために製剤を調製する場合に、１種または複数のアジュバントを、グリホサート組成物および希釈の水と混合してもよい。このようなアジュバントは、除草剤有効性をさらに増強する目的で、さらなる界面活性剤および／または無機塩（例えば、硫酸アンモニウム）を含み得る。
【０２０５】
必要に応じて、ユーザーはまた、植物をさらに保護するため、および／またはより多くの除草剤に対する交差抵抗性を加えるために、グリホサート製剤中に適当な薬剤軽減剤（safener）を使用してもよい。薬剤軽減剤は、雑草防除有効性を損なうことなく、生理学的または分子的機序によって作物に対する除草剤の殺草性を低減する化学物質である。薬剤軽減剤は、通常、ｃＰ４５０を活性化すること／発現することによって植物の免疫系を高めるよう作用する。例示的薬剤軽減剤として、例えば、限定するものではないが、ベノキサコール（benoxacor）、クロキントセット（cloquintocet）、シオメトリニル（cyometrinil）、ジクロルミド（dichlormid）、ジシクロノン（dicyclonon）、ジエトラート（dietholate）、フェンクロラゾール（fenchlorazole）、フェンクロリム（fenclorim）、フルラゾオール（flurazole）、フルキソフェニム（fluxofenim）、フリラゾール（furilazole）、イソキサジフェン（isoxadifen）、メフェンピル（mefenpyr）、メフェナート（mephenate）、無水フタル酸およびオキサベトリニル（oxabetrinil）が挙げられる。
【０２０６】
薬剤軽減剤は、チオカルバメートおよびクロロアセトアニリドファミリーの植え込み前組込み除草剤または発芽前適用除草剤に対する大型種子のイネ科草本作物、例えば、限定するものではないが、トウモロコシ、穀実用モロコシおよび水稲（wet sown）イネの保護のために使用され得る。薬剤軽減剤はまた、アリールオキシフェノキシプロピオネートおよびスルホニル尿素除草剤の発芽後適用に対してなど、コムギなどの冬作穀物を保護するために開発された。スルホニル尿素、イミダゾリノン、シクロヘキサンジオン、イソキサゾールおよびトリケトン除草剤に対する、トウモロコシおよびイネの保護のための薬剤軽減剤（safeners）の使用もまた、十分に確立されている。
【０２０７】
植物アクチベーター（植物を、その防御機序を活性化することによって保護する化合物の新規クラス）もまた、本明細書における実施形態において使用され得る。例示的な植物アクチベーターとして、アシベンゾラル（acibenzolar）およびプロベナゾール（probenazole）が挙げられる。
【０２０８】
本発明の実施形態は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、単に例示目的で与えられるということは理解されなくてはならない。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者ならば、本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の使用および条件に適応させるために本発明の実施形態の種々の変法および修飾を行うことができる。したがって、本明細書において示され、記載されるものに加えて、本発明の実施形態の種々の修飾は、以下の記載から当業者に明らかとなる。このような修飾はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。以下は、例示として提供され、本発明の範囲を制限するものではない。
（実施例）
【実施例１】
【０２０９】
材料および方法
本開示の実施形態は、以下の実施例においてさらに記載され、これは例示のために提供され、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図しない。
【０２１０】
大腸菌（Esherichia coli）の５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ酵素（ＥＰＳＰシンターゼ）における１アミノ酸突然変異（Ｇ９６Ａ）は、グリホサート非感受性をもたらすことができる（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。この突然変異はグリホサートに対する耐性を付与するが、その天然基質であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によるＥＰＳＰシンターゼの結合に悪影響を及ぼすことも知られている。基質結合効率において生じた変化は、グリホサートに対するｉｎ  ｐｌａｎｔａにおける耐性を提供するために、突然変異した酵素を不適当なものにし得る。
【０２１１】
ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入したＧ９６Ａ突然変異と類似した位置でアラニンを天然に含有するＥＰＳＰシンターゼタンパク質配列とポリヌクレオチド配列についてインシリコにおいてＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースをスクリーニングした（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al, (2002); Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。
【０２１２】
この位置で天然のアラニンを含むことが同定された１つの酵素は、ストレプトマイセス・スビセウス（Streptomyces sviceus）ＡＴＣＣ２９０８３由来のＤＧＴ−２８（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０６９１７２４０．１）であった。さらに、インシリコのデータマイニングは、ＤＧＴ−２８；ＤＧＴ−３１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＹＰ＿００４９２２６０８．１）；ＤＧＴ−３２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０４６９６６１３）；およびＤＧＴ−３３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＮＣ＿０１０５７２）により高い相同性を有する３つの他の固有のストレプトマイセス酵素を示した。これらの酵素のそれぞれは、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入されたＧ９６Ａ突然変異と類似した位置で天然のアラニンを含有する。図１。
【０２１３】
異なる生物由来のＥＰＳＰシンターゼタンパク質は長さが異なるため、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の大腸菌（E.coli）バージョンの突然変異の番号付けは、他の生物由来のＥＰＳＰシンターゼ酵素の突然変異の番号付けと必ずしも対応しない。これらの同定されたＥＰＳＰシンターゼ酵素は、グリホサート耐性またはＰＥＰ基質親和性に関して従前特徴付けられていなかった。さらに、これらのＥＰＳＰシンターゼ酵素は、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の新しいクラスを表し、前述のクラスＩ（米国再発行特許第３９２４７号にさらに記載されている植物由来の配列）、ＩＩ（米国再発行特許第３９２４７号にさらに記載されている細菌由来の配列）、およびＩＩＩ（国際特許出願ＷＯ２００６／１１０５８６にさらに記載されている細菌由来の配列）のＥＰＳＰシンターゼ酵素を特徴付けるために使用されているいずれもの配列モチーフを含まない。
【０２１４】
新規なＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３酵素は、クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素と比較することによって、グリホサート耐性およびＰＥＰ基質親和性について特徴付けられた。以下のクラスＩの酵素；ダイズ（Glycine max）由来のＤＧＴ−１、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のＤＧＴ−３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｐ１７６８８）、およびコムギ（Triticum aestivum）由来のＤＧＴ−７（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＥＵ９７７１８１）は比較のためのものであった。クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素およびその変異改変体を合成し、評価した。植物ＥＰＳＰシンターゼ酵素に導入された突然変異は、酵素の大腸菌（E.coli）バージョン由来のＧ９６Ａ突然変異と同様の位置で、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内でなされたグリシンからアラニンへの突然変異からなっていた。さらに、トレオニンからイソロイシンおよびプロリンからセリンの突然変異は、Funke et al., (2009)において記載されているように、大腸菌（E.coli）のＥＰＳＰシンターゼにおけるアミノ酸９７（ＴからＩ）とアミノ酸１０１（ＰからＳ）の突然変異と類似した位置で、これらのクラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素内に導入された。
【０２１５】
図１は、他のＥＰＳＰシンターゼ酵素に対するＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３の部分配列のアラインメントを示す。４つすべてのＤＧＴ酵素は、ａｒｏＡ  ＥＰＳＰシンターゼ酵素のアミノ酸９６位で保存されたアラニンを共有する。このアミノ酸の位置は、アスタリスクによって示されて、アミノ酸残基には下線が付されている。
【０２１６】
図２は、ＤＧＴ−１、ＤＧＴ−３、およびＤＧＴ−７酵素のアラインメントを示す。グリシンからアラニンに突然変異したアミノ酸残基の位置は、第１のアスタリスクで示されている。トレオニンからイソロイシンに突然変異したアミノ酸残基の位置は、第２のアスタリスクで示されている。プロリンからセリンに突然変異した第３のアミノ酸残基の位置は、第３のアスタリスクで示されている。これらの突然変異は、ＤＧＴ−１、ＤＧＴ−３、およびＤＧＴ−７の異なるバージョンに導入された。突然変異を含む遺伝子の異なるバージョン（ｖ１、ｖ２、ｖ３．．．ｖＮ）は、以下により詳細に記載されている。
【実施例２】
【０２１７】
植物および細菌における発現のための配列の最適化
植物の最適化。双子葉植物および単子葉植物（トウモロコシ）のコドンバイアスは、単一のコドンが、すべてのアミノ酸に対するコドンと比較して使用される頻度として計算された。表１。あるいは、コドンバイアスは、単一のコドンが、そのアミノ酸（同義コドン）に対する他のすべてのコドンと比較して、特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度として計算されてもよい。植物発現のためのコード領域の設計において、植物に好ましい一次（「第１選択」）のコドンが決定され、複数の選択肢が存在する場合、第２、第３、第４選択などの好ましいコドンが決定された。
【０２１８】
ストレプトミセス・スビセウス（S. sviceus）由来のＤＧＴ−２８コード配列の分析は、最適な植物発現に有害であると考えられたいくつかの配列モチーフの存在、ならびに双子葉植物および単子葉植物における発現のために最適でないコドン組成を明らかにした。
【０２１９】
【表１】
0006537825.tif 000002
【０２２０】
ＤＧＴ−２８タンパク質をコードする植物最適化された遺伝子を遺伝子操作するために、ＤＮＡ配列は、特定の宿主植物のためのタンパク質コード配列からコンパイルされたコドンバイアス表から確立された重複した遺伝コードを利用して、アミノ酸配列をコードするように設計された。表１において、ＤおよびＩ列は、単子葉（トウモロコシ）植物のコード領域に見られるように、それぞれのアミノ酸に対する同義コドンの分布（そのアミノ酸のすべてのコドンに対する使用％で）を示す。ＥおよびＪ列は、双子葉植物のコード領域に見られるように、それぞれのアミノ酸に対する同義コドンの分布（そのアミノ酸のすべてのコドンに対する使用％で）を示す。いくつかのアミノ酸に対するいくつかの同義コドンは、植物遺伝子（例えばＣＧＧ）において稀にしか見られない。通常、コドンは、いずれかの植物タイプ（表１のＣとＨ列においてＤＮＵによって示される）の遺伝子における関連アミノ酸をコードすることが約１０％以下の確率で示される場合、稀に使用されることが考えられた。アミノ酸に対する残りのコドン選択肢の分布を量るために、それぞれのコドンについての加重平均表現は、以下の式を用いて計算された。
Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋他）×％Ｃ１×１００、（１）
式中、Ｃ１は、対象とするコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３などは、表１の残りの同義コドンの双子葉植物の％値の平均（関連コドンに対する平均％値がＣとＨ列から採用される）を表す。
【０２２１】
それぞれのコドンについての加重平均％値を表１のＣとＨ列に示す。
【０２２２】
前述の手法を用いて、本質的にＤＧＴ−２８タンパク質のアミノ酸配列をコードする新しいＤＮＡ配列は、双子葉植物の遺伝子において見出される頻繁に使用されるコドンの平衡状態のコドン分布を用いて、双子葉植物における最適な発現のために設計された。本質的にＤＧＴ−２８タンパク質のアミノ酸配列をコードする第２のＤＮＡ配列は、単子葉植物の遺伝子において見出される頻繁に使用されるコドンの平衡状態のコドン分布を用いて、単子葉植物における最適な発現のために設計された。２つの新しいＤＮＡ配列は、タンパク質アミノ酸配列内のそれぞれの位置で適切なアミノ酸を特定するための植物（第１の好ましい、第２の好ましい、第３の好ましい、または第４の好ましい）コドンの置換によって、ｄｇｔ−２８をコードする元のＤＮＡ配列とは異なった。
【０２２３】
植物最適化されたＤＮＡ配列の設計は、ＤＧＴ−２８タンパク質配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＺＰ＿０６９１７２４０．１）のタンパク質配列の逆翻訳によって開始された。配列番号１は、表１；ＥとＪ列から構築された双子葉植物コドンバイアス表を用いて逆翻訳された。配列番号１の第２の逆翻訳は、表１；ＤとＩ列から構築された単子葉植物コドンバイアス表を用いて完了させた。
【０２２４】
次に、最初の逆翻訳配列は、制限酵素認識部位を除去または付加し、高度に安定した鎖内二次構造を除去し、植物において操作された遺伝子のクローニング操作または発現に有害であり得る他の配列を除去するために、コドン変化（全体の加重平均コドン表現を保持したまま）を相殺することによって改変された。次に、ＤＮＡ配列は、改変によって作製された可能性がある制限酵素認識部位について再分析された。同定された部位は、第１、第２、第３、または第４選択の好ましいコドンで関連するコドンを置き換えることによってさらに改変された。対象とする遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼし得る配列における他の部位は、エクソン：イントロン接合部（５’または３’）、ポリＡ付加シグナル、およびＲＮＡポリメラーゼ終結シグナルを含む。改変された配列はさらに分析され、ＴＡまたはＣＧダブレットの頻度を減少させ、およびＴＧまたはＣＴダブレットの頻度を増加させるようにさらに改変された。これらのダブレットに加えて、［Ｇ＋Ｃ］または［Ａ＋Ｔ］の約６を超える連続残基を有する配列ブロックは、配列の転写または翻訳に影響を及ぼし得る。したがって、これらの配列ブロックもまた、第１または第２選択のコドンなどを、最適な他の好ましいコドンで置き換えることによって改変された。稀にしか使用されないコドンは、遺伝子設計において実質的な程度までには含まれず、それ自体、コドン組成とは異なる設計基準を受け入れる必要がある場合のみ（例えば、制限酵素認識部位の付加または欠失）使用された。
【０２２５】
新たに設計された、双子葉植物の最適化されたｄｇｔ−２８  ｖ５ポリヌクレオチド配列は配列番号２に列挙されている。新たに設計された、単子葉植物の最適化されたｄｇｔ−２８  ｖ６ポリヌクレオチド配列は配列番号３に列挙されている：この配列は、制限酵素部位を導入するために、第２のアミノ酸位置でアラニンを含むことによって僅かに改変された。得られたＤＮＡ配列は、高度なコドン多様性、所望の塩基組成を有し、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または生成物ｍＲＮＡの翻訳を干渉し得る配列を欠損している。
【０２２６】
６個のフレーム終止（コード配列の３’端に追加された全６個のリーディングフレームに位置した終止コドン）およびクローニングのための５’制限部位などの追加配列を含有する配列番号２と配列番号３を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者（ＤＡＮ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって行われた。次に、合成核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ、以下の実施例に記載されるように、植物または細菌に形質転換された。
【０２２７】
同様のコドン最適化戦略を用いて、ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３  ｖ２（Ｇ１７３Ａ）、ｄｇｔ−３  ｖ３（Ｇ１７３Ａ；Ｐ１７８Ｓ）、ｄｇｔ−３  ｖ４（Ｔ１７４Ｉ；Ｐ１７８Ｓ）、ｄｇｔ−７  ｖ４（Ｔ１６８Ｉ；Ｐ１７２Ｓ）、ｄｇｔ−３２  ｖ３、ｄｇｔ−３３  ｖ３、およびｄｇｔ−３３  ｖ３を設計した。これらの遺伝子のコドン最適化バージョンは、それぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１４４として列挙されている。
【０２２８】
細菌の最適化。大腸菌（Escherichia coli）細胞における発現のために最適化される配列番号１のＤＧＴ−２８タンパク質をコードする新しいＤＮＡ配列を設計した。大腸菌（E. coli）用に最適化されたＤＮＡ配列の設計は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの独自のコドン最適化プロトコールを用いて、配列番号１のタンパク質配列の逆翻訳によって開始された。初期配列は、制限酵素認識部位を除去または付加し、高度に安定した鎖内二次構造、および操作された遺伝子のクローニング操作または発現に有害であり得る他の配列を除去するために、コドン変化（全体の加重平均表現を保持しながら）を相殺することによって改変された。コドン領域内で避けるべきこのような有害配列の例としては、例えば２つの連続したアルギニンアミノ酸をコードし得るが、遺伝子内（したがって望ましくない）の翻訳開始シグナルとしても機能する場合がある、ＡＧＧＡＧＧなどの１６ＳリボソームＲＮＡ結合配列（「シャイン・ダルガノ配列」）が挙げられる。配列番号１のタンパク質をコードする大腸菌（E. coli）バイアスｄｇｔ−２８  ＤＮＡ配列（ｄｇｔ−２８  ｖ１）を配列番号４として示す。
【０２２９】
クローニングを促進し、効率的な翻訳開始を確実にするために、５’末端ＮｄｅＩ制限酵素認識配列をＡＴＧ翻訳開始コドンの上流に配置させた。また、クローニングを促進し、適切な翻訳終了を確実にするために、２つのＴＡＡ翻訳終止コドンをコードする塩基とＸｈｏＩ制限酵素認識部位をコード領域の３’末端に含めた。配列番号４を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者であるＧｅｎｅＡｒｔ（商標）によって行われた。
【０２３０】
同様の大腸菌（E. coli）コドン最適化戦略を用いて、ｄｇｔ−１  ｖ５、ｄｇｔ−１  ｖ６（Ｇ１１２Ａ）、ｄｇｔ−１  ｖ７（Ｇ１１２Ａ；Ｐ１１７Ｓ）、ｄｇｔ−１  ｖ８（Ｔ１１３Ｉ；Ｐ１１７Ｓ）、ｄｇｔ−３  ｖ６（Ｇ１０５Ａ）、ｄｇｔ−３  ｖ７（Ｇ１０５Ａ；Ｐ１１２Ｓ）、ｄｇｔ−３  ｖ８（Ｔ１０６Ｉ；Ｐ１１２Ｓ）、ｄｇｔ−７  ｖ５、ｄｇｔ−７  ｖ６（Ｇ１１３Ａ）、ｄｇｔ−７  ｖ７（Ｇ１１３Ａ；Ｐ１１７Ｓ）、ｄｇｔ−７  ｖ８（Ｔ１１４Ｉ；Ｐ１１７Ｓ）、ｄｇｔ−３２  ｖ５、およびｄｇｔ−３３  ｖ５を設計した。ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７配列バージョンは、葉緑体標的配列の除去によって改変された。これらの遺伝子の大腸菌（E. coli）コドン最適化バージョンは、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４として列挙される。
【実施例３】
【０２３１】
グリホサート耐性遺伝子の細菌発現用ベクター
大腸菌（E. coli）発現用のｐＥＴ発現ベクター、ｄｇｔ−２８の構築。インビトロ試験のために、ｄｇｔ−２８  ｖ１の大腸菌（E. coli）用に最適化された遺伝子配列（配列番号４）は、合成とクローニングのためにＧｅｎｅＡｒｔ（商標）によって合成され、クローニングされた。合成されたｄｇｔ−２８  ｖ１遺伝子配列は、追加されたＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＴ２８発現ベクターにクローニングされた。得られた構築物は、Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグを導入し、ｐＤＡＢ１００４４５と名付けられた。図１４。
【０２３２】
ｄｇｔ−２８  ｖ１の部位特異的突然変異誘発。部位特異的突然変異誘発をｄｇｔ−２８  ｖ１について行い、グリホサートに対する耐性の提供における、８４位のアラニンの役割を評価した。この天然のアラニンはグリシンに突然変異させ、この変更が、グリホサートに対する酵素の耐性またはＰＥＰに対する親和性を低下させるかどうかを決定した。このアミノ酸残基は、前述のように、大腸菌（E. coli）ＥＰＳＰシンターゼに導入されたＧ９６Ａ突然変異に対応するため選択された。
【０２３３】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）からのＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＩＩ（商標）キットを用いて、突然変異誘発を行った。ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡとしてｐＤＡＢ１００４４５（ｄｇｔ−２８  ｖ１）を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）プロトコールに従って設定された。突然変異したｄｇｔ−２８  ｖ２遺伝子配列を含む構築物は、ｐＤＡＢ１０２９４６（図１５）と命名され、ＤＮＡ配列決定を介して確認された。以下のプライマー：
ＤＧＴ２８  ＭｕｔＦ（配列番号２５；5' gATgTTTATTgCCgTgATggTggAACCACCgCACgTTTTC）
ＤＧＴ２８  ＭｕｔＲ（配列番号２６；5' gAAAACgTgCggTggTTCCACCATCACggCAATAAACATC）
を設計し、アミノ酸スイッチを作製した。
【０２３４】
突然変異誘発の第２ラウンドは、グリホサートに対する耐性をさらに低下させる試みにおいて、ｄｇｔ−２８  ｖ２について行われた。第２の突然変異であるＴ１７２Ａは、すでに突然変異誘発されたｄｇｔ−２８  ｖ２に導入された。この位置でのＥＰＳＰシンターゼのアラニンとトレオニンの相互突然変異は、従前、Haghani et al., (2008)において記載され、そこでは、グリホサートに対する非感受性をもたらした。最終的な結果は、二重Ａ８４Ｇ、Ｔ１７２Ａ突然変異体の生成であり、ｄｇｔ−２８  ｖ３と命名された。ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡとしてｐＤＡＢ１０２９４６（ｄｇｔ−２８  ｖ２）を用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）プロトコールに従って設定された。突然変異したｄｇｔ−２８  ｖ３遺伝子配列を含む構築物は、ｐＤＡＢ１００４６９（図１６）と命名された。以下のプライマー：
ＤＧＴ２８  Ｍｕｔ２Ｆ（配列番号２７；5' gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg）
ＤＧＴ２８  Ｍｕｔ２Ｒ（配列番号２８；5' CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAgCAgC）
を用いて、Ｔ１７２Ａ突然変異を生じさせた。
【０２３５】
大腸菌（E. coli）発現用の追加の構築物、ｐＥＴ発現ベクター。インビトロ試験について、ｄｇｔ−１  ｖ５、ｄｇｔ−１  ｖ６、ｄｇｔ−１  ｖ７、ｄｇｔ−１  ｖ８、ｄｇｔ−３  ｖ６、ｄｇｔ−３  ｖ７、ｄｇｔ−３  ｖ８、ｄｇｔ−７  ｖ５、ｄｇｔ−７  ｖ６、ｄｇｔ−７  ｖ７、ｄｇｔ−７  ｖ８、ｄｇｔ−３２  ｖ５、およびｄｇｔ−３３  ｖ５遺伝子配列を合成し、クローニングした（ＧｅｎｅＡｒｔ（商標））。合成された遺伝子をｐＥＴ２８発現ベクターにクローニングした。得られた構築物は、ｄｇｔ−１  ｖ５を含むｐＤＡＢ１０２０２８（図１７）、ｄｇｔ−１  ｖ６を含むｐＤＡＢ１０２０２９（図１８）、ｄｇｔ−１  ｖ７を含むｐＤＡＢ１０２０３２（図１９）、ｄｇｔ−１  ｖ８を含むｐＤＡＢ１０２０３４（図２０）、ｄｇｔ−３  ｖ６を含むｐＤＡＢ１００４２９（図２１）、ｄｇｔ−３  ｖ７を含むｐＤＡＢ１００４４２（図２２）、ｄｇｔ−３  ｖ８を含むｐＤＡＢ１００４３０（図２３）、ｄｇｔ−７  ｖ５を含むｐＤＡＢ１０２０３６（図２４）、ｄｇｔ−７  ｖ６を含むｐＤＡＢ１０２０３８（図２５）、ｄｇｔ−７  ｖ７を含むｐＤＡＢ１０２０４０（図２６）、およびｄｇｔ−７  ｖ８を含むｐＤＡＢ１０２０４２（図２７）と名付けられた。
【０２３６】
ＤＧＴ−３２およびＤＧＴ−３３のクローニング。インビトロ試験について、以下の植物に最適化された遺伝子；ｄｇｔ−３２  ｖ３、およびｄｇｔ−３３  ｖ３は、それぞれ、バイナリーベクターｐＤＡＢ１０７５３２（図１１）とｐＤＡＢ１０７５３４（図１２）の外で増幅された。以下のプライマーセット：
ｐＭＡＬＤＧＴ３２Ｆ（配列番号２９；CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG）および
ｐＭＡＬＤＧＴ３２Ｒ（配列番号３０；GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG）（ｄｇｔ−３２）、
ならびにｐＭＡＬＤＧＴ３３Ｆ（配列番号３１；CATATGGGTGCAGTTACCGTTATTGA）、
ｐＭＡＬＤＧＴ３３Ｒ（配列番号３２；GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC）（ｄｇｔ−３３）
を使用した。
【０２３７】
次に、増幅された配列は、それぞれの遺伝子がｍａｌＥコード配列とのインフレーム融合物であるように、ｐＭＡＬ−ｃ５Ｘにサブクローニングされた。最終的な発現構築物は、ｄｇｔ−３２  ｖ３を含むｐＤＡＢ１０７７１３（図２９）とｄｇｔ−３３  ｖ３を含むｐＤＡＢ１０７７１４（図３０）であった。
【実施例４】
【０２３８】
インビトロ生化学酵素動力学アッセイ
組換えＤＧＴ酵素の過剰発現および精製。組換えＤＧＴタンパク質は、上記の構築物からＲｏｓｅｔｔａ２（商標）（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）において過剰発現された。単一コロニーを用いて、一晩３７℃にて培養されたクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢの５０ｍＬスターター培養物を接種した。一晩培養物を用いて、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢの１Ｌを接種した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．６まで培養物を３７℃にて増殖させ、次に、氷水浴に１０分間置いた。標的タンパク質の発現は、５００μＭの最終濃度までＩＰＴＧの添加によって達成された。
【０２３９】
誘導は、一晩２０℃にて進行させ、８，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットは、精製に必要とされるまで、−８０℃にて保存された。すべての精製工程を４℃にて行った。１Ｌの培養物からの細胞ペレットを２０〜３０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）に再懸濁した。次に、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５０ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）およびリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、懸濁液を２０分間撹拌した。Ｂｒａｎｓｏｎ（商標）Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（商標）２５０（３×６０秒バースト）を用いて細胞溶解を行い、続いて、１６，０００ｒｐｍで４５分間の遠心分離によって細胞破片を除去した。
【０２４０】
ＤＧＴ酵素は、５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ粗製カラムを用いて、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介して、一工程で均質になるまで精製された。カラムを緩衝液Ａで平衡化し、試料を同じ緩衝液中に充填した。次に、カラムは、１０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、続いて、直線勾配で２５カラム体積以上の０〜１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって判断されるように、標的タンパク質を含む画分は、１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ超遠心分離デバイスを用いて、２．５ｍＬに濃縮された。精製されたＤＧＴ酵素は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および５％グリセロール中に緩衝液交換され、その後、約１ｍＬに濃縮された。試料は、典型的には、１：５０に希釈され、ＵＶ−可視スペクトルは、Ｃａｒｙ５０（商標）Ｂｉｏ  ＵＶ−可視分光光度計で２４０〜７００ｎｍについて記録された。次に、理論上の吸光係数を用いて、２８０ｎｍ（ＥｘＰＡＳｙ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の吸光度に基づいてタンパク質濃度を計算した。
【０２４１】
組換えＤＧＴ−３２およびＤＧＴ−３３融合物の発現および精製。ＤＧＴ−３２およびＤＧＴ−３３酵素は、酵素のアミノ末端に位置したマルトース融合タグを含むように構築された。ｐＤＡＢ１０７７１２（図２８）、ｐＤＡＢ１０７７１３、およびｐＤＡＢ１０７７１４で形質転換された大腸菌（Escherichia coli）細胞を単離し、確認した。それぞれの細菌株の単一コロニーを用いて、１００μｇ／μＬカルベニシリンおよび２５μｇ／μＬクロラムフェニコールを含む５０ｍＬのＬＢ培地を接種した。スターター培養物を一晩３７℃にて増殖させ、その後、これを用いて、０．２％グルコース、１００μｇ／μＬカルベニシリン、および２５μｇ／μＬクロラムフェニコールが補足された６００ｍＬのＬＢ培地を接種した。ＯＤ６００＝０．４まで培養物を３７℃にて増殖させ、その時点で、最終濃度が５０μＭ  ＩＰＴＧとなるようにＩＰＴＧを添加した。培養物を１５時間１８℃で誘導した。翌日、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離によって培養物を回収し、細胞をペレットにした。細胞ペーストは、精製に必要とされるまで、−８０℃にて保存された。
【０２４２】
冷凍ペレットは、２０〜３０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％グリセロール、および１ｍＭ  ＤＴＴ）と１錠のプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）中に再懸濁された。ペレットが完全に可溶化したら、１ｍｇ／ｍＬリゾチームを添加し、試料を４℃にて１５〜２０分間混合した。リゾチームとともにインキュベーション後、試料を５０ｍＬの遠心管に移し、氷上に置いた。次に、試料を分間隔で超音波処理し、続いて、４分間冷却した。この工程は、全３回の超音波処理サイクルでさらに２回繰り返された。細胞破片は、１６，５００ｒｐｍで４５分間の遠心分離によって除去され、上清は、５０ｍＬの注入ループに充填された。粗製溶解物は、アミロースカラムに適用され、緩衝液Ａを用いた７カラム体積で洗浄され、１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａおよび１０ｍＭマルトース）で溶出された。標的タンパク質をプールし、３０ｋＤａのＭＷＣＯセントリコンを用いて２．５ｍＬに濃縮した。精製されたタンパク質は、ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを使用して、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、および５％グリセロールに緩衝液交換された。タンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定された。純粋なタンパク質を液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。
【０２４３】
植物および細菌ＤＧＴ酵素のインビトロ動力学特徴付け。野生型（ＷＴ）および突然変異体ＤＧＴの酵素活性は、Lanzetta et al. (1979) Anal. Bioch. 100:95-7によって記載されている修飾された手法における無機リン酸塩（Ｐｉ）生成によって測定された。アッセイは、Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｍａｘ  １９０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上の全５０μＬの９６ウェルプレートフォーマットにおいて行われた。典型的なアッセイは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および１ｍＭ  Ｓ３Ｐを含んだ。ＰＥＰおよびグリホサート濃度は指示されるように変化させた。グリホサートは、遊離酸としてＳｉｇｍａから得られ、ｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁された。グリホサートは、混合物のｐＨが中性になるまで、ＫＯＨの添加によって可溶化された。アッセイは、０．０１〜１μＭの間で変化させた濃度でＤＧＴ酵素の添加によって開始した。マラカイトグリーン：モリブデン酸アンモニウム溶液の３：１混合物の２３５μＬの添加によって、反応を停止させた。完全な発色（約１分）後、６６０ｎｍにおける吸光度の変化を記録し、形成されたＰｉの量を標準曲線から計算した。酵素を欠いている対照反応は、バックグラウンド吸光度を補正するために使用された。高濃度のＰＥＰ（＞２ｍＭ）およびグリホサート（＞３０ｍＭ）は、この検出方法を用いて、多量のバックグラウンド吸光度に寄与する。データは、ＫｍとＶｍａｘの決定（式３）を可能にするＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式に適合され、一方、ＩＣ５０は式４から決定された。ここで、ｙは、相対活性であり、ｓはヒル係数である。データはＧｒａＦｉｔ（商標）バージョン５ソフトウェア（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｈｏｒｌｅｙ、Ｕ．Ｋ．）を用いて分析された。
【０２４４】
【数１】
0006537825.tif 000003
【０２４５】
【数２】
0006537825.tif 000004
【０２４６】
競合阻害剤のＩＣ５０値は基質の濃度に依存して変化し、したがって、表２のＩＣ５０値は、１ｍＭのＰＥＰと６０μＭのＰＥＰ（植物の細胞内ＰＥＰ濃度の推定値）で得られた。同濃度のＰＥＰで測定したＩＣ５０値のみを比較する必要がある（ＤＧＴ−３２およびＤＧＴ−３３のＫｍ決定値は１００μＭのＰＥＰで測定された）。さらに、非常に寛容な酵素のＩＣ５０値は、Ｌａｎｚｅｔｔａの方法によって正確に決定することができず、したがって、相対的活性に基づいて推定された。
【０２４７】
植物ＤＧＴの動力学。突然変異していない天然配列を有する２つの酵素のＤＧＴ−１  ｖ５とＤＧＴ−７  ｖ５は、グリホサート感受性について基準パラメータを確立するために最初に試験された。両タンパク質は、ＰＥＰに対して低いＫｍ値を示し（約７０μＭ）、グリホサートに感受性であり、ＩＣ５０値は、１ｍＭのＰＥＰで約２０μＭ（表２）であった。ＤＧＴ−１  ｖ６、ＤＧＴ−３  ｖ６、およびＤＧＴ−７  ｖ６について観察されるように、ＧからＡの単一点突然変異は、グリホサートに対する耐性を有意に改善したが（８〜２１ｍＭのＩＣ５０値）、さらに、ＰＥＰに対するＫｍを約８倍増大させた。すべての植物由来のＤＧＴ（ＤＧＴ−１  ｖ７、ＤＧＴ−３  ｖ７、およびＤＧＴ−７  ｖ７）についての二重突然変異（ＧＡＰＳ）はまた、グリホサート耐性を高めたが、再度、結果としてＰＥＰ  Ｋｍをかなり上昇させた。表２。ＴＩＰＳ突然変異体（ＤＧＴ−１  ｖ８、ＤＧＴ−３  ｖ８、およびＤＧＴ−７  ｖ８）は、適度な濃度のグリホサート（３〜６ｍＭ）に耐性であるが、ＧＡおよびＧＡＰＳ突然変異体とは対照的に、Ｋｍレベルは、６０〜２００μＭ間の野生型タンパク質に近いままであった。図３１は、特定された突然変異の導入の際に、ＤＧＴ−１（Ａ）およびＤＧＴ−７（Ｂ）についてグリホサート耐性のシフトを示す。ＰＥＰ濃度は、図３１に示されるデータをもたらす実験について１ｍＭに保持した。これは、ＤＧＴ−７  ｖ８に対してＩＣ５０（＞８０ｍＭ）の上昇へと導き得た。さらなる手法は、より低いレベルのＰＥＰが、グリホサートに対する相対的な耐性を改変するかどうかを決定するために行われた。ＰＥＰの生理学的に関連したレベルは、５〜６０μＭの範囲である。６０μＭのＰＥＰを用いると、ＩＣ５０値は有意に減少した（３．６ｍＭ）。これは、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ反応速度論から期待され、表２に記載されているように、最初の決定は過剰なＰＥＰによって影響されたことを示唆した。
【０２４８】
図３１は、１ｍＭのＰＥＰを用いて、ＤＧＴ−１（Ａ）およびＤＧＴ−７（Ｂ）内の様々な突然変異の導入後に得られたＩＣ５０値を示す。ＡとＢのＩＣ５０曲線の両方について、黒三角は野生型を表し、黒丸はＧＡ突然変異体を表し、白四角はＧＡＰＳ突然変異体を表し、黒四角はＴＩＰＳ突然変異体を表す。
【０２４９】
【表２】
0006537825.tif 000005
【０２５０】
細菌ＤＧＴの動力学。細菌酵素のうち、ＤＧＴ−２８  ｖ１は最も有利な全体的な動力学パラメータ（高いＩＣ５０とｋｃａｔ／Ｋｍ値）を有する。酵素は、＞８０ｍＭの濃度でグリホサートに対して耐性であり、１．３２×１０５Ｍ−１ｓ−１の触媒効率を示した。ＤＧＴ−２８  ｖ２におけるＡ→Ｇ突然変異は、ＩＣ５０を２．１７ｍＭに（６０μＭのＰＥＰで）低下させ、ＰＥＰ（１６１μＭ）のＫｍを僅かに上昇させた。この突然変異体酵素は、ＤＧＴ−２８  ｖ１で見られる高い触媒効率を保持している。低下させたＩＣ５０を用いたときでさえ、この突然変異した酵素は、特定の用途におけるｉｎ  ｐｌａｎｔａにおいてグリホサートに対する耐性を提供するのに適している。データは、この新しいクラスのＥＰＳＰシンターゼにおいて、アラニンはグリホサートに対する耐性のための唯一の決定要因ではないことを示唆している。他の可能性のある決定要因を探索するために、追加の変異体であるＤＧＴ−２８  ｖ３（Ａ８４Ｇ  Ｔ１７２Ａの二重突然変異体）を構築した。この酵素は、グリホサートに対して低下した耐性を示し、ＩＣ５０値は５．１５ｍＭ（６０μＭのＰＥＰで）であった。ＤＧＴ−２８  ｖ３に対するＩＣ５０の減少は、触媒効率の２００倍の減少を伴い、これは、第２の突然変異が意図していない効果をもたらしたことを示唆した（表２）。より高い同一性のＤＧＴ−２８  ｖ１ホモログ（約７５％のアミノ酸同一性）であるＤＧＴ−３２とＤＧＴ−３３は、ＰＥＰに対して低いＫｍ（約１１４〜１３９μＭ）を有したが、しかしながら、触媒効率は、ＤＧＴ−２８  ｖ１より１００倍低かった。触媒効率のこの低下は、おそらく、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合に由来する。また、酵素は、５０ｍＭより大きいＩＣ５０値を示すグリホサートに対して非感受性である。様々なＤＧＴ酵素がグリホサートに対する耐性を提供することを示したこれらのインビトロのアッセイの結果として、ＤＧＴ酵素をｉｎ  ｐｌａｎｔａにおいて試験した。
【実施例５】
【０２５１】
植物形質転換ベクターのクローニング
植物バイナリーベクター構築。標準的なクローニング法は、インフレーム融合としてｄｇｔ−２８に連結した葉緑体輸送ペプチドポリヌクレオチド配列を含有するエントリーベクターの構築に使用された。ｄｇｔ−２８に融合した輸送ペプチド（ＴｒａＰ）を含むエントリーベクターは、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて組み立てられた。融合の結果として、第１のアミノ酸であるメチオニンをｄｇｔ−２８から除いた。輸送ペプチドＴｒａＰ４  ｖ２（配列番号３３）、ＴｒａＰ５  ｖ２（配列番号３４）、ＴｒａＰ８  ｖ２（配列番号３５）、ＴｒａＰ９  ｖ２（配列番号３６）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（配列番号３７）、およびＴｒａＰ１３  ｖ２（配列番号３８）は、それぞれ、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成され、最大で固有のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むｄｇｔ−２８の５’端の断片に融合させた。
【０２５２】
様々なＴｒａＰおよびｄｇｔ−２８発現カセットを含んだバイナリープラスミドをシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０  ｖ２；Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）によって駆動させ、隣接してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの２３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１；米国特許第５，４２８，１４７号）を並べた。
【０２５３】
組み立てられたＴｒａＰおよびｄｇｔ−２８発現カセットは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて遺伝子操作され、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換を介して植物に形質転換させた。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションのために使用した。選択マーカーカセットキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ  ｖ２；Verdaguer et al, (1996) Plant Mol. Biol, 31: 1129-1139）−ＤＳＭ−２（米国特許出願第２００７／０８６８１３号）−アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの１つの３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦｌ  ３’ＵＴＲ  ｖ６；Huang et al, (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-1822）を含む単一のデスティネーションベクターに１つのエントリーベクターを組み込むことによって、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ  ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ反応を行った。プラスミド調製は、供給業者の指示に従って、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。ＤＮＡ断片は、アガロース、Ｔｒｉｓ−アセテートゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離された。
【０２５４】
すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、ミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングされた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、市販のシークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（商標）ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって配列決定された。配列データを組み立て、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて分析した。
【０２５５】
以下のバイナリー構築物は、様々なＴｒａＰ：ｄｇｔ−２８融合遺伝子配列を発現する：ｐＤＡＢ１０７５２７（図３）はＴｒａＰ４  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号７９）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３０（図４）はＴｒａＰ５  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号８０）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３１（図５）はＴｒａＰ８  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号８１）を含む；ＰＤＡＢ１０５５３２（図６）はＴｒａＰ９  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号８２）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３３（図７）はＴｒａＰ１２  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号８３）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３４（図８）はＴｒａＰ１３  ｖ２：ｄｇｔ−２８  ｖ５（配列番号８４）を含む。ｐＤＡＢ１０５５３４のｄｇｔ−２８  ｖ５配列は修飾され、第１のコドン（ＧＣＡ）を（ＧＣＴ）に変更した。
【０２５６】
追加の植物バイナリーベクター構築。上述したものと類似したクローニング戦略を用いて、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、ｄｇｔ−３３、ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７を含むバイナリープラスミドを構築した。
【０２５７】
微生物由来の遺伝子；ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３は、先に記載したものとは異なる葉緑体輸送ペプチドと融合させた。以下の葉緑体輸送ペプチドを使用した；ＴｒａＰ１４  ｖ２（配列番号３９）、ＴｒａＰ２３  ｖ２（配列番号４０）、ＴｒａＰ２４  ｖ２（配列番号４１）。ｐＤＡＢ１０７５３２（図１１）は、ＴｒａＰ１４  ｖ２に融合させたｄｇｔ−３２  ｖ３（配列番号４２）を含み、ｐＤＡＢ１０７５３４（図１２）は、ＴｒａＰ２４  ｖ２と融合させたｄｇｔ−３３  ｖ３（配列番号４３）を含み、ｐＤＡＢ１０１７５３３（図５４）は、ＴｒａＰ２３  ｖ２に融合させたｄｇｔ−３１  ｖ３（配列番号１４３）を含む。ｄｇｔ発現カセットは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２）によって駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの２３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１）を並べた。キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ  ｖ２）−ＤＳＭ−２−アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの１つの３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１  ３’ＵＴＲ  ｖ６）を含むＤＳＭ−２選択マーカーカセットもバイナリーベクターに存在した。
【０２５８】
ｄｇｔ−３１  ｖ３、ｄｇｔ−３２  ｖ３、およびｄｇｔ−３３  ｖ３が先に記載された葉緑体輸送ペプチド配列に融合している追加のバイナリーを構築する。例えば、ＴｒａＰ８  ｖ２配列は、ｄｇｔ−３１  ｖ３、ｄｇｔ−３２  ｖ３、およびｄｇｔ−３３  ｖ３に融合され、上記したバイナリーベクターにクローニングされる。
【０２５９】
クラスＩ遺伝子（ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７）を含むバイナリーベクターを構築した。以下のバイナリーベクターを構築し、植物に形質転換した：米国特許出願公開第２０１１／０１２４５０３号に記載されているｄｇｔ−１  ｖ４配列を含むｐＤＡＢ４１０４（図９）を米国特許出願公開第２００９／００６４３７６号に記載されているニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）オスモチン配列；ｐＤＡＢ１０２７１５（図１０）；ｐＤＡＢ１０２７１６（図４５）；ｐＤＡＢ１０２７１７（図４６）；およびｐＤＡＢ１０２７８５（図１３）と並べる。ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３に融合させた様々なＴｒａＰ葉緑体輸送ペプチドは、これらの植物由来の配列は天然の植物葉緑体輸送ペプチドを有するため、クラスＩ遺伝子に追加されなかった。これらのベクターは、表３においてさらに詳細に記載されている。
【０２６０】
【表３】
0006537825.tif 000006
【実施例６】
【０２６１】
アラビドプシス属（Arabidopsis）への形質転換と選択
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換。アラビドプシス属（Arabidopsis）は、CloughおよびBent（1998）のフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記のバイナリープラスミドの１つを含む選択されたアグロバクテリウムコロニーを使用して、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＹＥＰブロスの１つまたは複数の１００ｍＬの前培養物を植菌した。培養物を２２５ｒｐｍで一定に撹拌しながら一晩２８℃にてインキュベートした。細胞を１０分間、室温にて約５０００×ｇでペレットにし、得られた上清を捨てた。５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０μｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン、および０．０４％Ｓｉｌｗｅｔ（商標）Ｌ−７７を含有する４００ｍＬの液体培地において穏やかに再懸濁させた。約１カ月齢の植物は、穏やかに撹拌しながら５〜１０分間、培地中に浸漬させた。植物は、それらの側面を下に置き、２〜３時間、透明または不透明なプラスチックバッグで覆い、その後、直立に配置された。植物は、２２℃にて１６時間の明／８時間の暗の光周期で成長させた。浸漬から約４週間後、種子を回収した。
【０２６２】
形質転換植物の選択。新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔとＤＳＭ−２発現カセットを含む］を７日間室温にて乾燥させた。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイに播種され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存された、層状にしたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
【０２６３】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４０ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５日間、湿気ドームで覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換されたＤＳＭ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体選択の１日前に外された。
【０２６４】
植え付け後（ＤＡＰ）７日とさらに１１ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−ｌｆ段階）は、適用あたり２８０ｇ  ａｉ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ  ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．２％溶液で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜７日後に特定され、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０）を用いて調製された３インチ（７．６２センチメートル）のポットに個別に移植された。移植された植物は、３〜４日間、湿気ドームで覆われ、前述のように２２℃の成長チャンバー内に置かれ、または温室に直接移された。その後、ドームを外し、植物を温室（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、１４時間の明：１０時間の暗、最小５００μΕ／ｍ２ｓ１自然＋補助照明）で育てた。分子確認分析は、生存Ｔ１植物について完了し、グリホサート耐性遺伝子が植物のゲノムに安定に組み込まれたことを確認した。
【０２６５】
分子確認。ｐＤＡＢ１０７５２７、ｐＤＡＢ１０５５３０、ｐＤＡＢ１０５５３１、ｐＤＡＢ１０５５３２、ｐＤＡＢ１０５５３３、またはｐＤＡＢ１０５５３４で形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）植物のゲノム内でｄｇｔ−２８およびＤＳＭ−２導入遺伝子の存在が確認された。これらのポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセイ、遺伝子発現カセットＰＣＲ（植物転写単位ＰＣＲ−−ＰＴＵ  ＰＣＲとも記載される）、サザンブロット分析、および定量的逆転写ＰＣＲ分析によって確認された。
【０２６６】
Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、最初に、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされ、ＤＳＭ−２およびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認した。事象は、遺伝子発現カセットＰＣＲによりスクリーニングされ、ｄｇｔ発現カセットが、再配列することなく、植物ゲノムに完全に組み込まれたかどうかを決定した。これらの研究から得られたデータを用いて、自家受精およびＴ２世代への進行に関して、導入遺伝子のコピー数を決定し、選択アラビドプシス属（Arabidopsis）事象を同定した。また、進行したＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物を加水分解プローブアッセイによりスクリーニングし、植物染色体内にＤＳＭ−２遺伝子とｄｇｔ遺伝子の存在を確認し、そのコピー数を推定した。最後に、サザンブロットアッセイを用いて、Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のサブセット上の推定コピー数を確認した。
【０２６７】
同様のアッセイを用いて、ｐＤＡＢ４１０１で形質転換された植物由来のｄｇｔ−１導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３２で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３２導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３４で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０２７１５で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０２７１６で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０２７１７で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、およびｐＤＡＢ１０２７８５で形質転換された植物由来のｄｇｔ−７導入遺伝子の存在を確認した。
【０２６８】
加水分解プローブアッセイ。後述する加水分解プローブアッセイを用いて、Ｔ１とＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物におけるコピー数を決定した。様々な数の導入遺伝子を有する植物を同定し、その後のグリホサート耐性研究に進めた。
【０２６９】
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｌ  ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ  Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）。組織浸軟後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ（商標）９６植物キット（Ｑｉａｇｅｎ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式でゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整された。加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＤＳＭ−２、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子、ＴＡＦＩＩ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＣ００３０７５；Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61）について設計された。
【０２７０】
増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ＤＳＭ−２とｄｇｔ−２８用のそれぞれ０．１μＭのプライマー、ＴＡＦＩＩ１５についてそれぞれ０．４μＭのプライマーおよび０．２μＭのそれぞれのプローブを含有する１０μＬ体積の多重反応物において１×最終濃度で調製された。表４。二段階増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行い、蛍光を得た。すべての試料を実施し、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行い、ΔΔＣｔ法に基づいている。このために、１コピーの較正物質由来のゲノムＤＮＡの試料と既知の２コピーチェックをそれぞれの実行に含めた。加水分解プローブスクリーニングのコピー数の結果は、Ｔ１およびＴ２トランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について決定された。
【０２７１】
【表４】
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【０２７２】
サザンブロット分析を介したｄｓｔ−２８組み込み確認。サザンブロット分析を用いて、挿入されたＴ−鎖ＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、ｄｇｔ−２８を含有する事象を同定した。データを作成し、アラビドプシス属（Arabidopsis）ゲノム内の導入遺伝子挿入物の組み込みと完全性を実証した。サザンブロットデータは、Ｔ−鎖ＤＮＡの無傷のコピーの単純な組み込みを同定するために使用された。詳細なサザンブロット分析は、ｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットに特異的なＰＣＲ増幅されたプローブを用いて行われた。特定の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、特定の分子量のゲノムＤＮＡ断片を同定した。そのパターンを用いて、次世代への進行のための完全長の単一挿入物Ｔ１トランスジェニック事象を同定した。
【０２７３】
組織試料を２ｍＬのコニカルチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標））に回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された。組織浸軟後、ＣＴＡＢ単離手法を用いてゲノムＤＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐｓキットを用いて、ゲノムＤＮＡをさらに精製した。ゲノムＤＮＡをＱｕａｎｔ−ＩＴ（商標）Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、一定濃度にするために４μｇに調整された。
【０２７４】
それぞれの試料について、制限酵素ＳｗａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）を用いて、４μｇのゲノムＤＮＡを完全に消化し、２５℃で一晩インキュベートし、次に、反応にＮｓｉＩを添加し、３７℃にて６時間インキュベートした。消化されたＤＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて沈殿させて濃縮された。その後、６５℃にて１時間、２５μＬの水にゲノムＤＮＡを再懸濁した。再懸濁した試料は、１×ＴＡＥ中で調製された０．８％アガロースゲルに装填され、１×ＴＡＥ緩衝液中で１．１Ｖ／ｃｍで一晩電気泳動された。連続的に、ゲルは、３０分間の変性（０．２ＭのＮａＯＨ／０．６ＭのＮａＣｌ）、および３０分間の中和（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１．５ＭのＮａＣｌ）に供された。
【０２７５】
ナイロンメンブレンへのＤＮＡ断片の転写は、クロマトグラフィーペーパーの芯や紙タオルを使用することによって、処理されたＩＭＭＯＢＩＬＯＮ（商標）ＮＹ＋転写メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上にゲルを介して一晩２０×ＳＳＣ溶液を受動的に吸い上げることによって行われた。転写後、メンブレンは、簡単に、２×ＳＳＣで洗浄し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて架橋し、８０℃にて３時間、真空乾燥させた。
【０２７６】
モデル４００ハイブリダイゼーションインキュベータ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｙｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ガラスローラーボトル中で１時間６５℃にてプレハイブリダイゼーション溶液（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｈｙｂ  ｐｌｕｓ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともにブロットをインキュベートした。プローブは、全コード配列を含むＰＣＲ断片から調製された。ＰＣＲアンプリコンは、ＱＩＡＥＸ（商標）ＩＩゲル抽出キットを用いて精製され、Ｒａｎｄｏｍ  ＲＴ  Ｐｒｉｍｅ  ＩＴ（商標）標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を介して、α３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識された。ブロットは、ブロットあたり約２００万カウント／ｍＬまでハイブリダイゼーション緩衝液に直接添加された変性プローブを用いて、一晩６５℃にてハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、ブロットは、連続して、６５℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄された。最後に、ブロットをストレージリン光イメージングスクリーンに曝露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ  ８６０（商標）イメージングシステムを用いて撮像した。
【０２７７】
この研究において完成されたサザンブロット分析を用いて、コピー数を決定し、その選択された事象がアラビドプシス属（Arabidopsis）のゲノム内のｄｇｔ−２８導入遺伝子を含有していることを確認した。
【０２７８】
ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットの確認。Ｔ１の植物事象に含まれるｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットの存在は、エンドポイントＰＣＲ反応によって検出された。ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２とｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットのＡｔｕＯＲＦ２３  ３’ＵＴＲ  ｖ１領域に特異的なプライマー（表５）を検出のために使用した。
【０２７９】
【表５】
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【０２８０】
ＰＣＲ反応は、遺伝子発現カセットを増幅するために、標準的な三段階のＰＣＲサイクリングプロトコールを必要とした。すべてのＰＣＲ反応は、以下のＰＣＲ条件を使用して完了された：９４℃にて３分間、続いて、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、および７２℃にて３分間の３５サイクル。製造者の指示に従って、ＥＸ−ＴＡＱ（商標）ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、反応を完了させた。最終サイクル後、反応を７２℃にて１０分間インキュベートした。ＴＡＥアガロースゲル電気泳動を用いて、ＰＣＲアンプリコンのサイズを決定した。予想されるサイズのＰＣＲアンプリコンは、全長遺伝子発現カセットの存在がトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象のゲノム中に存在することを示した。
【０２８１】
定量的逆転写ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−２８相対転写の確認。ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物の組織試料を９６ウェルプレートに回収し、８０℃にて凍結した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズ（Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｅｔａｌ  ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ  Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて行った。組織浸軟の後、全ＲＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、カラム上のオプションのＤｎａｓｅＩ処置を含めたＱｉａｇｅｎ（商標）Ｒｎｅａｓｙ  ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いたハイスループット形式で単離された。その後、このステップは、溶出された全ＲＮＡの追加のＤｎａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）処理に続いた。ｃＤＮＡ合成は、製造業者が示唆した手法に従って、オリゴヌクレオチド、ＴＶＮを加えて、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、鋳型として全ＲＮＡを使用して行われた。発現の定量は、加水分解プローブアッセイによって完了し、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより行われた。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブデザインソフトウェア２．０を用いて、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子「未知タンパク質」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＴ４Ｇ２４６１０）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、０．４μＭのそれぞれのプライマー、および０．２μＭのそれぞれのプローブを含む１０μＬ体積の一重反応中で１×最終濃度で調製された。表６。
【０２８２】
【表６】
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【０２８３】
二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべての試料は３重にして行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。マイナス逆転写反応をそれぞれの試料について行い、ｇＤＮＡ汚染がないことを確認した。リアルタイムＰＣＲデータの分析はΔΔＣｔ法に基づいて行った。このアッセイを用いて、ヘミ接合性およびホモ接合性であることが決定されたトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象におけるｄｇｔ−２８の相対的発現を決定した。ｄｇｔ−２８  ｍＲＮＡの相対的転写レベルは、内部対照より２．５倍から２０７．５倍高い範囲であった。これらのデータは、ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物が、機能的ｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットを含有し、植物がｄｇｔ−２８導入遺伝子を転写することができたことを示している。
【０２８４】
ウエスタンブロッティング分析。ＤＧＴ−２８は、トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物から得られる葉の試料において検出された。ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物由来の植物抽出物とＤＧＴ−２８タンパク質標準は、ＤＴＴを含有するＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに、９０℃にて１０分間インキュベートされ、アクリルアミドプレキャストゲルにおいて電気泳動的に分離された。次に、タンパク質は、製造者のプロトコールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写された。ＷＥＳＴＥＲＮＢＲＥＥＺＥ（登録商標）ブロッキングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロッキング後、ＤＧＴ−２８タンパク質を抗ＤＧＴ−２８抗血清、次にヤギ抗ウサギホスファターゼによって検出した。検出されたタンパク質は、化学発光基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴウエスタン分析試薬（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって可視化された。ウエスタンブロットを介した無傷のＤＧＴ−２８タンパク質の生産は、アッセイされたｄｇｔ−２８トランスジェニック植物がＤＧＴ−２８タンパク質を発現したことを示した。
【実施例７】
【０２８５】
グリホサート耐性
ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、異なる比率のグリホサートで噴霧された。高い比率がこの研究において適用され、抵抗性の相対的なレベル（１０５、４２０、１，６８０または３，３６０ｇ  ａｅ／ｈａ）を決定した。グリホサートの典型的な１×耕作地使用率は、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａである。この研究で使用されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、様々なコピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子であった。低コピーのｄｇｔ−２８  Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物を自家受粉し、これを用いてＴ２植物を生成させた。表７は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子、ｄｇｔ−１、および野生型対照を引用したｄｇｔ−２８トランスジェニック植物の比較を示す。表８は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子、ｄｇｔ−１、および野生型対照を引用したｄｇｔ−３２とｄｇｔ−３３の比較を示す。表９は、新規な微生物ＥＰＳＰシンターゼ酵素と、クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素およびグリホサート比率が１，６８０ｇ  ａｅ／ｈａの対照の比較を示す。
【０２８６】
形質転換されたｄｇｔ−２８アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のグリホサート選択の結果。アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して、非形質転換の種子のバックグラウンドから選択された。上記で選択されたＴ１植物は、分子的に特徴付けられ、その後、高コピー数植物は、個々のポットに移植され、前述のように、様々な比率の市販のグリホサートで噴霧された。これらの植物の応答は、処理から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは表に示され、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個々の植物を示す。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。
【０２８７】
植物応答のレベルは変化した。この差異は、それぞれの植物が独立した形質転換事象を表すという事実に起因することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は、植物ごとに変動する。導入遺伝子を含んでいたいくつかの植物はグリホサートに耐性ではなく；これらの植物が導入遺伝子を発現したかどうかを判断する徹底的な分析が完了しなかったことに気付いた。Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内での高いコピー数の導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングをもたらしたかまたはグリホサートに対する感受性をもたらした他のエピジェネティックな効果をもたらした可能性がある。
【０２８８】
比率による全体的な集団の損傷平均は、１，６８０ｇ  ａｅ／ｈａでのグリホサートの比率について表９に示され、ｄｇｔ−３、ｄｇｔ−７、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３対ｄｇｔ−１および野生型対照で形質転換された植物の間に有意な差を実証する。
【０２８９】
新規な細菌ＥＰＳＰシンターゼによって提供される耐性は、特異的酵素に依存して変化した。ＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３は、予想外にグリホサートに有意な耐性を示した。ｄｇｔ遺伝子は、試験したすべての輸送ペプチド全体で個々のＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物に除草剤抵抗性を付与した。このように、追加的な葉緑体輸送ペプチド（すなわち、ＴｒａＰ８−ｄｇｔ−３２またはＴｒａＰ８−ｄｇｔ−３３）の使用は、所定の処置内で報告されているのと同様の損傷レベルでグリホサートに対する保護を提供する。
【０２９０】
【表７】
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【０２９１】
【表８】
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【０２９２】
【表９】
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【０２９３】
選択マーカーとしてのｄｇｔ−２８。グリホサート選択剤のための選択マーカーとしてのｄｇｔ−２８の使用は、上記のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換植物を用いて試験される。約５０個のＴ４世代アラビドプシス属（Arabidopsis）種子（ｄｇｔ−２８についてホモ接合）は、約５，０００個の野生型（グリホサートに感受性である）の種子に混ぜられる。種子は発芽され、苗木はグリホサートの選択用量で噴霧される。グリホサートのいくつかの処理を比較する：植物のそれぞれのトレイは、以下の処置スキーム：７ＤＡＰ（植え付け後の日数）、１１ＤＡＰ、または７ＤＡＰの後１１ＤＡＰの１つにおいて、グリホサートの１回または２回の適用時期のいずれかを受ける。すべての植物はまた、同じ形質転換ベクターにグルホシネート抵抗性遺伝子を含んでいるため、グリホサートを用いて選択されたｄｇｔ−２８を含む植物は、グルホシネートを用いて選択されたＤＳＭ−２またはｐａｔを含む植物と直接比較することができる。
【０２９４】
前述のように、グリホサート処置は、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）噴霧チップを用いて適用される。ｄｇｔ−２８を含有するトランスジェニック植物は、「抵抗性」または「感受性」１７ＤＡＰとして同定される。植え付け後（ＤＡＰ）７日および１１日に適用された２６．２５〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａグリホサートの処理は、ｄｇｔ−２８を含むトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について有効な選択を示す。感受性および抵抗性の植物をカウントし、グリホサート耐性植物の数は、植え付けられるｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関することが見出される。これらの結果は、ｄｇｔ−２８が、形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）の集団に対して代替的な選択マーカーとして効果的に使用できることを示す。
【０２９５】
遺伝可能性。確認されたトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象は、Ｔ２種子を生産するために自家受粉された。これらの種子は、１００個の無作為なＴ２同胞に、グルホシネート（２００ｇ  ａｅ／ｈａ）を含有するＩｇｎｉｔｅ（商標）除草剤を適用することによって後代検定を行われた。それぞれの個々のＴ２植物は、噴霧適用（１８７Ｌ／ｈａ適用率でのトラック噴霧器）前に７．５ｃｍの正方形ポットに移植された。Ｔ１ファミリー（Ｔ２植物）は、カイ二乗分析（Ｐ＞０．０５）によって決定したメンデル遺伝を用いた優性遺伝単一遺伝子座について、予期される３抵抗性：１感受性モデルに分離した。期待されたメンデル遺伝を用いて分離されたＴ１ファミリーの割合は表１０に示され、ｄｇｔ−２８形質はＴ２世代にメンデル遺伝を介して渡されることを実証する。種子は、５〜１５個のＴ２個体（Ｔ３種子）から回収された。３〜４個の無作為に選択されたＴ２ファミリーのそれぞれからの２５個のＴ３同胞について前述のように後代検定を行った。データは分離を示さず、したがって、ｄｇｔ−２８およびｄｇｔ−３は、染色体内に安定に組み込まれ、少なくとも３世代にメンデル様式で遺伝されることを実証した。
【０２９６】
【表１０】
0006537825.tif 000014
【０２９７】
Ｔ２アラビドプシス属（Arabidopsis）データ。低コピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子を含んだ選択されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象の第２世代植物（Ｔ２）は、グリホサート耐性についてさらに特徴付けられた。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。Ｔ２世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率のグリホサートに含まれた。遺伝子座で同じ２つの対立遺伝子を含むホモ接合植物と比較して、ヘミ接合植物は、遺伝子座で２つの異なる対立遺伝子を含む。グリホサートに対する応答の変動性は、ホモ接合植物と比較して、ヘミ接合性についての遺伝子量の差の結果として、Ｔ２世代で期待される。グリホサートへの応答の変動性は、標準偏差と応答の範囲に反映される。
【０２９８】
Ｔ２世代において、１コピーとマルチコピーのｄｇｔ−２８事象の両方はグリホサート耐性について特徴付けられた。事象内では、１コピーの植物はグリホサートに対して同レベルの耐性を示した。１コピーＴ２事象について特徴的データを表１１に示す。ＴｒａＰ５  ｖ２と連結されたｄｇｔ−２８を含む事象は、他のＴｒａＰ輸送ペプチドを含有したｄｇｔ−２８構築物と比較して、グリホサートに対する強固な耐性を提供しなかった。しかしながら、ｄｇｔ−２８  ＴｒａＰ５構築物は、非形質転換コロンビア対照と比較して、低レベルのグリホサート耐性を提供した。２以上のコピーのｄｇｔ−２８を含有することが示された事象が高比率のグリホサートにより感受性であるという例があった（データ示さず）。グリホサートに対する感受性のこの増加は、高いコピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子も含有したＴ１植物について先に記載されたデータに類似する。アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内の高いコピー数の導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングまたはグリホサートに対する感受性をもたらす他のエピジェネティックな効果をもたらす可能性がある。
【０２９９】
これらの事象は、ＴｒａＰ５  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３０）、ＴｒａＰ１２  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３３）およびＴｒａＰ１３  ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３４）と連結したｄｇｔ−２８を含んでいた。
【０３００】
ｄｇｔ−２８に加えて、ｄｇｔ−３で形質転換されたＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）事象を表１２に示す。表１１においてｄｇｔ−２８事象について記載したように、データ表は、それぞれの構築物についてのグリホサートに対する応答に特徴的である代表的な事象を含む。ｄｇｔ−３の特徴付けのために、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆動されるｄｇｔ−３遺伝子を有する単一ＰＴＵ（植物形質転換単位）を含む構築物（ｐＤＡＢ１０２７１６、図４５とｐＤＡＢ１０２７１５、図１０）は、遺伝子の２ＰＴＵ（ｐＤＡＢ１０２７１９、図３２；ｐＤＡＢ１０２７１８、図３３）を含む同遺伝子を有する構築物と比較された。２ＰＴＵを含んだ構築物は、該遺伝子の１コピーを駆動するためにＡｔＵｂｉ１０プロモーターを使用し、他のコピーを駆動するためにＣｓＶＭＶプロモーターを使用した。二重ＰＴＵの使用は、ｄｇｔ−３トランスジェニック植物と、２コピーの導入遺伝子を含有したｄｇｔ−２８トランスジェニック植物を比較するために組み込まれた。データは、単一のＰＴＵのみを有する１コピーのＴ２  ｄｇｔ−３事象が、試験された１コピーのｄｇｔ−２８事象よりもグリホサートに対して感受性であるが、非形質転換対照より高い耐性であることを実証した。ｄｇｔ−３遺伝子の２ＰＴＵを含むＴ１ファミリーは、１ＰＴＵ構築物と比較して、グリホサートに対して高いレベルの視覚的耐性を提供した。いずれの場合も、Ｔ１ファミリーは、ｄｇｔ−１および野生型対照と比較された。Ｔ２データは、ｄｇｔ−２８が１コピー事象として強固な耐性を提供することを実証している。
【０３０１】
【表１１】
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0006537825.tif 000016
【０３０２】
【表１２】
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【０３０３】
Ｔ３アラビドプシス属（Arabidopsis）データ。低コピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子を含んだ選択されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象の第３世代植物（Ｔ２）は、グリホサート耐性についてさらに特徴付けられた。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。Ｔ３世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率のグリホサートに含まれた。遺伝子座で同じ２つの対立遺伝子を含むホモ接合植物と比較して、ヘミ接合植物は、遺伝子座で２つの異なる対立遺伝子を含んでいる。グリホサートに対する応答の変動性は、ホモ接合植物と比較して、ヘミ接合性についての遺伝子量の差の結果として、Ｔ３世代で期待される。グリホサートへの応答の変動性は、標準偏差と応答の範囲に反映される。
【０３０４】
【表１３】
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【０３０５】
形質転換植物の選択。新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３  ｖ１遺伝子］を室温にて乾燥させ、試験のためにインディアナポリスに搬送した。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ）に播種され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存された、層状にしたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
【０３０６】
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ  Ｍｉｘ  ＬＰ５（Ｓｕｎ  Ｇｒｏ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４０ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５日間、湿度ドーム（ＫＯＲＤ（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換されたｄｓｍ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体の選択前に植物が発芽した時点で外された。
【０３０７】
植え付け後（ＤＡＰ）６日とさらに１０ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−ｌｆ段階）は、適用あたり２００ｇ  ａｅ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、ＩＧＮＩＴＥ（商標）除草剤（２８０ｇ  ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．１％溶液で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜７日後に特定された。生存植物は、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ  Ｍｉｘ  ３６０（商標））を用いて調製された３インチ（７．６２センチメートル）のポットに個別に移植された。植物は、コピー数分析のための組織サンプリングの少なくとも１日前に温室において生育された。
【０３０８】
Ｔ１植物をサンプリングし、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３  ｖ１遺伝子についてのコピー数分析を完了した。次に、コピーの範囲が、それぞれの比率にあるように、Ｔ１植物を様々な比率のグリホサートに割り当てた。アラビドプシス属（Arabidopsis）について、２６．２５ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートは、感受性の植物と意味のあるレベルの抵抗性を有する植物を区別するのに有効な用量である。高い比率は、相対的レベルの抵抗性（１０５、４２０、１６８０、または３３６０ｇ  ａｅ／ｈａ）を決定するために適用された。表１５は、ｄｇｔ−１を引用した比較を示す。
【０３０９】
すべてのグリホサート除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積でトラック噴霧器によってなされた。使用されたグリホサートは、市販のＤｕｒａｎｇｏジメチルアミン塩製剤（４８０ｇ  ａｅ／Ｌ、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＡｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣ）であった。グルホシネートまたはグリホサートのいずれかに耐性を示した低コピーのＴ１植物は、Ｔ２世代においてさらに評価された。
【０３１０】
最初のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換は、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３  ｖ１を用いて行われた。Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを用いて、非形質転換種子のバックグラウンドから選択された。３フラットまたは３０，０００個の種子は、各Ｔ１構築物について分析された。形質転換頻度を計算し、Ｔ１のｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３構築物の結果は表１４に列挙する。
【０３１１】
【表１４】
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【０３１２】
その後、上記で選択されたＴ１植物は、個別のポットに移植され、様々な比率の市販のグリホサートで噴霧された。表１５は、アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体にグリホサート抵抗性を付与するｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３  ｖ１ならびに対照遺伝子の応答を比較する。応答は、２ＷＡＴで視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、それぞれの処理について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。輸送ペプチド（ＴｒａＰ２３）を有するＤＧＴ−３１（ｖ１）遺伝子は、陰性対照と比較して、個別のＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物に対してわずかな除草剤耐性を付与した。ＤＧＴ−３２とＤＧＴ−３３はともに、それぞれの葉緑体輸送ペプチド（それぞれＴｒａＰ１４とＴｒａＰ２４）を用いて試験された比率でグリホサートに対して強固な耐性を実証した。所与の処理中で、植物応答のレベルは非常に変化した。これは、それぞれの植物が独立した形質転換事象を表すという事実に帰することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は植物ごとに変動する。重要にも注目すべきことに、試験したそれぞれのグリホサート比率で、他よりも耐性である個体があった。比率による全集団の損傷平均は表１５に示され、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３  ｖ１対ｄｇｔ−１  ｖ１または野生型対照で形質転換された植物間で有意な相違を実証する。
【０３１３】
【表１５】
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【実施例８】
【０３１４】
選択マーカーとしてのｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３
選択剤としてグリホサートを用いて、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３  ｖ１は選択マーカーとして使用される。これらのマーカーの性能は、形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）を用いて分析される。約５０個のＴ４世代アラビドプシス属（Arabidopsis）種子（ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３  ｖ１についてのホモ接合）は、約５，０００個の野生型（感受性）種子に混ぜられる。いくつかの処理が比較され、植物のそれぞれのトレイは、以下の処置スキーム：７ＤＡＰ、１１ＤＡＰ、または７ＤＡＰ続く１１ＤＡＰの１つにおいて、グリホサートの１回または２回の適用時期のいずれかを受ける。すべての個体は、同じ形質転換ベクターにおいてｄｓｍ−２遺伝子も含むため、グリホサートで選択されるｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３は、グルホシネートで選択されるｄｓｍ−２と直接比較され得る。
【０３１５】
処理は、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）噴霧チップで適用される。植物は、抵抗性または感受性１７ＤＡＰとして識別される。植え付けから７日後と１１日後（ＤＡＰ）に適用された２６．２５〜２８０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４−Ｄの処理は、選択頻度において等しく効果的である。これらの結果は、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３  ｖ１が選択マーカーとして効果的に使用できることを示す。
【０３１６】
遺伝可能性。様々なＴ１事象は、Ｔ２種子を生成するために自家受粉された。これらの種子は、１００個の無作為なＴ２同胞に、ＩＧＮＩＴＥ（商標）（２００ｇ  ａｅ／ｈａ）を適用することによって後代検定が行われる。それぞれ個々のＴ２植物は、噴霧適用（１８７Ｌ／ｈａ適用比率でのトラック噴霧器）前に７．５ｃｍの正方形ポットに移植される。カイ二乗分析（Ｐ＞０．０５）によって決定したメンデル遺伝を用いた優性遺伝単一遺伝子座について、予期される３抵抗性：１感受性モデルに分離するＴ１ファミリー（Ｔ２植物）が決定される。
【０３１７】
種子は、５〜１５個のＴ２個体（Ｔ３種子）から回収される。３個の無作為に選択されたＴ２ファミリーのそれぞれからの２５個のＴ３同胞について後代検定を行う。分離を示さないデータは、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３  ｖ１が、それぞれ安定に組み込まれ、少なくとも３世代にメンデル様式で遺伝されることを実証する。
【０３１８】
Ｔ３  ＤＧＴ株のさらなる除草剤耐性特徴付け。Ｔ３世代アラビドプシス属（Arabidopsis）種子を層状にし、選択トレイに播種する。ｄｇｔ−１を含む形質転換対照株と非形質転換対照を同様の方法で植え付ける。実生は、温室内における個々の３インチ（７．６２センチメートル）ポットに移される。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器を用いて噴霧される。植物は、４２０〜３３６０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート（ＤＵＲＡＮＧＯ（商標）ＤＭＡ、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）の範囲で噴霧される。すべての適用は水中で製剤化される。それぞれの処理は４回繰り返され、植物は処置から７および１４日後に評価される。
【実施例９】
【０３１９】
追加の作物種の形質転換
ダイズは、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０５３４８２号の実施例１１または実施例１３に従前記載される実質的に同じ技術を利用して、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３（葉緑体輸送ペプチドを含むまたは含まない）で形質転換され、除草剤グリホサートに対して高レベルの抵抗性を提供する。
【０３２０】
ワタは、米国特許第７，８３８，７３３号の実施例１４、またはＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０５３４８２号の実施例１２に従前記載される実質的に同じ技術を利用することによって、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３（葉緑体輸送ペプチドを含むまたは含まない）で形質転換され、除草剤グリホサートに対して高レベルの抵抗性を提供する。
【０３２１】
カノーラは、米国特許第７，８３８，７３３号の実施例２６、またはＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０５３４８２号の実施例２２に従前記載されている実質的に同じ技術を利用することによって、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３（葉緑体輸送ペプチドを含むまたは含まない）で形質転換され、除草剤グリホサートに対して高レベルの抵抗性を提供する。
【実施例１０】
【０３２２】
トウモロコシ形質転換
トウモロコシ形質転換のためのＤＮＡ構築物。標準的なクローニング方法は、上述した通りであり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介したトウモロコシの形質転換において使用するためのバイナリーベクターの構築に用いた。表１６は、トウモロコシ形質転換のために構築されたベクターを列挙する。以下の遺伝子エレメントはｄｇｔ−２８を含んだベクターにおいて使用された；トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１；米国特許第５，５１０，４７４号）を用いて、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ  ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）に並べられたｄｇｔ−２８コード配列を駆動し、選択マーカーカセットは、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたａａｄ−１コード配列（米国特許第７，８３８，７３３号）を駆動するために使用されたトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターからなる。ａａｄ−１コード配列は、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤などのフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性を付与する。
【０３２３】
ｄｇｔ−２８構築物は、標準的なバイナリーベクターおよびアグロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクター（Ｊａｐａｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）として構築された。標準的なバイナリーベクターとしては、ｐＤＡＢ１０７６６３、ｐＤＡＢ１０７６６４、ｐＤＡＢ１０７６６５、およびｐＤＡＢ１０７６６５が挙げられる。アグロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクターには、ｐＤＡＢ１０８３８４、ｐＤＡＢ１０８３８５、ｐＤＡＢ１０８３８６、およびｐＤＡＢ１０８３８７が含まれる。
【０３２４】
黄色蛍光タンパク質（ｙｆｐ；米国特許出願公開第２００７／０２９８４１２号）レポーター遺伝子を含有しているさらなる構築物を完成した。ｐＤＡＢ１０９８１２は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５  ３’非翻訳領域（Ｚｍ  ｐｅｒ５  ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）に並べられたｙｆｐレポーター遺伝子カセットを含み、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター（ＳＣＢＶ；米国特許第５，９９４，１２３号）からなる。ｐＤＡＢ１０１５５６は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５  ３’非翻訳領域に並べられたｙｆｐカセットを含み、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターからなる。ｐＤＡＢ１０７６９８は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたｄｇｔ−２８カセットを含み、ｙｆｐカセットは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５  ３’非翻訳領域に並べられ、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターからなる。これらの構築物の３つすべてが標準的なバイナリーベクターである。
【０３２５】
【表１６】
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【０３２６】
穂の滅菌および胚の単離。トウモロコシ未熟胚を得るために、トウモロコシ（Zea mays）の同系交配株Ｂ１０４の植物を温室で生育させ、自家受粉または同胞受粉し、穂を生成した。受粉後の約９〜１２日目に穂を回収した。実験日に、穂は、次亜塩素酸ナトリウム（５％）の２０％溶液に浸漬することによって表面を滅菌し、２０〜３０分間振とうし、次に、滅菌水で３回濯いだ。滅菌後、未熟接合胚（１．５〜２．４ｍｍ）は、それぞれの穂から無菌的に切除し、液体感染培地（ＬＳ基礎培地、４．４３ｇ／Ｌ；Ｎ６ビタミン溶液［１０００×］、１．００ｍＬ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６８．５ｇ／Ｌ；Ｄ（＋）グルコース、３６．０ｇ／Ｌ；１０ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、１５０μＬ／Ｌ）を含む微量遠心管に無作為に分配した。所与の実験セットについて、３つの穂からプールされた胚をそれぞれの形質転換に使用した。
【０３２７】
アグロバクテリウム培養開始：
上記のバイナリー形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムのグリセロールストックは、適切な抗生物質を含むＡＢ最小培地プレート上に筋状にし、２０℃にて３〜４日間で増殖させた。単一のコロニーを採取し、同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート上に筋状にし、２８℃にて１〜２日間インキュベートした。
【０３２８】
アグロバクテリウム培養および共培養。アグロバクテリウムコロニーをＹＥＰプレートから採取し、５０ｍＬ使い捨てチューブ中の１０ｍＬ感染培地に懸濁した。細胞密度は、分光光度計を用いてＯＤ６００ｎｍが０．２〜０．４になるように調整した。アグロバクテリウム培養物を１２５ｒｐｍ、室温にてロータリーシェーカー上に置き、胚切除を行った。サイズが１．５〜２．４ｍｍ間の未熟接合胚は、滅菌トウモロコシ穀粒から単離し、１ｍＬの感染培地に入れ、同じ培地で１回洗浄した。アグロバクテリウム懸濁液（２ｍＬ）をそれぞれのチューブに加え、チューブを１０〜１５分間振とうプラットホーム上に置いた。胚を共培養培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオ−イノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌのＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；ＤＭＳＯ、１００μΜ）に移し、胚盤を上に向けて配向し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２５℃にて３日間インキュベートした。
【０３２９】
カルス選択および推定事象の再生。共培養期間後、胚を残りの培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ  ２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）（選択剤を含まない）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２５℃にて３日間インキュベートした。
【０３３０】
増殖阻害用量応答実験により、０．２５ｍＭ以上のグリホサート濃度が非形質転換Ｂ１０４トウモロコシ株において細胞増殖を阻害するのに十分であることが示唆された。胚は、０．５ｍＭグリホサートを含む選択１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、暗所および／または５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７〜１４日間インキュベートされた。
【０３３１】
増殖中の胚発生カルスは、１．０ｍＭグリホサートを含有する選択２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ  ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍＬ  ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ；Ｒ−ハロキシホップ酸０．１８１０ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所および／または５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて１４日間インキュベートされた。この選択工程は、トランスジェニックカルスをさらに増殖および分化させた。カルス選択期間を３〜４週間継続した。
【０３３２】
増殖中の胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有ＰｒｅＲｅｇ培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、３５０．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．２５０ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物  ５０．０ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ−ＮａＯＨ  ０．５００ｍｇ／Ｌ；ＡＢＡ−ＥｔＯＨ  ２．５０ｍｇ／Ｌ；ＢＡ  １．００ｍｇ／Ｌ；スクロース、４５．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．５０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ  ＡｇＮｏ３、１．００ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７日間培養された。
【０３３３】
シュート様芽を有する胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有再生培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ  Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；カルベニシリン、１２５．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で７日間培養された。
【０３３４】
一次根を有する小さなシュートは、Ｐｈｙｔｏｔｒａｙ中の発根培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍ  Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、１４０〜１９０μｍｏｌｅ  ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の１６／８時間の明／暗で２７℃にて７日間インキュベートされた。推定されるトランスジェニック苗木は、上述のプロトコールを用いて、導入遺伝子のコピー数について分析され、土壌に移された。
【０３３５】
トウモロコシ植物内のｄｇｔ−２８およびａａｄ−１導入遺伝子の存在の分子確認。ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１のポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセイによって確認された。単離されたＴ０トウモロコシ植物は、最初に、ａａｄ−１とｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認するために、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされた。これらの研究から生じたデータは、導入遺伝子のコピー数を決定するために使用され、Ｔ１世代へ戻し交配および進行のためのトランスジェニックトウモロコシ事象を選択するために使用された。
【０３３６】
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、組織浸軟は、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＲＬＴ緩衝液中でＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機およびステンレス製ビーズ（Ｈｏｏｖｅｒ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｕｍｍｉｎｇ、ＧＡ）を用いて行った。組織浸軟後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ  ９６（商標）Ｐｌａｎｔキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式で単離された。ゲノムＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ（商標）Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整された。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ２．０を用いて、ａａｄ−１、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子インベルターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ１６１２３．１）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ａａｄ−１とｄｇｔ−２８についての０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積の多重反応において１×最終濃度にて調製された（表１７）。
【０３３７】
二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべての試料を行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行われ、ΔΔＣｔ法に基づいている。対照は、それぞれの実行に含まれた単一コピー較正因子と既知の２つのコピーチェックからのゲノムＤＮＡの試料を含んだ。表１８は、加水分解プローブアッセイの結果を列挙する。
【０３３８】
【表１７】
0006537825.tif 000023
【０３３９】
【表１８】
0006537825.tif 000024
【実施例１１】
【０３４０】
ｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシにおける除草剤耐性
トウモロコシ（Zea mays）ｄｇｔ−２８形質転換事象（Ｔ０）は、温室で順化させ、植物が、組織培養から温室生育条件（すなわち、２〜４の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現していた）に移行するまで成長させた。植物を温室で、２７℃にて１６時間の明所：８時間の暗所の条件で生育した。次に、植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともに、ＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）（除草剤グリホサートを含む）の市販製剤で処理した。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。Ｔ０植物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系Ｂ１０４に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。
【０３４１】
Ｔ０  ｄｇｔ−２８トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａまでの比率で達成されたことを実証した。特定の媒体タイプをＴ０世代に使用した。非形質転換対照と比較した、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植物成長は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドに連結されたとき、ｄｇｔ−２８がグリホサートに対する強固な耐性を提供することを実証した。
【０３４２】
選択されたＴ０植物は、次世代におけるさらなる特徴付けのために自家受粉され、または戻し交配される。Ｔ１植物を含む１００個の選ばれたｄｇｔ−２８株は、１４０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａのグルホシネートまたは１０５〜１６８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートで噴霧される。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、１つの除草剤耐性遺伝子が除草剤で噴霧することによって選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。１４ＤＡＴで、抵抗性および感受性植物は、カイ二乗分析によって決定された単一遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された株の割合を決定するためにカウントされる。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝され得ることを実証する。グリホサート比率の増加は、ｄｇｔ−２８遺伝子によって提供される耐性および保護をさらに特徴付けるために、Ｔ１またはＦ１生存者に適用される。
【０３４３】
ｄｇｔ−２８で形質転換されたＴ０トウモロコシにおける発芽後の除草剤耐性。ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３と連結されたｄｇｔ−２８のＴ０事象は、アグロバクテリウム形質転換によって生成され、２〜４枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで、制御された成長チャンバー条件下で順化させた。植物は、個々の識別番号が割り当てられ、ｄｇｔ−２８とａａｄ−１の両方のコピー数分析のためにサンプリングされた。コピー数分析に基づいて、タンパク質発現分析のための植物を選択した。植物を新しい成長培地とともに大きなポットに移植し、温室で２７℃にて１６時間明所：８時間暗所の条件で生育した。次に、タンパク質発現のためにサンプリングされなかった残りの植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともにＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）（グリホサート）の市販製剤で処理した。植物のそれぞれのグループがコピー数を変化させるＴ０事象を含むように処置を分配させた。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。Ｔ０植物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系Ｂ１０４に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。Ｂ１０４は、形質転換体の遺伝的バックグラウンドであった。
【０３４４】
Ｔ０  ｄｇｔ−２８トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａまで達成されたことを実証する。表１９。非形質転換対照と比較した、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植物成長は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３に連結されたとき、ｄｇｔ−２８がグリホサートに対する強固な保護を与えることを実証した。
【０３４５】
【表１９】
0006537825.tif 000025
【０３４６】
標準的なＥＬＩＳＡによるタンパク質発現分析は、試験された構築物全体で１２．６〜２２．５ｎｇ／ｃｍ２のＤＧＴ−２８タンパク質の平均範囲を実証した。
【０３４７】
温室条件下でのＦ１世代におけるグリホサート耐性の確認。噴霧されなかった１コピーのＴ０植物は、次世代においてさらなる特徴付けのために、非形質転換のバックグラウンドＢ１０４に戻し交配された。Ｔ１世代において、グリホサート耐性は、ｄｇｔ−２８遺伝子の遺伝を確認するために評価された。Ｔ１植物について、除草剤ＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ（商標）（３５ｇ  ａｅ／ｈａのキザロホップ−メチル）は、ＡＡＤ−１タンパク質を選択するためのＶ１成長段階で適用された。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、１つの遺伝子が選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。７ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントし、ヌル植物を集団から除去した。これらのデータは、ｄｇｔ−２８（ｖ１）は、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝することができることを実証する。標準的なＥＬＩＳＡおよびＲＮＡ転写レベルによるＤＧＴ−２８タンパク質の特徴付けのために植物をサンプリングした。抵抗性植物は、前述のように、５６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートで噴霧された。データは、４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまで、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３と連結されたｄｇｔ−２８の強固な耐性を実証する。表２０。
【０３４８】
【表２０】
0006537825.tif 000026
【０３４９】
タンパク質発現データは、Ｔ１世代のタンパク質発現を確立する、Ｔ１事象および試験された構築物全体で、４２．２〜８８．２ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均ＤＧＴ−２８タンパク質を実証する。
【０３５０】
野外条件下のｄｇｔ−２８トウモロコシの特徴付け。１コピーのＴ１事象は、さらなる特徴付けのために、ハイブリッドヘミ接合種子と近交系ホモ接合種子の両方を作製するために野外場所に搬送された。ハイブリッド種子は、トウモロコシ形質転換株Ｂ１０４におけるＴ１事象を、事象について１：１（ヘミ接合：ヌル）を分離するハイブリッド集団を生成する近交株４ＸＰ８１１に交配させることによって作製された。得られた種子は、２つの別々の場所に搬送された。構築物あたり５つの１コピー事象の合計は、３重の無作為化された完全ブロック設計のそれぞれの場所で植え付けられた。野外は、Ｖ４成長段階で生じさせるためのグリホサート適用、およびＶ８成長段階で適用される植物の別のグループについて設計された。４ＸＰ８１１／Ｂ１０４の従来のハイブリッドを陰性対照として使用した。
【０３５１】
実験行は、ヌル分離体を排除するために、１８４ｇ  ａｅ／ｈａのＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ（商標）（１０６ｇ  ａｉ／Ｌのキザロホップ−メチル）で処理された。すべての実験エントリーは、ＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ（商標）適用に関して１：１（感受性：抵抗性）（ｐ＝０．０５）を分離した。選択された抵抗性植物は、標準的なＥＬＩＳＡによってＤＧＴ−２８タンパク質の定量化のためにそれぞれの事象からサンプリングされた。
【０３５２】
キザロホップメチル抵抗性植物は、Ｖ４またはＶ８成長段階のいずれかで２．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムの添加とともに、市販の除草剤ＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）（４８０ｇ  ａｅ／Ｌのグリホサート）で処理された。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの体積、５０ｃｍの噴霧高を送達するように較正されたブーム噴霧器を用いて行われた。植物は、非形質転換トウモロコシ株に対して重大な損傷を与えることができる１１２０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートのある範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、４ＸＰ８１１近交系に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。視覚的損傷評価は、７、１４および２１ＤＡＴ（処置後の日数）での視覚的な白化の割合、壊死の割合、成長阻害の割合および全視覚的損傷について行われた。評価は、それぞれの株および陰性対照について、未処理チェックと比較された。
【０３５３】
すべての評価時期の視覚的損傷データは、場所と適用時期の両方で、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａまでのＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）に対する強固な耐性を実証した。Ｖ４適用に関する代表的な事象は１つの場所から示され、他の事象、適用時期および場所と一致している。表２１。ＴｒａＰ２３（ｐＤＡＢ１０７６６５）と連結されたｄｇｔ−２８を含む構築物からの１つの事象は、ＡＡＤ−１タンパク質についてＡＳＳＵＲＥ  ＩＩ（商標）選択に対して耐性であったが、適用されたすべての比率のグリホサートに感受性であった。
【０３５４】
【表２１】
0006537825.tif 000027
【０３５５】
追加の評価は、４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート比率について、再生成長段階中に行われた。房、受粉時期および穂の膨らみの視覚的評価は、すべての構築物、適用時期および場所について、それぞれの株の未処理チェックと同様であった。ＤＧＴ−２８タンパク質の定量結果は、１８６．４〜３０３．０ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均タンパク質発現を実証した。データは、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまで再生成長段階を通じて、野外条件下でｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシの強固な耐性を実証する。また、データは、噴霧耐性結果に基づいて、ＤＧＴ−２８タンパク質の検出および機能を実証した。
【０３５６】
ホモ接合状態におけるｄｇｔ−２８トウモロコシの遺伝可能性および耐性の確認。Ｔ１Ｓ２から種子は、前述のように、温室条件下で植え付けられた。野外条件下で特徴付けた同じ５つの１コピー株は均一な状態で特徴付けた。植物は、Ｖ３成長段階まで成長させ、１１２０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート（ＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標））の範囲の３つの比率のグリホサートおよび処理あたり４つの複製に分離された。適用は、前述のようにトラック噴霧器で行われ、２．０％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムにおいて製剤化された。硫酸アンモニウムの適用は、それぞれの株に対して未処理のチェックとして用いた。前述のように、視覚的評価は処置から７日後および１４日後に行われた。データは、試験されたすべての事象について、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまで強固な耐性を実証した。表２２。
【０３５７】
【表２２】
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【０３５８】
野外条件下で耐性でないｐＤＡＢ１０７６６５からの株はグリホサートに対して耐性を示さず、したがって、野外観察と一致する（データ示さず）。前述の１つの株を除いて、株からグリホサートで処理したすべての複製物は、グリホサートに対して感受性でなかった。したがって、データは、メンデル様式でｄｇｔ−２８トウモロコシの均質な集団に対する遺伝可能性を実証する。標準的なＥＬＩＳＡによるＤＧＴ−２８タンパク質の発現は、グリホサートに耐性であった１コピー事象全体で２７．５〜６５．８ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均タンパク質発現を実証した。データは、機能的タンパク質、および世代全体でＤＧＴ−２８タンパク質の安定性を実証する。
【実施例１２】
【０３５９】
選択マーカーとしてのグリホサートの発芽後の除草剤耐性使用
前述したように、Ｔ０形質転換植物を組織培養から移動させ、温室内で順化させた。試験された事象は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドに連結されたｄｇｔ−２８を含有した。これらのＴ０植物は最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａまでのグリホサートに強固な耐性を提供し、非形質転換植物は、２８０ｇ  ａｅ／ｈａ程度に低い濃度のグリホサートで制御されたことが実証された。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が、２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの濃度を用いる選択マーカーとして利用され得ることを実証する。
【０３６０】
ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトウモロコシの固定された株からの多数の種子が、多数の非形質転換トウモロコシ種子に混ぜられた。種子を植え付け、Ｖ１〜Ｖ３発育段階まで生育させ、その時点で、苗木は、２８０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲でグリホサートの選択用量を用いて噴霧される。７〜１０日後に、感受性および抵抗性植物をカウントし、グリホサート耐性植物の量は、植え付けられるｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関する。
【実施例１３】
【０３６１】
ｄｇｔ−２８トウモロコシのスタッキング
ＡＡＤ−１タンパク質は、研究目的のためにｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシにおいて選択マーカーとして使用される。また、ａａｄ−１遺伝子は、作物における最大Ｖ８適用までに強固な２，４−Ｄ耐性を提供するために、トウモロコシにおける除草剤耐性の形質として利用することができる。構築物ｐＤＡＢ１０７６６３（ＴｒａＰ４：：ｄｇｔ−２８）、ｐＤＡＢ１０７６６４（ＴｒａＰ８：：ｄｇｔ−２８）およびｐＤＡＢ１０７６６６（ＴｒａＰ５：：ｄｇｔ−２８）からの４つの事象は、グリホサートおよび２，４−Ｄのタンク混合適用の耐性について特徴付けられた。特徴付け研究は、温室条件下でＦ１種子を用いて完了された。適用は、前述されるように、以下の比率：１１２０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート（ｄｇｔ−２８遺伝子について選択的である）、１１２０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ａａｄ−１遺伝子について選択的である）、または記載される比率での２つの除草剤のタンク混合物でトラック噴霧器において行われた。植物は７および１４ＤＡＴで等級付けされた。２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの除草剤の適用についての噴霧結果を表２３に示す。
【０３６２】
【表２３】
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【０３６３】
結果は、ｄｇｔ−２８がａａｄ−１と首尾よく積層できることを確認し、したがって、対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤（ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１についてそれぞれグリホサート＋フェノキシ酢酸）を増やす。防除が難しい広葉雑草または抵抗性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象とする作物の保護の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性はまた、トウモロコシおよび他の植物におけるｄｇｔ−２８遺伝子を用いて積層することができる。
【実施例１４】
【０３６４】
他の作物の形質転換
追加の作物は、公知の技術を用いて形質転換される。アグロバクテリウムを媒介したライムギの形質転換については、例えば、Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye," Transgenic Res. 2003 Oct;12(5):587-96を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したソルガムの形質転換については、例えば、Zhao et al, "Agrobacterium-mediated sorghum transformation," Plant Mol Biol. 2000 Dec;44(6):789-98を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したオオムギの形質転換については、例えば、Tingay et al, "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation," The Plant Journal, (1997) 11:1369-1376を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したコムギの形質転換については、例えば、Cheng et al,"Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiol. 1997 Nov;115(3):971-980を参照されたい。アグロバクテリウムを媒介したイネの形質転換については、例えば、Hiei et al, "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol. 1997 Sep;35(l-2):205-18を参照されたい。
【０３６５】
他の（非アグロバクテリウム）形質転換技術を用いて、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３を、例えば、トウモロコシ（Zea mays）、コムギ（コムギ属種（Triticum spp.））、イネ（イネ属種（Oryza spp.）およびマコモ属種（Zizania spp.））、オオムギ（オオムギ属種（Hordeum spp.））、ワタ（アブロマ・アウグスタ（Abroma augusta）およびゴシピウム属種（Gossypium spp.））、ダイズ（Glycine max）、シュガーおよびテーブルビート（ベータ属種（Beta spp.））、サトウキビ（アレンガベンケイソウ（Arenga pinnata））、トマト（トマト（Lycopersicon esculentum）および他の属種、オオブドウホオズキ（Physalis ixocarpa）、ソラナム・インカナム（Solanum incanum）および他の属種、ならびにシフォマンドラ・ベタセア（Cyphomandra betacea））、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、ライムギ（ライムギ属種（Secale spp.））、ペッパー（トウガラシ（Capsicum annuum）、カプシカム・シネンゼ（Capsicum chinense）、およびキダチトウガラシ（Capsicum frutescens））、レタス（レタス（Lactuca sativa）、ラクトウカ・ペレンニス（Lactuca perennis）、およびアメリカニガナ（Lactuca pulchella））、キャベツ（アブラナ属種（Brassica spp.））、セロリ（Apium graveolens）、ナス（Solanum melongena）、ラッカセイ（Arachis hypogea）、ソルガム（ソルガム属種（Sorghum spp.））、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa））、ニンジン（Daucus carota）、マメ（インゲンマメ属種（Phaseolus spp.）および他の属）、オート（エンバク（Avena sativa）およびストリゴーサ（Avena strigosa））、エンドウマメ（エンドウ属（Pisum）、ササゲ属（Vigna）、およびテトラゴノロブス属種（Tetragonolobus spp.））、ヒマワリ（Helianthus annuus）、カボチャ（Squash）（カボチャ属種（Cucurbita spp.））、キュウリ（Cucumis sativa）、タバコ（タバコ属種（Nicotiana spp.））、アラビドプシス属（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana））、シバクサ（ロリウム属（Lolium）、ヌカボ属（Agrostis）、イナゴツナギ属（Poa）、ギョウギシバ属（Cynodon）および他の属）、クローバー（シャジクソウ属（Trifolium））、ベッチ（ソラマメ属（Vicia））に形質転換する。
【０３６６】
ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３によって付与されるグリホサート抵抗性は、多くの落葉と常緑木材の作付け体系におけるシーズン使用のためのグリホサート除草剤の適用性を増加させる。グリホサート除草剤抵抗性の樹種は、損傷を懸念せずに、これらの除草剤の過度の使用の柔軟性を高める。このように、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３は、樹種：ハンノキ（ハンノキ属種（Alnus spp.））、セイヨウトネリコ（トネリコ属種（Fraxinus spp.））、アスペンおよびポプラ種（ポプラ属種（Populus spp.））、ブナノキ（ブナ属種（Fagus spp.））、カバノキ（カバノキ属種（Betula spp.））、チェリー（サクラ属種（Prunus spp.））、ユーカリ（ユーカリ属種（Eucalyptus spp.））、ヒッコリー（ペカン属種（Carya spp.））、カエデ（カエデ属種（Acer spp.））、オーク（コナラ属種（Quercus spp.））、およびマツ（マツ属種（Pinus spp.））に形質転換される。
【０３６７】
グリホサート除草剤抵抗性は、観賞用や果物有利子種における選択的雑草防除のためのグリホサート除草剤の適用性を高める。このように、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３は、観賞用および果物有利子種：バラ（バラ属種（Rosa spp.））、ホウキグサ（ニシキギ属種（Euonymus spp.））、ペチュニア（ペチュニア属種（Petunia spp.））、ベゴニア（begonia）（ベゴニア属種（Begonia spp.））、シャクナゲ（rhododendron）（シャクナゲ属種（Rhododendron spp.））、クラブアップルまたはアップル（リンゴ属種（Malus spp.））、セイヨウナシ（ナシ属種（Pyrus spp.））、モモ（サクラ属種（Prunus spp.））、およびマリーゴールド（マンジュギク属種（Tagetes spp.））に形質転換される。
【実施例１５】
【０３６８】
他の形質とのスタッキング
昆虫抵抗性（ＩＲ）形質を含むトランスジェニック作物は、北米全体でトウモロコシ、ダイズ、およびワタ植物で広く行き渡っており、これらの形質の利用が世界中に拡大している。昆虫抵抗性と除草剤耐性（ＨＴ）の形質を組み合わせた市販のトランスジェニック作物は、複数の種子会社によって開発されている。これらは、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）の形質（例えば、ウェブサイトlifesci.sussex.ac.uk、2006で列挙されているＢｔ毒素）、非Ｂｔ昆虫抵抗性形質、および上記のＨＴ形質のいずれかまたはすべてを含む。ＩＲ形質を介した複数の害虫問題を制御する能力は、価値のある商業的な製品コンセプトである。しかしながら、雑草防除および昆虫防除が互いに独立している場合は、この製品コンセプトの利便性が制限される。
【０３６９】
ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３は、単独でまたは１つまたは複数の追加のＨＴ形質と積み重ねられて、従来の育種を通じて、または新たな形質転換事象として一緒に、１つまたは複数の追加のインプット形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、またはストレス耐性など）と積み重ねられる（www.isb.vt.edu参照）。ＩＲ形質（複数可）は、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３とともに積み重ねられる。ＩＲ形質のコード配列を取得すると、発現エレメント（例えば、プロモーター、イントロン、３’ＵＴＲなど）が追加され、ＩＲ形質は、組換えＤＮＡ方法論を介して、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３とともに分子的に積み重ねられる。
【０３７０】
ＩＲ形質は、Ｃｒｙ１Ｆ（米国特許第５，１２６，１３３号；第５，１８８，９６０号；第５，６９１，３０８号；第６，０９６，７０８号；第６，５７３，２４０号；および第６，７３７，２７３号）、Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）（米国特許第６，１１４，１３８号；第５，７１０，０２０号；第６，２５１，６５６号；および第６，２２９，００４号）、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３のいずれかとのトリプルスタックとしてのＣｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａ（ｃ）、Ｃｒｙ３４Ａｂ（１）（米国特許第７，３２３，５５６号；第７，８９７，３４２号；第７，８８８，４９５号；第７，８７５，４３０号；第７，９３２，０３３号；第７，９５６，２４６号；第６，３４０，５９３号）、Ｃｒｙ３５Ａｂ（１）（米国特許第６，３４０，５９３号；第７，３２３，５５６号；第７，８９７，３４２号；第７，８８８，４９５号；第７，８７５，４３０号；第７，９３２，０３３号；第７，９５６，２４６号）、および／またはｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３とのトリプルスタックとしてのＣｒｙ３５Ａｂ（１）およびＣｒｙ３４Ａｂ（１）を含む。
【０３７１】
利点は、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３によって提供される改善された雑草防除を含み、これは、先の実施例に記載され、害虫および／または他の農学的ストレスを管理する能力と連結される。ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、および／またはｄｇｔ−３３と積み重ねられたこのような形質を備えた植物は、柔軟かつコスト効果的に様々な農学的な問題を制御する能力を有する、改善された作物の品質の完全な農学的パッケージを提供する。組み合わせられたＩＲおよびＨＴ形質は、大部分の農学的および園芸用／観賞用作物および林業における適用を有する。
【０３７２】
ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３の組合せ、およびＢｔまたは非ＢｔのＩＲ遺伝子の数のいずれかによって提供される同等の除草剤耐性と昆虫抵抗性は、本明細書に列挙されている作物種に適用することができる。このような作物における、本明細書に列挙されている様々な商業的な除草剤のいずれかの使用は、従来の育種または遺伝子操作のいずれかによって、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３の形質転換、および対応するＨＴ形質またはＩＲ形質との積み重ねによって可能にされる。これらの化学を代表する除草剤の特定の適用比率は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍または類似の編集においてコンパイルされた除草剤ラベル、またはオンラインでコンパイルされたラベル（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、またはいずれかの商業的または学術的な作物保護ガイド、例えば、Agriliance (2005)からの作物保護ガイドによって決定される。
【実施例１６】
【０３７３】
任意の作物におけるＡＡＤ形質と積み重ねられたＤＧＴ形質
従来の育種を通じて、または新たな形質転換事象として一緒に、ｄｇｔ形質をａａｄ形質（例えば、米国特許第７，８３８，７３３号に記載さているａａｄ−１；またはＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２００７／０５３４８２Ａ２号に記載されているａａｄ−１２）と積み重ねることによって、雑草防除効率、柔軟性、および雑草転換と除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善される。
【０３７４】
ａａｄ−１を用いた作物の形質転換により、栽培者は、単子葉作物におけるアリールオキシアルカノエート除草剤を選択的に適用することができる。このような単子葉作物は、フェノキシオーキシンの安全性のより高いマージンを有することになる。さらに、フェノキシオーキシンは、ａａｄ−１で形質転換された双子葉作物に選択的に適用することができる。ａａｄ−１２を用いた作物の形質転換により、栽培者は、雑草種を防除するために、双子葉作物においてピリジルオキシオーキシンおよびアリールオキシアルカノエート除草剤を選択的に適用することができる。ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３をａａｄ−１またはａａｄ−１２形質と積み重ねることによって、栽培者は、雑草の管理のために幅広い除草剤が提供される。さらに、除草剤の組合せの使用は、雑草種内の除草剤抵抗性を管理するためにより多くの柔軟性をもたらす。
【０３７５】
以下の雑草防除オプションは、植物に提供され、ここで、ｄｇｔ形質とａａｄ形質は、任意の単子葉作物種または双子葉作物種において積み重ねられる：
Ａ．グリホサートは、ほとんどの草と広葉雑草種の防除のために、標準的な発芽後の適用比率（４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）で適用される。ｄｇｔ形質は、グリホサートのこれらの適用比率で耐性を提供することができる。ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）のようなグリホサート抵抗性の広葉雑草、またはグリホサートでの防除が本質的に困難である雑草（例えば、ツユクサ属種（Commelina spp））の防除のために、２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ（例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の２，４−Ｄが、連続的に適用され、タンク混合され、またはグリホサートとの予混合として適用され、さらなる防除を付与する。ａａｄ−１とａａｄ−１２はともに２，４−Ｄに対する耐性を提供する。さらに、ａａｄ−１２は、トリクロピルおよびフルロキシピルなどのピリジルオキシオーキシン除草剤に対する耐性を提供する。ピリジルオキシオーキシン除草剤は、ヒメムカシヨモギ（Conyza canadensis）とツユクサ属種（Commelina spp）のようなグリホサート抵抗性の広葉雑草を防除するために適用される。トリクロピルについては、適用比率は、典型的には、７０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、１４０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲である。フルロキシピルについては、適用比率は、典型的には、３５〜５６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、７０〜２８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲である。
【０３７６】
Ｂ．グリホサートは、ほとんどの草と広葉雑草種の防除のために、標準的な発芽後の適用比率（４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａ）で適用される。ボウムギ（Lolium rigidum）またはオヒシバ（Eleusine indica）のようなグリホサート抵抗性の草種の防除のために、１０〜２００ｇ  ａｅ／ｈａ（例えば、２０〜１００ｇ  ａｅ／ｈａ）のキザロホップが、連続的に適用され、タンク混合され、またはグリホサートとの予混合として適用され、効果的な防除を付与する。ａａｄ−１はキザロホップに対する耐性を提供する。作物種におけるｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３と組み合わせたａａｄ−１の積み重ねは、上述される除草剤に耐性である作物をもたらす。
【０３７７】
Ｃ．グリホサートは、広葉雑草種以外の草種の防除に有効である。ａａｄ−１およびｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３で積み重ねられた形質は、グリホサートの草に対する有効な比率（１０５〜８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、２１０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の適用を可能にする。次に、２，４−Ｄ（２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａで）が、連続的に適用され、タンク混合され、または草に対する有効な比率のグリホサートとの予混合として適用され、必要とされる広葉雑草の防除を付与する。１０〜２００ｇ  ａｅ／ｈａ（例えば、２０〜１００ｇ  ａｅ／ｈａおよび２０〜３５ｇ  ａｅ／ｈａ）でのキザロホップのようなＡＯＰＰ除草剤は、より強固なイネ科雑草防除のために、および／またはグリホサート抵抗性の草の発生の遅延のために使用される。また、低比率のグリホサートは、広葉雑草防除にいくつかの利点を与える；しかしながら、主要な防除は２，４−Ｄからのものである。
【０３７８】
Ｄ．同様に、ａａｄ−１２およびｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３で積み重ねられた形質は、グリホサートの草に対する有効な比率（１０５〜８４０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、２１０〜４２０ｇ  ａｅ／ｈａ）の適用を可能にする。次に、２，４−Ｄ（２８０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａで）が、連続的に適用され、タンク混合され、または草に対する有効な比率のグリホサートとの予混合として適用され、必要とされる広葉雑草の防除を付与する。また上記で言及された比率で使用されるトリクロピルおよびフルロキシピルは、処置レジメンにおいて許容される成分である。また、低比率のグリホサートは、広葉雑草防除にいくつかの利点を与える；しかしながら、主要な防除は、２，４−Ｄ、トリクロピル、またはフルロキシピルからのものである。
【０３７９】
１つまたは複数の市販のアリールオキシオーキシン除草剤の単独または組み合わせた（連続または独立して）使用は、作物へのａａｄ−１２の形質転換によって促進される。同様に、１つまたは複数の市販のフェノキシオーキシン除草剤の単独、または１つまたは複数の市販のＡＯＰＰ除草剤と組み合わせた（連続または独立して）使用は、ａａｄ−１によって促進される。これらの形質のいずれかとｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２、またはｄｇｔ−３３を積み重ねることによって、雑草種のより強固な管理を可能にする。これらの化学を代表する他の除草剤の特定の比率は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍においてコンパイルされた除草剤ラベルまたは類似の編集、またはオンラインでコンパイルされたラベル（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、またはいずれかの商業的または学術的な作物保護ガイド、例えば、Agriliance (2005)からの作物保護ガイドによって決定される。
【実施例１７】
【０３８０】
任意の作物におけるＡＨＡＳ形質で積み重ねられたｄｇｔ−２８
イミダゾリノン除草剤耐性（ＡＨＡＳ）をコードする形質は、現在、北米において植え付けられた多数の作物に存在するが、限定されないが、トウモロコシ、イネ、ヒマワリ、およびコムギが挙げられる。さらなるイミダゾリノン耐性作物（例えば、ワタ、およびサトウダイコン）が開発されつつある。多数のイミダゾリノン除草剤（例えば、イマザモックス、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピック）は、現在、様々な従来の作物において選択的に使用されている。イマゼタピル、イマザモックス、および非選択的なイマザピルの使用は、ＡＨＡＳのようなイミダゾリノン耐性形質を通じて促進されてきた。これまでのイミダゾリノン耐性ＨＴＣは、非トランスジェニックであるという利点を有する。また、この化学クラスは、有意な土壌残留活性を有し、したがって、グリホサートまたはグルホシネートに基づく系とは異なり、適用時期を超えて延びる雑草防除を提供することができる。しかしながら、イミダゾリノン除草剤によって防除される雑草の範囲は、グリホサートほど広くない（Agriliance, 2003）。さらに、イミダゾリノン除草剤は、多数の雑草が抵抗性を生じている作用機序（アセト乳酸合成酵素の阻害、ＡＬＳ）を有する（Heap I (2004)。除草剤抵抗性雑草の国際調査、www.weedscience.comで利用可能）。
【０３８１】
ｄｇｔ−２８は、従来の育種を通じて、または新たな形質転換事象として一緒に、イミダゾリノン耐性形質とともに積み重ねられ、雑草防除効率、柔軟性、および雑草転換と除草剤抵抗性の発生を管理する能力が改善される。
【０３８２】
以下の雑草防除オプションは、植物に提供され、ここで、ｄｇｔ形質とイミダゾリノン耐性形質は、任意の単子葉作物種または双子葉作物種において積み重ねられる：
Ａ．イマゼタピルは、多くの草と広葉雑草種の防除のために、標準的な発芽後の適用比率（３５〜２８０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、７０〜１４０ｇ  ａｅ／ｈａ）で適用される。
ｉ）コモンウォーターヘンプ（Amaranthus rudis）、オオブタクサ（Ambrosia trifida）、シロザ（Chenopodium album）（とりわけ、Heap, 2004）のようなＡＬＳ阻害剤抵抗性広葉雑草は、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除される。
ｉｉ）サツマイモ属種（Ipomoea spp.）のようなイミダゾリノン除草剤に対して、本質的により耐性な広葉種は、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除される。
ｉｉｉ）セイバンモロコシ（Sorghum halepense）およびドクムギ属種（Lolium spp.）のようなＡＬＳ阻害剤抵抗性イネ科雑草は、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除される。
ｉｖ）本質的に耐性なイネ科雑草種（例えば、シバムギ（Agropyron repens））は、４２０〜２１６０ｇ  ａｅ／ｈａ、例えば、５６０〜１１２０ｇ  ａｅ／ｈａでグリホサートをタンク混合することによって防除される。
【０３８３】
様々な市販のイミダゾリノン除草剤またはグリホサート除草剤のいずれかの単独で、または複数の組み合わせた使用は、ｄｇｔ−２８形質転換によって、および従来の育種もしくは遺伝子工学のいずれかによる任意のイミダゾリノン耐性形質と積み重ねることによって、促進される。これらの化学を代表する他の除草剤の特定の比率は、ＣＰＲ（Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）書籍においてコンパイルされた除草剤ラベルまたは類似の編集、またはオンラインでコンパイルされたラベル（例えば、cdms.net/manuf/manuf.asp）、またはいずれかの商業的または学術的な作物保護ガイド、例えば、Agriliance (2005)からの作物保護ガイドによって決定される。
【実施例１８】
【０３８４】
ダイズ形質転換
安定に組み込まれたｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）は、アグロバクテリウムを媒介したダイズ子葉節外植片の形質転換を介して生成される。機能的ｄｇｔ−２８を含有するバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株を、形質転換を開始するために使用する。
【０３８５】
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Zengら（Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482）の修正された半子葉節手法を用いて行われる。簡単に説明すると、ダイズ種子（品種マーベリック）を基本培地で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムで感染させる。シュート開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤を介した選択を、非形質転換シュートの生育を阻害するために使用する。選択されたシュートを、根の発育のために発根培地に移し、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移す。
【０３８６】
選択された苗木の末端の小葉は、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草剤（葉塗装技術）で局所的に処理される。スクリーニングされた苗木を、温室に移し、順化させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認する。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、除草剤選択マーカーおよびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認する。Ｔ０植物を温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を作製する。
【０３８７】
第２のダイズ形質転換法を用いて、追加のトランスジェニックダイズ植物を作製することができる。機能的ｄｇｔ−２８を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株を使用して、形質転換を開始する。
【０３８８】
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Paz et al.（Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213）の修正された半種子手法を用いて実施される。簡単に説明すると、成熟ダイズ種子を、塩素ガスで一晩滅菌し、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換の２０時間前に滅菌Ｈ２Ｏを吸収させる。種子は、種子を分離し、種皮を除去するために、へそに沿って長手方向の切り込みによって半分に切断する。胚軸を切除し、いずれもの軸方向のシュート／芽を子葉節から除去する。得られた半種子の外植片をアグロバクテリウムで感染させる。シュート開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤選択を、非形質転換シュートの生育を阻害するために使用する。選択されたシュートを、根の発育のために発根培地に移し、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移す。
【０３８９】
選択された苗木の末端の小葉は、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草剤（葉塗装技術）で局所的に処理される。スクリーニングされた苗木は、温室に移され、順化させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認する。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、選択マーカーおよびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認する。いくつかの事象が、導入遺伝子を含むものとして同定される。これらのＴ０植物を、さらなる分析に進め、温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を生じさせる。
【０３９０】
Ｔ１世代へのｄｇｔ−２８の遺伝可能性の確認。Ｔ１世代へのＤＧＴ−２８タンパク質の遺伝可能性は、２つの方法のうちの１つにおいて評価された。第１の方法は、メトロミックス培地にＴ１種子を植え付け、第１の三つ葉成長段階で発芽した植物に４１１ｇ  ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ（商標）２８０ＳＬを適用することを含んだ。第２の方法は、ボールベアリングとジェノグラインダーを用いて、全８回の反復について種子を均質化することからなっていた。次に、ＰＡＴタンパク質を検出するためのＥＬＩＳＡストリップ試験は、選択マーカーがｄｇｔ−２８と同じプラスミド上にあるため、遺伝可能な事象を検出するために使用された。単一の植物がグルホシネートに耐性であった場合、またはＰＡＴ  ＥＬＩＳＡストリップ試験で検出された場合のいずれの方法について、事象は、Ｔ１世代への遺伝可能性を実証した。
【０３９１】
全５つの構築物は、前述のように、遺伝可能性についてスクリーニングされた。プラスミドは、ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３と連結されたｄｇｔ−２８を含んだ。構築物全体の事象は、Ｔ１世代へのＰＡＴ：：ＤＧＴ−２８タンパク質の遺伝可能性が６８％であることを実証した。
【０３９２】
ｄｇｔ−２８形質転換Ｔ１ダイズにおける発芽後の除草剤耐性。前述のスクリーニング法によって、遺伝可能性であることが決定されたＴ１事象由来の種子は、温室条件下でメトロミックス培地に植え付けられた。第１の三つ葉が完全に展開されるまで植物を生育させ、前述のように、ｐａｔ遺伝子の選択のために４１１ｇ  ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ（商標）２８０ＳＬで処理した。それぞれの事象由来の抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、十分な植物が存在する場合に処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、野生型のプチハバナタバコと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ（商標）ジメチルアミン塩（ＤＭＡ）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
【０３９３】
【表２４】
0006537825.tif 000030
【０３９４】
Ｔ２世代における高いグリホサート率に対するｄｇｔ−２８保護。４５個の植物の後代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の２〜５個のＴ２株に対して行われた。ホモ接合体株は、前の世代に完成した接合性分析に基づいて選択された。前述のように種子を植え付けた。次に、植物は、前述のようなｐａｔ選択マーカーの選択のために、４１１ｇ  ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ  ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントした。
【０３９５】
ｄｇｔ−２８と連結されたＴｒａＰ４を含む構築物（ｐＤＡＢ１０７５４３およびｐＤＡＢ１０７５４８）について、試験された１２個の株のうち９個は分離せず、それによって、Ｔ２世代において均一な株を確認した。ｄｇｔ−２８と連結されたＴｒａＰ８を含む株（ｐＤＡＢ１０７５４５）は、４つの株のうち２つは分離がないことを実証し、ダイズにおけるｄｇｔ−２８の少なくとも２つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。組織試料は、抵抗性植物から採取され、ＤＧＴ−２８タンパク質は、標準的なＥＬＩＳＡ法によって定量された。データは、試験された非分離のＴ２株について、３２．８〜１０７．５ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均ＤＧＴ−２８タンパク質を実証した。構築物ｐＤＡＢ１０７５５３（ＴｒａＰ２３：：ｄｇｔ−２８）由来の株は、グルホシネートで以前に選択されなかった。グリホサートの用量反応は、均質性と高い比率のグリホサートに対する耐性を試験するために利用された。構築物ｐＤＡＢ１０７５５３由来の株からの複製物は、５６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲の比率に耐性であり、したがって、少なくとも２つの世代で均質な集団であり、遺伝可能性であることが確認された。
【０３９６】
５６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡの比率は、前述のように２〜３個の三つ葉のダイズに適用された。１４ＤＡＴの視覚的損傷データは、Ｔ１世代において実証された耐性結果を確認した。
【０３９７】
【表２５】
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【実施例１９】
【０３９８】
ｄｇｔ−２８を用いたイネの形質転換
典型的な形質転換方法において、安定に組み込まれたｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックイネ（コメ（Oryza sativa））は、滅菌したイネ種子のアグロバクテリウムを媒介した形質転換を介して生成される。機能的ｄｇｔ−２８を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株は、形質転換を開始するために使用される。
【０３９９】
培養培地は、１ＭのＫＯＨでｐＨ５．８に調整され、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で固化される。胚発生カルスは、３０ｍｌの半固形培地を含む１００×２０ｍｍのペトリ皿中で培養される。イネ苗木は、ＭＡＧＥＮＴＡボックス中の５０ｍｌの培地上で生育される。細胞懸濁液は、３５ｍＬの液体培地を含む１２５ｍｌのコニカルフラスコ中で維持され、１２５ｒｐｍで回転させる。胚発生培養の誘導および維持は、２５〜２６℃にて暗所で発生させ、植物再生および全植物体培養は、１６時間の光周期（Ｚｈａｎｇら、１９９６）を用いて照明の部屋で発生させる。
【０４００】
胚発生カルスの誘導および維持は、前述されるような改変されたＮＢ基礎培地（Ｌｉら、１９９３）上で行われ、ここで、培地は、５００ｍｇ／Ｌのグルタミンを含むように適合される。懸濁培養物は、マルトースの代わりに３０ｇ／Ｌのスクロースを含む、ＳＺ液体培地（Ｚｈａｎｇら、１９９８）中で開始され、維持される。浸透培地（ＮＢＯ）は、それぞれ０．２５６Ｍのマンニトールとソルビトールの添加を伴うＮＢ培地からなる。除草剤抵抗性カルスは、３〜４週間、適切な除草剤選択剤が補足されたＮＢ培地上で選択される。プレ再生は、１週間、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１ｍｇ／ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５ｍｇ／ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）と選択的除草剤を含むＮＢ培地からなる培地（ＰＲＨ５０）上で行われる。苗木の再生は、推定上、トランスジェニックシュートが再生されるまで、２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび選択的除草剤を含有するＮＢ培地を含む再生培地（ＲＮＨ５０）上での培養に続く。シュートは、１％スクロースと選択的除草剤が補足された、半強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ基本塩とＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミンを含む発根培地に移される。
【０４０１】
コメ（Oryza sativa）Ｌ．ジャポニカ品種Ｔａｉｐｅｉ３０９の成熟乾燥種子は、Ｚｈａｎｇら、１９９６に記載されるように滅菌される。胚発生組織は、暗所においてＮＢ培地上で滅菌成熟イネ種子を培養することによって誘導される。約１ｍｍ径の一次カルスは、胚盤から取り出され、ＳＺ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用される。次に、懸濁液は、Zhang、1996に記載されるように維持される。懸濁誘導された胚発生組織は、先の継代培養から３〜５日後、液体培地から取り出され、ＮＢＯ浸透培地上に配置され、ペトリ皿全体において約２．５ｃｍの円を形成し、照射前４時間、培養される。照射の１６〜２０時間後、組織をＮＢＯ培地からＮＢＨ５０選択培地に移し、照射表面が上を向いていることを確認し、暗所にて１４〜１７日間インキュベートされる。次に、新たに形成されたカルスは、元の照射された外植片から分離され、同じ培地上で、近くに配置される。さらに８〜１２日後、比較的にコンパクトであり、不透明なカルスは、視覚的に識別され、暗所での７日間、ＰＲＨ５０プレ再生培地に移される。次に、よりコンパクトで不透明になる成長中のカルスは、１６時間の光周期の下で１４〜２１日間、ＲＮＨ５０再生培地上で継代培養される。再生中のシュートは、１／２のＭＳＨ５０培地を含むＭＡＧＥＮＴＡボックスに移される。単一の外植片から再生された複数の植物は、同胞種であると考えられ、１つの独立した植物株として処理される。植物は、厚く、白い根を生成し、１／２のＭＳＨ５０培地上で積極的に成長している場合、ｄｇｔ−２８遺伝子について陽性として採点される。苗木がＭＡＧＥＮＴＡボックスの最上部に達すると、１００％湿度で１週間、６ｃｍポット中の土壌に移され、次に、３０℃にて１４時間の光周期の成長チャンバーに移動させ、温室において１３ｃｍポットに移植される前に、２１℃にて２〜３週間、暗所に配置される。種子を回収し、４℃で保存する前に１週間、３７℃で乾燥させる。
【０４０２】
ｄｇｔ−２８イネのＴ０分析。アグロバクテリウム形質転換を介して得られた植え付けられたイネ形質転換体を培地に移植し、温室条件に順化させた。すべての植物は、ｄｇｔ−２８のＰＣＲ検出のためにサンプリングされ、結果は、ｐＤＡＢ１１０８２７（ＴｒａＰ８：：ｄｇｔ−２８）について２２個のＰＣＲ陽性事象と、ｐＤＡＢ１１０８２８（ＴｒａＰ２３：：ｄｇｔ−２８）について１６個のＰＣＲ陽性事象の最小を実証する。ＰＣＲ陽性事象のｄｇｔ−２８についてのサザン分析は、両方の構築物について単一（１〜２コピー）事象を実証した。選択されたＴ０事象のタンパク質発現は、ＤＧＴ−２８タンパク質の発現が、検出レベル未満から１３０ｎｇ／ｃｍ２の範囲であることを実証した。構築物ｐＤＡＢ１１０８２８からの選択されたＴ０事象は、前述されるように２２４０ｇ  ａｅ／ｈａのＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）で処理され、処置の７および１４日後に評価された。データは、適用されたグリホサートの比率に強固な耐性を実証した。すべてのＰＣＲ陽性植物は、さらなる特徴付けのためにＴ１種子を生成させた。
【０４０３】
イネにおけるｄｇｔ−２８遺伝可能性。１００個の植物後代検定は、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ８を含む構築物ｐＤＡＢ１１０８２７からのｄｇｔ−２８の４つのＴ１株において行われた。種子は、培地で満たされたポットに植えられた。次に、すべての植物は、前述されるように、ｄｇｔ−２８遺伝子の選択について、５６０ｇ  ａｅ／ｈａのＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）で噴霧された。７ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物をカウントした。それぞれの構築物について試験された４つの株のうちの２つは、カイ二乗分析によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ｄｇｔ−２８は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である。
【０４０４】
ｄｇｔ−２８形質転換されたＴ１イネにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定において使用されるそれぞれの事象からのＴ１抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、野生型のキタアケイネと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜２２４０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
【０４０５】
噴霧結果は、７ＤＡＴ（処置後の日数）で、高い比率のグリホサートに対する最小植物損傷が検出されたことを実証する（データ示さず）。
【０４０６】
【表２６】
0006537825.tif 000032
【０４０７】
ＤＧＴ−２８のタンパク質検出は、ｐＤＡＢ１１０８２７から試験された４つすべてのＴ１株からの複製物について評価された。データは、ＤＧＴ−２８平均タンパク質が、ヘミ接合複製物とホモ接合複製物について、それぞれ２０〜８２ｎｇ／ｃｍ２と２１〜２０９ｎｇ／ｃｍ２の範囲であることを実証した。これらの結果は、Ｔ１世代に対する安定なタンパク質発現と、選択のために使用された５６０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート適用後の最大２２４０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまでのｄｇｔ−２８イネの耐性を実証した。
【実施例２０】
【０４０８】
ｄｇｔ−２８を用いたシバクサの形質転換
クリーピングベントグラスにおけるｄｇｔ−２８導入遺伝子のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介した遺伝的形質転換は、種子から開始される胚発生カルスを介して達成される（栽培品種Ｐｅｎｎ−Ａ−４）。「Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation」（Luo et. al., 2004）を参照されたい。
【０４０９】
カルス細胞は、単子葉植物特異的プロモーターによって駆動される除草剤抵抗性導入遺伝子（例えば、ｄｇｔ−２８）を含むスーパーバイナリーベクターを有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）菌株で感染させる。全体的に安定した形質転換効率は、１８％〜４５％の範囲である。サザンブロットおよび遺伝的分析は、クリーピングベントグラスのゲノム内への導入遺伝子の組み込みと、Ｔ１世代における導入遺伝子の正常な伝達および安定な発現を確認する。すべての独立した形質転換事象は、導入遺伝子の１〜３コピーを担持し、過半数（６０〜６５％）は、明らかな再配列なしに導入遺伝子の単一コピーのみを含む。
【０４１０】
成熟種子は、サンドペーパーで脱穀され、９０分間激しく振とうしながら、１０％（ｖ／ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ（商標）漂白剤（６％次亜塩素酸ナトリウム）＋０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリソルベート２０）中で表面を滅菌する。滅菌蒸留水で５回濯いだ後、種子をカルス誘導培地（ＭＳ基礎塩およびビタミン類、３０ｇ／ｌスクロース、５００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、６．６ｍｇ／ｌ  ３，６−ジクロロ−ｏ−アニス酸（ジカンバ）、０．５ｍｇ／ｌ  ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および２ｇ／ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌに入れる。培地のｐＨを５．７に調整し、その後、１２０℃で２０分間オートクレーブする。）
【０４１１】
調製された種子外植片を含有する培養プレートを６週間、室温で暗所にて維持する。胚発生カルスを視覚的に選択し、共培養前の１週間、室温で暗所にて新鮮なカルス誘導培地上で継代培養する。
【０４１２】
アグロバクテリウムを媒介した感染の前日に、胚発生カルスは、１〜２ｍｍの小片に分割され、１００μＭアセトシリンゴンを含むカルス誘導培地上に置かれる。次に、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を保有するアグロバクテリウム懸濁液（６６０ｎｍでＯＤ＝１．０）の１０μｌアリコートは、カルスのそれぞれの小片に適用され、その後、２５℃で暗所にて３日間共培養される。続いて、カルスを移し、細菌の増殖を抑制するために、１２５ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび２５０ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地上で２週間培養する。
【０４１３】
カルスが、２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび除草剤を含むカルス誘導培地に移されるとき、トランスジェニック植物の選択が生じる。カルス材料は、３週間の選択継代間隔で８週間、この培地上で維持される。選択プロセスは、室温で暗所にて行われる。
【０４１４】
植物再生のために、除草剤抵抗性の増殖中のカルス事象は、最初に、セフォタキシムと選択のための除草剤が補足された再生培地（ＭＳ基礎培地、３０ｇ／ｌスクロース、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰおよび２ｇ／ｌ  Ｐｈｙｔａｇｅｌ）に移される。これらのカルスを暗所で室温にて１週間維持し、次に、シュートを発生させるために２〜３週間明所に移す。
【０４１５】
発生したシュートを分離し、除草剤およびセフォタキシムを含むホルモン不含の再生培地に移し、選択圧を維持し、いずれもの残りのアグロバクテリウム細胞を抑制しながら、根の成長を促進させる。次に、十分に育った根（３〜５週間）を有する苗木は、温室内または野外のいずれかで土壌に移し、生育される。
【０４１６】
トランスジェニック植物は、１２月の冬至まで、封じ込め苗床（３〜６カ月）でドアの外で維持される。次に、春化処理された植物は、温室に移され、２５℃にて１６／８時間光周期の下で維持され、他の花粉源からトランスジェニック植物を物理的に隔離する非トランスジェニック対照植物に囲まれる。トランスジェニック植物は、温室に戻された後の３〜４週間で開花が始まる。これらの植物は、周囲の対照植物からの花粉を用いて異種交配される。それぞれの個別のトランスジェニック植物から回収された種子は、２５℃にて土壌中で発芽し、Ｔ１植物は、さらなる分析のために温室で生育される。
【０４１７】
他の草は、記述されたプロトコールに従ってｄｇｔ−２８を用いて形質転換される。草には、スズメノカタビラ（Annual meadowgrass）（Poa annua）、バヒアグラス（Bahiagrass）、ベントグラス（Bentgrass）、バミューダグラス（Bermudagrass）、ブルーグラス（Bluegrass）、ブルーステムス（Bluestems）、ビロードキビ（Brachiaria）、ブロムグラス（Bromegrass）、ブラウントップ・ベント（Browntop bent）（アグロスチス・キャピラリーズ（Agrostis capillaries））、バッファログラス（Buffalograss）、カナリーグラス（Canary Grass）、カーペットグラス（Carpetgrass）、ムカデシバ（Centipedegrass）、チューイングス・フェスク（Chewings fescue）（イトウシノケグサ（Festuca rubra commutate））、メヒシバ（Crabgrass）、クリーピング・ベント（Creeping bent）（コヌカグサ（Agrostis stolonifera））、クレステッド・ヘアグラス（Crested hairgrass）（コエレリア・マクランタ（Koeleria macrantha））、ダリスグラス（Dallisgrass）、フェスク（Fescue）、フェストリウム（Festolium）、ハード／シープ・フェスク（Hard/sheeps fescue）（ウシノケグサ（Festuca ovina））、グラーマグラス（Gramagrass）、インディアングラス（Indiangrass）、ジョンソングラス（Johnsongrass）、ラブグラス（Lovegrass）、ミックス（エクイン（Equine）、パスチュア（Pasture）など）、ネイティブグラス（Native Grasses）、オーチャードグラス（Orchardgrass）、ペレニアルライグラス（Perennial ryegrass）（ペレニアルライグラス（Lolium perenne））、レッドトップ（Redtop）、イヌムギ（Rescuegrass）、一年草および多年草のライグラス（Ryegrass）、スレンダークリーピングレッドフェスク（Slender creeping red fescue）（フェスチュカ・ルブラ・トリコフィラ（Festuca rubra trichophylla））、ナガハグサ（Smooth-stalked meadowgrass）（ポア・プラテンシス（Poa pratensis））、セントオーガスチン（St. Augustine）、ストロングクリーピングレッドフェスク（Strong creeping red fescue）（フェスチュカ・ルブラ・ルブラ（Festuca rubra rubra））、スーダングラス（Sudangrass）、スイッチグラス（Switchgrass）、オニウシノケグサ（Tall fescue）（フェスチュカ・アルンジナセア（Festuca arundinacea））、ヒロハノコメススキ（Tufted hairgrass）（デスチャンプシア・カエピトーサ（Deschampsia caespitosa））、シバクサ（Turfgrasses）、ウィートグラス（Wheatgrass）、およびゾイシアグラス（Zoysiagrass）が含まれる。
【実施例２１】
【０４１８】
ｄｇｔ−２８を用いたアブラナ属種（Brassica spp.）の形質転換
グリホサートに対する抵抗性を付与するｄｇｔ−２８遺伝子は、アグロバクテリウムを媒介した形質転換を用いて、セイヨウアブラナ（Brassica napus）変種Ｎｅｘｅｒａ（商標）７１０を形質転換するために使用される。
【０４１９】
セイヨウアブラナ（Brassica napus）種子は、１０分間、１０％の市販の漂白剤を用いて表面滅菌され、滅菌蒸留水で３回濯がれる。次に、種子を半分の濃度のＭＳ基礎培地（Murashige and Skoog, 1962）に置き、２５℃、１６時間光／８時間暗の光周期に設定された生育レジームの下で維持する。
【０４２０】
胚軸セグメント（３〜５ｍｍ）は、５〜７日齢の実生から切り出され、前処理として３日間、カルス誘導培地Ｋ１Ｄ１（１ｍｇ／ｌカイネチンおよび１ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを含むＭＳ培地）に置かれる。次に、セグメントは、ペトリ皿に移され、ｄｇｔ−２８含む構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株で処理される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、１５０ｒｐｍにてシェーカー上で、一晩、２８℃、暗所で増殖させ、その後、培養培地中に再懸濁される。
【０４２１】
アグロバクテリウムを用いた胚軸セグメントの３０分間の処理後、これらのセグメントは、３日間、カルス誘導培地に戻される。共培養後、セグメントは、回復の一週間、Ｋ１Ｄ１ＴＣ（２５０ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび３００ｍｇ／ｌチメンチンを含むカルス誘導培地）に置かれる。あるいは、セグメントは、選択培地Ｋ１Ｄ１Ｈ１（除草剤を含む上記培地）上に直接置かれる。カルベニシリンおよびチメンチンは、アグロバクテリウムを死滅させるために使用される抗生物質である。選択剤は、形質転換細胞の増殖を可能にする。
【０４２２】
単離された独立した事象からのカルス試料をＰＣＲによって試験する。ｄｇｔ−２８の存在について試験で陽性である試料を確認し、再生用の培地に進める。次に、硬化した胚軸セグメントは、Ｂ３Ｚ１Ｈ１（ＭＳ培地、３ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／ｌゼアチン、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、５ｍｇ／ｌ硝酸銀、選択的除草剤、カルベニシリンおよびチメンチン）シュート再生培地に置かれる。３週間後、シュートは再生を始める。シュートとともに胚軸セグメントは、さらに３週間、Ｂ３Ｚ１Ｈ３培地（ＭＳ培地、３ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン、１ｍｇ／ｌゼアチン、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、５ｍｇ／ｌ硝酸銀、選択的除草剤、カルベニシリンおよびチメンチン）に移される。
【０４２３】
シュートは胚軸セグメントから切り出され、２〜４週間、シュート伸長培地ＭＥＳＨ１０（ＭＳ、０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ、選択的除草剤、カルベニシリン、チメンチン）に移される。伸長したシュートは、ＭＳＩ．１（０．１ｍｇ／ｌインドール酪酸を含むＭＳ）上で根の誘導のために培養される。植物が根系を確立したとき、植物を土壌に移植する。植物は、温室に移す前の１〜２週間、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）中で制御された環境条件下で順化される。
【０４２４】
形質転換されたＴ０植物は、Ｔ１種子を得るために温室で自家受粉される。Ｔ０植物とＴ１子孫は、ｄｇｔ−２８遺伝子による保護レベルを確立するために、ある範囲のグリホサート除草剤濃度で噴霧される。
【実施例２２】
【０４２５】
ｄｇｔ−２８を用いたタバコの形質転換
タバコ（cv. Petit Havana）の葉片を、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いて形質転換する。ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むプラスミドを含有する単一コロニーを、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１２５μｇ／ｍＬ）を含有する４ｍＬのＹＥＰ培地に植菌し、１９０ｒｐｍの振とう機上で一晩２８℃にてインキュベートする。その後、４ｍＬの種子培養物を用いて、１２５ｍＬのバッフルされた三角フラスコ中で同じ培地の２５ｍＬの培養物を植菌する。この培養物を、ＯＤ６００が約１．２に達するまで１９０ｒｐｍで振とうしながら２８℃にてインキュベートする。次に、１０ｍＬのアグロバクテリウム懸濁液を、滅菌した６０×２０ｍｍのペトリ（商標）皿に配置する。
【０４２６】
ＰｈｙｔａＴｒａｙｓ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）における３０ｇ／Ｌのスクロースを含むＭＳ培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ  Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）上で無菌で成長させた植物の新鮮なカットされた葉片（０．５ｃｍ２）を、アグロバクテリウムの１０ｍＬの一晩培養物に数分間浸漬させ、滅菌ろ紙上にブロット乾燥させ、次に、１ｍｇ／Ｌインドール酢酸および１ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリンの添加を伴う同じ培地上に配置する。３日後、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を保有するアグロバクテリウムと共培養された葉片を、５ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含む同じ培地に移す。
【０４２７】
３週間後、個々のＴ０苗木を、１０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ培地に移し、さらに３週間後、土壌に移植し、温室に移す。選択されたＴ０植物（上述の分子分析プロトコールを用いて同定される）に、自家受粉させ、完全に乾燥したとき、種子をカプセルから回収する。Ｔ１実生は、接合性およびレポーター遺伝子発現（後述）についてスクリーニングされ、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含む選択された植物を同定する。
【０４２８】
植物は、根から寒天を洗浄し、１３．７５ｃｍの正方形ポット中の土壌に移植し、ポットをＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグ（ＳＣ  Ｊｏｈｏｎｓｏｎ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎ．）に置き、バッグの底に水道水を入れ、間接光中の３０℃の温室に１週間置くことによって温室に移動された。３〜７日後、バッグを開封した；植物を受精し、植物が温室で順化されるまで開封したバッグで成長させた。その時点でバッグを除去した。植物は、通常の暖かい温室条件（日中２７℃、夜間２４℃、日中１６時間、最小の自然光＋補足光＝１２００μΕ／ｍ２ｓ１）下で成長させた。
【０４２９】
繁殖前に、Ｔ０植物をＤＮＡ分析のためにサンプリングし、リアルタイムＰＣＲによってインサートｄｇｔ−２８のコピー数を決定した。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃にて２日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ中に配置し、試料をＫｅｌｃｏビーズミルを用いた１分間の乾式粉砕に供した。次に、標準のＤＮｅａｓｙ（商標）ＤＮＡ単離手法を続けた（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ  ６９０１９）。抽出したＤＮＡのアリコートをピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準とともに蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ（商標））において読み出し、濃度（ｎｇ／μｌ）を得た。総ＤＮＡの全１００ｎｇを鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、９７００Ｇｅｎｅａｍｐ（商標）サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施され、試料を９４℃で３分間と、９４℃で３０秒間、６４℃にて３０秒間および７２℃で１分４５秒の３５サイクル、ならびに７２℃で１０分間に供した。ＰＣＲ産物をＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析し、サザンブロットによって確認した。
【０４３０】
異なる葉緑体輸送ペプチド配列を含む３つの構築物（ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３）からのｄｇｔ−２８遺伝子の１〜３コピーを有する５〜９個のＰＣＲ陽性事象を再生し、温室に移した。
【０４３１】
すべてのＰＣＲ陽性植物は、標準的なＥＬＩＳＡによってＤＧＴ−２８タンパク質の定量のためにサンプリングされた。ＤＧＴ−２８タンパク質は、すべてのＰＣＲ陽性植物において検出され、タンパク質濃度が増加する傾向は、ｄｇｔ−２８のコピー数の増加とともに注目された。
【０４３２】
タバコにおけるａａｄ−１２（ｖ１）遺伝可能性。１００個の植物の後代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の５つのＴ１株について行われた。構築物は、以下の葉緑体輸送ペプチド配列：ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８またはＴｒａＰ２３の１つを含んだ。種子は、大部分、上記で例示されたアラビドプシス属（Arabidopsis）手法のように、層状にし、播種され、植え付けられたが、ヌル植物は、植え付け前に初期の選択によって除かれなかったことを除く。次に、すべての植物は、前述されるように、ｐａｔ選択マーカーの選択のために、２８０ｇ  ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ  ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントした。
【０４３３】
それぞれの構築物について試験された５つの株のうちの４つは、カイ二乗分析によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ｄｇｔ−２８は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である。
【０４３４】
ｄｇｔ−２８形質転換されたＴ１タバコにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定において使用されるそれぞれの事象からのＴ１抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、野生型のプチハバナ（Petite havana）タバコと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
【０４３５】
噴霧結果は、７ＤＡＴ（処置後の日数）で、高い比率のグリホサートに対する最小植物損傷が検出されたことを実証する（データ示さず）。１４ＤＡＴ後、視覚的損傷データは、構築物ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３からの単一コピーの事象と比較して、ＴｒａＰ４を含む構築物の単一コピー事象を用いて損傷の増加を実証する。表２７。
【０４３６】
【表２７】
0006537825.tif 000033
【０４３７】
これらの結果は、最大４４８０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまでのｄｇｔ−２８の耐性、ならびにｄｇｔ−２８遺伝子に連結された葉緑体輸送ペプチド配列によって与えられる耐性における相違を実証した。
【０４３８】
Ｔ２世代における高いグリホサート比率に対するｄｇｔ−２８保護。２５個の植物の後代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の２〜３個のＴ２株について行われた。ホモ接合体株は、前の世代において完成された接合性分析に基づいて選択された。前述のように、種子を層状にし、播種し、および移植した。次に、すべての植物は、前述のように、ｐａｔ選択マーカーの選択のために、２８０ｇ  ａｅ／ｈａのＩｇｎｉｔｅ  ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性と感受性の植物をカウントした。それぞれの構築物について試験されたすべての株は分離せず、それによって、Ｔ２世代において均一な株を確認し、タバコにおけるｄｇｔ−２８の少なくとも２つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。
【０４３９】
４２０〜３３６０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ  ＤＭＡ（商標）の比率は、前述したように、２〜３枚の葉タバコに適用された。視覚的損傷データ１４ＤＡＴは、Ｔ１世代において実証された耐性の結果を確認した。ＴｒａＰ４を含む構築物由来の２コピー株からの葉面結果が単一コピーのＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３株と同様の耐性を示した（データは示さず）。
【０４４０】
【表２８】
0006537825.tif 000034
【０４４１】
データは、非形質転換対照と比較して、２つの世代を通じて最大３３６０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサートまでｄｇｔ−２８タバコの強固な耐性を実証する。
【０４４２】
それぞれの事象から選択された植物は、標準的なＤＧＴ−２８  ＥＬＩＳＡによって、ＤＧＴ−２８タンパク質の分析のために、グリホサート適用前にサンプリングされた。データは、７２．８〜１１４．５ｎｇ／ｃｍ２の範囲の構築物全体で単一（１〜２コピー）株のＤＧＴ−２８平均タンパク質発現を実証した。データは、形質転換されたタバコのＴ２世代において、ｄｇｔ−２８がタンパク質を発現していることを実証し、耐性データは、機能的なＤＧＴ−２８タンパク質を確認する。
【０４４３】
除草スペクトルを広げるためのｄｇｔ−２８のスタッキング。ホモ接合ｄｇｔ−２８（ｐＤＡＢ１０７５４３とｐＤＡＢ１０７５４５）およびａａｄ−１２  ｖ１（ｐＤＡＢ３２７８）植物（後者についてＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２１３３参照）はともに相互交雑され、Ｆ１種子を回収した。それぞれの遺伝子の２つの相互交雑からのＦ１種子は層状にされ、それぞれの交雑の処理された６個の代表は、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａのグリホサート（ｄｇｔ−２８遺伝子について選択的である）、１１２０ｇ  ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ａａｄ−１２遺伝子について選択的である）、または記載される比率での２つの除草剤のタンク混合物で処理された。植物は、１４ＤＡＴで等級付けされた。噴霧結果を表２９に示す。
【０４４４】
【表２９】
0006537825.tif 000035
【０４４５】
結果は、ｄｇｔ−２８がａａｄ−１２（ｖ１）と首尾よく積層され得ることを確認し、したがって、対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤（ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１２についてそれぞれグリホサート＋フェノキシ酢酸）を増やす。防除が難しい広葉雑草または抵抗性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象とする作物の保護の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性はまた、ｄｇｔ−２８遺伝子を用いて積層することができる。
【実施例２３】
【０４４６】
コムギにおけるグリホサートに対する抵抗性
ＤＧＴ−２８をコードするバイナリーベクターの製造。ＤＧＴ−２８発現およびＰＡＴ選択カセットを含むバイナリーベクターを設計し、当該技術分野において一般的に知られている技法および技術を用いて組み立てた。それぞれのＤＧＴ−２８発現カセットは、プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）由来のユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子からの５’非翻訳領域とイントロン（Toki et al., Plant Physiology 1992, 100 1503-07）、続く５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子（ＤＧＴ−２８）の合成バージョンの５’端に融合された４つの輸送ペプチドのうちの１つ（ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８、ＴｒａＰ２３またはＴｒａＰ５）からなるコード配列を含み、植物における発現にコドン最適化されている。ＤＧＴ−２８発現カセットは、トウモロコシ（Z. mays）由来のリパーゼ遺伝子（Ｖｐ１）の転写ターミネーターとポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（Paek et al., Mol. Cells 1998 30;8(3) 336-42）を用いて終了させた。ＰＡＴ選択カセットは、プロモーター、コメ（Oryza sativa）由来のアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子からの５’非翻訳領域とイントロン（McElroy et al., The Plant Cell 1990 2( 2) 163-171）、続くストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離されたホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成バージョンから構成され、植物における発現にコドン最適化されている。ＰＡＴ遺伝子は、ホフィノトリシン、グルホシネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする（Wohlleben et al., Gene 1988, 70(1), 25-37）。選択カセットは、転写ターミネーターとカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ｓ遺伝子（Chenault et al., Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396）からのポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲで終了された。
【０４４７】
選択カセットは、市販の遺伝子合成販売会社（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成され、およびゲートウェイ対応のバイナリーベクターにクローニングされた。ＤＧＴ−２８発現カセットをｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした。得られたエントリークローンは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）発現カセットをコードするゲートウェイ対応のバイナリーベクターを用いて、ＬＲクロナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応に使用された。すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＭＡ）とＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）から得られた制限エンドヌクレアーゼを用いて、精製されたＤＮＡの制限消化によってスクリーニングされた。プラスミドＤＮＡ調製物は、供給業者の指示に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）またはＰｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を用いて実施された。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、ＡＢＩ  Ｓａｎｇｅｒ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１サイクル配列決定プロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定された。配列データを集め、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて分析した。
【０４４８】
得られた４つのバイナリー発現クローン：ｐＤＡＳ０００１２２（ＴｒａＰ４−ＤＧＴ２８）、ｐＤＡＳ０００１２３（ＴｒａＰ８−ＤＧＴ２８）、ｐＤＡＳ０００１２４（ＴｒａＰ２３−ＤＧＴ２８）およびｐＤＡＳ０００１２５（ＴｒａＰ５−ＤＧＴ２８）はそれぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０５に形質転換された。
【０４４９】
ｄｇｔ−２８発現構築物を用いたトランスジェニックコムギ事象の生成。４つのＤＧＴ−２８発現構築物のうちの１つを発現するトランスジェニックコムギ植物は、Wuら、Transgenic Research 2008、17:425-436に類似したプロトコールに従って、ドナーコムギ株Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨを使用して、アグロバクテリウムを媒介した形質転換によって生成された。推定されるＴ０トランスジェニック事象は、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性について選択され、表現型はＰＡＴ選択マーカーによって付与され、土壌に移された。Ｔ０植物を温室の閉じ込められた条件下で成長させ、Ｔ１種子を作製した。全体として、約４５個の独立したＴ０事象が、それぞれのＤＧＴ−２８発現構築物について生成された。
【０４５０】
Ｔ０コムギｄｇｔ−２８コムギ事象におけるグリホサート抵抗性。Ｔ０事象を温室で順化させ、２〜４枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで成長させた（すなわち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行された）。植物は、成熟するまで温室で１２時間の補足照明下で、２５℃にて成長させた。グリホサート耐性とＴａｑｍａｎ分析の初期スクリーニングは、前述したように、同じ条件下で成長させたＴ１植物について完了された。データは、さらに特徴付けられる遺伝可能なＴ１事象の決定を可能にした。６つの低コピー（１〜２コピー）と２つのマルチコピーＴ１事象は、温室条件下で植え替えられ、３葉期まで成長させた。Ｔ１植物は、非形質転換のコムギ株に重大な損傷を与えることができる４２０〜３３６０ｇ  ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの市販製剤（Ｄｕｒａｎｇｏ  ＤＭＡ（商標））で噴霧された。２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加は適用に含まれた。致死量は、Ｂｏｂ  Ｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨ非形質転換対照に対して＞７５％損傷を引き起こす比率として定義される。除草剤を適用した。
【０４５１】
この実施例では、グリホサート適用は、Ｔ１世代におけるｄｇｔ−２８遺伝子の分離を決定すること、ならびにグリホサートの増加レベルに対する耐性を実証することについて利用された。植物の応答は、処理から２１日後（ＤＡＴ）の視覚的損傷の規模に関して提示される。データは、２５％未満の視覚損傷（４）、２５％〜５０％の視覚損傷（３）、５０％〜７５％の視覚損傷（２）、および７５％を超える損傷（１）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、コムギ形質転換のために使用される各構築物について提示されている。個別の応答におけるスコア範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示される。野生型、非形質転換コムギ（栽培品種Ｂｏｂ  Ｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨ）は、グリホサート感受性対照として用いた。Ｔ１世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたグリホサートのそれぞれの比率について含まれた。ヘミ接合植物は、ホモ接合植物としての遺伝子の用量の半分を含み、したがって、グリホサートに対する応答の変動性は、Ｔ１世代で予想され得る。
【０４５２】
Ｔ１のｄｇｔ−２８コムギ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３を用いて、最大３３６０ｇ  ａｅ／ｈａの比率で達成されることを実証した。表３０。データは、低コピーのＴ１事象のものであるが、それぞれの構築物について、集団の代表的なものである。
【０４５３】
【表３０】
0006537825.tif 000036
【０４５４】
２１ＤＡＴで、抵抗性および感受性植物をカウントし、カイ二乗分析によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された株の割合を決定する。表３１。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝可能であることを実証する。
【０４５５】
【表３１】
0006537825.tif 000037
【０４５６】
ＤＧＴ−２８をコードするＴ−ＤＮＡの組み込みについてのＴ０トランスジェニック植物の分子確認。ゲノムＤＮＡは、すべて推定のＴ０コムギ植物の凍結乾燥された葉材料から抽出された。新鮮に回収した葉組織を液体窒素で急速凍結させ、−４０℃、１３３×１０−３ミリバール圧でＬａｂｃｏｎｃｏ  Ｆｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５（登録商標）（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ）において２４時間凍結乾燥させた。凍結乾燥された材料は、製造業者の指示に従って、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）植物ＤＮＡ抽出Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ抽出に供された。
【０４５７】
それぞれのＴ０植物からのＤＮＡは、持ち越しの（carryover）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株の存否について、およびＤＧＴ−２８をコードするＴ−ＤＮＡの組み込まれたコピー数について試験された。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株の存否は、内因性ユビキチン遺伝子を増幅するために二重Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイを用いて行われた（フォワードとリバースプライマーおよびプローブ：コムギゲノムからの
5' GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3'（配列番号８５；フォワードプライマー）
5' CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3'（配列番号８６；リバースプライマー）
5' TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3'（配列番号８７；プローブ）
およびｐＴｉＢｏ５４２からのｖｉｒＣ：
5' CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3'（配列番号８８；フォワードプライマー）
5' CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3'（配列番号８９；リバースプライマー）
5' TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3'（配列番号９０；プローブ））。
【０４５８】
組み込まれたＴ−ＤＮＡのコピー数は、Livak and Schmittgen（Methods 2001 25:402-8）の手法に従って、二重Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ｑＰＣＲアッセイを用いて推定された。アッセイは、六倍体コムギのＤゲノム中の内因性単一コピーのプロインドリン−ｂ（Ｐｉｎｂ）遺伝子（Gautier et al. Plant Science 2000 153, 81-91）：
5' ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3'（配列番号９１；フォワードプライマー）
5' TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3'（配列番号９２；リバースプライマー）
5' ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3'（配列番号９３；プローブ）
およびＴ−ＤＮＡに存在するアクチン（Ａｃｔ１）プロモーターの領域：
5' CTCCCGCGCACCGATCTG 3'（配列番号９４；フォワードプライマー）
5' CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3'（配列番号９５；リバースプライマー）
5' AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3'（配列番号９６；プローブ）
を増幅した。
【０４５９】
ｖｉｒＣから産物を増幅せず、内因性ユビキチンおよびイネアクチンプロモーターに対するプライマーで正しい産物が増幅された植物は、トランスジェニックとして分類された。組み込まれたＴ−ＤＮＡの数は、Livak and Schmittgen（Methods 2001 25:402-8）に従って、２ΔΔｃ（Ｔ）から推定された。全体的に、すべてのＴ０植物の約９５％は、Ｔ−ＤＮＡの少なくとも１つの組み込まれたコピーを有した。表３２。
【０４６０】
【表３２】
0006537825.tif 000038
【０４６１】
導入遺伝子の継承を追跡するためのＰＣＲ接合性アッセイの開発。Ｔ−ＤＮＡの組み込み部位に隣接する配列は、８つの制限エンドヌクレアーゼを用いた、精製されたゲノムＤＮＡの消化によって同定され、次に、制限エンドヌクレアーゼによって作製されたオーバーハングに特異的な二本鎖アダプターをライゲーションさせた。アダプターのライゲーション後、ＰＣＲは、ＤＧＴ−２８をコードするＴ−ＤＮＡの３’または５’末端のいずれかに対するビオチン化プライマーと、それぞれのアダプターに対するプライマーを用いて行われた。ＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ）上に捕捉され、精製された。次に、入れ子ＰＣＲを行い、増幅産物は、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（登録商標）自動化キャピラリー電気泳動プラットフォーム上のＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ｖ３．１化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、サンガー法により配列決定された。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて行われた配列分析は、（可能であれば）コンセンサス配列を生成させるために使用された。得られたコンセンサス配列とシングルトンは、コムギ変種チャイニーズ・スプリング（www.wheatgenome.org）のフロー選別された染色体腕についての組み立てられたゲノム調査配列コンティグに対するＢｌａｓｔＮクエリーとして用いられ、Ｔ−ＤＮＡ組み込みが生じた染色体を決定し、ＰＣＲ接合性アッセイの開発のためのサブゲノム特異的プライマーの設計を可能にした。
【０４６２】
２つのＰＣＲアッセイは、導入遺伝子の継承を次世代において追跡できるようにするそれぞれのトランスジェニック事象のために開発された。第１のアッセイ（以下、アウト−アウトＰＣＲと称する。）は、Ｔ−ＤＮＡの組み込み部位を横切って増幅するように設計された。このアッセイにおけるサブゲノム特異的な増幅は、標的遺伝子座を、コムギゲノム中の他の場所の遺伝子座の重複した（同祖とパラロガスの両方）コピーと区別したヌクレオチド配列バリエーション全体で、（ホスホロチオエート結合を含んだ）最後から２番目の塩基を配置するように設計されたプライマーを用いたオン−オフＰＣＲを使用して達成された。第２のアッセイ（以下、イン−アウトＰＣＲと称する。）は、Ｔ−ＤＮＡから内因性配列に増幅するように設計された。このアッセイは、アウト−アウトＰＣＲアッセイからのプライマーの１つと、ＤＧＴ−２８をコードするＴ−ＤＮＡの３’または５’末端に対して設計されたプライマーを利用した。ＰＣＲプライマーは、長さを１８〜２７ヌクレオチドとし、６０〜６５℃、最適には６３℃の融解温度を有するように設計された。アウト−アウトおよびイン−アウトＰＣＲアッセイはともに、２５μｌの反応体積中で、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｕ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、２５ｎｇ精製されたゲノムＤＮＡ、および０．４μＭの各プライマーを用いて行われた。ＰＣＲサイクル条件は、９８℃で３０秒間、続いて、（９８℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で６０秒間）の４０サイクルであった。表３３に示すように、トランスジェニック植物の接合性が割り当てられた。
【０４６３】
【表３３】
0006537825.tif 000039
0006537825.tif 000040
【０４６４】
グリホサート耐性についてのＴ１トランスジェニック植物の表現型の評価。ＤＧＴ−２８発現構築物を含むトランスジェニック事象はグリホサート耐性を示すかどうかを判断するために、個別の事象由来のＴ１植物は、温室に封じ込めた条件下で表現型について評価された。２つの表現型スクリーニングを行った。第１の（予備）スクリーニングにおいて、トランスジェニック事象（両方の表現型スクリーニングについて十分なＴ１種子を有する）は、グルホシネートとグリホサート耐性について評価され、ＤＧＴ−２８発現を確認し、事象間の除草剤耐性について順位を確立した。第２の（詳細な）スクリーニングにおいて、選択されたトランスジェニック事象は、異なる噴霧用量比率でグリホサート耐性について評価され、事象内、およびＤＧＴ−２８発現構築物間で付与された除草剤耐性のレベルを確立した。
【０４６５】
選択された事象あたり１２個のＴ１種子と、非形質転換ドナーコムギ株Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨの３つの複製物（各１２個の種子）を８５ｍｍポットに播種し、１２時間の光周期を与える補助照明を用いて、２５℃にて十分に水を与える条件下で２葉段階まで生育させた。ポットは、データ解析中に環境影響が除かれるように無作為化された設計で置かれた。スクリーニングされたトランスジェニック事象を表３４に列挙する。２葉段階で、すべてのＴ１植物と１２個の非形質転換ドナーコムギ植物の第１の複製物は、４２０ｇ  ａｉ／ｈａの用量比率でグルホシネートが噴霧された。植物は、４日後に視覚的に検査され、表現型応答の範囲を捕捉する代表的な植物は、０〜６のスコアリングスケールを生じさせるために使用された。表３２。
【０４６６】
【表３４】
0006537825.tif 000041
0006537825.tif 000042
【０４６７】
【表３５】
0006537825.tif 000043
【０４６８】
次に、検査中のそれぞれの植物は、採点バイアスを排除するために植物の遺伝子型に関して「盲目」スコアラーで、スコアリングスケールを基準に採点された。グルホシネート採点の５日後、すべてのＴ１植物と非形質転換ドナーコムギ植物の第１および第２の複製物は、４２０ｇ  ａｉ／ｈａの用量比率のグリホサートで噴霧された。非形質転換ドナーコムギ株（全１２植物）の残りの第３の複製物は噴霧されなかった。植物は、噴霧の７日、１４日および２１日後に視覚的に検査された。表現型反応の範囲を捕捉するスコアリングスケールは、それぞれの時点について生じさせ、検査全体を採点するために使用された。それぞれの時点で、スコアラーは植物の遺伝子型に関して「盲目」とされた。噴霧の７日後のスコアリングスケールは、０〜７（表３６）の範囲であり、噴霧の１４日と２１日後は１〜４（表３７）の範囲であった。また、植物丈、茎数と形態異常は、グリホサート噴霧の１４日後にそれぞれの植物について記録された。遅延した発芽または乏しい確立の植物は、その後の分析から除外された。
【０４６９】
【表３６】
0006537825.tif 000044
【０４７０】
【表３７】
0006537825.tif 000045
【０４７１】
グルホシネート反応の分析は、噴霧された非形質転換ドナーコムギ植物と噴霧されなかった非形質転換ドナー植物間で明確な表現型の違いを明らかにすることができなかった（データ示さず）。結果として、グルホシネートに対するトランスジェニック事象の耐性は、確実に評価することができなかった。対照的に、噴霧から２１日後のグリホサート反応の分析は、噴霧された非形質転換ドナー植物と噴霧されなかった非形質転換ドナー植物の間に明確な表現型の違いを明らかにした。表３８。したがって、トランスジェニック事象のうちグリホサート耐性に関する分析は、噴霧から２１日後に回収された反応スコアに基づいた。トランスジェニック事象は、その事象について１２個のＴ１植物のうち４つ以上が、３より大きいまたは３に等しい反応スコアを有したとき、グリホサート耐性を示すと考えられた。この基準は、Ｔ１世代における導入遺伝子について、それぞれの事象が１：２：１（ホモ接合存在：ヘミ接合：ホモ接合不存在）に分離するという期待に基づき、弱いＤＧＴ２８発現を有する事象を同定できるようにした。トランスジェニック事象は、個々の耐性植物から計算された任意の集計スコアを用いて、観察されたグリホサート耐性についてランク付けされた。集計スコアは、噴霧から１４日および２１日後に反応スコアから計算され、植物丈、茎数と形態異常が噴霧から１４日後に記録された。
【０４７２】
【表３８】
0006537825.tif 000046
【０４７３】
全体的として、スクリーニングした９２個のトランスジェニック事象のうち６７個は、グリホサート耐性に関する証拠を示した。表３９。導入遺伝子の≦３の組み込まれたコピーを有することが推定された６個のトランスジェニック事象と、４個以上の組み込まれた導入遺伝子を有することが推定された２個のトランスジェニック事象は、第２の（詳細な）表現型スクリーニングにおいて封入のためのそれぞれのＤＧＴ−２８発現ベクターについて選択された。
【０４７４】
【表３９】
0006537825.tif 000047
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【０４７５】
詳細な表現型スクリーニング。選択された事象あたり１２個のＴ１種子の４つの複製物と、非形質転換ドナーコムギ株Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ＭＰＢ２６ＲＨの８つの複製物（各１２個の種子）を８５ｍｍポットに播種し、１２時間の光周期を与える補助照明を用いて、２５℃にて十分に水を与える条件下で２葉段階まで生育させた。ポットは、データ解析中に環境影響が除かれるように無作為化された設計で置かれた。スクリーニングされたトランスジェニック事象を表４０に列挙する。２葉段階で、植物丈と葉の数は、グリホサートを噴霧する前のそれぞれの植物について記録された。それぞれ選択された事象についてＴ１植物の第１、第２、第３および第４の複製物、ならびに非形質転換ドナーコムギ株は、それぞれ４２０、８４０、１６８０および３３６０ｇ  ａｉ／ｈａの用量比率で噴霧された。非形質転換ドナーコムギ株（合計４８植物）の第５、第６、第７および第８の複製物は噴霧されなかった。噴霧から７日、１４日および２１日後、植物は、植物丈、葉の数、および表３７におけるスコアリングスケールを用いたグリホサートに対する表現型反応について採点された。また、いずれかの形態異常も記録された。スコアリングについて、スコアラーは、採点バイアスを防ぐために、植物の遺伝子型と噴霧用量比率に関して「盲目」とされた。噴霧前の採点で、遅延した発芽および乏しい確立（基準：植物丈＜６ｃｍ）の植物は、その後の分析から除外された。
【０４７６】
【表４０】
0006537825.tif 000049
【０４７７】
噴霧から７日、１４日および２１日後のグリホサート反応の分析は、噴霧された非形質転換ドナーコムギ植物と噴霧されなかった非形質転換ドナーコムギ植物の間に明確な表現型の違いを明らかにした。この違いは２１日目で最大になり、すべてのグリホサート用量比率全体で観察された。表４１。それぞれの噴霧用量比率でのグリホサートに対するトランスジェニック事象の耐性を評価するために、ヌルＴ１植物（すなわち、導入遺伝子を担持していない植物）をその後の分析から除外した。噴霧から２１日後、３未満の反応スコアを有するＴ１植物は、ヌル遺伝子型を有すると考えられた。耐性表現型に基づく分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、ＤＧＴ−２８発現構築物、トランスジェニック事象およびグリホサート噴霧用量について有意な効果を明らかにした。表４２。しかしながら、個別の植物の表現型を記録するために使用される反応スコア（すなわち、１〜４０；表４０）が限られた範囲であるため、複数比較試験は、これらの違いの起源について意味のある生物学的解釈を明らかにすることができなかった。一般に、それぞれのＤＧＴ−２８発現構築物について試験された８つの独立したトランスジェニック事象は、それぞれの噴霧用量比率でグリホサートに対して類似した耐性を示した。これは、４つすべてのＤＧＴ−２８導入遺伝子が、優性表現型を付与したこと、および単一コピーがグリホサート耐性を付与するのに十分であったことを示している。ＤＧＴ−２８発現構築物のそれぞれは、少なくとも３３６０ｇ  ａｉ／ｈａグリホサートに対する効果的な耐性を明らかにした。
【０４７８】
【表４１】
0006537825.tif 000050
【０４７９】
【表４２】
0006537825.tif 000051
【０４８０】
グリホサート耐性Ｔ１植物におけるＴ−ＤＮＡ存在の分子確認。実施例２において開発されたＰＣＲ接合性アッセイを用いて、Ｔ２種子生成のために保存されたグリホサート耐性Ｔ１植物におけるＤＧＴ−２８をコードするＴ−ＤＮＡの存在を確認した（実施例６参照）。全体的に、ＰＣＲ接合性試験は、１０４個のＴ１植物について行われ、その８９％が導入遺伝子の少なくとも１コピーを含むことが確認された。表４３。これらの結果は、観察されたグリホサート耐性がＤＧＴ−２８をコードするＴ−ＤＮＡの存在によって付与されたことを確認した。
【０４８１】
【表４３】
0006537825.tif 000052
【０４８２】
グリホサート耐性トランスジェニック事象についてのＴ２種子の生成。約８個のグリホサート耐性Ｔ１植物は、詳細な表現型スクリーニングにおいて封入のために選択された３２個のトランスジェニック事象についての表現型スクリーニングから保存された（表４３）。植物を２００ｍｍポットに移し、１２時間の光周期を与える補助照明を用いて、２５℃にて十分に水を与える条件下で生育された。それぞれの植物の穂は、異種交配を防ぐために、開花前に個別に袋詰めされた。
【実施例２４】
【０４８３】
ストレプトマイセス・スビセウス（Streptomyces sviceus）の５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼの結晶化およびモデリング（ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼ）
タンパク質精製および結晶化。組換えＳｓｖＥＳＰＳシンターゼのクローニング、発現および精製は、次のようにして達成され得る。簡単に述べると、ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼの過剰発現プラスミドは、コンピテント大腸菌（E. coli）Ｒｏｓｅｔｔａ２株に形質転換され、組換えタンパク質発現は、１６時間、１８℃にて０．２ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって誘導される。細胞を遠心分離によって回収し、溶解緩衝液−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび０．１％両性イオン界面活性剤（ＤＤＭ（ドデシルマルトシド）またはＤＭ（デシルマルトシド）：βアノマーの純度＞９８％、および１％未満のαアノマーの混入）に再懸濁される。Ｃ５  Ａｖｅｓｔｉｎ細胞ホモジナイザーへの複数回の通過を用いて、細胞を溶解し、溶解物を超遠心分離によって清澄化する。溶解物を、溶解緩衝液で平衡化した５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムに装填する。３０ｍＭイミダゾールが補足された溶解緩衝液を用いてカラムを広く洗浄し、２００ｍＭイミダゾールまでの直線勾配によって溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されるように、純粋なタンパク質画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．９）、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％ＤＭ／ＤＤＭ中で１２時間透析する。ヘキサヒスチジンタグは、トロンビン（１ユニット／ｍｇのタンパク質）による消化、続く、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．０５％ＤＭ／ＤＤＭ中でのイオン交換クロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって除去される。Ａｍｉｃｏｎの遠心フィルターを用いてタンパク質を濃縮する。
【０４８４】
最初の結晶化条件は、シッティングドロップ蒸気拡散、ならびに市販および自家製の結晶化マトリックスを利用した疎行マトリックス法を用いて達成される。簡単に述べると、８ｍｇ／ｍＬ濃度のタンパク質試料の５０ｎｌ滴（２ｍＭシキミ酸３−リン酸および２ｍＭグリホサートが補足された２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．０５％  ＤＭ／ＤＤＭの緩衝液中）は、等体積のリザーバー母液と混合される。初期結晶は、沈殿剤としてポリエチレングリコールを用いて成長させ、１０日以内にその最大サイズに成長する。データ回収前に、結晶は、２５％グリセロールが補足された結晶化母液で構成される凍結保護溶液中に簡単に浸漬され、その後、液体窒素中に直接浸漬することによってガラス化される。
【０４８５】
位相および構造決定。結晶学的データは、ＭＡＲ電荷結合素子検出器を用いて、挿入デバイスシンクロトロン源（ＬＳ−ＣＡＴ，Ｓｅｃｔｏｒ  ２１  ＩＤ−Ｄ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）にて回収される。データは指標とされ、ＨＫＬ２０００パッケージ（Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., and Chruszcz, M. (2006) HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution-from diffraction images to an initial model in minutes, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 859-866参照）またはＸＤＳ（Kabsch, W. (2010) Xds, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-132参照）のいずれかを用いて計られる。初期の結晶学的位相は、プログラムのＣＣＰ４スーツ（Winn, M. D., Ballard, C. C., Cowtan, K. D., Dodson, E. J., Emsley, P., Evans, P. R., Keegan, R. M., Krissinel, E. B., Leslie, A. G., McCoy, A., McNicholas, S. J., Murshudov, G. N., Pannu, N. S., Potterton, E. A., Powell, H. R., Read, R. J., Vagin, A., and Wilson, K. S. (2011) Overview of the CCP4 suite and current developments, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 235-242参照）において実行されるＰＨＡＳＥＲソフトウェア（McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., and Read, R. J. (2007) Phaser crystallographic software, J Appl Crystallogr 40, 658-674参照）を用いたサーチプローブとして生じさせたＳｓｖＥＳＰＳシンターゼのホモロジーモデル（下記参照）による分子置換法を用いて決定される。主鎖と側鎖原子の再構築は、自動化手法（ＡＲＰ／ｗＡＲＰ）（Langer, G., Cohen, S. X., Lamzin, V. S., and Perrakis, A. (2008) Automated macromolecular model building for X-ray crystallography using ARP/wARP version 7, Nature protocols 3, 1171-1179参照）とＸｔａｌＶｉｅｗ（McRee, D. E. (1999) XtalView/Xfit- A versatile program for manipulating atomic coordinates and electron density, Journal of structural biology 125, 156-165参照）またはＣＯＯＴ（Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132参照）のいずれかを使用する手動介入との両方を用いて実行される。結晶学的精密化は、手動モデル構築のラウンドが組み入れられたＲＥＦＭＡＣ（Murshudov, G. N., Vagin, A. A., and Dodson, E. J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240-255参照）を用いる。交差検証は、モデル構築の過程、および遊離Ｒ因子の計算における５％のデータを用いた精密化の過程全体で日常的に使用される（Kleywegt, G. J., and Brunger, A. T. (1996) Checking your imagination: applications of the free R value, Structure 4, 897-904参照）。モデルの立体化学は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Laskowski, R. A., Rullmannn, J. A., MacArthur, M. W., Kaptein, R., and Thornton, J. M. (1996) AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR, Journal of biomolecular NMR 8, 477-486参照）を用いて精密化の過程全体でモニターされ、最終の結晶学的座標は、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ（Davis, I. W., Murray, L. W., Richardson, J. S., and Richardson, D. C. (2004) MOLPROBITY: structure validation and all-atom contact analysis for nucleic acids and their complexes, Nucleic Acids Res 32, W615-619参照）を用いて検証される。
【０４８６】
ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼのホモロジーモデリング。ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼの一次配列は、ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、タンパク質データバンクに対するクエリーのために使用された。以下の種由来の相同な酵素の結晶構造を検索した：コレラ菌（V. cholera）（ＰＤＢコード：３ＮＶＳ；１６０個の整列された残基に対して３９％配列同一性）、大腸菌（E. coli）（１Ｇ６Ｓ；１５８個の整列された残基に対して３８％配列同一性）、結核菌（M. tuberculosis）（２ＢＪＢ；１５０個の整列された残基に対して３６％配列同一性）、Ｃ．ブルネッティ（C. burnetii）（３ＲＯＩ；１１７個の整列された残基に対して２８％配列同一性）、およびアグロバクテリウム属種（Agrobacterium sp.）（２ＧＧＡ：１１６個の整列された残基に対して２７％配列同一性）。これらの構造の全てからの原子座標を（ＣＯＯＴを使用して）手動で重ね合わせ、ホモロジーモデリングのための最良の鋳型を決定するために活性部位を視覚的に検査した。２つの並行したアプローチをモデリングのために利用した：「最良の」鋳型を用いたＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬによる単一鋳型ベースのアプローチ（活性部位残基の手動アラインメントによって決定される）、およびＰＨＹＲＥ２を用いた複数鋳型モデリング（Bennett-Lovsey, R. M., Herbert, A. D., Sternberg, M. J., and Kelley, L. A. (2008) Exploring the extremes of sequence/structure space with ensemble fold recognition in the program Phyre, Proteins 70, 611-625参照）。複数鋳型手法について、Ｅ値カットオフが１０〜５０である全３３８個の異なる完全なモデルまたは部分的なモデルは、二次構造予測のためのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにおいて擬似複数配列アラインメントについて抜粋された。
【０４８７】
上位１１個の鋳型は、ＥＳＰＳシンターゼのホモログからなり、次の順位の鋳型を構成しているタンパク質のＩＦ３−スーパーファミリーを有する。リガンド用の結合部位は、３ＤＬｉｇａｎｄＳｉｔｅサーバー（Wass, M. N., Kelley, L. A., and Sternberg, M. J. (2010) 3DLigandSite: predicting ligand-binding sites using similar structures, Nucleic Acids Res 38, W469-473参照）を使用して確認され、シキミ酸３−リン酸とグリホサートの両方に適したポーズを特定した。必要に応じて、個別のモデル構造は、エネルギー最小化プロトコールのラウンドに供され、理想的な結合長、角度からのずれを低減し、および芳香族残基の平面性を維持した。モデルの信頼性は、予測された局所的な誤差のプロットを介して、およびほぼ同じ大きさのタンパク質のモデルについて期待された正規化されたＱＭＥＡＮ４  Ｚ−スコアを用いて評価された（Benkert, P., Kunzli, M, and Schwede, T. (2009) QMEAN server for protein model quality estimation, Nucleic Acids Res 37, W510-514参照）。得られたモデルについて、主鎖原子の９０％超が、１００％の精度でモデル化することができた。
【０４８８】
ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼの相同性モデル。最良の相同性モデルは、ＰＨＹＲＥ２に実行された複数鋳型アプローチを用いて誘導された。このモデルについて、主鎖と側鎖の原子の９０％超を正確にモデル化できた。相同性モデルのラマチャンドランマップは、最も好ましい領域内で残基の８９％を示し、さらに許容される領域では９．７％が付加される。２つの残基（Ａｌａ−２５５とＡｌａ−３１４）は、許容されていない領域にあるが、これらの残基は、活性部位に対して遠位であるループに配置されている。相同性モデルの有効性は、配列アラインメントのギャップ領域に位置した残基が、ラマチャンドラン制限内に十分に入るねじれ角でモデル化されるという事実によって確認され、残基には、二次構造要素によって束縛されないループ領域に配置される残基が含まれる。
【０４８９】
増加したグリホサート耐性に関する分子的機序。アグロバクテリウム属種（Agrobacterium sp.）由来のグリホサート耐性（クラスＩＩ）５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（ラウンドアップ・レディー植物内に遺伝子操作された抵抗性決定因子）の先の生化学的および生物物理学的特徴付けによって、活性部位での小さな変化がこの酵素における除草剤抵抗性の原因であり得ることが立証されている。具体的には、Ａｌａ−１００残基は、グリホサート感受性（クラスＩ）大腸菌（E. coli）酵素における同等の位置（Ｇｌｙ−９６）において見出されるＧｌｙの代わりに、アグロバクテリウム属種（Agrobacterium sp.）ＥＳＰＳシンターゼにおいて置換される。感受性大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼとの共結晶構造において、グリホサートは広がったように平衡状態にあり、一方、アグロバクテリウム属種（Agrobacterium sp.）ＥＳＰＳシンターゼにおいては、Ａｌａ−１００の側鎖との立体衝突は除草剤の圧縮をもたらし、これが耐性の原因となる。大腸菌（E. coli）酵素を用いた構造／機能の研究は、Ｇｌｙ−９６からＡｌａの突然変異がグリホサート抵抗性をもたらすことを示している。
【０４９０】
ＥＳＰＳシンターゼの構造では、Ａｌａ−１００（Ｇｌｙ−９６）残基は、グリホサート結合部位に隣接する長い内部α−ヘリックスの開始端に位置している。グリホサート感受性クラスＩ  ＥＰＳＰシンターゼでは、前述のＧｌｙ９６Ａｌａ突然変異に加えて、グリホサート耐性は、Ｔｈｒ９７Ｉｌｅ、Ｐｒｏ１０１Ｌｅｕ／Ｔｈｒ／Ａｌａ／Ｓｅｒを含む、このヘリックス内の残基の突然変異によって誘導され得る。これらの残基のいくつかがグリホサート結合部位から１０Åを超えて離れているとしても、これらの残基での変更は、Ｇｌｙ−９６を保有するヘリックスの配向におけるシフトを引き起し、これがグリホサート耐性の増加の原因となる。
【０４９１】
ＳｓｖＥＳＰＳの高解像度の相同性モデルでは、このＧｌｙ残基はＡｌａ−８４に変更される。さらに、Ａｌａ−８４を保有する内部ヘリックス（図５５）はさらに活性部位内に押し込まれる。このシフトは、次の変化の結果である：大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＡｌａ−９８はＴｈｒ−８６に置き換えられる；大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＭｅｔ−９９はＡｌａ−８７に置き換えられる；大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＰｒｏ−１０１はＰｈｅ−８９に置き換えられる；大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＡｌａ−１０３はＰｒｏ−９１に置き換えられる；大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＡｌａ−１０５はＬｅｕ−９３に置き換えられる；および大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＬｅｕ−１０６はＡｌａ−９４に置き換えられる。これらのアミノ酸は、図１ｂ中のモチーフＩＩＩを表す。
【０４９２】
Ｍｅｔ−５３（大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼ）からＰｈｅ−４４（モチーフＩＩ、図１ａ）およびＬｅｕ−１１５（大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼ）からＰｈｅ−１０３（モチーフＩＶ、図１ｂ）を含む、このヘリックスを強化する残基での追加的な代償性変化がある。最後に、大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼにおけるＡｓｎ−２６とＨｉｓ−５２の、より小さなＡｌａ−１７（モチーフＩ、図１ａ）とＧｌｙ−４３（モチーフＩＩ、図１ａ）による置き換えは、さらにグリホサート結合部位へのこの内部ヘリックスのシフトを可能にする空洞を作る。このヘリックスの反対側では、大腸菌（E. coli）ＥＳＰＳシンターゼ残基のＬｅｕ−３０とＭｅｔ−１７８は、Ｐｈｅ−２１（モチーフＩ、図１ａ）とＬｅｕ−１６７によって置き換えられ、このヘリックスは結合部位にさらに押し込まれる。これらの変化は、この内部ヘリックスの配向に著しいシフトをもたらし、次にこれがグリホサートを相当に塞ぐ。結果として、ＳｓｖＥＳＰＳシンターゼにおけるＡｌａ８４Ｇｌｙ突然変異は、感受性表現型をもたらすことにはならず、これは、この残基を保有する内部ヘリックスが、なおも活性部位にまでシフトされ、グリホサート結合を可能にするからである。構造的な予測は、定常状態の動力学およびＩＣ５０の研究によって実証され、この場合、ＤＧＴ−２８  ｖ２（Ａｌａ８４Ｇｌｙ）はグリホサートに対する高レベルの耐性を保持する。
【０４９３】
本発明の態様は、特定の実施形態において説明されてきたが、それらは、本開示の精神および範囲内でさらに変更されてもよい。したがって、本出願は、その一般原理を用いた本発明の実施形態の任意のバリエーション、用途、または適応をカバーすることを意図している。さらに、本出願は、これらの実施形態が関与し、添付の特許請求の範囲の限定に含まれる当該技術分野における公知または慣行に含まれるように本開示からのこのような逸脱をカバーすることを意図している。
（符号の説明）
【配列表フリーテキスト】
【０４９４】
配列番号１は、ＤＧＴ−２８のアミノ酸配列を示す。  配列番号６７は、ＤＧＴ−３３のアミノ酸配列を示す。  配列番号６８は、ＤＧＴ−３２のアミノ酸配列を示す。  配列番号１４５は、ＤＧＴ−３１のアミノ酸配列を示す。  配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８は、例示的クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列を示す。  配列番号１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７および１６９は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳをコードする例示的核酸を含む。  配列番号１７０は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質の特徴である保存されたアミノ酸配列：ＴＡＲＸＬＦ（式中、Ｘは、ＡまたはＧである）を示す。  配列番号１７１は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質の特徴である保存されたアミノ酸配列：ＥＧＦＸＥＧ（式中、Ｘは、ＴまたはＡである）を示す。  配列番号１７２は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質の特徴である保存されたアミノ酸配列：ＧＡＴＴＡＲＦＬＰＸ１ＬＸ２ＡＡ（式中、Ｘ１は、ＴまたはＡであり、Ｘ２は、ＡまたはＶである）を示す。  配列番号１７３は、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳタンパク質の特徴である保存されたアミノ酸配列：ＦＤＡＳを示す。
本発明は以下の態様を含む。
［１］
クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
［２］
クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳポリペプチドが、配列番号１、６７、６８、１４５、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６および１６８からなる群から選択される少なくとも１種のクラスＩＶ  ＥＰＳＰＳと少なくとも９０％の配列同一性を有する、［１］に記載の核酸分子。
［３］
クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳポリペプチドが、配列番号１７０〜１７３を含む、［１］に記載の核酸分子。
［４］
クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳポリペプチドが、クラスＩ  ＥＰＳＰＳポリペプチドと比較した場合に、ポリペプチド中のグリホサート結合部位と隣接している内部α−ヘリックスを含み、内部α−ヘリックスが、活性部位中に押し込まれ、その結果、グリホサートホスホネートを妨げる、［１］に記載の核酸分子。
［５］
配列番号１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７および１６９からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、［１］に記載の核酸分子。
［６］
［１］に記載の核酸分子を含むベクター。
［７］
異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、［６］に記載のベクター。
［８］
核酸のコード配列が、プロモーターと作動可能に連結している、［６］に記載のベクター。
［９］
異種核酸として、［１］に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
［１０］
プロモーターが、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターである、［８］に記載のベクター。
［１１］
植物細胞である、［９］に記載の宿主細胞。
［１２］
［１］に記載の核酸を含む、トランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
［１３］
植物、植物の一部、植物器官、植物種子および／または植物細胞が、同種の野生型植物と比較した場合に、グリホサートに対して耐性である、［１２］に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
［１４］
核酸が、ＬＧＮＡＡＴ（配列番号１４１）をコードせず、ＡＬＬＭＸＡＰＬＴ（式中、Ｘは、アラニン、セリンおよびトレオニンからなる群から選択される）（配列番号１４２）をコードしない、［１２］に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞。
［１５］
［１２］に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子および／または植物細胞から製造された再生可能な細胞の組織培養物。
［１６］
［１２］に記載のトランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞から製造されたプロトプラスト。
［１７］
再生可能な細胞が、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、葯、花、茎および鞘からなる群から選択される組織種から製造される、［１５］に記載の組織培養物。
［１８］
グリホサートに対して抵抗性である、［１５］に記載の組織培養物から再生された植物。
［１９］
グリホサートに対して抵抗性である、トランスジェニック植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞を作製する方法であって、
植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞を、［１］に記載の核酸分子を用いて形質転換することと、
クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳポリペプチドを発現させることと
を含む、方法。
［２０］
形質転換された植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞が、グリホサートに対して抵抗性である、［１９］に記載の方法。
［２１］
除草剤抵抗性植物を含有する耕作区域において雑草を防除する方法であって、
耕作区域に、異種核酸として、［１］に記載の核酸分子を含む植物または植物種子を植えることと
植物または植物種子に大幅に影響を及ぼすことなく、耕作区域において雑草を防除するのに十分な量の除草剤を耕作区域に適用することと
を含む、方法。
［２２］
除草剤が、グリホサートである、［２１］に記載の方法。
［２３］
［１に記載の異種核酸分子を含む植物または植物種子が、異種ポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、［２１］に記載の方法。
［２４］
第２の核酸が、ａａｄ−１またはａａｄ−１２を含む、［２３］に記載の方法。
［２５］
植物において除草剤に対する抵抗性を付与する方法であって、
植物を、［１］に記載の核酸と作動可能に連結しているプロモーターを含むＤＮＡ構築物を用いて形質転換することと、
形質転換された植物を再生させることと、
核酸分子を発現させて、クラスＩＶ  ＥＰＳＰＳポリペプチドを製造することと
を含む、方法。
［２６］
除草剤が、グリホサートである、［２５］に記載の方法。
［２７］
ＤＮＡ構築物が、植物において発現可能な異種ポリペプチドをコードする第２の核酸分子を含む、［２５］に記載の方法。
［２８］
異種ポリペプチドが、ａａｄ−１またはａａｄ−１２を含む、［２７］に記載の方法。
［２９］
異種核酸として［１］に記載の核酸がそのゲノム中に安定に組み込まれた植物であって、核酸が、プロモーターと作動可能に連結している、植物。
［３０］
ダイズ植物体である、［２９］に記載の植物。
［３１］
トウモロコシ植物体である、［２９］に記載の植物。
［３２］
コムギ、トウモロコシ、ダイズ、タバコ、ビロードキビ、イネ、アワ、オオムギ、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ、アルファルファ、ワタ、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ、レタス、ホウレンソウ、ペチュニア、バラ、キク、シバクサ、マツ、モミ、トウヒ、重金属蓄積植物、ヒマワリ、ベニバナ、ナタネおよびアラビドプシス属（Arabidopsis）からなる群から選択される、［２９］に記載の植物。
［３３］
アスパラガス属（Asparagus）、カラスムギ属（Avena）、ビロードキビ属（Brachiaria）、アブラナ属（Brassica）、シトラス属（Citrus）、スイカ属（Citrullus）、トウガラシ属（Capsicum）、カボチャ属（Cucurbita）、ニンジン属（Daucus）、ムカシヨモギ属（Erigeron）、ダイズ属（Glycine）、ワタ属（Gossypium）、オオムギ属（Hordeum）、ヒマワリ属（Helianthus）、アキノノゲシ属（Lactuca）、ドクムギ属（Lolium）、トマト属（Lycopersicon）、リンゴ属（Malus）、キャッサバ属（Manihot）、タバコ属（Nicotiana）、オオアラセイトウ属（Orychophragmus）、イネ属（Oryza）、ワニナシ属（Persea）、インゲンマメ属（Phaseolus）、エンドウ属（Pisum）、ナシ属（Pyrus）、サクラ属（Prunus）、ダイコン属（Raphanus）、ライムギ属（Secale）、ナス属（Solanum）、ソルガム属（Sorghum）、コムギ属（Triticum）、ブドウ属（Vitis）、ササゲ属（Vigna）およびトウモロコシ属（Zea）からなる群から選択される種である、［２９］に記載の植物。
［３４］
植物体を生成するよう再生可能ではない、［９］に記載の宿主細胞。
［３５］
植物体を生成するよう再生可能ではない、［１２］に記載の植物、植物の部分、植物器官、植物種子または植物細胞。
［３６］
植物体を生成するよう再生可能ではない植物、植物の一部、植物器官、植物種子または植物細胞が形質転換される、［１９］に記載の方法。
［３７］
核酸のコード配列が、植物における発現のために設計されている合成配列を含む、［１］に記載の核酸分子。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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