(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド化合物を調製する方法であって：
前記方法は、
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子およびアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮｗＩＢ−００を提供する工程であって、前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、工程；および、
遺伝子ノックアウト方法によって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００から、６つの異なる遺伝子操作されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ株の、ＮｗＩＢ−Ｘ０１、ＮｗＩＢ−Ｘ０２、ＮｗＩＢ−Ｘ０３、ＮｗＩＢ−Ｘ０４、ＮｗＩＢ−Ｘ０５、およびＮｗＩＢ−Ｘ０６を構築し、以下のステロイド化合物を産生するためにステロールを形質転換させて分解すべく、前記の６つの異なる遺伝子操作されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ株を培養する工程であって：
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｓｄ４Ａ）および３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ（ｋｓｈＡ１）が欠失しているＮｗＩＢ−Ｘ０１は１，４−ＢＮＡおよび４−ＢＮＡを産生し；
ｈｓｄ４Ａ、ｋｓｈＡ１および３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｋｓｔｄ１）が欠失しているＮｗＩＢ−Ｘ０２は、１，４−ＢＮＡおよび４−ＢＮＡを産生し；
ｈｓｄ４Ａ、ｋｓｈＡ１、ｋｓｔｄ１、ｋｓｔｄ２、およびｋｓｔｄ３が欠失しているＮｗＩＢ−Ｘ０３は、４−ＢＮＡおよび９−ＯＨ−ＢＮＡを産生し；
ｈｓｄ４Ａおよびｋｓｔｄ１が欠失しているＮｗＩＢ−Ｘ０４は、９−ＯＨ−ＢＮＡおよび９−ＯＨ−ＡＤを産生し；
ｈｓｄ４Ａ、ｋｓｔｄ１、ｋｓｔｄ２、およびｋｓｔｄ３が欠失しているＮｗＩＢ−Ｘ０５は、９−ＯＨ−ＢＮＡを産生し；ならびに、
ｋｓｈＡ１およびアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子（ｆａｄＡ５）が欠失しているＮｗＩＢ−Ｘ０６は、１，４−ＢＮＡおよび４−ＢＮＡを産生する、工程を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子操作の技術分野に関し、とりわけ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、遺伝子操作された株、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドとしても公知のステロイド化合物は、母核としてペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する、および類似構造を有する一種の化合物である。以下に例示されるように、基本構造は、Ａ環、Ｂ環、Ｃ環、およびＤ環としてそれぞれ知られている、３つの６員環および１つの５員環から成り、母核の１０位および１３位にメチル基を有し、３位、１１位、および１７位にヒドロキシル基、ケトン基、またはアルキル基を有してもよく、Ａ環、Ｂ環、Ｃ環、およびＤ環に二重結合を有してもよく、そして通常は１７位に異なる長さの側鎖を有する。ステロイドの核における、置換基、二重結合の位置、または３次元形状等の違いにより、固有の生理機能を備えた一連の化合物が産生される。ヒトおよび動物において、ステロイドは主要な内因性ホルモンであり、これは、生殖器および副腎皮質により分泌され、そして生殖、脳および骨の発達、安定した状態の維持、および生物学的効果の調節などに密接に関連する。外因性ホルモンとして、ステロイドホルモン薬物は、一種の不可欠な臨床薬でもあり、これは、身体に対する重要な調節の役割を果たし、かつ極めて重要な医学的価値を有し、例えば、副腎皮質ホルモンは、抗炎症性の反応、抗アレルギー作用の反応、抗アレルギー反応、抗ショック反応、および他の効果を有する。
【０００３】
【化１】
0006592101.tif 000002
【０００４】
図１に示されるように、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびアシル−ＣｏＡチオラーゼは、マイコバクテリウムによるステロール側鎖の分解に関与する、２つの重要な酵素である。結核菌のステロイド代謝遺伝子クラスターにおけるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの機能は、１７位のヒドロキシルステロイドデヒドロゲナーゼとして定義されているが、その様に命名されたのは、哺乳動物の細胞型ＩＶの１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのＮセグメント機能領域に非常に近似しているからである。一方で、酵素が３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの機能を有することも報告されてきたが、これまで確認されてはいなかった。アシル−ＣｏＡチオラーゼは、ステロール側鎖の分解のチオリシス脱炭反応に関与し、これは、脂肪酸のβ酸化のプロセスにおけるチオール基開裂反応に類似する。ステロール側鎖の分解は極めて複雑な酵素反応であり、このメカニズムはこれからさらに調査される予定である。
【０００５】
微生物変換は、ステロイド系医薬品産業において、生産プロセスにおける重要な工程である。旧式の生産プロセス、限られた効率の株、新しい生産ラインの構築に対する多額の投資、およびそれらの他の問題は、ステロイドの医薬品産業の急速な発展を深刻に制限し、これらはまた、ステロイド系薬物の生産の高いコストの重大な理由である。中国には多くのステロイドの医薬品生産企業があり、それらの産出量は莫大である。したがって、現在の重要なステロイドの微生物変換反応のうちのいくつかのための高効率な株の開発は、その産業により歓迎されると予想され、このことが、非常にステロイド薬産業の生産レベルを概して増強し、かつ結果としてもたらされる経済的便益は非常に強い効果を生むであろう。
【０００６】
ステロイドの医薬品産業における重要な微生物変換反応に関して、遺伝子操作による改変による改善された微生物変換反応の開発は、非常にステロイド系薬物の生産効率および製品品質を向上させ、ステロイド系薬物生産プロセスのエネルギー消費の削減を支援し、薬物前駆体の利用率を向上させ、生産工程を簡素化し、そして生産コストを下げ、そのことが、ステロイド系薬物の価格の下落に寄与する。加えて、微生物変換の条件は穏やかで、環境に優しく、無公害の化学技術に属し、したがって、本業界でその応用を精力的に増進させることは、社会の持続可能な開発の避けられない要件である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先行技術におけるステロイドの医薬品産業の生産プロセスが、複雑、低効率および高コストであり、それゆえ高価なステロイド系薬物の価格をもたらすという問題を解決するために、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、遺伝子操作された株、およびそれらの使用を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は以下の技術的解決法を採用する：
【０００９】
本発明の第１の態様は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を提供し、
前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下のタンパク質（ｉ）または（ｉｉ）をコードする：（ｉ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２のアミノ酸配列を有する；（ｉｉ）：（ｉ）によって定義されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸を置換するか、欠失させるか、または挿入することにより誘導され、（ｉ）のタンパク質の機能と同じ機能を有する。
【００１０】
好ましくは、ヒドロキシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子によりコードされたタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の相同性を有する。より好ましくは、８０％以上、およびより好ましくは９０％以上である。
【００１１】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の配列（１）または（２）を有する：（１）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の配列の１１４３−２０５４位に示されるヌクレオチド配列を有する；（２）：配列（１）に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％相同であるヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の配列の１１４３−２０５４位に示された配列に対して少なくとも８７％相同であるヌクレオチド配列を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の配列に対して少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列を有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の配列の残りのヌクレオチド配列は、その酵素の調節エレメントおよび隣接遺伝子断片を含む。
【００１２】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、放線菌、好ましくはマイコバクテリウム属の微生物およびロドコッカス属の微生物に由来する。
【００１３】
好ましくは、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、マイコバクテリウム属の微生物に由来する。
【００１４】
より好ましくは、マイコバクテリウム属の微生物は、増殖の早いタイプのマイコバクテリウムである。
【００１５】
さらに、増殖の早いタイプのマイコバクテリウムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ−３６８３、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３８０５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉから成る群から選択される。
【００１６】
さらに、増殖の早いタイプのマイコバクテリウム属の微生物は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍである。
【００１７】
最も好ましくは、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、増殖の早いタイプのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００に由来する。
【００１８】
本発明の第２の態様は、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を提供し、前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、以下のタンパク質（ｉｉｉ）または（ｉｖ）をコードする：（ｉｉｉ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４のアミノ酸配列を有する；（ｉｖ）：（ｉｉｉ）によって定義されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸を置換するか、欠失させるか、または挿入することにより誘導され、（ｉｉｉ）のタンパク質の機能と同じ機能を有する。
【００１９】
アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは８０％以上の相同性を有するタンパク質をコードする。
【００２０】
アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、以下の配列（３）または（４）を有する：（３）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３の配列の１０１０−２１７４位に示されるヌクレオチド配列を有する；（４）配列（３）において示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％相同である、より好ましくは８７％同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００２１】
アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３の配列に対して少なくとも６０％相同であるヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は放線菌に由来する。
【００２３】
好ましくは、放線菌は、マイコバクテリウム属の微生物およびロドコッカス属の微生物を含む。
【００２４】
より好ましくは、マイコバクテリウム属の微生物は、増殖の早いタイプのマイコバクテリウムである。
【００２５】
さらに、増殖の早いタイプのマイコバクテリウムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬ Ｂ−３６８３、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３８０５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉから成る群から選択される。
【００２６】
最も好ましくは、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、増殖の早いタイプのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００に由来する。
【００２７】
本発明の第３の態様は、一種の遺伝子操作されたマイコバクテリウム株を提供し、これは、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が欠失したマイコバクテリウムである。それらは、前述のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を突然変異させ、相同組み換えすることにより得られることを特徴とする。すなわち、遺伝子操作によって、ヒドロキシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化、および／またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ機能の不活性化を介して、ヒドロキシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を持たない、および／またはアシル−ＣｏＡチオラーゼの活性を持たない遺伝子操作されたマイコバクテリウム株を構築することであって、これは、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子に対する、標的である未標識の遺伝子操作により達成される。
【００２８】
好ましくは、本発明はまた、遺伝子操作されたマイコバクテリウム株を提供し、これは、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、が同時に欠失しているマイコバクテリウムである。
【００２９】
遺伝子操作されたマイコバクテリウム株は、３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、が同時に欠失しているマイコバクテリウムであることも好ましい。
【００３０】
遺伝子操作されたマイコバクテリウム株は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子と、が同時に欠失しているマイコバクテリウムであることがさらに好ましい。
【００３１】
遺伝子操作されたマイコバクテリウム株は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子と、が同時に欠失しているマイコバクテリウムであることも好ましい。
【００３２】
本発明の第４の態様は、ステロイド化合物の調製における上記の遺伝子操作されたマイコバクテリウム株の使用を提供する。
【００３３】
ステロイド化合物は：２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−１，４−ジエン−３−オン、２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−４−エン−３−オン、および９α，２２−ジヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−４−エン−３−オンを含む。
【発明の効果】
【００３４】
上記の観点から、本発明は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子およびアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を提供し、そしてヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性のない及びアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性のないマイコバクテリウムを含む、様々な操作された株が、様々な担体を構築し、関連する株を形質転換させることにより得られる。これらの操作された株を使用して、２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−１，４−ジエン−３−オン（１，４−ＢＮＡ）と、２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−４−エン−３−オン（４−ＢＮＡ）と、９α，２２−ジヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−４−エン−３−オン（９−ＯＨ−ＢＮＡ）と、を選択的に調製することができ、このことが、ステロイド系薬物の生産効率を非常に改善し、ステロイド系薬物生産プロセスのエネルギー消費の削減を支援し、薬物前駆体の利用率を向上させ、生産工程を簡素化し、そして生産コストを下げ、かつ反応条件は、穏やかで、環境に優しく、広く普及するのにふさわしく、高い経済的および社会的な便益を有している。この種の可能性および価値のある新規の前駆体化合物は、単純な化学反応を通して、副腎皮質ホルモン剤（特にプロゲステロン）を産生するために使用され得る。これが普及すれば、現存の副腎皮質製品の生産プロセスの後進的な情勢を大幅に改善するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】４−ＢＮＡ、１，４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡの調製のための、ステロールの微生物分解の、式の概略図および重要な酵素を示す。
【図２】ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｓｄ４Ａ）−欠失株が、現存のスクリーニング技術の応用により、マイコバクテリウム形質転換体に対して２工程のスクリーニングを行うことにより得られることを示し、ここで、ＭはＤＮＡ標準マーカーであり；ＤＣＯは、スクリーニングされたダブルクロスオーバー体の増幅の結果であり；および、ｗｔは、同じプライマーを用いた、原株のＰＣＲ増幅の結果である。
【図３】アシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｆａｄＡ５）−欠失株が、現存のスクリーニング技術の応用により、マイコバクテリウム形質転換体に対して２工程のスクリーニングを行うことによって得られることを示し、ここでＭはＤＮＡ標準マーカーであり；ＤＣＯは、スクリーニングされたダブルクロスオーバー体の増幅の結果であり；および、ｗｔは、同じプライマーを用いた、原株のＰＣＲ増幅の結果である。
【図４】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００による、フィトステロールの形質転換の結果の薄層クロマトグラム（ＴＬＣ）である。
【図５】ヒドロキシラーゼＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子−欠失株およびアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子−欠失株によるフィトステロールの形質転換の結果の薄層クロマトグラム（ＴＬＣ）である。
【図６】ヒドロキシラーゼＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子−欠失株およびアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子−欠失株によるフィトステロールの形質転換の結果の高性能な液体クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明を一層良く理解するために、本発明はさらに、以下の特定の実施形態に関して記述される。以下の例は、本発明を例示するように意図されるが、本発明の範囲を限定するようには意図されないことが理解されるだろう。
【００３７】
実験的方法は、特定の条件が示されない場合、以下の例において、通常は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）記述されるような、従来の条件に従って実行される。
【００３８】
本発明で利用された遺伝子操作技術は、主として未標識酵素機能不活性化技術である。未標識酵素機能不活性化技術は、主として以下のものを含む：非抵抗性マーカーの、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の、またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のインフレーム欠失。
【００３９】
本発明の実施例で使用される大腸菌ＤＨ５ａおよびｐＭＤ１９−Ｔの担体は、ノバジェン社から購入し、プライマーは大連タカラバイオ社により合成された。
【００４０】
本発明で使用されるステロイドの基質は３−アルコール−５−エン−ステロイド、例えば、３−アルコール−５−エン−ステロイドのクラスとしての「ステロール」のみである。ステロールは、普通は、コレステロールおよびフィトステロールなどの動植物に由来し、ここでコレステロールは、動物性脂肪に由来してもよく、そしてフィトステロールは、植物油の処理からの脱臭留出物、およびパルプ製紙工業からのトール油などの、様々なソースが利用可能である。フィトステロールは、通常は混合物であり、普通は、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、およびブラシカステロールを含む。ステロールのいくつかはまた、エルゴステロールおよびその他同種のものなどの微生物に由来することもある。
【００４１】
本発明において言及されたマイコバクテリウムは、非病原性の増殖の早いマイコバクテリウムである。本発明の一層良く理解するために、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍの標準株ＮｗＩＢ−００（受け入れ番号は以下の通り：ＡＴＣＣ ２５７９５）が、特定の実施形態のさらなる説明として使用される。以下の実施例は、本発明をよく例示するように意図されるが、本発明の範囲を限定するようには意図されていないことが理解されるだろう
【００４２】
＜実施例１＞
＜Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００において、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が欠失している、操作された株の構築＞
【００４３】
本実施例では、マイコバクテリウムにおいて使用される相同組み換えおよびダブルクロスオーバーノックアウトの主要で技術的な手段および方法は、例としてヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトを挙げることにより説明され、そしてアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のノックアウトは同じ方法により完結される。マイコバクテリウム遺伝子ノックアウトのための様々な方法が存在し、そして遺伝子ノックアウトの方法はここでは限定されない。Ｔａｎｙａ Ｐａｒｉｓｈ教授により開発された遺伝子ノックアウト方法を、標的遺伝子ノックアウトを例示するために、例としてここで使用する（Ｂｈａｖｎａ Ｇ． Ｇｏｒｄｈａｎ Ａｎｄ Ｔａｎｙａ Ｐａｒｉｓｈ． Ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ． Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． ２００１， ｐｐ７７−９２）。
【００４４】
マイコバクテリウムヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子ノックアウトプラスミドを構築し、その後、そのプラスミドを、電気的形質転換によりマイコバクテリウムへと入れる。スクリーニングをカナマイシンおよびヒグロマイシンを用いて実行し、その後、スクロースプレートで再度スクリーニングし、遺伝子ノックアウト組み換え体を得る。組み換え体をＰＣＲにより確認する。本発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００に対して、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子、３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のうちの１つ以上の遺伝子をノックアウトして、ＮｗＩＢ−Ｘ０１、ＮｗＩＢ−Ｘ０２、ＮｗＩＢ−Ｘ０３、ＮｗＩＢ−Ｘ０４、ＮｗＩＢ−Ｘ０５、ＮｗＩＢ−Ｘ０６と順に命名された６つの異なるマイコバクテリウム株を得る。
【００４５】
それらのうち、ＮｗＩＢ−Ｘ０１株は、ＮｗＩＢ−００株からの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｋｓｈＡ１）と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｓｄ４Ａ）とのノックアウト（順序はない）により得られ、それ故、このＮｗＩＢ−Ｘ０１株はステロイドの母核を分解することができず、言い換えると、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子および１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が、すなわちｋｓｈＡ１＋ｈｓｄ４Ａがノックアウトされている。
【００４６】
ＮｗＩＢ−Ｘ０２株は、ＮｗＩＢ−Ｘ０１株からの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトにより得られ、言い換えると、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡヒドロゲナーゼ遺伝子、および１つの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｋｓｔｄ１）、すなわちｋｓｈＡ１＋ｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１がノックアウトされている。
【００４７】
ＮｗＩＢ−Ｘ０３株は、ＮｗＩＢ−Ｘ０２の誘導体であり、ＮｗＩＢ−Ｘ０２株に基づいて、他の２つの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトにより得られ、言い換えると、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、および３つの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子、すなわち、ｋｓｈＡ１＋ｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１＋ｋｓｔｄ２＋ｋｓｔｄ３がノックアウトされている。
【００４８】
ＮｗＩＢ−Ｘ０４株は、ＮｗＩＢ−００株からの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子とのノックアウト（ノックアウトの順序は無い）により得られ、言い換えると、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、および１つの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子、すなわちｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１がノックアウトされている。
【００４９】
ＮｗＩＢ−Ｘ０５株は、ＮｗＩＢＸ０４の誘導体であり、ＮｗＩＢ−Ｘ０４株からの他の２つの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトにより得られ、言い換えると、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、および３つの３−ケトステロイド−１−デヒドロゲナーゼ遺伝子、すなわちｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１＋ｋｓｔｄ２＋ｋｓｔｄ３がノックアウトされている。
【００５０】
ＮｗＩＢ−Ｘ０６株は、ＮｗＩＢ−００株からの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子とのノックアウトにより得られ、言い換えると、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子、および１つのアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、すなわちｋｓｈＡ１＋ｆａｄＡ５がノックアウトされている。
【００５１】
ここで、その配列、および３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｋｓｈＡ１）のためのノックアウトの方法は、中国特許出願第２００９１００５１６１３．７号の特許明細書において具体的に見ることができ、ここでは記述しない。
【００５２】
それらのうち、これらの３種類の３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ（ｋｓｔｄ１、ｋｓｔｄ２、ｋｓｔｄ３）は類似の配列を有するアイソザイムであり、そしてその配列およびノックアウトの方法は中国特許出願第２００９１００５１６１５．６号の特許明細書で見ることができ、ここでは記述しない。
【００５３】
＜１．１ ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子に隣接する上流および下流の配列の獲得、およびノックアウトプラスミドの構築＞
【００５４】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００の全ゲノムを配列決定し、配列決定情報に基づいて、ゲノムアノテーション情報から、その情報と報告された類似の株の遺伝子クラスター情報と組み合わせて、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の完全なリーディングフレーム配列を検索し、発見した。ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子に隣接する、上流および下流の配列を得た。上流および下流の配列に基づいて、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトのための、上流および下流のプライマーを、ソフトウェアであるＯｌｉｇｏ ６．０およびＰｒｉｍｅｒ ５．０を使用して、以下のように設計した。
【００５５】
Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｕＦ：ＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡ
【００５６】
Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｕＲ：ＴＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＧＧ
【００５７】
Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｄＦ：ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＧ Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｄＲ：
【００５８】
Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｄＲ：ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＡ
【００５９】
ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流および下流の断片を、Ｍ． ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００のゲノムを鋳型として使用して、ＰＣＲ増幅により得た。標的遺伝子の上流および下流の遺伝子を、ｐＭＤ１９−Ｔベクターへとそれぞれクローン化し、その後、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれで酵素消化し、そして酵素消化産物を、対応する酵素消化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子ノックアウトプラスミドｐＮＬに連結させた。前述のプラスミドおよびｐＧＯＡＬ１９プラスミドをＰａｃＩで酵素消化し、非指向的に結合させ、遺伝子ノックアウトプラスミドＱＣ−ｈｓｄ４Ａを構築した。
【００６０】
＜１．２ アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子に隣接する上流および下流の配列の獲得、およびノックアウトプラスミドの構築＞
【００６１】
実施例１．１の方法に従って、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子（ｆａｄＡ５）のノックアウトのための、上流および下流のプライマーを、以下のように設計した。
【００６２】
Ｑ−ｆａｄＡ５−ｕＦ：ＧＣＧＣａａｇｃｔｔＧＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧ
【００６３】
Ｑ−ｆａｄＡ５−ｕＲ：ＴＡＴＡｇａａｔｔｃＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧ
【００６４】
Ｑ−ｆａｄＡ５−ｄＦ：ＧＣＧＣｇａａｔｔｃＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＧ
【００６５】
Ｑ−ｆａｄＡ５−ｄＲ：ＴＡＴＡｇｃｇｇｃｃｇｃＧＧＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＧＡＴＣＴＴ
【００６６】
アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子の上流および下流の断片を、ＮｗＩＢ−００のゲノムを鋳型として使用して、ＰＣＲ増幅により得た。標的遺伝子の上流および下流の遺伝子を、ｐＭＤ１９−Ｔベクターへとそれぞれクローン化し、その後、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩでそれぞれ酵素消化し、そしてその酵素消化産物を、対応する酵素消化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ遺伝子ノックアウトプラスミドｐ２ＮＩＬに連結させた。前述のプラスミドおよびｐＧＯＡＬ１９プラスミドをＰａｃＩで酵素消化し、遺伝子ノックアウトプラスミドＱＣ−ｆａｄＡ５を構築するように非指向的に結合させた。
【００６７】
＜１．３ マイコバクテリウムのコンピテント細胞へのノックアウトプラスミドの形質転換＞
【００６８】
マイコバクテリウムのコンピテント状態の調製：１級種をＯＤ０．５−１．５までインキュベートし、その５％−１０％を２級種へと変換し；１４−２４時間後に、２％グリシンを添加して、約２４時間、培養を継続させた。その細胞を遠心分離により採取し、１０％のグリセロールで４回洗浄し、懸濁させて、その後、遠心分離させた。最終的に、１ｍｌのグリセロールをその懸濁された細胞に添加し、個別に保存した。
【００６９】
電気的な形質転換：アルカリにより処理された前述の１０μｌのプラスミドを、１５分間、１００μｌのコンピテント細胞に添加し、ショック条件は以下の通りとした：２．５ｋｖ／ｃｍ、２５μＦ、２０ｍｓ。
【００７０】
＜１．４ 組み換え体のスクリーニングおよび検証＞
【００７１】
電気的形質転換の産物を、約３−２４時間の回復培養のために、培地に添加し、その後、固形培地（成分：ｈｙｇ ５０μｇ／ｍｌ、ｋｎ ２０μｇ／ｍｌ、Ｘ−ｇａｌ ５０μｇ／ｍｌ）上に塗布し、３−７日間、３０℃で放置して培養した。青いスポットを有するコロニーを選定して、ＰＣＲ検証した。確認されたシングルクロスオーバー体（ＳＣＯ）の菌を２％スクロースプレート上に塗布し、３−７日間、３０℃で放置して培養し、白いコロニーを選定して、ＰＣＲ検証した。
【００７２】
組み換え体の確認：シングルクロスオーバー体およびダブルクロスオーバー体のＰＣＲ検証、ならびにその検証の原理は、上で引用された文献に記載されている。ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子ノックアウト検証プライマーを、以下のように示す。
【００７３】
Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ＹＺ−Ｆ：ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧ
【００７４】
Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ＹＺ−Ｒ：ＴＡＧＴＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＧ
【００７５】
検証の結果は、図２に示される通りである。ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が成功裡にノックアウトされていない株に関して、理論的には、約１２００ｂｐのバンドのみが現われ；そして、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のダブルクロスオーバー体（ＤＣＯ）では、理論的には、約５００ｂｐのバンドのみが現われる。ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のシングルクロスオーバー体（ＳＣＯ）では、理論的には、約５００ｂｐと１２００ｂｐとの２本のバンドが存在し、それによって、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が成功裡にノックアウトされたこと、およびオリジナルの酵素の機能が破壊されたことが示される。
【００７６】
アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子ノックアウト検証プライマーを、以下のように示す。
【００７７】
Ｑ−ｆａｄＡ５−ＹＺ−Ｆ：ＴＣＡＧＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣ
【００７８】
Ｑ−ｆａｄＡ５−ＹＺ−Ｒ：ＡＴＣＣＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＴＧＧＡＡＴ
【００７９】
検証の結果は、図３に示される通りである。アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が成功裡にノックアウトされていない株に関して、理論的には、約１３００ｂｐのバンドのみが現われ；そして、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のダブルクロスオーバー体（ＤＣＯ）では、理論的には、約５００ｂｐのバンドのみが現れ、そのことが、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が成功裡にノックアウトされたこと、およびオリジナルの酵素の機能が破壊されたことを示す。
【００８０】
＜実施例２ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００によるステロイドの形質転換、および結果の分析方法＞
【００８１】
ステロール基質を１％から１０％の界面活性剤、高分子溶媒、または有機溶媒（Ｔｗｅｅｎ ８０、エタノール、シリコーン油、大豆油、その他など）を用いて可溶化した。二次培養または三次培養を採用し、５％から１０％の種を、最終的な形質転換培地に接種処置し、そしていつでもステロール基質を添加できる。ステロイドの形質転換に関する条件は、以下の通りとした：２５−３７℃のインキュベーション温度、高い溶存酸素値、およびｐＨ５．０から８．０。転換反応の終了時間を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析により判定した。反応後、ステロイド転換産物は、同体積の酢酸エチル、またはクロロホルム、および他の有機溶媒で、３回抽出できる。その得られた溶液を、混ぜ合わせて真空乾燥した。その後、分析および産物の調製を実行した。
【００８２】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００形質転換フィトステロールを振盪フラスコで培養し、３０ｍｌの試料量で２５０ｍｌの振盪フラスコにおいて、５％−１０％のＴｗｅｅｎ８０またはシリコーン油をフィトステロールの共溶媒として使用して２級培養し、ここで、５％−１０％の種が、０．４−２ｇ／ｌのフィトステロールを含む２級培養培地へと接種処置された。２６−３５℃、２００−３００ｒｐｍ、ｐＨ５．０−８．０の培養条件のもとで、３−７日間培養した後、酢酸エチルの抽出を実行し、そして有機相中のステロールの形質転換状況を、ＴＬＣおよびＧＣ等により検出した。
【００８３】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の操作条件を以下の通りとした：石油エーテル：酢酸エチル（６：４から７：３）を展開剤として使用し；薄板を、煙台シリコーン工場により生産された５×１０ｃｍ組み立て式プレートとし；２０％硫酸溶液を均一に吹付け；そして、プレートを、スポットが姿を現わすまで、１０５℃のオーブン中で、５分−１０分間ベークし、観察した。
【００８４】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００によるフィトステロールの形質転換の結果は、図４に示される通りである。１，４−ＢＮＡ、４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡ、および他の産物が蓄積することなく、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮｗＩＢ−００によって、フィトステロールを完全に分解かつ代謝できる。
【００８５】
＜実施例３ 遺伝子操作された株である、ＮｗＩＢ−Ｘ０１、ＮｗＩＢ−Ｘ０２、ＮｗＩＢ−Ｘ０３、ＮｗＩＢ−Ｘ０４、ＮｗＩＢ−Ｘ０５、およびＮｗＩＢ−Ｘ０６の、ステロールの分解による１，４−ＢＮＡ、４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡの調製における使用＞
【００８６】
遺伝子操作された株の培養条件、およびステロイドの形質転換の条件は、実施例２に従って実行できる。振盪フラスコ（３０ｍｌの充填液／２５０ｍｌの振盪フラスコ）中で、フィトステロールを基質として使用し、ここで、その投与量は０．５−５％であり、その形質転換時間は５−１０日であり、そして操作された株によるフィトステロールの形質転換の結果は、図５および図６に示される通りである。
【００８７】
遺伝子操作された株ＮｗＩＢ−Ｘ０１は、１，４−ＢＮＡおよび４−ＢＮＡを同時に産生するように、ステロールを形質転換し分解でき、ここで産物である１，４−ＢＮＡは主産物であり；ＮｗＩＢ−Ｘ０２は、ステロールを形質転換し分解でき、そして１，４−ＢＮＡおよび４−ＢＮＡも産生でき、ここで産物である４−ＢＮＡは、株中に３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子が存在しないため、主産物であり；そしてＮｗＩＢ−Ｘ０３は、ステロールを形質転換させ分解して、４−ＢＮＡおよび９−ＯＨ−ＢＮＡを生産でき、ここで産物である４−ＢＮＡは、株中に３つの３−ケトステロイド−△１−デヒドロゲナーゼ遺伝子が存在しないため、ＮｗＩＢ−Ｘ０２と比較して、主産物であり、遺伝子操作された株であるＮｗＩＢ−Ｘ０６は、１，４−ＢＮＡおよび４−ＢＮＡを産生するようにステロールを形質転換し、分解でき、これらに加えて、それは、アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン（ＡＤ）およびアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）も産生できる。
【００８８】
遺伝子操作された株であるＮｗＩＢ−Ｘ０４は、９−ＯＨ−ＢＮＡを産生するようにステロールを形質転換し、分解でき、これに加えて、９α−アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン（９−ＯＨ−ＡＤ）も産生でき；そして、ＮｗＩＢ−Ｘ０５も、９−ＯＨ−ＢＮＡを産生するようにステロールを形質転換し、分解できる。
【００８９】
上記の観点から、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子および／またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子の欠失により構築された、本発明の遺伝子操作されたマイコバクテリウム株によれば、２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−１，４−ジエン−３−オン、２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−４−エン−３−オン、および９α，２２−ジヒドロキシ−２３，２４−ビスノルコル−４−エン−３−オンの化合物を随意に調製できる。これらの産物は、副腎皮質ホルモンのステロイド薬の生産において産業上使用でき、そしてジエンを介するジオスゲニンに基づく副腎皮質ホルモンの産生のための、現在のプロセスを部分的に置き換えることができ、したがってステロイドの生産効率を大幅に改善し、ステロイド薬生産プロセスのエネルギー消費および原料消費を削減する助けとなり、生産工程を簡素化し、そして生産コストを削減できる。
【００９０】
前述の好ましい実施形態は、本質的に限定するというよりもむしろ、例示的であり、そして本発明の多くの変更が、上述の教示の観点から可能である。したがって、そのことが容易に理解されるように、本発明の特許請求の範囲および記載に従ってなされた同等な変更および修正は、特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲に分類される。詳細に記述されていない内容は、慣例の技術的解決法である。
【図１】
0006592101.tif 000003
【図２】
0006592101.tif 000004
【図３】
0006592101.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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