(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類（但し、クラミドモナス・レインハーディに属する藻類を除く）に以下の（１）及び（２）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるSQD2遺伝子のプロモーター、LDSP遺伝子のプロモーター、又はLPAT-Y遺伝子のプロモーター。
【請求項２】
藻類が、ナンノクロロプシス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項１に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
【請求項３】
トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
【請求項４】
トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
【請求項５】
藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
【請求項６】
コンストラクトが、トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。
【請求項７】
以下の（１）及び（２）を含むコンストラクトが導入されていることを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類（但し、クラミドモナス・レインハーディに属する藻類を除く）、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるSQD2遺伝子のプロモーター、LDSP遺伝子のプロモーター、又はLPAT-Y遺伝子のプロモーター。
【請求項８】
藻類が、ナンノクロロプシス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする請求項７に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
【請求項９】
トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする請求項７又は８に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
【請求項１０】
トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする請求項７又は８に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
【請求項１１】
藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする請求項７乃至１０のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
【請求項１２】
コンストラクトが、トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域を含むことを特徴とする請求項７乃至１１のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。
【請求項１３】
請求項７乃至１２のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にトリアシルグリセロールを蓄積させ、蓄積したトリアシルグリセロールを採取することを特徴とするトリアシルグリセロールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアシルグリセロール（以下、「TAG」という）高生産性藻類の作製法、及びTAG高生産性藻類、並びに前記藻類を用いたTAGの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii、以下「C. reinhardtii」という場合がある。）などの藻類にTAG合成酵素遺伝子を導入し、それにより細胞中にTAG蓄積させることは従来行われてきた（特許文献１、非特許文献１）。【０００３】
例えば、非特許文献１には、C. reinhardtiiに、強発現プロモーターであるpsaDを付加したDGAT2遺伝子を導入し、これを窒素又は硫黄欠乏条件下で培養し、TAGを細胞中に蓄積させる方法が記載されている。特許文献１にも、非特許文献１と同様に、psaDを付加したDGAT2遺伝子を導入したC. reinhardtiiが記載されている。【０００４】
TAGの生産に関しては、C. reinhardtii以外にも、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類も注目されている。この藻類は、C. reinhardtiiの100倍程の高密度で培養することが可能であることから、C. reinhardtiiよりもTAGの生産に適していると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO 2011/156520
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. La Russa et al., J. Biotechnol. 2012 Nov 30; 162(1):13-20
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したようにTAG合成酵素遺伝子を藻類に導入することにより、細胞中にTAGを蓄積させる方法は既に知られているが、それらの方法では十分な量のTAGを蓄積させることができなかった。例えば、非特許文献１には、窒素欠乏、硫黄欠乏のいずれの条件においても、DGAT2遺伝子導入株と野生株との間にTAGの蓄積量に統計的に意味のある差異はなかったと記載されている（Fig. 5など）。【０００８】
本発明は、このような背景の下、藻類の細胞中にTAGを効率的に蓄積させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、まず、従来の方法において十分な量のTAGが蓄積しないのはプロモーターに原因があるのではないかと考えた。即ち、TAGは栄養欠乏時に蓄積されるが、栄養欠乏時には、psaDのような強発現プロモーターは十分機能していないのではないかと考えた。そこで、強発現プロモーターに代えて、栄養欠乏応答プロモーターを使用するという発想を得た。また、本発明者は、窒素欠乏条件とリン欠乏条件におけるTAGの蓄積量とTAGの脂肪酸組成を調べた。その結果、１）増殖の盛んな細胞を植え継いだ場合、窒素欠乏条件よりリン欠乏条件の方がTAGの蓄積量が多いこと、２）窒素欠乏条件では、葉緑体の膜脂質由来の脂肪酸を含むTAGが多く、新しく合成された脂肪酸は少ないこと、３）窒素欠乏、リン欠乏のいずれの条件でも細胞の増殖は阻害されるが、リン欠乏条件では、窒素欠乏条件ほど、細胞の増殖は阻害されないことなどがわかった。これらの知見から、TAG高生産性藻類としては、窒素欠乏応答性のものよりも、リン欠乏応答性のものの方が好ましいという発想を得た。更に、本発明者は、リン欠乏応答プロモーターとしては、C. reinhardtiiのSQD2a遺伝子のプロモーターが好適であり、TAG合成酵素遺伝子としては、C. reinhardtiiのDGTT4遺伝子が好適であるという知見も得た。【００１０】
以上の知見に基づき、本発明者は、SQD2a遺伝子のプロモーターを付加したDGTT4遺伝子をC. reinhardtiiに導入することにより、高いTAG生産能を持つC. reinhardtii株の作製に成功し、このTAG高生産性C. reinhardtii株に関する特許出願を行った（特開2014-68638、この出願は、本願の優先権の基礎である特願2014‐049651の出願時点においては出願公開されていなかった。）。【００１１】
本発明者は、この研究を更に進め、C. reinhardtiiよりもTAGの生産に適した藻類であるナンノクロロプシス属の藻類についても、高いTAG生産能を持つ藻類株を得ることに成功した。また、DGTT4遺伝子をSQD2a遺伝子のプロモーターとナンノクロロプシス属の藻類由来の遺伝子の3'非翻訳領域で挟み込むような構造のコンストラクトを作製し、これをナンノクロロプシス属の藻類の細胞に導入することにより、効率的にTAG高生産性株を作製できるという知見を得た。【００１２】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。【００１３】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１９〕を提供するものである。
〔１〕  藻類に以下の（１）〜（３）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
（３）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。【００１４】
〔２〕リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする〔１〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００１５】
〔３〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００１６】
〔４〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００１７】
〔５〕藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００１８】
〔６〕藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００１９】
〔７〕以下の（１）〜（３）を含むコンストラクトが導入されていることを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、
（３）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域。【００２０】
〔８〕リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする〔７〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。【００２１】
〔９〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする〔７〕又は〔８〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。【００２２】
〔１０〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする〔７〕又は〔８〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。【００２３】
〔１１〕藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする〔７〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。【００２４】
〔１２〕藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする〔７〕乃至〔１０〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類。【００２５】
〔１３〕〔７〕乃至〔１２〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類をリン欠乏条件下で培養し、藻類細胞中にトリアシルグリセロールを蓄積させ、蓄積したトリアシルグリセロールを採取することを特徴とするトリアシルグリセロールの製造方法。【００２６】
〔１４〕藻類に以下の（１）及び（２）を含むコンストラクトを導入することを特徴とするトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法、
（１）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子、
（２）トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター。【００２７】
〔１５〕リン欠乏応答プロモーターが、SQD2遺伝子のプロモーターであることを特徴とする〔１４〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００２８】
〔１６〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGAT2遺伝子であることを特徴とする〔１４〕又は〔１５〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００２９】
〔１７〕トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子が、DGTT4遺伝子であることを特徴とする〔１４〕又は〔１５〕に記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００３０】
〔１８〕藻類が、ナンノクロロプシス属、クラミドモナス属、シュードコリシスチス属、フェオダクチラム属、オステレオコックス属、シアニディオシゾン属、クレブソルミディウム属、クロロキブス属、スピロギラ属、カラ属、コレオケーテ属、クロレラ属、又はフィスチュリフェラ属に属する藻類であることを特徴とする〔１４〕乃至〔１７〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００３１】
〔１９〕藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類であることを特徴とする〔１４〕乃至〔１７〕のいずれかに記載のトリアシルグリセロール高生産性藻類の作製法。【００３２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2014‐049651の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の高生産性藻類は、例えば、以下のような効果を有する。
（１）従来知られている藻類よりも、多くのTAGを蓄積する。
（２）TAG合成酵素遺伝子はリン欠乏応答プロモーターの制御下にあるので、通常培養時にこの遺伝子は強発現しない。このため、TAG蓄積のタイミングをコントロールすることができる。
（３）通常条件に比べて増殖効率は低下するものの、リン欠乏条件下でもある程度の細胞増殖は可能なので、細胞を増殖させながら、TAGを蓄積させることも可能である。
（４）蓄積されるTAG中の脂肪酸は、既に合成されている脂質（葉緑体の脂質など）に由来するものではなく、新たに合成されたものなので、有用な特殊脂肪酸の生産にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】栄養欠乏条件下での増殖曲線を示す図。図中のf/2はf/2培地、Nは窒素欠乏f/2培地、Pはリン欠乏f/2培地で培養した場合をそれぞれ示す。
【図２】培養開始から0日、5日、8日、及び13日後の培養液の状態を示す写真。図中のf/2はf/2培地、Nは窒素欠乏f/2培地、Pはリン欠乏f/2培地で培養した場合をそれぞれ示す。
【図３】栄養欠乏時の細胞の蛍光顕微鏡写真。図中のf/2はf/2培地、-Nは窒素欠乏f/2培地、-Pはリン欠乏f/2培地、TAPはTAP培地、TAP-Nは窒素欠乏TAP培地、TAP-Pはリン欠乏TAP培地で培養した場合をそれぞれ示す。
【図４】培養液1L当たりのTAG量を示す図。
【図５】TAG生産系強化のためのコンストラクトの構造を模式的に表した図。
【図６】定量PCRによるCrDGTT4遺伝子の発現確認実験の結果を示す図。
【図７】細胞当たりのTAG量を示す図。図中のP4d及びP7dはそれぞれ培養4日目及び7日目のTAG量を示す。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。なお、#19の7日目のTAG量は測定していない。
【図８】培養液1L当たりのTAG量を示す図。図中のP4d及びP7dはそれぞれ培養4日目及び7日目のTAG量を示す。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。なお、#19の7日目のTAG量は測定していない。
【図９】培養4日目のTAG脂肪酸組成を示す図。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。
【図１０】培養7日目のTAG脂肪酸組成を示す図。各棒グラフは、左から野生株、コントロール株、#18、#3、#8、#9、#19、#21のTAG量を示す。
【図１１】N. 2145を栄養欠乏下で育てたときの遺伝子発現の変化を示す図（栄養欠乏4日目）。図中のF2NはF2N50%SW培地、Pはリン欠乏F2N50%SW培地、Nは窒素欠乏F2N50%SW培地で培養した場合をそれぞれ示す。グラフの縦軸は、アクチンの発現量に対する相対値を示す。
【図１２】N. 2145を栄養欠乏下で育てたときの遺伝子発現の変化を示す図（栄養欠乏6日目）。図中のF2NはF2N50%SW培地、Pはリン欠乏F2N50%SW培地、Nは窒素欠乏F2N50%SW培地で培養した場合をそれぞれ示す。グラフの縦軸は、アクチンの発現量に対する相対値を示す。
【図１３】N. 2145由来のプロモーターを用いたコンストラクトの構造を模式的に表した図。
【図１４】定量PCRによるCrDGTT4遺伝子の発現確認実験の結果を示す図。左図は栄養欠乏４日目の結果を示し、右図は栄養欠乏６日目の結果を示す。
【図１５】細胞当たりのTAG量[pg]（上図）と培養液当たりのTAG量[mg]（下図）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３６】
本発明のTAG高生産性藻類の作製法は、藻類に（１）TAG合成酵素遺伝子、（２）TAG合成酵素遺伝子の上流に配置されるリン欠乏応答プロモーター、及び（３）TAG合成酵素遺伝子の下流に配置され、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域を含むコンストラクトを導入することを特徴とするものである。
【００３７】
TAG合成酵素遺伝子としては、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)遺伝子を使用することができる。DGATには、DGAT1とDGAT2という２種類のアイソザイムが存在する。本発明においてはいずれも使用できるが、DGAT2を使用するのが好ましい。DGAT2やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されているので（例えば、Jay M. Shockey et al., The Plant Cell, Vol. 18 September 2006, 2294-2313、Miller et al., Plant Physiology, vol.154 2010, 1737-1752）、当業者はDGAT2遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。DGAT2遺伝子の具体例としては、後述するC. reinhardtiiのDGTT4遺伝子のほか、Nannochloropsis sp.のDGAT2A遺伝子（その塩基配列を配列番号２８に示す。）、DGAT2B遺伝子（その塩基配列を配列番号２９に示す。）、DGAT2C遺伝子（その塩基配列を配列番号３０に示す。）、DGAT2D遺伝子（その塩基配列を配列番号３１に示す。）、DGAT2E遺伝子（その塩基配列を配列番号３２に示す。）、DGAT2F遺伝子（その塩基配列を配列番号３３に示す。）、DGAT2G遺伝子（その塩基配列を配列番号３４に示す。）、DGAT2H遺伝子（その塩基配列を配列番号３５に示す。）、DGAT2I遺伝子（その塩基配列を配列番号３６に示す。）、DGAT2J遺伝子（その塩基配列を配列番号３７に示す。）、DGAT2K遺伝子（その塩基配列を配列番号３８に示す。）などを挙げることができる。
【００３８】
DGAT2遺伝子としては、例えば、DGTT4遺伝子を使用することができる。DGTT4は、C. reinhardtiiに含まれるDGAT2ファミリーに属するタンパク質であり、このタンパク質やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されているので（例えば、Boyle et al. The Journal of biological chemistry, 287 (2012), pp. 15811-15825、 Chen JE and Smith AG, J Biotechnol. 2012 Jun 29）、当業者はDGTT4遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。DGTT4のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号２に示すとおりである。本発明におけるDGTT4遺伝子には、C. reinhardtiiのDGTT4遺伝子(Cre03.g205050)だけでなく、他の生物におけるこの遺伝子に相当する遺伝子（ホモログなど）も含まれる。このようなC. reinhardtii以外の生物におけるDGTT4遺伝子の具体例としては、Volvox carteri f. nagariensisのDGAT2 (JGI protein ID77655)遺伝子、Ostreococcus tauriのDGAT2 (JGI protein ID 21937)遺伝子などを挙げることができる。
【００３９】
DGTT4遺伝子の塩基配列としては、配列番号２に示す塩基配列を例示できる。また、DGTT4遺伝子の塩基配列は、配列番号２示す塩基配列と高い同一性を示す塩基配列であって、活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性など）のあるタンパク質をコードしている塩基配列であってもよい。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。なお、本明細書における「同一性」の値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出することができる。例えば、NCBIの相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００４０】
また、DGTT4遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、活性（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性など）のあるタンパク質をコードするものであってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。
【００４１】
TAG合成酵素遺伝子としては、DGTT4遺伝子以外の酵素遺伝子を使ってもよい。例えば、多価不飽和脂肪酸を多く含むTAGを藻類に生産させたい場合は、多価不飽和脂肪酸を優先的にTAG内に取り込むTAG合成酵素遺伝子を使えばよい。このような遺伝子としては、例えば、タラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）の持つDGAT2遺伝子（特表2011-507513号公報）など挙げることができる。
【００４２】
リン欠乏応答プロモーターとしては、例えば、SQD2遺伝子のプロモーターを使用することができる。SQD2はスルホキノボシルジアシルグリセロール（SQDG）の合成に関与する酵素であり、この酵素やそれをコードする遺伝子については、多くの論文において報告されており（例えば、 Yu B, Xu C, Benning C., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr;99(8):5732-7.）、また、この酵素のアミノ酸配列もデータベース上で公表されているので（例えば、C. reinhardtiiのSQD2(SQD2a)のアミノ酸配列はGenBank Accession No. XP_001689662に記載されている。）、当業者はSQD2遺伝子がどのようなものであるか理解することができる。SQD2遺伝子のプロモーターとしては、C. reinhardtiiのSQD2a遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号１に示す。）、Nannochloropsis sp.のSQD2A遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号４５に示す。）、Nannochloropsis sp.のSQD2B遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号１５に示す。）などを使用することができる。
【００４３】
SQD2遺伝子のプロモーターの塩基配列としては、配列番号１、配列番号１５若しくは配列番号４５に示す塩基配列、又は配列番号１、配列番号１５若しくは配列番号４５に示す塩基配列と高い同一性を示す塩基配列であって、プロモーター活性を維持している塩基配列などを例示できる。ここでいう「高い同一性」とは、通常９０％以上の同一性、好ましくは９５以上の同一性、より好ましくは９７％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。
【００４４】
また、SQD2遺伝子のプロモーターの塩基配列は、配列番号１、配列番号１５若しくは配列番号４５に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、プロモーター活性を維持している塩基配列であってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、「欠失、置換若しくは付加」には、人為的な変異のほか、個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutantやvariant）も含まれる。
【００４５】
リン欠乏応答プロモーターとしては、SQD2遺伝子のプロモーター以外のプロモーターを使ってもよい。例えば、LDSP遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号４６に示す。）、LPAT-Y遺伝子のプロモーター（その塩基配列を配列番号４４に示す。）なども使うことができる。
【００４６】
リン欠乏応答プロモーターは、藻類に導入するコンストラクトにおいて、TAG合成酵素遺伝子の上流に配置される。リン欠乏応答プロモーターは、TAG合成酵素遺伝子に直接接続していてもよいし、リンカーなどを介して接続していてもよい。
【００４７】
3'非翻訳領域は、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域を使用する。実施例では、VCP(violaxanthin/chlorophyll a-binding protein)1の3'非翻訳領域を使用しているが、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来する遺伝子の3'非翻訳領域であればどのようなものでもよい。VCP1遺伝子以外の遺伝子の3'非翻訳領域としては、カリフラワーモザイクウィルスのT35Sの3'非翻訳領域、ナンノクロロプシス属の藻類のRubisco小サブユニットRBCS2の3'非翻訳領域などを例示できる(Genome, Functional Gene Annotation, and Nuclear Transformation of the Heterokont Oleaginous Alga Nannochloropsis oceanica CCMP1779, PLoS Genet. 2012 Nov;8(11). Epub 2012 Nov 15.)。3'非翻訳領域の長さは特に限定されないが、500〜1500塩基とするのが好ましく、500〜700塩基とするのが更に好ましい。コンストラクト中にTAG合成酵素遺伝子とプロモーターのほかに、この3'非翻訳領域を含めることにより、効率的にTAG高生産性藻類を作製できるようになる。
【００４８】
3'非翻訳領域は、藻類に導入するコンストラクトにおいて、TAG合成酵素遺伝子の下流に配置される。3'非翻訳領域は、TAG合成酵素遺伝子に直接接続していてもよいし、リンカーなどを介して接続していてもよい。
【００４９】
コンストラクトは、上述したTAG合成酵素遺伝子、プロモーター、及び3'非翻訳領域のほかに、他の遺伝子等、例えば、抗生物質耐性遺伝子やそれを発現させるためのプロモーターなどを含んでいてもよい。
【００５０】
コンストラクトの導入対象とする藻類としては、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属の藻類が好ましいが、これ以外の藻類、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、シュードコリシスチス（Pseudochoricystis）属、フェオダクチラム（Phaeodactylum）属、オステレオコックス（Ostreococcus）属、シアニディオシゾン（Cyanidioschyzon）属、クレブソルミディウム（Klebsormidium）属、クロロキブス（Chlorokybus）属、スピロギラ（Spirogyra）属、カラ（Chara）属、コレオケーテ（Coleochaete）属、クロレラ（Chlorella）属、又はフィスチュリフェラ（Fistulifera）属に属する藻類などであってもよい。ナンノクロロプシス属の藻類としては、ナンノクロロプシス・オクラタ (Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・ ガディタナ(Nannochloropsis gaditana)などを例示でき、クラミドモナス属の藻類としては、クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）などを例示でき、シュードコリシスチス属の藻類としては、シュードコリシスチス・エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）などを例示でき、フェオダクチラム（Phaeodactylum）属の藻類としてはフェオダクチラム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）を例示でき、オステレオコックス属の藻類としてはオステレオコックス・タウリ（Ostreococcus tauri）を例示でき、シアニディオシゾン属の藻類としてはシアニディオシゾン・メロラ（Cyanidioschyzon merolae）を例示でき、クレブソルミディウム属の藻類としてはクレブソルミディウム・フラチダム（Klebsormidium flaccidum）を例示でき、カラ属の藻類としては、カラ・フラギリス（Chara fragilis）を例示でき、コレオケーテ属の藻類としては、コレオケーテ・スクタータ（Coleochaete scutata）を例示でき、クロレラ属の藻類としては、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）などを例示でき、フィスチュリフェラ属の藻類としては、フィスチュリフェラ・ソラリス（Fistulifera solaris）などを例示できる。
【００５１】
上述したように、3'非翻訳領域は、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種の藻類に由来するものである必要があるが、TAG合成酵素遺伝子とリン欠乏応答プロモーターは、コンストラクトを導入しようとする藻類と同種、異種のいずれの藻類由来のものであってもよい。
【００５２】
コンストラクトの構築やこれを藻類に導入する操作などは常法に従って行うことができる。
【００５３】
上述した方法によって作製されたTAG高生産性藻類の培養は、TAG蓄積時にリン欠乏条件下で培養すること以外、通常の藻類の培養と同様に行うことができる。例えば、藻類として、ナンノクロロプシス属の藻類を培養する場合は、培地としては、f/2培地などを用いることができ、培養温度は20〜25℃程度とすることができ、培養時の光強度は10〜40μE/m2/secとすることができ、クラミドモナス属の藻類を培養する場合は、培地としては、TAP培地などを用いることができ、培養温度は23〜25℃程度とすることができ、培養時の光強度は10〜40μE/m2/secとすることができる。
【００５４】
TAG高生産性藻類にTAGを蓄積させる場合は、リン欠乏条件下で培養する。リン欠乏条件下での培養は、例えば、対数増殖期の細胞を、増殖時に用いていた培地からリン成分（例えば、K2HPO4、KH2PO4など）を除いた培地、あるいはリン成分の濃度を33μM以下にした培地に移して培養することにより、行うことができる。通常、8〜13日程度の培養で細胞中に十分な量のTAGが蓄積される。また、ナンノクロロプシス属の藻類など高密度培養が可能な藻類では、リン成分を除いた培地等に移すことなく、増殖時に用いていた培地で、高密度条件下で一定期間以上培養することによっても、TAGを蓄積させることができる。これは、長期間培養することにより、自然にリン欠乏条件になるためであると考えられる。この高密度培養法では、通常、7〜20日程度の培養で細胞中に十分な量のTAGが蓄積される。なお、ここでいう「高密度培養」とは、通常、細胞密度が1x108cells/ml以上の培養をいう。
【００５５】
TAGを蓄積した細胞からTAGの採取は常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
〔実験材料〕
（１）藻類株
真正眼点藻 Nannochloropsis NIES-2145 (以後N. 2145)を使用した。この藻類株は独立行政法人国立環境研究所(http://www.nies.go.jp/)から入手可能である。【００５７】
緑藻Chlamydomonas reinhardtii C9株（CC-408 mt-）を使用した。この藻類株はChlamydomonas Center (http://chlamycollection.org/)から入手可能である。
（２）遺伝子名とprotein ID
遺伝子名とprotein ID(JGI Chlamydomonas reinhardtii 4.0)は以下の通りである。
DGTT4: PID190539
SQD2a: PID116277
CBLP: PID164254
（３）遺伝子配列
C. reinhardtii由来のSQD2aプロモーター（pCrSQD2a）の配列は、配列番号１に示す通りである。【００５８】
C. reinhardtii由来のDGTT4遺伝子（CrDGTT4）の配列は、配列番号２に示す通りである。【００５９】
sh ble遺伝子の配列は、配列番号４に示す通りである。【００６０】
ナンノクロロプシス由来のVCP2遺伝子のプロモーター（NannoVCP2gene promoter）の配列は、配列番号５に示す通りである。【００６１】
ナンノクロロプシス由来のVCP1遺伝子の3'非翻訳領域（NannoVCP1(VCP1) 3'UTR）の配列は、配列番号６に示す通りである。【００６２】
〔実験操作〕
（１）培養条件
C. reinhardtiiの培養にはTAP培地を通常培養の培地として使用した。【００６３】
Na2EDTA ・ 2H2O 5 g, ZnSO4 ・ 7H2O 2.2 g, H3BO3 1.14 g, MnCl2 ・ 4H2O 506 mg, FeSO4 ・ 7H2O 499 mg, CoCl2 ・ 6H2O 161 mg, CuSO4・ 5H2O 157 mg, ( NH4 )6Mo7O24 ・ 4H2O 110 mg, KOH 1.6gをイオン交換水 1Lへ溶解し、 Hutner’s trace elementsとして4℃に保存しておいた。【００６４】
NH4Cl 400 mg , CaCl2 ・ 2H2O 51 mg,  MgSO4 ・ 7H2O 100 mg, K2HPO4 119 mg, KH2PO4 60.3 mg, Hutner’s trace elements 10 mL, 酢酸 1 mL, Tris ( hydroxymethyl ) aminomethane 2.42 gをイオン交換水 998 mLへ溶解し、オートクレーブ滅菌してから液体TAP培地として使用した。プレート培地として使用する場合はINA Agar 12 gをオートクレーブ前に添加した。【００６５】
TAP培地を通常培養の培地として使用し、20〜30 μE/m2/sec, 23℃で旋回培養した。リン欠乏培地ではTAP培地から K2HPO4, KH2PO4をのぞき、窒素欠乏培地では NH4Clをのぞいた。【００６６】
N. 2145の培養にはf/2培地又はF2N50%SW培地を通常培養の培地として使用した。【００６７】
f/2培地は、以下のように調製した。
Na2EDTA ・ 2H2O 440 mg, FeCl3 ・ 6H2O 316 mg, CoSO4 ・ 7H2O 1.2 mg, ZnSO4 ・ 7H2O 2.1 mg, MnCl2 ・ 4H2O 18 mg, CuSO4 ・ 5H2O 0.7 mg, Na2MoO4 ・ 2H2O 0.7 mgをイオン交換水 100 mLへ溶解し、f/2 metalとして4℃に保存しておいた。NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.6 mg, Vitamin B12 0.05 μg, Biotin 0.05 μg, Thiamine HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.1 mLを人工海水 99.9 mLへ溶解し、フィルター滅菌してから液体f/2培地として使用した。プレート培地として使用する場合は NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4 ・ 2H2O 0.6 mg, Vitamin B12 0.05 μg, Biotin 0.05 μg, Thiamine HCl 10 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.1 mlを２倍濃度の人工海水 50 mLに溶解し、フィルター滅菌しておき、別のフラスコでINA Agar 8 gをイオン交換水 50 mLに加えてオートクレーブしてから、培地に加えた。【００６８】
野生型N. 2145を用いた実験（図１〜４）では、f/2培地を通常培養の培地として使用し、20〜30 μE/m2/sec, 23℃で旋回培養した。リン欠乏培地ではf/2培地からNaH2PO4をのぞき、窒素欠乏培地ではNaNO3をのぞいた。【００６９】
F2N50%SW培地は、F2N培地（PNAS, 2011, vol. 108 (no. 52) 21265-21269）に含まれる人工海水を50%濃度にしたものであり、以下のように調製した。
Tris(hydroxymethyl)aminomethane 12.11gをイオン交換水 100 mLへ溶解し、HClでpH7.6にあわせたものを1 M Tris(pH7.6)とした。1 M Tris(pH7.6) 10 mL, NH4Cl 26.745 mg, NaNO3 7.5 mg, NaH2PO4・2H2O 3.0 mg, Vitamin B12 0.25 μg, Biotin 0.25 μg, Thiamine HCl 50 μg, Na2SiO3 ・ 9H2O 1 mg, f/2 metal 0.5 mLを50%濃度の人工海水へ溶解して全量100 mLとし、フィルター滅菌してから液体F2N50%SW培地として使用した。脂質合成遺伝子発現のコンストラクトを導入したN. 2145を用いた実験（図６〜１５）では、F2N50%SW培地をコントロール培地、コントロール培地からNaH2PO4をのぞいたものをリン欠培地、コントロール培地からNaNO3、NH4Clをのぞいたものを窒素欠乏培地とした。【００７０】
（２）脂質抽出
培養液100〜450 mLを800×g, 5分間遠心して、培養細胞を沈殿させ、イオン交換水1 mLに懸濁した後、-80℃に保存した。【００７１】
凍結細胞を解凍し、クロロホルム 1 mL, メタノール 2 mLを添加し、10分おきに懸濁しながら１時間室温に置いた。800 g, 5分間スイングローターで遠心し、上清 4 mLを回収した。沈殿に1%(W/V)KCl 0.8 mL, クロロホルム 1 mL, メタノール 2 mLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上清 3.8 mLを先ほどの上清とあわせて回収した。上清 7.8 mLにクロロホルム 2 mL, 1%(W/V)KCl 1.2 mLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、下層の脂質抽出液を回収した。脂質抽出液を乾燥させ、60 mg/mLになるようにクロロホルム：メタノール＝2:1に溶解した後、-20℃に保存した。【００７２】
（３）脂質分析
脂質抽出液50 μLを薄層シリカプレートにスポットし、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝160:40:4の展開液で45分間展開した。0.001%プリムリンを用いて、UV照射下でTAGを確認した。TAGがのっている部分のシリカを削り取り、1mM ペンタデカン酸 100 μL, 5% 塩酸/メタノールを500 μLを添加し、懸濁した後、85℃, 1時間静置した。ヘキサン 500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層のメチルエステル化した脂肪酸を回収した。下層に再びヘキサン500 μLを添加し、懸濁した後、800×g, 5分間スイングローターで遠心し、上層を回収した。メチルエステル化した脂肪酸を乾燥させた後、ヘキサン60 μLに溶解し、ガスクロマトグラフィサンプルとした。ガスクロマトグラフィはSHIMADZU GC-2014にHR-SS-10 25m (length) × 0.25mm (i.d.) (Shinwa Chemical Industries, Ltd., Japan)を取り付けて行った。【００７３】
（４）RNA抽出
凍結細胞に３倍量以上のRNA抽出液と３倍量以上の酸性フェノールを加え、凍ったまま超音波破砕（超音波15秒、氷冷３０秒）を４回行った。20000×g, 5分間, 4℃で遠心し、上清400〜500 μLを回収した。上清に酸性フェノール 300 μL, クロロホルム 300 μLを添加し、懸濁した後、14k rpm, 5分間, 4℃で遠心し、上清400〜500 μLを回収し、この操作を５回繰り返した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g, 5分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノールを1 mL加え、20000×g,５分間, 4℃で遠心し、この操作を２回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 400 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度の核酸であることを確認した。核酸 40 μLに10×DNase I Buffer 5 μL, DNase I 0.5 μL, 滅菌イオン交換水 4.5 μLを加え、37℃, 30分間静置した。酸性フェノール 50 μL, クロロホルム 50 μLを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、上清 35 μLを回収した。上清の1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、1倍量のイソプロパノールを添加し、懸濁した後、20000×g,10分間, 4℃で遠心した。沈殿物に70% エタノール 150 μL加え、20000×g,10分間, 4℃で遠心し、この操作を２回繰り返した後、沈殿物を乾燥させた。乾燥した沈殿を滅菌イオン交換水 50 μLに溶解した後、1 μg/μL以上の濃度のRNAであることを確認した。【００７４】
（５）cDNAの調製
RNA 1 μgに10 mM dNTP 0.5 μL, 100 mM oligo dT18 0.25 μL, 100 mM random 6mer 0.25 μL, RNase free waterを適量（0 〜 5 μL）加えて全量を6 μLとし、65℃, 5分間処理した後、氷上に静置した。さらに5xcDNA Synthesis Buffer 2 μL, 0.1 M DTT 0.5 μL, RNase OUT 0.5μL, Thermo Script RT 0.5 μL, RNase free water 0.5 μLを添加し、50℃, ４０分間, 60℃, ２０分間, 85℃, ５分間 処理した。得られたcDNAは-20℃ に保管した。【００７５】
（６）定量RT-PCR法
2×SYBR Green (TAKARA) 12.5 μL, 10 μM primer_F 1 μL, 10 μM primer_R 1 μL, ５倍希釈したcDNA 2 μL, 滅菌イオン交換水 8.5 μLを懸濁し、反応に用いた。【００７６】
プライマーは以下のものを使用した。
Nanno_realRT_TUBf  AGCATGGCATTGACTCCACC（配列番号７）
Nanno_realRT_TUBr  AACGGCCTCGTTGTAGTACACG（配列番号８）
CrDGTT4_realRT_F  GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG（配列番号９）
CrDGTT4_realRT_R  CGGGCAGAATCCGAACA（配列番号１０）【００７７】
（７）プロモーター配列の獲得
C. reinhardtii C9株のゲノムを鋳型にPCR反応を行い、プロモーター領域pCrSQD2aを得た。得られた約１kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2（Invitrogen）へ導入した。【００７８】
2x GC Buffer II 5 μL, 2.5 mM dNTP 1.6 μL, C9株のゲノム 1 μL, LA Taq 0.05 μL, 10 μM primer_F 1 μL, 10 μM primer_R 1 μL, 滅菌イオン交換水 1.35 μLを懸濁し、PCR反応に用いた。【００７９】
PCR反応条件は以下の3stepで行った。
step1 94℃ ２分間
step2 94℃ ４５秒間, 55℃ ３０秒間, 71℃ １分３０秒間を４０サイクル
step3 71℃ ５分間
プライマーは以下のものを使用した。
SQD2a_F2   CGGGATAGTTGTAGCTGTAG（配列番号１１）
SQD2a_R2   CGAAGAGTTGAGGTGTGTGTTC（配列番号１２）【００８０】
（８）CrDGTT4遺伝子の配列の獲得
リン欠乏時のC. reinhardtiiのcDNAを鋳型にPCR反応を行い、DGTT4遺伝子の全長を得た。得られた約１kbの配列をpMD20-T vector(TAKARA)またはpZErO-2（Invitrogen）へ導入した。【００８１】
LA PCR x10 buffer 1.5 μL, 2.5 mM dNTP 1.2 μL, MgCl2 1.05 μL, LA Taq 0.075 μL, 5 M ベタイン 1.5 μL, DMSO 0.45 μL, 10 μM primer_F 1.5 μL, 10 μM primer_R 1.5 μL, cDNA 0.2 μL, 滅菌イオン交換水 6.1 μLを懸濁し、PCR反応に用いた。【００８２】
PCR反応条件は以下の3stepで行った。
step1 94℃ ３分間
step2 94℃ ３０秒間, 54℃ ３０秒間, 72℃ １分間を４１サイクル
step3 72℃ ３分間
プライマーは以下のものを使用した。
DGTT4_F2   ATGCCGCTCGCAAAGCTGCG（配列番号１３）
DGTT4_R2   CTACATTATGACCAGCTCCTC（配列番号１４）【００８３】
（９）N. 2145形質転換法
通常培地で2〜3×106 cells/mLになるまで培養したN. 2145株 500mLを4℃, 980×g, 10分間遠心し、細胞を沈殿させた。上清をのぞいた後、氷冷した375 mM Sorbitolで3回洗浄した。洗浄後の沈殿細胞を終濃度5×108 cells/mLになるように375 mM Sorbitolに懸濁した。濃縮細胞 200 μlに2〜10 μgのコンストラクトDNA, 10 mg/mL キャリアssDNA（Salmon Sperm）2 μLを添加した。細胞懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット（2 mm幅）に入れ、11kV/cm, 時定数 12 msecで１回電圧をかけた。通常培地 1 mLをキュベットへ添加し、細胞を懸濁した後、15 mLチューブへ移した。さらに通常培地を4 mL添加し、全量を5 mLとした。10 μE/m2/sec, 23℃, 48 時間旋回培養し、0.4% INA Agar/f/2 5 mLを添加し、2 μg/μLゼオシンを添加したプレートに蒔いた。20〜30 μE/m2/sec, 23℃で静置し、14〜20日後に生えて来たコロニーを形質転換株として新しいゼオシン入りプレートへ植えついだ。【００８４】
〔実験結果〕
（１）TAG/膜脂質合成系の制御検討 
モデル藻類C. reinhardtiiでの脂質蓄積に関する知見として、窒素欠乏条件下で脂質が蓄積すること、脂質の中では貯蔵脂質であるTAGが蓄積すること、飽和脂肪酸の割合が増えることが報告されている（BMC Biotechnol. 2011; 11: 7.）。本発明者は対数増殖期の細胞をリン欠乏条件下におくと脂質蓄積がおこることを見出した（特開2014-049651）。超微細藻類であり、オイル高生産能がある真正眼点藻N. 2145でも同様にリン欠条件下での脂質蓄積を調べた。【００８５】
（２）栄養欠乏条件下でのTAG蓄積量の比較
C. reinhardtiiでの脂質蓄積の結果をふまえ、増殖が盛んな対数増殖期 (1×107 cells/mL) のN. 2145を用いて窒素欠乏条件、リン欠乏条件の比較を行った。【００８６】
窒素欠乏条件へ植え継いだ場合、C. reinhardtiiと同様に細胞増殖が大きく阻害されることがわかった（図１〜３）。リン欠乏条件へ植え継いだ場合、C. reinhardtiiと同様に窒素欠乏条件下ほど阻害されず、TAG蓄積が見られた（図１〜４）。リン欠乏条件へ植え継いだ場合、増殖が窒素欠乏条件下ほど阻害されないこと、TAG蓄積量が多いことから、C. reinhardtiiと同様にTAGの脂肪酸組成を膜脂質に含まれる脂肪酸から大きく改変するのに向いていることを見出した。【００８７】
また、本発明者はN. 2145のリン欠乏条件でのTAG蓄積量はC. reinhardtiiを上回っていることを見いだした。リン欠乏条件で培養１週間目の培養液１ L当たりのTAG蓄積量は12 mg/Lであり、同期間培養したC. reinhardtiiの２倍であった。さらに、N. 2145は通常培地で1×109 cells/mL、リン欠乏培地で2×108 cells/mLまで高密度培養が可能である。これは C. reinhardtiiの１００倍の細胞密度である。高密度培養でリン欠乏培地に植え継げば、培養液１Lあたり１g以上のTAGが得られると期待される。【００８８】
（３）C. reinhardtii由来脂質合成遺伝子発現のコンストラクト
Diacylglycerol acyltransferase (DGAT)はTAG生合成の最終ステップを触媒する酵素である。DGATは動物、植物に広く存在する酵素であり、DGAT1, DGAT2の２種類が報告されている。【００８９】
C. reinhardtiiには、DGAT１が１種類、DGAT2が５種類（DGTT1-5）存在することがわかっており、これらのうちDGTT1については窒素欠乏条件下でmRNA量の変化がみられること、DGTT2およびDGTT3については窒素欠乏条件下でmRNA量の変化が少ないこと、DGTT5は発現していないことが報告されている（Plant Physiol. 2010, Vol.154, 1737-1752）。本発明者はリン欠条件下で強発現を誘導するプロモーターpSQD2aを見いだし、DGTT4遺伝子に連結することで、TAG蓄積を促進する方法を開発した（特開2014-049651）。【００９０】
今回、本発明者はC. reinhardtiiのゲノムを鋳型として、SQD2aのプロモーター領域pCrSQD2aをPCRにより増幅した。またC. reinhardtiiのリン欠乏時のcDNAからCrDGTT4遺伝子の配列を得た。pCrSQD2aをCrDGTT4遺伝子上流に接続し、pCrSQD2aCrDGTT4とした。変異株選抜用にゼオシン遺伝子耐性遺伝子（S. hindustanus由来 ble）を上流に接続し、shblepCrSQD2aCrDGTT4を得た。 Kilian et al. PNAS 2011を参考に、この配列の5’末端側と3’末端側にそれぞれ N.2145のVCP2のプロモーターと N.2145のVCP1 3'UTRを挿入したものをTAG生産系強化のためのコンストラクト(F)とした。コントロールにはN.2145のVCP2のプロモーターとN.2145のVCP1 3'UTRの間にshbleのみを挿入したコンストラクト(control)を用いた。さらにN.2145のVCP1 3'UTRをpCrSQD2aCrDGTT4の3’末端側につけることの有効性を確認するために、pCrSQD2aCrDGTT4を逆向きに挿入したコンストラクト(R)も作成した（図５）。【００９１】
（４）N. 2145でのTAG増産
図５のコンストラクトをN. 2145へ形質転換し、ゼオシンで選抜後、control株とF株については形質転換株を２０〜３０株得た。R株は４株得られた。リン欠乏条件５日目の形質転換株から回収したRNAを用いて、定量RT-PCRを行い、CrDGTT4遺伝子の発現上昇が確認された株をさらに選抜した。野生株、control株、R株ではCrDGTT4遺伝子発現上昇は確認されなかった(図６)。このことから、プロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせは間に挟んだ遺伝子の発現上昇に有効であると考えられる。【００９２】
野生株、コントロール株と、F株のうち、CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた５株（#3, #8, #9, #19, #21）と上昇の見られなかった１株（#18）についてリン欠乏培地300 mLで培養し、リン欠乏４日目と７日目で細胞を回収し、TAG蓄積量を調べた(図７、図８)。【００９３】
図７、図８より、リン欠乏４日目ではCrDGTT4遺伝子発現上昇の見られなかった#18はコントロール株と同程度のTAG蓄積しかみられなかった。CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた５株（#3, #8, #9, #19, #21）ではリン欠乏条件下で野生株、コントロール株よりも２〜３倍のTAGが蓄積していることを発見した。７日目ではCrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた株と野生株との差は小さくなった。これはN. 2145細胞由来の１１種類のDGAT2遺伝子発現によると考えられる。本手法は、短期間で効率よく脂質を蓄積できる方法であり、植物よりもバイオマスの大きい、藻類におけるバイオディーゼル生産や有用脂質生産を効実現するために、極めて有用性の高い手法である。【００９４】
さらに、４日目のリン欠乏条件下でのTAGの脂肪酸組成は図９に示したように、 CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた株では野生株やコントロール株に比べてC18:1の割合が増加していた。７日目にはこの差は顕著ではなくなっていた。CrDGTT4はC18:1を基質として好むことが報告されている（Plant Cell 2013 Feb;25(2):677-93）。このことからプロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせはTAGの脂肪酸組成を膜脂質に含まれる脂肪酸から大きく改変するのに向いていると考えられる。【００９５】
今回の発明で使用したリン欠乏応答プロモーターpCrSQD2aとN.2145由来の3'UTRの組み合わせは通常培養時には発現を誘導しないので、油脂蓄積のタイミングをコントロールすることができる。リン欠乏条件下で細胞増殖させながら、油脂蓄積を行わせることができるので、新規脂肪酸合成に適している。これは有用な特殊脂肪酸を蓄積させるにも有効な方法である。【００９６】
〔実施例２〕
リン欠乏に応答するN. 2145由来のプロモーター候補を探すために、栄養欠乏条件４日目、６日目の細胞からRNAを回収し、定量RT-PCR法を行った。C. reinhardtiiではリン欠乏条件下でSQD2aの発現上昇が見られたので、N. 2145の相同遺伝子であるSQD2A,SQD2B,SQD2Cの遺伝子発現を調べた。また、先行論文（Plant Physiology, April 2012, Vol. 158, pp. 1562-1569）から、LDSP（lipid droplet surface protein)の高発現が予想され、LPATについても本発明者の所属する研究室の先行研究より高発現が予想されたので、遺伝子発現を調べた。このとき、アクチンの発現をコントロールとした。
使用したプライマー配列は以下の通りである。【００９７】
NannoACTf: 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3（配列番号１６）
NannoACTr: 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3（配列番号１７）
NannoSQD2A_realRT_F:5-TCCCTTGCTTACTGCTCTGG-3（配列番号１８）
NannoSQD2A_realRT_R:5-GATTCGCGTAGCCGCTTA-3（配列番号１９）
NannoSQD2B_realRT_F:5-CTTAATACGACCACACACGTCCTC-3（配列番号２０）
NannoSQD2B_realRT_R:5-TGATACGCCTCCGCACTTT-3（配列番号２１）
NannoSQD2C_realRT_F:5-CCACGACTGCCGAATGA-3（配列番号２２）
NannoSQD2C_realRT_R:5-TGCTAGTGGACCCTTGTTGG-3（配列番号２３）
qRT_LPATY_L:5-gcttgtcgagtacccattcat-3（配列番号２４）
qRT_LPATY_:5-cagcagcccaaagaggttc-3（配列番号２５）
qRT_LDSP_L:5-gtgcctttcgacctctcg-3（配列番号２６）
qRT_LDSP_R:5-ggcacaaaaagatcctagcaa-3（配列番号２７）【００９８】
LPAT-Y, SQD2-A, SQD2-Bがリン欠乏条件で発現上昇し、LDSPがリン欠乏および窒素欠乏条件で発現上昇した（図１１及び図１２）。N. 2145の11種類のDGAT2(DGAT2AからDGAT2K)と２種類のDGAT1についても発現を調べたが、上記４遺伝子ほどの発現上昇は見られなかった。そこで上記４遺伝子のプロモーター領域約１kbをリン欠条件下で強発現を誘導するN. 2145由来のプロモーターpNLPATY, pNSQD2A, pNSQD2B, pNLDSPとした。【００９９】
本発明者はリン欠乏条件で発現上昇の見られたLPAT-Y、SQD2-Bのプロモーター領域pNLPATY、pNSQD2BをN. 2145のゲノムを鋳型としてPCRにより増幅した。pNLPATY、pNSQD2BをpCrSQD2aのかわりにCrDGTT4遺伝子上流に接続し、pNLPATYCrDGTT4、pNSQD2BCrDGTT4とした（図１３）。図１３のコンストラクトをN. 2145へ形質転換し、pCrSQD2aCrDGTT4の場合と同様に、ゼオシンで選抜後、リン欠乏条件４日目、６日目の形質転換株から回収したRNAを用いて、定量RT-PCRを行った。定量RT-PCRには以下のプライマーを使用した。
NannoACTf: 5-ACCTTCTACAACGAGCTGC-3（配列番号４７）
NannoACTr: 5-GAACGTCTCAAACATAATCTGG-3（配列番号４８）
CrDGTT4_realRT_F:5-GTTCGTGCAGTTCAGTGTGG-3（配列番号４９）
CrDGTT4_realRT_R:5-CGGGCAGAATCCGAACA-3（配列番号５０）【０１００】
野生株、control株ではCrDGTT4遺伝子発現は確認されず、形質転換体pLPATY-1、pLPATY-2、pLPATY-3、pSQD2B-1、pSQD2B-2、pSQD2B-3ではCrDGTT4の発現が確認された（図１４）。リン欠乏培地200 mlで培養し、リン欠乏４日目で細胞を回収し、TAG蓄積量を調べた(図１５)。図１５より、CrDGTT4遺伝子発現上昇の見られた形質転換体pLPATY-3、pSQD2B-1ではリン欠乏条件下で野生株よりもTAGが蓄積していることを発見した。このことからリン欠乏条件に応答する遺伝子のプロモーター領域をTAG増産のための遺伝子発現に用いる本手法は短期間で効率よく脂質を蓄積できる方法であるといえる。【０１０１】
なお、本実施例で使用した遺伝子等の配列は以下の通りである。
N. 2145由来のDGAT2A遺伝子の配列は、配列番号２８に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2B遺伝子の配列は、配列番号２９に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2C遺伝子の配列は、配列番号３０に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2D遺伝子の配列は、配列番号３１に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2E遺伝子の配列は、配列番号３２に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2F遺伝子の配列は、配列番号３３に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2G遺伝子の配列は、配列番号３４に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2H遺伝子の配列は、配列番号３５に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2I遺伝子の配列は、配列番号３６に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2J遺伝子の配列は、配列番号３７に示す通りである。
N. 2145由来のDGAT2K遺伝子の配列は、配列番号３８に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2A遺伝子の配列は、配列番号３９に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2B遺伝子の配列は、配列番号４０に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2C遺伝子の配列は、配列番号４１に示す通りである。
N. 2145由来のLPAT-Y遺伝子の配列は、配列番号４２に示す通りである。
N. 2145由来のLDSP遺伝子の配列は、配列番号４３に示す通りである。
N. 2145由来のLPAT-Y遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号４４に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2A遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号４５に示す通りである。
N. 2145由来のSQD2B遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号１５に示す通りである。
N. 2145由来のLDSP遺伝子のプロモーターの配列は、配列番号４６に示す通りである。【０１０２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、TAG生産に関連する各種産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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