(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍疾患の予防又は治療における使用のための医薬組成物であって、
ここで該腫瘍が、機能的な主要組織適合抗原(MHC)クラスI複合体を欠いており、かつ、MHCクラスI提示複合体の変更によって免疫回避を示し、
該医薬組成物が、GM-CSF受容体α鎖(CSF2RA)（配列番号１）又はチロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)(配列番号２)のアミノ酸配列由来の少なくとも8つの連続するアミノ酸を含むタンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドであって、前記タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドはT細胞反応を引き起こすことができ及び／又は同系統のT細胞受容体を結合することができる、前記タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２】
MHC-非依存性T細胞反応、又は、MHCクラスI非依存性T細胞反応、又は、MHCクラスI及びII非依存性T細胞反応をもたらすことができる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
MHCクラスI非依存性T細胞又はMHCクラスI及びII非依存性T細胞によって発現された同系統のT細胞受容体を結合することができる、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
増殖性の疾患、腫瘍疾患又は悪性腫瘍の予防、診断又は治療における使用のための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記腫瘍が、CSF2RA(配列番号1)及び／又はTRP-2(配列番号2)、又はCSF2RA若しくはTRP-2に少なくとも95%の配列同一性を持っているタンパク質を発現する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記腫瘍が、皮膚の腫瘍、又は黒色腫若しくは膠芽腫である、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記腫瘍が、CSF2RAを発現する、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍疾患の予防又は治療における使用のための医薬組成物であって、
ここで該腫瘍が、機能的なMHCクラスI複合体を欠いており、かつ、MHCクラスI提示複合体の変更によって免疫回避を示し、
該医薬組成物が、請求項１〜７のいずれか一に記載のタンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む、医薬組成物。
【請求項９】
腫瘍疾患の予防又は治療における使用のための医薬組成物であって、
ここで該腫瘍が、機能的なMHCクラスI複合体を欠いており、かつ、MHCクラスI提示複合体の変更によって免疫回避を示し、
該医薬組成物が、請求項８に記載の核酸分子を含むベクターを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
腫瘍疾患の予防又は治療における使用のための医薬組成物であって、
ここで該腫瘍が、機能的なMHCクラスI複合体を欠いており、かつ、MHCクラスI提示複合体の変更によって免疫回避を示し、
該医薬組成物が、請求項８に記載の核酸分子又は請求項９に記載のベクターを含む細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号９〜１４の全て、又は配列番号２１〜２６の全て、又は配列番号１５〜２０の全てを含む、T細胞受容体α鎖又はその結合性断片、及びT細胞受容体β鎖又はその結合性断片である結合剤であって、
ここで該T細胞受容体がMHCクラスI複合体から非依存的にCSF2RA又はTRP-2を認識し、及び
ここで配列番号９〜１１はそれぞれCTL 1A.1/506のα鎖配列のCDR1〜3であり、配列番号１２〜１４はそれぞれCTL 1A.1/506のβ鎖配列のCDR1〜3であり、配列番号１５〜１７はそれぞれCTL 2C/417のα鎖配列のCDR1〜3であり、配列番号１８〜２０はそれぞれCTL 2C/417のβ鎖配列のCDR1〜3であり、配列番号２１〜２３はそれぞれCTL 1A3/46のα鎖配列のCDR1〜3であり、及び配列番号２４〜２６はそれぞれCTL 1A3/46のβ鎖配列のCDR1〜3である、結合剤。
【請求項１２】
配列番号３及び配列番号４の全ての配列、又は配列番号７及び配列番号８の全ての配列、又は配列番号５及び配列番号６の全ての配列を含む、請求項１１に記載の結合剤であって、
ここで配列番号３がCTL 1A.1/506のTCRα鎖配列であり、配列番号４がCTL 1A.1/506のTCRβ鎖配列であり、配列番号５がCTL 2C/417のTCRα鎖配列であり、配列番号６がCTL 2C/417のTCRβ鎖配列であり、配列番号７がCTL 1A3/46のTCRα鎖配列であり、及び配列番号８がCTL 1A3/46のTCRβ鎖配列である、結合剤。
【請求項１３】
マウス定常領域及びヒト可変領域を含むキメラT細胞受容体である請求項１１又は１２に記載の結合剤。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一に記載の結合剤を含む、単離T細胞。
【請求項１５】
MHC非依存的T細胞を生成する生体外の方法であって、
（i）請求項１〜７のいずれか一に記載のタンパク質、タンパク質断片又はポリペプチド、あるいは、全長CSF2RA又はTRP-2を発現する第一の細胞を提供すること、
（ii）末梢血単核細胞(PBMC)の集合体を、前記第一の細胞と接触させ、それによって前記PBMCを刺激すること、及び
（iii）前記第一の細胞におけるMHCの発現から非依存的に、該第一の細胞を認識する能力をもつT細胞を、刺激されたPBMC集合体から選択すること
を含む、生体外の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、（iii）において、前記第一の細胞におけるMHCの発現から非依存的に、該第一の細胞を認識するT細胞の能力が、該第一の細胞に対する前記T細胞の反応性をテストすることで決定され、ここで、
（a）前記第一の細胞は、MHCクラスI又はMHCクラスI及びIIを欠いており、
（b）前記T細胞は、MHCクラスI又はIIに対する抗体の存在下で、該第一の細胞に対してその反応性がテストされ、及び/又は
（c）前記T細胞は、前記タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチド、あるいは、全長CSF2RA又はTRP-2をコードするDNA若しくはRNAで形質転換された異種の細胞に対してその反応性についてテストされ；
ここで、上記(a),(b)及び/又は(c)において、反応性を示すT細胞が、該第一の細胞におけるMHCの発現から非依存的に、該第一の細胞を認識する能力をもつT細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか一に記載の結合剤、又は請求項１４に記載の単離T細胞、又はこれらのワクチン形態を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MHCを経た提示からは非依存的にCD8陽性T細胞反応をもたらす新規腫瘍関連抗原に関する。本発明において、GM-CSF受容体α鎖(CSF2RA)及びチロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)は、HLAＩ陰性メラノーマ細胞の表面上に検知することができ、そしてCD8陽性反応性T細胞クローンの標的であることが見出された。したがって、本発明は、例えば、腫瘍疾患の治療、診断及び予防医学で使用される新規抗原であるタンパク質、タンパク質断片及びポリペプチドを供給する。
更に提供されるのは、本発明の抗原を発現する核酸T細胞受容体鎖のような本発明の抗原に特異的な結合物質、及び本発明の抗原に対して反応性がある若しくは本発明のT細胞受容体を発現する単離されたT細胞を含む。
本発明は、さらに、本発明による抗原、核酸、結合物質あるいはＴ細胞を含む医薬組成物、特にワクチン組成物、及びMHC非依存的に本発明の抗原に特異的に反応性をもつT細胞の生成の方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、広範囲な放射線療法及び化学療法を含む多くの治療法の開発にかかわらず、いまだ主要な死亡原因である。更に、腫瘍抵抗メカニズムは、主要組織適合抗原(MHC)提示を経る腫瘍関連抗原(TAA)断片の検出によって癌細胞と正常細胞を区別することができる、自己由来の免疫細胞、特にT細胞、によって仲介されることは知られている。健康な組織では発現されないが、腫瘍細胞で特異的に発現される抗原は4つのタイプに分類することができる。
（Ｉ）変異抗原が、腫瘍細胞内の点突発変異若しくは転移によって腫瘍形成中に展開する。それらの抗原は、厳密に腫瘍特異的である。
（ＩＩ）癌/生殖細胞系抗原は、健康な体細胞組織中ではなくもっぱら成人の生殖細胞内でのみ通常発現される。しかしながら、癌細胞においては、後発的な調整の欠失により、生殖細胞特異的遺伝子が活性化されうる。
（ＩＩＩ）異分化抗原は、腫瘍及びそれらの健康な先祖細胞で発現される。このような抗原に対するCTL反応は、しばしば自己免疫反応に帰着する。
（ＩＶ）過剰発現のTAAは、正常細胞ではほんの少しの発現しか見られないが、腫瘍では、それらの抗原は強く活性化される。
ヒト腫瘍は、異なるカテゴリーの抗原を通常発現し、またそれぞれHLAクラスI及びクラスII分子を経るこれらのタンパク質の各々から区別されるペプチドをさらに生み出し及び提示するかもしれない。
【０００３】
ヒトにおけるMHC分子は、HLA(ヒト白血球抗原)分子と通常呼ばれる。それは、HLA分子の2つの主要なクラスがある:クラスI及びクラスII。CD8陽性T細胞は、通常、細胞障害性であり、したがって、細胞障害性T細胞=CTLと命名され、任意の細胞内局在性のタンパク質から細胞内で（プロセシング）処理され、HLAクラスI分子によって細胞表面上に提示される9〜10のアミノ酸のペプチドを認識する。ヒト癌免疫学の分野で、最近の20年間は、癌に関連し、癌特異的抗原を特徴づける集中的な努力がなされた。さらに、努力はヒト腫瘍抗原の抗体の分析に向けられた。このような抗体は、抗癌剤と結合させて診断・治療の目的に例えば使用することができる。さらに、ワクチン療法の見込みあるアプローチは、現在、MHCクラスＩ抗原断片に基づき開発されているが、ほとんどの癌タイプに利用可能な満足な免疫療法はまだない。
【０００４】
現在まで、CD4若しくはCD8陽性T細胞を経る、TAAのHLA/MHC非依存的認識はほんの数例で知られている。Barnd及び同僚（1989  PNAS）は、乳癌と卵巣癌細胞での上皮ムチンの認識を記述した。
HLA非依存的認識は、接触性皮膚炎の2人の患者でニッケル反応性CD8陽性T細胞に(Moulonら  J Invest Dermatol 2003)、相応する抗原を同定することなしにメラノーマ反応性T細胞クローンに(SomasundaramらJ Transl Med 2005)、及び腎臓細胞癌反応性T細胞クローンに(ワングら  J Immunol 2008年)見出された;後者の抗原は最近公表された(花田ら  血液2011)。
【０００５】
上記言及された４つのカテゴリーすべてから多くのHLA拘束TAAが、過去に同定されたが、いまだ、抗原特異的T細胞のアドプティブ(adoptive)移入、治療的ワクチン化に基づく満足な治療は可能ではない。これは、部分的には、臨床研究での結果の再現性に関し、あるいはワクチンの単に不十分な臨床効果による。癌免疫療法において、しばしば遭遇した問題はさらに癌組織における免疫原性の損傷である。この、いわゆる「免疫回避」は、新生細胞で遭遇した発現型差に基づいて理解することができる。
例えば、腫瘍細胞は、抗原を生み出しそして提示する能力が減少し、自己由来のT細胞を刺激する能力を減少し、癌化細胞に関係する免疫原性タンパク質の完全なダウンレギュレーション及び／若しくは白血球接着分子あるいは他のアクセサリー分子の低い若しくはゼロ発現及びMHCクラスI及びクラスII対立遺伝子の選択的なダウンレギュレーションを示す。
後者は、すべてのクラスI/II抗原、あるいはそれらの単に一部に影響するかもしれない。機能または発現の部分的なHLA欠失は、単一のHLA対立遺伝子、HLAハプロタイプあるいは両対立形質のβ2m遺伝子欠失による完全なＨＬＡクラスＩ欠失によって引き起こされうる（Aptsiauriら、Cancer Immunol Immunother 2008年;バナールM.ら、Cancer Immunol Immunother 61:1359-71、2012年)。かくして、HLA発現能を失った腫瘍は、HLA依存性T細胞に基づいたいかなる治療に対し耐性をもつ。実際、HLA機能の損傷は、腫瘍細胞の重要な「免疫回避」メカニズムの1つでありT細胞仲介免疫療法の応用範囲を狭めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の背景技術を考慮して、本発明の目的は、癌の新規治療手段の開発を可能にする、新規な腫瘍関連抗原(TAA)を提供すること、特に癌細胞における免疫回避の問題を克服する、新規な治療手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様では、上記の目的は、GM-CSF受容体α鎖(CSF2RA)(SEQ ID NO. 1)若しくはチロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)(SEQIDNO. 2)のアミノ酸配列から少なくとも8つの連続するアミノ酸を含むタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドの提供により解決され、当該タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドはT細胞反応の誘導及び／または同系統のT細胞受容体への結合ができる。
【０００８】
本発明の別の態様では、当該タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、天然型TRP-2若しくはCSF2RAタンパク質の複合エピトープのアミノ酸配列を含む。ここに記述された、本発明において複合エピトープはT細胞受容体(TCR)あるいは抗体のような免疫学的結合物の結合部位であり、それは、天然の三次元の折り重ねられたタンパク質に空間的に極めて近接性をもつ２以上のアミノ酸配列を含み、抗原の線形のアミノ酸配列の1つの連続した配列を構成しない。例えば、複合エピトープは、抗原内の、あるいはマルチタンパク質複合体の接触するサブユニットの2つの別個のアミノ酸鎖間の、2つの緊密に折り重ねられた２次構造のアミノ酸配列の伸張から構成されうる。
【０００９】
本発明者は、驚いたことに、黒色腫(TRP-2)及び他の悪性細胞タイプ(CSF2RA)において発現される分子として、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)及びGM-CSF受容体α鎖(CSF2RA)を同定し、それはHLA非依存的にT細胞によって認識された。
したがって、本発明の抗原に対してT細胞は、HLAクラスI発現に完全に陰性か、あるいは少なくともHLA発現及び/又は機能の損傷を示す癌細胞を溶解するという驚くべき有利性を提供した。通常、このような細胞は、患者の生まれつきあるいは治療上引き起こされた免疫拒否反応を回避する。
【００１０】
付加的な実施態様において、本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、GM-CSF受容体α鎖(CSF2RA)(SEQ ID NO. 1)あるいはチロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)(SEQ ID NO. 2)のアミノ酸配列由来の、少なくとも10、好適には15、20、50、そして、より好適には100の連続したアミノ酸を含み、該タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドはT細胞反応を引き起こすことができ、及び/又は同系統のT細胞受容体に結合することができる。
【００１１】
本発明の記述において、「タンパク質」、「ポリペプチド」という用語は相互互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸モノマーから構成されるポリマーを意味する。「ペプチド結合」は、2つのアミノ酸間の共有結合であり、そこで、1つのアミノ酸のα-アミノ基は、別のアミノ酸のα-カルボキシル基に結合する。全てのアミノ酸あるいはポリペプチド鎖は、もし他の方法で特定されなかったならば、アミノ末端(N-末端)からカルボキシ末端(C末端)に記述されている。用語「タンパク質」、「タンパク質断片」及び「ポリペプチド」は、アミノ酸の分子鎖を指し、物質の特異的な長さを特定せず、また、もし要すれば、生体外又は生体内で、例えば、糖鎖形成、アミド化、カルボキシル化あるいは燐酸化によって修飾されうる。したがって、とりわけ、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれている。
【００１２】
もちろん、ポリペプチドの機能的な誘導体及び用語「タンパク質断片」の用語でつかわれる断片も、本発明に含まれている。機能的な誘導体は、全配列の1つ以上のアミノ酸において異なる（それらは欠失、置換、転換、挿入あるいは付加がある)ポリペプチドを含むことを意図する。本質的に生物学・免疫学的活性を変更しないと予想することができるアミノ酸置換は記述した。関連するアミノ酸間でのアミノ酸置換あるいは進化で頻繁に生じた置換は、とりわけSer/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Valである。
【００１３】
さらに、これらのポリペプチドの用語「機能的な誘導体」は、ポリペプチドの付加塩類、ポリペプチドのアミド特にC-末端アミド、エステル特にC-末端エステル及びN-アシル誘導体特にN-末端アシル誘導体及びN-アセチル誘導体を意図する。
【００１４】
本発明において、タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、タンパク質GM-CSF受容体α鎖(CSF2RA)あるいはチロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2)のアミノ酸配列、特にSEQ ID NO. 1あるいは2番に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、最も好ましくは99%、そしてさらに好ましくは100%の同一性を含むタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドである。
【００１５】
好ましい態様では、ここに記述された抗原のタンパク質断片は免疫原性のある断片で、それは、好適には、MHCクラスI及び/またはIIに非依存的に、なお免疫原性反応を引き起こす能力を持っている。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、SEQ ID NO.1あるいは2番に示されるアミノ酸配列から成る。
【００１７】
本発明によるポリペプチドは、合成的にあるいは組み換えDNA技術によって生産することができる。合成ポリペプチドを生産する方法は、当業者において周知である。
【００１８】
本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドのサポートで、細胞障害性及びヘルパーT細胞を生成することができ、それは、本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して抗原特異的なMHC非依存的細胞障害活性を展開し、腫瘍細胞を破壊する。したがって、これらのポリペプチドは、その途上で免疫反応の抑制(それは腫瘍患者でしばしばみられる)が逆転されうる、有効な腫瘍治療の可能性を開く。
【００１９】
本発明は、さらに前記タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドのうちの1つと別のタンパク質あるいはポリペプチドから構成される融合タンパク質に関する。このような融合タンパク質は、診断剤、予防剤、治療剤の使用に、あるいはTRP-2あるいはCSF2RAを、特にMHC経由のそれらの提示に非依存的に、認識するT細胞の検出及び/又は操作のために、適している。例えば、HSA、コラーゲンあるいは他のタンパク質のような担体蛋白質と本発明のポリペプチドの1つ以上から成る融合タンパク質の設計を描くことができる。この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに本発明の主題である。
【００２０】
さらなる本発明は、ある細胞で発現されるとき、細胞膜の外部への分子の細胞内輸送を仲介するシグナルペプチドの存在によって特徴づけられる、本発明によるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドに関する。シグナルペプチドは当業者に周知である。より好ましくは、本発明によるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、本発明の分子を細胞膜に固着することができるドメインを含む。このようなドメインは膜アンカーあるいは膜貫通領域でありえる。
【００２１】
1つの具体的な態様で、本発明による、タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、それが主要組織適合抗原(MHC)非依存的T細胞反応、好適にはMHCクラスI非依存的T細胞反応、あるいはMHCクラスI及びII非依存的T細胞反応をみちびくことができる、という点で特徴づけられる；及び/又は本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、それがMHCクラスI非依存的T細胞又はMHCクラスI及びII非依存的T細胞によって発現された同系統のT細胞受容体に結合することができるという点で特徴づけられる。
【００２２】
HLA/MHC発現からの本発明の分子の認識における非依存性の驚くべき発見により、本発明によるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドがMHCクラスI、あるいはMHCクラスI及びIIによって提示されないという一つのさらに好適な態様が存在する。本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、それがMHC拘束抗原の提示で知られているような断片化を受けずに、細胞表面上で、好適に発現される。したがって、本発明は、好ましい具体化態様において、HLA/MHC陰性細胞で発現された時、なおT細胞反応を引き起こすことができるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドに関係する。
【００２３】
ここに記述された様々な具体化態様の内容で、HLA非依存的T細胞反応を仲介するその能力に加えて、なおMHC/HLAパスウェイによってプロセスされ提示されうるので、タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドはそのような内容を本発明の範囲から除外するものでない。本発明の特異的な実施例で、MHC/HLAクラスI及び/またはII結合エピトープから成る場合のみ、そのようなタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは除外される。
【００２４】
本発明の特に好ましい1つの実施態様は、医学領域で使用するために、特に、手術または治療においてヒトか動物の処置の方法での使用、あるいは人間か動物で履行される診断方法について、本発明からなるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドに関係がある、
【００２５】
さらに本発明によって提供するのは、増殖性疾患の予防、診断あるいは治療で使用するための、ここに記述のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドであり、好適には、増殖性疾患は腫瘍疾患である。本発明による好ましい腫瘍疾患は、機能的なMHCクラスI複合体が欠けている、あるいは機能的なMHCクラスI及びII複合体が欠けている、特にMHCクラスIを発現しないか、あるいはMHCクラスI及びIIを発現しない腫瘍疾患である。従って、ここに記述のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドは、特に、MHCクラスI及び/またはII提示複合体の変更によって免疫回避を示す腫瘍の予防、診断あるいは治療での使用を意図する。
【００２６】
本明細書で使用される、用語「腫瘍」あるいは、「腫瘍疾患」は良性と悪性腫瘍両方か、新生物を意味し、黒色腫、リンパ腫、白血病及び肉腫を含み、腫瘍組織の実例となる例は悪性黒色腫と菌状息肉腫のような皮膚疾患;白血病のような血液の腫瘍、例えば急性リンパ芽球性、急性骨髄球性、あるいは慢性骨髄性白血病;ホジキン病または悪性リンパ腫のようなリンパ腫;卵巣・子宮の腫瘍のような婦人科分野の腫瘍;前立腺、膀胱あるいは精巣のような泌尿器分野の腫瘍;軟部組織肉腫、骨あるいは非骨の肉腫、乳がん;脳下垂体、甲状腺及び副腎皮質の腫瘍;食道、胃、腸及び結腸のような胃腸の腫瘍;膵臓及び肝臓腫瘍;喉頭パピローマ/癌及び肺腫瘍。
【００２７】
好ましい具体化態様では、処置され、分析され、予防される腫瘍は、CSF2RA(SEQ ID No.1)及び/またはTRP-2(SEQ ID No.2)の発現によって特徴づけられる。あるいは上述の抗原の類似体を発現する腫瘍であって、類似体とは、SEQ ID No.1あるいはNo.2に各々示される配列にくらべ少なくとも75、好適には80、90あるいは95%の配列同等性によって特徴付けられる。
【００２８】
更に、このような腫瘍は、腫瘍細胞内HLA複合体(クラスIあるいはIIか、両方のいずれか)の発現及び/又は機能の変化で、免疫回避メカニズムを受けた或いは受けているリスクにあるものであって本発明の種々の実施例と一致しているものが好適である。
【００２９】
TRP-2に関し本発明の好ましい腫瘍は、皮膚の腫瘍であり、好適には黒色腫、あるいは中枢神経系、好適には膠芽腫の腫瘍である。
【００３０】
他方、CSF2RAに関しての本発明の好ましい腫瘍(あるいは悪性腫瘍)は、黒色腫のような皮膚の腫瘍、白血病のようなCSF2RA発現血液悪性腫瘍、及び肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌と卵巣癌のようなCSFRA発現固形癌である。特に好適な別の実施態様で、CSF2RAを発現する悪性腫瘍がCSF2RBを発現しない、あるいはCSF2RAより著しく低いレベルでCSF2RBを発現する。
【００３１】
本発明の好ましい実施例で、医療で使用の上記記述の本発明タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチド、或いは、ここに記述の特異的な方法で使用されるタンパク質は、CSF2RA及び/またはTRP-2の全長タンパク質であり、それは、SEQ ID No.1あるいはNo.2の各々に示される配列に比べアミノ酸残基が好適には50、40、30、20、好適には、10、最も好ましくは5以下のマイナーなアミノ酸変更が可能である。このような配列変更は、1つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、置換、転換、挿入あるいは化学的修飾でありうる。
【００３２】
本発明の付加的態様では、本発明はさらに単離された核酸分子を提供し、該核酸分子は、
(a)本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドをコードする鎖をもつ;
(b) (a)の鎖に相補的な鎖をもつ;
あるいは、
(c) (a) あるいは(b)に記述されるような分子とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする鎖をもつ。
ストリンジェントな条件は、当業者には周知、特にSambrookらの「Molecular Cloning」に知られている。それに加えて、核酸は、特に哺乳類/ヒト細胞での発現のために、タンパク質に相応する核酸配列を発現するのに必要なさらなる配列を持つ。使用された核酸は、細胞において、ペプチドに相応する核酸配列の発現をおこすのに適したベクター中に含まれうる。しかしながら、核酸は、提示細胞を形質転換するのにも使え、それは樹状細胞のような古典的抗原提示細胞に拘束されず、このような方法で、自身、それらの細胞表面上で、相当するタンパク質生産する。
【００３３】
本発明の核酸分子は、好適には医療で使用される。
【００３４】
さらに、本発明は、上記の核酸分子を含むベクター或いは細胞を提供し、特にベクターは医用向けである。さらに、本発明によるベクターを含む細胞が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様は、腫瘍治療あるいは腫瘍予防における免疫反応を誘発するための、本発明による核酸又は本発明による少なくとも1つのタンパク質、タンパク質断片若しくはポリペプチドの使用である。ここに有利には、頻繁に観察された免疫回避メカニズム及び腫瘍疾患におけるTAAに対する耐性が、本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチド、又は核酸の使用によって克服（或いは逆転）することができるという事実である。本発明に従う使用法は、また、既に確立している腫瘍治療に加えて使用することができる。
【００３６】
例えば、それらが遺伝的に以前から傾向をもっていたので、あるいは既に以前に腫瘍があったので、ここに記述された本発明の内容における予防的治療は、腫瘍を生じさせる増加した危険を持っている人に恐らく主として利益をもたらす。別の実施態様では、予防的治療は、免疫拒絶に対する抵抗性、例えばHLAクラスI/II複合体の機能及び/又は発現の変化を経た免疫回避による、を備えたか、備えつつある増加したリスクをもつ腫瘍疾患患者のために利益がある。
【００３７】
さらに、本発明の別の態様は、結合剤に関係し、該結合剤は上記のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドに結合し、特に該結合剤は、該タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチド特異的である。好ましい具体例では、ここに記述される結合剤は医用向けである。
【００３８】
1つの具体例では、本発明による結合剤は抗体、あるいはそれの断片である。ここに、その種々の文法的な形態で用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、例えば抗体結合部位或いはパラトープを含む分子、を意味する。このような分子も免疫グロブリン分子の「抗原結合断片」と呼ばれる。実例となる抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、及び、Fab、Fab’、F(ab’)2及びF(v)として当技術分野で知られているような部分である抗原結合部位を含んでいる免疫グロブリン分子のこれらの部分である。本発明の抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。用語抗体は、また、単一鎖抗体、キメラ・ヒト化若しくは霊長類化（CDR-移植化）抗体、及び2つの異なる種からの部分を含むキメラ若しくは霊長類化単一鎖抗体のような同等物をも包含する。レシチンを含むワクチン用の免疫学的アジュバントは、抗体産生を刺激するために使用されてもよい。
【００３９】
別の具体化では、本発明の結合剤はT細胞受容体(TCR)、あるいはそれの断片である。TCRは、信号伝達を仲介する際に関与するCD3複合体の定常タンパク質に関係している免疫グロブリンスパーファミリーの異種ダイマーの表面のタンパク質である。TCRはαβ及びγδ形式で存在する。それは構造上類似しているが、全く別個の解剖学的の局在性及び恐らく機能を持っている。天然型異種ダイマーαβTCRの細胞外部分は、2つのポリペプチドからなり、その各々は、膜近位に定常領域を及び膜遠位に可変領域をもつ。定常・可変領域の各々は、鎖内ジスルフィド結合を含んでいる。可変領域は抗体の相補性決定領域(CDR)と類似した非常に多形態のループを含んでいる。
【００４０】
1つの好ましい具体化態様では、本発明のTCRは、SEQ ID No.3〜8のうちの任意の1つの配列を含むことによって特徴づけられるか、あるいは少なくともSEQ ID No.3〜8のうちの任意の1つの配列と75、好適には80、90あるいは95%同一の配列をもつことによって特徴づけられる。さらに、本発明は、SEQ IDNo.3〜8のうちの任意の1つの配列をもつTCRを発現するか、あるいは少なくともSEQ ID No.3〜8のうちの任意の1つの配列と75、好適には80、90あるいは95%同一の配列をもつTCRを発現するT細胞を含む。
【００４１】
本発明の抗原結合剤、望ましくは、TCR若しくは抗体は、一つの実施態様において、図と表１で本発明のTCRの各α若しくはβ鎖を示すようなCDR 1〜3配列の任意の一つ若しくは好適には全ての存在によって特徴づけられる。この具体化態様では、本発明のTCRが、例えば、オリジナルのヒト定常領域をマウス定常領域と完全あるいは一部分の交換により、キメラ化されることが好適である(図13を参照)。定常領域の好ましいマウス化は、少なくとも定常領域の細胞外部分のマウス配列との交換である。
【００４２】
本発明の1つの実施態様は、本発明で単離された及び表１に例示されたTCRの任意の一つの、少なくとも1つのCDR配列、好適にはCDR3、より好適にはCDR1, CDR2及びCDR3を含む抗原結合ポリペプチドに関係する。
【００４３】
表1:   本発明のT細胞受容体クローンのCDR配列。SEQ ID No.は(  )の中に示される:
【表１】
0006475166.tif 000002
【００４４】
本発明の抗原結合ポリペプチドは好適にはTCRである。
【００４５】
好適には、SEQ ID No. 9 〜 11, 若しくは 15 〜17, 若しくは 21 〜 23の任意のもの或は全てを含むT細胞受容体α鎖である。
【００４６】
好適には、SEQ ID No. 12 〜 14, 若しくは 18 〜 20, 若しくは 24 〜 26の任意のもの或は全てを含むT細胞受容体β鎖である。
【００４７】
好適には、本発明のT細胞受容体若しくはその結合性断片は、SEQID No. 9, 10及び／又は11のCDR配列を含むα鎖可変領域とSEQ ID No.12, 13及び／又は14のCDR配列を含むβ鎖可変領域をもつ。このようなTCRは、抗原CSF2RAに対し特異的TCRである。好適には、実施例で記述されるようにCTL 1A.1/506から単離されるようなTCRである。このような受容体は、1つの具体化態様において、SEQ ID No. 3 (α鎖)及び 4 (β鎖)による配列の、少なくとも可変領域、好適には全長、を含むことができる。
【００４８】
好適には、本発明のT細胞受容体若しくはその結合性断片は、SEQID No. 21, 22及び／又は23のCDR配列を含むα鎖可変領域とSEQ ID No. 24, 25及び／又は26のCDR配列を含むβ鎖可変領域を持つ。このようなTCRは、抗原CSF2RAに対し特異的TCRである。好適には、実施例で記述されるようにCTL 1A3/46から単離されるようなTCRである。1つの具体化態様において、SEQ ID No. 7 (α鎖)及び8 (β鎖)による配列の、少なくとも可変領域、好適には全長、を含むことができる。
【００４９】
好適には、T細胞受容体若しくはその結合性断片は、SEQ IDNo. 15, 16及び／又は17のCDR配列を含むα鎖可変領域とSEQ ID No. 18, 19及び／又は20のCDR配列を含むβ鎖可変領域をもつ。このようなTCRは、抗原TRP2に対して特異的TCRである。好適には、実施例で記述されるようにCTL 2C/417から単離されるようなTCRである。1つの具体化態様において、SEQ ID No. 5 (α鎖)及び6 (β鎖)による配列の、少なくとも可変領域、好適には全長、を含むことができる。
【００５０】
さらに、本発明の別の実施態様は結合剤としての単一鎖TCR(scTCR)、好適にはαβ-scTCRに関係する。単一鎖TCR(scTCRs)は単一のアミノ酸鎖から成る人工構築物である。scTCRは、第一のTCR鎖(例えばα鎖)の可変領域のポリペプチド及び別のTCR鎖全体(全長)(例えばβ鎖)のポリペプチドを、あるいはその逆のポリペプチドを含むことができる。更に、scTCRは、2つ以上のポリペプチドを連結する1つ以上のリンカーを所望により含むことができる。リンカーは、例えば2つの単一鎖をともに連結するペプチドでありうる。このようなscTCRは、ここに提供されるような可変領域及び／又は定常領域のうちのいずれかからでもできていることができる。
【００５１】
さらに、本発明は、IL-2、IL-7あるいはIL-15のようなヒトサイトカインに融合されたscTCRを提供する。
【００５２】
本発明による結合剤は、また、多重結合の複合体の形式でも提供され、それは少なくとも2つのscTCR分子を含み、該scTCR分子は各々少なくとも1つのビオチン部分に融合され、及び該scTCRは、多重結合の複合体を形成させるように、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用によって相互的に結合する。さらに、本発明は、2以上のscTCRを含むより高次の多重結合の複合体が提供される。
【００５３】
別の好ましい具体化態様で、本発明の結合剤は、上述されるような抗体の結合性断片と例えばCD3特異的な別の抗体の結合性断片を含む２重特異性の単クローン抗体である。
【００５４】
本発明の別の態様は、ここに記述されるTCRまたは抗原結合剤をコードする核酸に関係する。
【００５５】
さらなる実施態様において、本発明の目的は、本発明によるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドのうちの任意の1つ、特にCSF2RAあるいはTRP-2、に対して反応性あるT細胞の提供により解決される。好ましい具体化態様では、本発明のT細胞は、MHCクラスI及び/またはクラスIIによる当該タンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドの提示と非依存的に、本発明によるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドに対して反応性をもつ。さらに本発明の好適な具体化態様は、本発明によるタンパク質、タンパク質断片、或はポリペプチドに結合するT細胞受容体(TCR)を含むT細胞を提供することであり、該結合がMHCクラスIあるいはMHCクラスI及びIIによる該ポリペプチドの提示に非依存的である。本発明のT細胞は、好適にはCD8及び/またはCD4陽性である。
【００５６】
さらに本発明は、癌の治療用薬剤の調製における又は癌診断用試薬の調製における、上記のタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチド、上記の核酸、上記のベクターあるいは細胞である、上記の結合剤、上記のT細胞、上記の多重結合の複合体の使用を提供する。癌は哺乳類の癌であり得、又癌は特にヒト癌であり得る。例えば、癌は、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣癌、子宮頸癌あるいは胆道癌であることができる。特に好ましい癌は黒色腫、膠芽腫あるいは白血病である。該薬剤は、ワクチンであり得る。
【００５７】
別の態様において、本発明の目的は、MHC非依存性T細胞を生成するための生体外の方法によってさらに解決され、それは次の工程を含む；
ｉ．本発明によるタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドを、好適には該ポリペプチドは全長CSF2RAかTRP-2を発現する第一の細胞、好適には腫瘍細胞、を準備すること、
ｉｉ．第一の細胞と末梢血単核細胞(PBMC)の集合体を接触させ、該PBMCを刺激すること、及び
ｉｉｉ．該細胞におけるＭＨＣ発現から非依存的に、（ｉ）で使われたタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドを発現する細胞を認識する能力をもつＴ細胞を刺激済みPBMC集合体から選択する。
この態様において、MHCは好適にはMHCクラスI及び/またはクラスIIである。
【００５８】
上記の方法の好ましい具体化態様において、該腫瘍細胞及び該PBMCは、腫瘍患者の自己由来細胞である。この具体化態様は、腫瘍患者のためにMHC非依存的T細胞が生成されうるという長所を持つ。このようなT細胞は、患者の腫瘍に対する治療剤として患者への再注入が可能である。
【００５９】
1つの好ましい具体化態様において上記の方法は、該第1の細胞として、MHCクラスI若しくはMHCクラスI及びIIを発現しない細胞、あるいは少なくともMHCクラスI及び/又はII機能及び/又は発現が害されている細胞を含む。
【００６０】
なお、さらに好適な上記方法の具体化態様は、ステップ（iii）において、当該細胞でのMHCの発現と非依存的に、（i）で使われた該タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを発現している細胞を認識するためにT細胞の該能力が、該タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを発現している該細胞に対する該T細胞の反応性をテストすることにより決定され、そこにおいて、
(a) 該タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを発現する該細胞は、MHCクラスI若しくはMHCクラスI及びIIを欠いている、及び/又は
(b) 該T細胞は、MHCクラスI若しくはIIに対する抗体の存在下で該タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを発現している該細胞に対してのその活性がテストされた、及び/又は
(c) 該T細胞は、該タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドをコードするDNA又はRNAで形質転換された異種細胞に対するその反応性がテストされた、
ここで、(a)、(b)及び/又は(c)において、反応性を示すT細胞は、該細胞においてHLA/MHCの発現とは非依存的に、（i）で使われた該タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを発現している細胞を認識する能力をもつT細胞である。
【００６１】
さらに、提供されるのは、上記のように、本発明による方法によって生成されるT細胞である。好適には、本発明のT細胞は、医学分野向けでの使用である。特に、本発明のT細胞は、該患者への注入による悪性疾患に苦しむ患者の治療用であり、好適には、該T細胞は該患者の自己PBMCに由来する。
【００６２】
さらなる態様は、本発明によるタンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドを含む医薬組成物、又は本発明による核酸、ベクター、細胞、結合剤若しくは単離されたT細胞を含む医薬組成物に関する。好ましい具体化態様は、医薬組成物はワクチンである。
【００６３】
本発明に役立つ薬学的に使用可能な担体あるいは希釈剤の例は、SPGA、炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、糊、蔗糖、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインのようなタンパク質、牛の血清或いはスキムミルクのような蛋白質含有剤、及び緩衝液（例えば燐酸緩衝液）を含んでいる。
【００６４】
選択的に、アジュバント活性をもつ1つ以上の化合物が、ワクチンに加えられうる。適切なアジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸塩若しくは酸化物、油乳濁剤(例えば、Bayol F<((R) >あるいはMarcol52<(R)>)、サポニンあるいはビタミンE溶解物である。本発明によるワクチンは、とりわけ静脈内に、腹腔内に、鼻腔内で、皮内に、皮下にあるいは筋肉内に投与することができる。
【００６５】
処理される有用な有効量は、ワクチン投与モード及び患者の年齢及び重量に依存して変わる。
【００６６】
ワクチンは特にT細胞反応を得るために使用することができる。しかし、B細胞反応がワクチン接種の後に排除される可能性はありえる。そうならば、B細胞反応は、ワクチンのタンパク質、タンパク質断片あるいはポリペプチドに対する抗体の形成に結びつき、その抗体は、抗原生産(つまり腫瘍細胞)の起源に向けられる。このように、該腫瘍細胞は、免疫系の細胞性と体液性の両反応によって攻撃を受ける。
【００６７】
ワクチンが、MHC発現と非依存的に、抗原提示細胞において、本発明の抗原を含む時、免疫学的防御の両反応はさらにより有効に引き金となる。抗原提示は、本発明の抗原のうちの1つで負荷された、単球、マクロファージ、指状突起細胞、ランゲルハンス細胞及び特に樹状細胞を使用することにより達成することができる。
【００６８】
さらに、本発明の抗原のための情報を保持するクローニングビークルで既に形質導入された細胞を使用することも可能である。これらの細胞は、抗原提示細胞として働き、そしてMHC非依存的な方法で、その表面上で、本発明の全長抗原又はその断片を提示する。したがって、本発明の内容では、抗原提示細胞の細胞表面へ運ばれるというように、本発明の抗原を発現することが好適である。
【００６９】
該所望の発現産物のそばで、発現するそして細胞の所望の免疫反応に否定的に影響するという多くの要素をもつ、これら細胞でのワクチン化の代わりに、ワクチンが、本発明のタンパク質、タンパク質断片及びポリペプチドを充填された、そしてこれら免疫原を宿主免疫系へさらす、リポソームから構成されることは可能である。このようなリポソームは、例えば、リンホカインで満たされえ、そして、このようなリポソームは免疫学的T細胞反応を引き起こす。
【００７０】
さらに、それが生体内で提示されるのと同じ方法で、タンパク質、タンパク質断片あるいはペプチドを提示することによって、増強されたT細胞反応が喚起されるだろう。更に、比較的大きな抗原提示細胞の自然なアジュバント作用によって、B細胞反応は引き起こされる。このB細胞反応は、生来の抗原に向けられた抗体の形成に導くだろう。特に、この複合体は、癌細胞に見出され、そこでは本発明の抗原は、自然に提示され、かくしてT細胞反応導き出しうる。本発明のタンパク質、タンパク質断片あるいはペプチドを既に提示する細胞でのワクチン化によって拡大する自然に発生する現象である。拡大によって、拡大したT細胞反応のみが喚起されるではなく、B細胞反応もまた開始され、それは、MHC非依存的ペプチドに対して向けられた抗体を導く。
【００７１】
本発明によるワクチンは、ワクチン化の後にT細胞及びB細胞両反応の開始と維持に関し、増強効果もつ多数の化合物によって強化することができる。
【００７２】
このような方法で、ワクチンへのサイトカインの添加は、T細胞反応を増強する。好適なサイトカインは、例えばIL-2、IL-4、IL-7、IL-15あるいはIL-12のようなインターロイキン、GM-CSF、RANTES、腫瘍壊死因子及びIFN-α, -β, 若しくは -γのようなインターフェロンである
【００７３】
同様の方法で、CD2、CD3、CTLA-4、PD-1、CD27及びCD28のようなT細胞表面抗原に対する抗体は、免疫原的反応を増強する。
【００７４】
さらに、CD4<+>ヘルパー細胞あるいはCD8<+>キラー細胞を刺激するヘルパーエピトープの添加は、免疫原的反応を増大する。あるいは、さらに、他の抗原からのヘルパーエピトープ、例えば熱ショック由来タンパク質あるいはコレラ毒素からのものを使用することができる。
【００７５】
最後に、本発明は腫瘍疾患の患者を治療する方法に関し、治療効果達成するために十分量で、治療上有効な量の少なくとも1つの本発明のタンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドタンパク質、及び/又は少なくとも1つの核酸及び/又は少なくとも1つの結合剤及び/又は少なくとも1つのベクター分子及び/又は少なくとも1つの本発明のT細胞を投与することを含む。別の態様は、本発明(本発明のタンパク質、タンパク質断片及びポリペプチド)による、MHC非依存抗原の反応誘発量の投与を含む腫瘍特異的CTL反応を導きだす方法である。標的悪性腫瘍は、CSF2RA及びTRP-2を発現するものである。
【００７６】
本発明は、さらに、以下の実施例で、図面と配列によって、引用文献を援用して記述されるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的のために、ここに引用される参照文献は、その参照によってそれらの全体が本発明に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】患者MA-MEL-86(略図)の別個のリンパ節転移から生成されたメラノーマ細胞株MA-MEL-86A、-86B、-86C及び -86F のHLAクラスI-発現型。  MEL-86Aは、患者のHLAクラスI対立遺伝子をすべて発現する、しかしメラノサイト分化抗原の発現には陰性であった。異なる変異によるβ2-ミクログロブリン(β2m)遺伝子の両対立形質の不活性化は、MA-MEL-86Bそして-FにおいてHLA分子の表面発現の全失に帰着した。MA-MEL-86Cは、1つの(「青」)HLAクラスIハプロタイプの発現を失った。
【図２】非依存的に生成された混合リンパ細胞腫瘍細胞群(MLTC)による異なるMA-MEL-86黒色腫系の認識。  いくつかの異なるMLTCが、黒色腫系MA-MEL-86A(A)あるいは-86C(B)のいずれかで、末梢血単核細胞(PBMC)の刺激によって生成された。その後、MLTC応答 (20,000/ウェル)が、20h-IFNγ-ELISpot-分析の使用によるコントロール細胞系統と同様にMA-MEL-86A、-86B及び86C(50,000細胞/ウェル)の認識に関してテストされた。
【図３】MLTC 1A.1を使ったcDNAライブラリスクリーニング。  MLTC 1A.1が、MA-MEL-86A細胞系統から構築されたcDNA発現ライブラリーのスクリーニングに適用された。左部分:図は、陽性ウェルを含むELISpotプレートの拡大されたセクション示す。右部分:図は、アッセイの分析結果を示す。  （A）プール#701-796を含むウェルあたり100 cDNAのプールのELISpotプレート試験。293T細胞へのHLA-A*24:02-cDNAと共にこれらのcDNAプールの共トランスフェクションの後、MLTC 1A.1は、プール#709(赤い円)を発現するトランスフェクタントを認識した。同じ方法でテストされた100xプール#709に由来したウェルあたり10 cDNAsのプールがT細胞(B)によって認識されているようにプール#39及び#51を同定した（B）。  プール#39はさらにサブクローニングするために選ばれた。cDNAクローン709.39.1〜709.39.96の後の試験は、MLTC 1A.1によって認識されているようにcDNA-クローン#18を同定した(C)。標的: 293T細胞(20,.000、細胞/ウェル)、MA-MEL-86A(50,000、細胞/ウェル);T細胞: MLTC 1A.1(10,000リンパ細胞/ウェル);トランスフェクトされたcDNAs: HLA-cDNA(100ng/ウェル);cDNAプール(300ng/ウェル);20h-IFN -γ- ELISpot-分析。  cDNAクローン#709.39.18のシークエンシング及び該由来した配列でのブラストサーチは、認識された抗原としてCSF2RA(GM-CSF受容体のα鎖)を同定した。#709.39.18-cDNAの1.831 bp 長ORFは、その翻訳がCSF2RAタンパク質のアイソフォームAに帰着する、遺伝子の転写バリアント２をコードする。
【図４】健康なドナーの軟膜(BC)から単離された異なる骨髄性細胞に対するCSF2RA反応性CTL 1A.1/506の反応。  CTL 1A.1/506(40,000セル/ウェル)は、単球、顆粒球細胞及び樹状細胞(DC)(50,000セル/ウェル)の認識のために分析され、後者は、4人の異なる健康なドナーのBCのPBMCから生体外で分離され区別された。自己由来の黒色腫ラインはコントロールとして使用した。
【図５】CTL 1A.1/506によるCSF2RAでのトランスフェクション後の様々な種のセルの認識。  ヒト(K562、293T)、猿(COS-7)及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が、CSF2RAで一時的にトランスフェクトされ、IFN-γELISpot分析を使用して、CTL 1A.1/506による認識のためにテストした。すべての反応は、２度テストされた。
【図６】抗体ブロッキングのある及びなしでのCTL 1A.1/506による腫瘍認識。  CTL 1A.1/506(10.000個のセル/ウェル)が、IFN-γ-ELISpot分析で、MA-MEL-86B  (50.000個のセル/ウェル)の認識についてテストされた。pan-HLAI,CD3 若しくは CSF2RAに特異的単クローン抗体(mAbs)が、ブロック認識に適用された。CSF2RAあるいはT細胞受容体(CD3)に結合するmAbsだけが、CTL反応を阻害した。
【図７】CTL 1A.1/506のT細胞受容体(TCR)のクローニング。  TCRα-及びβ-鎖のクローニングが、Birkholzら(J Immunol Meth、2009年)によって公表されたプロトコルによって行われた。TCR cDNAクローンは、IMGT/VQuestデータベースを使用して、配列決定され分析された。TCRβ鎖は、V(可変)-、D(多様性)-、そしてJ(接着点)-セグメントから構成され、一方、α鎖がVとJ領域のみよって構築されている。CDR(相補性決定領域)。
【図８】CTL2C/417によるTRP-2でトランスフェクション後の様々な種の細胞の認識、2C/417。  ヒト(K562、293T、L721.221)、猿(COS-7)、マウス(RMA/A2#7,P815-TK)-)及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が、TRP-2で一時的にトランスフェクトされ、IFN-γ-ELISpot分析を使い、CTL 2C/417による認識についてテストされた。すべての反応は２度テストされた。
【図９】共焦点レーザー走査顕微鏡によるTRP-2表面発現の検知。  膜結合型のpEYFP-Mem(a)及びヒトTRP-2をコードするプラスミドでトランスフェクトされた293T細胞が、顕微鏡スライド上で培養された。TRP-2は、TRP-2に対するアレクサの564-ラベル化ポリクローナル抗体で検知された(b)。3D共焦点図は、TRP-2がこの抗体によって膜貫通型タンパク質として検知されることを明らかにした(c)。
【図１０】TRP-2-α-BTX融合タンパク質を使用して、共焦点レーザー走査顕微鏡によるTRP-2表面発現の検知。  13アミノ酸長のα-BTX結合部位は、高親和性をもって、α-ブンガロトキシンを結合する。α-BTX結合サイトをコード化する配列が、TRP-2(A)の細胞外部分をコードする配列における異なる部位に組み込まれた。顕微鏡スライド上で培養されたMA-MEL-86A細胞が、細胞膜トラッキング試薬pEYFP-Mem(a)及びTRP2/αBTX融合タンパク質をコードするプラスミドで一時的に共トランスフェクトされた。蛍光ラベル化α-ブンガロトキシン(赤い蛍光、b)で染色後、2つの図を重ね、融合タンパク質の細胞表面発現は明白になった(黄色の蛍光、c)。
【図１１】CTL2C/417によるTRP-2の認識は、タンパク質が膜貫通領域(TMD)を含むことを必要とする。  TRP-2 cDNAの全長(fl)あるいはタンパク質(TMDdel)のTMDコード配列を欠くTRP-2バリアントが、293T細胞へトランスフェクトされ、IFN-γ-ELISpot分析を経てCTL2C/417による認識のためにテストした。欠失バリアントは認識されなかった(A)。オリジナルのTMDコード配列がHLA-A24-cDNAからクローンされたTMDで取り替えられ、この置換バリアントが、293T細胞へTRP-2 fl-cDNAとの比較においてトランスフェクトされた時、CTLは両方のバリアントを認識した(B)。  この結果は、さらにT細胞によって認識されるようになるために細胞表面にTRP-2が表示される必要があることを確認した。 (C) HLA-A24-TMDを含んでいる組み換えTRP-2の略図。
【図１２】CTL2C/417のT細胞受容体(TCR)のクローニング。  TCR α- 及び β-鎖のクローニングが、Birkholzら(J Immunol Meth、2009年)によって公表されたプロトコルによって行われた。TCR cDNAクローンは、IMGT/VQuestデータベースを使用して、配列決定され分析された。TCRβ鎖はV（可変)-、D(多様性)-そしてJ(接着)-セグメントからなり、α鎖はVとJ領域のみによって構築されている。CDR(相補性決定領域)。
【図１３−１】CTL 1A.3/46から分離された天然及びキメラ化TCRのクローニング、発現及び分析。
【図１３−２】同上。
【００７８】
SEQ ID No.1は、CSF2RAのアミノ酸配列を示す:
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEKSDLRTVAPASSLNVRFDSRTMNLSWDCQENTTFSKCFLTDKKNRVVEPRLSNNECSCTFREICLHEGVTFEVHVNTSQRGFQQKLLYPNSGREGTAAQNFSCFIYNADLMNCTWARGPTAPRDVQYFLYIRNSKRRREIRCPYYIQDSGTHVGCHLDNLSGLTSRNYFLVNGTSREIGIQFFDSLLDTKKIERFNPPSNVTVRCNTTHCLVRWKQPRTYQKLSYLDFQYQLDVHRKNTQPGTENLLINVSGDLENRYNFPSSEPRAKHSVKIRAADVRILNWSSWSEAIEFGSDDGNLGSVYIYVLLIVGTLVCGIVLGFLFKRFLRIQRLFPPVPQIKDKLNDNHEVEDEIIWEEFTPEEGKGYREEVLTVKEIT
【００７９】
SEQ ID No.2は、TRP-2(アイソフォーム1)のアミノ酸配列を示す。
MSPLWWGFLLSCLGCKILPGAQGQFPRVCMTVDSLVNKECCPRLGAESANVCGSQQGRGQCTEVRADTRPWSGPYILRNQDDRELWPRKFFHRTCKCTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPPVIRQNIHSLSPQEREQFLGALDLAKKRVHPDYVITTQHWLGLLGPNGTQPQFANCSVYDFFVWLHYYSVRDTLLGPGRPYRAIDFSHQGPAFVTWHRYHLLCLERDLQRLIGNESFALPYWNFATGRNECDVCTDQLFGAARPDDPTLISRNSRFSSWETVCDSLDDYNHLVTLCNGTYEGLLRRNQMGRNSMKLPTLKDIRDCLSLQKFDNPPFFQNSTFSFRNALEGFDKADGTLDSQVMSLHNLVHSFLNGTNALPHSAANDPIFVVLHSFTDAIFDEWMKRFNPPADAWPQELAPIGHNRMYNMVPFFPPVTNEELFLTSDQLGYSYAIDLPVSVEETPGWPTTLLVVMGTLVALVGLFVLLAFLQYRRLRKGYTPLMETHLSSKRYTEEA
【００８０】
SEQ ID No.3は、CTL 1A.1/506のTCRα鎖配列を示す。
METLLGPLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQSGDSATYLCAVGGNDYKLSFGAGTTVTVRANIQNSDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
【００８１】
SEQ ID No.4は、クローンCTL 1A.1/506のTCRβ鎖配列を示す。
MGTRLFFYVALCLLWTGHMDAGITQSPRHKVTETGTPVTLRCHQTENHRYMYWYRQDPGHGLRLIHYSYGVKDTDKGEVSDGYSVSRSKTEDFLLTLESATSSQTSVYFCAISEKLAGAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
【００８２】
SEQ ID No.5はクローンCTLのTCRα鎖配列に2C/417を示す。
MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDMIEGGGNKLTFGTGTQLKVELNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWS
【００８３】
SEQ ID No.6はクローンCTLのTCRβ鎖配列に2C/417を示す。
MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSRQGAVGQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
【００８４】
SEQ ID No.7は、クローンCTL 1A3/46のTCRα鎖配列を示す。
MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCAMRPHFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWS
【００８５】
SEQ ID No.8は、クローンCTL 1A3/46のTCRβ鎖配列を示す。
MGTRLFFYVALCLLWTGHMDAGITQSPRHKVTETGTPVTLRCHQTENHRYMYWYRQDPGHGLRLIHYSYGVKDTDKGEVSDGYSVSRSKTEDFLLTLESATSSQTSVYFCAISEKLAGAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG*
【００８６】
SEQ ID No. 9〜26は、本発明のTCRのCDR配列を示す。
【実施例】
【００８７】
実施例1: 黒色腫反応性CD8陽性T細胞の生成
黒色腫患者MA-MEL-86から、４つの異なったパーマネント腫瘍細胞株(MA-MEL-86A、-86B、-86C、-86F)が、個別のリンパ節転移から確立された。MA-MEL-86B及びMA-MEL-86Fの両方は、β2ミクログロブリン遺伝子における2対立遺伝子の変異によってそれらの細胞表面でHLAを発現しなかった。腫瘍細胞株MA-MEL-86Cは1つのHLAハプロタイプを失くしていた。対照的に、MA-MEL-86AラインはHLA I対立遺伝子をすべて発現したが、メラノソームの異分化抗原の非発現を、4つの腫瘍細胞株のうちの唯一のものとして示した(図1)
【００８８】
腫瘍反応性CD8陽性T細胞が、いわゆる混合リンパ球腫瘍細胞カルチャーにおいて、自己由来の腫瘍細胞株MA-MEL-86AあるいはMA-MEL-86Cで、末梢血単核細胞、PBMCから得たリンパ細胞の週毎の刺激によって生成された。驚いたことに、本発明者は、認識パターンの変更でMLTC応答リンパ細胞は、なお、HLA I陰性バリアントMA-MEL-86B (図2) とMA-MEL-86Fを認識したということ知った。これは、これらのMLTCからクローン化T細胞(CTL)で確認された。MLTC及びCTLクローンが、それらの標的分子の同定に使用された。
【００８９】
実施例２
CSF2RAの同定
真核生物の発現ベクターpcDNA3.1に構築されたメラノーマ細胞株MEL-86AのcDNAライブラリーは、MLTC1A.1の応答者リンパ細胞で選別された。最初の工程で、100cDNAクローンから成るcDNAプールが、293T細胞へ患者のHLA I対立遺伝子で共トランスフェクトされた。トランスフェクタントはT細胞によって認識に関してテストされた。プールのうちの1つは反応性あることが見出された。続いて、ステップ毎にcDNAクローニングが行なわれた。このように、CSF2RAは、MLTC 1A.1の標的であると同定された(図3)。その後、HLA I陰性のメラノーマ細胞バリアントを検出することができ、CSF2RAに対して向けられたT細胞クローンが単離された。特に、CSF2RAに対するT細胞の交差反応性を見る場合、一つは抗原の特殊性を認識する。CSF2RA反応性T細胞は、利用可能なメラノーマ細胞ラインの60%を検出でき、また膵臓、結腸、肺、卵巣、骨髄性白血病と同様に胆嚢起源の腫瘍細胞株も検出することができた(表2)。
表2: CSF2RA反応性CTL 1A.1/506によって認識された同種異型の腫瘍株。
【表２】
0006475166.tif 000003
【００９０】
他方、末梢血に由来したメラノサイト、顆粒球細胞及び単球のうち、全てのテストされた正常細胞は、CSF2RA反応性T細胞によって認識されなかった(図4を参照)。細胞調製物の純度は、フローサイトメトリーによって前もってテストされた。さらに、CSF2RAでトランスフェクション後、CSF2RA反応性T細胞によって異なる種からの細胞ラインを検知することができた(図5を参照)。HLA Iでの共トランスフェクションは必要ではなかった。
【００９１】
フローサイトメトリーを使い、さらに本発明者は、全てのCSF2RA反応性T細胞が、TCRαβ陽性、CD3陽性及びCD8陽性でありT細胞受容体β鎖Vβ12(TRBV10-3)を発現したことを証明した。これらのT細胞の反応性は、CD3またはCSF2RAに対する抗体によってのみ阻害でき、HLA IあるいはIIに対する抗体ではできなかった (図6を参照)。
【００９２】
HLA非依存的なCSF2RA反応性T細胞クローン1A.1/506のTCRのα及びβ鎖cDNAsが、クローン化され、配列特定された(図7、SEQ ID 3番及び4番を参照)。
【００９３】
実施例3:
TRP-2の同定
パネル・テストで、既知の黒色腫に関連する抗原をコードする40cDNAクローンが、293T細胞へトランスフェクトされた。つづいて、トランスフェクタントは、MLTC 1C及び2Cの反応者リンパ細胞によって認識に関しテストされた。それら由来のMLTC及びCTLクローンの両方が、HLA I陰性の腫瘍細胞株MA-MEL-86B及び86Fを認識でき、またメラノソームの分化抗原TRP-2を標的化することを見出した。それらは、正常なメラノサイトと同様に研究所で利用可能なTRP-2-発現メラノーマ細胞株、及びTRP-2でトランスフェクション後、マウス、ハムスター及び猿起源の非メラノサイト細胞とも交差反応した(図8を参照)。HLA I分子の共トランスフェクションは必要でなかった。HLA非依存的TRP-2反応性T細胞は、トランスフェクションの後に、マウスメラノーマ細胞及びマウスTRP-2をも認識した。
【００９４】
フローサイトメトリーを使い、本発明者は、さらに、全てのTRP-2-反応性T細胞が、TCRαβ陽性、CD3陽性及びCD8陽性であり、またT細胞受容体β鎖Vβ3(TRBV28)を発現したことを証明した。これらのT細胞の反応性は、CD3に対する抗体によってのみ阻害でき、HLA IあるいはIIに対する抗体ではできなかった
【００９５】
CD8陽性T細胞によるTRP-2の直接の認識は、抗原の細胞表面発現を必要とする。実際、本発明者は、TRP-2反応性抗体で細胞表面発現を示した(図9を参照)。ヒトメラノーマ細胞の表面上のTRP-2のはっきりとした証拠のために、本発明者は、13アミノ酸長アルファ・ブンガロトキシン認識部位を備えたTRP-2を修飾するために組換えDNA技術を使用した。このサイトは、高い親和性及び特異性をもって、神経毒アルファ-BTXに結合することができる。蛍光色素結合アルファ-BTXを使用して、トランスフェクタントの細胞表面上にTRP-2融合タンパク質のビジュアル化が、可能になった(図10を参照)。
【００９６】
この結果は、TRP-2の膜貫通領域(TMD)の欠失がT細胞による認識の損失に帰着した発見によりさらに支持された。これは、HLA-A*24:01の無関係TMDとの置換によって逆にすることができる (図11を参照)。
【００９７】
HLA非依存的TRP-2-反応性T細胞クローン2C/417のTCRのα及びβ鎖cDNAsがクローン化され、そしてそれらの機能が、健康ドナーのPBMC のCD8陽性T細胞へのトランスファーを経てテストされた。
【００９８】
実施例4:  第２のCSF2RA特異a/bT細胞レセプターのクローニング、異所的発現及び機能分析
a- 及びb- T細胞受容体鎖-(TCR)cDNAsが、CSF2RA特異CTL 1A.3/46から単離され、レトロウイルス・ベクターへ２シストロン性の構成物としてクローン化された(図13A)。続いて、ヒト定常領域が、ヒトT細胞における異所的発現後に、内生的TCR鎖での形質導入されてのペアリングを最小にするために、マウスTCR定常領域によって置き換えられた（キメラ化又はマウス化）。
【００９９】
天然の(左)及びキメラ化（右）構成物で形質導入されたヒトT細胞におけるCSF2RA特異TCRの細胞表面発現が、図13Bで示された。このサンプルにおける未形質導入PBMCにおけるTCR-Vb12陽性T細胞のパーセンテージは、<3%であった(表示されていない)。
【０１００】
CSF2RA-TCR-形質導入同種異型T細胞への比較でのCSF2RA反応性CTL 1A.3/44の反応分析において、CSF2RA陽性標的細胞(MA-MEL-86F及び293T)細胞は、内生的にCSF2RAを発現しているMA-MEL-86及び抗原でトランスフェクトされた293T細胞が認識されている間は、認識されなかった(図13C)。キメラ化TCRで形質導入されたT細胞は、CSF2RA反応性CTL1A.3/44のそれに比べられる反応性を示し、天然TCR構成物で形質導入されたT細胞より著しく高い反応性を示した。
【図１】
0006475166.tif 000004
【図２】
0006475166.tif 000005
【図３】
0006475166.tif 000006
【図４】
0006475166.tif 000007
【図５】
0006475166.tif 000008
【図６】
0006475166.tif 000009
【図７】
0006475166.tif 000010
【図８】
0006475166.tif 000011
【図９】
0006475166.tif 000012
【図１０】
0006475166.tif 000013
【図１１】
0006475166.tif 000014
【図１２】
0006475166.tif 000015
【図１３−１】
0006475166.tif 000016
【図１３−２】
0006475166.tif 000017
【配列表】
0006475166000001.app