(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
シクロ（−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｈｒ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−）
（Ｉ）
［式中、
Ｘａａ１はＯｃｔＧｌｙ、Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、またはＧｌｕ（フェネチル）；
Ｘａａ２はＧｌｕ、Ｎｌｅ、ｈＴｙｒ、またはＶａｌ；
Ｘａａ４はＡｌａ、またはＡｌｌｙｌＧｌｙ；
Ｘａａ６はＩｌｅ；
Ｘａａ７はＰｒｏ；
Ｘａａ８はＰｒｏ；
Ｘａａ９はＧｌｎ、またはＴｙｒ；
Ｘａａ１０はＬｙｓ；
Ｘａａ１１はｈＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ｈＧｌｎ、またはＨｉｓ；
Ｘａａ１２はＤＰｒｏ、および
Ｘａａ１３はＰｒｏ；
但し、
Ｘａａ１がＯｃｔＧｌｙであるとき、
Ｘａａ２はＧｌｕ、またはＮｌｅ；
Ｘａａ４はＡｌａ；
Ｘａａ６はＩｌｅ；
Ｘａａ１０はＬｙｓ；
Ｘａａ１１はＳｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｓｎ
Ｘａａ１３はＰｒｏであり、
さらに
Ｘａａ１１がＴｙｒ、またはＨｉｓであるとき、
Ｘａａ１はＡｒｇ、ｈＡｒｇまたはＧｌｕ（フェネチル）である］
で示される、１３アミノ酸残基から構成される環状骨格ペプチド化合物およびその製薬的に許容し得る塩。
【請求項２】
Ｘａａ１はＯｃｔＧｌｙ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ（フェネチル）；
Ｘａａ２はＧｌｕ、Ｎｌｅ、ｈＴｙｒ、またはＶａｌ；
Ｘａａ４はＡｌａ；
Ｘａａ６はＩｌｅ；
Ｘａａ７はＰｒｏ；
Ｘａａ８はＰｒｏ；
Ｘａａ９はＧｌｎ、またはＴｙｒ；
Ｘａａ１０はＬｙｓ；
Ｘａａ１１はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓ；
Ｘａａ１２はＤＰｒｏ、および
Ｘａａ１３はＰｒｏ；
但し、
Ｘａａ１がＯｃｔＧｌｙであるとき、
Ｘａａ２はＧｌｕ、またはＮｌｅであり；
さらに
Ｘａａ１１がＴｙｒ、またはＨｉｓであるとき、
Ｘａａ１はＡｒｇである、
請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘａａ１はＡｒｇ、またはｈＡｒｇ；
Ｘａａ２はＧｌｕ、Ｖａｌ、またはｈＴｙｒ；
Ｘａａ４はＡｌａ、またはＡｌｌｙｌＧｌｙ；
Ｘａａ６はＩｌｅ；
Ｘａａ７はＰｒｏ；
Ｘａａ８はＰｒｏ；
Ｘａａ９はＧｌｎ、またはＴｙｒ；
Ｘａａ１０はＬｙｓ；
Ｘａａ１１はｈＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはｈＧｌｎ；
Ｘａａ１２はＤＰｒｏ、および
Ｘａａ１３はＰｒｏである、
請求項１記載の化合物。
【請求項４】
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Asn-DPro-Pro-)；
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Ser-DPro-Pro-)；
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-hTyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Nle-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-AllylGly-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-Ser-DPro-Pro-)；
シクロ(-hArg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-hLeu-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-hGln-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-His-DPro-Pro-)；
シクロ(-Glu(フェネチル)-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-hTyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)
から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項５】
医薬として使用するための、遊離形態または製薬的に許容し得る塩の形態の、請求項１〜４のいずれか記載の化合物。
【請求項６】
肺癌、乳癌、乾癬、α1アンチトリプシン欠損症、肺気腫、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、突発性肺線維症、気管支拡張症、肺高血圧、肺動脈高血圧、心肥大、心筋炎、急性心筋梗塞、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、膵炎、アレルギー性鼻炎、全身性炎症反応症候群、炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患、またはクローン病の処置または予防のための、エラスターゼに対する阻害活性を有する、遊離形態または製薬的に許容し得る塩の形態の、請求項１〜４のいずれか記載の化合物。
【請求項７】
遊離形態または製薬的に許容し得る塩の形態の、請求項１〜４のいずれか記載の化合物または該化合物の混合物および医薬的に不活性な担体を含有してなる、特に吸入、経口、局所、経皮、注射、口腔、筋肉、経粘膜、直腸、吸入投与に適当な、特に錠剤、糖衣錠、カプセル、溶液、液体、ジェル、硬膏、クリーム、軟膏、シロップ、スラリー、懸濁液、粉末または坐薬の形態の医薬組成物。
【請求項８】
特にヒト好中球エラスターゼに対する選択的プロテアーゼ阻害活性および／または抗癌活性および／または抗炎症活性および／または抗感染活性および／または抗心疾患活性および／または抗免疫学的活性および／または抗神経変性活性を有する医薬的に活性な物質としての、遊離形態または製薬的に許容し得る塩の形態の、請求項１〜４のいずれか記載の化合物。
【請求項９】
エラスターゼ活性が介在するまたはエラスターゼ活性により生じる、または免疫学的反応にエラスターゼ活性が介在するまたはエラスターゼ活性により生じる、感染またはそのような感染に関連する疾患、または癌（肺癌または乳癌等）、または免疫学的疾患（乾癬等）、または肺疾患（α1アンチトリプシン欠損症、肺気腫、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、突発性肺線維症、気管支拡張症、肺高血圧または肺動脈高血圧等）、または心疾患（心肥大、心筋炎または急性心筋梗塞等）、または神経変性疾患、または炎症または炎症に関連する疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、膵炎、アレルギー性鼻炎、全身性炎症反応症候群、炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患またはクローン病等）の処置または予防のための、エラスターゼに対する阻害活性を有する医薬としての、遊離形態または製薬的に許容し得る塩の形態の、請求項１〜４のいずれか記載の化合物または請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
エラスターゼ活性が介在するまたはエラスターゼ活性により生じる、または免疫学的反応にエラスターゼ活性が介在するまたはエラスターゼ活性により生じる、感染またはそのような感染に関連する疾患、または癌（肺癌または乳癌等）、または免疫学的疾患（乾癬等）、または肺疾患（α1アンチトリプシン欠損症、肺気腫、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、突発性肺線維症、気管支拡張症、肺高血圧または肺動脈高血圧等）、または心疾患（心肥大、心筋炎または急性心筋梗塞等）、または神経変性疾患、または炎症または炎症に関連する疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、膵炎、アレルギー性鼻炎、全身性炎症反応症候群、炎症性皮膚疾患、炎症性腸疾患またはクローン病等）の処置または予防のための、エラスターゼに対する阻害活性を有する医薬の製造のための、遊離形態または製薬的に許容し得る塩の形態の、請求項１〜４のいずれか記載の化合物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか記載の化合物を含んでなる、エラスターゼ活性が介在するまたはエラスターゼ活性により生じる、または免疫学的反応にエラスターゼ活性が介在するまたはエラスターゼ活性により生じる、感染またはそのような感染に関連する疾患若しくは障害、または癌、または免疫学的疾患、肺疾患、または心疾患、または神経変性疾患、または炎症を処置するための医薬組成物。
【請求項１２】
下記ステップを含んでなる、請求項１〜４のいずれか記載の化合物の製造方法
（ａ）適当に官能基化された固体支持体を、所望の最終産物においてＸａａｎ（ｎは１３、８、７、６、５または４）に対応するアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）とカップリングし；
（ｂ）得られた生成物からＮ−保護基を脱離し；
（ｃ）得られた生成物を、所望の最終産物においてＸａａｎ−１に対応するアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）とカップリングし；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた生成物からＮ−保護基を脱離し；
（ｅ）所望の最終産物においてｎ−２位から１位のアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）を用いて、ステップ（ｃ）および（ｄ）に実質的に対応するステップを行い、
（ｆ）ｎが１３でなければ、所望の最終産物において１３位からｎ＋１位の位置のアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）を用いて、ステップ（ｃ）および（ｄ）に実質的に対応するステップを行い、
（ｇ）得られた生成物を固体支持体から切り離し；
（ｈ）固体支持体から切り離した生成物を環化し；
（ｉ）アミノ酸残基の鎖の官能基に存在する保護基をいずれも脱離し、および
（ｊ）所望により、得られた生成物を製薬的に許容し得る塩に変換するか、または製薬的に許容し得る若しくは許容されない得られた塩を、対応する遊離形態の化合物または異なる製薬的に許容し得る塩に変換する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ酵素の阻害剤として有用であり、WO2006/087001 A1に一般的開示があるが具体的には開示されていない、β−ヘアピンペプチド模倣体を提供する。
【０００２】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は、一般式
シクロ(Xaa1−Xaa2−Thr3−Xaa4−Ser5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Xaa10−Xaa11−Xaa12−Xaa13−)
（Xaa1、Xaa2、Xaa4、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12およびXaa13は、明細書および特許請求の範囲において定義される特定のタイプのアミノ酸残基である）
で示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である。
【０００３】
これらのβ−ヘアピンペプチド模倣体は、プロテアーゼ酵素の阻害剤として有用であり、特にエラスターゼ等の特定のセリンプロテアーゼの阻害剤として有用である。
【０００４】
さらに、本発明は、これらの化合物が、必要に応じ、ライブラリーフォーマットで得られる効率的な製造方法を提供する。
【０００５】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は、ヒト好中球エラスターゼに対し高い阻害活性を示す一方、プロテアーゼ３に対しては低い阻害活性を有し、意外にもブタ膵エラスターゼ（ＰＰＥ）に対し低い阻害活性を有する。これらの好ましい活性／選択性プロファイルは、モノ環状ペプチド模倣体における特定のタイプのα−アミノ酸残基とその位置の適切な選択によるものである。
【背景技術】
【０００６】
プロテアーゼの阻害剤が、癌(R. P. Beckett, A. Davidson, A. H. Drummond, M. Whittaker, Drug Disc. Today 1996, 1, 16-26、L. L. Johnson, R. Dyer, D. J. Hupe, Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 466-71、D. Leung, G. Abbenante, and D. P. Fairlie, J. Med. Chem. 2000, 43, 305-341、T. Rockway, Expert Opin. Ther. Patents 2003, 13, 773-786)、寄生の真菌およびウイルス感染症（例えば住血吸虫症（M. M. Becker, S. A. Harrop, J. P. Dalton, B. H. Kalinna, D. P. McManus, D. P. Brindley, J. Biol. Chem. 1995, 270, 24496-501）、C. albicans （C. Abad-Zapetero, R. Goldman, S. W. Muchmore, C. Hutchins, K. Stewart, J. Navaza, C. D. Payne, T. L. Ray, Protein Sci. 1996, 5, 640-52）、HIV (A. Wlodawer, J. W. Erickson, Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 543-85、P. L. Darke, J. R. Huff, Adv. Pharmacol. 1994, 5, 399-454）、肝炎ウイルス（J. L. Kim, K. A. Morgenstern, C. Lin, T. Fox, M. D. Dwyer, J. A. Landro, S. P. Chambers, W. Markland, C. A. Lepre, E. T. O’Malley, S. L. Harbeson, C. M. Rice, M. A. Murcko, P. R. Caron, J. A. Thomson, Cell, 1996, 87, 343-55、R. A. Love, H. E. Parge, J. A. Wickersham, Z. Hostomsky, N. Habuka, E. W. Moomaw, T. Adachi, Z. Hostomska, Cell, 1996, 87, 331-342）、ヘルペス（W. Gibson, M. R. Hall, Drug. Des. Discov. 1997, 15, 39-47））および炎症性疾患、免疫学的疾患、呼吸器疾患（P. R. Bernstein, P. D. Edwards, J. C. Williams, Prog. Med. Chem. 1994, 31, 59-120、T. E. Hugli, Trends Biotechnol. 1996, 14, 409-12）、心疾患（M. T. Stubbs, W. A. Bode, Thromb. Res. 1993, 69, 1-58、H. Fukami et al, Current Pharmaceutical Design 1998, 4, 439-453）および神経変性異常（アルツハイマー病（R. Vassar, B. D. Bennett, S. Babu-Kahn, S. Kahn, E. A. Mendiaz, Science, 1999, 286, 735-41）を含む）、血管新生（M. Kaatinen et al, Atherosklerosis 1996, 1231-2, 123-131）および多発性硬化症（M. Z. Ibrahim et al, J. Neuroimmunol 1996, 70, 131-138）等の疾患の処置における治療的用途を期待して登場してきている。
【０００７】
プロテアーゼのなかでも、セリンプロテアーゼは重要な治療上の標的である。セリンプロテアーゼはその基質特異性によって、特にP1に存在する残基のタイプによって、トリプシン様（P1に正に荷電したLys/Argがよくみられる）、エラスターゼ様（P1に小さい疎水性残基が存在する）またはキモトリプシン様（P1に大きな疎水性残基Phe/Tyr/Leuが存在する）のいずれかに分類される。プロテアーゼ阻害剤のＸ線結晶データがＰＤＢデータベース(PDB: www.rcsb.org/pdb)上で入手可能なセリンプロテアーゼとして、トリプシン、α−キモトリプシン、γ−キモトリプシン、ヒト好中球エラスターゼ、ブタ膵エラスターゼ、トロンビン、サブチリジン、ヒトサイトメガロウイルスプロテアーゼ、アクロモバクタープロテアーゼ１、ヒトカテプシンＧ、グルタミン酸特異的プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＤ、血液凝固因子ＶＩＩａ、ブタ因子１ＸＡ、腸間膜ペプチダーゼ、ＨＣＶプロテアーゼおよびテルミターゼが挙げられる。治療上興味深い他のセリンプロテアーゼとしては、トリプターゼ、補体コンバターゼ、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質ＮＳ３プロテアーゼが挙げられる。トロンビンの阻害剤（例えばJ. L. Metha, L. Y. Chen, W. W. Nichols, C. Mattsson, D. Gustaffson, T. G. P. Saldeen, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998, 31, 345-51、C. Lila, P. Gloanec, L. Cadet, Y. Herve, J. Fournier, F. Leborgne, T. J. Verbeuren, G. DeNanteuil, Synth. Comm. 1998, 28, 4419-29）および第Xa因子(例えばJ. P. Vacca, Annu. Rep. Med. Chem. 1998, 33, 81-90)は、抗血栓薬として臨床評価中であり、エラスターゼの阻害剤（J. R. Williams, R. C. Falcone, C. Knee, R. L. Stein, A. M. Strimpler, B. Reaves, R. E. Giles, R. D. Krell, Am. Rev. Respir. Dis. 1991, 144, 875-83)は、肺気腫および他の肺疾患について臨床試験中であり、トリプターゼ阻害剤は、現在、喘息について（C. Seife, Science 1997, 277, 1602-3）、ウロキナーゼ阻害剤は乳癌について、およびキマーゼ阻害剤は心臓関連疾患について、第ＩＩ相臨床試験中である。最終的に、カテプシンＧ、エラスターゼおよびプロテアーゼ３は、サイトカインおよびそれらの受容体の活性の調節に密接に関連している。特に炎症の部位では、浸潤性の多形核細胞から放出されたこれら３つの好中球セリンプロテアーゼ（NSP）の高い濃度が炎症性サイトカインの上昇したレベルと経時的に密接に相関しており、これらのプロテアーゼがサイトカインの生物活性とアベイラビリティの制御に関与することを強く示している（U. Bank, S. Ansorge, J. Leukoc. Biol. 2001, 69, 177-90）。したがって、選択性の高いエラスターゼ阻害剤は、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症および虚血再かん流傷害のような肺疾患、ならびに糸球体腎炎、関節炎および水疱性類天疱瘡のような非感染プロセスを含む炎症性疾患（H. Ohbayashi, Epert Opin. Investig. Drugs 2002, 11, 965-980、B. Korkmaz, T. Moreau, F. Gauthier, Biochimie 2008, 90, 227）に関する新規な薬物候補の有効な標的となる。
【０００８】
存在している多くのタンパク質セリンプロテアーゼ阻害剤の１つに、配列および立体配置の両方においてセリンプロテアーゼ阻害剤のボーマン・バークファミリーのトリプシン反応性ループとの類似性を示す、ヒマワリトリプシン阻害剤（SFTI-1）と称する、ヒマワリ種に由来の１４アミノ酸の環状ペプチドがある（S. Luckett, R. Santiago Garcia, J. J. Barker, A. V. Konarev, P. R. Shewry, A. R. Clarke, R. L. Brady, J. Mol. Biol. 1999, 290, 525-533、Y.-Q. Long, S.-L. Lee, C.-Y. Lin, I. J. Enyedy, S. Wang, P. Li, R. B. Dickson, P. P. Roller, Biorg. & Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2515-2519）。この阻害剤は、ウシβ−トリプシンの活性部位に結合するとβ−ヘアピンのコンフォメーションをとる。SFTI-1は、β−トリプシン（Ki<0.1nM）、カテプシンＧ（Ki 約0.15nM）、エラスターゼ（Ki 約105μM）、キモトリプシン（Ki 約7.4μM）およびトロンビン（Ki 約１３６mM）を阻害した。
【０００９】
化合物のβ−ヘアピンコンフォメーション
シクロ(−Xaa1−Xaa2−Thr3−Xaa4−Ser5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Xaa10−Xaa11−Xaa12−Xaa13−)は、第１２番にてD-アミノ酸残基、第３番および第５番にてそれぞれ保存されたアミノ酸残基ThrおよびSerを有する、天然に存在するペプチドのβ−ヘアピンループに基づく。
【００１０】
テンプレートに結合したヘアピン模倣ペプチドが文献（D. Obrecht, M. Altorfer, J. A. Robinson, Adv. Med. Chem. 1999, 4, 1-68、J. A. Robinson, Syn. Lett. 2000, 4, 429-44）に記載されており、セリンプロテアーゼ阻害テンプレートに固定されたペプチド模倣体およびその合成方法が、国際特許出願（WO2003/054000 A1, WO2006/087001 A1）およびA. Descours, K. Moehle, A. Renard, J.A. Robinson, ChemBioChem 2002, 3, 318-323に記載されているが、これまでに開示された分子はこのような好ましい活性／選択性プロファイルを示さない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
コンビナトリアルおよびパラレル合成法を用いてβ−ヘアピンペプチド模倣体を作製する能力は示されている（L. Jiang, K. Moehle, B. Dhanapal, D. Obrecht, J. A. Robinson, Helv. Chim. Acta. 2000, 83, 3097-3112）。本明細書に記載した方法によれば、大量のヘアピン模倣ライブラリーの合成とスクリーニングが可能になり、構造・活性相関の研究、高い効力と選択性を有するセリンプロテアーゼ阻害活性、特に本明細書に記載する好ましい活性／選択性プロファイルを有する、新規な薬物に適した化合物の特性を有する新しい分子の発見が大いに促進される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は、一般式
シクロ(−Xaa1−Xaa2−Thr3−Xaa4−Ser5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Xaa10−Xaa11−Xaa12−Xaa13−)
（Ｉ）
［式中、
Xaa1はOctGly、Arg、hArg、Cha、Glu(フェネチル)、またはDab(ブタノイル)；
Xaa2はGlu、Val、Leu、Nle、Phe、hPhe、DiHPhe、Tyr、hTyr、またはTrp；
Xaa4はAla、AllylGly、Abu、またはVal；
Xaa6はIleまたはOctGly；
Xaa7はPro；
Xaa8はPro；
Xaa9はGln、またはTyr；
Xaa10はLys、またはAsn；
Xaa11はhLeu、Ser、hSer、hSer(Me)、Thr、alloThr、Asn、Gln、hGln、Dap、Tyr、またはHis；
Xaa12はDPro、および
Xaa13はPro、Tic、Glu、Asp、Ala、Val、またはLys；
但し、
Xaa1がOctGlyであるとき、
Xaa2はGlu、またはNle；
Xaa4はAla、またはAbu；
Xaa6はIle、またはOctGly；
Xaa10はLys；
Xaa11はSer、Thr、Asn、またはGln；
Xaa13はPro、Tic、Ala、Val、またはLys、および／または
Xaa6がOctGlyであるとき、
Xaa1はOctGly、Arg、またはCha；
Xaa2はGlu、またはNle；
Xaa4はAla、またはAbu；
Xaa10はLys；
Xaa11はSer、Thr、Asn、Gln；
Xaa13はPro、Tic、Ala、Val、またはLysであり、さらに、
Xaa11がTyr、またはHisであるとき、
Xaa1はArg、hArg、またはGlu(フェネチル)である］
で示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である。
【００１３】
本発明によれば、これらのβ−ヘアピンペプチド模倣体は以下のステップを含んでなる製造方法により製造することができる
（ａ）適当に官能基化された固体支持体を、所望の最終産物においてXaan（ｎは13、8、7、6、5または4）に対応するアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）とカップリングし；
（ｂ）得られた生成物からＮ−保護基を脱離し；
（ｃ）得られた生成物を、所望の最終産物においてXaan-1に対応するアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）と適当にカップリングし；
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた生成物からＮ−保護基を脱離し；
（ｅ）所望の最終産物においてｎ−２から１の位置のアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）を用いて、ステップ(c)および(d)に実質的に対応するステップを行い、
(f)nが13でなければ、所望の最終産物において１３からｎ＋１の位置のアミノ酸が適当にＮ−保護された誘導体（ここで、該Ｎ−保護アミノ酸誘導体に存在するいずれの官能基も同様に適当に保護されている）を用いて、ステップ（ｃ）および（ｄ）に実質的に対応するステップを行い、
（ｇ）所望により、ステップ（ｅ）または（ｆ）で得られた生成物からＮ−保護基を脱離する前に、分子に存在する保護された官能基の１つまたは幾つかを選択的に脱保護し、酸、アミノ酸またはアミンから誘導される１またはいくつかの部分を結合させて遊離させた反応性の基で適当に置換し、得られた生成物からＮ−保護基を脱離し；
（ｈ）得られた生成物を固体支持体から切り離し；
（ｉ）固体支持体から切り離した生成物を環化し；
（ｊ）アミノ酸残基の鎖の官能基に存在する保護基をいずれも脱離し、および
（ｋ）所望により、得られた生成物を製薬的に許容し得る塩に変換するか、または製薬的に許容し得る若しくは許容されない得られた塩を、対応する遊離形態の化合物または異なる製薬的に許容し得る塩に変換する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的に適するアミノ酸、アミノ酸の残基の一覧（略号は一般的に採用されている常例に対応する）を以下に示す。
３文字コード                                    １文字コード
Ala                  L-アラニン                      Ａ
Val                  L-バリン                        Ｖ
Leu                  L-ロイシン                      Ｌ
Phe                  L-フェニルアラニン              Ｆ
His                  L-ヒスチジン                    Ｈ
Tyr                  L-チロシン                      Ｙ
Trp                  L-トリプトファン                Ｗ
Lys                  L-リシン                        Ｋ
Arg                  L-アルギニン                    Ｒ
Ser                  L-セリン                        Ｓ
Thr                  L-トレオニン                    Ｔ
Asp                  L-アスパラギン酸                Ｄ
Asn                  L-アスパラギン                  Ｎ
Glu                  L-グルタミン酸                  Ｅ
Gln                  L-グルタミン                    Ｑ
Pro                  L-プロリン                      Ｐ
AllylGly             L-アリルグリシン
Abu                  L-α-アミノ酪酸
OctGly               L-オクチルグリシン
Cha                  L-シクロヘキシルアラニン
Nle                  L-ノルロイシン
hLeu                 L-ホモ-ロイシン
hPhe                 L-ホモフェニルアラニン
DiHPhe               L-ジホモモ-フェニルアラニン
(2S)-2-アミノ-5-フェニル吉草酸
hTyr                 L-ホモ-チロシン
Dap                  L-2,3-ジアミノプロピオン酸
hArg                 L-ホモ-アルギニン
hSer                 L-ホモ-セリン
hSer(Me)             L-ホモ-O-メチルセリン
alloThr              (2S,3S)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-酪酸
hGln                 L-ホモ-グルタミン
Glu(フェネチル)      (2S)-2-アミノ-5-フェネチルアミノ-5-オキソ吉草酸
Dab(ブタノイル)      (2S)-2-アミノ-4-ブタンアミド-酪酸
Tic                  (3S)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸
【００１５】
本発明の特定の態様では、β−ヘアピンペプチド模倣体は一般式Ｉで示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である
［式中、
Xaa1はOctGly、Arg、hArg、またはGlu(フェネチル)；
Xaa2はGlu、Nle、hTyr、またはVal；
Xaa4はAla、またはAllylGly；
Xaa6はIle；
Xaa7はPro；
Xaa8はPro；
Xaa9はGln、またはTyr；
Xaa10はLys；
Xaa11はhLeu、Ser、Thr、Asn、Tyr、hGln、またはHis；
Xaa12はDPro、および
Xaa13はPro；
但し、
Xaa1がOctGlyであるとき、
Xaa2はGlu、またはNle；
Xaa4はAla；
Xaa6はIle；
Xaa10はLys；
Xaa11はSer、Thr、またはAsn
Xaa13はProであり、さらに
Xaa11がTyr、またはHisであるとき、
Xaa1はArg、hArgまたはGlu(フェネチル)である］。
【００１６】
本発明の別の特定の態様では、β−ヘアピンペプチド模倣体は一般式Ｉで示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である
［式中、
Xaa1はOctGly、Arg、またはGlu(フェネチル)；
Xaa2はGlu、Nle、hTyr、またはVal；
Xaa4はAla；
Xaa6はIle；
Xaa7はPro；
Xaa8はPro；
Xaa9はGln、またはTyr；
Xaa10はLys；
Xaa11はSer、Thr、Asn、Tyr、またはHis；
Xaa12はDPro、および
Xaa13はPro；
但し、
Xaa1がOctGlyであるとき、
Xaa2はGlu、またはNleであり；
さらに
Xaa11がTyr、またはHisであるとき、
Xaa1はArgである］。
【００１７】
本発明の別の特定の態様では、β−ヘアピンペプチド模倣体は一般式Ｉで示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である
［式中、
Xaa1はArg、またはhArg；
Xaa2はGlu、Val、またはhTyr；
Xaa4はAla、またはAllylGly；
Xaa6はIle；
Xaa7はPro；
Xaa8はPro；
Xaa9はGln、またはTyr；
Xaa10はLys；
Xaa11はhLeu、Ser、Thr、またはhGln；
Xaa12はDPro、および
Xaa13はProである］。
【００１８】
本発明の別の特定の態様では、β−ヘアピンペプチド模倣体は、
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Asn-DPro-Pro-)；
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Ser-DPro-Pro-)；
シクロ(-OctGly-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-hTyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Nle-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-His-DPro-Pro-)；
シクロ(-Glu(フェネチル)-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Tyr-DPro-Pro-)
から選択される、一般式Ｉで示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である。
【００１９】
本発明の別の特定の態様では、β−ヘアピンペプチド模倣体は、
シクロ(-Arg-Glu-Thr-AllylGly-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-Ser-DPro-Pro-)；
シクロ(-hArg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-hLeu-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-hGln-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Glu-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Tyr-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-Val-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)；
シクロ(-Arg-hTyr-Thr-Ala-Ser-Ile-Pro-Pro-Gln-Lys-Thr-DPro-Pro-)
から選択される、一般式Ｉで示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩である。
【００２０】
本発明の製造方法は、上記一般式Ｉのβ−ヘアピンペプチド模倣体のライブラリーを得るためのパラレルアレイ合成として好都合に実施することができる。このようなパラレル合成により、一般式Ｉの数多くの（通常２４〜１９2、典型的には９６）化合物のアレイを、高い収率と規定された純度で得ることができ、二量体や重合体の副生成物の形成を最小限にすることが可能である。固体支持体（即ち、固体支持体＋リンカー分子）、テンプレート及び環化部位の適切な選択は、それにより重要な役割を果たす。
【００２１】
官能基化固体支持体は、ジビニルベンゼン（好ましくは１〜５％）で架橋されたポリスチレン、ポリエチレングリコールスペーサー（Tentagel（登録商標））でコーティングされたポリスチレン、およびポリアクリルアミド樹脂から好都合に誘導される（D. Obrecht, J.M. Villalgordo, "Solid- Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries", Tetrahedron Organic Chemistry Series, Vol. 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998）。
固体支持体はリンカー（即ち、一端に固体支持体に結合させるためのアンカー基と、他端に後の化学的変換および開裂手順のために用いる選択的に開裂可能な官能基を含む二官能性スペーサー分子）で官能基化される。本発明では２つのタイプのリンカーが用いられる：
【００２２】
タイプ１リンカーは、酸性条件下でアミド基を放出するようにデザインされる（H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3783-3790）。この種のリンカーは、アミノ酸のカルボキシル基のアミドを形成する。このようなリンカー構造で官能基化された樹脂の例としては、
４−[(((2,4−ジメトキシ-フェニル)Fmoc−アミノメチル) フェノキシアセトアミド)アミノメチル]PS樹脂、４−[(((2,4−ジメトキシフェニル)Fmoc−アミノメチル)フェノキシ−アセトアミド)アミノメチル]−4−メチル−ベンズヒドリルアミンPS樹脂(RinkアミドMBHA PS樹脂)、および4−[(((2,4−ジメトキシ−フェニル)Fmoc−アミノメチル)フェノキシアセトアミド)アミノメチル]ベンズヒドリルアミンPS樹脂(RinkアミドBHA PS樹脂)が挙げられる。好ましくは、支持体は、ジビニルベンゼン（最も好ましくは１〜５％）で架橋され、４−(((2,4−ジメトキシフェニル)Fmoc−アミノメチル)フェノキシアセトアミド）リンカーを用いて官能化されたポリスチレンから誘導される。
【００２３】
タイプ２のリンカーは、酸性条件で最終的にカルボキシル基を放出するようにデザインされる。この種のリンカーは、アミノ酸のカルボキシル基と、酸に不安定なエステル（一般に酸に不安定なベンジル、ベンズヒドリルおよびトリチルエステル）を形成する、このようなリンカー構造の例としては２−メトキシ−4−ヒドロキシメチルフェノキシ(Sasrin（登録商標）リンカー)、４−(2,4−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)−フェノキシ(Rink リンカー)、４−(4−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ)酪酸(HMPB リンカー)、トリチルおよび2−クロロトリチルが挙げられる。好ましくは、支持体は、ジビニルベンゼン（最も好ましくは１〜５％）で架橋され、２−クロロトリチルリンカーを用いて官能化されたポリスチレンから誘導される。
【００２４】
パラレル合成として実施するとき、本発明の製造方法は、本明細書の以下に記載するとおり好都合に実施することができるが、本発明の単一の化合物を合成することが望まれる場合、これらの手順をどのように修正しなければならないかは、当業者には直ぐに解ることであろう。
【００２５】
パラレル法によって合成される化合物の総数に等しい数の反応容器に、25〜1000ｍg、好ましくは60ｍg、の適当な官能基化固体支持体、好ましくは１〜５％架橋ポリスチレンまたはTentajel樹脂、をロードする。
【００２６】
用いる溶媒は、樹脂を膨潤することが可能なものである必要があり、ジクロロメタン(DCM)、ジメチルホルムアミド(DMF)、n-メチルピロリドン(NMP)、ジオキサン、トルエン、テトラヒドロフラン(THF)、エタノール(EtOH)、トリフルオロエタノール(TFE)、イソプロピルアルコールなどが挙げられるが、これに限定されない。少なくとも１つの成分として極性溶媒(例えば20％TFE/DCM、35％THF/NMP)を含有する溶媒混合物は、樹脂に結合したペプチド鎖の高い反応性と溶媒和を確保する上で有益である(G.B. Fields, C.G. Fields, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4202−4207)。側鎖の官能基を保護している、酸に不安定な基に影響を及ぼさないマイルドな酸性条件下でＣ末端のカルボン酸基を放出する様々なリンカーの開発が、保護されたペプチドフラグメントの合成においてかなり進んでいる。２−メトキシ−4−ヒドロキシベンジルアルコールから誘導されたリンカー(Sasrin（登録商標）リンカー、Mergler et al., Tetrahedron Lett. 1988, 29 4005−4008)は、希トリフルオロ酢酸（ＤＣＭ中0.5〜1％ＴＦＡ）で開裂可能であり、ペプチド合成中のFmoc 脱離条件に対しても安定であり、Boc/tBuベースのさらなる保護基はこの保護スキームに適合している。本発明の製造方法に適当な他のリンカーとしては、超強酸に不安定な４−(2,4−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)−フェノキシリンカー(Rinkリンカー、H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3787−3790)（ペプチドの脱離にDCM中の10％酢酸またはDCM中0.2％トリフルオロ酢酸が必要）、４−(4−ヒドロキシメチル−3−メトキシフェノキシ)酪酸から誘導されるリンカー(HMPB-リンカー、Florsheimer & Riniker, Peptides 1991, 1990 131)（酸に不安定なすべての側鎖保護基を含むペプチドフラグメントを得るため、１％ＴＦＡ/DCMで開裂）、そしてさらに、２−クロロトリチルクロリドリンカー(Barlos et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943−3946)（氷酢酸/トリフルオロエタノール/DCM(1:2:7)の混合物を３０分間用いてペプチドの脱離が可能）が挙げられる。
【００２７】
アミノ酸、およびそれぞれのその残基、のための適当な保護基は、例えば以下のとおりである。
−アミノ基(例えば、リジンの側鎖にも存在する)の保護基
Cbz        ベンジルオキシカルボニル
Boc        tert-ブチルオキシカルボニル
Fmoc       9-フルオレニルメトキシカルボニル
Alloc      アロイルカルボニル
Teoc       トリメチルシリルエトキシカルボニル
Tcc        トリクロロエトキシカルボニル
Nps        o-ニトロフェニルスルホニル；
Trt        トリフェニルメチルまたはトリチル；
−カルボキシル基（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖にも存在する）の（アルコール成分とのエステルに変換することによる）保護基
tBu        tert-ブチル
Bn         ベンジル
Me         メチル
Ph         フェニル
Pac        フェナシル
アリル
Tse        トリメチルシリルエチル
Tce        トリクロロエチル；
−グアニジノ基(例えば、アルギニンの側鎖に存在する)の保護基
Pmc        2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル
Ts         トシル(即ちp-トルエンスルホニル)
Cbz        ベンジルオキシカルボニル
Pbf        ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル；
−ヒドロキシ基（例えば、トレオニン及びセリンの側鎖に存在する）の保護基
tBu        tert-ブチル
Bn         ベンジル
Trt        トリチル。
【００２８】
９−フルオレニルメトキシカルボニル−(Fmoc)−保護アミノ酸誘導体は、好ましくはビルディングブロックとして、本発明のβ−ヘアピンループ模倣体の構築に用いられる。脱保護、即ちFmoc基の切断、には、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンまたはＤＭＦ中の2％DBU/2％ピペリジン、並びにＣＨ2Ｃｌ2中の25％ ヘキサフルオロイソプロパノールが用いられる。
【００２９】
反応物質、即ちアミノ酸誘導体、の量は、最初に反応チューブ内に量り入れた官能基化固体支持体のミリ当量/グラム(meq/g)に基づいて1〜20当量である(典型的には0.1〜2.85meq/gポリスチレン樹脂)。所望により、反応物質のさらなる当量を用いて妥当な時間に反応が完結するよう操作することができる。好ましいワークステーション（但し、それに限定されるものではないが）は、Labsource’s Combi-chem station, Protein Technologies’Symphony and MultiSyn Tech’s-Syro合成装置であり、後者は、固体支持体から完全に保護された直鎖ペプチドを脱離するプロセス中、さらにトランスファーユニットとリザーバボックスを備えている。すべての合成装置は管理された環境を提供することが可能であり、例えば、室温と異なる温度で、並びに、所望により不活性ガス雰囲気下で、反応を行うことができる。
【００３０】
アミド結合の形成には、アシル化工程のためのα−カルボキシル基の活性化が必要である。この活性化を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、Sheehan & Hess, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 1067-1068)またはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、Sarantakis et al Biochem. Biophys. Res. Commun.1976, 73, 336-342)等の通常用いられるカルボジイミドによって行う場合、得られるジシクロヘキシル尿素およびジイソプロピル尿素は、通常用いられる溶媒にそれぞれ不溶および可溶である。カルボジイミド法の別法では、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt、Koenig & Geiger, Chem. Ber. 1970, 103, 788-798)がカップリング混合物への添加物として含まれる。HOBtは、脱水を防ぎ、活性化アミノ酸のラセミ化を抑制し、遅いカップリング反応を改善する触媒として作用する。ある種のホスホニウム試薬を、直接のカップリング剤、例えばベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP、Castro et al., Tetrahedron Lett. 1975, 14, 1219-1222, Synthesis 1976, 751-752)、またはベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(Py BOP, Coste et al., Tetrahedron Lett. 1990, 31, 205-208)、または2-(1H-ベンゾトリアゾール1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボーレート(TBTU)、またはヘキサフルオロホスフェート(HBTU, Knorr et al., Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930)として用いられ、これらホスホニウム試薬も、保護されたアミノ酸誘導体とのHOBtエステルのin situ形成に適している。より最近では、ジフェノキシホスホリルアジド(DPPA)またはO-(7-アザベンゾトリアゾール−１−イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボーレート(TATU)、またはO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)/7-アザ-1-ヒドロキシ ベンゾトリアゾール(HOAt、Carpino et al., Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279 2281)または(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-N,N,N’,N’-1,1,3,3-テトラメチル-ウロニウムテトラフルオロボーレート(TCTU)、またはヘキサフルオロホスフェート(HCTU、Marder, Shivo and Albericio：HCTU and TCTU：New Coupling Reagents：Development and Industrial Applications、Poster Presentation、Gordon Conference February 2002)もカップリング剤として用いられ、1,1,3,3-ビス(テトラメチレン)クロロウロニウム ヘキサフルオロ-ホスフェート(PyClU)（特にN-メチル化アミノ酸のカップリング用に）(J. Coste, E. Frerot, P. Jouin, B. Castro, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 1967)またはペンタフルオロフェニル ジフェニル-ホスフィネート(S. Chen, J. Xu、Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6711)も用いられる。
【００３１】
ほぼ定量的なカップリング反応が必須であるという事実から、反応が完結したという実験的エビデンスを得ることが望ましい。樹脂に結合したペプチドのアリコートに対する陽性比色反応が定量的に第1級アミンの存在を示す、ニンヒドリン試験(Kaiser et al., Anal. Biochemistry 1970、34、595)は、各カップリング工程後に容易に速やかに実施することができる。Fmoc化学は、Fmoc発色団が塩基で放出されると、その分光光度的検出が可能になる(Meienhofer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1979, 13, 35-42)。
【００３２】
下記の２つの方法の１つにより純粋な溶媒に反復的に暴露することにより、各反応容器内の樹脂に結合した中間体を洗浄し過剰の残存試薬、溶媒、および副生成物を除去する。
１）反応容器を溶媒（好ましくは5ｍL）で満たし、5〜300分間、好ましくは15分間攪拌し、次いで排液して溶媒を除去する、
２）反応容器を溶媒（好ましくは5ｍL）で満たし、試験チューブまたはバイアルなどの受取容器に排液する。
上記の両洗浄手順を最高約50回（好ましくは約10回）繰り返し、洗浄物のTLC、GC、または検査などの方法により、試薬、溶媒および副生成物の除去効率をモニターする。
【００３３】
反応ウェル内で樹脂に結合した化合物と試薬とを反応させ、次いで過剰の試薬、副生成物、および溶媒を除去する上記手順を、最終的に樹脂に結合した完全に保護された直鎖ペプチドが得られるまで一連の変換を繰り返す。
【００３４】
この完全に保護された直鎖ペプチドを固体支持体から脱離する前に、所望により、分子内に存在する１つまたは幾つかの保護された官能基を選択的に脱保護し、脱保護されたその反応性の基を適当に置換することが可能である。これを行うためには、最初に目的の官能基を、存在する他の保護基に影響を及ぼすことなく選択的に脱離することができる保護基で置換する必要がある。
Alloc(アロイルカルボニル)はアミノ保護基の一例であり、アリルはカルボン酸保護基の一例である。いずれの基も、ＣＨ2Ｃｌ2中のPdおよびフェニルシランを用いて、分子内に存在する他の保護基（例えばFmoc）に影響を及ぼすことなく選択的に脱離することができる。次いで、このように脱保護された反応性の基を、所望の置換基を導入するのに適した試薬で処理することができる。即ち、例えば、アミノ基は、導入すべきアシル置換基に対応するアシル化剤を用いてアシル化することができ、カルボキシル基は、アミノ置換基を導入して誘導体化することができる。好ましくは、Allocまたはアリルは、室温で１５分間、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中、0.2当量のテトラキス(トリフェニル-ホスフィン)パラジウム(0) (10 mM)および10当量フェニルシランを適用することにより脱離する。濾過および樹脂の洗浄後、新しい試薬溶液を用いてこの手順を繰り返すことにより脱保護を行う。脱保護したカルボキシ基の場合には、例えば、続いてのアミンのカップリングは、例えば、上記のアミド結合形成のための試薬／反応条件を適用することにより行うことができる。
【００３５】
完全に保護された直鎖ペプチドの固体支持体からの脱離は、ロードした樹脂を、開裂に用いる試薬の溶液(好ましくは3〜5mL)に暴露することにより達成される。温度調節、攪拌、および反応のモニタリングは上記のごとく実施する。トランスファーユニットを介して反応容器をリザーバーチューブを含むリザーバーボックスと接続し、開裂した生成物溶液を効率的に回収する。次に、反応容器中に残る樹脂を上記のごとく3〜5mLの適切な溶媒で2〜5回洗浄し、分離した生成物をできる限り抽出する（洗い流す）。得られた生成物溶液を混入を避けるよう注意しながら混合する。次に、個々の溶液/抽出物を必要に応じて操作して最終化合物を単離する。典型的操作としては、蒸発、濃縮、液体/液体抽出、酸性化、塩基性化、中和、または溶液中でのさらなる反応が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
固体支持体から開裂し塩基で中和した、完全に保護された直鎖ペプチド誘導体を含む溶液を蒸発させる。次に、環化をDCM、DMF、ジオキサン、THFなどの溶媒を用いて溶液中で行う。上に記載した種々のカップリング剤を環化に用いることができる。環化の継続時間は約6〜48時間、好ましくは約16時間である。反応を進行させ、次いで、例えばRP-HPLC(逆相高性能液体クロマトグラフィ)を行う。次に、溶媒を蒸発させて除去し、完全に保護された環状ペプチド誘導体を、水と混和しない溶媒（例えばDCM）に溶解し、該溶液を水または水混和性溶媒の混合物で抽出し、過剰のカップリング剤を除去する。
【００３７】
最終的に、完全に保護されたペプチド誘導体を、95％TFA、2.5％H2O、2.5％TIS、または保護基の開裂を行うための別のスカベンジャー混合物で処理する。開裂反応時間は通常30分間〜12時間、好ましくは約2.5時間である。
あるいはまた、固体支持体からの完全に保護されたペプチドの脱離および完全な脱保護はガラス容器中で手作業で達成することができる。
【００３８】
完全に脱保護した後、例えば以下の方法をさらなる後処理に用いることができる：
１）揮発性物質を蒸発乾固し、粗製のペプチドを水中20％AcOHに溶解し、イソプロピルエーテルまたは適切な他の溶媒で抽出する。水層を回収して蒸発乾固し、完全に脱保護されたペプチド、シクロ(−Xaa1−Xaa2−Thr3−Xaa4−Ser5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Xaa10−Xaa11−Xaa12−Xaa13−)を最終生成物として得る；
２）脱保護混合物を減圧下で濃縮する。好ましくは０℃にてジエチルエーテル中、完全に脱保護されたペプチドを沈殿させた後、該固体を最高約10回、好ましくは3回洗浄し、乾燥して、完全に脱保護されたペプチド、シクロ(−Xaa1−Xaa2−Thr3−Xaa4−Ser5−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Xaa10−Xaa11−Xaa12−Xaa13−)を最終生成物として得る。
【００３９】
純度によって、上記のとおり得られた最終生成物を生物学的アッセイに直接用いることができるか、またはさらに精製（例えば、分取HPLCにより）する必要がある。
上に記載したとおり、所望により、次いで、得られた完全に脱保護された環状生成物を製薬的に許容し得る塩に変換するか、または得られた製薬的に許容し得るまたは許容されない塩を、対応する遊離化合物または異なる製薬的に許容し得る塩に変換することができる。これら操作はいずれも当該分野でよく知られた方法により実施することができる。
【００４０】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は、炎症性の疾患または肺疾患または感染症または免疫学的疾患又は心疾患又は神経変性疾患がセリンプロテアーゼ活性が介在するまたはそれに起因する、あるいは、癌がセリンプロテアーゼ活性が介在するまたはそれに起因する、広範囲の適用に用いることができる。プロテアーゼ阻害剤を用いた処置に適している病気または疾患の制御または予防のために、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体をそれ自体で投与するか、あるいは当業者に周知の担体、希釈剤または賦形剤とともに適当な製剤として適用することができる。
【００４１】
α１アンチトリプシン欠損症（AATD）、肺気腫、慢性関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、乾癬、嚢胞性線維症（CF）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、突発性肺線維症（IPF）、気管支拡張症、気管支拡張（bronchodilation）、慢性気管支炎、多発性硬化症、急性呼吸促迫症候群（ARDS）、急性肺損傷（ALI）、肺高血圧（PH）、肺動脈高血圧（PAH）、膵炎、喘息、アレルギー性鼻炎、炎症性皮膚疾患、血管形成術後の再狭窄、全身性炎症反応症候群（SIRS）、虚血再かん流傷害、心肥大、心筋炎、急性心筋梗塞（AMI）、心不全、心臓移植、炎症性腸疾患（IBD）、大腸炎、クローン病、刺激結腸（adaptive colitis）または癌（肺癌、乳癌または血管形成または転移に関連する癌が挙げられるがこれに限定されない）等の疾患の、治療、予防、調節、またはリモデルに用いる場合、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体を単独で、幾つかのβ−ヘアピンペプチド模倣体の混合物として、他の抗炎症薬あるいは抗菌薬または抗癌剤と組み合わせて、および／または他の医薬的に活性な薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体はそれ自体でまたは医薬組成物として投与することができる。
【００４２】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体を含有する医薬組成物は、常套的混合、溶解、顆粒化、コーティング錠製造、湿式粉砕（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、活性本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体の、医薬的に用いることができる調製物への加工を促進する、１またはそれ以上の生理学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を用いて常套的方法で製剤化することができる。適切な製剤は選択した投与方法に依存する。
【００４３】
局所投与用の本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣体は、当分野で周知の溶液剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。
【００４４】
全身用製剤としては、注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下、または腹腔内注射により投与するために設計されたもの、および経皮、経粘膜、経口、または肺投与のために設計されたものが挙げられる。
【００４５】
注射用の本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は、適切な溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水緩衝液中で製剤化することができる。溶液は、製剤用試薬、例えば懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤を含有することができる。あるいはまた、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は、使用前は適当なビークル、例えば無菌発熱性物質除去水と混合するための粉末の形態であってもよい。
経粘膜投与用として、当分野で知られているように、透過する障壁に適した浸透剤を製剤に用いる。
【００４６】
経口投与用としては、化合物を、本発明の活性なβ−ヘアピンペプチド模倣体を当分野で知られている製薬的に許容される担体と混合することにより容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体を、処置される患者が経口摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、サスペンジョン剤、粉末剤などとして製剤化するのを可能にする。例えば粉末剤、カプセル剤、および錠剤などの経口製剤に適した賦形剤には、充填剤、例えば糖（ラクトース、ショ糖、マンニトール、およびソルビトール等）、セルロース調製物（トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ガムトラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等）、顆粒化剤、および結合剤が含まれる。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）を加えることができる。所望により、固体の剤形には、標準的な技術を用いて糖コーティングまたは腸溶コーティングを施すことができる。
【００４７】
懸濁剤、エリキシル剤および溶液剤などの経口用液体製剤に適した担体、賦形剤、または希釈剤としては、水、グリコール、油、アルコールなどが挙げられる。さらに香味料、保存料、着色料などを加えることができる。
【００４８】
口腔投与用の組成物は、当分野において知られているように製剤化される、錠剤、トローチ剤などの剤形をとり得る。
【００４９】
吸入投与による投与では、適当なプロペラント（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、二酸化炭素または他の適当なガス）を用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体が好都合に送達される。加圧エアロゾル剤の場合、計量された量を送達するためのバルブを備えることにより、投与単位を決定することができる。本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体および適当な粉末基剤（ラクトースまたはデンプン等）の粉末混合物を含有する、吸入器（inhalerまたはinsufflator）で用いるためのゼラチン等のカプセルやカートリッジを製剤化してもよい。
【００５０】
化合物を、適当な坐薬用基剤（例えばココアバターまたは他のグリセリド）と共に坐薬などの直腸または膣用組成物に製剤化することもできる。
【００５１】
上記の製剤に加えて、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬は、デポー調製物として製剤化することもできる。そのような長時間作用する製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）および筋肉内注射により投与することができる。そのようなデポー製剤の製造では、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬を、適切なポリマーまたは疎水性物質（例えば許容し得る油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性塩として製剤化することができる。
【００５２】
さらに、他の医薬的デリバリーシステム、例えば当該分野でよく知られたリポソームおよびエマルジョンを用いることができる。ある種の有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド）も用いることができる。さらに、本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬は、持続放出システム（例えば、治療薬剤を含む固体ポリマーの半透過マトリックスを用いて送達することができる。様々な持続放出材料が確立され、当業者にはよく知られている。持続放出カプセル剤は、その化学的性質に応じて化合物を数週間〜１００日間以上放出することができる。治療薬剤の化学的性質と生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のためのさらなる戦略を用いることができる。
【００５３】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体は荷電した残基を含んでいるので、それ自身としてまたは製薬的に許容し得る塩として、いずれかの上記製剤に含有させることができる。製薬的に許容し得る塩は、対応の遊離形態の場合と比べて、水性のまたは他のプロトン性溶媒に溶けやすくなる。特に適当な製薬的に許容し得る塩としては、カルボン酸、ホスホン酸、スルホン酸およびスルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アミノ酸（グルタミン酸またはアスパラギン酸等）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、シクロヘキサンカルボン酸、アダマンタンカルボン酸、安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、フタル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、桂皮酸、メタン−またはエタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、１，５−ナフタレンジスルホン酸、２−、３−または４−メチル−ベンゼンスルホン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、ドデシル硫酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸、Ｎ−メチル−、Ｎ−エチル−またはＮ−プロピル−スルファミン酸、および他の有機のプロトン酸（アスコルビン酸等）との塩が挙げられる。適当な無機酸は、例えばハロゲン化水素酸（塩酸等）、硫酸およびリン酸である。
【００５４】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体、その組成物は、一般的には、意図する目的を達成するのに効果的な量で用いられる。使用する量は具体的な適用に依存すると理解される。
【００５５】
ベータヘアピン模倣体による処置に適している疾患の処置または予防のための局所投与のための治療的有効量は、例えば実施例に記載のin vitroアッセイを用いて決定することができる。疾患が顕在化している間、または顕在化していない場合でも治療を適用することができる。当業者は、過度な実験を行うことなく局所的に疾患を治療するための治療的有効量を決定することができるだろう。
【００５６】
治療または予防するための局所投与の治療的有効用量は、例えば実施例に記載のin vitroアッセイを用いて決定することができる。HIV感染が顕在化している間、または顕在化していない場合でも治療を適用することができる。当業者は、過度な実験を行うことなく局所HIV感染を治療するための治療的有効量を決定することができるだろう。
【００５７】
全身投与の治療的有効用量は、in vitroアッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環β−ヘアピンペプチド模倣体の濃度範囲を達成するように処方することができる。そのような情報を用いてヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。
初期用量も、当該分野でよく知られた技術を用いてin vivoデータ（例えば動物モデル）から決定することができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。
セリンプロテアーゼとしての適用用量は、治療効果を維持するのに充分な本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体の血漿濃度をもたらすために個々に調整することができる。治療的有効血清濃度は、毎日複数回用量を投与することにより達成することができる。
局所投与または選択的摂取の場合、本発明のβ-ヘアピンペプチド模倣体の有効局所濃度は血漿濃度と関連するものでなくてもよい。当業者は、過度な実験を行うことなく治療的に有効な局所濃度を最適化することができるだろう。
当然、投与するβ−ヘアピンペプチド模倣体の量は、治療する対象、対象の体重、病気の重症度、投与方法、および処方する医師の判断に依存するだろう。
【００５８】
通常、本明細書に記載のβ−ヘアピンペプチド模倣体の治療的有効量は、実質的な毒性を生じることなく治療効果をもたらすだろう。
【００５９】
本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣薬の毒性は、ＬＤ５０（ポピュレーションの５０％に対する致死用量）またはＬＤ１００（ポピュレーションの５０％に対する致死用量）を決定するなどの細胞培養または実験動物を用いる標準的医薬的手順により決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数である。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これら細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトに用いて毒性がない用量範囲を処方するのに用いることができる。本発明のβ−ヘアピンペプチド模倣体の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がない有効用量を含む一定の循環濃度範囲内にある。該用量は、用いる剤形と用いる投与経路に応じてその範囲内で変更しうる。正確な製剤、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、Fingl et al. 1975、The Pharmacological Basis of Therapeutic、Ch.1、p.1参照)。
【００６０】
本発明は、通常天然にみられる質量数または質量と異なる質量数または質量を有する原子により置換される場合（例えば２Ｈ（Ｄ）、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１２９Ｉなどで豊富化された化合物）を除き、一般式：シクロ（−Xaa１−Xaa２−Ｔｈｒ３−Xaa４−Ｓｅｒ５−Xaa６−Xaa７−Xaa８−Xaa９−Xaa１０−Xaa１１−Xaa１２−Xaa１３−）で示される化合物と同一の化合物を包含する。これらの同位体類似体およびその医薬的塩、および製剤は、それに限定されるものではないが、例えばin vivo半減期の微調整によって最適化された投薬計画がもたらされる場合、治療および／または診断において有用な物質であると考えられる。
以下の実施例で本発明を説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００６１】
１．ペプチド合成
最初に保護されたアミノ酸残基の樹脂へのカップリング
１ｇ（１．４ｍＭｏｌ）の２−クロロトリチルクロリド樹脂（１．４ｍＭｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ、コポリ（スチレン−１％ＤＶＢ）ポリマーマトリックス、Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989、30、3943-3946）を乾燥フラスコに入れた。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に懸濁し、持続的振盪下、室温で３０分間膨潤させた。９６０μｌ（４当量）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）と混合したＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の０．９８ｍＭｏｌ（０．７当量）の最初に適切に保護されたアミノ酸残基（下記参照）の溶液を加えた。反応混合物を２５℃で４時間振盪した後、樹脂をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｘ）、ＤＭＦ（１ｘ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（１ｘ）で順次に洗浄した。ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（１７／２／１、１０ｍＬ）の溶液を樹脂に加え、懸濁液を３０分間振盪した。ろ過後、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２（１ｘ）、ＤＭＦ（１ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｘ）、ＭｅＯＨ（１ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｘ）、ＭｅＯＨ（１ｘ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｘ）、Ｅｔ２Ｏ（２ｘ）の順番に洗浄し、次いで真空下で６時間乾燥した。
典型的な充填量を０．６〜０．７ｍＭｏｌ／ｇとした。
【００６２】
下記の予め充填した樹脂を調製した：
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂およびＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂．
２４〜９６反応容器を用い、Ｓｙｒｏペプチド合成装置（ＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈ）を用いて合成を行った。各容器に、０．０４ｍＭｏｌの上記樹脂を入れ、樹脂をＣＨ２Ｃｌ２およびＤＭＦでそれぞれ１５分間膨潤させた。下記反応サイクルをプログラムし、実施した。
工程      試薬                                        時間
１        DMF、洗浄                                  5x1分
２        20％ ピペリジン/DMF                        1x5分、1x15分
３        DMF、洗浄                                  5x1分
４        3.6当量Fmoc アミノ酸、3.6当量HOAT/DMF
+3.6当量DIC/DMF                            1x40分
５        DMF、洗浄                                  1x1分
６        3.6当量Fmoc アミノ酸、3.6当量HOAT/DMF
+3.6当量HATU
+7.2当量DIPEA                              1x40分
特記しない限り、アミノ酸の最終カップリングに次いで上記反応サイクルの工程1〜3を適用することによりFmoc脱保護を行った。
適当に保護されたアミノ酸ビルディングブロックは、商業的に入手可能かまたは当分野で知られているように合成することができる。
【００６３】
カルボキシル基を有する側鎖へのフェネチルアミンの結合
手順Ａ
樹脂上で選択的に脱保護した直鎖ペプチドへのフェネチルアミンの結合：
樹脂に結合したペプチドに存在するカルボキシ官能基からアリル保護基を脱離するために、新たに蒸留したＣＨ2Ｃｌ2にて樹脂（０．０４ｍＭｏｌ）を少なくとも１５分膨潤させた後、乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の０．２当量のテトラキス（トリフェニル−ホスフィン）パラジウム（０）（１０ｍＭ）および１０当量フェニルシランを加えた。反応混合物を１５分間室温にて振盪した後、樹脂を濾過し、新たに試薬の溶液を加えてこの手順を繰り返した。樹脂を、ＣＨ2Ｃｌ2、ＤＭＦおよびＥｔ2Ｏで順次に洗浄した後、樹脂をＣＨ2Ｃｌ2にて再度膨潤させ、続いて、ＤＭＦに溶解した３．６当量のフェネチルアミンおよび３．６当量のＨＯＡｔと、ＤＭＦに溶解した３．６当量ＤＩＣとの混合物を加え、反応混合物を時々攪拌する以外は１時間静置することにより、フェネチルアミンを結合させた。濾過し、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した後、ＤＭＦに溶解した3.6当量の同アミンおよび3.6当量HOAtの混合物と、ＤＭＦに溶解した3.6当量HATUおよび7.2当量DIPEAの混合物を用い、この手順を繰り返すことにより、カップリングを完結した。
【００６４】
環化および環化したペプチド骨格の後処理
完全に保護されたペプチド断片の開裂
合成が完結した後、樹脂（０．０４ｍＭｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（ｖ／ｖ）中の１％ＴＦＡ、１ｍＬ（０．１３ｍＭｏｌ、３．４当量）に３分間懸濁し、ろ過し、次いで濾液をＣＨ２Ｃｌ２（ｖ／ｖ）中の１０％ＤＩＥＡ、１ｍＬ（０．５８ｍＭｏｌ、１４．６当量）で中和した。開裂を確実に完結させるためこの手順を３回反復した。濾液を蒸発乾固し、生成物の試料を９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％水、および２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を含む開裂混合物を用いて完全に脱保護し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム）およびＥＳＩ  ＭＳによる分析により直鎖ペプチド合成の効率をモニターした。
【００６５】
直鎖ペプチドの環化
完全に保護された直鎖ペプチド（０．０４ｍＭｏｌ）をＤＭＦ（４μＭｏｌ／ｍＬ）に溶解した。次に、３０．４ｍｇ（０．０８ｍＭｏｌ、２当量）のＨＡＴＵ、１０．９ｍｇ（０．０８ｍＭｏｌ、２当量）のＨＯＡｔおよび２８μｌ（０．１６ｍＭｏｌ、４当量）のＤＩＥＡを加え、混合物を２５℃で１６時間ボルテックスし、次いで高真空下で濃縮した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２とＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（９０／１０：ｖ／ｖ）に分配した。ＣＨ２Ｃｌ２相を蒸発させ、完全に保護された環状ペプチドを得た。
【００６６】
環状ペプチドの完全脱保護
得られた環状ペプチドを、８２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％水、５％チオアニソール、５％フェノール、および２．５％エタンジチオール（ＥＤＴ）を含む開裂混合物、３ｍＬに溶解した。混合物を２５℃で２．５時間放置し、次いで真空下で濃縮した。完全に脱保護された環状ペプチドを０℃のジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）で沈殿させた後、固体をＥｔ２Ｏで２回洗浄し、次いで乾燥させた。
分取ＨＰＬＣにて組成物を精製後、ペプチドを凍結乾燥（白色の粉末）し、以下の分析法により分析した。
【００６７】
分析方法Ａ（実施例５〜１０、１６〜１８）
分析用ＨＰＬＣ保持時間（ＲＴ，分）の測定は、Ascentis Express C18 カラム, 50 x 3.0 mm, (cod. 53811-U- Supelco)を使用し、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ）およびＢ（ＣＨ3ＣＮ＋０．０１％ＴＦＡ）を以下のグラジェントで用いて行った：０−０．０５分：９７％Ａ，３％Ｂ、４．９５分：３％Ａ，９７％Ｂ、５．３５分：３％Ａ，９７％Ｂ、５．４０分：９７％Ａ，３％Ｂ。
流速＝１．３ｍＬ／分、ＵＶ＿Ｖｉｓ＝２２０ｎｍ．
【００６８】
分析方法Ｂ（実施例１〜４）
分析用ＨＰＬＣ保持時間（ＲＴ，分）の測定は、Ascentis Express C18 カラム, 50 x 3.0 mm, (cod. 53811-U- Supelco)を使用し、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ）およびＢ（ＣＨ3ＣＮ＋０．０１％ＴＦＡ）を以下のグラジェントで用いて行った：０−０．０５分：９７％Ａ，３％Ｂ、３．４０分：３３％Ａ，６７％Ｂ、３．４５分：３％Ａ，９７％Ｂ、３．６５分：３％Ａ，９７％Ｂ、３．７０分：９７％Ａ，３％Ｂ。
流速＝１．３ｍＬ／分、ＵＶ＿Ｖｉｓ＝２２０ｎｍ．
【００６９】
分析方法Ｃ（実施例１１〜１５）
分析用ＨＰＬＣ保持時間（ＲＴ，分）の測定は、Xselect CSH C18 XP カラム, 100 x 3.0 mm, (cod. 186006107, Waters)を使用し、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ）およびＢ（ＣＨ3ＣＮ＋０．０１％ＴＦＡ）を以下のグラジェントで用いて行った：０−０．０５分：９５％Ａ，５％Ｂ、１０．０５分：３％Ａ，９７％Ｂ、１２．０５分：３％Ａ，９７％Ｂ、１２．１０分：９５％Ａ，５％Ｂ。
流速＝０．６ｍＬ／分、ＵＶ＿Ｖｉｓ＝２２０ｎｍ．
【００７０】
実施例１〜１３をTable 1に示す。ペプチドは以下のとおり合成した：
出発物質の樹脂を、上記のとおり調製したFmoc-Ser(tBu)-O-2-クロロトリチルとした。この樹脂にXaa４（最終的に４位となる）を結合させた。以下の配列の直鎖ペプチドを上記手順に従って固体支持体上に合成した：樹脂-Ser5-Xaa4-Thr3-Xaa2-Xaa1-Xaa13-Xaa12-Xaa11-Xaa10-Xaa9-Xaa8-Xaa7-Xaa6。上記のごとく最終Ｆｍｏｃ脱保護後、上記のごとくペプチドを樹脂から開裂させ、環化、脱保護および精製した。
上記の分析方法を用いて測定した、ＨＰＬＣ保持時間およびＵＶ−純度をTable 1に示す。
【００７１】
実施例１４、１６をTable 1に示す。ペプチドは以下のとおり合成した：
出発物質の樹脂を、上記のとおり調製したFmoc-Pro-O-2-クロロトリチル樹脂とした。この樹脂にXaa１２（最終的に１２位となる）を結合させた。以下の配列の直鎖ペプチドを上記手順に従って固体支持体上に合成した：樹脂-Pro13-Xaa12-Xaa11-Xaa10-Xaa9-Xaa8-Xaa7-Xaa6-Ser5-Xaa4-Thr3-Xaa2-Xaa1。上記のごとく最終Ｆｍｏｃ脱保護後、上記のごとくペプチドを樹脂から開裂させ、環化、脱保護および精製した。
上記の分析方法を用いて測定した、ＨＰＬＣ保持時間およびＵＶ−純度をTable 1に示す。
【００７２】
実施例１５をTable 1に示す。ペプチドは以下のとおり合成した：
出発物質の樹脂を、上記のとおり調製したFmoc-Pro-O-2-クロロトリチル樹脂とした。この樹脂にXaa１２（最終的に１２位となる）を結合させた。以下の配列の直鎖ペプチドを上記手順に従って固体支持体上に合成した：樹脂-Pro13-Xaa12-Xaa11-Xaa10-Xaa9-Xaa8-Xaa7-Xaa6-Ser5-Xaa4-Ser3-Xaa2-Glu1。最終のＦｍｏｃ脱保護の前に、手順Ａを適用してフェニルエチルアミンをＧｌｕ１の側鎖に結合した。上記の最終のＦｍｏｃ脱保護後、上記のごとくペプチドを樹脂から開裂させ、環化、脱保護および精製した。
上記の分析方法を用いて測定した、ＨＰＬＣ保持時間およびＵＶ−純度をTable 1に示す。
【００７３】
実施例１７〜１８をTable 1に示す。ペプチドは以下のとおり合成した：
出発物質の樹脂を、上記のとおり調製したFmoc-Pro-O-2-クロロトリチル樹脂とした。この樹脂にXaa７（最終的に７位となる）を結合させた。以下の配列の直鎖ペプチドを上記手順に従って固体支持体上に合成した：樹脂-Pro8-Xaa7-Xaa6-Ser5-Xaa4-Thr3-Xaa2-Xaa1-Xaa13-Xaa12-Xaa11-Xaa10-Xaa9。上記のごとく最終Ｆｍｏｃ脱保護後、上記のごとくペプチドを樹脂から開裂させ、環化、脱保護および精製した。
上記の分析方法を用いて測定した、ＨＰＬＣ保持時間およびＵＶ−純度をTable 1に示す。
0006499182.tif 000002
0006499182.tif 000003
【００７４】
２．生物学的方法
２．１．ペプチド試料の調製
凍結乾燥ペプチドをMicrobalance(Mettler MT5)で秤量し、ＤＭＳＯに溶解して最終濃度１０ｍＭとした。ストック溶液を遮光して＋４℃で保存した。生物学的分析は、特記しない限り、ＤＭＳＯ１％未満の分析条件下で行った。
【００７５】
２．２．ヒト好中球エラスターゼの阻害
ヒト好中球エラスターゼ（Serva Electrophoresis, Germany）の加水分解活性を阻害する本発明のペプチドの能力を、合成テトラペプチド基質MeOSuc-AAPV-pNA （Bachem, Switzerland）を用い、以下のとおり測定した。
上記基質（０．３ｍＭ）およびヒト好中球エラスターゼ（１０ｎＭ）を、アッセイバッファー（５０ｍＭトリス、ｐＨ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で連続希釈したペプチド（終濃度１％ＤＭＳＯ）とともに３７℃にてインキュベーションした。
次いで、ｐＮＡの放出を４０５ｎｍでの吸光度の変化を３０分間モニタリングすることにより追跡した。上記と同アッセイ条件でペプチドなしでの対照のアッセイは直線的に進行した。用量−応答データを４パラメータのＨｉｌｌの式に当てはめ、Graphpad (Prism 5)を用いてＩＣ５０値を求めた。
【００７６】
２．３．ブタ膵エラスターゼの阻害
ブタ膵エラスターゼ（Sigma, USA）の加水分解活性を阻害する本発明のペプチドの能力を、合成トリペプチド基質MeOSuc-AAA-pNA（Bachem, Switzerland）を用い、以下のとおり測定した。
上記基質（１ｍＭ）およびブタ膵エラスターゼ（１５ｎＭ）を、アッセイバッファー（５０ｍＭトリス、ｐＨ８，１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で連続希釈したペプチド（終濃度０．５％ＤＭＳＯ）とともに３７℃にてインキュベーションした。
次いで、ｐＮＡの放出を４０５ｎｍでの吸光度の変化を３０分間モニタリングすることにより追跡した。上記と同アッセイ条件でペプチドなしでの対照のアッセイは直線的に進行した。用量−応答データを４パラメータのＨｉｌｌの式に当てはめ、Graphpad (Prism 5)を用いてＩＣ５０値を求めた。
【００７７】
２．４．ヒトプロテアーゼ３の阻害
本発明のペプチドによるヒトプロテアーゼ3 (Elastin Products Company, USA)の不活性化を、合成トリペプチド基質Boc-Ala-Ala-Nva-SBzl (Elastin Products Company, USA)を用い、以下のとおり測定した。
上記基質(1mM), 4,4’-ジチオジピリジン (250μM)およびヒト プロテアーゼ3 (10nM)をアッセイバッファー（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で連続希釈したペプチド（終濃度０．５％ＤＭＳＯ）とともに３７℃にてインキュベーションした。反応プロセスを３４０ｎｍでの吸光度の変化を３０分間モニタリングすることにより追跡した。上記と同アッセイ条件でペプチドなしでの対照のアッセイは直線的に進行した。用量−応答データを４パラメータのＨｉｌｌの式に当てはめ、Graphpad (Prism 5)を用いてＩＣ５０値を求めた。
【００７８】
３．０  結果
上記２．２〜２．４で行った実験の結果を、以下のTable 2 に示す。
0006499182.tif 000004
0006499182.tif 000005