(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主に下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列、
配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列、又は
配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列
において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）において、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファン又はフェニルアラニンに、それぞれ置換されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）において、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸及び２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに置換されている、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）が、さらに下記（Ｃａ）〜（Ｃｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
（Ｃａ）配列番号１の１４３位のロイシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
（Ｃｂ）配列番号１の１４６位のヒスチジン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン又はセリンに置換。
（Ｃｃ）配列番号１の１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに置換。
（Ｃｄ）配列番号１の２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
（Ｃｅ）配列番号１の２１２位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
（Ｃｆ）配列番号１の２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｃｇ）配列番号１の２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
（Ａ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列において、６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列に１〜２０個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、
配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列、
配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列に１〜２０個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、
配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列、又は
配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列に１〜２０個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列
において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
前記宿主が微生物である、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
前記微生物が微細藻類である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の製造方法。
【請求項１０】
前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つで規定されるタンパク質。
（Ａ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列、
配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、
配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列、又は
配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列に１〜８個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列
において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１３】
下記（Ａ１）〜（Ｃ１）で規定するいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列において、６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列に１〜２０個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、
配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列、
配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列に１〜２０個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、
配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列、又は
配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列に１〜２０個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列
において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１２若しくは１３記載の遺伝子、又は請求項１４記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
【請求項１６】
宿主に請求項１２若しくは１３記載の遺伝子、又は請求項１４記載の組換えベクターを導入し、得られた形質転換体が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【請求項１７】
宿主に請求項１２若しくは１３記載の遺伝子、又は請求項１４記載の組換えベクターを導入する、炭素数８、１０、又は１２の脂肪酸の生産性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子を導入した形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤に日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。【０００３】
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia californica（California  bay））由来のアシル−ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しない。そのため藻類は、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、珪藻網等でわずかに報告例があるのみである（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９２／２０２３６号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Voelker  TA，et  al.，Science，1992，vol．257(5066)，p．72-74
【非特許文献２】Yangmin  Gong，et  al.，Journal  of  Basic  Microbiology，2011，vol．51，p．666-672
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、宿主に下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【０００８】
また、本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）に関する。
また、本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子に関する。
また、本発明は、宿主に前記遺伝子を導入して得られた形質転換体に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ナンノクロロプシス・オキュラータ（Nannochloropsis oculata）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「NoTE」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号１）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「NgTE」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号３）、及びナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「NgrTE」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号４９）を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類由来の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列を改変した、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、及びこれを用いた脂質の製造方法を提供する。また、本発明は、前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子を提供する。また、本発明は、当該遺伝子を導入し、生産される脂質の脂肪酸組成を変化させた形質転換体を提供する。
【００１１】
本発明者らは、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行い、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを取得し、このアミノ酸配列に変異を導入して、複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体を得た。そして、これらを用いて形質転換を行った結果、いくつかの形質転換体において、野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体と比較して、脂質中の総脂肪酸成分における特定の炭素数の脂肪酸の含有率が有意に向上することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１２】
本発明の形質転換体は、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来の野生型アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを導入した形質転換体に比べ、特定の炭素数の脂肪酸の生産能に優れる。当該形質転換体を用いた本発明の脂質の製造方法は、特定の炭素数の脂肪酸及びこれらを構成成分とする脂質の生産性に特に優れる。本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び脂質の製造方法は、特定の炭素数の脂肪酸及び脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
【００１３】
本明細書における「脂質」には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記で「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合の数がｙの脂肪酸やアシル基を表す。また、「Ｃｘ脂肪酸」や「Ｃｘアシル」はそれぞれ、炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
以下本明細書において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」を単に「TE」ともいい、TEをコードする遺伝子を「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子」又は「TE遺伝子」ともいう。
【００１４】
以下、本発明のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子及びこれを用いた形質転換体、並びに脂質の製造方法について順に説明する。
【００１５】
１．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体
本発明のタンパク質（以下、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体」又は「TE改変体」ともいう）は、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が改変され、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。TEの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。TEには、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られている。よってTEは、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
本明細書で記載する「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
【００１６】
本発明のTE改変体として、具体的には以下のタンパク質（Ａ）〜（Ｃ）が挙げられる。
（Ａ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつTE活性を有するタンパク質。
【００１７】
配列番号１は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来のTE（NoTE）のアミノ酸配列である。
本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列中、１２８位〜２８７位の領域がTEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることを見出した。すなわち、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質は、TE活性を有する。
前記タンパク質（Ａ）は、このTE活性にとって十分な領域を有し、TEとして機能する。
【００１８】
前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列は、TE活性にとって十分な領域である配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列を基本とし、さらに当該配列中の特定の位置のアミノ酸が置換されている。配列番号１において後述する位置のアミノ酸を置換したTE改変体では、特定の炭素数のアシル−ＡＣＰ、特にＣ８アシル−ＡＣＰ、Ｃ１０アシル−ＡＣＰ、及びＣ１２アシル−ＡＣＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のアシル−ＡＣＰ、に対する特異性が向上する。すなわち、本発明のTE改変体は、野生型TEと比べて、基質として特定の炭素数のアシル−ＡＣＰ（具体的には、Ｃ８アシル−ＡＣＰ、Ｃ１０アシル−ＡＣＰ、及びＣ１２アシル−ＡＣＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のアシル−ＡＣＰ）を選択的に利用し、これを加水分解する活性が向上する。
【００１９】
前記タンパク質（Ａ）において、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列中、２０３位と２０４位のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されている。配列番号１に示す野生型TEでは、２０３位のアミノ酸はグリシン、２０４位のアミノ酸はバリンである。
特定の炭素数のアシル−ＡＣＰ、特にＣ８アシル−ＡＣＰ、Ｃ１０アシル−ＡＣＰ、及びＣ１２アシル−ＡＣＰからなる群より選ばれる少なくとも１種のアシル−ＡＣＰ、への特異性を向上させる観点から、前記タンパク質（Ａ）において、配列番号１の２０３位のグリシンがトリプトファンに置換され、２０４位のバリンがトリプトファン又はフェニルアラニンに置換されていることが好ましく、配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリンがそれぞれトリプトファンに置換されていることがより好ましい。
【００２０】
本明細書においては、特定のアミノ酸置換を有するTE改変体を以下のように略記することがある。
NoTE(G203W)：配列番号１の２０３位のグリシン（Gly；Ｇ）がトリプトファン（Trp；Ｗ）に置換された、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のTE改変体。
NoTE(G203W+V204F)：配列番号１の２０３位のグリシン（Gly；Ｇ）がトリプトファン（Trp；Ｗ）に、２０４位のバリン（Val；Ｖ）がフェニルアラニン（Phe；Ｆ）置換された、ナンノクロロプシス・オキュラータ由来のTE改変体。
【００２１】
さらに前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１の２０３位及び２０４位以外の位置にアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、特定の炭素数のアシル−ＡＣＰへの特異性を向上させる観点から、前記タンパク質（Ａ）は、下記（Ｃａ−１）〜（Ｃｇ−１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに有することが好ましい。
（Ｃａ−１）配列番号１の１４３位のロイシン（Leu；Ｌ）をプロリン（Pro；Ｐ）に置換。
（Ｃｂ−１）配列番号１の１４６位のヒスチジン（His；Ｈ）をアスパラギン（Asn；Ｎ）又はセリン（Ser；Ｓ）に置換。
（Ｃｃ−１）配列番号１の１６０位のグリシン（Gly；Ｇ）をアラニン（Ala；Ａ）に置換。
（Ｃｄ−１）配列番号１の２０２位のメチオニン（Met；Ｍ）をフェニルアラニン（Phe；Ｆ）、ヒスチジン（His；Ｈ）、ロイシン（Leu；Ｌ）、グルタミン（Gln；Ｑ）、又はバリン（Val；Ｖ）に置換。
（Ｃｅ−１）配列番号１の２１２位のグリシン（Gly；Ｇ）をプロリン（Pro；Ｐ）に置換。
（Ｃｆ−１）配列番号１の２１３位のアスパラギン（Asn；Ｎ）をチロシン（Tyr；Ｙ）に置換。
（Ｃｇ−１）配列番号１の２８１位のプロリン（Pro；Ｐ）をグルタミン（Gln；Ｑ）に置換。
【００２２】
前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリンがそれぞれトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ−１）〜（Ｃｇ−１）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。あるいは、前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１の２０４位のバリンがトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ−１）〜（Ｃｇ−１）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
【００２３】
前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を基本とし、かつ、TE活性を有する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにTE活性が保持され、かつ配列番号１で示すアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２４】
さらに、前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列中に、前記タンパク質（Ａ）におけるアミノ酸置換と同様のアミノ酸置換を有している。すなわち、前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列では、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸置換を有している。
上述した前記タンパク質（Ａ）と同様、前記タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列も、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換され、２０４位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファン又はフェニルアラニンに置換されていることが好ましく、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸がそれぞれトリプトファンに置換されていることがより好ましい。
【００２５】
さらに、前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の２０３位及び２０４位に相当する位置以外の位置にアミノ酸置換を有していてもよい。例えば前記タンパク質（Ｂ）は、下記（Ｃａ−２）〜（Ｃｇ−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに有することが好ましい。
（Ｃａ−２）配列番号１の１４３位に相当する位置のアミノ酸をプロリンに置換。
（Ｃｂ−２）配列番号１の１４６位に相当する位置のアミノ酸をアスパラギン又はセリンに置換。
（Ｃｃ−２）配列番号１の１６０位に相当する位置のアミノ酸をアラニンに置換。
（Ｃｄ−２）配列番号１の２０２位に相当する位置のアミノ酸をフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
（Ｃｅ−２）配列番号１の２１２位に相当する位置のアミノ酸をプロリンに置換。
（Ｃｆ−２）配列番号１の２１３位に相当する位置のアミノ酸をチロシンに置換。
（Ｃｇ−２）配列番号１の２８１位に相当する位置のアミノ酸をグルタミンに置換。
【００２６】
前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の２０３位及び２０４位に相当する位置のアミノ酸がそれぞれトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ−２）〜（Ｃｇ−２）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。あるいは、前記タンパク質（Ｂ）は、配列番号１の２０４位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換され、さらに前記（Ｃａ−２）〜（Ｃｇ−２）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。
【００２７】
本明細書で記載する、アミノ酸配列又は塩基配列における「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のLipman-Pearson法等に基づいて手作業で行うこともできるし、Clustal  Wマルチプルアラインメントプログラム（Thompson，J．D．et  al，Nucleic  Acids  Res.，1994，vol．22，p．4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うこともできる。Clustal  Wは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European  Bioinformatics  Institute：EBI，[www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ，[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【００２８】
配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として、配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列、及び配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３は、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のTE（NgTE）である。配列番号４９は、ナンノクロロプシス・グラニュラータNIES2588株由来のTE（NgrTE）である。
なお、配列番号１，３，４９に示したアミノ酸配列又はその部分配列からなるタンパク質を「野生型TE」といい、野生型TEのアミノ酸配列が一部変異したアミノ酸配列からなるタンパク質を「TE改変体」という。
【００２９】
図１に示すように、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列、及び配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列は、互いに高い同一性を有する。配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列との同一性は約９１％である。また、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列との同一性は約９８％である。
配列番号１と同様、配列番号３のアミノ酸配列における１１５位〜２７４位の領域、及び配列番号４９のアミノ酸配列における１２６位〜２８５位の領域も、TEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることが、本発明者らによって確認されている。したがって、配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列からなるタンパク質も、TE活性を有する。
【００３０】
前記タンパク質（Ｂ）としては、下記タンパク質（Ｂａ）又は（Ｂｂ）が好ましい。
（Ｂａ）配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列において、配列番号３の１９０位のグリシン及び１９１位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
（Ｂｂ）配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列において、配列番号４９の２０１位のグリシン及び２０２位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質。
【００３１】
図１に示すように、配列番号１の２０３位のグリシン、２０４位のバリン、１４３位のロイシン、１４６位のヒスチジン、１６０位のグリシン、２０２位のメチオニン、２１２位のグリシン、２１３位のアスパラギン、２８１位のプロリンはそれぞれ、配列番号３の１９０位のグリシン、１９１位のバリン、１３０位のロイシン、１３３位のヒスチジン、１４７位のグリシン、１８９位のメチオニン、１９９位のグリシン、２００位のアスパラギン、２６８位のプロリンに相当する。
また、配列番号１の２０３位のグリシン、２０４位のバリン、１４３位のロイシン、１４６位のヒスチジン、１６０位のグリシン、２０２位のメチオニン、２１２位のグリシン、２１３位のアスパラギン、２８１位のプロリンはそれぞれ、配列番号４９の２０１位のグリシン、２０２位のバリン、１４１位のロイシン、１４４位のヒスチジン、１５８位のグリシン、２００位のメチオニン、２１０位のグリシン、２１１位のアスパラギン、２７９位のプロリンに相当する。
前記タンパク質（Ｂａ）及び（Ｂｂ）のアミノ酸配列においても、これらのアミノ酸が前記タンパク質（Ａ）と同様に置換されていることが好ましい。
【００３２】
前記タンパク質（Ｂａ）は、前記タンパク質（Ａ）と同様、特定の炭素数のアシル−ＡＣＰへの特異性が向上する。前記タンパク質（Ｂａ）のアミノ酸配列は、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と９０％程度の同一性を有する。このことから、前記タンパク質（Ｂ）において、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列に対する同一性は、８６％以上であることが好ましく、８８％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。
【００３３】
また、前記タンパク質（Ｂ）において、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列としては、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列、又は配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列において１又は数個（好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、よりさらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。
なお、アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
【００３４】
前記タンパク質（Ｃ）は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を含んでおり、かつTE活性を示す。
前記タンパク質（Ｃ）を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列以外の配列としては、例えば、配列番号１の１２８位〜２８７位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位〜２７４位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号４９の１２６位〜２８５位以外の任意のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１以上２０個以下、より好ましくは１以上１５個以下、さらに好ましくは１以上１０個以下、よりさらに好ましくは１以上５個以下、よりさらに好ましくは１以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。
また、前記タンパク質（Ｃ）として、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。シグナルペプチドの付加の例としては、葉緑体移行シグナルペプチドのＮ末端への付加等が挙げられる。
【００３５】
前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１の１位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の４９位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の５８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の７８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８７位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の９８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１０８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１１８位〜１２７位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸変異（アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）が導入されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１の４９位〜２８７位、５８位〜２８７位、７８位〜２８７位、８７位〜２８７位、８８位〜２８７位、９８位〜２８７位、１０８位〜２８７位、若しくは１１８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００３６】
また、前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、前記タンパク質（Ｂａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号３の３６位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の４５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の５５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の６５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の７５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の８５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の９５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の１０５位〜１１４位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸変異（アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）が導入されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、配列番号３の３６位〜２７４位、４５位〜２７４位、５５位〜２７４位、６５位〜２７４位、７５位〜２７４位、８５位〜２７４位、９５位〜２７４位、若しくは１０５位〜２７４位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００３７】
また、前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、前記タンパク質（Ｂｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４９の１位〜１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の３５位〜１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の５５位〜１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の８５位〜１２５位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸変異（アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加）が導入されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、配列番号４９のアミノ酸配列、又は配列番号４９の３５位〜２８５位、５５位〜２８５位、若しくは８５位〜２８５位のアミノ酸配列からなるタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００３８】
また、前記タンパク質（Ｃ）として好ましくは、配列番号１、３又は４９に示すアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質である。
さらに、前記タンパク質（Ｃ）として、配列番号１、３又は４９に示すアミノ酸配列において、前述のアミノ酸置換を有し、配列番号１の１〜１２７位、配列番号３の１〜１１４位、又は配列番号４９の１〜１２５位の任意の位置でＮ末端側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００３９】
本発明のTE改変体がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。この場合、総脂肪酸量に占める特定の炭素数の脂肪酸の割合を、野生型TEを発現させた系と比較することで、TE改変体で特定の炭素数のアシル−ＡＣＰに対する特異性の変化を確認できる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にTE遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したTE遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L．et  al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
【００４０】
本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的手法又は遺伝子工学的手法等により得ることができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。例えば、ナンノクロロプシス・オキュラータからクローニングによって取得したTE遺伝子を遺伝子組み換え技術により改変したものを用いることで、TE改変体を得ることができる。
また、ナンノクロロプシス・オキュラータ等のナンノクロロプシス属に属する藻類は、The  culture  collection  of  algae  at  University  of  Texas  at  Austin  (UTEX)、独立行政法人国立環境研究所(NIES)、National  Center  for  Marine  Algae  and  Microbiota  (NCMA：旧CCMP)、Culture  Collection  of  Algae  and  Protozoa  (CCAP)、Australian  National  Algae  Culture  Collection（CSIRO）等から入手できる。
【００４１】
２．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ改変体をコードする遺伝子
本発明の遺伝子は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子である。
配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株由来の野生型TEをコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列をコードする。
配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号４に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号４に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来の野生型TEをコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列は、配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列をコードする。配列番号４の３４３位〜８２５位までの塩基配列は、配列番号２の３８２位〜８６４位までの塩基配列と約７６％の同一性を有する。
配列番号４９に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号５０に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号５０に示す塩基配列は、ナンノクロロプシス・グラニュラータNIES2588株由来の野生型TEをコードする遺伝子の塩基配列である。配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列は、配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列をコードする。配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列は、配列番号２の３８２位〜８６４位までの塩基配列と約９３％の同一性を有する。
【００４２】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列において、６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ１）前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列を有し、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００４３】
前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子は、前記タンパク質（Ａ）をコードする遺伝子である。
前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基（コドン）がトリプトファンをコードする塩基に置換され、６１０位〜６１２位の塩基がトリプトファンをコードする塩基又はフェニルアラニンをコードする塩基に置換されていることが好ましく、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換されていることがより好ましい。
【００４４】
さらに、前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位以外の位置に塩基置換を有していてもよい。例えば、前記ＤＮＡ（Ａ１）は、下記（Ｃ１ａ−１）〜（Ｃ１ｇ−１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換をさらに有することが好ましい。
（Ｃ１ａ−１）配列番号２の４２７位〜４２９位の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｂ−１）配列番号２の４３６位〜４３８位の塩基がアスパラギン又はセリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｃ−１）配列番号２の４７８位〜４８０位の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｄ−１）配列番号２の６０４位〜６０６位の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｅ−１）配列番号２の６３４位〜６３６位の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｆ−１）配列番号２の６３７位〜６３９位の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｇ−１）配列番号２の８４１位〜８４３位の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
【００４５】
前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ−１）〜（Ｃ１ｇ−１）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。あるいは、前記ＤＮＡ（Ａ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ−１）〜（Ｃ１ｇ−１）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。
【００４６】
前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子は、前記タンパク質（Ｂ）が有するアミノ酸置換に相当する塩基置換を有する遺伝子である。
前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基がトリプトファン又はフェニルアラニンをコードする塩基に置換されていることが好ましく、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換されていることがより好ましい。
【００４７】
さらに、前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置以外の位置に塩基置換を有していてもよい。例えば、前記ＤＮＡ（Ｂ１）は、下記（Ｃ１ａ−２）〜（Ｃ１ｇ−２）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換をさらに有することが好ましい。
（Ｃ１ａ−２）配列番号２の４２７位〜４２９位に相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｂ−２）配列番号２の４３６位〜４３８位に相当する位置の塩基がアスパラギン又はセリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｃ−２）配列番号２の４７８位〜４８０位に相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｄ−２）配列番号２の６０４位〜６０６位に相当する位置の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｅ−２）配列番号２の６３４位〜６３６位に相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｆ−２）配列番号２の６３７位〜６３９位に相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｇ−２）配列番号２の８４１位〜８４３位に相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
【００４８】
前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基に相当する位置がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ−２）〜（Ｃ１ｇ−２）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。あるいは、前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子の塩基配列は、配列番号２の６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、さらに前記（Ｃ１ａ−２）〜（Ｃ１ｇ−２）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有することがより好ましい。
【００４９】
前記ＤＮＡ（Ｂ１）からなる遺伝子としては、下記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）又は（Ｂ１ｂ）からなる遺伝子が好ましい。
（Ｂ１ａ）配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列において、５６８位〜５７０位の塩基及び５７１位〜５７３位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ１ｂ）配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列において、６０１位〜６０３位の塩基及び６０４位〜６０６位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００５０】
配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基、６１０位〜６１２位の塩基、４２７位〜４２９位の塩基、４３６位〜４３８位の塩基、４７８位〜４８０位の塩基、６０４位〜６０６位の塩基、６３４位〜６３６位の塩基、６３７位〜６３９位、８４１位〜８４３位の塩基の塩基はそれぞれ、配列番号４の５６８位〜５７０位の塩基、５７１位〜５７３位の塩基、３８８位〜３９０位の塩基、３９７位〜３９９位の塩基、４３９位〜４４１位の塩基、５６５位〜５６７位の塩基、５９５位〜５９７位の塩基、５９８位〜６００位の塩基、８０２位〜８０４位の塩基に相当する。
また、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基、６１０位〜６１２位の塩基、４２７位〜４２９位の塩基、４３６位〜４３８位の塩基、４７８位〜４８０位の塩基、６０４位〜６０６位の塩基、６３４位〜６３６位の塩基、６３７位〜６３９位、８４１位〜８４３位の塩基の塩基はそれぞれ、配列番号５０の６０１位〜６０３位の塩基、６０４位〜６０６位の塩基、４２１位〜４２３位の塩基、４３０位〜４３２位の塩基、４７２位〜４７４位の塩基、５９８位〜６００位の塩基、６２８位〜６３０位の塩基、６３１位〜６３３位の塩基、８３５位〜８３７位の塩基に相当する。
前記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）及び（Ｂ１ｂ）の塩基配列においても、これらの塩基が前記ＤＮＡ（Ａ１）の塩基配列と同様に置換されていることが好ましい。
【００５１】
前記ＤＮＡ（Ｂ１）において、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列に対する同一性は、７２％以上が好ましく、７４％以上がより好ましく、７６％以上がさらに好ましい。
【００５２】
また、前記ＤＮＡ（Ｂ１）において、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列は、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列、配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列、又は配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列において１又は数個（好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００５３】
前記ＤＮＡ（Ｃ１）は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列を含む。
前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列中、前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列以外の塩基配列としては、例えば、配列番号２の３８２位〜８６４位以外の任意の塩基配列、配列番号４の３４３位〜８２５位以外の任意の塩基配列、配列番号５０の３７６位〜８５８位以外の任意の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１以上２０個以下、より好ましくは１以上１５個以下、さらに好ましくは１以上１０個以下、よりさらに好ましくは１以上５個以下、さらに好ましくは１以上３個以下）の変異が導入された塩基配列、等が挙げられる。変異としては、塩基の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列の5’末端側に付加されることが好ましい。
また、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列も好ましい。シグナルペプチドとしては、前記タンパク質（Ｃ）で述べたものが挙げられる。シグナルペプチドをコードする塩基配列は、前記ＤＮＡ（Ａ１）又は（Ｂ１）の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
【００５４】
前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列として好ましくは、前記ＤＮＡ（Ａ１）の塩基配列の5'末端側に、配列番号２の１位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の１４５位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の１７２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２３２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２５９位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２６２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２９２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の３２２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の３５２位〜３８１位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基変異（塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が導入された塩基配列、が付加された塩基配列である。なお、配列番号２の塩基配列、又は配列番号２の１４５位〜８６４位、１７２位〜８６４位、２３２位〜８６４位、２５９位〜８６４位、２６２位〜８６４位、２９２位〜８６４位、３２２位〜８６４位、若しくは３５２位〜８６４位の塩基配列がコードするタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００５５】
また、前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列として好ましくは、前記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号４の１０６位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の１３３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の１６３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の１９３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の２２３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の２５３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の２８３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の３１３位〜３４２位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基変異（塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が導入された塩基配列、が付加された塩基配列である。なお、配列番号４の１０６位〜８２５位、１３３位〜８２５位、１６３位〜８２５位、１９３位〜８２５位、２２３位〜８２５位、２５３位〜８２５位、２８３位〜８２５位、若しくは３１３位〜８２５位の塩基配列がコードするタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００５６】
また、前記ＤＮＡ（Ｃ１）の塩基配列として好ましくは、前記ＤＮＡ（Ｂ１ｂ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号５０の１位〜３７５位の塩基配列、配列番号５０の１０３位〜３７５位の塩基配列、配列番号５０の１６３位〜３７５位の塩基配列、配列番号５０の２５３位〜３７５位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下）の塩基変異（塩基の欠失、置換、挿入又は付加）が導入された塩基配列、が付加された塩基配列である。なお、配列番号５０の塩基配列、又は配列番号５０の１０３位〜８５８位、１６３位〜８５８位、若しくは２５３位〜８５８位の塩基配列がコードするタンパク質が、TE活性を有することは本発明者らにより確認されている。
【００５７】
また、前記ＤＮＡ（Ｃ１）として好ましくは、配列番号２、４又は５０に示す塩基配列において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
さらに、前記ＤＮＡ（Ｃ１）として、配列番号２、４又は５０に示す塩基配列において、前述の塩基置換を有し、配列番号２の１〜３８１位、配列番号４の１〜３４２位、又は配列番号５０の１〜３７５位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
【００５８】
TE改変体をコードする遺伝子の調製方法の一例としては、まず、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株よりクローニングした野生型TE遺伝子の塩基配列（配列番号２で示される塩基配列）を、In-Fusion（登録商標）  HD  Cloning  Kit（Clonthech，Mountain  View，California）を用いてベクターに組み込む。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、配列番号１で示されるアミノ酸配列において配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸又は２０４位に相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲ法によってＤＮＡ断片を増幅する。ここで、ＰＣＲの反応条件の好ましい一例としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９８℃で１０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃で約１０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を７２℃で約３０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを３０サイクル行うことが挙げられる。
ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡを、メチル化ＤＮＡを特異的に切断するDpnＩ酵素で処理し、これを用いて大腸菌を形質転換し、抗生物質含有プレート培地で選択する。形質転換された大腸菌よりプラスミド抽出することで、目的のアミノ酸変異が導入されたTE改変体をコードする遺伝子を取得することができる。
【００５９】
３．形質転換体
本発明の形質転換体は、宿主に前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、ナンノクロロプシス属に属する藻類由来の野生型TE遺伝子を導入した形質転換体に比べ、特定の炭素数の脂質の生産能、特にＣ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、又はＣ１２脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、野生型TE遺伝子を導入した形質転換体と比べ、前述した特定の炭素数の脂肪酸の生産性が向上することにより、生産される脂質中の脂肪酸組成が変化する。なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００６０】
本発明の形質転換体は、TE改変体をコードするTE遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、TE改変体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００６１】
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、又は動物体が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、モルチエレラ・エスピー（Mortierella  sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又はナンノクロロプシス属の藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属の藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis  sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００６２】
遺伝子発現ベクターの母体となるベクター（プラスミド）としては、TE改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（非特許文献２参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver  Kilian，et  al.，Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America，Dec  27;108(52)，2011、の文献記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片や制限酵素で切断したＤＮＡ断片が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００６３】
発現ベクターや遺伝子発現カセットに用いるプロモーターやターミネーター等の発現調節領域も、使用する宿主やベクターの種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主やベクターの種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００６４】
上記ベクターに前記TE改変体をコードする遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、使用する宿主やベクターの種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法又はLP形質転換方法等を用いることができる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor  Radakovits,  et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012、等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００６５】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００６６】
４．脂質の製造方法
本発明の脂質の製造方法は、TE改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を培養し、脂質を生産させる工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、TE改変体をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。なお、本明細書で記載する「形質転換体を培養する」とは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、「培養物」には、形質転換体の培養液に加えて、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
【００６７】
培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができる。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばTEの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００６８】
培養条件の１例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）で、３０〜３７℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。
また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００６９】
形質転換体の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００〜５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００〜１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００〜６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは３〜３０日間、さらに好ましくは７〜３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００７０】
形質転換体が産生した脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００７１】
本発明のTE改変体は、野生型TEと比べ、特定の炭素数のアシル−ＡＣＰ、例えば、Ｃ８アシル−ＡＣＰ、Ｃ１０アシル−ＡＣＰ、又はＣ１２アシル−ＡＣＰに対する特異性が向上する。その結果、当該改変体を導入した形質転換体では、野生型TEを導入した形質転換体と比べて、総脂肪酸成分におけるＣ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸など、特定の炭素数の脂肪酸の含有率が増加する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、特定の炭素数脂質、特にＣ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、又はＣ１２脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
【００７２】
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質であることが好ましく、脂肪酸又はそのエステルを含んでいることがさらに好ましい。脂質中に含まれる脂肪酸又はそのエステルは、界面活性剤等への利用性から、Ｃ８〜Ｃ１６の脂肪酸又はそのエステルが好ましく、Ｃ１２〜Ｃ１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、Ｃ１２脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルがよりさらに好ましい。
採取された総脂質成分中の総脂肪酸量に対するＣ１２脂肪酸の含有量は、界面活性剤として利用する観点から、好ましくは３質量％以上である。ここで、「採取された総脂質成分」とは、実施例で用いられた方法により算出された総脂質成分をいう。
【００７３】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００７４】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、形質転換体、形質転換体の作製方法、タンパク質、遺伝子、脂肪酸組成の改変方法及び脂質生産性の向上方法を開示する。
【００７５】
＜１＞宿主に下記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体を培養して脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列において、２０３位のグリシン及び２０４位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００７６】
＜２＞前記タンパク質（Ｂ）において、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列との同一性が８６％以上、好ましくは８８％以上、より好ましくは９０％以上、である、前記＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞前記タンパク質（Ｂ）が、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列、配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列、又は配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞前記タンパク質（Ｂ）が、下記タンパク質（Ｂａ）又は（Ｂｂ）である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の製造方法。
（Ｂａ）配列番号３の１１５位〜２７４位のアミノ酸配列において、配列番号３の１９０位のグリシン及び１９１位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｂｂ）配列番号４９の１２６位〜２８５位のアミノ酸配列において、配列番号４９の２０１位のグリシン及び２０２位のバリンの少なくとも一方がトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
【００７７】
＜５＞前記タンパク質（Ｃ）が、配列番号１、３又は４９に示すアミノ酸配列において、配列番号１の２０３位に相当する位置のアミノ酸及び２０４位に相当する位置のアミノ酸の少なくとも一方がトリプトファンに置換され、配列番号１の１〜１２７位、配列番号３の１〜１１４位、又は配列番号４９の１〜１２５位の任意の位置でＮ末端側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜６＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１の１位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の４９位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の５８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の７８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８７位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の８８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の９８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１０８位〜１２７位のアミノ酸配列、配列番号１の１１８位〜１２７位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜７＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ｂａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号３の３６位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の４５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の５５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の６５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の７５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の８５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の９５位〜１１４位のアミノ酸配列、配列番号３の１０５位〜１１４位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜８＞前記タンパク質（Ｃ）が、前記タンパク質（Ｂｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号４９の１位〜１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の３５位〜１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の５５位〜１２５位のアミノ酸配列、配列番号４９の８５位〜１２５位のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の製造方法。
【００７８】
＜９＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）において、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファン又はフェニルアラニン、好ましくはトリプトファン、にそれぞれ置換されている、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜１０＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）が、さらに下記（Ｃａ）〜（Ｃｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の製造方法。
（Ｃａ）配列番号１の１４３位のロイシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
（Ｃｂ）配列番号１の１４６位のヒスチジン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン又はセリンに置換。
（Ｃｃ）配列番号１の１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに置換。
（Ｃｄ）配列番号１の２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
（Ｃｅ）配列番号１の２１２位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
（Ｃｆ）配列番号１の２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
（Ｃｇ）配列番号１の２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
＜１１＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置及び２０４位のバリン又はこれに相当する位置がそれぞれトリプトファンに置換され、前記（Ｃａ）〜（Ｃｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有する、前記＜１０＞項記載の製造方法。
＜１２＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置がトリプトファンに置換され、前記（Ｃａ）〜（Ｃｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つのアミノ酸置換を有する、前記＜１０＞項記載の製造方法。
【００７９】
＜１３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のアミノ酸配列が、下記(1)〜(14)のいずれか１つで規定するアミノ酸置換を有する、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の製造方法。
(1)配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換。
(2)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに置換。
(3)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに置換。
(4)配列番号１の２０３位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
(5)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、１４３位のロイシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
(6)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに置換。
(7)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、２１２位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がプロリンに置換。
(8)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
(9)配列番号１の２０３位のグリシン及び２０４位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに、１６０位のグリシン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアラニンに、２１３位のアスパラギン又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
(10)配列番号３の１９０位のグリシン及び１９１位のバリン又はこれらに相当する位置のアミノ酸それぞれがトリプトファンに置換。
(11)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、１４６位のヒスチジン又はこれに相当する位置のアミノ酸がアスパラギン、又はセリンに置換。
(12)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンに置換。
(13)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
(14)配列番号１の２０４位のバリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がトリプトファンに、２０２位のメチオニン又はこれに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに、２８１位のプロリン又はこれに相当する位置のアミノ酸がグルタミンに置換。
【００８０】
＜１４＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の製造方法。
（Ａ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列において、６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ１）配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ１）前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を有し、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００８１】
＜１５＞前記ＤＮＡ（Ｂ１）において、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列に対する同一性が７２％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは７６％以上、である、前記＜１４＞項記載の製造方法。
＜１６＞前記ＤＮＡ（Ｂ１）が、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列、配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列、又は配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜３個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞又は＜１５＞項記載の製造方法。
＜１７＞前記ＤＮＡ（Ｂ１）が下記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）又は（Ｂ１ｂ）である、前記＜１４＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の製造方法。
（Ｂ１ａ）配列番号４の３４３位〜８２５位の塩基配列において、配列番号４の５６８位〜５７０位の塩基及び５７１位〜５７３位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｂ１ｂ）配列番号５０の３７６位〜８５８位の塩基配列において、配列番号５０の６０１位〜６０３位の塩基及び６０４位〜６０６位の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００８２】
＜１８＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、配列番号２、４又は５０に示す塩基配列において、配列番号２の６０７位〜６０９位に相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位に相当する位置の塩基の少なくとも一方がトリプトファンをコードする塩基に置換され、配列番号２の１〜３８１位、配列番号４の１〜３４２位、又は配列番号５０の１〜３７５位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡである、前記＜１４＞〜＜１７＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜１９＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、前記ＤＮＡ（Ａ１）の塩基配列の5'末端側に、配列番号２の１位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の１４５位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の１７２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２３２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２５９位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２６２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の２９２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の３２２位〜３８１位の塩基配列、配列番号２の３５２位〜３８１位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列、が付加された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２０＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、前記ＤＮＡ（Ｂ１ａ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号４の１０６位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の１３３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の１６３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の１９３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の２２３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の２５３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の２８３位〜３４２位の塩基配列、配列番号４の３１３位〜３４２位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２１＞前記ＤＮＡ（Ｃ１）が、前記ＤＮＡ（Ｂ１ｂ）の塩基配列の5'末端側に、配列番号５０の１位〜３７５位の塩基配列、配列番号５０の１０３位〜３７５位の塩基配列、配列番号５０の１６３位〜３７５位の塩基配列、配列番号５０の２５３位〜３７５位の塩基配列、又はこれらの配列に１又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである、前記＜１４＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の製造方法。
【００８３】
＜２２＞前記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）において、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がトリプトファン又はフェニルアラニンをコードする塩基、好ましくはトリプトファンをコードする塩基、に置換されている、前記＜１４＞〜＜２１＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２３＞前記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）が、さらに下記（Ｃ１ａ）〜（Ｃ１ｇ）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する、前記＜１４＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の製造方法。
（Ｃ１ａ）配列番号２の４２７位〜４２９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｂ）配列番号２の４３６位〜４３８位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がアスパラギン又はセリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｃ）配列番号２の４７８位〜４８０位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｄ）配列番号２の６０４位〜６０６位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｅ）配列番号２の６３４位〜６３６位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｆ）配列番号２の６３７位〜６３９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（Ｃ１ｇ）配列番号２の８４１位〜８４３位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
＜２４＞前記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）の塩基配列が、配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基又はこれに相当する位置の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がそれぞれトリプトファンをコードする塩基に置換され、前記（Ｃ１ａ）〜（Ｃ１ｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有する、前記＜２３＞項記載の製造方法。
＜２５＞前記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）の塩基配列が、配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換され、前記（Ｃ１ａ）〜（Ｃ１ｇ）からなる群より選ばれる１つ又は２つの塩基置換を有する、前記＜２３＞項記載の製造方法。
【００８４】
＜２６＞前記ＤＮＡ（Ａ１）〜（Ｃ１）の塩基配列が、下記(1-1)〜(14-1)のいずれか１つで規定する塩基置換を有する、前記＜１４＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の製造方法。
(1-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換。
(2-1)配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に置換。
(3-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に置換。
(4-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
(5-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、４２７位〜４２９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
(6-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、４７８位〜４８０位の塩基又はこれに相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に置換。
(7-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、６３４位〜６３６位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がプロリンをコードする塩基に置換。
(8-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、６３７位〜６３９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
(9-1)配列番号２の６０７位〜６０９位の塩基及び６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に、４７８位〜４８０位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がアラニンをコードする塩基に、６３７位〜６３９位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
(10-1)配列番号４の５６８位〜５７０位の塩基及び５７１位〜５７３位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基それぞれがトリプトファンをコードする塩基に置換。
(11-1)配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、４３６位〜４３８位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がアスパラギン、又はセリンをコードする塩基に置換。
(12-1)配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、６０４位〜６０６位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、又はバリンをコードする塩基に置換。
(13-1)配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、８４１位〜８４３位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
(14-1)配列番号２の６１０位〜６１２位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がトリプトファンをコードする塩基に、６０４位〜６０６位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に、８４１位〜８４３位の塩基又はこれらに相当する位置の塩基がグルタミンをコードする塩基に置換。
【００８５】
＜２７＞前記宿主が微生物である、前記＜１＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２８＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、である、前記＜２７＞項記載の製造方法。
＜２９＞前記微生物が大腸菌である、前記＜２７＞項記載の製造方法。
＜３０＞前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、前記＜１＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜３１＞前記脂質中の炭素数８、１０、又は１２の脂肪酸の含有率が、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体から採取された脂質と比べて増加している、前記＜１＞〜＜３０＞のいずれか１項記載の製造方法。
【００８６】
＜３２＞前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つで規定されるタンパク質。
＜３３＞前記タンパク質が、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の製造方法で規定するタンパク質のいずれか１つである、前記＜３２＞項記載のタンパク質。
＜３４＞前記＜３２＞又は＜３３＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜３５＞前記（Ａ１）〜（Ｃ１）で規定するいずれか１つのＤＮＡからなる遺伝子。
＜３６＞前記ＤＮＡが、前記＜１４＞〜＜２６＞のいずれか１項に記載の製造方法で規定するＤＮＡのいずれか１つである、前記＜３４＞又は＜３５＞項記載の遺伝子。
＜３７＞前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
【００８７】
＜３８＞前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを宿主に導入してなる、形質転換体。
＜３９＞前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜４０＞前記宿主が微生物である、前記＜３８＞又は＜３９＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４１＞前記微生物が微細藻類、好ましくはナンノクロロプシス属に属する藻類、である、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜４２＞前記微生物が大腸菌である、前記＜４０＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
【００８８】
＜４３＞脂質を製造するための、前記＜３８＞〜＜４２＞のいずれか１項記載の形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜４４＞前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、前記＜４３＞項記載の使用。
【００８９】
＜４５＞宿主に前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを導入し、得られた形質転換体が生産する脂質中の脂肪酸組成を改変する、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
＜４６＞宿主に前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを導入する、脂質の生産性を向上させる方法。
＜４７＞前記脂質が炭素数８、１０、若しくは１２の脂肪酸又はそのエステルを含む、前記＜４５＞又は＜４６＞項記載の方法。
＜４８＞宿主に前記＜３４＞〜＜３６＞のいずれか１項記載の遺伝子、又は前記＜３７＞項記載の組換えベクターを導入する、炭素数８、１０、又は１２の脂肪酸の生産性を向上させる方法。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１〜４に示す。【００９１】
【表１】
0006592434.tif 000002
【００９２】
【表２】
0006592434.tif 000003
【００９３】
【表３】
0006592434.tif 000004
【００９４】
【表４】
0006592434.tif 000005
【００９５】
実施例１  NoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NoTE遺伝子の取得、及びNoTE発現プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）の全ＲＮＡを抽出し、SuperScript（商標）III  First-Strand  Synthesis  SuperMix  for  qRT-PCR（invitrogen社製）を用いて逆転写を行ってcDNAを得た。このcDNAを鋳型として、表１に示すプライマー番号５及びプライマー番号６のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号２の２６２位〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。また、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号７及びプライマー番号８のプライマー対を用いたPCRによりpBluescriptII  SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これら２つの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、NoTE発現プラスミドNoTE_262を構築した。このプラスミドNoTE_262は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１位〜８７位のアミノ酸残基を除去し、その上流にプラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸残基が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_262」は、配列番号１の８８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号２の２６２位〜８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。【００９６】
（２）NoTE改変体発現プラスミドの構築
前記プラスミドNoTE_262を鋳型として、表１に示すプライマー番号９〜１２のいずれか１つのプライマーと、プライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、各種NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(G203W)、NoTE_262(V204W)、NoTE_262(G203W+V204W)、NoTE_262(G203W+V204F)）をそれぞれ構築した。これらのプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【００９７】
(i)NoTE_262(G203W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(ii)NoTE_262(V204W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(iii)NoTE_262(G203W+V204W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。
(iv)NoTE_262(G203W+V204F)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがフェニルアラニンをコードするコドン（TTT）に、それぞれ置換されている。【００９８】
続いて、前記プラスミドNoTE_262(G203W+V204W)を鋳型として、表１に示すプライマー番号１４及びプライマー番号１５のプライマー対、プライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対、プライマー番号１８及びプライマー番号１９のプライマー対、プライマー番号２０及びプライマー番号２１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、各種NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(WW+L143P)、NoTE_262(WW+G160A)、NoTE_262(WW+G212P)、NoTE_262(WW+N213Y)）をそれぞれ構築した。これらのプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【００９９】
(v)NoTE_262(WW+L143P)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１４３位のロイシン（Ｌ）をコードするコドンがプロリンをコードするコドン（CCT）に、それぞれ置換されている。
(vi)NoTE_262(WW+G160A)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１６０位のグリシンをコードするコドンがアラニンをコードするコドン（GCT）に、それぞれ置換されている。
(vii)NoTE_262(WW+G212P)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２１２位のグリシンをコードするコドンがプロリンをコードするコドン（CCA）に、それぞれ置換されている。
(viii)NoTE_262(WW+N213Y)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２１３位のアスパラギンをコードするコドンがチロシンをコードするコドン（TAC）に、それぞれ置換されている。【０１００】
さらに、前記プラスミドNoTE_262(WW+N213Y)を鋳型として、表１に示すプライマー番号１６及びプライマー番号１７のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(WW+G160A+N213Y)）を構築した。【０１０１】
(ix)NoTE_262(WW+G160A+N213Y)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１６０位のグリシンをコードするコドンがアラニンをコードするコドン（GCT）に、２１３位のアスパラギンをコードするコドンがチロシン（Ｙ）をコードするコドン（TAC）に、それぞれ置換されている。【０１０２】
（３）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記各種NoTE改変体発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株（K27株（fadD88）、Overath  et  al.，Eur．J．Biochem.，1969，vol．7，p．559-574参照）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。得られた形質転換体を３０℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto  Trypton  1%，Yeast  Extract  0.5%，NaCl  1%，アンピシリンナトリウム50μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。この培養液２μＬを、２ｍＬのOvernight  Express  Instant  TB  Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。２４時間の培養後、培養液に含まれる脂質成分を、下記に示す方法にて分析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)で形質転換した大腸菌K27株、及び前述の野生型NoTE発現プラスミド（NoTE_262）で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。【０１０３】
＜脂質成分の分析方法＞
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ/ｍＬの7-ペンタデカノン５０μＬを添加後、クロロホルム０．５ｍＬ、メタノール１ｍＬ及び２Ｎ塩酸１０μＬを培養液に添加して激しく攪拌し、３０分間放置した。その後さらに、クロロホルム０．５ｍＬ及び１．５％ＫＣｌ０．５ｍＬを添加して攪拌し、３，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。【０１０４】
下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
キャピラリーカラム：DB-1  MS（３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ、J＆W  Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：１．０ｍＬ／分
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／分→３００℃（５分間）
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力：１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／分
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃【０１０５】
脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
その結果を表５に示す。なお、以下の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸量の割合を示す。また、「Ｃ１７：０Δ」及び「Ｃ１９：０Δ」はそれぞれ、cis-9,10-Methylen-hexadecanoic  acid及びcis-11,12-Methylen-octadecanoic  acidを表す。さらに「Ｃ１２：ｎ」は、Ｃ１２：１とＣ１２：０の脂肪酸の総和を表し、「Ｃ１２：ｎ（％ＴＦＡ）」は、総脂肪酸の重量に対するＣ１２：ｎの脂肪酸量の割合を表す。【０１０６】
【表５】
0006592434.tif 000006
【０１０７】
表５に示すように、前記プラスミドNoTE_262を導入した形質転換体と比べ、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸の少なくとも一方をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE改変体を導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。
また、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸の両方がトリプトファンに置換されるように構築したプラスミドNoTE_262(G203W+V204W)、及び配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸がそれぞれトリプトファン及びフェニルアラニンに置換されるように構築したプラスミドNoTE_262(G203W+V204F)、をそれぞれ導入した形質転換体では、NoTE_262(G203W)及びNoTE_262(V204W)をそれぞれ導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸の含有率がさらに増加した。
さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸に加えて、他の特定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換されるように構築したNoTE_262(WW+L143P)、NoTE_262(WW+G160A)、NoTE_262(WW+G212P)、NoTE_262(WW+N213Y)を導入した形質転換体では、NoTE_262(G203W+V204W)を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸の含有率がさらに増加した。特に、NoTE_262(WW+G160A+N213Y)を導入した形質転換体では、NoTE_262(WW+G160A)やNoTE(WW+N213Y)を導入した形質転換体株と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸の含有率が一層増加した。【０１０８】
実施例２  配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端を削除したNoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NoTE改変体発現プラスミドの構築
実施例１で作製した前記プラスミドNoTE_262及びNoTE_262(G203W+V204W)をそれぞれ鋳型として、表１に示すプライマー番号２２及びプライマー番号８のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の３８２位〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号２に示す塩基配列の３８２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の手法により、NoTE発現プラスミド（NoTE_382）、及びNoTE改変体発現プラスミド（NoTE_382(G203W+V204W)）をそれぞれ構築した。
なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_382」は、配列番号１の１２８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号２の３８２位〜８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。
また、前記プラスミドNoTE_382(G203W+V204W)は、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１０９】
(x)NoTE_382(G203W+V204W)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。【０１１０】
（２）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
実施例１と同様の方法で、前記プラスミドNoTE_382(G203W+V204W)を大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、陰性対象として、前記プラスミドNoTE_382についても同様の実験を行った。結果を表６に示す。【０１１１】
【表６】
0006592434.tif 000007
【０１１２】
表６に示すように、NoTEのＮ末端のアミノ酸を１２７残基削除した場合においても、野生型NoTE_382発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_382(G203W+V204W)を導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。【０１１３】
実施例３  NgTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NgTE遺伝子の取得、及びNgTE発現プラスミドの構築
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるナンノクロロプシス・ガディタナ由来アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子（NgTE遺伝子、配列番号４）を、人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得した。
前記NgTE遺伝子を鋳型として、表１に示すプライマー番号２３及びプライマー番号２４のプライマー対を用いたPCRにより、配列番号４の２５３位〜８２５位の塩基配列からなる遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片を、実施例１と同様の方法でpBluescriptII  SK(-)ベクターに融合し、野生型NgTE発現プラスミドNgTE_253を構築した。このプラスミドNgTE_253は、配列番号３に示すアミノ酸配列のＮ末端側１位〜８４位のアミノ酸残基を除去し、その上流にプラスミドベクターpBluescriptII  SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位〜２９位のアミノ酸残基が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
なお、以下のプラスミド表記において、「NgTE_253」は、配列番号３の８５位〜２７４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号４の２５３位〜８２５位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。【０１１４】
（２）NgTE改変体発現プラスミドの構築
前記プラスミドNgTE_253を鋳型として、表１に示すプライマー番号２５及びプライマー番号２６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号４に示す塩基配列の２５３位〜８２５位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の手法により、NgTE改変体発現プラスミド（NgTE_253(G190W+V191W)）を構築した。
なお、前記プラスミドNgTE_253(G190W+V191W)は、配列番号４の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１１５】
(xi)NgTE_253(G190W+V191W)：配列番号３に示すアミノ酸配列の１９０位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１９１位のバリンをコードする塩基がトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。【０１１６】
（３）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
実施例１と同様の方法で、前記プラスミドNgTE_253(G190W+V191W)を大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、陰性対象として、前記プラスミドNgTE_253についても同様の実験を行った。結果を表７に示す。【０１１７】
【表７】
0006592434.tif 000008
【０１１８】
表７に示すように、野生型NgTE_253発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、配列番号３に示すアミノ酸配列の１９０位と１９１位のアミノ酸をトリプトファンに置換されるように構築したNgTE_253(G190W+V191W)を導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。【０１１９】
実施例４  NoTE改変体をコードする遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オキュラータによる脂質の製造
（１）NoTE改変体発現プラスミドの構築
実施例１で作製したプラスミドNoTE_262、NoTE_262(G203W+V204F)、及びNoTE_262(G203W+V204W)を鋳型として、表２に示すプライマー番号２７及びプライマー番号２８のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。【０１２０】
GenBankに登録されているナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis  sp.）W2J3B株のVCP1（ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質）遺伝子のcomplete  cds配列（Accession  number：JF957601.1）より、VCP1プロモーター配列（配列番号２９）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号３０）、及びVCP1ターミネーター配列（配列番号３１）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号３２及びプライマー番号３３のプライマー対、プライマー番号３４及びプライマー番号３５のプライマー対、並びにプライマー番号３６及びプライマー番号３７のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表２に示すプライマー番号３８及びプライマー番号３９のプライマー対を用いたPCRを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。【０１２１】
上記により得られたNoTE遺伝子断片、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を、実施例１と同様の方法でプラスミドベクターpUC19に融合し、NoTE発現用プラスミドNoTE_262_Nanno、並びにNoTE改変体発現用プラスミドNoTE_262(G203W+V204F)_Nanno及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nannoをそれぞれ構築した。なおこれらのプラスミドは、VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、NoTE遺伝子断片（野生型又は改変型）、及びVCP1ターミネーター配列の順に連結したNoTE遺伝子発現用配列と、pUC19ベクター配列からなる。
なお、前記プラスミドは、配列番号１の８８位〜２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、配列番号２の２６２位〜８６４位の塩基配列をプラスミドが有する。
また、前記NoTE改変体発現用プラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１２２】
(xii)NoTE_262(G203W+V204F)_Nanno：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがフェニルアラニンをコードするコドン（TTT）に、それぞれ置換されている。
(xiii)NoTE_262(G203W+V204W)_Nanno：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。【０１２３】
（２）ゼオシン耐性遺伝子のナンノクロロプシス発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号４０）、及び文献（Randor  Radakovits,  et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号４１）を人工合成した。
合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号４２及びプライマー番号４３のプライマー対、並びにプライマー番号４４及びプライマー番号４５のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ取得した。これらの増幅断片と、前記VCP1ターミネーター配列、及びプラスミドベクターpUC19の増幅断片を、実施例１と同様の方法で融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したゼオシン耐性遺伝子発現用配列と、pUC19ベクター配列からなる。【０１２４】
（３）各種NoTE発現プラスミド及びゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドのナンノクロロプシスへの導入
前記発現プラスミドNoTE_262_Nanno、NoTE_262(G203W+V204F)_Nanno、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nannoを鋳型として、表２に示すプライマー番号４６とプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、当該プラスミド中のNoTE遺伝子発現用配列を増幅した。
また、前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号４８とプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現用配列を増幅した。
増幅したＤＮＡ断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。【０１２５】
約１×１０９細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株（独立行政法人国立環境研究所(NIES)より入手）を、ソルビトール溶液３８４ｍＭで洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したNoTE遺伝子発現用ＤＮＡ断片（野生型又は改変型）及びゼオシン耐性遺伝子発現用ＤＮＡ断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞と混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。
ｆ／２液体培地（NaNO3  ７５ｍｇ、NaH2PO4・2H2O  ６ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．５μｇ、ビオチン  ０．５μｇ、チアミン  １００μｇ、Na2SiO3・9H2O  １０ｍｇ、Na2EDTA・2H2O  ４．４ｍｇ、FeCl3・6H2O  ３．１６ｍｇ、FeCl3・6H2O  １２μｇ、ZnSO4・7H2O  ２１μｇ、MnCl2・4H2O  １８０μｇ、CuSO4・5H2O  ７μｇ、Na2MoO4・2H2O  ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った。その後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％CO2雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーの中から、NoTE遺伝子発現用断片を含むものをＰＣＲ法により選抜した。選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、Ｎ１５Ｐ５培地）２０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％CO2雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液２ｍＬを、１８ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％CO2雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２週間振盪培養した。なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。【０１２６】
（４）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
培養後実施例１と同様の方法で、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。結果を表８に示す。なお、表８において、「ｎ」は、０〜５の整数を表し、例えば「Ｃ１８：ｎ」と記載した場合には、組成がＣ１８：０，Ｃ１８：１，Ｃ１８：２，Ｃ１８：３，Ｃ１８：４，及びＣ１８：５の各脂肪酸の総和を表す。【０１２７】
【表８】
0006592434.tif 000009
【０１２８】
表８に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位と２０４位のアミノ酸の少なくとも一方をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(G203W+V204F)_Nanno、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nannoを導入した形質転換体では、NoTE_262発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１２：０脂肪酸、及びＣ１４：０脂肪酸の割合が有意に増加した。【０１２９】
実施例５  NoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）NoTE多重改変体発現プラスミドの構築
実施例１で作製したプラスミドNoTE_262(V204W)を鋳型として、表３に示すプライマー番号５１とプライマー番号５２のプライマー対、プライマー番号５１とプライマー番号５３のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５５のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５６のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５７のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５８のプライマー対、プライマー番号５４とプライマー番号５９のプライマー対、並びにプライマー番号６０とプライマー番号６１のプライマー対をそれぞれ用いてPCRを行い、配列番号２の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、各種NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(V204W+H146N)、NoTE_262(V204W+H146S)、NoTE_262(V204W+M202F)、NoTE_262(V204W+M202H)、NoTE_262(V204W+M202L)、NoTE_262(V204W+M202Q)、NoTE_262(V204W+M202V)、NoTE_262(V204W+P281Q)）をそれぞれ構築した。これらのプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１３０】
(xiv)NoTE_262(V204W+H146N)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１４６位のヒスチジンをコードするコドンがアスパラギンをコードするコドン（AAC）に、それぞれ置換されている。
(xv)NoTE_262(V204W+H146S)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、１４６位のヒスチジンをコードするコドンがセリンをコードするコドン（TCA）に、それぞれ置換されている。
(xvi)NoTE_262(V204W+M202F)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがフェニルアラニン（F）をコードするコドン（TTC）に、それぞれ置換されている。
(xvii)NoTE_262(V204W+M202H)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがヒスチジンをコードするコドン（CAT）に、それぞれ置換されている。
(xviii)NoTE_262(V204W+M202L)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがロイシンをコードするコドン（CTA）に、それぞれ置換されている。
(xix)NoTE_262(V204W+M202Q)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがグルタミンをコードするコドン（CAA）に、それぞれ置換されている。
(xx)NoTE_262(V204W+M202V)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがバリンをコードするコドン（GTA）に、それぞれ置換されている。
(xxi)NoTE_262(V204W+P281Q)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２８１位のプロリンをコードするコドンがグルタミンをコードするコドン（CAG）に、それぞれ置換されている。【０１３１】
続いて、前記プラスミドNoTE_262(V204W+P281Q)を鋳型として、表３に示すプライマー番号５４とプライマー番号５６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片を取得した。この遺伝子断片を用いて、前記手法と同様の手法により、NoTE改変体発現プラスミド（NoTE_262(V204W+M202H+P281Q)）を構築した。このプラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１３２】
(xxii)NoTE_262(V204W+M202H+P281Q): 配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０２位のメチオニンをコードするコドンがヒスチジンをコードするコドン（CAT）に、２８１位のプロリンをコードするコドンがグルタミンをコードするコドン（CAG）に、それぞれ置換されている。【０１３３】
（２）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
実施例１と同様の方法で、前記発現プラスミドを大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、比較対象として、前記発現プラスミドNoTE_262、NoTE_262(V204W)についても同様の実験を行った。結果を表９に示す。【０１３４】
【表９】
0006592434.tif 000010
【０１３５】
表９に示すように、前記プラスミドNoTE_262を導入した形質転換体と比べ、いずれの変異体も総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸の割合が有意に増加した。
また、配列番号１に示すアミノ酸配列の１４６位のアミノ酸が置換されるように構築した、プラスミドNoTE_262(V204W+H146N)及びプラスミドNoTE_262(V204W+H146S)をそれぞれ導入した形質転換体では、NoTE_262導入株やNoTE_262(V204W)をそれぞれ導入した形質転換体ではほとんど存在を確認できなかったＣ８脂肪酸の生産が確認された。
さらに、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをトリプトファンに、２０２位のメチオニンや２８１位のプロリンを他のアミノ酸にそれぞれ置換されるように構築したプラスミドを導入した形質転換体では、NoTE_262(V204W)を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１２脂肪酸の含有率がさらに増加した。【０１３６】
実施例６  NoTE改変体をコードする遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オキュラータによる脂質の製造
（１）NoTE改変体発現プラスミドの構築
実施例１で作製したプラスミドNoTE_262、NoTE_262(G203W)、NoTE_262(V204W)、及びNoTE_262(G203W+V204W)を鋳型として、表２に示すプライマー番号２７及びプライマー番号２８のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、及び配列番号２に示す塩基配列の２６２位〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。【０１３７】
実施例４で作製したVCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、及びVCP1ターミネーター配列を含むpUC19ベクターを鋳型とし、表２に示すプライマー番号３２及び表３に示すプライマー番号６２のプライマー対を用いたPCRを行い、NoTE発現カセット（VCP1プロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル配列、野生型又は改変型NoTE配列、VCP1ターミネーター配列からなる断片）を増幅した。【０１３８】
続いて、実施例４で作製したゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号３９及び表３に示すプライマー番号６３のプライマー対を用いたPCRを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
前記NoTE発現カセットと、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット及びpUC19配列からなる断片を、実施例１と同様の方法で融合し、NoTE発現カセットとゼオシン耐性遺伝子発現カセットが連結した薬剤耐性連結型NoTE発現プラスミド（NoTE_262_Nanno(zeo)、NoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)、NoTE_262(V204W)_Nanno(zeo)、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)）をそれぞれ構築した。前記NoTE発現プラスミドは、配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１３９】
(xxiii)NoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(xxiv)NoTE_262(V204W)_Nanno(zeo)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。
(xxv)NoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０３位のグリシンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に、それぞれ置換されている。【０１４０】
（２）各種NoTE発現プラスミドのナンノクロロプシスへの導入、形質転換体の培養、培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
前記発現プラスミドNoTE_262_Nanno(zeo)、NoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)、NoTE_262(V204W)_Nanno(zeo)、及びNoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)を鋳型として、表２に示すプライマー番号４６とプライマー番号４７のプライマー対を用いてPCRを行い、NoTE遺伝子発現カセットとゼオシン耐性遺伝子発現カセットが連結した断片を増幅した。
実施例４と同様の方法で、得られたＤＮＡ断片を精製し、エレクトロポレーション法によりナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株に導入した。【０１４１】
（３）ナンノクロロプシス培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
実施例４と同様の方法で、形質転換体の選抜及び培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。なお、脂質抽出の際に用いるヘキサンの量は０．５ｍＬとした。結果を表１０に示す。【０１４２】
【表１０】
0006592434.tif 000011
【０１４３】
表１０に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列２０３位のグリシンをトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(G203W)_Nanno(zeo)、２０４位のバリンをトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(V203W)_Nanno(zeo)、２０３位と２０４位のアミノ酸をともにトリプトファンに置換されるように構築したNoTE_262(G203W+V204W)_Nanno(zeo)をそれぞれ導入した形質転換体では、NoTE_262を導入した形質転換体と比べ、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸の含有率が有意に増加した。【０１４４】
実施例７  Ｎ末端長を変更したNoTE改変体をコードする遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）Ｎ末端長を変更したNoTE改変体発現プラスミドの構築
実施例１で調製したナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のcDNAを鋳型として、表４に示すプライマー番号６４〜６９及び表１に示すプライマー番号２２のいずれか１つのプライマーと、表１に示すプライマー番号６のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の１〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の１７２〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の２３２〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の２９２〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の３２２〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の３５２〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、配列番号２の３８２〜８６４位の塩基配列からなる遺伝子断片、をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の方法により、Ｎ末端長を変更したNoTE発現プラスミドNoTE_1、NoTE_172、NoTE_232、NoTE_292、NoTE_322、NoTE_352、NoTE_382、をそれぞれ構築した。
なお、以下のプラスミド表記において、「NoTE_1」、「NoTE_172」、「NoTE_232」、「NoTE_292」、「NoTE_322」、「NoTE_352」、「NoTE_382」はそれぞれ、配列番号１の１〜２８７位、５７〜２８７位、７７〜２８７位、９７〜２８７位、１０７〜２８７位、１１７〜２８７位、１２７〜２８７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列として、それぞれ配列番号２の１〜８６４位、１７２〜８６４位、２３２〜８６４位、２９２〜８６４位、３２２〜８６４位、３５２〜８６４位、３８２〜８６４位の塩基配列をプラスミドが有することを意味する。【０１４５】
これらのプラスミドを鋳型として、表１に示すプライマー番号１０及びプライマー番号１３のプライマー対を用いてPCRを行い、配列番号２の１〜８６４位、１７２〜８６４位、２３２〜８６４位、２９２〜８６４位、３２２〜８６４位、３５２〜８６４位、３８２〜８６４位の塩基の一部を変異させた遺伝子断片をそれぞれ取得した。これらの遺伝子断片を用いて、実施例１と同様の方法によりＮ末端長を変更したNoTE改変体発現プラスミドNoTE_1(V204W)、NoTE_172(V204W)、NoTE_232(V204W)、NoTE_292(V204W)、NoTE_322(V204W)、NoTE_352(V204W)、NoTE_382(V204W)、をそれぞれ構築した。
これらのプラスミド(xxvi)NoTE_1(V204W)、(xxvii)NoTE_172(V204W)、(xxviii)NoTE_232(V204W)、(xxix)NoTE_292(V204W)、(xxx)NoTE_322(V204W)、(xxxi)NoTE_352(V204W)、(xxxii)NoTE_382(V204W)はいずれも配列番号２の塩基配列に対して、下記の部位のコドンが改変されている。【０１４６】
(xxvi)〜(xxxii)：配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のバリンをコードするコドンがトリプトファンをコードするコドン（TGG）に置換されている。【０１４７】
（２）発現プラスミドの大腸菌への導入、大腸菌培養液中の脂質の抽出、及び構成脂肪酸の分析
実施例１と同様の方法で、前記プラスミドNoTE_1(V204W)、NoTE_172(V204W)、NoTE_232(V204W)、NoTE_292(V204W)、NoTE_322(V204W)、NoTE_352(V204W)、NoTE_382(V204W)をそれぞれ大腸菌へ導入して培養を行い、培養液に含まれる脂質成分の分析を行った。また、陰性対象として、前記プラスミドNoTE_1、NoTE_172、NoTE_232、NoTE_292、NoTE_322、NoTE_352、NoTE_382についてもそれぞれ同様の実験を行った。結果を表１１に示す。
【０１４８】
【表１１】
0006592434.tif 000012
【０１４９】
表１１に示すように、NoTEのＮ末端のアミノ酸を種々の長さに変更した場合においても、野生型NoTE発現用プラスミドを導入した形質転換体と比べ、配列番号１に示すアミノ酸配列の２０４位のアミノ酸をトリプトファンに置換されるように構築したNoTE改変体発現用プラスミドを導入した形質転換体では、総脂肪酸量に占めるＣ１０脂肪酸及びＣ１２脂肪酸（Ｃ１２：ｎ）の割合が有意に増加した。【０１５０】
以上のように、本発明で規定するタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することで、特定の炭素数の脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、特定の脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【図１】
0006592434.tif 000013
【配列表】
0006592434000001.app