(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナタネ植物からハイブリッド種子を生産するための方法であって、
ａ．エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を含んでなる雄性不稔母本ナタネ植物を準備する工程；
ｂ．エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなる雄性稔性父本ナタネ植物を準備する工程；
ｃ．前記父本ナタネ植物からの花粉を前記母本ナタネ植物に受粉させる工程；
ｄ．前記母本植物からハイブリッド種子を採種する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記雄性稔性父本ナタネ植物が、エリートイベントＲＦ−ＢＮ１をホモ接合型で含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナタネ植物がブラシカ・ナプス種またはブラシカ・ジュンセア種に属する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
その核ゲノム内に少なくとも１コピーのエリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）と、少なくとも１コピーのエリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）とを含んでなる、ナタネ植物。
【請求項５】
前記ナタネ植物がブラシカ・ナプス種またはブラシカ・ジュンセア種に属する、請求項４に記載のナタネ植物。
【請求項６】
請求項４のナタネ植物の細胞または組織または種子。
【請求項７】
ハイブリッド種子の生産において使用するためのナタネ植物のペアであって、前記ナタネ植物の一方がエリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を含んでなり、前記ナタネ植物の他方がエリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなる、ペア。
【請求項８】
請求項４に記載のナタネ植物のゲノムＤＮＡ。
【請求項９】
エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなる、ブラシカ・ジュンセア植物または植物細胞。
【請求項１０】
エリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなる請求項９に記載のブラシカ・ジュンセア植物からの種子（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）。
【請求項１１】
エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）をさらに含んでなる、請求項９に記載の植物または細胞。
【請求項１２】
トランスジェニックナタネ植物において種子収量を増大させるための、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）の使用。
【請求項１３】
前記ナタネ植物がブラシカ・ジュンセアである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ナタネ植物の収量を増大させるための方法であって、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を有する前記ナタネ植物を準備する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物が、特に、アブラナ属ゲノム内のある特定の位置における雄性不稔遺伝子およびアブラナ属ゲノム内の別の特定の位置における稔性回復遺伝子の存在により、２つの特定の形質転換イベントの組合せを有することを特徴とする、トランスジェニックアブラナ属植物、植物材料および種子、特にナタネ植物に関する。本発明はまた、ハイブリッド種子の生産に特に適切なトランスジェニックアブラナ属植物、特にナタネ植物のペアに関する。より具体的には、これらの植物の一方はそのゲノム内における雄性不稔遺伝子の存在のための雄性不稔であることを特徴とし、他方は雄性不稔遺伝子の活性を防ぐことができる稔性回復遺伝子を保有することを特徴とする。本発明のアブラナ属植物のペアは、ハイブリッド種子形成能と最適な総合的農業生産力、遺伝的安定性および異なる遺伝的背景への適合性を併せ持つ。
【背景技術】
【０００２】
植物における導入遺伝子の表現型の発現は、遺伝子自体の構造および植物ゲノム内でのその位置の両方によって決まる。同時に、ゲノム内で異なった位置に導入遺伝子（外来ＤＮＡ中）が存在すれば、植物の総合的表現型に異なった様式で影響を及ぼす。遺伝子操作による植物の商業上注目される形質の、農業上または工業上好結果をもたらす導入は、種々の要因に依存する冗長な手法であり得る。実際の形質転換および遺伝的に形質転換された植物の再生は、詳細な遺伝子同定、育種および圃場試験での評価を含む一連の選抜工程の最初の段階に過ぎない。
【０００３】
用語「ナタネ」は、アブラナ属(Brassica)種の総ての種子を包含する。アブラナ属は、中国およびインドからフィンランドおよびカナダまで、最も有用な油料作物の１つとして栽培されている。ほとんどのアブラナ属の種類は十字花科(Cruciferae)に属する。それらは７（ブラシカ・フルティクロサ（Brassica fruticulosa））から１２（シナプシス・アルバ（Sinapsis alba））の範囲の異数性の染色体数を有する２倍体種として起源するものであった。カナダで最も広範囲に栽培されているアブラナ属種は、ターニップレイプ、またはブラシカ・カンペストリス(Brassica campestris)（ａａ、ｎ＝１０）として知られている。ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)（ｃｃ、ｎ＝９）は、最近の進化歴で、ブロッコリー、カリフラワーおよびキャベツを含む少なくとも６つの主要な園芸タイプに分化した。ブラシカ・ニグラ(Brassica nigra)（ｂｂ、ｎ＝８）またはブラックマスタードは商業上重要度の低い作物であるが、その種子に関して、それからカラシナが最初に作出されたことが主に知られている。これらの基本型から、より最近の進化段階で交雑によって異数性ハイブリッドが得られた。これらのうち最も重要なのはブラシカ・ナプス(Brassica napus)（ａａｃｃ）（その冬型は北欧で最高のナタネ収量を上げる）、ブラシカ・ジュンセア(Brassica juncea)（ａａｂｂ）またはインド亜大陸の主要油料作物の１つであるブラウンマスタードである。異なるアブラナ属種（特に、適合するゲノムを有するもの）の間での交雑は可能であり、育種目的ではよく行われるが、総ての形質（または遺伝子）がある種から他の種に移すことができるわけではなく、または異なる種に移す場合に、総ての形質が同じ特徴（もしくは発現パターン）を保持するわけではない。従って、あるアブラナ属種において天然遺伝子またはキメラ遺伝子の最適な発現を付与する遺伝子座が、別のアブラナ属種で必ずしも同じ効果を有するわけではない。
【０００４】
アブラナ属種は雌雄同体であり、一般に６０〜７０％が自家受粉する。選抜の基礎としてのハイブリッドの作出および遺伝的変種の導入は、従来、自家不和合性および細胞質雄性不稔などの自然に存在する現象の順応に依存していた。手による除雄または除雄剤の使用などの人工受粉制御法は、それぞれ実行可能性の限界および高いコストのためにアブラナ属の育種では広く適用されていない。
【０００５】
雄性不稔植物または雌性不稔植物の作出のために、トランスジェニック法が開発され、これらの方法は従来技術に代わる興味深い代替法を提供する。
【０００６】
ＥＰ０，３４４，０２９は核雄性不稔を得るための系を記載しており、これにより、植物は、例えば、タペータム特異的プロモーターＴＡ２９の制御下にバルナーゼ分子をコードするＤＮＡを含んでなる雄性不稔遺伝子で形質転換され、植物に組み込まれた際にタペータム細胞の選択的破壊が確保される。タバコおよびナタネ植物をこのような遺伝子で形質転換すると、花粉の形成が完全に抑えられた植物が得られる(Mariani et al. 1990, Nature 347: 737-741)。
【０００７】
キメラＰＴＡ２９：バルナーゼ遺伝子を含んでなるブラシカ・ナプス植物の葯の発達の細胞化学的および組織化学的分析は、De Block and De Brouwer (1993, Planta 189:218-225)により記載されている。
【０００８】
雄性不稔植物の後代において稔性を回復させるために、雄性不稔植物を、発現すると雄性不稔遺伝子の活性を阻害または抑制する稔性回復遺伝子を有するトランスジェニック植物と交配する系が開発された（ＵＳ５，６８９，０４１；ＵＳ５，７９２，９２９；De Block and De Brouwer，前掲）。
【０００９】
良好な農業生産力を有する形質転換体の頻度を高めるための雄性不稔植物の作出における共調節遺伝子の使用がＷＯ９６／２６２８３に記載されている。一般に、不稔ＤＮＡがバルナーゼをコードする場合、共調節ＤＮＡはバルスターをコードする。
【００１０】
エリートイベントＭＳ−Ｂ２、および雄性不稔を付与するこのエリートイベントを含んでなる雄性不稔植物は、導入遺伝子の特徴および挿入された導入遺伝子にすぐ隣接する植物ＤＮＡ配列の特徴を含め、ＷＯ０１／３１０４２（引用することにより本明細書の一部とされる）に詳細に記載されている。
【００１１】
エリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなるリファレンス種子は、１９９９年１０月１４日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−８５０としてＡＴＣＣ(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)に寄託された。同じ種子の別のサンプルが、受託番号ＰＴＡ−２４８５として寄託された。ＭＳ−Ｂ２の別名はＭＳ  １１である。
【００１２】
エリートイベントＲＦ−ＢＮ１、および雄性不稔を付与するこのエリートイベントを含んでなる植物は、導入遺伝子の特徴および挿入された導入遺伝子にすぐ隣接する植物ＤＮＡ配列の特徴を含め、ＷＯ０１／４１５５８（引用することにより本明細書の一部とされる）に詳細に記載されている。
【００１３】
エリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなるリファレンス種子は、１９９９年９月２０日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−７３０としてＡＴＣＣ(10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)に寄託された。ＲＦ−ＢＮ１の別名はＲｆ  ３である。
【００１４】
ＷＯ０１／４１５５８にはまた、エリートイベントＭＳ−ＢＮ１、前記イベントを含んでなる雄性不稔植物、ならびにこのような植物およびその後代を同定するための方法が記載されている。ＭＳ−ＢＮ１の別名はＭＳ  ８である。
【００１５】
ＭＳ−ＢＮ１イベントおよびＲＦ−ＢＮ１イベントは、Ｉｎ  Ｖｉｇｏｒ（登録商標）Ｃａｎｏｌａの銘柄で販売されているハイブリッドＢ．ナパス植物に含まれている。
【００１６】
以上に述べたこれらの文献は、アブラナ属植物におけるＭＳ−Ｂ２とＲＦ−ＢＮ１の特定の組合せも記載していなければ、ハイブリッド種子の生産におけるその使用も記載していない。ブラシカ・ジュンセアのＲＦ−ＢＮ１も、アブラナ属油料種子植物の収量を増大させるためのＭＳ−Ｂ２の使用も、これまでのところ記載されていない。
【発明の概要】
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ナタネ植物、例えば、ブラシカ・ナプスまたはブラシカ・ジュンセアからハイブリッド種子を生産するための方法であって、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を含んでなる雄性不稔母本ナタネ植物を準備する工程；エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を好ましくはホモ接合型で含んでなる雄性稔性父本ナタネ植物を準備する工程；前記父本ナタネ植物からの花粉を前記母本ナタネ植物に受粉させる工程；前記母本植物からハイブリッド種子を採種する工程を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、その核ゲノム内に少なくとも１コピーのエリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）と少なくとも１コピーのエリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）とを含んでなるナタネ植物、例えば、ブラシカ・ナプスまたはブラシカ・ジュンセア植物を提供する。また、このようなナタネ植物の細胞または組織または種子も提供される。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態では、ハイブリッド種子の生産において使用するためのナタネ植物のペアが提供され、前記ナタネ植物の一方は、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を含んでなり、前記ナタネ植物の他方は、エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなる。
【００２０】
その核ゲノム内に少なくとも１コピーのエリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）と少なくとも１コピーのエリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）とを含んでなる、ナタネ植物、例えば、ブラシカ・ナプスまたはブラシカ・ジュンセア植物のゲノムＤＮＡを提供することも本発明の目的である。
【００２１】
また、本発明により、エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなるブラシカ・ジュンセア、ならびにその細胞および種子も提供される。このような植物は、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）をさらに含んでなり得る。
【００２２】
本発明はさらに、トランスジェニックナタネ植物、例えば、ブラシカ・ジュンセア植物において種子収量を増大させるための、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）の使用を提供する。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態では、ナタネ植物の収量を増大させるための方法であって、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を有するナタネ植物を準備する工程を含んでなる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】除草剤施用後のＭＳ／ＲＦハイブリッドＢ．ナパス系統の雑種強勢の比較。パネルＡ：グルホシネートアンモニウム施用無し。パネルＢ：グルホシネートアンモニウム施用１回。パネルＣ：グルホシネートアンモニウム施用２回。四角：ＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１植物；点：ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１植物。
【図２】除草剤施用後のＭＳ／ＲＦハイブリッドＢ．ナパス系統の収量の比較。パネルＡ：グルホシネートアンモニウム施用無し、パネルＢ：グルホシネートアンモニウム施用１回。パネルＣ：グルホシネートアンモニウム施用２回。濃いグレーのバー：ＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１植物；薄いグレーのバー：ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１植物。Ｌｏｃ１〜Ｌｏｃ５：圃場試験場所；ＡＶＧ：全場所の平均。収量は、１００％としたＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１植物と比較した％として表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本発明は、ナタネ植物、特に、ブラシカ・ナプスおよびブラシカ・ジュンセアにおける雄性不稔イベントＭＳ−Ｂ２と稔性回復イベントＲＦ−ＢＮ１の新規な組合せを記載する。
【００２６】
本発明は、とりわけ、稔性回復を付与するエリートイベントＲＦ−ＢＮ１が、その植物が雄性不稔を付与するエリートイベントＭＳ−Ｂ２もさらに含む場合に、アブラナ属ナタネ植物において稔性を回復させるのに十分効果的であるという予期しない発見に基づく。ＲＦ−ＢＮ１は、これまで、エリートイベントＭＳ−ＢＮ１を含んでなるナタネ植物において稔性を回復させるために首尾良く使用されてきたが、ＲＦ−ＢＮ１がまたエリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなるナタネ植物において稔性を回復させるためにも使用可能であるかどうかは予測できなかった。エリートイベントを含んでなる異なった雄性不稔は、トランスジェニック雄性不稔遺伝子により発現されるバルナーゼ産物の発現レベルが異なり、ＲＦ−ＢＮ１内のトランスジェニック稔性回復遺伝子により産生されるバルナーゼ阻害因子バルスターのレベルが他の個々の雄性不稔イベントにおけるバルナーゼの発現とマッチすると予測できない。以下の例で示されるように、本発明の組合せは、同じ雄性不稔イベントＭＳ−Ｂ２と他の稔性回復イベントの組合せで本質的により高い収量をもたらした。
【００２７】
さらに、ＲＦ−ＢＮ１は、Ｃゲノムに位置することがこれまでに記載されている（ＷＯ０１／３１０４２参照；また、例えば、www.agbios.com/dbase.php?action=showProd&data=MS8xRF3も参照）。従って、Ｂ．ナパス（ａａｃｃ）由来のＲＦ−ＢＮ１を、Ｃゲノムを含まないＢ．ジュンセア（ａａｂｂ）へ導入するということは、当業者ならば簡単とは考えない。しかしながら、本明細書で、ＲＦ−ＢＮ１はＡゲノムに位置するので交雑によりＢ．ジュンセアに導入可能であるというデータを提供する。
【００２８】
さらに、圃場試験は、ＭＳ−Ｂ２の存在がＭＳ−Ｂ２不含の同質遺伝子植物系統と比較した場合に平均収量（子実収量）を増大させることを明らかにしていない。
【００２９】
よって、本発明の一実施形態では、ナタネ植物、例えば、ブラシカ・ナプスまたはブラシカ・ジュンセアからハイブリッド種子を生産するための方法であって、
・雄性不稔遺伝子を含んでなるエリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなる雄性不稔母本ナタネ植物を準備する工程；
・稔性回復遺伝子を、好ましくはホモ接合型で含んでなるエリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなる雄性稔性父本ナタネ植物を準備する工程；
・父本ナタネ植物からの花粉を母本ナタネ植物に受粉させる工程；および
・前記母本植物からハイブリッド種子を採種する工程
を含んでなる方法が提供される。
【００３０】
用語「遺伝子」とは、本明細書で使用する場合、プロモーターと５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（一緒にプロモーター領域を形成する）、コード領域（タンパク質をコードしてもコードしなくてもよい）、およびポリアデニル化部位を含んでなる非翻訳３’領域（３’ＵＴＲ）などのいくつかの機能的に連結されたＤＮＡ断片を含んでなるＤＮＡ配列を意味する。一般に、植物細胞では、５’ＵＴＲ、コード領域および３’ＵＴＲが転写されてＲＮＡとなり、タンパク質コード遺伝子の場合には、このＲＮＡが翻訳されてタンパク質となる。遺伝子は、例えばイントロンなどの付加的ＤＮＡ断片を含み得る。本明細書で使用する場合、遺伝子座は、植物のゲノム内の所与の遺伝子の位置である。
【００３１】
用語「キメラ」は、遺伝子またはＤＮＡ配列に関する場合、その遺伝子またはＤＮＡ配列が本来互いに関連がなく、例えば異なる供給源に由来する少なくとも２つの機能的に関連するＤＮＡ断片（例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン）を含んでなることを示して使用される。「外来」とは、植物種に関する遺伝子またはＤＮＡ配列に関する場合、その遺伝子またはＤＮＡ配列がその植物種には本来見られないか、またはその植物種のその遺伝子座には本来見られないことを示して使用される。用語「外来ＤＮＡ」は、本明細書では、形質転換の結果として植物のゲノムに組み込まれた場合のＤＮＡ配列を意味して使用される。「形質転換ＤＮＡ」とは、本明細書で使用する場合、形質転換に使用される組換えＤＮＡ分子を意味する。形質転換ＤＮＡは通常、形質転換植物に１以上の特定の特徴を付与することができる少なくとも１つの「目的遺伝子」（例えば、キメラ遺伝子）を含んでなる。用語「組換えＤＮＡ分子」は、例示のために使用され、従って、ＤＮＡであり得、かつ、組換えまたは他の手順によって得ることができる単離された核酸分子を含み得る。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「導入遺伝子」は、植物のゲノム内に組み込まれた場合の目的遺伝子を意味する。「トランスジェニック植物」とは、その全細胞のゲノム内少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる植物を意味する。
【００３３】
本発明の植物に存在する外来ＤＮＡは好ましくは、２つの目的遺伝子、より具体的には、雄性不稔遺伝子と除草剤耐性遺伝子か稔性回復遺伝子と除草剤耐性遺伝子のいずれかを含んでなる。
【００３４】
「雄性不稔遺伝子」は、本明細書で使用する場合、植物を、植物内で発現した際に稔性があり生存能力のある花粉を産生することができない植物にする遺伝子を意味する。雄性不稔遺伝子の一例は、タペータム細胞での発現を指示するプロモーターの制御下にバルナーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる遺伝子である。より具体的には、本発明によれば、雄性不稔遺伝子は、本明細書に記載されるような「ＴＡ２９−バルナーゼ」である。
【００３５】
「稔性回復遺伝子」は、本明細書で使用する場合、雄性不稔遺伝子を含んでなる植物内で発現した際に、雄性不稔遺伝子の表現型発現を抑制し、その植物において稔性を回復させることができる遺伝子を意味する。より具体的には、稔性回復遺伝子は、少なくとも雄性不稔ＤＮＡが発現される細胞において発現を指示するプロモーターの制御下に雄性不稔遺伝子の表現型発現を抑制することができるタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。より具体的には、本発明によれば、稔性回復遺伝子は、本明細書に記載されるような「ＴＡ２９−バルスター」である。
【００３６】
組換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組み込みは一般に、細胞または組織の形質転換から（または別の遺伝子操作から）生じる。組み込みの特定の部位は、偶然によるかまたは所定の位置である（標的化組込みが使用される場合）。
【００３７】
外来ＤＮＡは、植物ゲノムにおける組換えＤＮＡ分子の組み込みの部位の位置および構成によって特徴的であり得る。組換えＤＮＡが挿入されている植物ゲノム内の部位は、「挿入部位」または「標的部位」とも呼ばれる。植物ゲノムにおける導入遺伝子の挿入は、「標的部位欠失」と呼ばれる植物ＤＮＡの欠失と関連し得る。「隣接領域」または「隣接配列」とは、本明細書で使用する場合、外来ＤＮＡのすぐ上流で隣接するか、またはすぐ下流で隣接して位置する植物ゲノムの少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、最大５０００ｂｐの配列を意味する。外来ＤＮＡのランダムな組込みをもたらす形質転換手順は種々の隣接領域と形質転換体を生じ、それらは各形質転換体に特徴的かつユニークである。導入遺伝子が従来の交配により植物に導入される場合、植物ゲノムにおけるその挿入部位、またはその隣接領域は一般に変わらない。「挿入領域」は、本明細書で使用する場合、（非形質転換）植物ゲノムにおける導入遺伝子の上流隣接領域および下流隣接領域により包含され、かつ、挿入部位（および可能性のある標的部位欠失）を含む、少なくとも４０ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、最大１００００ｂｐを超える領域に相当する領域を意味する。ある種内の突然変異による微細な違いを考慮すれば、挿入領域は、その種の所与の植物内の外来ＤＮＡの上流隣接領域および下流隣接領域を含んでなる配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を保持する。
【００３８】
目的遺伝子の発現は、その遺伝子がその植物に（１または複数の目的遺伝子の遺伝子の一部または全部の構造および機能に基づき）形質転換の際に使用される組換えＤＮＡ分子、すなわち、形質転換ＤＮＡの導入によって付与することを意図した１以上の表現型形質（例えば、除草剤耐性）を付与するということを意味する。
【００３９】
「イベント」とは、遺伝子操作の結果として少なくとも１コピーの１または複数の目的遺伝子を含んでなる外来ＤＮＡを有する（人工）遺伝子座と定義される。あるイベントの典型的な対立遺伝子の状態は、外来ＤＮＡが存在するかしないかである。本明細書で使用する場合、「ＭＳ」イベントおよび「ＲＦ」イベントは、それぞれ「ＴＡ２９−バルナーゼ」および「ＴＡ２９−バルスター」導入遺伝子を有するイベントを意味する。あるイベントは、１以上の導入遺伝子の発現により表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルで、イベントは植物の遺伝子構成の一部である。分子レベルでは、イベントは制限地図（例えば、サザンブロット法により決定されるもの）により、ならびに／または導入遺伝子の上流および／もしくは下流隣接配列、および／または導入遺伝子の分子の立体配置により特徴付けられる。通常、少なくとも１つの目的遺伝子を含んでなる形質転換ＤＮＡで植物を形質転換すると、それぞれユニークな複数のイベントが生じる。
【００４０】
「エリートイベント」は、本明細書で使用する場合、同じ形質転換ＤＮＡでの形質転換によって、またはこのような形質転換により得られる植物と戻し交配することによって得られる一群のイベントから、導入遺伝子の発現および安定性ならびにそれを含んでなる植物の最適な農業特性との適合性に基づいて選択されるイベントである。よって、エリートイベント選抜の判定基準は、以下のものの１以上、好ましくは２以上、有利には全部である：
ａ）導入遺伝子の存在が、農業生産力または商業価値に関するものなどの植物の他の所望の特徴を損なわないこと；
ｂ）そのイベントが十分に定義された分子の立体配置により特徴付けられ、それが安定に受け継がれ、かつ特性管理(identity control)のための適当な診断ツールが開発可能であること；
ｃ）導入遺伝子内の１または複数の目的遺伝子が、そのイベントのヘテロ接合（または半接合）状態でもホモ接合状態でも、そのイベントを有する植物が通常の農学的使用で曝される可能性のある環境条件の範囲において、商業的に許容可能なレベルで、適性、適当で安定な空間的および時間的表現型発現を示すこと。
【００４１】
外来ＤＮＡは、所望の商業上の遺伝的背景への遺伝子移入を可能とする植物ゲノム内の位置に連結されることが好ましい。
【００４２】
エリートイベントとしてのイベントの状態は、異なった関連の遺伝的背景におけるエリートイベントの遺伝子移入および１つ、２つまたは総ての判定基準、例えば、上記のａ）、ｂ）およびｃ）との適合性を観察することにより確認される。
【００４３】
加えて、本明細書に記載の雄性不稔および稔性回復をコードする導入遺伝子については、エリートイベントの選抜は、これらのイベント間の適合性、より具体的には、雄性不稔イベントを有する植物と稔性回復イベントを有する植物の間の交配から得られる後代に関して決定付けられ、ここで、両イベントは以下の特徴を有する：
ａ）稔性回復表現型、すなわち、雄性稔性の十分な表現型発現；および
ｂ）前記２つのイベントを有する植物が通常の農学的使用で曝される可能性のある環境条件の範囲で、商業的に許容可能なレベルでの表現型発現。
【００４４】
よって、「エリートイベント」は、上記の判定基準に応える導入遺伝子を含んでなる遺伝子座を意味する。植物、植物材料、または種子などの後代は、そのゲノム内に１以上のエリートイベントを含んでなり得る。
【００４５】
エリートイベントＭＳ−Ｂ２は、ＷＯ０１／３１０４２（特に、実施例１および３を参照）に詳細に記載されているように特性決定された。形質転換ＤＮＡは、実施例１に記載されている。導入遺伝子の挿入後に隣接する植物ＤＮＡ配列が単離および同定されている（ＷＯ０１／３１０４２、特に、実施例３．２ならびに配列番号１および２を参照）。また、生物材料においてエリートイベントＭＳ−Ｂ２の同定を可能とする診断的ＰＣＲも、ＷＯ０１／３１０４２、特に、実施例５に記載されている。エリートイベントＭＳ−Ｂ２がアブラナ属植物、細胞、種子または組織に存在する場合、そのゲノムＤＮＡを用いて、それぞれ配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して１６０〜２００ｂｐの間、特に約１８３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することができる。リファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０またはＰＴＡ−２４８５として寄託されている。エリートイベントＭＳ−Ｂ２の別名はＭＳ１１である。
【００４６】
エリートイベントＲＦ−ＢＮ１は、ＷＯ０１／４１５５８（特に、実施例１ｂおよび４．２．２を参照）に詳細に記載されているように特性決定された。形質転換ＤＮＡは実施例１ｂに記載されている。導入遺伝子の挿入後に隣接する植物ＤＮＡ配列は、単離および同定されている（ＷＯ０１／３１０４２、特に、実施例４．２．２ならびに配列番号５および６を参照）。生物材料においてエリートイベントＲＦ−ＢＮ１の同定を可能とする診断的ＰＣＲも、ＷＯ０１／４１５５８、特に、実施例５．２に記載されている。エリートイベントＲＦ−ＢＮ１がアブラナ属植物、細胞、種子または組織に存在する場合、そのゲノムＤＮＡを用い、それぞれ配列番号７および配列番号８のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、１９５〜２３５ｂｐの間、特に、約２１５ｂｐのＤＮＡ断片を使用することができる。リファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている。ＲＦ−ＢＮ１の別名は、ＲＦ３またはＡＣＳ−ＢＮ００３−６である。
【００４７】
ＲＦ−ＢＮ１またはＭＳ−Ｂ２を保有する植物は、例えば、ＡＴＣＣに寄託されている種子から得ることができる。このような植物をさらに繁殖させ、かつ／または同じ植物種の他の栽培品種に本発明のエリートイベントを導入するために従来の育種スキームで使用することができる。寄託された種子はブラシカ・ナプス種に属する。しかしながら、Ｂ．ナパス由来のＡゲノムに位置する対立遺伝子または導入遺伝子をＢ．ジュンセアに導入する方法が当技術分野で周知であり、反復戻し交配を含む。
【００４８】
本発明は、稔性回復ゲノムを含んでなるそれらの核ゲノムエリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなるＢ．ジュンセア植物、種子、細胞および組織を初めて提供する。これまでに入手可能な情報は、エリートイベントＲＦ−ＢＮ１がＣゲノム上に存在することを示したが、本明細書で提供される情報では、ＲＦ−ＢＮ１挿入はＡゲノム内に位置するので、エリートイベントのＢ．ジュンセアへの移行が可能である。
【００４９】
ＭＳ−Ｂ２および／またはＲＦ−ＢＮ１を保有するアブラナ属植物はまた、それらのグルホシネート耐性も特徴とし、これは、本発明に関して、植物が除草剤リバティー（商標）に対して耐性であることを含む。リバティー（商標）に対する耐性は、３〜４葉期（３Ｖ〜４Ｖ）の植物に少なくとも２００グラムの有効成分／ヘクタール（ｇ．ａ．ｉ．／ｈａ）、好ましくは４００ｇ．ａ．ｉ．／ｈａ、可能性としては最大１６００ｇ．ａ．ｉ．／ｈａを噴霧しても植物を枯死させないという基準によって定義される。ＭＳ−Ｂ２および／またはＲＦ−ＢＮ１を保有する植物はさらに、ＰＡＴアッセイ(De Block et al, 1987, EMBO J. 6: 2513-2518)で決定される、それらの細胞におけるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼの存在によって特性決定することもできる。
【００５０】
本発明のアブラナ属植物は、慣行法により栽培することができる。３５Ｓ−ｂａｒ遺伝子の存在は、それらがグルホシネート耐性であることを確定する。従って、このようなアブラナ属植物が栽培されている圃場の雑草は、有効成分としてグルホシネートを含んでなる除草剤（例えば、リバティー（商標））の施用によって防除することができる。
【００５１】
圃場試験では、さらに、アブラナ属植物におけるＭＳ−Ｂ２の存在が、ＭＳ−Ｂ２を含まない同質遺伝子植物系統と比較した場合に種子または子実収量の増大をもたらすことが明らかになった。よって、本発明の実施形態は、エリートＭＳ−Ｂ２を有するナタネ植物を準備する工程を含んでなる、ナタネ植物の種子収量を増大させるための方法である。
【００５２】
以下の特許請求の範囲で使用されるように、そうではないことが明示されない限り、用語「植物」は、任意の成熟段階の植物組織、ならびに限定されるものではないが、任意の種子、葉、茎、花、根、単細胞、生殖体、細胞培養物、組織培養物またはプロトプラストを含むこのような任意の植物から採種された、または由来する任意の細胞、組織、または器官を包含することを意図する。植物細胞は、本明細書で使用する場合、再生可能でない植物細胞も包含する。
【００５３】
「アブラナ属」植物は、本明細書で使用する場合、アブラナ科の植物、好ましくは、Ａゲノムを含んでなる植物に関する。好ましくは、アブラナ属植物は、ブラシカ・ナプス種、ブラシカ・ラパ（Brassica rapa)（またはカンペストリス(campestris)）種、またはブラシカ・ジュンセア種の１つに属すると考えられる。あるいは、植物は、これらのアブラナ属種の交雑に起源する種、例えば、Ｂ．ナポカンペストリス(B. napocampestris)、またはこれらのアブラナ属種の１つとクルシフェラセア(Cruciferacea)の別の種の人工交配に起源する種に属し得る。本明細書で使用する場合、「油料種子植物」は、ブラシカ・ナプス種、ブラシカ・ラパ（もしくはカンペストリス）種、またはブラシカ・ジュンセア種のうちいずれか１つを意味する。
【００５４】
本発明による油料種子植物はまた、クロピラリド(Clopyralid)、ジクロホップ(Diclofop)、フルアジホップ(Fluazifop)、グルホシネート(Glufosinate)、グリホセート(Glyphosate)、メタザクロル(Metazachlor)、トリフルラリン(Trifluralin)、エタメトスルフロン(Ethametsulfuron)、キンメラック(Quinmerac)、キザロホップ(Quizalofop)、クレトジム(Clethodim)、テプラロキシジム(Tepraloxydim)を含む除草剤；アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル(Fludioxonil)、イプロジオン(Iprodione)、プロクロラズ(Prochloraz)、ビンクロゾリン(Vinclozolin)を含む殺真菌剤、または  カルボフラン、有機リン剤(Organophosphates)、ピレトロイド(Pyrethroids)、チアクロプリド(Thiacloprid)、デルタメトリン(Deltamethrin)、イミダクロプリド(Imidacloprid)、クロチアニジン(Clothianidin)、チアメトキサム(Thiamethoxam)、アセタミプリド(Acetamiprid)、ジネトフラン(Dinetofuran)、β−シフルトリン(Cyfluthrin)、γおよびλシハロトリン(Cyhalothrin)、τ−フルバリレート(Fluvaleriate)、エチプロル(Ethiprole)、スピノサド(Spinosad)、スピノトラム(Spinotoram)、フルベンジアミド(Flubendiamide)、リナキシピル(Rynaxypyr)、サイアジピル(Cyazypyr)または４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオルエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オンを含む殺虫剤で処理することができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合「含んでなる」は、述べられているように、記載の特徴、整数、工程もしくは成分を明示することと解釈されるべきであり、１以上の特徴、整数、工程もしくは成分、またはその群の存在または付加を排除するものではない。よって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含んでなる核酸またはタンパク質は、実際に引用されたもの以外のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでなってもよく、すなわち、より大きな核酸またはタンパク質に埋め込まれていてもよい。機能的または構造的に定義されるＤＮＡ配列を含んでなるキメラ遺伝子は、付加的ＤＮＡ配列を含んでなってもよいなどである。
【００５６】
以下の実施例で、エリートイベントＭＳ−Ｂ２およびＲＦ−ＢＮ１を保有するナタネ植物の特徴を説明する。
【００５７】
そうではないことが示されない限り、総ての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY and in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAに記載のとおりの標準的プロトコールに従って行う。植物分子研究のための標準的な材料および方法は、Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UKに記載されている。
【００５８】
説明および実施例において、以下の配列が参照される。
配列番号１：    ５’隣接配列ＭＳ−Ｂ２
配列番号２：    ３’隣接配列ＭＳ−Ｂ２
配列番号３：    ＭＳ−Ｂ２の検出用のオリゴヌクレオチドプライマー１
配列番号４：    ＭＳ−Ｂ２の検出用のオリゴヌクレオチドプライマー２
配列番号５：    ５’隣接配列ＲＦ−ＢＮ１
配列番号６：    ３’隣接配列ＲＦ−ＢＮ１
配列番号７：    ＲＦ−ＢＮ１の検出用のオリゴヌクレオチドプライマー１
配列番号８：    ＲＦ−ＢＮ１の検出用のオリゴヌクレオチドプライマー２
配列番号９：    プラスミドｐＴＨＷ１１８
配列番号１０：  プラスミドｐＴＣＯ１１３
本発明の上記説明は、例示であることを意図し、限定されない。
【００５９】
当業者ならば、記載の実施形態における様々な変更または改変を想到し得る。これらは本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく行うことができる。
【実施例】
【００６０】
実施例１．ＭＳ−Ｂ２およびＲＦ−ＢＮ１の簡単な説明
１．１．エリートイベントＭＳ−Ｂ２
エリートイベントＭＳ−Ｂ２は、タペータム特異的プロモーターの制御下にバルナーゼ遺伝子を含んでなるキメラＤＮＡを用いたＢ．ナパス植物のアグロバクテリウムを介した形質転換により作出した（ｐＴＣＯ１１３）。
【００６１】
プラスミドｐＴＣＯ１１３は、本質的には中間ベクターｐＧＳＶ１に由来した。ベクターｐＧＳＶ１はそれ自体、ｐＧＳＣ１７００(Cornelissen and Vandewielle, 1989)に由来するが、ＴＬ−ＤＮＡ型ｐＴｉＢ６Ｓ３の左境界配列および右境界配列からなる人工Ｔ−領域と、Ｔ−ＤＮＡ境界リピート間へのキメラ遺伝子の挿入を可能とするマルチリンカークローニング部位とを含んでなる。ｐＧＳＶ１ベクターは、大腸菌での発現のための調節シグナルを含むプラスミドメインフレーム上にバルスター遺伝子が提供されている。
【００６２】
ｐＴＣＯ１１３の境界リピート間に含まれるＤＮＡの詳細な説明を表１に示す（配列番号１０）。
【００６３】
【表１】
0006502320.tif 000002
0006502320.tif 000003
【００６４】
隣接配列は、ＷＯ０１／３１０４２に記載のように単離した。
【００６５】
右（５’）隣接領域
５’隣接領域をおよそ４１５ｂｐの断片として増幅し、その全配列を決定した（配列番号１）。ヌクレオチド１〜２３４の間の配列は植物ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド２３５〜４１５の間の配列はＴ−ＤＮＡに相当する。
【００６６】
左（３’）隣接領域
３’隣接領域をおよそ４１６ｂｐの断片として増幅し、その全配列を決定した（配列番号２）。ヌクレオチド１〜１９３の間の配列はＴ−ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド１９４〜４１６の間の配列は植物ＤＮＡに相当する。
【００６７】
ＭＳ−Ｂ２のＰＣＲ同定
ＷＯ０１／３１０４２に記載にされるように、ＭＳ−Ｂ２を含んでなる生物材料を、そこに記載されているＰＣＲ同定プロトコールを用いて同定することができる。
【００６８】
外来ＤＮＡおよびＭＳ−Ｂ２の隣接配列を特異的に認識する以下のプライマーを使用することができる：
B01: 5’-gAA.ATC.CAT.gTA.AAg.CAg.CAg.gg-3’（配列番号３）
（標的：植物ＤＮＡ）
B02: 5’-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CTT.gAC-3’（配列番号４）
（標的：Ｔ−ＤＮＡ）
【００６９】
ＰＣＲ反応において予想される増幅断片は：
プライマー対Ｂ０１−Ｂ０２に関して：１８３ｂｐ（ＭＳ−Ｂ２エリートイベント）
である。
【００７０】
１．２．エリートイベントＲＦ−ＢＮ１
エリートイベントＲＦ−ＢＮ１は、ＴＡ２９プロモーターの制御下にバルスター遺伝子を含んでなるキメラＤＮＡを用いたＢ．ナパス植物のアグロバクテリウムを介した形質転換により作出した（ｐＴＨＷ１１８）。
【００７１】
プラスミドｐＴＨＷ１１８もまた、本質的に中間体ベクターｐＧＳＶ１（上記）に由来した。ｐＴＨＷ１１８の境界リピート間に含まれるＤＮＡの詳細な説明を表２に示す（配列番号９）。
【００７２】
【表２】
0006502320.tif 000004
【００７３】
隣接配列は、ＷＯ０１／４１５５８に記載のように単離した。
【００７４】
右（５’）隣接領域
５’隣接領域をおよそ１０７７ｂｐの断片として増幅し、その全配列を決定した（配列番号５）。ヌクレオチド１と８８１の間の配列は植物ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド８８２と１０７７の間の配列はＴ−ＤＮＡに相当する。
【００７５】
左（３’）隣接領域
３’隣接領域をおよそ１５００ｂｐの断片として増幅し、その全配列を決定した（配列番号６）。のヌクレオチド１〜１６６間の配列はＴ−ＤＮＡに相当し、ヌクレオチド１６７〜１４４１の間の配列は植物ＤＮＡに相当する。
【００７６】
ＲＦ−ＢＮ１のＰＣＲ同定
ＷＯ０１／４１５５８に記載されるように、ＲＦ−ＢＮ１を含んでなる生物材料を、そこに記載されているＰＣＲ同定プロトコールを用いて同定することができる。
【００７７】
ＲＦ−ＢＮ１を含んでなる植物材料を同定するために、導入遺伝子およびＲＦ−ＢＮ１の隣接配列を特異的に認識する以下のプライマーを使用する。
BNA03: 5’-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3’（配列番号７）
（標的：導入遺伝子）
BNA04: 5’-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3’（配列番号８）
（標的：植物ＤＮＡ）
【００７８】
ＰＣＲ反応において予想される増幅断片は：
プライマー対ＢＮＡ０３−ＢＮＡ０４に関して：２１５ｂｐ（ＲＦ−ＢＮ１エリートイベント）
である。
【００７９】
実施例２．ＲＦ−ＢＮ１遺伝子座が位置するゲノムの同定およびブラシカ・ジュンセアへの導入
ＲＦ−ＢＮ１遺伝子座がブラシカ・ナプスのＡゲノム上に位置するかＣゲノム上に位置するかを決定するために、アブラナ属ゲノム上でＲＦ−ＢＮ１が既知のマーカーと一緒に受け継がれるかまたは連鎖しているかどうかを、ＲＦ−ＢＮ１導入遺伝子をホモ接合状態で含むドナー系統と導入遺伝子を含まない反復親の間の交配に由来する４つの異なる分離Ｂ．ナパスＢＣ１集団において分析した。ＡＦＬＰ法を用いて遺伝子マーカーを作出した。ＡＦＬＰ分析はVos et al. (1995, NAR 23:4407-4414、ＥＰ０５３４８５８およびＵＳ６，０４５，９９４)から採用した。ＲＦ−ＢＮ１に連鎖したＡＦＬＰマーカーを同定するために、Michelmore et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9828-9823)に従って大量分離体分析(bulked segregant analysis)（ＢＳＡ）を行った。
【００８０】
ＲＦ−ＢＮ１陽性植物プール（可視的ＡＦＬＰマーカーを含有する）とＲＦ−ＢＮ１陰性植物プール（前記マーカーが見られなかった）の間で示差的増幅を示したＡＦＬＰ遺伝子マーカーの総てを、ＢＳＡ分析においてＡＦＬＰマーカーが連鎖している可能性があることが示されているＢＣ１集団の少なくとも４６の個々のサンプルで分析した。ＲＦ−ＢＮ１  ＰＣＲマーカーと著しい量の共分離を示したマーカーのみを保持し、この基準を満たさない潜在的な他のマーカーはＢＳＡ分析から偽陽性として排除した。連鎖分析は、JoinMap Version 3.0 (Van Ooijen and Vorrips (2001) JoinMap Version 3.0, Software for the calculation of genetic linkage maps, Plant Research International, Wageningen, The Netherlands)を個々に用いて、各ＢＣ１集団について１個体の植物で生成された、保持されているＡＦＬＰマーカーおよびＲＦ−ＢＮ１  ＰＣＲマーカーデータからのデータを用いて行った。ＲＦ−ＢＮ１遺伝子座前後の４つの個々の地図は著しい一致を示したので、これらの４つのＢＣ１地図は、ＲＦ−ＢＮ１遺伝子座のローカルマッピングが可能な同じソフトウエアを用い、ＲＦ−ＢＮ１遺伝子座前後の領域を表す１つのＢＣ１地図に統合することができた。
【００８１】
次に、得られたＲＦ−ＢＮ１領域のローカルマップを、全Ｂ．ナパス染色体を表す遺伝子リファレンスマップと比較した。このリファレンスマップに関しては、染色体番号はSharpe et al. (1995, Genome 38:112-1121) and Parkin et al. (1995, Genome 38:1122-1131)に従ってすでに割り付けられている。Ｎ０１〜Ｎ１０はＡゲノム染色体であり、Ｎ１１〜Ｎ１９はＣゲノム染色体である。ＲＦ−ＢＮ１領域マップとＡゲノム染色体であることが知られているリファレンスマップからのＮ０７染色体との間には極めて明確な相関が見られた。ＲＦ−ＢＮ１は、Ｂ．ナパスのＡゲノム上に位置する。
【００８２】
イベントＲＦ−ＢＮ１を、イベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなるＤｒａｋｋａｒ変種植物からブラシカ・ジュンセア栽培品種への反復戻し交配によって導入した。少なくとも４世代の加速化戻し交配の後、Ｂ．ジュンセア植物を調べ、以下のことが確認された：
ａ）外来ＤＮＡの存在は、農業生産力または商業的価値に関するものなどの植物の他の所望の特徴を損なわなかった；
ｂ）イベントは十分に定義された分子の立体配置を特徴とし、それは安定に受け継がれた；および
ｃ）外来ＤＮＡ中の１または複数の目的遺伝子は、そのイベントのヘテロ接合（または半接合）状態でもホモ接合状態でも、そのイベントを有する植物が通常の農学的使用で曝される可能性のある環境条件の範囲において、商業的に許容可能なレベルで、適性、適当で安定な空間的および時間的表現型発現を示した。さらに、これらの植物を野生型ブラシカ・ジュンセア種に比べた場合のそれらの農業的特徴および生産力に関して評価した。
【００８３】
圃場における詳細試験では、ブラシカ・ジュンセア中のＲＦ−ＢＮ１が、最適な農業生産力を兼ね備えた外来ＤＮＡ中の目的遺伝子の十分な発現、すなわち、雄性不稔表現型を示す植物をもたらすことが示された。よって、元はＢ．ナパスにおいて開発されたが、驚くことに、ＲＦ−ＢＮ１はブラシカ・ジュンセアにおいてもエリートイベントであった。さらに、ＲＦ−ＢＮ１は、ＭＳ−Ｂ２を含んでなるＢ．ジュンセア植物において稔性を回復させるために効果的に使用することができた。
【００８４】
実施例３．ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１植物の農業生産力
ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１イベントを含んでなるアブラナ属ナタネ植物に、同質遺伝子非トランスジェニック対照チェックならびに他の回復イベントを含んでなるＭＳ−Ｂ２植物とともに圃場試験を行った。相対的収量データを下表にまとめる。
さらなる植物系統の圃場試験データも平均値、有意性などの計算のための分析に含めたことに留意されたい。
【００８５】
ＭＳ−Ｂ２およびＲＦ−ＢＮ１収量を含んでなる植物系統は、ＭＳ−Ｂ２および他の稔性回復イベント（ＲＦ−ＢＮ２）を含んでなる植物系統よりも一貫して高い収量であることが明らかである。
【００８６】
さらに、ＭＳ−Ｂ２を含んでなる植物系統は、同質遺伝子非トランスジェニック植物系統よりも高い収量であることも明らかである。
【００８７】
【表３】
0006502320.tif 000005
【００８８】
【表４】
0006502320.tif 000006
【００８９】
【表５】
0006502320.tif 000007
【００９０】
【表６】
0006502320.tif 000008
【００９１】
実施例４．ＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１  Ｂ．ナパス植物に比べたＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１  Ｂ．ナパス植物の農業生産力
ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１  Ｂ．ナパスハイブリッドの回復を確認し、同じ遺伝的背景のＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１ハイブリッドと比較して除草剤耐性および農業生産力を評価するために、圃場試験を５箇所（４反復／全区画）で行った。
【００９２】
グルホシネート噴霧の不在下（Ａ）、またはグルホシネート（リバティー（登録商標））の従来施用の１回処理（Ｂ）または２回処理（Ｃ）の場合で収量および成長力を決定した。
【００９３】
結果を図１にまとめる。ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１ハイブリッドの成長力は、非処理（Ａ）、グルホシネートアンモニウムでの１回処理（Ｂ）２回処理（Ｃ）のいずれの場合でも常にＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１の成長力より大きい。
【００９４】
ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１ハイブリッドは全体的に、ＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１ハイブリッドよりも早期に開花（開始および終了）する傾向があり、早期に成熟した。
【００９５】
上記のＡ、Ｂ、Ｃ型の圃場試験に関して収量も決定し、結果を図２にまとめる。ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１ハイブリッドは、ＭＳ−ＢＮ１／ＲＦ−ＢＮ１ハイブリッドよりも２〜５％高い収量を有する。
【００９６】
ＭＳ−Ｂ２／ＲＦ−ＢＮ１における回復は総ての遺伝子型および位置で完全であると見られた。
【００９７】
要約すると、本発明は、以下に符番した段落に記載される実施形態で表される。
１．ナタネ植物からハイブリッド種子を生産するための方法であって、
ａ．エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を含んでなる雄性不稔母本ナタネ植物を準備する工程；
ｂ．エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を好ましくはホモ接合型で含んでなる雄性稔性父本ナタネ植物を準備する工程；
ｃ．前記父本ナタネ植物からの花粉を前記母本ナタネ植物に受粉させる工程；
ｄ．前記母本植物からハイブリッド種子を採種する工程
を含んでなる、方法。
【００９８】
２．前記ナタネ植物がブラシカ・ナプス種またはブラシカ・ジュンセア種に属する、段落１に記載の方法。
【００９９】
３．その核ゲノム内に少なくとも１コピーのエリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）と少なくとも１コピーのエリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）とを含んでなるナタネ植物。
【０１００】
４．前記ナタネ植物がブラシカ・ナプス種またはブラシカ・ジュンセア種に属する、段落３に記載のナタネ植物。
【０１０１】
５．段落３のナタネ植物の細胞または組織または種子。
【０１０２】
６．ハイブリッド種子の生産において使用するためのナタネ植物のペアであって、前記ナタネ植物の一方がエリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を含んでなり、前記ナタネ植物の他方がエリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなる、ペア。
【０１０３】
７．段落２に記載のナタネ植物のゲノムＤＮＡ。
【０１０４】
８．エリートイベントＲＦ−ＢＮ１（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）を含んでなるブラシカ・ジュンセア植物または植物細胞。
【０１０５】
９．エリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなる段落５に記載のブラシカ・ジュンセア植物からの種子（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−７３０として寄託されている）。
【０１０６】
１０．エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）をさらに含んでなる、段落８に記載の植物または細胞。
【０１０７】
１１．トランスジェニックナタネ植物において種子収量を増大させるための、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）の使用。
【０１０８】
１２．前記ナタネ植物がブラシカ・ジュンセアである、段落１１に記載の使用。
【０１０９】
１３．ナタネ植物の収量を増大させるための方法であって、エリートイベントＭＳ−Ｂ２（前記エリートイベントを含んでなるリファレンス種子は、ＡＴＣＣに寄託番号ＡＴＣＣ＿ＰＴＡ  ２４８５またはＡＴＣＣ＿ＰＴＡ−８５０として寄託されている）を有する前記ナタネ植物を準備する工程を含んでなる、方法。
【０１１０】
１４．ハイブリッドＢ．ジュンセアの種子および植物を生産するための方法であって、
ａ．エリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなるＢ．ジュンセア植物とエリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなるＢ．ジュンセア植物を間作すること；
ｂ．植物を他家受粉させること；
ｃ．エリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなるＢ．ジュンセア植物からの種子を採種すること
を含んでなる、方法。
【０１１１】
１５．後代植物を生産するためまたは種子を生産するための、エリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなるＢ．ジュンセア植物の使用。
【０１１２】
１６．ＭＳ−Ｂ２を含んでなるＢ．ジュンセア植物に雄性稔性を回復させるためのＲＦ−ＢＮ１の使用。
【０１１３】
１７．ＲＦ−ＢＮ１を含んでなるＢ．ジュンセアのゲノムＤＮＡ。
【０１１４】
１８．ＭＳ−Ｂ２をさらに含んでなる、段落１７に記載のゲノムＤＮＡ。
【０１１５】
１９．そのゲノム内に配列番号５のヌクレオチド配列を有する配列と配列番号６のヌクレオチド配列を有する配列とを含んでなり、前記の配列と配列の間にバルスター阻害因子コード配列をさらに含んでなる、Ｂ．ジュンセア植物の細胞、植物または種子。
【０１１６】
２０．そのゲノム内に配列番号１のヌクレオチド配列を有する配列と配列番号２のヌクレオチド配列を有する配列とをさらに含んでなり、前記の配列と配列の間にバルナーゼ阻害因子コード配列をさらに含んでなる、段落１９に記載の植物細胞、植物または種子。
【０１１７】
２１．ハイブリッドＢ．ナパス種子および植物を生産するための方法であって、
ａ．エリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなるＢ．ナパス植物とエリートイベントＲＦ−ＢＮ１を含んでなるＢ．ナパス植物を間作すること；
ｂ．植物を他家受粉させること；
ｃ．エリートイベントＭＳ−Ｂ２を含んでなるＢ．ナパス植物から種子を採種すること
を含んでなる、方法。
【０１１８】
２２．ＲＦ−ＢＮ１を含んでなり、ＭＳ−Ｂ２をさらに含んでなる、Ｂ．ナパスのゲノムＤＮＡ。
【０１１９】
２３．そのゲノム内に、配列番号５のヌクレオチド配列を有する配列と配列番号６のヌクレオチド配列を有する配列（前記の配列と配列の間にバルスター阻害因子コード配列をさらに含んでなる）、ならびに配列番号１のヌクレオチド配列を有する配列と配列番号２のヌクレオチド配列を有する配列（前記の配列と配列の間にバルナーゼ阻害因子コード配列をさらに含んでなる）を含んでなる、Ｂ．ナパスの植物細胞、植物または種子。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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