(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活しており、
前記ペディオコッカス属菌が、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）であり、前記ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、またはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である、形質転換体。
【請求項２】
ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、前記欠失または失活している遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれている、請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活しており、前記ペディオコッカス属菌が、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）であり、前記ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、またはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である形質転換体の製造方法であって、
シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーターならびにペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む発現カセットならびにシゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーターならびにラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む発現カセット、または、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーター、ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子ならびにラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む発現カセットを、前記宿主に導入して形質転換体を得る工程を含み、
前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活した宿主を用いるか、または前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子を欠失または失活させる、
形質転換体の製造方法。
【請求項５】
ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、前記欠失または失活している遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項４に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項６】
前記ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子および前記ラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を、前記宿主の染色体に導入する、請求項４または５に記載の形質転換体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換体を培養液または発酵液中で培養または発酵し、該培養液または該発酵液からＤ−乳酸を取得する、乳酸の製造方法。
【請求項８】
濃度１〜５０質量％のグルコースまたはスクロースを含む培養液または発酵液を使用して培養または発酵を行う、請求項７に記載の乳酸の製造方法。
【請求項９】
前記形質転換体により産生されるＤ−乳酸により、前記培養液または発酵液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養または発酵を継続する、請求項７または８に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１０】
前記培養液または発酵液中の形質転換体の初発菌体濃度を０．１〜５０ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌとする、請求項７〜９のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１１】
前記形質転換体により産生された培養液または発酵液中のＤ−乳酸を中和することなく培養または発酵を継続する、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１２】
前記形質転換体により産生された培養液または発酵液中のＤ−乳酸を中和することなく、培養液または発酵液から乳酸を分離する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法に関する。より詳細には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）に、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込み、かつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子を欠失または失活させた形質転換体、該形質転換体の製造方法、ならびに該形質転換体を培養液または発酵液中で培養または発酵し、該培養液または該発酵液から乳酸を取得する乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は食品用途や、医療、化粧品等の化学原料用途に広く用いられている。また、乳酸を用いて得られるポリ乳酸は、微生物等により最終的に二酸化炭素と水にまで分解される生分解性プラスチックとして注目されている。そのため、乳酸を安価に高い生産性で製造することが必要である。【０００３】
乳酸の製造方法としては、乳酸菌により糖を発酵させ製造する生物学的方法が知られている。しかし、乳酸菌は耐酸性が低いため、この方法で高い生産性を得るには発酵により産生される乳酸をアルカリにより中和して乳酸塩とする必要がある。このようなアルカリによる中和を行う製造方法においては、乳酸塩を乳酸に戻す工程が必要となるため、製造工程が煩雑になり製造コストも高くなる。【０００４】
アルカリによる中和を行わずに乳酸を得る方法としては、酵母に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法がある。たとえば特許文献１には、シゾサッカロミセス・ポンベに、ヒト等の哺乳動物由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつシゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子を欠失または失活させた形質転換体を用いて乳酸発酵することにより、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造し得ることが開示されている。また、特許文献２には、培養培地中で培養した際に本質的にエタノールを産生しないサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に、ラクトバチルス・プランタラム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ)のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養することによりＬ−乳酸が得られることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０２１６２９号
【特許文献２】日本国特表２００７−５１２０１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性でＤ−乳酸を産生できるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の形質転換体および該形質転換体の製造方法を目的とする。
また、前記形質転換体を用いて、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造する方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活しており、前記ペディオコッカス属菌が、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）であり、前記ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、またはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である。
また、本発明に係る形質転換体においては、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、前記欠失または失活している遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。
さらに、前記Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれていることも好ましい。
【０００８】
また、本発明に係る形質転換体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活しており、前記ペディオコッカス属菌が、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）であり、前記ラクトバチルス属菌がラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、またはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）である形質転換体の製造方法であり、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーターならびにペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む発現カセットならびにシゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーターならびにラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む発現カセット、または、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーター、ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子ならびにラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を含む発現カセットを、前記宿主に導入して形質転換体を得る工程を含み、前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活した宿主を用いるか、または前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子を欠失または失活させる。
また、本発明に係る形質転換体の製造方法においては、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、前記欠失または失活している遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。
さらに、前記ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子および前記ラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を、前記宿主の染色体に導入することが好ましい。
【０００９】
また、本発明に係る乳酸の製造方法は、前記形質転換体を培養液または発酵液中で培養または発酵し、該培養液または該発酵液からＤ−乳酸を取得することを特徴とする。
本発明に係る乳酸の製造方法としては、濃度１〜５０質量％のグルコースまたはスクロースを含む培養液または発酵液を使用して培養または発酵を行うことが好ましい。また、前記形質転換体により産生されるＤ−乳酸により、前記培養液または発酵液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養または発酵を継続することが好ましく、前記形質転換体により産生された培養液または発酵液中のＤ−乳酸を中和することなく培養または発酵を継続することも好ましく、前記形質転換体により産生された培養液または発酵液中のＤ−乳酸を中和することなく、培養液または発酵液から乳酸を分離することも好ましい。さらに、前記培養液または発酵液中の形質転換体の初発菌体濃度を０．１〜５０ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌとすることも好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体は、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性でＤ−乳酸を産生できる。また、高濃度の糖、特にグルコース、フルクトース、スクロース、またはマルトースの存在下でのＤ−乳酸産生に適し、かつ高密度乳酸発酵にも適している。
前記形質転換体は、本発明に係る形質転換体の製造方法により簡便に得ることができる。
また、本発明に係る乳酸の製造方法は、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性でＤ−乳酸を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、組換えベクターｐＳＥの構造の模式図である。
【図２】図２は、組換えベクターｐＳＬｈの構造の模式図である。
【図３】図３は、例４において、連続発酵における発酵液中のグルコース、エタノールおよびＤ−乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示した図である。
【図４】図４は、例４において、連続発酵における発酵液中のＤ−乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））およびＤ−乳酸の対糖収率（％）の経時変化を示した図である。
【図５】図５は、例４において、連続発酵における発酵液ｐＨの経時変化を示した図である。
【図６】図６は、例５および例６において、連続発酵における発酵液中のグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示した図である。
【図７】図７は、例５および例６において、連続発酵における発酵液中のエタノールの濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示した図である。
【図８】図８は、例５および例６において、連続発酵における発酵液中のＤ−乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示した図である。
【図９】図９は、例５および例６において、連続発酵における発酵液中のＤ−乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））の経時変化を示した図である。
【図１０】図１０は、例５および例６において、連続発酵における発酵液中のＤ−乳酸の対糖収率（％）の経時変化を示した図である。
【図１１】図１１は、例５および例６において、連続発酵における発酵液ｐＨの経時変化を示した図である。
【図１２】図１２は、例５および例６において、連続発酵における発酵液中の生菌率の経時変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ポンベともいう）を宿主とし、ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつＳ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活している、形質転換体である。
【００１３】
＜Ｓ．ポンベ＞
宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下におけるＤ−乳酸の生産性に優れ、高密度発酵（大量の酵母を用いた発酵）にも適していることがわかった。そのため、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性でＤ−乳酸を製造できる。
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  Ｇｅｎｅ  ＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名や前記系統名で検索して、入手できる。
また、Ｓ．ポンベは公的あるいは民間の寄託機関、すなわち、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＹＣ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＢＲＣ、千葉県木更津市）、および酵母遺伝資源センター（ＹＧＲＣ、大阪市立大学大学院理学研究科内）などから入手できる。
【００１４】
＜ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子＞
Ｓ．ポンベにおけるピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう。）群には、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ１遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ２遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素３をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ３遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素４をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ４遺伝子」という。）の４種類がある。なかでも、Ｓ．ポンベにおいては、ＰＤＣ２遺伝子とＰＤＣ４遺伝子が主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。各ＰＤＣ遺伝子の系統名は以下の通りである。
ＰＤＣ１遺伝子（Ｐｄｃ１）；ＳＰＡＣ１３Ａ１１．０６
ＰＤＣ２遺伝子（Ｐｄｃ２）；ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ
ＰＤＣ３遺伝子（Ｐｄｃ３）；ＳＰＡＣ１８６．０９
ＰＤＣ４遺伝子（Ｐｄｃ４）；ＳＰＡＣ３Ｇ９．１１ｃ
前記ＰＤＣ遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名や系統名で検索して入手できる。
【００１５】
野生型Ｓ．ポンベでは、解糖系によりグルコースがピルビン酸まで代謝され、前述のＰＤＣ遺伝子から発現されるピルビン酸脱炭酸酵素によりピルビン酸がアセトアルデヒドに変換され、次いで該アセトアルデヒドがアルコール脱水素酵素によりエタノールへと変換されることでエタノール発酵が行われる。また、野生型Ｓ．ポンベは機能を持った乳酸脱水素酵素遺伝子（乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をコードする遺伝子、以下「ＬＤＨ遺伝子」ともいう。）を有していないことより、ピルビン酸から乳酸が生成するルートは存在しない。
一方、組み込まれたＬＤＨ遺伝子から発現されるＬＤＨは、ピルビン酸を乳酸に還元することにより乳酸を産生させる。そのため、野生型Ｓ．ポンベにＬＤＨ遺伝子を組み込んで乳酸を産生できるようにしただけでは、エタノール発酵と乳酸発酵の両方を行うことになるため、乳酸の生産性が充分に高くならない。
【００１６】
本発明に係る形質転換体は、前記ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、一部の遺伝子が欠失または失活した染色体を有する。形質転換体のＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活していることにより、形質転換体のエタノール発酵の効率が低下し、エタノールに変換されるピルビン酸量が少なくなるため、乳酸の生産性が向上する。ただし、ＰＤＣ遺伝子群を完全に欠失または失活させると、エタノール発酵が全く行えなくなって生育が阻害されるため、欠失または失活させるのはＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子とする。
【００１７】
欠失または失活させるＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ２遺伝子であることが特に好ましい。ＰＤＣ２遺伝子は、特に主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。
前述のように、ＰＤＣ遺伝子を全て欠失または失活させてしまうと、その形質転換体はエタノール発酵が行えなくなるために生育が阻害される。そのため、ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、生育に必要なエタノール発酵能を残して充分な形質転換体量が得られるようにしつつ、エタノール発酵能を低下させて乳酸の発酵効率を向上させられるように行わなければならない。この課題に対して本発明者等が検討を行った結果、ＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させるとＰＤＣ４遺伝子がある程度活性化し、充分な形質転換体量が得られる程度のエタノール発酵能と、高い発酵効率での乳酸の生産が両立できることを見い出した。
【００１８】
ＰＤＣ遺伝子の欠失や失活は、公知の方法で行うことができる。たとえば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁および国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることによりＰＤＣ遺伝子を欠失させることができる。
また、ＰＤＣ遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、または付加による変異を導入することにより、該ＰＤＣ遺伝子を失活させることもできる。欠失、挿入、置換、または付加による変異は、それらのいずれか１つのみを導入してもよく、２つ以上を導入してもよい。
【００１９】
ＰＤＣ遺伝子の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。
たとえば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．誌、１９９２年、第２巻、２８−３３頁）等が挙げられる。
【００２０】
また、一部に変異が導入されたＰＤＣ遺伝子は、温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現するものであってもよい。温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素とは、ある培養温度においては野生型のピルビン酸脱炭酸酵素と同等の活性を示すが、特定の培養温度以上になると活性の消失または低下が見られる酵素である。
変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現する突然変異株は、温度により活性が制限されない条件下では野生型酵母と同等の生育速度を示し、活性が制限される特定の温度条件下において生育速度が著しく低下するものを選択することで得ることができる。
【００２１】
＜ＬＤＨ遺伝子＞
本発明に係る形質転換体は、ＬＤＨ遺伝子を有する。前記のように、Ｓ．ポンベは本来ＬＤＨ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物のＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。
【００２２】
本発明に係る形質転換体は、ペディオコッカス属菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する。本発明に係る形質転換体は、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を１個ではなく、少なくとも２個以上有することにより、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の発現効率を高めることができ、ひいてはＤ−乳酸の生産効率が向上する。さらに、特定の微生物由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み合わせて有していることにより、Ｄ−乳酸をより大量に産生できる。
【００２３】
ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子としては、ペディオコッカス属菌が生来有しているＤ−ＬＤＨ遺伝子（野生型）に加えて、該Ｄ−ＬＤＨ遺伝子において１または数個の塩基が置換、挿入、または欠失され、Ｄ−ＬＤＨ活性を有する蛋白質をコードする変異遺伝子、該Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がコードするＤ−ＬＤＨにおいて１または数個のアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され、Ｄ−ＬＤＨ活性を有する蛋白質をコードする変異遺伝子、および該遺伝子の上流または下流に他のペプチド等をコードする塩基配列が付加された遺伝子も含む。ラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子についても同様である。
【００２４】
具体的には、ペディオコッカス属菌または由来のＤ−ＬＤＨとしては、たとえば、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のＤ−ＬＤＨ（ＰａＤＬＤＨ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＣＡＡ５０２７５．１）またはペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）のＤ−ＬＤＨ（ＰｐＤＬＤＨ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＪ６７９３５．１）が挙げられる。ラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨとしては、たとえば、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）のＤ−ＬＤＨ（ＬｐＤＬＤＨ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＡ１４３５２．１）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のＤ−ＬＤＨ（ＬｂＤＬＤＨ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＣＡＡ４２７８１．１）、またはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のＤ−ＬＤＨ（ＬｂｒＤＬＤＨ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦＲ１１４５９．１）が挙げられる。なお、ＧｅｎｂａｎｋはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースである。
【００２５】
本発明に係る形質転換体は、少なくとも１個のペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子または少なくとも１個のラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する。または、本発明に係る形質転換体は、少なくとも１個のペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子および少なくとも１個のラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する。本発明に係る形質転換体が有するペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子は、１個のみであってもよく、２個以上であってもよい。２個以上を有している場合、同種のペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子であってもよく、異種のペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子であってもよい。ラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子についても同様である。
【００２６】
［形質転換体の製造］
本発明に係る形質転換体は、ＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して得られる。また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを宿主とし、該Ｓ．ポンベにペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入して形質転換体を得て、その後得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることもできる。後述の実施例では、前者の方法で目的の形質転換体を製造したが、後者の方法でもほぼ同等の形質転換体を製造できる。いずれの方法においても、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子は、順次（順不同）導入してもよく、同時に導入してもよい。
【００２７】
以下、ＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入する方法を例に、形質転換体の製造方法を説明する。
【００２８】
＜宿主＞
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法が用いられる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、および国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．誌、１９９２年、第２巻、２８−３３頁）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）による削除または不活性化の方法である。
【００２９】
ＰＤＣ遺伝子が欠失または失活した変異体は、本発明に係る形質転換体を製造するための宿主として好ましく使用できる。また、前記ＰＤＣ遺伝子に加えて、さらにＰＤＣ遺伝子以外の特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベを宿主とすることもできる。プロテアーゼ遺伝子等を欠失または失活させることにより異種蛋白質の発現効率を高めることができ、本発明における宿主に適用することによりＤ−乳酸の生産効率の向上が期待できる。
【００３０】
さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いることができるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
【００３１】
また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを形質転換体製造のための宿主として使用することもできる。この場合の宿主としては、ＰＤＣ遺伝子以外の前記のような遺伝子（栄養要求性マーカーやプロテアーゼ遺伝子など）が欠失または失活しているものを使用できる。該宿主を用いて形質転換体を製造した後、得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることができる。
【００３２】
＜Ｄ−ＬＤＨ遺伝子導入方法＞
遺伝子工学的方法で宿主にＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに異種蛋白質の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、日本国特開平５−１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、日本国特開平１０−２３４３７５号公報、日本国特開２０００−２６２２８４号公報、日本国特開２００５−１９８６１２号公報、国際公開第２０１１／０２１６２９号などに記載の方法を使用できる。
【００３３】
＜発現カセット＞
発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子ならびに宿主内で機能するプロモーターおよびターミネーターを含む。本発明に係る形質転換体の製造において用いられる発現カセットは、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子の少なくとも一方と、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターとを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。１の発現カセットには複数のＤ−ＬＤＨ遺伝子が存在していてもよい。１の発現カセット中のＤ−ＬＤＨ遺伝子の数は１〜８が好ましく、１〜５がより好ましい。また、１の発現カセット中に複数のＤ−ＬＤＨ遺伝子が含まれている場合、２種類以上のＤ−ＬＤＨ遺伝子が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、１または複数のＤ−ＬＤＨ遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、および栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。
【００３４】
本発明に係る形質転換体の製造において、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子は、それぞれ別個の発現カセットにより宿主に導入してもよく、両遺伝子を１の発現カセットにより宿主に導入してもよい。ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットとしては、たとえば、５’末端側から、プロモーター、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子、切断配列、栄養要求性相補マーカー（たとえば、ｕｒａ４遺伝子）、ラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子、およびターミネーターを有する発現カセットが好ましい。
【００３５】
発現カセットに含めるペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子またはラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子の遺伝子配列としては、野生型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、野生型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
【００３６】
Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、本発明に係る形質転換体によりＤ−乳酸が蓄積して形質転換体の細胞内が酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能してＬＤＨの発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）やＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
【００３７】
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照）などが挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、日本国特開平５−１５３８０号公報、日本国特開平７−１６３３７３号公報、日本国特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
【００３８】
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターやＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、日本国特開平５−１５３８０号公報、日本国特開平７−１６３３７３号公報、日本国特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００３９】
＜ベクター＞
本発明に係る形質転換体は、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子およびラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセット、またはペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットとラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットの両方を、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。各発現カセットを含む形質転換体は、各発現カセットを含むベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
【００４０】
前記各発現カセットを含むベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＡＲＳ）を含むプラスミドであることが好ましい。一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造とし、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
【００４１】
前記各発現カセットを含むベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、栄養要求性相補マーカーである、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）およびイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
【００４２】
各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体にＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。また、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子は染色体に複数導入することもできる。本発明に係る形質転換体において、染色体に組み込まれたペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子の数は１〜２０が好ましく、特に１〜８が好ましい。また、該形質転換体の染色体に組み込まれたラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子の数は１〜２０が好ましく、特に１〜８が好ましい。
【００４３】
染色体にＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。たとえば、前記日本国特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法で染色体にＤ−ＬＤＨ遺伝子を複数導入できる。また、該方法で染色体にＤ−ＬＤＨ遺伝子を１個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に１個または複数のＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入することもできる。
ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子またはラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
【００４４】
ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
【００４５】
ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域や抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
【００４６】
染色体にＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み込む場合、ベクターは、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造であることが好ましい。すなわち、該ベクターが通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
【００４７】
ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
この場合、Ｓ．ポンベの染色体の相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、日本国特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、日本国特開平５−１５３８０号公報、日本国特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号、日本国特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法を用いてもよい。
【００４８】
＜標的部位＞
ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中のＤ−ＬＤＨ遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができ、これによりＤ−ＬＤＨの発現量を増大させ、Ｄ−乳酸の生産性を向上させることができる。たとえば、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを第１の標的部位を有するベクターに組み込み、ラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを第２の標的部位を有するベクターに組み込み、該ベクターを用いてＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活しているＳ．ポンベを宿主として形質転換することにより、本発明に係る形質転換体が得られる。
【００４９】
１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば日本国特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法に示された標的部位を使用できる。該方法を用いれば、異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込むこともできる。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、該方法は煩雑である。
【００５０】
染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、この複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込むことができる。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数のＤ−ＬＤＨ遺伝子が組み込まれている場合に比較して、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位にＬＤＨ遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際にＤ−ＬＤＨ遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
【００５１】
染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が好ましい。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
Ｎａｔｈａｎ  Ｊ．Ｂｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ，“Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌ  ＩＩ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ”，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００３  １３：１９８４−１９９７
【００５２】
染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込むことができる。この場合、２個以上のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。この場合、２個以上のＤ−ＬＤＨ遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くのＤ−ＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。Ｔｆ２の１３箇所すべてにベクターが組み込まれると、形質転換体の生存や増殖に対する負荷が大きくなりすぎるおそれがある。好ましくは、１３箇所のＴｆ２の８箇所以下にベクターが組み込まれることが好ましく、５箇所以下にベクターが組み込まれることがより好ましい。
【００５３】
＜形質転換方法＞
形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、日本国特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００５４】
Ｓ．ポンベ宿主を相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。本発明に係る形質転換体を製造する際の形質転換方法としては、上述のＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、その染色体に上述のベクターを用いて、発現カセットを相同組換えにより組み込む方法が好ましい。該方法によれば、本発明に係る形質転換体を簡便に製造できる。
【００５５】
形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地を用いてスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質（本発明においては、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨまたはラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ）の発現量を調べ、該異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整できる。ベクターの大きさ（塩基数）や構造により、組み込み効率や組み込み数も変化すると考えられる。
【００５６】
一般には発現カセットの数が多いほどＤ−ＬＤＨの発現効率が高まり、ひいてはＤ−乳酸の生産効率が高まると予想される。このため、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み込むことによりＤ−ＬＤＨの発現量を増大させ、Ｄ−乳酸の生産性を向上させることができると考えられる。しかし、発現カセットの数が多すぎると細胞の生存や増殖に対する負荷が増大し、ひいてはＤ−乳酸生産効率が低下することも考えられる。一方で、１の発現カセットに複数の遺伝子を含ませることにより、染色体に組み込む発現カセットの数を抑えつつ、多数のＤ−ＬＤＨ遺伝子を染色体に組み込むことができる。しかし、ベクターが大きくなると、染色体に組み込まれる確率が低下し、組み込まれるベクター数を多くすることが困難となり、ひいては形質転換体を得ること自体が困難となると考えられる。
【００５７】
そこで、本発明者等は、適度な大きさの発現カセットを染色体に比較的少数組み込んだ場合でも、より高いＤ−乳酸生産効率を有するＳ．ポンベ形質転換体を得るためには、Ｓ．ポンベにおける発現効率が高く、かつ発現したＤ−ＬＤＨの活性も高い外来Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を選択して導入することが必要であると考えた。様々な微生物由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を調べたところ、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子またはラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子をＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活しているＳ．ポンベ形質転換体に組み込むことにより、Ｄ−乳酸産生効率が非常に高い形質転換体が得られることがわかった。さらに驚くべきことに、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子とラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子をともに組み込むことによって、他の生物種由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み合わせて組み込んだ場合よりもＤ−乳酸産生効率が顕著に高い形質転換体が得られた。
【００５８】
［乳酸の製造方法］
本発明に係る乳酸の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体を発酵液中で発酵させ、該発酵液からＤ−乳酸を取得する乳酸の製造方法である。
本発明に係る形質転換体を、糖を含む発酵液中で発酵させることにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸がＤ−乳酸脱水素酵素により還元されてＤ−乳酸が産生され、発酵液に産出されたＤ−乳酸を発酵液から取得することで乳酸を製造できる。
【００５９】
Ｄ−乳酸の製造に用いる培養培地または発酵培地としては、糖を含有する公知の酵母向け培養培地または発酵培地を用いることができ、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養または発酵を効率良く行えるものであればよい。培養培地または発酵培地としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピドなどの発酵促進因子などを含ませることができる。
【００６０】
本発明に係る乳酸の製造方法では、糖として特にグルコースまたはスクロースを含有する発酵培地を用いることが好ましい。発酵初期の発酵液（１００質量％）中のグルコースまたはスクロース濃度は１質量％以上が好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、２〜１６質量％がさらに好ましい。発酵によりグルコース濃度またはスクロース濃度が低下することより、必要によりグルコースや発酵培地を添加して発酵を継続することが好ましい。発酵終期のグルコース濃度等は１質量％以下となってもよい。また、連続的に発酵槽からＤ−乳酸を含む発酵上清を回収すると共に発酵培地を供給する連続発酵を行う場合には、前記グルコース濃度等を維持することが好ましい。グルコース濃度等を２質量％以上とすることにより、Ｄ−乳酸の生産性がより向上する。また、発酵液中のグルコースまたはスクロースを１６質量％以下とすることにより、Ｄ−乳酸の生産効率がより向上する。
【００６１】
また、Ｄ−乳酸製造の生産性を高くするために、高密度発酵を行うことが好ましい。高密度発酵では、発酵液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５０ｇ／Ｌとすることが好ましい。発酵液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して１０〜４０ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集や精製効率の低下などの問題が生じるおそれがある。
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ６６０＝１は、１０００ｍLの培養液において分裂酵母乾燥重量の０．２ｇ、湿重量の０．８ｇに相当する。
【００６２】
酵母の培養または発酵には公知の方法を用いることができ、たとえば振とう培養もしくは振とう発酵、または攪拌培養もしくは攪拌発酵等により行うことができる。
また、培養温度または発酵温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間または発酵時間は適宜決定できる。
また、培養または発酵は、回分培養または回分発酵であってもよく、連続培養または連続発酵であってもよい。たとえば、回分発酵で発酵を行った後、菌体を発酵液から分離して、Ｄ−乳酸を含む発酵上清を取得できる。また、連続発酵法では、たとえば、発酵槽から発酵液の一部を抜き出し、抜き出した発酵液からＤ−乳酸を含む発酵上清を分離回収するとともに菌体を含む未分離液を発酵槽に戻し、該発酵槽に新たなグルコースや発酵培地を加える方法が挙げられる。連続発酵を行うことにより、Ｄ−乳酸の生産性がより向上する。
【００６３】
本発明に係る形質転換体を用いた乳酸の製造方法では、耐酸性に特に優れたＳ．ポンベを用いているため、乳酸の蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２〜４程度）となっても中和を行わずにＤ−乳酸を生産できる。そのため、発酵液のｐＨが３．５以下になった後も、連続発酵等によりさらに発酵を継続し、Ｄ−乳酸を製造できる。発酵終期のｐＨや連続発酵におけるｐＨは、１．５〜３．５が好ましく、特に２．３〜３．５が好ましい。Ｄ−乳酸の生産性を高くするために、発酵液のｐＨが３．５以下になった後にさらに発酵を継続することが好ましい。本発明に係る形質転換体は耐酸性が優れているため、該形質転換体により産生された発酵液中のＤ−乳酸を中和することなく発酵を継続できる。
【００６４】
発酵液からのＤ−乳酸の取得は、公知の方法を用いることができる。特に、発酵液中のＤ−乳酸を中和することなく、発酵液とＤ−乳酸を分離して、Ｄ−乳酸を取得することが好ましい。たとえば、発酵終了後の発酵液から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。また、場合によっては発酵液中のＤ−乳酸を中和した後発酵液と乳酸塩を分離して、Ｄ−乳酸を取得することもできる。たとえば、発酵液中のＤ−乳酸をカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、この中和塩を晶析する方法でＤ−乳酸を取得することもできる。
【００６５】
以上説明した本発明に係る乳酸の製造方法は、特に耐酸性に優れたＳ．ポンベを宿主とする形質転換体を用いるため、アルカリによる中和を行わなくても高い生産性で簡便にＤ−乳酸を製造できる。また、ＰＤＣ遺伝子群のうち一部の遺伝子が欠失または失活していることでエタノール発酵の効率が低下しているため、Ｄ−乳酸の対糖収率（消費された糖の量に対する乳酸の生産量の割合）が向上する。本発明においては、Ｄ−乳酸の対糖収率を５０％以上とすることが容易にできる。場合により、Ｄ−乳酸の対糖収率は７０％以上にも達する。また、本発明に係る乳酸の製造方法は、高濃度のグルコース存在下、および高濃度の形質転換体による高密度発酵にも適している。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。また、以下の実施例では、特に記載のないかぎり、Ｄ−乳酸を単に「乳酸」ともいう。【００６７】
［例１］  
＜Ｓ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株の作製＞
Ｓ．ポンベのウラシル要求性株ＡＲＣ０１０株（遺伝子型：ｈ−、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）をＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、および国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレットに記載）に従って形質転換し、ＰＤＣ２遺伝子（系統名：ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ）を削除した削除株（ＩＧＦ５４３株）を作製した。
削除断片の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ−）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。【００６８】
【表１】
0006499587.tif 000002
【００６９】
具体的には、ＵＦとＵＲでＵＰ領域を、ＯＦとＯＲでＯＬ領域を、ＤＦとＤＲでＤＮ領域をそれぞれＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれＦＦとＦＲを用いた同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、表２に示す塩基配列を有する２種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を用い、ＡＲＣ０３２株より同様に調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、同様のＰＣＲ法によって調製したＳ．ポンベのウラシル要求性マーカーｕｒａ４（ＧｅｎｅＤＢ収載の系統名ＳＰＣＣ３３０．０５ｃ、オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素遺伝子）領域断片も鋳型として合わせて使用した。【００７０】
【表２】
0006499587.tif 000003
【００７１】
得られたＳ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株（ＩＧＦ５４３株、ｈ−  ｌｅｕ１−３２ ｕｒａ４−Ｄ１８  ｐｄｃ２−Ｄ２３）は生育速度が遅いものであった。そこで、その生育速度を回復すべく、ＩＧＦ５４３株をＹＥＳプレート（イーストエキス０．５％、グルコース３％、ＳＰサプリメント）にストリークして２５℃にて培養し、得られたコロニーをＹＰＤ培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）に植え継ぎ２５℃にて培養し、充分に生育した培養液を用いてグリセロールストックを作製し、−８０℃にて保存した。前記作業を適切な生育速度が得られるまで繰り返し、生育速度の回復した株を作製した（名称はＩＧＦ５４３を継承）。【００７２】
［例２］  
＜Ｓ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株の作製＞
ＰａＤＬＤＨ遺伝子、ＰｐＤＬＤＨ遺伝子、ＬｂＤＬＤＨ遺伝子、ＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＬｆＤＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＧ２８１０６．１．）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＬｃＤＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＣＡＱ６７４０５．１．）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＬｐｌＤＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＣＣＣ７９３０１．１．）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＳａＤＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＢＡＢ９６３０９．１．）、またはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＤ−ＬＤＨ遺伝子（ＬｍＤＬＤＨ遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢＪ６２８４３．１．）を導入したＳ．ポンベ形質転換株を作製した（表１３）。【００７３】
具体的には、例１で作製したＩＧＦ５４３株（Ｓ．ポンベの遺伝子削除株）を、ＰａＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨ、ＰｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＰｐＤＬＤＨ、ＬｂＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｂＤＬＤＨ、ＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｂｒＤＬＤＨ、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨ、ＬｆＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｆＤＬＤＨ、ＬｃＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｃＤＬＤＨ、ＬｐｌＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｐｌＤＬＤＨ、ＳａＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＥ−ＳａＤＬＤＨ、またはＬｍＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＥ−ＬｍＤＬＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換した。【００７４】
単座組込型組換えベクターｐＳＥは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、分裂酵母用組込型ベクターｐＴＬ２Ｍ５（特許文献１参照。）を制限酵素ＡｆｌＩＩＩとＸｂａＩで二重消化して得られたＤＮＡ断片に、Ｓ．ポンベゲノムを鋳型とし配列番号１１、１２に示すプライマーセットによるＰＣＲにて増幅したｕｒａ４−ＯＲＦ断片をライゲーションして、ベクターｐＴＬ２Ｍ５−ｕｒａ４を得た。ｐＴＬ２Ｍ５−ｕｒａを制限酵素Ｂｓｔ１１０７Ｉで消化して得られたＤＮＡ断片と、全合成した制限酵素ＰｍｅＩとＰｍａＣＩの認識配列を含む配列番号１３のＤＮＡ断片をライゲーションしてｐＲＵベクターとした。得られたｐＲＵベクターを制限酵素ＰｍｅＩで消化し得られた断片に、Ｓ．ポンベゲノムを鋳型とし配列番号１４、１５に示すプライマーセットによるＰＣＲにて増幅したｅｆ１−ＤＷ断片を制限酵素ＰｍｅＩで消化して得られた断片をライゲーションして、ベクターｐＲＵ−ｅｆｄを得た。さらに得られたｐＲＵ−ｅｆｄベクターを制限酵素ＳｐｅＩで消化し得られた断片に、Ｓ．ポンベゲノムを鋳型とし配列番号１６、１７に示すプライマーセットによるＰＣＲにて増幅したｅｆ１−ＵＰ断片を制限酵素ＮｈｅＩで消化して得た断片をライゲーションして、配列番号１８にその配列（５’→３’、環状）を示すベクターｐＳＥ（７１８０ｂｐ、図１）を作製した。【００７５】
単座組込型組換えベクターｐＳＬｈは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ＤＮＡ全合成により作製された配列番号１９に示す配列Ｙ１を含むベクターを鋳型とし、配列番号２０、２１に示すプライマーセットによるＰＣＲ反応を行い、増幅したＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎIとＳｎａＢＩで二重消化してＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片と、ｐＳＬ１ベクターを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し得られた断片と、ｐＳＬ６ベクターを鋳型とし配列番号２２、２３に示すプライマーセットによるＰＣＲ反応により得たＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｉＷＩで消化し再び制限酵素ＫｐｎＩとＳｎａＢＩで二重消化して得られたＤＮＡ断片をライゲーションし、配列番号２４にその配列（５’→３’、環状）を示すｐＳＬｈ（５９３６ｂｐ、図２）を作製した。【００７６】
ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ペディオコッカス・アシディラクティシＮＢＲＣ３０７６株（ＮＢＲＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＩＴＥ）より入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＰａＤＬＤＨ−Ｆ、ＰａＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＰａＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＰａＤＬＤＨ（配列番号２７）をコードしていた。【００７７】
【表３】
0006499587.tif 000004
【００７８】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は該キットのマニュアルに則り行った。すなわち、得られたＰＣＲ産物をスピンカラムにより精製し、ｐＳＬｈと共にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応液に加え、５０℃、１５分間反応させた。【００７９】
ｐＳＬｈ−ＰｐＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＢＲＣ１０７７６８株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＰｐＤＬＤＨ−Ｆ、ＰｐＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＰｐＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＰａＤＬＤＨ（配列番号３０）をコードしていた。【００８０】
【表４】
0006499587.tif 000005
【００８１】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＰｐＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【００８２】
ｐＳＬｈ−ＬｂＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ブルガリクスＮＢＲＣ１３９５３株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｂＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｂＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｂＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｂＤＬＤＨ（配列番号３３）をコードしていた。【００８３】
【表５】
0006499587.tif 000006
【００８４】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｂＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【００８５】
ｐＳＬｈ−ＬｂｒＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ブレビスＮＢＲＣ１０７１４７株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表６に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｂｒＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｂｒＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｂｒＤＬＤＨ（配列番号３６）をコードしていた。【００８６】
【表６】
0006499587.tif 000007
【００８７】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｂＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【００８８】
ｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ペントーサスＮＢＲＣ１０６４６７株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｐＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｐＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｐＤＬＤＨ（配列番号３９）をコードしていた。【００８９】
【表７】
0006499587.tif 000008
【００９０】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【００９１】
ｐＳＬｈ−ＬｆＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ファーメンタムＮＢＲＣ３９５６株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｆＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｆＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｆＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｆＤＬＤＨ（配列番号４２）をコードしていた。【００９２】
【表８】
0006499587.tif 000009
【００９３】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｆＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【００９４】
ｐＳＬｈ−ＬｐｌＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・プランタラムＮＢＲＣ１５８９１株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表９に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｐｌＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｐｌＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｐｌＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｐｌＤＬＤＨ（配列番号４５）をコードしていた。【００９５】
【表９】
0006499587.tif 000010
【００９６】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｐｌＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【００９７】
ｐＳＬｈ−ＬｃＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・カゼイＮＢＲＣ１５８８３株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１０に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｃＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｃＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｃＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｃＤＬＤＨ（配列番号４８）をコードしていた。【００９８】
【表１０】
0006499587.tif 000011
【００９９】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＬｈに組み込んで、ｐＳＬｈ−ＬｃＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【０１００】
ｐＳＥ−ＳａＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、スタヒロコッカス・アウレウスＮＢＲＣ１０２１３５株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１１に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＳａＤＬＤＨ−Ｆ、ＳａＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＳａＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＳａＤＬＤＨ（配列番号５１）をコードしていた。【０１０１】
【表１１】
0006499587.tif 000012
【０１０２】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＥに組み込んで、ｐＳＥ−ＳａＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【０１０３】
ｐＳＥ−ＬｍＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ロイコノストック・メセンテロイデスＮＢＲＣ１００４９６株（ＮＢＲＣより入手）の培養物からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１２に記載の２種の合成オリゴＤＮＡ（ＬｍＤＬＤＨ−Ｆ、ＬｍＤＬＤＨ−Ｒ、オペロン社製）を使用し、ＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって、ＬｍＤＬＤＨ遺伝子のＯＲＦ断片を得た。当該ＯＲＦ断片は、ＬｍＤＬＤＨ（配列番号５４）をコードしていた。【０１０４】
【表１２】
0006499587.tif 000013
【０１０５】
得られた増幅断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法によりｐＳＥに組み込んで、ｐＳＥ−ＬｍＤＬＤＨを作製した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ法は、ｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨの作製と同様にして行った。【０１０６】
【表１３】
0006499587.tif 000014
【０１０７】
＜発酵試験＞
得られた各形質転換体をＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件下で２４時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度を３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件下で３または７時間発酵を行い、終了後、発酵液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。測定結果ならびに該測定結果より計算した、乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））、乳酸の対糖収率（％）、発酵終了後の乾燥菌体濃度（ｇ／Ｌ）、および乾燥菌体あたりの乳酸生産速度（ｇ／（ｇ・ｈ））を、発酵時間とともに表１４に示す。【０１０８】
【表１４】
0006499587.tif 000015
【０１０９】
この結果、ペディオコッカス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子であるＰａＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５５０株およびＰｐＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５５２株、ならびに、ラクトバチルス属菌由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子であるＬｂＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５３３株、ＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５３５株、ＬｆＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５４０株、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５４１株、ＬｃＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５３７株、およびＬｐｌＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ４５４５株では、乳酸産生が確認された。特に、ＡＳＰ４５５０株、ＡＳＰ４５３７株、ＡＳＰ４５４０株、およびＡＳＰ４５３３株は、対糖収率が５５％以上であり、非常に高かった。これに対して、ＬｍＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３４６２株およびＳａＤＬＤＨ遺伝子を導入したＡＳＰ３４６６株では、乳酸産生は確認されなかった。【０１１０】
［例３］  
＜Ｄ−ＬＤＨ遺伝子２コピー導入株の作製＞
例１で作製したＩＧＦ５４３株の染色体中の２箇所に、同種または異種の生物由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を導入した形質転換体を作製し、それぞれの乳酸産生能を調べた。ウラシル要求性およびロイシン要求性を回復させた株であって、ＰａＤＬＤＨ遺伝子が２コピー導入された株をＡＳＰ４７０７株、ＰａＤＬＤＨ遺伝子とＬｐＤＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ４１５６株、ＰａＤＬＤＨ遺伝子とＬｂＤＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ４７０３株、ＰａＤＬＤＨ遺伝子とＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ４７０４株、ＰａＤＬＤＨ遺伝子とＰｐＤＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ４７０８株、ＬｆＤＬＤＨ遺伝子とＬｐＤＬＤＨ遺伝子が１コピーずつ導入された株をＡＳＰ４７５２株とした（表１５）。【０１１１】
具体的には、まず、例１で作製したＩＧＦ５４３株（Ｓ．ポンベのＰＤＣ２遺伝子削除株）を、ＰａＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＥ−ＰａＤＬＤＨ、またはＬｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＥ−ＬｐＤＬＤＨの制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換し、ＰａＤＬＤＨ遺伝子が１コピー導入されたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株（ＡＳＰ３４７２株）またはＬｐＤＬＤＨ遺伝子が１コピー導入されたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株（ＡＳＰ３４６８株）を作製した。【０１１２】
ｐＳＥ−ＰａＤＬＤＨは、以下に示す工程で作製した。すなわち、例２で作製したｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＰａＤＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＳＥに組み込んで、ｐＳＥ−ＰａＤＬＤＨを作製した。【０１１３】
同様にして、例２で作製したｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨより発現カセット（ｈＣＭＶプロモーター／ＬｐＤＬＤＨ−ＯＲＦ／ＬＰＩターミネ―ター）を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉを用いた二重消化によって切り出し、ｐＳＥに組み込んで、ｐＳＥ−ＬｐＤＬＤＨを作製した。【０１１４】
得られたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子１コピー導入株に対して、それぞれＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸）処理を行ってｕｒａ４遺伝子を除去した後、例２で作製したＰａＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＰａＤＬＤＨ、ＰｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＰｐＤＬＤＨ、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｐＤＬＤＨ、ＬｂＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｂＤＬＤＨ、ＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｂｒＤＬＤＨ、またはＬｆＤＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターｐＳＬｈ−ＬｆＤＬＤＨを用い、岡崎らの方法（Ｏｋａｚａｋｉほか、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．誌、１９９０年、１８巻、６４８５−６４８９頁）により形質転換し、Ｌｅｕ１座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＰａＤＬＤＨ遺伝子、ＰｐＤＬＤＨ遺伝子、ＬｐＤＬＤＨ遺伝子、ＬｂＤＬＤＨ遺伝子、ＬｂｒＤＬＤＨ遺伝子、またはＬｆＤＬＤＨ遺伝子をさらに１コピー導入したＳ．ポンベＤ−ＬＤＨ遺伝子２コピー導入株を作製した。【０１１５】
得られたＳ．ポンベＬＤＨ遺伝子２コピー導入株に対して、それぞれＦＯＡ処理を行ってｕｒａ４遺伝子を除去した後、ｌｅｕ１遺伝子断片（配列番号５５）およびｕｒａ４遺伝子断片（配列番号５６）を用いて形質転換を行い、ウラシル要求性およびロイシン要求性を回復させた株を作製した。【０１１６】
＜発酵試験＞
例２と同様にして、各Ｓ．ポンベＬＤＨ遺伝子２コピー導入株をそれぞれＹＰＤ６液体培地に植菌して培養し、回収した菌体について１１．１％グルコース水溶液中で発酵を行い、終了後、発酵液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。また、乳酸の光学純度を、配位子交換型カラムを用いて光学異性体を分離し測定した。光学純度は、各光学異性体のピークエリア面積から、下記式により算出して求めた。
式：［光学純度（％ｅｅ）］＝（［Ｄ体］−［Ｌ体］）／（［Ｄ体］＋［Ｌ体］）×１００
（［Ｄ体］：Ｄ−乳酸のピークエリア面積、［Ｌ体］：Ｌ−乳酸のピークエリア面積）【０１１７】
発酵時間、測定結果ならびに該測定結果より計算した、Ｄ−乳酸の対糖収率（％）およびＤ−乳酸の光学純度（％ｅｅ）を表１５に示す。対照として、ＦＯＡ処理を行ったＰａＤＬＤＨ遺伝子１コピー導入株（ＡＳＰ３４７２株）についても同様に発酵試験を行った【０１１８】
【表１５】
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【０１１９】
ペディオコッカス属由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を２コピー導入したＡＳＰ４７０７株およびＡＳＰ４７０８株の対糖収率は７０％に届かず、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を１コピーのみ導入したＡＳＰ３４７２株に比べてさほど乳酸産生能の向上はみられなかった。また、ラクトバチルス属由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を２コピー導入したＡＳＰ４７５２株は、２コピー導入されているにもかかわらず、１コピー導入株であるＡＳＰ３４７２株よりも対糖収率が低かった。これに対して、ペディオコッカス属由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子とラクトバチルス属由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み合わせて導入したＡＳＰ４１５６株、ＡＳＰ４７０３株、およびＡＳＰ４７０４株の対糖収率は、いずれも７５％以上であり、ＡＳＰ３４７２株よりも顕著に高かった。該結果から、ペディオコッカス属由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子とラクトバチルス属由来のＤ−ＬＤＨ遺伝子を組み合わせて導入することにより、他の組み合わせよりも顕著に乳酸の産生能が高い形質転換体が得られることがわかった。【０１２０】
［例４］  
＜ＬｐＤＬＤＨ遺伝子／ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株のフェッドバッチ培養＞
ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）５ｍＬに、ＡＳＰ４１５６株（ＬｐＤＬＤＨ遺伝子／ＰａＤ−ＬＤＨ遺伝子導入株）を植菌し、試験管にて３２℃で２４時間培養した（前培養１）。さらに、ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）２００ｍＬに、前培養１で得られた培養液４ｍＬを植菌し、１Ｌ容坂口フラスコにて３２℃で３０時間培養した（前培養２）。
次いで、５Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、表１６に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた初発培地（１Ｎの硫酸水溶液を用いてｐＨ４．５に調整済。）１８００ｍＬに、前培養２で得られた培養液２００ｍＬを加え、３０℃で培養を開始した。尚、表１６の各成分の濃度は、前培養２植菌後の体積における濃度を示す。培養開始から３９時間後に、表１７に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた流加培地（１Ｎの硫酸水溶液を用いてｐＨ４．５に調整済。）を用いて流加を開始した。培養開始から１１７時間後に、培養を終了した。培養中は１２．５％アンモニア水の添加制御により、ｐＨの下限値を４．５に保った。【０１２１】
【表１６】
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【０１２２】
【表１７】
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【０１２３】
＜ＬｐＤＬＤＨ遺伝子／ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株の連続発酵＞
フェッドバッチ培養終了後の培養液から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体を表１８に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた発酵培地に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１８０）になるように接種したものを発酵液とした。該発酵液５００ｍＬをクロスフロー方式の精密濾過膜が接続された１Ｌ容ジャーファーメンター中に移した。その後、該発酵液をジャーファーメンターから該精密濾過膜を通り再びジャーファーメンターに戻る経路で循環させた状態とした。そして、一定流量で発酵培地の供給および膜濾過液の引抜きを行う連続発酵を、２８℃で１６３時間行った。その際、希釈率は０．０６６（１／ｈ）とした。該連続発酵では、菌体のサイズよりも小さい細孔径の精密濾過膜を用いているため、菌体は槽内へ還流され、１６３時間の連続発酵中においてリサイクルされた。アルカリを用いたｐＨの中和は行わず、連続発酵中に発酵液のｐＨは２．３まで低下した。【０１２４】
【表１８】
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【０１２５】
ＡＳＰ４１５６株の連続発酵における発酵液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を図３に、乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））および乳酸の対糖収率（％）の経時変化を図４に、発酵液ｐＨの経時変化を図５にそれぞれ示す。発酵液ｐＨは、サンプリングした発酵液についてポータブルｐＨ計で測定した。フェッドバッチ培養により取得した菌体を用いて連続発酵を１６３時間行った結果、発酵終了時の乳酸生産速度は５．１ｇ／（Ｌ・ｈ）、乳酸の対糖収率は７１％であった。発酵開始から１８時間後に、乳酸濃度は７０ｇ／Ｌ以上に増加し、発酵１６３時間後程度まで維持された。連続発酵中は、アルカリを用いたｐＨの中和は行わず、ｐＨは２．３まで低下したが、５ｇ／（Ｌ・ｈ）程度の乳酸生産速度が維持された。【０１２６】
連続発酵終了時点での発酵液中の乳酸の光学純度を、例３と同様にして、配位子交換型カラムを用いて光学異性体を分離し測定したところ、Ｄ−乳酸の光学純度は９９.２８％ｅｅを示した。【０１２７】
[例５]
＜ｕｒａ４を復帰したＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株（ＡＳＰ４８７８）の作製＞
ｐＳＥを制限酵素ＢｓｉＷＩで消化したＤＮＡ断片を用いてＰａＤＬＤＨが導入されているＡＳＰ４５５０株を形質転換し、得られた形質転換体をＡＳＰ４８７８と名付けた。【０１２８】
＜ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株のフェッドバッチ培養＞
ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）５ｍＬに、ＡＳＰ４８７８株（ｕｒａ４復帰ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株）を植菌し、試験管にて３２℃で２４時間培養した（前培養１）。さらに、ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）２００ｍＬに、前培養１で得られた培養液４ｍＬを植菌し、１Ｌ容坂口フラスコにて３２℃で２４時間培養した（前培養２）。
次いで、例４と同様の初発培地、流加培地およびｐＨ制御用アルカリを用いて、フェッドバッチ培養を行った。５Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、初発培地１８００ｍＬに、前培養２で得られた培養液２００ｍＬを加え、３０℃で培養を開始した。培養開始から２４時間後に、流加培地を用いて流加を開始した。培養開始から７１時間後に、培養を終了した。培養中はｐＨの下限値を４．５に保った。フェッドバッチ培養終了時の菌体濃度は、３８．７ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１９６）を示した。【０１２９】
＜ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株の連続発酵＞
フェッドバッチ培養終了後の培養液５００ｍＬを、１Ｌ容ジャーファーメンター中に移し、例４と同様にクロスフロー方式の精密濾過膜を通して循環させた状態とした。そして、例４と同様の条件にて、一定流量で発酵培地の供給および膜濾過液の引抜きを行い１６６時間の連続発酵を行った。例４と同様にアルカリを用いたｐＨの中和は行わず、連続発酵中に発酵液のｐＨは２．５まで低下した。【０１３０】
［例６］
＜ＬｐＤＬＤＨ遺伝子／ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株のフェッドバッチ培養（その２）＞
ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）５ｍＬに、ＡＳＰ４１５６株（ＬｐＤ−ＬＤＨ遺伝子／ＰａＤ−ＬＤＨ遺伝子導入株）を植菌し、試験管にて３２℃で２４時間培養した（前培養１）。さらに、ＹＥＳ培地（ｐＨ４．５）１２０ｍＬに、前培養１で得られた培養液２．４ｍＬを植菌し、５００ｍＬ容坂口フラスコにて３２℃で３０時間培養した（前培養２）。
次いで、例４と同様の初発培地、流加培地およびｐＨ制御用アルカリを用いて、フェッドバッチ培養を行った。３Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、初発培地１０８０ｍＬに、前培養２で得られた培養液１２０ｍＬを加え、３０℃で培養を開始した。培養開始から３９時間後に、流加培地を用いて流加を開始した。培養開始から１３４時間後に、培養を終了した。培養中は、ｐＨの下限値を４．５に保った。フェッドバッチ培養終了時の菌体濃度は、２８．７ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１４５）を示した。【０１３１】
＜ＬｐＤＬＤＨ遺伝子／ＰａＤＬＤＨ遺伝子導入株の連続発酵（その２）＞
フェッドバッチ培養終了後の培養液６２５ｍＬを、１Ｌ容ジャーファーメンター中に移し、例４と同様にクロスフロー方式の精密濾過膜を通して循環させた状態とした。菌体濃度を高めるために１２５ｍＬの膜濾過液を引抜いた。その後、例４と同様の条件にて、一定流量で発酵培地の供給および膜濾過液の引抜きを行い１６８時間の連続発酵を行った。例４と同様にアルカリを用いたｐＨの中和は行わず、連続発酵中に発酵液のｐＨは２．３まで低下した。【０１３２】
例６のＡＳＰ４１５６株の連続発酵（その２）および例５のＡＳＰ４８７８株の連続発酵の結果を比較し、発酵液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の各濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化をそれぞれ図６、図７および図８に示す。なお、発酵開始時に含まれている乳酸は、乳酸発酵用の菌体取得のために行われたフェッドバッチ培養段階で副成した乳酸の持ち込み分である。さらに、乳酸生産速度（ｇ／（Ｌ・ｈ））および乳酸の対糖収率（％）の経時変化を図９および図１０に、発酵液ｐＨおよび生菌率の経時変化を図１１および図１２にそれぞれ示す。生菌率は、発酵液をトリパンブルー染色液と等量混合し、検鏡観察にて染色された死細胞数と未染色の生細胞数をそれぞれ計数し、算出した。
Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を２コピー導入したＡＳＰ４１５６株では、発酵終了時（連続発酵１６８時間）の乳酸生産速度は５．５ｇ／（Ｌ・ｈ）、乳酸の対糖収率は６９％、生菌率は５８％を示した。これに対し、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を１コピー導入したＡＳＰ４８７８株では、発酵終了時（連続発酵１６６時間）の乳酸生産速度は２．４ｇ／（Ｌ・ｈ）、乳酸の対糖収率は５４％、生菌率は２５％を示した。ＡＳＰ４１５６株では、連続発酵中にＤ−乳酸濃度の低下はみられなかったが、ＡＳＰ４８７８株では発酵４７時間以降でＤ−乳酸濃度が減少傾向を示し、ＡＳＰ４１５６株と比較して乳酸の対糖収率も１０％以上低く、生菌率の低下傾向も顕著であった。【０１３３】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０１３年１１月２２日出願の日本特許出願２０１３−２４２２３６に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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