(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重ライゲーション依存性プローブ増幅による、複数の異なる標的核酸を１回の実行で検索する方法であって、
（ａ）少なくとも１００の異なる、ゲノムＤＮＡである標的核酸を検索するためのサンプル組織を提供するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１００の異なる標的核酸のそれぞれに対する複数の異なるプローブセットであって、各々が、
第１のアダプター配列および第１の標的特異的部分からなる第１の遺伝子座特異的プローブと、
第２のアダプター配列、および前記第１の標的特異的部分に隣接する第２の標的特異的部分からなる第２の遺伝子座特異的プローブと
を含むプローブセットを提供するステップと、
（ｃ）前記複数の異なるプローブセットを前記少なくとも１００の異なる標的配列にハイブリダイズさせて、少なくとも１００のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、
（ｄ）前記少なくとも１００のハイブリダイゼーション複合体を連結して、少なくとも１００の連結プローブを形成するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１００の連結プローブを増幅して少なくとも１００のアンプリコンを形成するステップであって、前記第１のアダプター配列に相補的な領域を含む第１のユニバーサルプライマーと、前記第２のアダプター配列に相補的な領域を含む第２のユニバーサルプライマーとを用いて実行される増幅ステップと、
（ｆ）前記少なくとも１００のアンプリコンのそれぞれを配列決定することによって、長さに関係なく前記複数のアンプリコンを検出システムで検出するステップと
を有してなる方法。
【請求項２】
前記少なくとも１００の異なる標的核酸のそれぞれについてコピー数を決定するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００よりも多いことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００〜５００の範囲の標的核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００〜１，０００の範囲の標的核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１００の異なる標的核酸が１００〜１０８の範囲の標的核酸であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記検出システムが合成によるシークエンシングを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記検出システムが、前記少なくとも１００の異なるアンプリコンを含むアレイにおいて合成によりシークエンシングのサイクルを実施するように形成された流体取扱いシステムを備え、該検出システムが、放射線を線源から前記アレイへ方向付け、前記アレイからの蛍光発光をカメラへ方向付けるように形成され、該検出システムが、前記アレイへ方向付けられた放射線の暴露レベルを増大させるために前記検出システムを自動的に変更し、増大された暴露レベルにおいて前記アレイから前記カメラへの蛍光発光を検出するように形成されたシステムコントロールインターフェースを備えることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
一塩基多型を検出するステップを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１００の異なる標的核酸の少なくとも一部分のメチル化度を決定するステップを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１００の異なるアンプリコンの配列を決定するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示される実施形態は核酸に関し、より詳細には、標的核酸配列の多重検出のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）は、特に、単一の実験においていくつかの標的核酸のコピー数の評価を可能にする多重ＰＣＲ技術である。ＭＬＰＡにおいて、検索される各標的核酸は、連結プローブの増幅によって検出される。連結プローブは、対象の標的核酸配列に沿って互いに隣接して存在するように設計された一対のハーフプローブを含むプローブセットのハイブリダイゼーションおよびライゲーションによって生成される。ハーフプローブが標的核酸にハイブリダイズしたときにだけ、ライゲーションおよびその後の増幅が起こり得る。
【０００３】
図１は、典型的なＭＬＰＡアッセイの流れ図を示す。アッセイは、ＤＮＡサンプルの変性、およびプローブセットのその標的核酸配列へのハイブリダイゼーションから始まる。ハイブリダイゼーションの後、隣接するハーフプローブは連結され、結果として得られる連結プローブセットはＰＣＲ増幅を受ける。次に、増幅された連結プローブセットは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって分析される。ＣＥ読出し情報のピーク高さは、ゲノム標的コピー数に対する読出し情報としての役割を果たす。
【０００４】
図１に示されるように、各プローブセットは、標的特異的配列およびユニバーサルプライマー配列を有する５’および３’ハーフプローブから構成され、全ての連結プローブセットの同時多重ＰＣＲ増幅を可能にする。さらに、一方（図１に示される通り）または両方のハーフプローブは、ＣＥによる増幅プローブの検出における区別を容易にするスタッファー配列をさらに含む。核酸の長さに基づくＣＥ検出を可能にするためのこれらのスタッファー配列の使用は、１回の実行で検索され得る標的核酸の数に制限を課している。現在、その制限は約４０標的核酸である。低コスト、高スループットの可能性、およびＭＬＰＡに関連する小さい再配列を検出する能力のために、１回の実行で検索することができる標的核酸配列の数を拡大することは有益であろう。本開示は、検索数のこのような拡大のための方法を提供し、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書で説明される実施形態によると、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイにおいて検索することができる標的核酸の数を増大させるための方法が提供されている。
【０００６】
いくつかの態様において、本明細書に開示される実施形態は、（ａ）複数の異なる標的核酸を検索するためのサンプル組織を提供するステップと、（ｂ）複数の異なる標的核酸のそれぞれに対して複数の異なるプローブセットを提供するステップであって、各プローブセットが、第１のアダプター配列および第１の標的特異的部分を含む第１の遺伝子座特異的プローブと、第２のアダプター配列、および第１の標的特異的部分に隣接する第２の標的特異的部分を含む第２の遺伝子座特異的プローブとを含むステップと、（ｃ）複数の異なるプローブセットを複数の異なる標的配列にハイブリダイズさせて、複数のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、（ｄ）複数のハイブリダイゼーション複合体を連結して、複数の連結プローブを形成するステップと、（ｅ）複数の連結プローブを増幅して複数のアンプリコンを形成するステップであって、第１のアダプター配列に相補的な領域を含む第１のユニバーサルプライマーと、第２のアダプター配列に相補的な領域を含む第２のユニバーサルプライマーとを用いて実行される増幅ステップと、（ｈ）複数のアンプリコンのそれぞれを配列決定することによって、長さに関係なく複数のアンプリコンを検出システムで検出するステップとを有してなる、多重ライゲーション依存性プローブ増幅のための方法を提供する。
【０００７】
他の態様において、本明細書に開示される実施形態は、複数のアンプリコンを含むアレイにおいて合成によりシークエンシングのサイクルを実施するように形成された流体取扱い（ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｈａｎｄｌｉｎｇ）システムを備え、放射線を線源からアレイへ方向付け、アレイからの蛍光発光をカメラへ方向付けるように形成された検出システムであって、アレイへ方向付けられた放射線の暴露レベルを増大させるために検出システムを自動的に変更し、増大された暴露レベルにおいてアレイからカメラへの蛍光発光を検出するように形成されたシステムコントロールインターフェースを備える検出システムを提供するステップと、多重ライゲーション依存性プローブ増幅によって複数のアンプリコンを提供するステップと、複数のアンプリコンの配列を決定するステップとを有してなる方法を提供する。
【０００８】
本発明の実施形態をより良く理解するために、添付図面を参照することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】キャピラリー電気泳動検出システムを用いる多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）の流れ図を示す。
【図２】本明細書に開示される実施形態に従う、ＭＬＰＡ−合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）の流れ図を示す。
【図３】本明細書に開示される実施形態に従う、インデキシングを用いるＭＬＰＡ−ＳＢＳの流れ図を示す。
【図４】デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子に関連する７９のエクソンについてエクソン番号に対する読取りカウントのプロットを示しており、本明細書に開示される実施形態に従って、男性、女性、および対照サンプルにおいてコピー数変化を検出するための１回実行型のＭＬＰＡ−ＳＢＳシステムの使用が実証される。
【図５】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図４とは別の例を示す。女性サンプルは上方面にあり、男性サンプルは下方面に示される。四角の枠内に強調されるのは、エクソン３〜１７における欠失を有する男性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０３７８２）からの読取りカウントである。
【図６】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン４６〜５０における欠失を有する男性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０３９２９）からの読取りカウントである。
【図７】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン４９〜５２における欠失を有する女性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０４０９９）からの読取りカウントである。
【図８】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン４９〜５２における欠失を有する男性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０４１００、ＮＡ０４０９９の息子）からの読取りカウントである。
【図９】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン４４における欠失を有する女性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０４３１５）からの読取りカウントである。
【図１０】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン５〜７における重複を有する男性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０４３２７）からの読取りカウントである。
【図１１】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン５１〜５５における欠失を有する男性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０４３６４）からの読取りカウントである。
【図１２】ＤＭＤ遺伝子のエクソン番号に対する規格化読取りカウントの、図５とは別の例を示す。四角の枠内に強調されるのは、エクソン４５〜５３における欠失を有する男性（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＤＮＡサンプルｉｄ  ＮＡ０４９８１）からの読取りカウントである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の説明において、本明細書に開示される本発明の実施形態の範囲から逸脱することなく他の実施形態が利用され、構造および操作上の変化が成され得ることは理解される。
【００１１】
本明細書に開示される実施形態によると、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）アッセイにおいて検索することができる標的核酸の数を、１回の実行につき約４０標的核酸配列である現在の制限から実質的に増大させることができる方法が提供される。例えば、増幅産物の検出のために合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）システムを使用すると、ＣＥベースの検出システムにより設定される検索数制限を取り除くことができる。実際的な見地から、本明細書に開示される方法で検索される標的配列の数は、適切なプローブセットの利用可能性によってのみ制限されることが必要である。
【００１２】
さらに、ＳＢＳ検出システムの使用は、増幅プローブ産物を区別するための手段としてスタッファー配列の必要性を排除することによってプローブセット設計を簡単にすることができ、従ってプローブセットの開発に関連するコストが低減され得る。ＳＢＳ検出システムは、増幅プローブの長さに無関係な方法で、プローブセットの任意選択のインデキシングを利用し得る。有利に、ＳＢＳ検出システムをインデキシングと共に使用すると、例えば、多数の患者／組織サンプルの同時検索が容易になり得る。最後に、ＳＢＳ検出は増強された検出感度を提供することができ、ＣＥベースの技術と比べてサンプルサイズの減少が可能になる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、（ａ）複数の異なる標的核酸を検索するためのサンプル組織を提供するステップと、（ｂ）複数の異なる標的核酸のそれぞれに対して複数の異なるプローブセットを提供するステップであって、各プローブセットが、第１のアダプター配列および第１の標的特異的部分を含む第１の遺伝子座特異的プローブと、第２のアダプター配列、および第１の標的特異的部分に隣接する第２の標的特異的部分を含む第２の遺伝子座特異的プローブとを含むステップと、（ｃ）複数の異なるプローブセットを複数の異なる標的配列にハイブリダイズさせて、複数のハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、（ｄ）複数のハイブリダイゼーション複合体を連結して、複数の連結プローブを形成するステップと、（ｅ）複数の連結プローブを増幅して複数のアンプリコンを形成するステップであって、第１のアダプター配列に相補的な領域を含む第１のユニバーサルプライマーと、第２のアダプター配列に相補的な領域を含む第２のユニバーサルプライマーとを用いて実行される増幅ステップと、（ｆ）複数のアンプリコンのそれぞれを配列決定することによって、長さに関係なく複数のアンプリコンを検出システムで検出するステップとを有してなる、多重ライゲーション依存性プローブ増幅のための方法が提供される。
【００１４】
本明細書に開示される実施形態は、プライマーおよびプローブ／プローブセットとしていくつかの異なる核酸を提供する。本明細書で使用される場合、「核酸」または文法的等価物は、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。核酸は通常リン酸ジエステル結合を含有し得るが、場合により、特にプローブと共に使用する場合には、例えば、ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４），Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；ならびにＰａｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１  ９１９８６））、ホスホロチオアート（Ｍａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号明細書）、ホスホロジチオアート（Ｂｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９）、Ｏ−メチルホスホルアミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、およびペプチド核酸主鎖および結合（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７（１９９６）を参照、これらは全て参照によって援用される）を含む代替主鎖を有し得る核酸類似体も含むことができる。他の類似体核酸には、正に帯電した主鎖（Ｄｅｎｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５））、非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号明細書、同第５，６３７，６８４号明細書、同第５，６０２，２４０号明細書、同第５，２１６，１４１号明細書および同第４，４６９，８６３号明細書；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９９４）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ３，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．��ａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９８６））、および非リボース主鎖（米国特許第５，２３５，０３３号明細書および同第５，０３４，５０６号明細書、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されるものを含む）を有するものが含まれる。１つまたは複数の炭素環糖を含有する核酸も核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）ｐｐ１６９−１７６を参照）。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ，Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎ．２，１９９７  ｐａｇｅ  ３５に記載されている。また核酸は「ロックド核酸」でもあり得る。これらの参考文献は全て、参照によってその全体が本明細書に明確に援用される。標識の付加を容易にするため、または例えば生理環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大させるために、リボース−リン酸主鎖の修飾が成されてもよい。当業者によって認識されるように、これらの核酸類似体は全て、本明細書に開示される方法においてプローブとしての利用を見出すことができる。さらに、天然に存在する核酸および類似体の混合物も調製することができる。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然に存在する核酸および類似体の混合物が使用されてもよい。
【００１５】
本明細書に開示される方法において使用されるプライマーおよびプローブ核酸のサイズは、当業者によって認識されるように、各ユニバーサルプライマーおよびハーフプローブの各部分によって異なることができ、ハーフプローブの全長は通常約５から約５００ヌクレオチド長まで様々である。プローブセットのハーフプローブの各部分は、約１０〜約１００のヌクレオチド長、約１５〜約５０のヌクレオチド長、または約１０〜約３５のヌクレオチド長の範囲（間の全ての部分範囲も含む）であり得る。例えば、ハーフプローブのアダプター配列は１５〜２５ヌクレオチド長の範囲であり、通常は２０ヌクレオチド長であり得る。各ハーフプローブの標的特異的部分は、約１５〜約５０ヌクレオチド長、または約３０〜約４０ヌクレオチド長の範囲（間の全ての部分範囲も含む）であり得る。従って、連結産物（２つのハーフプローブのライゲーション）における標的配列の全長は、約３０〜約１００ヌクレオチド長、または約６０〜約８０ヌクレオチド長の範囲（間の全ての部分範囲も含む）であり得る。
【００１６】
本明細書に開示される方法は、複数の標的プローブセットを提供する。「プローブセット」は、ＭＬＰＡアッセイにおいて使用される複数の遺伝子座特異的ハーフプローブ対を包含する。これに関連して、複数とは、アッセイ、サンプルおよび試験目的に応じて少なくとも２、または少なくとも１０、または少なくとも５０、または少なくとも１００などを意味する。
【００１７】
「ユニバーサルプライミング部位」とは、本明細書では、増幅のためのＰＣＲプライマーに結合し得るものの配列を意味する。各ハーフプローブは、上流ユニバーサルプライミング部位（ＵＵＰ）または下流ユニバーサルプライミング部位（ＤＵＰ）のいずれかを提供するアダプター配列を含む。「上流」および「下流」は特定の５’−３’方向を示唆することを意味せず、システムの方向に依存し得る。さらに、このようなプライミング配列に隣接される配列のみが増幅され得るので、アダプター配列は通常ハーフプローブまたは連結産物の５’および３’末端に位置する。
【００１８】
さらに、ユニバーサルプライミング配列は、通常、特定のアッセイおよび宿主ゲノムを仮定してできるだけ独特であるように選択され、アッセイの特異性を保証する。一般に、ユニバーサルプライミング配列は、約５〜約３５ヌクレオチドの範囲のサイズであり、通常は約２０ヌクレオチドであり得る。
【００１９】
当業者によって認識されるように、連結プローブセットにおける２つのプライミング部位の方向は異なる。すなわち、一方のＰＣＲプライマーは第１のアダプター配列（第１のユニバーサルプライミング部位）と直接ハイブリダイズし得るが、他方のＰＣＲプライマーは第２のアダプター配列（第２のユニバーサルプライミング部位）の補体とハイブリダイズし得る。別の言い方をすると、第１のプライミング部位はセンス方向であり、第２のプライミング部位はアンチセンス方向である。
【００２０】
プライマー部位として使用されるアダプター配列に加えて、ハーフプローブは、標的核酸の一部分に対して実質的に相補的である少なくとも第１の遺伝子座特異的配列を含む。以下で概説されるように、ライゲーションプローブはそれぞれ、遺伝子座特異的配列の別々の部分を含む。当業者によって認識されるように、遺伝子座特異的配列は、プローブの使用に応じて、様々な種類のフォーマットを取ることができる。「ハーフプローブ」について言及されるが、これは、検索標的核酸にまたがる２つのハーフプローブが標的核酸の標的のちょうど半分に対して相補的でなければならないことを意味するように意図されない。例えば、２つのハーフプローブは、検索標的核酸を、標的核酸の約３分の１に対して相補的である配列を含む第１の遺伝子座特異的部分と、標的核酸の約３分の２に対して相補的であり得る第２の遺伝子座特異的部分とに分割するように設計され得る。さらに、２つのハーフプローブは、必ずしも標的核酸配列の全体にまたがる必要はない。当業者は、適切なハーフプローブの正確な設計選択が、特に計算方法によって促進され得ることを認識するであろう。
【００２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子座特異的配列は、対象のスプライスジャンクションにまたがり得る。本明細書において概説されるように、遺伝子座特異的配列は、個々の代替エクソンの末端の配列に対して実質的に相補的であるように設計することができる。実質的に相補的とは、本明細書では、標準反応条件下でハイブリダイズして、必要なアニーリング特異性を提供するために、プローブが標的配列に対して十分に相補的であることを意味する。エクソンはイントロンによって分離されるので、検出配列は、ＲＮＡ分子の異なる部分に存在し得る。従って、遺伝子座特異的配列は、第１のエクソンの末端に相補的な上流部分と、第２のエクソンの末端に相補的な下流部分との２つの部分を含み得る。スプライシングが生じ、介在性のイントロンが切除された場合にだけ、標的特異的配列はアッセイ条件下で標的核酸配列にハイブリダイズし得る。
【００２２】
実施形態において、遺伝子座特異的プローブは、対立遺伝子特異的プローブを含み得る。従って、第１の遺伝子座特異的プローブおよび第２の遺伝子座特異的プローブはいずれも対立遺伝子特異的プローブであり得る。
【００２３】
高、中および低ストリンジェンシー条件を含む様々なハイブリダイゼーション条件を本発明において使用することができ、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌが参照される（参照によって本明細書に援用される）。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、状況が異なれば異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの詳細なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜約１０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）である（Ｔｍにおいて、標的配列は過剰に存在するので、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、通常約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）については少なくとも約６０℃であるような条件を含む。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどのらせん不安定化剤の添加によって達成することもできる。またハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において知られているように非イオン性主鎖、すなわちＰＮＡが使用される場合にも異なる可能性があり、さらに、ハイブリダイゼーション複合体の２本の鎖を架橋、すなわち共有結合させるために標的結合の後に架橋剤が添加されてもよい。
【００２４】
従って、ＭＬＰＡアッセイは一般に、標的の存在下でハイブリダイゼーション複合体の形成だけを可能にするストリンジェンシー条件下で実行される。ストリンジェンシーは、温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、ｐＨ、有機溶媒濃度などを含むがこれらに限定されない、熱力学的変数であるステップパラメータを変更することによって制御することができる。米国特許第５，６８１，６９７号明細書に概説されるように、これらのパラメータは非特異的な結合を制御するためにも使用され得る。従って、非特異的な結合を低減するために特定のステップをより高ストリンジェンシー条件で実施するのが望ましいこともある。
【００２５】
ハイブリダイゼーション複合体の形成の後、ハーフプローブは連結され、連結産物は増幅されてアンプリコンを形成し得る。そして次に、アンプリコンが検出される。これは、例えば、ＰＣＲ増幅によって行うことができる。いくつかの実施形態では、アンプリコン内に標識を組み入れることができる。
【００２６】
例えば、Ｌｅｈｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０−７９７（１９７４）、Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅｓ，ｐａｇｅｓ  ３−３０  ｉｎ  Ｂｏｙｅｒ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｖｏｌ．１５Ｂ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）など、当該技術分野で知られている多数のリガーゼは、本明細書に開示される方法で使用するために適切であり得る。いくつかのリガーゼは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼ、およびＴｔｈリガーゼを含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（上記）、Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：５−１６（１９９１）、Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５：７３−７６（１９９２）など、これらの使用のためのプロトコルは周知である。一般に、リガーゼは、隣接する鎖の３’ヒドロキシルへのライゲーションのために５’リン酸基の存在を必要とする。いくつかの実施形態では、リガーゼは、ｐｆｕリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、ＴａｑリガーゼおよびＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（商標）ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）などの熱安定性または（好熱性）リガーゼを含む。ＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（商標）は、低平滑末端ライゲーション活性を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、リガーゼは、最小ミスマッチライゲーションを有するものである。リガーゼの特異性は、特異性の低いＴ４ＤＮＡリガーゼの代わりに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼおよび（熱安定性）Ｔａｑリガーゼなどのより特異的なＮＡＤ＋依存性リガーゼを使用することによって増大させることができる。ライゲーション反応におけるＮＡＤ類似体の使用は、ライゲーション反応の特異性をさらに増大させる。米国特許第５，５０８，１７９号明細書（Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ）を参照されたい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、増幅技術はＰＣＲである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は広く使用および記載されており、標的配列の増幅のために熱循環と併せたプライマー伸長法の使用を含む。米国特許第４，６８３，１９５号明細書および同第４，６８３，２０２号明細書、ならびにＰＣＲ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ，Ｊ．Ｗ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｅｄ．Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ，１９９５（これらは全て、参照によってその全体が援用される）を参照されたい。
【００２９】
一般に、ＰＣＲは、以下のように簡単に説明され得る。二本鎖連結プローブセットは、通常、温度を上昇させることによって変性され、次に過剰のＰＣＲプライマーの存在下で冷却され、これは次に第１のアダプター配列とハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼは次に、ｄＮＴＰによりプライマーを伸長するように作用し、ハイブリダイゼーション複合体を形成する新しい鎖の合成をもたらす。次にサンプルを再度加熱して、ハイブリダイゼーション複合体を解離させ、プロセスが繰り返される。第２のアダプター配列とハイブリダイズする相補的な標的鎖のために第２のＰＣＲプライマーを用いることによって、急速および指数関数的な増幅が起こる。従って、ＰＣＲステップは、変性、アニーリングおよび伸長である。ＰＣＲの詳細はよく知られており、ＴａｑＩポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼおよび熱循環の使用を含む。適切なＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ１．０およびＳＥＱＵＥＮＡＳＥ２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
ＰＣＲ反応は、ユニバーサルプライマー、ポリメラーゼおよびヌクレオチドのセットを含む溶液に、連結プローブセットを導入することによって開始され得る。これに関連する「ヌクレオチド」とは、本明細書では、デオキシヌクレオシド−３リン酸（デオキシヌクレオチドまたはｄＮＴＰ、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰとも呼ばれる）を意味する。いくつかの実施形態では、以下に概説されるように、ヌクレオチドの１つまたは複数は、一次標識でも二次標識でもよい検出可能な標識を含み得る。さらに、ヌクレオチドは、系の配置に応じて、ヌクレオチド類似体であってもよい。同様に、プライマーも一次または二次標識を含み得る。
【００３１】
従って、ＰＣＲ反応は、２つのＰＣＲプライマー（順方向および逆方向）、ポリメラーゼ、およびｄＮＴＰのセットを利用する。本明細書において概説されるように、プライマーが標識を含んでいてもよいし、あるいはｄＮＴＰの１つまたは複数が標識を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第１のユニバーサルプライマーおよび第２のユニバーサルプライマーの少なくとも１つは、インデキシング配列をさらに含む。国際公開第０５０６８６５６号パンフレット（その内容は参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されるものなどのインデキシング配列の使用によって、各サンプルの同一性を保存しながら、多数の異なるサンプルを同じシークエンシングの実行中に分析できるようになる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、アンプリコンは、検出標識によって標識化され得る。「検出標識」とは、本明細書では、検出を可能にする部分を意味する。いくつかの実施形態では、検出標識は一次標識である。一次標識は、フルオロフォアなどの直接検出可能なものである。一般に、標識は、ａ）放射性または重同位体であり得る同位体標識と、ｂ）磁気、電気、熱標識と、ｃ）着色または発光色素との３つの種類に分類される。標識は、酵素（西洋わさびペルオキシダーゼなど）および磁性粒子を含むこともできる。標識は、発色団またはリン光体、および蛍光色素を含む。本明細書に開示される方法で使用するのに適した色素には、蛍光ランタニド錯体（ユウロピウムおよびテルビウムの錯体を含む）、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、量子ドット（「ナノ結晶」とも呼ばれる、参照によって本明細書に援用される米国特許出願第０９／３１５，５８４号明細書を参照されたい）、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）、テキサスレッド、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、アレクサ（ａｌｅｘａ）色素、フィコエリチン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）、ボディピー、および「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第６版，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ著（参照によってその全体が本明細書に明確に援用される）に記載されるその他の色素が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
ＰＣＲ増幅ステップで生成されるアンプリコンは、長さとは無関係に、多数の方法で分析することができる。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）法によって特徴付けることができる。通常はシークエンシングプライマーのアニーリングによって提供される遊離３’ヒドロキシル基へ、ヌクレオチドが連続的に付加され、５’から３’への方向でポリヌクレオチド鎖の合成が生じる任意の適切な「合成によるシークエンシング」技術を用いて、シークエンシングを実行することができる。付加されるヌクレオチドの性質は、各付加の後に決定することができる。
【００３４】
本発明の方法において使用可能な１つの適切なシークエンシング法は、連鎖停止剤として作用することができる修飾ヌクレオチドの使用に依存している。シークエンシング中の連結プローブの領域に対して相補的である成長ポリヌクレオチド鎖内に修飾ヌクレオチドが取りこまれたら、さらなる配列伸長を指示するために利用可能な遊離３’−ＯＨ基は存在せず、従ってポリメラーゼは、さらなるヌクレオチドを付加することができない。成長鎖に取り込まれた塩基の性質が決定されたら、３’ブロックは除去されて、次の連続ヌクレオチドの付加を可能にし得る。これらの修飾ヌクレオチドを用いて得られる産物を整理することによって、連結プローブの核酸配列を推定することが可能である。このような反応は、修飾ヌクレオチドのそれぞれに、特定の塩基に相当することが分かっている異なる標識が付着されていれば１回の実験で行うことができ、各取込みステップで付加された塩基間の区別が容易になる。あるいは、修飾ヌクレオチドのそれぞれを別々に含有する別々の反応が実行されてもよい。
【００３５】
修飾ヌクレオチドは、その検出を促進するために標識を有していてもよい。いくつかのこのような実施形態では、これは蛍光標識であり得る。各ヌクレオチド型は異なる蛍光標識を有し得る。しかしながら、検出可能な標識は蛍光標識である必要はない。ヌクレオチドの核酸配列への取込みの検出を可能にする任意の標識を使用することができる。
【００３６】
蛍光標識ヌクレオチドを検出するための１つの方法は、標識ヌクレオチドに特異的な波長の放射線の使用、または他の適切な照射源の使用を含む。ヌクレオチド上の標識からの蛍光は、ＣＣＤカメラまたは他の適切な検出手段によって検出され得る。
【００３７】
本明細書に記載される方法は上記で概説したシークエンシング法の使用に限定されず、本質的に、ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への連続取込みに依存する任意のシークエンシング方法と共に使用することができる。適切な技術には、例えば、ＰＹＲＯＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ（商標）、ＦＩＳＳＥＱ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕシークエンシング）、ＭＰＳＳ（大規模並列シグネチャシークエンシング）、およびライゲーションベースの方法によるシークエンシングが含まれる。いくつかの実施形態では、連結プローブセットのアレイを調製することが可能である。アレイの使用により、同一または異なる配列の多数の標的を並行して配列決定することが可能である。
【００３８】
図２を参照すると、本明細書に開示される実施形態に従って、ＭＬＰＡ−ＳＢＳアッセイのための例示的な方法を要約するフロースキームが示されている。図２に示されるように、ＤＮＡの検索サンプルは、ゲノム標的を横切ってハイブリダイズする５’および３’ハーフプローブ（左側プローブおよび右側プローブ）を含むプローブセットによってハイブリダイズされる。ハーフプローブは、ゲノム標的上で互いに隣接するように選択され、従って、プローブセットのライゲーションが可能になる。ハーフプローブは、ＰＣＲ増幅において使用され得るアダプター配列も備える。ライゲーションの後、連結プローブセットは、修飾順方向および逆方向プライマーを用いてＰＣＲ増幅される。これらは、ハーフプローブの標的特異的部分に隣接するアダプター配列に相補的であるように選択されるユニバーサルプライマーである。次に、ＰＣＲ増幅によって生成されたアンプリコンを配列決定することができる。いくつかの実施形態では、適切なシークエンシング法は、ＭＩＳＥＱ（登録商標）の利用により開発された次世代シークエンシング（ＮＧＳ）システムまたはＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＨＩＳＥＱ（登録商標）システムプラットホームを含むことができる。いくつかの実施形態では、このような検出システムは、複数のアンプリコンを含むアレイにおいて合成によりシークエンシングのサイクルを実施するように形成された流体取扱いシステムと、放射線を線源からアレイへ方向付け、アレイからの蛍光発光をカメラへ方向付けるように形成された検出システムと、アレイへ方向付けられた放射線の暴露レベルを増大させるために検出システムを自動的に変更し、増大された暴露レベルにおいてアレイからカメラへの蛍光発光を検出するように形成されたシステムコントロールインターフェースとを含み得る。図３は図２に示されるものと同様の方法のフロースキームを示し、インデキシング配列が修飾逆方向プライマーに提供されている。フロースキームの順序は同じであるが、得られるアンプリコン中にインデキシング配列が見られ、多数の線源からの標的核酸の同定を容易にする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１回の実行につき約１００よりも多い複数の異なる標的核酸を検索するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１回の実行につき約５０〜約１００の標的核酸の範囲である、複数の異なる標的核酸を検索するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１回の実行につき約１００〜約５００の標的核酸の範囲である、複数の異なる標的核酸を検索するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１回の実行につき約１００〜約１，０００の標的核酸の範囲である、複数の異なる標的核酸を検索するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１回の実行につき約１００〜約１０８の標的核酸の範囲である、複数の異なる標的核酸を検索するために使用され得る。原則として、検索され得る標的核酸の数は、適切なプローブセットの利用可能性によってのみ制限され得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の異なる標的核酸のそれぞれについてコピー数を決定するステップを含み得る。いくつかのこのような実施形態において、合成によるシークエンシングからの読出し情報は、コピー数情報を直接提供することができる。いくつかの実施形態では、コピー数の決定は対照の存在下で実施され、コピー数について検索される各標的核酸は、この対照に基づいて規格化され得る。いくつかの実施形態では、コピー数の決定は、異常なコピー数変化（ＣＮＶ）に関連する遺伝性疾患の存在を評価するために使用され得る。従って、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的核酸のコピー数を決定するステップを含む、異常なＣＮＶに関連する疾患または障害の検出方法が提供されている。いくつかのこのような実施形態では、疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、圧迫性麻痺の傾向を伴う遺伝性ニューロパチー（ＨＮＮＰ）、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）、および非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）を含むことができるが、これらに限定されない。当業者は、これらが単に例示的な疾患／障害にすぎず、異常なコピー数変化が任意の伝子において起こり、様々な他の病的状態をもたらし得ること認識するであろう。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＣＮＶの決定は、癌の進行の診断および／または監視のための方法において使用され得る。正常細胞を癌細胞に形質転換する遺伝的事象の根本的な進行は、二倍体から異数体状態への移行によって特徴付けることができる（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．３６９−７６およびＬｅｎｇａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３９６，ｐｐ．６４３−９）。ゲノム不安定性の結果、癌細胞は、点突然変異から全染色体異常までの多数のレベルで、ランダムかつ必然的な変更を蓄積する。癌の進行の診断および／または監視におけるコピー数変化には、腫瘍抑制遺伝子の損失をもたらし得るヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）およびホモ接合性欠失、ならびに細胞の癌原遺伝子の活性化をもたらし得る遺伝子増幅事象を検出することが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出するステップを含み得る。多型は、集団における２つ以上の遺伝的に決定された代替配列または遺伝子座の出現を指す。多型マーカーまたは部位は、相違が生じる遺伝子座である。いくつかの実施形態では、マーカーは少なくとも２つの遺伝子座を有し、それぞれ、選択された集団の約１％よりも高い頻度で発生し、他の実施形態では１０％または２０％よりも高い頻度で発生する。多型は、１つまたは複数の塩基の変化、挿入、反復、または欠失を含み得る。多型遺伝子座は、１塩基対程度の大きさであり得る。多型マーカーは、制限断片長多型、タンデム反復数（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純反復配列、およびＡｌｕなどの挿入要素を含み得る。最初に同定される対立遺伝子形態は、基準形態として任意に指定することができ、他の対立遺伝子形態は、代替または異型遺伝子座として指定される。選択された集団において最も頻繁に発生する対立遺伝子形態は、野生型と呼ばれることもある。二倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。二対立遺伝子多型は２つの形態を有する。三対立遺伝子多型は三つの形態を有する、などである。２つの核酸間の多型は、化学物質、酵素、もしくは他の薬剤への暴露もしくはこれらとの接触、または核酸に損傷を引き起こす作用物質（例えば、紫外放射線、突然変異原または発癌物質）への暴露によって自然に発生じ得る。一塩基多型（ＳＮＰ）は、２つの代替塩基がヒト集団において相当な頻度（約１％よりも高い）で発生する位置であり、ヒト遺伝的変異の最も一般的なタイプである。
【００４３】
遺伝子型同定という用語は、個体がゲノム内の１つまたは複数の位置において有する遺伝情報の決定を指す。例えば、遺伝子型同定は、個体が単一のＳＮＰについてどの遺伝子座（単数または複数）を有するかの決定、または個体が複数のＳＮＰに対してどの遺伝子座（単数または複数）を有するかの決定を含み得る。例えば、ゲノム内の特定のヌクレオチドは、Ａである個体もあれば、Ｃである個体もあり得る。その位置にＡを有する個体はＡ遺伝子座を有し、Ｃを有する個体はＣ遺伝子座を有する。二倍体生物において、個体は多型位置を含有する配列の２つのコピーを有し得るので、個体はＡ遺伝子座およびＣ遺伝子座、あるいはＡ遺伝子座の２つのコピーまたはＣ遺伝子座の２つのコピーを有し得る。Ｃ遺伝子座の２つのコピーを有する個体はＣ遺伝子座についてホモ接合性であり、Ａ遺伝子座の２つのコピーを有する個体はＣ遺伝子座についてホモ接合性であり、各遺伝子座の１つのコピーを有する個体はヘテロ接合性である。アレイは、可能性のあるこれらの３つの結果のそれぞれを区別するように設計され得る。多型位置は可能性のある２つ以上の遺伝子座を有することができ、アレイは、可能性のある全ての組み合わせを区別するように設計され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の異なる標的核酸の少なくとも一部のメチル化度の決定を含み得る。プロモーター領域ＳのＣｐＧアイランドにおけるＤＮＡメチル化は、転写サイレンシングおよび他の細胞プロセスに関連する。しかしながら、異常なＤＮＡメチル化はいくつかの遺伝性ヒト疾患に関連し、特に、腫瘍抑制遺伝子におけるＣｐＧアイランドのメチル化は腫瘍形成に関与している。多数の障害に関与する遺伝子のエピジェネティックな変化を検出するために、メチル化特異的ＭＬＰＡ（ＭＳ−ＭＬＰＡ）が開発されている（例えば、その内容全体が参照によって全体として本明細書中に援用されるＮｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１２８（２００５）を参照されたい）。ＭＳ−ＭＬＰＡにおいて、標的核酸は、非メチル化ＧＣＧＣ配列を認識するエンドヌクレアーゼＨｈａＩに対する制限部位を含有する。ハイブリダイゼーションステップの後、アニールされたプローブセットは、非メチル化ＤＮＡにハイブリダイズしたプローブセットを消化するＨｈａＩで処理され、メチル化ＤＮＡにハイブリダイズした未消化のプローブセットが残され得る。従って、メチル化ＤＮＡに関連したプローブセットのみが増幅される。メチル化のレベルは、対照との比較によって定量化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるメチル化度の決定方法は、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）またはアンジェルマン症候群（ＡＳ）を診断するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるメチル化度の検出方法は、腫瘍における遺伝子の過剰メチル化を評価するために使用することができ、このような遺伝子にはＭＧＭＴ、ＴＩＭＰ３、およびＣＤＫＮ２Ａが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
当業者によって認識されるように、ＤＮＡに関連して本明細書に記載される方法は、ＲＮＡベースの検出にも等しく適用させることができる。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、標的ｍＲＮＡを定量化するステップを含み得る。特にｍＲＮＡプロファイリングのために開発された逆転写酵素ＭＬＰＡ（ＲＴ−ＭＬＰＡ）は、ＭＬＰＡにおける変化形である。ｍＲＮＡ検出および定量化のためのＲＴ−ＭＬＰＡは、種々のアポトーシスおよび炎症遺伝子の検索において使用され得る。
【００４６】
ＭＬＰＡにおいて通常使用されるＭＬＰＡリガーゼ酵素は、ＲＮＡ標的にアニールされたＤＮＡオリゴを連結しない。これを回避するために、ＲＴ−ＭＬＰＡは、ＲＴ−プライマーを用いて、プローブ認識部位に直接隣接するか、あるいはそれと重複してアニールし、従って短いｍＲＮＡ断片をｃＤＮＡに逆転写する逆転写酵素反応から始まる。短いｃＤＮＡ断片は、プローブが結合するために既に十分なので、ＲＴ−ＭＬＰＡ結果に対するＲＮＡ分解の影響は小さい。
【００４７】
ＲＴ反応の後、プローブのその標的ｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションから始まり、ＲＴ−ＭＬＰＡは標準ＭＬＰＡの場合と同様に継続する。いくつかの実施形態では、ＲＴ−ＭＬＰＡプローブは、その標的配列内にエクソン境界を含むように設計される：プローブのある部分はエクソン１の最後の２５ヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、他の部分はエクソン２の最初の３５ヌクレオチドに結合する。このような「イントロンスパニング（ｉｎｔｒｏｎ  ｓｐａｎｎｉｎｇ）」設計によって、プローブは、ＲＮＡサンプル中に存在することが多い汚染ゲノムＤＮＡにおけるシグナルの発生が阻止される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、コピー数、一塩基多型の存在、メチル化度、およびｍＲＮＡの量、またはこれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを決定するために使用され得る。
【００４９】
上記で開示されるおよびその他の様々な特徴および機能、またはこれらの代替物が、多数の他の異なるシステムまたは用途に望ましく結合され得ることは認識されるであろう。また、現在予期または予測されないその中の種々の代替物、修正、変更または改善が当業者によって後で行われる可能性があり、これらも特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【００５０】
特定の実施形態を参照して上記で説明されたが、その趣旨から逸脱することなく多数の修正が成され得ることは理解されるであろう。本明細書中の実施形態の真の範囲および趣旨の範囲内に入り得るので、特許請求の範囲はこのような修正を包含することが意図される。
【００５１】
従って、現在開示される実施形態は全ての面で説明的なものであって限定的なものではないと考えられるべきであり、実施形態の範囲は、上記の説明よりも特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の等価性の意味および範囲内に入る全ての変化は本明細書中に包含されることが意図される。
【実施例】
【００５２】
本明細書において以下に説明される実施例は、本発明の実施形態の実施において使用することができる異なる組成および条件を説明する。全ての割合は、他に記載されない限り重量による。しかしながら、本発明の実施形態が、多くのタイプの組成と共に実施可能であり、上記の開示に従って、そして以下に指摘されるように多数の異なる使用を有することができることは明らかであろう。
【００５３】
実施例Ｉ
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子におけるコピー数変化
この実施例は、単一のＭＬＰＡ−ＳＢＳアッセイにおいて７９のエクソンＤＭＤ遺伝子をスクリーニングするためのＭＬＰＡ−ＳＢＳの使用を示す。
【００５４】
ＤＭＤ遺伝子において既知のコピー数変異体を有する２人のデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者からのＤＮＡおよび正常対照をバイオロジカル・リポジトリ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（ワールドワイドウェブでｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｎ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｌｓ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｒｍｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｐｄｆ／ｄｕｃｈｅｎｎｅ＿ｂｅｃｋｅｒ．ｐｄｆにおいて）から購入した。ＤＭＤ遺伝子の全てのエクソンに対して設計された従来のＭＬＰＡプローブを購入し、これらのゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、熱安定性リガーゼにさらした（ワールドワイドウェブでｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｌｐａ．ｃｏｍに記載されるプロトコルによって）。ライゲーション後に、下記に記載されるプライマーにより反応をＰＣＲ増幅した。
【００５５】
プライマー１．０  定常領域により修飾
【００５６】
【化１】
0006484177.tif 000002
【００５７】
ＳＢＳインデックス＃１  リバース定常領域に対する補体により修飾
【００５８】
【化２】
0006484177.tif 000003
【００５９】
Ｅｄプローブ例。ＭＲＣ−ｈｏｌｌａｎｄのＤＭＤプローブ対＃０１６９１−Ｌ００４６５を表す２つのオリゴヌクレオチドが示される。下線領域は、ゲノムに対してｉｄｅｉｚｅするが、強調表示された領域は全てのＭＬＰＡプローブオリゴヌクレオチドに対して一定である。可能性のあるライゲーションは、「−」によって示される。連結ＭＬＰＡプローブを増幅し、同時に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｅｑシステムにおける多重化ＳＢＳシークエンシングのためにこれらを調製するためのＳｅｄ。
【００６０】
これらのプライマーは、１）うまく連結されたＭＬＰＡプローブ（定常領域を介して）を全てバッチ増幅する、２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ−特異的アダプター配列を付加してＳＢＳを可能にする、そして３）貯蔵したシークエンシングランにおいてサンプル−サンプル間の同定のためにサンプル特異的バーコードを適用するように設計した。増幅後の産物を精製し、定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）において一緒に配列決定した。配列の読取りをヒトゲノムにアラインし、各ＤＭＤプローブに位置する読取りの数をカウントし、規格化し、図４のようにプロットした。規格化読取りカウントが、男性患者のエクソン４９−５２における完全な欠失と、女性キャリア患者（男性患者の母親）のエクソン４９−５２におけるヘテロ接合性欠失とを明らかにすることは、図４のプロットから明らかである。ＤＭＤはＸ連結遺伝子であり、従って、欠失は男性では読取りカウントゼロとして現れるが、キャリア女性では対照のほぼ半分の読取りカウントとして現れるであろう。これらのアノテーションは遺伝子リポジトリから得られる元の患者遺伝子型のものと一致し、従ってＭＬＰＡ−ＳＢＳによるコピー数の検出が実証される。
【００６１】
実施例ＩＩ
ＭＬＰＡの原理の証明
この実施例は、読出し情報のために市販のシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いる、高度に多重化されたＭＬＰＡの使用を示す。ＤＭＤ、ＢＲＣＡ１／２、ＰＭＳ２、ＳＭＮ１／２のためのスタッファーのないプローブ、および対照遺伝子を以下のように設計した。左側および右側プローブ配列（ＬＰＯおよびＲＰＯ）に、Ｉｌｌｕｍｉｎａインデキシングプライマーによる増幅を可能にする配列を加えた。各プローブ対について、その５’端部にＬＰＯ配列（ゲノムにアニールされる）を加えて以下のオリゴヌクレオチド：
５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−［ＬＰＯ］−３’  配列番号５
を形成した。同様に、その３’端部において各プローブ対内にＲＰＯを加えて、以下のオリゴヌクレオチド：
５’−Ｐ−［ＲＰＯ］−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ−３’  配列番号６
を形成した。このＲＰＯオリゴヌクレオチドは、５’リン酸によって修飾されて、ＬＰＯに隣接するアニーリングにおけるライゲーションを容易にする。
部分的な左側アダプター：
５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−ＬＰＯ  配列番号７
ＬＰＯは、ゲノムＤＮＡ標的にアニールする相補的配列に相当する左側プローブオリゴヌクレオチドである。
部分的な右側アダプター（「Ｐ」で示される５’リン酸を有する）：
Ｐ−ＲＰＯ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ−３’  配列番号８
ＲＰＯは、ＬＰＯに直接隣接するゲノムＤＮＡ標的にアニールする相補的配列に相当する右側プローブオリゴヌクレオチドである。
【００６２】
標準オリゴヌクレオチド合成を用いて、２５７のプローブ対を合成し、等モル量で貯蔵した。
【００６３】
上記のプローブ対のプールを変性ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、アニールしたプローブ対を連結し、以下に記載されるプライマーを用いて増幅した。
【００６４】
成功したハイブリダイゼーションおよびライゲーションの後、プローブ対は以下の配置であった：
５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ−ＬＰＯ−ＲＰＯ−ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＣ−‘３  配列番号９
示されるプライマーによるライゲーション後の増幅は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング、特にフローセル増幅およびサンプルの多重同定に必要とされる付加的な配列を付加する。
【００６５】
【化３】
0006484177.tif 000004
【００６６】
このアッセイを、既に特徴付けられたコピー数変化をＤＭＤ遺伝子に含有する８つのサンプルにおいて実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑにおいて５０ｂｐシングルエンドの実行を用いて、産物を配列決定した。読取りをタグベースの基準に対してマッピングし、各サンプルについて、各タグに対するヒットを全産生量に対して規格化した。規格化されたタグカウントは、図５〜１２に示される。規格化された読取りカウントの非常に複雑な分析なしに、８つの事象は全て容易に検出可能であった。
【００６７】
最初に提示され、そして補正され得るような特許請求の範囲は、本明細書に開示される実施形態および教示の変化物、変更物、代替物、修正物、改善物、等価物、および実質的に等価物（現在予見できないまたは価値を認められていないもの、例えば出願人／特許権所有者などから生じ得るものを含む）を包含する。請求項において明確に記載されないかぎり、請求項のステップまたは構成要素は、任意の特定の順序、数、位置、サイズ、形状、角度、色、または材料に関して本明細書または任意の他の請求項から示唆または導入されてはならない。
【００６８】
本明細書中で参照される全ての特許および出願は、本明細書によって明確にそして本明細書において参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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