(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質
【請求項２】
下記（ｃ）から（ｅ）のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項３】
下記（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体。
【請求項６】
植物である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
植物が、双子葉植物である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチド、もしくは請求項４に記載のベクターを植物細胞内に導入することを含む、ポティウイルス抵抗性が付与された形質転換植物の作製方法。
【請求項９】
下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのＲｓｖ４遺伝子マーカーを検出し得る２以上のポリヌクレオチドから構成されるポティウイルス抵抗性検出用プライマーセット。
（Ａ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７８２の塩基のＳＮＰ
（Ｂ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号９７７の塩基のＳＮＰ
（Ｃ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号１３９１から１７３０の塩基配列のＳＳＲ
（Ｄ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号６５９４のＳＮＰ
（Ｅ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７２７０のＳＮＰ
（Ｆ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号２００１から７５２９の塩基配列のＳＴＳ
【請求項１０】
以下のポリヌクレオチド（Ｆ１）及び（Ｆ２）を含む請求項９に記載のプライマーセット。
（Ｆ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から２７２５の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｆ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６３４１から９５２９の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項１１】
配列番号８５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号５３に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、配列番号５４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８１に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、配列番号８２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号９１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号９２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群より選ばれる２以上のポリヌクレオチドを含む請求項９に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプライマーセットを含むポティウイルス抵抗性検出用キット。
【請求項１３】
ダイズの核酸試料中の配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無を検出し、挿入がなければポティウイルスへの抵抗性ありと判断し、挿入があればポティウイルスへの抵抗性なしと判断する、ダイズのポティウイルス抵抗性の判定方法。
【請求項１４】
挿入位置が、配列番号４または５の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列中１６９番目のアデニン及び１７０番目のグアニンの間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ダイズの核酸試料中の配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無の検出は、下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１つであるポティウイルス抵抗性マーカーのタイピングにより行う請求項１３または１４に記載の方法。
（Ａ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７８２の塩基のＳＮＰ
（Ｂ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号９７７の塩基のＳＮＰ
（Ｃ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号１３９１から１７３０の塩基配列のＳＳＲ
（Ｄ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号６５９４のＳＮＰ
（Ｅ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７２７０のＳＮＰ
（Ｆ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号２００１から７５２９の塩基配列のＳＴＳ
【請求項１６】
変異の有無の検出を請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプライマーセット、もしくは請求項１２に記載のキットを用いて行う、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポティウイルス抵抗性を有するポリヌクレオチド、タンパク質およびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポティウイルス属は、２００近くの種を含み、世界中の多様な農作物に甚大な被害を与えている。ポティウイルス属ウイルスの一つであるダイズモザイクウイルス（ＳＭＶ）は、アブラムシによって媒介されるウイルスである。ダイズにおけるＳＭＶ被害軽減のため、Ｒｓｖ１、Ｒｓｖ３またはＲｓｖ４などのＳＭＶ抵抗性遺伝子座を持つ抵抗性品種が育成されてきた。
【０００３】
Ｒｓｖ１遺伝子およびＲｓｖ３遺伝子はすべてのＳＭＶ系統に有効ではなく抵抗性打破系統の出現も問題になっている。一方、Ｒｓｖ４遺伝子座の抵抗性対立遺伝子を有するダイズ系統は、防御反応を介さずにウイルスの増殖を著しく遅延させることができ、米国のＳＭＶ全系統（Ｇ１〜Ｇ７）および日本国内の全系統（Ａ〜Ｅ）に対する抵抗性系統であることが報告されている（非特許文献１および２参照）。
【０００４】
非特許文献３には、Ｒｓｖ４遺伝子座の候補領域を、第２染色体上の２１２ＭＡＴ１６と２１２ＭＴＡＴＡ１１の２つのマーカーに挟まれた１００ｋｂ以下の領域に絞りこんだことが記載され、Ｒｓｖ４遺伝子座の責任遺伝子の候補となる１０個の遺伝子を提示している。非特許文献４には、Ｒｓｖ４遺伝子座の候補領域を、ＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０２＿０６１０とＢＡＲＣＳＯＹＳＳＲ＿０２＿０６１６の２つのマーカーに挟まれた２００ｋｂ以下の領域に絞り込んだことを記載し、Ｒｓｖ４遺伝子座の責任遺伝子の候補となる１７個の遺伝子を提示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｕｎｄｕｚ  Ｉ，Ｂｕｓｓ  ＧＲ，Ｃｈｅｎ  Ｐ，Ｔｏｌｉｎ  ＳＡ（２００４）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＰＩ  ８８７８８  ｓｏｙｂｅａｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ９４：６７８−６９２
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｎａｇａｓａｗａ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｔ，Ｉｉｚｕｋａ  Ｎ（１９８７）Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ．Ｍｉｓｃ  Ｐｕｂｌ  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｎａｔｌ  Ａｇｒｉｃ  Ｅｘｐ  Ｓｔｎ  ７：１−３５
【非特許文献３】Ｓａｇｈａｉ  Ｍａｒｏｏｆ  ＭＡ，Ｔｕｃｋｅｒ  ＤＭ，Ｓｋｏｎｅｃｚｋａ  ＪＡ，Ｂｏｗｍａｎ  ＢＣ，Ｔｒｉｐａｔｈｙ  Ｓ，Ｔｏｌｉｎ  ＳＡ（２０１０）Ｆｉｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ，Ｒｓｖ４．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ３：１４−２２
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  Ｄ，Ｍａ  Ｙ，Ｙａｎｇ  Ｙ，Ｌｉｕ  Ｎ，Ｌｉ  Ｃ，Ｓｏｎｇ  Ｙ，Ｚｈｉ  Ｈ．（２０１１）  Ｆｉｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｒ（ＳＣ８）  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ．Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２２：５５５−５６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、各文献においてはＲｓｖ４遺伝子座の責任遺伝子（Ｒｓｖ４遺伝子）を実際に単離したことは報告されていない。従って、本発明は、ポティウイルス抵抗性を有するＲｓｖ４遺伝子の遺伝情報を解明し、その用途を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の各発明を提供する：
〔１〕下記（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質
〔２〕下記（ｃ）から（ｅ）のいずれかである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ
〔３〕下記（ａ）または（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質
〔４〕〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
〔５〕〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体。
〔６〕植物である〔５〕に記載の形質転換体。
〔７〕植物が、双子葉植物である〔５〕に記載の形質転換体。
〔８〕〔１〕または〔２〕に記載のポリヌクレオチド、もしくは〔４〕に記載のベクターを植物細胞内に導入することを含む、ポティウイルス抵抗性が付与された形質転換植物の作製方法。
〔９〕下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１つであるポティウイルス抵抗性マーカー。
（Ａ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７８２の塩基のＳＮＰマーカー
（Ｂ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号９７７の塩基のＳＮＰマーカー
（Ｃ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号１３９１から１７３０の塩基配列のＳＳＲマーカー
（Ｄ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号６５９４のＳＮＰマーカー
（Ｅ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７２７０のＳＮＰマーカー
（Ｆ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号２００１から７５２９の塩基配列のＳＴＳマーカー
〔１０〕下記（Ａ）〜（Ｆ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのＲｓｖ４遺伝子マーカーを検出し得る２以上のポリヌクレオチドから構成されるポティウイルス抵抗性検出用プライマーセット。
（Ａ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７８２の塩基のＳＮＰ
（Ｂ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号９７７の塩基のＳＮＰ
（Ｃ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号１３９１から１７３０の塩基配列のＳＳＲ
（Ｄ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号６５９４のＳＮＰ
（Ｅ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７２７０のＳＮＰ
（Ｆ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号２００１から７５２９の塩基配列のＳＴＳ
〔１１〕以下のポリヌクレオチド（Ｆ１）及び（Ｆ２）を含む〔１０〕に記載のプライマーセット。
（Ｆ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から２７２５の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｆ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６３４１から９５２９の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
〔１２〕配列番号８５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号５３に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、配列番号５４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号８１に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、配列番号８２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号１２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号９１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号９２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドからなる群より選ばれる２以上のポリヌクレオチドを含む〔１０〕に記載のプライマーセット。
〔１３〕〔１０〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のプライマーセットを含むポティウイルス抵抗性検出用キット。
〔１４〕ダイズの核酸試料中の配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無を検出し、挿入がなければポティウイルスへの抵抗性ありと判断し、挿入があればポティウイルスへの抵抗性なしと判断する、ダイズのポティウイルス抵抗性の判定方法。
〔１５〕挿入位置が、配列番号４または５の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列中１６９番目のアデニン及び１７０番目のグアニンの間である、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕ダイズの核酸試料中の配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無の検出は、〔９〕記載のマーカーのタイピングにより行う〔１４〕または〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕変異の有無の検出を〔１０〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載のプライマーセット、もしくは〔１３〕に記載のキットを用いて行う、〔１４〕〜〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ポティウイルス抵抗性を有するＲｓｖ４遺伝子の遺伝情報、及びその用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域における予測遺伝子の分布とＲｓｖ４候補遺伝子の場所を示す図である。
【図２】図２は、Ｒｓｖ４遺伝子及び該遺伝子がコードするタンパク質とＲＮａｓｅ  Ｈドメインを示す模式図である。上段はＲｓｖ４遺伝子の模式図である。図中、黒箱がコーディング領域（ＣＤＳ）、灰色が非翻訳領域（ＵＴＲ）、上部の逆三角は感受性品種（Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２，Ｅｎｒｅｉ）に存在する約３．６ｋｂの挿入配列の位置をそれぞれ示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２及びＥｎｒｅｉの非翻訳領域の上流には短い欠失領域（両矢印）がある。下段はＲｓｖ４タンパク質の模式図である。Ｒｓｖ４遺伝子の２つのコーディング領域のうちＣＤＳ２のアミノ酸配列は、ＲＮａｓｅＨに類似していた。感受性品種に存在する約３．６ｋｂの挿入配列はＣＤＳ１のアミノ酸配列を大きく変化させることが明らかとなった。
【図３】図３は、Ｒｓｖ４を過剰発現する形質転換ダイズにおけるＳＭＶに対する増殖抑制効果を示す図である。図中、Ｊａｃｋおよび２７ｃ−１は、それぞれ非形質転換体および形質転換体を示す。ＳＭＶ  ＣＰおよびＲｓｖ４は、それぞれＳＭＶの外被タンパク質およびＲｓｖ４タンパク質を示す。
【図４】図４は、Ｒｓｖ４遺伝子の一過的発現におけるＳＭＶに対する増殖抑制効果を示す図である。図中、ＧＵＳ、Ｒｓｖ４、Ｒｓｖ４（Ｄ９９Ｎ）は、それぞれタバコ近縁種で一過的に発現させたβ−グルクロニダーゼ、Ｒｓｖ４タンパク質、ＲＮａｓｅ  Ｈドメインの活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質をそれぞれ示し、ＳＭＶ−ＣＰはＳＭＶの外被タンパク質を示す。
【図５】図５は、Ｒｓｖ４遺伝子の一過的発現系における抵抗性打破ＳＭＶ変異株に対する増殖抑制効果を示す図である。図中、ＳＭＶ−Ｃ（ｗｔ）、ＳＭＶ−Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）、Ｒｓｖ４およびＤ９９Ｎは、それぞれＳＭＶ野生株、抵抗性打破ＳＭＶ変異株、Ｒｓｖ４タンパク質、およびＲＮａｓｅ  Ｈドメインの活性中心変異タンパク質を示す。
【図６】図６は、Ｒｓｖ４遺伝子の一過的発現系におけるＳＭＶ以外のポティウイルスに対する増殖抑制効果を示す図である。図中、Ｒｓｖ４およびＲｓｖ４（Ｄ９９Ｎ）は、それぞれＲｓｖ４タンパク質およびＲＮａｓｅ  Ｈドメインの活性中心を破壊した変異型タンパク質を一過的に発現させたタバコ近縁種を示す。ＴｕＭＶ、ＰＶＹ、ＢＣＭＶ、ＰＶＡ、およびＰｅＭｏＶは、それぞれカブモザイクウイルス、ジャガイモＹウイルス、インゲンマメモザイクウイルス、ジャガイモＡウイルス、およびラッカセイ斑紋ウイルスを示す。
【図７】図７は、Ｒｓｖ４タンパク質が有する二本鎖ＲＮＡ分解活性を示す図である。図中、Ｒｓｖ４およびＤ９９Ｎは、それぞれＲｓｖ４タンパク質およびＲＮａｓｅ  Ｈドメインの活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質を示す。ｓｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡは、それぞれ一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを示す。
【図８】図８は、Ｒｓｖ４タンパク質とＳＭＶのＰ３タンパク質との間の相互作用を示す図である。図中、Ｒｓｖ４、Ｒｓｖ４（Ｄ９９Ｎ）およびＰ３−Ｍｙｃは、それぞれＲｓｖ４タンパク質、ＲＮａｓｅ  Ｈドメインの活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質およびＭｙｃタグ融合Ｐ３タンパク質を示す。
【図９】図９は、Ｒｓｖ４タンパク質の作用機構モデルを示す図である。図中、Ｐ３およびＰｏｌは、それぞれポティウイルスのＰ３タンパク質およびＲＮＡポリメラーゼを示す。
【図１０】図１０は、感染性ＳＭＶ  ｃＤＮＡクローンを模式的に示す図である。
【図１１】図１１は、パーティクルガン法によるダイズ形質転換に用いたＲｓｖ４遺伝子過剰発現ベクターの模式図である。図中、ｐ３５ＳはカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の５’制御領域、Ｒｓｖ４はダイズ由来Ｒｓｖ４ｃＤＮＡ（配列番号１）、ＮｏｓＴはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｎｏｓ遺伝子のポリＡ付加配列、ＨＰＴはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシン耐性ダイズ選抜マーカー）、ＤｓＲｅｄ２はイソギンチャクモドキ由来赤色蛍光タンパク質遺伝子（ダイズ選抜マーカー）を、それぞれ示す。制限酵素サイトＳｐｅＩとＸｈｏＩの外側はｐＵＨＲ−ＳＫ（Ｋ  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ  Ｋｉｔａ，Ｍ  Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｍ  Ｉｓｈｉｍｏｔｏ（２００６）Ａ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲｅｄ２，ａｓ  ａ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２５（１２），１３５５−１３６１．）に由来している。
【図１２】図１２は、Ｒｓｖ４遺伝子座における各マーカーの位置を示す模式図である。図中、ボックスはＲｓｖ４遺伝子のエキソンを示し、黒はコーディング領域、白は非翻訳領域をそれぞれ示す。逆三角部分は、ポティウイルス感受性品種に存在する約３．６ｋｂの挿入配列の位置を示す。ＸはＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）、黒長丸はＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）マーカーの位置をそれぞれ示す。矢印は各マーカーを検出するためのプライマー位置を示し、上下の数字は各プライマー配列の塩基配列番号を示す。数字は配列番号１８における塩基配列数を示す。
【図１３】図１３は、Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域における乗換え個体のグラフィカルジェノタイプを示す模式図である。
【図１４】図１４は、ダイズ品種Ｐｅｋｉｎｇ、Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉ及びＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１のＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列アライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、植物のＲｓｖ４遺伝子に関連しており、植物へのポティウイルス抵抗性付与に有用な遺伝情報およびその用途に関する。
【００１１】
ポティウイルスとしては、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  ｖｉｒｕｓ（スイセン黄色条斑ウイルス）、Ｓｃａｌｌｉｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｔｕｒｎｉｐ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＴｕＭＶ、カブモザイクウイルス）、Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｙａｍ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ヤマノイモモザイクウイルス）、Ｓｗｅｅｔ  ｐｏｔａｔｏ  ｆｅａｔｈｅｒｙ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（サツマイモ斑紋モザイクウイルス）、Ｐｌｕｍ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ（ウメ輪紋ウイルス）、Ｋｏｎｊａｃ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（コンニャクモザイクウイルス）、Ｌｅｔｔｕｃｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（レタスモザイクウイルス）、Ｙａｍ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｃｌｏｖｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｉｎ  ｖｉｒｕｓ（クローバ葉脈黄化ウイルス）、Ｂｅａｎ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（インゲンマメ黄班モザイクウイルス）、Ｌｅｅｋ  ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｔｈｕｎｂｅｒｇ  ｆｒｉｔｉｌｌａｒｙ  ｖｉｒｕｓ、Ｌｉｌｙ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ  Ａ（ジャガイモＡウイルス）、Ｔｏｂａｃｃｏ  ｖｅｉｎ  ｍｏｔｔｌｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ、Ｗｉｌｄ  ｐｏｔａｔｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ  Ｖ（ジャガイモＶウイルス）、Ｐｅｒｕ  ｔｏｍａｔｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐｅｐｐｅｒ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（トウガラシ斑紋ウイルス）、Ｐｅｐｐｅｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐｏｔａｔｏ  ｖｉｒｕｓ  Ｙ（ＰＶＹ，ジャガイモＹウイルス）、Ｖｅｒｂｅｎａ  ｖｉｒｕｓ  Ｙ、Ｐｅｐｐｅｒ  ｖｅｉｎａｌ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｉｌｌｉ  ｖｅｉｎａｌ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｗｉｌｄ  ｔｏｍａｔｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ  ｖｅｉｎ  ｂａｎｄｉｎｇ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（タバコ脈緑モザイクウイルス）、Ａｌｇｅｒｉａｎ  ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐａｐａｙａ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ（パパイア輪点ウイルス）、Ｄａｐｈｎｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐａｐａｙａ  ｌｅａｆ−ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（パパイア奇形葉モザイクウイルス）、Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（スイカモザイクウイルス）、Ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＳＭＶ、ダイズモザイクウイルス）、Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｖｅｉｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｙ  ｖｉｒｕｓ  Ｙ、Ｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｖｉｒｕｓ（トケイソウ東アジアウイルス）、Ｔｅｌｏｓｍａ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｂｅａｎ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＢＣＭＶ、インゲンマメモザイクウイルス）、Ｂｅａｎ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ、Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ  ｍｉｌｄ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｄａｓｈｅｅｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（サトイモモザイクウイルス）、Ｚｕｃｃｈｉｎｉ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ズッキーニ黄斑モザイクウイルス）、Ｂａｓｅｌｌａ  ｒｕｇｏｓｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｂｅｅｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐｅａｎｕｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｂａｎａｎａ  ｂｒａｃｔ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｐｅａ  ｓｅｅｄ−ｂｏｒｎｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（エンドウ種子伝染モザイクウイルス）、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ソルガムモザイクウイルス）、Ｍａｉｚｅ  ｄｗａｒｆ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）、Ｓｕｇａｒｃａｎｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（サトウキビモザイクウイルス）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎｇｒａｓｓ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ  ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ、Ｓｈａｌｌｏｔ  ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔｒｉｐｅ  ｖｉｒｕｓ、Ｏｎｉｏｎ  ｙｅｌｌｏｗ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ（タマネギ萎縮ウイルス）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｖｉｒｕｓ、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓが例示される。
【００１２】
〔ポリヌクレオチドおよびタンパク質〕
本発明のポリヌクレオチドは、植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとは、通常、ヌクレオチドの重合体を意味する場合があり、通常は単離されたポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であってもよい。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターに特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが例示される。ＤＮＡおよびＲＮＡは、特に断らない限り、２本鎖及び１本鎖のいずれでもよい。１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは、特に断らない限り、コード鎖（センス鎖）でも、非コード鎖（アンチセンス鎖）でもよい。
本発明において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、例えば以下を意味する。該ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合には、該ＤＮＡ又は該ＤＮＡを含む発現ベクターを原核細胞又は細胞真核細胞、好ましくは植物細胞に導入したときに、該ＤＮＡが転写された結果提供されるｍＲＮＡが、又は該ＲＮＡの細胞内でのスプライシングの結果提供される成熟ｍＲＮＡが翻訳されることにより、該タンパク質が生産されるようなＤＮＡを意味する。また、該ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合には、該ＲＮＡを細胞内に導入したときに、該ＲＮＡが、又は細胞内でのスプライシングの結果提供されたＲＮＡが翻訳されることにより該タンパク質が生産されるようなＲＮＡを意味する。
本発明において、「単離された」ポリヌクレオチドとは、天然において該ポリヌクレオチドと共存している他の細胞内構成成分、たとえば、リボゾーム、ポリメラーゼや他のゲノムＤＮＡと実質的に分離されたポリヌクレオチドをいう。また、「単離された」ポリヌクレオチドには、天然から分離されたポリヌクレオチドばかりでなく、組換えポリヌクレオチドや化学的に合成されたポリヌクレオチドが含まれる。
【００１３】
ポリヌクレオチドは、化学的に合成されたポリヌクレオチドであってもよい。化学的な合成方法としては、リン酸トリエステル法を利用する化学的合成法、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を利用する方法が例示される。市販のポリヌクレオチド改変キットとしては、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などが例示される。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号１４から１６に記載されたポティウイルス抵抗性ダイズ品種のＲｓｖ４ゲノム遺伝子の全体又はその一部であってＲｓｖ４タンパク質コーディング領域全体の配列を含むＤＮＡが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、下記（ｃ）から（ｅ）に示すＤＮＡが含まれる：
（ｃ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号１から３のいずれかの塩基配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１５】
配列番号１の塩基配列は、ダイズ品種Ｐｅｋｉｎｇから得たＲｓｖ４遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。配列番号２の塩基配列は、ダイズ品種ＢｙｏuｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１から得たＲｓｖ４遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。配列番号３の塩基配列は、ダイズ品種Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉから得たＲｓｖ４遺伝子のコーディング領域の塩基配列である。よって、（ｄ）および（ｅ）は、（ｃ）の変異体、誘導体、バリアント、またはホモログを意味する。
【００１６】
抵抗性ダイズ品種のＲｓｖ４ゲノム遺伝子のタンパク質コーディング領域には１つのイントロン領域が挿入されている。配列番号１〜３のいずれかの塩基配列を含むＤＮＡは、抵抗性ダイズ品種のＲｓｖ４ゲノム遺伝子のタンパク質コーディング領域に挿入されているイントロン領域の配列を含まないため、ｃＤＮＡに対応する。したがって、（ｃ）〜（ｅ）は、天然に存在するポリヌクレオチドではない。
【００１７】
（ｄ）においてストリンジェントな条件とは、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件を言う。換言すれば、同一性が高いポリヌクレオチド同士、例えば、完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件とも言える。ストリンジェントな条件としては、以下の条件が挙げられる：６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件下でハイブリダイズする条件；及び、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＤＳの条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズする条件。当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１０  Ｓｋｙｌｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等の文献を参照すれば、このような遺伝子を容易に取得できる。ポリヌクレオチドの塩基配列は、ジデオキシ法等の方法により決定され得る。
【００１８】
（ｅ）において塩基配列の同一性は、塩基配列全体又は機能発現に必要な領域で９０％以上であり、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ［Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９３）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７］等のアルゴリズムを用いて決定でき、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．”  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を利用しても決定できる。ＢＬＡＳＴＸを用いて配列を決定する際のパラメーターとしては、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３が例示される。ＢＬＡＳＴＮを用いて配列を決定する際に用いるパラメーターとしては、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２が例示される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いればよい。
【００１９】
本発明のタンパク質、すなわち、植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質は、その変異体、誘導体、バリアント又はホモログを含み、例えば以下の（ａ）から（ｂ）に示すタンパク質が挙げられる：
（ａ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、かつ植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質
【００２０】
配列番号６のアミノ酸配列は、ダイズ品種Ｐｅｋｉｎｇから得たＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号７のアミノ酸配列は、ダイズ品種ＢｙｏuｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１から得たＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号８のアミノ酸配列は、ダイズ品種Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉから得たＲｓｖ４タンパク質のアミノ酸配列である。よって、（ｂ）は（ａ）の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログを意味している。
【００２１】
（ｂ）において、変異後のアミノ酸残基においては、変異前のアミノ酸側鎖の性質が保存されていることが好ましい。アミノ酸を側鎖の性質により分類すると、以下のとおりである：疎水性アミノ酸（アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、バリン（Ｖ）等）；親水性アミノ酸（アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）等）；脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）等）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）等）；硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）等）；カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）等）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）等）；酸含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）等）；β位分岐側鎖を有するアミノ酸（トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）等）；及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）等）。
【００２２】
本発明においてアミノ酸残基は、３文字記号または１文字記号で表すものとする。例えばチロシンは、３文字記号の場合「Ｔｙｒ」、１文字記号の場合「Ｙ」である。
【００２３】
（ｂ）において、アミノ酸配列の同一性は、アミノ酸配列全体又は機能発現に必要な領域で９０％以上であり、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。アミノ酸配列の同一性の解析は、先述のＢＬＡＳＴ等のアルゴリズム、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ等のプログラムを用いて行えばよい。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質、および本発明のタンパク質の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログは、以下の（ｆ）であってもよい：
（ｆ）配列番号６から８のいずれかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質
【００２５】
（ｆ）において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されていてもよいアミノ酸残基数は、例えば５０個以内、４０個以内、３０個以内、２９個以内、２８個以内、２７個以内、２６個以内、２５個以内、２４個以内、２３個以内、２２個以内、２１個以内、１５個以内、１０個以内であり、好ましくは５個以内であり、より好ましくは４個以内であり、更に好ましくは３個以内であり、更により好ましくは２個以内であり、とりわけ好ましくは１個である。
【００２６】
本発明において「植物にポティウイルス抵抗性を付与できるタンパク質」とは、植物体内で該タンパク質を発現させた場合に該植物がポティウイルス抵抗性を示すタンパク質、好ましくは、防御反応を介さずにポティウイルスの増殖を遅延させることができるタンパク質である。該タンパク質が有する植物へのポティウイルス抵抗性の付与活性は、（ａ）のタンパク質のポティウイルス抵抗性の付与活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上であることが好ましい。
【００２７】
本発明のタンパク質の変異体、誘導体、バリアントまたはホモログのアミノ酸配列は、配列番号６から８に示すアミノ酸配列の、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の９９〜２２１番目のアミノ酸配列、配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の９５〜２１７番目のアミノ酸配列又は配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１１１〜２３３番目のアミノ酸配列に変異を有さず保持されていることが好ましく、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の９９番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の９５番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１１１番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の１４３番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の１３９番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１５５番目のアミノ酸残基のグルタミン酸、配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の１６９番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の１６５番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の１８１番目のアミノ酸残基のアスパラギン酸及び配列番号６に示すタンパク質のアミノ酸配列の２２１番目のアミノ酸残基と配列番号７に示すタンパク質のアミノ酸配列の２１７番目のアミノ酸残基と配列番号８に示すタンパク質のアミノ酸配列の２３３番目のアミノ酸残基のアスパラギンに変異を有さず保持されていることがさらに好ましい。後段の実施例のとおり、この部分はＲｓｖ４タンパク質が有するＲＮＡ分解酵素活性の活性中心部分と推定されるため（図２、図１４）、この部分が保持されるタンパク質は変異前の活性を維持する可能性が高いためである。
【００２８】
タンパク質が植物にポティウイルス抵抗性を付与できるか否かの確認は、例えば、ポティウイルスに感受性の植物組織（ダイズ品種Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２など）中でタンパク質を発現させ、これに各種ポティウイルスを感染させて増殖の可否を調べることにより確認できる。植物組織中でのタンパク質の発現は、例えば、一過性発現系にて行うことができる。一過性発現系としては例えば、実施例のように、適当な発現ベクター中にタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組み込み、該組換えベクターをアグロバクテリウムに導入し、ポティウイルスに感受性の植物組織に該アグロバクテリウムを注入する発現系が挙げられる。また別の態様として、ポティウイルス感受性植物のゲノムＤＮＡにポリヌクレオチドを導入する安定した発現系にて行うことができる。ポティウイルスの感染方法としては例えば、実施例のようにアグロバクテリウムを利用してポティウイルスのｃＤＮＡを植物組織中で発現させること、または、ポティウイルス粒子あるいは感染葉破砕液を常法により葉組織に接種することが挙げられる。
【００２９】
本発明のタンパク質がポティウイルス抵抗性を付与する対象となる植物は、ポティウイルスが感染する可能性のある植物であればよく、双子葉植物及び単子葉植物のいずれであってもよい。双子葉植物としては、ダイズ属植物（ダイズなど）、ナス属植物（ジャガイモ、ナス、トマトなど）、トウガラシ属植物（ピーマンなど）、タバコ属植物（タバコなど）、アブラナ属植物（カブ、カリフラワー、カラシナ、セイヨウナタネなど）スイセン属植物（ニホンズイセン、ラッパズイセンなど）、ヤマノイモ属植物（ヤマノイモなど）、サツマイモ属植物（サツマイモなど）、サクラ属植物（ウメ、アンズ、サクラなど）、コンニャク属植物（コンニャクなど）、アキノノゲシ属（レタスなど）、シャジクソウ属植物（クローバーなど）、インゲンマメ属植物（インゲンマメなど）、ネギ属植物（ネギ、タマネギなど）、ユリ属植物（ヤマユリ、オニユリなど）、パパイア属植物（パパイアなど）、スイカ属植物（スイカなど）、トケイソウ属植物（パッションフルーツなど）、ササゲ属植物（ササゲなど）、カボチャ属植物（カボチャ、ズッキーニなど）、ツルムラサキ属植物（ツルムラサキなど）、エンドウ属植物（エンドウなど）、ワタ属（ワタなど）、ウマゴヤシ属（アルファルファなど）、ナデシコ属（カーネーションなど）、バラ属（バラなど）、フダンソウ属（テンサイなど）が例示される。単子葉植物としては、オランダカイウ属植物（オランダカイウなど）、サトイモ属植物（サトイモなど）、トウモロコシ属植物（トウモロコシなど）、サトウキビ属植物（サトウキビなど）、チカラシバ属植物（チカラシバなど）、イネ属（イネなど）、コムギ属（コムギなど）、オオムギ属（オオムギなど）が例示される。このうち、双子葉植物が好ましく、ダイズ属植物、ナス属植物、アブラナ属植物、インゲンマメ属植物がより好ましく、ダイズ属植物がより好ましい。
【００３０】
本発明のタンパク質、および本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。異種部分としては、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（Ｎｕｓ−ｔａｇなど）、シャペロンとして働くペプチド成分（トリガーファクターなど）、他の機能を有するペプチド成分（全長タンパク質またはその一部など）およびリンカーが例示される。目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分としては、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩなどのタグ部分；および、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などの目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質が例示される。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、翻訳後修飾タンパク質、または翻訳後非修飾タンパク質であってもよい。これにより、宿主細胞の種類に応じて該タンパク質の産生を効率よく行うことができる。本発明のタンパク質は、真核生物であるダイズに由来するので、天然では翻訳後修飾（グリコシル化など）される可能性があると考えられる。原核生物ではタンパク質が翻訳後修飾されないこと、および、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、下等真核生物などの生物では、タンパク質の翻訳後修飾が大きく異なることが一般に知られている。したがって、天然で植物細胞に由来するタンパク質を、このような異種宿主細胞で産生させた場合、天然では生じ得ない、翻訳後非修飾タンパク質、または異なる翻訳後修飾を有するタンパク質を入手し得ると考えられる。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質としては、ダイズに由来するタンパク質、天然に存在するそのホモログ、人為的に作出された変異タンパク質などが例示される。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られる変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、部位特異的変異導入、および無作為変異導入処理（変異剤による処理、紫外線照射など）が例示される。
【００３３】
（ｃ）〜（ｅ）において各ポリヌクレオチドを構成するコドンは、対応するアミノ酸をコードするコドンであればよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ｇ）であってもよい：
（ｇ）（ｃ）〜（ｅ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【００３４】
「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。
【００３５】
縮重変異体は、導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体であることが好ましい。これにより、遺伝子を異種宿主細胞（微生物など）で発現させる場合にも対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給され、翻訳効率および／または翻訳の正確さを維持または向上させることができる。
【００３６】
縮重変異体がＲＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１〜５００個、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、または１〜１００個である。
【００３７】
〔ベクター〕
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを有する。ベクターは例えば、ポティウイルス抵抗性遺伝子を植物に導入するために利用することができる。
【００３８】
本発明のベクターは、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターのいずれであってもよく、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターおよび人工染色体のいずれであってもよい。組込み型ベクターは、全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよく、その一部（本発明のポリヌクレオチドが発現するために必要な部分など）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
【００３９】
細胞系ベクターは、宿主に適した公知の発現ベクターであればよい。例えば、アグロバクテリウムのプラスミド（ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド）由来のバイナリーベクター、ｐＲＩ（ｐＲＩ１０１、ｐＲＩ２０１など）、ｐＵＣ（ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８など）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（ｐＢＲ３２２など）、ｐＨＳＧ（ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８など）、ＲＳＦ（ＲＳＦ１０１０など）、ｐＡＣＹＣ（ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４など）、ｐＭＷ（ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８など）、ｐＱＥ（ｐＱＥ３０など）およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００４０】
無細胞系ベクターとしては、Ｔ７またはＴ３プロモーターを有する発現ベクター、ＳＰ６プロモーターなどを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクターなどが例示される。
【００４１】
ベクターには、転写を進める要素（プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、分泌シグナル配列、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）など）、選択マーカーなどの、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドが含まれていてもよい。転写に必要な要素は、宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であればよく、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。転写に必要な要素は、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結されていればよい。
【００４２】
プロモーターとしては、植物ウイルス由来プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ｓプロモーターなど）、植物由来プロモーター（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）アクチン２プロモーターなど）が挙げられる。プロモーターは、ダイズ以外の生物（微生物、動物、昆虫、植物、ウイルスなど）に由来するプロモーターであってもよい。このようなプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどが例示される。
【００４３】
ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターなどが例示される。
【００４４】
ポリアデニル化シグナルとしては、アグロバクテリウムＴｉプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のポリＡシグナル、カリフラワーモザイクウイルスのポリＡシグナル配列などが例示される。
【００４５】
選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子（アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ビアラフォス、ビスピリバックソディウムなど）、蛍光タンパク質遺伝子（Ds-Red、EGFPなど）などが例示される。本発明のベクターは、これらのポリヌクレオチドのうち１種有していてもよいし、２種以上有していてもよい。
【００４６】
本発明のベクターの作成方法は特に限定されない。例えば、挿入前のベクターに本発明のポリヌクレオチドおよび本発明のポリヌクレオチド以外の所望のポリヌクレオチドを作動可能に連結し挿入することにより得ればよい。例えば、ポリヌクレオチドを制限酵素で切断し、ベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに連結または挿入することによりベクターを得る方法が挙げられる。また、Ｇａｔｅｗａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）による組換えシステムを用いて所望のポリヌクレオチドが挿入されたベクターを得る方法が挙げられる。
【００４７】
〔形質転換体〕
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドが導入されている形質転換体である。
【００４８】
ポリヌクレオチドが導入される宿主又は宿主細胞は、特に限定されない。宿主または宿主細胞は、本発明のタンパク質および本発明のポリヌクレオチドが由来する生物と同種および異種のいずれでもよい。例えば、植物、細菌（大腸菌など）、酵母（サッカロミセス・セレビシエなど）、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられ、植物であることが好ましい。植物の例および好ましい例は、ポリヌクレオチドの説明中における例および好ましい例と同様である。植物は、植物の細胞、組織および植物体のいずれであってもよい。
【００４９】
本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを発現してタンパク質を産生できる宿主又は宿主細胞であればよく、例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを含む宿主、または宿主細胞が挙げられる。本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドの例および好ましい例は、本発明のベクターの説明にて示した例および好ましい例と同様である。
【００５０】
〔形質転換植物の作製方法〕
本発明の形質転換植物の作製方法は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを植物細胞内に導入することを含む。
【００５１】
形質転換される植物としては、ポリヌクレオチドの説明中における例および好ましい例と同様である。宿主又は宿主細胞への導入方法は特に限定されず、本発明のベクターを導入する方法、本発明のポリヌクレオチドをパーティクルガン法などで直接導入する方法が例示される。前者としては、本発明のベクターをエレクトロポレーション法などの方法によりアグロバクテリウム中に導入し、これを植物細胞と共培養して植物細胞に感染させる方法が例示される。
【００５２】
〔マーカー〕
本発明のポティウイルス抵抗性マーカーは、以下の（Ａ）〜（Ｆ）である。
（Ａ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７８２の塩基のＳＮＰマーカー
（Ｂ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号９７７の塩基のＳＮＰマーカー
（Ｃ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号１３９１から１７３０の塩基配列のＳＳＲマーカー
（Ｄ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号６５９４のＳＮＰマーカー
（Ｅ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号７２７０のＳＮＰマーカー
（Ｆ）配列番号１８の塩基配列の塩基番号２００１から７５２９の塩基配列のＳＴＳマーカー
【００５３】
（Ａ）は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーであり、ダイレクトシークエンス法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＬＡＭＰ法、ＤＮＡチップ、ビーズアレイ法、ＨＲＭ法等の方法で検出することができる。後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＴアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＣアレルである。従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。
【００５４】
（Ｂ）は、ＳＮＰマーカーであり、（Ａ）で例示した方法により検出することができる。後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＡアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＧアレルである。従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。
【００５５】
（Ｃ）は、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔ）マーカーであり、該マーカーを含む部分を増幅することにより同定することができる。後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合には増幅断片長が３３６ｂｐ以下である。一方、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合には増幅断片長が３３７ｂｐ以上である。従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。
【００５６】
（Ｄ）は、ＳＮＰマーカーであり、（Ａ）で例示した方法により検出することができる。後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＣアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＡアレルである。従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。
【００５７】
（Ｅ）は、ＳＮＰマーカーであり、（Ａ）で例示した方法により検出することができる。後段の実施例の結果から明らかなとおり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合にはＧアレル、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合にはＡアレルである。従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。
【００５８】
（Ｆ）は、ＳＴＳ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｇｅｄ  Ｓｉｔｅ）マーカーであり、該マーカーを含む部分の増幅により検出することができる。Ｒｓｖ４遺伝子が発現している場合には増幅断片長が３ｋｂｐ以下であり、Ｒｓｖ４遺伝子が発現していない場合には増幅断片長が５ｋｂｐ以上である。従って、Ｒｓｖ４遺伝子マーカー、すなわちポティウイルス抵抗性マーカーとして有用である。
【００５９】
〔プライマーセット〕
本発明のプライマーセットは、上記マーカーを検出し得る２以上のポリヌクレオチドから構成される。
【００６０】
本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ａ１）及び（Ａ２）を含むことが好ましい。これにより（Ａ）マーカーを検出することができる。
（Ａ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から７８１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ａ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号７８３から１６０８の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００６１】
本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｂ１）及び（Ｂ２）を含むことが好ましい。これにより（Ｂ）マーカーを検出することができる。
（Ｂ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から９７６の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号９７８から１９７７の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００６２】
本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｃ１）及び（Ｃ２）を含むことが好ましい。これにより（Ｃ）マーカーを検出することができる。
（Ｃ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から１６１１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１６５２から２６５１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００６３】
本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｄ１）及び（Ｄ２）を含むことが好ましい。これにより（Ｄ）マーカーを検出することができる。
（Ｄ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号５５９４から６５９３の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６５９５から７５９４の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００６４】
本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｅ１）及び（Ｅ２）を含むことが好ましい。これにより（Ｅ）マーカーを検出することができる。
（Ｅ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６２７０から７２６９の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｅ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号７２７１から８２７０の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００６５】
本発明のプライマーセットは、以下のポリヌクレオチド（Ｆ１）及び（Ｆ２）を含むことが好ましい。これにより、（Ｆ）マーカーを検出することができる。
（Ｆ１）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から２７２５の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
（Ｆ２）配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６３４１から９５２９の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列の少なくとも一部と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００６６】
配列番号１８の塩基配列は、ダイズのポティウイルス感受性品種であるＷｉｌｌｉａｍｓ８２のＲｓｖ４のゲノムＤＮＡである。配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号２７２６〜６３４０の３．６１ｋｂｐの挿入配列は、配列番号１３の塩基配列に相当し、感受性品種には存在するが抵抗性品種には存在しない。該挿入配列が存在すればＲｓｖ４遺伝子（配列番号１〜３の塩基配列）が発現せず、存在しなければＲｓｖ４遺伝子は発現する。従って、この領域を増殖するか、あるいはこの挿入配列に特異的な遺伝子マーカーをタイピングすることにより、抵抗性又は感受性の判定が可能である。
【００６７】
「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイズの条件下において、対象である塩基配列とのみハイブリダイズし、その他とは実質的にハイブリダイズしないという意味である。通常のハイブリダイズの条件下とは、通常のＰＣＲのアニーリングやプローブによる検出に用いられる条件下を意味する。Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲの場合、一般的な緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．３〜９．０)、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2など）を用いて、適当なアニーリング温度（５４℃〜６０℃程度）で反応を行なう条件が例示される。ノーザンハイブリダイゼーションの場合、一般的なハイブリダイゼーション溶液（５ｘＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１〜０．５％ＳＤＳ）を用いて、適当なハイブリダイゼーション温度（４２℃〜６５℃程度）で反応を行なう条件が例示される。アニーリング温度およびハイブリダイゼーション温度は、プライマーとして用いるポリヌクレオチド（そのＴｍ値など）および／または実験者の経験則に基づいて適宜定めることができ、当業者であれば容易に定めることができる。
【００６８】
「実質的にハイブリダイズしない」とは、全くハイブリダイズしないこと、またはハイブリダイズする量が対象領域にハイブリダイズする量よりも大幅に少ないもしくは相対的に無視できる程度の微量であることを意味する。
【００６９】
（Ａ１）〜（Ｆ２）において、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。とりわけ好ましくは、対象領域の塩基配列と同一の塩基配列である。同一性の定義は、上記と同様である。また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。
【００７０】
（Ａ１）〜（Ｆ２）において、「配列番号１８の塩基配列のうちの所定の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列」は、その相補的な塩基配列も含む意味である。
【００７１】
「少なくとも一部」とは、塩基配列中の一部の領域を意味し、通常は連続する領域であることが好ましい。該領域の塩基数は、通常は１０塩基以上であり、好ましくは１５塩基以上であり、より好ましくは２０塩基以上であり、さらに好ましくは２５塩基以上である。上限は、通常は５０塩基以下であり、好ましくは４５塩基以下であり、より好ましくは４０塩基以下であり、さらに好ましくは３５塩基以下である。プライマーとして用いる場合、通常は１０塩基以上であり好ましくは１５塩基以上であり、さらに好ましくは２０塩基以上である。例えば、（Ｆ１）における該領域は、通常は配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号１から２７２５の塩基配列の少なくとも一部を含む領域であり、塩基番号１〜２７２５の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることが好ましく、塩基番号１６４５〜２７２５の少なくとも一部を含む領域であることがより好ましく、塩基番号２００１〜２７２５の少なくとも一部を含む領域であることがさらに好ましい。（Ｆ２）における該領域は、通常は配列番号１８の塩基配列のうち塩基番号６３４１から９５２９の塩基配列の少なくとも一部を含む領域であり、塩基番号６３４１〜９５２９の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることが好ましく、塩基番号６３４１〜８１８９の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることがより好ましく、塩基番号６３４１〜７５２９の少なくとも一部の塩基配列を含む領域であることがさらに好ましい。
【００７２】
（Ａ１）〜（Ｆ２）の各ポリヌクレオチドは、その一部（末端など）に対象とハイブリダイズしない領域を含んでいてもよい。例えば、（Ａ１）は、ハイブリダイズする領域がプライマー全体のおよそ半分以上を占めかつ３'末端側にあることが好ましい。（Ｂ１）、（Ｃ１）、（Ｄ１）、（Ｅ１）及び（Ｆ１）も同様である。例えば、（Ａ２）は、ハイブリダイズする領域がプライマー全体のおよそ半分以上を占めかつ５'末端側にあることが好ましい。（Ｂ２）、（Ｃ２）、（Ｄ２）、（Ｅ２）及び（Ｆ２）も同様である。これにより、任意の付加配列があっても正常にアニーリングして伸長反応を生じることができる。ハイブリダイズしない領域としては、制限酵素認識配列などが例示される。制限酵素認識配列は通常、プライマーの５'側に付加される。なお、各ポリヌクレオチドの末端に対象とハイブリダイズしない領域が含まれている場合、同一性の算出は、ハイブリダイズしない末端の領域は考慮せず、ハイブリダイズする領域のみに着目して行うことが好ましい。
【００７３】
（Ａ１）〜（Ｆ２）の各ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、または２０個以上であってもよく、好ましくは２５個以上である。また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、５０個以下、４０個以下、または３０個以下であってもよい。
【００７４】
（Ａ１）〜（Ｆ２）は、当業者であればＰｒｉｍｅｒ３などのソフトウェアを用いて設計することができ、その中から適切な塩基配列を選択すればよい。
プライマーは、増幅産物の検出を容易に行うため標識物質で標識されていてもよい。蛍光物質としては、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＨＥＸなどの蛍光物質が例示される。一方、プライマーは、標識されていなくてもよく、ゲル電気泳動などの方法で増幅産物のサイズの差異を確認してもよい。
【００７５】
（Ａ１）としては、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ａ２）としては、配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００７６】
（Ｂ１）としては、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ｂ２）としては、配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号８５の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８６の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００７７】
（Ｃ１）としては、配列番号５３の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ｃ２）としては、配列番号５４の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号５３の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号５４の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００７８】
（Ｄ１）としては、配列番号８３の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ｄ２）としては、配列番号８４の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号８３の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８４の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００７９】
（Ｅ１）としては、配列番号８１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ｅ２）としては、配列番号８２の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号８１の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号８２の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００８０】
（Ｆ１）としては、配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ｆ２）としては、配列番号１２の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号１２の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
また、（Ｆ１）としては、配列番号９１の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。（Ｆ２）としては、配列番号９２の塩基配列を含むポリヌクレオチドが例示される。本発明のプライマーセットは、配列番号９３の塩基配列を含むポリヌクレオチドと配列番号９４の塩基配列を含むポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。
【００８１】
本発明のプライマーセットは、植物のポティウイルス抵抗性の判別に用いることができる。植物、ポティウイルスの例および好ましい例は、先述したとおりである。
【００８２】
〔キット〕
本発明のキットは、上述した各種プライマーセットを含むキットに関する。  
【００８３】
本発明のキットは、プライマーセットの他に、増幅反応で用いられるタンパク質、蛍光試薬、基質（ｄＮＴＰｓなど）、補酵素（ＡＴＰなど）をさらに含んでいてもよい。増幅反応で用いられるタンパク質としては、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ、リガーゼ、ヘリカーゼおよびリコンビナーゼが例示される。本発明のキットは、ポジティブコントロール（ＰｅｋｉｎｇのゲノムＤＮＡ、ＦｕｋｕｓｅｎｎａｒｉのゲノムＤＮＡ、ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１のゲノムＤＮＡなど）および／またはネガティブコントロール（Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２のゲノムＤＮＡ、ＥｎｒｅｉのゲノムＤＮＡなど）を含んでいてもよい。
【００８４】
本発明のキットは、個々の容器（チューブなど）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。
【００８５】
〔抵抗性の判定方法〕
本発明のダイズのポティウイルス抵抗性の判定方法は、植物の核酸試料中の配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無を検出し、当該挿入配列の挿入があればポティウイルスへの抵抗性なしと判断し、当該挿入配列の挿入がなければポティウイルスへの抵抗性ありと判断する方法である。
【００８６】
植物の核酸試料は、植物の核酸を含む、又は含む可能性がある試料である。核酸は、通常はＤＮＡであり、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡのいずれであってもよい。植物がダイズである場合、核酸試料は、第２染色体の核酸の一部を含むことが好ましく、配列番号１４〜１８の塩基配列またはこれらのいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むことがより好ましい。配列番号１４の塩基配列は、ＰｅｋｉｎｇのＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列なし）の塩基配列であり、配列番号１５の塩基配列は、ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１のＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列なし）の塩基配列であり、配列番号１６の塩基配列は、ＦｕｋｕｓｅｎｎａｒｉのＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列なし）の塩基配列であり、配列番号１７は、ＥｎｒｅｉのＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列あり）の塩基配列であり、配列番号１８は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２のＲｓｖ４遺伝子のゲノムＤＮＡ（上記挿入配列あり）の塩基配列である。
【００８７】
配列番号１４〜１８のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列とは、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。とりわけ好ましくは、対象領域の塩基配列と同一の塩基配列である。同一性の定義は、上記と同様である。また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。
【００８８】
本発明の方法においては、配列番号１３の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入の有無を検出する。配列番号１３の塩基配列は、Ｒｓｖ４遺伝子における挿入配列であり、挿入配列が挿入されていると活性を有するＲｓｖ４タンパク質は生産されず、挿入配列が挿入されていないと活性を有するＲｓｖ４タンパク質が生産される。配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列は、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。同一性の定義は、上記と同様である。また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。
【００８９】
配列番号１３の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列の挿入位置は、配列番号４または配列番号５の塩基配列またはこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列中、塩基番号１６９（アデニン）と１７０（グアニン）との間であることが好ましい。配列番号４または配列番号５の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列は、植物、中でもダイズの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列を意味する。同一性は、例えば９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または９５％以上であり、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、更に好ましくは９８％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。同一性の定義は、上記と同様である。また、それぞれの塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列とは、それぞれの塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入、付加など）を含む塩基配列であってもよい。このようなダイズの各品種における対応箇所の塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかである。例えば、ダイズの品種における上記挿入領域周辺の塩基配列を解読することにより、またはダイズの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、決定できる。
【００９０】
塩基配列の挿入の有無の検出は、本発明のマーカーのタイピングにより行うことが好ましい。その際、本発明のプライマーセットまたはキットを用いて行うことが好ましい。検出手段としては、核酸増幅法（ＰＣＲ法など）が例示される。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例により説明する。なお、以下の実施例の説明においては、結果と考察を先に記載し、実験方法は実施例８の結果及び考察の後段にて説明する。
【００９２】
実施例１  Ｒｓｖ４のポジショナルクローニング
エンレイ（ＳＭＶ感受性）×Ｐｅｋｉｎｇ（ＳＭＶ抵抗性）の戻し交雑後代９，３２０個体の遺伝子型を解析し、Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域を第２染色体上の約９．８ｋｂｐの領域まで絞り込んだ（図１）。この領域は、別のグループによって既に報告されているＲｓｖ４遺伝子座候補領域（Ｓａｇｈａｉ  Ｍａｒｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２０１０（非特許文献３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１１（非特許文献４））と異なっていた。既に解読されているＷｉｌｌｉａｍｓ８２（ＳＭＶ感受性）ゲノムＤＮＡ塩基配列における、上記約９．８ｋｂｐのＲｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域の塩基配列にはタンパク質コード領域の存在は予測されず、レトロトランスポゾンらしき約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在した。
【００９３】
一方、ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域の塩基配列を解読したところ、この約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在せず、２５９アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするタンパク質コード領域が存在していた。ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける当該タンパク質コード領域の塩基配列を配列番号１に示す。このタンパク質コード領域の塩基配列から予測されるタンパク質（配列番号６）はＲＮａｓｅ  Ｈファミリーの属するタンパク質に共通して含まれるドメインをもつと予測された（図２）。
【００９４】
Ｐｅｋｉｎｇと同様にＳＭＶ抵抗性品種であるＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１及びＦｕｋｕｓｅｎｎａｒｉのゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域の塩基配列を解読したところ、これらの塩基配列中にはＰｅｋｉｎｇの場合と同様に約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在せず、これによりそれぞれ２５５及び２７１アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするタンパク質コード領域が存在していることがわかった（配列番号２、３、７および８、図１４）。一方、ＳＭＶ感受性品種であるＥｎｒｅｉのゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に対応する領域においてはＷｉｌｌｉａｍｓ８２の場合と同様にタンパク質コード領域の存在は予測されず、約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）が存在した。さらに、ＥｎｒｅｉおよびＷｉｌｌｉａｍｓ８２の当該領域の塩基配列から約３．６ｋｂｐの配列（配列番号１３）を除くと、ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける上記タンパク質コード領域の塩基配列と高い同一性を有するタンパク質コード領域の配列を再構成することができた（配列番号４、５、９および１０）。
【００９５】
実施例２  Ｒｓｖ４遺伝子によるＳＭＶの増殖抑制効果
ＰｅｋｉｎｇゲノムＤＮＡにおける上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に存在するタンパク質コード領域によってコードされるタンパク質（Ｒｓｖ４タンパク質）を恒常的に発現する形質転換ダイズを作製し、ＳＭＶ接種後１０日目の非接種上位葉におけるＳＭＶの外被タンパク質（ＳＭＶ  ＣＰ）の蓄積をウェスタンブロット法により検出した。このとき、Ｒｓｖ４タンパク質の蓄積を、特異的抗体を用いて同時に検出した。非形質転換ダイズ（Ｊａｃｋ）と比べて、Ｒｓｖ４タンパク質を発現するダイズ（２７ｃ−１）ではＳＭＶのＣＰの蓄積が低く、ＳＭＶの増殖が抑制されたことを示している（図３）。
【００９６】
実施例３  Ｒｓｖ４タンパク質の活性中心のＳＭＶの増殖抑制効果への影響
アグロインフィルトレーション法によるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ一過的発現系を用いてＲｓｖ４タンパク質のＳＭＶ増殖抑制能を調べた。Ｒｓｖ４タンパク質を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウム、ＲＮａｓｅ  Ｈドメインの活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質（Ｄ９９Ｎ変異体）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウム、およびネガティブコントロールとしてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムを、それぞれＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に接種した。１日後にそれらの葉に感染性ＳＭＶ  ｃＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムを接種した後、５日後に、感染性ＳＭＶ  ｃＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムが接種された葉におけるＳＭＶのＣＰおよびＲｓｖ４タンパク質の蓄積をウェスタンブロット法により検出した。ＧＵＳおよびＤ９９Ｎ変異型Ｒｓｖ４タンパク質を発現する葉ではＳＭＶのＣＰが蓄積したが、Ｒｓｖ４タンパク質を発現する葉ではＣＰの蓄積は検出されなかった（図４）。本実施例の結果は、Ｒｓｖ４タンパク質がダイズ以外の植物において発現した場合にもＳＭＶの増殖を抑制する活性を有すること、及び、Ｒｓｖ４タンパク質の活性中心に存在すると考えられる９９番目のアスパラギン酸残基は、ＳＭＶの増殖抑制活性にとって重要であることを示している（図４）。
【００９７】
実施例４  Ｒｓｖ４遺伝子による抵抗性打破ＳＭＶ変異株の増殖抑制効果
Ｒｓｖ４遺伝子座によるＳＭＶ抵抗性は、ＳＭＶが有するＰ３タンパク質における特定のアミノ酸置換により打破されることが知られている（Ｃｈｏｗｄａ−Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．  Ｖ．Ｓｕｎ  Ｈ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｐｏｙｓａ  Ｖ，Ｌｉｎｇ  Ｈ，Ｇｉｊｚｅｎ  Ｍ，＆  Ｗａｎｇ  Ａ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐ３  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ２  Ｉｓｏｌａｔｅｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｒｓｖ４−Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｓｏｙｂｅａｎ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２４，３７−４３（２０１１）．Ａｈａｎｇａｒａｎ，Ａ．，Ｈａｂｉｂｉ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｇ．−Ｈ．Ｍ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｓ．＆  Ｇａｒｃｉａ−Ａｒｅｎａｌ，Ｆ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｉｒａｎ  ａｌｌｏｗｓ  ｔｈｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  Ｒｓｖ４−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９４，２５５７−２５６８（２０１３）．Ｋｈａｔａｂｉ，Ｂ．，Ｆａｊｏｌｕ，Ｏ．Ｌ．，Ｗｅｎ，Ｒ．Ｈ．＆  Ｈａｊｉｍｏｒａｄ，Ｍ．Ｒ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｇａｉｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｒｓｖ−ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｎ  Ｒｓｖ４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３，１０７７−１０８８（２０１２）．）。そこで、上記アミノ酸置換を有する抵抗性打破ＳＭＶ変異株（ＳＭＶ−Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ））の増殖が、Ｒｓｖ４タンパク質を発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉で抑制されるか調べた。
【００９８】
本実施例では、ＳＭＶ感染性プラスミドを有するアグロバクテリウムをＯＤ600＝０．００５で接種した。これに、Ｒｓｖ４を発現させるプラスミドをもつアグロバクテリウムをＯＤ600＝０．５で接種したときにはＳＭＶ−Ｃ（ｗｔ）およびＳＭＶ−Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）ともに増殖が阻害された（図５）。一方、それよりも低い濃度のＯＤ600＝０．０５で接種したときにはＳＭＶ−Ｃ（ｗｔ）の増殖は阻害されたが、抵抗性打破系統のＳＭＶ−Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）は増殖した（図５）。
【００９９】
以上より、上記Ｒｓｖ４遺伝子座候補領域に存在する上記タンパク質コード領域を含む遺伝子がＲｓｖ４遺伝子座の責任遺伝子であると結論付けた。またこの結果から、植物内でＲｓｖ４タンパク質を過剰発現することにより、抵抗性打破変異ウイルスの増殖も抑制可能であり、当該植物に対しより強力な抵抗性を付与できるものと考えられた。
【０１００】
実施例５  Ｒｓｖ４遺伝子によるＳＭＶ以外のポティウイルスの増殖抑制効果
ポティウイルス属は１４６種が正式に登録されており（Ｎｉｎｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．（２０１２）Ｅｄ：Ｋｉｎｇ，Ａ．Ｍ．Ｑ．，Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｅ．Ｊ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、未決定のものも含めると約２００種にも上る。農作物に甚大な被害を与えるウイルスも多い。Ｒｓｖ４がＳＭＶ以外のポティウイルスの増殖も阻害し得るか調べるため、Ｒｓｖ４を一過的に発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉にカブモザイクウイルス（ＴｕＭＶ）、ジャガイモＹウイルス（ＰＶＹ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＣＭＶ）、ジャガイモＡウイルス（ＰＶＡ）、ラッカセイ斑紋ウイルス（ＰｅＭｏＶ）を接種し、７〜１４日後の非接種上位葉におけるウイルスＲＮＡの蓄積をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。コントロールとして用いた活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質（Ｄ９９Ｎ）を発現する植物と比較して、Ｒｓｖ４タンパク質発現植物ではウイルスＲＮＡの蓄積が著しく抑制されていた（図６の左図）。このとき、ＴｕＭＶを接種したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａは激しい病徴を示したが、Ｒｓｖ４タンパク質発現葉にＴｕＭＶを接種した植物は病徴が著しく遅延あるいは全く示さなかった（図６の右図）。
【０１０１】
本実施例の結果は、Ｒｓｖ４タンパク質がＳＭＶ以外のポティウイルスに対しても増殖抑制効果を発揮し得ることを示す。
【０１０２】
実施例６  Ｒｓｖ４タンパク質が二本鎖ＲＮＡ分解酵素であることの確認
Ｒｓｖ４のアミノ酸配列から予想されるＲＮａｓｅ  Ｈは、一般にＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるが、ポティウイルスを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは、相補鎖ＲＮＡを介して複製され、その過程ではＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖は生じないことから、Ｒｓｖ４とポティウイルスの増殖抑制効果との間に明瞭な関係が見いだせない。そこでＲｓｖ４タンパク質がどのような生化学的特性をもつか解析した。
【０１０３】
Ｃ末端にＦＬＡＧタグを融合したＲｓｖ４タンパク質を、アグロインフィルトレーション法を用いてＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉で発現し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降により精製タンパク質を得た。この精製タンパク質、すなわちＦＬＡＧタグ融合Ｒｓｖ４タンパク質がＳＭＶ増殖抑制能をもつことは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを用いた一過的発現実験により確認された。この精製タンパク質を用いて、32Ｐで標識したＲＮＡが分解されるかを調べた。反応のコントロールとして大腸菌由来のＲＮａｓｅ  ＨおよびＳ１ヌクレアーゼを使用した。Ｒｓｖ４タンパク質は一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を切断しなかったが、マンガン依存的に二本鎖ＲＮＡを分解した（図７）。この二本鎖ＲＮＡ分解活性はＤ９９Ｎ変異体では見られなかった。
【０１０４】
本実施例の結果は、Ｒｓｖ４タンパク質が二本鎖ＲＮＡ分解酵素であることを示すとともに、９９番目のアスパラギン酸残基が当該タンパク質の活性に必要であることを裏付けている。
【０１０５】
実施例７  Ｒｓｖ４とＳＭＶ  Ｐ３との相互作用の確認
ＲＮＡウイルスは相補鎖ＲＮＡを介して複製することから、ウイルス複製時に生じる二本鎖ＲＮＡはウイルス特異的分子パターン物質として宿主の防御機構の標的となる（Ｋａｒｐａｌａ  ＡＪ，Ｄｏｒａｎ  ＴＪ，Ｂｅａｎ  ＡＧＤ：Ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｄｓＲＮＡ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８３，２１１−２１６（２００５）．ＤｅＷｉｔｔｅ−Ｏｒｒ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｋ．Ｌ．ｄｓＲＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５，３２５−３４１（２０１０）．）。多くの真核生物は、この二本鎖ＲＮＡを分解する酵素（例えばＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのＤｉｃｅｒなど）をもつが、プラス鎖ＲＮＡウイルスはこれに感染することができる。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、二本鎖ＲＮＡを隠すために、細胞質から隔離された場を作り、そこでのみ複製を行うので、このような分解酵素を有する真核生物にも感染することができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｊａｎｄａ  Ｍ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｍ，ｄｅｎ  Ｂｏｏｎ  Ｊ，Ａｈｌｑｕｉｓｔ  Ｐ，Ａ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｐａｒａｌｌｅｌｓ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｃａｐｓｉｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，９（３），５０５−５１４（２００２）．）。Ｒｓｖ４は、複製時に生じるウイルス二本鎖ＲＮＡを分解していると考えるのが最も単純な作用機構の仮説となるが、このときに上の事情を勘案すると、二本鎖ＲＮＡ分解活性をもつことだけではＳＭＶに対する増殖抑制効果を十分説明できたとは言えない。
【０１０６】
細胞質から隔離された複製の場においてＲｓｖ４がウイルス二本鎖ＲＮＡを分解するにはウイルスの近くにＲｓｖ４が存在しなければならない。ＳＭＶのＰ３タンパク質の機能は不明であるが、膜貫通領域をもつと予測され、いくつかのポティウイルス属ウイルスにおいては、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Pol）と相互作用することが報告されている（Ｍｅｒｉｔｓ，Ａ．，Ｇｕｏ，Ｄ．，Ｊａｒｖｅｋｕｌｇ，Ｌ．＆  Ｓａａｒｍａ，Ｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｐｏｔａｔｏ  Ａ  Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ−Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｐ１  ａｎｄ  Ｐ３  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６３，１５−２２（１９９９）．Ｇｕｏ，Ｄ．，Ｒａｊａｍａｋｉ，Ｍ．−Ｌ．，Ｓａａｒｍａ，Ｍ．＆  Ｖａｌｋｏｎｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｔ．Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｐ  ｏｆ  ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２，９３５−９３９（２００１）．Ｓｈｅｎ  ＷＴ，Ｗａｎｇ  ＭＱ，Ｙａｎ  Ｐ，Ｇａｏ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｆ  Ｐａｐａｙａ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｐ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ．Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ，５４（１）：４９−５４（２０１０）．）。したがって、Ｐ３は複製の場に存在することが予想され、Ｒｓｖ４がＰ３と相互作用するならば、本来細胞質から隔離された複製の場であっても、Ｒｓｖ４が潜り込んでウイルス二本鎖ＲＮＡを分解することで増殖を抑制する可能性がある。そこで、Ｒｓｖ４とＳＭＶ  Ｐ３の相互作用を調べた。
【０１０７】
ＦＬＡＧタグ融合Ｒｓｖ４とＭｙｃタグ融合Ｐ３（Ｐ３−Ｍｙｃ）を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムをＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に接種し、３日後に葉を破砕して遠心により調製した膜画分をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化した後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降を行った。すると免疫沈降画分（ＦＬＡＧ―ＩＰ）にＲｓｖ４−ＦＬＡＧとともにＰ３−Ｍｙｃが検出された。このことから、Ｒｓｖ４とＳＭＶ  Ｐ３との相互作用が確認された（図８）。この相互作用は、Ｄ９９Ｎ変異体においても維持された。
【０１０８】
以上の結果より、Ｒｓｖ４はＰ３との相互作用を介してＳＭＶの複製の場に潜り込み、そこでウイルスの複製により生じた二本鎖ＲＮＡを分解することによって抵抗性を示すという作用機構のモデルが考えられた（図９）。
【０１０９】
実施例８  Ｒｓｖ４遺伝子の連鎖マーカーの特定
Ｒｓｖ４連鎖マーカー（Ｒｓｖ４＿４４６およびＲｓｖ４＿３２０、２マーカーの物理距離は１２６ｋｂ）を用いて「エンレイ」を反復親とする「エンレイ」×「Ｐｅｋｉｎｇ」の戻し交雑後代合計９，３２０個体（表１）の遺伝子型を解析し、２つのＲｓｖ４連鎖マーカー間で乗り換えを生じていた３９個体を選抜した（表１）。さらに、１２６ｋｂの候補領域内に存在するＳＳＲ、エンレイ−Ｐｅｋｉｎｇの塩基配列比較によって見出されたＳＮＰおよびＩｎｄｅｌの変異を解析し、６箇所のＳＳＲ、２箇所のＳＴＳ、５箇所のＳＮＰの遺伝子型を決定した（図１３）。乗り換え個体から得られた種子を用いてＳＭＶ−Ｃ系統の後代検定を行った結果、Ｒｓｖ４遺伝子を９．８ｋｂｐの領域（図１３中の両矢印）に絞り込んだ。この領域には、表６及び図１２に示す連鎖マーカーが含まれていた。約１万個体を調べても、ＳＭＶ抵抗性と完全に一致していることから、表６及び図１２に記載した連鎖マーカーは高精度の選抜が可能なマーカーと言える。
【０１１０】
以下に、各実施例で用いられた実験方法を記載する。
各ウイルス株は農業生物資源研究所ジーンバンクより入手した。各ウイルスの登録番号は、以下のとおりである。ＳＭＶ−Ｃ：ＭＡＦＦ  １０４０６５，ＴｕＭＶ：ＭＡＦＦ  ７１５０６２，ＰＶＹ：ＭＡＦＦ  ３０７０２４，ＢＣＭＶ：ＭＡＦＦ  ７１５０４９，ＰＶＡ：ＭＡＦＦ  ３０７０２８，ＰｅＭｏＶ：３０７０４４。ウイルスの機械接種には、感染葉を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で破砕したものを感染源として使用した。ウェスタンブロッティングには、大腸菌で発現した組換えＳＭＶ  ＣＰ及びＲｓｖ４（配列番号６）の残基番号７８〜２５９を含む断片を抗原としたウサギ抗血清を使用した。ウイルスを検出するためのＲＴ−ＰＣＲは、表５に記載のプライマー（配列番号９７〜１０６）のうち各ウイルスに対応したものを選択して用いるとともに、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＧＥＮ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いて行った。
【０１１１】
Ｒｓｖ４のポジショナルクローニングに用いた材料のうち、ＳＭＶ全系統抵抗性品種「Ｐｅｋｉｎｇ」および感受性品種「エンレイ」は２００６年に長野県中信農業試験場（現長野県野菜花き試験場）より入手した。ＳＭＶ抵抗性遺伝子Ｒｓｖ４周辺におけるＳＳＲマーカーの開発には、「エンレイ」×「Ｐｅｋｉｎｇ」のＦ２雑種集団を用いた。また、Ｒｓｖ４のファインマッピングには、「エンレイ」×「Ｐｅｋｉｎｇ」のＦ１雑種に反復親の「エンレイ」を戻し交雑したＢＣ１Ｆ１個体をはじめ、さらに戻し交雑を進めた種々の世代の戻し交雑後代を使用した（表１）。
【０１１２】
【表１】
0006549393.tif 000002
【０１１３】
ＳＭＶの接種検定は、以下に説明するＳＳＲマーカー解析、ＳＴＳマーカー解析、ＳＮＰマーカーのうちのいずれかの遺伝子型解析方法により選ばれた植物を用いて行った。まず、植物体の遺伝子型を決定し、その植物体から得た自殖種子を播種し、初生葉が展開した約２週間後の次世代の実生株をＳＭＶの接種検定に用いた。ＳＭＶの接種は、あらかじめＳＭＶを増殖させた感受性品種「Ｊａｃｋ」の感染葉を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で破砕し、カーボランダムを用いた汁液接種法により初生葉に接種することにより行った。接種後、約１週間から１０日の上位葉における病徴を観察することにより抵抗性を判定した。系統あたり１５株〜３０株を調査し、全く病徴が現れなかった系統を抵抗性、８割以上が発病したものを罹病性、それらの中間をヘテロとしてそれぞれ判定した。
【０１１４】
ダイズのゲノムＤＮＡは、グアニジン塩酸塩とプロテイナーゼＫを用いたＫｈｏｓｌａ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｋｈｏｓｌａ  Ｓ，Ａｕｇｕｓｔｕｓ  Ｍ、Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ  Ｖ  （１９９９）．Ｓｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｄｌｅ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅａｌｙｂｕｇ  Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：３７４５−３７５１）に従い、凍結乾燥させた未展開葉３小葉、またはドリルで削りとった約１００ｍｇの種子粉末より抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ社のＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて未展開の第２あるいは第３本葉３枚より抽出した。
【０１１５】
Ｒｓｖ４遺伝子の染色体上の座乗位置を大まかに絞り込むため、近傍に座乗すると予想された５種類のＳＳＲマーカー（表２）を用いてＦ２雑種集団のＳＳＲマーカー解析を実施した。Ｒｓｖ４遺伝子と最も近接していたＳＳＲマーカーのＧＭＥＳ０７７７の塩基配列情報を用いて、米国ＤＯＥ−ＪＧＩ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって２００９年に公開されたダイズゲノムアッセンブリ“Ｇｌｙｍａ０”の塩基配列情報をＢｌａｓｔ検索し、ＧＭＥＳ０７７７を含む塩基配列情報を取得した。さらにＲｓｖ４遺伝子に近接したＳＳＲマーカーを設計し、Ｆ２雑種集団のＳＳＲマーカー解析を実施するために、反復配列抽出ソフトのｒｅａｄ２Ｍａｒｋｅｒ（Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ，Ｎｕｎｏｍｅ  Ｔ，Ｍｉｎａｍｉｙａｍａ  Ｙ，Ｋｏｎｏ  Ｉ，Ｎａｍｉｋｉ  Ｎ，Ｋｏｊｉｍａ  Ａ（２００５）．Ｒｅａｄ２Ｍａｒｋｅｒ：ａ  ｄａｔａ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅｍ  ｄａｔａ  ｓｅｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３９：４７２−４７６．）を用いて、取得した“Ｇｌｙｍａ０”に含まれるＳＳＲ配列および位置情報を抽出し、それを挟みかつ百数十塩基の配列を増幅させるようにプライマー設計ソフトＰｒｉｍｅｒ３（Ｒｏｚｅｎ  Ｓ，Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ  ＨＪ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．Ｉｎ：Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（ｅｄｓ）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ  ３６５−３８６．）を用いて２５種類のＳＳＲプライマーを設計した（配列番号２９〜７８：表２〜３の「Ｒｓｖ４のマッピングに使用したプライマー（新たに設計したもの）」参照）。フォワードプライマーの５’末端はＡＢＩ社の蛍光色素で標識した。ＳＳＲプライマー（配列番号１９〜７８：表２〜３の「Ｒｓｖ４のマッピングに使用したプライマー」及び「Ｒｓｖ４のマッピングに使用したプライマー（新たに設計したもの）」参照）、ゲノムＤＮＡ、およびＱＩＡＧＥＮ社のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを混合してＰＣＲを行い、蛍光化されたＰＣＲ産物を増幅した。これをＡＢＩ社のＡＢＩ３７００もしくはＡＢＩ３７３０  ＤＮＡシーケンサーを用いて電気泳動し、ＡＢＩ社のフラグメント解析ソフトＧｅｎｅｍａｐｐｅｒを用いて、ＳＳＲマーカーの両親間多型および雑種後代の遺伝子型を解析した。ＳＳＲマーカーをはじめとする各種のマーカーとＲｓｖ４遺伝子との連鎖解析には連鎖解析ソフトＪｏｉｎＭａｐ  ４．０（Ｖａｎ  Ｏｏｉｊｅｎ，ＪＷ（２００６）ＪｏｉｎＭａｐ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０，Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐｓ．Ｋｙａｚｍａ  Ｂ．Ｖ．，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ,  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。
【０１１６】
イルミナ社の次世代型シーケンサーＨｉｓｅｑ２０００を用いてダイズ品種「エンレイ」および「Ｐｅｋｉｎｇ」のそれぞれについて１３．１Ｇｂｐおよび９．１Ｇｂｐの塩基配列解読データを取得した。この塩基配列解読データをＣＬＣ社の次世代型塩基配列用解析ソフトＣＬＣ−Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈのマッピングモジュールを用いて、ダイズゲノムのリファレンス配列“Ｇｌｙｍａ１”（米国ＤＯＥ−ＪＧＩによって２０１０年に公開）にマップした。ＳＮＰマーカー解析を実施するため、リファレンス配列の供与親である感受性品種「Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２」の塩基配列（配列番号１８）と、「エンレイ」および「Ｐｅｋｉｎｇ」の塩基配列情報（配列番号１７および１４）を比較して、Ｒｓｖ４遺伝子座に連鎖したＳＳＲマーカーに挟まれたＲｓｖ４遺伝子座候補領域内のエンレイ−Ｐｅｋｉｎｇ間のＳＮＰ（配列番号１３）を抽出し、その周辺配列に上記のプライマー設計ソフトを用いて１０種類（配列番号７９〜８８：表４の「ダイレクトシーケンスによるＳＮＰマーカー解析に使用したプライマー」参照）のプライマーを設計し、ダイレクトシーケンス法による塩基配列解読を行い、７種類のＳＮＰマーカー（Ｒｓｖ４−ｓ０４−０７−０１、Ｒｓｖ４−ｓ０４−０７−０２、Ｒｓｖ４−ｓ０３５−６＿７１、Ｒｓｖ４−８６１０５ｓｎｐ＿４２、Ｒｓｖ４−ＲＣ−１＿９３＿１、Ｒｓｖ４−ＲＣ−１＿９３＿２、Ｒｓｖ４−ＲＣ−３＿５５）の遺伝子型を判定した。
【０１１７】
Ｒｓｖ４遺伝子近傍では、感受性品種の「Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２」のリファレンス配列と上記の感受性品種「エンレイ」の塩基配列解読データは類似していたが、「Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２」のリファレンス配列には、抵抗性品種「Ｐｅｋｉｎｇ」の解読データの存在しない約３．６ｋｂの配列が見つかった。そこで、その配列が存在するか否かを判定するためのＳＴＳマーカー解析を実施した。上記のプライマー設計ソフトを用いて、その周辺配列にＳＴＳプライマーを設計し（Ｒｓｖ４−Ｓｅｑ０３、配列番号１１および１２：表３の「ＩｎＤｅｌを検出するためのＳＴＳプライマー」参照）、当該領域をＴａｋａｒａ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬを用いたＰＣＲにより増幅し、１％のアガロース電気泳動によってＰＣＲ産物を検出した。ＳＴＳマーカーの遺伝子型はＰＣＲ産物のサイズにより判定した。
【０１１８】
Ｒｓｖ４遺伝子座を挟む２つのＳＳＲマーカー（Ｒｓｖ４−４４６およびＲｓｖ４−３２０）を用いて、計９，３２０個体の雑種後代のＳＳＲマーカー解析を実施し、２つのＳＳＲマーカー間で乗換えを生じた３９個体の雑種後代を選出した（表１）。これらの乗換え個体から得られた種子を用いてＳＭＶの接種検定を行い、ＳＭＶに対する表現型を決定したとともに、Ｒｓｖ４遺伝子座近傍の各種マーカーの遺伝子型を解析した。ＳＭＶ抵抗性の表現型と強連鎖するマーカーを検索したところ、６種類のＳＮＰマーカー（Ｒｓｖ４−ｓ０３５−６＿７１、Ｒｓｖ４−８６１０５ｓｎｐ＿４２、Ｒｓｖ４  −ｓｅｑ−０３、Ｒｓｖ４＿３５５、Ｒｓｖ４−ＲＣ−１＿９３＿１、Ｒｓｖ４−ＲＣ−１＿９３＿２）の遺伝子型が表現型と一致し、それらが座乗する約９．８ｋｂｐの領域がＲｓｖ４遺伝子座候補領域であると考えられた。また、これらのマーカーは表６に記載されている基準に基づけば、機能を有するＲｓｖ４遺伝子の有無を高精度に判定できる。これらのマーカーの検出に用いるプライマーセット及びその配列は、表３、表４及び配列表に記載した。
上記リファレンス配列上では、この上流に２つの遺伝子（Ｇｌｙｍａ０２ｇ１３４６０およびＧｌｙｍａ０２ｇ１３４７０）が予測されているが、それらの機能はＲｓｖ４遺伝子が有する特徴的な抵抗性を説明できるものではなかった。
【０１１９】
・Ｒｓｖ４遺伝子の塩基配列解読
ゲノム増幅用のプライマーペアｒｓｖ４Ｌ１５＿Ｌ＿４９５７（配列番号８９および９０：表４の「Ｒｓｖ４を含むゲノム領域(１６ｋｂ)の塩基配列を決定するために使用したプライマー」参照）およびＴａｋａｒａ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲを用いて、抵抗性品種の「Ｐｅｋｉｎｇ」から上記の約９．８ｋｂｐの候補領域を含む約１６ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を増幅した。さらに、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社のＥＺ−Ｔｎ５（登録商標）＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ（登録商標）  Ｋｉｔを用いてランダムライブラリーを作製した。これらの塩基配列をサンガー法により解読し、Ｇｅｎｅｃｏｄｅ社のＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒを用いてアッセンブルし、ＰｅｋｉｎｇのＲｓｖ４遺伝子座候補領域の塩基配列を決定した。上記リファレンス配列が由来する感受性品種「Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２」や感受性品種の「エンレイ」では、この領域内にはレトロトランスポゾン様配列を含む約３．６ｋｂの断片が挿入されていたのに対し、抵抗性品種の「Ｐｅｋｉｎｇ」ではオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が２箇所存在することがわかった。
【０１２０】
タンパク質がコードされている可能性のあるＯＲＦにＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー（ＯＲＦ２：配列番号９１および９２、表５の「ＲＴ−ＰＣＲ用プライマー」参照）を設計し、実生の本葉から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡおよびＴａｋａｒａ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＴＯＹＯＢＯ社のＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｍＲＮＡ−を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡよりｍＲＮＡを精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）のＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）  ＫｉｔおよびＲｓｖ４候補遺伝子の５’末端および３’末端の読み枠に設計した４種類のネストプライマー（ｒｓｖ４−５−１、ｒｓｖ４−５−２、ｒｓｖ４−３−１、ｒｓｖ４−３−２：配列番号９３〜９６、表５の「ＧｅｎｅＲａｃｅｒに使用したプライマー」参照）を用いて、５’末端配列および３’末端配列を取得した。
【０１２１】
・ダイズ形質転換体の作出
カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の５’制御領域、Ｒｓｖ４タンパク質コード領域およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｎｏｓ遺伝子のポリＡ付加配列を連結したコンストラクト（配列番号１１２）をｐＵＨＲベクター（ＳＫ）（Ｋ  Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｙ  Ｋｉｔａ，Ｍ  Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｍ  Ｉｓｈｉｍｏｔｏ（２００６）Ａ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲｅｄ２，ａｓ  ａ  ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２５（１２），１３５５−１３６１．）のＳｐｅＩ−ＸｈｏＩサイトに組み込んでＲｓｖ４遺伝子過剰発現コンストラクトを作製した（図１１）。高木らのダイズの形質転換プロトコール（高木恭子・山田哲也・石本政男：形質転換プロトコール（植物編）（２０１２）田部井豊  編、化学同人．４０−５７）に従い、Ｒｓｖ４遺伝子過剰発現コンストラクトをパーティクルガン法によりＳＭＶ感受性のダイズ品種「Ｊａｃｋ」に導入した。
【０１２２】
・プラスミドの構築
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの一過的発現実験では以下のプラスミドを使用した。ｐＭＬＨ７１３３（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ａ，Ｎｉｓｈｉｚａｗａ  Ｙ，Ｏｎｏｄｅｒａ  Ｈ，Ｔａｂｅｉ  Ｙ，Ｔｏｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｉｃｅ  ｓｔｅｍ  ｂｏｒｅｒｓ，Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ．Ｅｎｔｏｍｏｌ  Ｅｘｐ  Ａｐｐｌ  ９３：１７３−１７８．）のＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ切断部位の間にＲｓｖ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入してＲｓｖ４タンパク質を発現するプラスミド（ｐＭＬＨＲｓｖ４）を作製した。Ｒｓｖ４タンパク質の活性中心を破壊した変異型Ｒｓｖ４タンパク質を発現するプラスミドは、ｐＭＬＨＲｓｖ４中のＲｓｖ４  ｃＤＮＡにおけるＲｓｖ４タンパク質の９９番目のアスパラギン酸残基をコードするコドン（ＧＡＴ）をアスパラギンのコドン（ＡＡＴ）に置換して作製した。ＦＬＡＧタグが付加されたＲｓｖ４タンパク質を発現するプラスミドは、ｐＭＬＨＲｓｖ４中のＲｓｖ４  ｃＤＮＡにおけるＲｓｖ４タンパク質の２５９番目のアスパラギン残基をコードするコドン（ＡＡＴ）と終止コドン（ＴＧＡ）の間に５’−ｇｇａｇｇｔｇｇａｇａｔｔａｔａａｇｇａｔｇａｔｇａｔｇａｔａａｇ−３’（配列番号１０７）を挿入して作製した。
【０１２３】
感染性ＳＭＶ  ｃＤＮＡクローンは、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅したＳＭＶ  ｃＤＮＡをｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングすることにより作製した（図１０）。ＳＭＶ−Ｌ（Ｑ１０３３Ｋ）はＧｅｎｂａｎｋに登録されたＳＭＶ−Ｌの配列（ＥＵ８７１７２４）を基に、ＳＭＶ  ｃＤＮＡの１０３３番目のグルタミン酸残基のコドン（ＣＡＧ）をリシン残基のコドン（ＡＡＧ）に置換した配列をもつ全長ｃＤＮＡを合成することにより作製した。Ｍｙｃタグが付加したＰ３を発現するプラスミドは、上記ＳＭＶ  ｃＤＮＡに対して、ＳＭＶ−Ｃポリプロテインの７６６番目のグリシン残基から１１１２番目のグルタミン残基までをコードする領域の５’側にａｔｇを、３’側に５’−ｇｇａａｇａｔｃｔｇａｇｃａｇａａｇｃｔｔａｔｔｔｃｔｇａｇｇａｇｇａｔｃｔｔｔｇａ−３’（配列番号１０８）を付加したのち、それをｐＭＬＨ７１３３にクローニングすることにより作製した。トマトブッシースタントウイルスのｐ１９を発現するプラスミドは、人工合成したｐ１９遺伝子配列をｐＲＩ１０１−ＡＮ（タカラバイオ社）にクローニングして作製した。
【０１２４】
ＲＮＡ分解活性の評価に用いる基質ＲＮＡを合成する際の転写鋳型となるプラスミド（ｐＧＥＭ−ＳＭＶ−７６１０−７９６０）は、ＳＭＶ−Ｃ感染性クローンを鋳型に、５’−ｃｃｃｇｇａｔｃｇａｔＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号１０９）と５’−ｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｃＴＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１１０）をプライマーに用いたＰＣＲによって増幅した３５０ｂｐのＤＮＡ断片を、プロメガ社ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）のＣｌａＩおよびＢａｍＨＩサイトの間にクローニングすることにより作製した。
【０１２５】
・アグロインフィルトレーション
各プラスミドを導入したアグロバクテリウムＣ５８Ｃ１株の菌体をバッファー（１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ５．８，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２００μＭ  アセトシリンゴン）に懸濁した。特に表記が無い場合にはＲｓｖ４タンパク質及びその誘導体あるいはＰ３−Ｍｙｃを発現するプラスミドを導入したアグロバクテリウム懸濁液は最終濃度ＯＤ600＝０．５に、感染性ＳＭＶ  ｃＤＮＡを含むプラスミドを導入したアグロバクテリウム懸濁液は最終濃度ＯＤ600＝０．１に希釈してＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に対するインフィルトレーションに用いた（Ｖａｇｈｃｈｈｉｐａｗａｌａ  Ｚ，  Ｒｏｊａｓ  ＣＭ，  Ｓｅｎｔｈｉｌ−Ｋｕｍａｒ  Ｍ，  Ｍｙｓｏｒｅ  ＫＳ（２０１１）Ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ６７８，  ６５−７６）。全ての実験において、上記アグロバクテリウム懸濁液に、強力なＲＮＡサイレンシングサプレッサーであるトマトブッシースタントウイルスのｐ１９を発現するプラスミドを保有するアグロバクテリウムを最終濃度ＯＤ600＝０．５となるように加えた。ウイルス増殖抑制能の評価には、Ｒｓｖ４タンパク質あるいはその誘導体を発現するアグロバクテリウムをインフィルトレーションした１日後に、ＳＭＶ感染性プラスミドを保有するアグロバクテリウムをインフィルトレーションあるいはウイルスを機械接種した。
【０１２６】
・ＲＮＡ分解活性の評価
Ｒｓｖ４−ＦＬＡＧあるいはＤ９９Ｎ−ＦＬＡＧを発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉（アグロ感染後３日目）を、乳鉢を用いてｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））中で破砕した。破砕液を８００ｘｇで３分間遠心した上清を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、沈殿を１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。次に懸濁液を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、上清をａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）と混合して４℃で２時間インキュベートした後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴ，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０００３％  ＢＳＡ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））で４回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３ｘＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅを含むｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで溶出した。溶出液を等体積のグリセロールと混合し、精製タンパク質として−３０℃で保存した。大腸菌由来のＲＮａｓｅ  ＨおよびＳ１  ｎｕｃｌｅａｓｅはタカラバイオ社より購入した。
【０１２７】
ｐＧＥＭ−ＳＭＶ−７６１０−７９６０をＢａｍＨＩで切断したＤＮＡを鋳型に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写によって［α−32Ｐ］ＣＴＰを取り込んだＲＮＡを作製し、これをＲＮＡ基質とした。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、合成された一本鎖ＲＮＡに合成ＤＮＡ（５’−ＧＧＴＴＣＴＣＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＣＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡ−３’：配列番号１１１）をアニールさせて作製した。二本鎖ＲＮＡは、ｐＧＥＭ−ＳＭＶ−７６１０−７９６０をＣｌａＩで切断したＤＮＡを鋳型にＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写により合成したＲＮＡとアニールさせることにより作製した。
【０１２８】
切断反応は、以下の通り行った。Ｒｓｖ４−ＦＬＡＧあるいはＤ９９Ｎ−ＦＬＡＧを発現するＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉（アグロ感染後３日目）を、乳鉢を用いてｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））中で破砕した。破砕液を８００ｘｇで３分間遠心した上清を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、沈殿を１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。次に懸濁液を１６，０００ｘｇで１５分間遠心し、上清をａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）と混合して４℃で２時間インキュベートした後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴ，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０００３％  ＢＳＡ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））で４回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３ｘＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅを含むｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで溶出した。この溶出液を酵素液とした。大腸菌由来のＲＮａｓｅ  ＨおよびＳ１  ｎｕｃｌｅａｓｅはタカラバイオ社より購入した。当該酵素液を適宜切断用バッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で希釈して、ＭｇＣｌ2あるいはＭｎＣｌ2を加えて、ＲＮＡ基質と２５℃で３０分間インキュベートした。反応後ＲＮＡを７Ｍ  Ｕｒｅａ−１０％  ＰＡＧＥで分離して、オートラジオグラフィーにより検出した。
【０１２９】
・Ｒｓｖ４−ＦＬＡＧとＰ３−Ｍｙｃの相互作用解析
Ｒｓｖ４−ＦＬＡＧとＰ３−Ｍｙｃを発現するアグロバクテリウムを同時にＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉にインフィルトレーションし、３日後に葉を乳鉢を用いてＴＲ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，８０ｍＭ  ＫＯＡｃ，１．８ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2，２ｍＭ  ＤＴＴ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））中で破砕した。破砕液を８００ｘｇで３分間遠心した上清をさらに１６，０００ｘｇで１５分間遠心して得た沈殿を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＲ  ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。次に懸濁液を１６，０００ｘｇで１５分間遠心して得た上清を、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）と混合して４℃で２時間インキュベートした。その後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＤＴＴ，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社））で４回洗浄し、０．１ｍｇ／ｍｌの３ｘＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅを含むＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで溶出した。溶出液およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化後の遠心上清を抗ｍｙｃ抗体（コスモバイオ社）および抗ＤＹＫＤＤＤＤＹタグ抗体（Ｗａｋｏ社）を用いたウェスタンブロットに供した。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
【表６】
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【配列表フリーテキスト】
【０１３５】
配列番号    １  ＰｅｋｉｎｇのＲｓｖ４  ＣＤＳ
配列番号    ２  ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１  Ｒｓｖ４  ＣＤＳ
配列番号    ３  Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉ  Ｒｓｖ４  ＣＤＳ
配列番号    ４  Ｅｎｒｅｉ  Ｒｓｖ４  仮想ＣＤＳ
配列番号    ５  Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２  Ｒｓｖ４  仮想ＣＤＳ
配列番号    ６  Ｐｅｋｉｎｇ  Ｒｓｖ４  アミノ酸配列
配列番号    ７  ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１  Ｒｓｖ４  アミノ酸配列
配列番号    ８  Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉ  Ｒｓｖ  ４  アミノ酸配列
配列番号    ９  Ｅｎｒｅｉ  Ｒｓｖ４  仮想ＣＤＳの推定アミノ酸配列
配列番号  １０  Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２  Ｒｓｖ４  仮想ＣＤＳの推定アミノ酸配列
配列番号  １１  Ｒｓｖ４−ｓｅｑ−０３＿Ｆ
配列番号  １２  Ｒｓｖ４−ｓｅｑ−０３＿Ｒ
配列番号  １３  Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２およびＥｎｒｅｉ  Ｒｓｖ４  インサーション配列
配列番号  １４  Ｐｅｋｉｎｇ  Ｒｓｖ４  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（６５４６ｂｐ）
配列番号  １５  ＢｙｏｕｔｏｕＳｈｕｓｈｉｔｏｕ１  Ｒｓｖ４  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（２５４２ｂｐ）
配列番号  １６  Ｆｕｋｕｓｅｎｎａｒｉ  Ｒｓｖ  ４  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（２５９０ｂｐ）
配列番号  １７  Ｅｎｒｅｉ  Ｒｓｖ４  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（９９８１ｂｐ）
配列番号  １８  Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２  Ｒｓｖ４  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（９５２９ｂｐ）
配列番号  １９〜１０６  各プライマーの塩基配列（表２〜５参照）
配列番号１０７  Ｒｓｖ４ＦＬＡＧ作製時の挿入配列
配列番号１０８  Ｐ３−Ｍｙｃ作製時の挿入配列
配列番号１０９  ｐＧＥＭ−ＳＭＶ−７６１０−７９６０作製時に用いたＰＣＲプライマーの塩基配列
配列番号１１０  ｐＧＥＭ−ＳＭＶ−７６１０−７９６０作製時に用いたＰＣＲプライマーの塩基配列
配列番号１１１  ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド合成時に用いた合成ＤＮＡ
配列番号１１２  カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の５’制御領域、Ｒｓｖ４タンパク質コード領域およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｎｏｓ遺伝子のポリＡ付加配列を連結したコンストラクトの塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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