(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸溶液中に安定化した不活化（死菌）レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の免疫原性細胞調製物を含有する液体組成物であって、該溶液が５〜６のｐＨで緩衝化されており、該溶液が１リットル当たり１０〜５０ｍｍｏｌのクエン酸を含む液体組成物。
【請求項２】
該レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌が、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）血清型ポートランド−ベレ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ−Ｖｅｒｅ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群イクテロヘモラジア（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）血清型コペンハゲニ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ）およびレプトスピラ・キルシュネリ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）血清群グリッポチホサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）血清型ダダス（Ｄａｄａｓ）から選択される、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項３】
該レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌がレプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）である、請求項２記載の液体組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の液体組成物を含む、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌による感染に対して動物を防御するためのワクチン。
【請求項５】
液体担体中の不活化レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の免疫原性調製物を、該担体中にクエン酸を溶解することにより安定化させるための１リットル当たり１０〜５０ｍｍｏｌのクエン酸の使用。
【請求項６】
該調製物が、１８℃を超える温度での３カ月間の貯蔵中に、その抗原質量の少なくとも２５％を維持する、請求項５記載の使用。
【請求項７】
該調製物が、１８℃〜３７℃の温度での３カ月間の貯蔵中に、その抗原質量の少なくとも２５％を保有する、請求項５または６記載の使用。
【請求項８】
該調製物が、３７℃での３カ月間の貯蔵中に、その抗原質量の少なくとも２５％を保有する、請求項５〜７のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不活化（死菌）レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）細菌の免疫原性細胞調製物を含有する組成物、レプトスピラ細菌による感染に対して動物を防御するためのワクチン、および不活化レプトスピラ細菌の免疫原性調製物を安定化させるための酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レプトスピラ症は、レプトスピラの多数の病原性血清型のいずれかによる感染により引き起こされる世界的な人獣共通感染症である。該生物の属は非常に多様性に富み、２５０個を超える血清型を含む。個々の病原性血清型の有病率は場所によって様々であり、これは恐らく、気候、土着動物相および農業的慣行のような要因に影響されるであろう。レプトスピラ症は実質的に全ての哺乳類種を冒す。ヒトレプトスピラ症も重要であり、熱帯地方では風土病として、そして温帯地方では流行病として生じる。しかし、他の種とは異なり、ヒトは自然界における該疾患の維持においては重要ではなく、ヒトからヒトへの感染は稀である。レプトスピラ症に対するヒトワクチン接種は研究界の目標であるが、進歩は非常に遅い。イヌレプトスピラ症は重要な疾患であり、イヌはレプトスピラ症の感染源であることを考慮して、多数のワクチンが該イヌ疾患に対して利用可能である。市販のイヌレプトスピラ症ワクチンは伝統的に血清群カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）およびイクテロヘモラジア（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）（イクテロ（Ｉｃｔｅｒｏ））の不活化抗原を含有し、５０年以上前から利用可能となっている。欧州の最近の推奨はワクチン内への血清群カニコラおよびイクテロの抗原の配合ならびに血清群グリッポチホサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）（グリッポ（Ｇｒｉｐｐｏ））およびアウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）の抗原の配合を継続することである。米国では、現在、４つの血清群（カニコラ、イクテロ、グリッポおよびポモナ）の抗原を含有する４つのイヌワクチンが利用可能であるが、欧州では、幾つかの伝統的な２価ワクチン（カニコラ、イクテロ）および僅か１つの３価ワクチン（カニコラ、イクテロおよびグリッポ）が現在利用可能である。
【０００３】
全てではないとしてもほとんどの商業的に入手可能なレプトスピラ症ワクチンは、不活化レプトスピラ細菌、例えばホルマリン不活化全細胞の免疫原性細胞調製物を含む。これらのワクチンは、室温より十分に低い貯蔵温度、典型的には２℃〜８℃で非常に安定であることが公知である。しかし、特に、レプトスピラ症は熱帯地方の風土病であることを考慮すると、室温を超える温度でワクチン安定性を有することが重要な利点となろう。なぜなら、これは、いずれの冷却装置をも必要とすることなく、外界条件下での貯蔵を可能にするからである。そのような不活化全細胞ワクチン内に存在するいずれかのタンパク質はレプトスピラ抗原の不安定性をもたらしうるため、そのようなタンパク質を（例えば、レプトスピラ抗原に影響を及ぼさない熱ショック処理を行うことにより）変性させることが安定性の有意な改善につながりうるかどうかが過去に試験されている。しかし、結果は否定的なものであった。
【発明の概要】
【０００４】
発明の目的
不活化レプトスピラ細菌の免疫原性細胞調製物を含む組成物の安定性を有意に改善すること、特に、室温を超える温度での少なくとも３カ月間の貯蔵の後でさえも免疫応答を惹起するのに尚も有効である組成物を得ることが必要とされている。特に、ワクチンの３７℃での３カ月間の貯蔵の後でさえも、特に、この温度での９カ月の貯蔵の後、レプトスピラ細菌による感染を予防するのを少なくとも補助するのに依然として有効であるレプトスピラ症ワクチンが必要とされている。
【０００５】
発明の概括
前記の発明の目的を達成するために、不活化レプトスピラ細菌の免疫原性細胞調製物がクエン酸溶液（ここで、「酸」なる語は該酸の共役塩基を含む）中に存在する、前文記載の組成物を本発明において案出した。この溶液中に該抗原を存在させることにより、該抗原の安定性が著しく改善されることが示されている。３７℃で少なくとも３カ月間貯蔵された本発明のワクチンは、レプトスピラ細菌による感染に対するほぼ完全な防御をもたらすのに十分な抗原質量レベルを保有する。
【０００６】
定義
本発明の意義におけるワクチンは、１以上の抗原を、典型的には、例えば、水含有液のような医薬上許容される担体であって、免疫刺激剤（アジュバント）、塩、バッファー、保存剤、粘性調整剤などを所望により含むものと組み合わせて含む、動物（ヒトを含む）への適用に適した構成であって、該動物への投与に際して、疾患または障害を治療する（すなわち、該疾患または障害の予防、改善または治癒を補助する）ための免疫応答を誘導するものである。  担体は、有用な形態で提示するように抗原を運搬するための手段である。典型的な担体は水または他の親水性液体であるが、固体粒子も一般に使用される（例えば、乾燥粉末ネブライザーにより投与される抗原の場合）。
【０００７】
不活化細菌の細胞調製物は、不活化細菌細胞を本質的に含有する調製物であり、該細胞は、例えば、より安定な又はより免疫原性の調製物を得るために、所望により更に処理されうる（該細胞を少なくとも部分的に細胞溶解することを含みうる）。細胞調製物は、抽出された表面タンパク質および／または多糖のような細菌細胞の抽出物を含む調製物と対比されるものである。
【０００８】
発明の実施形態
１つの実施形態においては、該溶液は１リットル当たり２０ｍｍｏｌのクエン酸を含む。
【０００９】
もう１つの実施形態においては、該溶液は５〜６のｐＨで緩衝化されている。
【００１０】
更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラ細菌は、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）血清型ポートランド−ベレ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ−Ｖｅｒｅ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群イクテロヘモラジア（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）血清型コペンハゲニ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ）およびレプトスピラ・キルシュネリ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）血清群グリッポチホサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）血清型ダダス（Ｄａｄａｓ）から選択され、特に、該レプトスピラ細菌はレプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）である。
【００１１】
クエン酸を液体担体中に溶解することにより該液体担体中の不活化レプトスピラ細菌の免疫原性調製物を安定化させるためのクエン酸の使用は、特に、１８℃を超える温度、特に３７℃での３カ月間の貯蔵中に該調製物がその抗原質量の少なくとも２５％（２〜８℃の温度で貯蔵された同じ調製物と比較された場合のＥＬＩＳＡ単位で測定される）を保有する使用において具体化される。
【００１２】
実施例
次に以下の実施例に基づいて本発明を更に詳しく説明することとする。
【００１３】
実施例１：商業的に入手可能なワクチン中に存在する不活化レプトスピラ抗原のイヌにおける効力の決定
実施例２：３７℃で貯蔵された場合のレプトスピラ抗原の安定性の決定
実施例３：３７℃で貯蔵された場合のクエン酸中で製剤化されたレプトスピラ抗原の安定性の決定
実施例１
この第１実施例においては、商業的に入手可能なワクチン中に存在する不活化レプトスピラ抗原の効力を通常のイヌにおいて決定した。この場合、該抗原は該ワクチンのラベルに従って製剤化されているか（１００％）、または４倍希釈される（２５％）。商業的に入手可能なワクチンであるＮｏｂｉｖａｃ  Ｌ４（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｏｘｍｅｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能；また、Ｎｏｂｉｖａｃ  Ｌ４に関しては、２１  Ｍａｙ  ２０１２  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＶＭＰ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙも参照されたい）中に存在するのと同じタイプおよび血清型、すなわち、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）血清型ポートランド−ベレ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ−Ｖｅｒｅ）（レプトスピラ・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）；５３００  ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）（レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）；１０００  ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群イクテロヘモラジア（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）血清型コペンハゲニ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ）（レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）；５４０  ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）およびレプトスピラ・キルシュネリ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）血清群グリッポチホサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）血清型ダダス（Ｄａｄａｓ）（レプトスピラ・グリッポチホサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｈｙｐｈｏｓａ）；１０００  ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ）の一定濃度の化学的不活化レプトスピラ細菌をｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＰＢＳバッファー（該バッファーは、水１リットル当たり、８．９ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４および０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を含有していた）中で製剤化した。該最終製剤を３ｍｌバイアル内に充填し、ゴム栓で栓をし、アルミニウムクリンプキャップで密封した。このワクチンを２〜８℃で貯蔵した（３９カ月間まで安定である）。このワクチンの次に、該抗原を同じＰＢＳバッファー中で希釈して１ｍｌ当たりのＥｌｉｓａ単位の量の２５％を含有する最終濃度にすることにより、希釈ワクチンを製造した。該ワクチンを以下のとおりに試験した。
【００１４】
試験動物の飼育
前記のレプトスピラ血清群のそれぞれに対する検出可能な凝集血清抗体を伴わない６週齢の通常のビーグルイヌが商業的供給業者から提供された。該研究のそれぞれにおいては、治療効果に影響を及ぼす性別および同腹子の影響を回避するために、処理群（ｎ＝８）は両方の性別の子イヌおよび異なる母親に由来する子イヌからなるものであった。選択されたイヌは、これらの研究に加入する前に臨床的異常または疾患を有していなかった。飼育は各研究において同じであった。
【００１５】
ワクチン接種
全ての研究において、１ｍｌのそれぞれのワクチンを６および１０週齢の該イヌの皮下に２回ワクチン接種した。
【００１６】
チャレンジ
使用したチャレンジ株はレプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）血清型カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）株モウルトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ）、レプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群イクテロヘモラジア（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）血清型コペンハゲニ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ）株ＣＦ１（両方の株はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，ＫＩＴ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから受領した）、レプトスピラ・キルシュネリ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）血清群グリッポチホサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）血清型バナナル（Ｂａｎａｎａｌ）／リアングアング（Ｌｉａｎｇｇｕａｎｇ）株１１８０８およびレプトスピラ・インタロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）株Ａｓ−０５−１０１（共にＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒから受領した）であった。それらの４つの株のそれぞれに関して、以下の手順に従った。実際のチャレンジ物を、液体窒素中で貯蔵された培養から調製し、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＨａｒｒｉｓ（Ｆａｉｎｅ  １９９４；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ；ｉｎ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ａｎｄ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４；ｐｐ  １−１３，１９９−２２５）により改変されたエリングハウゼン・マククウ（Ｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ−ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ）培地内で２回継代した。液体窒素中で貯蔵された培養は、実験的に感染した動物からの再単離物であった。すなわち、株ＣＦ１および１１８０８はハムスター腎臓再単離物であり、株モウルトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ）はイヌ腎臓再単離物であり、株Ａｓ−０５−１０１はイヌ尿再単離物であった。全ての研究において、２つのチャレンジ経路の組合せ（腹腔内（ＩＰ）注射（２ｍｌ）および結膜点滴（各眼の腹側結膜嚢内への０．２５ｍｌ））を用いて、第２ワクチン接種の３週間後にチャレンジを行った。該チャレンジ物における細菌細胞濃度（細胞／ｍｌ）を暗視野顕微鏡下での全直接顕微鏡計数により決定し、それは０．５〜１０×１０９  細胞／ｍｌであった。
【００１７】
検査
各実験の全体にわたって該イヌを定期的に検査した。これは、皮下トランスポンダを使用する、チャレンジの後の体温の測定を含むものであった。血小板計数、細菌培養、ＰＣＲおよびレプトスピラ抗体アッセイのために、該実験中、一定の間隔の頸静脈穿刺により血液および血清サンプルを採取した。血清群カニコラ、イクテロ、グリッポおよびアウストラリスに対する顕微鏡的凝集試験（ＭＡＴ）により該血清サンプルを分析した（Ｆａｉｎｅ  １９９４）。該顕微鏡的凝集力価を、５０％  凝集を誘導する最高血清希釈度の逆数として表した。抗凝集剤としてＥＤＴＡを使用する血液サンプルを、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ  ３５００細胞カウンター（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を使用した、チャレンジ後の血小板数の評価のために使用した。
【００１８】
チャレンジ後の第２１日まで、血液からのチャレンジ生物の再単離のためにＥＤＴＡまたはヘパリン化血液を使用した。同じ目的のために、尿サンプルを膀胱穿刺により一定間隔で集め、チャレンジの４週間後の剖検において採取された腎臓組織をサンプル採取し、既に記載されているとおりに加工した（Ｋｌａａｓｅｎ  ＨＬＢＭ，Ｍｏｌｋｅｎｂｏｅｒ  ＭＪＣＨ，Ｖｒｉｊｅｎｈｏｅｋ  ＭＰら．Ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００３；９５：１２１−１３２）。血液、尿および腎臓組織ホモジネートのサンプルをＥＭＪＨ培地内に接種し、培養をインキュベートし、検査した（Ｋｌａａｓｅｎにより記載されているとおりに行った）。
【００１９】
チャレンジ後の第０、３および７日の血清サンプルを、ｓｅｃＹ遺伝子を標的化するリアルタイムＰＣＲにより、チャレンジ生物からのＤＮＡの存在に関して検査した。このＰＣＲは妥当性が確認されたアッセイであり、全ての病原性レプトスピラ種からのＤＮＡの検出に適している（Ａｈｍｅｄ  Ａ，Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔｓ  ＭＦＭ，Ｂｏｅｒ  ＫＲら．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２００９；４（９）：ｅ７０９３）。該ＰＣＲはＷＨＯ／ＦＡＯ／ＯＩＥおよびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ，ＫＩＴ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより行われた。該ＰＣＲ結果を陽性、疑い例または陰性として評価した。
【００２０】
チャレンジ後に重篤な臨床徴候を有するイヌを人道的に安楽死させた。間質性腎炎の検出に特別な注意が払われる組織病理学的検査［Ｋｌａａｓｅｎ  ２００３］を含む死後検査をこれらの場合に行った。
【００２１】
感染に関して陽性のイヌの定義は、異なる日における血液（培養による）または血清（ＰＣＲによる）または尿／腎臓（培養による）の少なくとも２つの陽性サンプルを示すイヌ、あるいはチャレンジ誘発性腎炎またはレプトスピラ症に関する臨床的もしくは血液学的証拠（血小板減少症）を示すイヌであった。腎臓感染に関して陽性のイヌ（キャリアー動物、持続的病原体放出動物）の定義は、チャレンジ後の第１４日以降の尿／腎臓の少なくとも１つの陽性サンプルまたはチャレンジ誘発性腎炎（組織病理学的検査により実証される）を示すイヌであった。
【００２２】
結果
以下は４つのワクチン（非希釈体および希釈体）に関する結果である。それは、該ワクチンが２５％の希釈度においてさえも感染に対するイヌの防御を補助し、チャレンジされた動物のほぼ全てを腎臓感染に対して防御することを示している。
【表１】
0006502849.tif 000002
【００２３】
実施例２
不活化レプトスピラ細菌は２〜８℃で少なくとも３９カ月間安定である（商業的に入手可能なワクチンであるＮｏｂｉｖａｃ  Ｌ４のラベル）。この実験においては、実施例１に示されているとおりに製剤化された４つの抗原（１００％  ワクチン）が、３７℃で３カ月間貯蔵された場合に少なくとも２５％のＥＬＩＳＡ単位のレベルを維持するかどうかを決定した。結果を以下に示す。得られた抗原質量（３つの異なるバッチの平均値）は、２〜８℃で貯蔵された同じワクチンで得られた抗原質量の百分率として計算されている。
【表２】
0006502849.tif 000003
【００２４】
それは、血清群イクテロヘモラジア（Ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）およびグリッポチホサ（Ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）の不活化全細胞抗原は３７℃で比較的安定であるが、血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の抗原は非常に不安定であり、ワクチンとしての有効性のための所望の基準として設定された少なくとも２５％のレベルに到達しないことを示している。室温、典型的には２０〜２５℃では抗原質量の残存レベルはより高いかもしれないが、安定性、特に、ブラチスラバ抗原に関する安定性だけでなくグリッポチホサおよびカニコラ抗原に関する安定性も改善されうることが明らかである。
【００２５】
何らかの有意な改善がその他の抗原の安定性をも改善することを期待して、まず、ブラチスラバ抗原のみで、安定性を改善するための更なる試験を行った。
【００２６】
実施例３
一定濃度（１０００Ｕ／ｍｌ）の、実施例１に記載されているのと同じブラチスラバ抗原を、種々のｐＨを有する製剤中にクエン酸ナトリウムを溶解することにより、クエン酸と共に製剤化した。ｐＨ５にするために第１バッファー（１リットル当たり４．１グラムのクエン酸ナトリウム無水物および１．３グラムのクエン酸一水和物）を使用し、ｐＨ６にするために第２バッファー（１リットル当たり５．４グラムのクエン酸ナトリウム無水物および０．３３グラムのクエン酸一水和物）を使用した。また、クエン酸ナトリウム自体を溶解して、ｐＨ７とした。対照として、実施例１に記載されているＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）および２０ｍＭ  酢酸バッファー（ｐＨ５；１．９９グラムの酢酸ナトリウム三水和物および０．３２グラムの酢酸）中に該抗原を含有させた。以下の表６に示されている最終濃度を得た。これらの製剤を３ｍｌ  ガラスバイアル内に充填し、ゴム栓で栓をし、アルミニウムクリンプキャップで密封した。
【表３】
0006502849.tif 000004
【００２７】
該バイアルの半分を２〜８℃でインキュベートし、残りの半分を３７℃でインキュベートした。３および９カ月後、レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）抗原に関する抗原質量ＥＬＩＳＡ試験を用いてバイアルを分析した。該抗原質量を、参照標準体の抗原質量と比較して決定した。結果を以下の表７に示す。得られた抗原質量（３つの異なるバイアルの平均値）は、２〜８℃で貯蔵された同じワクチンの得られた抗原質量の百分率として計算されている。
【表４】
0006502849.tif 000005
【００２８】
それは、血清群アウストラリス（Ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、血清型ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）の不活化細菌抗原の安定性が該製剤へのクエン酸の添加により有意に増強することを示している。標準条件下で貯蔵されたワクチンと比較した場合の３７℃での３カ月間（および更に相当に長い期間）の貯蔵中の抗原質量の少なくとも２５％の所望の基準は、ｐＨ５〜６が最良の結果をもたらすようであるが、種々のｐＨレベルにおいて満たされている。クエン酸を使用せずにｐＨ５だけを用いることは有益な結果を全くもたらさない（製剤５）。クエン酸の下限は通常の実験により容易に決定されうる。３７℃での３カ月間の貯蔵の後の安定性が２５％以上である限り、所望の安定性基準が満たされる。上限も同様に見出されうるが、製剤の安全性も基準となりうるであろう。要求される安全性レベルはいずれかの所望のレベルに設定されることが可能であり、本発明自体には影響を及ぼさない。
【００２９】
抗原の高い類似性を考慮すると、同じ手段を用いること（レプトスピラ抗原をクエン酸溶液に加えること）により、他の不活化細菌レプトスピラ抗原の安定性も改善されると合理的に予想されうる。実施例４でこれを試験し、その結果を後記に示す。
【００３０】
実施例４
一定濃度の、実施例１に記載されているのと同じ４つのレプトスピラ抗原を、ｐＨ６で、３つの異なるクエン酸濃度（１０、２０および５０ｍｍｏｌ／ｌ）で製剤化した。対照として、該抗原をＰＢＳバッファーに含有させた。該製剤を３ｍｌのガラスバイアル内に充填し、ゴム栓で栓をし、アルミニウムクリンプキャップで密封した。
【００３１】
該バイアルの半分を２〜８℃でインキュベートし、残りの半分を２７℃でインキュベートした。８週間および９カ月後、レプトスピラ抗原に関する抗原質量ＥＬＩＳＡ試験を用いてバイアルを分析した。該抗原質量を、参照標準体の抗原質量と比較して決定した。結果を種々のタイプの抗原に関して以下の表８、９、１０および１１に示す。得られた抗原質量（３つの異なるバイアルの平均値）は、２〜８℃で貯蔵された同じワクチンの得られた抗原質量の百分率として計算されている。
【表５】
0006502849.tif 000006
【００３２】
それは、ブラチスラバ抗原での結果に基づく予想と一致して、種々のタイプの不活化細菌レプトスピラ抗原の安定性が、該製剤へのクエン酸の添加により有意に増強することを示している。標準条件下で貯蔵されたワクチンと比較した場合の２７℃での３カ月間（および更に相当に長い期間）の貯蔵中の抗原質量の少なくとも２５％の所望の基準は種々のクエン酸溶液において満たされている。