(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された、合成、又は組換え核酸であって、
(a)配列番号１に記載の配列を有する核酸配列を含む、プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
(b)配列番号１に記載の配列を有する核酸配列を含む、プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、若しくはプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするその断片；
(c)配列番号２に記載の配列を有するアミノ酸配列を含むプルラナーゼ活性を有するポリペプチド、若しくはプルラナーゼ活性を有するその断片をコードする核酸配列；
(d)プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、シグナル配列若しくは炭水化物結合モジュールを欠く、(a)、(b)、若しくは(c)に記載の核酸；
(e)プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、異種配列をさらに含む、(a)、(b)、(c)、若しくは(d)に記載の核酸；
(f)異種配列が異種シグナル配列、炭水化物結合モジュール、触媒ドメイン(CD)、若しくはその組合せをコードする配列を含み、又は異種シグナル配列、炭水化物結合モジュール、若しくは触媒ドメイン(CD)が別のプルラナーゼ酵素、若しくは非プルラナーゼ酵素に由来する、(e)に記載の核酸配列；又は
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、若しくは(f)と完全に相補的な核酸配列
から成る群より選択される、前記核酸。
【請求項２】
プルラナーゼ活性がα-1,6結合とα-1,4結合の両方の切断を含む、請求項１記載の単離された、合成、又は組換え核酸。
【請求項３】
プルラナーゼ活性がII型プルラナーゼ活性を含む、請求項１記載の単離された、合成、又は組換え核酸。
【請求項４】
プルラナーゼ活性が熱安定性及び/又は耐熱性である、請求項１記載の単離された、合成、又は組換え核酸。
【請求項５】
(a)配列番号２の配列に対して完全な配列同一性を有するアミノ酸配列；
(b)請求項１記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列を有すること；又は
(c)少なくとも1つの保存的アミノ酸残基置換を含む、(a)又は(b)に記載のアミノ酸配列
を含む、プルラナーゼ活性を有する単離された、合成、又は組換えポリペプチド。
【請求項６】
プルラナーゼ活性が熱安定性である、請求項５記載の単離された、合成、又は組換えポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドが、37℃〜84℃、又は55℃〜85℃、又は70℃〜84℃の温度範囲を含む条件下でプルラナーゼ活性を保持する、請求項５記載の単離された、合成、又は組換えポリペプチド。
【請求項８】
プルラナーゼ活性が耐熱性である、請求項５記載の単離された、合成、又は組換えポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが37℃超〜84℃、55℃超〜84℃の範囲の温度への曝露後にプルラナーゼ活性を保持する、請求項５記載の単離された、合成、又は組換えポリペプチド。
【請求項１０】
デンプンを含有する物質と請求項５記載のポリペプチドとを接触させることを含む、デンプン結合を加水分解する方法。
【請求項１１】
デンプンと請求項５記載のポリペプチドとを接触させることを含む、デンプン含有組成物を液化するための方法。
【請求項１２】
請求項５記載のポリペプチドの使用を含む、シロップを製造するための方法。
【請求項１３】
デンプンと請求項５記載のポリペプチドとを、液化にとって十分な条件下で接触させることを含む、デンプン液化のための方法。
【請求項１４】
請求項５記載のポリペプチドを含む洗剤添加物。
【請求項１５】
請求項５記載のポリペプチドの使用を含む、高マルトース又は高グルコースシロップを製造するための方法。
【請求項１６】
請求項５記載のポリペプチドの使用を含む、エタノールを製造する方法。
【請求項１７】
請求項５記載のポリペプチドの使用を含む、エタノールを製造する方法であって、該ポリペプチドは限界デキストランを消化することができる、前記方法。
【請求項１８】
プルラナーゼ又はその組合せの添加をさらに含む、請求項１０〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
請求項５記載のポリペプチドを含む洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、酵素、酵素をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにより具体的には、プルラナーゼ活性を有する酵素に関する。
配列表
本出願は、MPEP§502.05において許可および記載された通りに、USPTO EFS-WEBサーバーを介して電子出願され、この電子出願は電子的に提出された配列表を含む；この配列表の全内容は、本出願の明細書に参照により組込まれる。配列表は、以下のような電子出願されたASCII(.txt)テキストファイル上で同定される：
0006502314.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
プルラナーゼは、プルランを分解するデンプン分解外酵素である、特定の種類のグルカナーゼである。I型プルラナーゼは、α-1,6-結合を特異的に攻撃するが、II型プルラナーゼはα-1,4結合を加水分解することもできる。
【０００３】
プルラナーゼ(EC 3.2.1.41)はまた、プルラン-6-グルカノヒドロラーゼ(脱分枝酵素）としても知られる。その基質であるプルランは、α-1,6-グリコシド結合により連結されたマルトトリオース単位の鎖と見なされる。プルラナーゼは、プルラン（α-グルカン多糖）を加水分解的に切断する。
【０００４】
プルラナーゼは、デンプンの糖化、デンプンの液化、高マルトースコーンシロップの製造、高フルクトースコーンシロップの製造、デンプン加工、洗剤、シクロデキストリンの製造、および低カロリービールの製造、製パン工業、ならびに歯垢制御などの、いくつかの工業的および商業的適用のために用いられる(Siew Ling Hii、Joo Shun Tan、Tau Chuan Ling、およびArbakariya Bin Ariff、「Pullulanase: Role in Starch Hydrolysis and Potential Industrial Applications」、Enzyme Research、vol. 2012、Article ID 921362、14 pages, 2012）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、配列番号1に記載の配列を有する単離された核酸および配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を有し、プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするか、または配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を有するプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするその変異体を提供する。
【０００６】
本発明の一態様は、配列番号1に記載の配列を有する単離された核酸、それと実質的に同一の配列、およびそれと相補的な配列である。
【０００７】
本発明の別の態様は、配列番号1の核酸配列に記載の配列の少なくとも10個の連続する塩基を含む単離された核酸、それと実質的に同一の配列、およびそれと相補的な配列である。
【０００８】
さらに別の態様においては、本発明は、配列番号2に記載の配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸およびプルラナーゼ活性を有し、そのような配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするその変異体を提供する。本発明の別の態様は、配列番号2に記載の配列、およびそれと実質的に同一の配列を有するポリペプチドまたはその機能的断片をコードする単離された核酸である。
【０００９】
本発明の別の態様は、配列番号2に記載の配列、およびそれと実質的に同一の配列の少なくとも10個の連続するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする単離された核酸である。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号2に記載の配列、およびそれと実質的に同一の配列を有する精製されたポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明の別の態様は、配列番号2に記載の配列、およびそれと実質的に同一の配列を有するポリペプチドを作製する方法である。この方法は、核酸がプロモーターに機能し得る形で連結された、前記ポリペプチドをコードする核酸を、宿主細胞に導入し、その宿主細胞を、核酸の発現を可能にする条件下で培養することを含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、配列番号2、およびそれと実質的に同一の配列を有するポリペプチドを作製する方法である。この方法は、核酸がプロモーターに機能し得る形で連結された、前記ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入し、その宿主細胞を、核酸の発現を可能にする条件下で培養することによって、前記ポリペプチドを産生することを含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、配列番号1に記載の配列またはそれと実質的に同一の配列、配列番号1の配列と相補的な配列を有する核酸、前記配列の少なくとも30個の連続するヌクレオチドを含む断片を取得すること、および配列中の1個以上のヌクレオチドを別のヌクレオチドに変化させること、配列中の1個以上のヌクレオチドを欠失させること、または1個以上のヌクレオチドを配列に付加することを含む、変異体を生成する方法である。
【００１４】
本発明の別の態様は、配列番号1の配列に記載の配列、およびそれと実質的に同一の配列、または配列番号2のアミノ酸配列に記載のポリペプチド配列、およびそれと実質的に同一の配列が保存されたコンピュータにより読取り可能な媒体である。
【００１５】
本発明の別の態様は、配列番号2のアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列のポリペプチドの酵素機能を保持する、配列番号2のアミノ酸配列、およびそれと実質的に同一の配列の断片または変異体を同定するためのアッセイである。このアッセイは、配列番号2のアミノ酸配列、それと実質的に同一の配列のポリペプチド、またはポリペプチド断片もしくは変異体を、ポリペプチド断片もしくは変異体が機能することができる条件下で基質分子と接触させること、および基質レベルの低下またはポリペプチドと基質との反応の特異的反応生成物のレベルの増加を検出することによって、そのような配列の断片または変異体を同定することを含む。
【００１６】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された、合成、または組換え核酸であって、
(a)配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を有する核酸配列を含むプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
(b)配列番号1に対して少なくとも50%の配列同一性を有する核酸配列を含むプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、もしくはプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするその断片；
(c)配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
(d)配列番号2に対して少なくとも50%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプルラナーゼ活性を有するポリペプチド、もしくはプルラナーゼ活性を有するその断片をコードする核酸配列；
(e)プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、シグナル配列もしくは炭水化物結合モジュールを欠く、(a)、(b)、(c)、もしくは(d)に記載の核酸；
(f)プルラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、異種配列をさらに含む、(a)、(b)、(c)、(d)、もしくは(e)に記載の核酸；
(g)異種配列が異種シグナル配列、炭水化物結合モジュール、触媒ドメイン(CD)、もしくはその組合せをコードする配列を含み、または異種シグナル配列、炭水化物結合モジュール、もしくは触媒ドメイン(CD)が別のプルラナーゼ酵素、もしくは非プルラナーゼ酵素に由来する、(g)に記載の核酸配列；または
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、もしくは(g)と完全に相補的な核酸配列
からなる群より選択される、前記核酸。
（２）プルラナーゼ活性がα-1,6結合とα-1,4結合の両方の切断を含む、（１）に記載の単離された、合成、または組換え核酸。
（３）プルラナーゼ活性がII型プルラナーゼ活性を含む、（１）に記載の単離された、合成、または組換え核酸。
（４）プルラナーゼ活性が熱安定性および/または耐熱性である、（１）に記載の単離された、合成、または組換え核酸。
（５）(a)配列番号2の配列に対して少なくとも50%の同一性、または完全な配列同一性を有するアミノ酸配列；
(b)（１）に記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列を有すること；
(c)少なくとも1つの保存的アミノ酸残基置換を含む、(a)または(b)に記載のアミノ酸配列；
(d)(a)もしくは(b)もしくは(c)のアミノ酸配列またはプルラナーゼ活性を有するその断片
を含む、プルラナーゼ活性を有する単離された、合成、または組換えポリペプチド。
（６）プルラナーゼ活性が熱安定性である、（５）に記載の単離された、合成、または組換えポリペプチド。
（７）ポリペプチドが、約37℃〜約84℃、または約55℃〜約85℃、または約70℃〜約84℃の温度範囲を含む条件下でプルラナーゼ活性を保持する、（５）に記載の単離された、合成、または組換えポリペプチド。
（８）プルラナーゼ活性が耐熱性である、（５）に記載の単離された、合成、または組換えポリペプチド。
（９）ポリペプチドが37℃超〜約84℃、55℃超〜約84℃の範囲の温度への曝露後にプルラナーゼ活性を保持する、（２０）に記載の単離された、合成、または組換え核酸。
（１０）デンプンを含有する物質と、（５）に記載のポリペプチド、およびそれと実質的に同一の配列とを接触させることを含む、デンプン結合を加水分解する方法。
（１１）デンプンと、（５）に記載のポリペプチド、およびそれと実質的に同一の配列とを接触させることを含む、デンプン含有組成物を液化するための方法。
（１２）（５）に記載のポリペプチド、およびそれと実質的に同一の配列の使用を含む、シロップを製造するための方法。
（１３）デンプンと、（５）に記載のポリペプチドとを、液化にとって十分な条件下で接触させることを含む、デンプン液化のための方法。
（１４）（５）に記載のポリペプチドを含む洗剤添加物。
（１５）（５）に記載のポリペプチドの使用を含む、高マルトースまたは高グルコースシロップまたは混合シロップを製造するための方法。
（１６）（５）に記載のポリペプチドの使用を含む、エタノールを製造する方法。
（１７）（５）に記載のポリペプチドの使用を含む、エタノールを製造する方法であって、該ポリペプチドは限界デキストランを消化することができる、前記方法。
（１８）プルラナーゼまたはその組合せの添加をさらに含む、（１０）〜（１７）のいずれか１に記載の方法。
（１９）（５）に記載のポリペプチドを含む洗剤組成物。
以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、特許請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例1にさらに記載されるように、50℃で1%コーンスターチ基質と共に、配列番号1および2のプルラナーゼを用いる消化の結果を示すクロマトグラムである。
【図２】実施例1にさらに記載されるように、50℃で1%プルランと共に、配列番号1および2のプルラナーゼを用いる消化の結果を示すクロマトグラムである。
【図３】実施例1にさらに記載されるように、75℃で1%コーンスターチ基質と共に、配列番号1および2のプルラナーゼを用いる消化の結果を示すクロマトグラムである。
【図４】本発明のデオキシリボ核酸(DNA)配列である配列番号1である。
【図５】本発明のアミノ酸配列である配列番号2である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、プルラナーゼ酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製および使用する方法に関する。本発明は、プルラナーゼ活性を有する新規ポリペプチド、それらをコードする核酸に関する。本発明のポリペプチドを、様々な商業的、医学的、および工業的状況で用いることができる。本発明のポリペプチドを、例えば、洗剤のための添加物として、食品を加工するために、ならびに逆反応を用いる化学合成、デンプンの糖化、デンプンの液化、高マルトースコーンシロップの製造、高フルクトースコーンシロップの製造、デンプン加工、エタノール製造、シクロデキストリンの製造、および低カロリービールの製造、製パン工業、ならびに歯垢制御のために用いることができる。
【００１９】
本発明の一態様においては、プルラナーゼはII型プルラナーゼであるか、またはα-1,6結合とα-1,4結合の両方を切断することができる。本発明の別の態様においては、本発明のプルラナーゼは、プルランのα-1,6とα-1,4の両方を切断し、グルコース、マルトース、およびマルトトリオースをもたらすことができる。本発明のさらなる実施形態においては、本発明のプルラナーゼは熱安定性および/または耐熱性である。本発明のさらなる実施形態においては、本発明のプルラナーゼは、75℃で活性である。本発明のさらなる実施形態においては、本発明のプルラナーゼは、現在用いられているものよりも高い温度でデンプンの糖化を行うことによって、加工時間を減少させ、温度の低下をもたらす材料の老化速度の低下のため収率を増加させることができる。本発明のさらなる実施形態においては、プルラナーゼは、アミラーゼが消化することができない限界デキストランを消化することにより、エタノールまたはグルコース産生を増強することができる。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態においては、本発明のプルラナーゼは、アミラーゼ酵素と結合する。
【００２１】
一態様においては、核酸は、プルラナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする。
【００２２】
本発明の「合成」核酸(オリゴヌクレオチドを含む)、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、以下に記載されるような、任意の化学合成により調製されるものを含む。
【００２３】
語句「核酸」または「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはこれらのいずれかの断片、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖であってもよい、ゲノム、組換えもしくは合成起源のDNAもしくはRNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA)、ペプチド核酸(PNA)または例えば、miRNAもしくはsiRNA、リボ核タンパク質(例えば、iRNP)などのiRNAを含む、天然もしくは合成起源の任意のDNA様もしくはRNA様材料を含む。この用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含する。例えば、Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照されたい。
【００２４】
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えDNA技術により産生される、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性DNA構築物により形質転換された細胞から産生されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００２５】
用語「遺伝子」は、転写産物(例えば、メッセージ)の産生に関与し、次いで、翻訳されてポリペプチド鎖を産生するか、または遺伝子の転写、再生もしくは安定性を調節する、DNAのセグメントを含む核酸配列を含む。遺伝子は、リーダーおよびトレイラー、プロモーターおよびエンハンサー、ならびに適用可能な場合、個々のコードセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)などの、コード領域の前後の領域を含んでもよい。
【００２６】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターなどの発現カセットを含む、単離された核酸および組換え核酸を提供する。本発明はまた、本発明の核酸を用いる新しいプルラナーゼ配列を探索するための方法も含む。本発明はまた、本発明の核酸を用いる、プルラナーゼ遺伝子、転写物およびポリペプチドの発現を阻害するための方法も含む。
【００２７】
本発明の核酸を、例えば、PCRなどによる、cDNAライブラリーのクローニングおよび発現、メッセージまたはゲノムDNAの増幅により作製、単離および/または操作することができる。本発明を、科学文献および特許文献によく記載される、当業界で公知の任意の方法またはプロトコールまたはデバイスと共に実施することができる。
【実施例】
【００２８】
〔実施例１〕
本発明のプルラナーゼ(配列番号1および2により具体化される)を、試験細胞溶解物からのアリコートを用いて1%固体に対して試験した。図1、2および3に示される結果は、本発明のプルラナーゼがα-1,6結合とα-1,4結合の両方を切断することができることを示す。図2に示されるように、本発明のプルラナーゼ(配列番号1および2により具体化される)を、50℃で1%プルランを用いてアッセイした。図1に示されるように、本発明のプルラナーゼ(配列番号1および2により具体化される)を、50℃で1%コーンスターチを用いてアッセイした。図3に示されるように、本発明のプルラナーゼ(配列番号1および2により具体化される)を、75℃で1%コーンスターチを用いてアッセイした。図1、2および3に示されるように、反応生成物(主ピーク)はグルコース、マルトース、およびマルトトリオースであるため、酵素はII型プルラナーゼである。さらに、ピーク2の生成物はマルトースであり、イソマルトースではないと確認され、一方、ピーク3の生成物はマルトトリオースであり、パノースではないと確認された。
〔実施例２〕
本発明のプルラナーゼ(配列番号1および2により具体化される)の融点または温度変性を、示差走査熱量測定を用いて決定した。本発明(配列番号1および2により具体化される)のTmは、84℃である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0006502314.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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