(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下であるか、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下であり、前記生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン又はプロネクチンであり、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱により架橋されている、細胞移植用細胞構造体。
【請求項２】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項３】
前記生体親和性高分子ブロックの架橋度が６以上であり、かつ前記生体親和性高分子ブロックの吸水率が３００％以上である、請求項１又は２に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項４】
厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１から３の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項５】
細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から４の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項６】
血管新生因子を含む、請求項１から５の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項７】
前記細胞が、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１から６の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項８】
前記細胞が、非血管系の細胞のみである、請求項１から７の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項９】
前記細胞が、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む、請求項１から７の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項１０】
細胞構造体において、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する、請求項９に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項１１】
前記中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有する請求項１０に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項１２】
細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、１．０×１０−４cells/μｍ３以上である領域を有する、請求項９から１１の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項１３】
細胞移植用細胞構造体の内部において血管形成されている、請求項９から１２の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体。
【請求項１４】
グルタルアルデヒドを含まない細胞培養用の生体親和性高分子ブロックであって、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下であり、前記生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン又はプロネクチンであり、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、生体親和性高分子が熱により架橋されている、細胞培養用の生体親和性高分子ブロック。
【請求項１５】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１４に記載の生体親和性高分子ブロック。
【請求項１６】
架橋度が６以上であり、かつ吸水率が３００％以上である、請求項１４又は１５に記載の生体親和性高分子ブロック。
【請求項１７】
請求項１から１３の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体を製造するために使用する、請求項１４から１６の何れか１項に記載の生体親和性高分子ブロック。
【請求項１８】
請求項１４から１７の何れか１項に記載の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から１３の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体を製造するための試薬。
【請求項１９】
請求項１４から１７の何れか１項に記載の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することを含む、請求項１から１３の何れか１項に記載の細胞移植用細胞構造体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞移植用細胞構造体、生体親和性高分子ブロック、並びにそれらの製造方法に関する。詳しくは、本発明は、移植後に細胞の壊死が抑制された細胞移植用細胞構造体、その製造に用いる生体親和性高分子ブロック、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、及び神経再生治療などが挙げられる。これら新たな治療は、従来の人工物による代替医療（例えば、人工骨補填剤やヒアルロン酸注射など）とは異なり、生体組織の修復・再生を図るものであり、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が市販されてきた。
【０００３】
例えば、細胞シートを用いた心筋の再生においては、厚みのある組織を再生するには、細胞シートの多層構造体が必要であると考えられる。近年、岡野らは温度応答性培養皿を用いた細胞シートを開発した。細胞シートはトリプシンのような酵素処理が必要でないため、細胞と細胞との結合および接着蛋白が保持される。(非特許文献１から６)。このような細胞シート製造技術は、心筋組織の再生に有用であると期待される（非特許文献７）。また岡野らは、細胞シートに血管網を形成すべく、血管内皮細胞を一緒に導入した細胞シートの開発を行っている（非特許文献８）。
【０００４】
さらに、特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とをモザイク状に３次元配置することによって製造される細胞３次元構造体が記載されている。この細胞３次元構造体においては、外部から細胞３次元構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。また、特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Shimizu, T. et al., Circ. Res. 90, e40-48 (2002)
【非特許文献２】Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res. 51, 216-223 (2000)
【非特許文献３】Kushida, A. et al., J. Biomed. Mater. Res. 45, 355-362 (1999)
【非特許文献４】Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A. & Okano, T., Tissue Eng.7, 141-151 (2001)
【非特許文献５】Shimizu, T et al., J. Biomed. Mater. Res. 60,110-117(2002)
【非特許文献６】Harimoto, M. et al., J. Biomed. Mater. Res. 62, 464-470 (2002)
【非特許文献７】Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A. & Okano, T., Biomaterials 24, 2309-2316 (2003)
【非特許文献８】Inflammation and Regeneration vol.25 No.3 2005, p158-159. 第２６回  日本炎症・再生医学会  ―炎症学と再生医学の融合を目指して―  岡野光夫
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１の実施例に記載されている細胞構造体の高分子ブロックにおいては、高分子の架橋のために人体に対する毒性が強いグルタルアルデヒドが使用されている。このようなグルタルアルデヒドを用いて製造した細胞構造体は、人体に対する毒性が懸念されるために細胞移植治療のためには使用することができない。そこで、グルタルアルデヒドのような人体毒性を有する物質を含まず、かつ移植した細胞の壊死を抑制することができる細胞構造体は未だ提供されておらず、これらの条件を満たす、細胞移植治療用途に適した細胞構造体が望まれていた。
【０００８】
本発明は、グルタルアルデヒドのような細胞毒性を有する物質を含まずに、構造体中での移植した細胞の壊死が抑制される（即ち、細胞生存率に優れる）細胞移植用細胞構造体を提供することを課題とした。更に本発明は、上記した細胞移植用細胞構造体を製造するのに適した生体親和性高分子ブロックを提供することを課題とした。更に本発明は、上記細胞移植用細胞構造体の製造方法、並びに上記生体親和性高分子ブロックの製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを使用して、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックを配置することによって細胞移植用細胞構造体を製造する際に、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である生体親和性高分子ブロックを使用することによって、上記課題を解決した細胞移植用細胞構造体を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、細胞移植用細胞構造体が提供される。
【００１１】
さらに本発明によれば、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックであって、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、生体親和性高分子ブロックが提供される。
【００１２】
好ましくは、生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である。
好ましくは、生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である。
好ましくは、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている。
好ましくは、生体親和性高分子ブロックの架橋度が６以上であり、かつ前記生体親和性高分子ブロックの吸水率が３００％以上である。
好ましくは、生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである。
【００１３】
好ましくは、生体親和性高分子の多孔質体が、
（ａ）生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結処理により凍結する工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程：
を含む方法により製造されたものである。
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が未凍結状態で「溶媒融点−７℃」以下となる凍結処理により凍結する。
【００１４】
好ましくは、生体親和性高分子の多孔質体が以下の（ａ）及び（ｂ）に記載の特性を有する。
（ａ）８１％以上９９．９９％以下の空孔率を有する。
（ｂ）サイズが２０〜２００μｍである空孔が占める空間占有率が８５％以上である。
【００１５】
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む。
【００１６】
好ましくは、生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンである。
好ましくは、生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである。
【００１７】
好ましくは、リコンビナントゼラチンが、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される。
好ましくは、リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１８】
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、血管新生因子を含む。
好ましくは、細胞は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞のみである。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む。
【００１９】
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、細胞構造体において、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有する。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、１．０×１０-4cells/μｍ3以上である領域を有する。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体の内部において血管形成されている。
【００２０】
本発明の生体親和性高分子ブロックは、好ましくは、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造するために使用する。
【００２１】
本発明によればさらに、本発明の生体親和性高分子ブロックを含む、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造するための試薬が提供される。
本発明によればさらに、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することを含む、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造する方法が提供される。
【００２２】
本発明によればさらに、
（ａ）生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結処理により凍結する工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程：
を含む、生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法が提供される。
【００２３】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が未凍結状態で「溶媒融点−７℃」以下となる凍結処理により凍結する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の細胞移植用細胞構造体は、グルタルアルデヒドのような細胞毒性を有する物質を含まないことにより細胞移植治療のために使用できるとともに、構造体中での移植した細胞の壊死が抑制され、細胞生存率に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、in vitro ATPアッセイにおけるブロックによる違いを示す。
【図２】図２は、本発明のブロック又は比較用ブロックを用いたｈＭＳＣモザイク細胞塊中での細胞の生存状態の違い（２週間後）を示す。
【図３】図３は、本発明のブロック群内間での移植細胞の生存状態を示す。ｈＭＳＣモザイク細胞塊中の生存とブロックサイズによる差を示す。
【図４】図４は、移植２週間後のｈＭＳＣモザイク細胞塊における血管形成を示す。
【図５】図５は、移植２週間後のｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊における血管形成を示す。
【図６】図６は、多孔質体における各空孔サイズの空間占有率を示す。
【図７】図７は、ＣＢＥ３多孔質体のＨＥ断面画像及びポア形状と内部最高液温を示す。
【図８】図８は、棚板温度−４０℃（硝子板２．２ｍｍ）での内部最高液温の時間変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細胞移植用細胞構造体は、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、細胞移植用細胞構造体である。
【００２７】
（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体性親和性高分子
本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性材料で構成されることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、および、ＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）の群から選択される少なくとも１つの材料である。生分解性材料としては、具体的にはポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、および、キトサンの群から選択される少なくとも１つの材料である。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。尚、これら高分子材料には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよく、具体的な方法としては１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、２．「基材表面のアミノ化、カチオン化」、３．「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法が利用され得る。
【００２８】
ポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、天然ゼラチン、又はリコンビナントゼラチンが好ましい。さらに好ましくは、リコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００２９】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基く、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００３０】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞３次元構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００３１】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞３次元構造体（モザイク細胞塊；モザイク状になっている細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００３２】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られているが、本発明ではグルタルアルデヒドを使用しない架橋方法を使用する。本発明では好ましくは、アルデヒド類又は縮合剤を使用しない架橋方法を使用する。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００３３】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００３４】
架橋剤を使用しない架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００３５】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明にかかるリコンビナントゼラチンとは遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい（複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい）。好ましくは、細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができ、例えばEP1014176、US6992172、WO2004/85473、WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００３６】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは天然のゼラチン本来の性能から、生体適合性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは天然のものに比して均一であり、配列が決定されているので、強度、分解性においても後述の架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００３７】
リコンビナントゼラチンの分子量は２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であることが好ましい。より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下である。より好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。最も好ましくは、１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００３８】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有する。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシン、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧＸＹ配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ，Ｙであらわされるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくはその配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造であることが好ましい。
【００３９】
一般的なゼラチンは極性アミノ酸のうち、電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントペプチドにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ該極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、システインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００４０】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましく、さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００４１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置として、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
【００４２】
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００４３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましく、リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合に、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００４４】
また、リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００４５】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。
【００４６】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００４７】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれであっても構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、およびV型である。より好ましくは、I型、II型、III型である。別の形態によると、該コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットである。より好ましくはヒトである。
【００４８】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
【００４９】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
【００５０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の相同性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列；
を有するリコンビナントゼラチンである。
【００５１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００５２】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子を含有するブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではないが、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であること、又は前記生体親和性高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下であることの何れか１以上の条件を充足するものである。
【００５３】
本発明における生体親和性高分子ブロックのタップ密度は、１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、好ましくは、２０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下、より好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ3以上２２０ｍｇ／ｃｍ3以下、更に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ3以上１５０ｍｇ／ｃｍ3以下である。
【００５４】
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、及び生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在出来、細胞移植用細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００５５】
本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
【００５６】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、２０μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。より好ましくは２０μｍ以上１２０μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下である。
【００５７】
好ましくは、生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、かつ高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上１２０μｍ以下である。
【００５８】
本発明における生体親和性高分子ブロックの「断面積の平方根÷周囲長」は、０．０１以上０．１３以下であり、好ましくは、０．０２以上０．１２以下、より好ましくは０．０３以上０．１１５以下、更に好ましくは０．０５以上０．０９以下である。
【００５９】
生体親和性高分子ブロックの「断面積の平方根÷周囲長」とは、タップ密度と同様に、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、及び高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。「断面積の平方根÷周囲長」が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在出来、細胞移植用細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００６０】
生体親和性高分子ブロックの、二次元断面像における「面積の平方根÷周囲長」とは、生体親和性高分子ブロックの断面標本を作製し、断面構造を確認することによって求めることができる。例えば、まず、生体親和性高分子ブロックの断面構造を薄切標本（例えばＨＥ染色標本）として用意する。この際、生体親和性高分子ブロックだけでも構わないし、生体親和性高分子ブロックと細胞を含む細胞構造体として断面構造を観察することでも構わない。一つの生体親和性高分子ブロックについて、その断面積及び周囲長を求め、その後、「断面積の平方根÷周囲長」を算出する。それを１０か所以上の複数個にわたって計測し、それらの平均値として「断面積の平方根÷周囲長」を得ることができる。
【００６１】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、より優れた細胞生存率を達成することができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００６２】
本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは６以上であり、さらに好ましくは６以上３０以下であり、さらに好ましくは６以上２５以下であり、特に好ましくは８以上２２以下である。
【００６３】
高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプル及びブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式１）、及び（式２）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
【００６４】
（式１）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式１）は、高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
【００６５】
（式２）  １−（サンプル（式１）/未架橋の高分子（式１））×３４
（式２）は、１分子あたりの架橋数を示す。
【００６６】
本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは７００％以上、最も好ましくは８００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、又は２０００％以下である。
【００６７】
生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロックを約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式３）に従って吸水率を求めることができる。
【００６８】
（式３）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
【００６９】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、上記（１−４）に記載した条件を満たす生体親和性高分子ブロックが得られる限りは特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、上記（１−４）に記載した条件を満たす生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
【００７０】
本発明における「多孔質体」としては好ましくは、１ｍｍ角の材料として用意した場合に、本体内部に複数の「１０μｍ以上５００μｍ以下の空孔」を有する材料で、かつその本体中で空孔の占める体積が５０％以上の材料を使用することができる。これらの材料において、前述した内部の空孔は、互いに連通していてもよく、一部もしくは全部の空孔が材料表面に開口していてもよい。
【００７１】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する際に、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状となる。この工程を経て、当該氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状となる。この工程を経て、当該氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。
【００７２】
本発明においては、多孔質体の有する空孔の形状は、柱／平板孔であるよりも、球孔であることが好ましく、また、空孔のうち球孔の占める割合が５０％以上であることがさらに好ましい。
【００７３】
本発明では好ましくは、
（ａ）生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結処理により凍結する工程；及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程：
を含む方法により、生体親和性高分子の多孔質体を製造することができる。上記工程によれば、空孔の内、球孔の占める割合が５０％以上とすることができるからである。
【００７４】
より好ましくは、上記工程（ａ）において、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が未凍結状態で「溶媒融点−７℃」以下となる凍結処理により凍結することができる。この工程によれば、空孔の内、球孔の占める割合が８０％以上とすることができるからである。
【００７５】
多孔質体の有する空孔の平均空孔サイズは、当該多孔質体の断面構造観察から得られる。まず、多孔質体の断面構造を薄切標本（例えばＨＥ染色標本）として用意する。その後、高分子で形成されている壁の内、明瞭な突起部については、最接突起部と繋ぎ、空孔を明瞭化させる。そうして得られた区切られた個々の空孔面積を計測し、その後、当該面積を円換算した場合の円直径を算出する。得られた円直径を空孔サイズとし、２０個以上の平均値を平均空孔サイズとすることができる。
【００７６】
本明細書中における、ある空孔サイズの空間占有率とは、ある空孔サイズを有す空孔が多孔質体中で、どれくらいの体積を占めているかという割合のことをいう。具体的には、二次元断面画像から、ある空孔サイズの空孔が占める面積を全面積で除することにより、割合として求めることができる。また、用いる断面画像としては、実寸１．５ｍｍ大についての断面画像を利用することができる。
【００７７】
多孔質体の空孔サイズ２０μｍ〜２００μｍが占める空間占有率は、好ましくは８３％以上１００％以下であり、より好ましくは８５％以上１００％以下、さらに好ましくは９０％以上１００％以下、特に好ましくは９５％以上１００％以下である。
多孔質体の空孔サイズ３０μｍ〜１５０μｍが占める空間占有率は、好ましくは６０％以上１００％以下であり、より好ましくは７０％以上１００％以下、さらに好ましくは８０％以上１００％以下、特に好ましくは９０％以上１００％以下である。
【００７８】
多孔質体の空孔サイズ２０μｍ〜２００μｍが占める空間占有率、及び多孔質体の空孔サイズ３０μｍ〜１５０μｍが占める空間占有率とは、多孔質体中における空孔サイズ分布が所定の範囲に収まることを表している。つまり、当該多孔質体を粉砕することで得た高分子ブロックにおいて、サイズ２０μm〜２００μｍ大の高分子ブロックとした際、当該空孔サイズは、一つの高分子ブロックサイズと近いサイズであり、結果的に当該空孔サイズの割合が多い多孔質体では、粉砕後の高分子ブロックの構造が複雑となり、結果的にタップ密度や、「断面積の平方根÷周囲長」を小さくすることに繋がる。
【００７９】
空孔の形状については、個々の空孔について、長軸と短軸を求め、そこから「長軸÷短軸」を算出。それら「長軸÷短軸」が１以上２以下の場合を球孔、３以上の場合を柱／平板孔とした。
【００８０】
本発明における多孔質体の空孔率は、嵩密度（ρ）と真密度（ρc）を用いて、空孔率（P） = １−ρ/ρc （％）により求めることができる。嵩密度（ρ）は、乾燥質量と体積から算出し、真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めることができる。本発明における高分子多孔質体の空孔率は、好ましくは８１％以上９９．９９％以下であり、より好ましくは９５．０１％以上９９．９％以下である。
【００８１】
（１−６）生体親和性高分子ブロックの用途
本明細書中後記の通り、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造することができる。即ち、本発明の生体親和性高分子ブロックは、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造するための試薬として有用である。
【００８２】
（２）細胞
本発明で用いる細胞は、本発明の細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００８３】
例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患においては、自家および他家から摘出した心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、骨格筋由来細胞（特にサテライト細胞）、骨髄細胞（特に心筋様細胞に分化させた骨髄細胞）などを好適に使用することができる。更に、他の臓器においても、適宜移植細胞を選択することができる。例えば、脳虚血・脳梗塞部位への神経前駆細胞または、神経細胞に分化可能な細胞の移植、心筋梗塞部位・骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の移植などを挙げることができる。
【００８４】
また、糖尿病性の臓器障害に対する細胞移植に使用される細胞が挙げられる。例えば、腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対して、種々検討されている細胞移植治療法用の細胞が挙げられる。即ち、インスリン分泌能が低下した膵臓にインスリン分泌細胞を移植する試みや、四肢の血行障害に対する骨髄由来細胞の移植などが検討されており、このような細胞を使用することができる。
【００８５】
また本明細書中後述する通り、本発明においては、血管系の細胞を使用することもできる。本明細書において、血管系の細胞とは、血管形成に関連する細胞を意味し、血管および血液を構成する細胞、およびその細胞に分化することができる前駆細胞、体性幹細胞である。ここで、血管系の細胞には、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞等の万能細胞や、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のような、血管および血液を構成する細胞に、自然には分化しないものは含まれない。血管系の細胞として、好ましくは血管を構成する細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）では、血管を構成する細胞は、血管内皮細胞および血管平滑筋細胞を好適に挙げることができる。血管内皮細胞は、静脈内皮細胞および動脈内皮細胞どちらも含む。血管内皮細胞の前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞を使用することができる。好ましくは血管内皮細胞および血管内皮前駆細胞である。血液を構成する細胞は、血球細胞が使用でき、リンパ球や好中球などの白血球細胞、単球細胞、それらの幹細胞である造血幹細胞を使用できる。
【００８６】
本明細書において、非血管系の細胞とは、上記の血管系以外の細胞を意味する。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、肝細胞または神経細胞を使用することができる。好ましくは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、軟骨細胞、筋芽細胞、心筋幹細胞、心筋細胞、肝細胞またはｉＰＳ細胞を使用することができる。より好ましくは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心筋幹細胞、心筋細胞または筋芽細胞である。
【００８７】
（３）細胞構造体
本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の該高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能であり、かつ、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体を形成され、外部から細胞３次元構造体の内部への栄養送達を可能となる。これにより、本発明の細胞移植用細胞構造体を用いて、細胞移植を行うと、移植された細胞の壊死を抑制し、移植が可能となる。なお、ここでいう「壊死の抑制」とは、本発明の細胞構造体とせず、細胞のみを移植した場合と比較して、壊死の程度が低いことを意味する。
【００８８】
本発明の細胞移植用細胞構造体は、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００８９】
また、本発明にかかる高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００９０】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、本発明の作用効果である、外部から細胞３次元構造体の内部への栄養送達を可能とすること、移植された細胞の壊死を防止することを意味するものである。
【００９１】
本発明の細胞移植用細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００９２】
本発明の細胞移植用細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００９３】
また、後述する本発明の細胞移植用細胞構造体の製造方法での融合前の細胞構造体、または第二の高分子ブロック添加前の細胞構造体として、本発明の細胞構造体を使用する場合には、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、１０μｍ以上１ｃｍ以下、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。
【００９４】
本発明の細胞移植用細胞構造体は、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とするこのより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００９５】
また、本発明の細胞移植用細胞構造体は、血管新生因子を含んでいてもよい。ここで、血管新生因子としては、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などを好適に挙げることができる。血管新生因子を含む細胞移植用細胞構造体の製造方法は、特に制限されないが、例えば、血管新生因子を含浸させた高分子ブロックを使用することにより、製造することができる。血管新生を促進する観点からは、本発明の細胞移植用細胞構造体は、血管新生因子を含むことが好ましい。
【００９６】
本発明の細胞移植用細胞集合体の一例としては、非血管系細胞と血管系細胞で構成される細胞移植用細胞集合体であって、
（ａ）細胞集合体の中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有すること、および
（ｂ）中心部の血管系の細胞密度が、１．０×１０-4cells/μｍ3以上である領域を有すること、
のうち少なくとも一方の要件を満たすものである。
本発明の細胞移植用細胞集合体は、前記（ａ）および（ｂ）の両方の要件を満たすことが好ましく、前記中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有することも好ましい。
【００９７】
本発明の細胞移植用細胞構造体は、非血管系の細胞を含むものも好適に使用することができる。また、本発明の細胞移植用細胞構造体を構成する細胞が、非血管系の細胞のみであるものも好適に使用することができる。細胞として非血管系の細胞のみを含む本発明の細胞移植用細胞構造体により、移植後、移植部位に、血管を形成することができる。また、本発明の細胞移植用細胞構造体を構成する細胞が二種類以上であり、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む場合には、非血管系の細胞のみで構成されている場合と比較して、より血管形成することが可能となり、好ましい。
【００９８】
更にまた、本発明の細胞移植用細胞構造体を構成する細胞が二種類以上であり、細胞構造体の中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する場合、更に血管形成することが可能となり、更に好ましい。ここで、細胞構造体の中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有するとは、具体的には、任意の２μｍの薄切標本を作製したときに、上記となる領域を有する標本が存在することを言う。ここで、細胞構造体の中心部とは、中心から、細胞構造体の表面までの距離のうち、中心から８０％までの距離のエリアをいい、細胞構造体の周辺部とは、中心から８０％の場所から構造体表面までのエリアをいう。なお、細胞構造体の中心部は、以下のように定める。
【００９９】
細胞構造体の中心を通る任意の断面において、当該断面の外延に沿って、半径Ｘの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた部分の面積が、前記断面の断面積の６４％となるような半径Ｘを求める。当該半径Ｘの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた部分を細胞構造体の中心部とする。このとき、断面積が一番大きくなる断面が最も好ましい。なお、細胞構造体の中心とは、断面積が最大となる断面において、当該断面の外延に沿って、半径Ｙの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた部分が、一点に決まるような半径Ｙを求める。当該半径Ｙの円の中心を一周動かし、動かした円と断面の重複部分を除いた一点を細胞構造体の中心とする。一点に決まらず線分になる場合、またはその線分が複数個存在する場合は、それぞれの線分について、その長さを二等分する点を中心とする。
【０１００】
具体的には、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有することが好ましく、６５％〜１００％がより好ましく、８０％〜１００％が更に好ましく、９０％〜１００％が更に好ましい。なお、ここで、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、６０％〜１００％である領域を有するとは、具体的には、任意の２μｍの薄切標本を作製したときに、当該割合の領域を有する標本が存在することを言う。当該範囲とすることにより、血管形成をより促すことができる。
【０１０１】
なお、中心部の血管系の細胞の割合は、例えば、薄切標本を作製したときに、測定対象の血管系の細胞を染色し、画像処理ソフトＩｍａｇｅＪを用い、中心部の色の濃さ（強度）の平均値を求め、中心部の面積×強度を算出し、更に、全体の色の濃さ（強度）の平均値を求め、全体の面積×強度を算出し、全体の面積×強度に対する、中心部の面積×強度の割合を求めることによって算出することもできる。ここで、血管系の細胞を染色する方法は、適宜、公知の染色方法を使用することができ、例えば、細胞として、ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を使用する場合には、ＣＤ３１抗体を使用することができる。
【０１０２】
また、細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が１．０×１０-4cells/μｍ3以上である領域を有することが好ましく、細胞構造体の中心部全体で前記細胞密度となることが、より好ましい。なお、ここで、１．０×１０-4cells/μｍ3以上である領域を有するとは、具体的には、任意の２μｍの薄切標本を作製したときに、当該密度の領域を有する標本が存在することを言う。前記細胞密度は、より好ましくは１．０×１０-4〜１．０×１０-3cells/μｍ3、更に好ましくは１．０×１０-4〜２．０×１０-4cells/μｍ3、更に好ましくは１．１×１０-4〜１．８×１０-4cells/μｍ3、更に好ましくは１．４×１０-4〜１．８×１０-4cells/μｍ3である。当該範囲とすることにより、血管形成をより促すことができる。
【０１０３】
ここで、中心部の血管系の細胞密度は、実際に薄切標本の細胞数を数え、細胞数を体積で割って求めることができる。ここでの中心部とは、以下のように定める。前述の中心部に垂直方向に、薄切標本の厚みの分を切り取った部分とする。細胞密度の求め方は、例えば、上記の測定対象の血管系の細胞を染色した薄切標本と、細胞核を染色した薄切標本を重ね合わせ、重なった細胞核の数をカウントすることで、中心部の血管系の細胞数を算出することができ、体積は、ＩｍａｇｅＪを用いて中心部の面積を求め、その薄切標本の厚みをかけることで求められる。
【０１０４】
なお、本発明の細胞移植用細胞構造体には、細胞が二種類以上であり、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む本発明の細胞移植用細胞構造体を用いて、血管形成されたものも含む。また、ここで、「細胞が二種類以上であり、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む本発明の細胞移植用細胞構造体」の好適な範囲は上記と同様である。血管を構築する方法は、例えば、血管部分をトンネル状にくりぬいたゲル材料に、血管系細胞を混合した細胞シートを貼り付け、トンネルに培養液を流しながら培養する方法があげられる。また、細胞シートの間に血管系細胞をサンドイッチ状にはさむことでも、血管を構築できる。
【０１０５】
（４）細胞移植用細胞構造体の製造方法
本発明の細胞移植用細胞構造体は、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
【０１０６】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【０１０７】
上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、
（ａ）別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【０１０８】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【０１０９】
前記別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、前記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
【０１１０】
本発明の細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中前記と同様である。
【０１１１】
また、前記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径が１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、前記融合後の厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下であることが好ましい。ここで、前記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径として、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下であり、また、記融合後の厚さ又は直径の範囲として、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【０１１２】
前述した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法とは、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、該複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする工程を含む細胞構造体の製造方法である。ここで、「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中前記と同様である。
【０１１３】
ここで、融合させたい細胞構造体同士は、０以上５０μｍ以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、０以上２０μｍ以下、更に好ましくは０以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
【０１１４】
本発明の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【０１１５】
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
【０１１６】
非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む場合の細胞構造体の製造方法として、例えば、下記（ａ）〜（ｃ）の製造方法を好適に挙げることができる。
（ａ）は非血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「血管系の細胞および高生体親和性分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多く、周辺部では、非血管系の細胞と比較して、血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より多い細胞移植用細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より少ない細胞移植用細胞構造体、を製造することが可能となる。
（ｂ）は血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、非血管系の細胞と比較して、管系の細胞の面積が多く、周辺部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い細胞移植用細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より少ない細胞移植用細胞構造体、を製造することが可能となる。
（ｃ）は、非血管系の細胞および血管系の細胞を実質的に同時に使用し、前述の方法で細胞構造体を形成させる製造方法である。この方法では、細胞構造体のいずれの部位も、非血管系の細胞および血管系の細胞のいずれかが、大きく偏在することのない細胞構造体を製造することが可能となる。
【０１１７】
移植後、移植部位に血管を形成する観点では、細胞構造体の中心部では、非血管系の細胞と比較して、血管系の細胞の面積が多く、周辺部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多い細胞構造体や、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い、細胞移植用細胞構造体であることが好ましく、当該細胞構造体とすることにより、血管形成をより促進することができる。更に、当該細胞構造体において、中心部に存在する細胞数が多い方が、血管形成をより促進することができる。
同様の理由で、血管系の細胞により細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法が好ましい。そして、血管系の細胞数を多くすることがさらに好ましい。
【０１１８】
（５）細胞移植用細胞構造体の用途
本発明の細胞移植用細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることが出来る。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【０１１９】
また、本発明によれば細胞移植方法が提供される。本発明の細胞移植方法は、前記した本発明の細胞移植用細胞構造体を用いることを特徴とするものである。細胞移植用細胞構造体の好適な範囲は前述と同様である。
【０１２０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１２１】
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下記載のＣＢＥを用意した（ＷＯ2008-103041に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤ
構造： GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：9.34、GRAVY値：-0.682、１／ＩＯＢ値：0.323
【０１２２】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（WO2008／103041号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【０１２３】
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体（高分子多孔質体）の作製
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
【０１２４】
ＣＢＥ３水溶液を調製し、このＣＢＥ３水溶液を円筒形容器に流し込んだ。冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際、冷却棚板の温度、及び棚板と円筒形容器の間に挟む断熱板（硝子板）の厚さ、入れるＣＢＥ３水溶液の最終濃度、及び水溶液量を以下に記載の通り用意した。
「ア」  棚板温度-４０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度１２％、水溶液量４ｍＬ。
「イ」  棚板温度-６０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度７．５％、水溶液量４ｍＬ。
「ウ」  棚板温度-４０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４．０％、水溶液量４ｍＬ。
【０１２５】
このようにして得た凍結ＣＢＥ３ブロックを凍結乾燥して、ＣＢＥ３多孔質体を得た。
【０１２６】
[比較例１] リコンビナントペプチド単純凍結多孔質体の作製
５０℃で、２０００ｍｇのＣＢＥ３を１８ｍＬの超純水に溶解し、終濃度１０％のＣＢＥ３溶液を２０ｍＬ作製する。そのＣＢＥ３溶液を薄く伸ばして４mm厚程度の薄い板状のゲルを作製した。容器については、白い板に、シリコン枠（５ｃｍ×１０ｃｍ程度）をつけて、空気の隙間がないようにしっかりとシリコン枠を押し付けてから、その枠内へ上記のＣＢＥ３溶液（５０℃）を流し込んだ。液を流し込んだら、４℃へ移して約１時間ゲル化させ、固まっていることを確認した後、−８０℃へ移して、ゲルを３時間凍結させた。凍結後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＤＵ−１０００）で凍結乾燥を行った。尚、この時に得られた凍結乾燥体は多孔質体ではあり、平均ポアサイズが５７．３５μｍとなっていた。以後、これを単純凍結多孔質体と呼称する。
【０１２７】
［実施例３］リコンビナントペプチド多孔質体の空孔サイズと空間占有率の評価
実施例２で得られたＣＢＥ３多孔質体および比較例１で得られた単純凍結多孔質体について、多孔質の空孔サイズと空間占有率の評価を実施した。得られた多孔質体を１６０℃で２０時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤した。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色標本を作製した。  標本から実スケール１．５ｍｍ大の断面像を用意し、個々の空孔面積を計測し、その後、当該面積を円換算した場合の円直径を算出し、空孔サイズとした。この空孔の２０ヶ以上の平均値を平均空孔サイズとした。その結果、「ア」は６６．３９μｍ、「イ」は６３．１７μｍ、「ウ」は５６．３６μｍであった。
【０１２８】
算出した空孔サイズを元に、上記で用いた二次元断面画像から、ある空孔サイズの空孔が占める面積を全面積で除することにより、割合として求めた。その結果、実施例２で得られたＣＢＥ多孔質体では２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は、「ア」は１００％、「イ」は９９．９％、「ウ」は９９．９％であった。３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は、「ア」は９４．２％、「イ」は９７．９％、「ウ」は９９．３％であった。
【０１２９】
一方、比較例１で得られた単純凍結多孔質体では、空孔のサイズに大きくばらつきがあり、大きいサイズの集まった箇所と小さいサイズの集まった箇所が存在した。大きいサイズの箇所では、２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は、７４．３％、３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は、５５．８％であった。小さいサイズの集まった箇所では、２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は、８２．８％、３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は、５７．２％であった。大きいサイズの箇所と小さいサイズの箇所が半分ずつ混在することから、２０μｍ〜２００μｍの空孔の空間占有率は、７８．６％、３０μｍ〜１５０μｍの空孔の空間占有率は、５６．５％となる（図６）。
【０１３０】
[実施例４] リコンビナントペプチド多孔質体の空孔率測定
実施例２で得られたＣＢＥ３多孔質体について、空孔率を測定した。測定に当たっては、嵩密度（ρ）と真密度（ρｃ）を測定し、空孔率（Ｐ ＝ １−ρ/ρc（％））を求めた。ＣＢＥ３多孔質体の嵩密度（ρ）は、乾燥質量と体積から算出した。真密度（ρc）は、ハバード型形の比重瓶法により求めた。サンプル数（Ｎ）＝４の結果として、「ウ」の多孔質体では嵩密度が０．０５ｇ/ｃｍ3、真密度が１．２３ｇ/ｃｍ3、空孔率９６％（CV値は８％）であることが明らかになった。また、「ア」、「イ」ではそれぞれ空孔率が８７％（CV値は１０％）、９２％（CV値は７％）であることが分かった。
【０１３１】
[実施例５] リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２で得られた「ア」、「イ」、「ウ」のＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６μｍ〜１８０μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。  その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は２４時間、４８時間、５６時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１２０時間、２８８時間の９種類を実施した）を施して、試料を得た。以下、「ア」の５３〜１０６μｍを「１２％中」、「イ」の２５〜５３μｍを「７．５％小」、「イ」の５３〜１０６μｍを「７．５％中」、「イ」の１０６〜１８０μｍを「７．５％大」、「ウ」の５３〜１０６μｍを「４％中」と呼ぶ。
【０１３２】
[比較例２]リコンビナントペプチドのＧＡ（グルタルアルデヒド）架橋μブロックの作製
特許文献１に記載されているグルタルアルデヒドを使用する比較例として、基材としてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、不定形のＧＡ架橋μブロックを作製した。１０００ｍｇのＣＢＥ３を９４４８μＬの超純水に溶解し、１Ｎ  ＨＣｌを１５２μＬ添加後、終濃度１．０％となるように、２５％グルタルアルデヒドを４００μＬ添加し、５０℃で３時間反応させ、架橋ゲルを作製した。この架橋ゲルを、１Ｌの０．２Ｍグリシン溶液へ浸漬し、４０℃２時間振とうさせた。その後、架橋ゲルを、５Ｌの超純水中で１時間振とう洗浄、超純水を新しい物へ置換し、再び洗浄１時間、を繰り返し、計６回洗浄した。洗浄後の架橋ゲルを、−８０℃で５時間凍結させた後、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ、ＦＤＵ−１０００）で凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍのＣＢＥ３・ＧＡ架橋μブロックを得た。
【０１３３】
[比較例３] 比較用リコンビナントペプチドブロックの作製
比較例として、従来技術（特許文献１）から類推されるグルタルアルデヒドを含まない工程で作製した場合にできる比較用リコンビナントペプチドブロックを、以下に記載の通り作製した。基材としてリコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いてブロックを作製した。比較例１で得られた単純凍結多孔質体を、ニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍのＣＢＥ３ブロックを得た。それを１６０℃のオーブンに入れ、７２時間熱架橋した。
【０１３４】
[実施例６]リコンビナントペプチブロックのタップ密度測定
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。  タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
【０１３５】
その結果、比較例３のブロックは５２４ｍｇ/ｃｍ3であった。
一方、実施例５のブロックは「１２％中」が３７２ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％小」が２１３ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％中」が１８９ｍｇ/ｃｍ3、「７．５％大」が１６３ｍｇ/ｃｍ3、「４％中」が９８ｍｇ/ｃｍ3であった。実施例５のブロックでは、構造の複雑性に由来して、比較例３のブロックに対して、タップ密度は小さくなることが分かった。
【０１３６】
[実施例７] リコンビナントペプチドブロックの二次元断面画像における「面積の平方根÷周囲長」の算出
ブロックの複雑性を示す指標として、ブロックの「面積の平方根」と「周囲長」の関係を求めた。すなわち、ブロックの「面積の平方根÷周囲長」の値が小さい方がより複雑であると言える。この値は、画像解析ソフトを用いて算出した。まず、ブロックの形が分かる画像を用意した。具体的に、本実施例では、水で良く膨潤させたブロック群を、ミクロトームで凍結切片にし、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン））染色した標本を用いた。ブロック以外に細胞などが存在する場合は、photoshopで、自動選択ツールで製剤のみを抽出し、画像上にブロックのみとなるようにする。その画像を、Imagejを用いて、ブロックの面積と周囲長を求め、「面積の平方根÷周囲長」の値を算出した。ただし、１０μｍ以下のブロックは除いた。
【０１３７】
その結果、比較例３のブロックは０．１３９となった。
一方、実施例５のブロックは、「１２％中」が０．１１２、「７．５％小」が０．０８３、「７．５％中」が０．０８２、「７．５％大」が０．０７１、「４％中」が０．０６１であった。実施例５のブロックでは、構造の複雑性に由来して、比較例３のブロックに対して、「面積の平方根÷周囲長」の値は小さくなり、また、タップ密度と相関があることも分かった。
【０１３８】
[実施例８] リコンビナントペプチドブロックの架橋度測定
実施例５および比較例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルにサンプルを約１０ｍｇ、４％ＮａＨＣＯ3水溶液を１ｍＬ、１％のＴＮＢＳ水溶液を２ｍＬ添加し、３７℃で３時間振とうさせた。その後、１０ｍＬの３７％塩酸及び５ｍＬの純水を加えた後、３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。
【０１３９】
＜ブランク調整＞
ガラスバイアルにサンプルを約１０ｍｇ、４％ＮａＨＣＯ3水溶液を１ｍＬ、１％ＴＮＢＳ水溶液を２ｍＬ添加し、直後に３７％塩酸３ｍＬを加え、３７℃で３時間振とうさせた。その後、７ｍＬの３７％塩酸及び５ｍＬの純水を加えた後、３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
【０１４０】
純水で１０倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式１）、及び（式２）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。
【０１４１】
（式１）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式１）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）
【０１４２】
（式２）  １−（サンプル（式１）/未架橋リコンビナントペプチド（式１））×３４
（式２）は、１分子あたりの架橋数を示す。
【０１４３】
その結果、実施例５のブロックは、「１２％中」が４８時間架橋で架橋度１２、「７．５％小」と「７．５％中」と「７．５％大」は２４時間架橋で架橋度８、「４％中」が４８時間架橋で架橋度９であった。また、「７．５％中」で２８８時間架橋した場合は２２であった。一方、比較例３のブロックは７２時間架橋で１６であった。
【０１４４】
[実施例９] リコンビナントペプチドブロックの吸水率測定
実施例５および比較例３で作製したブロックの吸水率を算出した。
２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、ブロックを約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式３）に従って、吸水率を求めた。
【０１４５】
（式３）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
【０１４６】
その結果、実施例５のブロックは、「１２％中」が３０４％、「７．５％小」が８１９％、「７．５％中」が８９２％、「７．５％大」が８９２％、「４％中」が９０１％であった。一方、比較例３のブロックは２８０％であった。
【０１４７】
[実施例１０] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。
【０１４８】
[比較例４] 比較用リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例３で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ＣＢＥ３ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。
【０１４９】
[比較例５] リコンビナントペプチドGA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
比較用のグルタルアルデヒドを含むモザイク細胞塊を以下の通り作成した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、比較例２で作製したGA架橋μブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、GA架橋μブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。
【０１５０】
[実施例１１] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）
ヒト血管内皮前駆細胞（ｈＥＣＦＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ：ＥＧＭ−２＋ＥＣＦＣ  serum supplement）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、扁平状の、ＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例５で作製したＣＢＥ３ブロックを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊がある２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ程度の球状の、ｈＭＳＣとｈＥＣＦＣとＣＢＥ３ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。
【０１５１】
[実施例１２] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
実施例１０で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。
【０１５２】
[実施例１３] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣ）の融合
実施例１１で作製した２日目のモザイク細胞塊（本発明のＣＢＥ３ブロックを使用）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これは「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」のいずれも上記と同様に作成できた。
【０１５３】
[比較例６] 比較用リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
比較例４で作製した２日目のモザイク細胞塊（比較用のＣＢＥ３ブロック由来）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。
【０１５４】
[比較例７] リコンビナントペプチドＧＡ架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊（ｈＭＳＣ）の融合
比較例５で作製した２日目のモザイク細胞塊（ＧＡ架橋μブロック由来）５個をスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート中で並べ、２４時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。
【０１５５】
[実施例１４]  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＴＰ  アッセイ
各モザイク細胞塊中の細胞が産生・保持しているＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量を定量した。ＡＴＰは生物全般のエネルギー源として知られ、ＡＴＰ合成量・保持量を定量することで、細胞の代謝活性の状態、活動状態を知ることができる。測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。実施例１０および比較例４、比較例５で作製したモザイク細胞塊について、ともにＤａｙ７のもので、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて、各モザイク細胞塊中のＡＴＰ量を定量した。その結果、GA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊に比べ、比較用のＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊では、ATP量が少ない結果となった。一方、本発明のＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊は、GA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊よりもATP量が多いことが分かった。これは本発明のＣＢＥ３ブロックが、「１２％中」、「７．５％小」、「７．５％中」、「７．５％大」、「４％中」いずれの場合においても、同様に、GA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊よりも多くのＡＴＰを産生している結果となった（図１）。つまり、複雑な構造を持つ本発明のＣＢＥ３ブロックを用いたモザイク細胞塊の方が、内部の細胞の生存状態が良好であることが明らかになった。
【０１５６】
[実施例１５] リコンビナントペプチドブロックを用いた巨大モザイク細胞塊の作製
実施例１２のように１ｍｍのモザイク細胞塊を融合して、巨大なモザイク細胞塊を作製することは可能であるが、一度に巨大なモザイク細胞塊を作製できる方が、操作を簡便化できる。ここで、細胞の接着しない加工を施したスミロンセルタイトの９ｃｍシャーレに、を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）で１．５％アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ  Ｓ）溶液を５０ｍＬ入れた。その際、１ｃｍ四方の棒状にしたシリコンを５ｍｍ程度アガロース溶液中に浸るように固定し、アガロースが固まった後、シリコンを取り除き、アガロース中に１ｃｍ四方の窪みができた容器を作成した。そこに増殖培地を適量入れ、ゲルが乾かないように保存した。培地を取り除き、実施例５で作製したブロックの内、代表的な「７．５％中」１６ｍｇと、２５０万ｃｅｌｌｓのヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の懸濁物を窪みに入れ、その後静かに２５ｍＬの増殖培地を添加した。１日培養後、１ｃｍ四方、厚さ２−３ｍｍの巨大モザイク細胞塊を作製できた。これを、２５ｍＬの増殖培地を入れたスミロンセルタイトの９ｃｍシャーレに移し、さらに２日培養後、２５ｍＬの増殖培地を入れたスピナーフラスコに移して攪拌培養し、培養７日後のモザイク細胞塊の断面のＨＥ染色標本を作製した。その結果、培養７日後でも内部の細胞が生存していることを確認した。このように、細胞とブロックを混合し、型に流して培養することで、巨大なモザイク細胞塊を作製可能であることが明らかになった。また、この方法は、ＧＡ架橋μブロック、比較用ブロック及び本発明のブロックの何れでも可能であり、ブロックの種類に依存しない。
【０１５７】
[実施例１６]リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の移植
マウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤ（チャールズリバー）のオス、４〜６週齢のものを用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、上腹部の皮下に切れ込みを入れ、切れ込みからはさみを差し込み、皮膚を筋肉からはがした後、実施例１２、実施例１３、比較例６、及び比較例７で作成したモザイク細胞塊をピンセットですくい、切れ込みから１．５ｃｍほど下腹部寄りの皮下に移植し、皮膚の切れ込み部を縫合した。
【０１５８】
[実施例１７] リコンビナントペプチドブロックを用いたモザイク細胞塊の採取
解剖は移植から１週後及び２週後に行った。腹部の皮膚をはがし、モザイク細胞塊が付着した皮膚を、約１平方ｃｍの正方形の大きさに切り取った。モザイク細胞塊が腹部の筋肉にも付着している場合は、筋肉と共に採取した。
【０１５９】
[実施例１８] 標本解析
モザイク細胞塊が付着した皮膚片および、移植前のモザイク細胞塊について組織切片を作製した。皮膚を４％パラホルムアルデヒドに浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った。
【０１６０】
実施例１２の「７．５％中」、比較例６および比較例７を移植した２週間後のＨＥ標本を図２に示す。図２に記載の生存率は、全細胞数（生細胞数＋死細胞数）中の生細胞数の割合を示す。
比較例７のGA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊（図２のＡ：生細胞数１００個：生存率８０％）に比べ、比較例６のブロックを用いたモザイク細胞塊（図２のＢ：生細胞数３７個：生存率４５％）では、生細胞が少ないことが分かる。一方、実施例１２の本発明のブロック（「７．５％中」）を用いたモザイク細胞塊（図２のＣ：生細胞数１１６個：生存率８４％）は、比較例６のブロックを用いたモザイク細胞塊（図２のＢ：生細胞数３７個：生存率４５％）に比べて、生細胞が多く、生存が良好であることが分かった。この結果は、実施例１４でのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果とも一致し、本発明のブロックを採用することによって、移植した細胞の生存を良くすることが可能であることが分かった。
【０１６１】
また、本発明のブロック群内間での移植細胞の生存状態を図３に示す。図３に記載の生存率は、全細胞数（生細胞数＋死細胞数）中の生細胞数の割合を示す。
１０６〜１８０μｍサイズの「７．５％大」の生存率は５７％であり、「７．５％小」の生存率は６２％であり、「７．５％中」の生存率は８４％であり、「４％中」の生存率は８２％であった。即ち、本発明のブロック群内間では、１０６〜１８０μｍサイズの「７．５％大」よりも、「７．５％小」、「７．５％中」、「４％中」が更に細胞の生存が良くなることが分かった（図３）。また、最上の移植結果をもたらすものとしては、「７．５％中」と「４％中」が、「７．５％小」よりも、移植細胞の生存が良いことも分かった（図３）。即ち、高分子ブロックのタップ密度又は高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が所定の範囲内となるような構造を有することが重要であり、中でも、「５３〜１０６μｍ」＞「２５〜５３μｍ」＞「１０６〜１８０μｍ」という順で移植後の細胞生存が良くなることも分かった。
【０１６２】
また、この５３〜１０６μｍの大きさの本発明のブロックを用いた実施例１２のモザイク細胞塊を移植した場合における移植２週間後のＨＥ標本を図４に示す。また、図４中の血管数を計測した結果、６３本／ｍｍ2であった。図４に示す通り、モザイク細胞塊内部に血管が誘引されていることも分かった。
【０１６３】
さらに、実施例１３の内、代表的な「７．５％中」を用いた物について、血管系の細胞を入れたモザイク細胞塊を移植した場合における移植２週間後のＨＥ標本を図５に示す。図５中の血管数を計測した結果、１８０本／ｍｍ2であった。実施例１２を移植した場合に比べ、図５に示す通り、実施例１３の血管系の細胞を入れたモザイク細胞塊を移植した場合には、モザイク細胞塊内部により多くの血管が形成されていることが明らかになった。
【０１６４】
[実施例１９]  ｈＭＳＣ＋ｈＥＣＦＣモザイク細胞塊中のＥＣＦＣの割合と濃度の算出
実施例１１の内、代表的な「７．５％中」を用いたモザイク細胞塊は、切片をｈＥＣＦＣ染色用にＣＤ３１抗体（EPT  Anti CD31/PECAM-1）にＤＡＢ発色を用いたキット（ダコLSAB2キット  ユニバーサル K0673  ダコLSAB2キット/HRP(DAB) ウサギ・マウス一次抗体両用）による免疫染色を行った。画像処理ソフトＩｍａｇｅＪ、ＣＤ３１抗体による染色方法を使用し、中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の面積の割合を求めた。なお、ここでいう「中心部」とは前記定義したものである。
その結果、実施例１１の代表的な「７．５％中」モザイク細胞塊の中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の面積の割合は９９％であった。
【０１６５】
さらに実施例１１の代表的な「７．５％中」モザイク細胞塊について、上記のＣＤ３１抗体による染色と、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を重ね合わせることで、中心部に存在するｈＥＣＦＣの細胞密度を算出した。中心部の血管系の細胞密度は、実際に薄切標本の細胞数を数え、細胞数を体積で割って求めることができる。まず、Photoshopを用いて、上記２枚の画像を重ね合わせ、ＣＤ３１抗体による染色と重なったＨＥ染色の細胞核の数をカウントして細胞数を算出した。一方、体積は、ＩｍａｇｅＪを用いて中心部の面積を求め、その薄切標本の厚みの２μｍをかけることで求められた。
その結果、実施例１１の代表的な「７．５％中」モザイク細胞塊の中心部のｈＥＣＦＣ（血管系の細胞）の細胞数は2.58×10-4cells/μm3であった。
【０１６６】
[実施例２０] リコンビナントペプチド多孔質体（高分子多孔質体）の作製
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
【０１６７】
ＣＢＥ３を最終濃度７．５質量％としてリコンビナントペプチド水溶液を調製し、このリコンビナントペプチド水溶液を円筒形容器に流し込んだ。冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からリコンビナントペプチド水溶液を冷却した。この際、冷却棚板の温度、及び棚板と円筒形容器の間に挟む断熱板（硝子板）の厚さ、入れるリコンビナントペプチド水溶液量を変えることにより、液温の冷却過程を変えた。棚板温度は−４０℃と−６０℃と−８０℃、硝子板は０．７ｍｍと１．１ｍｍと２．２ｍｍ、リコンビナントペプチド水溶液量は４ｍＬと１２ｍＬと１６ｍＬ、それらの組合せを実施した。
【０１６８】
また、それぞれの水溶液は、底面から冷却される為、円中心部の水表面温度が最も冷却されにくい。従って、その部分が、溶液内で最も温度の高い液温となるため、その部分の液温を測定した（以後、当該部分の液温のことを内部最高液温と呼称する）。
【０１６９】
その結果、棚板温度−４０℃で硝子板２．２ｍｍの場合には、内部最高液温が−９．２℃となるまで、温度上昇が始まらず、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下の液温をとった状態である（図８）。この状態を経た後、−９．２℃で温度上昇がはじまり、凝固熱が発生したことがわかる（図８）。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている（図８）。測定している温度は氷内部の固体温度となる。つまり液温ではなくなる。  このように、凝固熱が発生する瞬間の内部最高液温を見れば、内部最高液温が未凍結状態で「溶媒融点−３℃」を経た後に凍結したかどうかが分かる。
【０１７０】
この凝固熱が発生する瞬間の未凍結状態での内部最高液温を組合せの６種類について、測定すると、以下のようになった。
Ａ  棚板温度-４０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量４ｍＬは、−９．２℃
Ｂ  棚板温度-４０℃で硝子板１．１ｍｍ、液量４ｍＬは、−８．３℃
Ｃ  棚板温度-４０℃で硝子板０．７ｍｍ、液量４ｍＬは、−２．２℃
Ｄ  棚板温度-６０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量４ｍＬは、−７．２℃
尚、ここでいうＤが実施例２でいうところの「イ」である。
Ｅ  棚板温度-８０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量４ｍＬは、−３．９℃
Ｆ  棚板温度-８０℃で硝子板１．１ｍｍ、液量４ｍＬは、−３．１℃
Ｇ  棚板温度-８０℃で硝子板０．７ｍｍ、液量４ｍＬは、  ５．８℃
Ｈ  棚板温度-４０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量１２ｍＬは、−６．５℃
Ｉ  棚板温度-４０℃で硝子板２．２ｍｍ、液量１６ｍＬは、−２．４℃
【０１７１】
このことから、Ａ,Ｂ,Ｄ,Ｅ,Ｆ,Ｈが、未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−３℃」以下の液温をとる凍結工程による製造法である。（内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」の凍結リコンビナントペプチドブロック）
また、Ｃ,Ｇ,Ｉが未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−３℃」以下の液温をとらない凍結工程による製造法である。（内部最高液温＞「溶媒融点−３℃」の凍結リコンビナントペプチドブロック）
【０１７２】
このようにして得た凍結リコンビナントペプチドブロックを凍結乾燥して、ＣＢＥ３多孔質体を得た。Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ由来を『内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」のＣＢＥ３多孔質体』、Ｃ，Ｇ，Ｉ由来を『内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」のＣＢＥ３多孔質体』と呼ぶ。
【０１７３】
［実施例２１］
実施例２０で得られたＣＢＥ３多孔質体について、多孔質の空孔サイズと空孔形状の評価を実施した。得られた多孔質体を１６０℃、２０時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン））染色標本を作製した。
得られた標本の中心部分の画像を図７（内部最高液温＞「溶媒融点−３℃」、と、内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」）に示した。その結果、内部最高液温＞「溶媒融点−３℃」（Ｃ，Ｇ，Ｉ）では、空孔は８０％以上が柱／平板孔となり、球孔は２０％以下であった。一方、内部最高液温≦「溶媒融点−３℃」（Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ）では、空孔は５０％以上が球孔となっていた。また、この内部最高液温≦「溶媒融点−７℃」（Ａ，Ｂ，Ｄ）では、空孔は８０％以上が球孔となっており、ほぼ全てが球孔で構成されていた。これにより、多孔質体の空孔形状を球孔にするには、未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−３℃」以下となることが重要で、更に「溶媒融点−７℃」以下とすることで、空孔の形状をほぼ全て球孔にすることができることが分かった。
【０１７４】
Ａ〜Ｉについての空孔形状及び平均ポアサイズは、以下の通りである。
Ａ：球孔１００％、６２．７４μｍ
Ｂ：球孔１００％、６５．３６μｍ
Ｃ：柱／平板孔９０％、７９．１９μｍ
Ｄ：球孔１００％、６３．１７μｍ
Ｅ：球孔７０％、６９．４４μｍ
Ｆ：球孔５０％、５３．９８μｍ
Ｇ：柱／平板孔９０％、７９．４８μｍ
Ｈ：球孔８０％、７６．５８μｍ
Ｉ：柱／平板孔９０％、７９．６５μｍ
【０１７５】
［実施例２２］  リコンビナントペプチドブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２１で得られたＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ及び５３〜１０６μｍのリコンビナントペプチドブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で７２時間、熱架橋を施して、試料を得た。これらの試料は、タップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であること、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下であることを充足するものであった。これらの試料を使用して実施例１０及び実施例１２と同じようにして作製したモザイク細胞塊ではＡ〜Ｉによらず、実施例１４と同じｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、並びに実施例１６〜１８と同じ評価による動物への移植結果において、いずれも、比較用ブロックよりも高い性能（細胞の高い生存率）を示した。ただ、これらのＡ〜Ｉの中で性能差を見ると僅かな差が生じており、Ａ、Ｂ、Ｄが最も性能が高く、ついでＥ、Ｆ、Ｈ、その後にＣ、Ｇ、Ｉがくるという順番になっていた。つまり、これは多孔質体の空孔形状によって、性能差を生じうることを示している。実施例１８では、代表的な結果としてＤ（実施例２でいうところの「イ」）について詳細に記述している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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