(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中に存在する分析対象物の存在を決定する方法であって、
ａ）該液体サンプルを、既定量の分析対象物の類縁体および第一の結合部位と接触させること、
ここで、類縁体は、それが１つのみの結合領域を包含するように、第二の結合部位により結合され得るアミノ酸からなる該結合領域を含んでインビトロで組み換え的に発現されるか、または合成されるアミノ酸配列を含み、
該結合領域は、分析対象物中に存在しないか、または存在するが、第二の結合部位にアクセス不可能であり、そして
第一の結合部位は、混合物が、類縁体−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または分析対象物がサンプル中に存在するとき、（ｉ）類縁体−第一結合部位複合体および分析対象物−第一結合部位複合体、または（ｉｉ）分析対象物−第一結合部位複合体を含み、かつ類縁体−第一結合部位複合体を含まないで形成されるように、分析対象物および類縁体のそれぞれに独立して結合可能であり；
ｂ）該混合物を第二の結合部位と接触させること、
ここで、第二の結合部位は、類縁体−第一結合部位複合体に結合できるが、分析対象物−第一結合部位複合体には結合できない抗体であり、そして固相に固定化されているか、または固定化可能であり；
ｃ）第二の結合部分に結合した類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルレベルを決定すること；
ここで、工程ｃ）で決定されたシグナルレベルが、分析対象物が存在しないときに決定された最大シグナルレベルより低いとき、分析対象物がサンプル中に存在する、
を含む、方法。
【請求項２】
液体サンプル中に存在する分析対象物の存在を決定する方法であって、
ａ）該液体サンプルを、既定量の分析対象物の類縁体および第一の結合部位と接触させること、
ここで、類縁体は、それが１つのみの結合領域を包含するように、第二の結合部位により結合され得るアミノ酸からなる該結合領域を含んでインビトロで組み換え的に発現されるか、または合成されるアミノ酸配列を含み、
該結合領域は、分析対象物中に存在しないか、または存在するが、第二の結合部位にアクセス不可能であり、そして
第一の結合部位は、混合物が、類縁体−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または分析対象物がサンプル中に存在するとき、（ｉ）類縁体−第一結合部位複合体および分析対象物−第一結合部位複合体、または（ｉｉ）分析対象物−第一結合部位複合体を含み、かつ類縁体−第一結合部位複合体を含まないで形成されるように、分析対象物および類縁体のそれぞれに独立して結合可能であるが、分析対象物および類縁体の両方に同時には結合不可能であり；
ｂ）該混合物を第二の結合部位と接触させること、
ここで、第二の結合部位は、類縁体−第一結合部位複合体に結合できるが、分析対象物−第一結合部位複合体には結合できない抗体であり、そして固相に固定化されているか、または固定化可能であり；
ｃ）第二の結合部分に結合した類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルレベルを決定すること；
ここで、工程ｃ）で決定されたシグナルレベルが、分析対象物が存在しないときに決定された最大シグナルレベルより低いとき、分析対象物がサンプル中に存在する、
を含む、方法。
【請求項３】
サンプルを、類縁体と接触させる前に、第一の結合部位と接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）で決定されたシグナルレベルをキャリブレーションデータと比較することにより、サンプル中に存在する分析対象物の量または濃度を決定する工程をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
分析対象物がhCGまたはそのフラグメントもしくは一部である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
シグナルが、第一の結合部位に直接的または間接的に結合されている標識に由来する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
標識が、酵素、フルオロフォア、放射性核種、コロイド状ゾル、発色団および発光化合物からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
類縁体が、該分析対象物の完全な配列または一部の配列のいずれかと同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第一の結合部位が抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第一の結合部位がＦａｂまたはＦ（ａｂ）２である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第一の結合部位が、hCGに特異的に結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第一の結合部位が、hCG β３−ループ−特異的モノクローナル抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが、血液、血清、血漿、間質液、唾液、痰、接眼レンズ液、汗、尿、乳汁、腹水液、粘液、滑膜液、腹膜液、経皮滲出液、咽頭滲出液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引液（tracheal aspiration)、脳脊髄液、精液、子宮頸管粘液、膣もしくは尿道分泌物または羊水を含む生理的供給源に由来するか、またはそれから構成される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）分析対象物類縁体；
ｉｉ）（ａ）標識された第一の結合部位、または（ｂ）標識されていない第一の結合部位および標識された第三の結合部位、のいずれか；および
ｉｉｉ）固定化可能な第二の結合部位
を含む、目的の分析対象物を検出するためのテストキットであって、
ここで、類縁体は、それが１つのみの結合領域を包含するように、第二の結合部位により結合され得るアミノ酸からなる該結合領域を含んでインビトロで組み換え的に発現されるか、または合成されるアミノ酸配列を含み、
該結合領域は、分析対象物中に存在しないか、または存在するが、第二の結合部位にアクセス不可能であり、そして
第一の結合部位が、類縁体および目的の分析対象物のそれぞれに独立して結合可能であり、第二の結合部位が、類縁体および第一の結合部位の複合体に結合できるが、分析対象物または第一の結合部位および分析対象物の複合体に結合できない抗体であり、そして第三の結合部位が、第一の結合部位または類縁体−第一結合部位複合体に結合可能である、
テストキット。
【請求項１５】
ｉ）分析対象物類縁体；
ｉｉ）（ａ）標識された第一の結合部位、または（ｂ）標識されていない第一の結合部位および標識された第三の結合部位、のいずれか；および
ｉｉｉ）固定化可能な第二の結合部位
を含む、目的の分析対象物を検出するためのテストキットであって、
ここで、類縁体は、それが１つのみの結合領域を包含するように、第二の結合部位により結合され得るアミノ酸からなる該結合領域を含んでインビトロで組み換え的に発現されるか、または合成されるアミノ酸配列を含み、
該結合領域は、分析対象物中に存在しないか、または存在するが、第二の結合部位にアクセス不可能であり、そして
第一の結合部位が、類縁体および目的の分析対象物のそれぞれに独立して結合できるが、類縁体および分析対象物の両方に同時には結合できず、第二の結合部位が、類縁体および第一の結合部位の複合体に結合できるが、分析対象物または第一の結合部位および分析対象物の複合体に結合できない抗体であり、そして第三の結合部位が、第一の結合部位または類縁体−第一結合部位複合体に結合可能である、
テストキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体サンプル中の分析対象物(analyte)の存在を決定するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
液体サンプル中の分析対象物の存在を決定するためのイムノアッセイ法はよく知られている。イムノアッセイ法の一般的な方法はサンドイッチイムノアッセイ法である。かかるアッセイ法において、サンプルを捕捉抗体でコーティングされたテストプレートに添加する。サンプル中に存在する分析対象物は捕捉抗体と結合し、プレート上に保持される。プレートを洗浄して、結合していない分析対象物を除去し、その後、捕捉抗体に結合されている分析対象物に結合する検出抗体を加え、それにより２つの抗体間の分析対象物のサンドイッチが形成される。分析対象物サンドイッチは、検出抗体に結合された標識によって、または検出抗体に結合する標識された抗体をさらに添加することによって、検出することができる。検出された標識の量は、サンプル中の分析対象物の濃度に正比例する。
【０００３】
別のアプローチは、競合的阻害アッセイである。上記と同様に、捕捉抗体をテストプレート上に提供する。サンプルおよび標識された目的の分析対象物をテストプレートに添加する。標識された分析対象物は、捕捉抗体への結合に関して、サンプル中に存在する分析対象物と競合する。プレートを洗浄し、捕捉された標識分析対象物の存在量を決定する。一般的に、検出される標識された分析対象物の量は、サンプル中の分析対象物の濃度に反比例する。
【０００４】
公知のアッセイには、多くの問題がある。例えば、特定のアッセイ法では、立体障害が抗体と分析対象物との免疫複合体の形成を損なうことがあり、例えば、かかる相互作用が表面上で生じるとき、それを制限し得る。
【発明の概要】
【０００５】
一面において、本発明は、液体サンプル中に存在する分析対象物の存在を決定する方法を提供する。本発明は、液体サンプル中に存在する分析対象物の存在を決定する方法であって、
ａ）該液体サンプルを、既定量の分析対象物の類縁体(analogue)および過剰量の第一の結合部位と接触させること、ここで、第一の結合部位は、混合物が、類縁体−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または分析対象物がサンプル中に存在するとき、（ｉ）類縁体−第一結合部位複合体および分析対象物−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または（ｉｉ）分析対象物−第一結合部位複合体を含み、かつ類縁体−第一結合部位複合体を含まないで形成されるように、分析対象物および類縁体のそれぞれに独立して結合可能であり；
ｂ）該混合物を第二の結合部位と接触させること、ここで、第二の結合部位は、類縁体−第一結合部位複合体に結合できるが、分析対象物−第一結合部位複合体には結合できず、そして固相に固定化されているか、または固定化可能であり；
ｃ）第二の結合部分に結合した類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルレベルを決定すること；
ここで、工程ｃ）で決定されたシグナルレベルが、分析対象物が存在しないときに決定された最大シグナルレベルより低いとき、分析対象物がサンプル中に存在する、
を含む、方法を提供する。
【０００６】
上記の工程（ａ）において、第一の結合部位は、類縁体と分析対象物の両方に同時に結合することができる。
【０００７】
本発明はさらに、液体サンプル中に存在する分析対象物の存在を決定する方法であって、
ａ）該液体サンプルを、既定量の分析対象物の類縁体および過剰量の第一の結合部位と接触させること、ここで、第一の結合部位は、混合物が、類縁体−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または分析対象物がサンプル中に存在するとき、（ｉ）類縁体−第一結合部位複合体および分析対象物−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または（ｉｉ）分析対象物−第一結合部位複合体を含み、かつ類縁体−第一結合部位複合体を含まないで形成されるように、分析対象物および類縁体のそれぞれに独立して結合可能であるが、分析対象物および類縁体の両方に同時には結合不可能であり；
ｂ）該混合物を第二の結合部位と接触させること、ここで、第二の結合部位は、類縁体−第一結合部位複合体に結合できるが、分析対象物−第一結合部位複合体には結合できず、そして固相に固定化されているか、または固定化可能であり；
ｃ）第二の結合部分に結合した類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルレベルを決定すること；
ここで、工程ｃ）で決定されたシグナルレベルが、分析対象物が存在しないときに決定された最大シグナルレベルより低いとき、分析対象物がサンプル中に存在する、
を含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明は、従来のアッセイ法よりも多くの利点を提供し、それには、従来のアッセイ法と比較してより少ない洗浄工程を伴う、溶液相中での第一の抗体−標的複合体の形成；溶液相中での競合的イムノアッセイ法の実行、その後の、表面への捕捉、および遊離標識からの結合標識の分離が含まれる。本発明の方法は、液体サンプル中の分析対象物の存在を公知の方法、例えば、ＲＩＡアッセイおよび／またはImmuliteアッセイよりも迅速に決定することができる。好ましくは、本発明の方法は、液体サンプル中の分析対象物の存在を２４時間未満、１２時間未満または４時間未満で決定することができる。
【０００９】
一旦、液体サンプルを類縁体および第一の結合部位と接触させると、該類縁体、第一の結合部位および、存在する場合には分析対象物は、ブラウン運動の周知の原理に従って溶液中に自由に拡散し、互いに相互作用し合う。サンプル中に分析対象物が存在しない場合、第一の結合部位は類縁体のみに結合することができ、類縁体−第一結合部位複合体を含む混合物が形成される。この混合物を第二の結合部位と接触させる。第二の結合部位は、類縁体に結合し(それが第一の結合部位との複合体であっても)、それ故に、類縁体−第一結合部位複合体は、好ましくは過剰量で提供される第二の結合部位に捕捉される。第二の結合部位は、例えば、マイクロタイタープレートのウェルのような表面上に固定化されていてよい。あるいは、第二の結合部位は、類縁体−第一結合部位複合体を結合する前または後のいずれかで表面上に固定化されるように、例えば固定化された結合部分の手段のように、固定化可能であり得る。この場合、本方法は、表面上に第二の結合部位を固定するために、第二の結合部位と表面を接触させるさらなる工程を含んでいてよい。第二の結合部位によって捕捉されていない第一の結合部位は、工程（ｃ）が行われる前に捕捉された類縁体−第一結合部位複合体から分離され得る。これにより、第二の結合部位により捕捉されなかった第一の結合部位の検出を避ける。任意の好適な分離法、例えば、緩衝液での洗浄、空気での洗浄、磁気分離、濾過またはイムノクロマトグラフィーを用いることができる。その後、捕捉された類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルのレベルが決定される
【００１０】
シグナルは、好ましくは、第一の結合部位に直接的または間接的に連結または結合される、ある標識に（直接的または間接的に）由来する。シグナルがどのように形成され、標識がどのように第一の結合部位に結合するかに関係なく、シグナルレベルは、第二の結合部位に捕捉された類縁体−第一の結合部位の量に比例し得る。
【００１１】
第一の結合部分は、それ自体が標識を含んでいてよい。あるいは、第一の結合部分は、標識を含まなくてもよく、本方法はさらに、第一の結合部分と第三の結合部分とを接触させることを含んでいてよく、ここで、第三の結合部分が第一の結合部分を（直接的または間接的に）結合し、標識を含む。従って、このような態様において、標識された第三の結合部分は、捕捉された類縁体−第一の結合部分複合体の存在を示すシグナルを提供する。第三の結合部分は、シグナルレベルが決定される前に、該方法の何れかの段階で第一の結合部分と接触させてもよい。例えば、第三の結合部分は、液体サンプルを第一の結合部分と接触させる前に、またはこの工程の後であるが、混合物を第二の結合部分と接触させる前に、または混合物を第二の結合部分と接触させた後であるが、シグナルレベルの決定前に、第一の結合部位と接触させてもよい。第三の結合部分は、第一の結合部分が類縁体と複合体を形成しており、該複合体が、第二の結合部分によって捕捉されているとき、第一の結合部分と接触させてもよい。１個またはそれ以上の中間結合部分は、第一の結合部分に第三の結合部分または標識を結合するために使用され得る。シグナルは、標識により直接的または間接的に生成され得る。例えば、標識は、試薬と反応してシグナルの生成をもたらし得る。この場合、本方法はさらに、シグナルを生成するのに好適な試薬を添加する工程を含んでいてよい。好適な標識を以下に詳述する。
【００１２】
サンプル中に分析対象物が存在しないときに検出されるシグナルレベルは、本試験の最大シグナルである。これは、第一の結合部位に結合するのに類縁体と競合する分析対象物が存在せず、それ故に、最大量の類縁体−第一結合部位複合体が形成され、第二の結合部位により捕捉されるからである。このように、最大シグナルは、分析対象物を包含することが知られていないサンプルに対して本発明の方法を実施することにより得られ得る。この最大シグナルは、分析対象物含量が未知のサンプルに対して同じ条件下(例えば、第一の結合部位、類縁体および第二の結合部位の濃度)で行った試験と、分析対象物が存在するかどうか、およびどの程度存在するかを決定するために、比較することができる。
【００１３】
第一の結合部位は、分析対象物および類縁体のそれぞれに独立して結合することができるが、好ましくは、分析対象物および類縁体の両方と同時には結合しない。好ましくは、分析対象物に対する第一の結合部位の親和性は、類縁体に対する第一の結合部位の親和性と実質的に同じである。サンプルおよび類縁体を、第一の結合部位と同時に接触させ得る。この場合、分析対象物がサンプル中に存在するとき、第一の結合部位に対する結合への類縁体と分析対象物との直接的な競合がある。あるいは、サンプルを、第一の結合部位と接触させ、その後該サンプルまたは第一の結合部位を類縁体と接触させてもよい。この場合、分析対象物がサンプル中に存在するとき、それは、利用可能な第一の結合部位の一部に結合する。その後、類縁体は、分析対象物によって占有されていない第一の結合部位にのみ結合し得る(実際に、第一の結合部位は分析対象物によって占有されていない)。両態様において、分析対象物は、第一の結合部位への結合に類縁体と競合すると言われ、分析対象物−第一結合部位複合体は、サンプル中の分析対象物の濃度に比例する量で形成される。その結果、分析対象物がサンプル中に存在しないときよりも、少ない類縁体−第一結合部位複合体が形成される。分析対象物が非常に高濃度で存在する場合、それは、第一の結合部位に結合するのに類縁体より完全に競合優位であり、類縁体−第一の結合部位は形成されない。従って、混合物は、(i)類縁体−第一結合部位複合体および分析対象物−第一結合部位複合体、または(ii)分析対象物−第一結合部位複合体のみ、のいずれかを含んで形成される。
【００１４】
該混合物を、第二の結合部位 (表面上に固定化されていても、固定化されていなくてもよい)と接触させる。分析対象物がサンプル中に存在しない場合よりも混合物中に存在する類縁体−第一結合部位複合体が少ない(または、類縁体−第一結合部位複合体が全くない)ため、第二の結合部位によって捕捉される類縁体−第一結合部位複合体の量もまた、分析対象物がサンプル中に存在しない場合に捕捉される量よりも少ない。第二の結合部位は、分析対象物−第一結合部位複合体に結合しないため、この複合体は、第二の結合部位によって捕捉されない。第二の結合部位は分析対象物に対する結合親和性を有しない。このことは、第二の結合部位のみが類縁体に対する結合親和性を有するため、第二の結合部位の最大量を、類縁体−第一結合部位複合体を捕捉するために利用可能であることを意味する。
【００１５】
第二の結合部位を該混合物と接触させた後、第二の結合部位に結合した類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルレベルを、上記の通りに決定する。第二の結合部位は、それが類縁体−第一結合部位複合体に結合するとき表面上に固定化されていない場合、本方法は、好ましくは、シグナルレベルを決定する前に、第二の結合部位をそれが固定化される表面と接触させる工程を含む。
【００１６】
分析対象物がサンプル中に存在するとき、形成され、かつ第二の結合部位によって捕捉される類縁体−第一結合部位複合体が少ないため、工程（ｃ）で決定されたシグナルレベルは、サンプル中に分析対象物が存在しない時に決定されたシグナルレベルよりも低いであろう。言い換えると、検出されるシグナルは、サンプル中の分析対象物の濃度に反比例する。
【００１７】
本発明の方法は、サンプル中に存在する分析対象物の量または濃度を決定するために使用することもできる。これを達成するために、工程（ｃ）で決定されたシグナルレベルを、一般に、キャリブレーションデータと比較する。キャリブレーションデータは、対照（コントロール）を分析することにより得られ、そこでは、一連の既知の分析対象物濃度について得られるシグナルレベルが測定される。類縁体、第一の結合部位および第二の結合部位の濃度は、試験する各分析対象物濃度について一定に保たれるべきである。同様に、試験に用いたこれらの各々の濃度も、試験結果が比較されるべきキャリブレーションデータを作成するために使用される濃度と同じであるべきである。従って、本発明の方法は、工程（ｃ）で決定されたシグナルレベルをキャリブレーションデータと比較することにより、サンプル中に存在する分析対象物の量または濃度を決定することを含み得る。
【００１８】
検出されたシグナルレベルは、分析対象物の濃度に反比例するため、シグナルレベルが高いほど、サンプル中の分析対象物の濃度は低く、逆に、シグナルレベルが低いほど、サンプル中の分析対象物の濃度は高い。この反比例関係は、分析対象物が非常に低レベルで存在する場合に特に有用である。なぜなら、そのような状況において検出されるシグナルレベルが高いため、シグナルレベルが分析対象物の濃度に比例する(従って、分析対象物が低濃度で存在するとき、非常に低いシグナルが生成される)場合、常套のアッセイ法よりも検出が容易だからである。従って、本発明の方法は、低レベルの分析対象物に対して高感度であるという利点を有する。
【００１９】
分析対象物は、本発明の第一の結合部位によって結合され得る任意の物質（entity）であり得る。例えば、分析対象物は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、炭水化物、病原体、ホルモン、ビタミン、ステロイド、薬物(例えば、薬物濫用者または病院到着時死亡者の薬物)、感染性因子もしくは感染状態を示唆する物質、微生物、細菌、ウイルス、毒素、有機化合物、汚染物質、農薬、疾患バイオマーカー、妊娠のバイオマーカーまたは上記の何れかの代謝産物もしくはそれらに対する抗体であるか、またはそれらを含んでいてよい。用語“分析対象物”にはまた、抗原性物質、ハプテン、抗体、巨大分子、およびそれらの組み合わせが含まれる。好ましくは、分析対象物は、抗体により認識されるエピトープを含む。一態様において、分析対象物は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)またはそのフラグメントもしくは一部であり、無傷の二量体hCG、遊離αサブユニット、遊離βサブユニット、ならびに無傷の二量体hCG、遊離αサブユニット、遊離βサブユニットのクリップされた形態、切断された形態または短縮型形態（グリコシル化変異体を含む、特に遊離βコアを含み得る）を含む。
【００２０】
ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)は、妊娠および腫瘍学において重要なバイオマーカーであり、通常、特定のイムノアッセイにより検出され、定量化されている。妊娠中に必須であり、受精から数日以内に検出可能なhCGは、最も高頻度にアッセイされるホルモンの１つとなっており、簡易な１工程の抗体ベースのhCG測定法は、現在、標準的な妊娠検査法である。さらに、悪性絨毛性疾患(絨毛癌)の診断および管理におけるhCGアッセイ法の役割は、腫瘍分野における重大なサクセスストーリーの１部である。それは、理想的な腫瘍マーカーであり、絨毛癌細胞が存在する場合に常に存在し、そしてその細胞数に量的に直接関連する。適切な治療との組み合わせでのhCGアッセイの正しい使用方法は、この他の進行性の癌において生存率を１００％に近づけている(Gregor, CR et al., J 2011, 'Antibody Recognition of a Human Chorionic Gonadotropin Epitope (hCG beta66−80) Depends on Local Structure Retained in the Free Peptide', Journal of Biological Chemistry, vol 286, no. 28, pp. 25016−25026)。
【００２１】
分析対象物の類縁体は、第一の結合部位が、好ましくは実質的に等しい親和性で、類縁体および分析対象物の両方に結合できるという点で、分析対象物に関係する。従って、類縁体および分析対象物は、構造、配列、化学的または免疫学的類似性を有してもよく、結合エピトープを含んでもよい。例えば、分析対象物がアミノ酸または核酸配列を含むとき、類縁体は、分析対象物の配列と配列同一性を有し得る。ある態様において、類縁体は、完全な分析対象物配列または分析対象物配列の一部の何れかと同一である配列を含む。他の態様において、類縁体は、完全な分析対象物配列または分析対象物配列の一部と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列を含む。類縁体配列の一部と同一である分析対象物配列の一部は、約５から約１０００残基長であってよい。例えば、該部分は、約５から約１０残基長、約１０から約１５残基長、約１５から約２０残基長、約２０から約３０残基長、約３０から約５０残基長、約５０から約７０残基長、約７０から約１００残基長、約１００から約１５０残基長、約１５０から約２５０残基長、約２５０から約５００残基長、約５００から約７５０残基長、または約７５０から約１０００残基長であってよい。
【００２２】
類縁体−第一結合部位複合体は、第二の結合部位によって結合され得る。好ましくは、類縁体自体は、第二の結合部位によって結合され得る。しかしながら、第二の結合部位は、類縁体および第一の結合部位の複合体にのみ結合することができる。これとは対照的に、第二の結合部位は、分析対象物−第一結合部位複合体には結合できない。従って、類縁体は、分析対象物中に存在しないか、または存在するが、第二の結合部位によって結合され得ない、第二の結合部位に対する結合領域を含んでいてよく、例えば、それは、第二の結合部位にアクセスできない分析対象物中の位置にある。そのような結合領域は、例えば、類縁体がアミノ酸配列または核酸配列のみで構成されるとき、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を含んでいてよい。類縁体がアミノ酸配列を含むとき、第二の結合部位によって認識される結合領域は、類縁体のアミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端または任意の他の位置であってよい。類縁体が核酸配列を含むとき、第二の結合部位によって認識される結合領域は、類縁体の核酸配列の５’末端、３’末端または任意の他の位置であってよい。
【００２３】
類縁体がアミノ酸配列を含むとき、それは、好ましくは、第二の結合部位によって結合され得て、分析対象物中に存在しないか、または分析対象物中に存在するが、第二の結合部位にアクセスできない、アミノ酸配列(結合領域)を含むように組換え的に発現される。あるいは、類縁体は、標準的なペプチド合成技術を用いて合成することができる。第二の結合部位によって認識されるアミノ酸結合領域を含むように、類縁体を組換え的に発現するか、またはデノボで合成する利点は、これらの結合領域の１つのみを各類縁体分子に組み込むことができることである。第二の結合部位によって認識される結合領域が、類縁体が合成された後に該類縁体に付加されているとき、複数の結合領域が類縁体に組み込まれる可能性がある。類縁体における複数の結合領域の存在は、本発明の方法を破壊または阻害し得る。例えば、複数の結合領域は、第一の結合部位を結合するのに分析対象物と類縁体をとの競合を避けるか、または第一の結合部位と複合体を形成しているとき、第二の結合部位に類縁体が結合するのを阻止し得る。
【００２４】
Ｎ末端配列またはＣ末端配列は、一般にタグと称されるタイプのものであってよい。非限定的な例としては、一般的に、親和性タグ、可溶性タグ、クロマトグラフィー用タグおよびエピトープタグが挙げられる。特定のタグの非限定例としては、FLAG−tag、MYC−tag、HA−tag、GST−tag、Strep−tagおよびポリヒスチジンタグが挙げられる。当業者は、多くの他の一般的なタグクラスおよび各クラスの具体的な例を知っているであろうし、それに応じて、適当な第二の結合部位を選択することができるだろう。ある態様において、結合領域は、抗原由来の既知のエピトープであるか、または合成されてよい。合成の場合は、分析対象物の観点から類縁体に特異的に設計され得る。既知の抗体または抗体フラグメントが特異的であるエピトープは、類縁体の一部を形成していてよい。
【００２５】
一態様において、分析対象物はhCGであり、類縁体は、配列番号１または配列番号２と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む:
【化１】
0006484250.tif 000002
【００２６】
両配列の下線部は、ユニークなエピトープ領域を示し、本明細書中“ＳＴ０６８”と記載する。該下線部には第二の結合部位が結合し、分析対象物、すなわちhCG中には存在しない。
【００２７】
配列番号１および２の二重下線部、すなわち、配列: SIRLPGCPRGVNP VVSYAは、hCGに見いだされるβ３として公知の結合ドメインを示す。従って、類縁体は、配列番号１の二重下線部、すなわち配列番号１の残基８５から１０２または配列番号２の二重下線部、すなわち配列番号２の残基７８から９５を含むかまたはそれから構成される配列を含み得る（および、第一の結合部位が結合し得る）。類縁体は、配列番号１の残基８から１５または配列番号２の残基１から８、すなわち、配列：NELSHFLE（これは、ＴＡＧエピトープと称され得る）を含むかまたはそれから構成される配列を含み得る（および、第一の結合部位が結合し得る）。類縁体は、配列：SIRLPGCPRGVNPVVSYAと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得て、および／または配列：NELSHFLEと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。類縁体は、ポリヒスチジンタグ、例えば配列番号１の残基１から７を含み得る。
【００２８】
他の態様において、特に、分析対象物がhCGであるとき、類縁体は、少なくとも１５７アミノ酸残基を含んでいてよく、少なくとも配列番号２のアミノ酸１から８および８４から９５を含み得る。あるいは、類縁体は、少なくとも１６４アミノ酸残基を含んでいてよく、少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および９５から１０２を含み得る。一態様において、類縁体は、配列番号１と５０％の配列同一性を有し、少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および７１から８３を含む。
【００２９】
別の態様において、類縁体は、ＮＥＬＳＨＦＬＥＸｍＳＩＲＬＰＧＺｎＰＶＶＳＹＡ（配列番号３）（ここで、Ｘは、長さ“ｍ”を有するリンカーであり、Ｚは、長さ“ｎ”を有するリンカーである)を含む。ＸおよびＺは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、それぞれ独立して、例えば、アミノ酸配列、ポリエチレングリコール(PEG)、VA (下記の構造を参照)またはベータ−アラニンであってよい。
【化２】
0006484250.tif 000003
【００３０】
リンカーＸの機能は、ＴＡＧエピトープとhCG配列との立体障害を低減することである。このためには、少なくとも１．５ｎｍ (１５オングストローム)の距離がなければならない。これは、５アミノ酸残基または２個のAEEAcリンカー (ＰＥＧよりも短いリンカー)または適当なＰＥＧリンカー(例えば、２つの繰り返し単位を有する)とほぼ等しい。
【００３１】
リンカーＺの機能は、hCG−β３の２つの隣接配列が第一の結合部位によって結合され得る立体配座エピトープにアライメントするように逆平行βターン構造を形成することである。この立体配座エピトープに対する第一の結合部位の親和性は、アッセイの観点において重要であり、リンカーの特性、例えばその長さおよびアミノ酸含有量を調整することにより最適化することができる。
【００３２】
Xおよび／またはZがアミノ酸配列であるとき、“ｍ”および“ｎ”は、それぞれ約３から約１００残基長、約５から約９０残基長、約１０から約８０残基長、または約２０から約７０残基長であり得る。例えば、“ｍ”および／または“ｎ”は、３、４または５残基長であってよい。“ｍ”および／または“ｎ”が３残基長である態様において、配列ＰＰＮを使用できる。本明細書で用いる用語“アミノ酸”には、天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸誘導体、例えばＡＥＥＡｃおよびアミノ−ＰＥＧ−酸等を含む、アミノ基および刈るボン酸基を有する分子が含まれる。
【００３３】
必要とされる類縁体の量は、種々の因子によって変わる。一般に、類縁体は、低濃度の制限された濃度で提供される。これは、約４−８ピコグラム／ｍｌであり得るが、必要とされる濃度は、バッチ毎に異なり、適当な濃度は、当業者によって決定され得る。
【００３４】
(第一、第二および／または第三の)結合部分は、天然由来であるか、または完全にもしくは部分的に合成することができる。結合部分およびその標的は共に結合パートナー対を形成する(類縁体および分析対象物は、第一の結合部位の標的であり、類縁体−第一結合部位複合体は、第二の結合部位の標的であり、そして第一の結合部位は、存在するとき、第三の結合部位の標的である)。該対メンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対型の例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、受容体−リガンド、酵素補因子−酵素、酵素阻害剤−酵素、酵素−基質、炭水化物−レクチン、高分子酸−塩基、色素−タンパク質結合物質、ペプチド−特異的タンパク質結合物質(例えば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼＳ−タンパク質)などが挙げられる。本発明は、概して、抗原−抗体型反応と関係しており、本発明の好ましい結合部位は、抗体またはそのフラグメントであるが、結合部分と結合対の他のタイプを採用する他の態様もまた、考慮される。
【００３５】
本明細書で用いる用語“抗体”は、天然か、または部分的もしくは完全に合成された、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。該用語はまた、抗体結合ドメインであるか、またはそれに相同である、結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を包含する。これらは、天然源に由来し得るか、または部分的にもしくは完全に合成的に製造されてよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ)ならびにそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ等の抗原結合ドメインを含むフラグメント；ならびに、二重特異性抗体である。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。モノクローナル抗体は、本明細書中、“mab”と称する。
【００３６】
モノクローナル抗体および他の抗体を用いること、ならびに元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生するための組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。かかる技術は、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に対する抗体の、免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを組み込むことを含み得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照のこと。
【００３７】
抗体は多くの方法で作製され、または改変され得るように、抗体という用語には、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する特異的結合メンバーまたは物質が包含されると解釈されるべきである。従って、この用語は、天然のまたは完全もしくは部分的に合成した、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物および抗体ホモログ、ヒト化抗体を包含する。従って、別のポリペプチドに融合した、免疫グロブリン結合ドメインまたは等価物を含むキメラ分子も包含される。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒトの、例えばマウスの可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾抗体であり得る。ヒト化抗体の作製方法は、例えば、米国特許第５２２５５３９に記載されている。
【００３８】
完全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を果たし得ることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward, E.S. et al., Nature 341:544−546 (1989)）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを結合させて、抗原結合部位を形成するのを可能とするペプチドリンカーによって連結されている（Bird et al., Science 242:423−426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879−5883 (1988)）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、ならびに（ｉｘ）“二重特異性抗体”、遺伝子融合により構築される多価または多重特異性フラグメント(WO94／13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444−6448 (1993))である。
【００３９】
二重特異性抗体は、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第一ドメインおよび免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第二ドメインを含み、該２つのドメインは、(例えば、ペプチド リンカーにより)結合しているが、互いに結合できず、抗原結合部位を形成している。抗原結合部位は、多量体内のあるポリペプチドの第一ドメインと多量体内の別のポリペプチドの第二ドメインとの連結により形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
【００４０】
二重特異性抗体が使用されるとき、これらは、種々の方法、例えば、化学的な製造法またはハイブリッドからの製造法で製造可能な従来の二重特異性抗体であってよいか(Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446−449 (1993))、または上記の二重特異性抗体フラグメントのいずれかであってよい。完全抗体よりも、ｓｃＦｖ二量体または二重特異性抗体を用いることが好ましい。二重特異性抗体およびｓｃＦｖは、Ｆｃ領域を含まず、可変ドメインのみを用いて構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を減少させる可能性がある。二重特異性抗体の他の形態は、一本鎖を含む（Traunecker et al., “Janusins”, EMBO Journal 10:3655−3659 (1991)）。
【００４１】
二重特異性完全抗体とは対照的に、二重特異性抗体は、それらを容易に構築し、大腸菌中で発現させることができるため有用であり得る。適当な結合特異性を有する二重特異性抗体(および、抗体フラグメントなどの多くの他のポリペプチド) は、容易にライブラリーからファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて容易に選択することができる。二重特異性抗体の一方のアームが一定に維持される、例えば、抗原Ｘに対する特異性を有する場合、ライブラリーは、他方のアームを変化させ、かつ選択した適当な特異性を有する抗体で作成することができる。
【００４２】
“抗原結合ドメイン”は、抗原の一部または全てに特異的に結合する領域を含む抗体の一部である。抗原が大きいとき、抗体は該抗原の特定の部分に結合することができ、該部分をエピトープと言う。抗原結合ドメインは、１つまたはそれ以上の抗体可変ドメインにより提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域(VL)および抗体重鎖可変領域(VH)を含み得る。
【００４３】
“特異的”とは、一般的に、結合部分がその標的以外の分子への有意な結合を示さないであろう状況を意味するために用いられ、例えば、他の分子との交差反応性が約３０％未満、好ましくは２０％、１０％、１％、０．５％、０．３％、０．２％または０．１％であることを意味する。該用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原により担持される特定のエピトープに対して特異的である場合に適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを担持する結合部分は、エピトープを担持する種々の抗原に結合することができる。
【００４４】
第一、第二および第三の結合部分は、必ずしも、同じタイプの結合部分である必要はないが、ある態様において、同じであってもよい。
【００４５】
第一の結合部位は、hCG β3ループ−特異的モノクローナル抗体であってよく、例えば、抗体“８Ｇ５”である(Gregor et al., J Biol Chem. 2011 Jul 15;286(28):25016−26を参照のこと)。第一の結合部位は、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で使用可能であり、抗体−HRP複合体であってもよい。
【００４６】
第二の結合部位は、マイクロタイタープレート、ニトロセルロースマトリックス、ガラス繊維マトリックス、粒子、膜、ペグ、スライド、吸水性膜、マイクロ流体デバイスの表面、クロマトグラフィー材料を含む群から選択される表面上に固定化されまたは固定化可能であり得る。例えば、粒子は、磁性粒子、ラテックス粒子、ガラス粒子、磁気感受性粒子、またはコロイド状金属粒子であってもよい。
【００４７】
上記の通り、シグナルは、好ましくは、第一の結合部位に直接的または間接的に連結された、または結合された標識から(直接的または間接的に)誘導される。“標識”は、視覚的手段または機器測定手段により検出可能なシグナルを生じ得る任意の物質を意味する。本発明において有用な種々の標識には、例えば光学的に検出可能であるように、化学的または物理的手段の何れかによりシグナルを生じる標識が含まれる。かかる標識には、酵素と基質、色素原、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、電気活性種、色素分子、放射性標識および粒子標識が含まれる。第一の結合部位自体が、本質的に検出可能なシグナルを生じることも可能である。標識は、共有結合により第一の結合部位に結合することができる。具体的には、標識は、光学的に検出可能なものから選択することができる。標識が酵素を含むとき、本方法は、シグナルを生成するために酵素と基質を接触させる工程を含み得る。一態様において、標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)である。
【００４８】
標識には、金、銀などの粒子、セレンもしくはテルルなどのコロイド状非金属粒子、色素を組み込んだポリマー粒子のような染色もしくは着色粒子、または染色ゾルが含まれ得る。色素は、例えば青色などの好適な色であってよい。色素は、蛍光色素であってよい。染色ゾルは、Foron Blue SRP (Sandoz)およびResolin Blue BBLS (Bayer)などの市販の疎水性染料から調製することができる。好適なポリマーラベルは、ポリスチレン、ポリビニルトルエン、ポリスチレン−アクリル酸およびポリアクロレインなどの合成ポリマーの範囲から選択することができる。使用されるモノマーは、通常、水に不溶性であり、モノマーミセルが形成されるように水性界面活性剤中に乳化され、その後、エマルジョンにイニシエーターを添加することにより重合化が誘導される。実質的に球状のポリマー粒子が製造される。かかるポリマー粒子の理想的なサイズ範囲は、約０．０５から約０．５ｕｍである。例示的態様によれば、標識は、青色のポリマー粒子または金粒子である。
【００４９】
上記の通り、第二の結合部位は表面上に固定化されてもよいが、該方法の初めから固定化されなくてもよい。後者の場合、第二の結合部位は、それが表面と接触し、固定化される前または後に、類縁体−第一結合部位複合体を接触させることができる。
【００５０】
液体サンプルは、産業的、環境的、農業上、または生物学的供給源などの供給源に由来し得る。サンプルは、血液、血清、血漿、間質液、唾液、痰、接眼レンズ液、汗、尿、乳汁、腹水液、粘膜、滑膜液、腹膜液、経皮滲出液、咽頭滲出液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引液（tracheal aspiration)、脳脊髄液、精液、子宮頸管粘液、膣もしくは尿道分泌物または羊水を含む生理的供給源に由来するかまたはそれから構成され得る。液体サンプルは、水性液体中への希釈、処理または抽出により半固体または固体源に由来し得る。
【００５１】
特定の状況下では、サンプルは、非常に高濃度の分析対象物を含むことが予想され得る。これは、例えば、サンプルが進行した病態を有する対象から得られた場合でもよい。そのような状況下では、サンプルは、アッセイに適する範囲内に分析対象物濃度をもたらすために、第一の結合部位および類縁体と接触させる前に希釈されてもよい。
【００５２】
第二の面において、本発明は、目的の分析対象物を検出するためのテストキットを提供する。本発明は、ｉ）分析対象物類縁体；
ｉｉ）（ａ）標識された第一の結合部位、または（ｂ）標識されていない第一の結合部位および標識された第三の結合部位のいずれか；および
ｉｉｉ）固定化可能な第二の結合部位
を含む、目的の分析対象物を検出するためのテストキットであって、
ここで、第一の結合部位が、類縁体および目的の分析対象物のそれぞれに独立して結合可能であり、第二の結合部位が、類縁体および第一の結合部位の複合体に結合できるが、分析対象物または第一の結合部位および分析対象物の複合体に結合できず、そして第三の結合部位が、第一の結合部位または類縁体−第一結合部位複合体に結合可能である、目的の分析対象物を検出するためのテストキットを提供する。
【００５３】
第一の結合部位は、類縁体と分析対象物の両方に同時に結合可能であってよい。
【００５４】
本発明は、ｉ）分析対象物類縁体；
ｉｉ）（ａ）標識された第一の結合部位、または（ｂ）標識されていない第一の結合部位および標識された第三の結合部位のいずれか；および
ｉｉｉ）固定化可能な第二の結合部位
を含む、目的の分析対象物を検出するためのテストキットであって、
ここで、第一の結合部位が、類縁体および目的の分析対象物のそれぞれに独立して結合できるが、類縁体および分析対象物の両方に同時には結合できず、第二の結合部位が、類縁体および第一の結合部位の複合体に結合できるが、分析対象物または第一の結合部位および分析対象物の複合体に結合できず、そして第三の結合部位が、第一の結合部位または類縁体−第一結合部位複合体に結合可能である、目的の分析対象物の検出のためのテストキットをさらに提供する。
【００５５】
分析対象物、類縁体、ならびに第一、第二および第三の結合部位は、本発明の第一の面で定義される通りであり得る。
【００５６】
第三の面において、本発明は、配列番号１または配列番号２の配列またはと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれから構成されるポリペプチド、またはアミノ酸配列ＮＥＬＳＨＦＬＥＸｍＳＩＲＬＰＧＺｎＰＶＶＳＹＡ（配列番号３）（ここで、ＸおよびＺは、それぞれ長さ“ｍ”および“ｎ”を有するリンカーであり、Ｘ、Ｚ、“ｍ”および“ｎ”は本発明の第一の面で定義の通りである)を含むかまたはそれから構成されるポリペプチドを提供する。
【００５７】
該ポリペプチドは、配列：SIRLPGCPRGVNPVVSYAと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでいてよく、および／または配列：NELSHFLEと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含んでいてよい。該ポリペプチドは、少なくとも１６４アミノ酸残基を含んでいてよく、少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および９５から１０２を含み得る。該ポリペプチドは、少なくとも１５７アミノ酸残基を含んでいてよく、少なくとも配列番号２のアミノ酸１から８および８４から９５を含み得る。一態様において、該ポリペプチドは、配列番号１と５０％の配列同一性を有し、少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および７１から８３を含む。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、単離された形態または組み換え形態で提供されてよく、他の分子と融合されていてよい。該ポリペプチドは、実質的に純粋な形態で提供されてよく、すなわち、他のタンパク質を実質的な程度まで含まないことを意味する。従って、ポリペプチドは、それが主成分として存在する組成物として提供され得る(すなわち、溶媒または担体を除く重量／重量ベースで測定されるとき、少なくとも５０％のレベル、好ましくは少なくとも７５％のレベル、少なくとも９０％のレベル、または少なくとも９５％のレベルで存在する。)。
【００５９】
本発明の第四の面は、第三の面のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００６０】
核酸分子に関して本明細書で使用されている、単離または組換えとは、ａ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりインビトロで増幅すること、ｂ）クローニングにより組換え的に製造すること、ｃ）例えば、ゲル分離により精製すること、ｄ）化学合成などによって合成すること、のいずれかを意味する。
【００６１】
核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡは、当技術分野で公知の方法、例えば常套の化学的方法またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅または他の増幅法を用いて合成され得る。
【００６２】
第五の面において、本発明は、第三の面に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００６３】
種々の宿主発現ベクターシステムが、本発明のポリペプチドを発現するために利用可能である。かかる宿主発現システムとは、目的のコード配列が産生され、その後精製され得るビヒクルを意味するが、適当なヌクレオチドコード配列で形質導入またはトランスフェクトされたとき、インサイチュウで本発明のポリペプチドを発現し得る細胞もまた意味する。これらには、微生物、例えばポリペプチドコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)；ポリペプチドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、出芽酵母、ピキア酵母)；ポリペプチドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系；ポリペプチドコード配列を含む、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV; タバコモザイクウイルス、TMV)で感染させたか、または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター; ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
細菌システムにおいて、多数の発現ベクターを、発現されるポリペプチドについて意図される使用に応じて有利に選択することができる。例えば、そのようなポリペプチドを大量に製造する場合、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが望ましい。かかるベクターには、大腸菌発現ベクターpUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791); pIN ベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101−3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503−5509)などが含まれるが、これに限定されない。pGEX ベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ (GST)との融合たんぱく質として外来ポリペプチドを発現するために使用可能である。一般的に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、吸着させ、グルタチオン−アガロースビーズを含むマトリックスに結合させ、次いで、遊離グルタチオンの存在下で溶出させて、容易に溶解細胞から精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部位から放出され得るように、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【００６５】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(AcNPV)を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。該ウイルスは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。ポリペプチドコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系(例えば、アデノウイルス発現系)を利用することができる。
【００６６】
上記の通り、挿入配列の発現を調節する、または変更する、所望の特定の様式で遺伝子産物を処理する宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾(例えば、グリコシル化）およびプロセシング(例えば、切断)は、タンパク質の機能にとって重要である。
【００６７】
本発明のポリペプチドの長期間の高収率産生には、安定な発現が好ましい。例えば、該ポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ポリペプチドのヌクレオチド配列および選択可能な(例えば、ネオマイシンまたはハイグロマイシン)のヌクレオチド配列を含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトし、選択可能なマーカーの発現について選択することにより製造可能である。そのように操作された細胞株は、ポリペプチドと直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【００６８】
本発明のポリペプチドの発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（総説、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)を参照のこと）。ポリペプチドを発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は、ポリペプチド遺伝子と関連しているので、ポリペプチドの産生も増加する(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【００６９】
一旦、本発明のポリペプチドを組換え的に発現させると、それは、ポリペプチドの精製のために当技術分野で公知の何れかの方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、タンパク質Ａ、ポリヒスチジンまたは特異的抗原などの親和性クロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心、示差溶解度により、またはタンパク質の精製のための他の標準的技術によって精製することができる。
【００７０】
あるいは、任意の融合タンパク質を、発現される融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより容易に精製することができる。例えば、Janknechtらによって記載されたシステムは、ヒト細胞株において発現される変性していない融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972−897)。このシステムにおいて、目的の遺伝子は、該遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳可能に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングされる。タグは、融合タンパク質のマトリックス結合ドメインとして機能する。組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞からの抽出物を、Ni2+ ニトリロ酢酸−アガロースカラム上にローディングし、ヒスチジンタグ付きタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶出される。
【００７１】
本発明の一態様において、第一の反応段階において、標識された抗体を、類縁体−標識された抗体複合体を形成するために、限界量（limiting quantity）の意図された標的分子(分析対象物)の修飾された形態（“タグ付けされた標的”または“類縁体”）の存在下でインキュベートする。少量の類縁体を混合物に適用し、類縁体がサンプル中に存在する天然の分析対象物と抗体への結合について競合するのを避ける。従って、アッセイの構成により、調査中のサンプル中に存在する分析対象物の量が多いほど、より少量の類縁体が、第一の結合によって捕捉され得る。従って、アッセイとしては、標識された抗体由来の検出可能なシグナルが、サンプル中に存在する目的の分析対象物の濃度に反比例するため、負のリードイムノアッセイが考慮される。
【００７２】
第二段階において、類縁体−標識された抗体複合体は、反応チャンバー内の類縁体分子に固有のタグに特異的な捕捉種をその上に固定化した固相に適用される。固相は、溶液中に存在する類縁体−標識された抗体複合体の効率的な捕捉を確実にするために、過剰量の捕捉分子がロードされている。固相捕捉分子上の類縁体−標識された抗体複合体の捕捉後、結合していない標識された抗体 (すなわち、標的分析対象物と複合体形成しているもの)を洗浄工程により反応チャンバーから取り除き、固相上に捕捉されている類縁体−標識された抗体複合体のみを残す。その後、標識の存在を、使用されている標識に応じて、適当な方法を用いて定量する。
【００７３】
抗体上の標識は、酵素、フルオロフォア、放射性核種、コロイド状ゾル、発色団、発光性化合物から選択され得る。選択された酵素に応じて、酵素の反応生成物は、光学的に (吸光度または蛍光または視覚的)または電気化学的に決定され得る。
【００７４】
本発明はまた、以下を提供する：
１．配列番号１の配列と少なくとも５０％の相同性を有する組換えペプチド。
２．配列番号１の配列と少なくとも７５％の相同性を有する組換えペプチド。
３．配列番号２の配列と少なくとも５０％の相同性を有する組換えペプチド。
４．配列番号２の配列と少なくとも７５％の相同性を有する組換えペプチド。
５．少なくとも配列番号２のアミノ酸１から８および８４から９５からなる、少なくとも１５７アミノ酸を含む組換えペプチド。
６．少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および９５から１０２からなる、少なくとも１６４アミノ酸を含む組換えペプチド。
７．配列番号３の配列を含む組換えペプチド（ここで、ＸおよびＺは、それぞれリンカーを表す）。
８．イムノアッセイの製造における、配列番号１のペプチドの使用であって、
アミノ酸９５から１０２を含む領域に結合特異性を有する第一の抗体；
アミノ酸８から１５を含む領域に結合特異性を有する第二の抗体；
（ここで、第二の抗体は、固相上に固定化され、第一の抗体は、検出可能な標識に結合されている）
を含む、使用。
【００７５】
９．検出可能な標識が、酵素、フルオロフォア、放射性核種、コロイド状ゾル、発色団、発光化合物を含む群から選択される、項８に記載のイムノアッセイ。
１０．第二の抗体が、マイクロタイタープレート、磁性粒子、膜、ペグ、ラテックス粒子、スライド、吸水性膜、マイクロ流体装置の表面、クロマトグラフィー材料を含む群から選択される固相に固定化される、項８に記載のイムノアッセイ。
１１．目的の標的を含むと予想されるサンプルと第一の標識抗体および配列番号１、配列番号２または配列番号３のいずれか１つの組換えペプチドとを接触させ、第一の標識抗体の標的への結合について競合的イムノアッセイを開始して、第一の抗体−組換えペプチド複合体を形成させ；
第一の標識抗体−標的複合体を第二の抗体に適用して、第二の抗体−第一の標識抗体−組換えペプチド複合体を形成させ；
結合していない第一の抗体を、第二の抗体−第一の抗体−組換えペプチド複合体混合物から分離し；そして、
第二の抗体によって捕捉された組換えペプチドに対する第一の標識抗体の存在を検出する
ことを含む、イムノアッセイを行う方法。
１２．第一の標識抗体−標的複合体を形成する工程がバルク溶液中で起こる、項１１に記載の方法。
１３．第二の抗体−第一の標識抗体組換えペプチド複合体を形成する工程が、表面で起こり、第二の抗体が表面上に固定化されている、項１１に記載の方法。
１４．検出可能な標識が、酵素、フルオロフォア、放射性核種、コロイド状ゾル、発色団、発光化合物を含む群から選択される、項１１に記載の方法。
１５．第二の抗体が、粒子、膜、マイクロタイタープレート、スライド、ニトロセルロースマトリックス、ガラス繊維マトリックスの表面上に固定化される、項１３に記載の方法。
１６．粒子が、磁気感受性粒子、コロイド金属粒子、ラテックス粒子またはガラス粒子である、項１５に記載の方法。
１７．結合していない第一の標識抗体を第二の抗体−第一の標識抗体−標的複合体から分離する工程が、緩衝液での洗浄、空気での洗浄、磁石、濾過またはイムノクロマトグラフィーを用いる、複合体からの溶液の除去を含む、項１１に記載の方法。
１８．配列番号１の配列と少なくとも５０％の相同性を有し、少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および７１から８３からなる、組換えペプチド。
【００７６】
本発明は、以下の番号を付した項でさらに定義され得る：
１．液体サンプル中に存在する分析対象物の存在を決定する方法であって、
ａ）該液体サンプルを、既定量の分析対象物の類縁体および過剰量の第一の結合部位と接触させること、ここで、第一の結合部位は、混合物が、類縁体−第一結合部位複合体を含んで形成されるか、または分析対象物がサンプル中に存在するとき、（ｉ）類縁体−第一結合部位複合体および分析対象物−第一結合部位複合体、または（ｉｉ）分析対象物−第一結合部位複合体を含み、かつ類縁体−第一結合部位複合体を含まないで形成されるように、分析対象物および類縁体のそれぞれに独立して結合可能であり；
ｂ）該混合物を第二の結合部位と接触させること、ここで、第二の結合部位は、類縁体−第一結合部位複合体に結合できるが、分析対象物−第一結合部位複合体には結合できず、そして固相に固定化されているか、または固定化可能であり；
ｃ）第二の結合部分に結合した類縁体−第一結合部位複合体の存在を示すシグナルレベルを決定すること；
ここで、工程ｃ）で決定されたシグナルレベルが、分析対象物が存在しないときに決定された最大シグナルレベルより低いとき、分析対象物がサンプル中に存在する、
を含む、方法。
２．サンプルを、類縁体と接触させる前に、第一の結合部位と接触させる、項１に記載の方法。
３．工程ｃ）で決定されたシグナルレベルをキャリブレーションデータと比較することにより、サンプル中に存在する分析対象物の量または濃度を決定する工程をさらに含む、項１または２に記載の方法。
４．分析対象物がｈＣＧまたはそのフラグメントもしくは一部である、項１から３のいずれかに記載の方法。
５．シグナルが第一の結合部位に直接的または間接的に結合されている標識に由来する、項１から４のいずれかに記載の方法。
６．標識が、酵素、フルオロフォア、放射性核種、コロイド状ゾル、発色団および発光化合物からなる群より選択される、項５に記載の方法。
７．分析対象物がアミノ酸配列を含み、類縁体が、分析対象物の完全な配列または分析対象物の一部の配列のいずれかと同一のアミノ酸配列を含む、項１から６のいずれかに記載の方法。
８．類縁体が、分析対象物中に存在していない結合領域を含む、項１から７のいずれかに記載の方法。
９．類縁体がアミノ酸配列を含み、組換え的に発現される、項１から８のいずれかに記載の方法。
【００７７】
１０．類縁体が、アミノ酸配列ＮＥＬＳＨＦＬＥＸｍＳＩＲＬＰＧＺｎＰＶＶＳＹＡ（配列番号３）（ここで、ＸおよびＺは、それぞれ長さ“ｍ”および“ｎ”を有するリンカーである）を含む、項１から９のいずれかに記載の方法。
１１．類縁体が、（ｉ）少なくとも１６４アミノ酸を含み、少なくとも配列番号１のアミノ酸１から１５および９５から１０２を含むか、または（ｉｉ）少なくとも１５７アミノ酸を含み、少なくとも配列番号２のアミノ酸１から８および８４から９５を含む、項１から１０のいずれかに記載の方法。
１２．類縁体が、配列番号１の残基８から１５および／または配列番号１の残基８５から１０２を含む、項１から１１のいずれかに記載の方法。
１３．類縁体が、配列番号１、または配列番号２の配列と、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１から１２のいずれかに記載の方法。
１４．第一の結合部位および／または第二の結合部位が抗体である、項１から１３のいずれかに記載の方法。
１５．第一の結合部位が、hCG β３−ループ−特異的モノクローナル抗体である、項１から１４のいずれかに記載の方法。
１６．サンプルが、血液、血清、血漿、間質液、唾液、痰、接眼レンズ液、汗、尿、乳汁、腹水液、粘液、滑膜液、腹膜液、経皮滲出液、咽頭滲出液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引液（tracheal aspiration)、脳脊髄液、精液、子宮頸管粘液、膣もしくは尿道分泌物または羊水を含む生理的供給源に由来するかまたはそれから構成される、項１から１５のいずれかに記載の方法。
１７．ｉ）分析対象物類縁体；
ｉｉ）（ａ）標識された第一の結合部位、または（ｂ）標識されていない第一の結合部位および標識された第三の結合部位のいずれか；および
ｉｉｉ）固定化可能な第二の結合部位
を含む、目的の分析対象物を検出するためのテストキットであって、
ここで、第一の結合部位が、類縁体および目的の分析対象物のそれぞれに独立して結合可能であり、第二の結合部位が、類縁体および第一の結合部位の複合体に結合できるが、分析対象物または第一の結合部位および分析対象物の複合体に結合できず、そして第三の結合部位が、第一の結合部位または類縁体−第一結合部位複合体に結合可能である、
テストキット。
１８．配列番号１または配列番号２の配列に７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、もしくはそれからなるポリペプチド、または配列ＮＥＬＳＨＦＬＥＸｍＳＩＲＬＰＧＺｎＰＶＶＳＹＡ（配列番号３）（ここで、ＸおよびＺは、それぞれ長さ“ｍ”および“ｎ”を有するリンカーである）を含むか、もしくはそれからなるポリペプチド。
１９．項１８に記載のポリペプチドをコードする核酸。
２０．項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【００７８】
本発明のそれぞれの面の好ましい特徴は、必要な変更を加えた他の面のそれぞれの場合と同様である。本明細書に記載の先行技術文献は、法律で認められる最大限の範囲に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、本発明の態様によるハイブリッド競合イムノアッセイの概略的説明を示し、標的分析対象物とサンプル中に存在するまたは存在する可能性のある別の種との間で生じる可能性のある交差反応を示す。標的分析対象物がhCGである例示的態様において、交差反応種はＬＨである。
【図２】図２は、阻害曲線を示し、hCG アッセイのために選択されたモノクローナル抗体である、保存的β3−hCG ループ領域に対して作製されたmoc1が、ＬＨと交差反応する程度を示している。データは、LHとの交差反応性は、抗体の５０％を飽和するのに必要なリガンドの量に基づいて、hCGと比較して０．２７％であることを示す。
【図３】図３は、βhCGへの結合について、モノクローナル抗体であるmoc1の特異性を示す、さらに特徴付けるデータを提供する。グラフは、y軸に、タグ付けされたhCGを結合しているI125放射性標識したmoc1によるカウント数を示し、x軸に、１０００倍から５１２０００倍の希釈レベルを示す。データは、βhCGとαhCGまたはLHのいずれかとを区別するためのmoc1抗体の能力を実証する一連の曲線を示す。緩衝液対照、569遊離αおよびLHはすべて、同様のプロファイルを示し、低希釈で高カウントであり、サンプルが希釈されるにつれて低下した。しかしながら、抗体およびタグ付けされたhCGを、遊離βhCG、“ニックの入った”βhCG、無傷のhCG、“ニックの入った”hCGまたは“コア”hCG (標識されていない標的)のいずれかと共にインキュベートしたとき、シグナルは、低希釈であっても顕著に低下し、これは、標識されていない標的が、抗体への結合に関してタグ付けされたhCGとの競合に打ち勝ったためである。
【図４】図４は、組換えmoc1 Fab1(単量体)およびFab2 (二量体)の比較を示す。
【図５】図５は、低から高濃度のｈＣＧを含むサンプルベースの血清ＴＡＧアッセイとＲＩＡアッセイとの比較を示す。x軸は、ＴＡＧアッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。y軸は、ＲＩＡアッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。
【図６】図６は、低から高濃度のｈＣＧを含むサンプルベースの血清ＴＡＧアッセイと Immulite アッセイとの比較を示す。x軸は、ＴＡＧアッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。y軸は、Immulite アッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。
【図７】図７は、中から高濃度のｈＣＧを含むサンプルベースの血清ＴＡＧアッセイとＲＩＡアッセイとの比較を示す。x軸は、ＴＡＧアッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。y軸は、ＲＩＡアッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。
【図８】図８は、中から高濃度のｈＣＧを含むサンプルベースの血清ＴＡＧアッセイとImmulite アッセイとの比較を示す。x軸は、Immulite アッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。y軸は、ＴＡＧアッセイにより測定されたｈＣＧ濃度 (IU／L)を示す。
【実施例】
【００８０】
実施例１ 血清ＴＡＧアッセイのプロトコール
試薬
標準希釈剤              − Serasub (SS)
サンプルプレ希釈剤      − ヒツジ正常血清 (NSS)
moc1                    − 4ml 3％ BSA／1％ NSS／PBS中、10ulストック溶液(1:1000)
TAG                    − 4ml 3％ BSA／1％ NSS／PBS中、10ulストック溶液(1:1000)
マイクロタイタープレート− 抗TAGで予めコーティング。
サンプル調製
0−100 IU／L        − SSで1:2希釈。
100−1000           − NSSで1:5希釈し、その後、要すればさらにSSで希釈。
＞1000              − NSSで1:50希釈し、要すればさらに、SSで希釈。
【００８１】
アッセイ
・５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および１．５６ＩＵ／Ｌの基準を生成するために、SSで６回、段階希釈トップのhCG標準(100 IU／L)による標準曲線を作製する。SSのみを０基準として包含させる。
・血清サンプルを適当に希釈する(上記で詳述)。
・マルチチャンネルピペットを用いて、３５μｌのmoc1溶液をマイクロタイタープレートのウェルに加える。
・３５μｌの標準液およびサンプルを加える。
・マルチチャンネルピペットを用いて、３５μｌのTAG溶液を全てのウェルに添加する。
・プレートを室温にて１時間振盪する。
・ティッシュペーパー上へ滲ませてウェルの内容物を取り除く。
・０．１％トゥイーン／PBSで６回洗浄する。
・１００μｌのフェムト基質を添加し、BMG フルオスター照度計で読み取る。
・BMG Omega Marsデータ分析ソフトウェアを用いて結果を計算する。
【００８２】
実施例２ 尿ＴＡＧアッセイのプロトコール
試薬
標準希釈剤              − Urisub (US)
サンプル希釈剤          − 10％ ヒツジ正常血清 (NSS)／US
moc1                    − 4ml 3％ BSA／1％ NSS／20％FCS／PBS中、10ul ストック溶液(1:1000)
TAG                    − 4ml 3％ BSA／1％ NSS／PBS中、2.3ul ストック溶液(1:1000)
マイクロタイタープレート− 抗TAGで予めコーティング。
サンプル調製
0−100 IU／L − そのまま
＞100 IU／L  − 10％ NSS／USで希釈。
【００８３】
アッセイ
・50、25、12.5、6.25、3.125および1.56 IU／Lの基準を作成するために、SSで６回、倍数希釈トップのhCG標準 (100 IU／L)による標準曲線を作製する。０基準を得るためにSSのみを含ませる。
・尿サンプルを適当に希釈する(上記で詳述)。
・マルチチャンネルピペットを用いて、３５μｌのmoc1溶液をマイクロタイタープレートのウェルに加える。
・３５μｌの標準液およびサンプルを加える。
・マルチチャンネルピペットを用いて、３５μｌのTAG溶液を全てのウェルに添加する。
・プレートを３７℃にて２時間振盪する。
・ティッシュペーパー上へ滲ませてウェルの内容物を取り除く。
・０．１％トゥイーン／PBSで６回洗浄する。
・１００μｌのフェムト基質を添加し、BMG フルオスター照度計で読み取る(セッティングデータを参照)。
・BMG Omega Marsデータ分析ソフトウェアを用いて結果を計算する(セッティングデータを参照)。
【００８４】
実施例３ moc1 Fab変異体の比較
組換えmoc1 Ｆａｂ１（単量体）およびＦａｂ２(二量体)を、当業者により当技術分野で公知の方法で大腸菌において産生した。各Fab変異体(単量体変異体および二量体変異体)を精製し、製造者の指示に従ってライトニングリンクHRPキット(Innova Bioscience) を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合させた。各Ｆａｂ変異体の分子量は、単量体Ｆａｂ１変異体および二量体Ｆａｂ２変異体がHRPで同程度のレベルで標識されるように、結合プロセスを考慮に入れた。
【００８５】
HRPで標識して、初期活性試験後に、標識されたFab変異体を、実施例１に提供される一般的な方法に従って標準曲線を導出するためにTAGおよびhCGを用いた競合アッセイで評価した。
【００８６】
アッセイの結果を表１および図４に示す。
【表１】
0006484250.tif 000004
【００８７】
表１および図４は、Ｆａｂ２二量体変異体が、同等のアッセイ条件下で、Ｆａｂ１単量体変異体と比較して、顕著な約２倍の化学発光出力の増加を示したことを実証する。加えて、Ｆａｂ２二量体変異体は、ｈＣＧ濃度範囲１．５６−２５ＩＵ／Ｌに亘って、この範囲で％シグナルの急激な低下を示すＦａｂ１単量体変異体と比較して、サンプル中のｈＣＧ濃度に対してより高い感度を有する (図４参照のこと)。
【００８８】
実施例４ ＴＡＧアッセイとImmuliteおよびＲＩＡアッセイとを比較する臨床試験
試験を、本明細書に記載のＦａｂ２二量体変異体用いるＴＡＧアッセイの能力と、公知のアッセイであるImmuliteアッセイおよびＲＩＡアッセイとを比較するために行い、臨床サンプル中のhCGを検出した。
【００８９】
臨床血清サンプルを、各アッセイ法によるhCGの存在および濃度について分析した。ＴＡＧアッセイを実施例１に記載の通りに行った。Immuliteアッセイ(Siemens)を、製造者の指示に従って行った。ＲＩＡアッセイを、National Health Service、UKにより提供されるプロトコール指示書に従って行った。簡単には、アッセイには、精製したポリクローナル抗体およびヨウ素化hCGを用い、ここで、サンプルを希釈し、抗体と混合し、測定前の２４時間hCGを標識した。
【００９０】
該アッセイの結果を、表２および３ならびに図５から８に示す。
サンプル全体でのhCG濃度範囲がローからハイのhCG濃度にしたことにより、TAGアッセイ、ImmuliteアッセイまたはRIAアッセイ法による臨床血清サンプル中の表2のhCG検出。
【表２】
0006484250.tif 000005
【表３】
0006484250.tif 000006
【００９１】
図５から図８は、ＴＡＧアッセイによる臨床血清サンプル中のhCG濃度の検出および測定が、全ての場合において、０．９以上のＲ２値で公知のImmuliteおよびＲＩＡアッセイと強く相関することを実証する。アッセイ法間の変動が、hCG上の標的エピトープの抗体認識の違いのために存在するが、全てのアッセイは、正確に臨床血清中のhCGを検出することができる。
【００９２】
また、さらなる臨床試験は、ＴＡＧアッセイの重要な利点が優れた感度で特異性を報告する能力であることを実証した。治療を受ける患者をモニターするのに有益となるように、特にhCGレベルが非常に低い場合、公知のＲＩＡおよびImmuliteアッセイを実施することができるようになる前に、非常に低レベルのhCGを検出し、患者サンプル中における増加を検出することが見いだされた。公知のアッセイ法よりも優れたＴＡＧアッセイの感度に加えて、ＴＡＧアッセイは、実験室ベースであり、単純な実験室設備および装置を用いる公知のアッセイよりも短時間（４時間）という非常に短い時間で完了することができる。
【図１】
0006484250.tif 000007
【図２】
0006484250.tif 000008
【図３】
0006484250.tif 000009
【図４】
0006484250.tif 000010
【図５】
0006484250.tif 000011
【図６】
0006484250.tif 000012
【図７】
0006484250.tif 000013
【図８】
0006484250.tif 000014
【配列表】
0006484250000001.app