(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
0006471236.tif 000006
（式中、
Ｒ１はＤａｂであり、
Ｒ２はＴｈｒであり、
Ｒ３はＤＴｈｒであり、
Ｒ４はＤａｂであり、
Ｒ５はＤａｂであり、
Ｒ６はＤＰｈｅであり、
Ｒ７はＬｅｕであり、
Ｒ８はＡｂｕであり、
Ｒ９はＤａｂであり、
Ｒ１０はＴｈｒであり、
Ｒ（ＦＡ）はオクタノイルである）
の化合物または医薬的に許容されるその塩。
【請求項２】
Ｒ１〜Ｒ１０がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１である、請求項１に記載の化合物または医薬的に許容されるその塩。
【請求項３】
有効量の請求項１または２に記載の化合物または医薬的に許容されるその塩と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項４】
１つまたは複数の他の有効成分をさらに含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記他の有効成分は、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシンおよび他のマクロライド類、ケトライド類、フルオロケトライド類、クリンダマイシンおよび他のリンコサミン類、ストレプトグラミン類、リファンピン、リファブチン、リファラジルおよび他のリファマイシン類、フシジン酸、ムピロシン、オキサゾリジノン類、バンコマイシン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシンおよび他のグリコペプチド系抗生物質、フルオロキノロン類、バシトラシン、テトラサイクリンおよびフルオロサイクリンの誘導体、ベータラクタム系抗生物質、ノボビオシン、プレウロムチリン類、葉酸合成阻害剤、デホルミラーゼ阻害剤、ならびに細菌排出ポンプ阻害剤からなる群から選択される抗菌剤である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗菌剤は、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、ソリスロマイシン、クリンダマイシン、ストレプトグラミン合剤キヌプリスチン−ダルホプリスチン、エラバサイクリン、ミノサイクリン、オマダサイクリン、リファンピン、リファブチン、リファラジル、フシジン酸、ムピロシン、オキサゾリジノン系のテジゾリドおよびリネゾリド、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、テラバンシン、フルオロキノロン系のモキシフロキサシン、デラフロキサシンおよびアバラフロキサシン、ならびに葉酸合成阻害剤トリメトプリムからなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
薬剤として使用される、請求項１もしくは２に記載の化合物または請求項３〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
細菌感染症の処置で使用される、請求項１もしくは２に記載の化合物または請求項３〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細菌はグラム陰性菌である、請求項８に記載するように使用される請求項１もしくは２に記載の化合物または請求項３〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細菌は、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・クロアカエ、シトロバクター・フレウンディ、シュードモナス・アエルギノーザ、およびアシネトバクター・バウマンニからなる群から選択される、請求項８に記載するように使用される請求項１もしくは２に記載の化合物または請求項３〜６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリミキシン誘導体およびグラム陰性菌により引き起こされる感染症の処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症性感染症が、毎年２１５，０００人超のアメリカ人の命を奪っている。７５０，０００人のアメリカ人が深刻な敗血症に感染し、毎年その２９％がそれにより死亡すると推定されている。敗血症死は、アメリカ合衆国の全死亡例の９％を占める。敗血症により、心筋感染症と同数、交通事故より多数のアメリカ人が死亡する。
【０００３】
２００万〜３００万人のアメリカ人が毎年院内感染し、これらの感染症の１０％が敗血症へと進行する。これらの患者の９０，０００人超が院内で感染した敗血症により死亡する。
【０００４】
大腸菌およびクレブシエラ・ニューモニエは両方ともグラム陰性菌だが、これらは全ての市中感染した敗血症性感染症の約４０％および全ての医療関連敗血症性感染症の約３分の１を引き起こす。それらは、全てのグラム陰性敗血症性感染症のうち約６０〜７５％を引き起こす。敗血症性感染症の原因となる他のグラム陰性物質としては、アシネトバクター・バウマンニおよび緑膿菌が挙げられる。全体で、グラム陰性菌は全敗血症性感染症の４０％超を引き起こし、これらの細菌の多くは極めて多耐性である。
【０００５】
ポリミキシン類は、パエニバシラス・ポリミキサ株および関連生物により産生される、近縁の抗生物質の群である。これらのカチオン性薬物は、分子量が約１０００の比較的単純なペプチドである。ポリミキシンＢなどのポリミキシン類はデカペプチド抗生物質であり、つまり、１０個のアミノアシル残基で構成されている。それらは殺菌性であり、特に、大腸菌および他の種の腸内細菌、シュードモナス、ならびにＡ．バウマンニなどのグラム陰性菌に対し効果的である。しかしながら、ポリミキシン類は、腎毒性および神経毒性などの重大な副作用を有する。したがって、これらの薬物は、高い全身毒性のために治療薬としての使用が制限されてきた。
【０００６】
臨床医は、現在、極度に多耐性のグラム陰性菌の大流行により、ポリミキシン類は腎毒性で有名であるものの、ポリミキシン類を重度の感染症の最後の治療として復活させることを余儀なくさせられている。ポリミキシン類の腎毒性は治療を複雑にするか、または、その中断さえ必要となる場合がある。したがって、腎毒性のリスクは、患者の生存に対する有益な効果と比較検討されなければならない。最近の研究によると、ポリミキシンＢと（コリスチンメタンスルホン酸から遊離させた）コリスチンの腎毒性率は１０％〜３０％まで幅があるが、選択された物質においては、コリスチンの比率は４３〜４８％、ポリミキシンＢのそれは５５％と高い場合がある。したがって、個人差が大きい（Ｖａａｒａ，Ｍ．２０１３，Ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３，６８：１２１３−９）。重体の患者においては現在の投薬レジメンは次善であり、血清濃度を低くし過ぎるということを示す最新のデータにより、状況はさらに不利になっている。したがって、臨床医はより多くの投薬量を用いるように勧められるが、これはさらに腎毒性を増大させる。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、グラム陰性菌に対し効果的で腎毒性を減らしたポリミキシン誘導体を提供することが本発明の目的である。本発明の目的は、ポリミキシン誘導体および医薬的に許容されるその塩、ならびにその使用により達成され、これらは独立請求項で述べることにより特徴付けられる。本発明の好適な実施形態は、従属請求項において開示する。
【０００８】
以下において、添付［付属］の図面を参照しながら、好適な実施形態を用いて本発明をより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）、ＮＡＢ７３９、またはＮＡＢ８１５を用いた処置の前（−７日目／−８日目）および処置中（２日目〜８日目）のＳ−ＢＵＮ（ｍｇ／ｄＬ）を示す図である（１群あたり３動物、ＩＶ、ＴＩＤ）。
【図２】ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）、ＮＡＢ７３９、またはＮＡＢ８１５を用いた処置の前（−７日目／−８日目）および処置中（２日目〜８日目）のＳ−Ｃｒｅａ（ｍｇ／ｄＬ）を示す図である（１群あたり３動物、ＩＶ、ＴＩＤ）。
【図３】ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）、ＮＡＢ７３９、またはＮＡＢ８１５を用いた処置の前（−７日目／−８日目）および処置中（２日目〜８日目）のＵ−ＮＡＧ（Ｕ／Ｌ）／Ｕ−Ｃｒｅａ（ｍｇ／ｄＬ）比×１０を示す図である（１群あたり３動物、ＩＶ、ＴＩＤ）。
【図４】ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）、ＮＡＢ７３９、またはＮＡＢ８１５を用いた処置の前（−７日目／−８日目）および処置中（２日目〜８日目）のＵ−ＧＧＴ（Ｕ／Ｌ）／Ｕ−Ｃｒｅａ（ｍｇ／ｄＬ）比を示す図である（１群あたり３動物、ＩＶ、ＴＩＤ）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
最近、より忍容性の高いポリミキシン誘導体を開発するためにいくつかの試みがなされている。我々は以前、ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０５０４４１（この全ての内容および開示が参照により本明細書に組み込まれる）で開示した化合物が顕著な抗菌作用を有し、グラム陰性菌により引き起こされる感染症の処置に有用であることを示した。さらに、我々は、いずれも３個の正電荷のみを担持するこれらの化合物は、５個の正電荷を担持する化合物よりも腎毒性が低いことを示唆し、また、それについての予備的証拠も示した（Ｖａａｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ｔｈｒｅｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２００８，５２：３２２９−３６；  Ｖａａｒａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｖａａｒａ  Ｔ．Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ．２０１０．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ７，８０７，６３７；  Ｖａａｒａ  Ｍ．Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１０；  １３：５７４−８１；  Ｍｉｎｇｅｏｔ−Ｌｅｃｌｅｒｃｑ  Ｍ．−Ｐ．Ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｒｅ  ｌｅｓｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｈａｎ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ  ｔｏ  ｒｅｎａｌ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２０１２；  ３５：２４８−５２；  Ｖａａｒａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｖａａｒａ  Ｔ．Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ＮＡＢ７３９  ｉｓ  ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ  ｌｅｓｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｈａｎ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  ｃｏｌｉｓｔｉｎ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１３，４１：２９２−３；  Ｖａａｒａ，Ｍ．２０１３，Ｎｅｗ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３，６８：１２１３−９）。
【００１１】
ＮＡＢ７３９などのこれらの化合物は、グラム陰性菌に対し良好な抗菌作用を有するが、さらに忍容性が高い誘導体を確実かつ明解な方法で開発しようと試みることが望ましい。
【００１２】
このたび、驚くべきことに、本明細書で定義する特定のポリミキシン誘導体が、容認できない腎毒性なく、グラム陰性菌に対し求められている高い抗菌効果を示すことが分かった。
【００１３】
米国特許出願公開第２００６／００４１８５号明細書（Ｑｕａｌｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ＣＢ−１８２，８０４  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，Ｍｉｃｒｏｂ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  ２０１２，１３：５７４−８１も参照されたい）における、ＣＢ−１８２，８０４、Ｎ末端に結合した脂肪アシル部分として２−クロロ−フェニルアミノ−カルボニルを保持するがそれ以外はポリミキシンＢと同じである分子の開発は、２０１０年に中止された。Ｄａｐ−３ポリミキシン類似体は、イヌでの腎毒性研究においてポリミキシンＢと十分に相違しなかった（Ｍａｇｅｅ  Ｔ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄａｐ−３  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３，５６：５０７９−５０９３）。両プログラムには、５個の正電荷を有する化合物のみが含まれた。試みとしてはＫｅｒｎおよび協力者によるものも挙げられるが（Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  Ｎ，Ｅａｒｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２０１４，１３７：２７８−９１）、詳細または任意のさらなる進捗については発行されていない。
【００１４】
特許出願国際公開第２０１３／０７２６９５号は、それぞれが少なくとも４個の正電荷を担持する３０超のポリミキシンノナペプチドについて記載する。それらのいくつかは、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ｈＲＰＴＥＣ）株ＨＫ−２に対し、ポリミキシンＢおよびコリスチンより細胞毒性が低かった。さらに、７日間のラット研究では、それらのうち３つが、等価用量のコリスチンよりも少ない程度に尿シスタチンＣ、アルブミン、およびＮＡＧのレベルを上昇させた。
【００１５】
特許出願国際公開第２０１４／１８８１７８号は、国際公開第２０１３／０７２６９５号に記載されている研究を継続するものである。名称「異なった抗生物質と一緒の組合せ療法におけるポリミキシン誘導体及びその使用（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」が示すように、以前の特許出願のポリミキシン誘導体およびいくつかの新規の誘導体による、リファンピンなどの他の抗生物質の作用の増強に主眼が置かれている。新規の誘導体のいくつか（例えば、誘導体４４、４６、および４８）は、Ｒ３（ポリミキシンで一般的に用いられる方式に従った、アミノアシル残基の番号付け。つまり、ポリミキシンＢのＮ末端から最初の残基をＲ１と番号付けする）においてＤＳｅｒを担持する。それらのうち１つ（誘導体４６）は、３個の正電荷のみを担持する。それはＮＡＢ７３９の類似体であり、末端部分としてＮＡＢ７３９がオクタノイルを担持する一方で２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシエタノイル（２−シクロヘキシル−２−ヒドロキシアセチルとしても知られる）を担持するが、それ以外はＮＡＢ７３９と同じである。要するに、前記出願は約１００個の誘導体について記載し、これらは、上記の誘導体例４６を除き、４〜６個の正電荷を担持する。ポリミキシンＥと同じ環状ヘプタペプチド部を有する誘導体例１９、３０、３１、および３２、ならびに、ポリミキシンＳと同じ環状ヘプタペプチド部を有する誘導体例５０を除き、全ての誘導体がポリミキシンＢと同じ環状ヘプタペプチド部を有した。誘導体の多くは、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ｈＲＰＴＥＣ）株ＨＫ−２に対しポリミキシンＢおよびコリスチンより細胞毒性が低かった。さらに、７日間のラット研究では、それらのうち３つ（誘導体例１、４、および１０）が、等価用量のコリスチンよりも少ない程度に尿シスタチンＣ、アルブミン、およびＮＡＧのレベルを上昇させることが示された。前記出願では、Ｎ末端基内のアミノ官能性の存在が、腎毒性を低減させ得ることを示唆する。しかしながら、腎毒性で知られるポリミキシンＢおよびコリスチンにおいて、Ｒ１は遊離アミノ基を担持する。前記出願はまた、Ｎ末端におけるヒドロキシル基および／またはヘテロシクリル基が同様に毒性低減効果を有し得ることを示唆する。
【００１６】
臨床的に重要な腎毒性モデルを見つけることは困難である。Ｍａｇｅｅ  Ｔ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３（上記参照）は、ポリミキシン誘導体５ｘ（式中、Ｒ３は、（ジアミノブチリルではなく）ジアミノプロピオニル、および、脂肪酸アシル置換としての比較的極性の６−オキソ−１−フェニル−１，６−ジヒドロピリジン−３−カルボニルである）が、ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（ｈＲＰＴＥＣ）に対し、ポリミキシンＢより著しく細胞毒性が低いことを示した。さらに、７日間のラット研究では、５ｘの腎毒性はポリミキシンＢより低かった。これらの結果に勇気づけられ、筆者らは、７日間のイヌ研究を行った。この研究では、腎毒性の結果は、５ｘをわずかに支持しただけであった。筆者らは、その種における腎毒性を予測するにはｈＲＰＴＥＣ試験は失敗であったことを指摘しつつ、５ｘは、腎病変に関し、ラットではポリミキシンＢより忍容性が高いが、この利点はイヌでは崩れると結論付けた。
【００１７】
同じ研究所による別の研究では（Ｂｕｒｔ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ−ｓｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１４；  ３７：２０４−１２）、ポリミキシンＢは、イヌおよびサルにおいてＳ−ＣｒｅａおよびＢＵＮ反応の迅速な開始を引き起こしたが、ラットでは引き起こさなかった。筆者らは、ラットにおける反応の欠如は、種特異的なポリミキシンＢの反応および腎生理学における違いに起因し得ると結論付けた。化合物５ｘはこの研究には含まれなかった。Ｓ−ＣｒｅａおよびＢＵＮは臨床治療において腎毒性の非常に重要なマーカであるため、イヌまたはサルなどの動物モデルは、ヒトにおける腎毒性を予測するのに、げっ歯類モデルよりもはるかに信頼性が高いと予想し得た。
【００１８】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏｈＲＰＴＥＣ試験およびｉｎ  ｖｉｖｏラット研究は、他の点では魅力的だが、ヒトにより近い動物モデルでは再現できない見込みある結果を、誤解を招くように提供する場合がある。
【００１９】
ＮＡＢ８１５および上記したその参照化合物ＮＡＢ７３９は、３個の正電荷のみを担持するポリミキシンのカテゴリーに属する。ここで示すように、両方ともカニクイザルにおいてはポリミキシンＢよりも明確に腎毒性が低い。さらに、ＮＡＢ８１５は、ＮＡＢ７３９より腎毒性がはるかに低い。全ての動物がそれに耐えた。一部の患者が他よりも腎毒性の影響をより受けやすいようであることから、ポリミキシンＢおよびコリスチンに対する患者の反応における不均一性は臨床的意義を有する。等しく高用量（３６ｍｇ／ｋｇ／ｄ）のＮＡＢ７３９およびＮＡＢ８１５により引き起こされる形態的所見の組織病理学的比較は、ＮＡＢ８１５での腎症的変化がそれほど深刻ではないことを示す。したがって、ＮＡＢ８１５は、ＮＡＢ７３９より明確に有利である。理論に拘束されることを望むものではないが、これは電荷分布の違いによると考えられる。ＮＡＢ７３９はヘプタペプチド環においてその３個の正電荷を全て担持するが、ＮＡＢ８１５はヘプタペプチド環に２個の正電荷しか担持しない。したがって、ＮＡＢ８１５のヘプタペプチド環は、既知のポリミキシン類のいずれにも似ていない。
【００２０】
同じ発明者の以前の特許出願（ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０５０４４１）および刊行物（Ｖａａｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｏｎｌｙ  Ｔｈｒｅｅ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｈａｒｇｅｓ  Ａｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５２：３２２９−３２３６；  Ｖａａｒａ，Ｍ．，Ｔ．Ｖａａｒａ．２０１０．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｒｒｙ  ｏｎｌｙ  ｔｈｒｅｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅｓ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３１：２３１８−２３２１）では、リング部分に２個の正電荷、テール部分に１個の正電荷を有する全ての分子（ＮＡＢ７１５、ＮＡＢ７１６、およびＮＡＢ７１７）が１つのテーマの変形であった。テールにおける１個の正電荷はＲ３位置にあり、環状部分における２個の正電荷は、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９における３つの潜在的位置の間で移動した。３つの組み合わせ（Ｒ５およびＲ８、Ｒ５およびＲ９、ならびにＲ８およびＲ９における正電荷）のうち１つだけ（Ｒ５およびＲ９）が活性を示したが、該活性は、環状部分（Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９）において３個の正電荷全てを有する最良の化合物（ＮＡＢ７３９およびＮＡＢ７３７）よりも著しく低かった。
【００２１】
本特許出願下で化合物（ＮＡＢ８１５）を設計する際、全く異なるアプローチをとった。テール部分では、（Ｒ２およびＲ３それぞれのＴｈｒおよびＤＴｈｒによる）２個のヒドロキシル基を保存し、正電荷を（Ｒ３ではなく）Ｒ１に置いた。驚くべき結果として、３個の正電荷のうち１つがテール部分に位置しつつ、高い抗菌作用が保たれた。以前の特許出願およびその後の刊行物は、完全長のテール（Ｒ１、Ｒ２およびＲ３）を有し、そこに１つの正電荷を有する化合物はいずれも開示していない。
【００２２】
かなり驚くべきことに、本明細書で示すように、ポリミキシンＢの排出はほぼゼロである一方、ＮＡＢ８１５はカニクイザルにおいて尿にかなりの程度が排出される。これは尿路より生じる重篤な感染症の治療において有利であり得る。
【００２３】
したがって、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
0006471236.tif 000002
（式中、
Ｒ１はＤａｂであり、
Ｒ２はＴｈｒであり、
Ｒ３はＤＴｈｒであり、
Ｒ４はＤａｂであり、
Ｒ５はＤａｂであり、
Ｒ６はＤＰｈｅであり、
Ｒ７はＬｅｕであり、
Ｒ８はＡｂｕであり、
Ｒ９はＤａｂであり、
Ｒ１０はＴｈｒであり、
Ｒ（ＦＡ）はオクタノイルである）
を有する化合物および医薬的に許容されるその塩を提供する。
【００２４】
本発明の化合物は、環状ヘプタペプチド部分Ｒ４〜Ｒ１０およびＮ末端アミノアシル残基Ｒ４に結合した側鎖を含む。側鎖は、Ｒ（ＦＡ）−トリペプチド（Ｒ１〜Ｒ３）残基からなる。Ｒ（ＦＡ）は、トリペプチド側鎖のＮ末端アミノ酸残基のα−アミノ基に結合したオクタノイル残基（ＯＡ）である。
【００２５】
特に、Ｒ１〜Ｒ１０は、アミノ酸配列Ｄａｂ−Ｔｈｒ−ＤＴｈｒ−ｃｙ［ＤＡｂ−ＤＡｂ−ＤＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｂｕ−ＤＡｂ−Ｔｈｒ−］、つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を表す。したがって、本発明の化合物は、ＯＡ−Ｄａｂ−Ｔｈｒ−ＤＴｈｒ−ｃｙ［Ｄａｂ−Ｄａｂ−ＤＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｂｕ−Ｄａｂ−Ｔｈｒ−］、つまりＯＡ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１、またはその医薬的に許容される塩である。
【００２６】
式（Ｉ）の化合物は高い抗菌作用を示し、以下に示す例示的な薬理学的テストの結果により示されるように、投与時に不所望の腎毒性作用をわずかに示すのみか、または全く示さない。
【００２７】
本明細書で用いる略語：Ｄａｂは、α，γ−ジアミノ−ｎ−ブチリル、つまり２，４−ジアミノブチリルを指し；Ａｂｕは２−アミノブチリルを指し；ＴｈｒはＬ−トレオニンを指し、；ＤＴｈｒはＤ−トレオニンを指し；ＤＰｈｅはＤ−フェニルアラニンを指し；ＬｅｕはＬ−ロイシンを指し；ＯＡはオクタノイルを指す。
【００２８】
表現「医薬的に許容される」は、概して安全、無毒であり、生物学的にもその他の点においても有害ではない医薬組成物を調製する際に有用であることを表し、家畜への使用およびヒトへの医薬的使用の両方で有用であることが含まれる。
【００２９】
用語「医薬的に許容される塩」は、酸および塩基を有する塩を指し、これは無毒であることが知られ、医薬文献で一般的に使われている。このような塩の例は、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、安息香酸、酒石酸、および炭酸などの医薬的に許容される無毒な酸の使用により形成される、酸付加塩である。医薬的に許容される塩の形成のために典型的に用いられる酸は、硫酸である。
【００３０】
本明細書で用いる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、その後に記載される一組が他の要素を含む場合もあるが、含む必要はないことを意味する。
【００３１】
本発明の化合物は、臨床的に重要なグラム陰性菌の成長を抑制し、グラム陰性菌を抗菌剤に対し敏感にすることができる。前記グラム陰性菌は、アシネトバクター、アエロモナス、アルカリゲネス、ボルデテラ、ブランメラヘラ、カンピロバクター、シトロバクター、エンテロバクター、エシェリキア、フランシセラ、フソバクテリウム、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシエラ、レジオネラ、モラクセラ、パスツレラ、プレシオモナス、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、およびエルシニア種の属に属するものであり得る。細菌は、例えば、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター・アエロゲネス、エンテロバクターの他の種、シトロバクター・フレウンディ、シュードモナス・アエルギノサ、シュードモナスの他の種、アシネトバクター・バウマンニ、および非発酵性グラム陰性菌の多くの他の種であり得る。細菌には、ヘリコバクター・ピロリおよび他の臨床的に重要なグラム陰性菌も含まれる。特に、前記グラム陰性菌は、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、エンテロバクター・クロアカエ、シトロバクター・フレウンディ、シュードモナス・アエルギノーザ、およびアシネトバクター・バウマンニからなる群から選択され、好適には、前記グラム陰性菌は、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーザ、およびアシネトバクター・バウマンニからなる群から選択される。
【００３２】
本発明の化合物で処置できる細菌感染症としては、例えば、菌血症、敗血症、皮膚および軟組織感染症、肺炎、髄膜炎、骨盤の腹膜部分の感染、異物感染、血液患者の発熱、静脈ラインもしくは他のカテーテル、キャニルおよび／または装置に関連する感染症、胃腸管、目、または耳における感染症、表在性皮膚感染症、ならびに、潜在的に有毒な細菌による胃腸管、粘膜、および／または皮膚のコロニー形成が挙げられる。
【００３３】
本発明の化合物は、細菌感染および／または細菌感染症、特にグラム陰性菌により引き起こされるものの処置に有用であり得る。炎症性の病気および症状の例としては、限定されるわけではないが、重篤な院内感染症、免疫不全患者の感染症、臓器移植患者の感染症、集中治療室（ＩＣＵ）での感染症、火傷による重篤な感染症、重篤な市中感染症、嚢胞性線維症患者の感染症、および多耐性グラム陰性菌によって引き起こされる感染症が挙げられる。
【００３４】
したがって、本発明により、本明細書で定義する化合物または本明細書で定義する医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、細菌感染症、特にグラム陰性菌により引き起こされる感染症を処置する方法を提供する。
【００３５】
本発明の化合物は、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約３００ｍｇ、好適には３ｍｇ〜１００ｍｇの間の１日投与量範囲内の有効量で投与され得る。本発明の化合物は、１日１回用量で投与するか、または、１日の総投与量を１日に２回、３回、または４回に分割した用量で投与することができる。
【００３６】
「有効量」は、処置を受ける対象に治療効果を与える化合物の量を指す。治療効果は客観的である場合と（つまり、いくつかのテストまたはマーカで測定可能）、主観的である場合（つまり、対象が効果の兆候を示すか、または効果を感じる）がある。このような処置では、病状を必ずしも完全に改善する必要はない。さらに、このような処置または予防策は、当業者の知っている、症状を減らすための他の伝統的処置と組み合わせて用いることが可能である。
【００３７】
本発明の化合物は、最も好適には、単独で、または他の有効成分、特に他の抗菌剤において用いる。前記他の有効成分は、本発明の化合物と同時に、または、任意の順序で連続的に投与することができる。前記抗菌剤は、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシンおよび他のマクロライド類、ケトライド類、フルオロケトライド類、クリンダマイシンおよび他のリンコサミン類、ストレプトグラミン類、リファンピン、リファブチン、リファラジルおよび他のリファマイシン類、フシジン酸、ムピロシン、オキサゾリジノン類、バンコマイシン、ダルババンシン、テラバンシン、オリタバンシンおよび他のグリコペプチド系抗生物質、フルオロキノロン類、バシトラシン、テトラサイクリンおよびフルオロサイクリンの誘導体、ベータラクタム系抗生物質、ノボビオシン、プレウロムチリン類、葉酸合成阻害剤、デホルミラーゼ阻害剤、ならびに細菌排出ポンプ阻害剤からなる群から選択することができる。特に、前記抗菌剤は、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、テリスロマイシン、ソリスロマイシン、クリンダマイシン、ストレプトグラミン合剤キヌプリスチン−ダルホプリスチン、エラバサイクリン、ミノサイクリン、オマダサイクリン、リファンピン、リファブチン、リファラジル、フシジン酸、ムピロシン、オキサゾリジノンテジゾリドおよびリネゾリド、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、テラバンシン、フルオロキノロン系のモキシフロキサシン、デラフロキサシンおよびアバラフロキサシン（ａｖａｒａｆｌｏｘａｃｉｎ）、ならびに葉酸合成阻害剤トリメトプリムからなる群から選択することができる。
【００３８】
本発明の化合物は、非経口、皮下、静脈内、関節内、くも膜下腔内、筋肉内、腹腔内などの種々の経路により、皮内注射により、経皮、直腸、口腔、口腔粘膜、鼻腔、眼球の経路を介して、吸入を介して、および移植を介して、投与することができる。
【００３９】
有効成分として本発明の化合物を含む医薬組成物は、さらに、活性化合物を医薬的に用いることが可能な製剤に加工することを容易にする、医薬的に許容される担体および／または賦形剤といった医薬的に許容される添加剤を含むことができる。適切な医薬組成物は、１つまたは複数の他の有効成分、特に、上記の抗菌剤と組み合わせて本発明の化合物を含み得る。化合物は適切な組成物に配合することができ、適切な投与形式としては、例えば、溶液、分散体、懸濁液、粉、カプセル、タブレット、ピル、制御放出カプセル、制御放出タブレット、および制御放出ピルが挙げられる。
【００４０】
調製法の概要
本発明の化合物は、当技術分野で既知の方法により調製することができる。以下の例は、式（Ｉ）の化合物の調製を示す。
【００４１】
実施例１：ＮＡＢ８１５の合成
ＮＡＢ８１５はオクタノイル−αＤａｂ−Ｔｈｒ−ＤＴｈｒ−［シクロ−α，γＤａｂ−αＤａｂ−ＤＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｂｕ−αＤａｂ−Ｔｈｒ］という構造式を有し、式中、Ｒ１０のカルボキシ末端Ｔｈｒは、そのカルボキシル基を介してＲ４の２，４−ジアミノ酪酸残基（Ｄａｂ）の４−アミノ基に結合し、相対分子質量は１１７５．４４であるが、該ＮＡＢ８１５は、例えば、ＮＡＢ７３９などの他のポリミキシン誘導体に関し以前記載された方法論（米国特許第７８０７６３７号明細書）を用いた、従来の固相化学により合成することが可能である。Ｃ末端のアミノ酸は、固相に予め付着したものとして市販されており、樹脂を酸で開裂するとＣ末端カルボキシル酸が生じる。
【００４２】
保護における戦略は、αアミノ官能基に対する一時的なＦｍｏｃ保護、酸開裂段階中に除去される基による環化に伴うＤａｂ残基のγ−アミノ基の保護、および、環化反応が起きる間に反応性側鎖官能基を覆う半永久的保護という３つのレベルの直交保護の使用である。樹脂からペプチドを開裂した後、Ｃ末端カルボキシル酸をＲ４のジアミノ酪酸残基（Ｄａｂ）のγ−アミノ基と反応させて環状ペプチドを形成する。環化工程後、半永久的保護基を除去してＮＡＢペプチドを得る。
【００４３】
したがって、アミノ酸のαアミノ官能基をフルオレニル−メトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）によって保護し、Ｆｍｏｃを各サイクルで２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）により除去する。環化に関係するアミノ酸、つまりＲ４のＤａｂを、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）、開裂工程で除去される不安定な酸の基により保護する。側鎖官能基を有するアミノ酸は、酸開裂段階で安定な基、つまり、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）により保護する。アミノ酸のＤ−フェニルアラニンおよびロイシンは、当然側鎖の保護を必要としない。アミノ末端は保護されず、これによりアシル化手順における直接的な反応を可能にする。
【００４４】
合成工程を、Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）を活性剤として用いた市販の自動化シンセサイザーで行った。
【００４５】
４倍モル過剰の各アミノ酸または脂肪酸と、４倍モル過剰の活性剤ＨＣＴＵ（上記参照）と、８倍モル過剰のＮ−メチルモルホリンとを用いることにより、アシル化を行った。反応時間は３０分であった。
【００４６】
アミノ酸は一般の業者から、既に保護された状態で購入した。ペプチドを室温で９５％トリフルオロ酢酸および５％水の溶液で２時間反応させることにより樹脂から除去して、部分的に保護された生成物を得た。結果として生じた生成物をジエチルエーテルで沈殿させた。
【００４７】
使用した環化混合物は、モル過剰２倍のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｏｐ）、モル過剰２倍のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）、およびモル過剰４倍のＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）であった。ペプチドをジメチルホルムアミドに溶解し、環化混合物を加えて２時間反応させた。環化し、保護したペプチドを冷ジエチルエーテルの添加により沈殿させた。あらゆる残留ＰｙＢｏｐを、ペプチドを水で洗浄することにより除去した。
【００４８】
残りの側鎖保護基（Ｚ）を触媒脱水素により除去した。ペプチドを酢酸−メタノール−水（５：４：１）に水素雰囲気下およびパラジウム炭触媒の存在下で溶解した。
【００４９】
ペプチドを、アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸の従来の勾配を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。生成物を凍結乾燥によって乾燥させた。
【００５０】
ＮＡＢ８１５をその硫酸塩に転化した。生成物は白色凍結乾燥物であった。溶液（水１ｍＬに対し１ｍｇ）におけるその外観は透明で無色であった。ＥＳＩ−ＭＳにより確認すると、ｍは１１７５．４ｕ（平均質量）であった。
【００５１】
薬理学的テスト
本発明を例示的な方法で示すために以下の例を提供するが、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきではない。さらに、試験における化合物の濃度は例示であり、限定と取るべきではない。当業者は、当分野で既知の方法を用いて、医薬的に適切な濃度を定義することができる。倫理行為規範および適切な動物実験方針に従って全ての動物実験を行った。
【００５２】
実施例２：ＮＡＢ８１５の抗菌作用およびそのコンパレータ
化学物質源：ＮＡＢ８１５硫酸塩（ロット１０５１６０７；ＨＰＬＣによる純度、９８．８％）およびオクタノイル−Ｔｈｒ−ＤＳｅｒ−［シクロ−α，γＤａｂ−αＤａｂ−ＤＰｈｅ−Ｌｅｕ−αＤａｂ−αＤａｂ−Ｔｈｒ］、つまりＯＡ−ＳＥＱ  ＩＤ  ２という構造式を有するＮＡＢ７３９硫酸塩（ロット１０４９８５１、ＨＰＬＣによる純度、９７．３％）。ポリミキシンＢ硫酸塩は、シグマアルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した（カタログ番号Ｐ０９７２、ロットＢＣＢＦ８３８２Ｖ；純度、８９．３％。）
【００５３】
最低阻害濃度（ＭＩＣ）試験を、ＣＬＳＩ標準方法論およびＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１２に記載されるＭｕｅｌｌｅｒ−ＨｉｎｔｏｎＩＩブロス（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ。認可基準、第９版、ＣＬＳＩドキュメントＭ０７−Ａ９、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ペンシルバニア州ウェイン）を用いて３回完了した。５％ヒツジ血液を含有するトリプチケースソイ寒天培地での一晩培養により、開始接種原（５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を調製した。マイクロタイタープレートを３５℃で２０時間インキュベーションし、その時点で視覚的に読み取った。ポリミキシン誘導体を、グラム陰性菌の無傷外膜が透過性障害として機能するような抗菌剤のモデル化合物であるリファンピンと組み合わせて用いることにより、相乗研究を行った。
【００５４】
表１は、ＭＩＣ値（μｇ／ｍＬ）、つまり、ポリミキシンＢ、参照化合物（ＮＡＢ７３９）、および本発明の化合物（ＮＡＢ８１５）の単独の抗菌作用と、固定濃度のリファンピン（０．２５μｇ／ｍＬ）＊と組み合わせた場合の抗菌作用を示し、ポリミキシン感受性株およびポリミキシン非感受性株の両方が含まれる。
【００５５】
【表１】
0006471236.tif 000003
＊リファンピンを欠く場合のＭＩＣ値は、三重測定による形式上のＭＩＣ値および二重チェッカーボード試験によるＭＩＣの一覧である。リファンピン（０．２５μｇ／ｍＬ）の存在下でのＭＩＣ値は、二重チェッカーボード試験による。（三重測定による）各標的株に対するリファンピンの形式上のＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）を、標的細菌株の名称の後の括弧内に示す。
【００５６】
大腸菌、Ｋ．ニューモニエ、およびアシネトバクターといったポリミキシン感受性株に対するＮＡＢ８１５のＭＩＣは、ＮＡＢ７３９およびポリミキシンＢのそれと同じであるか、または非常に近かった。ポリミキシンＢは、緑膿菌、ならびにポリミキシンＢに対し感受性が低い３株のうちの２つ（Ｋ．ニューモニエＪＭ１０９およびＡ．バウマンニＣＭＩ４１７）に対しては、ＮＡＢ８１５およびＮＡＢ７３９よりも高い作用を示した。
【００５７】
阻害濃度以下の３つのペプチドは全て、リファンピンの作用を著しく増強した（表１）。１μｇ／ｍＬでは、ＮＡＢ８１５は、Ｋ．ニューモニエＡＴＣＣ４３８１６に対するリファンピンのＭＩＣを１６μｇ／ｍＬから０．２５μｇ／ｍＬまで低減させ（つまり６４分の１）、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２および大腸菌ＪＭＩ３３２８に対するそれは８μｇ／ｍＬから０．２５μｇ／ｍＬまで低減させた（つまり３２分の１）。実に重要なことには、ポリミキシン類に対し感受性の低下を示した株も、ＮＡＢ８１５およびリファンピンの組み合わせ作用に対する感受性は高かった。非常に類似した結果がＮＡＢ７３９でも得られた。緑膿菌に対しては、ＮＡＢ８１５およびＮＡＢ７３９は両方とも、注目に値するリファンピンとの相乗作用はなかった。
【００５８】
結論を言えば、ＮＡＢ８１５およびＮＡＢ７３９の抗菌作用は、単独時だけでなくリファンピンの存在下でも互いに同じであるか、または非常に近かった。
【００５９】
実施例３：毒性およびトキシコキネティクスの研究
毒性およびトキシコキネティクスのｉｎ  ｖｉｖｏ研究を、カニクイザルを用いて行った。動物研究を行った研究所は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）により認証されており、米国実験動物福祉局（ＯＬＡＷ：Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ）により発行された動物福祉保証（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ）を有し、アメリカ農務省（ＵＳＤＡ）に登録し、人道的保護および実験動物の使用に関する適用可能な法規の順守に責任を有する施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）を有する。
【００６０】
実験されたことのないメスのカニクイザルを研究室に２８日間順化させ、その間に各動物に永久的な留置大腿カテーテルを植え込んで、継続的な静脈注入を可能にした。動物には、投薬を始める前に少なくとも２週間の術後回復期を与えた。
【００６１】
化学物質源は次の通りであった：ＮＡＢ８１５硫酸塩（ロット１０５１６０７；ＨＰＬＣによる純度９８．８％およびロット１０５４３０８；ＨＰＬＣによる純度９８．４％）ならびにＮＡＢ７３９硫酸塩（ロット１０４９８５１、ＨＰＬＣによる純度９７．３％）。ポリミキシンＢ硫酸塩は、シグマアルドリッチ（カタログ番号Ｐ０９７２、ロット番号ＢＣＢＦ８３８２Ｖ）からであった。使用日の各日において、適切な量のＮＡＢ７３９、ＮＡＢ８１５、またはポリミキシンＢを量り、適切な量の滅菌生理食塩水に溶解して各試験物および陽性対照用の原液を調製した。補正因子を原液調製に用いて、各試験物における純度および硫酸塩含有量の両方を説明した。したがって、（３６ｍｇ／ｋｇ／ｄといった）用量は、硫酸塩としてではなく遊離塩基形態としての純ペプチドの用量を指す。
【００６２】
容量は以下の通りであった：ポリミキシンＢ  １８ｍｇ／ｋｇ／ｄ（群１）、ポリミキシンＢ  ２４ｍｇ／ｋｇ／ｄ（群２）、ＮＡＢ７３９  ２４ｍｇ／ｋｇ／ｄ（群３）、ＮＡＢ７３９  ３６ｍｇ／ｋｇ／ｄ（群４）、ＮＡＢ８１５  ２４ｍｇ／ｋｇ／ｄ（群５）、ＮＡＢ８１５  ３６ｍｇ／ｋｇ／ｄ（群６）。３頭の動物が各研究群に含まれた。
【００６３】
７日間、動物に、１日３回（ＴＩＤ）、静脈内（ＩＶ）注入により１０ｍＬ／ｋｇの用量体積を１時間（±１０分）の間、８±０．５時間間隔で投与した。最初の用量投与日を研究１日目と指定し、後続日には連続的に番号を付けた。最初の用量投与日前の日には、−１日目のように、順化の最終日を用いて連続的に番号を付けた。
【００６４】
以下のパラメータ：臨床的観察、体重、臨床病理学（血液学、凝固、血液生化学検査、尿沈査および尿生化学検査を含む尿検査）、トキシコキネティクス（血漿および尿）、ならびに解剖病理学（腎臓）を、予定した間隔で評価した。予定外の理由で殺処分した動物の場合、殺処分日にサンプルを採取した。
【００６５】
剖検日に、動物にケタミンを投与し、体重を量り、市販のペントバルビタールおよびフェニトインの溶液の静脈内注入で麻酔をかけ、続けて放血した。
【００６６】
生存中の動物については、末期剖検を８日目に行った。ポリミキシンＢ群では、予定外の剖検を、１８ｍｇ／ｋｇ／ｄを投薬した１頭（群１）および２４ｍｇ／ｋｇ／ｄを投薬した２頭（群２）については４日目に、１８ｍｇ／ｋｇ／ｄを投薬した２頭（群１）については５日目に行った。３６ｍｇ／ｋｇ／ｄを投薬したＮＡＢ７３９群（群４）の１頭についても、予定外の剖検を５日目に行った。
【００６７】
剖検では、粗観測および臓器の重量を記録し、特定の組織を回収した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した腎臓断片において組織病理学を実行した。
【００６８】
トキシコキネティクス（ＴＫ）研究での血漿および尿の濃度は、タンパク質沈殿後、質量分析計に接続された液体クロマトグラフを用いることにより求めた。サンプル（１００μＬ）を、水：ギ酸（９９：１ｖ／ｖ；５０ｍＬ）の内部標準溶液と混ぜた。次に、６００μＬの１００：１のアセトニトリル：ギ酸を加えた。プレートを３２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。Ｔｏｍｔｅｃ  Ｑｕａｄｒａ９６を用いて、４５０μＬのアリコットを新しい９６ウェルプレートに移し、４０℃の窒素下で乾燥させた。次に、２００μＬの水：メタノール：ギ酸（８５：１５：１  １ｖ／ｖ）を加えて、プレートをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ注入用に封止した。ＬＣ−ＭＳシステムは、ポジティブイオンモードでイオン化されたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅトリプル四重極ＭＳに接続されたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ液体クロマトグラフから構成されている。各サンプル（２０μＬ）を、５０℃で平衡させたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８カラム（２．１×５０ｍｍ；１．７μｍ）に注入した。移動相Ａは８５：１５：１ｖ／ｖの水：メタノール：ギ酸であった。移動相Ｂは、５０：５０：１ｖ／ｖのアセトニトリル：メタノール：ギ酸であった。
【００６９】
全化合物を定量化するのに適した勾配を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0006471236.tif 000004
【００７１】
各化合物の質量トランジションおよび保持時間を表３に示す。
【００７２】
【表３】
0006471236.tif 000005
【００７３】
内部標準としてコリスチンを用いた、ポリミキシンＢへの（１／濃度２）直線当てはめを用いて、キャリブレーション標準応答に由来するピーク面積率の回帰処理を行った。ＮＡＢ７３９およびＮＡＢ８１５では、（内部標準を使用せず）（１／濃度２）二次当てはめを用いてキャリブレーション標準応答に由来するピーク面積率の回帰処理を行った。
【００７４】
回帰モデルは、開発時に用いた濃度範囲にわたる分析対象の挙動に基づいて選択した。
【００７５】
トキシコキネティクス分析をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．３  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ノースカロライナ州ケーリー）を用いて行った。血漿ＴＫには、無隔壁ＩＶ注入モデルを用いた。
【００７６】
図は、血中尿素窒素レベル（Ｓ−ＢＵＮ；図１）および血中クレアチニンレベル（Ｓ−Ｃｒｅａ；図２）を示し、両方とも、処置を受ける前の動物と、その後ポリミキシンＢ、ＮＡＢ７３９、またはＮＡＢ８１５を投薬した同じ動物における、腎障害用の血液マーカである。図はまた、尿Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ／尿クレアチニン比（Ｕ−ＮＡＧ／Ｃｒｅａ；図３）および尿γグルタミルトランスフェラーゼ／尿クレアチニン比（Ｕ−ＧＧＴ／Ｃｒｅａ；図４）を示し、両方とも該動物における腎障害用の尿バイオマーカである。Ｓ−ＣｒｅａおよびＵ−Ｃｒｅａは、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＯＡ）と修正Ｊａｆｆｅ法を用いることにより測定し、Ｓ−ＢＵＮはＯＡおよびウレアーゼ／Ｌ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いることにより測定した。Ｕ−ＮＡＧは、ＯＡ／酵素を用いることにより測定し、Ｕ−ＧＧＴはＯＡおよびグルタミル−カルボキシ−ｐ−ニトロアニリドＩＦＣＣを用いることにより測定した。図１〜４において、「＊」は、重い腎毒性作用のため動物を安楽死させなければならなかったことを示す。
【００７７】
ＮＡＢ８１５は、ＮＡＢ７３９より忍容性が著しく高かったと結論付けることが可能である。３６ｍｇ／ｋｇ／ｄのＮＡＢ７３９を投薬した一頭の動物は、重い腎毒性作用のため安楽死させなければならなかった。この動物では、４つのマーカ全てが著しく上昇した。３６ｍｇ／ｋｇ／ｄのＮＡＢ７３９を投薬した別の動物は、尿バイオマーカの両方が顕著に上昇した。対照的に、ＮＡＢ８１５の動物は、４つのパラメータの上昇が見られたとしてもわずかしか示さず、予定されていた剖検を受けることはなかった。
【００７８】
２４ｍｇ／ｋｇ／ｄの用量では、ＮＡＢ７３９を投薬した一頭の動物のＳ−Ｃｒｅａが目立った上昇を示した。同等用量のＮＡＢ８１５を投薬した動物では、いずれのパラメータも上昇しなかった。
【００７９】
予想したように、ポリミキシンＢは著しく有毒であった。２４ｍｇ／ｋｇ／ｄのポリミキシンＢを投薬した２頭の動物および１８ｍｇ／ｋｇ／ｄのポリミキシンＢを投薬した３頭の動物の全てを、安楽死させなければならなかった。６頭の動物全てにおいて、Ｓ−ＢＵＮ、Ｓ−Ｃｒｅａ、およびＵ−ＧＧＴ／Ｃｒｅａが顕著に上昇した。Ｕ−ＮＡＧ／Ｃｒｅａは５頭の動物において顕著に上昇した。
【００８０】
等しく高用量（３６ｍｇ／ｋｇ／ｄ）のＮＡＢ７３９およびＮＡＢ８１５により引き起こされる形態的所見の組織病理学的比較によると、ＮＡＢ８１５での腎症的変化はそれほど深刻ではなかった。以下の神経病理的パラメータの存在を各動物において記録した：尿細管好塩基性（再生）、尿細管変性／壊死、（単核および／または混合炎症細胞による）浸潤、尿細管拡張、ならびに尿細管円柱。各パラメータは以下のように点数を付けた：グレードコード＝０：著しい所見なし；１：最小；２：軽い；３：中程度；４：顕著。顕著な所見は、安楽死させた、ＮＡＢ７３９で処置した動物でのみ記録され、次のようであった：顕著な尿細管変性／壊死および顕著な尿細管円柱の存在。処置に耐えたＮＡＢ７３９で処置した動物では、両方とも２つのパラメータで中程度の所見が見られた。ＮＡＢ８１５で処置した動物のうち２頭では、両方とも１つのパラメータにおいてのみ中程度の所見が見られた。ＮＡＢ８１５で処置した３頭目の動物は、最小のまたは軽い所見以外はなかった。したがって、ＮＡＢ８１５で処置した動物では、ＮＡＢ７３９で処置した動物で観察されるものと比較し、組織変化はそれほど深刻でなかった。
【００８１】
８ｍｇ／ｋｇを注入した後の、ＮＡＢ８１５の０ｈ〜８ｈの濃度時間下面積（ＡＵＣ０〜８ｈ、ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）は、１日目に求めると１０２（ＳＤ＝５）で、７日目に求めると１１０（ＳＤ＝１２）であった。等価用量（８ｍｇ／ｋｇ）のＮＡＢ７３９の後では、対応する値は１０８（ＳＤ＝２）および１３７（ＳＤ＝２）であった。等価用量のポリミキシンＢ（８ｍｇ／ｍＬ）の後では、１日目に求めると、値は１１２（ＳＤ＝５）であった。したがって、３つの化合物それぞれのＡＵＣ値は互いに非常に近かった。
【００８２】
かなり驚くべきことに、ＮＡＢ８１５の用量のかなりの部分が注入後８時間以内に尿に排出された（０〜８ｈ回収率）。８ｍｇ／ｋｇのＮＡＢ８１５を注入した後の０〜８ｈ回収率は、最大で用量の３８％、５５％、および８８％であった（各動物で得られたパーセンテージ）。ＮＡＢ７３９での対応する回収率は、最大で２０％、９１％、および９２％であり、ポリミキシンＢでのそれは１％、２％、および２％であった。結果として生じるＮＡＢ８１５およびＮＡＢ７３９の尿における濃度は、非常に高かった、８ｍｇ／ｋｇのＮＡＢ８１５を注入した後、１７５、２２５、および２６０μｇ／ｍＬもの高濃度が０〜４ｈまたは４〜８ｈのサンプルの何れかで見られた（各動物で得られた濃度）。ＮＡＢ７３９での対応する濃度は、８０、１４０、および１５５μｇ／ｍＬであり、ポリミキシンＢでのそれは７、９、および１５μｇ／ｍＬであった。
【００８３】
要するに、ＮＡＢ８１５は、ＮＡＢ７３９より著しく腎毒性が低かった。両化合物のＡＵＣは、互いに非常に近かった。両者ともかなりの程度が尿に排出され、結果的に尿における濃度は非常に高かった。
【００８４】
実施例４：さらなる薬物動態学的データ
データは、ペプチドを１日３回の１時間静脈内注入として投与した、実施例３に記載したカニクイザルの研究による。ペプチドの血漿レベルおよび尿レベルを実施例３のように求めた。
【００８５】
３６ｍｇ／ｋｇ／ｄのペプチドを投与した場合、ＮＡＢ８１５のＡＵＣ（ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）は、１日目および７日目それぞれにおいて１５３（ＳＤ、３２）および２０５（ＳＤ、５６）であった。ＮＡＢ７３９の対応する値は、２３９（ＳＤ、９）および３０２（ＳＤなし、動物頭数、２）であった。この投与量では、ＮＡＢ８１５の尿回収率（０〜８ｈ尿収集）は、３頭の動物について１日目で１４．３％、２０．９％、および３６．３％、７日目で３３．９％、４０．５％、および４１．９％であった。ＮＡＢ７３９の対応する値は、１日目で１５．４％、２０．４％、および２６．４％、７日目で３０．６％および５５．８％であった（２頭の動物のみ）。さらに、ＮＡＢ８１５の尿濃度（μｇ／ｍＬ、０〜８ｈ尿収集）は、３頭の動物について１日目で１１４、１７３、および２６５、７日目で１７、６２、および１４９であった。ＮＡＢ７３９の対応する値は、１日目で３３、８２、および９２、７日目で２６８および３４８であった（２頭の動物のみ）。
【００８６】
実施例５：ＮＡＢ８１５とポリミキシンＢのマウス尿路感染症における効力比較
研究では、体重２８〜３２グラムの６４匹の非近交ＯＦ−１メスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、フランス）、および大腸菌Ｃ１７５−９４（血清型Ｏ８：Ｋ４８：Ｈ４）、１型線毛を産生する臨床分離体を用いた。ペプチドは、ＮＡＢ８１５（ロット１０５４３０８）およびポリミキシンＢ（シグマアルドリッチ、バッチＢＣＢＦ８３８２Ｖ）であった。研究は、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（デンマーク、コペンハーゲン）が行った。
【００８７】
研究開始前の３日間および研究中、マウスは飲料水として５％グルコースを自由に利用できた。
【００８８】
０日目において、腹腔をそっと押すことにより膀胱から尿を取り出した。その後、約０．１５ｍＬのＺｏｌｅｔｉｌ  ｍｉｘ（登録商標）を皮下投与することによりマウスを麻痺させた。細菌懸濁液を含有するポリエチレンカテーテルを備えたシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｓｏｎ）を尿道を介して膀胱に挿入し、５０μＬの細菌接種原をゆっくりと膀胱に注入した。その後、マウスをケージに置いた。マウスを暖かいキャビネットに置き、完全に目を覚ますまで監視下においた。
【００８９】
コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した後、８．０８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／マウスに対応する９．３８ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬを含有するように、接種原を決定した。
【００９０】
感染後１日目および２日目において、マウスをＮＡＢ８１５、ポリミキシンＢ、または溶媒（０．９％ＮａＣｌ）を含有する溶液（０．２ｍＬ）を用いて１日に２回、皮下的に処置した。処置群（それぞれ６匹のマウス）は以下のようであった：溶媒対照；ＮＡＢ８１５、０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量；ＮＡＢ８１５、０．５ｍｇ／ｋｇ／用量；ＮＡＢ８１５、１ｍｇ／ｋｇ／用量；ＮＡＢ８１５、２ｍｇ／ｋｇ／用量；ポリミキシンＢ、０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量；ポリミキシンＢ、０．５ｍｇ／ｋｇ／用量；ポリミキシンＢ、１ｍｇ／ｋｇ／用量；およびポリミキシンＢ、２ｍｇ／ｋｇ／用量。加えて、１群は予備処置対照として機能し、感染後１日目の処置開始前に、感染が如何に進行したかを評価するのに役立った。
【００９１】
感染後１日目、２日目、および３日目に、コロニーカウントのために尿のサンプルを抽出した。感染後１日目（予備処置対照群）および感染後３日目（他の群全て）に尿サンプルを採取した後、頚椎脱臼によりマウスを殺処分し、膀胱および腎臓を無菌的に取り出した、膀胱および腎臓を−８０℃で保存し、その後、０．５ｍＬおよび１ｍＬの生理食塩水にそれぞれ均質化した。
【００９２】
尿におけるＣＦＵをサンプリング後２〜３時間以内に即時に求めた。冷凍した臓器を解凍し、ｔｉｓｓｕｅ  ｌｙｓｅｒのスチールビーズを用いて均質化した。全サンプル、つまり尿、腎臓、および膀胱を生理食塩水において１０倍に希釈し、２０μＬのスポットを２通りで血液寒天平板に適用した。加えて、未希釈の尿サンプル（尿の量に応じて２〜１００μＬ）を、別の寒天平板に広げて、検出できる最低レベルのコロニーカウントを求めた。全ての寒天平板を周辺空気中で、１８〜２２時間、３５℃でインキュベーションした。
【００９３】
感染後１日目の予備処置対照群のレベルを、３日目の処置開始２日後のレベルと比較すると、１ｍｇ／ｋｇ／用量および２ｍｇ／ｋｇ／用量のＮＡＢ８１５での処置は、結果的に、尿におけるＣＦＵレベルを著しく減少させた（それぞれ、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５（ＡＮＮＯＶＡ  Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定法））。対照的に、溶媒対照群、０．２５ｍｇ／ｋｇ／用量および０．５ｍｇ／ｋｇ／用量を投薬したＮＡＢ８１５群、ならびにポリミキシンＢ群では、対応するレベルの間に著しい差は見られなかった。
【００９４】
ＮＡＢ８１５での処置は、膀胱および腎臓のＣＦＵにおいて、用量応答の傾向を示したが、ポリミキシンＢでの処置は、いずれの用量応答傾向も示さなかった。
【００９５】
０．２５〜２ｍｇ／ｋｇ／用量のＮＡＢ８１５で処置した２４匹の全マウスのうち、８匹のマウスの尿および２０匹のマウスの腎臓における細菌レベルは検出限界を下回ったが、ポリミキシンＢで処置した対応する数のマウスでは、それぞれ１および１０であった。
【００９６】
当業者には、技術が進歩すると、発明概念は様々な方法で実行可能であることが明らかだろう。発明およびその実施形態は上記の例に限定されず、特許請求の範囲内で変わり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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