(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に感受性であり、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現し、トランスポゾンの使用によりSV40 T抗原をコードする遺伝子が細胞ゲノムに組込まれ、レトロウイルス遺伝子発現が可能なレトロウイルス長末端反復ＤＮＡを含まないことを特徴とする不死化ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）。
【請求項２】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を含まない、請求項１に記載の不死化ＰＡＭ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の不死化ＰＡＭを含む細胞培養物。
【請求項４】
ＰＲＲＳＶに感染している、請求項３に記載の細胞培養物。
【請求項５】
Ｍ−ＣＳＦを含む、請求項３または４に記載の細胞培養物。
【請求項６】
ａ）ブタ被験体から細胞含有気管支肺胞洗浄サンプルを得る工程、
ｂ）該サンプルから細胞成分を分離する工程、
ｃ）トランスポゾンを含み、適当なプロモーターの制御下でＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子で該細胞成分をトランスフェクトする工程、および
ｄ）少なくとも５細胞周期にわたって培養されたＰＡＭ細胞を選択する工程
を含む、請求項１または２に記載の不死化ＰＡＭの製造方法。
【請求項７】
工程ｄ）において、少なくとも１０細胞周期にわたって培養された細胞を選択する、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
トランスフェクション工程前に細胞含有気管支肺胞洗浄サンプルおよび／または細胞成分に少なくとも５ｎｇ／ｍｌの量のＭ−ＣＳＦを加える工程を含む、請求項６または７に記載の製造方法。
【請求項９】
工程ｄ）中および／または該不死化ＰＡＭの培養中に少なくとも１ｎｇ／ｍｌの量のマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を加える工程を更に含む、請求項６〜８のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１０】
ａ）請求項１または２に記載の不死化ＰＡＭを培養する工程、
ｂ）該不死化ＰＡＭをＰＲＲＳウイルスと接触させる工程、
ｃ）ＰＲＲＳＶを複製させる工程、および、
ｄ）後代ウイルスを単離する工程
を含む、ＰＲＲＳＶの複製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法、およびそれに続く、該ウイルスを医薬上許容される担体と混合する工程を含むことを特徴とする、ＰＲＲＳＶを含むワクチンの製造方法。
【請求項１２】
ＰＲＲＳＶが生弱毒化または不活化形態である、請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は不死化ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）、かかるＰＡＭを含む細胞培養物、ＰＡＭの不死化のための方法、不死化ＰＡＭ上でのＰＲＲＳウイルスの複製方法、およびＰＲＲＳＶを含むワクチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、世界中の養豚業に影響を及ぼす最も経済的に重要なアルテリウイルスである。このウイルスの感染は成長遅延、飼料効率の低減、食欲不振および発熱（仕上げブタに対する離乳におけるもの）、妊娠ブタにおける流産および若いブタにおける呼吸障害を引き起こす。米国だけでも、ＰＲＲＳＶ感染に関連した年間損失は２００５年には約５億６０００万ドルおよび２０１１年には６億６４００万ドルにのぼると推定された。ＰＲＲＳＶ感染は養豚業における健康問題の第１位にランクされている。２００６年の東南アジアにおけるＰＲＲＳＶの高病原性株の出現、およびアジアの養豚業が世界最大であることを考慮すると、世界のこの地域における損失は、欧州および米国に関して報告されているものより一層高いと考えても差支えないであろう。
【０００３】
ＰＲＲＳＶは養豚業にとって依然として重大な脅威である。なぜなら、生弱毒化ワクチンおよび不活化ワクチンの両方がＰＲＲＳＶに対して利用可能であるにもかかわらず、関連疾患を抑制することが困難であることが判明しているからである。
【０００４】
生弱毒化ワクチンの場合も不活化ワクチンの場合も、ＰＲＲＳＶワクチンの製造のためには、感受性細胞上で該ウイルスが複製される必要がある。ＰＲＲＳＶの増殖に直面する問題の１つは該ウイルスの非常に限定された細胞指向性である。それは主として初代ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）に感染する。そのようなＰＡＭは入手が困難であり、それらは通常、通常は６〜１２週齢の子ブタの肺洗浄により得られる（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．ら，Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  １３：１２１−１３０（１９９１））。この方法は面倒であり、高価であり、バッチ間の大きなばらつきを有するバッチを与える。更に、初代ＰＡＭは非常に限られた長さの時間しか細胞培養内で維持できない。したがって、初代ＰＡＭはＰＲＲＳＶの増殖に非常に適しているが、それは例えば実験的感染研究および実験的ワクチンの製造に有用であるに過ぎない。初代ＰＡＭ上の商業的ワクチンの製造は経済的には実施不可能である。
【０００５】
この問題ゆえに、科学者は、ＰＲＲＳＶに感受性である他の細胞またはより良好な細胞系を見出すことを試みている。以下の３つの細胞系のみが特定されている：ＭＡ１０４サル腎細胞系ならびにＭＡ１０４の２つの誘導体であるＭＡＲＣ−１４５およびＣＬ２６２１細胞（Ｋｕｍａｒ  Ｓｈａｎｍｕｋｈａｐｐａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００７，４：６２）。これらの細胞系はＰＲＲＳＶの増殖のために現在商業的に使用されている。
【０００６】
これらの細胞系上でＰＲＲＳＶを比較的高い力価まで増殖させることは可能であるが、ブタ細胞系でさえないそのような非ＰＡＭは以下の欠点を有する。すなわち、それらはＰＲＲＳＶの自然宿主ではないため、これらの細胞系にＰＲＲＳＶを順応させなければ、高い力価を得ることができない。その結果、ＭＡ１０４もＭＡＲＣ−１４５またはＣＬ２６２１も、新たに見出された野外株の増殖のための第１の候補とはならないであろう。ＰＡＭは、新規ＰＲＲＳＶ野外分離体を拾い上げるためには、遥かに好適であろう。不死化ＰＡＭ細胞系は前記の問題の解決策をもたらしうると期待されている。
【０００７】
不死化ＰＡＭ細胞系は、原理的には、限定的なものではないがその継代レベルまで増殖可能であり、それはＰＲＲＳＶのための最も好適な宿主細胞である。
【０００８】
不死化ＰＡＭ細胞系を開発するための幾つかの試みが行われている。
【０００９】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００８／０８９０９４は、ブタ胎児から得られた２つの天然の意図的に形質転換されていないＰＡＭ突然変異体を開示している。これらの細胞は不死化ＰＡＭ細胞系の挙動を示しており、それらはＰＲＲＳＶを増殖させうる。記載されている方法の欠点は、それが、成果が非常に不確かな、試行錯誤に基づく方法であることである。特に、この方法を用いて単離されたいずれかの胎児細胞系が実際に安定に不死化されるのか、あるいは若干延長した寿命を有するに過ぎないのか、あるいは初代ＰＡＭと比較して数回多く分裂可能であるに過ぎないのかどうかは疑わしい。したがって、該方法は、ＰＡＭ細胞系を必要としている当業者にとって魅力的なものではない。
【００１０】
Ｊｉａｎ−Ｊｕｎ  Ｊｉａ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００９，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）による論文は、主張によると、ＰＲＲＳＶに感受性であるブタ肺細胞系を記載しているが、この細胞系は肺胞細胞系ではなく、上皮細胞系であり、更にはブタ由来でないことが後に判明した（Ｄ．Ｗ．Ｓｉｌｖｅｒｓｉｄｅｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８４：５４５４−５４５５（２０１０））。
【００１１】
真の不死化ＰＡＭ細胞系を作製するもう１つの試みはＨ．Ｍ．Ｗｅｉｎｇａｒｔｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０４：２０３−２１６（２００２）により記載されている。Ｗｅｉｎｇａｒｔｌは、ネオマイシン耐性およびＳＶ４０  Ｔ抗原の遺伝子を保持するプラスミドｐＳＶ３ｎｅｏでの初代ＰＡＭのトランスフェクションを記載している。これは３つの骨髄（単球／マクロファージ）不死化細胞系の単離をもたらした。しかし、この実験の結果は不可解なものであった。すなわち、これらの細胞系のいずれにおいてもＳＶ４０  Ｔ抗原は検出できず、更に該細胞系はいずれもＰＲＲＳＶ複製を支持しなかった。したがって、Ｗｅｉｎｇａｒｔｌは、ＳＶ４０  Ｔ抗原の存在ではなく、代替メカニズムが不死化を説明しうると結論づけている。
【００１２】
この失敗の後、ＳＶ４０  Ｔ抗原を使用する経路は捨てられ、代替アプローチが採用された。Ｙｏｏ  Ｊｉｎ  Ｌｅｅらは、Ｗｅｉｎｇａｒｔｌにより開発された細胞系が、検出可能なレベルの１３０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質ＣＤ１６３（これはＰＲＲＳＶの細胞受容体であることが知られている）を発現しないことを見出した（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６３：４１０−４１５（２０１０））。したがって、Ｙｏｏ  Ｊｉｎ  Ｌｅｅは更に、レトロウイルスＬＴＲプロモーターの制御下でレトロウイルスベクター内にクローニングされたＣＤ１６３遺伝子でＷｅｉｎｇａｒｔｌのＰＡＭ細胞系の１つをトランスフェクトした。これは実際に、ＰＲＲＳＶを増殖させうる不死化ＰＡＭ細胞系の形成をもたらした。
【００１３】
ＰＡＭ特異的マーカー、例えばＣＤ１６３のような初代細胞の元の特性の喪失はＳＶ４０  Ｔ抗原での形質転換によるものでありうることが、Ｙｏｏ  Ｊｉｎ  Ｌｅｅが属する研究グループのＭｉｎｇｅｕｎ  Ｓａｇｏｎｇにより２０１２年に結論づけられた（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７９：２６−３２（２０１２））。そのため、ＰＡＭを不死化するための代替経路がＳａｇｏｎｇにより追跡された。この経路は、テロメラーゼ活性を回復させるために、ＰＡＭにおいてレトロウイルスベクターを使用してヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を発現させることを含む。テロメラーゼ活性の回復はテロメアＤＮＡの喪失を回避し、したがって細胞の複製老化を回避する。Ｍｉｎｇｅｕｎ  Ｓａｇｏｎｇは、ＳＶ４０  Ｔ抗原で形質転換されたＰＡＭとは対照的に、ｈＴＥＲＴ不死化は、該細胞を、それらの親細胞の表現型の信頼しうる代表例にしうることを、自分たちのデータは示している、と結論づけている。
【００１４】
前記から言えることは、老化を回避するために追跡される経路には無関係に、不死化を誘導する目的でＰＡＭを成功裏に形質転換するためには、ＳＶ４０  Ｔ抗原の使用は回避されるべきであり、ＰＡＭのゲノム内にＤＮＡを挿入するためには、レトロウイルスまたは少なくとも大きなレトロウイルス配列を使用しなければならないことである。細胞を形質転換するためにレトロウイルスまたは少なくとも大きなレトロウイルス配列を使用する重大な欠点は、全ての場合において、細胞の形質転換に使用されるＤＮＡ内に長末端反復（ＬＴＲ）配列が存在することである。ＬＴＲは、レトロウイルス遺伝子発現のための全ての必要なシグナル、すなわち、エンハンサー、プロモーター、転写開始配列、転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルを含むレトロウイルス要素である。これらのＬＴＲは腫瘍化作用を有する疑いがある。これは、それらが他の細胞遺伝子をシス活性化することが公知であること、およびそれらが細胞ゲノム内の他のレトロウイルス配列と組換わりうることによるものである（Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  ９：６８−７５（２００４））。それでも、ＬＴＲ配列を含むレトロウイルスＤＮＡでの細胞の形質転換およびＳＶ４０  Ｔ抗原の使用の回避が、不死化ＰＡＭを得るための唯一の方法だと思われれる。
【発明の概要】
【００１５】
驚くべきことに、不死化されており、尚もＰＲＲＳＶに感受性であり、それにもかかわらずレトロウイルス長末端反復ＤＮＡを含有しないＰＡＭを成功裏に得ることが可能であることが、本発明において見出された。
【００１６】
かかる本発明の不死化ＰＡＭは、ＳＶ４０  Ｔ抗原を含むが本発明においては細胞ゲノム内の安定な組込みの達成のための手段としてのトランスポゾンの使用と組合されたＤＮＡのトランスフェクションにより、意外にも入手可能であった。
【００１７】
トランスポゾンは、組込みウイルスと同様に効率的なゲノム挿入が可能な天然ＤＮＡ導入ビヒクルとみなされうる。
【００１８】
理由は解明されていないが、前記のレトロウイルスＤＮＡの存在下または非存在下のＳＶ４０  Ｔ抗原の負の効果は、トランスポゾンおよびＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子を使用して細胞が形質転換された場合には、意外にも回避されうる。
【００１９】
原理上は、トランスポゾンはゲノム内の組込みの後も依然として細胞ゲノム内に安定に存在する。したがって、好ましくは、本発明の不死化ＰＡＭはトランスポゾンを含む。
【００２０】
本発明の目的においては、不死化細胞系は多細胞生物からの細胞（この場合はＰＡＭ）の集団であり、正常であれば無限に増殖しないが、突然変異ゆえに正常な細胞老化を回避しており、それどころか、分裂し続けることが可能である。そのような細胞は有限回数のみの分裂周期にわたる正常な増殖制限を逃れている。
【００２１】
本発明の不死化ＰＡＭの製造のために用いられる方法は、基本的には、以下の工程を含む。
【００２２】
ａ）ブタ被験体から細胞含有気管支肺胞洗浄サンプルを得る工程。そのような工程は、とりわけ、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．ら（１９９１年）（前記参照）、Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ，Ｈ．Ｍ．ら（前記参照）などにより既に記載されており、それらは尚も、ＰＡＭを得るための好ましい方法である。
【００２３】
ｂ）該サンプルから細胞成分を分離する工程。この工程も当技術分野でよく知られており、同様に、とりわけ、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔにより、そしてＷｅｉｎｇａｒｔｌにより記載されており、それは通常、肺洗浄物の低速遠心分離により行われる。
【００２４】
ｃ）トランスポゾンを含み、適当なプロモーターの制御下でＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子で該細胞成分をトランスフェクトする工程。
【００２５】
トランスフェクションは当技術分野で公知の多数の方法により行われうる。トランスフェクションのための市販キットが、とりわけ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００  Ａｌｆｒｅｄ  Ｎｏｂｅｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ  ９４５４７，ＵＳＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１７５  Ｓｔａｌｅｙ  Ｒｏａｄ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ  １４０７２，ＵＳＡ）から現在入手可能である。試薬に基づく一般に用いられるトランスフェクション方法は脂質、リン酸カルシウム、カチオンポリマー、ＤＥＡＥ−デキストラン、活性化デンドリマーおよび磁気ビーズの使用を含む。装置に基づく方法はエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む。
【００２６】
トランスポゾンを含む、そして適当なプロモーターの制御下でＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子は、例えば、適当なプロモーターの制御下でＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むプラスミドでありうるであろう。このプラスミドは、それがトランスフェクション工程に使用される場合には、環状または線状形態でありうる。
【００２７】
トランスポゾン自体の使用は当技術分野でよく知られている。Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．およびＩｚｓｖａｋ  Ｚ．による論文はトランスポゾンおよびそれらの使用を詳細にレビューしており、トランスポゾンの作用メカニズムにおける洞察を提供している（Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  １：２５−３９（２０１０））。
【００２８】
ＳＶ４０  Ｔ抗原に関するＤｅｅｐｉｋａ  Ａｈｕｊａによる総説はこのタンパク質の作用メカニズムにおける洞察を提供している（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：７７２９−７７４５（２００５））。基本的には、ＳＶ４０  Ｔ抗原は腫瘍抑制因子のｐ５３およびＲｂ−ファミリーを抑制する。細胞の不死化特性へと細胞のトランスフォーメーション（形質転換）を引き起こすと考えられているのはＴ抗原のこの活性である。
【００２９】
ＳＶ４０  Ｔ抗原の発現のための多数の適当なプロモーターが当技術分野で公知であり、これらはそれらの効率的な発現レベルに関して認識されている。それらには以下のものが含まれる：古典的プロモーター、例えば（ヒト）サイトメガロウイルス最初期プロモーター（Ｓｅｅｄ，Ｂ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，８４０−８４２，１９８７；Ｆｙｎａｎ，Ｅ．Ｆ．ら，ＰＮＡＳ  ９０，１１４７８−１１４８２，１９９３；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１７４５−１７４８，１９９３）、ＢｏＨＶ−１のｇＤの発現のためのヒトサイトメガロウイルス  エンハンサー−プロモーター（Ｄｏｎｏｆｒｉｏ  Ｇ．ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２４６−１２５４，（２００６））、マウスサイトメガロウイルス最初期（ＭＣＭＶｉｅ１）プロモーター、マウスサイトメガロウイルス初期（ＭＣＭＶｅ１）プロモーター、ＳＶ４０最初期プロモーター（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｊ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５，７７３，１９８３）、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９−４２，１９８２）、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）、Ａｄ２の主要後期プロモーターおよびβ−アクチンプロモーター（Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，１５２−１５４，１９９２）。
【００３０】
好ましいプロモーターはＣＡＧプロモーターである（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ；Ｔａｋａｋｉ，Ｓ；Ａｒａｋｉ，Ｋ；Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｆ；Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ａ；Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ；Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｇｅｎｅ  ７９（２）：２６９−７７（１９８９），およびＮｉｗａ，Ｈ；Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ；Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ，．Ｇｅｎｅ  １０８（２）：１９３−９（１９９１））。
【００３１】
ｄ）持続的増殖が可能な細胞を選択する工程。持続的増殖が可能なＰＡＭ細胞は、少なくとも５細胞周期にわたって培養された細胞である。細胞周期または細胞分裂周期は、細胞の分裂および複製（細胞複製）をもたらす、細胞において生じる一連の事象である。持続的増殖が可能な細胞の選択は、以下の理由により、非常に簡単なプロセスである。すなわち、初代ＰＡＭはその天然環境（ブタの肺）以外ではほとんど分裂しない又は分裂不可能である。図２の最初の２本の棒グラフ（Ｍ−ＣＳＦ無添加）から認められうるとおり、肺洗浄および単離の後の生きた初代ＰＡＭ細胞の数は経時的に減少する。２０００００個のＰＡＭ細胞から開始する培養において、３日後に尚も生存可能なのは該細胞の約半数のみである。この量は経時的に着実に更に減少する。
【００３２】
このことは、細胞数の増加が認められる場合には、これは、トランスポゾンを含むＤＮＡ分子で１以上の細胞が成功裏にトランスフェクトされており、ＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子が細胞ゲノム内に挿入されていることによるに違いないことを意味する。したがって基本的には該プロセスは自己選択的である。すなわち、適当な細胞増殖培地内で成功裏に形質転換されたＰＡＭの維持は、成功裏に形質転換された細胞の複製に自動的につながり、一方、非不死化細胞は分裂を停止し、死滅するであろう。適当な細胞増殖培地は当技術分野で公知であり、とりわけ、実施例の部に記載されている。それらはまた、とりわけ、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．ら（１９９１年）（前記参照）、Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ，Ｈ．Ｍ．ら（前記参照）により記載されている。細胞培養条件に関する更なる指針は実施例において見出されうる。
【００３３】
したがって、本発明の１つの実施形態は、
ａ）ブタ被験体から細胞含有気管支肺胞洗浄サンプルを得る工程、
ｂ）該サンプルから細胞成分を分離する工程、
ｃ）トランスポゾンを含む、そしてプロモーターの制御下でＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子で該細胞成分をトランスフェクトする工程、および
ｄ）少なくとも５細胞周期にわたって培養されうる細胞を選択する工程
を含む、不死化ＰＡＭの製造方法に関する。
【００３４】
通常、少なくとも５細胞周期にわたって培養された細胞を選択する。そのような細胞に関しては、それらは成功裏に不死化されたＰＡＭであると合理的に考えられうる。なぜなら、初代ＰＡＭは通常、肺からの単離の後でインビトロでは、１回または２回を超えては、例外的にも５回までは複製されない。
【００３５】
例外的な場合には、初期細胞周期は、例えばトランスポゾンが細胞ゲノム内の非常に重要な部位に組込まれたことにより、またはＳＶ４０  Ｔ抗原をコードする遺伝子の不安定な組込みゆえに、不安定な挙動を示しうる。したがって、実際には、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または更には６０細胞周期（好ましい順）にわたって培養された細胞を選択する。いずれかの不安定性が明白になる可能性は、選択された不死化ＰＡＭの細胞周期の数と共に減少する。
【００３６】
したがって、好ましくは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または更には６０細胞周期（好ましい順）にわたって培養された細胞を選択する。
【００３７】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の存在は数回以上の細胞分裂のための初代ＰＡＭの複製を有意には刺激しない。顆粒球−Ｍ−ＣＳＦ（ｇＭ−ＣＳＦ）の存在は、非常に短い期間にわたって幾らかの複製が存在する範囲でさえも、初代ＰＡＭの状態を改善しうる。しかし、ｇＭ−ＣＳＦの使用はＣＤ１６３発現の低減をもたらすことが本発明者らにより示された。そして、ＣＤ１６３はＰＡＭに対してＰＲＲＳＶの複製に関与するため、この点においてｇＭ−ＣＳＦの使用は正味の有益な効果をもたらさないかもしれない。Ｍ−ＣＳＦは、ｇＭ−ＳＣＦより低い度合で、初代ＰＡＭの状態を改善するようであるが、それはＣＤ１６３の産生を妨げない。
【００３８】
しかし、驚くべきことに、トランスフェクションに付される前の肺洗浄により得られたＰＡＭの増殖培地におけるＭ−ＣＳＦの存在は、該細胞を、トランスフェクションのストレス性プロセスに対して幾分良好に抵抗性にすることが判明した。したがって、トランスフェクション効率はＭ−ＣＳＦの存在下で有意に増加する。Ｍ−ＣＳＦの適量は例えば５、１０、２５、５０、１００または２００ｎｇ／ｍｌ（その増加する順に好ましい）である［図２においては、実際、Ｍ−ＣＳＦの存在下、肺洗浄および単離の後の生きた初代ＰＡＭ細胞の数は減少する（または６日間にわたってせいぜい安定である）ことが認められうる］。該減少は、Ｍ−ＣＳＦの非存在下の減少と比較して経時的にそれほど劇的でないが、いずれの場合も統計的確率の範囲内で細胞数の増加は見られない。
【００３９】
したがって、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、トランスフェクション工程前に細胞含有気管支肺胞洗浄サンプルおよび／または細胞成分に少なくとも５ｎｇ／ｍｌの量のＭ−ＣＳＦを加える工程を含む本発明の製造方法に関する。
【００４０】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００８／０８９０９４は、不死化しているが形質転換されていない胎児ＰＡＭの生存を維持するための必須増殖培地成分としてのＭ−ＣＳＦの使用を開示している。これとは異なり、本発明においては、ＰＡＭを不死化させる前にＭ−ＣＳＦまたはｇＭ−ＣＳＦを使用する。
【００４１】
意外にも、工程ｄ）中および／または本発明の不死化ＰＡＭ、すなわち、形質転換された非胎児ＰＡＭの培養中のＭ−ＣＳＦの存在は、本発明のこれらの形質転換された非胎児細胞の生存性をも改善することが、本発明者らにより示された。図４において認められうるとおり、本発明の不死化ＰＡＭの生存度および複製率の両方がＭ−ＣＳＦの存在下で有意に改善する。１、２、３、４または５ｎｇ／ｍｌの規模の少量のＭ−ＣＳＦでも生存度および複製率の両方を改善するのに十分である。Ｍ−ＣＳＦの好ましい濃度は６、１２、２５、５０、１００、２００または更には４００ｎｇ／ｍｌ（増加する順に好ましい）である。
【００４２】
したがって、また、この実施形態のもう１つの好ましい形態は、工程ｄ）中および／または本発明の不死化ＰＡＭの培養中に少なくとも１ｎｇ／ｍｌの量のＭ−ＣＳＦを加える工程を更に含む本発明の製造方法に関する。
【００４３】
図５は、ＰＡＭ細胞におけるＰＲＲＳＶウイルスの侵入および複製に必須であることが実証されている２つの受容体であるＣＤ１６３およびＰ２１０に対する抗体が本発明の不死化ＰＡＭに対して実際に反応性であることを示している。これは、ＣＤ１６３およびＰ２１０が本発明の不死化ＰＡＭ上に実際に存在することを意味する。
【００４４】
図６は、本発明の不死化ＰＡＭがＰＲＲＳＶ複製を実際に支持することを示している。ＰＲＲＳＶ野外分離体は、感染後の最初の２〜３日においては、初代ＰＡＭと比較して一層速く及びより高い力価まで複製されることが認められうる。
【００４５】
図７は、ＰＲＲＳＶ野外分離体が、本発明の不死化ＰＡＭ上では、ＭＡＲＣ−１４５細胞上の複製より速く及びより高い力価まで実際に複製されることを示している。野外分離体は、ＰＡＭが不死化されているか否かに無関係に、ＰＡＭ上では、ＭＡＲＣ−１４５細胞上の複製と比較して概ね良好に実際に複製されることも認められうる。
【００４６】
図７はまた、ＭＡＲＣ−１４５細胞上での複製に順応したＰＲＲＳＶ  Ｉ型およびＩＩ型株が、ＭＡＲＣ−１４５細胞上で、ＰＡＭ上の複製より高い力価まで複製され、その逆も同様であることを示している。
【００４７】
これは実際に、本発明の不死化ＰＡＭがＰＲＲＳＶ野外分離体の複製に初代ＰＡＭと同様に好適であり、したがって、ＭＡ１０４、ＭＡＲＣ−１４５またはＣＬ２６２１細胞のような非ＰＡＭ細胞よりこの目的に好適であることを示している。
【００４８】
本発明の第２の実施形態は、不死化ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）であって、該ＰＡＭがブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に感受性であり、該ＰＡＭがＳＶ４０  Ｔ抗原を発現し、該ＰＡＭがレトロウイルス長末端反復ＤＮＡを含まないことを特徴とする不死化ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）に関する。
【００４９】
本発明の不死化ＰＡＭは、原理上は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）をコードする機能的遺伝子を更に含みうる。しかし、これは必ずしも必要でない。なぜなら、ＳＶ４０  Ｔ抗原は本発明のＰＡＭの不死化状態を維持しうるからである。実際、不死化ＰＡＭの製造の技術的な簡便性のために過ぎないが、該細胞の不死化にはＳＶ４０  Ｔ抗原のみが使用される。
【００５０】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、該ＰＡＭがｈＴＥＲＴを含まないことを特徴とする本発明の不死化ＰＡＭに関する。
【００５１】
本発明の第３の実施形態は、
ａ）本発明の不死化ＰＡＭを培養する工程、
ｂ）該不死化ＰＡＭをＰＲＲＳと接触させる工程、
ｃ）ＰＲＲＳＶを複製させる工程、および
ｄ）後代ウイルスを単離する工程
を含む、ＰＲＲＳウイルスの複製方法に関する。
【００５２】
本発明の第４の実施形態は、本発明の不死化ＰＡＭを含む細胞培養物に関する。
【００５３】
この実施形態の好ましい形態においては、不死化ＰＡＭを含む細胞培養物にＰＲＲＳＶを感染させる。
【００５４】
この実施形態のもう１つの好ましい形態においては、不死化ＰＡＭを含む細胞培養物はＭ−ＣＳＦを含む。
【００５５】
本発明の第５の実施形態は、ＰＲＲＳＶを含むワクチンの製造方法であって、該方法が、本発明のＰＲＲＳＶを複製させる方法、およびそれに続く、該ウイルスを医薬上許容される担体と混合する工程を含むことを特徴とする、製造方法に関する。
【００５６】
この実施形態の好ましい形態においては、ＰＲＲＳＶは生弱毒化または不活化形態である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇのベクター地図。
【図２】Ｍ−ＣＳＦは初代ＰＡＭのインビトロ生存度を増加させる。Ｍ−ＣＳＦを含有しない又は種々の濃度のＭ−ＣＳＦを含有する培地内に２０００００個の初代ＰＡＭ細胞をｔ＝０の時点（第０日）で二重重複して播いた。播いてから３および６日後に生細胞数を決定した。ウェル当たり二重重複で細胞数を決定した。示されているデータは４つの独立した測定の平均±ＳＥＭである。
【図３】ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇトランスフェクト化細胞におけるコロニー形成。コロニーは黒色矢印で示されている。
【図４】Ｍ−ＣＳＦはＰＡＭ  ＳＶｈ細胞の増殖を刺激する。Ｍ−ＣＳＦを含有しない又は種々の濃度のＭ−ＣＳＦを含有する培地内に２５０００個のＰＡＭ  ＳＶｈ細胞をｔ＝０の時点（第０日）で播いた。播いてから３、４、５および６日後に生細胞数を決定した。示されているデータはウェル当たり２回の細胞計数の平均である。
【図５】ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞はＣＤ１６３およびシアロアドヘシンを発現する。ＰＡＭＳＶｈ細胞をＣＤ１６３もしくはｐ２１０に対する抗体またはアイソタイプ対照抗体で標識した。細胞をＦＩＴＣ標識二次抗体で標識し、フローサイトメトリーにより分析した。抗体当たりのＦＩＴＣ陽性細胞の百分率が示されている。
【図６】ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞上のＰＲＲＳＶの複製。ｔ＝０の時点で病原性ＰＲＲＳＶ野外分離体を細胞に感染させた（ＭＯＩ  ０，００１）。上清を感染後の種々の日数の時点で集め、滴定してウイルス力価を決定した。初代ＰＡＭ（中空の棒グラフ）およびＰＡＭ  ＳＶｈ（黒塗の棒グラフ）に関してＴＣＩＤ５０／ｍｌの１０ｌｏｇ値が示されている。データは２つの独立した滴定の平均である。
【図７Ａ】ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞系上の種々のＰＲＲＳＶ株の複製。（Ａ）病原性ＰＲＲＳＶ野外分離体（ＭＯＩ  ０，０００１）、（Ｂ）ＰＲＲＳＶ  Ｉ型ワクチン株（ＭＯＩ  ０，００１）または（Ｃ）ＰＲＲＳＶ  ＩＩ型ワクチン株（ＭＯＩ  ０，００１）のいずれかをｔ＝０の時点で細胞に感染させた。上清を感染後の種々の日数の時点で集め、滴定してウイルス力価を決定した。ＭＡＲＣ−１４５（中空の棒グラフ）、初代ＰＡＭ（陰影付き棒グラフ）およびＰＡＭ  ＳＶｈ（黒塗の棒グラフ）に関してＴＣＩＤ５０／ｍｌの１０ｌｏｇ値が示されている。データは２つの独立した滴定の平均である。
【図７Ｂ】ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞系上の種々のＰＲＲＳＶ株の複製。（Ａ）病原性ＰＲＲＳＶ野外分離体（ＭＯＩ  ０，０００１）、（Ｂ）ＰＲＲＳＶ  Ｉ型ワクチン株（ＭＯＩ  ０，００１）または（Ｃ）ＰＲＲＳＶ  ＩＩ型ワクチン株（ＭＯＩ  ０，００１）のいずれかをｔ＝０の時点で細胞に感染させた。上清を感染後の種々の日数の時点で集め、滴定してウイルス力価を決定した。ＭＡＲＣ−１４５（中空の棒グラフ）、初代ＰＡＭ（陰影付き棒グラフ）およびＰＡＭ  ＳＶｈ（黒塗の棒グラフ）に関してＴＣＩＤ５０／ｍｌの１０ｌｏｇ値が示されている。データは２つの独立した滴定の平均である。
【図７Ｃ】ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞系上の種々のＰＲＲＳＶ株の複製。（Ａ）病原性ＰＲＲＳＶ野外分離体（ＭＯＩ  ０，０００１）、（Ｂ）ＰＲＲＳＶ  Ｉ型ワクチン株（ＭＯＩ  ０，００１）または（Ｃ）ＰＲＲＳＶ  ＩＩ型ワクチン株（ＭＯＩ  ０，００１）のいずれかをｔ＝０の時点で細胞に感染させた。上清を感染後の種々の日数の時点で集め、滴定してウイルス力価を決定した。ＭＡＲＣ−１４５（中空の棒グラフ）、初代ＰＡＭ（陰影付き棒グラフ）およびＰＡＭ  ＳＶｈ（黒塗の棒グラフ）に関してＴＣＩＤ５０／ｍｌの１０ｌｏｇ値が示されている。データは２つの独立した滴定の平均である。
【００５８】
［実施例］
実施例１：
材料および方法
プラスミド
ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇを構築するために、プライマーＳＶ４０  Ｔａｇ  ５’−ＢＩＩ（５’−ＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧ−３’）およびＳＶ４０  Ｔａｇ  ３’−ＸＩ（５’−ＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧ−３’）を使用するＰＣＲによりＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位をＳＶ４０  Ｔ  Ａｇに付加した。フュージョン（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ＤＮＡポリメラーゼを製造業者のプロトコル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従いＰＣＲのために使用した。該断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にクローニングし、配列決定により確認した。次に、ＳＶ４０  Ｔ  ＡｇをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔから切り出し、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位を使用してｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮ（Ｙｕｓａら，２００９）内にクローニングしてｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇ（図１）を得た。該最終構築物を配列決定により確認した。初代ＰＡＭ細胞内へのトランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡをキアゲン・エンドフリー・プラスミド・マキシ・キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ  ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。
【００５９】
初代細胞およびＰＡＭ  ＳＶｈ細胞の単離および増殖
ブタ肺胞マクロファージを１〜２週齢のＰＲＲＳＶ陰性ＳＰＦ子ブタの肺から集めた。該肺を無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で３〜５回洗浄した。洗浄流体を１０００×ｇ、４℃で１０分間（１０’）遠心分離して細胞をペレット化した。細胞を、５０％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ  グルタミン、抗生物質および１０％  ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ  １６４０＋ＨＥＰＥＳ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁させ、液体窒素中で保存した。解凍に際して、ＰＡＭ細胞を培養内に加え、２０％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ  グルタミン、抗生物質を含有するＲＰＭＩ  １６４０＋ＨＥＰＥＳ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で３７℃で５％  ＣＯ２中で増殖させた。組換えヒトＭ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞を培地＋１００ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）内で増殖させた。
【００６０】
生存度アッセイ
初代ＰＡＭ細胞のインビトロ生存に対するＭ−ＣＳＦの効果を、種々の濃度のＭ−ＣＳＦを含有する培地内に２４ウェル当たり２００．０００個の細胞を播くことにより調べた。各条件を二重重複して試験した。細胞を播いてから３日後および６日後、ウェルから細胞サンプルを採取し、Ｖｉａｃｏｕｎｔ色素（Ｇｕａｖａ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造業者のプロトコルに従い使用してＧＵＡＶＡ  Ｅａｓｙｃｙｔｅ  ｐｌｕｓ（Ｇｕａｖａ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で生細胞数を決定した。各サンプルを２回計数した。
【００６１】
ＰＡＭ  ＳＶｈ増殖に対するＭ−ＣＳＦ濃度の効果を、若干の調節を行って同様にして調べた。この場合、２５０００細胞を超低接着９６ウェルプレート内に播き、播いてから３、４、５および６日後に計数のために細胞を集めた。各サンプルを２回計数した。
【００６２】
トランスフェクション
培養内で６日後、初代ＰＡＭ細胞を集め、生細胞を計数した。この実験においては、Ｍ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を培地に加えて初代ＰＡＭのインビトロ生存を促進させた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ４Ｄ（Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＡＧ）のプログラムＤＮ−１００を使用して、トランスフェクション当たり、１．１０Ｅ６個の生細胞を１００μｌの初代細胞バッファーＰ３＋補足物（Ｌｏｎｚａ  Ｃｏｌｏｇｎｅ  ＡＧ）内にトランスフェクトした。細胞を１，６μｇのｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇおよび０，４μｇのｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅ（Ｙｕｓａら，２０１１）のいずれかで、または対照としての１，６μｇのｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮおよび０，４μｇのｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅでトランスフェクトした。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｕｌｓｅの投与の後、細胞を室温で１０分間放置した。次に４００μｌのＲＰＭＩ  １６４０（３７℃）を該細胞にゆっくり加え、細胞を３７℃で５分間インキュベートした。ついで細胞を注意深く再懸濁させ、２０％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭ  グルタミン、抗生物質および１００ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０＋ＨＥＰＥＳ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に播き、３７℃および５％  ＣＯ２でインキュベートした。
【００６３】
抗生物質およびフローサイトメトリー
ブタＣＤ１６３に対するマウスモノクローナル抗体（クローン２Ａ１０／１１，ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ブタ  シアロアドヘシン／ｐ２１０に対するマウスモノクローナル抗体（Ｄｕａｎら，１９９８）またはＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）で細胞を標識した。洗浄後、細胞を抗ＣＤ１６３で標識し、あるいは抗シアロアドヘシン／ｐ２１０抗体をＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して細胞を分析した。
【００６４】
ＰＲＲＳＶの複製および力価測定
ＰＲＲＳＶ複製のための基質としての初代ＰＡＭ、ＰＡＭ  ＳＶｈまたはＭＡＲＣ−１４５細胞を比較するために、等量の細胞を１２ウェル内に播いた。ｔ＝０の時点で病原性野外分離体、Ｉ型ワクチン株またはＩＩ型ワクチン株をＭＯＩ  ０，００１またはＭＯＩ  ０，０００１で細胞に感染させた。感染の数日後に上清を集め、−２０℃で保存した。初代ＰＡＭおよびＰＡＭ  ＳＶｈ上清を初代ＰＡＭ上で、そしてＭＡＲＣ−１４５上清をＭＡＲＣ−１４５上で滴定することにより、ウイルス力価を決定した。全ての滴定は二重重複で行った。力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの方法を用いて計算し、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。
【００６５】
結果：
Ｍ−ＣＳＦは初代ＰＡＭのインビトロ生存性を促進させる。
【００６６】
初代ＰＡＭは、２０％  ＦＣＳを含有する標準的なＲＰＭＩ  １６４０培地内で低いインビトロ生存率を示す（図２）。生細胞数は時間と共に減少し、３日後には細胞の約５０％のみが尚も生存可能である。培地へのマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の添加は生存に対して正の効果をもたらし、Ｍ−ＣＳＦの非存在下で増殖した細胞と比較して３または６日後の生細胞数を明らかに増加させる。
【００６７】
ＳＶ４０不死化ＰＡＭ細胞系の樹立
初代細胞を、Ｍ−ＣＳＦを含有する培地内で６日間増殖させ、ついで、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼをコードするｐＰＢ−ＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅベクターと組合されたｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  ＡｇまたはｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮでトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を増殖に関して注意深く毎日モニターし、培地に新鮮培地＋１００ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦを定期的に補充した。ｐＰＢ−ＣＡＧ−ＥＢＮＸＮでトランスフェクトされた対照細胞においては細胞増殖は視認可能でなく、トランスフェクションの４〜５週間後に全ての細胞が死亡した。これとは対照的に、トランスフェクションの３〜４週間後、小さなコロニーがｐＰＢ−ＣＡＧ−ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇトランスフェクト化細胞の培養内で成長した（図３）。これらのコロニーは増殖し続け、これらを継代して細胞数を増加させた。免疫蛍光による判定では、全ての細胞はＳＶ４０  Ｔ  Ａｇ陽性であった（非表示データ）。
【００６８】
これらの細胞は増殖し続け、週２回継代可能であり、８カ月以上にわたって（５０〜６０継代）培養内で現在維持されている。この細胞系は液体窒素保存後に培養内で容易に再成長可能である。このようにして樹立された細胞系をＰＡＭ  ＳＶｈと命名した。
【００６９】
ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞系の増殖はＭ−ＣＳＦ濃度に左右される。
【００７０】
ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞系が増殖のためにＭ−ＣＳＦを要するかどうかを決定するために、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞を種々の濃度のＭ−ＣＳＦの非存在下または存在下で培養した。播いてから３および６日後、生細胞の数を決定した。ＰＡＭ  ＳＶｈの増殖は濃度依存的にＭ−ＣＳＦ依存的である（図４）。細胞数の最大増加は高濃度（４００〜１００ｎｇ／ｍｌ）のＭ−ＣＳＦの存在下で見られる。より低いＭ−ＣＳＦ濃度は細胞増殖の低減をもたらし、Ｍ−ＣＳＦの非存在下では細胞数の増加はほどんど又は全く検出されなかった。このことは、ＰＡＭ  ＳＶｈの増殖が培地内のＭ−ＣＳＦ濃度に左右されることを示している。
【００７１】
ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞はシアロアドヘシン／ｐ２１０およびＣＤ１６３マーカーを発現する。
【００７２】
ＰＡＭ細胞におけるＰＲＲＳウイルスの侵入および複製のためには、２つの受容体、すなわち、シアロアドヘシン／ｐ２１０およびＣＤ１６３が必須であることが示されている。シアロアドヘシン／ｐ２１０の発現はＰＲＲＳＶのＰＡＭ細胞への結合および侵入に必須であることが判明しており、一方、ＣＤ１６３は細胞内のＰＲＲＳＶの複製に要求されることが示されている（Ｄｅｌｐｕｔｔｅら，２００５；Ｖａｎ  Ｇｏｒｐら，２００８；Ｃａｌｖｅｒｔら，２００７）。本発明者らは、これらの受容体に対する特異的抗体で細胞を標識し、フローサイトメトリーによりそれらを分析することにより、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞がシアロアドヘシン／Ｐ２１０およびＣＤ１６３を発現するかどうかを調べた。ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞の８０％以上がＣＤ１６３＋であり、７０％以上がシアロアドヘシン／Ｐ２１０＋であることが判明した。このことは、これらの細胞がＰＲＲＳＶの感染および複製に好適でありうることを示唆している。
【００７３】
ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞はＰＲＲＳＶ複製のための好適な基質である。
【００７４】
本発明者らは、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞がＰＲＲＳＶ複製のための基質であるかどうかを、それらに病原性野外分離体を感染させることにより試験した。上清を感染後の種々の日数の時点で集め、滴定してウイルス力価を決定した。比較のために、同じ実験において初代ＰＡＭ細胞にも感染させた。ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞は該ＰＲＲＳＶ野外分離体に感染した。そして該細胞はＰＲＲＳＶウイルスを明らかに産生する（図６）。初代ＰＡＭと比較して、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞により得られたウイルス力価は感染後第１日および第２日にはより高く、第３日および第４日には同等であり、第５日にはより低かった。
【００７５】
ＭＡＲＣ−１４５細胞はＰＲＲＳＶワクチン株ウイルスの産生のための基質として一般に使用される。本発明者らは種々のＰＲＲＳＶ株の複製のための基質としての初代ＰＡＭ、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞およびＭＡＲＣ−１４５細胞を比較した。等しい数の初代ＰＡＭ、ＰＡＭ  ＳＶｈおよびＭＡＲＣ−１４５細胞に病原性野外分離体、ＰＲＲＳＶ  Ｉ型ワクチン株またはＰＲＲＳＶ  ＩＩ型ワクチン株のいずれかを感染させた。
【００７６】
感染後の種々の日数の時点で上清を集め、上清を滴定してウイルス力価を決定した。この場合もまた、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞は、初代ＰＡＭと比べて同等またはより高い、ＰＲＲＳＶ野外分離体の力価を示している（図７Ａ）。ＰＡＭ  ＳＶｈはまた、ＭＡＲＣ−１４５細胞より高い、ＰＲＲＳＶ野外分離体の力価を示している。種々の基質上で産生されたＰＲＲＳＶ  Ｉ型およびＩＩ型株のウイルス力価を比較したところ、どちらの株も、これらの弱毒化ウイルスの製造に通常使用される基質であるＭＡＲＣ−１４５細胞上で最も良く複製されることを、本発明者らは見出した（図７ＢおよびＣ）。しかし、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞は、どちらのワクチン株に関しても、全ての時点において初代ＰＡＭより高い力価を示した。このことは再び、ＰＡＭ  ＳＶｈ細胞が、初代ＰＡＭより良好な、ＰＲＲＳＶ複製のための基質であることを示している。
【００７７】
参考文献の一覧
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Ｏｋａｂｅ  Ｍ，Ｉｋａｗａ  Ｍ，Ｋｏｍｉｎａｍｉ  Ｋ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ  Ｙ．’Ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｅ’  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｇｒｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７  Ｍａｙ  ５；４０７（３）：３１３−９．
Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ＡＮ，Ｃｏｕｃｈｍａｎ  ＪＲおよびＷｈｉｔｅｆｏｒｄ  ＪＲ．Ｔｈｅ  ＣＭＶ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ  ａｃｔｉｎ  （ＣＡＧ）  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｄｒｉｖｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：  ２，２００８．
【図１】
0006499660.tif 000002
【図２】
0006499660.tif 000003
【図３】
0006499660.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
0006499660.tif 000008
【図７Ｂ】
0006499660.tif 000009
【図７Ｃ】
0006499660.tif 000010
【配列表】
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