(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料添加部と、標識物質保持部と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部と、吸収部とを含む、検体中のジカウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び前記検出部が、配列番号１で示されるジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
【請求項２】
前記標識物質保持部及び前記検出部の少なくとも一方が、前記非構造性タンパク質であるＮＳ１の全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有する、請求項１に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項３】
前記標識物質保持部及び前記検出部が、前記非構造性タンパク質であるＮＳ１の全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有する、請求項２に記載の免疫クロマト分析装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
【請求項５】
請求項４に記載の免疫クロマト分析キットを用いて、検体中のジカウイルスを検出する免疫クロマト分析方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料として、試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されているジカウイルスの非構造性タンパクであるＮＳ１を認識する抗体により、検体中のジカウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び前記抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された前記移動相中のジカウイルスを、検出部に含まれるジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体により検出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析キットおよび免疫クロマト分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジカウイルス感染症を引き起こすジカウイルス（Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ）は、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス等とともにフラビウイルス科（Ｆｒａｖｉ  ｖｉｒｕｓ）に属するウイルスである。ジカウイルスはヒトを含む脊椎動物に広く分布し、蚊やダニといったベクターを介して伝播することが知られている。また、ジカウイルスは、母子垂直感染や性的接触による感染、血液感染等により伝播することも報告されている。
【０００３】
ヒトがジカウイルスに感染すると、３〜１２日の潜伏期間の後、急性の発熱（いわゆるジカ熱）が起こり、また非化膿性の結膜炎、頭痛、筋痛、関節痛等の種々の症状が現れる。
【０００４】
ジカウイルス感染症に関しては、現在のところ有効な薬剤やワクチンは開発されていない。一方、ジカウイルス感染の拡大を防止するため、ジカウイルス感染の早期診断が望まれている。
【０００５】
従来、ジカウイルス感染の診断は、血液検査、尿検査、唾液検査において、ジカウイルスのＲＮＡを検出することにより行われてきた（非特許文献１）。また、血清学的手法として、ジカウイルス感染者が体内に有するジカウイルスに対する抗体（ＩｇＭやＩｇＧ）をＥＬＩＳＡや蛍光抗体法で検出することも行われてきた（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ，ＬＨ；Ｈａｍｅｒ，ＤＨ（２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１６）．“Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ：Ｒａｐｉｄ  Ｓｐｒｅａｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ．”Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
【非特許文献２】Ｈａｙｅｓ，Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．“Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｏｕｔｓｉｄｅ  Ａｆｒｉｃａ”．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １５  （９）：１３４７−５０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記ＲＮＡの検出によるジカウイルス感染の診断には、特別な設備や試薬等が必要であるためコストがかかり、またこれらの検査には半日から一日程度の時間がかかり、検査結果が得られるまで長時間を要していた。
【０００８】
また、上記のジカウイルスに対する抗体を検出する方法は、ジカウイルスを直接検出するものではなく、ジカウイルスに感染してから所定期間経過後にヒトの体内で作られるＩｇＭやＩｇＧを検出することにより、間接的にジカウイルス感染の診断を行うものであるため、ジカウイルス感染初期の診断としては不適であった。また当該方法は、ジカウイルスを直接検出するものではないため、例えば、ジカウイルスと同じフラビウイルス科に属するデングウイルスやウエストナイルウイルスの感染と区別して診断することは難しかった。そのため、ジカウイルスを直接検出することにより、感染初期からジカウイルス感染の診断を行う方法が求められている。
【０００９】
そこで本発明は、ジカウイルス感染の診断を簡易かつ迅速に行うことのできる免疫クロマト分析装置を提供することを目的とする。また、ジカウイルス自体を直接検出することにより、ジカウイルス感染を早期に発見でき、かつ、ジカウイルス以外のフラビウイルス科に属するウイルスに対する交叉反応が軽減され、ジカウイルスを特異的に検出することのできる免疫クロマト分析装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、免疫クロマト分析装置において、ジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体を用いることによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．試料添加部と、標識物質保持部と、検出部を有するクロマトグラフ媒体部と、吸収部とを含む、検体中のジカウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置であって、
前記標識物質保持部及び前記検出部が、配列番号１で示されるジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体を含有する、免疫クロマト分析装置。
２．前記標識物質保持部及び前記検出部の少なくとも一方が、前記非構造性タンパク質であるＮＳ１の全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有する、前記１に記載の免疫クロマト分析装置。
３．前記標識物質保持部及び前記検出部が、前記非構造性タンパク質であるＮＳ１の全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有する、前記２に記載の免疫クロマト分析装置。
４．前記１〜３のいずれか１に記載の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む、免疫クロマト分析キット。
５．前記４に記載の免疫クロマト分析キットを用いて、検体中のジカウイルスを検出する免疫クロマト分析方法であって、以下の工程（１）〜（４）を含む免疫クロマト分析方法。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料として、試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されているジカウイルスの非構造性タンパクであるＮＳ１を認識する抗体により、検体中のジカウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び前記抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された前記移動相中のジカウイルスを、検出部に含まれるジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体により検出する工程
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、免疫クロマト分析装置において、ジカウイルスが有する非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体を使用することによって、ジカウイルス以外の他のウイルス等との交叉反応を抑え、ジカウイルスを迅速かつ特異的に検出することができる。特に、ジカウイルスのＮＳ１の全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を用いることによって、ジカウイルスをより特異的に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態の免疫クロマト分析装置の構造を説明するための断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明を実施するための形態を説明する。
【００１５】
なお、本明細書において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されていることを意味し、「保持」とは、膜等の担体の中または表面を移動可能に配置されることを意味する。
【００１６】
また、本明細書において、抗体が特定のタンパク質を「認識する」とは、抗原抗体反応により抗体が当該タンパク質の有するアミノ酸配列の一部と結合することを示す。また、抗体が特定のアミノ酸配列を「認識する」とは、抗体が、特定のアミノ酸配列の全体又はその一部と抗原抗体反応により結合することを示す。
【００１７】
＜検体＞
本発明の免疫クロマト分析装置は、検体中のジカウイルスを検出する。本発明に用いることのできる検体は、ジカウイルスを含む可能性のあるものであれば特に制限されない。具体的には、ジカウイルス感染者の血清、血漿、全血、精液、髄液等が挙げられる。好ましくは、迅速診断の観点から、全血、血清、及び血漿である。
【００１８】
＜免疫クロマト分析装置＞
本発明の、ジカウイルスを検出するための免疫クロマト分析装置は、検体を含有する試料（以下、単に試料ともいう）を添加する試料添加部と、標識物質を保持する標識物質保持部と、ジカウイルスを検出する検出部を有するクロマトグラフ媒体部と、検出部を通過した液体を吸収する吸収部とを備え、標識物質保持部及び検出部が、ジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体を含有することを特徴としている。
【００１９】
（抗体）
本発明の免疫クロマト分析装置に使用する抗体は、ジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＳ１，以下単にＮＳ１ともいう）を認識する抗体である。
【００２０】
ジカウイルスのＮＳ１は、配列番号１で示される３５２個のアミノ酸からなり、他のフラビウイルスと同様にウイルスの複製等に関わるタンパク質である事が示唆されているが、詳細な機能、構造は不明である。
【００２１】
本発明においては、ジカウイルスが有する種々のタンパク質の中でも特にＮＳ１を認識する抗体を用いることによって、ジカウイルス以外の他のウイルス等との交叉反応を抑え、ジカウイルスを特異的に検出することができるものである。本発明における抗体によれば、例えば、ジカウイルスと同じフラビウイルス科に属する、デングウイルス等に対する交叉反応を軽減できる。具体的には、配列番号６で示されるデングウイルスの非構造性タンパク質のＮＳ１に対しては、後述する実施例に示すように交叉反応を示さない。
【００２２】
特に、免疫クロマト分析装置の標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方が、ＮＳ１を認識する抗体の中でも特に、ＮＳ１の全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有することが好ましい。上記アミノ酸配列の少なくとも１つを認識する抗体を用いることによって、ジカウイルス以外の他の抗原との交叉反応をより低減することができ、ジカウイルスをより特異的に検出することができる。
【００２３】
配列番号２のアミノ酸配列（ＥＮＧＶＱＬＴＶＶＶ  ＧＳＶＫＮＰＭＷＲＧ  ＰＱＲＬＰＶＰＶＮＥ  ＬＰＨＧＷＫＡＷＧＫ）はＮＳ１の全アミノ酸配列のうち８１番目から１２０番目までのアミノ酸配列に該当し、配列番号３のアミノ酸配列（ＳＹＦＶＲＡＡＫＴＮ  ＮＳＦＶＶＤＧＤＴＬ  ＫＥＣＰＬＥＨＲＡＷ  ＮＳＦ）はＮＳ１の全アミノ酸配列のうち１２１番目から１５３番目までのアミノ酸配列に該当し、配列番号４のアミノ酸配列（ＧＰ  ＬＳＨＨＮＴＲＥＧＹ  ＲＴＱＶＫＧＰＷＨＳ  ＥＥＬＥＩＲＦＥＥＣ  ＰＧＴＫＶＹＶ）はＮＳ１の全アミノ酸配列のうち２４９番目から２８７番目までのアミノ酸配列に該当する。また、よりＣ末端側であり、ＮＳ１の全アミノ酸配列のうち２９１番目から３２０番目までのアミノ酸配列に該当する配列番号５（ＣＧＴＲＧＰＳＬＲＳ  ＴＴＡＳＧＲＶＩＥＥ  ＷＣＣＲＥＣＴＭＰＰ）を認識する抗体を用いた場合でも検出は可能だが、他のウイルスＮＳ１タンパク質と相同性が高い為、特異性に欠けることが推測される。
【００２４】
本発明における抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。感度の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２５】
（抗体の作製方法）
ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体の作製方法について、以下例示的に説明をする。
【００２６】
抗体産生動物種としては、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を使用できる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。
【００２７】
一実施態様において、免疫原としてのジカウイルスＮＳ１ペプチドは、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。すなわち、ジカウイルスから抽出精製したジカウイルスＮＳ１ペプチド、またはクローニングされたジカウイルスＮＳ１の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製したジカウイルスＮＳ１ペプチド、さらにはジカウイルスＮＳ１ペプチドの一部を構成するポリペプチドを免疫原として用いることができる。
【００２８】
モノクローナル抗体は、常法に従って、上記免疫原で免疫したマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する［例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）４９５−４９７）を参照］。ポリクローナル抗体は、常法により、上記免疫原を産生動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。
【００２９】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の上記免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行うことができる。
【００３０】
このハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、単離および／または精製されることが好ましい。
【００３１】
このようにして、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を作製することができる。
【００３２】
なお、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体は市販のものを購入して使用することもできる。例えば、ｃｌｏｎｅ  ２８０１１１６（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｓ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ社）やｃｌｏｎｅ  ２９０１１２６（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  ＮＳ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａａｌｔｏ  Ｂｉｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ社）等を購入し、使用できる。
【００３３】
また、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体のうち、特に、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体は、例えば、上記のようにジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を作製した場合、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列に相当するペプチド断片を用いたＥＬＩＳＡ試験やウエスタンブロッティング等により、上記ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を産生するハイブリドーマの中から、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列に対してより強い反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、入手し、使用できる。
【００３４】
（免疫クロマト分析装置）
次に、図面を参照しながら本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態について説明する。
【００３５】
本発明の免疫クロマト分析装置の一実施形態としては、図１に示すように、試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、吸収部（５）、バッキングシート（６）から構成されている。
【００３６】
試料添加部（１）は、免疫クロマト分析装置において、検体を含有する試料を添加する部位である。試料添加部（１）では試料が迅速に吸収されるが、速やかに試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成することができる。多孔質シートとしては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。
【００３７】
標識物質保持部（２）には、後述する標識物質で標識化された標識抗体（以下、単に、標識抗体ともいう）が保持されており、上記標識抗体が検体中の被検出物質と結合する部位である。この標識抗体はジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体であり、標識物質保持部（２）内を試料が移動する際に、上記抗体と検体中の上記ジカウイルスのＮＳ１とが結合する。
【００３８】
標識物質保持部（２）には、グラスファイバー、セルロース等の膜が通常使用される。
【００３９】
標識物質保持部（２）の標識抗体の含有量は、通常０．０５μｇ／装置〜０．５μｇ／装置であり、好ましくは０．０５μｇ／装置〜０．２５μｇ／装置であり、より好ましくは０．０７μｇ／装置〜０．１μｇ／装置である。また、標識物質保持部（２）の単位面積当たりの標識抗体の含有量は、通常０．０５μｇ／ｃｍ２〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１μｇ／ｃｍ２〜０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１７μｇ／ｃｍ２〜０．６μｇ／ｃｍ２である。
【００４０】
免疫クロマト分析において抗体を標識する標識物質としては、一般的に酵素等も使用されるが、被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、標識物質としては、不溶性担体を用いることが好ましい。すなわち本発明において、標識物質保持部（２）が含有する抗体としては、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を不溶性担体に感作することにより標識化した標識抗体を使用することが好ましい。なお、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を不溶性担体に感作する手段は、公知の方法に従えばよい。
【００４１】
標識物質としての不溶性担体には、金、銀もしくは白金等の金属粒子、酸化鉄等の金属酸化物粒子、硫黄等の非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、またはその他の不溶性担体を用いることができる。上述のように不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。金属粒子及び金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。
【００４２】
標識物質としての不溶性担体は、特に金粒子が、検出が簡便であり、かつ凝集しづらく非特異的な発色が起こりにくい点で好ましい。金粒子の平均粒径は、例えば１０ｎｍ〜２５０ｎｍ、好ましくは３５ｎｍ〜１２０ｎｍである。平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ：日本電子（株）製、ＪＥＭ−２０１０）により、撮影した投影写真を用いて無作為に１００個の粒子の投影面積円相当径を計測し、その平均値から算出することができる。標識物質保持部における金粒子の含有量は、標識物質保持部の単位面積あたり、通常０．００６μｇ／ｃｍ２〜０．４２μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．０１μｇ／ｃｍ２〜０．３μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．０１μｇ／ｃｍ２〜０．２μｇ／ｃｍ２である。上記範囲に設定することによって、標識された粒子が分散したまま展開し、抗体の認識部位が阻害されず高感度化できるからである。
【００４３】
クロマトグラフ媒体部（３）は、クロマトグラフの展開部位である。クロマトグラフ媒体部（３）は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性の膜である。クロマトグラフで使用される検出試薬、固定化試薬または被検出物質などと反応性を有しないという観点から、また、本発明の効果が向上するという観点から、例えば、ニトロセルロース製のメンブレン（以下、ニトロセルロースメンブレンともいう）や、酢酸セルロース製のメンブレン（以下、酢酸セルロースメンブレンともいう）が好ましく、ニトロセルロースメンブレンがさらに好ましい。なお、セルロース類メンブレン、ナイロンメンブレン及び多孔質プラスチック布類（例えばポリエチレン、ポリプロピレン等）も使用可能である。
【００４４】
ニトロセルロースメンブレンとしては、ニトロセルロースが主体で含まれていればよく、純品またはニトロセルロース混合品などニトロセルロースを主材とするメンブレンを使用することができる。
【００４５】
ニトロセルロースメンブレンは、さらに、毛細管現象を促進させる物質を含有させることもできる。当該物質としては、膜面の表面張力を低下させ、親水性をもたらす物質が好ましい。例えば、糖類、アミノ酸の誘導体、脂肪酸エステル、各種合成界面活性剤またはアルコール等の両親媒性の作用を有する物質であって、被検出物質の移動に影響がなく、標識物質の発色に影響を及ぼさない物質が好ましい。
【００４６】
ニトロセルロースメンブレンは、多孔性であって、毛細管現象を示す。この毛細管現象の指標は、吸水速度（吸水時間：ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｌｏｗ  ｔｉｍｅ）を測ることで確認できる。吸水速度は、検出感度と検査時間に影響する。
【００４７】
上記のようなニトロセルロースメンブレンや酢酸セルロースメンブレンに代表されるクロマトグラフ媒体部（３）の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。
【００４８】
さらに操作をより簡便にするためには、クロマトグラフ媒体部（３）の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
【００４９】
また、クロマトグラフ媒体部（３）上には、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体部（３）に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理は、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼインまたはゼラチン等のタンパク質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
【００５０】
検出部（４）は、上記クロマトグラフ媒体部（３）上の任意の位置に形成されており、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を含有する。検出部（４）へのジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体の固定化は、常法に従って行うことができる。
【００５１】
検出部（４）では、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中のジカウイルスが、検出部（４）に固定されているジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体と、標識物質が結合したジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合する。
【００５２】
検出部（４）に含有される、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体の含有量は、通常０．１μｇ〜３．０μｇであり、好ましくは０．３μｇ〜２．０μｇであり、より好ましくは０．３μｇ〜１．０μｇである。また、検出部（４）の単位面積当たりの、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体の含有量は、通常０．０４μｇ／ｃｍ２〜１．０μｇ／ｃｍ２であり、好ましくは０．１２５μｇ／ｃｍ２〜０．８μｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．１２５μｇ／ｃｍ２〜０．４２μｇ／ｃｍ２である。
【００５３】
吸収部（５）は、クロマトグラフ媒体部（３）の末端に、検出部（４）を通過した検体や展開液等の液体を吸収させるために設置される。本発明において、吸収部（５）は、例えばグラスファイバー、パルプ、セルロースファイバー等、またはそれら不織布にアクリル酸重合体等の高分子、エチレンオキサイド基等を持つ親水性薬剤を含有させたものが用いられ、特に好ましくはグラスファイバーである。
【００５４】
バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けたりすることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフ媒体部（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
【００５５】
本発明の免疫クロマト分析装置は、製品化する前に、通常乾燥処理に施される。乾燥温度は例えば２０℃〜５０℃、乾燥時間は０．５時間〜１時間である。
【００５６】
本発明の免疫クロマト分析装置において、標識物質保持部及び検出部の少なくとも一方は、ジカウイルスの全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有することが好ましい。上記アミノ酸配列の少なくとも１つを認識する抗体を用いることによって、他の抗原との交叉反応をより低減でき、ジカウイルスをより特異的に検出することができる。
【００５７】
このとき、標識物質保持部及び検出部の一方のみが、ジカウイルスの全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有するとしても、標識物質保持部及び検出部のうち上記抗体を含有しない方は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を認識する抗体を含有すればよい。
【００５８】
より好ましくは、標識物質保持部及び検出部が、いずれも、ジカウイルスの全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体を含有する場合である。
【００５９】
なお、標識物質保持部及び検出部が含有する抗体のいずれもが、ジカウイルスの全アミノ酸配列中に存在する配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体であり、かつ、標識物質保持部及び検出部が含有する上記抗体の両方とも同じ配列番号で示されるアミノ酸配列を認識する抗体であってもよい。この場合、標識物質保持部が含有する抗体と検出部が含有する抗体は、同じ配列番号で示されるアミノ酸配列の中で、異なる箇所のアミノ酸配列と結合することになる。
【００６０】
本発明の免疫クロマト分析装置は、検体中に存在するジカウイルスを検出するのと同時に、検体中に存在するジカウイルスに対する抗体（ヒトＩｇＭ及び／又はヒトＩｇＧ）を検出できるように、以下に説明するように装置を設計することもできる。
【００６１】
本発明の免疫クロマト分析装置において、標識物質保持部（２）には、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体の他に、別途、検体中に存在する抗体（ヒトＩｇＭ及び／又はヒトＩｇＧ）を認識する抗体を含有させる。
【００６２】
この場合、さらに、上記クロマトグラフ媒体部（３）上に、配列番号１で示されるジカウイルスのＮＳ１の全アミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列の１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を含むペプチド、又はこれらのペプチドに他のタンパク質等を付加したペプチド等を含有する検出部を、上述した検出部（４）とは別途設ける。好ましくは、上述した配列番号２〜４で示されるアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも１種のペプチド、又は配列番号２〜４で示されるアミノ酸配列の１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を含むペプチド、又はこれらのペプチドに他のタンパク質等を付加したペプチドの少なくとも１種のペプチドを含有する検出部を、上述した検出部（４）とは別途設ける。
【００６３】
免疫クロマト分析装置がこのような構成を有することにより、検体中に存在するジカウイルスに対する抗体を検出することも可能となる。
【００６４】
これは、例えば、ジカウイルス感染者から採取した血液等を検体とした場合、当該検体中に含まれるジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体（ヒトＩｇＭ及び／又はヒトＩｇＧ）を、標識物質保持部（２）が含有するヒトＩｇＭ及び／又はヒトＩｇＧを認識する抗体に認識させ、さらに、クロマトグラフ媒体部（３）上に検出部（４）とは別途設けられた上記検出部が含有する上記ペプチドに、上記ヒトＩｇＭ及び／又はヒトＩｇＧを認識する抗体が結合することよって、検体中に存在するジカウイルスに対する抗体を検出することができるというものである。
【００６５】
このように、上記免疫クロマト分析装置によれば、検体中に存在するジカウイルスを直接検出できると同時に、検体中に存在するジカウイルスに対する抗体（ヒトＩｇＭ及び／又はヒトＩｇＧ）を検出することで間接的にもジカウイルス感染を鑑別できる。
【００６６】
検体中に存在するジカウイルスとそれに対する抗体の比率は、ジカウイルスに感染してからの日数等にも依存するため、両者を同時に検出することにより、ジカウイルス感染からの経過日数を大まかに推定することが可能である。
【００６７】
なお、上述のように、標識物質保持部がジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体とジカウイルスに対する抗体を認識する抗体とを両方含有する場合、それぞれの抗体は、両抗体が相互に反応して凝集することのない抗体を選択することが好ましい。両抗体が相互に反応して凝集する場合は、標識物質保持部から検出部に至るまで両抗体が接触しないように、本装置を任意に設計すればよい。
【００６８】
＜免疫クロマト分析キット＞
本発明の免疫クロマト分析キットは、上記の免疫クロマト分析装置と、検体を希釈して展開するための検体希釈液とを含む。
【００６９】
本発明の免疫クロマト分析キットにおいて、検体希釈液は、展開液としても使用することができるものである。検体希釈液は通常溶媒として水を用い、これに緩衝液、塩、および非イオン性界面活性剤を含有する。さらに、例えば抗原抗体反応の促進または非特異的反応を抑制するためのタンパク質、高分子化合物（ＰＶＰ等）、イオン性界面活性剤もしくはポリアニオン、または、抗菌剤、キレート剤等の１種もしくは２種以上を加えてもよい。
【００７０】
検体希釈液を展開液として用いる場合には、検体と展開液を予め混合したものを試料として、試料添加部に供給・滴下して展開させることもできるし、先に検体を含有する試料を試料添加部に供給・滴下した後、展開液を試料添加部に供給・滴下して展開させてもよい。
【００７１】
＜免疫クロマト分析方法＞
本発明の免疫クロマト分析方法は以下の工程（１）〜（４）を含み、上記の免疫クロマト分析キットを用いて検体に含まれるジカウイルスを検出する。
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料として、試料添加部に添加する工程
（２）標識物質保持部に保持されているジカウイルスの非構造性タンパクであるＮＳ１を認識する抗体により、検体中のジカウイルスを認識させる工程
（３）前記検体及び前記抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
（４）展開された前記移動相中のジカウイルスを、検出部に含まれるジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体により検出する工程
各工程について以下に説明する。
【００７２】
（１）検体希釈液により検体を希釈した検体含有液を試料として、試料添加部に添加する工程
工程（１）では、第１に、検体を、測定精度を低下させることなく、免疫クロマトグラフ媒体中をスムーズに移動する程度の濃度に、検体希釈液で調整または希釈して検体含有液とするのが好ましい。検体希釈液は上述したものを使用できる。第２に、検体含有液を試料として、試料添加部（１）上に、所定量（通常、０．１ｍｌ〜２ｍｌ）滴下する。試料が試料添加部（１）に滴下されると、試料添加部（１）中で移動を開始する。
【００７３】
本発明において使用する検体は、上述したように、被検出物質であるジカウイルスを含む可能性のあるものであり、具体的には、ジカウイルスに感染した患者の、血清、血漿、全血、精液、髄液等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
（２）標識物質保持部に保持されているジカウイルスの非構造性タンパクであるＮＳ１を認識する抗体により、検体中のジカウイルスを認識させる工程
工程（２）は、工程（１）において試料添加部に添加された試料を、標識物質保持部（２）へと移動させ、標識物質保持部に保持されている、標識物質が結合したジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体により、検体中の被検出物質であるジカウイルスを認識させる工程である。標識物質は上述したものを使用できる。
【００７５】
（３）前記検体及び前記抗体を移動相としてクロマトグラフ媒体部に展開させる工程
工程（３）は、工程（２）において被検出物質であるジカウイルスが標識物質保持部において標識物質が結合したジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体に認識された後、検体および前記抗体を、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過させる工程である。
【００７６】
（４）展開された前記移動相中のジカウイルスを、検出部に含まれるジカウイルスの非構造性タンパク質であるＮＳ１を認識する抗体により検出する工程
工程（４）は、クロマトグラフ媒体部上を移動相として通過した検体中のジカウイルスが、抗原・抗体の特異的結合反応により、検出部に固定されているジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体と、前記工程（２）において標識物質が結合したジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部が着色する工程である。
【００７７】
被検出物質であるジカウイルスが存在しない場合には、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフ媒体部上の検出部を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部が着色しない。
【００７８】
最後に、検体含有液の水分は、吸収部（５）へと移動する。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は下記例に制限されるものではない。
【００８０】
製造例１（抗体の作製）
ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を以下のように作製した。
まず、配列番号１で示されるジカウイルスのＮＳ１のアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。Ｈｉｓ−ｔａｇ発現用ベクターであるｐＥＴ３０２／ＮＴ−Ｈｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理としてアルカリフォスファターゼにより処理し、前記ペプチドと混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いてライゲーション反応をおこなった。
目的遺伝子を組み込んだ組換えＮＳ１プラスミドを組換え蛋白発現用宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。導入菌をＬＢ寒天平板培地で培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地で培養した。さらに１ｍＭ  ＩＰＴＧ（タカラバイオ）を添加して組換えＮＳ１の発現を誘導した後、Ｅ．ｃｏｌｉを回収した。回収した菌を可溶化バッファー［０．５％Ｔｒｉｒｏｎ  Ｘ−１００（ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、２０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］に再浮遊し、超音波処理により可溶化した後、組換えＮＳ１をＨｉｓ  ｔｒａｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。この精製タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと称する）に対して透析し、目的の組換えＮＳ１とした。
【００８１】
得られた組換えＮＳ１を免疫用抗原として、組換えＮＳ１に対するモノクローナル抗体を作製した。モノクローナル抗体の作製は次のように、常法に従っておこなった。１００μｇの組換えＮＳ１と等量のＡｄｕｖａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ（Ｄｉｆｃｏ）を混合して、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、５週齢、日本ＳＬＣ）に３回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（Ｓｈｕｌｍａｎら、１９７８）を用いた。細胞の培養には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）にＬ−グルタミン  ０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリンＧカリウム  １００単位／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン  １００μｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｔａｃｉｎ  ４０μｇ／ｍｌを添加し（ＤＭＥＭ）、これに牛胎児血清（ＪＲＨ）を１０％となるように加えた培養液を用いた。細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞を混合し、そこにＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより行った。融合細胞はＨＡＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ、０．４μＭ  Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎおよび０．０１６ｍＭ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、酵素結合抗体法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体産生を確認した。抗体産生陽性の細胞をＨＴ−ＤＭＥＭ［０．１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅおよび０．１６ｍＭ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅを含む血清加ＤＭＥＭ］で培養し、さらに血清加ＤＭＥＭで培養を続けた。
【００８２】
クローニングした細胞は、２，６，１０，１４−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を接種しておいたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、リタイア、日本ＳＬＣ）に腹腔内接種し、腹水を採取した。この腹水をプロテインＧカラムに供し、モノクローナル抗体を精製した。
このようにして得られたモノクローナル抗体に対して、組換えＮＳ１を９６穴プレートに固定化した直接ＥＬＩＳＡ法にて抗体をスクリーニングした。
その結果、ジカウイルスのＮＳ１を認識する３種類の抗体が得られた。以下この３種類の抗体を、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３の抗体として説明する。
【００８３】
参考例１（ＥＬＩＳＡ試験）
製造例１で作製したジカウイルスのＮＳ１を認識する各抗体（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３の抗体）が、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識するか否かについて、ＥＬＩＳＡ試験を行うことで調べた。ＥＬＩＳＡ試験で使用したペプチドは、配列番号２〜４で示されるアミノ酸配列それぞれからなるペプチド３種類（下記に示すペプチド１〜３）であり、ペプチドの化学合成法の常法であるペプチド固相合成法により作製した。
ペプチド１：ＥＮＧＶＱＬＴＶＶＶ  ＧＳＶＫＮＰＭＷＲＧ  ＰＱＲＬＰＶＰＶＮＥ  ＬＰＨＧＷＫＡＷＧＫ（配列番号２）
ペプチド２：ＳＹＦＶＲＡＡＫＴＮ  ＮＳＦＶＶＤＧＤＴＬ  ＫＥＣＰＬＥＨＲＡＷ  ＮＳＦ（配列番号３）
ペプチド３：ＧＰ  ＬＳＨＨＮＴＲＥＧＹ  ＲＴＱＶＫＧＰＷＨＳ  ＥＥＬＥＩＲＦＥＥＣ  ＰＧＴＫＶＹＶ（配列番号４）
【００８４】
まず、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、コード４６９９４９）ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに、上記ペプチド１〜３の混合物（以下、混合ペプチドという）を、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で固定化した。
【００８５】
一次抗体として、上記作製したＮｏ．１〜Ｎｏ．３の各抗体溶液（１μｇ／ｍＬ）１００μＬをそれぞれ別々のウェルに加え３７℃で１時間インキュベートした後、一次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ  ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）にて３回ウォッシュした。その後１％ＢＳＡ溶液１００μＬをウェルに加え、７℃で１．５時間インキュベートした。その後ＢＳＡ溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ  ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
二次抗体として、Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｒａｂｂｉｔ，ＩｇＧ  Ｗｈｏｌｅ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｊｕｇａｔｅｄ（和光純薬社製、コード０１４−１７６１１）１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ、ウェルに加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。その後二次抗体溶液を取り除き、ウェルを３００μＬ  ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｉｎ  ＰＢＳ）にて３回ウォッシュし、ウェルに残った液は、ペーパータオルに叩き付けて取り除いた。
ウェルに発色基質としてＳｕｒｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）（ＫＰＬ社製、コード５３−００−０１）を１００μＬ加え、１５分反応させ、２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクと比較して反応が見られたものを＋、見られなかったものを−とした。結果を表１に示す。
【００８６】
【表１】
0006452644.tif 000002
【００８７】
この結果から、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の抗体は、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識することが分かった。
【００８８】
〈実施例１〉
検体希釈液、及び、試料添加部（１）と、標識物質保持部（２）と、検出部（４）を有するクロマトグラフ媒体（３）と、吸収部（５）とを含む免疫クロマト分析装置からなる免疫クロマト分析キットを作製した。
なお、標識物質保持部が含有する抗体には、上記で作製したＮｏ．１の抗体を使用し、検出部が含有する抗体には、上記で作製したＮｏ．２の抗体を使用した。以下詳細に説明する。
【００８９】
（１）試料添加部の作製
試料添加部としてグラスファイバーからなる不織布（ミリポア社製：３００ｍｍ×３０ｍｍ）を用いた。
【００９０】
（２）標識物質保持部の作製
金コロイド懸濁液（田中貴金属工業社製：ＬＣ４０ｎｍ）０．５ｍｌに、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように希釈した上記Ｎｏ．１抗体を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。
次いで、１質量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え、更に室温で１０分間静置した。その後、十分撹拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、１質量％のＢＳＡを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加えた。以上の手順で標識物質溶液を作製した。
上記作製した標識物質溶液３００μＬに、３００μＬの１０質量％トレハロース水溶液と１．８ｍＬの蒸留水を加えたものを１２ｍｍ×３００ｍｍのグラスファイバーパッド（ミリポア社製）に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識物質保持部を作製した。
【００９１】
（３）クロマトグラフ媒体部および検出部の作製
メンブレンとしてニトロセルロースからなるシート（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、３００ｍｍ×２５ｍｍ）を用いた。
次に、５質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１．０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、上記Ｎｏ．２抗体を希釈した溶液１５０μＬを、乾燥されたメンブレン上の検出部に１ｍｍの幅でイムノクロマト用ディスペンサー「ＸＹＺ３０５０」（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１μＬ／ｍｍの量（１シートあたり２５μＬ）でライン状に塗布した。
また、金ナノ粒子標識試薬の展開の有無や展開速度を確認するために検出部位の下流に、金ナノ粒子標識物質と広く親和性を有するヤギ由来抗血清をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した液をコントロール部位（コントロールライン）に塗布した。その後、５０℃で３０分間乾燥させ、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体部および検出部を作製した。
【００９２】
（４）免疫クロマト分析装置の作製
次に、バッキングシートからなる基材に、試料添加部、標識物質保持部、検出部を有するクロマトグラフ媒体部、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収部としてグラスファイバー製の不織布を順次貼り合わせた。そして、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、免疫クロマト分析装置とした。なお、標識物質保持部の試料展開方向の長さを１２ｍｍとした。
【００９３】
（５）検体希釈液の調製
１質量％の非イオン性界面活性剤（ナカライテスク社製ＮＰ−４０と日油社製ノニデットＭＮ−８１１の１：１混合物）を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を調製し、検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
【００９４】
〈実施例２〉
実施例１において、標識物質保持部が含有する抗体を、上記作製したＮｏ．２の抗体とし、検出部が含有する抗体を、上記作製したＮｏ．１の抗体とした点を除いては、実施例１と同様にして、実施例２の免疫クロマト分析キットを作製した。
【００９５】
〈実施例３〉
実施例１において、標識物質保持部が含有する抗体を、上記作製したＮｏ．２の抗体とした点を除いては、実施例１と同様にして、実施例３の免疫クロマト分析キットを作製した。
【００９６】
〈実施例４〉
実施例２において、標識物質保持部が含有する抗体を、上記作製したＮｏ．３の抗体とした点を除いては、実施例２と同様にして、実施例４の免疫クロマト分析キットを作製した。
【００９７】
〈実施例５〉
実施例１において、標識物質保持部が含有する抗体を、上記作製したＮｏ．３の抗体とした点を除いては、実施例１と同様にして、実施例５の免疫クロマト分析キットを作製した。
【００９８】
試験例１（ジカウイルスＮＳ１組換え抗原を用いた測定）
本試験では、上記作製した実施例１〜５の免疫クロマト分析キットを用い、ジカウイルスＮＳ１組換え抗原を検体として測定を行った。検体としては、Ｚｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  ＮＳ１  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＭｅｒｉｄｉａｎＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い、濃度が５ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬとなるように検体希釈液で希釈し、検体含有液を調製し、これを陽性検体試料とした。
上記調製した各検体含有液９０μＬを免疫クロマト分析装置の試料添加部に滴下し展開させ、１５分後にテストラインを目視で確認した。テストラインの赤い線がより強く発色したものを「＋＋＋」、赤い線が強く発色したものを「＋＋」、赤い線が発色したものを「＋」、赤い線がわずかに発色したものを「±」、赤い線を目視確認できないものを「−」とした。結果を表２に示す。
また、上記陽性検体の代わりにＰＢＳ及びヒト標準血清（Ａｃｃｅｓｓ  Ｂｉｏ社製）を用いた陰性検体試料を作製し、同様の試験を行った。結果を表２に示す。
【００９９】
【表２】
0006452644.tif 000003
【０１００】
この結果、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を用いた本発明の免疫クロマト分析装置によれば、検体中のジカウイルスを検出できることがわかった。特に、標識物質保持部と検出部に、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識するＮｏ．１またはＮｏ．２の抗体を含有させた実施例１〜３の免疫クロマト分析装置では、より感度良くジカウイルスを検出できることがわかった。
【０１０１】
試験例２（不活化したジカウイルスを用いた測定）
本試験では、上記作製した実施例１〜４の免疫クロマト分析キットを用い、不活化したジカウイルスを検体として測定を行った。検体としては、Ｚｉｋａ  ｖｉｒｕｓ  Ｈｅａｔ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＺｅｐｔＭｅｔｒｉｘ社製、原液濃度：ＴＣＩＤ５０＝１×１０５．２３Ｕ／ｍＬ）を用い、その濃度が原液、１０倍希釈、１００倍希釈、１０００倍希釈となるように、検体希釈液で希釈し、検体含有液を調製した。
調製した検体含有液を試料として、試験例１と同様に測定を行った。結果を表３に示す。
【０１０２】
【表３】
0006452644.tif 000004
【０１０３】
この結果、検体をＺｉｋａ  Ｖｉｒｕｓ  ＮＳ１  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎとして陽性反応が見られた実施例１〜４の免疫クロマト分析キットについて、検体を不活化したジカウイルスとした場合でも、同様に陽性反応を示した。
【０１０４】
また、特に、標識物質保持部と検出部に、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配列を認識するＮｏ．１またはＮｏ．２の抗体を含有させた実施例１〜３の免疫クロマト分析キットでは、より感度良く不活化したジカウイルスを検出できることがわかった。
【０１０５】
試験例３（デングウイルスを用いた測定）
本試験では、上記作製した実施例１〜４の免疫クロマト分析キットを用い、不活化したデングウイルスを検体として測定を行った。検体としては、Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２  ＡｂＤ（ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を用い、濃度が１×１０７ｐｆｕ／ｍＬとなるように検体希釈液で希釈し、検体含有液を調製した。
調製した検体含有液を試料として、試験例１と同様に測定を行った。結果を表４に示す。
【０１０６】
【表４】
0006452644.tif 000005
【０１０７】
この結果、本発明の免疫クロマト分析キットは、ジカウイルスと相同性の高いデングウイルスに対して交叉反応を起こさず、ジカウイルスを特異的に検出できることが分かった。
【０１０８】
以上の実施例の結果により、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を用いた本発明の免疫クロマト分析装置によれば、検体中のジカウイルスを検出できることがわかった。特に、標識物質保持部と検出部に、配列番号２〜４で示される３つのアミノ酸配列のうち少なくとも１つのアミノ酸配列を認識する抗体である、Ｎｏ．１またはＮｏ．２の抗体を含有させた免疫クロマト分析キットでは、特に感度良くジカウイルスを検出できることがわかった。
【０１０９】
さらに、ジカウイルスのＮＳ１を認識する抗体を用いた本発明の免疫クロマト分析装置によれば、ジカウイルスと相同性の高い他のウイルスに対して交叉反応を起こさず、ジカウイルスを特異的に検出できることが分かった。
【符号の説明】
【０１１０】
１  試料添加部
２  標識物質保持部
３  クロマトグラフ媒体部
４  検出部
５  吸収部
６  バッキングシート
【図１】
0006452644.tif 000006
【配列表】
0006452644000001.app