(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜であって、リポーター剤に機能的に連結された機能性嗅覚受容体を発現するか、又は異種の機能性嗅覚受容体を発現する、前記細胞若しくは前記細胞系又はそれらの細胞膜。
【請求項２】
請求項１に記載の哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜であって、前記細胞が一次細胞、不朽化細胞、ヒト以外の（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）哺乳類細胞、ヒト細胞、ネズミ細胞、有郭味覚乳頭細胞、茸状味覚乳頭細胞又は葉状味覚乳頭細胞である、前記細胞若しくは前記細胞系又はそれらの細胞膜。
【請求項３】
請求項１に記載の哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜であって、嗅覚受容体が哺乳類受容体又はヒト嗅覚受容体又はネズミ嗅覚受容体又は異種嗅覚受容体である、前記細胞若しくは前記細胞系又はそれらの細胞膜。
【請求項４】
請求項１に記載の哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜であって、嗅覚受容体が異種の又は外生の嗅覚受容体である、前記細胞若しくは前記細胞系又はそれらの細胞膜。
【請求項５】
請求項１に記載の哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜であって、リポーター剤に機能的に連結された機能性嗅覚受容体が哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜にとって本来のものである、前記細胞若しくは前記細胞系又はそれらの細胞膜。
【請求項６】
嗅覚受容体のモジュレーターの同定方法であって、
試験薬剤の存在下及び不在下で哺乳類味覚乳頭細胞又は哺乳類味覚乳頭細胞系又は哺乳類味覚乳頭細胞膜の前記嗅覚受容体の活性を検出する工程、及び
前記試験薬剤の不在下における前記嗅覚受容体の活性に対して前記試験薬剤の存在下で前記嗅覚受容体活性が向上又は低下したら、前記試験薬剤を嗅覚受容体のモジュレーターとして同定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記試験薬剤の存在下で前記嗅覚受容体の活性を検出する工程が
（ａ）前記哺乳類味覚乳頭細胞又は前記哺乳類味覚乳頭細胞系又は前記味覚乳頭細胞膜を該試験薬剤と接触させる工程、又は
（ｂ）細胞内Ｃａ2+レベルを決定する工程、又は
（ｃ）リポーター剤を検出する工程
を含み、かつ、前記哺乳類味覚乳頭細胞又は前記哺乳類味覚乳頭細胞系又は前記味覚乳頭細胞膜が前記リポーター剤に機能的に連結された嗅覚受容体を発現する、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記試験薬剤が天然薬剤又は合成薬剤又は臭気分子である、方法。
【請求項９】
嗅覚受容体リガンドの同定方法であって、
（ａ）嗅覚受容体を含有する哺乳類味覚乳頭細胞又は哺乳類味覚乳頭細胞系又は哺乳類味覚乳頭細胞膜と試験薬剤とを接触させる工程、及び
（ｂ）前記嗅覚受容体の活性を検出する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、さらに
（ｃ）前記活性に基づいて嗅覚受容体リガンドの存在又は不在を検出する工程を含む、方法。
【請求項１１】
嗅覚受容体リガンドのエンハンサー又はブロッカーの同定方法であって、
（ａ）嗅覚受容体を含んでなる哺乳類味覚乳頭細胞又は哺乳類味覚乳頭細胞系又は哺乳類味覚乳頭細胞膜を前記嗅覚受容体リガンドの存在下で試験薬剤と接触させる工程、及び
（ｂ）前記試験薬剤の存在下及び不在下で前記嗅覚受容体の活性を検出する工程
を含み、かつ
前記試験薬剤の存在下における前記嗅覚受容体の活性が前記試験薬剤の不在下における前記嗅覚受容体の活性に対して向上したら前記試験薬剤は前記嗅覚受容体リガンドのエンハンサーであるとし、
前記試験薬剤の存在下における前記嗅覚受容体の活性が前記試験薬剤の不在下における前記嗅覚受容体の活性に対して低下したら前記試験薬剤は前記嗅覚受容体リガンドのブロッカーであるとする、方法。
【請求項１２】
請求項６、９及び１１のいずれかに記載の方法であって、前記哺乳類味覚乳頭細胞若しくは前記哺乳類味覚乳頭細胞系又は哺乳類味覚乳頭細胞膜がヒト以外の哺乳類細胞、ヒト細胞、ネズミ細胞、不朽化細胞、不朽化味覚乳頭細胞から得られる細胞膜、一次細胞、一次味覚乳頭細胞から得られる細胞膜、有郭味覚乳頭細胞若しくは有郭味覚乳頭細胞膜、茸状味覚乳頭細胞若しくは茸状味覚乳頭細胞膜又は葉状味覚乳頭細胞若しくは葉状味覚乳頭細胞膜である、方法。
【請求項１３】
請求項６、９及び１１のいずれかに記載の方法であって、前記嗅覚受容体が哺乳類受容体又はヒト嗅覚受容体又はネズミ嗅覚受容体又は異種嗅覚受容体である、方法。
【請求項１４】
請求項６、９及び１１のいずれかに記載の方法であって、前記嗅覚受容体が哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜にとって本来のものである、方法。
【請求項１５】
請求項９又は１１に記載の方法であって、前記検出がリポーター剤の検出又は細胞内Ｃａ2+レベルの決定を含む、方法。
【請求項１６】
請求項９又は１１に記載の方法であって、前記試験薬剤が臭気分子である、方法。
【請求項１７】
請求項１１に記載の方法であって、前記試験薬剤が前記嗅覚受容体への結合に関して前記嗅覚受容体リガンドと競争するものである、方法。
【請求項１８】
嗅覚受容体リガンドのブロッカー若しくはエンハンサーとして又は匂い物質として、薬剤を同定するためのキットであって、機能性嗅覚受容体を発現する、哺乳類味覚乳頭細胞又は哺乳類味覚乳頭細胞系又は哺乳類味覚乳頭細胞膜、と使用説明書を含む、キット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットであって、さらに前記薬剤に反応する前記嗅覚受容体の活性の検出を可能にするリポーター剤を含む、キット。
【請求項２０】
請求項１８に記載のキットであって、前記哺乳類味覚乳頭細胞若しくは前記哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜がヒト以外の哺乳類細胞、ヒト細胞、ネズミ細胞、不朽化細胞、不朽化味覚乳頭細胞から得られる細胞膜、一次細胞、一次味覚乳頭細胞から得られる細胞膜、有郭味覚乳頭細胞若しくは有郭味覚乳頭細胞膜、茸状味覚乳頭細胞若しくは茸状味覚乳頭細胞膜又は葉状味覚乳頭細胞若しくは葉状味覚乳頭細胞膜である、キット。
【請求項２１】
請求項１８に記載のキットであって、前記嗅覚受容体が哺乳類受容体又はヒト嗅覚受容体又はネズミ嗅覚受容体又は異種嗅覚受容体である、キット。
【請求項２２】
請求項１８に記載のキットであって、前記嗅覚受容体が哺乳類味覚乳頭細胞若しくは哺乳類味覚乳頭細胞系又はそれらの細胞膜にとって本来のものである、キット。
【請求項２３】
請求項１８に記載のキットであって、さらに既知の匂い物質を含む、キット。
【請求項２４】
請求項１８に記載のキットであって、前記哺乳類味覚乳頭細胞又は前記哺乳類味覚乳頭細胞系又は前記哺乳類味覚乳頭細胞膜がリポーター剤に機能的に連結された嗅覚受容体を発現する、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
化学コミュニケーション（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）は、生命のために必要な情報を環境から得るために、種々の生物の中で広く用いられる。嗅覚及び味覚はそれぞれ化学受容（ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）の１つの形態である。味覚及び嗅覚系はそれぞれ外界における独特の化学物質の組に対して調整され、それらの対応する感覚空間（ｓｅｎｓｏｒｙ  ｓｐａｃｅｓ）が脳内の種々の領域中にマッピングされる。脊椎動物において、それぞれの味覚細胞はそれが発現する味覚受容体の組み合わせに従う少なくとも１つの味覚モダリティー（ｍｏｄａｌｉｔｙ）に感受性である：苦味に関するＴ２Ｒ受容体、甘味及びうま味に関するＴ１Ｒ受容体及び酸味に関するＰＫＤ２Ｌ１イオンチャンネル。脊椎動物において嗅覚受容体は、哺乳類の種において最大で１０００種のメンバーが予測されるＧタンパク質共役受容体の最大のサブファミリーを構成する。この多様性は、嗅覚系が数千の匂い物質の間を区別することを可能にする分子的基礎に相当する。
【０００２】
ほとんどの動物において味覚と嗅覚は別の感覚系であるが、いくつかの生物は１つの化学的感覚を有する。例えばヘビはその知覚系の一部としてその舌を用いる。舌が空気中にはじき出されると、舌の上の受容体は小さい（ｍｉｎｕｓｃｕｌｅ）化学粒子を拾い、それは匂いとして知覚される。舌がその鞘（ｓｈｅａｔｈ）中に引き込まれると、舌の先端はヤコブソン器官にぴったりはまり、集めた化学情報を器官を介して脳に送り、そこで情報は迅速に処理され且つ分析されて、ヘビがそれに基づいて敏速に行動できるようにする。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及び他のいくつかの昆虫において、異所性の嗅覚受容体を発現する味覚ニューロンは匂いを感知することができる。
【０００３】
哺乳類の嗅覚センセーション（ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）の理解における進歩は、嗅覚受容体のモジュレーターの同定において用いるためのモデルシステムの欠如により有意に妨げられてきた。本明細書に、哺乳類の味覚乳頭細胞における嗅覚受容体の機能的発現の発見に基づく嗅覚受容体のモジュレーターの同定方法を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
概案
本明細書に、嗅覚受容体のモジュレーターの同定方法を提供する。方法は、試験薬剤の存在下及び不在下で味覚乳頭細胞又は味覚乳頭細胞膜の嗅覚受容体の活性を検出し；試験薬剤の不在下における嗅覚受容体の活性に対して該試験薬剤の存在下において受容体活性が向上又は低下したら、試験薬剤を嗅覚受容体のモジュレーターとして同定することを含む。
【０００５】
本明細書に、嗅覚受容体リガンドの同定方法も提供する。該方法は、嗅覚受容体を含んでなる味覚乳頭細胞又は味覚乳頭細胞膜を試験薬剤と接触させ；嗅覚受容体の活性を検出することを含む。方法はさらに、嗅覚受容体の活性に基づいて嗅覚受容体リガンドの存在又は不在を検出することを含むことができる。
【０００６】
さらに本明細書に、嗅覚受容体を含んでなる味覚乳頭細胞又は味覚乳頭細胞膜を嗅覚受容体リガンドの存在下で試験薬剤と接触させ；試験薬剤の存在下及び不在下における嗅覚受容体の活性を検出することによる嗅覚受容体リガンドのエンハンサーの同定方法を提供し、ここで試験薬剤の存在下で嗅覚受容体の活性が試験薬剤の不在下における嗅覚受容体の活性に対して向上したら試験薬剤は嗅覚受容体リガンドのエンハンサーである。
【０００７】
本明細書に、嗅覚受容体を含んでなる味覚乳頭細胞又は味覚乳頭細胞膜を嗅覚受容体リガンドの存在下で試験薬剤と接触させ；試験薬剤の存在下及び不在下における嗅覚受容体の活性を検出することによる嗅覚受容体リガンドのブロッカーの同定方法も提供し、ここで試験薬剤の存在下で嗅覚受容体の活性が試験薬剤の不在下における嗅覚受容体の活性に対して低下したら試験薬剤は嗅覚受容体リガンドのブロッカーである。いくつかの態様において、試験薬剤は嗅覚受容体への結合に関して嗅覚受容体リガンドと競争する。
【０００８】
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、味覚乳頭細胞又は細胞膜を試験薬剤と接触させることにより、嗅覚受容体の活性を検出する。細胞内Ｃａ2+レベルの決定により、又はリポーター剤（ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）の検出により嗅覚受容体の活性を検出することができる。
【０００９】
方法に従って用いられる味覚乳頭細胞又は細胞膜は、哺乳類、例えばヒト又はネズミのものであることができる。開示される方法のいくつかの態様において、味覚乳頭細胞は不朽化味覚乳頭細胞であるか、あるいは味覚乳頭細胞膜を不朽化味覚乳頭細胞から得る。他の態様において、味覚乳頭細胞は一次味覚乳頭細胞であるか、あるいは味覚乳頭細胞膜を一次味覚乳頭細胞から得る。
【００１０】
方法に従って用いられる味覚乳頭細胞又は細胞膜は有郭味覚乳頭細胞又は細胞膜、茸状味覚乳頭細胞又は細胞膜あるいは葉状味覚乳頭細胞又は細胞膜であることができる。
【００１１】
本明細書に提供される方法に従って用いられる試験薬剤は天然の薬剤又は合成薬剤又は臭気分子（ｏｄｉｆｅｒｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であることができる。
【００１２】
方法のいくつかの態様において、嗅覚受容体は哺乳類嗅覚受容体、例えばヒト嗅覚受容体又はネズミ嗅覚受容体である。嗅覚受容体は異種嗅覚受容体であることができる。
【００１３】
本明細書でさらに具体化されるのは、薬剤を匂い物質として同定するためのキットである。そのようなキットは哺乳類味覚乳頭細胞又は細胞膜及び使用説明書を含む。キットは、薬剤に反応する嗅覚受容体の活性の検出を可能にするリポーター剤も含むことができる。味覚乳頭細胞又は味覚乳頭細胞膜は哺乳類、例えばこれらに限られないがヒト又はネズミのものであることができる。味覚乳頭細胞又は細胞膜は一次又は不朽化味覚乳頭細胞又は細胞膜であることができる。味覚乳頭細胞又は細胞膜は有郭味覚乳頭細胞又は細胞膜、茸状味覚乳頭細胞又は細胞膜あるいは葉状味覚乳頭細胞又は細胞膜であることができる。いくつかの態様において、味覚乳頭細胞又は細胞膜は哺乳類嗅覚受容体、例えばヒト嗅覚受容体又はネズミ嗅覚受容体を含む。いくつかの態様において、味覚乳頭細胞又は細胞膜は異種嗅覚受容体を含む。
【００１４】
哺乳類味覚乳頭細胞又は細胞膜及び既知の匂い物質を含む、嗅覚受容体リガンドのブロッカー又はエンハンサーとして薬剤を同定するためのキットも提供する。キットは使用説明書も含むことができる。キットは、薬剤に反応する嗅覚受容体の活性の検出を可能にするリポーター剤も含むことができる。味覚乳頭細胞又は味覚乳頭細胞膜は哺乳類、例えばこれらに限られないがヒト又はネズミのものであることができる。味覚乳頭細胞又は細胞膜は一次又は不朽化味覚乳頭細胞又は細胞膜であることができる。味覚乳頭細胞又は細胞膜は有郭味覚乳頭細胞又は細胞膜、茸状味覚乳頭細胞又は細胞膜あるいは葉状味覚乳頭細胞又は細胞膜であることができる。いくつかの態様において、味覚乳頭細胞又は細胞膜は哺乳類嗅覚受容体、例えばヒト嗅覚受容体又はネズミ嗅覚受容体を含む。いくつかの態様において、味覚乳頭細胞又は細胞膜は異種嗅覚受容体を含む。
【００１５】
さらに本明細書に、リポーター剤に機能的に連結された嗅覚受容体を発現する哺乳類味覚乳頭細胞又はその細胞膜を提供する。細胞は一次細胞又は不朽化細胞であることができる。細胞は好ましくは哺乳類、例えばこれらに限られないがヒト又はネズミのものである。細胞は有郭味覚乳頭細胞、茸状味覚乳頭細胞あるいは葉状味覚乳頭細胞であることができる。嗅覚受容体は、好ましくは哺乳類嗅覚受容体、より好ましくはヒト又はネズミ嗅覚受容体である。いくつかの態様において、嗅覚受容体は異種嗅覚受容体である。前記の哺乳類味覚乳頭細胞又は細胞膜及び使用説明書を含んでなるキットも提供する。
【００１６】
リポーター剤に機能的に連結された嗅覚受容体を発現する哺乳類味覚乳頭細胞系も提供する。細胞系は好ましくは哺乳類、例えばこれらに限られないがヒト又はネズミのものである。細胞系は有郭味覚乳頭細胞、茸状味覚乳頭細胞あるいは葉状味覚乳頭細胞に由来することができる。嗅覚受容体は、好ましくは哺乳類嗅覚受容体、より好ましくはヒト又はネズミ嗅覚受容体である。いくつかの態様において、嗅覚受容体は異種嗅覚受容体である。前記の哺乳類味覚乳頭細胞系及び使用説明書を含んでなるキットも提供する。
【００１７】
細胞、細胞膜、キット及び関連する使用方法を本明細書でさらに十分に議論する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な記述
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、ｍＯＲ−Ｉ７−ＧＦＰマウスの有郭味覚乳頭中のＩ７嗅覚受容体の透過画像（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｍａｇｅｓ）を示す。ｍＯＲ−Ｉ７−ＧＦＰトランスジェニックマウスは、有郭味覚乳頭における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す。ＬＥＩＣＡ（登録商標）ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を取得した。図１Ａは対応する領域の透過画像を示す。図１Ｂは有郭乳頭におけるＧＦＰの発現を示す。図１ＣはＧＦＰと有郭乳頭の重なりを示す。ＬＣＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）及びＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ｅｌｅｍｅｎｔ  ２．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて画像を配置し、コントラスト及び輝度に関して最低限調整した。スケールバー＝２５μＭ。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスの有郭味覚乳頭中のＭ７１嗅覚受容体の透過画像を示す。ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰトランスジェニックマウスは、有郭味覚乳頭における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す。ＬＥＩＣＡ（登録商標）ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を取得した。図２Ａは対応する領域の透過画像を示す。図２Ｂは有郭乳頭におけるＧＦＰの発現を示す。図２ＣはＧＦＰと有郭乳頭の重なりを示す。図１Ａ〜１Ｃに関して上記で記載した通りに画像を配置し、最低限調整した。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスの有郭味覚乳頭中のオイゲノール嗅覚受容体の透過画像を示す。ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰトランスジェニックマウスは、有郭味覚乳頭におけるＧＦＰの発現を示す。ＬＥＩＣＡ（登録商標）ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を取得した。図３Ａは対応する領域の透過画像を示す。図３Ｂは有郭乳頭におけるＧＦＰの発現を示す。図３ＣはＧＦＰと有郭乳頭の重なりを示す。図１Ａ〜１Ｃに関して上記で記載した通りに画像を配置し、最低限調整した。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスの有郭味覚乳頭中のオイゲノール嗅覚受容体の透過画像を示す。ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰトランスジェニックマウスは、有郭味覚乳頭におけるＧＦＰの発現を示す。ＬＥＩＣＡ（登録商標）ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像を取得した。図４Ａは対応する領域の透過画像を示す。図４Ｂは有郭乳頭におけるＧＦＰの発現を示す。図１Ａ〜１Ｃに関して上記で記載した通りに画像を配置し、最低限調整した。
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、ｍＯＲ−Ｉ７−ＧＦＰマウスの有郭乳頭におけるＰＬＣ−ｂ２（Ａ、Ｂ）及びＧＦＰ（Ｃ、Ｄ）の共局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）の透過画像である。
【図６Ａ−６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスの有郭乳頭におけるＰＬＣ−ｂ２（図６Ｃ）及びＧＦＰ（図６Ｂ）の共局在を示す透過画像である。未染色（ｕｎｓｔａｉｎｅｄ）（図６Ａ）及び重ね（ｏｖｅｒｌａｙ）（図６Ｄ）も示す。
【図７Ａ−７Ｄ】図７Ａ〜７Ｄは、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスの有郭乳頭におけるＰＬＣ−ｂ２（７Ｂ）及びＧＦＰ（７Ｃ）の共局在を示す。重ね（７Ｄ）及び未染色（７Ａ）の透過画像も示す。
【図８Ａ−８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスの有郭乳頭におけるガストデューシン（８Ｂ）及びＧＦＰ（８Ｃ）の共局在を示す透過画像である。標準（ｎｏｒｍａｌ）（８Ａ）及び重ね（８Ｄ）も示す。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｄは、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰの有郭乳頭におけるガストデューシン（９Ｂ）及びＧＦＰ（９Ｃ）の共局在を示す透過画像である。標準（９Ａ）及び重ね（９Ｄ）も示す。
【図１０Ａ−１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｍ７１及びオイゲノールトランスジェニックマウスの作製に用いられる培養野生型マウス味覚（Ｍ１２９）細胞において、４８８ｎｍの波長（ＧＦＰ関連シグナルを誘導する）により誘導されるシグナルが観察されなかったことを示す。新しく単離された味覚組織（図１０Ａ及び１０Ｃ）は、４８８ｎｍの波長の光により誘導された後にＧＦＰ発現を示さなかった。Ｍ１２９マウスから得られる培養味覚乳頭細胞（図１０Ｂ及び１０Ｄ）は、４８８ｎｍの波長の光により誘導される時にＧＦＰ発現を示さなかった。ＤＡＰＩ染色は細胞の核を示す。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰ（“Ｍ７１”）マウスから新しく単離される味覚組織が４８８ｎｍの波長の光により誘導される時にＧＦＰを発現することを示す。
【図１２Ａ−１２Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｆは、ペプチド阻害アッセイにより確証される培養ヒト茸状味覚細胞におけるＯＲ８Ｄ１の発現を示す。図１２Ａ及び１２Ｄは、ＯＲ８Ｄ１特異的ペプチドのそれぞれ不在下又は存在下における培養ヒト味覚乳頭細胞の透過画像を示す。ＯＲ８Ｄ１抗体の特異的なペプチドの不在下（図１２Ｂ）及び存在下（図１２Ｅ）においてＯＲ８Ｄ１抗体を用いて染色された培養ヒト味覚乳頭細胞（ＨＢＯ）を示す。図１２Ｂは培養ヒト味覚乳頭細胞のサブグループにおけるＯＲ８Ｄ１発現の存在を示すが、ＯＲ８Ｄ１抗体のその特異的なペプチドと一緒の予備インキュベーションはＯＲ８Ｄ１特異的免疫染色の完全な除去を生じた（図１２Ｅ）。図１２Ｃ及び１２Ｆは、ＯＲ８Ｄ１特異的ペプチドのそれぞれ不在下又は存在下における培養ヒト味覚乳頭細胞の核の透過画像を示す。
【図１３】図１３は、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰ（“Ｍ７１”）マウスから得られる培養味覚乳頭細胞が受容体特異的な匂い、アセトフェノン及び苦味混合物に反応することを示すグラフであり、１つの細胞上における嗅覚及び味覚受容体の両方を示している。
【図１４】図１４は、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰ（“Ｍ７１”）マウスから得られる培養味覚乳頭細胞が受容体特異的なにおい、ベンズアルデヒド及び苦味混合物に反応することを示し、１つの細胞上における味覚及び嗅覚受容体の両方を示している。
【図１５】図１５は、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰ（“Ｍ７１”）マウスから得られる培養味覚乳頭細胞が受容体特異的な匂い、アセトフェノン及びベンズアルデヒドならびに苦味混合物に反応することを示し、１つの細胞上における嗅覚及び味覚受容体の両方を示している。
【図１６】図１６は、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰ（“ｍＥＵＧ”）マウスから得られる培養味覚乳頭細胞が受容体特異的な匂い、オイゲノール及び苦味混合物に反応することを示し、１つの細胞上における味覚及び嗅覚受容体の両方を示している。ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞は特定的に（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）、１つの細胞上における嗅覚及び味覚受容体の両方を示している。
【図１７】図１７は、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰ（“ｍＥＵＧ”）マウスから得られる培養味覚乳頭細胞が苦味混合物及びＭｉｘ  Ａに反応することを示し、１つの細胞上における味覚及び嗅覚受容体の両方を示している。
【図１８】図１８は、Ｍ１２９マウスから得られる培養味覚乳頭細胞がオイゲノールに感受性であることを示す。
【図１９】図１９は、Ｍ１２９マウスから得られる培養味覚乳頭細胞がＭｉｘ  Ａに感受性であることを示す。
【図２０】図２０は、Ｍ１２９マウスから得られる培養味覚乳頭細胞がアセトフェノンに感受性であることを示す。
【図２１】図２１は、Ｍ１２９マウスから得られる培養味覚乳頭細胞がＭｉｘ  Ｂ、ベンズアルデヒド及び苦味混合物に反応することを示し、１つの細胞上における味覚及び嗅覚受容体の両方を示している。
【図２２】図２２は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞が匂い刺激物質Ｍｉｘ  Ａ及びＭｉｘ  Ｂに反応することを示す。ｆｕｒａ−２標準カルシウム画像化系（ｆｕｒａ−２  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、培養ヒト茸状味覚細胞中での細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ２＋］ｉ）における変化を測定した。グラフは、匂いへの暴露の間の個々の細胞での代表的な［Ｃａ＋２］ｉレベルにおける変化を示す。刺激物質はリンゲル液中に溶解され、ｐＨ及び容量オスモル濃度に関して調整された。
【図２３】図２３は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞がオイゲノールに感受性であることを示す。反応に含まれる可能性のある受容体は、ヒトＯＲ５Ｄ１８（又はマウスＯｌｆｒ７３）である。
【図２４】図２４は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞がヘキサン酸に感受性であることを示す。反応に含まれる可能性のある受容体はヒトＯＲ５１Ｌ１（あるいはマウスＯｌｆｒ６４及び／又はＯｌｆｒ６５３）である。
【図２５】図２５は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞がクマリンに感受性であることを示す。反応に含まれる受容体はおそらくヒトＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ１及びＯＲ５Ｐ３（あるいはマウスＯｌｆｒ１５１９、Ｏｌｆｒ７４９、Ｏｌｆｒ１３５２、Ｏｌｆｒ１０７９、Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ１３４１、Ｏｌｆｒ１０６２、Ｏｌｆｒ１０９、Ｏｌｆｒ５０８、Ｏｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ８７６、Ｏｌｆｒ１１０４及びＯｌｆｒ８９５）の１つもしくはそれより多くである。
【図２６】図２６は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞がアセトフェノンに感受性であることを示す。反応に含まれる受容体はヒトＯＲ２Ｗ１及びＯＲ５Ｐ３（あるいはマウスＯｌｆｒ７４９、Ｏｌｆｒ１３５２、Ｏｌｆｒ１０７９、Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ１３４１、Ｏｌｆｒ１０６２、Ｏｌｆｒ１０９、Ｏｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ８７６、Ｏｌｆｒ１１０４、Ｏｌｆｒ８９５、Ｏｌｆｒ１６８、Ｏｌｆｒ４２９、Ｏｌｆｒ１６７及びＯｌｆｒ１５１）の１つもしくはそれより多くである。
【図２７】図２７は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞がヘプタナールに感受性であることを示す。反応に含まれる受容体はおそらくＯＲ２Ｗ１（又はマウスＯｌｆｒ１７）である。
【図２８】図２８は、ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞がライラール（ｌｙｒａｌ）に感受性であることを示す。反応に含まれる受容体はヒトＯＲ１０Ｊ５（又はマウスＯｌｆｒ１５及びＯｌｆｒ１６）である。
【図２９Ａ−２９Ｃ】図２９Ａ〜２９Ｃは、オイゲノールに反応性であったｍＯＲ−ＥＵＧ−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞におけるＧＦＰの発現を示す。カルシウム画像化後に写真を撮った。図２９Ａは培養ｍＯＲ−ＥＵＧ−ＧＦＰマウス味覚細胞の光透過を示す。図２９Ｂは、ＧＦＰを発現する図２９Ａの細胞を示す。図２９Ｃは、重ねにおける図２９Ａの細胞を示す。これらの図は、オイゲノール反応性細胞がＧＦＰを発現することを示し、オイゲノールに反応した培養マウス味覚細胞上におけるオイゲノール受容体の存在を示している。
【図３０Ａ−３０Ｃ】図３０Ａ〜３０Ｃは、アセトフェノンに反応性であったｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞におけるＧＦＰの発現を示す。カルシウム画像化後にこの画像を撮った。矢印で標識される反応性の細胞はＧＦＰの発現を示した。図３０Ａは、培養ｍＯＲ−ＥＵＧ−ＧＦＰマウス味覚細胞の光透過を示す。図３０Ｂ及び３０Ｃは、ＧＦＰを発現する培養マウス味覚細胞を示す。これらの図は、オイゲノール反応性細胞がＧＦＰを発現することを示し、オイゲノールに反応した培養マウス味覚細胞上におけるオイゲノール受容体の存在を示している。
【図３１Ａ−３１Ｂ】図３１Ａ及び３１Ｂは、ＯＲ７Ｄ４又はＯＲＳ６を用いてトランスフェクションされた培養味覚細胞が、それぞれの受容体に関する匂いリガンドへの向上したカルシウム反応を示すことを示すグラフである。
【図３２Ａ−３２Ｅ】図３２Ａ〜３２Ｅは、ヘプタアルデヒド（３２Ａ）、アセトフェノン（３２Ｂ）、メチルシナモン（３２Ｃ）、オイゲノール（３２Ｄ）及びライラール（３２Ｅ）に特異的な匂い受容体の存在を示した通り、不朽化ヒト茸状味覚乳頭細胞が受容体特異的な匂いに反応することを示す。培養ヒト茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞の不朽化により、不朽化ヒト茸状味覚乳頭細胞を得た。これらの結果は、不朽化ヒト茸状味覚乳頭細胞がその最初の生理学的性質及び分子的性質及びシグナル伝達性を保存していることを示す。
【代表的な態様の詳細な記述】
【００１９】
明細書及び請求項全体を通じて記述の側面に関連する種々の用語が用いられる。そのような用語は、他に指示されなければ、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の特定的に定義される用語は、本明細書に与えられる定義と一致する方法で解釈されるべきである。
【００２０】
本明細書及び添付の請求項において用いられる場合、単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、内容が明らかに他のように指定していなければ、複数の対象（ｒｅｆｅｒｅｎｔｓ）を含む。かくして例えば「細胞」（“ａ  ｃｅｌｌ”）への言及は、２個もしくはそれより多い細胞の組み合わせなどを含む。明細書中の種々の態様は、「含んでなる」という用語を用いて示され、それは他の成分又は方法段階を含む。「含んでなる」が用いられる場合、関連する態様は他の成分又は方法段階を排除する「より成る」という用語ならびに態様又は発明の性質を実質的に変える成分又は方法段階を排除する「本質的により成る」という用語を用いる記述を含むことが理解されるべきである。
【００２１】
量、一時的持続時間などのような測定可能な値に言及する時に本明細書で用いられる「約」という用語は、特定される値から最高で±１０％の変動を包含するものとし、それは、そのような変動が開示される方法の実施に妥当であるからである。他のように指示されなければ、明細書及び請求項中で用いられる成分の量、分子量のような性質、反応条件などを表すすべての数は、すべての場合に「約」という用語により修飾されると理解されるべきである。従って、そうでないと指示されなければ、以下の明細書及び添付の請求項中に示される数的パラメーター（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は近似値であり、それは本発明が得るべく追及する所望の性質に依存して変わり得る。何はともあれ、そして請求項の範囲への同等事項の理論の適用を制限するつもりはなく、各数的パラメーターは少なくとも報告される有意な桁数を見て、且つ通常の丸め法の適用により解釈されるべきである。
【００２２】
本発明の広い範囲を示している数的範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例中に示される数値は可能な限り正確に報告される。しかしながらいずれの数値も本質的に、それらそれぞれの試験測定値中に見出される標準偏差から必然的に生ずるある種の誤差を含有する。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「結合に関して競争する」という用語は、ある活性を有する第２の薬剤が結合すると同じ基質に結合する活性を有する第１の薬剤に言及して用いられる。第１の薬剤による結合の効率（例えば速度論又は熱力学）は第２の薬剤による基質結合の効率と同じか、又はそれより高いか、又はそれより低いことができる。例えば基質への結合に関する平衡結合定数（ＫD）は２つの薬剤に関して異なることができる。
【００２４】
本明細書で用いられる「一次細胞」という用語は、組織から直接単離された非−形質転換、非−不朽化細胞を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「リポーター遺伝子」という用語は、アッセイされ得るタンパク質をコードする遺伝子を指す。「リポーター遺伝子又は分子」は、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、クエンチング剤、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、酵素、基質、補因子、阻害剤及び当該技術分野において既知の他の部分をコードする遺伝子を含む。ある態様における「リポーター分子」は測定可能なシグナルを発することができる。リポーター遺伝子の例にはルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（例えばタウＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄−赤色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限られない。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、アッセイへの言及において用いられる時の「反応」という用語は、検出可能なシグナルの発生を指す（例えばリポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の向上、検出可能な化学生成物の蓄積）。
【００２７】
本明細書で用いられる「味覚乳頭細胞」という句は、味覚基底細胞ならびに／あるいは１個もしくはそれより多い味覚受容体を発現し、１つもしくはそれより多い味物質刺激に反応する（例えば細胞内カルシウムレベル及び／又は電気生理学的データの監視により決定される）細胞を指す。いくつかの態様において、味覚乳頭細胞は味覚乳頭細胞の１つもしくはそれより多いバイオマーカー（例えばホスホリパーゼ−ベータ２及び／又はガストデューシン）を発現する。味覚基底細胞は１つもしくはそれより多い幹細胞マーカー（例えばシトケラチン  ８（ＣＫ８）、ＨＥＳ１、ＨＥＳ６、Ｓｏｘ２、ｍａｓｈ１など）を発現し、味覚細胞型（例えばＴｙｐｅ  Ｉ、Ｔｙｐｅ  ＩＩ又はＴｙｐｅ  ＩＩＩ）に分化することができる。
【００２８】
「試験薬剤」という用語は、いずれかの天然又は合成化学成分、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、薬剤、食品などを指す。例えば試験薬剤は食物、医薬品、食物もしくは医薬品の成分もしくは分解生成物又は食物もしくは医薬品の汚染物質であることができる。
【００２９】
同族嗅覚受容体リガンドならびにそのエンハンサー及びブロッカーの同定のためのモデルシステムを提供することにより、嗅覚コーディング（ｃｏｄｉｎｇ）の理解を促進するのに役立つ細胞、細胞膜、方法及びキットを本明細書に記載する。記載される細胞、細胞膜、方法及びキットは多数の研究的、診断的、治療的、薬剤及び食品スクリーニング用途を与える。例えば記載される細胞、細胞膜、方法及びキットは、健康状態及び嗅覚反応を担う嗅覚受容体リガンドの同定及び特性化を可能にする。かくして細胞、細胞膜、方法及びキットは、嗅覚反応の操作（例えば知覚された匂いの抑制のため）を可能にするリガンドの同定のための手段も与える。
【００３０】
味覚乳頭細胞及び細胞膜
本明細書に、１つもしくはそれより多い嗅覚受容体（ＯＲｓ）を機能的に発現する味覚
乳頭細胞を提供する。いくつかの態様において、味覚乳頭細胞が発現する１つもしくはそれより多い嗅覚受容体は細胞にとって本来のものである。ＯＲをコードする１つもしくはそれより多いポリヌクレオチドを含むように改変された味覚乳頭細胞（すなわち例えば組み換えにより発現される異種発現）も提供する。当該技術分野における熟練者により理解される通り（例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる米国特許第７，４８８，５９９号明細書を参照されたい）、嗅覚受容体をコードするポリヌクレオチドを含むように細胞を形質転換する方法を用い、本明細書に記載される改変された細胞を作製することができる。好ましい態様において、味覚乳頭細胞及び細胞膜は、鳥類、マウス、ラット、ウサギ、サル、エイプ又はヒトを含むがこれらに限られない哺乳類のものであり、好ましくはヒト又はネズミのものである。
【００３１】
１つもしくはそれより多い嗅覚受容体を機能的に発現する記載される味覚乳頭細胞の細胞膜も提供する。
【００３２】
嗅覚受容体はＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、それに匂い物質が結合して、細胞内カルシウムレベルを変化させる細胞内シグナリング事象のカスケードを開始させる。嗅覚受容体ニューロンの細胞膜中で発現される嗅覚受容体は匂い分子の検出を担う。活性化された嗅覚受容体はシグナル伝達カスケードの最初の演者であり、カスケードは最後に神経インパルスを生じ、それは脳に伝達される。これらの受容体はＧＰＣＲｓのクラスＡロドプシン−様ファミリー（ｃｌａｓｓ  Ａ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｍｉｌｙ）のメンバーである。哺乳類嗅覚細胞又はＯＲｓを発現する味覚細胞中に、ＯＲｓの細胞−表面膜への交通（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）及びリガンド−誘導反応を助長するある種のシャペロン又は補助タンパク質、例えばＲＴＰ１Ｓが存在する。非−嗅覚起源の培養細胞中で異種発現されると、匂い物質受容体タンパク質は小胞体中に保持される。かくして本来のＯＲを含有する味覚細胞でない本明細書に記載される細胞、細胞系又は細胞膜は、異種細胞（すなわち自然にＯＲ又は補助タンパク質を含有していない細胞）における細胞−表面膜へのそれらの交通及びリガンド−誘導反応を助長するために、ＲＴＰ１Ｓのような補助タンパク質を含有するように改変されねばならない。あるいはまた、自然に補助タンパク質を含有する細胞を、本明細書に記載する通りに、及び通常のトランスフェクション又は他の既知の細胞改変法を用いて、追加のＯＲｓを含有し且つ発現するように改変することができる。
【００３３】
当該技術分野において既知の手段により（例えば細胞内カルシウムレベル及び／又は電気生理学的データの監視により）、機能性嗅覚受容体発現を決定することができる。嗅覚受容体は、鳥類、マウス、ラット、ウサギ、サル、エイプ又はヒトから得られる嗅覚受容体を含むがこれらに限られないいずれの哺乳類嗅覚受容体であることもできる。嗅覚受容体は、好ましくはヒト又はネズミのものである。嗅覚受容体の例は当該技術分野における熟練者に既知であり、ヒトＯＲ５１Ｌ、ＯＲ５Ｄ１８、ＯＲ８Ｄ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ｊ５及びＯＲ５Ｐ３；ネズミＯｌｆｒ１５、Ｏｌｆｒ１６、Ｏｌｆｒ１７、Ｏｌｆｒ６４、Ｏｌｆｒ７３、Ｏｌｆｒ６５３、Ｏｌｆｒ１５１９、Ｏｌｆｒ７４９、Ｏｌｆｒ１３５２、Ｏｌｆｒ１０７９、Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ１３４１、Ｏｌｆｒ１０６２、Ｏｌｆｒ１０９、Ｏｌｆｒ５０８、Ｏｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ８７６、Ｏｌｆｒ１１０４、Ｏｌｆｒ１６８、Ｏｌｆｒ４２９、Ｏｌｆｒ１６７、Ｏｌｆｒ１５１及びＯｌｆｒ８９５；ならびに匂い物質により誘導される反応を行う能力を有するその断片及び誘導体が含まれるが、これらに限られない。例えばＺｈａｎｇ  ａｎｄ
Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ著，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，５（２）：１２４−１３３；Ｍａｌｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．著，ＰＮＡＳ，２００４，１０１（８）：２５８４−２５８９；Ｏｌｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，３（１）：８７−９７；Ｚｏｚｕｌｙａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，２００１，２（６）：ｒｅｓｅａｒｃｈ００１８．１−００１８．２を参照さ
れたい。これらの参照文献のそれぞれは引用することによりそれらの記載事項が本明細書の内容となる。
【００３４】
舌のような末梢組織から葉状、茸状又は有郭味覚乳頭細胞又はその細胞膜を含む味覚乳頭細胞及び細胞膜を得ることができる（例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる米国特許第７，４８８，５９９号明細書を参照されたい）。本明細書に記載される方法及びキットに従って用いるための味覚乳頭細胞及び細胞膜は一次又は不朽化味覚乳頭細胞又はそれから得られる細胞膜であることができる。かくして本明細書に、１つもしくはそれより多い嗅覚受容体を発現する哺乳類味覚乳頭細胞の細胞系も提供する。
【００３５】
記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜のいくつかの態様において、嗅覚受容体遺伝子又は遺伝子プロモーターがリポーター剤に機能的に連結されるようにそれらを改変する。代表的なネズミ嗅覚受容体遺伝子プロモーターにはオイゲノールプロモーター、Ｍ７１プロモーター及びＩ７プロモーターならびにＯｌｆｒ１５、Ｏｌｆｒ１６、Ｏｌｆｒ１７、Ｏｌｆｒ６４、Ｏｌｆｒ７３、Ｏｌｆｒ６５３、Ｏｌｆｒ１５１９、Ｏｌｆｒ７４９、Ｏｌｆｒ１３５２、Ｏｌｆｒ１０７９、Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ１３４１、Ｏｌｆｒ１０６２、Ｏｌｆｒ１０９、Ｏｌｆｒ５０８、Ｏｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ８７６、Ｏｌｆｒ１１０４、Ｏｌｆｒ１６８、Ｏｌｆｒ４２９、Ｏｌｆｒ１６７、Ｏｌｆｒ１５１及びＯｌｆｒ８９５プロモーターが含まれるが、これらに限られない。代表的なヒトプロモーターには嗅覚受容体ＯＲ５１Ｌ、ＯＲ５Ｄ１８、ＯＲ８Ｄ１、ＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ１、ＯＲ１０Ｊ５及びＯＲ５Ｐ３のプロモーターが含まれるが、これらに限られない。適したリポーターを本明細書に挙げる。いくつかの態様において、リポーター剤をコードする配列を内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と一緒に導入する。そのような連結は嗅覚受容体の発現の検出を可能にする。選ばれたプロモーターを適した手段により誘導し、続いてリポーター剤を検出することができる。
【００３６】
１つの態様において、適したプロモーター及び場合によるリポーター遺伝子ならびに場合により上記で議論したシャペロンＤＮＡに機能的に連結された嗅覚受容体ＤＮＡを用いて味覚細胞を一過的にトランスフェクションする。そのようなトランスフェクションのためのＤＮＡ配列の形成のために用いられる方法は、当該技術分野において記述されている；例えば上記で引用した公開文献の１つあるいはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。細胞が受容体を発現することを可能にするための上記の適したプロモーター、適した嗅覚受容体ＤＮＡ、リポーター配列ならびに補助ＤＮＡ配列の選択。そのような補助配列にはＲＴＰ１Ｓ，Ｍ１配列が含まれる（例えばＷｕ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｕｎｅ  ２０１２，”Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １  Ｓｈｏｒｔ（ＲＴＰ１Ｓ）  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｄｏｒａｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  Ａｃｔｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｔｅｐｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（２６）：２２２８７−９４を参照されたい）。他の有用な配列には内部リボザイム進入部位（ＩＲＥＳ）、例えばポリオウイルス内部リボソーム進入配列が含まれる。当該技術分野においてさらに他が既知であり、入手可能である。ＩＲＥＳの代わりとして、ＤＮＡは翻訳後事象において自己−切断する２Ａペプチドをコードする配列を含むことができる。例えばＭ．Ｌ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ  １）：１３−２１（Ｊａｎ  １９９７）；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３（Ｊｕｎｅ  ２００１）；Ｋｌｕｍｐ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７（Ｍａｙ
２００１）を参照されたい。さらに別の望ましい配列は、約１５〜２５個の核酸のスペーサー配列又はプロモーターと１個もしくはそれより多いオペレーター配列の間に間隔を
置くイントロンならびに核局在化配列（ＮＬＳ）である。ＤＮＡ配列中に含むための追加の調節配列にはエンハンサー配列、スプライスドナー配列及びスプライスアクセプター配列、転写開始及び終止のための部位、リボソーム結合部位、エピトープタグ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓ“ＴＡＴＡ”要素、制限酵素切断部位、選択可能マーカー、複製起点、ポリアデニル化配列（例えばＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ）、薬剤耐性マーカー（例えばカナマイシン耐性）が含まれるが、これらに限られない。すべてのそのような要素を広く既知の配列の中から選ぶこともできる。
【００３７】
ＤＮＡ配列は、エレクトロポレーション、適したウイルスもしくはウイルス−様粒子、例えばＡＡＶを介する送達又は他の既知の方法のような通常の経路により、細胞内にトランスフェクションされる。本明細書に記載される発明は、用いられるトランスフェクションの特定の方法によってもトランスフェクションされるべきＤＮＡ配列の成分の選択によっても制限されない。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹの種々の版のようなテキストを参照されたい。
【００３８】
記載される味覚乳頭細胞及び細胞膜の使用方法
記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜を、本明細書に提供される嗅覚受容体のリガンド及びモジュレーターの同定方法において用いることができる。試験薬剤が味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜上の嗅覚受容体に結合する能力を、例えば薬剤を放射性同位体又は酵素標識にカップリングさせ、複合体中の標識された薬剤を検出することによって嗅覚受容体への薬剤の結合を決定できるようにすることにより、遂行することができる。例えば試験薬剤を125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は3Ｈで直接又は間接に標識し、放射線放射の直接カウンティングにより、又はシンチレーションカウンティングにより放射性同位体を検出することができる。あるいはまた、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はルシフェラーゼを用いて試験薬剤を酵素的に標識し、適した基質の生成物への転換の決定により酵素標識を検出することができる。いずれかの相互作用物の標識を用いて又は用いずに、試験薬剤が嗅覚受容体と相互作用する能力を当該技術分野おいて既知のいずれかの手段により評価することもできる。
【００３９】
いくつかの態様において、嗅覚受容体リガンドの同定方法は、記載される機能性嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を試験薬剤に暴露し、続いて嗅覚受容体活性を検出することを含む。用いられ得る試験薬剤にはいずれかの天然又は合成化学成分、医薬品、薬剤、食品などが含まれるが、これらに限られない。例えば試験薬剤は食物、医薬品、食物もしくは医薬品の成分もしくは分解生成物、臭気分子又は組成物（例えばヘプタナール、アセトフェノン、ライラール、オイゲノール、苦味混合物、Ｍｉｘ  Ａ、Ｍｉｘ  Ｂ）あるいは食物もしくは医薬品の汚染物質であることができる。試験薬剤が嗅覚受容体に関して特異的なリガンドである場合、嗅覚受容体活性における変化が検出可能であろう。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を、嗅覚受容体の活性化に続くシグナル伝達を監視するセカンドメッセンジャーアッセイ（ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ａｓｓａｙ）において用いることができる（例えば細胞内Ｃａ+2レベル又はｃＡＭＰレベルの測定）。セカンドメッセンジャーアッセイにおいて、細胞又は細胞膜を１種の薬剤又は複数種の薬剤（例えば組み合わせライブラリから）と接触させ、反応の存在又は不在に関してアッセイする。いくつかの態様において、セカンドメッセンジャーアッセイは、膜受容体及びイオンチャンネルの刺激の結果としての細胞内変化（例えばＣａ2+レベル、膜電位、ｐＨ、ｃＡＭＰ、ＩＰ3、アラキドン酸放出）に反応する受容体分子からの蛍光シグナルを検出又は測定する。リポーター分子の例には
ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）系（例えばＣｕｏ−脂質及びオキソノール、ＥＤＡＮ／ＤＡＢＣＹＬ）、カルシウム感受性インジケーター（例えばＦｌｕｏ−３、ＦＵＲＡ
２、ＩＮＤＯ  １及びＦＬＵＯ３／ＡＭ、ＢＡＰＴＡ  ＡＭ）、塩素−感受性インジケーター（例えばＳＰＱ、ＳＰＡ）、カリウム−感受性インジケーター（例えばＰＢＦＩ）、ナトリウム−感受性インジケーター（例えばＳＢＦＩ）ならびにｐＨ感受性インジケーター（例えばＢＣＥＣＦ）が含まれるが、これらに限られない。一般に試験薬剤への暴露の前に細胞又は細胞膜にリポーター分子を負荷する。試験薬剤を用いる処理への細胞又は細胞膜の反応は、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメトリー、マイクロ流体デバイス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ）、ＦＬＩＰＲ系を含むがこれらに限られない当該技術分野において既知の方法により検出され得る。例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＳｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｎｅａｇｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １：７５（１９９６）及びプレートリーダー系（ｐｌａｔｅ−ｒｅａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照されたい。
【００４１】
他の態様において、転写／翻訳レベルにおける細胞反応を監視するリポーター遺伝子アッセイにおいて味覚乳頭細胞及び細胞膜を用いることができる。例えば嗅覚受容体遺伝子又は遺伝子プロモーターをリポーター剤（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、６−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、β−ガラクトシダーゼ及びＧＡＬ４）に機能的に連結すると、リポーター剤の発現又は発現における変化が検出可能になるであろう。
【００４２】
記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜を、嗅覚受容体のモジュレーターの同定方法において用いることができる。いくつかの態様において、方法は試験薬剤の存在下及び不在下において、記載される味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜が発現する機能性嗅覚受容体の活性を測定又は検出することを含む。用いられ得る試験薬剤にはいずれかの天然又は合成化学成分、医薬品、薬剤、食品などが含まれるが、これらに限られない。例えば試験薬剤は食物、医薬品、食物もしくは医薬品の成分もしくは分解生成物、臭気分子又は組成物（例えばヘプタナール、アセトフェノン、ライラール、オイゲノール、苦味混合物、Ｍｉｘ  Ａ、Ｍｉｘ  Ｂ）あるいは食物もしくは医薬品の汚染物質であることができる。試験薬剤が嗅覚受容体モジュレーターである場合、嗅覚受容体活性は、試験薬剤の不在下における嗅覚受容体活性に対して試験薬剤の存在下で向上又は低下するであろう。いくつかの態様において、本明細書に記載される味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を、嗅覚受容体の活性化に続くシグナル伝達を監視するセカンドメッセンジャーアッセイにおいて用いることができる（例えば細胞内Ｃａ＋２レベル又はｃＡＭＰレベルの測定）。他の態様において、転写／翻訳レベルにおける細胞反応を監視するリポーター遺伝子アッセイにおいて味覚乳頭細胞を用いることができる。例えば嗅覚受容体遺伝子又は遺伝子プロモーターをリポーター剤（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、６−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、β−ガラクトシダーゼ及びＧＡＬ４）に機能的に連結すると、試験薬剤の存在下におけるリポーター剤の発現又は試験薬剤の不在下における発現に対するその発現における変化が検出可能になるであろう。
【００４３】
別の態様において、記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜を、本明細書に提供される方法に従う匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのエンハンサーの同定方法において用いることができる。かくしていくつかの態様において、既知の匂い物質又は嗅覚受容体リガンドに反応する嗅覚受容体活性を向上させるか又は増強する天然もしくは合成薬剤の同定方法を提供する。本明細書に提供される匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのエンハンサーの同定方法において、記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜を用いることができる
。かくしていくつかの態様において、匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのエンハンサーの同定方法は、本明細書に記載される機能性嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を匂い物質又は嗅覚受容体リガンドの存在下で試験薬剤と接触させ；そして試験薬剤の存在下及び不在下で嗅覚受容体活性を測定又は検出することを含む。用いられ得る試験薬剤にはいずれかの天然又は合成化学成分、医薬品、薬剤、食品などが含まれるが、これらに限られない。例えば試験薬剤は食物、医薬品、食物もしくは医薬品の成分もしくは分解生成物、臭気分子又は組成物（例えばヘプタナール、アセトフェノン、ライラール、オイゲノール、苦味混合物、Ｍｉｘ  Ａ、Ｍｉｘ  Ｂ）あるいは食物もしくは医薬品の汚染物質であることができる。嗅覚受容体活性が試験薬剤の不在下における嗅覚受容体活性に対して試験薬剤の存在下で向上したら、試験薬剤は匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのエンハンサーである。いくつかの態様において、本明細書に記載される味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を、匂い物質受容体の活性化に続くシグナル伝達を監視するセカンドメッセンジャーアッセイにおいて用いることができる（例えば細胞内Ｃａ+2レベル又はｃＡＭＰレベルの測定）。試験薬剤の不在下における活性に対してセカンドメッセンジャーアッセイにより測定される試験薬剤の存在下での受容体活性における向上は、エンハンサーを示す。他の態様において、転写／翻訳レベルにおける細胞反応を監視するリポーター遺伝子アッセイにおいて味覚乳頭細胞を用いることができる。例えば嗅覚受容体遺伝子又は遺伝子プロモーターをリポーター剤（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、６−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、β−ガラクトシダーゼ及びＧＡＬ４）に機能的に連結する場合、試験薬剤の不在下におけるリポーター剤の検出に対する試験薬剤の存在下でのリポーター剤の検出における増加は、エンハンサーを示す。
【００４４】
記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜を、本明細書に提供される方法に従う匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのブロッカーの同定方法において用いることもできる。かくしていくつかの態様において、既知の匂い物質又は嗅覚受容体リガンドに反応する嗅覚受容体活性を低下させるか又は減じる天然もしくは合成薬剤の同定方法を提供する。本明細書に提供される匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのブロッカーの同定方法において、記載される味覚乳頭細胞、細胞系及び細胞膜を用いることができる。かくしていくつかの態様において、匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのブロッカーの同定方法は、本明細書に記載される機能性嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を匂い物質又は嗅覚受容体リガンドの存在下で試験薬剤と接触させ；そして試験薬剤の存在下及び不在下で嗅覚受容体活性を測定又は検出することを含む。用いられ得る試験薬剤にはいずれかの天然又は合成化学成分、医薬品、薬剤、食品などが含まれるが、これらに限られない。例えば試験薬剤は食物、医薬品、食物もしくは医薬品の成分もしくは分解生成物、臭気分子又は組成物（例えばヘプタナール、アセトフェノン、ライラール、オイゲノール、苦味混合物、Ｍｉｘ  Ａ、Ｍｉｘ  Ｂ）あるいは食物もしくは医薬品の汚染物質であることができる。嗅覚受容体活性が試験薬剤の不在下における嗅覚受容体活性に対して試験薬剤の存在下で低下したら、試験薬剤は匂い物質又は嗅覚受容体リガンドのブロッカーである。いくつかの態様において、本明細書に記載される味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を、嗅覚受容体の活性化に続くシグナル伝達を監視するセカンドメッセンジャーアッセイにおいて用いることができる（例えば細胞内Ｃａ＋２レベル又はｃＡＭＰレベルの測定）。試験薬剤の不在下における活性に対してセカンドメッセンジャーアッセイにより測定される試験薬剤の存在下での受容体活性における低下は、エンハンサーを示す。他の態様において、転写／翻訳レベルにおける細胞反応を監視するリポーター遺伝子アッセイにおいて味覚乳頭細胞を用いることができる。例えば嗅覚受容体遺伝子又は遺伝子プロモーターをリポーター剤（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、６−ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、β−ガラクトシダーゼ及びＧ
ＡＬ４）に機能的に連結する場合、試験薬剤の不在下におけるリポーター剤の検出に対する試験薬剤の存在下でのリポーター剤の検出における減少は、ブロッカーを示す。
【００４５】
キット
１種の薬剤又は複数種の薬剤を匂い物質又は嗅覚受容体のモジュレーターとして同定するためのキットも本明細書に提供する。いくつかの態様において、キットは１つもしくはそれより多い嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜及び使用説明書を与える。キットは嗅覚受容体の活性の検出を可能にするリポーター剤も含むことができる。
【００４６】
本明細書に、試験薬剤を嗅覚受容体リガンドのブロッカー又はエンハンサーとして同定するためのキットも提供し、ここでキットは１つもしくはそれより多い嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜ならびに既知の匂い物質を含む。いくつかの態様において、試験薬剤を嗅覚受容体リガンドのブロッカー又はエンハンサーとして同定するためのキットは、使用説明書を含む。
【００４７】
本明細書に記載されるキットと一緒に与えられる味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜は、好ましくは鳥類、マウス、ラット、ウサギ、サル、エイプ又はヒトを含むがこれらに限られない哺乳類のものであり、好ましくはヒト又はネズミのものである。味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜が発現する１つもしくはそれより多い嗅覚受容体は、鳥類、マウス、ラット、ウサギ、サル、エイプ又はヒトを含むがこれらに限られない哺乳類のものであり、好ましくはヒト又はネズミのものである。いくつかの態様において、嗅覚受容体は味覚乳頭細胞又は細胞膜にとって本来のものである。いくつかの態様において、嗅覚受容体は異種である。「異種」により、嗅覚受容体が細胞にとって本来のものでないか、あるいは細胞にとって本来のものであるが、本質的に細胞ゲノム中の異なる位置に存在するか、あるいは本来の細胞において改変された細胞と異なるレベルで発現されることを意味する。いくつかの態様において、キットと一緒に与えられる味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜が発現する１つもしくはそれより多い嗅覚受容体はリポーター剤に機能的に連結される。
【００４８】
１つもしくはそれより多い嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞又は細胞膜は一次細胞又は不朽化細胞あるいはその細胞膜であることができる。好ましい態様において、味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜を末梢組織、好ましくは舌組織から得る。１つもしくはそれより多い嗅覚受容体を発現する味覚乳頭細胞、細胞系又は細胞膜は有郭味覚乳頭細胞又は有郭味覚乳頭細胞膜；茸状味覚乳頭細胞又は茸状味覚乳頭細胞膜；あるいは葉状味覚乳頭細胞又は葉状味覚乳頭細胞膜であることができる。
【００４９】
使用説明書は、本明細書に記載される方法に従ってキットを用いるように使用者に指示することができる。いくつかの態様において、細胞、細胞系又は細胞膜の試験薬剤への暴露に続く嗅覚受容体活性の検出を可能にするリポーター剤を用いて、嗅覚受容体を標識する。
【００５０】
前記の開示を補足するため、及び本明細書に記載される主題のさらに良い理解を与えるために以下の実施例を提供する。これらの実施例は記載される主題を制限するとみなされるべきではない。本明細書に記載される実施例及び態様は例示目的のみのためであること、ならびにそれを見て種々の修正又は変更が当該技術分野における熟練者に明らかであり、それらは本発明の真の範囲内に含まれるべきであり、且つ本発明の真の範囲から逸脱することなる成され得ることが理解される。
【００５１】
参照文献（それらのそれぞれは引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる）：
１．Ｇａｕｄｉｎ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｕｓｅ  ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｈｕｍ
ａｎ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ
ｔｈｅ  ｔｏｎｇｕｅ．Ｇｅｎｅ．２００６  Ｏｃｔ  １５；３８１：４２−８．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｊｕｎ  ２２．
２．Ｄｕｒｚｙｎｓｋｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃＤＮＡｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｎｇｕａｌ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５  Ｊｕｌ  ２２；３３３（１）：２６４−７２．
３．Ｇａｕｄｉｎ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ＧＰＣＲｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎｌｉｎｇｕａｌ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ．Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２００１  Ｎｏｖ；２６（９）：１１５７−６６．
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下の実施例は単に例示であり、本発明の範囲を制限しない。
【００５３】
実施例１−材料及び方法
Ａ．Ｉ７、Ｍ７１及びオイゲノールトランスジェニックマウスの作製：
味覚乳頭細胞の匂い物質（又は嗅覚）受容体（ＯＲ）性をＩ７、Ｍ７１及びオイゲノール（ＥＧ）トランスジェニックマウスの味覚乳頭を調べることにより研究した。１つの態様において、ｍＯＲ−ＥＧ−ＩＲＥＳ−ｇａｐＥＧＦＰが続くｍＯＲ−ＥＧ転写開始部位の３．０ｋｂ上流から成る導入遺伝子を用いて、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰ系を作製した（”ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰ”）。ＩＲＥＳ配列は、ＯＲとリポーター配列の共発現を可能にする。（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＯｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００６，５２：８５７−８５９）。別の態様において、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及び蛍光性軸索マーカー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，ａｘｏｎａｌ
ｍａｒｋｅｒ）ｔａｕＧＦＰをコードする配列（ＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰ）をＭ７１  ＯＲコード配列の下流に挿入し、Ｍ７１−ＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰ（Ｍ７１−Ｇ）突然変異を生じさせることにより、ＧＦＰ標識Ｍ７１マウス系を作製した（”ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰ”）。（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＡｘｅｌ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２００８，６０（６）：１０６８−１０８１）。さらに別の態様において、Ｉ７  ＯＲコード配列の下流にＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰを挿入してＩ７−ＩＲＥＳ−ｔａｕＧＦＰを作製することにより、ＧＦＰ標識Ｉ７マウス系を作製した（”ｍＯＲ−Ｉ７−ＧＦＰ”）。（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＢｏｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２（８）：３０３３−３０４３）。構築物を受精卵の前核中に顕微注入した。
【００５４】
Ｂ．ヒト茸状味覚乳頭細胞の培養物の確立及び保持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）
公開されている案に従ってヒト茸状乳頭細胞を培養した（それぞれ引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＯｚｄｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｓｅｎｓｅｓ．２００６  Ｍａｒ；３１（３）：２７９−９０；Ｏｚｄｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａｎｉｍａｌ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１１，４７（８）：５１３−１４）。要するに、ヒト茸状味覚乳頭を取り出し、直後に単離溶液［２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，２．５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4，２０ｍＭ  グルコース，６５ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ＫＣｌ及び１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］中に入れ、続いてプロナーゼＥ及びエラスターゼを用いて酵素消化した。消化された茸状乳頭を次いで手術用カミソリ（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒａｚｏｒ）を用いて穏やかに細かく切り刻み、１型コラーゲン被覆カバーガラス上に播種し、５％ＣＯ2を含有する加湿環境中で３６℃においてインキュベーションした。ヒト茸状味覚乳頭を、１０％胎児ウシ血清、１：５の比のＭＣＤＢ  １５３及び抗体のトリプルカクテル（１００Ｕ／ｍＬ／１００μｇ／ｍＬ，ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．５μｇ／ｍＬ  ファンギゾン）を含有するイスコフ改変ダルベッコ培
地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した。ヒト茸状味覚乳頭細胞は、生存力の損失なく、且つ急に（ａｃｕｔｅｌｙ）単離された味覚細胞の分子的及び生化学的性質を保持して１年より長期間培養中に保持された。
【００５５】
Ｃ．マウス味覚乳頭細胞の培養
野生型（ｍ１２９）、Ｉ７、Ｍ７１及びオイゲノールトランスジェニックマウスから得られる有郭及び葉状乳頭を、前に公開された方法（上記で引用したＯｚｄｅｎｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，２００６）に従って単離した。要するに、酵素の混合物（プロナーゼ，１ｍｇ／ｍｌ  Ｓｉｇｍａ及びエラスターゼ，１ｍｇ／ｍｌ  Ｓｉｇｍａ）の注入によりマウス味覚乳頭を取り出し、直後に単離溶液中に入れ、続いて酵素消化した。消化された味覚乳頭組織を、次いで手術用カミソリを用いて穏やかに細かく切り刻み、１型コラーゲン被覆カバーガラス上に播種し、５％ＣＯ2を含有する加湿環境中で３６℃においてインキュベーションした。
【００５６】
Ｄ．免疫組織化学及び免疫細胞化学
マウス有郭及び葉状味覚乳頭組織を、リン酸塩−緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）中の４％パラホルムアルテヒド（ＰＦＡ）中で、室温において１時間固定し、次いでＰＢＳ中の１０％、２０％及び３０％スクロース中に順にそれぞれ２４時間浸漬することにより、凍害保護した。Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ  ５００  ＯＭクリオスタット上で各乳頭の矢状切片を１０μｍにおいて切断した。組織切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）スライド上に解凍−固定（ｔｈａｗ−ｍｏｕｎｔｉｎｇ）し、ＧＦＰ発現に関して直接観察するか、あるいはＧＦＰ及び味覚関連分子、ホスホリパーゼベータ２（ＰＬＣ−ｂ２）又はガストデューシンの共−発現を局在化する（ｌｏｃａｌｉｚｅ）するために染色した（下記に記載する）。
【００５７】
培養ヒト茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞（継代４−５）を、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡを用いて室温で１０分間固定した。ＰＢＳ中の３％正常ヤギ血清、３％ウシ血清アルブミン及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて３０〜６０分間、細胞をブロッキングし、次いで一次抗体（ＯＲ８Ｄ１，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）と一緒に４℃で終夜インキュベーションした。この抗体の特異性を決定するために、この抗体をその特異的なペプチドと一緒に４℃で終夜（又は室温で４〜５時間）予備−インキュベーションし、次いで細胞もこの抗体＋ペプチド混合物に４℃で終夜供した。
【００５８】
マウス味覚乳頭組織のために、一次抗体を以下の希釈で用いた：１：５００（抗−α−ガストデューシン  ＳａｎｔａＣｒｕｚ，抗−ＰＬＣ−β２  ＳａｎｔａＣｒｕｚ）。この段階に続き、ブロッキング緩衝液中で希釈された二次抗体と一緒に室温で３０分間インキュベーションした。二次抗体は抗−ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ６３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）であった。ＰＢＳ及び水を用いる洗浄の後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）を用いてカバーガラスにＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を載せた（ｍｏｕｎｔｅｄ）。少なくとも３つの領域（ｆｉｅｌｄｓ）において２０ｘの倍率で免疫反応性細胞を数えた。Ｌｅｉｃａ（登録商標）ＴＣＳ  ＳＰ２  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて画像を取得した。用いられた励起波長はＧＦＰの場合に４０５ｎｍ及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３の場合に６３３ｎｍであり、適した波長において発光を検出した。
【００５９】
Ｌｅｉｃａ（登録商標）Ｓｃａｎｗａｒｅソフトウェアを用い、３線及び２枠平均化（３  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ２  ｆｒａｍｅｓ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ）を用いる１０２４ｘ１０２４画素フォーマットにおいて一方向的に走査することにより、共焦点画像を取得し
た。コンピューター制御デジタルズームを用い、２０ｘの対物レンズを用いて２．３ｘの最大まで倍率を上げた。ＬＣＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）及びＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ｅｌｅｍｅｎｔ  ２．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて画像を配置し、コントラスト及び輝度に関して最低限調整した。
【００６０】
Ｄ．ＲＮＡアレイのアフィメトリクス（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｃｓ）分析
標準的な方法を用い、培養ヒト茸状味覚乳頭味覚細胞からのＲＮＡを得た。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ
Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を製造者の推薦案に従って用いることにより、マイクロアレイ上で用いるために全ＲＮＡを処理した。
【００６１】
Ｅ．カルシウム画像化：
刺激物質に反応する細胞内カルシウムレベルにおける変化を測定した。培養ヒト茸状及びマウス味覚乳頭細胞を１５ｍｍのカバーガラス上に播種した。細胞に、改変リンゲル液中の１０ｍｇ／ｍＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）中の１ｍＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）を３６℃で１時間負荷した。個々の匂い、苦味混合物［フェニルチオカルバミド（ＰＴＣ，２ｍＭ）及びデナトニウム（２ｍＭ）、サリシン（５ｍＭ）］；ならびにＭｉｘ  Ａ［ラット生化学的アッセイにおけるｃＡＭＰ−生産性匂い（ｃＡＭＰ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｏｄｏｒｓ）（両方とも引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＢｒｅｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｋｈｏｆｆ，１９９１，Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ，１６（１）：１９−２９及びＲｅｓｔｒｅｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：９０７−９２４）］（１００ｍＭ）：ヘジオン（ｈｅｄｉｏｎｅ）、ゲラニオール、フェニルエチルアルコトール、シトラルバ（ｃｉｔｒａｌｖａ）、シトロネラール（ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ）及びオイゲノール］；ならびにＭｉｘ  Ｂ［ラット生化学的アッセイにおけるＩＰ３−生産性匂い（Ｂｒｅｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｋｈｏｆｆ；１９９１及びＲｅｓｔｒｅｐｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９３）］（１００ｍＭ）：ライラール、リリアール、トリエチルアミン、エチルバニリン、イソ吉草酸及びフェニルエチルアミン］）を、ｐＨを７．２に調整し、容量オスモル濃度を３００ミリモル／ｋｇに調整して調製されたリンゲル液中で希釈した。チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）に送達管及び排液管が接続されたｐ４チャンバー系中にカバーガラスを置いた。これは、チャンバーの内外における液体の安定且つ一定の流れを可能にした。３８０ｎｍの励起波長を用いる倒立型蛍光顕微鏡を用いて細胞を可視化した。ＰＴＩソフトウェアを用いて刺激物質の選択及び送達、焦点調節ならびに画像取得を行った。画像の取得に続き、背景対照標準領域と共に細胞上の問題の領域（ＲＯＩｓ）を選び、蛍光比及び強度値に関して測定した。培養味覚乳頭細胞を最初にリンゲル液を用いて１〜３分間洗浄し、次いで刺激物質の送達を開始した。各刺激物質を３０秒〜１分間送達し、それにリンゲル液を用いて約２分間の洗浄期間が続いた。細胞に関する比のデータを続いてＥｘｃｅｌ上で分析し、どの細胞が細胞内カルシウムにおける有意な変化を以て反応したかを決定した。カルシウム画像化の後、４％ＰＦＡを用いてカバーガラスを１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。カルシウム画像化の前又はその後に、蛍光画像化顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）及び共焦点顕微鏡法下で細胞をＧＦＰ特異的シグナルに関して、ならびに嗅覚反応性特異的細胞の共−局在に関して観察した。
【００６２】
実施例２−遺伝子改変されたマウスの味覚乳頭組織中での嗅覚受容体のプロモーター下におけるＧＦＰの発現：
この研究は、ヒト及びマウス味覚乳頭細胞上における生理学的に活性な嗅覚受容体の発現を示した。Ｍ７１、Ｉ７又はオイゲノール（ＥＧ）プロモーターの調節下でＧＦＰを発現するように遺伝子改変されたマウスから得られる味覚乳頭組織を、共焦点顕微鏡法下で
調べた。トランスジェニックマウスの味覚乳頭中でＧＦＰが発現され、味覚乳頭細胞中におけるＩ７、Ｍ７１及びオイゲノール受容体の存在を示した。ＧＦＰの発現は、味覚乳頭中に特異的に局在して見出された。図１Ａ−１Ｄに示される通り、ｍＯＲ−Ｉ７−ＧＦＰトランスジェニックマウスは有郭味覚乳頭における緑色蛍光タンパク質の発現を示した。図２Ａ−２Ｃに示される通り、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰトランスジェニックマウスは有郭味覚乳頭における緑色蛍光タンパク質の発現を示した。ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰトランスジェニックマウスは有郭味覚乳頭におけるＧＦＰの発現を示した（図３Ａ−３Ｃ及び４Ａ−４Ｂ）。
【００６３】
味覚組織をＩＩ型味覚細胞マーカー（ＰＬＣ−ｂ２及びガストデューシン）で染色すると、味覚乳頭細胞におけるＧＦＰならびにＰＬＣ−ｂ２及びガストデューシン発現の共−局在が観察された。ＰＬＣ−ｂ２発現は、ｍＯＲ−Ｉ７−ＧＦＰマウス（図５Ａ−５Ｄ）、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰトランスジェニックマウス（図６Ａ−６Ｄ）及びｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰトランスジェニックマウス（図７Ａ−７Ｄ）の有郭乳頭においてＧＦＰ発現と共−局在することが示された。ガストデューシン発現もｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰトランスジェニックマウス（図８Ａ−８Ｄ）及びｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰトランスジェニックマウス（図９Ａ−９Ｄ）の有郭乳頭においてＧＦＰ発現と共−局在した。
【００６４】
対照標準実験において、ＧＦＰ発現ベクターを有していない野生型マウス（ｍ１２９）からＧＦＰの人工シグナル（ａｒｔｅｆａｃｔ  ｓｉｇｎａｌ）は観察されなかった（図１０Ａ−１０Ｄ）。新しく単離されるｍ１２９味覚細胞もＧＦＰを発現しなかったが、ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスから新しく単離される味覚組織はＧＦＰを発現した（図１１Ａ−１１Ｄ）。興味深いことに、マウス糸状乳頭はＧＦＰタンパク質を発現し、舌の非−味覚細胞中に嗅覚受容体が存在する可能性を示した。
【００６５】
マウス組織の他に、培養ヒト茸状味覚乳頭細胞（ＨＢＯ）において嗅覚受容体の存在を調べた。ＯＲ８Ｄ１受容体抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いて培養ヒト茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞を染色し、ＯＲ８Ｄ１タンパク質の発現を示した（図１２Ａ−１２Ｃ）。ペプチド阻害アッセイの使用により、ＯＲ８Ｄ１の特異性を調べた。特定的に、ＯＲ８Ｄ１抗体をそれ自身の特異的なペプチドと一緒に予備−インキュベーションし、ＯＲ８Ｄ１免疫反応性の特異性を決定した。その特異的なペプチドと一緒にインキュベーションされたＯＲ８Ｄ１抗体は、ＯＲ８Ｄ１特異的免疫反応性の完全な除去を生じた（図１２Ｄ−１２Ｆ）。
【００６６】
実施例４−哺乳類味覚細胞の嗅覚性
培養ヒト茸状味覚乳頭のアフィメトリクスＲＮＡ分析は、４００より多い嗅覚受容体関連ｍＲＮＡｓの存在を示した。哺乳類味覚細胞の機能性嗅覚的特性も調べた。特定的に、培養野生型（ｍ１２９）、Ｍ７１及びオイゲノールマウス味覚細胞ならびに培養ヒト茸状味覚乳頭細胞の嗅覚的特性を、ある種の嗅覚受容体に特異的な種々の匂いを用いるカルシウム画像化により調べた。野生型（ｍ１２９）及びトランスジェニックマウスならびにヒトからの培養味覚乳頭細胞は、最適濃度（１００μＭ）において受容体−特異的な匂い物質に対する強い反応を示すことが見出され、哺乳類味覚細胞中における匂い特異的受容体の存在を示している。さらに匂い物質反応性の培養味覚細胞は苦味混合物に反応することが示された。特にｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスの味覚細胞培養物（２日〜６日）は、アセトフェノン（示されていない）ならびにアセトフェノンと苦味混合物（図１３）に対する反応を示した。ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞は受容体特異的な匂い、ベンズアルデヒド及び苦味混合物に反応した（図１４）。ｍＯＲ−Ｍ７１−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞は受容体特異的な匂い、アセトフェノン及びベンズアルデヒドならびに苦味混合物に反応した（図１５）。
【００６７】
さらに、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞は受容体特異的な匂い、オイゲノールに反応した（図１６）。ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスから得られる培養（４日）マウス味覚細胞は、苦味混合物及びＭｉｘ  Ａに反応した（示されていない）。ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰマウスから得られる培養味覚乳頭細胞は苦味混合物及びＭｉｘ  Ａに反応した（図１７）。培養野生型マウス（ｍ１２９）味覚乳頭細胞は、ベンズアルデヒド（図２１）、ｍｉｘ  Ａ（図１９）、アセトフェノン（図２０）及びｍｉｘ  Ｂ（図２１）に反応した。
【００６８】
培養ヒト茸状味覚乳頭細胞は、最適濃度（１００μＭ）において特異的な匂い物質に反応することが見出され、哺乳類味覚細胞中における匂い特異的な受容体の存在を示した。匂い物質反応性培養味覚細胞が苦味混合物に反応することも示された。匂い反応性細胞と苦味反応性細胞の間の関連性を確かめるために、カルシウム画像化後に細胞を固定した。ヒト舌から得られる培養茸状味覚乳頭（ＨＢＯ）細胞はＭｉｘ  Ａ及びＭｉｘ  Ｂに感受性である（図２２）。培養ヒト味覚細胞は匂い刺激に反応した。ｆｕｒａ−２−標準カルシウム画像化系を用い、培養ヒト茸状味覚細胞中での細胞内カルシウムレベル（［Ｃａ２＋］ｉ）における変化を測定した。刺激物質はリンゲル液中に溶解され、ｐＨ及び容量オスモル濃度に関して調整された。グラフは、匂いへの暴露の間の個々の細胞中での［Ｃａ＋２］ｉレベルにおける代表的な変化を示す。
【００６９】
ヒト舌から得られる培養ＨＢＯ細胞はオイゲノールに感受性である（図２３）。反応に含まれる可能性のある受容体はヒトＯＲ５Ｄ１８（又はマウスＯｌｆｒ７３）である。ヒト舌から得られる培養ＨＢＯ細胞はヘキサン酸に感受性である（図２４）。反応に含まれる可能性のある１つの受容体はヒトＯＲ５１Ｌ１（あるいはマウスＯｌｆｒ６４及び／又はＯｌｆｒ６５３）である。ヒト舌から得られる培養ＨＢＯ細胞はクマリンにも感受性である（図２５）。反応に含まれる可能性のある受容体はヒトＯＲ２Ｊ２、ＯＲ２Ｗ１又はＯＲ５Ｐ３（又はマウスＯｌｆｒ１５１９、Ｏｌｆｒ７４９、Ｏｌｆｒ１３５２、Ｏｌｆｒ１０７９、Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ１３４１、Ｏｌｆｒ１０６２、Ｏｌｆｒ１０９、Ｏｌｆｒ５０８、Ｏｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ８７６、Ｏｌｆｒ１０４及びＯｌｆｒ８９５）である。
【００７０】
ヒト舌から得られる培養ＨＢＯ細胞はアセトフェノンに感受性である（図２６）。反応に含まれる可能性のある受容体はヒトＯＲ２Ｗ１及びＯＲ５Ｐ３（又はマウスＯｌｆｒ７４９、Ｏｌｆｒ１３５２、Ｏｌｆｒ１０７９、Ｏｌｆｒ１３７７、Ｏｌｆｒ５５６、Ｏｌｆｒ１３４１、Ｏｌｆｒ１０６２、Ｏｌｆｒ１０９、Ｏｌｆｒ９８３、Ｏｌｆｒ８７６、Ｏｌｆｒ１１０４、Ｏｌｆｒ８９５、Ｏｌｆｒ１６８、Ｏｌｆｒ４２９、Ｏｌｆｒ１６７及びＯｌｆｒ１５１）である。ヒト舌から得られる培養ＨＢＯ細胞はヘプタナールに感受性である（図２７）。反応に含まれる可能性のある受容体はＯＲ２Ｗ１（又はマウスＯｌｆｒ１７）である。ヒト舌から得られる培養ＨＢＯ細胞はライラールに感受性である（図２８）。反応に含まれる可能性のある１つの受容体はヒトＯＲ１０Ｊ５（又はマウスＯｌｆｒ１５及びＯｌｆｒ１６）である。
【００７１】
実施例５−匂い反応性細胞と苦味反応性細胞の間の関連性：
ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰトランスジェニックマウスから得られる培養味覚細胞をカルシウム画像化後に固定した。カルシウム画像化及び反応性細胞のために用いられる図を位置決定した（Ｔｈｅ  ｖｉｅｗ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗａｓ  ｌｏｃａｔｅｄ）。反応性細胞がＧＦＰを発現することが見出され、匂い物質がそれら自身の受容体を発現するように細胞を刺激することを示した。匂い物質反応性且つＧＦＰ−陽性細胞が苦味刺激にも反応性であることも観察された。特に図２９Ａ−２９Ｃは、ｍＯＲ−ＥＧ−ＧＦＰ培養味覚乳頭細胞がカルシウム画像化後にオイゲノールに反応することを示す。図３０Ａ−３０Ｃは、ｍＯＲ
−Ｍ７１−ＧＦＰ培養味覚乳頭細胞がカルシウム画像化後にアセトフェノンに反応することを示す。カルシウム画像化及び反応性細胞のために用いられる図を位置決定した。反応性細胞がＧＦＰを発現することが見出され、匂い物質がそれら自身の受容体を発現するように細胞を刺激することを示した。匂い物質反応性且つＧＦＰ−陽性細胞が苦味刺激にも反応性であることも観察された。
【００７２】
実施例６−細胞における匂い受容体の一過的発現
１つの研究において、シャペロンＤＮＡ（受容体トランスポータータンパク質１ショート（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｓｈｏｒｔ）（ＲＴＰ１Ｓ）及びＭ３（ムスカリン性アセチルコリン受容体））を有する約１．５マイクログラムの嗅覚受容体ＤＮＡ  ＯＲＳ６（又、Ｏｌｆｒ５４４，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＮＭ ０２０２８９．２）ならびにシャペロンＤＮＡ（ＲＴＰ１Ｓ及びＭ３）を有する嗅覚受容体ＯＲ２４０（又、ＯＲ７Ｄ４；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ ００１００５１９１．２）を用いて培養ヒト味覚（ＨＢＯ）細胞をトランスフェクションした。シャペロンＤＮＡは上記で引用されたＷｕ  ２０１２において同定される。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を用い、製造者の示唆に従ってトランスフェクションを行った。終夜のインキュベーションの後、培地をさらに２４時間変え、続いて受容体特異的な匂い、例えばＯＲ  ７Ｄ４／２４０に関して特異的なアンドロスタノン（Ａｎｄｒｏｓｔａｎｏｎｅ）及びＳ６に関する特異的な匂いであるノナン二酸（ｎｏｎａｎｅｄｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を用いる手動カルシウム画像化を行った。図３１Ａ及び３１Ｂを参照されたい。描かれていないが、反応は３０又は１００マイクロモル濃度において起こった。
【００７３】
類似のやり方で、不朽化ヒト茸状味覚乳頭（Ｕｌｄｕｚ）細胞は、受容体特異的な匂い、ヘプタアルデヒド、アセトフェノン、メチルシナモン、オイゲノール及びライラールに反応した。図３２Ａ−３２Ｅを参照されたい。
【００７４】
本明細書で引用されるすべての公開文献、特に２０１３年１２月１６日に申請された米国暫定特許出願第６１／９１６４２３号明細書は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。特定の態様に言及して発明を記載してきたが、発明の精神から逸脱することなく修正を行い得ることが認識されるであろう。そのような修正は添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１Ａ−１Ｃ】
0006592442.tif 000002
【図２Ａ−２Ｃ】
0006592442.tif 000003
【図３Ａ−３Ｃ】
0006592442.tif 000004
【図４Ａ−４Ｂ】
0006592442.tif 000005
【図５Ａ−５Ｄ】
0006592442.tif 000006
【図６Ａ−６Ｄ】
0006592442.tif 000007
【図７Ａ−７Ｄ】
0006592442.tif 000008
【図８Ａ−８Ｄ】
0006592442.tif 000009
【図９Ａ−９Ｄ】
0006592442.tif 000010
【図１０Ａ−１０Ｄ】
0006592442.tif 000011
【図１１Ａ−１１Ｃ】
0006592442.tif 000012
【図１２Ａ−１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−２９Ｃ】
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【図３０Ａ−３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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