(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子薬物複合体を合成する方法であって、
（ｉ）生体分子と、ＦＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｆ１Ｐ  ＨＦ（商品名）樹脂、ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１Ｐ（商品名）樹脂、またはＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ２Ｐ（商品名）樹脂、または前記生体分子のための捕捉部分を含む捕捉樹脂とを、前記生体分子を固定化するために適切な条件下で接触させ、それによって、固定化生体分子を提供する工程であって、前記捕捉部分が、
下記式の分枝型リガンド足場：
【化７】
0006484607.tif 000020
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであるか、又は異なっており、それぞれ場合により置換されたアルキル又はアリールリガンドであり、並びにＲ３は、場合によりスペーサーモチーフにより結合された固体支持体である）；または
下記式の分枝型トリアジル足場：
【化８】
0006484607.tif 000021
（式中、Ｑは、場合によりスペーサーモチーフを用いた、固体支持体マトリックスへの結合点を表し、基Ａ及びＢは、水素結合可能な１つ又はそれ以上の置換基、好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ又はＣＯ２Ｈの１つ又はそれ以上で置換されたフェニル又はナフチル基である）であり、前記生体分子が抗体、改変抗体又は抗体断片である、工程、
（ｉｉ）場合により、前記固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させて、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子を提供する工程、
（ｉｉｉ）前記固定化生体分子又は前記化学的に改変された、若しくは活性化された固定化生体分子と、薬物成分とを接触させて、固定化生体分子薬物複合体を形成する工程、
（ｉｖ）前記生体分子薬物複合体を前記捕捉樹脂から放出する工程を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉ）が、前記生体分子と前記捕捉樹脂とをインキュベートする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーションが、約１０から約４０℃、場合により約１５から約３７℃の温度において実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インキュベーションが、約１０分から約１８時間の期間実施される、請求項２又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベーションが、バッファー溶液、場合によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される、請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記インキュベーションが、約５から約８のｐＨにおいて実施される、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉ）の後で、前記固定化生体分子が洗浄され、前記捕捉樹脂に固定化されなかったすべての生体分子が除去される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）が、前記生体分子を還元する工程を伴う、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子が、生体分子と還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（merceptoethylamine）又は他の適切な還元剤とを接触させる工程により還元される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）が、前記生体分子と架橋剤部分とを反応させる工程を伴い、場合により、前記架橋剤部分がスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉ）が、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）が、約７から約８のｐＨにおいて実施される、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉ）が、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される、請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）が、前記生体分子と前記還元剤とを、約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉ）の後で、前記活性化された固定化生体分子が洗浄され、すべての改変剤／活性化剤が除去される、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉｉ）が、前記化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、バッファー溶液中で接触させる工程を伴う、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉｉｉ）が、前記化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、約７から約８、好ましくは約７．４のｐＨにおいて接触させる工程を伴う、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉｉｉ）が、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉｉ）が、前記化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉｉｉ）の後で、前記固定化生体分子薬物複合体が洗浄され、すべての未反応の薬物成分が除去される、請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｉｖ）が、ｐＨを変更して、支持体−生体分子の結合を破壊する工程を伴う、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ｐＨが、約ｐＨ５未満、場合により約ｐＨ３に低下される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶出された生体分子薬物複合体が、前記捕捉樹脂から前記複合体を放出する工程の後で中和され、場合により、前記複合体が、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に捕捉される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）抗体、改変抗体、又は抗体断片が固定化された捕捉樹脂であって、前記捕捉樹脂がＦＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｆ１Ｐ  ＨＦ（商品名）樹脂、ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１Ｐ（商品名）樹脂、またはＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ２Ｐ（商品名）樹脂、または前記生体分子のための捕捉部分を含む捕捉樹脂であり、前記捕捉部分が、
下記式の分枝型リガンド足場：
【化７】
0006484607.tif 000022
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであるか、又は異なっており、それぞれ場合により置換されたアルキル又はアリールリガンドであり、並びにＲ３は、場合によりスペーサーモチーフにより結合された固体支持体である）；または
下記式の分枝型トリアジル足場：
【化８】
0006484607.tif 000023
（式中、Ｑは、場合によりスペーサーモチーフを用いた、固体支持体マトリックスへの結合点を表し、基Ａ及びＢは、水素結合可能な１つ又はそれ以上の置換基、好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ又はＣＯ２Ｈの１つ又はそれ以上で置換されたフェニル又はナフチル基である）である、捕捉樹脂、ならびに（ｉｉ）還元剤又は架橋剤部分を含む、混合物。
【請求項２５】
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびメルカプトエチルアミン（merceptoethylamine）からなる群から選択され、前記架橋剤部分が、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である、請求項２４に記載の混合物。
【請求項２６】
前記捕捉樹脂が、その表面に固定化された、抗体、改変抗体、又は抗体断片を含む、請求項２４または２５に記載の混合物。
【請求項２７】
生体分子薬物複合体の合成における捕捉樹脂の使用であって、前記捕捉樹脂が、ＦＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｆ１Ｐ  ＨＦ（商品名）樹脂、ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１Ｐ（商品名）樹脂、またはＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ２Ｐ（商品名）樹脂、または前記生体分子のための捕捉部分を含む捕捉樹脂であり、前記捕捉部分が、
下記式の分枝型リガンド足場：
【化７】
0006484607.tif 000024
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであるか、又は異なっており、それぞれ場合により置換されたアルキル又はアリールリガンドであり、並びにＲ３は、場合によりスペーサーモチーフにより結合された固体支持体である）；または
下記式の分枝型トリアジル足場：
【化８】
0006484607.tif 000025
（式中、Ｑは、場合によりスペーサーモチーフを用いた、固体支持体マトリックスへの結合点を表し、基Ａ及びＢは、水素結合可能な１つ又はそれ以上の置換基、好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ又はＣＯ２Ｈの１つ又はそれ以上で置換されたフェニル又はナフチル基である）であり、前記生体分子が抗体、改変抗体又は抗体断片である、使用。
【請求項２８】
前記捕捉樹脂の前記リガンドが、下記の構造：
【化４】
0006484607.tif 000026
または
【化９】
0006484607.tif 000027
を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体分子が抗体であり、場合により、前記抗体が、モノクローナル抗体であり、および／または前記抗体がトラスツズマブである、請求項１〜２３および請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬物が、チューブリン阻害剤またはＤＮＡ相互作用剤であり、場合により、前記チューブリン阻害剤が、（ａ）オーリスタチン、および（ｂ）メイタンシン誘導体からなる群から選択され、場合により、前記ＤＮＡ相互作用剤が、（ａ）カリケアマイシン、（ｂ）デュオカルマイシン及び（ｃ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される、請求項１〜２３および請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉樹脂の前記リガンドが、下記の構造：
【化４】
0006484607.tif 000028
または
【化９】
0006484607.tif 000029
を有する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３２】
前記生体分子が抗体であり、場合により、前記抗体が、モノクローナル抗体であり、および／または前記抗体がトラスツズマブである、請求項２４〜２６および請求項３１のいずれか一項に記載の混合物。
【請求項３３】
前記捕捉樹脂の前記リガンドが、下記の構造：
【化４】
0006484607.tif 000030
または
【化９】
0006484607.tif 000031
を有する、請求項２７に記載の使用。
【請求項３４】
前記生体分子が抗体であり、場合により、前記抗体が、モノクローナル抗体であり、および／または前記抗体がトラスツズマブである、請求項２７または３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記薬物が、チューブリン阻害剤またはＤＮＡ相互作用剤であり、場合により、前記チューブリン阻害剤が、（ａ）オーリスタチン、および（ｂ）メイタンシン誘導体からなる群から選択され、場合により、前記ＤＮＡ相互作用剤が、（ａ）カリケアマイシン、（ｂ）デュオカルマイシン及び（ｃ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される、請求項２７、３３、および３４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子薬物複合体を合成する固相方法に関する。特に、本発明は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を合成する固相方法に関する。本発明はさらに、固定化された、化学的に改変された生体分子、例えば抗体を作製する中間的方法に関する。
【０００２】
上記方法に加えて、本発明は、捕捉樹脂のさまざまな使用、本発明の方法の生体分子薬物複合体、中間産物及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫毒素及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、標的特異的結合ドメインと、細胞障害性であると分類することができる、十分な潜在的毒性の薬物分子とを組み合わせたタンパク質性薬物である。抗体は、細胞障害性薬を所望の投与部位まで直接輸送可能な、高度な特異性及び高度な抗原アフィニティーを組み合わせた標的化系を作り出す本目的のために理想的な生体分子である。これらの薬物構築体は、特に、腫瘍学内で罹患が見出される疾患に対して潜在的な治療薬である。
【０００４】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の主要な基準は、毒素「弾頭（薬物）」が、極めて低いレベル（ピコＭ）の活性を有することである。さらに、周期のポイントとは関係なく腫瘍細胞に対して効能を有することが有利である。この目的のために、ＤＮＡ活性物質は、修復可能かどうかに関わらず、ＤＮＡ損傷が周期のポイントとは関係なくアポトーシスを駆動する毒素候補として支持された。
【０００５】
原理上は、ＡＤＣに適切な毒素は、Ｌ０１  ＡＴＣ分子（「解剖治療化学分類法（Anatomical Therapeutic Chemical Classification System）」、Ｌ０１は、ＷＨＯの医薬品統計法共同研究センター（Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology）により、抗腫瘍性薬及び免疫調節剤に定義されるサブグループである）として定義される任意の部分であってよい。又は、ＡＤＣの適切なペイロードとして分類され得る他の部分が、内在化されると細胞にとって毒性である物質として単純に定義することができる。後者のカテゴリーに収まるほとんどの部分は、有効であるための十分な効力が足りないと思われる。したがって、工業は、「超強力」な材料を同定及び開拓する傾向がある。
【０００６】
免疫毒素の理論的根拠、デザイン及び有効性についての専門的な総説及びＡＤＣの調査は：J. Adair et al, Expert Opin. Biol. Ther., 2012, 12(9): P1 191-206、G. Casi et al, Journal of Controlled Release, 2012, 161 , 2, PA22-A2Q及びF. Dosio et al, Toxins, 2011, 3, P848-883に見出すことができる。
【０００７】
多数の溶液相方法が、生体分子薬物複合体、例えば、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の製造に使用することができる。しかし、溶液相法は、大量の廃液を生じるという点でそれ自体に無駄が多く、合成に際して生体分子薬物複合体の凝集という点で問題がある。
【０００８】
生体分子薬物複合体を製造する溶液相法の第１工程は、一般に、生体分子の化学的改変又は活性化を伴う。例えば、生体分子が抗体である場合、該抗体は、抗体の還元又は部分的還元により、「化学的改変」又は「活性化」することができる。抗体の部分的還元に適切な過程は、「Bioconjugate Techniques」page 96/97, Greg T. Hermanson, Academic Press; 2nd edition, 2008, ISBN-13: 978-0123705013に示される。還元剤、例えばＴＣＥＰが、一般に還元過程に用いられる。
【０００９】
抗体の化学的改変又は活性化、例えば還元の後で、次の工程は、任意の過剰な活性化剤／化学的改変剤、例えば過剰な還元剤の除去である。この工程は、時として、試料を分離カラムに複数回通す必要があるので、非常に時間がかかる。このことは、生体分子の安定性が課題となる場合、分解という点でも問題となり得る。化学的に改変された／活性化された生体分子の精製の課題は、この過程が、かなり過剰な還元剤によるＴｈｉｏｍＡｂの完全な還元を伴う場合、特に問題である。
【００１０】
上記の精製工程の後で、化学的に改変された／活性化された、例えば還元された抗体は、その後、薬物部分と複合体化される。この過程の主要な問題は、生体分子薬物複合体の凝集の高い確率である。高度疎水性薬物がこの工程に用いられる場合、これは特に問題である。凝集は、使用できない生体分子薬物複合体をもたらし得るので、主要な問題である。最も優れたシナリオにおいて、生体分子薬物複合体の凝集体が混入した生体分子薬物複合体は、さらに精製して凝集体を除去する必要があり、これは時間の浪費及び非常な無駄の両方である。薬物は凝集された生体分子薬物複合体の一部を形成するので、薬物はかなりの割合で精製の間に失われる。最も悪い場合には、このような高い度合いで生体分子薬物複合体の凝集体が混入した生体分子薬物複合体のすべてのバッチが完全に使用できず、廃棄しなければならない。
【００１１】
腫瘍学者は、細胞障害性薬を腫瘍部位に送達するための、標的特異的モノクローナル抗体の利用について、モノクローナル抗体が存在するのと同じだけ長く、３０年近く研究してきた。現在までに３種の毒素が、本分野を支配してきた。すなわち、カリケアマイシン、メイタンシン及びオーリスタチン。これらの細胞障害性薬は、すべて通常はそのままでは疎水性である。抗体と複合体化された場合、これらの存在は、抗体の全体の疎水性を、著明に、ある場合には、複合体との疎水性相互作用が複合体の凝集をもたらす程度まで増加させる。この課題の重要性の順番は、Ｍｙｌｏｔａｒｇ及びＣＭＣ−５４４の両方に関する過程が、クロマトグラフィーによる凝集体除去工程を含有するという教示に基づき、カリケアマイシン＞メイタンシン＞オーリスタチンである。メイタンシンの過程のおよそ５０％は、凝集体除去工程を含有し、オーリスタチンの過程のごくわずかが凝集体除去工程を含有する。
【００１２】
より最近、デュオカルマイシン（www.syntarga.com）及びピロロベンゾジアゼピン（pyrollebenzodiazepene）（ＰＢＤ）二量体（www.spirogen.com)に基づく毒素が抗体と複合体化されており、前臨床評価に供されている。これらの新しいクラスの毒素は、それらの前身である細胞障害薬よりさらに疎水性であり、抗体と複合体化された場合より凝集が生じやすい。
【００１３】
意義深い努力が、親水性リンカーの組み込みによる薬物の疎水性の改変に集中されてきた（Zhao et al, J. Med. Chem., 2011, 54, 10, 3606-3623）。凝集体の形成が調節できない場合、開発者らは、タンパク質系治療薬からの凝集体の除去に関する周知の技術に頼ってきた。これらは、イオン交換、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト及び当業者に周知の他の技術を含む、さまざまな異なるクロマトグラフィー分離を含む。このようなクロマトグラフィー精製技術に着手することは、十分な質の生成物を得るが、この過程による産出は費用がかさむという結果になる。製造に関する抗体及び抗体系治療薬を用いる研究の場合、あいまいで付随的な副反応又は不必要な生理化学的相互作用を介した材料の物理的損失は非常に重要な財政的影響を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】J. Adair et al, Expert Opin. Biol. Ther., 2012, 12(9): P1 191-206
【非特許文献２】G. Casi et al, Journal of Controlled Release, 2012, 161 , 2, PA22-A2Q
【非特許文献３】F. Dosio et al, Toxins, 2011, 3, P848-883
【非特許文献４】Bioconjugate Techniques」page 96/97, Greg T. Hermanson, Academic Press; 2nd edition, 2008, ISBN-13: 978-0123705013
【非特許文献５】Zhao et al, J. Med. Chem., 2011, 54, 10, 3606-3623
【００１５】
したがって、生体分子薬物複合体を製造するための従来の溶液相過程は困難が伴い、生体分子薬物複合体を製造するための改善された方法の提供が望ましい。
【００１６】
本発明は、従来の溶液相法の上記の課題の１又はそれ以上に対処する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、以下を提供する。
［１］生体分子薬物複合体を合成する方法であって、
（ｉ）生体分子と捕捉樹脂とを、生体分子を固定化するために適切な条件下で接触させ、それによって、固定化生体分子を提供し、該生体分子が抗体、改変抗体又は抗体断片であり、該捕捉樹脂が、（１）アミノ酸系、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体を含む非ペプチド系、（２）ペプチド系のプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分及び（４）糖タンパク質捕捉部分、からなる群から選択される生体分子捕捉部分を含む工程、
（ｉｉ）場合により、固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させて、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子を提供する工程、
（ｉｉｉ）固定化生体分子又は化学的に改変された、若しくは活性化された固定化生体分子と、薬物成分とを接触させて、生体分子薬物複合体を形成する工程、
（ｉｖ）生体分子薬物複合体を捕捉樹脂から放出する工程
を含む方法。
［２］工程（ｉ）が、生体分子と捕捉樹脂とをインキュベートする工程を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］インキュベーションが、約１０から約４０℃、場合により約１５から約３７℃の温度において実施される、上記［２］に記載の方法。
［４］インキュベーションが、約１０分から約１８時間の期間実施される、上記［２］又は上記［３］に記載の方法。
［５］インキュベーションが、バッファー溶液、場合によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される、上記［２］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］インキュベーションが、約５から約８のｐＨにおいて実施される、上記［２］から［５］のいずれかに記載の方法。
［７］工程（ｉ）の後で、固定化生体分子が洗浄され、捕捉樹脂に固定化されなかったすべての生体分子が除去される、上記［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］工程（ｉｉ）が、生体分子を還元する工程を伴う、上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］生体分子が、生体分子と還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（merceptoethylamine）又は他の適切な還元剤とを接触させる工程により還元される、上記［８］に記載の方法。
［１０］工程（ｉｉ）が、生体分子と架橋剤部分とを反応させる工程を伴い、場合により、上記架橋剤部分がスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である、上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［１１］工程（ｉｉ）が、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される、上記［８］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］工程（ｉｉ）が、約７から約８のｐＨにおいて実施される、上記［８］から［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］工程（ｉｉ）が、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される、上記［８］から［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］工程（ｉｉ）が、生体分子と還元剤とを、約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う、上記［８］から［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］工程（ｉｉ）の後で、活性化された固定化生体分子が洗浄され、すべての改変剤／活性化剤が除去される、上記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］工程（ｉｉｉ）が、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、バッファー溶液中で接触させる工程を伴う、上記［１］から［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］工程（ｉｉｉ）が、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、約７から約８、好ましくは約７．４のｐＨにおいて接触させる工程を伴う、上記［１］から［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］工程（ｉｉｉ）が、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される、上記［１］から［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］工程（ｉｉｉ）が、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う、上記［１］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］工程（ｉｉｉ）の後で、固定化生体分子薬物複合体が洗浄され、すべての未反応の薬物成分が除去される、上記［１］から［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］工程（ｉｖ）が、ｐＨを変更して、支持体−生体分子の結合を破壊する工程を伴う、上記［１］から［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］ｐＨが、約ｐＨ５未満、場合により約ｐＨ３に低下される、上記［２１］に記載の方法。
［２３］溶出された生体分子薬物複合体が、捕捉樹脂から複合体を放出する工程の後で中和され、場合により、上記複合体が、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に捕捉される、上記［２１］又は［２２］に記載の方法。
［２４］（ｉ）（１）非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（２）ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分、並びに（４）糖タンパク質捕捉部分からなる群から選択される、抗体、改変抗体又は抗体断片捕捉部分を含む、捕捉樹脂、並びに
（ｉｉ）化学的改変剤又は活性化剤
を含む混合物。
［２５］捕捉樹脂が、固定化された抗体、改変抗体又は抗体断片をこれらの表面に含む、上記［２４］に記載の混合物。
［２６］（１）非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（２）ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分及び（４）糖タンパク質捕捉部分からなる群から選択される抗体、改変抗体又は抗体断片捕捉部分を含む捕捉樹脂の、生体分子薬物複合体の合成における使用。
［２７］捕捉樹脂が非タンパク質性捕捉樹脂である、上記［１］から［２６］のいずれかに記載の方法、混合物又は使用。
［２８］捕捉樹脂の生体分子捕捉部分が、約１０００Ｄａ以下の分子量を有する、上記［１］から［２７］のいずれかに記載の方法、混合物又は使用。
［２９］捕捉樹脂のリガンドが、構造：
【化１２】
0006484607.tif 000002
を有する、上記［１］から［２８］のいずれかに記載の方法、混合物又は使用。
［３０］生体分子が抗体であり、場合により、上記抗体が、モノクローナル抗体である、及び／又は上記抗体がトラスツズマブである、上記［１］から［２９］のいずれかに記載の方法、混合物又は使用。
［３１］薬物が、チューブリン阻害剤又はＤＮＡ相互作用剤であり、場合により上記チューブリン阻害剤が、（ａ）オーリスタチン及び（ｂ）メイタンシン誘導体からなる群から選択され、場合により、上記ＤＮＡ相互作用剤が、（ａ）カリケアマイシン、（ｂ）デュオカルマイシン及び（ｃ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される、上記［１］から［３０］のいずれかに記載の方法、混合物又は使用。
生体分子薬物複合体の合成方法：
【００１８】
本発明に従って、生体分子薬物複合体を合成する方法が提供され、該方法は
（ｉ）生体分子と捕捉樹脂とを、生体分子を固定化するために適切な条件下で接触させ、それによって、固定化生体分子を提供し、該生体分子が抗体、改変抗体又は抗体断片であり、該捕捉樹脂が、（１）アミノ酸系、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体を含む非ペプチド系、（２）ペプチド系のプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分及び（４）糖タンパク質捕捉部分、からなる群から選択される生体分子捕捉部分を含む工程、
（ｉｉ）場合により、固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させて、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子を提供する工程、
（ｉｉｉ）固定化生体分子又は化学的に改変された、若しくは活性化された固定化生体分子と、薬物成分とを接触させて、生体分子薬物複合体を形成する工程、
（ｉｖ）生体分子薬物複合体を捕捉樹脂から放出する工程、
を含む。
【００１９】
本発明の上記の方法の鍵となる特色は、この過程に用いる捕捉樹脂が、一貫性があり、再現可能な様式で生体分子を固定化できることである。生体分子の捕捉樹脂への一貫した固定化は、上記の方法により作製された、得られた生体分子薬物複合体において変動の低減をもたらすはずである。例えば、薬物成分が固定化生体分子に付着されるポイントの変動が低減され、したがって、薬物成分と固定化生体分子との間の付着のより一貫したポイントをもたらす。このような領域特異性の改善は得られた生体分子薬物複合体生成物の一貫性の改善という点で望ましいと思われる。
【００２０】
非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬ模倣体又はペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬ模倣体（すなわち、上記の方法の第１工程の（１）又は（２））を生体分子捕捉部分として用いることは、親プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬの生体分子捕捉部分としての採用とは対照的に、従来のプロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬに基づく系に対する模倣体の領域特異性の増加のため、生体分子の固定化における一貫性の相対的改善をもたらし得る。生体分子のタンパク質への固定化の領域特異性が低い場合、親プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬの生体分子捕捉部分としての採用は、生体分子の捕捉樹脂への固定化の変動可能性を本質的にもたらす。例えば、親プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬは、全体的な相互作用を複雑にし得る、タンパク質の他の部位を介した非特異的結合を示し得る。上で説明したように、本発明において想定された生体分子の捕捉樹脂への一貫した固定化は、その後、上記の方法により作製された、得られた生体分子薬物複合体の変動の低減をもたらし得る。このことは有利である。本発明の樹脂系の別の有利性は、従来のプロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬに基づく系の場合より、広範囲の薬物が、原理上樹脂と複合体化することができるという事実にある。例えば疎水性分子の場合、親プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬに基づく系において起こり得る他の非特異的結合が、このような薬物の有効な複合体化を破壊又は妨害する恐れがある。
【００２１】
同様の利益が、ヌクレオチド結合部位捕捉部分又は糖タンパク質捕捉部分（すなわち、上記の方法の第１工程の（３）又は（４））の生体分子捕捉部分としての採用にも存在する。
【００２２】
一実施形態において、捕捉樹脂は、非タンパク質性捕捉樹脂である。一実施形態において、捕捉樹脂の生体分子捕捉部分は、約１０００Ｄａ以下、場合により約５００Ｄａ以下、約３００Ｄａ以下又は約２００Ｄａ以下の分子量を有する。一実施形態において、捕捉樹脂は、非タンパク質性捕捉樹脂であり、捕捉樹脂の生体分子捕捉部分は、約１０００Ｄａ以下の分子量を有する。
【００２３】
非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬ模倣体又はペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬを生体分子捕捉部分として採用する別の利益は、親プロテインＡ、プロテインＧ若しくはプロテインＬを生体分子捕捉部分としての採用とは対照的に、模倣体生体分子捕捉部分が、広範囲の一般的な抗体複合体化化学と適合性であり、工業レベルに拡大が可能であることである。これは、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ系生体分子捕捉部分とは対照的である。
【００２４】
例えば、多くの場合、固定化抗体上のリジル側鎖官能基を標的化することが望ましい。現在臨床開発中の２８種の抗体薬物複合体のうち、ほぼ半数（下記の方の灰色にかげをつけたもの）は、リジン指向性複合体化化学を用いている。プロテインＡ、Ｇ又はＬの表面上の固定化リガンドのタンパク質特性は、タンパク質捕捉樹脂上のリジル側鎖官能基の非意図的標的化をもたらすものである。プロテインＡ（ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  Ｐ０２９７６）は、５９のリジン残基を有し、プロテインＧ（ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  Ｐ９１９９０９）は５９のリジン残基を有し、並びにプロテインＬ（ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  Ｑ５１９１８）は１３２のリジン残基を有する。
0006484607.tif 000003
【００２５】
上記のリガンドと抗体リジル残基との間の競合に加えて、プロテインＡ、Ｇ及びＬ系捕捉樹脂にはさらに他の課題が存在する。これらは、タンパク質の浸出及び浸出された付加体の免疫原性を含む。これは、これらのアフィニティー支持体が、製造過程の終わりに、（精製及び複合体化のために）採用できないことを意味する。プロテインＡ、Ｇ及びＬ系捕捉樹脂を採用するこのような過程から供給されるいずれの複合体材料も、抗体精製及び生成物の品質の現在の規制ガイドラインを満たすことはないであろう。
【００２６】
化学的に改変された、活性化された、固定化生体分子の合成方法：
【００２７】
本発明に従って、化学的に改変された、又は活性化された、固定化生体分子を合成する方法が提供され、該方法は、
（ｉ）生体分子と捕捉樹脂とを、生体分子を固定化するために適切な条件下で接触させ、それによって、固定化生体分子を提供し、該生体分子が抗体、改変抗体又は抗体断片であり、該捕捉樹脂が、（１）アミノ酸系、プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体を含む非ペプチド系、（２）ペプチド系のプロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分及び（４）糖タンパク質捕捉部分、からなる群から選択される生体分子捕捉部分を含む工程、並びに
（ｉｉ）固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させて、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子を提供する工程、
を含む。
【００２８】
タンパク質、より詳細には抗体の複合体化は、多くの場合、調査、診断及び治療に使用される。Bioconjugate Techniques, Second Edition (Greg T Hermanson）は、標識された分子又は複合体分子の作製のための化学反応、試薬系及び実際の適用について非常に詳細な情報を提供している。これはさらに、数百の市販の試薬を用いた数十の反応並びにペプチド及びタンパク質、糖及び多糖類、核酸及びオリゴヌクレオチド、脂質並びに合成ポリマーの改変又は架橋のためのこれら試薬の使用について、詳細に記載している。抗体に適用される鍵となる複合体化化学反応の簡単な概要を、以下に提供する。
【００２９】
天然の鎖間ジスルフィドの還元後の遊離のチオールとの複合体化が、抗体の複合体化への一般的な取り組み及び市販のＡＤＣ  ＡＤＣｅｔｒｉｓ（登録商標）のために用いられる化学反応である。この過程は、抗体と還元剤、例えば、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、メルカプトエチルアミン（merceptoethylamine）又は当分野において周知の他の適切な還元剤とを接触させ、次いで、式Ｄ−Ｘ（式中、Ｄは薬物、リガンド又は標識であり、Ｘは、マレイミド、ハロアルカン、ピリジルジスルフィド及び当分野において公知の他のチオール反応性化学物質から選択される反応性基である）の薬物、リガンド、標識と複合体化する工程を含む。
【００３０】
チオールと抗体との複合体化への別の取り組みは、抗体の特異的部位の反応性システイン残基を操作して、鎖間ジスルフィド結合を破壊することなく、薬物を、定義された化学量論で複合体化可能にする。操作されたシステインは、多くの場合、システイン又はグルタチオンの混合型ジスルフィドとして存在する。付加体は、完全な還元、続く透析ろ過により除去される。これは、鎖間ジスルフィドを破壊し、この鎖間ジスルフィドは、空気、ＣｕＳ０４又はデヒドロアスコルビン酸による酸化によって再形成される必要がある。
【００３１】
複合体化のための別の一般的部位は、リジン残基の側鎖に存在するアミノ基である。最も単純な取り組みは、抗体と、式Ｄ−Ｙの薬物、リガンド、標識又はリンカーとを接触させる工程を含む。Ｄは、上記と同じ定義を有し、Ｙは、イソシアネート、ＮＨＳエステル、スルホニルクロライド、エポキシド及び当業者に公知の他の試薬から選択される反応性基である。
【００３２】
リジンとの間接的複合体化もまた、多くの場合用いられる。リジン側鎖のアミノ基を、ヘテロ二官能性リンカーでまず活性化して、その後、これを、称賛に値する反応性化学物質を含有する薬物と複合体化する。このようなカプレットの例としては、新しいチオールを作製するための２−イミノチオランによるリジンの改変、続く上記のチオール反応性薬物−リンカー（Ｄ−Ｘ）のいずれかとの複合体化が挙げられる。別のカプレットは、リジン結合マレイミドを作製するためのＳＭＣＣによるリジンの改変、続く遊離のチオールを含有する薬物との複合体化である。間接的リジン複合体化のために有用な潜在的カプレットの完全な総説に関して、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ及びＰｅｒｂｉｏの架橋剤カタログを参照されたい。
【００３３】
タンパク質の２０のタンパク新生アミノ酸側鎖に対して化学的に直交する側鎖を有する、非天然アミノ酸を組み込むためのいくつかの基が開発されている。
【００３４】
Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（www.redwoodbioscience.com）は、開発者らがＡｌｄｅｈｙｄｅ  Ｔａｇｇｉｎｇと呼ぶ技術を開発した。この技術において、開発者らは、ホルミルグリシン酵素（ＦＧＥ）と呼ばれる天然酵素を利用し、この酵素は、普通は、高度に保存された１３アミノ酸配列内のＣｙｓ残基を、タイプＩスルファターゼでホルミルグリシン（アルデヒド）に変換する（Wu et al, PNAS, 2009, 106, 9, 3001）。このような改変抗体に複合体化される薬物、リガンド又は標識は、アルデヒド反応性化学物質、例えば、オキシアミン又はヒドラジンを含有しなければならない。アルデヒド反応性官能基の完全な開示は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ及びＰｅｒｂｉｏのカタログに見出すことができる。
【００３５】
Ａｍｂｒｙｘは、開発者らがＥｕＣｏｄｅと呼ぶ技術を開発した（Liu et al, Anu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413）。ＥｕＣｏｄｅは、細胞を操作して、３つの非天然成分：
１．媒体に添加された非天然アミノ酸
２．直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ａａＲＳ）
３．直交ｔＲＮＡ
を発現系に包含することによって、非天然アミノ酸を異種タンパク質に組み込むプラットホームである。
【００３６】
直交ａａＲＳ／ｔＲＮＡペアは、アンバー終止コドンにおける通読を促進し、その位置に非天然アミノ酸を組み込むように操作／選択されている。７０ほどのｎｎＡＡが、この取り組みを使用してタンパク質に組み込まれている。下記の図は、直交アミノ酸側鎖と反応性化学物質との組み合わせ候補についてさらに詳しく述べている（２０１２年２月のＨａｎｓｏｎ  Ｗａｄｅ  ＡＤＣサミットミーティングのＡｍｂｒｙｘのプレゼンテーションから適合）。
【００３７】
Ｓｕｔｒｏは、オープンな無細胞合成（ＯＣＦＳ）技術を使用する、抗体及びサイトカインの作製を記載している。ＯＣＦＳの特色は、非天然アミノ酸を、特定のコドンに向かわせて、非天然アミノ酸をタンパク質の特定の位置に送達できる荷電ｔＲＮＡによりタンパク質に組み込み、特異的改変を受けやすい、又は新しい所望の特性をもたらすタンパク質を作る能力である（Goerke et al, Biotechnol. Bioeng., 2008, 99: 351-367）。
【００３８】
固定化抗体の複合体化は、１つの条件のもと、すべての非天然アミノ酸側鎖と、称賛に値する反応性化学物質とに適合性である。抗体捕捉リガンドは、非天然アミノ酸側鎖の一部として組み込まれた新規な化学物質を含有してはならない。
【化１】
0006484607.tif 000004
【００３９】
糖タンパク質中の多糖類残基の、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化は、その後のアミン又はヒドラジド含有分子、薬物、リガンド又は標識との複合体化のための反応性アルデヒド基を作製する、穏やかで効率的な方法を提供する。この過程は、まず抗体と過ヨウ素酸ナトリウムとを接触させる工程及びその後のアミン、ヒドラジド、アミノオキシ又は当分野において公知の他のアルデヒド反応性化学物質から選択される反応性基と複合体化する工程を伴う。
【００４０】
工程（ｉ）：
【００４１】
一実施形態において、生体分子と捕捉樹脂とを接触させる工程は、生体分子と捕捉樹脂とをインキュベートする工程を含む。
【００４２】
インキュベーションは、約０から約１００℃の温度、好ましくは約５から約５０℃の温度、並びに場合により約１０から約４０℃の温度において実施することができる。理想的には、インキュベーションは、約１５から約３７℃の温度で実施され、例えば、インキュベーションは、室温、例えば約２１℃において実施される。又は、インキュベーションは約３７℃において実施される。
【００４３】
インキュベーションは、約１分から約３日の期間、例えば約１０分から約１８時間の期間実施することができる。好ましくは、インキュベーションは、約２０分から約１時間の期間実施される。
【００４４】
一実施形態において、インキュベーションは、水性媒体中で実施される。代替の実施形態において、インキュベーションは、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は所望の結合ｐＨ及び化学物質と適合性の任意の緩衝化塩中で実施され、場合により、インキュベーションは、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水中で実施される。一実施形態において、インキュベーションは、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなどの溶媒を含む共溶媒を使用して実施される。共溶媒は、０．５−８０％ｖ／ｖ、例えば０．５−５０％ｖ／ｖの範囲内で存在してよい。
【００４５】
一実施形態において、インキュベーションは、約５から約１０、好ましくは約５から約８、より好ましくは約６から約８のｐＨにおいて実施される。好ましい実施形態において、インキュベーションは、約６から約７．５のｐＨ、理想的には約６．５のｐＨにおいて実施される。別の好ましい実施形態において、インキュベーションは、約７から約８のｐＨ、理想的には約７．４のｐＨにおいて実施される。これは、抗体と、誘導体化された支持体との結合の改善をもたらす。
【００４６】
一実施形態において、固定化生体分子（すなわち、捕捉樹脂に固定化された生体分子）は洗浄され、捕捉樹脂に固定化されていないすべての生体分子が除去される。固定化生体分子の洗浄は、新鮮な溶媒ですすぐことによって影響を受け得る。例えば、固定化生体分子の洗浄は、バッファー溶液、例えばＰＢＳですすぐことによって影響を受け得る。場合により、固定化生体分子のすすぎは、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。又は、固定化生体分子の洗浄は、リン酸ナトリウムバッファー、ＮａＣｌ及びキレート剤、例えばＥＤＴＡを含む「改変バッファー」ですすぐことによって影響を受け得る。
【００４７】
工程（ｉｉ）：
【００４８】
一実施形態において、固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させ、改変又は活性化された固定化生体分子を提供する工程は、生体分子を還元する工程を伴う。一実施形態において、生体分子の還元は、完全還元を伴う。一実施形態において、生体分子の還元は、部分的還元を伴う。一実施形態において、生体分子の還元は、完全還元、続く再酸化を伴う。
【００４９】
一実施形態において、生体分子は、生体分子と還元剤、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエチルアミン（merceptoethylamine）又は他の適切な還元剤と接触させることにより還元される。好ましくは、還元剤はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。
【００５０】
一実施形態において、還元された生体分子は、還元生体分子と酸化剤、例えば、空気、ＣｕＳ０４又はデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）とを接触されることによって再酸化される。好ましくは、酸化剤はデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）である。
【００５１】
一実施形態において、生体分子を還元する過程は、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される。
【００５２】
一実施形態において、生体分子を還元する過程は、約５から約１０、好ましくは約７から約８、好ましくは約７．４のｐＨにおいて実施される。
【００５３】
一実施形態において、生体分子を還元する過程は、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。
【００５４】
一実施形態において、生体分子を還元する過程は、生体分子と還元剤とを、約２０分から約３日の期間、場合により約１時間から約２日、さらに場合により約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う。
【００５５】
一実施形態において、固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させ、改変又は活性化された固定化生体分子を提供する工程は、生体分子と架橋剤部分とを反応させる工程を伴う。例えば、架橋剤部分は、アミンとスルフヒドリルとの架橋剤、例えば、ＮＨＳエステル及びマレイミド反応性基を反対端に有する架橋剤であってよい。生体分子を改変又は活性化するこの方法は、生体分子−リンカー−薬物−複合体を有効にもたらす。適切な架橋剤は、一般に（反応性ＮＨＳエステル端により）薬物の第１級アミン基と反応し、（反応性マレイミド端により）生体分子のシステイン残基とさらに反応することができる。この特定の実施例において、マレイミド端は、固定化生体分子中のシステインと反応する。このような架橋剤の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である。
【００５６】
一実施形態において、架橋剤と反応させる過程は、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される。又は、架橋剤と反応させる過程は、リン酸ナトリウムバッファー、ＮａＣｌ及びキレート剤、例えばＥＤＴＡを含む「改変バッファー」中で実施される。
【００５７】
一実施形態において、架橋剤と反応させる過程は、約７から約９、好ましくは約７から約８、好ましくは約８．０のｐＨにおいて実施される。
【００５８】
一実施形態において、架橋剤と反応させる過程は、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。
【００５９】
一実施形態において、架橋剤と反応させる過程は、生体分子と架橋剤とを、約２０分から約３日、場合により約１時間から約２日、並びにさらに場合により約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う。
【００６０】
一実施形態において、固定化生体分子と化学的改変剤又は活性化剤とを接触させて、改変又は活性化された固定化生体分子を提供する工程は、生体分子とトラウト試薬（Traut’s reagent）とを反応させる工程を伴う。
【００６１】
一実施形態において、トラウト試薬（Traut's reagent）と反応させる過程は、バッファー溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施される。
【００６２】
一実施形態において、トラウト試薬（Traut's reagent）と反応させる過程は、約７から約９、好ましくは約７から約８、好ましくは約８．０のｐＨにおいて実施される。
【００６３】
一実施形態において、トラウト試薬（Traut's reagent）と反応させる過程は、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。
【００６４】
一実施形態において、トラウト試薬（Traut's reagent）と反応させる過程は、生体分子と還元剤とを、約２０分から約３日、場合により約１時間から約２日、並びにさらに場合により約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う。
【００６５】
一実施形態において、活性化された固定化生体分子は洗浄され、すべての改変剤／活性化剤が除去される。一実施形態において、洗浄工程はバッファーですすぐ工程を伴い、場合により該バッファーはリン酸緩衝生理食塩水である。他の適切なバッファーとしては、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパンバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、酢酸ナトリウムバッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、カコジル酸バッファー、酢酸アンモニウムバッファー、イミダゾールバッファー、ビシンバッファー及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーが挙げられる。例えば、固定化生体分子は、バッファー溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で約７から約８、好ましくは約７．４のｐＨにおいて洗浄することができる。場合により、活性化された固定化生体分子をすすぐ工程は、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。活性化された固定化生体分子をすすぐ工程の別の例は、樹脂をバッファー、例えばＰＢＳによりすすぎ、次いで、クエン酸ナトリウム、ＮａＣｌ及びキレート剤、例えばＥＤＴＡを含む「複合体化バッファー」によりすすぐ工程を伴う。
【００６６】
工程（ｉｉｉ）：
【００６７】
一実施形態において、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを接触させ、固定化生体分子薬物複合体を形成する工程は、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と、薬物成分とを、工程（ｉｉ）に関してこれ以前に記載されたバッファー溶液中で接触させる工程を伴う。
【００６８】
一実施形態において、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを接触させ、固定化生体分子薬物複合体を形成する工程は、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、約５から約８、好ましくは約約７から約８並びにより好ましくは約７．４のｐＨにおいて接触させる工程を伴う。
【００６９】
一実施形態において、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを接触させ、固定化生体分子薬物複合体を形成する工程は、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。
【００７０】
一実施形態において、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを接触させ、固定化生体分子薬物複合体を形成する工程は、化学的に改変された、又は活性化された固定化生体分子と薬物成分とを、約２０分から約３日、場合により約１時間から約２日、並びにさらに場合により約６時間から約１８時間の期間インキュベートする工程を伴う。
【００７１】
一実施形態において、固定化生体分子薬物複合体は、生体分子薬物複合体を捕捉樹脂から放出する工程の前に洗浄される。洗浄工程は、未反応のすべての薬物成分を除去する。一実施形態において、洗浄工程は、バッファーによりすすぐ工程を伴い、場合により、バッファーはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び他の溶媒である。他の適切なバッファーとしては、リン酸カリウムバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパンバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、酢酸ナトリウムバッファー、クエン酸ナトリウムバッファー、カコジル酸バッファー、酢酸アンモニウムバッファー、イミダゾールバッファー、ビシンバッファー及び２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーが挙げられる。例えば、固定化生体分子薬物複合体は、バッファー溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で約５から約７のｐＨにおいて洗浄することができる。場合により、固定化生体分子薬物複合体をすすぐ工程は、キレート剤、例えばＥＤＴＡの存在下で実施される。
【００７２】
工程（ｉｖ）：
【００７３】
一実施形態において、生体分子薬物複合体を捕捉樹脂から放出する工程は、
ａ）支持体−生体分子化合物を放出剤に曝露する工程、及び／又は
ｂ）ｐＨを変更して、支持体−生体分子の結合を破壊する工程、
を伴う。
【００７４】
一実施形態において、放出剤は、水素結合破壊剤、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール、２，２，２−トリフルオロエタノール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の共溶媒である。
【００７５】
一実施形態において、放出剤は、支持体−生体分子と一緒にインキュベートされる。
【００７６】
インキュベーションは、約０から約１００℃の温度、好ましくは約５から約５０℃の温度、並びに場合により約１０から約４０℃の温度において実施することができる。理想的には、インキュベーションは、約１５から約３７℃の温度で実施され、例えば、インキュベーションは、室温、例えば約２１℃において実施される。又は、インキュベーションは約３７℃において実施される。
【００７７】
インキュベーションは、約１分から約３日の期間実施することができる。好ましくは、インキュベーションは、約３０分から約２時間の期間実施される。
【００７８】
インキュベーションは水性媒体中で実施することができる。又は、インキュベーションは溶媒、例えば、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＭｅＯＨ又はＭｅＣＮ中で実施することができる。又は、インキュベーションは、最大８０％の溶媒、好ましくは０．５から５０％及び最も好ましくは０．５％から１０％ｖ／ｖの溶媒を含む水性−溶媒混合物中で実施することができる。ある場合において、水を含む、上記の溶媒の１つ又はそれ以上の混合物が適切であると思われる。必要に応じて、複合体が確実に無傷のままであるために、安定剤もまた含まれてよい。
【００７９】
一実施形態において、生体分子薬物複合体を捕捉樹脂から放出する工程は、ｐＨを変更する工程を伴う。ｐＨは、支持体−生体分子の結合を破壊するために十分であるが、生体分子の活性、完全性又は３Ｄ構造に影響を与えない任意の量により変更することができる。
【００８０】
例えば、ｐＨは、酸性であるように調整することができる。一実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ２からｐＨ６に低下される。場合により、ｐＨは、約ｐＨ５未満、例えば約ｐＨ３から約５、例えば約ｐＨ４未満に調整される。一実施形態において、ｐＨは約ｐＨ３に低下される。
【００８１】
又は、ｐＨは塩基性であるように調整することができる。一実施形態において、ｐＨは約ｐＨ８から約ｐＨ１０に上昇される。場合により、ｐＨはｐＨ８より高く調整される。例えば、ｐＨは約ｐＨ９に上昇される。ｐＨは、ｐＨ９より高いように上昇させることができる。例えば、ｐＨは約ｐＨ１０に上昇させることができる。ｐＨはｐＨ１０より高いように上昇させることができるが、普通はｐＨ１４未満のものである。
【００８２】
生体分子薬物複合体は、放出剤による１つ又はそれ以上の処理に供することができる。有利には、新鮮な放出剤による第２又は続く処理の使用は、捕捉樹脂から放出される生体分子薬物複合体の量の増加をもたらす。新鮮な放出剤は、以前に固定化生体分子薬物複合体と一緒にインキュベートされたことがない放出剤である。
【００８３】
一実施形態において、生体分子薬物複合体を捕捉樹脂から放出する工程は、生体分子薬物複合体と塩とを接触させる工程を伴う。例えば、生体分子薬物複合体はＮａＣｌと接触させてよい。塩の濃度は、約０．１から約１０Ｍ、好ましくは約０．１から約１Ｍの範囲であってよい。
【００８４】
一実施形態において、溶出された生体分子薬物複合体は、複合体を捕捉樹脂から放出させる工程の後で中和される。例えば、複合体は、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に捕捉されてよい。
【００８５】
洗浄工程：
【００８６】
一実施形態において、本発明の方法において中間体を洗浄する工程は、捕捉樹脂に結合されていない物質、例えば混入物を除去する工程を含む。通常の混入物は、固定化生体分子を活性化するために使用される過剰の試薬、捕捉樹脂に固定化されていなかった生体分子及び活性化された固定化生体分子と反応されなかった薬物成分が挙げられる。生体分子の活性、完全性若しくは３Ｄ構造又は固定化生体分子と捕捉樹脂との間の結合の完全性に影響を与えない任意の媒体が、中間体の洗浄に使用できる。
【００８７】
好ましくは、バッファーは等張性であり、生理的ｐＨ及びイオン強度を模倣することによって、生体分子、例えば抗体に安定な環境を誘導する。一実施形態において、活性化された固定化生体分子は、ろ過により洗浄される。場合により、得られたろ液は、例えば膜カートリッジを使用する遠心分離によりバッファー交換される。
【００８８】
通常、添加剤がバッファー媒体に導入される。これらの添加剤は、バッファー系及びそこに含有される生体分子に一定レベルの調節を誘導する。例えば、添加剤、例えばトリス又はヒスチジンは、緩衝化されたプロセス流に導入され、ｐＨを維持し、付随的な酸性化を最小化する。通常、生体分子プロセス流のｐＨは、ｐＨ５から９．５の間に維持されなければならず、長期間の極端なｐＨ限界は避けるべきである。無機塩、例えば０．１Ｍ ＮａＣｌ（水溶液）を加えて、プロセス流のイオン強度を維持してもよい。イオン性及び非イオン性洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）をバッファーに加えて、難溶性生体分子のバッファー媒体への溶解度を有利に上昇させ、凝集を最小化することができる。
【００８９】
捕捉樹脂及び活性化剤を含む混合物：
【００９０】
本発明に従って、
（ｉ）（１）非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（２）ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分及び（４）糖タンパク質捕捉部分、からなる群から選択される抗体、改変抗体又は抗体断片捕捉部分を含む捕捉樹脂、並びに
（ｉｉ）化学的改変剤又は活性化剤
を含む混合物が提供される。
【００９１】
一実施形態において、捕捉樹脂は、固定化抗体、改変抗体又は抗体断片を、これらの表面に含む。
【００９２】
生体分子薬物複合体の合成における捕捉樹脂の使用：
【００９３】
本発明に従って、（１）非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（２）ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体、（３）ヌクレオチド結合部位捕捉部分及び（４）糖タンパク質捕捉部分、からなる群から選択される抗体、改変抗体又は抗体断片捕捉部分を含む捕捉樹脂の、生体分子薬物複合体の合成における使用が提供される。
【００９４】
捕捉樹脂：
【００９５】
数年の間、研究者らは、伝統的なプロテインＡ、Ｇ又はＬ系アフィニティー精製支持体の代替として、さまざまな完全長抗体、断片又は融合体に対するアフィニティーを有するリガンドの開発を試みてきた。リガンドの発見／開発の成功の主要な基準は、
１．高度な初期精製を可能にする、抗体に対する高い選択性
２．有用な動的結合能
３．抗体完全性の保持と適合性の溶出条件
４．複数の溶出／クリーニングサイクルの間の支持体の安定性
５．プロテインＡ、Ｇ又はＬ系支持体と比較して低コスト
であった。
【００９６】
固相のためのこれらのリガンドの使用に関連して、上記の抗体複合体化基準１は、精製された抗体を用いて複合体化過程を開始する場合には重要でない。しかし、リガンドは、残りの４つの基準を完全に満たさなければならない。加えて、理想的にはリガンドは、複合体化のための適切なアフィニティー結合強度を可能にする、抗体と相互作用する規定の部位を有さなければならない。この属性は、抗体が支持体に結合可能であり、継時的なバッファーの補充の間に不注意に溶出されないように必要である。加えて、相互作用の規定の部位は、結合された抗体複合体の一貫した立体構造の、周囲の溶解相への提示及び一貫した再現可能な複合体化化学反応の手段を提供する効果を推測することが望ましい。抗体は、アフィニティー精製のために利用される多数の十分に規定された結合ドメインを有する、十分に特徴付けられた生体分子である。
【００９７】
第１の規定領域（複数可）は、プロテインＡ／Ｇ及びプロテインＡ／Ｇ模倣体系支持体を使用するアフィニティークロマトグラフィーに利用されるプロテインＡ及びプロテインＧ結合ポケットである。プロテインＡは、アミノ酸残基：Ｔｈｒ２５０、Ｌｅｕ２５１、Ｍｅｔ２５２、Ｉｌｅ２５３、Ｈｉｓ３１０、Ｇｌｎ３１１、Ｌｅｕ３１４、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３３８、Ｇｌｕ３４５、Ａｌａ４３１、Ｌｅｕ４３２、Ｈｉｓ４３３、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５と数多くの非共有結合的相互作用により、Ｆｃ領域のＣＨ２ＣＨ３鎖間ドメインと相互作用する。プロテインＡ模倣体系支持体は、上で規定されたアミノ酸の１つ又はそれ以上によりこのドメインと相互作用するように、合理的にデザインされている。これらの模倣体系支持体は、ＩｇＧの結合及び複合体化のための適切なアフィニティーリガンドをもたらす。プロテインＡ模倣体系支持体は、非ペプチド系、ペプチド系又はアミノ酸系リガンドを組み込むサブクラスに規定することができる。同様に、プロテインＧは、アミノ酸残基Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｇｌｎ３１１、Ｇｌｕ３８０、Ｇｌｕ３８２、Ｈｉｓ４３３、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５と数多くの非共有結合的相互作用により、Ｆｃ領域のＣＨ２ＣＨ３鎖間ドメインと相互作用する。プロテインＧ模倣体支持体は、上記のアミノ酸の１つ又はそれ以上によりこのドメインと相互作用するように、合理的にデザインされている。これもまた同様に、これらの模倣体支持体は、ＩｇＧの結合及び複合体化のための適切なアフィニティーリガンドをもたらす。プロテインＧ模倣体支持体は、非ペプチド系、ペプチド系又はアミノ酸系リガンドを組み込むサブクラスに規定することができる。一実施形態において、捕捉樹脂は、生体分子のプロテインＡ又はプロテインＧ結合ポケットに結合することができる。
【００９８】
第２の規定領域は、プロテインＬアフィニティーマトリックスにより標的化される抗体の軽鎖である。プロテインＬは、カッパＩ、ＩＩ及びＩＶ軽鎖に特異的に結合するが、カッパＩＩＩ軽鎖ともガンマ軽鎖とも結合しない。プロテインＬと抗体との間の相互作用はマッピングされており、水素結合及び塩架橋が結合に重要であることに留意されたい。合計１１の親水性アミノ酸残基−すなわち、プロテインＬドメインのＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒが、これらの結合の形成に重要である。プロテインＬ模倣体系アフィニティー支持体は、上に開示した１１アミノ酸に構造的に類似の化合物を使用する、トリアジン足場コンビナトリアルライブラリを作製することによって開発されてきた（国際公開第２００４／０３５１９９Ａ号）。国際公開第２００４／０３５１９９Ａ号に開示されたプロテインＬ模倣体は、抗体又は断片に対してプロテインＬの５０％のアフィニティー及びＦａｂ断片の結合により立証された軽鎖に対する特異性を有するリガンドとして定義されている。当該特許出願明細書に開示された、及び当業者に公知の任意の適切な足場を、アフィニティーの特色及び軽鎖に対する特異性が保持される限り、トリアジン足場と置換することができる。このような樹脂は、カッパＩ、ＩＩ及びＩＶ軽鎖を含有する抗体及び断片の固定化に有用である。プロテインＬ模倣体の市販の一実施形態は、Ｆａｂｓｏｒｂｅｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ（ＰｒｏＭｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。このアフィニティー支持体は、プロテインＬ模倣体に対する基準を満たすが、ガンマ軽鎖含有抗体及び断片とも結合する。したがって、このアフィニティー支持体は、抗体のアフィニティー結合及び複合体化に広く適用可能である。一実施形態において、該捕捉樹脂は、プロテインＬアフィニティーマトリックスにより標的化される抗体軽鎖と結合することができる。
【００９９】
第３の規定領域は、広範囲の種にわたったすべての抗体アイソタイプのＦａｂアームの保存されたヌクレオチドドメインである。結合部位は４アミノ酸残基を含み、第１はＴｙｒ又はＰｈｅのいずれかであり、残りの３つはＴｙｒ、Ｔｙｒ及びＴｒｐである。結合ポケットの位置及びアミノ酸側鎖の配向は、表面を覆った結晶構造に保存されるが、抗体ごとの全体の骨格配列の変動及びナンバリングスキームがわずかに異なる。このことは、市販の抗体であるハーセプチン及びリツキシマブに対する保存ヌクレオチド結合部位を比較することによって、下記に実証される。上記のアミノ酸の１つ又はそれ以上によりこのドメインと相互作用するように、合理的にデザインされているヌクレオチド模倣体（非ペプチド、ペプチド、ヌクレオチド類似体及びアミノ酸）は、ＩｇＧの結合及び複合体化のための適切なアフィニティーリガンドである。
0006484607.tif 000005
【０１００】
一実施形態において、捕捉樹脂は、抗体のＦａｂアームの保存ヌクレオチドドメインと結合することができる。
【０１０１】
第４の規定領域は、無傷の抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７に存在するグリカン構造である。アフィニティーリガンドとして作用するｍ−アミノフェニルボロン酸は、糖タンパク質分子の糖部分に存在するような、糖残基、例えばマンノース、ガラクトース又はグルコースのシスジオール基と結合する。可逆的な五員環複合体が、この相互作用から供給される。典型的な抗体グリカン構造を下記に示し、抗体グリカン中のマンノース及びガラクトースの存在を強調する（Arnold et al, Advances in Experimental Medicine and Biology, 2005, 564, 27-43から適合）。一実施形態において、捕捉樹脂は、無傷の抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７に存在するグリカン構造と結合することができる。
【化２】
0006484607.tif 000006
【０１０２】
リガンドは、アフィニティークロマトグラフィーの分野において周知のさまざまな固体支持体マトリックスと結合することができる。これらは、例としては、合成ポリマー、例えば、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール又はポリスチレン、特に架橋合成ポリマー、無機支持体、例えば、シリカ系支持体並びに、特に多糖類支持体、例えばデンプン、セルロース及びアガロースが挙げられる。
【０１０３】
抗体結合に適切な特異的リガンド−支持体を、以下に記載する：
【０１０４】
「非ペプチド系」プロテインＡ、Ｇ及びＬ模倣体系アフィニティー支持体
【０１０５】
合成化学ライブラリのスクリーニングと組み合わせたプロテインＡ、Ｇ又はＬの相互作用の分子モデリングは、これらのタンパク質の小分子模倣体の半合理的（semi-rational）デザインを可能にした（Li et al, Nature Biotechnology, 1998, 16, 190-195）。このような樹脂の例としては、市販の支持体であるｍＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１Ｐ及びＦＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｆ１Ｐ  ＨＦ（ＰｒｏＭｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。
【０１０６】
ｍＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１Ｐ及びＦＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ｆ１Ｐ  ＨＦ支持体は、多成分ウギ反応を使用してトリアジンの足場に形成される（www.prometicbioscience.com）。
【０１０７】
米国特許出願第２００１００４５３８４号は、イミノジアセテート（ＩＤＡ）タイプの足場に組み立てられるプロテインＡ模倣体リガンド−複合体を開示している。ＩＤＡ足場は、トリアジルリガンドにより誘導体化され、多価トリアジルリガンド−複合体をもたらす。
【０１０８】
国際公開第９８０８６０３号は、アフィニティー樹脂を使用する、細胞培養上清、血清、血漿又は初乳からの、免疫グロブリンの単離を記載している。これらのアフィニティー樹脂は、合成の単環式又は二環式芳香族又はヘテロ芳香族リガンドで構成され、免疫グロブリンの精製を容易にする。
【０１０９】
抗体アフィニティー樹脂として有望な別のリガンドはスルファメタジンである。スルファメタジンとカップリングされたデキストラン微粒子は、抗体を特異的に結合する（Yi et al, Prep. Biochem. Biotechnol., 2012, 42, 6, 598-610）。
【０１１０】
上記の有力候補リガンドの選択において、多数のリガンドが、抗体特異性の欠落に基づき除外された。本明細書において、特異性が、固相抗体複合体化樹脂に対する結合の効率、能力及び安定性ほど重要ではなく、したがってこれらは考慮に入れないことを開示する。
【０１１１】
「ペプチド」プロテインＡ、Ｇ又はＬ模倣体系アフィニティー支持体
【０１１２】
数多くのプロテインＡ模倣体ペプチドが開示されている。Ｍｅｎｅｇａｔｔｉは、抗体のＦｃ領域に結合する配列ＨＷＲＧＷＶを有するヘキサペプチドを同定した（Menegatti et al, Journal of Separation Science, 2012, 35, 22, 3139-3148。Ｆａｓｓｉｎａらは、四配座リジンコアを含むランダム化された合成分子で構成される、合成多量体のペプチドライブラリの合成及びスクリーニングを介してプロテインＡ模倣体ペプチドＴＧ１９１３１８を同定している(Fassina et al, J. Mol. Recognit., 1996, 9, 564）。欧州特許第１９９７８２６号は、Ｘ１−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒを含むペプチドを開示している。Ｌｕｎｄらは、抗体アフィニティークロマトグラフィーに適切な２つのペプチドリガンドを開示している（Lund et al, J Chromatogr. A, 2012, 1225, 158-167）。ＤＡＡＧ及びＤ２ＡＡＧは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グリシン及び合成の芳香族酸２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジルアクリレート（ＤＢＨＢＡ）を含有する。
【０１１３】
アミノ酸系プロテインＡ、Ｇ又はＬ模倣体系アフィニティー支持体
【０１１４】
上記の複合体巨大分子リガンドに加えて、同じ方法で抗体に結合する単純なアミノ酸がプロテインＡ模倣体として提唱されている（Naik et al, J. Chromatogr. A, 2011, 1218, 1756-1766）。この例は、ＡｂＳｅｐ、抗体のＦｃ領域のプロテインＡ結合部位に対して高いアフィニティーを有する、トリプトファン含有ポリメタクリレート樹脂である。アミノ酸のチロシン、ヒスチジン及びフェニルアラニンを含有する樹脂もまた、抗体の固定化及び複合体化に適切である（Bueno et al, J. Chromatogr. B, Biomed. Appl., 1995; 667, 1, 57-67）。
【０１１５】
ヌクレオチド結合部位系アフィニティー支持体
【０１１６】
抗体精製リガンドを開発するための別の戦略は、あまり有名でない、抗体のＦａｂ可変領域の保存されたヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）を利用していた（Alves et al, Anal. Chem., 2012, 84, 7721-7728）。ヌクレオチド類似体のインドール酪酸を、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  ＡＦ−６５０−アミノＭ樹脂とカップリングさせて、上記の基準１−５を満たす支持体を調製した。抗体アフィニティークロマトグラフィーに有用な、広範囲にわたる他のヌクレオチド類似体が、国際公開第／２０１２／０９９９４９号に記載されている。
【０１１７】
炭水化物結合樹脂
【０１１８】
さまざまな支持体に固定化されたリガンドのアミノフェニルボロン酸は、糖タンパク質の精製に使用されている。リガンドは、抗体を含む糖タンパク質分子の糖部分に存在する糖残基、例えばマンノース、ガラクトース又はグルコースのシスジオール基と結合し、可逆的な五員環複合体を形成する。この複合体は、ｐＨを低下させることによって、又はトリス又はソルビトールいずれかを含有する溶出バッファーを使用することによって解離させることができる。
【０１１９】
捕捉樹脂のリガンドは、リガンドと生体分子、例えば、タンパク質、抗体、改変抗体又は抗体断片との間の、特異的、可逆的及び非共有結合的相互作用により、生体分子と相互作用することができる。非共有結合的相互作用は、イオン性、ファンデルワールス、水素結合又は疎水性として分類可能である。これらの相互作用は、３次元的様式で作用して、捕捉樹脂のリガンドに対する標的生体分子の柔軟性及び立体構造を支援する。リガンドに近接する場合、生体分子は、これらの相互作用の１つ、いくつか、又はすべてを推測して、リガンド−生体分子複合体をもたらすことができる。リガンドと生体分子との間の距離並びにリガンドの極性及び電気陰性度が、これらの相互作用の強度を決定する。さらに、これらの相互作用の強度を、親和力として定義することができる。リガンドと生体分子との間の親和力の高さが、リガンド−生体分子複合体の安定性の強化を構成する（米国特許出願第２００９／０２４００３３号）。
【０１２０】
一実施形態において、捕捉樹脂は、非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体を含む。該捕捉樹脂は、抗体、改変抗体又は抗体断片と結合することができる。
【０１２１】
非ペプチド系プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＬ模倣体は、色素リガンドクロマトグラフィーに使用されており、これは、固体支持体、例えばアガロースに固定化された共有結合された繊維色素を利用して、タンパク質を精製する、アフィニティークロマトグラフィーの一様式である。これらの色素はタンパク質がアフィニティーを有する天然物質／プロテインリガンドと似ている。この様式の精製及び分離は、多くの場合、擬似アフィニティークロマトグラフィーと称される。色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーは非特異的であるが、この技術はさまざまなタンパク質に対する広範囲な結合のため有利である。用いる精製技術の進歩は、色素を、タンパク質の正常な基質／リガンドに対する競合阻害剤として作用するように改変した（P. Dean et al, J. Chromatography, 1979, 165, 3, 301-319）。トリアジニル系リガンド、例えばＣｉｂａｃｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３ＧＡ、Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｒｅｄ  Ｈ−３Ｂ、Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｂｌｕｅ  ＭＸ  ３Ｇ、Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｈ−Ａなどは一般的に用いられ、元々の市販の色素、例えばＢｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ（Lowe et al, Trends Biotechnology, 1992, 10, 442-448）の精製、漏出及び毒性の懸念に対処した。トリアジニルリガンドは、アルブミン、オキシドレダクターゼ、デカルボキシラーゼ、糖分解酵素、ヌクレアーゼ、ヒドロラーゼ（hydroloases）、リアーゼ、シンセターゼ及びトランスフェラーゼの精製に使用され成功している（N. Labrou, Methods Mol. Biol. 2002, 147, 129-139）。生体模倣色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーの限界は、生体分子ごとのアフィニティー強度がかなり可変であり、多くの場合、あるタンパク質に対して強力なアフィニティー強度のあるリガンドは、別のタンパク質には適用できないことである。したがって、広範囲にわたる経験的なスクリーニング過程が、対象となる生体分子に対して所望のアフィニティーを有する適切なリガンドを同定するために行われる必要がある。
【０１２２】
生体分子とのアフィニティー結合をもたらす適切なリガンドの構造的解明の支援の結果として、 多価足場モチーフがリガンド構造に組み込まれ、支持体からのリガンドの厳密な空間的分離と併せて、リガンドのライブラリが導入され、スクリーニングされ得る構築体が提供されている。
【０１２３】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、国際公開第９８／０８６０３号の開示に列挙された構造に従った構造を有する。国際公開第９８／０８６０３号の捕捉樹脂は、合成の単環式又は二環式の芳香族又はヘテロ芳香族リガンドを含み、免疫グロブリンの精製を容易にする。捕捉樹脂の構造に関する国際公開第９８／０８６０３号の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第９８／０８６０３号は、アフィニティー樹脂を使用する、細胞培養液上清、血清、血漿又は初乳からの免疫グロブリンの単離を記載している。
【０１２４】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、国際公開第２００９／１４１３８４号の開示に列挙された構造に従った構造を有する。国際公開第２００９／１４１３８４号の捕捉樹脂は一般式：
【化３】
0006484607.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、リガンドが、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の１つを介してアミド結合により固相支持体に固定化される、分子量１５−１０００ｇ／ｍｏｌ、総重量が２００−２０００ｇ／ｍｏｌの有機部分を表す）を有する。捕捉樹脂の構造に関する国際公開第２００９／１４１３８４号の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第２００９／１４１３８４号は、該リガンドがタンパク質性Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩポリペプチドと結合することを記載している。
【０１２５】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、米国特許出願第２００１００４５３８４号の開示に列挙された構造に従った構造を有する。米国特許出願第２００１００４５３８４号の捕捉樹脂は、イミノジアセテート（ＩＤＡ）タイプ足場の上に組み立てられたプロテインＡ模倣体リガンド−複合体である。捕捉樹脂の構造に関する米国特許出願第２００１００４５３８４号の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＤＡ足場は、トリアジルリガンドで誘導体化され、多価トリアジルリガンド複合体をもたらす。米国特許出願第２００１００４５３８４号内で定義された例示的トリアジルリガンド複合体を、下記に示す：
【化４】
0006484607.tif 000008
【０１２６】
このプロテインＡ模倣体は、免疫グロブリン、例えばＩｇＧに対するアフィニティー精製媒体としての有用性が実証されている。リガンド複合体中の隣接するトリアジンリガンドの分子幾何構造が、ＩＤＡ足場を使用する有利性であることが主張されている。
【０１２７】
米国特許出願第２００１００４５３８４号内で定義された別の例示的複合体を、下記に示す：
【化５】
0006484607.tif 000009
【０１２８】
この分枝型多価フタル酸リガンド足場のプロテインＡ模倣体−リガンド複合体が、免疫グロブリンに対するアフィニティーを有することが実証された。
【０１２９】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、国際公開第９７１０８８７号及び米国特許第６１１７９９６号の開示に列挙された構造に従った構造を有する。捕捉樹脂の構造に関する国際公開第９７１０８８７号及び米国特許第６１１７９９６号の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第９７１０８８７号及び米国特許第６１１７９９６号は、タイプ：
【化６】
0006484607.tif 000010
（式中、（Ａ）は、トリアジン足場の多糖類固体支持体への、場合によりリガンドと固体支持体との間に挿入されたスペーサーアームを介した共有結合点を表し、Ｒ１及びＱは、タンパク質性材料に対するアフィニティーを有する、場合により置換されたリガンドである）のトリアジル−リガンドアフィニティー構築体を開示する。有機部分はプロテインＡ模倣体として記載され、タンパク質性材料の精製のためのプロテインＡに対する代替の精製媒体として例示される。
【０１３０】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、国際公開第２００４／０３５１９９号の開示に列挙された構造に従った構造を有する。捕捉樹脂の構造に関する国際公開第２００４／０３５１９９号の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第２００４／０３５１９９号は、一般式、
【化７】
0006484607.tif 000011
（式中、Ｒ１及びＲ２は同じであるか、又は異なっており、それぞれ場合により置換されたアルキル又はアリールリガンドであり、並びにＲ３は、場合によりスペーサーモチーフにより結合された固体支持体である）の分枝型リガンド足場を含むプロテインＬ模倣体の使用を開示する。トリアジル−リガンド足場は、免疫グロブリン又はこれらの抗体断片（ｆＡｂ）のアフィニティー結合のための、適切なプロテインＬ模倣体リガンドとして開示されている。さらに、これらのトリアジル−リガンド足場は、免疫グロブリンκ及びλ軽鎖に対する優先的結合アフィニティーを有することが開示されている。
【０１３１】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、米国特許出願第２０１１００４６３５３号の開示に列挙された構造に従った構造を有する。捕捉樹脂の構造に関する米国特許出願第２０１１００４６３５３号の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許出願第２０１１００４６３５３号は、調製媒体からの抗体断片（ｆＡｂ）の精製を開示している。抗体断片は、プロテインＡ媒体において精製することはできない。ｆＡｂは、抗原に結合できる結合ドメインを有することを特徴としており、開示されている多くの実施形態において、１つの重鎖（Ｖｈ）若しくはこれらの機能性断片及び１つの軽鎖（ＶＩ）若しくはこれらの機能性断片を、少なくとも１つの他の鎖と一緒に有することからなる。式
【化８】
0006484607.tif 000012
（式中、Ｑは、場合によりスペーサーモチーフを用いた、固体支持体マトリックスへの結合点を表し、基Ａ及びＢは、水素結合可能な１つ又はそれ以上の置換基、好ましくは、−ＯＨ、−ＳＨ又はＣＯ２Ｈの１つ又はそれ以上で置換されたフェニル又はナフチル基である）の分枝型トリアジル足場からなる、ｆＡｂに対するアフィニティーリガンドが定義される。極めて優れた結果が、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商品名ＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ１Ｐ及びＭＡｂｓｏｒｂｅｎｔ  Ａ２Ｐで市販されている、支持されたアフィニティーリガンドを使用して、報告されている。
【０１３２】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、構造：
【化９】
0006484607.tif 000013
を有する。
【０１３３】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、構造：
【化１０】
0006484607.tif 000014
を有する。
【０１３４】
一実施形態において、捕捉樹脂のリガンドは、構造：
【化１１】
0006484607.tif 000015
を有する。
【０１３５】
一実施形態において、捕捉樹脂はビーズの形態である。一実施形態において、ビーズのサイズはビーズの直径を単位として、約１０μｍから約２０００μｍ、好ましくは約５０μｍから約１０００μｍ及び最も好ましくは約７５μｍから約５００μｍである。
【０１３６】
一実施形態において、捕捉樹脂は、ポリスチレン、ジビニルベンゼンと軽度に架橋されたポリスチレン（ＰＳ−ＤＶＢ）（０．１−５．０％ ＤＶＢ、Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓと呼ばれる）、ジビニルベンゼンと高度に架橋されたポリスチレン（ＰＳ−ＤＶＢ）（５−６０％ ＤＶＢ、Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓと呼ばれる）、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールグラフト化ポリスチレン（ＰＳ−ＰＥＧコポリマー）、ポリアクリルアミド、定孔ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）ビーズ、シリカ、珪藻土、ポリプロピレン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリエチレン、セルロース、ポリメタクリレート、官能化モノリス、官能化ファイバー、モノリスカラム（例えば、Nikzad et al, OPRD, 2007, 11, 458-462）、アガロース、セファロース及び復元可能な磁気ポリマービーズからなる群から選択される材料から作製された移動性支持体を含む。
【０１３７】
好ましい実施形態において、捕捉樹脂は、アガロース、セファロース及びセルロースからなる群から選択される材料により作製される移動性支持体である。
【０１３８】
一実施形態において、捕捉樹脂は、市販の捕捉樹脂、例えば、Ｆａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ樹脂である。一実施形態において、捕捉樹脂は、市販の捕捉樹脂、例えばＭａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）樹脂である。
【０１３９】
生体分子：
【０１４０】
一実施形態において、生体分子は、生物中に天然に存在する。又は、生体分子は、生物中に天然に存在する化合物の誘導体であってもよい。例えば、生体分子は、その生物活性に影響を与えない方法で化学的又は遺伝学的に改変されている生体分子であってもよい。
【０１４１】
一実施形態において、生体分子は抗体である。
【０１４２】
一実施形態において、生体分子は改変抗体、例えば、非天然アミノ酸を含む抗体である。
【０１４３】
一実施形態において、生体分子は抗体断片である。
【０１４４】
一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１４５】
一実施形態において、抗体はトラスツズマブである。
【０１４６】
一実施形態において、抗体、改変抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、例えば、５つのヒト免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥの１つである。抗体という用語は、モノクローナル抗体を包含する。抗体という用語は、ポリクローナル抗体を包含する。抗体という用語は、所望の生体活性を示す限り抗体断片を包含する。抗体は、ヒト抗体、動物抗体、ネズミ抗体、ヒト化抗体又はヒト及び動物配列を含むキメラ抗体であってよい。
【０１４７】
抗体構造の基本単位は、少なくとも２０，０００ダルトン、例えば約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質複合体である。抗体は、少なくとも９００アミノ酸長、例えば１４００アミノ酸長であってよい。抗体は、非共有結合性会合及びジスルフィド結合の両方により１つに連結された、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）から構成される。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔をあけて鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、約５０，０００ダルトンである。各重鎖は、少なくとも３００アミノ酸長、例えば約４５０アミノ酸長である。抗体は、重鎖のみの抗体であってもよい。各軽鎖は約２０，０００ダルトンである。各軽鎖は、少なくとも１００アミノ酸長、例えば約２５０アミノ酸長である。
【０１４８】
抗体生体分子は、２つの同一ペアのポリペプチド鎖を含有し、各ペアは、１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する。各軽鎖及び重鎖は、順に２つの領域：標的抗原への結合に関与する可変領域（「Ｖ」）及び免疫系の他の成分と相互作用する定常領域（「Ｃ」）からなる。軽鎖及び重鎖の可変領域は、３次元空間で一体となり、抗原（例えば、細胞の表面の受容体）に結合する可変領域を形成する。
【０１４９】
一実施形態において、生体分子は抗体断片である。抗体断片は、完全長抗体の一部、一般にこれらの抗原結合部又は可変領域を含む。
【０１５０】
抗体断片の例としては、Ｆａｂ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖ断片、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体生体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片は、少なくとも１０アミノ酸長であり得、例えば、抗体断片は、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０又は３００アミノ酸長であり得る。
【０１５１】
一実施形態において、生体分子は、改変抗体又は改変抗体断片である。「改変抗体」又は「改変抗体断片」は、少なくとも１つのアミノ酸の改変によって、親抗体と異なる抗体を意味する。改変抗体又は改変抗体断片は、野生型抗体と比較して、そのサイズが異なる、又はそのグリコシル化が異なるが、そのリガンドに対して野生型抗体と同様のアフィニティーを有する抗体を指す。
【０１５２】
薬物：
【０１５３】
「薬物」という用語は、生物の体内に投与した場合、正常な身体機能を改変する任意の物質を含む。概して、薬物は、疾患の治療、治癒、予防又は診断に使用される物質であり、又は心身の健康状態を強化するために使用される物質である。一実施形態において、薬物は細胞障害性薬である。
【０１５４】
今日までの有力な「超強力」な（薬物）候補は、２つのカテゴリー：（ｉ）チューブリン阻害剤及び（ｉｉ）ＤＮＡ相互作用剤のいずれかに定義される。チューブリン阻害剤はチューブリン重合を調節する。ＤＮＡ相互作用剤は、細胞性ＤＮＡを標的とする。
【０１５５】
一実施形態において、薬物はチューブリン阻害剤である。
【０１５６】
一実施形態において、チューブリン阻害剤は、（ａ）オーリスタチン及び（ｂ）メイタンシン誘導体からなる群から選択される。
【０１５７】
一実施形態において、薬物はオーリスタチンである。
【０１５８】
オーリスタチンは、天然に存在する化合物ドラスタチン−１０の合成誘導体を含む。オーリスタチンは、抗新生物性／細胞増殖抑制性の擬似ペプチドのファミリーである。ドラスタチンは、天然の生合成産物中に同定される４つの異常アミノ酸（ドラバリン（Dolavaine）、ドライソロイン（Dolaisoleuine）、ドラプロイン（Dolaproine）及び（ドラフェニン（Dolaphenine）)の組み込みにより、構造的に特有である。加えて、天然産物のこのクラスは、Ｐｅｔｔｉｔら（米国特許第４，９７８，７４４号）による全合成研究により定義された多数の不斉中心を有する。構造活性相関から、ドライソロイン及びドラプロイン残基が、抗新生物活性に必要であると思われる（米国特許第５，６３５，４８３号及び米国特許第５，７８０，５８８号）。
【０１５９】
一実施形態において、オーリスタチンは、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、オーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ｖｃＭＭＡＥ及びｖｃＭＭＡＦからなる群から選択される。
【０１６０】
一実施形態において、薬物はメイタンシン又はメイタンシンの構造的類似体である。
【０１６１】
一実施形態において、薬物はメイタンシンである。
【０１６２】
メイタンシンは、構造的に複雑な抗有糸分裂ポリケチドを含む。メイタンシンは、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらす微小管会合（microtubulin assembly）の強力な阻害剤である。
【０１６３】
一実施形態において、メイタンシンは、メルタンシン（ＤＭ１）及びメイタンシンの構造類似体、例えば、ＤＭ３又はＤＭ４からなる群から選択される。好ましくは、薬物はメルタンシン（ＤＭ１）である。
【０１６４】
一実施形態において、薬物はＤＮＡ相互作用剤である。ＤＮＡ相互作用剤は、「超強力」な（薬物）候補として公知である。
【０１６５】
一実施形態において、ＤＮＡ相互作用剤は、（ａ）カリケアマイシン、（ｂ）デュオカルマイシン及び（ｃ）ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。
【０１６６】
一実施形態において、薬物はカリケアマイシンである。
【０１６７】
カリケアマイシンは、二本鎖ＤＮＡの破壊を引き起こし、細胞死をもたらす、強力な細胞障害性薬である。カリケアマイシンは、天然に存在するエンジイン抗生物質である（A. L. Smith et al, J. Med. Chem., 1996, 39, 11, 2103-2117）。カリケアマイシンは、土壌微生物のミクロモノスポラ・エチノスポラ（Micromonosporaechinospora）中に見出された。
【０１６８】
一実施形態において、カリケアマイシンはカリケアマイシンガンマ１である。
【０１６９】
一実施形態において、薬物はデュオカルマイシンである。
【０１７０】
デュオカルマイシンは、ＤＮＡ二本鎖の副溝における配列選択的結合を介してこれらの生物学的効果を発揮し、アデニンのＮ３をアルキル化する、強力な抗腫瘍抗生物質である（D. Boger, Pure & Appl. Chem., 1994, 66, 4, 837-844）。
【０１７１】
一実施形態において、デュオカルマイシンは、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、シクロプロピルベンゾインドール（ＣＢＩ）デュオカルマイシン、センタナマイシン（Centanamycin）、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、アドゼレシン、ビゼレシン及びカルゼルシンからなる群から選択される。
【０１７２】
一実施形態において、薬物はピロロベンゾジアゼピンである。
【０１７３】
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）は、天然に存在する抗腫瘍抗生物質の１種である。ピロロベンゾジアゼピンはストレプトミセス（Streptomyces）中に見出される。ＰＢＤは、プリン−グアニン−プリン単位において副溝でＤＮＡと特異的に共有結合することによって、これらの抗腫瘍活性を発揮する。ＰＢＤは、アミナール連結を介してグアニン（guamine）のＮ２に挿入し、これらの形状のため、これらが引き起こすＤＮＡヘリックスの崩壊は最小限である。ＤＮＡ−ＰＢＤ付加体の形成は核酸合成を阻害し、ＤＮＡヘリックスにおける一本鎖及び二本鎖の除去依存性破壊を引き起こすと考えられる。合成の誘導体の場合、柔軟なポリメチレン鎖を介した２つのＰＢＤの一体化接合は、ＰＢＤ二量体を、高度に致命的な病変を作り出す、対抗するＤＮＡに架橋させる。
【０１７４】
一実施形態において、薬物は、柔軟なポリメチレン鎖を介して一体に接合された2つのピロロベンゾジアゼピン単位の合成誘導体である。
【０１７５】
一実施形態において、ピロロベンゾジアゼピンは、アントラマイシン（及びこれらの二量体）、マゼトラマイシン（及びこれらの二量体）、トメイマイシン（及びこれらの二量体）、プロトラカルシン（及びこれらの二量体）、チカマイシン（及びこれらの二量体）、ネオトラマイシンＡ（及びこれらの二量体）、ネオトラマイシンＢ（及びこれらの二量体）、ＤＣ−８１（及びこれらの二量体）、シビロマイシン（及びこれらの二量体）、ポロトラマイシンＡ（及びこれらの二量体）、ポロトラマイシンＢ（及びこれらの二量体）、シバノマイシン（Sibanomycin）（及びこれらの二量体）、アベイマイシン（及びこれらの二量体）、ＳＧ２０００及びＳＧ２２８５からなる群から選択される。
【０１７６】
一実施形態において、薬物は、アルキル化を介したＤＮＡの鎖間架橋を標的とする薬物である。アルキル化を介したＤＮＡの鎖間架橋を標的とする薬物は、ＤＮＡ標的化マスタード、グアニン特異的アルキル化剤及びアデニン特異的アルキル化剤から選択される。
【０１７７】
一実施形態において、薬物はＤＮＡ標的化マスタードである。例えば、ＤＮＡ標的化マスタードは、オリゴピロール、オリゴイミダゾール、ビス−（ベンズイミダゾール）キャリア、ポリベンズアミドキャリア及び９−アニリノアクリジン−４−カルボキサミド担体からなる群から選択され得る。
【０１７８】
一実施形態において、薬物はネトロプシン、ジスタマイシン、レキシトロプシン、タリムスチン、ジブロモタリムスチン、ＰＮＵ１５７９７７及びＭＥＮ１０７１０からなる群から選択される。
【０１７９】
一実施形態において、薬物はビス−（ベンズイミダゾール）キャリアである。好ましくは、薬物はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８である。
【０１８０】
グアニン特異的アルキル化剤は、特定のヌクレオシド位置において反応する、高度に位置特異的アルキル化剤である。
【０１８１】
一実施形態において、薬物は、Ｇ−Ｎ２アルキレーター、Ａ−Ｎ３アルキレーター、マイトマイシン、カルメチゾール類似体、エクテイナシジン類似体からなる群から選択されるグアニン特異的アルキル化剤である。
【０１８２】
一実施形態において、マイトマイシンは、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン及びＫＷ−２１４９から選択される。
【０１８３】
一実施形態において、カルメチゾール類似体は、ビス−（ヒドロキシメチル）ピロリジジン及びＮＳＣ６０２６６８から選択される。
【０１８４】
一実施形態において、エクテイナシジン類似体はエクテイナシジン７４３である。
【０１８５】
アデニン特異的アルキル化剤は、ポリピリミジン配列中のアデニンのＮ３において反応する、位置特異的及び配列特異的副溝アルキレーターである。シクロプロパインドロン（Cyclopropaindolones）及びデュオカルマイシンは、アデニン特異的アルキレーターとして定義することができる。
【０１８６】
一実施形態において、薬物はシクロプロパインドロン（cyclopropaindolone）類似体である。好ましくは、薬物はアドゼレシン及びカルゼルシンから選択される。
【０１８７】
一実施形態において、薬物はベンズインドロンである。好ましくは、薬物はＣＢＩ−ＴＭＩ及びイソ−ＣＢＩから選択される。
【０１８８】
一実施形態において、薬物はビゼレシンである。
【０１８９】
一実施形態において、薬物は海洋性抗腫瘍薬である。海洋性抗腫瘍薬は、抗腫瘍薬開発領域の開発分野である（I. Bhatnagar et al,Mar. Drugs 2010, 8, P2702-2720 and T. L. Simmons et al, Mol. Cancer Ther. 2005, 4(2), P333-342）。海綿、海綿−微生物共生会合、サンゴ虫、放線菌及び軟体サンゴを含む海洋生物は、潜在的抗癌剤のために広く利用されている。
【０１９０】
一実施形態において、薬物は：シタラビン、Ａｒａ−Ｃ、トラベクテジン（ＥＴ−７４３）及びエルブリンメシレートから選択される。
【０１９１】
一実施形態において、エルブリンメシレートは、（Ｅ７３８９）、ソブリドチン（ＴＺＴ１０２７）、スクアラミンラクテート、セマドチン、プリナブリン（ＮＰＩ−２３５８）、プリチデプシン、エリシデプシン；ザリプシス、タシドチン、シンタドチン、（ＩＬＸ−６５１）、ディスコデルモリド、ＨＴ１２８６、ＬＡＦ３８９、カハラリドＦ、ＫＲＮ７０００、ブリオスタチン１、ヘミアステリン（Ｅ７９７４）、マリゾミブ、サリノスポラミドＡ、ＮＰＩ−００５２）、ＬＹ３５５７０３、ＣＲＹＰＴＯ５２、デプシペプチド（ＮＳＣ６３０１７６）、エクテイナシジン７４３、シンタドチン、カハラリドＦ、スクアラミン、デヒドロジデムニンＢ、ジデムニンＢ；セマドチン、ソブリドチン、Ｅ７３８９、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ディスコデルモリド、ＨＴＩ−２８６、ＬＡＦ−３８９、ＫＲＮ−７０００（アゲラスフィン誘導体）；クラシンＡ、ＤＭＭＣ、サリノスポラミドＡ、ラウリマリド、ビチレブアミド、ジアゾナミド、エリュテロビン、サルコジクチン、ペロルシドＡ、サリシリハラミドＡ及びＢ、チオコラリン、アシジデミン；バリオリン；ラメラリンＤ、ジクチオデンドリン、ＥＳ−２８５（スピスロシン）及びハリコンドリンＢから選択される。
【０１９２】
下記の薬物もまた、本発明に包含される：テングダケ属（genus Amanita）の担子菌により産生されるアマトキシン（α−アマニチン）−二環式オクタペプチド、例えば、グリーンタマゴテングダケキノコ（Green Deathcap mushroom）、チューブリシン（tubulysin）、細胞溶解素、ドラベラニン、エポチロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ。
【０１９３】
エポチロンは、一種の非タキサン系チューブリン重合剤を構成し、ミクソバクテリアのソランギウム・セルロスム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）の自然発酵により得られる。これらの部分は、微小管の安定化と連結し、Ｇ２／Ｍ期移行において有糸分裂の停止をもたらす強力な細胞障害性活性を保有する。エポチロンは、がん細胞系のパネルにわたって強力な細胞障害性を実証し、多くの場合、パクリタキセルより強い効力を示す（X. Pivot et al, European Oncology, 2008; 4(2), P42-45）。
【０１９４】
一実施形態において、薬物はアマトキシンである。
【０１９５】
一実施形態において、薬物はチューブリシン（tubulysin）である。
【０１９６】
一実施形態において、薬物は細胞溶解素である。
【０１９７】
一実施形態において、薬物はドラベラニンである。
【０１９８】
一実施形態において、薬物はエポチロンである。
【０１９９】
下記の薬物もまた、本発明に包含される。一実施形態において、薬物は、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、デトルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、メトトレキサート、メトプテリン、ブレオマイシン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド、タキソール、アングイジン、メルファラン、ビンブラスチン、ホモプシンＡ、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）、ダウノルビシン、ビンカアルカロイド、イダルビシン、メルファラン、シス−プラチン、リシン、サポリン、アントラサイクリン、インドリノ−ベンゾジアゼピン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシン、ロイロイシン、ロイロシデイン（Leurosideine）、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン（Tallysomycin）、ポドフィロトキシン、エトポシド、ヘアピンポリアミド、エトポシドホスフェート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソテールレチノイン酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテンシン、エスペラミシン及びエンジインから選択される。
【０２００】
一実施形態において、薬物はドキソルビシンである。
【０２０１】
一実施形態において、薬物はエピルビシンである。
【０２０２】
一実施形態において、薬物はエソルビシンである。
【０２０３】
一実施形態において、薬物はデトルビシンである。
【０２０４】
一実施形態において、薬物はでモルホリノ−ドキソルビシンある。
【０２０５】
一実施形態において、薬物はメトトレキサートである。
【０２０６】
一実施形態において、薬物はメトプテリンである。
【０２０７】
一実施形態において、薬物はブレオマイシンである。
【０２０８】
一実施形態において、薬物はジクロロメトトレキサートである。
【０２０９】
一実施形態において、薬物は５−フルオロウラシルである。
【０２１０】
一実施形態において、薬物はシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドである。
【０２１１】
一実施形態において、薬物はタキソールである。
【０２１２】
一実施形態において、薬物はアングイジンである。
【０２１３】
一実施形態において、薬物はメルファランである。
【０２１４】
一実施形態において、薬物はビンブラスチンである。
【０２１５】
一実施形態において、薬物はホモプシンＡである。
【０２１６】
一実施形態において、薬物はリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である。
【０２１７】
一実施形態において、薬物はダウノルビシンである。
【０２１８】
一実施形態において、薬物はビンカアルカロイドである。
【０２１９】
一実施形態において、薬物はイダルビシンである。
【０２２０】
一実施形態において、薬物はメルファランである。
【０２２１】
一実施形態において、薬物はシス−プラチンである。
【０２２２】
一実施形態において、薬物はリシンである。
【０２２３】
一実施形態において、薬物はサポリンである。
【０２２４】
一実施形態において、薬物はアントラサイクリンである。
【０２２５】
一実施形態において、薬物はインドリノ−ベンゾジアゼピンである。
【０２２６】
一実施形態において、薬物は６−メルカプトプリンである。
【０２２７】
一実施形態において、薬物はアクチノマイシンである。
【０２２８】
一実施形態において、薬物はロイロイシンである。
【０２２９】
一実施形態において、薬物はロイロシデイン（Leurosideine）である。
【０２３０】
一実施形態において、薬物はカルミノマイシンである。
【０２３１】
一実施形態において、薬物はアミノプテリンである。
【０２３２】
一実施形態において、薬物はタリソマイシン（Tallysomycin）である。
【０２３３】
一実施形態において、薬物はポドフィロトキシンである。
【０２３４】
一実施形態において、薬物はエトポシドである。
【０２３５】
一実施形態において、薬物はヘアピンポリアミドである。
【０２３６】
一実施形態において、薬物はエトポシドホスフェートである。
【０２３７】
一実施形態において、薬物はビンブラスチンである。
【０２３８】
一実施形態において、薬物はビンクリスチンである。
【０２３９】
一実施形態において、薬物はビンデシンである。
【０２４０】
一実施形態において、薬物はタキソテールレチノイン酸である。
【０２４１】
一実施形態において、薬物はＮ８−アセチルスペルミジンである。
【０２４２】
一実施形態において、薬物はカンプトテンシンである。
【０２４３】
一実施形態において、薬物はエスペラミシンである。
【０２４４】
一実施形態において、薬物はエンジインである。
【０２４５】
生体分子薬物複合体：
【０２４６】
本発明に従って、本発明の過程により得ることができる生体分子薬物複合体を提供する。
【０２４７】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照してこれ以降さらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】図１は、実施例２により作製された固相のハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ複合体のＨＩＣ分析の図である。トレースは、下から上にハーセプチン−ｖｃＥ１．３、ハーセプチン−ｖｃＥ２．４、ハーセプチン−ｖｃＥ３．４、ハーセプチン−ｖｃＥ４．４である。ＲＴ４．３分−非複合体化ハーセプチン、ＲＴ５．９分−薬物抗体比２、ＲＴ７．５分−薬物抗体比４、ＲＴ８．９分−薬物抗体比６及びＲＴ９．８分−薬物抗体比８。
【０２４９】
【図２】図２は、実施例２により作製された固相のハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ複合体のＳＥＣ分析の図である。トレースは、下から上に、ハーセプチン、ハーセプチン−ｖｃＥ１．３、ハーセプチン−ｖｃＥ２．４、ハーセプチン−ｖｃＥ３．４、ハーセプチン−ｖｃＥ４．４である。
【０２５０】
【図３】図３は、クロマトグラフィー流動固相ハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ複合体のＨＩＣ分析の図である。溶液相ハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ複合体（上のパネル）、カラムＡにより製造されたハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ（中間のパネル）、カラムＢにより製造されたｖｃＭＭＡＥ（下のパネル）のＨＩＣ分析である。
【０２５１】
【図４】図４は、固相ハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ複合体のＳＥＣ分析の図である。溶液相ハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ複合体（上のパネル）、カラムＡにより製造されたハーセプチン  ｖｃＭＭＡＥ（中間のパネル）、カラムＢにより製造されたｖｃＭＭＡＥ（下のパネル）のＳＥＣ分析である。
【発明を実施するための形態】
【０２５２】
本明細書の説明及び特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」及び「含む（contain）」という用語並びにこれらの変形は、「含むがこれに限定されない」という意味であり、他の部分、添加剤、成分、整数又は工程を排除する（及び排除しない）ことを意図するものではない。本明細書の説明及び特許請求の範囲を通して、単数形は、文脈が他のことを要求していない限り、複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈が他のことを要求していない限り、複数及び単数を企図するものと理解すべきである。
【０２５３】
本発明の特定の態様、実施形態又は実施例と併せて記載される特色、整数、特徴、化合物、化学的部分又は基は、これらが矛盾しない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は実施例に適用可能であることを理解すべきである。本明細書に開示の特色のすべて（すべての添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）及び／又はそのように開示された任意の方法及び過程のすべての工程は、このような特色及び／又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、前述の実施形態のいずれかの説明に限られるものではない。本発明は、本明細書（すべての添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示の特色の任意の新規な１つ又は任意の新規な組み合わせ、又はこのように開示された任意の方法若しくは過程の工程の任意の新規な１つ又は任意の新規な組み合わせに及ぶ。
【０２５４】
読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時に、又は先行して提出され、本明細書の縦覧が開放されているすべての論文及び文献に向いており、すべてのこのような論文及び文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２５５】
下記の技術を実施例において使用した。
【０２５６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
【０２５７】
サイズ排除クロマトグラフィーを、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）ＧＷ３０００ＳＷｘｌカラムを使用して、０．２５ｍＭ 塩化カリウムを含む０．２Ｍ リン酸カリウムｐＨ６．９５及び１０％ ＩＰＡにおいて流速０．５ｍｌ／分で実施した。複合体の凝集状態は、２８０ｎｍにおける溶出ピーク面積吸光度の積分により決定した。
【０２５８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
【０２５９】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）ブチルＮＰＲカラムを使用して、０−１００％の、バッファーＡからＢへの線形勾配で１２分にわたって流速０．８ｍｌ／分で実施した。バッファーＡは２５ｍＭ リン酸ナトリウムを含む１．５Ｍ 酢酸アンモニウムｐＨ６．９５であり、バッファーＢは２５％ ＩＰＡを含む２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．９５である。複合体の抗体薬物比は、２８０ｎｍにおける溶出ピーク面積吸光度の積分により決定した。
【０２６０】
逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＰＬＲＰ）
【０２６１】
逆相（ポリマーラボラトリー社、ＰＬＲＰ）クロマトグラフィーを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＬＲＰ−Ｓ  ＰＬ１９１２−１５０２カラム及びバッファーＡからＢへの２５−９５％の勾配を使用して３１分にわたって流速０．２５ｍｌ／分で実施した。バッファーＡは、０．０５％ ＴＦＡを含む水であり、バッファーＢは０．０４％ ＴＦＡを含むＡＣＮである。試料を、５０ｍＭ ＤＴＴを含有する２０ｍＭ ホウ酸ナトリウム  ｐＨ８．４を３７℃において１５分間事前注入して還元した。複合体の抗体薬物比は、２８０ｎｍにおける溶出ピーク面積吸光度の積分により決定した。
【０２６２】
ＵＶ分析による薬物抗体比
【０２６３】
ＵＶ分析のために、試料を、路長１ｃｍの４００ｕｌの石英キュベットに加え、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＧＯ分光光度計において測定した。２５２ｎｍ及び２８０ｎｍのデータを使用して、薬物抗体比を、これらの波長におけるハーセプチン及びＤＭ１に関する公表モル吸光係数に基づき計算した。
【０２６４】
実施例１
固相抗体薬物複合体のスクリーニング
【０２６５】
この実施例は、固定化抗体が、過程の開発の必要性を否定する包括的過程で規定の薬物負荷で複合体化できることを実証している。この取り組みは、９６ウェルプレートのハイスループットスクリーニングに適している。
【０２６６】
ハーセプチン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの０．５、ｐＨ７．４）を、樹脂スラリーと抗体溶液を穏やかに６０分間混合することによって、ＰＢＳにより平衡化させた１００μｌ（定着済み樹脂の体積）のＦａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ樹脂と結合させた。未結合のハーセプチンを、ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡで樹脂を洗浄することによって除去し、最後に樹脂を０．５ｍｌ ＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁した。
【０２６７】
結合されたハーセプチン（Ｈｅｒ）を、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を最終濃度２ｍＭまで加えることによって還元し、その後、懸濁液を周囲温度において１８時間インキュベートした。樹脂をＰＢＳ／ＥＤＴＡで洗浄し、未反応のＴＣＥＰを除去して、その後、４７５μｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁した。
【０２６８】
ｖｃＭＭＡＥ（ｖｃＥ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を加え、最終濃度１ｍＭ マレイミド（ｖｃＥ及びＮＥＭの合計）及び５％ｖ／ｖ ＤＭＡを得た。ｖｃＥ対ＮＥＭの比は、１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５及び０：１００に変動した。還元された抗体を、樹脂懸濁液と周囲温度において６０分間インキュベートすることによって複合体化した。樹脂を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡ及び０．１Ｍ グリシン  ｐＨ５．０で連続して洗浄した。
【０２６９】
複合体を、０．１Ｍ グリシン  ｐＨ３．０で溶出した。溶出された複合体を、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に回収して、これらを中和した。
【０２７０】
中和された複合体を、その後、サイズ排除クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー（ポリマーラボラトリーズ社、ＰＬＲＰ）クロマトグラフィーにより分析して、凝集の百分率及び平均薬物負荷を決定した。
【０２７１】
結果を、下記の表１に要約する：
【表１】
0006484607.tif 000016
【０２７２】
最も高い薬物負荷複合体の凝集体含有量でさえ、抗原結合及び細胞系アッセイにおけるさらなる評価に許容可能である。ＰＢＳ／ＥＴＤＡ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡ及びその後の０．１Ｍ グリシン  ｐＨ５．０を用いた連続洗浄により、最終複合体が、未反応の薬物リンカー、ＮＥＭ及び溶媒を含まず、バイオアッセイのデータの解釈に支障をきたさないことを確実にする。Ｆａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ樹脂によるこの取り組みは、無傷の抗体及びＦａｂ断片の抗体の両方を含有する組織培養液上清から直接ＡＤＣを作製するための、続く抗体薬物複合体化の開発のためのクローン選択の一部として、ネズミモノクローナルのスクリーニングパネルにとって有用である。
【０２７３】
実施例２
バッチモードの固相部分的ＴＣＥＰ還元
【０２７４】
この実施例は、固定化抗体が、鎖間ジスルフィド結合の部分的還元、続くｖｃＭＭＡＥとの複合体化によって、規定の薬物負荷に複合体化できること、及び生成物の質が、溶液中で作製された同じ複合体と比較して強化されることを示す。
【０２７５】
ハーセプチン（２ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳの０．５ｍｌ、ｐＨ７．４）を、樹脂スラリーと抗体溶液を穏やかに３０分間混合することによって、ＰＢＳで平衡化させた１００μｌ（定着済み樹脂の体積）のＦａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ樹脂と結合させた。未結合のハーセプチンを、ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡで樹脂を洗浄することによって除去し、最後に樹脂を０．５ｍｌ ＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁した。
【０２７６】
結合されたハーセプチンを、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を１から４モルのＴＣＥＰ／モルハーセプチンの比で加えることによって還元し、その後、懸濁液を周囲温度において２時間インキュベートした。
【０２７７】
ｖｃＭＭＡＥ及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を加え、２．５から１０モルのｖｃＭＭＡＥ／モルハーセプチン及び５％ｖ／ｖ ＤＭＡを得て、複合体化を、３０分間周囲温度において進行させた。Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を加え、未反応のｖｃＭＭＡＥをクエンチし、２０分間反応させ、その後樹脂をＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡ及び０．１Ｍ グリシン  ｐＨ５．０で連続して洗浄した。
【０２７８】
複合体を０．１Ｍ グリシン  ｐＨ３．０で溶出した。溶出された複合体を、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に回収し、これらを中和した。
【０２７９】
一致するＤＡＲを有する、ハーセプチンとｖｃＭＭＡＥとの、等価の一連の溶液相複合体を作製し、分析し、固相及び溶液相の複合体の質の比較を提供した。
【０２８０】
溶出された複合体を、その後疎水性相互作用クロマトグラフィー（図１）及びサイズ排除クロマトグラフィー（図２）により分析して、凝集百分率及び平均薬物負荷を決定した。
【０２８１】
結果を、下記の表２に要約する：
【表２】
0006484607.tif 000017
【０２８２】
このデータは、固体支持体におけるＴＣＥＰ対抗体の比と、最終薬物負荷との間の関係が線形であることを示す。加えて、溶液中で作製された等価の複合体と比較した場合、固相の複合体が、低い凝集百分率を示す。
【０２８３】
実施例３
カラムにおける固相部分的ＴＣＥＰ還元
【０２８４】
この実施例は、固定化抗体の複合体化が、優れた再現性のあるクロマトグラフィー流動過程に適合可能であることを示す。
【０２８５】
ハーセプチン（２ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳの５ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１２０ｃｍ／時で負荷することによって、１ｍｌ カラムのＦａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ樹脂（あらかじめＰＢＳで平衡化）に結合させた。結合されたハーセプチンを、樹脂をＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡで平衡化することによって、還元のために調製した。
【０２８６】
マイクロぜん動ポンプを使用して、ＴＣＥＰを加えて、２ＴＣＥＰ／モルハーセプチンのモル比を得るカラムを通した（カラムの外部にある、およそ２００μＬの）低容量のＰＢＳ／ＥＤＴＡ再循環ループを作製した。これを、１２０分間周囲温度において再循環させ、ハーセプチンを還元した。
【０２８７】
リザーバ及びカラムの内容物を廃棄のために流出させ、ｖｃＭＭＡＥを加えたＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡと置き換えて、５ｖｃＭＭＡＥ／モル還元ハーセプチンのモル比を得た。これを６０分間周囲温度で再循環させ、還元ハーセプチンを複合体化させた。
【０２８８】
Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を加えて、未反応のｖｃＭＭＡＥをクエンチし、２０分間反応させ、その後樹脂を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡ及び０．１Ｍ グリシン  ｐＨ５．０で連続して洗浄した。
【０２８９】
複合体を、０．１Ｍ グリシン  ｐＨ３．０で溶出させた。溶出された複合体を、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に回収し、これらを中和した。
【０２９０】
この過程を、独立した第２の実験において、第２のカラム／オペレーターを使用して反復した。
【０２９１】
溶出された複合体を、その後疎水性相互作用クロマトグラフィー（図３）及びサイズ排除クロマトグラフィー（図４）により分析して、凝集百分率及び平均薬物負荷を決定した。
【０２９２】
結果を、下記の表３に要約する：
【表３】
0006484607.tif 000018
【０２９３】
このデータは、クロマトグラフィー流動モードに適合させた場合、ｖｃＭＭＡＥとハーセプチンとの複合体化は、平均薬物負荷及び凝集の発生に関して一致していることを示す。バッチモード及びクロマトグラフィーモードで得られたＤＡＲは、ＴＣＥＰ対抗体の比が一致する場合同じである。
【０２９４】
実施例４
リジン側鎖のＳＭＣＣ活性化を介した、バッチモードにおけるＤＭ１との固相ハーセプチン複合体化
【０２９５】
この実施例は、固定化抗体が、ＳＭＣＣによる改変、続くＤＭ１との複合体化によりリジンの側鎖と複合体化できること、及び生成物の質が、溶液中で作製された同じ複合体と比較して強化されることを示す。
【０２９６】
ハーセプチン（４ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳの０．５ｍｌ、ｐＨ７．４）を、樹脂スラリーと抗体溶液を穏やかに３０分間混合することによって、ＰＢＳで平衡化させた１００μｌ（定着済み樹脂の体積）のＦａｂｓｏｒｂａｎｔ（商標）Ｆ１Ｐ  ＨＦ樹脂と結合させた。ＰＢＳ、その後「改変バッファー」（５０ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ  ｐＨ６．７）で樹脂を洗浄することによって未結合のハーセプチンを除去し、最後に樹脂を５％ｖ／ｖ  ＤＭＡを含有する改変バッファーに再懸濁した。
【０２９７】
結合されたハーセプチンを、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキシル−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）に、５から２０モルのＳＭＣＣ／モルハーセプチンの比で加え、その後、懸濁液を周囲温度で４時間インキュベートすることによって改変させた。未反応のＳＭＣＣを、樹脂をＰＢＳ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡ、その後「複合体化バッファー」（３５ｍＭ クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ  ｐＨ５．０）で洗浄することによって除去し、最後に樹脂を３％ｖ／ｖ ＤＭＡを含有する複合体化バッファーに再懸濁した。
【０２９８】
ＤＭ１を加えて１５モルのＤＭ１／モルハーセプチンを得、複合体化を周囲温度（at ambient）で１８時間進行させた。その後樹脂を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ／５％ｖ／ｖ ＤＭＡ及び０．１Ｍ グリシン  ｐＨ５．０で連続して洗浄した。
【０２９９】
複合体を、０．１Ｍ グリシン  ｐＨ３．０で溶出させた。溶出された複合体を、２％ｖ／ｖの１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）中に回収し、これらを中和した。
【０３００】
一致するＤＡＲを有する、ハーセプチンとＤＭ１との、等価の溶液相複合体を、ハーセプチンと７．６モルのＳＭＣＣ、次いで５モルのＤＭ１／モルハーセプチンを反応させることによって作製し、分析して、固相及び溶液相の複合体の質の比較を提供した。改変及び複合体化反応の間のハーセプチンの濃度は、それぞれ、１０及び５ｍｇ／ｍｌであった。
【０３０１】
溶出された複合体を、その後サイズ排除クロマトグラフィー及びＵＶにより分析して、凝集百分率及び平均薬物負荷を決定した。
【０３０２】
結果を、下記の表４に要約する：
【表４】
0006484607.tif 000019
【０３０３】
このデータは、固体支持体においてリジン側鎖の複合体化が可能であり、ＳＭＣＣ対抗体の比と、最終薬物負荷の間の関係が線形であることを示す。
【０３０４】
加えて、溶液中で作製された等価の複合体と比較した場合、固相の複合体は、複合体化反応の間のタンパク質濃度が４倍に増加したにもかかわらず、等価の凝集百分率を示す。
【図１】
0006484607.tif 000032
【図２】
0006484607.tif 000033
【図３】
0006484607.tif 000034
【図４】
0006484607.tif 000035