(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者におけるグルテン不耐症の調節に使用するための組成物であって、
有効量のネペンテシンを含む、組成物。
【請求項２】
グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物の摂取前、その摂取と共に、またはその摂取後に前記患者に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ネペンテシンがネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ネペンテシンが組み換え型のネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
グルテン不耐性を治療または軽減するための固体組成物であって、
（ａ）ネペンテシンＩの塩、ネペンテシンＩＩの塩、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるネペンテシンの有効量と、
（ｂ）前記固体組成物のｐＨを、前記ネペンテシンが投与前に不活性である、５またはそれ以上に維持するための有効量の緩衝液と、
を含み、
前記ネペンテシンの有効量が、グルテンを分解するのに十分であり、これによってグルテン不耐症を調節する、組成物。
【請求項６】
必要とする患者におけるグルテンの分解に使用するための経口投与される組成物であって、
有効量のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩおよび／またはそれらの塩を含む組成物を前記患者に経口投与することを含み、
前記ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩおよび／またはそれらの塩の前記有効量がグルテンを分解するのに十分であり、これによってグルテン不耐症を調節する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、セリアック病等のグルテン不耐症および関連する状態を治療する組成物、食物および方法を提供する。さらに本明細書は、クロストリジウム・ディフィシルまたはピロリ菌などの消化管の細菌感染症を治療するための、ネペンテシンまたはその誘導体を含む医薬組成物、およびネペンテシンまたはその誘導体を使用する方法を提供する。さらに本明細書は、水素／重水素交換においてネペンテシンまたはその誘導体を使用する方法を提供する。さらに本明細書は、組み換えネペンテシンＩもしくはネペンテシンＩＩ、または相同タンパク質を含む組成物、およびこの組成物を作製する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グルテンを含有する小麦、大麦、ライ麦、および場合によってはオート麦の摂取は、グルテン不耐症な個人に、セリアック病、小麦アレルギー、疱疹状皮膚炎等の自己免疫反応異常を生じさせ得る。グルテンは、グルタミンとプロリンとを多く含む、グルテニンおよびプロラミンタンパク質分子の混合物である。自己免疫反応異常のある個人の多くは、ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）ＤＱ２またはＤＱ８分子を発現する。自己免疫反応は、陰窩過形成および粘膜炎を伴う、小腸粘膜の絨毛萎縮を発生させる。セリアック病の症状は、個人差が発生することがあり、疲労、慢性的な下痢、便秘、栄養素の吸収不良、体重減少、腹部膨満、貧血症のうち１つ以上を含み得るほか、骨粗鬆症および腸の悪性腫瘍（リンパ腫および癌腫）の発生のリスクを大きく増大させる。
【０００３】
一般に、グルテン不耐症の治療では、生涯続く厳格なグルテン抜きの食事療法が行なわれる。しかし、グルテン抜きの食事療法は、不便で、制限が多く、またグルテンを控えるのは困難である。そのため、グルテン不耐症の効果的な代替治療が必要とされている。
【０００４】
多くの種類の細菌が消化管の感染症の原因であることが知られている。現在このような感染症の治療は、抗生剤に非常に依存しているが、数が増え続けている細菌感染症は、少なくともいくつかの抗生剤に抵抗性があることが見出されている。さらに、かなりの細菌種は、根絶することが特に困難である内生胞子を形成する。ペプシンなどの胃のプロテアーゼは、たとえば内生胞子を保護するタンパク質性コートを崩壊できないため、概して内生胞子を死滅させることができない。そのため、細菌感染症の効果的な代替療法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酵素ネペンテシンが、特に、低ｐＨ（例えば、約２〜３）において、タンパク質およびオリゴペプチド（グルテンを含有する）を切断する高いタンパク質分解活性を有するという発見に関する。ネペンテシン（ＥＣ  ３．４．２３．１２）は、熱帯地方において、一般的にモンキーカップ（ｍｏｎｋｅｙ  ｃｕｐｓ）の名で知られる、ウツボカズラ属（食虫性の嚢状葉植物）の嚢状葉の分泌液等、様々な植物源から単離または濃縮され得る植物由来のアスパルチルプロテアーゼである。Ｔｏｋｅｓらの「食虫植物Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ  Ｌ．，Ｐｌａｎｔａから分泌される消化酵素（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ  Ｌ．）」，  Ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌ．）  １１９，  ３９−４６  （１９７４）。ネペンテシンの活性は、食品タンパク質のペプチドへの分解を部分的に担う胃に存在する酵素である、ペプシン（ＥＣ  ３．４．２３．１）よりも約１０００倍高いことが分かっている。また、ネペンテシンが、アミノ酸残基Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＩおよびＷを除くほとんどのアミノ酸残基の後ろを効果的に切断する、ペプシンに比べはるかに緩い特異性を有することも分かっている。特に、ネペンテシンはアミノ酸残基Ｋ、ＲおよびＰの後ろを切断する。比較すると、ペプシンは、疎水性アミノ酸残基Ｆ、ＬおよびＭを効率良く切断するが、アミノ酸残基Ｐ、Ｈ、ＫおよびＲの後ろを切断することは基本的にできない。
【０００６】
ネペンテシンは、２つの知られているアイソフォーム：ネペンテシンＩ（２つの変異体：ネペンテシンＩａおよびネペンテシンＩｂを有すると知られている）およびＩＩを有する。両方のアイソフォームは、アミノ酸ＰおよびＱに対してペプシンより高い切断親和性を有することが見出されている。驚くべきことに、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの組み合わせは、ネペンテシンＩ単独とわずかに異なる切断親和性を有することが発見されている。具体的には、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩを含む抽出物は、ネペンテシンＩ単独よりも、グリアジンのＮ末端部のアミノ酸ＱおよびグリアジンのＣ末端部のアミノ酸Ｐの後ろをより効率的に切断する。
【０００７】
セリアック病および／または疱疹状皮膚炎等のグルテン不耐症および関連する状態ならびに症状は、小腸粘膜における患者のグルテンに対する自己免疫反応異常により生じる。特定のグルテン成分は、ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシン等の胃および膵臓のペプチダーゼにより切断されにくい。特定の理論に縛られることを望むものではないが、患者の腸管に到達する前にネペンテシンによりグルテンが非毒性ペプチドに分解されることにより、小腸に入る毒性のグルテンタンパク質またはペプチドの濃度が減少すると考えられる。ネペンテシンは酸安定性であるため、胃のｐＨに適合し、グルテンを消化して患者のグルテン不耐症または関連する状態もしくは症状を調節する。
【０００８】
低ｐＨにおいて活性が高く広範囲で活性を示すことを考慮すると、ネペンテシンは胃でのグルテンタンパク質の消化に特に有用である。非毒性ペプチドへのグルテンの分解は、グルテンの解毒とも呼ばれる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、プロリンとグルタミンとを多く含むタンパク質を含むグルテンの非毒素ペプチドへの分解は、ペプシンなどの胃の酵素による分解よりも、ネペンテシンよってより効率的に達成できると考えられる。
【０００９】
さらに本発明は、消化管の細菌感染症の治療における、ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンならびにその誘導体の使用に関する。低ｐＨでの高活性および広範囲の活性を考慮すると、ネペンテシンは消化管の細菌感染症を治療する際に有用である。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ネペンテシンは、細菌細胞壁および内生胞子コートの破壊において胃の酵素よりも効率的であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、グルテン不耐症の患者においてグルテン不耐症を調節する方法であって、有効量のネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体をその患者に投与することを含む方法が提供される。一態様において、ネペンテシンＩまたはその誘導体をその患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩＩまたはその誘導体をその患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体を、その患者に投与する。
【００１１】
一実施形態において、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体は、グルテン含有食物とネペンテシンまたはその誘導体を混合してグルテン不耐症に関連する状態を調節または抑制する食品添加物として投与する。ネペンテシンまたはその誘導体は、単独でまたはそのような食物と組み合わせて使用できる。一態様において、ネペンテシンＩまたはその誘導体を使用する。一態様において、ネペンテシンＩＩまたはその誘導体を使用する。一態様において、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体を使用する。
【００１２】
他の態様において、患者のグルテン不耐症により引き起こされる状態を調節する方法であって、有効量のネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体をその患者に投与することを含む方法が提供される。当該状態は例示に過ぎないが、セリアック病、小麦アレルギー、グルテン過敏症および／または疱疹状皮膚炎を含む。一態様において、ネペンテシンＩまたはその誘導体をその患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩＩまたはその誘導体をその患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体をその患者に投与する。
【００１３】
いずれの場合も、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を摂取する前、摂取と同時、またはその直後に投与され得る。一態様において、ネペンテシンＩまたはその誘導体をその患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩＩまたはその誘導体をその患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体をその患者に投与する。
【００１４】
他の態様として、それを必要とする患者においてセリアック病、小麦アレルギー、グルテン過敏症または疱疹状皮膚炎等のグルテン不耐症または関連する状態を調節する方法であって、患者が摂取する前に、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を有効量のネペンテシンで処理することを含む方法が提供される。一態様において、食物を有効量のネペンテシンＩまたはその誘導体で処理する。一態様において、食物をネペンテシンＩＩまたはその誘導体の有効量で処理する。一態様において、食物をネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体の有効量で処理する。
【００１５】
他の態様として、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体を含む食物または組成物を提供する。一態様において、この食物または組成物はネペンテシンＩまたはその誘導体を含む。一態様において、この食物または組成物はネペンテシンＩＩまたはその誘導体を含む。一態様において、この食物または組成物はネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体を含む。
【００１６】
他の態様として、組み換えネペンテシンＩおよび組み換えネペンテシンＩＩの混合物を含む、プロリン残基でのグルテンタンパク質の切断を最適化する組成物を提供する。一態様において、組み換えネペンテシンＩおよび組み換えネペンテシンＩＩの混合物を含む、グルタミン残基でのグルテンタンパク質の切断を最適化する組成物を提供する。
【００１７】
他の態様として、断片化グルテンを含む組成物であって、グルテンのプロリン残基でグルテンを切断することにより産生されるグルテン断片を多く含む、組成物を提供する。一態様において、断片化グルテンを含む組成物であって、グルタミン残基でグルテンを切断することにより産生されるグルテン断片を多く含む、組成物を提供する。
【００１８】
他の態様として、グルテンを含むタンパク質を消化する方法であって、有効量のネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩとタンパク質を接触させることを含む、方法を提供する。
【００１９】
他の態様として、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどの組み換えネペンテシンまたはその誘導体を産生する方法であって、ネペンテシンまたはその相同体をコードし、適切に設計されたベクターに挿入されている核酸配列を選択した宿主生物において発現することを含む、ネペンテシンまたはその相同体を入手する方法を提供する。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体である。
【００２０】
他の態様として、組み換えネペンテシンまたはその誘導体を含む組成物を提供する。一態様において、組み換えネペンテシンは組み換えネペンテシンＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンは組み換えネペンテシンＩＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンは組み換えネペンテシンＩおよび組み換えネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体である。
【００２１】
他の態様として、患者において消化管の細菌または寄生虫の感染を予防または治療する方法であって、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体の治療上有効量を患者に投与することを含む、方法を提供する。一態様において、ネペンテシンＩまたはその誘導体を患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩＩまたはその誘導体を患者に投与する。一態様において、ネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体を患者に投与する。
【００２２】
本発明の上記または他の態様を、以下の説明において詳説する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（Ａ）Ｐ１または切断部位のＮ末端側および（Ｂ）Ｐ１′または切断部位のＣ末端側におけるネペンテシン切断優先部位を示す図である。データを、アミノ型に応じて分類し、Ｈａｍｕｒｏらの「Ｈ／Ｄ交換適合条件における豚由来の固定化ペプシンの特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｐｓｉｎ  ｉｎ  Ｈ／Ｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２２（７）：１０４１−１０４６（２００８）によるペプシンのデータを同様に表記したものと比較する。黒色の棒はネペンテシン消化を示し、灰色の棒はペプシン消化を示す。切断割合（％）は、集合におけるある残基の総数に対する、ある残基で観察される切断数を表す。実施例２に記載するように、６つの変性タンパク質の消化物からネペンテシンデータを得た。
【図２】ドメイン型の種類に応じて配置された、ＸＲＣＣ４複合ペプチドの配列表を示す図である。４つの異なる酵素：基質比（６５：１〜５２０：１、薄灰色／棒の上部）におけるペプシン消化、および４つの異なる酵素：基質比（０．００７５：１〜０．３８：１、濃灰色／棒の底部）におけるネペンテシン消化により、ペプチドを得た。
【図３】Ｃ末端アミノ酸により分類された、ネペンテシン消化後に得られたペプチドの平均ＭＡＳＣＯＴスコアを示す図である。各計算に使用したペプチド数は、棒の上部にあり、末端アミノ酸に関する。実施例２に記載するように、６つの変性タンパク質よりペプチドを得た。
【図４】さまざまな酵素：基質比（凡例に示す）により（Ａ）ネペンテシンおよび（Ｂ）ペプシンで消化されたＸＲＣＣ４のペプチドイオンクロマトグラム（ＰＩＣ）を示す図である。カラム上に基質を同質量負荷して酵素消化のＰＩＣを作製した。
【図５】ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分後に小麦由来のグリアジンのネペンテシン消化物から同定された全てのペプチドの平均長を示す図である。偽陽性同定を排除するため、スコアにおける信頼水準９５％のカットオフ値（ｐ＜０．０５）を使用した。ペプチド長の相対標準偏差を入れ子の図に示す。
【図６】３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分間の消化後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチド数を長さで分類し表示する図である。データは、図５に示すものと同様である。
【図７】３７℃で１０分、６０分、１２０分、３６０分または８１０分間の消化後に特定の長さを得る確率として、図５に示すものと同一のデータを表示する図である。
【図８】（Ａ）Ｐ１または切断部位のＮ末端側、およびＰ１´または切断部位のＣ末端側（Ｂ）でのネペンテシン切断優先部位を示す図である。各残基の左の棒はネペンテシン抽出物での消化を示し、真ん中の棒は精製したネペンテシン抽出物での消化を示し、右の棒は組み換えネペンテシンＩでの消化を示す。切断割合（％）は、存在するペプチドの合計数に対して、所定の残基で観察される切断の数を表す。ネペンテシンのデータは、実施例９に記載されるように、グリアジンの消化物から得た。
【図９】Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のネペンテシンＩ、ならびにＮｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のネペンテシンＩＩのタンパク質配列のアライメントを示す図である。
【図１０】異なる種間でのネペンテシンタンパク質の関連性を示す系統樹を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．定義
別段の規定のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。本発明の実施または検査のため、本明細書に記載されるものと同様または均等な方法および物質を使用可能であるが、好ましい方法、装置、および物質を以下に記載する。本明細書は、本明細書において引用される全ての技術刊行物および特許公報の全体を、参考として組み込む。本明細書のいかなる内容も、先行発明によって、本発明がそのような開示に先行することが認められていないことを承認したと解釈されるものではない。
【００２５】
本開示の実務は、別段の規定のない限り、当業者の技能の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、たとえば以下の刊行物中の文献に完全に説明されている。たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編集  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）；  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編集（２００７））シリーズ；  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）シリーズ；  ＰＣＲ  １：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１））；  ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編集（１９９５））；  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  （ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編集（１９９９））；ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ  （Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ第５版（２００５））；  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  （Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．  （１９８４））；  Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号；  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  編集（１９８４））；  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  （Ｍ．Ｌ．Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９９））；  ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編集（１９８４））；  ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８６））；  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  （１９８４）；  ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ  （Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編集（１９８７）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；  ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＩＮ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ  （Ｓ．Ｃ．  Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｄ．  （２００３））  ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ロンドン）（１９８７））；  ＷＥＩＲ’Ｓ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  （Ｌ．Ａ．  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら編集（１９９６））を参照されたい。
【００２６】
明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の指定のない限り複数形を含む。
【００２７】
本明細書において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、他を除外することなく、組成物および方法が列挙された要素を含む意味を有することを意図している。組成物および方法を定義するため使用される場合の「本質的に〜からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組み合わせに対し本質的に意味のある他の要素を除外する意味を有するものとする。例えば、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求の範囲に係る発明の基本的で新規な特徴に重大な影響を実質的に及ぼさない他の要素を除外しない。「からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、微量とは言えない他の配合成分および列挙された実質的な方法工程を除外する意味を有するものとする。これらの他動的用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）により定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「グルテン」は、大麦およびライ麦を含む、小麦または近縁穀物に存在するタンパク質を一般的に指し、それらのタンパク質は特定の個人に悪影響をもたらす可能性がある。グルテンタンパク質は、単量体タンパク質である、α−グリアジン類、β−グリアジン類、γ−グリアジン類およびω−グリアジン類等のグリアジン類、およびジスルフィド結合により結合した高分子量および低分子量のサブユニットの凝集体の非常に不均一な混合物であるグルテニン類を含む。多くの小麦グルテンタンパク質は、特徴が明らかにされている（例えば、Ｗｏｙｃｈｉｋらの「小麦グルテンのタンパク質のアミノ酸成分（Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｌｕｔｅｎ）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ９（４），  ３０７‐３１０  （１９６１）参照）。本明細書で使用される用語「グルテン」は、グルテン含有食物由来のグルテンタンパク質の通常のヒト消化物に由来し、異常な免疫反応を生じさせる可能性があるオリゴペプチドをも含む。それらのオリゴペプチドのうちいくつかは、通常の消化酵素に耐性がある。上述のタンパク質およびオリゴペプチドを含むグルテンは、グルテン不耐症患者のセリアックスプルーのＴ細胞の抗原として作用すると考えられている。
【００２９】
用語「ネペンテシン」は、酵素番号ＥＣ  ３．４．２３．１２のアスパルチルプロテアーゼを指し、ネペンテシンＩやネペンテシンＩＩ等のネペンテシンの全てのアイソフォームおよび変異体、組み換えネペンテシン、ならびにこれらの塩を含む。塩類は、遊離ネペンテシンの生物学的効果および性質を維持し、かつ生物学的にまたはその他の意味において有害ではない、１つ以上の塩基または１つ以上の酸とネペンテシンにより形成される塩類を指す。無機塩基由来の塩類としては、限定するものではないが、ナトリウム塩類、カリウム塩類、リチウム塩類、アンモニウム塩類、カルシウム塩類、マグネシウム塩類、鉄塩類、亜鉛塩類、銅塩類、マンガン塩類、およびアルミニウム塩類等が挙げられる。有機塩基由来の塩類としては、限定するものではないが、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、およびポリアミン樹脂等の、第１級、第２級、および第３級アミンと、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミンならびに塩基性イオン交換樹脂が挙げられる。塩類を形成可能な酸としては、限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸等の無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、Ｐ−トルエンスルホン酸、およびサリチル酸等の有機酸が挙げられる。
【００３０】
ネペンテシン誘導体は、タンパク質分解性の活性を保持する、生物学的等価物、断片および伸長したネペンテシン、ならびにそれらの塩を含む。いくつかの実施形態において、ネペンテシン誘導体は、ネペンテシンの生物学的等価物を含む。「生物学的等価物」は、ネペンテシンと、少なくとも約８０％の相同性または同一性、あるいは少なくとも約８５％、あるいは少なくとも約９０％、あるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９８％の相同性を有するもの、またあるいは、所望の構造を維持し、かつネペンテシンのタンパク質分解活性の少なくとも一部を呈しつつ、厳密な条件下でネペンテシンまたはその相補体をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ネペンテシン誘導体は全長ネペンテシンタンパク質のうち少なくとも約２０個の連続するアミノ酸、もしくは少なくとも約５０個の連続するアミノ酸を有する、または１００個以上の連続するアミノ酸を最大でネペンテシンの完全なタンパク質まで含む、ネペンテシンの断片である。ネペンテシン誘導体はまた、付加配列を有するネペンテシンをも含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ネペンテシン誘導体は、少なくとも約１０％のネペンテシンのタンパク質分解活性、または少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約９０％のネペンテシンのタンパク質分解活性、または１００％以上のネペンテシンのタンパク質分解活性を有する。
【００３３】
本明細書中で使用されるように、用語「その生物学的等価物」は、参照となるタンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸を指す際に望ましい構造または機能性を今まで通り維持しつつ最小の相同性を維持するものを意図する「その等価物」と同じ意味を持つと意図される。代替的な実施形態では、用語ポリヌクレオチド「の生物学的等価物」は、参照となるポリヌクレオチドまたはその相補体に対して厳密な条件下でハイブリダイズするものを指す。本明細書中で特に列挙されない限り、本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はその等価物も含むと考えられる。たとえば、等価物は、少なくとも８０％の相同性または同一性、あるいは少なくとも８５％、あるいは少なくとも約９０％、またあるいは少なくとも約９５％、あるいは少なくとも約９８％、またあるいは９９％の相同性または配列同一性を意図し、参照となるタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価な生物学的活性を呈する。
【００３４】
別の配列に対して特定のパーセンテージ（たとえば８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）とは、並べた場合に、塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、その２つの配列を比較する際に同一であることを意味する。アライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当業者に知られているソフトウェアプログラムを使用して決定できる。たとえばこれらのプログラムは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌら編集。１９８７）  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，  ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８，  Ｔａｂｌｅ  ７．７．１に記載される。好ましくは、デフォルトパラメータを、アライメントに使用する。１つのアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴである。プログラムの例として、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰが挙げられる。これらは、以下の、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝  ｓｔａｎｄａｒｄ；  ｆｉｌｔｅｒ  ＝  ｎｏｎｅ；  ｓｔｒａｎｄ  ＝  ｂｏｔｈ；  ｃｕｔｏｆｆ  ＝  ６０；  ｅｘｐｅｃｔ  ＝  １０；  Ｍａｔｒｉｘ  ＝  ＢＬＯＳＵＭ６２；  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ  ＝  ５０  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；  ｓｏｒｔ  ｂｙ  ＝  ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ＝  ｎｏｎ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，  ＧｅｎＢａｎｋ  ＋  ＥＭＢＬ  ＋  ＤＤＢＪ  ＋  ＰＤＢ  ＋  ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ  ＋  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ  ＋  ＳＰｕｐｄａｔｅ  ＋  ＰＩＲといったデフォルトパラメータを使用する。これらのプログラムのデータベースの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴを使用して見出すことができる。
【００３５】
適切な発現ベクターは、このようなＤＮＡの発現を調節できるプロモーター領域および／またはエンハーサーなどの調節エレメントに作動可能なように連結されるポリヌクレオチドを発現できるベクターを含む。したがって、発現ベクターは、適切な宿主細胞へ導入すると、挿入したＤＮＡの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたは他のベクターなどの組み換えＤＮＡまたはＲＮＡの構築物を指す。適切な発現ベクターは、真核細胞および／または原核細胞で複製可能なベクター、およびエピソームを維持するベクター、または宿主細胞ゲノムへ統合するベクターを含む。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「ベクター」は、たとえば形質転換の工程により、細胞内に配置された際にベクターが複製され得るように未処置のレプリコンを含む非染色体性の核酸を指す。ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であってもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）、または天然に存在するウイルスの改変体を含む。核酸を送達する例示的な非ウイルス性ベクターは、ネイキッドＤＮＡ；単独の、またはカチオン性ポリマーと組み合わせた、カチオン性脂質と複合体を形成するＤＮＡ；アニオン性リポソームおよびカチオン性リポソーム；ＤＮＡ−タンパク質複合体、および異種ポリリジン、定義された長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと縮合し、場合によってはリポソームに含まれるＤＮＡを含む粒子；ならびにウイルスおよびポリリジン−ＤＮＡを含む三元複合体の使用を含む。
【００３７】
非ウイルス性ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで標的細胞に送達できる異種ポリヌクレオチドを含むプラスミドを含んでもよい。異種ポリヌクレオチドは、対象となる配列を含むことができ、１つ以上の調節エレメントに作動可能に結合でき、かつ対象となる核酸配列の転写を制御してもよい。本明細書中で使用されるように、ベクターは、最終的な標的細胞または対象中で複製できる必要はない。このベクターという用語は、発現ベクターおよびクローニングベクターを含んでもよい。
【００３８】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間または２つの核酸の間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために並べられ得る各配列中のある位置を比較することにより決定できる。比較される配列中のある位置が、同一の塩基またはアミノ酸により占められる場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の度合いは、配列により共有される一致するまたは相同的な位置の数の関数である。「関連のない」または「非相同性」の配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、またはあるいは２５％未満の同一性を共有する。
【００３９】
「ハイブリダイゼーション」は、異なる「厳密度」の条件下で行われてよいハイブリダイゼーション反応を指す。ハイブリダイゼーション反応の厳密さを高める条件は、周知であり、当該技術分野において（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ編（２００１）「モレキュラークローニング：研究マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第３版、参照）に公開されている。（厳密さを高めるための）適切な条件の例としては、培養温度：２５℃、３７℃、５０℃、および６８℃、緩衝液濃度：１０倍のＳＳＣ、６倍のＳＳＣ、１倍のＳＳＣ、０．１倍のＳＳＣ（ＳＳＣとは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸緩衝液）、ならびに他の緩衝液系によるそれらの等価物、ホルムアミド濃度：０％、２５％、５０％、および７５％、培養時間：５分〜２４時間および期間を延長した洗浄、頻度を増加させた洗浄、または緩衝液濃度を減少させた洗浄などの条件が挙げられる。
【００４０】
１実施形態では、「治療上有効量」は、患者の症状の予防もしくは軽減、または望ましい生物学的予後、たとえば臨床兆候の改善、疾患の発症の遅延などをもたらす化合物の量を指す。この有効量は、当業者の一人により決定できる。選択される用量レベルは、治療される状態の重症度、ならびに治療される患者の状態および病歴に依存する場合がある。しかしながら、望ましい治療上の有効性を得るために必要な用量より少ないレベルで化合物の用量を開始して、所望の有効性を得るまで用量を徐々に増加することは当業者の範囲内にある。
【００４１】
本明細書中で使用される「同時投与」または「共‐治療」は、共に、または互いに前後する薬剤の投与を含む。
【００４２】
用語「調節する」または「調節」は、哺乳類等の対象における疾患または障害を治療することを意味し、
・疾患または障害を予防するまたは疾患または障害から保護すること、すなわち、異常な生物学的反応または症状を進行させないこと
・疾患または障害を抑制すること、すなわち、異常な生物学的反応および／または臨床状態の進行を阻止するまたは抑えること、および／または
・疾患または障害を軽減させること、すなわち、異常な生物学的反応および／または臨床状態を後退させること
を含む。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「予防」は、それを必要とする患者の予防的治療を指す。予防的治療は、疾病を患う危険のある対象に適切な用量の治療薬を与え、実質的に疾病の発症を防ぐことにより達成できる。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「状態」は、本明細書に記載の化合物、組成物および方法を使用している病態を指す。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「患者」または「対象」は、哺乳類を指し、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む。本明細書の特定の実施形態において、患者または対象はヒトである。
【００４６】
数値の前で使用される用語「約」は、値が、±５％、±１％、および±０．２％等の妥当な範囲内で変化してもよいことを示す。
【００４７】
ＩＩ．方法
一態様において、グルテン不耐症の患者のグルテン不耐症を調節する方法であって、その患者に有効量のネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩ、またはその誘導体を投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
一実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、グルテン含有食物とネペンテシンまたはその誘導体を混合してグルテン不耐症に関連する状態を調節または抑制する食品添加物として投与する。ネペンテシンまたはその誘導体は、単独でまたはそのような食物と組み合わせて使用できる。
【００４９】
他の態様において、患者のグルテン不耐症により引き起こされる状態を調節する方法であって、有効量のネペンテシンまたはその誘導体をその患者に投与することを含む方法が提供される。当該状態としては、例示に過ぎないが、セリアック病、小麦アレルギー、グルテン過敏症および疱疹状皮膚炎が挙げられる。ネペンテシンまたはその誘導体は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を摂取する前、摂取と同時、またはその直後に投与され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩなどのネペンテシン、またはその誘導体は、グルテンを含むかまたはグルテンを含有する可能性のある食品を患者が摂取する前に投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、患者が摂取する食物中のグルテンを分解するのにネペンテシンまたはその誘導体が少なくとも部分的に効果的である（例えば、本来の活性のうち少なくとも約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％）期間内に投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、患者が食物を摂取する前の約４時間、３時間、２時間、１時間、または３０分以内に投与される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を患者が摂取すると同時に患者に投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、原料または食物への添加剤等、食物と共に投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、食物とは別に投与される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を患者が摂取した直後に患者に投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、食物中のグルテンの少なくとも一部（例えば、少なくとも約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％）が患者の胃にまだ残っている期間内に投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、患者が食物を摂取した後の４時間、３時間、２時間、１時間または３０分以内に投与される。
【００５３】
別の態様において、患者において消化管の細菌または寄生虫の感染症を予防または治療する方法であって、ネペンテシンまたはその誘導体の有効量を含む組成物をこの患者に投与することを含む、方法を提供する。単なる例示として、このような細菌感染症は、バチルス・セレウス、バチルス・アントラシス、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ、カンピロバクター、Ｅ．  ｃｏｌｉ、シゲラ、クロストリジウム・ディフィシル、ビブリオ・コレラエ、スタフィロコッカス・アウレウス、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ボツリヌム、カンピロバクター・ジェジュニ、およびリステリア・モノサイトゲネスなどの細菌により引き起こされ得る。一態様において、この組成物はネペンテシンＩまたはその誘導体を含む。一態様において、この組成物はネペンテシンＩＩまたはその誘導体を含む。一態様において、この組成物はネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体を含む。
【００５４】
クロストリジウム・ディフィシルは、集合の小さなサブセットに天然に存在する腸管細菌叢である。しかしながら、ほとんどの人々が、細菌の胞子を摂取することにより、病院、老人ホーム、または類似の施設の患者としてクロストリジウム・ディフィシルにさらされている。クロストリジウム・ディフィシルは、正常な腸管細菌叢を破壊する広範囲のスペクトラムの抗生剤での治療により、通常、日和見性の病態の下、消化管にはびこる場合がある。この細菌は、腹部膨満、下痢、および重篤な腹痛を引き起こし得る毒素を放出する。クロストリジウム・ディフィシルの感染症は、偽膜性大腸炎の最も一般的な原因であり、まれにではあるが生命の危険のある中毒性巨大結腸症へと進行する。クロストリジウム・ディフィシルの発生率は、長期入院しているかなりの数の患者により得られる。感染は最大２週間入院する患者で１３％と推定され、４週間超の入院の患者では５０％と推定される（Ｃｌａｂｏｔｓ，  ＣＲ；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ；  Ｏｌｓｏｎ，  ＭＭ；  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  ＬＲ；  Ｇｅｒｄｉｎｇ，  ＤＮ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９２）．  “Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｂｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ  ｎｅｗ  ａｄｍｉｓｓｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６６  （３）：  ５６１‐７）。
【００５５】
ヘリコバクターは、哺乳類および一部の鳥類の上部消化管および肝臓の裏層で生存していることが発見されている。ピロリ菌は、ヒトの最大５０％に感染しており、ヒトに対し病原性である場合がある。ピロリ菌は、消化性潰瘍、慢性胃炎、十二指腸炎、および胃癌と密接に関連する。他のヘリコバクター種もこれらの状態と関連しており、Ｈ．ｓｕｉｓ、Ｈ．ｆｅｌｉｓ、Ｈ．ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉｉおよびＨ．ｓａｌｏｍｏｎｉｓを含む。
【００５６】
一態様において、治療上有効量の本発明の医薬組成物を、消化管感染症を有しているか、または有する疑いのある患者に投与する。他の態様において、本組成物を、感染するリスクのある患者、たとえば、長期間入院する患者および／または広いスペクトラムの抗生剤を処方される患者に投与する。
【００５７】
概して、ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体は、望ましいグルテン解毒作用を生じさせるか、または細菌感染症を治療するために安全かつ十分な量投与される。ネペンテシンまたはその誘導体の化合物の用量は、投与される特定のネペンテシンまたはその誘導体、患者のグルテンに対する感受性、摂取するグルテン含有食品の量および種類、薬力学的特性、投与方式、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、症状の性質および度合い、治療の頻度ならびに併用治療の種類、もし存在するならば化合物のクリアランス比率などの多くの要因に応じて変動する場合がある。当業者は、上記の要因に基づき適切な用量を決定できる。最初に本化合物は、臨床応答に応じ、必要に応じて調節され得る適切な用量で投与さてもよい。病原性細菌の感染と相関するかまたはこの感染により引き起こされる疾患の治療に有効なネペンテシンＩおよび／もしくはネペンテシンＩＩまたはその誘導体の量は、たとえば、本発明の記載に基づく標準的な臨床技術により決定できる。さらに、インビトロアッセイを、最適な用量範囲の同定を支援するために任意に使用してもよい。製剤化に使用される正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重症度に依存しており、医師の判断およびそれぞれの対象の状況により決定されるものである。
【００５８】
成年患者の用量または投与のレジメンは、小児および乳児に対して比例して調節してもよく、また、たとえば分子量または免疫応答に応じて他の投与または他の形式に調節してもよい。投与または治療は、適切な間隔で、医師の裁量で反復してもよい。
【００５９】
通常、ネペンテシンまたはその誘導体は、患者が、グルテンを含むかもしくはグルテンを含有する可能性のある食品を消費しているかもしくは消費したか、または細菌感染症を有するか、もしくは有する疑いのある場合などに、必要に応じて投与される。あるいは、ネペンテシンまたはその誘導体を含む医薬組成物は、その必要のある患者に投与されてもよい。いずれにせよ、本組成物は、１日につき約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）、または平均的な人に対し１回につき約１ｍｇ〜約１００ｇの投与量で投与できる。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、１日に、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、５０、１００、５００、または１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）およびそれらの値のうち任意の２つの間の範囲（終点を含む）で投与することができる。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、１日につき１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、７０ｇ、１００ｇ、およびそれらの値のうち任意の２つの間の範囲（終点を含む）で投与できる。いくつかの実施形態において、患者がグルテンを含有する食物を消化する回数に応じて、または細菌もしくは寄生虫の感染症の種類、重症度、もしくはリスクに応じて１日に、１回、２回、３回等投与され得る。
【００６０】
本発明の化合物は、単一の活性剤として投与でき、または同一もしくは類似する治療上の活性を示し、併用投与にとって安全かつ有益であると判定されている他の化合物を含む、他の薬剤と併用（同時、経時的もしくは別々に、または共処方を介して）投与できる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、胃のプロテアーゼ（例えば、ペプシンおよびペプシノゲン）など別の酵素、Ｃｈｅｎらの「米のアスパルチルプロテアーゼの遺伝子ファミリー：遺伝子構造および発現、予想されるタンパク質の特徴と系統発生の関係（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｒｉｃｅ：  Ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎ）」Ｇｅｎｅ  ４４２：１０８−１１８（２００９）に記載されるもの等の別のアスパルチルプロテアーゼ、およびプロピルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ  ＩＶ）、およびジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＤＣＰ）または米国特許第７，９１０，５４１号に記載のシステインプロテイナーゼＢ等の酵素と共に投与される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンは、別の薬剤と共に患者に投与される。ネペンテシンと共に投与することができる薬剤の非限定の例としては、組織トランスグルタミナーゼの阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチンおよびアトルバスタチン）、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（例えば、モンテルカストおよびザフィルルカスト）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブおよびロフェコキシブ）、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＲＢ−７９６）等の抗炎症剤、クロモグリケート酸ナトリウム（クロモリン）、ペミロラスト、プロキシクロミル、レピリナスト、ドキサントラゾール、アンレキサノクス  ネドクロミルおよびプロビクロミル等の肥満細胞安定化剤、抗潰瘍剤、抗ヒスタミン剤（例えば、アクリバスチン、セチリジン、デスロラタジン、エバスチン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジンおよびミゾラスチン）等の抗アレルギー剤、トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）の阻害剤、抗ＴＮＦα剤、ならびに抗生剤が挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンは、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、ポリミキシン、リファマイシン、リピラマイシン（ｌｉｐｉａｒｍｙｃｉｎ）、キノロン、スルホンアミド、β−ラクタム、フルオロキノロン、グリコペプチド、ケトライド、リンコサミド、ストレプトグラミン、アミノグリコシド、マクロライド、テトラサイクリン、環状リポペプチド、グリシルシクリン（ｇｌｙｃｙｌｃｙｃｌｉｎｅ）、またはオキサゾリジノンなどの抗生剤と共投与される。これらの分類の抗生剤は当業者に知られている。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンは抗感染剤（たとえば抗真菌トリアゾールまたはアンホテリシン）と共投与される。これらは、治療上の有効性を広くするためにカルバペネム、たとえばメロペネムまたはイムペネムを含んでもよい。
【００６５】
また、本明細書は、上述の状態および疾患のうちの１つの治療または予防のため、薬物を製造する際のネペンテシンまたはその誘導体の使用を提供する。
【００６６】
組成物
ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体は、単独で投与でき、または適切な、薬学的に許容可能な担体もしくは希釈剤もしくは食品成分と併用して投与できる。
【００６７】
したがって、他の態様では、本明細書は、ネペンテシンまたはその誘導体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は食用組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は栄養補助食品である。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は食品または食品添加物である。組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、液剤、注射剤、ゲル剤、およびミクロスフェア等の固体、半固体、または液体状に製剤され得る。ネペンテシンまたはその誘導体の投与は、例えば、経口投与など様々な方法で成される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、治療上有効量の薬剤および薬学的に許容可能な担体を含む。好ましい実施形態において、用語「薬学的に許容可能な」は、動物、より好ましくはヒトにおいて使用するための、連邦または州の政府の監督機関により認可されるか、または米国の薬局方もしくは一般に認可された薬局方に記載されているものを意味する。用語「担体」は、治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような薬学的な担体は、水、ならびにピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物性油、植物性油または合成源を含む油などの滅菌液体であってよい。食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として使用できる。
【００６９】
適切な薬学的賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギコ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。また、本組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態をとることができる。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されており、その全体は参照により本明細書中に組み込まれる。このような組成物は、好ましくは精製した形態で、ネペンテシンまたはその誘導体の治療上有効量を含み、適切な量の担体と共に対象に適切に投与するための形態を提供する。この製剤は投与の形式に適するものである。
【００７０】
経口投与では、ネペンテシンまたはその誘導体は、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤などを形成する適切な添加剤と組み合わせて使用できる。例えば、ネペンテシンまたはその誘導体の固体経口剤形は、従来の添加剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香味剤を用いて調製され得る。賦形剤の非限定例としては、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、香料および色素が挙げられる。いくつかの実施形態において、製剤は患者の胃でネペンテシンまたはその誘導体を放出し、グルテンがネペンテシンまたはその誘導体により分解され得る。
【００７１】
ネペンテシンまたはその誘導体は、任意に、適切な緩衝液（例えばリン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、イミダゾール緩衝液）および賦形剤（例えば、スクロース、ラクトース、トレハロースなどの凍結保護剤）の存在下で、水溶液から凍結乾燥できる。凍結乾燥された塊は任意に賦形剤と混合され、異なる形状に形成され得る。
【００７２】
別の態様において、それを必要とする患者において、セリアック病、小麦アレルギー、グルテン過敏症および疱疹状皮膚炎等のグルテン不耐症または関連する状態を治療する方法であって、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物を患者が摂取する前に有効量のネペンテシンまたはその誘導体で処理することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、食物を有効量のネペンテシンまたはその誘導体とその調製中に、好ましくは任意の加熱工程の後に、混合する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、小麦、ライ麦、および大麦等から作られたパン、パスタ、およびシリアル等のグルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある食物と共に、食品添加物として投与される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、そのような食物の材料として添加される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、任意に約ｐＨ５以上等の不活性なｐＨで、摂取前の食物に分散される。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、グルテン含有食物が患者に摂取される際にその食物に適用可能な粉末、スプレッド、スプレー、ソース、ディップ、ホイップクリーム等として作製されるかまたはそれらに取り込まれ得る。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、容易な投与のために、キャンディー、チューインガム、咀嚼する栄養補助食品、シロップ等の個人の食欲に訴える形状に作製できる。いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、砂糖、塩、サラダドレッシング、スパイス、チーズ、バター、マーガリン、揚げ用ショートニング、マヨネーズ、乳製品、ナッツバター、シードバター、カーネルバター、ピーナッツバター等の一般的な食料品と混ぜることができる。好ましくは、ネペンテシンを含む食料品または添加剤は、温度上昇によるネペンテシンまたはその誘導体の活性の損失の可能性を最小限にするため、患者に摂取される前の熱処理を不要とする。
【００７４】
別の態様において、ネペンテシンまたはその誘導体を含む食料製品が提供される。いくつかの実施形態において、食料製品は、小麦、ライ麦、および大麦から作られるベーカリー製品（例えば、ケーキ、マフィン、ドーナツ、ペストリー、ロールパン、およびパン）、パスタ、クラッカー、トルティーヤチップス、シリアル等、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のあるものである。いくつかの実施形態において、食料製品は、グルテンを含有するかまたはグルテンを含有する可能性のある別の食物と共に摂取され得る。そのような食物の非限定の例としては、粉末、スプレッド、スプレー、ソース、ディップ、ホイップクリーム、キャンディー、チューインガム、シロップ、砂糖、塩、サラダドレッシング、スパイス、チーズ、バター、マーガリン、スプレッド、バター、揚げ用ショートニング、マヨネーズ、乳製品、ナッツバター、シードバター、カーネルバター、ピーナッツバターなどが挙げられる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンまたはその誘導体は、食物と混合されるか、またはグルテンを含有する食材を前処理するために使用される。食物中のネペンテシンは酵素的に活性であり、摂取前または摂取中に食物中のグルテンの濃度を減少させ得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、組成物（医薬組成物または食用組成物など）または食料製品は、約０．１％〜約９９％、約０．５％〜約９５％、約１％〜約９５％、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約２５％〜約７５％のネペンテシンを含む。いくつかの実施形態において、組成物（医薬組成物または食用組成物など）または食料製品中のネペンテシンは、組成物または食料製品全体の約０．０１％、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であり、またはこれら値のうち任意の２つの間の範囲（終点を含む）の範囲にある。
【００７７】
別の態様において、組み換えネペンテシンＩおよび組み換えネペンテシンＩＩの混合物を含む、プロリン残基でのグルテンタンパク質の切断を最適化するための組成物を提供する。一態様において、組み換えネペンテシンＩおよび組み換えネペンテシンＩＩの混合物を含む、グルタミン残基でのグルテンタンパク質の切断を最適化するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、同一の量または濃度のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩのいずれか単独を含む組成物と比較して、プロリン残基でのグルテンタンパク質の切断において少なくとも約２０％、５０％、２倍、５倍、または１０倍有効である。いくつかの実施形態において、組成物は、同一の量または濃度のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩのいずれか単独を含む組成物と比較して、グルタミン残基でのグルテンタンパク質の切断において少なくとも約２０％、５０％、２倍、５倍、または１０倍有効である。
【００７８】
別の態様において、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、および／またはＮなどのアミノ酸残基でのタンパク質の切断を最適化するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、同一の量または濃度のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩのいずれか単独を含む組成物と比較して、所定のアミノ酸残基でのタンパク質の切断において少なくとも約２０％、５０％、２倍、５倍、または１０倍有効である。いくつかの実施形態において、組成物は、同一の量または濃度のペプシンを含む組成物と比較して、所定のアミノ酸残基でのタンパク質の切断において少なくとも約１０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１４００倍、または２０００倍またはそれを超えて有効である。いくつかの実施形態において、この残基はペプシンにより切断できる残基である。いくつかの実施形態において、この残基はペプシンにより有効に切断されない残基である。
【００７９】
別の態様において、断片化グルテンを含む組成物であって、グルテンのプロリン残基でのグルテンの切断により産生されるグルテン断片を多く含む、組成物を提供する。一態様において、断片化グルテンを含む組成物であって、グルタミン残基でのグルテンの切断により産生されるグルテン断片を多く含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、グルテンのプロリン残基でのグルテンの切断により産生されるグルテン断片は、同一の量または濃度の単独のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩのいずれかを含む組成物によるグルテンのプロリン残基でのグルテンの切断で産生されるグルテン断片の少なくとも２倍、５倍、または１０倍である。いくつかの実施形態において、グルテンのグルタミン残基でのグルテンの切断により産生されるグルテン断片は、同一の量または濃度の単独のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩのいずれかを含む組成物によるグルテンのグルタミン残基でのグルテンの切断により産生されるグルテン断片の少なくとも２倍、５倍、１０倍である。
【００８０】
別の態様において、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、および／またはＮなどの他のアミノ酸残基でのタンパク質の切断を最適化するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、タンパク質の所定のアミノ酸残基でのタンパク質の切断により産生されるタンパク質断片は、同一の量または濃度の単独のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩのいずれかを含む組成物によるタンパク質の所定のアミノ酸残基でのタンパク質により産生されるタンパク質断片の少なくとも２倍、５倍、または１０倍である。いくつかの実施形態において、タンパク質の所定のアミノ酸残基でのタンパク質の切断により産生されるタンパク質断片は、同一の量または濃度のペプシンを含む組成物によるタンパク質の所定のアミノ酸残基でのタンパク質の切断により産生されるタンパク質断片の少なくとも約１０倍、５０倍、５００倍、１０００倍、１４００倍、または２０００倍以上である。いくつかの実施形態において、この残基はペプシンにより切断できる残基である。いくつかの実施形態において、この残基はペプシンにより効率的に切断されない残基である。
【００８１】
調製方法
ネペンテシンは、ウツボカズラ属などの植物の嚢状葉の分泌物などの天然源から、固定化ペプスタチンに基づく濾過またはアフィニティ精製などの知られている方法により濃縮（もしくは抽出）または精製できる。ネペンテシンＩおよびＩＩは、天然の植物の分泌物中に比較的少量で見出される。たとえば、生物工学技術を使用して増大した量のネペンテシンＩまたはネペンテシンＩＩ、またはその誘導体を発現および／または分泌するトランスジェニック植物を作製し、ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩの産生を増大できる。
【００８２】
植物供給源からの単離に加えて、ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどのネペンテシンまたはその誘導体は、化学合成により調製されてもよい。化学合成は、ネペンテシンの配列に応じたアミノ酸のカップリングにより成され得る。ペプチドまたはタンパク質を合成するための様々なペプチドカップリング法および市販のペプチド合成装置が使用可能であり、例えばアプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．カリフォルニア州フォスターシティ）、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）や他のメーカー製の自動合成装置などがある。
【００８３】
別の態様において、細胞がネペンテシンを産生できるように、ネペンテシンのＤＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡで細胞を形質転換または遺伝子導入することによる組み換え産生システムを使用して、ネペンテシンを調製する方法を提供する。例えば、ネペンテシンは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ラクトバチルス、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）、およびタバコ細胞等の植物細胞培養などの生物での宿主ベクター系を確立することにより産生できる。
【００８４】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかを含むポリヌクレオチドおよび組成物を含む、ベクターおよびＥ．  ｃｏｌｉなどの宿主細胞もまた提供する。
【００８５】
別の態様において、ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどの組み換えネペンテシンまたはその誘導体を産生する方法であって、上記ネペンテシンまたはその相同体をコードする核酸配列を選択した宿主生物で発現することと、適切に設計されたベクターに核酸配列を挿入することを含む、方法を提供する。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体である。
【００８６】
別の態様において、ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどの組み換えネペンテシンまたはその誘導体を含む組成物を提供する。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩＩまたはその誘導体である。一態様において、組み換えネペンテシンはネペンテシンＩおよびネペンテシンＩＩの混合物またはその誘導体である。
【００８７】
ネペンテシンは、既知の２つのアイソフォーム：ネペンテシンＩ（ネペンテシンＩａおよびネペンテシンＩｂといった２つの変異体を有することが知られている）ならびにＩＩを有する。ネペンテシンの配列およびネペンテシンをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は当業者に知られており、たとえば、Ａｔｈａｕｄａ  ＳＢらのＥｎｚｙｍｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｐｅｎｔｈｅｓｉｎ，  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３８１：２９５‐３０６  （２００４）に記載される。ネペンテシンＩのｍＲＮＡ配列は、いくつかの種、たとえば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＪＸ４９４４０１）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＢ１１４９１４）、およびＮｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＢ２６６８０３）から記載されている。ネペンテシンＩＩのｍＲＮＡ配列は、いくつかの種、たとえば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＪＸ４９４４０２）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＢ１１４９１５）、およびＺｅａ  ｍａｙｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＮＭ＿００１１４７８６９）から記載される。ネペンテシンＩのタンパク質は、いくつかの種、たとえば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＦＶ２６０２４）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ０７４７４）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＦ９８９１５）、およびＺｅａ  ｍａｙｓ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  配列：ＮＰ＿００１１５０９２５）から記載される。ネペンテシンＩＩのタンパク質配列は、いくつかの種、たとえば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＦＶ２６０２５）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ０７４７５）、およびＺｅａ  ｍａｙｓ（ＮＣＢＩ  参照配列：ＮＰ＿  ００１１４９２２９）から記載される。推定上のネペンテシンＩのタンパク質は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ３８０２０）について記載されている。推定上のネペンテシンＩＩのタンパク質は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ８２０００）について記載されている。
【００８８】
知られているネペンテシンタンパク質（および推定上のタンパク質）の配列アライメントを図９に示し、対応する対のアライメントスコアを表１に示す。データを代表する系統図を図１０に示す。Ａｔｈａｕｄａらは関連する典型的なアスパルプロテアーゼとネペンテシンをさらに比較した。Ａｔｈａｕｄａらは、ブタのペプシンＡの構造に基づきネペンテシンＩａの骨格構造を予測した（ネペンテシンＩｂおよびＩＩは、ネペンテシンＩａと本質的に同一と予測された）。推定上の触媒アスパラギン酸残基は、この解析に基づき保存されていた。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ネペンテシンの生合成は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡ、たとえば配列番号１のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＪＸ４９４４０１、ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＢ１１４９１４、またはＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＢ２６６８０３）を含むベクターで細胞を形質転換することにより達成できる。いくつかの実施形態において、ネペンテシンの生合成は、その配列がプロテアーゼ活性を伴うタンパク質をコードする、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに相同な配列を含むベクターで細胞を形質転換することにより達成できる。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約６０％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約７０％の相同性を有しても良い。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８０％相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８５％相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９０％相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９５％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９６％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９７％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９８％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９９％の相同性を有してもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ネペンテシンの生合成は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡ、たとえばＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＪＸ４９４４０２またはＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＢ１１４９１５のヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換することにより達成できる。いくつかの実施形態において、ネペンテシンの生合成は、その配列がプロテアーゼ活性を伴うタンパク質をコードする、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと相同の配列を含むベクターで細胞を形質転換することにより達成できる。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約６０％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約７０％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８０％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約８５％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９０％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９５％の配列を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９６％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９７％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９８％の相同性を有してもよい。この配列はネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡと少なくとも約９９％の相同性を有してもよい。
【００９１】
ネペンテシンＩおよび／またはネペンテシンＩＩなどの合成ネペンテシンまたはその誘導体は、植物の嚢状葉の液体からネペンテシンまたはその誘導体を単離する方法などの知られている方法により、濃縮または精製できる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、天然源または合成源から単離されたタンパク質産物は、少なくとも２０重量％のネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、単離されたタンパク質産物は、少なくとも約５０重量％、約７５重量％、約９０重量％、約９５重量％のネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、単離されたタンパク質産物は、少なくとも９９重量％のネペンテシンまたはその誘導体を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、実質的にネペンテシンＩのみを含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、実質的にネペンテシンＩＩのみを含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１００：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約９０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約７０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約６０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約５０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約４０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約３０：１のネペンテシンＩ：ネペンテシンＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約２０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１０：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約５：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約４：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約３：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約２：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：１のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：２のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：３のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：４のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：５の比率のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：１０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：２０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：３０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：４０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：５０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：６０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：７０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：８０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：９０のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。いくつかの実施形態において、組み換えネペンテシンは、少なくとも約１：１００のネペンテシンＩ対ネペンテシンＩＩの比率を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、天然源または合成源から単離したタンパク質産物は、ネペンテシンＩと少なくとも約７０％相同でありプロテアーゼ活性を保持するタンパク質を含む。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約８０％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約８５％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約９０％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約９５％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約９６％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約９７％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約９８％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩと少なくとも約９９％相同であってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態において、天然源または合成源から単離したタンパク質産物は、ネペンテシンＩＩと少なくとも７０％相同でありプロテアーゼ活性を保持するタンパク質を含む。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約８０％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約８５％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約９０％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約９５％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約９６％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約９７％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約９８％相同であってもよい。このタンパク質は、ネペンテシンＩＩと少なくとも約９９％相同であってもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態において、天然源または合成源から単離したタンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の約１００％超を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態において、天然源または合成源から単離したタンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質産物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の約１００％超を有するネペンテシンまたはその誘導体を含む。
【００９８】
ＩＩＩ．実施例
別段の記述がない限り、明細書全体を通して使用される略語は、以下の意味を有する。
【表１】
0006502269.tif 000002
【００９９】
これらの１文字の記号は、アミノ酸を表す場合、以下の意味を有する。
【表２】
0006502269.tif 000003
【０１００】
実施例１
ネペンテシン抽出物の調製
化学品
水およびアセトニトリル、ＨＰＬＣグレード形態のＢｕｒｄｉｃｋ＆ＪａｃｋｓｏｎをＶＷＲ社から購入した。ギ酸、トリス、グリシンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
【０１０１】
植物培養
Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｒａｆｆｌｅｓｉａｎａ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｍｐｕｌａｒｉａ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、およびＮｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｌｏｂｏｓａの移植体をＫｅｅｈｎｓ  Ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ社（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｅｈｎｓｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ．ｃａ）から購入した。これらを、木の樹皮、パーライト、ピートモス及び腐植（それぞれ４０、３５、１０、５％）で鉢植した。成育条件としては、１日につき１４時間光を当て、湿度８０％、２３〜２８℃の温度で、週に２〜３回水やりをした。嚢状葉の成熟に際し、植物に、嚢状葉毎に１匹または２匹のショウジョウバエを与え、１週間後に嚢状葉の液体を採取した。第２回目の給餌および抽出前に嚢状葉とそれらの分泌液を一週間そのままにしておき回復させた。
【０１０２】
抽出物の調製
嚢状葉液を全４種の植物から回収し、混合した。まず、粗嚢状葉液を０．２２μｍフィルターを通して清澄化し、その後アミコンウルトラ遠心１０ｋＤａ分子量カットオフフィルターを使用して８０〜１００倍に濃縮した（共に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）。消化に使用する前に、濃縮物を１００ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．５）を用いて３時間酸活性化し、その後、洗浄ごとに１０倍の液体容積を使用して、濾過装置において１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で３回洗浄した。その後、最終単離物を嚢状葉液の元のサンプリングに基づき、１１倍の濃縮物に再び希釈した。
【０１０３】
嚢状葉液抽出物の特徴付け
嚢状葉植物の分泌液を濃縮し、消化酵素をｐＨを低下（ｐＨ２．５）させることにより、活性化させた。濃縮工程およびプロテオーム液の活性化による影響をプロテオミクス法を用いて決定した。まず、ネペンテシン酵素の存在を確認するため、不活性な濃縮物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ごくわずかにクマシー染色された７つの連続したゲル領域をトリプシンで消化し、標準的な方法を用いてナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。活性化したプロテアーゼ液の完全なカタログであることを期待してはいないが、分析により、アスパルチルプロテアーゼ  ネペンテシンＩ／ＩＩの存在に加え、植物由来のグルカナーゼ、キチナーゼ、カルボキシペプチダーゼおよびペルオキシダーゼ、さらにはわずかなレベルのショウジョウバエおよび細菌の混入を確認した。プロテオーム液の複雑性の低さは、最近の分析、Ｈａｔａｎｏ  Ｎ、Ｈａｍａｄａ  Ｔ（２０１２）の「食虫植物Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａの嚢状葉液の餌動物の成分により導かれる分泌タンパク質のプロテオーム解析（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｅｙ  ｉｎ  ｐｉｔｃｈｅｒ  ｆｌｕｉｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ  ｐｌａｎｔ  Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａ）」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３；７５（１５）：４８４４−５２  （Ｅｐｕｂ  Ｊｕｎ．  １５，  ２０１２）と一致したが、この分析において、ネペンテシン−Ｉが、より幅広い質量範囲（４０〜７０ｋＤａ）に分布していることが分かった。その後、酸活性化液体を同様の様式で処理し、分析した。活性化工程により全タンパク質収量が減少し、かつ組成物の簡略化も見られた。ネペンテシン−Ｉ以外には、ケラチンとアクチンからのごくわずかな混入が見られた。これらの分析は、ネペンテシンが主成分である濃縮液体の複雑さの低さを示す。活性化および８０倍に濃縮した液体の総タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイにより２２ｎｇ／μＬと計測された。この値は、液体の濃縮について記述する以前の研究（Ｔｏｋｅｓ  ＺＡら「食虫植物Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ−Ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ−Ｌにより分泌される消化酵素（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ−Ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ−Ｌ）」  Ｐｌａｎｔａ  １１９（１）：３９−４６（１９７４））と一致している。
【０１０４】
実施例２
ペプシンおよびネペンテシン抽出物によるタンパク質の消化マッピング
質量分析によるネペンテシン消化物のマッピング
ネペンテシン抽出物は実施例１と同様に調製した。
水素／重水素交換（ＨＤＸ）用途に設計されたＬＥＡＰ  ＨＴＸ−ＰＡＬオートサンプラーおよびディスペンスシステムを使用して溶液中でタンパク質の消化を行い、データをＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｔｒｉｐｌｅ−ＴＯＦ  ５６００  ＱｑＴＯＦ質量分析計で収集した。ＭＳ／ＭＳデータからＭａｓｃｏｔ  （ｖ２．３）を用いて、ペプチドを同定した。つまり、８μＬの８μＭ  タンパク質（ＸＲＣＣ４、ＸＬＦ、リガーゼ  ＩＶ−タンデムＢＲＣＴドメイン、ＰＮＫ、ミオグロビン、またはシトクロムＣ）を１０μＬの１１倍濃縮液体と、１０℃で２分間混合した。ミオグロビンおよびシトクロムＣは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。１μＭの基質濃度に希釈後、１５μＬを質量分析計に接続された冷却逆相ＬＣシステム（４℃）に注入した。ペプチドを５ｃｍの２００μｍ  ｉ．ｄ．  Ｏｎｙｘ  Ｃ１８モノリス型カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）で捕え、３％〜４０％のグラジエントのアセトニトリルで１０分間溶出させた。これらの分析で検出されたペプチドを、気相分取法（ｇａｓ−ｐｈａｓｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）に似た、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複数のデータ依存的測定におけるＣＩＤフラグメンテーションのため選択した。Ｂｌｏｎｄｅｒ  Ｊら、「質量分析法による、気相分取を用いたナチュラルキラー細胞ミクロソームのプロテオミクス研究（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇａｓ−ｐｈａｓｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １６９８（１）：８７−９５  （２００４）。スペクトルを全６つのタンパク質の配列を保存している小規模データベースで探索した。配列結果を手動で確認した。
【０１０５】
結果
一連のタンパク質をＨＤＸ−ＭＳ実験に適した条件下で、濃縮液体で消化した。濃縮物の消化特異性を、ペプシンで行われた同様の研究（Ｈａｍｕｒｏ  Ｙら「Ｈ／  Ｄ交換に互換性のある条件における固定化ブタペプシンの特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐｅｐｓｉｎ  ｉｎ  Ｈ／Ｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２２（７）：１０４１−１０４６（２００８））との比較のために、位置Ｐ１およびＰ１′で特徴づけた（図１）。本実施例においては、いくつかの混入したタンパク質が明らかに存在していたとしても、濃縮液体中の計測されたタンパク質の全てがネペンテシンであるという仮定に基づき、酵素―基質比は１：８５であった。
【０１０６】
ネペンテシンデータは、１６１２残基の評価を表し、対応するペプシンデータ（１３，７６６残基）のように広範囲ではないが、配列の多様性は、位置Ｐ１およびＰ１′のレベルでの比較を保証するために設定されたタンパク質において十分に高い。ペプシンの最も高い特異性は位置Ｐ１に現れている。これは疎水性残基Ｆ、ＬおよびＭの高効率な切断を表すが、Ｐ、Ｈ、ＫおよびＲの後ろでの切断は基本的に起こらない。ネペンテシンは、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＩおよびＷを除くほとんどの残基の後ろを切断する。それは、予想されるペプシンＰ１残基の後ろだけでなく、ペプシン消化において起こらない残基、特にＫ、Ｒ、およびＰにおける高率の切断を示す。位置Ｐ１′において、ペプシンは一般的に、芳香族の任意の残基を含む疎水性残基に対する優先性を示す。逆に、ネペンテシンは、恐らくＧ、ＰおよびＨに対する選択性を除き、位置Ｐ１′における選択性をほとんど示さない。全体として、ネペンテシンは、ペプシンに対し、位置Ｐ１における著しく緩い特異性を示し、非常に高効率であることを示唆する。
【０１０７】
実施例３
ペプシンおよびネペンテシン抽出物によるマルチドメインタンパク質  ＸＲＣＣ４の消化マッピング
ＤＮＡ損傷修復に関与する複合体のＨＤ交換
ネペンテシン抽出物は実施例１と同様に調製した。
ＢＲＣＴを備えるＸＲＣＣ４（１−２００）およびＢＲＣＴを備えるＸＲＣＣ４（完全長）の原液を、等モル濃度（１０μＭ）までバッファー（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５）で希釈し、最低３０分間４℃でインキュベートして、複合体形成を促進させた。ＨＤＸ解析まで試料を４℃で保持した。Ｄ２Ｏ（２５％ｖ／ｖ）を添加しつつ、アリコートを２０℃で２分間、重水素化した。その後、アリコートを２つの方法で消化した。第１の消化法では、試料に１００ｍＭの冷グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を添加することによりタンパク質の重水素化物を急冷し、急冷タンパク質溶液をペプシンマイクロリアクターに注入した。このマイクロリアクターを注入バルブとＣ１８カラムの間のＨＴＸ−ＰＡＬシステムに搭載した。タンパク質消化物を、モノリス型Ｃ１８キャピラリーカラムで捉え、質量分析計に溶出させた。マイクロリアクターを含む全液体要素を４℃で冷却し、分析時間（＜１５分）中の重水素化の逆交換を最小限とした。第２の消化法では、等量の重水素化タンパク質を同時に急冷して３μＬまたは５μＬの１１倍ネペンテス液で１０℃にてそれぞれ３分間または５分間消化した。試料を質量分析計に接続された冷却ＬＣシステムに注入した。
【０１０８】
反復質量シフト計測を行い（４回以上）、対照タンパク質状態（遊離ＸＲＣＣ４（１−２００）、遊離ＸＲＣＣ４（完全長）および遊離ＬｉｇＩＶ−ＢＲＣＴ）に参照した。各ペプチドの平均重水素化レベルを、Ｈｙｄｒａ  ｖ１．５．  Ｓｌｙｓｚ  ＧＷらの、「Ｈｙｄｒａ：ＭＳまたはタンデムＭＳ分析からのＨ／Ｄ交換データの目的に合わせた処理を行うソフトウェア（Ｈｙｄｒａ：  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｈ／Ｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ＭＳ  ｏｒ  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ  ａｎａｌｙｓｅｓ）」Ｂｍｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １０  （２００９）の改訂版である、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  Ｓｔｕｄｉｏ（投稿準備中）を用いて決定した。質量シフトの摂動は、（ａ）各状態の分析からプールされた標準偏差を使用して両側ｔ検定（ｐ＜０．０５）を通過した場合、（ｂ）スペクトルの重複を防ぐ分布分析を通過した場合、および（ｃ）シフトノイズの計測に基づきかつその正規分布を前提としてシフト閾値（±２標準偏差）を超える場合、有意であるとみなした。Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＭＪら「質量シフトの摂動マッピングによるラウリマライド−微小管の結合方式の発見と特性（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｕｌｉｍａｌｉｄｅ−Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｄｅ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｈｉｆｔ  Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ）」  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７（７）：７２５−７３４（２０１０）。
【０１０９】
結果
緩い特異性がＨＤＸ−ＭＳ用途の配列マッピングの改善につながるかどうかを決定するため、完全長ＸＲＣＣ４（球状ドメイン、および伸張ヘリカルストーク、ならびに長く不規則なＣ末端を含むタンパク質）をプロファイルした。Ｈａｍｍｅｌ  Ｍら「ＸＲＣＣ４リガーゼＩＶ複合体のＸＬＦ調節フィラメントアーキテクチャ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｆｉｌａｍｅｎｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＸＲＣＣ４．  Ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １８（１１）：１４３１−１４４２（２０１０）、およびＪｕｎｏｐ  ＭＳら「Ｘｒｃｃ４  ＤＮＡ修復タンパク質の結晶構造および末端結合の影響（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｘｒｃｃ４  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）」Ｅｍｂｏ  Ｊ  １９（２２）：５９６２−５９７０（２０００）。そのようなマルチドメインタンパク質は、単一の消化プロトコルで網羅することは困難であり、特に天然変性領域は疎水性残基が比較的乏しくプロリンおよび荷電残基に富むためペプシンで消化しにくい傾向がある。Ｄｕｎｋｅｒ  ＡＫら「天然変性タンパク質（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ＆Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  １９（１）：２６−５９（２００１）。このタンパク質のペプシンおよびネペンテシンマップを図２に示す。この比較において、異なるプロテアーゼ量および再帰ＭＳ／ＭＳ実験を用いた、両酵素の徹底的なマッピングを進めた。ネペンテシンは完全長のタンパク質のカバー範囲に優れており、ペプシンが１８７に対し（濃灰色の棒）、ネペンテシンは３５７個のペプチドである（薄灰色の棒）。（１１残基の平均ペプチド長は、両酵素において同一であった）。両酵素は、多数の重複ペプチドがある球状およびストーク領域を表すが、ネペンテシンにより提供される補完性は明らかである。例えば、ネペンテシンは、球状ドメイン（残基１〜３０）におけるβシート領域の非常に深いカバー範囲を提供する。変性Ｃ末端領域もはるかに大きい範囲までカバーされ、および非常に高いレベルの冗長性までカバーされる。この変性テール領域の各残基は、ネペンテシンを用いて、１６倍のカバー範囲およびペプシンでわずかに４．７倍のカバー範囲を受ける。
【０１１０】
ペプチド検出におけるバイアスの存在は、メートル法で平均検索スコアを選択することにより探索される（図３）。このアプローチは、それにより配列マップが定義される主要な手段として配列同定における信頼性を強調する。１つの異常値はＲである。Ｒで終結するペプチドの高いスコアは、高い平均ペプチド強度と優れた断片化の組み合わせを表していると考えられ、このことはトリプシン系ボトムアッププロテオミクスから得ている知見と一致する。Ｗａｒｗｏｏｄ  Ｓら「定性的および定量的プロテオミクスのグアニジン化学（Ｇｕａｎｉｄｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２０（２１）：３２４５−３２５６（２００６）。
【０１１１】
実施例４
酵素‐基質の比率を変動させたＸＲＣＣ４の消化
酵素効率をより詳細に試験した。単に、酸素・基質比を変えることによりペプチド質量マップを変化させ得るまたは調節し得る度合を図４に示す。ネペンテシン負荷を溶液中の消化のため、５０倍の範囲にわたって変化させた。ペプシンの実験では、広範囲のペプシン自己分解を避けるため、遊離ペプシンではなくスラリー形式の固定化ペプシンを使用した。酵素負荷を８倍の範囲にわたって変化させた。より低量ではペプチド度強度に乏しく、より高量ではマップへの影響はなかった。ネペンテシンは高い負荷でさえも非常に低い自己分解プロファイルを生成したことが見出された。効果的な消化の計測として凝集ペプチドのイオンクロマトグラム（ＰＩＣ）を使用した。０．３８：１（ネペンテシン：基質）と５２０：１（ペプシン：基質）において見出された相対的に類似した分布の比較は、ＨＤＸ様の用途でのペプシンに対するネペンテシンの効果における顕著な１４００倍の改善を表している。
【０１１２】
ネペンテシン消化は、酵素負荷を変化させ、かつＸＲＣＣ４の可変呈示を作製することにより、大きな断片から小さな断片へとより容易に調整できた。これは、ＰＩＣにおける低負荷での長い保持時間から高負荷での短い保持時間への移行により、図４Ａにおいて示される。この移行は、低酵素負荷時の＞１２から高酵素負荷時の１０にシフトする、最も豊富なペプチドの平均ペプチド長に相関した。逆に、可変のペプシン負荷は、ＰＩＣまたは平均ペプチド長を著しく変化させることはなかった（図４Ｂ）。強制流ペプシンマイクロリアクターはチューニングを改善するかもしれないが、より小さな断片を生じさせないであろう。
【０１１３】
実施例５
ネペンテシン抽出物によるグリアジンの消化
ネペンテシンによるグリアジンの消化を水素／重水素交換（ＨＤＸ）用途に設計されたＬＥＡＰ  ＨＴＸ−ＰＡＬオートサンプラーおよびディスペンスシステムを用いて、溶液中で実行した。データをＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｔｒｉｐｌｅ−ＴＯＦ  ５６００  ＱｑＴＯＦ  質量分析計を用いて収集した。ペプチドをＭＳ／ＭＳデータからＭａｓｃｏｔ（ｖ２．３）を用いて同定した。簡潔に説明すると、１２ｐｍｏｌの粗グリアジン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入）を、実施例１に記載されるように生成した２μＬの１００倍濃縮抽出物と混合した。消化後、全容量を質量分析計に接続された逆相ＬＣシステムに注入した。ペプチドを７ｃｍの１５０μｍ  ｉ．ｄ．Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８カラムで捕え、１０分または３０分間で、１０％〜４０％のグラジエントのアセトニトリルで溶出した。これらの分析で検出されたペプチドを、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複数のデータ依存的測定におけるＣＩＤフラグメンテーションのため選択した。スペクトルを、全ての同定された小麦グリアジン（α、β、γ、ω）タンパク質、さらに低分子量および高分子量のグルテニンの配列を含有する小型のデータベースで探索した。図５は、３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、小麦からのグリアジンのネペンテシン消化物から同定された全てのペプチドの平均長を示す。偽陽性同定を排除するため、スコアにおける信頼水準９５％のカットオフ値を使用した。ペプチド長の相対標準偏差を入れ子の図に示す。
【０１１４】
図６は、３７℃で１分、５分、１０分、１５分、３０分、６０分、１３０分、３６０分または８１０分間の消化後ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定されたペプチド数を示す。データは、図５と同じである。
【０１１５】
図７は、３７℃で１０分、６０分、１２０分、３６０分または８１０分間の消化後に特定の長さを得る確率として、図５と同一のデータを示す。
【０１１６】
実施例６
ネペンテシン抽出物の精製
抽出物の精製
セファロース固定化ペプスタチンを含む５０×２ｃｍのＩＤカラムを、２０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５〜３で平衡化した。濾過した嚢状葉液体（実施例１に記載されるよう調製）を、カラムを介して２回循環し、カラムを１００ｍＬの平衡バッファー（２０ｍＭのグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５）で洗浄した。カラムを１００ｍＭの重炭酸アンモニウムｐＨ８．７で溶出し、画分を収集した、最大酵素活性を保存するために、画分を収集した直後に２ＭのグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５でｐＨを４まで低下させた。活性を、消化アッセイを使用して検証し、最も活性のある画分を組み合わせ、本来の液体容量に基づき約８０倍まで濃縮した。
【０１１７】
実施例７
組み換えネペンテシンＩ
ネペンテシンＩの遺伝子（配列番号１参照；Ｎ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のアミノ酸残基２０〜４１３をコードし、植物のシグナル配列をもたない）を、ネペンテシンＩのｃＤＮＡから調製し、ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間に配置した。この配列を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）（ニュー・イングランド・バイオラボ（ＮＥＢ））、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（ＮＥＢ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）（ＮＥＢ）、０．５μｇのｐＥＴ２１ａベクターおよび２μｇのネペンテシンＩのｃＤＮＡを使用して、ｐＥＴ２１ａ中にクローン化した。これを、１８℃で４時間インキュベートした。ライゲーション混合物（５μＬ）を２００μＬのＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。細胞をヒートショック（４２℃で４５秒、直後に１ｍｌのＬＢ培地と共に氷冷）により形質転換し、３７℃で１時間インキュベートし、抗生剤（テトラサイクリンおよびアンピシリン）と共にプレートに播いた。いくつかの白いコロニー中に遺伝子の存在を確認した後、代表的なコロニーをマキシプレップ用に選択した。結果として得られる組み換えプラスミドｐＥＴ２１ａ／Ｒ．ＮｅｐＩを、上記のようにヒートショックによりＥ．  ｃｏｌｉ  Ｃ４１に形質転換し、ＩＰＴＧによる誘導下、発現させた。ここで、細胞を、ＯＤ６６０が最大０．６となるまで増殖させ、３７℃で４時間０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。発現したタンパク質は封入体となった。
【０１１８】
封入体を以下のように単離した。細胞を遠心し、スクロース溶解バッファーを添加し（２５％のショ糖、５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＮ３、およびプロテアーゼ阻害剤）、細胞に、凍結／解凍および超音波処理を４回行った。次いで、これに続きＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅを添加し、室温で３０分間インキュベーションした。調製物を遠心（〜１５分、５０００×ｇ）し、封入体および膜画分をペレット状にした。このペレットを、トリトンバッファー（５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＮ３、０．５％のトリトンＸ１００＋プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で超音波処理を実施した。これを再び遠心し、封入体をペレット状にした。このペレットを氷上で（混合および超音波処理を行いながら）トリトンフリーバッファー（５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤）で２回洗浄した。
【０１１９】
次いで、このタンパク質ペレットを再フォールディングさせた。１ｇの封入体を、１ｌの、５０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１０．５、８Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのグリシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのβメルカプトエタノール中に懸濁し、１時間振盪した。懸濁物を、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１に対して、１回につき１時間、合計２回透析し、次いで、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５に対して１日透析し、最後に、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸塩バッファー、ｐＨ７．０に対して透析した。
【０１２０】
溶液を高速で遠心し（１００００×ｇ、１５分間）し、再フォールディングしていないタンパク質を除去し、上清を２２μｍの膜を介して濾過した。ネペンテシンＩを４℃で一晩、ｐＨ２．５（グリシンＨＣｌ）で活性化させた。収率は、細胞培養物１Ｌから開始して、フォールディングした活性化タンパク質が１０〜１００ｍｇの範囲である。
【０１２１】
実施例８
組み換えネペンテシンＩＩ
ネペンテシンＩＩのｃＤＮＡ（Ｎ．  ｇｒａｃｉｌｉｓ由来、植物のシグナル配列をもたない）を使用して、ネペンテシンＩＩのｃＤＮＡを調製した。この配列を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）（ニュー・イングランド・バイオラボ（ＮＥＢ））、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（ＮＥＢ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）（ＮＥＢ）、０．５μｇのｐＥＴ２１ａベクターおよびネペンテシンＩＩのｃＤＮＡ２μｇを使用して、ＮｄｅｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間でｐＥＴ２１ａ中へクローン化した。これを、１８℃で４時間インキュベートした。ライゲーション混合物（５μＬ）を、２００μｌのＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を、ヒートショック（４２℃で４５秒、直後に、１ｍＬのＬＢ培地と共に氷冷）により形質転換し、３７℃で１時間インキュベートし、抗生剤（テトラサイクリンおよびアンピシリン）と共にプレートに播いた。いくつかの白いコロニー中に遺伝子の存在を確認した後、代表的なコロニーをマキシプレップ用に選択した。結果として得られる組み換えプラスミドｐＥＴ２１ａ／Ｒ．ＮｅｐＩを、上記のようにヒートショックにより、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ４１へと形質転換し、ＩＰＴＧによる誘導下で発現させた。ここで細胞を、ＯＤ６６０が最大０．６となるまで増殖させ、３７℃で４時間、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。発現したタンパク質は封入体となった。
【０１２２】
封入体を以下のように単離した。細胞を遠心し、スクロース溶解バッファーを添加し（２５％のショ糖、５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＮ３、およびタンパク質阻害剤）、細胞に、凍結／解凍および超音波処理を４回行った。これに続き、ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅを添加し、室温で３０分間インキュベーションを行った。調製物を遠心し（〜１５分、５０００×ｇ）、封入体および膜画分をペレット状にした。このペレットを、トリトンバッファー（５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＮ３、０．５％のトリトンＸ１００＋プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で超音波処理を実施した。これを再度遠心し、封入体をペレット状にした。このペレットを、トリトンフリーバッファー（５０ｍＭのトリスＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤）中、氷上で２回（混合および超音波処理を行いながら）洗浄した。
【０１２３】
次いで、このタンパク質ペレットを再フォールディングした。１ｇの封入体を、１Ｌの、５０ｍＭのＣＡＰＳ（ｐＨ  １０．５）、８Ｍの尿素、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのグリシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのβメルカプトエタノール中に懸濁し、１時間振盪した。この懸濁物を、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１に対して１回につき１時間、２回透析し、次いで、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５に対して１日透析し、最後に、３００ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸塩バッファー、ｐＨ７．０に対して透析した。
【０１２４】
この溶液を高速（１００００×ｇ、１５分間）で遠心して、再フォールディングしていないタンパク質をすべて除去し、上清を２２μＭの膜を介して濾過した。ネペンテシンＩＩを４℃で一晩、ｐＨ２．５（グリシンＨＣｌ）で活性化させた。収率は、細胞培養物１Ｌから開始して、フォールディングした活性化タンパク質が１０〜１００ｍｇの範囲である。
【０１２５】
実施例９
ネペンテシンによるグリアジンの消化マッピング
ネペンテシン抽出物を実施例１に記載のように調製した。精製したネペンテシン抽出物を実施例６に記載のように調製した。組み換えネペンテシンＩを実施例７に記載のように調製した。
【０１２６】
グリアジンの消化を、酵素に対する基質の比率が約１０００：１であることを除き、実施例５に記載のように実施した。グリアジンを、ネペンテシン抽出物、精製したネペンテシン抽出物、または組み換えネペンテシンＩを用いて、３７℃で２時間消化した。
【０１２７】
グリアジンは、コムギおよび他の穀物粒に見出されるタンパク質のクラスである。グリアジンは、プロリンおよびグルタミン残基を非常に多く含む。本出願人は、組み換えネペンテシンＩがグリアジンタンパク質をｐＨ２〜３で非常に効率的に消化することを決定した。組み換えネペンテシンＩのＰ１切断優先性は、濃縮した液体抽出物、および抽出物の精製画分の優先性と非常に類似している（図８Ａ）。驚くべきことに、この抽出物は、精製抽出物または組み換えネペンテシンＩのいずれかよりもグルタミンに対して高い優先性を示した。
【０１２８】
組み換えネペンテシンＩのＰ１切断優先性は、濃縮した液体抽出物および抽出物の精製画分の優先性と非常に類似している（図８Ｂ）。驚くべきことに、この抽出物は、精製抽出物または組み換えネペンテシンＩよりも高いプロリン優先性を示した。
【０１２９】
この抽出物はネペンテシンＩおよびＩＩを両方含むが、この精製法では、ネペンテシンＩよりもずっと活性の少ないネペンテシンＩＩを回収する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、抽出物によるＰ１グルタミン位置およびＰ１´のプロリン位置での高切断は、ネペンテシンＩＩおよび／またはネペンテシンＩとネペンテシンＩＩとの間の相乗作用によるものであると考えられる。
【０１３０】
実施例１０
ネペンテシンタンパク質の比較
既知のおよび推定上のネペンテシンタンパク質のタンパク質配列を、Ｃｌｕｓｔａｌ  ２．１  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔを使用してアライメントした。ネペンテシンＩの配列は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＦＶ２６０２４）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ０７４７４）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ａｌａｔａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＦ９８９１５）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  配列：ＮＰ＿００１１５０９２５）、およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ３８０２０）であった。ネペンテシンＩＩの配列は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＡＦＶ２６０２５）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  （ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ０７４７５）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（ＮＣＢＩ  参照配列：ＮＰ＿００１１４９２２９）、およびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号：ＢＡＤ８２０００）であった。結果として得られるアライメントを図９に示す。図１０は、異なる種の間でのネペンテシンタンパク質の関連性を示す系統樹を示す。表１は、各配列間での対のアライメントスコアを示す。
【表３】
0006502269.tif 000004
0006502269.tif 000005
【０１３１】
上記の実施例に挙げられるデータは、混合物またはその精製成分もしくは組み換え成分のいずれかのネペンテシンがグルテンを効率的に消化し、それに対してペプシンはそうではないことを示した。したがって、本発明は、ネペンテシンの混合物またはその精製成分もしくは組み換え成分の使用により、グルテンを含むタンパク質中のグルテンを消化するための方法を提供する。
【０１３２】
明確な理解のため、説明および実施例によって、上記をいくらか詳細に記載したが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および改変を実施してもよいことを理解するであろう。また、本明細書に記載の引用文献は、各引用文献が参照により個別に援用される場合と同程度に、その全体が参照により援用される。
【図１】
0006502269.tif 000006
【図２】
0006502269.tif 000007
【図３】
0006502269.tif 000008
【図４】
0006502269.tif 000009
【図５】
0006502269.tif 000010
【図６】
0006502269.tif 000011
【図７】
0006502269.tif 000012
【図８】
0006502269.tif 000013
【図９】
0006502269.tif 000014
【図１０】
0006502269.tif 000015
【配列表】
0006502269000001.xml