(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の染色体の数的異常である遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための１３番染色体、１８番染色体、および２１番染色体から選択される１つ以上の染色体上の目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
前記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
前記単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
前記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読し、胎児由来の増幅産物の配列リード数と母親由来の増幅産物の配列リード数の比を求め、前記比があらかじめ決定したカットオフ値以上であれば胎児に染色体の数的異常があると判定するＤＮＡシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、前記目的領域選択工程は、前記単一細胞単離工程および前記ゲノムＤＮＡ抽出工程の両工程の前もしくは後に、または前記単一細胞単離工程および前記ゲノムＤＮＡ抽出工程の両工程と並行して行われ、
前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
前記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、アラインメントのスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求めたアラインメントのスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う第１段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、アラインメントのスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求めたアラインメントのスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う第２段階選抜工程と、
前記第１段階選抜工程および前記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記ローカルアラインメント工程および前記第１段階選抜工程の両工程は、前記グローバルアラインメント工程および前記第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記グローバルアラインメント工程および前記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【請求項２】
前記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第１の標的領域を選択する、第１の標的領域選択工程と、
前記第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第１の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、アラインメントのスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
前記第１のローカルアラインメント工程において求めたアラインメントのスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、アラインメントのスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
前記第１のグローバルアラインメント工程において求めたアラインメントのスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
前記第１の第１段階選抜工程および前記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
前記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第２の標的領域を選択する、第２の標的領域選択工程と、
前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第２の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列および前記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、アラインメントのスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
前記第２のローカルアラインメント工程において求めたアラインメントのスコアに基づいて、前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、アラインメントのスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
前記第２のグローバルアラインメント工程において求めたアラインメントのスコアに基づいて、前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
前記第２の第１段階選抜工程および前記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、前記第１のローカルアラインメント工程および前記第１の第１段階選抜工程の両工程は、前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
前記第２のローカルアラインメント工程および前記第２の第１段階選抜工程の両工程は、前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
前記標的領域が３箇所以上である場合は、前記第２の標的領域選択工程から前記第２のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、請求項１に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡシークエンシング工程まで行った結果、胎児の遺伝子状態を判定することができなかった場合には、前記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも前記ゲノムＤＮＡ抽出工程から前記ＤＮＡシークエンシング工程までを繰り返す、請求項１または２に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【請求項４】
前記遺伝子状態がトリソミーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と前記ＤＮＡシークエンシング工程との間に、さらに、
前記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、請求項１〜４のいずれか１項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【請求項６】
前記目的領域選択工程において、さらに、Ｘ染色体およびＹ染色体から選択される１つ以上の染色体上の目的領域を選択する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎児の遺伝子状態を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断として、従来、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われてきた。しかし、この方法では、流産の可能性があることが、大きな問題として指摘されている。【０００３】
安全な出生前診断として、最近では、母体血液中に母親の無細胞ＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸）と混在して存在する胎児由来の無細胞ＤＮＡを分析する方法で出生前診断が行われるようになった。この方法は、非侵襲性であり、胎児の遺伝的情報を高い確率で取得できる方法として注目を集めている。特許文献１には、胎児の母親由来のＤＮＡと胎児由来のＤＮＡの混合試料から測定された遺伝子型データ、および必要に応じて、母親および父親からの遺伝子型データを利用して妊娠中の胎児における染色体の倍数性状態を決定するための方法が記載されている。【０００４】
一方、母体の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが知られている。このような胎児細胞中のゲノムＤＮＡを再現性よく確実に分析することが可能となれば、流産の可能性のない、安全で、しかも直接胎児由来のＤＮＡを分析する出生前診断が実現できることとなる。【０００５】
しかし、母体の血液中に存在する胎児細胞（例えば、胎児有核赤血球）は、母体血の数ｍＬ中に１個程度しか存在しないことが理解されるようになったことから、胎児細胞を確実に取得する方法が種々検討されている。このような公知の技術を用いて希少な胎児細胞を確実に選別した場合に得られる胎児細胞の数は、高々数個、あるいは１つに限られる場合がある。【０００６】
細胞中のＤＮＡを増幅する増幅技術に関して、特許文献１には、複数のプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）により複数の関心対象座を増幅し、突然変異および染色体異常などの遺伝子疾患を検出する方法が記載されている。また、特許文献２には、胎児由来のゲノムＤＮＡの特定の配列を、高度多重標的化ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅し、シークエンサーで各標的遺伝子座における対立遺伝子頻度を決定する方法が開示されている。【０００７】
２つ以上の増幅対象領域を一つの反応系で同時に増幅する反応としてマルチプレックスＰＣＲが知られている。マルチプレックスＰＣＲは微量の血液から抽出される少量のＤＮＡから増幅対象領域を効率よく増幅し、多数のＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphisms：一塩基多型）をタイピングするのに有用な技術であることが知られている。特許文献３には、複数の増幅部位（ターゲット）を効率よく増幅できるマルチプレックスＰＣＲ用のプライマー設計方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００３／０７４７２３
【特許文献２】国際公開第２０１２／１０８９２０
【特許文献３】国際公開第２００８／００４６９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
胎児由来の有核赤血球を分離し、公知の技術を用いて、取得した細胞中のＤＮＡを分析して胎児の遺伝子状態を判定するためには、単一細胞からＤＮＡを抽出して解析に必要な量まで増幅を行う必要があり、全ゲノム増幅が行われる場合が多い。
しかし、全ゲノム増幅は、一細胞から抽出した微量のゲノムＤＮＡを飛躍的に増加させるという利点を有するものの、増幅領域により増幅倍率を一定に保つことが難しく、増幅によりＰＣＲ産物にバイアスがかかるという欠点があった。
そのため、全ゲノム増幅を行わなかったとしても、単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として目的領域のＰＣＲ増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態の判定をする方法が求められている。【００１０】
そこで、本発明は、目的領域のポリメラーゼ連鎖反応（PCR: Polymerase Chain Reaction）による増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態を判定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマーダイマー形成性の評価を、プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下で、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求め、求めたローカルアラインメントスコアに基づいて第１段階の選抜を行い、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求め、求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて第２段階の選抜を行い、第１段階および第２段階のいずれにおいても選抜されたプライマーを採用すると、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを得られることを知得し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（６）である。
（１）胎児の遺伝子状態を判定する方法であって、
ヒトゲノム上の領域から、上記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、
母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、
上記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、
上記単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読するＤＮＡシークエンシング工程と、
を備え、
ここで、上記目的領域選択工程は、上記単一細胞単離工程および上記ゲノムＤＮＡ抽出工程の両工程の前もしくは後に、または上記単一細胞単離工程および上記ゲノムＤＮＡ抽出工程の両工程と並行して行われ、
上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットは、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う第１段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う第２段階選抜工程と、
上記第１段階選抜工程および上記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第１段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法
によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法。
（２）上記目的領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するように設計されたプライマーセットが、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第１の標的領域を選択する、第１の標的領域選択工程と、
上記第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第１の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
上記第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
上記第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
上記第１の第１段階選抜工程および上記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
上記目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第２の標的領域を選択する、第２の標的領域選択工程と、
上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第２の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
上記第２のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
上記第２のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
上記第２の第１段階選抜工程および上記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記第１のローカルアラインメント工程および上記第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第２のローカルアラインメント工程および上記第２の第１段階選抜工程の両工程は、上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記標的領域が３箇所以上である場合は、上記第２の標的領域選択工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計方法によって設計される、上記（１）に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
（３）上記単一細胞単離工程において胎児由来の単一細胞を単離できるまで、少なくとも上記ゲノムＤＮＡ抽出工程から上記ＤＮＡシークエンシング工程までを繰り返す、上記（１）または（２）に記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
（４）上記遺伝子状態が染色体の数的異常である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
（５）上記ポリメラーゼ連鎖反応による増幅工程と上記ＤＮＡシークエンシング工程との間に、さらに、
上記目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を磁性ビーズを用いて精製する磁性ビーズ精製工程を備える、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
（６）上記ＤＮＡシークエンシング工程において、さらに、配列リード数を測定する、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の胎児の遺伝子状態を判定する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、目的領域のポリメラーゼ連鎖反応による増幅を均一かつ精度よく行える、胎児の遺伝子状態を判定する方法を提供することができる。【００１４】
また、本発明によれば、目的領域における遺伝子配列決定を、短い工程で、確実に、効率良く行えるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明における、プライマーおよびプライマーセットの設計方法を表すブロックダイアグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、概して、基板上に固定した細胞を剥離してゲノムＤＮＡを抽出し、増幅対象領域のＤＮＡ増幅を行って、胎児由来の有核赤血球の遺伝子状態を判定する技術に関する。より詳細には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅対象領域のＤＮＡ増幅を行う際に、プライマー間の相補性が低下するように設計したプライマーを用いてＤＮＡ増幅を行うことによって、作業工程を短くし、複数細胞間においてＰＣＲ増幅産物の量がばらつく課題を解決する技術に関するものである。
【００１７】
従来の非侵襲的出生前診断は、母体血液中に母親の無細胞ＤＮＡと混在して存在する胎児由来の無細胞ＤＮＡを分析する方法である。この方法は、胎児染色体の数的異常を検出する方法として有用であるが、母親の無細胞ＤＮＡと胎児由来の無細胞ＤＮＡが混在した状態で分析するため、数的異常以外の遺伝子状態を判定することが難しいという欠点を有する。これに対して、本発明は、胎児由来の単一細胞を解析する技術であり、検出領域には、既に公知である遺伝的多型部位および／または体細胞突然変異部位を含むことが可能であるので、数的異常に限らない遺伝子状態を判定することが可能である。
【００１８】
増幅産物の配列解析において、増幅産物を効率よく解析するためには、シークエンスライブラリーに混入するプライマーダイマーのような非特異産物を減少させて、精度よく増幅を行う必要がある。本発明では、ポリメラーゼ連鎖反応に使用するプライマーおよびプライマーセットの設計方法を改良し、単一細胞の非常に少ないＤＮＡからでも様々な遺伝子領域を均一に精度よく増幅し、確実に胎児の遺伝子異常の有無を検出することを可能にした。
【００１９】
以下、本発明の胎児の遺伝子状態を判定する方法について説明する。
【００２０】
本発明の胎児の遺伝子状態を判定する方法は、ヒトゲノム上の領域から、上記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する目的領域選択工程と、母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程と、上記単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出するゲノムＤＮＡ抽出工程と、上記単一細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、上記目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、上記目的領域をＰＣＲ増幅するＰＣＲ増幅工程と、上記目的領域のＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ塩基配列を解読するＤＮＡシークエンシング工程と、を備え、ここで、前記目的領域選択工程は、前記単一細胞単離工程および前記ゲノムＤＮＡ抽出工程の両工程の前もしくは後に、または前記単一細胞単離工程および前記ゲノムＤＮＡ抽出工程の両工程と並行して行われ、上記目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットは、後述する「〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉」において説明するプライマーおよびプライマーセットの設計方法によって設計される、胎児の遺伝子状態を判定する方法である。
【００２１】
〈目的領域選択工程〉
目的領域選択工程では、ヒトゲノム上の領域から、前記遺伝子状態を判定するための目的領域を選択する。
【００２２】
（ヒトゲノム上の領域）
本発明において「ヒトゲノム上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患および／またはがん等に関係する部位が存在するゲノムＤＮＡ上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、１塩基以上であればよい。
目的領域が選択されるヒトゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームＲＮＡ（Ribonucleic acid：リボ核酸）遺伝子およびトランスファーＲＮＡ遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、５’−リーダー配列および３’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
【００２３】
遺伝子多型は、例えば、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）、ＳＮＶ（Single Nucleotide Variant：一塩基変異）、ＳＴＲＰ（Short Tandem Repeat Polymorphism：縦列型反復配列多型）、ミューテーション、ならびに挿入および／または欠失（インデル）などである。
単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに／または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および／もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。
多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、ＳＮＰの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。
がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性（家族性）のがんが存在し、遺伝子腫瘍（家族性腫瘍）などと称される。
【００２４】
ヒトゲノム上の領域の数は特に限定されない。ヒトゲノム上の領域は、目的領域を選択する際の候補リストであり、膨大な数がリストされていたとしても、そのすべてについて解析しなければならないわけではないからである。
【００２５】
（目的領域）
目的領域は、上記ヒトゲノム上の領域から、遺伝子状態を判定する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、またはがん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は１つに限定されず、２つ以上の目的を有していてもよい。
【００２６】
目的領域として選択するヒトゲノム上の領域の数は、目的とする遺伝子状態により異なり、１箇所以上であれば特に限定されないが、好ましくは３箇所以上、より好ましくは５箇所以上、さらに好ましくは１０箇所以上である。
【００２７】
（遺伝子状態の判定）
単一遺伝子の異常が疾患の原因となるメンデル遺伝性疾患について、検出を所望する原因遺伝子をＯＭＩＭ（Online Mendelian Inheritance in Man：オンライン・ヒトメンデル遺伝形質）データベースから選択し、検査したい変異箇所の数のプライマーを設計する。設計したプライマーセットを用いて、胎児有核赤血球から抽出したゲノムＤＮＡの標的遺伝子領域を増幅し、増幅産物の塩基配列をシークエンサーで求める。解読した塩基配列を健常なリファレンスゲノムと比較したとき、遺伝子の欠失、重複、逆位および／または転座を認めた場合、胎児が遺伝子疾患を有すると予想される。
【００２８】
〈単一細胞単離工程〉
単一細胞単離工程では、母体血試料から単一細胞を単離する。
【００２９】
母体血試料は、母体（妊婦）から採取した血液試料であれば特に限定されないが、母体の末梢血が好ましい。母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球およびリンパ球等の白血球、ならびに核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球および胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後６週程度から母体血中に存在するといわれている。そのため、本発明では、妊娠後６週程度以降の妊婦の末梢血を検査することが好ましい。
【００３０】
単一細胞は、胎児由来のものであれば特に限定されないが、胎児由来の有核赤血球が好ましい。胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母親の血液中に存在する赤血球前駆体である。母親が妊娠中は、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個程度の割合で存在しているといわれており、妊婦の抹消血中の存在確率は非常に小さい。
【００３１】
（胎児有核赤血球の濃縮）
国際公開第２０１２／０２３２９８号に、胎児由来の有核赤血球を含めた母体の血球の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度である。一方、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度であり、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度であり、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度であり、好塩基球は１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度であり、リンパ球は１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度であり、単核球は１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。
【００３２】
単一細胞を単離する際の好ましい実施態様として、密度勾配遠心分離を用いて、胎児由来の有核赤血球を濃縮することが可能である。この態様で使用する、第一の媒体および第二の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、および／またはポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるヒストパック（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，シグマアルドリッチ社製）等の媒体を使用することができる。
本発明では、パーコールおよびヒストパックを使用することが好ましい。パーコールは、密度１．１３０ｇ／ｃｍ３（比重１．１３０）の製品が市販されており、希釈することによって、目的とする密度（比重）の媒体を調製することができる。また、ヒストパックは、密度１．０７７ｇ／ｃｍ３（比重１．０７７）の媒体および密度１．１１９ｇ／ｃｍ３（比重１．１１９）の媒体が市販されており、これらを混合することによって、目的とする密度（比重）の媒体を調製することができる。パーコールおよびヒストパックを使用することによって、第一の媒体および第二の媒体を調製することが可能である。
【００３３】
密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度である、胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、積層する媒体の密度が設定される。胎児由来の有核赤血球の中心密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この中心密度を挟む２つの異なる密度の媒体（第一の媒体および第二の媒体）を作成し、隣接して重層すると、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を有する画分を集めることが可能となる。好ましくは、第一の媒体の密度を１．０８０ｇ／ｍＬ以上、１．１００ｇ／ｍＬ以下に設定し、第二の媒体の密度を１．０６０ｇ／ｍＬ以上、１．０８０ｇ／ｍＬ以下に設定する。より好ましくは、第一の媒体の密度を１．０８０ｇ／ｍＬ以上、１．０９０ｇ／ｍＬ以下に設定し、第二の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上、１．０８０ｇ／ｍＬ以下に設定する。具体的な一実施態様としては、第一の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬに、および第二の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに、それぞれ設定して、血漿成分、好酸球および単核球を、回収する所望の画分から分離することが好ましい。また、このように設定することによって、赤血球、好中球およびリンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第一の媒体および第二の媒体は、同じ種類の媒体であってよいし、異なる種類の媒体であってもよいが、好ましくは同じ種類の媒体である。
【００３４】
（有核赤血球候補の単離）
母体の血液から有核赤血球候補を取得するために、血液を基板上に塗布して乾燥させ、血球細胞を塗抹した基板（血球細胞標本）を作製することが可能である。この基板としては、透明媒体を用いることが好ましく、スライドガラスを用いることがより好ましい。
【００３５】
血球細胞標本から得られる血球細胞の形態情報に基づいて、胎児由来の有核赤血球候補を選別することが可能である。好ましい実施態様としては、細胞の、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合いおよび／または核領域の面積等を利用して、胎児由来の有核赤血球候補を選別することが可能である。特に、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合または核の円形度合いが条件を満足する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。
【００３６】
一例として、本発明では、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合「Ｎ／Ｃ」が下記式（１）を満足する細胞を選別することが好ましい。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０          ・・・（１）
ただし、式（１）中、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「Ｃ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積である。
【００３７】
別の一例として、本発明では、核の長径の長さの平方に対する核領域の面積の割合「Ｎ／Ｌ２」が下記式（２）を満足する細胞を選別することが好ましい。
０．６５＜Ｎ／Ｌ２＜０．７８５    ・・・（２）
ただし、式（２）中、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「Ｌ」は画像解析する細胞の核の長径の長さ、すなわち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円の長径の長さである。
【００３８】
細胞の形態情報を用いて胎児由来の有核赤血球候補を選別するシステムは、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理ＰＣ、制御ＰＣ、およびディスプレイを装備している。光学搬送系は、対物レンズおよびＣＣＤカメラを備える。画像処理ＰＣは、データ解析およびデータ記憶を行う処理系を備える。制御ＰＣは、スライドガラス用のステージの位置制御および全体の処理を制御する制御系を備える。
【００３９】
人を含むすべての脊椎動物の血液中にある赤血球に存在する蛋白質がヘモグロビンである。有核赤血球は、血液中の有核細胞の１種である白血球とはヘモグロビンの有無が異なる。ヘモグロビンは、酸素と結合した場合、鮮明な赤色を呈する酸化ヘモグロビン、酸素と結合していない場合、暗赤色を呈する還元ヘモグロビンであり、動脈中および静脈中には、酸素結合量が異なるヘモグロビンが流れている。ヘモグロビンは、３８０ｎｍ〜６５０ｎｍに吸収を持つため、この波長領域の吸光度の違いに起因する少なくとも１つの単色光の情報でヘモグロビンを検出することが可能である。ヘモグロビンの存在を確認するには単色光を用いることが好ましく、ヘモグロビンの吸収が大きい４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長領域の単波長の光、または５２５ｎｍ〜５８０ｎｍの波長領域の単色光を選択することができる。これらの波長領域の吸収係数は、ヘモグロビンが存在することで高い値を示すため、白血球の細胞質の吸収係数との比は１以上となる。
【００４０】
実施態様として、円形に近い細胞核が存在する細胞で、しかもヘモグロビンを有する細胞を、有核赤血球の候補として識別することが可能である。さらに、胎児由来の有核赤血球および成人由来の有核赤血球は、胎児のヘモグロビンがヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）であり、成人のヘモグロビンがヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）であることから、異なる酸素結合能力により生じる分光特性の差異を利用して、胎児由来の有核赤血球を選別することが可能である。
【００４１】
細胞質の吸収係数を測定する場合には、顕微分光光度計を用いることができる。顕微分光光度計は、通常の分光光度計と同じ原理を、顕微鏡の光学系を利用する光度計であり、市販の装置を使用することが可能である。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様では、マイクロマニュピュレーターにより透明基板上から単一の細胞を剥離して細胞を取得することが可能である。
【００４３】
細胞の形態情報および／または吸光度のみによっては、単離した有核赤血球が胎児由来であるか、または母体（妊婦）由来であるかの確定をすることができない場合がある。しかし、本発明においては、ＳＮＰおよび／またはＳＴＲ（Short Tandem Repeat：短鎖縦列反復配列）等による多型解析、ならびにＹ染色体の存在の確認など、ＤＮＡ解析によって、単離した有核赤血球の由来を判別することができる。ＤＮＡ解析は、後述のＤＮＡシークエンシング工程の「（胎児有核赤血球の同定）」において説明するとおり、遺伝子状態の判定と同時に行うことが可能である。
【００４４】
〈ゲノムＤＮＡ抽出工程〉
ゲノムＤＮＡ抽出工程では、上記「〈単一細胞単離工程〉」において単離した単一細胞からゲノムＤＮＡを抽出する。
【００４５】
〈ＰＣＲ増幅工程〉
ＰＣＲ増幅工程では、上記「〈ゲノムＤＮＡ抽出工程〉」において抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセットを用いて、前記目的領域をＰＣＲ増幅する。なお、「目的領域をＰＣＲ増幅するように設計されたプライマーセット」の設計方法については、後述する「〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉」において、詳細に説明する。
【００４６】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
ポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型ＤＮＡを繰り返し複製させる。増幅させるＤＮＡ塩基配列の始めと終わりの部分で鋳型ＤＮＡとハイブリダイズする短いＤＮＡプライマーを加えてポリメラーゼにより複製を開始する。複製を繰り返すたびに鋳型２本鎖ＤＮＡの２本の鎖が解離し別々に複製される。
【００４７】
マルチプレックスＰＣＲは、一般的なＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが可能であるが、夫々のプライマー対が鋳型ＤＮＡにアニーリングする温度が異なる為、反応条件の検討が必要な場合がある。そのため、マルチプレックスＰＣＲに最適化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファーを用いることが好ましく、本発明では、マルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）を用いて反応することがより好ましい。
【００４８】
プライマーおよびプライマーセットの設計方法についての詳細は後述するため、ここでは、例示として、１３番、１８番および／または２１番染色体の異数性を検出する場合の概略を述べる。
目的領域の数は、１３番、１８番および／または２１番染色体の異数性を検出する場合では、上記染色体に特異的なＤＮＡ配列領域から、検査に応じて必要とする箇所の標的領域を選択して、各標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成し、プライマー塩基配列間の相補性が低いものを選抜することによって、単一細胞のような微量のゲノムＤＮＡに対しても目的領域の増幅性が非常に改良される。
【００４９】
次世代シークエンサー技術は飛躍的に進化しているものの、シークエンス解析に用いるサンプルの調製は非常に複雑な工程が必要となる。サンプルの前処理は、最も広く応用されているゲノム解析の場合、サンプルから核酸の抽出後、（１）ＤＮＡの断片化、（２）ＤＮＡサイズセレクション、（３）ＤＮＡ末端の平滑化処理、（４）ＤＮＡ末端へのアダプター配列の付加、（５）ＤＮＡの精製、および（６）ＤＮＡの増幅というプロセスを必要とする。
【００５０】
複雑なサンプル調整工程は時間および労力を要し、工程が適切に行われていることを確認しなければならない。また、各工程においてバイアスが生じていくため、特に結果の精度および確度を高いレベルで要求される医療現場での診断ツールとしての使用に際しては、このバイアスを減らす必要がある。
【００５１】
これらを解決するために、本発明においては、後述する特定の方法を用いて設計したプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことによって、遺伝子状態を判別するために選択した目的領域のより均一な増幅が可能となる。さらに、ＰＣＲ産物を磁性ビーズにより精製することによって、より効果的な増幅産物の回収が可能となる。ＰＣＲ反応溶液中には、余剰のプライマー、ｄＮＴＰｓ（Deoxynucleotides：デオキシヌクレオチド）、および酵素等の夾雑物が残留しているため、高精度のシークエンスデータを得る際の障害となる場合がある。しかし、ＰＣＲ増幅産物を、磁性ビーズを用いて精製することによって、ＰＣＲ増幅産物の損失を著しく抑制しながら、十分な精製を行うことができる。この場合、単一細胞の非常に少ないＤＮＡからでも、（１）ＤＮＡの増幅、および（２）ＤＮＡの精製という、シンプルなサンプル調整工程のみで、様々な遺伝子領域を均一に精度よく増幅し、確実に胎児の遺伝子異常の有無を検出する方法を用いることが好ましい。
【００５２】
増幅されたＤＮＡの量の測定は、例えば、２６０ｎｍの波長の吸収度を測定する超微量分光光度計ナノドロップ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、レーザー蛍光検出法を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（アジレント社製）、または蛍光法により２本鎖ＤＮＡを定量するＱｕａｎｔｕｓフルオロメーター（プロメガ社製）等を用いて行うことが可能である。
【００５３】
〈ＰＣＲ増幅産物の精製工程〉
ＰＣＲ増幅産物を含む反応液には、酵素、ヌクレオチド、塩類、およびその他不純物が混在するため、それらを除去することが好ましい。
核酸の精製方法としては、例えば、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた方法、カオトロピック塩の存在下でシリカメンブレンフィルタなどのシリカ担体に選択的に吸着させる方法、およびＰＥＧ（Polyethylene glycol：ポリエチレングリコール）存在下においてカルボキシル基で修飾された磁性ビーズに核酸が選択的に結合する現象を利用した方法などが知られている。
本発明の好ましい実施態様として、マルチプレックスＰＣＲ増幅産物は、磁性ビーズを利用した精製法を選択することができる。
【００５４】
（磁性ビーズ精製工程）
ＰＣＲ増幅産物を、常磁性微小ビーズである磁性ビーズを利用した精製を行うことによって、さらに効率的に目的領域のみの解析を可能とすることができる。磁性ビーズを利用した精製方法は、磁性ビーズの粒子表面に核酸を可逆的に結合させ、磁性ビーズをマグネットで吸着し、増幅したＤＮＡ断片と液体とを分離することによって、効率よく酵素、ｄＮＴＰｓ、ＰＣＲプライマー、プライマーダイマー、および塩などの夾雑物を除去することができる。磁性ビーズを利用した方法は、他の精製方法と比較して、サンプルロスが少なく、かつ、夾雑物の除去効率が高い。その結果として、ＤＮＡシーケンス工程において、効率的に目的領域のみの解析を行うことが可能となる。
磁性ビーズは市販されており、例えば、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキット（ベックマンコールター社製）、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（タカラバイオ社製）、またはＥｐｉＮｅｘｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＨＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（エピジェンテック社製）等を用いることができる。なかでも、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキット（ベックマンコールター社製）を用いて精製することが好ましい。
【００５５】
〈ＤＮＡシークエンシング工程〉
ＰＣＲ増幅産物の配列解析には、次世代シークエンサー、特に、ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いることが望ましい。複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を次世代シークエンサー「ＭｉＳｅｑ」を用いてシークエンシングする場合、それぞれのマルチプレックスＰＣＲ産物に６〜８塩基で構成されるサンプル識別配列（インデックス配列）ならびにＭｉＳｅｑフローセル上のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションさせるためのＰ５配列およびＰ７配列を付加する必要がある。これらの配列の付加により、最大９６種類のマルチプレックスＰＣＲ産物を１回で測定することが可能である。
インデックス配列、Ｐ５配列およびＰ７配列をマルチプレックスＰＣＲ産物の両末端へ付加する方法としては、アダプターライゲーション法またはＰＣＲ法などを用いることが可能である。
【００５６】
また、複数のマルチプレックスＰＣＲ産物を混合してＭｉＳｅｑで測定する場合には、それぞれのＰＣＲ産物を正確に定量することが望ましい。ＰＣＲ産物の定量方法としては、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ（アジレント社製）またはＱｕａｎｔｕｓフルオロメーター（プロメガ社）を用いることも可能であるが、マルチプレックスＰＣＲ産物を定量ＰＣＲ法で測定する方法がさらに好ましい。本発明での定量方法としては、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（日本ジェネティクス社製）を用いて定量することが好ましい。
ＭｉＳｅｑで得られたシーケンスデータを解析する方法としては、ＢＷＡ（Burrows-Wheeler Aligner；バーロウズ−ホィーラー・アライナー：Li, H.、外1名、「Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第14号、ｐ．1754-1760.；Li, H.、外1名、「Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第5号、ｐ．589-595）を用いて既知のヒトゲノム配列へマッピングすることが好ましく、遺伝子異常を解析する手段としては、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Li, Heng、外、「The Sequence Alignment/Map format and SAMtools」、Bioinformatics、2009年、第25巻、第16号、ｐ．2078-2079；ＳＡＭは“Sequence Alignment/Map”に由来する。）、および／またはＢＥＤｔｏｏｌｓ（Quinlan, A. R.、外1名、「BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features」、Bioinformatics、2010年、第26巻、第6号、ｐ．841-842）を用いることで遺伝子の変異や染色体数の定量を解析することが好ましい。
【００５７】
（配列リード数の決定）
ＤＮＡシークエンシング工程においては、さらに、配列リード数を測定することが望ましい。
例えば、胎児有核赤血球の細胞が同定され、標的領域をＰＣＲ増幅して得たＤＮＡ断片に対して、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求めることができる。基準（あるいは参照）として、母親由来の有核赤血球の細胞と同定された細胞の、あらかじめ決定された１４０ｂｐ以上１８０ｂｐ以下の領域の配列を有する増幅産物の増幅量（配列リード数）をシークエンサーで求める。胎児が正常な状態であれば、胎児由来の増幅産物の増幅量（配列リード数）と、母親由来の増幅産物の増幅量（配列リード数）とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。胎児が増幅した染色体由来のトリソミーである疾患を有する場合には、その比は、１：１．５（または２：３）となることが予想される。
【００５８】
本発明においては、あらかじめ、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母親由来のＰＣＲ増幅産物の量（配列リード数）に対する胎児由来のＰＣＲ増幅産物の量（配列リード数）の比を複数求め、その分布を求める。また、トリソミーの胎児を妊娠した場合の母親由来の増幅産物の量（配列リード数）に対する胎児由来の増幅産物の量（配列リード数）の比を複数求め、その分布を求める。この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定することもできる。この、あらかじめ決定したカットオフ値と、増幅産物の比を求めた結果とを比較して、その比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである、と検査結果を解釈することも可能である。
【００５９】
結果が得られない場合には、母体血試料から単一細胞を単離する単一細胞単離工程に戻って、再度、本発明の方法を実施してもよい。
【００６０】
（単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認）
単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認を行って、胎児由来の単一細胞の遺伝子状態の判定を行ったことを確定させてもよい。
妊娠母体から採取した抹消血の有核赤血球には、母親由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球が混在していることが知られており、本発明の方法は胎児の遺伝子状態を判定しながら、胎児由来の有核赤血球を同定することができる。遺伝子配列の個人差を識別する方法としては、一般的に、対立遺伝子に存在する遺伝子多型を検出する方法で行われている。一例として、父子判別には、遺伝子多型の一種にＳＴＲも使用することができる。また、個人差を識別する方法として、ゲノム塩基配列中の一塩基が変異し、１％以上の頻度で観察されるＳＮＰｓも使用することができる。本発明では、次世代シークエンサーを用いて、有核赤血球の中に、異なるＳＴＲまたはＳＮＰｓを有する細胞の有無により、胎児細胞と、母親細胞を識別することもできる。また、別に遺伝子状態の判定に補助的な情報を使って、胎児由来の有核赤血球か否かを判定するには、例えば、母親由来の白血球を取得して、同様にＳＴＲまたはＳＮＰｓを分析することによって、行うことができる。
【００６１】
また、有核赤血球を採取する前に超音波検査で胎児が男児であると確認されている場合であれば、採取した有核赤血球のＹ染色体の有無を検出することによって、有核赤血球が胎児由来であるか否かを判定することができる。一般的に、採取した細胞のＹ染色体の有無を検出する方法としては、Ｙ染色体特異的な蛍光プローブを用いるＦＩＳＨ（Fluorescent in situ hybridization：蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）法が知られている。一例としては、ＣＥＰ  Ｘ／Ｙ  ＤＮＡプローブキット（アボット社製）が使用されている。本発明では、Ｙ染色体に特異的な塩基配列を持つプライマーを作製しＰＣＲを用い、その増幅有無を確認することで男児の胎児由来の有核赤血球であることを同定することが好ましい。
【００６２】
〈プライマーおよびプライマーセットの設計方法〉
本発明の特徴的な点の一つである、プライマーおよびプライマーセットの設計方法は、概していえば、複数の特定の標的領域を選択し、近傍の塩基配列を検索し、抽出済プライマーセットの各々との相補性を確認し、相補性の少ない塩基配列を選択することによって、標的領域を増幅対象に含み、かつ互いに相補的にならないプライマー群を得る。プライマー配列の相補性の確認は、ローカルアライメントを用いて配列全体の相補性が低くなるように、かつ、プライマー配列の端部に対して、グローバルアライメントを用いて相補性が低くなるようにプライマー群を作成する点に特徴がある。以下に詳細に説明する。
【００６３】
本発明における、プライマーおよびプライマーセットの設計方法の第１の態様は、以下の工程を備える。
（ａ）目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
（ｂ）上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
（ｃ）上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
（ｄ）上記（ｃ）ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う第１段階選抜工程と、
（ｅ）上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
（ｆ）上記（ｅ）グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う第２段階選抜工程と、
（ｇ）上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と、
を備え、
ここで、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
【００６４】
本発明におけるプライマーおよびプライマーセットの設計方法の第１の態様の各工程について詳細に説明する。
【００６５】
（ａ）標的領域選択工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）標的領域選択工程」として示す。
標的領域選択工程は、目的領域選択工程において、ヒトゲノム上の領域から選択された胎児の遺伝子状態を判定するための目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する標的領域を選択する工程である。
【００６６】
（標的領域）
標的領域は、上記目的領域から、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する対象として選択された領域である。
【００６７】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型ＤＮＡからＤＮＡを合成する反応である。細胞内でのＤＮＡ合成とは異なり、ＰＣＲでは、ＤＮＡを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが１種類以上、通常は２種類以上、必要となる。１つのＰＣＲ反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
ＰＣＲは、１ペアのプライマーセットを用いて１つの領域を増幅する単純な系から、複数ペアのプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系（マルチプレックスＰＣＲ）まで、容易に拡張することができる。
ＰＣＲの利点は、ヒトのゲノム（３０億塩基対）のような非常に長大なＤＮＡ分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、ＰＣＲの利点としては、プログラムにもよるが、概ね、増幅に要する時間が２時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、ＰＣＲの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
【００６８】
（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
【００６９】
標的領域の近傍領域とは、標的領域の５’端から外側の領域、および標的領域の３’端から外側の領域を総称していう。標的領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
【００７０】
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、Ｔｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度である。Tmはmelting temperatureに由来する。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
【００７１】
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは２０ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、さらに好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
【００７２】
ＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
【００７３】
Ｔｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
Ｔｍ値は、OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights社製)、または Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
【００７４】
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
【００７５】
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
【００７６】
（特異性チェック工程）
所望により、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、ゲノムＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、ゲノムＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
【００７７】
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
【００７８】
スコアリング・システム、およびローカルアラインメントスコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基（マッチ）＝＋１、非相補塩基（ミスマッチ）＝−１、挿入および／または欠失（ギャップペナルティ）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定することが考えられる。
【００７９】
プライマー候補の塩基配列がゲノムＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、標的領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
【００８０】
（ｃ）ローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した２つの塩基配列からなるペアのすべてについて、比較する部分配列が前記塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
【００８１】
ローカルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
【００８２】
なお、後述する（ｅ）グローバルアラインメント工程および（ｆ）第２段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、（ｆ）第２段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する（ｄ）第１段階選抜工程を行ってもよい。
【００８３】
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアライメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【００８４】
【表１】
0006502477.tif 000002
【００８５】
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表１に示すとおりとする。
【００８６】
【表２】
0006502477.tif 000003
【００８７】
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリックス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
【００８８】
【表３】
0006502477.tif 000004
【００８９】
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。
【００９０】
【表４】
0006502477.tif 000005
【００９１】
マッチ（＋１）×９、ミスマッチ（−１）×９、インデル（−３）×０なので、ローカルアラインメントスコアは「±０」である。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【００９２】
（ｄ）第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第１段階選抜工程」として示す。
第１段階選抜工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う工程である。
【００９３】
ローカルアラインメントスコアの閾値（第１の閾値）を予め設定しておく。
ローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
【００９４】
ここで、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程に示した例において、第１の閾値を「３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「±０」であり、第１の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
【００９５】
なお、本工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
【００９６】
（ｅ）グローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した２つの塩基配列からなるペアのすべてについて、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
【００９７】
グローバルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
【００９８】
なお、上述した（ｃ）ローカルアラインメント工程および（ｄ）第１段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、（ｄ）第１段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する（ｆ）第２段階選抜工程を行ってもよい。
【００９９】
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【０１００】
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字部分。「３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列」に該当する。）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表１に示すとおりとする。
【０１０１】
【表５】
0006502477.tif 000006
【０１０２】
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。
【０１０３】
【表６】
0006502477.tif 000007
【０１０４】
マッチ（＋１）×０、ミスマッチ（−１）×３、インデル（−３）×０なので、グローバルアラインメントスコアは「−３」である。
【０１０５】
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【０１０６】
（ｆ）第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第２段階選抜工程」として示す。
第２段階選抜工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う工程である。
【０１０７】
グローバルアラインメントスコアの閾値（第２の閾値）を予め設定しておく。
グローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
【０１０８】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアを第２の閾値未満とすることができる。
【０１０９】
ここで、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程に示した例において、第２の閾値を「３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
【０１１０】
なお、本工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
【０１１１】
上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
【０１１２】
また、計算量を低減させるため、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆ）第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１１３】
これは、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアライメントスコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアライメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
【０１１４】
（増幅配列長チェック工程）
所望により、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
【０１１５】
（ｇ）プライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
【０１１６】
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
【０１１７】
【表７】
0006502477.tif 000008
【０１１８】
既に記載したように、ローカルアラインメントスコアは「±０」であり、第１の閾値である「３」未満である。そして、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
【０１１９】
本発明における、プライマーおよびプライマーセットの設計方法の第２の態様は、以下の工程を備える。
（ａ１）目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第１の標的領域を選択する、第１の標的領域選択工程と、
（ｂ１）上記第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第１の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
（ｃ１）上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
（ｄ１）上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
（ｅ１）上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
（ｆ１）上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
（ｇ１）上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
さらに、
（ａｎ）目的領域選択工程で選択した遺伝子状態を判定するための目的領域からポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを設計する第ｎの標的領域を選択する、第ｎの標的領域選択工程と、
（ｂｎ）上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第ｎの標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程と、
（ｃｎ）上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第ｎのローカルアラインメント工程と、
（ｄｎ）上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第ｎの第１段階選抜工程と、
（ｅｎ）上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第ｎのグローバルアラインメント工程と、
（ｆｎ）上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第ｎの第２段階選抜工程と、
（ｇｎ）上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第ｎのプライマー採用工程。
ただし、ｎは２以上の整数であり、ｎが目的領域選択工程で選択した目的領域の数に到達するまで、上記（ａｎ）第ｎの標的領域選択工程から上記（ｇｎ）第ｎのプライマー採用工程までの各工程をすべての標的領域について、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す。
ここで、上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程および上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
【０１２０】
本発明におけるプライマーおよびプライマーセットの設計方法の第２の態様の各工程について詳細に説明する。
【０１２１】
（ａ１）第１の標的領域選択工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）標的領域選択工程」として示す。
目的領域の１つを第１の標的領域として選択する点を除いて、前述した第１の態様の「（ａ）標的領域選択工程」と同様である。
【０１２２】
（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記（ａ１）第１の標的領域選択工程において選択した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
【０１２３】
（特異性チェック工程）
本発明の設計方法の第１の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【０１２４】
（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）ローカルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｃ）ローカルアラインメント工程」と同様である。
【０１２５】
（ｄ１）第１の第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第１段階選抜工程」として示す。
上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｄ）第１段階選抜工程」と同様である。
【０１２６】
（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）グローバルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｅ）グローバルアラインメント工程」と同様である。
【０１２７】
（ｆ１）第１の第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第２段階選抜工程」として示す。
上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｆ）第２段階選抜工程」と同様である。
【０１２８】
本発明の設計方法の第１の態様と同様に、上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程および上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
【０１２９】
また、計算量を低減させるため、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程および上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１３０】
（増幅配列長チェック工程）
第１の態様における「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【０１３１】
（ｇ１）第１のプライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー採用工程」として示す。
上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｇ）プライマー採用工程」と同様である。
【０１３２】
本発明の第２の態様では、第１の標的領域を増幅するためのプライマーを設計した後、第ｎ（ｎは２以上の整数）の標的領域を増幅するためのプライマーを設計する。
【０１３３】
（ａｎ）第ｎの標的領域選択工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの標的領域選択工程」として示す。
目的領域のうち第（ｎ−１）標的領域選択工程までに選択されていないものから１つの目的領域を第ｎの標的領域として選択する点を除いて、前述した第１の態様の「（ａ）標的領域選択工程」と同様である。
なお、第ｎの標的領域の選択は、第（ｎ−１）の標的領域の選択と同時に、またはその後に、することができる。ここで、ｎは２以上の整数である。
【０１３４】
（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記（ａｎ）第ｎの標的領域選択工程において選択した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
【０１３５】
（特異性チェック工程）
本発明の設計方法の第１の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【０１３６】
（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのローカルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｃ）ローカルアラインメント工程」と同様である。
ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第１の標的領域から第（ｎ−１）の標的領域までのそれぞれの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である（以下同じ）。
【０１３７】
（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第１段階選抜工程」として示す。
上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｄ）第１段階選抜工程」と同様である。
【０１３８】
（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｅ）グローバルアラインメント工程」と同様である。
【０１３９】
（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第２段階選抜工程」として示す。
上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｆ）第２段階選抜工程」と同様である。
【０１４０】
なお、本発明の設計方法の第１の態様と同様に、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
【０１４１】
また、計算量を低減させるため、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【０１４２】
（増幅配列長チェック工程）
本発明の設計方法の第１の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【０１４３】
（ｇｎ）第ｎのプライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー採用工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｇ）プライマー採用工程」と同様である。
【０１４４】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１４５】
［実施例１］
〈目的領域選択〉
１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体およびＸ染色体上のＳＮＰを表８に、Ｙ染色体に特異的な領域を表９に示す。【０１４６】
【表８】
0006502477.tif 000009
【０１４７】
【表９】
0006502477.tif 000010
【０１４８】
〈単一細胞単離〉
（末梢血液試料取得）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid：エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、妊婦のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。【０１４９】
（有核赤血球の濃縮）
パーコール液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用して、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の液および密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液２ｍＬを添加し、冷蔵庫で４℃に３０分冷却した。
その後、冷蔵庫から遠沈管を取り出し、密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の液２ｍＬを重層した。
その後、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）の媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。
その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。
遠沈管を取り出し、密度１．０７０（ｇ／ｃｍ３）と密度１．０９５（ｇ／ｃｍ３）の液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。
このように採取した血液の画分を、片手でスライドガラス基板１を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を点着した。もう一方の手で別のスライドガラス基板２を持ち、１端をスライドガラス基板１に３０°の角度で接触させ、スライドガラス基板２の接触した面を血液の画分に触れることで、毛管現象により２枚のガラスに囲まれた空間に血液が広がった。
次に、角度を保ったまま、スライドガラス基板２をスライドガラス基板１の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、スライドガラス基板１上に血液を均一に塗布した。塗布終了後、送風により、１時間以上、十分に乾燥させた。このガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸緩衝液に浸漬して洗浄後、リン酸緩衝液で希釈して濃度３％としたギムザ染色液に１０分浸漬した。
その後、純水で洗浄し、乾燥させて、染色済みのガラス基板を複数枚作製した。【０１５０】
（細胞の形態情報により有核赤血球を識別する）
スライドガラス基板上に塗布した細胞から、有核赤血球候補を選別するため、電動ＸＹステージと、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、Ｚ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上述したとおり準備した、スライドガラス基板上に塗布した血液細胞をＸＹステージに乗せて、スライドガラス上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により目的の細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の２つの条件を満たす細胞を検出し、ＸＹ位置を記録した。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０            ・・・（１）
０．６５＜Ｎ／Ｌ２＜０．７８５       ・・・（２）
ここで、「Ｎ」は画像解析を行う細胞の核領域の面積であり、「Ｃ」は画像解析を行う細胞の細胞質の面積であり、「Ｌ」は画像解析する細胞の核の長径の長さである。なお、細胞の核の長径の長さは、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径の長さと定義した。
スライドガラス基板上に存在する有核赤血球から、上記式（１）および（２）を満たすものを選択し、次の工程の有核赤血球候補とした。【０１５１】
（胎児有核赤血球の選別）
細胞の形態情報により有核赤血球を識別する工程で識別した有核赤血球の候補について、顕微分光装置を用いて、分光情報の解析を行った。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補を特定し、そのうちの１つの細胞に対して、４１５ｎｍ近傍の単色光を照射し、その細胞の吸収係数を測定した。
次に、その細胞の近傍にある核の形状が上記（２）式を満たさない白血球について、有核赤血球の候補に最も近い細胞から３個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、吸収係数を計算し、平均の吸収係数２を計算した。
スライドガラス基板上の有核赤血球候補の残りの細胞に対しても上記と同様に、吸収係数を測定し、それぞれの細胞の近傍の白血球３個に対して、吸収係数の平均値を算出した。これらの結果から、白血球の平均の吸収係数に対する有核赤血球候補の吸収係数の比が１以上となる細胞を抽出した結果、明らかに１以上である細胞が８個検出された。【０１５２】
（細胞回収）
上述したとおり決定された８個の細胞を、マイクロマニュピュレーターを使用して回収した。【０１５３】
〈ゲノムＤＮＡ抽出〉
採取した単一細胞に対して、Single Cell WGA kit（New England Biolabs社製）を用いて細胞溶解を行った。具体的には、キット付属の説明書の「Sample Preparation Methods」および「Pre-Amplification Protocol」の記載に従って、各単一細胞を５μＬの Cell extraction buffer に混合した後、４．８μＬの Extraction Enzyme Dilution Buffer および０．２μＬの Cell Extraction Enzyme を混合して総液量を１０μＬとし、７５℃で１０分間インキュベートした後、さらに９５℃で４分間のインキュベートを行った。
これにより、ゲノムＤＮＡを調製した。【０１５４】
〈ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットの設計〉
（プライマーの作製）
胎児細胞の由来および染色体の数的異常を分析する目的で、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体上の領域から２５個所の標的領域を選択した。各標的領域について、当該標的領域を増幅するためのプライマーセットを、配列長２０ｂｐであり、Ｔｍ値が５６〜６４℃の範囲内であり、かつ、ＰＣＲ増幅産物のサイズが１４０〜１８０塩基対の範囲内となるように設計し、これらの中から、各プライマー間の３’末端固定のローカルアラインメントスコアが３未満、かつ、各プライマーの３’末端３塩基のグローバルアラインメントスコアが０となるプライマーセットを２５セット選抜した（表１０）。【０１５５】
【表１０】
0006502477.tif 000011
【０１５６】
（シングルプレックスＰＣＲによる増幅の確認）
作製した各プライマーセットが標的領域を増幅できることを確認するため、シングルプレックスＰＣＲにより増幅の確認を行った。
具体的には、調製したゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ）  ２μＬ、プライマーミックス  ２μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス２  １２．５μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス１  ０．１２５μＬ、および水  適量を混合して、最終液量  ２５μＬの反応溶液を調製した。なお、上記プライマーミックスは１つのプライマーセットを構成する各プライマーをそのプライマーの終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃  ６０秒を行った後、熱変性９４℃  ３０秒、アニーリング６０℃  ９０秒、および伸長反応７２℃  ３０秒のサーマルサイクルを３０サイクル繰り返して、シングルプレックスＰＣＲを行った。
シングルプレックスＰＣＲを行った反応溶液の一部をアガロースゲル電気泳動にかけ、増幅の有無を確認した。【０１５７】
〈ポリメラーゼ連鎖反応による増幅〉
シングルプレックスＰＣＲによる増幅が確認できた２５種類のプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行った。
具体的には、調製したゲノムＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ）  ２μＬ、２５セットプライマーミックス  ２μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス２  １２．５μＬ、マルチプレックスＰＣＲミックス１  ０．１２５μＬ、および水  適量を混合して、最終液量  ２５μＬの反応溶液を調製した。なお、上記２５セットプライマーミックスは、シングルプレックスＰＣＲによる増幅が確認できた２５種類のプライマーセットを構成する各プライマーをその終濃度が５０ｎＭとなるように混合したものであり、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。
調製した反応溶液を用いて、初期熱変性９４℃  ６０秒を行った後、熱変性９４℃  ３０秒、アニーリング６０℃  ９０秒、および伸長反応７２℃  ３０秒のサーマルサイクルを３０サイクル繰り返して、マルチプレックスＰＣＲを行った。【０１５８】
（ＰＣＲ産物の精製）
得られたマルチプレックスＰＣＲ産物は、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキット（ベックマンコールター社製）を用いて精製された。反応溶液  ２５μＬに、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ４５μＬを加え、磁性ビーズにＰＣＲ反応産物を結合させた。磁性ビーズをマグナスタンド（Magna Stand)（日本ジェネティクス社製）の磁力で分離し、夾雑物を除いた。７０％エタノールで洗浄後、磁性ビーズに結合した核酸をＴＥ（Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethane ) - EDTA：トリス−エチレンジアミン四酢酸）緩衝液で溶出した。【０１５９】
（インデックス配列およびフローセル結合用配列の付加）
ＭｉＳｅｑ（イルミナ社製）を用いてシーケンス反応を行うため、サンプル識別用のインデックス配列、ならびにフローセル結合用のＰ５配列およびＰ７配列を、マルチプレックスＰＣＲ産物の両末端に付加した。プライマーとして、各１．２５μＭのP5_F(D501)およびP7_R(D701〜D705)（表１１に示す。）を用い、マルチプレックスＰＣＲ産物、マルチプレックスＰＣＲミックス１、マルチプレックスＰＣＲミックス２および水と混合して反応溶液を調製し、初期熱変性９４℃  ３分の後、熱変性９４℃  ３０秒、アニーリング５０℃  ６０秒および伸長反応７２℃  ３０秒のサーマルサイクルを５サイクル、さらに、熱変性９４℃  ４５秒、アニーリング  ５５℃  ６０秒および伸長反応７２℃  ３０秒のサーマルサイクルを１１サイクル行った。なお、上記マルチプレックスＰＣＲミックス１および上記マルチプレックスＰＣＲミックス２はマルチプレックスＰＣＲアッセイキット（タカラバイオ社製）に含まれる試薬である。【０１６０】
【表１１】
0006502477.tif 000012
【０１６１】
得られたＰＣＲ産物は、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキットを用いて精製し、正確な増幅産物の定量として、ＫＡＰＡライブラリー定量キット（日本ジェネティクス社製）を用いて定量を行った。【０１６２】
〈ＤＮＡシークエンシング〉
単一細胞由来のマルチプレックスＰＣＲ産物を、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ２  ３００  Ｃｙｃｌｅ（イルミナ社製）を用いてシーケンスを行い、得られたＦａｓｔＱファイルを、ＢＷＡ（Burrows-Wheeler Aligner：バーロウズ−ホィーラー・アライナー）を用いてヒトゲノム配列（ｈｇ１９）へマッピングを行い、ＳＡＭｔｏｏｌｓにより遺伝子多型情報を抽出し、ＢＥＤｔｏｏｌｓにより各検出領域のシーケンスリード数を算出することで解析を行った。【０１６３】
（単離した有核赤血球細胞が胎児由来であるか否かの確認）
各細胞から増幅したＰＣＲ増幅産物の、１３番、１８番および２１番染色体のＳＮＰを比較することによって、８個の細胞のうち、１個の細胞が異なるＳＮＰ情報を有することが確認出来た。別途、核の形状より白血球と予想される細胞を、マイクロマニュピュレーターを用いて、血液を塗布したスライドガラス上から回収し、８個の細胞の増幅時に使用したプライマーを用いて、同様にしてＤＮＡを増幅し、ＳＮＰを調べたところ、７個の細胞のＳＮＰと一致することが確認された。以上より、１個の細胞が胎児由来の有核赤血球細胞と確定し、７個の細胞が、母親由来の有核細胞であることが確認された。また、Ｙ染色体の情報が得られなかったことから胎児は女児であることが確認された。【０１６４】
（増幅産物の量（配列リード数）の測定）
マルチプレックスＰＣＲ増幅産物の配列解析で判別した胎児由来と同定された有核赤血球の２１番染色体の検出領域の増幅産物の量を、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（登録商標；イルミナ社製）を用いて増幅産物のシークエンシングを行って、確定させた。別途、母親由来と同定された有核細胞の２１番染色体の検出領域の増幅産物の量（配列リード数）を、ＭｉＳｅｑを用いて増幅産物のシークエンシングを行って、測定した。これらの増幅産物の量（配列リード数）を比較したところ、細胞間でのばらつきは小さく、かつ、この２つの量比を計算したところ、１：１．５に近い値となり、胎児はトリソミーであることが推定された。【０１６５】
［比較例１］
マルチプレックスＰＣＲ増幅工程では、実施例１で使用した、プライマー間の相補性が低くなるよう設計したプライマー対に代えて、相補性を計算した効果を確認するための比較として、プライマー間の相補性を考慮しないプライマー対を設計した。プライマーの設計は実施例１と同じ染色体位置ないしは遺伝子に対し、Ｐｒｉｍｅｒ３（http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/）を使用して、Ｔｍ値が５６℃〜６４℃、かつＰＣＲ増幅塩基長としては、１４０〜１８０塩基対となる２０ｂｐのプライマーを各々作製した。
これらのプライマー対を使用してマルチプレックスＰＣＲを行ったことを除き、他は実施例１と同様にして、増幅産物の配列決定を行った。その結果、マッピング率が著しく低下し、かつ細胞間の増幅産物量の分散が大きく、数的異常を明確に判断できないほど、ばらつきが大きかった。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明は、胎児由来の単一細胞を解析する技術であり、検出領域には、既に公知である遺伝的多型部位、体細胞突然変異部位を含むことが可能であるので、遺伝子異常の検出に限定されず、遺伝子状態を判定することが可能である。
【図１】
0006502477.tif 000013
【配列表】
0006502477000001.app