(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）及び（Ｂ）に記載の特徴を有する、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子：
（Ａ）下記（ａ１）に記載の遺伝子を構成するエクソン内に、コード蛋白質における２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う変異を有する特徴、
（ａ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列、からなる蛋白質をコードする遺伝子であって、グルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する蛋白質をコードする遺伝子；
（Ｂ）前記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の機能に関する特徴であって、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型が、当該機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子のホモ型となった場合に、その表現型として肥大根部のグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下となる特徴。
【請求項２】
前記（ａ１）に記載の遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子。
【請求項３】
さらに下記（Ｃ）に記載の特徴を有する、請求項１又は２に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子：
（Ｃ）上記（Ａ）に記載の変異が、少なくとも１ｋｂｐの塩基配列の挿入を伴う変異である。
【請求項４】
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかにおける上記（Ａ）に記載の変異の存在の有無を検出することを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定方法。
【請求項６】
下記（Ｄ）及び（Ｅ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キットであって、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有する遺伝子型を判定するための前記キット：
（Ｄ）請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は下記に示す当該遺伝子の隣接領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の存在を検出可能な位置に設計された２０塩基以上からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（Ｅ）請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は下記に示す当該遺伝子の隣接領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる２０塩基以上からなる塩基配列であって、上記（Ｄ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（隣接領域）当該遺伝子の最初のエクソンの最上流塩基より上流側２９７１塩基の塩基配列で構成される領域、及び、当該遺伝子の最後のエクソンの最下流塩基より下流側２６６６塩基の塩基配列で構成される領域。
【請求項７】
上記（Ｄ）に記載のプライマーが、下記（ｄ１）又は（ｄ２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項６に記載の遺伝子型判定用キット：
（ｄ１）上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合において、当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｄ２）上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
さらに、下記（Ｆ）及び（Ｇ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる、請求項６又は７に記載の遺伝子型判定用キット：
（Ｆ）請求項１〜４のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は下記に示す当該遺伝子の隣接領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の不存在を検出可能な位置に設計された２０塩基以上からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（Ｇ）請求項１〜４のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は下記に示す当該遺伝子の隣接領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる２０塩基以上からなる塩基配列であって、上記（Ｆ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（隣接領域）当該遺伝子の最初のエクソンの最上流塩基より上流側２９７１塩基の塩基配列で構成される領域、及び、当該遺伝子の最後のエクソンの最下流塩基より下流側２６６６塩基の塩基配列で構成される領域。
【請求項９】
下記（Ｈ）又は（Ｉ）に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キットであって、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有する遺伝子型を判定するための前記キット：
（Ｈ）請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる２０塩基以上からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合における当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ；
（Ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる２０塩基以上からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
下記（Ｊ）及び（Ｋ）に記載の特徴を有する、請求項６〜９のいずれかに記載の遺伝子型判定用キット：
（Ｊ）上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴；
（Ｋ）上記グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列からなるグルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴。
【請求項１１】
請求項７における上記（Ｄ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであり、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有する遺伝子型を判定するための前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１２】
下記（Ｐ）に記載の工程を含むことを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失系統の作出方法であって、
請求項５に記載の遺伝子型判定方法を使用して行うものである、前記作出方法：
（Ｐ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンを、自殖操作又は所望のダイコンと交配する工程。
【請求項１３】
前記（Ｐ）に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンが、下記（Ｑ）〜（Ｓ）に記載のいずれかのダイコンである、請求項１２に記載の作出方法：
（Ｑ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン；
（Ｒ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン；
（Ｓ）上記（Ｑ）又は（Ｒ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
【請求項１４】
さらに下記（Ｔ）に記載の工程を含むことを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の作出方法：
（Ｔ）上記（Ｐ）に記載の工程により得られた後代集団から、請求項５に記載の遺伝子型判定方法を使用して、グルコラファサチン欠失性を示すダイコン個体を選抜する工程。
【請求項１５】
下記（Ｕ）に記載の工程を含むことを特徴とする、グルコラファサチン欠失性を示すダイコンの作出方法であって、
請求項５に記載の遺伝子型判定方法を使用して行うものである、前記作出方法：
（Ｕ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に請求項１〜４のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンを、自殖操作又は所望のダイコンと交配する工程。
【請求項１６】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法によりダイコン系統を作出し、又は、請求項１５に記載の方法によりダイコンを作出し、作出された前記ダイコン系統又は前記ダイコンを用いることを特徴とする、ダイコン植物体を生産する方法。
【請求項１７】
前記ダイコン植物体が、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の方法によりダイコン植物体を得て、得られた前記ダイコン植物体を用いることを特徴とする、大根加工飲食品又は大根を利用した製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイコンの機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子に係る発明に関する。また、本発明は、前記機能欠損型遺伝子を利用したグルコラファサチンを欠失したダイコン系統の作出技術に係る発明に関する。また、本発明は、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記機能欠損型遺伝子をホモ型で有するダイコン系統に係る発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコシノレートは、カラシ油配糖体とも呼ばれる含硫化合物の総称であり、アブラナ科及びその近縁科の植物に特徴的に含まれる二次代謝物質である。アブラナ科植物には、化合物構造の異なる１２０種以上のグルコシノレートが報告されている。
アブラナ科植物の一種であるダイコン（Raphanus sativus）では、その主要なグルコシノレートは「グルコラファサチン」と呼ばれる物質である。ダイコンの肥大根部に含まれる総グルコシノレート量は、実に９０％以上がグルコラファサチンで占められている。
グルコラファサチンは、ダイコンに特徴的なグルコシノレートであり、ダイコンが属するRaphanusと同じアブラナ科の植物（例えば、近縁属であるBrassicaなど）においても、グルコラファサチンを優占グルコシノレート成分として含む植物は見出されていない。
【０００３】
ダイコンに含まれるグルコラファサチンは、それ自体はほとんど無味無臭の化合物であるが、内在性酵素ミロシナーゼが作用して４メチルチオ−３−ブテニルイソチオシアネートと呼ばれるダイコン特有の辛み成分となる。「４メチルチオ−３−ブテニルイソチオシアネート」は、イソチオシアネートの一種であるが、化合物として不安定な物質であるため、短時間で化学分解されてしまう性質を有する。ダイコンおろし等のダイコン加工品の辛味が短時間で消失してしまい、風味劣化を抑えた保管がしにくい問題は、４メチルチオ−３−ブテニルイソチオシアネートの不安定さに起因する現象である。
さらに、ダイコンに含まれるグルコラファサチンは、ダイコンを加工した食品において、ダイコン特有の悪臭や黄変の問題を引き起こす、深刻な原因成分となっている。
図１に示すように、ダイコンに特徴的な悪臭である沢庵臭（大根臭等と表現される場合もある）の原因成分であるメチルメルカプタン等の生成や、黄変による色ムラ発生の原因成分である黄色成分ＴＰＭＰ（２−［３−（２−チオキソピロリジン−３−イリデン）メチル］−トリプトファン）の生成などは、グルコラファサチンから生成された４メチルチオ−３−ブテニルイソチオシアネートの分解によって引き起こされる現象である。
このような「風味劣化」、「沢庵臭の発生」及び「黄変化による色ムラの発生」は、特に保存等の経時変化や加熱処理等に伴って顕著な問題となる現象である。特に、一部の大根漬、大根おろし、切り干し大根等の大根加工食品において、その品質を著しく劣化させる主たる原因となっている。
現在、日本国内のダイコン生産量の約６割が加工用として使用されていることから、大根加工食品等における風味劣化防止、低臭化、及び黄変化防止を実現可能とする技術は、農業及び飲食品産業の各分野の製造業者等にとって、その解決が切望されている技術である。
【０００４】
このような産業分野からの要望に応えて、本発明者らは、大根加工食品等における風味劣化、沢庵臭の発生、及び黄変化等の品質劣化の問題を解決するため、グルコシノレート組成が通常のダイコン品種系統とは全く異なるダイコン系統の作出に取り組んだ。
その結果、本発明者らは、特定の品種系統に着目して人為的な育種的操作を行うことによって、グルコラファサチンとは別種のグルコシノレートを高含有する形質を有するダイコン系統を作出できることを見出した（特許文献１）。具体的には、本発明者らは、特許文献１に記載の方法に従って、種子やスプラウト等に「グルコラファニン」（※抗癌作用成分であるスルホラファンの前駆物質）を高含有する系統、肥大根部に「グルコエルシン」を高含有する系統、などを複数系統作出し、そのうちの１系統である「安濃５号」を、ダイコン品種「だいこん中間母本農５号」として品種登録した（品種登録第２２６６２号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１０２３８号公報（グルコラファニンを高含有するダイコン系統の作出方法）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の所望のグルコシノレート組成を有するダイコン系統を得る方法では、グルコシノレート組成が野生型で維持されている特定品種系統集団の中から変異個体を選抜する方法であるため、作出効率が低いという課題があった。
また、特許文献１に記載の方法では、表現型の判定のために、グルコシノレート組成を測定したい組織部位を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて分析することが必要であった。しかし、ＨＰＬＣ分析等に供するための十分な試料量を採取するには、数週間の栽培期間を要するため、迅速な分析が困難であるという課題があった。また、ＨＰＬＣ分析等で得られる情報はあくまでも表現型の情報に過ぎないため、育種を効率に行うことを可能とする遺伝子型の情報までは原理的に得ることができなかった。
また、得られた作出系統（特に中間母本系統）を形質供与体である交配親として用いて、他の有用形質を備えた品種系統と交配して新たな系統等を作出する場合、表現型の後代検定のための育成に甚大な労力と時間が必要であるという課題があった。
【０００７】
本発明は、上記従来技術の課題を鑑みて、大根加工食品等における風味劣化、沢庵臭の発生、及び黄変化等の品質劣化の問題を根本的に解決する技術に関して、グルコラファサチン欠失性を示すダイコン系統を、短期間で且つ高い精度にて作出可能とする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み、本発明者らが独自に作出した優れたグルコラファサチン欠失性を示す系統（ＮＲ１５４Ｅ系統、ＭＲ０５０Ｅ系統）を用いて、ダイコンのグルコシノレート組成を劇的に変化させる原因の１つであると考えられるグルコラファサチン欠失性を支配する遺伝子、を同定するという視点に着目した。
しかしながら、グルコラファサチン欠失性遺伝子を同定するためには、対象がダイコン植物であるという本件特有の事情に起因して、分子生物学的手法の適用の困難な技術的な問題が存在した。
【０００９】
i ）まず、植物においてグルコラファサチン代謝に関与する遺伝子の情報は一切不明であった。そのため、本件課題を解決する手段として、他の植物の遺伝子の相同性配列を手掛かりにする遺伝子単離法（縮重配列プライマーを利用したＰＣＲ法、ハイブリダイゼーションを利用したスクリーニング法など）の手段を、全く利用することができない状況にあった。
ii）また、近年の次世代シーケンサー等の遺伝子解析技術の進展により、ダイコンのドラフトゲノム配列がデータベースとして公開されて、網羅的解析の基盤整備が充実しつつある（Raphanus sativus Genome DataBase（http://radish.kazusa.or.jp/））が、当該データベースにおいては、機能解析が行われていない遺伝子のアノテーション情報までは掲載されていなかった。
当該データベースに掲載されているゲノム配列上の予測遺伝子の推定機能は、既知の他の生物の相同性検索情報やドメイン予測から推定された情報を掲載したものに過ぎないため、「遺伝子機能の解析が行われていない新規のダイコン遺伝子」については、当該データベース上でその存在を見出すことはできなかった。
また、勿論であるが、各変異系統の変異型遺伝子の配列情報も登録されていないため、当該データベース上にて各変異体の原因遺伝子を見出すことはできなかった。
【００１０】
以上に示すように、既知の遺伝子配列情報を利用する手段によっては、グルコラファサチン代謝に関わる遺伝子（ダイコンの新規遺伝子）の単離・同定を行うことはできない状況であった。
そこで、本発明者らは鋭意研究を重ね、膨大な量の実験を行った。まず、本発明者らが独自に作出したＮＲ１５４Ｅ系統というグルコラファサチン欠失系統と、グルコラファサチン含有系統（野生型）との連鎖マーカー（ＳＮＰ，ＳＳＲ）を同定して、両系統間の連鎖マーカーの連鎖地図を作製した。そして、当該連鎖地図を利用して、ポジショナルクローニング法により連鎖解析と高精度連鎖解析を繰り返すことで、対象遺伝子の座乗領域を狭める操作を繰り返し行い、２３．８ｋｂｐの座乗領域を特定した。
配列予測、定量的発現解析、及び機能獲得型（gain of function）の遺伝子導入試験等の詳細な解析を行った結果、当該座乗領域にあるグルコラファサチン欠失性を支配する原因遺伝子を同定した。当該遺伝子は、野生型のダイコンにおいては、グルコラファサチン合成酵素をコードする遺伝子であることが明らかになった。
また、当該機能欠損を誘起する挿入配列は、対象遺伝子内の変異配列であるため、対象形質との分離が生じ得ない優れた選抜ＤＮＡマーカーとして利用できることが示された。
【００１１】
本発明は、上記知見に基づいて想到されたものであり、具体的には以下の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子及びその利用に係る発明に関する。
［１］
下記（Ａ）及び（Ｂ）に記載の特徴を有する、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子；
（Ａ）下記（ａ１）に記載の遺伝子を構成するエクソン内に、コード蛋白質における２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部の欠失を伴う変異を有する特徴、
（ａ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列、からなる蛋白質をコードする遺伝子であって、グルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する蛋白質をコードする遺伝子、
（Ｂ）ダイコンゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座が当該機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子のホモ型となった場合に、肥大根部のグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下となる特徴。
［２］
さらに下記（Ｃ）に記載の特徴を有する、前記［１］に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子；
（Ｃ）上記（Ａ）に記載の変異が、少なくとも１ｋｂｐの塩基配列の挿入を伴う変異である。
［３］
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む遺伝子である、前記［１］又は［２］に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子。
［４］
前記［１］〜［３］のいずれかにおける上記（Ａ）に記載の変異の存在の有無を検出することを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定方法。
［５］
下記（Ｄ）及び（Ｅ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キット；
（Ｄ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の存在を検出可能な位置に設計された少なくとも１２塩基からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（Ｅ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ｄ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
［６］
上記（Ｄ）に記載のプライマーが、下記（ｄ１）又は（ｄ２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーである、前記［５］に記載の遺伝子型判定用キット；
（ｄ１）上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合において、当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（ｄ２）上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
［７］
さらに、下記（Ｆ）及び（Ｇ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる、前記［５］又は［６］に記載の遺伝子型判定用キット；
（Ｆ）前記［１］〜［３］のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異の不存在を検出可能な位置に設計された少なくとも１２塩基からなる塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー、
（Ｇ）前記［１］〜［３］のいずれかにおける上記（ａ１）に記載のグルコラファサチン合成酵素遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上の領域、を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ｆ）に記載のプライマーとプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
［８］
下記（Ｈ）又は（Ｉ）に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含んでなることを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キット；
（Ｈ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異が挿入変異である場合における当該変異を構成する塩基配列又はその相補配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ、
（Ｉ）前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる少なくとも１２塩基からなる塩基配列であって、上記（Ａ）に記載の変異をその配列内に含む塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
［９］
下記（Ｊ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）に記載の特徴を有する、前記［５］〜［８］のいずれかに記載の遺伝子型判定用キット；
（Ｊ）上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴、
（Ｋ）上記グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号２に記載の塩基配列からなるグルコラファサチン合成酵素遺伝子である特徴、
（Ｌ）上記染色体上の領域が、配列番号１における第１番目から第２９７１番目までの塩基からなる塩基配列で構成される領域、及び、配列番号１における第４７５９番目から第７４２４番目までの塩基からなる塩基配列で構成される領域、である特徴。
［１０］
前記［５］又は［６］における上記（Ｄ）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーであって、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用のオリゴヌクレオチドプライマー。
［１１］
前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座にホモ型で有し、肥大根部の乾燥重量に対するグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下であることを特徴とするダイコン系統。
［１２］
下記（Ｍ）〜（Ｏ）のいずれかに記載のダイコンを自殖操作し又は所望のダイコンと交配し、その後代集団から選抜して得られた、前記［１１］に記載のダイコン系統；
（Ｍ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン、
（Ｎ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン、
（Ｏ）上記（Ｍ）又は（Ｎ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
［１３］
上記機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が、配列番号７又は９に記載の塩基配列を含む機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子である、前記［１１］又は［１２］に記載のダイコン系統。
［１４］
前記［１１］〜［１３］のいずれかに記載のダイコン系統の植物体から得られた、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗。
［１５］
下記（Ｐ）に記載の工程を含むことを特徴とする、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失系統の作出方法；
（Ｐ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンを、自殖操作又は所望のダイコンと交配する工程。
［１６］
前記（Ｐ）に記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコンが、下記（Ｑ）〜（Ｓ）に記載のいずれかのダイコンである、前記［１５］に記載の作出方法；
（Ｑ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子が導入されたダイコン、
（Ｒ）ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型変異が導入されたダイコンであって、ゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有するダイコン、
（Ｓ）上記（Ｑ）又は（Ｒ）に記載のダイコンの後代集団から得られたダイコンであって、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子をゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に有するダイコン。
［１７］
前記［４］に記載の遺伝子型判定方法を使用して行うものである、前記［１５］又は［１６］に記載の作出方法。
［１８］
さらに下記（Ｔ）に記載の工程を含むことを特徴とする、前記［１５］〜［１７］のいずれかに記載の作出方法；
（Ｔ）上記（Ｐ）に記載の工程により得られた後代集団から、前記［４］に記載の遺伝子型判定方法を使用して、グルコラファサチン欠失性を示すダイコン個体を選抜する工程。
［１９］
前記［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法により作出されたダイコン系統を用いることを特徴とする、ダイコン植物体を生産する方法。
［２０］
前記ダイコン植物体が、根、胚軸部、肥大根部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、又は苗である、前記［１９］に記載の方法。
［２１］
前記［１９］又は［２０］に記載の方法により得られたダイコン植物体を用いることを特徴とする、大根加工飲食品又は大根を利用した製品の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子及びその遺伝子配列情報を、ダイコンの育種に有効に利用することが可能となる。これにより、本発明によれば、大根加工食品等における風味劣化、沢庵臭の発生、及び黄変化等の品質劣化の問題について、当該問題を本質的に解決可能とするグルコラファサチン欠失性を示すダイコン系統を、短期間で且つ高い精度にて作出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】グルコシノレート組成が通常野生型である一般のダイコン品種系統について、グルコラファサチンに関する分解経路を示した模式図である。
【００１４】
【図２】ＮＲ１５４Ｅ系統ダイコンの特徴を模式的に説明した図である。（Ａ）：ＮＲ１５４Ｅ系統について、植物体の外観形状を撮影した写真像図。当該図中の符号は次のものを示す。符号１：肥大根部。符号２：葉柄。（Ｂ）：ＮＲ１５４Ｅ系統について、グルコラファサチン欠失による分解経路への影響を示した模式図。
【００１５】
【図３】実施例１において、連鎖解析にて明らかになった連鎖地図（連鎖群Ｒ１〜３）を示した図である。
【００１６】
【図４】実施例１において、連鎖解析にて明らかになった連鎖地図（連鎖群Ｒ４〜６）を示した図である。
【００１７】
【図５】実施例１において、連鎖解析にて明らかになった連鎖地図（連鎖群Ｒ７〜９）を示した図である。
【００１８】
【図６】実施例１に係るポジショナルクローニング法において、各工程の説明を模式的に示したフロー図である。図中「Ｎ」が示す数は、連鎖解析又は高精度連鎖解析に供した植物体の数を示す。
【００１９】
【図７】実施例１に係る高精度連鎖解析において、絞り込まれたグルコラファサチン欠失性原因遺伝子の座乗領域を示した模式図である。図中の数字１〜７は、候補遺伝子１〜７を示す。図中の矢印は、配列解析により存在が予測された遺伝子を示す。矢印の向きは遺伝子が座乗する方向を示す。
【００２０】
【図８】実施例２に係るＲＴ−ＰＣＲによる発現解析において、遺伝子３（グルコラファサチン合成酵素遺伝子、図７における灰色矢印）のＲＴ−ＰＣＲ後の電気泳動ゲルを撮影した写真像である。当該図中における省略記号は、次のダイコン品種系統名を示す。「ＴＩＢ」：耐病総太り。「ＮＲ１５４Ｅ」：ＮＲ１５４Ｅ。
【００２１】
【図９】実施例３に係る配列解析において、遺伝子３蛋白質に存在するドメイン構造の予測結果を示した図である。
【００２２】
【図１０】実施例３に係る配列解析において、遺伝子３の遺伝子構造をエクソン／イントロン構造により模式的に示した図である。（Ａ）：野生型遺伝子３。（Ｂ）：ＮＲ１５４Ｅ型遺伝子３（機能欠損型遺伝子）。（Ｃ）：ＭＲ０５０Ｅ型遺伝子３（機能欠損型遺伝子）。
【００２３】
【図１１】実施例３に係る配列解析において、機能欠損型遺伝子３の挿入配列の導入部位を示した図である。（Ａ）：ＮＲ１５４Ｅ型遺伝子３。（Ｂ）：ＭＲ０５０Ｅ型遺伝子３。図中における塩基配列の下段にある英文字１文字表記は、コドンによって指定されるアミノ酸を示す。
【００２４】
【図１２】実施例３に係る配列解析において、各ダイコン系統からの遺伝子３の予測アミノ酸配列のアライメント結果を示した図である。図中における省略記号は、次の蛋白質の予測アミノ酸配列を示す。「Ｗ．Ｔ．」：ＨＡＧＨＮ系統。「ＭＲ０５０Ｅ」：ＭＲ０５０Ｅ系統。「ＮＲ１５４Ｅ」：ＮＲ１５４Ｅ系統。また、図中の矩形域で囲った領域は、次のドメインを示す。「白色」：non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal domain。「灰色」：2-oxoglutarate and Fe(II)-dependent oxygenase domain。
【００２５】
【図１３】実施例４に係る定量的ＲＴ−ＰＣＲによる発現解析において、遺伝子３の相対発現量の測定結果を示した図である。当該図中における省略記号は、次のダイコン品種系統名を示す。「ＨＡＧ」：ＨＡＧＨＮ。「ＴＩＢ」：耐病総太り。「ＭＹＳ」：宮重ダイコン。「ＫＲＭ」：辛味１９９。「ＮＲ１５４Ｅ」：ＮＲ１５４Ｅ。「ＭＲ０５０Ｅ」：ＭＲ０５０Ｅ。
【００２６】
【図１４】実施例５に係る遺伝子導入試験において、抽苔前の育成植物体を上面視にて撮影した写真像を示す図である。（Ａ）：エンプティベクター導入シロイヌナズナ。（Ｂ）：遺伝子３過剰発現体シロイヌナズナ。
【００２７】
【図１５】実施例５に係る遺伝子導入試験において、育成した植物体のグルコシノレートプロファイルをＨＰＬＣ分析クロマトグラフにより示した図である。当該図中の符号は、次のものを示す。符号２１：グルコエルシンのピーク。符号２２：グルコラファサチンのピーク。（Ａ）：エンプティベクター導入シロイヌナズナ。（Ｂ）：遺伝子３過剰発現体シロイヌナズナ。
【００２８】
【図１６】野生型ダイコン又は遺伝子３過剰発現体シロイヌナズナにおいて、グルコエルシンからグルコラファサチンが生成される反応を示した模式図である。
【００２９】
【図１７】グルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用プライマーセットの設計例の一例を示した模式図である。当該図中の符号は次のものを示す。符号３１：グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成するゲノムＤＮＡ。符号３２：機能欠損型の変異型遺伝子における挿入配列。符号３３：機能欠損型遺伝子検出用プライマー。符号３４：野生型遺伝子検出用プライマー。符号３５：共通用プライマー。
【００３０】
【図１８】実施例６に係る遺伝子型判定例において、遺伝子型判定用プライマーセットを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動ゲルを撮影した写真像図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明は、ダイコンにおける機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子に係る発明に関する。また、本発明は、前記機能欠損型遺伝子を利用したグルコラファサチンを欠失したダイコン系統の作出技術に係る発明に関する。また、本発明は、ゲノムのグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に前記機能欠損型遺伝子をホモ型で有するダイコン系統に係る発明に関する。
【００３２】
１．用語の説明
本明細書で用いる用語について、以下に説明する。
本明細書中、「ダイコン（ダイコン植物）」とは、アブラナ科ダイコン属サティバス（Raphanus sativus）に属する植物種を指す。具体的には、日本ダイコン（R. sativus var. longipinnatus）、ハツカダイコン（R. sativus var. sativus）、クロダイコン（R. sativus var. niger）等を含めて、全世界で千種以上の品種系統が存在することが知られている。ダイコンの植物体では、主に肥大した根が食用となり、加工食品としても利用される。スプラウト（かいわれ）、ベビーリーフ、葉も食用となる。
本明細書中、「肥大根部」とは、ダイコンの成熟した根及び胚軸部を指す。
【００３３】
本明細書中、「遺伝子」とは、エクソン及びイントロンから構成されるゲノムＤＮＡ中の領域を指し、最初のエクソンの最上流塩基（ＯＲＦの５’末端：転写開始点）から最後のエクソンの最下流塩基（ＯＲＦの３’末端）までの領域を指す。
本明細書中、「コーディング領域（ＣＤＳ）」とは、遺伝子において蛋白質に翻訳される領域を指し、エクソンにおける開始コドンの第１塩基〜終止コドンの第３塩基までの領域を指す。真核生物のゲノムＤＮＡにおいては、イントロンで分断されて存在する場合が多い。
【００３４】
本明細書中、「グルコシノレート」（本明細書中、単に「ＧＳＬ」という場合がある。）とは、カラシ油配糖体とも呼ばれる含硫化合物の総称であり、アブラナ科及びその近縁科の植物に特徴的に含まれる二次代謝物質である。アブラナ科植物には、化合物構造の異なる１２０種以上のグルコシノレートが報告されている。ダイコンでは、その主要なグルコシノレートは「グルコラファサチン」と呼ばれる物質である。ダイコン肥大根部に含まれる総グルコシノレート量は、実に９０％以上がグルコラファサチンで占められている。
【００３５】
本明細書中、「グルコラファサチン」（Glucoraphasatin）とは、下記（式１）に示す化学式の化合物を指す。グルコラファサチンは、ダイコンにおいて特徴的に存在するグルコシノレートであり、他の植物にはほとんど存在しない化合物である。ダイコンが属するRaphanusと同じアブラナ科の植物（例えば、近縁属であるBrassicaなど）においても、グルコラファサチンを優占グルコシノレート成分として含有する植物は、ダイコン以外には確認されていない。
【００３６】
【化１】
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【００３７】
本明細書中、「野生型ダイコン品種系統」とは、ダイコンの植物体においてグルコラファサチンを主要なグルコシノレート成分として含有する性質を示すダイコン品種系統を示す。
【００３８】
２．機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子
本発明に係る「機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子」（本明細書中、単に「機能欠損型遺伝子」という場合がある。）とは、ダイコンのグルコラファサチン合成酵素遺伝子に機能欠損型の変異が存在する、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の変異型遺伝子を指す。
【００３９】
［野生型のグルコラファサチン合成酵素遺伝子］
「グルコラファサチン合成酵素遺伝子」（本明細書中、単に「野生型遺伝子」という場合がある。）とは、本発明者らが見出した新規遺伝子であり、ダイコンにおいてグルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する蛋白質をコードする遺伝子を指す。具体的には、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を指す。
なお、当該遺伝子のアミノ酸配列は、宮重ダイコン系の自殖系統、西町理想系の自殖系統、及び辛味ダイコン系の自殖系統などの品種系統においては、配列番号５に記載のアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列であることが確認されている。
【００４０】
また、グルコラファサチン合成酵素遺伝子としては、ダイコン種内における品種系統間の違いによるアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を伴う遺伝子配列の変異を許容するものである。
遺伝子配列の変異の許容範囲として、具体的には、i）配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して高い配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子であり、且つ、ii）その遺伝子機能を担保するアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子であれば、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対する変異は許容される。
【００４１】
ここで、i)「高い配列相同性」としては、具体的には、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、の配列相同性を挙げることができる。
また、ii)「遺伝子機能の担保」とは、コード蛋白質が、グルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する蛋白質であること、が担保されていることを指す。
具体的には、当該遺伝子がダイコン植物体にて通常の発現量にて発現して、生体内にてコード蛋白質が正常に合成された場合、当該ダイコンが「グルコラファサチン含有性」の表現型を示すことを指す。
ここで、「グルコラファサチン含有性」とは、具体的には、肥大根部の乾燥重量に対するグルコラファサチン含量が、３μｍоｌ／ｇを超える含量、好ましくは４μｍоｌ／ｇ以上、より好ましくは６μｍоｌ／ｇ以上、さらに好ましくは１０μｍоｌ／ｇ以上、となる表現型を示す性質を指す。
【００４２】
当該遺伝子のコード蛋白質である「グルコラファサチン合成酵素」は、グルコエルシンからグルコラファサチンを合成する反応に関与する酵素蛋白質である。当該蛋白質は、グルコエルシンからグルコラファサチンを生成する反応のいずれかに関与する酵素として機能し、当該酵素の機能が欠損するとダイコン植物体におけるグルコラファサチンは欠失する。
当該蛋白質は、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメイン（2-oxoglutarate and Fe(II)-dependent oxygenase domain、2 OG-Fe(II) oxygenase domainともいう。）というドメイン構造を有する。当該ドメインは、配列番号５に記載のアミノ酸配列上においては、第２２３番目から第３１９番目までの９７アミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する領域である（図９、１２）。
なお、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインを有する蛋白質は、植物においてスーパーファミリーを形成しており、様々な酸化還元酵素を含む酵素であることが知られているが、ダイコンのグルコラファサチン合成酵素と同様の活性を有する酵素の存在は報告されていない。
また、当該蛋白質には、配列番号５に記載のアミノ酸配列上、第６５番目から第１７８番目までの１１４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する領域に、酸化還元酵素ドメインの一種であるnon-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal domainも存在する（図９、１２）。
【００４３】
野生型のグルコラファサチン合成酵素遺伝子のゲノム配列としては、上記グルコラファサチン合成酵素である蛋白質をコードする遺伝子であれば特に制限はなく、イントロン等の配列に変異は特に問題なく許容されるものである。なお、宮重ダイコン系の自殖系統では、野生型のグルコラファサチン合成酵素遺伝子のゲノム配列の全長（第１エクソンの最上流塩基から第３エクソンの最下流塩基）は、配列番号２に記載の塩基配列である。
また、グルコラファサチン合成酵素遺伝子のゲノム構造は、既存の野生型のダイコン品種系統において、３つのエクソンと２つのイントロンから構成される構造であることを確認しているが（図１０）、当該エクソン及びイントロン構造と同一構造であるものに限定されるものではない。
なお、ダイコンゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の数は、単一遺伝子座であると認められる。また、当該遺伝子に対して機能相補性や冗長性を示す極めて高い相同性を示す遺伝子の存在は確認されていない。
【００４４】
ダイコン以外の他のアブラナ科植物では、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の相同遺伝子が存在する。具体的には、Arabidopsis（ダイコンが属するRaphanusの近縁属）のシロイヌナズナには、配列番号５に記載のアミノ酸配列と、８０％程度の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子が存在する。
しかし、シロイヌナズナには、グルコシノレート組成にグルコラファサチンが存在しない。この点、シロイヌナズナには、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の「相同遺伝子」は存在するものの、当該相同遺伝子のコード蛋白質は、グルコエルシンからグルコラファサチンへの合成反応に関与する機能を有していない。
【００４５】
［機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の特徴］
本発明に係る機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子は、上記したグルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成するエクソン内の塩基配列上に、遺伝子としての重要機能が欠損する変異を有する遺伝子である。
ここで、グルコラファサチン合成酵素遺伝子が「機能欠損型遺伝子」であるかどうかは、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子の遺伝子座が、当該変異型遺伝子のホモ型となった場合に、ダイコン植物体におけるグルコラファサチンが完全に又は実質的に欠失している状態であれば、機能欠損型遺伝子であると判定することができる。
【００４６】
本明細書中、「ダイコン植物体においてグルコラファサチンが実質的に欠失している状態」であるか否かの判定は、次の値を指標とするものである。ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座が、対象とする変異型遺伝子のホモ型となった場合に、肥大根部の乾燥重量に対するグルコラファサチン含量が３μｍоｌ／ｇ以下、好ましくは２μｍоｌ／ｇ以下、さらに好ましくは１μｍоｌ／ｇ以下、より好ましくは０．１μｍоｌ／ｇ以下、特に好ましくは０．０１μｍоｌ／ｇ以下であれば、グルコラファサチンが実質的に欠失している状態であると判定することができる。
なお、通常の野生型ダイコン品種系統では、当該含量が数十〜数百μｍоｌ／ｇのものがほとんどである。
【００４７】
また、別の判定指標としては、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座が、対象とする変異型遺伝子のホモ型となった場合に、肥大根部の乾燥重量に対するグルコラファサチン含量が総グルコシノレート量に対して、１／１０以下、好ましくは１／１００以下、さらに好ましくは１／１０００以下であれば、グルコラファサチンが実質的に欠失している状態であると判定することができる。
また、当該総グルコシノレート量に対する比率の指標と、上記グルコラファサチン含量の指標とを、両方合わせて判定指標とするとさらに好適である。
ここで、グルコラファサチン及びグルコシノレート含量の測定は、常法によりＨＰＬＣ分析等で行うことができる。
【００４８】
なお、最も好適には、ダイコンにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座が当該変異型遺伝子のホモ型となった場合に、肥大根部においてグルコラファサチンを全く含まない状態（完全に欠失した状態）となる機能欠損型遺伝子が最も好適である。
【００４９】
・蛋白質構造上の機能欠損
グルコラファサチン合成酵素遺伝子が機能欠損型遺伝子となるためには、当該遺伝子のコード蛋白質を構成するアミノ酸配列に置換、欠失、挿入及び／又は付加を伴う変異を有することが必要である。具体的には、グルコラファサチン合成酵素遺伝子が「機能欠損型遺伝子」になるためには、当該遺伝子のコード蛋白質が、「２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメイン」の全部又は一部の欠失を伴う変異であることが好適である。
ここで、「一部を欠失する変異」とは、当該ドメインを構成する９７アミノ酸残基のうち１アミノ酸残基以上、好ましくは５アミノ酸残基以上、より好ましくは１０アミノ酸残基以上の欠失を伴う変異を挙げることができる。特には、当該ドメインのＣ端側を構成する１６アミノ酸残基以上、好ましくは３２アミノ酸残基以上、より好ましくは４８アミノ酸残基以上、さらに好ましくは６４アミノ酸残基以上、特に好ましくは７２アミノ酸残基以上の欠失を伴う変異である場合、当該遺伝子の機能欠損型の変異としてより好適である。
なお、本発明においては、当該ドメインの全部を欠失する変異であることが最も好適である。「全部を欠失する変異」とは、当該ドメインを構成する９７アミノ酸残基からなる領域について、当該ドメイン全領域の欠失を伴う変異を意味する。
【００５０】
当該変異が存在する部位としては、上記「ドメイン欠失」を伴う変異であれば、特に制限はないが、好ましくは第１エクソン又は第２エクソン内の変異、より好ましくは第１エクソン内の変異であることが好適である。
当該「ドメイン欠失」を伴う変異の態様としては、具体的には、i) コーディング領域内の塩基配列に終止コドンの出現を伴う置換、挿入、又は欠失による変異、ii) 塩基配列の挿入変異であって当該挿入塩基配列上に終止コドンの出現を伴う変異、iii) フレームシフトにより終止コドンの出現を伴う挿入又は欠失による変異、などを挙げることができる。
【００５１】
・遺伝子発現の低減による遺伝子機能欠損
本発明に係る機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子は、コード蛋白質の構造的な機能欠損がやや不十分であると推測される場合であっても、その「遺伝子発現量」が大幅に低減されている場合には、機能欠損型遺伝子であると認められる。
例えば、上記コーディング領域への変異が存在するものの、アミノ酸配列上での酵素機能の欠損がやや不十分であると推測される場合であっても、遺伝子発現量が著しく低下したものであれば、ダイコン植物体におけるグルコラファサチンが完全に又は実質的に欠失している状態となる。即ち、当該変異型遺伝子は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子としては「機能欠損型遺伝子」となる。なお、ダイコン植物体においてグルコラファサチンが欠失又は実質的に欠失している状態とは、上記段落「２．機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子」に記載した状態を指す。
【００５２】
遺伝子発現量が大幅に低減された変異型遺伝子となるのは、エクソン内の「挿入変異」を有する変異型遺伝子の場合が好適である。この場合、転写されるｍＲＮＡ長が長くなる程、遺伝子発現量自体が低下する傾向が認められる。例えば、少なくとも１ｋｂｐの挿入変異を有することで、遺伝子発現量が激減した遺伝子となる。挿入塩基長としては、ｌｋｂｐ以上、好ましくは１．２ｋｂｐ以上、より好ましくは３ｋｂｐ以上、さらに好ましくは５ｋｂｐ以上、特に好ましくは８．８ｋｂｐ以上、一層好ましくは９ｋｂｐ以上を挙げることができる。
なお、挿入配列の上限としては特に制限はないが、強いて挙げるならば、１０００ｋｂｐ以下、好ましくは５００ｋｂｐ以下、より好ましくは１００ｋｂｐ以下、さらに好ましくは５０ｋｂｐ以下を挙げることができる。
例えば、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の発現量を、品種「耐病総太り」（一般的なグルコシノレート組成である通常野生型）と比較した場合、約１．２ｋｂｐの挿入変異型遺伝子をホモ型で有するダイコン変異体では、遺伝子発現量は約１／４０と激減する。
特に、約９ｋｂｐの挿入変異型遺伝子のホモ型変異体では、約１／１０００以下となり、遺伝子発現自体がほとんど起こらなくなる。当該変異体は、ｎｕｌｌ変異体に近い状態となる。
【００５３】
・変異数の範囲
本発明に係る機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子は、上記した「機能欠損」を伴う変異以外の変異についてもその存在を許容するものであるが、遺伝子における変異数の上限については、次のように変異の数の範囲を定義することができる。
【００５４】
当該「変異数」の範囲としては、配列番号２に記載の塩基配列と比較した場合において、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子の「コーディング領域に相当する領域」に存在する変異数が、一定数以下であると定義することができる。具体的には、当該変異型遺伝子における「コーディング領域に相当する領域」に存在する置換、挿入、及び／又は欠失による変異の数が、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子におけるコーディング領域、を構成する塩基数の５％以下、好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下、である数と定義することができる。
【００５５】
ここで、本明細書における「変異数」とは、変異が生じた数（即ち、変異が導入された回数）を指す数である。例えば、１００ｂｐの挿入配列が「１回」の挿入変異で導入された場合であれば、変異の数は「１」となる。一方、１ｂｐの置換変異が独立して「１０ヶ所」で導入されている場合であれば、変異の数は「１０」となる。
例えば、配列番号２に記載の塩基配列におけるコーディング領域（配列番号４）の塩基数は１１１９ｂｐであるため、その５％に相当する数は約「５６」となる。当該変異の全てがアミノ酸変異を伴う変異であると仮定した場合であっても、配列番号５に記載のアミノ酸配列（野生型グルコラファサチン合成酵素を構成するアミノ酸配列）に対して、約８５％という高い配列相同性を有するアミノ酸配列の範囲に含まれるものとなる。
【００５６】
また、本発明に係る機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の変異数の範囲は、上記のように定義するものであるが、遺伝子を構成するエクソン及びイントロン全体として、次のような定義を加えることもできる。
具体的には、配列番号２に記載の塩基配列と比較した場合において、当該変異型遺伝子の「全領域」に存在する置換、挿入、欠失、及び／又は付加による変異の数が、配列番号２に記載の塩基配列を構成する塩基数の２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、特に好ましくは２％以下、一層好ましくは１％以下、である数と定義することができる。なお、ここで「変異数」とは、上記と同様の意味であり、変異が生じた数（即ち、変異が導入された回数）を指す。
【００５７】
・機能欠損型遺伝子の具体例
上記のような機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子としては、後述する実施例に記載した機能欠損型の変異型遺伝子を挙げることができる。
具体的には、配列番号７に記載の塩基配列を含むグルコラファサチン合成酵素遺伝子（ＮＲ１５４Ｅ型遺伝子）を挙げることができる。当該機能欠損型遺伝子は、野生型グルコラファサチン合成酵素遺伝子（配列番号２）の第５５７番目の塩基と第５５８番目の塩基の間に、約９ｋｂｐの挿入配列（配列番号７における第５５８番目から第９４１０番目までの塩基からなる塩基配列）が導入された変異を有し、インレームにて終止コドンが出現する変異型遺伝子である。コード蛋白質は、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインを完全に欠失した構造を有する。
また、配列番号９に記載の塩基配列を含むグルコラファサチン合成酵素遺伝子（ＭＲ０５０Ｅ型遺伝子）を挙げることもできる。当該機能欠損型遺伝子は、野生型グルコラファサチン合成酵素遺伝子（配列番号２）の第１２４３番目の塩基と第１２４４番目の塩基の間に、約１．２ｋｂｐの挿入配列（配列番号９における第１２４４番目から第２４６５番目までの塩基からなる塩基配列）が導入された変異を有し、インレームにて終止コドンが出現する変異型遺伝子である。コード蛋白質は、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインのＣ端側１６アミノ酸残基を欠失した構造を有する。
【００５８】
３．遺伝子型判定用ＤＮＡマーカー
本発明においては、ダイコンゲノム中におけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子の「機能欠損を引き起こす変異」の存在を、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の遺伝子型判定用のＤＮＡマーカーとして利用することが可能となる。
即ち、本発明においては、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の機能欠損を引き起こす変異の有無を検出することによって、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座における「遺伝子型」を高精度で判定することが可能となる。
【００５９】
当該機能欠損変異をＤＮＡマーカーとして利用する場合、当該変異はグルコラファサチン合成酵素遺伝子内の変異そのものであるため、組換え分離によって対象遺伝子型と不一致となる現象は原理的に生じないと解される。即ち、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の遺伝子型を、極めて高精度に判定することが可能となる。
一方、連鎖マーカーであるＳＮＰ（一塩基多型）やＳＳＲ（マイクロサテライト多型）などの遺伝子型を指標とした場合では、極めて近接する領域のものを利用しない限りは、組換え分離によって、連鎖マーカー型と対象遺伝子型が一致しない場合がある。この場合、必ずしも正確な遺伝子型が判定できるとは限らない。
【００６０】
また、本発明においては、当該グルコラファサチン合成酵素遺伝子の遺伝子型を判定することによって、その遺伝子型を有する個体のグルコシノレート組成に関する「表現型」を、高精度で判定することができる。即ち、一般的な核酸検出技術を利用して遺伝子型を調べるのみで、対象のダイコン個体がグルコラファサチン欠失系統に属する個体であるか、又は、グルコラファサチン含有系統に属する個体であるかを、高い精度で識別することが可能となる。
【００６１】
当該機能欠損変異の検出手段としては、既存の核酸検出技術を利用することによって、容易に行うことが可能である。例えば、ＰＣＲ法を利用した技術、ハイブリダイゼーション法を利用した技術、を利用することができる。また、プローブとプライマーを併用したリアルタイムＰＣＲ法、変異型と野生型の２種類のプローブを併用したドットブロット法、などの多型検出技術を利用することも可能である。また、制限酵素断片長多型、シーケンサーによる塩基配列決定、などによって、変異を検出することも可能である。
【００６２】
［オリゴヌクレオチドプライマー］
核酸検出技術によって当該機能欠損変異を検出するためには、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ法を利用する方法が有効である。
本明細書中、「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、デオキシヌクレオチドを重合させて合成したオリゴヌクレオチドであって、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ伸長反応の起点として機能する、特定塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列で構成されるように設計された一本鎖ＤＮＡを指すものである。
【００６３】
当該オリゴヌクレオチドプライマーとしては、グルコラファサチン合成酵素遺伝子（機能欠損型遺伝子、野生型遺伝子）を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列を、連続して少なくとも１２塩基含むプライマーが好適である。好適な塩基長（塩基：ｍｅｒ）としては、当該塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列を、連続して少なくとも１２塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、さらに好ましくは２５塩基以上含むプライマーであることが好適である。
また、オリゴヌクレオチドプライマーの塩基長の上限としては、プライマーとして機能する範囲を逸脱しない内であれば特に制限はないが、例えばプライマー全長の塩基長が、２００塩基以下、好ましくは１００塩基以下、より好ましくは５０塩基以下、のものを挙げることができる。
また、配列特異的性を上げて、非特異的ＰＣＲ増幅を下げるためには、プライマー対を形成するプライマーとのＴｍ値を合わせた上で、塩基長の長い適切なプライマーを設計することが好適である。
なお、オリゴヌクレオチドプライマーの５’端は、ベクター挿入等に利用するための制限酵素サイトや各種ベクター導入用の修飾塩基配列を付加したものであっても良い。また、蛍光物質や標識物質等を結合した形態のものであっても良い。
また、オリゴヌクレオチドプライマーの３’端は、機能欠損型遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列と完全一致する塩基配列であることが好適である。
【００６４】
・機能欠損型遺伝子検出用プライマーセット
本発明では、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の存在を特異的に検出可能なプライマーセットを設計することによって、機能欠損遺伝子を有する遺伝子型を判定することが可能となる。ここで、機能欠損型遺伝子の存在を検出可能なプライマーセットとしては、「機能欠損変異を含む塩基配列」又は「機能欠損変異を構成する塩基配列」を、ＰＣＲ反応にて特異的に増幅可能なプライマー対（機能欠損型遺伝子検出用プライマー１及び２）からなるプライマーセットを指すものである。
【００６５】
ＰＣＲ法を利用して当該機能欠損変異を検出するためのプライマーセットとしては、「機能欠損型遺伝子検出用プライマー１」を設計することが必要である。機能欠損型遺伝子検出用プライマー１は、当該機能欠損変異の「存在」を検出可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。
機能欠損型遺伝子検出用プライマー１の設計可能な位置は、下記（１）又は（２）に記載の条件を満たす限り、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子と同じ染色体上にあるゲノムＤＮＡ領域上であれば、如何なる領域にある塩基配列（当該領域を構成する塩基配列又はその相補配列）に設計することが可能である。即ち、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の領域だけでなく、その周辺のプロモーターやスペーサー領域に設計することも可能である。
【００６６】
機能欠損型遺伝子検出用プライマー１としては、具体的には、（１）機能欠損型遺伝子に存在する「機能欠損型遺伝子に特異的な塩基配列」を含むプライマーを挙げることができる。即ち、当該プライマーは、野生型遺伝子には、ハイブリダイズしないプライマーとなる。この場合、機能欠損型遺伝子検出用プライマー２（後述）とのＰＣＲを行うことで、機能欠損型遺伝子に対してはＰＣＲ増幅するが、野生型遺伝子が対してはＰＣＲ増幅産物が得られないプライマーセットとなる。例えば、i) 挿入変異の場合において、当該挿入変異上の塩基配列又はその相補配列、を含むプライマーを挙げることができる。また、ii) 置換、欠失、又は挿入変異の場合において、当該変異を配列内に含む塩基配列（好ましくは変異部位を３’端に有する塩基配列）、を含むプライマーを挙げることができる。即ち、これらのプライマーは、野生型遺伝子には、ハイブリダイズしないプライマーとなる。
また、機能欠損型遺伝子検出用プライマー１としては、（２）機能欠損型遺伝子に挿入又は欠失による当該機能欠失変異がある場合において、「当該変異を挟む位置の一方」に設計したプライマーを挙げることができる。この場合、機能欠損型遺伝子検出用プライマー２とのＰＣＲを行うことで、機能欠損型遺伝子と野生型遺伝子とで、異なる塩基長のＰＣＲ増幅産物が得られることになる。例えば、iii) 挿入又は欠失変異の場合における当該変異の５’側にある塩基配列、を含むプライマーを挙げることができる。
【００６７】
なお、機能欠損型遺伝子検出用プライマー１を設計する領域としては、好ましくは、上記 i) の場合では、挿入配列と元々の遺伝子配列の境界に近接する５’側の領域に設計することが好適である。上記 ii) の場合では、当該変異がプライマー配列内の３’側（好ましくは３’端）に含まれるように、設計することが好適である。上記 iii) の場合では、当該機能欠損変異に近接する５’側の領域に設計することが好適である。
【００６８】
ＰＣＲ法により当該機能欠損型変異を検出するためには、「機能欠損型遺伝子検出用プライマー２」を設計することが必要である。機能欠損型遺伝子検出用プライマー２は、ＰＣＲ反応において上記した機能欠損型遺伝子検出用プライマー１とプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。
機能欠損型遺伝子検出用プライマー２を設計可能な領域としては、上記した機能欠損型遺伝子検出用プライマー１とプライマー対を形成して、ＰＣＲ増幅が可能なダイコンゲノム領域であれば、機能欠損型遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上にある領域（当該領域を構成する塩基配列又はその相補配列）に設計することが可能である。
ＰＣＲの技術的な点を考慮すると、機能欠損型遺伝子検出用プライマー２を設計可能な領域としては、増幅産物の塩基長がＰＣＲ増幅に適した領域であることが好適である。具体的には、ＰＣＲ増幅産物の塩基長（塩基対：ｂｐ）が、５ｋｂｐ以下となる位置に、上記機能欠損型遺伝子検出用プライマー２を設計することが好適である。好ましくは、３０ｂｐ〜５ｋｂｐ、好ましくは５０ｂｐ〜３ｋｂｐ、より好ましくは７５ｂｐ〜２ｋｂｐ、さらに好ましくは１００ｂｐ〜１．５ｋｂｐ、となる塩基長が好適である。なお、増幅長があまりに長鎖になり過ぎるように設計した場合、ＰＣＲ増幅産物が得られ難くなり好適でない。
【００６９】
機能欠損型遺伝子検出用プライマー１及び２を設計可能な領域としては、具体的には、ＮＲ１５４Ｅ型遺伝子の変異を検出する場合、上記条件を満たすようにして、配列番号１、２、又は７に記載の塩基配列又はその相補配列上に設計することができる。また、ＭＲ０５０Ｅ型遺伝子の変異を検出する場合、上記条件を満たすようにして、配列番号１、２、又は９に記載の塩基配列又はその相補配列上に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。
【００７０】
・野生型遺伝子検出用プライマーセット
また、本発明では、野生型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の存在を特異的に検出可能なプライマーセットをさらに設計することによって、より詳細な遺伝子型の判定が可能となる。ここで、野生型遺伝子を検出可能なプライマーとしては、野生型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列をＰＣＲ反応にて特異的に増幅可能なプライマー対（野生型遺伝子検出用プライマー１及び２）、からなるプライマーセットを指すものである。
【００７１】
ＰＣＲ法を利用して当該野生型遺伝子を特異的に検出するためのプライマーセットとしては、「野生型遺伝子検出用プライマー１」を設計することが必要である。野生型遺伝子検出用プライマー１は、当該機能欠損変異の「不存在」を検出可能な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。
野生型遺伝子検出用プライマー１の設計可能な位置は、下記（３）又は（４）に記載の条件を満たす限り、グルコラファサチン合成酵素遺伝子と同じ染色体上にあるゲノムＤＮＡ領域上であれば、如何なる領域にある塩基配列（当該領域を構成する塩基配列又はその相補配列）に設計することが可能である。即ち、野生型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の領域だけでなく、その周辺のプロモーターやスペーサー領域に設計することも可能である。
【００７２】
野生型遺伝子検出用プライマー１としては、具体的には、（３）機能欠損型遺伝子には存在しない野生型に特異的な塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。この場合、野生型遺伝子に対してはＰＣＲ増幅するが、機能欠損型遺伝子に対してはＰＣＲ増幅産物が得られないプライマーセットとなる。即ち、野生型遺伝子検出用プライマー２（後述）とのＰＣＲを行うことで、野生型遺伝子に対してはＰＣＲ増幅するが、機能欠損型遺伝子に対してはＰＣＲ増幅産物が得られないプライマーセットとなる。例えば、機能欠損型遺伝子に置換、欠失、又は挿入による当該機能欠損変異が存在する場合において、当該機能欠損変異に対応する野生型部位を有する塩基配列（好ましくは、当該機能欠損に対応する野生型部位を３’端に有する塩基配列）、を含むプライマーを挙げることができる。即ち、機能欠損型変異を有する塩基配列とはハイブリダイズしないプライマーとなる。
また、野生型遺伝子検出用プライマー１としては、（４）機能欠損型遺伝子に挿入又は欠失による当該機能欠失変異がある場合において、これに対応する野生型部位を挟む位置の一方に設計したプライマーを挙げることができる。この場合、野生型遺伝子検出用プライマー２とのＰＣＲを行うことで、野生型遺伝子と機能欠損型遺伝子とで、異なる塩基長のＰＣＲ増幅産物が得られるプライマーセットとなる。例えば、機能欠損型遺伝子に挿入又は欠失変異が存在する場合において、当該機能欠損変異に対応する野生型部位の５’側にある塩基配列、を含むプライマーを挙げることができる。
【００７３】
なお、野生型遺伝子検出用プライマー１を設計する領域としては、好ましくは、上記（３）の場合では、当該変異に対応する野生型部位が、プライマー配列内の３’側（好ましくは３’端）に含まれるように設計することが好適である。上記（４）の場合では、当該機能欠損変異に近接する５’側の領域に設計することが好適である。
【００７４】
ＰＣＲ法により当該野生型遺伝子を機能欠損型遺伝子と区別して検出するためには、「野生型遺伝子検出用プライマー２」を設計することが必要である。野生型遺伝子検出用プライマー２は、ＰＣＲ反応において上記した野生型遺伝子検出用プライマー１とプライマー対を形成可能な位置にある塩基配列、を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。
野生型遺伝子検出用プライマー２を設計可能な領域としては、上記した野生型遺伝子検出用プライマー１とプライマー対を形成して、ＰＣＲ増幅が可能なダイコンゲノム領域であれば、野生型遺伝子又は当該遺伝子と同じ染色体上にある領域（当該領域を構成する塩基配列又はその相補配列）を用いることができる。
【００７５】
ＰＣＲの技術的な点を考慮すると、野生型遺伝子検出用プライマー２を設計可能な領域としては、増幅産物の塩基長がＰＣＲ増幅に適した領域であることが好適である。具体的には、ＰＣＲ増幅産物の塩基長（塩基対：ｂｐ）が、５ｋｂｐ以下となる位置に、上記野生型遺伝子検出用プライマー２を設計することが好適である。好ましくは、３０ｂｐ〜５ｋｂｐ、好ましくは５０ｂｐ〜３ｋｂｐ、より好ましくは７５ｂｐ〜２ｋｂｐ、さらに好ましくは１００ｂｐ〜１．５ｋｂｐ、となる塩基長が好適である。なお、増幅長があまりに長鎖になりすぎるように設計した場合、ＰＣＲ増幅産物が得られにくくなり好適でない。
【００７６】
野生型遺伝子検出用プライマー１及び２を設計可能な領域としては、具体的には、上記条件を満たすようにして、配列番号１又は２に記載の塩基配列又はその相補配列上に設計することができる。
【００７７】
・ＰＣＲ法による遺伝子型判定
ＰＣＲ法による遺伝子型判定を行うためには、対象ダイコン植物体におけるＤＮＡを、ＰＣＲ反応にて増幅可能な試料として調製することが必要である。プライマーセットの設計条件によっては、破砕試料や溶出試料等を用いることも可能であるが、好適には常法や市販キット等を用いてＤＮＡ抽出を行って、ＰＣＲ反応に適した試料を調製することが望ましい。なお、ＰＣＲ法は極めて感度が高い検出法であるため、調製する試料の量は微量（例えば、発芽直後のスプラウトの一部分）でも十分に分析に供することが可能である。また、試料調製に用いるダイコン植物体の組織は、ＤＮＡを含む如何なる組織であっても使用可能である。
【００７８】
本発明においては、上記した「機能欠損型遺伝子検出用プライマー１及び２」を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、対象であるダイコンのグルコラファサチン合成酵素遺伝子における「機能欠失変異」の存在を検出することが可能となり、この結果を基に遺伝子型を判定することができる。
具体的には、上記（１）又は（２）に記載のプライマーセットを用いて機能欠損型遺伝子に特異的ＰＣＲ増幅産物が得られた場合、対象ダイコンのグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型は、「機能欠損型遺伝子を有する遺伝子型」であると判定することができる。即ち、この場合、対象であるダイコンの遺伝子型は、「機能欠損型遺伝子ホモ型」又は「ヘテロ型」（機能欠損型遺伝子／野生型遺伝子のヘテロ型）であると判定することができる。
なお、上記（２）に記載のプライマーセットを用いた場合において、増幅産物の塩基長の設定が適正である場合、塩基長の違いによって「機能欠損型遺伝子ホモ型」と「ヘテロ型」の判別も可能となる。
これらの遺伝子型であるダイコン個体は、そのゲノム中に機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有する個体であるため、グルコラファサチン欠失系統を作出するための育種素材及び遺伝子資源として、有効に用いることができる。
【００７９】
また、さらに本発明においては、「野生型遺伝子検出用プライマー１及び２」を用いることによって、「機能欠損型遺伝子ホモ型」と「ヘテロ型」を区別して、より確実に検出することが可能となる。
具体的には、上記（３）又は（４）に記載のプライマーセットを用いて野生型遺伝子に特異的ＰＣＲ増幅産物が得られた場合、対象ダイコンのグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型は、「野生型遺伝子を有する遺伝子型」であると判定することができる。即ち、この場合、対象であるダイコンの遺伝子型は、「野生型遺伝子ホモ型」又は「ヘテロ型」であると判定することができる。
従って、本発明においては、「機能欠損型遺伝子検出用プライマー１及び２」と「野生型遺伝子検出用プライマー１及び２」の２対のプライマーセットを両方用いることによって、「機能欠損型遺伝子ホモ型」、「ヘテロ型」、及び「野生型遺伝子ホモ型」の３種類の遺伝子型を区別して、遺伝子型を高精度で判定することが可能となる。
【００８０】
ここで、上記におけるＰＣＲ反応は、通常のＰＣＲ法により行うことが可能である。また、ｄＮＴＰに標識物質を結合させて、ＰＣＲ反応を行う方法も可能である。ＰＣＲ反応後は、通常の手法（インターカレート法、蛍光検出法、発光検出法、発色検出法、抗体検出法、ＲＩ検出法など）によって、ＰＣＲ増幅産物が得られているかを容易に検出することが可能である。簡便な方法としては、エチジウムブロマイド、蛍光物質等を用いて容易に検出が可能である。リアルタイムＰＣＲ装置を利用した手法を用いることも好適である。
【００８１】
本発明においては、「機能欠損型遺伝子検出用プライマー１及び２」と「野生型遺伝子検出用プライマー１及び２」の２対のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う場合、具体的には次に示す方法にてＰＣＲを行うことが可能である。
まず、i ）第１の方法としては、プライマーセットごとに２つの反応液を調製して、それぞれ別途にＰＣＲ反応を行う方法を挙げることができる。この場合、それぞれの反応液を電気泳動し、増幅パターンを総合することで遺伝子型を判定することができる。
また、ii）第２の方法としては、当該２対のプライマーセットを混合して１つの反応液として調製し、１回のＰＣＲを行う方法を挙げることができる。この場合、１つのレーンにおける電気泳動後の増幅パターンから遺伝子型を判定することが可能となる。そのため、１検体につき１試料の調製のみで結果が得られ、検体数が極めて多い場合に有効である。しかし、当該方法においては、野生型遺伝子由来の増幅産物と機能欠損型遺伝子由来の増幅産物の間で、２種類の増幅産物の差異を区別できるようにする必要がある。例えば、増幅産物の塩基長の長さが異なるようにプライマーセットを設計する、プライマーに両者を区別可能な標識物質等をそれぞれに付与する、等の態様が必要となる。
なお、各プライマーセットで検出可能な遺伝子型の例を表１に示した。
【００８２】
【表１】
0006499817.tif 000003
【００８３】
また、２対のプライマーセットの設計例の応用として、機能欠損型遺伝子検出用プライマー２と野生型遺伝子検出用プライマー２とを共用プライマーとするようにプライマーセットを設計することによって、２対のプライマーセットを３種類のプライマーのみで構成する態様を挙げることができる。この場合の具体的態様としては、「機能欠損型遺伝子検出用プライマー１」、前記プライマーとプライマー対を形成する「共通用プライマー（機能欠損型遺伝子検出用プライマー２であり且つ野生型遺伝子検出用プライマー２であるプライマー）」、及び前記共通用プライマーとプライマー対を形成する「野生型遺伝子検出用プライマー１」、の３種類のプライマーからなるプライマーセットを挙げることができる。
【００８４】
［オリゴヌクレオチドプローブ］
本発明において当該機能欠損変異を検出する手段としては、オリゴヌクレオチドプローブを用いた技術を利用する方法も有効である。
本明細書中、「オリゴヌクレオチドプローブ」とは、デオキシヌクレオチド又はヌクレオチドを重合させて合成したオリゴヌクレオチドであって、特定塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列で構成された一本鎖核酸を指すものである。核酸分子種としてはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれも利用することができる。また、モルフォリノオリゴなどの核酸類似物質を用いることもできる。
【００８５】
ハイブリダイゼーション法により当該機能欠損型遺伝子を野生型遺伝子と区別して検出するためには、機能欠損変異の存在を特異的に検出可能なプローブを設計することが必要である。
ここで、当該機能欠損変異を検出するためのプローブ（「機能欠損型遺伝子検出用プローブ」）としては、機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を構成する塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列であって、当該機能欠損変異を特異的に検出可能な塩基配列を含むプローブを挙げることができる。
具体的に、i) 挿入変異の場合において、当該挿入変異上の塩基配列又はその相補配列、を含むプローブを挙げることができる。当該態様の場合、野生型遺伝子とのミスハイブリを回避して、検出シグナルの特異性を担保するために、好ましくは野生型遺伝子に共通して存在する領域の塩基配列又はその相補配列を含まないプローブとすることが好適である。当該態様の場合、機能欠損型遺伝子に対しては特異的にハイブリダイゼーションするが、野生型遺伝子に対してはハイブリダイゼーションしないプローブとなる。
また、当該プローブの別態様としては、ii) 置換、欠失、又は挿入変異の場合において、当該変異部位を含む塩基配列、を含むプローブを挙げることができる。当該態様の場合、機能欠損型遺伝子に対してはハイブリダイゼーションしやすいが、野生型遺伝子に対してはハイブリダイゼーションしにくいプローブとなる。
【００８６】
機能欠損型遺伝子検出用プローブと野生型遺伝子とのミスハイブリを回避し、検出感度を向上させる手段としては、マスキングプローブの使用を挙げることができる。ここで、「マスキングプローブ」とは、野生型遺伝子に特異的な塩基配列又はその相補配列を含むプローブであって、当該機能欠損変異に対応する野生型部位を含む塩基配列、を含むプローブを指すものである。
当該マスキングプローブは、機能欠損型遺伝子検出用プローブよりも野生型遺伝子にハイブリダイズする親和性が高いため、機能欠損型遺伝子検出用プローブとマスキングプローブが競合する共存在下においては、機能欠損型遺伝子検出用プローブが野生型遺伝子にミスハイブリすることを顕著に抑制することが可能となる。特に、上記ii)に記載のプローブの場合、マスキングプローブの使用は極めて好適である。
【００８７】
当該オリゴヌクレオチドプローブとしては、プローブの用途によって異なるが、グルコラファサチン合成酵素遺伝子（機能欠損型遺伝子、野生型遺伝子）を構成する塩基配列又はその相補配列と一致する塩基配列を、連続して少なくとも１２塩基有するプローブが好適である。好適な塩基長（塩基：ｍｅｒ）としては、当該塩基配列又はその相補配列に含まれる塩基配列を、連続して少なくとも１２塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、さらに好ましくは２５塩基以上、含むプローブであることが好適である。
また、オリゴヌクレオチドプローブの塩基長の上限としては、挿入配列の塩基長自体を上限とすることもできるが、例えば、１０００塩基以下、好ましくは５００塩基以下、より好ましくは１００塩基以下を挙げることができる。
また、ドットブロット法、TaqMan(R)プローブ法、マイクロアレイ法などによって、１〜数塩基の相違を検出するのであれば、検出感度を担保するために、上限値が短い鎖とした方が好適である。この場合の上限値としては、２００塩基以下、好ましくは１００塩基以下、より好ましくは５０塩基以下程度の短いプローブとすることが好適である。
また、オリゴヌクレオチドプローブの５’端や３’端は、検出用の蛍光物質や標識物質等を結合したものを好適に用いることができる。また、プローブ合成時に、ｄＮＴＰやＮＴＰに標識物質を結合させたものをプローブ構成塩基として取り込ませて用いることもできる。
【００８８】
・オリゴヌクレオチドプローブを用いた遺伝子型判定
プローブを用いた遺伝子型判定を行うためには、対象ダイコン植物体におけるＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応が可能な試料を調製することが必要である。
ハイブリダイゼーションの条件によっては、破砕試料や溶出試料等を用いることも可能であるが、具体的には、常法や市販キット等を用いてＤＮＡ抽出を行って、ハイブリダイゼーション反応に適した試料を調製することが望ましい。なお、ハイブリダイゼーション法は極めて感度が高い検出法であるため、調製する試料の量は微量（例えば、発芽直後のスプラウトの一部分）でも十分に分析に供することが可能である。また、試料調製に用いるダイコン植物体の組織は、ＤＮＡを含む如何なる組織であっても使用可能である。
シグナルの検出法としては、通常の手法（インターカレート法、蛍光検出法、発光検出法、発色検出法、抗体検出法、ＲＩ検出法など）によって、特異的なハイブリダイゼーションシグナルが得られているかを容易に検出することが可能である。好ましくは、プローブ自体に蛍光物質や標識物質を結合して、ハイブリダイズしたプローブのシグナルを特異的に検出する方法が好適である。
【００８９】
本発明においては、上記機能欠損型遺伝子検出用プローブを用いて機能欠損型遺伝子に特異的なシグナルが得られた場合、対象ダイコンのグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型は、「機能欠損型遺伝子を有する遺伝子型」であると判定することができる。即ち、この場合、対象であるダイコンの遺伝子型は、「機能欠損型遺伝子ホモ型」又は「ヘテロ型」であると判定することができる。
これらの遺伝子型であるダイコン個体は、当該ゲノム中に機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子を有する個体であるため、グルコラファサチン欠失系統を作出するための育種素材及び遺伝子資源として、有効に用いることができる。
【００９０】
［近接領域連鎖マーカーの利用］
本発明においては、グルコラファサチン合成酵素遺伝子と分離が生じ得ないような極めて近接な領域に存在する連鎖マーカー（ＳＮＰ、ＳＳＲなど）については、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の変異の有無の検出に利用することが可能である。即ち、当該近接領域連鎖マーカーについては、当該遺伝子座の「機能欠損変異の有無」を間接的であるが比較的精度良く検出して、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型を判定することが可能となる。
【００９１】
このような近接領域として、具体的には、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の３’側及び５’側のそれぞれに近接する２００ｋｂｐ以内、好ましくは１００ｋｂｐ以内、より好ましくは７５ｋｂｐ以内、さらに好ましくは５０ｋｂｐ以内、特に好ましくは２０ｋｂｐ以内、一層好ましくは１０ｋｂｐ以内の領域を挙げることができる。このようなグルコラファサチン合成酵素遺伝子座と極めて近接する領域にある連鎖マーカーであれば、組換えによるグルコラファサチン合成酵素遺伝子との分離は極めて生じ難いため、連鎖マーカー型から当該機能欠損型変異の有無を判定することができる。この点は、ポジショナルクローニング法により近傍連鎖マーカーを利用するためには、大規模な分離集団を用いた高精度連鎖解析が必要となる点からも支持される知見である。
当該近接領域に存在する連鎖マーカー型の検出は、ＰＣＲ法を利用した技術、ハイブリダイゼーション法を利用した技術、を利用することができる。また、プローブとプライマーを併用したリアルタイムＰＣＲ法、変異型と野生型の２種類のプローブを併用したドットブロット法、などの多型検出技術を利用することも可能である。また、制限酵素断片長多型、シーケンサーによる塩基配列決定、などによって、マーカー型を検出することも可能である。
【００９２】
当該近接領域連鎖マーカーとしては、一例として挙げると、後述するＮＲ１５４Ｅ系統又は当該系統に由来する系統の場合であれば、実施例１（６）に記載の連鎖マーカーを用いることが可能である。但し、ＮＲ１５４Ｅ系統以外の別系統（例えば、ＭＲ０５０Ｅ系統など）において機能欠失型遺伝子を検出する場合であれば、各変異系統に特異的な近傍連鎖マーカーを探索して、利用することが必要となる。
【００９３】
［系統識別］
本発明においては、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型を判定することによって、その判定した遺伝子型情報を用いて、グルコラファサチン含有性又は欠失性に関する表現型を識別することが可能となる。ここで、当該遺伝子型は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子そのものの変異を指標としているため、通常の連鎖マーカー（上記、近接領域連鎖マーカーを除く）を利用した方法とは異なり、グルコラファサチン欠失性を示す表現型の高精度での識別及び選抜が可能となる。
また、勿論であるが、当該機能欠損型の変異をＤＮＡマーカーとして利用した場合の方が、原理的に上記近傍連鎖マーカーよりも正確な識別及び選抜が可能となる。
【００９４】
グルコラファサチン欠失性は劣性遺伝子によるものであるため、遺伝子型と表現型の関係は次のようになる。
具体的には、当該遺伝子型が「野生型遺伝子ホモ型」及び「ヘテロ型」を示す遺伝子型である場合、そのダイコン個体は、他のグルコラファサチン代謝を司る遺伝子にグルコラファサチンを欠失させる変異が生じていない限り、その表現型はグルコラファサチン含有性を示す表現型となる。
一方、当該遺伝子型が「機能欠損型遺伝子ホモ型」の場合、グルコラファサチン欠失性を示す表現型となる。
【００９５】
以上に示すように、本発明においては、上記プライマーセット及び／又はプローブを用いて遺伝子型の判定を行うことによって、当該遺伝子型に起因する「グルコラファサチン欠失系統」を高精度で識別することが可能となる。
【００９６】
［遺伝子型判定用キット、系統識別用キット］
本発明においては、上記オリゴヌクレオチドプライマーセット及び／又はオリゴヌクレオチドプローブを含むキットを、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型判定用キットとすることができる。当該キットは、ＰＣＲ反応用試薬、ハイブリダイゼーション反応用試薬、検出用試薬等、を含めた製品形態のキットとすることもできる。
また、上記オリゴヌクレオチドプライマーセット及び／又はオリゴヌクレオチドプローブを、メンブレンや濾紙等のセルロース担体、ガラスチップ等の基盤担体、合成樹脂等のカラム担体などに固定して、簡易に遺伝子型判定が可能な製品形態とすることもできる。
さらに、当該遺伝子型判定キットは、系統識別用キットとして、グルコラファサチン欠失系統識別用キットの製品形態とすることも可能である。
【００９７】
４．機能欠損型遺伝子をホモ型で有するダイコン系統
ダイコンゲノムにおいて、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座に上記した機能欠損型遺伝子を「ホモ型」で有する個体は、グルコシノレート組成がグルコラファサチン欠失性を示すダイコンとなる。
ここで、「グルコラファサチン欠失性」とは、ダイコン植物体においてグルコラファサチンが欠失又は実質的に欠失している性質を指す。具体的には、上記段落「２．機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子」に記載したグルコラファサチン含量及び／又はグルコシノレート組成である性質を指す。
なお、当該遺伝子座において、当該機能欠損型遺伝子と野生型遺伝子の組み合わせで有する個体（機能欠損型遺伝子／野生型遺伝子のヘテロ型個体）では、「グルコラファサチン欠失性」を示す個体にはならず、通常野生型のグルコシノレート組成である「グルコラファサチン含有性」の表現型を示す個体となる。
【００９８】
ここで、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座に当該機能欠損型遺伝子をホモ型に有することにすることが可能な「ダイコン（ダイコン植物）」とは、一般的なRaphanus sativusに属する植物種であれば、いずれの品種系統のものを挙げることができる。具体的には、日本ダイコン（R. sativus var. longipinnatus）、ハツカダイコン（R. sativus var. sativus）、クロダイコン（R. sativus var. niger）等を挙げることができる。より具体的には、日本ダイコン（R. sativus var. longipinnatus）に属する品種系統を挙げることができる。
なお、ダイコンゲノムにおけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の数は、単一遺伝子座であると認められる。また、当該遺伝子に対して機能相補性や冗長性を示す極めて高い相同性を示す遺伝子の存在は確認されていない。
なお、通常のダイコンは二倍体であるが、染色体の倍数体化（例えば複二倍体化、四倍体化等）が生じた品種系統である場合、当該遺伝子座における全ての遺伝子が機能欠損型遺伝子になる（ホモ型になる）ようにすることで、グルコラファサチン欠失性の表現型を示すダイコンとなる。
【００９９】
［機能欠損型遺伝子ホモ型系統の作出困難性］
本発明者らが見出したグルコラファサチン欠失性を誘起する原因遺伝子は、ＮＲ１５４Ｅ系統を用いたポジショナルクローニング法（連鎖解析及び高精度連鎖解析）、定量的発現解析、機能獲得型遺伝子導入試験、遺伝子配列解析、等を駆使して同定された、グルコラファサチン欠失性を誘起する原因遺伝子である。当該原因遺伝子の野生型遺伝子は、グルコラファサチンの合成反応に関与する酵素をコードする遺伝子である。
【０１００】
ＮＲ１５４Ｅ系統は、品種「西町理想」（通常野生型のグルコシノレート組成を示す品種）を原集団として、人為的な自殖操作及びグルコシノレート組成を指標とする優良個体の選抜を繰り返して行うことによって、作出された系統のうちの１系統である。具体的には、ゲノム中のグルコラファサチン合成酵素遺伝子座に、配列番号７に記載の塩基配列を含む遺伝子をホモ型で有するダイコン系統である。
なお、原集団である品種「西町理想」は、通常野生型のグルコラファサチン含有性を示す品種であり、グルコラファサチン欠失性を示すことは知られていない。ＮＲ１５４Ｅ系統は、品種「西町理想」の人為的な栽培集団内において生じた当該機能欠損型の突然変異遺伝子を「ホモ型」で有する個体について、自殖操作と集団内からグルコラファサチン含量を指標として選抜することによってはじめて得られた系統である。
【０１０１】
ここで、ダイコンの「自殖操作」とは、人為的な隔離操作を行って、開花前の自家不和合性のみられない一定期間内に自家花粉を受粉させ、得られた集団からグルコラファサチン欠失性を示す個体を選抜する操作を行う工程である。なお、ダイコンの自家受粉は、自由交配の状態では起こり難い現象である。
また、「グルコラファサチン欠失性」という表現型は、植物体の外形では判別できない内在成分に係るグルコシノレート組成に関する形質であるため、当該含量を指標とした表現型判定を行うためには、ＨＰＬＣ分析等により行うことが必要となる。即ち、ダイコンの形態（形状、色彩等）を見ても、当該表現型を判定することはできない。
これらの点から明らかなように、当該「グルコラファサチン欠失性」という形質を集団内で固定するためには、ＨＰＬＣ分析等で各個体のグルコシノレート含量を測定した上で、人為的に自殖操作及び選抜操作を行うことが必要であると認められる。
【０１０２】
なお、本発明者らは、本発明に係る研究を開始するにあたり、世界中で保存されているダイコン遺伝子資源「６５０品種系統以上」を対象にして、グルコラファサチン欠失性を示す品種系統の探索を網羅的に行ったが、「グルコラファサチン欠失性」を示す形質が集団内に固定されたダイコン品種系統は見出されなかった。
従来品種系統において、グルコラファサチン欠失系統（具体的には当該機能欠損型遺伝子をホモ型で有するダイコン系統を含む集団）が見いだされなかった理由としては、次の理由が考えられる。即ち、ダイコンでは、i）通常の状態では本発明に係る劣性突然変異が生じにくく、ii）また、劣性突然変異型遺伝子は、集団内に広がる前に淘汰され消滅していた可能性が考えられる。
【０１０３】
［グルコラファサチン欠失性を誘起する作用機序］
本発明におけるグルコラファサチン欠失性ダイコン系統は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座に機能欠損型遺伝子をホモ型で有すること（作用機序）によって、グルコラファサチン欠失性を示すようになったダイコン系統である。
例えば、ＮＲ１５４Ｅ系統は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の第１エクソンに機能欠損型変異を有する遺伝子（配列番号７に記載の塩基配列を含む遺伝子）をホモ型で有するダイコン系統である。また、ＭＲ０５０Ｅ系統は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の第３エクソンに機能欠損型変異を有する遺伝子（配列番号９に記載の塩基配列を含む遺伝子）をホモ型で有するダイコン系統である。
【０１０４】
ここで、ダイコンにおけるグルコラファサチン代謝（合成や分解等）に関与する遺伝的因子は、原理的には、本発明に係るグルコラファサチン合成酵素遺伝子以外にも複数存在すると考えられる。具体的には、当該遺伝子とは別途にグルコラファサチンの合成・生成に関与する遺伝子、当該グルコラファサチン合成酵素遺伝子の発現調節を行う遺伝子、グルコラファサチンの分解反応に関与する遺伝子、グルコラファサチンからの二次代謝物の生成に関与する遺伝子、などの存在が推測される。
これらの遺伝子のいずれかにその機能を欠損又は過剰作用する変異が生じた場合、グルコラファサチンが欠失する表現型になると推測される。
また、グルコラファサチン代謝の例ではないが、近縁属の植物であるシロイヌナズナには、アリファティック系グルコシノレート全般の生合成を制御する転写制御因子であるＭｙｂ転写因子が存在することが知られている（Hirai et al., 2007 PNAS, 104: 6478-6483）。
以上の知見は、「グルコラファサチン欠失性」を示すダイコン系統の全ての系統が、本発明に係るグルコラファサチン合成酵素遺伝子の機能欠損によって誘起されるわけではない可能性を示している。即ち、「グルコラファサチン欠失性」という表現型は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子とは異なる別の遺伝子の機能欠損や機能異常によって誘起される可能性があり、本発明とは全く異なる「作用機序」の存在も想定される。
【０１０５】
［グルコラファサチン欠失系統の作出方法］
グルコラファサチンを欠失したダイコン系統を作出するためには、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座に当該機能欠失型遺伝子を「ホモ型」で有するダイコンを作出する必要がある。そのためには、当該遺伝子座に当該機能欠失型遺伝子を有するダイコンを「遺伝子供与体」として用いた育種的手法を利用することが好適である。
ここで、遺伝子供与体（交配親）として用いる「当該遺伝子座に当該機能欠失型遺伝子を有するダイコン」としては、上記した機能欠損型遺伝子を当該遺伝子座に有するダイコンであれば、如何なる個体を用いることができる。また、機能欠損型遺伝子をホモ型で有する個体だけでなく、ヘテロ型（機能欠損型遺伝子／野生型遺伝子のヘテロ型）で有する個体も、遺伝子供与体として好適に用いることができる。
【０１０６】
「機能欠損型遺伝子の供与体（交配親）」として用いることが可能なダイコンとしては、具体的には、i）当該遺伝子座へ「当該機能欠損型遺伝子が導入されたダイコン」を用いることができる。ここで、当該遺伝子座への当該機能欠損型遺伝子の導入手段としては、如何なる遺伝子導入手段を挙げることができる。例えば、アグロバクテリウム、エレクトロポレーション、パーティクルガン、細胞融合等、遺伝子導入を利用した相同組み換え技術により、当該機能欠損型遺伝子が当該遺伝子座に導入されたダイコンを挙げることができる。また、人為的な交配手法によって当該機能欠損型遺伝子が当該遺伝子座に導入されたダイコンを挙げることができる。
また、ii）当該遺伝子座に存在する野生型のグルコラファサチン合成酵素遺伝子に、機能欠損型の変異が導入されたダイコンを得て、当該ダイコンを遺伝子供与体として用いることができる。ここで、当該遺伝子への当該機能欠損型変異の導入として、如何なる変異導入を挙げることができる。例えば、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、植物ウイルス等を介した挿入配列導入を伴う変異導入を挙げることができる。また、種子に対する放射線照射処理、重イオンビーム処理、変異源物質を含む溶液での処理などを行った突然変異促進により変異導入を挙げることができる。また、遺伝子編集技術（ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ等）による変異導入を挙げることができる。
このような変異導入によって得られた機能欠損型遺伝子を有する個体は、遺伝子供与体として好適に用いることができる。
また、iii）既に作出した当該遺伝子座に当該機能欠損型遺伝子を有するダイコンがある場合、そのダイコンを遺伝子供与体として用いることができる。
また、iv）上記 i）〜iii）のいずれかのダイコンに由来する後代系統（自殖及び／又は交配により得られた系統）に属するダイコンであって、当該遺伝子座に機能欠損型遺伝子を有するダイコンについても、遺伝子供与体として用いることができる。
【０１０７】
一方、他方の交配親（所望のダイコン）としては、通常であれば、i）当該機能欠損型遺伝子の受容体として、所望の形質を有するダイコン品種系統に属する個体（所望のダイコン個体）を用いることができる。
ここで、「所望の形質」としては、栽培特性や品質、ダイコン加工品等に有利になる全ての形質を挙げることができる。例えば、肥大根部の品質を向上させる形質（例えば、肥大根部の大きさ、肥大根部の形状、肥大根部の柔組織の密度等）、環境耐性に関する形質（例えば、耐寒性、耐暑性等）、耐病性に関する形質、成長に関する形質（例えば、栽培期間の早晩性、植物ホルモン合成系等）、生殖に関する形質（例えば、花成制御、自家不和合性、細胞質雄性不稔性等）、色素に関する形質（例えば、アントシアニン組成、アントシアニン含量等）等を挙げることができる。
また、他方の交配親（所望のダイコン）としては、ii）当該機能欠損型遺伝子を有するダイコンをそのまま用いることも可能である。この場合、当該機能欠損型遺伝子を有するダイコンどうしである２個体（同系統どうし又は他系統どうし）を、他殖操作によって受粉させる操作を行う。また、iii）所望によっては、他方の交配親を用いずに自家受粉による交配（自殖操作）を行うことによって、所望のダイコンを得ることも可能である。
【０１０８】
上記交配操作を行った後は、必要に応じて自殖操作及び選抜操作を行うことによって、所望の優良形質を有し且つ当該機能欠損型遺伝子をホモ型で有する個体を得ることが可能である。また、更に必要に応じて、更なる所望のダイコン個体との交配、自殖操作、及び選抜操作を繰り返して行うことによって、更に優良形質を有するダイコン個体を得ることもできる。
本発明では、当該グルコラファサチン欠失性及び所望の形質が遺伝的に固定された集団を得ることで、グルコラファサチン欠失性を示すダイコン系統（又は品種）を作出することが可能となる。
【０１０９】
本発明では、上記交配後の後代集団からの「選抜操作」において、本発明に係る遺伝子型判定方法を利用することにより、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型を高精度で判定することが可能となる。これにより、グルコラファサチンに関する所望の個体を高い精度にて選抜することが可能となり、グルコラファサチン欠失系統を短期間で且つ効率良く作出することが可能となる。
【０１１０】
［グルコラファサチン欠失系統の植物体］
本発明に係るグルコラファサチン欠失系統のダイコンから得られた植物体は、農業及び食品等の様々な分野において、極めて有効に利用することができる。当該植物体を利用することによって、農作物としてのダイコン、大根加工食品（沢庵、漬物、大根おろし、切り干し大根、つま、など）、大根を利用した各種製品（飲料、色素等）等の各分野において、「風味劣化」、「沢庵臭の発生」、及び「黄変化による色ムラの発生」などの品質劣化の問題を根本的に解決することが可能となる。
ここで、「ダイコンから得られた植物体」としては、ダイコンの植物体を構成する全ての部位や組織、全ての生育段階に属する植物体を挙げることができる。具体的には、根（側根や未発達状態の根を含む）、胚軸部、葉、葉柄、茎、花蕾、花、種子、スプラウト、ベビーリーフ、苗、などを挙げることができる。
農作物及び加工食品等の利用を考慮すると、肥大根（根と胚軸部からなる部分）部を好適に用いることができる。生鮮食品として、スプラウト（発芽直後の子葉、胚軸、及び根からなる植物体）も好適に用いることができる。また、ベビーリーフや葉についても食品として用いることができる。
また、種子、苗（好ましくは発芽後４０日程度までの幼苗）は、栽培や育種に好適に用いることができる。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【０１１２】
［実施例１］『ポジショナルクローニングによる遺伝子座の同定』
ポジショナルクローニングによる連鎖解析及び高精度連鎖解析を行い、グルコラファサチン欠失形質の原因遺伝子座の同定を行った。
【０１１３】
（１）「グルコラファサチン欠失性ダイコン系統」
ポジショナルクローニング法によりグルコラファサチン欠失性の原因遺伝子座を同定するため、グルコシノレート組成の表現型がグルコラファサチン欠失性を示す「ＮＲ１５４Ｅ」系統を用いた（図２）。
当該ＮＲ１５４Ｅ系統は、本発明者らが独自に作出した複数のグルコラファサチン欠失系統のうちの１系統である。具体的には、当該系統は、品種「西町理想」（通常野生型のグルコシノレート組成を示す品種）を原集団として、人為的な自殖操作及びグルコシノレート組成を指標とする優良個体の選抜を繰り返して行うことによって、作出した系統のうちの１系統である。
当該「ＮＲ１５４Ｅ」系統は、他の通常野生型の品種系統と比べて、グルコラファサチンを含まず、その代わりにグルコエルシン含量が高いという性質を示す。また、グルコシノレート総量自体が低いという性質を示す。
【０１１４】
「ＮＲ１５４Ｅ」系統の優れたグルコラファサチン欠失性を確認するため、肥大根（肥大した根及び胚軸）部の乾燥重量あたりのグルコシノレート含量の測定を行った。当該測定は、肥大根部を液体窒素で凍結粉末化した後、７０％メタノールで抽出したグルコシノレートを脱硫化してＨＰＬＣ分析に供し、グルコシノレート組成を内部標準であるシニグリン換算で定量化することで行った。
その結果、表２に示すように、「ＮＲ１５４Ｅ」系統ではグルコラファサチンが検出されず、グルコラファサチン欠失性という観点において、極めて優れた性質を示す系統であることが示された。（※なお、表２における「ＭＲ０５０Ｅ」系統も本発明者らが作出したグルコラファサチン欠失系統であるが、ＮＲ１５４Ｅ系統とは別起源であるグルコシノレート総量が多い系統である。）
【０１１５】
また、本発明者らは、世界中で保存されているダイコン遺伝子資源「６５０品種系統以上」を対象にして、グルコラファサチン欠失性を示す品種系統の探索を網羅的に行ったが、当該グルコラファサチン欠失性形質が固定された品種系統を発見することができなかった。
【０１１６】
【表２】
0006499817.tif 000004
【０１１７】
（２）「分離比解析」
戻し交雑（ＢＣ１）集団の分離比の解析を行ったところ、当該グルコラファサチン欠失性は、単因子劣性遺伝子によることが示唆された。
【０１１８】
（３）「原因遺伝子座の同定（連鎖解析）」
「ＮＲ１５４Ｅ」及び「ＨＡＧＨＮ」の両系統の個体からそれぞれＤＮＡを抽出し、無作為に選択した遺伝子領域２８８０ヶ所をＰＣＲ法により増幅し、その塩基配列を決定して両系統間の多型を同定した。
得られた多型のうち１３１ヵ所のＳＮＰ領域に、ＮＲ１５４Ｅ型ＳＮＰを含む塩基配列からなる標識したオリゴヌクレオチドプローブを設計した。また、ＳＮＰのＨＡＧＨＮ型（対立座）の塩基配列からなる非標識のオリゴヌクレオチドプローブも設計した。これら対立座の関係にある２種類のオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を混合した。
１３１ヶ所それぞれのＳＮＰについて、同様にしてプローブ溶液を調製して、１３１ヶ所のそれぞれのＳＮＰ領域に対応したＳＮＰ検出用プローブ溶液を調製した。また、４９ヵ所の片親特異的に増幅するプライマーを同定した。
【０１１９】
連鎖解析用の集団を確保するため、上記グルコラファサチン欠失性（変異型）である「ＮＲ１５４Ｅ」系統と、グルコラファサチン含有性（通常野生型）であるダイコン自殖系統「ＨＡＧＨＮ」とを交配することで、グルコラファサチン欠失形質の原因遺伝子（以下、単に原因遺伝子という場合がある。）を同定するための分離Ｆ２集団を育成した。
当該育成したＦ２集団９６個体からＤＮＡを抽出し、前記１３１ヶ所のＳＮＰ領域をＰＣＲ法により増幅し、ＳＮＰごとに各個体から得られたＰＣＲ増幅産物をナイロンメンブレンにスポットして固定した。（即ち、ＳＮＰごとにＰＣＲ産物をスポットしたナイロンメンブレンを１３１枚作成した。）
各ナイロンメンブレン（各ＳＮＰのＰＣＲ増幅産物）に対応するＳＮＰ検出用プローブ溶液を用いて、ドットブロットハイブリダイゼーション法（Dot-blot hybridization法；Shirasawa et. al., 2006 Theor. Appl. Genet. 113: p147-155）を行うことで、Ｆ２集団９６個体それぞれにおける１３１ヶ所のＳＮＰ型を決定した。
当該遺伝子型の情報からJoinMap4.0（Kyazma）を用いて各マーカー間の組換え価を算出し、連鎖地図を構築した。当該連鎖地図において、本実施例に係る原因遺伝子のマッピングに利用したＳＮＰを表３及び図３〜５に示した。
【０１２０】
Ｆ２集団９６個体の本葉１ｇを用いて、グルコラファサチン含量を測定し、各個体の表現型を判定した。グルコラファサチン含量の測定は、石田ら（Ishida et al., 2011 Breeding Science 61: 208-211）に記載の方法に準じたＨＰＬＣ分析により行った。
ここで、上記（２）で記載したように、当該グルコラファサチン欠失形質性は、単因子劣性遺伝子によること示唆されていることから、原因遺伝子の遺伝子型を次のように仮定した。
即ち、 i) グルコラファサチン欠失性を示す個体の遺伝子型を「ＮＲ１５４Ｅホモ型」と仮定した。また、ii) グルコラファサチン含有性を示す個体の遺伝子型を「ＨＡＧＨＮホモ型」又は「ヘテロ型」と仮定した。
【０１２１】
各個体における原因遺伝子の予測遺伝子型と上記各マーカー遺伝子型の情報を用いて、原因遺伝子と各マーカー間の組換え価を算出した。当該組換え価の値から、連鎖地図上に当該原因遺伝子の座乗領域を位置づけた。
その結果、当該原因遺伝子の座乗領域は、ＳＮＰマーカー「ＣＬ４６２４」と「ＣＬ６０２４」の範囲の間に存在することが示された（図６）。
【０１２２】
（４）「原因遺伝子座の絞り込み（連鎖解析）」
近傍連鎖マーカー（ＳＮＰ、ＳＳＲなど）を利用して、さらなる原因遺伝子座の絞り込みを行った。
上記原因遺伝子座乗領域の近傍ＳＮＰである「ＣＬ４６２４」と「ＣＬ６０２４」のＦ２集団１３５８個体のＳＮＰ型を決定し、２つのＳＮＰの間で組換えが生じていた４４個体を選抜した。
次に、当該両ＳＮＰで挟まれた領域内に、「ＮＲ１５４Ｅ」系統と「ＨＡＧＨＮ」系統とが区別できるＤＮＡマーカーを新たに探索して同定した。ＤＮＡマーカーの探索及びＤＮＡマーカー型の決定は、上記（３）に記載のＳＮＰ型の決定手順に準じて行った。探索の結果、新たなＳＮＰ及びＳＳＲを同定した。
上記選抜した４４個体について、上記（３）に記載の方法と同様にして、本葉におけるグルコラファサチン含量を測定し、表現型及び原因遺伝子の遺伝子型を判定した。そして、当該原因遺伝子と、上記新たに見出した各ＤＮＡマーカーとの組換え値を算出し、当該組換え価と比較することで、座乗領域をさらに絞り込んだ。
その結果、当該原因遺伝子の座乗領域は、ＳＳＲマーカー「４Ｄ０１＿ＮＥＤ」とＳＮＰマーカー「６Ｃ０４＿ｐｏｓｔ」の間（約１ｃＭ）に絞り込めることが明らかになった（図６）。
【０１２３】
（５）「ゲノムコンティグ配列」
次に、グルコラファサチン含有性（野生型）系統である「Aokubi S-h」系統のＢＡＣライブラリーの塩基配列及びＳｃａｆｆｏｌｄ配列（Rsa1.0_00457.1）を用いて、前述のＳＳＲマーカー「４Ｄ０１＿ＮＥＤ」及びＳＮＰマーカー「６Ｃ０４＿ｐｏｓｔ」を用いたスクリーニングを行った。ダイコンのゲノム塩基配列は、Raphanus sativus Genome DataBase（http://radish.kazusa.or.jp/）から入手した。
その結果、当該原因遺伝子は、「Aokubi S-h」系統で解析された１つのＳｃａｆｆｏｌｄ配列と２クローンのＢＡＣライブラリーによりカバーされる領域内に、座乗することが明らかとなった（図６）。
これらの塩基配列情報から、当該対象原因遺伝子の座乗範囲を物理的にカバーするゲノムコンティグ配列（野生型である「Aokubi S-h」系統のゲノム配列）を作成した。
【０１２４】
（６）「高精度連鎖解析」
高精度連鎖解析により当該原因遺伝子をマップベースクローニング法で単離するためには、大量の分離集団を用いて組換え価を算出することが必要となる。そこで、当該原因遺伝子座が「ヘテロ型」となっているＦ２個体について自殖操作を行い、３８４０個体からなるＦ３集団を育成した。Ｆ３集団の育成は１２８穴セルトレイを用いて行い、各植物体からＤＮＡを抽出した。
当該原因遺伝子を挟み込む位置にあるＳＳＲマーカー「ｓｃａ８１５９＿Ａ０２」及び「ｎｏｄｅ１１＿Ｆ０３」に着目し、これら２つのマーカー間で組換えのある２１個体を選抜した。得られた組換え個体を９ｃｍポットへ移植した。
選抜個体について、上記（３）に記載の方法と同様にして、本葉におけるグルコラファサチン含量を測定し、表現型及び原因遺伝子の遺伝子型を判定した。
【０１２５】
次に、原因遺伝子の座乗領域を狭めるため、当該原因遺伝子と上記（４）で同定した各ＤＮＡマーカーとの組換え価を高精度で算出し、当該組換え価と比較することで、座乗領域をさらに絞り込んだ。
その結果、最終的に、ＳＳＲマーカー「ｓｃａ８１５９＿Ｄ０７」及び「ｓｓＧ０２」に挟まれる約２３．８ｋｂｐの領域内に、当該原因遺伝子が座乗することが明らかになった（図６）。
【０１２６】
【表３】
0006499817.tif 000005
【０１２７】
［実施例２］『グルコラファサチン欠失性原因遺伝子の推定』
上記高精度連鎖解析にて明らかになった座乗領域において、当該座乗領域に存在する遺伝子の中からグルコラファサチン欠失性原因遺伝子の推定を行った。
【０１２８】
（１）「配列予測」
実施例１にて同定された原因遺伝子の座乗領域について、当該領域に含まれる全ての遺伝子を推定した。遺伝子配列の推定には、遺伝子予測プログラムであるＡｕｇｕｓｔｕｓ（http://augustus.gobics.de/）及びＧＥＮＳＣＡＮ（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html）による配列解析を行った。
その結果、高精度連鎖解析で絞り込んだ当該座乗領域には、７つの遺伝子（遺伝子１〜７）が存在することが推定された（図７）。即ち、当該解析により、グルコラファサチン欠失性原因遺伝子の候補が、７つの候補遺伝子に絞り込めることが示された。
【０１２９】
（２）「発現解析による候補遺伝子の推定」
上記高精度連鎖解析で得られた座乗領域に存在する７つの候補遺伝子（遺伝子１〜７）について、発現解析を行うことによって、当該原因遺伝子の候補の絞り込みを行った。
グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」系統の肥大根部及び本葉から、RNeasy plant mini kit（QIAGEN社製）を使用して、全ＲＮＡ（total RNA）を抽出した。得られたＲＮＡを鋳型として、PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa bio社製）を用いて、ｃＤＮＡ（相補鎖ＤＮＡ）を合成した。対照試料として、グルコラファサチン含有品種（野生型）である「耐病総太り」を用い、同様にして全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した。
合成した各ｃＤＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行うことで、遺伝子１〜７のそれぞれの遺伝子発現を検出した。ＰＣＲ反応は、SYBR(R) Premix Ex Taq(TM)(Tli RNaseH Plus)（TaKaRa bio社製）を使用し、上記鋳型ｃＤＮＡを用いて、９５℃ ５秒，６０℃ ３０秒、表４に示すプライマーを用いて、３０サイクル又は３５サイクルのＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルに電気泳動し、試料間のＰＣＲ産物の増幅量の度合いを検出することで、各遺伝子における「ＮＲ１５４Ｅ」及び「耐病総太り」の間での発現量の相対的な差異を検出した。結果を表５に示した。当該表中において、ＰＣＲ増幅が明確に確認された試料を「＋」、増幅が明確に確認されなかった試料を「−」で示した。また、両系統間で増幅量に明確な差異が検出された場合、「＊」で示した。
【０１３０】
その結果、「ＮＲ１５４Ｅ」系統と「耐病総太り」とでは、遺伝子３の遺伝子発現に顕著な差異があることが明らかになった（表５）。具体的には、図８のゲル写真が示すように、遺伝子３の遺伝子発現は、グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」系統では、グルコラファサチン含有品種（野生型）の「耐病総太り」よりも、著しく減少していることが明らかになった。当該結果は、肥大根部及び本葉の両方において、同様の発現様式を示す結果であった。
一方、他の６つの遺伝子（遺伝子１，２，４〜７）では、「ＮＲ１５４Ｅ」系統と「耐病総太り」との間で、発現様式に明確な差異は検出されなかった（表５）。
【０１３１】
これらの結果から、グルコラファサチン含有品種（野生型）である「耐病総太り」では、遺伝子３は正常に遺伝子発現していることが示唆された。一方、グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」系統では、当該遺伝子が発現しておらず、遺伝子機能が欠失している可能性が示唆された。
当該遺伝子発現解析の結果を踏まえると、高精度連鎖解析で絞り込んだ座乗領域に存在する７つの遺伝子（遺伝子１〜７）のうち、「遺伝子３」が、グルコラファサチン欠失性原因遺伝子であることが示唆された。
【０１３２】
【表４】
0006499817.tif 000006
【０１３３】
【表５】
0006499817.tif 000007
【０１３４】
［実施例３］『グルコラファサチン欠失性原因遺伝子の遺伝子構造』
上記実施例にてグルコラファサチン欠失性原因遺伝子と推定された「遺伝子３」について、その遺伝子構造を詳細に解析した。
【０１３５】
（１）「野生型遺伝子３の構造」
グルコラファサチン含有系統「ＨＡＧＨＮ」（野生型）の本葉からＤＮＡを抽出し、「Aokubi S-h」のＳｃａｆｆｏｌｄ配列（Rsa1.0_00457.1）の配列を基に作成したプライマーを用いてＰＣＲを行い、遺伝子３のゲノム配列を単離してゲノムの塩基配列を決定した。
【０１３６】
また、「ＨＡＧＨＮ」（野生型）の本葉からRNeasy Plant（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、First Choice RLM-RACE Kit（ライフテクノロジーズ社）を使用してＣＡＰ構造を有するｍＲＮＡを特異的に選抜し、５’ＲＡＣＥ法によりｃＤＮＡ配列の単離を行った。シーケンサー（3730xl DNA Analyzer, Applied Biosystems社製）を用いて５’端ｃＤＮＡ配列の決定し、ゲノム配列と比較することで「転写開始点」（ＯＲＦの５’端、第１エクソンの第１塩基）の決定を行った。
その結果、遺伝子３の「転写開始点」は、翻訳開始コドンの最初の塩基から上流２９ｂｐの位置にあると推測された。
【０１３７】
また、同様にして、「ＨＡＧＨＮ」（野生型）の本葉からＲＮＡを用いて３’ＲＡＣＥを行って、３’端ｃＤＮＡ配列を決定し、ゲノム配列と比較することで「ＯＲＦ３’末端」（オープンリーディングフレーム末端である第３エクソンの最下流塩基）の決定を行った。
その結果、遺伝子３の「ＯＲＦ３’末端」は、終止コドンの第３塩基から３３４ｂｐの位置にあると推測された。
【０１３８】
以上、得られた当該ゲノム配列情報と転写開始点及びＯＲＦ末端の情報を総合すると、野生型遺伝子３（「ＨＡＧＨＮ」由来の遺伝子）は、配列番号２に記載の塩基配列からなる全長１７８７ｂｐの遺伝子であることが明らかになった。当該ゲノム配列上の遺伝子構造は、３つのエクソン及び２つのイントロンを含むゲノム構造であることが明らかにあった（図１０）。
ここで、野生型遺伝子３の全長は、第１エクソンの最上流の塩基（ＯＲＦ５’端）から第３エクソンの最下流の塩基（ＯＲＦ３’末端）までの塩基配列（全長１７８７ｂｐ）であった（表６）。また、当該「ＨＡＧＨＮ」（野生型）からのゲノムＤＮＡ配列は、「Aokubi S-h」のＳｃａｆｆｏｌｄ配列の遺伝子３配列（配列番号１における第２９７２番目から第４７５８番目までの塩基からなる塩基配列）と一致する配列であることが確認された。
【０１３９】
【表６】
0006499817.tif 000008
【０１４０】
当該野生型遺伝子３のゲノム配列を基にグルコラファサチン含有系統「ＨＡＧＨＮ」（野生型）から、完全長ｃＤＮＡの単離を行ったところ、遺伝子３のｃＤＮＡ配列は、配列番号３に記載の塩基配列であることが明らかになった。その構造は、５’ＵＴＲ〜３’ＵＴＲまで全長１４８２ｂｐのＤＮＡであった（表７）。
また、コーディング領域（ＣＤＳ：開始コドンの第１塩基〜終止コドンの第３塩基）は、配列番号４の塩基配列からなる１１１９ｂｐのＤＮＡであった（表７）。
【０１４１】
【表７】
0006499817.tif 000009
【０１４２】
次に、アミノ酸配列予測ソフト（GENETYX ver.12.0.1, GENETYX社製）を用いて野生型遺伝子３にコードされるアミノ酸配列を予測したところ、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる全長３７２ａａの蛋白質であることが示された。
ＮＣＢＩデータベースを用いた相同性検索を行った結果、先行の登録配列は存在せず、完全に新規タンパク質をコードする遺伝子であることが分かった。また、ドメイン予測解析（NCBI, Conserved Domain Search Service (CD Service), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)を行ったところ、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメイン（2-oxoglutarate and Fe(II)-dependent oxygenase domain、2 OG-Fe(II) oxygenase domainともいう。）を有することが示された（図９、表８）。
ここで、当該酵素ドメインを有する蛋白質は、植物においてスーパーファミリーを形成しており、様々な酸化還元酵素を含む酵素群である。
以上の知見から、遺伝子３の翻訳産物は、酸化還元酵素の一種として機能する酵素蛋白質であると認められた。なお、高度連鎖解析における他の６つの候補遺伝子（遺伝子１、２、４〜６）に、他に酵素をコードする遺伝子は存在しなかった。
【０１４３】
【表８】
0006499817.tif 000010
【０１４４】
（２）「変異型遺伝子３の構造」
i）ＮＲ１５４Ｅ変異型遺伝子３
上記野生型遺伝子３の配列からプライマーを作成し、グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」系統の遺伝子３の塩基配列を決定した。
その結果、ＮＲ１５４Ｅ系統からの遺伝子３は、野生型遺伝子３の第１エクソンに相当する領域に、約９ｋｂｐの挿入配列が導入された変異型遺伝子であることが明らかになった（図１０）。
具体的には野生型遺伝子３（配列番号２）の第５５７番目の塩基と第５５８番目の塩基の間に、８８５３ｂｐの挿入配列（配列番号７における第５５８番目から第９４１０番目までの塩基からなる塩基配列）が導入された変異を有し、インフレームにて終止コドンが導入された変異型遺伝子（ＮＲ１５４Ｅ型遺伝子３）であることが明らかになった（図１１）。当該変異型遺伝子３に係るゲノム配列を配列番号７に示した。
その予測アミノ酸配列は、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる全長１７６ａａの蛋白質であると推定されたが、野生型遺伝子３蛋白質のＣ端側１８４ａａを欠失した構造であった（図１２）。特に、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部が完全欠失した構造であることから、酵素としての蛋白質機能が失われていると推測された。
当該結果は、ＮＲ１５４Ｅ系統に遺伝子３の機能欠損型の挿入変異が存在するという結果であった。即ち、当該結果は、遺伝子３がグルコラファサチン欠失性原因遺伝子であることを裏付ける結果であると認められた。
【０１４５】
ii）ＭＲ０５０Ｅ型遺伝子３の構造
「ＭＲ０５０Ｅ」系統は、本発明者らがＮＲ１５４Ｅ系統とは別途に作出したグルコラファサチン欠失系統の１系統である。そこで、当該ＭＲ０５０Ｅ系統についても遺伝子３の塩基配列を解析し、遺伝子３の変異の有無を確認した。
その結果、ＭＲ０５０Ｅ系統からの遺伝子３は、野生型遺伝子３の第３エクソンに相当する領域に、約１．２ｋｂｐの挿入配列が導入された変異型遺伝子であることが明らかになった（図１０）。
具体的には、野生型遺伝子３（配列番号２）の第１２４３番目の塩基と第１２４４番目の塩基の間に、１２２２ｂｐの挿入配列（配列番号９における第１２４４番目から第２４６５番目までの塩基からなる塩基配列）が導入された変異を有し、インレームにて終止コドンが導入された変異型遺伝子（ＭＲ０５０Ｅ型遺伝子３）であることが明らかになった（図１１）。当該変異型遺伝子３に係るゲノム配列を配列番号９に示した。
その予測アミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる全長３０３ａａの蛋白質であると推定されたが、野生型遺伝子３蛋白質のＣ端側６９ａａを欠失した構造であった（図１２）。特に、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインのＣ端側１６ａａが欠失した構造であることから、酵素としてのその蛋白質機能は、大幅に欠失していると推測された。
【０１４６】
当該結果から明らかなように、ＭＲ０５０Ｅ系統は、ＮＲ１５４Ｅ系統と同じ遺伝子にインフレームでの挿入変異が導入されて作出された、グルコラファサチン欠失系統であることが示された。但し、ＭＲ０５０Ｅ系統の有する遺伝子３の変異（ＭＲ０５０Ｅ型変異）は、ＮＲ１５４Ｅ系統の変異（ＮＲ１５４Ｅ型変異）とは異なるものであった。
以上の結果は、遺伝子３の機能欠損（loss of function）により、グルコラファサチン欠失型の表現型が作出できることを支持する結果と認められた。
【０１４７】
【表９】
0006499817.tif 000011
【０１４８】
［実施例４］『遺伝子３の定量的発現解析』
上記実施例により原因遺伝子と推定された遺伝子３について、グルコラファサチン欠失系統と野生型品種系統とを比較した遺伝子発現量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより詳細に分析した。
【０１４９】
表１１に示す各ダイコン品種系統の本葉から、RNeasy plant mini kit（QIAGEN社製）を使用して、全ＲＮＡ（total RNA）を抽出した。得られたＲＮＡを鋳型として、PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa bio社製）を用いて、ｃＤＮＡ（相補鎖ＤＮＡ）を合成した。
得られた各本葉（試料）からのｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲ法によりグルコラファサチン合成酵素遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。グルコラファサチン合成酵素遺伝子の増幅プライマーとしては、第３エクソン後半から３’ＵＴＲの共通配列をターゲットとした、表１０に示すプライマーセットを用いた。また、内部標準遺伝子としてはアクチン遺伝子（Zou et al. 2013 PLos One 8: e53541.）を採用し、その増幅プライマーとしては、表１０に示すプライマーセットを用いた。
リアルタイムＰＣＲ分析は、Thermal Cycler Dice(R) Real Time System II（TaKaRa bio社製）を分析装置として用いて行った。ＰＣＲ反応は、SYBR(R) Premix Ex Taq(TM)(Tli RNaseH Plus)（TaKaRa bio社製）を使用し、上記鋳型ｃＤＮＡとプライマーセットを用いて、９５℃ ５秒，６０℃ ３０秒のサイクル反応を３５サイクル行うＰＣＲ反応を行った。上記分析装置によりＰＣＲ反応中の増幅産物の蛍光強度をリアルタイムにて経時的に測定した。
測定対象である「グルコラファサチン合成酵素遺伝子の蛍光強度測定値（平均値）」を、「内部標準遺伝子の蛍光強度測定値（平均値）」で除した値を求め、各試料間で比較可能なグルコラファサチン合成酵素遺伝子の相対発現量として算出した。結果を表１１及び図１３に示した。当該表において、括弧内の数値は、品種「耐病総太り」の値を基準にした場合の値である。
【０１５０】
その結果、本葉における遺伝子発現量は、グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」及び「ＭＲ０５０Ｅ」の両系統では、グルコラファサチン含有品種系統（野生型）と比較して、「遺伝子３」の発現量が顕著に減少していることが明らかになった。
具体的には、「ＭＲ０５０Ｅ」系統では、野生型である「ＨＡＧＨＮ」系統に比べて、当該遺伝子が１／４０しか発現していないことが示された。そして、特に「ＮＲ１５４Ｅ」系統では、野生型である「ＨＡＧＨＮ」系統に比べて、当該遺伝子が１／１０００未満という極微量しか発現してないことが示された。
一方、野生型品種系統である「ＨＡＧＨＮ」、「耐病総太り」、「宮重ダイコン」、及び「辛味１９９」の４品種系統の間では、グルコラファサチン合成酵素遺伝子の発現量に大きな差異はなく、当該遺伝子が正常に発現し機能していると認められた。
【０１５１】
当該結果から、グルコラファサチン欠失性系統においては、蛋白質の構造欠失の点に加えて、遺伝子発現量の点においても、「遺伝子３」の機能が大幅に失われていることが示された。
【０１５２】
【表１０】
0006499817.tif 000012
【０１５３】
【表１１】
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【０１５４】
［実施例５］『機能獲得型遺伝子導入試験』
上記実施例にてグルコラファサチン欠失性原因遺伝子と推定された「遺伝子３」について、シロイヌナズナへの機能獲得型の遺伝子導入試験を行った。
【０１５５】
（１）「シロイヌナズナで機能獲得型遺伝子導入試験をする意義」
ここで、「シロイヌナズナ」は、ダイコンの属するRaphanusと近縁関係にある属であるArabidopsisに属する植物である。遺伝子３について、ＮＣＢＩデータベースを用いた相同性検索を行った結果、シロイヌナズナのゲノム配列には、遺伝子３と配列類似性を示す、２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインを有する遺伝子（当該遺伝子ファミリーに属する遺伝子）が複数存在することが示された（The Arabidopsis Information Resource（TAIR）, http://www.arabidopsis.org/）。
しかし、「グルコラファサチン」はダイコン植物に特徴的なグルコシノレートであり、シロイヌナズナには、グルコラファサチンが全く含まれない点で、シロイヌナズナとダイコンとは、全く異なるグルコシノレート組成を有している（表１２）。
また、シロイヌナズナでは全ゲノム配列が解読されている（Nature 2000 Dec.14; 408 (6814): p796-815）。
以上の知見から明らかなように、シロイヌナズナゲノム配列には、「遺伝子３と同等の機能を有する遺伝子」は存在しない。
従って、シロイヌナズナに「遺伝子３」を遺伝子導入した過剰発現体を作製し、本来はグルコラファサチンを含まないはずのシロイヌナズナからグルコラファサチンが検出されれば、「遺伝子３」がグルコラファサチン合成に関与する遺伝子であることの証拠となる。
【０１５６】
【表１２】
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【０１５７】
（２）「強制発現コンストラクト」
グルコラファサチン含有系統（野生型）である「ＨＡＧＨＮ」の本葉からRNeasy plant mini kit（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。当該ｃＤＮＡを鋳型として、表１３に記載のプライマーを用いて野生型遺伝子３の完全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
得られた完全長ｃＤＮＡをＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に連結した後、ｐＰＺＰ２０２（Hajdukiewicz P. et al., 1994 Plant Mol. Biol, 25: p989-994）より改変したバイナリベクターｐＺＫ３Ｂ（Kuroda et al., 2010 Biosci. Biotechnol. Biochem., 74:2348-2351）へ組み込んだコンストラクトを作製し、当該コンストラクトのプラスミドＤＮＡを調製した。
また、対照として、ｃＤＮＡを組み込まない以外は同様にしてエンプティベクターのプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１５８】
【表１３】
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【０１５９】
（３）「遺伝子３過剰発現体の作製」
上記調製したプラスミドＤＮＡをアグロバクテリウムＧＶ３１０１へ形質転換し、当該アグロバクテリウム懸濁液を用いたフローラルディップ法（Floral-dip法）によりシロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０系統）へ導入し種子を得た。
得られた種子を５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシン存在下で育成して形質転換体の選抜を行い、Ｔ２世代の後代検定により導入遺伝子がホモ型に固定されている系統を選抜した。形質転換した植物体（遺伝子３過剰発現体（実験対象）及びエンプティベクター導入体（対照））の育成は、２２℃にて１２時間日長のチャンバー内で行った。なお、植物体の生育状態は、遺伝子３強制発現体（実験対象）及びエンプティベクター導入体（対照）の間で、差異は見られなかった（図１４）。
【０１６０】
（４）「グルコシノレート組成の分析」
育成個体について、抽だい直前の植物体からＨＰＬＣ分析によりグルコシノレート組成を分析した。分析方法は、実施例１（１）に記載の方法に準じて行った。ＨＰＣＬ分析後のグルコシノレートプロファイリングの結果を図１５に示した。当該図中において、溶出時間１３．８９７分のピークは「グルコエルシン」（符号２１）を、溶出時間１４．６５５分のピークは「グルコラファサチン」（符号２１）を表す。
また、グルコエルシン（符号２１）とグルコラファサチン（符号２２）のピークについては、ピーク面積値（相対値）を表１４に示した。
【０１６１】
その結果、図１５及び表１４が示すように、エンプティベクター導入体（対照）では、グルコエルシンのピーク（符号２１）が確認されたが、グルコラファサチンのピーク（符号２２）は全く確認されなかった。
一方、遺伝子３過剰発現体（実験対象）では、グルコエルシンのピーク（符号２１）が減少し、グルコラファサチンのピーク（符号２２）が生成されていることが確認された。
【０１６２】
（５）「原因遺伝子の同定」
以上の結果から、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失性原因遺伝子に関して、次の重要な知見が得られた。
i ）通常の野生型シロイヌナズナの植物体では、グルコラファサチンを含まないことから、「遺伝子３」は「グルコラファサチン合成に関与する遺伝子」であることが示された。
ii）「遺伝子３過剰発現体」では、グルコエルシン含量が低下しその代わりにグルコラファサチンの生成が確認された。グルコエルシンの分子構造は、３位と４位の炭素間が二重結合化される（酸化される）と、グルコラファサチンの分子構造となる関係にある。また、アミノ酸配列予測の結果から、遺伝子３のコード蛋白質は、遺伝子発現を調節する蛋白質（転写因子等）ではなく、酸化還元酵素の一種であると認められる。
以上の知見から、「遺伝子３」がコードする蛋白質は、グルコエルシンからグルコラファサチンを合成するいずれかの反応に関与する酵素であると認められた（図１６）。即ち、遺伝子３は、「グルコラファサチン合成酵素遺伝子」であると認められた。
iii）野生型シロイヌナズナでは、グルコシノレート組成の点でグルコラファサチン欠失性の表現型を示す。従って、本実施例における遺伝子導入試験（機能獲得：gain of function）は、ダイコンのグルコラファサチン欠失系統での機能相補試験とみなすことができる。
従って、本実施例において遺伝子３過剰発現体シロイヌナズナから、本来存在しないはずのグルコラファサチンが検出されたという結果は、「遺伝子３」がグルコラファサチン欠失系統の原因遺伝子であることを示す結果であると認められた。
iv）原因遺伝子の同定に関する当該知見は、ＮＲ１５４Ｅ系統とは別途に作出されたＭＲ０５０Ｅ系統において、当該遺伝子３に遺伝子機能欠損（loss of function）が導入されていたことからも支持される結果であった。
【０１６３】
以上の結果から、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失性原因遺伝子は、遺伝子３が原因遺伝子であると同定された。また、遺伝子３は、グルコエルシンからグルコラファサチンを生成する反応に関与する酵素をコードする遺伝子（グルコラファサチン合成酵素遺伝子）であると同定された。
なお、「グルコラファサチン」が野生型シロイヌナズナに全く存在しない点を踏まえると、遺伝子３の当該遺伝子機能は、シロイヌナズナの類似配列遺伝子（例えば、At1g03410等，The Arabidopsis Information Resource（TAIR）, http://www.arabidopsis.org/）には存在しない機能であることが示された。
【０１６４】
【表１４】
0006499817.tif 000016
【０１６５】
［実施例６］『選抜ＤＮＡマーカーとしての利用』
機能欠損型グルコラファサチン合成酵素遺伝子の挿入塩基配列を利用して、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座における遺伝子型の判定が可能なＰＣＲプライマーセットを設計した。
【０１６６】
（１）「プライマーセットの設計」
グルコラファサチン合成酵素遺伝子の塩基配列を利用したＰＣＲプライマーセットとして、次の３つのプライマーからなるプライマーセットを設計した（表１５、図１７）。
まず、 i) 第１のプライマーとして、ＮＲ１５４Ｅ系統におけるグルコラファサチン合成酵素遺伝子の第１エクソンへの挿入配列上（図１７）に、「機能欠損型遺伝子検出用プライマー」を設計した。具体的には、配列番号４７に記載の塩基配列からなるプライマー（図１７符号３３のリバースプライマー）を設計した。
また、ii) 第２のプライマーとして、上記挿入配列が挿入された部位より下流側に、「野生型遺伝子検出用プライマー」を設計した。具体的には、配列番号４８に記載の塩基配列からなるプライマー（図１７符号３４のリバースプライマー）を設計した。
また、iii) 第３のプライマーとして、上記 i) 及び ii) に記載のプライマーとの増幅対になる「共通用プライマー」をグルコラファサチン合成酵素遺伝子の第１エクソン上に設計した。具体的には、配列番号４９に記載の塩基配列からなるプライマー（図１７符号３５のフォワードプライマー）を設計した。
【０１６７】
【表１５】
0006499817.tif 000017
【０１６８】
（２）「ＰＣＲ増幅パターンによる遺伝子型の識別」
表１７に示す系統又はＦ１の本葉からＤＮＡを抽出し、上記３つ全てのプライマーを含むプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、表１６に記載の条件にて行った。結果を表１７及び図１８に示した。
その結果、グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」系統からは、機能欠損型遺伝子検出用プライマーと共通プライマーの増幅長と一致する５８８ｂｐの増幅が得られることが確認された。当該増幅は、ＮＲ１５４Ｅ系統の変異型遺伝子に由来するものと認められた。
一方、野生型である「ＨＡＧＨＮ」系統からは、野生型遺伝子検出用プライマーと共通用プライマーの増幅長と一致する７１４ｂｐの増幅が得られた。当該増幅は、ＨＡＧＨＮ系統の野生型遺伝子に由来するものと認められた。
また、両者のＦ１個体からは、上記変異型遺伝子及び野生型遺伝子に相当する２つの増幅が確認された。
以上の結果から、当該プライマーセットを用いたＰＣＲにより、得られた増幅パターンからグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型が識別できることが示された。特に、表現型に現れない遺伝子型である「ヘテロ型」の検出も可能であることが示された。
【０１６９】
【表１６】
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【０１７０】
【表１７】
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【０１７１】
（３）「分離集団と表現型との相関」
上記作成したプライマーセットを用いて分類した分離集団について、マーカー遺伝子型と表現型が相関するかを確認した。
グルコラファサチン欠失系統である「ＮＲ１５４Ｅ」系統について、表１８〜２０に示すグルコラファサチン含有性（野生型）系統との戻し交雑を２回行い、次いで自殖操作を２回行って、ＢＣ２Ｆ２集団を得た。
ＢＣ２Ｆ２集団の各個体について、上記（２）に記載の操作と同様にしてＰＣＲ反応を行って、ＰＣＲ増幅パターンからグルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型を推定して、３集団（機能欠損型遺伝子ホモ型、野生型遺伝子ホモ型、ヘテロ型）に分類した。
また、ＢＣ２Ｆ２集団の各個体について、肥大根部におけるグルコラファサチン含量を測定し、選抜マーカーにより分類した遺伝子型と表現型との一致を確認した。なお、グルコラファサチン含量の測定方法は、実施例１（３）に記載の方法と同様にして行った。結果を表１８〜２０に示した。
【０１７２】
その結果、いずれのグルコラファサチン含有性（野生型）系統との戻し交雑及び自殖を経た集団においても、上記プライマーセットを用いて分類して得た分離集団では、遺伝子型と表現型が一致することが確認された。
即ち、選抜マーカーのＰＣＲ増幅パターンによる当該遺伝子型が「機能欠損型遺伝子ホモ型」と分類された集団では、グルコラファサチン含量が著しく低い値を示した。一方、当該遺伝子型が「野生型遺伝子ホモ型」又は「ヘテロ型」に分類された集団では、グルコラファサチン含量が高い値を示した。
また、これら分類された集団全てにおいて、グルコラファサチン含量の標準誤差のばらつきが著しく少ないことから、当該選抜ＤＮＡマーカーによる表現型の識別精度は極めて高いことが示された。
【０１７３】
【表１８】
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【０１７４】
【表１９】
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【０１７５】
【表２０】
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【０１７６】
［実施例１〜６からの知見］
以上、上記実施例に係る実験結果からの知見を整理して示した。
【０１７７】
（１）「グルコラファサチン欠失性原因遺伝子について」
上記実施例１〜５から、グルコラファサチン欠失性原因遺伝子に関して、次の知見が得られた。
i）ポジショナルクローニング法による連鎖解析及び高精度連鎖解析から、グルコラファサチン欠失性原因遺伝子の座乗領域が特定された。当該座乗領域には、７つの候補遺伝子の存在が予測されたが、ＲＴ−ＰＣＲの発現解析の結果、「遺伝子３」が候補遺伝子であると推測された。
ii）グルコラファサチン欠失性系統である「ＮＲ１５４Ｅ」と「ＭＲ０５０Ｅ」の両系統とも、遺伝子３のコード蛋白質は、インレームにて終止コドンが挿入された変異蛋白質となっており、蛋白質の重要構造である２オキソグルタル酸−鉄（II）依存性オキシゲナーゼドメインの全部又は一部を欠失していることが示された。
また、当該両系統における変異型遺伝子３の発現量は、野生型品種系統より著しく低い値であり、遺伝子発現量の点でも、遺伝子機能が失われていることが示された。
iii）シロイヌナズナへの遺伝子３の機能獲得（gain of function）型の遺伝子導入試験により、ダイコンにおけるグルコラファサチン欠失性原因遺伝子は、遺伝子３が原因遺伝子であると同定された。また、遺伝子３は、グルコラファサチン合成酵素遺伝子であると同定された。
【０１７８】
（２）「ＤＮＡマーカーについて」
また、実施例６から、グルコラファサチン合成酵素遺伝子のゲノム配列内の挿入配列をＤＮＡマーカーとして利用することについて、次の知見が得られた。
i）ＰＣＲ増幅パターンによって、グルコラファサチン合成酵素遺伝子座の遺伝子型（野生型、変異型、ヘテロ型）を、容易に判定できることが示された。
ii）通常の連鎖マーカー（ＳＮＰ、ＳＳＲなど）とは異なり、グルコラファサチン合成酵素遺伝子そのものの変異を指標としているため、当該グルコラファサチン合成酵素遺伝子の遺伝子型を利用することで、グルコラファサチン欠失性を示す表現型の高精度での識別及び選抜が可能であることが示された。
iii）従来においては、劣性ホモ遺伝子のＢＣ１世代以降の戻し交雑を行うためには、当該遺伝子がヘテロ型となっている個体を選抜する必要があった。そのため、ヘテロ型の遺伝子型を判別するためには、それぞれの個体について自殖操作を行って後代集団の表現型分離比を調べる必要があった。当該選抜ＤＮＡマーカーを用いることによって、後代集団の育成を行うことなく各個体におけるＰＣＲ増幅パターンを調べるのみで、容易に「ヘテロ型」の遺伝子型を判別できることが示された。
iv）本実施例は、ＮＲ１５４Ｅ系統の変異型遺伝子を検出する例であるが、変異配列の識別を可能とするプライマー設計が可能であれば、原理的には全ての機能欠損型遺伝子の検出に応用可能であると認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明は、ダイコン品種系統の開発を行っている種苗メーカー及び公設試験場において、有効に利用される技術となることが期待される。また、ダイコン生産農家及び大根加工飲食品等を扱う各分野の製造業者等にとって有効に利用される技術となることが期待される。
【符号の説明】
【０１８０】
１．  肥大根部
２．  葉柄
【０１８１】
２１．  グルコエルシンを示すピーク
２２．  グルコラファサチンを示すピーク
【０１８２】
３１．  グルコラファサチン合成酵素遺伝子（ゲノムＤＮＡ）
３２．  機能欠損型遺伝子における挿入配列
３３．  機能欠損型遺伝子検出用プライマー
３４．  野生型遺伝子検出用プライマー
３５．  共通用プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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