(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト好中球活性化を予防するための医薬処方物であって、
構造：
【化１】
0006506177.tif 000026
式中：
Ａは、以下の構造：
【化２】
0006506177.tif 000027
を有するエフェクター部分および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、
低級アルキル；
低級アルコキシ；
からなる群より、独立して選択され；
Ｌは、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、以下の構造：
【化３】
0006506177.tif 000028
【化４】
0006506177.tif 000029
【化５】
0006506177.tif 000030
【化６】
0006506177.tif 000031
または
【化７】
0006506177.tif 000032
を有するターゲティング基である、
を有する、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤、またはその溶媒和物、塩または異性体を含む、
前記医薬処方物。
【請求項２】
抗酸化剤が、ＳｋＱ１：
【化８】
0006506177.tif 000033
またはその還元された（キノール）形態、ＳｋＱ１Ｈ２である、請求項１に記載の医薬処方物。
【請求項３】
抗酸化剤が、ＳｋＱＲ１：
【化９】
0006506177.tif 000034
またはその還元された（キノール）形態、ＳｋＱＲ１Ｈ２である、請求項１に記載の医薬処方物。
【請求項４】
抗酸化剤が、ＳｋＱ３：
【化１０】
0006506177.tif 000035
またはその還元された（キノール）形態、ＳｋＱ３Ｈ２である、請求項１に記載の医薬処方物。
【請求項５】
抗酸化剤が、ＳｋＱＲＢＨ２：
【化１１】
0006506177.tif 000036
またはその酸化された（キニーネ）形態、ＳｋＱＲＢである、請求項１に記載の医薬処方物。
【請求項６】
抗酸化剤が、ＳｋＱＢ１：
【化１２】
0006506177.tif 000037
またはその還元された（キノール）形態、ＳｋＱＢ１Ｈ２である、請求項１に記載の医薬処方物。
【請求項７】
抗酸化剤が、ＳｋＱＢＰ１：
【化１３】
0006506177.tif 000038
またはその還元された（キノール）形態、ＳｋＱＢＰ１Ｈ２である、請求項１に記載の医薬処方物。
【請求項８】
活性化されたヒト好中球からのMMP-9放出を予防するための医薬処方物であって、
構造：
【化１４】
0006506177.tif 000039
式中：
Ａは、以下の構造：
【化１５】
0006506177.tif 000040
を有するエフェクター部分および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、
低級アルキル；
低級アルコキシ；
からなる群より、独立して選択され；
Ｌは、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、
以下の構造：
【化１６】
0006506177.tif 000041
【化１７】
0006506177.tif 000042
【化１８】
0006506177.tif 000043
【化１９】
0006506177.tif 000044
または
【化２０】
0006506177.tif 000045
を有するターゲティング基である、
を有する、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤、またはその溶媒和物、塩または異性体を含む、
前記医薬処方物。
【請求項９】
抗酸化剤が、ＳｋＱ１、ＳｋＱ１Ｈ２、ＳｋＱＲ１、ＳｋＱＲ１Ｈ２、ＳｋＱ３、ＳｋＱ３Ｈ２、ＳｋＱＲＢ、ＳｋＱＲＢＨ２、ＳｋＱＢ１、ＳｋＱＢ１Ｈ２、ＳｋＱＢＰ１、および／またはＳｋＱＢＰ１Ｈ２である、請求項８に記載の医薬処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、2013年1月22日に出願された米国仮特許出願第61/755,234号、表題「Method of Treatment of Inflammatory Conditions With Mitochondrially Targeted Antioxidants」についての優先権およびこれの利益を主張し、当該仮出願の全内容は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本開示は、薬理学および医学の分野におけるものであり、特に炎症および関連する状態についてのものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
細菌の侵入に対する応答における白血球浸潤は、組織損傷の原因となり得る（Gupta et al. (1996b) Kidney Int. 49:26-33）。病原体感染に対する応答における白血球浸潤は、白血球およびマクロファージにより形成される反応性酸素種（ROS）が、これらの細胞内部の食作用性の液胞内にとどまっている限りは、組織における病態変化をもたらさない。しかし、抗病原体応答の一般的機構は（感染により誘導される炎症の場合においては）、好中球およびマクロファージのNADPHオキシダーゼによるROSの生成を伴う（Sanmun et al. (2009) Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297:C621-631）。ROSの細胞外放出は、損傷を引き起こすようになり、組織の傷害および機能不全をもたらす（Mundi et al. (1991) Infect. Immun, 59:4168-4172）。ROS放出に加えて、炎症応答はまた、サイトカインであるエイコノサイドの放出、補体活性化、および破壊性酵素の可動化を伴い（Nassar and Badr (1998) J. Nephrol. 11:177-184）、単核細胞（MNC）、すなわちマクロファージおよび単球が、かかる組織損傷において役割を果たす（Friedewald and Rabb (2004) Kidney Int. 66:486-491）。例えば、組織損傷の特徴である線維化は、腎臓における単球浸潤のレベルが低い場合には、はるかに顕著でないことが、示されている。
【０００４】
急性腎盂腎炎（APN）は、細菌感染により初期に引き起こされる障害の一例であり、ここで、感染に対する炎症応答は、腎臓傷害および機能不全をもたらす。腎臓および尿路は、通常では微生物フリーであるが、一生の間に、女性の４０％および男性の１２％が、尿路感染（UTI）を経験する（O'Hanley（1996年）：Urinary Tract Infections: Molecular Pathogenesis and Clinical Management（Mobleyら編）中、（Washington, DC: ASM Press）、405-425頁）。APNは、潜在的に生命を脅かすUTIの合併症であり、感染が上部尿路まで進行する場合に起こる。この疾患に最も頻繁に関連する尿路疾患性病原体（uropathogen）は、Escherichia coliの腎盂腎炎原性（pyelonephritogenic）のサブセットであり、これは、合併症を伴うUTIおよびこれを伴わないUTIの両方の８５％までもにおいて関連付けられる（Hill et al. (2005) Obstet. Gynecol. 105:18-23）。
【０００５】
APNの薬理学的処置は、酸化ストレス応答を管理し、それにより腎症状を予防することにおける治療効果を提供するために用いられる（Aydogdu et al. (2006) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33:119-124; Koyner et al. (2008) Nephron. Exp. Nephrol. 109:e109-117; Polo-Romero et al. (2004) Ren. Fail. 26:613-618; Rodrigo et al. (2004) Nephrol. Dial. Transplant. 19:2237-2244; Sadeghi et al. (2008) Pediatr. Nephrol. 23:1503-1510; Singh et al. (2004) Toxicology 201:143-151）。しかし、処置は、ROS発生機構の多様性、および宿主の感染に対する防御および付帯的組織損傷へのそれらの異なる寄与により複雑化する。ミトコンドリアおよびNADPHオキシダーゼは、二つの主要なROSのソースであるが、炎症の病態に対するそれらの相対的寄与は、よく定義されていない。
【０００６】
したがって、必要とされるのは、特定の障害に付随する炎症から生じるROS放出に関連する組織損傷を、処置する、または阻害する、または予防する、改善された方法である。
【発明の概要】
【０００７】
要旨
特定の炎症性障害の重要な要素は、病態の進行の全ての段階において生成される過剰なミトコンドリアの反応性酸素種（ROS）であることが決定されている。この発見を活用して、MTAをこれらの組織におけるミトコンドリアにターゲティングすることにより特定の組織における酸化ストレスを緩和または軽減する、本発明の方法を提供する。MTAが、炎症のプロセスの間の好中球の活性化を防止し、それにより障害における炎症の損傷効果を軽減することを発見した。
【０００８】
したがって、一側面において、本開示は、好中球活性化を予防する方法を提供し、該方法は、好中球を含む試料を、構造：
【化１】
0006506177.tif 000002
式中：
Ａは、以下の構造：
【化２】
0006506177.tif 000003
を有するエフェクター部分、および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、
低級アルキル；
低級アルコキシ；
からなる群より、独立して選択されるか、または
２つの隣接したＹ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、以下の構造：
【化３】
0006506177.tif 000004
および／またはその還元された形態を形成し、式中：
Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、互いに独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシであり；
Ｌは、
ａ）１または２以上の置換基により任意に置換されていてもよく、１または２以上の二重または三重結合を任意に含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖；または
ｂ）天然のイソプレン鎖；
を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、Ｓｋ＋Ｚ−を含むターゲティング基であって、式中：
Ｓｋは、親油性カチオンであり；および
Ｚは、薬理学的に受容可能なアニオンである、
を有する、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤、およびその溶媒和物、塩、異性体またはプロドラッグと接触させることを含む。
【０００９】
幾つかの態様において、MTAは、ＳｋＱ１、ＳｋＱ１Ｈ２、ＳｋＱＲ１、ＳｋＱＲ１Ｈ２、ＳｋＱ３、ＳｋＱ３Ｈ２、ＳｋＱＲＢ、ＳｋＱＲＢＨ２、ＳｋＱＢ１、ＳｋＱＢ１Ｈ２、ＳｋＱＢＰ１、および／またはＳｋＱＢＰ１Ｈ２である。一態様において、試料は血液試料である。
【００１０】
別の側面において、本開示は、活性化された好中球からのMMP-9放出を予防する方法を提供し、該方法は、活性化された好中球を、構造：
【化４】
0006506177.tif 000005
式中：
Ａは、以下の構造：
【化５】
0006506177.tif 000006
を有するエフェクター部分および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、
低級アルキル；
低級アルコキシ；
からなる群より、独立して選択されるか、または
２つの隣接したＹ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、以下の構造：
【化６】
0006506177.tif 000007
および／またはその還元された形態を形成し、式中：
Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、互いに独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシであり；
Ｌは、
ａ）１または２以上の置換基により任意に置換されていてもよく、１または２以上の二重または三重結合を任意に含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖；または
ｂ）天然のイソプレン鎖；
を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、Ｓｋ＋Ｚ−を含むターゲティング基であって、式中：
Ｓｋは、親油性カチオンであり；および
Ｚは、薬理学的に受容可能なアニオンである、
を有する、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤、およびその溶媒和物、塩、異性体またはプロドラッグと接触させることを含む。
【００１１】
幾つかの態様において、抗酸化剤は、ＳｋＱ１、ＳｋＱ１Ｈ２、ＳｋＱＲ１、ＳｋＱＲ１Ｈ２、ＳｋＱ３、ＳｋＱ３Ｈ２、ＳｋＱＲＢ、ＳｋＱＲＢＨ２、ＳｋＱＢ１、ＳｋＱＢ１Ｈ２、ＳｋＱＢＰ１、および／またはＳｋＱＢＰ１Ｈ２である。
【００１２】
別の側面において、本開示は、炎症性障害を罹患する患者を処置する方法を提供し、該方法は、前記患者に、構造：
【化７】
0006506177.tif 000008
式中：
Ａは、以下の構造：
【化８】
0006506177.tif 000009
を有するエフェクター部分および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、
低級アルキル；
低級アルコキシ；
からなる群より、独立して選択されるか、または
２つの隣接したＹ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、以下の構造：
【化９】
0006506177.tif 000010
および／またはその還元された形態を形成し、式中：
Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、互いに独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシであり；
Ｌは、
ａ）１または２以上の置換基により任意に置換されていてもよく、１または２以上の二重または三重結合を任意に含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖；または
ｂ）天然のイソプレン鎖；
を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、Ｓｋ＋Ｚ−を含むターゲティング基であって、式中：
Ｓｋは、親油性カチオンであり；および
Ｚは、薬理学的に受容可能なアニオンである、
を有する、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤、およびその溶媒和物、塩、異性体またはプロドラッグの治療有効量を投与することを含む。
【００１３】
幾つかの態様において、抗酸化剤は、ＳｋＱ１、ＳｋＱ１Ｈ２、ＳｋＱＲ１、ＳｋＱＲ１Ｈ２、ＳｋＱ３、ＳｋＱ３Ｈ２、ＳｋＱＲＢ、ＳｋＱＲＢＨ２、ＳｋＱＢ１、ＳｋＱＢ１Ｈ２、ＳｋＱＢＰ１、および／またはＳｋＱＢＰ１Ｈ２である。
【００１４】
ある態様において、炎症性障害は、腎盂腎炎、膵炎、糖尿病、外傷、敗血症、感染または肝炎により引き起こされる。他の態様において、炎症性障害は、慢性もしくは急性の炎症性障害、または自己免疫疾患である。幾つかの態様において、炎症性障害は、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、虚血、急性大動脈解離、腎臓疾患、糖尿病、高血糖症または細菌感染により引き起こされる。幾つかの態様において、処置は、組織における高グルコースにより引き起こされる、患部組織（例えば、肝臓、腎臓、網膜、皮膚、脳）における細胞間の接触の解体を予防する、および／または、好中球が活性化されることを予防することにより、組織損傷を予防する。
【００１５】
本開示はまた、グルコース代謝障害を罹患する哺乳動物において血管透過性を低下させる方法を提供し、該方法は、前記哺乳動物に、構造：
【化１０】
0006506177.tif 000011
式中：
Ａは、以下の構造：
【化１１】
0006506177.tif 000012
を有するエフェクター部分および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、
低級アルキル；
低級アルコキシ；
からなる群より、独立して選択されるか、または
２つの隣接したＹ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、以下の構造：
【化１２】
0006506177.tif 000013
および／またはその還元された形態を形成し、式中：
Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、互いに独立して、低級アルキルまたは低級アルコキシであり；
Ｌは、
ａ）１または２以上の置換基により任意に置換されていてもよく、１または２以上の二重または三重結合を任意に含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖；または
ｂ）天然のイソプレン鎖；
を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、Ｓｋ＋Ｚ−を含むターゲティング基であって、式中：
Ｓｋは、親油性カチオンであり；および
Ｚは、薬理学的に受容可能なアニオンである、
を有する、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤、およびその溶媒和物、塩、異性体またはプロドラッグの治療有効量を投与し、
それにより、その哺乳動物における内皮の細胞間接触の解体を予防することを含む。
【００１６】
ある態様において、抗酸化剤は、ＳｋＱ１、ＳｋＱ１Ｈ２、ＳｋＱＲ１、ＳｋＱＲ１Ｈ２、ＳｋＱ３、ＳｋＱ３Ｈ２、ＳｋＱＲＢ、ＳｋＱＲＢＨ２、ＳｋＱＢ１、ＳｋＱＢ１Ｈ２、ＳｋＱＢＰ１、および／またはＳｋＱＢＰ１Ｈ２である。
【００１７】
本開示の上記および他の対象、その多様な特徴、ならびに発明自体は、以下の説明から、添付の図面と一緒に読む場合に、より完全に理解することができ、添付の図面においては以下のとおりである：
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、正常な対照腎臓の写真表示である；
【００１９】
【図１Ｂ】図１Ｂは、腎盂腎炎を有する腎臓の写真表示である；
【００２０】
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎を有する腎臓の写真表示である；
【００２１】
【図２Ａ】図２Ａは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色された対照ラット皮質の組織学的切片の写真表示である；
【００２２】
【図２Ｂ】図２Ｂは、腎盂腎炎を有するラットからの腎皮質の組織学的切片の写真表示である；
【００２３】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎を有するラットからの腎皮質の写真表示である；
【００２４】
【図３Ａ】図３Ａは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色された対照髄質の組織学的切片の写真表示である；
【００２５】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色された腎盂腎炎を有する対照髄質の組織学的切片の写真表示である；
【００２６】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎を有する対照髄質の組織学的切片の写真表示である；
【００２７】
【図４】図４は、図２および３において表される髄質および腎皮質における炎症指標（方法を参照）を示す図である；
【００２８】
【図５Ａ】図５Ａは、組織におけるMDA蓄積により測定される酸化ストレスを伴う、腎臓における炎症の図示である；
【００２９】
【図５Ｂ】図５Ｂは、MPTO活性により測定される、酸化ストレスを伴う腎臓における炎症の図示である（バー、５０μｍ。*−ｐ＜０．０１、**−ｐ＜０．０５）；
【００３０】
【図６Ａ】図６Ａは、DCF-DAで染色された対照腎尿細管細胞（RTC）の共焦点顕微鏡写真の表示であり（バー、５０μｍ）、可視可能なDCF蛍光を示さない；
【００３１】
【図６Ｂ】図６Ｂは、活性化された白血球（LC）＋細菌ライセート（BL）とともにインキュベートされ、DCF-DAで染色された、対照腎尿細管細胞（RTC）の表示であり（バー、５０μｍ）、強調された蛍光を示す；
【００３２】
【図７Ａ】図７Ａは、異なる方法において処理され、DCF-DAで染色されたRTCの、定量的結果および効果を示す図である（バー、５０μｍ）；
【００３３】
【図７Ｂ】図７Ｂは、異なる方法において処理されたRTCにおける、総NO産生の指示薬としての亜硝酸濃度を示す図である；
【００３４】
【図７Ｃ】図７Ｃは、異なる方法において処理されたRTCにおける、DAF-2FM蛍光により測定される、RTCにおけるNOの生成の図示である；
【００３５】
【図７Ｄ】図７Ｄは、RTC細胞の死および幾つかの薬物の保護的効果の図示である（*−ｐ＜０．０１、**−ｐ＜０．０５）；
【００３６】
【図８Ａ】図８Ａは、対照ラット、腎盂腎炎ラットにおける、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける、増加した血液白血球カウントの図示である；
【００３７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける、増加した好中球カウントの図示である；
【００３８】
【図８Ｃ】図８Ｃは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットの血液中の単球濃度の図示である（*対照に対してｐ＜０．０５；**APN群に対してｐ＜０．０５）；
【００３９】
【図８Ｄ】図８Ｄは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける、リンパ球のレベルの図示である（*対照に対してｐ＜０．０５；**APN群に対してｐ＜０．０５）；
【００４０】
【図８Ｅ】図８Ｅは、ラットにおける腎盂腎炎の誘導の後でのリンパ球濃度の図示であり、炎症促進性TNFαの産生を示している；
【００４１】
【図８Ｆ】図８Ｆは、腎盂腎炎の誘導およびＳｋＱ１による処置の後での、ラット血液中の好中球濃度の図示である；
【００４２】
【図８Ｇ】図８Ｇは、腎盂腎炎の誘導およびＳｋＱ１による処置の７日後における、ラットにおけるミエロペルオキシダーゼ（MPO）活性の図示である；
【００４３】
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、好中球の増大が、これらの細胞におけるROSバーストを伴ったことを示すスキャンの模式図である；
【００４４】
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＳｋＱＲ１を用いた処置による炎症性の変化の予防を示す表示である（*−ｐ＜０．０１、**−ｐ＜０．０５）；
【００４５】
【図１０Ａ】図１０Ａは、対照ラット、腎盂腎炎ラットにおける、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける、抗アポトーシス性Bcl-2を示すSDSゲルの表示である；
【００４６】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットの単離された腎臓ミトコンドリアにおけるBcl-2のSDSゲルの表示である；
【００４７】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、図１０Ａの結果の図示である；
【００４８】
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、図１０Ｂにおいて示す結果の図示である：
【００４９】
【図１１】図１１は、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットの生存率の図示である；
【００５０】
【図１２】図１２は、細菌の侵入の後での、白血球および腎細胞ならびにそれらのミトコンドリアの変化のスキームの図示である（青＝生存促進性（pro-survival）および赤＝細胞死促進性（pro-death）の要素）。NOX＝NADPHオキシダーゼ；iNOS、誘導性NOシンターゼ；TNFR、TNF-αの受容体；RIRR, ROSにより誘導されるROS放出カスケード；P-GSK-3βおよびGSK-3β、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βの生存促進性の（リン酸化された）およびアポトーシス促進性の（脱リン酸化された）形態；
【００５１】
【図１３Ａ】図１３Ａは、Trolox、SkQR1で処理されていない、またはこれで処理された、RTCと活性化された白血球（LC+BL）との共培養における、TNFαの産生の図示であり、TNFαの産生が、活性化されたLCにおいて、対照LCと比較して、特にRTCとの共培養において、有意に高かったが、一方で、示された薬物とのインキュベーションは効果を有さなかったことを示す；
【００５２】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、DCF蛍光により測定される、通常培地およびLC条件付け培地中のRTCにおけるTNFαの産生の図示である（*−ｐ＜０．０１）；
【００５３】
【図１４Ａ】図１４Ａは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットの白血球におけるΙκΒαの発現により提示される、NF-κΒ経路の活性化を示すSDSゲルの表示である；
【００５４】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットの白血球におけるP-GSK3βの発現を示すSDSゲルの表示である；
【００５５】
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、対照ラット、腎盂腎炎ラットにおける、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける白血球のΙκΒ含有量を示すSDSゲルの表示である；
【００５６】
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける、リン酸化されたAktの濃度を示す表示である；
【００５７】
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、対照ラット、腎盂腎炎ラット、およびＳｋＱＲ１で処置された腎盂腎炎ラットにおける、ホスホ-GSK-3βのレベルを示すSDSゲルの表示である；
【００５８】
【図１５Ａ】図１５Ａは、RTCと活性化された白血球との共培養における細胞間相互作用の欠如を示す、走査型電子顕微鏡写真の表示であり、ここで、２４時間の共培養の後での白血球とRTCとの間の密接な接触のコミュニケーションを、矢印により示す（バー、１０μｍ、３μｍ）；
【００５９】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、RTCと活性化された白血球との共培養における細胞間相互作用を示す、走査型電子顕微鏡写真の表示であり、ここで、２４時間の共培養の後での白血球とRTCとの間の密接な接触のコミュニケーションを、矢印により示す（バー、１０μｍ、３μｍ）；
【００６０】
【図１６】図１６は、ディッシュ中のGFP陽性白血球のカウントにより測定される、細菌ライセートによる活性化の後での白血球の生存率を示す図示であり、ここで、腎細胞は、これら２種の細胞の間の区別を補助するGFPを担持する白血球と共培養されたものである。共培養条件下において、活性化された白血球の生存は、腎細胞なしで観察されたものよりも高かった（*−ｐ＜０．０１）；
【００６１】
【図１７】図１７は、相対的VE−カドヘリン含有量により測定される、様々な濃度のＳｋＱ１およびグルコースの、内皮細胞接触に対する、抗炎症および抗糖尿病効果を示す図である；
【００６２】
【図１８】図１８は、様々な濃度のＳｋＱ１およびf-MLPの、ヒト好中球に対する抗炎症効果を示す図である（MMP9活性により測定されるゼラチナーゼ活性）；ならびに
【００６３】
【図１９】図１９は、ＳｋＱ１処置が急性膵炎のモデルにおいて膵臓浮腫を予防することを示す図であり、ここで、４群の動物の膵臓のグラムにおける重量を示す（平均値およびＳＥを示す）。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
説明
本願を通して、多様な特許、特許出願および刊行物が参照される。これらの特許、特許出願および刊行物の開示は、それらの全体において、本明細書において記載され請求される発明の日のものとして、それらにおける当業者に公知である最新技術をより完全に記載するために、本明細書により参照により本願中に組み込まれる。当該特許、特許出願および刊行物と本開示との間に任意の不一致が存在する場合は、本開示が支配する。
【００６５】
ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤（MTA）
ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤（Mitochondria-targeted antioxidant：MTA）は、今や、多数の疾患、障害および外傷に関連する炎症を予防および処置することにおいて有用であることを見出された。
【００６６】
MTAは、以下の式：
【化１３】
0006506177.tif 000014
式中：
Ａは、任意に以下の構造：
【化１４】
0006506177.tif 000015
を有するエフェクター部分‐抗酸化剤、および／またはその還元された形態であって、式中：
ｍは、１〜３の整数であり；
各々のＹは、低級アルキル、低級アルコキシからなる群より、独立して選択されるか；または、２つの隣接したＹ基は、それらが結合している炭素原子と一緒に、以下の構造：
【化１５】
0006506177.tif 000016
および／またはその還元された形態を形成し、式中：
Ｒ１およびＲ２は、同じであっても異なっていてもよく、互いに独立して低級、低級アルコキシであり；
Ｌは、
ａ）１または２以上の置換基により任意に置換されていてもよく、１または２以上の二重または三重結合を任意に含む、直鎖状または分枝状の炭化水素鎖；または
ｂ）天然のイソプレン鎖；
を含むリンカー基であり；
ｎは、１〜４０、または２〜１５、または５〜１１の整数であり；
Ｂは、Ｓｋ＋Ｚ−を含むターゲティング基であって、式中：
Ｓｋは、親油性カチオンであり；および
Ｚは、薬理学的に受容可能なアニオンである、
の化合物、およびその溶媒和物、塩、異性体またはプロドラッグである。
【００６７】
具体的な有用なMTAとして、限定されないが、
【化１６】
0006506177.tif 000017
【化１７】
0006506177.tif 000018
およびそれらの還元された（キノール）形態、それぞれＳｋＱ１Ｈ２およびＳｋＱＲ１Ｈ２が挙げられる。これらのMTAは、PCT/RU2006/000394において記載されている。他の有用なMTAバリアントとして、限定されないが、
ＳｋＱ３：
【化１８】
0006506177.tif 000019
およびその還元された（キノール）形態、ＳｋＱ３Ｈ２；
ＳｋＱＲＢ：
【化１９】
0006506177.tif 000020
およびその酸化された（キニーネ）形態、ＳｋＱＲＢ；
ＳｋＱＢ１：
【化２０】
0006506177.tif 000021
およびその還元された（キノール）形態、ＳｋＱＢ１Ｈ２；ならびに
ＳｋＱＢＰ１：
【化２１】
0006506177.tif 000022
およびその還元された（キノール）形態、ＳｋＱＢＰ１Ｈ２が挙げられる。
【００６８】
これらのMTAは、少なくとも部分的に、炎症により誘導される組織損傷を軽減または予防することにより、炎症の症状を予防および処置することにおいて有用である。かかる症状として、限定されないが、腎盂腎炎、膵臓、糖尿病および他のグルコース代謝障害、肝炎、慢性閉塞性肺疾患、虚血、急性大動脈解離、腎臓疾患、外傷、細菌感染、急性炎症性障害、敗血症、および、限定されないが、気管支喘息などの自己免疫性障害が挙げられる。
【００６９】
腎盂腎炎モデル
腎盂腎炎を、例示的な炎症の病態として研究した。なぜならば、ミトコンドリアのROSは、実験的APNにおいて、膀胱中への細菌の接種に基づく従来のin vivoモデル、および病原体／エンドトキシンにより活性化された白血球と培養された腎臓上皮細胞との相互作用に基づく新規の炎症のin vitroモデルの両方において、腎細胞損傷のソースであるからである。このストレスの結果として、酸化ストレスの進行を腎細胞においてin vitroで観察し、それらの死を観察した。この酸化ストレスは、ROSを産生する白血球により引き起こされたものであり、これは細菌の抗原との相互作用により開始される。活性化の後で、白血球は、外部に、ROS、NOおよびTNFを排出する。白血球のNADPHオキシダーゼの抑制は、腎細胞内での劇的なROSの減少をもたらし、これは、白血球が特に、腎盂腎炎の腎臓における過剰なROS産生の原因であるというアイディアを支持する論拠として役立ち得る。
【００７０】
ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤（MTA）（例えばSkQ1およびSkQR1）の保護的効果を示した（例１）。MTA処置は、細胞死へ向かう経路における「不回帰点（point of no return）」の達成を予防した（Kroemer et al. (1995) FASEB J. 9: 1277-1287）。
【００７１】
SkQ1およびSkQR1により得られた腎細胞保護は、伝統的な水溶性抗酸化剤であるTroloxにより得られるものよりも顕著であった。このことは、腎臓の病態の発症および進行の予防における、抗酸化剤をミトコンドリア中にターゲティングすることの役割を示す。重要なことに、これらのMTAは、細菌ライセートに暴露された白血球によるTNFα産生のレベルに対しては効果を有しなかった。このことは、MTAは、炎症の特定の段階を抑制しないことを示唆している。したがって、ミトコンドリアのROSを標的とすることは、進行中の感染であって、伝統的な抗炎症薬が微生物のクリアランスを妨害し得る条件下において、有益である。
【００７２】
実験的APNのin vivoモデルにおける腎細胞傷害において、ミトコンドリアにより媒介される酸化ストレスが役割を有することを決定した。一研究において、脂質の過酸化の指示薬であるMDA（Cherubini, et al. (2005) Free Radic. Biol. Med. 39:841-852; Gupta et al. (1996a) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 13:35-42）が、実験的APNを有するラットの腎臓において上昇し、酸化による腎損傷を示した。
【００７３】
さらに、腎盂腎炎ラットの血液白血球においては、より高いレベルのROS産生が観察された。ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤SkQR1は、血液白血球における、および腎盂腎炎の動物の腎臓におけるROSのレベルを正常化した。SkQR1処置はまた、疾患を有する腎臓における好中球浸潤、ならびに、組織におけるTNFαのレベルを抑制し、腎臓における炎症性傷害を予防することにおける、ミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤の高い効率を示した。
【００７４】
膀胱中に注入された細菌の力価が高い場合、実験動物の間で高い死亡のレベルが観察され、これは、高いレベルのTNFαおよび菌血症と一緒に、敗血症の進行の強力なエビデンスを提供した。MTAは、重篤なAPNを有する動物の生存を著しく増加させる。
【００７５】
APNに続く腎損傷は、腎臓に対する細菌の直接的な効果によるものというよりはむしろ、主に感染に関連する炎症のプロセスにより引き起こされる（Bennett et al. (1999) J. Urol. 161:1681-1684); Haraoka et al. (1994) J. Urol. 151:1078-1080); Imamoglu et al. (2006) Urology 67:1315-1319）。宿主の腎臓の細菌の侵入は、自然免疫系の引き金を引く。細菌の認識の後で、toll様受容体シグナル伝達（Shirali and Goldstein, (2008) J. Am. Soc. Nephrol. 19:1444-1450）が、核因子κBならびにサイトカインおよびケモカインの産生を伴う免疫応答を開始させる（Li et al. (2002) Respir. Res. 3:23; Ragnarsdottir et al. (2008) Eur. J. Clin. Invest. 38(Suppl.)2:12-20; Tullus et al. (1997) Acta Paediatr. 86:1198-1202）。
【００７６】
腎盂腎炎ラットからの白血球培養培地中で、TNFαのレベルが継時的に増加すること、およびこの培地自体が、腎細胞における酸化ストレスを引き起こし得ることを決定した。in vitroモデルにおいて、および実験的APNの条件下の両方において、腎細胞および白血球の両方におけるtoll受容体のレベルの著しい増加を観察した。MTAであるSkQR1による処置は、APN下において活性化された腎臓の様々な領域におけるこれらの受容体の正常な発現をもたらした。このこととは別に、APNの発症は、末梢白血球における炎症促進性シグナル伝達経路の活性化と関連する。この活性化は、SkQR1処置ラットにおいて抑制された。
【００７７】
腎盂腎炎の腎細胞の周囲およびその中において起こる病態学的イベントのモデルを、図１１において示す。このモデルは、炎症性細胞の損傷および死の発生率を説明する。このモデルにおける要素は、病態の進行の全ての段階におけるミトコンドリアROSの役割である。病態学的（中間）段階の多くにおいて、細胞死促進性および生存促進性のシグナル伝達は、ミトコンドリアの機能に関連付けられ、MTAは、直接的な抗菌手段が限定される場合において（小児、妊婦、原発性免疫不全症を有する個体などにおいて）、またはこれが不十分である場合において（抗生物質耐性細菌株の場合において）、瘢痕および腎機能不全を予防するための高い効力を有する、有効な抗腎盂腎炎薬である。
【００７８】
感染に対する宿主の防御は、耐性（resistance）および寛容（tolerance）の機構を通して達成され得る（Medzhitov et al. (2012) Science 335:936-941）。本研究（例えば例１）は、ミトコンドリアのROSが、炎症により誘導される組織損傷の重要な原因であること、および、ミトコンドリアのROSを標的とすることにより、そうしなければ致死的となる細菌感染の間の宿主の生存率を改善することができることを示す。
【００７９】
血管透過性に対するMTAの効果
例２において示すとおり、SkQ1処置は、高グルコース処置により引き起こされる内皮細胞間の接触の解体を予防した（このことは、VE−カドヘリンのイムノブロット分析により決定した）。内皮細胞間の接触は、糖尿病、外傷、敗血症および他の炎症性疾患を含む多様な病理学的条件下において、容易に解体される。これは、血管透過性の増大をもたらし、生命を脅かす状態をもたらし得る。したがって、これらの状況下においては血管透過性を低下させるべきである。SkQ1は、循環中の高グルコースおよび炎症性サイトカインに対して内皮細胞および血管を保護することにおいて有効であることを示した。したがって、SkQ1は、糖尿病および高血糖症を含むグルコース代謝障害、敗血症、外傷、ならびに慢性および急性の炎症性疾患により引き起こされる病理学的条件の処置において有用である。
【００８０】
好中球活性化に対するMTAの効果
例２はまた、SkQ1処置が、細菌の生成物のアナログであるfMet-Leu-Pheにより引き起こされるヒト好中球活性化を予防することを示す（ザイモグラフィー分析により決定される）。この知見は予想外であった。なぜならば、ヒト好中球は、非常に低い代謝活性を有する少量のミトコンドリアを含むからである。
【００８１】
ヒト好中球は、病原体および破壊されたヒト細胞の成分、ならびに炎症促進性サイトカインにより活性化される。MMP-9は、活性化された好中球から放出されるメタロプロテイナーゼである。過剰な好中球活性化は、大規模な組織損傷をもたらす。活性化されたMMP-9は、気管支喘息および慢性閉塞性肺疾患（Takafuji et al. (2003) J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 13:50-55）、虚血（Gidday et al. (2005) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289:558-568）、急性大動脈解離（Kurihara et al. (2012) Circulation. 126:3070-3080）、腎臓疾患、外傷、敗血症、炎症、ならびに組織のリモデリングを伴う多くの他の疾患および病理学的状態に関与していることが知られている。
【００８２】
本明細書において提供されるデータは、活性化されたヒト好中球からのMMP-9放出に関連する組織損傷を示す。SkQ1が、MMP-9に関連する損傷ならびに病原体および／または炎症性サイトカインにより引き起こされる損傷に対してヒト組織を保護することにおいて有効であることを示した。したがって、SkQ1は、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、虚血、急性大動脈解離、腎臓疾患、外傷、敗血症および他の炎症性疾患の予防および処置において有用である。
【００８３】
他の炎症性モデルに対するMTAの効果
MTAの保護的効果を、また、肝炎のモデルにおいて（例４）および膵炎のモデルにおいて（例５）示した。
【００８４】
本発明を説明する具体例への参照を行う。例は、ある態様を説明するために提供されるものであり、それにより、本発明の範囲に対する何らかの限定を意図するものではないことが、理解されるべきである。
【００８５】
例
例１
急性腎盂腎炎のモデルにおけるMTAの保護的効果
Ａ．実験手順
１．初代ラット腎細胞培養
１〜３日齢のラットからの腎臓を、無菌条件下において切除した。組織を混合し、コラゲナーゼ処置（０．５％、３７℃で３０分間）により解離させた。最終懸濁液を５分間にわたり５０ｇで遠心分離した。ペレットを、１０％のFCS（Gibco、USA）を添加した約１０ｍｌのDMEM/F12（Gibco、USA）中に再懸濁して２分間置き、その後、別の管に上清を移し、ペレットを繰り返し再懸濁した。１０分後、尿細管をペレット化し、懸濁液中に残っている解離した細胞を捨てた。ペレットを、１０％のFCSを添加したDMEM/F12中で再懸濁し、２４ウェルプレート上に、または３５ｍｍのガラス底ペトリ皿中に置いたカバースリップ上に播種した。
【００８６】
２．細菌の培養
E. coli株No.85を、１％のトリプトン、０．５％の酵母抽出物および１％のＮａＣｌを含む培養培地（Sigma-Aldrich、USA）中で一晩培養した。１ｍｌあたりおよそ１０９コロニー形成単位（CFU）を含む培地を、３００ｇで３分間ペレット化した。３ｍｌの０．９％のＮａＣｌ中で、３０ｍｌの一晩（ON）培養物を希釈し、沈殿を希釈して、その後１．５時間、１２０℃でオートクレーヴすることにより、細菌ライセートを調製した。
【００８７】
３．末梢血からの白血球の調製
成体オスラットの頸静脈から収集した５ｍｌのヘパリン処理した血液を、慎重に、５ｍｌのフィコール−ウログラフィンの上に層状に重ね（１．０７７ｇ／ｃｍ３の密度）、３０分間、２００ｇで遠心分離した。この手順は赤血球のペレット化をもたらし、一方で、白血球の単核の画分がフィコール表面上に相間のリングを形成した。これを慎重に収集した。白血球を別の管中に移し、３分間、２００ｇで遠心分離した。生じたペレットを、５ｍｌのDMEM/F12中で再懸濁した。血球計数器における細胞計数の後で、細胞を、１ｍｌあたり約１×１０５細胞の最終濃度まで希釈した。
【００８８】
好中球の調製のために、フィコール勾配からの特有の画分を別の管に移し、１０ｍｌのDMEM/F12と混合し、３分間にわたり２００ｇで遠心分離した。好中球を含む最終ペレットを、５ｍｌのDMEM/F12中で再懸濁し、細胞を計数して、次いで、１ｍｌあたり約１×１０５細胞の最終濃度まで希釈した。
【００８９】
同じ手順を、GFPマウスから白血球を得るために適用した。
【００９０】
４．in vitroでの炎症リモデリング
２日齢の腎細胞培養物において、培地を、（目的に依存して）以下を添加したDMEM/F12（ウェルあたり４００μｌ、ディッシュあたり１６００μｌ）で置換した：GSK-3β阻害剤LiCl（９ｍＭ）（Sigma-Aldrich、USA）、水溶性抗酸化剤Trolox（５０μＭ、１００μＭ）（Sigma-Aldrich、USA）、MTAである１０−（６−プラストキノニル）デシル−トリフェニルホスホニウム（SkQ1）（Antonenko et al. (2008) Biochemistry (Mosc) 73:1273-87に従って合成されたもの）（１０ｎＭ、１００ｎＭ）、および１０−（６’−プラストキノニル）デシルローダミン19 SkQR1）（Antonenko（2008）に従って合成されたもの）、（１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭ）。腎細胞をこの培地中で２時間インキュベートし、その後、DMEM/F12中の白血球または好中球、および対照試料においてDMEM/F12単独を添加した（ウェルあたり４００μｌ、ディッシュあたり１６００μｌ）。同時に、DMEM/F12中の細菌ライセートまたはリポ多糖（１００ｎｇ／ｍｌ、LPS、Sigma-Aldrich, USA）溶液、および対照試料においてDMEM/F12単独を添加した（ウェルあたり１００μｌ、ディッシュあたり４００μｌ）。腎細胞、白血球（好中球）を２４または４８時間にわたり細菌ライセートまたはLPSと共培養した。細胞死（壊死およびアポトーシスによるものの両方）の率を、アネキシン−Ｖ FITCキット（Invitrogen, USA）を用いて評価した。
【００９１】
５．APNのin vivoラットモデル
APNのin vivo実験モデルを用いた。ここで、細菌を、ラットの膀胱中に導入する（Gupta et al. (1995) J. Med. Microbiol. 43:33-36）。実験は、自由に摂食させた非近交系の白色メスラット（１８０〜２００ｇ）において行った。動物のプロトコルは、治験審査委員会により承認された。ラットを抱水クロラールで麻酔した（３００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉｐ））。柔らかいIntramedic非放射線不透過性ポリエチレンカテーテル（Clay Adams、USA）を用いて、動物を尿道内感染させた。接種菌（５ｍｌ／ｋｇ、１×１０８ＣＦＵ／ｍｌのラット糞便細菌組成物）を、膀胱中へのいかなる漏出をも回避するためにゆっくりと注入した。対照動物は処置しなかった。この病態を処置するために用いたSkQR1の治療プロトコルは、以下のとおりである：細菌の注射の１時間後に、SkQR1のｉｐ注射（体重１ｋｇあたり１００ｎｍｏｌｅｓ）、その後、１２、２４、３６および４８時間において同量のSkQR1の注射；合計で各動物は、体重１ｋｇあたり５００ｎｍｏｌのSkQR1を投与された。
【００９２】
注射後の２日目において、血液試料を採取し、ミトコンドリア単離、組織におけるMDAレベルの決定、ウェスタンブロットおよび病理組織学的検査のために、腎臓を切除した。
【００９３】
腎臓ミトコンドリアを、２５０ｍＭのスクロース、２０ｍＭのHEPES-KOH、１ｍＭのEGTAおよび０．１％のBSAを含む培地（ｐＨ７．４）中でのホモジェネーションおよび分画遠心により単離した。ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Sigma-Aldrich、USA）を用いて、ミトコンドリアの総タンパク質を決定した。培養した腎細胞からのミトコンドリアを、同じプロトコルにより単離した。
【００９４】
６．ROS、NO、MDAおよびTNFの測定
炭酸水素塩を含まないDMEM/F12中に溶解した（最終濃度１０μＭ）ROS感受性蛍光プローブ2,7-DCF-DA（Molecular Probes、USA）を、腎細胞に添加し（２４ウェルプレートのウェルあたり５００μｌ、ディッシュあたり２ｍｌ）、１５分間にわたり３７℃でインキュベートし、その後、炭酸水素塩を含まないDMEM/F12で洗浄した。MDAは、MiharaおよびUchiyama（1978年、Anal. Biochem. 86:271-8）においてのとおり決定した。生細胞におけるNOの決定のために、蛍光プローブDAF-2-DA（Calbiochem, San Diego, CA, USA）を用いた。手順は、2,7-DCF-DAについてのものと同じであった。亜硝酸／硝酸アッセイキット（Sigma-Aldrich、USA）を用いて、培養培地中の亜硝酸／硝酸の濃度（NO酸化の生成物として）を決定した。キット、ラットTNFαELISA Ready-SET-Go（Ebioscience, USA）を用いて、TNFαを決定した。
【００９５】
７．共焦点および走査型電子顕微鏡法
腎細胞を、LSM510倒立型共焦点顕微鏡（Carl Zeiss Inc., Jena, Germany）を用いて、４８８ｎｍにおける励起、および１５０μｍの直径のピンホールを用いて５００ｎｍ〜５３０ｎｍにおいて収集される発光により、イメージングした。ImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて、画像を処理した。
【００９６】
走査型電子顕微鏡法のために、細胞および細菌を、５ｍＭのEDTA、５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフロリドおよびｐＨ７．３における１０ｍＭのHEPESを添加した、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋フリーのHanksバッファー中２．５％のグルタルアルデヒド中で固定した。細胞を、ｐＨ７．３における０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムと０．１Ｍのスクロース中１％の四酸化オスミウムで後固定し（グルタルアルデヒドを含有するバッファーを交換することなく）、アセトンシリーズにおいて脱水し、Balzers装置において移行液として液体ＣＯ２を用いて臨界乾燥し、金−パラジウムでスパッタコートし、Camscan S-2またはJSM-6380走査型電子顕微鏡を用いて１５ｋＶにおいて観察した。
【００９７】
８．腎組織学および炎症性組織損傷の類別
動物を安楽死させた後、速やかに腎臓を単離し、氷冷PBSで灌流した。それを、次いで、１０％の中性に緩衝化されたホルマリン溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、病理組織学的試験のために用いた。５マイクロメートル厚の切片を切り出し、脱パラフィンし、含水させ、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。腎臓の切片を、盲検の様式において、全ての処置動物の腎臓における白血球による炎症および浸潤について試験した。各腎臓スライドについて最少で１０視野を試験し、病理学的重篤度についてスコア付けした。
【００９８】
APN下における炎症インディケーター（すなわち、全ての層における浸潤した白血球の数、および膿瘍の存在）の所見を、以下のスケールを用いて評価した：０、なし；１、視野中に５〜５０の白血球；３、視野中に＞１００；４、膿‐壊死性の含有物を伴う膿瘍。炎症性変化の分布（すなわち、浸潤および膿瘍の比較分析）を、以下の基準により評価した：０、いずれの層においてもなし；１、髄質層における浸潤；２、皮質に達する浸潤。
【００９９】
９．ミエロペルオキシダーゼ活性アッセイ
MPO決定のための腎臓ホモジェネートを、２００００ｇで１５分間遠心分離し、０．５％のCTABを含む５０ｍＭのＫ−リン酸バッファー中でペレットを再懸濁した。生じた試料を３回凍結融解し、次いで、１０６００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、ｏ−フェニレンジアミン（OPD）による発色反応においてMPO活性について分析した。１００μｌの試料を、１００μｌの基質バッファー（２５ｍＭのＮａ−クエン酸、５０ｍＭのＮａ−リン酸、０．４５ｍｇ／ｍｌのOPD、０．１％のＨ２Ｏ２、ｐＨ５．０）と混合し、１５分間、室温でインキュベートし、次いで、４９２ｎｍにおいてODを検出した。
【０１００】
１０．免疫組織化学
細胞および腎臓のスライスを、PBS中で洗浄し、PBS中４％のホルムアルデヒド中で４℃で３０分間にわたり固定し、０．０２％のTriton X-100を含むPBS（ウェルあたり０．５ｍｌ、スライスあたり５ｍｌ）中で６０分間にわたり４℃で透過処理し、その後、０．５％のウシ血清アルブミンを含むPBS（PBS-BSA）中で６０分間にわたり室温でブロッキングした（ウェルあたり０．５ｍｌ、スライスあたり２ｍｌ）。PBS-BSA中での３回の１５分間のリンスの後で、細胞を、１：２００希釈した二次抗体（FITC共役抗ウサギIgG、Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA）と共に１時間にわたりインキュベートした。腎臓スライスおよび細胞が付着したカバースリップを洗浄し、マウントメディウムを用いて顕微鏡スライド上に置き、カバースリップの下で密封した。共焦点顕微鏡画像は、ImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて処理した。
【０１０１】
１１．ウェスタンブロット分析
腎臓ホモジェネートの試料を、１５％のTris−グリシンポリアクリルアミドゲル上にロードした（レーンあたり１０〜２０μｇの総タンパク質）。電気泳動の後で、ゲルを、PVDF膜（Amersham Pharmacia Biotech、UK）上にブロットした。膜を、PBS中５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の脱脂乳および０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のTween 20でブロッキングし、その後、適切な一次抗体と共にインキュベートした。膜を、次いで、対応する抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体で処理した。ECL Plusウェスタンブロットキット（Amersham Pharmacia Biotech、UK）を用いて、特異的バンドを可視化した。スキャンの後で、ImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて、膜中の生じた染色の密度を、各バンドについて測定した。
【０１０２】
１２．統計学
全ての実験を、少なくとも３回の複製において行った。全てのデータを、平均±ＳＥＭとして表す。スチューデントｔ検定を用いて群の間の比較を行い、０．０５未満のＰ値を、統計学的有意を示すものとみなした。
【０１０３】
Ｂ．結果
１．組織におけるAPNにより誘導される酸化ストレスに対するMTA SkQR1の効果
APNモデルにおいて、炎症および酸化による腎臓組織損傷の多数の兆候が観察された（図１Ａ〜１Ｃ）。腎盂腎炎ラットの腎臓（図１Ｂ）は、多数の膿瘍を示し、これらは、SkQR1で処置したラットにおいては、顕著に蔓延性が低かった（図１Ｃ）。腎臓の広範な白血球浸潤が起きた（図２および３）。間質への浸潤は時には局所的であったが、しばしば、腎臓の実質の著しい部分をカバーし、ほとんど排他的に侵入した多形核白血球（好中球）に起源を有した。幾つかの部位においては、浸潤物は血管を包含した。重篤かつ特徴的な変化は、尿細管においてもまた明らかであった。それらは腫大し、それらの細胞は編成して、しばしば管腔に剥がれ落ちていた。しばしば、管は、膿‐壊死性および細菌性の含有物で充填されていた。病理学的変化は、ほとんどが腎臓の髄質部分において観察された（図２〜４）。大部分の場合における糸球体および皮質の管は、相対的に無傷であった。重要なことに、SkQR1による処置は、全ての腎臓の層における白血球浸潤および炎症のプロセスの拡大の両方を阻害した（図２〜４）。
【０１０４】
全腎臓組織における酸化ストレスの指標であるマロニルジアルデヒド（MDA）などの過酸化による生成物の濃度は、APNの誘導の後で上昇した（図５Ａ）。このことは、顕著な酸化による組織損傷を示している。MDA濃度は、SkQR1を投与されている動物において、著しくより低かった（図５Ａ）。このことは、このミトコンドリアにターゲティングされた抗酸化剤により得られた、酸化ストレスからの腎臓組織の保護を示している。
【０１０５】
好中球浸潤の指標であるミエロペルオキシダーゼ（MPO）の組織活性は、腎盂腎炎の腎臓において著しく上昇したが、やはり、SkQR1で処置されたラットにおいて、著しく阻害された（図５Ｂ）。
【０１０６】
２．酸化およびニトロソ化ストレスならびに腎細胞死
ミトコンドリアにより媒介される酸化ストレスを、腎尿細管細胞（RTC）を抗原（細菌ライセートにより活性化された白血球）と共培養する腎盂腎炎のモデルにおいて研究した。このモデルを用いて、対照（図６Ａ）におけるものよりも著しく高いDCFからの蛍光シグナル（これは抗原により媒介されたROS産生を示す）が観察された（図６Ｂ）。特に、ROSレベルは、対照（未処置）細胞におけるものよりも約５倍高かった。これは、腎細胞における酸化ストレスの開始が活性化された白血球により媒介されるという仮説と一致する。活性化されていない白血球はまた、RTCにおけるROS産生の増大を引き起こすが（示さない）、それはまた、活性化された白血球の場合よりもほぼ２倍低い；このことは、それらの調製のプロセスの間に起り得る白血球の活性化により説明することができる。共焦点顕微鏡法により、活性化された白血球−腎細胞の共培養において検出されたより高いROSシグナルは、主に腎細胞に起源を有することが確認された（図６Ｂ）。
【０１０７】
細菌細胞壁から単離された純粋なLPSは、一般に、白血球刺激のために用いられる（Sakaguchi et al. (2007) Int. Immunopharmacol. 7: 191-197）。LPSおよび細菌ライセートの効果を比較した。LPSの適用はまた、白血球の活性化および腎細胞におけるより高いROSレベルを引き起こした（図７Ａ）。特に、１００ｎｇ／ｍｌのLPSは、細菌ライセートを用いて観察されたものと同じ効果を有した。しかし、細菌ライセートの利用は、腎盂腎炎の開始の後でのin vivo条件の模倣という意味で、より適当である。細菌ライセートは、ヒト樹状細胞における活性化形質の誘導について、細菌由来の可溶性生成物よりも効率的であることが示されている。NADPHオキシダーゼの特異的阻害剤であるジフェニレンヨードニウム（DPI）（０．５μΜ）（Morandi et al. (2011) Immunol. Lett. 138:86-91）による本実験は、DPIが腎細胞中でのROS産生を阻害したことから、この酵素が、この系における一次的および／または二次的なROS産生の原因であることを示した（図７Ａ）。
【０１０８】
腎細胞における酸化ストレスを予防するために、ならびに細胞死を減少させるために、強力な抗酸化能力を有する３つの薬物を用いた：ビタミンＥの水溶性アナログであるTrolox、ならびにMTAであるSkQ1およびSkQR1。これらの各々による処置は、腎細胞において劇的により低いROS産生レベルをもたらし（図７Ａ）、１０ｎＭのSkQ1、１０ｎＭのSkQR1、または１００μΜのTroloxによる２時間にわたる腎細胞の前処置は、活性化された白血球との共培養の後のROS産生の、対照において観察されるレベルに近いレベルまでの抑制をもたらした。同様に、LiCl前処置はまた、抗酸化効果を有した（図７Ａ）。
【０１０９】
ROSに加えて、抗原により活性化される白血球は、相当な量のNOを産生し得る。腎細胞の白血球および細菌ライセートとの２４時間にわたるインキュベーションの後で、培地中の硝酸／亜硝酸のレベル（NO酸化の塩基性の産物）は、対照におけるものよりも５倍高かった（図７Ｂ）。しかし、腎細胞におけるNO産生に対する白血球活性化の効果は、DAF-2の蛍光により測定した場合、はるかにより顕著ではないと考えられる（図７Ｃ）。ニトロソ化ストレスは、白血球活性化に対して、酸化ストレスよりも著明でない応答を示す。しかし、３つの異なる薬物とのプレインキュベーションは、硝酸／亜硝酸の蓄積の何らかの抑制を明らかにした（図７Ｂ）。
【０１１０】
本発明の腎盂腎炎の細胞モデルにおいて、活性化された白血球への暴露の４８時間後に相当な腎細胞死が観察された（腎細胞のうちの１０％より多くがアネキシンＶ陽性となった）。３つの異なる薬物とのプレインキュベーションは保護的であり、SkQR1が最も高い効率を示した（図７Ｄ）。酸化ストレス（図７Ａ）および細胞死（図７Ａ）のレベルに対するSkQR1とTroloxとの保護的効果の比較は、これらの化合物の区別し得る効果を示す。特に、MTAは、腎細胞死に対する保護において、最も高い効力を示した。同様に、LiClはまた、腎細胞を死から保護し、その効果は、Troloxのものよりも顕著であった。
【０１１１】
３．腎臓における酸化ストレスに対するTNFの効果
細菌ライセートは、白血球による強力なTNF産生を誘導する（図１２Ａ）。興味深いことに、培地におけるTNF放出は、活性化された白血球と腎細胞との共培養の後で、さらにより高かった（図１３Ａ）。このことは、炎症の誘導における腎細胞−白血球相互作用の役割を指す。Trolox、LiClおよびSkQR1は、RTC−白血球共培養におけるTNF放出に対して、著しい効果を有しなかった。
【０１１２】
放出されたTNF自体が、酸化ストレスを誘導することにより腎細胞に影響を及ぼし得るか否かを、次いで試験した。この目的のために、白血球を細菌ライセートで処置した培地を遠心分離し、腎細胞に添加した。TNF含有培地は、腎細胞におけるROSレベルを増大することが示されたが、腎細胞と活性化された白血球との共培養の後で観察されたものと比較して、より低い程度までであった（図７Ａと図１３Ｂとを比較する）。したがって、腎細胞と共培養された白血球との直接的相互作用は、腎細胞における酸化ストレスの誘導において、重要な役割を果たす。
【０１１３】
４．酸化ストレスおよび血液白血球の変化
APNのin vivoモデルにおいて、感染の３日後の血液中の白血球の数は、対照レベルと比較して２倍増加した（図８Ａ）。SkQR1による前処置は、白血球のレベルの上昇を予防した（図８Ａ）。白血球増加症は、好中球増加症と相関した（好中球レベルが３倍高い、図８Ｂ）。白血球濃度の上昇は、主に、好中球の量がほぼ５倍増加することから、好中球の割合の増大に起因した（図８Ｆ）。好中球数は、全ての群の動物において、腎盂腎炎の７日目において、自然に低下した。単球カウントもまた、腎盂腎炎ラットにおいてより高かったが（図８Ｃ）、一方、血中のリンパ球含有量は、３群全てにおいて類似した（図８Ｄ）。腎盂腎炎の誘導の後３日目において、SkQ1（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内投与した。APNの効果は、SkQR1で処置されたラットにおいて阻害され、これは、一般的な白血球増加症を焼失させ、他の炎症マーカーを低下させた（図８Ａ〜８Ｃ）。これは、好中球濃度の低下を含み、好中球濃度は、７日目において、SkQ1を投与されなかった動物のものよりも２倍低かった（図８Ｆ）。したがって、SkQ1による処置は、疾患の７日目において、血中の白血球濃度を著しく低下させた。
【０１１４】
さらに、腎臓組織の炎症をまた観察した。特に、抗菌応答の進行において次亜塩素酸塩を生成する好中球酵素であるMPOの活性が、著しく増大した。MPOは、好中球浸潤の原因であり、炎症組織における酸化バースト発症の原因でもある、主要な酵素である。腎盂腎炎の７日目において、腎組織におけるその酵素活性は、健康な動物の腎臓におけるものよりも約５倍高かった（図８Ｇ）。腎盂腎炎誘導の３日後におけるSkQ1の腹腔内投与は、MPOの活性の低下からも結論付けることができるとおり、腎臓組織の炎症の著しい抑制をもたらした。
【０１１５】
急性腎盂腎炎のin vivoモデル下において腎臓組織において見出される酸化ストレス依存的な有害傾向を、さらに血液白血球において確認した。腎盂腎炎の腎臓の組織におけるより高いレベルのMDA産物とは別に（図５Ａ）、APNを有するラットから単離された白血球はまた、より高いレベルのROSを有した。特に、フローサイトメトリー分析により、腎盂腎炎ラットからの白血球集団におけるDCF蛍光の平均強度が、対照動物におけるものの２倍高いことを示した（図９Ａ、９Ｂ）。病気の動物において、白血球は、より活性化された状態にある。実際に、腎盂腎炎ラットからの白血球細胞を腎細胞培養物に添加することは、腎細胞において、健康な動物からの白血球との共培養下において観察されるものよりもはるかに著明な酸化ストレスを引き起こした。
【０１１６】
MTAは、in vitroモデルにおいて腎盂腎炎モデルにおける酸化ストレスを予防することにおいて高い効力を示すことから、ラットにおけるAPN下におけるそれらの効果、in vivoラットモデルを研究した。SkQR1を投与されている腎盂腎炎ラットからの白血球において測定されたDCF蛍光により決定されたROS産生は、未処置の動物におけるものよりも低かった（図９Ａ〜９Ｄ）。
【０１１７】
同様に、SkQR1による前処置は、炎症応答において不可欠な役割を果たすTNFαの腎臓組織における濃度を低下させることを見出した（Sanchez-Nino et al. (2010) Mediators Inflamm.）。特に、本発明のAPNのモデルにおいてはTNFαのレベルは対照ラットのものの２倍である一方で、SkQR1処置された腎盂腎炎ラットの腎臓組織におけるそのレベルは、SkQR1を用いないAPNラットにおけるものよりも低かった（図８Ｅ）。これらの細胞におけるIκBのレベルは、未処置の腎盂腎炎ラットにおいてはより低かったが、SkQR1処置ラットにおいてはそうではなかったことから（図１４Ａ）、白血球におけるTNFα産生の活性化は、NF-κB依存的な経路により媒介され得る。
【０１１８】
５．腎盂腎炎の腎組織における抗アポトーシス性Bcl-2の変化
3 Cl-2は、ミトコンドリアにおいて見出される抗アポトーシス性（生存促進性）タンパク質であり、そのレベルは、酸化ストレスの間に低下する。BCl-2の抑制は、ミトコンドリアの透過性のROSへの移行のより低い耐容性を誘導し得、より高い細胞死率をもたらし得る。
【０１１９】
腎盂腎炎の腎臓組織における酸化ストレスおよびその帰結を限定する目的（これは細胞保護戦略の開発として処方されてもよい）を考慮して、腎盂腎炎下におけるアポトーシス性の活性と抗アポトーシス性の活性との間のバランスを評価した。腎臓の尿細管細胞における抗アポトーシス性タンパク質Bcl-2のレベルは、現在のAPNのin vivoモデルにおいては低下する。腎臓の総ホモジェネートにおいて、腎盂腎炎の誘導（これはSkQR1を投与されている腎盂腎炎ラットにおいては不在であった）により、著しくより低いBcl-2レベルが観察された（図１０Ａおよび１０Ｃ）。また、腎盂腎炎の動物の腎臓から単離されたミトコンドリアにおけるBcl-2の含有量は、対照ミトコンドリアにおけるものよりも１．５倍低い（図１０Ａ、１０Ｃ）。Bcl-2についての２６ｋＤにおけるより弱いバンドと平行して、１５ｋＤにおける比較的より強いバンドが、Bcl-2について陽性に染色された。このことは、腎盂腎炎の条件下におけるBcl-2の切断を示唆している。これらの変化は、SkQR1による処置の後で減少した（図１０Ｂ、１０Ｄ）。したがって、酸化ストレスを伴う腎盂腎炎は、ミトコンドリアにおける抗アポトーシス性タンパク質Bcl-2のレベルの著しい抑圧を引き起こし、この効果はSkQR1感受性である。
【０１２０】
６．白血球と腎細胞との細胞間接触の役割
さらに、走査型電子顕微鏡法により、共培養された細胞の形態学を研究した。腎細胞は、本研究において用いられた条件下において半単層を形成するという、上皮細胞に典型的な形態を有した。２４時間の白血球の画分との共培養の後で、幾つかの白血球細胞（それらの形態学によれば単球）が腎細胞に付着しているのを見出した（図１５Ｂ）。これらの単球は、細胞フリーのプラスチックに、または直接的に腎細胞に接着しているようであった。より早期の同じ方法を用いる研究は、白血球と損傷を受けた内皮細胞との相互作用を示した（Galkina et al. (2004) Med. Sci. Monit. 10:BR307-316）。本発明の腎盂腎炎のモデルにおいて、類似の相互作用が起こる。TNF放出が、腎細胞との共培養の後で、活性化された白血球の純粋培養において観察されるものより高いという事実（図１４）は、白血球と腎細胞との間の細胞接触依存的なコミュニケーションの寄与を示唆する。さらに、活性化された白血球は、速やかに死に、死の速度は共培養の条件下において５倍低い（図１６）。
【０１２１】
個々の白血球の（LC）および腎細胞（RTC）を用いる実験により、これら２種の細胞の直接的な接触が、炎症促進性の応答および細胞死を調節するために必要とされるというアイディアについての、さらなる支持が提供された。次の実験のセットにおいて、交換可能な拡散可能な化合物を介するコミュニケーションは許容するが、細胞間の直接的な接触を防止する、０．４μｍの多孔質PET膜（細胞培養インサート、SPL Lifesciences）で、共培養された細胞を分離した。この系において、TNF放出は、空間的に制限されない共培養と比較した場合に、減少する（表１）。
【表１】
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【０１２２】
７．急性腎盂腎炎を有する動物の生存率
本発明のAPNのvivoモデルにおいて、ラットの死亡率は、敗血症の発症に起因してかなり高い（Giamarellos-Bourboulis et al. (2006) Shock 26:410-416）。著しいことに、感染後の初めの２日間の間のSkQR1による処置は、著しくより高い動物生存率をもたらした（図１０）。この結果は、ミトコンドリアのROS産生が、APNに関連する腎臓損傷およびその後の敗血症の死亡率において、重要な役割を果たすことを示す。
【０１２３】
例２
内皮損傷に対するSkQ1の効果
この実験は、炎症のプロセスおよび／または糖尿病の間に起こる内皮損傷を示す。
【０１２４】
高グルコースおよび／または炎症性サイトカインは、酸化ストレスおよび血管の炎症の増大と共に、VE−カドヘリン切断を通して内皮の接触の解体を誘導し、内皮機能不全および多臓器不全すらもたらすことが知られている。
【０１２５】
ヒト内皮細胞株EA.hy926（ATCCコレクション；カタログ番号CRL-2922）を、炎症のプロセスおよび／または糖尿病の間に起こる内皮血管損傷のモデルとして用いた。この細胞株は、初代HUVEC細胞株と類似し（Edgell et al. (1983) PNAS, 80(12):3734-7；Edgell et al. (1990) In Vitro Cell Dev. Biol., 26(12): 1167-72）、炎症の研究のための適切なモデルとして広く用いられている（Riesbeck et al. (1998) Clin. Vaccine Immunol., 5:5675-682）。
【０１２６】
したがって、ヒト内皮細胞EA.hy926を、１０％の胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、２ｎＭおよび２０ｎＭのSkQ1溶液と共に４日間にわたりプレインキュベートした（例１）。細胞を、次いで、１％FBSおよび５ｍＭのＤ−グルコースを含むDMEM培地と共に２日間インキュベートした。細胞を、次いで、４５ｍＭのＤ−グルコースと共に２日間インキュベートし、次いで、VE−カドヘリンのイムノブロット検出のために用いた。
【０１２７】
このアッセイからのデータを、少なくとも３回の別々の実験についての平均として示す。図１７において示すとおり、SkQ1は、SkQ1を用いないビヒクル対照と比較して、高グルコースにより誘導されるVE−カドヘリンの下方調節を防止する。したがって、SkQ1は、内皮細胞をサイトカインの炎症作用に対して保護する有効物質であり、糖尿病および高血糖症を含むグルコース代謝障害、敗血症、外傷、ならびに慢性および急性の炎症性疾患により引き起こされる病理学的状態の予防および処置のために用いることができることが示された。
【０１２８】
例３
組織損傷に対するSkQ1の効果
ヒト好中球を、炎症のプロセスおよび／または外傷の間の組織損傷のモデルとして用いた。
【０１２９】
抗凝固剤処置した健康なドナーの血液から、ヒト好中球を単離した。好中球を、１０％の胎児血清を添加したRPMI-1640培地中の０．２ｎＭ、２ｎＭ、２０ｎＭ、２００ｎＭおよび５００ｎＭのSkQ1溶液と共に、１．５時間にわたり３７℃で５％のＣＯ２中でプレインキュベートした。細胞を、次いで、１ｎＭのＮ−ホルミル−メチオニン−ロイシン−フェニルアラニン（f-MLP）で３０分間刺激した。細胞化の上清を、ザイモグラフィー分析によりMMP-9活性を検出するために用いた（MMP-9放出を用いて組織損傷を推定する）。このアッセイからのデータを、３回の別々の実験についての平均として示した。
【０１３０】
図１８において示すとおり、０．２ｎＭ、２ｎＭおよび２００ｎＭの濃度におけるSkQ1は、SkQ1を用いないビヒクル対照と比較して、f-MLPにより誘導される好中球−MMP-9活性化を防止した。
【０１３１】
したがって、SkQ1は、病原体および／または炎症性サイトカインにより引き起こされる損傷に対してヒト組織を保護することにおいて有効であるので、それはしたがって、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、虚血、急性大動脈解離、腎臓疾患、外傷、敗血症および他の炎症性疾患の予防および処置のために有用である。
【０１３２】
例４
肝炎モデルにおけるMTAの保護的効果
８〜１０週齢の体重８０ｇ〜１２０ｇのWistarラットにおいて、０．９％のＮａＣｌ中の５００ｍｇ／ｋｇのＤ−ガラクトサミンの腹腔内注射により、実験的な肝炎を誘導した。SkQ1を、経管栄養により、水溶液において、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日、５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日、２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日、および１２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の用量において、投与した。これは肝炎の誘導の７日前に開始し、誘導の日に終了した。肝炎の誘導の２４時間後に、動物を安楽死させた。炎症スコアは、各々の動物について、３点スケールにおいて、ヘマトキシリン−エオジン染色された肝臓切片の盲検により推定した。
【０１３３】
図１９において示すとおり、１２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日におけるSkQ1は、炎症スコアを、対照群における中央値２から、中央値１まで減少させた（ｐ＜０．００１）。５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日におけるSkQ1は、炎症スコアを１．５まで減少させた（ｐ＜０．０１）。
【０１３４】
例５
膵炎モデルにおけるMTAの保護的効果
４２個体のWistarラット（週齢：２０〜２５週、体重４００ｇ〜７５０ｇ）を、同じ平均体重により４つの実験群に分配した。SkQ1を、飲料水により、２５０ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日または５０ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ／日の推定投与量により、投与した。単回のアルギニンの腹腔内（ｉｐ）注射（動物の体重１００ｇあたり１００ｍｇ；約２．５ｍｌのリン酸バッファー中２０％のアルギニン溶液）により、急性膵炎を誘導した。
【０１３５】
実験群は、以下の通りであった:（１）無処置（ｎ＝１０）；（２）アルギニンｉｐ注射で処置された対照（ｎ＝１０）；（３）SkQ250〜SkQ1による、２５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日の投与量による９日間にわたる前処置、２４時間にわたるSkQ1処置の継続（ｎ＝１０）；および（4）SkQ50〜SkQ1による、５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ／日の投与量による９日間にわたる前処置。９日目におけるアルギニンのIP注射、２４時間にわたるSkQ1処置の継続（ｎ＝１０）。
【０１３６】
図１９において示す結果は、SkQ1の両方の投与量が、膵臓の重量の増大を予防し、したがって、炎症により引き起こされる浮腫を劇的に軽減したことを示す。
【０１３７】
膵臓ミエロペルオキシダーゼ（MPO）の活性を、また、例１において（腎臓組織について）記載するように測定した。
【０１３８】
結果は、SkQ1処置はMPO活性を（したがって膵臓組織ホモジェネート中の炎症を）著しく低下させたことが示されたことを示す（表２）。
【表２】
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【０１３９】
ラット膵臓試料の病理組織学的検査はまた、SkQ1の有益な効果を明らかにした。膵臓の試料を、１０％ホルマリン中で固定し、次いで、標準的な技術を用いて、５μｍ〜６μｍの切片のエオジン‐ヘマトキシリン染色のために調製した。染色された試料（切片）を、光学顕微鏡下において調べた。
【０１４０】
試料における炎症の強さを、標準的な０〜３の上向きスケールスコアにより測定した。SkQ処置をしていないラットにおける炎症の平均スコアは、２５０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の投与量において1.5.SkQ1であり、炎症平均スコアを０．６まで著しく減少させた（ｐ＜０，０１；Mann-Whitney検定）。結果を表３において示す。
【表３】
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【０１４１】
均等物
当業者は、本明細書において特に記載される特定の態様に対する多数の均等物を、認識するか、または、慣用的な実験のみを用いてこれを確認することができる。かかる均等物は、以下の請求の範囲において包含されることを意図される。
【図１】
0006506177.tif 000046
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
0006506177.tif 000052
【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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