(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子（Ｐ）を製造する方法であって、前記方法は、
ａ．
- 外側表面、孔及び前記孔で規定される被接続内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）であって、少なくとも１種のポリマーを含み及び前記外側表面及び内側表面上に、少なくとも１種の官能基を含む、前記多孔性粒子（Ｐｐ）、並びに
- 表面上に少なくとも１種の官能基を含む磁性粒子（Ｍｐ）であって、全磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、前記多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、磁性粒子（Ｍｐ）
を提供するステップ、並びに、
ｂ．非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の表面上の官能基と、前記磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基とを反応させ、共有結合を形成するステップ
を含み、
前記多孔性粒子（Ｐｐ）の内側表面及び外側表面から選択される少なくとも１種に共有結合する前記磁性粒子（Ｍｐ）で補充される粒子（Ｐ）を得る、方法であって、
磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種の全てを反応させないで、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種との共有結合を形成して、官能基の前記少なくとも１種のある画分が前記磁性粒子（Ｍｐ）及び前記多孔性粒子（Ｐｐ）から選択される少なくとも１種において利用可能なままであり、
磁性粒子（Ｍｐ）のある画分は、多孔性粒子（Ｐｐ）に入る直径を有している、
方法。
【請求項２】
前記多孔性粒子（Ｐｐ）が、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、及びアクリレートからなる群から選択される少なくとも１種の材料を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、前記非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、及びアミドからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、及びシランからなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
磁性粒子（Ｍｐ）の官能基の前記少なくとも１種が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、及びアミドからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記磁性粒子（Ｍｐ）が少なくとも１種のポリマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、及びシランからなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分子相互作用に適合する分子が、多孔性粒子（Ｐｐ）及び磁性粒子（Ｍｐ）からなる群から選択される少なくとも１種に導入される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが官能基の前記少なくとも１種を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
残りの磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の少なくとも１種の反応しない前記画分は、分子と前記磁性粒子（Ｍｐ）とのその後の結合を促進するために反応させられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、並びに
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
ＩＤＡ（イミノジアセテート）、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）、及びＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、及び
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール、チオフェノール、及びメルカプトピリジンからなる群から選択される少なくとも１種の基を含む、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、及び、
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される少なくとも１種を含む、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
外側表面、孔及び前記孔で規定される内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）を含む粒子（Ｐ）であって、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーを含み、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は、それに共有結合する少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）を含み、全磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、粒子（Ｐ）であり、
磁性粒子（Ｍｐ）のある画分は、多孔性粒子（Ｐｐ）に入る直径を有している、
粒子（Ｐ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、一般的に非磁性多孔性粒子が磁性粒子で補充されているクラスターを含む分子及び細胞の分離及び解析に適する磁性粒子の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子及び細胞の分離及び解析技術は、限定されるものではないが、例えば、生物薬剤学、生物工学、食品工学、解析化学、医薬品化学及び浄水などの多くの技術的用途において極めて重要である。例えば、バイオ親和性に基づくクロマトグラフ法が、５０年を超えて使用されている。１つの重要なバイオ親和性システムは、固定化されたプロテインＡであり、それにより、免疫グロブリンは、生体分子特異的に相互作用するであろう。これは、非常に効率的な方法で、モノクローナル抗体を単離することを可能にする。
【０００３】
現在最も頻繁に使用されている分離技術は、分離メディアがシリンダーに充填され、そして対象分子の分離を可能にするクロマトグラフィーシステムに接続している、クロマトグラフ技術である。この技術によるいくつかの不利な点の１つは、プロセス時間である。分離そのものに相当な時間がかかるだけでなく、クロマトグラフィーシステムを準備することも、時間の消費である。器具及び装置は、高価であり、準備するために時間がかかる。更に、システムを扱うこと、及び結果を評価することを可能にするために、専門的知識及び経験が必要である。
【０００４】
代替方法は、存在し、磁性粒子の使用はそれらの１つである。
【０００５】
米国特許出願第６，６２３，６５５は、金属キレート化合物の調製方法を開示する。
【０００６】
Ｚｈａｏ  ａｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００９，９，２９８１−２９８６は、細胞を対象とした区画、及び磁性ナノ粒子の区画を用いた粒子を製造するための技術を記載している。
【０００７】
米国特許出願番号第４，４３８，１７９は、ポリマー粒子表面に結合する磁性粒子を有するポリマー粒子を記載している。磁性材料は、イオン性又は金属キレートもしくは錯体の形成が可能な官能基を含む結合ポリマーの層に結合する。あるいは、磁性材料はポリエチレングリコール及び／又はポリプロピレングリコールによって結合する。
【０００８】
国際公開ＷＯ２０１２／０１５８９１は、粒子表面において、より小さい無機粒子を有する多孔性であってもよい粒子を開示する。粒子は、プリンタのトナー粒子として提供される。
【０００９】
英国特許１５７７９３０は、多孔性ポリマーマトリックスに埋め込まれる吸着粒子及び磁性粒子を開示する。マトリックスの多孔性は、特定の分子量に至る分子のみをマトリックスの裂け目に浸透させるようなものであり、その結果、生成物は溶液から溶けた物質を選択的に吸着する。化合物材料、特に真珠の形状の化合物材料は、特に不必要なわずかな風味を種々の食品から分離する、又はビタミンのような有用な材料を種々の生成物から回収するため、食品業界に特に有用である。特定の用途は、苦いイソフムロンの濃縮イースト抽出物からの除去；及びリボフラビンのホエーからの回収が挙げられる。選択的に吸着された物質を含む粒子は、それらの磁気特性により、媒体から容易に分離されるため、このタイプの先行技術吸着材料で遭遇する分離問題を克服する。吸着粒子は、例えば、炭素、Ａｌ２Ｏ３、シリカゲル、活性ケイ酸マグネシウム、粘土などであってもよい。磁性粒子は、例えば、磁鉄鉱、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライトなどであってもよい。多孔性マトリックスは、例えば、ＰＶＣ、ポリアクリルアミド（任意選択的に、エピクロルヒドリンで架橋される）フェノール樹脂、ＨＣＨＯで架橋されるナイロン−６，６などであってもよい。
【００１０】
米国特許第８，５１８，２６５は磁性粒子、並びに磁性粒子の表面において提供される疎水基及び親水基を含む官能性粉末に関連し、疎水基の数（Ｍ）及び親水基の数（Ｎ）が、０．２〜０．８であるＭ／Ｎの条件を満たす。独立請求項には、不純物が粉末の表面上に吸着するために、そして磁力を用いて水から不純物を吸着する官能粉末を除去するために、不純物を含有する水の中で官能性粉末を分散させる工程を含む水処理方法（例えば、産業的な廃水のような廃水処理）が含まれる。
【００１１】
磁性材料を含む多孔性ポリマー粒子が、例えば種々の物質の精製のために現在使用される。そのような粒子が商業的用途で成功的に使用されていても、改良の余地が残されている。先行技術の粒子において、粒子の磁性材料は、精製又は解析のために使用できる粒子のスペースの重要な部分を占める。
【００１２】
したがって、先行技術においては、増加した担持許容量を有する、精製目的の粒子を提供する必要がある。製造の、及び粒子を使用する際の種々の目的の両方のための単純及び強力な方法も必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
少なくとも先行技術の不利な点のいくらかを軽減し、かつ、材料のために製造方法と同様に改善された材料を分離及び／又は解析に提供することが、発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の様態において、
ａ．外側表面、孔及び前記孔で規定される被接続内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）であって、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーを含み、前記外側表面及び内側表面上に、少なくとも１種の官能基を含む前記多孔性粒子（Ｐｐ）、及び、
表面上に少なくとも１種の官能基を含む磁性粒子（Ｍｐ）であって、全ての前記磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、前記多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、磁性粒子（Ｍｐ）
を提供を提供するステップ、及び、
ｂ．非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の表面上の官能基と、前記磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基とを反応させ、共有結合を形成するステップを含み、
前記多孔性粒子（Ｐｐ）の内側表面及び外側表面から選択される少なくとも１種に共有結合する前記磁性粒子（Ｍｐ）で補充される粒子（Ｐ）を得る、粒子（Ｐ）の製造方法であって、
磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種の全てを反応させないで、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種との共有結合を形成して、官能基の前記少なくとも１種のある画分は、前記磁性粒子（Ｍｐ）及び前記多孔性粒子（Ｐｐ）から選択される少なくとも１種において利用可能なままである、方法が提供される。
【００１５】
第２の様態では、外側表面、孔及び前記孔で規定される内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）を含む粒子（Ｐ）であって、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーを含み、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は、それに共有結合する少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）を含み、前記磁性粒子（Ｍｐ）すべての少なくとも９５重量％の最小直径が、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、粒子（Ｐ）が提供される。
【００１６】
本明細書に記載の態様及び実施形態による粒子（Ｐ）は、既知の磁性粒子と比較して増加した結合許容量を有する。影響を受けず、かつ分離される成分との吸着及び結合反応に利用可能である、多孔性粒子（Ｐｐ）の内側体積の大部分を残しながら、配位子が固定化可能な磁性粒子（Ｍｐ）で補充される粒子（Ｐ）を形成することにより、結合許容量は、維持される、及び／又はむしろ改善される。多孔性粒子（Ｐｐ）が内部の比表面積の大部分を有するため、磁性粒子（Ｍｐ）が小さ過ぎず、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔をブロックしない場合、反応及び／又は吸着許容量は維持されるであろう。
【００１７】
更なる利点は、粒子（Ｐ）を調製する間のすべてのステップが、適度な温度（すなわち約２０〜６０℃）で水性溶液においてでさえ実行するのが容易であることである。
【００１８】
他の利点は、多孔性粒子（Ｐｐ）の表面及び内側の基を含む、反応中に形成された共有結合が、単一の点で付着する分子でさえも、安定であるということである。
【００１９】
重要な利点は、磁性粒子が多孔性粒子に強く結合することであり、それにより、粒子を高い流速に供することを可能にする。粒子の改善された強度は粒子の整合性を維持し、更に粒子を強く磁性表面を接着させ、それにより流動するメディアでも磁性分離を実行することを可能にする。
【００２０】
更に他の利点は、方法が極めて少ないステップで実行できることである。前記方法は、先行技術の方法と比較すると、実施がより容易である。
【００２１】
例えば、表面上の官能基により磁性粒子（Ｍｐ）が結合許容量に寄与できることにより、粒子（Ｐ）の結合許容量が増加することは、利点である。磁性粒子（Ｍｐ）と多孔性粒子（Ｐｐ）との共有結合を作ることに関与しない官能基は、結合許容量を改良するために、このように又は更なる他の分子との反応のいずれかにより、適切に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
態様及び実施形態は、以下の図を参照して説明及び実施例により詳細に記載する。
【００２３】
【図１】図１は、多孔性非磁性粒子（Ｐｐ）と、その表面に分布する複数磁性粒子（Ｍｐ）とを含む粒子（Ｐ）の断面図を示す。この特定の実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、多孔性粒子（Ｐｐ）の内側表面に付着せず、その代わり、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面に付着している。
【００２４】
【図２】図２は、磁性粒子（Ｍｐ）を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）を含む同様の粒子（Ｐ）であって、多孔性粒子の孔の直径に対するサイズに応じて、前記粒子の中に大なり小なり侵入した粒子（Ｐ）の断面図を示す。この特定の実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、多孔性粒子（Ｐｐ）の内側表面及び外側表面に付着している。
【００２５】
【図３】図３は、エポキシド活性化アガロース６Ｂと、１０μｍ、５μｍ及び２μｍのサイズを有するチオラート化Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｍ  ＮＨ２粒子との反応の結果として得られる、表面に結合したより小さい磁性粒子を有する多孔性粒子としてのアガロースビーズの光学顕微鏡画像を示す。
【００２６】
【図４】図４は、エポキシド活性化アガロース６Ｂと２μｍのＭｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｍ  ＮＨ２粒子との反応の結果として得られる磁性アガロース磁性アガロース粒子の光学顕微鏡画像を示す。
【００２７】
【図５】図５は、永久立方体磁石を用いることによる、磁性アガロース４Ｂ粒子の分離の画像を示す。
【００２８】
【図６】図６は、プロテインＡ官能化された磁性アガロース４Ｂ及び６Ｂ粒子並びにＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いることによる、ヒト血清からＩｇＧを精製するための還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像を示す。レーン１：タンパク質分子量標識；レーン２：精製前のヒト血清；レーン３〜４：プロテインＡ磁性アガロース６Ｂ粒子からの溶出画分；レーン５〜７：プロテインＡ磁性アガロース４Ｂ粒子からの溶出画分；レーン８：プロテインＡ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）からの溶出画分；レーン９〜１０：９８％の純度のヒトＩｇＧ１０及び２０μｇ。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
種々の態様及び実施形態を詳細に説明する前に、この記載は本明細書に記載の特定の化合物、構成、方法ステップ、基質及び材料に限定されず、そのような化合物、構成、方法ステップ、基質、材料は変わり得る。本明細書で使用されている専門用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定する意図はなく、当該実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物のみによって限定されることを理解すべきである。
【００３０】
本願明細書及び添付の請求項にて用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、前後関係で明確に指示しない限り、複数の参照物を含むことに留意する必要がある。
【００３１】
また、用語「約」は、該当する場合、数値の±１０％、及び最も好ましくは±５％の偏差を示すために使用される。
【００３２】
特に定義のない場合、本願明細書において使用されるいかなる用語を含む科学的専門用語は、本開示に関連する当業者により一般に理解される意味を有することを意図する。
【００３３】
明細書及び請求の範囲の全体を通じて使用されるように、球体の直径は、球体の中心及び球体に存在する終点を通過する、直線である。
【００３４】
発明者は広範囲な調査を実施し、特許請求の範囲で定義した粒子（Ｐ）が、高収率で容易に形成すること、及び容易に分離することを見出した。生体分子をクラスターに結合させ、生体分子をクラスターから分離する許容量は、当該技術分野による対応する粒子のいかなる発表されたデータよりも高いことが見いだされた。
【００３５】
実施形態による形成された粒子（Ｐ）は、磁性であり、生体分子の分離のための方法で使用するのが容易である。それらの有用性は、少量及び大量用途において等しく高い。固定化した分子及び／又は細胞を伴う粒子は、外部の磁石を使用して、容易に分離される。磁性粒子（Ｍｐ）が粒子（Ｐ）に付加的な密度を与えるにつれて、分離は遠心によって、又は、重力を使用する静的固定によって補助されることができる。密度に基づく分離は、予備分離ステップとして及び／又は磁気分離の一部として使われることができる。
【００３６】
第１の様態において、
ａ．
- 外側表面、孔及び前記孔で規定される被接続内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）であって、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーを含み、前記外側表面及び内側表面上に、少なくとも１種の官能基を含む前記多孔性粒子（Ｐｐ）、及び、
- 表面上に少なくとも１種の官能基を含む磁性粒子（Ｍｐ）であって、全ての前記磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、前記多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、磁性粒子（Ｍｐ）
を提供するステップ、及び、
ｂ．非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の表面上の官能基と、前記磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基とを反応させ、共有結合を形成するステップを含み、
前記多孔性粒子（Ｐｐ）の内側表面及び外側表面から選択される少なくとも１種に共有結合する前記磁性粒子（Ｍｐ）で補充される粒子（Ｐ）を得る、粒子（Ｐ）の製造方法であって、
前記磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種の全てを反応させないで、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種との共有結合を形成して、官能基の前記少なくともある１種の画分は、前記磁性粒子（Ｍｐ）及び前記多孔性粒子（Ｐｐ）から選択される少なくとも１種において利用可能なままである、方法が提供される。
【００３７】
ある実施形態において、すべての磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、多孔性粒子（Ｐｐ）のすべての孔の少なくとも９５重量％の最大直径よりも大きい。
【００３８】
すべての磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径は、すべての磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％のすべてのとりうる直径の最小のものを記載する。重量パーセント及び数ではないものは、非常に小さい粒子の相対的な重量を低減するために使用される。
【００３９】
多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径は、見かけの孔の寸法（更に詳細にはＨａｇｅｌ、Ｏｓｔｂｅｒｇ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ＡのＪｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌｕｍｅ７４３、ｉｓｓｕｅ１、１９９６年８月３０日、３３〜４２ページにあるように）として、測定及び定義される。いくつかの商業的に入手可能なポリマーのデータも存在する。例えば６％アガロースの平均（又は見かけの）の孔の直径は、２４ｎｍである。
【００４０】
すべての磁性粒子（Ｍｐ）のほとんどすべて（少なくとも９５重量％）で最小直径が、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径より大きい場合、磁性粒子はある程度、しかし磁性粒子（Ｍｐ）が多孔性粒子（Ｐｐ）の許容量をブロックするほど大きくない程度に、多孔性粒子（Ｐｐ）に侵入することができる。磁性粒子（Ｍｐ）が多孔性粒子（Ｐｐ）に侵入することを、ある程度可能とすることにより、磁性粒子（Ｍｐ）が、表面に利用可能な官能基（直接的に又は他の分子を結合する更なる反応により結合許容量を増加することに利用可能な官能基）を有するため、粒子（Ｐ）の全結合許容量は実際増加する。磁性粒子（Ｍｐ）の画分を侵入させることにより、磁性材料の担持は、粒子の中で増加し、それにより粒子（Ｐ）が分離においてより有用になる。これは粒子がより多くの磁性材料を有する場合、分離が早いためである。
【００４１】
多くの用途において、特に分離において、高磁気モーメントが粒子に要求される。また、粒子Ｐの結合許容量は高い必要がある。これが解析され、磁性粒子（Ｍｐ）が官能基により誘導体化することが可能になり、磁性粒子が粒子（Ｐ）の全結合許容量に寄与する。粒子（Ｐ）の結合許容量及び、磁気モーメントの両方は、いくつかの若干の磁性粒子（Ｍｐ）を多孔性粒子（Ｐｐ）に侵入させることにより、及び、粒子（Ｐ）の全結合許容量に寄与する官能基によって磁性粒子（Ｍｐ）を誘導体化することにより、最大化される。
【００４２】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は２０ｎｍ、又はそれより大きい。ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は４μｍ、又はそれより小さい。代替的な実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、１００ｎｍ、又はそれより小さい。ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）の安定コロイドは、製造方法の間、利用される。磁性粒子（Ｍｐ）がクラスターを形成する場合、個々の磁性粒子（Ｍｐ）の直径は、使用され、全クラスターの最大直径は相当大きくなることができる。
【００４３】
たとえ製造プロセスが満足である場合でも、実用的な製造プロセスで意図されたサイズよりも大きい又は小さいサイズの粒子がいくつか存在する可能性があると理解される。
【００４４】
代替的な実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）の最小直径は、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径と等しい又はそれよりも小さい。本実施例において、磁性粒子の少なくとも一部は、多孔性粒子の孔に侵入する。孔のサイズに関連して磁気要素のサイズを選択することにより、磁性担持は、要望通り適合可能である。
【００４５】
磁性粒子（Ｍｐ）の最小直径は、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径（見かけの直径）よりも大きい。磁性粒子（Ｍｐ）の最小直径が、磁性粒子（Ｍｐ）の実質的にすべて（少なくとも９５重量％）の最小直径を意味することが意図される。ここで、最小直径は、粒子のサイズが最小である寸法で測定される。そのような代替的な実施形態において、実質的にすべての磁性粒子（Ｍｐ）は、多孔性粒子の平均的な孔に侵入するにはあまりに大きい。孔のサイズを変えることができ、特定のサイズ分布を有するであろうと理解され、そのような実施形態において、いくつかの孔は磁性粒子（Ｍｐ）に到達することが可能である。
【００４６】
別の代替的な実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）の最小直径は、多孔性粒子（Ｐｐ）のすべての孔の直径より大きい。そのような実施形態において、孔は磁性粒子（Ｍｐ）に到達することが不可能である。
【００４７】
いくつかの特徴的な用途には、磁性粒子（Ｍｐ）が多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面のみに存在することが望まれる。
【００４８】
ある実施形態によると、多孔性粒子（Ｐｐ）は実質的に球形であるが、他の形状も包含され、多孔性粒子（Ｐｐ）はいかなる特定の形状に限定されない。すべての形状は、本願明細書において示される実施形態の範囲内に含有される。磁性粒子（Ｍｐ）も同様とする。
【００４９】
球状又は実質的に球状の粒子について、通常の定義に従い、直径を決定することは容易である。完全に球状の粒子については、最小及び最大直径は等しい。しかし変則的な形状の粒子、すなわち非球状の粒子については、直径は、質量中心を通して、表面のあるポイントから、表面の他のポイントまで多くの異なる方向において測定することができる。そのようなある直径は、変則的な粒子では最小であり、そしてそのようなある直径は最大である。球体の質量中心は、球体が均一であれば、球体の中心である。球体では、直径は球体の中心を通過する必要がある。
【００５０】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、アクリレート及びそれらの誘導体からなる群から選択される材料を含む。
【００５１】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する。
【００５２】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種は、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、及びアミドからなる群から選択される。
【００５３】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基は、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む。
【００５４】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基は、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、及びアミドからなる群から選択される少なくとも１種である。
【００５５】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種及び磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種から選択される少なくとも１種は、複合結合基を含む。ある実施形態において、複合結合基は、ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基である。これらの複合結合構造は、例えばヒスチジンを含むペプチド鎖と次々に相互作用可能な金属イオンと結合できる。ヒスチジン鎖又はタグを含む抗体が精製されうる場合、そのような基は使用に適する。
【００５６】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種及び磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種から選択される少なくとも１種は、疎水基を含む。ある実施形態において、疎水基は、ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１種である。前記粒子が疎水性クロマトグラフィーに類似する用途で使用される場合、そのような疎水基が適切である。ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）は、限定されないがアルカンＣｎＨ２ｎ＋２を含む多くの異なる有機化合物の一般式である。
【００５７】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種及び磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種から選択される少なくも１種は、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピル及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む。
【００５８】
ある実施形態において、前記磁性粒子（Ｍｐ）は、少なくとも１種のポリマーを含む。
【００５９】
ある実施形態において、残りの磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の少なくとも１種の反応しない前記画分は、分子と前記磁性粒子（Ｍｐ）との次の結合を促進するために反応する。多孔性粒子（Ｐｐ）に共有結合を形成するために反応を起こさなかった官能基は、多孔性粒子（Ｐｐ）と同様に磁性粒子（Ｍｐ）に結合を提供することにより選択された物質のための粒子（Ｐ）の結合許容量を増加するために適切に利用される。ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）のすべての官能基も反応を起こさず、粒子（Ｐ）の全結合許容量を増加させるために同様に利用できる。
【００６０】
ある実施形態において、官能基の少なくとも２５％は、反応しないままである。代替的な実施形態において、官能基の少なくとも５０％は、反応しないままである。別の他の代替的な実施形態において、官能基の少なくとも７５％は、反応しないままである。
【００６１】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基は、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種を含む。
【００６２】
ある実施形態において、分子相互作用に適合する分子は、多孔性粒子（Ｐｐ）、又は磁性粒子（Ｍｐ）のいずれか、又はその両方に導入される。
【００６３】
ある実施形態において、分子相互作用に適合する分子は、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００６４】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが官能基を含む。
【００６５】
ある実施形態によると、磁性粒子（Ｍｐ）は、磁性金属、磁性金属合金、及び磁性酸化物、又はそれらの組み合わせから選択される少なくとも１種の磁性材料を含む。非限定的な例として、鉄、ニッケル、コバルト、ガドリニウム、ネオジム及びサマリウムならびにそれらの酸化物及び合金が挙げられる。代替的な実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、鉄、ニッケル、コバルト、並びにそれらの酸化物及び合金から選択される少なくとも１種の磁性材料を含む。他の実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、鉄、ニッケル、コバルト、ガドリニウム、ネオジム、並びにサマリウム及びそれらの酸化物及び合金から選択される少なくとも１種の磁性材料を含む。
【００６６】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する。したがって、磁性粒子（Ｍｐ）は、全粒子（Ｐ）の密度を増加させることに使用できる。重力又は遠心分離が、プロセスの間、粒子分離（Ｓｐ）のために使用すべき場合、これは有用であり得る。
【００６７】
第２の態様において、外側表面、孔及び前記孔で規定される内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）を含む粒子（Ｐ）であって、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーを含み、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は、それに共有結合する少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）を含み、前記磁性粒子（Ｍｐ）全ての少なくとも９５重量％の最小直径が、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、粒子（Ｐ）が提供される。
【００６８】
第２の態様のある実施形態において、全磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径は、多孔性粒子（Ｐｐ）の全孔の少なくとも９５％の最大直径よりも大きい。
【００６９】
第２の態様のある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、アクリレート及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の材料を含む。
【００７０】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）の直径は４０〜１５０μｍの範囲である。代替的な実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）の直径は１０〜２５０μｍの範囲である。非球状の粒子においては、直径は最大直径と定義される。ある実施形態において、すべての粒子の９５重量％超が直径範囲内であり、その範囲の上限及び下限が、１０％を超えて異ならないため、多孔性粒子（Ｐｐ）のサイズのサイズ分布は狭い。
【００７１】
第２の態様のある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する。
【００７２】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は酸化鉄とコバルトから選択される少なくとも１種を含む。ある実施形態において磁性粒子（Ｍｐ）はＦｅＣｏ合金を含む。
【００７３】
第２の態様のある実施形態において、前記多孔性粒子（Ｐｐ）及び前記少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）からなる群から選択される少なくとも１種は、分子相互作用に適合する分子を含む。
【００７４】
第２の態様のある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが官能基の少なくとも１種を含む。
【００７５】
第２の態様のある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、少なくとも１種のポリマーを含む。
【００７６】
磁性粒子（Ｍｐ）上の化学基及び非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の化学基は、磁性粒子（Ｍｐ）上の化学基及び非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）上の化学基の間の反応を可能にするため、適合される。したがって、他の官能基との反応に適するある官能基は、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）と付着可能であり、適切な対応する官能基は磁性粒子（Ｍｐ）と付着可能である。ある官能基は、それが反応可能な他の粒子上の適切な官能基がある限り、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）又は磁性粒子（Ｍｐ）のどちらか１つと付着結合可能である。ある実施形態において、異なるいくつかの化学基は、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）に付着し、対応する異なるタイプの適切な官能基は、多孔性粒子（Ｐｐ）の異なった官能基に付着する。
【００７７】
分子を粒子（Ｐ）に結合させる１つの方法は、米国特許第５，９４２，４６３号に記載される方法である。
【００７８】
第１の態様のある実施形態において、分子相互作用に適合する分子は、多孔性粒子（Ｐｐ）、及び磁性粒子（Ｍｐ）からなる群から選択される少なくとも１種に導入される。第１の態様のある実施形態において、分子相互作用に適合する前記分子は、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００７９】
第１の態様のある実施形態において、検出に適合する分子は、多孔性粒子（Ｐｐ）及び磁性粒子（Ｍｐ）からなる群から選択される少なくとも１種に導入される。第１の態様のある実施形態において、検出に適合する分子は、有機分子、タンパク質、核酸及びレクチンからなる群から選択される少なくとも１種である。
【００８０】
第１の態様のある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが官能基の少なくとも１種を含む。
【００８１】
第２の態様のある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む。
【００８２】
磁性粒子（Ｍｐ）は、少なくとも１種の磁性材料を含むものであり、例えば、これらに限定しないが、磁性金属、磁性金属合金及び磁性酸化物又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８３】
ある実施形態において、磁性粒子（Ｍｐ）は、非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する。密度は、ＩＳＯ  １１８３−１：２０１２に従って測定される。
【００８４】
ある実施形態において、前記多孔性粒子（Ｐｐ）の少なくとも１種及び前記少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）は、分子相互作用に適合する分子を含む。相互作用に適合する分子は、例えば、これに限定されるものではないが、他の分子を用いて結合を形成することを含む手段によって、他の分子と相互作用する許容量を有する分子である。
【００８５】
ある実施形態において、前記多孔性粒子（Ｐｐ）の少なくとも１種及び／又は前記少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）は、検出に適合する分子を含む。
【００８６】
ある実施形態において、検出に適合する前記分子は、有機分子、核酸、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、複合糖質、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。検出に適合する分子は、いかなる手段によっても検出可能な分子である。例えば、少なくとも１種の特定の波長の光を放射する分子が挙げられる。
【００８７】
ある実施形態において、磁性粒子が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の材料の粒子を含み、ポリマーマトリックスが官能基を含む。磁性粒子（Ｍｐ）の材料の例としては、これらに限定されるわけではないが、鉄、コバルト及びそれらの酸化物の、磁性金属、磁性金属合金、及び磁性酸化物が挙げられる。
【００８８】
ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）は磁性粒子（Ｍｐ）よりも非常に大きく、ある実施形態において、多孔性粒子（Ｐｐ）は、参照されたサイズの磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍である。非球状の粒子については、最小直径が使用される。
【００８９】
ある実施形態によると、粒子（Ｐ）は、クロマトグラフィー分離メディアである。クロマトグラフィーのカラムにおいて、クロマトグラフィーメディアは、多数の粒子（Ｐ）を含み、従来のクロマトグラフィーメディアとして利用することができる。
【００９０】
本明細書は、第２の態様において記載されるように、粒子（Ｐ）の使用を含む分析の実行のための方法も提供される。前記方法は以下のステップを含む：ａ）解析される少なくとも１つの解析物を有する粒子（Ｐ）を含むステップ、ｂ）ｉ）磁場、ｉｉ）重力、及びｉｉｉ）遠心分離からなる群から選択される少なくとも１種に粒子（Ｐ）を曝露するステップ、並びにｃ）粒子（Ｐ）から検出可能な信号を読むステップ。
【００９１】
分離は、磁場、又は密度の差の利用の両方により、実行可能である。ある実施形態において、磁性粒子は磁性があり、高密度を有し、それにより磁場に基づく分離及び／又は密度の差に基づく分離が使用可能である。密度に基づく分離は、遠心分離及び／又は重力への暴露を含む。重力への暴露は、より高密度な粒子が沈殿するように、試料を単に静置させることである。
【実施例】
【００９２】
例１  エポキシド活性化アガロース粒子の調製
アガロース６Ｂ、アガロースＣＬ６Ｂ、アガロース４Ｂ及びアガロースＣＬ４Ｂを、以下の通りにエポキシド基とともに別々に活性化した。アガロースゲルをガラスフィルター上で蒸留水により洗浄し、吸引乾燥した。約３ｇの乾燥アガロースゲル粒子を、２．４ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液中で懸濁させ、エピクロルヒドリン０．４５ｍｌを、室温、攪拌下で、滴下した。温度を６０℃に上昇させ、２時間維持した。エポキシド活性化アガロースゲルを、焼結フィルター漏斗（Ｐｏｒ３）上で中性になるまで、蒸留水を用いて洗浄し、最終的に蒸留水中で再懸濁した。５０％ゲル濃度であった。生成物は、多孔性粒子（Ｐｐ）の例を構成する。平均見かけの孔半径は、約２４〜４５ｎｍである。
【００９３】
例２  エポキシド活性化アガロース粒子の外側部上の磁性粒子の共有結合固定化
３０ｎｍ〜１０μｍのサイズにおけるアミノ（ＮＨ２）官能性を有する商業的に入手可能な磁性ナノ−及びマイクロ粒子を、磁性材料として、調査において使用した。これらの粒子は、磁性粒子（Ｍｐ）の例である。
【００９４】
磁性粒子（Ｍｐ）は、以下の通りに、多孔性エポキシド活性化アガロース粒子（Ｐｐ）に、通常通り共有結合した。Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｋｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨのチオラート化Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）−Ｍ−ＮＨ２（２５０μＬ、７×１０８粒子／ｍｌ）を、１０００μＬのＰＢＳ（１５ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて２回洗浄し、１０００μＬのＰＢＳ中で、再懸濁した。エポキシド活性化アガロース粒子（１ｍｌの固定化したゲル）を、１０ｍｌの０．０１ＭのＮａＯＨ溶液中で再懸濁し、磁性粒子懸濁液に加え、室温で１２時間、ボルテックスにおいて反応させた。
アミノ官能性による過剰な磁性粒子を、焼結フィルター漏斗上で、５０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４を用いて除去し、磁性粒子で装飾したアガロース粒子を有する溶液をもたらした。図３及び図４は磁性粒子で装飾したアガロース６Ｂ粒子を示す。これは、粒子（Ｐ）を構成する。
【００９５】
例３  磁性粒子（Ｐ）の磁気分離
１０００μｌのＰＢＳ中で懸濁した約５０μｌの固定化磁性粒子（Ｐ）を、２ｍｌのバイアルへ移した。バイアルをボルテックスし、永久立方体磁石に曝露した。１秒以内に、磁性アガロース６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４Ｂ及びＣＬ４Ｂ粒子は、永久立方体磁石に隣接するバイアル壁に付着した。磁性アガロース４Ｂ粒子について、磁気分離を、図５に示す。
【００９６】
例４  磁性アガロース粒子に対してのチオール化プロテインＡの固定化
約６０μｌの固定化磁性アガロース６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４Ｂ及びＣＬ４Ｂ粒子を、１．５ｍｌのエッペンドルフ管に、ピペットで取った。磁性アガロース粒子は永久磁石によってエッペンドルフ管の壁に付着し、溶液を除去し、粒子をチオール化プロテインＡ（１５ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ８  １ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌの溶液中で再懸濁した。室温で穏やかな混合による１時間の反応後、永久磁石により溶液から、粒子の分離を用いて、上清を収集した。上清中のプロテインＡの内容物を、Ｕｖ／Ｖｉｓ分光法を用いて、２８０ｎｍ（Ａ２８０ｎｍ）にける吸光度を測定することにより、評価した。（磁性アガロース４Ｂ粒子との反応については、表１参照）
【表１】
0006452704.tif 000002
【００９７】
６０μｍ磁性アガロース４Ｂ粒子上のタンパク質プロテインＡの含有量を、上清（０．６ｍｇ／ｍｌ）中のプロテインＡの含有量を、添加プロテインＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の含有量から減算することにより決定した。プロテインＡのリガンド濃度が、およそ６．５ｍｇ／ｍｌの固定化磁性アガロース４Ｂ粒子であることを決定した。
【００９８】
例５  プロテインＡ磁性アガロース粒子を用いたヒトＩｇＧの捕獲
０．５ｍｌのＰＢＳ中の、約５０μｌの固定化プロテインＡ磁性アガロース６Ｂ、ＣＬ６Ｂ、４Ｂ及びＣＬ４Ｂ粒子を２ｍｌのバイアルへ移行し、１．０ｍｌのＰＢＳを用いて、磁石を使用し、更に２回洗浄し、結合していないプロテインＡ及び貯蔵溶液を除去した。プロテインＡ磁性アガロース粒子を、ヒトＩｇＧ（２ｍｇ／ｍｌ）の１．０ｍｌ溶液中で再懸濁し、６０分間室温において、回転撹拌混合により反応させた。そして上清を、永久磁石を用いて溶液から粒子を分離することにより収集し、Ｕｖ／Ｖｉｓ分光法を用いて２８０ｎｍで、ＩｇＧ定量化（ＩｇＧ結合許容量）のために貯蔵した。そして磁性アガロース粒子を１．０ｍｌのＰＢＳを用いて２回洗浄し、結合していないタンパク質及び不純物を除去した。そしてヒトＩｇＧが捕獲されたプロテインＡを、５００μｌのクエン酸塩溶液（６０ｍＭ、ｐＨ３．０）を加えることにより、磁性アガロース粒子から溶出した。１５分間室温でボルテックスをした後、溶出画分を収集し、５００μｌのＰＢＳで希釈し、Ｕｖ／Ｖｉｓ分光法を用いて２８０ｎｍで、ＩｇＧ定量化（回収）のために貯蔵した（表２参照）。２８０ｎｍにおいてヒトＩｇＧのための吸光度を、１．０ｍｇ／ｍｌで１．３８に設定した。
【表２】
0006452704.tif 000003
【００９９】
ヒトＩｇＧに対する磁性粒子１ｍｌ当たりの許容量を、およそ以下の通りであると決定した：
・１８ｍｇ／ｍｌの固定化プロテインＡ磁性アガロース６Ｂ粒子
・１６ｍｇ／ｍｌの固定化プロテインＡ磁性アガロースＣＬ６Ｂ粒子
・３４ｍｇ／ｍｌの固定化プロテインＡ磁性アガロース４Ｂ粒子
・３０ｍｇ／ｍｌの固定化プロテインＡ磁性アガロースＣＬ４Ｂ粒子
著者の知る限り、プロテインＡ磁性アガロース４Ｂ及びＣＬ４Ｂ粒子についてのＩｇＧ結合許容量は、いかなる磁性粒子の中でも最も利用可能なものである。
【０１００】
例６  プロテインＡ磁性アガロース粒子を用いたヒト血清からのＩｇＧの主精製
プロテインＡ磁性アガロース６Ｂ及び４Ｂ粒子を用いたヒト血清からのＩｇＧの精製を、従来の固定化磁性粒子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡと比較した。５００μｌの１０％のプロテインＡ磁性アガロース６Ｂ及び４Ｂ粒子溶液（５０μｌ粒子）及び５００μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡ溶液を、以下のように平行して試験した。５００μｌのプロテインＡ磁性粒子を、１．５ｍｌのマイクロ遠心管に加えた。貯蔵溶液を、磁気分離により除去した。磁性粒子を、１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。懸濁液を、磁気分離により除去した。磁性粒子を、５００μｌのＰＢＳで再懸濁した。
【０１０１】
３５０μｌのヒト血清を、５００μｌの磁性粒子懸濁液を含むマイクロ遠心分離機管に加え、混合物を室温で穏やかに６０分間混合し、プロテインＡ磁性粒子にＩｇＧの捕獲を可能にさせた。
【０１０２】
粒子を、１ｍｌのＰＢＳで、磁気分離を使用し、３回洗浄し、結合していないタンパク質と不純物を除去した。
【０１０３】
ＰＢＳ懸濁液を、磁気分離により粒子から除去した。５００μｌの溶離緩衝剤（６０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ３．０）を粒子に加え、混合物を室温で１５分間混合し、プロテインＡ磁性粒子からＩｇＧの溶出を可能にした。溶出画分を磁気分離により収集し、７０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和した。溶出液を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）還元条件により分解した（図６参照）。
【０１０４】
結果は、プロテインＡ磁性アガロース粒子（図６のレーン３〜７）が、抗体収率の手段においてＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）相対物（図６のレーン８）を明らかに上回ったことを示す。すべての画分は、９８％純粋なヒトＩｇＧ（図６のレーン９〜１０）と比較して、高い特定の精製を示す。ＩｇＧ結合許容量の従来の結果に従い、プロテインＡ磁性アガロース４Ｂ（図６のレーン３〜５）は、プロテインＡ磁性アガロース６Ｂ粒子（レーン６〜７）よりも高い収率を示す。約２ｍｇのヒトＩｇＧを、プロテインＡ磁性アガロース４Ｂ粒子を使用する各溶出画分において、定量化した。
特許請求の範囲
［請求項１］
粒子（Ｐ）を製造する方法であって、前記方法は、
ａ．
- 外側表面、孔及び前記孔で規定される被接続内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）であって、少なくとも１種のポリマーを含み及び前記外側表面及び内側表面上に、少なくとも１種の官能基を含む、前記多孔性粒子（Ｐｐ）、並びに
- 表面上に少なくとも１種の官能基を含む磁性粒子（Ｍｐ）であって、全磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、前記多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、磁性粒子（Ｍｐ）
を提供するステップ、並びに、
ｂ．非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の表面上の官能基と、前記磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基とを反応させ、共有結合を形成するステップ
を含み、
前記多孔性粒子（Ｐｐ）の内側表面及び外側表面から選択される少なくとも１種に共有結合する前記磁性粒子（Ｍｐ）で補充される粒子（Ｐ）を得る、方法であって、
磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種の全てを反応させないで、多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種との共有結合を形成して、官能基の前記少なくとも１種のある画分が前記磁性粒子（Ｍｐ）及び前記多孔性粒子（Ｐｐ）から選択される少なくとも１種において利用可能なままである、
方法。
［請求項２］
前記多孔性粒子（Ｐｐ）が、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、アクリレート及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の材料を含む、請求項２に記載の方法。
［請求項３］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、前記非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する、請求項１又は２に記載の方法。
［請求項４］
多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、及びアミドからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］
多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］
磁性粒子（Ｍｐ）の官能基の前記少なくとも１種が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、及びアミドからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項７］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が少なくとも１種のポリマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項８］
磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の前記少なくとも１種が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項９］
分子相互作用に適合する分子が、多孔性粒子（Ｐｐ）及び磁性粒子（Ｍｐ）からなる群から選択される少なくとも１種に導入される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
分子相互作用に適合する前記分子が、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
［請求項１１］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが官能基の前記少なくとも１種を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１２］
残りの磁性粒子（Ｍｐ）の表面上の官能基の少なくとも１種の反応しない前記画分は、分子と前記磁性粒子（Ｍｐ）とのその後の結合を促進するために反応させられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、並びに
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１４］
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、及び
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１５］
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、及び、
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピル及びその誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１６］
外側表面、孔及び前記孔で規定される内側表面を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）を含む粒子（Ｐ）であって、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーを含み、前記多孔性粒子（Ｐｐ）は、それに共有結合する少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）を含み、全磁性粒子（Ｍｐ）の少なくとも９５重量％の最小直径が、多孔性粒子（Ｐｐ）の孔の平均直径よりも大きい、粒子（Ｐ）。
［請求項１７］
前記多孔性粒子（Ｐｐ）が、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、アクリレート及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の材料を含む、請求項１６に記載の粒子（Ｐ）。
［請求項１８］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、前記非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）の密度よりも高い密度を有する、請求項１６又は１７に記載の粒子（Ｐ）。
［請求項１９］
前記多孔性粒子（Ｐｐ）及び前記少なくとも１種の磁性粒子（Ｍｐ）からなる群から選択される少なくとも１種が、分子相互作用に適合する分子を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の粒子（Ｐ）。
［請求項２０］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが、前記官能基を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の粒子（Ｐ）。
［請求項２１］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、少なくとも１種のポリマーを含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の粒子。
［請求項２２］
前記磁性粒子（Ｍｐ）が、酸化鉄及びコバルトからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の粒子。
［請求項２３］
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、並びに、
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）上の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む、
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の粒子。
［請求項２４］
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、並びに
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びそれらの誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及びその誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む、
請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の粒子。
［請求項２５］
ａ）多孔性粒子（Ｐｐ）の外側表面及び内側表面上の官能基の前記少なくとも１種、並びに
ｂ）磁性粒子（Ｍｐ）の官能基の前記少なくとも１種
から選択される少なくとも１種が、
アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピル、並びにそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む、
請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の粒子。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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