(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さいＩＬ−２ムテインであって、
Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ及びＳ１３０Ｒのアミノ酸置換を含む、ＩＬ−２ムテイン。
【請求項２】
ＩＬ−２Ｒβ＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力が、野生型ｈＩＬ−２と比較して、低減している、請求項１に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項４】
ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を刺激する能力が、野生型ｈＩＬ−２と比較して、低減している、請求項１に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項５】
ＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５アンタゴニストである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５  ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害剤である、請求項５に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５誘導性増殖の阻害剤である、請求項５に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項８】
ＩＬ−２依存性ＴＣＲ誘導性細胞増殖の阻害剤である、請求項５に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項９】
ＩＬ−２依存性Ｔｈ１、Ｔｈ９、及び／またはＴｒｅｇ分化の阻害剤である、請求項５に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項１０】
Ｔｈ１７分化のプロモーターである、請求項５に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項１１】
ＮＫ細胞のＩＬ−２依存性活性化の阻害剤である、請求項５に記載のＩＬ−２ムテイン。
【請求項１２】
ヒトＦｃ抗体フラグメントに連結する、請求項１に記載のＩＬ−２ムテインを含むＩＬ−２ムテイン融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１に記載のＩＬ−２ムテイン、または、請求項１２に記載のＩＬ−２ムテイン融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療するための医薬組成物であって、請求項１に記載のＩＬ−２ムテイン、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
成人Ｔ細胞白血病を治療するための医薬組成物であって、請求項１に記載のＩＬ−２ムテイン、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載のＩＬ−２ムテイン、及び異種ポリペプチドを含む、ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された助成金番号第ＡＩ０５１３２１号及び同第ＤＫ０９４５４１号のもとに、米国政府の支援で行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、正常な免疫応答をもたらすことにおいて重要な役割を果たす、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞により主に産生される多能性サイトカインである。ＩＬ−２は、活性化Ｔリンパ球の増殖及び拡張を促進し、Ｂ細胞の成長を強化し、単球及びナチュラルキラー細胞を活性化する。ＩＬ−２が試験され、癌の承認治療薬（アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））として使用されることは、これらの活性のおかげである。
【０００３】
真核細胞において、ヒトＩＬ−２は、１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、これから２０アミノ酸が除去されて、成熟分泌型ＩＬ−２を生じる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  １９８３）。組換えヒトＩＬ−２は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  １９８４）、昆虫細胞（Ｓｍｉｔｈ  １９８５）、及び哺乳類のＣＯＳ細胞（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  １９８３）で産生されている。
【０００４】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔ細胞の成長因子として最初に同定され（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：  １００７  （１９７６））、その後、幅広い作用を有することが示された、４つのαヘリックスバンドルＩ型サイトカインである。ＩＬ−２は、Ｔヘルパーの分化（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４４５（２０１０）；Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１２８８（２００８）；及びＬｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：５５１  （２０１１））、ならびに、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の成長（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４１：６３（２０１１））を促進し、ナチュラルキラー及びリンホカイン活性化キラー活性を誘導し（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：１３（２０１３））、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を媒介する（Ｌｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８５８（１９９１））。
【０００５】
ＩＬ−２は、３つの異なる受容体：インターロイキン−２受容体α（ＩＬ−２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン−２受容体β（ＩＬ−２Ｒβ；ＣＤ１２２）、及びインターロイキン−２受容体γ（ＩＬ−２Ｒγ；ＣＤ１３２；共通γ鎖）と相互作用することにより機能する。同定される最初の受容体は、ＩＬ−２Ｒαであった。これは、Ｔ細胞活性化の際に現れ、元々（Ｔ活性化（Ｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の代わりに）Ｔａｃ抗原と呼ばれていた、５５ｋＤポリペプチド（ｐ５５）である。ＩＬ−２Ｒαは、約１０−８ＭのＫｄで、ＩＬ−２と結合し、「低親和性」ＩＬ−２受容体としても知られている。ＩＬ−２の、ＩＬ−２Ｒαのみを発現する細胞への結合は、任意の検出可能な生物学的応答をもたらさない。
【０００６】
ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒβ及び共通サイトカイン受容体γ鎖であるγｃ（ＩＬ−２Ｒγ）からなる休止Ｔ細胞及びＮＫ細胞上の中程度の親和性受容体（Ｋｄ約１０−９Ｍ）を介して、または、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）をさらに発現する活性化リンパ球及びＴｒｅｇ細胞上の高親和性受容体（Ｋｄ約１０−１１Ｍ）を介して、シグナルを出す（Ｌｅｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８５８（１９９１）、及びＹｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２５９：１０３（２０１４））。γｃが、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の受容体により共有され（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：２００（２００１））、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症に罹患しているヒトにおいて変異した遺伝子によりコードされる（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３：１４７（Ａｐｒ  ９，１９９３））が、ＩＬ−２Ｒβは、ＩＬ−１５の受容体により共有され（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５９５（２００６））、ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞及びメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の正常な成長のために重要であるサイトカインである（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５９５（２００６））。
【０００７】
受容体と結合されたＩＬ−２及びＩＬ−１５の３次元構造は、受容体アセンブリ及びシグナル伝達に洞察を加える（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１１５９  （２００５）、及びＲｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：１１８７（２０１２））。正常な免疫応答における生理学的役割に加えて、ＩＬ−２及びＩＬ−１５は、病理学的応答を促進することができ、治療の目的は、不適当な自己免疫または免疫抑制応答を遮断しながら、これらのサイトカインの所望の作用を維持することである。ヒトＩＬ−２Ｒαに対する２つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるダクリズマブ及びバシリキシマブは、ＦＤＡにより承認されおり、腎移植の拒絶反応（Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３８：１６１（１９９８））、心臓移植（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５２：２７０５（２００５））、多発性硬化症（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３８１：２１６７（２０１３））、ならびに、ぜんそく（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：８７０５（２００４）；及びＢｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７８：１００２（２００８））における有効性を示すが、それらは、ＮＫ細胞及びメモリーＣＤ８＋細胞上に発現された中程度の親和性ＩＬ−２Ｒβ−γｃ受容体を介するＩＬ−２シグナル伝達を遮断せず、ＩＬ−１５シグナル伝達を遮断できない（Ｔｋａｃｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２：３１（２００２））。抗ヒトＩＬ−２Ｒβ  ｍＡｂ  Ｍｉｋβ１が、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の、ＩＬ−２Ｒβ−γｃ受容体を発現する細胞へのトランス提示を遮断できる（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：４０１（２００６））が、それは、高親和性ヘテロ三量体受容体複合体を介する、ＩＬ−２またはＩＬ−１５によるシスシグナル伝達を遮断することにおいて比較的効果がない（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：４０１（２００６）、及びＷａｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２１：４７６（２０１３））。そのため、１つ以上のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５の機能を遮断できる新しいＩＬ−２ムテインが必要である。本開示はＩＬ−２パーシャルアゴニスト及びアンタゴニストとして機能する新規ＩＬ−２ムテインを提供する。
【発明の概要】
【０００８】
ＩＬ−２は、免疫系に広範な効果を発揮し、免疫活性化及び免疫恒常性の両方を制御することにおいて重要な役割を果たす。免疫系刺激物質として、ＩＬ−２は、癌及び慢性ウイルス感染の治療における使用を見出されている。ＩＬ−２の刺激作用は、混乱も引き起こして、自己免疫及び移植拒絶を媒介する可能性がある。免疫制御及び免疫疾患における有益な役割のために、ＩＬ−２パーシャルアゴニスト及びアンタゴニストなどの新しいＩＬ−２分子の同定は、依然として活発な研究領域である。
【０００９】
ＩＬ−２がその同種受容体と、どのように相互作用するかの新たな洞察に基づいた新規ＩＬ−２組成物が、本明細書で提供される。ほとんどの状況では、ＩＬ−２は、３つの異なる受容体：ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、及びＩＬ−２Ｒγを介して機能する。休止Ｔ細胞などのほとんどの細胞は、ＩＬ−２に対し低親和性を有するＩＬ−２Ｒβ、及びＩＬ−２Ｒγしか発現しないので、ＩＬ−２に応答しない。刺激の際に、休止Ｔ細胞は、比較的高親和性のＩＬ−２受容体であるＩＬ−２Ｒαを発現する。ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒαへの結合は、この受容体をＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγに逐次的に関与させ、Ｔ細胞の活性化をもたらす。
【００１０】
ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性の強化により、作用が増大するＩＬ−２「スーパーカイン」は、以前に開発された（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９（２０１２））。この高親和性スーパーカイン／ＩＬ−２Ｒβ複合体が、内因性のシグナル伝達を遮断する「受容体シグナル伝達クランプ」を生成するドミナントネガティブなスカフォールドとして役立つことができると仮定された。ＩＬ−２Ｒγｃへの結合を減少させる、これらのスーパーＩＬ−２の「完全アゴニスト」の定方向変異は、ＩＬ−２Ｒβ−γｃのヘテロ二量化を減弱させ、内因性サイトカインを遮断し、それら自身の作用を発揮しないことによりアンタゴニストとして機能的に作用する、作用機序に基づいたＩＬ−２パーシャルアゴニスト及び非シグナル伝達（ニュートラル）分子の新しいクラスを代表するであろう（図１の概略図を参照のこと）。
【００１１】
新規ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）ムテインまたはその多様体が、本明細書で提供される。特に、ＩＬ−２Ｒβ受容体に対する結合能力が増加し、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体への結合能力が減少したＩＬ−２ムテインが提供される。このようなＩＬ−２ムテインは、例えば、１つ以上のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５の機能の減少または阻害が、（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び成人Ｔ細胞白血病の治療において）有用である用途におけるＩＬ−２パーシャルアゴニスト及びアンタゴニストとしての使用を見出す。このようなＩＬ−２ムテインをコードする核酸、このようなＩＬ−２ムテインの作成方法、このようなＩＬ−２ムテインを含む医薬組成物、及びこのようなＩＬ−２ムテインを使用する治療法も提供される。
【００１２】
一態様では、野生型ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さいＩＬ−２ムテインが、本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、（ａ）ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させ、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされたアミノ酸位置２４、６５、７４、８０、８１、８５、８６、８９、９２、及び／または９３から選択される１つ以上のアミノ酸置換；及び、（ｂ）ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させ、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされたアミノ酸位置１８、２２、１２６、及び／または１３０から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００１３】
種々の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｄ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、及び／若しくはＩ９３、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｎ７４Ｑ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ａ１２６Ｔ、及び／若しくはＳ１３０Ｒ、またはそれらの組み合わせを含む。具体的な実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｑ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｌ１８Ｒ及びＱ２２Ｅを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。
【００１５】
一実施形態では、ＩＬ−２ムテインが、アミノ酸置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さいＩＬ−２ムテイン。
【００１６】
一実施形態では、ＩＬ−２ムテインが、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さいＩＬ−２ムテイン。
【００１７】
一実施形態では、ＩＬ−２ムテインが、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｑ１２６Ｔ、及びＩ９２Ｆを含む、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さいＩＬ−２ムテイン。
【００１８】
一実施形態では、ＩＬ−２ムテインが、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さいＩＬ−２ムテイン。
【００１９】
ある特定の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、野生型ｈＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力が低減している。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００２０】
一部の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインの、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を刺激する能力が、野生型ｈＩＬ−２と比較して、低減している。
【００２１】
ある特定の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５アンタゴニストである。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５  ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害剤である。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５誘導性増殖の阻害剤である。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２依存性ＴＣＲ誘導性細胞増殖の阻害剤である。一実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２依存性Ｔｈ１、Ｔｈ９、及び／またはＴｒｅｇ分化の阻害剤である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、Ｔｈ１７分化のプロモーターである。一部の実施形態では、ムテインは、ＮＫ細胞のＩＬ−２依存性活性化の阻害剤である。
【００２２】
別の態様では、ヒトＦｃ抗体フラグメントに連結された、本明細書に記載されるＩＬ−ムテインのいずれか１つを含む、ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質が、本明細書で提供される。
【００２３】
別の態様では、本明細書に記載されるＩＬ−２ムテインまたはＩＬ−２ムテイン融合タンパク質のいずれか１つ、及び、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを有するＩＬ−２ムテインを含む。
【００２４】
さらに別の態様では、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患している対象の治療方法が、本明細書で提供される。種々の実施形態では、方法は、本明細書で開示されるＩＬ−２ムテインのいずれか１つを含む治療的有効量の医薬組成物を、対象に投与することを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを有するＩＬ−２ムテインを含む。
【００２５】
別の態様では、成人Ｔ細胞白血病に罹患している対象の治療方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書で開示されるＩＬ−２ムテインのいずれか１つを含む治療的有効量の医薬組成物を、対象に投与することを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを有するＩＬ−２ムテインを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本明細書で提供される主題のＩＬ−２ムテインを産生するための概略図を示す。左では、ＩＬ−２において、緑色の領域は、ＩＬ−２Ｒβへの高親和性結合を有するＨ９「スーパーＩＬ−２」を生じ、それにより、内因性ＩＬ−２の結合を遮断する、以前に報告された変化を示す。赤色の円は、ＩＬ−２Ｒγｃへの結合及びＩＬ−２Ｒβ−γｃヘテロ二量化を減少させるＩＬ−２の変化を示す。右では、ＩＬ−２Ｒγｃ結合の妨害のレベルに応じて、異なるレベルの活性及び機能が、示されるように生成されるべきである。
【図２】本明細書に記載されるようなＩＬ−２ムテインライブラリのＦＡＣＳプロファイルを示す。ヒトＩＬ−２遺伝子のエラープローンＰＣＲの産物を選択にかけた。第１世代ＩＬ−２ライブラリを、６回の選択を通して作成した。ＩＬ−２ムテイン（Ａ）を発現する酵母を結合するフィコエリトリン（ＰＥ）に連結された四量体のＩＬ−２Ｒβを使用して、第１回を実施した。ＰＥで標識された単量体のＩＬ−２Ｒβを使用して、後続の回の選択を達成した。（Ｂ）第２世代ＩＬ−２ライブラリからの結果。
【図３】野生型ＩＬ−２配列と比較して示された、高親和性ＩＬ−２Ｒβ結合を有するＩＬ−２ムテイン中の変更されたアミノ酸残基を示す。各ムテイン及びＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性も示される。
【図４】ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞における、ＩＬ−２Ｒβへの高親和性結合を有するＩＬ−２ムテインの刺激効果を示す。ＳＴＡＴ５リン酸化における野生型ＩＬ−２及びＩＬ−２ムテイン６−６、Ｄ１０、ならびにＨ９の用量−反応関係は、処理された（Ａ）ＣＤ２５−及び（Ｂ）ＣＤ２５＋ＹＴ−１  ＮＫ細胞で見られた。円は野生型ＩＬ−２であり、四角は、６−６であり、上向き三角は、Ｈ９であり、下向き三角は、Ｄ１０である。
【図５】ＩＬ−２ムテイン結合のＣＤ２５独立性を示す。ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋ＹＴ−１  ＮＫ細胞に対するＳＴＡＴ５リン酸化の用量−反応曲線。（Ａ）ＩＬ−２及びＩＬ−２（Ｆ４２Ａ）（円、実線は野生型ＩＬ−２、ＣＤ２５＋細胞）；四角、実線はＩＬ−２  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５＋細胞；上向き三角、破線は野生型ＩＬ−２、ＣＤ２５−細胞；下向き三角、破線はＩＬ−２  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５−細胞である。）（Ｂ）Ｈ９及びＨ９（Ｆ４２Ａ）（円、実線は野生型Ｈ９、ＣＤ２５＋細胞）；四角、実線はＨ９  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５＋細胞；上向き三角、破線はＨ９、ＣＤ２５−細胞；下向き三角、破線はＨ９  Ｆ４２Ａ、ＣＤ２５−細胞である。）Ｆ４２Ａ変異は、ＣＤ２５＋細胞上の、野生型ＩＬ−２の用量−反応曲線を右シフトするが、ＣＤ２５−上の観察可能な効果はなく、Ｈ９及びＨ９  Ｆ４２Ａに対する用量−反応曲線は、ＣＤ２５発現にかかわらず、実質的に重なり合っていた。
【図６】ＩＬ−２Ｒαの不存在下で、いくつかのＩＬ−２ムテイン「スーパーアゴニスト」（すなわち、ＩＬ−２Ｒβへの高親和性結合を有するムテイン）のＴ細胞を刺激する能力を示す。ＣＤ２５ノックアウトマウスから単離されたＴ細胞を、ＩＬ−２ムテインまたは野生型ＩＬ−２で刺激した。ＩＬ−２ムテインの用量−反応曲線及びそれぞれのＥＣ５０が提示される。示されるように、被験ＩＬ−２ムテインの全ては、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒαの不存在下で、Ｔ細胞刺激の相対的な増加をもたらした。
【図７】ＩＬ−２ムテイン「スーパーアゴニスト」の、経験のあるＴ細胞刺激を誘導する相対的な能力を比較するＦＡＣＳ解析である。Ｔ細胞を、２つの濃度（１０ｎｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−２ムテインまたは野生型ＩＬ−２で刺激した。刺激されたＴ細胞の百分率を、各ＦＡＣＳプロファイルに示す。
【図８】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞機能におけるＩＬ−２「スーパーアゴニスト」ムテインＤ１０の効果、具体的には、自発的及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を示す。ナチュラルキラー細胞（エフェクター）及びＣｒ５１で標識された腫瘍細胞（標的）を、抗ＥＧＦＲ抗体であるセツキシマブを用いてまたは用いずに、野生型ＩＬ−２またはＩＬ−２ムテインＤ１０の存在下で５時間、一緒にインキュベーションした。ＮＫ細胞の自発的細胞傷害のＤ１０による刺激は、ＩＬ−２またはＤ１０による刺激なしの、最小限の自発的細胞傷害を有する、高用量のＩＬ−２（＊ｐ＝０．００８、＊＊ｐ＝０．００１）を上回った。さらに、Ｄ１０の添加により、セツキシマブ抗体のＡＤＣＣが強化された。
【図９】Ｄ１０の結晶構造を示す。初期疎水性コア変異のＬ８５Ｖにより、複数の疎水性コア残基及び高親和性コンセンサス配列を標的とする第２世代のＩＬ−２ライブラリがもたらされた。Ｄ１０の結晶構造は、ヘリックスＣの前のループ領域に、明確な電子密度を含んだ。
【図１０】ＩＬ−２Ｒβへの高親和性結合を有するＩＬ−２「スーパーアゴニスト」ムテインは、ＩＬ−２と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激の強化を示すが、Ｔｒｅｇｓの刺激の強化は示さない。（Ａ）宿主ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈメモリー表現型（ＭＰ）Ｔ細胞の全細胞数、及び、（Ｂ）宿主ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞（制御性Ｔ細胞）を、ＰＢＳ、２０μｇのＩＬ−２、２０μｇのＨ９、または１．５μｇのＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体複合体（ＩＬ−２／ｍＡｂ）のいずれかを投与されているマウスの脾臓で測定した。
【図１１】ＩＬ−２Ｒβへの高親和性結合を有するＩＬ−２ムテインアゴニストは、ＩＬ−２と比較して、有害な影響の減少した抗腫瘍応答の強化を示す。肺浮腫（肺の湿潤重量）は、ＩＬ−２治療の後の有害な毒性影響の尺度として役立ち、乾燥前後に肺を計量することにより決定された（Ａ）。Ｐ値は、治療法間の比較を指す。＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１。（Ｂ）Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を使用して、ＩＬ−２ムテインの抗腫瘍特性をインビボで試験した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３〜４マウス／群）に、１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を皮下注入し、続いて、腫瘍結節が、通常は腫瘍細胞注射後の４〜５日または約１５ｍｍ２の腫瘍サイズに相当する、可視及び触知可能になった後に、５日間ＰＢＳ、２０μｇのＩＬ−２、２０μｇのＨ９、または１．５μｇのＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体複合体（ＩＬ−２／ｍＡｂ）のいずれかを毎日注射した。ｍｍ２単位の平均腫瘍面積（±ＳＤ）対腫瘍接種時からの時間が示される。Ｐ値は、ＩＬ−２の他の治療法との比較を指す。
【図１２】γｃ結合を妨害することによる、作用機序に基づいたＩＬ−２ムテインの生成を示す。（Ａ）Ｈ９−ＩＬ−２Ｒβ−γｃ複合体の構造（Ｈ９は緑色；ＩＬ−２Ｒβは青色；γｃは金色である）。ＩＬ−２のγｃとの相互作用を阻害するために、Ｈ９−ＲＥＴＲに組み込まれる変異（Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒ）が、藍色で示される（パネルの右部分）。（Ｂ、Ｃ）Ｈ９−ＩＬ−２Ｒβ（Ｃ）及びＨ９−ＲＥＴ−ＩＬ−２Ｒβ（Ｄ）複合体の、γｃへの結合の表面プラズモン共鳴分析。
【図１３−１】ＩＬ２Ｒγｃに対する結合親和性が減少したＩＬ−２ムテインのシグナル伝達の減弱を示す。（Ａ、Ｂ）野生型ＩＬ−２または種々のＨ９多様体を、ＣＤ２５−（Ａ）及びＣＤ２５＋（Ｂ）ＹＴ−１ヒトＮＫ様細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する能力についてアッセイした。（Ｃ、Ｄ）サイトカイン刺激の後の、ＣＤ２５−ＹＴ−１細胞における最大の表面発現と比較した、ＩＬ−２Ｒβ（Ｃ）及びＩＬ−２Ｒγ（Ｄ）の内在化の動態。
【図１３−２】（Ｅ）新たに単離された（上パネル）または予め活性化された（下パネル）ＣＤ８＋Ｔ細胞を、刺激しないままか、または、３０分間、１μｇ／ｍｌのＩＬ−２、Ｈ９−ＲＥ、Ｈ９−Ｔ、Ｈ９−ＲＥＴ、またはＨ９−ＲＥＴＲで刺激した。ＣＤ２５発現（左パネル）またはｐＳＴＡＴ５（右パネル）を、フローサイトメトリーでアッセイした。（Ｆ）示されるような細胞を、ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、またはＨ９−ＲＥＴＲで処理し、溶解し、ｐＳＴＡＴ５または全ＳＴＡＴ５に対する抗体でウェスタンブロッティングした。（Ｇ）野生型ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥ、Ｈ９−Ｔ、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲにより誘導されるｐＳＴＡＴ５の用量−反応曲線。（Ｈ）野生型ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲによるホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（ｐＳ６）の用量−反応曲線。ＭＦＩは、平均蛍光強度。用量−反応実験（Ａ、Ｂ、Ｇ、Ｈ）の場合、横軸は、ｎｇ／ｍｌ単位のサイトカイン濃度の対数を示す。ＭＦＩは、平均蛍光強度。データは、パネル当たり少なくとも２つの実験を代表するものである（エラーバー、三重測定の平均値の標準誤差）。
【図１４】２つの異なるアッセイにおいて、ＩＬ２Ｒγｃに対する結合親和性が減少したＩＬ−２ムテインのシグナル伝達の減弱を示す。（Ａ）ＣＤ２５−ＹＴ１ヒトＮＫ様細胞上のホスホ−ＥＲＫ１／ＥＲＫ２タンパク質の用量−反応曲線。（Ｂ）新たに単離された（上パネル）、または、予め活性化された（下パネル）ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγ発現の比較。データは、パネル当たり少なくとも２つの実験を代表するものである。エラーバーは、三重測定の平均値の標準誤差を表す。
【図１５】ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥ、Ｈ９−Ｔ、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲに応答する増殖及びＣＤ２５発現を示す。ＩＬ−２及びＨ９によるが、Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲによらない、新たに単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導（Ｈ９−Ｔの効果は中程度）。細胞を、ＣＦＳＥで標識して、示されたＩＬ−２多様体で刺激し、ＣＦＳＥ希釈物を、５日後にフローサイトメトリーで評価した。
【図１６−１】増殖、ＳＴＡＴ５結合、及び遺伝子発現におけるＨ９−ＲＥＴ及びＲＥＴＲの効果を示す。（Ａ）新たに単離され予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、２日間、様々な濃度の示されたＩＬ−２多様体の入った９６ウェルプレートで培養し、［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した。バーは、平均±平均値の標準誤差を表す。２つの個々のドナーからの細胞を、組み合わせた。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。（Ｂ）２４時間、ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲ（１μｇ／ｍｌ）で処理された予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＲＮＡ−Ｓｅｑヒートマップ解析。発現が、対照と比較して、ＩＬ−２によりアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかをされた遺伝子が示される（各遺伝子の発現は、カラースケールに従って、−１．００及び１．００の間で正規化される）。２倍以上に優先的にアップレギュレーション（赤色）またはダウンレギュレーション（緑色）されたｍＲＮＡが示される。
【図１６−２】（Ｃ）示されたサイトカインで刺激した後に、アップレギュレーションされた（白抜きバー）またはダウンレギュレーションされた（黒塗りバー）ｍＲＮＡの数。ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲはそれぞれ、７３１、７４２、６５、及び２３のｍＲＮＡを誘導し、４３７、３９７、１３、及び４６のｍＲＮＡを抑制した（倍数変化≧２；ｐ値＜１ｅ−１０）。（Ｄ）ＩＬ−２多様体で処理された、予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑに基づいたＳＴＡＴ５Ｂ結合部位の数及びそれらのゲノム全体の分布。ヒトＲｅｆＳｅｑデータベースに規定される５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、エクソン、イントロン、及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が示される（アセンブリＧＲＣｈ３７．ｐ９）。ＴＳＳの５ｋｂ上流を、プロモーター領域として指定した。
【図１６−３】（Ｅ）ＩＬ−２誘導性のＳＴＡＴ５Ｂピークを使用して、（位置「０」により示された）ＳＴＡＴ『ピーク頂点』の約１ｋｂ上流の及び１ｋｂ下流の中央を占めるヒートマップクラスタリングを実施した。ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲにより誘導される結合の強度は、赤色の強さにより示される。（Ｆ）刺激されないままか、または、２４時間、ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲで刺激された、予め活性化された細胞におけるＲＰＬ７と比較したＩＬ２ＲＡ、ＬＴＡ、ＣＩＳＨ、ＩＬ７ＲＡ、及びＢＣＬ６ＲＮＡの発現。データは、選択遺伝子が、ＲＴ−ＰＣＲにより確認されるＲＮＡ−Ｓｅｑ実験を除いて、少なくとも２つの実験を代表するものである（テキストを参照のこと）。
【図１７】ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥ、Ｈ９−Ｔ、Ｈ９−ＲＥＴ、またはＨ９−ＲＥＴＲで処理された、予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５発現を示す。データは、３つの独立した実験を代表するものである。
【図１８−１】Ｈ９−ＲＥＴＲがＩＬ−２Ｒ媒介性シグナル伝達を阻害することを示す。（Ａ及びＢ）Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲは、ＩＬ−２及びＩＬ−１５の拮抗的阻害剤である。予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌのＨ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲの不存在下または存在下で、示された濃度のＩＬ−２またはＩＬ−１５とインキュベーションした。（Ｃ及びＤ）Ｈ９−ＲＥＴＲは、予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞において、抗ＴａｃまたはＭｉｋβ１  ｍＡｂよりも、ＩＬ−２誘導性及びＩＬ−１５誘導性のＳＴＡＴ５リン酸化をより強力に遮断する。（Ｅ及びＦ）Ｈ９−ＲＥＴＲは、抗ＴａｃまたはＭｉｋβ１よりも、ＩＬ−２誘導性またはＩＬ−１５誘導性増殖をより強力に阻害する。平均±平均値の標準誤差が示される。データは、３つの独立した実験を代表するものである。
【図１８−２】（Ｇ）Ｈ９−ＲＥＴＲは、ＩＬ−２誘導性（上パネル）及びＩＬ−１５誘導性（下パネル）のインビボでのＳＴＡＴ５リン酸化を阻害する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＩＬ−２またはＩＬ−１５を注射する６０分前に、Ｆｃ４またはＦｃ４−Ｈ９−ＲＥＴＲを腹腔内注射した。ｐＳＴＡＴ５を、脾臓のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞において、３０分後に測定した。ＭＦＩが示される。データは、３つの独立した実験を代表するものである。（Ｈ）Ｆｃ４−Ｈ９−ＲＥＴＲは、ＧＶＨＤを減弱させる。ＢＡＬＢ／ｃマウスに照射し（９５０ｃＧｙ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の２００万のＴｒｅｇ枯渇汎Ｔ細胞を用いずにまたは用いて、１０００万のＴ枯渇骨髄（ＢＭ）細胞を移植した。汎Ｔ細胞が投与されているマウスを、１日に２回、１００μｇ／用量で、１０日間、腹腔内注射によりＦｃ４またはＦｃ４−Ｈ９−ＲＥＴＲ融合タンパク質で治療した。データは、３つの独立した実験からプールされた生存曲線を表し、カプラン・マイヤー法及びログランク検定を使用して解析した。Ｆｃ４対Ｈ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４については、ｐ＝０．０００１。
【図１８−３】（Ｉ）示されるようなＵＰＣ１０、ダクリズマブ、Ｍｉｋβ１、またはＨ９−ＲＥＴＲの存在下または不存在下で、３日間５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と培養されたＥＤ４０５１５（＋）Ｔ細胞の増殖の遮断。データは、２つの実験を代表するものであり、それぞれは、３回実施される。（Ｊ）ＵＰＣ１０、ダクリズマブ、Ｍｉｋβ１、またはＨ９−ＲＥＴＲで治療された、くすぶり型ＡＴＬに罹患している患者由来の細胞の、６日間の自発的増殖アッセイ。アッセイを、３回行った。
【図１９】ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＩＬ−２ムテインＨ９−ＲＥＴ、及びｈ９−ＲＥＴＲの効果を示す。（Ａ）Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲは、予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞上のＩＬ−２誘導性のＣＤ２５発現を阻害した。（Ｂ）Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲの存在下または不存在下で、ＩＬ−２で刺激された予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における（ＲＰＬ７発現に正規化された）ＩＬ２ＲＡ  ｍＲＮＡレベル。データは、３つの独立した実験を代表するものである。（Ｃ）Ｈ９−ＲＥＴＲによる、ＩＬ−２誘導性及びＩＬ−１５誘導性Ｔ細胞増殖の阻害。新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、１μｇ／ｍｌのＨ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲの存在下または不存在下で、ＣＦＳＥ標識し、ＩＬ−２またはＩＬ−１５（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＣＦＳＥ希釈物を評価した。データは、３つの独立した実験（Ａ及びＣ）を代表するものであるか、または、３回なされる２つの独立した実験（Ｂ）からプールされたものである。
【図２０】ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＩＬ−２ムテインＨ９−ＲＥＴ、及びｈ９−ＲＥＴＲの効果を示す。（Ａ）Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲの両方は、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲ誘導性増殖を抑制する。細胞を、ＣＦＳＥで標識し、１μｇ／ｍｌのＨ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲを用いてまたは用いずに、４日間、プレートと結合した抗ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）＋可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＣＦＳＥ希釈物をフローサイトメトリーにより評価した。（Ｂ）１μｇ／ｍｌのＨ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲのいずれかは、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３＋１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８で、４日間刺激された末梢血のＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＴＣＲ誘導性のＣＤ２５発現を阻害した。データは、３つの独立した実験を代表するものである。
【図２１】Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲが、Ｔｈ１、Ｔｈ９、及びＴｒｅｇ分化を阻害するが、Ｔｈ１７分化を促進することを示す。細胞を、Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲの存在下または不存在下で、種々のＴヘルパーの分極条件下で分化した。データは、各タイプの細胞に対する少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図２２】Ｈ９−ＲＥＴＲが、ＩＬ−２誘導性のＮＫ細胞活性化及び細胞傷害を遮断することを示す。（Ａ）ＩＬ−２とは異なり、Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲ（１μｇ／ｍｌ）のいずれもが、２４時間インキュベーションした後の初代ヒトＮＫ細胞においてＣＤ６９発現を刺激しなかったが、Ｈ９−ＲＥＴＲはＩＬ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）誘導性のＣＤ６９発現を阻害した。実験を２回実施した。（Ｂ、Ｃ）Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲのいずれもが、初代ヒトＮＫ細胞において細胞傷害を刺激せず、１０３ｎｇ／ｍＬのＨ９−ＲＥＴＲは、ＨＥＲ１８（Ｂ）及びＫ５６２（Ｃ）標的細胞のＩＬ−２誘導性のＮＫ細胞の細胞傷害を阻害した。ＮＫ細胞及び標的細胞を、示されたサイトカインの存在下で、４時間、１０：１の割合でインキュベーションした。ＨＥＲ１８細胞溶解を、５１Ｃｒ放出により判定し、３回実施した。Ｋ５６２細胞の溶解を、フローサイトメトリーにより評価した。４回の独立した実験を実施した。
【図２３】図１８Ｇの実験に対して使用されたプロトコールの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示がより容易に理解されるためには、ある特定の用語及び語句が、以下に、及び、本明細書を通して、定義される。
【００２８】
定義
本明細書で引用された全ての参考文献は、完全に記載されているかのように、その全体が参照により組み込まれる。別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、当業者に、本開示で使用される多くの用語に対する一般的指針を提供する。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、別途記載のない限り、製造業者の定めたプロトコール及び／またはパラメータに従って、一般的に実施される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ＩＬ−２」は、天然または組換えにかかわらず、野生型ＩＬ−２を意味する。成熟ヒトＩＬ−２は、Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８０，７４３７−７４４１（１９８３）に記載されるように、（さらなる２０Ｎ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドを除いた）１３３アミノ酸配列として発生する。ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列（配列番号１）は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｌｏｃａｔｏｒ）：ＮＰ＿０００５７７．２下に見出される。成熟ヒトＩＬ−２のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。マウス（ハツカネズミ）ＩＬ−２アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号（配列番号３）に見出される。成熟マウスＩＬ−２のアミノ酸配列は、配列番号４に示される。
配列番号１
【化１】
0006592505.tif 000002
配列番号２
【化２】
0006592505.tif 000003
配列番号３
【化３】
0006592505.tif 000004
配列番号４
【化４】
0006592505.tif 000005
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ＩＬ−２ムテイン」は、インターロイキン−２タンパク質に対する特異的置換がなされているＩＬ−２ポリペプチドを意味する。ＩＬ−２ムテインは、天然のＩＬ−２ポリペプチド鎖の１つ以上の部位または他の残基での、アミノ酸挿入、欠失、置換、及び修飾を特徴とする。本開示に従って、任意のこのような挿入、欠失、置換、及び修飾は、ＩＬ−２Ｒβ結合活性を保持するＩＬ−２ムテインをもたらす。例示的ムテインとしては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸の置換を挙げることができる
【００３１】
ムテインは、ＩＬ−２の他の位置での保存的修飾及び置換も含む（すなわち、ムテインの２次または３次構造に最小限の影響を有するもの）。このような保存的置換としては、ＤａｙｈｏｆｆによりＴｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５（１９７８）に記載されるもの、及び、ＡｒｇｏｓによりＥＭＢＯ  Ｊ．，  ８：７７９−７８５（１９８９）に記載されるものが挙げられる。例えば、次のグループ：グループＩ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；グループＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；グループＶ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；及びグループＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕ、のうちの１つに属するアミノ酸は、保存的変更に相当する。
【００３２】
「ＩＬ−２に従って番号付けされた」は、選択されたアミノ酸が通常、野生型ＩＬ−２の成熟配列中に存在する位置を基準として、そのアミノ酸を同定することを意味し、例えば、Ｒ８１は、配列番号２中に存在する８１番目のアミノ酸、アルギニンを指す。
【００３３】
「ＩＬ−２Ｒαβγ受容体を有する細胞型」という用語は、この受容体型を有することが知られている細胞、すなわち、Ｔ細胞、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、活性化された単球、及び活性化されたＮＫ細胞を意味する。「ＩＬ−２Ｒβγ受容体を有する細胞型」という用語は、その受容体タイプを有することが知られている細胞、すなわち、Ｂ細胞、休止単球、及び休止ＮＫ細胞を意味する。
【００３４】
ポリペプチドまたはＤＮＡ配列に関して、本明細書で使用される「同一性」という用語は、２つの分子間のサブユニットの配列の同一性を指す。分子の両方におけるサブユニット位置が、同じ単量体サブユニット（すなわち、同じアミノ酸残基またはヌクレオチド）によって占められる時、その場合、分子は、その位置で同一である。２つのアミノ酸配列間の、または、２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同一の位置の数の直接の関数である。一般に、配列は、最高次数の合致が得られるように、アラインされる。必要に応じて、同一性は、公開された技術及び幅広く利用可能なコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）、を使用して計算できる。配列同一性は、デフォルトのパラメータを有する配列解析ソフトウェア、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ（１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）の遺伝学コンピュータグループの配列解析ソフトウェアパッケージを使用して測定できる。
【００３５】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、または「ペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【００３６】
本開示の変異体ＩＬ−２ポリペプチドが、「実質的に純粋」である場合、それらは、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）の目的のポリペプチド、例えば、変異体ＩＬ−２アミノ酸配列を含有するポリペプチドであることができる。例えば、ポリペプチドは、少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、または約９９重量％の目的のポリペプチドであることができる。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析で測定できる。
【００３７】
「アゴニスト」は、標的と相互作用して、標的の活性化における増加を引き起こす、または、促進する化合物である。
【００３８】
「パーシャルアゴニスト」は、アゴニストと同じ標的と相互作用するが、パーシャルアゴニストの投薬量を増加させることによっても、アゴニストと同じくらい大きい生化学的及び／または生理学的効果の大きさを生じない化合物である。
【００３９】
「スーパーアゴニスト」は、標的受容体に対する内因性アゴニストよりも大きい最大応答を生じることができるアゴニストのタイプであり、それにより、１００％を超える有効性を有する。
【００４０】
「アンタゴニスト」は、例えば、アゴニストの活性を、防止する、低減させる、阻害する、または中和することによりアゴニストの作用に対抗する化合物である。「アンタゴニスト」は、同定されるアゴニストがない場合でさえ、標的、例えば、標的受容体、の構成的活性も防止する、阻害する、または低減させることができる。
【００４１】
「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列（すなわち、ＩＬ−２ムテインをコードする配列）が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするやり方で（例えば、インビトロ転写／翻訳系で、または、ベクターが宿主細胞に導入された時の宿主細胞中で）、制御配列（複数可）に連結されることを意味することが意図される。「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照のこと。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び、ある特定の宿主細胞中のみでヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異性制御配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されることになる宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存する可能性があることは、当業者に理解されるであろう。本発明の発現構築物は、宿主細胞に導入して、それにより、本明細書で開示されるヒトＩＬ−２ムテインを産生できるか、または、それらの生物学的に活性な多様体を産生できる。
【００４２】
「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同じ意味で使用される。このような用語は、特定の対象の細胞のみを指すわけではなく、このような細胞の後代または潜在的後代も指すことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、ある特定の修飾が後の世代に生じることがあるため、このような後代は事実上親細胞と同一ではないことがあるが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、粒子銃、または電気穿孔法を含む、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該技術分野で認識される種々の技術を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むが、これらに限定されない。補助的な活性化合物（例えば、抗生物質）も、組成物に組み込むことができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「癌」（または「癌の」）、「過剰増殖性」、及び「新生物の」という用語は、自律的成長（すなわち、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状況または状態）のための能力を有する細胞を指す。過剰増殖性及び新生物疾患状態は、病理学的に分類（すなわち、病状を特徴づけることまたは構成すること）されても良く、または、それらは、非病理学的に（すなわち、正常状態からの逸脱ではあるが、疾患状態とは関連しない状態として）分類されても良い。用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性ステージにかかわらず、全てのタイプの癌の成長若しくは発癌プロセス、転移性組織、または悪性形質転換細胞、組織、若しくは器官を含むことを意味する。「病理学的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍生長を特徴とする病状に見られる。非病理学的過剰増殖性細胞の例は、創傷修復と関連する細胞の増殖を含む。「癌」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺及びリンパ系組織、胃腸器官、ならびに泌尿生殖器に影響を与えるものを含む、種々の器官系の悪性腫瘍、ならびに、一般的に悪性腫瘍、例えば、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、及び／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌、及び食道の癌を含むと考えられる腺癌、を指すために使用される。
【００４６】
「癌腫」という用語は、当該技術分野で認識され、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、及び黒色腫を含む、上皮または内分泌腺組織の悪性腫瘍を指す。「腺癌」は、腺組織に由来する、または、腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する、癌腫を指す。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「造血新生物障害」という用語は、造血系由来の、例えば、骨髄、リンパ、または赤血球系統から生じる、過形成性／新生物細胞、またはそれらの前駆体細胞が関与する疾患を指す。好ましくは、疾患は、低分化急性白血病（例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病）から生じる。さらなる例示の骨髄障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７で概説されている）が挙げられるが、これらに限定されず、リンパ悪性腫瘍としては、Ｂ系統ＡＬＬ及びＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、毛様細胞性白血病（ＨＬＬ）、及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態としては、非ホジキンリンパ腫及びその多様体、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、ならびにリード・シュテルンベルク疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
ＩＬ−２ムテイン
ＩＬ−２ムテインパーシャルアゴニスト及びアンタゴニスト
一態様では、パーシャルアゴニスト及びアンタゴニストであるＩＬ−２ムテインが、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、野生型ＩＬ−２（例えば、ヒトＩＬ−２、配列番号２）と比較して、ＩＬ−２ムテインのＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性を低減させる１つ以上の変異を含有するＩＬ−２ムテインが、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「共通γ鎖」、「γｃ」、「ＩＬ−２Ｒγｃ」、「Ｙｃ」、「ＩＬ−２Ｒγ」、「ＩＬ−２受容体サブユニットγ」、及び「ＩＬ−２ＲＧ」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００２０６及びＮＰ＿０００１９７（ヒト）ならびにＮＭ＿０１３５６３及びＮＰ＿０３８５９１（マウス））という用語は全て、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１受容体を含むが、これらに限定されない少なくとも６つの異なるインターロイキン受容体のための受容体複合体に対するサイトカイン受容体サブユニットであるＩ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーを指す。ＩＬ−２Ｒγｃは、ＩＬ−２Ｒβと相互作用して、主にメモリーＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に中程度の親和性ＩＬ−２受容体を形成し、ＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒβと相互作用して、活性化されたＴ細胞及び制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）上に、高親和性ＩＬ−２受容体を形成する。特定の動作理論に束縛されるものではないが、このようなムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋／ＩＬ−２Ｒγｃ＋細胞（例えば、休止Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）上のＩＬ−２Ｒβと結合する際に、ＩＬ−２β／ＩＬ−２γｃヘテロ二量化及びシグナル伝達を減弱させる、または、阻害することにより、ＩＬ−２パーシャルアゴニストまたはアンタゴニストとして機能できると考えられている。
【００４９】
例示的な主題のＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。変異は、アミノ酸残基の数または含有量における変化からなる可能性がある。例えば、変異体ＩＬ−２は、野生型ＩＬ−２よりも、大きいまたは小さいアミノ酸残基の数を有することができる。代わりにまたは加えて、例示的変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２に存在する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含有できる。種々の実施形態では、変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、単一のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換により、野生型ＩＬ−２とは異なる可能性がある。
【００５０】
実例として、参照アミノ酸配列である配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ−２ムテインは、配列番号２の参照アミノ酸配列の多くとも５つの変更を含むことを除いて、参照配列と同一である配列を含むポリペプチドである。例えば、参照配列における多くとも５％のアミノ酸残基は、欠失されるか、または別のアミノ酸若しくは多くのアミノ酸と置換されても良く、参照配列における全アミノ酸残基の５％までは、参照配列に挿入されても良い。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ−−）末端位置若しくはカルボキシ（Ｃ−−）末端位置、または、これらの末端位置の間のどこにでも、生じることができ、参照配列の残基中に個別に、または、参照配列内の１つ以上の連続的なグループの中のいずれかに散在する。
【００５１】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％小さい親和性で、ＩＬ−２Ｒγｃと結合する。ＩＬ−２ムテインの結合親和性はまた、野生型ＩＬ−２のＩＬ−２γｃに対する親和性の１．２、１．４、１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、またはそれ以上分の１と表すことができる。主題のＩＬ−２ムテインのＩＬ−２γｃに対する結合親和性は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して測定できる。ＩＬ−２Ｒγｃ結合を測定するための好適な方法としては、放射性リガンド結合アッセイ（例えば、飽和結合、スキャッチャードプロット、非線形カーブフィッティングプログラム、及び競合結合アッセイ）；非放射性リガンド結合アッセイ（例えば、蛍光偏光（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、及び表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、Ｄｒｅｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４９３：３２３−３４３（２００９）を参照のこと））；液相リガンド結合アッセイ（例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、及び免疫沈降）；ならびに、固相リガンド結合アッセイ（例えば、マルチウェルプレートアッセイ、ビーズ上のリガンド結合アッセイ、カラム上のリガンド結合アッセイ、及びフィルタアッセイ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２ＲβのＩＬ−２Ｒγｃとの会合を分裂させ、その結果、このＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−２Ｒγｃ相互作用は、野生型ＩＬ−２と比較して、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する。
【００５３】
一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインのＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性を低減させる１つ以上の変異は、アミノ酸置換である。一部の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２（配列番号２）と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のアミノ酸置換からなる。置換アミノ酸残基（複数可）は、必ずしもではないが、次のグループ：グリシン、アラニン、バリン；イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン、内の置換を通常含む、保存的置換である可能性がある。特定の実施形態では、置換は、ＩＬ−２Ｒγｃ結合界面に接触するＩＬ−２のアミノ酸残基の置換である。
【００５４】
ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、野生型ｈＩＬ−２（例えば、配列番号２）に従って番号付けされた位置：１８、２２、１２６、及び／または１３０から選択された野生型ＩＬ−２の１つ以上のアミノ酸位置での置換である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ａ１２６Ｔ、及び／若しくはＳ１３０Ｒ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｑ１２６Ｔを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｌ１８Ｒ及びＱ２２Ｅを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、及びＱ１２６Ｔを含む。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させるアミノ酸置換は、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。
【００５６】
一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ受容体に対する結合親和性が減少するＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させる、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の変異をさらに含む。本明細書で使用される場合、「ＩＬ−２Ｒβ」及び「ＣＤ１２２」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８７８及びＮＰ＿０００８６９（ヒト））という用語の両方は、ＩＬ−２Ｒγｃと相互作用して、主にメモリーＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に中程度の親和性ＩＬ−２受容体を形成し、ＩＬ−２Ｒα及びＩＬ−２Ｒγｃと相互作用して、活性化されたＴ細胞及び制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）上に、高親和性ＩＬ−２受容体を形成する、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーを指す。特定の動作理論に束縛されるものではないが、強い結合親和性のＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγｃに対する弱い結合親和性を有するこのようなＩＬ−２ムテインは、内因性のシグナル伝達を遮断する「受容体シグナル伝達クランプ」を生成するドミナントネガティブなスカフォールドとして役立つと考えられている。このようなＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ−γｃヘテロ二量化を減弱させることになり、新しいクラスの、作用機序に基づいたＩＬ−２パーシャルアゴニスト、及び、内因性サイトカインを遮断し、それ自身の作用はなんら発揮しないことによりアンタゴニストとして機能的に作用する非シグナル伝達（ニュートラル）分子、を表す（図１の概略図を参照のこと）。
【００５７】
ある特定の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号２）と比較して、少なくとも１つの変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換）を含み、野生型ＩＬ−２よりも高い親和性で、ＩＬ−２Ｒβと結合する。
【００５８】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２よりも、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％大きい親和性で、ＩＬ−２Ｒβと結合する。ＩＬ−２ムテインの結合親和性はまた、野生型ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβに対する親和性の１．２、１．４、１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、２５０、またはそれ以上倍と表すことができる。主題のＩＬ−２ムテインのＩＬ−２Ｒβへの結合は、上記の方法を含むが、これらに限定されない、当業者らに知られている任意の好適な方法により評価できる。
【００５９】
一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させる少なくとも１つの変異は、アミノ酸置換である。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、野生型ｈＩＬ−２（配列番号２）に従って番号付けされたアミノ酸位置Ｉ２４、Ｐ６５、Ｑ７４、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｌ８５、Ｉ８６、Ｉ８９、Ｉ９２、及び／またはＶ９３に、置換を含み：ある特定の実施形態では、置換は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及び／若しくはＶ９３Ｉ、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、置換としては、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｄ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、及び／若しくはＩ９３Ｖ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６０】
一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ結合親和性を増加させるアミノ酸置換は、Ｑ７４Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。
【００６１】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化５】
0006592505.tif 000006
を有する。
【００６２】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化６】
0006592505.tif 000007
を有する。
【００６３】
例示的な実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化７】
0006592505.tif 000008
を有する。
【００６４】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化８】
0006592505.tif 000009
を有する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化９】
0006592505.tif 000010
を有する。
【００６６】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１０】
0006592505.tif 000011
を有する。
【００６７】
例示的な実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１１】
0006592505.tif 000012
を有する。
【００６８】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１２】
0006592505.tif 000013
を有する。
【００６９】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１３】
0006592505.tif 000014
を有する。
【００７０】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１４】
0006592505.tif 000015
を有する。
【００７１】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１５】
0006592505.tif 000016
を有する。
【００７２】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１６】
0006592505.tif 000017
を有する。
【００７３】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｑ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１７】
0006592505.tif 000018
を有する。
【００７４】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１８】
0006592505.tif 000019
を有する。
【００７５】
例示的な実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化１９】
0006592505.tif 000020
を有する。
【００７６】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｈ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２０】
0006592505.tif 000021
を有する。
【００７７】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２１】
0006592505.tif 000022
を有する。
【００７８】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２２】
0006592505.tif 000023
を有する。
【００７９】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２３】
0006592505.tif 000024
を有する。
【００８０】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２４】
0006592505.tif 000025
を有する。
【００８１】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２５】
0006592505.tif 000026
を有する。
【００８２】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２６】
0006592505.tif 000027
を有する。
【００８３】
種々の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２７】
0006592505.tif 000028
を有する。
【００８４】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２８】
0006592505.tif 000029
を有する。
【００８５】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｑ７４Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化２９】
0006592505.tif 000030
を有する。
【００８６】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ７４Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化３０】
0006592505.tif 000031
を有する。
【００８７】
ある特定の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｓ、Ｑ７４Ｈ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ９２Ｆ、及びＱ１２６Ｔを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化３１】
0006592505.tif 000032
を有する。
【００８８】
一部の実施形態では、野生型ヒトＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性がより大きく、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体に対する結合親和性がより小さい主題のＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｓ、Ｑ７４Ｈ、Ｒ８１Ｔ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸配列：
【化３２】
0006592505.tif 000033
を有する。
【００８９】
種々の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、以下の式によるアミノ酸配列を有する：
【００９０】
Ａ−Ｐ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｋ−Ｋ−Ｔ−Ｑ−Ｌ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｈ−Ｌ−（Ｘ１）ｎ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−（Ｘ２）ｎ−−Ｍ−（Ｘ３）ｎ−−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｉ−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｋ−Ｎ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｔ−Ｒ−Ｍ−Ｌ−Ｔ−Ｆ−Ｋ−Ｆ−Ｙ−Ｍ−Ｐ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｈ−Ｌ−Ｑ−Ｃ−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−（Ｘ４）ｎ−−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｎ−Ｌ−Ａ−（Ｘ５）ｎ−−Ｓ−Ｋ−Ｎ−Ｆ−Ｈ−（Ｘ６）ｎ−（Ｘ７）ｎ−−Ｐ−Ｒ−Ｄ−（Ｘ８）ｎ−−（Ｘ９）ｎ−−Ｓ−Ｎ−（Ｘ１０）ｎ−−Ｎ−Ｖ−（Ｘ１１）ｎ−−（Ｘ１２）ｎ−−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｔ−Ｔ−Ｆ−Ｍ−Ｃ−Ｅ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｉ−Ｖ−Ｅ−Ｆ−Ｌ−Ｎ−ＲＷ−Ｉ−Ｔ−Ｆ−Ｃ−（Ｘ１３）ｎ−−Ｓ−Ｉ−Ｉ−（Ｘ１４）ｎ−−Ｔ−Ｌ−Ｔ、
（式中、各ｎは、０または１から個別に選択され；
Ｘ１は、Ｌ（野生型）またはＲであり；
Ｘ２は、Ｑ（野生型）またはＥであり；
Ｘ３は、Ｉ（野生型）またはＶであり；
Ｘ４は、Ｐ（野生型）またはＨであり；
Ｘ５は、Ｑ（野生型）、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＳであり；
Ｘ６は、Ｌ（野生型）、Ｆ、またはＶであり；
Ｘ７は、Ｒ（野生型）、Ｉ、Ｔ、またはＤであり；
Ｘ８は、Ｌ（野生型）またはＶであり；
Ｘ９は、Ｉ（野生型）またはＶであり；
Ｘ１０は、Ｉ（野生型）またはＶであり；
Ｘ１１は、Ｉ（野生型）またはＦであり；
Ｘ１２は、Ｖ（野生型）またはＩであり；
Ｘ１３は、Ａ（野生型）またはＴであり；
Ｘ１４は、Ｓ（野生型）またはＲである（配列番号５０））。
【００９１】
配列番号５０によるＩＬ−２ムテインのある特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、またはＸ１４のうちの少なくとも１つにおけるアミノ酸は、野生型アミノ酸ではない。一部の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、またはＸ１４のうち、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４におけるアミノ酸は、野生型アミノ酸ではない。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、配列番号５０のＩＬ−２ムテインと、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の相同性を有する。
【００９２】
一部の実施形態では、パーシャルアゴニストである主題のＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、１つ以上の機能が低減している。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−２Ｒγｃヘテロ二量化に依存する、１つ以上のシグナル伝達経路を刺激する能力が低減している。一部の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、野生型ｈＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力が低減している。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、Ｌ−２Ｒβ＋細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を、野生型ＩＬ−２が同じ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以下のレベルで、刺激する。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００９４】
一部の実施形態では、ムテインは、野生型ｈＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞においてＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を刺激する能力が低減している。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞においてｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を、野生型ＩＬ−２が同じ細胞においてｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２シグナル伝達を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以下のレベルで、刺激する。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００９５】
ＳＴＡＴ５及びＥＲＫ１／２シグナル伝達は、例えば、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して、ＳＴＡＴ５及びＥＲＫ１／２のリン酸化により測定できる。例えば、ＳＴＡＴ５及びＥＲＫ１／２リン酸化反応は、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリー分析と組み合わせて、これらの分子のリン酸化バージョンに特異的な抗体を使用して測定できる。
【００９６】
一部の実施形態では、ムテインは、野生型ｈＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞において、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達を刺激する能力が低減している。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞においてＰＩ３キナーゼシグナル伝達を、野生型ＩＬ−２が同じ細胞においてＰＩ３キナーゼシグナル伝達を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以下のレベルで刺激する。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＩＬ−２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００９７】
ＰＩ３キナーゼシグナル伝達は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して測定できる。例えば、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達は、本明細書に記載されるように、フローサイトメトリー分析と共に、ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質に特異的な抗体を使用して測定できる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、リンパ球増殖を誘導する能力が低減している。一部の実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、リンパ球は、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、リンパ球は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。細胞増殖は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して測定できる。例えば、リンパ球増殖は、本明細書に記載されるように、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルジエステル（ＣＦＳＥ）希釈アッセイを使用して、または、［３Ｈ］チミジン取り込みにより、測定できる。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、リンパ球増殖を、野生型ＩＬ−２がリンパ球増殖を誘導するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以下のレベルで、誘導する。
【００９９】
一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、リンパ球において、ＩＬ−２Ｒα発現を活性化する能力が低減している。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、リンパ球においてＩＬ−２Ｒα発現を、野生型ＩＬ−２が同じ細胞においてＩＬ−２Ｒα発現を活性化するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以下のレベルで、活性化する。一部の実施形態では、リンパ球は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１００】
特定の動作理論に束縛されるものではないが、ＩＬ−２Ｒβ結合の強化及びＩＬ−２Ｒγｃの減少を示すＩＬ−２ムテインが、ドミナントネガティブなＩＬ−２アンタゴニストとして機能し、１つ以上のＩＬ−２依存性の機能を妨げる可能性があると考えられている。このようなアンタゴニストは、ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒβへの結合を妨げ、一方、ＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−２Ｒγｃヘテロ二量化も阻害することにより、機能する。さらに、ＩＬ−１５シグナル伝達がＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−２Ｒγｃ受容体結合を介して機能するので、このようなＩＬ−２ムテインがＩＬ−１５アンタゴニストとしても機能できると考えられている。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、１つ以上のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５の機能を阻害する。
【０１０１】
一部の実施形態では、１つ以上のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５の機能を阻害するＩＬ−２ムテインは、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされたアミノ酸位置１８、２２、及び１２６でのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインのアミノ酸置換は、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされたＬ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、及びＱ１２６Ｔを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、１つ以上のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５の機能を阻害するＩＬ−２ムテインは、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされたアミノ酸位置１８、２２、１２６、及び１３０でのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインのアミノ酸置換は、野生型ｈＩＬ−２に従って番号付けされたＬ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、ムテインは、ＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５  ＳＴＡＴ５リン酸化の阻害剤である。一部の実施形態では、ムテインは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５誘導性増殖の阻害剤である。一部の実施形態では、ムテインは、ＩＬ−２依存性ＴＣＲ誘導性細胞増殖の阻害剤である。
【０１０４】
ＩＬ−２は、Ｔｈ１、Ｔｈ９、及びＴｒｅｇ  Ｔ細胞分化を促進し、Ｔｈ１７分化を阻害する。それ故、特定の動作理論に束縛されるものではないが、ＩＬ−２アンタゴニストとして機能するＩＬ−２ムテインは、Ｔｈ１、Ｔｈ９、及び／若しくはＴｒｅｇ細胞分化を阻害できる、または、Ｔｈ１７細胞分化を促進できると考えられている。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、ＩＬ−２依存性のＴｈ１、Ｔｈ９、及び／またはＴｒｅｇ分化の阻害剤である。ある特定の実施形態では、ムテインは、Ｔｈ１７分化のプロモーターである。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、ムテインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＬ−２依存性活性化の阻害剤阻害剤である。ＮＫ細胞のＩＬ−２活性化は、本明細書に記載されるように、当該技術分野で既知の任意の好適な方法により、例えば、ＩＬ−２誘導性ＣＤ６９発現及び／または細胞傷害を測定することにより、測定できる。
【０１０６】
ＩＬ−２ムテインの組換え発現、発現ベクター、及び宿主細胞
種々の実施形態では、本発明の実施に際して使用されるポリペプチドは、合成ポリペプチドであるか、または、組換え核酸分子の発現により産生される。ポリペプチドが、キメラ（例えば、少なくとも変異体ＩＬ−２ポリペプチド及び異種ポリペプチドを含有する融合タンパク質）である場合、変異体ＩＬ−２の全部または一部をコードする１つの配列、及び、異種ポリペプチドの全部または一部をコードするもう１つの配列、を含有するハイブリッド核酸分子によりコードできる。例えば、本明細書に記載される主題のＩＬ−２ムテインは、細菌で発現させたタンパク質の精製を容易にするために、ヘキサヒスチジンタグに融合されても良く、または、真核細胞で発現させたタンパク質の精製を容易にするために、赤血球凝集素タグに融合されても良い。
【０１０７】
ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築するための、及び、適切に形質転換された宿主におけるこれらの配列を発現させるための方法は、ＰＣＲアシスト変異誘発技術を使用することを含むが、これらに限定されない。アミノ酸残基のＩＬ−２ポリペプチドへの欠失または付加からなる変異は、標準的な組換え技術でも行うことができる。欠失または付加の場合、ＩＬ−２をコードする核酸分子は、適当な制限エンドヌクレアーゼで任意に消化される。得られるフラグメントは、直接発現、または、例えば、もう１つのフラグメントへのライゲーションによるさらなる操作のいずれかができる。核酸分子の２つの端が互いに重なり合う相補的ヌクレオチドを含有する場合、ライゲーションは容易になることがあるが、平滑末端のフラグメントも、ライゲーションできる。ＰＣＲで生成された核酸も、種々の変異体配列を生成するために使用できる。
【０１０８】
完全なアミノ酸配列は、逆翻訳遺伝子を構築するために使用できる。ＩＬ−２ムテインをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーが合成できる。例えば、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成でき、次に、ライゲーションできる。個々のオリゴヌクレオチドは通常、相補的なアセンブリのための５′突出部または３′の突出部を含有する。
【０１０９】
組換え分子生物学技術により変更されている核酸分子の発現を介して変異体ポリペプチドを生成することに加えて、主題のＩＬ−２ムテインは、化学的に合成できる。化学的に合成されたポリペプチドは、当業者らにより日常的に生成される。
【０１１０】
（合成、部位特異的変異誘導法、または別の方法により）、一旦アセンブリングされると、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクターに挿入され、所望の形質転換された宿主において、ＩＬ−２ムテインの発現のために適切な発現制御配列に動作可能に連結されることになる。適正なアセンブリは、ヌクレオチドの配列決定、制限マッピング、及び、好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認することができる。当技術分野でよく知られているように、宿主において、高発現レベルのトランスフェクションされた遺伝子を得るためには、この遺伝子を、選択された発現宿主で機能する、転写及び翻訳の発現制御配列に動作可能に連結されなければならない。
【０１１１】
ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列はまた、部位特異的変異誘導法、化学合成、または他の方法で調製されるかどうかにかかわらず、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列も含むことができる。このようなシグナル配列は、存在する場合、ＩＬ−２ムテインを発現させるために選択される細胞により認識されるものでなければならない。それは、原核細胞のもの、真核細胞のもの、またはこれら２つの組み合わせであることができる。それはまた、天然ＩＬ−２のシグナル配列であることができる。シグナル配列の組入れは、それがなされる組換え細胞でＩＬ−２ムテインを分泌することが所望されるかどうかに依存する。選択される細胞が原核細胞である場合、ＤＮＡ配列がシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。選択される細胞が真核細胞である場合は、シグナル配列がコードされることが一般に好ましく、野生型ＩＬ−２のシグナル配列が使用されることが最も好ましい。
【０１１２】
ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質
前述したように、例示的な主題のＩＬ−２ムテインは、主題のＩＬ−２ムテイン及び異種ポリペプチド（すなわち、ＩＬ−２またはその変異体でないポリペプチド）（例えば、米国特許第６，４５１，３０８号を参照のこと）を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製できる。例示的な異種ポリペプチドは、インビボで、キメラポリペプチドの循環半減期を増加させることができ、それ故、変異体ＩＬ−２ポリペプチドの特性をさらに強化することがある。種々の実施形態では、循環半減期を増加させるポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、または、ＩｇＧの重鎖可変領域を欠く抗体のＩｇＧサブクラスのＦｃ領域であることがある。例示的なＦｃ領域は、補体固定及びＦｃ受容体結合を阻害する変異を含むことができるか、または、溶解性があっても良く、すなわち、補体と結合することができるか、若しくは、抗体依存性補体溶解（ＡＤＣＣ；１９９４年１２月１２日に出願されたＵＳＳＮ０８／３５５，５０２）などの別の機構で細胞を溶解させることができる。
【０１１３】
「Ｆｃ領域」とは、ＩｇＧをパパインで消化させることにより生成される、ＩｇＧのＣ末端ドメインと相同な天然または合成のポリペプチドであることができる。ＩｇＧのＦｃの分子量は、約５０ｋＤａである。変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、または、小部分が一部となるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持する小部分を含むことができる。加えて、完全長またはフラグメント化されたＦｃ領域は、野生型分子の多様体であることができる。すなわち、それらは、ポリペプチドの機能に影響を及ぼし得るか、または、及ぼし得ない変異を含有することができる。以下でさらに記載されるように、天然の活性は、全ての場合に、必要とされない、または、所望されない。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２ムテイン融合タンパク質（例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−２パーシャルアゴニストまたはアンタゴニスト）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。
【０１１４】
Ｆｃ領域は、「溶解性」または「非溶解性」であることができるが、通常は非溶解性である。非溶解性のＦｃ領域は通常、高親和性Ｆｃ受容体結合部位及びＣ′１ｑ結合部位を欠く。マウスＩｇＧのＦｃの、高親和性Ｆｃ受容体結合部位は、ＩｇＧのＦｃの２３５位にＬｅｕ残基を含む。従って、Ｆｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を変異または欠失させることにより破壊できる。例えば、ＧｌｕのＬｅｕ２３５に対する置換は、Ｆｃ領域が高親和性Ｆｃ受容体と結合する能力を阻害する。マウスＣ′１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８残基、Ｌｙｓ３２０残基、及びＬｙｓ３２２残基を変異または欠失させることにより機能的に破壊できる。例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２をＡｌａ残基で置換すると、ＩｇＧ１のＦｃが、抗体依存性補体溶解を指示することができなくなる。対照的に、溶解性のＩｇＧのＦｃ領域は、高親和性のＦｃ受容体結合部位及びＣ′１ｑ結合部位を有する。高親和性のＦｃ受容体結合部位は、ＩｇＧのＦｃの２３５位にＬｅｕ残基を含み、Ｃ′１ｑ結合部位は、ＩｇＧ１のＧｌｕ３１８残基、Ｌｙｓ３２０残基、及びＬｙｓ３２２残基を含む。溶解性ＩｇＧのＦｃは、これらの部位に野生型残基または保存的アミノ酸置換を有する。溶解性ＩｇＧのＦｃは、細胞を、抗体依存性細胞傷害または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の標的にすることができる。また、ヒトＩｇＧに適切な変異も知られている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：１１９−１２４，１９９４；及びＢｒｅｋｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ２：  １２５，１９９４を参照のこと）。
【０１１５】
他の実施形態では、キメラポリペプチドは、主題のＩＬ−２ムテイン及びＦＬＡＧ配列などの抗原性タグとして機能するポリペプチドを含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載されるように、ビオチン化高特異的抗ＦＬＡＧ抗体により認識される（Ｂｌａｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１０１４，１９９２；  ＬｅＣｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：８１４５，１９９２も参照のこと）。一部の実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｃ末端のｃ−ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。
【０１１６】
他の実施形態では、キメラポリペプチドは、変異体ＩＬ−２ポリペプチド及びＡｇａ２ｐアグルチニンサブユニット（例えば、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５：５５３−７，１９９７を参照されたい）などの変異体ＩＬ−２ポリペプチドの、発現を強化するか、または、細胞内局在化を指示するように機能する異種ポリペプチドを含む。
【０１１７】
他の実施形態では、変異体ＩＬ−２及び抗体またはその抗原結合部分を含むキメラポリペプチドが生成できる。キメラタンパク質の抗体または抗原結合成分は、標的部分として機能できる。例えば、それは、キメラタンパク質を、細胞または標的分子の特定のサブセットに局在させるために使用できる。サイトカイン−抗体キメラポリペプチドを生成する方法は、例えば、米国特許第６，６１７，１３５号に記載されている。
【０１１８】
変異体ＩＬ−２をコードする核酸分子
一部の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインは、単独で、または、上述したようなキメラポリペプチドの一部として、核酸分子の発現により得ることができる。ＩＬ−２ムテインが、野生型ＩＬ−２ポリペプチドとの同一性の観点から記載できることと同様に、それらをコードする核酸分子も、野生型ＩＬ−２をコードするものと一定の同一性を必然的に有することになる。例えば、主題ＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子は、野生型ＩＬ−２（例えば、配列番号２）をコードする核酸と少なくとも５０％、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば、９９％）同一であることができる。
【０１１９】
提供される核酸分子は、天然配列、または、天然に発生するものと異なる配列を含むことができるが、遺伝子コードの縮重に起因して、同じポリペプチドをコードする。これらの核酸分子は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ、例えば、ホスホルアミダイトベースの合成により生成されるもの）、または、これらのタイプの核酸中のヌクレオチドの組み合わせ若しくは修飾からなる可能性がある。加えて、核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖）であることができる。
【０１２０】
核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず、コード配列（例えば、ＩＬ−２のコード配列）の上流または下流にある非コード配列の一部または全部も含むことができる。分子生物学の当業者らは、核酸分子を単離するための所定の手順に精通している。それらは、例えば、ゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで処理すること、または、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することにより生成できる。核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、分子は、例えば、インビトロ転写により生成できる。
【０１２１】
本開示の例示的な単離核酸分子は、天然状態にそれだけでは見出されないフラグメントを含むことができる。従って、本開示は、組換え分子、例えば、核酸配列（例えば、変異体ＩＬ−２をコードする配列）が、ベクター（例えば、プラスミドベクター若しくはウイルスベクター）、または、異種細胞のゲノム（若しくは天然の染色体位置以外の位置での同種細胞のゲノム）に組み込まれるもの、を含む。
【０１２２】
上記のような、主題のＩＬ−２ムテインは、キメラポリペプチドの一部として存在しても良い。上記の異種ポリペプチドに加えて、または、これらの代わりに、主題の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含有できる。マーカーまたはレポーター遺伝子の例としては、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃｚ（β−ガラクトシダーゼをコードする）、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。当業者は、さらなる有用な試薬、例えば、マーカーまたはレポーターの機能を果たすことができるさらなる配列、を知っているであろう。
【０１２３】
主題の核酸分子は、哺乳動物の細胞などの、任意の生物学的細胞から得た、ＩＬ−２をコードするＤＮＡに、変異を導入することにより得ることができる。従って、主題の核酸（及びそれらがコードするポリペプチド）は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌ、またはネコのものであることができる。一実施形態では、核酸分子は、ヒトのものとなる。
【０１２４】
変異体ＩＬ−２遺伝子産物の発現
上記核酸分子は、例えば、ベクターが形質導入されている細胞において、核酸分子の発現を指示することができるベクター内に含まれる可能性がある。従って、主題のＩＬ−２ムテインに加えて、主題のＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子も含有する発現ベクター、及び、これらのベクターがトランスフェクションされた細胞は、好ましい実施形態の１つである。
【０１２５】
本明細書に記載されるＤＮＡ配列を発現するために、全てのベクター及び発現制御配列が十分に等しく機能するわけではないことが当然理解されるべきである。全ての宿主が、同じ発現系で十分に等しく機能するわけではない。しかし、当業者は、過度の実験なしに、これらのベクター、発現制御配列、及び宿主の中で選択しても良い。例えば、ベクターの選択では、ベクターが、宿主の中で複製しなければならないので、宿主は考慮されなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び抗生物質マーカーなどのベクターによりコードされる他の任意のタンパク質の発現も考慮されるべきである。例えば、使用できるベクターは、ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡを、コピー数において増幅させるものを含む。このような増幅可能なベクターは、当該技術分野においてよく知られている。それらは、例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ、米国特許第４，４７０，４６１号；Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｕｔｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．１３０４−１９（１９８２）を参照のこと）、または、グルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州出願公開第３３８，８４１号を参照のこと）により、増幅することが可能なベクターを含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示のヒトＩＬ−２ムテインは、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現されるであろう。ベクターは、宿主細胞における自律複製に有用であるか、または、宿主細胞に導入される際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれても良く、それにより、宿主のゲノムと共に複製される（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）。発現ベクターは、それらが作動可能に連結されたコード配列の発現を指示することができる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは多くの場合、プラスミド（ベクター）の形態をとる。しかし、他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）も含まれる。
【０１２７】
例示的な組換え発現ベクターは、発現に使用されることになる宿主細胞に基づき選択され、発現されることになる核酸配列に作動可能に連結された、１つ以上の制御配列を含むことができる。
【０１２８】
発現構築物またはベクターは、原核生物または真核生物の宿主細胞における、ＩＬ−２ムテインまたはその多様体の発現のために設計できる。
【０１２９】
ベクターのＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により、原核または真核細胞に導入できる。宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトする好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）、及び、他の標準的な分子生物学の研究室マニュアルに見出すことができる。
【０１３０】
原核生物におけるタンパク質の発現は多くの場合、構成的または誘導的プロモーターを含有するベクターと、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で実施される。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えタンパク質発現を最大化する戦略は、例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０）ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．），ｐｐ．  １１９−１２８及びＷａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：２１１１−２１１８に見出すことができる。細胞由来のＩＬ−２ムテインまたはその多様体を、成長させる、採取する、破壊する、または抽出するプロセスは、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６０４，３７７号；同第４，７３８，９２７号；同第４，６５６，１３２号；同第４，５６９，７９０号；同第４，７４８，２３４号；同第４，５３０，７８７号；同第４，５７２，７９８号；同第４，７４８，２３４号；及び同第４，９３１，５４３号に実質的に記載されている。
【０１３１】
一部の実施形態では、組換えＩＬ−２ムテインまたはそれらの生物学的に活性な多様体も、酵母またはヒト細胞などの真核生物で作製できる。好適な真核宿主細胞としては、昆虫細胞（培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターの例としては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３：２１５６−２１６５）、及び、ｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる）；酵母細胞（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｎｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）；または、哺乳動物細胞（哺乳動物の発現ベクターとしては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：１８７：１９５）が挙げられる）が挙げられる。好適な哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞が挙げられる。哺乳動物細胞では、発現ベクターの制御機能は多くの場合、ウイルス制御エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、及びシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に好適な他の発現系の場合は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）の第１６章及び第１７章を参照のこと。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照のこと。
【０１３２】
本開示のヒトＩＬ−２ムテインをコードする配列は、目的の宿主細胞における発現について最適化することができる。配列のＧ−Ｃの含有量は、宿主細胞で発現させた既知の遺伝子を参照することにより計算されるように、所与の細胞宿主について平均したレベルに調整できる。コドン最適化のための方法は、当該技術分野においてよく知られている。コード配列内のコドンの約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または多くとも１００％が、特定の宿主細胞における発現について最適化されるように、ＩＬ−２ムテインコード配列内のコドンは最適化され、宿主細胞における発現を強化できる。
【０１３３】
使用に好適なベクターとしては、細菌中で使用されるＴ７系ベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６：１２５，１９８７を参照のこと）、哺乳動物細胞中で使用されるｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：３５２１，１９８８）、ならびに、昆虫細胞中で使用されるバキュロウイルス由来ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ（カリフォルニア州）製の発現ベクターｐＢａｃＰＡＫ９）が挙げられる。
【０１３４】
一部の実施形態では、このようなベクターにおいて主題のＩＬ−２ムテインをコードする核酸インサートは、配列を、例えば、発現が求められる細胞型に基づき選択されるプロモーターに作動可能に連結できる。
【０１３５】
発現制御配列の選択では、種々の因子も考慮されるべきである。これらは、例えば、配列の相対強度、制御可能性、及び主題のＩＬ−２ムテインをコードする実際のＤＮＡ配列との適合性、特に、潜在的な二次構造に関するものを含む。宿主は、選択されたベクターとの適合性、本発明のＤＮＡ配列によりコードされる産物の毒性、分泌特性、ポリペプチドを正しく折りたたむ能力、発酵または培養要件、及びＤＮＡ配列によりコードされる産物の精製の容易さを考慮することにより選択されるべきである。
【０１３６】
これらのパラメータのうちで、当業者は、例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ７細胞を使用して、発酵上または大規模な動物培養物中で、所望のＤＮＡ配列を発現することになる種々のベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを選択しても良い。
【０１３７】
発現制御配列及び発現ベクターの選択が、一部の実施形態では、宿主の選択に依存することになる。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を有するベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲＩ、ｐＥＲ３２ｚ、ｐＭＢ９、及びそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドなどの既知の細菌プラスミド；ＲＰ４などの広宿主域プラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ラムダファージの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、ならびにＭ１３及び糸状一本鎖ＤＮＡファージなどの他のＤＮＡファージが挙げられる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２μプラスミド及びその誘導体を含む。昆虫細胞に有用なベクターとしては、ｐＶＬ９４１及びｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）が挙げられる。Ｃａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”，  Ｃｅｌｌ，４５，ｐｐ．６８５−９８（１９８６）。
【０１３８】
加えて、多種多様な発現制御配列のうちのいずれかは、これらのベクターで使用できる。このような有用な発現制御配列は、上述の発現ベクターの構造遺伝子と関連する発現制御配列を含む。有用な発現制御配列の例としては、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、ラムダファージの主要なオペレーター領域及びプロモーター領域、例えば、ＰＬ、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、例えば、ＰｈｏＡ、酵母ａ接合系のプロモーター、バキュロウイルスの多角体プロモーター、ならびに原核細胞若しくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせが挙げられる。
【０１３９】
Ｔ７プロモーターは、細菌に使用することができ、多角体プロモーターは、昆虫細胞に使用することができ、サイトメガロウイルスプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターは、哺乳動物の細胞に使用できる。さらに、高等真核生物の場合、組織特異的プロモーター及び細胞型特異的プロモーターが幅広く利用可能である。これらのプロモーターは、それらが体内の所与の組織または細胞型における核酸分子の発現を指示する能力のためにそのように呼ばれる。当業者らは、多数のプロモーター及び核酸の発現を指示することに使用できる他の制御エレメントについて十分に把握している。
【０１４０】
挿入された核酸分子の転写を容易にする配列に加えて、ベクターは、複製起点及び選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有できる。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏｒ）遺伝子は、それが発現される細胞にＧ４１８耐性を付与し、それにより、トランスフェクションされた細胞の表現型の選択が可能になる。当業者らは、所与の制御エレメントまたは選択マーカーが特定の実験状況での使用に適するかどうかを容易に決定できる。
【０１４１】
本発明に使用できるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴のベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びウシパピローマウイルスベクターが挙げられる。（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｅｄ．），Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０１４２】
本明細書で開示された主題のＩＬ−２ムテインをコードする核酸分子を含有及び発現する原核細胞または真核細胞も、本発明の特色である。本発明の細胞は、トランスフェクションされた細胞、すなわち、核酸分子、例えば、変異体ＩＬ−２ポリペプチドをコードする核酸分子が組換えＤＮＡ技術を用いて導入されている細胞である。このような細胞の後代も、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１４３】
発現系の正確な構成要素は、重要ではない。例えば、ＩＬ−２ムテインは、細菌であるＥ．ｃｏｌｉなどの原核宿主、または、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１細胞）または哺乳動物の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、またはＨｅＬａ細胞）などの真核宿主で産生できる。これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を含む多くの供給源から入手可能である。発現系の選択では、構成要素が互いに適合性があることのみが重要である。当業者らは、このような決定を下すことが可能である。さらに、ガイダンスが発現系の選択に必要される場合、当業者らは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）及びＰｏｕｗｅｌｓら  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １９８５  Ｓｕｐｐｌ．１９８７）を参考にしても良い。
【０１４４】
発現させたポリペプチドは、所定の生化学的手順を使用して発現系から精製することができ、例えば、本明細書に記載されるような治療薬として使用できる。
【０１４５】
一部の実施形態では、得られたＩＬ−２ムテインは、ムテインを産生させるのに使用される宿主生物に応じてグリコシル化または非グリコシル化されることになる。細菌が宿主として選択される場合、続いて、産生したＩＬ−２ムテインは、非グリコシル化されることになる。他方では、真核細胞は、おそらく天然ＩＬ−２がグリコシル化される方法と同じ方法ではないが、ＩＬ−２ムテインをグリコシル化するであろう。形質転換された宿主により産生されるＩＬ−２ムテインは、任意の好適な方法に従って精製できる。ＩＬ−２を精製するための種々の方法が知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２．Ｅｄｓ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｂｅｎ  Ｍ．  Ｄｕｎｎ，Ｈｉｄｄｅ  Ｌ．  Ｐｌｏｅｈｇ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｐａｕｌ  Ｔ．  Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｕｎｉｔ  ６．５（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  １９９７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。ＩＬ−２ムテインは、陽イオン交換、ゲル濾過、及び／または逆相液体クロマトグラフィーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉで産生される封入体から、または、所与のムテインを産生する哺乳動物または酵母培養物のいずれかに由来する馴化培地から、単離できる。
【０１４６】
ＩＬ−２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築する別の例示的な方法は、化学合成によるものである。これは、記載される特性を示すＩＬ−２ムテインをコードするタンパク質配列の、化学的手段によるペプチドの直接合成を含む。この方法は、ＩＬ−２の、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβ、及び／またはＩＬ−２Ｒγとの相互作用に影響を及ぼす位置に、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸の両方を組み込むことができる。あるいは、所望のＩＬ−２ムテインをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して、化学的手段により合成できる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のＩＬ−２ムテインのアミノ酸配列に基づき設計され、組換えムテインが産生されることになる宿主細胞に好ましいコドンを選択することが好ましい。この点に関しては、遺伝子コードが、縮重している−アミノ酸が複数のコドンによりコードされることがある−ことが十分に認識されている。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドンであるＴＩＣまたはＴＴＴによりコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによりコードされ、ｈｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによりコードされる。Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一のコドンであるＴＧＧによりコードされる。従って、特定のＩＬ−２ムテインをコードする所与のＤＮＡ配列に対して、そのＩＬ−２ムテインをコードすることになる多くのＤＮＡ縮重配列が存在するであろうことが理解されるであろう。例えば、図２に示されるムテイン５−２に好ましいＤＮＡ配列に加えて、示されるＩＬ−２ムテインをコードする多くの縮重ＤＮＡ配列が存在するであろうことが理解されるであろう。これらの縮重ＤＮＡ配列は、本開示の範囲内であるとみなされる。従って、本発明の文脈における「それらの縮重多様体」は、特定のムテインをコードし、それにより、これの発現を可能にする全てのＤＮＡ配列を意味する。
【０１４７】
ＩＬ−２ムテインの生物活性は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法によりアッセイできる。このようなアッセイは、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ増殖及びＮＫ細胞増殖を含む。
【０１４８】
治療法
一部の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテイン及び／またはそれらを発現する核酸は、対象に投与して、異常なアポトーシスまたは分化プロセスと関連する障害（例えば、能動または受動免疫を生成することにより、例えば、癌などの細胞増殖障害または細胞分化障害）を治療できる。このような疾患の治療では、開示されるＩＬ−２ムテインは、血管漏出症候群の低減などの有利な性質を有することがある。
【０１４９】
細胞増殖障害及び／または細胞分化障害の例としては、癌（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害、または造血新生物障害、例えば、白血病）が挙げられる。転移性腫瘍は、前立腺、結腸、肺、乳房、及び肝臓の腫瘍を含むがこれらに限定されない多数の原発性腫瘍型から生じる可能性がある。本発明の組成物（例えば、変異体ＩＬ−２ポリペプチド及び／またはそれらをコードする核酸分子）は、ウイルス（例えば、ＡＩＤＳまたはインフルエンザ）感染している患者にも投与することができる。
【０１５０】
変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、腎臓癌若しくは黒色腫、または任意のウイルス疾患を含む任意のタイプの癌に罹患している、これに罹患している疑いがある、または、これを発症する高いリスクがあり得る患者を治療するために使用できる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、及び卵巣の組織から形成するものが挙げられる。この用語は、癌性及び肉腫性組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。
【０１５１】
増殖性障害のさらなる例としては、造血新生物障害が挙げられる。
【０１５２】
増殖性障害及び／または分化障害の他の例としては、皮膚障害が挙げられる。皮膚障害は、真皮層、表皮層、または皮下層の細胞または細胞若しくは層の群の異常活性、あるいは、真皮−表皮接合部の異常を伴うことがある。例えば、皮膚障害は、ケラチノサイト（例えば、過剰増殖性の基底層及び基底層直上のケラチノサイト）、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、及び表皮層、例えば、基底層（発芽層）、有棘層、顆粒層、透明層、または角質層、のうちの１つ以上において見出される他の細胞の異常活性を伴うことがある。他の実施形態では、障害は、真皮層、例えば、乳頭層または網状層において見出される真皮細胞、例えば、真皮内皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞（例えば、マスト細胞またはマクロファージ）の異常活性を伴うことがある。
【０１５３】
皮膚障害の例としては、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（湿疹）、例えば、剥脱性皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、バラ色粃糠疹、類乾癬、苔癬状粃糠疹、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様紅皮症、角皮症、皮膚疾患、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、白斑、類天疱瘡（例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡）、蕁麻疹、汗孔角化症、関節包を覆う上皮関連細胞の過剰増殖及び炎症を伴う関節リウマチ；脂漏性皮膚炎及び日光皮膚炎などの皮膚炎；脂漏性角化症、老人性角化症、光線性角化症、光誘起角化症、及び毛包角化症などの角化症；尋常性ざ瘡；ケロイド及びケロイド形成に対する予防；母斑；疣贅、コンジローム、または尖圭コンジローマ、及び性病性疣贅などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を含む疣；白板症；扁平苔癬；及び角膜炎が挙げられる。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎若しくはアレルギー性皮膚炎、または乾癬である可能性がある。
【０１５４】
治療に適した患者は、乾癬も有することがある。「乾癬」という用語は、その医学的意味、つまり、主に皮膚が罹患し、隆起性、肥厚性、鱗屑性、非瘢痕性の病変をもたらす疾患という意味を有することが意図される。病変は通常、重なり合った光沢のある鱗屑で覆われた輪郭の鮮明な紅斑性丘疹である。鱗屑は通常、銀色またはわずかに乳白色である。爪の病変が頻繁に起こり、結果として爪の陥凹、剥離、肥厚、及び変色がもたらされる。乾癬は、関節炎と関連することがあり、麻痺性である場合がある。ケラチノサイトの過剰増殖は、表皮炎症及びケラチノサイトの分化の低減と共に乾癬性表皮過形成の重要な特徴である。乾癬を特徴づけるケラチノサイトの過剰増殖を説明するために、複数の機序が引き合いに出されている。細胞性免疫の障害は、乾癬の発症機序に関与している。乾癬性障害の例としては、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性（滴状）乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬（Ｖｏｎ  Ｚｕｍｂｕｓｃｈ型）、環状膿疱性乾癬、及び限局性膿疱性乾癬が挙げられる。
【０１５５】
患者に直接投与する方法に代えてまたはそれに加えて、一部の実施形態では、変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、エクスビボでの方法に使用できる。例えば、細胞（例えば、末梢血リンパ球、または患者から単離され、培養物中に静置若しくは維持される精製されたリンパ球の集団）は、インビトロの培養培地中で培養することができ、接触させるステップは、ＩＬ−２変異体を培養培地に添加することにより影響を受ける可能性がある。培養ステップは、例えば、増殖を刺激するため、または、目的の抗原（例えば、癌抗原またはウイルス抗原）に対し反応性がある細胞の集団を増殖させるために、細胞が他の薬剤で刺激または処理されるさらなるステップを含むことができる。次に、細胞は、処理された後に、患者に投与される。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−２アンタゴニストとして機能する主題のＩＬ−２ムテインは、１つ以上のＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５依存性の機能の抑制が有用である１つ以上の状態の治療に有用である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ−２ムテインアンタゴニストは、ＩＬ−２Ｒβ／ＩＬ−２Ｒγヘテロ二量化及び下流シグナル伝達の抑制が有用である１つ以上の疾患または状態（例えば、ＧＶＤＨまたは白血病）の治療に使用される。
【０１５７】
一実施形態では、治療の方法は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療のためのものである。一部の実施形態では、治療は、ＩＬ−２アンタゴニストである治療的有効量のＩＬ−２ムテインを、ＧＶＨＤに罹患している対象に投与するステップを含む。ＩＬ−２及びＩＬ−１５は、ＧＶＨＤに寄与することが知られている（（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３７：１８７４（１９８６）；及びＢｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５：８９４（２００５））。それ故、特定の動作理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載されるＩＬ−２アンタゴニストは、ＧＶＨＤの治療に有用であると考えられている。一実施形態では、ＧＶＨＤの治療のためのＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２ムテインのＩＬ−２Ｒγｃ受容体への結合を低減させる１つ以上の変異を含む（例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−２Ｒγｃ受容体結合を低減させる変異のうちの任意の１つ）。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を低減させる変異は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性がさらに減少したＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対するＩＬ−２ムテイン結合親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸変異（例えば、本明細書に記載されるようにＩＬ−２Ｒβ結合を増加させる変異のうちの任意の１つ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｑ１２６Ｔ、Ｓ１３０Ｒ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。
【０１５８】
別の実施形態では、治療方法は、ＩＬ−２及び／またはＩＬ−１５媒介性白血病の治療のためのものである。特定の実施形態では、白血病は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）である。ＡＴＬは、ＩＬ−２及びＩＬ−１５による自己分泌シグナル、ならびに、ＩＬ−９によるパラ分泌シグナルを伴う初期の成長段階を示すＣＤ４＋Ｔ細胞の悪性増殖を特徴とする。このようなサイトカイン依存性増殖は、急性ＡＴＬでなく、慢性ＡＴＬ及びくすぶり型ＡＴＬに罹患している患者において明らかである。それ故、特定の動作理論に束縛されるものではないが、ＩＬ−２パーシャルアゴニスト及びアンタゴニストは、白血病のこのような形態を治療するために使用できると考えられている。一部の実施形態では、治療は、ＩＬ−２アンタゴニストである治療的有効量のＩＬ−２ムテインを、成人Ｔ細胞白血病に罹患している対象に投与するステップを含む。一部の実施形態では、患者は、慢性ＡＴＬ及びくすぶり型ＡＴＬに罹患している。一実施形態では、ＡＴＬの治療のためのＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２ムテインのＩＬ−２Ｒγｃ受容体への結合を低減させる１つ以上の変異（例えば、本明細書に記載されるようなＩＬ−２Ｒγｃ受容体結合を低減させる変異のうちの任意の１つ）を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性を減少させる変異は、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ、及びＳ１３０Ｒを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２Ｒγｃ受容体の結合親和性がさらに減少したＩＬ−２ムテインは、野生型ＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２Ｒβに対するＩＬ−２ムテイン結合親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸変異（例えば、本明細書に記載されるようにＩＬ−２Ｒβ結合を増加させる変異のうちの任意の１つ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ−２ムテインは、アミノ酸置換Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｑ１２６Ｔ、Ｓ１３０Ｒ、Ｉ８６Ｖ、及びＩ９２Ｆを含む。
【０１５９】
医薬組成物及び投与方法
一部の実施形態では、主題のＩＬ−２ムテイン及び核酸は、医薬組成物を含む組成物に組み込むことができる。このような組成物は通常、ポリペプチドまたは核酸分子及び薬学的に許容される担体を含む。
【０１６０】
医薬組成物は、意図される投与経路と適合性があるように製剤化される。本発明の変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、経口投与されても良いが、非経口経路により投与されることになる可能性が高い。投与の非経口経路の例としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、及び直腸内投与が挙げられる。非経口用途に使用される溶液または懸濁液は、次の構成成分：注射用水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液、及び、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど等張性を調整するための薬剤を含むことができる。ｐＨは、一塩基性及び／若しくは二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で（例えば、約７．２〜７．８、例えば、７．５のｐＨに）調整できる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラス製若しくはプラスチック製の複数回投与のバイアルに封入できる。
【０１６１】
注射使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び、滅菌注射用溶液若しくは分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩液、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌であり、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在するような程度にまで流動性がなければならない。組成物は、製造及び保管条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対し保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体のポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合に必要とされる粒子サイズを維持すること、及び界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを使用することにより適正な流体性が維持できる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖；マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール；塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことにより、もたらされることができる。
【０１６２】
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中の必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つとまたはそれらの組み合わせと組み込み、続いて、濾過の滅菌処理をすることにより、調製できる。一般に、分散液は、基本的な分散媒、及び、上記で列挙されたものに由来する必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらは、任意のさらなる所望の成分を加えた活性成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から、生じる。
【０１６３】
経口組成物は、使用される場合、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口療法薬投与の場合、活性化合物は、賦形剤と組み込むことができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用できる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用される流動性担体を使用して調製できる。薬学的に適合性のある結合剤及び／または補助剤材料は、組成物の一部として含まれる可能性がある。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、次の成分または性質の類似する化合物：結晶セルロース、トラガカントゴム、若しくはゼラチンなどの結合剤；デンプン若しくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）、若しくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）などの滑沢剤；コロイド状の二酸化ケイ素などの滑剤；スクロース若しくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料などの着香剤のうちのいずれかを含有する可能性がある。
【０１６４】
吸入投与の場合、主題のＩＬ−２ムテインまたはそれらをコードする核酸は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧容器若しくはディスペンサー、または、ネブライザからのエアゾールスプレーの形態で送達される。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されるものが挙げられる。
【０１６５】
主題のＩＬ−２ムテインまたは核酸の全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものである可能性がある。経粘膜または経皮投与の場合、浸透されることになるバリアに適している浸透剤が、製剤に使用される。このような浸透剤は一般に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄薬、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用により、実施できる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野で一般に知られているような軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１６６】
一部の実施形態では、化合物（変異体ＩＬ−２ポリペプチドまたは核酸）はまた、（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を有する）坐剤または経直腸送達用の停留浣腸の形態で調製できる。
【０１６７】
一部の実施形態では、化合物（主題のＩＬ−２ムテインまたは核酸）はまた、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：６８９３，２００２）、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１００６−１０１０，２００２）、またはＰｕｔｎａｍ（Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．  Ｐｈａｒｍ．  ５３：１５１−１６０，１９９６，Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．  Ｐｈａｒｍ．  ５３：３２５，１９９６に正誤表）に記載された方法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている方法を使用するトランスフェクションまたは感染により投与できる。
【０１６８】
一実施形態では、主題のＩＬ−２ムテインまたは核酸は、インプラント及びマイクロカプセル化された送達系を含む放出制御製剤などの、身体からの迅速な排泄から、変異体ＩＬ−２ポリペプチドを保護することになる担体と調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーが使用できる。このような製剤は、標準的な技術を使用して調製できる。材料はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手できる。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染した細胞を標的とするリポソームを含む）リポソーム懸濁液はまた、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者らに知られている方法に従い調製できる。
【０１６９】
このような主題のＩＬ−２ムテインまたは核酸化合物の投薬量、毒性、及び治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用されても良いが、感染していない細胞への潜在的損傷を最小化して、それにより、副作用を低減するために、このような化合物を影響を受ける組織部位に向ける送達系を設計するように注意が払われるべきである。
【０１７０】
細胞培養物アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトに使用される幅広い投薬量を処方することに使用できる。このような化合物の投薬量は、毒性のほとんどないまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しても良い。本発明の方法で使用される任意の化合物の場合、治療有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定できる。用量は、細胞培養物中で決定さるようなＩＣ５０（すなわち、最大半量の症状の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方されても良い。このような情報は、ヒトの有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定しても良い。
【０１７１】
本明細書で定義されるように、主題のＩＬ−２ムテインの治療的有効量（すなわち、有効な投薬量）は、選択されるポリペプチドに依存する。例えば、患者体重１ｋｇ当たり約０．００１〜０．１ｍｇの範囲の単回投与量が投与できるが、一部の実施形態では、約０．００５、０．０１、０．０５ｍｇ／ｋｇが投与されても良い。一部の実施形態では、６００，０００ＩＵ／ｋｇが投与される（ＩＵは、リンパ球増殖バイオアッセイにより決定することができ、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  １ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２（ヒト）に定められた国際単位（ＩＵ）で表される）。投薬量は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）について規定されたものと同様であっても良いが、これよりも少ないと予測される。組成物は、１日おきに１回を含む、日に１回以上〜週に１回以上投与できる。当業者は、対象の、疾患若しくは障害の重症度、過去の治療、全般的な健康状態、及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されないある特定の因子が、対象を効果的に治療することに必要とされる投薬量及びタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の主題のＩＬ−２ムテインでの対象の治療は、単回治療を含むことができ、または一連の治療を含むことができる。一実施形態では、組成物は、５日間、８時間ごとに投与し、続いて、２〜１４日間、例えば、９日間、の休薬期間、続いて、さらに５日間、８時間ごとに投与する。
【０１７２】
医薬組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれる可能性がある。
【０１７３】
本明細書で提供される本発明のある特定の実施形態について記載する次の実施例が提供され、これらは、限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７４】
実施例１：酵母の表面におけるＩＬ−２の機能的発現
ＩＬ−２は既にバクテリオファージ上にディスプレイされている（Ｂｕｃｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３９：７９−８４，１９９７）が、従来の系は、指向的進化に従わず、それ故、ＩＬ−２Ｒのサブユニットに対する結合が改善されたＩＬ−２の変異体を得るのに好適でない。これを克服するため、ＩＬ−２を、酵母細胞の表面に発現させた。ヒトＩＬ−２ＤＮＡを、酵母ディスプレイベクターであるｐＣＴ３０２にクローニングした。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株ＥＢＹ１００を、ｐＣＴ３０２＿ＩＬ−２ベクターで形質転換し、ＳＤ−ＣＡＡプレート上３０℃で３日間成長させた。ＩＬ−２酵母の個別のコロニーを、ＳＤ−ＣＡＡ中３０℃で一晩成長させ、次に、２０℃で２日間ＳＧＣＡＡに導入した。酵母を、ビオチン化γの存在下で、四量体化ビオチン化ＩＬ−２Ｒβ、ビオチン化γ、またはビオチン化ＩＬ−２Ｒβで染色した。ＩＬ−２Ｒβ及びγの外部ドメインを、Ｃ末端でビオチン化し、染色及び選別試薬として使用されるフィコエリトリンコンジュゲートストレプトアビジンに連結させた。氷上で１５分間、２μΜのビオチン化ＩＬ−２Ｒβを、４７０ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベーションすることにより、ＩＬ−２Ｒβ四量体を形成した。これらの受容体「四量体」は、低親和性単量体外部ドメイン（ＥＣＤ）のＩＬ−２との相互作用の結合活性を強化して、ライブラリからのＩＬ−２多様体の最大限の回収を可能にした。溶体の野生型ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−２Ｒβ単独に弱く結合する、酵母により提示されるＩＬ−２は、γ単独には全く結合しないが、フローサイトメトリー（データは示さない）により見られる対角染色（ｄｉａｇｏｎａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）で証明されるように、ＩＬ−２Ｒβの存在下ではγに結合した。従って、酵母ディスプレイされるＩＬ−２は、可溶性のＩＬ−２に見られる、細胞上におけるヘテロ二量体受容体複合体の協調的アセンブリを繰り返し、それ故、ライブラリ選択のためのプラットフォームとして適する。
【０１７５】
実施例２：ＩＬ−２変異体ライブラリの構築及びスクリーニング
第１世代のインビトロ戦略は、ＩＬ−２遺伝子全体のエラープローンＰＣＲライブラリを作成することであった。第１世代の変異体ＩＬ−２ライブラリは、次のように構築した。野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を、製造者の使用説明書に従い、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩランダム変異誘発キットを使用するエラープローン変異誘発にかけた。次のプライマーを、エラープローンＰＣＲのために使用した：５’−ＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’（ＩＬ−２＿ｅｒｒｐｒｏｎｅ＿ｆｏｒ）及び５’−ＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’（ＩＬ−２＿ｅｒｒｐｒｏｎｅ＿ｒｅｖ）。次に、次のプライマー：５’ＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＣＴＡＧＣＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号３３）及び５’ＡＣＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号３４）を使用して、エラープローンＰＣＲ反応の生成物を増幅して、約１３０μｇのＤＮＡを得た。酵母ディスプレイベクターｐＣＴ３０２を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩでダブル消化し、ゲル精製した。エレクトロコンピテントＥＢＹ１００酵母と、ＩＬ−２ＤＮＡ及びｐＣＴ３０２ＤＮＡを、５：１のμｇ比で共に混合した。酵母を電気穿孔して、ライブラリＤＮＡの酵母への移入を容易にした。この電気穿孔を約２０回繰り返し、最終ライブラリサイズ１×１０８の形質転換体を得た。
第１世代のＩＬ−２ライブラリの選択：
ライブラリは、ＩＬ−２Ｒβに対する選択に６回かけた（図２Ａ）。第１回では、ライブラリを４７０ｎＭの四量体のＩＬ−２Ｒβで標識した。これは、２μＭのビオチン化ＩＬ−２Ｒβを４７０ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（ＳＡＶ−ＰＥ）と１５分間混合することにより形成した。ライブラリを、ＩＬ−２Ｒβと１．５時間インキュベーションし、ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水＋ウシ血清アルブミン）で洗浄し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  抗ＰＥ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓと４℃で２０分間インキュベーションした。細胞を再度洗浄し、選択用の磁気カラムに流した。ＩＬ−２Ｒβの濃度（２回目：１μＭ、３回目：１μＭ、４回目：３００ｎＭ、５回目：３００ｎＭ、６回目：１００ｎＭ、全て単量体ＩＬ−２Ｒβ）のみを変更して、この選択方法をさらに５回反復することに成功した。選択の終わりに、５回目及び６回目の酵母培養物をＳＤ−ＣＡＡプレート上に塗布し、これが、個別の酵母コロニーを生じた。得られる１８の酵母コロニーを、５００ｎＭのＩＬ−２Ｒβへの結合について試験した。これらの１８の酵母コロニーから単離されたＩＬ−２ＤＮＡを、配列決定した。これらの１８個の酵母コロニー間の、野生型ＩＬ−２の対応する残基と比較したアミノ酸の差異を、表１に示す。
【表１】
0006592505.tif 000034
第２世代のＩＬ−２ライブラリのライブラリ構築：
Ｌ８５Ｖを含有する高い割合のクローンに基づき、第２のＩＬ−２ライブラリを、主に疎水性のコア残基に焦点を当てて構築した。Ｑ７４、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｌ８５、Ｉ８６、Ｉ８９、Ｉ９２、Ｖ９３に変異を有する部位特異的ＩＬ−２ライブラリを構築した。Ｑ７４を、Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｒ／Ｓとして変化させた。Ｒ８１は、ＮＮＫ縮重コドンを伴う２０アミノ酸の全てで変化させた。ここで、Ｎは、アデニン、チミン、グアニン、及びシトシンヌクレオシドのそれぞれ２５％の混合物を表し、Ｋは、グアニンまたはチミンのいずれかである。残りの残基を、Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖとして変化させた。ライブラリを、次のオリゴを使用するアセンブリＰＣＲにより構築した。
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０１
【化３３】
0006592505.tif 000035
（配列番号３５）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０２
【化３４】
0006592505.tif 000036
（配列番号３６）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０３
【化３５】
0006592505.tif 000037
（配列番号３７）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０４Ｂ
【化３６】
0006592505.tif 000038
（配列番号３８）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０５Ｂ
【化３７】
0006592505.tif 000039
（配列番号３９）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０６
【化３８】
0006592505.tif 000040
（配列番号４０）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０７
【化３９】
0006592505.tif 000041
（配列番号４１）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０８
【化４０】
0006592505.tif 000042
（配列番号４２）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ０９
【化４１】
0006592505.tif 000043
（配列番号４３）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ１０
【化４２】
0006592505.tif 000044
（配列番号４４）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ１１
【化４３】
0006592505.tif 000045
（配列番号４５）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ１２
【化４４】
0006592505.tif 000046
（配列番号４６）
ＩＬ−２＿ａｆｆｍａｔ＿ａｓｓ１３
【化４５】
0006592505.tif 000047
（配列番号４７）
部位特異的ＰＣＲを、次のオリゴで増幅した。
ＰＣＲ増幅オリゴ（５０ｂｐ相同性を含む）
ＩＬ−２＿ｓｉｔｅ２＿ａｓｓＦｏｒ：
【化４６】
0006592505.tif 000048
ＩＬ−２＿ｓｉｔｅ２＿ａｓｓＲｅｖ：
【化４７】
0006592505.tif 000049
ＰＣＲは、４０μｇのＤＮＡを生成し、これを、ダブル消化されたｐＣＴ３０２及びエレクトロコンピテントＥＢＹ１００酵母と混合し、第１世代のライブラリと同様に電気穿孔した。
第２世代ＩＬ−２ライブラリの選択：
ライブラリを、ＩＬ−２Ｒβに対する選択に５回かけた（図２Ｂ）。使用されるＩＬ−２Ｒβの濃度（１回目：１μＭ、２回目：１００ｎＭ、３回目：３０ｎＭ、４回目：３０ｎＭ、５回目：１０ｎＭ、全て単量体ＩＬ−２Ｒβ）のみを変更して、この選択方法を、第１世代ライブラリと全く同様に、実施した。選択の終わりに、４回目及び５回目の酵母培養物をＳＤ−ＣＡＡプレート上に塗布し、これが、個別の酵母コロニーを生じた。両方の回からの４８の個別の酵母クローンを、９６ウェルブロックフォーマットで成長させ、５ｎＭのＩＬ−２Ｒβ、次に、ＳＡＶ−ＰＥで標識することによりスクリーニングした。スクリーニングにより、ＩＬ−２Ｒβへの７つの高親和性結合物が生じた（図３及び表２）。野生型ＩＬ−２の対応する残基と比較した、これらの７個の高親和性結合物間のアミノ酸の差異を、ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性と共に表２に示す。
【表２】
0006592505.tif 000050
【０１７６】
実施例３：ＩＬ−２ムテインタンパク質発現及び精製
ヒトＩＬ−２多様体（アミノ酸１〜１３３）、ＩＬ−２Ｒβ外部ドメイン（アミノ酸１〜２１４）、及びγｃ（アミノ酸３４〜２３２）を、Ｎ末端ｇｐ６７シグナル配列及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグとインフレームでｐＡｃＧＰ６７−Ａベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングし、バキュロウイルス発現系を使用して生成した。ＳＦ９００ＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞におけるトランスフェクション及び増幅により、バキュロウイルスストックを調製し、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｅｃｔ−ＸＰＲＥＳＳ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ）中で成長したＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標））細胞懸濁液中で、タンパク質発現を実施した。タンパク質を発現させ、ニッケルアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）により４８〜６０時間後のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）上清から捕捉し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーで濃縮及び精製した。ＳＰＲ及び細胞系アッセイに使用されるＩＬ−２多様体を、完全にグリコシル化させて発現させた。ビオチン化受容体発現の場合、ＩＬ−２Ｒβ及びγｃを、Ｃ末端ビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ及びヘキサヒスチジンタグと、ｐＡｃＧＰ６７−Ａベクターにクローニングした。受容体タンパク質を、過剰なビオチン（１００ｕＭ）を有するＢｉｒＡリガーゼと共に共発現させた。
【０１７７】
実施例４：ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋ナチュラルキラー（ＹＴ−１）細胞の刺激
１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、最小限の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で、ＹＴ−１細胞及びＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞を培養した。ＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞を、次のように精製した：１×１０７個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水＋２％のウシ血清アルブミン）で洗浄し、４℃で２０分間、ＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬ中、ＰＥとコンジュゲートした抗ヒトＣＤ２５（１：２０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。染色された細胞を、抗ＰＥ  ＩｇＧへと連結された常磁性マイクロビーズで標識し、製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用説明書に従い、ＬＳ  ＭＡＣＳ（登録商標）分離カラムにより分離した。溶出された細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中に１×１０５個の細胞濃度で再懸濁させ、後続の実験のために増殖させた。Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターを使用して、ＦＬ−２チャネルでのフローサイトメトリーで、細胞の濃縮をモニタリングした。
【０１７８】
フローサイトメトリーでＳＴＡＴ５リン酸化をアッセイすることにより、ＹＴ−１細胞に対するＨ９、Ｄ１０、及び６−６の用量−反応関係を決定した（図４Ａ及び４Ｂ）。ＣＤ２５＋またはＣＤ２５−ＹＴ−１細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、９６ウェルプレート内のＦＡＣＳ緩衝液２００μＬ中で、示された濃度の野生型、６−６、Ｈ９、またはＤ１０と再懸濁させた。細胞を、室温で２０分間刺激し、次いで、ホルムアルデヒドを１．５％まで添加することにより固定し、１０分間インキュベーションした。細胞を、氷上で２０分間、１００％の氷冷メタノールで透過処理した後、−８０℃で一晩インキュベーションした。固定され、透過処理された細胞を、過剰なＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２０に希釈された、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート抗ＳＴＡＴ５  ｐＹ６９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）５０μＬと２０分間インキュベーションした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーターのＦＬ−４チャネルを使用して、平均細胞蛍光を決定した。
【０１７９】
ＩＬ−２の十分に特徴づけられた変異（４２位のフェニルアラニンをアラニンにした（Ｆ４２Ａ））を利用することにより、ＩＬ−２ムテイン（いわゆる「スーパー２」分子）のＣＤ２５非依存性を、さらに試験した。この変異（Ｆ４２Ａ）は、ＣＤ２５への結合を消滅させるが、ＩＬ−２ＲβまたはＩＬ−２Ｒγに結合する能力に影響を及ぼさない（Ｍｏｔｔ，１９９５）。この変異を、Ｈ９ムテインにも導入して、Ｈ９  Ｆ４２Ａを得た。ＩＬ−２、ＩＬ−２  Ｆ４２Ａ、Ｈ９、及びＨ９  Ｆ４２Ａによる、ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞に対するＳＴＡＴ誘導の比較を実施した（図５）。ＩＬ−２  Ｆ４２Ａ変異は、ＣＤ２５＋細胞に対する野生型ＩＬ−２の用量−反応曲線を約１ｌｏｇだけ右側にシフトさせたが、このＦ４２Ａ変異は、ＣＤ２５−細胞におけるＳＴＡＴ誘導に対する観察可能な影響がなかった（図５Ａ）。これに対して、Ｈ９及びＨ９  Ｆ４２Ａの用量−反応曲線は、ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋細胞の両方で実質的に重なり合った（図５Ｂ）。従って、これらの実験は、ＩＬ−２ムテインが、ＣＤ２５の存在から明らかに利益を受けないが、それらの活性は、ＣＤ２５の界面を破壊する変異に対して反応しないことを実証する。
【０１８０】
実施例５：ＣＤ２５−及びＣＤ２５＋Ｔ細胞の刺激
ヒト及びマウスのＣＤ４Ｔ細胞を、ＰＢＭＣ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）ならびにＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓及びリンパ節から、それぞれ、抗体でコーティングされたＣＤ４  Ｔ細胞単離磁気ビーズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ及びＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して調製した。ナイーブ細胞刺激アッセイの場合、細胞を即座に使用した。「経験のある（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ）」Ｔ細胞のインビトロ生成の場合、１００ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ヒトの場合ＯＫＴ３、マウスの場合２Ｃ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプレートをコーティングする前に、ウェルを、ｐＨ９．６の重炭酸緩衝液中の二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）でプレコーティングした。Ｔ細胞を、可溶性の抗ＣＤ２８（ヒトの場合ＣＤ２８．２、マウスの場合３７．５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、０．１×１０６個の細胞／ウェルで播種した。細胞を、刺激された完全ＴＣＲと３日間培養した後、馴化培地中に２日間静置し、新鮮な培養培地中に２日間静置した。使用前に、生細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ−Ｍ（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）遠心分離で回収し、計数した。
【０１８１】
ＣＤ２５の発現不全またはＣＤ２５の発現のいずれかであるＴ細胞上のＩＬ−２ムテインの活性を評価した（図６）。野生型ＩＬ−２及び６つのＩＬ−２ムテインの用量−反応関係を、１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲のタンパク質濃度において、ＳＴＡＴ５リン酸化についてアッセイした。ＩＬ−２ムテインの、ＣＤ２５欠損Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する能力は、それらのＩＬ−２Ｒβに対する親和性とよく相関した。ＩＬ−２ムテインによるＳＴＡＴ５リン酸化の増加は、ＩＬ−２より２桁大きかった。
【０１８２】
大量の完全ＩＬ−２受容体複合体、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒα）、ＩＬ−２Ｒβ、及びγｃを発現する経験のあるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する、ＩＬ−２ムテインの能力も評価した（図７）。ヒトＣＤ４  Ｔ細胞をインビトロでＴＣＲ刺激し、静置して、「経験のある」ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔリンパ球を生じさせた。１ｎｇ／ｍＬでは、ＳＴＡＴ５リン酸化の差異がほとんど観察されなかった。野生型を含む各ＩＬ−２多様体は、９０％を超える細胞を刺激した。０．１ｎｇ／ｍＬでは、小さな差異が観察された。野生型ＩＬ−２は、４８％のｐＳＴＡＴ５刺激をもたらし、ＩＬ−２ムテインは、６５〜７９％のｐＳＴＡＴ５刺激を生じた。それ故、ＩＬ−２ムテインは、経験のあるヒトＴ細胞を、野生型ＩＬ−２よりも、明らかによく刺激するが、この強化は、ＣＤ２５を欠く細胞においての強化程、顕著ではない。
【０１８３】
実施例６：ＮＫ細胞の細胞傷害アッセイ
ＥＧＦＲ（内皮成長因子受容体）発現扁平上皮癌細胞株（ＳＣＣ６）及びＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブを使用して、ナチュラルキラー細胞の機能、特に、自発的な抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）におけるＤ１０  ＩＬ−２ムテインの効果を評価した。ヒトＥＧＦＲ＋扁平上皮癌細胞株ＳＣＣ６を、Ｊ．Ｓｕｎｗｏｏ研究室（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）から供与された。１０％の加熱不活性化したＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、ＳＣＣ６細胞株を培養した。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で、培養液中に付着させて成長させた。セツキシマブ（マウスキメラＩｇＧ１抗ヒト上皮成長因子受容体−ＥＧＦＲ、ＩＭＣ−Ｃ２２５、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））を、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから入手した。
【０１８４】
クロム放出を、次のように実施した：約１×１０９個の細胞を含有する健康なドナーの白血球除去システム（ＬＲＳ）生成物から、ＮＫ細胞を単離した。製造者の使用説明書に従い、ＮＫ細胞単離ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用するネガティブ磁気細胞選別により、ＮＫ細胞を単離した。ＮＫ細胞を純度（ＣＤ３−ＣＤ５６＋フローサイトメトリーにより規定される＞９０％の純度）について評価した。ＳＣＣ６標的細胞を、細胞１×１０６個当たり１５０μＣｉの５１Ｃｒで２時間標識した。培地単独中で、セツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）中で、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）中で、ＩＬ−２  Ｄ１０（１ｐｇ／ｍＬ）中で、ＩＬ−２  Ｄ１０（１０ｐｇ／ｍＬ）中で、または、ＩＬ−２（１０００ＩＵ／ｍＬ）を加えたセツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２Ｄ１０（１ｐｇ／ｍＬ）を加えたセツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）、若しくはＩＬ−２Ｄ１０（１０ｐｇ／ｍＬ）を加えたセツキシマブ（１００ｐｇ／ｍＬ）を含む、組み合わせ中で、５１Ｃｒ標識されたＳＣＣ６細胞と、０：１、１：１、及び５：１の可変のエフェクター細胞：標的細胞比で、精製されたＮＫ細胞を５時間培養した後に、細胞溶解率を決定した。アッセイを、３回実施した。精製されたＮＫ細胞を、種々の濃度のセツキシマブ、ＩＬ−２またはＩＬ−２  Ｄ１０の存在下または不存在下で、５１Ｃｒ標識ＳＣＣ６細胞と培養した。Ｄ１０によるＮＫ細胞の自発的細胞傷害の刺激は、高用量のＩＬ−２（図８、＊ｐ＝．００８、＊＊ｐ＝．００１）を上回り、ＩＬ−２またはＤ１０による刺激のない自発的細胞傷害は最小限であった。セツキシマブ結合ＳＣＣ６のＡＤＣＣを、高用量のＩＬ−２またはセツキシマブ単独と比較して、Ｄ１０による刺激で同様に増加させた（＊ｐ＝．０００５、＊＊ｐ＝．０００１）。特に、Ｄ１０を高用量のＩＬ−２と比較して、細胞傷害（自発的な細胞傷害及びＡＤＣＣの両方）のより高い機能強化が、１：１を含む、全てのエフェクター：標的比において生じた。
【０１８５】
実施例７：ＩＬ−２ムテインは、抑制型Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の比較的低い刺激で、メモリー表現型増殖の強化をもたらす。
低レベルのＣＤ２５を発現するが、高レベルのＩＬ−２Ｒβγを発現するメモリー表現型ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖におけるＩＬ−２ムテインＨ９の効能を、インビボで評価した。Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、ＰＢＳ、２０μｇのＩＬ−２、２０μｇのＨ９、または１．５μｇのＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体複合体のいずれかを投与され、脾臓のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉｇｈメモリー表現型Ｔ細胞の全細胞数を、フローサイトメトリーで評価した。脾臓細胞懸濁液を調製し、蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５（クローンＰＣ６１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＴｈｙ１．１（クローンＨＩＳ５１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。少なくとも１００，０００個の生存細胞を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩフローサイトメーターを使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｉＳｔａｒ，  Ｉｎｃ．）を使用して解析した。図１０Ａに示されるように、開示されるＩＬ−２ムテインでの治療は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴ細胞である制御性Ｔ細胞の増殖は制限されながら、他の治療法と比較して、メモリー表現型Ｔ細胞のより大きい増殖をもたらした（図１０Ｂ）。
【０１８６】
実施例８：ＩＬ−２ムテインのインビボ毒性の低減
ＩＬ−２治療は、急性肺浮腫などの重度の有害な影響をもたらす可能性があることが知られており、これは、現時点では、ＩＬ−２の有効な使用を妨げる制約となっている。従って、ＩＬ−２と比較した、開示されるＩＬ−２ムテインの毒性を評価した（図１１Ａ）。Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、ＰＢＳ、ＩＬ−２  ２０μｇ、Ｈ９  ２０μｇ、または１．５μｇのＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体複合体の毎日の腹腔内注射を、５日間連続して受けた。養子細胞移入の６日後、肺を取り出し、真空下５８℃で一晩乾燥する前後で計量した。肺の湿潤重量は、脱水後の肺重量から初期の肺重量を差し引くことにより計算した。
【０１８７】
実施例９：インビボでのＩＬ−２ムテインの抗腫瘍活性の増加
開示されたＩＬ−２ムテインの腫瘍細胞に対する効能を、インビボで試験した。１００μｌのＲＰＭＩ中の１０６個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、マウス（群当たり３〜４匹のマウス）の背部の真皮上層に注射した。治療は、ＰＢＳ、２０μｇのＩＬ−２、２０μｇのＨ９、または１．５μｇのＩＬ−２／抗ＩＬ−２モノクローナル抗体複合体（ＩＬ−２／ｍＡｂ）のいずれかの毎日の注射５回からなり、腫瘍小塊が約１５ｍｍ２のサイズではっきりと目に見え、かつ触知できた１日後に開始した。開示されるＩＬ−２ムテインは、図１１Ｂで実証されるように、インビボでの抗腫瘍活性の強化をもたらした。
【０１８８】
実施例１０：ＩＬ−２ムテイン及びＩＬ−２の構造比較
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、ＩＬ−２ムテインのＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性及び反応速度を測定するために、ＩＬ−２ムテインのうちのいくつかを組換え発現させた。ＩＬ−２及びＩＬ−２Ｒβ間の親和性は、ＫＤ＝２８０ｎＭであった。ＩＬ−２ムテインを、低親和性、中親和性、及び高親和性のクラスにクラスタリングした。低親和性ＩＬ−２ムテイン（５−２及び６−６）は、それぞれ、５０〜７０ｎＭのＫＤでＩＬ−２Ｒβと結合し、野生型ＩＬ−２の４〜６倍の親和性の獲得は、ほぼ完全にＬ８５Ｖ置換によるものであった。第２の部位特異的ライブラリから選択された中親和性及び高親和性変異体は、それぞれ、１０〜１５ｎＭ（Ｃ５、Ｈ４）及び１．２〜１．７ｎＭ（Ｂ１、Ｄ１０、Ｅ１０、Ｇ８、Ｈ９）のＫＤを有した。親和性の増加は、オフレートの減少に一様に現れ、高親和性のＩＬ−２ムテインは、Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ８６Ｖ／Ｉ９２Ｆのうちの無作為の位置にコンセンサス配列を含有した。
【０１８９】
ＩＬ−２ムテインの構造的結果を理解するために、Ｄ１０ムテイン、ならびに、ＩＬ−２Ｒβ及びγｃに結合されたＤ１０の三元複合体を結晶化させた。Ｄ１０単独の構造では、６つの変異のうちの５つが、Ｂ−Ｃループ上及びＣヘリックスコア内に、ＩＬ−２Ｒβに接触しない位置で、クラスタを形成する。特に、Ｂ−Ｃヘリックスのリンカー領域は、電子密度マップにおいて、この領域が部分的にまたは完全に無秩序である他のＩＬ−２と比較して秩序立っている（図９）。全体的に、Ｆ８０、Ｖ８５、及びＶ８６の置換は、ループを安定させ、Ｃヘリックスを分子のコアに「ピン止め」して、ヘリックスＢを充填する疎水性クラスタへと陥没したように見える。Ｈ７４及びＤ８１変異は、溶媒に曝露されており、従って、それらの構造的役割はそれほど明らかではないが、Ａｓｐは、ヘリックスＣ構造にさらに寄与することができる、よく知られているヘリックスＮキャッピング残基である。６つのコンセンサス変異のうちの１つ、Ｉ９２Ｆのみが、受容体複合体においてＩＬ−２Ｒβに接触する位置にあった。Ｐｈｅ９２は、ＣヘリックスとＡヘリックスとの間に深く挿入され、Ｉｌｅ９２と比較して、複合体のＩＬ−２Ｒβに覆われる分子表面のさらなる１０Å２だけ寄与するに過ぎない。従って、そのＩＬ−２Ｒβ接触は、全体で約３００倍のＤ１０の親和性の獲得に、わずかに寄与する可能性がある。
【０１９０】
Ｄ１０三元受容体複合体の低解像度（３．８Å）の構造も決定して、変異がＩＬ−２Ｒβ／γｃ受容体の結合形状を混乱させているかどうかを評価した。Ｄ１０及びＩＬ−２Ｒβの安定的な三元複合体を結晶化させ、ＣＤ２５の不存在下で精製した。Ｄ１０三元複合体における全体のＩＬ−２Ｒβ／γｃヘテロ二量体アーキテクチャ及びサイトカイン／ＩＬ−２Ｒβ接触の様式は、既に報告されている四元アセンブリの場合と実質的に同一である。従って、スーパー２の効能増加は、受容体二量体アーキテクチャの構造変化に起因するものではなく、親和性の強化に起因する可能性がある。
【０１９１】
上述したように、ＩＬ−２のＣヘリックスは、二元及び四元複合体の両方に見られるように、ＩＬ−２Ｒαへの結合時に微細な再配置を受けるように見える。対照的に、ＰＤＢデータベースにおいて、３つの野生型のリガンド結合していない構造を検査することにより、Ｃヘリックスの位置のばらつきが明らかになり、このことは、分子の残りの部分と比較して、このヘリックスのより高いＢ因子と一致する。Ｄ１０の構造の、リガンド結合していないＩＬ−２及び受容体複合体におけるＩＬ−２の構造との比較が行われた。Ｄ１０のＣヘリックスが、遊離形態よりも、ＩＬ−２の２つの受容体が結合したコンフォメーションに見られるものとより類似し、ヘリックスコアの上方及び内部にシフトされていることが観察された。
【０１９２】
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを使用して、ＩＬ−２ムテインがＩＬ−２Ｒβに対するより高い結合親和性を与えられる機構を調べた。ＩＬ−２対ＩＬ−２ムテインの相対的なコンフォメーションの可撓性を精査するために、原子レベルの精密なマルコフ状態モデル（ＭＳＭ）を構築した。このＭＳＭにおける状態は、原子論的シミュレーションから得られる急速に相互変換するコンフォメーションの動態クラスタリングに由来する。これらの準安定状態のそれぞれは、系の構造及び動態を最終的に決定する根本的な自由エネルギー状況における極小値に対応する。ＭＳＭの分析は、ＩＬ−２ムテインが、ＩＬ−２よりも安定であることができ、ＩＬ−２が、ＩＬ−２ムテインのほぼ２倍のクラスタを与えることを実証する。例えば、ＩＬ−２ムテインの最も密度の高い状態（ｍｏｓｔ  ｐｏｐｕｌａｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）は、平衡確率が、ＩＬ−２の場合の約０．０５と比較して、約０．２０である。ＩＬ−２ムテインのヘリックスＢ、Ｂ−Ｃループ、及びヘリックスＣは、ＩＬ−２と比較して剛直化される。発生した変異は、Ｂ−Ｃループ内（Ｈ７４、Ｄ８１）上に、及びＢ及びＣヘリックスとの充填界面内（Ｆ８０、Ｖ８５、Ｖ８６）に存在するので、ヘリックスＣのみでなく、両方のヘリックスが、変異から利益を受け、集合的安定化を受ける。Ｆ９２は、ヘリックスＣとヘリックスＡとの間の分子くさびとして作用し、ヘリックスのよりＣ末端側でさらなる安定化の影響として作用すると考えられる。ＭＤシミュレーションが、ヘリックスＢを、スーパー２においてさらに安定化されることの原因であると示唆することは、驚きであった。というのは、このことは、ＩＬ−２の結晶構造の比較からは明らかでなかったからである。ＩＬ−２Ｒαは、主にＢヘリックス及びＤヘリックスの一部で、ＩＬ−２に結合する。ＭＤシミュレーションは、ＩＬ−２ＲαのＩＬ−２への結合は、ヘリックスＢを剛直化することがあり、この構造的安定化は、Ｂ−Ｃループ及びヘリックスＣへと伝播し得る可能性を示唆する。原理的には、ＩＬ−２ムテイン中の変異の明白な効果と同様である。
【０１９３】
最も密度の高いコンフォメーションを各タンパク質のシミュレーションから視覚化すると、ヘリックスＣは、ＩＬ−２ムテインよりも、ＩＬ−２において可撓性が大きいことが示され、ＩＬ−２ムテイン中の変異が、受容体結合様コンフォメーションを実際に安定化させることも示される。
【０１９４】
実施例１１：パーシャルＩＬ−２アゴニスト及びアンタゴニスト
ＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性の強化により、作用が増大するＩＬ−２「スーパーカイン」は、以前に開発された（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９（２０１２））。この高親和性スーパーカイン／ＩＬ−２Ｒβ複合体が、内因性のシグナル伝達を遮断する「受容体シグナル伝達クランプ」を生成するドミナントネガティブなスカフォールドとして役立つことができると仮定された。γｃへの結合を減少させる、これらのスーパーＩＬ−２「完全アゴニスト」の定方向変異は、ＩＬ−２Ｒβγｃのヘテロ二量化を減弱させ、作用機序に基づいたＩＬ−２パーシャルアゴニスト、及び、内因性サイトカインを遮断し、それ自身の作用はなんら発揮しないことによりアンタゴニストとして機能的に作用する非シグナル伝達（ニュートラル）分子の新しいクラスを表すであろう（図１の概略図を参照のこと）。
【０１９５】
ＩＬ−２−ＩＬ−２Ｒ結晶構造に基づいて、ＩＬ−２γｃ界面での４つの重要な残基を特定し（図１２Ａ）、Ｈ９多様体を生じ、各Ｈ９多様体は、１つ（Ｑ１２６[Ｔ]）、２つ（Ｌ１８[Ｒ]、Ｑ２２[Ｅ]）、３つ（Ｌ１８[Ｒ]、Ｑ２２[Ｅ]、及びＱ１２６[Ｔ]）、または４つ（Ｌ１８[Ｒ]、Ｑ２２[Ｅ]、Ｑ１２６[Ｔ]、及びＳ１３０[Ｒ]）の変異（新しく導入されたアミノ酸に基づいて、それぞれ、Ｈ９−Ｔ、Ｈ９−ＲＥ、Ｈ９−ＲＥＴ、及びＨ９−ＲＥＴＲと表記される）を含有する。（訳者注：上記で[  ]で囲まれている箇所はＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７６３５では下線が引かれた文字である。）表面プラズモン共鳴により、組換えＨ９及びＨ９−ＲＥＴタンパク質は、ＩＬ−２Ｒβに対する類似した親和性を有する。しかし、これに対して、Ｈ９−ＩＬ−２Ｒβ複合体が、γｃと効率的に結合した（図１２Ｂ）が、Ｈ９−ＲＥＴ−ＩＬ−２Ｒβは、結合しなかった（図１２Ｃ）。
【０１９６】
Ｈ９多様体の活性を測定するために、ＮＫ様ＹＴ−１細胞のＣＤ２５＋及びＣＤ２５−亜集団を精製し、シグナル伝達を定量した。Ｈ９変異体は、ＩＬ−２パーシャルアゴニストとして挙動し、ＳＴＡＴ５のリン酸化の野生型Ｅｍａｘ（最大可能効果）レベルの約９０％から約１０％までの幅広いシグナル伝達効力を生じ（図１３Ａ）、各類似体に対する活性のレベルは、γｃ界面での変異の程度と逆相関する。ＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞（図１３Ｂ）対ＣＤ２５−ＹＴ−１細胞（図１３Ｃ）上のＨ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲに対する相対Ｅｍａｘ値により実証されるように、シグナル伝達効能は、ＩＬ−２Ｒαに相対的に依存せず、ＩＬ−２Ｒβ及びγｃへの変更された結合が、Ｈ９多様体の挙動の主な原因になったことを示唆した。
【０１９７】
Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲは、ＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞のｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２を含む他のＩＬ−２シグナル伝達経路の誘導の減少も示した（図１４Ａ）。受容体の内在化が、シグナル伝達における重要なイベントであるので、ＩＬ−２多様体に応答するＹＴ−１細胞におけるＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγの表面発現も評価した。ＩＬ−２及びＨ９のように、Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲの両方は、ＩＬ−２Ｒβの内在化を急速に引き起こし、完成させる（図１３Ｂ）が、これらのパーシャルアゴニストは、γｃの内在化を促進することにおいて、極めて効率が低く（図１３Ｃ）、このことは、γｃへの結合の減少と一致する。従って、Ｈ９のγｃ結合界面を可変的に撹乱すると、豊富なレパートリーのシグナル伝達の効果を潜在的に有する種々のＩＬ−２パーシャルアゴニストを得ることができる。
【０１９８】
次に、初代細胞におけるこれらの分子の効果を分析した。Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲのいずれもが、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５を誘導できなかったことが判明した（図１３、Ｅ及びＦ、上パネル）。このＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞よりも少ないＩＬ−２Ｒβ及びＩＬ−２Ｒγを発現し（図１４ｂ、上パネル対下パネル）、ＩＬ−２Ｒαをほとんどまたは全く発現しない（図１３Ｅ、左上パネル）。しかし、驚くべきことに、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化後に、Ｈ９−ＲＥＴは、ＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路のメンバーである、ＳＴＡＴ５（図１３Ｅの右下パネル；図１３Ｆの下パネル；図１３Ｇ）及びＳ６リボソームタンパク質（図１３Ｈ）の弱い／部分的リン酸化を誘導することができる。一方、Ｈ９−ＲＥＴＲは本質的に不活性のままであった。興味深いことに、Ｈ９−Ｔは、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５を著しく誘導し（図１３Ｅの右上パネル）、これは、予め活性化されたＴ細胞において顕著に増加したが、それでも、ＩＬ−２、Ｈ９、またはＨ９−ＲＥで観察されたレベルまではない（図１３Ｅの右下パネル、及び図１３Ｇ）。従って、Ｈ９−Ｔ及びＨ９−ＲＥＴは、真のパーシャルアゴニストを連想させる中程度の活性を示す。
【０１９９】
Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲにより誘導される弱いｐＳＴＡＴ５発現を前提として、リンパ球増殖におけるこれらの分子の効果をさらに調べた。ＩＬ−２及びＨ９は、初代ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を強く誘導し、Ｈ９−Ｔは、その効果が中程度であったが、Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲのいずれもが、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）希釈（図１５）または［３Ｈ］チミジン取り込み（図１６Ａの上パネル）により評価される場合に、これらの細胞の増殖を誘導しなかった。しかし、予め活性化された細胞が使用された時に、Ｈ９−ＲＥＴＲは、依然として効果がないが、Ｈ９−ＲＥＴは、増殖を再現可能に誘導して（図１６Ｂの下パネル）、Ｈ９−ＲＥＴが、別の細胞サブセットにおける、異なる機能的結果を誘導できることを明らかにした。このことは、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞対予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５上のＨ９−ＲＥＴの異なる効果と一致する（図１３Ｅ）。予想されるように、ＩＬ−２及びＨ９は、予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２Ｒα発現を強力に誘導でき、Ｈ９−Ｔは、ＩＬ−２Ｒα誘導のレベルが中程度であった。一方、Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲは、ＩＬ−２Ｒα発現を、実際に対照レベル以下まで著しく減少させ、このことは、おそらく、内因性ＩＬ−２との強力な競合を反映している（図１７）。次に、ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して、予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲの弱い作用に対する条件をさらに明らかにした（図１６、Ｂ及びＣ）。予想されるように、ＩＬ−２及びＨ９は、細胞周期を制御するか、またはサイトカインシグナル伝達に関与する遺伝子（例えば、ＣＣＮＤ２、ＩＬ２ＲＡ、ＣＩＳＨ、及びＣＤＫ６）を誘導したが、多くの他の遺伝子（例えば、ＩＬ７Ｒ，ＢＣＬ６）を抑制した。一方、Ｈ９−ＲＥＴは、弱い刺激活性しか有せず、Ｈ９−ＲＥＴＲは、ほとんど効果がなく（図１６Ｂ及び表Ｓ１）、完全アゴニストシグナルとパーシャルアゴニストシグナルとの間の、遺伝子発現における定量的差異及び定性的差異の両方を明らかにした。ＩＬ−２及びＨ９は、抑制するよりも多くの遺伝子を誘導し、一方、Ｈ９−ＲＥＴＲは、全体的な効果が最小であったが、誘導するよりも多くの遺伝子を抑制した（図１６Ｃ）。ＳＴＡＴ５は、ＩＬ−２誘導性転写の重要なメディエーターであり、クロマチン免疫沈降、及び次世代塩基配列決定（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）を使用して、ゲノムＳＴＡＴ５結合を全体的に評価した。Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲ誘導性ＳＴＡＴ５のコンセンサスＴＴＣｎｎｎＧＡＡモチーフへの結合を、ＩＬ−２またはＨ９のいずれかで観察したよりも、より少ない部位で、観察した（図１６Ｄ）。ヒートマップクラスタリングに基づいて、わずか約３５％のＩＬ−２誘導性ＳＴＡＴ５部位を、Ｈ９−ＲＥＴでも誘導し、一方、Ｈ９−ＲＥＴＲはほとんど効果がなかった（図１６Ｅ）。ＩＬ−２及びＨ９により予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるいくつかのＳＴＡＴ５標的遺伝子の誘導（ＩＬ２ＲＡ、ＣＩＳＨ、ＬＴＡ）または抑制（ＩＬ７ＲＡ、ＢＣＬ６）は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認された（図１６Ｆ）。一方、Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲのいずれもが、興味深いことに、ＲＥＴＲとは異なり、ＲＥＴがＢＣＬ６発現を再現可能に低下させたことを除いて効果がなかった（図１６Ｆ）。
【０２００】
上記の研究により、事実上、ＩＬ−２のドミナントネガティブなアンタゴニストであるＨ９−ＲＥＴの活性の減少及びＨ９−ＲＥＴＲのごくわずかの活性を確認した。予め活性化されたＴ細胞上でのＩＬ−２Ｒβへの結合及びＩＬ−２Ｒα発現を減少させる能力の強化を前提として、これらの分子が、ＩＬ−２Ｒβ及びγｃによってもシグナル伝達する内因性ＩＬ−２だけでなくＩＬ−１５も阻害するであろうことが仮定された。確かに、Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲの両方は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２誘導性（図１８Ａ）及びＩＬ−１５誘導性（図１８Ｂ）ｐＳＴＡＴ５を阻害し、Ｈ９−ＲＥＴＲは、より強力であった。Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲ処理によるｐＳＴＡＴ５の阻害は、それによりＴＣＲ誘導性（図１７）及びＩＬ−２誘導性（図１９Ａ）ＣＤ２５発現が、刺激されていない対照細胞で観察されたもの以下のレベルへ低下したことと相関した。それに対応してＨ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲは、ＩＬ−２誘導性ＩＬ２ＲＡ  ｍＲＮＡ発現（図１９Ｂ）ならびに予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２誘導性及びＩＬ−１５誘導性増殖（図１９Ｃ）を阻害した。
【０２０１】
Ｈ９−ＲＥＴＲが、ＩＬ−２シグナル伝達を阻害するので、Ｈ９−ＲＥＴＲが、ＩＬ−２に依存するＴＣＲ誘導性細胞増殖も阻害するであろうことが推測され、これは実際に事実であり（図２０Ａ）、ＣＤ２５発現の減少と相関性があった（図２０Ｂ）。同様に、ＩＬ−２がＴｈ１、Ｔｈ９、及びＴｒｅｇ分化を促進できるが、Ｔｈ１７分化を阻害でき（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：１３（２０１３））、これらのプロセスにおけるＨ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲの効果を試験した。驚くべきことに、Ｈ９−ＲＥＴ及びＨ９−ＲＥＴＲの両方が、Ｔｈ１、Ｔｈ９、及びＴｒｅｇ分化を阻害したが、Ｔｈ１７分化を増大させて（図２１）、ＩＬ−２の強力なアンタゴニストとしての作用を明白に示した。
【０２０２】
ＩＬ−２誘導性ＣＤ６９発現（図２２Ａ）ならびに乳癌細胞株ＨＥＲ１８（図２２Ｂ）及び慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（図２２Ｃ）に対する細胞傷害で測定される場合、ＩＬ−２による初代ヒトＮＫ細胞の活性化も、Ｈ９−ＲＥＴＲで強力に遮断した。Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲのいずれもが、初代ＮＫ細胞でのＣＤ６９発現または細胞傷害を刺激しなかった（図２２Ａ）。
【０２０３】
実施例１２：パーシャルＩＬ−２アゴニスト及びアンタゴニスト−インビボでの効果
インビトロのＩＬ−２／ＩＬ−１５アンタゴニストとしてのＨ９−ＲＥＴＲの有効性を前提として、発明者らは、インビボでの内因性サイトカインの効果に拮抗する能力を調べた。ＩＬ−２が、短い血清半減期を有するので（Ｂｏｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：１８０（２０１２））、Ｈ９−ＲＥＴＲを、抗体依存性細胞傷害／食作用（ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ）が減少したアイソタイプであるヒトＩｇＧ４のＦｃフラグメント（Ｆｃ４）に融合させた（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：６８５  （２００９））。驚くべきことに、ＣＤ２５に対する抗Ｔａｃ  ｍＡｂ及びＩＬ−２Ｒβに対するＭｉｋβ１  ｍＡｂ（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：４０１（２００６））と比較された場合、Ｈ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４は、予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＩＬ−２媒介性（図１８Ｃ）及びＩＬ−１５媒介性（図１８Ｄ）ｐＳＴＡＴ５誘導を非常により強力に遮断し、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＬ−２誘導性（図１８Ｅ）及びＩＬ−１５誘導性（図１８Ｆ）増殖を遮断した。重要なことに、Ｈ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４は、ＩＬ−２増殖を遮断することにおいて、抗Ｔａｃ及びＭｉｋβ１の組み合わせと同程度の有効性があり（図１８Ｅ）、ＩＬ−１５誘導性増殖を阻害することにおいて、Ｍｉｋβ１よりもより強力であった（図１８Ｆ）。
【０２０４】
次に、インビボでのＨ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃの有効性を評価した。定常状態条件下で、Ｔｒｅｇ細胞は、高親和性ＩＬ−２受容体を発現する初代細胞の優性集団であり、ＩＬ−２のシグナル伝達の体系的な「バロメータ」として作用できる。ＩＬ−２またはＩＬ−１５の投与前に、Ｈ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４でのマウスの前処理は、エクスビボで評価した場合、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞においてＳＴＡＴ５のリン酸化を有意に阻害して（図２３及び図１８Ｇ）、ＩＬ−２アンタゴニストとしてのＨ９−ＲＥＴＲ−のＦｃ４のインビボでの可能性を示した。ＩＬ−２及びＩＬ−１５シグナル伝達が、実験のマウスモデルの急性ＧＶＨＤの一因となっている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３７：１８７４（１９８６）；及びＢｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５：８９４（２００５））ので、Ｈ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４が、完全ＨＭＣミスマッチの骨髄移植のＴ細胞媒介性Ｃ５７ＢＬ／６−ｉｎｔｏ−ＢＡＬＢ／Ｃモデルにおいて、致死性ＧＶＨＤを阻害し得ると仮定された。確かに、Ｈ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４で１０日間治療されたマウスは、アイソタイプ対照Ｆｃ４タンパク質で治療されたマウスよりも長く生存していた（Ｐ＜０．００１）（図１８Ｈ）。
【０２０５】
ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスＩ（ＨＴＬＶ−Ｉ）は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）、すなわち、ＩＬ−２及びＩＬ−１５による自己分泌シグナルならびにＩＬ−９によるパラ分泌シグナルを伴う初期の増殖段階を示すＣＤ４＋Ｔ細胞の悪性増殖を引き起こす。このようなサイトカイン依存性増殖は、急性ＡＴＬでなく、慢性ＡＴＬ及びくすぶり型ＡＴＬに罹患している患者において明らかである（Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１７，１９３８（２０１１））。そのため、この系におけるＨ９−ＲＥＴＲの有効性を試験した。外因性ＩＬ−２を添加することにより、成長がインビトロでサポートされているＡＴＬ由来細胞株、ＥＤ４０５１５を最初に使用した。Ｈ９−ＲＥＴＲは、これらの細胞の増殖を強力に阻害し、ダクリズマブ及びＭｉｋβ１よりも上回っていた（図１８Ｉ）。そこで、次に、くすぶり型ＡＴＬに罹患している患者から新たに単離された細胞を使用し、６日間のアッセイで自発的増殖についてアッセイした。１０μｇ／ｍｌのＲＥＴＲは、ダクリズマブよりもわずかに効果的であり、Ｍｉｋβ１よりもかなり効果があり（図１８Ｊ）、これらの勢いよく増殖する悪性細胞の制御における潜在的有用性を明白に示した。
【０２０６】
リガンド飽和でのシグナル伝達振幅（Ｅｍａｘ）の減少として定義される部分作動は、ＧＰＣＲ、チャネル、及び他のマルチパス膜貫通タンパク質を標的とする小分子と通常関連する薬理学的特性である。サイトカインなどのタンパク質成長因子に応答するＩ型膜貫通受容体の二量体を介した調整可能なシグナル伝達の概念（部分作動）は、実証されていない。構造情報に基づいて、二量化及びシグナル開始を操作するために、１つの受容体部位（ＩＬ−２Ｒβ）における親和性を強化する一方、第２の受容体結合部位（γｃ）における相互作用を弱めることにより、ＩＬ−２多様体を改変した。ＩＬ−２Ｒβ結合の増大のために、これらの分子は、内因性ＩＬ−２よりも優性であり、γｃ相互作用のレベルが、細胞により認識されるシグナルの強度を設定し、それにより、パーシャルアゴニストのＥｍａｘのレベルでのシグナル伝達振幅を「クランピング」した。これらのパーシャルアゴニストを使用して、新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞対予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、これらの細胞におけるＨ９−Ｔ及びＨ９−ＲＥＴの異なる効果により証明されるように、ＩＬ−２シグナル伝達強度に対する個別の活性化の閾値を有していたことを実証した。これに対して、ｐＳＴＡＴ誘導により示されるような極めて弱いパーシャルアゴニストであるＨ９−ＲＥＴＲは、新しいタイプの免疫抑制剤としての可能性のある顕著な阻害特性を有した。特に、それは、エクスビボで評価された場合、ＩＬ−２Ｒα誘導を遮断することができ、ＧＶＨＤモデルにおける生存を延長し、くすぶり型ＡＴＬに罹患している患者由来の末梢血Ｔ細胞の自発的増殖を強力に阻害した。Ｔ細胞におけるその効果に加えて、Ｈ９−ＲＥＴＲは、ＮＫ媒介性細胞傷害も阻害した。パーシャルアゴニストの異なる活性を前提として、より多数のレパートリーのＩＬ−２多様体は、部分作動から完全拮抗までおよび、エフェクターＴ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞などのＴ細胞サブセット上の特徴的な作用を有するさらなる分子を潜在的に含む、さらに広範な特徴的なシグナル伝達活性を示すことがある。さらに、発明者らが使用している合理的な設計アプローチは、他のγｃファミリーサイトカインに適合することができ、実際に広範なサイトカイン及び成長因子にも同様に適合できる。さらなるパーシャルアゴニストサイトカイン類似体は場合により、別の多面発現性免疫経路の機能を解明することができ、状況に応じて特徴的な治療上の利点を有することができる可能性がある。
【０２０７】
材料及び方法
タンパク質発現及び精製
ヒトＩＬ−２（アミノ酸１〜１３３）及びその多様体、ヒトＩＬ−２Ｒβ外部ドメイン（アミノ酸１〜２１４）、ならびにγｃ外部ドメイン（アミノ酸３４〜２３２）を、上述のように、バキュロウイルス発現系を使用して分泌及び精製した（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９３：１００７（Ｓｅｐ  １０，１９７６））。簡単に言うと、全ての構築物配列を、Ｎ末端ｇｐ６７シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有するｐＡｃＧＰ６７Ａベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。ＳＦ９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中２８℃で培養されたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞を、プラスミド構築物とトランスフェクションして、高力価組換えウイルスを樹立し、続いて増幅した。Ｉｎｓｅｃｔ−ＸＰＲＥＳＳ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ）中２８℃で成長したＴｒｉｃｈｏｐｕｌｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標））昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、抗力価ウイルスに感染させて、組換えタンパク質を発現させた（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４４５（２０１０）及びＷ．  Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１２８８（２００８））。組換えウイルスに感染した３日後に、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティークロマトグラフィーで抽出し、濃縮し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイジングカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で＞９８％の均質性までさらに精製した。Ｆｃ４及びＦｃ４−ＲＥＴＲ融合タンパク質も、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（Ｆｃ４）またはヒトＩＬ−２ＲＥＴＲ多様体、続いて、Ｃ末端ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（Ｆｃ４−ＲＥＴＲ）を、Ｎ末端ｇｐ６７シグナルペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含有するｐＡｃＧＰ６７Ａベクターにクローニングすることにより、このバキュロウイルス発現系を使用して分泌及び精製した。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメインを、改変されたＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異を有する変性ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）から得た（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：５５１（２０１１））。インビボの実験の場合、内毒素を、上述したように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を使用して調製されたタンパク質から除去した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４１：６３（２０１１））、内毒素除去をＬＡＬ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で確認した。
【０２０８】
ビオチン化タンパク質発現の場合、Ｃ末端ビオチンアクセプタペプチド（ＢＡＰ）−ＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを有するγｃを発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）アフィニティークロマトグラフィーで精製し、次に、０．５ｍＭのビシンｐＨ８．３、１００ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭの酢酸マグネシウム、及び５００ｍＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ）中の可溶性ＢｉｒＡリガーゼ酵素でビオチン化した。タンパク質を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。
【０２０９】
表面プラズモン共鳴結合測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器でＢｉａｃｏｒｅ  ＳＡセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する結合相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）研究により特性決定した。γｃを、低密度でチップ表面に固定し（ＲＵｍａｘ＜１００応答単位）、及びＨ９：ＩＬ−２ＲβまたはＨ９−ＲＥＴ：ＩＬ−２Ｒβ複合体の系列希釈液を、６０秒間表面に曝露した。次に、解離を２００秒間追跡した。無関係なビオチン化タンパク質を、参照チャネル内に固定して、非特異的結合を測定値から差し引いた。実験を、２５℃で、０．２％のＢＳＡが補充されたＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で実施した。全ての結合研究を、３０ｍＬ／分の流速で実施して、物質輸送の寄与を最小限にし、検体の再結合を防止した。測定値については、データ解析ならびに平衡及び動態パラメータの決定を、１：１のラングミュア結合モデルを想定した、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００評価版ソフトウェア  バージョン２．０を使用して実施した。
【０２１０】
組織培養物及びＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞の磁気精製
未変性ＹＴ９（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４４５（２０１０））及びＣＤ２５＋ＹＴ−１ナチュラルキラー様細胞（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１２８８（２００８））を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、最小限の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地）中で培養した。両方の細胞株を、５％のＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で維持した。
【０２１１】
ＣＤ２５を発現するかまたは発現しないＹＴ−１細胞の亜集団を、上述したように、磁気選択で精製した（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：１３（２０１３））。１０００万の選別されていないＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．２）で洗浄し、その後、４℃で２時間、ＦＡＣＳ緩衝液中で、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＢＣ９６）とインキュベーションした。次に、ＰＥ染色されたＣＤ２５＋細胞を、４℃２０分間、抗ＰＥ  ＩｇＧにコンジュゲートされた常磁性マイクロビーズで標識し、冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、製造者のプロトコールに従い、ＬＳ  ＭＡＣＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して選別した。溶出した細胞を、再懸濁させ、ＲＰＭＩ完全培地中で成長させ、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用してＣＤ２５＋細胞の濃縮を評価した。選別されたＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞上のＣＤ２５発現の持続性を、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ２５抗体を使用して、フローサイトメトリー分析でモニタリングした。
【０２１２】
細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ５及びホスホ−ＥＲＫ１／２のフローサイトメトリー分析
約２×１０５個のＹＴ細胞またはＣＤ２５＋ＹＴ−１細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルにプレーティングし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、またはＨ９−ＲＥＴＲの系列希釈液を含有するＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁させた。細胞を、３７℃で２０分間刺激し、１．５％までのホルムアルデヒドの添加により直ちに固定し、続いて、室温で１０分間インキュベーションした。次に、細胞を、４℃３０分間１００％の氷冷メタノールで透過処理して、細胞内シグナルエフェクターの検出を可能にした。固定及び透過処理された細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、室温で２時間、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈されたＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ＳＴＡＴ５  ｐＹ６９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ＥＲＫ１／２  ｐＴ２０２／ｐＹ２０４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とインキュベーションした。次に、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で定量化した。刺激されていない細胞のＭＦＩを差し引き、サイトカイン刺激により誘導された最大シグナル強度に正規化した後に、用量−反応曲線を生成し、ＥＣ５０及びＥｍａｘ値を、グラフパッドプリズムデータ解析ソフトウェアを使用して計算した。
【０２１３】
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離及びｐＳＴＡＴ５及びｐＳ６リボソームタンパク質の細胞内染色
バフィーコートを、ＮＩＨ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋの健康なドナーから得、リンパ球分離培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，ＶＡ）を使用して、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、勾配遠心分離により単離した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞アイソレーションキットＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、細胞を単離した。細胞を予め活性化する場合、６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌのプレート結合抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でプレコーティングした。細胞を、３日間１μｇ／ｍｌの可溶抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する完全培地（グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１０％のＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ培地）に１×１０６個の細胞／ｍｌで播種して、次に、新鮮な培地中に４８時間置いた。初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞における用量−反応実験を、上述したように実施した（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：１３（２０１３））；簡単に言うと、細胞を、ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、Ｈ９−ＲＥＴＲの系列希釈液で処理し、次に、１０分間室温で、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ  Ｆｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次に、冷ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩを徐々に加えることにより、細胞を、透過処理し、氷上で３０分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、暗所で３０分間室温で、ＰＥコンジュゲート抗ＳＴＡＴ５  ｐＹ６９４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＡＰＣコンジュゲート抗ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）（クローンＤ５７．２．２Ｅ）で染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で再度洗浄し、データを、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用することにより解析した。
【０２１４】
エクスビボでのＳＴＡＴ５リン酸化の分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ実験室から入手した。動物プロトコールは、ＮＨＬＢＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから承認を得、ＮＩＨのガイドライン「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｒａｍｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」に従った。ＳＴＡＴ５リン酸化を、製造者のプロトコール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してアッセイした。簡単に言うと、ＩＬ−２またはＩＬ−１５を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内注射し、全脾細胞を単離し、ＢＤ  Ｐｈｏｓｐｈｏｆｌｏｗ（商標）Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液を使用して直ちに固定し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して染色し、次に、暗所の氷上で３０分間、ＢＤ  ＰｈｏｓＦｌｏｗ  Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩを使用して透過処理した。次に、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、製造者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により、抗ＦｏｘＰ３で染色し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、暗所で３０分間室温で、抗ホスホ−ＳＴＡＴ５−ＰＥ（１：３０）（ＢＤ）で染色した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄して、データをＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して解析した。
【０２１５】
ＩＬ−２受容体の内在化実験
ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、またはＨ９ＲＥＴＲ（１μＭ）を、２、５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、または２４０分間、９６ウェルプレート中で、３×１０５個のＹＴ−１細胞とインキュベーションした。さらなる受容体の内在化を防ぐために、細胞を直ちに氷に移し、氷冷ＰＢＳＡ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％のＢＳＡ）で２回洗浄した。細胞を、氷上で３０分間、ＰＢＳＡ緩衝液中で、アロフィコシアニンコンジュゲート抗ヒトＩＬ−２Ｒβ抗体（ＴＵ２７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びフィコエリトリンコンジュゲート抗ヒトＩＬ−２Ｒγ抗体（ＴＵＧｈ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の１：５０の希釈液で同時染色した。氷冷ＰＢＳＡ緩衝液でさらに２回洗浄した後に、細胞を、ＰＢＳＡ中１．５％のパラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定し、最後に１回洗浄し、ＰＢＳＡ緩衝液中で再懸濁した。平均細胞蛍光を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターで定量化した。内在化データを、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の非線形最小二乗回帰法を使用して、単一指数減衰モデルに適合させた。
【０２１６】
ＩＬ−２誘導性ｐＳＴＡＴ５の阻害
新たに単離されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及び予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｈ９−ＲＥＴまたはＨ９−ＲＥＴＲＩＬ−２の不存在下または存在下で、ＩＬ−２で刺激し、ｐＳＴＡＴ５のレベルを評価した。細胞を、抗Ｔａｃ若しくはＭｉｋβ１またはＦｃ４−Ｈ９−ＲＥＴＲを用いてまたは用いずに１時間インキュベーションし、次に、３０分間広範な用量のＩＬ−２またはＩＬ−１５で刺激し、ｐＳＴＡＴ５のレベルをフローサイトメトリーで測定した。ＮＫ細胞実験の場合、新たに単離されたヒトＮＫ細胞（ＮＫ細胞アイソレーションキットＩＩ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、示されたＩＬ−２多様体の存在下または不存在下で、ＩＬ−１５の系列希釈液で刺激し、ｐＳＴＡＴ５を評価した。
【０２１７】
ウェスタンブロット分析
サイトカインを用いてまたは用いずに刺激された細胞を、１％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた。等量の溶解物を、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離させ、膜に転写し、この膜を、ｐＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）に対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）またはＳＴＡＴ５  （ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と室温で１時間インキュベーションした。結合された抗体を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（１：５，０００希釈）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００希釈）（Ｂｉｏｒａｄ）で検出した。増強化学発光（ＥＣＬ，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、免疫ブロットを可視化した。一部の実験では、室温で１５分間ストリッピング緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中でインキュベーションした後に、膜を再利用した。
【０２１８】
ＣＦＳＥ希釈及びＥｄＵ増殖アッセイ
新たに単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞または予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞（２０×１０６個／ｍｌ）を、７分間室温で、ＰＢＳ中の２．５μＭのＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識して、１００％ＦＢＳ（２ｍｌ／試料）で１回すぐに洗浄して、次に完全ＲＭＰＩ中で洗浄した。２×１０６個／ｍｌのＣＦＳＥ標識細胞を、野生型ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、Ｈ９−ＲＥＴＲ、またはＨ９−ＲＥＴＲを加えたＩＬ−２の不存在下または存在下で培養した。示された時点でのＣＦＳＥ希釈物をフローサイトメトリー分析することにより、細胞増殖を評価した。ＥｄＵ増殖アッセイの場合、上記のように予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を培養した。採取の１６時間前に、製造者のプロトコール（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、１０ｍＭのＥｄＵを添加し、細胞を、示されるような表面抗原について染色し、次に、細胞内ＥＤＵについて染色した。細胞増殖を、フローサイトメトリーで評価した。
【０２１９】
ＥＤ４０５１５細胞及びくすぶり型ＡＴＬに罹患している患者由来の細胞の増殖
ＩＬ−２依存性ＥＤ４０５１５（＋）（Ｌｅｎａｒｄｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８５８（１９９１））細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＩＬ−２を用いてまたは用いずに、かつ、試薬を用いてまたは用いずに、ＲＰＭＩ１６４０培地の１×１０４個の細胞／１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、次に、３日間３７℃でインキュベーションした。
【０２２０】
ＡＴＬ患者由来の血液試料を、ＮＩＨのＮＣＩのリンパ性悪性腫瘍支部の臨床試験チームのケアの下で入手した。この実験プロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内倫理委員会により承認された。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って得られた。ＡＴＬ患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン添加血からフィコール・ハイパック密度勾配遠心分離により分離した。１×１０５個の細胞／１００μｌ／ウェルのアリコートを、６日間、試薬を用いてまたは用いずに、１０％のＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中でエクスビボで培養した。
【０２２１】
培養の最後の６時間に、ＥＤ４０５１５（＋）細胞またはＡＴＬのＰＢＭＣを、１μＣｉ（０．０３７ＭＢｑ）の［３Ｈ］チミジンでパルスし、次に、セルハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）で細胞を採取し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋＥｍｅｒ）で計数した。アッセイを、３回行った。
【０２２２】
ＮＫ細胞の活性化
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２４時間、１μｇ／ｍＬのＩＬ−２類似体の存在下で培養した。次に、細胞を、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ５６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、パシフィックブルーコンジュゲート抗ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６９（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。試料を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーで分析した。ＮＫ細胞を、ＣＤ３陰性、ＣＤ５６陽性としてゲーティングした。
【０２２３】
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して勾配遠心分離で単離し、次に、ヒトＮＫ細胞アイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してそのままのＮＫ細胞を精製し、続いて、ａｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して分離した。ＨＥＲ１８標的細胞を、２時間、１×１０６個の細胞当たり１５０μＣｉの５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で標識した。ＮＫ細胞を、１０：１のエフェクター：標的比で、１０，０００個のＨＥＲ１８細胞に添加した。種々の濃度のＩＬ−２類似体の存在下で、培養の４時間後に、特異的溶解を判定した。
【０２２４】
初代ＮＫ細胞によるＫ５６２細胞の溶解を、記載されるように実施した（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２５９，１０３（２０１４））。簡単に言うと、ヒトＮＫアイソレーションキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を使用して、そのままのヒトＮＫ細胞を精製した。Ｋ５６２細胞を、ＰＫＨ６７緑色蛍光細胞リンカーキット（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）で標識し、ＮＫ細胞を、１０：１の比で５，０００個のＫ５６２細胞に添加し、４時間３７℃で、種々の濃度のＩＬ−２類似体の存在下で培養し、さらなる反応を防ぐために氷上に置いた。次に、細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、ＰＩ＋ＰＫＨ６７＋Ｋ５６２細胞の百分率をフローサイトメトリーで決定した。
【０２２５】
Ｔヘルパーの分極及び細胞内サイトカイン染色
ナイーブＣＤ４＋Ｃ５７ＢＬ／６Ｔ細胞を、示されたサイトカインの不存在下または存在下で、異なるＴヘルパーの分極条件下で分化させた。４日後、細胞をまず、示されるような発現抗原について染色し、次に、製造者のプロトコールに従い、ＢＤ  ｃｙｔｏｆｉｘ及びｃｙｔｏｐｅｒｍまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦｏｘＰ３  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ｋｉｔ中で、ＩＦＮγ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−１７Ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、またはＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）対する抗体で染色した。染色された細胞を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。全てのマウスサイトカインは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製であった。
【０２２６】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析
予め活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、完全培地中で２日間休ませ、１μｇ／ｍｌの野生型ＩＬ−２、Ｈ９、Ｈ９−ＲＥＴ、またはＨ９−ＲＥＴＲで２４時間刺激し、５×１０６個の細胞からの全ＲＮＡを単離した（ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。５人のドナー由来のＲＮＡをプールし、１μｇのプールされたＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリを、上述のように作成した（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３８：１３（２０１３）。ＰＣＲ増幅された産物を、バーコード付けし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００プラットフォームを使用して配列決定した。配列決定されたリードを、Ｂｏｗｔｉｅ  ０．１２．４を使用して、ヒトゲノム（ｈｇ１８、ＮＣＢＩビルド３６．１）に対してアラインした（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：２００（２００１））。独自にマッピングされたリードを維持し、デジタル発現レベルの遺伝子を、ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）を使用して計算した。ＲパッケージｅｄｇｅＲを使用して、特異的に発現させた遺伝子を同定し、倍数変化（ｌｏｇ２スケールで）の差を、治療されていない細胞、または、２４時間ＩＬ−２多様体で治療された細胞の間で比較した。
【０２２７】
ＣｈＩＰ−Ｓｅｑライブラリの作成及び分析
予め活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、９０分間異なるサイトカインで治療し、次に、１％のパラホルムアルデヒドで化学的に架橋した。１０００〜２０００万個の細胞からのクロマチンを、２５０〜５００ｂｐのフラグメントになるように超音波処理し、抗ＳＴＡＴ５Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫沈降し、上述のように、配列決定のために処理した（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７３：１４７（１９９３））。全てのリードを、Ｂｏｗｔｉｅ  ０．１２．４を使用して、ヒトゲノム（ｈｇ１８、ＮＣＢＩビルド３６．１）に対してアラインした（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１：２００（２００１）。独自にマッピングされたリードをブラウザ拡張可能なデータ（ｂｒｏｗｓｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ｄａｔａ）（ＢＥＤ）ファイルに変換し、重複リード（同じゲノム位置の複数のリード）をフィルタする。次に、フィルタされた（非重複）ＢＥＤファイルを、バイナリデータ（．ｔｄｆ）に変換し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して可視化した。
【０２２８】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、２００ｎｇを、オリゴｄＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）と共に使用して、ｃＤＮＡを合成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＡＢＩ  ７９００  ＨＤ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで実施した。ＲＴプライマー及びプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製であった。発現レベルを、ＲＰＬ７に正規化した。
【０２２９】
同種異系宿主への骨髄移植
ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙからの７週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ２Ｋｂ）及びＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２Ｋｄ）マウスを、特定の病原体フリーの施設で飼育し、ＮＣＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された、承認動物プロトコールに従い治療した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、９５０ｃＧｙの全身照射で条件付けし、次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の１０００万個のＴ細胞枯渇骨髄細胞単独か、または、それと２００万個のＴｒｅｇ枯渇汎Ｔ細胞と共に、再構成した。Ｔ細胞枯渇を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製キットを使用して、抗ＣＤ９０［Ｔｈｙ１．２］マイクロビーズ（全Ｔ細胞枯渇）または抗ＣＤ２５（Ｔｒｅｇ枯渇）で実施した。汎Ｔ細胞を投与されているマウスを、Ｆｃ４またはＨ９−ＲＥＴＲ−Ｆｃ４（１０日間、１日２回１００μｇの腹腔内投与）でさらに治療した。飲み水に、全身照射の前日〜１４日目までシプロフロキサシンを補充した。生存及び体重減少をモニタリングした。生存を、カプラン・マイヤー法に従い分析し、ログランク検定を使用して、生存曲線を比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを使用して、統計分析を実施した。
【０２３０】
他の実施形態
本発明を、その発明を実施するための形態と共に記載しているが、上述の記載は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を例示するものであって、これを限定するものではないことを理解すべきである。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。例えば、ＩＬ−２は、本明細書の全体にわたって言及されているが、当業者であれば、本明細書に記載される方法及び組成物が、他のサイトカイン、例えば、この特性を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、またはＩＬ−１５、に等しく適用可能であることを理解するであろう。従って、本発明は、野生型と比較して、それぞれの受容体に対する結合親和性が増加したＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、及びＩＬ−１５の変異体、ならびにそれらの変異体を同定及び使用するための方法も含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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