(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）をこの順で含む、発現ベクター：
（ｉ）ＳＥＤ１プロモーターＤＮＡ、
（ｉｉ）以下：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列であって、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、かつ配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、かつ分泌シグナル活性を有するペプチド、
からなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；ならびに
（ｉｉｉ）目的タンパク質をコードするＤＮＡ、または該目的タンパク質をコードするＤＮＡを挿入するためのクローニング部位。
【請求項２】
前記（ｉｉｉ）が目的タンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項４】
タンパク質を分泌生産する酵母の作製方法であって、
ＳＥＤ１プロモーターＤＮＡ；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列であって、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、かつ配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチドからなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；ならびに目的タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む発現カセットを酵母に導入し、形質転換酵母を得る工程、
を含む、方法。
【請求項５】
酵母においてタンパク質を分泌生産する方法であって、
請求項３に記載の形質転換酵母または請求項４に記載の方法により作製された酵母を培養する工程
を含む、方法。
【請求項６】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）をこの順で含む、発現ベクター：
（ｉ）ＳＥＤ１プロモーターＤＮＡ、
（ｉｉ）以下：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列であって、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、かつ配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、
からなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）目的タンパク質をコードするＤＮＡ、または該目的タンパク質をコードするＤＮＡを挿入するためのクローニング部位；ならびに、
（ｉｖ）アンカードメインをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記アンカードメインがＳＥＤ１アンカードメインである、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記（ｉｉｉ）が目的タンパク質をコードするＤＮＡである、請求項６または７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターが導入された形質転換酵母。
【請求項１０】
タンパク質を表層提示する酵母の作製方法であって、
ＳＥＤ１プロモーターＤＮＡ；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列であって、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズし、かつ配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチドからなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；目的タンパク質をコードするＤＮＡ；ならびにアンカードメインをコードするＤＮＡをこの順で含む発現カセットを酵母に導入し、形質転換酵母を得る工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分泌シグナルペプチドならびにそれを利用したタンパク質の分泌および細胞表層提示に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、低炭素循環型社会実現の観点から、再生可能資源であるリグノセルロース系バイオマスからエタノールを製造する技術の導入が望まれている。その普及には、植物原料をエタノールに変換するための多段階の工程を統合し、効率化された、低コスト型同時糖化発酵プロセスの構築が急務である。【０００３】
この構築にあたり、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素を細胞表層に提示することで糖化能力を付与した酵母が作製されている。細胞表層提示技術としては、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカータンパク質を利用する方法が挙げられる。このような細胞表層提示技術には、例えば、プロモーター、分泌シグナルペプチド、表層提示するための遺伝子、およびＧＰＩアンカータンパク質の遺伝子を含む発現カセットが用いられる。【０００４】
ＧＰＩアンカータンパク質およびプロモーターについては、種々の報告がある（特許文献１〜４および非特許文献１〜５）。【０００５】
分泌シグナルペプチドは、細胞膜、細胞壁に局在する、または細胞外に分泌されるタンパク質のＮ末端に存在しているペプチドである。タンパク質の分泌発現系においては、目的タンパク質の分泌シグナルペプチドを高効率な分泌シグナルペプチドと置換することで、発現効率及び発現成功率を上げることができることが報告されている。したがって、タンパク質の細胞表層提示系、および分泌生産系の高効率化において、分泌シグナルペプチドの高効率化は重要な要素である。【０００６】
既存の酵母における高効率な分泌タンパク質発現系で用いられているサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の代表的な分泌シグナルペプチドとしては、例えば、α−因子（非特許文献６）由来の分泌シグナルペプチド（MFα prepro）が挙げられる。また、このα-因子由来の分泌シグナルペプチドを超える分泌能力を有するとされるサッカロマイセス・セレビシエ由来の分泌シグナルペプチドも報告されている（特許文献５）。【０００７】
一方で、一般的に、分泌シグナルペプチドの分泌能力は、その前後に接続されるプロモーターおよびタンパク質との組み合わせによって大きく変動することが知られている。また、分泌能力の安定性を、分泌シグナルペプチド配列から予測することは現在のところ困難である。従って、ある特定のプロモーターおよびタンパク質との組み合わせでは高い分泌能力を発揮できた分泌シグナル配列であっても、他の組み合わせにおいてはその分泌能力が大きく低下するということが頻繁に起こりうる。【０００８】
例えば、特許文献５において高効率とされる分泌シグナルペプチドの分泌能力とは、単一のプロモーター（ＨＳＰ１プロモーター）および単一のタンパク質（ルシフェラーゼ）と組み合わせた場合の活性のみを指標として評価されたものである。【０００９】
さらに、特許文献５において高効率とされる分泌シグナルペプチドの分泌能力とは、目的タンパク質を細胞外（培養上清）へ分泌させた場合の活性のみを指標として評価されたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１１−１６０７２７号公報
【特許文献２】特開２００８−８６３１０号公報
【特許文献３】特開２００７−１８９９０９号公報
【特許文献４】特開２００５−２４５３３５号公報
【特許文献５】特開２００７−１６７０６２号公報
【特許文献６】特開２０１１−３０５６３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Biotechnol. Lett.，2010年，第３２巻，第1131-1136頁
【非特許文献２】Mol. Microbiol.，2004年，第５２巻，第1413-1425頁
【非特許文献３】Appl. Environmen. Microbiol.，1997年，第６３巻，第615-620頁
【非特許文献４】Biotechnol. Lett.，2010年，第３２巻，第255-260頁
【非特許文献５】J. Bacteriol.，1997年，第１７９巻，第1513-1520頁
【非特許文献６】Protein Eng.，1996年，第９巻，第1055-1061頁
【非特許文献７】Appl. Microbiol. Biotechnol.，2006年，第７２巻，第1136-1143頁
【非特許文献８】Nature Methods，2009年，第６巻，第343-345頁
【非特許文献９】FEMS Yeast Res.，2014年，第１４巻，第399-411頁
【非特許文献１０】Biotechnol. Biofuels，2014年，第７巻，第8頁
【非特許文献１１】Enzyme Microb. Technol.，2012年，第５０巻，第343-347頁
【非特許文献１２】J Biochem.，2012年，第１４５巻，第701-708頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、タンパク質の分泌生産および細胞表層提示において、従来用いられてきた分泌シグナルペプチドを上回る分泌能力を有する分泌シグナルペプチドを提供することを目的とする。【００１３】
本発明はまた、異なる複数のプロモーター、およびタンパク質との組み合わせにおいても、従来用いられてきた分泌シグナルペプチドを上回る分泌能力を安定して有する分泌シグナルペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む、発現ベクターを提供する（この発現ベクターを分泌型の発現ベクターともいう）：
（ｉ）プロモーターＤＮＡ、
（ｉｉ）以下：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、
からなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；ならびに
（iii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ、または該目的タンパク質をコードするＤＮＡを挿入するためのクローニング部位。【００１５】
１つの実施形態では、上記分泌型の発現ベクターにおいて、上記プロモーターは、ＳＥＤ１プロモーターである。【００１６】
１つの実施形態では、上記分泌型の発現ベクターにおいて、上記（ｉｉｉ）は、目的タンパク質をコードするＤＮＡである。【００１７】
本発明は、上記分泌型の発現ベクターが導入された形質転換酵母を提供する。【００１８】
本発明は、タンパク質を分泌生産する酵母の作製方法を提供し、当該方法は、以下：
プロモーターＤＮＡ；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチドからなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；ならびに目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現カセットを酵母に導入し、形質転換酵母を得る工程を含む。【００１９】
本発明は、酵母においてタンパク質を分泌生産する方法を提供し、この方法は、上記形質転換酵母または上記方法で作製された酵母を培養する工程を含む。【００２０】
本発明は、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含む、発現ベクターを提供する（この発現ベクターを表層提示型の発現ベクターともいう）：
（ｉ）プロモーターＤＮＡ、
（ｉｉ）以下：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、
からなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；
（iii）目的タンパク質をコードするＤＮＡ、または該目的タンパク質をコードするＤＮＡを挿入するためのクローニング部位；ならびに、
（iv）アンカードメインをコードするＤＮＡ。【００２１】
１つの実施形態では、上記表層提示型の発現ベクターにおいて、上記プロモーターは、ＳＥＤ１プロモーターである。【００２２】
１つの実施形態では、上記表層提示型の発現ベクターにおいて、上記アンカードメインがＳＥＤ１アンカードメインである。【００２３】
１つの実施形態では、上記表層提示型の発現ベクターにおいて、上記（iii）は、目的タンパク質をコードするＤＮＡである。【００２４】
本発明は、上記表層提示型の発現ベクターが導入された形質転換酵母を提供する。【００２５】
本発明は、タンパク質を表層提示する酵母の作製方法を提供し、当該方法は、以下：
プロモーターＤＮＡ；（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、および（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチドからなる群より選択されるいずれかのペプチドをコードするＤＮＡ；目的タンパク質をコードするＤＮＡ；ならびにアンカードメインをコードするＤＮＡを含む発現カセットを酵母に導入し、形質転換酵母を得る工程、
を含む。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、高活性でタンパク質を分泌、または細胞表層に提示することができる。本発明の分泌シグナルペプチドは、タンパク質の分泌および細胞表層提示の両方に好適に使用することができる。さらに、本発明の分泌シグナルペプチドは、様々なプロモーターおよびタンパク質遺伝子との組合せにおいて安定して高い分泌能力を付与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】発現カセットＸ１〜Ｘ４を用いて得られた各種の表層提示形質転換酵母について、培養の際の菌体のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図２】発現カセットＸ５〜Ｘ８を用いて得られた各種の分泌形質転換酵母について、培養の際の培地中のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図３】発現カセットＸ９〜Ｘ１１を用いて得られた各種の表層提示形質転換酵母について、４８時間培養後の菌体のエンドグルカナーゼ活性を示すグラフである。
【図４】発現カセットＸ１２〜Ｘ１７を用いて得られた各種の表層提示形質転換酵母について、培養の際の菌体のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図５】発現カセットＸ１８およびＸ１９を用いて得られた各種の分泌形質転換酵母について、培養の際の培地中のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【図６】発現カセットＸ２０〜Ｘ２２を用いて得られた各種の分泌形質転換酵母について、２４時間培養後の培地中のＧＦＰ蛍光強度の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明について、以下、詳細に説明する。
【００２９】
（分泌シグナルペプチド）
分泌シグナルペプチドは、細胞膜、細胞壁に局在する、または細胞膜外に分泌されるタンパク質のＮ末端に通常結合しているペプチドである。分泌シグナルペプチドは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される過程でシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。例えば、分泌シグナルペプチドは、当該分泌シグナルペプチドを本来有するタンパク質（分泌性タンパク質）または異種タンパク質のＮ末端に、これらのタンパク質が発現されるべき細胞内で連結されることで、その分泌性タンパク質または異種タンパク質を細胞外に分泌させるように機能する。
【００３０】
本明細書においては、酵母において、目的タンパク質の発現に際し、分泌シグナルペプチドとして機能することを「分泌シグナル活性」ともいう。
【００３１】
本発明によれば、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかのペプチドが、分泌シグナルペプチドとして提供される：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド；および
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド。
【００３２】
さらに、本発明によれば、上記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかのペプチド（本明細書においては、単に「本発明の分泌シグナルペプチド」ともいう）をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチドもまた提供される。本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの一例は、配列番号１で表される塩基配列であり、これは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする。
【００３３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列（配列番号１）は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の定常期における主要な細胞表層局在タンパク質であるＳＥＤ１の分泌シグナルペプチドに由来するが、起源はこれに限定されない。ＳＥＤ１は、ストレスによって誘導され、細胞壁の完全性（integrity）の維持に寄与すると考えられている。ＳＥＤ１の遺伝子（Ｓｅｄ１）は、例えば、GenBankに登録された配列情報に基づき、当業者が通常用いる方法を用いて入手し得る（GenBank accession number NM_001180385；ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８５１６４９）。
【００３４】
ここで、本明細書において記載されるタンパク質またはペプチドは、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドであってもよく、ポリヌクレオチドは、そのようなタンパク質またはペプチドをコードするものを含んでもよい。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異（例えば、欠失、置換もしくは付加）は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、１または数個であるが、その所望の機能または効果を実質的に有する限り特に限定されず、タンパク質またはペプチドの大きさにも依存し得る。変異の総数は、例えば、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、または１個以上２個以下であるが、これらに限定されない。また、変異の総数は、例えば、以下に説明する配列同一性を満たす範囲内であり得る。アミノ酸置換の例としては、各機能または効果を実質的に保持する限りにおいていずれの置換であってもよい。例えば、保存的置換が挙げられる。保存的置換としては、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、（フェニルアラニン、チロシン）。
【００３５】
他の実施形態としては、本明細書において記載されるタンパク質またはペプチドは、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドであってもよく、ポリヌクレオチドは、そのようなタンパク質またはペプチドをコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上であり得る。
【００３６】
本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３７】
さらに他の実施形態として、本明細書に記載されるタンパク質またはペプチドは、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡによりコードされたものであってもよく、そしてポリヌクレオチドは、そのようなハイブリダイズしたＤＮＡを含むものでもよい。開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとのハイブリダイズについては、好ましくは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
【００３８】
ストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と例えば、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ〜７５０ｍＭ、５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、または３００ｍＭ〜７５０ｍＭ、温度が例えば、２５℃〜７０℃、５０℃〜７０℃、または５５℃〜６５℃、そしてホルムアミド濃度が例えば、０％〜５０％、２０％〜５０％、または３５％〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ〜６００ｍＭ、５０ｍＭ〜６００ｍＭ、または３００ｍＭ〜６００ｍＭ、そして温度が例えば５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、または６０℃〜６５℃である。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）の中、６５℃でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed,, Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法などの周知の方法で行うことができる。温度が高いほど、または塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性（配列同一性）の高いポリヌクレオチドを単離できる。
【００３９】
さらなる他の実施形態として、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、開示される塩基配列と例えば、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつその所望の機能または効果を実質的に有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
所定のアミノ酸配列（例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列）をコードする塩基配列は、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の塩基に置換することもできる。さらなる他の実施形態として、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変更された塩基配列を有するＤＮＡも包含する。
【００４１】
本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡまたは当該ＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、所定の酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことによって、核酸断片として取得し得る。本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡまたは当該ＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、核酸断片として取得し得る。本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡまたは当該ＤＮＡを含むポリヌクレオチドは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００４２】
また、上記でポリヌクレオチドについて説明した各種実施形態について、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法、Gapped duplex法などの公知手法またはこれに準ずる方法が挙げられる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）など）などを用いて、またはTAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異が導入される。
【００４３】
以下に詳述するように、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡまたは当該ＤＮＡを含むポリヌクレオチドを用いて、目的タンパク質を分泌生産させるための分泌カセットおよび目的タンパク質を細胞表層に提示させる表層提示カセットのような発現カセットを作製することができる。
【００４４】
（アンカードメインをコードするＤＮＡ）
表層提示カセットは、アンカードメインをコードするＤＮＡを含む。
【００４５】
アンカードメインとしては、細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域が用いられ得る。「細胞表層局在タンパク質」は、細胞表層に固定化または付着もしくは接着し、そこに局在するタンパク質をいう。細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。
【００４６】
細胞表層局在タンパク質の代表例として、ＧＰＩ（glycosyl phosphatidyl inositol：エタノールアミンリン酸−６マンノースα−１，２マンノースα−１，６マンノースα−１，４グルコサミンα−１，６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質）アンカータンパク質を挙げることができる。ＧＰＩアンカータンパク質は、そのＣ末端に糖脂質であるＧＰＩを有しており、このＧＰＩが細胞膜中のＰＩ（phosphatidyl inositol）と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
【００４７】
ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端へのＧＰＩの結合は、以下のようにして行われる。ＧＰＩアンカータンパク質は、転写および翻訳の後、Ｎ末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端またはその近傍の領域に、ＧＰＩアンカーがＧＰＩアンカータンパク質と結合する際に認識されるＧＰＩアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔およびゴルジ体において、このＧＰＩアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるＣ末端にＧＰＩが結合する。
【００４８】
ＧＰＩが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、ＧＰＩが細胞膜のＰＩに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
【００４９】
本発明では、細胞表層局在タンパク質であるＧＰＩアンカータンパク質の全体、またはその細胞膜結合領域であるＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用いることができる。細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端側の領域である。細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、融合タンパク質の酵素活性を阻害しない限り、ＧＰＩアンカータンパク質のその他の任意の部分を含んでいてもよい。
【００５０】
ＧＰＩアンカータンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよい。このようなＧＰＩアンカータンパク質としては、例えば、α−またはａ−アグルチニン（ＡＧα１、ＡＧＡ１）、ＴＩＰ１、ＦＬＯ１、ＳＥＤ１、ＣＷＰ１およびＣＷＰ２が挙げられる。好ましくは、ＳＥＤ１またはその細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）が用いられる。Ｓｅｄ１のアンカータンパク質コーディング領域の塩基配列を配列番号４に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す（但し、配列番号４および５はそれぞれ、開始コドンおよびそれによりコードされるメチオニンを含まない）。また、ＳＥＤ１の細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、例えば、配列番号５の１０９位から３３７位を含む領域である。ＳＥＤ１アンカードメインとしては、配列番号５のアミノ酸配列の全長であっても、またはアンカー機能を損なわない限り、その一部の配列（例えば、配列番号５の１０９位から３３７位のアミノ酸配列を含む配列）であってもよい。
【００５１】
アンカードメインおよびそのコードＤＮＡについて、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
【００５２】
アンカードメイン（例えば、細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域）をコードするＤＮＡは、これらを有する微生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型として、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲによって核酸断片として取得し得る。このようなポリヌクレオチドは、既知の配列情報に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、核酸断片として取得し得る。上記ポリヌクレオチドを含む既存のベクターから、核酸断片として切り出して利用することもできる。ポリヌクレオチドは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００５３】
（プロモーターＤＮＡ）
プロモーターＤＮＡは、プロモーター活性を有していればよく、「プロモーター活性」とは、プロモーター領域に転写因子が結合し、転写を惹起する活性をいう。プロモーターＤＮＡは、所望のプロモーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターとの重複部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することによりプロモーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーターＤＮＡを化学合成してもよい。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドに含まれるプロモーターＤＮＡは、酵母においてプロモーター活性を有する限り、任意のプロモーターであり得る。プロモーターＤＮＡは、発現を目的とする遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものを利用してもよい。また、アンカードメインとして用いられる細胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターであってもよい。例えば、ＳＥＤ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、およびＴＤＨ１プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターの塩基配列はそれぞれ、配列番号３、１２、１３、１８、および２１で表される塩基配列である。目的の機能を果たすものであれば、上記のように、それらの塩基配列において、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異された塩基配列であってもよい。
【００５５】
（目的タンパク質）
目的タンパク質の種類、もしくはその起源は特に限定されない。目的タンパク質の種類として、例えば、酵素、抗体、リガンド、蛍光タンパク質などが挙げられる。酵素としては、例えば、セルロース分解酵素、デンプン分解酵素、グリコーゲン分解酵素、キシラン分解酵素、キチン分解酵素、脂質分解酵素などが挙げられ、より具体的には、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼ、アミラーゼ（例えば、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ）、リパーゼなどが挙げられる。
【００５６】
目的タンパク質をコードするＤＮＡは、イントロンを除いたｃＤＮＡ配列が好ましい。
【００５７】
目的タンパク質をコードするＤＮＡは、その全長をコードする配列であってもよく、目的タンパク質の活性を示すものであれば目的タンパク質の一部領域をコードする配列であってもよい。また、上記のように、目的タンパク質の活性を示す限り、天然型タンパク質をコードする塩基配列において、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異を含む塩基配列であってもよく、あるいは１または２以上（例えば数個）アミノ酸が欠失、付加または置換などの変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。
【００５８】
目的タンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）は、そのタンパク質を有するまたは産生する微生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型として、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲによって核酸断片として取得し得る。このようなポリヌクレオチドは、既知の配列情報に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、核酸断片として取得し得る。また、目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む既存のベクターから、核酸断片（発現カセットの形態であってもよい）として切り出して利用することもできる。このような遺伝子は、必要に応じて宿主のコドン頻度を考慮して最適化した配列に基づいて、人工的に合成して得ることもできる。
【００５９】
目的タンパク質の一例として、以下、セルロース分解酵素を例に挙げて説明する。
【００６０】
セルロース分解酵素は、β１，４−グリコシド結合を切断し得る任意の酵素をいう。セルロース分解酵素は、任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。
【００６１】
以下、代表的なセルロース分解酵素として、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼについて説明するが、セルロース分解酵素はこれらに限定されない。
【００６２】
エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖を生じる（「セルロース分子内切断」）。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、エンドグルカナーゼＩＶ、およびエンドグルカナーゼＶと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、エンドグルカナーゼＩＩ：ＥＧＩＩ（例えば、特許文献６））が用いられ得るが、これに限定されない。
【００６３】
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、セロビオヒドロラーゼＩＩ：ＣＢＨＩＩ（例えば、特許文献６））が用いられ得るが、これに限定されない。
【００６４】
β−グルコシダーゼは、セルロースの非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である（「グルコース単位切断」）。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グリコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ（特に、β−グルコシダーゼ１：ＢＧＬ１（例えば、非特許文献７））が用いられ得るが、これに限定されない。
【００６５】
セルロースの良好な加水分解のために、セルロース加水分解様式の異なる酵素を組み合わせてもよい。セルロース分子内切断、セルロース分子末端切断、およびグルコース単位切断などの種々の異なるセルロース加水分解様式で作用する酵素が適宜、組み合わされ得る。それぞれの加水分解様式を有する酵素の例として、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるがこれらに限定されない。セルロース加水分解様式の異なる酵素の組合せは、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択され得る。セルロースの構成糖であるグルコースを最終的に生産できることが望ましいので、グルコースを生成し得る酵素を少なくとも１つ含むことが好ましい。グルコースを生成し得る酵素としては、グルコース単位切断酵素（例えば、β−グルコシダーゼ）に加え、エンドグルカナーゼもグルコースを生成し得る。例えば、酵母において、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼを分泌または表層提示させ得る。
【００６６】
（ターミネーターＤＮＡ）
分泌カセットまたは表層提示カセットを含むポリヌクレオチドは、さらにターミネーターＤＮＡを含むことができる。
【００６７】
ターミネーターＤＮＡは、ターミネーター活性を有していればよく、「ターミネーター活性」とは、ターミネーター領域において転写を終結させる活性をいう。ターミネーターは、ターミネーター活性を有しさえすればよく、所望のターミネーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターの挿入部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のターミネーター領域を増幅することによりターミネーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているターミネーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のターミネーターＤＮＡを化学合成してもよい。
【００６８】
ターミネーターＤＮＡとしては、α−アグルチニンターミネーター、ＡＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）ターミネーター、ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド−３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）ターミネーター、ＤＩＴ１ターミネーターなどが挙げられる。
【００６９】
（発現カセットの構築）
本明細書において、「発現カセット」とは、目的タンパク質が発現し得るように、該目的タンパク質をコードするＤＮＡと、その発現を調節するための種々の調節エレメントとが、宿主の微生物または細胞中で機能し得る状態で連結されているＤＮＡ配列またはポリヌクレオチドをいう。ここで「機能し得る状態で連結されている」とは、目的タンパク質をコードするＤＮＡが、プロモーターの制御下で、そして場合により他の調節エレメントの制御下で、発現されるように、発現カセットまたは発現ベクターに含まれる各構成要素が連結されていることを意味する。各構成要素は、目的タンパク質が発現し得る限りにおいて、それらの要素間にリンカーなどの配列をさらに含んで連結されていてもよい。
【００７０】
発現カセットとしては、以下に説明するような分泌型の発現カセットおよび表層提示型の発現カセットが挙げられる。
【００７１】
分泌型の発現カセットは、プロモーターＤＮＡ、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、および目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む（この発現カセットを、分泌カセットともいう）。
【００７２】
表層提示型の発現カセットは、プロモーターＤＮＡ、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、およびアンカードメインをコードするＤＮＡを含む（この発現カセットを、表層提示カセットともいう）。
【００７３】
分泌カセットでは、プロモーターＤＮＡ、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、および目的タンパク質をコードするＤＮＡが、宿主微生物または宿主細胞中で機能し得る状態で連結され得る。分泌カセットは、例えば、５’から３’に向かって、プロモーターＤＮＡ、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、および目的タンパク質をコードするＤＮＡを記載の順に含むように構築される。分泌カセットは、目的タンパク質をコードするＤＮＡの下流にターミネーターＤＮＡをさらに含み得る。
【００７４】
表層提示カセットでは、プロモーターＤＮＡ、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、およびアンカードメインをコードするＤＮＡが、宿主微生物または宿主細胞中で機能し得る状態で連結され得る。表層提示カセットは、例えば、５’から３’に向かって、プロモーターＤＮＡ、本発明の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、およびアンカードメインをコードするＤＮＡを記載の順に含むように構築される。表層提示カセットは、アンカードメインをコードするＤＮＡの下流にターミネーターＤＮＡをさらに含み得る。
【００７５】
各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。各構成要素の結合については、例えば、ＰＣＲ法により適当な制限酵素の認識配列を付与された各構成要素のＤＮＡをその制限酵素で切断し、リガーゼなどを用いて連結すること、あるいはOne-step isothermal assembly（非特許文献８）を用いて行うことができる。これらの方法を用いることにより、正確な分泌シグナルペプチドの切断および活性な酵素の発現が可能である。
【００７６】
目的タンパク質（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどの酵素、蛍光タンパク質、または各種抗体）をコードする領域（構造遺伝子）、およびプロモーターおよびターミネーターなどの発現調節配列を含むプラスミドから、適宜、ベクターの調製に適した形態で切り出して、インサートを調製することによって利用することもできる。
【００７７】
あるいは、本発明の発現カセット（分泌カセットおよび表層提示カセット）は、目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む代わりに、目的タンパク質をコードするＤＮＡを挿入するためのクローニング部位を含有するものであってもよい。そのようなクローニング部位は当技術分野で公知であり、例えば、様々な制限酵素により認識される部位を含むマルチクローニング部位を利用することができる。このようなクローニング部位を含有する発現カセットの場合、目的タンパク質をコードするＤＮＡを、そのクローニング部位を介して発現カセットに挿入することが容易となる。
【００７８】
（発現ベクター）
本発明は、上記発現カセットを含む発現ベクターを提供する。本発明の分泌型の発現ベクターは、上記分泌型の発現カセットを含み、そして本発明の表層提示型の発現ベクターは、上記表層提示型の発現カセットを含む。本明細書において「発現ベクター」とは、目的タンパク質をコードするＤＮＡの発現のためのユニット（発現カセット）が挿入されたベクターをいい、目的タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたものを含む。発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であってもよい。酵母を宿主とする場合、ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドの形態が好ましい。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、調節配列（オペレーター、エンハンサーなど）を含み得る。このようなベクターは、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（以下に説明）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有する。
【００７９】
酵母選択マーカーとしては、公知の任意のマーカーが利用され得る。例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、Ｏ−アセチルホモセリンＯ−アセチルセリンスルフィドリラーゼ（ＭＥＴ１５）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など）が挙げられる。例えば、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＭＥＴ１５欠損マーカーなど）が好ましく用いられ得る。
【００８０】
（形質転換酵母の調製）
宿主として用いる酵母は、子のう菌酵母（Ascomycetous yeast）に属するものであればよく、特に限定されない。例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、スキゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ハンセヌラ属（Hancenula）、クロッケラ属（Kloeckera）、シュワニオマイセス属（Schwanniomyces）、コマガタエラ属（Komagataella）およびヤロウィア属（Yarrowia）などの酵母が挙げられる。
【００８１】
本発明の酵母は、上記発現カセットまたは発現ベクターを宿主となる酵母に導入することにより得られる。「導入」とは、発現カセットまたは発現ベクター中の発現を目的とする遺伝子（目的タンパク質をコードするＤＮＡ）が宿主細胞に導入されるだけでなく、宿主細胞で発現されることも含む。導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記説明した本発明の発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
【００８２】
分泌カセットを含む発現ベクターを酵母に導入し、形質転換酵母を得ることにより、タンパク質を分泌する酵母を作製し得る。表層提示カセットを含む発現ベクターを酵母に導入し、形質転換酵母を得ることにより、タンパク質を細胞表層に提示する酵母を作製し得る。
【００８３】
上記発現カセットまたは発現ベクターが導入された酵母は、常法に従い、酵母選択マーカーによる形質、菌体の目的タンパク質の活性（表層提示型）または菌体外の目的タンパク質の活性（分泌型）などを指標として選択することができる。
【００８４】
また、表層提示カセットを含む発現ベクターを酵母に導入して得られた形質転換酵母の細胞表層に目的タンパク質が固定（細胞表層提示）されていることは、常法により確認することができる。例えば、被験酵母に、このタンパク質に対する抗体と、ＦＩＴＣのような蛍光標識２次抗体またはアルカリフォスファターゼのような酵素標識２次抗体などとを作用させる方法、このタンパク質に対する抗体とビオチン標識２次抗体とを反応させた後さらに蛍光標識ストレプトアビジンを作用させる方法などが挙げられる。
【００８５】
複数種のタンパク質を分泌または細胞表層提示発現するように、酵母を形質転換することもできる。この場合、複数種のタンパク質のそれぞれをコードする配列の遺伝子発現カセットを含むそれぞれの発現ベクターを構築してもよく、複数の遺伝子発現カセットを１つの発現ベクターに入れることもできる。例えば、３遺伝子同時発現用ベクターpATP403を利用することができる（非特許文献９）。
【００８６】
本発明の形質転換酵母は、一般的に酵母に適用可能な培養条件下で培養し得る。形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地組成、培養ｐＨおよび培養温度は、その酵母の性質および目的タンパク質に応じて、適宜設定し得る。培養の際の菌体密度および培養時間もまた、その酵母の性質および目的タンパク質に応じて適宜設定し得る。
【００８７】
さらに、本発明によれば、タンパク質を分泌生産する方法もまた提供される。本方法は、分泌型の形質転換酵母を上述した培養工程を用いて実施することができる。例えば、当該方法により、抗体や酵素等のタンパク質を分泌生産し得る。必要に応じて、培養液から生産含有画分を回収する工程、さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもできる。これらの工程およびそれらに要する手段は、当業者によって適宜選択される。
【００８８】
本発明の形質転換酵母を発酵培養に供する場合、酵母に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養のために、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下、および好気条件などから適宜選択することができる。培地組成、培地ｐＨ、培養温度、培養の際の菌体密度および培養時間、その後の回収、精製、濃縮については、適宜設定され得る。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００９０】
SED1分泌シグナル（配列番号２）およびCWP2分泌シグナル（配列番号２０）のアミノ酸配列は、GenBankに登録されたそれぞれの遺伝子にコードされるアミノ酸配列から、シグナルペプチド予測プログラムPSORT（http://psort.nibb.ac.jp/）（WoLF PSORT（http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）として利用可能）による予測に基づき、抽出した。【００９１】
本実施例で用いた酵母サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株（非特許文献８）は、Invitrogen社より入手した。【００９２】
本実施例に示す全てのＰＣＲ法には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて実施した。【００９３】
本実施例に示す全ての酵母への遺伝子導入は、酢酸リチウム法によって実施した。【００９４】
（調製例１：各種発現カセットを含有するベクタープラスミドの調製）
下記発現カセットＸ１〜Ｘ１９をそれぞれ含むプラスミドを調製した：
Ｘ１：SED1プロモーター＋グルコアミラーゼ分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ２：SED1プロモーター＋SED1分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ３：SED1プロモーター＋MFα prepro＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ４：SED1プロモーター＋HKR1分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ５：SED1プロモーター＋グルコアミラーゼ分泌シグナル＋BGL1
Ｘ６：SED1プロモーター＋SED1分泌シグナル＋BGL1
Ｘ７：SED1プロモーター＋MFα prepro＋BGL1
Ｘ８：SED1プロモーター＋HKR1分泌シグナル＋BGL1
Ｘ９：SED1プロモーター＋グルコアミラーゼ分泌シグナル＋EGII＋SED1アンカードメイン
Ｘ１０：SED1プロモーター＋SED1分泌シグナル＋EGII＋SED1アンカードメイン
Ｘ１１：SED1プロモーター＋MFα prepro＋EGII＋SED1アンカードメイン
Ｘ１２：TDH3プロモーター＋グルコアミラーゼ分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ１３：TDH3プロモーター＋SED1分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ１４：TDH3プロモーター＋MFα prepro＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ１５：PGK1プロモーター＋グルコアミラーゼ分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ１６：PGK1プロモーター＋SED1分泌シグナル＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ１７：PGK1プロモーター＋MFα prepro＋BGL1＋SED1アンカードメイン
Ｘ１８：CWP2プロモーター＋SED1分泌シグナル＋BGL1
Ｘ１９：CWP2プロモーター＋CWP2分泌シグナル＋BGL1
Ｘ２０：ピキア・パストリス由来TDH1プロモーター＋MFα prepro＋GFP
Ｘ２１：ピキア・パストリス由来TDH1プロモーター＋グルコアミラーゼ分泌シグナル＋GFP
Ｘ２２：ピキア・パストリス由来TDH1プロモーター＋SED1分泌シグナル＋GFP【００９５】
上記発現カセットに含まれる各構成要素の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下に示されるとおりである：
配列番号１：サッカロマイセス・セレビシエ由来のSED1の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のSED1の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のSED1のプロモーターの塩基配列
配列番号４：本発明の実施例においてＳＥＤ１アンカードメインとして用いた、サッカロマイセス・セレビシエ由来のSED1アンカータンパク質のコーディング領域から開始コドンを除いた領域のＤＮＡの塩基配列
配列番号５：本発明の実施例においてＳＥＤ１アンカードメインとして用いた、サッカロマイセス・セレビシエ由来のSED1アンカータンパク質（但し開始メチオニンを含まない）のアミノ酸配列
配列番号６：リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のグルコアミラーゼ分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号７：リゾプス・オリゼ由来のグルコアミラーゼ分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号８：サッカロマイセス・セレビシエ由来のMFα preproをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号９：サッカロマイセス・セレビシエ由来のMFα preproのアミノ酸配列
配列番号１０：サッカロマイセス・セレビシエ由来の分泌タンパク質HKR1の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１１：サッカロマイセス・セレビシエ由来の分泌タンパク質HKR1の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号１２：サッカロマイセス・セレビシエ由来のTDH3プロモーターの塩基配列
配列番号１３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のPGK1プロモーターの塩基配列
配列番号１４：アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（BGL1）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１５：アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（BGL1）のアミノ酸配列
配列番号１６：トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（EGII）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１７：トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（EGII）のアミノ酸配列
配列番号１８：サッカロマイセス・セレビシエ由来のCWP2プロモーターの塩基配列
配列番号１９：サッカロマイセス・セレビシエ由来のCWP2分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２０：サッカロマイセス・セレビシエ由来のCWP2分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号２１：ピキア・パストリス由来のTDH1プロモーターの塩基配列
配列番号２２：ピキア・パストリスのコドンに最適化したウミキノコグリーン１（ｍＵｋＧ１）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２３：ウミキノコグリーン１（ｍＵｋＧ１）のアミノ酸配列【００９６】
以下、本実施例で用いる形質転換酵母株を得るために使用した各種プラスミドの調製手順について説明する。【００９７】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子Ｓｅｄ１について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対Sed1p-F（配列番号２４）およびSed1ss-R（配列番号２５）を用いて増幅し、プロモーター領域および分泌シグナル配列を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SGS（栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３、およびＢＧＬ１発現カセット（すなわち、ＳＥＤ１プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）遺伝子のコーディング領域、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域、およびα−アグルチニン遺伝子のコーディング領域下流４４５ｂｐのターミネーター領域がこの順に配置されているカセット：発現カセットＸ１）を有する表層発現用ベクター：非特許文献１０のpIBG-SSに相当）を鋳型とし、プライマー対BGL1-F（配列番号２６）およびPRS-R（配列番号２７）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ２を含むプラスミドをpIBG-SSSと命名した。【００９８】
サッカロマイセス・セレビシエ由来のMFα prepro leader配列を含む断片を、ＰＣＲ法により、pIUPGSBAAG（MFα prepro配列およびα−アグルチニン遺伝子の３’側の半分の領域を有するα−アミラーゼの表層発現用ベクター：非特許文献１１）を鋳型とし、プライマー対MFa-F（配列番号２８）およびMFa-R（配列番号２９）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SGSを鋳型とし、プライマー対BGL1-F2（配列番号３０）およびSed1p-R（配列番号３１）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ３を含むプラスミドをpIBG-SMSと命名した。【００９９】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の分泌タンパク質遺伝子Ｈｋｒ１について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対Hkr1ss-F（配列番号３２）およびHkr1ss-R（配列番号３３）を用いて増幅し、分泌シグナル配列を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SGSを鋳型とし、プライマー対BGL1-F3（配列番号３４）およびSed1p-R2（配列番号３５）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ４を含むプラスミドをpIBG-SHSと命名した。【０１００】
pIBG-SGS、pIBG-SSS、pIBG-SMS、およびpIBG-SHSのＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域を除いた配列を、それぞれのプラスミドを鋳型とし、プライマー対PRS-BsrGI-F（配列番号３６）およびBGL1-BsrGI-R（配列番号３７）を用いて増幅することにより調製した。これらの断片をそれぞれBsrGIで処理し、セルフライゲーション法により環状化させた。得られた発現カセットＸ５、Ｘ６、Ｘ７、またはＸ８を含むプラスミドをそれぞれpIBG-SGsec、pIBG-SSsec、pIBG-SMsec、およびpIBG-SHsecと命名した。【０１０１】
トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）遺伝子のコーディング領域を、ＰＣＲ法により、pIEG-SGS（栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３、およびＥＧＩＩ発現カセット（すなわち、ＳＥＤ１プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、ＥＧＩＩ遺伝子のコーディング領域、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域、およびα−アグルチニン遺伝子のコーディング領域下流４４５ｂｐのターミネーター領域がこの順に配置されているカセット：発現カセットＸ９）を有する表層発現用ベクター：非特許文献１０のpIEG-SSに相当）を鋳型とし、プライマー対EGII-F（配列番号３８）およびEGII-R（配列番号３９）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SSSを鋳型とし、プライマー対Sed1a-F（配列番号４０）およびSed1ss-R2（配列番号４１）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１０を含むプラスミドをpIEG-SSSと命名した。【０１０２】
ＥＧＩＩ遺伝子のコーディング領域を、ＰＣＲ法により、pIEG-SGSを鋳型とし、プライマー対EGII-F2（配列番号４２）およびEGII-R（配列番号３９）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SMSを鋳型とし、プライマー対Sed1a-F（配列番号４０）およびMFa-R2（配列番号４３）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１１を含むプラスミドをpIEG-SMSと命名した。【０１０３】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＴＤＨ３のプロモーター領域を、ＰＣＲ法により、pIBG-TGS（栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３、およびＢＧＬ１発現カセット（すなわち、ＴＤＨ３プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、ＢＧＬ１遺伝子のコーディング領域、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域、およびα−アグルチニン遺伝子のコーディング領域下流４４５ｂｐのターミネーター領域がこの順に配置されているカセット：発現カセットＸ１２）を有する表層発現用ベクター：非特許文献１０のpIBG-TSに相当）を鋳型とし、プライマー対TDH3p-F（配列番号４４）およびTDH3p-R（配列番号４５）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SSSを鋳型とし、プライマー対Sed1ss-F（配列番号４６）およびPRS-R2（配列番号４７）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１３を含むプラスミドをpIBG-TSSと命名した。【０１０４】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＴＤＨ３のプロモーター領域を、ＰＣＲ法により、pIBG-TGSを鋳型とし、プライマー対TDH3p-F（配列番号４４）およびTDH3p-R2（配列番号４８）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SMSを鋳型とし、プライマー対MFa-F2（配列番号４９）およびPRS-R2（配列番号４７）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１４を含むプラスミドをpIBG-TMSと命名した。【０１０５】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＰＧＫ１のプロモーター領域を、ＰＣＲ法により、pGK403（ＰＧＫ１のプロモーター領域およびターミネーター領域を有するタンパク質発現用ベクター：非特許文献１２）を鋳型とし、プライマー対PGK1p-F（配列番号５０）およびPGK1p-R（配列番号５１）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SGSを鋳型とし、プライマー対GAss-F（配列番号５２）およびPRS-R3（配列番号５３）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１５を含むプラスミドをpIBG-PGSと命名した。【０１０６】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＰＧＫ１のプロモーター領域を、ＰＣＲ法により、pGK403を鋳型とし、プライマー対PGK1p-F（配列番号５０）およびPGK1p-R2（配列番号５４）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SSSを鋳型とし、プライマー対Sed1ss-F2（配列番号５５）およびPRS-R3（配列番号５３）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１６を含むプラスミドをpIBG-PSSと命名した。【０１０７】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＰＧＫ１のプロモーター領域を、ＰＣＲ法により、pGK403を鋳型とし、プライマー対PGK1p-F（配列番号５０）およびPGK1p-R3（配列番号５６）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SMSを鋳型とし、プライマー対MFa-F3（配列番号５７）およびPRS-R3（配列番号５３）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１７を含むプラスミドをpIBG-PMSと命名した。【０１０８】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子ＣＷＰ２のプロモーター領域を、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対Cwp2p-F（配列番号５８）およびCwp2p-R（配列番号５９）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SSsecを鋳型とし、プライマー対Sed1ss-F3（配列番号６０）およびPRS-R4（配列番号６１）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１８を含むプラスミドをpIBG-CSsecと命名した。【０１０９】
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子ＣＷＰ２のプロモーター領域および分泌シグナル配列を、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対Cwp2p-F（配列番号５８）およびCwp2ss-R（配列番号６２）を用いて増幅することにより調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG-SSsecを鋳型とし、プライマー対BGL1-F4（配列番号６３）およびPRS-R4（配列番号６１）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られた発現カセットＸ１９を含むプラスミドをpIBG-CCsecと命名した。【０１１０】
ピキア・パストリス由来のＴＤＨ１遺伝子のプロモーター領域、SpeIサイト、サッカロマイセス・セレビシエ由来のMFα prepro leader配列、XhoIサイト、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コーディング領域、およびピキア・パストリス由来のＡＯＸ１遺伝子のターミネーター領域がこの順に配置されている断片を、両端に制限酵素HindIIIおよびBamHIのサイトを付与したうえで遺伝子合成した。なお、ＧＦＰ遺伝子には、ピキア・パストリスのコドンに最適化したウミキノコグリーン１（ｍＵｋＧ１）遺伝子を用いた。この断片をHindIIIおよびBamHIで処理し、同様に処理したプラスミドpUC19に連結した。得られたプラスミドをpmUkG1_MFαと命名した。続いて、Ｇ４１８耐性遺伝子配列を、ＰＣＲ法により、Life technology社製プラスミドpPIC9Kを鋳型とし、プライマー対G418r-BamHI-F（配列番号６４）およびG418r-EcoRI-R（配列番号６５）を用いて増幅することにより調製した。この断片をBamHIおよびEcoRIで処理し、同様に処理したプラスミドpmUkG1_MFαに連結した。得られた発現カセットＸ２０を含むプラスミドをpGmUkG1_MFαと命名した。【０１１１】
リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列を、ＰＣＲ法により、pIBG-SGSを鋳型とし、プライマー対MFa-SpeI-F（配列番号６６）およびMFa-XhoI-R（配列番号６７）を用いて増幅することにより調製した。この断片をSpeIおよびXhoIで処理し、同様に処理してMFα prepro leader配列を除いたプラスミドpGmUkG1_MFαに連結した。得られた発現カセットＸ２１を含むプラスミドをpGmUkG1_GAと命名した。【０１１２】
サッカロマイセス・セレビシエ由来ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列を、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対Sed1ss-SpeI-F（配列番号６８）およびSed1ss-XhoI-R（配列番号６９）を用いて増幅することにより調製した。この断片をSpeIおよびXhoIで処理し、同様に処理してMFα prepro leader配列を除いたプラスミドpGmUkG1_MFαに連結した。得られた発現カセットＸ２２を含むプラスミドをpGmUkG1_SED1と命名した。【０１１３】
（調製例２：各種形質転換酵母の調製）
調製例１に記載の以下のプラスミド（pIBG-SGS、pIBG-SSS、pIBG-SMS、pIBG-SHS、pIBG-SGsec、pIBG-SSsec、pIBG-SMsec、pIBG-SHsec、pIEG-SGS、pIEG-SSS、pIEG-SMS、pIBG-TGS、pIBG-TSS、pIBG-TMS、pIBG-PGS、pIBG-PSS、pIBG-PMS、pIBG-CSsec、およびpIBG-CCsec）をNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株をそれぞれBY-BG-SGS株、BY-BG-SSS株、BY-BG-SMS株、BY-BG-SHS株、BY-BG-SGsec株、BY-BG-SSsec株、BY-BG-SMsec株、BY-BG-SHsec株、BY-EG-SGS株、BY-EG-SSS株、BY-EG-SMS株、BY-BG-TGS株、BY-BG-TSS株、BY-BG-TMS株、BY-BG-PGS株、BY-BG-PSS株、BY-BG-PMS株、BY-BG-CSsec株、およびBY-BG-CCsec株と称する。【０１１４】
調製例１に記載の以下のプラスミド（pGmUkG1_MFa、pGmUkG1_GA、およびpGmUkG1_SED1）をBsiWIで処理し、それぞれ酵母ピキア・パストリスＣＢＳ７４３５株（野生株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株をそれぞれPP-GFP-MFα株、PP-GFP-GA株、およびPP-GFP-SED1株と称する。【０１１５】
（試験例１：β−グルコシダーゼ活性（ＢＧＬ）の検討）
表層提示株については菌体のＢＧＬ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（Ｕ））を、そして分泌株については培地中のＢＧＬ活性（培地１Ｌ当たりの活性量（Ｕ））を測定した。β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性の検討を以下の手順に従って行った。【０１１６】
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの２４時間経過ごとに培養液をそれぞれ回収し、１，０００ｇ、５分間の遠心分離にて菌体と培地とを分離した。【０１１７】
菌体のβ−グルコシダーゼ活性の測定は、以下のように行った：
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液５００μＬ（組成：１０ｍＭ  ｐＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）１００μＬ（最終濃度２ｍＭ）；５００ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）  ５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２５０μＬ；および酵母懸濁液１００μＬ）（最終菌体濃度１〜１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、５００ｒｐｍ、３０℃にて１０分間反応；
（３）反応終了後、３Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ５００μＬを加え反応を停止；そして
（４）１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の４００ｎｍにおける吸光度ＡＢＳ４００を測定。１分間で１μmolのｐＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）を遊離する酵素量を１Ｕとする。【０１１８】
培地中のＢＧＬ活性を測定する場合は、上記反応液の調製を、酵母懸濁液の代わりに培地１００μＬを添加して行った以外は、上述のとおりに行った。【０１１９】
（試験例２：エンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性の検討）
表層提示株について、菌体のＥＧ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（Ｕ））を以下の手順に従って行った。【０１２０】
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの４８時間後に培養液をそれぞれ回収し、１，０００ｇ、５分間の遠心分離にて菌体と培地とを分離した。【０１２１】
菌体のエンドグルカナーゼ活性の測定は、以下のように行った：
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液２５００μＬ（組成：セラザイムＣタブレット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１錠；５００ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）  ２５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２０００μＬ；および酵母懸濁液２５０μＬ（最終菌体濃度１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、静置、３８℃にて４時間反応；
（３）反応終了後、１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の５９０ｎｍの吸光度ＡＢＳ５９０を測定。【０１２２】
（試験例３：ピキア・パストリスにおけるGFP分泌発現の検討）
キア・パストリスのGFP分泌株については培地中のGFP蛍光強度を以下の手順に従って行った。【０１２３】
菌体を９６穴ディープウェルプレートに入れたＢＭＧＹ培地５００μＬに移植し、３０℃、１８００ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いでそれぞれの前培養液を９６穴ディープウェルプレートに入れたフレッシュなＢＭＧＹ培地５００μＬに移植し、３０℃、１８００ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの２４時間後に９６穴ディープウェルプレートを３，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、それぞれの培養上清を得た。【０１２４】
各培養上清１００μＬを96穴ブラックプレートへ添加し、各ウェルのＧＦＰ蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ：蛍光波長：５１０ｎｍ）をEnVison 2104 Multilabel Reader (Perkin Elmer社製) にて測定した。【０１２５】
（実施例１：β−グルコシダーゼ表層提示における各種分泌シグナルの比較）
本実施例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれの発現カセットを含むプラスミドを導入して得られた各種の表層提示形質転換酵母（BY-BG-SGS株、BY-BG-SSS株、BY-BG-SMS株、およびBY-BG-SHS株）について、菌体のＢＧＬ活性を測定した。【０１２６】
この結果を図１に示す。図１の横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、β−グルコシダーゼ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（「Ｕ／ｇ乾燥菌体重量」）を示す。図１中の記号は以下の通りである：黒丸、ＳＥＤ１分泌シグナル（ＳＥＤ１）；黒菱形、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナル（ＧＡ）；黒三角、ＭＦαprepro（ＭＦα）；および黒四角、ＨＫＲ１分泌シグナル（ＨＫＲ１）。【０１２７】
図１に示されるように、ＳＥＤ１分泌シグナルを用いたＢＧＬ表層提示形質転換株は、従来高効率な分泌タンパク質発現によく用いられているMFαpreproや、表層提示タンパク質発現によく用いられているリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナルを用いた形質転換株と比較しても、相当に高い表層ＢＧＬ活性を示すことが分かった。【０１２８】
（実施例２：β−グルコシダーゼ分泌における各種分泌シグナルの比較）
本実施例では、Ｘ５〜Ｘ８のそれぞれの発現カセットを含むプラスミドを導入して得られた各種の分泌形質転換酵母（BY-BG-SGsec株、BY-BG-SSsec株、BY-BG-SMsec株、およびBY-BG-SHsec株）について、培地中のＢＧＬ活性を測定した。【０１２９】
この結果を図２に示す。図２の横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、β−グルコシダーゼ活性（培地中の活性量（「Ｕ／Ｌ」）を示す。図２中の記号は以下の通りである：黒丸、ＳＥＤ１分泌シグナル（ＳＥＤ１）；黒菱形、グルコアミラーゼ分泌シグナル（ＧＡ）；黒三角、ＭＦαprepro（ＭＦα）；および黒四角、ＨＫＲ１分泌シグナル（ＨＫＲ１）。【０１３０】
図２に示されるように、ＳＥＤ１分泌シグナルを用いたＢＧＬ分泌形質転換株は、従来高効率な分泌タンパク質発現によく用いられているMFαpreproや、表層提示タンパク質発現によく用いられているリゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナルを用いた形質転換株と比較しても、相当に高いＢＧＬ活性を示すことが分かった。【０１３１】
（実施例３：エンドグルカナーゼ表層提示における各種分泌シグナルの比較）
本実施例では、Ｘ９〜Ｘ１１のそれぞれの発現カセットを含むプラスミドを導入して得られた各種の表層提示転換酵母（BY-EG-SGS株、BY-EG-SSS株、およびBY-EG-SMS株）について、菌体のＥＧ活性を測定した。【０１３２】
この結果を図３に示す。図３の縦軸は、ＥＧ活性（吸光度測定値（「ＡＢＳ５９０」）を示す。図３の棒グラフは、左から順に：リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナル（ＧＡ）、ＭＦαprepro（ＭＦα）およびＳＥＤ１分泌シグナル（ＳＥＤ１）を表す。【０１３３】
図３に示されるように、エンドグルカナーゼ活性を指標とした場合でも、ＳＥＤ１分泌シグナルを用いた表層提示形質転換株は、従来よく用いられている分泌シグナルを用いた表層提示形質転換株よりも高い分泌効率を示すことが観察された。【０１３４】
（実施例４：各種プロモーターとの組み合わせの検討）
本実施例では、Ｘ１２〜Ｘ１７のそれぞれの発現カセットを含むプラスミドを導入して得られた各種の表層提示転換酵母（BY-BG-TGS株、BY-BG-TSS株、BY-BG-TMS株、BY-BG-PGS株、BY-BG-PSS株、およびBY-BG-PMS株）について、菌体のＢＧＬ活性を測定した。【０１３５】
この結果を図４に示す（上のグラフ：ＴＤＨ３プロモーター；および下のグラフ：ＰＧＫ１プロモーター）。図４の各グラフの横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、β−グルコシダーゼ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（「Ｕ／ｇ乾燥菌体重量」）を示す。図４中の記号は以下の通りである：黒四角、ＳＥＤ１分泌シグナル（ＳＥＤ１）；黒菱形、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナル（ＧＡ）；および黒三角、ＭＦα prepro（ＭＦα）。【０１３６】
図４に示されるように、ＳＥＤ１プロモーター以外のプロモーターと組み合わせた場合も、ＳＥＤ１分泌シグナルを用いた株は、従来よく用いられている分泌シグナルを用いた表層提示形質転換株と同等以上の高い酵素活性を、安定して示すことが観察された。特に、ＴＤＨ３プロモーターでは、図１に示したＳＥＤ１プロモーターと組み合わせた場合と同様に、活性上昇率が顕著であった。【０１３７】
（実施例５：各種プロモーターとの組み合わせの検討）
本実施例では、Ｘ１８およびＸ１９のそれぞれの発現カセットを含むプラスミドを導入して得られた各種の分泌形質転換酵母（BY-BG-CSsec株、およびBY-BG-CCsec株）について、培地中のＢＧＬ活性を測定した。【０１３８】
この結果を図５に示す。図５の横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、β−グルコシダーゼ活性（培地中の活性量（「Ｕ／Ｌ」）を示す。図５中の記号は以下の通りである：黒菱形、ＣＷＰ２プロモーター＋ＳＥＤ１分泌シグナル；および黒四角、ＣＷＰ２プロモーター＋ＣＷＰ２分泌シグナル。【０１３９】
図５に示されるように、ＣＷＰ２プロモーターについて、ＳＥＤ１分泌シグナルと併せて用いた分泌形質転換株は、同じ遺伝子に由来するＣＷＰ２分泌シグナルと併せて用いた分泌形質転換株と比較しても、高いＢＧＬ活性を示すことが観察された。【０１４０】
（実施例６：異種酵母における分泌能力の検討）
本実施例では、Ｘ２０、Ｘ２１およびＸ２２のそれぞれの発現カセットを含むプラスミドを導入して得られた酵母ピキア・パストリスのGFP分泌形質転換体（PP-GFP-MFα株、PP-GFP-GA株、およびPP-GFP-SED1株と称する。）について、培地中のＧＦＰ蛍光強度を測定した。【０１４１】
この結果を図６に示す。図６の縦軸は、PP-GFP-MFα株の培地中のＧＦＰ蛍光強度を１とした場合の各株の培地中のＧＦＰ蛍光強度の相対値を示す。図６の棒グラフは、左から順に：ＭＦαprepro（ＭＦα）、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナル（ＧＡ）、およびＳＥＤ１分泌シグナル（ＳＥＤ１）を表す。【０１４２】
図６に示されるように、ピキア・パストリスを宿主とした場合にも、ＳＥＤ１分泌シグナルを用いた分泌形質転換株は、従来よく用いられている分泌シグナルを用いた分泌形質転換株よりも相当に高いＧＦＰ蛍光強度を示すことが観察された。この結果から、ＳＥＤ１分泌シグナルが、サッカロマイセス・セレビシエ以外の酵母種を宿主とした場合でも、タンパク質の分泌量を従来よりも向上させることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明によれば、酵素等の様々なタンパク質を効率良く細胞外に分泌、または細胞表層に提示できる。これにより、酵母を用いた物質生産の効率化、低コスト化およびその普及の促進に非常に有用である。より具体的な応用分野としては、抗体、酵素等のタンパク質の分泌生産、セルロース分解酵素を細胞表層に提示した酵母によるセルロース系バイオマスからの化学品生産等の効率化、低コスト化が考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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