(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存または保持する方法であって、
（ｉ）非ゼラチン状の形態の培地を前記少なくとも１つの幹細胞に接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）前記培地の温度を変化させることにより、前記培地を前記非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に変化させ、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）前記ゲル状の幹細胞組成物を前記静止状態の幹細胞と共に保存することと
を含み、
前記培地が、幹細胞の生存率を維持するための栄養素として幹細胞培養用培地を含む水性媒体と、前記水性媒体内に分散した合成熱応答性コポリマー粒子とを含み、
前記培地が、前記温度の変化に応じて前記非ゼラチン状の形態とゼラチン状の形態との間で形態が変化し、前記非ゼラチン状の形態では、前記培地がコロイド状の安定した前記合成熱応答性コポリマー粒子の水性分散体を含み、前記ゼラチン状の形態では、前記培地が静止状態で幹細胞を収容できるスキャフォールドまたはマトリックスを提供するゲル形態であり、
少なくとも１つの前記ヒト幹細胞が、分化と増殖が生じない静止状態にあり、
前記熱応答性コポリマーが、ブロックコポリマーであり、下記式Ｂによって定義され、
【化１】
0006499975.tif 000008
ここで、式中、Ｐ１がモノマーＭ１に由来するポリマー成分を表し、Ｐ２が水溶性のモノマーＭ２に由来する非水溶性のポリマー成分を表し、
前記Ｐ１のポリマー成分が、前記Ｐ２のポリマー成分と比べて親水性であり、
前記Ｐ１のポリマー成分が、前記Ｐ２のポリマー成分よりも熱応答性が低く、
前記ヒト幹細胞が、多能性のヒト幹細胞である、
方法。
【請求項２】
前記増殖の静止状態が、ｋｉ６７免疫標識を用いた目視検査を介して判定され、
前記分化の静止状態が、特異的なマーカーモノクローナル抗体を用いる蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による解析を介して判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地の前記非ゼラチン状の形態と前記ゼラチン状の形態の間の転移及びその逆が、前記熱応答性コポリマー粒子の形態の温度依存的変化によってもたらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉ）が、１０℃以下の温度の前記幹細胞培地を用いて実施され、ステップ（ｉｉ）が、前記幹細胞マトリックスの温度を１０℃以下から１８℃以上に調整することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉｉ）が、１８℃以上の温度で前記ゲル状の幹細胞組成物を保存することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉｉ）が前記ゲル状の幹細胞組成物を少なくとも７日間保存することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞の生存率を維持するための栄養素として幹細胞培養用培地を含む水性媒体と、前記水性媒体内に分散した合成熱応答性コポリマー粒子と、生きた多能性のヒト幹細胞とを含む、生きたヒト幹細胞を静止状態で保存および保持するための培地であって、
前記培地が、温度の変化に応じて非ゼラチン状とゼラチン状との間で形態が変化し、前記非ゼラチン状の形態では、コロイド状の安定した前記合成熱応答性コポリマー粒子の水性分散体を含み、前記ゼラチン状の形態では、静止状態で幹細胞を収容することができるスキャフォールドまたはマトリックスを提供するゲル形態であり、
前記少なくとも１つのヒト幹細胞が、分化と増殖が生じない静止状態にあり、
前記熱応答性コポリマーが、ブロックコポリマーであり、下記式Ｂによって定義され、
【化２】
0006499975.tif 000009
ここで、式中、Ｐ１がモノマーＭ１に由来するポリマー成分を表し、Ｐ２が水溶性のモノマーＭ２に由来する非水溶性のポリマー成分を表し、
前記Ｐ１のポリマー成分が、前記Ｐ２のポリマー成分と比べて親水性であり、
前記Ｐ１のポリマー成分が、前記Ｐ２のポリマー成分よりも熱応答性が低い、
培地。
【請求項８】
請求項７に記載の培地を調製するためのキットであって、
（ｉ）請求項７で定義する合成熱応答性コポリマー粒子と、
（ｉｉ）請求項７で定義する水性媒体と、
（ｉｉｉ）生きた多能性のヒト幹細胞と
を含むキット。
【請求項９】
請求項７に記載の培地内に分散した少なくとも１つの生きた多能性のヒト幹細胞を含む、ゲル状の幹細胞組成物。
【請求項１０】
ゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
（ｉ）請求項９に記載のゲル状の幹細胞組成物を準備することと、または請求項１〜６のいずれか一項に記載のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行うことと、
（ｉｉ）前記幹細胞培地の温度を変化させて、前記ゼラチン状の形態から前記非ゼラチン状の形態に前記培地を変化させることによって、流動性の幹細胞組成物を生成することと
を含む方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の、ゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
（ｉｉｉ）流動性の幹細胞組成物を生成した後、前記流動性の幹細胞組成物から前記幹細胞を単離することを更に含む、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の、ゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
（ｉｖ）流動性の幹細胞組成物を生成した後、前記幹細胞の分化および／または増殖を生じさせることを更に含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記培地が、温度の変化に応じて、前記非ゼラチン状の形態と前記ゼラチン状の形態の間の可逆的に形態を変化する、方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記培地が、そのゲル化温度より低い温度にて前記非ゼラチン状の形態で存在し、前記ゲル化温度より高い温度にてゼラチン状の形態で存在し、２０℃以上の温度で前記ゼラチン状の形態である、方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、（いかなる幹細胞／分化後細胞も除いて）前記培地が動物由来の生成物を含まない、方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記合成熱応答性コポリマー粒子が、前記培地が前記非ゼラチン状の形態の場合に球状のものであり、
前記培地が前記ゼラチン状の形態である場合に異方性の「ワーム」または「ワーム様」の粒子である、方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
各モノマーＭ１が、下記式Ｍ１Ａ、Ｍ１Ｂおよび／またはＭ１Ｃのモノマーから選択され、
【化３】
0006499975.tif 000010
【化４】
0006499975.tif 000011
ここで、式中、Ｒ１、Ｒ１０およびＲ１１が、Ｐ１を少なくとも部分的に水溶性にする、Ｍ１ＡまたはＭ１Ｃの置換基を表し、
Ｒ２が、Ｈ、ＣＨ３またはＣＮを表し、
ＲＳが、前記Ｐ１を少なくとも部分的に水溶性にするのに有効な、芳香族環の少なくとも１つの置換基を表し、
各モノマーＭ２が、下記式Ｍ２Ａおよび／またはＭ２Ｂのモノマーから選択され、
【化５】
0006499975.tif 000012
ここで、式中、Ｒ３が、Ｐ２を非水溶性にするＭ２の置換基であり、Ｒ４およびＲ６が独立に、Ｈまたはメチルを表し、または
Ｐ１が、モノマーＭ２とともにモノマーＭ１を含むコポリマーであり、前記ポリマーＰ１が水溶性のままである、方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
Ｐ１が、それ自体がグリセロールモノメタクリレート（ＧＭＡ）モノマー単位を含むポリマーまたはコポリマーであり、
Ｐ２が、それ自体が２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）モノマー単位を含むポリマーまたはコポリマーである、方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記熱応答性コポリマーが、以下を含む群：
２０〜２００の重合度を有するＰＧＭＡブロックと、５０〜３００の間の重合度を有するＰＨＰＭＡブロックとからなる、ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡ、
１０〜１２０の重合度（ＤＰ）を有するＰＧＭＡブロックと、２０〜２００の間の重合度（ＤＰ）を有するＰ（ＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロックとからなる、ＰＧＭＡ−Ｐ（ＧＭＡ−ＨＰＭＡ）、及び
２０〜２００の間の重合度を有するＰＧＭＡブロックと、２０〜２００の間の重合度（ＤＰ）を有するＰ（ＤＥＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロックとからなり、前記Ｐ（ＤＥＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロック内のＤＥＧＭＡモノマー単位対ＨＰＭＡモノマー単位のモル比が１０：１〜１：１０である、ＰＧＭＡ−Ｐ（ＤＥＧＭＡ−ＨＰＭＡ）
から選択される前記式Ｂ［Ｐ１−Ｐ２］のブロックコポリマーである、方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜１９のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記培地が、
１〜３０％ｗ／ｗの合成熱応答性コポリマー粒子と、
７０〜９９％ｗ／ｗの水性媒体と
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜２０のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記幹細胞が、全能性および／または多能性の幹細胞である、方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜２１のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記熱応答性コポリマー粒子が、限外濾過を通じて滅菌される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を静止状態で保存もしくは保持する方法、または請求項１０〜２２のいずれか一項に記載のゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの生きたヒト幹細胞を放出する方法であって、
前記培地が、前記栄養素としてヒト胚性幹細胞培養用培地を含み、前記合成熱応答性コポリマーとしてＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡジブロックコポリマーを含み、
前記培地内で保存している間、前記培地が、幹細胞の分化および／または増殖を遅延させるおよび／または防止する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を保存する、保持する、培養する及び／又は分化させるための培地に関し、本発明の培地を使用して幹細胞を保存する、保持する、培養する及び／又は分化させる方法にも関する。また、本発明の培地及び培地内に分散した幹細胞を含む組成物（例えば医薬組成物）を形成するためのキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、長い間熾烈な研究の焦点となっており、幹細胞の生物学及び機能への本質的な関心、並びにその潜在的な治療的使用への非常に高い関心が集まっている。
【０００３】
医療分野では、研究者は、幹細胞はある種のヒト疾患の治療に革命を起こす可能性があると信じている。実際、いくつかの成体幹細胞療法が既に存在しており、例えば白血病治療で使用される骨髄移植である。将来的には、医学研究者は、幹細胞研究に由来する技術を、多くの他の機能障害及び状態の中で、癌、パーキンソン病、脊髄傷害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症及び筋損傷を含めた幅広い疾患の治療のために使用できると予測している。
【０００４】
進行中の幹細胞研究及び将来の幹細胞に基づく療法の開発に関して、効果的かつ費用対効果が大きい幹細胞を培養する方法が要求されている。特に、保存、輸送及び培養の間に幹細胞の生存率及び表現型を維持できる培養培地が必要である。また、容易に滅菌することと（ｉ）、生物物質の存在を排除又は最小限にすることと（ｉｉ）、要求に応じて、培養培地からの幹細胞の容易な収集及び単離を可能とする幹細胞培養用の培地も必要である（ｉｉｉ）。
【０００５】
現在市場に出ている幹細胞用の培地製品は、動物由来の材料を使用し、これはその組成物のバッチ間変動が原因でサブオプティマルなものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであって、上述要求のいくつか又はすべてに対処できる幹細胞用培地を提供することを目的する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、水性媒体内に分散した合成熱応答性コポリマー粒子を含む幹細胞用培地であって、温度の変化に応じて非ゼラチン状の形態とゼラチン状の形態の間の変化を受けることができ、非ゼラチン状の形態では、コロイド状に安定した、合成熱応答性コポリマー粒子の水性分散体を含み、ゼラチン状の形態では、幹細胞を収容することができるスキャフォールド又はマトリックスを提供するゲル形態であり、水性媒体が、幹細胞の生存率を維持するための栄養素をさらに含む、幹細胞用培地が提供される。
【０００８】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様による培地内に分散した少なくとも１つの幹細胞を含む幹細胞組成物が提供される。
【０００９】
本発明の第３の態様によれば、本発明の第２の態様による幹細胞組成物を生成する方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物(a fluid stem cell composition)（すなわち、培地中の流動性の幹細胞分散体(a fluid dispersion of stem cells in the medium）を生成することと
（ｉｉ）任意選択的に培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状培地内に幹細胞が分散しているゲル状の幹細胞組成物(a gelled stem cell composition)を生成すること
を含む方法が提供される。
【００１０】
本発明の第４の態様によれば、少なくとも１つの幹細胞を保存又は保持する方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）ゲル状の幹細胞組成物を保存することと
を含む方法が提供される。
【００１１】
本発明の第５の態様によれば、幹細胞を培養する方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）培地の温度を変化させて非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）ゲル状の幹細胞組成物内で幹細胞を培養することと
を含む方法が提供される。
【００１２】
本発明の第６の態様によれば、幹細胞を分化させる方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）幹細胞の分化を促進するための条件下で幹細胞を培養することと
を含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の第７の態様によれば、本明細書で定義されたゲル状の幹細胞組成物から少なくとも１つの幹細胞を放出する方法であって、
（ｉ）第１の態様によるゼラチン状の形態の培地内に分散した少なくとも１つの幹細胞を含むゲル状の幹細胞組成物を準備することと、
（ｉｉ）幹細胞培地の温度を変化させて、ゼラチン状の形態から非ゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）その後、任意選択的に流動性の幹細胞組成物から前記幹細胞を単離することと
を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明の第８の態様によれば、本発明の第１の態様による培地を作製する方法であって、幹細胞の生存率を維持するための栄養素をさらに含む水性媒体中で、前記合成熱応答性コポリマー粒子を分散させることを含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の第９の態様によれば、本発明の第１の態様による培地を調製するためのキットであって、
（ｉ）本明細書で定義される合成熱応答性コポリマー粒子と、
（ｉｉ）幹細胞の生存率を維持するための栄養素をさらに含む水性媒体と
を含むキットが提供される。
【００１６】
本発明の第１０の態様によれば、本発明の第２の態様による幹細胞組成物及び任意選択的に１種又は複数の医薬的に許容される賦形剤(excipient)を含む医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明の第１１の態様によれば、療法で使用するための、第１０の態様による医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明の第１１の態様によれば、幹細胞療法で使用するための、第１０の態様による医薬組成物が提供される。
【００１９】
本発明の第１２の態様によれば、少なくとも１つの幹細胞の保存、保持、培養及び／又は分化のための、本明細書で定義される培地の使用が提供される。
【００２０】
なお、任意の適切な、及び好ましい、本発明の特定の態様の特徴を含めた特徴は、別段の記載がない限り、本発明の他の態様の任意の適切な、及び好ましい特徴を含めた特徴として適用できることを当業者なら理解できるであろう。
【００２１】
以下に、本発明の実施形態について添付の図面を参照してさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｄ４−メタノール中で記録された、ＰＧＭＡ４５−ＰＨＰＭＡ１１０及びＰＧＭＡ４５に関する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】図２は、１０％ｗ／ｗのＰＧＭＡ４５−ＰＨＰＭＡ１１０ジブロックコポリマー分散体に関する損失弾性率及び保存弾性率の温度依存性を示す図である。臨界ゲル化温度（ＣＧＴ）を１７℃と推定した。
【図３】図３は、粗製のＰＧＭＡ５５−Ｐ（ＨＰＭＡ８４−スタット−ＤＥＧＭＡ３６）に関する、ｄ４−メタノール中で記録された１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】図４は、１０％ｗ／ｗのＰＧＭＡ５５−Ｐ（ＨＰＭＡ８４−スタット−ＤＥＧＭＡ３６）ジブロックコポリマーに関する損失弾性率及び保存弾性率の温度依存性を示す図である。臨界ゲル化温度（ＣＧＴ）を２６℃と推定した。
【図５】図５は、ゲル内の胚性幹細胞の凝集体（４日間の培養後）を示す図である。培養期間終了まで、凝集体の増殖がほとんどなかった。
【図６】図６は、２１日後にゲルから回復させた胚性幹細胞の凝集体を示す図である。凝集体は、比較的小さい分化の形態的徴候を示す。
【図７】図７は、２１日間の培養後にゲルから回復させ、標準的な胚性幹細胞培養に継代した胚性幹細胞の凝集体を示す。４８時間後、胚性幹細胞のコロニーが形成され、凝集体から拡散する（図中、矢印で示している）。
【図８】図８は、予めワームゲル／細胞複合培地で２１日間インキュベートした胚性幹細胞の凝集体に関して、抗体表面マーカーのＴｒａ−１−６０（多能性）、ＳＳＥＡ−４（多能性）、ＳＳＥＡ１（分化）で標識された細胞の割合に関するＦＡＣＳ解析のヒストグラムを示す図である。
【図９】図９は、２１日間の培養後にゲルから回復させ、標準的な胚性幹細胞培養に継代した胚性幹細胞の凝集体を示す図である。培養してから１４日後に、凝集体は様々な細胞型への形態分化を示す。
【図１０】図１０は、培地単体（コントロール−ゲルなし）を含むウェルに蒔いた胚性幹細胞の凝集体に関して、抗体表面マーカーのＴｒａ−１−６０（多能性）、ＳＳＥＡ−４（多能性）、ＳＳＥＡ１（分化）で標識された細胞の割合に関するＦＡＣＳ解析のヒストグラムを示す図である。
【図１１】図１１は、温度に応じて様々な形態を形成するＰＧＭＡ−ＨＰＭＡブロックコポリマーを示す図である。
【図１２】図１２は、ＭＴＳアッセイを示す図である。ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１細胞を、組織培養プラスチック（２Ｄ）及びＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡコポリマーゲル（３Ｄ）中で７日間まで培養した。
【図１３】図１３は、ＮＴＥＲＡクローンＤ１のＥＣ細胞のアクチン／ＤＡＰＩ染色を示す図である。ワームゲルと２Ｄ平面状基材（組織培養プラスチック）の比較によって、７日間までの細胞増殖が示される。
【図１４】図１４は、免疫蛍光法によって解析したマーカーの発現を示す図である。３Ｄ（ワームゲル）及び２Ｄ（組織培養プラスチック）中で、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１のＥＣ細胞をレチノイン酸を用いて７、１４、２１日間培養した後の、ＴＲＡ１−６０多能性マーカーの発現（赤）及びＤＡＰＩ核酸染色（青）。３Ｄ（ワームゲル）及び２Ｄ（組織培養プラスチック）中で、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１のＥＣ細胞を、レチノイン酸を用いて７、１４、２１日間培養した後の、Ｖｉｎ２Ｐｂ２２分化マーカーの発現（赤）及びＤＡＰＩ核酸染色（青）。
【図１５】図１５は、ｑＰＣＲによって解析したマーカーの発現を示す図である。Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−０４及びβ３チューブリン、ｈ−ＡＳＨ１は、それぞれ、レチノイン酸を用いて培養してから１４日後に、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１のＥＣ細胞に関して解析された多能性及び分化マーカーである。値は、Δ／ΔＣｔ値として表す。
【図１６】図１６は、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５コポリマーワームゲルに関する、ＨＤＦ細胞の生存率の最適化を示す図である。細胞培養培地でのコポリマーワームゲルの生成について、３つのプロトコルを評価した。プロトコル１（１５０ｍＭのＰＢＳ中で調製し、２倍希釈し、ＰＢＳに対して２日間透析した２０％ｗ／ｖのコポリマーゲル）、プロトコル２（プロトコル１と同様であるが、７日間透析した）、プロトコル３（プロトコル２と同様であるが、続いて一晩凍結乾燥し、純粋な細胞培養培地（ＤＭＥＭ）中に再分散させた。細胞単層を用いる直接的な接触アッセイとＴｈｉｎＣｅｒｔインサートを使用する間接的なアッセイの両方によって、ＨＤＦ細胞の生存率を評価した。ＭＴＴアッセイを使用して、３７℃での細胞生存率を評価した。実験は３連で行った（Ｎ＝３）；＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１７】図１７は、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルを使用した、ｈＥＳ細胞コロニーについて用いられるゲル化／脱ゲル化プロセスを示す図である。Ａ）ｔ２５容器内のＮｕｔｒｉｓｔｅｍで増殖したコロニーを機械的に収集し、８ウェルのｉｂｉｄｉスライド上で直ちにゲル化した。細胞コロニーを含むゲルを、７、１４又は２１日間にわたって、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）において３７℃で維持した。Ｂ）各時点の後、ゲル化を誘導するために、ｉｂｉｄｉウェルを５分間氷上に置いた。次いでコロニーを放出するために、細胞コロニーを含む自由流動性冷却コポリマー分散体を、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地を含む、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ処理（a Cellstart-treated）した６ウェルプレート中に約１０倍希釈した。
【図１８】図１８は、共焦点顕微鏡を使用した、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル内に浸積したｈＥＳ細胞コロニーの生／死画像を示す図である。（プロトコル３に従って調製した）ワームゲル中に７、１４又は２１日間３７℃で浸積した細胞コロニーに関する、Ｓｙｔｏ９及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素を使用した生／死染色後に記録された代表的な蛍光顕微鏡写真。細胞透過性色素であるＳｙｔｏ−９は細胞膜の完全性（生細胞）について報告し、一方、細胞非透過性色素であるＰＩは死細胞のみを染色する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、核対比染色として使用した。
【図１９】図１９は、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍを使用して調製したＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル中にて３７℃で長期保存した後のｈＥＳ細胞コロニーの回復を示す図である。％コロニー回復は、（脱ゲル化より前の最初のコロニー数に対して標準化されたＳＥＭをともなう）時点あたりの平均コロニー回復として計算した。％コロニー減少も同様に推定した。内部コントロール群も本研究に含め、コロニーをワームゲル中に約１０分間浸積し、５℃に冷却して脱ゲル化を誘導し、その後に遠心分離によって単離した。実験は、３連のウェルサンプル中で、ｎ＝３の独立の実験で実施した。
【図２０】図２０は、ワームゲル中にて３７℃で１４日間長期保存し、続いて、５℃への冷却による脱ゲル化を介して単離した後のコロニー回復に対する、元のｈＥＳコロニーサイズの影響を示す図である。ｈＥＳＣコロニーを、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ細胞培養培地を含む水性ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡワームゲル中に機械的に分散させ、１４日間３７℃で保存した。次いで、コロニーを５℃への冷却による脱ゲル化を介して単離し、その後、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ及びＮｕｔｒｉｓｔｅｍ液体培地上に蒔いた。（Ａ）〜（Ｅ）培養してから５日後の様々なｈＥＳ細胞コロニーについて記録された光学顕微鏡写真。小さなコロニー（＜１００μｍ）は、（Ａ）ごくわずかな、経時的な増殖及び分化、又は（Ｂ）脱ゲル化後に成長できないことのいずれかを示した。（Ｃ）サイズが１００μｍを超えるコロニーについては、付着及び増殖が改善され、（Ｄ）１００〜２００μｍのコロニーについては、最適な増殖が得られ、これは特徴的なＥＳ細胞形態も示した。（Ｅ）高密度培養における比較的大きな（＞＞２００μｍ）コロニーの端部で観察された、分化した神経細胞。トレースした線は、最初の脱ゲル化後の元のコロニーサイズを示す。
【図２１】図２１は、６％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル中に２１日間まで３７℃で浸積したｈＥＳ細胞の増殖曲線を示す図である。実施例９に記載されているように、適切な時点（０、７、１４及び２１日間）で脱ゲル化を介してコロニーを収集し、全ＤＮＡを収集し、定量化した。０日目に播種したコロニーから得られた最初のＤＮＡ量（１００％とする）に対してデータを標準化した。データは、２連のウェルで行われたｎ＝３の実験の平均値を表す。光学顕微鏡画像（挿入図を参照）によって、非常に小さな経時的なコロニーサイズの変化が示され、これは非増殖の観察と矛盾がない。
【図２２】図２２は、実施例９に記載されているように行った免疫標識実験を示す図である。（Ａ）ｈＥＳ細胞コロニーは、液体培地及びＣｅｌｌｓｔａｒｔマトリックスでの通常の増殖の間、ｋｉ−６７に対して陽性に染色された。次いで、コロニーを機械的に取り出し、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地を含むＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル中に、（Ｂ）７日間、（Ｄ）１４日間及び（Ｆ）２１日間３７℃で浸積した。ワームゲル内に浸積されている間、いずれの細胞コロニーについてもｋｉ−６７タンパク質は検出されなかった（Ｂ、Ｄ及びＦ）。（Ｃ）７日、（Ｅ）１４日及び（Ｇ）２１日後に、脱ゲル化を介してコロニーを単離し、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆されたウェルに再度蒔き、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地で５日間増殖させてから、ｋｉ−６７に対してさらなる免疫標識実験を行った。すべての場合（Ｃ、Ｅ及びＧを参照）で、陽性染色（Ｃｙ３、赤）によってｋｉ−６７の存在が確認された。核対比染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、青）。実験は、３連のウェル中で、ｎ＝３の独立の実験で実施した。
【図２３】図２３は、１８〜２２℃で７２時間まで保存した後のｈＥＳ細胞コロニーの回復を示す図である。各時点（すなわち、２４時間、４８時間又は７２時間）の後、液体Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍに保存したｈＥＳ細胞コロニーを通常の細胞培養条件（加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中で３７℃に戻し、一方、６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル内に保存したｈＥＳ細胞コロニーを、先に記載したように脱ゲル化を介して単離した。細胞コロニーを、細胞インキュベーター中に一晩放置して回復させた。光学顕微鏡写真は、１６時間の回復期間後の細胞コロニーの典型的な外観を図示する。
【図２４】図２４は、従来の液体３ｉ細胞培養培地又は同じ３ｉ培地を使用して調製した６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル中に３７℃で２４時間保存した後のｈＥＳ細胞の回復を示す図である。（Ａ）従来の液体３ｉ培地内に３７℃で２４時間保存した個々のｈＥＳ細胞の懸濁液を、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された６ウェルプレートで培養した。（Ｂ）加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中にて３７℃で２４時間保存した後、６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル内に浸積したｈＥＳ細胞を脱ゲル化を介して単離し、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された６ウェルプレート上に蒔いた。細胞培養物をＣｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された６ウェルプレートに１６時間接着させ、次いで、光学顕微鏡によって調べた。それらの保存条件にかかわらず、多能性幹細胞と関係がある特徴的な形態が観察された。
【図２５】図２５は、（ａ）１．０％の歪み付加及び１．０ｒａｄ  ｓ−１の固定角振動数で、６％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル（プロトコル３に従って、凍結乾燥したコポリマー粉末を様々な水性培地媒に４℃で分散させることによって調製した；詳細についてはラベルを参照）を３７℃から２℃まで冷却する際のゲル強度（Ｇ’、Ｇ”）の温度依存性、（ｂ）１ｒａｄ  ｓ−１の角振動数における３７℃での歪み付加にともなうゲル強度（Ｇ’、Ｇ”）の変動、（ｃ）様々な細胞培養培地における６％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルに対する、（１．０％の固定歪み付加での）角振動数にともなうゲル強度（Ｇ’、Ｇ”）の変動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
［定義］
本明細書では、特段の記載がない限り、全ての温度、温度範囲及び温度に対応する材料の任意選択的な特徴／特性は、一般的な大気圧の１バールを想定して与えられている。
【００２４】
本明細書では、用語「幹細胞（複数可）(stem cell(s))」は、分裂し、幅広い特殊化した細胞型に分化することができ、かつ自己再生／複製して、未分化状態のより多くの幹細胞をもたらすことができる細胞を指す。今や、幹細胞を人工的に増殖させることができるが、哺乳類の幹細胞には、胚盤胞の内部細胞塊から単離される「胚性幹細胞(embryonic stem cells)」並びに以下を含めた様々な組織で見出される「成体幹細胞(adult stem cells)」が含まれる：
−骨髄（これは骨（例えば、大腿骨又は腸骨稜）に穴をあけることによる抽出を必要とする）、
−脂肪組織（脂質細胞）（これは脂肪吸引による抽出を必要とする）
−血液（これは、フェレーシスを介する抽出を必要とし、血液をドナーから抽出し、幹細胞を抽出する機械を通過させ、血液の他の部分をドナーに戻す）、及び
−分娩直後の臍帯血。
本明細書では、「幹細胞」には、全能性及び多能性の幹細胞（いかなる細胞型にも成熟することができる）が含まれるが、多分化能又は単分化能の前駆細胞（なることができる細胞型に関してより限定される）も含まれる。最も適切には、本発明と共に使用するための「幹細胞」には、全能性及び／又は多能性の幹細胞、特に多能性幹細胞が含まれる。
【００２５】
本明細書では、用語「全能性(totipotent)」は、胚細胞型及び胚体外細胞型に分化することができ、完全な生存可能な生物体の構築につながり得る幹細胞を指す。そうした細胞は、卵子と精細胞を融合することによって生成され、受精卵の最初の数サイクルの分裂によってさらに生成される。
【００２６】
本明細書では、用語「多能性(pluripotent)」は、全能性幹細胞に由来し、３つの胚葉、すなわち、内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）又は外胚葉（上皮組織及び神経系）のいずれかから実質的にすべての細胞型に分化することができる幹細胞を指す。多能性細胞は、任意選択的な胎性又は成体の細胞型を導くことができるが、これらは、胚体外の組織（例えば、胎盤）に寄与する能力を欠くので、それ自体で胎性又は成体の生物体に発達することができない。多能性幹細胞（例えば卵割球）は、哺乳類胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得ることができる。
【００２７】
本明細書では、用語「多分化能(multipotent)」又は「多分化能前駆細胞（複数可）(multipotent progenitor cell(s))」は、いくつかの細胞型にさらに分化することができるが、近縁関係にあるファミリーの細胞型に限られる、幹細胞を指す。したがって、多分化能細胞は、全能性幹細胞又は多能性幹細胞よりも定められた運命を有する。多分化能前駆細胞は長期間にわたって自己再生することができるが、多能性幹細胞と異なり無期限ではない。多分化能前駆細胞は、非胚性生物体の組織内に存在する細胞を示すために、「成体幹細胞」又は「間葉系間質細胞」とも呼ばれている。多分化能前駆細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、乳房、肝臓、皮膚、消化管、胎盤及び子宮から得ることができる。多分化能前駆細胞としては、神経細胞に分化することができる神経幹細胞、血液細胞に分化することができる造血幹細胞、骨、軟骨、脂肪、及び筋肉に分化することができる間葉系幹細胞、並びに肝細胞に分化することができる肝臓幹細胞が挙げられ得る。
【００２８】
本明細書では、用語「分化細胞(differentiated cell)」は、特定の細胞型になる運命にあり、通常、他の細胞型に分化することができない細胞を指す。分化細胞の例としては、例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋、皮膚及び間質線維芽細胞、神経細胞（例えば、星状細胞、神経単位及び乏突起膠細胞）、心細胞、肝細胞及び膵細胞が挙げられる。
【００２９】
本明細書では、「未分化細胞(undifferentiated cells)」は、未だ特定の細胞型になっていない幹細胞である。
【００３０】
本明細書では、「分化後の幹細胞(post-differentiated)」への言及は、本発明に従って、すなわち本明細書に記載の幹細胞培地を使用して分化した幹細胞を意味し、別段の記載がない限り、任意選択的に他の方法によって分化した幹細胞を含むことを意図するものではない。
【００３１】
本明細書では、分化細胞及び多分化能前駆細胞としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなど、あらゆる動物に由来するもの、好ましくはヒトに由来するものが挙げられる。
【００３２】
本明細書では、用語「水性媒体(aqueous vehicle)」は、全体を通して、本発明の培地を形成するように、合成熱応答性コポリマーが分散している培地を指す。水性媒体は、その中に保存された幹細胞の生存率を引き延ばす栄養素を必ず含むものである。したがって、水性媒体は、簡単に幹細胞を生存させることができる。これに限らず、水性媒体は、幹細胞の増殖（すなわち複製）及び生存を助長するための培養培地でもよいし、その培養培地を含んでいてもよい。さらに、水性媒体は、ｉｎ  ｓｉｔｕでの幹細胞の分化を助長するための他の分化剤の増殖因子であってもよいし、その因子を含んでもよいし、それを添加されていてもよい。
【００３３】
本明細書では、用語「培養培地(culture medium)」、特に「標準的な培養培地(standard culture medium)」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞の増殖及び生存を可能にする培地を指す。本発明で使用するための培養培地としては、一般的に当技術分野で使用される適切な培地のすべてが挙げられ得る。培養培地は、細胞培養最小培地（cell culture minimum medium: ＣＣＭＭ）でもよく、これは一般に、炭素源、窒素源及び微量元素を含む。ＣＣＭＭの例としては、これらに限定されないが、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（最少必須培地）、ＢＭＥ（イーグルの基礎培地）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭＥＭ（α最少必須培地）、ＧＭＥＭ（グラスゴー最少必須培地）及びＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）が挙げられる。本発明で使用するための培養培地は、当技術分野において知られているように、いくつかの異なる添加物の少なくとも１つのをさらに含んでもよい。これらの添加物は、例えば、抗生物質、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン若しくはそれらの組み合わせ、アミノ酸、ビタミン、ウシ胎仔血清、又はそれらの代替物である。
【００３４】
本明細書では、細胞に関連して、用語「培養された(cultured)」は、決められた培養培地の存在下において、制御された環境条件下で、一般的には３７℃に維持され、約２１％の酸素及び約５〜１０％のＣＯ２を含む哺乳動物細胞用の環境で増殖した細胞集団を意味する。同様に、用語「培養している(culturing)」は、制御された環境条件下で、一般的には、設定温度で維持され、酸素とＣＯ２の決められた濃度及び任意選択的な湿度などの他のパラメーター並びに設定速度における制御された方式での撹拌を提供するインキュベーター中における、ある細胞又は目的の細胞の増殖により、細胞集団を拡大しているプロセスを指す。
【００３５】
本明細書では、細胞との関連で使用される場合の用語「生存可能(viable)」は、生細胞を指す。
【００３６】
本明細書では、用語「細胞生存率(cell viability)」は、所与のサンプルにおける生細胞の割合に関し、これは、当技術分野で周知の方法によって定量的に評価することができる。
【００３７】
本明細書では、「保持された生存率(preserved viability)」、「延ばされた生存率(extended viability)」、「引き延ばされた生存率(prolonged viability)」、「延ばされた保存寿命(extended storage life)」、「引き延ばされた維持(prolonged maintenance)」及び「引き延ばされた生存(prolonged survival)」などの用語は互換的に使用され、本発明の処理方法（例えば、保存／保持の方法）の一つにかけられた細胞集団中に生存する生細胞の、そのように処理されていない細胞集団又はそれらのサンプルと比較した際の、高い割合を指す。
【００３８】
本明細書では、用語「室温(room temperature)」は、２０から２６℃の範囲の温度を指す。
【００３９】
本明細書では、用語「周囲温度(ambient temperature)」は、約１８℃から約３２℃の範囲内の温度を指す。
【００４０】
幹細胞培地がゼラチン状になるか又はなり始める温度より低い又は高い温度は、本明細書では、「ゲル化温度(gelling temperature)」と言及する。本明細書では、ゲル化温度に「わたって(across)」温度を調整することは、（あるポイントから温度を下げる際に培地がゼラチン状になる実施形態において）温度をゲル化温度より低く下げること、又は（あるポイントから温度を上げる際に培地がゼラチン状になる実施形態において）ゲル化温度より高く温度を上げることのいずれかを意味する。
【００４１】
本明細書では、用語「ゼラチン状(gelatinous)」は、ゲル（すなわちゼリー様）形態の物質（例えば幹細胞培地）を説明するのに使用される。ゲルは硬質でも軟質でもよいが、一般的には、本発明の培地のゲル形態は軟質である。そうしたゲルは非流動性であり、一般的には、その定常状態では流動しない。
【００４２】
本明細書では、用語「非ゼラチン状(non-gelatinous)」は、（実質的に）流動性形態の物質、例えば幹細胞培地を説明するのに使用される。そうした流動性形態は、一般に流動性特性を示す。
【００４３】
［概要］
本発明は、基本的に、可逆的なゲル化を受けることができる幹細胞用培地（すなわち、幹細胞培地）を提供する。したがって、この培地は、培地のゲル化温度にわたって温度を簡単に調整することによって、非ゼラチン状（流動性）形態とゼラチン状の形態の間を容易に「転換(switched)」できる。したがって、幹細胞を非ゼラチン状／流動性形態の培地と簡単に混合し、次いで、培地のゲル化温度にわたって温度を調整することにより培地をゲル化することにより、３Ｄゲルマトリックス内に幹細胞を容易に捕獲することができる。次いで、ゼラチン状の形態の培地内に被包された幹細胞を、（例えば、療法又は培養、分化などにおいて）幹細胞を直接的に培地内で使用する前に、又は培地からそれらを抽出した後に、長期間にわたって保持することができる。
【００４４】
さらに、ゲル状培地は、幹細胞の３Ｄ培養及び／又は分化のための培地として使用することができる。培地内の栄養素は、幹細胞の培養を促進するように改変できる。幹細胞分化を促進するために、さらなる栄養素、増殖因子又はインキュベーション条件を使用することができる。したがって、本発明の培地は非常に多用途なものである。
【００４５】
周囲温度又は室温での比較的長期の幹細胞保存に本発明の培地を適合させることができるため、より簡便で、費用対効果が大きく、エネルギー効率のよい幹細胞保存システムが提供できる。特に、本発明の培地によれば、幹細胞の長期保存及び／又は輸送のための高価な冷却システムの必要性を軽減できる。
【００４６】
本発明の培地を生成するのに使用される材料は、比較的安価であり、強力かつ拡張性のある合成化学的な技法を使用して容易に生成できる。
【００４７】
本発明の培地が完全に合成的であることを考えれば、（動物由来の生成物を使用してそうした培地を形成する場合と異なって）保存されている幹細胞の生物的な夾雑又はそうした幹細胞への干渉の危険性はない。さらに、本発明の培地の合成的な性質は、バッチ間のより優れた再現性を助長し、それによって、一般に生物に由来する生成物、例えば動物タンパク質の使用に付随する望ましくない変動性が低減される。本発明のコポリマーの合成的な性質はまた、必要に応じて特性を最適化するために、培地を合理的に(judicious)調整することも可能にする。
【００４８】
本発明の培地は幹細胞と生体適合性であり、幹細胞に対して無毒である。ゼラチン状の形態の培地の相対的な柔軟さ及び透過性によって、培地全体にわたって栄養素が容易に拡散できるようなり、確実に、その中に含まれる幹細胞が適切に生育され、それによって保持される。
【００４９】
本発明の培地は（小型の熱応答性コポリマー粒子及びこの形態の培地の流動性質の結果）その非ゼラチン状の形態を濾過することによって容易に滅菌できるので、滅菌が容易である。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明の培地は透明でもあり、これによって、例えば光学顕微鏡を使用して、培地それ自体の中で幹細胞を研究することが可能になる。このことは、問題の幹細胞を培養する及び／又は分化させるのにも培地が使用されている場合は、特に有用である。
【００５１】
培地の転換可能な形態は、幹細胞を容器の間を容易に移すことが可能になり、幹細胞の正確な容量測定及び分注を助長することもできる。
【００５２】
本発明の培地の可逆的なゲル化は、その中に保存された幹細胞の容易な操作を可能にする。これは、非ゼラチン状の流動性形態中に放出する前に、ゼラチン状の形態の培地内に幹細胞をしばらく保存することができ、これによって、幹細胞がゼラチン状の形態の培地内に再捕獲される前に、さらなる栄養素の受け取りが可能になるからである。
【００５３】
本発明の培地は生体適合性でもあり、そのため、培地は、幹細胞の埋植体、パッチ又は他の適切な投与可能形態の一部であろうとなかろうと、幹細胞の治療的投与のための医薬担体又は媒体として、それ自体が働くことができる。さらに、ゲル化温度がどの治療的使用に対しても適切であるように培地を調整することができることが想定される。
【００５４】
本発明の培地のいくつかの他の利点は、以下の説明から明らかになるであろう。
【００５５】
［培地］
本発明は、水性媒体内に分散した合成熱応答性コポリマー粒子を含む幹細胞用培地であって、温度の変化に応じて非ゼラチン状の形態とゼラチン状の形態の間の変化を受けることができ(capable of undergoing a change)、非ゼラチン状の形態では、コロイド状に安定した、合成熱応答性コポリマー粒子の水性分散体を含み、ゼラチン状の形態では、幹細胞を収容することができるスキャフォールド又はマトリックスを提供し、水性媒体が、幹細胞の生存率を維持するための栄養素をさらに含む、幹細胞用培地を提供する。
【００５６】
培地は、適切には幹細胞培地である。
【００５７】
培地は、合成熱応答性コポリマー粒子が存在するため、適切には熱応答性である。
【００５８】
培地は、適切には、温度の変化に応じて、非ゼラチン状の形態とゼラチン状の形態の間の可逆的な変化を受けることができる。これは、少なくとも１サイクルの可逆的なゲル化を行うことができること、すなわち、少なくとも１サイクルのゲル化及びその後の脱ゲル化（すなわち、流動化）を、（適切な温度の変化によって）選択的に誘導することができることを意味する。特定の実施形態では、培地は、１サイクルを超えて可逆的なゲル化ができ、適切には、可逆的なゲル化は、複数サイクルのゲル化及び脱ゲル化にわたって保たれる。そうした可逆的なゲル化によって、幹細胞が本発明のゲル状の幹細胞組成物内に繰り返し捕獲／被包され、次いで、そこから放出されることが可能になる。
【００５９】
培地の非ゼラチン状の形態とゼラチン状の形態の間の転移及びその逆は、適切には、培地の状態の相転移又は変化を特徴とする。相転移は、適切には、熱応答性コポリマー粒子の形態の温度依存的変化の結果である。巨視的スケールでは、培地の相転移は、培地の粘性の変化を特徴とする。非ゼラチン状の形態の培地は比較的自由流動性の流体であり、それにより比較的粘性が低いが、ゼラチン状の形態は実質的に自立型ゲルであり、自由流動性でなく、それにより比較的粘性が高い。
【００６０】
ゼラチン状の形態の培地は、適切には、比較的軟質のゲルである。
【００６１】
好ましい実施形態では、培地は、ゲル化温度より低い温度において非ゼラチン状の形態で存在し、培地のゲル化温度より高い温度においてゼラチン状の形態で存在する。
【００６２】
好ましい実施形態では、培地は、周囲温度及び／又は室温でゼラチン状の形態である。適切には、培地は、１５℃以上、適切には２０℃以上、適切には３０℃以上の温度でゼラチン状の形態である。適切には、培地は、３５℃から４０℃の温度でゼラチン状の形態である。適切には、培地は、４５℃まで、適切には６０℃までの温度でゼラチン状の形態のままである。
【００６３】
好ましい実施形態では、培地は、１０℃以下、適切には５℃以下の温度で非ゼラチン状の形態である。適切には、培地は、０℃に至るまで、適切には−５℃に至るまでの温度で非ゼラチン状の形態のままである。
【００６４】
適切には、幹細胞培地の「ゲル化温度」は、５〜３０℃の間、適切には１０〜２５℃の間、適切には１５〜２０℃の間である。ある種の重要なパラメーター、例えば熱応答性コポリマー又はそれらの一部の重合度、熱応答性コポリマーの親水性／疎水性のバランス、熱応答性コポリマーに存在する特定のモノマーなどを調整することによって、ゲル化温度及び培地の特性を変化させることができる。したがって、本発明は、関係のある特定の適用のために、培地のゲル化温度を調整する手段を提供する。
【００６５】
培地は、適切には生体適合性である。特に、培地それ自体が、適切には細胞に無毒、特に幹細胞に無毒である。適切には、培地内での幹細胞の保存は、前記幹細胞の生存率を保持し、必要な場合には栄養素が存在する。
【００６６】
培地は、適切には哺乳動物細胞、特にヒト細胞と生体適合性であり（例えば、治療適用のために、組成物、例えば医薬組成物内に組み入れられる場合）、適切には、治療的有効量において、哺乳類種及び／又は細胞に無毒である。これによって、幹細胞療法（又は幹細胞に由来する分化細胞療法）を施すために、培地を媒体又は医薬担体として働かせることが可能になる。
【００６７】
培地は、ゼラチン状の形態において適切には透明であり、又はゼラチン状の培地内に捕獲される任意選択的な細胞を肉眼で及び／又は（例えば、光学顕微鏡又は共焦点顕微鏡を使用して）適切な拡大率によって観察することが可能になるくらいに、少なくとも十分に透明である。培地は、適切には非ゼラチン状の形態において透明であり得、又はその中に分散している任意選択的な細胞を肉眼で及び／又は（例えば、光学顕微鏡又は共焦点顕微鏡を使用して）適切選択的な拡大率によって見えることが可能になるくらいに、少なくとも十分に透明であり得る。そうした透明性によって、培地内の細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ解析が可能になる。
【００６８】
（いかなる幹細胞／分化後細胞も除いて）培地は、適切には動物由来の生成物がない。適切には、本発明の培地は、生物的（例えば、動物）供給源から得られるいかなる熱応答性タンパク質、ペプチド又は他のバイオポリマーもない。例えば、熱応答性コポリマーは、適切には完全に合成的である。培地内で使用される熱応答性コポリマーの合成的な性質によって、（生物体由来の熱応答性コポリマーを用いる培地とは対照的に）バッチ間変動を最小限にすることが可能になり、それによって、本発明の幹細胞培地の信頼性が改善される。
【００６９】
ゲル形態では、培地は、幹細胞を保存する、保持する、培養する及び／又は分化させるのに特に適した、３Ｄスキャフォールド又はマトリックスを提供する。適切には、スキャフォールドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる３次元（３Ｄ）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を効果的に模倣する。
【００７０】
本発明の培地は、適切には、ゼラチン状の形態の培地への幹細胞の選択的捕獲又は被包を可能にするように構成される。次いで、培地を非ゼラチン状の形態にまた変換することによって、幹細胞をその後に放出及び単離することができる。例えば、最初に前記幹細胞を非ゼラチン状の形態の培地と混合し、次いで、ゲル化温度にわたって温度を調整することによって培地をゼラチン状の形態に変化させ、それによって、ゼラチン状の形態の培地内に幹細胞を被包することによって、幹細胞をゼラチン状の培地内に適切に被包することができる。これによって、ゲル状の幹細胞組成物が得られる。次いで、幹細胞を、ゲル状の幹細胞組成物内で保存する、保持する、培養する及び／又は分化させることができる。ゲル化温度にわたって温度を調整することにより再び培地を非ゼラチン状の形態に変化させることによって、幹細胞をゲル状の幹細胞組成物／マトリックスから適切に放出することができる。任意選択的に、次いで、全プロセスを繰り返すことによって、幹細胞をゼラチン状の培地内に再捕獲することができる。
【００７１】
（例えば、幹細胞培地を非ゼラチン状の形態に変化させることによって）幹細胞がゼラチン状の形態の培地から放出される場合は、当技術分野で周知の方法、例えば限外濾過及び／又は遠心分離によって、幹細胞を非ゼラチン状の形態の培地から適切に抽出することができる。
【００７２】
上で概要を述べたプロセスは、幹細胞の生存率に影響を及ぼさないことが見出された。したがって、本発明の培地は、幹細胞を保存／保持する、培養する、及び／又は分化させるための有用な手段であり、幹細胞を使用する研究者、製造者、療法士及び臨床医にかなりの利益を与える。
【００７３】
本発明の培地は、適切には、１〜３０％ｗ／ｗの間の合成熱応答性コポリマー、適切には２〜２０％ｗ／ｗの間の合成熱応答性コポリマー、適切には３〜１２％ｗ／ｗの間の合成熱応答性コポリマーを含む。特定の実施形態では、本発明の培地は、３〜７％ｗ／ｗの間の合成熱応答性コポリマーを含む。特定の実施形態では、本発明の培地は、８〜１２％ｗ／ｗの間の合成熱応答性コポリマーを含む。特定の実施形態では、本発明の培地は、５〜１２％ｗ／ｗの間の合成熱応答性コポリマーを含む。
【００７４】
本発明の培地は、幹細胞の生存率を維持するための栄養素を含む。合成熱応答性コポリマーを希釈するために、そうした栄養素を、合成熱応答性コポリマー又はそれらの分散体に直接的に添加することができる。あるいは、透析を介して、そうした栄養素を合成熱応答性コポリマーの分散体に導入することができる。あるいは、透析法と直接的な添加の組み合わせによって、そうした栄養素を培地に導入することができる。
【００７５】
適切には、幹細胞培地は界面活性剤が（実質的に）なく、適切には、１ｗｔ％以下の界面活性剤、適切には０．５ｗｔ％以下の界面活性剤、適切には０．１ｗｔ％以下の界面活性剤を含み、適切には界面活性剤を含まない。
【００７６】
適切には、幹細胞培地は、（実質的に）ドデシル硫酸ナトリウム（すなわち、ＲＡＦＴ重合反応で使用されることもある界面活性剤の種類）がなく、適切には、１ｗｔ％以下のドデシル硫酸ナトリウム、適切には０．５ｗｔ％以下のドデシル硫酸ナトリウム、適切には０．１ｗｔ％以下のドデシル硫酸ナトリウムを含み、適切にはドデシル硫酸ナトリウムを含まない。
【００７７】
［合成熱応答性コポリマー粒子］
合成熱応答性コポリマー(the synthetic thermo-responsive copolymer)は、適切には合成的であり、すなわち、これは、生物に由来するのよりはむしろ、合成化学的な技法を介して形成されるものである。
【００７８】
熱応答性コポリマー(The thermo-responsive copolymer)は、適切には生体適合性であり、適切には幹細胞に無毒である。また適切には、熱応答性コポリマーは、（実質的に）界面活性剤がない。更に適切には、熱応答性コポリマーは（実質的に）ドデシル硫酸ナトリウムを含有しない。
【００７９】
熱応答性コポリマーは、水性媒体内にミセル粒子を適切に形成する。これらの粒子は、温度依存的な形態変化を適切に受け、非ゲル状からゲル状の状態に培地を変化させると理解されるのは、この形態変化である。適切には、コア形成鎖(core-forming chains)（すなわちＰ２）は、適切には（実質的に）水性／水不溶性又は適切にはそうでなければ（少なくとも安定剤鎖（すなわちＰ１）と比べて）疎水性であり、熱応答性である。適切には、安定剤鎖（すなわちＰ１）は、適切には（実質的に）水性／水可溶性又は適切にはそうでなければ（少なくともコア形成鎖（すなわちＰ２）と比べて）親水性であり、コア形成鎖（すなわちＰ２）よりも熱応答性が低く、最も適切には、安定剤鎖は（実質的に）非熱応答性である。したがって、適切には、コポリマーの熱応答性作用に関与するのはコア形成鎖である。これは、式Ａの部分（以下を参照されたい−これはＰ１部分に関する）を含む予め形成された水性の可溶性ポリマーを用いて開始し、（実質的に）水溶性／水可溶性のモノマーＭ２（これが最適な粒子形成を助長するため）の存在下でのＲＡＦＴ重合を介する鎖延長を通じて前記ポリマーの上にさらなる（実質的に）非水溶性／水不溶性のブロック（Ｐ２）を構築することによって、熱応答性コポリマー粒子を形成することにより、適切に達成される。賢明には、それぞれのコモノマー及びポリマーの相対的な溶解度を改変することにより、この性質の熱応答性コポリマーの形成を助長することができる。個々のポリマーブロックが水溶性／水可溶性及び／又は熱応答性であるかどうかを識別することは、当業者にとって簡単である。
【００８０】
粒子が形態変化を受ける温度は、培地のゲル化温度に相当する。したがって、いくつかの実施形態では、このような形態変化は、１５℃〜３０℃の間、適切には１０℃〜３０℃の間、適切には６〜３６℃の間で起こる。
【００８１】
「非ゼラチン状の形態(non-gelatinous form)」の培地では、熱応答性コポリマー粒子は、ポリマー粒子のコロイド状に安定した分散体である。適切には、粒子は、サイズが５００ｎｍ未満、より適切には１００ｎｍ未満であるナノ粒子である。適切には、粒子は、実質的に球状（例えば、球体又は球体様粒子）のものであり、適切にはミセルの形態である。この非ゼラチン状の形態は、当然ながら、幹細胞培地の対応するゼラチン状の形態よりも流動性であり、粘性が低い。非ゼラチン状の形態の培地は自由流動性であり、その中で幹細胞を混合するのに適する。
【００８２】
「ゼラチン状の形態(gelatinous form)」の培地では、熱応答性コポリマー粒子は、適切には、非ゼラチン状の形態に存在する粒子と形態が異なる、コロイド状に安定したポリマー粒子である。適切には、「ゼラチン状の形態」の培地では、熱応答性コポリマー粒子は、適切には異方性の「ワーム(worms)」又は「ワーム様(worm-like)」粒子である。こうした細長い粒子は、互いに相互作用して、ゼラチン状の形態の培地を形成する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、こうした「ワーム様」粒子は互いに相互作用すると考えられ、この「相互作用」が「ゼラチン状の形態」の培地を生じさせると考えられる。ゼラチン状の形態の幹細胞培地は、適切には、自由流動性でないにもかかわらず比較的軟質であり、これは、栄養素の拡散を助長し、生幹細胞を収容するのに役立ち、それによって、幹細胞の生存率を引き延ばす。弾性率（Ｇ’）は、一般的には２０〜１０００Ｐａ、適切には１０〜２００Ｐａである。
【００８３】
このような粒子の形は、当技術分野で既知の適切な電子顕微鏡法（例えば、ＳＥＭ、ＴＥＭ）を使用して、正しく検証することができる。
【００８４】
熱応答性コポリマーは、適切には、１，０００ｇ／ｍｏｌから１００，０００ｇ／ｍｏｌの間の、適切には５，０００ｇ／ｍｏｌから８０，０００ｇ／ｍｏｌの間の、より適切には７，０００ｇ／ｍｏｌから７０，０００ｇ／ｍｏｌの間の、最も適切には１０，０００ｇ／ｍｏｌから６０，０００ｇ／ｍｏｌの間の数平均モル質量（Ｍｎ）を有する。
【００８５】
熱応答性コポリマーは、適切には、Ｍｗ／Ｍｎが１．０５から１．５０の間であるように、数平均モル質量（Ｍｎ）及び重量平均モル質量（Ｍｗ）を有する。
【００８６】
熱応答性コポリマー粒子の性質は、ゼラチン状の幹細胞培地内であろうと非ゼラチン状の形態の幹細胞培地内であろうと、現在温度（すなわち、現在温度がコポリマーの形態を決定する）、及びコポリマーそれ自体の性質（すなわち、問題の温度においてコポリマーが「球状」粒子を形成するか「ワーム様」粒子を形成するか）に依存する。
【００８７】
熱応答性コポリマーは、適切には、両親媒性コポリマーである（すなわち、親水性と疎水性の両方の特性を含む）。多くの実施形態では、熱応答性コポリマーは、少なくとも１つの親水性ポリマーブロック及び少なくとも１つの疎水性ポリマーブロックを含む。
【００８８】
適切には、熱応答性コポリマーは、熱応答性ポリマーブロックを含む。特定の実施形態では、熱応答性コポリマーは、熱応答性ポリマーブロック及び非熱応答性ブロックを含み、非熱応答性ポリマーブロックは、０℃から４５℃の温度範囲において、適切には（実質的に）熱応答性でない。特定の実施形態では、熱応答性コポリマーは、熱応答性である第一のポリマーブロック及び第一のポリマーブロックより熱応答性が低い第二のポリマーブロックを含む。
【００８９】
一実施形態では、熱応答性コポリマーは式Ｂによって定義され得る。
【化１】
0006499975.tif 000002
式中、Ｐ１はモノマーＭ１に由来するポリマー成分を表し、Ｐ２は水溶性のモノマーＭ２に由来する実質的に非水溶性のポリマー成分を表す。
【００９０】
Ｐ１、Ｍ１、Ｐ２及びＭ２は、本発明による熱応答性コポリマーがもたらされる（すなわち、非熱応答性コポリマーが正しく排除される）範囲において、ＷＯ２０１１／１１０８４１Ａ２（ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ、２０１１年３月８日に出願）においてこれらに与えられる任意選択的な意味によって、定義されることができる。同様に、式Ｂによって定義される熱応答性コポリマーは、本発明による熱応答性コポリマーがもたらされる（すなわち、非熱応答性コポリマーが正しく排除される）範囲において、ＷＯ２０１１／１１０８４１Ａ２（ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ、２０１１年３月８日に出願）で定義された方法のうちのいずれかによって生成することができる。したがって、ＷＯ２０１１／１１０８４１Ａ２は参照によって本明細書に組み込まれる。必要とされる熱応答性特性は、本発明に従って水又はさらには水性媒体の中にコポリマーを分散させ、「非ゼラチン状」と「ゼラチン状」形態の間又はその逆の転移に関する温度範囲にわたって得られた分散体を検査することによって、正しく検証することができる。
【００９１】
適切には、Ｐ１は少なくとも部分的に水溶性／水可溶性である。適切にはＰ１は（実質的に）水溶性／水可溶性である。適切にはＰ１はＰ２よりも水溶性／水可溶性である。
【化２】
0006499975.tif 000003
【００９２】
適切には、各モノマーＭ１は、式Ｍ１Ａ、Ｍ１Ｂ及び／又はＭ１Ｃのモノマーから選択され、
【化３】
0006499975.tif 000004
式中、Ｒ１、Ｒ１０及びＲ１１は、Ｐ１を少なくとも部分的に水溶性にする、Ｍ１Ａ又はＭ１Ｃの置換基を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨ３又はＣＮを表し、
ＲＳは、Ｐ１を少なくとも部分的に水溶性にするのに有効な、芳香族環の少なくとも１つの置換基を表し、
各モノマーＭ２は、式Ｍ２Ａ及び／又はＭ２Ｂのモノマーから選択され、
【化４】
0006499975.tif 000005
式中、Ｒ３は、Ｐ２を実質的に非水溶性にする、Ｍ２の置換基であり、Ｒ４及びＲ６は独立に、Ｈ又はメチルを表し、
又はＰ１は、モノマーＭ２と共にモノマーＭ１を含むコポリマーであり、但しポリマーＰ１は水溶性のままである。
【００９３】
本発明の一実施形態では、Ｐ１は、上記で定義された式Ｍ１Ａ、Ｍ１Ｂ及びＭ１Ｃの２つ以上のモノマーＭ１を含むコポリマーである。
【００９４】
別の実施形態では、Ｐ１は、上記で定義された式Ｍ１Ａ、Ｍ１Ｂ及びＭ１Ｃのモノマーから選択される単一のモノマーＭ１を含むホモポリマーである。
【００９５】
一実施形態では、Ｐ１は、式Ｍ１Ａ又はＭ１Ｂのモノマーを含む、ホモポリマー又はコポリマーである。
【００９６】
一実施形態では、Ｐ１は、式Ｍ１Ａのモノマーを含む、ホモポリマー又はコポリマーである。
【００９７】
一実施形態では、Ｐ１は、モノマーＭ２Ａと共にモノマーＭ１を含むコポリマーであり、但しポリマーＰ１は水溶性のままである。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態では、Ｐ２はコポリマーであり、モノマーＭ２は、上記で定義された式Ｍ２Ａ及びＭ２Ｂの２つ以上のモノマーから選択されるものである。
【００９９】
別の実施形態では、Ｐ２は、式Ｍ２Ａ及びＭ２Ｂのモノマーから選択される単一のモノマーＭ２を含むホモポリマーである。
【０１００】
適切には、Ｐ２は、式Ｍ２Ａのモノマーから選択されるモノマーＭ２を含む、ポリマー又はコポリマーである。したがって、特定の実施形態では、Ｐ２は、式Ｍ２Ａのモノマーを含む、ポリマー又はコポリマーである。
【０１０１】
一実施形態では、Ｐ２がコポリマーであろうとホモポリマーであろうと、Ｐ２は、架橋結合モノマー単位（例えば、ＥＧＤＭＡなど）をさらに含むことができる。他の実施形態では、Ｐ２は、いかなる架橋結合モノマー単位も含まない。
【０１０２】
好ましい実施形態では、Ｐ１及びＰ２の両方は上記で定義されたホモポリマーである。
【０１０３】
一実施形態では、熱応答性コポリマーは式Ｂによって定義され、Ｐ１はそれ自体がグリセロールモノメタクリレート（ＧＭＡ）モノマー単位を含む、ポリマー又はコポリマーであり、Ｐ２はそれ自体が２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）モノマー単位を含む、ポリマー又はコポリマーである。Ｐ１及び／又はＰ２はホモポリマー、例えばそれぞれ、ポリ（グリセロールモノメタクリレート）（ＰＧＭＡ）及びポリ（２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）（ＰＨＰＭＡ）でもよい。あるいは、Ｐ１及び／又はＰ２のいずれか又は両方は、コポリマーでもよく、さもなければ他のモノマー単位でドープされた実質的にホモポリマーでもよい。例えば、Ｐ１がホモポリマーのポリ（グリセロールモノメタクリレート）（ＰＧＭＡ）ブロックでもよいのに対して、Ｐ２は、ＧＭＡとＨＰＭＡの両方のモノマー単位を含むコポリマーのブロックでもよく、又はＰ２は、（ジエチレングリコール）メタクリレート（ＤＥＧＭＡ）とＨＰＭＡの両方のモノマー単位を含むコポリマーのブロックでもよい。
【０１０４】
特定の実施形態では、熱応答性コポリマーは、以下を含む群から選択される式Ｂ［Ｐ１−Ｐ２］のブロックコポリマーである：
１．ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡ
ＰＧＭＡブロックは、適切には、１０から２００の間、適切には２５から１００の間、適切には３０から８０の間の重合度（ＤＰ）を有し得る。ＰＨＰＭＡブロックは、適切には、５０から３００の間、適切には６０から２８０の間、適切には７０から２５０の間の重合度（ＤＰ）を有し得る。
２．ＰＧＭＡ−Ｐ（ＧＭＡ−ＨＰＭＡ）
ＰＧＭＡブロックは、適切には、１０から１２０の重合度（ＤＰ）を有し得る。Ｐ（ＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロックは、適切には、２０から２００の間、適切には５０から１５０の間、適切には７０から１２０の間の重合度（ＤＰ）を有し得る。Ｐ（ＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロック内のＧＭＡモノマー単位対ＨＰＭＡモノマー単位の比は、適切には１０：１から１：１０の間、適切には１：１から１：５の間、適切には１：２から１：３の間である。
３．ＰＧＭＡ−Ｐ（ＤＥＧＭＡ−ＨＰＭＡ）
ＰＧＭＡブロックは、適切には、１０から２００の間、適切には３０から１００の間、適切には４０から６０の間の重合度（ＤＰ）を有し得る。Ｐ（ＤＥＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロックは、適切には、２０から２００の間、適切には５０から１５０の間、適切には７０から１２０の間の重合度（ＤＰ）を有し得る。Ｐ（ＤＥＧＭＡ−ＨＰＭＡ）ブロック内のＤＥＧＭＡモノマー単位対ＨＰＭＡモノマー単位の比は、適切には１０：１から１：１０の間、適切には１：１から１：５の間、適切には１：２から１：３の間である。
【０１０５】
熱応答性コポリマー粒子は、適切には、本発明の幹細胞培地内にそれらが封入される前に、適切な合成プロセスを使用して予め形成される。これに限らず、一実施形態では、熱応答性コポリマー粒子を水性培地内においてｉｎ  ｓｉｔｕで形成することができ、その水性培地は幹細胞培地の水性媒体であるか、（適切な栄養素を添加した後に）幹細胞培地の水性媒体になる。粒子は、「ゼラチン状」又は「非ゼラチン状」形態（例えば、それぞれワーム又は球体として）のいずれかで最初に形成することができるが、「非ゼラチン状」形態（すなわち、コロイド状に分散した流体様形態）で粒子を最初に形成すること、又は少なくとも、幹細胞培地を生成するより前に「非ゼラチン状」形態に粒子を変換することが、取り扱いの観点から、より簡便である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、熱応答性コポリマー粒子は、予め形成され、次いで、限外濾過してから幹細胞培地内で使用する。最も適切には、前記粒子を「非ゼラチン状」形態の間に限外濾過する（すなわち、コロイド状に安定したポリマー粒子、好ましくは実質的に「球状の」粒子の水性分散体として限外濾過する）。適切には、そうした限外濾過は低温で実施され、適切には、限外濾過時に、コロイド状に安定したコポリマー粒子の濾過前の水性分散体は、１０℃以下、より適切には５℃以下の温度である。適切には、このように粒子を限外濾過して、粒子を滅菌してから、幹細胞培地内に粒子を封入する。しかしながら、そうした限外濾過は、好都合には、粒子形成に関与する試薬及び副産物を除去することもできる。次いで、水性媒体中又は水性培地内に粒子を適切に分散し、その後に、これを、本発明の水性媒体を形成するように適合させる。
【０１０７】
特定の実施形態では、熱応答性コポリマー粒子は、制御された合成重合法によって、最も好ましくは重合誘導性自己構築（すなわち、これによって、粒子が水性重合反応培地内でｉｎ  ｓｉｔｕで形成される）によって予め形成される。特定の実施形態では、熱応答性コポリマー粒子は、水性分散重合条件下で行われる可逆的付加開裂連鎖移動（Reversible Addition−Fragmentation chain Transfer: RAFT）、すなわち（ＲＡＦＴ）型重合プロセスを使用して調製される。特に好ましい実施形態では、熱応答性コポリマー粒子は、本発明による熱応答性コポリマーがもたらされる（すなわち、非熱応答性コポリマーが正しく排除される）範囲において、ＷＯ２０１１／１１０８４１Ａ２（ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ、２０１１年３月８日に出願）で定義された方法のうちのいずれかによって生成される。そうした技法は、制御され、再現性のある方式で、ジブロックコポリマーのコロイド粒子を生成するのに理想的である。したがって、ＷＯ ２０１１／１１０８４１ Ａ２は参照により本明細書に組み込まれる。必要とされる熱応答性特性は、本発明に従って水又はさらには水性媒体の中にコポリマーを分散させ、「非ゼラチン状」と「ゼラチン状」形態の間又はその逆の転移に関する温度範囲にわたって得られた分散体を検査することによって、正しく検証することができる。
【０１０８】
特定の実施形態では、熱応答性コポリマー粒子は、水性培地中で、
（ａ）式Ａの部分を含む水溶性ポリマー
【化５】
0006499975.tif 000006
（式中、Ｘは、Ｐ１の末端基を表し、少なくともある程度の基Ｘは連鎖移動剤（ＣＴＡ）の末端基である）
と、
（ｂ）上記にて定義したモノマーＭ２と、を混合し、
水性分散重合条件下で行われる可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合を開始して、式Ｂのブロックコポリマーを提供することにより、上記で定義した式Ｂのブロックコポリマーを形成することによって、形成される。
【０１０９】
適切には、式Ｂのブロックコポリマーを形成するための可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合は、（実質的に）界面活性剤の非存在下で実施される。適切には、式Ｂのブロックコポリマーを形成するための可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合は、（実質的に）ドデシル硫酸ナトリウムの非存在下で実施される。適切には、式Ｂのブロックコポリマーを形成するための可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合は、たとえいくらかの界面活性剤が存在するとしても、式Ａの部分を含む水溶性ポリマーに対する全界面活性剤（複数可）の重量比が、１：２５以下（すなわち、界面活性剤がより少ない）、適切には１：１００以下、適切には１：２００以下であるように実施される。適切には、式Ｂのブロックコポリマーを形成するための可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合は、たとえいくらかの界面活性剤が存在するとしても、モノマーＭ２に対する全界面活性剤（複数可）の重量比が１：２５以下（すなわち、界面活性剤がより少ない）、適切には１：１００以下、適切には１：２００以下、適切には１：１０００以下であるように実施される。
【０１１０】
特定の実施形態では、熱応答性コポリマーは、式Ｂによって定義される。
【化６】
0006499975.tif 000007
式中、Ｐ１は、実質的に水溶性（又は水可溶性）の、モノマーＭ１（これも適切には実質的に水溶性／水可溶性）に由来するポリマー成分を表し、Ｐ２は、水溶性（又は水可溶性）モノマーＭ２に由来する実質的に非水溶性（又は水不溶性）のポリマー成分を表し、
ここでは、以下のいずれかである：
ｉ）コア形成鎖（すなわちＰ２）は熱応答性であり、安定剤鎖（すなわちＰ１）は非熱応答性である、又は
ｉｉ）安定剤鎖（すなわちＰ１）はコア形成鎖（すなわちＰ２）よりも熱応答性が低く、最も適切には、安定剤鎖は（実質的に）非熱応答性である。
【０１１１】
前述のように、Ｐ１、Ｍ１、Ｐ２及びＭ２は、本発明による熱応答性コポリマーがもたらされる（すなわち、非熱応答性コポリマーが正しく排除される）範囲において、ＷＯ２０１１／１１０８４１Ａ２（ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ、２０１１年３月８日に出願）においてこれらに与えられる任意選択的な意味によって、定義することができる。
【０１１２】
［水性媒体］
水性媒体は、水及び幹細胞用の適切な栄養素を含む。水性媒体は、適切には、８０〜９５ｗｔ％の水を含む。なお、このような栄養素は、当技術分野で既知の任意の適切な細胞培養栄養素でもよい。
【０１１３】
水性媒体は、適切には、緩衝食塩水、例えばリン酸緩衝食塩水を含む。
【０１１４】
一実施形態では、水性媒体は、当技術分野で既知の水性培養培地でもよいし、それを含んでいてもよい。
【０１１５】
水性媒体は、適切には、栄養素として、幹細胞培養用培地、適切にはヒト幹細胞培養用培地、最も適切にはヒト胚性幹細胞培養用培地（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＫＯ−ＤＭＥＭ培地）を含む。そうした幹細胞培養用培地は、適切には、それ自体が、適切な栄養素の水性の溶液又は分散体として提供される。適切には、水性媒体は、少なくとも２０％ｗ／ｗの幹細胞培養用培地、適切には少なくとも４０％ｗ／ｗの幹細胞培養用培地を含む。適切には、水性媒体は、最大で９７％ｗ／ｗの幹細胞培養用培地、適切には最大で９５％ｗ／ｗの幹細胞培養用培地、適切には最大で８０％ｗ／ｗの幹細胞培養用培地、適切には最大で６０％ｗ／ｗ幹培養培地を含む。
【０１１６】
培地は、所望の細胞型への幹細胞の分化を促進する増殖因子又は他の栄養素をさらに含むことができる。
【０１１７】
［幹細胞］
任意選択的な幹細胞を本発明の培地で使用することができる。
【０１１８】
一実施形態では、本発明の方法及び培地を用いて使用するための幹細胞は、哺乳類幹細胞、最も適切にはヒト幹細胞である。特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）である。しかしながら、そうした胚性幹細胞は、適切にはヒト胚及び／又はヒト胚性幹細胞の破壊を含む方法によって生成される又は得られるもの以外の幹細胞である。別の実施形態では、幹細胞は、非胚性（例えば成体）幹細胞である。
【０１１９】
適切には、幹細胞は実質的に未分化である。適切には、幹細胞は多能性幹細胞である。
【０１２０】
胚性幹細胞は、適切には胚盤胞の内部細胞塊から単離される。
【０１２１】
非胚性幹細胞は、以下を含めた様々な組織から得ること及び単離することができる。
−骨髄（これは骨（例えば、大腿骨又は腸骨稜）に穴をあけることによる抽出を必要とする）、
−脂肪組織（脂質細胞）（これは脂肪吸引による抽出を必要とする）、
−血液（これは、フェレーシスを介する抽出を必要とし、血液をドナーから抽出し、幹細胞を抽出する機械を通過させ、血液の他の部分をドナーに戻す）、
−分娩直後の臍帯血。
【０１２２】
本発明において使用する幹細胞は、適切には全能性又は多能性の幹細胞、最も適切には多能性幹細胞である。そうした多能性幹細胞は、適切には、３つの胚葉、すなわち、内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）又は外胚葉（上皮組織及び神経系）のいずれかから細胞型に分化することができる。あるいは、幹細胞は多分化能幹細胞でもよい。
【０１２３】
本発明の幹細胞培地は、適切には、少なくとも１つの幹細胞をゲルマトリックス内に捕獲／被包するように構成されるが、幹細胞培地はゼラチン状の形態である。そうした幹細胞は、適切には、ゲル内で幹細胞を生存及び増殖さえさせる適切な栄養素と共に、３Ｄスキャフォールド内に被包される。
【０１２４】
単離細胞の適切な調製は、一般的には、供給源、例えば骨髄、全末梢血、白血球フェレーシス又はアフェレーシス生成物、臍帯血及び組織又は器官から調製される細胞懸濁液から得られる多分化能前駆細胞が濃縮されるものであり得る。
【０１２５】
多分化能前駆細胞は、当技術分野で既知の細胞培養、細胞増殖及び細胞分離に関する方法を使用して、例えば、本発明の発明者によってＵＳ６，７３７，０７４及びＵＳ６，５０３，７３１に開示されるように、フィブリンミクロビーズを使用して単離することができる。代替方法としては、中でも、ＵＳ７，５９２，１７４、ＵＳ５，９０８，７８２、ＵＳ５，４８６，３５９並びにＵＳ ２０１０／００６８１９１、ＵＳ２００９／０１２４００７及びＵＳ２０１０／０２９７２３３に開示されているものが挙げられる。
【０１２６】
細胞の濃縮及び／又は単離の典型的な方法としては、密度段階勾配（例えば、フィコール（Ｒ）、コロイドシリカ）、エルトリエーション、遠心分離、低浸透圧ショックによる赤血球の溶解、及びそうした方法の様々な組み合わせが挙げられる。例えば、骨髄からの幹細胞の精製は赤血球及び顆粒球の除去を必要とし、これは、フィコール（Ｒ）密度勾配遠心、続いて、通常の遠心分離よる洗浄ステップを繰り返すことによって達成されることが多い。
【０１２７】
細胞の濃縮及び／又は単離の方法としては、当技術分野で既知の細胞分離用の様々な種類のフィルターによる濾過も挙げられる。例えば、米国特許第７，７９０，０３９号に開示されているように、十字流濾過としても知られるタンジェント流濾過を、骨髄又は血液成分の不均一な混合物から幹細胞を濃縮するために使用することができる。
【０１２８】
混合物からの多分化能細胞の分離は、プラスチック培養容器などの適切な基材への吸着ステップを組み入れることもできる。
【０１２９】
本発明で使用するための単離多分化能前駆細胞(Isolated multipotent progenitor cells)としては、「間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells)」（本明細書では「ＭＳＣ」とも称する）と呼ばれるもの、例えば骨髄基質及び臍帯血から得られるものが挙げられ、これは、様々な細胞型、特に、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞及び筋細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化する能力を有する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、筋肉、神経細胞様前駆体、心筋細胞及びおそらく他の細胞型に分化するＭＳＣの能力が示された。さらに、ＭＳＣは、造血幹細胞の増殖に有効な支持細胞層を提供することが開示された。
【０１３０】
特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞、特に多能性のヒト胚性幹細胞である。幹細胞は、適切には、機械的に（例えば、ピペットによって）収集してから、本発明の培地に移す。適切には、幹細胞凝集体が幹細胞培地に添加される。適切には、培地に対する幹細胞（又は幹細胞凝集体）の容積比は、１：１０００から１：５の間、より適切には１：１００から１：１０の間、最も適切には１：５０から１：２０の間である。例えば、約２０μＬの幹細胞凝集体（典型的にはそれぞれ２０〜２００μｍのサイズにする）を約６００μＬの培地に添加する。
【０１３１】
［培地内での幹細胞の収容］
ゼラチン状の形態では、培地は生幹細胞を収容することができる。さらに、培地中の幹細胞は、（分化を促進する薬剤又は条件が存在しない限り）いかなる表現型の変化もなしに、長期間にわたってその生存率を維持することができる。
【０１３２】
適切には、ゼラチン状の培地は、少なくとも７日間、適切には少なくとも１４日間、より適切には少なくとも２１日間、より適切には少なくとも２８日間、最も適切には少なくとも５６日間、幹細胞の生存率を維持することができる。分化剤（例えば、増殖因子）が培地に添加されていないと仮定すれば、収容された幹細胞は、未分化形態で維持され、生存可能なままである。そうした収容された幹細胞は、適切には、培地から抽出した後に自己再生／複製することができる。
【０１３３】
適切には、ゼラチン状の形態の幹細胞培地は、周囲温度並びに／又は最適な培養（すなわち、３０〜４２℃）及び／若しくは分化温度で生幹細胞を収容することができる。これは、幹細胞が、保存される、培養される及び／又は分化を受けるかどうかに依存する。適切には、ゼラチン状の形態の幹細胞培地は、１５から４２℃の間の温度で生幹細胞を収容することができる。そうした幹細胞は、休眠状態又は静止状態（すなわち、実質的に分化及び／又は増殖が生じない）で保存できる。
【０１３４】
［幹細胞培地を生成する方法］
本発明は、本発明の第１の態様による培地を作製する方法であって、合成的な生体適合性熱応答性コポリマーの前記粒子を、幹細胞の生存率を維持するための栄養素をさらに含む水性媒体中に分散させることを含む方法を提供する。
【０１３５】
熱応答性コポリマー粒子及び水性媒体は、別々に調製／提供することができ、次いで、混合することができる。次いで、合成熱応答性コポリマー粒子を、適切には得られた培地が非ゼラチン状の形態で存在する温度で水性媒体内に分散する。
【０１３６】
熱応答性コポリマー粒子は、本明細書に記載の方法のいずれかによって、特にＷＯ２０１１／１１０８４１Ａ２（ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＯＦ  ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ、２０１１年３月８日に出願）に開示されている方法によって提供することができる。したがって、前記粒子は、適切には、制御されたラジカル重合、例えばＲＡＦＴ重合によって、水性媒体中でｉｎ  ｓｉｔｕで形成される。適切には、そうした粒子は、
（ｉ）重合培地(a polymerization medium)／溶媒（例えば、水）に溶解した、予め形成された（例えば、ＰＧＭＡの）ポリマーブロックを準備することと、
（ｉｉ）前記予め形成されたポリマーブロックから、（例えば、適切なモノマー（複数可）を使用して、さらなる重合、例えばＲＡＦＴ重合を開始することによって）第二のポリマーブロックを増殖させ、前記第二のポリマーブロックが、重合培地／溶媒内で得られたジブロックコポリマーを（実質的に）不溶性にして、ｉｎ  ｓｉｔｕでコロイド粒子を形成すること
によって形成される。
【０１３７】
熱応答性コポリマー粒子は、適切には、滅菌してから幹細胞培地内に組み入れる。そうした滅菌は、限外濾過を通じて実施することができる。最も適切には、粒子を、その非ゼラチン状の形態で限外濾過する（すなわち、適切なコロイド粒子が最小であるならば、流体の粘性が最小限に抑えられる）。したがって、粒子（又は対応するそれらの分散体）を非ゼラチン状の形態で提供する適切な温度で、粒子を限外濾過することができる。
【０１３８】
熱応答性コポリマー粒子の限外濾過は、適切には、０．０１〜１μｍのフィルター、適切には０．３〜０．６μｍのフィルターを通して実施することができる。いくつかの実施形態では、フィルターは、０．２２又は０．４５μｍのフィルターでもよい。
【０１３９】
適切には、熱応答性コポリマー粒子が分散されることになる水性媒体は、その中に熱応答性コポリマー粒子を分散させるより前に、予め別々に形成する。しかしながら、あるいは、例えば、部分的に形成された水性媒体（例えば、水）中に粒子を最初に分散させてから、水性媒体を、ｉｎ  ｓｉｔｕで調製してもよい。そうした場合では、粒子が正しく分散してから、部分的に形成された水性媒体に適切な栄養素を添加することができる。
【０１４０】
一旦形成されれば、培地は、適切に保存されるか、幹細胞と共に直ちに使用される。
【０１４１】
［幹細胞組成物］
本発明は、本明細書で定義される幹細胞培地内に分散した少なくとも１つの(one or more)幹細胞を含む幹細胞組成物を提供する。
【０１４２】
水性媒体、特にその中の幹細胞栄養素は、ゼラチン状の形態の培地の全体にわたって容易に拡散することができる。適切には、ゼラチン状の形態の幹細胞マトリックスの全体にわたって水性媒体及び／又はその中に含まれる栄養素を容易に拡散することによって、幹細胞培地及び／又は水性媒体の内容に応じて、その中に被包される幹細胞を保存する、保持する、培養する及び／又は分化させることが可能になる。
【０１４３】
幹細胞組成物マトリックスは、１０％ｖ／ｖの幹細胞まで含むことができる。幹細胞マトリックスは少なくとも０．５％ｖ／ｖの幹細胞を含むことができる。
【０１４４】
［幹細胞組成物を形成する方法］
本発明はまた、本発明の第２の態様による幹細胞組成物を生成する方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物（すなわち、培地中の流動性幹細胞分散体）を生成することと、
（ｉｉ）任意選択的に培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状培地中で幹細胞が分散しているゲル状の幹細胞組成物を生成すること
を含む方法を提供する。
【０１４５】
適切には、幹細胞組成物のゲル化を開始するより前に流動性の幹細胞組成物を十分に撹拌して、適切には、（実質的に）均一な様式で分散した少なくとも１つの幹細胞を有する流動性の幹細胞組成物を提供する。
【０１４６】
好ましくは、次いで、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって幹細胞組成物をゲル化し、それによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成する。
【０１４７】
［幹細胞を保存及び／又は保持する方法］
本発明は、少なくとも１つの幹細胞を保存又は保持する方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）ゲル状の幹細胞組成物を保存すること
を含む方法を提供する。
【０１４８】
好ましい実施形態では、上記の方法のステップ（ｉ）は、適切には１０℃以下、適切には５℃以下の温度の幹細胞培地を用いて実施する。
【０１４９】
温度を変化させることは、培地及びそれに関連する熱応答性コポリマーのゲル化特性に応じて、それぞれゲル化温度より高く、又は低く、温度を上昇又は下降させることを含むことができる。
【０１５０】
好ましい実施形態では、幹細胞培地は、ゲル化温度より下で非ゼラチン状であり、ゲル化温度より上でゼラチン状である。したがって、上記の方法のステップ（ｉｉ）は、適切には、最初にゲル化温度より下からゲル化温度以上に幹細胞組成物の温度を上げることを含む。最も適切には、ステップ（ｉｉ）は、幹細胞マトリックスの温度を、１０℃以下から１８℃以上(or below 10℃ up to or above 18℃)、適切には３５℃以上、最も適切には約３７℃まで調整することを含む。
【０１５１】
次いで、適切な期間にわたって、ゲル状の幹細胞組成物内に幹細胞を保存することができる。特に、少なくとも７日間、適切には少なくとも１４日間、適切には少なくとも２１日間、適切には少なくとも２８日間、適切には少なくとも５６日間、生存可能な状態でマトリックス内に幹細胞を保存することができる。しかしながら、実務家は前記幹細胞をより短い時間保存することを選択することができる。適切には、１８℃以上、適切には３５℃以上、最も適切には、約３７℃の温度で幹細胞を保存する。
【０１５２】
幹細胞が保存されているゲル状の幹細胞組成物は、それ自体が、適切には容器内に、最も適切には密閉された容器内に、適切に含まれ得る。いくつかの実施形態では、幹細胞マトリックスを、少なくとも１％ｖ／ｖのＣＯ２、適切には少なくとも３％ｖ／ｖのＣＯ２、より適切には少なくとも４．５％ｖ／ｖのＣＯ２を含む密閉された雰囲気内に保存する。適切には、密閉された雰囲気は、８％を超えないＣＯ２、適切には６％を超えないＣＯ２を含む。密閉された雰囲気は、適切には、少なくとも８０％の湿度、適切には少なくとも９０％の湿度、適切には約９５％の湿度を有する。密閉された雰囲気は、適切には、最大で１００％の湿度、適切には最大で９８％の湿度を有する。
【０１５３】
本発明の培地内で幹細胞を保存している間、ゲル状培地を、栄養培地、例えば本明細書に記載の幹細胞培養用培地、特にヒト胚性幹細胞培養用培地で重層することができる。そうした栄養培地は、定期的に交換及び／又は補充することができる（例えば、少なくとも２日毎）。そうしたプロセスは、幹細胞の生存率を維持するために役立つことができる。
【０１５４】
また、前述した方法は、幹細胞の捕獲及び保存に加えて、幹細胞を放出する後続ステップを含むことができる。一般的に、これは、培地をその非ゼラチン状の形態に戻して、流動性の幹細胞組成物を得ること（例えば、１０℃以下又は５℃以下に温度を調整することによる）を含み、この流動性の幹細胞組成物から幹細胞を抽出することをさらに含むことができる。幹細胞は、機械的に、例えば、ピペットによって抽出することができる。そうした幹細胞は、適切には本発明の培地への導入前に収集するのと同じ方式で、凝集体として抽出することができる。次いで、幹細胞は、任意の適切な方式で、引き続き使用することができる。
【０１５５】
本発明の培地は、適切には前記培地内で保存している間、特に２１日間以下の保存期間にわたって、幹細胞の分化及び／又は増殖を（特に、標準的な幹細胞培養用培地での保存と比較して）遅延させる及び／又は防止するものである。増殖の状況又は低減は、目視可能な検査、例えば顕微鏡を介して判定することができる。分化の状況又は低減は、細胞の形態検査によって、及び特異的なマーカーモノクローナル抗体を用いる蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による解析を介して、判定することができる。
【０１５６】
［幹細胞を培養する方法］
本発明は、幹細胞を培養する方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）ゲル状の幹細胞組成物内で幹細胞を培養することと
を含む方法を提供する。
【０１５７】
ゲル状の幹細胞組成物は、幹細胞を培養するための３Ｄゲルネットワークを提供する。これは、標準的な２Ｄ細胞培養方法と異なる。
【０１５８】
好ましい実施形態では、培養は、３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、最も好ましくは３７℃の温度で、幹細胞マトリックスを用いて行う。
【０１５９】
培養培地は、水性媒体それ自体でもよい。いくつかの実施形態では、水性媒体は、培養培地として最初に調製する。いくつかの実施形態では、例えば、幹細胞の保存、保持又は分化の後に、さらなる成分を水性媒体に添加して、培養培地を生成することができる。
【０１６０】
培養培地は、適切には、幹細胞の増殖を促進する標準的な培養栄養素を含むことができる。そうした標準的な培養培地は、ＨＥＳ培地及びマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞を含むことができる。そうした培養培地は、適切には、幹細胞の保存の間に本発明の培地内で使用される任意の幹細胞栄養素／培養培地とは異なるものである。
【０１６１】
なお、本明細書では、幹細胞を培養する方法は、任意の分化後の幹細胞の培養を含むことを意図している。
【０１６２】
このような培養方法は、培養の前又は培養の後の保存及び／又は保持をさらに含むことができる。
【０１６３】
幹細胞の保存又は保持方法と同様に、幹細胞のこの培養方法は、幹細胞を放出する後続ステップを含むことができる。一般的には、これは、幹細胞培地が非ゼラチン状になるようにして流動性の幹細胞マトリックスを形成することを含み、流動性の幹細胞マトリックスから幹細胞を抽出することをさらに含むことができる。次いで、本明細書に記載の適用のいずれかを含めた、任意の適切な方式で幹細胞を使用することができる。
【０１６４】
［幹細胞を分化させる方法］
本発明は、幹細胞を分化させる方法であって、
（ｉ）本発明の第１の態様による非ゼラチン状の形態の培地を少なくとも１つの幹細胞と接触させて、流動性の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉ）培地の温度を変化させて、非ゼラチン状の形態からゼラチン状の形態に培地を変化させることによって、ゲル状の幹細胞組成物を生成することと、
（ｉｉｉ）幹細胞の分化を促進するための条件下で幹細胞を培養すること
を含む方法を提供する。
【０１６５】
好ましい実施形態では、培養は３０〜４５℃の間、好ましくは３５〜４０℃、最も好ましくは３７℃の温度で、幹細胞マトリックスを用いて達成される。
【０１６６】
幹細胞の分化を促進するのに適切な薬剤は、初めから培地中に存在してもよく、あるいは、培養中に（例えば、幹細胞の保存の後、保持の後又は培養の後でさえ）ゲル状の幹細胞組成物に添加することができる。
【０１６７】
この方法は、幹細胞分化の前又は後の(before after)いずれかでの細胞培養を含むことができる。いくつかの実施形態では、そうした分化及び培養をｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができるが、同時よりはむしろ連続的なほうが適切である。
【０１６８】
分化の方法は、幹細胞分化の前又は後に細胞を保存及び／又は保持することを、さらに含むことができる。
【０１６９】
幹細胞の保存又は保持方法と同様に、この幹細胞を分化させる方法は、幹細胞を放出する後続ステップを含むことができる。一般的には、これは、幹細胞培地が非ゼラチン状になるようにして、流動性の幹細胞マトリックスを形成することを含み、流動性の幹細胞マトリックスから幹細胞を抽出することをさらに含むことができる。次いで、本明細書に記載の適用のいずれかを含めた、任意の適切な方式で幹細胞を使用できる。
【０１７０】
［幹細胞を保存する、保持する、培養する及び／又は分化させるためのキット］
本発明は、本発明の第１の態様による培地を調製するためのキットであって、
（ｉ）本明細書で定義される合成熱応答性コポリマー粒子と、
（ｉｉ）任意選択的に、幹細胞の生存率を維持するための栄養素をさらに含む水性媒体
を含むキットを提供する。
【０１７１】
粒子は、水性媒体を混合するより前に、水性媒体（例えば、水）内で予め形成することができる。あるいは、水性媒体中に分散しており、それによって水性媒体が適切なコロイド粒子を自発的に形成する固形物として、コポリマーを提供することができる。
【０１７２】
適切には、水性媒体は、幹細胞用の栄養素をさらに含むが、一実施形態では、栄養素は別々に添加することができ、キットの別々の構成成分を形成する。
【０１７３】
［細胞療法及び医薬組成物］
本発明は、本発明の第２の態様による幹細胞組成物及び任意選択的に１種又は複数の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。
【０１７４】
当技術分野で既知の任意の適切な医薬品賦形剤を使用することができる。本発明のほとんどの医薬組成物は、本発明の幹細胞組成物を含む注射、注入液又は埋植体であることが想定される。
【０１７５】
本発明の第１１の態様によれば、療法で使用するための、本明細書で定義される医薬組成物が提供される。
【０１７６】
本発明の第１１の態様によれば、幹細胞療法で使用するための、本明細書で定義される医薬組成物が提供される。
【０１７７】
本発明の第１２の態様によれば、少なくとも１つの幹細胞の保存、保持、培養及び／又は分化のための、本明細書で定義される培地の使用が提供される。
【０１７８】
上文に定義された細胞又は幹細胞マトリックスを適切な投薬量範囲で投与する場合に、有害な毒物学的影響は予想されない。
【０１７９】
療法で使用するための有効量の本発明の細胞又は幹細胞組成物は、医学的状態を患う患者（例えば、ヒト）において、問題の医学的状態の症状を症候的に軽減する、前記医学的状態の進行を遅らせる、又は症状が悪化する危険性を低減するのに十分な量である。
【０１８０】
本発明の細胞又は幹細胞組成物の治療的又は予防的目的のための用量サイズは、当然ながら、医学の周知の原則に従って、状態の性質及び重症度、動物又は患者の年齢及び性別並びに投与経路によって変動する。
【０１８１】
本明細書で定義される細胞及び幹細胞組成物を使用することができる療法は、最も適切には細胞療法、特に幹細胞療法である。このような療法を受けることが意図される対象は、適切にはヒト又は動物対象である。この療法は、細胞欠損（例えば、組織欠損、軟骨欠損、骨欠損、骨疾患）、骨関節症、骨粗鬆症、脊髄傷害、歯周疾患、心筋梗塞、癌、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、筋変性障害及び筋損傷の治療を含み得る。この療法は、例えば、白血病を治療するための骨髄移植を含み得る。本発明の細胞及び幹細胞マトリックスは、組織及び／又は器官の修復、再建及び／又は交換で使用することができる。
【０１８２】
本発明の培地は、ある種の治療的な手順の間、患者から得た幹細胞を維持するのに、例えば、集中的な癌化学療法又は放射線療法な手順の間、患者の骨髄から得られた幹細胞を維持するのに使用することもできる。次いで、医学的治療の後に、幹細胞を患者に再導入することができる。
【実施例】
【０１８３】
＜材料及び方法＞
特記しない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったままの状態で使用したものである。また、ＧＭＡモノマーはＧＥＯ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｙｔｈｅ、ＵＫ）によって提供されたものであり、ＨＰＭＡモノマーはＡｌｆａ−Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ、ＵＫ）から購入したものである。
【０１８４】
分子量分布は、溶離液としてＤＭＦを使用し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって評価した。ＧＰＣ装置は、６０℃で維持された、２つのＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＰＬゲル５μｍ混合−Ｃカラム及び１つのＰＬ極性ゲル５μｍガードカラムを、Ｖａｒｉａｎ３９０ＬＣ屈折率検出器と直列に含む。ＤＭＦ移動相は１０ｍＭのＬｉＢｒを含んでおり、流速は１．０ｍＬ  ｍｉｎ−１とした。１０個のほぼ単分散のポリ（メチルメタクリレート）標準（Ｍｐ＝６２５〜６１８，０００ｇ  ｍｏｌ−１）をキャリブレーションに使用した。数平均分子量（Ｍｎ）とＭｗ／Ｍｎは、ほぼ単分散のポリ（メチルメタクリレート）キャリブレーション標準を使用してＧＰＣ曲線から計算した。
【０１８５】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ１−４００ＭＨｚ分光計を使用して、ｄ４−メタノール中で記録した。
【０１８６】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）研究は、Ｇａｔａｎ  １ｋ  ＣＣＤカメラを備えた、１００ｋＶで操作するＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１００機器を使用して行った。炭素被覆銅グリッドを２０〜３０秒間グロー放電して、親水性面を作出した。次いで、グリッドを、水性のブロックコポリマー分散体（０．５ｗ／ｗ％）に１分間浸積し、次いで、ギ酸ウラニル溶液（０．７５％ｗ／ｖ）に２０秒間浸積して、陰性染色を行った。次いで、各グリッドを濾紙でブロットし、バキュームホースを使用して乾燥した。
【０１８７】
［実施例１］
＜リン酸緩衝食塩水中でのＲＡＦＴ水性分散重合による、ポリ（グリセロールモノメタクリレート）−ポリ（２−ヒドロキシプロピルメタクリレート）（ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡ）ワームゲルの合成＞
［２−シアノプロピルジチオベンゾアト（ＣＰＤＢ）を使用した、ポリ（グリセロールモノメタクリレート）マクロ−ＣＴＡの合成］
ＣＰＤＢ（０．５７６ｇ、８０％純度、０．００２０８ｍｏｌ）及びＧＭＡ（２０．００ｇ、１２５．０ｍｏｌ、６０ｅｑ．）を２５０ｍｌの丸底フラスコに秤量し、Ｎ２で２０分間パージした。ＡＣＶＡ（０．１１７ｇ、０．４１６ｍｍｏｌ、［ＣＰＤＢ］／［ＡＣＶＡ］＝５．０）を添加し、フラスコをさらに５分間脱気した。脱気した無水エタノール（３０ｍｌ）を添加し、フラスコをさらに５分間脱気してから、７０℃に設定した油浴に浸漬した。１１５分後に、粗生成物の１Ｈ  ＮＭＲ解析によって、７１％のモノマー変換が示された。得られたＰＧＭＡマクロ−ＣＴＡを、メタノールから過剰量のジクロロメタン中に２回再沈殿させることによって精製し、次いで、水に溶解し、一晩凍結乾燥して、ピンク色の粉末を得た。これは、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって、＞９９％純粋であると判定された。
【０１８８】
１Ｈ  ＮＭＲによって決定された平均重合度は４５であった（図１参照）。
【０１８９】
ＤＭＦ  ＧＰＣ解析（対ＰＭＭＡ標準）：Ｍｎ＝１３，８００ｇ  ｍｏｌ−１、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１３。
【０１９０】
［ＰＧＭＡ４５−ＰＨＰＭＡ１１０ジブロックコポリマーワームの合成］
ＰＧＭＡ４５（４．９０４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）及びＨＰＭＡ（１０．０ｇ、６９．４ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの丸底フラスコ中に秤量し、Ｎ２で２０分間パージした。ＡＣＶＡ（５９．０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをさらに５分間脱気した。次いで、予め３０分間Ｎ２でパージしたリン酸緩衝食塩水溶液（５９ｍｌ）を添加し、この溶液をさらに５分間脱気してから、フラスコを、７０℃に設定した油浴に浸漬した。３時間後に、粗生成物の１Ｈ  ＮＭＲ解析によって、５．５から６．５ｐｐｍの間のビニルシグナルの消失に基づいて、＞９９％のＨＰＭＡのモノマー変換が示された。得られたジブロックコポリマーをリン酸緩衝食塩水溶液に対して一晩透析して、モノマーを含まない２０％ｗ／ｗのコポリマー分散体を生成し、これは、室温で自立型ゲルを形成した。乾燥したコポリマーサンプルを、１Ｈ  ＮＭＲ及びＤＭＦ  ＧＰＣによって解析した。
【０１９１】
１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって決定したジブロック組成物は、ＰＧＭＡ４５−ＰＨＰＭＡ１１０である（図１参照）。
【０１９２】
ＤＭＦ  ＧＰＣ解析（対ＰＭＭＡ標準）：Ｍｎ＝３１，６００ｇ  ｍｏｌ−１、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０９。
【０１９３】
レオロジー測定によって１７℃の臨界ゲル化温度（ＣＧＴ）が示された（図２参照）。
【０１９４】
［実施例２］
＜リン酸緩衝食塩水中でのＲＡＦＴ水性分散重合による、ポリ（グリセロールモノメタクリレート）−ブロック−ポリ（２−ヒドロキシプロピルメタクリレート−スタット−ジエチレングリコールメタクリレート）（ＰＧＭＡ−Ｐ（ＨＰＭＡ−ＤＥＧＭＡ））ワームゲルの合成＞
［ＰＧＭＡ５５マクロ−ＣＴＡの合成］
ＰＧＭＡマクロ−ＣＴＡを上記プロトコルに従って合成した。この場合、８８％のＧＭＡ変換が２時間後に達成され、５５の平均重合度（ＤＰ）が１Ｈ  ＮＭＲによって計算された。
【０１９５】
ＤＭＦ  ＧＰＣ解析（対ＰＭＭＡ標準）：Ｍｎ＝１５，７００ｇ  ｍｏｌ−１、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１７。
【０１９６】
［ＰＧＭＡ５５−Ｐ（ＨＰＭＡ８４−スタット−ＤＥＧＭＡ３６）ジブロックコポリマーの合成］
ＰＧＭＡ５５（０．７５０ｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）、ＨＰＭＡ（１．０２８ｇ、７．１４ｍｍｏｌ）、ＤＥＧＭＡ（０．５７６ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）及びＡＣＶＡ（８．０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの丸底フラスコ中に秤量した。予め３０分間Ｎ２でパージしたリン酸緩衝食塩水溶液（２０ｍｌ）を添加し、この溶液をさらに１時間Ｎ２でパージしてから、フラスコを、７０℃に設定した油浴に浸漬した。３時間後、粗生成物の１Ｈ  ＮＭＲ解析によって、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおける５．５から６．５ｐｐｍの間のモノマービニルシグナルの消失に基づいて、＞９９％の総モノマー変換が示された（図３参照）。得られたジブロックコポリマーをリン酸緩衝食塩水溶液に対して一晩透析して、１０％ｗ／ｗのコポリマー分散体を生成した。乾燥サンプルを、１Ｈ  ＮＭＲ及びＤＭＦ  ＧＰＣによって解析した。
【０１９７】
１Ｈ  ＮＭＲによって決定されたジブロック組成物＝ＰＧＭＡ５５−Ｐ（ＨＰＭＡ８４−スタット−ＤＥＧＭＡ３６）。
【０１９８】
ＤＭＦ  ＧＰＣ解析（対ＰＭＭＡ標準）：Ｍｎ＝３６，０００ｇ  ｍｏｌ−１、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１８。
【０１９９】
レオロジー測定によって２６℃の臨界ゲル化温度が示された（図４参照）。
【０２００】
［実施例３］
＜ゲル化可能な幹細胞培地の生成＞
実施例１に由来する１０ｍｌの１０％ｗ／ｗワームゲル（リン酸緩衝食塩水中）を、予め洗浄したＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（分子量カットオフ＝１０００）を使用して、１００ｍｌのヒト胚性幹細胞培養用培地（ＫＯ−ＤＭＥＭ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して２４時間４℃で透析し、次いで、予め氷上で冷却した０．２２μｍのフィルターユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｍｉｎｓａｒｔ）を使用して、濾過滅菌した。このゲル混合物を、ＫＯ−ＤＭＥＭ培地で５０：５０に希釈し（最終的に５％ｗ／ｗ）、アイスベッド上で冷却した１２ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）のウェル（６００μｌ／ウェル）にピペットで移し、プレートを撹拌して、混合物を一様に拡散した。
【０２０１】
次いで、ウェル内のゲル化可能な幹細胞培地をその後の実験で使用した。
【０２０２】
［実施例４］
＜幹細胞の捕獲、保存及び回復＞
胚性幹細胞（Ｓｈｅｆ１、１１及びＲＰＥ１細胞株）をピペットによって機械的に収集し、５０〜１００個の凝集体（直径５０〜１００μｍ）を低容量（約２０μｌ）で、プラスチックのパスツールピペットを使用して、実施例３に記載されているゲルウェル又は細胞培養培地単体を有するプレートのウェル（コントロール）に移した。プレートを撹拌して、細胞凝集体を分布させ、３７℃、空気中５％のＣＯ２及び９５％の湿度のインキュベーターに直ちに移した。５分後に、幹細胞培地の温度誘導性相転移後に形成したゲルを１００μｌの細胞培養培地で覆い、インキュベーターに戻した。ゲルを重層する培地を２日毎に交換し、顕微鏡によってウェルを調べた。
【０２０３】
幹細胞を４、７、１４及び２１日間保存してから回復させ、以下の試験を行った。
【０２０４】
［実施例５］
＜保存／回復幹細胞の試験＞
４、７、１４及び２１日目に、幹細胞凝集体を、アイスベッド上で冷却したウェルプレートから回復させ、この時点で、幹細胞培地は、流動性形態へ戻る相転移を受け、標準的な培養条件（ｈＥＳ培地及びマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞）を有するウェルプレートに移して、細胞生存率及び自発的な細胞分化を観察した。
【０２０５】
細胞とゲルとの間に小さな間隙があるゲルに囲まれた幹細胞の凝集体を観察することができた（図５参照）。位相差顕微鏡検査によって判定されたように、培養において、経時的に、各細胞凝集体の増殖がほとんど又は全く増大しないように見えた。上記の指定された期間後に細胞凝集体を回復させた場合（図６参照）、これらは、単層増殖によって示されたような生存率、並びに細胞形態及び特異的なマーカーモノクローナル抗体を用いる蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による解析で示された細胞分化による多能性を示した（図７〜図９参照）。
【０２０６】
細胞培養培地単体に蒔いたコントロールの幹細胞凝集体は、形態的観察及びＦＡＣＳ解析によって示されるように、即時に分化を示した（図１０参照）。
【０２０７】
要約すれば、ゲル状の幹細胞培地組成物での胚性幹細胞の凝集体のインキュベーションによって、標準的な幹細胞培養と比較して、幹細胞の分化と増殖の両方が２１日間にわたって静止した。
【０２０８】
［実施例６］
＜ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１胚性癌腫幹細胞の被包＞
本実施例では、細胞を被包するための３Ｄスキャフォールドとしての、ポリ（グリセロールモノメタクリレート）（ＰＧＭＡ）と共重合した２−ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）の使用を検討した。このコポリマーは、ワーム様ミセルに室温で自己構築することができる。これらのミセルは、３Ｄゲルマトリックスを生成するように、互いに相互作用することができる。細胞分化及び多能性マーカーの評価は、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１のＥＣ細胞をポリマーゲルに被包した後に評価した。  
【０２０９】
［実験手順］
コポリマー３Ｄワームゲルは、Ａｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄａｍ  Ｂｌａｎａｚｓ，Ｊｅｐｐｅ  Ｍａｄｓｅｎ，Ｇｉｕｓｅｐｐｅ  Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｊ．Ｒｙａｎ，ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｐ．Ａｒｍｅｓ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１６５８１）によって以前に記載されたように調製した。次いで、０．２μｍの注射器フィルターを使用して、コポリマーゲルを濾過滅菌した。ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１胚性癌腫幹細胞を脱離させ、次いで、４℃でゲル内に被包した。参照物として、これらを、マルチウェル細胞培養プレート中の２Ｄにも蒔いた。
【０２１０】
２４時間後に、細胞培養培地を、レチノイン酸を含む分化培地と交換した。３Ｄ（ゲル）及び２Ｄ（組織培養プラスチック）システムを、様々な時点で、ＭＴＳ及びマーカー発現（例えば、ＴＵＪ１、ＴＲＡ１−６０及びＶｉｎ２Ｐｂ２２）についてアッセイした。
【０２１１】
［結果］
細胞をゲル内に被包した（図１１参照）後に、７日間培養を続けた。ＭＴＳアッセイ（図１２参照）によって、ワームゲルは、この種類の細胞培養については有毒ではないことが示された。さらに、細胞のアクチン−ＤＡＰＩ染色によって、ちょうど７２時間後に、分裂、増殖及び３Ｄ球状体を形成できることが示された（図１３参照）。そして７日後に、大きな細胞コロニーが形成され、球状体の形成がより明らかになった（図１３）。
【０２１２】
次いで、周知の多能性幹細胞マーカーであるＴＲＡ１−６０を使用して細胞を染色した。図１４は、組織培養プラスチックで培養された細胞と比較して、１４日及び２１日後においてもなお、被包化細胞がこのマーカーを発現していたことを示す。Ｖｉｎ２Ｐｂ２２などの分化マーカーの解析によって、２Ｄシステム（組織培養プラスチック）のみで２１日まで発現が検出されるという特異な状況が示された。
【０２１３】
免疫蛍光アッセイのデータを、ｑＰＣＲを使用して確認し、マーカー発現の実際の差を定量化した。図１５は、２つの多能性マーカーであるＮａｎｏｇ及びＯＣＴ−０４の発現を示している。これらは、分化マーカーのβ３チューブリン及びｈ−ＡＳＨ１と比較して、有意に異なっていた。
【０２１４】
これらの結果によって、ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡワームゲルは、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１のＥＣ細胞に有毒ではないことが示された。さらに、アクチン／ＤＡＰＩの染色によって確認されたように、細胞は増殖し、球状体を形成した。これは、ワームゲルを、３Ｄ細胞環境をシミュレートするシステム内で分化プロセス及び細胞の発達を研究するための優れた候補とするものである。発現マーカーの研究によって、レチノイン酸での培養の２１日間にわたって細胞が未分化のままであることが示唆される。ｑＰＣＲの結果によって、レチノイン酸を用いると細胞が分化しないことが確認され、これは、おそらくＰＧＭＡ−ＨＰＭＡワームゲルとの相互作用が少ないためである。これらの観察は、幹細胞の分化は、生理活性分子からの刺激よりも、細胞とスキャフォールドの間の機械的シグナル伝達力に依存することを示唆するものである。
【０２１５】
［実施例７］
＜ワームゲルを細胞培養培地で直接的に調製するための、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ジブロックコポリマーワームの使用＞
［２−シアノプロピルジチオベンゾアト（ＣＰＤＢ）を使用した、ＰＧＭＡ５５マクロ−ＣＴＡの合成］
ＣＰＤＢ（０．８０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）及びグリセロールモノメタクリレート（ＧＭＡ、４０．５９ｇ、０．２５ｍｏｌ）を２５０ｍｌの丸底フラスコに秤量し、Ｎ２で２０分間パージした。ＡＣＶＡ（２０２．９ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液をさらに５分間脱気した。脱気した無水エタノール（６１ｍｌ、１．０４ｍｏｌ）を添加し、この溶液をさらに再び５分間脱気してから、７０℃に設定した油浴に浸漬した。２時間後に、ＣＤ３ＯＤ中で１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録し、これによって、約８０％のＧＭＡのモノマー変換が示された。メタノールから過剰量のジクロロメタン中に２回沈殿させて、未反応のモノマーを除去することによって、得られたポリマーを精製した。２回目の沈殿後に、精製したポリマーを濾過し、得られた固形物を水（２００ｍＬ）に溶解した。３０℃に設定したロータリーエバポレーターを使用して、残留するジクロロメタンを蒸発させた。溶媒のすべての痕跡が一旦除去されると、この水溶液を一晩凍結乾燥して、ピンク色の粉末を得た。ＣＤ３ＯＤに溶解した純粋なポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光研究によって、５５の平均重合度が示された。ＤＭＦ  ＧＰＣ解析（対ポリ（メチルメタクリレート）キャリブレーション標準）によって、１４，１００ｇ  ｍｏｌ−１のＭｎ及び１．０９のＭｗ／Ｍｎが得られた。
【０２１６】
［２０％ｗ／ｖの固形物での、０．１５ＭのＰＢＳにおけるＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ジブロックコポリマーワーム合成］
ＰＧＭＡ５５（３．０２３ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＨＰＭＡ（６．２４０ｇ、４１．６２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌの丸底フラスコに秤量し、Ｎ２で２０分間パージした。ＡＣＶＡ（３１．１．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをさらに５分間脱気した。次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ａ、Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、３７ｍｌ、１５０ｍＭ、予め３０分間Ｎ２でパージした）を添加し、この溶液をさらに５分間脱気してから、反応フラスコを、７０℃に設定した油浴に２時間浸漬して、その後、ＣＤ３ＯＤ中で記録された１Ｈ  ＮＭＲスペクトルによって、ほぼ１００％のＨＰＭＡ変換（５．６及び６．２ｐｐｍでのビニルシグナルの消失）が示された。ＤＭＦ  ＧＰＣ解析（対ポリ（メチルメタクリレート）キャリブレーション標準）によって、得られたＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ジブロックコポリマーに関して、３５，９００ｇ  ｍｏｌ−１のＭｎ及びＭｗ／Ｍｎ＝１．１０が得られた。
【０２１７】
細胞生物学的研究について、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルを精製及び調製するための３つのプロトコルを評価した。以下を参照されたい。
【０２１８】
［プロトコル１］
合成されたままの２０％ｗ／ｖの水性ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルを、透析液（ＰＢＳ）を１２時間毎に変えて、ＰＢＳに対して２日間４℃で透析した（ＭＷＣＯ＝１，０００）。得られた自由流動性の冷却コポリマー分散体を適切な細胞培地（ＤＭＥＭ又はＮｕｔｒｉｓｔｅｍ；混合前に予め４℃に冷却した）に希釈して所望の濃度（一般的には６％ｗ／ｖ又は１０％ｗ／ｖのコポリマーのいずれか）にし、この温度で下記のように濾過滅菌してから使用した。
【０２１９】
［プロトコル２］
合成されたままの２０％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ゲルを、透析液を１２時間毎に変えて、ＰＢＳに対して７日間４℃で透析した（ＭＷＣＯ＝１，０００）。得られた自由流動性の冷却分散体を適切な細胞培地（ＤＭＥＭ又はＮｕｔｒｉｓｔｅｍ；混合前に予め４℃に冷却した）に希釈して所望の濃度（一般的には６％ｗ／ｖ又は１０％ｗ／ｖのコポリマーのいずれか）にし、この温度で下記のように濾過滅菌してから使用した。
【０２２０】
［プロトコル３］
合成されたままの２０％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ゲルを、透析液を１２時間毎に変えて、純水に対して７日間４℃で透析した（ＭＷＣＯ＝１，０００）。得られたゲルを凍結乾燥して、乾燥したコポリマーワームの微細な粉末を得た。この粉末を適切な細胞培養培地（ＤＭＥＭ、ＥＢ（胚様体培地）又はＮｕｔｒｉｓｔｅｍ；混合前に予め４℃に冷却した）に再分散して、６％ｗ／ｖ又は１０％ｗ／ｖのコポリマー分散体のいずれかを得た。氷浴を使用して温度を約４℃で維持し、完全な分散が達成されるまで少なくとも２０分間磁気攪拌を続けた。得られた液体を下記のように濾過滅菌してから使用した。
【０２２１】
［滅菌プロトコル］
所望の細胞培養培地に分散させた６％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５コポリマーワームゲルを４℃に冷却して、ワームから球体への転移を誘導し、したがって、脱ゲル化を受けて、自由流動性のコポリマー球体分散体を得た。次いで、この冷却低粘性流体を、滅菌した０．２０μｍの注射器フィルターを使用して、ラミナーフローキャビネット内に設置した滅菌容器に限外濾過した。接触時のゲル化を防止するために、限外濾過より前に、注射器及びフィルターを少なくとも１時間−２０℃で保存した。次いで、得られた滅菌コポリマー分散体を細胞コロニー被包実験に直ちに使用するか、今後の使用のために（細胞培地の仕様に応じて）４℃又は２０℃のいずれかで保存した。
【０２２２】
［ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルとの直接的な接触における細胞生存率］
細胞生存率アッセイは、一次ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）を使用して実施した。
一次ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）は、ＡＴＣＣ（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、ＵＫ）からバッチで得た。これらは、主として乳房縮小部(breast reduction)及び新生児包皮から抽出された。線維芽細胞は、標準的な培養培地（１０％ＦＣＳ、２×１０−３ｍｏｌ  ｄｍ−３Ｌ−グルタミン、０．６２５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）を使用し、Ｔ７５フラスコで日常的に培養した。線維芽細胞は、継代４から９の間の試験に使用した。
【０２２３】
［ＭＴＴアッセイを使用した、ヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）での細胞生存率アッセイ］
ＨＤＦを、ウェルあたり３×１０４細胞の密度で２４ウェルプレートに播種し、８０％コンフルエンスまで（一般的には４８時間）増殖させた。細胞との直接的な接触とさらには非直接的な接触（バスケット方法）の両方でゲルを評価した。非接触ＴｈｉｎＣｅｒｔ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ＵＫ）装置を使用して、ワームゲル中に存在し得る有毒な低分子量化合物（例えば、未反応のＨＰＭＡモノマー）を同定した。ＴｈｉｎＣｅｒｔは、２４ウェルプレート上に適合するポリカーボネート膜の底面を有する組織培養プラスチックの小型バスケット様構造物である。したがって、細胞は、２４ウェルプレート中の細胞培地を通じて、直接的な接触によらずに、ゲルにさらされる。この装置は、細胞へのワームゲルの直接的な接触の影響と残留する小分子不純物の影響を識別する。
【０２２４】
間接的接触装置については、２５０μｌの１０％コポリマーゲルを各ＴｈｉｎＣｅｒバスケットに添加した。細胞を各バスケットより低く設置し、適切な細胞培養培地（５００μｌ）中に浸積した。直接的接触装置については、細胞培地をウェルから除去し、ゲル（一般的には５００μｌ）を細胞単層上に直接的に加えた。ゲルバッチを、８０％コンフルエントなＨＤＦ細胞で２４時間にわたって試験した。次いで、ＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって細胞生存率を評価した。細胞を冷却ＰＢＳで４℃で洗浄し、次いで、ＭＴＴ溶液（２０℃のＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ、２４ウェルプレートのウェルあたり１ｍｌ）と共に加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中にて１時間３７℃でインキュベートした。健常な生細胞については、ＭＴＴは、細胞生存率の分光学的定量化を可能にする、ミトコンドリアの酵素であるスクシニルデヒドロゲナーゼによって、紫色のホルマザン塩に還元される。１時間後に、溶液を吸引し、細胞内の不溶性ホルマザン生成物を可溶化し、酸性化ｉｓｏ−プロパノール（２４ウェルプレートのウェルあたり０．３０ｍｌ）を加えて細胞から取り出し、続いて１０分間インキュベートした。次いで、プレート読み取り可視吸収分光光度計を使用して、参照として６３０ｎｍでの吸光度を用いて、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。平均生存率データ及びＳＥＭを陰性コントロール（無処理、１００％生存率）に対して標準化し、パーセンテージ生存率±ＳＥＭとして表した。実験は、２連の(in duplicate)ウェルサンプルで、ｎ＝３の独立の実験で実施した。統計的分析については、生データにおいてスチューデントの対応ｔ検定を使用して、サンプルとコントロール群の差の有意性を評価した。
【０２２５】
［結果］
重合誘導性自己構築（ＰＩＳＡ）配合物（Ｂｌａｎａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，２０１２，１３４，９７４１−９７４８）を使用して、純水中又はＰＢＳなどの生理的緩衝液中のいずれかで、ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡジブロックコポリマーワームゲルを直接的に合成することができる。原理上は、ＰＢＳは細胞の生体適合性を促進するはずであるので、最初の配合物（上記のプロトコル１を参照）は、所望の細胞培養培地で希釈して６％ｗ／ｖのワームゲルを得る前に、（いかなる低分子量不純物も確実に完全に除去するために）ＰＢＳ中に２０％ｗ／ｖの固形物でのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルを合成し、それに続いて、その非ゲル状形態でＰＢＳに対して２日間４℃で透析を行うことを伴う。それにもかかわらず、ヒト真皮線維芽（ＨＤＦ）細胞での細胞生存率アッセイによって、このプロトコルは、最適な細胞生存率を達成することができないことが示唆された（図１６）。実際に、直接的な接触と間接的な接触のＴｈｉｎＣｅｒｔアッセイの両方が、細胞生存率の有意な低減（ｐ＜０．０１）を示した（図１６参照）。したがって、新しいアプローチ（上記のプロトコル２を参照）を開発し、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５コポリマー分散体を２日間の代わりに７日間透析にかけた。細胞生存率アッセイによって、パフォーマンスの改善が確認され、ＴｈｉｎＣｅｒｔアッセイは、未処理のコントロール群と比較して有意差を示さなかった（図１６参照）。しかしながら、直接的な接触アッセイは、それでも、最適以下の細胞生存率（ｐ＜０．０５）を示した。そうしたワームゲルを調製する際に細胞培地をＰＢＳで２倍希釈したので、その最適な濃度ではなかったので、これは予想外ではなかった。細胞生存率をさらに最適化するために、第三のプロトコルを考案し（上記のプロトコル３を参照）、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５コポリマーワームを２０％ｗ／ｖにてＰＢＳ中で調製し、これによって、純水に対して７日間透析し、一晩凍結乾燥して、乾燥粉末を得た。この粉末は、１００％細胞培養培地に再分散させ、自立型の透明な水性ワームゲルを再形成することができた。この後者のプロトコルは、非常に高い細胞生存率を示すハイドロゲルを生成し（図１６）、一方、細胞生物的適用に所望される熱可逆的なゲル化作用を維持した。
【０２２６】
［実施例８］
＜ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル中で３７℃で長期浸漬し、続いて４℃で脱ゲル化を介して細胞を収集した後の、生／死アッセイを使用したｈＥＳ細胞コロニーの生存の定量化＞
［％コロニー回復実験(% Colony recovery experiments)］
ｈＥＳ細胞は、別段の記載がない限り、一般的に、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ細胞培養培地（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、ＵＫ）及びＣｅｌｌｓｔａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）で被覆されたｔ２５容器を使用して、異物を含まない条件下で増殖した。細胞培養は、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中にて３７℃で維持し、培地は毎日新しくした。培養が最適な細胞密度（一般的には６０〜７０％表面被覆率）に達すると、細胞培地を補充し、光学顕微鏡を用いてコロニーを機械的に収集した。コロニーを細胞培地から回復させ、ゲル播種に備えて、３５ｍｍペトリディッシュに設置した。Ｉｂｉｄｉの８ウェルスライドを氷上に設置し、５００μｌの冷却６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５コポリマー分散体（これは約４℃で自由流動性の液体である）を各ウェルに添加した。「極細(super-fine)」チップを備えた滅菌プラスチックパスツールピペットを使用して、個々のコロニーを各ｉｂｉｄｉウェルの中心に設置し、穏やかに攪拌して混合した。３７℃に設定した加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中でｉｂｉｄｉウェルを設置することによって、ゲル化（図１７）が直ちに引き起こされた。細胞コロニーを所望の期間（すなわち、７、１４又は２１日間）インキュベートしてから、収集した。ゲル状の各ウェル中のコロニー数（一般的には３〜１５）を、光学顕微鏡を使用して測定した。各ｉｂｉｄｉスライドを氷上に約５分間設置することによって脱ゲル化（図１７）が引き起こされ、細胞コロニーを含む得られた自由流動性の冷却コポリマー分散体を、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（５．０ｍｌ）を含む、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ処理した６ウェルプレートに約１０倍希釈した。これよって、培養培地中にコロニーが放出された。光学顕微鏡を使用してｉｂｉｄｉウェルを調べ、ウェルに残存しているコロニー数（又はコロニー減少）を記録した。この６ウェルプレートを加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中で約３時間保存して、生細胞コロニーをＣｅｌｌｓｔａｒｔマトリックスに接着させた。その後に、培地を毎日補充し、コロニーを７日間までモニターし、成長しているコロニーの数を記録した。％コロニー回復は、脱ゲル化より前の最初のコロニー数に対して標準化した、時点あたりの平均コロニー回復±ＳＥＭとして計算した。％コロニー減少も同様に推定した。内部コントロール群を本研究に含め、これは、細胞コロニーをワームゲル中にちょうど１０分間浸積し、次いで、直ちに収集した。これによって、コロニー単離及びコロニー移動のプロトコルの効率を評価することが可能になった。実験は、３連の(in triplicate)ウェルで、ｎ＝３の独立の実験で実施した。
【０２２７】
［生／死アッセイ(Live/Dead assay)］
周知の市販の生／死アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）を使用して、ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル中に浸積したｈＥＳ細胞コロニーの生存率を評価した。このアッセイは、細胞透過性ＳＹＴＯ（登録商標）９緑色蛍光性核酸染色（励起４８０ｎｍ、放出５００ｎｍ）と不透過性の赤色蛍光性核酸染色であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ、励起４９０ｎｍ、放出６３５ｎｍ）の二成分混合物を利用する。膜が損なわれた（すなわち、リーキーな）細胞は、赤（ＰＩ）に染色され、死んだ又は死につつあると指定される。一方、膜が無傷な細胞は、緑（Ｓｙｔｏ−９）に染色され、生きていると指定される。単独で使用した場合、ＰＩ染色は一般にすべての細胞を標識するが、両方の色素が存在する場合は、ＰＩは損傷した膜を透過し、Ｓｙｔｏ９による蛍光をクエンチし、その結果、その緑色シグナルは検出されない。手短に言えば、ゲル状コロニーを約４℃に５分間冷却して脱ゲル化を引き起こし、次いで、重力下で沈降させた。自由流動性水性コポリマー分散体の上清を部分的に除去し、予め４℃に冷却した細胞培養培地でコロニーを一度洗浄した。次いで、水性流体を除去して、温かい（３７℃）細胞培養培地を、Ｓｙｔｏ９（１５μＭ）及びＰＩ（６０μＭ）を含む各ウェルに添加した。色素の取り込みを起こさせるために、細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中で２５分間インキュベートした。次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）でさらに５分間細胞核を対比染色した。最後に、コロニーを（予め４℃に冷却した）ＰＢＳで洗浄し、さらなる培養培地（容器に応じて、一般的には、６ウェルプレートに対して３ｍｌ及びｉｂｉｄｉイメージングプレートに対して５００μｌ）を添加してから、生細胞の研究用にＯｋｏｌａｂ環境制御チャンバーを備えた、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１共焦点顕微鏡を使用して検査した。
【０２２８】
［結果］
共焦点顕微鏡と組み合わせた蛍光色素保持に基づく生／死細胞アッセイによって、ワームゲル中に浸積しながら、細胞をその生存率についてモニターすることが可能になった（図１８参照）。７日後では、すべての細胞コロニーが高い生存率を示し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、死細胞を赤に選択的に染色する）染色の証拠が極めて少なく、主に緑色蛍光マーカー（Ｓｙｔｏ９）が観察された。浸漬してから１４日後では、いくらかのコロニーが、非生存のＰＩ染色された細胞の領域（全領域の＜１０％と推定される）を含んでいたが、コロニーの大部分の細胞は、Ｓｙｔｏ９による緑色蛍光によって示されるように、優れた生存率を示した（図１８）。ワームゲル内に浸漬してから２１日後では、細胞コロニーの有意な割合が、少なくともある程度の生細胞をなお示した（図１８参照）。
【０２２９】
これらのワームゲル内の細胞コロニーの生存率をさらに評価するために、脱ゲル化後に回復した生存コロニーの比率を測定した（図１９）。コロニー脱離機構がＰＳＣ生存率を損ない得ることが知られている（Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７，４７，３３−３７）ので、コントロール実験（図１９参照、０週目）を行い、これは、細胞コロニーをワームゲル中にちょうど１０分間浸積してから、冷却遠心分離によって再び取り出した。約７０±３％の収集した細胞コロニーがＣｅｌｌｓｔａｒｔに付着し、増殖することができた。７及び１４日後では、それぞれ、５７±１０％及び５９±５％の生存コロニーが回復した。
【０２３０】
％コロニー回復実験用に播種したコロニーを機械的に脱凝集させたので、均一なコロニーサイズ分布を達成するのは困難であった。最初のコロニーサイズが、ワームゲルから単離した後のアウトカムにかなりの影響があることが分かった。コロニーサイズが直径１００μｍ未満であった場合は、極わずかのコロニーが単離後にＣｅｌｌｓｔａｒｔに接着し、増殖し、このマイナー集団は十分に分化したか、成長しなかったかのいずれかであった（図２０Ａ及び２０Ｂ）。より優れた回復率が１００μｍを超えるコロニーサイズについて観察され（図２０Ｃ、２０Ｄ）、１００から２００μｍの範囲にわたるコロニーは、典型的なＥＳ細胞形態を示した（図２０Ｄ）。液体培養培地を使用した場合に、細胞生存率に対するコロニーサイズの同様の影響が他の研究者によって以前に報告されている（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｓ．，Ｗａｋｎｉｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ，Ｊ．Ｊ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｖ．Ｓ．ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，１１４５−１１４７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００，１８，３９９−４０４。興味深いことに、比較的大きな（＞＞２００μｍ）コロニーをワームゲル中に浸積した場合（図２０Ｅ）、これらは、平らに拡散するよりはむしろ、上部で有意に高密度になった。さらに、そうしたコロニーの端部は、光学顕微鏡によって判定されたように、ある程度の神経細胞分化を示すことが多かった。液体培地中に分散した高密度コロニーについて同様の観察が報告されている（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，１８，３９９−４０４。
【０２３１】
［実施例９］
＜非増殖性静止状態(non-proliferative stasis)（仮死状態: suspended animation）に関する実験的証拠＞
［ＤＮＡ抽出］
コロニーをｔ２５フラスコから機械的に回復させ、３５ｍｍのペトリディッシュに設置してから使用した。固定容量（５００μｌ）の細胞コロニーで各ｉｂｉｄｉウェルを播種した。この懸濁液を５分間沈降させ、次いで、液体培地を慎重に除去した。次いで、６％ＰＧＭＡ−ＰＨＰＭＡコポリマー分散体（５００μｌ；予め４℃に冷却した）を各ウェルに添加し、穏やかに攪拌して、混合した。ｉｂｉｄｉウェルを加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中に３７℃で設置することによって、ゲル化を直ちに引き起こした。次いで、細胞コロニーを７、１４又は２１日間インキュベートした。必要であれば、各ｉｂｉｄｉスライドを氷上に約５分間設置して、脱ゲル化を引き起こした。次いで、各ウェルの内容物を、氷冷ＰＢＳ（１．０ｍｌ）を含むラベルされた１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに設置した。サンプルを、５分間４℃で２回遠心分離した（１０００ｒｃｆ）。細胞ペレットを、１００μｌの消化緩衝液（０．２％ＳＤＳを加えたＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含む）を使用して、４時間３７℃でインキュベートした。これに続いて、ＴＥ緩衝液で飽和した２５：２４：１のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（１００μｌ）を含む溶媒混合液を各Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに添加し、ボルテックスによって完全に混合した。このサンプルを２０℃で５分間遠心分離した（１４，０００ｒｃｆ）。次いで、水性の上清をデカントし、氷冷エタノール（４５０μｌ）と３Ｍ酢酸ナトリウム（５０μｌ）に混合した。２０℃で５分間遠心分離（１４，０００ｒｃｆ）して、ＤＮＡを沈降させた。上清を慎重にデカントし、３７℃の乾燥器中でＤＮＡペレットを乾燥させた。乾燥したペレットをＴＥ緩衝液（２０μｌ）に再懸濁した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、２６０ｎｍで吸光度を測定することによってＤＮＡ濃度を計算した。細胞コロニーを約１０分間ゲル化し、次いで直ちに収集した（０日目）内部コントロール群に対してデータを標準化した。実験は、２連のウェルで、ｎ＝３の独立の実験で実施した。
【０２３２】
［ｋｉ６７免疫標識］
ｋｉ６７に対する免疫標識アッセイを、ゲル状コロニー及び回復コロニー（すなわち熱誘導性脱ゲル化後）の両方について実施した。蒔いた回復コロニーをＰＢＳで直接２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ水溶液（７５０μｌ）を使用して３０分間固定した。氷上で約５分間インキュベートして脱ゲル化を誘導することによって、コロニーをワームゲルから単離した。次いで、各ウェルを、氷冷ＰＢＳ（１ｍｌ）を含む１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに収集した。コロニーを５分間４℃で２回（１０００ｒｃｆ）洗浄し、次いで、４％ホルムアルデヒドのＰＢＳ水溶液（１００μｌ）を使用して、３０分間固定した。次いで、すべてのサンプルをＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ＰＢＳ溶液を使用して、２０分間透過処理した（６ウェルプレートのウェルあたり１ｍｌ及びＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブあたり１００μｌ）。次いで、コロニーをＰＢＳ中で３回洗浄し、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中にて２時間２０℃でブロッキングしてから、一次抗体溶液（ＰＢＳ中に１：１０００ウサギ抗ヒトｋｉ６７モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）＋１％ＢＳＡ）と共に、一晩４℃で穏やかに揺らしてインキュベートした。次いで、これらの抗体標識されたコロニーをＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで、二次抗体溶液（ＰＢＳ中に１：１０００ヤギ抗ウサギＣｙ３  ＩｇＧ（ａｂｃａｍ）＋１％ＢＳＡ）と共に、１時間２０℃で穏やかに揺らしてインキュベートした。コロニーをＰＢＳで３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫ）で細胞核を５分間対比染色した。最後に、各サンプルを、ＰＢＳを使用して３回洗浄し、ＥＶＯＳ落射蛍光イメージングシステムを使用して検査した。
【０２３３】
［結果］
ｈＥＳコロニーの経時的な光学顕微鏡的研究によって、コロニーのサイズ又は数の変化がほぼないことが明らかになった（図２１参照）。それにもかかわらず、生／死イメージング及びコロニー回復データによって、ワームゲル中で長期保存した後に、比較的高い比率のコロニーが生存可能なままであることが示唆された（図１８参照）。ワームゲル内での細胞増殖の程度を評価するために、コロニーを収集し、（０日目に対して）標準化した、細胞核から抽出したＤＮＡ量を経時的に測定した（図２１参照）。ＤＮＡ総量の有意な変化は検出されず、これは、ワームゲル中に保存している間の、無視できるほどの細胞コロニーの増殖を示唆するものである。免疫標識実験（図２２参照）は、一旦ワームゲル中に浸積させると、ｈＥＳ細胞はＧ１／Ｓチェックポイントで細胞周期停止を受けることを示す。ｋｉ−６７の存在は、細胞増殖の周知のマーカーであり、このタンパク質は、細胞周期の各段階の間ずっと存在する（Ｓｃｈｏｌｚｅｎ  ａｎｄ  Ｇｅｒｄｅｓ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，１８２，３１１−３２２）。ゲル状コロニーにｋｉ−６７がないことは、調査した時点毎に選択的染色実験によって確認され、これは、ｈＥＳ細胞がＧｏで細胞周期を出て、休眠状態又は静止状態に入ることを示唆している（図２２参照）。また、それとは対照的に、脱ゲル化、それに続く適切なＥＣＭマトリックス（すなわち、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔ）への接着を介する収集は、（陽性のｋｉ−６７染色によって判定されたように）コロニーを細胞周期に再進入させ、その増殖性状態を取り戻すことを可能にした（図２２参照）。ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ジブロックコポリマーのワームゲルは、細胞接着を促進するための特異的な結合モチーフを含むものではない。実際、その多価ヒドロキシ官能性は、細胞接着を低減することが知られている（Ｆａｕｃｈｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００４，２５，２７２１−２７３０；Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００７，１７，４０７９−４０８７）。最近、ｈＥＳ細胞が、（ｉ）細胞接着がない状態での細胞死機序（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２５，６８１−６８６）及び（ｉｉ）分化中の典型的な生理的現象（Ｃｏｕｃｏｕｖａｎｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｅｌｌ，１９９５，８３，２７９−２８７）としてアノイキスを利用することが、報告された。したがって、こうしたワームゲルのような、そうした生物学的に不活性な非相互作用３Ｄマトリックス中へのｈＥＳ細胞の浸漬が、アノイキスよりはむしろ静止状態をもたらすであろうことは明らかでない。
【０２３４】
［実施例１０］
＜輸送データ＞
近年、世界的に胚性幹細胞バンクが設立された。これらバンクは、研究コミュニティーに対して、高品質なヒト及び動物のＥＳ細胞の保管及び提供において重要な役割を果たすこととなる。これら細胞バンクは、多数の凍結保持された細胞株及び遺伝子操作された（すなわち、レポーター遺伝子）細胞株を効率的に作出し、これらの系統を依頼する研究者に供給している。凍結保存は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の保存及び輸送のための重要なステップである（Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋｉｎｇ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ａｎｄ  Ｒｅｐ，２００９，５，３０１−３１４）。効率的な凍結保存方法は、高い解凍効率を与え、細胞の多能性及び分化能力の両方を維持する必要がある。しかしながら、凍結保持された細胞の輸送には、比較的高価であり、多くの付随する問題がある。例えば、受け入れ施設は、特定の凍結融解プロトコルについて必要とされる技能及び機器を整える必要があり、送達時間を最適化することが重要である（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  ＮａｋａｇａｔａＭｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００２，１８０，２０７−２２８）。さらに、最適以下の凍結融解プロセスは、著しい損傷を細胞に引き起こし得る（Ｓｈａｗ  ａｎｄＮａｋａｇａｔａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００２，１８０，２０７−２２８）。さらに、液体窒素容器の輸送は、国際航空運送協会によって厳重に規制されるので（ＩＡＴＡ０（ＩＡＴＡ  ｄａｎｇｅｒｏｕｓ  ｇｏｏｄｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｍａｎｕａｌ  ５４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｉｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｄｅ：ＢＫ−ＩＡＴＡ１３，２０１３）、代替のより安く安全な輸送オプションが非常に望ましい。しばしば、研究所は、液体培地で満たした、ＣＯ２ガスで処理した細胞培養容器中でそれらを輸送するセルを交換する。これは有用な代替法である可能性があるが、培養中のＥＳ細胞は低温ストレスに十分対処しない（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２００１，１６，２１８７−２１９４）。おそらく、驚いたことに、特に発展中のＥＳ細胞市場に対する潜在的な商業収益を考慮すると、むしろ、この課題に対する研究はほとんど行われてこなかった。局地的に配布可能な製品に関しては、輸送条件下で少なくとも２４時間生存できるべきである。その生存期間を４８時間まで延ばすことができれば、大陸間の送達が可能になり、７２時間の生存では、原理上は世界的送達が可能になる。
【０２３５】
Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍを使用して調製した６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルを、２４、４８及び７２時間の保存時間用の潜在的な輸送培地として調査した（図２３参照）。コントロール実験として、液体（すなわち、非ゲル状）形態での従来の細胞培養培地として、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍも使用した。この場合、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された個々の３５ｍｍのｉｂｉｄｉディッシュの底面に細胞コロニーを付着させた。ワームゲル又は液体Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍのいずれかに浸積した細胞コロニーを、５％ＣＯ２−加湿インキュベーター中にて３７℃で８時間平衡化してから、典型的なポリスチレン輸送ボックスに保存した。仮定の保存時間中、加熱（３７℃）パッドを保存ボックスに加えて、この期間にわたって熱損失を最小限にした。これによって、３７℃よりはむしろ約１８から２２℃の温度範囲を維持することが可能になった。各時点の後、液体Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍに浸積した細胞を通常の細胞培養条件（すなわち、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中で３７℃に戻し、一方、ワームゲル内のコロニーを、（以前に記載したように）脱ゲル化を介して単離し、次いで、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された個々の３５ｍｍのｉｂｉｄｉディッシュの底面に接着させた。付着した細胞コロニーを、インキュベーター中に一晩（約１６時間）放置して回復させ、次いで、これらのコロニーの光学画像を記録した（図２３参照）。液体Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ中の細胞コロニーは、シミュレートした輸送保存条件の間、２４時間まで十分に生存し、ほとんどのコロニーは典型的なｈＥＳ形態を示した。同様に、ワームゲル中に浸積したコロニーも、同一条件下で保存した後、十分に回復した。しかしながら、液体Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ中に保存した細胞は、４８時間後にストレスのサインを示した。コロニーは「凝集(clumping)」を示し、いくらかのコロニーはなお付着したままであったが、脱離したデブリの量が増大した（図２３参照）。それとは対照的に、ワームゲル内に保存した細胞コロニーは、４８時間後に比較的十分に回復し、その特徴的な形態を保ったが、２４時間後に単離したものと比較して著しく少ない生存コロニーが回復した。７２時間後では、液体Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍから回復できた生存コロニーはなく、すべてのコロニーが脱離し、凝集したように思われた（図２３）。しかしながら、ワームゲル内に７２時間保存した後、少数の生細胞コロニーは、なお回復することができた（図２３）。
【０２３６】
［実施例１１］
＜ワームゲル内での個々のｈＥＳ細胞の保存＞
本実施例では、（ｈＥＳコロニーよりはむしろ）個々のｈＥＳ細胞の懸濁液を保持するためのワームゲルの使用を検討した。個々のｈＥＳ細胞の懸濁液を培養し、次いで、３ｉ培地を使用して調製した６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲル内にゲル化した。この特定の培地は、個々のｈＥＳ細胞培養に有利である特異的なアノイキス阻害剤（Ｇａｆｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３，５０４（７４７９），２８２−２８６）を含む。手短に言えば、培養中のｈＥＳ細胞を含む各ｔ２５容器をＰＢＳで一旦洗浄し、次いで、細胞解離溶液（１．５０ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中にて３分間３７℃でインキュベートした後、３ｉ細胞培養培地（１．５ｍｌ）を添加し、続いて１０００ｒｃｆにて５分間２０℃で遠心分離することによって、個々の細胞の懸濁液を収集した。液体３ｉ培地（１．５ｍｌ）中、又は３７℃で温める際に急速にワームゲルを形成する、約４℃の自由流動性の冷却コポリマー分散体（３ｉ培地を使用して調製した）中のいずれかに、ペレットを再懸濁した。液体３ｉ培地中の細胞を、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された６ウェルプレートで培養し、一方、３ｉ培地を加えたワームゲル内に保存した細胞を、加湿インキュベーター（５％ＣＯ２／９５％空気）中にて３７℃で２４時間たった後、脱ゲル化を介して単離し、次いで、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔで被覆された６ウェルプレートに接着させた。１６時間後に、光学顕微鏡によって細胞を調べた（図２４）。液体３ｉ培地及び３ｉ培地を加えたワームゲルから回復させた細胞は、回復後に、同様のサイズ、形態及び表面被覆率を示した。したがって、６％ＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５ワームゲルは、いかなる識別可能な有害な影響もなしに、個々のｈＥＳ細胞の懸濁液を保存するのに使用することができる。
【０２３７】
［実施例１１］
＜レオロジー的研究＞
可変温度のペルチェプレート及び４０ｍｍの２°アルミニウムコーンを備えたＡＲ−Ｇ２レオメーター（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、様々な水性媒体中の６％ｗ／ｖのＰＧＭＡ５５−ＰＨＰＭＡ１３５コポリマーワームゲルで、レオロジー研究を行った。
【０２３８】
３種類の細胞培養培地（例えば、ＰＢＳ、ＥＢ（胚様体培地、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＮＳ（Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）又は３ｉ培地（Ｇａｆｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３，５０４（７４７９），２８２−２８６）については、ゲル強度（Ｇ’約１０１Ｐａ）又は臨界ゲル化温度（ＣＧＴ約１８℃）のどちらにおいても、有意差は観察されなかった。ＰＢＳを使用して調製したワームゲルに対するＣＧＴは、わずかに低かった（１７℃）が、その熱可逆的な作用は、その他の点では、広く類似している。各ゲルに対する歪みスイープ（図２５ｂ）は、すべての場合で約６０％歪み付加あたりで起こる線形粘弾性領域からの逸脱をともなう、匹敵するＧ’値（９から１３Ｐａ）をもたらした。角振動数スイープ（図２５ｃ）もまた広く匹敵し、これは、細胞培養培地の変更は、ワームゲルレオロジーに対して比較的わずかな影響のみを有することを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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