(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
前記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う第１段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う第２段階選抜工程と、
前記第１段階選抜工程および前記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と
を備え、
ここで、前記ローカルアラインメント工程および前記第１段階選抜工程の両工程は、前記グローバルアラインメント工程および前記第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または前記グローバルアラインメント工程および前記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法。
【請求項２】
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第１の標的領域を選択する、第１の標的領域選択工程と、
前記第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第１の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求められたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求められたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
前記第１の第１段階選抜工程および前記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第１の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
ゲノム上の領域から、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第２の標的領域を選択する、第２の標的領域選択工程と、
前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第２の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列および前記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメントスコアに基づいて、前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメントスコアに基づいて、前記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
前記第２の第１段階選抜工程および前記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第２の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と
を備え、
ここで、前記第１のローカルアラインメント工程および前記第１の第１段階選抜工程の両工程は、前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
前記第２のローカルアラインメント工程および前記第２の第１段階選抜工程の両工程は、前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または前記第２のグローバルアラインメント工程および前記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
前記標的領域が３箇所以上である場合は、前記第２の標的領域選択工程から前記第２のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、請求項１に記載のプライマーの設計方法。
【請求項３】
前記グローバルアラインメント工程において、前記予め設定した配列長が３塩基以下の長さである、請求項１に記載のプライマーの設計方法。
【請求項４】
前記第１のグローバルアラインメント工程および前記第２のグローバルアラインメント工程において、前記予め設定した配列長が３塩基以下の長さである、請求項２に記載のプライマーの設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法およびプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、次世代シーケンシング技術の普及によって、塩基配列データの質および量を担保することが容易になったことから、遺伝子解析が手軽に行われるようになってきた。ＮＧＳ（Next Generation Sequencing：次世代シーケンシング）技術の導入によって、全ゲノム解析の技術的困難の多くは解消されつつある。しかし、ゲノムの総塩基長は、ヒトゲノムの場合で３０億塩基対以上と、一般に膨大であり、ＮＧＳ技術をもってしても、全ゲノム解析を行うにはかなりの費用および時間を要する。【０００３】
一方、遺伝子異常を検出するという目的を達成するための手段として、全ゲノム解析は最適とはいえない。遺伝子異常に関係する遺伝子領域のみを解析すれば足りるからである。なお、遺伝子異常に関係する遺伝子領域は、コーディング領域および非コーディング領域の両方を含む。そのため、必要な特定の遺伝子領域のみを増幅し、その塩基配列に限定してリードを行うことで、効率的かつ精度よく遺伝子解析を行う技術としてＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法が普及している。特に、ある１つのＰＣＲ反応系に複数種類のプライマーを同時に供給することで、複数の遺伝子領域を選択的に増幅する手法をマルチプレックスＰＣＲと称する。【０００４】
しかしながら、一般に、マルチプレックスＰＣＲで同時に増幅する領域の数は、あまり多くすることができない。その要因の一つとして、プライマー同士が反応することによって、プライマーダイマーと呼ばれる余計な増幅産物が生成され、目的の遺伝子領域を効率的に増幅することができなくなるという問題が挙げられる。この問題は、例えば、シングルセル（単一細胞）解析といった、ＰＣＲ反応の鋳型となるＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸）量が極めて少ない場合に顕著である。【０００５】
プライマーダイマーの形成を抑制する手段として、例えば、特許文献１では、プライマーの塩基配列を定常領域と可変領域とに分割し、定常領域においては同一の塩基列を配し、可変領域においてはシトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）のうち、相互に相補的にならないような２種類の塩基のみに限定することで、膨大な数の領域に対してＰＣＲをかける手段が記載されている。また、特許文献２では、プライマーのすべての組合せについて、プライマー間の３’末端での相補性を示すスコア（３’末端のローカルアライメントスコア）を計算し、プライマー同士の相補性が低いプライマーの組合せを選び出すことによって、マルチプレックスＰＣＲで異なるターゲットのプライマー同士がプライマーダイマーを形成する可能性を低くすることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０８１２２５号
【特許文献２】国際公開第２００８／００４６９１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者が検討したところでは、特許文献１に記載の手段は、ユニバーサルなプライマーを提供することで、全ゲノム領域に対して偏りのない増幅手段を提供することを目的としているため、特定の可変領域を含む塩基配列に挟まれた領域しか対象にできず、複数の特定領域のみを効率的に選択することができない。また、単一細胞からのマルチプレックスＰＣＲのような極微量の鋳型ＤＮＡに対するＰＣＲ反応では、プライマー端部のみでアニーリングして形成されるプライマーダイマーを考慮することも重要であるが、特許文献２に記載の手段は、そこまでは考慮していない。その結果として、特許文献１または２に記載された手段では、昨今要求される水準で、ゲノム上の複数の領域のみを効率的に選択増幅することができなかった。【０００８】
そこで、本発明は、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、プライマーダイマー形成性の評価を、プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下で、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求め、求めたローカルアラインメントスコアに基づいて第１段階の選抜を行い、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコア求め、求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて第２段階の選抜を行い、第１段階および第２段階のいずれにおいても選抜されたプライマーを採用すると、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを得られることを知得し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（３）である。
（１）ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う第１段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う第２段階選抜工程と、
上記第１段階選抜工程および上記第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第１段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法。
（２）ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第１の標的領域を選択する、第１の標的領域選択工程と、
上記第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第１の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求められたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求められたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
上記第１の第１段階選抜工程および上記第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第２の標的領域を選択する、第２の標的領域選択工程と、
上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第２の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、少なくとも１つずつ作成する、第２のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第２のローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第２の第１段階選抜工程と、
上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第２のグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第２の第２段階選抜工程と、
上記第２の第１段階選抜工程および上記第２の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第２のプライマー採用工程と
を備え、
ここで、上記第１のローカルアラインメント工程および上記第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記第１のグローバルアラインメント工程および上記第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第２のローカルアラインメント工程および上記第２の第１段階選抜工程の両工程は、上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記第２のグローバルアラインメント工程および上記第２の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記標的領域が３箇所以上である場合は、上記第２の標的領域選択工程から上記第２のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、上記（１）に記載のプライマーの設計方法。
（３）ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットであって、
それぞれのプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であり、かつ
それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満である、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法を提供することができる。【００１２】
また、本発明によれば、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる、ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明のプライマーの設計方法のブロックダイアグラムである。
【図２】図２は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号２で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図３】図３は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号３で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図４】図４は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号４で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図５】図５は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号５で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図６】図６は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図７】図７は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図８】図８は、実施例１での、配列番号１で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図９】図９は、実施例１での、配列番号２で示される塩基配列と配列番号３で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１０】図１０は、実施例１での、配列番号２で示される塩基配列と配列番号４で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１１】図１１は、実施例１での、配列番号２で示される塩基配列と配列番号５で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１２】図１２は、実施例１での、配列番号２で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１３】図１３は、実施例１での、配列番号２で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１４】図１４は、実施例１での、配列番号２で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１５】図１５は、実施例１での、配列番号３で示される塩基配列と配列番号４で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１６】図１６は、実施例１での、配列番号３で示される塩基配列と配列番号５で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１７】図１７は、実施例１での、配列番号３で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１８】図１８は、実施例１での、配列番号３で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図１９】図１９は、実施例１での、配列番号３で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２０】図２０は、実施例１での、配列番号４で示される塩基配列と配列番号５で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２１】図２１は、実施例１での、配列番号４で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２２】図２２は、実施例１での、配列番号４で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２３】図２３は、実施例１での、配列番号４で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２４】図２４は、実施例１での、配列番号５で示される塩基配列と配列番号６で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２５】図２５は、実施例１での、配列番号５で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２６】図２６は、実施例１での、配列番号５で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２７】図２７は、実施例１での、配列番号６で示される塩基配列と配列番号７で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２８】図２８は、実施例１での、配列番号６で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図２９】図２９は、実施例１での、配列番号５で示される塩基配列と配列番号８で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図３０】図３０は、実施例１での、配列番号１〜８で示される塩基配列から選ばれる任意の２つの塩基配列のペアの３’末端２塩基についてのグローバルアラインメントを表す図である。
【図３１】図３１は、比較例１での、配列番号９で示される塩基配列と配列番号１０で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図３２】図３２は、比較例２での、配列番号１１で示される塩基配列と配列番号１２で示される塩基配列とのペアについてのローカルアラインメントを表す図である。
【図３３】図３３は、比較例２での、配列番号１１で示される塩基配列と配列番号１２で示される塩基配列とのペアの３’末端２塩基についてのグローバルアラインメントを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
まず、本発明の従来技術に比べた有利な点について説明する。
本発明の特許文献１に記載された従来技術に対する有利な点として、特許文献１に記載の技術は、ユニバーサルなプライマーを提供することで、全ゲノム領域に対して偏りのない増幅手段を提供しようとするものであり、特定の遺伝子領域を選択的に増幅するものではないのに対して、本発明では、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる点が挙げられる。また、本発明の特許文献２に記載された従来技術に対する有利な点として、特許文献２に記載の技術は、プライマー塩基配列全体についてローカルアライメントを行って、配列全体の相補性が低いプライマーを選択することにより、プライマーダイマーが形成されにくいプライマーセットを設計しようとするものであるが、配列全体の相補性を低くするだけではプライマーダイマーの形成を十分に防止できないのに対して、本発明では、ローカルアライメントを用いて３’末端を含む配列全体の相補性が低くなるようにするとともに、グローバルアライメントを用いて３’末端の、例えば５ヌクレオチド長程度以下のごく短い部分配列の相補性が低くなるようにプライマー群を作成するので、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる点が挙げられる。
【００１５】
本発明について、以下に詳細に説明する。
【００１６】
［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法（第１の態様）］
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法の第１の態様は、
（ａ）ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
（ｂ）上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
（ｃ）上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
（ｄ）上記（ｃ）ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う第１段階選抜工程と、
（ｅ）上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
（ｆ）上記（ｅ）グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う第２段階選抜工程と、
（ｇ）上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第１段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法である。
【００１７】
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法の第１の態様の各工程について詳細に説明する。
【００１８】
（ａ）標的領域選択工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）標的領域選択工程」として示す。
標的領域選択工程は、ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する工程である。
【００１９】
（ゲノム上の領域）
本発明において「ゲノム上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患、がん等に関係する部位が存在するゲノムＤＮＡ上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、１塩基以上であればよい。
標的領域が選択されるゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームＲＮＡ（Ribonucleic acid：リボ核酸）遺伝子およびトランスファーＲＮＡ遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、５’−リーダー配列および３’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
【００２０】
遺伝子多型は、例えば、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）、ＳＮＶ（Single Nucleotide Variant：一塩基変異）、ＳＴＲＰ（Short Tandem Repeat Polymorphism：縦列型反復配列多型）、ミューテーション、ならびに挿入および／または欠失（インデル）などである。
単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに／または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および／もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。
多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、ＳＮＰの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。
がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性（家族性）のがんが存在し、遺伝子腫瘍（家族性腫瘍）などと称される。
【００２１】
ゲノム上の領域の数は特に限定されない。ゲノム上の領域は、標的領域を選択する際の候補リストであり、膨大な数がリストされていたとしても、そのすべてについてプライマーを設計しなければならないわけではないからである。
【００２２】
（標的領域）
標的領域は、上記ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、がん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は１つに限定されず、２以上の目的を有していてもよい。
【００２３】
標的領域として選択するゲノム上の領域の数は、目的により異なるが、１箇所以上であれば特に限定されず、通常、３箇所以上が好ましく、５箇所以上がより好ましく、１０箇所以上がさらに好ましい。
【００２４】
（ポリメラーゼ連鎖反応）
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型ＤＮＡからＤＮＡを合成する反応である。細胞内でのＤＮＡ合成とは異なり、ＰＣＲでは、ＤＮＡを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが１種類以上、通常は２種類以上、必要となる。１つのＰＣＲ反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
ＰＣＲは、１ペアのプライマーセットを用いて１つの領域を増幅する単純な系から、複数ペアのプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系（マルチプレックスＰＣＲ）まで、容易に拡張することができる。
ＰＣＲの利点は、ヒトのゲノム（３０億塩基対）のような非常に長大なＤＮＡ分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、ＰＣＲの利点としては、プロトコルにもよるが、概ね、増幅に要する時間が２時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、ＰＣＲの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
【００２５】
（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する工程である。
【００２６】
標的領域の近傍領域とは、標的領域の５’端から外側の領域、および標的領域の３’端から外側の領域を総称していう。標的領域の内側は近傍領域には含まない。
近傍領域の長さは特に限定されないが、ＰＣＲによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するＤＮＡフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および／またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。ＰＣＲにおいて用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは２０〜５００塩基程度、より好ましくは２０〜３００塩基程度、さらに好ましくは２０〜２００塩基程度、いっそう好ましくは５０〜２００塩基程度である。
【００２７】
また、プライマー候補の塩基配列を作成する際には、プライマーの長さ、ＧＣ含量（全核酸塩基中のグアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の合計モル百分率をいう。）、Ｔｍ値（二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度である。Tmはmelting temperatureに由来する。）、および配列の偏りなど、一般的なプライマーの設計方法において留意する点は同じである。
【００２８】
プライマーの長さ（ヌクレオチド数）は、特に限定されないが、好ましくは１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、より好ましくは１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒ、さらに好ましくは１５ｍｅｒ〜２５ｍｅｒ、いっそう好ましくは１５ｍｅｒ〜２０ｍｅｒである。プライマーの長さがこの範囲内であると、特異性および増幅効率に優れるプライマーを設計しやすい。
【００２９】
ＧＣ含量は、特に限定されないが、好ましくは４０モル％〜６０モル％、より好ましくは４５モル％〜５５モル％である。ＧＣ含量がこの範囲内であると、高次構造に起因する特異性および増幅効率の低下の問題が生じにくい。
【００３０】
Ｔｍ値は、特に限定されないが、好ましくは５０℃〜６５℃の範囲内、より好ましくは５５℃〜６５℃の範囲内である。
Ｔｍ値は、OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights社製)、または Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のＡ、Ｔ、ＧおよびＣの数（それぞれ、ｎＡ、ｎＴ、ｎＧおよびｎＣとする）から、下記式によって計算により求めることもできる。
Ｔｍ値（℃）＝２（ｎＡ＋ｎＴ）＋４（ｎＣ＋ｎＧ）
Ｔｍ値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってＴｍ値を算出することができる。
【００３１】
プライマー候補の塩基配列は、全体的に塩基の偏りがない配列にすることが好ましい。例えば、部分的にＧＣリッチな配列および部分的にＡＴリッチな配列を避けることが望ましい。
また、Ｔおよび／またはＣの連続（ポリピリミジン）、ならびにＡおよび／またはＧの連続（ポリプリン）も避けることが望ましい。
【００３２】
さらに、３’末端塩基配列が、ＧＣリッチな配列またはＡＴリッチな配列を避けることが好ましい。３’末端塩基はＧまたはＣが好ましいが、これらに限定はされない。
【００３３】
（特異性チェック工程）
所望により、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムＤＮＡに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、ゲノムＤＮＡの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムＤＮＡに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムＤＮＡの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが１本鎖ＤＮＡであるのに対して、ゲノムＤＮＡは２本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
【００３４】
また、プライマー候補の塩基配列をクエリー配列として、ゲノムＤＮＡ塩基配列データベースに対して相同性検索をしてもよい。相同性検索ツールとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool：ブラスト）（Altschul, S. A.、外4名、“Basic Local Alignment Search Tool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215巻、ｐ．403-410）およびＦＡＳＴＡ（ファストエー）（Pearson, W. R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1988年、4月、第85巻、ｐ．2444-2448）等が挙げられる。相同性検索を行った結果として、ローカルアラインメントを得ることができる。
【００３５】
スコアリング・システム、およびローカルアラインメントスコアの閾値は、いずれも、特に限定されず、プライマー候補の塩基配列の長さ、および／またはＰＣＲ条件等によって、適宜設定することができる。相同性検索ツールを使用する場合には、その相同性検索ツールの既定値を使ってもよい。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基（マッチ）＝＋１、非相補塩基（ミスマッチ）＝−１、挿入および／または欠失（ギャップペナルティ）＝−３を採用し、閾値を＋１５に設定することが考えられる。
【００３６】
プライマー候補の塩基配列がゲノムＤＮＡ上の想定外の位置の塩基配列と相補性を有し、特異性が低い場合には、その塩基配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った際に、標的領域ではなくアーティファクトを増幅する場合があるため、除外する。
【００３７】
（ｃ）ローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した２つの塩基配列からなるペアのすべてについて、比較する部分配列が前記塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
【００３８】
ローカルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
【００３９】
なお、後述する（ｅ）グローバルアラインメント工程および（ｆ）第２段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、（ｆ）第２段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する（ｄ）第１段階選抜工程を行ってもよい。
【００４０】
ローカルアラインメントは、部分配列に対して行うアラインメントであり、相補性の高い部分を局所的に調べることができる。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の３’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の３’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の３’末端から始まり他方の配列の３’末端で終わるアライメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の３’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表１のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【００４１】
【表１】
0006475321.tif 000002
【００４２】
例えば、以下の表２に示す配列番号１および２の塩基配列について、ローカルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表１に示すとおりとする。
【００４３】
【表２】
0006475321.tif 000003
【００４４】
配列番号１および２の塩基配列から、表３に示すドット行列（ドットマトリックス）を作成する。具体的には、配列番号１の塩基配列を左から右へ、５’から３’の向きで並べ、配列番号２の塩基配列を下から上へ、５’から３’の向きで並べ、塩基が相補的であるグリッドに「・」を記入して、表３に示すドットマトリクスを得る。
【００４５】
【表３】
0006475321.tif 000004
【００４６】
表３に示すドットマトリクスから、以下の表４に示す、部分配列のアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得る（表３の斜線部分参照）。
【００４７】
【表４】
0006475321.tif 000005
【００４８】
マッチ（＋１）×２、ミスマッチ（−１）×６、インデル（−３）×０なので、ローカルアラインメントスコアは「−３」である。
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【００４９】
（ｄ）第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第１段階選抜工程」として示す。
第１段階選抜工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う工程である。
【００５０】
ローカルアラインメントスコアの閾値（第１の閾値）を予め設定しておく。
ローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第１の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第１の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第１の閾値を設定してもよい。
【００５１】
ここで、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程に示した例において、第１の閾値を「３」に設定した場合を考える。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「−３」であり、第１の閾値である「３」未満であったから、配列番号１および２の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
【００５２】
なお、本工程は、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
【００５３】
（ｅ）グローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した２つの塩基配列からなるペアのすべてについて、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
【００５４】
グローバルアラインメントを行う塩基配列のペアの組合せは、重複を許して選択した組合せであってもよいし、重複を許さず選択した組合せであってもよいが、同一塩基配列のプライマー間でのプライマーダイマー形成性をまだ評価していない場合には、重複を許して選択した組合せが好ましい。
組合せの総数は、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をｍ個として、重複を許して選択した場合は、「ｍＨ２＝ｍ＋１Ｃ２＝（ｍ＋１）！／２（ｍ−１）！」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「ｍＣ２＝ｍ（ｍ−１）／２」通りである。
【００５５】
なお、上述した（ｃ）ローカルアラインメント工程および（ｄ）第１段階選抜工程の両工程を先に行った場合には、（ｄ）第１段階選抜工程で選抜されたプライマー候補に対して、本工程および後述する（ｆ）第２段階選抜工程を行ってもよい。
【００５６】
グローバルアラインメントは、「配列全体」に対して行うアラインメントであり、配列全体の相補性を調べることができる。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および／または欠失（インデル）を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致（マッチ）とし、相補的でない場合を不一致（ミスマッチ）とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表１のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表１中「−」はギャップ（挿入および／または欠失（インデル））を表す。
【００５７】
例えば、以下の表５に示す配列番号１および２の塩基配列について、それぞれの３’末端の３塩基（大文字部分。「３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列」に該当する。）についてグローバルアラインメントを行うことを考える。ここで、スコアリング・システムは表１に示すとおりとする。
【００５８】
【表５】
0006475321.tif 000006
【００５９】
スコアが最大となるように、配列番号１の塩基配列の３’末端の３塩基（大文字箇所）および配列番号２の３’末端の３塩基（大文字箇所）の塩基配列についてグローバルアラインメントを行うと、以下の表６に示すアラインメント（ペアワイズアラインメント）を得ることができる。
【００６０】
【表６】
0006475321.tif 000007
【００６１】
マッチ（＋１）×０、ミスマッチ（−１）×３、インデル（−３）×０なので、グローバルアラインメントスコアは「−３」である。
【００６２】
なお、アラインメント（ペアワイズアラインメント）は、ドットマトリクス法、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
【００６３】
（ｆ）第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第２段階選抜工程」として示す。
第２段階選抜工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う工程である。
【００６４】
グローバルアラインメントスコアの閾値（第２の閾値）を予め設定しておく。
グローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第２の閾値以上であれば、これらの２つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第２の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムＤＮＡの量などのＰＣＲ条件によって、第２の閾値を設定してもよい。
【００６５】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることによって、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアを第２の閾値未満とすることができる。
【００６６】
ここで、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程に示した例において、第２の閾値を「３」に設定した場合を考える。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満であるから、配列番号１および２の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
【００６７】
なお、本工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程においてスコアを算出したすべてのペアに対して行う。
【００６８】
上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
【００６９】
また、計算量を低減させるため、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆ）第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃ）ローカルアラインメント工程および上記（ｄ）第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【００７０】
これは、上記（ｅ）グローバルアラインメント工程では「予め設定した配列長」という短い長さの塩基配列についてグローバルアラインメントを行うので、３’末端を含むという条件下で塩基配列全体から相補性が高い部分配列を見つけるローカルアライメントスコアよりも計算量が少なく、高速に処理できるからである。なお、通常知られているアルゴリズムでは、同じ長さの配列に対するアライメントであれば、ローカルアラインメントよりもグローバルアラインメントの方が高速であることが知られている。
【００７１】
（増幅配列長チェック工程）
所望により、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムＤＮＡまたは染色体ＤＮＡ上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類等のＰＣＲ条件によって、適宜設定することができる。例えば、１００〜２００塩基（対）の範囲内、１２０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１８０塩基（対）の範囲内、１４０〜１６０塩基（対）の範囲内、１６０〜１８０塩基（対）の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
【００７２】
（ｇ）プライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記（ｄ）第１段階選抜工程および上記（ｆ）第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
【００７３】
例えば、表７に示す配列番号１および２の塩基配列について、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することを考える。
【００７４】
【表７】
0006475321.tif 000008
【００７５】
既に記載したように、ローカルアラインメントスコアは「−３」であり、第１の閾値である「３」未満である。そして、グローバルアラインメントスコアは「−３」であり、第２の閾値である「３」未満である。
したがって、配列番号１で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号２で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
【００７６】
［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法（第２の態様）］
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法の第２の態様は、以下の工程を備える。
（ａ１）ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第１の標的領域を選択する、第１の標的領域選択工程と、
（ｂ１）上記第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第１の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第１のプライマー候補塩基配列作成工程と、
（ｃ１）上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第１のローカルアラインメント工程と、
（ｄ１）上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第１の第１段階選抜工程と、
（ｅ１）上記プライマー候補の塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第１のグローバルアラインメント工程と、
（ｆ１）上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第１の第２段階選抜工程と、
（ｇ１）上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第１の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第１のプライマー採用工程と、
さらに、
（ａｎ）ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第ｎの標的領域を選択する第ｎの標的領域選択工程と、
（ｂｎ）上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第ｎの標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも１つずつ作成する、第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程と、
（ｃｎ）上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第ｎのローカルアラインメント工程と、
（ｄｎ）上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第１段階の選抜を行う、第ｎの第１段階選抜工程と、
（ｅｎ）上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の３’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第ｎのグローバルアラインメント工程と、
（ｆｎ）上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第２の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第２段階の選抜を行う、第ｎの第２段階選抜工程と、
（ｇｎ）上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第ｎの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第ｎのプライマー採用工程。
ただし、ｎは２以上の整数であり、ｎが目的領域選択工程で選択した目的領域の数に到達するまで、上記（ａｎ）第ｎの標的領域選択工程から上記（ｇｎ）第ｎのプライマー採用工程までの各工程をすべての標的領域について、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す。
ここで、上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程および上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
【００７７】
本発明におけるプライマーおよびプライマーセットの設計方法の第２の態様の各工程について詳細に説明する。
【００７８】
（ａ１）第１の標的領域選択工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）標的領域選択工程」として示す。
ゲノム上の領域から１つの遺伝子領域を第１の標的領域として選択する点を除いて、前述した第１の態様の「（ａ）標的領域選択工程」と同様である。
【００７９】
（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記（ａ１）第１の標的領域選択工程において選択した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
【００８０】
（特異性チェック工程）
本発明の設計方法の第１の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【００８１】
（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）ローカルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｃ）ローカルアラインメント工程」と同様である。
【００８２】
（ｄ１）第１の第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第１段階選抜工程」として示す。
上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｄ）第１段階選抜工程」と同様である。
【００８３】
（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）グローバルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｅ）グローバルアラインメント工程」と同様である。
【００８４】
（ｆ１）第１の第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）第２段階選抜工程」として示す。
上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｆ）第２段階選抜工程」と同様である。
【００８５】
本発明の設計方法の第１の態様と同様に、上記（ｃ１）第１のローカルアラインメント工程および上記（ｄ１）第１の第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および上記（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記（ｅ１）第１のグローバルアラインメント工程および（ｆ１）第１の第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
【００８６】
また、第１の態様と同様に、計算量を低減させるため、「（ｅ１）グローバルアラインメント工程」および「（ｆ１）第２段階選抜工程」を先に実施して、第２段階選抜工程を通過した組合せについて、「（ｃ１）ローカルアラインメント工程」および「（ｄ１）第１段階選抜工程」を実施することが好ましい。
【００８７】
（増幅配列長チェック工程）
第１の態様における「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【００８８】
（ｇ１）第１のプライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「（第１の）プライマー採用工程」として示す。
上記（ｂ１）第１のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第１の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｇ）プライマー採用工程」と同様である。
【００８９】
本発明の第２の態様では、第１の標的領域を増幅するためのプライマーを設計した後、第ｎ（ｎは２以上の整数）の標的領域を増幅するためのプライマーを設計する。
【００９０】
（ａｎ）第ｎの標的領域選択工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの標的領域選択工程」として示す。
ゲノム上の領域のうち第（ｎ−１）標的領域選択工程までに選択されていないものから１つの遺伝子領域を第ｎの標的領域として選択する点を除いて、前述した第１の態様の「（ａ）標的領域選択工程」と同様である。
なお、第ｎの標的領域の選択は、第（ｎ−１）の標的領域の選択と同時に、またはその後に、することができる。ここで、ｎは２以上の整数である。
【００９１】
（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記（ａｎ）第ｎの標的領域選択工程において選択した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｂ）プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
【００９２】
（特異性チェック工程）
本発明の設計方法の第１の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【００９３】
（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのローカルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｃ）ローカルアラインメント工程」と同様である。
ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第１の標的領域から第（ｎ−１）の標的領域までのそれぞれの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である（以下同じ）。
【００９４】
（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第１段階選抜工程」として示す。
上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｄ）第１段階選抜工程」と同様である。
【００９５】
（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｅ）グローバルアラインメント工程」と同様である。
【００９６】
（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎの第２段階選抜工程」として示す。
上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｆ）第２段階選抜工程」と同様である。
【００９７】
なお、本発明の設計方法の第１の態様と同様に、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程は、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程よりも前または後に実施してもよいし、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程と並行して実施してもよい。
【００９８】
また、計算量を低減させるため、上記（ｅｎ）第ｎのグローバルアラインメント工程および上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程の両工程を先に実施して、上記（ｆｎ）第ｎの第２段階選抜工程を通過した組合せに対して、上記（ｃｎ）第ｎのローカルアラインメント工程および上記（ｄｎ）第ｎの第１段階選抜工程の両工程を実施することが好ましい。特に、標的領域の数が増加するほど、プライマー候補の塩基配列数が増加するほど、計算量を低減させる効果が大きく、全体の処理の高速化を図ることができる。
【００９９】
（増幅配列長チェック工程）
本発明の設計方法の第１の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
【０１００】
（ｇｎ）第ｎのプライマー採用工程
図１のブロックダイアグラムに「第ｎのプライマー採用工程」として示す。
上記（ｂｎ）第ｎのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第ｎの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第１の態様の「（ｇ）プライマー採用工程」と同様である。
【０１０１】
［ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセット］
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットは、上述したポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法によって設計されたプライマーのセットである。
すなわち、それぞれのプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記塩基配列の３’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第１の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第２の閾値未満である。
【０１０２】
なお、プライマーの３’末端から数塩基の塩基配列を同一塩基配列とすることで、それぞれのプライマーの塩基配列の３’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアを第２の閾値未満とすることができる。
【０１０３】
本発明を用いることによって、極微量ＤＮＡに対するＳＮＰ判定および／またはＳＮＶ判定を行うことができる。さらに、標的領域を特定の染色体内の任意の箇所に設定することにより、特定の染色体ごとの定量比を知ることができる。これにより新出生前診断などといった単一細胞や極微量ＤＮＡからのゲノム異常検査が可能となる。
【０１０４】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０５】
［実施例１］
（１）標的領域の選択
表８に示すＳＮＰ位置を標的領域として選択した。なお、ＳＮＰ  ＩＤは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information：国立生物工学情報センター）が運営するｄｂＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism Database：一塩基多型データベース）で使用されている識別番号である。【０１０６】
【表８】
0006475321.tif 000009
【０１０７】
（２）プライマー候補塩基配列の作成
選択した各標的領域に対して、それぞれ、表９に示すプライマー候補塩基配列（配列番号１〜８）を作成した。ここで、「フォワードプライマー」とは、ＳＮＰ位置の５’側領域（座標が小さい側の領域）の塩基配列に基づいて作成したプライマーをいい、「リバースプライマー」とは、ＳＮＰ位置の３’側領域(座標が大きい側の領域）の塩基配列（染色体ＤＮＡ相補鎖の塩基配列）に基づいて作成したプライマーをいう。【０１０８】
【表９】
0006475321.tif 000010
【０１０９】
（３）ダイマー形成性の評価
プライマーダイマーを形成しやすいプライマー候補塩基配列を排除するため、ローカルアラインメントスコアによるダイマー形成性の評価を行い、それによりダイマー形成性が低いと評価されたプライマー候補塩基配列について、さらに、グローバルアラインメントスコアによるダイマー形成性の評価を行って、ダイマー形成性の低いプライマー候補塩基配列の組合せを得た。
ａ）ローカルアラインメントスコアによる評価
配列番号１〜８で示されるプライマー候補塩基配列のすべてのペア（２８組）について、比較する部分塩基配列が、プライマー候補塩基配列の３’末端を含むという条件（拘束条件）の下にペアワイズでローカルアラインメントを行った。ローカルアラインメントは、表１０に示すスコアリング・システムを用いて、上記拘束条件の下でアラインメントスコアが最大となるようにした。なお、表１０において、「-」はギャップ（インデル、挿入／欠失）を示す。
ローカルアラインメントスコアの閾値を３に設定し、３未満であるペアをパスさせることとした。【０１１０】
【表１０】
0006475321.tif 000011
【０１１１】
得られたアラインメントを図２から図２９までの図に示す。すべての組合せについて、ローカルアラインメントスコアが「３」未満であり、ダイマー形成性が低いと評価された。【０１１２】
ｂ）グローバルアラインメントスコアによる評価
配列番号１〜８で示されるプライマー候補塩基配列のすべてのペア（２８組）について、プライマー候補塩基配列の３’末端からの３塩基を抜き出し、その３塩基からなる塩基配列（すべて、５’−ＴＧＧ−３’）についてグローバルアラインメントを行った。グローバルアラインメントは、表１０に示すスコアリング・マトリックスを用いて、アラインメントスコアが最大となるようにした。スコアの閾値を３に設定し、３未満をパスさせることとした。なお、表１０において、「-」はギャップ（インデル、挿入／欠失）を示す。
得られたアラインメントを図３０に示す。すべてのペアについて、グローバルアラインメントスコアが「３」未満であり、ダイマー形成性が低いと評価された。【０１１３】
（４）プライマー間距離の評価
上記「（３）ダイマー形成性の評価」によって得られたダイマー形成性の低いプライマー候補塩基配列の組合せから、各標的領域をＰＣＲ増幅するためのプライマー候補のペア（配列番号１および２のペア、配列番号３および４のペア、配列番号５および６のペア、ならびに配列番号７および８のペア）のそれぞれについて、プライマー間距離（増幅開始位置から増幅終了位置までの長さ）を算出した。
プライマー間距離が１６０〜１８０塩基の範囲内にあるものをパスさせることとした。
表２に示すとおり、すべてのプライマー候補のペアのプライマー間距離は、１６０〜１８０塩基の範囲内であった。【０１１４】
（５）プライマーセットの確定
表１に示す４箇所のＳＮＰ位置をマルチプレックスＰＣＲにより増幅するためのプライマーセットとして、配列番号１〜８で示される塩基配列からなるプライマーのセット（プライマーセット）を得た。
このプライマーセットは、プライマーダイマー形成性が低く、単一細胞から抽出したごく微量のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとした場合であっても、マルチプレックスＰＣＲにより、同時に、標的領域を選択的かつ効率的に増幅することができる。【０１１５】
［比較例１］
（１）プライマー候補塩基配列の作成
プライマー候補塩基配列として、配列番号９で示される塩基配列および配列番号１０で示される塩基配列のペアを作成した。
（２）ダイマー形成性の評価
ローカルアラインメントスコアの閾値を「３」に設定し、「３」以上であるペアはダイマー形成性が高いものとして、さらにダイマー形成性の評価を行わず、排除することとした。
配列番号９、１０で示される塩基配列のペアについて、実施例１と同様にして、ローカルアラインメントを行った。
得られたアラインメントを、図３１に示す。配列番号９、１０で示される塩基配列のペアのローカルアラインメントスコアは「７」であり、閾値である「３」以上であったため、このペアはダイマー形成性が高いものとして排除された。
なお、配列番号９の塩基配列で示されるプライマーと配列番号１０の塩基配列で示されるプライマーとを用いて実際にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）を行うと、プライマーダイマーが形成される。第１段階選抜工程により、こういったハイスコアなアライメントから得られるダイマーを防ぐことができる。【０１１６】
【表１１】
0006475321.tif 000012
【０１１７】
［比較例２］
（１）プライマー候補塩基配列の作成
プライマー候補塩基配列として、配列番号１１で示される塩基配列および配列番号１２で示される塩基配列のペアを作成した。
（２）ダイマー形成性の評価
ａ）ローカルアラインメントスコアによる評価
ローカルアラインメントスコアの閾値を「３」に設定し、「３」未満であるペアをパスさせ、さらにダイマー形成性の評価を行うこととした。
配列番号１１、１２で示される塩基配列のペアについて、実施例１と同様にして、ローカルアラインメントを行った。
得られたアラインメントを、図３２に示す。配列番号１１、１２で示される塩基配列のペアのローカルアラインメントスコアは「−４」であり、閾値である「３」未満であったため、このペアには、さらにダイマー形成性の評価を行うこととした。
ｂ）グローバルアラインメントスコアによる評価
グローバルアラインメントスコアの閾値を「２」に設定し、「２」以上であるペアはダイマー形成性が高いものとして、さらにプライマーの評価を行わず、排除することとした。
配列番号１１、１２で示される塩基配列のペアについて、実施例１と同様にして、グローバルアラインメントを行った。
得られたアラインメントを、図３３に示す。配列番号１１、１２で示される塩基配列のペアの３’末端２塩基についてのグローバルアラインメントスコアは「２」であり、閾値である「２」以上であったため、このペアはダイマー形成性が高いものとして排除された。
このように，プライマーの３’末端部数塩基のみでプライマーダイマーを形成してしまうこともあるため、第１段階選抜工程に加えて、第２段階選抜工程を実施することにより、配列全体から見るとアライメントスコアが低いが、３’末端部数塩基のみでのアニーリングによるダイマー形成を防ぐことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、増幅する遺伝子領域の数が比較的少ない場合でも、比較的多い場合でも、目的の領域を選択的かつ効率的に増幅することができるプライマーセットを提供することができ、さらに、単一細胞からのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）増幅のような、極微量のゲノムＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid：デオキシリボ核酸）を鋳型ＤＮＡとした場合のＰＣＲにおいて有用であるので、遺伝子診断用途をはじめとする様々なＰＣＲ法を用いる用途に適用することができる。
【図１】
0006475321.tif 000013
【図２】
0006475321.tif 000014
【図３】
0006475321.tif 000015
【図４】
0006475321.tif 000016
【図５】
0006475321.tif 000017
【図６】
0006475321.tif 000018
【図７】
0006475321.tif 000019
【図８】
0006475321.tif 000020
【図９】
0006475321.tif 000021
【図１０】
0006475321.tif 000022
【図１１】
0006475321.tif 000023
【図１２】
0006475321.tif 000024
【図１３】
0006475321.tif 000025
【図１４】
0006475321.tif 000026
【図１５】
0006475321.tif 000027
【図１６】
0006475321.tif 000028
【図１７】
0006475321.tif 000029
【図１８】
0006475321.tif 000030
【図１９】
0006475321.tif 000031
【図２０】
0006475321.tif 000032
【図２１】
0006475321.tif 000033
【図２２】
0006475321.tif 000034
【図２３】
0006475321.tif 000035
【図２４】
0006475321.tif 000036
【図２５】
0006475321.tif 000037
【図２６】
0006475321.tif 000038
【図２７】
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【図２８】
0006475321.tif 000040
【図２９】
0006475321.tif 000041
【図３０】
0006475321.tif 000042
【図３１】
0006475321.tif 000043
【図３２】
0006475321.tif 000044
【図３３】
0006475321.tif 000045
【配列表】
0006475321000001.app