(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）由来のキノリン酸シンターゼ活性を有するように形質転換された、キノリン酸生産能を有するエシェリキア属微生物であって、該エシェリキア属微生物が、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼの内在性の活性と比較してより強化された活性をさらに有し、かつ該クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する、エシェリキア属微生物。
【請求項２】
前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドが、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のキノリン酸生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項３】
前記エシェリキア属微生物が、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの内在性の活性と比較してより低下した活性をさらに有する、請求項１に記載のキノリン酸生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項４】
前記エシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項１に記載のキノリン酸生産能を有するエシェリキア属微生物。
【請求項５】
キノリン酸を生産する方法であって、以下：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリキア属微生物を培地で培養するステップ、及び
（ｂ）前記ステップ（ａ）の培養された微生物、培地又はその両方からキノリン酸を回収するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キノリン酸生産能を有する微生物及びそれを用いてキノリン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キノリン酸（quinolinic acid）は、２，３−ピリジン−ジカルボン酸（2,3-Pyridinedicarboxilic acid）とも呼ばれ、医学用、農業用化学物質、染色物質など、非常に多くの分野で化学合成物の前駆体として用いられている。
【０００３】
前記キノリン酸は、化学的又は生物学的合成方法により作製することができる。化学的合成方法は、石油由来の再生不可能な（non-renewable）材料を原料として用いるので、環境的な問題や石油価格又は石油抽出コストに大きく影響されるという問題がある。
【０００４】
生物学的合成方法の代表的な例として、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（ＮａｄＢ）、キノリン酸シンターゼ（ＮａｄＡ）をコードする遺伝子をそれぞれ異なるコピー数のプラスミドにクローニングし、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性を除去した大腸菌において前述した２種類の酵素の発現を強化し、次いで前記菌株からキノリン酸を生産する方法が挙げられる（非特許文献１）。しかし、その際のキノリン酸の濃度は５００ｍｇ／Ｌ以下と非常に低いレベルであった。
【０００５】
このように低い濃度でキノリン酸が生成される第一の原因はＬ−アスパラギン酸オキシダーゼをコードするｎａｄＢとキノリン酸シンターゼをコードするｎａｄＡ遺伝子のＮＡＤ関連転写阻害因子であるＮａｄＲにより転写段階の発現調節が阻害されることであり、第二の原因はＬ−アスパラギン酸オキシダーゼであるＮａｄＢタンパク質がＮＡＤによりフィードバック阻害されることであり、第三の原因は用いられた大腸菌自体の炭素源からＬ−アスパラギン酸までの生合成経路が弱いことであると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許第０６２００９２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Eur. J. Biochem. 175,221 -228 (1988), DE3826041
【非特許文献２】Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21
【非特許文献３】"Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176
【非特許文献４】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 米国, 1981
【非特許文献５】Mendoza-Vargas et al.,PLoS ONE, 4: e7526
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、これらのうち第一の原因を解決する方法として高活性の外来キノリン酸シンターゼを見出し、それを用いてキノリン酸を増加させるべく鋭意努力した結果、キノリン酸生産能を有する微生物にクレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼの活性を導入すると、大腸菌由来のキノリン酸シンターゼを用いた場合に比べて、キノリン酸の生産能がより優れることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）由来のキノリン酸シンターゼ（quinolinate synthase）活性を有するように形質転換された、キノリン酸生産能を有する微生物を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、前記キノリン酸生産能を有する微生物を用いてキノリン酸を生産する方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のキノリン酸生産能を有する微生物はキノリン酸の効果的生産に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の具体的な一態様は、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）由来のキノリン酸シンターゼ（quinolinate synthase）活性を有するように形質転換された、キノリン酸生産能を有する微生物である。
【００１３】
本発明における「キノリン酸シンターゼ（quinolinate synthase）」とは、イミノコハク酸からキノリン酸を合成する活性を有する酵素を意味する。前記キノリン酸シンターゼは、ＥＣ番号がＥＣ ２．５．１．７２であり、ＮａｄＡともいう。前記キノリン酸シンターゼの有する活性は次の通りである。
［キノリン酸シンターゼの活性］
α−イミノスクシナート＋ジヒドロキシアセトンホスフェート＜＝＞キノリン酸＋ホスフェート＋２Ｈ２Ｏ
【００１４】
本発明に用いられる前記キノリン酸シンターゼは、クレブシエラ属由来のキノリン酸シンターゼであり、具体的にはクレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼであってもよい。本発明における前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼはＮａｄＡ（ＫＰ）ともいう。
【００１５】
前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼの配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）及び日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などの当業界で公知のデータベースから容易に得ることができ、例えばＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋの登録番号３３９７６１０１６の遺伝子の配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。それだけでなく、配列番号１と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を有するタンパク質であって、実質的にクレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼと同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
【００１７】
また、前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号２のポリヌクレオチド配列を有するか、それと相同性が８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９９％以上の塩基配列を有するが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明における「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分間の同一性の割合を意味する。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定される。例えば、相同性は、配列情報を整列させることのできる、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて、２つのポリヌクレオチド分子又は２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列させることにより決定される。前記コンピュータプログラムは、ＢＬＡＳＴ（NCBI）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（CLC bio）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（DNASTAR Inc）などであってもよい。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、その後単鎖特異的なヌクレアーゼで分解し、分解したフラグメントのサイズにより決定することができる。
【００１９】
具体的には、前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼ活性を有するように形質転換された、キノリン酸生産能を有する微生物は、クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼ活性が内在性活性より強化されたものであってもよい。
【００２０】
本発明における「内在性活性」とは、本来タンパク質が天然の状態、すなわち改変されていない状態で示す当該タンパク質の活性状態を意味する。「内在性活性より強化」するとは、本来タンパク質が天然の状態で示す当該タンパク質の活性よりその活性が増加することを意味し、当該タンパク質の活性を有さない微生物に当該活性を導入することも含まれる概念である。
【００２１】
このような活性の強化は、当業界で周知の様々な方法で行われるが、例えば当該タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に発現能が強化されたプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を与えたタンパク質を導入する方法、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変異体を導入する方法などを用いることができる。また、微生物が当該タンパク質の活性を有する場合、当該タンパク質をコードする遺伝子発現調節配列を改変する方法、前記タンパク質の活性が強化されるように前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子に変異を導入する方法などにより行われる。しかし、これらに限定されるものではない。また、このような活性を強化する方法は、本発明における他のタンパク質の活性強化においても同様に用いられる。
【００２２】
前記発現能が強化されたプロモーターとしては公知のプロモーターが用いられ、例えばｃｊ１プロモーター（特許文献１）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター及びｔｅｔプロモーターが挙げられる。
【００２３】
本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００２４】
本発明に用いられるベクターは、宿主内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現するようにする一連の作業を意味する。前記宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであればいかなる形態でもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自己発現するのに必要な全ての要素（前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター(promoter)、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、翻訳終結シグナルなど）を含む構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入することができるが、前記発現カセットは自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００２６】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
【００２７】
このようなタンパク質活性の強化は、対応するタンパク質の活性又は濃度が初期の微生物菌株における活性又は濃度に比べて、一般に少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％又は２０００％まで増加したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、前記キノリン酸生産能を有する微生物は、さらにＬ−アスパラギン酸オキシダーゼの活性が内在性活性より強化されたものであってもよい。
【００２９】
本発明における「Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ」とは、Ｌ−アスパラギン酸をイミノスクシナートに酸化させる活性を有する酵素を意味する。前記Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼは、ＥＣ番号が１．４．３．１６であり、ＮａｄＢともいう。Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼの有する活性は次の通りである。
［Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼの活性］
Ｌ−アスパラギン酸＋フマラート＜＝＞α−イミノスクシナート＋スクシナート＋Ｈ＋
あるいは
Ｌ−アスパラギン酸＋酸素＜＝＞過酸化水素＋α−イミノスクシナート＋Ｈ＋
【００３０】
また、前記Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼの配列は、非特許文献２に公開されている大腸菌（Escherichia coli）のゲノム配列（ＧＩ:８９１０９３８０）であるか、ＮＣＢＩやＤＤＢＪなどの当業界で公知のデータベースから容易に得ることができる。
【００３１】
例えば、前記Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼは、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を有するタンパク質であるが、これらに限定されるものではない。実質的に前記Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼと同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
【００３２】
また、前記Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。また、前記ポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号２０のポリヌクレオチド配列を有してもよく、それと相同性が８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３３】
また、前記エシェリキア属微生物は、さらにキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（quinolinate phosphoribosyltransferase）の活性が内在性活性より低下したものであってもよい。
【００３４】
前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼとは、キノリン酸をニコチン酸モノヌクレオチドに転換する活性を有する酵素を意味する。前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼは、ＥＣ番号が２．４．２．１９であり、ＮａｄＣともいう。キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの有する活性は次の通りである。
［キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの活性］
５−ホスホ−α−Ｄ−リボース１−ジホスファート＋キノリン酸＋２Ｈ＋＜＝＞ＣＯ２＋ジホスファート＋ニコチン酸モノヌクレオチド
【００３５】
また、前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの配列は、非特許文献２に公開されている大腸菌（Escherichia coli）のゲノム配列（ＧＩ：８９１０６９９０）であるか、ＮＣＢＩやＤＤＢＪなどの当業界で公知のデータベースから容易に得ることができ、例えば配列番号３で表されるアミノ酸配列だけでなく、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９９％以上の相同性を有するタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
また、前記キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。また、前記ポリヌクレオチド配列は、例えば配列番号４のポリヌクレオチド配列を有してもよく、それと相同性が８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００３７】
前記ＮａｄＣの活性を内在性活性より低下させることにより、細胞内にキノリン酸の蓄積を増加させることができる。
【００３８】
前記タンパク質の活性が内在性活性より低下するとは、本来微生物が天然の状態で有するタンパク質の活性と比較して、その活性が低下することや活性がないことが全て含まれる概念である。
【００３９】
このようなタンパク質活性の低下は、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる。前記方法の例として、前記タンパク質の活性を除去する場合をはじめとして、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、前記酵素の活性が低下するように突然変異した遺伝子により染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が低い配列や活性のない配列に置換する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在性プロモーターより弱いプロモーターに置換する方法）、前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合させて前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、当該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
【００４０】
具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部を欠失させる方法は、微生物内の染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われる。例えば、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を用いることができるが、これに限定されるものではない。また、前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なり、当業者が適宜決定することができ、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、さらに具体的には１〜５０個である。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
【００４１】
また、発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
また、染色体上の遺伝子配列を改変する方法は、前記タンパク質の活性がさらに低下するように、遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された遺伝子配列又は活性がなくなるように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
また、前記エシェリキア属微生物は、さらにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase, PPC）又はＬ−アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase）の活性が内在性活性より強化されたものであってもよい。
【００４４】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとは、ホスホエノールピルベートとＣＯ２からオキサロ酢酸を生成する反応を媒介する酵素である。前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、ＥＣ番号が４．１．１．３１であり、ＰＰＣともいう。
［ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性］
ホスホエノールピルベート＋ＣＯ２→オキサロ酢酸＋ホスフェート
【００４５】
また、Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼは、ホスホエノールピルベートからＬ−アスパラギン酸を合成する活性を有する。前記Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼは、ＥＣ番号が２．６．１．１であり、ＡｓｐＣ又はＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼともいう。
［Ｌ−アスパラギン酸トランスアミナーゼの活性］
オキサロ酢酸＋グルタミン酸＜＝＞Ｌ−アスパラギン酸＋２−ケトグルタミン酸
【００４６】
前記酵素をコードする遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣの配列は、非特許文献２に公開されている大腸菌のゲノム配列（ｇｉ：８９１１００７４，ＧＩ：８９１０７７７８）であるか、ＮＣＢＩやＤＤＢＪなどのデータベースから得ることができる。
【００４７】
前記ＰＰＣ及びＡｓｐＣは、ホスホエノールピルベートからキノリン酸の前駆体であるＬ−アスパラギン酸の合成を媒介するので、この活性を強化すると、細胞内でのキノリン酸の前駆体であるＬ−アスパラギン酸の生産を増加させることができ、それによりキノリン酸の生産を増加させることができる。
【００４８】
本発明における「キノリン酸生産能を有する微生物」とは、培地中の炭素源からキノリン酸を生産する微生物を意味する。また、前記キノリン酸を生産する微生物は組換え微生物であってもよい。例えば、前記キノリン酸を生産する微生物は、キノリン酸を生産するものであればその種類が特に限定されるものではなく、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物が挙げられ、具体的にはエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物、より具体的には大腸菌であるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の具体的な他の態様は、前記クレブシエラ・ニューモニア由来のキノリン酸シンターゼ活性を有し、キノリン酸生産能を有する微生物を用いてキノリン酸を生産する方法である。
【００５０】
具体的には、前記方法は、（ａ）前記微生物を培地で培養するステップと、（ｂ）前記（ａ）ステップの微生物、培地又はその両方からキノリン酸を得るステップとを含んでもよい。
【００５１】
前記微生物の培養は、当業界で公知の好適な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される微生物に応じて容易に調整して用いることができる。培養方法には、回分、連続及び流加培養が含まれるが、これらに限定されるものではない。微生物の様々な培養方法は、例えば非特許文献３に開示されている。
【００５２】
培養に用いられる培地は、特定の微生物の要件を満たさなければならない。様々な微生物の培地は、例えば非特許文献４に開示されている。前記培地は、様々な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。
【００５３】
微生物培養用培地に用いることのできる炭素源には、ブドウ糖、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記炭素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。
【００５４】
微生物培養用培地に用いることのできる窒素源には、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液（ＣＳＬ）、大豆粕、などの有機窒素源、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記窒素源は、単独で用いることもでき、組み合わせて用いることもできる。
【００５５】
微生物培養用培地には、リンの供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及びそれらに相当するナトリウム含有塩が含まれてもよい。また、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩が含まれてもよい。さらに、アミノ酸、ビタミン、好適な前駆体などが培地に含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。微生物培養用培地又は個別成分は、培養液に回分式又は連続式で添加することができる。
【００５６】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を微生物培養液に好適な方式で添加することにより、培養液のｐＨを調整することができる。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に酸素又は酸素を含むガス（例えば、空気）を注入してもよい。培養液の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃である。培養期間は、キノリン酸の所望の生成量が得られるまで続けてもよく、具体的には１０〜１６０時間である。
【００５７】
前記（ｂ）ステップにおけるキノリン酸を得るステップは、当業界で周知の様々な方法により行われてもよく、精製工程を含んでもよい。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１  キノリン酸を生産する菌株の作製
１−１．キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ除去菌株の作製
キノリン酸の分解経路に関与するキノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｎａｄＣを欠損させるべく次の実験を行った。
【００６０】
大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、キノリン酸分解経路のｎａｄＣ遺伝子を得た。米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｎａｄＣ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１０６９９０”，配列番号４）を得た。そのアミノ酸配列を配列番号３に示す。配列番号４に基づいて、ｎａｄＣ遺伝子の下流（downstream）部分を増幅する配列番号５及び６のプライマー、ｎａｄＣの上流及び下流部分とｌｏｘｐＣｍを増幅する配列番号７及び８のプライマー、上流部分を増幅する配列番号９及び１０のプライマーを合成した。
【００６１】
大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６と配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、それぞれ０．５ｋｂ及び０．３ｋｂのｎａｄＣ遺伝子の上流部分及び下流部分を増幅した。また、ｌｏｘｐＣｍを含有するプラスミドベクターｐＬｏｘｐＣａｔ２ベクター（Genbank Accession No. AJ401047）を鋳型とし、配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、１．０ｋｂの両末端にｎａｄＣ遺伝子と相同配列を有するｌｏｘｐＣｍ遺伝子を増幅した。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。
【００６２】
その後、前記ＰＣＲ反応により得られたｎａｄＣ・上流断片、ｎａｄＣ・下流断片、ｌｏｘｐＣｍ断片を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間の変性、及び７２℃で１分間の伸長からなるサイクルの１０回の繰り返し、及び配列番号５及び１０のプライマーを添加したサイクルの２０回の繰り返しとした。その結果、１．８ｋｂのｎａｄＣ遺伝子上流・ｌｏｘｐＣｍ・下流を含有するｎａｄＣ欠損カセットが得られた。
【００６３】
作製されたｎａｄＣ欠損カセットを、ラムダレッドリコンビナーゼ（lambda red recombinase）発現ベクターであるｐＫＤ４６を含有する大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０に電気穿孔により形質転換させ、選択マーカーであるクロラムフェニコールが含まれるＬＢ（Luria-Bertani）平板培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、及びアガー１．５％）上に塗抹して３７℃で一晩培養し、その後クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選択した。
【００６４】
選択した菌株を直接鋳型とし、配列番号６及び９のプライマーを用いて同一条件でＰＣＲを行い、その後１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが野生株の場合は１．６ｋｂ、ｎａｄＣ除去菌株の場合は１．３ｋｂであることを確認することにより、ｎａｄＣ遺伝子の欠失を確認した。これをＷ３１１０−△ｎａｄＣと命名した。
【００６５】
１−２．キノリン酸シンターゼ除去菌株の作製
本発明のクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）キノリン酸シンターゼの活性を確認するために、微生物自体のキノリン酸シンターゼをコードするｎａｄＡを欠損させるべく次の実験を行った。
【００６６】
大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、キノリン酸シンターゼのｎａｄＡ遺伝子を得た。米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｎａｄＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１０７６０１”，配列番号１２）を得た。そのアミノ酸配列を１１に示す。配列番号１２に基づいて、ｎａｄＡ遺伝子の下流（downstream）部分を増幅する配列番号１３及び１４のプライマー、ｎａｄＡの上流及び下流部分とｌｏｘｐＣｍを増幅する配列番号１５及び１６のプライマー、上流部分を増幅する配列番号１７及び１８のプライマーを合成した。
【００６７】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４と配列番号１７及び１８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、それぞれ０．５ｋｂ及び０．５ｋｂのｎａｄＡ遺伝子の上流部分及び下流部分を増幅した。また、ｌｏｘｐＣｍを含有するプラスミドベクターｐＬｏｘｐＣａｔ２ベクター（Genbank Accession No. AJ401047）を鋳型とし、配列番号１５及び１６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、１．０ｋｂの両末端にｎａｄＡ遺伝子と相同配列を有するｌｏｘｐＣｍ遺伝子を増幅した。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。
【００６８】
その後、前記ＰＣＲ反応により得られたｎａｄＡ・上流断片、ｎａｄＡ・下流断片、ｌｏｘｐＣｍ断片を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９６℃で６０秒間の変性、５０℃で６０秒間の変性、及び７２℃で１分間の伸長からなるサイクルの１０回の繰り返し、及び配列番号１３及び１８のプライマーを添加したサイクルの２０回の繰り返しとした。その結果、２．０ｋｂのｎａｄＡ遺伝子上流・ｌｏｘｐＣｍ・下流を含有するｎａｄＡ欠損カセットが得られた。
【００６９】
作製されたｎａｄＡ欠損カセットを、ラムダレッドリコンビナーゼ（lambda red recombinase）発現ベクターであるｐＫＤ４６を含有する大腸菌Ｗ３１１０−△ｎａｄＣに電気穿孔により形質転換させ、選択マーカーであるクロラムフェニコールが含まれるＬＢ（Luria-Bertani）平板培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、及びアガー１．５％）上に塗抹して３７℃で一晩培養し、その後クロラムフェニコールに対する耐性を示す菌株を選択した。
【００７０】
選択した菌株を直接鋳型とし、配列番号１４及び１７のプライマーを用いて同一条件でＰＣＲを行い、その後１．０％アガロースゲル上で遺伝子の大きさが野生株の場合は１．１ｋｂ、ｎａｄＡ除去菌株の場合は１．３ｋｂであることを確認することにより、ｎａｄＡ遺伝子の欠失を確認した。これをＷ３１１０−△ｎａｄＣ△ｎａｄＡと命名した。
【００７１】
１−３．大腸菌Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ発現ベクターの作製
Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼをコードする遺伝子ｎａｄＢを強化すべく次の実験を行った。
【００７２】
大腸菌由来の野生型ｎａｄＢ遺伝子を発現ベクターにクローニングした。そのための鋳型としては、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２５７）の染色体を用いた。遺伝子配列としては、米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）の遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１０９３８０”，配列番号２０）を用いた。そのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。ｎａｄＢ遺伝子のＯＲＦ部分を増幅し、制限酵素認識部位ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩを有する配列番号２１及び２２のプライマーを合成した。
【００７３】
前記大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１及び２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲにより、ｎａｄＢＯＲＦ遺伝子と制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩの認識部位を含有する約１．９ｋｂの増幅された遺伝子を得た。
【００７４】
前記ＰＣＲにより得られたｎａｄＢ遺伝子は、アガロースゲル溶出（agarose gel elution）により回収し、その後制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理した。その後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理したｐＰｒｏＬａｒ（CloneTech社，米国）ベクターにライゲーション（ligation）し、ｐＰｒｏプロモーターに連結されたｎａｄＢ遺伝子からＬ−アスパラギン酸オキシダーゼが発現するようにした。前記方法で作製されたベクターをｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターと命名した。
【００７５】
１−４．キノリン酸シンターゼ発現ベクターの作製
（１）ｐＮａｄＡ−ｎａｄＡベクターの作製
大腸菌由来の野生型キノリン酸シンターゼをコードするｎａｄＡ遺伝子を発現ベクターにクローニングした。そのための鋳型としては、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２３２５７）の染色体を用いた。米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から配列番号１２のｎａｄＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１０７６０１”）を得た。また、それに基づいて、ｎａｄＡ遺伝子のＡＴＧ部分及びＴＡＡを含有するＯＲＦ部分を増幅するのに用いることができ、制限酵素ＸｂａＩ認識部位及びＢａｍＨＩ認識部位を有する配列番号２５及び２６のプライマーを合成した。
【００７６】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５及び２６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｎａｄＡ遺伝子と制限酵素ＸｂａＩ認識部位及びＢａｍＨＩ認識部位を含有する約１ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００７７】
また、非特許文献５に基づいて、ｐＮａｄＡプロモーターを含む大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ｐＮａｄＡプロモーターを得た。ｐＮａｄＡプロモーターと前述したように増幅されたｎａｄＡ遺伝子をライゲーションさせるために、制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｂａＩの認識部位を有する配列番号２３及び２４のプライマーを合成した。
【００７８】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号２３及び２４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｐＮａｄＡプロモーターと制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｂａＩ認識部位を含有する約０．３ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００７９】
前記ＰＣＲにより得られたｎａｄＡ遺伝子を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理し、増幅されたｐＮａｄＡプロモーター断片をＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理した。制限酵素で処理したｎａｄＡ及びｐＮａｄＡプロモーター断片をｐＣＬ１９２０ベクターにライゲーション（ligation）でクローニングすることによりｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ組換えベクターを作製した。これを配列番号２７に示す。
【００８０】
（２）ｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ（ＫＰ）ベクターの作製
クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）由来のキノリン酸シンターゼを作製するために、クレブシエラキノリン酸シンターゼをコードするｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子を発現ベクターにクローニングした。そのための鋳型としては、クレブシエラ菌株の染色体ＤＮＡを用いた。菌株としては、ＡＴＣＣ Ｎo.２５９５５番を購入して用いた。遺伝子配列としては、米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）の遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：３３９７６１０１６”）の配列番号２を用いた。そのアミノ酸配列を配列番号１に示す。遺伝子クローニングのために、ｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子部分を増幅することができる制限酵素ＸｂａＩ認識部位及びＢａｍＨＩ認識部位を有する配列番号２８及び２９のプライマーを合成した。
【００８１】
クレブシエラの染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号２８及び２９のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子と制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩの認識部位を含有する約１ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００８２】
前記ＰＣＲにより得られたｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理し、制限酵素で処理したｎａｄＡ（ＫＰ）断片をｐＮａｄＡプロモーターを含むｐＣＬ１９２０ベクターに制限酵素で処理したｎａｄＡ（ＫＰ）断片をライゲーション（ligation）することによりｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ（ＫＰ）組換えベクターを作製した。その塩基配列を配列番号３０に示す。
【００８３】
１−５．アスパラギン酸オキシダーゼ及びキノリン酸シンターゼ発現用プラスミドの作製
（１）ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡベクターの作製
キノリン酸を生産するためには、アスパラギン酸オキシダーゼとキノリン酸シンターゼの２つの酵素の強化が必要である。そこで、この２つの酵素をコードするｎａｄＢとｎａｄＡの遺伝子を同時に発現するプラスミドを作製した。まず、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、キノリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｎａｄＡを得た。米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）からｎａｄＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１０７６０１”）を用いた。それを配列番号１２に示す。それに基づいて、ｎａｄＡ遺伝子のＡＴＧ部分及びＴＡＡを含有するＯＲＦ部分を増幅するのに用いることができ、制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩの認識部位を有する配列番号３１及び３２のプライマーを合成した。
【００８４】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１及び３２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｎａｄＡ遺伝子と制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩの認識部位を含有する約１．０ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００８５】
特許文献１に基づいて、ｐＣＪ１プロモーターを含むプラスミドＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ｐＣＪ１プロモーターを得た。ｐＣＪ１プロモーターと前述したように増幅されたｎａｄＡ遺伝子をライゲーションするために、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｐａＩの認識部位を有する配列番号３３及び３４のプライマーを合成した。
【００８６】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号３３及び３４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲ条件は、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｐＣＪ１プロモーターと制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位及びＡｐａＩ認識部位を含有する約０．３ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００８７】
前記ＰＣＲにより得られたｎａｄＡ遺伝子を制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩで処理し、増幅されたｐＣＪ１プロモーター断片をＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで処理した。制限酵素で処理したｎａｄＡ及びｐＣＪ１プロモーター断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで処理した前記１−３で得られたｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターにライゲーションによりクローニングし、最終的に構成的プロモーターであるｐＰｒｏプロモーターにより発現調節されるｎａｄＢ遺伝子と、ｐＣＪ１遺伝子プロモーターにより発現調節されるｎａｄＡ遺伝子がクローニングされた５．９ＫｂのｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣＪ１−ｎａｄＡ組換えベクターを作製した。
【００８８】
（２）ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ（ＫＰ）ベクターの作製
キノリン酸を生産するためには、アスパラギン酸オキシダーゼとキノリン酸シンターゼの２つの酵素の強化が必要である。この２つの酵素をコードするｎａｄＢとｎａｄＡ（ＫＰ）の遺伝子を同時に発現することができるプラスミドを作製するために、クレブシエラ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、キノリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｎａｄＡ（ＫＰ）を得た。遺伝子配列としては、米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）の遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：３３９７６１０１６”）の配列を用いた。それを配列番号２に示す。それに基づいて、ｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子のＡＴＧ部分及びＴＡＡを含有するＯＲＦ部分を増幅するのに用いることができ、制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩの認識部位を有する配列番号３５及び３６のプライマーを合成した。
【００８９】
クレブシエラ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３５及び３６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社，米国）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｎａｄＡ遺伝子と制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩの認識部位を含有する約１．０ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００９０】
前記ＰＣＲにより得られたｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子を制限酵素ＡｐａＩ及びＮｏｔＩで処理し、ＡｐａＩ及びＮｏｔＩで処理した前記１−５（１）で得られたｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡベクターにライゲーションによりクローニングし、最終的に構成的プロモーターであるｐＰｒｏプロモーターにより発現調節されるｎａｄＢ遺伝子と、ｐＣＪ１遺伝子プロモーターにより発現調節されるｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子がクローニングされた５．９ＫｂのｐＰｒｏ−ｎａｄＢ＿ｐＣＪ１−ｎａｄＡ（ＫＰ）組換えベクターを作製した。
【００９１】
１−６．ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びＬ−アスパラギン酸トランスアミナーゼ発現用プラスミドの作製
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｐｃを得た。米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から配列番号３７のｐｐｃ遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１１００７４”）を得た。それに基づいて、ｐｐｃ遺伝子のプロモーターからターミネーターまでを含有する部分を増幅することができ、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ認識部位を有する配列番号３８及び３９のプライマーを合成した。
【００９２】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３８及び３９のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で４分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ｐｐｃ遺伝子と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩの認識部位を含有する約３．１ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。前記ＰＣＲにより得られたｐｐｃ遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで処理し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで処理したｐＣＬ１９２０（ＡＢ２３６９３０）ベクターにライゲーションによりクローニングし、最終的にｐｐｃ遺伝子がクローニングされたｐＣＰ組換えベクターを作製した。
【００９３】
ｐｐｃ遺伝子がクローニングされているｐＣＰ組換えベクター上にａｓｐＣ遺伝子をクローニングするために、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＬ−アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子ａｓｐＣを得た。米国国立保健研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から配列番号４０のａｓｐＣ遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩ登録番号“ＧＩ：８９１０７７７８”）を得た。それに基づいて、ａｓｐＣ遺伝子のプロモーターからターミネーターまでを含有する部分を増幅することができ、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ認識部位を有する配列番号４１及び４２のプライマーを合成した。
【００９４】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４１及び４２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲは、９６℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長からなるサイクルを３０回繰り返した。その結果、ａｓｐＣ遺伝子と制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩの認識部位を含有する約１．５ｋｂの増幅された遺伝子が得られた。
【００９５】
前記ＰＣＲにより得られたａｓｐＣ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで処理し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで処理したｐＣＰベクターにライゲーションによりクローニングし、最終的にａｓｐＣ遺伝子とｐｐｃ遺伝子が同時にクローニングされたｐＣＰＡ組換えベクターを作製した。作製したｐＣＰＡベクターは配列番号４３の配列を有する。
【００９６】
実施例２  キノリン酸生産菌株の生産能評価
ｎａｄＡ（ＫＰ）遺伝子強化菌株のキノリン酸生産能力を評価するために、Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ菌株にｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ及びｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ（ＫＰ）ベクターを導入した。Ｗ３１１０△ｎａｄＣ／ｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ、Ｗ３１１０△ｎａｄＣ／ｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ（ＫＰ）菌株をそれぞれＣＶ０１−０８１２、ＣＶ０１−０８１３と命名した。さらに、ｎａｄＢ強化のために、ＣＶ０１−０８１２及びＣＶ０１−０８１３にｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターを導入した。それぞれＣＶ０１−０８１４、ＣＶ０１−０８１５と命名した。
【００９７】
ベクターの導入方法は、ＣａＣｌ２方法を用いて形質転換し、３７℃の培養器にて、ＣＶ０１−０８１２、ＣＶ０１−０８１３の場合はＬＢ−Ｓｐ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，トリトン１０ｇ／Ｌ，アガー１．５％，スペクチノマイシン５０μｇ／Ｌ）、ＣＶ０１−０８１４、ＣＶ０１−０８１５の場合はＬＢ−Ｓｐ、Ｋｍ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，トリトン１０ｇ／Ｌ，アガー１．５％，カナマイシン５０μｇ／Ｌ，スペクチノマイシン５０μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹して一晩培養した。その後、抗生剤耐性を有する、得られた単一コロニーを２５ｍＬのキノリン酸力価培地に１白金耳ずつ接種し、３３℃にて２５０ｒｐｍで２４〜７２時間培養した。下記表１はキノリン酸生産用培地の組成を示す表である。
【００９８】
【表１】
0006502515.tif 000002
【００９９】
培養液中のキノリン酸をＨＰＬＣで分析した。その結果を下記表２に示す。表２から分かるように、キノリン酸を生産する際にｎａｄＢとｎａｄＡの同時強化が必要であることが確認され、クレブシエラベースのｎａｄＡ（ＫＰ）を強化した菌株は、野生型ｎａｄＡを強化した菌株よりキノリン酸の生産量が約１０％増加することが確認された。
【０１００】
【表２】
0006502515.tif 000003
【０１０１】
単一種のキノリン酸シンターゼの活性を評価するために、ｐＰｒｏ−ｎａｄＢベクターが含まれるＷ３１１０−△ｎａｄＣ△ｎａｄＡ菌株にｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ及びｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ（ＫＰ）ベクターをそれぞれＣａＣｌ２方法を用いて形質転換した。Ｗ３１１０△ｎａｄＣ△ｎａｄＡ／ｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ，ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ、Ｗ３１１０△ｎａｄＣ△ｎａｄＡ／ｐＮａｄＡ−ｎａｄＡ（ＫＰ），ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ菌株をそれぞれＣＶ０１−０８１６、ＣＶ０１−０８１７と命名した。そのうちＣＶ０１−０８１７菌株は、ブダペスト条約に基づいて２０１４年１１月２７日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１１６１２Ｐとして寄託した。
【０１０２】
前述した２つの菌株を用いて、次のようにキノリン酸力価培地の評価を行った。
【０１０３】
形質転換された前記ＣＶ０１−０８１６、ＣＶ０１−０８１７菌株を３７℃の培養器にてＬＢ−Ｋｍ、Ｓｐ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，トリトン１０ｇ／Ｌ，アガー１．５％，カナマイシン５０μｇ／Ｌ，スペクチノマイシン５０μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹して一晩培養した。その後、カナマイシン及びスペクチノマイシン耐性を有する、得られた単一コロニーを２５ｍＬのキノリン酸力価培地に１白金耳ずつ接種し、３３℃にて２５０ｒｐｍで２４〜７２時間培養した。
【０１０４】
培養液中のキノリン酸をＨＰＬＣで分析した。その結果を下記表３に示す。表３から分かるように、クレブシエラベースのｎａｄＡ（ＫＰ）を強化すると、キノリン酸の生産がｎａｄＡを強化した場合より９％以上増加することが確認された。
【０１０５】
【表３】
0006502515.tif 000004
【０１０６】
さらに、生合成経路を強化した際のキノリン酸生産能力を評価するために、Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ及びＷ３１１０−△ｎａｄＣ△ｎａｄＡ菌株にｐＣＰＡベクターを導入し、またｎａｄＢ、ｎａｄＡが同時に強化されたｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ及びｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ（ＫＰ）ベクターをそれぞれ導入した。Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ／ｐＣＰＡ，ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ、Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ／ｐＣＰＡ，ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ（ＫＰ）、Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ△ｎａｄＡ／ｐＣＰＡ，ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ、Ｗ３１１０−△ｎａｄＣ△ｎａｄＡ／ｐＣＰＡ，ｐＰｒｏ−ｎａｄＢ−ｐＣＪ１−ｎａｄＡ（ＫＰ）菌株をそれぞれＣＶ０１−０８１８、ＣＶ０１−０８１９、ＣＶ０１−０８２０、ＣＶ０１−０８２１と命名した。
【０１０７】
導入方法は、ＣａＣｌ２方法を用いて形質転換し、３７℃の培養器でＬＢ−Ｋｍ、Ｓｐ（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，トリプトン１０ｇ／Ｌ，カナマイシン５０μｇ／Ｌ，スペクチノマイシン５０μｇ／Ｌ）平板培地に塗抹して一晩培養した。その後、カナマイシン及びスペクチノマイシン耐性を有する、得られた単一コロニーを２５ｍＬのキノリン酸力価培地に１白金耳ずつ接種し、３３℃にて２５０ｒｐｍで２４〜７２時間培養した。
【０１０８】
培養液中のキノリン酸をＨＰＬＣで分析した。その結果を下記表４に示す。これは菌株のキノリン酸を生産する生産能を示すものである。下記表４から分かるように、クレブシエラベースのｎａｄＡ（ＫＰ）を強化すると、キノリン酸の生産がｎａｄＡを強化した場合より１０％以上増加することが確認された。
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【０１１１】
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【配列表】
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