(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第一の抗原に対する第一の結合部位を含むＦａｂ断片；
ｂ）第二の抗原に対する第二の結合部位を含むｓｃＦｖ断片；および
ｃ）単量体ＣＨ２ドメイン、ここで、該ＣＨ２ドメインを通じて前記Ｆａｂ断片および前記ｓｃＦｖ断片が連結される、
を含む二重特異性抗体であって、
−第一の抗原がＣＤ９５であり、そして第二の抗原がＣＤ２０であるか；または
−第一の抗原がＣＤ２０であり、そして第二の抗原がＣＤ９５である
前記二重特異性抗体。
【請求項２】
ＣＤ２０に結合する結合部位が、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含む、請求項１記載の二重特異性抗体であって
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）を含む
前記二重特異性抗体。
【請求項３】
配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、またはその機能的活性変異体を含む、請求項１または２記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
変異体が、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、またはその機能的活性変異体を含む、ヒト化変異体である、請求項３記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
ＣＤ９５に結合する結合部位が、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含む、請求項１〜４のいずれか記載の二重特異性抗体であって
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）を含む
前記二重特異性抗体。
【請求項６】
配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいはその機能的活性変異体を含む、請求項１〜５のいずれか記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
変異体が、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいはその機能的活性変異体を含む、ヒト化変異体である、請求項６記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
配列番号２１の軽鎖配列および配列番号２３の重鎖配列、またはその機能的活性変異体を含む、請求項１〜７のいずれか記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
変異体が、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび／または配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、あるいはその機能的活性変異体を含む、ヒト化変異体である、請求項８記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
ネズミ、キメラおよび／またはヒト化配列を含む、請求項１〜９のいずれか記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
ＣＤ２０にＫｄ＜１０−８Ｍで結合し、そしてまたはＣＤ９５にＫｄ＜１０−８Ｍで結合する、請求項１〜１０のいずれか記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
医学的使用のための、請求項１〜１１のいずれか記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
Ｂ細胞障害の治療または防止のための医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれか記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか記載の二重特異性抗体および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
Ｂ細胞障害の治療または防止に使用するための、請求項１４記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１６記載の核酸配列または請求項１７記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか記載の二重特異性抗体を産生する方法であって、請求項１８記載の宿主細胞を、前記宿主細胞が二重特異性抗体を産生する条件下で培養するかまたは維持する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ２０およびＣＤ９５に結合する新規二重特異性抗体形式に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ９５／Ｆａｓ／Ａｐｏ−１は、ヒト細胞のアポトーシス死を誘導可能な細胞表面受容体である。この受容体の生理学的リガンドＣＤ９５Ｌと同様、アゴニスト性抗ＣＤ９５抗体は、例えば五量体ＩｇＭまたは自己凝集性ＩｇＧ３のように多量体形式でＣＤ９５への結合が生じた場合、アポトーシスを誘導しうる。あるいは、抗ＣＤ９５抗体は、隣接する細胞上のＦｃ受容体によって、または二次抗体によって架橋されて、アゴニスト活性を達成することも可能である。
【０００３】
多くの腫瘍細胞がＣＤ９５を発現するため、プロトタイプＣＤ９５抗体が最初に特徴付けられた後、腫瘍療法のためのアゴニスト性抗ＣＤ９５抗体の使用が熱心に追求されてきている。しかし、少なくとも、患者にアゴニスト性抗ＣＤ９５抗体または組換えＣＤ９５Ｌを適用する最も単純な型では、多くの正常細胞タイプが機能性ＣＤ９５を発現し、そしてアゴニスト性抗体によって殺される可能性があるため、このアプローチは失敗することがすぐに明らかになった。
【０００４】
ＣＤ２０は、多くのリンパ腫および自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関与するＢ細胞マーカーである。
【０００５】
Ｂ細胞に関連するＣＤ２０表面抗原に対して向けられる抗体は、正常Ｂ細胞ならびに悪性Ｂ細胞をターゲットとしうる。これらは、それぞれ、Ｂ細胞由来白血病およびリンパ腫、ならびに抗体仲介性自己免疫疾患の治療に成功裡に用いられている。リツキシマブ（商標リツキサンおよびマブテラ）は、タンパク質ＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体である。リツキシマブはＢ細胞を破壊し、そしてしたがって、過剰な数のＢ細胞、過剰反応性Ｂ細胞、または機能障害性Ｂ細胞によって特徴付けられる疾患を治療するために用いられる。これには、多くのリンパ腫、白血病、移植拒絶、およびいくつかの自己免疫障害が含まれる。
【０００６】
しかし、リツキシマブは、ＣＤ２０陽性細胞を非特異的に殺し、そしてＭＳにおいては臨床的に有効であることが示されたが、副作用（例えば進行性多巣性白質脳症、ＰＭＬ）によって損なわれる。
【０００７】
ＣＤ９５ならびにリンパ腫細胞上の異なるターゲット抗原、例えばＣＤ２０およびＣＤ４０に対する特異性を持つ二重特異性Ｆ（ａｂ’）２断片（ｂｓ−Ｆ（ａｂ’）２）は、ＣＤ９５およびそれぞれのターゲット抗原に陽性の細胞のアポトーシスを誘導することが先に示された。ＣＤ９５を発現するがターゲット抗原を発現しないリンパ腫細胞は殺されなかった（Ｊｕｎｇら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，  １８４６−１８４８（２００１））。
【０００８】
Ｈｅｒｒｍａｎｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８（４）：１２２１−７（２００８））は、腫瘍細胞における選択的ＣＤ９５仲介性アポトーシスに対する、抗体形式およびターゲット抗原の性質の影響を評価した。
【０００９】
ＵＳ２００３／０２３２０４９Ａ１は、細胞表面受容体を選択的に刺激する多重特異性試薬を記載する。細胞表面受容体、例えば細胞死受容体、例えばＣＤ９５に対する第一の結合部位、および同じ細胞のターゲット抗原、例えばＣＤ２０またはＣＤ４０に対する第二の結合部位を含む、抗原結合抗体断片からなる二重特異性抗体は、癌細胞を殺すと記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ２００３／０２３２０４９Ａ１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊｕｎｇら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，  １８４６−１８４８（２００１）
【非特許文献２】Ｈｅｒｒｍａｎｎら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８（４）：１２２１−７（２００８））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、改善された生物学的活性を持つ、ＣＤ２０およびＣＤ９５に対して向けられる二重特異性抗体形式を提供することである。
この目的は、請求するような主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明にしたがって
ａ）第一の抗原に対する第一の結合部位を含むＦａｂ断片；
ｂ）第二の抗原に対する第二の結合部位を含むｓｃＦｖ断片；
ｃ）場合によるリンカー配列（単数または複数）；および
ｄ）ＣＨ２ドメインであって、Ｆａｂ断片およびｓｃＦｖ断片が該ＣＨ２ドメインを通じて連結される、前記ＣＨ２ドメイン
を含むかまたはこれらからなる二重特異性抗体形式であって
−第一の抗原がＣＤ９５であり、そして第二の抗原がＣＤ２０であるか；または
−第一の抗原がＣＤ２０であり、そして第二の抗原がＣＤ９５である
前記二重特異性抗体形式を提供する。
【００１４】
特に、抗体形式は、図１に示すような構造を含む。これは例えば、ＮＡ−Ｃ２０またはＮｏｖｏｔａｒｇと称される。
特定の態様にしたがって、形式は、
ａ）ＶＬ／ＶＨドメイン対およびＣＬ／ＣＨ１ドメイン対からなるＦａｂ断片であって、第一の結合部位を含む、前記Ｆａｂ断片；
ｂ）互いに連結されるＶＨ／ＶＬドメインからなるｓｃＦｖ；
ｃ）場合によるリンカー配列（単数または複数）；および
ｄ）ａ）のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインをｂ）のｓｃＦｖのＶＨドメインに連結する、ＣＨ２ドメイン
を含むかまたはこれらからなる構築物であって
−第一の抗原がＣＤ９５であり、そして第二の抗原がＣＤ２０であるか；または
−第一の抗原がＣＤ２０であり、そして第二の抗原がＣＤ９５である
前記構築物である。
【００１５】
構造は、リンカー配列を含むまたは含まない特異的抗体ドメインに基づく。
本発明の抗体形式は、好ましくは、前記抗体形式を発現する異種配列を含む組換え宿主細胞によって産生される、組換え抗体形式である。
【００１６】
好ましくは、本発明の抗体形式は、モノクローナル抗体形式であり、天然アミノ酸配列を含んでもよいし、あるいはアミノ酸配列、三次構造および場合によってグリコシル化の１またはそれより多い突然変異を含み、例えばターゲットへの結合の特異性、アフィニティおよび／またはアビディティを改善するか、または形式の安定性を改善するか、または組換え分子の生産可能性を増加させてもよい。
【００１７】
特に、抗体ドメインは、哺乳動物起源、例えば齧歯類、例えばネズミ、またはヒト起源であるか、あるいはヒト以外の哺乳動物起源のキメラまたはヒト化抗体ドメイン、例えばヒト化ネズミまたはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体ドメインである。
【００１８】
特定の側面にしたがって、ＣＤ２０に結合する結合部位は、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含み
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）を含むか；
あるいは
Ｂ）以下の少なくとも１つである、その機能的活性変異体であり
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＭ（配列番号１２）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＡＰＳＮＬＡＳ（配列番号１３）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＷＳＦＮＰＰＴ（配列番号１４）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＳＹＮＭＨ（配列番号１６）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１７）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして／または
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＶＶＹＹＳＮＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号１８）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明は、特に、上記の配列Ａ  ｉ）からｖｉ）由来のＣＤ２０結合部位、例えば軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、および／または重鎖可変領域のＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列を含む任意の抗体形式であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の組み合わせ、またはＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の組み合わせのいずれかを含む単一可変ドメイン、あるいはこうした単一可変ドメインの対、例えばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＨ／ＶＬドメイン対を含む構築物を含む、前記抗体形式の使用を意図する。
【００２０】
特定の態様は、ＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む抗体形式を指す。
さらなる特定の態様は、ＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む抗体形式を指す。
【００２１】
特定の態様は、Ａ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）のＣＤＲ２配列およびＡ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＡ  ｉｖ）またはＢ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）またはＢ  ｖ）のＣＤＲ５配列およびＡ  ｖｉ）またはＢ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域の使用を指し、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の少なくとも１つがＢの機能的活性変異体を含む。
【００２２】
さらなる特定の態様は、Ａ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）のＣＤＲ５配列およびＡ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域、ならびにＡ  ｉ）またはＢ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）またはＢ  ｉｉ）のＣＤＲ２配列およびＡ  ｉｉｉ）またはＢ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の使用を指し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の少なくとも１つがＢの機能的活性変異体を含む。
【００２３】
Ｂの変異体は、場合によって、例えばアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または化学的誘導体化による１つ、２つまたは３つの点突然変異を含有する、列挙するような特定のＣＤＲ配列を含む。
【００２４】
ＣＤ２０結合剤の変異体は、ＣＤ２０、特にヒトＣＤ２０に、特に、高アフィニティで、例えばＫｄ＜１０−８Ｍで結合する場合、機能的活性変異体と見なされる。
特定の態様にしたがって、二重特異性抗体形式は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号１５のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、またはその機能的活性変異体を含む。
【００２５】
特に、変異体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号２０のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、またはその機能的活性変異体を含む、ヒト化変異体である。
【００２６】
特定の側面にしたがって、ＣＤ９５に結合する結合部位は、抗体可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ６）を含み
Ａ）
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）を含み；そして
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）を含むか；
あるいは
Ｂ）以下の少なくとも１つである、その機能的活性変異体であり
ｉ）ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＱ（配列番号２）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＶＡＳＮＶＥＳ（配列番号３）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＳＴＫＶＰＷＴ（配列番号４）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）ＣＤＲ４がアミノ酸配列ＴＮＡＭＮ（配列番号６）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
ｖ）ＣＤＲ５がアミノ酸配列ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＥＳＶＫＤ（配列番号７）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして／または
ｖｉ）ＣＤＲ６がアミノ酸配列ＤＧＹＹ（配列番号８）と少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明は、特に、上記の配列Ａ  ｉ）からｖｉ）由来のＣＤ９５結合部位、例えば軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、および／または重鎖可変領域のＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列を含む任意の抗体形式であって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の組み合わせ、またはＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の組み合わせのいずれかを含む単一可変ドメイン、あるいはこうした単一可変ドメインの対、例えばＶＨ、ＶＨＨまたはＶＨ／ＶＬドメイン対を含む構築物を含む、前記抗体形式の使用を意図する。
【００２８】
特定の態様は、ＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む抗体形式を指す。
さらなる特定の態様は、ＢのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ、およびＡのＣＤＲ配列の少なくとも１つを含む抗体形式を指す。
【００２９】
特定の態様は、Ａ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）のＣＤＲ２配列およびＡ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域、ならびにＡ  ｉｖ）またはＢ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）またはＢ  ｖ）のＣＤＲ５配列およびＡ  ｖｉ）またはＢ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域の使用を指し、ＣＤＲ４、ＣＤＲ５およびＣＤＲ６配列の少なくとも１つがＢの機能的活性変異体を含む。
【００３０】
さらなる特定の態様は、Ａ  ｉｖ）のＣＤＲ４配列、Ａ  ｖ）のＣＤＲ５配列およびＡ  ｖｉ）のＣＤＲ６配列を含む重鎖可変領域、ならびにＡ  ｉ）またはＢ  ｉ）のＣＤＲ１配列、Ａ  ｉｉ）またはＢ  ｉｉ）のＣＤＲ２配列およびＡ  ｉｉｉ）またはＢ  ｉｉｉ）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の使用を指し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の少なくとも１つがＢの機能的活性変異体を含む。
【００３１】
Ｂの変異体は、場合によって、例えばアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または化学的誘導体化による１つ、２つまたは３つの点突然変異を含有する、列挙するような特定のＣＤＲ配列を含む。
【００３２】
ＣＤ９５結合剤の変異体は、ＣＤ９５、特にヒトＣＤ９５に、特に、高アフィニティで、例えばＫｄ＜１０−８Ｍで結合する場合、機能的活性変異体と見なされる。
特定の態様にしたがって、二重特異性抗体形式は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号５のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、またはその機能的活性変異体を含む。
【００３３】
特に、変異体は、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、またはその機能的活性変異体を含む、ヒト化変異体である。
【００３４】
別の特定の態様にしたがって、二重特異性抗体形式は、配列番号２１の軽鎖配列および配列番号２３の重鎖配列、またはその機能的活性変異体を含むかまたはこれらからなる。
特に、変異体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＬドメインおよび／または配列番号２８のアミノ酸配列を含むかまたは該配列からなるＶＨドメイン、あるいはその機能的活性変異体を含む、ヒト化変異体である。
【００３５】
本発明記載の二重特異性抗体形式は、特に、ネズミ、キメラ、ヒト化および／またはヒト配列を含む。
本発明記載の二重特異性抗体形式が、ＣＤ２０にＫｄ＜１０−８Ｍで結合し、そして／またはＣＤ９５にＫｄ＜１０−８Ｍで結合することが好ましい。
【００３６】
例示的な構築物は、図１に模式的に記載する、ＣＤ２０ＸＣＤ９５特異性を持つ組換え二重特異性Ｆａｂ−一本鎖（ｂｓＦａｂＸｓｃ）である。これは例えば、ＮＡ−Ｃ２０またはＮｏｖｏｔａｒｇと称される。
【００３７】
特に、形式は、ＩｇＧクラス、特に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブクラスのいずれか、特にヒトＩｇＧ抗体由来の抗体ドメインまたは配列を含む抗体由来であってもよい。
【００３８】
特に、形式は、ヒトＩｇＧ抗体由来であってもよい。
別の特定の側面にしたがって、抗体形式は、医学的使用のため、好ましくはＢ細胞障害の治療または防止における使用のために提供される。
【００３９】
特定の側面にしたがって、本発明の抗体形式は、Ｂ細胞の望ましくないレベルまたは上方制御、例えば過剰なまたは悪性のＢ細胞、あるいは異常な、過剰なまたは望ましくない免疫反応によって引き起こされる免疫障害に関連する疾患状態を治療する、医学的使用のために提供される。例示的な疾患状態は、自己免疫疾患または癌であり、白血病またはリンパ腫が含まれる。
【００４０】
本発明にしたがって、Ｂ細胞障害の治療または防止のための方法であって、必要とする被験体に、療法的有効量の二重特異性抗体形式を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００４１】
本発明の別の側面にしたがって、Ｂ細胞を治療するための方法であって、本発明の二重特異性抗体形式を含む組成物と、前記細胞を接触させる工程を含む、前記方法を提供する。こうした治療法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。
【００４２】
特に、前記細胞によって発現される細胞死受容体ＣＤ９５および細胞表面抗原ＣＤ２０は、二重特異性抗体形式によってターゲットとされ、それによって細胞のアポトーシスおよび／または阻害を引き起こす。
【００４３】
特に、本発明の二重特異性抗体形式は、療法的有効量で必要とする被験体に投与され、好ましくは非経口使用のための配合物中で、例えば静脈内または皮下配合物中で、特に抗体形式および場合によって薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む薬学的調製物中で提供される。
【００４４】
本発明にしたがって、本発明の抗体形式および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む薬学的組成物をさらに提供する。
特に、薬学的組成物は、Ｂ細胞障害の治療または防止に使用するために提供される。
【００４５】
本発明にしたがって、Ｂ細胞障害の治療または防止のための方法であって、必要とする被験体に療法的有効量の薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【００４６】
別の側面にしたがって、試料におけるＢ細胞をターゲットとする本発明の抗体形式を含み、そして場合によって、Ｂ細胞障害を引き起こすＢ細胞の量および／または性質を決定する、診断試薬またはツール、例えば標識をさらに含む、診断試薬またはキットをさらに提供する。適切なアッセイは、免疫吸着アッセイ、例えばＥＬＩＳＡである。本発明記載の抗体を、例えば結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）および結合研究において、コンジュゲートの単純な検出を可能にする他の分子にコンジュゲート化してもよい。
【００４７】
さらに、特定の態様にしたがって、本発明記載の抗体形式を、例えば有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、コロイド性金、およびその混合物より選択される、標識またはレポーター分子にコンジュゲート化する。標識またはレポーター分子にコンジュゲート化した抗体を、例えば、アッセイ系または診断法において使用してもよい。
【００４８】
さらなる側面にしたがって、本発明の抗体形式を使用して、診断法、すなわち試料におけるＢ細胞を測定する方法を提供する。
試料は、血液、血清または尿を含む体液試料であってもよい。
【００４９】
別の側面にしたがって、本発明の抗体形式をコードする核酸配列をさらに提供する。
別の側面にしたがって、本発明の核酸配列を含むベクターをさらに提供する。
別の側面にしたがって、本発明の核酸配列または本発明のベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【００５０】
別の側面にしたがって、本発明の抗体形式を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を、前記宿主細胞が抗体形式を産生するような条件下で培養するかまたは維持する工程を含む、前記方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】単量体ＣＨ２ドメインをリンカーとして用いて、ｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含有する、組換え二重特異性Ｆａｂ−一本鎖（本明細書において、キメラバージョンに関してはｂｓＦａｂＸｓｃまたはＮＡ−Ｃ２０、そしてヒト化バージョンに関してはＮｏｖｏｔａｒｇとも称される）。  本発明の例示的な抗体形式の模式図：ＣＤ２０およびＣＤ９５の両方を発現する、正常、活性化または悪性Ｂ細胞表面上の細胞死受容体ＣＤ９５の選択的刺激のため、二重特異性ＣＤ２０  Ｘ  ＣＤ９５抗体形式を提供する。  ＣＤ２０抗体（２Ｈ７、ネズミ、キメラおよびヒト化）およびＣＤ９５抗体（ネズミ、キメラおよびヒト化）のものを含む、この抗体の配列を図２Ｅに提供する。標準的技術を用いて、該抗体をコードする遺伝子構築物をＳｐ２／０細胞に安定トランスフェクションした。ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国チャルフォント、セント・ジャイルズより購入したＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂を用いたアフィニティ・クロマトグラフィを用いて、トランスフェクション細胞の上清から、タンパク質を精製した。
【図２−１】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ａ：ＣＤ９５に対して向けられる結合部位を含む抗体形式のマウスＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号１および５）、ＣＤＲ配列を下線で示す（ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号２〜４；ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号６〜８）。  図２Ｂ：ＣＤ９５に対して向けられる結合部位を含む抗体形式のＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号９および１０）（ヒト化）、ＣＤＲ配列を下線で示す。
【図２−２】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ｃ：ＣＤ２０に対して向けられる結合部位を含む抗体形式のＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号１１および１５）（ネズミ、Ｌｉｕら  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３９，  ３５２１−３５２６（１９８７）に記載されるような抗体２Ｈ７由来、ＮＣＢＩ寄託Ｍ１７９５３およびＭ１７９５４）、ＣＤＲ配列を下線で示す（ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号１２〜１４；ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３：配列番号１６〜１８）。  図２Ｄ：ＣＤ２０に対して向けられる結合部位を含む抗体形式のＶＬおよびＶＨ配列（それぞれ、配列番号１９および２０）（ヒト化、抗体２Ｈ７由来）、ＣＤＲ配列を下線で示す。
【図２−３】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ｅ：例示的二重特異性抗体形式ＣＤ９５ｘＣＤ２０、キメラおよびヒト化バージョン：  配列番号２１：キメラバージョン、軽鎖のアミノ酸配列；  配列番号２２：キメラバージョン、軽鎖のヌクレオチド配列；  配列番号２３：キメラバージョン、重鎖のアミノ酸配列；  配列番号２４：リンカー配列；  配列番号２５：キメラバージョン、重鎖のヌクレオチド配列；  配列番号２６：ヒト化バージョン、軽鎖のアミノ酸配列；  配列番号２７：ヒト化バージョン、軽鎖のヌクレオチド配列；  配列番号２８：ヒト化バージョン、重鎖のアミノ酸配列；  配列番号２９：ヒト化バージョン、重鎖のヌクレオチド配列。
【図２−４】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ｅ続き。
【図２−５】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ｅ続き。
【図２−６】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ｅ続き。
【図２−７】実施例に言及する例示的な抗体形式の配列。  図２Ｅ続き。
【図３】ＣＤ２０およびＣＤ９５に対するＮＡ−Ｃ２０の結合特異性：  表示された濃度の精製ＮＡ−Ｃ２０（キメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体）とインキュベーションした後のＣＤ９５−／ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞（●）およびＣＤ９５＋／ＣＤ２０−  ＬＮ−１８（○）細胞のフローサイトメトリー分析。これを、クローン５Ｂ１２（ＮＡ−Ｃ２０を発現）由来の未希釈上清中の抗体の結合に比較した。検出抗体：ヤギαヒトＦｃγ−ＰＥ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９−１１６−０９８。
【図４】ＣＤ２０およびＣＤ９５に対するＮｏｖｏｔａｒｇの結合特異性：  表示された濃度の精製Ｎｏｖｏｔａｒｇ（ヒト化ＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体）とインキュベーションした後のＣＤ９５−／ＣＤ２０＋Ｄａｕｄｉ細胞（●）およびＣＤ９５＋／ＣＤ２０−  ＬＮ−１８細胞（○）のフローサイトメトリー分析。これを、クローン２５−ＣＨＯ−Ｓ／ＢＶ００４／Ｋ４４（Ｎｏｖｏｔａｒｇを発現）由来の上清の表示された希釈中の抗体の結合に比較した。検出抗体：ヤギαヒトＦｃγ−ＰＥ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０９−１１６−０９８。
【図５】キメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期：  Ｃ５７ＢＬ６（雄、６週齢）に、５０μｇのＮＡ−Ｃ２０を注射し、そして０．５時間、１．０時間、２．０時間および４．０時間で血液試料を採取した。血清を、ＳＫＷ  ６．４細胞とインキュベーションし、これを次いで、フローサイトメトリーで結合抗体に関して分析した（検出抗体：ＰＥ−ヤギ抗ヒトＦｃγ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【図６】ＮＡ−Ｃ２０およびＮｏｖｏｔａｒｇがＣＤ９５＋／ＣＤ２０＋細胞においてＣＤ９５を活性化する能力：  表示された濃度のＮＡ−Ｃ２０（●）またはＮｏｖｏｔａｒｇ（○）とのインキュベーション後のＣＤ９５＋／ＣＤ２０＋  ＳＷＫ  ６．４細胞を用いたチミジン取り込みアッセイ。未処理細胞が陰性対照（細胞のみのカラム）として働き、Ａｐｏ−１に対するマウスｍＡｂ（ヤギ抗マウスＡｂによって架橋）とインキュベーションした細胞が陽性対照として働いた（ＧａＭ＋Ａｐｏのカラム）。
【図７】ＳＣＩＤマウスモデルにおけるＮＡ−Ｃ２０の試験：  ８匹のＳＣＩＤマウスに、致死用量のＣＤ２０＋／ＣＤ９５＋  Ｂリンパ芽球様細胞株ＳＫＷ  ６．４を第０日に注射した。以下のように、マウスに、２０μｇのＮＡ−Ｃ２０（○）、ＮＡ−ＣＭｅＩ（▼）または１００μｌ  ＰＢＳ（●）のいずれかを、腫瘍細胞接種の１日、２日および３日後に反復して注射するか、あるいはそれぞれ、６０μｇのＣＤ２０に対するキメラ抗体（■ 、▽）およびＥＧＦＲに対する抗体（上皮増殖因子受容体、□）を腫瘍細胞接種の１日後に１回、注射してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
用語「抗体形式」は、本明細書において、リンカー配列を含みまたは含まず、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の定常および／または可変ドメインとして理解される、抗体ドメインからなるかまたはこうしたドメインを含む、ポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。本発明の抗体形式は、特に、ＶＬ／ＶＨドメイン対および定常抗体ドメイン、例えばＣＬ／ＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片の結合部位を含む特異的構造であり、そしてさらに、ｓｃＦｖの結合部位を含み、これはＣＨ２ドメインによってｓｃＦｖに連結される。
【００５３】
抗体をパパインによって消化すると、３つの断片：２つのＦａｂ断片および１つのＦｃ断片が生じる。用語「Ｆａｂ」は、本明細書において、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）を含むと理解され、これはヒンジ領域を含んでもまたは含まなくてもよい。Ｆａｂ断片は、なお抗原に結合するが、Ｆｃ部分を含まず一価である、抗体構造である。
【００５４】
抗体ドメインは、天然構造であってもよいし、あるいは突然変異誘発または誘導体化によって修飾されて、例えば抗原結合特性または任意の他の特性、例えば安定性または機能特性、例えばＦｃ受容体ＦｃＲｎおよび／またはＦｃガンマ受容体への結合が修飾されていてもよい。ポリペプチド配列は、ループ配列によって連結された抗体ドメイン構造の少なくとも２つのベータ鎖からなるベータ−バレル構造を含む場合、抗体ドメインであると見なされる。
【００５５】
用語「抗体形式」は、特に二重特異性結合特性、すなわちターゲット抗原ＣＤ２０およびＣＤ９５に対する特性を示す、ポリペプチドまたはタンパク質を指すものとする。
例示的な抗体形式は、図１に示すような特異的構造を有する。これは、Ｆａｂ断片、ＣＨ２ドメインおよび一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、特にＶＨ／ＶＬ配向のｓｃＦｖで構成されてもよい。抗体分子は、ＣＨドメインがＮ末端を通じてＦａｂ断片の重鎖ＣＨ１およびＶＨドメインにカップリングし、そしてＣ末端を通じてｓｃＦｖ断片にカップリングする主鎖を有してもよい。
【００５６】
これはまた、ＣＨ２ドメインがＦａｂ断片の軽鎖に連結している、すなわち主鎖がＶＬおよびＣＬドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインならびに一本鎖Ｆｖ断片を含む、主鎖を含んでもよい。
【００５７】
さらなる例は、主鎖がＶＬおよびＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインならびにｓｃＦｖ断片を含む、抗体形式を指す。より重量が軽い第二の鎖には、ＶＨおよびＣＬドメインが含まれる。こうした抗体形式において、Ｆａｂ断片は、したがって、軽鎖および重鎖の可変ドメインがそれぞれの定常ドメイン（それぞれ、ＣＬまたはＣＨ１）に融合している「古典的な（天然存在）」Ｆａｂ断片ではなく、可変ドメインが、「反対の」鎖の定常ドメインに融合している、すなわちＶＨドメインがＣＬドメインに融合し、そしてＶＬドメインがＣＨ１ドメインに融合している「ハイブリッド」Ｆａｂ断片である。
【００５８】
さらなる例にしたがって、抗体形式は、ＣＨ２ドメインがＣＬおよびＶＨドメインに連結されている、主鎖を含む分子を含む。より軽い分子量の第二の鎖には、ＶＬおよびＣＨ１ドメインが含まれる。
【００５９】
さらに、さらなる例にしたがって、抗体形式は、ヒンジおよびＣＨ２ドメインに修飾を含み、例えば単量体ＣＨ２ドメイン、例えばＣＨ２ドメインおよび／またはヒンジ領域中のアミノ酸が修飾されている、例えば鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基（ヒトＩｇＧ抗体中のＣ２２６および／またはＣ２２９、本明細書に提供するようなアミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付け（ＥＵインデックス）と一致する）が二量体形成を妨げるように交換されている、ＣＨ２ドメインを得るように修飾を含む、分子を含む。例示的な点突然変異は、Ｃ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓである。１つの態様において、第一の主鎖のヒンジドメインおよび第二の主鎖のヒンジドメインの間のジスルフィド結合は、Ｋａｂａｔの番号付け（ＥＵインデックス）にしたがって、ヒンジドメインの１つの配列位２２６のシステイン残基および配列位２２９のシステイン残基の少なくとも１つによって定義される。
【００６０】
例示的な抗体形式は、配列番号２６（軽鎖）および配列番号２８（重鎖）のアミノ酸配列を含む。
さらなる例は、ありうるＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の減少を得る修飾を指し、例えば、ＩｇＧ１をＩｇＧ２サブタイプにスイッチすることによるか、例えばＥ２２３Ｐおよび／またはＬ２３４Ｖおよび／またはＬ２３５Ａおよび／またはＧ２３６欠失による。
【００６１】
さらなる例は、全身活性を減少させる修飾を指し、例えばＦｃ受容体に対する結合を減少させることにより、例えばＤ２６５Ｇおよび／またはＡ３２７Ｑおよび／またはＡ３３０Ａがある。
【００６２】
さらなる例は、例えばレクチン受容体への結合障害を提供するグリコシル化部位欠損、例えばＮ２９７Ｑによって、免疫原性を減少させる修飾を指す。
用語「抗体形式」には、特に、本明細書において、異なるターゲット抗原に対して向けられるかまたは抗体ドメインの異なる構造配置を含む他の抗体形式を実質的に含まないと理解される単離型の抗体形式が含まれるものとする。それでもなお、本発明にしたがって用いられるような単離抗体形式は、組み合わせ調製物中に含まれてもよく、単離抗体形式と、例えば少なくとも１つの他の抗体形式、例えば異なる特異性を有するモノクローナル抗体または抗体断片を含有することも可能である。
【００６３】
本明細書において、抗体形式は、組換え二重特異性抗体形式であってもよく、該用語には、組換え手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離されるすべての抗体形式、例えば動物、例えばヒトを含む哺乳動物に由来し、異なる起源由来の遺伝子または配列を含む抗体、例えばキメラ、ヒト化抗体、またはハイブリドーマ由来抗体が含まれる。さらなる例は、抗体形式を発現するよう形質転換された宿主から単離された抗体形式、あるいは抗体または抗体ドメインの組換えコンビナトリアルライブラリーから単離された抗体形式、あるいは抗体遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製されるか、発現されるか、生成されるかまたは単離される抗体形式を指す。
【００６４】
用語「抗体形式」には、その誘導体が含まれると理解される。誘導体は、本発明の１またはそれより多い抗体ドメインまたは抗体形式の任意の組み合わせ、およびまたは本発明の抗体形式の任意のドメインが、１またはそれより多い他のタンパク質、例えば他の抗体または抗体形式、例えばＣＤＲループを含む結合構造、受容体ポリペプチドであってもよいが、リガンド、足場タンパク質、酵素、毒素等であってもよいタンパク質の任意の位に融合していてもよい融合タンパク質である。本発明のモジュラー抗体の誘導体はまた、多様な化学的技術、例えば共有カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等によって、他の物質に会合または結合することによっても得られうる。免疫グロブリンに結合する他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機および無機分子またはその任意の組み合わせ（例えばＰＥＧ、プロドラッグまたは薬剤）であってもよい。本発明の特定の態様において、本発明の抗体形式は、生物学的に許容されうる化合物との特異的相互作用を可能にするさらなるタグを含む誘導体である。本発明において使用可能なタグに関しては、抗体形式のそのターゲットへの結合にまったく影響がないか、または許容されうる負の影響しかない限り、特定の制限はない。適切なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、カルモジュリン−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＭＢＰ−タグ、およびＳ−タグが含まれる。
【００６５】
用語、誘導体にはまた、抗体形式の断片、変異体、類似体または相同体、あるいは特定のグリコシル化パターンを含む抗体形式、例えば機能的であり、そして機能的同等物として働くことが可能であり、例えば特定のターゲットに結合し、そして機能的特性、例えばＢ細胞をターゲティングする活性、例えばアポトーシス活性を持つ、糖鎖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって産生される抗体形式も含まれる。さらに好ましい誘導体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくはアポトーシス活性を持つ。
【００６６】
用語「糖鎖操作」は、抗体配列に関して、糖鎖操作の結果、修飾免疫原性特性、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを有するグリコシル化変異体を指すものとする。すべての抗体は、重鎖定常領域中の保存された位で、炭水化物構造を含有し、各アイソタイプは、Ｎ連結炭水化物構造の別個のアレイを所持し、該構造は、タンパク質集合、分泌または機能活性に多様に影響を及ぼす。ＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で保存されるＮ連結グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に包埋され、ポリペプチド主鎖と広範な接触を形成し、そしてその存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を仲介するために必須である（Ｌｉｆｅｌｙ，  Ｍ．  Ｒ．ら，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：８１３−８２２（１９９５））。例えばＮ２９７を例えばＡに突然変異させることによってＮ２９７のＮ−グリカンを、またはＴ２９９を除去すると、ＡＤＣＣが減少した不グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体形式が生じる。
【００６７】
抗体グリコシル化の主な相違は、細胞株間で起こり、そして異なる培養条件下で増殖させた所定の細胞株に関して、さらに重要でない相違が見られる。細菌細胞における発現は、典型的には、不グリコシル化抗体を提供する。
【００６８】
本発明記載の抗体形式は、特に活性Ｆｃ部分を欠いており、したがって、ＦＣＧＲ結合部位を持たない抗体ドメインで構成され、特にＣＨ２およびＣＨ３ドメインの鎖を欠く任意の抗体形式を含むか、あるいは例えばＦｃエフェクター機能を減少させる、特にＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を無効にするかまたは減少させる修飾によってＦｃエフェクター機能を欠く抗体ドメインを含む。こうした修飾は、突然変異誘発、例えばＦＣＧＲ結合部位の突然変異によって、あるいは抗体形式のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性に干渉する誘導体または剤によって達成されて、Ｆｃエフェクター機能の減少またはＦｃエフェクター機能の欠如を達成することも可能であり、これは、典型的には、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性によって測定した際、非修飾（野生型）形式の１０％未満、好ましくは５％未満のＦｃエフェクター機能を指すと理解される。
【００６９】
用語「Ｂ細胞障害」は、本明細書において、多様な障害を指し、これらには、限定されるわけではないが、Ｂ細胞悪性腫瘍、自己免疫障害、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、および他の障害が含まれる。自己免疫障害の特定の例は、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、移植片対宿主病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、セリアック病、クローン病、悪性貧血、尋常性天疱瘡、白斑、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞動脈炎、重症筋無力症、多発性硬化症（ＭＳ）、好ましくは再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、水疱性類天疱瘡、潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、抗リン脂質症候群、ナルコレプシー、サルコイドーシス、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される。
【００７０】
本発明記載の抗体形式は、Ｂ細胞の自己反応性を減少させるため、Ｂ細胞レパートリーの調節を可能にする。調節は、単一特異性抗体によって達成されるよりもより特異的であり、これはＣＤ９５を発現する活性化されたＢ細胞のみが影響を受け、そしてＣＤ９５を欠く休止細胞は影響を受けないためである。本発明記載の抗体形式が活性化Ｂ細胞のアポトーシスを誘導し、そしてさらに、活性化誘導性ＩｇＧ産生を抑制し、そして活性化Ｂ細胞のＩｇＧ合成を阻害することも示されることが可能であった。したがって、自己免疫ターゲット、例えば自己抗原に対して向けられるＩｇＧ抗体を産生する自己反応性Ｂ細胞産生は、有効に減少させうる。
【００７１】
本発明の二重特異性抗体形式によって、悪性Ｂ細胞のみでなく、ＣＤ９５細胞死受容体を発現する活性化正常（良性）Ｂ細胞もまたターゲティングされ、そして枯渇されうる。対照的に、休止Ｂ細胞はターゲティングされず、こうした正常Ｂ細胞では影響はまったく見られない。これは、活性化Ｂ細胞が、本発明の抗体形式とのインキュベーション後、アポトーシス性細胞死を経るようにＣＤ９５感受性であることを示す。
【００７２】
活性化Ｂ細胞の枯渇は、抗体産生を抑制する。これは、最終分化した抗体産生細胞、すなわち形質細胞が、ＣＤ２０を発現しないため、驚くべきことであった。活性化前駆体Ｂ細胞の抑制は抗体産生を抑制するために、明らかに十分である。
【００７３】
本発明の二重特異性抗体形式による抗体産生の抑制は、自己反応性または活性化Ｂ細胞を正常または休止Ｂ細胞から区別することなく、すべてのＣＤ２０発現Ｂ細胞を枯渇させるリツキシマブ（リツキサン（登録商標））のような確立された単一特異性ＣＤ２０抗体の使用よりも好ましい。
【００７４】
用語「結合部位」は、本明細書において、本発明記載の抗体または抗体形式に関して、抗原と結合相互作用が可能な分子構造を指す。典型的には、結合部位は、本明細書において、「ＣＤＲ結合部位」とも称される、多様な抗原に対する結合機能を与える多様な構造を含む特定の領域である、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する。多様な構造は、抗体の天然レパートリー、例えばネズミまたはヒトレパートリーに由来してもよいし、あるいは組換え的または合成的に、例えば突然変異誘発によって、そして特にランダム化技術によって産生されてもよい。これらには、突然変異誘発ＣＤＲ領域、可変抗体ドメインのループ領域、特に抗体のＣＤＲループ、例えばＶＬおよび／またはＶＨ抗体ドメインのいずれかのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ループが含まれる。本発明にしたがって用いられるような抗体形式は、典型的には、抗原に各々特異的な、１またはそれより多いＣＤＲ結合部位を含む。
【００７５】
用語「特異的」または「二重特異性」は、本明細書において、分子の異種集団において、関心対象の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンドの決定要因である結合反応を指すものとする。したがって、指定された条件下、例えばイムノアッセイ条件下で、特定のターゲットに特異的に結合する抗体形式は、試料中に存在する他の分子に、有意な量では結合しない。
【００７６】
特異的結合部位は、典型的には、他のターゲットと交差反応しない。それでもなお、特異的結合部位は、ターゲットの１またはそれより多いエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合可能であるし、あるいは他の関連するターゲット抗原、例えば相同体または類似体に交差反応性であることも可能である。
【００７７】
特異的結合は、結合が、ターゲット同一性に関して、選択されるように、高い、中程度または低い結合アフィニティまたはアビディティで選択的であることを意味する。選択的結合は、通常、結合定数または結合動力学が、少なくとも１０倍異なる、好ましくは相違が少なくとも１００倍である、そしてより好ましくは少なくとも１０００倍である場合、達成される。
【００７８】
本発明の二重特異性抗体形式は、特に、特異的結合特性を持つ２つの部位を含み、ここで２つの異なるターゲット抗原が抗体形式によって認識される。したがって、例示的な二重特異性抗体形式は、２つの結合部位を含むことも可能であり、結合部位の各々は、異なる抗原、例えば細胞死受容体およびＢ細胞の細胞表面抗原に特異的に結合可能である。
【００７９】
用語「一価」は、本明細書において、抗体または抗体形式の結合部位に関して、ターゲット抗原に対して向けられる唯一の結合部位を含む分子を指すものとする。用語「結合価」は、したがって、抗原の同じまたは異なるいずれかのエピトープに特異的に結合する、同じターゲット抗原に対して向けられる結合部位の数と理解される。
【００８０】
本発明の抗体形式は、細胞死受容体ターゲットに特異的に結合する一価結合部位、およびＢ細胞、特に自己反応性Ｂ細胞上に発現される細胞表面抗原に特異的に結合する別の一価結合部位を含むと理解される。
【００８１】
用語「抗原」は、本明細書において、用語「ターゲット」または「ターゲット抗原」と交換可能に用いられ、抗体結合部位によって認識される全ターゲット分子またはこうした分子の断片を指すものとする。特に、一般的に「エピトープ」と称される、抗原の下位構造、例えばポリペプチドまたは炭水化物構造、例えば免疫学的に適切であるＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープは、こうした結合部位によって認識されうる。用語「エピトープ」は、本明細書において、特に、本発明の抗体形式の結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に構成してもよいし、または特異的結合パートナーの一部であってもよい、分子構造を指すものとする。エピトープは、炭水化物、ペプチド性構造、脂肪酸、有機、生化学的または無機物質またはその誘導体およびその任意の組み合わせのいずれで構成されてもよい。エピトープがペプチド性構造、例えばペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質で構成される場合、これには通常、少なくとも３アミノ酸、好ましくは５〜４０アミノ酸、そしてより好ましくは約１０〜２０アミノ酸が含まれるであろう。エピトープは直鎖エピトープまたはコンホメーションエピトープのいずれであってもよい。直鎖エピトープは、ポリペプチドまたは炭水化物鎖の一次配列の単一セグメントで構成される。直鎖エピトープは、連続または重複していてもよい。コンホメーションエピトープは、ポリペプチドをフォールディングして三次構造を形成することによって寄せ集められたアミノ酸または炭水化物で構成され、そしてアミノ酸は直鎖配列中で必ずしも互いに隣接していなくてもよい。
【００８２】
用語「細胞表面抗原」は、Ｂ細胞に関して、本明細書において、結合するアンタゴニストでターゲティング可能である、Ｂ細胞、好ましくは成熟、活性化または自己反応性Ｂ細胞表面上に発現される抗原を指すものとする。ＣＤ２０は、本発明の抗体形式によってターゲティングされる例示的なＢ細胞表面マーカーと見なされる。
【００８３】
ＣＤ２０に特異的に結合する結合部位は、該抗原に対して向けられる商業的に入手可能なモノクローナル抗体、例えばＣＤ２０に対して向けられるリツキシマブまたはオクレリズマブに由来してもよい。特に、図２に例示されるような抗ＣＤ２０抗体形式のいずれか由来の結合部位を使用してもよい。
【００８４】
用語「ＣＤ２０」には、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ２０遺伝子でトランスフェクションされた細胞上に発現されるヒトＣＤ２０の任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。
【００８５】
用語「細胞死受容体」は、本明細書において、用語「ＣＤ９５」と交換可能に用いられ、１またはそれより多いアポトーシス経路によってプログラム細胞死を導く細胞表面上の受容体由来の抗原を指すものとする。活性化Ｂ細胞とは対照的に、ＣＤ９５は正常休止Ｂ細胞上には発現されないことがわかった。
【００８６】
ＣＤ９５はまた、ＦａｓまたはＡｐｏ−１および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーとしても知られる。ＣＤ９５に特異的に結合する結合部位は、ＣＤ９５に対して向けられる抗体、例えばＡｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ドイツ・ヘルフォルトによって流通されるクローンＡＰＯ−１またはＬＴ９５およびＤＸ２に由来してもよい。特に、図２に例示するような抗ＣＤ９５抗体形式のいずれかに由来する結合部位を用いてもよい。
【００８７】
用語「ＣＤ９５」には、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＤ９５遺伝子でトランスフェクションされた細胞上に発現されるヒトＣＤ９５の任意の変異体、アイソフォームおよび種相同体が含まれる。
【００８８】
用語「変異体」は、例えば部位特異的突然変異誘発法によって得られ、特に特定の抗体領域で欠失させ、交換し、該領域内に挿入するか、またはアミノ酸配列を化学的に誘導体化して、定常ドメインにおいて、抗体エフェクター機能または半減期を操作するか、あるいは可変ドメインにおいて、例えばアフィニティ成熟技術によって抗原結合特性を改善した、突然変異体を指すものとする。例えばランダム化技術によって得られる、望ましい位での点突然変異を含む、任意の既知の突然変異誘発法を使用してもよい。いくつかの場合、抗体配列をランダム化するために、例えば任意のありうるアミノ酸、または好ましいアミノ酸の選択のいずれかを有するように、位をランダムに選択する。用語「変異体」は、特に機能的活性変異体を含むものとする。
【００８９】
用語、分子、例えば抗体の「機能的活性変異体」は、本明細書において、配列内あるいは配列の遠位端のいずれかまたは両方の、１またはそれより多いアミノ酸の挿入、欠失または置換、あるいは１またはそれより多いアミノ酸残基またはヌクレオチドの化学的誘導体化によって、この配列（親配列）の修飾から生じ、そして修飾がこの配列の活性に影響を及ぼさない（特に該活性を損なわない）配列を意味する。選択されるターゲット抗原に特異性を有する結合部位の場合、分子の機能的活性変異体はなお、あらかじめ決定された結合特異性を有するであろうが、これは、変化することも可能であり、例えば特定のエピトープに対する細かい特異性、アフィニティ、アビディティ、ＫｏｎまたはＫｏｆｆ速度等を変化させることも可能である。
【００９０】
機能的活性変異体は、親抗体形式の配列、例えば図２の配列のいずれか、例えば図２Ｅ  ｉ）またはｉｉ）のＮＡ−Ｃ２０またはＮｏｖｏｔａｒｇ配列のいずれかを変化させることによって得ることも可能であり、そしてＣＤ２０および／またはＣＤ９５に結合する能力、あるいは活性化または自己反応性Ｂ細胞をターゲティングする能力を含めて、それぞれの配列によって示されるものと類似の生物学的活性を有することによって特徴付けられる。
【００９１】
抗体形式の機能的活性変異体は、好ましくは、活性化または自己反応性Ｂ細胞をターゲティングする特異的結合アッセイまたは機能性試験によって決定されるような、実質的に同じ生物学的活性を有する。用語「実質的に同じ生物学的活性」は、本明細書において、親抗体形式、例えば図２Ｅの組換え二重特異性抗体形式ＮＡ−Ｃ２０またはＮｏｖｏｔａｒｇに関して決定される活性の、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％、または少なくとも１１０％、または少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％、または少なくとも１６０％、または少なくとも１７０％、または少なくとも１８０％、または少なくとも１９０％、例えば最大２００％である、実質的に同じ活性であることによって示されるような活性を指す。
【００９２】
好ましい態様において、機能的活性変異体は
ａ）分子の生物学的活性断片であり、該断片は、該分子の配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％を含み；
ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換、付加および／または欠失によって該分子から得られ、ここで機能的活性変異体は、該分子またはその部分に配列同一性を有し、例えば少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％そして最も好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性の抗体であり；そして／または
ｃ）該分子またはその機能的活性変異体、およびさらに該ポリペプチドまたは該ヌクレオチド配列に異種性の少なくとも１つのアミノ酸またはヌクレオチドからなり、好ましくはここで、機能的活性変異体は、天然存在または組換え抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０および／または抗ＣＤ９５抗体のいずれかに由来する。
【００９３】
本発明の１つの好ましい態様において、本発明記載の抗体の機能的活性変異体は、本質的に、上記変異体と同一であるが、異なる種の相同配列に由来する点で、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列がそれぞれ異なる。これらは天然存在変異体と称される。
【００９４】
本発明は特に、キメラ、ヒト化またはヒト配列、およびこうしたキメラ、ヒト化またはヒト配列を含む親抗体形式の機能的活性変異体を提供する。
用語「キメラ」は、本発明の抗体形式に関して用いた際、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列各々の１つの部分が特定の種由来のまたは特定のクラスに属する抗体中の対応する配列に相同である一方、鎖の残りのセグメントが別の種またはクラス中の対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖両方の可変領域が、哺乳動物の１種由来の抗体の可変領域を模倣する一方、定常部分が別の種に由来する抗体の配列に相同である。例えば、可変領域は、例えばヒト細胞調製物から得られる定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なＢ細胞またはハイブリドーマを用いて、現在知られる供給源から得られることも可能である。
【００９５】
用語「ヒト化」は、本発明の抗体形式に関して用いた際、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、該分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメインを含むか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むかいずれであってもよい。抗原結合部位は、野生型であっても、あるいは、例えば１またはそれより多いアミノ酸置換によって修飾されていてもよく、好ましくはヒト免疫グロブリンにより緊密に似るように修飾される。ヒト化抗体のいくつかの型は、すべてのＣＤＲ配列を保持する（例えばマウス抗体由来の６つのＣＤＲすべてを含有するヒト化マウス抗体）。他の型は、元来の抗体に関して改変された１またはそれより多いＣＤＲを有する。
【００９６】
用語「ヒト」は、本発明の抗体形式に関して用いた際、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含むように理解される。本発明のヒト抗体形式には、例えばＣＤＲ中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダムまたは部位特異的突然変異誘発によって、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入される突然変異）が含まれてもよい。本発明のヒト抗体形式には、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいは１またはそれより多いヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである動物から単離された抗体が含まれる。
【００９７】
用語「機能的活性変異体」にはまた、天然存在アレル変異体、ならびに突然変異体または任意の他の非天然存在変異体も含まれる。当該技術分野に知られるように、アレル変異体は、本質的にはポリペプチドの生物学的機能を改変しない、１またはそれより多いアミノ酸の置換、欠失、または付加を有すると特徴付けられる、（ポリ）ペプチドの代替型である。
【００９８】
機能的活性変異体は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列中の、例えば１またはそれより多い点突然変異による配列改変によって得られることも可能であり、ここで配列改変は、本発明と組み合わせて用いた際、改変されないポリペプチドまたはヌクレオチド配列の機能を保持する。こうした配列改変には、限定されるわけではないが、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入が含まれてもよい。
【００９９】
ＣＤＲ変異体には、少なくとも１つのアミノ酸によって修飾されるアミノ酸配列が含まれ、ここで前記修飾は、アミノ酸配列の化学的または部分的改変であってもよく、こうした修飾は、変異体が非修飾配列の生物学的特性を保持することを可能にする。例えば、変異体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０またはＣＤ９５に結合する機能的変異体である。ＣＤＲアミノ酸配列の部分的改変は、１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の欠失または置換によるか、あるいは１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の付加または挿入によるか、あるいは１から数個のアミノ酸、例えば１、２、３、４または５アミノ酸の化学的誘導体化によるか、あるいはその組み合わせであってもよい。アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよく、例えば１つの疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に対して置換してもよい。
【０１００】
保存的置換は、側鎖および化学的特性が関連するアミノ酸ファミリー内で行われるものである。こうしたファミリーの例は、塩基性側鎖を持つアミノ酸、酸性側鎖を持つアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を持つアミノ酸、非極性芳香族側鎖を持つアミノ酸、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸、小側鎖を持つアミノ酸、大側鎖を持つアミノ酸等である。
【０１０１】
点突然変異は、特に、異なるアミノ酸に対するアミノ酸の１またはそれより多い単一（非連続）または２つ組の置換または交換、欠失または挿入において、非操作アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現を生じるポリヌクレオチドの操作と理解される。
【０１０２】
好ましい点突然変異は、同じ極性および／または電荷のアミノ酸の交換を指す。これに関して、アミノ酸は、６４の３つ組コドンによってコードされる２０の天然存在アミノ酸を指す。これらの２０のアミノ酸は、中性荷電、正荷電、および負荷電を有するものに分けられうる：
「中性」アミノ酸を、それぞれの３文字および１文字コードおよび極性とともに、以下に示す：
アラニン：（Ａｌａ、Ａ）非極性、中性；
アスパラギン：（Ａｓｎ、Ｎ）極性、中性；
システイン：（Ｃｙｓ、Ｃ）非極性、中性；
グルタミン：（Ｇｌｎ、Ｑ）極性、中性；
グリシン：（Ｇｌｙ、Ｇ）非極性、中性；
イソロイシン：（Ｉｌｅ、Ｉ）非極性、中性；
ロイシン：（Ｌｅｕ、Ｌ）非極性、中性；
メチオニン：（Ｍｅｔ、Ｍ）非極性、中性；
フェニルアラニン：（Ｐｈｅ、Ｆ）非極性、中性；
プロリン：（Ｐｒｏ、Ｐ）非極性、中性；
セリン：（Ｓｅｒ、Ｓ）極性、中性；
スレオニン：（Ｔｈｒ、Ｔ）極性、中性；
トリプトファン：（Ｔｒｐ、Ｗ）非極性、中性；
チロシン：（Ｔｙｒ、Ｙ）極性、中性；
バリン：（Ｖａｌ、Ｖ）非極性、中性；および
ヒスチジン：（Ｈｉｓ、Ｈ）極性、正（１０％）、中性（９０％）。
【０１０３】
「正」荷電アミノ酸は：
アルギニン：（Ａｒｇ、Ｒ）極性、正；および
リジン：（Ｌｙｓ、Ｋ）極性、正
である。
【０１０４】
「負」荷電アミノ酸は：
アスパラギン酸：（Ａｓｐ、Ｄ）極性、負；および
グルタミン酸：（Ｇｌｕ、Ｅ）極性、負
である。
【０１０５】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書に同定するポリペプチド配列に関して、配列を整列させ、そして必要であればギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。当業者は、比較中の配列の全長にわたって最大整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列を測定するための適切なパラメータを決定可能である。
【０１０６】
用語「被験体」は、本明細書において、温血哺乳動物、特にヒトを指すものとする。特に、本発明の医学的使用形式またはそれぞれの治療法は、Ｂ細胞障害またはＢ細胞障害に関連する疾患状態の予防または治療が必要な被験体に適用される。被験体は、初期または後期疾患を患う患者であってもよいし、あるいはそうでなければ、例えば遺伝的素因によって、こうした疾患の素因を有する被験体であってもよい。
【０１０７】
特定の態様にしたがって、本発明の抗体形式は、免疫エフェクター細胞、例えばＮＫ細胞に依存せずに、ターゲットＢ細胞に対して、アポトーシス活性、すなわち直接細胞傷害活性を有する。特に、本発明の抗体形式は、標準的アポトーシスアッセイにおいて測定されるような、例えば標準的ＤＮＡ断片化アッセイにおいて測定されるような、アポトーシス活性を有する。
【０１０８】
アポトーシス活性は、好ましくは、死につつあるおよび／または死んだ細胞を決定する標準法を用いて測定される。アポトーシスを測定するため、細胞傷害性アッセイを使用してもよい。死につつある細胞は、漏出性になるため、これらのアッセイは、形質膜浸透性の増加を測定する放射性および非放射性アッセイであってもよく、あるいはミトコンドリアの代謝活性の減少を測定する比色アッセイであってもよい。死んだ細胞中のミトコンドリアは色素を代謝することが不可能であり、一方、生存細胞中のミトコンドリアは代謝可能である。
【０１０９】
また、細胞表面外部上のホスファチジルセリン出現を生じる膜非対称の改変などの、アポトーシスに関する初期指標を測定してもよい（アネキシンＶに基づくアッセイ）。あるいは、アポトーシスのより後期の段階、例えばカスパーゼの活性化を、細胞集団において、または個々の細胞において、測定してもよい。さらに、ミトコンドリアからのチトクロームＣおよびＡＩＦの細胞質への放出、または染色体ＤＮＡの断片化の測定を決定してもよい。
【０１１０】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）は、アポトーシスシグナル伝達カスケードから生じるＤＮＡ断片化を検出するための一般的な方法である。該アッセイは、ＤＮＡ中のニックの存在に頼り、該ニックは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって同定可能であり、該酵素はブロモ化（ｂｒｏｍｏｌａｔｅｄ）ｄＵＴＰの付加を触媒し、これは二次的に、特異的標識抗体で検出される。
【０１１１】
本発明記載の抗体形式の好ましいアポトーシス活性は、それぞれ、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞殺傷アッセイで測定した際；例えば二重特異性抗体とのインキュベーション後、フローサイトメトリーによってＢ細胞生存を測定して、細胞溶解の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％に達する。
【０１１２】
特に、本発明の抗体形式は、Ｆｃエフェクター機能を欠き、そして例えば細胞表面上に受容体ターゲットを発現する細胞を使用して、標準的ＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイにおいて測定した際に、免疫エフェクター細胞の存在下で、有意な細胞傷害活性を持たない。
【０１１３】
ＡＤＣＣまたはＣＤＣアッセイのいずれかによって決定した際の低い細胞傷害活性は、対照に比較した際、細胞溶解の割合の有意な増加がなければ、本発明の任意の抗体形式に関して示されうる。Ｆｃエフェクター機能の欠如は、典型的には、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性の絶対割合増加によって測定した際、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満の場合、決定される。
【０１１４】
好ましくは、高アフィニティで、特に高いオンおよび／または低いオフ速度で、あるいは高い結合アビディティで、ターゲット抗原の一方または両方に結合する抗体形式を用いる。抗体の結合アフィニティは、通常、解離定数（ＫｄまたはＫＤ）として知られる、抗原結合部位の半分が占有される抗体濃度に関して特徴付けられる。通常、結合剤は、Ｋｄ＜１０−８Ｍ、好ましくはＫｄ＜１０−９Ｍで、高アフィニティ結合剤と見なされ、さらにより好ましくはＫｄ＜１０−１０Ｍである。
【０１１５】
さらに、別の好ましい態様において、個々の抗原結合アフィニティは、中程度のアフィニティであり、例えば少なくとも２つの抗原に結合する際、例えば１０−６Ｍ未満、そして１０−８Ｍまでである。
【０１１６】
本発明の二重特異性モノクローナル抗体形式は、組換え抗体技術を含む多様な技術によって、場合によってハイブリドーマまたはヒト抗体配列ライブラリーを使用して、産生可能である。組換え抗体技術は、トランスフェクション細胞による再現可能な産生および単純な精製が可能であるため、好ましい。
【０１１７】
本発明の抗体形式は、薬学的組成物中で特に提供される。本発明の抗体形式および１またはそれより多い療法的活性剤が配合される、薬学的組成物が意図される。凍結乾燥配合物、水溶液または水中油エマルジョンの形の、所望の度合いの純度を有する抗体形式を、場合によって薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤または安定化剤と混合することによって、本発明の抗体形式の安定な配合物を保存のために調製する。
【０１１８】
典型的には、こうした組成物は、許容されうる薬学的実施によって知られ、そして要求されるように薬学的に許容されうるキャリアーを含む。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１６版（１９８０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．を参照されたい。こうしたキャリアーの例には、場合によって５〜８の範囲内のｐＨに適切な緩衝剤で緩衝された、滅菌キャリアー、例えば生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられる配合物は、無菌である必要がある。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過または他の適切な方法によって容易に達成される。
本発明の抗体形式を含む薬学的組成物の投与は、全身または非経口投与を含む多様な方法で、好ましくは無菌水溶液の形で、例えば静脈内、筋内または皮下経路で実行可能であるが、経口、鼻内、耳内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）、経皮、粘膜、局所（例えばジェル、膏薬（ｓａｌｖｅｓ）、ローション、クリーム等）、腹腔内、筋内、肺内、膣内、非経口、直腸、または眼内であってもよい。したがって、本発明は、こうした使用に適したそれぞれの配合物中の抗体形式を提供する。
【０１２０】
本発明には、活性物質として療法的有効量の本発明の抗体形式を含有する薬学的調製物が含まれる。特に、抗体形式の薬学的に許容されうる配合物は、治療を必要とする被験体の治療と適合する。
【０１２１】
用語「療法的有効量」は、本明細書において、本発明の抗体形式の「有効量」または「十分量」のいずれとも交換可能に用いられ、被験体に投与された際、臨床的結果を含む有益なまたは望ましい結果を達成するために十分な量または活性であり、そしてこうしたものとして、有効な量またはその同義語は、適用される背景に応じる。疾患の背景において、抗体形式の療法的有効量を用いて、例えば自己免疫反応、例えば自己反応性Ｂ細胞障害に関連する急性または慢性炎症性疾患を阻害するため、過剰なＢ細胞の下方制御または減少から利益を得る疾患または状態を治療するか、調節するか、減弱させるか、逆転させるか、またはこれらに影響を及ぼすことも可能である。有効量は、こうした疾患または障害を治療するか、防止するかまたは阻害するのに十分な化合物の量を意味すると意図される。こうした量に対応するであろう抗体形式の量は、多様な要因、例えば所定の薬剤または化合物、薬学的配合物、投与経路、疾患または障害のタイプ、治療される被験体または宿主の同一性等に応じて多様であるが、にもかかわらず、当業者によってルーチンに決定可能である。
【０１２２】
さらに、本発明の抗体形式の療法的有効量での被験体の治療または防止措置は、単一の投与からなることも可能であるし、または一連の適用を含むことも可能である。例えば、少なくとも１年に１回、少なくとも半年に１回、または少なくとも１ヶ月に１回、抗体形式を投与してもよい。しかし、別の態様において、所定の治療のため、週あたり約１回からほぼ毎日、被験体に抗体形式を投与してもよい。治療期間の長さは、疾患の重症度、患者の年齢、抗体形式の濃度および活性などの多様な要因に応じる。治療または予防に用いられる有効投薬量は、特定の治療または予防措置の経過中、増加させてもまたは減少させてもよいこともまた認識されるであろう。投薬量の変化が生じることも可能であり、そして当該技術分野に知られる標準的診断アッセイによって明らかとなりうる。いくつかの例において、長期投与が必要となる可能性もある。
【０１２３】
療法が必要なヒト患者に提供されるような抗体形式の療法的有効量は、特に、０．５〜５００ｍｇ、好ましくは１〜４００ｍｇの範囲、さらにより好ましくは最大３００ｍｇ、最大２００ｍｇ、最大１００ｍｇまたは最大１０ｍｇであることも可能であるが、例えば急性疾患状態を治療するためには、より高い用量が示されうる。
【０１２４】
非経口投与に用いられるような例示的な配合物には、例えば無菌溶液または懸濁物として、皮下、筋内または静脈内注射に適切なものが含まれる。
１つの態様において、本発明記載の抗体形式は、例えば疾患修飾単一療法として、患者に投与される唯一の療法的活性剤である。
【０１２５】
あるいは、本発明記載の抗体形式を、限定されるわけではないが、標準的治療、例えば悪性疾患の場合の化学療法、あるいはＭＳの場合のインターフェロン−ベータまたはステロイド、あるいはＩＴＰの場合の高用量免疫グロブリンを含む、１またはそれより多い他の療法剤と組み合わせて投与する。
【０１２６】
組み合わせ療法は、特に、標準的措置、例えばＲＲＭＳを治療するために用いられるものを使用する。これには、インターフェロン−ベータまたはステロイドが含まれることも可能である。
【０１２７】
組み合わせ療法において、抗体形式を混合物として、あるいは１またはそれより多い他の療法措置と併用して、例えば併用療法の前、併用療法と同時または併用療法の後に、投与してもよい。
【０１２８】
本発明記載の抗体形式の生物学的特性は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞、組織、および全生物実験において、特徴付けられうる。当業者に知られるように、薬剤はしばしば、ｉｎ  ｖｉｖｏで、限定されるわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、およびサルを含む動物において、疾患または疾患モデルに対する治療のための薬剤有効性を測定するため、あるいは薬剤の薬物動態、薬力学、毒性、および他の特性を測定するため、試験される。動物は、疾患モデルと呼ばれてもよい。療法はしばしば、限定されるわけではないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、およびトランスジェニックマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含む、マウスで試験される。こうした実験は、適切な半減期、エフェクター機能、アポトーシス活性およびＩｇＧ阻害活性を持つ療法剤として、抗体形式が用いられる潜在的可能性を決定するために、意味があるデータを提供しうる。任意の生物、好ましくは哺乳動物が試験に使用可能である。例えば、ヒトへの遺伝的類似性のため、霊長類、サルが適切な療法モデルである可能性があり、そしてしたがって、これらを用いて、本発明記載の抗体形式の有効性、毒性、薬物動態、薬力学、半減期、または他の特性を試験してもよい。ヒトにおける物質の試験は、薬剤としての認可のために最終的には必要であり、そしてこれらの実験が本明細書に意図される。したがって、本発明の抗体形式を、動物モデルにおいてまたはヒトにおいて試験して、療法的有効性、毒性、免疫原性、薬物動態、および／または他の臨床特性を決定することも可能である。
【０１２９】
本発明にしたがって、抗体を産生し、そして特徴付けるための方法が当該技術分野に周知である。好ましい態様において、抗体変異体を産生し、そして本発明の抗体形式を発現する細胞を使用する１またはそれより多い細胞に基づくアッセイ、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、あらかじめ定義された特性に関してスクリーニングする。こうしたアッセイはしばしば、抗体に対する細胞の反応、例えば細胞生存、細胞死、細胞形態の変化、あるいは転写活性化、例えば天然遺伝子または受容体遺伝子の細胞発現を監視することを伴う。
【０１３０】
これらのアッセイは、典型的には抗体形式の機能に基づく；すなわち、抗体形式が、例えば同じ細胞上のターゲット抗原に結合し、そしていくつかの生化学的事象、例えば競合結合アッセイにおける前記細胞のアポトーシスまたは阻害、Ｂ細胞結合阻害あるいは本発明の抗体の存在下または非存在下でのＩｇＧ発現の減少を仲介する能力。
【０１３１】
細胞死または生存度を監視するための方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、色素、免疫化学、細胞化学、および放射性試薬の使用が含まれる。例えば、カスパーゼ染色アッセイは、アポトーシスが測定されることを可能にし、そして放射性物質またはアラマーブルーなどの蛍光色素の取り込みまたは放出は、細胞増殖または活性化が監視されることを可能にしうる。
【０１３２】
転写活性化もまた、細胞に基づくアッセイにおいて、機能をアッセイするための方法として使用されうる。この場合、上方制御されうる天然遺伝子または免疫グロブリンに関してアッセイすることによって、反応を監視してもよく、例えば特定のインターロイキンの放出を測定してもよく、あるいは読み取りは、レポーター構築物を通じてでもよい。細胞に基づくアッセイはまた、本発明記載の抗体の存在に対する反応としての細胞の形態学的変化の測定を伴ってもよい。
【０１３３】
本発明の抗体形式の組換え産生は、好ましくは、例えば抗体形式をコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物またはベクターを含む、発現系を使用する。
用語「発現系」は、これらの配列で形質転換されるかまたはトランスフェクションされた宿主が、コードされるタンパク質を産生することが可能であるように、所望のコード配列および機能可能な連結にある調節配列を含有する核酸分子を指す。形質転換を達成するため、発現系にはベクターが含まれてもよい；しかしまた、次いで適切なＤＮＡを、宿主染色体に組み込んでもよい。あるいは、発現系をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のために使用してもよい。
【０１３４】
「発現構築物」または「ベクター」は、本明細書において、適切な宿主生物における、クローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写、およびそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。発現ベクターは、発現カセットを含み、そしてさらに、通常、宿主細胞またはゲノム組み込み部位における自律複製のための起点、１またはそれより多い選択可能マーカー（例えばアミノ酸合成遺伝子、あるいはゼオシン、カナマイシン、Ｇ４１８またはハイグロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を与える遺伝子）、いくつかの制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列および転写終結因子を含み、これらの構成要素はともに機能可能であるように連結される。用語「プラスミド」および「ベクター」には、本明細書において、自律複製ヌクレオチド配列、ならびにゲノム組み込みヌクレオチド配列が含まれる。
【０１３５】
特に、該用語は、それによって、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）、例えば本発明の抗体形式をコードするヌクレオチド配列が、宿主を形質転換し、そして導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、宿主細胞内に導入されることも可能である、ビヒクルを指す。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。
【０１３６】
ベクターは、典型的には、伝達性剤のＤＮＡであって、その中に外来ＤＮＡが挿入される、前記ＤＮＡを含む。ＤＮＡの１つのセグメントを、ＤＮＡの別のセグメント内に挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（特定のヌクレオチド群）でＤＮＡを切断する、制限酵素と呼ばれる酵素の使用を伴う。「カセット」は、定義される制限部位で、ベクター内に挿入可能な、発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを指す。カセット、制限部位は、適切な読み枠で、カセットが挿入されることを確実にするように設計される。一般的に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１またはそれより多い制限部位に挿入され、そして次いで、ベクターによって、伝達性ベクターＤＮＡとともに宿主細胞内に運ばれる。挿入されたまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡセグメントまたは配列、例えば発現ベクターはまた、「ＤＮＡ構築物」とも称されうる。ベクターの一般的なタイプは、一般的には、さらなる（外来）ＤＮＡを容易に受け入れ可能であり、そして適切な宿主細胞内に容易に導入可能な、二本鎖ＤＮＡの自己充足型分子である、「プラスミド」である。本発明のベクターは、しばしば、コードＤＮＡおよび発現調節配列、例えばプロモーターＤＮＡを含有し、そして外来ＤＮＡを挿入するために適した、１またはそれより多い制限部位を有する。コードＤＮＡは、本発明の抗体形式などの特定のポリペプチドまたはタンパク質の特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コードＤＮＡの発現を開始するか、制御するか、あるいは別の方式で仲介するかまたは調節する、ＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来でもよいし、または異なる遺伝子由来でもよく、そして同じまたは異なる生物由来であってもよい。本発明の組換えクローニングベクターには、しばしば、クローニングまたは発現のための１またはそれより多い複製系、宿主における選択のための１またはそれより多いマーカー、例えば抗生物質耐性、および１またはそれより多い発現カセットが含まれるであろう。
【０１３７】
例えば本発明の因子および／またはＰＯＩを提供するかまたはコードするＤＮＡ配列、プロモーター、ターミネーターおよびさらなる配列それぞれを連結するために用いられる方法、ならびに組み込みまたは宿主複製に必要な情報を含有する適切なベクター内にこれらを挿入するために用いられる方法は、当業者に周知であり、例えばＪ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第２版”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。
【０１３８】
用語「細胞株」は、本明細書において、長期間にわたって、増殖する能力を獲得している特定の細胞タイプの確立されたクローンを指す。用語「宿主細胞株」は、内因性または組換え遺伝子を発現してポリペプチド、例えば本発明の組換え抗体形式を産生するために使用されるような細胞株を指す。「産生宿主細胞株」または「産生細胞株」は、一般的に、産生プロセスの産物、本発明の組換え抗体形式を得るため、バイオリアクター中で培養するために使用準備済みの細胞株と理解される。
【０１３９】
宿主細胞は、特に、本発明記載のベクターなどの発現構築物でトランスフェクションされた組換え細胞または細胞株と理解される。
用語「組換え」は、本明細書において、例えば特に、組換えベクターまたは組換え宿主細胞中に取り込まれた異種配列を使用して、「遺伝子操作によって調製された」または「遺伝子操作の結果」を意味するものとする。
【０１４０】
任意の既知のそしてよく確立された発現系および組換え細胞培養技術を用いて、例えば細菌宿主（原核系）、あるいは酵母、真菌、昆虫細胞または哺乳動物細胞などの真核系において、本発明の二重特異性モノクローナル抗体形式を産生することも可能である。本発明の抗体分子を、ヤギ、植物、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座の巨大断片を有し、そしてマウス抗体産生が欠損した操作マウス株であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック生物において産生してもよい。抗体はまた、化学的合成によって産生されてもよい。
【０１４１】
特定の態様にしたがって、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ６、ＣＡＰ、ＨＥＫ、ＨｅＬａ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ハイブリドーマおよびＪｕｒｋａｔからなる群より選択される細胞の産生細胞株である。より具体的には、宿主細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４またはＣＨＯ−Ｓ細胞から得られる。
【０１４２】
抗体産生には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が最も一般的に用いられてきている。適切なグリコシル化パターンを提供することに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定で、非常に産生性が高いクローン性細胞株の一貫した生成を可能にする。これらは、血清不含培地を用いて、単純なバイオリアクター中で高密度に培養可能であり、そして安全でそして再現性があるバイオプロセスの発展を可能にする。
【０１４３】
本発明の宿主細胞は、特に、例えば血清の代替物として、他の構成要素、例えば血漿タンパク質、ホルモン、および増殖因子を含む、血清不含培地中で培養されるかまたは維持される。
【０１４４】
宿主細胞は、血清不含条件下で確立され、適応され、そして完全に培養された場合に、そして場合によって、動物起源のいかなるタンパク質／ペプチドも含まない培地中で培養された際に、最も好ましい。
【０１４５】
前述の説明は、以下の実施例を参照すると、より完全に理解されるであろう。こうした例は、しかし、本発明の１またはそれより多い態様を実施する方法の単に代表であり、そして本発明の範囲を限定するとして読んではならない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：  ＣＤ２０およびＣＤ９０に対する特異性を持つ二重特異性抗体構造の産生
キメラ型（ＮＡ−Ｃ２０と称される）
キメラ軽鎖（マウス抗ＣＤ９５−ＶＪ／ヒトＣＬ；配列番号２１）およびキメラ重鎖（マウス抗ＣＤ９５−ＶＤＪ／ヒトＣＨ１／ヒンジ／修飾ＣＨ２／抗ＣＤ２０  ＶＨＶＬ；配列番号２３）は、ＳＰ２／０細胞株において成功裡に発現された。タンパク質は、ヌクレオチド配列、配列番号２２および配列番号２５によってコードされ、これらを正しく組み立てて、前記二重特異性抗ＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体を形成した。これは、ウェスタンブロットにおいて、ヒトＩｇＧ１およびヒト・カッパ軽鎖に特異的な抗体での検出によって確認された。さらなる特徴付けのため、アフィニティ・クロマトグラフィ（ＣａｐｔｏＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、タンパク質を細胞培養上清から精製した。
【０１４７】
ヒト化型（Ｎｏｖｏｔａｒｇと称される）
ヒト化ＣＤ９５−ＶＪ／ヒトＣＬ（配列番号２６）およびヒト化ＣＤ９５−ＶＤＪ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ／ヒト化ＣＤ２０ｓｃＦｖ（配列番号２８）をコードするアミノ酸配列を、ｎｔ配列に逆翻訳し、そしてチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）にコドン最適化した。対応するヌクレオチド配列を、配列番号２７および配列番号２９に列挙する。合成遺伝子を設計し、合成し、そしてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞株のトランスフェクションのため、適切な発現ベクター内にクローニングした。両方の配列を発現させ、そして成功裡に組み立てて、前記二重特異性抗体誘導体を形成した。これは、ウェスタンブロットにおいて、ヒトＩｇＧ１およびヒト・カッパ軽鎖に特異的な抗体での検出によって確認された。さらなる特徴付けのため、アフィニティ・クロマトグラフィ（ＣａｐｔｏＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、タンパク質を細胞培養上清から精製した。
【０１４８】
実施例２：  ＣＤ２０およびＣＤ９０に対する特異性を持つ二重特異性抗体構造の特徴付け
ＣＤ９５およびＣＤ２０に対するキメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体の結合アフィニティ
ターゲットに対するキメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体の結合成功を、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）によって確認した。ＣＤ２０＋／ＣＤ９５−  Ｂリンパ芽球細胞株（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ２０−／ＣＤ９５＋神経膠腫細胞株（ＬＮ−１８）を、それぞれ、キメラ抗体誘導体の連続希釈とインキュベーションした（ＰＢＳ  １％ＦＣＳ  ０．０１％ＮａＮ３中、２ｘ１０６細胞／試料、４℃で１時間）。結合したタンパク質を、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０９−１１６−０９８、１：２００、４℃で３０分間）で検出した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の濃度依存性増加は、ＣＤ２０ならびにＣＤ９５に対するキメラ二重特異性抗体の結合成功を確認した（図３）。
【０１４９】
ＣＤ９５およびＣＤ２０に対するヒト化ＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体の結合アフィニティ
ターゲットに対するヒト化ＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体の結合成功を、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）によって確認した。ＣＤ２０＋／ＣＤ９５−  Ｂリンパ芽球細胞株（Ｄａｕｄｉ）およびＣＤ２０−／ＣＤ９５＋神経膠腫細胞株（ＬＮ−１８）を、それぞれ、キメラ抗体誘導体の連続希釈とインキュベーションした（ＰＢＳ  １％ＦＣＳ  ０．０１％ＮａＮ３中、２ｘ１０６細胞／試料、４℃で１時間）。結合したタンパク質を、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号１０９−１１６−０９８、１：２００、４℃で３０分間）で検出した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の濃度依存性増加は、ＣＤ２０ならびにＣＤ９５に対するヒト化二重特異性抗体の結合成功を確認した（図４）。
【０１５０】
キメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期
Ｃ５７ＢＬ６マウス（雄、６週齢、ｎ＝３）に、５０μｇのキメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体（ＮＡ−Ｃ２０）を静脈内（尾静脈）投与した。注射の０．５時間、１．０時間、２．０時間および４．０時間後に、血液試料を採取した。フローサイトメトリーを通じた、ＣＤ２０＋／ＣＤ９５＋  Ｂリンパ芽球細胞株ＳＫＷ  ６．４に結合した抗体の検出によって、血清抗体濃度を測定した（図５）。
【０１５１】
実施例３：  ＣＤ２０およびＣＤ９０に対する特異性を持つ二重特異性抗体構造に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ概念実証
ＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体の強度
ＣＤ２０＋／ＣＤ９５＋  Ｂ細胞上のＣＤ９５を活性化する強度を、ＣＤ２０＋／ＣＤ９５＋  Ｂリンパ芽球細胞株ＳＫＷ  ６．４に対して、キメラ（ＮＡ−Ｃ２０）およびヒト化変異体（Ｎｏｖｏｔａｒｇ）の両方に関して立証した。細胞をＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体の連続希釈とインキュベーションし、そしてチミジン取り込みアッセイによって、細胞増殖を決定した。簡潔には、ウェルあたり３ｘ１０４細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレート内に植え付け、そして抗体誘導体をそれぞれの濃度で添加した。２４時間後、［３Ｈ］メチル−チミジン（Ｈａｒｔｍａｎ  ａｎａｌｙｔｉｃｓより購入、カタログ番号ＭＴ６０３５／３）を細胞に添加して、０．５μＣｉ／ウェルの最終濃度を達成した。さらに２０時間インキュベーションした後、細胞を採取し、そして液体シンチレーション分光測定（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ液体シンチレーション分析装置ＭｉｃｒｏＢｅａｔａ２）によってトリチウム取り込みを分析した。増殖の用量依存性阻害が観察可能であり、ＮＡ−Ｃ２０およびＮｏｖｏｔａｒｇがＣＤ２０およびＣＤ９５の両方を発現している細胞において、細胞死受容体ＣＤ９５を選択的に刺激する能力が立証された（図６）。
【０１５２】
実施例４：  ＣＤ２０およびＣＤ９０に対する特異性を持つ二重特異性抗体構造に関するｉｎ  ｖｉｖｏ概念実証
ｉｎ  ｖｉｖｏリンパ腫ＳＣＩＤマウスモデル
４〜５週齢のＳＣＩＤマウス（Ｂｏｓｍａら，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８３  Ｆｅｂ  １０；３０１（５９００）：５２７−３０）に、致死用量の１ｘ１０７細胞のＣＤ２０＋／ＣＤ９５＋  Ｂリンパ芽球細胞株ＳＫＷ  ６．４を静脈内（尾静脈）注射した（ｎ＝８）。注射の１日、２日、および３日後、８匹のマウスに、２０μｇのキメラＣＤ９５ＸＣＤ２０抗体誘導体（ＮＡ−Ｃ２０）を投与する一方、対照群にはＰＢＳまたは２０μｇ  ＮＡ−ＣＭｅｌをそれぞれ投与した（ｉ．ｐ．）。ＮＡ−ＣＭｅｌは、ＣＤ９５および第二の関連しないターゲット（黒色腫関連プロテオグリカン）に対する特異性を持つ、二重特異性抗体誘導体である。結果を図７に示す。４０日後、対照群のすべてのマウスは死亡しており、一方、ＮＡ−Ｃ２０処置群由来の７匹のマウスは生き延びた。この群のうち、６匹のマウスは１２０日後もなお生きていた。これは、これらのマウスにおいて、ＣＤ２０＋／ＣＤ９５＋  ＳＫＷ  ６．４細胞が有効に枯渇されたことを示す。次に、ＮＡ−ＣＭｅｌ処置対照群の８匹のマウスのうち７匹が、第４０日には死亡していた。ＮＡ−ＣＭｅｌは、明らかに、有効な腫瘍細胞枯渇を行うことができない。ＮＡ−Ｃ２０とは対照的に、ＮＡ−ＣＭｅｌは、一価で結合するＣＤ９５以外には、ＳＫＷ  ６．４細胞上に発現されるタンパク質に対する他のターゲット特異性をまったく持たない。これは、有効なＣＤ９５活性化およびアポトーシス誘導の必要条件である、受容体架橋を妨げる。ＮＡ−ＣＭｅｌは、ＣＤ９５に対する特異性を持つ二重特異性抗体誘導体の、ターゲット細胞に制限される作用様式を立証する。ＮＡ−Ｃ２０は、したがって、ＣＤ９５＋／ＣＤ２０＋細胞に対してのみ有効であり、ＣＤ９５＋／ＣＤ２０−細胞、例えば肝細胞は影響を受けないままにしておくと予期される。これは、選択的ターゲティングおよびオフ−ターゲット効果減少を確実にする（Ｊｕｎｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  Ｍａｒｃｈ  １：６１（５）：１８４６−８）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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