(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、
（i）ピーナッツアレルゲンara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6であって、
ara h 1が、配列番号4に記載のアミノ酸配列、又は配列番号4と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ara h 2が、配列番号6に記載のアミノ酸配列、又は配列番号6と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ara h 3が、配列番号8に記載のアミノ酸配列、又は配列番号8と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および
ara h 6が、配列番号10に記載のアミノ酸配列、又は配列番号10と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ピーナッツアレルゲン、並びに
（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグであって、該プロテアソーム分解タグがユビキチンモノマーを含み、該ユビキチンモノマーが、配列番号2に記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロテアソーム分解タグ、
を含み、
該ピーナッツアレルゲンは、分解後にMHCクラスIと複合体化され得、Tリンパ球に提示され得る、ポックスウイルスベクター。
【請求項２】
融合タンパク質が、ara h 4、ara h 5、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11からなる群から選択される1つ以上のピーナッツアレルゲンをさらに含み、
該1つ以上のピーナッツアレルゲンは、分解後にMHCクラスIと複合体化され得、Tリンパ球に提示され得る、請求項1に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項３】
融合タンパク質が、配列番号12に記載のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項４】
ポックスウイルスベクターが、配列番号11に記載の核酸配列、若しくはそれと少なくとも95％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項５】
プロテアソーム分解タグがユビキチンCを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項６】
ポックスウイルスベクターがワクシニアベクターである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項７】
ポックスウイルスベクターが、改変ワクシニアベクター又はアビポックスベクターである、請求項6に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項８】
融合タンパク質をコードする核酸配列が、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクター。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターを含む、対象又は患者において、アレルギー反応に対して寛容を誘導する又はアレルギー反応を抑制する医薬。
【請求項１０】
アレルギー反応がピーナッツアレルゲンに対するアレルギー反応である、請求項9に記載の医薬。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターを含む、キット。
【請求項１２】
ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する医薬の製造におけるTH1リンパ球集団の使用であって、該TH1リンパ球集団は、該対象由来のリンパ球を、ex vivoにて、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターがトランスフェクトされた細胞と共培養して、該細胞上のMHCクラスI分子と会合したプロテアソーム分解されたピーナッツアレルゲン融合タンパク質を認識するTH1リンパ球集団を生成及び／又は増幅させることを含む方法により調製される、使用。
【請求項１３】
ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する医薬の製造における活性化抗原提示細胞集団の使用であって、該活性化抗原提示細胞集団は、該対象由来のナイーブ抗原提示細胞を、ex vivoにて、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポックスウイルスベクターがトランスフェクトされた細胞と共培養して、該細胞上のMHCクラスI分子と会合したプロテアソーム分解されたピーナッツアレルゲン融合タンパク質を認識する活性化抗原提示細胞集団を生成することを含む方法により調製される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は一般に、予防又は治療ワクチンの分野に関する。特に、本明細書は、ピーナッツアレルギーを、それに対するアレルギー反応を抑制することにより治療するためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
原理上、アレルギー性疾患は、TH1及びTH2リンパ球サブセットの調節異常と関連する免疫系の障害である［de Vries et al. 1999, Parronchi et al. 1999, Singh et al. 1999］。ワクチン接種、抗生物質の使用及び他の公衆衛生活動に起因する感染性疾患発症率の低下とともに、TH1免疫誘発の主な原因は失われており、結果として、環境アレルゲンに対してTH2バイアスの免疫応答が増加すると仮定されている［Holgate 1999, Shaheen et al. 1996］。
【０００３】
一般集団に影響を及ぼす様々なアレルギー性疾患のうち、ピーナッツにより誘発されるアナフィラキシーは特に重篤であり、アナフィラキシー反応を治療するための救急科入院の最も一般的な原因である。
【０００４】
ピーナッツに対するアレルギーは、それ以外には無害の環境抗原に対する異常な免疫応答に起因する。ピーナッツアレルギー及びアナフィラキシーは、TH2 T細胞の産生及びIgE抗体分泌B細胞の産生を特徴とする2型の免疫応答を中心とする。対照的に、1型の免疫応答は、主にIgG（マウスではIgG2aアイソタイプ）の抗体、NK細胞及び食細胞の活性化、並びに細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の発生により特徴づけられ得る。1型及び2型の応答はともにヘルパーT細胞によって調整されており、TH1及びTH2リンパ球を含む複数の機能的に異なるサブセットへと分化する。これらのサブセットは、そのサイトカイン分泌プロファイルによって特徴付けられ［Mosmann et al. 1989］、ここでは、TH1細胞によりIFN-γが産生され、TH2細胞により、典型的にはIL-4、IL-5及びIL-13が分泌される。
【０００５】
経口摂取されたピーナッツアレルゲンは、最初に腸管粘膜免疫系と出合う。小襞（M）細胞は、特殊な濾胞関連（follicle-associated）細胞であり、消化管上皮に並び（line）、パイエル板に近接して存在する。それらは、寛容化の誘導及び／又は保護的な腸管関連免疫応答と関与している。食物アレルゲンへの感作は、外来性の食物抗原がM細胞により取り込まれ、次いで、マクロファージ及び樹状細胞（DCs）に提示される場合に生じる［DeLong et al. 2011］。マクロファージ及びDCsにより取り込まれると、抗原はエンドサイトーシスされ（endocytosed）、次いで、およそ12〜20アミノ酸長のペプチドへと変性及び分解される。次いで、これらの小ペプチドフラグメントの小さなフラクションは、細胞内に輸送され、CD4+ T細胞との特異的相互作用のために、細胞表面のMHCクラスII分子上で提示される。これらの活性化CD4+ T細胞はその後、その数を増やし、TH2サイトカインを放出する。TH2細胞、IL-4及びIL-5は、表面の免疫グロブリン（Ig）受容体と結合したアレルゲンを有するB細胞の、アレルゲン特異的IgE抗体を分泌する細胞への分化を促進する［Turcanu et al. 2010］。これらのIgE産生B細胞は、次いで、その数を増やし、形質細胞となり、アレルゲン特異的IgE抗体を継続的に分泌する。ピーナッツに対する環境暴露は、マスト細胞及び好塩基球上の特異的IgEコーティングとピーナッツアレルゲンとの結合をもたらす。その後、Fc受容体架橋により、強力な活性化刺激がもたらされ、好塩基球及びマスト細胞の脱顆粒が引き起こされ、予め生成された様々な炎症促進性及び血管作動性の化合物、例えば、プロスタグランジン、ロイコトリエン、セリンプロテアーゼ、ヒスタミン及びサイトカインなどが細胞外液へと急速に放出されて炎症反応を生じ［Sicherer et al. 2010］、これらはすべて、急性アレルギー反応の臨床症状に至る［Long 2002］。
【０００６】
ピーナッツアレルギーの局所症状は、腹痛、嘔吐、痙攣及び下痢を含み、軽度のピーナッツアレルギーの場合でもよく見られる。この急性の非致死的反応は、一時的な腸透過性の増大を引き起こし、その後、巨大分子、例えば、ピーナッツアレルゲン全体などを全身へと分布させ、その後のピーナッツアレルゲン暴露に対するアレルギー反応を悪化させ、致死的なアナフィラキシー反応を引き起こし得る［Sanderson et al. 1993］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
草花粉、ダストマイト及び蜂刺されによる毒（bee sting venom）に対するアレルギー反応のための従来の免疫療法とは異なって、ピーナッツ抽出物の皮下注射による脱感作は、許容できないリスク便益を有する［Oppenheimer et al. 1992］。従って、現在のところ、ピーナッツを回避することが、更なる反応を予防するために唯一利用可能な方法である。しかしながら、厳密な回避は、特に突発的なピーナッツへの暴露（例えば、レストラン、学校、フードコート、社員食堂など、ピーナッツを含むものと同じ付近で調製される加工食品や食品の摂取を介して多くの場合生じる）を考慮すると、多くの個人にとって非現実的なストラテジーである場合が多い。従って、ピーナッツアレルギーを治療及び予防するための効果的な治療ストラテジーに対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明の一側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分（part）、からなるリストから選択される少なくとも2つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【０００９】
本発明の一側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも2つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００１０】
本発明の別の側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも3つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００１１】
本発明の別の側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも3つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００１２】
本発明の別の側面において、ピーナッツアレルギーの治療における、又はピーナッツアレルギーを治療するための医薬の製造における、本明細書に開示のポックスウイルスベクターの使用を提供する。
【００１３】
本発明の別の側面において、対象又は患者において、アレルギー反応に対して寛容（tolerance）を誘導する又はアレルギー反応を抑制する方法であって、本明細書に開示のポックスウイルスベクターの有効量を、抑制／寛容を引き出すのに十分な時間及び条件下にて対象又は患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の側面において、ピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導するために対象にワクチン接種する方法であって、本明細書に開示のポックスウイルスベクターを投与することを含む、方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の側面において、本明細書に開示のポックスウイルスベクターを含むキットを提供する。
【００１６】
上記要旨は、本発明の全ての実施態様を包括するものではなく、いかなる場合にもそのようなものと受け取られるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、プロテアソーム分解タグ及び複数のピーナッツアレルゲンを含む、本発明の一実施態様に従うPHAV抗原の配置（図1A及びB）、並びにプロテアソーム分解タグを含まない、本発明の一実施態様に従うPHAV抗原の配置（図1C）を示す。
【図２−１】図2は、UBc.PHAV発現カセットの核酸配列を示す。
【図２−２】図2は、UBc.PHAV発現カセットの核酸配列を示す。
【図３−１】図3は、ユビキチン配列を含まない、PHAVagコンストラクト発現カセットの核酸配列を示す。
【図３−２】図3は、ユビキチン配列を含まない、PHAVagコンストラクト発現カセットの核酸配列を示す。
【図４】図4は、PHAV発現カセットを、相同組換えによりワクシニアウイルスコペンハーゲン（Copenhagen）株のA39R ORFへと挿入した図式表示である。
【図５】図5は、図4にて図式により表示した相同組換えカセットの特徴を列挙する。
【図６−１】図6は、UBc.PHAV相同組換えカセットの核酸配列を示す。
【図６−２】図6は、UBc.PHAV相同組換えカセットの核酸配列を示す。
【図６−３】図6は、UBc.PHAV相同組換えカセットの核酸配列を示す。
【図７−１】図7は、PHAV相同組換えカセットの核酸配列を示す。
【図７−２】図7は、PHAV相同組換えカセットの核酸配列を示す。
【図７−３】図7は、PHAV相同組換えカセットの核酸配列を示す。
【図８】図8は、pTC11（UBc.PHAV）及びpTC12（PHAV）の図式表示である。プラスミドを図8に示す。
【図９】図9は、細胞におけるプロテアソーム分解経路の図式表示である。
【図１０】図10は、エンプティベクター（SCV000）又はUBc.PHAVベクター（SCV201C）でワクチン接種する前及び後（ワクチン接種17日後）におけるピーナッツタンパク質特異的血清IgE（図10A）及びIgG2a（図10B）抗体レベルを示す；*=p<0.05。
【図１１】図11は、SCV000及びSCV201Cワクチン接種マウスの脾臓から得られた培養リンパ球により分泌される、IFN-γ（IFN-g；TH1サイトカイン；図11A）、IL4（TH2サイトカイン；図11B）及びIL5（TH2サイトカイン；図11C）レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本明細書におけるいずれの従来技術への言及も、この従来技術がいずれかの国において、共通の一般知識の一部を形成するとの承認ではなく、又はそのいかなる形態の示唆でもなく、またそのようなものと解釈されるべきでない。
【００１９】
本明細書を通じて、文脈がそうでないことを要求する場合を除き、単語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」及び「含むこと（comprising）」は、述べられた工程若しくは要素、又は工程若しくは要素の群の包含を意味するが、あらゆる他の工程若しくは要素、又は工程若しくは要素の群の排除を意味するものではないことが理解されるであろう。従って、用語「含むこと」などの使用は、列挙された要素は必要であるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、存在しても存在しなくてもよいことを示す。「からなる（consisting of）」により、フレーズ「からなる」に続くものはいずれも含み、これに限定されることを意味する。従って、フレーズ「からなる」は、列挙された要素は必要であるか又は必須であり、且つ他の要素はいずれも存在しなくてよいことを示す。「実質的に〜からなる（consisting essentially of）」により、該フレーズの後に列挙されるいずれの要素も含まれ、且つ列挙された要素についてその開示で特定される活性又は作用を妨げないか又はこれに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、フレーズ「実質的に〜からなる」は、列挙された要素は必要であるか又は必須であるが、他の要素は、列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かに応じて、任意選択であり、存在しても存在しなくてもよいことを示す。
【００２０】
本明細書で使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかにそうでないことを指示する場合を除き、複数の側面を含む。従って、例えば、「組成物（a composition）」への言及は、単一の組成物及び2以上の組成物を含み；「薬剤（an agent）」への言及は、1つの薬剤及び2以上の薬剤を含み；「発明（the invention）」への言及は、発明の単一及び複数の側面を含むなどである。
【００２１】
別段の定めがある場合を除き、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の通常の技術者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の材料及び方法が、本発明を実施又は試験するために使用され得る。
【００２２】
本明細書により、ピーナッツアレルギーを治療又は予防するための治療剤の開発に対するワクチンアプローチが可能となる。特に、本明細書により、例えば、最も広範囲又は厄介なピーナッツアレルゲンの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つなど、主要なピーナッツアレルゲンとの関連において治療を提供することできる薬剤が可能となる。
【００２３】
本発明は、融合タンパク質を作動的（operatively）にコードする核酸構築物を含むDNAワクチンであって、該融合タンパク質が、プロテアソーム分解タグ（例えば、ユビキチン）と連結されたピーナッツアレルゲン（例えば、ara h 1）を含む、DNAワクチンが、対象において、TH1表現型へと偏った免疫応答を誘導することができ、従って、そうでなければピーナッツアレルゲン暴露に際してアレルギー反応を促進するであろうピーナッツアレルゲン特異的IgE抗体とは対照的に、ピーナッツアレルゲン特異的IgG抗体の分泌がもたらされる、との本発明者らによる驚くべき発見を前提とする。
【００２４】
従って、本発明の一側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも2つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００２５】
本発明の別の側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも2つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００２６】
本発明の別の側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも3つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００２７】
本発明の別の側面において、融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11、並びにそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体又は部分、からなるリストから選択される少なくとも3つのピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００２８】
本発明の別の側面において、融合タンパク質を対象の細胞中で発現するポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）（a）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7、若しくはそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体若しくは部分、からの少なくとも2つのピーナッツアレルゲン、又は（b）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7、若しくはそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体若しくは部分、からの少なくとも3つのピーナッツアレルゲン、からなるリストから選択されるピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００２９】
本発明の別の側面において、融合タンパク質を対象の細胞中で発現するポックスウイルスベクターであって、該融合タンパク質が、（i）（a）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11、若しくはそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体若しくは部分、からの少なくとも2つのピーナッツアレルゲン、又は（b）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11、若しくはそれと少なくとも70％の配列同一性を有するその誘導体若しくは部分、からの少なくとも3つのピーナッツアレルゲン、からなるリストから選択されるピーナッツアレルゲン、並びに（ii）該融合タンパク質の細胞内分解を高めるためのプロテアソーム分解タグを含む、ポックスウイルスベクターを提供する。
【００３０】
ピーナッツアレルゲン
ピーナッツアレルゲンは当業者に既知であり、これには、対象が、例えば、接触、吸入、摂取、注入などを介して暴露され得るアラキス・ヒュポガエア（Arachis hypogaea）種の任意のペプチドが含まれる。一実施態様において、少なくとも2つのピーナッツアレルゲンは、ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7からなる群から選択される。別の実施態様において、少なくとも2つのピーナッツアレルゲンは、ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11からなる群から選択される。
【００３１】
融合タンパク質は、ara h 1〜ara h 11の任意の2つ以上のピーナッツアレルゲンを含み得る。例えば、融合タンパク質は以下のピーナッツアレルゲンを含んでよい：
（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11；
（ii）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9及びara h 10；
（iii）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8及びara h 9；
（iv）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7及びara h 8；
（v）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7；
（vi）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5及びara h 6；
（vii）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4及びara h 5；
（viii）ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 4；
（ix）ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6；
（x）ara h 1、ara h 2及びara h 3；
（xi）ara h 1及びara h 2；
（xii）ara h 1及びara h 3；
（xiii）ara h 1及びara h 4；
（xiv）ara h 1及びara h 5；
（xv）ara h 1及びara h 6；
（xvi）ara h 1及びara h 7；
（xvii）ara h 1及びara h 8；
（xviii）ara h 1及びara h 9；
（xix）ara h 1及びara h 10；
（xx）ara h 1及びara h 11；
（xxi）ara h 2及びara h 3；
（xxii）ara h 2及びara h 4；など。
【００３２】
融合タンパク質の構成要素としてプロテアソーム分解タグ（例えば、ユビキチン）を用いることにより、合成された融合タンパク質はプロテアソーム分解の標的とされ、それにより小ペプチドフラグメントの生成がもたらされ、これは小胞体（ER）に入り、そこでMHCクラスIタンパク質と複合体化され、次いで細胞表面へと輸送されてTリンパ球に提示される。結果として、MHCクラスIでのタンパク質フラグメントの提示が高められる。従って、当業者ならば、核酸配列が2つ以上のピーナッツアレルゲンを含む融合タンパク質をコードする場合、発現される融合タンパク質はプロテアソーム分解に供されるであろうことから、該2つ以上のピーナッツアレルゲンは、融合タンパク質において任意の特定の順序で見られ得ることを理解するだろう。
【００３３】
当業者ならば、ピーナッツアレルゲン（単数又は複数）の選択は、特定の治療的及び／又は予防的適用に依存する可能性が高いことを理解するだろう。例えば、ピーナッツアレルゲンAra h1に対してアレルギーがある対象において寛容を誘導するためにワクチンが使用されるべき場合には、融合タンパク質は、望ましくはara h 1を含むであろうし；ピーナッツアレルゲンara h 2に対してアレルギーがある対象において寛容を誘導するためにワクチンが使用されるべき場合には、融合タンパク質は、望ましくはara h 2を含むであろうし；ピーナッツアレルゲンara h 1及びara h 2に対してアレルギーがある対象において寛容を誘導するためにワクチンが使用されるべき場合には、融合タンパク質は、望ましくはara h 1及びara h 2を含むであろうなどである。
【００３４】
一実施態様において、ピーナッツアレルゲンは、以下を含む群から選択される：arah 1, Clone P41B（GenBankアクセッション番号L34402又はスイスプロット：P43238.1）；ara h 1 Clone P17（GenBankアクセッション番号L38853）；ara h 2 cDNA（GenBankアクセッション番号L7797又はUniProtKB/TrEMBL：Q8GV20）；ara h 3 cDNA（GenBankアクセッション番号AF093541又はACH91862）；ara h 4 cDNA（GenBankアクセッション番号AF086821）；ara h 5 cDNA（GenBankアクセッション番号AF059616）；ara h 6 cDNA（GenBankアクセッション番号AF092846又はUniProtKB/TrEMBL：Q647G9）、ara h 7 cDNA（GenBankアクセッション番号AF091737）、ara h 8（GenBankアクセッション番号AY328088、EF436550）、ara h 9（GenBankアクセッション番号EU159429、EU161278）、ara h 10（AY722694、AY722695）及びara h 11（DQ097716）。
【００３５】
一実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも4つのピーナッツアレルゲンを含み、より好ましくは、ピーナッツに対してアレルギーがある個体に影響を及ぼす最も一般的なピーナッツアレルゲンのうち少なくとも4つを含む。一実施態様において、融合タンパク質は、ピーナッツアレルゲンara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6を含む。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「ピーナッツアレルゲン」（ara h 1、ara h 2などの具体例を含む）は、そのホモログ又はバリアントも含むものと理解されるべきである。用語「ホモログ」は、本明細書に記載の核酸配列又はポリペプチド（例えば、配列番号1〜12のいずれか1つを含む）のホモログに関して本明細書で使用する場合、本明細書に記載の核酸又はポリペプチドの、例えば、オーソログ、パラログ、変異体（mutants）及びバリアントなどを含むものと理解されるべきである。いくつかの実施態様において、ホモログは、本明細書に記載の核酸又はアミノ酸配列と少なくとも70％の配列同一性、少なくとも75％の配列同一性、少なくとも80％の配列同一性、少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、少なくとも96％の配列同一性、少なくとも97％の配列同一性、少なくとも98％の配列同一性、又は少なくとも99％の配列同一性を含む核酸又はアミノ酸配列を含む。
【００３７】
従って、一実施態様において、ara h 1は、配列番号4のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ara h 2は、配列番号6のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ara h 3は、配列番号8のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ara h 6は、配列番号10のアミノ酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列含む。
【００３８】
別の実施態様において、ara h 1は、配列番号3の核酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有する核酸配列によりコードされ、ara h 2は、配列番号5の核酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有する核酸配列によりコードされ、ara h 3は、配列番号7の核酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有する核酸配列によりコードされ、ara h 6は、配列番号9の核酸配列又はそれと少なくとも70％の同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「配列同一性」は、配列が比較ウインドウに対してヌクレオチド毎又はアミノ酸毎に同一である程度をいう。従って、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウに対して2つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、及びMet）が双方の配列において生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数（すなわち、ウインドウのサイズ）によって除し、配列同一性のパーセンテージを得るために、その結果に100を乗じることにより計算される。本発明の目的のために、「配列同一性」は、適切な方法により計算される「マッチパーセンテージ」を意味すると理解されるだろう。例えば、配列同一性分析は、DNASISコンピュータープログラム（ウィンドウズ用バージョン2.5；Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USAから入手可能）を用いて、ソフトウェアに添付された参照マニュアルで使用されるように、標準的なデフォルトを用いて実施されてよい。いくつかの実施態様において、包含されるピーナッツアレルゲンのアミノ酸又はヌクレオチド配列の配列同一性は、少なくとも75％又は少なくとも80％又は少なくとも85％又は少なくとも90％又は少なくとも95％又は少なくとも98％の配列同一性まで増加される。
【００４０】
いくつかの実施態様において、用語「アレルゲン」は、前記ペプチドいずれか1つのフラグメントを含んでもよい。従って、核酸は、前記ピーナッツアレルゲン1つのフラグメントをコードするヌクレオチドを含んでよい。
【００４１】
いくつかの実施態様において、ピーナッツアレルゲンは、8塩基以上の反復配列を天然のピーナッツアレルゲン配列から除去することにより改変（modified）されたピーナッツアレルゲンを含む。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、2つ以上のピーナッツアレルゲンを含む。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、2つ以上のピーナッツアレルゲンを含み、そのうちの少なくとも1つは、ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6、又はそのホモログを含む。
【００４２】
いくつかの実施態様において、単一の融合タンパク質の発現を促進するために、核酸は、ピーナッツアレルゲンをコードする2つの配列間に終止コドンを持たない。
【００４３】
プロテアソーム分解タグ
本発明者らは、驚くべきことに、融合タンパク質の構成要素としてプロテアソーム分解タグ（例えば、ユビキチン）を使用することにより、非ユビキチン化ピーナッツアレルゲンペプチド構築物が組換え発現に対して有する明らかな毒性作用及び／又は阻害作用が克服され得ることを発見した。プロテアソーム分解タグを使用することにより、発現される融合ペプチドがプロテアソーム分解の標的とされる。ユビキチンを標的としたプロテアソーム分解の結果、融合ペプチドの小ペプチドフラグメント（例えば、約8〜12アミノ酸長のペプチド）は小胞体（ER）に入り、そこでMHCクラスIタンパク質と複合体化され、その後、細胞表面へと輸送されてTリンパ球に提示される。結果として、MHCクラスIでの融合ペプチドフラグメントの提示が高められ、ピーナッツアレルゲンに対して、より大きなTH1免疫応答がもたらされる。従って、プロテアソーム分解タグは、予想外にも、インタクトなピーナッツアレルゲンペプチド構築物が宿主細胞において組換え発現を阻害することを予防し、且つ免疫応答をTH1表現型へと偏らせる。
【００４４】
プロテアソーム分解タグは、融合タンパク質をプロテアソーム分解の標的とする任意のタグであってよい。いくつかの実施態様において、プロテアソーム分解タグは、ユビキチン分子又はユビキチン結合ドメインを含んでよい。一実施態様において、プロテアソーム分解タグは、ユビキチンモノマーであり、その説明例はユビキチンCである。いくつかの実施態様において、ユビキチンモノマーは、配列番号2のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70％のヌクレオチド配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４５】
いくつかの実施態様において、ユビキチンモノマーのC末端はアラニン残基である。
【００４６】
別の実施態様において、ユビキチンモノマーは、配列番号1のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも70％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。
【００４７】
プロテアソーム分解タグをコードする配列は、少なくとも1つのピーナッツアレルゲンをコードする配列の前又は後ろに置かれてよい（すなわち、タンパク質分解タグは、融合タンパク質のC末端又はN末端であってよい）。
【００４８】
ユビキチン分子は、任意の適した種に由来してよい。ヒト治療を対象とするワクチンのために、ユビキチン分子は、ヒトユビキチン分子、又は別の動物種のユビキチン分子（ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されていてよい）であってよい。いくつかの実施態様において、ユビキチン分子はユビキチンCモノマーであってよい。ユビキチン分子は、発現されると、他のユビキチン分子を引き寄せてこれと結合し、融合タンパク質上でポリユビキチン鎖を形成し得る。ユビキチン分子及び／又はポリユビキチン鎖は、融合タンパク質をプロテアソーム分解へと向かわせ得る。
【００４９】
いくつかの実施態様において、核酸構築物は、複数のユビキチン分子、又は切断（truncated）若しくは改変（modified）されたユビキチン分子をコードする1つ以上の配列を動作可能（operably）にコードする。複数のユビキチン分子がコードされる場合には、融合タンパク質全体の翻訳を可能にするために、1つ以上の開始及び終止コドンが除去されてよい。
【００５０】
いくつかの実施態様において、切断されたユビキチン分子は、天然ユビキチン分子のC末端に最も近いリジンの排除を伴い得る。いくつかの実施態様において、改変されたユビキチン分子は、天然配列の1つ以上のリジンが、配列から除去又は置換（例えば、アルギニンで）されてよい。いくつかの実施態様において、ユビキチン分子は、単一のリジンのみを有してよい。
【００５１】
いくつかの実施態様において、ユビキチン分子のC末端は改変されてよい。例えば、天然分子のC末端グリシンはアラニンで置換されてよい。グリシンをアラニン又は別のアミノ酸で置換することにより、アレルゲンからプロテアソーム分解タグがプロテアーゼ切断されることを妨げ得る。グリシンのアラニンでの置換はまた、プロテアソーム分解タグとアレルゲンとの間での共有結合の形成を可能にし得る。この共有結合は、プロテアーゼ切断に対して抵抗性であり得る。
【００５２】
いくつかの実施態様において、プロテアソーム分解タグはユビキチン結合ドメインを含んでよい。タンパク質分解タグは、UbL（ユビキチン様（ubiquitin-like））-UBA（ユビキチン結合（ubiquitin-associated））ドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであってよい。これに関して、発現される融合タンパク質は、結合ドメインとユビキチン分子との結合を引き出し得、融合タンパク質のプロテアソーム分解が導かれる。
【００５３】
融合タンパク質
いくつかの実施態様において、核酸配列は、対象における発現のために最適化されている融合タンパク質をコードする。例えば、ピーナッツアレルゲン融合タンパク質に対する配列は、ヒト細胞における発現のために最適化され得る。同様に、いくつかの実施態様において、プロテアソーム分解タグは、対象における発現のために最適化され、且つ／或いは所望の対象と同じ種からクローニングされたプロテアソーム分解タグであってよい。いくつかの実施態様において、コドン最適化は、あるコドンを、同じアミノ酸をコードするが、標的の種（例えば、ヒト）においてより効率的又は正確に翻訳される異なるコドンで置換することを伴う。
【００５４】
いくつかの実施態様において、対象における発現のための配列最適化はまた、反復配列の除去を含む。例えば、いくつかの実施態様において、8塩基以上の反復配列がピーナッツアレルゲン配列から除去される。これは、バック・トランスレーション（back translation）によって配列を合成的に構築する場合に特に重要であり得る。合成配列は、通常、進化を通じたコドン最適化の利点を欠く。従って、アミノ酸配列を変化させることなくヌクレオチド塩基を交換することによって、配列内にランダムに生じた不安定な反復配列を分断する（disrupting）ことにより、配列の発現が向上し得る。
【００５５】
いくつかの実施態様において、プロテアソーム分解タグは、配列番号1に従う核酸配列、又はそのホモログによりコードされる。いくつかの実施態様において、融合タンパク質のピーナッツアレルゲンは、配列番号3、配列番号5、配列番号7、及び／若しくは配列番号9に従う核酸配列、又は前記いずれか1つのホモログによりコードされる。
【００５６】
いくつかの実施態様において、プロテアソーム分解タグは、配列番号2に従うアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、融合タンパク質のピーナッツアレルゲンは、配列番号4、配列番号6、配列番号8、及び／又は配列番号10に従うアミノ酸配列を含む。
【００５７】
立体構造エピトープは、MHC-1提示に必要でなく、アレルゲン特異的IgE抗体結合を妨げるために、いくつかの点で望ましくないことから、融合タンパク質の一部として発現されるアレルゲンは、その天然の構造形態であることを必要としない。これは、使用されるべき複数のピーナッツアレルゲンを含む融合タンパク質を可能にし得、融合タンパク質の設計において柔軟性を提供する。
【００５８】
従って、いくつかの実施態様において、核酸構築物は、2つ以上のピーナッツアレルゲンを動作可能にコードする。例えば、融合タンパク質は、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれより多いピーナッツアレルゲンをコードしてよい。いくつかの核酸のために、アレルゲンの少なくとも1つは、以下のピーナッツアレルゲン又はそのホモログから選択されてよい：ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10、又はara h 11。説明例において、核酸構築物は、ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6、又はそのホモログを動作可能にコードする。例えば、核酸構築物は、配列番号11に従う核酸配列を含んでよく、或いは配列番号12に従うアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしてよい。
【００５９】
各アレルゲンは、それ自身のプロテアソーム分解タグと融合されてよく、それ自身のプロモーターと動作可能に結合されてよい（例えば、複数の融合タンパク質が発現されてよい）。或いは、プロテアソーム分解タグ及びアレルゲンに対する配列は、プロテアソーム分解タグ及び複数のアレルゲンを含む融合タンパク質の発現を可能にするよう配置されてよい。この後者のアプローチは、異なるアレルゲンの差次的な発現を妨げることができ、且つ／或いは複数の発現カセットを同一プロモーターとともに使用する場合の分子内組換えを妨げることができる。
【００６０】
2つ以上のアレルゲンを有する融合タンパク質の翻訳を可能にするために、核酸は、ピーナッツアレルゲンをコードする2つの配列間に終止コドンを持たなくてよい。いくつかの実施態様において、核酸配列は、ピーナッツアレルゲンをコードする配列のいずれかの配列間に終止コドンを持たなくてよく、且つ／或いはプロテアソーム分解タグをコードする配列とアレルゲンをコードする配列との間に終止コドンを持たなくてよい。
【００６１】
翻訳を推進するために、融合タンパク質の最初のパートをコードする配列は、配列の5’末端に開始コドンを含んでよい。開始コドンは、融合タンパク質の残りの部分をコードする配列にはなくてよい。これに関して、プロテアソーム分解タグと融合されていないアレルゲンの発現は、最小化又は妨げられ得る。これにより、インタクトなピーナッツアレルゲンが、細胞から分泌されるか又は細胞表面に提示されることを最小化又は妨げることができ、そうでなければアレルゲンに対するTH2免疫応答が刺激され得る。
【００６２】
一実施態様において、融合タンパク質は、配列番号12のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６３】
別の実施態様において、融合タンパク質は、配列番号11の核酸配列、又はそれと少なくとも70％の同一性を有する核酸配列によりコードされる。
【００６４】
いくつかの実施態様において、インタクトなタンパク質として融合タンパク質の発現を促進し、且つ各アレルゲンの差次的な発現を低下させるために、ベクターは、インタクトな融合タンパク質の発現を促進するための転写調節配列（例えば、プロモーター）及び単一の開始コドンを含む。
【００６５】
いくつかの側面において、本発明は、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作（desensitizing）する又は対象において寛容を誘導するための核酸カセットであって、i）本明細書に記載するようなワクチン、及びii）該カセットの配列の各末端における末端制限酵素リンカーを含む、核酸カセットを提供する。いくつかの実施態様において、少なくとも1つの末端制限酵素リンカーは、Pac1制限酵素認識／切断配列を含む。いくつかの実施態様において、カセットはウイルスベクターカセットである。
【００６６】
核酸構築物は、有利には、融合タンパク質をコードする核酸配列と動作可能に結合された転写調節配列を含んでよい。
【００６７】
用語「転写調節配列（transcriptional control sequence）」は、動作可能に結合された核酸の転写をもたらす任意の核酸配列を含むことが理解されるべきである。適切な転写調節配列は当業者に既知であろう。説明例として、リーダー、ポリアデニル化配列、プロモーター、エンハンサー又は上流活性化配列、及び転写ターミネーターが挙げられる。典型的には、転写調節配列はプロモーターを少なくとも含む。本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、細胞における核酸分子の発現をもたらす、活性化する又は高める任意の核酸を述べる。
【００６８】
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの転写調節配列は、融合タンパク質をコードする核酸と動作可能に結合される。本発明の目的のために、転写調節配列は、それが所与の遺伝子又は他のヌクレオチド配列の転写を促進、阻害又はそうでなければ調節（modulate）することができる場合に、その遺伝子又はヌクレオチド配列と「動作可能に結合される（operably connected）」とみなされる。
【００６９】
プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、臓器又は発生段階に関して、生理学的ストレス、病原体又は金属イオンなどの外部刺激に応答して、又は1つ以上の転写活性化因子に応答して、動作可能に結合されたヌクレオチド配列の発現を構成的又は差次的に制御し得る。従って、本発明のワクチン及び／又は方法に従って使用されるプロモーターとして、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又は活性化可能プロモーター（activatable promoter）が挙げられ得る。本発明は、対象の細胞において活性である任意のプロモーターの使用を企図する。
【００７０】
「組織特異的プロモーター」は、生物の1以上の特定（specific）の細胞、組織若しくは臓器において、及び／又は生物の1以上の発生段階において、選択的（preferentially）又は特異的に発現されるプロモーターを含む。組織特異的プロモーターは、構成的又は誘導性でもあることが理解されるべきである。
【００７１】
プロモーターはまた、1つ以上の転写活性化因子によって活性化可能であるプロモーターであってもよく、本明細書において「活性化可能プロモーター」と称する。例えば、活性化可能プロモーターは、とりわけ1つ以上の転写活性化因子に対するDNA結合部位を含む上流活性化配列（UAS）と動作可能に結合されたミニマルプロモーターを含んでよい。
【００７２】
本明細書で称する場合、用語「ミニマルプロモーター（minimal promoter）」は、少なくともRNAポリメラーゼ結合部位と、任意選択でTATAボックス及び転写開始点並びに／又は1つ以上のCAATボックスが組み込まれた任意のプロモーターを含むことが理解されるべきである。
【００７３】
上記のように、活性化可能プロモーターは、上流活性化配列（UAS）と融合されたミニマルプロモーターを含んでよい。UASは、転写活性化因子と結合してミニマルプロモーターを活性化できる任意の配列であってよい。例示的な転写活性化因子として、例えば以下が挙げられる：酵母由来転写活性化因子、例えば、Gal4、Pdr1、Gcn4及びAce1；ウイルス由来転写活性化因子、VP16；Hap1（Hach et al., J Biol Chem278：248-254, 2000）；Gaf1（Hoe et al., Gene 215（2）：319-328, 1998）；E2F（Albani et al., J Biol Chem 275：19258-19267, 2000）；HAND2（Dai and Cserjesi, J Biol Chem 277：12604-12612, 2002）；NRF-1及びEWG（Herzig et al., J Cell Sci113：4263-4273, 2000）；P/CAF（Itoh et al., Nucl Acids Res 28：4291 - 4298, 2000）；MafA（Kataoka et al., J Biol Chem 277：49903-49910, 2002）；ヒト活性化転写因子4（human activating transcription factor 4）（Liang and Hai, J Biol Chem 272：24088 - 24095, 1997）；Bcl10（Liu et al., Biochem Biophys Res Comm 320（1）：1-6, 2004）；CREB-H（Omori et al., Nucl Acids Res 29：2154 - 2162, 2001）；ARR1及びARR2（Sakai et al., Plant J24（6）：703-711, 2000）；Fos（Szuts and Bienz, Proc Natl Acad Sci USA 97：5351-5356, 2000）；HSF4（Tanabe et al., J Biol Chem 274：27845 - 27856, 1999）；MAML1（Wu et al., Nat Genet26：484-489, 2000）。
【００７４】
転写調節配列はまたターミネーターを含んでもよい。用語「ターミネーター」は、転写の終結をシグナルする、転写ユニット末端にあるDNA配列をいう。ターミネーターは、一次転写産物の3’末端へのポリアデニル化配列（polyadenylate sequences）の付加を促進するポリアデニル化シグナルを通常含む3’非翻訳DNA配列である。プロモーター配列と同様に、ターミネーターは、その使用が意図される細胞、組織又は臓器において動作可能である任意のターミネーター配列であってよい。いくつかの実施態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードする配列の3’にウイルス初期転写終止配列（viral early transcriptional stop sequence）を含んでよい。
【００７５】
ベクター
一実施態様において、核酸構築物は、ベクター中に動作可能に組み込まれる。
【００７６】
いくつかの実施態様において、ベクターは、真核細胞における発現に適した発現ベクターであってよい。本明細書で使用する場合、「ベクター」は、所望の配列が挿入され得る多数の核酸のいずれかであってよい。ベクターには、プラスミド、ファージミド及びウイルスゲノムが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、発現ベクターはまた、宿主細胞（例えば、細菌細胞）において複製可能であり、且つ組換えベクターが宿主細胞において複製する能力を保持するように、1つ以上のエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位をさらに含んでもよく、そこではベクターが決定可能（determinable）な様式で切断され得、所望のDNA配列がそこにライゲートされ得る。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌内でプラスミドのコピー数が増加するにつれて多数回生じ得るか、又は有糸分裂によって宿主が増殖（reproduce）する前に、宿主当たり1回のみ生じ得る。ファージの場合、複製は、溶菌フェーズ（phase）の間に能動的に、又は溶原フェーズの間に受動的に生じ得る。
【００７７】
発現ベクターは、標的細胞（例えば、ヒト細胞）において、挿入された核酸の発現を推進するための転写調節配列を含んでよい。転写調節配列は、上述のものを含み、例えば、プロモーターが挙げられる。
【００７８】
ベクターはさらに、ベクターが形質転換又はトランスフェクトされているか又はされていない細胞の同定に使用するのに適した、1つ以上の選択可能マーカー配列を含んでよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質又は他の化合物への抵抗性又は感受性のいずれかを増加又は減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当分野で既知の標準的なアッセイによりその活性が検出可能である酵素をコードする遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）、及び形質転換又はトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー又はプラークの表現型に目に見える影響を及ぼす遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）などの様々な蛍光タンパク質）が挙げられる。いくつかのベクターは、自律複製可能であってよく、エピソームベクターとも称される。或いは、ベクターは、染色体への挿入に適したものであってよい（いわゆる、組み込み型ベクター（integrating vectors））。ベクターは、細胞／組織特異的発現を媒介する転写調節配列（プロモーター配列）とともに提供されてよい。これらのプロモーター配列は、細胞／組織特異的、誘導性又は構成的であってよい。
【００７９】
いくつかの実施態様において、ベクターはウイルスベクターであってよい。適切なウイルスベクターは当業者に既知である。ウイルスベクターの説明例として、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスウイルスベクターが挙げられる。ポックスウイルスベクターとしては、例えば、アビポックスウイルスベクター（例えば、鶏痘又はカナリア痘）が挙げられ得る。いくつかの実施態様において、ポックスウイルスウイルスベクターは、複製が制限されたウイルスベクターであってよく、これには、例えば、改変ワクシニアウイルスアンカラ（Modified Vaccinia Ankara）（MVA）ウイルス、アビポックスウイルス、又は不活発（crippled）なワクシニアウイルスが含まれる。ウイルスベクターの使用は、ウイルスベクター自体が細胞上でのIL-12受容体発現を促進し得ることから、分解されたピーナッツアレルゲンペプチドフラグメントをMHCクラスI分子上で発現する細胞に対してTH1応答をさらに偏らせるのに有益であり得る。さらに、ウイルスベクターによる免疫細胞の活性化は、細胞間相互作用及びサイトカイン産生カスケードの複雑なネットワークを開始させ得、結果として、抗原依存性の様式で、TH1免疫機能の全体的な増強がもたらされる。
【００８０】
一実施態様において、ウイルスベクターはポックスウイルスウイルスベクターである。
【００８１】
いくつかの実施態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードする配列の3’にウイルス初期転写終止配列を含む。
【００８２】
クローニングを容易にするために、核酸構築物は、核酸カセット（すなわち、発現カセット）中に含まれてよい。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ピーナッツアレルゲンに対して対象を脱感作するための核酸カセットであって、本明細書に記載するような融合タンパク質を動作可能にコードする核酸構築物、及び該カセットの配列の各末端における末端制限酵素リンカーを含む、核酸カセットを提供する。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「核酸カセット」は、核酸分子（例えば、本明細書に記載するような核酸構築物）をベクター又はゲノムへと導入するように設計された核酸配列を意味することを意図する。
【００８４】
カセットは、典型的には、カセットの配列の各末端に末端制限酵素リンカーを含むだろう。各末端の末端制限酵素リンカーは、同一又は異なる末端制限酵素リンカーであってよい。いくつかの実施態様において、各末端に同一の末端制限酵素リンカーを有することは、細菌細胞におけるカセットの複製を所望する場合（且つカセットが複製起点を含む場合）、該カセットを適切な制限酵素で消化して、その末端を共にライゲートすることによりカセットを環化し得ることから有利であり得る。同様に、環状カセットは、該カセットを単一の制限酵素で消化することにより直鎖化され得る。
【００８５】
いくつかの実施態様において、末端制限酵素リンカーは、核酸、又はベクター若しくはゲノムであってカセットが導入されるべきもの、の意図しない消化が生じないように、稀な制限酵素認識／切断配列を含んでよい。いくつかの実施態様において、末端制限酵素リンカーはPac1制限酵素認識／切断配列を含む。
【００８６】
カセットは、哺乳動物発現ベクター、細菌発現若しくはクローニングベクター、昆虫発現ベクター、植物発現ベクター又はウイルスベクターにクローニングされてよい。従って、カセットは、哺乳動物ベクターカセット、細菌ベクターカセット、昆虫ベクターカセット、植物ベクターカセット又はウイルスベクターカセットであってよい。
【００８７】
ピーナッツアレルギーの治療及び予防
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のワクチンが、偏った抗ピーナッツタンパク質TH1免疫応答を生じさせ、現存するアレルゲン特異的TH2免疫応答を支配し、そうすることで、その後のピーナッツアレルゲン暴露に対して個体を脱感作することを発見した。さらに、TH1サイトカイン（例えば、IFNγ、IL-12、TGF-β、IL2など）の発現により、TH2サイトカイン（例えば、IL-3、IL-4、IL-5、IL6、IL10など）の発現を低下させることができ、アレルゲンに対する免疫応答をTH1免疫応答へと偏らせ、その結果、IgE抗体産生B細胞、マスト細胞及び好酸球の活性化及び／又は動員が阻害又は改善され、それにより、その後のアレルゲン暴露に対するアレルギー反応（例えば、アナフィラキシー反応）が低下又は予防される。従って、本発明のワクチンは、対象におけるピーナッツアレルギーの治療に使用するのに適している。
【００８８】
本発明者らはまた、驚くべきことに、本発明のワクチンが、既存のピーナッツアレルギーとは独立したピーナッツアレルゲンに対して、偏ったTH1免疫応答を生じさせることも発見した。従って、本発明のワクチンは、そのリスクがあり得る対象におけるピーナッツアレルギーの予防に使用するのに適している。
【００８９】
従って、別の側面において、対象におけるピーナッツアレルゲンに対する寛容の誘導、又はそのための医薬の製造における、本明細書に開示のポックスウイルスベクターの使用を提供する。
【００９０】
一実施態様において、本明細書に開示のポックスウイルスベクターは、ピーナッツアレルギーを発症するリスクのある対象において、ピーナッツアレルギーを予防又は改善するための予防薬として使用される（すなわち、ピーナッツアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクのある対象において寛容が誘導され得る）。ピーナッツアレルギーを発症するリスクのある対象は、花粉症、喘息若しくは他の食物アレルギーなどのアレルギーに既に罹患している人、又はアレルギーの家族歴を有する人を含んでよい。
【００９１】
別の側面において、対象においてピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導する方法であって、例えば対象においてピーナッツアレルゲン特異的TH1応答を誘導することなどによって、抑制及び／又は寛容を引き出すのに十分な時間及び条件下にて、本明細書に開示のポックスウイルスベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「アレルギー反応」、「アレルギー」、「アレルギー性障害（allergic disorder）」などは、免疫系が、それ以外には無害の環境物質に対して過敏である免疫障害を意味するものと理解されるべきである。アレルギーを引き起こすこれらの環境物質は、「アレルゲン」と称される。一般的なアレルギーには、季節性鼻結膜炎（例えば、ブタクサやオオアワガエリなどの草及び花粉に対するアレルギー）、ネコの鱗屑又はイヌの鱗屑などのペットの鱗屑に対するアレルギー、ピーナッツ、乳製品及び小麦アレルギーなどの食物アレルギー、ハチ毒アナフィラキシー及び喘息が含まれる。アレルギー性障害は、典型的には、IgEの産生を特徴とする。
【００９３】
アレルギー性疾患は、それ以外には無害の環境抗原に対する免疫応答によって生じ、TH2 T細胞の産生を特徴とし、これにより、IL-4及びIL-5が産生され、B細胞のIgE抗体分泌細胞への分化が促進される。IgE抗体は、好塩基球及びマスト細胞上の高親和性受容体と結合する。アレルゲン暴露により、表面IgEによるアレルゲン分子の結合、及び受容体の架橋が導かれ、それにより、好塩基球及びマスト細胞の活性化及び脱顆粒が引き起こされる。後者は、予め生成された様々な炎症促進性及び血管作動性の化合物、例えば、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン及びサイトカインなどを放出し、炎症反応を引き起こす。マスト細胞及び好塩基球の表面と結合するIgE抗体とピーナッツアレルゲンとの結合は、最終的にアレルギー反応へと至る起因事象である。マスト細胞及び／又は好塩基球と結合したIgEとアレルゲンとの結合を妨げることにより、アレルギー反応の発症が予防されるだろう。ピーナッツアレルゲンへの暴露に際しアレルゲン特異的IgEの産生を予防することは、ピーナッツに対する寛容を誘導するだろう。
【００９４】
本明細書で使用する場合、用語「寛容（tolerance）」は、ピーナッツアレルゲン暴露に対するアレルギー反応の阻害（部分的又は完全な）を意味すると解される。阻害は、アレルギー反応の予防、遅延、低下、抑止（abrogation）、又はそうでなければ妨害（hindrance）であってよい。かかる阻害は、大きさの性質であってよく、及び／又は時間的性質であってよい。特定の状況において、用語「阻害する（inhibit）」及び「予防する（prevent）」、並びにそのバリエーションは、交換可能に使用されてよい。寛容は、当業者に既知の任意の手段によって評価され得る。説明例として、本明細書に開示のポックスウイルスベクターでの治療の前及び／又は後に、皮膚プリックテストを用いて、アレルゲン又は複数のアレルゲンに対する対象の反応を測定することができる。例えば、ピーナッツに対してアレルギーがある対象において、1つ以上のピーナッツアレルゲンを用いた皮膚プリックテストは、典型的には、局所的な発疹、蕁麻疹及び／又は腫脹を特徴とする、観察可能な局所的アレルギー反応を生じるだろう。本明細書に開示のポックスウイルスベクターで治療後の同一個体における寛容は、典型的には、皮膚プリックテストに対する局所的アレルギー反応の低下として現れるだろう。この低下は、例えば、治療前後の局所的アレルギー反応のサイズ（例えば、直径）の差などによって測定できる。
【００９５】
別の説明例において、寛容は、ピーナッツアレルゲンへの突発的暴露後のアレルギー反応の重症度の予防、遅延、阻害、低下、抑止又は妨害により評価される。例えば、ある対象がピーナッツアレルゲン暴露に対するアナフィラキシー反応歴を有する場合、本発明に従うポックスウイルスベクターでの治療結果としての寛容は、たとえ対象が発疹などの他のアレルギー反応サインを示す場合があるとしても、その後のピーナッツアレルゲン暴露後にアナフィラキシー反応が存在しないことにより決定されてよい。
【００９６】
別の説明例において、寛容は、対象において循環ピーナッツアレルゲン特異的IgE抗体レベルを決定することにより評価される。例えば、ピーナッツアレルゲン暴露に対するアレルギー反応（アナフィラキシー反応を含む）歴を有する対象は、典型的には、例えばピーナッツアレルギーを有さない対象などと比較して、より高いレベルのピーナッツアレルゲン特異的IgE抗体を有するだろう。かかる個体において、寛容は、本発明のワクチンでの治療後に、循環ピーナッツアレルゲン特異的IgE抗体レベルが低下することにより決定されてよい。代替的又は追加的に、寛容は、本発明のポックスウイルスベクターでの治療後に、循環ピーナッツアレルゲン特異的IgG抗体レベルが高まることにより決定されてよく、これは、TH1免疫応答の特徴であり、典型的には寛容状態を示すものである。
【００９７】
代替的又は追加的に、寛容は、対象から得られたサンプル（例えば、血漿又は血清サンプルを含む血液サンプル）におけるサイトカインプロファイルを評価することにより決定されてよい。例えば、より高いレベルのIFN-γは、アレルゲン特異的TH1応答への偏りを示し、一方で、より高いレベルのIL-4及び／又はIL-5は、アレルゲン特異的TH2応答への偏りを示す。
【００９８】
代替的又は追加的に、寛容は、本明細書に開示するように、本発明に従うポックスウイルスベクターで治療されている対象からTリンパ球サンプルを得て、該リンパ球のサイトカインプロファイルをex vivoで測定することにより決定されてよい。例えば、Tリンパ球による、より高いレベルのIFN-γ産生は、アレルゲン特異的TH1応答への偏りを示し、一方で、Tリンパ球による、より高いレベルのIL-4及び／又はIL-5産生は、アレルゲン特異的TH2応答への偏りを示す。TH1応答とTH2応答とを区別可能な、ピーナッツアレルゲン特異的IgE及び／又はIgG抗体並びにサイトカインのレベルを測定する方法は、当業者に既知であろう。説明例には、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）が含まれる。
【００９９】
本明細書に開示のポックスウイルスベクターは、それを必要とする対象において所望の治療的又は予防的効果（すなわち、ピーナッツアレルゲンに対する寛容の誘導）を提供する、単回投与又は一連の投与の一部としてのいずれかで投与されるべきであることが当業者に理解されるだろう。望ましくない作用、例えば副作用は、所望の治療的及び／又は予防的効果と共に現れる場合があり得る；それゆえ、医師は、通常、適切な有効量を決定する際に、潜在的リスクと潜在的利益とのバランスをとるだろう。必要とされるワクチンの正確な量は、対象の種、年齢及び全身状態、投与様式などに応じて対象ごとに異なるだろう。従って、正確な有効量を特定することが可能でない場合がある。しかしながら、任意の個々のケースにおける適切な有効量は、ルーチンなスキル又は実験を用いて、当業者により決定され得る。当業者ならば、対象のサイズ及び体重、対象の症状の重症度、並びに提案される投与経路のような因子に基づいて、必要な量を決定できるだろう。
【０１００】
用語「治療」は、ピーナッツアレルギーの1以上の症状における、少なくとも複数の対象での、任意の測定可能又は統計的に有意な阻害又は改善をいう。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、本明細書に開示のポックスウイルスベクターは、1つ以上のピーナッツアレルゲンに対するピーナッツアレルギーを有する対象（すなわち、1つ以上のピーナッツアレルゲンに対して過敏である対象）を脱感作するために利用される。用語「対象を脱感作する」は、ピーナッツアレルゲンに関して本明細書で使用する場合、ピーナッツアレルゲンに対する対象の感受性（sensitivity）を低下、改善又は排除することを意味することが意図される。これに関して、対象におけるピーナッツアレルギーの症状は、1つ以上のピーナッツアレルゲンへの再暴露に際して、部分的又は完全に低下する。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、代替的又は追加的に、核酸配列は、対象において1つ以上のピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導するために利用される。1つ以上のピーナッツアレルゲンに対する寛容の誘導は、ピーナッツアレルギーを有する対象において実施されるか、又はピーナッツアレルギーを発症するリスクがあり得る対象において実施される（すなわち、核酸は、ピーナッツアレルギーの予防的治療の一部として利用されてよい）。
【０１０３】
本明細書に開示のポックスウイルスベクターは、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導するために種々の方法で利用されるが（本明細書に記載するように）、ポックスウイルスベクターが機能する一般的原理は同一である。融合ペプチドが細胞で発現される場合、それはプロテアソーム分解タグによってプロテアソーム分解の標的とされ、これにより、インタクトな融合タンパク質が細胞から分泌されることが妨げられる。
【０１０４】
一実施態様において、ピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導するために対象にワクチン接種する方法であって、本明細書に開示するようなポックスウイルスベクターを投与することを含む、方法を提供する。特定の実施態様において、該方法は、少なくとも2つ又は少なくとも3つの主要なピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導するためのものである。
【０１０５】
本発明は、本明細書に開示するようなポックスウイルスベクターを含むキットにも及ぶ。
【０１０６】
本発明のポックスウイルスベクターは、当分野で既知の方法により、in vivo又はex vivoにて細胞にデリバリーされてよい（例えば、ネイキッドDNAとして又はベクター中で）。説明例として、ウイルスデリバリー、マイクロインジェクション、遺伝子銃、インペイルフェクション（impalefection）、静水圧、エレクトロポレーション、ソニケーション、及び／又はリポフェクションが挙げられる。ポックスウイルスベクターはまた、医薬組成物として細胞にデリバリーされてもよい。
【０１０７】
リポソームは、ポックスウイルスベクターのためのキャリアとして働き得る。リポソームは脂質ベースの小胞であり、後に患者へと導入される選択治療剤（例えば、ベクター）を包含する。リポソームは、純粋なリン脂質、又はリン脂質とホスホグリセリドとの混合物のいずれかから製造されてよい。典型的には、リポソームは、直径200 nm未満で製造でき、これにより静脈内注射が可能となり、肺毛細血管床を通過することができる。さらに、リポソームの生化学的性質は、選択組織へアクセスするために血管メンブレンを通過する透過性に寄与する。
【０１０８】
ポックスウイルスベクターは裸（naked）であってよく、すなわち、レシピエントの免疫系に影響を及ぼし得る任意のタンパク質又は他の作用物質（agents）を伴わなくてよい。この場合、ポックスウイルスベクターは、生理学上許容される溶液中、例えば、滅菌生理食塩水（saline）又は滅菌緩衝生理食塩水（これらに限定されない）中などにあることが望ましい。或いは、ワクチンは、リポソーム、例えば、レシチンリポソーム又は当分野で既知の他のリポソームなどと関連してよい。核酸分子の細胞取り込みを助ける作用物質、例えばカルシウムイオン（これに限定されない）などを用いてもよい。
【０１０９】
非ウイルスベクターの場合、レシピエントへ導入されるべき核酸の量は、非常に広範な投与量範囲となるだろうし、例えば、使用される転写及び翻訳プロモーターの強度に依存し得る。さらに、免疫応答の大きさは、タンパク質発現レベル、及び発現される融合タンパク質産物の免疫原性に依存し得る。有効用量範囲は、約1 ng〜5 mg、約100 ng〜2.5 mg、約1 μg〜750 μg、又は約10 μg〜300 μgの核酸（例えば、ポックスウイルスベクターの一部として）を含んでよい。
【０１１０】
ポックスウイルスベクターは、アジュバント又は他の物質であって、DNA取り込みを促進するか又は接種部位に免疫系細胞を動員する能力を有するものの存在下、皮下、筋内、皮内、又は他の様式、例えば、腹腔内、静脈内若しくは吸入などにより、投与又は接種されてよい。選択される投与経路は、組成物及び患者の疾患状態に依存するだろう。関連のある考慮事項には、活性化されるべき免疫細胞のタイプ、抗原が免疫系に暴露される時間、及び免疫化スケジュールが含まれる。ブースター治療が提供されてよいことも企図される。
【０１１１】
本明細書に記載するように、ポックスウイルスベクターは、細胞における融合タンパク質の発現により対象を脱感作（すなわち、対象において寛容を誘導）することができる。融合タンパク質は細胞内で分解され、分解されたピーナッツアレルゲンフラグメントは、MHCクラスI分子と会合して細胞表面上に発現される。いくつかの実施態様において、本発明の方法の間、インタクトでない発現ピーナッツアレルゲンが、対象の免疫系に暴露される。これは、発現される融合タンパク質の細胞内プロテアソーム分解を推進するプロテアソーム分解タグのためである。
【０１１２】
ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する方法は、ポックスウイルスベクター、又はポックスウイルスベクターを含む医薬組成物を対象に投与することを伴ってよい。従って、本発明は、ピーナッツアレルゲンに対して対象を脱感作する方法であって、対象の細胞中で融合タンパク質を発現させることを含み、ここで、発現される融合タンパク質のプロテアソーム分解タグが、該融合タンパク質を、細胞内プロテアソーム分解、及び分解されたピーナッツアレルゲンペプチドとMHCクラスI分子との会合（association）の標的として、該ピーナッツアレルゲンに対するTH1応答の生成を促進し、それゆえ、該ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する、方法を提供する。
【０１１３】
本発明はまた、対象においてピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導するための予防的治療方法であって、対象の細胞中で融合タンパク質を発現させることを含み、ここで、発現される融合タンパク質のプロテアソーム分解タグが、該融合タンパク質を、細胞内プロテアソーム分解、及び分解されたピーナッツアレルゲンペプチドとMHCクラスI分子との会合の標的として、該ピーナッツアレルゲンに対するTH1応答の生成を促進し、それゆえ、該ピーナッツアレルゲンに対する対象の感受性（sensitivity）を予防する、方法を提供する。
【０１１４】
これらの方法は、in vivoにて細胞中で融合タンパク質を発現させることを伴い得るが、他の方法は、ex vivoにて細胞中で融合タンパク質を発現させることを含み得る。従って、本発明はまた、融合タンパク質を発現する細胞を提供する。これに関して、該細胞は、in vitro実験、in vivo治療、及び／又はex vivo治療のために使用されてよい。
【０１１５】
対象
用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書において交換可能に使用されて、本開示が適用可能であり得る任意の対象、特に脊椎動物対象、さらにとりわけ哺乳動物対象をいう。本発明の範囲内にある適切な脊椎動物として、霊長類、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ目動物（logomorphs）（例えば、ウサギ、野ウサギ）、ウシ属動物（bovines）（例えば、ウシ）、ヒツジ類（ovines）（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（caprines）（例えば、ヤギ）、ブタ類（porcines）（例えば、ブタ）、ウマ科動物（equines）（例えば、ウマ）、イヌ科動物（canines）（例えば、イヌ）、ネコ科動物（felines）（例えば、ネコ）、鳥類（avians）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガン、ペットのトリ、例えば、カナリア、セキセイインコなど）、海洋哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲなど）及び魚類を含む、脊索動物亜門（subphylum Chordata）の任意の一員が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、対象は霊長類（例えば、ヒト、類人猿、サル、チンパンジー）である。
【０１１６】
好ましい実施態様において、対象はヒトである。従って、いくつかの実施態様において、融合タンパク質をコードする核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。
【０１１７】
医薬組成物
本発明に従うポックスウイルスベクターは、医薬上又は生理学上許容される担体（carrier）及び／又は希釈剤を含む形態で提供されてよい。
【０１１８】
従って、別の側面において、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導するための医薬組成物であって、本明細書に開示のポックスウイルスベクター及び医薬上許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０１１９】
医薬組成物は、従来の薬剤調合（pharmaceutical compounding）技術に従って、都合よく調製される。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A., 1990を参照。これらの組成物は、活性物質の1つに加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤、又は当分野で公知の他の材料を含んでよい。かかる材料は、非毒性であるべきであり、且つ活性成分の有効性を妨げるべきでない。担体は、投与（例えば、静脈内、経口又は非経口）に望まれる調製物の形態に応じて、広範な形態をとり得る。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、本発明は、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する方法であって、対象の細胞中で、本明細書に記載するような融合ペプチドを発現させることを含み、ここで、発現される融合タンパク質のプロテアソーム分解タグが、該融合タンパク質を、細胞内プロテアソーム分解、及び分解されたピーナッツアレルゲンペプチドとMHCクラスI分子との会合の標的として、該ピーナッツアレルゲンに対するTH1応答の生成を促進し、それゆえ、該ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する、方法を提供する。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本発明は、対象においてピーナッツアレルゲンに対する寛容を誘導するための予防的治療方法であって、対象の細胞中で、本明細書に記載するような融合ペプチドを発現させることを含み、ここで、発現される融合タンパク質のプロテアソーム分解タグが、該融合タンパク質を、細胞内プロテアソーム分解、及び分解されたピーナッツアレルゲンペプチドとMHCクラスI分子との会合の標的として、該ピーナッツアレルゲンに対するTH1応答の生成を促進し、それゆえ、該ピーナッツアレルゲンに対する対象の感受性を予防する、方法を提供する。
【０１２２】
本発明者らは、驚くべきことに、ピーナッツアレルゲン及びプロテアソーム分解タグを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポックスウイルスベクターが、ワクチン接種に際して、ピーナッツ特異的TH1免疫応答を生じさせ得る（ピーナッツアレルゲン特異的IgG2a抗体の産生、及びリンパ球からのピーナッツアレルゲン誘導性のTH1サイトカイン分泌により測定されるように）ことを発見した。このポックスウイルスベクターは、ピーナッツアレルゲン特異的TH1免疫応答を刺激したことから、当然、本明細書に開示のポックスウイルスベクターは、ピーナッツアレルゲンに対してアレルギーがある対象を脱感作（すなわち、対象において寛容を誘導）するために使用できるということになる。
【０１２３】
本発明はまた、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導するための核酸配列であって、該核酸が、プロテアソーム分解タグ及びピーナッツアレルゲンを含む融合タンパク質をコードする配列を含む、核酸配列を提供する。核酸は、遺伝子ワクチンとして使用されてよい。
【０１２４】
本明細書に記載するように、いくつかの実施態様において、核酸は、in vivoにて細胞中でのユビキチン化融合タンパク質の発現を可能にするよう対象に投与され得る発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）又は医薬組成物中に含まれる。或いは、核酸は、ex vivo細胞（例えば、抗原提示細胞）で発現され、次いで、これを対象に投与してよい。代替的又は追加的に、トランスフェクトされた細胞を用いて、ex vivoにてTH1リンパ球集団を刺激及び増大させることができ、次いで、これを対象に投与する。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、提示されたピーナッツアレルゲンペプチドに対するTH1メモリーの確立により、その後のピーナッツアレルゲン暴露に際し、ピーナッツアレルゲンに対するTH2免疫応答が予防又は低下され得る。いくつかの実施態様において、ピーナッツアレルゲンに対するTH1メモリーは、ピーナッツアレルゲン特異的CD8+T細胞の活性化及び維持により確立される。
【０１２６】
細胞
本発明の別の側面において、本明細書に記載するような融合タンパク質を発現する細胞、例えば、宿主細胞又は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）などを提供する。次いで、融合タンパク質を発現するトランスフェクト細胞を用いて、in vivo又はex vivoにて、ピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球集団を生成及び／又は増大（expand）し得る。従って、一実施態様において、本開示は、ex vivoにてピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球集団を生成及び／又は増大する方法であって、本明細書に記載するような細胞（すなわち、融合タンパク質を発現するトランスフェクト細胞）を1つ以上のTリンパ球とともに培養することを含む、方法を可能にする。別の実施態様において、本開示は、in vivoにてピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球集団を生成及び／又は増大する方法であって、本明細書に記載するようなトランスフェクト細胞を、それを必要とする対象において投与することを含み、ここで、投与されたトランスフェクト細胞が、対象においてナイーブT細胞を活性化してピーナッツアレルゲン特異的TH1細胞にする、方法を可能にする。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、本発明は、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する方法であって、i）対象からリンパ球を集めること；ii）該リンパ球を、本明細書に記載するような細胞（すなわち、本明細書に開示の融合タンパク質を発現するトランスフェクト細胞）と共培養して、細胞上でMHCクラスI分子と会合したプロテアソーム分解されたピーナッツアレルゲン融合タンパク質を認識するTH1リンパ球集団を生成及び／又は増大すること；並びにiii）（ii）からのTH1リンパ球を該対象に投与すること、を含む方法を提供する。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）を含んでよい。原核細胞は、核酸構築物（例えば、ベクター形態）を複製するために、及び／又は様々なクローニングステップで使用されてよい。いくつかの実施態様において、細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含んでよい。これに関して、本発明はまた、融合タンパク質を動作可能にコードする核酸構築物を発現する細胞を含む。
【０１２９】
本明細書に開示するようなポックスウイルスベクターは、ナイーブ抗原提示細胞を活性化するためにも使用でき、次いで、これを対象に再導入して戻して、ナイーブT細胞を活性化しピーナッツアレルゲン特異的TH1細胞にすることができる。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導する方法であって、i）対象から抗原提示細胞を集めること；ii）該抗原提示細胞を、本明細書に記載するような細胞（すなわち、本明細書に開示の融合タンパク質を発現するトランスフェクト細胞）と共培養して、活性化TH1抗原提示細胞集団の集団を生成及び／又は増大すること；並びにiii）（ii）からの活性化TH1抗原提示細胞を該対象に投与して、Tリンパ球をアレルゲン特異的TH1表現型へと活性化すること、を含む方法を提供する。適切なナイーブ抗原提示細胞は当業者に既知であろう。説明例として、樹状細胞及び線維芽細胞が挙げられる。
【０１３０】
融合タンパク質を発現する細胞のタイプは、該細胞が、MHCクラスI分子を発現する有核細胞であるべきという点でのみ制限される。これに関して、細胞は、細胞株（例えば、CHO細胞株、HEK細胞株、線維芽細胞株など）由来の細胞、又は初代細胞（例えば、線維芽細胞、樹状細胞）であってよい。細胞がex vivo自家移植治療（autologous treatment）として意図される実施態様において、該細胞は、対象から容易に取り出され得る細胞（例えば、血液、リンパ液、骨髄中の細胞）及び／又は組織サンプルから容易に培養され得る細胞（例えば、線維芽細胞）であってよい。いくつかの実施態様において、細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、上皮細胞など）であってよく、又は非プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵β細胞、血管内皮細胞など）であってよい。
【０１３１】
ex vivoにて細胞中で融合タンパク質を発現させること（例えば、本明細書に開示のポックスウイルスベクターを細胞にトランスフェクトすること）は、核酸を発現する細胞数をコントロールし得るという点で有利であり得る。さらに、広範な核酸デリバリーシステムが、ex vivoにて細胞に利用可能である。次いで、融合タンパク質を発現する細胞（すなわち、トランスフェクト細胞）を対象に投与して、該対象におけるナイーブT細胞をピーナッツアレルゲン特異的TH1表現型へと活性化してよく、次いで、1つ以上のピーナッツアレルゲンに対して、対象を脱感作する又は対象において寛容を誘導することができる。或いは、融合タンパク質を発現する細胞をex vivoにてリンパ球と培養してピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球を生成してよく、次いで、これを対象に投与してよい。
【０１３２】
従って、本発明はまた、ex vivoにてピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球を生成及び／又は増大する方法であって、融合タンパク質を発現する細胞を1つ以上のTリンパ球と培養することを含む、方法を提供する。Tリンパ球は、混合リンパ球集団中に含まれてよく、又は単離されたTリンパ球であってよい。混合リンパ球集団は、当分野で既知の方法により、末梢血、リンパ液又は骨髄から容易に得られ得る。T細胞は、当分野で既知の方法により、かかる混合リンパ球集団から単離されてよく、該方法には、例えば、ナイロンウール分離（nylon wool isolation）、FACSソーティング、磁気ビーズ分離などが含まれる。いくつかの実施態様において、核酸を発現する細胞との培養のために、特定のTリンパ球サブセットを単離してよい。
【０１３３】
本明細書に開示するように、ex vivoにて細胞をトランスフェクトして融合タンパク質を発現させる場合、並びに／又はex vivoにてTH1リンパ球集団を生成及び／若しくは増大する場合には、自己細胞（すなわち、治療されるべき対象に由来する細胞）を使用することが多くの場合望ましく、それにより、同種異系細胞（すなわち、異なる対象に由来する細胞）を用いて対象に投与する場合に生じ得る免疫応答が回避又は最小化されることが当業者に理解されるだろう。
【０１３４】
ピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球のex vivoでの増大は、多数のピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球を生成するために使用されてよく、次いで、ピーナッツアレルギーの予防的又は治療的処置として、これを対象に投与してよい。いくつかの例において、ex vivoでの増大は、ピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球の活性化及び増大を、in vivoでの活性化及び増大と比較して加速し得る。さらに、ex vivoでの増大は、増大されるピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球の数及び反応性をコントロールすることを可能にする。いくつかの実施態様において、ピーナッツアレルゲン反応性TH1リンパ球は、対象に対して自家性（autologous）であってよい。
【０１３５】
従って、本発明はまた、ピーナッツアレルゲンに対して対象を脱感作する方法であって、（i）対象からリンパ球を集めること；（ii）該リンパ球を、融合タンパク質を発現する細胞と共培養して、細胞上でMHCクラスI分子と会合したプロテアソーム分解された融合タンパク質ペプチドフラグメントを認識するTH1リンパ球を生成及び／又は増大すること；並びに（iii）（ii）からのTH1リンパ球を該対象に投与すること、を含む方法を提供する。いくつかの実施態様において、リンパ球は、本明細書に開示するようなポックスウイルスベクターの投与の前に対象から集められる。
【０１３６】
いくつかの実施態様において、前記方法は、対象に投与する前に、工程（ii）からリンパ球を単離することを含んでよい。工程（ii）からリンパ球を単離することは、核酸を発現する細胞から全てのリンパ球を単離することを含んでよく、且つ／或いは1つ以上のリンパ球タイプ（例えば、全てのT細胞リンパ球、全てのTH1リンパ球など）を単離することを含んでよい。或いは、（ii）からのTH1リンパ球は、融合タンパク質を発現する細胞からリンパ球を単離することなく対象に投与されてよく、この場合、投与される融合タンパク質発現細胞は、in vivoにて更なるTH1リンパ球を活性化し続け得る。対象からリンパ球を単離するための方法、T細胞及びT細胞サブセットを単離するための方法は、上記これらの方法を含む。
【０１３７】
また本明細書において、本発明に従って治療される対象から、単離の有無にかかわらず、Tリンパ球を得て、本明細書に開示するように、該リンパ球がTH1表現型へと偏っているかどうかを決定する（例えば、ex vivoにてサイトカイン発現プロファイルを決定する）、方法も可能である。このアプローチは、ポックスウイルスベクターの投与が、対象において、TH1に偏ったアレルゲン特異的免疫応答を誘導しているかどうかを決定するという追加の利点を有する。従って、いくつかの実施態様において、前記方法は、工程（ii）から単離されたリンパ球がTH1表現型へと偏っているかどうかを、対象に投与する前に決定することを含む。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、ピーナッツアレルゲンに対する対象の脱感作又は寛容誘導は、対象のその後のピーナッツへの暴露に対する過敏症反応を予防又は低下させ得る。従って、上記方法は、ピーナッツに対して既にアレルギーがある対象において、該対象のその後のピーナッツへの暴露に際し、ピーナッツに対するアナフィラキシー反応のリスクを低下させ得、且つ／或いはピーナッツアレルギーを発症するリスクのある対象において、ピーナッツに対するアナフィラキシー反応のリスクを低下させ得る。
【０１３９】
本発明を以下の非限定的な実施例によりさらに記載する。以下の記載は、特定の実施態様のみを記載する目的であり、先の記載について限定するものであることを意図しないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１４０】
材料及び方法
PHAV抗原の作製：ヒトユビキチンCモノマー（Ubc）及び4つのピーナッツアレルゲンを含む融合タンパク質（PHAV抗原）に対する核酸配列を以下に記載するように設計し、図1Aに示す。
【０１４１】
オンラインタンパク質配列データベースから、Ubc（NM_021009）、ara h 1（スイスプロットエントリーP43238）、ara h 2（TrEMBLエントリーQ8GV20）、ara h 3（Genbankタンパク質ACH91862）及びara h 6（UniProtKB/TrEMBLエントリーQ647G9）についてのアミノ酸配列を得た。開始コドンアミノ酸Met（M）をara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6タンパク質配列から除去し、その後、該配列をつないで1つの連続したタンパク質配列をUbc + ara h1 + ara h2 + ara h3 + ara h6の順序で形成した。このPHAVagタンパク質をコードするDNA配列をホモ・サピエンス（Homo Sapiens）コドン優先表（codon preferred table）を用いてバック・トランスレーションにより得た。
【０１４２】
Gene Designer（DNA2.0 Inc）を用いてPHAVagアミノ酸配列をヌクレオチド配列へとバック・トランスレーションし、10％閾値に設定したホモ・サピエンス（Homo Sapiens）コドン最適化を実施した。8塩基以上の反復配列もフィルタリングして除外した。得られた配列を、DNA2.0 Incにより、二次構造形成ポテンシャル及び不安定要素についてさらにスクリーニングした。PHAVagタンパク質配列の最終的なヌクレオチド配列をポックスウイルス初期転写モチーフ「TTTTTNT」についてスクリーニングした。しかしいずれも発見されなかった。
【０１４３】
PHAV抗原をコードするヌクレオチド配列の末端に「TAA」終止コドンを付加した。ポックスウイルス初期転写終止配列TTTTTATも終止コドンの直後に付加した。発現カセットの側面にPac Iリンカーを置いた。Pac I認識部位はカセット内に存在しないので、このカセットは、プラスミドへとクローニングされ、Pac I制限エンドヌクレアーゼ消化によりプラスミドから全体を切り出すことができた。
【０１４４】
表1に示すように、PHAV抗原中のUbc、ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6は、天然配列に対しておよそ75％の核酸配列同一性を有した。
【０１４５】
【表１】
0006549042.tif 000002
【０１４６】
PHAV抗原構築物及びその構成要素の核酸及びアミノ配列の概要を表2に記載する。
【０１４７】
【表２】
0006549042.tif 000003
【０１４８】
代替的PHAV抗原の作製：以下のタンパク質コーディング配列の融合から構成されるPHAV抗原タンパク質配列を含むユビキチン化ピーナッツ低アレルギー（hypo-allergy）ワクチン抗原（UBc.PHAVag）を作製した：ユビキチンCモノマー、ピーナッツアレルゲンara h 1、ピーナッツアレルゲンara h 2、ピーナッツアレルゲンara h 3及びピーナッツアレルゲン ara h 6、ポックスウイルス初期転写終止配列、並びに最後に別のPac 1リンカー。
【０１４９】
ユビキチンCモノマーはC末端を改変して、末端Gly（G）残基をAla（A）で置換した。改変されたユビキチンCは、宿主細胞において、合成に際しPHAV抗原をプロテアソーム分解経路へと標的化する（図9を参照）。これは、非インタクトなタンパク質が抗体産生のために提示されること、及び結果として生じたペプチドフラグメントがMHCクラスI経路によりプロセシングされ、PHAV抗原に対するTH1免疫応答が誘発されることを確実にする。
【０１５０】
PHAV発現カセットの構造及び特徴を図1Bに図示し、これには、Pac I制限エンドヌクレアーゼリンカーが5’及び3’末端に、且つワクシニア初期／後期プロモーターが5’末端に含まれる。
【０１５１】
UBc、ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6についてのアミノ酸配列は、Swit-Prot又はEMBLタンパク質データベースのいずれかから得た。Met（M）残基をコードする開始コドンをara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 6核酸配列から除去し、その後、それらをつないで、タンパク質配列UBc+h1+h2+h3+h6をその順序でコードする連続した核酸配列を形成した。
【０１５２】
このUBc.PHAVagをコードするDNA配列をホモ・サピエンス（Homo Sapiens）コドン優先表を用いてバック・トランスレーションにより得た。Gene Designer（DNA2.0 Inc）を用い、10％閾値に設定したホモ・サピエンス（Homo Sapiens）コドン最適化を利用し、且つ8塩基以上の反復配列をフィルタリングして除外して、UBc.PHAVagアミノ酸配列をヌクレオチド配列へとバック・トランスレーションした。得られた配列は、DNA2.0 Incにより、二次構造形成ポテンシャル及び不安定要素についてさらにスクリーニングした。UBc.PHAVagをコードする最終的なヌクレオチド配列をポックスウイルス初期転写モチーフ「TTTTTNT」についてスクリーニングした - いずれも発見されなかった。UBc.PHAVをコードするヌクレオチド配列の末端に「TAA」終止コドンを付加した。ポックスウイルス初期転写終止配列TTTTTATも終止コドンの直後に付加した。発現カセットの側面にPac Iリンカーを置き、Pac I認識部位はカセット内に存在しないことから、このカセットは、プラスミドへとクローニングされ、Pac I制限エンドヌクレアーゼ消化によりプラスミドから全体を切り出すことができる。UBc.PHAV発現カセットのDNA配列は図2を参照のこと。
【０１５３】
ピーナッツ低アレルゲン（hypollergen）ワクチン抗原はまた、5’末端のユビキチンモノマーを除外して構築した。この構築物は、上記のように、UBc.PHAVag構築物と同一であったが、ユビキチン配列を有さなかった。この構築物をPHAVagと称し、PHAVagの構造及び特徴の図式による表示は図1Cを参照し、DNA配列は図3を参照のこと。
【０１５４】
UBc.PHAVag及びPHAVag発現カセットはともに、PacI/Sbf I消化及びゲル精製によりクローニング後にこれらの発現カセットを回収できるように、細菌プラスミドへとクローニングした。
【０１５５】
以下のピーナッツアレルゲンを含む追加のユビキチン化ピーナッツ低アレルギーワクチン抗原を作製できた：
（i）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11；
（ii）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9及びara h 10；
（iii）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8及びara h 9；
（iv）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7及びara h 8；
（v）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7；
（vi）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5及びara h 6；
（vii）ara h 1、ara h 2、ara h 3、ara h 4及びara h 5；
（viii）ara h 1、ara h 2、ara h 3及びara h 4；
（ix）ara h 1、ara h 2及びara h 3；
（x）ara h 1及びara h 2；
（xi）ara h 1；
（xii）ara h 2；
（xiii）ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11；
（xiv）ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9及びara h 10；
（xv）ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8及びara h 9；
（xvi）ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7及びara h 8；
（xvii）ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7；
（xviii）ara h 2、ara h 3、ara h 4、ara h 5及びara h 6；
（xix）ara h 2、ara h 3、ara h 4及びara h 5；
（xx）ara h 2、ara h 3及びara h 4；
（xxi）ara h 2及びara h 3；
（xxii）ara h 3；
（xxiii）ara h 1、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11；
（xxiv）ara h 1、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9及びara h 10；
（xxv）ara h 1、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8及びara h 9；
（xxvi）ara h 1、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7及びara h 8；
（xxvii）ara h 1、ara h 3、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7；
（xxviii）ara h 1、ara h 3、ara h 4、ara h 5及びara h 6；
（xxix）ara h 1、ara h 3、ara h 4及びara h 5；
（xxx）ara h 1、ara h 3及びara h 4；
（xxxi）ara h 1及びara h 3；
（xxxii）ara h 1、ara h 2、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11；
（xxxiii）ara h 1、ara h 2、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9及びara h 10；
（xxxiv）ara h 1、ara h 2、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8及びara h 9；
（xxxv）ara h 1、ara h 2、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7及びara h 8；
（xxxvi）ara h 1、ara h 2、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7；
（xxxvii）ara h 1、ara h 2、ara h 4、ara h 5及びara h 6；
（xxxviii）ara h 1、ara h 3、ara h 4及びara h 5；
（xxxix）ara h 1、ara h 2及びara h 4；
（xl）ara h 1、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9、ara h 10及びara h 11；
（xli）ara h 1、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8、ara h 9及びara h 10；
（xlii）ara h 1、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7、ara h 8及びara h 9；
（xliii）ara h 1、ara h 4、ara h 5、ara h 6、ara h 7及びara h 8；
（xliv）ara h 1、ara h 4、ara h 5、ara h 6及びara h 7；
（xlv）ara h 1、ara h 4、ara h 5及びara h 6；
（xlvi）ara h 1、ara h 4及びara h 5；
（xlvii）ara h 1及びara h 4；
（xlviii）ara h 4；など。
【０１５６】
ara h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10及びh11についてのアミノ酸配列は、Swit-Prot又はEMBLタンパク質データベースのいずれかから容易に得られる。Met（M）残基をコードする開始コドンと、また終止コドンもara h核酸配列から除去し、その後、それらをつないで、任意の特定の順序で任意の2つ以上のara hタンパク質の融合タンパク質をコードする連続した核酸配列を形成した。しかしながら、開始コドンは、融合タンパク質コーディング配列の開始時に必要とされ、終止コドンは、コードされた融合タンパク質の発現を終結させるために必要とされた。
【０１５７】
ワクシニアウイルス相同組換えプラスミドの構築：相同組換えカセットは、以下の要素からなり、これらはすべてLife TechnologiesのGeneArt GmbHにより合成的に作製された：（i）コペンハーゲン（Copenhagen）株のVACV-A39R ORFの上流側面に位置する、500 bpの左側相同組換えアーム、（ii）ワクシニア初期／後期プロモーターの制御下にあり、ポックスウイルス初期転写終止配列（TTTTTNT）において終結する、EGFP発現カセット、（iii）ワクシニア初期／後期プロモーターの制御下にあり、ポックスウイルス初期転写終止配列（TTTTTNT）において終結する、Ecogpt発現カセット；（iv）上記のような、ピーナッツ低アレルゲンワクチン抗原発現カセット（UBc.PHAVag又はPHAVag）、（v）コペンハーゲン株のVACV-A39R ORFの下流側面に位置する、500 bpの右側相同組換えアーム。これらのカセットの図式による表示は図4を参照し、それらのDNA配列は図6及び7を参照のこと。
【０１５８】
UBc.PHAV及びPHAV相同組換えカセットはともに、Not I制限酵素部位が側面に位置しており、これらをプラスミドへとクローニングして、クローンpTC11（UBc.PHAV）及びpTC12（PHAV）を形成した。プラスミドを図8に示す。これらのカセットは合成的に作製されたので、EGFP及びEcogptのタンパク質コーディング配列とともに生じるTTTTTNT配列はいずれも、コードされるアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、サイレント変異（silent mutations）で分断させた。
【０１５９】
ピーナッツ低アレルゲンワクチン抗原を発現するワクシニアウイルスの構築：PHAV発現カセットを、相同組換えにより、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のA39R ORFに挿入した。図4は、A39R ORF内の挿入部位を説明するマップを示す。簡単に述べると、BHK21細胞を細胞あたり0.01 pfuの低感染多重度（moi）で45分間感染させ、次いでNot I直鎖化pTC11又はpTC12プラスミドベクターのいずれかを該細胞にトランスフェクトすることによりこれを実施した。次いで、感染がほぼ完了に達する時点で感染／トランスフェクト細胞を採取した。次いで、採取した細胞をソニケーションして、ウイルス抽出物を作製し、これらのウイルス抽出物を、キサンチン、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンの存在下、ミコフェノール酸（MPA）でのポジティブセレクション下で1ラウンドのプラーク精製に供した。次いで、プラーク精製されたクローンを、MPAポジティブセレクション下で連続的に増幅して、ウイルスのシードストックを作製した。UBc.PHAVag発現カセットを内部に有する組換えワクシニアウイルスをSCV201Cと表し、PHAVag発現カセットを内部に有する組換えウイルスをSCV202Cと表した。
【０１６０】
Ecogptセレクション方法を用いて組換えワクシニアウイルスを作製するための詳細なプロトコルはSmith 1993を参照のこと。SCV201C及びSCV202Cを作製するために利用した方法を以下に概説する。
【０１６１】
相同組換え：各ウイルス構築物のために、増殖培地（RPMI-1640/10％FCS/2 mM Glutamax/Pen-Strep）を含有する3つのT25フラスコにBHK21細胞を播種し、37℃／5％CO2にてサブコンフルエントまで培養した。感染日に、2つのフラスコにVACV-COPをmoi 0.01 pfu／細胞で感染させ、残りのフラスコには感染させなかった（非感染コントロール）。フラスコ1及び2を室温で45分間感染させた後、ウイルス接種材料を除去し、単層細胞をPBSで2回洗浄した。洗浄後、同じ洗浄工程を経たフラスコ3を含む各フラスコに、4 mlの維持培地（Maintenance Medium）（MM：RPMI-1640/2％FCS/2 mM Glutamax/Pen-Strep）を添加した。
【０１６２】
トランスフェクションは、Effectene Transfection試薬（Qiagen, Cat No 301425）を用いて、製造者に指示に従って実施した。簡単に述べると、150 μLのECバッファー中2 μgの直鎖化pTC11又はpTC12に16 μLのEnhancerを添加し、十分混合した後、室温で5分間静置した。これに25 μlのEffectene Transfection試薬を添加し、十分に混合し、室温で10分間静置した。最後に、1 mlのMM（RPMI-1640/2％FCS/2 mM Glutamax/Pen-Strep）を十分に混合して添加し、一緒に穏やかに混合した。次いで、このトランスフェクションミックスを、予めVACV-COPを感染させておいたフラスコ1に添加した。
【０１６３】
フラスコ1（相同組換え）、フラスコ2（感染のみのコントロール）及びフラスコ3（非感染コントロール）を37℃/5％CO2で一晩インキュベートし、翌日、25 μg/mLのミコフェノール酸（MPA）、250 μg/mLのキサンチン及び1x HAT（Sigma Cat# H0262-10VL）を含む新鮮なMM（フラスコあたり5 mL）で各フラスコを培地交換し、フラスコ1のみ肉眼的（gross）なCPEが観察され得るまで、37℃/5％CO2でさらにインキュベートした。MPA処理によりVACV-COPの感染拡大が阻害されたことから、フラスコ2では肉眼的なCPEのサインは殆ど又は全く存在せず、フラスコ3では単層は健康そうに見えた。
【０１６４】
フラスコ1の細胞を、培養培地へと細胞をスクレイピングすることにより採取し、次いで、低速遠心分離（500 g、室温で5分間）によりペレット化し、それに続いて、1 mLの10 mM Tris-HCl pH8に細胞ペレットを再懸濁した。複数回の凍結融解サイクルによりウイルス抽出物を調製し、次いで、プラーク精製段階に備えて-80℃で保存した。ウイルス構築物をSCV201C（UBc.PHAV挿入）及びSCV202C（PHAV挿入）と表した。
【０１６５】
プラーク精製プロセス：相同組換え抽出物を段階希釈し、各希釈物を用いて、MPAの存在下、48ウェルプレート中で培養したBHK21細胞一列を感染させた。その目的は、ウェルあたり1 pfu感染に下がるまでウイルスを希釈し、採取前、およそ30時間感染させた後に1のみの蛍光プラークを含むウェルを探すことであった。
【０１６６】
BHK21細胞を48ウェルプレートの各ウェルに播種し、増殖培地（RPMI-1640/10％FBS/2 mM Glutamax/pen-strep）中、37℃/5％CO2で100％まで培養した。その後、25 μg/mL MPA、250 μg/mLキサンチン及び1x HAT（Sigma Cat# H0262-10VL）を含むMMと培地を交換し、さらに一晩インキュベートした。
【０１６７】
感染のために、相同組換え抽出物（SCV201C及びSCV202C）を融解し、簡単にソニケーションして、集合体（lumps）及び凝集体（aggregates）を壊した。各ウイルス抽出物を10-5まで下げる10倍段階希釈は、1 mL体積でMM（RPMI/2％FBS/Glutamax/PenStrep）を用いて実施した。各希釈のために、各ウェルから増殖培地を除去しPBSで1回洗浄した後、48ウェルプレートの一列に100 μLの希釈ウイルスを播種した。ウイルス吸着を生じさせるために、48ウェルプレートを室温で45分間放置した。ウイルス吸着後、各ウェルからウイルス接種材料を慎重に除去し、残った接種材料を、ウェルあたり500 μLのPBSからなる洗浄工程により除去した。洗浄後、25 μg/mL MPA、250 μg/mLキサンチン及び1x HAT（Sigma Cat# H0262-10VL）を含む500 μLのMM（RPMI/2％FBS/Glutamax/PenStrep）を各ウェルに添加し、次いで、蛍光顕微鏡下、感染の蛍光緑色フォーカス（fluorescent green foci）が明確に見られ得るまで、37℃/CO2でインキュベートした。
【０１６８】
採取のために、最も高い希釈可能性で単一の蛍光フォーカスを含むウェルのみを選択した。選択したウェルから培地を慎重に除去し、100 μLの10 mM TrisHCl pH8を添加した。プレートを3回凍結融解し、選択したウェルの内容物を回収した。
【０１６９】
次いで、25 μg/mL MPA、250 μg/mLキサンチン及び1x HAT（Sigma Cat# H0262-10VL）で一晩前処理したBHK21細胞を100％コンフルエントで含む6ウェルプレートの1ウェルを、該ウェルから培養培地を除去し、PBS中500 μLまで希釈したウイルス抽出物10 μLを添加することにより感染させて、1つの選択クローンをさらに増幅した。室温で45分後、25 μg/mL MPA、250 μg/mLキサンチン及び1x HAT（Sigma Cat# H0262-10VL）を含む2 mLのMMをウェルに添加し、細胞の大多数が、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を発するまで、3日間、37℃/5％CO2でさらにインキュベートした。感染させたウェル内の細胞を培養培地中へとスクレイピングし、次いで、500 gで5分間ペレット化した。ペレット化した細胞を、500 μLの10 mM TrisHCl pH8に再懸濁し、簡単にソニケーションして、ウイルス抽出物を作製した。
【０１７０】
この抽出物の一部を、MPAセレクション下、BHK21の5つのT175フラスコを感染させることにより更に増幅させるために使用した。感染細胞を回収し、次いで、500 gで5分間ペレット化した。5つすべてのフラスコについてペレット化した細胞を、5 mLの10 mM TrisHCl pH8に再懸濁し、簡単にソニケーションして、ウイルス抽出物を作製した。次いで、500 gで5分間ペレット化することにより不溶性物質を除去した。次いで、以下で概説する以下の手順を用いて、上清（ウイルス抽出物）をBHK21細胞においてタイトレーションし、A39R ORF内の挿入UBc.PHAVの存在をPCR分析により確認した。
【０１７１】
タイトレーション：タイトレーションは、24ウェルプレートフォーマットを用いて実施した。プラークは、肉眼で見られるように、単層中、クリスタルバイオレットで対比染色されたホール（プラーク）として明確に区別可能であった。
【０１７２】
タイトレーションされるべき各組換えウイルスのために、1つの24ウェルプレートにBHK21細胞を播種し、増殖培地（RPMI/10％FBS/Glutamax/Pen Strep）中、コンフルエントになるまで培養した。タイトレーションの日に、各ウイルスストックを融解し、ソニケーションして集合体及びクランプを壊した。各ウイルスをPBS中で10-8に下がるまで段階希釈した。各ウェルから培地を除去し、10-8希釈から開始して、500 μLの各希釈物を、24ウェルプレート中のカラムの各ウェルに添加（希釈あたり4ウェル）し、ウイルスを細胞に吸着させるために、45分間室温でインキュベートしたままとした。この後、ウイルス接種材料を各ウェルから除去し、次いで、各ウェルをPBSで1回洗浄した。洗浄後、1 mLのMM（RPMI/2％FBS/Glutamax/PenStrep）を各ウェルに添加し、プラークが単層で見られ得るまで、37℃/5％CO2でプレートをインキュベートした。プラークの対比染色のために、各ウェルから培地を除去し、500 μLのクリスタルバイオレット溶液（20％エタノール中、0.4％w/v）を各ウェルに添加した。染色を室温で15〜30分間実施し、その後、クリスタルバイオレット染色剤を各ウェルから除去し、各ウェルを空気乾燥させたままとして、その後、プラークをカウントした。ウェルあたり10〜30カウントを生じさせた希釈物から、平均を計算した。次いで、この値に段階希釈の逆数を乗じ、次いでさらに2を乗じて（すなわち、2×500 μL＝1 mL）、pfu/mLで力価を得た。
【０１７３】
C3H/HeJマウスにおけるSCV201Cの免疫原性試験：SCV201Cの免疫原性を試験し、ユビキチン化PHAV抗原がピーナッツタンパク質特異的TH1免疫応答を誘導し得るかどうかを決定するために、3グループのC3H/HeJマウス（グループあたり5匹のマウス）に以下をワクチン接種した：（i）106 pfuのSCV201Cを腹腔内投与（IP）、（ii）106 pfuのSCV000を腹腔内投与（IP）、及び（iii）PBSを腹腔内投与（IP）。ワクチン接種の直前（前採血（prebleed））及びワクチン接種17日後に血液サンプルを得た。サイトカインプロファイリングのために脾臓を、ワクチン接種9週間で採取した。
【０１７４】
可溶性ピーナッツタンパク質抽出物の調製：ローストされた無塩ピーナッツから可溶性ピーナッツタンパク質を抽出するために使用した方法は、Sachs et al.（1981）及びBurks et al.（1992）により記載される手順に由来した。ローストされた無塩ピーナッツは、近所のスーパーから購入した。次いで、ナッツをブレンダーにて粗挽き粉へと、次いでバターペーストへと粉砕した。脱脂試薬ヘキサンの添加により、ピーナッツバターから脂質／脂肪を除去した。これを行うために、n-ヘキサンをピーナッツバターに添加し、激しく撹拌して混合した。混合物をガラスビーカーに移し、溶媒及び固体相に落ち着くよう放置した。溶媒相（抽出された脂質／脂肪を含む）を固体相から除去した。固体相がケーキとなるまで空気乾燥した。このケーキを0.1 M NH4HCO3（1グラムあたり2 mL）に4℃、36時間、撹拌しながら溶解して、可溶性タンパク質を抽出した。スラリーを10,000 gで15分間遠心分離して固体を除去した。3500 MWCOメンブレン／チュービングを用いて、5 mMリン酸塩バッファー（pH7〜pH8）又はPBSに対して上清を透析した。透析した溶液を10,000 gで4℃、15分間遠心分離して、抽出物を澄ませた（clarify）。標準的な技術を用いて、可溶性抽出物中の総タンパク質濃度を測定した。得られた可溶性タンパク質抽出物（10 mg/ml）は、保存のために-20℃に保ち、使用前に溶解した。
【０１７５】
ピーナッツ特異的血清IgE及びIgG2aの定量化：平底96ウェルEIA/RIA ELISAプレート（Costar）に、PBS中2 μg/ウェルの精製ピーナッツ抽出物をコーティングし、37℃で1時間、次いで4℃で一晩インキュベートした。プレートを200 μl/ウェルのPBSで3回洗浄し、その後、PBS及び0.05％Tweeenとともに5％のスキムミルク（SM+PBS+TW）でブロッキングした。37℃で少なくとも1時間、非特異的結合をブロッキングし、その後、0.05％TweenとともにPBS（PBS+TW）で3回の洗浄（200 μl/ウェル）を行った。洗浄後、血清サンプルをSM+PBS+TW中、IgEアッセイのために最初に1:100希釈するか、又はIgG1及びIgG2aアッセイのために1:500希釈した。3つのカラムにわたって、血清サンプルを段階希釈した。各種ウェルをバックグラウンドコントロールとして血清を含めずに置いた。プレートを37℃で1時間インキュベートした。
【０１７６】
プレートを200 μlのPBSで5回洗浄し、SM+PBS+TWで希釈した二次抗体（1:500のヤギ抗マウスIgE HRPコンジュゲート、Alpha Diagnostic；1:1000のHRPラット抗マウスIgG2a、BD Biosciences - BD Pharmingen）を添加した（100 μl/ウェル）。プレートを1時間インキュベートし、次いで、上記のように5回洗浄し、製造者の指示に従って調製したo-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD）基質溶液（100 μl/ウェル）（SigmaFASTTM OPD, Sigma-Aldrich）を添加した。「ブランク」ウェルで発色を開始した時に（IgG1及びIgG2aアッセイにおける5分間からIgEアッセイについての45分間まで及ぶ）、20 μl/ウェルの1 M HClで反応を停止させた。プレートリーダー上、450 nmで光学密度を測定した（EL808 Ultra Microplate Reader, Bio-tek Instruments Inc）。
【０１７７】
各それぞれの時点からの段階希釈に対する光学密度を、GraphPadPrisim V5.01（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて、対数スケールで希釈倍率（dilution factor）に対してプロットした。各時点についてのエンドポイント力価は、計算されたカットオフ光学密度（前採血サンプルの標準誤差（SEM）の最低3倍であるが、全ての前採血サンプルについて測定された最も高い光学密度値よりも大きい）をカーブがインターセプトした希釈値として決定した。
【０１７８】
統計解析：統計比較は、GraphPad Prism V5.01（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて実施した。二元配置分散分析（ANOVA）をBonferroniポストテスト（post-testing）とともに用いて、ELISA結果間の有意差を推定した。
【０１７９】
実施例1：PHAV抗原のユビキチン化はSCV201Cの発現成功を可能にしたが、SCV202Cではそうではなかった
UBc.PHAVag発現カセットをワクシニアウイルスのA39Rへと挿入後のSCV201Cの発現は成功した。相同組換え後、プラーク精製工程の間に、MPA抵抗性プラークが、MPAの存在下、明確に同定及び増幅でき、マウスにおける次の免疫原性試験工程へと進むのに十分な力価を生じるシードストックを作製できた。
【０１８０】
一方、SCV202Cの発現は、明確に識別できるプラークが高希釈範囲でいずれも発見できなかったことから、プラーク精製工程を超えて進めることが困難であった。蛍光感染細胞は、低希釈範囲で検出でき、これらの希釈において、認識できるプラークとは対照的に、100％CPEのみが感染ウェルで見られた。これらのウェルを採取し、MPAの存在下で更なる増幅に供した場合、非常に少ないウイルス力価が得られ、PCR分析、及びMPAの非存在下で蛍光プラークの欠如を示すプラークアッセイにより決定されるように、その大部分は親ウイルスからなった。
【０１８１】
感染後のPHAVagの発現は、ウイルス増殖に対して阻害性又は毒性の作用を有し、これはSCV201C構築物で克服された。理論又は特定の適用様式に拘束されるものではないが、合成されたPHAVagの阻害性又は毒性の作用は、発現されるPHAVagをプロテアソーム分解の標的とするプロテアソーム分解タグ（ユビキチンなど）の使用により克服されたと想定される。
【０１８２】
インタクトなPHAVagを発現することによる、このウイルス増殖の阻害作用は、A39R ORFへと挿入されたEcogpt及びEFGP発現カセットのみを含む組換えワクシニアの構築が容易に達成可能（SCV000と表す）であったことから、さらに確認された。
【０１８３】
実施例2：ワクチン接種後の抗原特異的抗体反応
ワクチン接種の前後（ワクチン接種17日後）におけるピーナッツタンパク質特異的血清IgE（図10A）及びIgG2a（図10B）抗体レベルの両方について、その結果を図10に示す。SCV201Cでのワクチン接種により、ワクチン接種17日後、有意なレベルのピーナッツタンパク質特異的IgG2aが生じたことが明らかに見られる。これらのレベルは、ベクターのみのコントロール（SCV000）及びPBSコントロールよりも有意に高く、SCV201Cが、特異的な抗ピーナッツタンパク質抗体反応を生じることを実証する。SCV201Cは、IgG2a反応と比較して、非常に小さなIgE反応を生じたことに留意すべきである；すなわち、IgG2aについて1:1,000,000に達するエンドポイント希釈と比較して、IgEについては1:2,500のエンドポイント希釈。さらに、IgE反応は、エンプティベクター（SCV000）又はPBSコントロールにより誘導される反応とあまり変わらなかった。
【０１８４】
これらの結果は、SCV201Cが、ピーナッツタンパク質に対してIgG2a反応を生じるが、IgE反応は非常に小さいことを示しており、これは、SCV201Cが、PHAVagに反応してピーナッツ特異的なTH1に偏った免疫応答を開始したことを示す。
【０１８５】
実施例3：マウスにおけるSCV201Cワクチン接種後のリンパ球サイトカインプロファイル
マウスから脾臓を採取し、完全RPMIに保存し、その後、60 mmの組織培養ディッシュに移した。次いで、脾臓を3つのセクションに切断し、単細胞浮遊液へと脱凝集させた。次いで、細胞をフィルターにかけ、5％RPMIで洗浄（300 g×5分間）した。次いで、5 mlのアルカリ性溶解バッファーに赤血球を5分間溶解し、次いで、5％RPMIで20 mlに希釈し、200 gで5分間遠心分離した。次いで、細胞を再懸濁し、カウントした。一方で、コントロールRPMI、可溶性ピーナッツ抗原（100 μg/ml）及びConA（5 μg/ml）ウェルを有する96ウェルプレートを調製した。次いで、リンパ球を400,000細胞/ウェルで添加し、37℃で96時間インキュベートした。
【０１８６】
96時間のインキュベーション期間後、それぞれから100 μlの上清を集め、-80℃で凍結した。次いで、Th1/Th2サイトカインを、製造者の指示に従って（BD Biosciences # 551287）、フローサイトメトリーにより定量化した。次いで、サンプルをBD FACSCanto IIフローサイトメーターに流した。サイトカイン濃度は、Soft Flow FCAP Arrayソフトウェアを用いて決定した。全ての更なる分析はGraph Pad 6.0で実施した。
【０１８７】
図11に示す結果は、明らかに、SCV201Cでのワクチン接種が、ピーナッツタンパク質暴露に対して偏ったTH1免疫応答を生じることを示す。これは、SCV201Cワクチン接種マウスの脾臓から得られた培養リンパ球により分泌されるIL4及びIL5（TH2サイトカイン；図11B及び11C）レベルと比較して、有意に高いIFN-γ（IFN-g；TH1サイトカイン；図11A）レベルにより説明される。
【０１８８】
結論
SCV201Cでのマウスのワクチン接種は、偏った抗ピーナッツタンパク質TH1免疫応答を生じた。アレルゲン特異的TH1免疫応答は、現存するアレルゲン特異的TH2免疫応答を支配し、そうすることで、その後のアレルゲン暴露に対して個体を脱感作するだろう。本明細書に開示の研究は、ユビキチン化ピーナッツ低アレルゲンワクチン抗原（UBc.PHAVag）が、抗ピーナッツタンパク質特異的TH1免疫応答を刺激することを示す。従って、本明細書に記載するようなユビキチン化低アレルゲンワクチン抗原を含むワクチンは、ピーナッツアレルゲンに対して個体を脱感作するために使用でき、従って、ピーナッツアレルゲンへの暴露により誘発される、個体におけるアレルギー反応を治療及び／又は予防するために使用できる。
【０１８９】
上記のように、SCV201C構築物の発現が感染後に成功した一方、非ユビキチン化SCV202C構築物の発現は、プラーク精製工程を超えて進めることが困難であった。従って、感染後のPHAVagの発現は、ウイルス増殖に対して阻害性又は毒性の作用を有するように見え、これはユビキチン化SCV201C構築物で克服された。理論又は特定の適用様式に拘束されるものではないが、合成されたPHAVagの阻害性又は毒性の作用は、発現されるPHAVagをプロテアソーム分解の標的とするユビキチンの使用により克服されたと想定される。PHAVagのユビキチン標的化プロテアソーム分解の結果として、PHAVagの小ペプチドフラグメントが小胞体（ER）に入り、そこでMHCクラスIタンパク質と複合体化され、その後、細胞表面へと輸送されてTリンパ球に提示される（例えば、図9を参照）。この結果として、MHCクラスIでのPHAVagフラグメントの提示が高められ、ピーナッツアレルゲンに対して、より大きなTH1免疫応答がもたらされる。従って、プロテアソーム分解タグ（例えば、ユビキチン）は、予想外にも、人工的でインタクトなPHAVag融合タンパク質がウイルス複製を阻害することを妨げる。
【０１９０】
ara h 1、ara h 2、ara h 3は、感受性のある個体においてピーナッツ特異的アレルギー反応を引き起こすことが示されている、3つの主要なピーナッツアレルゲンである。ara h 6は、ピーナッツアレルギーに対する幼児期感受性に関わっている（Flinterman et al. 2007）。ara h 7は43％のピーナッツアレルギー個体で認識され、ara h 8は85％のピーナッツアレルギー個体で認識され、ara h 4は54％のピーナッツアレルギー個体で認識され、ara h 5は13％のピーナッツアレルギー個体で認識される。
【０１９１】
本明細書で引用する全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
本発明の範囲から逸脱することなく、多数の改変が当業者には明らかだろう。
【０１９３】
参考文献
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【図１】
0006549042.tif 000004
【図２−１】
0006549042.tif 000005
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
0006549042.tif 000010
【図６−１】
0006549042.tif 000011
【図６−２】
0006549042.tif 000012
【図６−３】
0006549042.tif 000013
【図７−１】
0006549042.tif 000014
【図７−２】
0006549042.tif 000015
【図７−３】
0006549042.tif 000016
【図８】
0006549042.tif 000017
【図９】
0006549042.tif 000018
【図１０】
0006549042.tif 000019
【図１１】
0006549042.tif 000020
【配列表】
0006549042000001.app