(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ベースの薬物スクリーニングアッセイの方法であって、
−培養環境において細胞集団を培養するステップと、
−細胞の経時的な生理学的変化及び挙動を確認するために、前記細胞型、前記細胞の生理学的特性、形成組織の生理学的特性、原薬の作用様式、及び前記培養環境のうちの少なくとも１つに依存して少なくとも２つの監視時点を定義する、プロファイル決定ステップと、
−プロファイル決定した生理学的特性に基づいて、少なくとも１つの処理時点で同じ細胞型の培養細胞に原薬を適用する、スクリーニングステップと、
−少なくとも前記２つの監視時点で細胞または形成組織に対する前記原薬の効果を監視するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記監視時点が、
−特定の細胞の早期の時点である、前記環境において前記細胞を培養してから４〜７日後、
−進行期の時点である、前記環境において前記細胞を培養してから１４〜１７日後、
かつ
選択された生理学的特性の有無によって定義される時点、
及び
−予め定められた薬物不使用の回復期後に薬物有効性を測定する時点、からなる群から選択される、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
細胞増殖の監視が、前記薬物適用の終了後１〜７日以上続く、請求項１または２に記載の前記方法。
【請求項４】
細胞が、ある環境において培養され、前記環境が、三次元マトリックスへの重合を可能にする、構造化合物及びリンカー化合物を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５】
前記三次元環境が、前記被包された細胞の三次元成長を促進する、請求項４に記載の前記方法。
【請求項６】
前記三次元環境が、ゲル鋳込デバイスまたは標準細胞培養デバイスである受容器において鋳込される、請求項４または５に記載の前記方法。
【請求項７】
前記細胞が、任意の細胞型、細胞株、分化細胞、ならびに癌細胞からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項８】
前記細胞が、前記成長が前記薬物処理によって促進される細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
前記原薬が、
（ｉ）任意の化学、天然、または合成物質、及び既知の薬物スクリーンの任意の物質、または
（ｉｉ）（ｉ）に従う物質の任意の組み合わせ、
（ｉｉｉ）溶液中の、または任意の担体、ナノ粒子、もしくは送達デバイスと組み合わされるかいずれかの、（ｉ）または（ｉｉ）に従う任意の物質（複数可）、からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
細胞特性の監視が、
代謝活性、
及び／またはフローサイトメトリー、
及び／またはＤＮＡ量、
及び／またはタンパク質定量、
及び／または細胞計数、
及び／または画像に基づく分析、
及び／または低酸素及び血管形成マーカのレベル、
及び／またはリボ核酸（ＲＮＡ）レベル、
及び／またはタンパク質発現レベル、
及び／または質量分析法、
及び／または免疫組織化学的検査によってアッセイされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１１】
原薬の最大耐量が、所与の細胞型に対して決定される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１２】
原薬の最小有効量が、所与の細胞型に対して決定される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１３】
（ｉ）適用された物質に関する分化細胞の初期化と、
（ｉｉ）適用された物質に関する幹細胞の分化と、を評価するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の前記方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立請求項１の前提部に従う培養環境において培養された細胞における薬物スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞ベースのスクリーニング方法は、前臨床薬物開発の早期において、例えば、新抗癌剤である新たな化合物の有効性及び毒性等の作用様式を評価するための意思決定プロセスにおける情報の重要な供給源を表わす（Ｍｉｃｈｅｌｉｎｉ，Ｃｅｖｅｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）"Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ：ｆｕｅｌｌｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．"Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９８（１）：２２７−２３８．；Ａｎ  ａｎｄ  Ｔｏｌｌｉｄａｙ（２０１０），"Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．"Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４５（２）：１８０−１８６；Ｓｈａｒｍａ，Ｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）"Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ．"Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １０：２４１−２５３。）。
【０００３】
薬物開発におけるこれらの重要な役割を考慮すると、過去１０年間により生理学的に関連性のある細胞ベースのアッセイの開発に向けた多数の新規手法が研究された（Ｙａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ（２００７），"Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ３Ｄ．"Ｃｅｌｌ  １３０（４）：６０１−６１０；Ｐａｍｐａｌｏｎｉ，  Ｒｅｙｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）；"Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｔｈｅ  ｇａｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｌｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ．"Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８（１０）：８３９−８４５）。例えば、癌細胞生物学及び抗腫瘍薬物開発において、相次ぐ科学的根拠は、三次元構造（三次元培養モデル）において癌細胞の器質化及び成長を可能にする方法が、平坦な可塑性表面の従来型培養（二次元培養モデル）と比較して、特に、細胞成長、細胞情報伝達、及び遺伝子発現に関してインビボで観察される挙動をより密接に反映することを提案している（Ａｂｂｏｔｔ（２００３）．"Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｂｉｏｌｏｇｙ’ｓ  ｎｅｗ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ．"Ｎａｔｕｒｅ  ４２４（６９５１）：８７０−８７２，Ｋｕｎｚ−Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ，Ｆｒｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），"Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ３−Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｍｏｄｅｌ．"Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  ９（４）：２７３−２８５；Ｂｉｓｓｅｌｌ（２００７），"Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｏｒｍａｌ  ｇｌａｎｄ．"Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３５（Ｐｔ  １）：１８−２２．；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｓｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）．"Ｓｐｈｅｒｏｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ：ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．"Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４（３）：３０９−３２４；Ｄｅｂｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｇｅ（２００５），"Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．"Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５（９）：６７５−６８８）。
【０００４】
いくつかの技術を用いてこれらのより生理学的三次元培養モデルを生成して抗癌剤を試験した（Ｎｙｇａ  ２０１１，Ｃｈｅｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），"３Ｄ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｏｄｅｌｓ：ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ"Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ．５，２３９−２４８）。最も一般的な三次元技術は、（ｉ）細胞被包のための天然（Ｗｅａｖｅｒ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），"Ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．"Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７（１）：２３１−２４５．；Ｆｉｅｂｉｇ，Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），"Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．"Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４０（６）：８０２−８２０；Ｋｒａｕｓｚ，ｄｅ  Ｈｏｏｇｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），"Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ３Ｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．"Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １８（１）：５４−６６）または合成（Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｓｔｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．"Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ３Ｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｏ  ｅｘｐｌｏｒｅ  ｃｅｌｌ−ＥＣＭ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．"Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３１（３２）：８４９４−８５０６；Ｓｉｅｈ，Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），"Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ＬＮＣａＰ  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．"ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ７（９）：ｅ４０２１７．；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ  （２０１１）．"Ａ  ３Ｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｔｏ  ｅｘｐｌｏｒｅ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ−ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ．"Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３０３−３１０）由来のゲルマトリックス、（ｉｉ）細胞播種のための剛性高分子三次元足場（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），"Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ３Ｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．"Ｎａｔ  Ｍｅ���ｈｏｄｓ  ４（１０）：８５５−８６０；Ｋｎｉｇｈｔ，Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．"Ａｌｖｅｔｅｘ（Ｒ）：ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６９５：３２３−３４０）、または（ｉｉｉ）三次元癌細胞構造（例えば、スフェロイド、組織）を成長させるためのマトリックス不使用の細胞集合プロセス（国際公開第２０１０／０３１１９４  Ａｌ号；（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｓｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），"Ｓｐｈｅｒｏｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ：ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．"Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ４（３）：３０９−３２４；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｆｒｙｋｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．"Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ＨＣＴ−１１６  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ３−Ｄ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．"Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１８（１３）：１５７７−１５８５；Ｔｕｎｇ，Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．"Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ３Ｄ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ３８４  ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ  ａｒｒａｙ．"Ａｎａｌｙｓｔ  １３６（３）：４７３−４７８；Ｌａｍａ，Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｉｌｏｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｌｔｉ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｔｅｓｔｉｎｇ．"Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２１（４）：９２２−９３１）のいずれかを使用する。
【０００５】
疾患進行における変動を考慮に入れることができないと、偽陽性薬物候補（ヒトにおいて奏功しないであろう薬物）を選択し、偽陰性薬物候補（ヒトにおいて奏功していたであろう薬物）を廃棄する確率を増加させ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それゆえ、既知の薬物スクリーニング方法の不利点を回避し、具体的に、異なる重要な生理学的インビボ疾患状態を示すプロファイル決定した細胞で試験された薬物活性のデータを提供することが、本発明の目的である。本目的は、請求項１に従う薬物スクリーニング方法によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に従うと、細胞ベースの薬物スクリーニングアッセイは、薬物の作用様式を理解するために、細胞ならびにその経時的な生理学的変化及び挙動を考慮に入れる。このことは、細胞型、培養環境、細胞の生理学的特性、細胞集団の生理学的特性、形成組織の生理学的特性、または原薬の種類、例えば、原薬の作用の標的とする機構、に依存して少なくとも２つの監視時点を決定することを含む。原薬は、少なくとも１つの処理時点で培養細胞に適用される。細胞成長動態、挙動、及び／または生理学的特性における薬物の種類の効果は、少なくとも２つの当該監視時点で監視される。本時点は、具体的な瞬間だけではなく特定の期間でもあり得る。
【０００８】
培養環境は、特定の細胞及び／または形成組織に対する細胞と細胞及び細胞とマトリックスの相互作用を含む、具体的な物理的、生物学的、及び生化学的特徴を考慮に入れる生理学的に関連性のある微小環境を含む。
【０００９】
少なくとも２つの時点、例えば「早期」及び「進行期」時点での細胞増殖の監視は、細胞成長及び／もしくは生理学的特徴の発達中の２つの段階、ならびに／または薬物処理の効果の比較を可能にし得る。細胞成長環境及び生理学的特徴は、所与の細胞型または薬物に調整される必要があり得る。監視の時点は、したがって、好ましくは、薬物の作用モードの観点から、例えば癌の早期または進行期に関連性のある情報を提供するように等で選択され、特定の癌では、好ましくは、生理学的に関連性のある環境で培養してから４〜７日後を「早期」、及び好ましくは、生理学的に関連性のある環境で培養してから１４〜１７日後を「進行期」と見なしてもよい。「進行期」はまた、特徴の具体的な生理学的特性、例えば、低酸素または細胞成長動態もしくは細胞構成の変化の有無によっても定義され得る。
【００１０】
細胞の監視は、薬物適用の終了後１〜７日以上続いてもよい。薬物不使用の期間の開始時及び終了時は、特定の細胞型及び薬物に対して決定されなければならない。細胞が薬物処理から回復できるため、本期間は、「回復期」と名付けられる。第１及び／または第２の薬物適用後の回復に関連性のある時点を含むことは、効果的な薬物または細胞に即時効果を有しない薬物の特定のために必要不可欠であり得る。
【００１１】
好ましい実施形態は、「早期」の処理及び「回復期」を含むまたは含まない少なくとも２つの関連する時点の監視、または「進行期」の処理及び「回復期」を含むまたは含まない少なくとも２つの関連する時点の監視、または「早期」及び「進行期」の処理及び「回復期」を含むまたは含まない少なくとも２つの関連する時点の監視を含むプロセスを指し得る。
【００１２】
細胞培養に使用される環境は、細胞の微小環境を模倣する基質マトリックスまたは培地、好ましくは、構造化合物及び重合を容易にするリンカー化合物からなる三次元マトリックスを含み得る。構造化合物は、不飽和末端基、好ましくは、ビニル基を含む多分岐状ポリエチレングリコールであり得る。リンカー化合物は、このリンカー化合物によって架橋される構造化合物の重合を可能にする少なくとも２つのシステインまたはチオール基を有する、ペプチドを含む。三次元マトリックスは、好ましくは、欧州公開第２  ５６１  ００５号に記載されるマトリックス組成物を含む。
【００１３】
細胞培養に使用される環境は、細胞が当該環境に播種された場合、（ｉ）多細胞性エンティティを形成する単一細胞、または（ｉｉ）多細胞性エンティティを形成する多細胞の三次元成長を促進し得る。優先的に、細胞は、成長して細胞コロニーまたは細胞集団を形成する。例えば、癌細胞のコロニー配列は、外部細胞が容易に到達可能であるのと同時に、そのコアにある細胞を隠蔽する、腫瘍の三次元配列を模倣する、スフェロイドを形成する。
【００１４】
確定された硬化度及び適切な生理学的及び生物学的特性を有する三次元環境を生成するために、受容器または標準細胞培養デバイス、好ましくは、３８４ウェルプレートが使用され得る。当該環境及び細胞は、次いで細胞培養インキュベータに設置され得る細胞培養培地を有するデバイス内に分注され得る。細胞増殖及び活性の監視は、受容器またはデバイスと互換性のある画像及び知覚性設備、好ましくは、自動化された設備を用いて測定されてもよく、出力監視データの再現性を最大化し得る。
【００１５】
当該環境において培養するために使用される細胞は、任意の生物の任意の細胞型、インビトロで培養された細胞または細胞株、生物及び優先的に結腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び卵巣癌細胞等の生物の癌細胞に由来する分化または幹細胞だけではなく、成長が促進される健康な細胞であってもよい。
【００１６】
培養細胞に適用される原薬は、任意の化学、天然、または合成物質、既知の薬物スクリーンの任意の物質、及び以前に抗癌剤として認識された物質からなる群から選択される任意の物質であってもよい。原薬は、液体形態中に適用されてもよく、その液体は、粉末として、丸剤として、または担体中に被包されたもの、好ましくは、ナノ粒子として原薬を含む有機溶媒または水性緩衝液であり得る。
【００１７】
細胞成長動態及び活性を監視するアッセイ読み出し様式は、好ましくは、（ｉ）代謝活性、好ましくは、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、フローサイトメトリー、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）含有量、タンパク質定量、細胞計数、画像に基づく分析、遺伝子発現レベル、質量分析法、ラベルベースの測定法（レポーター遺伝子技術、共鳴エネルギー転移、タンパク質断片またはスプリット相補性アッセイ等）からなる群から選択される任意のもの、またはラベルを含まないベースの測定法（電気バイオセンサ／インピーダンスシステム、光学的バイオセンサシステム、表面プラズモン共鳴システム、超音波バイオセンサシステム、及び電気活性の熱量測定、変化を活用するシステム等によって、または（ｉｉ）上述の監視アッセイの任意の組み合わせによって実行され得る。細胞増殖の監視は、細胞形状及び組成への薬物誘発性効果についての直接情報を提供する。
【００１８】
他の生理学的及び生物学的特性（例えば、低酸素及び／または血管形成マーカ）を決定するためのアッセイ読み出し様式は、好ましくは、（ｉ）リボ核酸（ＲＮＡ）レベル、タンパク質発現レベル、質量分析法、免疫組織化学的検査、画像に基づく分析、プロテオミクス方法からなる群から選択される任意のものによって、または（ｉｉ）上述の監視アッセイの任意の組み合わせによって実行され得る。
【００１９】
適用される原薬の最大耐量または濃度は、所与の細胞及び細胞型に対して決定され得る。細胞、細胞型、または組織の許容される薬物量を決定することは、疾患細胞、好ましくは、癌細胞を標的とする場合、適用される薬物量の調整を可能にする。
【００２０】
適用される原薬の最小有効量は、所与の細胞及び細胞型に対して決定され得る。細胞、細胞型、または組織の最小有効量を決定することは、疾患細胞、好ましくは、癌細胞を標的とする場合、適用される薬物量の調整を可能にする。
【００２１】
本発明の別の目的は、（ｉ）疾患細胞を治癒または死滅させること、健康な細胞を維持すること、及び健康な細胞が薬物処理によって疾患の状態に入るように誘発すること、または（ｉｉ）細胞の初期化及び／または分化を監視する方法の使用を提供する。
【００２２】
適用される原薬に関する幹細胞または前駆体細胞への分化細胞の初期化は、好ましくは、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、フローサイトメトリー、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）量、タンパク質定量、細胞計数、画像に基づく分析、遺伝子発現レベル、質量分析法、レベルに基づく測定法（レポーター遺伝子技術、共鳴エネルギー転移、タンパク質断片またはスプリット相補性アッセイ等）の代謝活性からなる群から選択される任意のもの、またはレベルを含まないものに基づく測定法（電気バイオセンサ／インピーダンスシステム、光学的バイオセンサシステム、表面プラズモン共鳴システム、超音波バイオセンサシステム、及び電気活性の熱量測定、変化を活用するシステム等によって、または（ｉｉ）上述の監視アッセイの任意の組み合わせによってアッセイされ得る。分化細胞は、任意の細胞、細胞型、細胞培養由来の細胞、または特定の組織由来の細胞であり得る。ここで、適用される原薬は、初期化プロセスをトリガし得る。
【００２３】
本方法は、（ｉ）Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、フローサイトメトリー、低酸素及び血管形成マーカ、リボ核酸（ＲＮＡ）レベル、タンパク質発現レベル、質量分析法、ＤＮＡ量、タンパク質定量、細胞計数、画像に基づく分析、及び免疫組織化学的検査を用いる代謝活性からなる群から選択される任意のものを含むか、または（ｉｉ）上述の監視アッセイの任意の組み合わせによって、細胞成長動態及び活性に従う、適用される原薬に関する分化細胞への幹細胞の分化を分析するために使用され得る。ここで、適用される原薬は、分化プロセスをトリガし得る。
【００２４】
本発明の更なる態様及び詳細は、以下に提供される図及び実施例から明らかとなり、それらは、次の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】細胞コロニープロファイル決定及び三次元マトリックスの結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の低酸素条件を示すグラフ及び画像である。
【図１Ｂ】細胞コロニープロファイル決定及び三次元マトリックスの結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の低酸素条件を示すグラフである。
【図１Ｃ】細胞コロニープロファイル決定及び三次元マトリックスの結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の低酸素条件を示す画像である。
【図２】三次元生理学的微小環境ならびに従来の二次元単層培養の薬物処理スケジュールの決定を示す概略図である。
【図３Ａ−１】図２の決定された薬物処理スケジュールを用いた薬物の二次元対三次元スクリーニングを比較するグラフである。
【図３Ａ−２】図２の決定された薬物処理スケジュールを用いた薬物の二次元対三次元スクリーニングを比較するグラフである。
【図３Ｂ】図２の決定された薬物処理スケジュールを用いた薬物の二次元対三次元スクリーニングを比較するグラフである。
【図４Ａ】「早期」及び「進行期」処理後の用量依存薬物有効性プロファイルの決定を示すグラフである。
【図４Ｂ】「早期」及び「進行期」処理後の用量依存薬物有効性プロファイルの決定を示すグラフ及び画像である。
【図５】処理終了時の直後、及び薬物不使用の期間の後に測定した薬物活性の有効性を比較するグラフである。
【図６】三次元環境及び従来の２Ｄ細胞培養モデルにおいて成長させたＨＣＴ１１６細胞のコロニーに対する５−フルオロウラシル薬物有効性をまとめた表である。
【図７】結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の二次元成長を示すグラフである。
【図８Ａ】結腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び卵巣癌細胞の三次元環境における低酸素マーカのそれぞれの成長及び遺伝子発現プロファイルの比較を示すグラフ及び画像である。
【図８Ｂ】結腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び卵巣癌細胞の三次元環境における低酸素マーカのそれぞれの成長及び遺伝子発現プロファイルの比較を示すグラフである。
【図８Ｃ−１】結腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び卵巣癌細胞の三次元環境における低酸素マーカのそれぞれの成長及び遺伝子発現プロファイルの比較を示すグラフである。
【図８Ｃ−２】結腸癌細胞、膵臓癌細胞、及び卵巣癌細胞の三次元環境における低酸素マーカのそれぞれの成長及び遺伝子発現プロファイルの比較を示すグラフである。
【図９】独立した処理スケジュールを用いた二次元及び三次元細胞培養のための成長プロファイルを示すグラフである。
【図１０】ゲムシタビンで処理した膵臓癌細胞を示すグラフである：処理終了時の直後、及び薬物不使用の回復期間の４〜７日後に測定した薬物活性の比較。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図１は、薬物処理を行わない三次元生理学的微小環境の結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）の成長プロファイルを示す。Ａ）では、細胞は、単一細胞として被包された場合、細胞のコロニーまたはミニ腫瘍を模倣する癌スフェロイドとして成長する。スフェロイドのサイズは、経時的に増加する。左側のパネルは、異なる時点で形成されたスフェロイドのサイズの分布を定量するヒストグラムとして表わされた画像に基づく分析を示す。癌細胞のスフェロイドの径サイズは、成長の第４日目の３５μｍから第２１日目の１５５μｍに増加した。右側のパネルは、成長する癌細胞の蛍光  カルセインベースのライブ染色画像を示す。三次元マトリックスにおける癌細胞スフェロイドの成長動態を、Ｂ）に示す。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）による代謝活性及びフローサイトメトリーによる細胞計数を示し、両者とも、初期に迅速かつ続いて平らになる細胞成長動態を特徴とする同様の細胞成長プロファイルを示す最適化アッセイ条件で実施する。Ｃ）では、細胞スフェロイドを、低酸素条件で、ライブ細胞の場合、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎｅ）（緑色）で、細胞の場合、ハイポキシセンス（ｈｙｐｏｘｉｓｅｎｓｅ）（赤色）で、染色した。この癌細胞株では、赤色で特定された低酸素（通常、細胞スフェロイドの中央にある）を、培養の第１４日目ごろから観察した。赤色染色を呈している無彩色スケールのスフェロイドの可視化については、点線円で示す。赤色染色は、スフェロイドの中央部に最も集中している。
【００２７】
癌細胞のプロファイル決定は、成長の異なる時点での癌細胞スフェロイドの生理学的特性（例えば低酸素）を特定及び研究することを可能にするため、本発明において重要なステップである。重要なことには、これらの特性は、（図８に示されるように）腫瘍組織の由来に強力に依存する。加えて、腫瘍の薬物有効性は、（図３及び４に示されるように）腫瘍生理学の特徴に強力に依存する。本発明における癌細胞スフェロイドのプロファイル決定した生理学的特性に基づいて、薬物スクリーニングのための処理時点は、その後、インビボの腫瘍の異なる段階を模倣するように適合され得る。細胞増殖の異なる段階及び生理学的特性（例えば、低酸素条件）を示すゲルマトリックスのスフェロイドは、図１及び８に示される。
【００２８】
図２は、プロファイル決定した細胞成長及び癌の生理学的特性に基づく、薬物処理スケジュール及び読み出し時点の決定を示す。実施例を、三次元マトリックスの細胞成長のための「早期」及び「進行期」薬物処理を含んで提供する。異なる癌段階の条件を特定し、図１にあるように、プロファイル決定アッセイに由来し、薬物スクリーニングのためのスケジュールを、それに合うように決定する。ここで、三次元マトリックスにおいて培養された細胞のための異なる癌段階を、「早期」及び「進行期」癌処理として決定する。
【００２９】
「早期」は、読み出しのための２つの時点を含む。第７日目の第１の時点は、薬物処理の終了時であるが、第７日目の第２の時点は、薬物不使用の回復期に続く。「進行期」は、読み出しのための２つの時点を含む。第１７日目の第１の時点は、第２の（「早期」から独立している）薬物処理期の終了時である。第２１日目の第２の時点は、薬物不使用の回復期に続く。更なる時点の測定は、処理の開始前及び／または異なる薬物不使用の回復期の後に実施することができる。
【００３０】
第４〜７日目である「早期」には、３５μｍの径を有する小さいスフェロイド、高度に増殖性の細胞（図９に示される）を示すが、低酸素マーカ発現または他の生化学的手段の測定値を用いて決定された低酸素条件を示さない（図１Ｃ）。反対に、「進行期」は、１５５μｍの径を有する大きいスフェロイドの存在、低細胞増殖（図９に示される）、及び低酸素条件の存在を示す（図１Ｃ）。いずれの場合においても、読み出しは、即時の薬物有効性を試験するために処理終了時直後に、ならびに「ミニ腫瘍」の再発及び／またはゲムシタビンで観察される場合のような遅延した薬物効果を試験するために４日間の薬物不使用の期間の後に、実施される（図１０）。
【００３１】
参照としての二次元アッセイについては、通常、第１日目〜第４日目の対数的増殖期内に薬物を用いて試験される（図９）。
【００３２】
図３は、結腸癌ＨＣＴ１１６細胞のコロニーにおける図２に示されるような処理スケジュールを用いる薬物スクリーニングキャンペーンを示す。「ヒット」生成の実施例としては、市販の薬物ライブラリ（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ）からの薬物の選択を、使用する。Ａ）には、代謝読み出し（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））によって測定された癌細胞における６０の薬物の効果を、示す。化合物を、１０μΜの濃度で３連で試験する。平均値及び標準偏差を、ここに示す。薬物は、３連の実験結果がＨＩＴ閾値を超える場合のみ「ヒット」と見なす（平均＋／−３×負の対照の標準偏差。薬物を欠いているＤＭＳＯビヒクルを有する条件を、負の対照として使用する）。上部のチャートは、二次元において成長した癌細胞及び三次元マトリックスに包埋された癌細胞の早期処理を直接比較したものを示し、下部のチャートは、三次元マトリックスの包埋細胞の「早期」及び「進行期」処理の比較を示す。これは、「早期」及び「進行期」処理を用いて、偽陽性薬物の特定が効率的に回避されて、ヒットの数を減少させることを示している。
【００３３】
図３Ｂでは、細胞コロニー、具体的には「早期」及び「進行期」処理の直後に測定された癌スフェロイドの径サイズの分布を定量する画像に基づく分析を、１０μΜの薬物濃度での図３Ａからの薬物の選択の実施例として示す。「早期」及び「進行期」の終了時に代謝の読み出しを用いて決定したとき、黒く塗りつぶされた曲線は、「ヒット」に対応し、塗りつぶされていない曲線は、「ヒットなし」である（正の対照：硫酸銅で処理した細胞；負の対照：ＤＭＳＯで処理した細胞）。
【００３４】
図４では、図２において選択された「ヒット」のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）による読み出しとしての、結腸癌ＨＣＴ１１６細胞のコロニーに対する例示の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）半数阻害濃度（ＩＣ５０）の決定を示す。読み出しは、三次元マトリックスの細胞の「早期」及び「進行期」処理の直後に実施した。用量依存薬物有効性を、図４Ａに示す。矢印は、「早期」から「後期」処理まで、より高いＩＣ５０濃度へのシフトを示す。このことは、５−ＦＵが進行期癌の治療においてあまり強力でないことを示し、図３にあるように「進行期」薬物スクリーニングにおけるこの薬物に対して「ヒットを獲得しなかった」ことを確認している。二次元参照アッセイを用いて獲得されたＩＣ５０曲線は、本発明（三次元）の「早期」処理条件にしばしば類似している。このことを、図３Ａ（上にあるパネル）の２つのアッセイ方法を使って観察された大部分の「ヒット」の薬物スクリーニング相関においても示す。異なる反復実験における決定されたＩＣ５０濃度のまとめを、図６に提供する。図４Ｂでは、選択された薬物濃度ＩＣ５０及び１ｍＭで「早期」及び「進行期」処理後に三次元マトリックスにおいて成長させた癌細胞スフェロイドの画像に基づく分析を示す。上にあるパネルはスフェロイドのサイズ分布を示し、下にあるパネルはカルセインベースの蛍光画像に対応する。代謝読み出し分析においても観察されたように（図３Ａ及び４Ａ）、５−ＦＵは「早期」においてスフェロイド成長の強力な阻害を示したが、「進行期」処理では示さなかった。これらの結果は、膵臓癌を治癒するために臨床において単剤としてもはや用いられない５−ＦＵの臨床的使用と一致している。
【００３５】
図５は、処理の終了時の直後及び「回復」と名付けられた薬物不使用の期間の後の薬物有効性の比較を示す。ここで、結腸癌細胞のコロニーにおける５−ＦＵ処理を、一実施例として提供する。「早期」（左側のパネル）及び「進行期」処理スケジュール（右側のパネル）に対する用量依存有効性プロファイルを、図２に記載の処理スケジュールに従って４日間の薬物不使用の回復期の前及び後に測定した。有意差は、ＩＣ５０曲線及び濃度において薬物不使用の期間の前及び後に観察されなかった（図６）。興味深いことに、膵臓由来の別の癌細胞及び薬物ゲムシタビンを用いる場合、薬物不使用の回復期は、本発明を用いる薬物有効性の検出に対して重要なことであった（図１０）。本発明は、適用された薬物の効果が薬物不使用の期間後に検出可能な場合であっても、薬物の特定を可能にする。
【００３６】
図６は、本発明及び結腸癌細胞を使った参照二次元細胞培養アッセイを用いて決定した薬物５−ＦＵのＩＣ５０濃度のまとめを示す。３つの独立した反復実験の結果を示す。
【００３７】
癌細胞は、通常、細胞供給元及び化学文献によって説明されるように組織培養可塑性において二次元単層として成長する。
【００３８】
図７では、結腸癌ＨＣＴ１１６細胞の二次元の環境における成長を示す。コンフルエンス状態に達した時点で、全体的な組織培養物の可塑性表面は細胞に覆われ、細胞は、空間制限に起因して正常な成長を停止する。不利なことに、インビトロ状況は、生理学的インビボ状態を適切に反映しない（例えば、二次元法における細胞層対インビボまたは三次元培養法における三次元の細胞凝集；二次元のインビトロでの栄養分及び酸素供給に曝露された全ての細胞対インビボまたは三次元培養法におけるスフェロイド内部の細胞に対する低栄養分及び低酸素状態）。
【００３９】
図８では、異なる癌の種類からの細胞は、スフェロイドのサイズ及び成長が凝集性細胞の数に依存する細胞集合に基づく他の三次元細胞培養法とは反対に、具体的には三次元環境の単一細胞から成長しているときコロニー成長及びインビボの生理学的特性における重要なことを反映するスフェロイド形成における有意差を示す。左側の細胞の画像は、第１４日目のものである。３つの癌細胞株、結腸ＨＣＴ１１６、膵臓Ｐａｎｃ−１、及び卵巣癌細胞を比較した。第１４日目の三次元マトリックスにおいて成長したスフェロイドのカルセインベースの蛍光画像を、Ａ）の左側に示す。右側には、第１４日目に癌細胞によって形成されたスフェロイドのサイズの分布を定量するヒストグラムとして表わされた画像に基づく分析を示す。一般的には、卵巣癌細胞が最大の癌細胞スフェロイドを、膵臓細胞が最小の癌細胞スフェロイドを、試験された癌細胞のセットから形成し、それをインビボ腫瘍成長と比較できる。Ｂ）では、異なる癌細胞のスフェロイド成長曲線を、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）代謝活性蛍光読み出しを用いて決定した。卵巣及び結腸癌細胞が、その成長プラトーに第７日目〜第１４日目の間に達し、膵臓癌細胞が、第２１日目に達した。卵巣及び結腸癌細胞コロニー形成は、膵臓癌細胞と比較すると、早期に平らになることを伴って迅速な初期成長動態を示した。
【００４０】
図８Ｃ）では、経時的な遺伝子発現に基づいて提示される、本発明の三次元環境において成長した３つの細胞株の比較を、低酸素条件において典型的に観察されるマーカに関して示す。比較した細胞株は、結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）、膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ−１）、及び卵巣癌細胞（Ａ２７８０）である。試験した低酸素マーカは、ＨＩＦ−ｌａ（低酸素誘導因子１アルファ；低酸素の主要制御因子）、ＶＥＧＦＡ（血管形成に関わる血管内皮増殖因子Ａ；ｐＨ制御に関わるＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、エネルギー生成に関わるＧＬＵＴ−１（グルコース輸送体１）、エネルギー生成に関わるＬＤＨＡ（乳酸脱水素酵素Ａ）、アポトーシスに関わるＢＮＩＰ３（ＢＣＬ−２／アデノウイルス−ＥＩＢ−１９−ｋＤａ−相互作用タンパク質３）である。遺伝子レベル（経時的な遺伝子発現プロファイル）で試験した３つの癌細胞株は、著しく異なる挙動を示す。ＨＩＦ−ｌａ遺伝子発現は、経時的にＡ２７８０及びＨＣＴ１１６細胞の基礎レベルに留まるが、経時的にＰａｎｃ−１細胞において増加する。ＶＥＧＦＡ発現は、Ａ２７８０細胞に対して一定であり、ＨＣＴ１１６及びＰａｎｃ−１細胞において最大６倍に増加する。ＣＡＩＸ発現は、経時的に増加するが、その発現の規模は、試験した細胞株間で劇的に異なる。最も強いＣＡＩＸ遺伝子発現を、Ａ２７８０細胞において観察し（約４０００倍の増加）、ＨＣＴ１１６（約４００〜５００倍の増加）及びＰａｎｃ−１細胞（約６０〜８０倍の増加）における発現が後に続いた。ＢＮＩＰ３、ＧＬＵＴ−１、及びＬＤＨＡの遺伝子発現プロファイルは、経時的に遺伝子発現を増加させる傾向を共有する。癌細胞の遺伝子発現プロファイル決定は、成長の異なる時点の癌細胞スフェロイドの生理学的特性の特定及び研究を可能にする。図８Ａ）、Ｂ）、及びＣ）は、これらの生理学的特性が腫瘍細胞の起源及び／または細胞成長の段階に強く依存することを示す。図８Ｃ）は、関連する段階で提示されるように薬物スクリーニングを実施するために、癌細胞の早期及び進行期層を特定することの重要性を支持する定量データを提供する。
【００４１】
図９では、癌細胞ＨＣＴ１１６成長プロファイル内の処理スケジュールを、三次元生理学的環境に包埋された細胞を用いて本発明のために示した（高いほうのパネル）。比較のために、二次元参照アッセイ（低いほうのパネル）を示す。二次元参照アッセイは、第１日目〜第４日目の初期成長期のみを包含する。本発明にあるような薬物処理の分割は、「三次元早期処理期」（第４日目〜第７日目）及び「三次元後期処理期」（第１４日目〜第１７日目）を包含する。前者は、比較的小さいスフェロイド、低酸素条件がない、及び高増殖を示すスフェロイドの初期成長期を特徴とし、後者は、大きいスフェロイドのサイズ、低酸素条件、及び停止細胞増殖を示す静置期を特徴とする。これは、インビボ腫瘍成長に一致している。
【００４２】
図１０は、ゲムシタビンを用いて処理した膵臓Ｐａｎｃ−１癌細胞を示す。三次元マトリックスの膵臓癌細胞培養においてゲムシタビンを用いた「進行期」処理のための用量依存有効性プロファイルを、４〜７日の薬物不使用の回復期の前及び後にＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（登録商標）読み出しに従って測定した。処理の直後に測定された二次元参照アッセイ及び三次元アッセイからの読み出しによると、ゲムシタビンは、活性であると示されなかった。しかしながら、測定を薬物不使用の回復期後に実施した場合、ゲムシタビンは、三次元環境における癌細胞成長の強力細胞成長阻害剤であることを観察した。ゲムシタビンを、膵臓癌を治癒するために臨床において単剤として使用する。本発明では、強力原薬が例えば低酸素条件または静置細胞増殖等の特定の状況下で効果的であり、及び／または細胞の遅延有効性を示すことを特定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ−１】
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【図８Ｃ−２】
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【図９】
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【図１０】
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