(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0006537338.tif 000020
〔式中、
Ｘは、水素原子、トリチル系保護基、又はシリル系保護基を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
【請求項２】
式（ＩＩ）：
【化２】
0006537338.tif 000021
〔式中、
Ｘは、水素原子、トリチル系保護基、又はシリル系保護基を表し；
Ｌは、式（Ｌ）：
【化３】
0006537338.tif 000022
〔式中、Ｌ１は、式：−［（ＣＲ２）ａ−Ａ−］ｂ−（ＣＲ２）ｃ−〔式中、Ａは、結合手、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｐｈ−、−ＯＰｈＯ−、−ＣＯＮＨ−、又は−ＮＨＣＯ−を表し；Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はＣ１−６アルキルチオ基を表し；ａ及びｃは、それぞれ独立して、１〜６の整数を表し、ｂは、０〜６整数を表す。〕で表される二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
【請求項３】
Ｘが、トリチル系保護基又はシリル系保護基である請求項１又は２に記載の核酸固相合成用リンカー。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）：
【化４】
0006537338.tif 000023
〔式中、
Ｘは、水素原子、トリチル系保護基、又はシリル系保護基を表し；
Ｌは、式（Ｌ）：
【化５】
0006537338.tif 000024
〔式中、Ｌ１は、式：−［（ＣＲ２）ａ−Ａ−］ｂ−（ＣＲ２）ｃ−〔式中、Ａは、結合手、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｐｈ−、−ＯＰｈＯ−、−ＣＯＮＨ−、又は−ＮＨＣＯ−を表し；Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、又はＣ１−６アルキルチオ基を表し；ａ及びｃは、それぞれ独立して、１〜６の整数を表し、ｂは、０〜６整数を表す。〕で表される二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基を表し；
Ｓｐは、固相担体を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される構造を有する核酸固相合成用担体。
【請求項５】
Ｘが、トリチル系保護基又はシリル系保護基である請求項４に記載の核酸固相合成用担体。
【請求項６】
ＳｐとＬの結合が、アミド結合又はエステル結合である請求項４〜５の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体。
【請求項７】
Ｓｐが、多孔質ポリマー担体又はガラス系多孔質担体の固相担体である、請求項４〜６の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体。
【請求項８】
請求項４〜７の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体上で核酸合成反応を行う工程を含む、核酸の製造方法。
【請求項９】
該核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸固相合成に用いるリンカー、該リンカーを担持してなる固相合成用担体、及び該担体を用いた核酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の化学合成には、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。固相ホスホロアミダイト法では、概ね以下の工程により核酸合成を行う。
先ず、合成する核酸の３'末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーと、３'−ＯＨ基を介してエステル結合させ、固相合成用担体上にあらかじめ担持させる（ヌクレオシドリンカー）。次に、このヌクレオシドリンカーが担持された固相合成用担体を、反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。
以降は核酸自動合成装置の合成プログラムに従い、反応カラム中、一般に以下の工程：
（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液などの酸により保護ヌクレオシドの５'−ＯＨ基の脱保護を行う工程；
（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）を活性化剤（テトラゾール等）の存在下、脱保護した５'−ＯＨ基ヘのカップリングを行う工程；
（３）無水酢酸などにより未反応の５'−ＯＨ基をキャップする工程；及び
（４）含水ヨウ素などによりホスファイトを酸化する工程：からなる合成反応が行われる。この合成サイクルを繰り返し、３'末端から５'末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることで、目的の配列を持った核酸が合成される。
最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液などにより開裂性リンカーを加水分解させ、合成した核酸を固相合成用担体から切り離す（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、上記のような合成を行う場合、前述したように、出発物質である３'末端となるヌクレオシドを、開裂性リンカーを介してあらかじめ固相合成用担体に担持しておく必要がある。さらに、合成したい核酸の配列により３'末端は異なり、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴの４種類が、ＲＮＡの場合にもｒＡ、ｒＧ、ｒＣ、ｒＵの４種類が必要となり、さらに修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合には修飾されたヌクレオシドをあらかじめ担持した固相合成用担体が必要になり煩雑であった。
【０００４】
そこで前記の問題点を克服するため、固相担体と出発物質を繋ぐリンカーとして、これまで一般に用いられてきたヌクレオシド・スクシニルリンカー等に替わり、ユニバーサルリンカーを担持した固相合成用担体（ユニバーサルサポート）が考案されている。ユニバーサルサポートを用いると、目的の核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させて合成を開始し、目的の核酸を合成した後、通常と同様の方法で固相合成用担体から切り出すだけであり、前述のように種々のヌクレオシド−リンカーを担持した固相合成用担体を準備する必要がない。
【０００５】
例えば、３’末端がヒドロキシ基の核酸を合成できるユニバーサルサポートがいくつか提案されている（特許文献１〜５並びに非特許文献２及び３）。これらのユニバーサルサポートの構造中には、隣り合う２個の炭素原子が有り、一方の炭素原子には核酸合成の開始点となる−ＯＨ基が、もう一方の炭素原子には保護基を外すと求核基となる基（例えば−ＯＨ基、−ＮＨ２基、−ＳＨ基）が結合されており、核酸合成後のアンモニア水などによる核酸の切出し時に、これらの求核基の保護基も外れて３'末端のリンを攻撃し、環状リン酸エステルを生成する形で３'末端からリン酸基が切り離される。いずれも３'末端がヒドロキシ基となる核酸の合成に用いられる。
このような、３'末端がヒドロキシ基を有する核酸は、核酸医薬などの生化学の分野において幅広く求められているため、非常に有用である。
【０００６】
しかしながら、これまで知られているユニバーサルサポートを用いる方法では、ＤＮＡやＲＮＡの合成効率が十分ではなかった。
このような経緯から、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的に高い純度でＤＮＡやＲＮＡを合成することができるユニバーサルリンカー及び該リンカーを担持している核酸固相合成用担体が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５６８１９４５号明細書
【特許文献２】米国特許第６６５３４６８号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／０４９６２１号公報
【特許文献４】米国第２００５／０１８２２４１号公報
【特許文献５】特開２０１３−１７７３７１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry（2000）3.1.1-3.1.28
【非特許文献２】Bio Techniques，22，752-756（1997）
【非特許文献３】Tetrahedron，57，4977-4986（2001）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的に高い純度でＤＮＡやＲＮＡを合成することができるユニバーサルリンカー、該リンカーを担持してなる核酸固相合成用担体、及び該担体を用いた核酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕  式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
0006537338.tif 000002
【００１２】
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
【００１３】
〔２〕  式（ＩＩ）：
【００１４】
【化２】
0006537338.tif 000003
【００１５】
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
【００１６】
〔３〕  Ｌが、式（Ｌ）：
【００１７】
【化３】
0006537338.tif 000004
【００１８】
〔式中、Ｌ１は、不活性な二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基である上記〔２〕に記載の核酸固相合成用リンカー。
【００１９】
〔４〕  Ｘが、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である上記〔１〕〜〔３〕の何れかに記載の核酸固相合成用リンカー。
【００２０】
〔５〕  酸により脱離するヒドロキシ基の保護基が、トリチル系保護基又はシリル系保護基である上記〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸固相合成用リンカー。
【００２１】
〔６〕式（ＩＩＩ）：
【００２２】
【化４】
0006537338.tif 000005
【００２３】
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｓｐは、固相担体を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される構造を有する核酸固相合成用担体。
【００２４】
〔７〕  Ｌが、式（Ｌ）：
【００２５】
【化５】
0006537338.tif 000006
【００２６】
〔式中、Ｌ１は、不活性な二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基である上記〔６〕に記載の核酸固相合成用担体。
【００２７】
〔８〕  Ｘが、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である上記〔６〕または〔７〕に記載の核酸固相合成用担体。
【００２８】
〔９〕  酸により脱離するヒドロキシ基の保護基が、トリチル系保護基又はシリル系保護基である上記〔６〕〜〔８〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体。
【００２９】
〔１０〕  ＳｐとＬの結合が、アミド結合又はエステル結合である上記〔６〕〜〔９〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体。
【００３０】
〔１１〕  Ｓｐが、多孔質ポリマー担体又はガラス系多孔質担体の固相担体である、上記〔６〕〜〔１０〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体。
【００３１】
〔１２〕  上記〔６〕〜〔１１〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体上で核酸合成反応を行う工程を含む、核酸の製造方法。
【００３２】
〔１３〕  該核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、上記〔１２〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の核酸固相合成用担体は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的に高い純度でＤＮＡやＲＮＡを合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、実施例１（ａ）、比較例１（ｂ）で得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液の、ＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図２】図２は、実施例２（ａ）、比較例２（ｂ）で得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液の、ＨＰＬＣチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカーを提供する。
【００３６】
【化６】
0006537338.tif 000007
【００３７】
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｒ１〜Ｒ７は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（８）フェノキシ基；（９）Ｃ１−７アシル基；（１０）モノ又はジ‐Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１１）モノ又はジ‐フェニルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
【００３８】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基」としては、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。中でもメチル基、エチル基が好ましい。
【００３９】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基、及びフェニル基から選ばれる置換基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基」としては、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ｎ-プロピルカルバモイル基、イソプロピルカルバモイル基、ｎ−ブチルカルバモイル基、イソブチルカルバモイル基、ｓｅｃ−ブチルカルバモイル基、ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル基、ｎ−ペンチルカルバモイル基、イソペンチルカルバモイル基、ｓｅｃ−ペンチルカルバモイル基、ｔｅｒｔ−ペンチルカルバモイル基、ヘキシルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、ジ−ｎ−プロピルカルバモイル基、ジ−イソプロピルカルバモイル基、ジ−ｎ−ブチルカルバモイル基、ジ−イソブチルカルバモイル基、ジ−ｓｅｃ−ブチルカルバモイル基、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル基、ジ−ｎ−ペンチルカルバモイル基、ジ−イソペンチルカルバモイル基、ジ−ｓｅｃ−ペンチルカルバモイル基、ジ−ｔｅｒｔ−ペンチルカルバモイル基、ジヘキシルカルバモイル基、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基、ジフェニルカルバモイル基、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルカルバモイル基などが挙げられる。中でもカルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基が好ましい。
【００４０】
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などが挙げられる。中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。
【００４１】
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」としては、上記の「Ｃ１−６アルキル基」における例示に加えて、メトキシメチル基、メトキシエチル基、メトキシｎ-プロピル基、メトキシイソプロピル基、エトキシメチル基、ｎ-プロポキシメチル基、ｎ−ブトキシメチル基などが挙げられる。中でもメチル基、エチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基が好ましい。
【００４２】
本明細書中、「ハロゲン原子」としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。中でも塩素原子、フッ素原子、臭素原子が好ましい。
【００４３】
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基、及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基」としては、フェニル基、Ｃ１−６アルコキシ基で置換されたフェニル基、Ｃ１−６アルキル基で置換されたフェニル基、ハロゲン原子で置換されたフェニル基、ニトロ基で置換されたフェニル基（それぞれ、下記で詳述）等が挙げられる。
【００４４】
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基で置換されたフェニル基」としては、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、ｎ−プロピルフェニルオキシ基、イソプロピルオキシフェニル基、ｎ−ブチルオキシフェニル基、イソブチルオキシフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基などが挙げられる。中でもメトキシフェニル基、ベンジルエチルエーテルエトキシフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基が好ましい。
【００４５】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基で置換されたフェニル基」としては、メチルフェニル基、エチルフェニル基、ｎ-プロピルフェニル基、イソプロピルフェニル基、ｎ−ブチルフェニル基、イソブチルフェニル基、tert−ブチルフェニル基、ジメチルフェニル基などが挙げられる。中でも、メチルフェニル基、tert−ブチルフェニル基、ジメチルフェニル基が好ましい。
【００４６】
本明細書中、「ハロゲン原子で置換されたフェニル基」としては、塩化フェニル基、フッ化フェニル基、臭化フェニル基、ジ塩化フェニル基、ジフッ化フェニル基、ジ臭化フェニル基などが挙げられる。中でも、フッ化フェニル基、臭化フェニル基、ジ臭化フェニル基が好ましい。
【００４７】
本明細書中、「ニトロ基で置換されたフェニル基」としては、２−ニトロフェニル基、３−ニトロフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。中でも、４−ニトロフェニル基が好ましい。
【００４８】
本明細書中、「Ｃ１−７アシル基」並びに「Ｃ１−７アシルアミノ基」中の「Ｃ１−７アシル」部分としては、(1)ホルミル基、(2)カルボキシ基、(3)Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、(4)Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、(5)ベンゾイル基等が挙げられる。
【００４９】
「Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」としては、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、イソブタノイル基、ペンタノイル基、イソペンタノイル基、ヘキサノイル基などが挙げられる。中でもアセチル基が好ましい。
【００５０】
「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｎ−ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、ｓｅｃ−ペンチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。中でもメトキシカルボニル基が好ましい。
上記した「Ｃ１−７アシル基」の中でも、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、ベンゾイル基等が好ましく、アセチル基、ベンゾイル基が特に好ましい。
【００５１】
本明細書中、「Ｃ１−７アシルアミノ基」としては、ホルミルアミノ基、アセチルアミノ基、プロパノイルアミノ基、ブタノイルアミノ基、イソブタノイルアミノ基、ペンタノイルアミノ基、イソペンタノイルアミノ基、ヘキサノイルアミノ基、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、ｎ−プロポキシカルボニルアミノ基、イソプロポキシカルボニルアミノ基、ｎ−ブトキシカルボニルアミノ基、ｎ−ペンチルオキシカルボニルアミノ基、イソペンチルオキシカルボニルアミノ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシカルボニルアミノ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニルアミノ基、ヘキシルオキシカルボニルアミノ基、ベンゾイルアミノ基などが挙げられる。中でもアセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基が好ましい。
【００５２】
本明細書中、「シアノ基、及びフェニル基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基」としては、上記の「Ｃ１−６アルコキシ基」における例示に加えて、シアノメトキシ基、ベンジルオキシ基などが挙げられる。
【００５３】
本明細書中、「モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基」としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ-プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ｓｅｃ−ペンチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジｎ-プロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジｎ−ブチルアミノ基などが挙げられる。中でもメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基が好ましく、特にメチルアミノ基、ジメチルアミノ基が好ましい。
【００５４】
本明細書中、「モノ又はジ‐フェニルアミノ基」としては、フェニルアミノ基、ジフェニルアミノ基が挙げられる。中でもフェニルアミノ基が好ましい。
【００５５】
本明細書中、「置換されていてもよい」とは、無置換または１〜３個の置換基で置換されている態様を意味する。２または３置換の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本明細書中、「置換された」とは、１〜３個の置換基で置換されている態様を意味する。２または３置換の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【００５６】
ある好ましい実施形態では、Ｘは、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である。
【００５７】
酸により脱離するヒドロキシ基の保護基は、トリクロロ酢酸又はジクロロ酢酸などのブレンステッド酸により脱保護可能な保護基であれば限定されないが、例えば、トリチル系保護基、シリル系保護基等が挙げられる。
【００５８】
本明細書中、「トリチル系保護基」としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子等から選ばれる置換基（２個以上の置換基が一緒になって環を形成していてもよい））で置換されていてもよいトリチル基が挙げられ、具体的には、トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（例えば、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ））、ジメトキシトリチル基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ））、９−フェニルキサンテン−９−イル基（ピクシル基）等が挙げられ、好ましくは、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）である。
【００５９】
本明細書中、「シリル系保護基」としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、フェニル基等から選ばれる置換基）でトリ置換されたシリル基が挙げられ、具体的には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルメトキシシリル基、メチルジメトキシシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられ、好ましくは、トリメチルシリル基である。
【００６０】
酸により脱離するヒドロキシ基の保護基は、酸による脱保護が容易であることから、トリチル系保護基が好ましく、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）がより好ましい。
【００６１】
Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ好ましくは水素原子である。
【００６２】
Ｒ５〜Ｒ７は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、ニトロ基、臭素原子、シアノ基、塩素基、メトキシ基、エトキシ基、ベンジルオキシ基、シアノメトキシ基、フェノキシ基、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、フェニルアミノ基、アセチル基、ベンゾイル基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基である。
【００６３】
式（Ｉ）で表される化合物（核酸固相合成用リンカー）は、固相合成において反応基質（即ち核酸）と担体を結びつけるためのリンカーであり、核酸固相合成用担体の合成開始部位（即ち、後述するＳｐで表される固相担体に結合する式（ＬＩＩＩ）で表される構造）を形成する際の原料として用いることができる。ここで、合成開始部位とは、固相合成の伸長反応を行う際に、最初に反応基質を化学結合させる部分を示す。
【００６４】
また、本発明は、下記式（ＩＩ）で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカーを提供する。
【００６５】
【化７】
0006537338.tif 000008
【００６６】
〔式中、Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
【００６７】
Ｌは、アンモニア及び／又はアミン類等のアルカリで処理することにより、Ｌ及びＯの共有結合が切断される構造であれば特に限定されるものではなく、
例えば、式（Ｘ）：
【００６８】
【化８】
0006537338.tif 000009
【００６９】
〔式中、Ｌ１は、不活性な二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基であり；
好ましくは、スクシニル基（Ｌ１が−ＣＨ２ＣＨ２−）である。
【００７０】
本明細書中、「不活性な二価の基」の「不活性な」とは、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、スルファニル基、スルホ基等の固相合成反応を阻害する官能基を有さないことを示す。
【００７１】
Ｌ１は、好ましくは、主鎖が、炭素原子、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる原子（好ましくは、１〜２００個、より好ましくは、１〜２５個、さらに好ましくは、１〜１０個）からなる不活性な二価の基である。
【００７２】
Ｌ１は、より好ましくは、式：−［（ＣＲ２）ａ−Ａ−］ｂ−（ＣＲ２）ｃ−〔式中、Ａは、結合手、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｐｈ−、−ＯＰｈＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−等を表し；Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基等を表し；ａ及びｃは、それぞれ独立して、１〜６（好ましくは１〜３）の整数を表し、ｂは、０〜６（好ましくは０〜３）の整数を表す。〕で表される二価の基である。
【００７３】
Ｌ１は、さらに好ましくは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２−、−Ｐｈ−、−ＣＨ２ＰｈＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２−等である。
【００７４】
Ｌ１は、特に好ましくは、−ＣＨ２ＣＨ２−である。
【００７５】
上記の「Ｐｈ」は、１，４−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，２−フェニレンを示す。
【００７６】
式（ＩＩ）で表される化合物（核酸固相合成用リンカー）は、固相合成において反応基質（即ち核酸）と担体を結びつけるためのリンカーであり、核酸固相合成用担体の合成開始部位（即ち、後述するＳｐで表される固相担体に結合する式（ＬＩＩＩ）で表される構造）を形成する際の原料として用いることができる。ここで、合成開始部位とは、固相合成の伸長反応を行う際に、最初に反応基質を化学結合させる部分を示す。固相合成において、式（ＩＩ）中、ＨＯ−Ｌ−で表される部位を予め固相担体に化学結合させておき、Ｘで表される保護基を脱保護して得られるヒドロキシ基に反応基質を化学結合させて、化学反応を繰り返し、伸長させることができる。
【００７７】
また、式（ＩＩ）で表される化合物は、塩の形態も包含する。塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）等が挙げられる。
【００７８】
また、本発明は、下記式（ＩＩＩ）で示される核酸固相合成用担体（ユニバーサルサポート）を提供する。
【００７９】
【化９】
0006537338.tif 000010
【００８０】
〔式中、Ｓｐは、固相担体を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
【００８１】
本明細書中、「核酸」とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。核酸は１本鎖、２本鎖のいずれであってもよいが、核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、好ましくは１本鎖である。本明細書において「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、これらの修飾核酸塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。
【００８２】
Ｓｐで表される固相担体は、過剰に用いた試薬を洗浄によって簡単に除去できる固相合成用の担体であれば特に限定されないが、例えば、ガラス系多孔質担体、又はポリスチレン系多孔質担体、アクリルアミド系多孔質担体などの多孔質ポリマー担体等が挙げられ、好ましくは、ポリスチレン系多孔質担体、ガラス系多孔質担体であり、より好ましくは、ポリスチレン系多孔質担体である。
【００８３】
本明細書中、「ガラス系多孔質担体」とは、ガラスを構成成分として含む多孔質担体をいい、例えば、粒子形状の多孔質ガラス粒子（ＣＰＧ）等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、前記ＣＰＧとしては、長鎖のアミノアルキルスペーサーを有するＣＰＧ固相担体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ固相担体）が好適に用いられ、更には、長鎖ヌクレオチドの合成の場合においては、ＣＰＧの孔が２０〜４００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍ、更に好ましくは１００ｎｍのものが最も好ましく用いられる。
【００８４】
本明細書中、「ポリスチレン系多孔質担体」とは、主にスチレン又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するポリスチレン系多孔質担体が好ましい。
【００８５】
ポリスチレン系多孔質担体としては、例えば、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子からなる多孔質担体（特開２００５−０９７５４５、特開２００５−３２５２７２及び特開２００６−３４２２４５を参照）、又はスチレン−（メタ）アクリロニトリル−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体からなる多孔質担体（特開２００８−０７４９７９を参照）等が挙げられる。
【００８６】
本明細書中、「アクリルアミド系多孔質担体」とは、主にアクリルアミド又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましく、ヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましい。
【００８７】
アクリルアミド系多孔質担体としては、例えば、芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体からなる多孔質担体等が挙げられる。Ｓｐが、アクリルアミド系固相担体である場合において、（メタ）アクリルアミド誘導体モノマー由来の構造単位の含有量は、少なすぎると核酸の合成量の減少及び合成純度の低下を回避し得るという効果が得られず、他方、多すぎると多孔質樹脂ビーズを形成し難い。従って好ましくは０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．４〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは０．６〜３ｍｍｏｌ／ｇである。
【００８８】
本発明において、固相担体は、式（ＬＩＩＩ）：
【００８９】
【化１０】
0006537338.tif 000011
【００９０】
〔式中、各記号は、上記定義の通りである。〕
で表される構造が導入可能な官能基を有する固相担体であればよい。なかでも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基（特に好ましくは、ヒドロキシ基）を有する固相担体であることが好ましい。この場合において、ＳｐとＬの結合は、例えば、アミド結合又はエステル結合（好ましくは、エステル結合）である。
【００９１】
本発明において、固相担体中の、式（ＬＩＩＩ）で表される構造が導入可能な官能基の含有量は、特に限定されるものではないが、該官能基の含有量が少なすぎると核酸の収量が低下し、他方、該官能基の含有量が多すぎると、得られる核酸の純度が低下する。従って好ましくは１０〜２０００μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは、５０〜１０００μｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは１００〜８００μｍｏｌ／ｇである。
【００９２】
式（ＬＩＩＩ）で表される構造が導入可能な官能基がヒドロキシ基である場合、本発明の多孔質粒子のヒドロキシ基量はＪＩＳ  Ｋ００７０に基づいた滴定により測定される。
【００９３】
本発明において、固相担体の形状は、特に限定されず、平板状、粒子状、繊維状等いずれの形状であってもよいが、合成反応容器への充填効率を高くすることができ、該反応容器が破損し難いという点から、好ましくは粒子の形状を呈する多孔質ポリマー粒子である。本明細書にて、「粒子」とは、厳密な球状を呈することを意味するのではなく、一定形状（例えば、楕円球状などの略球状、多面体形状、円柱形状、金平糖形状などの異型形状など）を有していればよいことを意味する。
【００９４】
本発明において、固相担体の大きさ（体積）は、特に限定されないが、多孔質粒子のレーザー回折（散乱式）により測定される平均粒径が１μｍよりも小さいと、カラムに充填して使用した場合に背圧が高くなりすぎる、又は送液速度が遅くなるという不具合が生じ、他方、平均粒径が１０００μｍよりも大きいと、カラムに充填したとき、担体粒子間の空隙が大きくなり、一定容量のカラムに効率よく担体粒子を充填することが困難となる。従って好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは５〜５００μｍ、更に好ましくは１０〜２００μｍである。
【００９５】
本発明において、固相担体の多点ＢＥＴ法により測定した比表面積は、特に限定されないが、比表面積が０．１ｍ２／ｇより小さいと有機溶媒中での膨潤度が低くなるため、合成反応が起こりにくくなる傾向があり、他方、５００ｍ２／ｇより大きいと、細孔径が小さくなるため、合成反応が起こりにくくなる傾向がある。従って好ましくは０．１〜５００ｍ２／ｇ、より好ましくは１０〜３００ｍ２／ｇ、更に好ましくは５０〜２００ｍ２／ｇである。
【００９６】
本発明において、固相担体の水銀圧入法により測定される平均細孔径は、特に限定はされないが、孔径が小さすぎる場合、合成反応の場が小さくなり所望の反応が起き難くなる、又はヌクレオチド長が所望の数より少なくなる傾向があり、他方、孔径が大きすぎる場合には、反応場であるポリマー粒子表面のヒドロキシ基と反応に関わる物質との接触機会が少なくなるため、歩留まりが低下する傾向がある。従って好ましくは１〜２００ｎｍ、より好ましくは５〜１００ｎｍ、更に好ましくは２０〜７０ｎｍである。
【００９７】
本発明において、固相担体は、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）として市販されている低膨潤性架橋ポリスチレン粒子が特に好ましい。ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）を用いた核酸固相合成方法は、不純物によるピーク面積が少なく、ラボスケールから大量合成系までの幅広いスケールにおいて高収率・高純度が保証されるため、好適に用いられる。
【００９８】
式（ＩＩＩ）で示される核酸固相合成用担体における、Ｓｐで表される固相担体に結合する式（ＬＩＩＩ）で表される構造の形成量（ユニバーサルリンカーの結合量）は、特に限定されるものではないが、リンカーの結合量が少なすぎると核酸の収量が低下するため、好ましくは、４５μｍｏｌ／ｇ以上であり、より好ましくは、５０μｍｏｌ／ｇ以上である。
【００９９】
なお、固相担体に結合するリンカーの量は、分光光度計を用いて公知の方法により測定することができる。
【０１００】
本発明の核酸固相合成用担体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、以下のスキーム１（工程１〜４）で示される方法で製造することができる。
【０１０１】
【化１１】
0006537338.tif 000012
【０１０２】
〔式中、ＰＧは、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
【０１０３】
１.工程１
上記スキームの工程１は、化合物（１）を、溶媒中、四酸化オスミウム及び再酸化剤の存在下で反応させて化合物（Ｉ’）を得る工程である。溶媒としては、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）、アルコール系溶媒（例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール等）、水等が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。再酸化剤としては、例えば、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド、トリメチルアミンＮ−オキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド等が挙げらる。
【０１０４】
２．工程２
上記スキームの工程２は、化合物（Ｉ’）を、塩基条件下にて、保護化剤と反応させて化合物（Ｉ’’）を得る工程である。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、無機塩基（例えば、炭酸ナトリウム等）等が挙げられる。保護化剤は、「酸により脱離するヒドロキシ基の保護基」を導入する際に有機合成において一般に用いられる試薬であれば特に限定されず、例えば、ハロゲン化トリチル類（例えば、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド等）、ハロゲン化シリル類（例えば、トリメチルシリルクロライド等）等が挙げられる。必要に応じて溶媒を用いてもよい。溶媒は、不活性な溶媒であればよく、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
【０１０５】
３．工程３
上記スキームの工程３は、化合物（Ｉ’’）に、ＨＯ−Ｌ−で表される基を導入して化合物（ＩＩ’）を得る工程である。導入する方法としては、例えば、対応する酸無水物と反応させる方法が挙げられる。酸無水物としては、導入する基に対応するものであればよく、例えば、コハク酸無水物、グルタル酸無水物等が挙げられる。また、必要に応じて、塩基や活性剤を加えてもよい。塩基は、工程２で挙げられたものと同様のものを用いることができる。活性剤としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。必要に応じて溶媒を用いてもよい。溶媒は、不活性な溶媒であればよく、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
【０１０６】
４．工程４
上記スキームの工程４は、化合物（ＩＩ’）を、溶媒中、縮合剤及び塩基の存在下、固相担体と反応させることにより、核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）を得る工程である。溶媒は、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）、ニトリル系溶媒（例えば、アセトニトリル等））等が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。縮合剤としては、例えば、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）およびその塩酸塩等が挙げられる。塩基としては、例えば、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール等が挙げられる。
【０１０７】
得られた核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）は、必要により、公知の方法によりキャッピング処理を行ってもよい。例えば、未反応のカルボキシ基は、前記溶媒中、前記縮合剤、前記塩基の存在下、メタノール、エタノールなどのアルコール類とエステル化することによりキャッピングすることができ、未反応の−ＯＨ基又は−ＮＨ２基は、前記溶媒中、前記塩基の存在下、無水酢酸と反応させてアセチル化することによりキャッピングすることができる。
【０１０８】
なお、工程１〜４それぞれにおいて、反応温度や反応時間は、用いる試薬、濃度条件、反応速度などに応じて適宜設定すればよく、例えば、反応温度は、通常−８０から１５０℃であり、反応時間は、通常０．１から２００時間である。各試薬の量は、各反応により適宜設定すればよく、例えば、反応基質に対して、０．０１モル当量〜過剰量である。また、原料化合物は、塩の形態であってもよい。
【０１０９】
本発明の核酸固相合成用担体を用いた核酸合成は、核酸自動合成装置を用い、自体公知の種々の合成法を用いることができる。本明細書において、「核酸合成反応」とは、特に核酸を構成するヌクレオチドの伸長反応を意味する。即ち、固相担体上に結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに、ヌクレオチドを順次結合させることにより、伸長されたオリゴヌクレオチドを得る。
該核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法などが挙げられるが、なかでも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、固相ホスホロアミダイト法が好ましい。
【０１１０】
固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応の好ましい実施態様としては、例えば、本発明の核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）を核酸自動合成装置の反応カラムに投入し、下記で表される工程Ａ１〜Ａ３を経て、さらに工程Ｂ１〜Ｂ３を単数又は複数回繰り返し、最後に工程Ｃ２（必要に応じて工程Ｃ１）を経ることにより核酸を製造する方法が挙げられる。
【０１１１】
【化１２】
0006537338.tif 000013
【０１１２】
【化１３】
0006537338.tif 000014
【０１１３】
【化１４】
0006537338.tif 000015
【０１１４】
〔式中、Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；ＷＧは、それぞれ独立して、電子吸引性基を表し；Ｒ８は、それぞれ独立して、水素原子、又は保護されていてもよいヒドロキシ基を表し；Ｒ９は、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表し；Ｒ１０及びＲ１１は、それぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル基を示すか、或いは一緒になって環を形成してもよく；ｎは、０以上の整数を表し；ｍは、１以上の整数を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
【０１１５】
本明細書中、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基、アデニル基、グアニル基や、これらの修飾核酸塩基である、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等が挙げられる。
【０１１６】
本明細書中、「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アデニル基、グアニル基及びシトシル基又は修飾核酸塩基のアミノ基が保護されていてもよいことを示し、アミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル等が挙げられる。
【０１１７】
ＷＧで表される「電子吸引性基」としては、例えば、シアノ、ニトロ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ハロゲン原子を挙げることができ、中でも、シアノが好ましい。
【０１１８】
Ｒ８で表される「保護されていてもよいヒドロキシ基」としては、２−シアノエチル、２−ニトロエチル、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１−ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボキシ）ベンジル、４−［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４−（フェニルカルボキシ）ベンジル、及びシリル系保護基等で保護されていてもよいヒドロキシ基が挙げられる。
【０１１９】
ｎは、好ましくは、０〜２００の整数であり、より好ましくは、１〜１００の整数である。ｍは、好ましくは、１〜２０１の整数であり、より好ましくは、２〜１０１の整数である。
【０１２０】
１．脱保護工程（工程Ａ１、Ｂ１及びＣ１）
上記スキームにおいて、工程Ａ１、Ｂ１及びＣ１で示される脱保護工程は、酸を反応カラムに流し、担体（ＩＩＩ’）、（ＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩ）におけるヒドロキシ基の保護基を脱保護する工程である。酸としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。酸は単独で用いてもよいし、溶媒と混合して用いてもよい。溶媒としては、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）等が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
【０１２１】
２．縮合工程（工程Ａ２及びＢ２）
上記スキームにおいて、工程Ａ２及びＢ２で示される縮合工程は、溶媒中、ホスホロアミダイト（Ｖ）を、担体（ＩＩＩ’’）又は（ＸＩＩＩ）のヒドロキシ基と縮合反応させる工程である。溶媒としては、例えば、脱保護工程と同様のものが挙げられる。本工程では、必要に応じて活性剤を用いてもよい。活性剤としては、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ−フェニルベンズイミダゾリウムトリフラート、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、Ｎ−ＰｈＩＭＰ、５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート、トリアゾリウムトリフラート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はＮ−（シアノメチル）ピロリジニウムテトラフルオロポレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。上記の反応後、必要に応じて、無水酢酸処理によるアセチル化などの公知の方法により、未反応のヒドロキシ基にキャップを行ってもよい。また、本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
【０１２２】
３．酸化工程（工程Ａ３及びＢ３）
上記スキームにおいて、工程Ａ３及びＢ３で示される酸化工程は、溶媒中、担体（ＩＶ）又は（ＸＩＶ）を、酸化剤又は硫化剤と反応させて、酸化又は硫化させる工程である。溶媒としては、例えば、脱保護工程と同様のものが挙げられる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ−クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２−ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、過酸化水素等が挙げられる。硫化剤としては、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、硫黄等が挙げられる。本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
【０１２３】
４．後処理工程（工程Ｃ２）
上記スキームにおいて、工程Ｃ２で示される後処理工程は、担体（ＸＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩ’）を、アンモニア及び／又はアミン類で処理して核酸（ＸＸＩＩＩ）を回収する工程である。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。アンモニア及び／又はアミン類は、溶媒と混合して用いるのが望ましい。溶媒としては、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）等が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。この工程により、中間体（ＸＸＶ）を経て、３’末端にヒドロキシ基を有する核酸（ＸＸＩＩＩ）が生成される。
【実施例】
【０１２４】
以下に、実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施例によって限定されるものではない。
【０１２５】
合成例１
化合物（ｄ）を下記の合成スキームに従って合成した（有限会社新成化学に委託した）。
【０１２６】
【化１５】
0006537338.tif 000016
【０１２７】
〔式中、ＤＭＴｒは、４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。〕
（工程１）  ＷＯ２００１／０３４６０４に記載されている方法と同様の用法により得られた化合物（ａ）をｔ−ＢｕＯＨ／水の混合液に溶解し、２当量のＮ−メチルモルホリンＮ−オキシドを加えた。四酸化オスミウム（ｔ−ＢｕＯＨ）を０．１当量加え、室温で終夜撹拌した。反応終了後、Ｎａ２ＳＯ３水溶液を加えてクエンチした。シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｂ）を得た。
（工程２）  化合物（ｂ）をピリジンに溶解し、−２０℃に冷却した。ＤＭＴｒ−Ｃｌを１．５当量加え、室温で終夜撹拌した。濃縮し、シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｃ）を得た。
（工程３）  化合物（ｃ）をピリジンに溶解し、５当量のコハク酸無水物と触媒量のＤＭＡＰを加え２日撹拌した。濃縮し、シリカゲルカラムで精製し、ＨＰＬＣで分取し、化合物（ｄ）を得た。
【０１２８】
実施例１
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、ＤＮＡ２０ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｎ）の合成
合成例１に示される方法により得られた化合物（ｄ）０．０１８ｇと、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工株式会社製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））０．５ｇをアセトニトリル５ｍＬに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ０．０１４ｇ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．０１３ｍＬを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。固相担体をアセトニトリル２５０ｍＬで洗浄後、無水酢酸０．２５ｍＬ、Ｎ−メチルイミダゾール０．２５ｍＬ、ピリジン０．３８ｍＬ、４−ジメチルアミノピリジン０．０１２５ｇ、アセトニトリル４．１３ｍＬを加えて、２８℃で２２時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、アセトニトリル２５０ｍＬで洗浄後、下記式：
【０１２９】
【化１６】
0006537338.tif 000017
【０１３０】
〔式中、円は固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ）を表す。〕
で示される核酸固相合成用担体（Ａ）を得た。
前記のようにして得られた本発明のリンカーの固相担体ヘの結合量は、分光光度計による吸光度（４１２ｎｍ）の測定により算出した。リンカーの固相担体ヘの結合量は、５２．７μｍｏｌ／ｇであった。
核酸固相合成用担体（Ａ）１９．０ｍｇを反応カラムに充填し、核酸合成装置nS-8 II（ジーンデザイン社製）を用いて、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎ（５’末端保護基を外さない方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、該ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／エタノール（３：１）混合溶液に５５℃で１５時間浸漬して、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。
【０１３１】
比較例１
ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した核酸固相合成用担体を用いた、ＤＮＡ２０ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｎ）の合成
実施例１と同様にして市販の固相担体ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）に、開裂性リンカーＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Beijing OM Chemicals製）を結合した。該化合物の固相担体ヘの結合量を実施例１と同様の方法により測定した結果、結合量は５９．７μｍｏｌ／ｇであった。
この固相担体１６．８ｍｇを反応カラムに充填し、実施例１と同様にして２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎ（５’末端保護基を外さない方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。
【０１３２】
実験例１
実施例１及び比較例１にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ  ＨＦＩＰ／７ｍＭ  ＴＥＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；３０℃）。図１（ａ）、（ｂ）にそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また、実施例１及び比較例１にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／７ｍＭ  ＴＥＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；３０℃）。
その結果、実施例１で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３’末端にヒドロキシ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；６４３９）。一方、比較例１で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークも、３'末端にヒドロキシ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒであることが、確認された（分子量（測定値）；６４３９）。
【０１３３】
実施例２
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、ＲＮＡ２１ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｆｆ）の合成
合成例１に示される方法により得られた化合物（ｄ）から実施例１と同様にして核酸固相合成用担体（Ａ）を得た。
核酸固相合成用担体（Ａ）１５．８ｍｇを反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置 ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’：配列番号２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆ（５’末端保護基を外す方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／メチルアミン（１：１）混合溶液に６５℃で１．５時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。その後、トリエチルアミン３フッ化水素／ジメチルスルホキシド（５：１）を加え、６５℃で１．５時間保温し、ＲＮＡ２’末端保護基、ＴＢＤＭＳ基を脱保護し、５０μＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた。
【０１３４】
比較例２
核酸固相合成用担体（Ｂ）を用いた、ＲＮＡ２１ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｆｆ）の合成
エチレン及びフランをシュレンク型反応管に加えて、室温で反応させた。触媒として四酸化オスミウムを用いて、生成物を酸化させた。次に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを反応させて、一部のヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護し、化合物を得た。その後、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工株式会社製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））にスクシニル基を導入したものをアセトニトリルに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、アセトニトリルを加えて、２８℃で２２時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、下記式：
【０１３５】
【化１７】
0006537338.tif 000018
【０１３６】
で示される核酸固相合成用担体（Ｂ）を得た。
前記のようにして得られたリンカーの固相担体ヘの結合量を実施例１と同様の方法により測定した結果、結合量は、３６．８μｍｏｌ／ｇであった。
この核酸固相合成用担体（Ｂ）２７．１ｍｇを反応カラムに充填し、実施例２と同様にして２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’：配列番号２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆ（５’末端保護基を外す方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、核酸固相合成用担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。その後、ＲＮＡ２’末端保護基、ＴＢＤＭＳ基を脱保護した。
【０１３７】
実験例２
実施例２及び比較例２にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ  ＨＦＩＰ／７ｍＭ  ＴＥＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。図２（ａ）、（ｂ）にそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また、実施例２及び比較例２にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ  ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／７ｍＭ  ＴＥＡ  ｉｎ  Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。
【０１３８】
その結果、実施例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは２本あるが、そのうち前の大きなピークが、３’末端にヒドロキシ基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド２１ｍｅｒであり（分子量（測定値）；７０３６）、後の小さなピークが不純物であることが確認された。一方、比較例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは２本あり、一方は３'末端にヒドロキシ基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド２１ｍｅｒであったが、もう一方は、ＲＮＡ２１ｍｅｒにリンカーが結合したもの（不純物）であることが確認された（分子量（測定値）；７２１９）。
【０１３９】
図２に示されるように、実施例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドの方が、比較例２のものに比べて不純物のピークの割合が小さく、不純物の生成が抑えられていることがわかった。よって、核酸固相合成用担体（Ａ）の方が核酸固相合成用担体（Ｂ）に比べてユニバーサルサポートとしての性能が高いことが示された。
【０１４０】
表１に、実験例１及び２で得られたデータをまとめて示す。
【０１４１】
【表１】
0006537338.tif 000019
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明の核酸固相合成用担体は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的に高い純度でＤＮＡやＲＮＡを合成することができるため、様々な核酸医薬の製造開発において、幅広く用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列番号１：人工合成されたオリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒ）
【０１４４】
配列番号２：人工合成されたオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）
【図１】
0006537338.tif 000025
【図２】
0006537338.tif 000026
【配列表】
0006537338000001.app