(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、
それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列によ
って表されるポリペプチドを含み、
(i) 配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されており、
(ii) 配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されており、配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、または
(iii) 配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、かつ、配列番号１のＬ９９、Ｅ１０３、Ｆ１６６およびＫ２９４の１個またはそれ以上が他のアミノ酸残基に置換されており、
配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基が、Ｃ８７またはＣ２８５であり、
前記ポリペプチドは、配列番号１のＣ８７およびＣ２８５の両方がＳｅｒで置換されているポリペプチドではない、
修飾ＣｌｙＡ細孔。
【請求項２】
Ａｌａで置換された前記Ｃｙｓ残基がＣ８７であり、および／またはＳｅｒで置換され
た前記Ｃｙｓ残基がＣ２８５である、請求項１に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔。
【請求項３】
それぞれのサブユニットが、
(i) Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６ＹおよびＫ２９４Ｒから選択される少なくとも１個の追加アミノ酸置換、
(ii) 配列番号１のＩ２０３における追加のアミノ酸置換Ｉ２０３Ｖ、ならびに／または
(iii) 配列番号３のアミノ酸配列によって表されるポリペプチド
を含む、請求項１または２に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔。
【請求項４】
修飾ＣｌｙＡ細孔が、
(i)少なくとも１２個のサブユニットを含み、(ii)１２個のサブユニットを含み、(iii)
１３個のサブユニットを含み、(iv)少なくとも３．５ｎｍのｃｉｓ直径を有し、(v)少な
くとも６ｎｍのｔｒａｎｓ直径を有し、または(vi)前記修飾ＣｌｙＡ細孔を通る電圧が＋
９０から−１５０ｍＶの範囲である場合、開口したままである、請求項１から３のいずれ
か一項に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔。
【請求項５】
核酸を移動させるための、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡ細孔の
使用。
【請求項６】
(i)複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている、修飾ＣｌｙＡ細孔、ならびに
(ii)選択的結合特性を有するリガンド
を含み、
配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基が、Ｃ８７またはＣ２８５であり、
前記ポリペプチドは、配列番号１のＣ８７およびＣ２８５の両方がＳｅｒで置換されているポリペプチドではない、
ナノ細孔バイオセンサー。
【請求項７】
前記修飾ＣｌｙＡ細孔が、請求項２から４のいずれか一項において定義されるものであ
る請求項６に記載のナノ細孔バイオセンサー。
【請求項８】
リガンドが、(i)アプタマー、抗体、レセプター、もしくは標的タンパク質に結合する
ペプチド、または(ii)標的タンパク質の前記修飾ＣｌｙＡ細孔への結合を阻害する、標的
タンパク質の阻害剤である、請求項６又は７に記載のナノ細孔バイオセンサー。
【請求項９】
タンパク質を検出するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾ＣｌｙＡ細
孔、または請求項６から８のいずれか一項に記載のナノ細孔バイオセンサーの使用。
【請求項１０】
前記タンパク質が、(i)前記修飾ＣｌｙＡ細孔の内腔内に結合する、(ii) 前記修飾Ｃｌ
ｙＡ細孔の内腔内の複数の部位に結合する、および／または(iii)１５〜７０ｋＤａの範
囲の分子量を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
試料中の少なくとも１つのタンパク質分析物の存在を検出する方法であって、
（ａ）複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている、修飾ＣｌｙＡ細孔、または修飾ＣｌｙＡ細孔を含む請求項６から８のいずれか１項に記載のナノ細孔バイオセンサーと、試料とを接触させるステップであって、
配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基が、Ｃ８７またはＣ２８５であり、
前記ポリペプチドは、配列番号１のＣ８７およびＣ２８５の両方がＳｅｒで置換されているポリペプチドではない、ステップと、
（ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って電位を加えるステップと、
（ｃ）修飾ＣｌｙＡ細孔を介して通る電流を測定するステップと、
（ｄ）測定された電流を基準電流と比較するステップとを含み、基準電流に対する電流の変化は、試料中にタンパク質分析物が存在することを示す、
前記方法。
【請求項１２】
前記修飾ＣｌｙＡ細孔が、請求項２から４のいずれか一項において定義されるものであ
る請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
修飾ＣｌｙＡ細孔を通ってＤＮＡを移動させる方法であって、
（ａ）複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている、修飾ＣｌｙＡ細孔を提供するステップであって、
配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基が、Ｃ８７またはＣ２８５であり、
前記ポリペプチドは、配列番号１のＣ８７およびＣ２８５の両方がＳｅｒで置換されているポリペプチドではない、ステップと、
（ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切る少なくとも＋５０ｍＶの電圧を加えるステップと、
（ｃ）修飾ＣｌｙＡ細孔のｃｉｓ開口部にＤＮＡ含有試料を加えるステップと、
（ｄ）細孔を通る流動電流を測定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１４】
(i)ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡであり、(ii)電流遮断はＤＮＡの移動を示し、(iii)修飾Ｃｌ
ｙＡ細孔は、高イオン強度の条件下で使用され、または(iv)前記修飾ＣｌｙＡ細孔が、請
求項２から４のいずれか一項において定義されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡを移動させるためのデバイスであって、
第１のチャンバーへの膜によって分離されている液体を充填したコンパートメントと、
膜を横切って電位を加えることができる電極と、
膜に挿入された、複数のサブユニットを含む１以上の修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、および／または配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている、修飾ＣｌｙＡ細孔と、
１つのチャンバー内の高イオン強度の溶液
とを含み、
配列番号１の厳密に１個のＣｙｓ残基が、Ｃ８７またはＣ２８５であり、
前記ポリペプチドは、配列番号１のＣ８７およびＣ２８５の両方がＳｅｒで置換されているポリペプチドではなく、
ＤＮＡは１以上の修飾ＣｌｙＡ細孔を通って第１のチャンバーから第２のチャンバーへ移動する、
前記デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、修飾細胞溶解素タンパク質をベースとするナノ細孔バイオセンサーに関する。ナノ細孔バイオセンサーは、折り畳みタンパク質をはじめとする巨大分子、および二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをはじめとする核酸と適合し、他のナノ細孔バイオセンサーに比べ、高い活性、溶解性および電気的特性を示した。
【背景技術】
【０００２】
生体膜を通過するイオンまたは分子の輸送は、細胞生命における基本的なプロセスであり、イオンチャネル、輸送体および細孔によって厳密に制御されている。近年、研究者は、単一分子の分析５において、生物学的ナノ細孔１、固体ナノ細孔２、ＤＮＡオリガミナノ細孔３およびハイブリッドナノ細孔３ａ、ｂ、４を採用してきている。生物学的ナノ細孔は、それらの合成対応物と比べ利点を有している。その理由は、主として、生物学的ナノ細孔は高い再現性で製造することができ、人工ナノ細孔では未だ対応させることができない原子レベルの精度で修飾することができるからである。しかし、生物学的ナノ細孔にも欠点がある。生物学的ナノ細孔の機械的安定性は個々の事例に依存する。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のα溶血素（αＨＬ）およびマイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）由来のポリンＡ（ＭｓｐＡ）ナノ細孔は、高印加電位下において脂質二重層中で開口したままであり、温度６、ｐＨ６ｂ、７、および変性剤濃度６ｂ、８の極端な条件に驚くほど良好に対処することができる。しかし、他のほとんどのポリンおよびチャネルにはそれほどの安定性はない。しかしながら、おそらく、生物学的ナノ細孔における最大の欠点は、それらの固定サイズである。例えば、αＨＬ、ＭｓｐＡまたはアエロリジンのナノ細孔の寸法は、一本鎖核酸、アプタマーまたは小ペプチドを分析することができるが９、それらの小さな内径（約１ｎｍ）は、他の重要な生物系、例えば、折り畳み酵素またはリボザイムなどの直接検査を困難にしている。
【０００３】
最近、かなりの数の試験で人工ナノ細孔を通る折り畳みタンパク質の移動がサンプリングされた１０。しかし、タンパク質は不均一な電荷分布を有しており、それらはナノ細孔表面へ吸着することが多く、適切にサンプリングするにはそれらが非常に速く移動するので、固体ナノ細孔によるタンパク質の検査は困難である１０ｃ。さらに、タンパク質はコンパクトな折り畳み構造を有するので、ナノ細孔の直径はタンパク質の直径と同じでなければならない１０ｂ。最近、本発明者らは、天然折り畳みタンパク質を検査することができる最初の生物学的ナノ細孔として、腸チフス菌（Salmonella typhi）由来の細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）を導入した７ａ。タンパク質、例えば、トロンビン（３７ｋＤａ）またはリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（二量体、３５ｋＤａモノマー）などを広いｃｉｓ側入口（５．５ｎｍ、表１）と狭いｔｒａｎｓ側出口（３．３ｎｍ、表１）との間で電気泳動的に捕捉することができ、したがって、数分間でサンプリングが可能になるため、ＣｌｙＡ構造はこの目的にとって理想的である。ＣｌｙＡを通過するイオン電流は、ヒトおよびウシトロンビンの遮断を容易に区別することができる入口の隙間環境に対して非常に感度が高い７ａ。本発明者らの研究は、ＣｌｙＡ−ＷＴの２個の天然システイン残基（Ｃ８７およびＣ２８５）がセリンで置き換えられているＣｌｙＡ構築物（ＣｌｙＡ−ＳＳ）に基づいたものである７ａ。しかし、ＣｌｙＡ−ＳＳモノマーは、ＣｌｙＡ−ＷＴモノマーと比べると、水溶性が低く、活性も低いことが明らかであり（図Ｓ１）、平面脂質二重層において、＋６０ｍＶよりも高い、または−９０ｍＶよりも低い印加電位で自然開閉した（ゲート制御された）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、当技術分野では、標的分析物に対する感度が高く、水溶性も高く、しかも一連の電位における安定性が高いナノ細孔バイオセンサーが依然として必要とされている。ナノ細孔バイオセンサーは、オリゴマー化、電圧依存ゲート開閉、および単一チャネル電流記録における電気的ノイズに関する好ましい特性を有していなければならない。本開示は、天然システイン残基および他の残基への特定置換によってＣｌｙＡ−ＷＴおよびＣｌｙＡ−ＳＳと比べた場合に追加の特性が得られる、操作したナノ細孔に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の一態様は、複数のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔であって、それぞれのサブユニットが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されている、修飾ＣｌｙＡ細孔に関する。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ残基はＣ２８５である。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔のそれぞれのサブユニットは、Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６Ｙ、およびＫ２９４Ｒから選択される少なくとも１個の追加アミノ酸置換を含む。例えば、それぞれのサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、それぞれのサブユニット中の厳密に１個のＣｙｓ残基はＡｌａで置換されている。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔のそれぞれサブユニットは、Ｌ２０３ＶおよびＨ２０７Ｙから選択される少なくとも１個の追加アミノ酸置換を含む。例えば、それぞれのサブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み得る。
【０００６】
いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は少なくとも１２個のサブユニットを含む。例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔は１２個のサブユニットを含んでいてもよく、または１３個のサブユニットを含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、少なくとも３．５ｎｍのｃｉｓ直径を有する。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、少なくとも６ｎｍのｔｒａｎｓ直径を有する。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔を通過する電圧が−６０＋９０から−１５０ｍＶの範囲である場合、修飾ＣｌｙＡ細孔は開口したままである。
【０００７】
いくつかの実施形態において、タンパク質分析物は修飾ＣｌｙＡ細孔の内腔内で結合する。タンパク質分析物は、修飾ＣｌｙＡ細孔の内腔内の複数の部位へ結合し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質分析物は、１５〜７０ｋＤａの範囲の分子量を有するタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】大腸菌（E. coli）ＣｌｙＡ構造からホモロジーモデリングによって構築された腸チフス菌（S. typhi）ＣｌｙＡナノ細孔のリボン描写を示す図である（ＰＤＢ：２ＷＣＤ、９０％の配列同一性）１７。図１ａにおいて、１つのプロトマーは、二次構造エレメントにＮ末端からＣ末端まで濃い灰色で影を付けて強調表示している；他のプロトマーは、薄い灰色に変えて示している。指定の開発実験によって変化させたアミノ酸の側鎖は球体として表示している。２個の天然システイン残基とフェニルアラニン１６６は標識されている。図１ｂは、ＣｌｙＡ−ＷＴに対するＣｌｙＡ−ＳＳ、ＣｌｙＡ−ＣＳおよびＣｌｙＡ−ＡＳの配列変化を示す。
【図２】ＣｌｙＡ−ＷＴ、ＣｌｙＡ−ＳＳおよび開発されたＣｌｙＡ変異体のオリゴマー化およびナノ細孔形成を示す図およびグラフである。図２ａは、４〜２０％のＢＮ−ＰＡＧＥによって試験したＣｌｙＡナノ細孔のオリゴマー化を示す。タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）は、ゲルへの装填前に（４０μｇ／レーン）、３０分間室温で０．５％ＤＤＭとプレインキュベートした。レーン１：タンパク質ラダー、レーン２：ＣｌｙＡ−ＷＴ、レーン３：ＣｌｙＡ−ＳＳ、レーン４：ＣｌｙＡ−ＡＳおよびレーン５：ＣｌｙＡ−ＣＳ。図１ｂは、０．５％ＤＤＭ中でプレオリゴマー化を行った後にＣｌｙＡ−ＷＴ（上図）、ＣｌｙＡ−ＣＳ（中図）およびＣｌｙＡ−ＡＳ（下図）ナノ細孔に関する平面脂質二重層において再構築された１００ナノ細孔から得られたナノ細孔ユニタリコンダクタンス分布を示す。記録は、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、−３５ｍＶで実施し、温度は２８℃であった。
【図３】４〜２０％のアクリルアミドＢＮ−ＰＡＧＥで分離されたＣｌｙＡ−ＣＳの最も低い（図３ａ）、２番目に低い（図３ｂ）および３番目に低い（図３ｃ）オリゴマーバンドから抽出された６２のＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔のユニタリコンダクタンスを示すグラフである。ＣｌｙＡ−ＣＳモノマーは、０．５％ＤＤＭ中でプレインキュベートし、図２で述べたＢＮ−ＰＡＧＥに装填した。挿入図において、切り取ったバンドは枠で囲み、矢印でマークした。記録は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５中で、−３５ｍＶ、２８℃にて実施した。
【図４】３種類の型のＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔に対してＨＴによって引き起こされる電流遮断を示す図である。図４ａにおいて、左から右に、ナノ細孔の入口の隙間内にＨＴ（黒色）を含むＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型のＣｌｙＡナノ細孔（灰色）を通過した。ＩＩ型およびＩＩＩ型のＣｌｙＡナノ細孔は、補足情報で述べた１３量体（ＩＩ型）または１４量体（ＩＩＩ型）としてモデル化した。図４ｂは、−３５ｍＶでのＩ型（左）、ＩＩ型（中間）またはＩＩＩ型（右）ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔に対するＨＴ遮断を示す。Ｉ型およびＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳに対するＨＴ電流遮断は、Ｌ１電流レベル（それぞれ、ＩＲＥＳ％＝５６±１および６８±１）とＬ２（それぞれ、ＩＲＥＳ％＝２３±３および３１±１）の電流レベル間で切り替わった。遮断は数分間継続した。したがって最初の数秒のみ電流トレースが示されている。Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳにおいて、Ｌ１が最も示された電流遮断であったが（７０％）、ＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳにおいては、Ｌ２にほとんど集中していた（９６％）。ＩＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔に対するＨＴ電流遮断は、Ｌ２電流レベルのみを示した（ＩＲＥＳ＝３２±９）。記録は、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で、−３５ｍＶにて実施した。図４ｂのトレースは、カットオフが２０００Ｈｚのベッセルローパスフィルタを適用して収集し、１０ｋＨｚでサンプリングし、温度は２８℃であった。
【図５】Ｉ型およびＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔を通るタンパク質移動を示すグラフおよび図である。図５ａは、Ｉ型（白色丸印）およびＩＩ型（黒色四角形）のＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔に対して測定されたＨＴ遮断滞留時間の電圧依存性を示す。各電圧での持続時間は、少なくとも５０遮断の滞留時間から構築される累積分布（ｎ≦３）に対する単一指数関数的適合から計算した。線は、実験点に対する二重指数関数的適合を示す。図５ｂは、−１５０ｍＶでのＩ型（左側）およびＩＩ型（右側）のＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔に対するＨＴ電流遮断を示す。遮断は、両ナノ細孔についてＬ２電流レベルのみを示した（Ｉ型およびＩＩ型のＣｌｙＡ−ＣＳについて、それぞれ、ＩＲＥＳ％＝２３±２および３１±５）。図５ｃは、「ショルダー」および「スパイク」電流特性を示している、−１５０ｍＶでのＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳに対する代表的なＨＴ電流遮断を示す。記録は、２０ｎＭのＨＴの存在下、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で実施した。図５ｂのトレースは、カットオフが２０００Ｈｚのベッセルローパスフィルタを適用して収集し、１０ｋＨｚでサンプリングした。ｃのトレースは、カットオフが１０ｋＨｚのベッセルローパスフィルタを適用して収集し、５０ｋＨｚでサンプリングした。温度は２８℃であった。誤差は標準偏差として示している。
【図６】精製ＣｌｙＡモノマーの特性決定を示す図である。ａ）精製ＣｌｙＡモノマーの溶解性は、４〜２０％アクリルアミドＢＮ−ＰＡＧＥによって試験した。等量（４０μｇ）の精製ＣｌｙＡモノマー（界面活性剤含まず）に約１０％グリセロールおよび１×ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）泳動バッファーおよび１×陰極バッファー添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を補充し、それぞれのレーンに装填した：レーン１：マーカー、レーン２：ＣｌｙＡ−ＷＴ、レーン３：ＣｌｙＡ−ＳＳ、レーン４：ＣｌｙＡ−ＣＳ、レーン５：ＣｌｙＡ−ＡＳ。ｂ）ＣｌｙＡ変異体の過剰発現。ＣｌｙＡ変異体を過剰発現している終夜培養物由来の等量細菌ペレットを約１００ｍｇ／ｍＬ濃度に再懸濁し、超音波処理によって破壊し、続いて１０分間２０，０００ｇ（４℃）で遠心分離を行った。ＣｌｙＡタンパク質の可溶性画分を含有する２０μＬの上清を１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン２、４、６および８に装填した。溶解産物ペレットは、１５ｍＭ、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２％ＳＤＳｗ／ｖを含有する溶液を添加することによって原体積にした。こうした溶液の２０μＬを、同じ１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン３、５、７および９に装填した。したがって、レーン１：タンパク質マーカー、レーン２および３：それぞれ、ＣｌｙＡ−ＳＳ上清およびペレット画分；レーン４および５：それぞれ、ＣｌｙＡ−ＷＴ上清およびペレット画分；レーン６および７：それぞれ、ＣｌｙＡ−ＣＳ上清およびペレット画分；ならびにレーン８および９：それぞれ、ＣｌｙＡ−ＡＳ上清およびペレット画分。ｃ）溶血アッセイ。ＣｌｙＡモノマー（０．６μＭ）を１％ウマ赤血球懸濁液（１１０μＬ最終容量）の１００μＬとインキュベートし、濁度の低下を６５０ｎｍ（ＯＤ６５０ｎｍ）で測定した。ＣｌｙＡ−ＷＴは太い灰色の線で示し、ＣｌｙＡ−ＳＳは太い黒色の線で示し、ＣｌｙＡ−ＣＳは細い黒色の線で示し、ＣｌｙＡ−ＡＳは破線で示している。ｄ）タンパク濃度に対してプロットされた溶血率（濁度の５０％に到達する時間の逆数として計算）、ＣｌｙＡ−ＷＴ（三角形、太い灰色の線）、ＣｌｙＡ−ＳＳ（正方形、太い黒色の線）、ＣｌｙＡ−ＡＳ（円、破線）およびＣｌｙＡ−ＣＳ（ダイヤ形、細い黒色の線）。
【図７】４〜２０％のアクリルアミドＢＮ−ＰＡＧＥを使用してＣｌｙＡ変異体のオリゴマー化をスクリーニングする例を示す図である。ａ）ラウンド４。レーン１、２：ＣｌｙＡ−ＣＳ、レーン３および４：４ＣｌｙＡ５、レーン５および６：４ＣｌｙＡ３、レーン７および８：４ＣｌｙＡ１、レーン９および１０：４ＣｌｙＡ２、レーン１１および１２：４ＣｌｙＡ６。０．０５％（偶数レーン番号）または０．１％（奇数レーン番号）のＳＤＳを補充した試料は、図６ａで説明したように調製した。ＳＤＳは、試料に存在する多量のＤＤＭの「スミアリング」の影響を抑制するため使用した。ｂ）ラウンド５。レーン１、２：５ＣｌｙＡ２、レーン３：５ＣｌｙＡ１、レーン４：ＣｌｙＡ−ＡＳ。試料に０．０５％のＳＤＳを補充した。オリゴマー化は１％のＤＤＭを添加することによって引き起こし、ＣｌｙＡ変異体は、方法で述べたＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって部分精製した。
【図８】１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ中、電位−３５ｍＶ下での３種類のＣｌｙＡナノ細孔のノイズ特性を示すグラフである。−３５ｍＶでのＩ型（破線）、ＩＩ型（点線）およびＩＩＩ型（明るい灰色の実線）のＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔の電流スペクトル密度は、０．５ｓトレースから得た。０ｍＶでの電流スペクトル密度は黒色で示す。それぞれの線は、異なる単一チャネルに対して実施した３つの記録から計算した電流スペクトルの平均に対応する。
【図９】Ｉ型ＣｌｙＡ−ＳＳ細孔に対するＨＴ遮断（ａ）およびＧＦＰ遮断（ｂ）の期間を示すグラフである。トレースは、２ｋＨｚで設定された内部ローパスベッセルフィルタを用いて１０ｋＨｚのサンプリングレートで記録した。それぞれのプロット値は、少なくとも３つの異なる単一チャネルを使用して決定された平均に対応する。誤差は標準偏差として示す。
【図１０】「ショルダー」および「スパイク」電流特性を示している、−１５０ｍＶでのＩ型ＣｌｙＡに対する代表的なＨＴ電流遮断を示す図である。記録は、２０ｎＭのＨＴの存在下において、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で実施した。トレースは、１０，０００Ｈｚのカットオフフィルタでガウスローパスフィルタを用いてフィルタにかけ、５０，０００Ｈｚでサンプリングした。
【図１１】ＣｌｙＡナノ細孔を通るｄｓＤＮＡ移動を示す図である。電流トレースの右側に、ＣｌｙＡ（細孔型構造）およびニュートラアビジン（濃灰色）を示し、また、ｄｓＤＮＡを黒色の線として示している。ａ）大腸菌（E. coli）ＣｌｙＡ構造からホモロジーモデリングによって構築された腸チフス菌（Salmonella typhi）由来のＣｌｙＡの通過セクション（ＰＤＢ：２ＷＣＤ、９０％配列同一性）２２。ＣｌｙＡは、原子のファン−デル−ワールス半径を含む細孔測定値を用いて示し、細孔上の残基１０３（ＷＴ配列内のセリン）のおおよその位置を示した。ｂ）＋１００ｍＶで（レベルＩＯ＋１００＝１．７４±０．０５ｎＡ）、０．１２μＭの２９０ｂｐ  ｄｓＤＮＡ１をＣｌｙＡナノ細孔のｃｉｓ側に添加すると、細孔を通るｄｓＤＮＡの移動によってＩＲＥＳ＝０．６３±０．０１（レベル１＊＋１００＝１．１０±０．０３ｎＡ、ｎ＝３）の短い電流遮断が引き起こされる。ニュートラアビジンをｃｉｓチャンバーへ添加すると、細孔を通るＤＮＡの部分的移動によって、短い電流遮断が、ＩＲＥＳ＝０．６８±０．０１（レベル１＋１００＝１．１９±０．０１）の高導電性であって長時間継続する電流遮断に変換された。開口細孔電流は、電位を−１００ｍＶに逆転することにより戻した（赤色星印）。挿入図は典型的な一過性の電流遮断を示す。ｃ）＋１００ｍＶでのｃｉｓ擬ロタキサンの形成による電流遮断に関する詳細。ｄ）ｔｒａｎｓ側からｄｓＤＮＡ：ニュートラアビジン複合体（上記参照）を通すことによる−１００ｍＶでのｔｒａｎｓ擬ロタキサンの形成（レベル１−１００＝１．０２±０．０３ｎＡ、ＩＲＥＳ＝０．６２±０．０１、ｎ＝４）。電気的記録は、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５中、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚのローパスベッセルフィルタを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
【図１２】ナノ細孔ＤＮＡロタキサンの形成を示す図である。ａ）ロタキサンの形成に使用されるＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションの表示。矢印記号は、鎖の３’末端を示す。ｂ）ロタキサン形成。−１００ｍＶでニュートラアビジン（０．３μＭ）およびｏｌｉｇｏ４（１μＭ）と複合形成したＤＮＡハイブリッド３（１μＭ）をｔｒａｎｓコンパートメントに添加した後、ＣｌｙＡ−２の開口細孔電流（ＩＯ−１００＝−１．７１±０．０７ｎＡ、ｎ＝４）はレベル１−１００＝１．１±０．０４ｎＡ（ＩＲＥＳ値０．６４±０．０２、ｎ＝４）まで低下した。このことは、ｄｓＤＮＡがｔｒａｎｓ側から細孔を通ることを示唆している。＋１００ｍＶ（赤色星印）までの段階的上昇は、ＩＲＥＳ＝０．７７±０．０４（レベル２＋１００＝１．３１±０．０９ｎＡ、ｎ＝４）で電流遮断を生じた。このことは、ＤＮＡがまだなお正の印加電位で細孔を塞いていることを示唆している。レベル２は、おそらく、細孔の入口の隙間を塞いでいるｓｓＤＮＡに相応する。正の印加電位への連続的切り替えでは開口細孔電流は戻らなかった（図１６）。このことからロタキサンが永続的に形成されていることが確認される。ｃ〜ｅ）ロタキサン除去。ｃ）＋１００ｍＶで、ＣｌｙＡ−２ナノ細孔を通るイオン電流は数多くの速やかな電流遮断を示した（図１５）。このことは、細孔のｃｉｓ入口で結合されているｓｓＤＮＡ分子が細孔の内腔を一時的に塞いでいることを示唆している。ｄ）ロタキサンが形成された後（図１２ｂ）、＋１００ｍＶで、ナノ細孔は安定したイオン電流を示す（レベル２＋１００）。このことは、単一ＤＮＡ分子が細孔を塞いでいることを示唆している。ｅ）２０ｍＭのＤＴＴをｃｉｓコンパートメントに添加した２０分後、ＣｌｙＡ細孔上のＤＮＡ分子は除去され、＋１００ｍＶでの開口細孔電流は戻る（ＩＯ＋１００＝１．７８±０．０７、ｎ＝４）。記録は、図１１で述べたように実施した。
【図１３】ＣｌｙＡ−ＣＳに対するｓｓＤＮＡ遮断を示す図である。＋１００ｍＶで、０．６μＭのニュートラアビジンの存在下においてＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔のｃｉｓ側に２μＭのビオチン化ｓｓＤＮＡ（５ａ）を添加すると、一過性の電流遮断が引き起こされた（１．２４±０．０２ｎＡ、ＩＲＥＳ＝０．６９±０．０４、ｎ＝３）。このことは、ｓｓＤＮＡが、単に一時的にではあるが、細孔内腔に入ることができることを示唆している。引き続いて相補的ｓｓＤＮＡ鎖（５ｂ）を添加すると電流遮断がレベル１＋１００ブロックに変換されたが（１．２２±０．１３ｎＡ、ＩＲＥＳ＝０．６７±０．０１、ｎ＝３）、このことは、ｄｓＤＮＡが細孔の全長を直ちに移動することができることを示唆している。
【図１４】ＣｌｙＡナノ細孔を通るＤＮＡの輸送を示す図である。ａ）細孔からのＤＮＡの放出を促進する鎖置換反応の概略図。ｂ）＋５０ｍＶで、かつ３（０．３μＭ）の存在下において、ＣｌｙＡ−２は安定した開口細孔電流を示した（ＩＯ＋５０＝０．８５±０．０１ｎＡ、ｎ＝３）。このことは、細孔に結合されているｓｓＤＮＡ鎖が細孔内腔を通って進まず、ｄｓＤＮＡ形態溶液の移動を妨げていることを示している。ｃ）ｃｉｓチャンバーへｓｓＤＮＡ鎖６（４０ｎＭ）を添加すると、ＩＲＥＳ＝０．７０±０．０２（レベル２＋５０＝０．５９±０．０２ｎＡ、ｎ＝５）で長く継続する電流遮断が生じ、ｄｓＤＮＡハイブリッドが細孔を進むことを示している。ｄ）続いてｔｒａｎｓチャンバー（＋５０ｍＶ）に、０．３μＭのニュートラアビジンも含有する１μＭの７を添加すると、ＤＮＡスレッドの放出が促進され、開口細孔電流は戻った。次に、ｄｓＤＮＡ分子が連続して捕捉され、多数の閉塞および開口細孔電流によって示されるように、放出された。簡潔にするため、ニュートラアビジンは図面の提示に含んでいない。電気的記録は２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５中、２２℃で実施した。データは、１０ｋＨｚローパスベッセルフィルタを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。パネルｄの電流シグナルは、取り込み後のローパスガウシアンフィルタを用いて２ｋＨｚでデジタル的にフィルタにかけた。高い印加電位ではｃｉｓ中のＤＮＡの捕捉が非常に速くなるので、この実験の印加電位は＋５０ｍＶに設定して多数の遮断および放出についての観察を容易にした（図１４ｄ）。
【図１５】図１２のすべての成分がＤＮＡロタキサンの形成に必要であることを示している、対照実験の結果を示す図およびグラフである。ａ）架橋配列４が存在しないと、ＣｌｙＡ−２と３の間は結合できない。複合体は−１００ｍＶで捕捉された後、＋１００ｍＶでのＣｌｙＡ−２に関する開口細孔電流の典型的な電流特性によって明らかであるように、それは＋１００ｍＶで細孔から容易に放出される（星印）。ｂ）細孔上部からの２が存在しないと（例えば、ＤＴＴによる切断後）、−１００ｍＶで捕捉される場合、３・４ＤＮＡハイブリッドは細孔に結合することはできない。＋１００ｍＶまで電位を逆転すると（赤色星印）、開口細孔電流は戻る。ｃ）＋１００ｍＶでのＣｌｙＡ−２ナノ細孔について記録された典型的な電流。ｄ）ａで示した電流トレースの２０秒間の全点のヒストグラム（５ｐＡ  ｂｉｎサイズ）。レベルＩＯ＋１００＝１．７１±０．０７ｎＡ、レベルＡ＝１．６２±０．１２ｎＡ、レベルＢ＝１．４３±０．０５ｎＡ、およびレベルＣ＝１．２８±０．０６ｎＡ、それぞれ、０．９４±０．０４、０．８４±０．０３および０．７５±０．０３のＩＲＥＳ値に対応。１２の実験から計算した値は、ＣｌｙＡの内腔内に装填されているＤＮＡ鎖を示すことができる。
【図１６】ＣｌｙＡ−２ナノ細孔に関する電流対電圧（ＩＶ）の関係を示すグラフである。ａ）ロタキサン形成前（ライトグレー色の線）および形成後（黒色の線）のＣｌｙＡ−２に関する典型的な曲線。ミディアムグレー色の線は、ナノ細孔に結合されているＤＮＡ分子がＤＴＴ添加によって除去された後の同一ナノ細孔を示す。電流の記録は、４秒間−１００ｍＶから＋１００ｍＶまで電圧を上昇させる自動プロトコルを適用することにより測定した。ｂ）定常状態（１ｓ）ＣｌｙＡ−２開口細孔電流レベル（白色丸印）とロタキサン構造中のＣｌｙＡ−２開口細孔電流レベル（黒色丸印）を示す４つの実験の平均から計算したＩ−Ｖ曲線。Ｉ−Ｖ曲線の傾斜から計算したナノ細孔のユニタリコンダクタンス値は、正バイアスおよび負バイアスの両方でＣｌｙＡ−２に関して１７．１ｎＳであり、負バイアスのロタキサンに関して１０．８ｎＳであり、正バイアスで１３．０ｎＳであった。ロタキサンは、図１２で述べたようにして調製した。
【図１７−１】ＣｌｙＡ−ＣＳに対するｄｓＤＮＡの電流遮断を示すグラフである。それぞれの電流のトレースの右側に、図で電流記録の物理的解釈を示す。ａ〜ｄ）異なる印加電位で６・７（星印で示す）とハイブリダイゼーションした後のＣｌｙＡ−２に関する電流記録。ｅ）＋５０ｍＶで、６（４０ｎＭ）および２とハイブリダイゼーションした場合、ＩＯ＋５０＝０．８５±０．０１ｎＡからレベル２＋５０遮断（ＩＲＥＳ＝０．７０±０．０２）までイオン電流が低下することによって明らかであるように、ＤＮＡ二本鎖３（０．３μＭ）は細孔を通り輸送される。−５０ｍＶまで印加電位を逆転させると開口細孔電流は戻る（ＩＯ−５０＝０．８３±０．００）。ｆ）続いて１μＭのニュートラアビジン（黒色）をｔｒａｎｓチャンバーに加えると、遮断された細孔レベル（ＩＲＥＳ＝０．６７±０．０２）が観察された場合、後で電位が−５０ｍＶに逆転することが明らかであるように、細孔内のＤＮＡスレッドは固定された。
【図１７−２】ＣｌｙＡ−ＣＳに対するｄｓＤＮＡの電流遮断を示すグラフである（図１７−１の続き）。
【図１８−１】ＣｌｙＡ−２−細孔を通る選択的ＤＮＡ移動を示すグラフである。ａ）左図、＋５０ｍＶで、ＣｌｙＡ−２ナノ細孔を通るイオン電流は速やかで浅い電流遮断を示し、このことは、ｃｉｓ入口で結合されているｓｓＤＮＡ分子が細孔内腔を一次的に塞ぎ得ることを示唆している。中央図、ｄｓＤＮＡ鎖１（５０ｎＭ）をｃｉｓチャンバーに加えた後、電流シグナルは変化せず、このことはｄｓＤＮＡがＣｌｙＡ−２を移動しないことを示唆している。右図、ｃｉｓコンパートメントに２０ｍＭのＤＴＴを加えた２０分後、ＣｌｙＡ細孔上のＤＮＡ分子は除去され、ＤＮＡは細孔を通り移動することができる。ｂ）１μＭのニュートラアビジンの存在下におけること以外は、パネルａで述べたのと同様の実験。ｃ）＋１００ｍＶであること以外、パネルｂと同様。
【図１８−２】ＣｌｙＡ−２−細孔を通る選択的ＤＮＡ移動を示すグラフである（図１８−１の続き）。
【図１９−１】ｓｓＤＮＡ−ｄｓＤＮＡハイブリッド構築物とＣｌｙＡ−ＣＳ細孔との相互作用の電圧依存を示すグラフである。ａ）パネルｂ（左）およびパネルｃ（右）に記載した実験において使用したＤＮＡ分子の説明。ｂ）＋５０ｍＶ（左）、＋７０ｍＶ（中央）および＋１００ｍＶ（右）でのニュートラアビジンとの複合体におけるＤＮＡハイブリッド３（パネルａ、左）の電流遮断。ｃ）＋５０ｍＶ（左）、＋７０ｍＶ（中央）および＋１００ｍＶ（右）でのニュートラアビジンとの複合体におけるＤＮＡハイブリッド３：６（パネルａ、右）の電流遮断。
【図１９−２】ｓｓＤＮＡ−ｄｓＤＮＡハイブリッド構築物とＣｌｙＡ−ＣＳ細孔との相互作用の電圧依存を示すグラフである（図１９−１の続き）。
【図２０】ブール論理による鎖放出を示す図である。ＯＲゲートは上図に示しており、ＡＮＤゲートは下図に示している。ＤＮＡは方向線で表され、矢印の頭は３’末端を表す。同一ＤＮＡ鎖内のセクションは、ハイブリダイゼーション、分岐移動または解離におけるユニットとして作用するＤＮＡドメインを表す。ドメインは、文字Ｄとその後の数字によって表される。Ｔは足場ドメイン（toehold domain）を示す。星印を付けたドメインは、星印のないドメインに配列において相補的なドメインを示す。図１４は、ＯＲゲートの第１の反応の実施を示す。
【図２１−１】ＣｌｙＡナノ細孔を通るＤＮＡの代替輸送を示す図である。ａ）図１８に記載したＯＲゲートの第２の反応の実施を示す鎖置換によるＤＮＡスレッドの放出の概略図。ｂ）＋３５ｍＶでのＣｌｙＡ−２の開口細孔電流。ｃ）ｃｉｓチャンバーにＤＮＡ鎖３（１μＭ）および８（０．５μＭ）を加えると長く継続する電流遮断が生じ、ｄｓＤＮＡハイブリッドが細孔を通過していることを示す。ｄ）＋３５ｍＶで、１μＭのニュートラアビジンも含有していてもよい、１μＭの９をｔｒａｎｓチャンバーへ続いて加えると、ＤＮＡスレッドの放出が促進され、開口細孔電流が戻った。次に、他のｄｓＤＮＡ分子が捕捉され、次いで、閉塞および開口細孔電流のサイクルによって明らかなように放出される。データは、１０ｋＨｚローパスベッセルフィルタを適用し、２０μｓ（５０ｋＨｚ）サンプリングレートを使用して記録した。
【図２１−２】ＣｌｙＡナノ細孔を通るＤＮＡの代替輸送を示す図である（図２１−１の続き）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は、様々な用途、例えば、限定するものではないが、タンパク質の検出および定量ならびにＤＮＡの移動などに使用することができるナノ細孔バイオセンサーに関する。ナノ細孔は、大型の高分子、例えばタンパク質、および核酸などに対してチャネルとして作用する、細孔形成性細菌性細胞毒素をベースとする。核酸としては、ＤＮＡ、例えば、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）もしくは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ペプチド核酸、および／または核酸類似体が挙げられる。
【００１０】
修飾ナノ細孔バイオセンサー
本開示の一態様は、修飾細孔タンパク質から調製されたナノ細孔バイオセンサーに関する。例示的な細孔タンパク質としては、限定するものではないが、細胞溶解素、溶血素、ポリン、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびモータータンパク質が挙げられる。細孔タンパク質としては、細菌タンパク質またはウイルスタンパク質であってもよい。
【００１１】
ある特定の実施形態において、修飾細孔タンパク質は、細孔形成細胞毒性タンパク質、例えば、細菌細胞溶解素である。細胞溶解素は、グラム陰性細菌、例えば、サルモネラ（Salmonella）または大腸菌（E. coli）由来の細胞溶解素Ａ（ＣｌｙＡ）であってもよい。いくつかの実施形態において、修飾細胞溶解素は、腸チフス菌（S. typhi）またはパラチフス菌（S. paratyphi）由来の修飾ＣｌｙＡである。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は複数のサブユニットを含み、ここで、それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、サブユニットは、配列番号１と少なくとも８５％同一、９０％同一、９５％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列によって表される。同一とは、アミノ酸同一性を意味していてもよく、あるいは、構造的および／または機能的同一性を意味していてもよい。したがって、配列番号１と比べた場合、１個以上のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されていてもよい。細孔のサイズ、結合特性および／または構造を変化させるために、修飾によって細孔内腔を変化させることができる。また、修飾は、内腔外側のＣｌｙＡ細孔を変化させることもできる。
【００１２】
ある特定の実施形態において、それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、ここで、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されている。それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列によって表すことができ、さらに、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されていてもよい。Ｃｙｓ残基は、配列番号１中のＣｙｓ８７および／またはＣｙｓ２８５であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ残基はＣｙｓ２８５である。他のアミノ酸残基は、例えば、同様の特性、例えば、構造、電荷、疎水性または親水性などを共有するアミノ酸で置換されていてもよい。ある特定の実施形態において、置換残基は、１個または複数のＬ９９、Ｅ１０３、Ｆ１６６およびＫ２９４である。例えば、置換残基は、１個または複数のＬ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６ＹおよびＫ２９４Ｒであってもよい。例示的なサブユニットは、置換Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６Ｙ、Ｋ２９４ＲおよびＣ２８５Ｓを含み得る。したがって、それぞれのサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み得る。厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されているサブユニットを含む例示的な修飾ＣｌｙＡ細孔は、ＣｌｙＡ−ＣＳと呼ぶことができる。
【００１３】
修飾ＣｌｙＡ細孔は複数のサブユニットを含んでいてもよく、ここで、それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されている。システイン残基は、Ｃｙｓ８７またはＣｙｓ２８５であってもよい。それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列によって表すことができ、厳密に１個のＣｙｓ残基はＳｅｒで置換されていてもよく、かつ／または、厳密に１個のＣｙｓ残基はＡｌａで置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列によって表すことができ、さらに、厳密に１個のＣｙｓ残基はＳｅｒで置換されていてもよく、かつ厳密に１個のＣｙｓ残基はＡｌａで置換されていてもよい。他のアミノ酸残基は、例えば、同様の特性、例えば、構造、電荷、疎水性または親水性などを共有するアミノ酸で置換されていてもよい。ある特定の実施形態において、置換残基は、１個または複数のＬ９９、Ｅ１０３、Ｆ１６６、Ｋ２９４、Ｌ２０３およびＨ２０７である。例えば、置換残基は、Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６Ｙ、Ｋ２９４Ｒ、Ｌ２０３ＶおよびＨ２０７Ｙであり得る。例示的なサブユニットは、Ｌ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６Ｙ、Ｋ２９４Ｒ、Ｌ２０３ＶおよびＨ２０７Ｙ、ならびにＣ２８５Ｓを含み得る。したがって、それぞれのサブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み得る。厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されており、かつ厳密に１個のＣｙｓ残基がＡｌａで置換されているサブユニットを含む例示的な修飾ＣｌｙＡ細孔は、ＣｌｙＡ−ＡＳと呼ぶことができる。
【００１４】
さらに本開示は、修飾ＣｌｙＡ細孔をコードしている核酸に関する。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔をコードしている核酸は、配列番号４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列によって表される。核酸は、配列番号５または配列番号６によって表すことができる。ヌクレオチド配列は、適切な宿主、例えば大腸菌（E. coli）での発現に最適化されたコドンであってよい。
【００１５】
修飾ＣｌｙＡ細孔は、直径が少なくとも３ｎｍの細孔内腔を有していてもよく、例えば、直径は、３ｎｍ、３．５ｎｍ、４ｎｍ、４．５ｎｍ、５ｎｍ、５．５ｎｍ、６ｎｍ、６．５ｎｍ、７ｎｍ、またはそれ以上であり得る。細孔内腔のサイズは、修飾ＣｌｙＡ細孔によって検出する分析物に依存し得る。細孔内腔のｃｉｓ直径は少なくとも３．５ｎｍであってもよく、かつ／または、ＣｌｙＡ細孔のｔｒａｎｓ直径は少なくとも６ｎｍであってもよい。一般に、ｃｉｓとは分析物が加えられる修飾ＣｌｙＡ細孔の末端を意味し、一方、ｔｒａｎｓとは細孔内腔の全長を移動した後に分析物が排出される修飾ＣｌｙＡ細孔の末端を意味している。人工脂質二重層においては、例えば、細孔のｔｒａｎｓ末端は脂質二重層に挿入されていてもよく、一方、細孔のｃｉｓ末端は脂質二重層の同一面上に保持されていてもよい。したがって、細孔のｃｉｓ直径は、細孔のｃｉｓ末端の開口直径、および分析物が加えられる開口の直径であり、一方、細孔のｔｒａｎｓ直径は、分析物が排出される細孔のｔｒａｎｓ末端の開口の直径である。
【００１６】
また細孔内腔のサイズは、修飾ＣｌｙＡ細孔のサブユニットの数によって決まり得る。例えば、１３または１４個のサブユニットから構成されている大きな細孔は、７個のサブユニットから構成されている細孔よりも大きな内腔を有することができる。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は１２個以上のサブユニットを含む。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は１２個のサブユニットを含む。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は１３個のサブユニットを含むか、または１４個のサブユニットを含む。サブユニットは、好ましくは、サブユニットのアミノ酸配列に応じて、１２量体および／または１３量体に集合することができる。いくつかの実施形態において、それぞれのサブユニットは本明細書で開示したポリペプチドを含む。単一修飾ＣｌｙＡ細孔内では、それぞれのサブユニットは同一であってもよいし、あるいは、サブユニットは異なっていてもよく、その結果、修飾ＣｌｙＡ細孔中のサブユニットは、同一修飾ＣｌｙＡ細孔内に他のポリペプチドサブユニットの配列と異なる配列を含み得る。ある特定の実施形態において、本明細書で開示した修飾ＣｌｙＡ細孔、例えば、ＣｌｙＡ−ＣＳ細孔は、サブユニット組成に応じて複数のサブタイプを形成することができる。例えば、サブユニットに応じて、修飾ＣｌｙＡ−ＣＳ細孔の少なくとも２または３つの様々なサブタイプ（すなわち、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）が存在し得る。それぞれのサブタイプは、他のサブタイプと比べた場合、様々なコンダクタンス測定値を有し得る。サブタイプは、好ましくは、特定のポリペプチド配列のサブユニットによって形成することができる。
【００１７】
特定残基での置換は、自然界で確認される野生型ＣｌｙＡ細孔と比べ、修飾ＣｌｙＡ細孔に新しい特性を付与することができる。特定電圧での細孔の電圧依存性開口および閉塞（ゲート開閉）は特性の１つである。平面脂質二重層において、例えば、ＣｌｙＡ−ＳＳは、＋６０ｍＶよりも高い、または−９０ｍＶよりも低い印加電位で自然に開閉する。いくつかの実施形態において、細孔を通過する電圧（すなわち、修飾ＣｌｙＡ細孔が存在する膜を通過する電圧）が＋９０ｍＶから−１５０ｍＶの範囲にある場合、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔は開いたままである。したがって、細孔を通過する電圧が、＋９０、＋８５、＋８０、＋７５、＋７０、＋６５、＋６０、＋５５、＋５０、＋４５、＋４０、＋３５、＋３０、＋２５、＋２０、＋１５、＋１０、＋５、０、−５、−１０、−１５、−２０、−２５、−３０、−３５、−４０、−４５、−５０、−６０、−６５、−７０、−７５、−８０、−８５、−９０、−９５、−１００、−１１０、−１１５、−１２０、−１２５、−１３０、−１３５、−１４０、−１４５、−１５０ｍＶで維持される場合、修飾ＣｌｙＡ細孔は開いたままであることが可能であり、かつ／または、細孔を通過する電圧は、＋９０ｍＶから−１５０ｍＶ（＋９０ｍＶと−１５０ｍＶを含む）で、またはその間の電圧の任意のサブ範囲で調整することができる。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、シグナル（すなわち、測定された電流遮断）と比べ、低い電気的ノイズを示す。したがって、本明細書に記載した細孔が使用される場合、修飾ＣｌｙＡ細孔に固有のノイズは低減される。例示的な修飾ＣｌｙＡ細孔は、−３５ｍＶ下で、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  １５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中、ｐＨ７．５の条件において、１．５ｐＡ  ｒｍｓから３ｐＡ  ｒｍｓのノイズ測定値を示す。特に、ノイズは、塩濃度の増加、および／または電流遮断が測定されている時間の長さの変更によって減らすことができる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、野生型ＣｌｙＡ細孔とは異なる溶解性特性を示す。例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔のモノマーは、水中、および／またはＳＤＳもしくはＤＤＭなどの界面活性剤が存在しない他の溶液中に溶解させることができる。安定したオリゴマーは、修飾ＣｌｙＡ細孔が挿入される膜または脂質二重層を通過する＋１５０ｍＶから−１５０ｍＶの印加電位に耐えることができる修飾ＣｌｙＡ細孔である。
【００１９】
リガンドを含むナノ細孔
本開示のさらなる態様は、修飾ＣｌｙＡ細孔タンパク質が、選択的結合特性を有するリガンドと組み合わされているナノ細孔バイオセンサーに関する。いくつかの実施形態において、これらの修飾細孔およびリガンドは、例えば、複合生体試料中、例えば、組織および／または体液中のタンパク質分析物の同定に使用される。標的タンパク質分析物は、試料の他の成分よりも低濃度で存在していてもよい。いくつかの実施形態において、リガンドはまた、分析物の構造または機能特性に基づいた巨大分子分析物の一部分を標的とするために使用することができる。リガンドの存在によって、標的タンパク質分析物と修飾細孔との会合が高まり得る。例えば、リガンドは、細孔の入口で選択性フィルタとして作用し、試料中の他の非標的タンパク質を拒絶しながら、標的タンパク質の捕捉を増加させることができる。
【００２０】
例示的なリガンドとしては、限定するものではないが、アプタマー、抗体、受容体、および／または標的タンパク質に結合するペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、リガンドは、修飾ＣｌｙＡ細孔への標的タンパク質の結合を抑制する、標的タンパク質の阻害剤であってもよい。
【００２１】
ある特定の実施形態において、標的タンパク質分析物に結合するリガンドは、上記で記載した検出ステップよりも前に試料に添加する。このステップによって、標的タンパク質分析物が存在するという追加確認を提供することができる。したがって、試料中の少なくとも１つの標的タンパク質を検出する方法は、（ａ）試料を標的タンパク質に結合するリガンドと接触させるステップと、（ｂ）試料を本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔と接触させるステップと、（ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って電位を加えるステップと、（ｃ）１以上の時間間隔で修飾ＣｌｙＡ細孔を通過する電流を測定するステップと、（ｄ）１以上の時間間隔で測定された電流を基準電流と比較するステップとを含むことができ、基準電流に対する電流の変化は、試料中に標的タンパク質が存在することを示す。さらに、電流の変化は、修飾ＣｌｙＡ細孔を通る電流を測定する前にリガンドと接触させなかった試料と比較することができる。標的タンパク質分析物が実際に存在するならば、リガンドの添加によって修飾ＣｌｙＡ細孔への標的タンパク質の結合が抑制され、電流遮断は検出されない。逆に、リガンドが添加されなかった場合、電流遮断が検出され得る。両結果を一緒に用いることで、標的タンパク質の存在と濃度を決定することができる。例えば、標的タンパク質分析物を含む様々なタンパク質を含有している所定の試料において、試料に、まず、毎秒Ｘの遮断が生じ得る。過剰の特異的リガンドを添加した後は、試料に毎秒（Ｘ−ｎ）の遮断が生じ得る。したがって、ｎは、オリジナル試料中の標的タンパク質分析物によって生成される毎秒の遮断を反映し得る。次に、これは、オリジナル試料中の標的タンパク質分析物の濃度に関する情報を提供することができる。
【００２２】
ある特定の実施形態において、種々の電位が修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って加えられる。例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔の横切って加えられる電位は、−９０ｍＶから＋９０ｍＶの範囲であってよい。電位は、−９０ｍＶ、−８５ｍＶ、−８０ｍＶ、−７５ｍＶ、−７０ｍＶ、−６５ｍＶ、−６０ｍＶ、−５５ｍＶ、−５０ｍＶ、−４５ｍＶ、−４０ｍＶ、−３５ｍＶ、−３０ｍＶ、−２５ｍＶ、−２０ｍＶ、−１５ｍＶ、−１０ｍＶ、−５ｍＶ、０ｍＶ、＋５ｍＶ、＋１０ｍＶ、＋１５ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋２５ｍＶ、＋３０ｍＶ、＋３５ｍＶ、＋４０ｍＶ、＋４５ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋５５ｍＶ、＋６０ｍＶ、および／または＋９０ｍＶであってよい。それぞれの電位について、電流を測定し、１以上の基準電流と比較することができる。いくつかの実施形態において、基準電流は、開口の非遮断細孔において測定される。いくつかの実施形態において、基準電流は、既知のタンパク質、例えば、その存在または非存在を溶液で判定するタンパク質に結合されている修飾ＣｌｙＡ細孔で測定する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔は、１以上のアプタマーにコンジュゲートされてもよい。複数のアプタマーがコンジュゲートされる場合、アプタマーは同一アプタマーであってもよいし、または異なるアプタマーであってもよい。１以上のアプタマーは、修飾ＣｌｙＡ細孔中のシステイン残基にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、細孔中の別のアミノ酸残基の代わりにシステイン残基を含む。このシステイン残基置換は、野生型細孔タンパク質に対して行った他のアミノ酸の置換、欠失および／または付加と組み合わせることができる。例えば、細孔内腔内の修飾は、サイズ、結合特性、および／または細孔の構造を変えるように操作することができる。いくつかの実施形態において、システイン残基は他のアミノ酸、例えばセリン残基で置換されている。修飾細孔タンパク質は、少なくとも１個のサブユニットが修飾アミノ酸を含む、複数のサブユニット、例えば１２個のサブユニットを含む細孔であってもよい。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡは、グラム陰性細菌、例えば、サルモネラ（Salmonella）または大腸菌（E. coli）由来である。いくつかの実施形態において、修飾細胞溶解素は、腸チフス菌（S. typhi）またはパラチフス菌（S. paratyphi）由来の修飾ＣｌｙＡである。いくつかの実施形態において、修飾Ａ修飾ＣｌｙＡ細孔は１２個のサブユニットを含み、それぞれのサブユニットは配列番号２に示す配列を含む。
【００２４】
アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または核酸類似体を含む核酸アプタマーであってよい。アプタマーは、ペプチドアプタマー、例えば、両端部で足場に結合されている可変ペプチドループを含むペプチドアプタマーであってもよい。アプタマーは、特異的標的タンパク質分析物に結合させるために選択することができる。ある特定の実施形態において、２個以上のアプタマーは同一の修飾ＣｌｙＡ細孔にコンジュゲートされる。例えば、５、６、７、８、または９個のアプタマーが修飾ＣｌｙＡ細孔にコンジュゲートすることができる。あるいは、１０、１１または１２個のアプタマーが修飾ＣｌｙＡ細孔にコンジュゲートすることができる。複数のアプタマーが修飾ＣｌｙＡ細孔にコンジュゲートされている場合、アプタマーは少なくとも２ｎｍ離して配置させることができる。
【００２５】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔は、１種以上のペプチドリガンドと組み合わせる。ペプチドリガンドは、ジスルフィド結合、架橋結合および／または化学的ライゲーションによって修飾ＣｌｙＡ細孔に結合させることができる。また修飾ＣｌｙＡ細孔は、１個以上のペプチドリガンドが修飾ＣｌｙＡ細孔の少なくとも１個のサブユニットに融合されている融合タンパク質として操作され得る。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、複数のペプチドリガンドと組み合わせられる。ペプチドリガンドは同一リガンドであってもよいし、異なるリガンドであってもよい。例示的なペプチドリガンドとしては、限定するものではないが、レセプター、抗体、阻害剤、アクチベーター、および／または標的タンパク質に結合する他のペプチドリガンドが挙げられる。
【００２６】
標的分析物
１．タンパク質分析物
いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔タンパク質は、タンパク質分析物が細孔内腔内に結合できるように操作される。この結合は安定的で再現可能な電流遮断を媒介し、非結合の細孔において測定された非遮断イオン電流と容易に区別される。タンパク質分析物は、１５〜７０ｋＤａの分子量の範囲であってよく、例えば、例示的なタンパク質分析物は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７０ｋＤａの分子量を有していてよい。分析物は、小タンパク質の二量体または他の多量体であってもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔タンパク質は、タンパク質分析物に対する複数の結合部位および／または滞留部位を含む。例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔タンパク質は、２つの部位を含み得る：レベル２は、深く、立体的に結合される部位でのタンパク質分析物の滞留に関連しており、一方、レベル１は、細孔の広いｃｉｓ入口に近い位置でのタンパク質分析物の滞留に関連し得る。タンパク質分析物は、２つの部位の間を移動することが可能であり、それによって、同じ電流遮断事象内で確認される２つの電流レベルが誘発される。したがって、修飾ＣｌｙＡ細孔タンパク質は、タンパク質分析物に結合する際に、複数の（すなわち、２つの）電流レベル測定値を提供することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ−ＣＳ細孔は、タンパク質分析物を検出し定量することができる。修飾ＣｌｙＡ細孔は、同じタンパク質の相同体、例えば、ウシトロンビンとヒトトロンビンを区別することができる。
【００２９】
ａ．タンパク質の検出および同定
本開示の別の態様は、試料中の特定のタンパク質の検出に関する。いくつかの実施形態において、試料中の少なくとも１つのタンパク質分析物の存在を検出する方法は、（ａ）試料を本明細書で開示した修飾ＣｌｙＡ細孔と接触させるステップと、（ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って１以上の電位を加えるステップと、（ｃ）１以上のそれぞれの電位で修飾ＣｌｙＡ細孔を通る電流を測定すること；（ｄ）測定された電流を基準電流と比較するステップとを含み、ここで、基準電流に対する電流の変化は、試料中にタンパク質分析物が存在することを示す。いくつかの実施形態において、電流の変化は電流の低下である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は１５〜５０ｋＤａの範囲の分子量、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｋＤａの分子量を有する。基準電流は、リガンドの非存在下で修飾ＣｌｙＡ細孔によって測定された電流であってもよいし、かつ／または、基準リガンドの存在下で修飾ＣｌｙＡ細孔によって測定された電流であってもよい。いくつかの実施形態において、基準リガンドおよびタンパク質分析物は同一である。ある特定の実施形態において、基準リガンドとタンパク質分析物は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である。したがって、いくつかの実施形態において、試料中のタンパク質分析物を同定する方法は、（ａ）試料を本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔と接触させるステップと、（ｂ）修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って１以上の電位を加えるステップと、（ｃ）それぞれの１以上の電位で修飾ＣｌｙＡ細孔を通過する電流を測定するステップと、（ｄ）測定した電流を既知のリガンドから得た１以上の基準電流と比較するステップとを含み、測定された電流と基準電流の間の合致は、タンパク質分析物および既知のリガンドが同一であることを示す。同様に、測定された電流と基準電流の間の不一致は、タンパク質分析物および既知のリガンドが同一でないことを示し得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、野生型の細孔タンパク質と比べた場合、アミノ酸置換、欠失および／または付加を含む。例えば、細孔内腔内の修飾は、細孔のサイズ、結合特性および／または構造を変えるように操作することができる。いくつかの実施形態において、システイン残基は他のアミノ酸、例えば、セリン残基で置換されている。修飾細孔タンパク質は、少なくとも１個のサブユニットが修飾アミノ酸を含む、複数のサブユニット、例えば、７〜１１個のサブユニット、１２個のサブユニット、１３個のサブユニットまたは１４個のサブユニットを含んでいる細孔であってもよい。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡは、グラム陰性細菌、例えば、サルモネラ（Salmonella）または大腸菌（E. coli）由来である。いくつかの実施形態において、修飾細胞溶解素は、腸チフス菌（S. typhi）またはパラチフス菌（S. paratyphi）由来の修飾ＣｌｙＡである。いくつかの実施形態において、修飾Ａ修飾ＣｌｙＡ細孔は１２個のサブユニットを含み、それぞれのサブユニットは配列番号１に示す配列を含む。
【００３１】
ある特定の実施形態において、種々の電位が修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って加えられる。例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って加えられる電位は、−９０ｍＶから＋９０ｍＶの範囲であってよい。電位は、−９０ｍＶ、−８５ｍＶ、−８０ｍＶ、−７５ｍＶ、−７０ｍＶ、−６５ｍＶ、−６０ｍＶ、−５５ｍＶ、−５０ｍＶ、−４５ｍＶ、−４０ｍＶ、−３５ｍＶ、−３０ｍＶ、−２５ｍＶ、−２０ｍＶ、−１５ｍＶ、−１０ｍＶ、−５ｍＶ、０ｍＶ、＋５ｍＶ、＋１０ｍＶ、＋１５ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋２５ｍＶ、＋３０ｍＶ、＋３５ｍＶ、＋４０ｍＶ、＋４５ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋５５ｍＶ、＋６０ｍＶ、＋６５ｍＶ、＋７０ｍＶ、＋８０ｍＶ、＋８５ｍＶ、および／または＋９０ｍＶであってよい。それぞれの電圧について、電流を測定し、１以上の基準電流と比較することができる。いくつかの実施形態において、基準電流は、開口の非遮断細孔において測定される。いくつかの実施形態において、基準電流は、既知のタンパク質、例えば、その存在または非存在を溶液で判定するタンパク質に結合されている修飾ＣｌｙＡ細孔で測定する。
【００３２】
ある特定の実施形態において、タンパク質分析物と修飾ＣｌｙＡ細孔との相互作用は、開口の非結合細孔と比べた場合、電流遮断を引き起こす。電流遮断の大きさは、開口細孔電流の残留電流率（ＩＲＥＳ）として測定することができる。いくつかの実施形態において、特有の電流遮断を使用して特定のタンパク質分析物を同定する。例えば、電流遮断は短く速い電流スパイクであってもよい。電流遮断は、一過性であってもよいし、１分以上続く場合もある。電流遮断は浅い場合もあれば、深い場合もある。浅い電流レベルは、約４１〜１００％のＩＲＥＳ値によって示すことができる。前記値は、標的タンパク質分析物が開口細孔電流の約４１％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の残留電流を残すことを示す。逆に、深い電流レベルは、約０〜４０％のＩＲＥＳ値によって示すことができる。前記値は、標的分析物が開口細孔電流の約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％である残留電流を残すことを示す。いくつかの実施形態において、電流遮断は複数の電流レベルを含み、例えば、電流遮断は浅い電流レベルと深い電流レベルを含み得る。１つの例示的な修飾ＣｌｙＡ細孔において、標的分析物は、ＩＲＥＳ値が約７０％の第１の電流遮断と、ＩＲＥＳ値が約１５％の第２の電流遮断を引き起こし得る。ある特定の実施形態において、タンパク質分析物の存在および／または同一性は、タンパク質分析物から得た浅い電流レベルおよび深い電流レベルを基準リガンドから得た浅い電流レベルおよび深い電流レベルと比較することによって判定する。浅い電流レベルと深い電流レベルの間の相互変換は比較可能であり、例えば、ＩＲＥＳ値は比較可能であり、浅い電流レベルと深い電流レベルの間の変換率は比較可能であり、浅い電流レベルと深い電流レベルの相対的持続時間は比較可能であり、かつ／または、浅い電流レベルと深い電流レベルの数値は比較可能である。
【００３３】
任意の標的タンパク質分析物に関して、修飾ＣｌｙＡ細孔を横切る電圧を変える場合、浅い電流レベルおよび／または深い電流レベルのパーセンテージも変化し得る。ある標的タンパク質分析物からの浅い電流レベルおよび／または深い電流レベルの分布は、別の標的タンパク質分析物からのものとは異なり得る。したがって、いくつかの実施形態において、２種以上の標的分析物は、それらの電流レベルの測定値に基づいて相互に区別される。２種以上の標的タンパク質分析物は、それらの電流遮断の強度および持続時間によって、かつ／またはそれらの電流レベルの分布によって区別され得る。例えば、第１のタンパク質は、細孔を横切る電圧が増加するにつれて浅いレベルのパーセンテージに大幅な低下を示す場合があり、一方、第２のタンパク質ではより穏やかな低下を示す場合がある。
【００３４】
ある特定の実施形態において、２種以上の標的タンパク質が約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％同一である。ある特定の実施形態において、２種以上の標的タンパク質またはそれらのサブユニットが、約６５％、６０％、５５％、５０％または４５％同一である。いくつかの実施形態において、２種以上の標的タンパク質が、同一タンパク質の種特異的形態である。
【００３５】
２．核酸の移動
本開示の一態様は、核酸の結合、検出、同定、移動、および／または輸送調節が可能な修飾ＣｌｙＡ細孔である。修飾ＣｌｙＡ細孔を通り移動する核酸としては、例えば、限定するものではないが、翻訳後修飾、例えばメチル化を生じ得る、または生じないＤＮＡ；ＲＮＡ、例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ干渉ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、およびノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）などが挙げられる。核酸類似体は、例えば、２’−Ｏ−メチル置換ＲＮＡ、ロックト核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジデオキシヌクレオチドなどがある。
【００３６】
ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、ＤＮＡ、例えば、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡなどが移動するように操作される。ｓｓＤＮＡは特に、生理学的な塩条件下では内腔中の負荷電残基からの反発電荷により修飾ＣｌｙＡ細孔に入らない場合があるが、ＤＮＡは高イオン強度条件下では本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔を通って移動する。いくつかの実施形態において、高イオン強度条件は、２．５ＭのＮａＣｌ溶液である（または、前記溶液のイオン強度に等しい強度を有する）。ある特定の実施形態において、高イオン強度条件は２．５ＭのＮａＣｌのイオン強度より高く、例えば、高イオン強度条件は、２．７５Ｍ、３Ｍ、３．２５Ｍ、３．５Ｍ、３．７５Ｍ、４Ｍ、４．２５Ｍ、４．５Ｍ、４．７５Ｍまたは５ＭのＮａＣｌ溶液であってよく（または前記イオン強度と同等であってよく）、かつ／または２．７５Ｍ、３Ｍ、３．２５Ｍ、３．５Ｍ、３．７５Ｍ、４Ｍ、４．２５Ｍ、４．５Ｍ、４．７５Ｍまたは５ＭのＫＣｌ溶液であってもよい（または前記強度と同等であってよい）。ＣｌｙＡ細孔の内部内腔を覆っている負荷電残基は、これらの条件下でスクリーニングすることができる。例えば、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおいて、＋１００ｍＶで本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔へｄｓ  ＤＮＡを加えると、細孔を通るｄｓＤＮＡの移動によって短い電流遮断が生じ得る。本明細書に示したように、ｄｓＤＮＡは、これらの条件下で修飾ＣｌｙＡ細孔を移動する。さらに、ｓｓＤＮＡは、例えば、高イオン強度条件下で、かつ／または折り畳み構造内で、修飾ＣｌｙＡ細孔を移動することができる。ｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡとは異なる速度で修飾ＣｌｙＡ細孔を移動し得る。
【００３７】
したがって、本開示の一態様は、ＤＮＡが移動することができる修飾ＣｌｙＡ細孔を通るＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡの移動方法であって、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔を得るステップと、修飾ＣｌｙＡ細孔を横切る少なくとも＋５０ｍＶの電圧を加えるステップと、修飾ＣｌｙＡ細孔のｃｉｓ開口部にＤＮＡ含有試料を加えるステップと、細孔を通る流動電流を測定するステップとを含む、方法である。電流の遮断は、ＤＮＡの移動を示している。電流は、電位を負電位、例えば、−１００ｍＶまたは−５０ｍＶに逆転することにより戻すことができる。いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は高イオン強度条件下で使用される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡを移動させるための修飾ＣｌｙＡ細孔は、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔を含む。修飾ＣｌｙＡ細孔は、核酸を移動するように操作することができる。例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔は少なくとも１２個のサブユニットを含んでいてもよく、ここで、それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み、厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されている。それぞれのサブユニットは、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列によって表すことができ、さらに厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されていてもよい。Ｃｙｓ残基は、配列番号１中のＣｙｓ８７および／またはＣｙｓ２８５であってよい。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ残基はＣｙｓ２８５である。他のアミノ酸残基は、例えば、同様の特性、例えば、構造、電荷、疎水性または親水性などを共有するアミノ酸で置換されていてもよい。ある特定の実施形態において、置換の残基は、１個または複数のＬ９９、Ｅ１０３、Ｆ１６６およびＫ２９４である。例えば、置換の残基は、１個または複数のＬ９９Ｑ、Ｅ１０３Ｇ、Ｆ１６６ＹおよびＫ２９４Ｒであってもよい。したがって、それぞれのサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列によって表されるポリペプチドを含み得る。厳密に１個のＣｙｓ残基がＳｅｒで置換されているサブユニットを含んでいる例示的な修飾ＣｌｙＡ細孔は、ＣｌｙＡ−ＣＳと呼ぶことができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は、一定の膜内外電位差下において生体膜を横断する特異的なＤＮＡ分子を認識し監視する。反応メカニズムはＤＮＡ鎖置換に基づき得る。例えば、選択されたＤＮＡ分子がＤＮＡ鎖置換反応によってナノ細孔を横切って輸送され得るように、ＤＮＡ部分はナノ細孔にコンジュゲートすることができる。ある特定の実施形態において、修飾ＣｌｙＡ細孔は少なくとも１２個のサブユニットを含み、ここで、それぞれのサブユニットはＣ８７Ｓ、Ｃ２８５ＳおよびＤ１０３Ｃ置換を含み、それぞれのサブユニットはオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。したがって、いくつかの実施形態において、ｄｓＤＮＡを移動する方法は、（ａ）それぞれのサブユニットがＣ８７Ｓ、Ｃ２８５ＳおよびＤ１０３Ｃ置換を含み、かつオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる、少なくとも１２個のサブユニットを含む修飾ＣｌｙＡ細孔を得るステップと、（ｂ）本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔を横切って＋５０ｍＶの電圧を加えるステップと、（ｃ）修飾ＣｌｙＡ細孔のｃｉｓ開口部にｄｓＤＮＡを含有している試料を加えるステップと、（ｄ）修飾ＣｌｙＡ細孔のｃｉｓ開口部に、（ｉ）ＣｌｙＡ細孔にコンジュゲートしているオリゴヌクレオチドの少なくとも１５個の核酸塩基に相補的な配列、および（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡの少なくとも１２個の核酸塩基に相補的である配列を含む、第１の一本鎖核酸を加えるステップと、修飾ＣｌｙＡ細孔を通る電流を測定するステップとを含み、ステップ（ｄ）後の電流の低下は、修飾ＣｌｙＡ細孔を通る二本鎖ＤＮＡの移動を示す。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本方法は、任意選択で、修飾ＣｌｙＡナノ細孔のｔｒａｎｓ開口部に、第１の一本鎖核酸に相補的な配列を含んでいる第２の一本鎖核酸を加えることを含む。ここで、修飾ＣｌｙＡ細孔のｔｒａｎｓ開口部に第２の一本鎖核酸を加えた後の修飾ＣｌｙＡ細孔を横切る電流の増加は、二本鎖ＤＮＡが完全に細孔を通って移動したことを示す。
【００４１】
本開示のさらなる態様は、ＤＮＡを移動させるためのデバイスであって、第１のチャンバーと第２のチャンバーへ膜によって分離されている液体を充填したコンパートメントと；膜を横切って電位を加えることができる電極と；膜に挿入された１種以上のナノ細孔と；膜の１つのチャンバー内の高イオン強度の溶液とを含み、ここで、ＤＮＡが第１のチャンバーから第２のチャンバーへナノ細孔を通って移動する、デバイスに関する。ある特定の実施形態において、ＤＮＡは二本鎖である。ナノ細孔はＣｌｙＡ細孔であってよく、例えば、本明細書に記載した修飾ＣｌｙＡ細孔であってもよい。細孔、例えば、修飾ＣｌｙＡ細孔は、少なくとも２．２ｎｍの内径を有し得る。いくつかの実施形態において、膜は人工脂質二重層である。いくつかの実施形態において、膜を横切る電位は−１００ｍＶから＋１００ｍＶの範囲である。高イオン強度の溶液は、２．５ＭのＮａＣｌを含み得る。
実施例
【００４２】
一般的な開示を提供したが、以下の実施例は、一般的な開示を例にあげて説明するのに有用である。これらの特定の実施例は、本開示のある特定の態様および実施形態を例示するために記載したものであり、それらは、いかなる点においても限定することを意図するものではない。しかし、実施例に記載した特定の一般的な原理は、本開示の他の態様または実施形態に一般に適用することができる。
【実施例１】
【００４３】
目的の開発に沿ったＣｌｙＡの特性のチューニング
所望の特性を有する酵素を調整するための目的の開発方法を使用してＣｌｙＡ−ＳＳの活性を改善した。Ｃ８７Ｓ置換およびＣ２８５Ｓ置換の悪影響を解消する変異は脂質二重層中のナノ細孔の安定性も増加させると推論される。ランダムライブラリーは、エラープローンＰＣＲによってＣｌｙＡ−ＳＳのバックグラウンドで生成し（１ラウンド当たり一遺伝子につき約１〜４つの変異）、溶血活性についてスクリーニングした（図６）。次いで、最も活性の高い変異体をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＢＮ−ＰＡＧＥによってオリゴマー形成に関して試験した（図７）。選択されたナノ細孔変異体は、選択の最終的および重要な基準として機能する所望の挙動（低電気的ノイズおよび高印加電位での開口維持能力）に関して平面脂質二重層において最終的にスクリーニングされた。４回目のスクリーニングの直後に、低電気的なノイズを示し（図８）、＋９０から−１５０で平面脂質二重層において開口が維持されたＣｌｙＡ−ＣＳ変異体が単離された（表１）。驚いたことに、８７位のセリンが、野生型遺伝子のもとの残基であるシステインに逆変換された。部位特異的化学修飾に適しているシステインが少ないＣｌｙＡ変異体を得るためには、ＣｌｙＡ−ＣＳを８７位での飽和突然変異誘発に供し、得られたライブラリーにスクリーニングを行い、所望の電気的特性（ＳＩ）を有するシステインを含まないＣｌｙＡ−ＡＳを選択した。ＣｌｙＡ−ＳＳとは反対に、開発されたＣｌｙＡナノ細孔は可溶性画分中の大腸菌（E.coli）細胞において発現され（図６）、このモノマーはアフィニティークロマトグラフィーによる一工程で精製することができ、これにより生成収率を１０倍増加させることができた（１０ｍｌ培養物当たり約０．６ｍｇ）。
【実施例２】
【００４４】
様々なサイズを有するＣｌｙＡナノ細孔の単離
ＣｌｙＡモノマーを０．５％ｗ／ｖのβ−ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）とインキュベーションすることによって形成したＣｌｙＡオリゴマーは、ＢＮ−ＰＡＧＥにおいて複数のバンドを示した（図２ａ）。このことは、ＣｌｙＡがいくつかのオリゴマー状態に集合し得ることを示唆している。大腸菌（E.coli）ＣｌｙＡオリゴマー化の厳密な化学量論は議論の的になっているので、これは特に興味深い。ＣｌｙＡ結晶構造（ＰＤＢ＿ＩＤ：２ＷＣＤ）からは、ｃｉｓ側に５．５ｎｍの開口部とｔｒａｎｓ入口に３．３ｎｍの開口を有する（アミノ酸側鎖のファン−デル−ワールス半径を含む）十二量体であることが示されたが、以前の低温電子顕微鏡構造からは、８１１または１３１２のサブユニットを有するナノ細孔であることが示されている。
【００４５】
平面脂質二重層において、ＤＤＭでプレインキュベートしたＣｌｙＡ−ＷＴは、約２ｎＳに及ぶ開口ナノ細孔コンダクタンスの広域分布を示したが（図２ｂ、上図）、このことは、脂質二重層においてもまた、ＣｌｙＡ−ＷＴは様々なサイズおよび／または幾何学のナノ細孔に集合し得ることを示唆している。ＣｌｙＡ−ＷＴのユニタリコンダクタンスの分布における主要ピークは（Ｉ型ＣｌｙＡ）、わずか２４％の再構成されたナノ細孔しか示さず、１．７〜１．９ｎＳのコンダクタンス範囲で１．８３±０．０６ｎＳの平均コンダクタンスを示した（−３５ｍＶ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）。ＣｌｙＡ−ＣＳ開口細孔コンダクタンスの分布は２つの主要ピークを示した：第１のピークは３７％の再構成されたナノ細孔を含み、Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳ（１．７９±０．０５ｎＳ）に対応した；一方、第２のピーク（ＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳ）は２３％のナノ細孔を含み、２．１９±０．０９ｎＳの平均コンダクタンスを示した（コンダクタンス２．１〜２．４ｎＳ、図２ｂ、中央図）。またＣｌｙＡ−ＷＴおよびＣｌｙＡ−ＡＳは、低いパーセンテージのＩＩ型ＣｌｙＡも示した（それぞれ、１８％および１６％）。ＣｌｙＡ−ＡＳのユニタリコンダクタンスは、Ｉ型ＣｌｙＡに対応する５２％の再構成されたナノ細孔と特に同じであった（図２ｂ、下図）。
【００４６】
ＣｌｙＡオリゴマーの異なるバンドが様々なサイズのナノ細孔に対応するかどうかを確証するため、ＣｌｙＡ−ＣＳをＢＮ−ＰＡＧＥの３つの主要オリゴマーのバンドから抽出し、測定を、ゲル抽出から２日以内に各々のバンド由来の６２のナノ細孔のユニタリ開口ナノ細孔コンダクタンスで行った。最も低いバンド由来のＣｌｙＡ−ＣＳオリゴマーの６２％はＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔を形成し（１．７８±０．０４ｎＳ、図３ａ）、一方、２番目に低いバンド（図３ｂ）から抽出されたナノ細孔の６８％はＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔（２．１９±０．０９ｎＳ）として再構成された。興味深いことに、第３のバンドから抽出されたナノ細孔の４２％は、コンダクタンス範囲２．５〜３．０ｎＳにおいて２．８１±０．１１ｎＳの平均コンダクタンスを示す第３のナノ細孔のタイプ（ＩＩＩ型ＣｌｙＡ）として脂質二重層中に再構成された（図３ｃ）。
【００４７】
総合すれば、これらの結果は、ＢＮ−ＰＡＧＥで確認されたＣｌｙＡオリゴマーの３本の主要バンドが様々なサイズおよび様々なユニタリコンダクタンスを有する３つの異なるナノ細孔タイプに対応することを示している。この知見は、高次対称オリゴマー構造は、多くの場合、サブユニットの化学量論に対して許容的であるという報告と一致している１３。したがって、Ｉ型ＣｌｙＡは１２量体の結晶構造を示す可能性が最も高く、一方、ＩＩ型ＣｌｙＡは以前の低温電子顕微鏡構造試験で観察された１３量体であり得ると仮定することができる。両ナノ細孔は低い電気的ノイズを示し（図８）、広範囲の印加電位にわたって（＋９０ｍＶから−１５０ｍＶまで）開口したままであった。Ｉ型およびＩＩ型のナノ細孔よりも高いノイズを示し（図８）、特に−４０ｍＶ未満、および＋５０ｍＶを超える印加電位で頻繁にゲート開閉されたＩＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔は、以前には確認されていないＣｌｙＡの１４量体バージョンに対応している可能性がある。
【実施例３】
【００４８】
様々なサイズのＣｌｙＡナノ細孔を試験する分子キャリパーとしてのＨＴ
同一のアミノ酸組成物であるがサイズは異なるナノ細孔を使用できることは、ナノ細孔のサイズが特定の分子を捕捉し試験するその機能が明らかであるので、生物学的ナノ細孔分野における新しい特徴であり、かつ重要である１０ｂ、１４。−３５ｍＶで、ＨＴ（ヒトトロンビン、３７ｋＤａ）が数分間継続してＩ型ＣｌｙＡ−ＳＳナノ細孔へ明確な電流遮断を引き起こすことは以前に示されている７ａ。遮断シグナルは、２つの電流レベル、レベル１［開口ナノ細孔電流のパーセンテージ（ＩＲＥＳ％）＝５６±１％］とレベル２（ＩＲＥＳ％＝２３±１％、表１および図４ａ）との間で速やかに切り替えられ、ＣｌｙＡナノ細孔内腔内のＨＴに関する２つの所在部位を反映している。レベル２は、おそらく深い部位のＨＴ所在に関連していると考えられ、一方、レベル１は、ナノ細孔のｃｉｓ入口付近のＨＴの所在に関連している７ａ。トロンビンがこうした明確な電流遮断のパターンを引き起こしたので、ここでは、ＨＴを分子キャリパーとして使用して様々なＣｌｙＡナノ細孔の幾何構造を比較した。
【００４９】
−３５ｍＶで、Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔へのＨＴ電流遮断はＩ型ＣｌｙＡ−ＳＳナノ細孔の遮断と同じであった（表１）。このことにより、本明細書で開示した変異体に蓄積された変異は、おそらくＣｌｙＡナノ細孔のサイズおよび幾何構造に変化をもたらさなかったと考えられることが確認された。ＩＩ型ＣｌｙＡへのＨＴ電流遮断もまた２つの電流レベル間で切り替わったが、それらの相対分布は異なっていた。Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳでは、ＨＴは、主として表在の結合部位に留まっていたが（閉塞率７０％）、ＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳでは、ＨＴはナノ細孔内の深い結合部位で優位であった（閉塞率９６％）。これらの結果は、両型のＣｌｙＡは主として同じような全体的ナノ細孔構造を維持していると思われるが、ＨＴに対して異なる立体障害を与えることを示唆している。ＩＩＩ型ＣｌｙＡに対するＨＴ遮断は速く（５５±４８ｍｓ）、また、レベル２の電流遮断のみを示した（３２±９％のＩＲＥＳ％）。このことは、ＩＩＩ型ＣｌｙＡが、ナノ細孔を通るＨＴを妨げることなく移動させることができるのに十分な大きさであることを示唆している（以下参照）。
【実施例４】
【００５０】
ＣｌｙＡナノ細孔を通るタンパク質移動
トロンビンは、直径４．２ｎｍ（ＳＩ）の球体にほぼ近い分子量を有する球状タンパク質である。したがって、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型のＣｌｙＡは様々なオリゴマー状態を有するナノ細孔に対応することが仮定される場合（上記参照）、ＨＴは、容易にはＩ型およびＩＩ型のＣｌｙＡナノ細孔を通って移動しないはずである。（それぞれ、３．３ｎｍおよび３．７ｎｍの原子のファン−デル−ワールス半径を含むｔｒａｎｓ直径、表１）。反対に、ＨＴはＩＩＩ型ＣｌｙＡと同じ直径を有しており（表１）、このことから、タンパク質はこのナノ細孔を通って移動することができることが示唆される。分子がナノ細孔を通り抜けるかどうかを評価する有力な方法は、タンパク質の電流遮断の期間の電圧依存を調査することである。電位の増加とともに電流遮断期間が低減するということは、分子がナノ細孔を通って移動している有力な証拠である。逆に、電圧とともに電流遮断期間が増加することは、タンパク質がナノ細孔内に送り込まれるが、それを通って移動しないことを示唆する１０ｆ、１５。−５ｍＶから−２５ｍＶまで、Ｉ型ＣｌｙＡ−ＳＳナノ細孔へのＨＴ遮断の停止時間は印加電位に伴い増加しており（図９ａ）、ＨＴがこの電圧間隔でナノ細孔を通って移動しないことが示唆された。Ｉ型およびＩＩ型の開発したＣｌｙＡナノ細孔は−１５０ｍＶ以下の印加電位で開口したままであるという事実を活用し、ＨＴ遮断が−６０から−１５０ｍＶのＩ型およびＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔について特性決定された。Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔については−１００ｍＶを超える印加電位で、またＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔については−６０ｍＶで、ＨＴ電流遮断の停止時間が電位の増加に伴い顕著に減少した（図５ａ）。このことは、この電位範囲において、ＨＴ分子がナノ細孔を通って移動することを示唆している。同様に、Ｄｅｎｄｒａ２＿Ｍ１５９Ａ（ＦＰ、ＧＦＰ様タンパク質、３０ｋＤａタンパク質）は、最初に増加を示し（−２５ｍＶから−４０ｍＶまで）、続いて、電流遮断期間の減少を示した（−５０ｍＶから−７０ｍＶまで）。このことは、ＦＰが−５０ｍＶを超える電位でＩ型ＣｌｙＡ−ＳＳナノ細孔を通って移動することを示唆している（図９ｂ）。ＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳを通るＨＴの移動が明らかとなった同じ電位で、ＨＴ遮断期間をＩ型およびＩＩ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔と比較すると、Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳよりも約２オーダー速かった（図５ｂ、表１）。これは、Ｉ型およびＩＩ型ＣｌｙＡが様々なサイズを有するナノ細孔と書かれている解釈に沿っている。
【実施例５】
【００５１】
折り畳み対非折り畳みの移動
分子がナノ細孔の内腔内に留まる場合、イオン電流遮断は、分子によって中に入れなくなった電解質の原子体積に比例する１０ｄ、１０ｆ、１６。したがって、分子が折り畳み構造を有するナノ細孔を通って移動する場合、ＩＲＥＳ％は様々な印加電圧で一定のままのはずである。逆に、タンパク質が移動の際、非折り畳みである場合、ＩＲＥＳ％は変化することが予想される。このことは、非折り畳みポリペプチド鎖の体積および形状が球状タンパク質の体積および形状とは異なることによって生じる。Ｉ型およびＩＩ型ナノ細孔を通るＨＴの移動の際のＩＲＥＳ％値は、−３５ｍＶおよび−１５０ｍＶで同一であった（レベル２、表１）。これは、この電位範囲において、ＨＴが、ナノ細孔中にある間、非折り畳みであることを示唆している。興味深いことに、Ｉ型ＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔単独では、−９０ｍＶ未満の電位でのＨＴの電流遮断は、多くの場合、高いＩＲＥＳ％の電流遮断（ショルダー）、続いて開口ナノ細孔電流に関する電流の増加（スパイク）を伴って終わった（図５ｃおよび図１０）。ＩＲＥＳ％値のショルダーはＨＴが移動の際に非折り畳みであることを示し得るが、タンパク質移動後の電流スパイクは、そうではなく、折り畳みＨＴがＩ型ナノ細孔を通り移動できるようにＣｌｙＡナノ細孔に変形させる必要があり得ることを示唆している。
【実施例６】
【００５２】
ＣｌｙＡ細孔を通るｄｓＤＮＡの移動
この研究では、野性型ＣｌｙＡと比較した場合に平面脂質二重層でのその活性、溶解性および好ましい挙動が増加したＣｌｙＡ−ＣＳが選択された。ＣｌｙＡ十二量体の内径（その狭い入口１７で３．８ｎｍ、図１１ａ）は、ｄｓＤＮＡの直径（Ｂ型構造において２．２ｎｍ）よりも大きい。これは、ｄｓＤＮＡが細孔を通り容易に電気泳動的に移動するはずであることを示唆している。しかし、おそらくは、生理学的な塩濃度でＣｌｙＡの内腔を負荷電残基が覆っているために（ｐＩ＝５．１）、ｓｓＤＮＡはナノ細孔に入らない７ａ。高アルカリｐＨでのα溶血素（αＨＬ）ナノ細孔に関する以前の研究を考慮し７ｂ、７ｃ、ＤＮＡがＣｌｙＡ−ＣＳナノ細孔を通り移動する能力は、細孔の内部電荷がスクリーニングされる、高イオン強度で試験した。＋１００ｍＶの印加電位下で、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５において、ｃｉｓコンパートメントに０．１２μＭのビオチン化ｄｓＤＮＡ１（２９０ｂｐ、表２）を添加すると、ＤＮＡが細孔の内腔に入り、それによって２．０±０．６ｍｓの停止時間で、０．６３±０．０１の残留電流（ＩＲＥＳ＝ＩＢ／ＩＯ）を示す（レベル１＊＋１００＝１．１０±０．０３ｎＡ、ｎ＝３実験）、開口細孔電流（ＩＯ）に対する一過性の電流遮断（ＩＢ）が生じる（図１１ｂ）。続いて、ビオチンと強固な複合体を形成する、０．３μＭのニュートラアビジンをｃｉｓコンパートメントに添加すると、高い残留電流値で（ＩＲＥＳ＝０．６８±０．０１）、一時的遮断が長く継続する電流遮断に変わった（レベル１＋１００＝１．１９±０．０１ｎＡ、ｎ＝４）。開口細孔電流は、印加電位を−１００ｍＶまで逆転させることによって戻すことができる（図１１ｂ）。これらの結果からは、ニュートラアビジンは、ｃｉｓタンパク質：ＤＮＡ複合体（この場合、ＤＮＡは細孔の完全な長さを占める）を形成することによって、ＣｌｙＡナノ細孔を通るＤＮＡの完全移動を妨げることがわかる（図１１ｃ）。ｔｒａｎｓ複合体もまた、ｄｓＤＮＡ：ニュートラアビジン複合体がｔｒａｎｓ側を通って通過する場合、−１００ｍＶで（レベル１−１００＝１．０２±０．０３ｎＡ、ＩＲＥＳ＝０．６２±０．０１、ｎ＝４）形成され得る（図１１ｄ）。
【実施例７】
【００５３】
ロタキサン系はＣｌｙＡナノ細孔内でｄｓＤＮＡを捕捉する
ロタキサンは超分子の連結系であって、そこで、線状ユニット（スレッド）はマイクロ環を通って移動し、２つの嵩高い置換基（ストッパ）によって捕捉される。このように力学的に結合されている分子は、例えば、分子エレクトロニクスにおけるスイッチまたは分子機構における成分としての用途を有する。ロタキサンは、ｄｓＤＮＡ２２を含む様々な分子から作製されるか、またはαＨＬナノ細孔を通って通過したビオチン化ｓｓＤＮＡ分子を一方の側でストレプトアビジンにより、また反対側でＤＮＡヘアピンにより固定化することによって作製した（ｄｓＤＮＡはαＨＬを通って移動することができない）２３。ここで、ＣｌｙＡナノ細孔を通るｄｓＤＮＡの移動を証明するために、ＣｌｙＡナノ細孔のｔｒａｎｓ側に付加されたｄｓＤＮＡ分子が、ナノ細孔の内腔を通って通り抜けた後に、ｃｉｓ側の第２のＤＮＡ鎖とハイブリダイズする、ロタキサン系を構築した。ジスルフィド結合を介して細孔のｃｉｓ入口に（図１１ａの１０３位に）導入されているシステイン残基に、５’末端で共有結合されている１２個のｓｓＤＮＡ分子２（５１塩基、表２、図１２ａ）を含有する、ＣｌｙＡナノ細孔ＣｌｙＡ−２を使用した。２は、ロタキサンストッパとして機能するように設計されている。スレッド３は、オリゴ６とのハイブリダイゼーションによってｃｉｓ側でストッパとハイブリダイズするように設計されている、５’末端のさらなる３１個の核酸塩基長を有するｓｓＤＮＡと；ｔｒａｎｓ側でニュートラアビジンとの複合体形成に使用される３’ビオチン化リンカーとを含むｄｓＤＮＡ分子（５９ｂｐ、表２）である。ｃｉｓ側でのスレッドとストッパの間の結合は、２の最初の１６個の核酸塩基と、３の最後の２５個の核酸塩基に相補的であるｓｓＤＮＡ分子４を架橋することによって媒介される（表２、図１２ａ）。３および４がｔｒａｎｓコンパートメントに加えられる場合、−１００ｍＶで、ＤＮＡスレッドは細孔によって捕捉されるが、電位が＋１００ｍＶ（レベル２+１００、ＩＲＥＳ＝０．７７±０．０４、ｎ＝４）に転換された際、細孔から放出されず、よってＤＮＡロタキサンが形成されていることが示唆される（図１２ｂ）。興味深いことに、＋１００ｍＶで、ロタキサンの残留電流は、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ擬スレッドのＩＲＥＳ値よりも高い（それぞれ、０．６８±０．０１および０．６２±０．０１）。このことは２のハイブリダイズしていないｓｓＤＮＡ長がこの電位で細孔に及んでいる可能性があることを示唆している（図１２ｂ）。ロタキサンは、ｃｉｓチャンバーに２０ｍＭのＤＴＴを添加すると分解される可能性があり、その結果、２とＣｌｙＡの間のジスルフィド結合は低下し、＋１００ｍＶでの開口細孔電流が戻る（図１２ｃ〜１２ｅ）。
【００５４】
ＣｌｙＡ−２細孔を通る選択的移動
データは、ＣｌｙＡ−２が細孔の細孔内腔から非特異的ＤＮＡを排除することを示し、細孔に結合されているメッシュｓｓＤＮＡ分子が連結されていないＤＮＡ移動のための立体的かつ／または静電気的障害を生じる可能性があることを示唆している。さらに、細孔に結合されているＤＮＡは細孔内腔を塞ぐことが多く（図１５ｃ）、したがって、他のＤＮＡ分子の侵入を妨げる。特異的ＤＮＡ分子がＣｌｙＡ−２にハイブリダイズされる場合、速やかなＤＮＡの捕捉が正の印加電位で観察される。細孔に結合されているｓｓＤＮＡの濃度は、以前に約２０ｍＭであると推定されている２１。したがって、細孔入口付近のｄｓＤＮＡの濃度の増加によって、特異的ＤＮＡ鎖の捕捉を促進することができる。この場合、ハイブリダイズしていない鎖２はさらに細孔に連結される可能性があり、その場合には、ｄｓＤＮＡ構築物は細孔内腔に入るためにｓｓＤＮＡ２と競合せざるを得ない。
【実施例８】
【００５５】
ナノ細孔：鎖置換反応を利用するＤＮＡデバイス
正の高い印加電位で、ＣｌｙＡ−２ナノ細孔のイオン電流は開口細孔レベルと数種類の閉塞細孔レベルの間で変動した（図１２ｃ、図１５および図１６ａ）。このことは、細孔の頂部に連結されているｓｓＤＮＡ分子はＣｌｙＡの内腔に入るが、細孔のｔｒａｎｓ側に永久的に通り抜けられないことを示唆している１ｃ。さらにこの解釈が示唆されている；＋１００ｍＶで、ＣｌｙＡ−ＣＳのｃｉｓ側にニュートラアビジンとの複合体の９０量体ｓｓＤＮＡ  ５ａ（表２）を加え、引き続き等モル濃度の相補的ｓｓＤＮＡ  ５ｂを加えた場合（表２、図１３）、長く継続するＤＮＡ移動事象に変換される一過性の電流遮断が生じた（図１３）。ナノ細孔を通るＤＮＡの移動は、細孔内腔の電荷分布をモジュレートすることによって２６、２７、または溶液のイオン強度を変化させることによって７ｃ、２８調整され得る閾値電位よりも上で観察されることが多い２４−２７。したがって、おそらく、その低い電荷密度および／または高い可撓性を理由に、これらの知見は、ｓｓＤＮＡがｄｓＤＮＡよりもＤＮＡ移動に関して高い閾値を有することを示している（図１３）。
【００５６】
これらの結果は、電位が印加されたにもかかわらず、ＣｌｙＡのｃｉｓ入口へ結合されているｓｓＤＮＡ分子はｃｉｓ溶液をサンプリングすると考えられることを示唆している。一方、ＤＮＡ分子が正の印加電位で（例えば、鎖ハイブリダイゼーションによって）二本鎖になる場合、ｄｓＤＮＡ鎖は細孔を通って移動し、ｔｒａｎｓ溶液をサンプリングする。したがって、ナノ細孔：ＤＮＡデバイスは、ナノ細孔のｃｉｓ側への特異的ＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションが細孔を通るＤＮＡハイブリッドの移動を促進するよう設計された。次いで、ＤＮＡ：ナノ細孔複合体は鎖置換反応によって分解され（図１４ａ）、これによって、二重層を横切るＤＮＡの輸送と、２が戻ってｃｉｓチャンバーをサンプリングすることが促進される。都合が良いことに、正の印加電位で、ｄｓＤＮＡ分子をＣｌｙＡ−２のｃｉｓ側に加えると電流遮断は生じない（図１８）。このことは、ＣｌｙＡ−２に結合されているｓｓＤＮＡ分子が溶液からのＤＮＡの移動を妨げ、または顕著に低減することを示唆している。したがって、ナノ細孔上のＤＮＡユニットは、非特異的ＤＮＡの移動に対する関門が生成されている間、特異的ＤＮＡ分子の移動を促進することによるこの系への特異性が推察され得る。＋５０ｍＶで、３をＣｌｙＡ−２のｃｉｓ側に加えると電流の遮断は生じなかった。このことから、ＣｌｙＡ−２に結合されているｓｓＤＮＡ分子は溶液中のＤＮＡが細孔に入ることを妨げることがさらに確認される（図１４ｂ）。それにもかかわらず、２の最初の１５塩基と３の最後の１２核酸塩基に相補的である（表２）６をｃｉｓチャンバーに加えた後に、ｄｓＤＮＡハイブリッドナノ細孔は、ＤＮＡ捕捉の特質である永久電流遮断をＩＲＥＳ＝０．７０±０．０２（レベル２＋５０＝０．５９±０．０２ｎＡ、図１４ｃ、ｎ＝５）で示した。３のｔｒａｎｓ側への移動は、ｔｒａｎｓチャンバーにニュートラアビジンを加えた際のロタキサンの形成によって確認された（図１４ｃ〜ｄ、図１７ｅ〜ｆ）。重要なこととして、６は、ロタキサンを分解する足場として機能を果たすよう１０核酸塩基の５’−１本鎖伸長を含むように設計された（図１４ａ）。特に、６に相補的なｓｓＤＮＡ分子である（表２）７をｔｒａｎｓチャンバーに加えた場合、まず足場ハイブリダイズが生じ、次いで鎖置換が促進されることにより、ナノ細孔から３が放出された（図１４ａ）。これは、３と６とが細孔から放出された後、ＣｌｙＡに連結されているｓｓＤＮＡ分子がｃｉｓ側に戻るにつれて、開口細孔電流が戻ることによって観察された（図１４ｄ）。意外なことに、ＤＮＡカーゴがｃｉｓチャンバーから捕捉され、細孔を通って輸送され、ｔｒａｎｓチャンバーに放出されるにつれて、ナノ細孔は、捕捉のサイクル、移動および放出を反映する、一連の開口および閉塞電流レベルを示した（図１４ｄ）。
【００５７】
ＣｌｙＡ−２ナノ細孔の上部のＤＮＡ鎖は、＋５０および＋１００ｍＶの両方で非特異的ＤＮＡの捕捉を著しく低減した（図１８）。これは、細孔の上部のＤＮＡが溶液からのｄｓＤＮＡの移動を妨げることを示唆している。特に、印加電位は、＋１００ｍＶでは、ＣｌｙＡ−２は時折、非特異的ＤＮＡの捕捉によって引き起こされる典型的な事象に似た長期の電流遮断を生じたので（図１８）、＋５０ｍＶに設定し、＋１００ｍＶには設定しなかった。こうした電流遮断は、低い印加電位では頻度が低かった；それ故、実験は＋５０ｍＶ（図１４）および＋３５ｍＶ（図２０）で実施した。低い印加電位で研究するさらなる理由は、図１４の凡例で説明したように、ＤＮＡ捕捉の頻度が電位に伴って低下するためである。したがって、低電位では、捕捉と放出のサイクルがより容易に観察される。
【００５８】
ｓｓＤＮＡ対ｄｓＤＮＡ移動
ロタキサン構造において、ｓｓＤＮＡ分子は、正の印加電位で細孔の全長に及び得る。これは、＋１００ｍＶでは、ロタキサンのＩＲＥＳ値（０．７７）が、細孔内に固定化されているｄｓＤＮＡを有するｃｉｓおよびｔｒａｎｓ擬ロタキサンのＩＲＥＳ値よりも高い（それぞれ０．６８および０．６２、図１１ｃおよび図１１ｄ）という理由から想定される。さらに、Ｉ−Ｖ曲線の傾斜から計算されるロタキサンのユニタリコンダクタンス値は、正バイアス（１３．０ｎＳ、図１６）よりも正の印加電位（１０．８ｎＳ）で低かった。ｓｓＤＮＡはｄｓＤＮＡ（Ｂ型構造ではｄ＝２．２）よりも直径が小さいので（ｄ＝１ｎｍ）、これらの結果は、さらに、ｓｓＤＮＡは正バイアスで細孔を塞ぐことを示唆している。ｓｓＤＮＡが細孔に広がる能力をさらに調査するため、５９核酸塩基対の３’ビオチン化ｄｓＤＮＡセクション、続いて５’末端の３１核酸塩基のｓｓＤＮＡ長によって形成されるＤＮＡハイブリッド３の能力を、ＣｌｙＡ−ＣＳ細孔を通る移動能力について試験した。＋１００ｍＶで、ＣｌｙＡ−ＣＳ細孔のｃｉｓ側にニュートラアビジンとの複合体の３を加えると、ＩＲＥＳ＝０．６７の長く継続する電流遮断が引き起こされ（図１９）、それはｃｉｓ−擬ロタキサンと同じＩＲＥＳであった（０．６８）。このことは、この電位で、ＤＮＡハイブリッドがＣｌｙＡを通って移動し、ｄｓＤＮＡが細孔内腔に広がることを示唆している。３の移動はｓｓＤＮＡ末端からしか開始されないことから、これらの結果は、＋１００ｍＶで、ｓｓＤＮＡ先導配列がＣｌｙＡの内腔を移動することができることを示唆している。興味深いことに、＋５０ｍＶおよび＋７０ｍＶでは、電流遮断は単なる一過性であり（図１９）、この電圧ではｓｓＤＮＡはＣｌｙＡ細孔を通過することができないことを示唆される。３の最後の１２核酸塩基に相補的である鎖６を加えると、長く継続する電流遮断が＋７０ｍＶで生じた（図１９）。これは、ＤＮＡ移動の閾値が低くなることを示唆する。
【００５９】
材料および方法
ＣｌｙＡナノ細孔のスクリーニング
ＣｌｙＡは、ｐＴ７プラスミドを使用することによって、Ｅ．  ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で発現させた。形質転換体は、５％ウマ血液（ＢＢＬ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を含んだブルセラ菌寒天培地で予備スクリーニングし、それぞれを増殖させ、９６穴ウェルプレートで過剰発現させた。細胞溶解産物からのモノマーは、まず、ウマ赤血球（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）上で溶血活性についてスクリーニングし、次いで、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。精製モノマーは、０．５％β−ドデシルマルトシド（ＧＬＹＣＯＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）１２の存在下でオリゴマー化し、未変性ゲル電気泳動ゲルに装填してオリゴマー化をチェックした。次いで、ＣｌｙＡオリゴマーの電気的特性を平面脂質二重層においてスクリーニングした。
【００６０】
開発されたＣｌｙＡナノ細孔の精製
ＣｌｙＡは、ｐＴ７プラスミドを使用することにより、Ｅ．  ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現させた。モノマーはＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、０．２％β−ドデシルマルトシド（ＧＬＹＣＯＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）の存在下でオリゴマー化した。
【００６１】
電気的記録
イオン電流は、ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から形成された平面二重層から記録することにより測定した。電流は、パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）１８を使用し、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極により測定した。
【００６２】
エラープローンＰＣＲによるＣｌｙＡライブラリーの構築
ライブラリーは、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネータープライマーを使用して、プラスミドＤＮＡ由来のＣｌｙＡ遺伝子を増幅することにより構築した（表３）。第１の突然変異誘発ラウンドにおいて、本発明者らは、テンプレートとして腸チフス菌（Salmonella typhi）由来のＣｌｙＡ−ＳＳをコードしている合成遺伝子含有のプラスミドを使用した。第２の突然変異誘発ラウンドから、本発明者らは、先の選択ラウンドに由来するＤＮＡプラスミドを使用した。ＣｌｙＡ−ＳＳにおいて、ＷＴ配列は、２個のＣｙｓ残基（８７位および２８５位）をＳｅｒで置換することにより、また、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＳｅｒリンカーをコードしているＤＮＡを結合させ、続いてＣ末端ヘキサヒスチジンタグ７ａを結合させることにより修飾した。
【００６３】
ＤＮＡ増幅はエラープローンＰＣＲによって実施した：４００μＬのＰＣＲミックス（２００μｌのＲＥＤＴａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ、８μＭ最終濃度のフォワードプライマーおよびリバースプライマー、約４００ｎｇのプラスミドテンプレート、ならびに４００μｌ以下のｄｄＨ２Ｏ）を０〜０．２ｍＭのＭｎＣｌ２を含有する８つの反応混合物へ分割して入れ、２７サイクル実施した（９５℃で３分間のプレインキュベーション、次いでサイクルの実施：９５℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、７２℃で３分の伸長）。これらの条件によって、典型的には、最終ライブラリーにおいて１遺伝子当たり１〜４個の変異が得られた。ＰＣＲ産物をまとめてプールし、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、ＭＥＧＡＷＨＯＰ手順によってｐＴ７発現プラスミド（ｐＴ７−ＳＣ１）へクローニングした：１９約５００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を約３００ｎｇのＣｌｙＡ−ＳＳサーキュラーＤＮＡテンプレートと混合し、増幅を５０μＬの最終容量でＰｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて実施した（９８℃で３０秒のプレインキュベーション、次いでサイクルの実施：３０サイクルについて、９８℃で５秒の変性、７２℃で１．５分の伸長）。サーキュラーテンプレートは、３７℃で２時間、Ｄｐｎ  Ｉ（１ＦＤＵ）とインキュベーションすることによって除去した。得られた混合物は、アガロースゲル（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中、２．５％アガロース）に対する透析を行い、脱塩し、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）１０Ｇ  ｃｅｌｌｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換させた。形質転換細菌は、典型的には、＞１０５個のコロニーが得られるアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天平板上で、終夜３７℃で増殖させ、ライブラリープラスミドＤＮＡを調製するため回収した。
【００６４】
開発したＣｌｙＡの８７位の飽和突然変異誘発ライブラリーの構築
システイン非含有ＣｌｙＡ変異体を含有するライブラリーを所持するため、４ＣｌｙＡ４をコードしている遺伝子（表２）を８７ＮＮＳプライマー（完全なセットのアミノ酸をコードしている８７位に縮重コドンを含有、表３）およびＴ７ターミネータープライマーを使用して増幅させた。ＰＣＲ条件：約４００ｎｇのテンプレートプラスミドを含有する、最終容量０．３ｍＬのＰＣＲミックス（ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標））について、３０回のサイクルを実施した（９５℃で３分のプレインキュベーション、次いでサイクルの実施：９５℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、７２℃で３分の伸長）。得られたＰＣＲ産物は、４ＣｌｙＡ４サーキュラーテンプレートを使用して、ＭＥＧＡＷＨＯＰ手順によってｐＴ７発現プラスミドへクローニングした（上記参照）。
【００６５】
ＣｌｙＡ−ＷＴの構築
ＣｌｙＡ−ＳＳ遺伝子は、８７Ｃプライマーおよび２８５Ｃプライマーを使用して増幅させた（表３）。ＰＣＲ条件：最終容量０．３ｍＬのＰＣＲミックス（１５０μｌのＲＥＤＴａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ、６μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、約４００ｎｇのテンプレートプラスミド）について、２７回のサイクルを実施した（９５℃で３分のプレインキュベーション、次いでサイクルの実施：９５℃で１５秒の変性、５５℃で１５秒のアニーリング、７２℃で３分の伸長）。得られたＰＣＲ産物は、ＣｌｙＡ−ＳＳのサーキュラーテンプレートを使用して、上記のＭＥＧＡＷＨＯＰ手順によってｐＴ７発現プラスミドへクローニングした。
【００６６】
ＣｌｙＡライブラリーのスクリーニングおよび溶血アッセイ
ＣｌｙＡ−ＳＳは「検出ボーダー」溶血活性を示すので、変異誘発の最初の２ラウンドの間、ライブラリーは、５％ウマ血液を含むブルセラ寒天培地に対する活性のみをスクリーニングした。第３の選択ラウンドからは、過剰発現後の粗製溶解産物から得たブルセラ寒天培地上で溶血活性を示すコロニーに対し、ウマ赤血球上での溶血活性についてさらにスクリーニングした。この研究の目的は、β−ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）中で十分にオリゴマー化され、脂質二重層において電気的ノイズが低く、ユニタリコンダクタンスが均一であるナノ細孔を形成するＣｌｙＡ変異体を得ることであった。したがって、溶血活性単独のスクリーニングは、こうした変異体を選択する唯一の基準として有用ではなかった（例えば、ＷＴ−ＣｌｙＡは非常に溶血作用的に活性であるが、非均一的な単位電流分布を示す）。このため、第４のラウンドから、粗製溶解産物からのタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、ＣｌｙＡのオリゴマー化はＤＤＭでのインキュベーション後にＢＮ−ＰＡＧＥで試験した。次いで、十分にオリゴマー化したＣｌｙＡナノ細孔を（高い印加電位において、形成されたチャネルの均一性、低電気ノイズおよび安定性に対して特定の応力を有する）平面脂質二重層において試験した。
【００６７】
ブルセラウマ血液寒天培地プレート上での溶血活性に対するスクリーニング
プラスミドＤＮＡをＥ．ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にエレクトロポレートした後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補充した５％ウマ血液（ＢＢＬ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を含むブルセラ寒天培地上で形質転換体を予備スクリーニングした。３７℃で終夜増殖させた後、コロニー周囲の細胞溶解兆候によって確認された溶血活性を示すクローンは、３７℃で終夜振盪することにより、９６穴ウェルプレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する０．５ｍＬ  ２×ＹＴ培地）でそれぞれ増殖させた。得られた培養物は、次のラウンド（ラウンド１および２）でテンプレートとして機能するプラスミドＤＮＡ（ＱＩＡｐｒｅｐ、Ｑｉａｇｅｎ）を調製するためにプールするか、タンパク質過剰発現（ラウンド３〜５）のスターターとして使用した。
【００６８】
ＣｌｙＡ過剰発現後の粗製溶解産物の溶血活性に対するスクリーニング
ラウンド３〜５：４００〜６００個のクローンから得たスターター培養物５０μｌ（上記参照）を新しい９６穴ウェルプレート中の新鮮な培地４５０μｌに接種し、ＯＤ６００〜０．８まで３７℃で培養物を増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を加えて過剰発現を誘導し、その温度は終夜のインキュベーションの間に２５℃まで下げた。翌日、細菌を４℃で３０００×ｇにて１５分間遠心分離を行って回収し、上清を廃棄し、ペレットを数時間−７０℃でインキュベートし細胞破壊を促進した。次いで、ペレットを溶解バッファー（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌリゾチームおよび０．２単位／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ  Ｉ）０．３ｍＬに再懸濁し、３７℃で３０分間、１３００ＲＰＭで振盪することにより溶解させた。次いで、５〜３０μＬの溶解産物を約１％のウマ赤血球懸濁液１００ｕＬに添加した。後者を、４℃で６０００×ｇにて５分間、ウマ血液（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を遠心分離にかけることにより調製し、ペレットを１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに再懸濁した（上清が赤色を呈した場合、再度、溶液を遠心分離にかけ、ペレットを同一バッファー中に再懸濁した）。溶血活性は、経時的に６５０ｎｍでのＯＤの低下をモニターした（約３〜１０分間隔、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＧＯ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを使用して測定）。クローンの溶血活性は、基準と同じプレートで増殖させた、前のラウンドから得た２〜４個の親クローンの活性と比較した。
【００６９】
開発された変異体のオリゴマー化に関するスクリーニングおよびナノ細孔形成。
ラウンド４：最も溶血作用的に活性のある変異体の６〜１２種は同じ溶解産物から部分的に精製し、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用することによりこれを溶血活性のスクリーニングに使用した：モノマーＣｌｙＡを含有する粗製溶解産物０．２ｍＬは、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、（ＣｌｙＡオリゴマー化誘発用）１％ＤＤＭおよび１０ｍＭイミダゾールを補充した１５０ｍＭ  ＮａＣｌで１ｍＬにし、周囲温度で２０分間インキュベートし、４℃で１０分間、２０，０００×ｇの遠心分離にかけた。清澄化溶解産物を２０μＬ（ビーズ容量）のＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）に、１時間、４℃で穏やかに混合することによって結合させた。未結合画分は、４℃で１０分間、２０，０００×ｇの遠心分離を行い除去した（上清の廃棄）。最後に、オリゴマー化したＣｌｙＡタンパク質は、６００ｍＭイミダゾールを含む１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ０．２％ＤＤＭの５０μＬで溶出した。典型的には、４０μｇのＣｌｙＡに、約１０％グリセロールおよび１×ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ（商標）泳動バッファーおよび１×陰極バッファー添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を補充し、次いで、ＢＮ−ＰＡＧＥに装填した（図７）。次いで、ＢＮ−ＰＡＧＥでオリゴマーを形成した変異体を、（形成されたチャネルの均一性に対して特定の応力を有する）平面脂質二重層において試験した。
【００７０】
ラウンド５において、８７位での飽和突然変異誘発に供されたＣｌｙＡ−ＣＳクローンをスクリーニングし、部位特異的化学修飾に適しているシステインを含まないＣｌｙＡ変異体を得た。したがって、８７位にシステインを含有するクローンは最も高い活性を示すことが予想されたので、このラウンドでは、粗製溶解産物で中〜高度の溶血活性を示したクローンを単離した。次いで、上記に説明したように、ＣｌｙＡ変異体を部分精製し選択した。
【００７１】
タンパク質の過剰発現および精製
Ｅ．  ｃｌｏｎｉ（登録商標）ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）細胞をＣｌｙＡ遺伝子含有ｐＴ７プラスミドで形質転換した。形質転換体は、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを補充したＬＢ寒天平板で終夜３７℃にて増殖させた。得られたコロニーをまとめてプールし、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地５０ｍＬに接種した。培養物は、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。次いで、ＣｌｙＡの発現は０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導し、増殖を２０℃で継続した。翌日、細菌を１０分間、６０００×ｇの遠心分離により回収し、ペレットを−７０℃で保存した。
【００７２】
モノマーＣｌｙＡ含有ペレットを、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５単位／ｍＬのＤＮＡｓｅ  Ｉを補充した洗浄バッファー（１０ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５）２０ｍＬに溶解および再懸濁させ、細菌を超音波処理によって溶解させた。粗製溶解産物を２０分間６０００×ｇの遠心分離で清澄化し、上清を、洗浄バッファーで予備平衡化した２００μＬのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した。１時間後、樹脂をカラム（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ  Ｓｐｉｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に装填し、約５ｍｌの洗浄バッファーで洗浄した。ＣｌｙＡは、３００ｍＭのイミダゾールを含有する概算で約０．５ｍＬの洗浄バッファー溶出した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定し、精製タンパク質は４℃で保存した。
【００７３】
ＣｌｙＡモデルの構築
１３量体および１４量体のＣｌｙＡナノ細孔は、以下のように、１２量体の結晶構造（ＰＤＢコード：２ＷＣＤ）からモデル化した。中心軸は１２量体の長さによって構築し（ａｘ１２）、細孔のおおよその半径（ｒ１２）を呈するモノマーＡの残基１１４のＣ−アルファ原子（１１４Ｃａ−Ａ）とａｘ１２の間の距離を測定した。１１４Ｃａ−ＡとモノマーＢ中の同等の原子（１１４Ｃａ−Ｂ）間の距離（ｄ）を使用して、１２量体（ｃ１２＝ｄｘ１２）、１３量体（ｃ１３＝ｄｘ１３）および１４量体（ｃ１４＝ｄｘ１４）のおおよその円周を計算した。次いで、３つのオリゴマーの半径（ｒ１２、ｒ１３およびｒ１４）を、簡易な三角法を使用して円周から計算した。次いで、１２量体、１３量体および１４量体をそれぞれ距離ｒ１２、ｒ１３およびｒ１４にモノマーを置くことにより中心軸から構築し、また、それぞれ、３６０°／１２、３６０°／１３および３６０°／１４の角度に対して回転させた。この方法を使用して構築された１２量体は、高次の細孔を構築する高度の対称性および実現可能性を示す、１２量体のＸ線の結晶構造を完全に再現した（ＲＭＳ＝０．２９Å）２０。
【００７４】
ナノ細孔開口のサイズは、細孔が閉じるまでＣｌｙＡの原子のファン−デル−ワールス半径を増加させることにより得た。次いで、ファン−デル−ワールス半径の増加値を細孔の半径として得た。トロンビンの直径は、測定したタンパク質の分子体積に対応する球体から計算した２０。
【００７５】
平面脂質二重層における電気的記録
印加電位はｔｒａｎｓ電極の電位を意味する。ＣｌｙＡナノ細孔は、グラウンドに接続されたｃｉｓコンパートメントから脂質二重層に挿入された。２つのコンパートメントは、直径約１００μｍの開口部を含む２５μｍ厚のポリテトラフルオロエチレンフィルム（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）によって分離させた。開口部は１０％のヘキサデカンを含むペンタン約５μＬで前処理し、二重層は、両電気生理学的チャンバーに１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）を含むペンタン（１０ｍｇ／ｍＬ）約１０μＬを添加することによって形成した。典型的には、単一チャネルを得るには、ｃｉｓコンパートメント（０．５ｍＬ）に０．０１〜０．１ｎｇのオリゴマーＣｌｙＡを添加することで十分であった。電気的記録は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．５において実施した。記録するチャンバーの温度は、チャンバーの底部および側面と直接接触している金属製ケースを通って循環する水によって２８℃に維持した。
【００７６】
データ記録および分析
平面二重層記録からの電気的シグナルはＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用することにより増幅し、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０  Ａ／Ｄコンバーター（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でデジタル化した。データはＣｌａｍｐｅｘ  １０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用することにより記録し、その後の分析はＣｌａｍｐｆｉｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて行った。開口細孔電流およびＨＴ遮断は、特段の記載がない限り、１０ｋＨｚのローパスベッセルフィルタを適用し、５０ｋＨｚでサンプリングすることにより記録した。ユニタリチャネルコンダクタンス分布データを収集するため、トレースは、カットオフが２００Ｈｚのガウスローパスフィルタを用いてさらにデジタル的に選別した。開口細孔電流は、細孔が正確な方向で挿入されることを確実にするため（ｃｉｓ側から再構築された場合、ＣｌｙＡのユニタリコンダクタンスは正の印加電位でより高い）＋３５および−３５ｍＶでのすべての挿入チャネルについて決定し、−３５ｍＶに対応する値を使用して分布を構築した。ＣｌｙＡに関する開口細孔電流値（ＩＯ）とＨＴに関する閉塞細孔電流値（ＩＢ）は、全点のヒストグラムに適合するガウスから計算した（０．３ｐＡ  ｂｉｎサイズ）３。ＨＴおよびＢＴ遮断に関するヒストグラムは、少なくとも１０の電流遮断から、少なくとも０．５秒の長さで作成した。残留電流値（ＩＲＥＳ）は次のように計算した：ＩＲＥＳ％＝ＩＢ／ＩＯ％。ＨＴが同じ遮断で２つの電流レベルを生じた場合、それらの相対的寄与率（図４ｂ、表１）は全点のヒストグラムに適合するガウスから得られるピークの面積から推定した３。ＨＴ遮断持続時間は、単一指数関数に少なくとも５０の事象での遮断滞留時間の累積分布をあてはめることによって計算した３。−５から−２０ｍＶまで、ＨＴ遮断持続時間は、３ステップからなる周期的掃引電圧プロトコルを適用することにより測定した。第１の「捕捉」ステップにおいて、印加電位は、２秒間、−６０ｍＶに設定した。第２の「放出」ステップにおいて、印加電位は、２〜１０秒で、ＨＴが細孔から放出される目的の電圧まで（−５〜−２０ｍＶ）低下した。最後に「再生」ステップにおいて、電位は、０．２秒の間＋３５ｍＶまですぐに逆転し、新しい非閉塞の開口細孔状態が再生成された。少なくとも５０の曲線を平均し、放出ステップに対応するトレースの部分を単一指数関数にあてはめた。時折レベル１電流およびレベル２電流の両方を示したＦＰ遮断期間（滞留時間）は、二桁にわたって分布しており、指数関数と十分に一致していなかった。したがって、平均滞留時間はＦＰに関して示す。トレースは、５ｋＨｚで設定した内部ローパスベッセルフィルタにより２０ｋＨｚのサンプリングレートで記録した。測定は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５で実施した。グラフはＯｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で作成し、温度は２８℃に設定した。この研究で示した値はすべて、別段の定めがない限り、少なくとも３つの個別の記録の平均に基づいている。
【００７７】
ＤＮＡ移動のためのＣｌｙＡ細孔
ＤＮＡの調製
ｓｓＤＮＡ分子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。１は、２つのプライマーの１つが５’ビオチン化されているＰＣＲによって調製した。３は、１つが３’末端でビオチン部分を含有している、２つの相補的ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートすることにより形成した。次いで、ＤＮＡハイブリッドは、アフィニティークロマトグラフィーによって過剰ｓｓＤＮＡから精製した。５および６は、ＩＤＴによって精製されたＨＰＬＣであった。
【００７８】
ＣｌｙＡ細孔の調製
ＣｌｙＡは、ｐＴ７プラスミドを使用することにより大腸菌（E. coli）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞で発現させた。Ｃ末端オリゴ−ヒスチジンタグを含有するモノマーは、大腸菌（E. coli）細胞で発現させ、可溶性画分はＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＣｌｙＡ十二量体は０．２％β−ドデシルマルトシド（ＤＤＭ）を添加することによって形成し、ブルー未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってモノマーから分離させた。オリゴマーＣｌｙＡ−ＣＳの最も低いバンドを抽出し、４℃で保存した。
【００７９】
ＣｌｙＡ−２ナノ細孔は、２個のＷＴシステイン残基（８７位および２８５位）がセリンで置換されているＣｌｙＡタンパク質（ＣｌｙＡ−ＳＳ）に２を共有結合させることにより調製し、システインは１０３位（ＷＴ遺伝子中のアスパラギン酸；ＣｌｙＡ−ＳＳＣ１０３）に導入された。ＣｌｙＡ−ＳＳＣ１０３は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒリンカー、続いてＣ末端ヘキサヒスチジンタグをもコードしているＣｌｙＡ−ＳＳから、Ｐｈｉｒｅ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用するメガプライマー法７ａを使用することによって構築した。次いで、Ｃ６リンカー（５ＴｈｉｏＭＣ６−Ｄ、ＩＤＴ）を介してＤＮＡ鎖の５’ヒドロキシルに結合されている保護チオール基を含有する、ＤＮＡ（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＴＡＡＡＧＡＧＴＧＣＡＧＡＧＴＴＡＣＴＴＡＧ−３’）をＣｌｙＡ−ＳＳＣ１０３モノマーにコンジュゲートさせ、記載のように精製およびオリゴマー化した。精製オリゴマーは、２０％グリセロール中で−８０℃にて保存した。
【００８０】
ＤＮＡの調製
１は、ＲＥＤＴａｑ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）ＰＣＲ反応ミックス（Ｓｉｇｍａ）製のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、５’ビオチン化フォワードプライマー（ｂｉｏ−５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）と非ビオチン化リバースプライマー（５’−ＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＣＡＣＣ−３’）を使用し、ｐＴ７−ＣｌｙＡ−ＷＴ  ＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅によって作製した。最大３５サイクルの後に、２４本の反応チューブ（各々のチューブ、５０μＬ）のＰＣＲ産物を、ＰＣＲクイック精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、構築物のサイズは２％アガロースゲル（ＴＡＥバッファー）を使用してチェックした。典型的な試料濃度は約２００ｎｇ／Ｌであった。
【００８１】
３は、３’ビオチン化ｓｓＤＮＡ分子（５’−ＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＴＣＧＣＡＣＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＣＣ−３’−ｂｉｏ、３ａ）を、２０％過剰の部分的相補的ｓｓＤＮＡ（５’−ＧＧＴＡＡＴＣＧＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＧＴＧＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＣ−３’、３ｂ、表４）とインキュベートすることにより形成させた。温度は１分間９５℃になるようにし、次いで、段階的に室温まで下げた。およその推定アニール温度で、温度は２℃の段階で下げ、それぞれを１分間維持した。次いで、ハイブリッドＤＮＡは、アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ）上に固定化されているモノマーアビジンを含有するビオチン結合カラムを使用し、アフィニティークロマトグラフィーによって過剰のｓｓＤＮＡから精製した。３は、プロトコルに従って、ビオチン遮断／溶出バッファーで溶出させた。典型的には、約４００ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度が得られた。ｄｓＤＮＡのサイズは、２％アガロースゲルを含むＴＡＥバッファーを使用してチェックした。精製ｄｓＤＮＡは、１μＭ  ＥＤＴＡの存在下で−２０℃にて保存した。
【００８２】
電気的記録
他に規定のない限り、シグナルは、１０ｋＨｚのベッセルフィルタを使用して、５０ｋＨｚのサンプリングレートで収集した。脂質二重層は、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤｐｈＰＣ）を含むペンタン（ｗ／ｖ）の１０％溶液１〜２μＬの添加によって形成させた。電位は、寒天ブリッジ（２．５ＭのＮａＣｌバッファー中３％ｗ／ｖの低溶解アガロース）中に沈めたＡｇ／ＡｇＣｌ電極の使用により加えた。印加電位は、チャンバーのｔｒａｎｓコンパートメントに接続された作用電極の電位を意味する。ＣｌｙＡナノ細孔溶液（０．０１〜０．１ｎｇ）は、外側電極に接続されたｃｉｓコンパートメントに加えた。単一チャネルを挿入した後、過剰タンパク質は数サイクルの潅流により除去した。電気的記録は、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８．０中、２２℃で実施した。誤差は、文字ｎで示している、少なくとも３つの独立した反復の平均からの標準偏差を示す。
【００８３】
参照による援用
本明細書に記載の全ての刊行物および特許は、それぞれの刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを示したかのように、本明細書にその全体を参考して援用する。矛盾する場合、本明細書中のあらゆる定義を含む本出願が規制する。
【００８４】
均等論
本発明の特定の実施形態を論じてきたが、上記明細書は例示であって、限定するものではない。本発明の多くの変更は、当業者によって、本明細書および以下の特許請求の範囲が検討された際に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲とそれらの完全な均等物の範囲、および明細書を、そのような変更を含めて参照することによって決定しなければならない。
【００８５】
参考文献
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【００８６】
表
【００８７】
【表１】
0006592427.tif 000002
【００８８】
【表２】
0006592427.tif 000003
【００８９】
【表３】
0006592427.tif 000004
【００９０】
【表４】
0006592427.tif 000005
【００９１】
【表５】
0006592427.tif 000006
0006592427.tif 000007
【図１】
0006592427.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006592427.tif 000023
【図１７−１】
0006592427.tif 000024
【図１７−２】
0006592427.tif 000025
【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【配列表】
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