(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種を含む被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種を含む被検試料及びプロテアーゼを含有する水溶液を混合し、得られた混合液を処理する工程、
当該混合液には、グルコース及びラクトースより選択される少なくとも１種の糖類、水、並びにｐＨ調整剤、緩衝剤及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１種が含まれる、
ｂ）ａ）工程で得られた処理物、並びに白金錯体、パラジウム錯体、及びイリジウム錯体からなる群から選択される少なくとも１種の金属錯体を混合し、処理する工程、
ｃ）上記ｂ）工程で得られた処理物について、上記被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｄ）上記ｃ）工程で得られた増幅産物を解析する工程。
【請求項２】
前記混合液中の前記糖類の濃度が０．１〜１．５質量％である、請求項１に記載する検出方法。
【請求項３】
プロテアーゼが、エンド型ペプチダーゼ、またはエンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの組み合わせである、請求項１または２に記載する検出方法。
【請求項４】
上記ａ）工程において、被検試料とプロテアーゼを含む水溶液との混合液を、当該プロテアーゼの至適ｐＨ及び至適温度の条件で、１〜６０分間撹拌処理することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載する検出方法。
【請求項５】
上記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、ＩＣＡＮ法、又はマイクロアレイ法である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ法が、リアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅法により、ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種を含む被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記からなる群から選択される少なくとも１つを含むキット：
１）プロテアーゼ、
２）ｐＨ調整剤、緩衝剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１種、並びにグルコース及びラクトースより選択される少なくとも１種の糖類、
３）白金錯体、白金錯体を生成する白金化合物、パラジウム錯体、パラジウム錯体を生成するパラジウム化合物、イリジウム錯体、及びイリジウム錯体を生成するイリジウム化合物からなる群から選択される少なくとも１種、
４）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、並びに
５）増幅産物を検出するためのプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種（以下、単に「蛋白質類」と記載する）を含む試料（例えば、飲食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌または拭き取り試料等）中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、蛋白質類を含む試料に含まれる微生物の生細胞を、当該試料中の蛋白質類の影響を抑えながら、死細胞及び損傷細胞と区別して選択的に且つ感度よく検出するための方法、及びそのために好適に使用される微生物検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
飲食品、生体試料、拭き取り試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間から一ヶ月程度の時間を要し、細菌の同定も困難であるという問題があった。
【０００３】
近年では、被検試料を、エチジウムモノアザイド（ＥＭＡ、ethidium monoazide）等のＤＮＡ架橋剤、及びトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した後、被検試料に含まれる微生物の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、生細胞を検出する技術が提案され、成果を挙げている（特許文献１〜４）。
【０００４】
上記のＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、死細胞及び損傷細胞の細胞壁に対する透過性が生細胞の細胞壁よりも高いため、死細胞及び損傷細胞の染色体ＤＮＡのほうが生細胞の染色体ＤＮＡよりも優先的に断片化される。このため、上記薬剤による処理後、染色体ＤＮＡの特定の領域をターゲットとしたＰＣＲを行うことで、生細胞を、死細胞や損傷細胞と区別して、選択的に検出することができる。
【０００５】
なお、上記ＰＣＲの鋳型としては、従来、被検試料に含まれる微生物細胞から抽出した核酸が用いられていたが、細胞から核酸抽出を行わずに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の存在下でＰＣＲを行うことで、迅速に生細胞を検出する方法が知られている（ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ）（特許文献４）。
【０００６】
前述するＤＮＡ架橋剤の一種であるＥＭＡは、ＤＮＡに水素結合した後、３５０〜７００ｎｍの波長の光照射を行うことによりＤＮＡの分子間を架橋する作用を有する化合物である。このため、ＤＮＡを架橋するためには被検試料への光照射が必須である。しかし、この光照射は、光源による加熱を防ぐため、被検試料を氷水中に浸漬した状態で行なう必要があり、煩雑さの要因になっている。これを解消する方法として、光源としてＬＥＤを用いる方法が提案されているが、光強度が不十分であり、また経時的に架橋剤の架橋能の低下がみられる等の問題がある。さらに、ＥＭＡ等の薬剤やそれを含む試料は、薬剤の変性等を防ぐため、光照射時以外は暗室などの遮光下におく必要がある。
【０００７】
また、従来の方法では、生細胞を死細胞及び損傷細胞と区別し、選択的に検出するために、ＰＣＲのターゲット領域として、一定以上の塩基長、例えば９００塩基（ｂｐ）以上の塩基長を有する領域を用いるのが一般的である。しかしながら、現在、一般的な定量ＰＣＲで使用されている８０〜２００ｂｐ程度のターゲット領域に比べて、９００ｂｐ以上の領域をＰＣＲにより増幅するためには、各ＰＣＲサイクルに数倍の時間を要し、また、定量性にも問題がないとはいえない。
【０００８】
一方、被検試料を架橋剤で処理した後、当該試料に培地を加えて加温し、再度架橋剤で処理するか（特許文献３）、又は、ＥＭＡとトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤とを併用すること（特許文献２）により、１００ｂｐ程度の比較的短いターゲット領域であっても、生細胞と死細胞又は損傷細胞との区別が可能なことが知られている。しかしながら、これらの方法は、工程または薬剤調製が煩雑である。
【０００９】
これらの方法の問題を解決する方法として、ダイレクト・リアルタイムＰＣＲに先だって、被検試料を白金錯体またはパラジウム錯体などの金属錯体で処理する方法が提案されている（特許文献５及び６）。白金錯体及びパラジウム錯体は、作用機序は異なるものの、いずれも被検試料に含まれる微生物の核酸のターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害する物質である。これらの金属錯体は、上記ＤＮＡ架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤と同様に、死細胞及び損傷細胞の細胞壁に対する透過性が生細胞の細胞壁よりも高いため、死細胞及び損傷細胞の染色体ＤＮＡのＰＣＲ反応が、生細胞の当該反応よりも優先して阻害される。その結果、ＰＣＲ反応によって、死細胞及び損傷細胞と区別して、生細胞が選択的に検出できるというものである。
【００１０】
これらの方法は、前述する従来の問題を解決した方法である点で有用な方法であるものの、例えば乳製品などのようにペプチドや蛋白質等を含む試料を対象とした場合、検出感度という面では、米国及び欧州のミルク大腸菌群検査に関するガイドラインの検査基準（5-10 cfu/ml）、並びに日本の食品衛生検査法の検査基準（0.45cfu/ml）が測定できるレベルの検出感度を十分満たすものではなく、さらなる改良が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００３−５３０１１８号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０９４０７７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９／０２２５５８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１１／０１０７４０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１４／０２１３５１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２０１４／０２１３５２号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、蛋白質類を含む試料中に存在する微生物の生細胞を、簡便な工程で、当該試料中の蛋白質類の影響を抑えながら、迅速に、且つ感度高く、死細胞及び損傷細胞と区別して選択的に検出することを可能とする方法を提供することを課題とする。また本発明は、当該方法を簡便に実施するために好適に使用できる検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねていたところ、蛋白質類を含む被検試料を、プロテアーゼを含有する水溶液で処理した後に、白金錯体、パラジウム錯体、又はイリジウム錯体等の金属錯体で処理し、その後、当該試料をＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法などの核酸増幅反応に供することで、簡便な工程で、試料中に含まれる蛋白質類の影響を抑えて、迅速に、しかも高い感度で、微生物の生細胞を、死細胞及び損傷細胞と区別して選択的に検出ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであって、下記の実施態様を包含するものである。
（Ｉ）被検試料中の微生物の生細胞を検出する方法（Ｉ−１）ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種（以下、「蛋白質類」という）を含む被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）蛋白質類を含む被検試料及びプロテアーゼを含有する水溶液を混合し、処理する工程、
ｂ）上記ａ）工程で得られた処理物と白金錯体、パラジウム錯体、及びイリジウム錯体からなる群から選択される少なくとも１種の金属錯体を混合し、処理する工程、
ｃ）上記ｂ）工程で得られた処理物について、被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｄ）上記ｃ）工程で得られた処理物について、増幅産物を解析する工程。
（Ｉ−２）上記ａ）工程において、被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液の混合液が、検出対象の微生物の生細胞の代謝活性を損なわないものであることを特徴とする、（Ｉ−１）に記載する検出方法。
（Ｉ−３）上記ａ）工程において、被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液の混合液が、検出対象の微生物の生細胞に対して等張性を有し、上記プロテアーゼの至適ｐＨ及び至適温度の範囲であることを特徴とする、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する検出方法。
（Ｉ−４）被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液の混合液が、被験試料及びプロテアーゼを含む生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−３）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−５）被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液の混合液が、ｐＨ調整剤、緩衝剤及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１種、被験試料、プロテアーゼ、水、並びに検出対象の微生物が資化する物質からなるものである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−６）検出対象の微生物が細菌またはウイルス、好ましくは細菌である（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−７）上記細菌がグラム陰性菌またはグラム陽性菌、好ましくはグラム陰性菌である（Ｉ−６）に記載する検出方法。
（Ｉ−８）上記グラム陰性菌が大腸菌である（Ｉ−７）記載する検出方法。
【００１５】
（Ｉ−９）検出対象の微生物が資化する物質が糖類である（Ｉ−５）〜（Ｉ−８）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−１０）糖類が、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、及びトレハロースからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくはグルコース及びラクトースから選択される少なくとも１種である（Ｉ−９）に記載する検出方法。
（Ｉ−１１）被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液の混合液中の糖類濃度が０.１〜１.５質量％である、（Ｉ−５）〜（Ｉ−１０）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−１２）プロテアーゼが、エンド型ペプチダーゼ、またはエンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの組み合わせである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−１１）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−１３）上記エンド型ペプチダーゼが、Tritirachium album起原酵素、及びBacillus sp.起原酵素からなる群から選択される少なくとも１種であり、
上記エンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの組み合わせが、Aspergillus melleus起原酵素、Aspergillus oryzae起原酵素、及びRhizopus oryzaeからなる群から選択される少なくとも１種のエンド型／エキソ型ペプチダーゼであるか、またはこれらのエンド型／エキソ型ペプチダーゼの少なくとも１種と上記エンド型ペプチダーゼの少なくとも１種との組み合わせである、（Ｉ−１２）に記載する検出方法。
【００１６】
（Ｉ−１４）上記ａ）工程において、被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液を混合し、当該混合液をプロテアーゼの至適ｐＨ及び至適温度の条件で１〜６０分間プロテアーゼ処理（撹拌処理）することを特徴とする、（Ｉ−１）〜（Ｉ−１３）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−１５）上記被検試料が、飲食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、（Ｉ−１）〜（Ｉ−１４）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−１６）上記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、ＩＣＡＮ法、又はマイクロアレイ法である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−１５）のいずれかに記載する検出方法。
（Ｉ−１７）上記ＰＣＲ法が、ｃ）工程（核酸増幅）とｄ）工程（増幅産物の解析）を同時に行うリアルタイムＰＣＲ法、好ましくは微生物を抽出処理せずにリアルタイムＰＣＲ法を行うダイレクト・リアルタイムＰＣＲ法である、（Ｉ−１６）に記載する検出方法。
（Ｉ−１８）ｄ）工程（増幅産物の解析）が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、（Ｉ−１）〜（Ｉ−１７）のいずれかに記載する検出方法。
【００１７】
（II）被検試料中の微生物の生細胞を検出するためのキット
（II−１）核酸増幅法により、蛋白質類を含む被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記からなる群から選択される少なくとも１つを含有するキット：
１）プロテアーゼ、
２）ｐＨ調整成分、緩衝剤、浸透圧調整剤、及び検出対象の微生物が資化できる物質からなる群から選択される少なくとも１種、
３）白金錯体、白金化合物、パラジウム錯体、パラジウム化合物、イリジウム錯体、及びイリジウム化合物からなる群から選択される少なくとも１種、
４）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、及び
５）増幅産物を検出するためのプローブ。
（II−２）上記プロテアーゼが、エンド型ペプチダーゼ、またはエンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの組み合わせである、（II−１）に記載する検出キット。
（II−３）上記エンド型ペプチダーゼが、Tritirachium album起原酵素、及びBacillus sp.起原酵素からなる群から選択される少なくとも１種であり、
上記エンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの組み合わせが、Aspergillus melleus起原酵素、Aspergillus oryzae起原酵素、及びRhizopus oryzaeからなる群から選択される少なくとも１種のエンド型／エキソ型ペプチダーゼであるか、またはこれらのエンド型／エキソ型ペプチダーゼの少なくとも１種と上記エンド型ペプチダーゼの少なくとも１種との組み合わせである、（II−２）に記載する検出キット。
【００１８】
（II−４）浸透圧調整剤が、被検試料及びプロテアーゼを含有する水溶液の混合液が被検試料中の微生物の生細胞と等張になるように調整するための成分を含有するものである、（II−１）〜（II−３）のいずれかに記載する検出キット。
（II−５）ｐＨ調整剤が、被検試料及びプロテアーゼを含有する水溶液の混合液を、プロテアーゼの至適ｐＨに調整するための成分を含有するものである、（II−１）〜（II−３）のいずれかに記載する検出キット。
（II−６）検出対象の微生物が細菌またはウイルス、好ましくは細菌である（II−１）〜（II−５）のいずれかに記載する検出キット。
（II−７）上記細菌がグラム陰性菌またはグラム陽性菌、好ましくはグラム陰性菌、より好ましくは大腸菌である（II−６）に記載する検出キット。
（II−８）検出対象の微生物が資化する物質が糖類である（II−１）〜（II−７）のいずれかに記載する検出キット。
（II−９）糖類が、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、及びトレハロースからなる群より選択される少なくとも１種、好ましくはグルコース及びラクトースから選択される少なくとも１種である（II−８）に記載する検出キット。
【００１９】
（II−１０）上記白金錯体が、シスプラチン、カルボプラチン、cis-ジアンミン（ピリジン）クロロ白金（II）クロリド、ジクロロ（エチレンジアミン）白金（II）、cis-ビス（ベンゾニトリル）ジクロロ白金（II）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金（II）、二硝酸（エチレンジアミン）ヨウ化白金（II）ダイマー、オキサリプラチン、ネダプラチン、及びトランスプラチンからなる群から選ばれる少なくとも１種であるか、または
上記白金化合物が、塩化白金、臭化白金、フッ化白金、ヨウ化白金、水酸化白金、硝酸白金、炭酸白金、酢酸白金、ジメトキシ白金、メトキシリン酸白金、リン酸白金、塩化白金酸、ジスルフメチル白金、ジシアノ白金、ジチオシアネート白金、二水素化白金、及びジメチル白金からなる群から選ばれる少なくとも１種である、（II−１）〜（II−９）のいずれかに記載する検出キット。
【００２０】
（II−１１）上記パラジウム錯体が、ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム (II)、ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム (II)、ジアンミンジクロロパラジウム (II)、ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム (II)、及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム (II) ジアセテートからなる群から選ばれる少なくとも１種であるか、または上記パラジウム化合物が、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム (II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジドからなる群から選ばれる少なくとも１種である、（II−１）〜（II−１０）のいずれかに記載する検出キット。
【００２１】
（II−１２）上記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリド、クロロトリカルボニルイリジウム、カルボニルクロロビス(トリフェニルホスフィン)イリジウム(I)、(アセチルアセトナト)ジカルボニルイリジウム(I)、(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I)、クロロビス(シクロオクテン)イリジウム(I)ダイマー、クロロジヒドリド[ビス(2-ジイソプロピルホスフィノ)エチルアミン]イリジウム(III)、クロロ(5-メトキシ-2-[1-[(4-メトキシフェニル)イミノ-N]エチル]フェニルl-C)(1,2,3,4,5-ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)、ジクロロテトラキス(2-(2-ピリジニル)フェニル)ジイリジウム(III)、ジヨード(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ダイマー、イリジウム(III)ブロミド水和物、イリジウム(IV)クロリド水和物、ペンタアンミンクロロイリジウム(III)クロリド、テトライリジウムドデシルカルボニル、イリジウム(III)アセチルアセトナート、(1,5-シクロオクタジエン)-η5-インデニル)イリジウム(I)、(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート、(1,5-シクロオクタジエン)(ピリジン)(トリシクロヘキシルホスフィン)-イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート、 (1,5-シクロオクタジエン)(ヘキサフルオロアセチルアセトナト)イリジウム(I)、(1,5-シクロオクタジエン)(メトキシ)イリジウム(I)ダイマー、ビス(シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラキス(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)ボラート、ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラフルオロボラート、ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) ジクロリド、ビス[1,2-ビス(ジフェニスホスフィノ)エタン]カルボニルクロロイリジウム(I)、及びペンタメチルシクロペンタジエニルイリジウム(III)クロリドダイマーからなる群から選ばれる少なくとも１種であるか、または
上記イリジウム化合物が、イリジウム、塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、ヨウ化イリジウム、水酸化イリジウム、硝酸イリジウム、炭酸イリジウム、酢酸イリジウム、ジメトキシイリジウム、メトキシリン酸イリジウム、リン酸イリジウム、塩化イリジウム酸、ジスルフメチルイリジウム、ジシアノイリジウム、ジチオシアネートイリジウム、二水素化イリジウム、メチルイリジウム、酸化イリジウム、五塩化イリジウム（IV）ジアンモニウム（ヘキサクロロイリジウム（IV）酸二アンモニウム）、クロロトリカルボニルイリジウム、これらの水和物、及びこれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１種である、（II−１）〜（II−１１）のいずれかに記載する検出キット。
【００２２】
（II−１３）さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、有機酸塩、及びリン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、（II−１）〜（II−１２）のいずれかに記載する検出キット。
（II−１４）さらに界面活性剤を含む、（II−１）〜（II−１３）のいずれかに記載する検出キット。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ペプチド及び蛋白質の少なくとも１種（蛋白質類）を含む試料中に存在する微生物の生細胞を、核酸増幅処理を含む簡便な処理で、当該試料中の蛋白質類の影響を抑えながら、迅速に、且つ感度高く、死細胞及び損傷細胞と区別して選択的に検出することが可能である。このため、蛋白質類を含む飲食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌または拭き取り試料などを対象として、これらの被験試料中に存在する微生物の生細胞を、死細胞及び損傷細胞と区別して、迅速且つ高感度に、選択的に検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（１）被検試料中の微生物の生細胞を検出する方法  本発明は、ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種（蛋白質類）を含む被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である：
ａ）蛋白質類を含む被検試料及びプロテアーゼを含有する水溶液を混合し、処理する工程、
ｂ）ａ）工程で得られた処理物、並びに白金錯体、パラジウム錯体、及びイリジウム錯体からなる群から選択される少なくとも１種の金属錯体を混合し、処理する工程、
ｃ）ｂ）工程で得られた処理物について、上記被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
ｄ）ｂ）工程で得られた増幅産物を解析する工程。
【００２５】
本発明において「被検試料」とは、本発明が検出対象とする試料を意味し、具体的にはその中に存在し得る微生物の生細胞を検出するための試料である。本発明では、特にペプチド及び蛋白質の少なくとも一種（蛋白質類）を含有する試料を対象とし、その中に存在し得る微生物の生細胞を、損傷細胞や死細胞と区別して選択的に検出することを目的とする。
【００２６】
かかる被検試料は、核酸増幅法による染色体ＤＮＡ又はＲＮＡの特定領域を増幅することで、微生物の生細胞の存在を検出することが可能なものであればよい。好ましくは、蛋白質類を含む試料であり、例えば蛋白質類を含む飲食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、及び拭き取り試料を挙げることができる。好ましくは蛋白質類を含む飲食品、及び生体試料である。以上説明するように、本発明で対象とする「被験試料」は蛋白質類を含むものであるため、以下、特に言及しない限り「被検試料」とは「ペプチド及び蛋白質の少なくとも一種を含む被験試料」を意味する。
【００２７】
ここで飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、スポーツ飲料及び乳酸菌飲料等の飲料または飲料水（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；牛乳（殺菌乳）、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター、育児用ミルク等の乳又は乳製品；経腸栄養食品、流動食；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品等を挙げることができる。好ましくは、アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；牛乳（殺菌乳）、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター、育児用ミルク等の乳又は乳製品；乳又は乳製品を原料とする飲食品；並びに経腸栄養食品、及び流動食であり、より好ましくは乳、乳製品、及び乳又は乳製品を原料とする飲食品である。
【００２８】
また、生体試料としては、血液、尿、髄液、滑液、胸水、喀痰、糞便、鼻腔粘液、喉頭粘液、胃洗浄液、膿汁、皮膚粘膜、口腔粘液、呼吸器粘膜、消化器粘膜、眼瞼結膜、胎盤、胚細胞、産道拭き取り試料、母乳、唾液、嘔吐物、又は水疱内容物等が例示される。好ましくは血液、及び母乳等である。
【００２９】
工業用水としては、製造業、電気供給業、ガス供給業及び熱供給業等の工業の用に供する水（水力発電用、飲用を除く）が例示される。
さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
【００３０】
拭き取り試料とは、工場の製造ラインや飲食店の調理場等の製造現場の洗浄度、衛生度、汚染度を測る目的として、生理食塩水やリン酸緩衝液等に浸したガーゼや脱脂綿等を用いて測定箇所を拭き取ったものから採取される試料を含むものである。
【００３１】
本発明においては、被検試料は、前記のような飲食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよいし、またこれらを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法の各工程で行う処理以外の方法で前処理をしたものであってもよい。当該前処理としては、微生物の生細胞を死滅させたり、また損傷を与える処理でなければよく、制限されないものの、濾過及び遠心分離等が挙げられる。
【００３２】
本発明が対象とする被験試料に含まれるペプチド及び／または蛋白質は、核酸増幅法を用いて微生物の生細胞を特異的にまた高感度で検出するという本発明の目的及び効果を妨げる可能性のあるものであり、この限りにおいて制限されず、あらゆるペプチド及び／または蛋白質が対象となる。ペプチドとして、好ましくは自然界（生体を含む）に存在しえる、アミノ酸が2個以上若しくは3個以上結合したペプチドを挙げることができる。これらのペプチドにはアミノ酸が10個以上結合し、分子量が5000以下のポリペプチドが含まれる。蛋白質として、好ましくは分子量が5000より大きいものであり、好ましくは自然界（生体を含む）に存在しえる分子量が5000より大きく150000以下の蛋白質である。
【００３３】
本発明が対象とする「微生物」は、核酸増幅法により検出することが可能であって、かつ、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合する金属錯体（白金錯体、パラジウム錯体、イリジウム錯体）の作用が、生細胞と死細胞及び損傷細胞とで異なる微生物であればよく、その限りにおいて、特に制限されない。好ましくは細菌、真菌（糸状菌［カビを含む］、酵母など）、又はウイルス等が挙げられる。好ましくは細菌である。また細菌としてはグラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。なお、金属錯体のうち白金錯体、及びパラジウム錯体が上記微生物全般について、生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別に使用できることについては、前述の特許文献５及び６にそれぞれ記載されている通りである。
【００３４】
また金属錯体のうちイリジウム錯体が、上記微生物全般について生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別に使用できる理由として、制限されないものの、下記事情を挙げることができる。
【００３５】
イリジウム錯体は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に直接的に、又はタンパク質等を介して間接的に結合もしくは干渉して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害する作用を有する。他方でイリジウム錯体は、生細胞の細胞壁よりも、死細胞及び損傷細胞の細胞壁の方が透過しやすいという性質を有する。このため、所定時間内であれば、微生物の損傷細胞及び死細胞の細胞壁及び細胞膜は透過するものの、微生物の生細胞の細胞壁及び／又は細胞膜は実質的に透過しない。その結果、イリジウム錯体は、微生物の死細胞及び損傷細胞の細胞内に選択的に侵入し、続いて、当該細胞内の染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡに直接的又は間接的に結合もしくは干渉し、その結果、イリジウム錯体が結合したＤＮＡ、又はＲＮＡは、核酸増幅反応の鋳型とはならなくなる。このように、生細胞よりも損傷細胞や死細胞に優先的にイリジウム錯体が透過すると、イリジウム錯体による影響を受けない生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対して、損傷細胞や死細胞では上記の通り、イリジウム錯体の影響を受けて核酸増幅反応が阻害される。そのため、微生物の生細胞を、損傷細胞や死細胞と区別して、選択的に検出することができるようになる。
【００３６】
以下、本明細書では、検出対象とする微生物を「ターゲット微生物」とも称する。
【００３７】
グラム陽性菌としては、ブドウ球菌（スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcus epidermidis））、及び黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus））等のスタフィロコッカス属細菌、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)）、ストレプトコッカス・ピオジェネス（Streptcoccus pyogenes）等のストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌、バチラス・セレウス（Bacillus cereus）、炭疽菌（バチラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)）等のバチラス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラー（Mycobacterium intracellulare）等のマイコバクテリウム属細菌、ボツリヌス菌（クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)）、ウェルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)）等のクロストリジウム属細菌等が挙げられる。
【００３８】
また、グラム陰性菌としては、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli））等のエシェリヒア属細菌、クロノバクター・サカザキ（Cronobacter sakazakii）（旧名、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii））等のエンテロバクター属細菌、シトロバクター・コーセリ（Citrobacter koseri）等のシトロバクター属細菌、クレブシェラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）等のクレブシェラ属細菌に代表される腸内細菌群、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、シュードモナス属細菌、レジオネラ属細菌等が挙げられる。
【００３９】
ウイルスとしては、エンベロープを有するインフルエンザウイルス等のウイルス、エンベロープを有さずヌクレオカプシドのみを有するノロウイルス、ロタウイルス、及びアデノウイルスなどが挙げられる。
【００４０】
本発明において「生細胞」（Live cell）とは、対象とする微生物をその好適条件（至適条件）で培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞膜または／及び細胞壁の損傷がほとんど無い細胞をいう。なお、ここでいう代謝活性としてはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。「生細胞」は、ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染し、増殖できる状態をいう。
【００４１】
「死細胞」（Dead cell）とは、対象とする微生物をその好適条件（至適条件）で培養した場合でも増殖せず、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染できない状態をいう。
【００４２】
「損傷細胞」（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、対象とする微生物をその好適条件（至適条件）で培養した場合に、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生細胞よりは低いものの死細胞と比較して有意に活性を有する状態の細胞である。ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染したとしても、細胞中で増殖できない状態をいう。
本明細書においては、特記しない限り「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
【００４３】
食品衛生検査及び臨床検査では、生細胞を、穏和な加熱処理や抗生物質投与により損傷を加えた損傷細菌と区別して検出する必要性が指摘されている。本発明においては、単に微生物（細胞）の検出に留まらず、微生物を生細胞と死細胞及び損傷細胞とに識別可能な検出方法を提供するものである。
【００４４】
尚、生細胞、損傷細胞及び死細胞の細胞数（単位）は、通常、いずれも「cells／ml」で表される。このうち、生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で好適な条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml：colony forming units/ml）で近似させることができる。また、損傷細胞の標準試料は、例えば、生細胞けん濁液を、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができ、この場合、損傷細胞の細胞数は、加熱処理する前の生細胞けん濁液の「cfu／ml」で近似させることができる。尚、損傷細胞を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば大腸菌の場合、５０秒程度で損傷細胞を調製することができる（例えば、T. Soejima et al., Microbiol. Immunol., 51(8), 763-775, 2007、及びT. Soejima et al., Journal of Clinical Microbiology, 2305-2313, 2008参照）。
【００４５】
さらに、損傷細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができ、その場合の損傷細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長600nm）の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、平板培地上で好適条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml）に近似させることができる。
【００４６】
ウイルスでは、細胞数単位は、プラーク形成単位（pfu又はPFU：plaque-forming units）で表される。
【００４７】
本発明の方法は、対象とする微生物（ターゲット微生物）の生細胞の検出が目的であり、生細胞と区別される微生物の細胞は、損傷細胞であっても死細胞であってもよい。
【００４８】
本発明において「生細胞の検出」とは、被検試料中の生細胞の有無の判別（定性分析）及び生細胞の量の決定（定量分析）のいずれをも含む。また、生細胞の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に含まれる生細胞量に対する相対的な量であってもよい。また、「生細胞を、死細胞及び損傷細胞と識別して検出する」とは、被検試料中の生細胞を、死細胞及び損傷細胞と区別して、選択的に検出することを意味する。尚、「生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別」には、生細胞と死細胞との識別、生細胞と損傷細胞との識別、並びに生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別のいずれもが含まれる。好ましくは生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別である。
【００４９】
以下、本発明の方法を工程ａ）〜ｄ）毎に説明する。
【００５０】
（１−１）工程ａ）：酵素処理
本工程ａ）は、検出対象とする微生物を含み得る被検試料及びプロテアーゼを含有する水溶液を混合し、当該混合液を処理する操作を含む。詳細には、当該工程ａ）は、被検試料にプロテアーゼを含有する水溶液を添加し（その逆も可）、被検試料をプロテアーゼ処理（酵素処理）する工程である。
【００５１】
一般に、プロテアーゼ（protease）は、アミノ酸がペプチド結合（-CO-NH-）によって鎖状に連結したペプチド（一般に100アミノ酸残基未満）及び蛋白質（一般に100アミノ酸残基以上）のペプチド結合を加水分解する酵素の総称であり、プロテイナーゼ（proteinase）とペプチダーゼ（peptidase）とに分類される。プロテイナーゼは、蛋白質分子のペプチド結合を加水分解する酵素であり、通常、蛋白質の途中のペプチド鎖を切断するため、エンドペプチダーゼ（endopeptidase）とも称される。高分子の蛋白質にプロテイナーゼが作用すると急速な低分子化が起こり、蛋白質はペプトン化する。またペプチダーゼは、ペプチド鎖のアミノ末端あるいはカルボキシ末端のペプチド結合を加水分解する酵素であり（アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ）、エキソペプチダーゼ（exopeptidase）とも称される。すなわち、ペプチダーゼ（エキソペプチダーゼ）は、蛋白質またはペプチドに作用して、Ｎ末端又はＣ末端から順次内側に向けて、1若しくは２アミノ酸残基単位で加水分解し、最終的には多くの遊離アミノ酸を生成する酵素である。
【００５２】
本発明が対象とするプロテアーゼは、上記のプロテイナーゼ（エンドペプチダーゼ）及びペプチダーゼ（エキソペプチダーゼ）を包含するものである。なお、本発明では、プロテイナーゼをその切断形式から「エンド型ペプチダーゼ」と総称し、ペプチダーゼをその切断形式から「エキソ型ペプチダーゼ」と総称する。また、プロテアーゼのなかには、蛋白質またはペプチドのペプチド結合を途中から切断する触媒活性（エンドペプチダーゼ活性）と、ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端のペプチド結合を切断する触媒活性（エキソペプチダーゼ活性）の両方を有するものがある。本発明ではかかる両活性を有するプロテアーゼを「エンド型／エキソ型ペプチダーゼ」と総称する。なお、当該「エンド型／エキソ型ペプチダーゼ」は、蛋白質またはペプチドの切断形式から、「エンド型ペプチダーゼ」でもあり、また「エキソ型ペプチダーゼ」でもある。このため、本発明において「エンド型ペプチダーゼ」という場合には、特に言及しない限り、「エンド型／エキソ型ペプチダーゼ」も含まれ、また同様に「エキソ型ペプチダーゼ」という場合にも、特に言及しない限り、「エンド型／エキソ型ペプチダーゼ」が含まれる。
【００５３】
プロテアーゼは一般に至適ｐＨによっても分類される。本発明が対象とするプロテアーゼには、至適ｐＨが中性領域（ｐＨ６〜８）にある中性プロテアーゼ、至適ｐＨが酸性領域（ｐＨ２〜６）にある酸性プロテアーゼ、及び至適ｐＨが塩基性領域（ｐＨ８〜１１）にあるアルカリプロテアーゼのいずれもが含まれ、ターゲット微生物の種類に応じて使い分けることができる。
【００５４】
例えば、大腸菌などのように中性条件下で生細胞として活性を残存する微生物（これを以下「好中性菌」とも称する）をターゲット微生物とする場合、当該微生物の生細胞の検出には、中性プロテアーゼを好適に使用することができる。この場合、より好ましい中性プロテアーゼは、例えば３０〜４５℃、ｐＨ６〜８の条件において短時間（５〜１５分間、好ましくは１０±２分間程度）で強いプロテアーゼ活性（エンドペプチダーゼ活性及び／又はエキソペプチダーゼ活性）を発揮するプロテアーゼ（エンド型ペプチダーゼ、エキソ型ペプチダーゼ、及び／又はエンド型／エキソ型ペプチダーゼ）である。
【００５５】
また、乳酸菌やビフィズス菌などのように、酸性条件下で生細胞として活性を残存する微生物（これを以下「好酸性菌」とも称する）をターゲット微生物とする場合、当該微生物の生細胞の検出には、酸性プロテアーゼを好適に使用することができる。この場合、より好ましい酸性プロテアーゼは、例えば３０〜４５℃、ｐＨ２〜６の条件において短時間（５〜１５分間、好ましくは１０±２分間程度）で強いプロテアーゼ活性（エンドペプチダーゼ活性及び／又はエキソペプチダーゼ活性）を発揮するプロテアーゼ（エンド型ペプチダーゼ、エキソ型ペプチダーゼ、及び／又はエンド型／エキソ型ペプチダーゼ）である。
【００５６】
さらにアルカリ性条件下で生細胞として活性を残存する微生物（これを以下「好アルカリ性菌」とも称する）をターゲット微生物とする場合、当該微生物の生細胞の検出には、アルカリプロテアーゼを好適に使用することができる。この場合、より好ましいアルカリプロテアーゼは、例えば３０〜４５℃、ｐＨ８〜１１の条件において短時間（５〜１５分間、好ましくは１０±２分間程度）で強いプロテアーゼ活性（エンドペプチダーゼ活性及び／又はエキソペプチダーゼ活性）を発揮するプロテアーゼ（エンド型ペプチダーゼ、エキソ型ペプチダーゼ、及び／又はエンド型／エキソ型ペプチダーゼ）である。
【００５７】
またプロテアーゼは一般に触媒機構によっても分類される。本発明が対象とするプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、Ｎ−末端スレオニンプロテア−ゼ、及びグルタミン酸プロテアーゼが含まれる。セリンプロテアーゼとしては、制限されないものの、トリプシン、並びにBacillus subtilis属由来、Streptomyces属由来、及びAspergillus属由来のアルカリプロテアーゼを例示することができる。チオールプロテアーゼとしては、制限されないものの、パパインを例示することができる。金属プロテアーゼは金属が触媒作用に関係しているプロテアーゼのことであり、制限されないものの、Bacillus subtilis属由来、Streptomyces属由来、及びAsperigillus属由来の中性プロテアーゼを例示することができる。アスパラギン酸プロテアーゼは活性中心にアスパラギン酸とアスパラギン酸のカルボキシレートが関与するプロテアーゼのことであり、制限されないものの、ペプシン、レンニン、並びにAspergillus属由来及びRhizoups属由来（特に、黴（カビ）の一種であるRhizoups niveus種）の酸性プロテアーゼを例示することができる。システインプロテアーゼはシステイン残基を基質とする酵素であり、制限されないものの、パパイン、及びカスパーゼを挙げることができる。プロテアーゼとして好ましくはセリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、及びシステインプロテアーゼである。なお、微生物（細菌、真菌）の中に存在するメタロチオネインを効率よく分解するためには、プロテアーゼとしてシステインプロテアーゼまたはチオールプロテアーゼを用いることが好ましい。これらのプロテアーゼで微生物を処理しておくと、その後の工程で、金属錯体に対して当該プロテアーゼが吸着（配位結合）する現象を阻止抑制することができる。
【００５８】
本発明が対象とするプロテアーゼは、由来を特に制限するものではなく、本発明の効果を奏する限り、動物、植物、及び微生物（細菌、ウイルス、真菌（カビ、酵母及びキノコ等）、藻類など）のいずれの生物に由来するものであってもよい。
【００５９】
本発明が対象とするエンド型ペプチダーゼ（エンド型／エキソ型ペプチダーゼを除く）には、Bacillus属由来プロテアーゼ、Engyodontium（旧名Tritirachium）属由来プロテアーゼ、及びPineapple属由来プロテアーゼが含まれる。好ましくはBacillus属由来プロテアーゼ、及びEngyodontium（旧名Tritirachium）属由来プロテアーゼである。ここで、Bacillus属にはBacillus subtilis、Bacillus amiloliquefaciens、Bacillus stearothermophilus、Bacillus licheniformisが含まれる。またEngyodontium属には、Engyodontium album（旧名Tritirachium album）が含まれる。
【００６０】
これらのエンド型ペプチダーゼは商業的に入手することができ、制限されないが、例えばBacillus属由来プロテアーゼとしては、サビナーゼ（Savinase）（登録商標）（Sigma）（Bacillus subtilis由来）、プロチンSD-NY10（天野エンザイム）（Bacillus amiloliquefaciens由来）、サモアーゼPC10F（天野エンザイム）（Bacillus stearothermophilus由来）、プロチンSD-AY10（天野エンザイム）（Bacillus licheniformis由来）；Engyodontium（旧名Tritirachium）属由来プロテアーゼとしてはプロテアーゼK（Sigma）（Engyodontium album（旧名Tritirachium album）由来）を挙げることができる。
【００６１】
サビナーゼは、至適ｐＨが酸性〜アルカリ領域の広範囲にわたるため（至適温度も広範囲にわたる）、好酸性菌、好中性菌及び好アルカリ性菌のいずれの微生物をターゲットとしてその生細胞の検出に使用することができる。プロチンSD-NY10及びサモアーゼPC10Fはいずれも至適ｐＨが中性域である中性プロテアーゼであるため（前者の至適温度50〜55℃、後者の至適温度が65℃）、好中性菌をターゲットとしてその生細胞の検出に使用することができる。またプロチンSD-AY10は、至適ｐＨがアルカリ域、至適温度が70℃であるアルカリ性プロテアーゼである。このため好アルカリ性菌をターゲットとしてその生細胞の検出に使用することができる。後述する試験例に示すように、大腸菌の生細胞の検出には、上記プロテアーゼのうち、中性領域に至適ｐＨを有する、サビナーゼ及びプロテアーゼKを好適に使用することができる。
【００６２】
また、本発明が対象とするエキソ型ペプチダーゼは、制限はされないものの、好ましくはRhizopus属由来ペプチダーゼ、及びAspergillus属由来ペプチダーゼを挙げることができる。ここで、Rhizopus属にはRhizopus oryzaeが、またAspergillus属には Aspergillus oryzaeが含まれる。Aspergillus属由来ペプチダーゼとして、特にカルボキシペプチダーゼを挙げることができる。当該エキソ型ペプチダーゼも商業的に入手することができ、制限されないが、例えばペプチダーゼR（天野エンザイム）（Rhizopus oryzae由来）、及びコクラーゼ（登録商標）・P（三菱化学フーズ）を挙げることができる。
【００６３】
さらに本発明が対象とするエンド型／エキソ型ペプチダーゼには、Aspergillus属由来ペプチダーゼ、Rhizopus属由来ペプチダーゼ、及びCarica属由来ペプチダーゼが含まれる。好ましくはAspergillus属由来ペプチダーゼ、及びRhizopus属由来ペプチダーゼであり、より好ましくはAspergillus属由来ペプチダーゼである。ここで、Aspergillus属には、Aspergillus melleus及びAspergillus oryzae；Rhizopus属にはRhizopus oryzae及びRhizopus niveus；及びCarica属にはCarica papaya Lがそれぞれ含まれる。
【００６４】
これらのエンド型／エキソ型ペプチダーゼも商業的に入手することができる。制限されないが、例えばAspergillus属由来ペプチダーゼとしてはプロテアーゼP「アマノ」3SD（天野エンザイム）（Aspergillus melleus由来）、プロテアックス（天野エンザイム）（Asperigillus oryzae由来）、プロテアーゼM「アマノ」3SD（天野エンザイム）（Aspergillus oryzae由来）、及びプロテアーゼA「アマノ」3SD（天野エンザイム）（Aspergillus oryzae由来）を挙げることができる。またRhizopus属由来ペプチダーゼとしてはペプチダーゼR（天野エンザイム）（Rhizopus oryzae由来）、及びニューラーゼF3（天野エンザイム）（Rhizopus niveus由来）を挙げることができる。Carica属由来ペプチダーゼとしてはパパインW-40（天野エンザイム）（Carica papaya L由来）を挙げることができる。これらのうち、プロテアーゼP「アマノ」3SD、プロテアックス、ペプチダーゼR、プロテアーゼM「アマノ」3SD、及びプロテアーゼM「アマノ」3SDはいずれも至適ｐＨが中性域にあるため、好中性菌の微生物をターゲットとしてその生細胞の検出に使用することができる。なかでも大腸菌の生細胞の検出には、プロテアーゼP「アマノ」3SD、プロテアックス、及びペプチダーゼRが好適に用いられる。ニューラーゼF3は、至適ｐＨが酸性域にあるため、好酸性菌の微生物をターゲットとしてその生細胞の検出に使用することができる。
【００６５】
本発明の目的及び効果の一つである「試料に含まれる蛋白質類（夾雑物）の影響を最小限に抑えて、かつ検出対象の微生物の生細胞の検出感度を高める」ことを達成するために、本発明で用いる「プロテアーゼを含む水溶液」は、これを被験試料に添加して、被験試料と「プロテアーゼを含む水溶液」との混合液とした場合に、当該混合液中でプロテアーゼが試料由来の蛋白質類（夾雑物）を分解するための酵素活性（触媒活性）を保持または発揮し、且つ被験試料中に含まれ得るターゲット微生物の生細胞が生きた状態で存在し得るものであること、さらにその後の核酸増幅に悪影響を及ぼさないものであることが必要である。とりわけ、被験試料と「プロテアーゼを含む水溶液」とを混合した後も、ターゲット微生物の生細胞が形態学的完全性を保持した状態で生存していることが好ましい。
【００６６】
ここで「混合液中でプロテアーゼが酵素活性（触媒活性）を保持する」とは、被験試料とプロテアーゼを含む水溶液とを混合した時点の混合液が、仮にプロテアーゼが触媒活性を示す条件（ｐＨ、濃度または温度）にない場合であっても、それを触媒活性を示す条件（至適ｐＨ、濃度または温度）に調整した場合には触媒活性を発揮する能力を潜在的に保有していることを意味する。また「混合液中でプロテアーゼが酵素活性（触媒活性）を発揮する」とは、被験試料とプロテアーゼを含む水溶液とを混合した混合液が、プロテアーゼが触媒活性を示す条件（至適ｐＨ、濃度または温度）を備えており、当該混合液中でプロテアーゼが触媒能を発揮することを意味する。また、上記において「当該混合液中で・・・ターゲット微生物の生細胞が生きた状態で存在する」とは、被験試料とプロテアーゼを含む水溶液との混合液中に、ターゲット微生物の生細胞が、当該微生物が有する代謝活性を保有した状態で存在することを意味する。なお、当該代謝活性としては、細胞が保有するエステラーゼ活性またはＡＴＰ活性を例示することができる。微生物の生細胞が代謝活性を保有するためには、少なくともターゲット微生物の生細胞が細胞膜または細胞壁を欠損若しくは損傷することなく有していることが好ましい。さらに、上記において「ターゲット微生物の生細胞が形態学的完全性を保持した状態で生存している」とは、ターゲット微生物の生細胞が、単に代謝活性を保有するだけでなく（つまり単に生きているというだけでなく）、細胞壁や細胞膜などの細胞の形態を完全な状態で保持していることを意味する。例えば、混合液中のプロテアーゼ濃度が必要以上に濃い場合、微生物の細胞の細胞壁、細胞膜及び／又は内膜貫通蛋白質が分解され、細胞の形態を完全な状態で保持することができなくなる。
【００６７】
またこの意味で、被験試料と「プロテアーゼを含む水溶液」の混合液は、ターゲット微生物の生細胞に対して等張性を有することが好ましい。より好ましくは「プロテアーゼを含む水溶液」そのものがターゲット微生物の生細胞に対して等張性を有することが好ましい。ここで「生細胞に対して等張性を有する」とは、プロテアーゼを含む水溶液（またはこれと被検試料との混合液）の浸透圧がターゲット微生物の生細胞の浸透圧と同じまたはほぼ同じであることを意味する。微生物のうち、細菌の細胞の浸透圧は300 mOmsと言われており、これは150 mMまたは0.9 (w/v)％の塩化ナトリウム水溶液の浸透圧とほぼ等しい。但し、等張性を有することは好適であるものの、ターゲット微生物の生細胞が形態学的完全性が損なわれない限り必須ではなく、その限りにおいて浸透圧０〜500 mOmsの範囲で適宜選択することができる。
【００６８】
また被験試料とプロテアーゼを含む水溶液の混合液は、プロテアーゼが触媒活性を発揮するように、当該プロテアーゼの至適ｐＨに調整されていることが好ましい。より好ましくは「プロテアーゼを含む水溶液」そのものが当該プロテアーゼの至適ｐＨを有することが好ましい。
【００６９】
例えば、ターゲット微生物が好中性菌である大腸菌である場合、浸透圧及び至適ｐＨの点から、「プロテアーゼを含む水溶液」として、好ましくはプロテアーゼを含有するｐＨが６．８〜７．４の領域にある水溶液を挙げることができる。制限されないものの、かかる水溶液として、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及びリン酸緩衝液などを例示することができる。ターゲット微生物が好酸性菌である場合、「プロテアーゼを含有する水溶液」として、好ましくはプロテアーゼを含有するｐＨが２．１〜４．７の領域にある水溶液を挙げることができる。制限されないものの、かかる水溶液として、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液、及びギ酸緩衝液などを例示することができる。ターゲット微生物が好アルカリ性菌である場合、「プロテアーゼを含む水溶液」として、好ましくはプロテアーゼを含有するｐＨが９．１〜１０．８の領域にある水溶液を挙げることができる。制限されないものの、かかる水溶液として、生理食塩水、（酢酸）エタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、及び炭酸−重炭酸緩衝液などを例示することができる。
【００７０】
被験試料及びプロテアーゼを含む水溶液の混合液は、ｐＨが上記範囲になるように、必要に応じてｐＨ調整剤または緩衝剤を用いて調整することが好ましく、また前述するように、微生物の生細胞に対して等張性を有するように、必要に応じて、浸透圧調整剤を用いて溶液の浸透圧を調整することが好ましい。
【００７１】
ｐＨ調整剤、緩衝剤、及び浸透圧調整剤としては、生化学の分野において細胞に使用される慣用のものを用いることができる。
【００７２】
例えば、ｐＨ調整剤としては、制限されないものの、クエン酸とクエン酸三ナトリウムとの組み合わせ、グルコン酸とグルコン酸ナトリウムとの組み合わせ、コハク酸及びコハク酸ナトリウムとの組み合わせ、及び炭酸水素ナトリウムを例示することができる。また緩衝剤としては、グッド緩衝剤などの生化学用緩衝剤を好適に例示することができる。グッド緩衝剤としては、制限されないものの、ＭＥＳ（利用最適ｐＨ範囲［以下、同じ］：pH 5.5-7.0）、Bis-Tris（pH 5.7-7.3）、ＡＤＡ（pH 5.8-7.4）、ＰＩＰＥＳ（pH 6.1-7.5）、ＡＣＥＳ（pH 6.0-7.5）、ＭＯＰＳＯ（pH 6.2-7.4）、ＢＥＳ（pH 6.6-8.0）、ＭＯＰＳ（pH 6.5-7.9）、ＴＥＳ（pH 6.8-8.2）、ＨＥＰＥＳ（pH 6.8-8.2）ＤＩＰＳＯ（pH 6.9-8.1）、ＴＡＰＳＯ（pH 7.0-8.2）、ＰＯＰＳＯ（pH 7.2-8.5）、ＨＥＰＰＳＯ（pH 7.4-8.6）、ＥＰＰＳ（pH 7.5-8.5）、Tricine（pH 7.8-8.8）、Bicine（pH 7.7-9.1）、ＴＡＰＳ（pH 7.7-9.1）、ＣＨＥＳ（pH 8.6-10.0）、ＣＡＰＳＯ（pH 9.3-10.7）、及びＣＡＰＳ（pH 9.7-11.1）を例示することができる。さらに浸透圧調整剤としては、制限されないものの、1,5-D-アンヒドログルシトール、高濃度ブドウ糖（グルコース）液、トレハロース、及びネオトレハロース（α-D-グルコピラノシルβ-D-グルコピラノシド）を例示することができる。
【００７３】
被験試料及びプロテアーゼを含有する水溶液の混合液は、上記するｐＨ調整剤、緩衝剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１種、被験試料、プロテアーゼ、並びに水に加えて、さらにターゲット微生物が資化する物質を含むことができる。好ましくは、当該混合液は、ｐＨ調整剤、緩衝剤、及び浸透圧調整剤からなる群から選択される少なくとも１種、被験試料、プロテアーゼ、並びに水に加えて、さらにターゲット微生物が資化する物質（以下、単に「資化物質」とも称する）のみを含む水溶液である。
かかる資化物質は、ターゲット微生物によって相違するものの、好ましくは炭水化物（資化炭水化物）であり、より好ましくは糖類である。ここで糖類には、グルコース、キシリトース及びフルクトースなどの単糖：スクロース、マルトース、ラクトース、及びトレハロースなどの二糖類が含まれる。ターゲット微生物が大腸菌である場合、好ましい糖類としてグルコース、キシリトース、フルクトース、ラクトース、及びトレハロースを挙げることができる。より好ましくはグルコース及びラクトースである。
【００７４】
被験試料及びプロテアーゼを含有する水溶液の混合液における資化物質（好ましくは糖類）の濃度としては、ターゲット微生物の種類、及び資化物質の種類によっても異なるが、例えば０．１〜５質量％の範囲を挙げることができる。より具体的には、例えばターゲット微生物が大腸菌で、資化物質が糖類である場合、上記混合液中における糖類の濃度として、好ましくは０．１〜１．５質量％、より好ましくは０．１〜１質量％の範囲を挙げることができる。
【００７５】
工程ａ）では、被検試料とプロテアーゼを含む水溶液とを混合した後、必要に応じて当該混合液を、プロテアーゼが触媒活性を発揮する好適な条件（ｐＨ、温度、及び濃度（浸透圧）等）になるように調整した後、当該条件下で、プロテアーゼと被検試料に存在しえるターゲット微生物を反応させる操作が含まれる。
【００７６】
プロテアーゼが触媒活性を発揮する好適な条件（ｐＨ、温度、及び濃度（浸透圧）等）は、前述するように、ターゲット微生物の種類、使用するプロテアーゼの種類や特性に応じて適宜選択することができる。
【００７７】
例えば、大腸菌などの好中性菌をターゲット微生物とする場合、プロテアーゼとして中性プロテアーゼを用いて、例えば３０〜４５℃（好ましくは３５〜４０℃）、ｐＨ６〜８、及び好中性菌の生細胞と等張条件下で、通常１〜６０分間、好ましくは５〜１５分間、より好ましくは８〜１２分間程度処理することで、当該中性プロテアーゼと被検試料に存在しえる好中性菌を反応させる。
【００７８】
また、乳酸菌やビフィズス菌などの好酸性菌をターゲット微生物とする場合、プロテアーゼとして酸性プロテアーゼを用いて、例えば３０〜４５℃（好ましくは３５〜４０℃）、ｐＨ２〜６、及び好酸性菌の生細胞と等張条件下で、通常１〜６０分間、好ましくは５〜１５分間、より好ましくは８〜１２分間程度処理することで、当該酸性プロテアーゼと被検試料に存在しえる好酸性菌を反応させる。
【００７９】
さらに、好アルカリ性菌をターゲット微生物とする場合、プロテアーゼとしてアルカリプロテアーゼを用いて、例えば３０〜４５℃（好ましくは３５〜４０℃）、ｐＨ８〜１１、及び好アルカリ性菌の生細胞と等張条件下で、通常１〜６０分間、好ましくは５〜１５分間、より好ましくは８〜１２分間程度処理することで、当該アルカリプロテアーゼと被検試料に存在しえる好アルカリ性菌を反応させる。
【００８０】
斯くして処理された処理物は、次いで下記工程ｂ）に供することができる。
【００８１】
（１−２）工程ｂ）：金属錯体処理
本工程ｂ）は、上記工程ａ）で得られた処理物、及び白金錯体、パラジウム錯体、及びイリジウム錯体からなる群から選択される少なくとも１種の金属錯体（以下、これらを「金属錯体」と総称する）を混合し、処理する操作を含む。詳細には、当該工程ｂ）は、上記工程ａ）で得られた処理物に金属錯体を添加し、被検試料に含まれる微生物を金属錯体で処理する工程である。
【００８２】
（ａ）白金錯体
工程ｂ）において、白金錯体は、被検試料（処理物）に含まれる微生物の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に直接的に結合して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害すると推定される。このため、白金錯体は核酸に結合する化合物であればよい。なお、白金錯体とＤＮＡ又はＲＮＡとの結合は、配位結合（共有結合）であり得る。
【００８３】
白金錯体は、微生物の生細胞に対する作用と、微生物の損傷細胞及び死細胞に対する作用、並びに白血球等の体細胞及び血小板等に対する作用とが異なるものであることが好ましい。より具体的には、白金錯体は、生細胞の細胞壁よりも、損傷細胞もしくは死細胞の細胞壁、及び白血球等の体細胞若しくは血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。なお、ここで白血球にはウシ白血球が含まれる。
【００８４】
白金錯体としては、生細胞の細胞壁に対する透過性と損傷細胞又は死細胞の細胞壁に対する透過性が異なり、かつ、細胞内の核酸に結合してターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害する作用を有するものであればよい。制限はされないが、例えば、配位子として、少なくともNH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO32-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、及びR-からなる群から選ばれる少なくとも一つを含む白金錯体が挙げられる（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。白金錯体は、上記に掲げる配位子を一つ含んでいてもよく、同一又は異なる配位子を２以上含んでいてもよい。また、上記以外の配位子を含んでいてもよい。
【００８５】
配位子として好ましくは、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO32-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R3P、及びRNCである（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。特に好ましくはNH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、R3P、及びRNCである。なお、ハロゲン元素としては、Cl（塩素）が好ましい。
【００８６】
また上記「R」の表記で示される飽和有機基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル、ペンチル基、シクロペンチル、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、及びシクロオクチル基等のアルキル基を挙げることができる。また、上記「R」の表記で示される不飽和有機基としては、ベンジル基（ベンゼン環）、ナフチル基（ナフタレン環）、アリル基、及びシクロオクタジエニル基等を挙げることができる。これらの飽和有機基及び不飽和有機基は置換基を有していてもよい。
【００８７】
Lippardら（生物無機化学 Lippard, S.J. and Berg, J.M.著；21-23頁“生物無機化学の研究における配位化学の原理”）の表2・1には、金属（ソフト、中間、ハードのルイス酸）と配位子（ソフト、中間、ハードのルイス塩基）の関係が記載されている。例外はあるものの、ソフトなルイス酸はハードなルイス塩基よりもソフトなルイス塩基と結合しやすいといわれている（同書21-22頁参照）。そして、ソフトなルイス酸である白金の各ルイス塩基との結合性は、［中間のルイス塩基］＞［ソフトなルイス塩基］＞［ハードなルイス塩基］の順である（「ブリプラチン注10 mg、ブリプラチン注25 mg、ブリプラチン注50 mg BRIPLATIN INJECTION（シスプラチン注射液）製品情報概要」、ブリストール・マイヤーズ株式会社、2007年12月参照）。またパラジウムのようなソフトなルイス酸と各ルイス塩基との結合性は、「ソフトなルイス塩基」（システイン[スルフヒドリル基]やメチオニン[チオエーテル部位]のようなタンパク質構成アミノ酸など）＞「中間のルイス塩基」（アデニン（A）やグアニン（G）など）＞「ハードなルイス塩基」（ClやNH3基など）の順であることが示唆されている（hard-soft acid-base theory；Lippardら、21-22頁参照）
【００８８】
このように、白金は、ソフトなルイス酸であるにも関わらず、中間のルイス塩基であるアデニン（A）やグアニン（G）などの核酸を配位結合の相手として最も好むので、ハード又はソフトなルイス塩基と白金とを予め配位結合させた白金錯体は、細胞中で核酸のAやGに配位結合して安定化されると推定される。
【００８９】
このため、核酸との結合性の観点から、また微生物の生死判定の感度又は精度の点から、白金錯体として好ましくは、ハード又はソフトなルイス塩基と白金とが配位結合した白金錯体であり、より好ましくはハードなルイス塩基と白金とが配位結合した白金錯体である。但し、中間のルイス塩基（例えばNO2-、Ar-NH2[Arは芳香環を始めとする不飽和有機基]、N2、SO32-、N3-、又はイミダゾール環など）を配位子として含む白金錯体も、本発明の金属錯体として使用することができ、この使用を制限するものではない。
【００９０】
一般に生細胞と比較して死細胞は形態学的に損傷が激しいため（損傷の程度が軽度なのが損傷細胞）、ハード又はソフトなルイス塩基を配位子として含む金属錯体は、一般に生細胞よりも死細胞及び損傷細胞の方が透過性は高いと考えられる。また、金属錯体は、全体としてプラスチャージまたはマイナスチャージを有している方が、無極性である場合よりも、一般には生細胞内に透過し難いといわれている。したがって、白金錯体は、錯体全体としてプラスチャージまたはマイナスチャージを有していることが好ましい。但し、シスプラチンのように、化合物全体として無極性であっても、作用時間をある程度短くすることによって、生細胞への透過は有意に抑制され得る（特許文献５の実施例参照）ので、無極性であってもよい。
【００９１】
白金錯体として具体的には、下記の化合物が挙げられる。
シスプラチン（cisplatin、cis-ジアンミン白金(II)ジクロリド、cis-diammineplatinum (II) dichloride、又はcis-dichlorodiammine platinum(II)；cis-DDP）、カルボプラチン（Carboplatin、cis-diammine(1,1-cyclobutanedicarboxylate)platinum）、cis−ジアンミン（ピリジン）クロロ白金(II)クロリド（cis-diammine (pyridine) chloroplatium(II) chloride; cis-DPCP）、ジクロロ（エチレンジアミン）白金(II)（dichloro(ethylenediamine)platinum(II)）、トランスプラチン（transplatin、trans-diamminedichloroplatinum(II)）、クロロ(2,2':6',2''-テルピリジン)白金(II)クロリド二水和物（chloro(2,2':6',2''-terpyridine)platinum(II) chloride dihydrate）、ビス（アセチルアセトナト）白金(II)（bis(acetylacetonato)platinum(II)）、cis−ジクロロビス（ピリジン）白金(II)（cis-dichlorobis(pyridine)platinum(II)）、白金オクタエチルポルフィリン（platinum octaethylporphyrin）、白金(II)アセチルアセトナト（platinum(II) acetylacetonate）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金(0)（tetrakis(triphenylphosphine)platinum(0)）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金(II)（tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)、ジクロロ（ジシクロペンタジエニル）白金(II)（dichloro(dicyclopentadienyl)platinum(II)）、[エチルイミノビス(ジフェニルシランジイル)]ビス(トリメチルホスホニオ)白金(IV)[ethyliminobis(diphenylsilanediyl)]bis(trimethylphosphonio)platinum(IV)）、ビス（メチルチオ）ジメチル白金(IV)（bis(methylthio)dimethylplatinum(IV)）、トリメチル（メチルシクロペンタジエニル）白金(IV)trimethyl(methylcyclopentadienyl)platinum(IV)）、エチレンビス（トリフェニルホスフィン）白金(0)（ethylenebis(triphenylphosphine)platinum(0)）、 ビス（トリ-tert-ブチルホスフィン）白金(0)（bis(tri-tert-butylphosphine)platinum(0)）、ジクロロ（1,5-シクロオクタジエン）白金(II)（dichloro(1,5-cyclooctadiene)platinum(II)）、ジクロロ（1,2-ジアミノシクロヘキサン）白金(II)dichloro(1,2-diaminocyclohexane)platinum(II)）、ジクロロ（1,10-フェナンスロリン）白金(II)（dichloro(1,10-phenanthroline)platinum(II)）、cis−ジクロロビス（トリエチルホスフィン）白金(II)（cis-dichlorobis(triethylphosphine)platinum(II)）、trans−ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）白金(II)（trans-dichlorobis(triphenylphosphine)platinum(II)）、trans−ジクロロビス（トリエチルホスフィン）白金(II)（trans-dichlorobis(triethylphosphine)platinum(II)）、cis−ジクロロビス（ジエチルスルフィド）白金(II)（cis-dichlorobis(diethyl sulfide)platinum(II)）、ジクロロ（2,2':6',2''-テルピリジン）白金(II)二水和物（dichloro(2,2':6',2''-terpyridine)platinum(II) dihydrate）、（N,N,N'-トリメチルエチレンジアミン）白金(II)クロリド（(N,N,N'-trimethylethylenediamine)platinum(II) chloride）、ジクロロビス（ジメチルスルフィド）白金(II)（dichlorobis(dimethyl sulfide)platinum(II)）、ジクロロビス（エチレンジアミン）白金(II)（dichlorobis(ethylenediamine)platinum(II)）、オキサリプラチン（Oxaliplatin、[(1R,2R)-cyclohexane-1,2-diamine](ethanedioato-O,O')platinum(II)）、ネダプラチン（Nedaplatin、glycolato-O,O')diammineplatinum(II)、ヘキサクロロ白金(IV)酸カリウム、アンモニウムヘキサクロロ白金酸(IV)（ammonium hexachloroplatinate(IV)）、アンモニウムテトラクロロ白金酸(II)（ammonium tetrachloroplatinate(II)）、ヘキサクロロ白金(IV)酸（hydrogen hexachloroplatinate(IV)）、ヘキサクロロ白金(IV)酸ナトリウム 六水和物、テトラクロロ白金(II)酸カリウム、テトラシアノ白金(II)酸カリウム 一水和物、（2,2'-ビピリジン）ジクロロ白金(II)（(2,2'-bipyridine)dichloroplatinum(II)）、（1,5-シクロオクタジエン）ジメチル白金(II)（(1,5-cyclooctadiene)dimethylplatinum(II)）、cis-ビス（アセトニトリル）ジクロロ白金(II)（cis-bis(acetonitrile)dichloroplatinum(II)）、（(+)-trans-ジクロロ（エチレン）α-メチルフェネチルアミン）白金(II)(+)-trans-dichloro(ethlene)(alpha-methylphenethylamine)platinum(II)）、cis-ビス（ベンゾニトリル）ジクロロ白金(II)（cis-bis(benzonitrile)dichloroplatinum(II)）、硝酸テトラアンミン白金(II)、塩化白金酸（chloroplatinic acid）、塩化白金酸 六水和物（chloroplatinic acid hexahydrate）、二硝酸（エチレンジアミン）ヨウ化白金(II)ダイマー（ethylenediamine)iodoplatinum(II)dimer dinitrate）、K2[Pt(CN)4]・H2O、cis-ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)白金(II)、テトラシアノ白金(II)酸セシウム（Cs2[Pt(CN)4]）、テトラシアノ白金(II)酸ナトリウム（Na2[Pt(CN)4]）、テトラシアノ白金(II)酸バリウム（四水和物）（Ba[Pt(CN)4]・4H2O）、テトラシアノ白金(VI)酸ルビジウム（Rb2[Pt(CN)4]）、シアノ白金（Pt(CN)2）、ジメチル白金、水素化白金、硫化白金。
【００９２】
好ましい錯体としては、下記の化合物が挙げられる：
シスプラチン（分子量300.04）、カルボプラチン（分子量371.25）、cis−ジアンミン（ピリジン）クロロ白金(II)クロリド（分子量379.14）、ジクロロ（エチレンジアミン）白金(II)（分子量326.10）、cis-ビス（ベンゾニトリル）ジクロロ白金(II)（分子量472.23）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金(II)（分子量1244.22）、塩化白金酸 六水和物（分子量517.90）、二硝酸（エチレンジアミン）ヨウ化白金(II)ダイマー（ethylenediamine)iodoplatinum(II)dimer dinitrate）（分子量888.17）。
【００９３】
また、白金錯体として、白金化合物を、配位子として白金に結合し得る有機溶媒、又は配位子として白金に結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成する白金錯体を用いることもできる。このような白金化合物としては、例えば、白金と他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成する白金化合物が挙げられる。
【００９４】
当該元素又は基としては、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、OH-、NO3-、CH3COO-、PO43-、RO-、CO32-、ROPO32-、(RO)2PO2-、RS-、CN-、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）等が挙げられる。前記白金化合物として具体的には、塩化白金、臭化白金、フッ化白金、ヨウ化白金、水酸化白金、硝酸白金、炭酸白金、酢酸白金、ジメトキシ白金、メトキシリン酸白金、リン酸白金、塩化白金酸、ジスルフメチル白金、ジシアノ白金、ジチオシアネート白金、二水素化白金、及びメチル白金等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化白金、臭化白金、フッ化白金、及びヨウ化白金が挙げられ、特に好ましい化合物として塩化白金が挙げられる。塩化白金としては、塩化白金（II）（単量体の分子量265.99）、塩化白金（IV）（単量体の分子量336.89）が挙げられる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ベンゾニトリル（benzonitrile）等が挙げられる。塩化白金をDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス（ジメチルスルホキシド）白金（II）、及び、テトラキス（ジメチルスルホキシド）白金（II）が挙げられる。
【００９５】
また、配位子として白金に結合し得る物質を含む溶液としては、ハルマリン（harmaline）溶液、例えばハルマリン塩酸塩の水溶液等、及び、ジフェロセニル・ホスフィン（diferrocenyl-phosphine）溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液等、が挙げられる。前記のような白金を含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、白金はハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、白金錯体として低分子化される。このようにして生成する白金錯体も、本発明に使用することができる。
【００９６】
白金錯体は、二量体等の多量体であってもよい。二量体としては、例えば、二硝酸（エチレンジアミン）ヨウ化白金(II)ダイマーが挙げられる。
【００９７】
白金錯体、及び、白金と他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成する白金化合物は、各種市販されており（例えば、和光純薬工業、シグマ）、それらを使用することができる。また、Weiss R.B., Christian M.C. (1993) Drugs 46:360; Gordon M., Hollander S. (1993) 24: 209; Khokhar A.R., Lopez-Berestein G., Perez-Soler P., US Patent 5 117 022, 1992; Brown D.B., Kohkhar A.R., Hacker M.P., McCommack J.J., European Patent EP 0130 482 b1, 1988; Yanai J., Japanese Patent JP 09 132 583 A2, 1997; Lippert B., Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of Leading Anti-cancer Drugs, 1st Ed., John Wiley and sons, ltd., 1999に記載の方法にしたがって合成することもできる。
【００９８】
（ｂ）パラジウム錯体
パラジウム錯体は、微生物細胞内において、核酸には実質的に結合せず、ＤＮＡ結合性タンパク質（例えばHUヒストン様タンパク質）、ＲＮＡ結合性タンパク質（例えばSynaptotagmin-binding，cytoplasmic RNA-interating protein「SYNCRIP」分子量66 kDa）（特開2002-101890号公報）、核内ＲＮＡ−タンパク質複合体・パラスペックル（paraspeckle）（Sasaki, Y. T. et. al., (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106 : 2525-2530）を形成するタンパク質、またはリボゾームタンパク質（リボソームタンパク質）といったタンパク質を介して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害すると推定される。このため、パラジウム錯体は、ＤＮＡ結合性タンパク質またはリボゾームタンパク質といったタンパク質と核酸が存在する細胞内では、主として同タンパク質に結合する化合物であればよい。なお、パラジウム錯体とタンパク質との結合は、配位結合（共有結合）であり得る。
【００９９】
パラジウム錯体は、白金錯体と同様、微生物の生細胞に対する作用と、微生物の損傷細胞及び死細胞に対する作用、並びに白血球等の体細胞及び血小板等に対する作用が異なるものであることが好ましい。より具体的には、パラジウム錯体は、微生物の生細胞の細胞壁よりも、微生物の損傷細胞もしくは死細胞の細胞壁、及び白血球等の体細胞若しくは血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。ここで白血球にはウシ白血球が含まれる。
【０１００】
パラジウム錯体としては、生細胞の細胞壁に対する透過性と損傷細胞又は死細胞の細胞壁に対する透過性が異なり、かつ、細胞内の核酸結合性タンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質又はＲＮＡ結合タンパク質）に直接結合してターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害し得るものであればよい。制限はされないが、例えば、配位子として、少なくともNH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、NO2-、Ar-NH2、Ar-CN（Arは芳香環等の不飽和有機基）、N2、SO32-、N3-、イミダゾール環、不飽和環状有機基、及びN3-から選ばれる少なくとも一つを含むパラジウム錯体が挙げられる。パラジウム錯体は、上記のような配位子を一つ含んでいてもよく、同一又は異なる配位子を２以上含んでいてもよい。
【０１０１】
配位子として好ましくは、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート基、H2O、CO32-、OH-、NO32-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R3P、Ar-CN、及び不飽和環状有機基である。特に好ましくは、NH3、RNH2、ハロゲン元素、カルボキシレート基、R3P、及びAr-CNである。なお、ハロゲン元素としては、Cl（塩素）が好ましい。
【０１０２】
また、上記「R」の表記で示される飽和有機基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のアルキル基を挙げることができる。また、上記「R」の表記で示される不飽和有機基としては、ベンジル基（ベンゼン環）、ナフチル基（ナフタレン環）、アリル基、シクロオクタジエニル基が挙げられる。これらの飽和有機基及び不飽和有機基は置換基を有していてもよい。
【０１０３】
Lippardら（生物無機化学 Lippard, S.J. and Berg, J.M.著；21-23頁“生物無機化学の研究における配位化学の原理”）の表2・1には、金属（ソフト、中間、ハードのルイス酸）と配位子（ソフト、中間、ハードのルイス塩基）の関係が記載されており、例外はあるものの、パラジウムのようなソフトなルイス酸と各ルイス塩基との結合性は、「ソフトなルイス塩基」（システイン[スルフヒドリル基]やメチオニン[チオエーテル部位]のようなタンパク質構成アミノ酸など）＞中間のルイス塩基（アデニン（A）やグアニン（G）など）＞［ハードなルイス塩基］（ClやNH3基など）の順であることが示唆されている（hard-soft acid-base theory；Lippardら、21-22頁参照）。
【０１０４】
このように、パラジウムは、ソフトなルイス塩基であるシステインやメチオニンを配位結合の相手として最も好むので、ハード又は中間のルイス塩基とパラジウムを予め配位結合させたパラジウム錯体は、細胞中でタンパク質中のアミノ酸に配位結合して安定化されると推定される。このため、核酸結合性タンパク質を介した核酸増幅抑制能の観点からは、本発明の薬剤は、ハード又は中間のルイス塩基とパラジウムが配位結合した化合物が好ましく、より好ましくはハードなルイス塩基とパラジウムが配位結合した化合物である。
【０１０５】
ただし、ソフトなルイス塩基、例えばR2S、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、R-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）を配位子として含むパラジウム錯体であっても、本発明の金属錯体として使用することができ、この使用を制限するものではない。
【０１０６】
白金錯体と同様に、パラジウム錯体も、化合物全体としてプラスチャージかマイナスチャージであることが好ましい。しかしながら、パラジウム錯体が全体として無極性であっても、作用時間をある程度短くすることによって、生細胞への透過は有意に抑制され得るので（特許文献６の実施例参照）、無極性であってもよい。
【０１０７】
パラジウム錯体として具体的には、下記の化合物が挙げられる。
ジクロロ(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)パラジウム(II)、ビス(ベンゾニトリル)ジクロロパラジウム(II)、ジアンミンジクロロパラジウム(II)、ジクロロ(エチレンジアミン)パラジウム(II)、クロロ(η2-P,C(-)トリス(2,4-ジ-tert-ブチルフェニル)ホスファイト)(トリシクロフェニルホスフィン)パラジウム(II)、ジ-μ-クロロ-ビス-[5-ヒドロキシ-2-[1-(ヒドロキシイミノ-κN)-エチル]-フェニル-κC]-パラジウム(II) ダイマー、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジクロリド、ブロモ(トリ-tert-ブチルホスフィン)パラジウム(I) ダイマー、1,2-ビス(フェニルスルフィニル)エタン パラジウム(II) アセテート、クロロ[2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)-3,6-ジメトキシ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル][2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ-(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ[2-(ジ-tert-ブチルホスフィノ)-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル][2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチル)フェニル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2-アミノエチルフェニル)]パラジウム(II)、ビス[(ジシクロヘキシル)(4-ジメチルアミノフェニル)ホスフィン] パラジウム(II) クロリド、ビス[ジ-(tert-ブチル)(4-トリフルオロメチルフェニル)ホスフィン]パラジウム(II) クロリド、2-(ジメチルアミノメチル)フェロセン-1-イル-パラジウム(II) クロリド ジノルボルニルホスフィン、1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾール-2-イリデン (1,4-ナフトキノン)パラジウム(0) ダイマー、サリチルアルデヒド チオセミカルバゾン パラジウム(II) クロリド、2-[ビス(2,4-ジ-tert-ブチル-フェノキシ)ホスフィノキシ]-3,5-ジ(tert-ブチル)フェニル-パラジウム(II) クロリド ダイマー、ジ-μ-クロロビス[5-クロロ-2-[(4-クロロフェニル)(ヒドロキシイミノ-κN)メチル]フェニル-κC]パラジウム ダイマー、パラジウム(II) アセテート-S-Phos(Pd:P 1:2)、トリス[ジベンジリデンアセトン]ジパラジウム(0)-S-Phos (Pd:P 1:2)、2-(ジメチルアミノ)-2-ビフェニリル-パラジウム(II) クロリド ジノルボルニルホスフィン コンプレックス、パラジウム ピバレート、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II) クロリド、パラジウム(II) トリフルオロアセテート、パラジウム(π-シンナミル) クロリド ダイマー、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) ジアセテート、1,4-ビス(ジフェニルホスフィノ)ブタン-パラジウム(II) クロリド、パラジウム(II) シアニド、パラジウム(II) プロピオネート、(2-メチルアリル)パラジウム(II) クロリド ダイマー、[2,6-ビス[(ジ-1-ピペリジニルホスフィノ)アミノ]フェニル]パラジウム(II) クロリド、[1,2-ビス(ジシクロヘキシルホスフィノ)エタン]パラジウム(II) クロリド、トリフェニルホスフィン パラジウム(II) ジクロリド ホスファアダマンタン エチル シリカ、ジクロロビス(トリシクロフェニルホスフィン)パラジウム(II)、ジクロロ(1,5-���クロオクタジエン)パラジウム(II)、(1,3-ビス(ジフェニルホスフィノ)プロパン)パラジウム(II) クロリド、1,1'-ビス(ジ-イソプロピルホスフィノ)フェロセン パラジウム ジクロリド、ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',4',6'-トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ビス(3,5,3',5'-ジメトキシジベンジリデンアセトン)パラジウム(0)、ジクロロ(1,10-フェナンスロリン)パラジウム(II)、ジクロロビス(トリ-o-トリルホスフィン)パラジウム(II)、trans-ベンジル(クロロ)ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、トリス(3,3',3''-ホスフィニジントリス(ベンゼンスルホナト)パラジウム(0) 九ナトリウム塩九水和物、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]-ジアクオ-パラジウム(II) ビス(トリフレート)、trans-ビス(ジシクロヘキシルアミン)パラジウム(II) アセテート、(R)-1-[(SP)-2-(ジシクロヘキシルホスフィノ)フェロセニル]エチルジ-tert-ブチルホスフィン パラジウム(II) ジクロリド、ジクロロ[2-(4,5-ジヒドロ-2-オキサゾリル)キノリン]パラジウム(II)、ポリマー修飾のビス[(ジフェニルホスファニル)メチル]アミン パラジウム(II) ジクロリド, trans-ジブロモビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]パラジウム(II) クロリド、2-[ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)ブロミド]ベンジルアルコール、[(R)-(+)-2,2'-ビス(ジ-p-トリルホスフィノ)-1,1'-biナフチル]パラジウム(II) クロリド、[ビス[((R)-(+)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル)パラジウム(II)]ビス(μ-ヒドロキソ)] ビス(トリフレート)、ジクロロビス(トリエチルホスフィン)パラジウム(II)、[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]-ジアクオ-パラジウム(II) ビス(トリフレート)、ジアセトビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)、[ビス[((S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル)パラジウム(II)]ビス(μ-ヒドロキソ)] ビス(トリフレート)、[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジ-p-トリルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]パラジウム(II) クロリド、クロロ[(1,2,5,6-η)-1,5-シクロオクタジエン](2,2-ジメチルプロピル)-パラジウム、クロロ[(トリシクロフェニルホスフィン)-2-(2'-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(トリフェニルホスフィン) [2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ[(S)-(-)-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル]パラジウム(II)、ビス(ベンゾニトリル)パラジウム(II) ブロミド、クロロ[(トリ-tert-ブチルホスフィン)-2-(2-アミノビフェニル)] パラジウム(II)、ジブロモ[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II)、ジブロモ(1,5-シクロオクタジエン)パラジウム(II)、ジクロロ[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]パラジウム(II) アセトン付加物、ジクロロ[8-(ジ-tert-ブチルホスフィノキシ)キノリン]パラジウム(II)、ジクロロ(クロロ-tert-ブチルシクロヘキシルホスフィン)パラジウム (ii) ダイマー、ジクロロ(クロロジ-t-ブチルホスフィン)パラジウム(ii) ダイマー、ジクロロ(クロロジシクロヘキシルホスフィン)パラジウム (ii) ダイマー、ジクロロビス(クロロt-ブチルシクロヘキシルホスフィン)パラジウム(ii)、ジクロロビス(クロロジ-tert-ブチルホスフィン) パラジウム (ii)、ジクロロビス(メチルジフェニルホスフィン)パラジウム(II)、trans-ジブロモ[ビス(トリ-o-トリルホスフィン)]パラジウム(II)、トリス[μ-[(1,2-η:4,5-η)-(1E,4E)-1,5-ビス(4-メトキシフェニル)-1,4-ペンタジエン-3-オン]]ジ-パラジウム、[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]クロロ[3-フェニルアリル]パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)パラジウム(II)、クロロ(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、[1,3-ビス(2,6-ジ-イソプロピルフェニル)-4,5-ジヒドロイミダゾール-2-イリデン]クロロ)[3-フェニルアリル]パラジウム(II)、ジクロロ[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-1,3-ジヒドロ-2H-イミダゾール-2-イリデン]パラジウム(II) ダイマー、ジクロロ-[1,3-ビス(ジイソプロピルフェニル)イミダゾリデン-2-イリデン]パラジウム(II) ダイマー、ビス[トリス(4-(1H,1H,2H,2H-パーフルオロデシル)フェニル)ホスフィン]パラジウム(II) ジクロリド、ブロモ[(2-(ヒドロキシ-κO)メチル)フェニルメチル-κC](トリフェニルホスフィン)パラジウム (II)、[(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-3,6-ジメトキシ-2',4',6'- トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル)-2-(2'-アミノ1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジイソプロポキシ-1,1'-ビフェニル)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、[(4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン)-2-(2'-アミノ1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、[(ジ(1-アダマンチル)-ブチルホスフィン)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、アリルクロロ[1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]パラジウム(ii)、ビス[トリス(4-(ヘプタデカフルオロオクチル)フェニル)ホスフィン]パラジウム(II) ジクロリド、クロロ[(1,3,5,7-テトラメチル-5-フェニル-2,4,8-トリオキサ-6-ホスファアダマンタン)-2-(2-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ[(4,5-ビス(ジフェニルホスフィノ)-9,9-ジメチルキサンテン)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ[(ジ(1-アダマンチル)-N-ブチルホスフィン)-2-(2-アミノビフェニル)]パラジウム(II)、クロロ(ソディウム-2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシ-1,1'-ビフェニル-3'-スルホネート)[2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、ジクロロ[(S)-N,N-ジメチル-1-[(R)-2-(ジフェニルホスフィノ)フェロセニル]エチルアミン]パラジウム(II)、ジクロロ[ビス(2-(ジフェニルホスフィノ)フェニル)ether]パラジウム(II)、ジクロロビス(3,7-ジアセチル-1,3,7-トリアザ-5-ホスファビシクロ[3.3.1]ノナン) パラジウム(II)、[(2-[ビス[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ホスフィン]-3,6-ジメトキシ-2',4',6'- トリイソプロピル-1,1'-ビフェニル )-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II) メタンスルホネート、クロロ[(2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ビス(N,N-ジメチルアミノ)-1,1'-ビフェニル)-2-(2'-アミノ-1,1'-ビフェニル)]パラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾール-2-イリデン]クロロパラジウム(II)、(1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)イミダゾリデン)(3-クロロピリジル)パラ��ウム(II)ジクロリド、2-(2'-ジ-tert-ブチルホスフィン)ビフェニルパラジウム(II) アセテート、テトラクロロパラジウム酸(II)ナトリウム、ビス(アセトニトリル)ジクロロパラジウム(II)、テトラクロロパラジウム酸(II)アンモニウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)アンモニウム、テトラクロロパラジウム酸(II)カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)カリウム、(2,2'-ビピリジン)ジクロロパラジウム(II)、(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2,5-ジエン)ジクロロパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-2-イミダゾリジニリデン]クロロパラジウム(II)、ジ-μ-クロロビス[1-[(1R)-1-(ジメチルアミノ)エチル]-2-ナフチル-C,N]ジパラジウム(II)、(2,2'-ビピリジン)ジクロロパラジウム(II)、(ビシクロ[2.2.1]ヘプタ-2,5-ジエン)ジクロロパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)-2-イミダゾリジニリデン]クロロパラジウム(II)、ジ-μ-クロロビス[1-[(1R)-1-(ジメチルアミノ)エチル]-2-ナフチル-C,N]ジパラジウム(II)、ビス(ジ-tert-ブチル(4-ジメチルアミノフェニル)ホスフィン)ジクロロパラジウム(II)、trans-ビス(アセタト)ビス[o-(ジ-o-トリルホスフィノ)ベンジル]ジパラジウム(II)、アリル[1,3-ビス(メシチル)イミダゾール-2-イリデン]クロロパラジウム(II)、[1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)、テトラクロロパラジウム酸(II)カリウム、ヘキサクロロパラジウム酸(IV)カリウム、アリルパラジウム(II) クロリド ダイマー、[1,1'-
ビス(ジ-tert-ブチルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)、及び(2-ブテニル)クロロパラジウム ダイマー。
（以下、上記化合物の英語表記によるＩＵＰＡＣ名：dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium(II)、bis(benzonitrile)dichloropalladium(II)、diamminedichloropalladium(II)、dichloro(ethylenediamine)palladium(II)、chloro(η2-P,C(-)tris(2,4-di-tert-butylphenyl)phosphite)(tricyclohexylphosphine)palladium(II)、di-μ-chloro-bis-[5-hydroxy-2-[1-(hydroxyimino-κN)-ethyl]-phenyl-κC]-palladium(II) dimer、bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride、bromo(tri-tert-butylphosphine)palladium(I) dimer、1,2-bis(phenylsulfinyl)ethane palladium(II) acetate、chloro[2-(dicyclohexylphosphino)-3,6-dimethoxy-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl][2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro-(2-Dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro[2-(di-tert-butylphosphino)-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl][2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethyl)phenyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2-aminoethylphenyl)]palladium(II)、bis[(dicyclohexyl)(4-dimethylaminophenyl)phosphine] palladium(II) chloride、bis[di-(tert-butyl)(4-trifluoromethylphenyl)phosphine]palladium(II) chloride、2-(dimethylaminomethyl)ferrocen-1-yl-palladium(II) chloride dinorbornylphosphine、1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)imidazol-2-ylidene (1,4-naphthoquinone)palladium(0) dimer、salicylaldehyde thiosemicarbazone palladium(II) chloride、2-[bis(2,4-di-tert-butyl-phenoxy)phosphinooxy]-3,5-di(tert-butyl)phenyl-palladium(II) chloride dimer、di-μ-chlorobis[5-chloro-2-[(4-chlorophenyl)(hydroxyimino-κN)methyl]phenyl-κC]palladium dimer、palladium(II) acetate-S-Phos(Pd:P 1:2)、tris[dibenzylideneacetone]dipalladium(0)-S-Phos (Pd:P 1:2)、2-(dimethylamino)-2-biphenylyl-palladium(II) chloride dinorbornylphosphine complex、palladium pivalate、bis(benzonitrile)palladium(II) chloride、palladium(II) trifluoroacetate、palladium(π-cinnamyl) chloride dimer、bis(triphenylphosphine)palladium(II) diacetate、1,4-bis(diphenylphosphino)butane-palladium(II) chloride、palladium(II) cyanide、palladium(II) propionate、(2-methylallyl)palladium(II) chloride dimer、[2,6-bis[(di-1-piperidinylphosphino)amino]phenyl]palladium(II) chloride、[1,2-bis(dicyclohexylphosphino)ethane]palladium(II) chloride、triphenylphosphine palladium(II) dichloride phosphaadamantane ethyl silica、dichlorobis(tricyclohexylphosphine)palladium(II)、dichloro(1,5-cyclooctadiene)palladium(II)、(1,3-bis(diphenylphosphino)propane)palladium(II) chloride、1,1'-bis(di-isopropylphosphino)ferrocene palladium dichloride、dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',4',6'-triisopropyl-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、bis(3,5,3',5'-dimethoxydibenzylideneacetone)palladium(0)、dichloro(1,10-phenanthroline)palladium(II)、dichlorobis(tri-o-tolylphosphine)palladium(II)、trans-benzyl(chloro)bis(triphenylphosphine)palladium(II)、tris(3,3',3''-phosphinidynetris(benzenesulfonato)palladium(0) nonasodium salt nonahydrate、[(R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]-diaquo-palladium(II) bis(triflate)、trans-bis(dicyclohexylamine)palladium(II) acetate、(R)-1-[(SP)-2-(dicyclohexylphosphino)ferrocenyl]ethyldi-tert-butylphosphine palladium(II) dichloride、dichloro[2-(4,5-dihydro-2-oxazolyl)quinoline]palladium(II)、bis[(diphenylphosphanyl)methyl]amine palladium(II) dichloride, polymer-bound、trans-dibromobis(triphenylphosphine)palladium(II)、[(R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、2-[bis(triphenylphosphine)palladium(II)bromide]benzyl alcohol、[(R)-(+)-2,2'-bis(di-p-tolylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、[bis[((R)-(+)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)palladium(II)]bis(μ-hydroxo)] bis(triflate)、dichlorobis(triethylphosphine)palladium(II)、[(S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]-diaquo-palladium(II) bis(triflate)、diacetobis(triphenylphosphine)palladium(II)、[bis[((S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl)palladium(II)]bis(μ-hydroxo)] bis(triflate)、[(S)-(-)-2,2'-bis(di-p-tolylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II) chloride、chloro[(1,2,5,6-η)-1,5-cyclooctadiene](2,2-dimethylpropyl)-palladium、chloro[(tricyclohexylphosphine)-2-(2'-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro(triphenylphosphine) [2-(2′-amino-1,1′-biphenyl)]palladium(II)、dichloro[(S)-(-)-2,2'-bis(diphenylphosphino)-1,1'-binaphthyl]palladium(II)、bis(benzonitrile)palladium(II) bromide、chloro[(tri-tert-butylphosphine)-2-(2-aminobiphenyl)] palladium(II)、dibromo[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II)、dibromo(1,5-cyclooctadiene)palladium(II)、dichloro[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]palladium(II) acetone adduct、dichloro[8-(di-tert-butylphosphinooxy)quinoline]palladium(II)、dichloro(chloro-tert-butylcyclohexylphosphine)palladium (ii) dimer、dichloro(chlorodi-t-butylphosphine)palladium(ii) dimer、dichloro(chlorodicyclohexylphosphine)palladium (ii) dimer、dichlorobis(chloro-t-butylcyclohexylphosphine)palladium(ii)、dichlorobis(chlorodi-tert-butylphosphine) palladium (ii)、dichlorobis(methyldiphenylphosphine)palladium(II)、trans-dibromo[bis(tri-o-tolylphosphine)]palladium(II)、Tris[μ-[(1,2-η:4,5-η)-(1E,4E)-1,5-bis(4-methoxyphenyl)-1,4-pentadien-3-one]]di-palladium、[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-ylidene]chloro[3-phenylallyl]palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、dichloro(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)palladium(II)、chloro(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、[1,3-bis(2,6-di-isopropylphenyl)-4,5-dihydroimidazol-2-ylidene]chloro)[3-phenylallyl]palladium(II)、dichloro[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-1,3-dihydro-2H-imidazol-2-ylidene]palladium(II) dimer、dichloro-[1,3-bis(diisopropylphenyl)imidazoliden-2-ylidene]palladium(II) dimer、bis[tris(4-(1H,1H,2H,2H-perfluorodecyl)phenyl)phosphine]palladium(II) dichloride、bromo[(2-(hydroxy-κO)methyl)phenylmethyl-κC](triphenylphosphine)palladium (II)、[(2-di-cyclohexylphosphino-3,6-dimethoxy-2',4',6'- triisopropyl-1,1'-biphenyl)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-diisopropoxy-1,1'-biphenyl)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、[(4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、[(di(1-adamantyl)-butylphosphine)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、allylchloro[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)imidazol-2-ylidene]palladium(ii)、bis[tris(4-(heptadecafluorooctyl)phenyl)phosphine]palladium(II) dichloride、chloro[(1,3,5,7-tetramethyl-5-phenyl-2,4,8-trioxa-6-phosphaadamantane)-2-(2-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro[(4,5-bis(diphenylphosphino)-9,9-dimethylxanthene)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、chloro[(di(1-adamantyl)-N-butylphosphine)-2-(2-aminobiphenyl)]palladium(II)、chloro(sodium-2-dicyclohexylphosphino-2',6'-dimethoxy-1,1'-biphenyl-3'-sulfonate)[2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、dichloro[(S)-N,N-dimethyl-1-[(R)-2-(diphenylphosphino)ferrocenyl]ethylamine]palladium(II)、dichloro[bis(2-(diphenylphosphino)phenyl)ether]palladium(II)、dichlorobis(3,7-diacetyl-1,3,7-triaza-5-phosphabicyclo[3.3.1]nonane) palladium(II)、[(2-[bis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]phosphine]-3,6-dimethoxy-2',4',6'- triisopropyl-1,1'-biphenyl )-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II) methanesulfonate、chloro[(2-dicyclohexylphosphino-2',6'-bis(N,N-dimethylamino)-1,1'-biphenyl)-2-(2'-amino-1,1'-biphenyl)]palladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazol-2-ylidene]chloropalladium(II)、(1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)imidazolidene)(3-chloropyridyl)palladium(II)dichloride、2-(2'-di-tert-butylphosphine)biphenylpalladium(II) acetate、sodium tetrachloropalladate(II)、bis(acetonitrile)dichloropalladium(II)、ammonium tetrachloropalladate(II)、ammonium hexachloropalladate(IV)、potassium tetrachloropalladate(II)、potassium hexachloropalladate(IV)、(2,2'-bipyridine)dichloropalladium(II)、(bicyclo[2.2.1]hepta-2,5-diene)dichloropalladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-2-imidazolidinylidene]chloropalladium(II)、di-μ-chlorobis[1-[(1R)-1-(dimethylamino)ethyl]-2-naphthyl-C,N]dipalladium(II)、(2,2'-bipyridine)dichloropalladium(II)、(bicyclo[2.2.1]hepta-2,5-diene)dichloropalladium(II)、allyl[1,3-bis(2,6-diisopropylphenyl)-2-imidazolidinylidene]chloropalladium(II)、di-μ-chlorobis[1-[(1R)-1-(dimethylamino)ethyl]-2-naphthyl-C,N]dipalladium(II)、bis(di-tert-butyl(4-dimethylaminophenyl)phosphine)dichloropalladium(II)、trans-bis(acetato)bis[o-(di-o-tolylphosphino)benzyl]dipalladium(II)、allyl[1,3-bis(mesityl)imidazol-2-ylidene]chloropalladium(II)、[1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)、potassium tetrachloropalladate(II)、potassium hexachloropalladate(IV)、allylpalladium(II) chloride dimer、[1,1'-bis(di-tert-butylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(II)、(2-butenyl)chloropalladium dimer）。
【０１０８】
好ましい錯体としては、下記の化合物が挙げられる。
ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム(II)（dichloro(η-cycloocta-1,5-diene)palladium(II)）（分子量285.51）、ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム(II)（bis(benzonitrile)dichloropalladium(II)）（分子量383.57）、ジアンミンジクロロパラジウム(II)（diamminedichloropalladium(II)）（分子量211.39）、ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム(II) dichloro(ethylenediamine)palladium(II)）（分子量237.41）、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(II) ジアセテート（bis(triphenylphosphine)palladium(II)diacetate）（分子量749.08）。
【０１０９】
また、パラジウム錯体として、パラジウム化合物を、配位子としてパラジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するパラジウム錯体が挙げられる。このようなパラジウム化合物としては、例えば、パラジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するパラジウム化合物が挙げられる。
【０１１０】
前記元素又は基としては、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、OH-、NO3-、CH3COO-、NO2-、CO32-、PO43-、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）、SO32-、及びN3-等が挙げられる。
【０１１１】
前記パラジウム化合物として具体的には、塩化パラジウム、フッ化パラジウム、臭化パラジウム、及び、ヨウ化パラジウム、水酸化パラジウム、二硝酸パラジウム(II)、四硝酸パラジウム(IV)、酢酸パラジウム、ジニトロパラジウム、炭酸パラジウム、リン酸パラジウム、ジメトキシパラジウム、メトキシリン酸パラジウム、亜硫酸パラジウム、ジニトロパラジウム、及びパラジウムジアジド等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化パラジウム、臭化パラジウム、フッ化パラジウム、及びヨウ化パラジウムが挙げられ、特に好ましい化合物として塩化パラジウムが挙げられる。塩化パラジウムとしては、塩化パラジウム（II）、及び塩化パラジウム（IV）が挙げられる。酢酸パラジウムとしては、酢酸パラジウム（II）（palladium(II)acetate、分子量224.5）が挙げられる。
【０１１２】
有機溶媒としては、DMSO等が挙げられる。塩化パラジウムをDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス（ジメチルスルホキシド）パラジウム（II）、及び、テトラキス（ジメチルスルホキシド）パラジウム（II）が挙げられる。
【０１１３】
また、配位子としてパラジウムに結合し得る物質を含む溶液としては、ハルマリン（harmaline）溶液、例えばハルマリン塩酸塩の水溶液等、及び、ジフェロセニル・ホスフィン（diferrocenyl-phosphine）溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液が挙げられる。前記のようなパラジウムを含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、パラジウムはハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、パラジウム錯体として低分子化される。このようにして生成するパラジウム錯体も、本発明に使用することができる。パラジウム錯体は、二量体等の多量体であってもよい。
【０１１４】
パラジウム錯体、及び、パラジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するパラジウム化合物は、各種市販されており（例えば、和光純薬工業、シグマ）、それらを使用することができる。また、例えばNishiyama M, Yamamoto T. (1998) Tetrahedron Lett, 39: 617-620やJ. Am. Chem. Soc. (1999) 121: 9550-9561等に記載の方法にしたがって合成することもできる。
【０１１５】
（ｃ）イリジウム錯体
工程ｂ）において、イリジウム錯体は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に直接的に、又はタンパク質等を介して間接的に結合もしくは干渉して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害すると推定される。このため、イリジウム錯体は核酸に結合する化合物であればよい。なお、イリジウム錯体と核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）との結合は、配位結合（共有結合）であり得る。
【０１１６】
イリジウム錯体は、微生物の生細胞に対する作用と、微生物の損傷細胞及び死細胞、並びにウシ白血球等の体細胞、白血球、及び血小板等に対する作用とが異なるものであることが好ましい。より具体的には、微生物の生細胞の細胞壁よりも、微生物の損傷細胞及び死細胞の細胞壁、並びにウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。
【０１１７】
イリジウム錯体としては、生細胞に対する透過性と損傷細胞又は死細胞の細胞壁に対する透過性が異なり、かつ、細胞内の核酸に結合してターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害する作用を有するものであればよい。制限はされないが、例えば、配位子として、少なくともNH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、NO2-、N2、N3-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、及びR-からなる群から選ばれる一つを含むイリジウム錯体が挙げられる（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。イリジウム錯体は、上記のような配位子を一つ含んでいてもよく、同一又は異なる配位子を複数含んでいてもよい。また、上記以外の配位子を含んでいてもよい。
【０１１８】
前記飽和有機基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル、ペンチル基、シクロペンチル、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、シクロオクチル基等のアルキル基等が挙げられる。また、不飽和有機基としては、ベンジル基（ベンゼン環）、ナフチル基（ナフタレン環）、アリル基、シクロオクタジエニル基、シクロオクテン基、ペンタメチルシクロペンタジエニル基、インデニル基等が挙げられる。これらの飽和有機基及び不飽和有機基は置換基を有していてもよい。
【０１１９】
上記配位子としては、NH3、RNH2、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H2O、CO32-、OH-、NO3-、ROH、N2H4、PO43-、R2O、RO-、ROPO32-、(RO)2PO2-、R2S、R2P-、R3P、RS-、CN-、RSH、RNC、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、CO、H-、及びR-からなる群から選ばれる一つ又はそれ以上が好ましい（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。これらの中では、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、ピリジン基、OH-、R-が特に好ましい。
【０１２０】
イリジウム錯体として具体的には、下記の化合物が挙げられる。
・ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]（Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]）（ C16H24Cl2Ir2）、 
・2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリド（2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride） （C15H20Cl2IrNO）、
・クロロトリカルボニルイリジウム（Chlorotricarbonyliridium(I)）（C3ClIrO3）、
・カルボニルクロロビス(トリフェニルホスフィン)イリジウム(I)（Carbonylchlorobis(triphenylphosphine)iridium(I)）（C37H30ClIrOP2）
・(アセチルアセトナト)ジカルボニルイリジウム(I)（Acetylacetonato)dicarbonyliridium(I))（ C7H7IrO4）、
・(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) （C13H19IrO2）、
・クロロビス(シクロオクテン)イリジウム(I)ダイマー（Chlorobis(cyclooctene)iridium(I)dimer）（C32H56Cl2Ir2）、
・クロロジヒドリド[ビス(2-ジイソプロピルホスフィノ)エチルアミン]イリジウム(III)（Chlorodihydrido[bis(2-diisopropylphosphino)ethylamine]iridium(III)） （C16H39ClIrNP2）、
・クロロ(5-メトキシ-2-[1-[(4-メトキシフェニル)イミノ-N]エチル]フェニルl-C)(1,2,3,4,5-ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)（Chloro(5-methoxy-2-[1-[(4-methoxyphenyl)imino-N]ethyl]phenyl-C)(1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)）（ C26H31ClIrNO2）、
・ジクロロテトラキス(2-(2-ピリジニル)フェニル)ジイリジウム(III)（Dichlorotetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)）（ C44H32Cl2Ir2N4）、
・ジヨード(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ダイマー（Diiodo(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III) dimer）（C20H30I4Ir2）、
・イリジウム(III)ブロミド水和物（Iridium(III) bromide hydrate）（Br3Ir・xH2O）、
・イリジウム(IV)クロリド水和物（Iridium(IV) chloride hydrate）（Cl4Ir・xH2O）、
・ペンタアンミンクロロイリジウム(III)クロリド（Pentaamminechloroiridium(III) chloride）（ H15Cl3IrN5）、
・テトライリジウムドデシルカルボニル（Tetrairidium dodecacarbonyl）（C12Ir4O12）、
・イリジウム(III)アセチルアセトナート（Iridium(III)acetylacetonate）（ C15H21IrO6）、
・(1,5-シクロオクタジエン)-η5-インデニル)イリジウム(I)（(1,5-cyclooctadiene)-η5-indenyl)iridium(I)）（C17H18Ir）、
・(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート（(1,5-cyclooctadiene)bis(methyldiphenylphosphine)iridium(I)hexafluorophospate）（C34H38F6IrP3）、
・(1,5-シクロオクタジエン)(ピリジン)(トリシクロヘキシルホスフィン)-イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート（(1,5-cyclooctadiene) (pyridine) (tricyclohexylphosphine)-iridium(I)hexafluorophosphate）（ C31H50F6IrNP2)、
・ (1,5-シクロオクタジエン)(ヘキサフルオロアセチルアセトナト)イリジウム(I)（(1,5-cyclooctadiene)(hexafluoroacetylacetonato)iridium）（C13H13F6IrO2）、
・(1,5-シクロオクタジエン)(メトキシ)イリジウム(I)ダイマー（(1,5-cyclooctadiene)(methoxy)iridium(I)dimer）（C18H30Ir2O2）、
・ビス(シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラキス(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)ボラート（bis(cyclooctadiene)iridium(I)tetrakis (3,5-bis(tryfluoromethyl)phenyl)borate）（C48H36BF24Ir）、
・ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラフルオロボラート（bis(1,5-cyclooctadiene)iridium(I)tetrafluoroborate）（ C16H24BF4Ir）、
・ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) ジクロリド（bis(1,5-cyclooctadiene)iridium(I)dichloride）（ C16H24Cl2Ir2）、
・ビス[1,2-ビス(ジフェニスホスフィノ)エタン]カルボニルクロロイリジウム(I)（bis[1,2-bis(diphenylphosphino)ethane]carbonylchloroiridium(I)）（C53H48ClIrOP4）、及び
・ペンタメチルシクロペンタジエニルイリジウム(III)クロリドダイマー（pentamethylcyclopentadienyliridium(III)chloride dimer）（C20H30Cl4Ir2）。
【０１２１】
好ましい錯体としては、下記の化合物が挙げられる。
・Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]（別名：ビス(1,5-シクロオクタジエン)ジイリジウム(I)ジクロリド（bis(1,5-cyclooctadiene)diiridium(I)dichloride））（化１、分子量（M.W.）又は式量（F.W.）：671.70）
・2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride（化２、分子量（M.W.）又は式量（F.W.）：493.45)
【０１２２】
【化１】
0006537894.tif 000002
【０１２３】
【化２】
0006537894.tif 000003
【０１２４】
また、イリジウム錯体として、イリジウム化合物を、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するイリジウム錯体が挙げられる。このようなイリジウム化合物としては、例えば、イリジウムと他の元素又は基との共有結合により、巨大分子を形成するイリジウム化合物が挙げられる。
【０１２５】
前記元素又は基としては、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、OH-、NO3-、CH3COO-、PO43-、RO-、CO32-、ROPO32-、(RO)2PO2-、RS-、CN-、(RS)2PO2-、(RO)2P(O)S-、SCN-、H-、及びR-（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）等が挙げられる。
【０１２６】
前記イリジウム化合物として具体的には、イリジウム、塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、ヨウ化イリジウム、水酸化イリジウム、硝酸イリジウム、炭酸イリジウム、酢酸イリジウム、ジメトキシイリジウム、メトキシリン酸イリジウム、リン酸イリジウム、塩化イリジウム酸、ジスルフメチルイリジウム、ジシアノイリジウム、ジチオシアネートイリジウム、二水素化イリジウム、メチルイリジウム、酸化イリジウム、五塩化イリジウム（IV）ジアンモニウム（ヘキサクロロイリジウム（IV）酸二アンモニウム）、クロロトリカルボニルイリジウム、これらの水和物、及びこれらの塩等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、及びヨウ化イリジウムが挙げられ、特に好ましい化合物として塩化イリジウムが挙げられる。塩化イリジウムとしては、塩化イリジウム（III）、及び塩化イリジウム（IV）が挙げられる。これらの塩としては、塩酸または硝酸などの無機酸の酸付加塩、シュウ酸などの有機酸の酸付加塩を例示することができる。
【０１２７】
有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO）、及びベンゾニトリル（benzonitrile）等が挙げられる。塩化イリジウムをDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス（ジメチルスルホキシド）イリジウム（III）が挙げられる。
【０１２８】
また、配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液としては、ハルマリン（harmaline）溶液、例えばハルマリン塩酸塩の水溶液等、及びジフェロセニル・ホスフィン（diferrocenyl-phosphine）溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液等、が挙げられる。前記のようなイリジウムを含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、イリジウムはハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、イリジウム錯体として低分子化される。このようにして生成するイリジウム錯体も、本発明に使用することができる。
【０１２９】
イリジウム錯体は、二量体（１錯体に２個のイリジウム元素を有するダイマー）等の多量体であってもよい。二量体としては、例えば、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)dimer]が挙げられる。
【０１３０】
イリジウム錯体、及びイリジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するイリジウム化合物は、各種市販されており（例えば、和光純薬工業、シグマ）、それらを使用することができる。また、Weiss R.B., Christian M.C. (1993) Drugs 46:360; Gordon M., Hollander S. (1993) 24: 209; Khokhar A.R., Lopez-Berestein G., Perez-Soler P., US Patent 5 117 022, 1992; Brown D.B., Kohkhar A.R., Hacker M.P., McCommack J.J., European Patent EP 0130 482 b1, 1988; Yanai J., Japanese Patent JP 09 132 583 A2, 1997; Lippert B., Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of Leading Anti-cancer Drugs, 1st Ed., John Wiley and sons, ltd., 1999に記載の方法に準拠して合成することもできる。
【０１３１】
（ｄ）金属錯体の使用
本発明のｂ）工程において、金属錯体（白金錯体、パラジウム錯、イリジウム錯体）は１種類を単独で用いてもよいし、２種以上を任意に組み合わせて用いることができる。ここで併用の態様には、同種類に属する金属錯体の中から異なる金属錯体を２種以上組み合わせるか、または異なる種類に属する金属錯体を２種以上組み合わせる態様が含まれる。好ましくは白金錯体とパラジウム錯体との併用である。
【０１３２】
金属錯体による処理の条件は、用いる金属錯体の種類に応じて、適宜設定することができる。例えば、検出対象の微生物の生細胞のけん濁液、及び同微生物の死細胞もしくは損傷細胞のけん濁液に、種々の濃度の金属錯体を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって微生物細胞（菌体）を分離し、次いで核酸増幅法で分析することによって、生細胞と死細胞もしくは損傷細胞とを区別しやすい条件を決定することができる。また、検出対象の微生物の生細胞のけん濁液、及び白血球等の体細胞又は血小板等のけん濁液に、種々の濃度の金属錯体を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって微生物細胞（菌体）及び前記各種細胞を分離し、次いで核酸増幅法で分析することによって、微生物の生細胞と上記各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。
【０１３３】
このような条件として、用いる金属錯体の種類に応じて、下記の条件を例示することができる。
【０１３４】
［白金錯体］
シスプラチン：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは２５〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃；反応時間５分〜２時間、
トランスプラチン：終濃度１０〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃；反応時間５分〜２時間、
カルボプラチン：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは２５０〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃；反応時間５分〜２時間、
オキサリプラチン又はネダプラチン：終濃度１０〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃；反応時間５分〜２時間、
cis−ジアンミン（ピリジン）クロロ白金（II）クロリド：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは２５〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
ジクロロ（エチレンジアミン）白金（II）：終濃度１０〜３０００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
cis−ビス（ベンゾニトリル）ジクロロ白金（II）：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１００〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
テトラキス（トリフェニルホスフィン）白金（II）：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは２５〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃；反応時間５分〜２時間、
二硝酸（エチレンジアミン）ヨウ化白金（II）ダイマー：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは４００〜３０００μＭ；反応温度４〜４３℃；反応時間５分〜２時間。
【０１３５】
塩化白金（II）、塩化白金（IV）、又は塩化白金酸（もしくは塩化白金酸六水和物）をDMSOに溶解して得られる錯体では、塩化白金（II）、塩化白金（IV）、又は塩化白金酸の量として終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間が例示される。
【０１３６】
［パラジウム錯体］
ジクロロ（η-シクロオクタ-1,5-ジエン）パラジウム(II)：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
ビス（ベンゾニトリル）ジクロロパラジウム(II)：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
ジアンミンジクロロパラジウム(II)：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
ジクロロ（エチレンジアミン）パラジウム(II)：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜２５０μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）ジアセート：終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間。
【０１３７】
塩化パラジウム（II）をDMSOに溶解して得られる錯体では、塩化パラジウム（II）の量として終濃度１０〜３０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間が例示される。酢酸パラジウム（II）をDMSOに溶解して得られる錯体では、酢酸パラジウム（II）の量として終濃度１〜３００μＭ、好ましくは１〜１０μＭ、反応温度４〜４３分、反応時間５分〜２時間が例示される。
【０１３８】
［イリジウム錯体］
Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]：終濃度２０〜３０００μＭ、好ましくは２５〜３００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間、
2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride：終濃度２０〜３０００μＭ、好ましくは５０〜３００μＭ、反応温度４〜４３℃、反応時間５分〜２時間。
【０１３９】
他のイリジウム錯体についても、これらのイリジウム錯体に準じて条件を設定することができる。また、細胞数が既知の試料を用いて、細胞を種々の条件でイリジウム錯体で処理して、試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅し、増幅産物を解析することによって、好適な条件を選択することができる。
【０１４０】
ａ）工程で得られた処理物（被検試料含有）と金属錯体との混合、上記のように処理物に金属錯体を添加して混合してもよいし、逆に金属錯体の溶液に被検試料を添加して混合してもよい。
【０１４１】
上記金属錯体を用いる方法は、従来のエチジウムモノアザイドを用いる方法と異なり、光照射を必要としない。このため、光照射による加熱を防ぐための冷却（例えば氷水への試料の浸漬）は不要である。また、上記方法は、従来のＥＭＡを用いる方法と異なり、遮光の必要もない。
【０１４２】
本発明で用いる金属錯体は、生細胞の細胞壁よりも、死細胞及び損傷細胞の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば微生物の生細胞の細胞壁・細胞膜は実質的に透過せず、微生物の損傷細胞もしくは死細胞、または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。
【０１４３】
このため、白金錯体は、まず体細胞の死細胞、並びに微生物の死細胞及び損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡ又はＲＮＡと結合し、その結果、白金錯体が結合したＤＮＡ又はＲＮＡは、核酸増幅反応の鋳型とはならなくなると推定される。生細胞よりも優先的に損傷細胞や死細胞に対して白金錯体が透過すると、生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷細胞や死細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡに白金錯体が結合し、核酸増幅反応が阻害されるため、生細胞を損傷細胞や死細胞に比べて選択的に検出することができる。
【０１４４】
パラジウム錯体は、まず体細胞の死細胞、並びに微生物の死細胞及び損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、核酸結合性タンパク質のシステインやメチオニン部位に配位結合する。このとき、錯体自身は直接核酸には作用していないものの、核酸と核酸結合性タンパク質は一体化している（円状の核酸結合性タンパク質に糸状の核酸が巻き付いている）ため、核酸伸長酵素（ＤＮＡポリメラーゼやＲＮＡポリメラーゼ等）による伸長反応が著しく阻害されると推定される。生細胞よりも優先的に損傷細胞や死細胞に対してパラジウム錯体が透過すると、生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷細胞や死細胞では核酸結合性タンパク質にパラジウム錯体が配位結合することにより、核酸伸長酵素の伸長反応を阻害するため、生細胞を損傷細胞や死細胞に比べて選択的に検出することができる。
【０１４５】
イリジウム錯体は、生細胞の細胞壁よりも、死細胞及び損傷細胞の細胞壁の方が透過しやすいという性質を有する。このため、前記に示す作用時間内であれば、微生物の生細胞の細胞壁及び細胞膜には実質的に透過せず、微生物の損傷細胞もしくは死細胞または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。その結果、イリジウム錯体は、体細胞の死細胞及び微生物の死細胞並びに損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡ又はＲＮＡに直接的又は間接的に結合もしくは干渉し、その結果、薬剤が結合したＤＮＡ、又はＲＮＡは、核酸増幅反応の鋳型とはならなくなると推定される。
【０１４６】
生細胞よりも損傷細胞や死細胞に優先的に薬剤が透過すると、生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷細胞や死細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡに薬剤が直接的又は間接的に結合もしくは干渉し、核酸増幅反応が阻害される。そのために、生細胞は損傷細胞や死細胞に比べて選択的に検出することができる。
【０１４７】
工程ｂ）の金属錯体による処理は、一回でもよく、又は２以上の回数を繰り返して行ってもよい。金属錯体の濃度は、一回目の金属錯体処理では、二回目以降よりも高くし、二回目以降の金属錯体処理では、一回目よりも低くすることが好ましい。また、一回目の金属錯体処理では、二回目以降の金属錯体処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
【０１４８】
金属錯体処理に用いる条件は、本発明の効果を奏するものであればよく、微生物の種類に応じて、適宜選択することができる。各微生物について、好適な処理条件の一例を挙げると、大腸菌のようなグラム陰性菌（中温細菌）については３７℃又はその付近で２５〜３０分間程度、黄色ブドウ球菌のようなグラム陽性菌（中温細菌）については３７℃又はその付近で１０〜１５分間程度、及び緑膿菌などのシュードモナス属に代表される好冷菌は、当該細菌の至適温度を考慮して、２５〜３０℃程度で１０〜３０分間程度の条件を例示することができる。本発明が対象とする金属錯体は、２５℃以下の温度にて作用させると、死菌のＤＮＡ及び／又は死菌のＤＮＡバインディングプロテインへの配位結合能力（静電気的結合能力を含む）が、有意に低下する傾向があるため、２５℃を超える温度条件を採用することが好ましい。
【０１４９】
先の金属錯体処理と、それ以降の金属錯体処理の間で、未反応の金属錯体を除去する工程を追加してもよい。金属錯体を除去する方法としては、被検試料を遠心分離して、微生物を含む沈殿と金属錯体を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、金属錯体を除去した後、適宜、洗浄剤で微生物を洗浄する工程を追加することも可能である。金属錯体処理した試料は、下記工程ｃ）の前に、未反応の金属錯体を除去しておくことが好ましい。
【０１５０】
白金元素は核酸のアデニン（A）やグアニン（G）を好んで配位結合するので、白金錯体を作用させた後、ターゲット遺伝子を含まない核酸やオリゴヌクレオチドを新たに添加することにより、未反応の白金錯体を除去し不活性化することが可能である。
【０１５１】
またパラジウム錯体は、システインやメチオニンというアミノ酸残基を有するタンパク質に対して、核酸よりも好んで配位結合するので、一回目の高濃度のパラジウム錯体の作用を無効化するために、ウシ血清アルブミン溶液や酵母エキス等タンパク質を含む培地（ラクトースブロスやブレイン・ハート・インフュージョン培地）を添加し、未反応のパラジウム錯体を前記タンパク質に結合・吸着させることで除去することが可能である。
【０１５２】
（１−３）工程ｃ）：核酸増幅
工程ｃ）は、上記工程ｂ）で得られた被検試料を対象として、当該被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する工程である。当該工程において、増幅する対象は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のいずれであってもよく、具体的には１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、及び２本鎖ＲＮＡを例示することができる。
【０１５３】
核酸増幅法は、微生物の細胞から抽出した試料を用いて行ってもよいし、また細胞から核酸抽出を行わずに、工程ｂ）で金属錯体処理した被検試料をそのまま用いて行ってもよい。検出の簡便性及び迅速性から、好ましくは細胞から核酸抽出を行わず、工程ｂ）で金属錯体処理した被検試料をそのまま用いることが望ましい。
【０１５４】
細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤（以下「核酸増幅阻害作用抑制剤」とも称する）を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい（特許第4825313号公報、国際公開第2011/010740号パンフレット参照）。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、マグネシウム塩、有機酸塩、及びリン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩を添加してもよいし、また界面活性剤を添加してもよい。これら（核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩、有機酸塩、リン酸塩、界面活性剤）は、いずれか一種、又は任意の二種以上の組合わせで使用することができる。
【０１５５】
例えば、マグネシウム塩は有機酸塩と組み合わせて用いるか、またリン酸塩と組み合わせて用いることが好ましい。また、核酸増幅阻害作用抑制剤は、マグネシウム塩、有機酸塩、及びリン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩（好ましくはマグネシウム塩と有機酸塩、またはマグネシウム塩とリン酸塩）と組み合わせて用いてもよいし、また界面活性剤と組み合わせて用いてもよい。さらに、核酸増幅阻害作用抑制剤は、マグネシウム塩、有機酸塩、及びリン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩（好ましくはマグネシウム塩と有機酸塩、またはマグネシウム塩とリン酸塩）と界面活性剤とを組み合わせて使用することができる。好ましくは３番目の態様であり、核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩、有機酸塩及び界面活性剤の組み合わせ、または核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩、リン酸塩及び界面活性剤の組み合わせを好適に挙げることができる。
【０１５６】
これらの核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩、有機酸塩、リン酸塩、及び界面活性剤の添加の順序は問わず、また、同時に添加してもよい。必要に応じ、核酸伸長酵素も通常のＰＣＲ法で使用している濃度の２倍〜１０倍の濃度で添加してもよい。
【０１５７】
前述する核酸増幅阻害物質とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等が挙げられる。正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（heme）等が挙げられる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性細菌細胞壁外膜等が挙げられる。飲食品や臨床検体中には、このような核酸増幅阻害物質が多く含まれているといわれている。
【０１５８】
上記のような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤（核酸増幅阻害作用抑制剤）としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチーム、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素からなる群から選択される少なくとも１種を例示することができる。これらは１種単独で用いてもよいし、また２種以上を任意に選択して用いることもできる。
【０１５９】
ここでポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が例示される。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等が挙げられる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素が挙げられる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂが好ましい。
【０１６０】
核酸増幅阻害作用抑制剤として、好ましくは、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びリゾチームである。これらの核酸増幅阻害作用抑制剤は、血液、糞便、及び肉等の検査材料のＰＣＲ反応液に添加することで、当該検査材料中に含まれる核酸増幅阻害物質による核酸増幅阻害作用が低減されることが確認されている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000）。
【０１６１】
アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。アルブミンは単量体であっても、また複合体であってもよい。またアルブミンは精製物でも、また粗精製物でもよく、本発明の効果を損なわない限りグロブリン等の他の成分を含んでいてもよい。さらに、アルブミンは、例えば限外濾過などによりある一定の分子量以上またはその分子量以下に分画された分画物であってもよい。核酸増幅を行う被検試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、制限されないものの、通常０．０００１〜１質量％の範囲を挙げることができる。好ましくは０．０１〜１質量％、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。
【０１６２】
デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられる。好ましくはデキストラン４０である。核酸増幅を行う被検試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１〜８質量％、好ましくは１〜６質量％、より好ましくは１〜４質量％である。
【０１６３】
Ｔ４ジーン３２プロテイン（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）の被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１〜１質量％、好ましくは０．０１〜０．１質量％、より好ましくは０．０１〜０．０２質量％である。
【０１６４】
リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームが挙げられる。核酸増幅を行う被検試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは６〜１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは９〜１３μｇ／ｍｌである。
【０１６５】
界面活性剤としては、Triton（ユニオンカーバイド社の登録商標）、Nonidet（シェル社）、Tween（ICI社の登録商標）、及びBrij（ICI社の登録商標）等の非イオン系界面活性剤；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）等の陰イオン系界面活性剤；塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム等の陽イオン界面活性剤が挙げられる。TritonとしてはTriton X-100（ポリエチレングリコール tert−オクチルフェニルエーテル）等が、NonidetとしてはNonidet P-40（オクチルフェニル−ポリエチレングリコール）等が、TweenとしてはTween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミタート）、Tween 60（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアラート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート）等が、BrijとしてはBrij56（ポリオキシエチレン(10) セチルエーテル）、Brij58（ポリオキシエチレン(20) セチルエーテル）等が挙げられる。
【０１６６】
被検試料（核酸増幅反応液）中の界面活性剤の種類及び濃度は、微生物の細胞内へのＰＣＲ試薬の透過を促進し、核酸増幅反応を実質的に阻害しないものである限り、特に制限されない。具体的には、界面活性剤として例えばSDSを用いる場合、被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度として、通常０．０００５〜０．０１質量％の範囲を挙げることができる。好ましくは０．００１〜０．０１質量％、より好ましくは０．００１〜０．００５質量％、より好ましくは０．００１〜０．００２質量％である。
【０１６７】
また界面活性剤として、例えばNonidet P-40を用いる場合、被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．００１〜１．５質量％、好ましくは０．００２〜１．２質量％、より好ましくは０．９〜１．１質量％である。例えばTween 20を用いる場合、被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．００１〜１．５質量％、好ましくは０．００２〜１．２質量％、より好ましくは０．９〜１．１質量％である。例えばBrij56またはBrij58を用いる場合、被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．１〜１．５質量％、好ましくは０．４〜１．２質量％、より好ましくは０．７〜１．１質量％である。
【０１６８】
なお、核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、別途界面活性剤を添加することなく、当該酵素溶液由来の界面活性剤を、上記界面活性剤として用いることもできる。また、酵素溶液に含まれている界面活性剤に加えて、同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
【０１６９】
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、及び炭酸マグネシウムが挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度は、例えば、通常１〜１０ｍＭ、好ましくは２〜６ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭである。
【０１７０】
有機酸塩の有機酸としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、及び酪酸からなる群から選択される少なくとも１種の有機酸を挙げることができる。また、リン酸塩のリン酸として、好適にはピロリン酸を挙げることができる。これらの有機酸及びリン酸の塩としては、好適には、ナトリウム塩及びカリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。これらの有機酸塩またはリン酸塩は、それぞれ１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。被検試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度は、例えば、通常合計量で０．１〜２０ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭである（特許第4127847号、WO2007/094077参照）。
【０１７１】
被検試料中の細胞から核酸を抽出する場合、抽出方法は、抽出された核酸が核酸増幅における鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物の核酸抽出法に従って行うことができる。核酸の抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載されている。この場合、抽出した核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を鋳型として、通常の方法によりターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。
【０１７２】
被検試料中の細胞から核酸の抽出を行わない場合、前述する工程ｂ）で得られた被験試料を材料として、核酸増幅阻害作用抑制剤、及び必要に応じて他の各成分の存在下で、細胞内に存在する核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。
【０１７３】
核酸増幅法は、高温、例えば９０〜９５℃、好ましくは９３〜９５℃、より好ましくは９４〜９５℃における核酸の熱変性のステップを含むことが好ましい。
【０１７４】
核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification：新規遺伝子増幅法（LAMP法）の原理と応用 、納富継宣、長谷哲、BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：Edward L. Chan, et al.,Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）、ＴＭＡ法（Transcription-Mediated-Amplification：Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855 (2001)）、ＴＲＣ法（Transcription-Reverse Transcription-Concerted method：Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4248-4292 (2004)）、ＨＣ法（Hybrid Capture：Nazarenko I., Kobayashi L. et al., J. Virol. Methods, vol.154: p.76-81, 2008）、ＳＭＡＰ法（Smart Amplification Process、Smart Amp法；Mitani Y., et al., Nature Methods, vol.4, No.3, p.257-262 (2007)）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：国際公開第00/56877号パンフレット）、マイクロアレイ法（Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p.1620-1627, 2008）等がそれぞれ例示される。なお、本発明においては、ＰＣＲ法を利用することが特に好ましいが、これに制限されない。
【０１７５】
本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのうち、プライマーを用いた核酸増幅法により増幅され得る塩基配列領域である。検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料中に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な塩基配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、２以上であってもよい。
【０１７６】
検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の核酸に対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生細胞量と、多数種の微生物の生細胞量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとしては、通常５０〜５０００塩基、又は５０〜３０００塩基が挙げられる。本発明の方法では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば４００塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び損傷細胞との識別が可能である。
【０１７７】
核酸の増幅に用いるプライマーは、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されず、各種核酸増幅法の原理に基づいて、適宜設定することができる。
【０１７８】
好ましいターゲット領域の例は、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、及び病原遺伝子等の各種特異遺伝子である。これらの遺伝子の一つ又はその一部をターゲットとしてもよく、２又はそれ以上の遺伝子にまたがる領域をターゲットとしてもよい。例えば、配列番号１及び２に示すプライマーセットを用いることにより、大腸菌（E.coli）に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅することができる。また、市販されている１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマーを用いてもよい。
【０１７９】
また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のenterotoxin（エンテロトキシン）遺伝子やinvasion（ｉｎｖＡ）遺伝子、病原性大腸菌Ｏ−１５７、Ｏ−２６、Ｏ−１１１等のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属又はクロノバクター属細菌のouter-membrane-proteinA（ｏｍｐＡ）遺伝子（クロノバクター・サカザキ菌）及びmacromolecular synthesis（ＭＭＳ）オペロン（クロノバクター・サカザキ菌）、レジオネラ属細菌のmacrophage-invasion protein（ｍｉｐ）遺伝子、腸炎ビブリオ細菌の耐熱性溶血毒遺伝子、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子、赤痢菌及び腸管侵入性大腸菌のｉｐａ遺伝子（invasion plasmid antigen gene）や、ｉｎｖＥ遺伝子（invasion gene）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
【０１８０】
また、エンベロープを有するインフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニン（Ｈタンパク質）遺伝子やノイラミニダーゼ（Ｎタンパク質）遺伝子、ノロウイルスに代表されるカリシウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、各種カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域等が挙げられる。食中毒ウイルスとしてノロウイルスの他、ロタウイルス、アデノウイルスもあり、対象遺伝子はノロウイルス同様、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域が標的領域となる。
【０１８１】
複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生細胞を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生細胞を検出することができる。
【０１８２】
核酸増幅反応の条件は、各核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、ＩＣＡＮ法、又はマイクロアレイ法等）の原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【０１８３】
（１−４）工程ｄ）：増幅産物の解析
工程ｄ）は、上記工程ｃ）の核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する工程である。当該増幅産物の解析工程は、上記工程ｃ）で採用する核酸増幅法に応じて、工程ｃ）に続いて行われるか、又は、工程ｃ）と同時に行われる。例えば、リアルタイムＰＣＲの場合は、工程ｄ）は工程ｃ）と同時に行うことができる。
【０１８４】
解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。尚、核酸増幅法にＰＣＲ法を用いた場合は、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）を利用することが可能である。
【０１８５】
電気泳動法によれば、核酸増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。
【０１８６】
リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１〜１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出し、そのＳＤ値に１０を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
【０１８７】
また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
【０１８８】
上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
【０１８９】
本発明の方法によって生細胞を検出する場合、核酸増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生細胞の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各工程を行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量又はＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡを標準試料として用いることもできる。
【０１９０】
（２）生細胞検出用キット
本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記からなる群から選択される少なくとも１つを含有する：  １）プロテアーゼ、
２）ｐＨ調整剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、及び検出対象の微生物が資化する物質からなる群から選択される少なくとも１種、
３）白金錯体、白金錯体を生成する白金化合物、パラジウム錯体、パラジウム錯体を生成するパラジウム化合物、イリジウム錯体、及びイリジウム錯体を生成するイリジウム化合物からなる群から選択される少なくとも１種、
４）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、並びに
５）増幅産物を検出するためのプローブ。
【０１９１】
本発明のキットは、前述する本発明の検出方法を実施するために好適に用いることができる。上記各成分については前記（１）で説明した通りであり、当該（２）において前記（１）の記載がそのまま援用される。
【０１９２】
本発明のキットは、好ましい態様では、さらに核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤（核酸増幅阻害作用抑制剤）、マグネシウム塩、有機酸塩及びリン酸塩のいずれか少なくとも１種、又はこれらの２種以上を含んでいてもよい。より好ましい態様では、核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩及び有機酸塩、または核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩、及びリン酸塩を含んでいてもよい。更に、核酸伸長酵素を、通常のＰＣＲもしくは通常のリアルタイムＰＣＲ時に使用する濃度の２倍〜１０倍濃度を含んだ方が、より好ましい。また、本発明のキットは、さらに界面活性剤を含んでいてもよい。
【０１９３】
プロテアーゼ、金属錯体、並びに必要に応じて、核酸増幅阻害作用抑制剤、マグネシウム塩、有機酸塩、リン酸塩、及び界面活性剤は、これらの成分を全て含む単一の組成物であってもよいし、また各成分を任意に組合わせて含む複数の溶液又は組成物であってもよい。
【０１９４】
前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、ＩＣＡＮ法、又はマイクロアレイ法であることが好ましい。なお、上記キットにおいて、架橋剤や培地は、本発明の方法で説明したものと同様である。
【０１９５】
また、核酸増幅阻害作用抑制剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２−マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチーム、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素から選択されるいずれか一種又は複数種を例示することができる。
【０１９６】
また、マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。
【０１９７】
また、有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
【０１９８】
本発明のキットは、さらに、希釈液、金属錯体による反応用の反応液、核酸増幅用の酵素及び反応液、及び／又は本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
【実施例】
【０１９９】
以下、試験例及び実施例等により本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではなく、本発明の範囲内で自由に変更することができる。なお、以下、特に言及がない限り、百分率（％）は質量％を意味する。
【０２００】
試験例１
１．試験材料及びその調製
（1）殺菌乳
殺菌乳として、市販の殺菌牛乳（蛋白質含量約3.3 g/100 g、脂質含量3.8 g/100 g、水分87.4 g/100 g）を使用した。当該殺菌乳中に含まれる大腸菌（E. coli）の生細胞数は、検出限界以下（<1 cfu/2.22 ml）であり、また同菌死細胞数は102cells/mlレベルであった。なお、牛乳に含まれる蛋白質は、一般にホエイプロテイン（乳清蛋白質）、及びカゼインであり、ホエイプロテインにはβ-ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリン等が含まれることが知られている。
【０２０１】
（2）生細胞・殺菌乳けん濁液
E. coli JCM1649株を生理食塩水に懸濁した生細胞けん濁液（1.8×109 cfu/ml）を、さらに殺菌乳にて10倍〜106倍希釈したものを「生細胞・殺菌乳けん濁液」とした。
【０２０２】
（3）死細胞・殺菌乳けん濁液
E. coli JCM1649株を生理食塩水に懸濁した生細胞けん濁液（1.8×109 cfu/ml）を沸騰した水浴中で3分間加熱し、その後急冷して調製した死細胞けん濁液（1.8×109  cells/ml）を、殺菌乳にて10倍希釈したものを「死細胞・殺菌乳けん濁液」とした。
【０２０３】
（4）生細胞接種乳
（2）にて調製した生細胞・殺菌乳けん濁液10 μlを殺菌乳14 mlに接種し、1.8×106 cfu/14 ml〜1.8×101 cfu/14 ml（1.3×105 cfu/ml〜1.3×100 cfu/ml）の生細胞接種乳を調製した。
【０２０４】
（5）死細胞接種乳
（3）にて調製した死細胞・殺菌乳けん濁液10 μlを殺菌乳14 mlに接種し、1.8×106  cells/14  ml（1.3×105 cells/ml）死細胞接種乳を調製した。
【０２０５】
（6）酵素
Savinase（Sigma）：エンド型ペプチダーゼ（セリンプロテアーゼ）、Bacillus sp.由来
ペプチダーゼR（天野エンザイム）：エンド型／ エキソ型ペプチダーゼ、Rhizopus oryzae由来、至適ｐＨ7.0、至適温度35-40℃。
【０２０６】
（7）溶媒など
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）：
生理食塩水：0.9 (w/v)％ 塩化ナトリウム水溶液(約150 mM NaCl水溶液, 浸透圧300 mOsm)、pH 7.0
LB broth（栄研化学）：1 (w/v)％トリプトン、0.5 (w/v)％酵母エキス、1(w/v)％ 塩化ナトリウム
BHI broth（栄研化学）：ブレインハートインフュージョン培地
【０２０７】
（8）白金錯体
Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)(Sigma、分子量1244.22) 17.48 mg（14.05 μmol）を、3511.8 μlのDMSOに溶解して4mM溶液を調製した。
【０２０８】
（9）パラジウム錯体
bis(benzonitrile)dichloropalladium (II) 7.18 mg (18.72 μmol)を、1871.7 μlのDMSOに溶解して50 mM溶液を調製した。その後、生理食塩水にて希釈し2.5 mM溶液とした。
【０２０９】
２．試験方法
２−１）酵素処理
上記１（4）で調製した生細胞接種乳（1.3×105cfu/ml〜1.3×100cfu/ml）、（5）で調製した死細胞接種乳（1.3×105 cells/ml）、及びE.coli未接種の14 ml殺菌乳（未接種乳）をそれぞれ冷却遠心(4℃、2,900 × G、10分)し、デカンテーションにより上清を除去した。次いで、得られた残渣（乳ペレット）に、表１に示す成分を含有する各溶液（以下、これを「酵素含有水溶液」と称する）を加え、よく攪拌した後、さらに37℃のインキュベーター内にて10分間攪拌した（intelli-mixer PM-2M［ELMI Ltd.］のF6仕様）。
【０２１０】
【表１】
0006537894.tif 000004
【０２１１】
その後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。なお、対照例１に関しては、別途10 ml PBSにて２回、同様の処理を行った（合計３回処理）。
【０２１２】
２−２）金属錯体処理
２−１）で調製した残渣（ペレット）を滅菌水970 μlにけん濁し、これに4 mM 白金錯体溶液（Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)溶液）20 μl及び2.5 mM パラジウム錯体（bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)）10 μlを添加し、37℃のインキュベーター内にて25分間攪拌した（intelli-mixer PM-2MのF7仕様）。次いで、これに滅菌水10 mlを加え、よく攪拌後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２１３】
次いで、得られた残渣（ペレット）を滅菌水160 μlにけん濁した後、200 μl 容量のABI製100-μlPCRチューブに移し、冷却遠心(4℃、3,000 × G、7分)し、上清を除去した。さらに、これに滅菌水150 μlを添加しけん濁した後、ピペッテイングし、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、再度上清を除去した。斯くして調製した残渣（ペレット）（細胞けん濁液5 μl相当）をPCR増幅用試料とし、下記のダイレクト・リアルタイムPCR（以下、「DqPCR」とも称する）に供した。
【０２１４】
２−３）ダイレクト・リアルタイムPCR（DqPCR）
表２に記載するDqPCR用マスターミックスを用いてDqPCR（50 cycles）を２回実施した。陰性コントロールには滅菌水5 μlを用い、非特異反応及び外来性DNAのケミカルコンタミネーションがないことを確認した。
なお、DqPCR用マスターミックスは、細胞から核酸を抽出することなく、リアルタイムPCRを行うための試薬混合液である。DqPCR用マスターミックス中のcDBC（濃縮ダイレクトバッファーコンポーネント）は、DqPCRを効率よく行うために添加した、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤混合物の濃縮液である。その組成を表３に示す。
【０２１５】
【表２】
0006537894.tif 000005
【０２１６】
【表３】
0006537894.tif 000006
【０２１７】
PCR増幅には、PCR増幅用プライマーとして、腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用フォワードプライマー（ENT-16S forward primer）、及び腸内細菌科菌群特異的16S rRNA遺伝子検出用リバースプライマー（ENT-16S reverse primer）を使用した。なお、両プライマーはニッポンジーンに製造委託した。これらのプライマー対で増幅されるrRNA遺伝子の断片長は424 bpであった。また、検出用プローブとして、腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）ENT-16S TaqMan probeを用いた。この検出プローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光物質56-FAM、中央部にZEN、３’末端に31ABkFQという消光色素（クエンチャー）を有している。プローブはIntegrated DNA Technologies社に委託製造した。なお、腸内細菌科菌群特異的16S rRNA遺伝子検出用プライマーに関する塩基配列情報は、Nakano, S. et al., J.Food Prot. 66:1798-1804, 2003から入手し、ENT-16S TaqMan probeの塩基配列は、各腸内細菌科菌群の16S rRNA遺伝子情報に基づいて、the GenBank database（http://www.ebi.ac.uk/genbank/）より腸内細菌科菌群内で相補的領域を選択した。
【０２１８】
プライマー及びプローブの塩基配列を下記表４に示す。
【表４】
0006537894.tif 000007
【０２１９】
リアルタイムPCR装置を用いて、下記のPCRサーマルサイクル条件により、リアルタイムPCRを２回実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（50サイクル）。
【０２２０】
３．試験結果
試験結果を表５に示す。
【０２２１】
【表５】
0006537894.tif 000008
【０２２２】
４．考察
表５に示すように、上記酵素処理工程（上記2-1）工程）で生細胞接種乳及び死細胞接種乳のペレットを溶媒（PBS）だけで処理した場合は、生細胞及び死細胞のいずれも検出できなかった（対照例１）。また当該ペレットを溶媒（PBS）で３回繰り返し処理した場合も同じで結果であり、処理回数に依存しないことが確認された。
【０２２３】
一方、溶媒（PBS）にSavinase（エンド型ペプチダーゼ）を配合した酵素含有水溶液で同ペレットを処理すると、生細胞接種乳において生細胞のみが選択的に検出できるようになった（実施例１）。また、Savinase（エンド型ペプチダーゼ）にペプチダーゼR（エンド型／エキソ型ペプチダーゼ）を組み合わせて配合した酵素含有水溶液で同ペレットを洗浄することで、生細胞の検出限界が10 cfu/mlユニットオーダー低下すること、つまり生細胞の検出感度が1.3×101 cfu/mlレベルまで上昇することが確認された（実施例２）。さらに、これらのプロテアーゼ（Savinase、ペプチダーゼR）に単糖または二糖といった糖類を併用した酵素含有水溶液を用いた場合でも、同様に生細胞のみを選択的に検出できることが確認された（実施例３〜１３）。また糖類として、特にグルコースまたはラクトースを用いることで、生細胞の検出限界がさらに10 cfu/mlユニットオーダー低下すること、つまり生細胞の検出感度が1.3×100 cfu/mlレベルまで上昇し、非常に高い感度で生細胞を死細胞と識別して検出できることが確認された（実施例３〜５及び８〜１０）。またこの結果から、酵素含有水溶液中のグルコースまたはラクトースの好適な濃度は０.１〜１.５質量％の範囲、より好ましくは０.１〜１質量％の範囲であると考えられる。なお、グルコース及びラクトースは、大腸菌が資化できる糖類である。このことから、生細胞を高感度に検出するためには、酵素含有水溶液に配合する糖類として、測定対象とする生細胞が資化しうる糖類を用いることが好ましいと考えられる。
【０２２４】
また溶媒として、PBSに代えて生理食塩水を用いた場合も、同様に高い感度で生細胞を死細胞と識別して検出できることが確認された（実施例１１〜１３）。また、結果は示さないものの、酵素含有水溶液に代えて生理食塩水を使用した場合も、非常に高い感度で生細胞を死細胞と識別して検出することができた。
【０２２５】
これに対して、酵素含有水溶液として、糖類に代えて、溶媒にプロテアーゼとともにデキストリン（多糖類）を含む溶液を用いた場合は、死細胞が検出され、生細胞を選択的に検出することができなかった（比較例１）。また、酵素含有水溶液として、糖類に代えて、溶媒にプロテアーゼとともにBSA（蛋白質）を含む溶液を用いた場合は、死細胞だけでなく生細胞も検出することができなかった（比較例２及び３）。さらに、酵素含有水溶液として、培地として使用されるLBブロスまたはBHIブロス (いずれも栄研化学)を使用した場合も、死細胞だけでなく生細胞も検出することができなかった（比較例４及び５）。LBブロスは０.５質量％程度のラクトースを含有し、またBHIブロスは０.２質量％程度のグルコースを含有する。この結果から、酵素含有水溶液には、溶媒にプロテアーゼとともに、微生物が資化し得る糖類を単独（但し、糖類同士の併用は可）で配合する必要があると考えられる。なお、溶媒として滅菌水を使用した場合も、死細胞だけでなく生細胞も検出することができなかった（比較例６）。しかし、この場合は、他の比較例とは異なり、洗浄後のペレットからガラスビーズ処理によりDNAを抽出してリアルタイムPCRを行った場合も死細胞及び生細胞は検出できなかったことから、滅菌水（＋プロテアーゼ）による処理により、浸透圧の影響で生細胞及び死細胞から染色体DNAが細胞外に流出している可能性が示唆された。このことから、微生物の酵素処理に使用する酵素含有水溶液は、微生物の細胞膜を損傷しない程度の浸透圧を有している必要がある（好ましくは等張液）。
【０２２６】
試験例２
１．試験材料及びその調製
（1）生細胞・殺菌乳けん濁液
E. coli JCM1649株を生理食塩水に懸濁した生細胞けん濁液（1.8×109 cfu/ml）を、さらに殺菌乳にて10倍希釈したものを「生細胞・殺菌乳けん濁液」（1.8×108 cfu/ml）とした。なお、殺菌乳として、試験例１と同様に、大腸菌（E. coli）の生細胞数が検出限界以下（<1 cfu/2.22 ml）で、同菌死細胞数が102cells/mlレベルの市販の殺菌牛乳を使用した（以下、同じ）。
【０２２７】
（2）生細胞接種乳
（1）にて調製した生細胞・殺菌乳けん濁液10 μlを殺菌乳14 mlに接種し、1.8×106 cfu/14 ml（1.3×105 cfu/ml）の生細胞接種乳を調製した。
【０２２８】
（3）酵素（表７参照）
Proteinase K（Sigma）：エンド型ペプチダーゼ（セリンプロテアーゼ）、Tritirachium album由来、至適ｐＨ7.5-9.0、至適温度37℃、
Savinase（Sigma）：エンド型ペプチダーゼ（セリンプロテアーゼ）、Bacillus sp.由来
プロテアーゼP「アマノ」3SD（天野エンザイム）：エンド型／エキソ型ペプチダーゼ、Aspergillus melleus由来、至適ｐＨ7.0-8.0、至適温度40℃、
ペプチダーゼR（天野エンザイム）：エンド型／エキソ型ペプチダーゼ、Rhizopus oryzae由来、至適ｐＨ7.0、至適温度35-40℃
【０２２９】
（4）溶媒
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）：
【０２３０】
（5）白金錯体
Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II) 17.48 mg（14.05 μmol）を、3511.8 μlのDMSOに溶解して4 mM溶液を調製した。
【０２３１】
（6）パラジウム錯体
bis(benzonitrile)dichloropalladium (II) 7.18 mg (18.72 μmol)を、1871.7 μlのDMSOに溶解して50 mM溶液を調製した。その後、生理食塩水にて希釈し2.5 mM溶液とした。
【０２３２】
２．試験方法
２−１）酵素処理
上記１（2）で調製した生細胞接種乳（1.3×105cfu/ml）、及びコントロールとしてE.coli未接種乳（殺菌乳）を冷却遠心し(4℃、2,900 × G、10分)、デカンテーションにより上清を除去した。
【０２３３】
次いで、得られた残渣（乳ペレット）に、表６に示す酵素含有水溶液（酵素含有PBS溶液10ml）を加え、よく攪拌した後、さらに37℃のインキュベーター内にて10分間攪拌した（intelli-mixer PM-2M［ELMI Ltd.］のF6仕様）。その後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２３４】
２−２）金属錯体処理
２−１）で調製した残渣（ペレット）の量を目視で確認した後（下記表６参照）、それを滅菌水970 μlにけん濁し、これに4 mM 白金錯体溶液（Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)溶液）20 μl、及び2.5 mM パラジウム錯体溶液（bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)溶液）10 μlを添加し、37℃のインキュベーター内にて25分間攪拌した（intelli-mixer PM-2MのF7仕様）。次いで、これに滅菌水10 mlを加え、よく攪拌後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２３５】
次いで、得られた残渣（ペレット）を滅菌水160 μμlにけん濁した後、200 μl容量のABI製100 μl PCRチューブに移し、冷却遠心(4℃、3,000 × G、7分)し、上清を除去した。さらに、これに滅菌水150 μlを添加しけん濁した後、ピペッテイングし、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、再度上清を除去した。斯くして調製した残渣（ペレット）（細胞けん濁液5 μl相当）をPCR増幅用試料とし、下記のダイレクト・リアルタイムPCR（DqPCR）に供した。
【０２３６】
２−３）DqPCR
DqPCRには、試験例１と同様に表２に記載するDqPCR用マスターミックスを用いて、DqPCR増幅（50 cycles）を２回実施した。陰性コントロールには滅菌水5 μlを用い、非特異反応及び外来性DNAのケミカルコンタミネーションがないことを確認した。また、プライマー及びプローブも、試験例１と同じものを使用した。
【０２３７】
リアルタイムPCR装置を用いて、下記のPCRサーマルサイクル条件により、リアルタイムPCRを２回実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（50サイクル）。
【０２３８】
３．試験結果
試験結果を表６に示す。
【０２３９】
【表６】
0006537894.tif 000009
【０２４０】
また、ここで使用した酵素のスペックの一覧を、試験例１で使用したペプチダーゼR、及び後述する試験例３で使用するプロテアックスとともに、表７に示す。
【０２４１】
【表７】
0006537894.tif 000010
【０２４２】
表６に示すように、PBS 10 mlにエンド型ペプチターゼであるProteinase KまたはSavinaseを0.6 Unitsの割合で含む酵素含有水溶液を用いてペレットを処理することにより、酵素処理後のペレット量を有意に減少させることができ、しかもその後の金属錯体（白金錯体・パラジウム錯体併用）処理、及びDqPCRにより、接種したE. coliの生細胞を選択的に検出することができた（実施例１４−１５）。一方、PBS 10 mlにエンド型／エキソ型ペプチターゼであるプロテアーゼP「アマノ」3SDを0.6 Unitsの割合で含む酵素含有水溶液を用いてペレットを処理した場合は、酵素処理による有意なペレット量の低減は認められなかったが、その後の金属錯体（白金錯体・パラジウム錯体併用）処理、及びDqPCRにより、接種したE. coliの生細胞を選択的に検出することができた（実施例１６）。
【０２４３】
尚、コントロールとしてE. coli未接種乳（殺菌乳）に関しても、前記酵素を含むPBS 10 mlにて同様に酵素処理し、次いで金属錯体（白金錯体・パラジウム錯体併用）処理、及びDqPCRを行ったが、細胞（生細胞、死細胞）はいずれも検出できなかった。このことから、本発明の方法によると、殺菌乳中に存在しているEnterobacteriaceaeバクテリア（腸内細菌科菌群）の死細胞は検出されず、E. coliの生細胞のみを選択的に検出することができることがわかる。
【０２４４】
試験例３
１．試験材料及びその調製
（1）生細胞・殺菌乳けん濁液
E. coli JCM1649株を生理食塩水に懸濁した生細胞けん濁液（2.1×109 cfu/ml）を、さらに殺菌乳にて100倍希釈したものを「生細胞・殺菌乳けん濁液」（2.1×107 cfu/ml）とした。なお、殺菌乳として、試験例１と同様に、大腸菌（E. coli）の生細胞数が検出限界以下（<1 cfu/2.22 ml）で、同菌死細胞数が102cells/mlレベルの市販の殺菌牛乳を使用した（以下、同じ）。
【０２４５】
（2）生細胞接種乳
（1）にて調製した生細胞・殺菌乳けん濁液10 μlを殺菌乳14 mlに接種し、2.1×105 cfu/14 ml（1.5×104 cfu/ml）の生細胞接種乳を調製した。
【０２４６】
（3）酵素（表７参照）
Savinase（Sigma）：エンド型ペプチダーゼ（セリンプロテアーゼ）、Bacillus sp.由来、
プロテアーゼP「アマノ」3SD（天野エンザイム）：エンド型／エキソ型ペプチダーゼ、Aspergillus melleus由来、
ペプチダーゼR（天野エンザイム）：エンド型／エキソ型ペプチダーゼ、Rhizopus oryzae由来、
プロテアックス（天野エンザイム）：エンド型／エキソ型ペプチダーゼ、Aspergillus oryzae由来。
【０２４７】
（4）溶媒
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）：
【０２４８】
（5）白金錯体
Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II) 17.48 mg（14.05μmol）を、3511.8μlのDMSOに溶解して4mM溶液を調製した。
【０２４９】
（6）パラジウム錯体
bis(benzonitrile)dichloropalladium (II) 7.18 mg (18.72 μmol)を、1871.7 μlのDMSOに溶解して50 mM溶液を調製した。その後、生理食塩水にて希釈し2.5 mM溶液とした。
【０２５０】
２．試験方法
２−１）酵素処理
上記１（2）で調製した生細胞接種乳（1.5×104cfu/ml）、及びコントロールとしてE.coli未接種乳（殺菌乳）を冷却遠心し(4℃、2,900 × G、10分)、デカンテーションにより上清を除去した。
【０２５１】
次いで、得られた残渣（乳ペレット）に、表８（Ａ）〜（Ｃ）に示す酵素含有水溶液（酵素含有PBS溶液10 ml）を加え、よく攪拌した後、さらに37℃のインキュベーター内にて10分間攪拌した（intelli-mixer PM-2M［ELMI Ltd.］のF6仕様）。その後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２５２】
２−２）金属錯体処理
２−１）で調製した残渣（ペレット）を滅菌水970 μlにけん濁し、これに4 mM 白金錯体溶液（Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)溶液）20 μl、及び2.5 mM パラジウム錯体溶液（bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)溶液）10 μlを添加し、37℃のインキュベーター内にて25分間攪拌した（intelli-mixer PM-2MのF7仕様）。次いで、これに滅菌水10 mlを加え、よく攪拌後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２５３】
次いで、得られた残渣（ペレット）を滅菌水160 μlにけん濁した後、200 μl容量のABI製100 μl PCRチューブに移し、冷却遠心(4℃、3,000 × G、7分)し、上清を除去した。さらに、これに滅菌水150 μlを添加しけん濁した後、ピペッテイングし、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、再度上清を除去した。斯くして調製した残渣（ペレット）（細胞けん濁液5 μl相当）をPCR増幅用試料とし、下記のダイレクト・リアルタイムPCR（DqPCR）に供した。
【０２５４】
２−３）DqPCR
DqPCRには、試験例１と同様に表２に記載するDqPCR用マスターミックスを用いて、DqPCR増幅（50 cycles）を２回実施した。陰性コントロールには滅菌水5 μlを用い、非特異反応及び外来性DNAのケミカルコンタミネーションがないことを確認した。また、プライマー及びプローブも、試験例１と同じものを使用した。
【０２５５】
リアルタイムPCR装置を用いて、下記のPCRサーマルサイクル条件により、リアルタイムPCRを２回実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（50サイクル）。
【０２５６】
３．試験結果
試験結果を表８（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【０２５７】
【表８】
0006537894.tif 000011
【０２５８】
表８（Ａ）に示すように、酵素含有水溶液として、0.6 Units Savinase（エンド型ペプチダーゼ）単独、または0.6 Units Savinase及び2.5〜10 UnitsペプチダーゼR（エンド型／エキソ型ペプチダーゼ）を、10 mlPBS中に含む溶液（酵素含有PBS溶液）を用いることで、処理後のペレット量を有意に減少させることができ、且つ、金属錯体（白金錯体・パラジウム錯体併用）処理後のDqPCRにより測定したCt値は、生細胞接種乳（1.5×104cfu/ml）に関しては18.1±0.16〜23.1±0.35であった（陽性）。一方、E. coli未接種乳（殺菌乳）に関しては、上記と同じ酵素処理及び金属錯体処理をした後のDqPCRの測定値はND（検出限界以下、陰性）であった。
【０２５９】
表８（Ｂ）に示すように、酵素含有水溶液として、0.6 Units Savinase（エンド型ペプチダーゼ）単独、または0.6 Units Savinase（エンド型ペプチダーゼ）及び3〜24 UnitsのプロテアーゼP「アマノ」3SD（エンド型／エキソ型ペプチダーゼ）を、10 mlPBS中に含む溶液（酵素含有PBS溶液）を用いることで、処理後のペレット量を有意に減少させることができ、且つ、金属錯体処理後のDqPCRにより測定したCt値は、生細胞接種乳（1.5×104cfu/ml）に関しては21.1±0.27〜28.8±0.94であり、陽性を示した。一方、E. coli未接種乳（殺菌乳）に関しては、上記と同じ酵素処理及び金属錯体処理をした後のDqPCRの測定値はND（検出限界以下、陰性）であった。
【０２６０】
表８（Ｃ）に示すように、酵素含有水溶液として、0.6 Units Savinase（エンド型ペプチダーゼ）単独、または0.6 Units Savinase（エンド型ペプチダーゼ）及び2.5〜10 Unitsのプロテアックス（エンド型／エキソ型ペプチダーゼ）を、10 mlPBS中に含む溶液（酵素含有PBS溶液）を用いることで、処理後のペレット量を有意に減少させることができ、且つ、金属錯体処理後のDqPCRにより測定したCt値は、生細胞接種乳（1.5×104cfu/ml）に関しては21.1±0.46〜22.9±0.48であり、陽性を示した。一方、E. coli未接種乳（殺菌乳）に関しては、上記と同じ酵素処理及び金属錯体処理をした後のDqPCRの測定値はND（検出限界以下、陰性）であった。
【０２６１】
以上の結果から、ターゲット微生物が大腸菌である場合、酵素含有水溶液に配合する酵素として、エンド型ペプチダーゼ単独か、またはエンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの併用、好ましくはエンド型ペプチダーゼとエンド型／エキソ型ペプチダーゼとの併用、より好ましくはSavinaseとペプチダーゼRとの併用がよいことがわかった。つまり、被検試料（大腸菌含有乳試料）をDqPCRに供するに際して、金属錯体による処理に先立って、エンド型ペプチダーゼ単独、またはエンド型ペプチダーゼとエキソ型ペプチダーゼとの併用、好ましくはエンド型ペプチダーゼとエンド型／エキソ型ペプチダーゼとを併用して、等張、35-40℃、中性ｐＨ条件下、短時間（10分間）酵素処理することで、PCR増幅を妨げる物質が有意に除去され、DqPCRによる検出感度が上昇することが判明した。
【０２６２】
試験例４
試験例３において最も好ましい酵素の組み合わせ（サビナーゼ：SavinaseとペプチダーゼR：Peptidase R）を用いて、両酵素の併用比を検討した。
【０２６３】
実験は、生細胞接種乳として、殺菌乳14 ml 中にE. coli JCM1649株を1.8×103−1.8×10１ cfu/14ml（1.3×102−1.3×100 cfu/ml）の割合で含むものを用い、また死細胞接種乳として、殺菌乳14 ml 中にE. coli の死細胞を1.8×106 cells/14ml（1.3×10５ cells/ml）の割合で含むものを用い、さらにコントロールとしてE. coli未接種乳（殺菌乳）を用いる以外は、下記に記載するように、試験例３と同様の処理（酵素処理、金属錯体処理、DqPCR）を行った。
【０２６４】
１．試験方法
１−１）酵素処理
生細胞接種乳（1.3×102−1.3×100 cfu/ml）、死細胞接種乳（1.3×10５ cells/ml）及びコントロールとしてE.coli未接種乳（殺菌乳）を冷却遠心し(4℃、2,900 × G、10分)、デカンテーションにより上清を除去した。
【０２６５】
次いで、得られた残渣（乳ペレット）に、表９に示す酵素含有水溶液（酵素含有PBS溶液10 ml）を加え、よく攪拌した後、さらに37℃のインキュベーター内にて10分間攪拌した（intelli-mixer PM-2M［ELMI Ltd.］のF6仕様）。その後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２６６】
１−２）金属錯体処理
１−１）で調製した残渣（ペレット）を滅菌水970 μlにけん濁し、これに4 mM 白金錯体溶液（Tetrakis(triphenylphosphine)platinum(II)溶液）20 μl、及び2.5 mM パラジウム錯体溶液（bis(benzonitrile)dichloropalladium (II)溶液）10 μlを添加し、37℃のインキュベーター内にて25分間攪拌した（intelli-mixer PM-2MのF7仕様）。次いで、これに滅菌水10 mlを加え、よく攪拌後、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、上清を完全に除去した。
【０２６７】
次いで、得られた残渣（ペレット）を滅菌水160 μlにけん濁した後、200 μl容量のABI製100 μl PCRチューブに移し、冷却遠心(4℃、3,000 × G、7分)し、上清を除去した。さらに、これに滅菌水150 μlを添加しけん濁した後、ピペッテイングし、冷却遠心(4℃、2,900 × G、7分)し、再度上清を除去した。斯くして調製した残渣（ペレット）（細胞けん濁液5 μl相当）をPCR増幅用試料とし、下記のダイレクト・リアルタイムPCR（DqPCR）に供した。
【０２６８】
１−３）DqPCR
DqPCRには、試験例１と同様に表２に記載するDqPCR用マスターミックスを用いて、DqPCR増幅（50 cycles）を２回実施した。陰性コントロールには滅菌水5 μlを用い、非特異反応及び外来性DNAのケミカルコンタミネーションがないことを確認した。また、プライマー及びプローブも、試験例１と同じものを使用した。
【０２６９】
リアルタイムPCR装置を用いて、下記のPCRサーマルサイクル条件により、リアルタイムPCRを２回実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（50サイクル）。
【０２７０】
２．試験結果
試験結果を表９に示す。
【０２７１】
【表９】
0006537894.tif 000012
【０２７２】
表９に示すように、酵素含有水溶液として、0.01−0.15 Units Savinase（エンド型ペプチダーゼ）及び0.77 Units Peptidase R（エンド型／エキソ型ペプチダーゼ）を10 mlPBS中に含む溶液（酵素含有PBS溶液）を用いることで、金属錯体（白金錯体・パラジウム錯体併用）処理後のDqPCRにより、死細胞接種乳は陰性、生細胞接種乳（1.3×101−1.3ｘ102 cfu/ml）は陽性としてほぼ同様に判断された。特にSavinaseは0.05−0.15 Unitsの範囲で用いることで、E.coli生細胞の検出感度が上がり、E.coli生細胞を1.3×101 cfu/mlレベルで含む生細胞接種乳についても陽性として判断することができた。
【０２７３】
以上に示すように、酵素含有水溶液（0.07 Units Savinase + 0.77 Units Peptidase R含有PBS溶液）10 ml−金属錯体（80 μM Pt(PPh3)4 ＋25 μM (PhCN)2Cl2Pd併用）処理―ダイレクト・リアルタイムPCRにより、14mlの殺菌乳を検体とし、E. coliの生細胞を1.3×101 cfu/mlレベルで検出することが可能であることが確認された。この検出感度は、欧州及び米国の殺菌乳食品衛生試験で要求されている生細胞検出限界とほぼ同等もしくは若干高いものであり、上記試験をほぼクリアしていることが伺えた。これはすなわち、本発明の方法（酵素処理−金属錯体処理）を行うことによって、被検試料（好ましくは乳または乳製品）を前培養することなく、直接、当該迅速検査（DqPCR）に供することが可能となることを示唆している。
【配列表】
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