(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴポリフェノールを含有する、ＵＶＢによる真皮におけるＣｙｒ６１の発現を抑制または阻害することにより皮膚の皺および弛みの発生を軽減するための抑制剤。
【請求項２】
前記リンゴポリフェノールの含有量は少なくとも５μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システインリッチ蛋白質６１（以下、「Ｃｙｒ６１」と言う。）の発現抑制剤に関し、特に、波長２９０〜３２０ｎｍの紫外線によってヒトの皮膚にＣｙｒ６１が発現されるのを抑制または阻害することにより、皮膚の皺および弛みの発生を軽減するための抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
紫外線を浴びることがヒト皮膚の光老化の要因となることは知られている。紫外線の中でも人体に有害なものとしては、波長３２０〜４００ｎｍの紫外線（以下、「ＵＶＡ」と言う。）、波長２９０〜３２０ｎｍの紫外線（以下、「ＵＶＢ」と言う。）、波長２００〜２９０ｎｍの紫外線（以下、「ＵＶＣ」と言う。）がある。（なお、波長についての分類は、ＵＶＡ：３１５〜４００ｎｍ、ＵＶＢ：２８０〜３１５ｎｍ、ＵＶＣ：１００〜２８０ｎｍとするものもあるが、本発明では、それらを厳密に規定するものではない。）
【０００３】
このうち、ＵＶＣは、強い殺菌作用があり、生体に対する破壊性が最も強いが、物質による吸収が著しく、通常は大気を通過することができず、人体への影響はないと言える。一方、ＵＶＡおよびＵＶＢはオゾン層を通過して地表に到達する。地表に到達する紫外線の９９％を占めるＵＶＡは、皮膚の真皮層に浸透して、皮膚のハリを保っているコラーゲンとエラスチンの２つの繊維を壊す分解酵素であるコラゲナーゼを増やし、コラーゲン繊維を小さく切断すると共にエラスチンを変性し、それにより、皮膚は張りや弾力を失って弛み、襞、皺など（光老化）を生じている。これに加え、ＵＶＡは、皮膚の細胞を遺伝子レベルで傷つけ、皮膚の免疫力を低下させてしまう。これに対し、ＵＶＢは、ヒト皮膚に曝露されると、即時的な皮膚反応として炎症性の紅斑反応や浮腫のようなサンバーン反応を引き起こし、炎症後の皮膚では、活性化された色素細胞によりメラニンの産生を高めて色素沈着が生じるだけでなく、ＵＶＢを長期間浴びることは、皮膚の免疫機能を低下させて皮膚癌の発症原因となることが知られている。このため、光老化に焦点を当てた研究はＵＶＡについて行われてきたが、ＵＶＢについては、主に炎症や色素沈着、皮膚癌に焦点を当てた研究が盛んに進められており、皮膚の皺および弛みの発生に焦点を当てた研究は実質的になされていないのが実情である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】特定非営利活動法人アンチエイジングネットワークＨＰ「光老化  紫外線によるダメージ」http://www.anti-ageing.jp/cause/hikari/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、これまで皮膚の光老化防止を意図する際に主要な原因と考えられていなかったＵＶＢによる皮膚の影響を分析し、ＵＶＢによる光老化を引き起こす要因を解明することにより、皮膚の皺および弛みの発生を軽減できる抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による抑制剤は、コラーゲンの産生を抑制する因子であるＣｙｒ６１が、ヒト皮膚の真皮には到達しないＵＶＢによって、真皮に発現することに着目して発明されたものであり、リンゴポリフェノールを含有することにより、ＵＶＢによるＣｙｒ６１の発現を抑制または阻害し、それにより、皮膚の皺および弛みの発生を軽減する。
【０００７】
本発明による抑制剤はまた、リンゴポリフェノールを少なくとも５μｇ／ｍＬ含有することにより、ＵＶＢによるＣｙｒ６１の発現を確実に抑制または阻害し、それにより、皮膚の皺および弛みの発生を軽減する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による抑制剤は、ＵＶＢによるＣｙｒ６１の発現を抑制または阻害することにより、皮膚の真皮におけるコラーゲンの産生が抑制されるのを回避し、ＵＶＢによる皮膚の皺および弛みの発生を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のＣｙｒ６１発現試験を説明するためのフロー図である。
【図２】図２は、本発明の試験で得られた、ＵＶＢ照射によるＣｙｒ６１の発現状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔リンゴポリフェノールの製造〕
リンゴ未熟果を洗浄後、破砕・搾汁して果汁を得た。搾汁して得た果汁からペクチンなどの不溶性成分を酵素分解および／または濾過することにより除去した。この果汁をカラムに通液し、ポリフェノール成分をカラムに保持させ、糖類・有機酸類などを水洗浄によって除去した。こののち、アルコール水溶液を用いてカラムよりポリフェノール成分を溶出し、ポリフェノール画分を得た。このポリフェノール画分を減圧濃縮後、噴霧乾燥し、リンゴポリフェノール（ＡＰ）を得た。このリンゴポリフェノール（ＡＰ）を用いて以下の試験を行った。
【００１１】
〔Ｃｙｒ６１発現試験〕
本発明による抑制剤のＵＶＢ照射時におけるＣｙｒ６１抑制効果を調べるために、サンプルをそれぞれ作製して試験し、各サンプル内に含まれるＣｙｒ６１の発現量を調べた。
（１）サンプルＡＰ５（ＵＶＢ＋）
図１は、サンプルの作製およびＣｙｒ６１発現量の測定方法を示す図である。
ステップＡ：  不死化ヒト角化細胞株であるＨａＣａＴ細胞を３．５×１０6 cells／１００mm dishで培養した。
ステップＢ：  ２４時間培養後に、５μｇ／ｍＬのリンゴポリフェノール（ＡＰ）を含む５％血清入り培地（ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に置換してさらに培養した。
ステップＣ：  ２４時間培養後に、細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬのリンゴポリフェノール存在下、２５ｍＪ／ｃｍ2の強度で細胞にＵＶＢ照射を行った。
ステップＤ：  照射後ただちに、５μｇ／ｍＬのリンゴポリフェノールを含む５％血清入り培地に置換してさらに培養した。
ステップＥ：  ２４時間培養後に、培養上清を回収した。
ステップＦ：  この培養上清を用いて、あらかじめ４×１０5 cells／３５mm dishで播種して２４時間培養しておいた正常ヒト真皮繊維芽細胞であるＮＨＤＦ細胞を培養した。
ステップＧ：  ４８時間培養後に、この培養上清をサンプルとして、ウェスタンブロッティングを実施して、サンプル内に含まれるＣｙｒ６１の発現量を調べた。
（２）サンプルＡＰ５０（ＵＶＢ＋）
上述したサンプルＡＰ５のステップＢ、ＣおよびＤにおけるリンゴポリフェノールの含有量を５０μｇ／ｍＬにそれぞれ変更し、サンプルＡＰ５と同様にしてサンプルを作製し、サンプル内に含まれるＣｙｒ６１の発現量を調べた。
【００１２】
（３）サンプルＮｏｎｅ、ＡＰＭ、ＮＡＣ；（ＵＶＢ＋）
比較または参考のために、サンプルＡＰ５のステップＢ、ＣおよびＤにおけるリンゴポリフェノールの代わりに、
ａ）リンゴポリフェノールを用いない場合（サンプルＮｏｎｅ）
ｂ）抗老化成分として知られている、水溶性のビタミンＣ誘導体であるアスコルビン酸りん酸マグネシウム、１１５６μｇ／ｍＬを用いた場合（サンプルＡＰＭ） 
ｃ）抗酸化剤の試薬として知られるＮ−アセチル−Ｌ−システイン、８１６μｇ／ｍＬを用いた場合（サンプルＮＡＣ）
における各サンプルを同様に作製して試験し、各サンプル内に含まれるＣｙｒ６１の発現量を調べた。
【００１３】
（４）サンプルＡＰ５、ＡＰ５０、Ｎｏｎｅ、ＡＰＭ、ＮＡＣ；（ＵＶＢ−）
また、ＵＶＢ照射の有無による違いを確認するために、前述したサンプルＡＰ５のステップＣにおけるＵＶＢ照射を行わずに、サンプルＡＰ５、ＡＰ５０、Ｎｏｎｅ、ＡＰＭおよびＮＡＣを同様に作製して試験し、各サンプル内に含まれるＣｙｒ６１の発現量を調べた。
【００１４】
〔試験結果〕
上述の各発現試験によりサンプルに含まれたＣｙｒ６１の発現量を図２に示す。なお、図中、「ＵＶＢ＋」で括られたグループのサンプルが、ＵＶＢ照射が行われたサンプルであり、「ＵＶＢ−」で括られたグループのサンプルは、ＵＶＢ照射が行われなかったサンプルである。両グループの各対応するサンプルを比較すると、コラーゲン産生抑制因子であるＣｙｒ６１の発現量は、いずれのサンプル間においても、グループＵＶＢ＋におけるＣｙｒ６１の発現量がグループＵＶＢ−におけるよりも大きくなっていることが確認された。
【００１５】
このことから、ヒト皮膚の真皮に到達することのないＵＶＢが表皮に曝露されると、表皮からシグナル分子が発せられ、そのシグナル分子が真皮に届くことによってＣｙｒ６１が発現されると考えるのが妥当である。
【００１６】
一方、ＵＶＢ照射したときの本発明のサンプルＡＰ５およびサンプルＡＰ５０におけるＣｙｒ６１発現量は、リンゴポリフェノールを用いないサンプル（サンプルＮｏｎｅ）のＣｙｒ６１発現量の約６０％（サンプルＡＰ５）、約２０％（サンプルＡＰ５０）に抑制されることが判明した。
【００１７】
このことから、少なくとも５μｇ／ｍＬのリンゴポリフェノールを含むことにより、コラーゲンの産生を抑制する因子であるＣｙｒ６１の発現を抑制または阻害できることを意味している。
【００１８】
〔コラーゲン遺伝子発現試験〕
本発明のＣｙｒ６１抑制剤による効果を確認するために、本発明のサンプルＡＰ５およびＡＰ５０、並びに比較用サンプルＮｏｎｅについて、ＵＶＢを照射しないとき（ＵＶＢ−）と、照射したとき（ＵＶＢ＋）におけるコラーゲン遺伝子の発現量を測定した。
【００１９】
（１）サンプルＡＰ５（ＵＶＢ＋）
Ｃｙｒ６１発現試験で述べたサンプルＡＰ５のステップＡ〜Ｆを行った。次いで、
ステップＧ´：  ２４時間培養後に、培養したＮＨＤＦ細胞からｍＲＮＡを回収した。
ステップＨ´：  回収したｍＲＮＡを逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡを鋳型として、内部標準遺伝子であるＧＡＰＤＨおよびＩ型コラーゲンの構成成分の一つ、α１鎖をコードする遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量的に解析した。
（２）サンプルＡＰ５０（ＵＶＢ＋）
上記のステップＢ、ＣおよびＤにおけるリンゴポリフェノールの含有量を５０μｇ／ｍＬにそれぞれ変更して、サンプルＡＰ５と同様にサンプルを作製し、ＧＡＰＤＨおよびＣＯＬ１Ａ１の遺伝子発現量を定量的に解析した。
【００２０】
（３）サンプルＮｏｎｅ（ＵＶＢ＋）
上記のステップＢ、ＣおよびＤにおけるリンゴポリフェノールを用いずに、サンプルＡＰ５と同様にサンプルを作製し、ＧＡＰＤＨおよびＣＯＬ１Ａ１の遺伝子発現量を定量的に解析した。
【００２１】
（４）サンプルＮｏｎｅ（ＵＶＢ−）
上記のステップＢ、ＣおよびＤにおけるリンゴポリフェノールを用いずに、かつ、ステップＣにおけるＵＶＢ照射を行わずに、サンプルＡＰ５と同様にサンプルを作製し、ＧＡＰＤＨおよびＣＯＬ１Ａ１の遺伝子発現量を定量的に解析した。
【００２２】
〔試験結果〕
この結果を表１に示す。
【表１】
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【００２３】
表１から明らかなように、本発明のリンゴポリフェノールを含むサンプルＡＰ５およびサンプルＡＰ５０におけるコラーゲン遺伝子の発現量は、ＵＶＢ照射しないときのリンゴポリフェノールを含まないサンプルＮｏｎｅの９０％前後を確保しており、また、ＵＶＢ照射したときのサンプルＮｏｎｅの１．６倍程度多く発現している。このことから、本発明のリンゴポリフェノールを含むサンプルＡＰ５およびサンプルＡＰ５０が、Ｃｙｒ６１によるコラーゲンの産生抑制を抑制または阻害していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明のＣｙｒ６１発現抑制剤は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、ファンデーション、日焼け止め等の化粧品、皮膚外用剤、医薬品等のような、紫外線ケアに用いられる製品に含有させることにより、ＵＶＢによる皮膚の皺および弛みの発生を軽減することができる。
【図１】
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【図２】
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