(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
決明子乳酸菌発酵物を便秘改善又は予防用の有効成分として含有する便秘改善又は予防用健康機能食品であって、前記決明子乳酸菌発酵物は、決明子の、水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒による抽出物の乳酸菌発酵物であり、該乳酸菌は、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］である、該健康機能食品。
【請求項２】
前記健康機能食品は、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸状、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ゼリー又はバー状の製剤であることを特徴とする、請求項１に記載の便秘改善又は予防用健康機能食品。
【請求項３】
決明子乳酸菌発酵物を便秘治療又は予防用の有効成分として含有する便秘治療又は予防用医薬組成物であって、前記決明子乳酸菌発酵物は、決明子の、水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒による抽出物の乳酸菌発酵物であり、該乳酸菌は、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］である、該医薬組成物。
【請求項４】
決明子抽出物を製造する段階； 
前記決明子抽出物に乳酸菌を接種して発酵させる段階；
前記発酵による決明子乳酸菌発酵物を得る段階；及び
前記決明子乳酸菌発酵物を便秘改善、治療又は予防用の有効成分として便秘改善、治療又は予防用組成物に含有せしめる段階；を含む便秘改善、治療又は予防用組成物の製造方法であって、
前記決明子抽出物は、決明子又はその粉砕物を水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒で抽出したものであり、
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］である、該製造方法。
【請求項５】
前記発酵させる段階において、前記抽出物に、前記乳酸菌を１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ〜１×１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように接種し、３０℃〜４５℃で１日〜７日間発酵させる、請求項４に記載の便秘改善、治療又は予防用組成物の製造方法。
【請求項６】
前記抽出する段階は、決明子粉砕物１重量部に対して水１０重量部〜５０重量部を混合した後、静置又は撹拌しながら０．５時間〜２４時間抽出することにより行うことを特徴とする、請求項４又は５に記載の便秘改善、治療又は予防用組成物の製造方法。
【請求項７】
前記抽出する段階は、決明子又はその粉砕物１重量部に対して２０重量％〜８０重量％のエタノール水溶液５重量部〜３０重量部を混合して０．５時間〜２４時間抽出した後、前記抽出液を乾燥することによってエタノールを除去することにより行うことを特徴とする、請求項４又は５に記載の便秘改善、治療又は予防用組成物の製造方法。
【請求項８】
前記発酵させる段階の前記決明子抽出物に乳酸菌栄養源をさらに添加することを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１つに記載の便秘改善、治療又は予防用組成物の製造方法。
【請求項９】
決明子を発酵させることによって便秘改善又は予防活性を増進させるラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、決明子乳酸菌発酵物を有効成分とする便秘改善又は予防用健康機能食品、便秘治療又は予防用医薬組成物に関する。また、便の水分含量及び重量を増加させる決明子乳酸菌発酵物の製造方法に関する。また、本発明は、それに用いられる菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
便秘（Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ）は、医学的に１週間に３回以下排便したり、又は１日の排便量が３０ｇ以下である状態と定義される。正常な状態では、食物を摂取してから２４時間以内に大便が排泄されるが、便秘がある人は、不定期な排便に悩まされていたり、排便が数日に１回であったり、一日の排便量が少ないので、結果的に摂取した食物の腸内の滞留時間が長くなる。
【０００３】
便秘の原因としては、朝食を取らないことによる大腸の蠕動運動の低下、食生活の西欧化による食餌性繊維の不足、運動不足による基礎体力及び腹筋力の低下、ダイエット、過多な薬物服用による薬物中毒などと様々な原因がある。
【０００４】
昔から万病の根源とまで称されている便秘は、食欲不振や、継続的な腹部膨満だけなく、排泄できなかった便の毒素が腸を通じて血液に吸収されることによって皮膚老化を促進させ、頭痛、にきび、皮膚発疹などをもたらし、便秘がひどくなると、排便時の裂肛や痔核の脱出などの痔疾の原因となり、便中の毒素によって大膓癌まで発生する。また、便秘が持続されると、体外に排出されなければならないコレステロールや脂肪が体内に残り、動脈硬化又は胆石症を誘発し得る。さらに、高血圧と心臓肥大を起こし、これが心臓病に悪化され得る。その他にも、便秘は、脳卒中、免疫欠乏、視力障害、精神疾患（鬱病)などと多様で且つ深刻な２次疾患の原因となるので、積極的な予防と治療が必要な重要な疾患である。
【０００５】
そこで、現在まで便秘治療又は改善のための多様な医薬品と健康機能食品が販売されているが、医薬品の場合、ほとんどがセンナ、大黄などのアントラキノン誘導体成分が含有された刺激性薬剤を用いているため、腹痛及び下痢などの副作用と共に、妊娠中の服用や持続的な服用に問題が発生する。また、健康機能食品の場合も、科学的にその効果が十分立証されていないものがほとんどであるので、便秘改善の根本的な問題を解決しておらず、製品の信頼性に乏しいのが実情である。
【０００６】
決明子は、豆科に属する１年草本であり、草決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ  Ｌ．）と決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｔｏｒａ  Ｌ．）の二つの品種が知られている。決明子は、韓国で「ｃｈｏ−ｇｙｅｏｌ−ｍｙｅｏｎｇ」又は「ｇｉｎ−ｇａｎｇ−ｎａｍ−ｃｈａ」とも言う。草決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ  Ｌ．）の原産地は中央アメリカで、日本など各地で栽培される。他の決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｔｏｒａ  Ｌ．）は熱帯アジア原産であり、中国、韓国など各地で栽培される。
【０００７】
実の形状は、不規則な六角柱状であり、一端が尖っている。外面の色は黄褐色又は黒褐色であり、長さが３ｍｍ〜６ｍｍ、直径が２ｍｍ〜３．５ｍｍである。種皮は堅固で且つ艶があり、左右両側には光沢のある幅が狭い一筋に掘られた柄があり、少し特異な匂いがする。Ｃ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａは種子が大粒で、Ｃ．ｔｏｒａは種子が小粒である。
【０００８】
決明子は、漢方の清熱明目作用を持つことで知られており、これにより、急性結膜炎、眼球出血、目の異物感や痛み、出涙、高齢者の目に発生する角膜混濁現象、いわゆる慢性進行性疾患、視神経・網膜萎縮に起因する若年性弱視、肥満、高血圧、精神的ストレスによる頭痛・耳鳴、目の腫瘍を治療し、降圧作用により、高血圧症、冠状動脈拡張で血流の抵抗を減少させることによって血圧を低下させ、脳卒中による半身不随、軽微な下痢作用、慢性疾患を治療し、コレステロール低減作用により、心血管疾患、とくにコレステロール値の正常範囲逸脱や冠状動脈硬化による狭心症を治療し、便秘治療としては、老人性便秘症、老人性高血圧症、体液不足による口腔内の乾燥、便秘気味による腹部膨満感、常習性便秘症などを治療するものと知られている。
【０００９】
韓国公開特許第１９９９−００８４２７１号では、決明子又は決明子葉と他の生薬材とを混合し、単純粉砕及び焙煎によって製造したティーバッグ茶が便秘改善に効果があると説明しており、韓国公開特許第２００３−００６２４９３号では、決明子を先に抽出及び濃縮した後、噴霧乾燥して製造した決明子抽出物粉末とカスカラサグラダ抽出粉末などを混合して製造した混合浸出茶が嗜好性に優れ、便秘症状改善効果を有することを説明している。前記各特許は、決明子を単純粉砕して焙煎したり、抽出及び濃縮して乾燥したものであるか、又は、これらと異なる便秘改善効果を有する生薬材と混合するものに過ぎなかった。
【００１０】
そこで、本発明者等は、伝統的に長い間使用されてその安全性が検証された生薬である決明子を乳酸菌で発酵させて得た決明子乳酸菌発酵物が、決明子抽出物に比べて便の個数、便の水分含量又は便の重量を増加させることによって便秘を改善又は治療する効果が著しく増進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、長い間使用されて安全性が高く、生薬として副作用発生可能性が少ない決明子を活用して便の水分含量及び重量を増加させる効果が著しく増進した便秘改善又は予防用健康機能食品を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、決明子を活用して便の水分含量及び重量を増加させる効果が著しく増進した便秘治療又は予防用医薬組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、優れた便秘改善又は予防活性を有する決明子乳酸菌発酵物の製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、決明子の便秘改善又は予防活性を増進できる新菌株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、決明子乳酸菌発酵物を有効成分とする便秘改善又は予防用健康機能食品を提供する。
【００１６】
前記決明子は、水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒の抽出物であり得る。
【００１７】
前記健康機能食品は、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸状、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ゼリー又はバー状の形態であり得る。
【００１８】
また、本発明は、決明子乳酸菌発酵物を有効成分とする便秘治療又は予防用医薬組成物を提供する。
【００１９】
前記決明子は、水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒の抽出物であり得る。
【００２０】
また、本発明は、決明子抽出物を製造する段階；及び前記決明子抽出物に乳酸菌を接種して発酵させる段階；を含む便の個数、便の水分含量及び便の重量のうちのいずれか一つ以上を増加させる決明子乳酸菌発酵物の製造方法を提供する。
【００２１】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属、ペジオコックス属、及びエンテロコッカス属乳酸菌から選ばれるいずれか一つ以上の乳酸菌であり得る。
【００２２】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］であり得る。
【００２３】
前記決明子乳酸菌発酵物の製造方法は、決明子又はその粉砕物を水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒で抽出する段階；及び前記段階の決明子抽出物にラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］を１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ 〜１×１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように接種し、３０℃〜４５℃で１日〜７日間発酵させる段階；を含むことができる。
【００２４】
前記抽出する段階は、決明子粉砕物１重量部に対して水１０重量部〜５０重量部を混合した後、静置又は撹拌しながら０．５時間〜２４時間抽出することにより行い得る。
【００２５】
前記抽出する段階は、決明子又はその粉砕物１重量部に対して２０重量％〜８０重量％のエタノール水溶液５重量部〜３０重量部を混合して０．５時間〜２４時間抽出した後、前記抽出液を乾燥することによってエタノールを除去することにより行い得る。
【００２６】
前記発酵させる段階の決明子抽出物には、乳酸菌栄養源をさらに添加し得る。
【００２７】
本発明は、また、決明子を発酵させることによって便秘改善又は予防活性を増進させるラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０［寄託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ］を提供する。
【００２８】
本発明は、更に、便秘患者に有効量の決明子乳酸菌発酵物を投与することを含む便秘患者の治療又は予防のための方法を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の決明子乳酸菌発酵物は、長い間使用されて安全性が高く、生薬として副作用発生可能性が少ないと共に、副作用問題で健康機能食品への使用が禁止された刺激性便秘治療剤であるセンノシドや、あるいはビサコジル及びドキュセートナトリウムを有効成分とする商用化されたダルコラックスＳと同等な便の個数、便の水分含量及び便の重量のうちのいずれか一つ以上を増加させる効果を示すので、便秘治療又は予防用医薬組成物、又は便秘改善又は予防用健康機能食品として活用することができる。また、本発明のラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０菌株は、便秘治療、改善又は予防活性が増進した決明子乳酸菌発酵物の製造に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ａ】実験例１で溶媒を異ならせた決明子抽出物をそれぞれ異なる発酵菌で発酵させたとき、発酵時間３６時間及び７２時間に測定したｐＨの変化を通じて乳酸菌発酵の進行を確認したグラフであり、図１ａは製造例１の抽出物を発酵させたものを示す。
【図１ｂ】実験例１で溶媒を異ならせた決明子抽出物をそれぞれ異なる発酵菌で発酵させたとき、発酵時間３６時間及び７２時間に測定したｐＨの変化を通じて乳酸菌発酵の進行を確認したグラフであり、図１ｂは製造例２の抽出物を発酵させたものを示す。
【図１ｃ】実験例１で溶媒を異ならせた決明子抽出物をそれぞれ異なる発酵菌で発酵させたとき、発酵時間３６時間及び７２時間に測定したｐＨの変化を通じて乳酸菌発酵の進行を確認したグラフであり、図１ｃは製造例３の希釈液を発酵させたものを示す。
【図２】実験例２のハ．で各実験群の便の個数を示したグラフである。
【図３】実験例２のハ．で各実験群の便の重量を示したグラフである。
【図４】実験例３のハ．で各実験群の便の個数を示したグラフである。
【図５】実験例３のハ．で各実験群の便の重量を示したグラフである。
【図６】実験例３のニ．で各実験群の実験動物を犠牲させた後、大腸を摘出して水洗した後の写真であり、それぞれの大腸写真の下側に表示した点はカーマイン（Ｃａｒｍｉｎｅ）色素が移動した距離を表示したものである。
【図７】図６のカーマイン色素の移動距離を示したグラフである。
【図８ａ】図８ａは、実験例４で製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物のＨＰＬＣ−ＩＴ／ＴＯＰ  ＭＳパターンを示した図でである。
【図８ｂ】図８ｂは、実験例４で製造例４の決明子乳酸菌発酵物のＨＰＬＣ−ＩＴ／ＴＯＰ  ＭＳパターンを示した図である。
【図９】実験例９で分離及び同定したラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０菌株の系統図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、決明子乳酸菌発酵物を有効成分とする便秘改善又は予防用健康機能食品に関する。また、本発明は、決明子乳酸菌発酵物を有効成分とする便秘治療又は予防用医薬組成物に関する。また、本発明は、決明子抽出物を製造する段階；及び前記決明子抽出物に乳酸菌を接種して発酵させる段階；を含む便の個数、便の水分含量及び便の重量のうちのいずれか一つ以上を増加させる決明子乳酸菌発酵物の製造方法に関する。
【００３２】
前記決明子は、草決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ  Ｌ．）又は決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｔｏｒａ  Ｌ．）であり、韓国で栽培される決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｔｏｒａ  Ｌ．）であることが好ましい。
【００３３】
前記抽出物は、抽出原材料に抽出溶媒を処理して得た粗抽出物のみならず、粗抽出物の加工物も含む。例えば、決明子抽出物は、減圧蒸留、凍結乾燥又は噴霧乾燥などの追加的な過程によって粉末状に製造することができる。前記抽出物は、前記粗抽出物を追加的に分画した分画物も含む。
【００３４】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属、ペジオコックス属、及びエンテロコッカス属乳酸菌から選ばれるいずれか一つ以上の乳酸菌であり得る。例えば、前記乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ケフィリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレビス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ペジオコックス・ペントサセウス、及びエンテロコッカス・フェカリスであり、ラクトバチルス属乳酸菌であることが好ましく、ラクトバチルス・ケフィリ又はラクトバチルス・アシドフィルスであることがより好ましく、本発明者等が新たに分離して同定したラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０であることが最も好ましい。
【００３５】
前記決明子乳酸菌発酵物の製造方法は、決明子又はその粉砕物を水、炭素数１〜４のアルコール又はこれらの混合溶媒で抽出する段階；及び前記段階の決明子抽出物に乳酸菌を１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ〜１×１０６ＣＦＵ／ｍｌになるように接種し、３０℃〜４５℃で１日〜７日間発酵させる段階；を含むことができる。前記決明子乳酸菌発酵物は、決明子抽出物に乳酸菌を接種して発酵させて得たものであり得る。
【００３６】
前記抽出の溶媒としては水を使用してもよい、この場合、決明子粉砕物１重量部に対して冷水又は室温の水１０重量部〜５０重量部で希釈した希釈液から決明子の成分を抽出することができる。冷水又は室温の水を用いて決明子成分を抽出する場合、発酵と別途に抽出することもでき、乳酸菌を接種して発酵させる過程で決明子から決明子の成分を溶出させることもできる。よって、本発明において、「決明子抽出物」は、広い意味では決明子粉末を水に希釈した希釈液を含む。後述の実験例において示されるように、決明子熱水抽出物又は決明子エタノール水溶液抽出物を乳酸菌で発酵させた乳酸菌発酵物に比べて、決明子水希釈液を乳酸菌で発酵させた乳酸菌発酵物の便秘改善、治療又は予防効果が多少低いが、乳酸菌で発酵させていない決明子抽出物に比べてはその効果が有意的に増大したことを確認することができた。
【００３７】
前記溶媒として水を使用する場合、抽出効率増進のために熱水抽出を用いることができる。例えば、決明子又はその粉砕物１重量部に対して８０℃〜１０５℃、好ましくは９０℃〜１００℃の水１０重量部〜５０重量部を混合した後、静置又は撹拌しながら０．５時間〜２４時間、好ましくは１時間〜６時間抽出することができる。
【００３８】
前記抽出の溶媒として、炭素数１〜４のアルコール又はそのアルコールの水溶液を使用してもよい、この場合、決明子又はその粉砕物１重量部に対してその溶媒を５重量部〜３０重量部混合して０．５時間〜２４時間抽出することができる。例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノールなどのアルコール水溶液で抽出してもよい。好ましくは２０重量％〜８０重量％のアルコール水溶液、より好ましくは５０重量％〜７０重量％のアルコール水溶液が使用される。アルコール水溶液抽出物を使用する場合、乳酸菌を接種する前にアルコール水溶液抽出物のアルコールを気化させることによってアルコール含量を低下させた濃縮液を得る。あるいはアルコール抽出物を濃縮、乾燥させ、これを水に溶解して使用する。
【００３９】
前記決明子抽出物に乳酸菌を接種する前に、乳酸菌生育を増進させるために、決明子抽出物にタンパク質源、炭水化物源、ビタミン又は無機質などの乳酸菌栄養源をさらに混合することができる。また、前記決明子抽出物に乳酸菌を接種する前に乳酸菌に前記乳酸菌栄養源を混合して増殖又は活性化させたスターターを乳酸菌として使用することができる。前記乳酸菌栄養源としては、市販される培地を用いたり、又は必要な栄養源のみを個別的に添加することができる。
【００４０】
また、前記決明子抽出物、又は決明子抽出物と乳酸菌栄養源との混合物は、乳酸菌を接種する前に加熱殺菌することができる。
【００４１】
前記決明子抽出物の固形分含量は、特に限定する必要はないが、抽出後に他の濃縮過程がない場合は１重量％〜１５重量％であり、これを直ぐ使用することもでき、濃縮して使用することもでき、濃縮又は乾燥した後で希釈して使用することもできる。
【００４２】
ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０菌株を用いて発酵させる段階又はその後に、便秘改善又は予防のための整腸作用のために補助的に別途の乳酸菌を添加してもよい。
【００４３】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属、ペジオコックス属、及びエンテロコッカス属乳酸菌から選ばれるいずれか一つ以上の乳酸菌であり得る。
【００４４】
前記発酵させる段階は、その条件が一般的な乳酸菌発酵と同様であるので、特に限定されないが、２５℃〜４０℃で２４時間〜９６時間行うことができる。
【００４５】
前記決明子乳酸菌発酵物は、乳酸菌の菌体を含む発酵物であってもよく、乳酸菌の菌体が除去された発酵物であってもよい。乳酸菌の菌体が除去された発酵物は、発酵物を滅菌することによって死菌体を含ませることもでき、ろ過又は遠心分離を通じて菌体を除去した余液又は遠心分離上澄液であり得る。
【００４６】
前記発酵物の便秘の改善、治療又は予防効果は、決明子抽出物に含まれた成分を、乳酸菌の増殖と共に生体内で利用しやすい成分に生物転換したり、便秘の改善、治療又は予防効果を有する新規の活性成分が生成されるためと予想され、単純な乳酸菌自体が付加されて得られる効果より著しく上昇したものである。前記決明子乳酸菌発酵物は、液体の形態であってもよい、この場合、その液状の発酵物を直に使用してもよく、あるいはこれを乾燥、粉砕して、粉末化してもよい。
【００４７】
前記決明子乳酸菌発酵物は、便秘改善又は予防用健康機能食品、あるいは便秘治療又は予防用医薬組成物の有効成分として用いることができる。
【００４８】
ここで「有効成分として含む」とは、前記決明子乳酸菌発酵物の便秘改善、治療又は予防効能又は活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。
【００４９】
前記健康機能食品は、前記決明子乳酸菌発酵物をカプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸状、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ゼリー又はバー状に製剤化して得られてもよい。あるいは、飲料、茶類、香辛料、ガム、菓子類などの食品原料に添加して一般食品の形態に製造してもよい。これを摂取するとき、健康上の特定の効果をもたらすことを意味するが、一般的な医薬品とは異なり、長期服用時に発生し得る副作用などがないという長所を有する。
【００５０】
前記健康機能食品は、日常的に摂取可能であるので非常に有用である。このような健康機能食品における決明子乳酸菌発酵物の添加量は、対象である健康機能食品の種類によって異なるため一律的に規定できないが、食品本来の味を損ねない範囲で添加すればよく、通常、対象食品に対して０．０１重量％〜５０重量％、好ましくは０．１重量％〜２０重量％の範囲である。また、カプセル、錠剤、粉末、顆粒、液状、丸状、片状、ペースト状、シロップ、ゲル、ゼリー又はバー状の健康機能食品の場合は、通常、０．１重量％〜１００重量％、好ましくは０．５重量％〜８０重量％の範囲で添加すればよい。１日の投与量は、決明子乳酸菌発酵物を基準にして０．００１ｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである。
【００５１】
前記健康機能食品は、有効成分として決明子乳酸菌発酵物のみならず、食品の製造時に通常的に添加される成分を含むことができ、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド（例えば、ブドウ糖、果糖など）；ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など）；ポリサッカライド（例えば、デキストリン、サイクロデキストリンなど）の通常の糖；及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として、天然香味剤［ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルヒジンなど）］及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。例えば、本発明の健康機能食品がドリンク剤と飲料類に製造される場合は、本発明の決明子乳酸菌発酵物以外に、クエン酸、液状果糖（高フルクトースコーンシロップ）、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、及び各種の植物抽出液などをさらに含ませることができる。
【００５２】
また、決明子乳酸菌発酵物を有効成分とする便秘の治療又は予防用医薬組成物において、決明子乳酸菌発酵物は、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以上、さらに好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ以上、さらにより好ましくは２５０ｍｇ／ｋｇ以上投与することができる。例えば、決明子乳酸菌発酵物は、２００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ投与することができる。決明子乳酸菌発酵物は、天然発酵物であり、過量投与しても人体に副作用がないので、本発明の組成物内に含まれる決明子乳酸菌発酵物の量的上限は当業者が適切な範囲内で選択して実施することができる。
【００５３】
前記医薬組成物には、前記有効成分以外に、薬剤学的に適合し、生理学的に許容される補助剤を含み得る。前記補助剤としては、賦形剤、崩解剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑択剤又は香味剤などが挙げられる。
【００５４】
前記医薬組成物は、投与のために製剤化してもよい。その場合、前記有効成分以外に、薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよい。
【００５５】
前記医薬組成物の製剤形態は、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠、カプセル剤、坐剤、液剤、シロップ、ジュース、懸濁剤、乳剤、点滴剤又は注射可能な液剤などになり得る。例えば、錠剤又はカプセル剤の形態への製剤化のために、有効成分は、エタノール、グリセロール、水などの経口、無毒性の薬剤学的に許容可能な不活性担体と結合することができる。また、所望であるか必要である場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩解剤及び発色剤も混合物として含ませることができる。適切な結合剤は、これに制限されるわけではないが、スターチ、ゼラチン、グルコース又はベータ−ラクトースなどの天然糖、コーンスイートナー、アカシア、トラガカント又はオレイン酸ナトリウムなどの天然及び合成ガム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩素酸ナトリウムなどが挙げられる。崩解剤は、これに制限されるわけではないが、スターチスターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。
【００５６】
前記組成物は、液状溶液に製剤化され得る。その場合の組成物において許容可能な薬学担体としては、滅菌及び生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加し、水溶液、懸濁液、エマルジョンなどの注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。
【００５７】
さらに、該当分野の適切な方法として知られる、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法などにより、適宜疾患又は成分に応じて製剤化することができる。
【００５８】
前記医薬組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができ、経口投与であることが好ましい。
【００５９】
前記医薬組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性などの各要因によって多様であり、普通に熟練した医者は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。好ましい具現例によると、前記医薬組成物の１日投与量は、０．００１ｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである。
【００６０】
前記医薬組成物は、当該発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造したり、又は多容量で製造することができる。このとき、剤型は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又はエマルジョンの形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を下記の実施例を参照してより具体的に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の理解を促進するためのものに過ぎなく、本発明の範囲が下記の実施例に限定されることはない。
【００６２】
製造例１：決明子熱水抽出物の製造
【００６３】
決明子は、全南生薬農業協同組合（和順郡)で購入した韓国産決明子（Ｃａｓｓｉａ  ｔｏｒａＬ．）を精選及び水洗した後、粉砕機で均一に粉砕し、平均粒子サイズ３００μｍの決明子粉末を製造して冷蔵保管しながら用いた。
【００６４】
前記決明子粉末の重量の１０倍の蒸留水を還流抽出器に入れ、１００℃で３時間にわたって２回抽出し、放冷してろ過した後、減圧濃縮機で濃縮して凍結乾燥することによって決明子熱水抽出物粉末を得た。収率は２．２％であった。
【００６５】
製造例２：決明子エタノール水溶液抽出物の製造
【００６６】
前記製造例１の粉砕された決明子の重量の４倍である５０重量％の酒精エタノール水溶液を添加して３日間室温で抽出し、ろ過した後、減圧濃縮機で濃縮して凍結乾燥することによって決明子エタノール水溶液抽出物粉末を得た。収率は９．８％であった。
【００６７】
製造例３：決明子水希釈液の製造
【００６８】
前記製造例１の粉砕された決明子を７重量％になるように水と混合し、決明子水希釈液を製造した。
【００６９】
製造例４：決明子発酵物の製造
【００７０】
前記製造例１又は２の決明子抽出物粉末を蒸留水に５重量％で希釈し、又は製造例３の決明子水希釈液を１２１℃、１．５気圧で１５分間滅菌した。表１の乳酸菌をそれぞれＭＲＳブロスとＧＡＭブロスを用いて２４時間、３７℃で静置培養して活性化させた後、乳酸菌の培養液５重量％（１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を前記決明子抽出物にそれぞれ接種し、３７℃で７２時間にわたって１５０ｒｐｍで撹拌しながら培養することによって培養液を得た。
【００７１】
酵母の場合は、製パン用商用酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を予め活性化させた酵母培養液５重量％（１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）を製造例２の決明子抽出物（固形分５重量％)に接種し、３０℃で７２時間にわたって１５０ｒｐｍで撹拌しながら培養することによって培養液を得た。
【００７２】
前記培養液を４℃、６，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、菌体が除去された上澄液を濃縮及び凍結乾燥することによって決明子発酵物粉末を得た。 
【表１】
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【００７３】
実験例１：決明子発酵物の発酵特性確認
【００７４】
製造例４の決明子乳酸菌発酵物又は決明子酵母発酵物の発酵特性を確認するために、接種してから３６時間及び７２時間目に発酵物のｐＨ及び生菌数の変化を確認した。
【００７５】
生菌数については、試料１ｍｌを滅菌生理食塩水９ｍｌに希釈してよく混ぜた後、段階別に希釈して０．１ｍｌを採取し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属は、ＭＲＳ寒天に塗抹し、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は５％のウマ血液を含有したＢＬ寒天に塗抹し、嫌気ジャー（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｊａｒ）（ＢＢＬガスパック嫌気システム（ＢＢＬ  Ｇａｓ  Ｐａｋ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ））を用いて最大限嫌気的な状態で保管し、３７℃で２４時間〜４８時間培養した後、生成されたコロニー数を計測し、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ属は、ＹＭ寒天に塗抹して２５℃で４８時間培養した後、生成されたコロニー数を計測し、その平均コロニー数に希釈倍数を掛けることによって培養液当たりのコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）数を算出した。
【００７６】
イ．ｐＨ変化
【００７７】
発酵菌の種類及び培養時間によるｐＨ変化を図１ａ、図１ｂ及び図１ｃに示した。図１ａは製造例１の抽出物、図１ｂは製造例２の抽出物、図１ｃは製造例３の希釈液をそれぞれ発酵させたものを示す。
【００７８】
初期ｐＨは６．４であり、３６時間目に５．２〜５．８に減少し、７２時間目に４．９〜５．５に減少した。
【００７９】
発酵菌別にｐＨの変化を比較すると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ２)は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ  １２８（Ｌ３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １４４（Ｌ４）、Ｂｉｆｉｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（Ｐ１）より相対的に大きい幅で減少した。また、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ１）は、製造例１の抽出物と製造例３の希釈液ではＬ２とＬ３の中間程度にｐＨが減少し、製造例２の抽出物ではＬ３と類似する水準にｐＨが減少した。
【００８０】
発酵菌が同一である場合、基質として製造例１の決明子熱水抽出物、製造例２の決明子エタノール抽出物、製造例３の決明子水希釈液を使用する培養液のｐＨにはほとんど差がなく、製造例３の場合、残りの製造例に比べて３６時間目及び７２時間目のｐＨが多少高かった。
【００８１】
ロ．生菌数の変化
【００８２】
６種の発酵菌を再び前培養し、菌株の成長能を確認するために、固形分含量６重量％の決明子抽出物に乳酸菌をそれぞれ１重量％ずつ接種して３７℃で２４時間発酵し、酵母菌は１重量％接種して２５℃で２４時間発酵した。その生菌数を測定し、その結果を表２に示した。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
前記表２に示したように、基質として製造例１の決明子熱水抽出物を使用した場合及び製造例２のエタノール水溶液抽出物を使用した場合においてほとんど差がなかったが、製造例３の決明子水希釈液を使用した場合は、発酵後の生菌数が製造例１及び２の生菌数の半分に少し及ばない水準であった。
【００８５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）菌株を使用して製造した培養液の生菌数が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ２）菌株を使用して製造した培養液の生菌数より３倍ほど多く、Ｓａｃｃｈｒｏｍｙ  ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ１）菌株を使用して製造した培養液の生菌数より５倍ほど多いことを確認することができた。
【００８６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ  １２８（Ｌ３）菌株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １４４（Ｌ４）菌株を使用して製造した培養液の生菌数は、Ｌ１菌株に比べて１／１０水準であり、Ｂｉｆｉｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１）菌株及びＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（Ｐ１）菌株を使用して製造した培養液の生菌数はＬ１菌株の１／１００水準であった。
【００８７】
したがって、ｐＨ減少と生菌数増加の側面で発酵特性に優れた乳酸菌として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）菌株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ２）菌株、そして、酵母であるＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ１）菌株を選択し、相対的に発酵特性が低下する比較群として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ  １２８（Ｌ３）菌株及びＢｉｆｉｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１）菌株を選択し、動物実験を通じて便秘改善又は予防効果が決明子抽出物に比べて増進されるか否かを確認した。
【００８８】
実験例２：発酵菌の種類による動物実験を通じた便秘予防効果確認
【００８９】
イ．実験動物及び実験群
【００９０】
実験動物は、ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットの４週齢の雄をダムルサイエンス（大田）で購入して使用し、温度２０±２℃、湿度５５±５％、１２時間の明暗条件で飼育した。実験動物は、購入してから１週間馴化した後、各群当たり５匹ずつを配置し、表３のように実験群を設定した。
【００９１】
【表３】
0006458059.tif 000004
【００９２】
正常対照群（ＮＯＲ）及び陰性対照群（ＬＯＰ）を除いた全ての実験群は、ロペラミドの投与前に、それぞれの陽性対照群薬物や製造例４の発酵物を５日間経口投与した。
【００９３】
正常対照群（ＮＯＲ）を除いた陰性対照群（ＬＯＰ）、あるいは陽性対照群（ＣＯＮ１、ＣＯＮ２）を除いた全ての実験群は、ロペラミドを５日間皮下投与することによって便秘を誘発し、ロペラミドの投与開始日から６日目に実験動物を犠牲させた。
【００９４】
ロ．体重、飼料摂取量及び飲水量
【００９５】
全ての実験群について、ロペラミドの投与開始日から実験動物を犠牲させるまで、実験動物の体重変化量（ｇ）、飼料摂取量（ｇ）及び飲水量（ｍＬ）を確認した結果、実験期間の間、飼料摂取量及び飲水量には有意的な差を示しておらず、体重増加量においても有意的な差を示していなかた。
【００９６】
ハ．便の個数
【００９７】
各実験群の便の個数結果は図２に示した。
【００９８】
便の個数は、正常対照群（ＮＯＲ）が４７．２±５．８個である一方、ロペラミド投与陰性対照群（ＬＯＰ）が２３．１±３．６個に減少し、ロペラミドによる便秘誘発が確認された。また、センノシド（ＣＯＮ１）がダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）より便の個数増加効果に優れることを確認することができた。
【００９９】
製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物を２００ｍｇ／ｋｇ投与した２−２００実験群は、有意的な便の個数増加効果をほとんど示しておらず、２−２００実験群と同様に２００ｍｇ／ｋｇを投与した２−Ｌ１−２００、２−Ｌ２−２００実験群はセンノシド（ＣＯＮ１）と同等な便の個数増加効果を示した。
【０１００】
投与量を５００ｍｇ／ｋｇに増加させて投与した場合、製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物を５００ｍｇ／ｋｇ投与した２−５００実験群は、依然として有意的な便の個数増加効果を示していなかったが、２００ｍｇ／ｋｇ投与群で便の個数の有意的な増加を示していなかった２−Ｌ３−５００、２−Ｂ１−５００実験群でも便の個数が有意的に増加した。但し、２−Ｓ１−５００実験群は５００ｍｇ／ｋｇ投与でも便の個数増加がなかった。
【０１０１】
前記結果をまとめると、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）菌株及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ２）菌株の発酵物は、センノシド（ＣＯＮ１)及びダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）と同等又はそれ以上の便の個数増加効果をもたらし、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ  １２８（Ｌ３）菌株及びＢｉｆｉｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１）菌株の発酵物は、５００ｍｇ／ｋｇ投与群でのみ便の個数増加効果を示し、酵母であるＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ１）菌株は、発酵した場合にも便の個数増加効果がなかった。
【０１０２】
したがって、各乳酸菌は、有効含量の差はあるが、決明子抽出物を発酵させることによって便の個数を増加させ、その中でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）菌株は、５００ｍｇ／ｋｇ投与群で正常対照群（ＮＯＲ）と同等な水準の便の個数を示し、便の個数増加効果に最も優れていた。
【０１０３】
ニ．便の重量
【０１０４】
各実験群の便の重量結果は図３に示した。
【０１０５】
便の重量も、正常対照群（ＮＯＲ）が４．８±０．８９ｇである一方、ロペラミド投与陰性対照群（ＬＯＰ）が２．６±０．３２ｇに減少し、ロペラミドによる便秘誘発が確認された。また、センノシド（ＣＯＮ１）とダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）の便の重量には有意的な差がなかった。
【０１０６】
製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物を２００ｍｇ／ｋｇ投与した２−２００実験群は、センノシド（ＣＯＮ１）よりは弱いが、陰性対照群（ＬＯＰ）よりは便の重量を有意的に増加させた。２−２００実験群と同様に２００ｍｇ／ｋｇを投与した２−Ｌ１−２００、２−Ｌ２−２００実験群は、センノシド（ＣＯＮ１）と同等で、ダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）より優れた便の重量増加効果を示した。
【０１０７】
投与量を５００ｍｇ／ｋｇに増加させて投与した場合、製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物を５００ｍｇ／ｋｇ投与した２−５００実験群は、２−２００実験群と類似する便の重量を示し、投与量増加による便の重量増加効果が明らかでなかったが、２００ｍｇ／ｋｇ投与群で便の重量の有意的な増加を示していなかった２−Ｌ３−５００、２−Ｂ１−５００実験群でも便の重量が有意的に増加した。但し、２−Ｓ１−５００実験群は、５００ｍｇ／ｋｇ投与でも便の重量増加がなかった。
【０１０８】
前記結果をまとめると、便の重量増加効果は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）菌株による発酵物がセンノシド（ＣＯＮ１）より優れ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌ２）菌株による発酵物は、センノシド（ＣＯＮ１）及びダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）と同等又はそれ以上の便の重量効果をもたらし、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｌｕｓ  １２８（Ｌ３）菌株及びＢｉｆｉｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１）菌株による発酵物は、センノシド（ＣＯＮ１）及びダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）よりは低いが、５００ｍｇ／ｋｇ投与群でのみ便の重量増加効果を示した。また、酵母であるＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ１）菌株は、発酵した場合にも便の重量増加効果がなかった。
【０１０９】
実験例３：抽出物の種類による動物実験を通じた便秘改善及び予防効果確認
【０１１０】
イ．実験動物及び実験群
【０１１１】
実験動物は、実験例２と同様に準備し、購入してから１週間馴化した後、各群当たり５匹ずつを配置し、表４のように実験群を設定した。
【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
１−Ｌ１−１００及び１−Ｌ１−２００は、決明子水抽出物の発酵物を投与したもので、３−Ｌ１−１００及び３−Ｌ１−２００は、決明子水希釈液の発酵物を投与したもので、２−Ｌ１−２００（Ｐ）は、ロペラミドを先処理することによって便秘を誘発させた後、便秘治療効果を確認するためのものである。
【０１１４】
正常対照群（ＮＯＲ）、陰性対照群（ＬＯＰ）及び２−Ｌ１−２００（Ｐ）を除いた各実験群は、ロペラミドの投与前にそれぞれの陽性対照群の薬物や製造例４の発酵物を５日間経口投与した。
【０１１５】
正常対照群（ＮＯＲ）を除いた陰性対照群（ＬＯＰ）、あるいは陽性対照群（ＣＯＮ１、ＣＯＮ２）及び２−Ｌ１−２００（Ｐ）を除いた全ての実験群は、ロペラミドを５日間皮下投与することによって便秘を誘発し、ロペラミドの投与開始日から６日目に実験動物を犠牲させた。
【０１１６】
２−Ｌ１−２００（Ｐ）は、陰性対照群（ＬＯＰ）と同様にロペラミドを５日間皮下投与することによって便秘を誘発させた後、２−Ｌ１−２００と同一の製造例２の抽出物のＬ１菌株発酵物（製造例４）２００ｍｇ／ｋｇを５日間経口投与した後、最後に発酵物を投与した次の日に実験動物を犠牲させた。
【０１１７】
ロ．体重、飼料摂取量及び飲水量
【０１１８】
２−Ｌ１−２００（Ｐ）を除いた全ての実験群は、ロペラミドの投与開始日から実験動物を犠牲させるまで、そして、２−Ｌ１−２００（Ｐ）は、ロペラミド発酵物の投与開始日から実験動物を犠牲させるまでの実験動物の体重変化量（ｇ）、飼料摂取量（ｇ）及び飲水量（ｍＬ）を確認した結果、実験期間の間、飼料摂取量及び飲水量には有意的な差を示しておらず、体重増加量においても有意的な差を示していなかった。
【０１１９】
ハ．便の個数
【０１２０】
各実験群の便の個数結果は図４に示した。
【０１２１】
２−Ｌ１−２００（Ｐ）は、発酵物の投与開始日から４日目、残りはロペラミドの投与開始日から４日目にケージ内の便を除去し、ベッドを取り替えた後、１日間の便を収去することによって便の個数及び便の重量を測定したものである。
【０１２２】
製造例１の決明子水抽出物２００ｍｇ／ｋｇを投与した１−２００実験群に比べて、同様に２００ｍｇ／ｋｇを投与した１−Ｌ１−２００及び３−Ｌ１−２００実験群で全て有意的に便の個数を増加させ、３−Ｌ１−１００実験群は、１００ｍｇ／ｋｇの投与でも、有意的に便の個数を増加させ、ダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）と同等の水準の効果を示した。
【０１２３】
便秘を誘発した後、製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物のＬ１菌株発酵物を投与した２−Ｌ１−２００（Ｐ）実験群は、便の個数が２６．２±３．１個であって、陰性対照群（ＬＯＰ）に比べて便の個数が有意的に再度増加した。
【０１２４】
ニ．便の重量
【０１２５】
各実験群の便の重量結果は図５に示した。
【０１２６】
製造例１の決明子水抽出物２００ｍｇ／ｋｇを投与した１−２００実験群に比べて、同様に２００ｍｇ／ｋｇを投与した１−Ｌ１−２００及び３−Ｌ１−２００実験群で全て有意的に便の重量を増加させ、１００ｍｇ／ｋｇを投与した１−Ｌ１−１００及び３−Ｌ１−１００実験群でも有意的に便の重量を増加させ、ダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）と同等な水準の効果を示した。
【０１２７】
２−Ｌ１−２００（Ｐ）実験群は、便の重量が３．１８±０．２８ｇであって、陰性対照群（ＬＯＰ）に比べて有意的に再度増加した。
【０１２８】
ホ．カーマイン（Ｃａｒｍｉｎｅ）色素の腸移動距離
【０１２９】
カーマイン色素の腸移動距離は、カーマイン色素を生理食塩水に１．５％（ｗ/ｖ）の濃度にして６日目に３ｍＬ経口投与し、経口投与してから２０分後に実験動物を犠牲させた後、大腸は盲膓以後の部分から直腸までの部位の両側を結紮して摘出し、ＰＢＳで臓器を水洗した後の写真を図６に示し、図６で表示したカーマイン色素の移動距離を測定して図７に示した。
【０１３０】
カーマイン色素の腸移動距離は、正常対照群（ＮＯＲ）が１３．４±０．９４ｃｍである一方、ロペラミド投与陰性対照群（ＬＯＰ）が６．６±０．７５ｃｍに減少し、ロペラミドによる便秘誘発が確認された。また、センノシド（ＣＯＮ１）とダルコラックスＳ（ＣＯＮ２）は、腸移動距離が陰性対照群（ＬＯＰ）に比べて著しく増加した。
【０１３１】
１−２００実験群は、腸移動距離で陰性対照群（ＬＯＰ）と有意な差がなかったが、２−２００実験群は、陰性対照群（ＬＯＰ）に比べて腸移動距離が有意的に増加した。
【０１３２】
１−Ｌ１−１００及び３−Ｌ１−１００実験群は、２−２００実験群の１／２の量で投与したにもかかわらず、２−２００実験群と類似する腸移動距離を示し、１−２００及び２−２００実験群と同一の量を投与した１−Ｌ１−２００及び３−Ｌ１−２００実験群は、２−２００実験群に比べて腸移動距離が著しく増加したことを確認した。
【０１３３】
１−Ｌ１−２００及び３−Ｌ１−２００実験群は、陽性対照群であるセンノシド及びダルコラックスＳと同等又はそれ以上の腸移動距離を示し、特に、３−Ｌ１−２００実験群は、正常対照群（ＮＯＲ）と同等な腸移動距離を示した。
【０１３４】
実験例４：発酵前後のＨＰＬＣ−ＩＴ／ＴＯＰ  ＭＳパターンの比較
【０１３５】
製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物粉末と製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物粉末をＬ１菌株で発酵させた製造例３の決明子乳酸菌発酵物粉末に対して、同一の濃度でＨＰＬＣ−ＩＴ／ＴＯＰ  ＭＳシステム（株式会社島津製作所、日本）を用いてＨＰＬＣ−ＩＴ／ＴＯＰ  ＭＳを実施することによってパターンを比較した。測定にはＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｃ−１８、１．７ｍ  ２．１×１００ｍｍカラムを使用し、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ、アセトニトリル１０％水溶液から７０％水溶液へのグラジエントで測定をした。
【０１３６】
製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物のパターンを図８ａに示し、製造例３の決明子乳酸菌発酵物のパターンは図８ｂに示した。前記パターン比較を通じて、製造例２の決明子エタノール水溶液抽出物パターンにおいて多数のピークの含量が発酵を通じて低くなったり消えてしまい、その代わりに新しいピークが生成されることを確認した。
【０１３７】
実験例５：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０（Ｌ１）菌株の同定
【０１３８】
イ．菌株の分離
【０１３９】
便秘改善又は予防活性に優れた決明子発酵物の製造に最も優れていたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０菌株の分離過程を説明する。
【０１４０】
１片のチベットキノコの表面を滅菌水で数回繰り返して洗浄した。準備された１片のチベットキノコをＭＲＳ液体培地に３７ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した後、１％ＣａＣＯ３が含有されたＭＲＳ平坦培地に滅菌水で１０倍ずつ３回希釈した。１×１０３倍で希釈されたチベットキノコ培養試料をＭＲＳ固体培地に１００Ｌ分塗抹した。塗抹された培地は、恒温恒湿培養器で３６時間〜４８時間にわたって培養した。そして、培養された各コロニーのうち形態学的に異なるものを選択し、ＭＲＳ寒天に平板画線して培養することによって純粋分離した。
【０１４１】
ロ．１６ｓ−ｒＤＮＡ配列分析を通じた菌株の同定
【０１４２】
配列分析のために分離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ  ＭＪ９０菌株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳブロスに培養し、培養液１．５ｍＬを採取して遠心分離した後、０．８％滅菌生理食塩水で水洗した。そして、ゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）  ＤＮＡキットを使用して染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）  ＤＮＡを抽出してＰＣＲのための鋳型ＤＮＡとして使用し、細菌の１６ｓ  ｒＲＮＡの増幅のために９Ｆ（５'−ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  Ｇ−３'）と１４１２Ｒ（５'−ＡＣＧ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＴ−３'）プライマーを使用した。ＰＣＲの遂行後、ＰＣＲ産物の電気泳動を通じて増幅産物を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して精製した。塩基配列は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭターミネータサイクルシーケンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７３０ｘｌアナライザ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＧｅｎｏ  Ｔｅｃｈ  Ｃｏ．（Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）で実施した。提供された塩基配列を用いてＮＣＢＩでブラスト検索を実施し、ＭＥＧＡ５．０プログラムを使用して系統図を調査して図９に示し、前記菌株はラクトバチルスケフィリと同定された。
【０１４３】
前記ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０の１６ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列は配列番号１に示し、前記ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒｉ）ＭＪ９０菌株は、韓国微生物保存センターに２０１４年１０月１日付けで寄託し、ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ受託番号を受けた。
【０１４４】
［受託番号］
【０１４５】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
【０１４６】
受託番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ
【０１４７】
受託日付：２０１４１００１
【０１４８】
特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約
国際様式
受信：へニム自然営農組合法人
大韓民国  全羅南道 海南郡  玉泉面  濃厚団地ギル  ３７
本ページの下に記載された国際寄託機関による
規定７．１に係る原寄託に対する受託証
I．微生物の分類
寄託者によって与えらえた同定レファレンス：ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｋｅｆｉｒｉ） ＭＪ９０ 
国際寄託機関によって与えられた取得番号：ＫＣＣＭ１１５７５Ｐ
II．科学的叙述と／又は提案された分類学的指定
［    ］科学的記述
［    ］提案された分類学的指定
（適用可能な部分にｘでマーク）
を伴う。
III．受託及び承認
本国際寄託機関は、前記Iで同定された微生物を２０１４年１０月１日付けで受けたことを承認する。（原受託日）１
VI．国際受託機関
名称：韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）
住所：１２０−０９１  大韓民国、ソウル  西大門区  弘済２街ギル  ４５  ユリムビル
承認された任員の国際寄託機関を代表する権利を有する者の署名：
日付：２０１４．１０．１
１規定６．４（ｄ）により、前記日付は、国際受託機関に受け付けられた状態の日付である。国際寄託機関に受け付けられた状態以後にブタペスト条約加入国以外で行われた受託は、ブタペスト条約下での受託に切り替えられ、その日付は、微生物が国際受託機関に受け付けられた日付である。
上記の内容は、原本と相違ないことを証明する。
２０１４年  １０月  ２９日
上記の翻訳人
弁理士          ソン・ソンチョル
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【配列表】
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