(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＲＰ１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）に対する抗体またはその抗原結合断片であって、
配列番号１〜３の各配列を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４〜６の各配列を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むか；
配列番号７〜９の各配列を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０〜１２の各配列を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含むか；あるいは、
配列番号７、８及び１３の各配列を有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０、１４及び１５の各配列を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含む
ことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号２８〜３３の配列で構成された群から選択された一つの配列を有する重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号３４〜４２の配列で構成された群から選択された一つの配列を有する軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片は、下記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
（ｉ）配列番号１６の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１７の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号１８の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９の配列を有する軽鎖可変領域；または
（ｉｉｉ）配列番号２０の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２１の配列を有する軽鎖可変領域。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項８】
下記の段階を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項７に記載の細胞を培養する段階；および
（ｂ）前記培養された細胞から抗体またはその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片および薬物を含む抗体−薬物接合体。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合断片、または請求項９に記載の抗体−薬物接合体を有効性分として含む癌の予防または治療用組成物。
【請求項１１】
前記癌は、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、睾丸癌、大腸癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、食道癌および前立腺癌で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＲＰ１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）に対する抗体またはその抗原結合断片、これをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体−薬物接合体、およびその癌予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロピリン（ＮＲＰ）は、ＮＲＰ１とＮＲＰ２を含み、これは神経細胞で最初に発見された。ＮＲＰ１は、約９２３個のアミノ酸で構成され、ＮＲＰ２は、約９２６個のアミノ酸で構成され、これらは共通して類似のドメイン構造を有し、全体的に４４％のアミノ酸相同性を有すると知られている。
【０００３】
ＮＲＰ１は、軸索誘導を調節するためにプレキシン補助−受容体と作用する、セマフォリン３Ａリカンドに結合する受容体として知られている。その後、ＮＲＰ１は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）リカンドファミリーの構成員に結合して血管発生を媒介することが明らかになった。
【０００４】
血管系の発生を介して数多くの生理的過程と病理的過程が進行される。腫瘍のように活動的に成長する組織には適切に血液が供給されなければならない。これらの組織は、一般に新しい血管形成と維持を増進させる全−血管新生因子を生成させることによって血管新生を介して血液を供給する。血管形成は単純な過程ではないが、次の段階を介して行われる：ａ）内皮細胞（ＥＣ）が既存の内皮細胞から増殖したり分化する段階；ｂ）内皮細胞が移動して癒着してコード（ｃｏｒｄ）−類似構造を形成させる段階；ｃ）血管コードが細管形成を進行して中央に内腔がある血管を形成させる段階；ｄ）既存のコードや血管に芽が出始めて２次血管を形成させる段階；ｅ）原始血管叢が追加の再形成と再生を進行する段階；およびｆ）内皮ペリプラズムを動員して内皮管に入れて、血管に対する維持および調整機能を提供する段階（このような細胞には、小さい毛細血管の場合には血管周皮細胞、大きい血管の場合には平滑筋細胞、および心臓内の心筋細胞が含まれる）。
【０００５】
ＮＲＰ１は、多様な種類のヒト腫瘍細胞株およびヒト腫瘍（膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、睾丸癌、大腸癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、食道癌および前立腺癌など）で発現すると知られていて、ＶＥＧＦおよびセマフォリンの癌細胞の増殖、生存および移動に及ぼす影響にかかわるとも知られている。また、ＮＲＰ１の発現程度に応じて癌進行程度が増加したり、癌患者の予後が良くないことが知られている。
【０００６】
腫瘍成長の場合、血管新生は過形成物から新生物に転移するのにおいて決定的で、腫瘍の成長と転移に対する栄養を提供するのにおいても決定的な役割をすることができる。新生血管形成により腫瘍細胞は正常細胞と比較して成長利点と増殖自律性を獲得できるようになる。腫瘍は通常、利用可能な毛細血管層からの距離のために、数立方ミリメートルの大きさでだけ増殖できる単一異常細胞として始まり、追加の成長と伝染なしに長期間「潜伏」状態で停滞され得る。続いて、いくつかの腫瘍細胞は、血管新生表現型に転換されて内皮細胞を活性化させて、新しい毛細血管に増殖および成熟される。このように新しく形成された血管は、原発性腫瘍を持続的に成長させるようにするだけでなく、転移性腫瘍細胞を伝播して再コロニー化させることができる。
【０００７】
これと関連して、ＮＲＰ１を過発現する癌を治療するために、ＮＲＰ１に高い親和力で結合して癌細胞の成長を阻害できる抗−ＮＲＰ１抗体が求められる。
【０００８】
治療用抗体市場は、年平均１１．８％に成長して２０１７年に８９９億ドルに達すると見込まれ、この中坑癌治療剤が最も大きい割合を占めている。現在２６０個の生命工学企業が約７００個の治療用抗体に対する開発を進行中であり、この中２２０個の抗体が臨床実験中である（Ｇａｂｉｌｏｎｄｏ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，２０００）。過去１５年間癌細胞に特異的に発現が高かったり突然変異された抗原を標的に種々の抗体が開発されて、血液癌と固形癌患者に投与された。
【０００９】
このような技術的背景下、本出願の発明者等は、種々の癌で発現されると知られているＮＲＰ１に結合して細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）される坑癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者等は、ファージディスプレイ技術を利用してＮＲＰ１に高い親和力で結合して細胞内に内在化される抗−ＮＲＰ１抗体を開発して、このような抗−ＮＲＰ１抗体が癌細胞の移動を顕著に抑制させる可能性があることを確認して、本発明を完成した。
【００１０】
本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に既知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＮＲＰ１に対する新規抗体またはその抗原結合断片を提供するところにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供するところにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞および前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供するところにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体−薬物接合体を提供するところにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片または抗体−薬物接合体を含む癌の予防または治療用組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、ＮＲＰ１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）に対する抗体またはその抗原結合断片として、細胞表面に発現されたＮＲＰ１に結合して細胞内に内在化されることを特徴とする抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００１９】
本発明はまた、下記の段階を含む前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；および（ｂ）前記培養された細胞で抗体またはその抗原結合断片を回収する段階。
【００２０】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体−薬物接合体を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を含む癌の予防または治療用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＮＲＰ１を過発現する患者由来細胞のＦＡＣＳ分析結果を示したものである。
【図２】抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体断片の同定のためのファージディスプレイ選別過程を見せる結果を示したものである。
【図３】ヒトＮＲＰ１に結合する４１種のｓｃＦｖ抗体断片の結合力を示したものである。
【図４】ｓｃＦｖ抗体断片の産生のためのファージミドベクターの構成図である。
【図５】精製された各ｓｃＦｖ抗体断片のクマシー染色結果を示したものである。
【図６】３種の抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体のＮＲＰ１に対する結合力を見せるＥＬＩＳＡ結果を示したものである。
【図７】３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の濃度に応じたＮＲＰ１に対する結合力を見せるＥＬＩＳＡ結果を示したものである。
【図８】ＳＰＲ分析を介した３種の抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体のＫＤ値を見せる結果を示したものである。
【図９】ＮＲＰ１過発現患者由来細胞に対する抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体断片の結合能を示すＦＡＣＳ分析結果である。
【図１０Ａ−１０Ｃ】３種の抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体の内在化機能を示す共焦点レーザー走査顕微鏡写真である。
【図１１】Ｕ８７ＭＧ細胞株を利用した抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体断片の細胞移動抑制効果を見せる結果を示したものである。
【図１２】３種の抗ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体に対する産生純度を示した結果である。
【図１３】３種の抗ＮＲＰ１  ＩｇＧ抗体に対するｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｔｅｓｔ結果を示したものである。
【図１４】ＥＬＩＳＡを利用した抗ＮＲＰ１  ＩｇＧのＫＤ値を測定した結果を示したものである。
【図１５】３種の抗ＮＲＰ１  ＩｇＧのヒトＮＲＰ１に対する特異的な結合能を測定した結果を示したものである。
【図１６】Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇを利用した癌細胞特異的な内在化結果を示したものである。
【図１７】Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇを利用した正常細胞内在化結果を示したものである。
【図１８】ＦＡＣＳを利用した癌細胞特異的な内在化結果を示したものである。
【図１９】膠芽細胞腫ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌにおけるＩＲＣＲ−１０１（３Ｈ１０）内在化結果を示したものである。
【図２０】ＩＲＣＲ−１０１（３Ｈ１０）の癌細胞特異的結合能を示した結果である。
【図２１】膠芽細胞癌ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌで癌特異的ＮＲＰ１に対するＩＲＣＲ−１０１（３Ｈ１０）の結合能を示した結果である。
【図２２】膠芽細胞腫ｐａｔｉｅｎｔ  ｓａｍｐｌｅで癌特異的ＮＲＰ１に対するＩＲＣＲ−１０１（３Ｈ１０）の結合能を示した結果である。
【図２３】膠芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧと患者由来細胞を利用した細胞移動能抑制結果を示したものである。
【図２４】膠芽細胞腫ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌにおけるＩＲＣＲ−１０１（３Ｈ１０）の新生血管生成抑制効果結果を示したものである。
【図２５】ＩＲＣＲ−１０１処理時関連信号因子変化結果を示したものである。
【図２６】膠芽細胞癌ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍｏｄｅｌでＩＲＣＲ−１０１の分布確認結果を示したものである。
【図２７】Ｍａｌｅ、Ｆｅｍａｌｅ  Ｍｏｎｋｅｙ  ＴＭＡ分析結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００２４】
一観点において、本発明は、ＮＲＰ１（Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ  １）に対する抗体またはその抗原結合断片として、細胞表面に発現されたＮＲＰ１に結合して細胞内に内在化されることを特徴とする抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００２５】
本発明者等は、様々な癌で発現すると知られているＮＲＰ１に結合して細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）される坑癌治療用抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者等は、ファージディスプレイ技術を利用して、ＮＲＰ１に高い親和力で結合して細胞内に内在化する抗−ＮＲＰ１抗体を製造して、このような抗−ＮＲＰ１抗体が癌細胞の移動を顕著に抑制させることができることを確認した。
【００２６】
本発明の一実施例で、本発明の抗−ＮＲＰ１抗体が、癌細胞表面に発現されたＮＲＰ１に結合された後、細胞内に内在化されることを確認した（図１０Ａ〜１０Ｃ参照）。細胞表面のＮＲＰ１に結合して該当部位の下位信号伝達を遮断する抗体とは異なり、本発明の抗体は、細胞表面のＮＲＰ１に結合して細胞内に入るので、ＮＲＰ１と関連した全ての信号伝達を遮断することができて、より大きい治療効果が期待できる。
【００２７】
本明細書の「ニューロピリン」または「ＮＲＰ」は、集合的にニューロピリン−１（ＮＲＰ１）、ニューロピリン−２（ＮＲＰ２）およびそれらのイソ型および変異体を含む。ニューロピリンは、１２０〜１３０ｋＤａ非−チロシンキナーゼ受容体である。多数のＮＲＰ−１およびＮＲＰ−２スプライス変異体および可溶性イソ型がある。ニューロピリンの基本構造は、５個のドメインを含む：３個の細胞外ドメイン（ａ１ａ２、ｂ１ｂ２およびｃ）、膜貫通ドメインおよび細胞質性ドメイン。ａ１ａ２ドメインは、２個のジスルフィドブリッシを形成する４個のシステイン残基を一般に含有する補体成分ＣｌｒおよびＣｌｓ（ＣＵＢ）と相同性である。ｂ１ｂ２ドメインは、凝固因子ＶおよびＶＩＩＩと相同性である。ｃドメインの中央部は、メプリン（ｍｅｐｒｉｎ）、Ａ５および受容体チロシンフォスファターゼμタンパク質との相同性のために、ＭＡＭと命名される。ａ１ａ２およびｂ１ｂ２ドメインは、リカンド結合に責任がある一方、ｃドメインは同種−二量体化または、異種−二量体化において決定的である。
【００２８】
「ニューロピリン−１媒介生物学的活性」は、ニューロピリン−１が実質的役割をする生理的または病理学的状態を意味する。例えば、胚芽神経系発生または神経細胞再生の間のエクソン案内、血管形成（血管再形成含む）、腫瘍生成および腫瘍転移であってもよいが、これに制限さない。
【００２９】
本発明で使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＮＲＰ１に特異的に結合する抗−ＮＲＰ１抗体を意味する。本発明の範囲にはＮＲＰ１に特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【００３０】
完全型抗体は、二つの全長（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および二つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有して、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００３１】
抗体の抗原結合断片または抗体断片とは、抗原結合能力を有する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖを含む。抗体断片の中Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（Ｃ  Ｈ１ドメイン）を有する構造で一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖Ｃ  Ｈ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有している最小の抗体断片として、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されていたり、またはＣ末端で直ちに連結されるため、二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を形成することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術を介して製作することができる。
【００３２】
一実施例で、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）中いずれか一つのイソタイプから選択され得る。例えば、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）またはガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ型であってもよい。
【００３３】
本明細書で使用される用語、「重鎖」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣ  Ｈ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む全長重鎖およびその断片をいずれも意味する。また、本明細書で使用される用語、「軽鎖」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片をいずれも意味する。
【００３４】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）および抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、または前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されない。
【００３５】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち集団を占めている個々の抗体が微量で存在することができる可能な天然発生的突然変異を除いては同じであることを指し示す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。
【００３６】
前記「ヒト化」形態の非−ヒト（例：ミューリン）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、収容者の超可変領域からの残基を目的する特異性、親和性および能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基で代替させたヒト免疫グロブリン（収容者抗体）である。
【００３７】
前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されているものを意味する。
【００３８】
重鎖および／または軽鎖の一部が特別な種から由来したり特別な抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である一方、残りの鎖（等）は、さらに他の種から由来したりさらに他の抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでなく目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
【００３９】
本願に使用されたような「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を指し示す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指し示す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指し示す。
【００４０】
「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）」は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し示す。各可変ドメインは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００４１】
「フレームワーク領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された四つのＦＲを有する。
【００４２】
一実施例で、本発明は、下記の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）及び軽鎖ＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する：配列番号１または７の配列を有するＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）Ｈ１、配列番号２または８の配列を有するＣＤＲＨ２、及び配列番号３、９及び１３で構成された群から選択されたいずれか一つの配列を有するＤＲＨ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４または１０の配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５、１１及び１４で構成された群から選択されたいずれか一つの配列を有するＣＤＲＬ２、及び配列番号６、１２及び１５で構成された群から選択されたいずれか一つの配列をＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
【００４３】
一実施例で、本発明は、下記のＣＤＲを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する：
配列番号１〜３の各配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４〜６の各配列を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号７〜９の各配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０〜１２の各配列を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域；または
（ｉｉｉ）配列番号７、８及び１３の各配列を有するＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０、１４及び１５の各配列を有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域。
一実施例で、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８〜３３の配列で構成された群から選択された一つの配列を有する重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）を含む重鎖可変領域を含んでもよい。
【００４４】
この場合、前記重鎖可変領域は、配列番号２８の配列を有する重鎖ＦＲ１、配列番号２９または３０の配列を有する重鎖ＦＲ２、配列番号３１または３２の配列を有する重鎖ＦＲ３、または配列番号３３の配列を有する重鎖ＦＲ４を含んでもよい。
【００４５】
また、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３４〜４２の配列で構成された群から選択された一つの配列を有する軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００４６】
この場合、前記軽鎖可変領域は、配列番号３４〜３６中いずれか一つの配列を有する軽鎖ＦＲ１、配列番号３７〜３９中いずれか一つの配列を有する軽鎖ＦＲ２、配列番号４０または４１の配列を有する軽鎖ＦＲ３、または配列番号４２の配列を有する軽鎖ＦＲ４を含んでもよい。
【００４７】
一実施例で、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、下記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでもよい：
（ｉ）配列番号１６の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１７の配列を有する軽鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号１８の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９の配列を有する軽鎖可変領域；または（ｉｉｉ）配列番号２０の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２１の配列を有する軽鎖可変領域。
【００４８】
より具体的には、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、下記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
（ｉ）配列番号１６の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１７の配列を有する軽鎖可変領域（４Ｆ１２抗体）；
（ｉｉ）配列番号１８の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号１９の配列を有する軽鎖可変領域（１Ａ０３抗体）；または
（ｉｉｉ）配列番号２０の配列を有する重鎖可変領域及び配列番号２１の配列を有する軽鎖可変領域（３Ｈ１０抗体）。
【００４９】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識および結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖで頑固に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【００５０】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および不変ドメインと、重鎖の可変および第１不変ドメイン（Ｃ  Ｈ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）抗体断片は、一般にそれらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近くに共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【００５１】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的する構造を形成することができるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを追加で含むことができる。
【００５２】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速かつ効率よく分類することができるとの事実にある。ペプチドおよびタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイするのは、特異的結合特性を有するポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに使用されてきた。
【００５３】
ファージディスプレイ技術は、特定リカンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成および選別するための強力なツールを提供した。ファージディスプレイ技術を使用して、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させて、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質またはポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低水準で発現されて野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現されて粒子感染性が維持される。
【００５４】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおける機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発するに当たり重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多くの方式、例えば無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法または関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象として、目的する特徴を伴った抗体または抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【００５５】
ファージディスプレイ技術は、目的する特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマおよび組換え方法に比べていくつかの利点を有している。このような技術は動物を使用しなくても短時間で様々な配列を有する大きい抗体ライブラリーを生成させることができるようにする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間を要することがある。また、免疫が全く求められないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性や抗原性が低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。さらにファージ抗体ライブラリーを使用して新規な治療的抗体を生成および確認することができる。
【００５６】
ファージディスプレイライブラリーを使用して免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖細胞系列配列、または未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を使用することができる。各種リンパ系組織を使用して、未感作または非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
【００５７】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認および分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離するのは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における産生効率およびライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは、抗体または抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コドンの存在による非効率的産生によって減少される。細菌性細胞における発現は、抗体または抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／不変界面の表面や選別されたＣＤＲ残基における残基を交代で突然変異させることによって改善させることができる。フレームワーク領域の配列は、細菌性細胞で抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一つの要素である。
【００５８】
高親和性抗体分離において、抗体または抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、これらがたびたび抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列および構造的立体形態面で非常に多様であるため、これを利用して様々なライブラリーを製造することができる。
【００５９】
また、各位置で２０個のアミノ酸全てを使用して可変重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個全てのアミノ酸を使用すると多様性が大きい変異体抗体配列が生成されて、新規な抗体を確認する機会が増加する。
【００６０】
本発明の抗体または抗体断片は、ＮＲＰ１を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗−ＮＲＰ１抗体の配列だけでなく、これの生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度および／またはその他生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入および／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸の側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疏水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいて起きる。アミノ酸の側鎖置換体の大きさ、形および種類に対する分析によって、アルギニン、リジンとヒスチジンは共に正電荷を帯びる残基で；アラニン、グリシンとセリンは、類似する大きさを有して；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、類似する形を有することが分かる。従って、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、生物学的に機能均等物といえる。
【００６１】
変異を導入するに当たり、アミノ酸の疏水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。各アミノ酸は、疏水性と電荷により疏水性インデックスが付与されている：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルタート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００６２】
タンパク質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を付与するに当たり、疏水性アミノ酸インデックスは大変重要である。類似する疏水性インデックスを有するアミノ酸で置き換えてこそ類似の生物学的活性を保有できることは公示された事実である。疏水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、さらに好ましくは±０．５以内の疏水性インデックス差を示すアミノ酸の間に置換を行う。
【００６３】
一方、類似する親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有するタンパク質を招くことも周知である。米国特許第４５５４１０１号に開示された通り、次の親水性値が各アミノ酸残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルタート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００６４】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質におけるアミノ酸交換は、当該分野に公示されている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常的に起きる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００６５】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮するならば、本発明の抗体またはこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、よりさらに好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公示されている。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、ＮＢＣＩなどからアクセス可能で、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動されて利用することができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。
【００６６】
他の観点において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体またはその抗原結合断片を組換え的に産生することができる。核酸を分離して、これを複製可能なベクター内に挿入して追加でクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）または追加で発現させる。これを基に、さらに他の観点において、本発明は前記核酸を含むベクターに関する。
【００６７】
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有して、核酸で基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【００６８】
一実施例で、本発明に係る抗体またはその抗原結合部位中で重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６であってもよく、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２３、配列番号２５または配列番号２７であってもよい。
【００６９】
本発明の核酸は、前記ヌクレオチド配列に対し実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。実質的な同一性とは、本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合、最小８０％の相同性、より好ましくは９０％の相同性、最も好ましくは最小９０％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００７０】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離または合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクターの成分には、一般に次の中の一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製基点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、および転写終結配列。
【００７１】
本発明で使用する用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段として、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記ベクターで抗体をコードする核酸は、プロモーターに作動的に連結されている。
【００７２】
用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味して、これによって前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または、解読を調節するようになる。
【００７３】
使用されるベクターが原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーターおよびＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、ベクターが真核細胞を宿主とする場合には、ほ乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーターおよびヒト筋肉クレアチンプロモーター）またはほ乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニー（ｍｏｌｏｎｅｙ）ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００７４】
場合により、ベクターは、それから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）および６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）等がある。
【００７５】
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常使用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネテシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００７６】
さらに他の観点においで、本発明は、上述したベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体形成させるために使用された細胞は原核生物酵母または高等真核生物細胞であってもよいが、これに制限されない。
【００７７】
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチルスおよびバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）またはスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）のような原核宿主細胞を利用することができる。
【００７８】
但し、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ  ５、ＦＳ４、Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０ＳまたはＨＴ１０８０であってもよいが、これに制限されない。
【００７９】
さらに他の観点においで、本発明は、（ａ）前記細胞を培養する段階；および（ｂ）前記培養された細胞で抗体またはその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関する。
【００８０】
前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地から制限せず培養培地として使用することができる。当業者に公示されているその他いずれの必須補充物が適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが、発現のために選別された宿主細胞と共にすでに使用されていて、これは当業者に明白である。
【００８１】
前記抗体またはその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離または、限外ろ過によって不純物を除去して、その結果を、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを利用して精製することができる。さらにその他の精製技術、例えば陰イオンまたは、陽イオン交換クロマトグラフィー、疏水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。
【００８２】
さらに他の観点においで、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片および薬物を含む抗体−薬物接合体に関する。ＮＲＰ１は、癌細胞の表面で過発現される分子であるため、本発明の抗体に薬物を追加的に結合させた抗体−薬物接合体を使用すると、正常細胞には最小限の影響を与えながら癌細胞だけを選択的にターゲッティングすることができる。
【００８３】
前記薬物には、化学物質、放射性核種、免疫治療剤、サイトカイン、ケモカイン、毒素、生物作用剤および酵素阻害物質などが含まれる。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、抗癌剤と直接または間接的に結合されることができ、前記抗癌剤は、例えば、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール、アクロナイシン、アドゼレシン、アラノシン、アルデスロイキン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アモナフィド、アンプリジェン、アムサクリン、アンドロゲン、アングイジン、アフィジコリングリシネート、アサリー（ａｓａｌｅｙ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、Ｂａｋｅｒのアンチホル（Ｂａｋｅｒ’ｓ  Ａｎｔｉｆｏｌ）、β−２−デオキシチオグアノシン、ビスアントレンＨＣｌ、ブレオマイシンサルフェート、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ブチオニンスルホキシミン、ＢＷＡ７７３Ｕ８２、ＢＷ５０２Ｕ８３／ＨＣｌ、ＢＷ７Ｕ８５メシレート、セラセミド、カルベチマー（ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）、カルボプラチン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、クロロキノキサリン−スルホンアミド（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、クロモマイシンＡ３（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ  Ａ３）、シスプラチン、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、コルチコステロイド、コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ＣＰＴ−１１、クリスナトル（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、シクロシチジン、シクロホスファミド、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シテムベナ（ｃｙｔｅｍｂｅｎａ）、ダビスマレエート（ｄａｂｉｓ  ｍａｌｅａｔｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣＬ（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ  ＨＣＬ）、デアザウリジン、デクスラゾキサン（ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ）、ジアンハイドロガラクチトール（ｄｉａｎｈｙｄｒｏｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）、ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジブロモズルシトール（ｄｉｂｒｏｍｏｄｕｌｃｉｔｏｌ）、ジデムニンＢ（ｄｉｄｅｍｎｉｎ  Ｂ）、エチルジチオカルバメート（ｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ）、ジグリコアルデヒド（ｄｉｇｌｙｃｏａｌｄｅｈｙｄｅ）、ジヒドロ−５−アザシチジン、ドキソルビシン、エキノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）、エダトレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、エデルホシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）、エフロルニチン（ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、エリオット溶液（Ｅｌｌｉｏｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、リン酸エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エストロゲン、エタニダゾール（ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）、エチオホス（ｅｔｈｉｏｆｏｓ）、エトポシド、ファドラゾール（ｆａｄｒａｚｏｌｅ）、ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）、フェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、フィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）、フラボン酢酸（ｆｌａｖｏｎｅ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、リン酸フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、５’−フルオロウラシル、ＦｌｕｏｓｏｌＴＭ、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、硝酸ガリウム、ゲムシタビン、酢酸ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ  ａｃｅｔａｔｅ）、ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）、ヘキサメチレンビスアセタミド（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｓａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ホモハリントニン（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ）、硫酸ヒドラジン、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、ヒドロキシ尿素、イダルビシンＨＣＬ（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ  ＨＣＬ）、イフォスファミド、４−イポメアノール（４−ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）、イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）、イソトレチノイン（ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、ロイコボリンカルシウム（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ  ｃａｌｃｉｕｍ）、酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、レバミソール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、リポソームダウノルビシン（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、リポソーム被包性ドキソルビシン、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、塩酸メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、メノガリル（ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メスナ（ｍｅｓｎａ）、バチルス・カルメット−グエリンのメタノール抽出物、メトトレキサート、Ｎ−メチルホルムアミド、ミフェプリストン（ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトマイシン−Ｃ、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、塩酸ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、モノサイト／マクロファージコロニー刺激因子、ナビロン（ｎａｂｉｌｏｎｅ）、ナフォキシジン（ｎａｆｏｘｉｄｉｎｅ）、ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、酢酸オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラ（ｐａｌａ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、ピペラジンジオン、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）、塩酸ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＰＩＸＹ−３２１、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ポルフィマーナトリウム（ｐｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロゲスチン、ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａ��ｏｓｔｉｍ）、セムスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、スロフェヌール（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）、スラミンナトリウム（ｓｕｒａｍｉｎ  ｓｏｄｉｕｍ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、テガフール（ｔｅｇａｆｕｒ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、テレフタルアミジン（ｔｅｒｅｐｈｔａｌａｍｉｄｉｎｅ）、テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）、チオグアニン、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）注射、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、塩酸トリフルオペラジン（ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、トリフルリジン（ｔｒｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）、ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌ  ｍｕｓｔａｒｄ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）、Ｙｏｓｈｉ８６４、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シトシンアラビノシド、エトポシド、メルファラン、タクソテールおよびタキソールなどが挙げられる。
【００８４】
さらに他の観点においで、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片または前記抗体−薬物接合体を有効性分として含む癌の予防または治療用組成物に関する。
【００８５】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＮＲＰ１に対する抗体またはその抗原結合断片、または抗体−薬物接合体の薬剤学的有効量；および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防または治療用薬剤学的組成物であってもよい。本発明はまた、患者に必要な有効な量で本発明に係るＮＲＰ１に対する抗体またはその抗原結合断片、または抗体−薬物接合体を投与する工程を含む癌の予防または治療方法に関する。
【００８６】
前記組成物は上述した本発明の抗−ＮＲＰ１抗体またはその抗原結合断片を有効性分として利用するため、この両者に共通した内容は、繰り返し記載による本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００８７】
下記の実施例で立証された通り、本発明に係る抗−ＮＲＰ１抗体は、ＮＲＰ１を発現する癌細胞の移動を抑制することができる（図１１参照）。このように本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＮＲＰ１に高い親和度で結合してＮＲＰ１を過発現する癌細胞の移動を抑制することができるので、抗体単独または抗体−薬物接合体形態で癌の予防および治療に使用可能である。
【００８８】
「予防」とは、本発明に係る組成物の投与で癌を抑制させたり進行を遅延させるいずれの行為を意味し、「治療」とは、癌の発展の抑制、癌の軽減または癌の除去を意味する。
【００８９】
前記組成物に採用される疾患である癌は、ＮＲＰ１を過発現する癌であり、例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、睾丸癌、大腸癌、黒色腫、膵臓癌、肺癌、乳癌、食道癌および前立腺癌等であってもよい。
【００９０】
「ＮＲＰ１を過発現する癌」とは、同じ組織類型の非−癌性細胞と比較して有意に高い水準でＮＲＰ１を癌細胞表面に有している癌を意味する。
【００９１】
一実施例で、本発明に係る組成物は癌細胞の転移または浸潤を抑制するためのものである。本発明はまた、本発明に係るＮＲＰ１に対する抗体またはその抗原結合断片、または抗体−薬物接合体を処理して癌細胞の転移または浸潤を抑制する方法に関する。
【００９２】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００９３】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。
【００９４】
経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃腸からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。
【００９５】
本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様であるが、通常の熟練した医師は、目的する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の薬学組成物の１日投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書で用語「薬剤学的有効量」とは、癌を予防または治療するのに十分な量を意味する。
【００９６】
本発明の薬剤学組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または、賦形剤を利用して製剤化することによって、単位容量形態で製造されるか、または多用量容器内に内含させて製造されることができる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態やエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【００９７】
前記組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与されることができる。
【実施例】
【００９８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００９９】
実施例１．患者由来細胞を利用した内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体同定
抗−ＮＲＰ１抗体断片同定ための細胞パニング（ｃｅｌｌ  ｐａｎｎｉｎｇ）に必要な細胞を選別するために事業団（サムスンソウル病院難治癌研究事業団）で保有している患者由来細胞中、ＮＲＰ１の発現水準が高い細胞をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）方法で選別した。これらの中最も多く表面にＮＲＰ１を発現する１３１細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）機関から得た患者由来細胞）を細胞パニングに利用した。１３１細胞のＦＡＣＳ分析結果は、図１に明示されている。
【０１００】
従来に製作された合成ｓｃＦｖ抗体断片ファージライブラリー（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．２７：２２５−２３５，２００９）を利用してヒトＮＲＰ１に結合するｓｃＦｖ抗体断片をファージディスプレイスクリーニングを介して同定した。大腸菌宿主ＥＲ２５３７内に導入されているファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターをファージ（ｐｈａｇｅ）形態で回収するために、４個の下位ライブラリーサンプルを各４００ｍｌの培養培地（ＳＢ／アンピシリン／２％グルコース）で２時間培養した。Ｏ．Ｄ６００で吸光度が０．５−０．７程度になると、５０００ｇで２０分間遠心分離して上澄み液を除去した後、４００ｍｌの２次培養培地（ＳＢ／アンピシリン）内に浮遊させた後、１０１２ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）のヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加して１時間培養した。その次に、カナマイシン抗生剤（ヘルパーファージ内導入された抗生剤遺伝子）を７０μｇ／ｍｌ添加した後、３０℃で一晩培養をしてファージライブラリーが宿主細胞外に分泌されるようにした。引き続き遠心分離を介して得た培養物をＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）溶液を利用して、ファージ形態だけ沈殿させてファージライブラリーを得た。
【０１０１】
このように得られたファージライブラリーとＮＲＰ１発現が高い患者由来細胞である１３１細胞（４Ｘ１０６）を混ぜて計５ｍｌ  ＮＢＡ（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）に入れて、４℃の回転機に固定させた後、１−２時間３６０°に回転させた。その次に、１３１細胞に結合しなかったファージ粒子を除去するために、３００ｇで５分間遠心分離して細胞を分離させた後、再び５ｍｌ  ＮＢＡを入れる洗浄過程を進めた。この過程を４回繰り返して、最後の過程では、予め３７℃のインキュベーターに置いたＮＢＡ  ５ｍｌを使用して、１３１細胞とファージをＴフラスコに入れて、３７℃で３０分間培養させて、細胞表面に付いたファージ粒子が内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を介して細胞中に入るように誘導した。
【０１０２】
その次に、１５ｍｌチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ）に移した後、３００ｇで５分間遠心分離させて細胞を分離させた後、この過程を冷たいＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）５ｍｌを入れる洗浄過程を６回繰り返して行って、細胞パニングの回数が重なるほどこの過程の回数を増加させた。以後、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．２）５ｍｌを入れて、常温で５分間置いて細胞表面にあるファージ粒子を細胞表面から分離させた。以後、３００ｇで５分間遠心分離させて細胞だけ分離させて、０．５ｍｌ  １００ｍＭ  ＴＥＡを入れて、これをｅ−チューブに移して常温で１５分間置いた。次に、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離させて細胞残渣を分離して細胞中にあるファージ粒子がある上澄み液を取って１ｍｌ  ２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）と混ぜて中和させた後、予め育てて置いたＥＲ２５３７が入っている８．５ｍｌの培養培地（ＳＢ）に入れて、３７℃で１２０ｒｐｍで培養させて、ファージ粒子を大腸菌宿主であるＥＲ２５３７に感染させた。以後、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させて沈んだＥＲ２５３７を培養培地（ＳＢ）５００ｕｌで混ぜた後、１５ｃｍ培養培地に塗抹して培養後、５ｍｌのＳＢ培養培地（５０％グリセロール）を添加してコロニーを回収および保管（−８０℃）した。引き続き繰り返される細胞パニング回数を進めるために保管された前回のファージ溶液中１ｍｌを取ってファージ粒子増幅作業を行った。宿主細胞であるＥＲ２５３７に培養後、ヘルパーファージを入れて回収されたファージ粒子は、ＰＥＧ沈殿を介して分離して、これを次回のパニング時も同様に使用した。３回目パニングを行って、このような細胞パニング過程は図２に示した。回数が重なるほどパニング前対比後のファージ粒子の割合が増加することを確認して、これは細胞パニングを経て内在化されたファージ粒子が増幅されることを意味して、これの結果を表１に示した。
【０１０３】
【表１】
0006475835.tif 000002
【０１０４】
実施例２．抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ候補選別のためのＥＬＩＳＡおよび配列分析
３回目細胞パニングで回収されたファージ粒子を宿主細胞（ＥＲ２５３７）感染を介して培養培地でコロニーで確認した。このコロニーを取って２００ｕｌ  ＳＢ／アンピシリン培養培地が入った９６−ウェルプレートに接種後、３７℃で２−３時間培養した。
【０１０５】
その次に、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩタンパク質発現誘導のために、各ウェルに終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理して３０℃で一晩培養した。培養したプレートは、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、培養細胞ペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）内にあるファージ粒子を回収するために、各ウェル当たり４０ｕｌのＴＥＳ溶液（２０％ｗ／ｖスクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れて、４℃で３０分間静置することによって細胞を溶解させた。以後、６０ｕｌの０．２Ｘ  ＴＥＳ溶液を処理して４℃で３０分間置いて浸透圧で細胞を分解させた後、プレートを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させて上澄み液のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩタンパク質を得た。
【０１０６】
予め準備したヒトＮＲＰ１タンパク質がコートされた９６−ウェルプレートに、得られた上澄み液中２５ｕｌを各該当ウェルに添加した後、１時間室温で結合させた後、ＴＢＳＴと蒸溜水を利用して６回洗浄した。以後、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩのＨＡ  ｔａｇに結合できるＨＲＰが結合された抗−ＨＡ抗体を利用して、１時間室温で結合させた後、再びＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）と蒸溜水を利用して６回洗浄した。ＴＭＢ溶液を利用した発色反応を誘導した後、Ｈ２ＳＯ４溶液で発色反応を止めて、Ｏ．Ｄ４５０ｎｍでその値を測定した。
【０１０７】
分析された全クローン数は３８４個であり、この中４１個のクローン（結合能倍数＞２）がヒトＮＲＰ１に対する高い結合能を示した（図３）。対照群では、ＢＳＡ溶液が使用されて、この４１個のクローン中再確認ＥＬＩＳＡを介して結合能が高い１０個のクローンを選択した。以後、１０個のクローンからファージミドを回収した後、ＤＮＡ配列分析を進めて、計６個の異なる配列を有するクローンを選別した。１Ｃ０８と同じ配列である３Ｈ１０を除いては、各異なる配列を有するクローンが選別されて、最終的に３Ｈ１０、１Ａ０３および４Ｆ１２クローンを抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ候補として選択した。３Ｈ１０、１Ａ０３および４Ｆ１２クローンのアミノ酸配列を表２に示した。
【０１０８】
【表２】
0006475835.tif 000003
【０１０９】
実施例３．抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ産生およびＮＲＰ１結合能確認
ファージミドの基本構成は、図４で確認でき、前記実施例で使用された宿主細胞ＥＲ２５３７の場合、ｐｈａｇｅ  ｐＩＩＩの前に位置した転写抑制コドン（ａｍｂｅｒ  ｃｏｄｏｎ（ＵＡＧ））を抑制するため、ｓｃＦｖ単独発現が不可能である。従って、非抑制宿主（ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）である発現菌株（ＴＯＰ１０Ｆ’）を利用してファージミドを発現菌株内に形質導入した。以後、ＤＮＡ配列分析を介して各ファージミドが突然変異なしに導入された発現菌株を確認し、この発現菌株をコロニーで取った後、ＬＢ／アンピシリン培養培地３ｍｌに接種後、３７℃で一晩培養した。その後、一晩培養させた培養液３ｍｌは、４００ｍｌ培養培地（ＳＢ／アンピシリン）に移してＯ．Ｄ６００で０．５−０．７になる時まで培養して、終濃度１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して、３０℃で一晩培養した。培養液は遠心分離後、ＴＥＳ溶液４０ｍｌを利用して発現宿主を溶解させた後、Ｏ．２Ｘ  ＴＥＳ  ６０ｍｌを投入してペリプラズム内ファージ粒子を回収して、回収した上澄み液は、０．４５ｕｍフィルターを介してろ過した。ろ過された溶液内に存在するｓｃＦｖタンパク質は、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製のために、Ｎｉ−ＮＴＡ  ｂｅａｄ（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌが添加されて常温で１時間結合され、以後自然落下式コラム（ｇｒａｖｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ，Ｂｉｏ−ｒａｄ）にパッキングされて２００ｍＭイミダゾール溶液を介して回収した。各クローンの発現および精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を介してｓｃＦｖ該当の大きさである約２８ｋＤａを確認した（図５）。
【０１１０】
精製されたｓｃＦｖを利用してＥＬＩＳＡを進めて標的ＮＲＰ１に対する結合能が存在するか否かを確認した。ＥＬＩＳＡ（３回繰り返し）で２００ｎｇ  ＮＲＰ１タンパク質をコートした９６ウェルと対照群であるＢＳＡ２００ｎｇをコートした９６ウェルに各クローン当たり５μｇ／ｍｌ水準で常温で１時間結合させた。その後、０．１％ＴＢＳＴを利用して３回洗浄した後、ＨＲＰが結合されたＨＡ抗体を１時間処理して、再度洗浄した後、ＴＭＢ溶液で５分間静置させた。そして、２Ｍ硫酸溶液で発色反応を停止させた後、ＯＤ値を測定した。
測定結果、ＮＲＰ１に結合しない１２Ｂ  ｓｃＦｖに比べて１Ａ０３、３Ｈ１０および４Ｆ１２  ｓｃＦｖは、ＮＲＰ１に対する特異的な結合能を示した（図６）。
【０１１１】
次に、ヒトＮＲＰ１に対する各抗体断片の濃度に応じた結合能を測定するために、各２００ｎｇのＮＲＰ１またはＢＳＡがコートされた９６ウェルに各ｓｃＦｖを２，０００ｎｇ／ｍｌ、１，０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌまたは１５．６２ｎｇ／ｍｌ濃度で処理してＯＤ値変化を分析した。ＮＲＰ１に対する結合能において、１２Ｂ  ｓｃＦｖの場合には濃度変化に伴うＯＤ値の変化がないのに対して、１Ａ０３、３Ｈ１０および４Ｆ１２  ｓｃＦｖの場合には高濃度に行くほどＢＳＡ対比ＮＲＰ１に結合したｓｃＦｖが増加することをＯＤ値変化を介して確認することができた（図７）。
【０１１２】
３種のｓｃＦｖ抗体断片のＮＲＰ１タンパク質に対する結合能の強度を数値化を介して正確に調べるために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ，ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）装備であるｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を利用してｋａとｋｄ値を介した最終的なＫＤ値を得た。ＫＤ値はｋｄ値をｋａ値で分けた値であり、低いほど該当物質に対する結合能が大きい。分析結果、４Ｆ１２  ｓｃＦｖの場合、ＫＤ（Ｍ）値が７３．６０Ｘ１０−９と最も低く、続いて１Ａ０３  ｓｃＦｖは、８９．４０Ｘ１０−９のＫＤ（Ｍ）値を示し、３Ｈ１０  ｓｃＦｖは、２９５．４Ｘ１０−９のＫＤ（Ｍ）値を示した（図８）。
【０１１３】
実施例４．ＮＲＰ１過発現細胞株を利用した抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ結合能確認
ヒトＮＲＰ１タンパク質に対する結合能をＥＬＩＳＡで確認した後、実際の細胞膜に存在するＮＲＰ１に結合するか否かを調べるために、ＮＲＰ１発現が高い１３１細胞を利用してＦＡＣＳ分析をした。各ｓｃＦｖ当たり５Ｘ１０５個の１３１細胞と４℃で約１時間結合させた後、ＦＡＣＳ溶液１ｍｌで３回洗浄した。その後、赤色蛍光（ＰＥ；ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｉｎ）が結合されたＨＡ抗体を１μｇ処理して、４℃で３０分間結合させた。引き続き、ＦＡＣＳ溶液１ｍｌで３回洗浄した後、ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭシステムを介して分析した。
【０１１４】
分析結果、ＰＥが結合されたＨＡ抗体と１２Ｂを処理した細胞に比べて、１Ａ０３、３Ｈ１０および４Ｆ１２等３種のｓｃＦｖ抗体断片はいずれもＮＲＰ１が過発現した細胞株に特異的に結合した（図９）。
【０１１５】
実施例５．抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖのＮＲＰ１過発現癌細胞内透過能確認
３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片の場合、細胞内透過性を細胞免疫蛍光染色法で確認した。チャンバースライドにＰＤ−リジン溶液を入れて常温で１−２時間コートさせた。その後、溶液を除去した後、スライドを乾燥させた。次に、５Ｘ１０４個の１３１細胞が入っているＮＢＡ溶液２００ｕｌをスライドに処理した後、３７℃で４−５時間培養してスライドに固定させた。次に、ＮＢＡ溶液を除去して、４％パラホルムアルデヒドを入れて４℃で１０分間固定させた。以後、ＰＢＳで３回洗浄過程を経た後、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を処理した細胞透過度増進作業を行った。以後、ＮＲＰ１タンパク質の染色のために、抗−ヒトＮＲＰ１抗体（Ｒ＆Ｄ）と同時に抗−ＮＲＰ１抗体断片を処理して、３７℃で１５／３０／６０分に分けて結合させた。ＰＢＳで３回洗浄過程を経た後、非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡ溶液で室温で１時間程度ブロッキングした。２次抗体では、ＮＲＰ１タンパク質を見るために緑色蛍光（Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８）が標識されたヤギ抗−マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理して、抗−ＮＲＰ１抗体断片を見るための抗−ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を処理して、常温で１時間結合させた。最後に核を染色するためのＤＡＰＩ染色を行った後、最終洗浄後ガラス蓋をスライド上に固定させた後、共焦点レーザー走査顕微鏡を利用して観察した。
【０１１６】
その結果、３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片全てに、１５分と３０分では、表面に付いた抗−ＮＲＰ１抗体断片と細胞内に挿入された抗−ＮＲＰ１抗体断片が混ざっていたが、６０分程度経過した時はほとんどの抗−ＮＲＰ１抗体断片が細胞内に透過して挿入されたことが確認された（図１０Ａ〜１０Ｃ）。特に、１Ａ０３と３Ｈ１０よりは４Ｆ１２抗体断片が相対的に細胞透過性が経時的に著しく現れた（図１０Ａ）。このような結果は、本発明の抗体を特定タンパク質発現抑制のための物質または治療／診断用化学薬物などを癌細胞内に伝達させる目的で利用できることを示している。
【０１１７】
実施例６．ＮＲＰ１過発現癌細胞株に対するｓｃＦｖ抗体断片の癌細胞移動抑制能確認
同定した１Ａ０３、３Ｈ１０および４Ｆ１２  ｓｃＦｖ抗体断片の癌細胞移動抑制を介した坑癌能力を検定するために、細胞移動分析法を行った。実験は、ＮＲＰ１が高く発現していると知られているＵ８７ＭＧ細胞株（膠芽細胞腫）を使用して、トランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＰＬＯ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を入れて室温で３０分間コートさせた後、自然乾燥させた。その後、１００ｕｌの成長因子が抜けたＤＭＥＭ培養液に５Ｘ１０４個のＵ８７ＭＧ細胞と３種の抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体断片５０μｇ／ｍｌを入れてトランスウェルに入れて、下のウェルには１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ培養液６００ｕｌを入れて、３７℃で一晩培養した。以後、１２ウェルにメタノール、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）６００ｕｌをトランスウェル当たり一つずつ準備した後、トランスウェルをメタノールに１分間置いた後、ヘマトキシリンに５分置いて核を染色した。その次に、水で洗浄した後、水気をなくして、エオシンに３０秒間置いて細胞質を染色させた後、再び水で洗浄して綿棒でトランスウェル内側をきれいに拭いた。
【０１１８】
図１１を見ると、ヘマトキシリンによって核は青黒く染色されて、エオシンによって細胞質は赤く染色された。図１１に示された通り、抗−ＮＲＰ１  ｓｃＦｖ抗体断片を処理しなかった対照群を１００％細胞移動されたと見なした時、１Ａ０３抗体断片を入れた細胞の場合は４１％、３Ｈ１０抗体断片の場合は４６％、４Ｆ１２抗体断片の場合は２９％の細胞移動を示している。このような結果は、３種の抗−ＮＲＰ１抗体断片をＮＲＰ１の発現が高い膠芽細胞腫、肺癌、すい臓癌などの坑癌治療剤として使用できることを示している。
【０１１９】
実施例７．抗ＮＲＰ１  ｓｃＦｖで抗ＮＲＰ１  ＩｇＧへのｔｒａｎｓｆｏｒｍ
抗−ＮＲＰ１抗体断片をＩｇＧ形態で形態転換のために、ＮＲＰ１  ｓｃＦｖの重鎖配列と軽鎖配列の遺伝子をＥｘｐｉ  ２９３Ｆ発現システム（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用して形質注入した。培養液にあるＮＲＰ１  ＩｇＧを得るために、ＡＥＫＴＡタンパク質精製システムとＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを利用して精製を行って、産生量はＩＲＣＲ−１０１（３Ｈ１０）は１２０ｍｇ／Ｌ、ＩＲＣＲ−１０２（１Ａ０３）は６６ｍｇ／Ｌ、ＩＲＣＲ−１０３（４Ｆ１２）は１５ｍｇ／Ｌであった。精製した抗ＮＲＰ１抗体の純度を確認するために、高速液体クロマトグラフィーを導入した。ＩｇＧの大きさが１５０ｋＤであるため、マーカーピークで１６．３８８分で出る物質に該当する。３種のＮＲＰ１抗体（ＩＲＣＲ−１０１、１０２、１０３）がこのピークで検出されて、純度は９９．５、９９．４、９９．５％に該当した（図１２）。産生された３種のＮＲＰ１抗体のｅｎｄｏｔｏｘｉｎ数値を調べるために、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）  ＱＣＬ−１０００ＴＭ  ｋｉｔを利用した。分析した結果３種の抗体は、０．５−３．１ＥＵ／ｍｇ程度で治療用タンパク質のｅｎｄｏｔｏｘｉｎ正常数値に該当した（図１３）。
【０１２０】
３種のＮＲＰ１抗体を利用してヒトＮＲＰ１に対する結合力をＥＬＩＳＡとＳＰＲ  ａｎａｌｙｓｉｓを介して分析した結果、１Ａ０３、３Ｈ１０、４Ｆ１２順に結合力が強いことを確認した。特に４Ｆ１２の場合、現在の治療用抗体水準の結合力である０．６ｎＭのＫＤ値を有する（図１４）。ヒトＮＲＰ１と類似する構造を有する他のタンパク質と比較することによって、ヒトＮＲＰ１に対する特異的結合力を分析した結果、３個のＮＲＰ１抗体全てがヒトＮＲＰ１にだけ結合することを確認した（図１５）。
【０１２１】
実施例８．癌細胞と正常細胞を利用して癌特異的な内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および結合力確認
ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）  Ｒｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＃ｐ３５３６３）を利用して３種の抗ＮＲＰ１  ＩｇＧが癌細胞と正常細胞で内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）される様子を比較した。前記ｋｉｔの原理は、抗体に発色試料をｃｏｎｊｕｇａｔｅさせて該当抗体が細胞外にあると発色されないのに対して、細胞中に入って周りの環境が酸性化されると発色する原理を利用して、該当抗体の細胞内在化を確認することができる。３種のＮＲＰ１  ＩｇＧにｃｏｎｊｕｇａｔｅさせて患者由来癌細胞と正常細胞であるＨＵＶＥＣ細胞を利用してｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ様子を比較した結果、患者由来癌細胞で２０分経過時から内在化された抗体が観察され始めた（図１６）。一方、正常細胞であるＨＵＶＥＣ細胞では、ＩＲＣＲ−１０３は、２時間経過内在化された抗体が観察され始めて、ＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２抗体は、内在化された抗体が発見されなかった。そこで、ＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２抗体は、癌細胞特異的な内在化を示すことを確認した（図１７）。
【０１２２】
正常細胞と癌細胞に対する４℃結合条件と３７℃（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）における結合を比較して、ＦＡＣＳで分析した。ＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２の二つの抗体は、４℃条件で正常細胞と癌細胞における内在化が起きないため、経時的に、細胞表面の抗体量が増加するか変化が殆どなかった。一方、３７℃条件では癌細胞だけで内在化されて細胞表面の抗体量が経時的に少なくなることが確認された。それに対して、ＩＲＣＲ−１０３抗体は、３７℃条件で正常細胞と癌細胞で内在化が起きて細胞表面の抗体量が経時的に少なくなることが確認された（図１８）。これにより、ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇとＦＡＣＳ分析を介してＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２抗体の癌特異的内在化機能を確認した。
【０１２３】
膠芽細胞腫ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌでＣｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ、ＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２を静脈注射を介して注入してから２０時間後、ｓａｃｒｉｆｉｃｅしてｃｅｌｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを介してｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌに分離後、ＦＡＣＳを介して癌細胞に対する内在能を比較して見た。Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎを介して癌細胞内にｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇされた抗体だけを選別した結果ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ対比ＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２は、５−６倍高いＭＦＩ（Ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）値を示した。先のＩｎ  ｖｉｔｒｏと同様にＩｎ  ｖｉｖｏモデルでも癌細胞特異的な内在能を確認した（図１９）。
【０１２４】
４℃の結合条件でＩＲＣＲ−１０１と既存ＮＲＰ１抗体を利用して正常細胞と癌細胞に対する結合力差を比較して見た。同じ濃度処理時、既存ＮＲＰ１抗体は、癌細胞対比正常細胞に、より大きい結合力を示すのに対して、ＩＲＣＲ−１０１は癌細胞特異的な結合力を示すことを確認した（図２０）。
【０１２５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌでも再現されるか否かを確認するために、膠芽細胞腫ｘｅｎｏｇｒａｆｔから得た癌組織を利用して、ＩＨＣ（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）とＩＦ（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で分析して見た。既存ＮＲＰ１抗体は、正常内皮細胞で構成された血管に結合力を示すのに対して、ＩＲＣＲ−１０１は、正常内皮細胞に結合しなかった（図２１）。これは、膠芽細胞腫患者組織でも同様に観察された（図２２）。
【０１２６】
実施例９．癌細胞移動と新生血管成長抑制確認
膠芽細胞腫細胞株であるＵ８７ＭＧと患者由来細胞を利用して、３種のＮＲＰ１抗体が癌細胞移動を抑制するか否かを確認した。各抗体処理後、２４時間３７℃で培養させた後確認した結果、ＩＲＣＲ−１０１、ＩＲＣＲ−１０２の場合、二つの細胞共に５０％以上癌細胞移動を抑制して、ＩＲＣＲ−１０３は、患者由来細胞で４０％程度癌細胞移動を抑制させた（図２３）。
【０１２７】
膠芽細胞腫ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌでＩＲＣＲ−１０１を静脈注射を介して２週間注入した後、ＣＤ３１変化を介して新生血管生成に影響を与えるか否かを調べた。対照群対比ＣＤ３１が顕著に少なくなることが分かり、血管の数及び血管の太さ共に減少した。従って、ＩＲＣＲ−１０１は、膠芽細胞腫で細胞移動能と共にＩｎ  ｖｉｖｏモデルで新生血管生成を抑制することを確認した（図２４）。
【０１２８】
ＩＲＣＲ−１０１処理時関連信号伝達物質の変化を調べるために、１５、３０、１２０分にＮＲＰ１、ＡＫＴ、ＥＲＫ変化をＩｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇを介して調べた。ＮＲＰ１の場合、３０分に完全にｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎされて見られないことを確認して、ＡＫＴとＥＲＫは、リン酸化されたＡＫＴとＥＲＫが減ることによって、これと関連した信号機序を抑制することを確認した（図２５）。
【０１２９】
実施例１０．Ｉｎ  ｖｉｖｏモデルでＩＲＣＲ−１０１分布確認とＭｏｎｋｅｙ  ＴＭＡ分析
膠芽細胞癌ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｍｏｄｅｌでＩＲＣＲ−１０１に蛍光物質を標識した後、これを静脈注射で注入して経時的な蛍光強度変化を観察した。１５ｍｉｎ、１ｈｒ、１ｄａｙ、２ｄａｙを観察した結果、１ｄａｙ時にｔｕｍｏｒ位置と一致する部位で強く蛍光が発色して３ｄａｙまで同じ位置で蛍光が発色することを確認した（図２６）。
【０１３０】
ＩＲＣＲ−１０１のｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔを調べるため、既存ＮＲＰ１抗体と共にｍａｌｅ、ｆｅｍａｌｅ  Ｍｏｎｋｅｙ  ＴＭＡ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｍｉｃｒｏＡｒｒａｙ）を実行した。分析結果、多くの正常な臓器組織でＩＲＣＲ−１０１抗体が既存のＮＲＰ１抗体より結合が低いか殆どないことを確認した。従って、正常組織に結合力が低いか殆どないことから、臨床試験時ＩＲＣＲ−１０１のｓｉｄｅ−ｅｆｆｅｃｔは低いと予測される（図２７）。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明の特徴および利点をまとめると下記のとおりである：
（ｉ）本発明は、癌細胞の表面に発現されたＮＲＰ１に結合した後、細胞内に内在化される抗−ＮＲＰ１抗体およびこれの医薬用途を提供する。
（ｉｉ）本発明の抗体は、ＮＲＰ１を発現する癌細胞の浸潤と転移を抑制する。
（ｉｉｉ）本発明の抗体は、単独でまたは抗体−薬物接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）形態で癌の治療に利用でき、ＮＲＰ１は、癌細胞の表面に過発現する分子であるため、本発明の抗体−薬物接合体を使用すると、正常細胞には最小限の影響を与えながら癌細胞だけを選択的にターゲッティングすることができる。
【０１３２】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
0006475835.tif 000005
【図３】
0006475835.tif 000006
【図４】
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【図５】
0006475835.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006475835.tif 000012
【図１０ａ】
0006475835.tif 000013
【図１０ｂ】
0006475835.tif 000014
【図１０ｃ】
0006475835.tif 000015
【図１１】
0006475835.tif 000016
【図１２】
0006475835.tif 000017
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006475835.tif 000021
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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