(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片であって、
前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されるヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢタンパク質配列の第６２位〜第１４８位のアミノ酸で示される配列及び第５４６位〜第７００位のアミノ酸で示される配列からなり、
前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片は、前記ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢタンパク質の抗原活性を保持することを特徴とする、ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片。
【請求項２】
ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片であって、
ヘルペスウイルスＨＮ１２０１株ｇＢタンパク質の第６２位〜第１４８位のアミノ酸で示される配列及び第５４６位〜第７００位のアミノ酸で示される配列、又は、  
ヘルペスウイルスＢａｒｔｈａ株ｇＢタンパク質の第６２位〜第１５０位のアミノ酸で示される配列及び第５４８位〜第７０２位のアミノ酸で示される配列、或いは、
ヘルペスウイルスＫａｐｌａｎ株ｇＢタンパク質の第６２位〜第１５４位のアミノ酸で示される配列及び第５５２位〜第７０６位のアミノ酸で示される配列、或いは、
ヘルペスウイルスＢｅｃｋｅｒ株ｇＢタンパク質の第６２位〜第１４７位のアミノ酸で示される配列及び第５４５位〜第６９９位のアミノ酸で示される配列、からなることを特徴とする、ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片。
【請求項３】
前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示される配列であることを特徴とする、請求項２に記載のヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片。
【請求項４】
ヘルペスウイルスｇＢ-ｇＤタンパク質であって、前記ｇＢ-ｇＤタンパク質は請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片及びヘルペスウイルスｇＤタンパク質を含むことを特徴とする、ヘルペスウイルスｇＢ-ｇＤタンパク質。
【請求項５】
前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片及び前記ｇＤタンパク質を、タンデム発現或いは融合発現させたタンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載のヘルペスウイルスｇＢ-ｇＤタンパク質。
【請求項６】
前記ｇＤタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示される配列であることを特徴とする、請求項４又は５に記載のヘルペスウイルスｇＢ-ｇＤタンパク質。
【請求項７】
ヘルペスウイルスサブユニットワクチンであって、前記サブユニットワクチンは、免疫量の、請求項１〜３のいずれか１項に記載する前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片及び薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、ヘルペスウイルスサブユニットワクチン。
【請求項８】
前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片の含有量が２５−１００μｇ/ｍｌであることを特徴とする、請求項７に記載のヘルペスウイルスサブユニットワクチン。
【請求項９】
前記サブユニットワクチンはアジュバントを含むことを特徴とする、請求項７に記載のヘルペスウイルスサブユニットワクチン。
【請求項１０】
ヘルペスウイルスサブユニットワクチンであって、前記サブユニットワクチンは、免疫量の、請求項４又は５に記載するｇＢ-ｇＤタンパク質及び薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、ヘルペスウイルスサブユニットワクチン。
【請求項１１】
前記ｇＢ-ｇＤタンパク質の含有量は２５−１００μｇ/ｍｌであることを特徴とする、
請求項１０に記載のヘルペスウイルスサブユニットワクチン。
【請求項１２】
前記サブユニットワクチンはアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１０に記載のヘルペスウイルスサブユニットワクチン。
【請求項１３】
サブユニットワクチンの製造方法であって、前記方法は、
１）請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片のヌクレオチド配列をクローニングする工程と、
２）前記工程１）でクローニングしたヌクレオチド配列を発現し、前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片を得る工程と、
３）前記工程２）で得た前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片に、薬学的に許容されるベクター及びアジュバントを添加してサブユニットワクチンを製造する工程と、を備えることを特徴とするサブユニットワクチンの製造方法。
【請求項１４】
サブユニットワクチンの製造方法であって、前記方法は、
１）請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片のヌクレオチド配列をクローニングし、及びヘルペスウイルスｇＤタンパク質のヌクレオチド配列をクローニングする工程と、
２）前記工程１）でクローニングした前記ヌクレオチド配列をタンデム発現或いは融合発現して、ｇＢ-ｇＤタンパク質を得る工程と、
３）前記工程２）で得た前記ｇＢ-ｇＤタンパク質に、薬学的に許容されるベクター及
びアジュバントを添加し、サブユニットワクチンを製造する工程と、を備えることを特徴とするサブユニットワクチンの製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記ヘルペスウイルスｇＢタンパク質断片、請求項４又は５に記載の前記ｇＢ-ｇＤタンパク質、請求項６又は７に記載の前記ヘルペスウイルスサブユニットワクチンを、ヘルペスウイルス関連疾患或いはヘルペスウイルスによる伝染を予防及び／又は治療する医薬品を製造することへの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は獣用生物製品分野に関し、具体的には、ヘルペスウイルスのサブユニットワクチン及びその製造方法、ならびにヘルペスウイルス関連疾患とヘルペスウイルスによる感染症を予防及び／又は治療する組成物の製造への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）アルファヘルペスウイルス亜科における豚ヘルペスウイルス１型（Ｓｕｉｄ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １  ｓｔｒａｉｎ、以下ＰＲＶと称する）を原因として、豚、牛、羊等の多種の家畜、家禽と野生動物で発症し、発熱、かゆみ（豚を除く）及び脳脊髄炎を主症状とする急性伝染病である。豚オーエスキー病は、中国で広く存在し、被害が深刻化している、大規模養豚場の生産を妨害する主な疫病の一つである。オーエスキー病に感染すると、妊娠母豚では、流産、死産又はミイラ胎児が発生し、一方、子豚では、神経症状、まひが発生して死亡率は高い。
【０００３】
ＰＲＶは強い向汎性、神経向性、潜伏感染特性を有し、末梢神経系に長期にわたって潜伏して感染することができる。潜伏したウイルスが活性化され、感染力を持つウイルスになると、潜伏感染している宿主は発病することとなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記問題に鑑み、本分野では、ヘルペスウイルス感染に対し、発現量が高く、有効的に免疫し、抵抗力があるサブユニットワクチンが求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明では、初めてヘルペスウイルスgBタンパク質の断片を取って融合発現を行い、サブユニットワクチンを製造した結果、意外にも、ヘルペスウイルスにより発症したオーエスキー病に対し、よりよい保護作用を有することを見出した。また、このgBタンパク質断片の発現量が顕著に向上し、この結果、免疫コストを大幅に低下できることを意外にも発見した。
本発明の一態様は、ヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片に関する。前記gBタンパク質断片は、gBタンパク質の抗原活性を保持できる。さらに、前記gBタンパク質断片の変異体又は活性断片のアミノ酸配列を前記gBタンパク質断片のアミノ酸配列と比べたとき、一つ或いは複数の保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失していても、前記gBタンパク質断片の変異体又は活性断片は前記gBタンパク質断片と同じ抗原活性を保持できる。
【０００６】
本発明の他の態様は、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片をコードするヌクレオチド配列に関する。
また、本発明の他の態様はヘルペスウイルスgB-gDタンパク質に関する。前記gB-gDタンパク質は、本発明のgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片、及びヘルペスウイルスgDタンパク質を含む。
また、本発明の他の態様はヘルペスウイルスサブユニットワクチンに関する。前記サブユニットワクチンは、免疫量の、本発明に係るgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片、及び薬学的に許容されるベクターを含む。
更にまた、本発明はヘルペスウイルスサブユニットワクチンに関する。前記サブユニットワクチンは、免疫量の、本発明に係るgB-gDタンパク質断片と薬学的に許容されるベクターを含む。
【０００７】
本発明は、更に、サブユニットワクチンの製造方法に関する。この方法は、1）本発明のgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片のヌクレオチド配列をクローニングする工程と、2）前記工程1）でクローニングしたヌクレオチド配列を発現させ、前記gBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片を得る工程と、3）前記工程2）で得られたgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片を用いて、薬学的に許容されるベクター及びアジュバントを添加し、サブユニットワクチンを製造する工程と、を含む。
【０００８】
本発明は、更に、サブユニットワクチンの製造方法に関する。この方法は、1）本発明のgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片のヌクレオチド配列をクローニングし、及びヘルペスウイルスgDタンパク質のヌクレオチド配列をクローニングする工程と、2）前記工程1）でクローニングしたヌクレオチド配列をタンデム発現又は融合発現させて、gB-gDタンパク質を得る工程と、3）前記工程2）で得られた前記gB-gDタンパク質を用いて、薬学的に許容されるベクター及びアジュバントを添加し、サブユニットワクチンを製造する工程と、を含む。
更にまた、本発明は、本発明のgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片、及び前記gB-gDタンパク質並びに前記ヘルペスウイルスサブユニットワクチンの使用に関する。つまり、ヘルペスウイルス関連疾患或いはヘルペスウイルスの伝染を予防及び／又は治療する医薬品の製造への使用に関する。
【０００９】
（配列表）
配列1はPRV HN1201株のgBタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列2はPRV HN1201株のgBタンパク質のアミノ酸配列である。
配列3はPRV HN1201株のgBタンパク質断片のヌクレオチド配列である。
配列4はPRV HN1201株のgBタンパク質断片のアミノ酸配列である。
配列5はPRV Bartha株のgBタンパク質断片のヌクレオチド配列である。
配列6はPRV Bartha株のgBタンパク質断片のアミノ酸配列である。
配列7はPRV Kaplan株のgBタンパク質断片のヌクレオチド配列である。
配列8はPRV Kaplan株のgBタンパク質断片のアミノ酸配列である。
配列9はPRV Becker株のgBタンパク質断片のヌクレオチド配列である。
配列10はPRV Becker株のgBタンパク質断片のアミノ酸配列である。
配列11はPRV HN1201株のgDタンパク質のヌクレオチド配列である。
配列12はPRV HN1201株のgDタンパク質のアミノ酸配列である。
配列13はPRV HN1201株のgBタンパク質断片とgDタンパク質との融合タンパク質のヌクレオチド配列である。
配列14はPRV HN1201株のgBタンパク質断片とgDタンパク質との融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ヘルペスウイルスHN1201株、Bartha株、Kaplan株、Becker株の各gBタンパク質のアミノ酸配列相同性を比較した図である。各gBタンパク質アミノ酸配列の第1位〜約第480位のアミノ酸残基間の配列を比較したものである。
【図１Ｂ】各gBタンパク質のアミノ酸配列の約第481位及び残りのアミノ酸残基間の配列を比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態を説明する。
「gBタンパク質」という用語は「gB糖タンパク質」とも呼ばれ、ヘルペスウイルスメンバーにおいて最も保存された糖タンパク質に該当し、その大きさはおよそ2.8 kbである。
本発明の一態様は、ヘルペスウイルスgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片に関する。前記gBタンパク質断片のアミノ酸は、サイトがSEQ ID NO：2で示されるヘルペスウイルスHN1201株gBタンパク質配列の約第62位〜第148位のアミノ酸で示される配列及び／又は約第546位〜第700位のアミノ酸で示される配列を含む。また、前記gBタンパク質断片はgBタンパク質の抗原活性を保持し、前記の変異体又は活性断片のアミノ酸配列を、前記gBタンパク質断片のアミノ酸配列と比べた場合、一つ或いは複数の保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失していても、gBタンパク質断片と同じ抗原活性を保持できる。
【００１２】
異なるヘルペスウイルス株のgBタンパク質の配列では、アミノ酸サイトの挿入、欠失により、本発明のgBタンパク質断片の配列部位は、ヘルペスウイルス株gBタンパク質配列によって異なる。たとえばヘルペスウイルスBartha株において対応するアミノ酸部位はgBタンパク質の第62位〜第150位、及び第548位〜第702位である。ヘルペスウイルスKaplan株において対応するアミノ酸部位はgBタンパク質の第62位〜第154位及び第552位〜706位である。ヘルペスウイルスBecker株において対応するアミノ酸部位はgBタンパク質の第62位〜第147位及び第545位〜第699位である。SEQ ID NO：2で示されるヘルペスウイルスHN1201株のgBタンパク質配列と対比すると、ヘルペスウイルスHN1201株のgBタンパク質の第62位〜第148位のアミノ酸で示される配列、及び第546位〜第700位のアミノ酸で示される配列に対応する配列は、本発明に係るgBタンパク質断片の配列である。
【００１３】
gBタンパク質断片のgBタンパク質配列におけるアミノ酸サイトを、DNAStarにより比較することで、異なるヘルペスウイルス株において本発明のgBタンパク質断片のアミノ酸配列が対応するサイトを確定できる。こうして、ヘルペスウイルスHN1201株、Bartha株、Kaplan株とBecker株のgBタンパク質断片のアミノ酸サイトを比較した結果を図1に示す。他の生物学ソフトウェアにより配列対比を行い、本発明のgBタンパク質断片の異なるヘルペスウイルス株におけるアミノ酸サイトを確定することができる。たとえばMEGA、DNAman、clustalX、bioedit、Vector NTIソフトウェア及びNCBIのblast機能が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いられる「保存的変異体」という用語は、基本的にその親の特性、例えば基本的な免疫学的生物特性、構造特性、調節特性、又は生化学的特性を保存する変異体を意味する。一般的に、ポリペプチドの保存的変異体のアミノ酸配列は親ポリペプチドと異なる。しかし、親ポリペプチド配列が保存的変異体と全体で非常に似ており、かつ多くの領域が同じであるように差異が制御される。保存的変異体と親ポリペプチドアミノ酸の配列との差異として、たとえば、一つ或いはいくつかのアミノ酸残基及びそれらの任意の組み合わせが置換、付加、または欠失していることが挙げられる。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされてもよく、或いは遺伝暗号によりコードされなくてもよい。ポリペプチドの保存的変異体は自然に産生した変異体であってもよく、或いは人工的に産生した変異体であってもよい。ポリペプチドから人工的に産生する保存的変異体は、変異誘導技術、或いは直接合成で産生する。
【００１５】
本発明の変異体或いはその活性断片のアミノ酸配列は、前記gBタンパク質断片のアミノ酸配列と比べた場合、一つ或いはいくつかの保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失していても、前記gBタンパク質断片の抗原活性を保持できる。なお、上記した、一つ或いはいくつかの保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失しているとは、１〜10個の保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失することを意味し、好ましくは１〜5個の保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失することを意味する。さらに、上記した、保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失しているとは、性質及び大きさが類似する置換、付加或いは欠失していることを意味し、グリシンとアラニンの置換、セリンとトレオニンの置換、アルギニンとリジンの置換が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の一実施態様では、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、前記gBタンパク質断片のアミノ酸は、サイトがSEQ ID NO：2で示されるヘルペスウイルスHN1201株のgBタンパク質配列を基準として、gBタンパク質の約第62位〜第148位のアミノ酸で示される配列及び／又は約第546位〜第700位のアミノ酸で示される配列を含む。前記gBタンパク質断片は前記gBタンパク質の抗原活性を保持する。上記の変異体又は活性断片のアミノ酸配列を、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列と比べた場合、一つ或いは複数の保存アミノ酸が置換、付加或いは欠失していても、gBタンパク質断片と同じ抗原活性を保持できる。
【００１７】
本発明の一実施態様では、本発明のワクチン組成物として、上記のgBタンパク質断片は、ヘルペスウイルスJS-2012株、ヘルペスウイルスHeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株とNVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、ヘルペスウイルス変異株PRV-ZJ01、ヘルペスウイルス変異株HN1201株、ヘルペスウイルス変異株HN1202株、ヘルペスウイルスFa株、ヘルペスウイルスBartha株、ヘルペスウイルスKaplan株、ヘルペスウイルスBecker株から選定される。
【００１８】
ヘルペスウイルスJS−2012株は、「免疫後発症した子ブタにおけるヘルペスウイルスの分離・同定」 [J]．童武、張青占、鄭浩など、中国動物伝染病学報、2013，21（3）：1−7に開示される。ヘルペスウイルスHeN1株は、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センタに寄託され、寄託番号がCGMCC  NO．6656であり、特許出願CN102994458Aに開示される。NVDC−PRV−BJ株、NVDC  PRV−HEB株、NVDC−PRV−SD株は、Pathogenic PseudorabiesVirus，Xiuling Yu， Zhi  Zhou，Dongmei Hu，et al．China，2012 EmergingInfectious Diseases、www．cdc．gov／eid ol．20，No．1，January 2014に開示される。PRV TJ strain（PRV TJ）株は、ChinaChun−Hua Wang Jin Yuan1，Hua−Yang Qin、et al、“A novel  gE−deleted pseudorabies virus（PRV）provides rapid and complete protection  from lethal challenge with the PRV variant emerging in  Bartha−K61−vaccinated swine population in China” Vaccine 32（2014）3379-3385に開示される。ヘルペスウイルス変異株PRV−ZJ01は、受託番号がCGMCC  No．8170であり、CN103627678Aに開示される。ヘルペスウイルスHN1201株（Pseudorabies  virus，strain HN1201）は、受託番号がCCTCC NO．V 201311であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は2013年5月20日である。ヘルペスウイルスHN1202株（Pseudorabies virus，strain HN1202）は、受託番号がCCTCC NO．V201335であり、中国典型培養物寄託センタに寄託され、寄託場所は中国武漢・武漢大学であり、寄託日は2013年8月26日である。ヘルペスウイルスFa株は、「ヘルペスウイルスFa株gB＿gC＿gD遺伝子のクローンと配列解析」［J］．陳振海等、福建農業学報2007、22（2）：120−125に開示される。ヘルペスウイルスBartha株及びヘルペスウイルスBecker株は、“A wide extent of inter-strain diversity in virulent and vaccine strains of alpha herpesviruses”、Szpara, M.L.,et al.、PLoS Pathog. 2011 Oct;7(10):e1002282に開示される。ヘルペスウイルスKaplan株は、“Analysis of viral and cellular factors influencing herpesvirus-induced nuclear envelope breakdown”、Grimm, K.S.,et al、J Virol.2012 Jun;86(12):6512-6521に開示される。
【００１９】
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片は、上記のヘルペスウイルスHN1201株のgBタンパク質の第62位〜第148位のアミノ酸で示される配列及び／又は第546位〜第700位のアミノ酸で示される配列を含む。
本発明の好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：3で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片は、ヘルペスウイルスBartha株のgBタンパク質の第62位〜第150位のアミノ酸で示される配列及び／又は第548位〜第702位のアミノ酸で示される配列を含む。
【００２０】
本発明の好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：6で示されるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：5で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
また、本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片は、ヘルペスウイルスKaplan株のgBタンパク質の第62位〜第154位のアミノ酸で示される配列及び／又は第552位〜第706位のアミノ酸で示される配列を含む。
本発明の好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：8で示されるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：7で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００２１】
本発明の一実施態様では、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片は、ヘルペスウイルスBecker株の第62位〜第147位のアミノ酸で示される配列及び／又は第545位〜第699位のアミノ酸で示される配列を含む。
本発明の好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：9で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００２２】
「gDタンパク質」または「gD糖タンパク質」という用語は、ヘルペスウイルスが感染するのに必要な構造タンパク質であり、成熟ウイルス粒子の膜表面の主な糖タンパク質の一つを意味し、「gp50タンパク」とも呼ばれる。
本発明のある態様はヘルペスウイルスgB-gDタンパク質に関し、上記のgB-gDタンパク質は本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片、及びヘルペスウイルスgDタンパク質を含む。
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片、及びヘルペスウイルスgDタンパク質を、タンデム発現或いは融合発現させる。
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgB-gDタンパク質において、前記gDタンパク質のアミノ酸配列はSEQ ID NO：12で示されるアミノ酸配列である。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のヘルペスウイルスgB-gDタンパク質において、前記gDタンパク質のアミノ酸配列はSEQ ID NO：11で示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００２３】
本発明の好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgB-gDタンパク質では、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列はSEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列であり、上記のgDタンパク質のアミノ酸配列はSEQ ID NO：12で示されるアミノ酸配列である。
本発明の最も好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgB-gDタンパク質は、上記のgBタンパク質断片とgDタンパク質との融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列はSEQ ID NO：14で示される。
本発明の最も好ましい一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスgB-gDタンパク質は、上記のgBタンパク質断片とgDタンパク質との融合タンパク質であり、そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：13で示される。
本発明の他の態様はヘルペスウイルスサブユニットワクチンに関し、このサブユニットワクチンは、免疫量の、本発明に係るヘルペスウイルスgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片、及び薬学的に許容されるベクターを含む。
本発明の一実施態様中、上記のサブユニットワクチンでは、上記のヘルペスウイルスgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片の含有量は、25-100μg/mlである。
【００２４】
本発明の一実施態様中、上記のサブユニットワクチンはアジュバントを含む。
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスサブユニットワクチンは、含有量が25-100μg/mlである本発明のSEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片を含む。
本発明の実施態様中、本発明のヘルペスウイルスサブユニットワクチンでは、本発明のSEQ ID NO：6、或いはSEQ ID NO：8、或いはSEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片により、SEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片を置換してもよい。
本発明により提供されるヘルペスウイルス感染を予防及び／又は治療するサブユニットワクチン組成物に含まれるgBタンパク質断片及びgDタンパク質は、機能化誘導体と基本的に同じアミノ酸配列のポリペプチドであってもよい。
【００２５】
「機能化誘導体」という用語は、インタクトプロテイン／ペプチド配列の生物活性と基本的に類似する機能的生物活性を有するタンパク質／ペプチド配列を意味する。換言すれば、好ましくは、上記の機能化誘導体を動物に投与するとき、免疫応答、例えばヘルペスウイルス株による攻撃に対する保護反応を引き起こす能力を基本的に保持するポリペプチド或いはその断片を意味する。
「ヌクレオチド断片」という用語は、人工的に構築（たとえば化学合成）し、又は天然産物を複数の小さな断片に分解し（制限酵素により、又は機械的分断し）て構築した本発明の核酸の分離部分、またはPCR、DNA重合酵素或いは本分野で既知の他の重合技術のいずれかにより合成した核酸の部分、或いは当業者に既知の組み換え核酸技術により宿主細胞に発現した核酸部分であるポリヌクレオチド配列を意味する。
本明細書で一般的に理解され使用されるように、「機能性断片」という用語は、インタクト核酸配列の生物活性と基本的に類似する機能的生物活性をコードする核酸配列を意味する。換言すれば、本発明の明細書中、好ましくは、このようなポリペプチド／タンパク質をコードする能力を保持する核酸或いはその断片を意味する。上記のポリペプチド／タンパク質が動物に投与されると、ヘルペスウイルスの攻撃に対する免疫応答、より好ましくは保護反応が引き起こされる。
【００２６】
アミノ酸配列が「基本的に同じ」という用語は、本発明のポリペプチドが相同的なアミノ酸配列を有するものと理解され、SEQ ID NO：4、12で示される配列の一部或いは全部とは、少なくとも70%の相同性を有し、好ましくは80%の相同性、より好ましくは90%の相同性、最も好ましくは95%の相同性を有することを意味する。
本文において「相同性」という用語は、更に参照配列と同じ或いは類似し、同時に任意のアミノ酸の簡単な置換／修飾を含むことを意味する。BLAST-P(ベーシック・ローカルアライメント検索ツール)を用いて、当業者に既知のプログラムで当該相同性検索を行うことができる。対応する核酸配列について、相同性は本分野において既知のBLASTXとBLASTNプログラムに係る。
なお、アミノ酸配列の相同性でも、ヌクレオチド配列の相同性でも、その相同性の高さは配列の変化が自己免疫原性を影響しない範囲に限られる。
【００２７】
「アジュバント」という用語は、本発明の組成物に添加して組成物の免疫原性を増加する物質を意味する。既知のアジュバントは、油アジュバント、水溶性アジュバント、アルミニウム塩アジュバント、サイトカインアジュバントを含むが、それらに限らない。
本発明で「油アジュバント」という用語は「油性アジュバント」或いは「油乳剤アジュバント」とも呼ばれ、植物油、動物油、鉱油の１種或いは複数種を含んでなり、免疫原の生体内における存在時間を延長し、免疫原を徐々に放出させて、マクロファージの食作用と殺菌力を向上する。
本発明に用いられる「水溶性アジュバント」という用語は、「水系アジュバント」又は「水アジュバント」とも呼ばれ、ポリマー水溶性分散体であり、水溶性ワクチンの効果と安全性を向上するために用いられ、高分子量ポリアクリル酸系合成ポリマーからなる。
本発明に用いられる「アルミニウム塩アジュバント」という用語は、「アルミニウムゲルアジュバント」或いは「アルミニウムアジュバント」とも呼ばれ、水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントを含み、主な機能として、徐放作用とともに、免疫細胞の活性化作用を有する。抗原を水酸化アルミニウム或いはリン酸アルミニウムと混合して注射することで、抗原を注射箇所に保持することができ、抗原の徐放作用と非特異的免疫刺激作用を有する。
【００２８】
本発明に用いられる「サイトカインアジュバント」という用語は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等を含み、また、「サイトカイン」或いは「細胞素」とも呼ばれる。サイトカインは生体宿主細胞から分泌され、拡散、細胞間接触、或いは血液循環を介して宿主の他の細胞に到着する。サイトカインは、体液において極めて低い濃度で作用する非免疫グロブリン、局所的天然タンパク質或いは糖タンパク質である。また、生体によって活性化される免疫細胞とある非免疫細胞から発生して分泌され、細胞の成長、分裂を調節でき、血液生成、炎症反応、免疫応答反応及び創傷治癒等と深く関わる高活性多機能小分子タンパク質の総称である。さらに、免疫機能を刺激又は抑制できて、免疫応答において細胞の成長分裂を促進し、細胞の生理機能と細胞間の情報伝達を調節し、免疫システムにおいて非常に重要な調節作用をもたらす。
本発明の実施例では、油アジュバントの一つである206アジュバントを使用した。
本発明の組成物に適用するアジュバントの量は、好ましく有効量である。この「有効量」とは、アジュバントを本発明の抗原と併用して投与するとき、宿主においてそれらの免疫的作用を発揮するのに必要又は十分な量であるが、副作用を引き起こさない量を意味する。投与しようとするアジュバントの正確な量は、様々な因子、例えば、用いる成分と治療するべき疾患の類型、治療する動物の類型と年齢、投与方式、及び組成物中の他の成分によって異なる。
【００２９】
本発明の組成物の成分又は組成成分の量は、治療有効量であることが好ましい。前記治療有効量とは、組成物が投与される宿主において免疫作用をもたらしながら、過度な副作用を引き起こすことがない必要量である。用いる成分と投与しようとする組成物の正確な量は、様々な因子、例えば治療するべき疾患の類型、治療する動物の類型と年齢、投与方式、及び組成物における他の成分によって異なる。
本発明の他の態様はヘルペスウイルスサブユニットワクチンに関し、前記サブユニットワクチンは、免疫量の、本発明のgB-gDタンパク質または薬学的に許容されるベクターを含む。
本発明の一実施態様中、前記サブユニットワクチンにおけるgB-gDタンパク質の含有量は、25-100μg/mlである。
本発明の一実施態様では、前記サブユニットワクチンはアジュバントを含む。
【００３０】
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスサブユニットワクチンは、本発明のSEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片及びSEQ ID NO：12で示されるアミノ酸配列のgDタンパク質をタンデム発現させたものを含む。このタンパク質抗原の含有量は、25〜100μg/mlである。
本発明の実施態様中、本発明のタンデム発現させて得られたヘルペスウイルスサブユニットワクチンでは、SEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片に代えて、SEQ ID NO：6、或いはSEQ ID NO：8、或いはSEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片を選択できる。
本発明の一実施態様中、本発明のヘルペスウイルスサブユニットワクチンは、本発明のSEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片とSEQ ID NO：12で示されるアミノ酸配列のgDタンパク質とを融合発現させたものを含む。このタンパク質抗原の含有量は、25〜100μg/mlである。
本発明の実施態様中、本発明の融合発現させて得られたヘルペスウイルスサブユニットワクチンでは、SEQ ID NO：4で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片に代えて、SEQ ID NO：6、或いはSEQ ID NO：8、或いはSEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片を選択できる。
【００３１】
本発明は、更に、サブユニットワクチンの製造方法に関する。この製造方法は、1）本発明のgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片のヌクレオチド配列をクローニングする工程と、2）前記工程1）でクローニングしたヌクレオチド配列を発現させ、上記のgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片を得る工程と、3）前記工程2）で得られたgBタンパク質断片、gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片を用いて、薬学的に許容されるベクター及びアジュバントを添加し、サブユニットワクチンを製造する工程と、を含む。
本発明の一実施態様として、本発明のサブユニットワクチンの製造方法中、上記のgBタンパク質断片のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：4、或いはSEQ ID NO：6、或いはSEQ ID NO：8、或いはSEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列である。
本発明は、更にまた、サブユニットワクチンの製造方法に関する。この方法は、1）本発明のgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片のヌクレオチド配列をクローニングし、及びgDタンパク質のヌクレオチド配列をクローニングする工程と、2）前記工程1）でクローニングした前記ヌクレオチド配列をタンデム発現又は融合発現させて、gB-gDタンパク質を得る工程と、3）前記工程2）で得られた前記gB-gDタンパク質を用いて、薬学的に許容されるベクター及びアジュバントを添加し、サブユニットワクチンを製造する工程と、を含む。
【００３２】
本発明の一実施態様では、本発明のサブユニットワクチンの製造方法中、発現させたgB-gDタンパク質は、SEQ ID NO：4、或いはSEQ ID NO：6、或いはSEQ ID NO：8、或いはSEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片、及びSEQ ID NO：12で示されるアミノ酸配列のgDタンパク質をタンデム発現させたタンパク質である。
本発明の一実施態様では、本発明のサブユニットワクチンの製造方法中、発現させたgB-gDタンパク質は、SEQ ID NO：4、或いはSEQ ID NO：6、或いはSEQ ID NO：8、或いはSEQ ID NO：10で示されるアミノ酸配列のgBタンパク質断片、及びSEQ ID NO：12で示されるアミノ酸配列のgDタンパク質を融合発現させたタンパク質である。
本発明の他の態様として、本発明のgBタンパク質断片、前記gBタンパク質断片の保存的変異体又は活性断片を、ヘルペスウイルス関連疾患或いはヘルペスウイルスによる伝染を予防及び／又は治療する医薬品の製造に使用することに関する。
本発明は、更に、本発明のgB-gDタンパク質を、ヘルペスウイルス関連疾患又はヘルペスウイルスによる伝染を予防及び／又は治療する医薬品の製造に使用することに関する。
本発明は、更にまた、本発明のヘルペスウイルスサブユニットワクチンを、ヘルペスウイルス関連疾患又はヘルペスウイルスによる伝染を予防及び／又は治療する医薬品の製造に使用することに関する。
【００３３】
「予防」という用語は、本発明のワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染を抑制し、又は発病を遅延させるいずれがの行為を意味する。また、「治療」という用語は、本発明のワクチン組成物を投与することで、ヘルペスウイルスの感染による症状を緩和又は改善するいずれかの行為を意味する。
本発明のヘルペスウイルスポリペプチドは、動物における保護反応を有利に引き起こす。具体的には、本発明のヘルペスウイルスポリペプチドは、その機能化誘導体と基本的に同じであるアミノ酸配列を含む。
「保護反応」という用語は、動物においてヘルペスウイルス関連疾患或いはヘルペスウイルスを起因とする伝染の発作を予防、或いはこのような疾患の重症度を低減することを意味する。
本文に用いられる「ヘルペスウイルス関連疾患」という用語は、ヘルペスウイルスに感染して罹患する疾病の意味として用いられる。その例として、発病した子豚は明らかな神経症状、昏睡、鳴き声、嘔吐、下痢、体温上昇などの症状を示す。また、妊娠する母豚は一旦発病すると、流産し、ミイラ胎児又は死産胎を産出し、又は繁殖障害が引き起こすが、それらに限定されるものではない。
【００３４】
本文に用いられる「ヘルペスウイルス関連疾患」という用語は、更に以下の症状を示す意味として用いられることがある。即ち、どんな年齢の豚でも感染されることがあり、豚群において水平伝播できて、潜伏期間が短く（1〜2日）、発病率は10％〜100％の範囲であり、発病した豚の死亡率は10％〜100％の範囲である（子豚の死亡率は100％と高い）。感染した豚は、高熱（40〜42℃、3日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、ついには不全による死亡に至る。また、種雄豚は精液の質が低下し、妊娠する母豚は流産（35％と高い）、早産、死産、弱い子豚産出（弱い子豚が14日齢になるまでに全て死亡）するなどの生殖障害症状が出るが、それに限定されない。感染した成熟豚（体重が50kg以上の豚である）は、高熱（40〜42℃、3日以上続く）、呼吸困難、下痢、喘息、咳、くしゃみ、後肢麻痺、犬的座り方、突然倒れ、けいれん、側臥位をとって立てなくなり、後弓反張、腕もがき、ついには不全による死亡に至ることがある。初生及び4週齢以下の子豚は突然発病し、多数が死亡し、死亡率が90％以上となる。発病した子豚の主な症状は、体温が41℃以上と上昇し、食欲がなくなるに伴い、明らかな神経症状と下痢がでることであり、離乳前後の子豚の主な症状は呼吸困難、咳、鼻水などの呼吸系症状である。
【００３５】
本発明は、以下のような際立った効果を有する。
（1）本発明のワクチン組成物は、遺伝子工学或いは人工合成によりワクチン組成物の組成成分を大量合成して発現することができ、その生産時間を短縮できるだけでなく、大規模生産に適用する。
（2）本発明のヘルペスウイルスワクチン組成物中の多免疫原性抗原の組み合わせによって、相乗的な免疫効果を生み出し、良好な免疫効果だけでなく、免疫使用量を低下させて、免疫コストを減少できる。
（3）本発明のワクチン組成物によって、豚をヘルペスウイルスの感染から保護できて、ヘルペスウイルス感染の良好な予防及び／又は治療手段を提供し、伝統的な生ワクチンの毒性回復及びウイルス分散のリスクを避けられて、ヘルペスウイルスの浄化に積極的現実味を提供する。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の利点と特徴がより明らかになるように、具体的な実施例をあげて、本発明を更に説明する。ただし、それらの実施例は単なる例にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、本発明の主旨と範囲から逸脱しない限り、本発明の技術方案の詳細や形式に対して修正又は変更を行うことができるが、それらの修正と変更はいずれも本発明の保護範囲に入ると理解すべきである。
【実施例１】
【００３７】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片の製造）
1.ヘルペスウイルスgBタンパク質断片遺伝子の増幅
良好に成長しているPK15細胞にPRV HN1201ウイルスを接種し、得られたウイルス液を200μL取り、geneaid社のviral nucleic acid extraction kit IIキットの明細書にしたがい、PRVゲノムDNAを抽出した。プライマーgBF1とgBR1で、gB遺伝子62-148aaを増幅し、プライマーgBF2とgBR2でgB遺伝子546-700aaを増幅し、Overlapping PCRにより両方を一緒になるように増幅した。また、プライマーのデザインを利用して、両方の間にGGSG連結アミノ酸を引き込んだ。プライマーは表1に示され、PCR系は表2に示され、PCR反応条件は表3に示される。
【００３８】
【表１】
0006475741.tif 000002
【表２】
0006475741.tif 000003
【表３】
0006475741.tif 000004
【００３９】
2.ドナープラスミドの構築
工程1で増幅したPCR産物をOMEGAゲル回収キットにより回収し、回収産物をEcoRIとHindIIIの２種類の制限酵素で切断した。同時に、シグナルペプチドを含むpFastBacIをEcoRIとHindIIIの２種類の制限酵素で切断した。制限酵素で切断したpFastBacIベクターとPCR産物を結合した。
通常の形質転換方法により、結合産物をDH5αに形質転換し、amp耐性のLB平板に塗布し、37℃で徹夜培養した。単一コロニーを3〜5mlのamp耐性液体LBに拾って、37℃、220rpmで、12〜16h培養し、Tiangen Plasmid Mini Preparation Kitの明細書にしたがってプラスミドを抽出し、EcoRIとHindIIIの２種類の制限酵素で切断して同定した。正しいと同定したものをpFastBac-HNgBΔ148〜546と命名した。
3  組み換えBacmidの構築
1〜2μL pFastBac-HNgBΔ148〜546プラスミドをDH10Bacコンピテントセルに導入し、軽くタッチして均一に混合し、氷に30min培養した後、42℃で60s加熱処理し、氷に5min培養した後、400μlのSOC培地に加入して、37℃で、200rpmで４時間培養した。100μlの菌液を取ってIPTG/X-gal/カナマイシン/テトラサイクリン/ゲンタマイシンを含むプレートに塗布し、37℃で少なくとも48h培養し、ブルー・ホワイトコロニーが明らかになる時にホワイトシングルコロニーを5mlカナマイシン/テトラサイクリン/ゲンタマイシンの液体LB培地に抽出し、終夜振とうした。翌日、テンプレートとして1μl取り、菌液をPCR同定し、PCR産物の大きさが2300bp+目標断片の大きさのものを、Tiangen Plasmid Mini Preparation Kitの試薬を用いて組み換えBacmidを抽出し、Bac-HNgBΔ148〜546と命名した。
【００４０】
4.組み換えバキュロウイルスの獲得及び継代培養
組み換えBacmidBac-HNgBΔ148〜546を昆虫細胞sf9にトランスフェクションした。Cellfectin(R)  II Regentの明細書を参照してトランスフェクションし、トランスフェクションから72h後、細胞が病変した後、細胞上澄みを得て、rBac-HNgBΔ148〜546 P1と標識した。
対数増殖期のsf9細胞を0.9×106cell/dishで10cmのシャーレに接種し、細胞が完全に接着した後、P1代の組み換えバキュロウイルスを、1:20-1:40の体積比で、sf9を敷いたシャーレに加え、27℃で継続培養し、約72時間後細胞病変が明らかになった時に、上澄みを収穫してP2代の組み換えバキュロウイルスと標識し、スズ箔で包んで遮光下に冷蔵庫に4℃で保存して供給した。接種割合を1:100-1:200としてこの工程を繰り返し、P3、P4代の組み換えバキュロウイルスを獲得した。
5.タンパク質の発現
P4まで継代した組み換えウイルスを1:5〜1:10の体積比でHi5細胞1Lに接種し、約48時間後細胞を収穫した。遠心分離した上澄みは、Western Blotにより目的タンパク質の発現を確認した。His親和クロマトグラフィーとモレキュラーシーブ精製により、碧雲天会社のBCAタンパク質濃度測定キットの方法を参照してタンパク質を定量した結果、1L細胞が発現し、HNgBΔ148〜546タンパク質10mgを獲得できた。
【実施例２】
【００４１】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質の製造）
1.ヘルペスウイルスgB遺伝子の増幅
実施例1で抽出したPRVゲノムDNAをテンプレートとし、プライマーgBFとgBRを利用してHNgB遺伝子62-752aaを増幅した。プライマーは表4に示され、PCR系は表2に示され、反応条件は表3を参照する。
【表４】
0006475741.tif 000005
2.ドナープラスミドの構築
実施例1におけるドナープラスミドの構築方法を参照して、工程1で増幅したPCR産物を回収してドナープラスミドを構築し、正しいと同定したものをpFastBac-HNgBと命名した。
3.組み換えBacmidの構築
実施例1における組換えBacmidの構築方法を参照して、工程2で獲得したドナープラスミドをDH10Bacに形質転換し、PCR法によって正しいと同定した組換えBacmidをBac-HNgBと命名した。
4.組み換えバキュロウイルスの獲得及び継代培養
実施例1における組み換えバキュロウイルスの獲得及び継代培養の方法を参照して、工程3で正しいと同定した組み換えBacmidBac-HNgBを細胞にトランスフェクションし、組み換えバキュロウイルスを製造した。
5.タンパク質の発現
工程4で得られた組み換えバキュロウイルスをP4代まで継代培養し、1:5〜1:10の体積比でHi5細胞2Lに接種し、約48時間後細胞を収穫した。遠心分離した上澄みはWestern Blotにより目的タンパク質の発現を確認した。His親和クロマトグラフィーとモレキュラーシーブ精製により、碧雲天会社のBCAタンパク質濃度測定キットの方法を参照してタンパク質を定量した結果、1L細胞が発現してHN  gBタンパク質5mgを獲得できることが認められた。
【実施例３】
【００４２】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgBタンパク質の発現量の比較）
実施例1と実施例2の二つのタンパク質の発現データを比較すると、gBタンパク質断片の発現量はgBタンパク質の発現量より同じ培養環境及び条件下で1倍向上することが分かった。、本発明により選定したgBタンパク質断片は、より発現しやすく、免疫コストを効果的に低下し、工業的に大規模な投入応用に役立つ。
【実施例４】
【００４３】
（ヘルペスウイルスサブユニットワクチンの製造）
実施例1と実施例2でそれぞれ製造したgBタンパク質断片とgBタンパク質を取り、ゆっくりとアジュバントに添加した。添加しながら、乳化機により回転速度800rpmで12min攪拌し、均一に混合し、4℃で保存し、ヘルペスウイルスのワクチン組成物とした。具体的な配合比を表5に示す。
【表５】
0006475741.tif 000006
【実施例５】
【００４４】
（ヘルペスウイルスサブユニットワクチンの免疫原性試験）
21日齢のPRV抗体陰性ブタ24匹をランダムに6組に分けた。4匹/組とし、1-4組には、それぞれ本発明の実施例4で製造したワクチン1、ワクチン2、ワクチン3、ワクチン4を注射し、第5組と第6組は定量のPBSを注射して、一回免疫した。免疫28日後攻撃を行い、投与量をヘルペスウイルスHN1201株2×108.0 TCID50/匹とし、攻撃後7日まで、毎日一定の時間帯に臨床状況を観察して体温を測量した。
その結果、当該投与量により、第1〜4の免疫組で4匹の子ブタは何れも保護され、暫く臨床症状を表したが、5日後逐次に正常な状態に戻って、最終的には生存した。第5組では、攻撃2日後2匹が死亡し、3日後全例死亡し、明らかな臨床症状を表した。第6組では、生存し、異常な現象は生じなかった。攻撃後の保護結果を表6に示す。
【表６】
0006475741.tif 000007
【００４５】
各動物について判断を行った。つまり、個体の免疫状況が分からない前提で疾患の臨床症状を評価した。体温上昇状況を表7に示した。臨床ブタの体温上昇日数を統計して、ANOVA分析により、ワクチンの子ブタ体温変化への作用を比較した。その結果、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3の免疫組の間では体温上昇に有意差がなかったが（P＞0.05）、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3とワクチン4の間で有意差があった（P＜0.01）。免疫子ブタの体温上昇日数の平均値を比較した結果、ワクチン4で免疫された子ブタの体温上昇日数の平均値は、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3で免疫された子ブタの体温上昇日数の平均値と比べると3日から1-1.25日に低下し、平均で58.3%-66.7%低下した。各ワクチンの免疫効果及び臨床評価結果の関連性を比較した結果、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3の免疫効果がワクチン4より著しく高いことが分かった。本発明のgBタンパク質断片を含むサブユニットワクチンの免疫効果は、gBタンパク質のサブユニットワクチンより優れることを証明した。更に、本発明のgBタンパク質断片を含むサブユニットワクチンは、より低い抗原含有量を有するものの、より優れた免疫効果をもたらすことを発見した。ワクチンの臨床疾患への影響を比較することから、本発明のワクチン組成物による臨床疾患は、gBタンパク質のサブユニットワクチンより著しく少ないことが分かった。
【表７】
0006475741.tif 000008
【００４６】
更に、各試験組の子ブタの摂取状況を統計した結果を表8に示す。臨床ブタの7日間の摂取量を統計して、ANOVA分析によりワクチンの子ブタ摂取量変化に対する作用を比較した。その結果、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3の免疫組の間で摂取量に有意差はなかったが（P＞0.05）、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3とワクチン4の間で有意差があった（P＜0.01）。免疫子ブタの摂取量の平均値を比較した結果、ワクチン4で免疫された子ブタの摂取量の平均値は、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3で免疫された子ブタの摂取量の平均値と比べると210.86ｇから285.60g-290.58ｇに上昇し、平均で35.45%-37.81%上昇した。各ワクチンの免疫効果及び臨床評価結果の関連性を比較した結果、ワクチン1、ワクチン2、ワクチン3の免疫効果がワクチン4より著しく高いことが分かった。更に、本発明のgBタンパク質断片を含むサブユニットワクチンの免疫効果がgBタンパク質のサブユニットワクチンより優れることを証明した。
【表８】
0006475741.tif 000009
【実施例６】
【００４７】
（ヘルペスウイルスBartha株、Kaplan株及びBecker株のgBタンパク質断片の製造）
本発明のヘルペスウイルスgBタンパク質断片の選定した抗原サイト免疫原性が共通の意味を有するかどうかを証明するために、ヘルペスウイルスBartha株gBタンパク質配列（登録号：AEM63980.1）、Kaplan株gBタンパク質配列（登録号：AFI70792.1）、Becker株gBタンパク質配列（登録号：AEM64118.1）で示される遺伝子の全長を、生工生物（上海）株式会社より合成した。合成した遺伝子断片の全長はそれぞれ2748bp、2760bp、2739bpであった。このように人工的に合成した遺伝子断片に基づいて本発明のヘルペスウイルスBartha株、Kaplan株及びBecker株のgB遺伝子テンプレートを製造した。
それぞれプライマーをデザインしてBartha株gB遺伝子62-150aaと548-702aa、Kaplan株gB遺伝子62-154aaと552-706aa、Becker株gB遺伝子62-147aaと545-699aaを増幅し、Overlapping PCRにより両者を一体に増幅し、また、プライマーのデザインにより、両者の間にGGSG接続アミノ酸を引き込んだ。先に述べた実施例の製造方法により、gBタンパク質断片を製造し、His親和クロマトグラフィーとモレキュラーシーブ精製により、碧雲天会社のBCAタンパク質濃度測定キットの方法を参照してタンパク質を定量した。その結果、1L細胞が発現してBartha gBΔ150~548タンパク質10mg 、Kaplan gBΔ154〜552 タンパク質10mg、Becker gBΔ147~545 タンパク質10mgを獲得できることが認められた。
【実施例７】
【００４８】
（ヘルペスウイルスBartha株、Kaplan株及びBecker株のサブユニットワクチンの製造）
それぞれ実施例6で製造したヘルペスウイルスBartha株、Kaplan株及びBecker株のgBタンパク質断片を取って、実施例4の製造方法を参照してサブユニットワクチンを製造した。具体的な配合比を表9に示す。
【表９】
0006475741.tif 000010
【実施例８】
【００４９】
（ヘルペスウイルスBartha株、Kaplan株及びBecker株のサブユニットワクチンの免疫原性試験）
21日齢のPRV抗体陰性子ブタ20匹をランダムに5組に分けて、4匹/組とした。即ち、1-3組はそれぞれ本発明の実施例7で製造したワクチン5、ワクチン6、ワクチン7を注射し、第4組と第5組は同量のPBSを注射して、一回免疫した。免疫28日後に攻撃を行い、投与量をヘルペスウイルスHN1201株2×108.0 TCID50/匹とし、攻撃後7日まで、毎日一定の時間帯に臨床状況を観察して体温を測量した。
その結果、当該投与量により、第1〜3の免疫組で4匹の子ブタは何れも保護され、暫く臨床症状を表したものの、5日後逐次に正常な状態に戻って、最終的には生存した。第4組では、攻撃2日後2匹が死亡し、3日後全例死亡し、明らかな臨床症状を表した。第5組では、全例生存し、異常な現象が生じなかった。攻撃後の保護結果を表10に示す。
【００５０】
【表１０】
0006475741.tif 000011
体温上昇状況を表11に示した。ワクチン免疫組の体温上昇日数は平均で1-1.25日であり、通常のgBタンパク質免疫後の攻撃後体温上昇日数の平均値の3日より少なかった。各ワクチンの免疫効果及び臨床評価結果の関連性を比較すると、ワクチン5、ワクチン6、ワクチン7はよい免疫効果を有することが分かるとともに、本発明で選定したヘルペスウイルスgBタンパク質断片の抗原サイトがよい免疫原性を持つことが、共通して証明された。
【表１１】
0006475741.tif 000012
【実施例９】
【００５１】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質とのタンデム発現）
1.gBタンパク質断片とgDタンパク質とのタンデム発現用ドナープラスミドの構築
実施例1で抽出したヘルペスウイルスHN1201株核酸をテンプレートとして、実施例1におけるPCR系及び条件を参照して、プライマーgD18F：AGGAATTC AGGCGGACGTGGACGCCGTGCCCGCG とgD353R：CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGを利用して、gD遺伝子を増幅した。EcoRI+Hind IIIを利用してPCR産物を２種類の制限酵素で切断して、同様に２種類の制限酵素で切断したpFastBac Iと接続し、接続産物をDH5αに形質転換して、獲得した陽性プラスミドをpFastBac-HNgDと命名した。
pFastBac-HNgDをテンプレートとして、プライマーGP67F(XhoI)とHNgD353R(NheI)を利用してPCRを行い、PCR系と条件について実施例1を参照し、回収したPCR産物をXhoIとNheIを用いて２種類の制限酵素で切断し、同様に２種類の制限酵素で切断したpFastBac-Dualベクターと接続し、接続して獲得した陽性クローンをpFastBac-gDと標識した。
GP67F(XhoI)：ccgctcgagATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGC
HNgD353R(NheI)：CTAgctagcCTAGTGATGGTGATGGTGATGGCGGTGGCGC
実施例1で製造したpFastBac-HNgBΔ148~546をBamHIとHindIIIの２種類の制限酵素で切断して回収し、同様に２種類の制限酵素で切断したpFastBac-gDと接続し、陽性プラスミドと同定したものがpFastBac-gD-gBΔ148〜546である。
【００５２】
2.組み換えBacmidの構築
2μL pFastBac-gD-gBΔ148〜546プラスミドをDH10Bacコンピテントセルに導入し、軽くタッチして均一に混合し、氷に30min培養した後、42℃で60秒加熱処理した。氷に5min培養した後、400μlのSOC培地に加入して、37℃、200 rpmで4時間培養し、100μlの菌液を取ってIPTG/X-gal/カナマイシン/テトラサイクリン/ゲンタマイシンを含むプレートに塗布した。37℃で少なくとも48h培養し、ブルー・ホワイトコロニーが明らかになった時に、ホワイトシングルコロニーを5mlカナマイシン/テトラサイクリン/ゲンタマイシン液体LB培地に抽出し、終夜振とうした。翌日、1μlの菌液を取ってテンプレートとしてPCR同定した。PCR産物の大きさが2560bp+のものを、Tiangen Plasmid Mini Preparation Kitの試薬を用いて組み換えBacmidを抽出し、Bac-HN gD-gBΔ148〜546と命名した。
【００５３】
3.組み換えバキュロウイルスの獲得及び継代培養
組み換えBacmidBac-HN gD-gBΔ148〜546を昆虫細胞sf9にトランスフェクションした。Cellfectin(R) II Regentの明細書を参照してトランスフェクションし、トランスフェクションから72h後、細胞が病変した後、細胞上澄みを得て、rBac-HN gD-gBΔ148〜546 P1と標識した。
対数増殖期のsf9細胞を0.9×106cell/dishで10cmのシャーレに接種し、細胞が完全に接着した後、P1代の組み換えバキュロウイルスを、1:20-1:40の体積比で、sf9を敷いたシャーレに加え、27℃で継続培養した。約72時間後細胞病変が明らかになった時に、上澄みを収穫してP2代の組み換えバキュロウイルスに標識し、スズ箔で包んで遮光下に冷蔵庫に4℃で保存して供給した。この工程を繰り返して1:100-200で接種し、P3、P4代組み換えバキュロウイルスを獲得した。
4.タンパク質の発現
P4まで継代した組み換えウイルスを、1:5〜1:10の体積比でHi5細胞1Lに接種し、約48時間後細胞を収穫した。遠心分離した上澄みをWesternBlot により目的タンパク質の発現を確認した。His親和クロマトグラフィーとモレキュラーシーブ精製により、碧雲天会社のBCAタンパク質濃度測定キットの方法を参照してタンパク質を定量した結果、1L細胞が発現してHNgBΔ148〜546+gDタンパク質15mgを獲得できることが認められた。
本発明のHNgBΔ148〜546+gDタンパク質もそれぞれHNgBΔ148〜546タンパク質断片とgDタンパク質を発現した。精製した後、二種類のタンパク質をある割合で混合した抗原を製造できた。
【実施例１０】
【００５４】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質とをタンデム発現させたサブユニットワクチンの製造）
実施例9で製造したヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質を取って、実施例4の製造方法を参照してサブユニットワクチンを製造した。具体的な配合比を表12に示す。
【表１２】
0006475741.tif 000013
【実施例１１】
【００５５】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質とをタンデム発現させたサブユニットワクチンの免疫原性試験）
21日齢のPRV抗体陰性子ブタ20匹をランダムに5組に分けて、4匹/組とした。即ち、1-3組はそれぞれ本発明の実施例10で製造したワクチン8、ワクチン9、ワクチン10を注射し、第4組と第5組は同量のPBSを注射して、一回免疫した。免疫28日後に攻撃を行い、投与量をヘルペスウイルスHN1201株2×108.0 TCID50/匹とし、攻撃後7日まで、毎日一定の時間帯に臨床状況を観察して体温を測量した。
その結果、当該投与量により、第1〜3の免疫組で4匹の子ブタは何れも保護され、暫く臨床症状を表したものの、5日後逐次に正常な状態に戻り、最終的に生存した。第4組では、攻撃2日後2匹が死亡し、3日後全例死亡し、明らかな臨床症状を表した。第5組では、全例生存し、異常な現象が生じなかった。攻撃後の保護結果を表13に示す。
【表１３】
0006475741.tif 000014
体温状況を表14に示したが、ワクチン免疫組で暫く体温上昇状況が現れた。各ワクチンの免疫効果及び臨床評価結果の関連性を比較した結果、ワクチン8、ワクチン9、ワクチン10は良好な免疫効果を有することが分かった。
【表１４】
0006475741.tif 000015
【実施例１２】
【００５６】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質との融合発現）
1.gBタンパク質断片とgDタンパク質との融合発現用ドナープラスミドの構築
実施例1で製造したpFastBac-gBΔ148〜546と実施例9で製造したpFastBac-gDをテンプレートとし、プライマーとしてgBFとgBDR1、gBDF2とgD 353Rを利用してそれぞれ増幅し、gBΔ148〜546とgDを獲得した。プライマーとしてgBFとgD 353Rを利用してこの二つの断片をoverlapping PCRにより一体接続し、PCR産物をHNgBΔ148〜546/gDと標識した。PCR産物をBamHIとHindIIIの２種類の制限酵素で切断した後、同様に２種類の制限酵素で切断したpFastBac Iベクターと接続して、構築した陽性プラスミドをpFastBacHNgBΔ148〜546/gDと命名した。
gBF:  AGGAATTC AG ACGCGGGCCGCCTCGGCCTCGC
gBDR1:  CGTCCACGTCCGCCGTCAGGTTCAGGGTCACCCGCG
gBDF2：  CTGAACCTGACGGCGGACGTGGACGCCGTGCCCG
gD353R:  CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCG
2.組み換えBacmidの獲得
1-2μL pFastBac HNgBΔ148〜546/gDプラスミドをDH10Bacに形質転換した。形質転換方法は参照して行い、カナマイシン/テトラサイクリン/ゲンタマイシンのLB平板に塗布し、37℃で培養相に約48h培養し、ホワイトコロニーを抽出した。プライマーとしてM13F:CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGとM13R:AGCGGATAACAATTTCACACAGGを利用してPCR同定した。Tiangen生化科技有限公司製プラスミド抽出キットにおける試薬を利用してBacmidを抽出し、Bac-HNgBΔ148〜546/gDと命名した。
【００５７】
3.組み換えバキュロウイルスの獲得及び継代培養
組み換えBacmidBac-HNgBΔ148〜546/gDを昆虫細胞sf9にトランスフェクションした。Cellfectin(R) II Regentの明細書を参照してトランスフェクションし、トランスフェクションから72h後、細胞が病変した後、細胞上澄みを得て、vBac-HNHNgBΔ148〜546/gD P1と標識した。
対数増殖期のsf9細胞を0.9×106cell/dishで10cmのシャーレに接種し、細胞が完全に接着した後、P1代の組み換えバキュロウイルスを、1:20-1:40の体積比で、sf9を敷いたシャーレに加え、27℃で継続培養した。約72時間後細胞病変が明らかになった時に、上澄みを収穫してP2代の組み換えバキュロウイルスと標識した。スズ箔で包んで遮光下に冷蔵庫に4℃で保存して供給した。この工程を繰り返して1:100-200で接種し、P3、P4代組み換えバキュロウイルスを獲得した。
4.タンパク質の発現
P4まで継代した組み換えウイルスを1:5〜1:10の体積比でHi5細胞1Lに接種し、約48時間後細胞を収穫した。遠心分離した上澄みは、WesternBlot により目的タンパク質の発現を確認した。His親和クロマトグラフィーとモレキュラーシーブ精製により、碧雲天会社のBCA タンパク質濃度測定キットの方法を参照してタンパク質を定量した結果、1L細胞が発現してHNgBΔ148〜546/gDタンパク質5mgを獲得できることが認められた。
【実施例１３】
【００５８】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質とを融合発現させたサブユニットワクチンの製造）
実施例12で製造したヘルペスウイルス融合タンパク質HNgBΔ148〜546/gDを取り、実施例4の製造方法を参照してサブユニットワクチンを製造した。具体的な配合比を表15に示す。
【表１５】
0006475741.tif 000016
【実施例１４】
【００５９】
（ヘルペスウイルスgBタンパク質断片とgDタンパク質とを融合発現させたサブユニットワクチンの免疫原性試験）
21日齢のPRV抗体陰性子ブタ20匹をランダムに5組に分けて、4匹/組とした。即ち、1-3組はそれぞれ本発明の実施例13で製造したワクチン11、ワクチン12、ワクチン13を注射し、第4組と第5組は同量のPBSを注射して、一回免疫した。免疫28日後に攻撃を行い、投与量をヘルペスウイルスHN1201株2×108.0 TCID50/匹とした。攻撃後7日まで、毎日一定の時間帯に臨床状況を観察して体温を測定した。
その結果、当該投与量により、第1〜3の免疫組で4匹の子ブタは何れも保護され、暫く臨床症状を表したものの、5日後逐次に正常な状態に戻り、最終的には生存した。第4組では、攻撃2日後2匹が死亡し、3日後全例死亡し、明らかな臨床症状を表した。第5組では、全例生存し、異常な現象が生じなかった。攻撃後の保護結果を表16に示す。
【００６０】
【表１６】
0006475741.tif 000017
また、体温状況を表17に示したが、ワクチン免疫組で暫く体温上昇状況が現れた。各ワクチンの免疫効果及び臨床評価結果の関連性を比較した結果、ワクチン11、ワクチン12、ワクチン13は良好な免疫効果を有することが分かった。
【表１７】
0006475741.tif 000018
【００６１】
以上の記載は本発明の好ましい実施例を説明しただけであり、本発明を限定するものではない。上記のように、好ましい実施例により本発明を開示したが、それらは本発明を限定するものではない。当業者は本発明の主旨の範囲内に、上記の技術的内容を利用して修正や変更を行って等価置換して等価実施例を作成できる。本発明の技術態様の範囲内において、本発明の技術主旨に基づき、上記の実施例に対して行ういかなる簡単な修正、等価置換及び修飾は、いずれも本発明の技術方案に該当する。
【図１Ａ】
0006475741.tif 000019
【図１Ｂ】
0006475741.tif 000020
【配列表】
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