(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）リガンドに結合する多量体化領域および（ｂ）改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞であって、ここで、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、（ｉ）配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、（ｉｉ）Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択されるアミノ酸置換とを含み、前記アミノ酸置換位置は、配列番号９のアミノ酸位置を反映しており、ここで、配列番号９はアミノ酸残基番号１３５から始まり、アミノ酸残基番号４１６で終わる、細胞。
【請求項２】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記アミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４ＤおよびＳ１９６Ｄからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、Ｄ３３０Ａである、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記アミノ酸置換が、Ｄ３３０Ｅである、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記アミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑである、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、およびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓからなる群より選択される２つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる５つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４ＡおよびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓからなる群より選択される２つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４ＹおよびＮ４０５Ｑからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする最適化されたコドンを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号３９の核酸配列によってコードされる、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、前駆細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、造血性前駆細胞である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記プロモーターが、組織特異的であり、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、特異的な組織において発現される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記プロモーターが、活性化Ｔ細胞において活性化される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記キメラタンパク質が、マーカーポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記マーカーポリペプチドが、ΔＣＤ１９ポリペプチドであり、ここで、ΔＣＤ１９は、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される完全長ＣＤ１９からなる、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２９】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、カスパーゼ動員ドメインを欠く、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３０】
前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記多量体化領域が、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３５】
前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３６】
前記多量体化領域が、配列番号２９のアミノ酸配列、またはリガンドに結合することができるそのフラグメントを有する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３７】
前記多量体化領域が、配列番号３０のヌクレオチド配列によってコードされるか、またはリガンドに結合することができるそのフラグメントである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３８】
前記多量体化領域が、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはリガンドに結合することができるそのフラグメントをさらに含む、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３９】
前記多量体化領域が、配列番号３１のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、またはリガンドに結合することができるそのフラグメントをさらに含む、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、異種ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４１】
前記異種ポリペプチドが、キメラ抗原レセプターである、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
単離されている、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４３】
ヒト被験体内に存在する、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４４】
ヒト被験体に移植される、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与するための組成物であって、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の細胞を含み、ここで、前記細胞は、ヒトドナーＴ細胞であり、前記組成物はヒト患者に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項４６】
幹細胞移植のための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物であって、前記細胞は、ヒトドナーＴ細胞であり、前記組成物は、幹細胞移植片と組み合わせてヒト患者に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項４７】
前記幹細胞移植片が、マッチした移植片、部分的にマッチした移植片、ハプロタイプ一致移植片およびＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植片からなる群より選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヒト患者が、癌を有する、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ヒト患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記多量体化領域に結合する多量体リガンドが、前記ヒト患者に投与されることをさらに特徴とする、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記多量体リガンドが、移植片対宿主病を処置するために投与されることを特徴とする、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記多量体リガンドの投与の後に、アロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記アロ反応性Ｔ細胞の数が、前記多量体リガンドの投与後に約９０％以上減少する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、前記患者に追加の用量の前記多量体リガンドが投与されることをさらに特徴とする、請求項５０〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
少なくとも１×１０６個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記ヒト患者に投与されることを特徴とする、請求項４５〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも１×１０７個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記ヒト患者に投与されることを特徴とする、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
少なくとも１×１０８個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記ヒト患者に投与されることを特徴とする、請求項４５〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物であって、前記組成物がヒト患者に投与され、多量体リガンドが前記ヒト患者に投与されることを特徴とし、ここで、前記多量体リガンドは、前記多量体化領域に結合し、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する投与された細胞は、前記多量体リガンドの投与後に殺傷される、組成物。
【請求項６０】
（ａ）リガンドに結合する多量体化領域と、（ｂ）改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドとを含むキメラポリペプチドであって、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、（ｉ）配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、（ｉｉ）Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択されるアミノ酸置換とを含み、前記アミノ酸置換位置は、配列番号９のアミノ酸位置を反映しており、ここで、配列番号９はアミノ酸残基番号１３５から始まり、アミノ酸残基番号４１６で終わる、キメラポリペプチド。
【請求項６１】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６２】
前記アミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４ＤおよびＳ１９６Ｄからなる群より選択される、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６３】
前記アミノ酸置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、請求項６０に記載の改変されたキメラポリペプチド。
【請求項６４】
前記アミノ酸置換が、Ｄ３３０Ａである、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６５】
前記アミノ酸置換が、Ｄ３３０Ｅである、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６６】
前記アミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑである、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６７】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、およびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓからなる群より選択される２つのアミノ酸置換を含む、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６８】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる５つのアミノ酸置換を含む、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６９】
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４ＡおよびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓからなる群より選択される２つのアミノ酸置換を含む、請求項６０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項７０】
請求項６０〜６９のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本技術は、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含む組成物、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチド、および細胞治療のための方法を含む、それらを使用する方法に部分的に関する。細胞治療のための方法は、移入される細胞を、誘導物質の非存在下では低い基底活性を有する誘導可能な改変されたカスパーゼ−９タンパク質を発現するように改変する工程を含む。
【０００２】
関連特許出願
優先権は、２０１３年３月１０日に出願され、「改変されたカスパーゼポリペプチドおよびその使用」との表題の米国特許出願第１３／７９２，１３５号（これは、その全体が全て本明細書に言及され、参考として援用される）に対して主張される。
【背景技術】
【０００３】
背景
改変された細胞または改変されていない細胞を患者に投与する細胞治療がますます使用されつつある。細胞治療の例は、ＣＤ３４＋幹細胞移植後の養子Ｔ細胞移入である。幹細胞移入の後にＴ細胞を投与することにより、患者レシピエントにおいて免疫系の再構成の促進が助けられる。マッチした親類のドナーもしくは無関係のドナーが利用可能でないか、またはその疾患が広範囲にわたるドナーの検索に対して侵襲的すぎるとき、ＨＬＡハプロタイプ一致の家族ドナーを使用することが有効であり得る。そのようなドナーは、両親、同胞または第二度近親者であり得る。そのような注入は、免疫の回復を増強し、それにより、ウイルス感染症を減少させ得、白血病細胞の再発を排除し得る。しかしながら、ドナー幹細胞グラフトの中にアロ反応性Ｔ細胞が共存すると、ドナー細胞がレシピエントに対して反応して、レシピエントの皮膚、腸、肝臓および他の器官を次第に損傷することがあり、しばしば致命的結果を伴う、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が引き起こされ得る。
【０００４】
細胞治療の他の例としては、天然の細胞または異種遺伝子を発現するように遺伝的に操作された細胞の使用が挙げられる。これらの処置は、例えば、血液障害に対して使用されるが、これらの治療は、マイナスの副作用を有し得る。他の方法では、多くのタイプの成熟細胞に分化し得る未熟な前駆細胞（例えば、間葉系ストローマ細胞）が、病的な細胞の機能を置き換えることによって障害を処置するために使用され得る。
【０００５】
リガンド媒介性の二量体化およびキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの活性化を使用するカスパーゼ−９システムを使用して選択的アポトーシスを誘導するための方法が、発明者としてＭａｌｃｏｌｍ  Ｋ．Ｂｒｅｎｎｅｒが挙げられている２０１１年５月２０日に出願された、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＩＮＤＵＣＩＮＧ  ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＰＯＰＴＯＳＩＳという表題の米国特許出願番号１３／１１２，７３９において論じられている（その全体が本明細書中で参照により援用される）。
【０００６】
より低い基底活性を有する誘導可能なカスパーゼシステムを提供することによって、細胞治療において使用されるドナー細胞の起こり得る悪影響を排除する迅速かつ有効な機構が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
選択的アポトーシスは、二量体のリガンド結合ポリペプチド、例えば、ＡＰ１９０３結合ポリペプチドＦＫＢＰ１２ｖ３６に融合されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを発現する細胞において誘導され得る。そのキメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、ＡＰ１９０３に対して非常に感受性であり、種々の標的細胞において約１０〜１００ｐＭのＥＣ５０でアポトーシスを引き起こすが、低レベルのリガンド非依存的活性が、産生細胞株において大幅に増幅され、ゲノムレベルが代表的な機能レベルよりも高くなり得る製造課題が生じる。さらに、低レベルの基底活性であっても、形質導入されたまたはトランスフェクトされた標的細胞の一部において、アポトーシス促進性の閾値超過レベルに達し、細胞産物（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の収率を低下させる。最終的に、いくつかの細胞は、この低いが計測可能なアポトーシス促進性の基底活性に対して他の細胞よりも感受性である可能性がある。低い基底活性を有するキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを開発するために、（ｉ）ホモ二量体化界面、（ｉｉ）カスパーゼ−３媒介性切断または自己切断に不可欠なアスパラギン酸残基、（ｉｉｉ）アポトーシスの阻害剤であるＸＩＡＰと直接接触する残基、および（ｉｖ）検証されたリン酸化部位を含む、カスパーゼ−９の標的化される領域に対して部位特異的変異誘発を行った。
【０００８】
改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチド（例えば、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、ｉＣａｓｐ９  Ｎ４０５ＱおよびｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ  Ｎ４０５Ｑを含む）は、それぞれ、ＳＥＡＰレポーターベースの代替殺傷アッセイ（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）においてＡＰ１９０３  ＩＣ５０に対して最小の悪影響で、低い基底活性から検出不可能な基底活性を示した。
【０００９】
いくつかの実施形態において、多量体化領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞が提供され、ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４ＳおよびＦ４０６Ｌからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙである。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙである。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１３３およびＳ１９６Ｄからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｄ３３０Ａである。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｄ３３０Ｅである。いくつかの実施形態において、その少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｎ４０５Ｑである。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔ、Ｄ３１５Ａ−Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ｆ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ｅ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＣＩＶＳＭ（ＣＡＳＰ−３）、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＡＡＡＡＡ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＹＣＳＴＬ（ＣＡＳＰ−２）および４０２ＧＦＮＦ４０６ＱＰＴＦＴ（ＣＡＳＰ−８）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）および３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏおよび４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４ＡｃｏおよびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４ＹＮ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４ＹおよびＮ４０５Ｑからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４ＳおよびＦ４０６Ｌからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。４７．少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、
Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５ＡおよびＮ４０５Ｔからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９Ｅ、Ｔ３１７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９ＫおよびＡ３３１Ｋからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９ＥおよびＴ３１７Ａからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３ＦおよびＳ３０７Ａからなる群より選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする最適化されたコドンを含み、いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含み、最適化されたコドンを含む。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３９の核酸配列を含む。
【００１１】
改変されたキメラカスパーゼ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞の一部として本明細書中で論じられるアミノ酸配列を含む改変されたカスパーゼポリペプチドもまた提供される。改変されたカスパーゼ９ポリペプチドおよび改変されたキメラカスパーゼ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供される。改変されたカスパーゼポリペプチドおよび改変されたキメラカスパーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。本願の細胞は、任意のタイプの真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ウマ、イヌ、ネコ、ウシまたはヒト細胞であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、造血性前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、骨髄から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、臍帯血から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血から得られるかまたは調製される。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血単核球から得られるかまたは調製される。
【００１３】
いくつかの態様において、キメラポリペプチドまたは改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、発生的に制御され、カスパーゼ−９ポリペプチドは、発生的に分化した細胞において発現される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的であり、カスパーゼ−９ポリペプチドは、その特異的な組織において発現される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、活性化Ｔ細胞において活性化される。いくつかの実施形態実施形態において、プロモーターは、５’ＬＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、マーカーポリペプチド、例えば、以下に限定されないが、ΔＣＤ１９ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、カスパーゼ−９ポリペプチドは、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、カスパーゼ−９ポリペプチドは、カスパーゼ動員ドメインを欠く。
【００１４】
いくつかの実施形態において、多量体化領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、ＦＫＢ１２領域は、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３であり、他の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号２９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号３０の中のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号３１の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号３１の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号２９もしくは配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体化領域は、配列番号３０もしくは配列番号３１の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む。
【００１５】
本願のいくつかの態様において、細胞は、ウイルスベクターで形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。そのウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルスベクターであるがこれに限定されない）；ＳＦＧベクター；およびアデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得るがこれらに限定されない。
【００１６】
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子発現ベクターでさらにトランスフェクトされるかまたは形質導入される。いくつかの実施形態において、細胞は、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、異種ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、異種ポリペプチドは、キメラ抗原レセプターである。いくつかの実施形態において、細胞は、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、第１および第２のカスパーゼ−９ポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を含み、異なる基底活性または異なるＩＣ５０を有する。いくつかの態様において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドおよびカスパーゼ−９ポリペプチド；または改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドおよび第２の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、異なるＩＣ５０もしくは異なる広範囲の（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）用量反応曲線、または異なるＩＣ５０および多量体リガンドに対する異なる広範囲の用量反応曲線を有する、細胞が提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、細胞は、単離されている。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト被験体内に存在する。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト被験体内に移植される。
【００１８】
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与する方法もまた提供され、その方法は、本願の細胞のいずれかをヒト患者に投与する工程を含み、ここで、その細胞は、ヒトドナーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、その細胞は、ドナー細胞培養物において形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、その方法は、患者に細胞を投与した後にその患者における移植片対宿主病の存在を検出する工程；および多量体化領域に結合する多量体リガンドを、移植片対宿主病の存在が検出された患者に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、移植片対宿主病の影響は、多量体リガンドの投与後に減少する。
【００１９】
幹細胞移植の方法もまた提供され、その方法は、幹細胞移植片をヒト患者に投与する工程；および本願の細胞をその患者に投与する工程を含み、ここで、その細胞は、ドナーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞移植片は、マッチした移植片、部分的にマッチした移植片、ハプロタイプ一致移植片およびＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植片からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ヒトドナーＴ細胞は、患者のＴ細胞とマッチしているか、部分的にマッチしているか、またはハプロタイプ一致である。
【００２０】
患者における移植された治療用細胞の生存をコントロールするための方法もまた、ある特定の態様において提供され、その方法は、本願の細胞をヒト患者に投与し、多量体リガンドをその患者に投与する工程を含み、ここで、その多量体リガンドは、多量体化領域に結合し、カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する投与された細胞は、多量体リガンド投与後に殺傷される。いくつかの実施形態において、その方法は、本願の細胞を移植のために調製する工程およびその治療用細胞をヒト患者に移植する工程を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、患者は、癌を有する。いくつかの実施形態において、患者は、固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態において、癌は、患者の血液中または骨髄中に存在する。いくつかの実施形態において、患者は、血液または骨髄の疾患を有する。いくつかの実施形態において、患者は、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている。
【００２２】
本願の方法は、マーカーを発現する細胞が患者への投与のために選択される選択工程をさらに含み得る。そのマーカーは、例えば、以下に限定されないが、ΔＣＤ１９であり得る。いくつかの実施形態において、細胞は、骨髄サンプルから調製されたドナー細胞培養物においてトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血から調製されたドナー細胞培養物においてトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、ドナー細胞培養物は、ドナー末梢血単核球から調製される。いくつかの実施形態において、ドナーＴ細胞は、トランスフェクションまたは形質導入の前に、ドナー細胞培養物から同種異系枯渇される（ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）。いくつかの実施形態において、ドナーＴ細胞は、トランスフェクションまたは形質導入の前にドナー細胞培養物から同種異系枯渇されない。いくつかの実施形態において、形質導入されたまたはトランスフェクトされたＴ細胞は、患者への投与の前にＩＬ−２の存在下において培養される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、本願の方法は、多量体化領域に結合する多量体リガンド（例えば、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７）を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、移植片対宿主病を処置するために投与される。いくつかの実施形態において、患者は、多量体リガンドが投与される前に、移植片対宿主病の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、ステージ０、ステージ１、ステージ２、ステージ３またはステージ４の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す。
【００２４】
上記方法のある特定の実施形態において、２以上の用量の多量体リガンドが、投与される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与後に、アロ反応性Ｔ細胞の数は、減少する。いくつかの実施形態において、アロ反応性Ｔ細胞は、マーカーおよびＣＤ３を発現する。いくつかの実施形態において、アロ反応性Ｔ細胞の数は、多量体リガンドの投与後に約９０％以上減少する。いくつかの実施形態において、増殖可能でありウイルスおよび真菌に反応性であるドナーＴ細胞は、多量体リガンドの投与後に患者内で生き残る。いくつかの実施形態において、増殖可能であり患者内の腫瘍細胞に反応性であるドナーＴ細胞は、多量体リガンドの投与後にその患者内で生き残る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、患者は、ドナーＴ細胞の投与の前または投与と同時に幹細胞移植片を投与される。いくつかの実施形態において、幹細胞移植片は、ハプロタイプ一致である。いくつかの実施形態において、ドナーＴ細胞は、ハプロタイプ一致であり、患者への投与の前に同種異系枯渇されない。
【００２６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１×１０６個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、患者に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１×１０７個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、患者に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも１×１０８個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、患者に投与される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与の前、追加の用量の多量体リガンドの投与の前、または多量体リガンドの投与に関与する方法および投与量を決定する際に、疾患または状態のステージまたはレベルが判定される個別化された処置が、提供される。これらの方法は、本願の任意の疾患または状態の方法のいずれかにおいて使用され得る。リガンドを投与する前に患者を評価するこれらの方法が、移植片対宿主病の状況において論じられる場合、これらの方法は、他の状態および疾患の処置に同様に提供され得ることが理解される。したがって、例えば、本願のいくつかの実施形態において、方法は、治療用細胞を患者に投与する工程を含み、その患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、その患者における状態の有無を特定する工程；およびその患者において特定された状態の有無に基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者への多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程をさらに含む。例えば、本願の他の実施形態において、方法は、患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、その患者に追加の用量の多量体リガンドを投与するか否か決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、およびその患者において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者への多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、およびその患者において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドをその患者に投与するべきであるか、またはその後にその患者に投与される多量体リガンドの投与量を調整するかを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、患者における移植片対宿主病の有無またはステージを含む情報を受け取る工程；およびその患者において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者への多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、およびその被験体において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に移植片対宿主病の有無またはステージを伝える工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、およびその被験体において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程をさらに含む。
【００２８】
いくつかの態様において、細胞治療を受けた患者における移植片対宿主病を処置するための方法が提供され、ここで、その治療のために導入された細胞の１つ以上は、本願の細胞であり、その方法は、多量体化領域に結合する多量体リガンドをその患者に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、アロ反応性Ｔ細胞の数は、多量体結合領域に結合する多量体リガンドの投与の後に減少する。いくつかの実施形態において、細胞分裂を起こしていないアロ反応性Ｔ細胞は、消失される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与の２時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％は、消失される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与の１時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％は、消失される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与の３０分以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％は、消失される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与の２４時間以内に、多量体リガンドの投与の３０分後のＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の量と比べてＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞のさらなる対数減少が存在する。いくつかの実施形態において、方法は、多量体リガンドの投与後の２４時間以内の皮膚ＧｖＨＤおよび肝ＧｖＨＤの回復をさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、細胞は、治療用細胞であり、第２の異種タンパク質をコードする第２の核酸で形質導入されるかまたはトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、治療用細胞には、キメラ抗原レセプターを発現する異種遺伝子が形質導入される。いくつかの実施形態において、治療用細胞には、改変されたＴＧＦ−βレセプターを発現する異種遺伝子が形質導入される。いくつかの実施形態において、治療用細胞には、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核酸が形質導入される前、形質導入されるのと同時、または形質導入された後に、異種遺伝子が形質導入される。
【００３０】
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与するための方法もまた提供され、その方法は、本願の形質導入されたまたはトランスフェクトされたＴ細胞をヒト患者に投与する工程を含み、ここで、その細胞は、同種異系枯渇されていないヒトドナーＴ細胞である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、治療用細胞は、非悪性の障害を有する被験体に投与されるか、またはその被験体は、非悪性の障害、例えば、原発性免疫不全障害（例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全などであるがこれらに限定されない）、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害（例えば、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症などであるがこれらに限定されない）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、サラセミアなどであるがこれらに限定されない）、代謝障害（例えば、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスなどであるがこれらに限定されない）または破骨細胞障害（例えば、大理石骨病であるがこれに限定されない）と診断されている。
【００３２】
治療用細胞は、例えば、所望の治療結果のために患者に投与される任意の細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、末梢血細胞、造血性前駆細胞、骨髄細胞または腫瘍細胞であり得る。改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、腫瘍細胞を直接殺傷するためにも使用され得る。１つの応用法において、誘導可能な改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、腫瘍に注射され得、１０〜２４時間後に（タンパク質発現を可能にするために）、リガンド誘導物質、例えば、ＡＰ１９０３が、アポトーシスを引き起こして微小環境に腫瘍抗原を放出させるために投与され得る。より免疫原性である腫瘍の微小環境をさらに改善するために、その処置は、１つ以上のアジュバント（例えば、ＩＬ−１２、ＴＬＲ、ＩＤＯ阻害剤など）と組み合わされ得る。いくつかの実施形態において、それらの細胞は、固形腫瘍を処置するために送達され得る（例えば、腫瘍床への細胞の送達）。いくつかの実施形態において、キメラカスパーゼ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ワクチンの一部としてまたは腫瘍床への直接送達によって投与され得、その結果、腫瘍細胞においてキメラカスパーゼ９ポリペプチドが発現され、それに続いて、リガンド誘導物質の投与後に腫瘍細胞のアポトーシスが生じる。したがって、いくつかの実施形態において、核酸ワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）もまた提供され、ここで、そのワクチンは、本願の誘導可能なカスパーゼ−９ポリペプチドまたは改変された誘導可能なカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。そのワクチンは、被験体に投与され、それにより、インビボにおいて標的細胞を形質転換し得るか、または形質導入し得る。次いで、本願の方法に従って、リガンド誘導物質が投与される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、切断型の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、カスパーゼ動員ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、カスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントによってコードされる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、上記方法は、多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、多量体リガンド結合領域は、ＦＫＢＰ１２領域である。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６様アナログリガンドである。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、ＡＰ１９０３である。いくつかの実施形態において、多量体リガンドは、移植片対宿主病を処置するために投与される。いくつかの実施形態において、患者は、多量体リガンドが投与される前に、移植片対宿主病の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、ステージ０の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、ステージ１の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、ステージ２の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、ステージ３の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、ステージ４の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、２以上の用量の多量体リガンドが、投与される。いくつかの実施形態において、多量体リガンドの投与後に、アロ反応性Ｔ細胞の数は減少する。いくつかの実施形態において、アロ反応性Ｔ細胞の数は、多量体リガンドの投与後に、約６０％〜９９％、約７０％〜９５％、８０％〜９０％または約９０％以上減少する。いくつかの実施形態において、増殖可能でありウイルスおよび真菌に反応性であるドナーＴ細胞は、多量体リガンドの投与後に患者内で生き残る。いくつかの実施形態において、増殖可能であり患者内の腫瘍細胞に反応性であるドナーＴ細胞は、多量体リガンドの投与後にその患者内で生き残る。
【００３５】
ある特定の実施形態が、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに説明される。
【００３６】
図面は、本技術の実施形態を図示しており、限定するものではない。図示を明確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の比率で拡大縮小して作成されておらず、場合によっては、特定の実施形態の理解を容易にするために、様々な態様が、誇張または拡大されて示されていることがある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書中で論じられるような様々なｉＣａｓｐ９発現ベクターを図示している。図１Ｂは、図１Ａに示されている発現ベクターによって産生された完全長および切断型のカスパーゼ−９タンパク質の代表的なウエスタンブロットを図示している。
【図１Ｂ】図１Ａは、本明細書中で論じられるような様々なｉＣａｓｐ９発現ベクターを図示している。図１Ｂは、図１Ａに示されている発現ベクターによって産生された完全長および切断型のカスパーゼ−９タンパク質の代表的なウエスタンブロットを図示している。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｂは、様々なｉＣａｓｐ９発現ベクターで形質導入された細胞の表現型に対するｉＣａｓｐ９発現構築物の発現の影響を評価するために行われた実験の結果を図表によって提示している。図２Ａは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における細胞表面マーカーのレベルを図示している。図２Ｂは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における抗原刺激時のＴｈ１およびＴｈ２タイプサイトカインの分泌レベルを図示している。図２Ｃは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における、ＥＶＢで形質転換された自己リンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、ＨＬＡミスマッチＬＣＬおよびＨＳＢ−２に対する細胞溶解活性のレベルを図示している。図２Ｄは、ｉＣａｓｐ９を形質導入された細胞株に対する抗原依存性の持続を図示している。抗原刺激を中断した後のＴ細胞の着実な減少に注意すること。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｂは、様々なｉＣａｓｐ９発現ベクターで形質導入された細胞の表現型に対するｉＣａｓｐ９発現構築物の発現の影響を評価するために行われた実験の結果を図表によって提示している。図２Ａは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における細胞表面マーカーのレベルを図示している。図２Ｂは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における抗原刺激時のＴｈ１およびＴｈ２タイプサイトカインの分泌レベルを図示している。図２Ｃは、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞における、ＥＶＢで形質転換された自己リンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、ＨＬＡミスマッチＬＣＬおよびＨＳＢ−２に対する細胞溶解活性のレベルを図示している。図２Ｄは、ｉＣａｓｐ９を形質導入された細胞株に対する抗原依存性の持続を図示している。抗原刺激を中断した後のＴ細胞の着実な減少に注意すること。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、ｉＣａｓｐ９発現構築物を発現している細胞における二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）の有効性を測定するために行われた様々な実験の結果を図示している。図３Ａは、ＣＩＤまたはキャリアで処理した後の細胞のＦＡＣＳプロットを図示している。選択されていない細胞（図３Ａの上の列）および高ＧＦＰ発現について選択された細胞（図３Ａの下の列）に対するＦＡＣＳプロットが、提示されている。図３Ｂは、ｉＣａｓｐ９を形質導入された細胞をＣＩＤで一晩処理した結果を図示している。処理されたパネルは、アポトーシスの特色を示す細胞を示している。図３Ｃは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色された、ＣＩＤで処理された細胞および処理されていない細胞の結果を図示している。図３Ｄは、ＣＩＤ  ＡＰ２０１８７に対する用量反応曲線を示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは、ｉＣａｓｐ９発現構築物を発現している細胞における二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）の有効性を測定するために行われた様々な実験の結果を図示している。図３Ａは、ＣＩＤまたはキャリアで処理した後の細胞のＦＡＣＳプロットを図示している。選択されていない細胞（図３Ａの上の列）および高ＧＦＰ発現について選択された細胞（図３Ａの下の列）に対するＦＡＣＳプロットが、提示されている。図３Ｂは、ｉＣａｓｐ９を形質導入された細胞をＣＩＤで一晩処理した結果を図示している。処理されたパネルは、アポトーシスの特色を示す細胞を示している。図３Ｃは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色された、ＣＩＤで処理された細胞および処理されていない細胞の結果を図示している。図３Ｄは、ＣＩＤ  ＡＰ２０１８７に対する用量反応曲線を示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｂは、ｉＣａｓｐ９発現構築物を発現している細胞における二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）の有効性を測定するために行われた様々な実験の結果を図示している。図３Ａは、ＣＩＤまたはキャリアで処理した後の細胞のＦＡＣＳプロットを図示している。選択されていない細胞（図３Ａの上の列）および高ＧＦＰ発現について選択された細胞（図３Ａの下の列）に対するＦＡＣＳプロットが、提示されている。図３Ｂは、ｉＣａｓｐ９を形質導入された細胞をＣＩＤで一晩処理した結果を図示している。処理されたパネルは、アポトーシスの特色を示す細胞を示している。図３Ｃは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色された、ＣＩＤで処理された細胞および処理されていない細胞の結果を図示している。図３Ｄは、ＣＩＤ  ＡＰ２０１８７に対する用量反応曲線を示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｂは、ｉＣａｓｐ９発現構築物を発現している細胞における二量体化化学誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）の有効性を測定するために行われた様々な実験の結果を図示している。図３Ａは、ＣＩＤまたはキャリアで処理した後の細胞のＦＡＣＳプロットを図示している。選択されていない細胞（図３Ａの上の列）および高ＧＦＰ発現について選択された細胞（図３Ａの下の列）に対するＦＡＣＳプロットが、提示されている。図３Ｂは、ｉＣａｓｐ９を形質導入された細胞をＣＩＤで一晩処理した結果を図示している。処理されたパネルは、アポトーシスの特色を示す細胞を示している。図３Ｃは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色された、ＣＩＤで処理された細胞および処理されていない細胞の結果を図示している。図３Ｄは、ＣＩＤ  ＡＰ２０１８７に対する用量反応曲線を示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、導入遺伝子の発現レベルとｉＣａｓｐ９の機能との相関関係を計測するために行われた様々な実験の結果を図示している。図４Ａは、ＧＦＰ発現に基づいた細胞集団選択の結果を示している。図４Ｂは、ＣＩＤで一晩処理され、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤについて染色された細胞の結果を図示している。図４Ｃは、形質導入されていないＴ細胞と１：１で混合され、抗原刺激後に１０ｎＭ  ＣＩＤとともにインキュベートされた、選択されたＴ細胞の結果を示している。７日目における残留ＧＦＰ陽性Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、Ｔ細胞におけるｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９の機能を比較する様々な実験の結果を図示している。図５Ａは、ｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９発現構築物で形質導入され、ＧＦＰの発現に従ってソーティングされた細胞の結果を図示している。図５Ｂは、ＣＩＤで処理した後のＧＦＰ発現の計測の結果を図示している。図５Ｃは、ヒト由来細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＭＴ−２において行われた発現研究の結果を示している。それらの細胞株をアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色した。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｃは、Ｔ細胞におけるｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９の機能を比較する様々な実験の結果を図示している。図５Ａは、ｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９発現構築物で形質導入され、ＧＦＰの発現に従ってソーティングされた細胞の結果を図示している。図５Ｂは、ＣＩＤで処理した後のＧＦＰ発現の計測の結果を図示している。図５Ｃは、ヒト由来細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＭＴ−２において行われた発現研究の結果を示している。それらの細胞株をアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色した。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、Ｔ細胞におけるｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９の機能を比較する様々な実験の結果を図示している。図５Ａは、ｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９発現構築物で形質導入され、ＧＦＰの発現に従ってソーティングされた細胞の結果を図示している。図５Ｂは、ＣＩＤで処理した後のＧＦＰ発現の計測の結果を図示している。図５Ｃは、ヒト由来細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＭＴ−２において行われた発現研究の結果を示している。それらの細胞株をアネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色した。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図６】図６は、Ｉｌ−２と同時発現されたときのｉＣａｓｐ９の機能を図表によって図示している。
【図７】図７は、インビボにおけるｉＣａｓｐ９の機能を図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図８】図８Ａは、ｉＣａｓｐ９発現構築物ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９の構造を図示している。図８Ｂは、同種異系枯渇された細胞における細胞発現産物ｉＣａｓｐ９を産生するために使用されたプロトコルを図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図９】図９は、同種異系枯渇された細胞が、形質導入後に首尾良く増殖され得ることを図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１０】図１０は、自殺遺伝子構築物を形質導入された細胞が、ＣＤ１９免疫磁気選択によって高純度に濃縮され得ることを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｃは、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、それらの抗ウイルスレパートリーおよび機能を保持することを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１１Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔによって評価されたときの、ウイルス抗原に応答したインターフェロン−γの分泌を示している。図１１Ｂは、同種異系枯渇された細胞がＥＢＶ−ＬＣＬで刺激された後の細胞傷害性アッセイの結果を示している。図１１Ｃは、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）からのエピトープであるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬに特異的なＴ細胞の頻度を図示している。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｃは、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、それらの抗ウイルスレパートリーおよび機能を保持することを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１１Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔによって評価されたときの、ウイルス抗原に応答したインターフェロン−γの分泌を示している。図１１Ｂは、同種異系枯渇された細胞がＥＢＶ−ＬＣＬで刺激された後の細胞傷害性アッセイの結果を示している。図１１Ｃは、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）からのエピトープであるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬに特異的なＴ細胞の頻度を図示している。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２５免疫毒素を使用した最初の同種異系枯渇にもかかわらず、遺伝子改変された最終産物細胞（ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｅｌｌｓ）から単離され得ることを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１２Ａは、Ｆｏｘｐ３発現のレベルを示している。図１２Ｂは、遺伝子改変され、枯渇されたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の添加によって、細胞増殖が有意に減少したことを示すために行われた機能アッセイの結果を図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｃは、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、ＡＰ２０１８７によって迅速かつ効率的に排除されること、ならびに導入遺伝子の発現および殺傷効率が、長時間の培養とともに減少し、Ｔ細胞が再活性化されると回復し得ることを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１３Ａは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色された細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示している。図１３Ｂは、ＡＰ２０１８７が投与されたときの殺傷に対するＴ細胞の再活性化の結果を図表によって図示している。図１３Ｃは、自殺遺伝子の機能に対する長時間の培養およびＴ細胞活性化の影響を示している代表的なＦＡＣＳプロットを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｃは、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、ＡＰ２０１８７によって迅速かつ効率的に排除されること、ならびに導入遺伝子の発現および殺傷効率が、長時間の培養とともに減少し、Ｔ細胞が再活性化されると回復し得ることを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１３Ａは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色された細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示している。図１３Ｂは、ＡＰ２０１８７が投与されたときの殺傷に対するＴ細胞の再活性化の結果を図表によって図示している。図１３Ｃは、自殺遺伝子の機能に対する長時間の培養およびＴ細胞活性化の影響を示している代表的なＦＡＣＳプロットを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１３−３】図１３Ａ〜１３Ｃは、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、ＡＰ２０１８７によって迅速かつ効率的に排除されること、ならびに導入遺伝子の発現および殺傷効率が、長時間の培養とともに減少し、Ｔ細胞が再活性化されると回復し得ることを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１３Ａは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色された細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示している。図１３Ｂは、ＡＰ２０１８７が投与されたときの殺傷に対するＴ細胞の再活性化の結果を図表によって図示している。図１３Ｃは、自殺遺伝子の機能に対する長時間の培養およびＴ細胞活性化の影響を示している代表的なＦＡＣＳプロットを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１３−４】図１３Ａ〜１３Ｃは、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、ＡＰ２０１８７によって迅速かつ効率的に排除されること、ならびに導入遺伝子の発現および殺傷効率が、長時間の培養とともに減少し、Ｔ細胞が再活性化されると回復し得ることを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１３Ａは、アネキシン−Ｖおよび７−ＡＡＤで染色された細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示している。図１３Ｂは、ＡＰ２０１８７が投与されたときの殺傷に対するＴ細胞の再活性化の結果を図表によって図示している。図１３Ｃは、自殺遺伝子の機能に対する長時間の培養およびＴ細胞活性化の影響を示している代表的なＦＡＣＳプロットを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、アロ刺激された細胞を二量体化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）で処理した後にウイルス特異的Ｔ細胞が部分的に保持されることを示すために行われた様々な実験の結果を図示している。図１４Ａは、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞に対する結果を示している。図１４Ｂは、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞に対する結果を示している。アロ刺激の前、アロ刺激（ａｌｌｏｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の後、およびアロ刺激された細胞を二量体化剤で処理した後に、五量体解析によって細胞を定量化した。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、健常個体由来の間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）の解析を図示している。図１５Ａは、骨髄から単離された単核接着性画分が、一様に、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について陽性であり、造血性マーカーについて陰性だったことを示している。図１５Ｂは、それらの細胞が、他の細胞系列に分化することができたことを示している解析を図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ヒトＭＳＣが、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９で容易に形質転換され、それらの表現型を維持することを示すために行われた実験の結果を図示している。図１６Ａは、ＣＤ１９陽性細胞（例えば、ｉＣａｓｐ９の形質導入成功の指標）のパーセンテージが、２週間超にわたって実質的に一定のままであることを図示している。図１６Ｂは、首尾良く形質導入された細胞および形質導入されていない細胞が、特徴的なＭＳＣ表面表現型を保持することを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、ｉＣａｓｐ９を発現しているヒトＭＳＣが、ＣＩＤに曝露された後、インビトロにおいてアポトーシスに選択的に駆動されることを示すために行われた実験の結果を図示している。図１７Ａは、２４時間にわたってＣＩＤで処理された細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示している。図１７Ｂは、ｉＣａｓｐ９＋／ＣＤ１９＋細胞の磁気精製の結果を示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図１８】図１８は、アポトーシスの有効性を測定するためおよびアポトーシス抵抗性集団を特定するために行われた実験の結果を図示している。
【図１９】図１９のパネルＡ〜Ｑは、特定の細胞系列を強調するために染色された、ｉＣａｓｐ９を発現しているヒトＭＳＣを図示しており、これは、形質導入された細胞が、改変されていないＭＳＣの分化能を保持することを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２０】図２０は、ｉＣａｓｐ９を発現しているヒトＭＳＣの分化した子孫が、インビトロにおいてＣＩＤに曝露されることによって殺傷されることを図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃは、ｉＣａｓｐ９を発現しているヒトＭＳＣが、ＣＩＤに曝露された後にインビボにおいて選択的に殺傷されることを示すために行われた実験の結果を図示している。図２１Ａは、動物全体のイメージングの結果を示している。図２１Ｂは、ＣＩＤに曝露された後のｉＣａｓｐ９＋細胞の殺傷の時間経過を図表によって示している。図２１Ｃは、ＭＳＣの皮下接種後の動物の連続的な検査の結果を示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２２】図２２は、どのようにして自殺遺伝子産物とＣＩＤとが相互作用してアポトーシスを引き起こすかを示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２３】図２３は、自殺遺伝子によって改変され、同種異系枯渇された細胞を作製するために使用されたプロトコルの概要を図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２４】図２４は、ｉＣａｓｐ９を発現している同種異系枯渇されたＴ細胞の免疫磁気濃縮の使用を描写している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２５】図２５は、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９発現構築物、およびその発現構築物を有するように細胞を形質導入する方法を図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図２６】図２６は、遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ｉＣａｓｐ９を発現している細胞）に対するＣＩＤ処理の影響を示している。
【図２７】図２７は、患者の末梢血における、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞の検出を示しているグラフを提供している。図２７Ａ：再発白血病のためにＨＬＡハプロタイプ一致幹細胞移植後に細胞治療を受けた４人の患者由来のｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９＋、ＣＤ４＋ＣＤ１９＋またはＣＤ８＋ＣＤ１９＋）に対するＦＡＣＳ解析。患者１、２および４は、皮膚／肝ＧｖＨＤを発症し、単回用量の二量体化薬ＡＰ１９０３を投与された。
【図２８】図２８および２９は、細胞表面マーカーによって示されたときの、形質導入されたｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の細胞系列増殖を図表によって図示している。
【図２９】図２８および２９は、細胞表面マーカーによって示されたときの、形質導入されたｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の細胞系列増殖を図表によって図示している。
【図３０】図３０は、二量体化薬ＡＰ１９０３で処理した後のＧｖＨＤの迅速な逆転のグラフおよび写真を提供している。（Ａ）は、処置後２４時間以内の患者１におけるビリルビン濃度の正規化を表しているグラフである。（Ｂ）は、処置後２４時間以内の患者２からの発疹の消失を示している写真を提供している。
【図３１】図３１および３２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増殖の後の急性肝臓ＧｖＨＤ（グレード２）の発生を図表によって図示している。図３２は、ＧｖＨＤの症状を示している患者を写真によっても図示している。図３３〜３５は、ＡＰ１９０３（例えば、ＣＩＤ）が患者に投与された後の、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の迅速かつ効率的な排除を示している。
【図３２】図３１および３２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増殖の後の急性肝臓ＧｖＨＤ（グレード２）の発生を図表によって図示している。図３２は、ＧｖＨＤの症状を示している患者を写真によっても図示している。図３３〜３５は、ＡＰ１９０３（例えば、ＣＩＤ）が患者に投与された後の、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の迅速かつ効率的な排除を示している。
【図３３】図３１および３２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増殖の後の急性肝臓ＧｖＨＤ（グレード２）の発生を図表によって図示している。図３２は、ＧｖＨＤの症状を示している患者を写真によっても図示している。図３３〜３５は、ＡＰ１９０３（例えば、ＣＩＤ）が患者に投与された後の、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の迅速かつ効率的な排除を示している。
【図３４】図３１および３２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞増殖の後の急性肝臓ＧｖＨＤ（グレード２）の発生を図表によって図示している。図３２は、ＧｖＨＤの症状を示している患者を写真によっても図示している。図３３〜３５は、ＡＰ１９０３（例えば、ＣＩＤ）が患者に投与された後の、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の迅速かつ効率的な排除を示している。
【図３５】図３５は、インビボにおいてＡＰ１９０３で処置された後の、ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋前駆体の薬物感受性および抗ウイルス機能の持続を示しているグラフを提供している。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞は、ＡＰ１９０３で処置された５ヶ月後に、末梢血中のＣＤ３＋集団内に残っている（患者２）。これらのＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞は、ＦＡＣＳ解析におけるＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞数の減少と（Ｂ）二量体化薬への曝露の前および後のｉｃａｓｐ９遺伝子の定量的ＰＣＲ解析との両方によって評価されたとき、インビトロにおいてＡＰ１９０３に対する感受性を保持している。（Ｃ）患者２から捕集された遺伝子改変されたＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞は、ＣＭＶで刺激された培養物中のＩＦＮ−ガンマ陽性ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の存在によって示されるように、ＡＰ１９０３の６日前においてＣＭＶペプチド混合物に対して応答性だったが、ネガティブコントロールの生存ペプチド混合物に対しては応答性でなかった。ＧｖＨＤを処置するためのＡＰ１９０３注入の６および１４日後における回復中のＣＤ３＋ＣＤ１９＋集団の評価は、再発性ＧｖＨＤの非存在下においてウイルス特異的細胞が生き残り続けていることを示した。
【図３６】図３６〜３８は、ｉＣａｓｐ９同種異系枯渇された細胞が、ＧｖＨＤの徴候なしに、ＡＰ１９０３処理後に増殖することができることを図表によって図示している。図３７は、ＡＰ１９０３処理後の、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞の再構成を示している。図３９は、同種異系枯渇されたｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の増殖およびドナーキメラ現象の回復を図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３７】図３６〜３８は、ｉＣａｓｐ９同種異系枯渇された細胞が、ＧｖＨＤの徴候なしに、ＡＰ１９０３処理後に増殖することができることを図表によって図示している。図３７は、ＡＰ１９０３処理後の、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞の再構成を示している。図３９は、同種異系枯渇されたｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の増殖およびドナーキメラ現象の回復を図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３８】図３６〜３８は、ｉＣａｓｐ９同種異系枯渇された細胞が、ＧｖＨＤの徴候なしに、ＡＰ１９０３処理後に増殖することができることを図表によって図示している。図３７は、ＡＰ１９０３処理後の、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞の再構成を示している。図３９は、同種異系枯渇されたｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の増殖およびドナーキメラ現象の回復を図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図３９】図３６〜３８は、ｉＣａｓｐ９同種異系枯渇された細胞が、ＧｖＨＤの徴候なしに、ＡＰ１９０３処理後に増殖することができることを図表によって図示している。図３７は、ＡＰ１９０３処理後の、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞の再構成を示している。図３９は、同種異系枯渇されたｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の増殖およびドナーキメラ現象の回復を図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図４０】図４０は、Ｔ細胞注入の前および後のウイルス特異的Ｔ細胞を図表によって図示している。
【図４１】図４１は、アスペルギルス抗原に応答した患者のＰＢＭＣによる細胞内ＩＦＮ−γ産生のレベルを図表によって図示している。
【図４２】図４２は、ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞の増殖を図表によって図示している。実験の条件および結果に関するさらなる考察は、実施例に提示されている。
【図４３】図４３は、キメラｉカスパーゼ９およびＣＤ１９ポリペプチドをコードする発現構築物の一部を図表によって図示している。
【図４４】図４４は、カスパーゼ−９ポリペプチドのタンパク質構造を図表によって図示している。基底のシグナル伝達を改変するために、ホモ二量体化（Ｇ４０２−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｆ４０６）（配列番号１３０）、タンパク質分解およびＸＩＡＰ−ＢＩＲ３ドメイン（ピンク色）との相互作用、カスパーゼ９の阻害剤（灰色）（Ｄ３１５−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｆ３１９（配列番号１３９）、Ｄ３３０−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｓ３３４（配列番号１４０））ならびにカスパーゼ９上のリン酸化部位において非常に重要であると以前に報告された残基に対して部位特異的変異誘発を行った。その結晶学は、１ｎｗ９（ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）に基づく。６５個のｉＣａｓｐ９変異体を試験し、より低い基底活性を有する有望な候補としては、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｄ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑが挙げられた。
【図４５】図４５は、ＳＥＡＰアッセイの解析を提供している。基底のシグナル伝達とＡＰ１９０３によって誘導される活性の両方を調べるために、１０６個の初期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、様々な量の野生型カスパーゼ、および細胞の生存に対するマーカーであるＳＥＡＰを駆動するためにＳＲαプロモーターを使用する５００ｎｇの発現プラスミドでコトランスフェクトした。製造者の提案に従って、抗生物質を含まない１ｍＬのＩＭＤＭ＋１０％ＦＢＳを各混合物に加えた。１０００μｌの混合物を、９６ウェルプレートの各ウェル上に播種した。１００μｌのＡＰ１９０３を、トランスフェクションの少なくとも３時間後に加えた。少なくとも２４時間にわたるＡＰ１９０３の添加の後、１００μｌの上清を９６ウェルプレートに移し、６８Ｃにおいて３０分間熱変性することにより、内因性のアルカリホスファターゼを不活性化した。アッセイに向けて、４−メチルウンベリフェリルホスフェート基質を、ＳＥＡＰによって、３６４ｎｍで励起して４４８ｎｍの発光フィルターを用いて検出され得る代謝産物である４−メチルウンベリフェロンに加水分解した。ＳＥＡＰは、細胞の生存に対するマーカーとして使用されるので、ＳＥＡＰ読み出しの減少は、ｉカスパーゼ−９活性の上昇に対応する。したがって、ＡＰ１９０３の非存在下におけるより高いＳＥＡＰ読み出しは、より低い基底活性を示唆し得る。所望のカスパーゼ変異体は、ＡＰ１９０３に対する高い感受性（すなわち、より低いＩＣ５０）とともに、低下した基底のシグナル伝達を有し得る。この研究の目標は、ＩＣ５０を有意に損なわずに、基底のシグナル伝達を減少させることである。
【図４６】図４６は、様々な改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの、基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３によって誘導されるシグナル伝達に関するデータを図表によって図示している。（３Ａ）ＨＥＫ２９３細胞１００万個あたり１μｇの改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするＤＮＡおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３／１６細胞の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体のすべてが、より低い基底のシグナル伝達を示した。（３Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞１００万個あたり０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰとともに２μｇの、改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３／１６細胞。（３Ｃ）改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドのＡＰ１９０３  ＩＣ５０推定値の要旨。すべての変異が、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を逆に上昇させた。データポイントは、２つのウェルの平均であり、示されているデータは、２つの独立した実験の代表である。
【図４７】図４７は、野生型（改変されていない）キメラカスパーゼ−９ポリペプチドおよび改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドのタンパク質発現およびタンパク質分解を解析しているウエスタンブロットの写真を含んでいる。（４Ａ）１または２μｇのｐＳＨ１−ｉＣａｓｐ９  ＷＴ、Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱまたはＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体で一過性にトランスフェクトされた、トランスフェクションの７２時間後のＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞のウエスタンブロット。両方のブロットにおいて、１レーンあたり３３μｇのタンパク質溶解産物をローディングした。プロセシングされていない産物とｐ３０切断産物の両方を検出するために、それらのブロットをヒトカスパーゼ−９の残基２９９〜３１８を標的化している１：１０００希釈のウサギ抗ヒトカスパーゼ−９ポリクローナル抗体で標識した。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、野生型ｉＣａｓｐ９と同様のレベルまたはそれよりも高いレベルで発現された。（４Ｂ）ストリッピングされたブロットを抗アクチンポリクローナル抗体で標識することにより、４Ａにおいて等しい量のタンパク質がローディングされていることが示された。
【図４８】上位の改変されたカスパーゼ変異体の基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３によって誘導されるシグナル伝達。４８Ａ）ＨＥＫ２９３の１００万個あたり２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３／１６の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。ｉＣＡＳＰ−９  Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔのすべてが、ＷＴ  ｉカスパーゼ９よりも低い基底のシグナル伝達を示す。（４８Ｂ）ＡＰ１９０３に対するカスパーゼ変異体の基底活性およびＩＣ５０推定値の要旨。すべての変異が、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を変化させる。データポイントは、２つのウェルの平均を反映しており、示されているデータは、２つの実験の代表である。
【図４９Ａ】上位の改変されたカスパーゼ変異体の基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３によって誘導されるシグナル伝達。（４９Ａ）ＨＥＫ２９３の１００万個あたり１または２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３／１６の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。ｉＣＡＳＰ−９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体のすべてが、野生型カスパーゼ−９（破線）と比べてより低い基底のシグナル伝達を示した。（４９Ｂ）ＡＰ１９０３に対するカスパーゼ変異体ポリペプチドのＩＣ５０推定値の要旨。Ｎ４０５Ｑは、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を逆に上昇させた。Ｄ３３０ＡとＮ４０５Ｑとの組み合わせは、ＩＣ５０を改善しなかった。データポイントは、３つ組の平均であり、示されるデータは、７つの実験の代表である。（４９Ｃ）１または２μｇのｐＳＨ１−ｉＣＡＳＰ９  ＷＴ、Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱまたはＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６の、トランスフェクションの７２時間後のウエスタンブロット。両方のブロットにおいて、１レーンあたり３３μｇのタンパク質をローディングした。プロセシングされていない産物とｐ３０切断産物の両方を検出するために、それらのブロットをヒトカスパーゼ−９の残基２９９〜３１８を標的化している１：１０００希釈のウサギ抗ヒトカスパーゼ−９ポリクローナル抗体で標識した。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、野生型ｉＣａｓｐ９と同様のレベルまたはそれよりも高いレベルで発現された。ｉＣＡＳＰ９  Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ変異体は、ＡＰ１９０３に応答して損なわれた切断を示した。
【図４９Ｂ】上位の改変されたカスパーゼ変異体の基底のシグナル伝達およびＡＰ１９０３によって誘導されるシグナル伝達。（４９Ａ）ＨＥＫ２９３の１００万個あたり１または２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３／１６の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。ｉＣＡＳＰ−９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体のすべてが、野生型カスパーゼ−９（破線）と比べてより低い基底のシグナル伝達を示した。（４９Ｂ）ＡＰ１９０３に対するカスパーゼ変異体ポリペプチドのＩＣ５０推定値の要旨。Ｎ４０５Ｑは、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を逆に上昇させた。Ｄ３３０ＡとＮ４０５Ｑとの組み合わせは、ＩＣ５０を改善しなかった。データポイントは、３つ組の平均であり、示されるデータは、７つの実験の代表である。（４９Ｃ）１または２μｇのｐＳＨ１−ｉＣＡＳＰ９  ＷＴ、Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱまたはＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ二重変異体で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６の、トランスフェクションの７２時間後のウエスタンブロット。両方のブロットにおいて、１レーンあたり３３μｇのタンパク質をローディングした。プロセシングされていない産物とｐ３０切断産物の両方を検出するために、それらのブロットをヒトカスパーゼ−９の残基２９９〜３１８を標的化している１：１０００希釈のウサギ抗ヒトカスパーゼ−９ポリクローナル抗体で標識した。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、野生型ｉＣａｓｐ９と同様のレベルまたはそれよりも高いレベルで発現された。ｉＣＡＳＰ９  Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ変異体は、ＡＰ１９０３に応答して損なわれた切断を示した。
【図５０】図５０は、Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓ変異体を用いたときに観察された基底活性の低下を示しているＳＥＡＰアッセイのグラフを提供している。Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓ変異は、ＸＩＡＰ結合を減少させる可能性があり、それは、基底のシグナル伝達を増加させると予想され得るが、その逆のことが観察された。
【図５１】図５１は、Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓ変異体のＳＥＡＰアッセイの棒グラフを提供している。Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓは、より低い基底活性を有するが、それらは、ＡＰ１９０３に対して野生型カスパーゼ９とほぼ等しく感受性であることから、これらは、新しい変異体に対する良好な候補になる。
【図５２】Ｄ３３０Ａバリアントの基底の活性化およびＡＰ１９０３によって誘導される活性化。ＨＥＫ２９３細胞１００万個あたり１または２μｇの変異体カスパーゼポリペプチドおよび０．５μｇのｐＳＨ１−ｋＳＥＡＰで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３／１６細胞の、トランスフェクションの７２時間後のＳＥＡＰアッセイ。２μｇの各発現プラスミド（ＷＴを含む）に基づいて正規化されたデータが、１μｇに基づくトランスフェクションからの正規化されたデータと混合されている。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、−Ｄ３３０Ｅおよび−Ｄ３３０Ｓは、野生型カスパーゼ９よりも統計的に低い基底のシグナル伝達を示した。
【図５３】２μｇのｐＳＨ１−ｉＣａｓｐ９  ＷＴ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｖ、Ｄ３３０ＧおよびＤ３３０Ｓで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞の、トランスフェクションの７２時間後のウエスタンブロット。それらのブロットを、いくつかのピコルナウイルスに由来する、１：１０００希釈の、２Ａ配列を認識するウサギポリクローナル抗「２Ａ」ペプチドで標識した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、−Ｄ３３０Ｅおよび−Ｄ３３０Ｇは、野生型ｉＣａｓｐ９と同様のレベルまたはそれよりも高いレベルで発現された。ＡＰ１９０３に応答して損なわれた切断が観察された。＊は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＭＷ  Ｐｒｏｔｅｉｎラダー（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を注解しており、
【００３８】
【化１】
0006537984.tif 000002
【００３９】
は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を注解している。
【図５４】ＶＳＶ−Ｇエンベロープに基づくレトロウイルス上清で交差形質導入された（ｃｒｏｓｓ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）ＰＧ１３パッケージング細胞から得られるウイルス力価に対する様々なカスパーゼ変異の影響。レトロウイルスマスター細胞株作製に対するＣａｓｐａＣＩＤｅに由来する基底のシグナル伝達の影響を調べるために、レトロウイルスパッケージング細胞株であるＰＧ１３を、４μｇ／ｍｌのトランスフェクションエンハンサーであるポリブレンの存在下において、ＶＳＶ−Ｇに基づくレトロウイルス上清で５回交差形質導入した。続いて、ＣａｓｐａＣＩＤｅを形質導入されたＰＧ１３細胞を、形質導入の指標として、ＰＥ結合体化抗ヒトＣＤ１９抗体で染色した。ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ａ、−Ｄ３３０Ｅおよび−Ｎ４０５Ｑを形質導入されたＰＧ１３細胞は、高いＣＤ１９平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示したことから、より多いレトロウイルスコピー数が示唆され、より低い基底活性が暗示される。ＰＧ１３形質導入体のウイルス力価をより直接的に調べるために、ＨＴ１０８０細胞をウイルス上清および８μｇ／ｍｌポリブレンで処理した。ＰＧ１３細胞においてＷＴ  ｉＣａｓｐ９に対してｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ、−Ｎ４０５Ｑおよび−Ｄ３３０Ｅ形質導入体の高いＣＤ１９  ＭＦＩは、ＨＴ１０８０細胞において観察されるように、より高いウイルス力価と正に相関する。最初に低かったウイルス力価（およそ１Ｅ５形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌ）に起因して、ウイルス収率を高めるＨＡＴ処理の非存在下では、ウイルス力価の差異は観察されなかった。ＨＡＴ培地で処理したとき、ＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｄ３３０Ａ、−Ｎ４０５Ｑまたは−Ｄ３３０Ｅを形質導入されたＰＧ１３細胞は、より高いウイルス力価を示した。ウイルス力価（形質導入単位）は、式：ウイルス力価＝（形質導入の当日における＃細胞）＊（％ＣＤ１９＋）／上清の体積（ｍｌ）を用いて計算される。より低い基底活性を有するＣａｓｐａＣＩＤｅ変異体の影響をさらに調べるために、ＣａｓｐａＣＩＤｅを形質導入されたＰＧ１３細胞の個々のクローン（コロニー）を選択し、増殖した。他のコホートよりも高いＣＤ１９  ＭＦＩを有するＣａｓｐａＣＩＤｅ−Ｎ４０５Ｑクローンが、観察された。
【図５５】ｉＣａｓｐ９変異体を形質導入されたＴ細胞のＡＰ１９０３用量依存的排除。健常ドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞を、変異体または野生型のｉＣａｓｐ９およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入後、ＣＤ１９マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞を精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１０ｎＭ）に曝露し、２４時間後にフローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について計測した。
【図５６】ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ変異体は、形質導入されたＴ細胞において、改善されたＡＰ１９０３依存的細胞傷害性を示す。健常ドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞を、変異体または野生型のｉＣａｓｐ９またはｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０ＡおよびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入後、ＣＤ１９マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞を精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝露し、２４時間後にフローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について計測した。
【図５７】ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ａ変異体は、形質導入されたＴ細胞において、改善されたＡＰ１９０３依存的細胞傷害性を示す。健常ドナー（ｎ＝６）由来の初代Ｔ細胞を、変異体または野生型のｉＣａｓｐ９またはｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０ＡおよびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入後、ＣＤ１９マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞を精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝露し、２４時間後にフローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について計測した。ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０ＡのＩＣ５０は、野生型ｉＣａｓｐ９よりも有意に低かった（ｐ＝０．００２）。
【図５８】Ｄ３３０ファミリーメンバーは、形質導入されたＴ細胞においてＤ３３０Ａと同様のＡＰ１９０３依存的細胞傷害性を示す。健常ドナー（ｎ＝２）由来の初代Ｔ細胞を、Ｄ３３０変異体または野生型のｉＣａｓｐ９およびΔＣＤ１９細胞表面マーカーをコードするレトロウイルスで形質導入した。形質導入後、ＣＤ１９マイクロビーズおよび磁気カラムを使用して、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞を精製した。次いで、Ｔ細胞をＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）に曝露し、２４時間後にフローサイトメトリーによってＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞について計測した。
【図５９】ＡＰ１９０３に対してより低い感受性を有するｉＣａｓｐ９変異体は、なおもインビトロにおいてＴ細胞増殖をコントロールする。活性化Ｔ細胞を、ｉＣａｓｐ９変異体を含むレトロウイルスで形質導入し、０および４日目にＡＰ１９０３（矢印）で処理し、続いて、１０日間にわたって数えた。野生型、Ｄ３３０Ａおよび他のｉＣａｓｐ９変異体の両方が、１０日後に、Ｔ細胞の増殖を停止し、Ｔ細胞の生存を減少させた。
【図６０】Ｎ４０５Ｑ変異体の改善された導入遺伝子発現は、形質導入されたＴ細胞においてＡＰ１９０３依存的細胞傷害性を改善する。Ｔ細胞を、ｉＣａｓｐ９野生型、Ｎ４０５Ｑ、コドン最適化されたＮ４０５ＱおよびＦｖ．Ｆｖ’．Ｎ４０５ＱをコードするＲＤ１１４シュードタイプ化レトロウイルスで形質導入し、次いで、様々な用量のＡＰ１９０３（０〜１００ｎＭ）で処理した。２４時間後、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって計測した。残存パーセントを、ＡＰ１９０３なしのときのＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度に対して正規化した。
【図６１】野生型ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞のインビボにおけるＡＰ１９０３用量依存的排除。Ｔ細胞を、ＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−２Ａ−ΔＣＤ１９レトロウイルスで形質導入し、免疫不全マウス（ＮＳＧ）にｉ．ｖ．注射した。２４時間後、マウスにＡＰ１９０３をｉ．ｐ．注射した（０〜５ｍｇ／ｋｇ）。さらに２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓（Ａ）および末梢血（Ｂ）からリンパ球を単離し、フローサイトメトリーによって、ヒトＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度について解析した。
【図６２】Ｄ３３０Ｅ  ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＴ細胞のインビボにおけるＡＰ１９０３用量依存的排除。Ｔ細胞を、ＳＦＧ−ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅ−２Ａ−ΔＣＤ１９レトロウイルスで形質導入し、免疫不全マウス（ＮＳＧ）にｉ．ｖ．注射した。２４時間後、マウスにＡＰ１９０３をｉ．ｐ．注射した（０〜５ｍｇ／ｋｇ）。さらに２４時間後、マウスを屠殺し、脾臓（Ａ）からリンパ球を単離し、フローサイトメトリーによって、ヒトＣＤ３＋ＣＤ１９＋Ｔ細胞の頻度について解析した。これは、ｉＣａｓｐ９−Ｄ３３０Ｅが、ＡＰ１９０３に応答して、野生型ｉＣａｓｐ９と同様のインビボ細胞傷害性プロファイルを示すことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
本明細書中で使用されるとき、請求項および／または明細書において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるときの単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」および「２つ以上の」の意味とも一致する。なおもさらに、用語「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな（ｏｐｅｎ  ｅｎｄｅｄ）用語であると認識している。
【００４１】
本明細書中で使用される用語「同種異系」は、抗原的に異なるＨＬＡ遺伝子座またはＭＨＣ遺伝子座のことを指す。
【００４２】
したがって、同じ種から移植される細胞または組織は、抗原的に異なり得る。同系マウスは、１つ以上の遺伝子座が異なり得（コンジェニック）、同種異系マウスは、同じバックグラウンドを有し得る。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体の産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化またはその両方を含み得る。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「癌」は、そのユニークな特質である正常なコントロールの喪失が、制御されない成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤および転移をもたらす、細胞の過剰増殖として定義される。例としては、メラノーマ、非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝細胞癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉、舌、神経芽細胞腫、頭部、頚部、乳、膵、前立腺、癌、骨、精巣、卵巣、中皮腫、子宮頸、胃腸、リンパ腫、脳、結腸、肉腫または膀胱が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
ドナー：用語「ドナー」とは、患者レシピエントでない哺乳動物、例えば、ヒトのことを指す。ドナーは、例えば、レシピエントとＨＬＡ同一性を有し得るか、またはレシピエントと部分的なまたはより大きなＨＬＡ不一致を有し得る。
【００４６】
ハプロタイプ一致：本明細書中で細胞、細胞型および／または細胞系列に関して使用される用語「ハプロタイプ一致」とは、ハプロタイプを共有する細胞、または１本の染色体上の密接に連結した遺伝子セットにおいて実質的に同じ対立遺伝子を有する細胞のことを指す。ハプロタイプ一致ドナーは、レシピエントと完全なＨＬＡ同一性を有するわけではなく、部分的なＨＬＡ不一致が存在する。
【００４７】
血液疾患：本明細書中で使用される用語「血液疾患」、「血液疾患」および／または「血液の疾患」は、血液およびその構成要素（血液細胞、ヘモグロビン、血液タンパク質を含むが、これらに限定されない）の産生、凝固のメカニズム、血液の産生、血液タンパク質の産生などおよびそれらの組み合わせに影響する状態のことを指す。血液疾患の非限定的な例としては、貧血、白血病、リンパ腫、血液学的新生物、アルブミン血症（ａｌｂｕｍｉｎｅｍｉａｓ）、血友病などが挙げられる。
【００４８】
骨髄疾患：本明細書中で使用される用語「骨髄疾患」は、血液細胞および血小板の産生の減少をもたらす状態のことを指す。いくつかの骨髄疾患では、正常な骨髄の構造が、感染症（例えば、結核）または悪性疾患によって取って代わられ得、その後、血液細胞および血小板の産生の減少に至り得る。骨髄疾患の非限定的な例としては、白血病、細菌感染症（例えば、結核）、放射線宿酔または放射線中毒、汎血球減少症（ａｐｎｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、貧血、多発性骨髄腫などが挙げられる。
【００４９】
Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞（これはＣＤ３＋細胞を意味することを含む）：Ｔ細胞（Ｔリンパ球とも称される）は、リンパ球と称される白血球の一群に属する。リンパ球は、一般に、細胞性免疫に関わる。「Ｔ細胞」における「Ｔ」とは、胸腺に由来する細胞またはその成熟が胸腺に影響される細胞のことを指す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターとして知られる細胞表面タンパク質の存在によって、他のリンパ球のタイプ（例えば、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）と区別され得る。本明細書中で使用される用語「活性化Ｔ細胞」は、クラスＩＩ主要組織適合性（ＭＨＣ）マーカーにおいて提示された抗原決定基の認識によって免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞のクローン性増殖）をもたらすように刺激されたＴ細胞のことを指す。Ｔ細胞は、抗原決定基、サイトカインおよび／またはリンフォカインならびに分化クラスター細胞表面タンパク質（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８などおよびそれらの組み合わせ）の存在によって活性化される。差次的なタンパク質のクラスターを発現する細胞は、しばしば、Ｔ細胞表面上のそのタンパク質の発現について「陽性」であると言われる（例えば、ＣＤ３またはＣＤ４の発現について陽性の細胞は、ＣＤ３＋またはＣＤ４＋と称される）。ＣＤ３およびＣＤ４タンパク質は、Ｔ細胞におけるシグナル伝達に直接的および／または間接的に関わり得る細胞表面レセプターまたはコレセプターである。
【００５０】
末梢血：本明細書中で使用される用語「末梢血」は、血液の循環プールから得られるかまたは調製され、リンパ系、脾臓、肝臓もしくは骨髄内に隔絶されない、血液の細胞成分（例えば、赤血球、白血球および血小板）のことを指す。
【００５１】
臍帯血：臍帯血は、末梢血、およびリンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔絶された血液とは異なる。交換可能に使用され得る用語「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」、「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ）」は、胎盤および出産後のつながったままの臍帯に残存する血液のことを指す。臍帯血は、造血細胞をはじめとした幹細胞を含むことが多い。
【００５２】
例えば、細胞の場合におけるような「得られるかまたは調製される」は、細胞または細胞培養物が、その供給源から単離されること、精製されることまたは部分的に精製されることを意味し、ここで、その供給源は、例えば、臍帯血、骨髄または末梢血であり得る。これらの用語は、元の供給源または細胞培養物が培養され、細胞が複製される場合、および子孫細胞がその元の供給源に由来する場合にも適用され得る。
【００５３】
あるパーセントの細胞が殺傷される場合におけるような「殺傷する」または「殺傷」は、アポトーシスを計測するための公知の任意の方法を用いて、例えば、本明細書中で論じられるアッセイ、例えば、本明細書中で論じられるＳＥＡＰアッセイまたはＴ細胞アッセイを用いて計測されるときの、アポトーシスによる細胞の死を意味する。この用語は、細胞剥離のことも指し得る。
【００５４】
同種異系枯渇（Ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）：本明細書中で使用される用語「同種異系枯渇」とは、アロ反応性Ｔ細胞の選択的枯渇のことを指す。本明細書中で使用される用語「アロ反応性Ｔ細胞」とは、例えば、移植された同種移植片における、外来細胞への曝露を受けて免疫応答をもたらすように活性化されるＴ細胞のことを指す。選択的枯渇は、一般に、免疫磁石（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｓ）、免疫毒素、フローソーティング、アポトーシスの誘導、フォトデプリーション（ｐｈｏｔｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）法などまたはそれらの組み合わせを使用して除去するために、細胞表面に発現される様々なマーカーまたはタンパク質（例えば、時折、分化クラスタータンパク質（ＣＤタンパク質）、ＣＤ１９など）を標的化することを含む。本方法では、同種異系枯渇の前または後に、細胞が、キメラタンパク質をコードするベクターで形質導入され得るか、またはトランスフェクトされ得る。また、同種異系枯渇工程なしで、細胞が、キメラタンパク質をコードするベクターで形質導入され得るか、またはトランスフェクトされ得、同種異系枯渇されていない細胞が、患者に投与され得る。多量体リガンドが投与されると、有害事象、例えば、移植片対宿主病が、緩和され得るので、付加される「安全スイッチ」のおかげで、例えば、同種異系枯渇されていない（ｎｏｎ  ａｌｌｏ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）Ｔ細胞を投与することが可能である。
【００５５】
移植片対宿主病：用語「移植片対宿主病」または「ＧｖＨＤ」とは、同種異系骨髄移植に伴うことが多く、時折、免疫無防備状態の患者への照射されていない血液の移入に伴う、合併症のことを指す。移植片対宿主病は時折、移植された骨髄中の機能的な免疫細胞が、レシピエントを「外来のもの」として認識し、免疫学的応答を開始するとき、生じ得る。ＧｖＨＤは、急性型と慢性型とに分けられ得る。急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）は、移植後または移入後の最初の１００日以内に観察されることが多く、肝臓、皮膚、粘膜、免疫系（例えば、造血系、骨髄、胸腺など）、肺および消化管に影響し得る。慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）は、移植または移入の１００日以上後に開始することが多く、急性ＧｖＨＤと同じ器官を攻撃し得るだけでなく、結合組織および外分泌腺にも影響し得る。皮膚の急性ＧｖＨＤは、びまん性斑状丘疹状皮疹、時折、レース状のパターンをもたらし得る。
【００５６】
ドナーＴ細胞：ここで使用される用語「ドナーＴ細胞」は、同種異系の幹細胞移植の後に抗ウイルス免疫および／または抗腫瘍免疫をもたらすためにレシピエントにしばしば投与されるＴ細胞のことを指す。ドナーＴ細胞は、骨髄移植片拒絶反応を阻害するためおよび同種異系生着（ａｌｌｏｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の成功を増加させるために利用されることが多いが、しかしながら、同じドナーＴ細胞は、宿主抗原に対する同種異系攻撃反応（ａｌｌｏａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こし得、それはその後、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらし得る。ある特定の活性化ドナーＴ細胞は、他の活性化Ｔ細胞よりも高いまたは低いＧｖＨＤ反応を引き起こし得る。ドナーＴ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞に対しても反応性であり得、有益な移植片対腫瘍効果を引き起こす。
【００５７】
間葉系ストローマ細胞：本明細書中で使用される用語「間葉系ストローマ細胞」または「骨髄由来間葉系ストローマ細胞」は、エキソビボ、インビトロおよびインビボにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化し得、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着する単核骨髄細胞の一部としてさらに定義され得る、多分化能幹細胞のことを指し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性である。
【００５８】
胚性幹細胞：本明細書中で使用される用語「胚性幹細胞」は、５０〜１５０個の細胞の初期胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する、多能性幹細胞のことを指す。胚性幹細胞は、それ自体を無限に再生する能力、ならびに３つの一次胚葉である外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化する能力を特徴とする。多能性細胞は、すべての細胞型を生み出せるが、多分化能細胞（例えば、成体幹細胞）は、限られた数の細胞型しか生み出せないという点で、多能性は、多分化能（ｍｕｔｉｐｏｔｅｎｔ）と区別される。
【００５９】
誘導可能な多能性幹細胞：本明細書中で使用される用語「誘導可能な多能性幹細胞」または「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞のような、すべての細胞型ではないが多くの細胞型に分化できる細胞を作製するように、遺伝的操作（例えば、後に多能性を活性化する遺伝子の発現）、生物学的操作（例えば、ウイルスまたはレトロウイルスによる処理）および／または化学的操作（例えば、小分子、ペプチドなど）によって「再プログラムされた」または誘導された、成体の細胞または分化細胞のことを指す。誘導可能な多能性幹細胞は、それらが、中間に分化したまたは高分化した状況（例えば、皮膚細胞、骨細胞、線維芽細胞など）を達成し、次いで、脱分化するように誘導され、それにより、多分化能細胞または多能性細胞を作製する能力の一部または全部を回復するという点で胚性幹細胞と区別される。
【００６０】
ＣＤ３４＋細胞：本明細書中で使用される用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現している細胞のことを指す。本明細書中で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子としてしばしば働き、リンパ節にＴ細胞が入ることに関与し、「分化クラスター」遺伝子ファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）のことを指す。ＣＤ３４は、骨髄、細胞外マトリックスに、またはストローマ細胞に直接、幹細胞が付着することも媒介し得る。ＣＤ３４＋細胞は、臍帯および骨髄において造血細胞として、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、リンパ管（胸膜のリンパ管を除く）ではなく血管の内皮細胞、マスト細胞、皮膚の真皮の間質におよび付属器周辺における樹状細胞の部分集団（ＸＩＩＩａ因子が陰性である）、ならびにある特定の軟部組織の腫瘍（例えば、胞状軟部肉腫、プレＢ急性リンパ芽球性白血病（Ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＭＬ−Ｍ７、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、巨細胞線維芽腫、顆粒球性肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、髄膜（ｍｅｎｇｉｎｇｅａｌ）血管周囲細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経鞘腫および甲状腺乳頭癌）における細胞に見られることが多い。
【００６１】
遺伝子発現ベクター：本文書全体を通じて交換可能に使用され得る、本明細書中で使用される用語「遺伝子発現ベクター」、「核酸発現ベクター」または「発現ベクター」は、宿主細胞内で複製され得、遺伝子を宿主細胞に導入するために利用され得る、核酸分子（例えば、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、人工染色体、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ））のことを広く指す。発現ベクター上に導入された遺伝子は、内在性遺伝子（例えば、宿主細胞または宿主生物に通常見られる遺伝子）または異種遺伝子（例えば、ゲノムに通常見られない遺伝子または宿主細胞もしくは宿主生物の染色体外核酸上の遺伝子）であり得る。発現ベクターによって細胞に導入される遺伝子は、天然の遺伝子、または改変されたもしくは操作された遺伝子であり得る。遺伝子発現ベクターは、発現ベクター上に保有された遺伝子の効率的な転写を促進し得るかまたは増強し得る、エンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時折、機能し得る、５’および３’非翻訳制御配列を含むようにも操作され得る。遺伝子発現ベクターは時折、特定の細胞型、細胞位置または組織タイプにおける複製および／または発現の機能性（例えば、転写および翻訳）について操作される。発現ベクターは時折、宿主細胞またはレシピエント細胞においてベクターを維持するための選択マーカーを含む。
【００６２】
発生的に制御されるプロモーター：本明細書中で使用される用語「発生的に制御されるプロモーター」は、発生のプログラムまたは経路によってコントロールされるか、開始されるか、または影響されるある特定の条件下で発現される遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼに対する最初の結合部位として作用するプロモーターのことを指す。発生的に制御されるプロモーターは、発生のプログラムまたは経路の一部である遺伝子の転写に影響し得る転写のアクチベーターまたはリプレッサーに結合するためのさらなる調節領域をプロモーター領域にまたはプロモーター領域付近に有することが多い。発生的に制御されるプロモーターは、時折、遺伝子産物が細胞の発生分化に影響する遺伝子の転写に関与する。
【００６３】
発生的に分化した細胞：本明細書中で使用される用語「発生的に分化した細胞」は、発生的に制御される特定の遺伝子の発現を伴うことが多く、特定の機能を果たすために、その細胞がそれほど特殊化されていない形態からより特殊化された形態に発展するプロセスを経た細胞のことを指す。発生的に分化した細胞の非限定的な例は、肝臓細胞、肺細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞などである。発生分化の変化は、通常、遺伝子発現の変化（例えば、遺伝子発現のパターンの変化）、遺伝子の再編成（例えば、サイレンシングされるかまたは発現される遺伝子をそれぞれ隠すかまたは曝すリモデリングまたはクロマチン）を含み、時々、ＤＮＡ配列の変化（例えば、免疫多様性の分化）を含む。発生中の細胞分化は、遺伝子制御ネットワークの結果として理解され得る。制御遺伝子およびそのシス制御のモジュールは、インプット（例えば、発生の経路またはプログラムの上流で発現されるタンパク質）を受け取り、そのネットワークの別の箇所でアウトプットをもたらす、遺伝子制御ネットワークにおける分岐点（ｎｏｄｅ）である（例えば、発現された遺伝子産物は、その発生の経路またはプログラムの下流の他の遺伝子に対して作用する）。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。これらの用語のすべてには、任意およびすべてのその後の世代のそれらの子孫も含まれる。故意または不注意の変異に起因して、すべての子孫が同一でない可能性があることが理解される。
【００６５】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｉカスパーゼ−９」分子、ポリペプチドまたはタンパク質は、誘導可能なカスパーゼ−９として定義される。用語「ｉカスパーゼ−９」は、ｉカスパーゼ−９核酸、ｉカスパーゼ−９ポリペプチドおよび／またはｉカスパーゼ−９発現ベクターを包含する。この用語は、天然のｉカスパーゼ−９ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列またはＣＡＲＤドメインを欠いている切断型の配列も包含する。
【００６６】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｉカスパーゼ１分子」、「ｉカスパーゼ３分子」または「ｉカスパーゼ８分子」は、それぞれ、誘導可能なカスパーゼ１、３または８として定義される。ｉカスパーゼ１、ｉカスパーゼ３またはｉカスパーゼ８という用語は、それぞれ、ｉカスパーゼ１、３もしくは８核酸、ｉカスパーゼ１、３もしくは８ポリペプチドおよび／またはｉカスパーゼ１、３もしくは８発現ベクターを包含する。この用語は、それぞれ天然のカスパーゼｉカスパーゼ−１、−３もしくは−８ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列、またはＣＡＲＤドメインを欠いている切断型配列も包含する。本明細書中に提供される実験の詳細の文脈における「野生型」カスパーゼ−９とは、ＣＡＲＤドメインを欠いているカスパーゼ−９分子のことを意味する。
【００６７】
改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラポリペプチドの中に、基底活性またはＩＣ５０に影響する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。基底活性およびＩＣ５０を試験するための方法は、本明細書中で論じられる。改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドは、このタイプのアミノ酸置換を含まない。改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドと改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドの両方が、例えば、ＣＡＲＤドメインを除去するように、切断され得る。
【００６８】
「機能保存的バリアント」は、タンパク質または酵素の全体的な立体配座および機能を変化させずに所与のアミノ酸残基が変更されたタンパク質または酵素であり、それには、あるアミノ酸を、極性または非極性の性質、サイズ、形状および電荷を含む類似の特性を有するアミノ酸で置き換えることが含まれるが、これらに限定されない。一般に公知の遺伝的にコードされないアミノ酸の多くに対する保存的アミノ酸置換は、当該分野で周知である。他のコードされないアミノ酸に対する保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比べたときの物理的特性に基づいて決定され得る。
【００６９】
保存アミノ酸と示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間のタンパク質配列またはアミノ酸配列の類似性のパーセントは、変動し得、アラインメントスキームに従って測定されるとき、例えば、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％であり得る。本明細書中で言及されるとき、「配列類似性」は、ヌクレオチド配列またはタンパク質配列が関係する程度を意味する。２つの配列間の類似性の程度は、配列同一性および／または保存のパーセントに基づき得る。本明細書中の「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が不変である程度を意味する。「配列アラインメント」は、類似性の程度を評価する目的のために最大の同一性（およびアミノ酸配列の場合、保存）レベルを達成するように２つ以上の配列を並べるプロセスを意味する。配列をアラインメントするためおよび類似性／同一性を評価するための数多くの方法（例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ法ならびにＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡ）が、当該分野で公知である。これらのプログラムのうちのいずれかを使用するとき、好ましい設定は、最も高い配列類似性をもたらす設定である。
【００７０】
本明細書中に言及されるアミノ酸残基の番号は、非切断型で改変されていないカスパーゼ−９ポリペプチドにおけるアミノ酸位置、例えば、配列番号９のアミノ酸位置を反映する。配列番号９は、ＣＡＲＤドメインを含まない切断型カスパーゼ−９ポリペプチドに対するアミノ酸配列を提供する。したがって、配列番号９は、完全長カスパーゼ−９アミノ酸配列に照らしたとき、アミノ酸残基番号１３５から始まり、アミノ酸残基番号４１６で終わる。当業者は、所望であれば、アミノ酸残基番号を相関させるために、例えば、本明細書中で論じられる配列アラインメント法を使用して、その配列をカスパーゼ−９ポリペプチドの他の配列と整列させ得る。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡのことを指すと意図されている。ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型もしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対立するものとしてｃＤＮＡを使用することの利点は、ｃＤＮＡが、主に、対応するタンパク質のコード配列を含む点である。完全または部分的なゲノム配列が使用されるときがあり、例えば、最適な発現のために非コード領域を必要とする場合、またはイントロンなどの非コード領域がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合が存在する。
【００７２】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現構築物」または「導入遺伝子」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝的構築物として定義され、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写されることが可能であり、ベクターに挿入され得る。転写産物は、タンパク質に翻訳されるが、必ずしも翻訳されるわけではない。ある特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写とｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施形態において、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。用語「治療的な構築物」は、発現構築物または導入遺伝子のことを指すためにも使用され得る。発現構築物または導入遺伝子は、例えば、過剰増殖性疾患または過剰増殖性障害（例えば、癌）を処置する治療として、使用され得、ゆえに、発現構築物または導入遺伝子は、治療的な構築物または予防的な構築物である。
【００７３】
本明細書中で使用されるとき、用語「発現ベクター」は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成では、これらの配列は、翻訳されない。発現ベクターは、種々の調節配列を含み得、それらの調節配列は、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列を転写するためおよびおそらく翻訳するために必要な核酸配列のことを指す。ベクターおよび発現ベクターは、転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、同様に他の機能を果たす核酸配列を含み得、それらは、下で論じられる。
【００７４】
本明細書中で使用されるとき、用語「エキソビボ」は、身体の「外側」のことを指す。用語「エキソビボ」および「インビトロ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００７５】
本明細書中で使用されるとき、用語「機能的等価物」は、それがカスパーゼ−９または切断型カスパーゼ−９に関するとき、例えば、カスパーゼ−９核酸のフラグメント、バリアントまたはアナログについて言及するとき、カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする核酸またはアポトーシス応答を刺激するカスパーゼ−９ポリペプチドのことを指す。「機能的等価物」とは、例えば、ＣＡＲＤドメインを欠いているが、アポトーシス細胞応答を誘導することができる、カスパーゼ−９ポリペプチドのことを指す。用語「機能的等価物」が、他の核酸またはポリペプチド、例えば、ＣＤ１９、５’ＬＴＲ、多量体リガンド結合領域またはＣＤ３に適用されるとき、この用語は、本明細書中の方法の参照ポリペプチドと同じまたは同様の活性を有するフラグメント、バリアントなどのことを指す。
【００７６】
本明細書中で使用されるとき、用語「遺伝子」は、機能的なタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする単位として定義される。理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するかまたは発現するように適合された、より小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。
【００７７】
用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖に起因する疾患として定義される。例示的な過剰増殖性疾患としては、癌または自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。他の過剰増殖性疾患としては、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症または炎症性腸疾患が挙げられ得る。
【００７８】
用語「免疫原性組成物」または「免疫原」は、免疫応答を引き起こすことができる物質のことを指す。免疫原の例としては、例えば、抗原、自己免疫疾患の誘導において役割を果たす自己抗原、および癌細胞上に発現された腫瘍関連抗原が挙げられる。
【００７９】
本明細書中で使用される用語「免疫無防備状態」は、免疫系が衰えているかまたは弱くなっている被験体として定義される。免疫無防備状態の状態は、免疫系の欠損もしくは機能不全または感染および／もしくは疾患への感受性を高める他の要因に起因し得る。そのような分類は、評価に対して概念的基礎を与えるが、免疫無防備状態の個体は、一方の群または他方の群に完全に当てはまらないことが多い。身体の防御機構における２つ以上の欠損が、影響され得る。例えば、ＨＩＶによって引き起こされる特定のＴリンパ球欠損を有する個体は、抗ウイルス治療のために使用される薬物によって引き起こされる好中球減少症も有し得るか、または皮膚および粘膜の完全性が破られたために免疫無防備状態であり得る。免疫無防備状態の状況は、留置中心ライン（ｉｎｄｗｅｌｌｉｎｇ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｉｎｅｓ）もしくは静脈内薬物乱用に起因する他のタイプの機能障害に起因し得るか；または続発性悪性疾患、栄養失調によって引き起こされ得るか、または他の感染病原体（例えば、結核）もしくは性行為感染症、例えば、梅毒もしくは肝炎に感染していることに起因し得る。
【００８０】
本明細書中で使用されるとき、用語「薬学的または薬理学的に許容され得る」は、動物またはヒトに投与されたとき、有害（ａｄｖｅｒｓｅ）反応、アレルギー反応または他の有害（ｕｎｔｏｗａｒｄ）反応をもたらさない分子実体および組成物のことを指す。
【００８１】
本明細書中で使用されるとき、「薬学的に許容され得るキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または作用物質が、本明細書中に提示されるベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
【００８２】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書中で使用される核酸およびポリヌクレオチドは、相互交換可能である。核酸は、モノマーの「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドである。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で使用されるとき、ポリヌクレオチドには、当該分野において利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されず、そのような手段としては、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲＴＭなどを使用する組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成手段が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの変異を含み、当該分野で周知の方法によるヌクレオチドまたはヌクレオシドの変異を含むが、これらに限定されない。核酸は、１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、通常、規定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドという用語は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語と相互交換可能である。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、用語「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
【００８５】
用語「トランスフェクション」および「形質導入」は、相互交換可能であり、外来性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスのことを指す。トランスフェクション（または形質導入）は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、スーパーフェクション（ｓｕｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）などを含むいくつかの手段のうちのいずれか１つによって達成され得る。
【００８６】
本明細書中で使用されるとき、用語「同系」とは、同一の遺伝子型、または組織移植が可能であるのに十分密接な関係がある遺伝子型、または免疫学的に適合性の遺伝子型を有する細胞、組織または動物のことを指す。例えば、同じ近交系の一卵性双生児または動物。同系および同遺伝子系は、交換可能に使用され得る。
【００８７】
用語「患者」または「被験体」は、相互交換可能であり、本明細書中で使用されるとき、生物または動物；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジまたは他の非ヒト哺乳動物を含む）；非哺乳動物（例えば、非哺乳動物の脊椎動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリまたはアヒル）または魚類、および非哺乳動物の無脊椎動物を含む））を含むが、これらに限定されない。
【００８８】
本明細書中で使用されるとき、用語「転写支配下」または「作動可能に連結された」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現をコントロールする核酸に対して正しい位置および方向で存在することとして定義される。
【００８９】
本明細書中で使用されるとき、用語「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置される」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、予防法および／または治療のことを指す。
【００９０】
本明細書中で使用されるとき、用語「ワクチン」とは、動物に投与することができる形態で存在する、本明細書中に提示される組成物を含む製剤のことを指す。代表的には、ワクチンは、組成物が懸濁されるかまたは溶解される従来の食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態において、組成物は、ある状態を予防するか、回復させるか、または別途処置するために都合よく使用され得る。ワクチンは、被験体に導入されたとき、抗体、サイトカインの産生および／または他の細胞応答を含むがこれらに限定されない免疫応答を引き起こすことができる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、核酸は、ウイルスベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、エキソビボにおいてウイルスベクターと接触され、いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、インビボにおいてウイルスベクターと接触されることが理解される。
【００９２】
造血幹細胞および細胞治療
造血幹細胞には、成熟血液細胞型に分化し得る未成熟の多分化能細胞である造血性前駆細胞が含まれる。これらの幹細胞および前駆細胞は、骨髄および臍帯血、ならびに場合によっては末梢血から単離され得る。他の幹細胞および前駆細胞としては、例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞が挙げられる。
【００９３】
骨髄由来の間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、標準的な培養条件においてプラスチック培養皿に接着し、造血系マーカーが陰性であり、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性であり、インビトロにおいて脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞に分化することができる、単核骨髄細胞の一部として定義されている。１つの生理学的役割は、造血の補助であると推定されているが、いくつかの報告は、ＭＳＣが、活発に成長している領域（例えば、瘢痕組織および腫瘍性組織）に入り込んで、おそらく増殖することができ、それらの天然の微小環境にホーミングし、病的な細胞の機能を置き換えることができることも確証した。それらの分化能およびホーミング能のおかげで、ＭＳＣは、再生用途のための天然の形態において、または有効な生物学的作用物質を特定の微小環境（例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物）に送達するための遺伝的改変を介して、細胞治療にとって魅力的なビヒクルになる。さらに、ＭＳＣは、強力な固有の免疫抑制活性を有し、これまで、移植片対宿主病および自己免疫障害の実験的処置において最も頻度の高い用途を見出した（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ら（１９９９）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−１４７；Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｍ．ら（２００６）．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ８：３１５−３１７；Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：７１−７４；Ｌｅｅ，Ｒ．Ｈ．ら（２００６）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１７４３８−１７４４３；Ｓｔｕｄｅｎｙ，Ｍ．ら（２００２）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：３６０３−３６０８；Ｓｔｕｄｅｎｙ，Ｍ．ら（２００４）．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９６：１５９３−１６０３；Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｅ．Ｍ．ら（１９９９）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：３０９−３１３；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｇ．ら（２００７）．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２７３９−２７４９；Ｐｈｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．（２００７）．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：２８９６−２９０２；Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｅ．Ｍ．ら（２００２）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：８９３２−８９３７；Ｈａｌｌ，Ｂ．ら（２００７）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８６：８−１６；Ｎａｕｔａ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｆｉｂｂｅ，Ｗ．Ｅ．（２００７）．Ｂｌｏｏｄ  １１０：３４９９−３５０６；Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，Ｋ．ら（２００８）．Ｌａｎｃｅｔ  ３７１：１５７９−１５８６；Ｔｙｎｄａｌｌ，Ａ．，ａｎｄ  Ｕｃｃｅｌｌｉ，Ａ．（２００９）．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）。
【００９４】
ＭＳＣは、報告された副作用が最小で、数百人の患者に注入された。しかしながら、追跡は、限られており、長期間の副作用は、不明であり、それらのインビボでの分化、例えば、軟骨もしくは骨への分化を誘導する今後の試みまたはそれらの機能を向上させるように遺伝的に改変する今後の試みに関連し得る重要性についてはほとんど分かっていない。いくつかの動物モデルでは、安全性の懸念が生じている。例えば、培養中の自発的な骨肉腫形成が、マウス由来ＭＳＣにおいて観察された。さらに、異所性骨化および石灰化巣が、ＭＳＣの局所注射後の心筋梗塞のマウスおよびラットモデルにおいて報告され、それらの不整脈誘発能もまた、新生仔ラット心室筋細胞との共培養実験において明らかになった。さらに、両側性びまん性肺骨化（ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が、おそらく、移植されたストローマ成分に起因して、イヌにおいて骨髄移植後に観察された（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｅ．Ｍ．ら（２００７）．Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １３：５３−５７；Ｔｏｌａｒ，Ｊ．ら（２００７）．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５：３７１−３７９；Ｙｏｏｎ，Ｙ．−Ｓ．ら（２００４）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９：３１５４−３１５７；Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ，Ｍ．ら（２００７）．Ｂｌｏｏｄ  １１０：１３６２−１３６９；Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｇ．ら（２００６）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３：１８３２−１８４１；Ｓａｌｅ，Ｇ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｓｔｏｒｂ，Ｒ．（１９８３）．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １１：９６１−９６６）。
【００９５】
細胞治療の別の例では、キメラ抗原レセプターをコードする核酸を形質導入されたＴ細胞が、癌を処置するために患者に投与された（Ｚｈｏｎｇ，Ｘ．−Ｓ．，（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：４１３−４２０）。例えば、ヒト化モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に基づくキメラ抗原レセプターを発現しているＴ細胞が、癌患者を処置するために使用された。しかしながら、有害事象が生じる可能性があり、少なくとも１つの報告された症例では、その治療は、患者に対して致命的結果をもたらした（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ら（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：８４３−８５１）。本明細書中に提示されるように、キメラカスパーゼ−９に基づく安全スイッチを細胞に形質導入することにより、有害事象が進行するのを阻止できる安全スイッチが提供され得る。
【００９６】
細胞治療の別の例において、Ｔ細胞は、非機能性のＴＧＦ−ベータレセプターを発現するように改変され、それにより、そのＴ細胞は、ＴＧＦ−ベータに抵抗性になる。これにより、その改変されたＴ細胞が、ＴＧＦ−ベータによって引き起こされる細胞傷害を回避することが可能になり、それらの細胞を細胞治療において使用できるようになる（Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｊ．ら（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：３１７９−３１８７；Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｃ．Ｍ．ら（２００４）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ．Ｍｅｄ．２００：１６２３−１６３３）。しかしながら、それは、Ｔ細胞リンパ腫、または改変されたＴ細胞が正常な細胞コントロールの一部を欠くときは他の有害作用ももたらし得；これらの治療用Ｔ細胞自体が、悪性になり得る。本明細書中に提示されるように、これらの改変されたＴ細胞に、キメラカスパーゼ−９に基づく安全スイッチを形質導入することにより、この結果を回避できる安全スイッチが提供され得る。
【００９７】
異種遺伝子（例えば、改変されたレセプターまたはキメラレセプター）を発現する、細胞治療において使用される細胞には、その細胞にその異種遺伝子を形質導入する前、後またはそれと同時に、キメラカスパーゼ−９に基づく安全スイッチをコードする核酸が形質導入され得る。
【００９８】
ハプロタイプ一致幹細胞移植
幹細胞移植は、造血幹細胞およびそれらの子孫が関わる多種多様の疾患を処置する有効な手段であると証明されているが、組織適合性ドナーの不足が、そのアプローチの最も広い用途にとっての主な妨げであると証明されている。広範なパネルの無関係の幹細胞ドナーおよびまたは臍帯血バンクの導入は、この問題の緩和に役立ったが、多くの患者がなおも、いずれかの供給源に適さないままである。マッチしたドナーを見つけることができたとしても、検索開始から幹細胞回収までの間の所要実時間は、通常３ヶ月を超え、これは、最も必要としている（ｎｅｅｄｉｅｓｔ）多くの患者の運命を定め得る遅れである。ゆえに、ＨＬＡハプロタイプ一致の家族ドナーの利用に相当な関心が寄せられている。そのようなドナーは、両親、同胞または第二度近親者であり得る。移植片拒絶反応の問題は、適切な前処置（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）と大用量の幹細胞とを組み合わせることによって克服され得る一方で、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、ドナーグラフトの広範なＴ細胞枯渇によって妨げられ得る。そのような手順の直接の結果は、満足のゆくものであり、移植後の免疫抑制が無くても成人と小児の両方において、生着率は＞９０％であり、重度のＧｖＨＤ率は＜１０％である。残念なことに、広範なＴ細胞枯渇およびドナーとレシピエントとの間のＨＬＡミスマッチに加えて、移植手順の著明な免疫抑制は、極端に高い比率の移植後感染合併症をもたらし高頻度の疾患再発に関与した。
【００９９】
ドナーＴ細胞の注入は、同種異系幹細胞移植後に抗ウイルスおよび抗腫瘍の免疫をもたらすために有効なストラテジーである。しかしながら、ハプロタイプ一致移植後の患者に単純にＴ細胞を戻しても、うまくいかない；アロ反応性Ｔ細胞の出現率は、例えば、ウイルス特異的Ｔリンパ球の出現率よりも数桁高い。最初にアロ反応性細胞（ｃｅｉｌｓ）を枯渇させたドナーＴ細胞を投与することによって免疫再構成を促進する方法が開発されている。これを達成する１つの方法は、ＥＢＶで形質転換されたレシピエントＢリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）でドナーＴ細胞を刺激することである。アロ反応性Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現をアップレギュレートし、ＣＤ２５  Ｍａｂ免疫毒素結合体であるＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡによって排除される。この化合物は、ヘテロ二機能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］を介して、化学的に脱グリコシル化されたリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化されたマウスＩｇＧ１抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターアルファ鎖）からなる。
【０１００】
ＬＣＬ刺激後のＣＤ２５免疫毒素による処理は、アロ反応性細胞を＞９０％枯渇させる。第Ｉ相臨床研究において、同種異系枯渇されたドナーＴ細胞を、Ｔ細胞が枯渇されたハプロタイプ一致ＳＣＴのレシピエントに２用量レベルで注入した後に、アロ反応性リンパ球を枯渇させるためにＣＤ２５免疫毒素を使用して、免疫再構成。８人の患者を、１０４細胞／ｋｇ／用量で処置し、８人の患者に、１０５細胞／ｋｇ／用量を投与した。１０５細胞／ｋｇ／用量を投与された患者は、１０４細胞／ｋｇ／用量を投与された患者と比べて、ＳＣＴの３、４および５ヶ月後に有意に改善されたＴ細胞の回復を示した（Ｐ＜．０５）。エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ（−）ＣＣＲ−７（−））集団の増殖の結果として、Ｔ細胞の回復の促進が生じたことから（Ｐ＜．０５）、防御性のＴ細胞応答が長続きする可能性があると示唆される。Ｔ細胞レセプターシグナルジョイント切除サークル（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｊｏｉｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｃｉｒｃｌｅｓ）（ＴＲＥＣｓ）が、用量レベル２の患者における再構成中のＴ細胞において検出されなかったことから、それらが、注入された同種異系枯渇された細胞に由来する可能性があると示唆される。４ヶ月後のＴ細胞のスペクトルタイピング（Ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｉｎｇ）から、ポリクローナルＶｂｅｔａレパートリーが実証された。四量体アッセイおよび酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを使用したとき、用量レベル２の６人中４人の評価可能患者において、移植の２〜４ヶ月後に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的応答およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）特異的応答が観察されたのに対し、そのような応答は、用量レベル１の患者では６〜１２ヶ月後まで観察されなかった。著しい急性移植片対宿主病（１６人中２人）および慢性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ；１５人中２人）の発生率は低かった。これらのデータは、同種異系枯渇されたドナーＴ細胞が、ハプロタイプ一致ＳＣＴ後にＴ細胞の回復を改善するために安全に使用され得ることを実証している。その後、注入された細胞の量を、ＧｖＨＤの証拠なしに１０６細胞／ｋｇまで漸増させた。
【０１０１】
このアプローチは、抗ウイルス免疫を再構成させたが、再発は、主な問題を残し、高リスク白血病のために移植された６人の患者は、疾患を再発し、死亡した。ゆえに、腫瘍反応性前駆体の推定出現率が、ウイルス反応性前駆体の出現率よりも１から２ｌｏｇ低いので、より高用量のＴ細胞が、抗腫瘍免疫を再構成するためおよび望まれる抗腫瘍効果をもたらすために有用である。しかしながら、一部の患者では、同種異系枯渇の後でさえも、ＧｖＨＤを引き起こすのにこれらの用量の細胞で十分であり得る（Ｈｕｒｌｅｙ  ＣＫら、Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００３；９：６１０−６１５；Ｄｅｙ  ＢＲら、Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６；１３５：４２３−４３７；Ａｖｅｒｓａ  Ｆら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９８；３３９：１１８６−１１９３；Ａｖｅｒｓａ  Ｆら、Ｊ  Ｃ  ｌｉｎ．Ｏｎ  ｃｏｌ．２００５；２３：３４４７−３４５４；Ｌａｎｇ  Ｐ，Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２００４；３３：２８１−２８７；Ｋｏｌｂ  ＨＪら、Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：７６７−７７６；Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  Ｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  ２００５；５６：２９−４４；Ｂｌｅａｋｌｅｙ  Ｍら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；４：３７１−３８０；Ａｎｄｒｅ−Ｓｃｈｍｕｔｚ  Ｉら、Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３６０：１３０−１３７；Ｓｏｌｏｍｏｎ  ＳＲら、Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０６：１１２３−１１２９；Ａｍｒｏｌｉａ  ＰＪら、Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：１７９７−１８０８；Ａｍｒｏｌｉａ  ＰＪら、Ｂｌｏｏｄ  ２００３；Ｇｈｅｔｉｅ  Ｖら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９１；１４２：２２３−２３０；Ｍｏｌｌｄｒｅｍ  ＪＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；５９：２６７５−２６８１；Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｋら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５；１  １：８７９９−８８０７；Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｋら、Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０２：２８９２−２９００）。
【０１０２】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）
移植片対宿主病は、ドナーの免疫担当細胞、例えば、Ｔ細胞をレシピエントに移植した後に時折生じる状態である。移植された細胞は、レシピエントの細胞を外来のものと認識し、それらを攻撃して破壊する。この状態は、特に、ハプロタイプ一致幹細胞移植に関連するときの、Ｔ細胞移植の危険な影響であり得る。有益な効果、例えば、免疫系の再構成およびグラフトの抗腫瘍効果をもたらすのに十分なＴ細胞が、注入されるべきである。しかしながら、移植され得るＴ細胞の数は、移植片が重度の移植片対宿主病をもたらし得るという懸念によって限定され得る。
【０１０３】
移植片対宿主病は、以下の表に示されるように病期分類され得る：
【０１０４】
【表１−１】
0006537984.tif 000003
【０１０５】
急性ＧｖＨＤの類別は、コンセンサスカンファレンス基準（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  Ｄら、１９９４  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｃｕｔｅ  ＧＶＨＤ  Ｇｒａｄｉｎｇ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １９９５；１５：８２５−８２８）によって行われ得る。
【０１０６】
【表１−２】
0006537984.tif 000004
【０１０７】
細胞治療および遺伝的に操作された細胞の移植のための「安全スイッチ」としての誘導可能なカスパーゼ−９
移植片対宿主病の影響の減少とは、例えば、より低いレベルのステージが患者に割り当てられ得るようなＧｖＨＤ症状の減少、すなわち、例えば、移植片対宿主病の症状の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の減少のことを意味する。移植片対宿主病の影響の減少は、ＧｖＨＤ反応に関与する活性化Ｔ細胞の減少、例えば、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９を発現し、かつＣＤ３を発現する細胞（例えば、ＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の減少の検出によっても計測され得る。
【０１０８】
健常志願者において安全であると証明された合成薬であるｍＡＰ１９０３（Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，４１：８７０−８７９）である二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）に結合するように最適化されたＦＫＢＰバリアント（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８，９５：１０４３７−１０４４２）と融合されたヒトアポトーシス促進性分子に基づく代替の自殺遺伝子ストラテジーが、本明細書中に提供される。この小分子の投与により、アポトーシス促進性標的分子の架橋および活性化がもたらされる。ヒトＴリンパ球におけるこの誘導可能なシステムの用途は、アポトーシス促進性分子としてＦａｓ関連デスドメイン含有タンパク質（ＦＡＤＤ）のＦａｓまたはデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用して探索された。これらの誘導可能なデス分子を形質導入されたＴ細胞の最大９０％が、ＣＩＤの投与後にアポトーシスを起こした（Ｔｈｏｍｉｓ  ＤＣら、Ｂｌｏｏｄ．２００１，９７：１２４９−１２５７；Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＤＭら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１９９６，６：８３９−８４７；Ｆａｎ  Ｌら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９，１０：２２７３−２２８５；Ｂｅｒｇｅｒ  Ｃら、Ｂｌｏｏｄ．２００４，１０３：１２６１−１２６９；Ｊｕｎｋｅｒ  Ｋら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３，１０：１１８９−１９７）。この自殺遺伝子ストラテジーは、細胞治療のために使用される任意の適切な細胞（例えば、造血幹細胞および他の前駆細胞（例えば、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞を含む）を含む）において使用され得る。
【０１０９】
ゆえに、カスパーゼ−９によって触媒されるこの安全スイッチは、トランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする状態が細胞治療患者に存在する場合に、使用され得る。それらの細胞が除去される必要があり得る状態としては、例えば、ＧｖＨＤ、それらの細胞が、誤った組織または細胞型のより成熟した細胞に不適切に分化すること、および他の毒性が挙げられる。不適切な分化の場合にカスパーゼ−９スイッチを活性化するために、組織特異的プロモーターを使用することが可能である。例えば、前駆細胞が、骨細胞および脂肪細胞に分化し、その脂肪細胞が、望まれない場合、その前駆細胞をトランスフェクトするためまたは形質導入するために使用されるベクターは、カスパーゼ−９ヌクレオチド配列に作動可能に連結された脂肪細胞特異的プロモーターを有し得る。このように、細胞が脂肪細胞に分化してしまったとき、多量体リガンドを投与すると、不適切に分化した脂肪細胞のアポトーシスが生じるはずである。
【０１１０】
上記方法は、例えば、細胞治療によって緩和され得る任意の障害（癌、血液または骨髄における癌、他の血液または骨髄による疾患（例えば、鎌状赤血球貧血および異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍｉｃ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））、および幹細胞移植によって緩和され得る任意の障害、例えば、血液または骨髄の障害（例えば、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィー（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｌ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ））を含む）のために使用され得る。
【０１１１】
養子免疫療法の有効性は、治療用Ｔ細胞を、腫瘍細胞が用いる免疫回避ストラテジーに対して抵抗性にすることによって、高められ得る。インビトロ研究から、これが、ドミナントネガティブレセプターまたは免疫調節性サイトカインの形質導入によって達成され得ることが示された（Ｂｏｌｌａｒｄ  ＣＭら、Ｂｌｏｏｄ．２００２，９９：３１７９−３１８７：Ｗａｇｎｅｒ  ＨＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００４，１１：８１−９１）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞レセプターの移入によって、より広い範囲の腫瘍に対するＴ細胞治療の適用が可能になる（Ｐｕｌｅ  Ｍら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００３，５：２１１−２２６；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２：５１２−５１９）。操作されたヒトＴ細胞に対する自殺システムが、後の臨床研究において使用可能にするように、開発され、試験された。カスパーゼ−９は、それらの機能および表現型の特色を損なわずに、ＣＩＤに対する感受性を示しつつ、アップレギュレートされた抗アポトーシス分子を有するＴ細胞においても、ヒトＴリンパ球において安定に発現されるように改変され、安定に発現されると示された（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ，Ｋ．Ｃ．ら、２００５，Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４８−５４）。
【０１１２】
遺伝子治療のために使用される遺伝的に改変された細胞において、その遺伝子は、その遺伝子を発現するように使用される細胞以外の起源に由来する異種ポリヌクレオチド配列であり得る。その遺伝子は、原核生物または真核生物の起源（例えば、細菌、ウイルス、酵母、寄生生物、植物または動物）に由来する。また、異種ＤＮＡは、２つ以上の起源に由来し、すなわち、多重遺伝子構築物または融合タンパク質である。また、異種ＤＮＡは、１つの起源に由来する制御配列および異なる起源に由来する遺伝子を含み得る。または、異種ＤＮＡは、細胞内在性遺伝子の正常な発現を変化させるために使用される制御配列を含み得る。
【０１１３】
他のカスパーゼ分子
本技術のキメラポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｏｔｉｄｅｓ）によってコードされ得るカスパーゼ−９以外のカスパーゼポリペプチドとしては、例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−８が挙げられる。これらのカスパーゼポリペプチドの考察は、例えば、ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９８）９５：３６５５−３６６０；およびＦａｎ，Ｌ．ら（１９９９）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：２２７３−２２８５）に見られ得る。
【０１１４】
発現構築物の操作
発現構築物は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチド、またはある特定の実施形態において、多量体リガンド結合領域およびマーカーポリペプチドに連結されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードし、それらのすべてが作動可能に連結されている。一般に、用語「作動可能に連結された」は、プロモーター配列が第２の配列に機能的に連結されていることを示すと意味され、ここで、例えば、そのプロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡの転写を開始し、媒介する。カスパーゼ−９ポリペプチドは、完全長または切断型であり得る。ある特定の実施形態において、マーカーポリペプチドは、カスパーゼ−９ポリペプチドに連結されている。例えば、マーカーポリペプチドは、ポリペプチド配列、例えば、切断可能な２Ａ様配列を介して、カスパーゼ−９ポリペプチドに連結され得る。マーカーポリペプチドは、例えば、ＣＤ１９であり得るか、または例えば、キメラカスパーゼポリペプチドの活性に影響しないように選択された異種タンパク質であり得る。
【０１１５】
２Ａ様配列または「切断可能な」２Ａ配列は、例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａを含む、例えば、多くの異なるウイルスに由来する。これらの配列は、時折、「ペプチドスキッピング配列」としても知られる。このタイプの配列が、分断されるように意図された２つのペプチドの間のシストロン内に配置されるとき、リボソームは、ペプチド結合をスキップするとみられ、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ配列の場合、Ｇｌｙアミノ酸とＰｒｏアミノ酸との間の結合が省略される。これにより、２つのポリペプチド、この場合、カスパーゼ−９ポリペプチドおよびマーカーポリペプチドが残される。この配列が使用されるとき、２Ａ配列の５’側でコードされるペプチドは、カルボキシ末端において、Ｇｌｙ残基および２Ａ配列内の任意の上流を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。２Ａ配列の３’側でコードされるペプチドは、アミノ末端において、Ｐｒｏ残基および２Ａ配列内の任意の下流を含むさらなるアミノ酸で終わることがある。
【０１１６】
発現構築物は、ベクター、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドに挿入され得る。提供される方法の工程は、任意の好適な方法を使用して行われ得、これらの方法としては、本明細書中に提示される抗原提示細胞に核酸を形質導入する方法、形質転換する方法または別途提供する方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドは、ＤＮＡリンカーを伴うもしくは伴わない、配列番号８、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７のヌクレオチド配列またはその機能的等価フラグメントによってコードされるか、あるいは配列番号９、配列番号２４、配列番号２６もしくは配列番号２８のアミノ酸配列またはその機能的等価フラグメントを有する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９ポリペプチドは、ＤＮＡリンカーを伴うもしくは伴わない、配列番号１４のヌクレオチド配列もしくはその機能的等価フラグメントによってコードされるか、または配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的等価フラグメントを有する。カスパーゼ−９ポリペプチドの機能的等価フラグメントは、配列番号９のポリペプチドと実質的に同じ、アポトーシスを誘導する能力を有し、配列番号９のポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％である。ＣＤ１９ポリペプチドの機能的に等価なフラグメントは、形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞を同定するためおよび選択するために使用されるマーカーとして作用する、配列番号１５のポリペプチドと実質的に同じ能力を有し、配列番号１５のポリペプチドと比べて、そのマーカーポリペプチドの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、標準的な検出法を使用して検出される。
【０１１７】
より詳細には、２つ以上のリガンド結合ドメインまたは多量体化領域が、発現構築物において使用され得る。なおもさらに、発現構築物は、膜標的化配列を含む。適切な発現構築物は、上記のＦＫＢＰリガンド結合エレメントのいずれかの側に共刺激ポリペプチドエレメントを含み得る。
【０１１８】
リガンド結合領域
発現構築物のリガンド結合（「二量体化」）ドメインまたは多量体化領域は、天然または非天然のリガンド、例えば、非天然の合成リガンドを使用して誘導を可能にし得る任意の好都合なドメインであり得る。多量体化領域は、構築物の性質およびリガンドの選択に応じて、細胞膜に対して内側または外側であり得る。上に示された細胞質領域と会合されるリガンド結合タンパク質を含むレセプターをはじめとした多種多様のリガンド結合タンパク質が公知である。本明細書中で使用されるとき、用語「リガンド結合ドメインは、用語「レセプター」と相互交換可能であり得る。リガンド（例えば、小さい有機リガンド）が公知であるかまたは容易に生成され得るリガンド結合タンパク質が、特に興味深い。これらのリガンド結合ドメインまたはレセプターには、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、上に示された他のレセプターなど、ならびに抗体から得ることができる「非天然の」レセプター、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、その変異された配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などによって得られるランダムアミノ酸配列が含まれる。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域、ステロイドレセプターリガンド結合領域、シクロフィリンレセプターリガンド結合領域およびテトラサイクリンレセプターリガンド結合領域からなる群より選択される。しばしば、リガンド結合領域は、ＦｖＦｖｌｓ配列を含む。時折、Ｆｖ’Ｆｖｌｓ配列は、さらなるＦｖ’配列をさらに含む。例としては、例えば、Ｋｏｐｙｔｅｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３１３−３２１（２０００）およびＧｅｓｔｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １０：６６７−６７５（２００７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  Ｔ（２００６）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  ６７：４４０−２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，ｓ．ら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，２００７））において論じられているものが挙げられる。
【０１１９】
おおむね、リガンド結合ドメインまたはレセプタードメインは、天然のドメインまたはその切断された活性な一部として、少なくとも約５０アミノ酸、および約３５０アミノ酸未満、通常、２００アミノ酸未満であり得る。結合ドメインは、例えば、低分子（ウイルスベクターでの効率的なトランスフェクションを可能にする＜２５ｋＤａ）であり得、モノマーであり得、非免疫原性であり得、二量体化のために形成され得る、合成的に入手可能な細胞透過性の無毒性リガンドを有し得る。
【０１２０】
レセプタードメインは、発現構築物のデザインおよび適切なリガンドの利用可能性に応じて、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドの場合、結合ドメインは、膜のいずれの側であってもよいが、親水性リガンド、特に、タンパク質リガンドの場合、リガンドを結合にとって利用可能な形態で内部移行するための輸送系が存在しない場合、結合ドメインは、通常、細胞膜に対して外側であり得る。細胞内レセプターの場合、構築物は、レセプタードメイン配列の５’または３’においてシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、またはレセプタードメイン配列の５’に脂質付着シグナル配列を有し得る。レセプタードメインが、シグナルペプチドと膜貫通ドメインとの間に存在する場合、レセプタードメインは、細胞外であり得る。
【０１２１】
レセプターをコードする発現構築物の一部は、種々の理由のために変異誘発に供され得る。変異誘発されたタンパク質は、より高い結合親和性を提供し得、天然に存在するレセプターと変異誘発されたレセプターとのリガンドによる区別を可能にし得、レセプター−リガンド対などをデザインする機会を提供し得る。レセプターの変更は、結合部位におけるコンビナトリアル法を使用したランダム変異誘発と知られているアミノ酸の変更を含み得、ここで、結合部位に関連するアミノ酸または立体構造変化に関連する他のアミノ酸に対するコドンが、特定のアミノ酸に対するコドンを公知の変化によってまたはランダムに変更し、得られるタンパク質を適切な原核生物宿主において発現し、次いで、得られたタンパク質を結合についてスクリーニングすることによって、変異誘発に供され得る。
【０１２２】
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖もしくは軽鎖、特にフラグメント、より詳細には、可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合をもたらす重鎖と軽鎖との融合物が、結合ドメインとして使用され得る。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）では発現されないであろう細胞外ドメインなどの異所的に発現されたヒト生成物であるものが含まれる。そのような例としては、低親和性神経成長因子レセプター（ＬＮＧＦＲ）および胚表面タンパク質（すなわち、癌胎児抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
なおもさらに、抗体は、生理的に許容され得るハプテン分子、および結合親和性についてスクリーニングされる個別の抗体サブユニットに対して調製され得る。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、単離され、定常領域、可変領域の一部の欠失、可変領域の変異誘発などによって改変されることにより、リガンドに対して適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このように、ほとんどの生理的に許容され得る任意のハプテン化合物が、リガンドとして使用され得るか、またはリガンドに対するエピトープを提供するために使用され得る。抗体単位の代わりに、結合ドメインが公知であって、結合のための有用なリガンドが存在する、天然のレセプターが使用され得る。
【０１２４】
オリゴマー化
形質導入されるシグナルは、通常、キメラタンパク質分子のリガンド媒介性のオリゴマー化によって、すなわち、リガンドが結合した後のオリゴマー化の結果として、生じ得るが、他の結合事象、例えば、アロステリックな活性化が、シグナルを惹起するために使用され得る。キメラタンパク質の構築物は、様々なドメインの順序および個々のドメインの反復の数に関して、変動し得る。
【０１２５】
レセプターを多量体化する場合、キメラ表面膜タンパク質のリガンド結合ドメイン／レセプタードメインに対するリガンドは、通常、少なくとも２つの結合部位を有し、それらの結合部位の各々がリガンドレセプタードメインに結合することができるという意味において、多量体であり得る。「多量体リガンド結合領域」とは、多量体リガンドに結合するリガンド結合領域のことを意味する。用語「多量体リガンド」には、二量体のリガンドが含まれる。二量体のリガンドは、リガンドレセプタードメインに結合することができる２つの結合部位を有し得る。望ましくは、対象のリガンドは、二量体またはそれより高次のオリゴマー、通常、約四量体以下の、小さい合成有機分子であり得、個々の分子は、代表的には、少なくとも約１５０Ｄａおよび約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満であり得る。合成リガンドとレセプターとの種々の対が、使用され得る。例えば、天然のレセプターを含む実施形態において、二量体のＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２レセプターとともに使用され得、二量体化されたシクロスポリンＡは、シクロフィリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたエストロゲンは、エストロゲンレセプターとともに使用され得、二量体化された糖質コルチコイドは、糖質コルチコイドレセプターとともに使用され得、二量体化されたテトラサイクリンは、テトラサイクリンレセプターとともに使用され得、二量体化されたビタミンＤは、ビタミンＤレセプターとともに使用され得るなど。あるいは、それより高次のリガンド、例えば、三量体が、使用され得る。非天然のレセプター、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可動性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、または改変されたレセプターならびにその変異された配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のうちのいずれかが使用され得る。これらのリガンド単位の有意な特色は、各結合部位が、高親和性でレセプターに結合することができる点、およびそれらのリガンド単位が、化学的に二量体化されることができる点である。また、リガンドが、機能的なレベルで血清に溶解することができ、なおもほとんどの用途のために原形質膜を横断して拡散することができるように、それらのリガンドの疎水性／親水性のバランスをとる方法も利用可能である。
【０１２６】
ある特定の実施形態において、本方法は、条件的にコントロールされるタンパク質またはポリペプチドを生成するために、化学的に誘導される二量体化（ＣＩＤ）の手法を利用する。この手法は、誘導可能であることに加えて、不安定な二量体化剤の分解またはモノマーの競合的阻害剤の投与に起因して、可逆的である。
【０１２７】
ＣＩＤシステムは、合成二価リガンドを使用して、リガンド結合ドメインに融合されたシグナル伝達分子を迅速に架橋する。このシステムは、細胞表面タンパク質（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３．２６２：ｐ．１０１９−１０２４；Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９６，６：８３９−８４７；Ｂｌａｕ，Ｃ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７，９４：３０７６−３０８１）またはサイトゾルタンパク質（Ｌｕｏ，Ｚ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８３：１８１−１８５；ＭａｃＣｏｒｋｌｅ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５：３６５５−３６６０）のオリゴマー化および活性化、転写を調節するＤＮＡエレメントへの転写因子のリクルートメント（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２：８２２−８２６；Ｒｉｖｅｒａ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９６，２：１０２８−１０３２）またはシグナル伝達を刺激する原形質膜へのシグナル伝達分子のリクルートメント（Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９２：９８０５−９８０９；Ｈｏｌｓｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９５，９５：９８１０−９８１４）を引き起こすために使用されている。
【０１２８】
ＣＩＤシステムは、表面レセプターの凝集が、下流のシグナル伝達カスケードを効率的に活性化するという概念に基づく。最も単純な実施形態において、ＣＩＤシステムは、脂質透過性免疫抑制薬ＦＫ５０６の二量体アナログを使用し、その二量体アナログは、その正常な生物活性を失っているが、ＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合された分子を架橋する能力を獲得している。１つ以上のＦＫＢＰを、カスパーゼ−９に融合することによって、二量体化薬物に依存的であるがリガンドおよび外部ドメインに非依存的な様式でカスパーゼ−９活性を刺激することができる。これにより、時間的なコントロール、モノマー薬物アナログを使用して可逆性、および高い特異性を備えたシステムが提供される。第３世代のＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３  ＣＩＤの、それらの結合ドメインであるＦＫＢＰ１２に対する高親和性は、インビボにおいて、内在性のＦＫＢＰ１２による非特異的な副作用を誘導することなく、組換えレセプターの特異的な活性化を可能にする。二量体化薬に結合する、アミノ酸の置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアント（例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６）もまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に対して抵抗性であり、それにより、インビボにおけるレセプターの活性化において、送達されるほとんどのタンパク質剤よりも効率的になる。
【０１２９】
使用されるリガンドは、リガンド結合ドメインの２つ以上に結合することができる。キメラタンパク質は、２つ以上のリガンド結合ドメインを含むとき、２つ以上のリガンドに結合することができる場合がある。そのリガンドは、代表的には、非タンパク質または化学物質である。例示的なリガンドとしては、ＦＫ５０６（例えば、ＦＫ１０１２）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１３０】
他のリガンド結合領域は、例えば、二量体の領域、またはゆらぎ置換によって改変されたリガンド結合領域、例えば、ＦＫＢＰ１２（Ｖ３６）であり得る：Ｆ３６がＶに置換されたヒト１２ｋＤａ  ＦＫ５０６結合タンパク質、完全に成熟したコード配列（アミノ酸１〜１０７）は、合成二量体化薬ＡＰ１９０３に対する結合部位を提供する（Ｊｅｍａｌ，Ａ．ら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．５８，７１−９６（２００８）；Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １１，１５６６−７２（１９９３））。上記タンパク質の２つのタンデムなコピーは、より高次のオリゴマーが、ＡＰ１９０３による架橋の際に誘導されるようにその構築物においても使用され得る。
【０１３１】
Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰ：Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、Ｆ３６Ｖ−ＦＫＢＰのコドンゆらぎバージョンである。それは、
Ｆ３６Ｖ−ＦＫＰＢと同一のポリペプチド配列をコードするが、ヌクレオチドレベルでは６２％の相同性しか有しない。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、レトロウイルスベクターにおける組換えを減少させるようにデザインされた（Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５７，１７３１−５（１９９７））。Ｆ３６Ｖ’−ＦＫＢＰは、ＰＣＲアセンブリ手順によって構築された。その導入遺伝子は、１コピーのＦ３６Ｖ−ＦＫＢＰに直接連結された１コピーのＦ３６Ｖ’−ＦＫＢＰを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、リガンドは、小分子である。選択されたリガンド結合領域に対する適切なリガンドが、選択され得る。しばしば、リガンドは、二量体であり、時折、リガンドは、二量体のＦＫ５０６または二量体のＦＫ５０６様アナログである。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ１９０３（ＣＡＳ索引名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０
分子量：１４１１．６５）である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７である。ある特定の実施形態において、リガンドは、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０である。いくつかの実施形態において、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２に対して適切であり得、ある特定のアナログは、ＦＫＢＰ１２のゆらぎバージョンに対して適切であり得る。ある特定の実施形態において、１つのリガンド結合領域が、キメラタンパク質に含められる。他の実施形態において、２つ以上のリガンド結合領域が、含められる。例えば、リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２である場合、これらの領域の２つが含められる場合、一方は、例えば、ゆらぎバージョンであり得る。
【０１３３】
企図される他の二量体化システムとしては、クーママイシン／ＤＮＡジャイレースＢシステムが挙げられる。クーママイシンによって誘導される二量体化は、改変されたＲａｆタンパク質を活性化し、ＭＡＰキナーゼカスケードを刺激する。Ｆａｒｒａｒら、１９９６を参照のこと。
【０１３４】
注射用のＡＰ１９０３
ＡＰ１９０３  ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．によって製造されており、ＡＰ１９０３  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって作製されている。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５（２５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化されている。室温において、この製剤は、透明でわずかに黄色の溶液である。冷蔵されると、この製剤は、可逆的な相転移を起こし、乳白色の溶液になる。室温に再度温めると、この相転移は、元に戻る。１本分は、３ｍＬのガラスバイアルにおける２．３３ｍＬである（バイアル１本あたり合計約１０ｍｇのＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
【０１３５】
ＡＰ１９０３は、患者に投薬する前の夜に冷蔵庫から取り出し、希釈する前に溶液が透明になるように、およそ２１℃の温度で一晩保管される。その溶液は、ガラスもしくはポリエチレンのボトルまたは非ＤＥＨＰバッグにおいて注入開始の３０分以内に調製され、投薬前におよそ２１℃で保管される。
【０１３６】
すべての試験薬が、２℃〜８℃の温度で維持され、過剰な光および熱から保護され、アクセスが制限された鍵が掛かった区域で保管される。
【０１３７】
ＡＰ１９０３を投与し、誘導性カスパーゼ−９ポリペプチドを誘導する必要性を決定する際、患者には、例えば、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットを使用して、２時間にわたるＩＶ注入によって、単一の固定された用量のＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（０．４ｍｇ／ｋｇ）が投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者に対して個別に計算され、体重が≧１０％上下しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水における１００ｍＬに希釈される。
【０１３８】
ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相研究では、２４人の健常志願者を、２時間にわたって、ＩＶ注入される０．０１、０．０５、０．１、０．５および１．０ｍｇ／ｋｇという投与レベルにおいて、単一用量のＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで処置した。ＡＰ１９０３血漿レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量の範囲にわたって、およそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬの範囲だった。最初の注入期間の後、血中濃度は、急速な分布相を示し、血漿レベルは、投与の０．５、２および１０時間後にそれぞれ最高濃度のおよそ１８、７および１％に減少した。ＡＰ１９０３  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、すべての用量レベルにおいて安全であり、耐容性がよいことが示され、好ましい薬物動態プロファイルを示した。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  ＪＤら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
【０１３９】
使用されるＡＰ１９０３  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎの固定された用量は、例えば、２時間にわたって静脈内に注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効率的なシグナル伝達のためにインビトロにおいて必要とされるＡＰ１９０３の量は、１０〜１００ｎＭ（１６００Ｄａ  ＭＷ）である。これは、１６〜１６０μｇ／Ｌまたは約０．０１６〜１．６ｍｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋｇ）に等しい。１ｍｇ／ｋｇまでの用量が、上に記載されたＡＰ１９０３の第Ｉ相研究において耐容性がよかった。ゆえに、０．４ｍｇ／ｋｇは、治療用細胞と併用される、この第Ｉ相研究に対するＡＰ１９０３の安全かつ有効な量であり得る。
【０１４０】
選択マーカー
ある特定の実施形態において、発現構築物は、その発現構築物にマーカーを含めることによってその発現がインビトロまたはインビボにおいて識別される核酸構築物を含む。そのようなマーカーは、その発現構築物を含む細胞の容易な識別を可能にする識別可能な変化を細胞にもたらし得る。通常、薬物選択マーカーを含めることが、クローニングおよび形質転換体の選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスＩのチミジンキナーゼ（ｔｋ）などの酵素が使用される。細胞外の非シグナル伝達ドメインまたは様々なタンパク質（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ１９、ＬＮＧＦＲ）を含む免疫学的表面マーカーもまた使用され得、それにより、磁性抗体または蛍光抗体によって媒介される選別のための直接的方法が可能になる。使用される選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例としては、例えば、レポーター（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ベータ−ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））が挙げられる。ある特定の実施形態において、マーカータンパク質、例えば、ＣＤ１９は、例えば、免疫磁気選択において、移入するための細胞の選択のために使用される。
【０１４１】
調節領域
１．プロモーター
目的のポリヌクレオチド配列の発現をコントロールするために使用される特定のプロモーターは、標的化された細胞においてそのポリヌクレオチドの発現を指示することができる限り、重要であると考えられない。したがって、ヒト細胞が標的化される場合、ポリヌクレオチド配列コード領域は、例えば、ヒト細胞において発現されることができるプロモーターに隣接しておよびそのプロモーターの支配下に配置され得る。一般的に言えば、そのようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターを含み得る。
【０１４２】
様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、β−アクチン、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。発現レベルが所与の目的にとって十分であるならば、目的のコード配列の発現を達成すると当該分野で周知である他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用も同様に企図される。周知の特性を有するプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後または形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
【０１４３】
特異的な生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にし得る。例えば、１つの導入遺伝子の発現、またはマルチシストロニックなベクターが使用されるときは複数の導入遺伝子の発現が、ベクターが生成される細胞にとって有毒である場合、それらの導入遺伝子のうちの１つ以上の発現を妨げるかまたは減少させることが望ましい。産生細胞株にとって有毒である導入遺伝子の例は、アポトーシス促進遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。いくつかの誘導性プロモーターシステムが、導入遺伝子産物が有毒である場合のウイルスベクターの作製に利用可能である（より誘導性のプロモーターを付加する）。
【０１４４】
エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするようにデザインされる。そのシステムは、導入遺伝子の基底レベルの発現ではなく２００倍超の誘導能を実質的に可能にする厳しく制御された発現機構からなる。そのシステムは、ショウジョウバエのヘテロ二量体エクジソンレセプターに基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログが、そのレセプターに結合すると、そのレセプターは、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写産物がもたらされる。このシステムでは、ヘテロ二量体レセプターの両方のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるのに対し、目的の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上に存在する。ゆえに、このタイプのシステムを目的の遺伝子トランスファーベクターに遺伝子操作して導入することが、有用であり得る。次いで、産生細胞株において目的の遺伝子を含むプラスミドとレセプターモノマーを含むプラスミドとをコトランスフェクションすることにより、潜在的に有毒な導入遺伝子を発現させずに、遺伝子トランスファーベクターの作製が可能になり得る。適切な時点において、導入遺伝子の発現が、エクジソンまたはムリステロンＡによって活性化され得る。
【０１４５】
有用であり得る別の誘導可能なシステムは、もともとはＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって開発された（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭまたはＴｅｔ−ＯｎＴＭシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。このシステムもまた、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答して高レベルの遺伝子発現を制御することが可能である。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの存在下において遺伝子発現がオンになるのに対し、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、ドキシサイクリンの非存在下において遺伝子発現がオンになる。これらのシステムは、大腸菌のテトラサイクリン抵抗性オペロンに由来する２つの制御エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテトラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質。目的の遺伝子は、プラスミドの中に存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有するプロモーターの後ろにクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリンによってコントロールされるトランス活性化因子と呼ばれる制御エレメントを含み、その制御エレメントは、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムでは、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリン（ｔｅｒｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）リプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの非存在下において、転写は、恒常的にオンである。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭシステムでは、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型でなく、ドキシサイクリンの存在下において転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下において産生細胞が生育され得、潜在的に有毒な導入遺伝子の発現を妨げ得るように、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステムが使用され得るが、そのベクターが患者に導入されると、遺伝子発現は恒常的にオンになり得る。
【０１４６】
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を制御することが望ましい。例えば、様々な活性強度を有する種々のウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに応じて使用される。哺乳動物細胞では、ＣＭＶ最初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−４８において概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターが使用されることが多い。所望の効果に応じて使用される他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のもの）、ＡＡＶ  ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫおよびトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【０１４７】
他の例では、発生的に制御され、特定の分化細胞において活性であるプロモーターが選択され得る。したがって、例えば、あるプロモーターは、多能性幹細胞では活性でないことがあるが、例えば、その多能性幹細胞が、より成熟した細胞に分化した場合、そのプロモーターは、活性化されることがある。
【０１４８】
同様に、組織特異的プロモーターは、標的化されていない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減少させるように、特定の組織または細胞において転写をもたらすために使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強力なプロモーターと比べて低い発現をもたらし得るが、より限定された発現および免疫原性ももたらし得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１９７５−７９；Ｃａｚｅａｕｘ．，Ｎ．ら、２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３３２２−３１）。例えば、組織特異的プロモーター（例えば、ＰＳＡ関連プロモーター）または前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
【０１４９】
組織特異的プロモーターまたは分化特異的プロモーターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂ２９（Ｂ細胞）；ＣＤ１４（単球性細胞）；ＣＤ４３（白血球および血小板）；ＣＤ４５（造血細胞）；ＣＤ６８（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ−１（膵腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）；およびＦｌｔ−１（内皮細胞）；ＧＦＡＰ（アストロサイト）。
【０１５０】
ある特定の適応症では、遺伝子治療ベクターを投与した後の特定の時点において転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインによって制御可能であるようなプロモーターを用いて行われる。使用され得るサイトカイン応答性プロモーターおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、アルファ−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、アルファ−１抗トリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属および糖質コルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導可能）、アルファ−２マクログロブリンおよびアルファ−１抗キモトリプシンが挙げられる。他のプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビンおよびクレアチンが挙げられる。
【０１５１】
上記プロモーターのいずれか単独または別のプロモーターとの併用が、所望の作用に応じて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。さらに、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的であると解釈されるべきでなく；他のプロモーターが、本明細書中に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
【０１５２】
２．エンハンサー
エンハンサーは、同じＤＮＡ分子上の離れた位置に配置されたプロモーターからの転写を増加させる遺伝的エレメントである。初期の例としては、コード配列に隣接し、かついくつかのイントロンの中に存在する、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターに関連するエンハンサーが挙げられる。多くのウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびレトロウイルスＬＴＲ）は、エンハンサーの活性と密接に関連し、単一エレメントのように扱われることが多い。エンハンサーは、ほぼプロモーターのように組織化される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写性タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの基本的な区別は、操作上のものである。エンハンサー領域は概して、少し離れて、しばしば向きに関係なく、転写を刺激する；これは、プロモーター領域またはその構成要素エレメントには必ずしも当てはまらない。他方で、プロモーターは、特定の部位において特定の向きでＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有するのに対し、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複し、近接することから、しばしば非常によく似たモジュール構成を有するようである。エンハンサーのサブセットは、転写活性を増加させ得るだけでなく、ゲノムにインテグレートされたとき、隣接する配列から転写性エレメントを（インスレーターエレメントとともに）隔離するのを助け得る、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）である。
【０１５３】
任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢのように）が、遺伝子の発現を駆動するために使用され得るが、多くは、特定の組織タイプまたは組織のサブセットに発現を限定し得る（例えば、Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：７７６−８８に概説されている）。例としては、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋肉クレアチンキナーゼ由来のエンハンサー、ならびにウイルスＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶ由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切なエンハンサーが、特定の用途に対して選択され得る。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質内転写を支持し得る。
【０１５４】
３．ポリアデニル化シグナル
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含めることが通常望ましいだろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本方法の実施の成功にとって重大であるとは考えられておらず、任意のそのような配列（例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルならびにＬＴＲポリアデニル化シグナル）が、使用される。１つの非限定的な例は、ｐＣＥＰ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。ターミネーターもまた、発現カセットのエレメントとして企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高めるため、およびそのカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ち得る。終止シグナル配列またはポリ（Ａ）シグナル配列は、例えば、ｍＲＮＡの３’末端における保存配列（ＡＡＵＡＡＡ）から約１１〜３０ヌクレオチド下流に位置し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら、１９９３．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：７７７−８３；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８）。
【０１５５】
４．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要とされることがある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンをはじめとした外来性翻訳調節シグナルが、提供される必要があり得る。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠とインフレームで配置される。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって上昇し得る。
【０１５６】
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子すなわちポリシストロニックなメッセージを作製するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回することができ、内部部位において翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：３２０−３２５，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメントが、論じられており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳも論じられている（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結され得る。各々がＩＲＥＳによって分断されている複数のオープンリーディングフレームが、共に転写され得、ポリシストロニックなメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され得る（米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号（各々が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【０１５７】
配列の最適化
タンパク質産生は、導入遺伝子におけるコドンを最適化することによっても増加され得る。タンパク質産生を増加させるために、種特異的コドンの変更が用いられ得る。また、コドンが最適化されることにより、最適化されたＲＮＡが生成され得、それにより、より効率的な翻訳がもたらされ得る。ＲＮＡに組み込まれるコドンを最適化することによって、不安定性を引き起こす二次構造をもたらすエレメント、例えばリボソーム結合を阻害し得るｍＲＮＡ二次構造、またはｍＲＮＡの核外輸送を阻害し得るクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）配列などのエレメントが、除去され得る（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｙａｎ．，Ｊ．ら、２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：４１１−２１；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｙ．Ｋ．ら、２００４．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３：６２９−３８；Ｎａｒｕｍ．，Ｄ．Ｌ．ら、２００１．６９：７２５０−５５；Ｙａｄａｖａ，Ａ．，ａｎｄ  Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，２００３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：４９６２−６９；Ｓｍｉｔｈ．，Ｊ．Ｍ．ら、２００４．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ２０：１３３５−４７；Ｚｈｏｕ，Ｗ．ら、２００２．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：１２７−５１；Ｗｕ，Ｘ．ら、２００４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１３：８９−９６；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４９：６９−７８；Ｄｅｍｌ，Ｌ．Ａ．ら、２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０９９−１１００１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｍ．ら、１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４８９２−４９０３；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｄ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４５３１−４０；ｚｕｒ  Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．ら、２０００．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８−２６３５）。例えば、ＦＢＰ１２、カスパーゼポリペプチドおよびＣＤ１９配列が、コドンの変更によって最適化され得る。
【０１５８】
リーダー配列
リーダー配列は、ｍＲＮＡの安定性を高めるためおよびより効率的な翻訳をもたらすために付加され得る。リーダー配列は、通常、ｍＲＮＡを小胞体に標的化することに関与する。例としては、自身の切断を遅延させる、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に対するシグナル配列、およびＩｇＥ遺伝子リーダー配列が挙げられる（Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８；Ｌｉ，Ｖ．ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７２：４１７−２８；Ｘｕ，Ｚ．Ｌ．ら、２００１．Ｇｅｎｅ  ２７２：１４９−５６；Ｍａｌｉｎ，Ａ．Ｓ．ら、２０００．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．２：１６７７−８５；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．ら、２００５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：１１２−１２５；Ｙａｎｇ．，Ｊ．Ｓ．ら、２００２．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：１３７９−８４；Ｋｕｍａｒ．，Ｓ．ら、２００６．ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５：３８３−９２；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、２００６．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４５３１−４０）。ＩｇＥリーダーは、小胞体への挿入を高めるために使用され得る（Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５９１２）。
【０１５９】
導入遺伝子の発現は、発現を最適化するための適切な方法を選択することによって、最適化され得るおよび／またはコントロールされ得る。これらの方法は、例えば、プロモーター、送達方法および遺伝子配列を最適化する工程を含む（例えば、Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２００８．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ  ３  ｅ２５１７；Ｋｕｔｚｌｅｒ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，２００８．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．９：７７６−８８に提示されているような）。
【０１６０】
核酸
本明細書中で使用される「核酸」は、一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（１本、２本またはそれ以上の鎖）のことを指す。核酸塩基には、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基が含まれる。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、その各々は、用語「核酸」の亜属として包含される。核酸は、少なくとも、多くとも、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０もしくは１０００ヌクレオチド長、またはこの中の導き出せる任意の範囲の長さであり得る。
【０１６１】
本明細書中に提供される核酸は、別の核酸に対して同一または相補的である領域を有し得る。その相補的または同一である領域は、少なくとも５つ連続した残基であり得ることが企図されるが、その領域は、少なくとも、多くとも、または約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００個連続したヌクレオチドであることが特に企図される。
【０１６２】
本明細書中で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、二本鎖分子もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味すると理解される。本明細書中で使用される用語「アニールする」は、「ハイブリダイズする」と同義である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズすることができる」は、用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」を包含する。
【０１６３】
本明細書中で使用されるとき、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、相補的な配列を含む１つ以上の核酸鎖の間のまたはその１つ以上の核酸鎖内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを妨げる条件である。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、たとえあったにしてもほとんど許容しない。そのような条件は、公知であり、高選択性が要求される用途のために使用されることが多い。非限定的な用途としては、核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特異的なｍＲＮＡ転写産物もしくはその核酸セグメントの検出などが挙げられる。
【０１６４】
ストリンジェントな条件は、約４２℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．５Ｍ  ＮａＣｌによって提供されるような、低塩および／または高温の条件を含み得る。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基含有量、核酸の電荷組成、ならびにハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定されることが理解される。
【０１６５】
ハイブリダイゼーションのためのこれらの範囲、組成および条件は、単なる非限定的な例という目的で言及されていること、特定のハイブリダイゼーション反応に対する所望のストリンジェンシーは、１つ以上のポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとの比較によって経験的に決定されることが多いことが理解される。想定される用途に応じて、標的配列に対する様々な程度の核酸選択性を達成するために、様々なハイブリダイゼーション条件が使用され得る。非限定的な例では、ストリンジェントな条件下において核酸にハイブリダイズしない関係する標的核酸の同定または単離は、低温および／または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例としては、約２０℃〜約５０℃の温度範囲における約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ  ＮａＣｌで行われるハイブリダイゼーションが挙げられる。低または高ストリンジェンシー条件は、特定の用途に適合させるためにさらに改変され得る。
【０１６６】
核酸修飾
下記で論じられる修飾のいずれかが、核酸に適用され得る。修飾の例としては、ＲＮＡもしくはＤＮＡの骨格、糖または塩基、およびそれらの様々な組み合わせに対する変更が挙げられる。核酸における任意の好適な数の骨格結合、糖および／または塩基が、修飾され得る（例えば、独立して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、最大１００％）。修飾されていないヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合された塩基アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルのうちのいずれか１つである。
【０１６７】
修飾塩基は、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基である。修飾塩基の非限定的な例としては、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピンなどが挙げられる。修飾塩基の他の非限定的な例としては、ニトロピロリル（例えば、３−ニトロピロリル）、ニトロインドリル（例えば、４−、５−、６−ニトロインドリル）、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルなどが挙げられる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、例えば、核酸（ｎｕｃｌｅｉｄ  ａｃｉｄ）は、リン酸骨格修飾を有する修飾された核酸分子を含み得る。骨格修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタールおよび／またはアルキルシリル修飾が挙げられる。ある特定の場合において、ヌクレオシドに天然に存在するリボース糖部分は、ヘキソース糖、多環式ヘテロアルキル環またはシクロヘキセニル基で置き換えられる。ある特定の場合において、ヘキソース糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたはそれらの誘導体である。ヘキソースは、Ｄ−ヘキソース、グルコースまたはマンノースであり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、環内に１つの酸素原子を含む二環式環であり得る。ある特定の場合において、多環式ヘテロアルキル基は、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［３．２．１］オクタンまたはビシクロ［３．３．１］ノナンである。
【０１６９】
ニトロピロリル核酸塩基およびニトロインドリル核酸塩基は、ユニバーサル塩基として公知の化合物のクラスのメンバーである。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解挙動または活性に実質的に影響せずに４つの天然に存在する塩基のいずれかを置き換え得る化合物である。天然に存在する核酸塩基に関連する安定化する水素結合相互作用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二重鎖は、スタッキング相互作用によって単独で安定化され得る。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が無いことにより、特定の相補性塩基に対する特異性は不必要になる。さらに、４−、５−および６−ニトロインドリルは、４つの天然塩基に対して非常に低い特異性しか示さない。１−（２’−Ｏ−メチル−．ベータ．−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドールを調製するための手順は、Ｇａｕｂｅｒｔ，Ｇ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００４，４５，５６２９に論じられている。他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。
【０１７０】
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然の核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然の核酸塩基チミンの同配体である。しかしながら、チミンとは異なり、ジフルオロトリルは、天然塩基のいずれに対しても、顕著な選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能する他の芳香族化合物は、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾールおよび４−メチルベンゾイミダゾールである。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体である３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列と比べてオリゴヌクレオチド二重鎖の不安定化をわずかにしか引き起こさないユニバーサル塩基である。他の非天然の核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造的誘導体が挙げられる。ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンゾイミダゾール、４−メチルベンゾイミダゾールおよび上で言及された他の非天然塩基の合成手順を含むより詳細な考察については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）を参照のこと。
【０１７１】
さらに、化学的置換基、例えば、架橋剤が、反応物に対して安定性または不可逆性をさらに付加するために使用され得る。架橋剤の非限定的な例としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能性マレイミド（例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの作用物質が挙げられる。
【０１７２】
ヌクレオチドアナログは、「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」核酸も含み得る。ある特定の組成物は、内因性の核酸を特定の構造に本質的に「繋ぎ止める」または「ロックする」ために使用され得る。配列を繋ぎ止めることは、核酸複合体の解離を防ぐために役立ち、ゆえに、複製を防ぎ得るだけでなく、内在性配列の標識、修飾および／またはクローニングも可能にし得る。ロックされた構造は、遺伝子発現を制御し得る（すなわち、転写または複製を阻害し得るかまたは増強し得る）か、または内在性の核酸配列を標識するためもしくはその他の方法で修飾するために使用され得る安定した構造として使用され得るか、またはその内在性配列を単離するために、すなわちクローニングのために使用され得る。
【０１７３】
核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡだけを含む分子に必ずしも限定されず、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。非ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのパーセントは、１％〜１００％（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％）であり得る。
【０１７４】
核酸調製物
いくつかの実施形態において、例えば、アッセイまたは治療薬において、コントロールまたは標準物質として使用するための核酸が、提供される。核酸は、当該分野で公知の任意の手法（例えば、化学合成、酵素的生成または生物学的生成）によって作製され得る。核酸は、生物学的サンプルから回収され得るかまたは単離され得る。核酸は、組換えであり得るか、または天然であり得るかもしくは細胞にとって内因性であり得る（細胞のゲノムから産生され得る）。生物学的サンプルは、小さい核酸分子の回収率を高めるような方法で処理され得ることが企図される。一般に、方法は、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液で細胞を溶解する工程を含み得る。
【０１７５】
核酸合成はまた、標準的な方法に従って行われ得る。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例としては、ホスホトリエステル、ホスフィットもしくはホスホルアミダイト化学を使用するインビトロ化学合成および固相法によってまたはデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を介して作製された核酸が挙げられる。様々な異なるオリゴヌクレオチド合成機構が、他の箇所に開示されている。
【０１７６】
核酸は、公知の手法を用いて単離され得る。特定の実施形態において、小さい核酸分子を単離するためおよび／またはＲＮＡ分子を単離するための方法が、使用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質または他の核酸から核酸を分離するためまたは単離するために使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いる電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿および／または他のクロマトグラフィーを含み得る。細胞からの核酸が、使用されるかまたは評価される場合、方法は、一般に、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実行する前に、細胞をカオトロピック（例えば、グアニジニウムイソチオシアネート）および／または界面活性剤（例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン）で溶解する工程を含む。
【０１７７】
方法は、核酸を単離するための有機溶媒および／またはアルコールの使用を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解産物に加えられるアルコールの量は、約５５％〜６０％というアルコール濃度に達する。種々のアルコールを使用できるが、エタノールがうまく機能する。固体支持体は、任意の構造であってよく、それには、電気陰性基を有する無機物またはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルターおよびカラムが含まれる。ガラス繊維のフィルターまたはカラムは、そのような単離手順にとって有効である。
【０１７８】
核酸単離プロセスは、時折、ａ）サンプル中の細胞を、グアニジニウムを含む溶解液で溶解する工程（ここで、少なくとも約１Ｍグアニジニウムの濃度を有する溶解産物が生成される）；ｂ）その溶解産物から核酸分子を、フェノールを含む抽出液を用いて抽出する工程；ｃ）その溶解産物にアルコール溶液を加えることにより、溶解産物／アルコール混合物を形成する工程（ここで、その混合物中のアルコールの濃度は、約３５％〜約７０％である）；ｄ）その溶解産物／アルコール混合物を固体支持体に適用する工程；ｅ）イオン性溶液を用いてその固体支持体から核酸分子を溶出する工程；およびｆ）その核酸分子を捕捉する工程を含み得る。サンプルは、乾燥され得、その後の操作にとって適切な液体および体積で再懸濁され得る。
【０１７９】
遺伝子移入の方法
細胞内での導入遺伝子発現の効果を媒介するために、発現構築物を細胞に移行させる必要があり得る。そのような移行は、ウイルスによる遺伝子移入方法またはウイルスによらない遺伝子移入方法を使用し得る。この項では、遺伝子移入の方法および組成物の考察が提供される。
【０１８０】
発現ベクターを含む形質転換された細胞は、その細胞に発現ベクターを導入することによって作製される。本方法とともに使用するための細胞小器官、細胞、組織または生物の形質転換のためのポリヌクレオチド送達に適した方法は、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を細胞小器官、細胞、組織または生物に導入し得る実質的に任意の方法を含む。
【０１８１】
宿主細胞は、ベクターに対するレシピエントとして使用され得るし、使用されてきた。宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターによってコードされるポリヌクレオチド配列の一部もしくは全部の発現であるかに応じて、原核生物または真核生物に由来し得る。数多くの細胞株および細胞培養物が、宿主細胞として使用するために利用可能であり、それらは、生存している培養物および遺伝物質に対する保管所としての機能を果たす組織であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。
【０１８２】
適切な宿主は、決定され得る。一般に、これは、ベクターの骨格および所望の結果に基づく。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために、原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５アルファ、ＪＭ１０９およびＫＣ８、ならびにいくつかの商業的に入手可能な細菌宿主（例えば、ＳＵＲＥ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＣｅｌｌｓおよびＳＯＬＯＰＡＣＫ  Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））が挙げられる。あるいは、大腸菌ＬＥ３９２などの細菌細胞が、ファージウイルスに対する宿主細胞として使用され得る。宿主細胞として使用され得る真核細胞としては、酵母、昆虫および哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの複製および／または発現のための哺乳動物真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２が挙げられるが、これらに限定されない。酵母株の例としては、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
核酸ワクチンは、例えば、非ウイルスＤＮＡベクター、「裸の」ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにウイルスベクターを含み得る。細胞をこれらのワクチンで形質転換する方法およびこれらのワクチンに含まれる遺伝子の発現を最適化するための方法は公知であり、それらの方法も本明細書中で論じられる。
【０１８４】
核酸またはウイルスベクターを移入する方法の例
細胞をトランスフェクトするためもしくは形質転換するため、または本方法のヌクレオチド配列もしくは組成物を投与するために、任意の適切な方法が使用され得る。ある特定の例が、本明細書中に提示され、それらの例としてはさらに、カチオン性ポリマー、脂質様分子およびある特定の市販品、例えば、ＩＮ−ＶＩＶＯ−ＪＥＴ  ＰＥＩを使用した送達などの方法が挙げられる。
【０１８５】
１．エキソビボ形質転換
生物から取り出された血管細胞および血管組織をエキソビボの環境においてトランスフェクトするために、様々な方法が利用可能である。例えば、イヌ内皮細胞は、インビトロにおけるレトロウイルス遺伝子移入によって遺伝的に変更され、イヌに移植された（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９）。別の例では、ユカタンミニブタ内皮細胞を、インビトロにおいてレトロウイルスでトランスフェクトし、ダブルバルーンカテーテルを使用して動脈に移植した（Ｎａｂｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９）。したがって、細胞または組織が、取り出され、本明細書中に提示されるポリヌクレオチドを使用してエキソビボにおいてトランスフェクトされ得ることが企図される。特定の態様において、移植された細胞または組織は、生物の中に配置され得る。
【０１８６】
２．注射
ある特定の実施形態において、抗原提示細胞または核酸ベクターもしくはウイルスベクターは、１つ以上の注射（すなわち、針による注射）、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｔａｔｉｃ）、腫瘍内、腹腔内などを介して、細胞小器官、細胞、組織または生物に送達され得る。注射の方法としては、例えば、食塩水溶液を含む組成物の注射が挙げられる。さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションによるポリヌクレオチドの導入を含む。使用される発現ベクターの量は、抗原の性質、ならびに使用される細胞小器官、細胞、組織または生物に応じて変動し得る。
【０１８７】
皮内注射、結節内注射またはリンパ管内注射は、ＤＣ投与のより一般的に使用される方法の一部である。皮内注射は、血流への吸収が低速度であるがリンパ系への取り込みが迅速であることを特徴とする。真皮に多数のランゲルハンス樹状細胞が存在することにより、インタクトな抗原ならびにプロセシングされた抗原が流入領域リンパ節に輸送され得る。これを正しく行うためには、適切な部位の準備が必要である（すなわち、適切な針の留置を観察するために、毛を刈り込む）。結節内注射は、リンパ系組織への抗原の直接的な送達を可能にする。リンパ管内注射は、ＤＣの直接投与を可能にする。
【０１８８】
３．エレクトロポレーション
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液を高圧放電に曝露することを含む。この方法のいくつかの変法では、ある特定の細胞壁分解酵素（例えば、ペクチン分解酵素）を使用して、標的レシピエント細胞を、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対してより感受性にする（参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３８４，２５３号）。
【０１８９】
エレクトロポレーションを使用した真核細胞のトランスフェクションは、かなり成功している。この様式で、マウスプレＢリンパ球がヒトカッパー免疫グロブリン遺伝子でトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，７１６１−７１６５）、ラット肝細胞がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，７１６−７１８）。
【０１９０】
インビボにおけるワクチン用エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、すなわちｅＶａｃは、単純な注射法を介して臨床で実行されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡベクターが、患者の皮内に注射される。次いで、電極によって皮内の空間に電気的パルスが適用されることにより、そこに局在化している細胞、特に、常在の皮膚樹状細胞が、ＤＮＡベクターを取り込み、コードされるポリペプチドを発現するようになる。次いで、局所炎症によって活性化された、ポリペプチドを発現しているこれらの細胞が、例えば、リンパ節に遊走し、抗原を提示し得る。核酸が、エレクトロポレーションによって細胞に送達され得る場合、その核酸は、例えば、限定されないが、核酸の注射または他の任意の投与手段の後で、エレクトロポレーションを使用して投与されるとき、電気穿孔的に（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）投与される。
【０１９１】
エレクトロポレーションの方法は、例えば、Ｓａｒｄｅｓａｉ，Ｎ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２３：４２１−９（２０１１）およびＦｅｒｒａｒｏ，Ｂ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ７：１２０−１２７（２０１１）（これらの全体が本明細書中で参照により援用される）に論じられている。
【０１９２】
４．リン酸カルシウム
他の実施形態では、リン酸カルシウム沈殿を用いて、ポリヌクレオチドが細胞に導入される。この手法を用いて、ヒトＫＢ細胞が、アデノウイルス５ＤＮＡでトランスフェクトされた（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７）。また、この様式において、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子でトランスフェクトされ（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５−２７５２，１９８７）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子でトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）。
【０１９３】
５．ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施形態では、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコールを使用して、ポリヌクレオチドが細胞に送達される。この様式において、レポータープラスミドが、マウス骨髄腫細胞および赤白血病細胞に導入された（Ｇｏｐａｌ，Ｔ．Ｖ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８５  Ｍａｙ；５（５）：１１８８−９０）。
【０１９４】
６．音波処理負荷（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ）
さらなる実施形態は、直接音波負荷（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｏｎｉｃ  ｌｏａｄｉｎｇ）によるポリヌクレオチドの導入を含む。ＬＴＫ線維芽細胞が、音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子でトランスフェクトされた（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，８４６３−８４６７）。
【０１９５】
７．リポソーム媒介性トランスフェクション
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質複合体、例えば、リポソームの中に閉じ込められ得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内側の水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質によって隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると、自発的に形成する。それらの脂質成分は、自己再配列を起こした後、閉鎖構造を形成し、水および溶解した溶質を脂質二重層の間に閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，（１９９１）Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ．ｐｐ．８７−１０４）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体化されたポリヌクレオチドも企図される。
【０１９６】
８．レセプター媒介性トランスフェクション
なおもさらに、ポリヌクレオチドは、レセプター媒介性送達ビヒクルを介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じているレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布に照らして、この送達方法は、別の特異性の程度を付加する。
【０１９７】
ある特定のレセプター媒介性遺伝子標的化ビヒクルは、細胞レセプター特異的リガンドおよびポリヌクレオチド結合剤を含む。他のものは、送達されるべきポリヌクレオチドに作動可能に付着された細胞レセプター特異的リガンドを含む。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性遺伝子移入のために使用され（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，４４２９−４４３２；Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：４０８６−４０９０，１９９４；Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ  ０２７３０８５）、これにより、この手法の実施可能性が確立された。別の哺乳動物細胞型における特異的送達も論じられている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３；参照により本明細書中に援用される）。ある特定の態様では、標的細胞集団上に特異的に発現されるレセプターに対応するリガンドが、選択される。
【０１９８】
他の実施形態において、細胞特異的ポリヌクレオチド標的化ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソームとともに特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべきポリヌクレオチドは、そのリポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜に機能的に組み込まれる。このようにして、そのリポソームは、標的細胞のレセプターに特異的に結合し、細胞にその内容物を送達し得る。そのようなシステムは、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）が、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞へのポリヌクレオチドのレセプター媒介性送達において使用されるシステムを使用して機能的であると示された。
【０１９９】
なおもさらなる実施形態において、標的化された送達ビヒクルのポリヌクレオチド送達ビヒクル成分は、リポソーム自体であり得、そのリポソームは、例えば、細胞特異的結合を指示する１つ以上の脂質または糖タンパク質を含み得る。例えば、ガラクトース末端のアシアロガングリオシドであるラクトシル−セラミドが、リポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された（Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９，１５７−１７６）。組織特異的な形質転換構築物が、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが企図される。
【０２００】
９．微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
微粒子銃法は、ポリヌクレオチドを少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に導入するために使用され得る（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；これらの各々は、参照により本明細書中に援用される）。この方法は、ＤＮＡでコーティングされた微小発射体が高速度に加速して、それらが細胞膜を貫通し、細胞を殺傷せずにそれらの細胞に入ることを可能にする能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３）。当該分野で公知の多種多様の微粒子銃法が存在し、それらの多くは、本方法に適用可能である。
【０２０１】
この微粒子銃では、１つ以上の粒子が、少なくとも１つのポリヌクレオチドでコーティングされ、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが、開発された。１つのそのようなデバイスは、電流を発生させ、その後その電流が輸送力を提供する高圧放電に依存する（Ｙａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９５６８−９５７２）。使用される微小発射体は、生物学的に不活性な物質（例えば、タングステンまたは金の粒子またはビーズ）からなった。例示的な粒子としては、タングステン、白金、およびある特定の例では、金を含む粒子（例えば、ナノ粒子を含む）が挙げられる。場合によっては、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を使用したレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要ないことがあることが企図される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡでコーティングされるのではなく、ＤＮＡを含み得ることが企図される。ＤＮＡでコーティングされた粒子は、粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得るが、本質的に必要ない。
【０２０２】
ウイルスベクター媒介性移入方法の例
被験体内の細胞がヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子を発現し得るようにそのヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列を含む組成物をその細胞またはその被験体に投与するのに適した任意のウイルスベクターが、本方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、細胞への遺伝子移入を媒介するウイルス粒子に組み込まれる。代表的には、そのウイルスは、単純に、適切な宿主細胞に生理学的条件下で曝露されることにより、ウイルスの取り込みが可能になり得る。本方法は、下記で論じられるように、種々のウイルスベクターを使用して都合よく使用される。
【０２０３】
１．アデノウイルス
アデノウイルスは、その中程度のサイズのＤＮＡゲノム、操作の容易性、高力価、広範囲な標的細胞および高感染力を理由に、遺伝子トランスファーベクターとして使用するのに特に適している。およそ３６ｋｂのウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス作用性エレメントを含む１００〜２００塩基対（ｂｐ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）によって境界されている。異なる転写単位を含む、ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される。
【０２０４】
Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の切り離しに関与する（Ｒｅｎａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．，１９，１９７−２１８）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によってもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後にだけ、発現される。ＭＬＰ（１６．８マップ単位に位置する）は、感染の後期において特に有効であり、このプロモーターからもたらされたすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳にとって有用にする５’トリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）（ＴＬ）配列を有する。
【０２０５】
アデノウイルスが遺伝子治療に対して最適化されるために、大きなＤＮＡセグメントを含むことができるように運搬能を最大にする必要がある。ある特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫学的反応を減少させることも非常に望ましい。これらの２つの目標は、アデノウイルス遺伝子の除去が両方の目的にかなうという点で、ある程度重なり合っている。本方法の実施によって、治療的な構築物を比較的容易にマニピュレートする能力を保持しつつ、これらの両方の目標を達成することができる。
【０２０６】
ウイルスＤＮＡの複製に必要とされるシスエレメントがすべて、直鎖状のウイルスゲノムのいずれかの末端の末端逆位配列（ＩＴＲ）（１００〜２００ｂｐ）に局在化するので、ＤＮＡの大きな置き換えが可能である。ＩＴＲを含むプラスミドは、非欠陥アデノウイルスの存在下において複製し得る（Ｈａｙ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８４  Ｊｕｎ  ５；１７５（４）：４９３−５１０）。ゆえに、これらのエレメントをアデノウイルスベクターに含めることにより、複製が可能になり得る。
【０２０７】
さらに、ウイルス封入のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左端の１９４〜３８５ｂｐ（０．５〜１．１マップ単位）に局在する（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。このシグナルは、左端に近いが付着末端配列の外側の特異的配列が、頭部構造へのＤＮＡの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する、バクテリオファージラムダＤＮＡにおけるタンパク質認識部位を模倣している。ＡｄのＥ１置換ベクターは、ウイルスゲノムの左端の４５０ｂｐ（０〜１．２５マップ単位）フラグメントが２９３細胞においてパッケージングを指示し得ることを実証した（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ，１０１：１９５−２０２，１９９１）。
【０２０８】
以前に、アデノウイルスゲノムのある特定の領域が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、コードされている遺伝子が発現され得ることが示された。これらの細胞株は、その細胞株によってコードされる、アデノウイルス機能に欠けたアデノウイルスベクターの複製を支持することができる。「補助」ベクター、例えば、野生型ウイルスまたは条件欠陥性変異体による複製欠損性アデノウイルスベクターの補完の報告も存在する。
【０２０９】
複製欠損性アデノウイルスベクターは、ヘルパーウイルスによってトランスで補完され得る。しかしながら、複製機能を提供するのに必要なヘルパーウイルスが存在するせいで、いずれの調製物も汚染され得るので、この知見だけでは、複製欠損性ベクターの単離が可能にならない。したがって、複製欠損性ベクターの複製および／またはパッケージングに特異性を付加し得るさらなるエレメントが必要だった。そのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。
【０２１０】
アデノウイルスに対するパッケージングシグナルは、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Ｔｉｂｂｅｔｔｓら（１９７７）Ｃｅｌｌ，１２，２４３−２４９）。後の研究から、ゲノムのＥ１Ａ（１９４〜３５８ｂｐ）領域に欠失を有する変異体が、初期（Ｅ１Ａ）機能を補完した細胞株においてさえ不十分にしか成長しないことが示された（Ｈｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７，８０９−８２２）。代償的な（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｎｇ）アデノウイルスＤＮＡ（０〜３５３ｂｐ）が、その変異体の右端に組み換えられたとき、そのウイルスは、正常にパッケージングされた。さらなる変異解析から、Ａｄ５ゲノムの左端に、短い反復性の位置依存性エレメントが同定された。その反復は、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率的なパッケージングには１コピーで十分であるが、Ａｄ５  ＤＮＡ分子の内側に向かって移動した場合は、そうではないことが見出された（Ｈｅａｒｉｎｇら、Ｊ．（１９８７）Ｖｉｒｏｌ．，６７，２５５５−２５５８）。
【０２１１】
パッケージングシグナルの変異バージョンを使用することによって、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。代表的には、変異は、点変異または欠失である。パッケージングが低効率であるヘルパーウイルスをヘルパー細胞内で生育させるとき、そのウイルスは、野生型ウイルスと比べて低い速度であったとしてもパッケージングされ、それにより、ヘルパーの繁殖が可能となる。しかしながら、これらのヘルパーウイルスを、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞内で生育させるとき、その野生型パッケージングシグナルは、変異バージョンよりも優先的に認識される。パッケージング因子の量が限られていると仮定すると、野生型シグナルを含むウイルスは、ヘルパーと比べて選択的にパッケージングされる。優先性が十分大きい場合、均質に近い系統が達成され得る。
【０２１２】
特定の組織または種に対するＡＤＶ構築物の向性を改善するために、レセプター結合ファイバー配列は、しばしばアデノウイルス分離株の間で置換され得る。例えば、アデノウイルス５において見出されたコクサッキー−アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）リガンドは、アデノウイルス３５由来のＣＤ４６結合ファイバー配列の代わりに用いられ、ヒト造血細胞に対する結合親和性が大幅に改善されたウイルスが作製され得る。得られた「シュードタイプ化された」ウイルスであるＡｄ５ｆ３５は、いくつかの臨床的に開発されたウイルス分離株の基礎となった。さらに、標的細胞に対してウイルスを再標的化することを可能にするファイバーを改変する様々な生化学的方法が存在する。方法は、二機能性抗体（一方の末端はＣＡＲリガンドに結合し、もう一方の末端は標的配列に結合する）の使用、およびカスタマイズされたアビジンベースのキメラリガンドとの会合を可能にするファイバーの代謝性のビオチン化を含む。あるいは、リガンド（例えば、抗ＣＤ２０５）をヘテロ二機能性リンカー（例えば、ＰＥＧ含有）によってアデノウイルス粒子に付着することができるだろう。
【０２１３】
２．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのＲＮＡを逆転写のプロセスによって感染細胞において二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，（１９９０）Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４３７−１５００）。次いで、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体内に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。その組み込みにより、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む。ｐｓｉと呼ばれる、ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。したがって、例えば、本技術は、例えば、細胞を形質導入するために使用されるポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに組み込まれた細胞を含む。
【０２１４】
レトロウイルスベクターを構築するために、プロモーターをコードする核酸を、ある特定のウイルス配列の位置のウイルスゲノム内に挿入することにより、複製欠損であるウイルスが作製される。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびｐｓｉ成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ，３３，１５３−１５９）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびｐｓｉ配列とともにヒトｃＤＮＡを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入するとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、そのｐｓｉ配列は、その組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングさせ、次いでそれを培養液中に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｒ．，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．）．Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ；Ｔｅｍｉｎら（１９８６）Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９−１８８；Ｍａｎｎら、１９８３）。組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、幅広い種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、多くのタイプのレトロウイルスの組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら（１９７５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７，２４２−２４８）。
【０２１５】
レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするようにデザインされたアプローチは、ウイルスエンベロープへのガラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。アシアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞などの細胞の特異的感染を可能にし得るこの修飾が望まれる場合がある。
【０２１６】
組換えレトロウイルスの標的化に対する異なるアプローチがデザインされており、そのアプローチは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的な細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用する。それらの抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９０７９−９０８３）。主要組織適合遺伝子複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞がインビトロにおいてエコトロピックウイルスに感染することが実証された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０２１７】
３．アデノ随伴ウイルス
ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状の一本鎖ＤＮＡを使用する。末端逆位配列は、ゲノムに隣接している。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、いくつかの異なる遺伝子産物を生じる。第１に、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２およびＶＰ−３と命名された３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を生成する。第２に、ｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造タンパク質（ＮＳ）をコードする。これらのｒｅｐ遺伝子産物の１つ以上は、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
【０２１８】
ＡＡＶにおける３つのプロモーターは、ゲノム内のそれらの位置によって、マップ単位で命名されている。これらは、左から右へ、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０である。転写によって、６つの転写産物が生じ、２つは、３つの各プロモーターにおいて開始され、各対の一方がスプライシングされる。マップ単位４２〜４６に由来するスプライス部位は、各転写産物にとって同じである。４つの非構造タンパク質は、より長い転写産物に由来するとみられ、３つのビリオンタンパク質のすべてが、最も小さい転写産物から生じる。
【０２１９】
ＡＡＶは、ヒトにおけるいかなる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ならびに当然のことながらアデノウイルスなどのウイルスからの「補助」機能を必要とする。それらのヘルパーのうち最も特徴付けられたものは、アデノウイルスであり、このウイルスに対する多くの「初期」機能は、ＡＡＶの複製を支援すると示された。ＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現は、ＡＡＶ構造発現を抑制すると考えられており、ヘルパーウイルス感染は、この阻止を取り消すと考えられている。
【０２２０】
ＡＡＶベクターの末端反復は、ＡＡＶまたは改変されたＡＡＶゲノムを含むｐ２０１などのプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７））またはＡＡＶの公開配列に基づく末端反復の化学的合成もしくは酵素的合成を含むがこれらに限定されない他の方法によって得ることができる。それは、機能、すなわち安定した部位特異的な組み込みを可能にするために必要とされるＡＡＶ  ＩＴＲの最小の配列または一部を、欠失分析によって決定することができる。また、安定した部位特異的な組み込みを指示する末端配列の能力を維持しつつ、配列のどの軽微な改変が許容され得るかを決定することもできる。
【０２２１】
ＡＡＶベースのベクターは、インビトロにおいて遺伝子送達するための安全で有効なビヒクルであることが証明されており、これらのベクターは、開発されており、エキソビボとインビボの両方における潜在的な遺伝子治療において広範囲に適用するために前臨床段階および臨床段階において試験されている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ，（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０；７９−９０；Ｃｈａｔｔｅｉｊｅｅら（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７０，７９−９０；Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，３２２７−３２３４；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３）；Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ，８４，１４９２−１５００；Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９４）Ｎａｔ’ｌ  Ｇｅｎｅｔ．，８，１４８−１５３；Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら、Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９６  Ｄｅｃ；６２（６）：１６６９−７６；Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４０８２−１４０８７；Ｋｏｅｂｅｒｌら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１４２６−１４３１；Ｍｉｚｕｋａｍｉら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４−１３０）。
【０２２２】
肺におけるＡＡＶ媒介性の効率的な遺伝子移入および遺伝子発現は、嚢胞性線維症の処置のための臨床試験に至っている（Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｆｌｏｔｔｅ，１９９５；Ｆｌｏｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７，（１９９３））。同様に、骨格筋へのジストロフィン遺伝子のＡＡＶ媒介性の遺伝子送達による筋ジストロフィーの処置、脳へのチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子送達によるパーキンソン病の処置、肝臓への第ＩＸ因子遺伝子送達による血友病Ｂの処置、および潜在的に、心臓への血管内皮成長因子遺伝子による心筋梗塞の処置の見込みは、これらの器官におけるＡＡＶ媒介性の導入遺伝子発現が高度に効率的であると最近示されたので、有望であるとみられる（Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，５２０−５３２；Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３；Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４；１９９６；Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７；ＭｃＣｏｗｎら（１９９６）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１３，９９−１０７；Ｐｉｎｇら（１９９６）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，３，２２５−２２８；Ｘｉａｏら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８０９８−８１０８）。
【０２２３】
４．他のウイルスベクター
他のウイルスベクターも、本発明の方法および組成物において発現構築物として用いられる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，（１９８８）Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，ｐｐ．４６７−４９２；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，（１９８６）Ｉｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｐｐ．１１７−１４８；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）カナリアポックスウイルスおよびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用される。これらのウイルスは、様々な哺乳動物細胞への遺伝子移入において使用するためのいくつかの特徴を提供する。
【０２２４】
いったん、構築物が細胞内に送達されたら、導入遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置づけられ、発現される。ある実施形態おいて、導入遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同組換えを介して相同の（ｃｏｇｎａｔｅ）位置および向きである（遺伝子置換）かまたはランダムで非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。なおもさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持される。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係のまたはそれと同期した維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達され、その核酸が細胞のどこにとどまるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０２２５】
疾患を処置するための方法
本方法は、疾患を処置するかまたは予防する方法も包含し、ここで、例えば注入による細胞の投与が、有益であり得る。
【０２２６】
細胞、例えば、前駆細胞、例えば、間葉系ストローマ細胞、幹細胞、多能性幹細胞および胚性幹細胞が、細胞治療のために使用され得る。それらの細胞は、ドナーに由来し得るか、または患者から得られた細胞であり得る。それらの細胞は、例えば、病的な細胞の機能を置き換えるための、例えば、再生において使用され得る。それらの細胞は、生物学的作用物質が、特定の微小環境、例えば、病的な骨髄または転移性の沈着物（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｅｐｏｓｉｔ）に送達され得るように、異種遺伝子を発現するようにも改変され得る。間葉系ストローマ細胞は、例えば、免疫抑制活性を提供するためにも使用されており、移植片対宿主病および自己免疫障害の処置において使用され得る。本願において提供される細胞は、細胞治療後にそれらの細胞が除去される必要がある状況において価値のあるものであり得る安全スイッチを含む。例えば、前駆細胞が、患者に提供される場合、場合によっては、細胞がより成熟した細胞型に不適切に分化することまたは別の組織への望まれない誘引（例えば、治療用細胞の除去を必要とするもの）などの有害事象が存在し得る。「治療用細胞」とは、細胞治療のために使用される細胞、すなわち、状態または疾患を処置するためまたは予防するために被験体に投与される細胞のことを意味する。細胞が悪影響を及ぼすような場合、本方法は、選択的アポトーシスを介して治療用細胞を除去するために使用され得る。
【０２２７】
他の例において、Ｔ細胞は、様々な疾患および状態を処置するために、ならびに幹細胞移植の一部として、使用される。ハプロタイプ一致Ｔ細胞の移植後に生じ得る有害事象は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。ＧｖＨＤが生じる可能性は、移植されるＴ細胞の数が増加するにつれて高まる。これにより、注入され得るＴ細胞の数が制限される。患者にＧｖＨＤが発生した場合に、注入されたＴ細胞を選択的に除去する能力を有することによって、１０６個を超えるか、１０７個を超えるか、１０８個を超えるか、または１０９個を超える細胞数まで増加させて、より多数のＴ細胞が、注入され得る。投与され得るＴ細胞数／ｋｇ体重は、例えば、約１×１０４Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約９×１０７Ｔ細胞／ｋｇ体重、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０４；約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０５；約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０６；または約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０７Ｔ細胞／ｋｇ体重であり得る。他の例では、Ｔ細胞以外の治療用細胞が、使用され得る。投与され得る治療用細胞数／ｋｇ体重は、例えば、約１×１０４Ｔ細胞／ｋｇ体重〜約９×１０７Ｔ細胞／ｋｇ体重、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０４；約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０５；約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０６；または約１、２、３、４、５、６、７、８もしくは９×１０７治療用細胞／ｋｇ体重であり得る。
【０２２８】
用語「単位用量」は、それが接種材料に関するとき、哺乳動物に対する単位投与量（ｕｎｉｔａｒｙ  ｄｏｓａｇｅｓ）として好適な物理的に分離した単位のことを指し、各単位は、必要とされる希釈剤とともに、所望の免疫原性効果をもたらすと計算された所定の量の薬学的組成物を含む。接種材料の単位用量に対する詳述は、薬学的組成物のユニークな特色および達成されるべき特定の免疫学的効果によって規定され、それらに依存する。
【０２２９】
本明細書中に提示される多量体リガンドなどの薬学的組成物の有効量は、カスパーゼ−９を発現する細胞の６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９７％超が殺傷されるような、カスパーゼ−９ベクターを含む細胞を選択的に除去するこの選択された結果を達成する量であり得る。この用語は、「十分な量」とも同義である。
【０２３０】
任意の特定の用途に対する有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の組成物、被験体のサイズおよび／または疾患もしくは状態の重症度などのような因子に応じて変動し得る。本明細書中に提示される特定の組成物の有効量は、過度の実験を必要とせずに、経験的に決定され得る。
【０２３１】
用語「接触される」および「曝露される」は、細胞、組織または生物に適用されるとき、薬学的組成物および／もしくは別の作用物質、例えば、化学療法剤または放射線治療薬が、標的細胞、組織もしくは生物に送達されるプロセス、または標的細胞、組織もしくは生物のすぐ近位に配置されるプロセスを記述するために本明細書中で使用される。細胞の殺傷または静止を達成するために、薬学的組成物および／またはさらなる作用物質が、細胞を殺傷するのに有効または細胞の分裂を防ぐのに有効な合計量で１つ以上の細胞に送達される。
【０２３２】
薬学的組成物の投与は、数分から数週間の範囲の間隔だけ、他の作用物質より先に行われ得る、他の作用物質と同時であり得る、および／または他の作用物質の後に行われ得る。薬学的組成物および他の作用物質が別々に細胞、組織または生物に適用される実施形態では、その薬学的組成物および作用物質がなおも、都合よく組み合わされた効果をその細胞、組織または生物に対して発揮することができ得るように、各送達の時点の間に有効時間が満了しないことが通常、保証され得る。例えば、そういった場合には、２、３、４つまたはそれ以上の様式を用いて、細胞、組織または生物を実質的に同時に（すなわち、約１分未満以内に）薬学的組成物と接触させ得ることが企図される。他の態様では、１つ以上の作用物質が、発現ベクターを投与する前および／または投与した後に、実質的に同時、約１分以内から、約２４時間、約７日間、約１〜約８週間またはそれ以上まで、およびそれらの中の任意の導き出せる範囲で投与され得る。なおもさらに、本明細書中に提示される薬学的組成物と１つ以上の作用物質との様々な併用レジメンが、使用され得る。
【０２３３】
最適化されたおよび個別化された治療的処置
上記二量体を投与した後のアポトーシスの誘導は、移植片対宿主病のステージを判定することまたは患者内に残存する望まれない治療用細胞の数を測定することによって、最適化され得る。
【０２３４】
例えば、患者がＧｖＨＤを有することおよびそのＧｖＨＤのステージの判定は、多量体リガンドを投与することによってカスパーゼ−９関連アポトーシスを誘導する必要があり得るという指示を臨床医に提供する。別の例では、多量体リガンドで処置した後に、患者が、低下したレベルのＧｖＨＤを有するという判定は、追加の用量の多量体リガンドが必要ないと臨床医に指示し得る。同様に、多量体リガンドで処置した後、患者が、ＧｖＨＤの症状を示し続けているかまたはＧｖＨＤの再発に苦しんでいるという判定は、少なくとも１つのさらなる用量の多量体リガンドを投与する必要があり得ると臨床医に指示し得る。用語「投与量」は、投与の用量と投与の頻度（例えば、次の投与のタイミング）の両方を含むと意味される。
【０２３５】
その後の薬物の用量、例えば、その後（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）の多量体リガンドの用量、および／またはその後の薬物投与量を調整するまたは維持する指示は、任意の好都合な様式で提供され得る。指示は、いくつかの実施形態において、表形式で（例えば、物理的媒体または電子媒体において）提供され得る。例えば、移植片対宿主病で観察された症状が、表に提供され得、臨床医は、疾患のステージのリストまたは表とその症状を比較し得る。次いで、その臨床医は、その表から、その後の薬物用量に対する指示を特定し得る。ある特定の実施形態において、指示は、それらの症状またはＧｖＨＤステージがコンピュータに提供された後（例えば、コンピュータ上のメモリに入れられた後）、コンピュータによって提示され得る（例えば、表示され得る）。例えば、この情報は、コンピュータに提供され得（例えば、ユーザーによってコンピュータメモリに入れられ得るか、またはコンピュータネットワーク内のリモートデバイスを介してコンピュータに送信され得）、コンピュータ内のソフトウェアが、その後の薬物用量を調整するかもしくは維持するための指示を生成し得、および／またはその後の薬物用量の量を提供し得る。
【０２３６】
その後の用量が、指示に基づいて決定されたら、臨床医は、その後の用量を投与し得るか、または別の人もしくは実体に対してその用量を調整する指示書を提供し得る。本明細書中で使用される用語「臨床医」は、意思決定者のことを指し、ある特定の実施形態において、臨床医は、医療専門家である。意思決定者は、いくつかの実施形態において、コンピュータまたは表示されたコンピュータプログラムのアウトプットであり得、保健サービス提供者は、コンピュータによって表示される指示またはその後の薬物用量に基づいて行動し得る。意思決定者は、その後の用量を直接投与し得る（例えば、その後の用量を被験体に注入し得る）か、または遠隔的に投与し得る（例えば、ポンプパラメータが、意思決定者によって遠隔的に変更され得る）。
【０２３７】
本明細書中に提示されるような方法は、有効量の活性化された細胞、核酸またはそれをコードする発現構築物の送達を含むが、これらに限定されない。薬学的組成物の「有効量」は、一般に、述べられた所望の結果を検出可能におよび繰り返し達成するのに十分な量、例えば、疾患またはその症状を回復させるか、減少させるか、最小にするか、またはその程度を限定するのに十分な量として定義される。疾患の排除、根絶または治癒を含む他のより厳密な定義が、適用され得る。いくつかの実施形態において、処置の有効性を評価するためおよび毒性をコントロールするために生物学的マーカーをモニターする工程が存在し得る。
【０２３８】
患者に投与するための製剤および経路
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現構築物、発現ベクター、融合タンパク質、トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞）を、意図される用途にとって適切な形態で調製する必要があり得る。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴い得る。
【０２３９】
多量体リガンド、例えば、ＡＰ１９０３は、例えば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．２〜４ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜３ｍｇ／ｋｇ被験体体重、約０．３〜２ｍｇ／ｋｇ被験体体重または約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ被験体体重、例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９もしくは１０ｍｇ／ｋｇ被験体体重の用量で送達され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、１用量あたり０．４ｍｇ／ｋｇ、例えば、５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。リガンドを、例えば、バイアル１本あたり約０．２５ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば、約０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｌ、例えば、約２ｍｌの体積で含むバイアルまたは他の容器が提供され得る。
【０２４０】
送達ベクターを安定にするためおよび標的細胞による取り込みを可能にするために適切な塩および緩衝剤を使用することが一般に望ましい場合がある。緩衝剤は、組換え細胞が患者に導入されるときにも使用され得る。水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒質に溶解されたまたは分散された細胞に対して有効量のベクターを含む。そのような組成物は、接種材料とも称される。薬学的に許容され得るキャリアは、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質および作用物質の使用は、公知である。任意の従来の媒質または作用物質が、ベクターまたは細胞と不適合性である場合を除いては、治療的な組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、その組成物に組み込まれ得る。
【０２４１】
活性な組成物は、従来の医薬品を含み得る。これらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の通常の経路を介し得る。これには、例えば、経口、経鼻、頬側、直腸、膣または局所的が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射による投与であり得る。そのような組成物は、通常、本明細書中で論じられる薬学的に許容され得る組成物として投与され得る。
【０２４２】
注射可能な使用に適した薬学的な形態としては、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌された粉末が挙げられる。すべての場合において、その形態は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性である。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用すること、分散液の場合、必要とされる粒径を維持すること、および界面活性物質を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。ある特定の例では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムが、含められ得る。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによってもたらされ得る。
【０２４３】
経口投与の場合、組成物は、賦形剤とともに組み込まれ得、摂取不可能なうがい薬および歯磨剤の形態で使用され得る。必要とされる量で活性成分をホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に組み込んでいるうがい薬が、調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組み込まれ得る。活性成分は、例えば、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤にも分散され得る。活性成分は、例えば、水、結合剤、研磨剤、香味料、起泡剤および湿潤剤を含み得るペースト歯磨剤に治療有効量で加えられ得る。
【０２４４】
組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容され得る塩としては、例えば、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも得ることができる。
【０２４５】
製剤化されると、溶液は、投与製剤（ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に適合した様式で、および治療的に有効であるような量で、投与され得る。それらの製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。例えば、水溶液における非経口投与の場合、その溶液は、必要であれば適切に緩衝され得、最初に、液体希釈剤が、十分な食塩水またはグルコースと等張性にされ得る。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。この文脈では、滅菌された水性媒質が使用され得る。例えば、１投与量が、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得るか、または提案される注入部位に注射され得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１０３５−１０３８および１５７０−１５８０頁を参照のこと）。処置されている被験体の状態に応じて、投与量のいくつかのバリエーションが必然的に生じる。いずれにしても、投与に関与する者が、個々の被験体に対する適切な用量を決定し得る。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準が要求するような、無菌性、発熱性ならびに一般的な安全性および純度の基準を満たし得る。
【実施例】
【０２４６】
下記に示される実施例は、ある特定の実施形態を例証するものであって、本技術を限定しない。
【０２４７】
ドナー細胞を選択的に除去するための機構は、細胞治療のための安全スイッチとして研究されてきたが、合併症が存在した。Ｔリンパ球を用いた免疫療法が、ウイルス感染症および悪性腫瘍に対する処置として効果的であると判明したので、安全スイッチ遺伝子を用いたいくつかの経験は、これまで、Ｔリンパ球におけるものだった（Ｗａｌｔｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９５，３３３：１０３８−４４；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１９９８，９２：１５４９−５５；Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９８：８５０−５４；Ｍａｒｊｉｔ，Ｗ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００３，１００：２７４２−４７）。単純ヘルペスウイルスＩ型由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子が、造血幹細胞移植後の再発性悪性腫瘍およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）リンパ球増殖を処置するためのドナーＴ細胞の注入においてインビボ自殺スイッチとして使用されてきた（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７，２７６：１７１９−１７２４；Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ  Ｐら、Ｂｌｏｏｄ．２００１，９７：６３−７２）。しかしながら、移植片対宿主病を引き起こすＴ細胞の破壊は、不完全であり、ＨＳＶ−ＴＫを活性化するプロドラッグとしてガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）（またはアナログ）を使用することにより、サイトメガロウイルス感染症に対する抗ウイルス薬としてのガンシクロビルの投与が必要なくなる。この作用機序は、細胞分裂に依存するＤＮＡ合成の干渉も必要とし、その結果、細胞の殺傷が、数日間にわたって長引くことがあり、不完全であり得、臨床的有用性の大幅な遅れがもたらされ得る（Ｃｉｃｅｒｉ，Ｆ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２００９，２６２：１０１９−２４）。さらに、ＨＳＶ−ＴＫに対する免疫応答は、免疫抑制されたヒト免疫不全ウイルス患者および骨髄移植患者でさえも、ＨＳＶ−ＴＫを形質導入された細胞の排除をもたらし、注入されたＴ細胞の存続、ゆえに有効性が損なわれる。ＨＳＶ−ＴＫは、ウイルス由来でもあり、ゆえに、潜在的に免疫原性である（Ｂｏｎｉｎｉ  Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７，２７６：１７１９−１７２４；Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９６，２：２１６−２３）。大腸菌由来のシトシンデアミナーゼ遺伝子もまた、臨床で使用されている（Ｆｒｅｙｔａｇ  ＳＯら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２，６２：４９６８−４９７６）が、異種抗原としてそれは免疫原性であり得、ゆえに、長期間の存続を必要とするＴ細胞に基づく治療と不適合性であり得る。モノクローナルキメラ抗ＣＤ２０抗体によって活性化され得るトランスジェニックヒトＣＤ２０は、非免疫原性の安全システムとして提案された（Ｉｎｔｒｏｎａ  Ｍら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００，１１：６１１−６２０）。
【０２４８】
以下の項では、カスパーゼ−９キメラタンパク質を使用して、細胞治療のために使用される細胞において安全スイッチを提供する方法の例が、提供される。
【０２４９】
実施例１：カスパーゼ−９自殺スイッチ発現ベクターの構築および評価
ベクターの構築および発現の確認
ヒトＴ細胞において安定にかつ効率的に発現され得る安全スイッチが、本明細書中に提示される。そのシステムは、改変された遺伝子を発現する形質導入されたＴ細胞の選択的排除を引き起こすことができる小分子二量体化薬と相互作用するように改変された低い潜在的な免疫原性を有するヒト遺伝子産物を含む。さらに、誘導可能なカスパーゼ−９は、抗アポトーシス分子を過剰発現するＴ細胞において機能を維持する。
【０２５０】
ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６に融合された改変されたヒトカスパーゼ−９活性を含む、治療薬として使用するのに適した発現ベクターを構築した。そのカスパーゼ−９／ＦＫ５０６ハイブリッドの活性は、小分子医薬を使用して二量体化され得る。カスパーゼ−９活性の完全長バージョン、切断型バージョンおよび改変バージョンを、リガンド結合ドメインすなわち多量体化領域に融合し、蛍光マーカーであるＧＦＰの発現も可能にするレトロウイルスベクターＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＲＰに挿入した。図１Ａは、アポトーシス誘導のための自殺スイッチとして構築され、評価された完全長、切断型および改変されたカスパーゼ−９発現ベクターを図示している。
【０２５１】
完全長の誘導可能なカスパーゼ−９分子（Ｆ’−Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）は、カスパーゼ分子の小サブユニットおよび大サブユニットにＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを用いて連結された、２つ、３つまたはそれ以上のＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ、例えば、ＦＫＢＰ１２ｖ３６バリアント）を含む（図１Ａを参照のこと）。完全長の誘導可能なカスパーゼ−９（Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰ）は、完全長カスパーゼ−９を有し、Ｆ３６Ｖ変異を含む２つの１２ｋＤａヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２８１８）に連結されたカスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１２２９）も含む（図１Ａ）。レトロウイルスにおいて発現されたときの相同組換えを防ぐために、１つ以上のＦＫＢＰ（Ｆ’）のアミノ酸配列は、コドンゆらぎにした（例えば、各アミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドを、元々コードされていたアミノ酸を維持するサイレント変異によって変更した）。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ３Ｓは、２８７位に、活性化部位を破壊するシステインからセリンへの変異を含む。構築物Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９、Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９およびＦ’−Ｃａｓｐ９では、カスパーゼ活性化ドメイン（ＣＡＲＤ）、１つのＦＫＢＰまたはその両方を、それぞれ欠失させた。すべての構築物を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰにクローニングした。
【０２５２】
２９３Ｔ細胞を、これらの構築物の各々でトランスフェクトし、形質導入の４８時間後に、マーカー遺伝子ＧＦＰの発現をフローサイトメトリーによって解析した。さらに、トランスフェクションの２４時間後に、２９３Ｔ細胞を１００ｎＭ  ＣＩＤとともに一晩インキュベートし、続いて、アポトーシスマーカーであるアネキシンＶで染色した。４つの別個の実験からの、二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）への曝露の前および後の導入遺伝子発現レベル（平均ＧＦＰ）およびアポトーシス細胞数の平均値および標準偏差（ＧＦＰ〜細胞内の％アネキシンＶ）を、図１Ａにおける表の２番目から５番目のカラムに示す。ＧＦＰ発現およびアネキシンＶに対する染色のレベルに加えて、完全長、切断型および改変されたカスパーゼ−９の発現された遺伝子産物を、ウエスタンブロットによっても解析することにより、カスパーゼ−９遺伝子が、発現されていることおよび発現された産物が予想サイズであることを確かめた。ウエスタンブロットの結果を図１Ｂに提示する。
【０２５３】
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞における、予想サイズの誘導可能なカスパーゼ−９構築物とマーカー遺伝子ＧＦＰとの同時発現を、完全長カスパーゼ分子と切断型カスパーゼ分子の両方の中に存在するアミノ酸残基２９９〜３１８に特異的なカスパーゼ−９抗体ならびにＧＦＰ特異的抗体を使用したウエスタンブロットによって実証した。ウエスタンブロットは、本明細書中に提示されるように行った。
【０２５４】
トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、アプロチニン、ロイペプチンおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む溶解緩衝液（５０％Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙ、１０％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、４％ベータ−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１２％水、４％ブロモフェノールブルー０．５％）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。３０分間の遠心分離の後、上清を収集し；１：２でＬａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）と混合し、煮沸し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにローディングした。膜を、ウサギ抗カスパーゼ−９（アミノ酸残基２９９〜３１８）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ；１：５００希釈）およびマウス抗ＧＦＰ  ＩｇＧ（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；１：２５，０００希釈）でプロービングした。次いで、ブロットを、適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体に曝露し、タンパク質の発現を、高感度化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）で検出した。次いで、その膜をストリッピングし、ヤギポリクローナル抗アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１：５００希釈）でリプロービングすることにより、ローディングの質を調べた。
【０２５５】
さらなるより小さいサイズのバンドが、図１Ｂに見られ、それらは、おそらく分解産物であるとみられる。Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９およびＦ’Ｆ−Ｃａｓｐ９構築物に対する分解産物は、それらの基底活性の結果としてのこれらの構築物のより低い発現レベルに起因して、検出されない可能性がある。各サンプルが等しくローディングされていることを、ウエスタンブロットの各レーンの下に示される実質的に等量のアクチンによって確かめ、それにより、実質的に同様の量のタンパク質が、各レーンにおいてローディングされていたことが示唆された。
【０２５６】
カスパーゼ−９自殺スイッチ発現構築物の評価
細胞株
Ｂ９５−８ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株（ＬＣＬ）、ＪｕｒｋａｔおよびＭＴ−２細胞（Ｄｒ  Ｓ．Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸからのご厚意により提供された）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中で培養した。ポリクローナルＥＢＶ特異的Ｔ細胞株を、４５％ＲＰＭＩ／４５％Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）／１０％ＦＢＳ中で培養し、以前に報告されたように作製した。簡潔には、末梢血単核球（２４ウェルプレートの１ウェルあたり２×１０６個）を、４０：１というレスポンダー対スティミュレーター（Ｒ／Ｓ）比において、４０００ｒａｄで照射された自己ＬＣＬで刺激した。９〜１２日後、生細胞を、４：１というＲ／Ｓ比において、照射されたＬＣＬで再刺激した。続いて、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を、４０Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）の存在下におけるＬＣＬでの毎週の再刺激によって、増殖した。
【０２５７】
レトロウイルス形質導入
レトロウイルスの一過性の作製のために、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ｇａｇ−ｐｏｌおよびＲＤ１１４エンベロープをコードするプラスミドとともに、ｉＣａｓｐ９／ｉＦａｓ構築物で２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８〜７２時間後にウイルスを収集し、急速凍結し、使用するまで約８０℃で保存した。一過性ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化レトロウイルス上清を用いた複数回の形質導入によって、安定なＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生株を作製した。導入遺伝子発現が最も高いＦＬＹＲＤ１８細胞を、単一細胞ソーティングし、最も高いウイルス力価をもたらしたクローンを増殖し、リンパ球の形質導入のためのウイルスを作製するために使用した。このクローンの導入遺伝子発現、機能およびレトロウイルス力価は、８週間超にわたる連続培養中、維持された。ヒトリンパ球の形質導入のために、組織培養用の処理が行われていない２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、組換えフィブロネクチンフラグメント（ＦＮ  ＣＨ−２９６；Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ；Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ；ＰＢＳ中４μｇ／ｍＬ、４℃で一晩）でコーティングし、１ウェルあたり０．５ｍＬのレトロウイルスとともに３７℃で３０分間、２回インキュベートした。続いて、１ウェルあたり３×１０５〜５×１０５個のＴ細胞を、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下において１ウェルあたり１ｍＬのウイルスを使用して、４８〜７２時間、形質導入した。同時発現されたマーカー遺伝子の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において解析することによって、形質導入効率を測定した。機能性研究に向けて、形質導入されたＣＴＬを、選択しないか、または示されているようにＭｏＦｌｏサイトメーター（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）を使用して、ＧＦＰ発現が低い、中程度もしくは高い集団に分けた。
【０２５８】
アポトーシスの誘導および解析
示される濃度のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７；ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞または形質導入されたＣＴＬに加えた。接着細胞および非接着細胞を収集し、アネキシン結合緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で洗浄した。製造者の指示書（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、細胞をアネキシン−Ｖおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で１５分間染色した。染色後１時間以内に、細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって解析した。
【０２５９】
細胞傷害性アッセイ
各ＣＴＬ株の細胞傷害活性を、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、以前に提示されたように評価した。標的細胞には、自己ＬＣＬ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩミスマッチＬＣＬ、およびリンフォカインによって活性化されたキラー細胞感受性Ｔ細胞リンパ腫株ＨＳＢ−２が含まれた。完全培地中または１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中でインキュベートされた標的細胞をそれぞれ自発的なおよび最大の５１Ｃｒ放出を測定するために使用した。３つ組ウェルの比溶解の平均パーセンテージを、１００×（実験による放出−自発的な放出）／（最大放出−自発的な放出）として計算した。
【０２６０】
表現型分析
細胞表面の表現型を、以下のモノクローナル抗体を使用して調べた：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣＤ５６ならびにＴＣＲ−α／β（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）。ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓを、抗ＮＧＦＲ抗体（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ，Ａｐｔｏｓ，ＣＡ）を使用して検出した。適切なマッチアイソタイプコントロール（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を各実験において使用した。ＦＡＣＳｓｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を解析した。
【０２６１】
サイトカイン産生の解析
ＣＴＬ培養上清中のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）の濃度を、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインサイトメトリビーズアレイ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して計測し、培養上清中のＩＬ−１２の濃度を、製造者の指示書に従って、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって計測した。
【０２６２】
インビボ実験
６〜８週齢の非肥満糖尿病重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを照射し（２５０ｒａｄ）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁された１０×１０６〜１５×１０６個のＬＣＬを、そのマウスの右側腹部の皮下に注射した。２週間後、直径およそ０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスの尾静脈に、形質導入されていないＥＢＶ  ＣＴＬとｉＣａｓｐ９．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈを形質導入されたＥＢＶ  ＣＴＬとの１：１混合物（合計１５×１０６個）を注射した。ＣＴＬ注入の４〜６時間前および３日後に、組換えｈＩＬ−２（２０００Ｕ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ）をマウスの腹腔内に注射した。４日目に、それらのマウスを、ランダムに２群に分けた：１群には、ＣＩＤ（５０μｇ  ＡＰ２０１８７、腹腔内）を投与し、もう１群には、キャリアのみ（１６．７％プロパンジオール、２２．５％ＰＥＧ４００および１．２５％Ｔｗｅｅｎ８０、腹腔内）を投与した。７日目に、すべてのマウスを殺した。腫瘍をホモジナイズし、抗ヒトＣＤ３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＦＡＣＳ解析によって、ゲーティングされたＣＤ３＋集団内のＧＦＰ＋細胞数を評価した。形質導入されていないＣＴＬ（合計１５×１０６個）だけを投与されたコントロール群のマウスからの腫瘍を、ＣＤ３＋／ＧＦＰ＋細胞の解析においてネガティブコントロールとして使用した。
【０２６３】
誘導可能なカスパーゼ−９の発現および機能の最適化
カスパーゼ３、７および９を、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞と形質導入されたヒトＴ細胞の両方において、誘導可能な安全スイッチ分子としての適格性についてスクリーニングした。誘導可能なカスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）だけが、選択されたＣＩＤ（例えば、二量体化化学誘導物質）に対する感受性を与えるのに十分なレベルで発現された。最初のスクリーニングは、おそらく、形質導入された細胞が、導入遺伝子の基底活性によって排除されることに起因して、完全長ｉＣａｓｐ９が、Ｔ細胞において高レベルで安定に維持されることができないことを示唆した。ＣＡＲＤドメインは、シトクロムＣおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によって駆動される、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１（Ａｐａｆ−１）との相互作用によるカスパーゼ−９分子の生理学的な二量体化に関与する。自殺スイッチの二量体化および活性化を誘導するためにＣＩＤを使用するので、ＣＡＲＤドメインの機能は、この状況では過剰であり、基底活性を低下させる方法として、ＣＡＲＤドメインの除去を調べた。カスパーゼ−９の活性化のために、多量体化ではなく二量体化だけが必要であることを考えて、活性化をもたらす方法として、単一のＦＫＢＰ１２ｖ３６ドメインも調べた。
【０２６４】
得られた切断型および／または改変型のカスパーゼ−９（例えば、ＣＡＲＤドメイン、または２つのＦＫＢＰドメインのうちの一方もしくは両方が除去されている）の活性を比較した。破壊された活性化部位を有する構築物であるＦ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓは、機能的でないコントロールを提供した（図１Ａを参照のこと）。レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）が導入遺伝子の発現を指示し、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の使用によって高感度ＧＦＰが同じｍＲＮＡから同時発現されるレトロウイルスベクターＭＳＣＶ２６に、すべての構築物をクローニングした。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において、予想サイズにおけるすべての誘導可能なカスパーゼ−９構築物の発現ならびにＧＦＰの同時発現をウエスタンブロットによって実証した（図１Ｂを参照のこと）。タンパク質発現（ＧＦＰの平均蛍光によって推定され、ウエスタンブロットにおいて可視化される）は、機能的でない構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓにおいて最も高く、完全長構築物Ｆ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９において大幅に減少した。ＣＡＲＤ（Ｆ’Ｆ−Ｃａｓｐ９）、１つのＦＫＢＰ（Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９）または両方（Ｆ−Ｃａｓｐ９）の除去により、誘導可能なカスパーゼ−９とＧＦＰの両方の発現が徐々に高まり、それに対応してＣＩＤに対する感受性も高まった（図１Ａを参照のこと）。これらの結果に基づいて、Ｆ−Ｃａｓｐ９構築物（これ以降、ｉＣａｓｐ９Ｍと称される）をヒトＴリンパ球におけるさらなる研究において使用した。
【０２６５】
ヒトＴリンパ球におけるｉＣａｓｐ９Ｍの安定した発現
自殺遺伝子は、遺伝的に操作された細胞が存続する限り、発現されなければならないので、自殺遺伝子の発現の長期間の安定性は、最も重要である。Ｔ細胞の形質導入に向けて、Ｔ細胞の形質導入を容易にするために、高力価のＲＤ１１４シュードタイプ化ウイルスを産生するＦＬＹＲＤ１８由来レトロウイルス産生クローンを作製した。ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株（ＥＢＶ−ＣＴＬ）は、十分に特徴付けられた機能および特異性を有し、ＥＢＶに関連する悪性腫瘍の予防および処置のためのインビボ治療としてすでに使用されているので、ＥＢＶ特異的ＣＴＬ株におけるｉＣａｓｐ９Ｍの発現を評価した。７０％超というＥＢＶ−ＣＴＬの一貫した形質導入効率（５人の異なるドナーにおける、平均値７５．３％；範囲７１．４％〜８３．０％）が、レトロウイルスによる単一の形質導入後に得られた。ＥＢＶ−ＣＴＬにおけるｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、導入遺伝子の機能の選択または喪失なしに、形質導入後少なくとも４週間にわたって安定していた。
【０２６６】
ｉＣａｓｐ９Ｍは、形質導入されたＴ細胞の特色を変化させない
ｉＣａｓｐ９Ｍの発現がＴ細胞の特色を変化させないことを保証するために、形質導入されていないまたは機能的でないｉＣａｓｐ９Ｃ−＞Ｓを形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬの表現型、抗原特異性、増殖能および機能を、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬのものと比較した。４人の別個のドナーにおいて、形質導入されたＣＴＬおよび形質導入されていないＣＴＬは、等しい数のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋およびＴＣＲα／β＋細胞からなった（図２Ａを参照のこと）。同様に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−２を含むサイトカインの産生は、ｉＣａｓｐ９Ｍの発現によって変化しなかった（図２Ｂを参照のこと）。ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬは、形質導入されていないＣＴＬおよびコントロールを形質導入されたＣＴＬに相当する自己ＬＣＬを特異的に溶解した（図２Ｃを参照のこと）。ｉＣａｓｐ９Ｍの発現は、指数関数的に成長するＣＴＬの成長の特色に影響せず、重要なことには、増殖に対する抗原およびＩＬ−２への依存は、保たれた（図２Ｄを参照のこと）。図２Ａおよび２Ｂは、抗原刺激の際のタイプＴＨ１およびＴＨ２サイトカインの表現型および分泌のデータを図表によって図示している。図２Ｃは、ＥＢＶで形質転換された自己リンパ芽球様Ｂ細胞株（ＬＣＬ）、ＨＬＡミスマッチＬＣＬおよびＨＳＢ−２（ＬＡＫ細胞標的）に対する細胞傷害活性のレベルを、形質導入後１５日目〜１８日目の、形質導入されていない（白色バー）、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍを形質導入された（黒色バー）およびＦ’Ｆ−Ｃ−Ｃａｓｐ９Ｃ−＞Ｓを形質導入された（点描（ｓｔｉｐｌｅｄ）バー）ＥＢＶ特異的ＣＴＬ（ＥＢＶ−ＣＴＬ）において比較した（形質導入後の２回の抗原刺激）ものを図表によって図示している。３つ組のウェルの平均値および標準偏差を示している。４人の異なるドナー由来のＥＢＶ−ＣＴＬを使用した実験の例が示されている。図２Ｄは、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＣＴＬの抗原依存性を図表によって図示している。形質導入後の２１日目に、自己ＬＣＬおよびＩＬ−２による通常の毎週の抗原刺激を続けたか（黒菱形）または中断した（黒四角）。抗原刺激の中断により、Ｔ細胞が着実に減少した。
【０２６７】
インビトロにおける導入遺伝子の高発現について選択されたＴリンパ球の９９％超の排除
ＣＴＬにおける誘導可能なｉＣａｓｐ９Ｍの実力（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）を、ＣＩＤの投与後に、ＧＦＰを発現している細胞の喪失をモニターすることによって試験した；ＧＦＰ＋細胞の９１．３％（５人の異なるドナーにおいて、範囲８９．５％〜９２．６％）が、単一の１０ｎＭ用量のＣＩＤの後に排除された（図３Ａを参照のこと）。ＣＩＤへの曝露時間に関係なく、同様の結果が得られた（範囲、１時間〜連続）。すべての実験において、ＣＩＤ処理を生き残ったＣＴＬは、低い導入遺伝子発現を有し、ＣＩＤの後、ＧＦＰの平均蛍光強度は７０％（範囲、５５％〜８２％）減少した。抗原刺激に続く２回目の１０ｎＭ用量のＣＩＤによって、生き残っているＧＦＰ＋Ｔ細胞のさらなる排除を、得ることはできなかった。ゆえに、応答しないＣＴＬは、ＣＩＤによる機能の活性化にとって不十分なｉＣａｓｐ９Ｍを発現した可能性が最も高かった。低レベルの発現とＣＩＤに対するＣＴＬの無反応との相関関係を調べるために、ＣＴＬを、連結されたマーカー遺伝子ＧＦＰの低発現、中発現および高発現についてソーティングし、同じドナー由来の形質導入されていないＣＴＬと１：１で混合することにより、ＣＩＤによって誘導されたアポトーシスに応答する形質導入されたＴ細胞の数の正確な定量化を可能にした。
【０２６８】
排除された形質導入されたＴ細胞の数は、ＧＦＰ導入遺伝子発現のレベルとともに増加した（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照のこと）。導入遺伝子の発現とｉＣａｓｐ９Ｍの機能との相関関係を解明するために、ｉＣａｓｐ９Ｍ  ＩＲＥＳ．ＧＦＰを形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬを、低ＧＦＰ発現（平均値２１）、中ＧＦＰ発現（平均値８０）および高ＧＦＰ発現（平均値１８９）について選択した（図４Ａを参照のこと）。選択されたＴ細胞を、１０ｎＭ  ＣＩＤとともに一晩インキュベートし、続いて、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤで染色した。アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−Ｔ細胞およびアネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋Ｔ細胞のパーセンテージが示されている（図４Ｂを参照のこと）。選択されたＴ細胞を、形質導入されていないＴ細胞と１：１で混合し、抗原刺激後に１０ｎＭ  ＣＩＤとともにインキュベートした。７日目における残留ＧＦＰ陽性Ｔ細胞のパーセンテージが示されている（図４Ｃを参照のこと）。
【０２６９】
ＧＦＰｈｉｇｈで選択された細胞の場合、１０ｎＭ  ＣＩＤは、形質導入された細胞の９９．１％（範囲、９８．７％〜９９．４％）の削除をもたらした（図３Ａを参照のこと）。抗原刺激の当日に、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入されたＣＴＬを、処理しなかったか、または１０ｎＭ  ＣＩＤで処理した。７日後、ＣＩＤに対する反応を、ＧＦＰに対するフローサイトメトリーによって計測した。形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを５０％に調整することにより、ＣＩＤ処理後の残留ＧＦＰ＋細胞の正確な計測が可能になった。選択されていないＣＴＬ（図３Ａの上の列）およびＧＦＰｈｉｇｈで選択されたＣＴＬ（図３Ａの下の列）におけるＣＩＤに対する反応を比較した。残留ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージが示されている（図３Ａを参照のこと）。
【０２７０】
ＧＦＰｈｉｇｈで選択された細胞におけるアポトーシスの迅速な誘導は、アポトーシスの特色（例えば、ＣＩＤ投与の１４時間以内における細胞の縮小および断片化）によって実証される（図３Ｂを参照のこと）。１０ｎＭ  ＣＩＤとともに一晩インキュベーションした後、Ｆ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈを形質導入されたＴ細胞は、顕微鏡評価によって、アポトーシスの特色（例えば、細胞の縮小および断片化）を有した。高発現について選択されたＴ細胞のうち、６４％（範囲、５９％〜６９％）が、アポトーシスの表現型（アネキシン−Ｖ＋＋／７−ＡＡＤ−）を有し、３０％（範囲、２６％〜３２％）が、ネクローシスの表現型（アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）を有した（図３Ｃを参照のこと）。アポトーシスのマーカーでの染色は、６４％のＴ細胞が、アポトーシスの表現型（アネキシンＶ＋，７−ＡＡＤ−，右下の象限）を有し、３２％が、ネクローシスの表現型（アネキシンＶ＋，７−ＡＡＤ＋，右上の象限）を有することを示した。３つの別個の実験の代表的な例が示されている。
【０２７１】
対照的に、アポトーシスの誘導は、中程度のまたは低いＧＦＰ発現について選択されたＴ細胞では有意に低かった（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照のこと）。ゆえに、臨床適用の場合、高コピー数、高発現レベルまたは高コピー数と高発現レベルの両方に対する選択を可能にする選択可能マーカーを有する発現構築物のバージョンが、望ましい場合がある。ＣＩＤによって誘導されるアポトーシスは、ＣＩＤを加える前の１時間にわたるｐａｎカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）によって阻害された。ＣＩＤの滴定は、１ｎＭ  ＣＩＤが、最大の削除効果を得るのに十分であることを示した（図３Ｄ）。示される量のＣＩＤ（ＡＰ２０１８７）を使用する用量反応曲線は、ＣＩＤに対するＦ−Ｃａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰｈｉｇｈの感受性を示している。示される量のＣＩＤの投与後７日目に、ＧＦＰ＋細胞の生存が計測される。各時点に対する平均値および標準偏差が与えられる。健常志願者に投与したとき有害作用を実質的に有しないと臨床で示された別の二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）であるＡＰ１９０３を使用して、同様の結果が得られた。用量反応は、形質導入後少なくとも４週間にわたって変化しないままだった。
【０２７２】
ｉＣａｓｐ９Ｍは、抗アポトーシス分子を発現する悪性細胞において機能的である
カスパーゼ−９は、アポトーシスシグナル伝達において比較的遅く作用するがゆえに、アポトーシス阻害剤による阻害にそれほど感受性でないと予想されるので、臨床で使用するための誘導可能なアポトーシス促進性分子として、以前に提示されたｉＦａｓおよびｉＦＡＤＤではなく、カスパーゼ−９を選択した。したがって、自殺機能は、抗アポトーシス分子を発現する悪性の形質転換されたＴ細胞株だけでなく、メモリー細胞の長期間にわたる保存を保証するプロセスの一部として高い抗アポトーシス分子を発現する正常なＴ細胞の部分集団においても保存されているべきである。この仮説をさらに調べるために、まず、ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能をＥＢＶ−ＣＴＬにおいて比較した。ベクターに基づく任意の潜在的な差異を排除するために、誘導可能なＦａｓもまた、ｉＣａｓｐ９のようにＭＳＣＶ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクターにおいて発現させた。これらの実験のために、ΔＮＧＦＲ．ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰとｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰの両方を形質導入されたＣＴＬを、ＧＦＰｈｉｇｈ発現についてソーティングし、形質導入されていないＣＴＬと１：１の比で混合することにより、ｉＦａｓまたはｉＣａｓｐ９Ｍを等しい比率かつ同様のレベルで発現する細胞集団を得た（図５Ａを参照のこと）。ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰで形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬは、図５Ａの左パネルに示されている。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰで形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬは、図５Ａの右パネルに示されている。ＥＢＶ−ＣＴＬを、高ＧＦＰ発現についてソーティングし、提示されているような形質導入されていないＣＴＬと１：１で混合した。ΔＮＧＦＲ＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞およびＧＦＰ＋Ｔ細胞のパーセンテージが示されている。
【０２７３】
１０ｎＭ  ＣＩＤを投与した後のＧＦＰ＋細胞の排除は、ｉＦａｓを形質導入されたＣＴＬよりもｉＣａｓｐ９Ｍにおいて迅速かつ効率的だった（ＣＩＤ後７日目における、ｉＦａｓを形質導入された細胞の８９．３％＋／−４．９％と比べて、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入された細胞の９９．２％＋／−０．１４％；Ｐ＜．０５；図５Ｂを参照のこと）。ＬＣＬ刺激の当日に、１０ｎＭ  ＣＩＤを投与し、示されている時点においてＧＦＰを計測することにより、ＣＩＤに対する反応を測定した。黒菱形は、ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに対するデータを表し；黒四角は、ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに対するデータを表している。３つの実験の平均値および標準偏差が、示されている。
【０２７４】
ｉＣａｓｐ９ＭおよびｉＦａｓの機能を、２つの悪性Ｔ細胞株においても比較した：アポトーシス感受性のＴ細胞白血病株であるＪｕｒｋａｔ、ならびにｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−ｘＬ発現に起因してアポトーシス抵抗性のＴ細胞株であるＭＴ−２。Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＭＴ−２細胞に、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍを同様の効率で（Ｊｕｒｋａｔにおいて９２％対８４％、ＭＴ−２において７６％対７０％）形質導入し、それらの細胞を１０ｎＭ  ＣＩＤの存在下で８時間培養した。アネキシン−Ｖ染色は、ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍが、等しい数のＪｕｒｋａｔ細胞においてアポトーシスを誘導した（それぞれ５６．４％＋／−１５．６％および５７．２％＋／−１８．９％）が、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化だけが、ＭＴ−２細胞のアポトーシスをもたらしたことを示した（ｉＦａｓおよびｉＣａｓｐ９Ｍに対してそれぞれ１９．３％＋／−８．４％および５７．９％＋／−１１．９％；図５Ｃを参照のこと）。
【０２７５】
ヒトＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ（左）およびＭＴ−２（右）に、ΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰ（図５Ｃの上の列）またはｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ（図５Ｃの下の列）を形質導入した。等しいパーセンテージのＴ細胞に、各自殺遺伝子を形質導入した：ＪｕｒｋａｔにおけるΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに対する９２％対ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに対する８４％、およびＭＴ−２におけるΔＮＧＦＲ−ｉＦａｓ．Ｉ．ＧＦＰに対する７６％対ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰに対する７０％。Ｔ細胞を、処理しなかったか、または１０ｎＭ  ＣＩＤとともにインキュベートした。ＣＩＤに曝露した８時間後、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤに対して染色することによって、アポトーシスを計測した。３つの実験の代表的な例が示されている。ＰＥは、フィコエリトリンを示している。これらの結果は、アポトーシス阻害分子を過剰発現しているＴ細胞では、ｉＦａｓの機能が阻止され得るが、ｉＣａｓｐ９Ｍは、アポトーシスをなおも効率的に誘導し得ることを実証している。
【０２７６】
免疫調節性導入遺伝子を発現しているＴ細胞のｉＣａｓｐ９Ｍ媒介性排除
ｉＣａｓｐ９Ｍが、活性な導入遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変された細胞を効率的に破壊し得るかを決定するために、ｉＣａｓｐ９Ｍが、ＩＬ−１２を安定に発現しているＥＢＶ−ＣＴＬを排除する能力を計測した。ＩＬ−１２は、形質導入されていないＣＴＬおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰを形質導入されたＣＴＬの上清中では検出不可能だったが、ｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＩＬ−１２を形質導入された細胞の上清は、３２４ｐｇ／ｍＬ〜７６２ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２を含んだ。しかしながら、１０ｎＭ  ＣＩＤを投与した後、その上清中のＩＬ−１２は、検出不可能なレベルに低下した（＜７．８ｐｇ／ｍＬ）。したがって、導入遺伝子を高発現する細胞に対する事前のソーティングなしでも、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、生物学的に関連のあるレベルのＩＬ−１２を産生するすべてのＴ細胞を完全に排除するのに十分である（図６）。ＩＬ−１２と同時発現されたときのｉＣａｓｐ９Ｍの機能は、図６において棒グラフによって図表によって表される。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰ構築物におけるマーカー遺伝子ＧＦＰを、ヒトＩＬ−１２のｐ４０およびｐ３５サブユニットをコードするｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２によって置き換えた。ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰおよびｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＩＬ−１２を形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬを、ＬＣＬで刺激し、次いで、処理せずに放置したか、または１０ｎＭ  ＣＩＤに曝露した。２回目の抗原刺激の３日後、培養上清中のＩＬ−１２のレベルを、ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡによって計測した（このアッセイの検出限界は、７．８ｐｇ／ｍＬである）。３つ組のウェルの平均値および標準偏差が、示されている。２人の異なるドナー由来のＣＴＬを用いた２つの実験のうちの１つの結果が、示されている。
【０２７７】
インビボにおける導入遺伝子の高発現について選択されたＴ細胞の９９％超の排除
ｉＣａｓｐ９Ｍの機能を、形質導入されたＥＢＶ−ＣＴＬにおいてインビボでも評価した。ＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植片モデルを養子免疫療法のために使用した。形質導入されていないＣＴＬとｉＣａｓｐ９Ｍ．ＩＲＥＳ．ＧＦＰｈｉｇｈを形質導入されたＣＴＬとの１：１混合物を、自己ＬＣＬ異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに静脈内注入した後、マウスを単一用量のＣＩＤまたはキャリアのみで処置した。ＣＩＤ／キャリア投与の３日後、腫瘍をヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋細胞について解析した。ヒト抗ＣＤ３抗体を使用した、注入生成物の形質導入されていない構成要素の検出により、ＣＩＤを投与されたマウスにおける尾静脈注入の成功が確かめられた。ＣＩＤで処置されたマウスでは、キャリアのみで処置された注入されたマウスと比べて、ヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞数の９９％超が減少したことから、インビボおよびインビトロにおけるｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＴ細胞の等しく高い感受性が実証された（図７を参照のこと）。
【０２７８】
インビボにおけるｉＣａｓｐ９Ｍの機能が、図７において図表によって図示されている。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを照射し、１０×１０６〜１５×１０６個のＬＣＬを皮下に注射した。１４日後、直径０．５ｃｍの腫瘍を有するマウスに、合計１５×１０６個のＥＢＶ−ＣＴＬを投与した（これらの細胞の５０％は形質導入されておらず、５０％には、ｉＣａｓｐ９Ｍ．Ｉ．ＧＦＰを形質導入し、高ＧＦＰ発現についてソーティングした）。ＣＴＬ投与後３日目に、マウスにＣＩＤ（５０μｇ  ＡＰ２０１８７；（黒菱形，ｎ＝６）またはキャリアのみ（黒四角，ｎ＝５）を投与し、６日目に、腫瘍内のヒトＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の存在を解析した。形質導入されていないＣＴＬ（１５×１０６個のＣＴＬ；ｎ＝４）だけを投与されたコントロール群マウスの腫瘍から単離されたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、腫瘍内のＣＤ３＋／ＧＦＰ＋Ｔ細胞の解析のためのネガティブコントロールとして使用した。
【０２７９】
考察
いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞をインビボにおいて排除するのに適した自殺遺伝子を発現する発現ベクターが、本明細書中に提示される。本明細書中に提示される自殺遺伝子発現ベクターは、改変している遺伝子を有するすべての細胞における安定した同時発現、細胞死を誘発するのに十分高いレベルでの発現、低い基底活性、高い比活性、および内因性抗アポトーシス分子に対する最小の感受性を含む、ある特定の非限定的な有益な特徴を有する。４週間超にわたってヒトＴ細胞において安定した発現を可能にしつつ低い基底活性を有する誘導可能なカスパーゼ−９であるｉＣａｓｐ９Ｍが、ある特定の実施形態において本明細書中に提示される。単一の１０ｎＭ用量の二量体化小分子化学誘導物質（ＣＩＤ）が、インビトロとインビボの両方において、導入遺伝子の高発現について選択されたｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入された細胞の９９％超を殺傷するのに十分である。さらに、Ｔｈ１サイトカインＩＬ−１２と同時発現されるとき、ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、導入遺伝子の高発現についての選択なしでさえも、すべての検出可能なＩＬ−１２産生細胞を排除した。カスパーゼ−９は、ほとんどの抗アポトーシス分子の下流で作用するがゆえに、ＣＩＤに対する高感度は、高レベルのｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス分子の存在に関係なく、保存されている。したがって、ｉＣａｓｐ９Ｍは、アポトーシスに比較的抵抗性である形質転換されたＴ細胞およびメモリーＴ細胞の破壊を誘導するためにも有用であると判明し得る。
【０２８０】
他のカスパーゼ分子とは異なり、タンパク質分解は、カスパーゼ−９の活性化にとって十分でないとみられる。結晶学的なデータおよび機能的なデータは、不活性なカスパーゼ−９モノマーの二量体化が、立体構造変化によって誘導される活性化をもたらすことを示唆している。生理学的な状況におけるプロカスパーゼ−９の濃度は、二量体化のために必要とされる閾値より十分低い約２０ｎＭの範囲内である。
【０２８１】
理論に限定されるものではないが、二量体化に対するエネルギー障壁は、シトクロムＣおよびＡＴＰによって駆動される、Ａｐａｆ−１のＣＡＲＤドメインとカスパーゼ−９のＣＡＲＤドメインとの間の同種親和性相互作用によって克服され得ると考えられている。２つのＦＫＢＰに接続されたカスパーゼ−９の過剰発現は、自発的な二量体化が生じるのを可能にすることがあり、最初の完全長カスパーゼ−９構築物の観察された毒性を説明し得る。１つのＦＫＢＰを除去した後に、おそらく、自発的な二量体化に関連する毒性の減少に起因して、毒性の減少および遺伝子発現の増加が観察された。多量体化は、しばしば、表面デスレセプターの活性化に関与するが、活性化を媒介するのには、カスパーゼ−９の二量体化で十分であるはずである。本明細書中に提示されるデータは、単一のＦＫＢＰを有するｉＣａｓｐ９構築物が、２つのＦＫＢＰを有するものと同程度に効率的に機能することを示唆している。ＣＡＲＤドメインの除去によるＣＩＤに対する感度の上昇は、ＣＩＤが結合した際の二量体化のエネルギー閾値の低下に相当し得る。
【０２８２】
ウイルスまたは細菌に由来する致死遺伝子（例えば、ＨＳＶ−ＴＫおよびシトシンデアミナーゼ）の存続および機能は、ウイルスまたは細菌に由来する致死遺伝子を発現している細胞に対する望まれない免疫応答によって損なわれ得る。ｉＣａｓｐ９Ｍの構成要素を形成するＦＫＢＰおよびアポトーシス促進性分子は、ヒト由来分子であり、ゆえに、免疫応答を誘導する可能性は低い。ＦＫＢＰとカスパーゼ−９との間のリンカーおよびＦＫＢＰドメイン内の単一の点変異は、新規のアミノ酸配列をもたらすが、それらの配列は、ｉＦａｓを形質導入されたＴ細胞のマカクレシピエントによって免疫学的に認識されなかった。さらに、ｉＣａｓｐ９Ｍの構成要素は、ヒト由来分子であるので、ＨＳＶ−ＴＫなどのウイルス由来タンパク質とは異なり、ジャンクション配列に特異的なメモリーＴ細胞は、レシピエントに存在しないはずであり、それにより、ｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＴ細胞の、免疫応答によって媒介される排除のリスクは低下する。
【０２８３】
誘導可能なＦａｓ、またはＦａｓ関連デスドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）のデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を使用した以前の研究は、形質導入された細胞のおよそ１０％が、破壊性遺伝子の活性化に対して無応答性であると示した。本明細書中に提示される実験において観察されたように、ＣＩＤに対する無応答性についての可能性のある説明は、導入遺伝子の低発現である。本発明者らの研究におけるｉＣａｓｐ９Ｍを形質導入されたＴ細胞、および他者による研究における、ＣＩＤ投与後に生き残った、ｉＦａｓを形質導入されたＴ細胞は、低レベルの導入遺伝子発現を有した。認知されているレトロウイルスの「位置効果」を克服する目的で、導入遺伝子の高レベルの均一な発現を、レトロウイルス組み込み体をニワトリベータ−グロビンクロマチンインスレーターのそばに配置することによって、達成した。クロマチンインスレーターの付加は、形質導入された２９３Ｔ細胞における発現の均一性を劇的に高めたが、形質導入された初代Ｔ細胞において有意な影響を及ぼさなかった。高発現レベルを有するＴ細胞の選択によって、二量体化剤に対する応答のばらつきが最小になった。高ＧＦＰ発現についてソーティングされた形質導入されたＴ細胞の９９％超が、単一の１０ｎＭ  ＣＩＤ用量の後に排除された。この実証は、高レベルの自殺遺伝子を発現している細胞が、選択可能マーカーを使用して単離され得るという仮説を支持する。
【０２８４】
非常に少数の抵抗性の残留細胞が、毒性の復活を引き起こすことがあり、最大２ｌｏｇの除去効率が、この可能性を有意に低下させ得る。臨床で使用するために、非免疫原性の選択可能マーカー（例えば、切断型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０またはＣＤ３４）（例えば、ＧＦＰの代わりに）との同時発現が、導入遺伝子を高発現しているＴ細胞の選択を可能にするだろう。自殺スイッチ（例えば、ｉＣＡＳＰ９Ｍ）と好適な選択可能マーカー（例えば、切断型ヒトＮＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３４などおよびそれらの組み合わせ）との同時発現は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断配列（例えば、２Ａ）を含む融合タンパク質の翻訳後修飾を用いて得ることができる。対照的に、唯一の安全性の懸念が、導入遺伝子によって媒介される毒性（例えば、人工Ｔ細胞レセプター、サイトカインなどまたはそれらの組み合わせ）である状況では、ｉＣａｓｐ９Ｍと導入遺伝子発現との間の密接な関連が、生物学的に関連のあるレベルの治療用導入遺伝子を発現している実質的にすべての細胞の排除を可能にするので、この選択工程は、不必要であり得る。これは、ｉＣａｓｐ９ＭをＩＬ−１２と同時発現することによって実証された。ｉＣａｓｐ９Ｍの活性化は、任意の計測可能なＩＬ−１２の産生を実質的に排除した。導入遺伝子発現の成功およびその後の「自殺スイッチ」の活性化は、その導入遺伝子の機能および活性に依存し得る。
【０２８５】
ＣＩＤに対する無応答性についての別の可能性のある説明は、高レベルのアポトーシス阻害剤が、ＣＩＤ媒介性のアポトーシスを減弱し得るということである。アポトーシス阻害剤の例としては、ｃ−ＦＬＩＰ、ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、および通常、アポトーシスと生存とのバランスを制御している、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）が挙げられる。例えば、ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−２のアップレギュレーションは、メモリープールを確立するように運命づけられたＴ細胞の部分集団を、同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）標的または抗原提示細胞に応答する、活性化によって誘導される細胞死に対して抵抗性にさせる。いくつかのＴリンパ系腫瘍において、アポトーシスと生存との生理学的なバランスは、細胞生存を優先して乱される。自殺遺伝子は、メモリー細胞および悪性形質転換した細胞を含む実質的にすべての形質導入されたＴ細胞を除去するはずである。ゆえに、選択された誘導可能な自殺遺伝子は、高レベルの抗アポトーシス分子の存在下において、その活性の実質的にすべてとまではいかなくてもかなりの部分を保持するはずである。
【０２８６】
アポトーシスシグナル伝達経路におけるｉＦａｓ（またはｉＦＡＤＤ）の頂点における位置は、それをアポトーシス阻害剤に対して特に脆弱にし得るので、これらの分子は、アポトーシスの安全スイッチの重要な構成要素になるのにあまりふさわしくない。カスパーゼ３または７は、末端のエフェクター分子として適切であるとみられ得るが；しかしながら、その両方ともが、初代ヒトＴ細胞において機能的なレベルで発現されることができなかった。ゆえに、カスパーゼ９は、アポトーシス経路において、ｃ−ＦＬＩＰおよび抗アポトーシスｂｃｌ−２ファミリーメンバーの阻害作用を迂回するのに十分な後の段階で機能し、また、カスパーゼ−９は、機能的なレベルで安定に発現され得るので、カスパーゼ−９を自殺遺伝子として選択した。Ｘ連鎖アポトーシス阻害剤（ＸＩＡＰ）は、理論上は、自発的なカスパーゼ−９の活性化を減少させ得るが、ＦＫＢＰＶ３６に対するＡＰ２０１８７（またはＡＰ１９０３）の高親和性が、この非共有結合的に会合したＸＩＡＰを置き換え得る。ｉＦａｓとは対照的に、ｉＣａｓｐ９Ｍは、ｂｃｌ−ｘＬを含む抗アポトーシス分子を過剰発現する形質転換されたＴ細胞株において機能的なままだった。
【０２８７】
ヒトＴ細胞によるオンコレトロウイルスベクターからの発現に対して特にデザインされた誘導可能な安全スイッチが、本明細書中に提示される。ｉＣａｓｐ９Ｍは、最適な削除効果のために必要とされる用量において安全であると判明しており、ガンシクロビルまたはリツキシマブとは異なってインビボにおいて他の生物学的影響を及ぼさない、小さい二量体化化学誘導物質であるＡＰ１９０３（またはアナログ）によって活性化され得る。ゆえに、養子移入のためのＴ細胞におけるこの自殺遺伝子の発現は、安全性を高めることができ、また、臨床適用の範囲を広げ得る。
【０２８８】
実施例２：ハプロタイプ一致幹細胞移植後の同種異系枯渇されたＴ細胞の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の使用
発現構築物、およびハプロタイプ一致幹細胞移植後の同種異系枯渇されたＴ細胞の安全性を改善するためにその発現構築物を使用する方法が、この実施例に提示される。ｉＣａｓｐ９および選択可能マーカー（切断型ＣＤ１９）をコードするレトロウイルスベクターを、ドナーＴ細胞に対する安全スイッチとして作製した。同種異系枯渇（抗ＣＤ２５免疫毒素を使用する）の後でさえも、ドナーＴ細胞は、効率的に形質導入され、増殖され、続いて、ＣＤ１９免疫磁気選択によって＞９０％純度に濃縮され得る。操作された細胞は、抗ウイルスの特異性および機能性を保持し、制御性の表現型および機能を有するサブセットを含んだ。小分子二量体化剤によるｉＣａｓｐ９の活性化は、＞９０％アポトーシスを迅速にもたらした。導入遺伝子発現は、静止状態のＴ細胞においてダウンレギュレートされたが、活性化された（アロ反応性）Ｔ細胞では発現が迅速にアップレギュレートされたので、ｉＣａｓｐ９は、効率的な自殺遺伝子として残った。
【０２８９】
材料および方法
同種異系枯渇されたＴ細胞の作製
同種異系枯渇された細胞を、先に提示されたように健常志願者から作製した。簡潔には、健常ドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換された、照射されたレシピエントリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）とともに、４０：１というレスポンダー対スティミュレーター比で、無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において共培養した。７２時間後、ＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素における一晩のインキュベーションによって共培養物から枯渇させた。残留ＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が、＜１％であり、３Ｈ−チミジン取り込みによる残留増殖が＜１０％である場合、同種異系枯渇は、十分であると考えられた。
【０２９０】
プラスミドおよびレトロウイルス
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９は、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９に連結された誘導可能なカスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる（ＣＤ１９；図８Ａを参照のこと）。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１２２９）に接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２８１８）からなる。Ｆ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高める。カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）の生理学的機能が、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられており、そのドメインの除去により、導入遺伝子の発現および機能が高まるので、カスパーゼ動員ドメインは、ヒトカスパーゼ−９配列から削除されている。２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、ｉＣａｓｐ９のＣ末端に１９個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断される完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１７７０）からなる。
【０２９１】
テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生する安定したＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって、作製した。これは、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスを産生した。そのＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含む産生株を作製した。単一細胞クローン化を行い、最も高い力価をもたらしたＰＧ１３クローンを、増殖し、ベクター作製のために使用した。
【０２９２】
レトロウイルス形質導入
Ｔ細胞の活性化および増殖のための培養液は、４５％ＲＰＭＩ１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４５％Ｃｌｉｃｋｓ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）からなるものだった。同種異系枯渇された細胞を、固定化された抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）によって４８時間活性化した後、レトロウイルスベクターで形質導入した（図８Ｂを参照のこと）。図８Ｂは、形質導入された導入遺伝子を発現する「最終的な細胞産物（ｆｉｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」を生成するためのプロセスの概要を提示している。ドナーＰＢＭＣをレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬと共培養してアロ反応性細胞を活性化することによって、選択的同種異系枯渇を行った：活性化された細胞は、ＣＤ２５を発現し、その後、抗ＣＤ２５免疫毒素によって排除された。同種異系枯渇された細胞を、ＯＫＴ３によって活性化し、４８時間後にレトロウイルスベクターで形質導入した。免疫磁気選択を、形質導入の４日目に行い；陽性画分をさらに４日間にわたって増殖し、凍結保存した。
【０２９３】
小規模実験では、組織培養用に処理されていない２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を、３７℃において２〜４時間にわたってＯＫＴ３  １μｇ／ｍｌでコーティングした。同種異系枯渇された細胞を、１ウェルあたり１×１０６細胞で加えた。２４時間後、１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ；Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を加えた。レトロウイルス形質導入を、活性化の４８時間後に行った。組織培養用に処理されていない２４ウェルプレートを、３．５μｇ／ｃｍ２組換えフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６；Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ；Ｔａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）でコーティングし、１ウェルあたり０．５ｍｌで３７℃において３０分間、レトロウイルスベクター含有上清で２回負荷し、その後、ＯＫＴ３によって活性化された細胞を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２が補充された、３：１という比の新鮮なレトロウイルスベクター含有上清およびＴ細胞培養液中に、１ウェルあたり５×１０５細胞でプレーティングした。細胞を２〜３日後に収集し、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下において増殖した。
【０２９４】
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞のスケールアップ産生
臨床適用のための形質導入プロセスのスケールアップでは、１０ｍｌのＯＫＴ３  １μｇ／ｍｌまたは１０ｍｌのフィブロネクチン７μｇ／ｍｌで４℃において一晩コーティングされた、組織培養用に処理されていないＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用した。高い細胞粘着性のためにコロナ処理されたフッ化エチレンプロピレンバッグ（２ＰＦ−００７２ＡＣ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）も使用した。同種異系枯渇された細胞を、ＯＫＴ３によってコーティングされたフラスコに、１×１０６細胞／ｍｌで播種した。翌日、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を加えた。レトロウイルス形質導入に向けて、レトロネクチンでコーティングされたフラスコまたはバッグを、１０ｍｌのレトロウイルス含有上清で２〜３時間、一度負荷した。ＯＫＴ３によって活性化されたＴ細胞を、レトロウイルスベクター含有新鮮培地と１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充されたＴ細胞培養液とが３：１の中に１×１０６細胞／ｍｌで播種した。細胞を、翌朝収集し、組織培養用に処理されたＴ７５またはＴ１７５フラスコ内、約５０〜１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２が補充された培養液中で、約５×１０５細胞／ｍｌ〜８×１０５細胞／ｍｌの播種密度で増殖させた。
【０２９５】
ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択を、形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、小規模実験ではＭＳまたはＬＳカラムにおいて、および大規模実験ではＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて、選択した。ＣＤ１９によって選択された細胞を、さらに４日間増殖させ、形質導入後の８日目に凍結保存した。これらの細胞は、「遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞」と称された。
【０２９６】
免疫表現型分析および五量体解析
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、以下の抗体を使用して行った：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６およびＣＤ６２Ｌ。ＣＤ１９−ＰＥ（クローン４Ｇ７；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、最適な染色をもたらすと見出されており、その後のすべての解析において使用された。形質導入されていないコントロールを、ＣＤ１９に対するネガティブゲートを設定するために使用した。ＨＬＡ−五量体であるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬ（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）を、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）由来のエピトープを認識するＴ細胞を検出するために使用した。ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ五量体を、ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原由来のエピトープを認識するＴ細胞を検出するために使用した。
【０２９７】
抗ウイルス応答に対するインターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＥＢＶ抗原、ＣＭＶ抗原およびアデノウイルス抗原に対する応答を評価するためのインターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔを、公知の方法を使用して行った。形質導入の８日後に凍結保存された、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞を解凍し、レスポンダー細胞として使用する前に、ＩＬ−２を含まない完全培地中で一晩休ませた。同じドナー由来の凍結保存されたＰＢＭＣを、比較対照として使用した。レスポンダー細胞を、１ウェルあたり２×１０５、１×１０５、５×１０４および２．５×１０４細胞という段階希釈において２つ組または３つ組でプレーティングした。スティミュレーター細胞を、１ウェルあたり１×１０５でプレーティングした。ＥＢＶに対する応答の場合、４０Ｇｙで照射されたドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬをスティミュレーターとして使用した。アデノウイルスに対する応答の場合、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスに感染したドナー由来活性化単球を使用した。
【０２９８】
簡潔には、ドナーＰＢＭＣを、２４ウェルプレートにおけるＸ−Ｖｉｖｏ１５（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に一晩プレーティングし、翌朝収集し、２００という感染効率（ＭＯＩ）でＡｄ５ｆ３５に２時間感染させ、洗浄し、３０Ｇｙで照射し、スティミュレーターとして使用した。抗ＣＭＶ応答の場合、ＣＭＶ  ｐｐ６５導入遺伝子（Ａｄ５ｆ３５−ｐｐ６５）をコードするＡｄ５ｆ３５アデノウイルスを５０００というＭＯＩで使用する同様のプロセスを使用した。特定のスポット形成単位（ＳＦＵ）を、レスポンダーのみおよびスティミュレーターのみのウェルのＳＦＵを試験ウェルから減算することによって計算した。ＣＭＶに対する応答は、Ａｄ５ｆ３５−ｐｐ６５のウェルとＡｄ５ｆ３５のウェルの間のＳＦＵの差異だった。
【０２９９】
ＥＢＶ特異的細胞傷害性
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞を、４０：１というレスポンダー：スティミュレーター比において、４０Ｇｙで照射されたドナー由来ＥＢＶＬＣＬで刺激した。９日後、培養物を、４：１というレスポンダー：スティミュレーター比で再刺激した。再刺激は、示されるように毎週行った。２または３回の刺激の後、標的細胞としてドナーＥＢＶ−ＬＣＬおよび自己コントロールとしてドナーＯＫＴ３芽球を使用する４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞傷害性を計測した。３０倍過剰の非放射性Ｋ５６２細胞を加えることによって、ＮＫ活性を阻害した。
【０３００】
二量体化化学誘導物質ＡＰ２０１８７によるアポトーシスの誘導
ＣＤ１９免疫磁気選択の翌日に、小分子合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を１０ｎＭの最終濃度で加えることによって、自殺遺伝子の機能を評価した。細胞を、２４時間後にアネキシンＶおよび７−アミノアクチノマイシン（７−ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。アネキシンＶと７−ＡＡＤの両方が陰性の細胞を、生細胞とみなし、アネキシンＶが陽性の細胞を、アポトーシス細胞とみなし、アネキシンＶと７−ＡＡＤの両方が陽性の細胞を、ネクローシス細胞とみなした。二量体化によって誘導されたパーセンテージ殺傷を、以下のとおり、ベースライン生存率について補正した：パーセンテージ殺傷＝１００％−（ＡＰ２０１８７で処理された細胞における％生存率÷処理されなかった細胞における％生存率）。
【０３０１】
長時間の培養および再活性化の後の導入遺伝子発現の評価
細胞を、形質導入の２２日後まで、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含むＴ細胞培地中で維持した。細胞の一部を、１ｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３および１μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（Ｃｌｏｎｅ  ＣＤ２８．２，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングされた２４ウェルプレート上で４８〜７２時間、再活性化した。再活性化された細胞と再活性化されていない細胞の両方におけるＣＤ１９の発現および自殺遺伝子の機能を、形質導入後２４または２５日目に計測した。
【０３０２】
いくつかの実験では、細胞を、形質導入後３週間にわたって培養し、１：１というレスポンダー：スティミュレーター比において、３０Ｇで照射された同種異系ＰＢＭＣで刺激した。共培養の４日後、細胞の一部を１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７で処理した。２４時間後のアネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって殺傷を計測し、バイスタンダーウイルス（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｖｉｒｕｓ）特異的Ｔ細胞に対する二量体化剤の影響を、ＡＰ２０１８７で処理された細胞および処理されなかった細胞に対する五量体解析によって評価した。
【０３０３】
制御性Ｔ細胞
ＣＤ４、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現を、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞において、フローサイトメトリーを使用して解析した。ヒトＦｏｘｐ３染色の場合、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）染色セットを、適切なラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロールとともに使用した。これらの細胞を、表面ＣＤ２５−ＦＩＴＣおよびＣＤ４−ＰＥで同時染色した。同種異系枯渇および遺伝子改変の後に選択されたＣＤ４＋２５＋細胞を、カルボキシフルオレセインジアセテートＮ−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識された自己ＰＢＭＣとともに共培養することによって、機能解析を行った。ＣＤ４＋２５＋選択は、まず、抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してＣＤ８＋細胞を枯渇させた後、抗ＣＤ２５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用するポジティブ選択によって、行った。ＣＦＳＥ標識は、１．５μＭ  ＣＦＳＥを含むリン酸緩衝食塩水中、２×１０７／ｍｌで自己ＰＢＭＣを１０分間インキュベートすることによって行った。等体積のＦＢＳを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることによって、その反応を停止した。使用する前に、細胞を２回洗浄した。ＣＦＳＥで標識されたＰＢＭＣを、５：１というＰＢＭＣ：同種異系フィーダー比において、ＯＫＴ３  ５００ｎｇ／ｍｌおよび４０Ｇで照射された同種異系ＰＢＭＣフィーダーで刺激した。次いで、それらの細胞を、等しい数の、遺伝子改変され、同種異系枯渇された自己ＣＤ４＋２５＋細胞ありまたはなしで、培養した。培養の５日後、細胞分裂をフローサイトメトリーによって解析し；ＣＤ１９を使用することにより、ＣＦＳＥで標識されていない、遺伝子改変されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞をゲーティングアウトした。
【０３０４】
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を判定した。すべてのデータを平均値±１標準偏差として表す。
【０３０５】
結果
選択的に同種異系枯渇されたＴ細胞には、ｉＣａｓｐ９が効率的に形質導入され得、その細胞は、増殖され得る。
【０３０６】
選択的同種異系枯渇を、臨床プロトコル手順に従って行った。簡潔には、３／６〜５／６のＨＬＡミスマッチＰＢＭＣおよびリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を共培養した。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素を、共培養の７２時間後に適用したところ、＜１０％の残留増殖を有し（平均値４．５±２．８％；範囲０．７４〜９．１％；１０回の実験）、＜１％の残留ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞を含み（平均値０．２３±０．２０％；範囲０．０６〜０．７３％；１０回の実験）、これは、選択的同種異系枯渇に対する放出基準を満たし、その後の操作に対する出発物質として働く同種異系枯渇された細胞が確かに作製された。
【０３０７】
固定化されたＯＫＴ３に対して４８時間にわたって活性化された同種異系枯渇された細胞を、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＣＤ１９をコードするＧａｌ−Ｖシュードタイプ化レトロウイルスベクターで効率的に形質導入することができた。形質導入の２〜４日後にＣＤ１９発現に対するＦＡＣＳ解析によって評価された形質導入効率は、約５３％±８％であり、小規模（２４ウェルプレート）および大規模（Ｔ７５フラスコ）の形質導入に対して匹敵する結果だった（６回および４回の実験においてそれぞれ約５５±８％対約５０％±１０％）。細胞数は、ＯＫＴ３活性化後の最初の２日で減少し、同種異系枯渇された細胞の約６１％±１２％（約４５％〜８０％の範囲）だけしか、形質導入の当日に回収されなかった（図９を参照のこと）。同種異系枯渇された細胞が形質導入後に首尾よく増殖できたかを決定するために行われた実験の結果のグラフが、図９に図示されている。黒菱形は、フラスコおよびバッグにおいて行われた大規模実験を表している。白丸は、２４ウェルプレートにおいて行われた小規模実験を表している。その後、それらの細胞は、有意な増殖を示し、その後の８日間にわたって約９４±４６倍の範囲（約４０〜約１５３の範囲）の平均増殖を示し、５８±３３倍の正味の増殖がもたらされた。小規模実験と大規模実験の両方における細胞の増殖は、似ており、５つの小規模実験において約４５±２９倍（約２５〜約９０の範囲）および３つの大規模実験において約７９±３４倍（約５０〜約１１６の範囲）という正味の増殖だった。
【０３０８】
ΔＣＤ１９は、免疫磁気カラムにおける、形質導入された細胞の効率的かつ選択的な濃縮を可能にする
自殺遺伝子活性化の効率は、時折、自殺遺伝子自体の機能に依存し、時折、遺伝子改変された細胞について濃縮するために使用される選択システムに依存する。ＣＤ１９選択によって、遺伝子改変された細胞の選択が十分な純度および収率で可能だったか、および選択が、その後の細胞成長に対して何らかの悪影響を及ぼしたかを決定するために、選択可能マーカーとしてのＣＤ１９の使用を調べた。製造者の指示書に従って小規模選択を行った；しかしながら、１．３×１０７細胞あたり１０ｌのＣＤ１９マイクロビーズを使用したとき、大規模選択が最適であることが明らかになった。抗ＣＤ１９マイクロビーズからの干渉を最小限にするために、免疫磁気選択の２４時間後にＦＡＣＳ解析を行った。免疫磁気選択後の細胞の純度は、一貫して９０％よりも高かった：ＣＤ１９＋細胞の平均パーセンテージは、小規模選択において約９８．３％±０．５％（ｎ＝５）の範囲内および大規模ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択において約９７．４％±０．９％（ｎ＝３）の範囲内だった（図１０を参照のこと）。形質導入の２日後に行われた免疫磁気選択の代表的なＦＡＣＳ解析の記録が、図１０に示されている。
【０３０９】
小規模選択および大規模選択の絶対収率は、形質導入効率に対する補正の後、それぞれ約３１％±１１％および約２８％±６％だった。形質導入された細胞の平均回収率は、小規模選択において約５４％±１４％であり、大規模選択において約７２％±１８％だった。選択プロセスは、その後の細胞増殖に対していかなる識別可能な悪影響も及ぼさなかった。４つの実験において、ＣＤ１９免疫磁気選択後の３日間にわたる平均細胞増殖は、選択されていない形質導入された細胞における約４．１倍（ｐ＝０．３４）および形質導入されていない細胞における約３．７倍（ｐ＝０．７５）に対して、ＣＤ１９陽性画分において約３．５倍だった。
【０３１０】
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞の免疫表現型
最終的な細胞産物（形質導入の８日後に凍結保存されていた遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞）を免疫表現型分析したところ、ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞の両方を含み、下記の表に示されているように６２％±１１％ＣＤ８＋対２３％±８％ＣＤ４＋でＣＤ８細胞が優勢であることが見出された。ＮＳ＝有意でない、ＳＤ＝標準偏差。
【０３１１】
【表１−３】
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【０３１２】
細胞の大部分は、ＣＤ４５ＲＯ＋であり、エフェクターメモリーＴ細胞の表面免疫表現型を有した。ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８を含むメモリーマーカーの発現は、不均一だった。細胞のおよそ２４％が、セントラルメモリー細胞上に主に発現されるリンパ節ホーミング分子であるＣＤ６２Ｌを発現した。
【０３１３】
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞は、抗ウイルスのレパートリーおよび機能を保持した
最終産物細胞が抗ウイルス免疫を媒介する能力を、インターフェロン−ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞傷害性アッセイおよび五量体解析によって評価した。凍結保存された、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞は、臨床研究における使用について現在評価されている産物の代表であるので、それらを、すべての解析において使用した。ドナー細胞によって提示されたアデノウイルス抗原、ＣＭＶ抗原またはＥＢＶ抗原に応答したインターフェロン−γ分泌は保存されたが、操作されていないＰＢＭＣと比べて、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞における抗ＥＢＶ応答が低下する傾向があった（図１１Ａを参照のこと）。インターフェロン分泌研究の結果が、図１１Ａに図示されている。ウイルス抗原に対する応答を、操作されていないＰＢＭＣと遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞（ＧＭＡＣ）との４つの対におけるＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。アデノウイルス抗原およびＣＭＶ抗原は、それぞれＡｄ５ｆ３５ヌルベクターおよびＡｄ５ｆ３５−ｐｐ６５ベクターに感染させることによって、ドナー由来の活性化単球によって提示された。ＥＢＶ抗原は、ドナーＥＢＶ−ＬＣＬによって提示された。スポット形成単位（ＳＦＵ）の数値を、スティミュレーターのみおよびレスポンダーのみのウェルに対して補正した。４人中３人のドナーしか、ＣＭＶ応答について評価可能でなく、１人の血清陰性ドナーは、除外された。図１１Ａにおいて、水平のバーは、中央値を表している。
【０３１４】
ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬを標的として使用して、細胞傷害性を評価した。ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬによる２または３回の刺激を受けた、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞は、ウイルスに感染した自己標的細胞を効率的に溶解することができた（図１１Ｂを参照のこと）。細胞傷害性アッセイの結果が、図１１Ｂに提示されている。遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞を、２または３サイクルにわたってドナーＥＢＶ−ＬＣＬで刺激した。５１Ｃｒ放出アッセイを、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬおよびドナーＯＫＴ３芽球を標的として使用して行った。ＮＫ活性は、３０倍過剰な非放射性Ｋ５６２によって阻止された。左パネルは、完全にまたは部分的にミスマッチのドナー−レシピエント対を用いた５つの独立した実験の結果を示している。右パネルは、無関係のＨＬＡハプロタイプ一致ドナー−レシピエント対を用いた３つの実験の結果を示している。エラーバーは、標準偏差を示している。
【０３１５】
ＥＢＶ−ＬＣＬを、選択的同種異系枯渇において抗原提示細胞として使用したので、ドナーとレシピエントとがハプロタイプ一致であるとき、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を有意に枯渇させることが可能だった。この仮説を調べるために、無関係のＨＬＡハプロタイプ一致ドナー−レシピエント対を使用する３つの実験を含め、その結果は、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬに対する細胞傷害性が保持されることを示した。それらの結果は、ＨＬＡ−Ｂ８陰性ハプロタイプ一致レシピエントに対する同種異系枯渇後の２人の情報価値のあるドナーにおける、ＥＢＶ溶解抗原（ＢＺＬＦ１）エピトープであるＨＬＡ−Ｂ８−ＲＡＫＦＫＱＬＬを認識するＴ細胞に対する五量体解析によって裏付けられた（図１１Ｃを参照のこと）。図１１Ｃは、ＢＺＬＦ１エピトープに特異的なＴ細胞の頻度を図示している。操作されていないＰＢＭＣを比較対照として使用した。ＲＡＫ−五量体陽性集団は、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞において保持され、ドナー由来ＥＢＶ−ＬＣＬによる数回のインビトロ刺激の後に増殖されることができた。図１１Ｃに提示されているグラフ内に示されているパーセンテージは、ＣＤ８集団内の五量体陽性細胞のパーセンテージを示す。まとめると、これらの結果は、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞が、有意な抗ウイルス機能を保持したことを示唆している。
【０３１６】
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞集団における制御性Ｔ細胞
フローサイトメトリーおよび機能解析を使用して、制御性Ｔ細胞が、本発明者らの同種異系枯渇され、遺伝子改変されたＴ細胞産物において保持されているかを決定した。図１２Ａに示されているように、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋２５＋集団を見出した。免疫磁気分離の後、濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋画分は、ＯＫＴ３および同種異系フィーダーの存在下において、ＣＦＳＥ標識された自己ＰＢＭＣと共培養されたとき、サプレッサー機能を示した（図１２Ｂを参照のこと）。図１２Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋機能アッセイの結果を図示している。ドナー由来ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、ＯＫＴ３および同種異系フィーダーで刺激した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、遺伝子改変された細胞集団から免疫磁気的に（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ）選択し、１：１の比で試験ウェルに加えた。５日後にフローサイトメトリーを行った。遺伝子改変されたＴ細胞をＣＤ１９発現によってゲーティングアウトした。遺伝子改変されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を加えることにより（下のパネル）、細胞増殖が有意に減少した。したがって、同種異系枯渇されたＴ細胞は、ＣＤ２５を枯渇させる免疫毒素に曝露された後でさえ、制御性の表現型を再獲得し得る。
【０３１７】
遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞を、二量体化化学誘導物質を加えることによって効率的かつ迅速に排除した
免疫磁気選択の翌日、１０ｎＭの二量体化化学誘導物質ＡＰ２０１８７を加えることにより、アポトーシスを誘導したところ、アポトーシスは、２４時間以内に発生した。２４時間後のアネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色によるＦＡＣＳ解析は、ＡＰ２０１８７で処理された細胞の約５．５％±２．５％だけしか生存可能のままでなかったのに対し、未処理細胞の約８１．０％±９．０％が、生存可能だったことを示した（図１３Ａを参照のこと）。ベースライン生存率に対する補正後の殺傷効率は、約９２．９％±３．８％だった。大規模ＣＤ１９選択は、小規模選択と同様の効率で殺傷された細胞をもたらした：大規模および小規模におけるＡＰ２０１８７ありおよびなしでの平均生存率、ならびにパーセンテージ殺傷は、それぞれ、約３．９％、約８４．０％、約９５．４％（ｎ＝３）および約６．６％、約７９．３％、約９１．４％だった（ｎ＝５）。ＡＰ２０１８７は、形質導入されていない細胞にとって無毒性だった：ＡＰ２０１８７ありおよびなしでの生存率は、それぞれ約８６％±９％および８７％±８％だった（ｎ＝６）。
【０３１８】
導入遺伝子の発現および機能は、長時間の培養で低下したが、細胞が再活性化されると回復した
導入遺伝子の発現および機能の安定性を評価するために、細胞を、Ｔ細胞培養液および低用量ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）中で、形質導入の２４日後まで維持した。次いで、細胞の一部をＯＫＴ３／抗ＣＤ２８で再活性化した。ＣＤ１９発現を、４８〜７２時間後にフローサイトメトリーによって解析し、自殺遺伝子の機能を、１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７で処理することによって評価した。図１３Ｂに示されている結果は、４８〜７２時間の再活性化ありまたはなしでの、形質導入後５日目（すなわち、ＣＤ１９選択の１日後）および形質導入後２４日目の細胞に対する結果である（５つの実験）。２つの実験において、活性化された細胞をさらに濃縮するために、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８活性化の後にＣＤ２５選択を行った。エラーバーは、標準偏差を示している。＊は、形質導入後５日目の細胞と比較したときのｐ＜０．０５を示している。２４日目まで、表面ＣＤ１９発現は、約９８％±１％から約８８％±４％に減少し（ｐ＜０．０５）、平行して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、７９３±１２８から４７８±１０７に減少した（ｐ＜０．０５）（図１３Ｂを参照のこと）。同様に、自殺遺伝子の機能が有意に減少した：残存生存率は、ＡＰ２０１８７で処理した後、１９．６±５．６％だった；５４．８±２０．９％というベースライン生存率に対する補正の後、これは、たった６３．１±６．２％という殺傷効率に等しかった。
【０３１９】
導入遺伝子発現の経時的な低下が、Ｔ細胞の休止後の転写の減少または形質導入された細胞の排除に起因するかを決定するために、細胞の一部を、形質導入後２２日目に、ＯＫＴ３および抗ＣＤ２８抗体で再活性化した。４８〜７２時間後（形質導入後２４または２５日目）、ＯＫＴ３／ａＣＤ２８によって再活性化された細胞は、再活性化されていない細胞よりも有意に高い導入遺伝子発現を有した。ＣＤ１９発現は、約８８％±４％から約９３％±４％に増加し（ｐ＜０．０１）、ＣＤ１９のＭＦＩは、４７８±１０７から６４３±１７４に増加した（ｐ＜０．０１）。さらに、自殺遺伝子の機能も、約６３．１％±６．２％の殺傷効率から約８４．６％±８．０％（ｐ＜０．０１）の殺傷効率に有意に上昇した。さらに、それらの細胞が、活性化マーカーＣＤ２５について免疫磁気的にソーティングされた場合、殺傷効率は完全に回復した：ＣＤ２５陽性細胞の殺傷効率は、約９３％．２±１．２であり、これは、形質導入後５日目の殺傷効率（９３．１±３．５％）と同じだった（図１３Ｃを参照のこと）。ＣＤ２５陰性画分の殺傷は、７８．６±９．１％だった。自殺遺伝子の機能に対する長時間の培養およびＴ細胞活性化の影響を示している代表的なＦＡＣＳプロットが、図１３Ｃに図示されている。
【０３２０】
注目すべき観察結果は、非特異的な分裂促進刺激ではなく同種異系ＰＢＭＣによって再活性化された遺伝子改変された細胞を枯渇させるために二量体化剤を使用したとき、多くのウイルス特異的Ｔ細胞は残されることだった。図１４Ａおよび１４Ｂに示されているような、同種異系細胞による再活性化の４日後、ＡＰ２０１８７による処理は、ＥＢＶおよびＣＭＶに由来するペプチドに特異的なＨＬＡ五量体と反応性のＴ細胞の比率によって計測されたとき、ウイルス反応性の部分集団を残す（およびそれにより、濃縮する）。導入遺伝子を下方調節するために、遺伝子改変され、同種異系枯渇された細胞を、形質導入後の３週間にわたって培養して維持した。細胞を同種異系ＰＢＭＣで４日間刺激し、その後、一部を１０ｎＭ  ＡＰ２０１８７で処理した。ＥＢＶ特異的Ｔ細胞（図１４Ａを参照のこと）およびＣＭＶ特異的Ｔ細胞（図１４Ｂを参照のこと）の頻度を、アロ刺激前、アロ刺激後、およびアロ刺激された細胞を二量体化剤で処理した後に、五量体解析によって定量化した。ウイルス特異的Ｔ細胞のパーセンテージは、アロ刺激後に低下した。二量体化剤で処理した後、ウイルス特異的Ｔ細胞は、部分的かつ優先的に保持された。
【０３２１】
考察
同種異系Ｔ細胞を２つの異なる安全機構である選択的同種異系枯渇および自殺遺伝子改変によって操作することの実行可能性が、本明細書中で実証された。組み合わせたとき、これらの改変は、ハプロタイプ一致移植の後でさえ、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を有する相当な数のＴ細胞のアドバック（ａｄｄｂａｃｋ）を促進し得るおよび／または可能にし得る。本明細書中に提示されるデータは、自殺遺伝子であるｉＣａｓｐ９が、効率的に機能すること（二量体化剤で処理した後の＞９０％アポトーシス）、および経時的に生じる導入遺伝子発現の下方調節が、アロ反応性Ｔ細胞がそれらの標的に遭遇したときに生じるようにＴ細胞が活性化されると迅速に逆転したことを示している。本明細書中に提示されるデータは、ＣＤ１９が、形質導入された細胞の効率的かつ選択的な＞９０％純度への濃縮を可能にした好適な選択可能マーカーであることも示している。さらに、本明細書中に提示されるデータは、これらの操作が、抗ウイルス活性の保持およびＴｒｅｇ活性を有するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋集団の再生とともに、操作されたＴ細胞の免疫学的適格性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）に対して識別可能な影響を及ぼさなかったことを示唆している。
【０３２２】
自殺遺伝子の全体的な機能が、自殺遺伝子自体と、形質導入された細胞を選択するために使用されるマーカーの両方に依存することを考えれば、臨床での使用に向けて変形していくには、両方の構成要素の最適化、および２つの遺伝子の発現を同時に生じさせる（ｃｏｕｐｌｅ）ために使用される方法の最適化が必要である。臨床行為において現在、最も広く使用されている２つの選択可能マーカーの各々は、欠点を有する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコードし、選択培地中での７日間の培養を必要とし、それは、そのシステムの複雑さを高めるだけでなく、ウイルス特異的Ｔ細胞を潜在的に損傷している。広く使用されている表面選択マーカーＬＮＧＦＲは、その明らかな臨床上の安全性にもかかわらず、最近、マウスモデルにおいて、その発癌能（ｏｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）および白血病との潜在的な相関関係に関する懸念が生じている。さらに、ＬＮＧＦＲ選択は、ほぼもっぱら遺伝子治療において使用されるので、広く利用可能でない。いくつかの代替の選択可能マーカーが、提案されている。ＣＤ３４は、インビトロにおいて十分に研究されてきたが、稀な造血前駆細胞を選択するように主に設定されたシステムを最適化するために必要な工程、およびより重大なことには、インビボＴ細胞ホーミングの変化の可能性は、ＣＤ３４を、自殺スイッチ発現構築物に対する選択可能マーカーとしての使用にとって最適以下にする。臨床グレードのＣＤ１９選択は、幹細胞自家移植片のＢ細胞枯渇のための方法として容易に利用可能であるので、ＣＤ１９を、代替の選択可能マーカーとして選択した。本明細書中に提示される結果は、ＣＤ１９の濃縮を高純度および高収率で行うことができたこと、およびさらに、選択プロセスが、その後の細胞の成長および機能に対して識別可能な影響を及ぼさなかったことを実証した。
【０３２３】
ＣＤ１９によって選択されたｉＣａｓｐ９細胞における自殺遺伝子活性化の有効性は、ＨＳＶｔｋ遺伝子を発現するように形質導入された、ｎｅｏ−またはＬＮＧＦＲによって選択された細胞の自殺遺伝子活性化の有効性と非常に好ましく匹敵していた。より初期の世代のＨＳＶｔｋ構築物は、インビトロにおいて長時間培養されると、３Ｈ−チミジン取り込みの８０〜９０％抑制をもたらし、殺傷効率の同様の低下を示したが、それにもかかわらず、それは、臨床的に効果的だった。急性ＧＶＨＤと慢性ＧＶＨＤの両方の完全な回復は、循環している遺伝子改変された細胞の、インビボにおける８０％もの減少として報告された。これらのデータは、ＧＶＨＤに関与する活性化Ｔ細胞が、自殺遺伝子の発現をアップレギュレートし、ゆえに、インビボにおいて選択的に排除されるので、インビトロにおいて見られる導入遺伝子の下方調節は問題になりそうにないという仮説を支持する。この効果が、インビボにおけるウイルス特異的Ｔ細胞および白血病特異的Ｔ細胞の保持を可能にするのに十分であるかが、臨床の状況において試験されるだろう。自殺遺伝子改変の前にインビトロにおける選択的同種異系枯渇を組み合わせることによって、自殺遺伝子の機構を活性化する必要性が有意に低下し得、それにより、Ｔ細胞に基づくアドバック療法の利点が最大になり得る。
【０３２４】
インビトロにおいて見られる、ｉＣａｓｐ９によって媒介される高効率の自殺は、インビボにおいて再現された。ＳＣＩＤマウス−ヒト異種移植片モデルにおいて、ｉＣａｓｐ９によって改変されたＴ細胞の９９％超が、二量体化剤を単回投与した後に排除された。ＡＰ２０１８７と極めて近い機能的および化学的な同等性を有し、現在、臨床適用における使用について提案されているＡＰ１９０３は、健常ヒト志願者において安全性試験が行われ、安全であると示された。約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１２７５ｎｇ／ｍｌというＡＰ１９０３の最大血漿レベル（約７ｎＭ〜約８９２ｎＭと等価）が、２時間の静脈内注入として投与された０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって達成された。実質的に有意な有害作用は無かった。迅速な血漿再分布を可能にした後、インビトロにおいて使用される二量体化剤の濃度は、インビボにおいて容易に達成可能なままである。
【０３２５】
表現型、レパートリーおよび機能のすべてが、ポリクローナルＴ細胞活性化のために使用される刺激、形質導入された細胞を選択するための方法および培養時間によって影響され得るので、自殺遺伝子によって改変されたＴ細胞の免疫学的適格性を維持するための最適な培養条件を決定しなければならず、それは、安全スイッチ、選択可能マーカーおよび細胞型の各組み合わせに対して定義されなければならない。ＣＤ４：ＣＤ８の比、ならびにリンパ節ホーミング分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７を含むメモリーサブセットマーカーの発現に関して、操作されていないＰＢＭＣに酷似している遺伝子改変された細胞を作製するためにＣＤ２８共刺激を付加することおよび細胞サイズの常磁性ビーズを使用することにより、遺伝子改変されたＴ細胞のインビボにおける機能が改善され得る。ＣＤ２８共刺激は、レトロウイルスの形質導入および増殖の効率も高め得る。しかしながら、興味深いことに、ＣＤ２８共刺激の付加は、同種異系枯渇された細胞の形質導入に対して影響を及ぼさないと見出され、示された細胞増殖の程度は、他の研究における抗ＣＤ３のみの群と比べたとき、より高かった。さらに、ｉＣａｓｐ９によって改変され、同種異系枯渇された細胞は、有意な抗ウイルス機能を保持し、およそ４分の１が、ＣＤ６２Ｌ発現を保持した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の再生も見られた。Ｔ細胞の活性化および形質導入のための出発物質として使用された、同種異系枯渇された細胞は、共刺激としての抗ＣＤ２８抗体の添加に対してそれほど感受性でなかった可能性がある。ＣＤ２５によって枯渇されたＰＢＭＣ／ＥＢＶ−ＬＣＬ共培養物は、操作されていないＰＢＭＣよりも有意に高いレベルでＣＤ８６をすでに発現しているＴ細胞およびＢ細胞を含み、それら自体が、共刺激を提供し得る。抗ＣＤ３によるポリクローナルＴ細胞活性化の前のＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の枯渇は、最終的なＴ細胞産物の免疫学的適格性を高めると報告されている。機能的適格性に対するインビトロにおける培養および増殖の影響を最小にするために、本明細書中に提示されるいくつかの実験において、比較的短い培養期間を使用し、形質導入の合計８日後に細胞を増殖し、ＣＤ１９選択は、４日目において行った。
【０３２６】
最後に、十分な細胞産物が作製されることにより、最大１０７細胞／ｋｇの用量で成人患者が処置され得るように、スケールアップした作製が実証された：同種異系枯渇された細胞は、活性化され、フラスコ１つあたり４×１０７細胞で形質導入され得、ＣＤ１９によって選択された最終的な細胞産物の最低８倍のリターン（ｒｅｔｕｒｎ）を形質導入後８日目に得ることができ、元のフラスコ１つあたり少なくとも３×１０８個の同種異系枯渇され、遺伝子改変された細胞が作製され得る。増加した培養体積は、さらなるフラスコまたはバッグに容易に収容される。
【０３２７】
本明細書中に提示される同種異系枯渇およびｉＣａｓｐ９改変は、特にハプロタイプ一致幹細胞同種移植の後、Ｔ細胞を戻すことの安全性を有意に改善し得る。そして、これは、より大きな用量漸増を可能にするはずであり、抗白血病効果をもたらす確率がより高くなるはずである。
【０３２８】
実施例３：ハプロタイプ一致幹細胞移植後に、誘導可能なカスパーゼ−９自殺遺伝子を形質導入された同種異系枯渇されたＴ細胞のＣＡＳＰＡＬＬＯ−第Ｉ相臨床試験
この実施例は、図２２に図示されている代替の自殺遺伝子ストラテジーを使用した第１相臨床試験の結果を提示する。簡潔には、ドナー末梢血単核球を、ＥＢＶで形質転換された、照射されたレシピエントリンパ芽球様細胞と７２時間にわたって共培養し（４０：１）、ＣＤ２５免疫毒素を用いて同種異系枯渇し、次いで、ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子および選択マーカー（ΔＣＤ１９）を有するレトロウイルスの上清で形質導入した；ΔＣＤ１９は、図２３に図示されるように、免疫磁気選択によって＞９０％の純度への濃縮を可能にした。
【０３２９】
細胞治療用産物を作製するためのプロトコルの例が、本明細書中に提供される。
【０３３０】
原材料
最大２４０ｍｌ（２回の収集における）の末梢血を、確立されたプロトコルに従って、移植ドナーから得た。場合によっては、ドナーおよびレシピエントのサイズに依って、白血球フェレーシスを行って、十分なＴ細胞を単離した。１０ｃｃ〜３０ｃｃの血液をレシピエントからも取り出し、スティミュレーター細胞として使用される、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたリンパ芽球様細胞株を作製するために使用した。場合によっては、低Ｂ細胞数の病歴および／または適応症に応じて、適切な第一度近親者（例えば、両親、同胞または子）の末梢血単核球を使用して、ＬＣＬを作製した。
【０３３１】
同種異系枯渇された細胞の作製
同種異系枯渇された細胞を、本明細書中に提示されるように移植ドナーから作製した。健常ドナー由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換された、照射されたレシピエントリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と、４０：１というレスポンダー対スティミュレーターの比で無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で共培養した。７２時間後、ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ免疫毒素中で一晩インキュベーションすることによって、共培養物からＣＤ２５を発現する活性化Ｔ細胞を除去した。残留ＣＤ３＋ＣＤ２５＋集団が＜１％であり、３Ｈ−チミジンの取り込みによる残留増殖が＜１０％である場合、同種異系枯渇は、十分であるとみなされる。
【０３３２】
レトロウイルス産生
レトロウイルス産生株クローンを、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９の構築のために作製した。その産生株のマスターセルバンクもまた作製した。複製能力のあるレトロウイルスの作製およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなどによる感染を排除するために、マスターセルバンクの試験を行った。産生株をコンフルエントまで生育し、上清を収集し、濾過し、等分し、急速凍結し、−８０℃で保存した。プロトコルに則って、複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）を排除するためにレトロウイルス上清の全バッチにおいてさらなる試験を行い、解析の証明書を発行した。
【０３３３】
同種異系枯渇された細胞の形質導入
同種異系枯渇されたＴリンパ球を、フィブロネクチンを使用して形質導入した。プレートまたはバッグを組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ，Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）でコーティングした。コーティングされたプレートまたはバッグにおいて産生株の上清をインキュベートすることによって、ウイルスをレトロネクチンに付着させた。次いで、細胞を、ウイルスがコーティングされたプレートまたはバッグに移した。形質導入後、プロトコルに則って、同種異系枯渇されたＴ細胞に、ＩＬ−２を１週間に２回供給して十分な細胞数に達するまでそれらを増殖した。
【０３３４】
ＣＤ１９免疫磁気選択
ＣＤ１９に対する免疫磁気選択を形質導入の４日後に行った。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて選択した（図２４を参照のこと）。臨床での注入にとって必要な細胞数に応じて、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存したか、またはＩＬ−２を用いてさらに増殖し、形質導入後６日目もしくは８日目に凍結保存した。
【０３３５】
凍結
ＦＤＡによる最終出荷試験のために要求される、形質導入の効率、同一性、表現型および微生物学的培養の試験のために、細胞のアリコートを取り出した。プロトコルに従って、それらの細胞を投与前に凍結保存した。
【０３３６】
試験薬
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ
ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、ヘテロ二機能性架橋剤［Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−アルファ−メチル−ｄ−（２−ピリジルチオ）トルエン］（ＳＭＰＴ）を介して、化学的に脱グリコシル化されたリシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合体化されたマウスＩｇＧ１抗ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターアルファ鎖）である。ＲＦＴ５−ＳＭＰＴ−ｄｇＡは、０．５ｍｇ／ｍｌの滅菌溶液として製剤化されている。
【０３３７】
合成ホモ二量体化剤ＡＰ１９０３
作用機序：ＡＰ１９０３によって誘導可能な細胞死は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する薬物結合ドメインに融合された、アポトーシス細胞死のシグナルを伝達するヒト（カスパーゼ−９タンパク質）レセプターの細胞内部分を含むキメラタンパク質を発現することによって達成される。このキメラタンパク質は、ＦＫＢＰドメインを架橋してカスパーゼシグナル伝達およびアポトーシスを惹起するＡＰ１９０３が投与されるまで、細胞内で静止状態のままである。
【０３３８】
毒性学：ＡＰ１９０３は、ＦＤＡによって研究新薬（ＩＮＤ）として評価され、第Ｉ相臨床安全性研究を首尾良く終了した。ＡＰ１９０３が０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与されたとき、有意な有害作用は、記述されなかった。
【０３３９】
薬理学／薬物動態：０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲にわたって１０ｎｇ／ｍＬ〜Ｉ２７５ｎｇ／ｍＬの血漿濃度を示し、投与の０．５および２時間後に血漿レベルが最大値の１８％および７％に低下する公開されたＰｋデータに基づいて、患者に０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として投与した。
【０３４０】
ヒトにおける副作用プロファイル：重篤な有害事象は、志願者における第１相研究において生じなかった。各処置後の有害事象の発生率は、非常に低く、すべての有害事象が、軽度の重症度だった。１つの有害事象だけが、ＡＰ１９０３におそらく関係すると考えられた。これは、１．０ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３投与量において、１人の志願者に対して「顔面潮紅」として示された血管拡張のエピソードだった。この事象は、注入開始の３分後に発生し、３２分間持続した後に回復した。この研究中に報告された他のすべての有害事象は、試験薬と無関係であるかまたは試験薬とのありそうもない関係を有すると研究者によって見なされた。これらの事象には、胸痛、インフルエンザ症候群、口臭、頭痛、注射部痛、血管拡張、咳の増加、鼻炎、発疹、歯肉出血および斑状出血が含まれた。
【０３４１】
グレード１のＧＶＨＤを発症している患者を、２時間の注入としての０．４ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３で処置した。グレード１のＧＶＨＤの患者にＡＰ１９０３を投与するためのプロトコルは、以下のとおり確立された。同種異系枯渇されたＴ細胞の注入後にＧｖＨＤを発症している患者に生検を実施することにより、診断を確認し、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を２時間の注入として投与する。グレードＩのＧＶＨＤを有する患者には、最初、他の治療を施さなかったが、しかしながら、その患者がＧｖＨＤの進行を示した場合、従来のＧｖＨＤ治療を施設のガイドラインに則って施した。グレード２〜４のＧＶＨＤを発症している患者には、ＡＰ１９０３二量体化薬に加えて、施設のガイドラインに従って標準的な全身免疫抑制療法を施した。
【０３４２】
調製および注入に対する指示書：注射用ＡＰ１９０３は、３ｍｌのバイアルにおける２．３３ｍｌの、５ｍｇ／ｍｉの濃度の濃縮液として得られる（すなわち、バイアル１本あたり１０．６６ｍｇ）。投与の前に、計算された用量を、注入用の０．９％生理食塩水において１００ｍＬになるように希釈した。１００ｍｌの体積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットおよび注入ポンプを使用して、ＩＶ注入によって２時間にわたって投与した。
【０３４３】
図２５に示されているｉＣａｓｐ９自殺遺伝子発現構築物（例えば、ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ＡＣＤ１９）は、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９（ＡＣＤ１９）に連結された誘導可能なカスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）からなる。ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（ＣＡＳＰ９；ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１２２９）に接続された、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＨ００２８１８）を含む。Ｆ３６Ｖ変異は、合成ホモ二量体化剤ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３に対するＦＫＢＰ１２の結合親和性を高め得る。カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は、ヒトカスパーゼ−９配列から削除されており、その生理学的機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられている。そのＦＫＢＰ１２によるＣＡＲＤの置き換えは、導入遺伝子の発現および機能を高める。その２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の１８アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での＞９９％の切断を媒介して、ｉＣａｓｐ９のＣ末端に１７個の追加のアミノ酸およびＣＤ１９のＮ末端に１つの追加のプロリン残基をもたらす。ΔＣＤ１９は、細胞質内ドメインを２４２アミノ酸から１９アミノ酸に短縮し、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべてのチロシン残基を除去する、アミノ酸３３３（ＴＤＰＴＲＲＦ）で切断された、完全長ＣＤ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００１７７０）からなる。ｉＣａｓｐ９自殺スイッチを有する遺伝子改変されたＴ細胞の排除におけるｉＣａｓｐ９およびＡＰ１９０３の結果は、図２６に図示されている。
【０３４４】
インビボ研究
３人の患者に、ハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植（ＳＣＴ）後に、ｉＣａｓｐ９＋Ｔ細胞を約１×１０６〜約３×１０６細胞／ｋｇの用量レベルで投与した。
【０３４５】
【表２】
0006537984.tif 000006
【０３４６】
注入されたＴ細胞は、注入後７日目という早さで、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋）またはｑＰＣＲによってインビボにおいて検出され、図２７、２８および２９に図示されているように、１７０±５という最大増殖率だった（注入後２９±９日目）。２人の患者は、グレードＩ／ＩＩのａＧＶＨＤを発症し（図３１〜３２を参照のこと）、ＡＰ１９０３投与は、注入の３０分以内にＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の＞９０％を消失させ（図３０、３３および３４を参照のこと）、２４時間以内にさらに対数減少し、２４時間以内に皮膚および肝臓のａＧｖＨＤが回復したことから（図３５を参照のこと）、ｉＣａｓｐ９導入遺伝子が、インビボにおいて機能的だったことが示された。
【０３４７】
【表３】
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【０３４８】
エキソビボ実験によって、このデータを確認した。さらに、同種異系枯渇された残留Ｔ細胞は、図３６〜４２に示されているように、増殖することができ、ウイルス（ＣＭＶ）および真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して反応性だった（ＩＦＮ−γ産生）。これらのインビボ研究は、単回投与の二量体化薬が、ＧｖＨＤを引き起こすＴ細胞の部分集団を減少させ得るかまたは排除し得るが、後で再増殖し得るウイルス特異的ＣＴＬを残し得ることを見出した。
【０３４９】
免疫再構成
患者の細胞および試薬の入手可能性に応じて、免疫再構成研究（免疫表現型分析、Ｔ細胞およびＢ細胞機能）が、移植後に連続した間隔で得られ得る。ｉカスパーゼが形質導入された同種異系枯渇されたＴ細胞に起因する免疫再構成を計測するいくつかのパラメータが、解析され得る。その解析は、総リンパ球数、Ｔ細胞数およびＣＤ１９  Ｂ細胞数の繰り返しの計測、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ解析を含む。患者のＴ細胞の入手可能性に応じて、制御性Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ４１ＣＤ２５１ＦｏｘＰ３）もまた解析する。およそ１０〜６０ｍｌの患者血液を、可能であれば、注入の４時間後、１ヶ月間にわたって毎週、毎月×９ヶ月、次いで１および２年後に、採取する。採取される血液の量は、レシピエントのサイズに依存し、任意の１回の採血において合計１〜２ｃｃ／ｋｇを超えない（臨床ケアおよび研究評価のために採取された血液を許容する）。
【０３５０】
形質導入され、同種異系枯渇されたＴ細胞の存続および安全性
形質導入されたＴ細胞の機能、存続および安全性をモニターするために、研究の日程表に示される時点において、末梢血サンプルに対して以下の解析も行った。
・トランスジェニック細胞の存在を検出する表現型
・ＰＣＲによるＲＣＲ試験
・レトロウイルス組み込み体を検出するための定量的リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲによるＲＣＲ試験は、研究の前、３、６および１２ヶ月後、ならびに次いで、合計１５年間にわたって毎年、行われる。ＦＤＡが要求したときのＲＣＲについての将来の研究において使用するために、組織、細胞および血清サンプルを保管する。
【０３５１】
統計解析および中止規則
ＭＴＤは、適格な症例の多くとも２５％においてグレードＩＩＩ／ＩＶの急性ＧｖＨＤを引き起こす用量であると定義される。その判定は、サイズ２のコホートを用いるロジスティックモデルを使用した、修正された連続再評価法（ＣＲＭ）に基づく。３つの用量群、すなわち、１×１０６、３×１０６、１×１０７が、評価されており、それらは、それぞれ１０％、１５％および３０％において毒性の事前確率が推定される。提案されるＣＲＭデザインは、各コホートに２人以上の被験体を獲得し、用量漸増を１用量レベル以下に制限し、形質導入されていない細胞に対して安全であると示された最低用量レベルにおいて患者登録を開始することによる、元のＣＲＭに対する修正を使用する。最低用量コホートにおける毒性の結果を使用して、用量−毒性曲線を更新する。次の患者コホートを、２５％という目標確率に最も近い毒性の関連する確率を有する用量レベルに割り当てる。少なくとも１０人の患者がこの用量漸増研究に獲得されるまで、このプロセスを続ける。患者の入手可能性に応じて、多くとも１８人の患者が、第Ｉ相試験に登録され得るか、または６人までの患者が、現在のＭＴＤにおいて処置されている。最終的なＭＴＤは、これらの終了時点において目標毒性率に最も近い確率を有する用量であり得る。
【０３５２】
提案されるデザインの実施の特色を判定するためにシミュレーションを行い、これを標準的な３＋３用量漸増デザインと比較した。提案されるデザインは、ＭＴＤとして適切な用量レベルを明らかにするより高い確率に基づいてＭＴＤのより良い推定値をもたらし、より低い用量レベルおよびおそらく無効の用量レベルにおいて獲得されるより少ない数の患者を提供し、この試験に必要とされる患者のより少ない平均総数を維持した。本明細書中に提案される用量の範囲にわたって、浅い（ｓｈａｌｌｏｗ）用量−毒性曲線が予想され、ゆえに、加速用量漸増が、患者の安全性を含めずに行われ得る。行われたシミュレーションは、修正されたＣＲＭデザインが、標準的なデザインと比べて総毒性のより大きな平均数を招かないことを示唆する（総毒性はそれぞれ１．９および２．１に等しい）。
【０３５３】
同種異系枯渇されたＴ細胞を最初に注入した後の４５日以内に生じるグレードＩＩＩ／ＩＶのＧＶＨＤは、その後のコホートに対する推奨用量を決定するＣＲＭの計算に入れられ得る。事前に特定した用量レベルのうちの１つを使用して、用量−毒性曲線の推定を実行するためおよび次の患者コホートに対する用量レベルを決定するために、患者の毒性結果のリアルタイムモニタリングをこの研究中に行う。
処置を制限する毒性は、以下を含み得る
ａ）注入に関連するグレード４の反応
ｂ）ＴＣ−Ｔの注入後３０日以内に生じるグラフト不全（少なくとも１４日間持続する成長因子治療に非応答性の、異なる日における連続した３回の測定に対する、その後の＜５００１ｍｍ３へのＡＮＣの減少として定義される）
ｃ）注入後３０日以内に生じるグレード４の非造血系および非伝染性の有害事象
ｄ）ＴＣ−Ｔの注入後４５日までのグレード３〜４の急性ＧＶＨＤ
ｅ）注入後３０日以内に生じる、処置に関連した死亡。
【０３５４】
安全性および毒性の他の尺度とともに記述統計学を用いて、ＧＶＨＤ率を要約する。同様に、グレード１より悪いＧＶＨＤに起因してＡＰ１９０３を投与された患者における臨床上の反応および生物学的反応を要約するために記述統計が計算され得る。
【０３５５】
ｉカスパーゼが形質導入された同種異系枯渇されたＴ細胞に起因する免疫再構成を計測するいくつかのパラメータが、解析され得る。これらは、総リンパ球数、Ｔ細胞数およびＣＤ１９  Ｂ細胞数の繰り返しの計測、ならびにＴ細胞サブセット（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ５６、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタＴ細胞レセプター）のＦＡＣＳ解析を含む。解析にとって十分なＴ細胞が残っている場合、ＣＤ４／ＣＤ２５／ＦｏｘＰ３などの制御性Ｔ細胞マーカーもまた解析され得る。各被験体は、上に提示されたように、注入前に、および注入後の複数の時点において計測され得る。
【０３５６】
全患者群における、および用量群ならびに計測時間に基づくこれらのパラメータの記述的要旨が、提示され得る。ある患者における経時的な測定値を表す成長曲線が、全体的な免疫再構成パターンを可視化するために作成され得る。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の比率もまた、各時点において要約され得る。注入前と比べた、経時的なこれらのエンドポイントにおける変化の対比較を、対応のあるｔ検定またはウィルコクソンの符号順位検定を使用して、実行し得る。
【０３５７】
ランダムな係数モデルを使用した、繰り返し計測された各免疫再構成パラメータの縦断解析が、行われ得る。縦断解析は、ある患者の中で切片および傾きを変動させつつ、患者ごとの免疫再構成のモデルパターンの構築を可能にする。患者に投与される種々の用量レベルを説明するそのモデルにおける独立変数としての用量レベルもまた、使用され得る。経時的な免疫機能の有意な改善が存在するか否かの試験、ならびに傾きの推定値およびその標準誤差に基づくこれらの改善の大きさの推定が、本明細書中に提示されるモデルを使用して可能であり得る。種々の用量レベルのＣＴＬにわたる免疫再構成率の差異の任意の指摘の評価もまた、行われ得る。恒等リンクによる正規分布が、これらのモデルにおいて利用され、ＳＡＳ  ＭＩＸＥＤ手順を使用して実行され得る。免疫再構成パラメータの正規性仮定が評価され得、必要であれば正規性を得るために、変換（例えば、ｌｏｇ、平方根）が行われ得る。
【０３５８】
上に提示されたストラテジーに類似のストラテジーが、Ｔ細胞の生存、増殖および存続の動態を評価するために使用され得る。Ｔ細胞の絶対数とマーカー遺伝子陽性細胞数との比が、長い時間にわたって長期的に測定され、モデル化され得る。傾きの正の推定値は、免疫回復に対するＴ細胞の寄与の高まりを示唆し得る。ｉＣａｓｐ９  Ｔ細胞のウイルス特異的免疫は、縦断的モデルを使用して、エキソビボ刺激ウイルス特異的ＣＴＬに基づいて、ＩＦＮガンマを放出しているＴ細胞数の解析によって評価され得る。免疫のＥＢＶ、ＣＭＶおよびアデノウイルスの評価の解析のために、別個のモデルが作製され得る。
【０３５９】
最後に、患者コホート全体における全生存率および無病生存率は、カプラン・マイヤー積・極限法を使用して要約され得る。生存している患者と移植の１００日後および１年後に無病である患者との比率は、カプラン・マイヤー曲線から推定され得る。
【０３６０】
結論として、ハプロＣＤ３４＋ＳＣＴの後の同種異系枯渇されたｉＣａｓｐ９＋Ｔ細胞のアドバックは、ａＧｖＨＤの回復とともに、インビボにおける機能的なドナーリンパ球の有意な増殖およびアロ反応性Ｔ細胞の迅速なクリアランスを可能にする。
【０３６１】
実施例４：インビボＴ細胞同種異系枯渇
実施例１〜３に提供されたプロトコルは、インビボでＴ細胞同種異系枯渇をもたらすようにも改変され得る。上記アプローチを、急性ＧｖＨＤなく免疫再構成から恩恵を受け得るより大きな群の被験体に拡張するために、Ｔ細胞枯渇のインビボ方法を提供することによって、上記プロトコルを単純化し得る。本明細書中で論じられるように、処置前の同種異系枯渇方法では、ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球様細胞株をまずレシピエントから調製する（それは、次に同種異系抗原提示細胞として作用する）。この手順は、最大８週間を要することがあり、特に、悪性腫瘍を有する広範囲に前処置された被験体が、最初の治療の構成要素としてリツキシマブを投与されていた場合、それらの被験体では失敗し得る。続いて、ドナーＴ細胞をレシピエントＥＢＶ−ＬＣＬと共培養し、次いで、アロ反応性Ｔ細胞（活性化抗原ＣＤ２５を発現する）をＣＤ２５−リシン結合体化モノクローナル抗体で処理する。この手順は、各被験体に対して、研究室での作業のさらに多くの日数を要することがある。
【０３６２】
二量体化薬によるアロ反応性Ｔ細胞の迅速なインビボ枯渇が観察されたこと、および刺激されていないがウイルス／真菌反応性のＴ細胞が残されることに基づいて、上記プロセスは、同種異系枯渇のインビボ方法を使用することによって単純化され得る。
【０３６３】
グレードＩまたはそれ以上の急性ＧｖＨＤが発生する場合、単回の二量体化薬を、例えば、２時間の静脈内注入としての０．４ｍｇ／ｋｇの用量のＡＰ１９０３で投与する。急性ＧｖＨＤが持続する場合、４８時間間隔でさらに最大３用量の二量体化薬が投与され得る。グレードＩＩまたはそれ以上の急性ＧｖＨＤを有する被験体では、これらの追加の用量の二量体化薬を、ステロイドと併用し得る。二量体化剤に対するグレードＩＩＩまたはＩＶの反応に起因して追加の用量の二量体化剤を投与されることができない持続的なＧＶＨＤを有する患者の場合、その患者は、０または１用量の二量体化剤の後にステロイドのみで処置され得る。
【０３６４】
治療用Ｔ細胞の作製
最大２４０ｍｌ（２回の収集における）の末梢血を、獲得の同意に従って、移植ドナーから得る。必要であれば、白血球搬出法を用いて十分なＴ細胞を得る；（幹細胞動員の前またはＧ−ＣＳＦの最後の投与の７日後）。肝炎およびＨＩＶなどの感染症を試験するために、追加の１０〜３０ｍｌの血液を捕集し得る。
【０３６５】
末梢血単核球を、０日目に抗ヒトＣＤ３抗体（例えば、Ｏｒｔｈｏｔｅｃｈ製またはＭｉｌｔｅｎｙｉ製）を使用して活性化し、２日目に組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）の存在下において増殖する。ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞を、組換えフィブロネクチンフラグメントＣＨ−２９６（ＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎＴＭ，Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）でコーティングされたフラスコまたはプレートにおいて、ｉカスパーゼ−９レトロウイルスベクターによって形質導入する。レトロネクチンがコーティングされたプレートまたはフラスコにおいて産生株の上清をインキュベートすることによって、ウイルスをレトロネクチンに付着させる。次いで、細胞を、ウイルスがコーティングされた組織培養デバイスに移した。形質導入後、プロトコルに則って、Ｔ細胞に、ｒｈＩＬ−２を１週間に２回供給して十分な細胞数に達するまでそれらを増殖する。
【０３６６】
注入されたＴ細胞の大部分が自殺遺伝子を有することを確実にするために、選択可能マーカー、切断型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）および市販の選択デバイスを使用して、形質導入された細胞を＞９０％純度にまで選択し得る。ＣＤ１９に対する免疫磁気選択を形質導入の４日後に行い得る。細胞を、モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に結合体化された常磁性マイクロビーズで標識し、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ  Ｐｌｕｓ自動選択デバイスにおいて選択する。臨床での注入にとって必要な細胞数に応じて、細胞を、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ選択後に凍結保存し得るか、またはＩＬ−２を用いてさらに増殖し、十分な細胞が増殖したらすぐに凍結保存し得る（作製開始から１４日目までに）。
【０３６７】
ＦＤＡによる最終出荷試験のために要求される、形質導入の効率、同一性、表現型、自律的増殖および微生物学的検査の試験のために、細胞のアリコートを取り出し得る。細胞を投与前に凍結保存する。
【０３６８】
Ｔ細胞の投与
形質導入されたＴ細胞を、例えば幹細胞移植の３０〜１２０日後に、患者に投与する。凍結保存されたＴ細胞を解凍し、生理食塩水とともにカテーテルラインを通じて注入する。小児の場合、前投薬を体重に基づいて行う。細胞の用量は、例えば、約１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０８細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０５細胞／ｋｇ〜１×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０６細胞／ｋｇ〜５×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０４細胞／ｋｇ〜５×１０６細胞／ｋｇの範囲、例えば、約１×１０４、約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約５×１０５、６×１０５、約７×１０５、約８×１０５、約９×１０５、約１×１０６、約２×１０６、約３×１０６、約４×１０６または約５×１０６細胞／ｋｇであり得る。
【０３６９】
ＧｖＨＤの処置
グレード≧１の急性ＧｖＨＤを発症している患者を、２時間の注入として０．４ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３で処置する。注射用ＡＰ１９０３は、例えば、３ｍｌのバイアルにおける２．３３ｍｌの、５ｍｇ／ｍｌの濃度の濃縮液として提供され得る（すなわち、バイアル１本あたり１０．６６ｍｇ）。投与の前に、計算された用量を、注入用の０．９％生理食塩水において１００ｍＬになるように希釈し得る。１００ｍｌの体積中の注射用ＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を、非ＤＥＨＰで非エチレンオキシドの滅菌された注入セットおよび注入ポンプを使用して、ＩＶ注入によって２時間にわたって投与し得る。
【０３７０】
【表４】
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【０３７１】
例えば、本明細書中の実施例１〜３に提供されているような臨床上の治療および評価のために他の方法を続けてもよい。
【０３７２】
実施例５：間葉系ストローマ細胞治療の安全性を改善するためのｉＣａｓｐ９自殺遺伝子の使用
間葉系ストローマ細胞（ＭＳＣ）は、これまで、報告された有害な副作用が最小で、数百人の患者に注入された。ＭＳＣは、疾患の処置において使用されて以来、長期間の副作用は、限られた追跡および比較的短い時間に起因して、不明である。いくつかの動物モデルは、副作用の可能性が存在すること、ゆえに、治療的に使用されるＭＳＣの成長および生存のコントロールを可能にするシステムが望ましいことを示唆していた。本明細書中に提示される誘導可能なカスパーゼ−９自殺スイッチ発現ベクター構築物を、インビボおよびインビトロにおいてＭＳＣを排除する方法として調べた。
【０３７３】
材料および方法
ＭＳＣの単離
ＭＳＣを健常ドナーから単離した。簡潔には、注入後の廃棄される健常ドナー骨髄収集バッグおよびフィルターを、ＲＰＭＩ１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭアラニル−グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が入った組織培養フラスコにプレーティングした。４８時間後、上清を廃棄し、細胞を完全培養液（ＣＣＭ）：１６．５％ＦＢＳ、２ｍＭアラニル−グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。細胞を８０％未満（ｌｅｓｓ  ｔｈｅｎ）のコンフルエンスまで生育し、必要に応じて、より低い密度で再度プレーティングした。
【０３７４】
免疫表現型分析
フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合体化されたＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１３３モノクローナル抗体を使用して、ＭＳＣを染色した。示されている場合を除いて、すべての抗体が、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製だった。適切なアイソタイプマッチ抗体で標識されたコントロールサンプルを各実験に含めた。細胞を、４つの蛍光シグナルに対するフィルターセットを備えた蛍光励起細胞分取ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析した。
【０３７５】
インビトロにおける分化研究
脂肪細胞の分化。ＭＳＣ（７．５×１０４細胞）を、ＮＨ  ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）が入った６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。培地を２１日間にわたって２日おきに交換した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドで固定した後、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ溶液（イソプロパノール中の０．５％ｗ／ｖ  Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを水で３：２の比で希釈することによって得る）で染色した。
【０３７６】
骨の分化。ＭＳＣ（４．５×１０４細胞）を、ＮＨ  ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が入った６ウェルプレートにプレーティングした。培地を１０日間にわたって２日おきに交換した。細胞を、冷メタノールで固定した後、製造者の指示書に則ってＳｉｇｍａ  Ｆａｓｔ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、アルカリホスファターゼ活性について染色した。
【０３７７】
軟骨芽細胞の分化。２．５×１０５〜５×１０５細胞を含むＭＳＣペレットを、１５ｍＬまたは１．５ｍＬのポリプロピレンコニカルチューブにおける遠心分離によって得て、ＮＨ  ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培養した。培地を、合計２４日間にわたって２日おきに交換した。細胞ペレットを、ＰＢＳ中の４％ホルマリンで固定し、通例のパラフィン切断に向けて処理した。ペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）による抗原回復の後、切片を、アルシアンブルーで、またはＩＩ型コラーゲンに対する間接免疫蛍光法（マウス抗ＩＩ型コラーゲンモノクローナル抗体ＭＡＢ８８８７，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて染色した。
【０３７８】
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルスの産生およびＭＳＣの形質導入
ＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９（ｉＣａｓｐ−ΔＣＤ１９）レトロウイルスは、切断可能な２Ａ様配列を介して切断型ヒトＣＤ１９（ΔＣＤ１９）に連結されたｉＣａｓｐ９からなる。上で述べたように、ｉＣａｓｐ９は、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーを介してヒトカスパーゼ−９（その動員ドメイン（ＣＡＲＤ）は、削除されており、その機能は、ＦＫＢＰ１２によって置き換えられている）に接続された、Ｆ３６Ｖ変異（この変異は、合成ホモ二量体化剤（ＡＰ２０１８７またはＡＰ１９０３）へのこのタンパク質の結合親和性を高める）を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）である。
【０３７９】
２Ａ様配列は、Ｔｈｏｓｅａ  Ａｓｉｇｎａ昆虫ウイルス由来の２０アミノ酸ペプチドをコードし、それは、グリシンと末端プロリン残基との間での９９％超の切断を媒介して、翻訳の際にｉＣａｓｐ９およびΔＣＤ１９の分断を確実にする。ΔＣＤ１９は、リン酸化に対する潜在的な部位である保存されたすべての細胞質内チロシン残基を除去する、アミノ酸３３３で切断されたヒトＣＤ１９からなる。テナガザル白血病ウイルス（Ｇａｌ−Ｖ）シュードタイプ化レトロウイルスを産生する安定したＰＧ１３クローンを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｅｃｏ細胞株（ＡＴＣＣ製品＃ＳＤ３４４４；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９で一過性にトランスフェクトすることによって作製し、それにより、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスがもたらされた。ＰＧ１３パッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）を、Ｅｃｏシュードタイプ化レトロウイルスで３回形質導入することにより、細胞１つあたり複数のＳＦＧ．ｉＣａｓｐ９．２Ａ．ΔＣＤ１９プロウイルス組み込み体を含む産生株を作製した。単一細胞クローン化を行い、最も高い力価をもたらすＰＧ１３クローンを増殖し、ベクター作製のために使用した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭアラニル−グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でその産生細胞株を培養することによって、レトロウイルス上清を得た。そのレトロウイルスを含む上清を、最初の培養の４８および７２時間後に捕集した。形質導入に向けて、およそ２×１０４ＭＳＣ／ｃｍ２を、６ウェルプレート、Ｔ７５またはＴ１７５フラスコ内のＣＭにプレーティングした。２４時間後、培地を、ポリブレンとともに１０倍希釈されたウイルス上清で置き換え（最終濃度５μｇ／ｍＬ）、細胞を３７℃、５％ＣＯ２において４８時間インキュベートし、その後、細胞を完全培地中で維持した。
【０３８０】
細胞濃縮
インビトロ実験のための誘導可能なｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９陽性ＭＳＣ選択に向けて、レトロウイルスによって形質導入されたＭＳＣを、製造者の指示書に従って、抗ＣＤ１９（クローン４Ｇ７）に結合体化された磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ１９陽性細胞について濃縮した。細胞サンプルを、ＰＥまたはＡＰＣに結合体化されたＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１）抗体で染色することにより、細胞画分の純度を評価した。
【０３８１】
インビトロにおけるアポトーシス研究
未分化なＭＳＣ。二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）（ＡＰ２０１８７；ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、完全培地中のｉＣａｓｐ９を形質導入されたＭＳＣ培養物に５０ｎＭで加えた。２４時間後に、細胞を収集し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中のアネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤで染色した後、ＦＡＣＳ解析によってアポトーシスを評価した。ｉＣａｓｐ９を形質導入されたコントロールＭＳＣを、ＣＩＤに曝露せずに、培養して維持した。
【０３８２】
分化したＭＳＣ。形質導入されたＭＳＣを、上に提示したように分化させた。分化期間の終わりに、ＣＩＤを分化培地に５０ｎＭで加えた。細胞を、上に提示したように、研究されている組織にとって適切であるように染色し、対比染料（メチレンアズール（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ａｚｕｒ）またはメチレンブルー）を使用して、核および細胞質の形態を評価した。並行して、組織を、製造者の指示書に従って（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、末端デオキシヌクレオチジル−トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのために処理した。各時点において、４つのランダムな視野を、４０×という最終的な倍率で写真撮影し、それらの像をＩｍａｇｅＪソフトウェアバージョン１．４３ｏ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）で解析した。単位表面積（ｍｍ２）あたりの核（ＤＡＰＩ陽性）の数として細胞密度を計算した。アポトーシス細胞のパーセンテージを、陽性ＴＵＮＥＬシグナル（ＦＩＴＣ陽性）を有する核の数と核の総数との比として測定した。コントロールを、ＣＩＤなしで、培養して維持した。
【０３８３】
マウスモデルにおけるインビボ殺傷研究
すべてのマウス実験を、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの畜産学ガイドラインに従って行った。インビボにおける改変されたＭＳＣの存続を評価するために、ＳＣＩＤマウスモデルを、インビボイメージングシステムとともに使用した。高感度緑色蛍光タンパク質−ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ）遺伝子のみまたはそれとともにｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子をコードするレトロウイルスでＭＳＣに形質導入した。細胞を、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用する蛍光励起細胞分取によってｅＧＦＰ陽性についてソーティングした。二重に形質導入された細胞もまた、ＰＥ結合体化抗ＣＤ１９で染色し、ＰＥ陽性についてソーティングした。ＳＣＩＤマウス（８〜１０週齢）の皮下に、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９ありおよびなしの５×１０５ＭＳＣを、反対側の側腹部に注射した。マウスに、５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を、１週間後に開始して、２４時間空けて投与した。ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃを発現しているＭＳＣのインビボイメージングに向けて、マウスの腹腔内にＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して解析した。各時点における総ルミネセンス（沈着した標識された総ＭＳＣに比例する測定値）を、ＭＳＣ移植部位における関心領域（ＲＯＩ）を自動的に定義することによって計算した。これらのＲＯＩには、バックグラウンドよりも少なくとも５％高いルミネセンスシグナルを有するすべての領域が含まれた。総光子数を各ＲＯＩに対して積分し、平均値を算出した。時間０が１００％シグナルに対応するように、結果を正規化した。
【０３８４】
第２の実験セットにおいて、２．５×１０６個のｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ標識ＭＳＣと２．５×１０６個のｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入されたｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ標識ＭＳＣとの混合物を右側腹部の皮下に注射し、そのマウスに５０μｇのＣＩＤの２回の腹腔内注射を、７日後に開始して２４時間空けて行った。ＣＩＤ注射後のいくつかの時点において、そのヒト検体全体を識別して捕集するため、およびマウス組織の混入を最小限にするために、ＭＳＣの皮下ペレットを、組織ルミネセンスを用いて収集した。次いで、ＱＩＡｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。１００ｎｇのＤＮＡのアリコートを定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において使用することにより、特異的プライマーおよびプローブ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ構築物用：順方向プライマー５’−ＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣ−３’、逆方向５’−ＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴ−３’、プローブ５’ＦＡＭ、６−カルボキシフルオレセイン−ＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＣ−３’ＭＧＢＮＦＱ、副溝結合非蛍光クエンチャー；ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９：順方向５’−ＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴ−３’、逆方向５’−ＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴ−３’、プローブ５’ＦＡＭ−ＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴ−３’ＭＧＢＮＦＱ）を使用して各導入遺伝子のコピー数を測定した。単一コピーの各導入遺伝子を含む既知数のプラスミドを使用して、検量線を確立した。ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃを単独で、またはｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃおよびｉＣａｓｐ９を二重に形質導入されたＭＳＣの「純粋な」集団から単離されたおよそ１００ｎｇのＤＮＡは、同様のｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子コピー数（およそ３．０×１０４）、ならびにそれぞれ０および１．７×１０３のｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子コピーを有したことが明らかになった。
【０３８５】
形質導入されていないヒト細胞およびマウス組織は、１００ｎｇのゲノムＤＮＡにおいて、０コピーのいずれかの遺伝子を有した。ｅＧＦＰ遺伝子のコピー数は、いずれかのＭＳＣ集団（ｉＣａｓｐ９陰性または陽性）から単離された同一の量のＤＮＡにおいて同じであるので、任意の細胞混合物から単離されるＤＮＡにおけるこの遺伝子のコピー数は、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ陽性細胞の総数（ｉＣａｓｐ９陽性＋陰性ＭＳＣ）に比例し得る。さらに、ｉＣａｓｐ９陰性組織は、ｉＣａｓｐ９コピー数に関与しないので、任意のＤＮＡサンプル中のｉＣａｓｐ９遺伝子のコピー数は、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の総数に比例し得る。ゆえに、任意のＤＮＡサンプルに対して、Ｇが、ＧＦＰ陽性かつｉＣａｓｐ９陰性の細胞の総数であり、Ｃが、ＧＦＰ陽性かつｉＣａｓｐ９陽性の細胞の総数である場合、ＮｅＧＦＰ＝ｇ・（Ｃ＋Ｇ）およびＮｉＣａｓｐ９＝ｋ・Ｃである（式中、Ｎは、遺伝子コピー数を表し、ｇおよびｋは、それぞれｅＧＦＰ遺伝子およびｉＣａｓｐ９遺伝子に対するコピー数および細胞数に関する定数である）。したがって、ＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰ＝（ｋ／ｇ）・［Ｃ／（Ｃ＋Ｇ）］であり、すなわち、ｉＣａｓｐ９コピー数とｅＧＦＰコピー数との比は、すべてのｅＧＦＰ陽性細胞のうちの二重に形質導入された（ｉＣａｓｐ９陽性）細胞の割合に比例する。ＮｉＣａｓｐ９およびＮｅＧＦＰの絶対値は、各ＭＳＣ外植片におけるマウス細胞による汚染が増加するにつれて小さくなるが、両方のタイプのヒト細胞が物理的に混合されているので、各時点に対して、その比は、含まれるマウス組織の量に関係なく一定であり得る。両方の集団において自発的なアポトーシスが同様の速度であると仮定すると（インビトロ培養によって記述されたように）、任意の時点と時間０とにおけるＮｉＣａｓｐ９／ＮｅＧＦＰの商は、ＣＩＤに曝露された後に生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞のパーセンテージに相当し得る。すべてのコピー数の測定は、３つ組で行われた。
【０３８６】
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定を使用して、サンプル間の差の統計的有意性を判定した。すべての数値データを平均値±１標準偏差として表す。
【０３８７】
結果
ＭＳＣは、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９で容易に形質導入され、それらの基本的な表現型を維持する
３人の健常ドナー由来のＭＳＣのフローサイトメトリー解析は、それらが、一様に、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について陽性であり、造血性マーカーＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３（図１５Ａ）およびＣＤ３４について陰性であることを示した。骨髄から単離された単核接着性画分は、均一的に、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について陽性であり、造血性マーカーについて陰性だった。単離されたＭＳＣの、脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨芽細胞への分化能が、特定のアッセイにおいて確かめられた（図１５Ｂを参照のこと）ことから、これらの細胞が、真のＭＳＣであることが実証された。図１５Ｂは、単離されたＭＳＣが、適切な培地中で培養されたとき、脂肪細胞（左、オイルレッドおよびメチレンブルー）、骨芽細胞（中央、アルカリホスファターゼ−ブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムおよびメチレンブルー）および軟骨芽細胞（右、抗ＩＩ型コラーゲン抗体−テキサスレッドおよびＤＡＰＩ）に分化することができたという分化研究の結果を図示している。
【０３８８】
初期継代ＭＳＣを、誘導可能な形態のカスパーゼ−９をコードするｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルスベクターで形質導入した。最適な単一形質導入条件下において、それらの細胞の４７±６％が、ＣＤ１９を発現し、その切断型は、ｉＣａｓｐ９とシスで転写され、形質導入の成功の代理として働き、形質導入された細胞の選択を可能にした。ＣＤ１９陽性の細胞のパーセンテージは、培養中の２週間超にわたって安定していたことから、図１６Ａに示されているように、その構築物のＭＳＣに対する悪影響または成長に有利な影響はないことが示唆される。図９Ａは、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９レトロウイルスによる１回の形質導入を受けたＭＳＣの結果を図示している。ｉＣａｓｐ９による形質導入の成功の代理であるＣＤ１９陽性細胞のパーセンテージは、２週間超にわたって一定のままである。その構築物の安定性にさらに対処するために、蛍光励起細胞分取器（ＦＡＣＳ）によって精製されたｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団を培養して維持した：６週間にわたって、ＣＤ１９陽性細胞のパーセンテージに有意差は認められなかった（ベースラインにおける９６．５±１．１％対４３日後の９７．４±０．８％、Ｐ＝０．４６）。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞の表現型は、その他の点では、形質導入されていない細胞の表現型と実質的に同一であり、図１６Ｂ）に図示されているように、実質的にすべての細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５について陽性であり、造血性マーカーについて陰性だったことから、ＭＳＣの遺伝子操作が、それらの基本的な特色を改変しないことが確かめられた。
【０３８９】
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入されたＭＳＣは、インビトロにおいてＣＩＤに曝露された後、選択的アポトーシスを起こす
アポトーシス促進性遺伝子産物ｉＣａｓｐ９は、ｉＣａｓｐ９産物に存在するＦＫ５０６結合ドメインに結合する、タクロリムスのアナログである小さい二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）ＡＰ２０１８７によって活性化され得る。形質導入されていないＭＳＣは、ベースラインにおけるｉＣａｓｐ９陽性細胞と同様の（１５±６％，Ｐ＝０．４７）、およそ１８％（±７％）という培養中のアポトーシスの自然発生率を有する。ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入した後のＭＳＣ培養物にＣＩＤ（５０ｎＭ）を加えることにより、２４時間以内にｉＣａｓｐ９陽性細胞の９０％超のアポトーシス死がもたらされる（９３±１％，Ｐ＜０．０００１）一方で、ｉＣａｓｐ９陰性細胞は、形質導入されていないコントロールと類似のアポトーシス指数を保持する（２０±７％，それぞれＣＩＤありまたはなしでの、形質導入されていないコントロールに対して、Ｐ＝０．９９およびＰ＝０．６９）（図１７Ａおよび７０Ｂを参照のこと）。ＭＳＣにｉＣａｓｐ９を形質導入した後、二量体化化学誘導物質（ＣＩＤ）を、完全培地中の培養物に５０ｎＭで加えた。２４時間後に細胞を収集し、アネキシンＶ−ＰＥおよび７−ＡＡＤで染色した後、ＦＡＣＳ解析によってアポトーシスを評価した。ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤ）の９３パーセントがアネキシン陽性になったのに対し、陰性集団（ｉＣａｓｐ陰性／ＣＩＤ）ではたった１９％しかアネキシン陽性にならず、これは、同じ化合物に曝露された形質導入されていないコントロールＭＳＣに匹敵する比率（コントロール／ＣＩＤ，１５％）およびＣＩＤに曝露されていないｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性細胞に匹敵する比率（ｉＣａｓｐ陽性／ＣＩＤなし，１３％）ならびに形質導入されていないＭＳＣのベースラインのアポトーシス率と類似する比率（コントロール／ＣＩＤなし，１６％）だった。ｉＣａｐ９−ＣＤ１９陽性細胞の磁気免疫選択は、高い純度に達し得る。選択された細胞の９５％超が、ＣＩＤへの曝露後にアポトーシスになる。
【０３９０】
ＣＩＤへの単回の曝露後の、後の時点における高度に精製されたｉＣａｓｐ９陽性集団の解析は、少ない割合のｉＣａｓｐ９陰性細胞しか増殖しないこと、およびｉＣａｓｐ９陽性細胞の集団が残るが、後者はＣＩＤへの再曝露によって殺傷され得ることを示す。したがって、ＣＩＤによるさらなる殺傷に対して抵抗性のｉＣａｓｐ９陽性集団は、検出されなかった（図１８を参照のこと）。ＣＩＤ導入の２４時間後には、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団が出現する。１００％の純度を有する集団を達成することは非現実的であり、ＭＳＣは、インビトロにおいて急速な増殖を支持する条件において培養されているので、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陰性ＭＳＣの集団が、予想される。殺傷が１００％効率的でないという事実によって予測されるように、ｉＣａｓｐ９−ＣＤ１９陽性集団のわずかしか存続しない（例えば、９９％純粋な集団の９９％の殺傷を仮定すると、得られる集団は、４９．７％のｉＣａｓｐ９陽性細胞および５０．３％のｉＣａｓｐ９陰性細胞を有し得る）。しかしながら、生き残った細胞は、ＣＩＤへの再曝露によって後の時点において殺傷され得る。
【０３９１】
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入されたＭＳＣは、改変されていないＭＳＣの分化能を維持し、それらの子孫は、ＣＩＤへの曝露によって殺傷される
ＣＩＤが、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣの分化した子孫を選択的に殺傷できるか判定するために、ＣＤ１９に対する免疫磁気選択を使用して、改変された集団の純度を高めた（１回の選択の後に＞９０％、図１６Ｂを参照のこと）。このようにして選択されたｉＣａｓｐ９陽性細胞は、インビボにおいて、研究されたすべての結合組織系列に分化することができた（図１９Ａ〜１９Ｑを参照のこと）。ヒトＭＳＣを、ＣＤ１９（ゆえにｉＣａｓｐ９）発現について免疫磁気的に選択したところ、９１％超の純度が得られた。特定の分化培地中での培養の後、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞系列（Ａ，オイルレッドおよびメチレンアズール）、骨芽細胞系列（Ｂ，アルカリホスファターゼ−ＢＣＩＰ／ＮＢＴおよびメチレンブルー）および軟骨芽細胞系列（Ｃ，アルシアンブルーおよびニュークリアレッド（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｄ））を生じることができた。これらの分化した組織は、５０ｎＭ  ＣＩＤへの曝露によってアポトーシスに駆動される（Ｄ〜Ｎ）。数多くのアポトーシス小体（矢印）、細胞膜ブレブ形成（挿入図）および細胞構造の喪失（ＤおよびＥ）；ｉＣａｓｐ９を形質導入された未処理コントロールに見られるもの（示されている脂肪生成条件、Ｏ〜Ｑ）（Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、ＤＡＰＩ；Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ，ＴＵＮＥＬ−ＦＩＴＣ；Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、オーバーレイ）と対照的に、軟骨細胞結節（Ｆ〜Ｈ）ならびに脂肪生成培養物（Ｉ〜Ｋ）および骨形成培養物（Ｌ〜Ｎ）における広範なＴＵＮＥＬ陽性に注意すること。
【０３９２】
５０ｎＭのＣＩＤに曝露した２４時間後、アポトーシスの微視的証拠が、脂肪生成培養物および骨形成培養物の全体にわたる、膜ブレブ形成、細胞の縮小および脱離ならびにアポトーシス小体の存在とともに観察された。ＴＵＮＥＬアッセイは、脂肪生成培養物および骨形成培養物および軟骨細胞結節において広範な陽性を示し（図１９Ａ〜１９Ｑを参照のこと）、これは、経時的に増加した（図２０を参照のこと）。脂肪細胞の分化培地中での培養の後、ｉＣａｓｐ９陽性細胞は、脂肪細胞を生じた。５０ｎＭ  ＣＩＤに曝露した後、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の比率の上昇によって証明されるように、漸進的なアポトーシスが観察された。２４時間後、細胞密度が有意に減少し（５８４細胞／ｍｍ２から＜１４細胞／ｍｍ２に）、ほとんどすべてのアポトーシス細胞がスライドから剥離したことから、アポトーシス細胞の比率のさらに信頼できる計算が妨げられた。したがって、ｉＣａｓｐ９は、ＭＳＣが分化した後でさえ機能的なままであり、その活性化により、分化した子孫の死がもたらされる。
【０３９３】
ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９を形質導入されたＭＳＣは、インビボでＣＩＤに曝露された後、選択的アポトーシスを起こす
静脈内注射されたＭＳＣは、短いインビボ生存時間を有すると見られるが、局所的に注射された細胞は、より長く生存し得、それに対応して、より著明な有害作用をもたらし得る。そのような状況においてｉＣａｓｐ９自殺システムのインビボ機能を評価するために、ＳＣＩＤマウスの皮下にＭＳＣを注射した。ＭＳＣに、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子（先に提示された）およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子を二重に形質導入した。また、ＭＳＣに、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃを単独で形質導入した。ｅＧＦＰ陽性（および適用できる場合、ＣＤ１９陽性）画分を、蛍光励起細胞分取によって純度＞９５％で単離した。各動物の皮下に、ｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣおよびコントロールＭＳＣ（両方ともｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ陽性）を、反対側の側腹部に注射した。ＭＳＣの局在化を、Ｘｅｎｏｇｅｎ−ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して評価した。別の実験セットでは、単独で形質導入されたＭＳＣと二重に形質導入されたＭＳＣとの１：１混合物を、上記のように、右側腹部およびＣＩＤを投与されたマウスの皮下に注射した。ＭＳＣの皮下ペレットを種々の時点において収集し、ゲノムＤＮＡを単離し、ｑＰＣＲを用いることにより、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を測定した。これらの条件下において、ｉＣａｓｐ９遺伝子とｅＧＦＰ遺伝子とのコピー数の比は、全ヒト細胞の中のｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合に比例する（詳細については上記の方法を参照のこと）。時間０が、ｉＣａｓｐ９陽性細胞の１００％に対応するように、それらの比を正規化した。ＭＳＣの皮下接種後（ＣＩＤ注射前）の連続的な動物の検査は、両方の細胞集団における自発的なアポトーシスの証拠を示す（全体のルミネセンスシグナルがベースラインの約２０％に低下することによって実証されるように）。これは、以前から、異種モデルにおいてＭＳＣの全身送達および局所送達後に観察されていた。
【０３９４】
ルミネセンスデータは、ＣＩＤ投与の前でさえ、ＭＳＣを局所送達した後の最初の９６時間にわたる（図２１Ｃを参照のこと）ヒトＭＳＣの実質的な損失を示し、１週間後には、およそ２０％の細胞しか生き残らなかった。しかしながら、その時点以降、二量体化薬ありとなしでのｉｃａｓｐ９陽性ＭＳＣの生存には有意差があった。ＭＳＣ移植の７日後、動物に、５０μｇのＣＩＤの２回の注射を２４時間空けて行った。図２１Ａに図示されているように、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＭＳＣは、ルミネセンスシグナルの消失によって実証されるように、その薬物によって迅速に殺傷された。ｉＣａｓｐ９が陰性の細胞は、その薬物によって影響されなかった。薬物を注射されなかった動物は、ＭＳＣ移植の１ヶ月後まで、両方の集団においてシグナルの持続を示した。細胞殺傷をさらに定量化するために、ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ遺伝子およびｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９遺伝子のコピー数を計測するｑＰＣＲアッセイを開発した。二重に形質導入されたＭＳＣと単独で形質導入されたＭＳＣとの１：１混合物を、マウスの皮下に注射し、ＭＳＣ移植の１週間後に、上記のようにＣＩＤを投与した。ＭＳＣ外植片をいくつかの時点において捕集し、それらのサンプルからゲノムＤＮＡを単離し、実質的に同一の量のＤＮＡに対してｑＰＣＲアッセイを行った。これらの条件下（方法を参照のこと）、任意の時点において、ｉＣａｓｐ９−ΔＣＤ１９とｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃとのコピー数の比は、生存可能なｉＣａｓｐ９陽性細胞の割合に比例する。ｉＣａｓｐ９陽性細胞の漸進的な殺傷が観察され（＞９９％）、生存しているｉＣａｓｐ９陽性細胞の比率は、１週間後に元の集団の０．７％にまで低下した（図２１Ｂを参照のこと）。ゆえに、ｉＣａｓｐ９を形質導入されたＭＳＣは、ＣＩＤに曝露された後、インビボにおいて選択的に殺傷され得るが、そうでなければ生き残り続ける。
【０３９５】
考察
誘導可能な自殺タンパク質を使用して安全機構を発現するようにヒトＭＳＣを操作する実行可能性が、本明細書中で実証される。本明細書中に提示されたデータ（ｄａｔｅ）は、ＭＳＣに、選択可能な表面メーカーＣＤ１９に結合された自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９が容易に形質導入され得ることを示している。同時に形質導入された遺伝子の発現は、ＭＳＣとそれらの分化した子孫の両方において安定しており、その表現型または分化に対する潜在能力を明らかに変化させない。これらの形質導入された細胞は、ｉＣａｓｐ９に結合する適切な二量体化小分子化学誘導物質に曝露されると、インビトロおよびインビボにおいて殺傷され得る。
【０３９６】
細胞に基づく治療を成功させるために、移植される細胞は、それらの収集から最終的なインビボでの臨床適用までの期間の間、生存しなければならない。さらに、細胞に基づく安全な治療は、首尾良く移植された細胞の望まれない成長および活性をコントロールする能力も備えるべきである。ＭＳＣは、多くの患者に著しい副作用なく投与されてきたが、最近の報告は、移植されたＭＳＣがその機能を高めるようにならびに骨および軟骨を含む系列に分化するように遺伝的におよび後成的に改変される潜在能力が、さらに調べられ、活用されるとき、本明細書中に提示される安全スイッチなどのさらなる保護が、細胞に基づく治療をコントロールするさらなる方法を提供し得ることを示唆している。生物学的に活性なタンパク質を放出するように遺伝的に改変されたＭＳＣを投与された被験体は、特に、自殺遺伝子によって提供される付加される安全性から恩恵を受け得る。
【０３９７】
本明細書中に提示される自殺システムは、他の公知の自殺システムに勝るいくつかの有望な利点を提供する。ヌクレオシドアナログが関わるストラテジー（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をガンシクロビル（ＧＣＶ）と組み合わせているもの、および細菌または酵母のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を５−フルオロ−シトシン（５−ＦＣ）と組み合わせているもの）は、細胞周期依存的であって、ＭＳＣを再生医学に適用しているときに形成され得る有糸分裂後の組織では効果的でありそうにない。さらに、増殖している組織でさえ、有糸分裂の部分が、すべての細胞を含んでいるわけではなく、グラフトのかなりの部分が、生存して機能障害性のままであり得る。場合によっては、自殺のために必要とされるプロドラッグ自体が、治療的な用途を有し得るがゆえに、それらは、非標的器官（例えば、多くのシトクロムＰ４５０基質）による代謝の結果として、または近隣組織への拡散（例えば、細菌のニトロレダクターゼに対する基質であるＣＢ１９５４）に起因して、標的細胞による活性化の後に、排除される（例えば、ＧＣＶ）か、または有毒であり得る（例えば、５−ＦＣ）。
【０３９８】
対照的に、本明細書中に提示される二量体化小分子化学誘導物質は、ｉＣａｓｐ９を活性化するために必要とされる用量よりも１０倍高い用量でさえ毒性の証拠を示さなかった。さらに、非ヒト酵素システム（例えば、ＨＳＶ−ｔｋおよびＤＣ）は、形質導入された細胞に対する破壊性の免疫応答の高リスクを有する。ｉＣａｓｐ９自殺遺伝子と選択マーカーＣＤ１９の両方が、ヒト起源であり、ゆえに、望まれない免疫応答を誘導する可能性は低いはずである。非ヒト起源の２Ａ様の切断可能ペプチドによる選択可能マーカーと自殺遺伝子との発現の連鎖は、問題を引き起こし得るが、２Ａ様リンカーは、２０アミノ酸長であり、非ヒトタンパク質よりもおそらく免疫原性が低い。最後に、ｉＣａｓｐ９陽性細胞における自殺遺伝子活性化の有効性は、他の自殺システムを発現している細胞の殺傷に好ましく匹敵し、ｉＣａｓｐ９によって改変されたＴ細胞の９０％以上が、二量体化剤の単回投与の後、排除され、これは、臨床的に効果的である可能性があるレベルである。
【０３９９】
本明細書中に提示されるｉＣａｓｐ９システムは、他の細胞に基づく治療および／または自殺スイッチに基づく治療で見られるさらなる制約も回避し得る。形質導入される構築物のサイレンシングに起因する発現低下が、哺乳動物細胞のレトロウイルス形質導入後に、頻繁に観察される。本明細書中に提示される発現構築物は、そのような影響の証拠を示さなかった。培養における１ヶ月後でさえ、発現の低下または誘導される死は、明白でなかった。
【０４００】
他の細胞に基づく治療および／または自殺スイッチに基づく治療において時折観察される別の潜在的な問題は、抗アポトーシス遺伝子がアップレギュレートされた細胞における抵抗性の発生である。この影響は、Ｆａｓなどのプログラム細胞死経路の種々のエレメントが関わる他の自殺システムにおいて観察されている。ｉＣａｓｐ９は、この制約を有する可能性が低かったので、本明細書中に提示される発現構築物に対する自殺遺伝子としてｉＣａｓｐ９を選択した。アポトーシスカスケードの他のメンバーと比べて、カスパーゼ−９の活性化は、アポトーシス経路の後期に生じるがゆえに、すべてではないが多くの抗アポトーシス制御因子（例えば、ｃ−ＦＬＩＰおよびｂｃｌ−２ファミリーメンバー）の影響を迂回するはずである。
【０４０１】
本明細書中に提示されるシステムに特異的な潜在的な制約は、ｉＣａｓｐ９の自発的な二量体化であり得、それはその後、望まれない細胞死および不十分な存続を引き起こし得る。この影響は、Ｆａｓを使用するある特定の他の誘導可能なシステムにおいて観察されている。インビボにおける、形質導入された細胞の低い自発的な死亡率およびトランスジェニック細胞の長期間の存続の観察結果は、この可能性が、ｉＣａｓｐ９に基づく発現構築物を使用するときに有意な考慮すべき点でないことを示唆する。
【０４０２】
ＭＳＣのレトロウイルス形質導入に由来する組み込み事象は、特に、レトロウイルスベクターの複数回の挿入が行われるとき、有害な変異誘発を潜在的に駆動し得、望まれないコピー数の影響および／または他の望ましくない影響を引き起こし得る。これらの望まれない影響は、レトロウイルスによって形質導入される自殺システムの利点を相殺し得る。これらの影響は、しばしば、安定した産生細胞株から得られる臨床グレードのレトロウイルス上清および類似の培養条件を使用してＴリンパ球を形質導入するとき、最小になり得る。本明細書中において形質導入され、評価されたＴ細胞は、約１〜３個の範囲の組み込み体を含む（その上清は約１×１０６ウイルス粒子／ｍＬの範囲で含む）。レトロウイルスベクターの代わりにレンチウイルスベクターを使用すると、特に、自己複製能および分化能が高い細胞において、遺伝毒性のリスクがさらに低下し得る。
【０４０３】
ＣＩＤへの単回の曝露後も、少ない比率のｉＣａｓｐ９陽性ＭＳＣが存続するが、これらの生存細胞は、その後、ＣＩＤへの再曝露後に殺傷され得る。インビボでは、２回の投与で＞９９％が枯渇されるが、臨床の状況では、ＣＩＤの反復投与が、最大の枯渇のために必要とされ得る可能性がある。誘導可能な自殺スイッチシステムを使用するときに追加の安全性を提供するさらなる非限定的な方法としては、投与される細胞集団の純度をさらに高めるためのさらなる回数の細胞のソーティングおよび殺傷の効率を高めるための２以上の自殺遺伝子システムの使用が挙げられる。
【０４０４】
他の利用可能な選択システム（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）および切断型低親和性神経成長因子レセプター（ΔＬＮＧＦＲ））に勝る潜在的な利点を理由に、Ｂリンパ球によって生理的に発現されるＣＤ１９分子を、形質導入された細胞に対する選択可能マーカーとして選択した。「ｎｅｏ」は、潜在的に免疫原性の外来タンパク質をコードし、選択培地中での７日間の培養を必要とすることから、システムの複雑さが増し、選択された細胞を潜在的に損傷する。ΔＬＮＧＦＲ発現は、他の表面マーカーと類似の単離ストラテジーを可能にするはずであるが、これらは、臨床で使用するには広く利用可能でなく、ΔＬＮＧＦＲの発癌能に関する根強い懸念が残る。対照的に、臨床グレードのデバイスを用いたＣＤ１９発現によるｉＣａｓｐ９陽性細胞の磁気選択は、容易に利用可能であり、その後の細胞の成長または分化に対する著しい影響も示していない。
【０４０５】
カスパーゼ−９安全スイッチを含む間葉系ストローマ細胞の調製および投与のために使用される手順は、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞の調製のためにも使用され得る。したがって、本実施例において概説された手順に対して、胚性幹細胞または誘導可能な多能性幹細胞を、この実施例において提供された間葉系ストローマ細胞の代わりに用いてもよい。これらの細胞では、例えば、ＣＭＶプロモーターまたはｒｏｎｉｎプロモーターを有する、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが、使用され得る。
【０４０６】
実施例６：より低い基底活性およびリガンドＩＣ５０の最小損失を有する改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド
アゴニストまたは活性化剤の非存在下におけるシグナル伝達である基底のシグナル伝達は、多数の生体分子に広く認められる。例えば、それは、複数のサブファミリー由来の６０個を超える野生型Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）［１］、キナーゼ（例えば、ＥＲＫおよびａｂｌ）［２］、表面免疫グロブリン［３］およびプロテアーゼにおいて観察されている。基底のシグナル伝達は、胚性幹細胞の多能性の維持、Ｂ細胞の発生および分化［４〜６］、Ｔ細胞の分化［２、７］、胸腺細胞の発生［８］、エンドサイトーシスおよび薬剤耐性［９］、自己免疫［１０］から、植物の生長および発生［１１］まで、非常に様々な生物学的事象に寄与すると仮定されている。その生物学的意義は、必ずしも完全に理解されていないかまたは明らかになっていないが、不完全な基底のシグナル伝達は、重大な結果に至り得る。不完全な基底のＧｓタンパク質シグナル伝達は、網膜色素変性症、色覚異常、腎性尿崩症、家族性ＡＣＴＨ抵抗性および家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症などの疾患をもたらした［１２、１３］。
【０４０７】
野生型イニシエーターカスパーゼ−９のホモ二量体化が、エネルギー的に好ましくなく、そのせいでそれらが主として溶液中でモノマーになったとしても［１４〜１６］、低レベルの固有の基底活性のプロセシングされていないカスパーゼ−９［１５、１７］は、その天然のアロステリック制御因子である、Ａｐａｆ−１に基づく「アポトソーム」の存在下において増強される［６］。さらに、超生理学的発現レベルおよび／または共局在化により、近接することによって駆動される二量体化がもたらされ、さらに基底の活性化が増強され得る。
【０４０８】
改変されていないキメラカスパーゼ−９ポリペプチドでは、生来のカスパーゼ−９の基底活性は、カスパーゼ動員プロドメイン（ＣＡＲＤ）を同起源の高親和性のＡＰ１９０３結合ドメインであるＦＫＢＰ１２−Ｆ３６Ｖで置き換えて、それを除去することによって［１８］、有意に低下した。細胞治療のためのアポトーシス促進性の「安全スイッチ」としてのその有用性は、複数の研究において十分に実証されている［１８〜２０］。その高い特異的かつ低い基底の活性のおかげで、それは、細胞治療における強力なツールになったが、Ｇタンパク質共役レセプターとは対照的に、現在のところ、基底のシグナル伝達を排除する「インバースアゴニスト」が存在しない［２１］ことから、それは、製造にとっておよびいくつかの用途にとって望ましい場合がある。キメラポリペプチドの低レベルの基底活性の大きな増幅に起因して、マスターセルバンクの調製は困難であると判明している。さらに、いくつかの細胞は、カスパーゼ−９の低レベルの基底活性に対して他のものよりも感受性であることから、形質導入された細胞の意図されないアポトーシスがもたらされる［１８］。
【０４０９】
キメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底活性を改変するために、ランダムに作製された変異体に対する選択圧として複数サイクルのスクリーニングを使用する「定向進化」［２２］ではなく、「合理的な設計」に基づく方法を使用して、ホモ二量体化、ＸＩＡＰ媒介性の阻害またはリン酸化において非常に重要な役割を果たすと知られている残基に基づいて、７５個のｉＣａｓｐ９変異体を操作した（図４４，下記の表）。二量体化によって駆動されるカスパーゼ−９の活性化は、イニシエーターカスパーゼ活性化の支配的なモデルであると考えられている［１５，２３，２４］。自発的な二量体化を減少させるために、ホモ二量体化、ゆえに基底のカスパーゼ−９シグナル伝達にとって非常に重要な残基の部位特異的変異誘発を行った。カスパーゼ−９の重要な二量体化界面であるβ６鎖（Ｇ４０２−Ｃ−Ｆ−Ｎ−Ｆ４０６）における５つの重要な残基を、恒常的に二量体のエフェクターカスパーゼ−３（Ｃ２６４−Ｉ−Ｖ−Ｓ−Ｍ２６８）のそれらで置き換えることにより、それは、有意な構造転位なく、Ａｐａｆ−１活性化に非応答性である恒常的に二量体のタンパク質に変換した［２５］。自発的なホモ二量体化を改変するために、溶液中では主にモノマーとして存在するイニシエーターカスパーゼ−２、−８、−９および−１０の対応する残基に対して、アミノ酸化学に基づいて、その５つの残基の体系的な変異誘発を行った［１４，１５］。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に基づく代替殺傷アッセイによって２８個のｉＣａｓｐ９変異体を作製し、試験した後（下記の表）、ＡＰ１９０３に対してより高いＩＣ５０という中程度（＜１０倍）のコストで基底のシグナル伝達を低下させるＮ４０５Ｑ変異が見出された。
【０４１０】
カスパーゼ活性化にとって通常必要とされるタンパク質分解は、カスパーゼ−９の活性化にとって絶対必要というわけではないので［２６］、自己タンパク質分解を阻害するために熱力学的な「ハードル」を高めた。さらに、ＸＩＡＰ媒介性カスパーゼ−９結合は、モノマーの状態でカスパーゼ−９を捕捉することにより、その触媒活性および基底活性を減弱するので［１４］、ＸＩＡＰとの相互作用にとって非常に重要なテトラペプチド（Ａ３１６−Ｔ−Ｐ−Ｆ３１９、Ｄ３３０−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｓ３３４）を変異誘発することによってＸＩＡＰとカスパーゼ−９との相互作用を強化する試みが行われた。これらのｉＣａｓｐ−９変異体のうちの１７個から、Ｄ３３０Ａ変異が、最小（＜５倍）のＡＰ１９０３  ＩＣ５０コストで基底のシグナル伝達を低下させることが明らかになった。
【０４１１】
第３のアプローチは、カスパーゼ−９が、ＰＫＣ−ζによるＳ１４４のリン酸化［２７］、タンパク質キナーゼＡによるＳ１８３のリン酸化［２８］、Ａｋｔ１によるＳ１９６のリン酸化［２９］の際にキナーゼによって阻害され、ｃ−ａｂｌによるＹ１５３のリン酸化の際に活性化される［３０］という以前に報告された知見に基づいた。これらの「ブレーキ」は、ＩＣ５０を改善し得るか、またはリン酸化模倣（「リン酸模倣（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃ）」）残基による置換は、これらの「ブレーキ」を増強することにより、基底活性を低下させ得る。しかしながら、これらの残基に基づく１５個の単一残基変異体のいずれもが、ＡＰ１９０３に対するＩＣ５０を首尾良く低下させなかった。
【０４１２】
例えば、実施例１〜５および本願全体において論じられたものなどの方法は、必要であれば、改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドならびに様々な治療用細胞に、適切な改変を加えて、適用され得る。
【０４１３】
実施例７：材料および方法
カスパーゼ−９のＰＣＲ部位特異的変異誘発：
カスパーゼ−９の基底のシグナル伝達を改変するために、ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発［３１］を、変異を含むオリゴおよびＫａｐａ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を用いて行った。１８サイクルの増幅の後、ＰＣＲ産物をインタクトのまま残すメチル化依存性ＤｐｎＩ制限酵素で親プラスミドを除去した。２μｌの得られた反応物を使用して、ＸＬ１−ｂｌｕｅまたはＤＨ５αを化学的に形質転換した。続いて、陽性の変異体を配列決定（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって同定した。
【０４１４】
細胞株の維持およびトランスフェクション：
初期継代ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシンが補充されたＩＭＤＭ，ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中、加湿された３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気において、トランスフェクションまで維持した。対数増殖期における細胞を、１５ｍＬのコニカルチューブにおいて細胞１００万個あたり、ｉＣａｓｐ９変異体をコードする８００ｎｇ〜２μｇの発現プラスミドおよびＳＲαプロモーターによって駆動されるＳＥＡＰをコードする５００ｎｇの発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。触媒的に不活性なカスパーゼ−９（Ｃ２８５Ａ）（ＦＫＢＰドメインを含まない）または「空の」発現プラスミド（「ｐＳＨ１−ヌル」）を、トランスフェクション間の総プラスミドレベルを一定に維持するために使用した。プラスミドＤＮＡ１μｇあたり３μｌの比のＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、抗生物質の非存在下において、ＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を一過性にトランスフェクトした。１００μｌまたは２ｍＬのトランスフェクション混合物を、それぞれ９６ウェルまたは６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ＳＥＡＰアッセイに向けて、トランスフェクション後の最低３時間のインキュベーションの後に、ＡＰ１９０３のｌｏｇ希釈物を加えた。ウエスタンブロットに向けて、細胞をＡＰ１９０３（１０ｎＭ）とともに２０分間インキュベートした後、収集した。
【０４１５】
分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ：
ＡＰ１９０３処理の２４〜４８時間後、約１００μｌの上清を９６ウェルプレートに収集し、記載されているように［１９，３２］、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした。簡潔には、熱に感受性である内因性（および血清由来）アルカリホスファターゼによって引き起こされるバックグラウンドを減少させる６５℃における４５分間の熱変性の後、５μｌの上清を９５μｌのＰＢＳに加え、２Ｍジエタノールアミンに再懸濁された１μｌの１００ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む１００μｌの基質緩衝液に加えた。ＳＥＡＰによる４−ＭＵＰの加水分解は、励起／発光（３５５／４６０ｎｍ）を有する蛍光基質を生成し、それは、容易に計測され得る。ウェル間の蛍光漏出を最小限するために、黒色不透明９６ウェルプレートにおいてアッセイを行った（図４５）。
【０４１６】
ウエスタンブロット解析：
４８〜７２時間にわたって２μｇのプラスミドで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞を、３７℃において７．５〜２０分間（示されているとおり）、ＡＰ１９０３で処理し、続いて、ＨａｌｔＴＭＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを含む５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ８．０／１４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル／１％デオキシコール酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ）中で溶解した。溶解産物を捕集し、３０分間、氷上で溶解した。細胞残屑をペレットにした後、覆っている上清のタンパク質濃度を、製造者が推奨するようにＢＣＡＴＭＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙによって９６ウェルプレートにおいて計測した。３０μｇのタンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で２．５％２−メルカプトエタノールとともに９５℃で５分間煮沸した後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  １０％Ｔｒｉｓ／グリシン（ｇｌｙｌｃｉｎｅ）タンパク質ゲルによって分離した。膜を、１／１０００ウサギ抗ヒトカスパーゼ−９ポリクローナル抗体に続いて１／１０，０００ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でプロービングした。タンパク質バンドを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ化学発光基質を使用して検出した。等しいサンプルローディングを保証するために、ブロットを６５℃において１時間、Ｒｅｓｔｏｒｅ  ＰＬＵＳ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒでストリッピングした後、１／１０，０００ウサギ抗アクチンポリクローナル抗体で標識した。別段述べられない限り、すべての試薬をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【０４１７】
実施例１〜５においておよび本明細書全体を通じて論じられる方法および構築物は、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをアッセイするためおよび使用するためにも使用され得る。
【０４１８】
実施例８：改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの評価および活性
基底活性とＡＰ１９０３によって誘導される活性との比較：
改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底活性とＡＰ１９０３によって誘導される活性の両方を調べるために、ＳＥＡＰおよび種々の量のｉＣａｓｐ９変異体でコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞のＳＥＡＰ活性を調べた。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、細胞１００万個あたり１μｇのｉＣａｓｐ９（１４８９２８、１７９０８１、２０５７７２対１１４５１８という相対的なＳＥＡＰ活性単位）または細胞１００万個あたり２μｇのｉＣａｓｐ９（１３６８６３、１７５５２９、１７４３６６対９８８８９）でトランスフェクトされた細胞に対して、改変されていないｉＣａｓｐ９よりも有意に低い基底活性を示した（図４６Ａ、４６Ｂ）。３つすべての改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底のシグナル伝達は、細胞１００万個あたり２μｇでトランスフェクトされたとき、有意に高かった（ｐ値＜０．０５）。ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、ＡＰ１９０３に対してＩＣ５０推定値の上昇も示したが、ＷＴに対する１ｐＭに対して（図４６Ｃ）、それらはすべてなおも６ｐＭ未満だった（ＳＥＡＰアッセイに基づいて）ことから、それらは、潜在的に有用なアポトーシススイッチである。
【０４１９】
タンパク質発現レベルおよびタンパク質分解の評価：
改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの基底活性の観察された減少が、低下したタンパク質の安定性またはトランスフェクション効率のばらつきに起因し得るという可能性を排除するため、およびｉＣａｓｐ９の自己タンパク質分解を調べるために、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ／１６細胞におけるカスパーゼ−９バリアントのタンパク質発現レベルをアッセイした。改変されていないキメラカスパーゼ−９ポリペプチド、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、およびｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑのタンパク質レベルのすべてが、この研究において使用されたトランスフェクション条件下において同様のタンパク質レベルを示した（図４７Ａ）。対照的に、ｉＣａｓｐ９  Ｎ４０５Ｑのバンドは、特に２μｇの発現プラスミドを使用したとき、他のものよりも濃く見えた。おそらく生細胞だけが捕集されたので、自己タンパク質分解は、使用されたトランスフェクション条件では容易に検出可能でなかった。抗アクチンタンパク質の再ブロッティングにより、類似の量の溶解産物が各レーンにローディングされていることを確かめた（図４７Ｂ）。これらの結果は、ＳＥＡＰアッセイによって観察された、ｉＣａｓｐ９  Ｄ３３０Ａ、Ｎ４０５ＱおよびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ変異体における観察されたより低い基底のシグナル伝達を支持する。
【０４２０】
考察：
ＳＥＡＰスクリーニングアッセイに基づいて、これらの３つの改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドは、ｉＣａｓｐ９  ＷＴトランスフェクタントと比べて、より高いＡＰ１９０３非依存的ＳＥＡＰ活性、ゆえに、より低い基底のシグナル伝達を示した。しかしながら、二重変異（Ｄ３３０−Ｎ４０５Ｑ）は、単一アミノ酸変異体に対して、基底活性またはＩＣ５０（０．０５ｎＭ）のいずれかをさらに減少させなかった（図４６Ａ、４６Ｂ、４６Ｃ）。観察された差異は、タンパク質の不安定性、またはトランスフェクションにおいて使用された異なる量のプラスミドに起因するようにはみられなかった（図４７Ｂ）。
【０４２１】
実施例９：改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドの評価および活性
誘導可能なカスパーゼ−９は、ＡＰ１９０３依存的様式で、細胞周期非依存性の迅速な細胞自律的な殺傷を提供する。この誘導可能なカスパーゼ−９ポリペプチドの特色を改善することにより、なおもより広い適用性が可能になり得る。タンパク質のリガンド非依存的細胞傷害性を減少させること、および低発現レベルにおいて殺傷を増加させることが、望ましい。リガンド非依存的細胞傷害性は、比較的低レベルの発現では懸念でないが、発現レベルが、ベクター作製中など、主要な標的細胞よりも１桁以上高くなり得る場合、それは、本質的な影響力を有し得る。また、細胞は、細胞が発現しているＸＩＡＰおよびＢｃｌ−２のようなアポトーシス阻害剤のレベルに起因して、低レベルのカスパーゼ発現に差次的に感受性であり得る。ゆえに、より低い基底活性およびＡＰ１９０３リガンドに対してできるだけより高い感受性を有するようにカスパーゼポリペプチドを再操作するために、４つの変異誘発ストラテジーを考案した。
【０４２２】
二量体化ドメイン：カスパーゼ−９は、溶液中において生理学的レベルで単量体であるが、Ａｐａｆによって駆動されるアポトーシス促進性「アポトソーム」において生じるような高レベルの発現時は、カスパーゼ−９は、二量体化して、Ｄ３１５における自己タンパク質分解および触媒活性の大幅な上昇に至り得る。Ｃ２８５は、活性部位の一部であるので、変異Ｃ２８５Ａは、触媒的に不活性であり、ネガティブコントロール構築物として使用される。二量体化は、特に５つの残基、すなわち、Ｇ４０２、Ｃ４０３、Ｆ４０４、Ｎ４０５およびＦ４０６の非常に密接な相互作用を伴う。各残基に対して、異なるクラスのアミノ酸（例えば、疎水性、極性など）に相当する種々のアミノ酸置換物を構築した。興味深いことに、Ｇ４０２におけるすべての変異体（すなわち、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ）およびＣ４０３Ｐは、触媒的に不活性なカスパーゼポリペプチドをもたらした。さらなるＣ４０３変異（すなわち、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３ＳおよびＣ４０３Ｔ）は、野生型カスパーゼと似ていたことから、さらに探究されなかった。Ｆ４０４における変異のすべてが、基底活性を低下させただけでなく、約１ｌｏｇから計測不可能までの、ＩＣ５０に対する感受性の低下も示した。有効な順に、それらは：Ｆ４０４Ｙ＞Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ＞＞Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４Ｓである。Ｎ４０５における変異は、Ｎ４０５Ａと同様に影響を及ぼさなかったか、Ｎ４０５Ｔにおけるように基底活性を上昇させたか、またはＮ４０５ＱおよびＮ４０５Ｆと同様にそれぞれＩＣ５０に対して小さな悪影響（約５倍）もしくはより大きな悪影響と同時に基底活性を低下させた。最後に、Ｆ４０４のように、Ｆ４０６における変異はすべて、基底活性を低下させ、約１ｌｏｇから計測不可能まで、ＩＣ５０に対する感受性の低下を示した。有効な順に、それらは：Ｆ４０６Ａ  Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ＞Ｆ４０６Ｔ＞＞Ｆ４０６Ｌである。
【０４２３】
二量体化ドメイン内に化合物変異を有するが、溶液中で単量体（例えば、カスパーゼ−２、−８、−１０）または二量体（例えば、カスパーゼ−３）であると知られている他のカスパーゼから類似の５つの残基を置換した、いくつかのポリペプチドを構築し、試験した。ＡＡＡＡＡアラニン置換とともにカスパーゼ−２、−３および−８からの５残基変化を含むカスパーゼ−９ポリペプチドはすべて、触媒的に不活性であったが、カスパーゼ−１０（ＩＳＡＱＴ）からの等価な残基が、基底活性の低下をもたらしたが、より高いＩＣ５０をもたらした。
【０４２４】
全体的に、ＩＣ５０に対しては単なる穏やかな影響と組み合わされる一貫してより低い基底活性の組み合わせに基づいて、Ｎ４０５Ｑをさらなる実験のために選択した。有効性を改善するために、Ｎ４０５Ｑｃｏと呼ばれる、Ｎ４０５Ｑ置換を有する、コドンが最適化されたバージョンの改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを試験した。このポリペプチドは、ＡＰ１９０３に対して、野生型Ｎ４０５Ｑ置換カスパーゼ−９ポリペプチドよりもわずかに感受性であるとみられた。
【０４２５】
切断部位変異体：アポトソーム内でのまたはＡＰ１９０３が強制するホモ二量体化を介したカスパーゼ−９の凝集の後、Ｄ３１５において自己タンパク質分解が生じる。これにより、新しいアミノ末端がＡ３１６に、少なくとも一過性に形成される。興味深いことに、新しく現れたテトラペプチド３１６ＡＴＰＦ３１９は、上に記載された二量体化モチーフＧＣＦＮＦにおいてカスパーゼ−９自体と二量体化について競合するカスパーゼ−９阻害剤ＸＩＡＰに結合する。ゆえに、Ｄ３１５切断の最初の結果は、さらなるカスパーゼ−９活性化を減弱するＸＩＡＰ結合である。しかしながら、第２のカスパーゼ切断部位が、下流のエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ−３の標的であるＤ３３０に存在する。アポトーシス促進性の圧力がかかるにつれて、Ｄ３３０は、ますます切断されるようになり、残基３１６〜３３０内のＸＩＡＰ結合小ペプチドが放出され、ゆえに、この軽減するカスパーゼ−９阻害剤が除去される。基底活性を低下させるがＮ４０５Ｑにおけるほどの低さではないＤ３３０Ａ変異体を構築した。高コピー数でのＳＥＡＰアッセイによって、ＩＣ５０のわずかな上昇も明らかになったが、初代Ｔ細胞における低コピー数では、標的細胞の殺傷の改善とともに、実際にＩＣ５０のわずかな上昇があった。自己タンパク質分解部位であるＤ３１５における変異もまた、基底活性を低下させたが、おそらくＤ３３０切断がカスパーゼ活性化に必要であるので、これは、ＩＣ５０の大幅な上昇をもたらした。Ｄ３１５ＡおよびＤ３３０Ａにおける二重変異は、正しくプロセシングされ得ない不活性な「ロックされた」カスパーゼ−９をもたらした。
【０４２６】
Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０ＳおよびＤ３３０Ｖを含む他のＤ３３０変異体も作製した。コンセンサスカスパーゼ−３切断部位がＤｘｘＤであるので、Ｄ３２７における変異もまた、Ｄ３３０における切断を妨げたが、Ｆ３２６Ｋ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｋ、Ｌ３２９ＧおよびＡ３３１ＫとともにいくつかのＤ３２７変異（すなわち、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７ＫおよびＤ３２７Ｒ）は、Ｄ３３０変異とは異なり、基底活性を低下させなかったことから、さらに探究されなかった。
【０４２７】
ＸＩＡＰ結合変異体：上に記載されたように、Ｄ３１５における自己タンパク分解は、ＸＩＡＰをカスパーゼ−９複合体に「引きつける」ＸＩＡＰ結合テトラペプチド３１６ＡＴＰＦ３１９を出現させる。ミトコンドリア由来抗ＸＩＡＰ阻害剤ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ由来の類似のＸＩＡＰ結合テトラペプチドＡＶＰＩによるＡＴＰＦの置換は、ＸＩＡＰにより強く結合し得、基底活性を低下させ得る。しかしながら、この４残基置換は、効果がなかった。ＡＴＰＦモチーフ内の他の置換は、効果なし（すなわち、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ）から、ＩＣ５０の非常に小さな上昇（すなわち、Ｔ３１７Ｓ、小さな（すなわち、Ｔ３１７Ａ）から大きな上昇（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ）を伴うより低い基底活性までに及んだ。全体的に、ＸＩＡＰ結合テトラペプチドを変更する影響は小さかった；それにもかかわらず、ＩＣ５０に対する影響がその群の中で最も小さかったので、二重変異（下記に記載される）における試験のために、Ｔ３１７Ｓを選択した。
【０４２８】
リン酸化変異体：少数のカスパーゼ−９残基が、阻害性のリン酸化（例えば、Ｓ１４４、Ｓ１８３、Ｓ１９５、Ｓ１９６、Ｓ３０７、Ｔ３１７）または活性化するリン酸化（すなわち、Ｙ１５３）の標的であると報告された。ゆえに、酸性残基（例えば、Ａｓｐ）で置換することによってリン酸化を模倣する変異（「リン酸模倣物（ｐｈｏｓｐｈｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」）またはリン酸化を排除する変異を試験した。概して、ほとんどの変異は、リン酸模倣物またはそうでないものを試したかに関係なく、基底活性を低下させた。より低い基底活性を有する変異体のうち、Ｓ１４４における変異（すなわち、Ｓ１４４ＡおよびＳ１４４Ｄ）およびＳ１９６Ｄは、ＩＣ５０に対して識別可能な影響を及ぼさず、変異体Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５ＡおよびＳ１９６Ａは、ＩＣ５０を少し上昇させ、変異体Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＳ３０７Ａは、ＩＣ５０に対して大きな悪影響を及ぼした。より低い基底活性と、ＩＣ５０に対するあったとしても最小の影響との組み合わせに起因して、二重変異（下記に記載される）のためにＳ１４４Ａを選択した。
【０４２９】
二重変異体：基底活性をさらに低下させ得る可能性のある残基と、Ｄ３３０Ａバリアントのわずかに改善された有効性を組み合わせるために、数多くのＤ３３０Ａ二重変異体を構築し、試験した。代表的には、Ｎ４０５Ｑ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３ＡおよびＳ１９６Ａに第２の変異を含むそれらは、ＩＣ５０のほんのわずかな上昇とともにより低い基底活性を維持した。二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔは、より高い基底活性を有し、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３ＦおよびＴ３１７ＥとともにＤ３３０Ａにおける二重変異体は、触媒的に不活性だった。有効性を改善することまたはＩＣ５０を低下させること目的としている、低い基底活性を有する一連の二重変異体Ｎ４０５Ｑを試験した。これらのすべてが、低い基底活性、およびＣａｓｐａＣＩＤｅ−１．０と比べてわずかに上昇したＩＣ５０に関してＮ４０５Ｑと同様であると見られ、それらには、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６ＤおよびＴ３１７Ｓを伴うＮ４０５Ｑが含まれた。
【０４３０】
図４８Ａは、二量体化ドメイン変異体のうちのいくつかの基底活性およびＣＩＤ感受性を研究するＳＥＡＰアッセイを表している。これは、ＡＰ１９０３非依存性のシグナル伝達の上方シフトによって判定されるとき、Ｎ４０５Ｑ（黒丸）が、ＷＴカスパーゼ−９よりも低い基底活性で、試験された変異体の中で最もＡＰ１９０３に感受性だったことを示している。Ｆ４０６Ｔは、この群の中で最もＣＩＤ感受性でなかった。４８Ｂは、最大ＳＥＡＰ活性（基底活性を反映する）およびＩＣ５０の表を示している。
【０４３１】
図４９Ａは、二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑとともに、変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑの二量体非依存性のＳＥＡＰ活性を表している。Ｎ４０５ＱがＤ３３０Ａよりも低い基底活性を有し、二重変異体が中間であることを図示している、複数のトランスフェクション（Ｎ＝７〜１３）の結果が示されている。
【０４３２】
図４９Ｂは、二重変異体Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑとともに、変異体カスパーゼポリペプチドＤ３３０ＡおよびＮ４０５Ｑの平均（＋ｓｔｄｅｖ，ｎ＝５）ＩＣ５０を表している。これらの結果は、一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、Ｄ３３０Ａが、ＡＰ１９０３に対してＮ４０５Ｑ変異体よりもいくらか感受性であるが、ＷＴカスパーゼ−９よりも約２倍感受性が低いことを示している。
【０４３３】
図５０は、ＷＴカスパーゼ−９、Ｎ４０５Ｑ、不活性Ｃ２８５Ａ、およびＸＩＡＰ結合ドメイン内のいくつかのＴ３１７変異体を反映しているＳＥＡＰアッセイを表している。これらの結果は、Ｔ３１７ＳおよびＴ３１７Ａが、ＡＰｆ１９０３に対するＩＣ５０の大きな変化なく、基底活性を低下させ得ることを示している。ゆえに、Ｎ４０５Ｑとの二重変異体を作製するためにＴ３１７Ｓを選択した。
【０４３４】
図５１は、実験５０ＢからのＩＣ５０を表しており、Ｔ３１７ＡおよびＴ３１７Ｓが、より低い基底活性を有するにもかかわらず、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドと同様のＩＣ５０を有することを示している。
【０４３５】
図５２は、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｖ、Ｄ３３０ＧおよびＤ３３０Ｓを含む、試験されたこのクラスのすべてのメンバーが、野生型カスパーゼ−９よりも低い基底活性を有することを示している、いくつかのＤ３３０変異体からの二量体非依存性のＳＥＡＰ活性を表している。
【０４３６】
図５３は、Ｄ３３０変異がＤ３３０における切断を阻止して、わずかに大きく（より遅く移動する）小さいバンド（＜２０ｋＤａマーカー）をもたらすことを図示しているウエスタンブロットの結果を示している。他のブロットは、Ｄ３２７変異もまた切断を阻止することを示している。
【０４３７】
図５４は、示されているカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするレトロウイルスで５回形質導入されたＰＧ１３の複数のクローンの平均蛍光強度を示している。より低い基底活性は通常、遺伝的に連結されたレポーターであるＣＤ１９とともにカスパーゼ−９遺伝子のより高い発現レベルに変換する。これらの結果は、概して、Ｎ４０５Ｑ変異体を発現しているクローンは、より高いレベルのＣＤ１９を発現することを示しており、これは、Ｄ３３０変異体またはＷＴカスパーゼ−９よりもＮ４０５Ｑのより低い基底活性を反映している。
【０４３８】
図５５は、初代Ｔ細胞における主に単一コピーの様々なカスパーゼポリペプチドの影響を示している。これは、これらの自殺遺伝子がどのようにして治療的に使用されるかをより正確に反映し得る。驚いたことに、そのデータは、２４時間のアッセイにおいて試験されたとき、Ｄ３３０Ａ変異体が、低力価においてＡＰ１９０３に対して実際により感受性であり、少なくともＷＴカスパーゼ−９と同様に殺傷することを示している。Ｎ４０５Ｑ変異体は、ＡＰ１９０３に対してそれほど感受性でなく、２４時間以内に効率的に標的細胞を殺傷できない。
【０４３９】
図５６は、別個の健常ドナーに由来する６つの独立したＴ細胞サンプルを形質導入した結果を示している。これらの結果は、Ｄ３３０Ａ変異体（ｍｕｔ）が、ＡＰ１９０３に対して野生型カスパーゼ−９ポリペプチドよりも感受性であることを確証させる。
【０４４０】
図５７は、図５６に示された６人の健常ドナーからの平均ＩＣ５０、範囲および標準偏差を示している。このデータは、その改善が統計学的に有意であることを示している。
【０４４１】
図５８は、いくつかのＤ３３０変異体の結果を示しており、試験された６つすべてのＤ３３０変異体（Ｄ３３０Ａ、Ｅ、Ｎ、Ｖ、ＧおよびＳ）が、ＡＰ１９０３に対して野生型カスパーゼ−９ポリペプチドよりも感受性であることを明らかにしている。
【０４４２】
図５９は、Ｎ４０５Ｑ変異体が、Ｆ４０４ＹおよびＦ４０６Ｙを含む他の二量体化ドメイン変異体とともに、１０日以内に、野生型カスパーゼ−９ポリペプチドまたはＤ３３０Ａと区別できない程度に標的Ｔ細胞を殺傷し得ることを示している。０日目にＡＰ１９０３を投与された細胞は、第２の用量のＡＰ１９０３を４日目に投与される。このデータは、制御される有効性スイッチの一部として、Ｎ４０５Ｑのような低下した感受性のカスパーゼ−９変異体を使用することを支持する。
【０４４３】
図６０は、「Ｎ４０５Ｑｃｏ」と呼ばれるＮ４０５Ｑカスパーゼポリペプチドのコドン最適化の結果を示しており、おそらく発現の増加をもたらすコドン最適化が、誘導可能なカスパーゼの機能に対してごくわずかな影響しか及ぼさないことを明らかにしている。これは、おそらく、元のカスパーゼ−９遺伝子における通常のコドンの使用を反映する。
【０４４４】
図６１は、カスパーゼ−９ポリペプチドを発現しているかなりの割合のＴ細胞を排除するために使用され得るカスパーゼ−９ポリペプチドが、インビボにおいて用量反応曲線を有することを示している。このデータは、ほとんどの改変されたＴ細胞をインビボにおいて排除するためには０．５ｍｇ／ｋｇ  ＡＰ１９０３の用量で十分であることも示している。
【０４４５】
図６２は、インビボにおけるＤ３３０Ｅ変異体の用量反応曲線を示している。この研究は、Ｔ細胞の排除が、インビボにおいて滴定可能であることも示している。
【０４４６】
結論：記載されたように、これまでの７８個の変異体のこの解析から、単一変異体の変異のうち、Ｄ３３０変異は、いくらか改善された有効性と、わずかに低下した基底活性とを同時に実現する。Ｎ４０５Ｑ変異体は、ＩＣ５０の４〜５倍増加によって反映されるほんのわずかに低下した有効性とともに非常に低い基底活性を有するので、それらもまた魅力的である。初代Ｔ細胞における実験は、Ｎ４０５Ｑ変異体が、標的細胞を効率的に殺傷し得るが、それは、Ｄ３３０変異体よりもいくらか遅い動態であることから、最初の用量のＡＰ１９０３の後に部分的に殺傷する段階的な自殺スイッチにとって潜在的に非常に有用になり、完全以下の殺傷が、第２の用量のＡＰ１９０３の際に達成され得ることを示した。
【０４４７】
以下の表は、本明細書中で論じられる方法に従って調製され、アッセイされた、様々な改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドに対する基底活性およびＩＣ５０の要旨を提供している。これらの結果は、１回試験されたサブセット（すなわち、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ａ３３１Ｋ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、ならびに以下の二重変異体：Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４ＤまたはＳ１８３Ａを伴うＤ３３０Ａ；およびＳ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６ＤまたはＴ３１７Ｓを伴うＮ４０５Ｑ）を除いては、最低２つの独立したＳＥＡＰアッセイに基づく。４つの多面的アプローチを取ることにより、試験された改変されたキメラカスパーゼ−９ポリペプチドを作製した。「死んだ」改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、もはやＡＰ１９０３に対して応答性でなかった。二重変異体は、ハイフンによって示され、例えば、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑは、３３０位における置換および４０５位における置換を有する改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを表す。
【０４４８】
【表５−１】
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【０４４９】
【表５−２】
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【０４５０】
【化２】
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【０４５１】
【化３】
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【０４５２】
【化４】
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【０４５３】
実施例１０：特定の核酸配列およびアミノ酸配列の例
図４３は、キメラタンパク質およびＣＤ１９マーカーの発現のために使用され得る構築物の例を提示している。この図は、ＳＦＧ．ｉＣ９．２Ａ．２ＣＤ１９．ｇｃｓ構築物を提示している。
【０４５４】
配列番号１、５’ＬＴＲ配列のヌクレオチド配列
ＴＧＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＡＧＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＡＴＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＣＴＣＧＧＧＧＣＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＴＣＣＧＡＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡ
配列番号２、Ｆｖ（ヒトＦＫＢＰ１２ｖ３６）のヌクレオチド配列
ＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡ
配列番号３  Ｆｖ（ヒトＦＫＢＰ１２ｖ３６）のアミノ酸配列
Ｇ  Ｖ  Ｑ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｄ  Ｇ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｋ  Ｒ  Ｇ  Ｑ  Ｔ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｈ  Ｙ  Ｔ  Ｇ  Ｍ  Ｌ  Ｅ  Ｄ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｖ  Ｄ  Ｓ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｒ  Ｎ  Ｋ  Ｐ  Ｆ  Ｋ  Ｆ  Ｍ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｑ  Ｅ  Ｖ  Ｉ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｅ  Ｅ  Ｇ  Ｖ  Ａ  Ｑ  Ｍ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｑ  Ｒ  Ａ  Ｋ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｐ  Ｄ  Ｙ  Ａ  Ｙ  Ｇ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ｈ  Ｐ  Ｇ  Ｉ  Ｉ  Ｐ  Ｐ  Ｈ  Ａ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｆ  Ｄ  Ｖ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｋ  Ｌ  Ｅ
配列番号４、ＧＳリンカーのヌクレオチド配列
ＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡ
配列番号５、ＧＳリンカーのアミノ酸配列
Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｇ
配列番号６、リンカーのヌクレオチド配列（ＧＳリンカーとＣａｓｐ９との間）
ＧＴＣＧＡＣ
配列番号７、リンカーのアミノ酸配列（ＧＳリンカーとＣａｓｐ９との間）
ＶＤ
配列番号８、Ｃａｓｐ９（切断型）のヌクレオチド配列
ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ
配列番号９、カスパーゼ−９（切断型）のアミノ酸配列−ＣＡＲＤドメイン欠失型
Ｇ  Ｆ  Ｇ  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｇ  Ｎ  Ａ  Ｄ  Ｌ  Ａ  Ｙ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｅ  Ｐ  Ｃ  Ｇ  Ｈ  Ｃ  Ｌ  Ｉ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｖ  Ｎ  Ｆ  Ｃ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｒ  Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｄ  Ｃ  Ｅ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｈ  Ｆ  Ｍ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｄ  Ｌ  Ｔ  Ａ  Ｋ  Ｋ  Ｍ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｅ  Ｌ  Ａ  Ｑ  Ｑ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｄ  Ｃ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｈ  Ｇ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｈ  Ｌ  Ｑ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｇ  Ｃ  Ｐ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｅ  Ｋ  Ｉ  Ｖ  Ｎ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  Ｃ  Ｐ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｉ  Ｑ  Ａ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ｆ  Ｅ  Ｖ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｅ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｄ  Ａ  Ｔ  Ｐ  Ｆ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｄ  Ｑ  Ｌ  Ｄ  Ａ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｐ  Ｔ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｋ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｅ  Ｑ  Ｗ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｒ  Ｖ  Ａ  Ｎ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ｑ  Ｍ  Ｐ  Ｇ  Ｃ  Ｆ  Ｎ  Ｆ  Ｌ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｋ  Ｔ  Ｓ
配列番号１０、リンカーのヌクレオチド配列（カスパーゼ−９と２Ａとの間）
ＧＣＴＡＧＣＡＧＡ
配列番号１１、リンカーのアミノ酸配列（カスパーゼ−９と２Ａとの間）
ＡＳＲ
配列番号１２、キャプシドタンパク質前駆体由来のＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス−２Ａのヌクレオチド配列
ＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣ
配列番号１３、キャプシドタンパク質前駆体由来のＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス−２Ａのアミノ酸配列
Ａ  Ｅ  Ｇ  Ｒ  Ｇ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｔ  Ｃ  Ｇ  Ｄ  Ｖ  Ｅ  Ｅ  Ｎ  Ｐ  Ｇ  Ｐ
配列番号１４、ヒトＣＤ１９（Δ細胞質ドメイン）のヌクレオチド配列（太字は膜貫通ドメイン）
ＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＴＴＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣ
配列番号１５、ヒトＣＤ１９（Δ細胞質ドメイン）のアミノ酸配列
Ｍ  Ｐ  Ｐ  Ｐ  Ｒ  Ｌ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｌ  Ｌ  Ｆ  Ｌ  Ｔ  Ｐ  Ｍ  Ｅ  Ｖ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ｅ  Ｐ  Ｌ  Ｖ  Ｖ  Ｋ  Ｖ  Ｅ  Ｅ  Ｇ  Ｄ  Ｎ  Ａ  Ｖ  Ｌ  Ｑ  Ｃ  Ｌ  Ｋ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  Ｄ  Ｇ  Ｐ  Ｔ  Ｑ  Ｑ  Ｌ  Ｔ  Ｗ  Ｓ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｐ  Ｌ  Ｋ  Ｐ  Ｆ  Ｌ  Ｋ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｌ  Ｐ  Ｇ  Ｌ  Ｇ  Ｉ  Ｈ  Ｍ  Ｒ  Ｐ  Ｌ  Ａ  Ｉ  Ｗ  Ｌ  Ｆ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｖ  Ｓ  Ｑ  Ｑ  Ｍ  Ｇ  Ｇ  Ｆ  Ｙ  Ｌ  Ｃ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ｅ  Ｋ  Ａ  Ｗ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｖ  Ｎ  Ｖ  Ｅ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｅ  Ｌ  Ｆ  Ｒ  Ｗ  Ｎ  Ｖ  Ｓ  Ｄ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｇ  Ｃ  Ｇ  Ｌ  Ｋ  Ｎ  Ｒ  Ｓ  Ｓ  Ｅ  Ｇ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｍ  Ｓ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｙ  Ｖ  Ｗ  Ａ  Ｋ  Ｄ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ｉ  Ｗ  Ｅ  Ｇ  Ｅ  Ｐ  Ｐ  Ｃ  Ｌ  Ｐ  Ｐ  Ｒ  Ｄ  Ｓ  Ｌ  Ｎ  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ｑ  Ｄ  Ｌ  Ｔ  Ｍ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｔ  Ｌ  Ｗ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｐ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｓ  Ｒ  Ｇ  Ｐ  Ｌ  Ｓ  Ｗ  Ｔ  Ｈ  Ｖ  Ｈ  Ｐ  Ｋ  Ｇ  Ｐ  Ｋ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｓ  Ｌ  Ｅ  Ｌ  Ｋ  Ｄ  Ｄ  Ｒ  Ｐ  Ａ  Ｒ  Ｄ  Ｍ  Ｗ  Ｖ  Ｍ  Ｅ  Ｔ  Ｇ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｐ  Ｒ  Ａ  Ｔ  Ａ  Ｑ  Ｄ  Ａ  Ｇ  Ｋ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｈ  Ｒ  Ｇ  Ｎ  Ｌ  Ｔ  Ｍ  Ｓ  Ｆ  Ｈ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｔ  Ａ  Ｒ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｗ  Ｈ  Ｗ  Ｌ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｇ  Ｇ  Ｗ  Ｋ  Ｖ  Ｓ  Ａ  Ｖ  Ｔ  Ｌ  Ａ  Ｙ  Ｌ  Ｉ  Ｆ  Ｃ  Ｌ  Ｃ  Ｓ  Ｌ  Ｖ  Ｇ  Ｉ  Ｌ  Ｈ  Ｌ  Ｑ  Ｒ  Ａ  Ｌ  Ｖ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｋ  Ｒ  Ｍ  Ｔ  Ｄ  Ｐ  Ｔ  Ｒ  Ｒ  Ｆ
配列番号１６、３’ＬＴＲのヌクレオチド配列
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配列番号１７、発現ベクター構築物のヌクレオチド配列−キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列ならびに５’および３’ＬＴＲ配列、およびさらなるベクター配列
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配列番号１８、（ＸｈｏＩ／ＳａｌＩリンカーを有するＦｖ’Ｆｖｌｓのヌクレオチド配列（Ｆｖ’の中の小文字はゆらいだコドン））
ｃｔｃｇａｇＧＧｃＧＴｃＣＡａＧＴｃＧＡａＡＣｃＡＴｔａｇｔＣＣｃＧＧｃＧＡｔＧＧｃａＧａＡＣａＴＴｔＣＣｔＡＡａａＧｇＧＧａＣＡａＡＣａＴＧｔＧＴｃＧＴｃＣＡｔＴＡｔＡＣａＧＧｃＡＴＧｔＴｇＧＡｇＧＡｃＧＧｃＡＡａＡＡｇＧＴｇＧＡｃａｇｔａｇｔａＧａＧＡｔｃＧｃＡＡｔＡＡａＣＣｔＴＴｃＡＡａＴＴｃＡＴＧｔＴｇＧＧａＡＡａＣＡａＧＡａＧＴｃＡＴｔａＧｇＧＧａＴＧＧＧＡｇＧＡｇＧＧｃＧＴｇＧＣｔＣＡａＡＴＧｔｃｃＧＴｃＧＧｃＣＡａｃＧｃＧＣｔＡＡｇＣＴｃＡＣｃＡＴｃａｇｃＣＣｃＧＡｃＴＡｃＧＣａＴＡｃＧＧｃＧＣｔＡＣｃＧＧａＣＡｔＣＣｃＧＧａＡＴｔＡＴｔＣＣｃＣＣｔＣＡｃＧＣｔＡＣｃｔＴｇＧＴｇＴＴｔＧＡｃＧＴｃＧＡａＣＴｇｔＴｇＡＡｇＣＴｃＧＡａｇｔｃｇａｇｇｇａｇｔｇｃａｇｇｔｇｇａａａｃｃａｔｃｔｃｃｃｃａｇｇａｇａｃｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｃｃａａｇｃｇｃｇｇｃｃａｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｃａｃｔａｃａｃｃｇｇｇａｔｇｃｔｔｇａａｇａｔｇｇａａａｇａａａｇｔｔｇａｔｔｃｃｔｃｃｃｇｇｇａｃａｇａａａｃａａｇｃｃｃｔｔｔａａｇｔｔｔａｔｇｃｔａｇｇｃａａｇｃａｇｇａｇｇｔｇａｔｃｃｇａｇｇｃｔｇｇｇａａｇａａｇｇｇｇｔｔｇｃｃｃａｇａｔｇａｇｔｇｔｇｇｇｔｃａｇａｇａｇｃｃａａａｃｔｇａｃｔａｔａｔｃｔｃｃａｇａｔｔａｔｇｃｃｔａｔｇｇｔｇｃｃａｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇｇｃａｔｃａｔｃｃｃａｃｃａｃａｔｇｃｃａｃｔｃｔｃｇｔｃｔｔｃｇａｔｇｔｇｇａｇｃｔｔｃｔａａａａｃｔｇｇａａｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｇａｔｃｃｇｇａｇｔｃｇａｇ
配列番号１９，（ＦＶ’ＦＶＬＳのアミノ酸配列）
ＧｌｙＶａｌＧｌｎＶａｌＧｌｕＴｈｒＩｌｅＳｅｒＰｒｏＧｌｙＡｓｐＧｌｙＡｒｇＴｈｒＰｈｅＰｒｏＬｙｓＡｒｇＧｌｙＧｌｎＴｈｒＣｙｓＶａｌＶａｌＨｉｓＴｙｒＴｈｒＧｌｙＭｅｔＬｅｕＧｌｕＡｓｐＧｌｙＬｙｓＬｙｓＶａｌＡｓｐＳｅｒＳｅｒＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｓｎＬｙｓＰｒｏＰｈｅＬｙｓＰｈｅＭｅｔＬｅｕＧｌｙＬｙｓＧｌｎＧｌｕＶａｌＩｌｅＡｒｇＧｌｙＴｒｐＧｌｕＧｌｕＧｌｙＶａｌＡｌａＧｌｎＭｅｔＳｅｒＶａｌＧｌｙＧｌｎＡｒｇＡｌａＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＳｅｒＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａＴｙｒＧｌｙＡｌａＴｈｒＧｌｙＨｉｓＰｒｏＧｌｙＩｌｅＩｌｅＰｒｏＰｒｏＨｉｓＡｌａＴｈｒＬｅｕＶａｌＰｈｅＡｓｐＶａｌＧｌｕＬｅｕＬｅｕＬｙｓＬｅｕＧｌｕ  （ＶａｌＧｌｕ）ＧｌｙＶａｌＧｌｎＶａｌＧｌｕＴｈｒＩｌｅＳｅｒＰｒｏＧｌｙＡｓｐＧｌｙＡｒｇＴｈｒＰｈｅＰｒｏＬｙｓＡｒｇＧｌｙＧｌｎＴｈｒＣｙｓＶａｌＶａｌＨｉｓＴｙｒＴｈｒＧｌｙＭｅｔＬｅｕＧｌｕＡｓｐＧｌｙＬｙｓＬｙｓＶａｌＡｓｐＳｅｒＳｅｒＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｓｎＬｙｓＰｒｏＰｈｅＬｙｓＰｈｅＭｅｔＬｅｕＧｌｙＬｙｓＧｌｎＧｌｕＶａｌＩｌｅＡｒｇＧｌｙＴｒｐＧｌｕＧｌｕＧｌｙＶａｌＡｌａＧｌｎＭｅｔＳｅｒＶａｌＧｌｙＧｌｎＡｒｇＡｌａＬｙｓＬｅｕＴｈｒＩｌｅＳｅｒＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａＴｙｒＧｌｙＡｌａＴｈｒＧｌｙＨｉｓＰｒｏＧｌｙＩｌｅＩｌｅＰｒｏＰｒｏＨｉｓＡｌａＴｈｒＬｅｕＶａｌＰｈｅＡｓｐＶａｌＧｌｕＬｅｕＬｅｕＬｙｓＬｅｕＧｌｕ−ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ
配列番号２０、ＦＫＢＰ１２ｖ３６（残基２〜１０８）
ＳＧＧＧＳＧリンカー（６ａａ）
ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）
ＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡｇＡＣｔＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣｇＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ
配列番号２１、ＦＫＢＰ１２ｖ３６（残基２〜１０８）
Ｇ  Ｖ  Ｑ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｄ  Ｇ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｋ  Ｒ  Ｇ  Ｑ  Ｔ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｈ  Ｙ  Ｔ  Ｇ  Ｍ  Ｌ  Ｅ  Ｄ  Ｇ  Ｋ  Ｋ  Ｖ  Ｄ  Ｓ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｒ  Ｎ  Ｋ  Ｐ  Ｆ  Ｋ  Ｆ  Ｍ  Ｌ  Ｇ  Ｋ  Ｑ  Ｅ  Ｖ  Ｉ  Ｒ  Ｇ  Ｗ  Ｅ  Ｅ  Ｇ  Ｖ  Ａ  Ｑ  Ｍ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｑ  Ｒ  Ａ  Ｋ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｐ  Ｄ  Ｙ  Ａ  Ｙ  Ｇ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ｈ  Ｐ  Ｇ  Ｉ  Ｉ  Ｐ  Ｐ  Ｈ  Ａ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｆ  Ｄ  Ｖ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｋ  Ｌ  Ｅ
配列番号２２、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）
Ｇ  Ｆ  Ｇ  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｇ  Ｎ  Ａ  Ｄ  Ｌ  Ａ  Ｙ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｅ  Ｐ  Ｃ  Ｇ  Ｈ  Ｃ  Ｌ  Ｉ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｖ  Ｎ  Ｆ  Ｃ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｒ  Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｄ  Ｃ  Ｅ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｈ  Ｆ  Ｍ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｄ  Ｌ  Ｔ  Ａ  Ｋ  Ｋ  Ｍ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｅ  Ｌ  Ａ  Ｒ  Ｑ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｄ  Ｃ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｈ  Ｇ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｈ  Ｌ  Ｑ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｇ  Ｃ  Ｐ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｅ  Ｋ  Ｉ  Ｖ  Ｎ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  Ｃ  Ｐ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｉ  Ｑ  Ａ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ｆ  Ｅ  Ｖ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｅ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｄ  Ａ  Ｔ  Ｐ  Ｆ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｄ  Ｑ  Ｌ  Ｄ  Ａ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｐ  Ｔ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｋ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｅ  Ｑ  Ｗ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｒ  Ｖ  Ａ  Ｎ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ｑ  Ｍ  Ｐ  Ｇ  Ｃ  Ｆ  Ｎ  Ｆ  Ｌ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｋ  Ｔ  Ｓ  
配列番号２３、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａのヌクレオチド配列
ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣｇＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ
配列番号２４、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａのアミノ酸配列
Ｇ  Ｆ  Ｇ  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｇ  Ｎ  Ａ  Ｄ  Ｌ  Ａ  Ｙ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｅ  Ｐ  Ｃ  Ｇ  Ｈ  Ｃ  Ｌ  Ｉ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｖ  Ｎ  Ｆ  Ｃ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｒ  Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｄ  Ｃ  Ｅ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｈ  Ｆ  Ｍ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｄ  Ｌ  Ｔ  Ａ  Ｋ  Ｋ  Ｍ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｅ  Ｌ  Ａ  Ｒ  Ｑ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｄ  Ｃ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｈ  Ｇ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｈ  Ｌ  Ｑ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｇ  Ｃ  Ｐ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｅ  Ｋ  Ｉ  Ｖ  Ｎ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  Ｃ  Ｐ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｉ  Ｑ  Ａ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ｆ  Ｅ  Ｖ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｅ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｄ  Ａ  Ｔ  Ｐ  Ｆ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｄ  Ｑ  Ｌ  Ａ  Ａ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｐ  Ｔ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｋ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｅ  Ｑ  Ｗ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｒ  Ｖ  Ａ  Ｎ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ｑ  Ｍ  Ｐ  Ｇ  Ｃ  Ｆ  Ｎ  Ｆ  Ｌ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｋ  Ｔ  Ｓ  
配列番号２５、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｎ４０５Ｑのヌクレオチド配列
ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣｇＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ
配列番号２６、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｎ４０５Ｑのアミノ酸配列
Ｇ  Ｆ  Ｇ  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｇ  Ｎ  Ａ  Ｄ  Ｌ  Ａ  Ｙ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｅ  Ｐ  Ｃ  Ｇ  Ｈ  Ｃ  Ｌ  Ｉ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｖ  Ｎ  Ｆ  Ｃ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｒ  Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｄ  Ｃ  Ｅ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｈ  Ｆ  Ｍ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｄ  Ｌ  Ｔ  Ａ  Ｋ  Ｋ  Ｍ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｅ  Ｌ  Ａ  Ｒ  Ｑ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｄ  Ｃ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｈ  Ｇ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｈ  Ｌ  Ｑ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｇ  Ｃ  Ｐ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｅ  Ｋ  Ｉ  Ｖ  Ｎ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  Ｃ  Ｐ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｉ  Ｑ  Ａ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ｆ  Ｅ  Ｖ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｅ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｄ  Ａ  Ｔ  Ｐ  Ｆ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｄ  Ｑ  Ｌ  Ｄ  Ａ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｐ  Ｔ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｋ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｅ  Ｑ  Ｗ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｒ  Ｖ  Ａ  Ｎ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ｑ  Ｍ  Ｐ  Ｇ  Ｃ  Ｆ  Ｑ  Ｆ  Ｌ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｋ  Ｔ  Ｓ  
配列番号２７、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａ  Ｎ４０５Ｑのヌクレオチド配列
ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣｇＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ
配列番号２８、ΔＣａｓｐ９（残基１３５〜４１６）Ｄ３３０Ａ  Ｎ４０５Ｑのアミノ酸配列
Ｇ  Ｆ  Ｇ  Ｄ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｇ  Ｎ  Ａ  Ｄ  Ｌ  Ａ  Ｙ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｍ  Ｅ  Ｐ  Ｃ  Ｇ  Ｈ  Ｃ  Ｌ  Ｉ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｖ  Ｎ  Ｆ  Ｃ  Ｒ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｒ  Ｔ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｉ  Ｄ  Ｃ  Ｅ  Ｋ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｈ  Ｆ  Ｍ  Ｖ  Ｅ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｄ  Ｌ  Ｔ  Ａ  Ｋ  Ｋ  Ｍ  Ｖ  Ｌ  Ａ  Ｌ  Ｌ  Ｅ  Ｌ  Ａ  Ｒ  Ｑ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ａ  Ｌ  Ｄ  Ｃ  Ｃ  Ｖ  Ｖ  Ｖ  Ｉ  Ｌ  Ｓ  Ｈ  Ｇ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｈ  Ｌ  Ｑ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｇ  Ｃ  Ｐ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｅ  Ｋ  Ｉ  Ｖ  Ｎ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｓ  Ｃ  Ｐ  Ｓ  Ｌ  Ｇ  Ｇ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｉ  Ｑ  Ａ  Ｃ  Ｇ  Ｇ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｄ  Ｈ  Ｇ  Ｆ  Ｅ  Ｖ  Ａ  Ｓ  Ｔ  Ｓ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｅ  Ｓ  Ｐ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｐ  Ｅ  Ｐ  Ｄ  Ａ  Ｔ  Ｐ  Ｆ  Ｑ  Ｅ  Ｇ  Ｌ  Ｒ  Ｔ  Ｆ  Ｄ  Ｑ  Ｌ  Ａ  Ａ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｐ  Ｔ  Ｐ  Ｓ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｔ  Ｆ  Ｐ  Ｇ  Ｆ  Ｖ  Ｓ  Ｗ  Ｒ  Ｄ  Ｐ  Ｋ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｗ  Ｙ  Ｖ  Ｅ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｄ  Ｉ  Ｆ  Ｅ  Ｑ  Ｗ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｌ  Ｒ  Ｖ  Ａ  Ｎ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ｑ  Ｍ  Ｐ  Ｇ  Ｃ  Ｆ  Ｑ  Ｆ  Ｌ  Ｒ  Ｋ  Ｋ  Ｌ  Ｆ  Ｆ  Ｋ  Ｔ  Ｓ  
配列番号２９、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）のヌクレオチド配列
ＧＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＴＡＧＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＣＴＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＡＴＴＧＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡ
配列番号３０、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ１）のアミノ酸配列
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号３１、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）のヌクレオチド配列
ＧＧａＧＴｇＣＡｇＧＴｇＧＡｇＡＣｇＡＴｔＡＧｔＣＣｔＧＧｇＧＡｔＧＧｇＡＧａＡＣｃＴＴｔＣＣａＡＡｇＣＧｃＧＧｔＣＡｇＡＣｃＴＧｔＧＴｔＧＴｃＣＡｃＴＡｃＡＣｃＧＧｔＡＴＧＣＴｇＧＡｇＧＡｃＧＧｇＡＡｇＡＡｇＧＴｇＧＡｃｔｃＴｔｃａｃＧｃＧＡｔＣＧｃＡＡｔＡＡｇＣＣｔＴＴｃＡＡｇＴＴｃＡＴＧｃＴｃＧＧｃＡＡｇＣＡｇＧＡｇＧＴｇＡＴｃｃＧＧＧＧｇＴＧＧＧＡｇＧＡｇＧＧｃＧＴｇＧＣｔＣＡｇＡＴＧＴＣｇＧＴｃＧＧｇＣＡａＣＧａＧＣｇＡＡｇＣＴｔＡＣｃＡＴｃＴＣａＣＣｃＧＡｃＴＡｃＧＣｇＴＡｔＧＧｇＧＣａＡＣｇＧＧｇＣＡｔＣＣｇＧＧａＡＴｔＡＴｃＣＣｔＣＣｃＣＡｃＧＣｔＡＣｇＣＴｃＧＴａＴＴｃＧＡｔＧＴｇＧＡｇｃＴｃｔｔｇＡＡｇＣＴｔＧａｇ
配列番号３２、ＦＫＢＰｖ３６（Ｆｖ２）のアミノ酸配列
ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号３３、ΔＣＤ１９のヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＴＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＣＣＡＡＣＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴＴＧＣＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＣＣＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＧＣＣＣＧＧＡＴＣＴＡＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＴＣＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＣＧＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＴＡＣＡＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＡＣＣＣＧＣＡＣＧＣＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＴＡＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＴＡＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＡＴＴＣＴＧＡ
配列番号３４、ΔＣＤ１９のアミノ酸配列
ＭＰＰＰＲＬＬＦＦＬＬＦＬＴＰＭＥＶＲＰＥＥＰＬＶＶＫＶＥＥＧＤＮＡＶＬＱＣＬＫＧＴＳＤＧＰＴＱＱＬＴＷＳＲＥＳＰＬＫＰＦＬＫＬＳＬＧＬＰＧＬＧＩＨＭＲＰＬＡＩＷＬＦＩＦＮＶＳＱＱＭＧＧＦＹＬＣＱＰＧＰＰＳＥＫＡＷＱＰＧＷＴＶＮＶＥＧＳＧＥＬＦＲＷＮＶＳＤＬＧＧＬＧＣＧＬＫＮＲＳＳＥＧＰＳＳＰＳＧＫＬＭＳＰＫＬＹＶＷＡＫＤＲＰＥＩＷＥＧＥＰＰＣＬＰＰＲＤＳＬＮＱＳＬＳＱＤＬＴＭＡＰＧＳＴＬＷＬＳＣＧＶＰＰＤＳＶＳＲＧＰＬＳＷＴＨＶＨＰＫＧＰＫＳＬＬＳＬＥＬＫＤＤＲＰＡＲＤＭＷＶＭＥＴＧＬＬＬＰＲＡＴＡＱＤＡＧＫＹＹＣＨＲＧＮＬＴＭＳＦＨＬＥＩＴＡＲＰＶＬＷＨＷＬＬＲＴＧＧＷＫＶＳＡＶＴＬＡＹＬＩＦＣＬＣＳＬＶＧＩＬＨＬＱＲＡＬＶＬＲＲＫＲＫＲＭＴＤＰＴＲＲＦ＊
コドン最適化されたｉＣａｓｐ９−Ｎ４０５Ｑ−２Ａ−ΔＣＤ１９配列：（ヌクレオチド配列の名称の後の．ｃｏは、それが、コドン最適化されていること（またはアミノ酸配列が、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされていること）を示唆する。
【０４５５】
配列番号３５、ＦＫＢＰｖ３６．ｃｏ（Ｆｖ３）のヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＡＣＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＴＡＣＴＧＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡ
配列番号３６、ＦＫＢＰｖ３６．ｃｏ（Ｆｖ３）のアミノ酸配列
ＭＬＥＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ
配列番号３７、リンカー．ｃｏのヌクレオチド配列
ＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡ
配列番号３８、リンカー．ｃｏのアミノ酸配列
ＳＧＧＧＳＧ
配列番号３９、カスパーゼ−９．ｃｏのヌクレオチド配列
ＧＴＧＧＡＣＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＧＧＧＣＴＧＣＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＴＣＴＡＧＧＧＣＣ
配列番号４０、カスパーゼ−９．ｃｏのアミノ酸配列
ＶＤＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＱＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳＲＡ
配列番号４１、リンカー．ｃｏのヌクレオチド配列
ＣＣＧＣＧＧ
配列番号４２、リンカー．ｃｏのアミノ酸配列
ＰＲ
配列番号４２：Ｔ２Ａ．ｃｏのヌクレオチド配列
ＧＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡ
配列番号４３：Ｔ２Ａ．ｃｏのアミノ酸配列
ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号４３：ΔＣＤ１９．ｃｏのヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＡＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＡＣＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＧＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＧＴＧＣＡＴＣＣＴＡＡＧＧＧＧＣＣＡＡＡＡＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＡ
配列番号４３：ΔＣＤ１９．ｃｏのアミノ酸配列
ＭＰＰＰＲＬＬＦＦＬＬＦＬＴＰＭＥＶＲＰＥＥＰＬＶＶＫＶＥＥＧＤＮＡＶＬＱＣＬＫＧＴＳＤＧＰＴＱＱＬＴＷＳＲＥＳＰＬＫＰＦＬＫＬＳＬＧＬＰＧＬＧＩＨＭＲＰＬＡＩＷＬＦＩＦＮＶＳＱＱＭＧＧＦＹＬＣＱＰＧＰＰＳＥＫＡＷＱＰＧＷＴＶＮＶＥＧＳＧＥＬＦＲＷＮＶＳＤＬＧＧＬＧＣＧＬＫＮＲＳＳＥＧＰＳＳＰＳＧＫＬＭＳＰＫＬＹＶＷＡＫＤＲＰＥＩＷＥＧＥＰＰＣＬＰＰＲＤＳＬＮＱＳＬＳＱＤＬＴＭＡＰＧＳＴＬＷＬＳＣＧＶＰＰＤＳＶＳＲＧＰＬＳＷＴＨＶＨＰＫＧＰＫＳＬＬＳＬＥＬＫＤＤＲＰＡＲＤＭＷＶＭＥＴＧＬＬＬＰＲＡＴＡＱＤＡＧＫＹＹＣＨＲＧＮＬＴＭＳＦＨＬＥＩＴＡＲＰＶＬＷＨＷＬＬＲＴＧＧＷＫＶＳＡＶＴＬＡＹＬＩＦＣＬＣＳＬＶＧＩＬＨＬＱＲＡＬＶＬＲＲＫＲＫＲＭＴＤＰＴＲＲＦ＊
【０４５６】
【表６−１】
0006537984.tif 000014
【０４５７】
【表６−２】
0006537984.tif 000015
【０４５８】
【表６−３】
0006537984.tif 000016
【０４５９】
【表６−４】
0006537984.tif 000017
【０４６０】
【表６−５】
0006537984.tif 000018
【０４６１】
【表６−６】
0006537984.tif 000019
【０４６２】
【表６−７】
0006537984.tif 000020
【０４６３】
【表６−８】
0006537984.tif 000021
【０４６４】
【表６−９】
0006537984.tif 000022
【０４６５】
【表６−１０】
0006537984.tif 000023
【０４６６】
【表６−１１】
0006537984.tif 000024
【０４６７】
【表６−１２】
0006537984.tif 000025
【０４６８】
【表６−１３】
0006537984.tif 000026
【０４６９】
【表６−１４】
0006537984.tif 000027
【０４７０】
【表６−１５】
0006537984.tif 000028
【０４７１】
【表６−１６】
0006537984.tif 000029
【０４７２】
【表６−１７】
0006537984.tif 000030
【０４７３】
【表６−１８】
0006537984.tif 000031
【０４７４】
【表６−１９】
0006537984.tif 000032
【０４７５】
【表６−２０】
0006537984.tif 000033
【０４７６】
【表６−２１】
0006537984.tif 000034
【０４７７】
【表６−２２】
0006537984.tif 000035
【０４７８】
【表６−２３】
0006537984.tif 000036
【０４７９】
【表６−２４】
0006537984.tif 000037
【０４８０】
【表６−２５】
0006537984.tif 000038
【０４８１】
【表６−２６】
0006537984.tif 000039
【０４８２】
【表６−２７】
0006537984.tif 000040
【０４８３】
【表６−２８】
0006537984.tif 000041
【０４８４】
【表６−２９】
0006537984.tif 000042
【０４８５】
【表６−３０】
0006537984.tif 000043
【０４８６】
実施例１１：代表的な実施形態
本技術のある特定の実施形態の例を、この後に提供する。
【０４８７】
Ａ１．ヒト患者にドナーＴ細胞を投与する方法であって、その方法は、
ａ）プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でドナー細胞培養物中のヒトドナーＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程（ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）；および
ｂ）その形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞をヒト患者に投与する工程
を含む、方法。
【０４８８】
Ａ１．５  前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａのアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載の方法。
【０４８９】
Ａ１．６．前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載の方法。
【０４９０】
Ａ１．７．前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａのアミノ酸置換を含み、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載の方法。
【０４９１】
Ａ２．ドナーＴ細胞移植後のヒト患者における移植片対宿主病の影響を減少させる方法であって、その方法は、
ａ）プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でドナー細胞培養物中のヒトドナーＴ細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程（ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）
ｂ）その形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞をその患者に投与する工程；
ｃ）（ｂ）の後の患者における移植片対宿主病の有無を検出する工程；および
ｄ）多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを、移植片対宿主病の存在が検出された患者に投与する工程
を含む、方法。
【０４９２】
Ａ３．幹細胞移植の方法であって、その方法は、
ａ）ハプロタイプ一致幹細胞移植片をヒト患者に投与する工程；および
ｂ）ハプロタイプ一致ドナーＴ細胞を患者に投与する工程（ここで、そのＴ細胞には、ハプロタイプ一致ドナー細胞培養物において、プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸がトランスフェクトされるかまたは形質導入される）
を含む、方法。
【０４９３】
Ａ４．前記ハプロタイプ一致幹細胞移植片が、ＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植片である、実施形態Ａ３に記載の方法。
【０４９４】
Ａ５．前記ヒトドナーＴ細胞が、患者のＴ細胞とハプロタイプ一致である、実施形態Ａ１〜Ａ４のいずれかに記載の方法。
【０４９５】
Ａ６  前記患者が、癌を有する、実施形態Ａ１〜Ａ５またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０４９６】
Ａ７  前記患者が、固形腫瘍を有する、実施形態Ａ１〜Ａ６またはＡ５８のいずれかに記載の方法。
【０４９７】
Ａ８  前記癌が、前記患者の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ａ８またはＡ５９に記載の方法。
【０４９８】
Ａ９  前記患者が、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ａ１〜Ａ８またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０４９９】
Ａ１０  前記患者が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている、実施形態Ａ１〜９またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５００】
Ａ１１  前記患者が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ａ１〜Ａ１０またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５０１】
Ａ１２  前記プロモーターが、活性化Ｔ細胞において活性化される、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれかに記載の方法。
【０５０２】
Ａ１３．前記プロモーターが、５’ＬＴＲ配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ１２のいずれかに記載の方法。
【０５０３】
Ａ１４．前記キメラタンパク質が、マーカーポリペプチドをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ１３またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５０４】
Ａ１５．前記マーカーポリペプチドが、ＣＤ１９ポリペプチドである、実施形態Ａ１４に記載の方法。
【０５０５】
Ａ１６．前記マーカーを発現する細胞が前記患者への投与のために選択される選択工程をさらに含む、実施形態Ａ１４に記載の方法。
【０５０６】
Ａ１７．前記細胞が、免疫磁気選択によって選択される、実施形態Ａ１４に記載の方法。
【０５０７】
Ａ１８．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ａ１〜Ａ１７またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５０８】
Ａ１９．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、カスパーゼ動員ドメインを欠く、実施形態Ａ１８に記載の方法。
【０５０９】
Ａ２０．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号２４、２６もしくは２８からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むか、あるいは配列番号８のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントによってコードされる、実施形態Ａ１８に記載の方法。
【０５１０】
Ａ２１．前記ドナー細胞培養物が、骨髄サンプルから調製される、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれかに記載の方法。
【０５１１】
Ａ２２  前記ドナー細胞培養物が、末梢血から調製される、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれかに記載の方法。
【０５１２】
Ａ２３．前記ドナー細胞培養物が、ドナー末梢血単核球から調製される、実施形態Ａ２２に記載の方法。
【０５１３】
Ａ２４．前記ドナーＴ細胞が、トランスフェクションまたは形質導入の前に前記ドナー細胞培養物から同種異系枯渇される、実施形態Ａ１〜Ａ２３のいずれかに記載の方法。
【０５１４】
Ａ２５．形質導入されたまたはトランスフェクトされた前記Ｔ細胞が、前記患者への投与の前に、ＩＬ−２の存在下において培養される、実施形態Ａ１〜Ａ２４のいずれかに記載の方法。
【０５１５】
Ａ２６．前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれかに記載の方法。
【０５１６】
Ａ２７．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ａ１〜Ａ２６またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５１７】
Ａ２８．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ａ１〜Ａ２７またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５１８】
Ａ２９．前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６様アナログリガンドである、実施形態Ａ２６またはＡ５９に記載の方法。
【０５１９】
Ａ３０．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ａ２６またはＡ５９に記載の方法。
【０５２０】
Ａ３１．前記多量体リガンドが、移植片対宿主病を処置するために投与される、実施形態Ａ２６またはＡ５９に記載の方法。
【０５２１】
Ａ３２．前記多量体リガンドが投与される前に、前記患者が、移植片対宿主病の症状を示す、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれかに記載の方法。
【０５２２】
Ａ３３．前記患者が、ステージ０の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、実施形態Ａ３２またはＡ５９に記載の方法。
【０５２３】
Ａ３４  前記患者が、ステージ１の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、実施形態Ａ３２またはＡ５９に記載の方法。
【０５２４】
Ａ３５  前記患者が、ステージ２の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、実施形態Ａ３２またはＡ５９に記載の方法。
【０５２５】
Ａ３６  前記患者が、ステージ３の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、実施形態Ａ３２またはＡ５９に記載の方法。
【０５２６】
Ａ３７  前記患者が、ステージ４の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、実施形態Ａ３２またはＡ５９に記載の方法。
【０５２７】
Ａ３８．２以上の用量の前記多量体リガンドが、投与される、実施形態Ａ３２またはＡ５９に記載の方法。
【０５２８】
Ａ３９．前記多量体リガンドの投与の後に、アロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、実施形態Ａ３２に記載の方法。
【０５２９】
Ａ４０．前記アロ反応性Ｔ細胞が、前記マーカーおよびＣＤ３を発現する、実施形態Ａ３１〜Ａ３９のいずれかに記載の方法。
【０５３０】
Ａ４１．前記アロ反応性Ｔ細胞の数が、前記多量体リガンドの投与後に約９０％以上減少する、実施形態Ａ３１〜Ａ４０のいずれかに記載の方法。
【０５３１】
Ａ４２．増殖可能でありウイルスおよび真菌に反応性であるドナーＴ細胞が、前記多量体リガンドの投与の後に前記患者内で生き残る、実施形態Ａ３１〜Ａ４１のいずれかに記載の方法。
【０５３２】
Ａ４３．増殖可能であり前記患者内の腫瘍細胞に反応性であるドナーＴ細胞が、前記多量体リガンドの投与の後に前記患者内で生き残る、実施形態Ａ３１〜Ａ４２のいずれかに記載の方法。
【０５３３】
Ａ４４．前記患者が、前記ドナーＴ細胞の投与の前または投与と同時にハプロ−ＣＤ３４＋幹細胞移植片を投与される、実施形態Ａ１〜Ａ４３のいずれかに記載の方法。
【０５３４】
Ａ４５．前記ドナーＴ細胞が、レトロウイルスベクターで形質導入されるかまたはトランスフェクトされる、実施形態Ａ１〜Ａ４４のいずれかに記載の方法。
【０５３５】
Ａ４６．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ａ４５に記載の方法。
【０５３６】
Ａ４７．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ａ４５に記載の方法。
【０５３７】
Ａ４８  前記トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞が、遺伝子発現ベクターでさらにトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ａ１〜Ａ４７のいずれかに記載の方法。
【０５３８】
Ａ４９．前記患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、その患者に追加の用量の前記多量体リガンドを投与するか否か決定する工程をさらに含む、実施形態Ａ３１〜Ａ４８またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５３９】
Ａ５０．追加の用量の前記多量体リガンドを前記患者に投与するか否か決定する工程をさらに含み、その判定は、その患者におけるマーカーおよびＣＤ３陽性Ｔ細胞の量または濃度に基づく、実施形態Ａ３１〜Ａ４８またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５４０】
Ａ５１．少なくとも１×１０６個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記患者に投与される、実施形態Ａ１〜Ａ５０のいずれかに記載の方法。
【０５４１】
Ａ５２．少なくとも１×１０７個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記患者に投与される、実施形態Ａ１〜Ａ５０のいずれかに記載の方法。
【０５４２】
Ａ５３．少なくとも１×１０８個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記患者に投与される、実施形態Ａ１〜Ａ５０のいずれかに記載の方法。
【０５４３】
Ａ５４．前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
その患者において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者への多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ５３のいずれかに記載の方法。
【０５４４】
Ａ５５．前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
その患者において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドをその患者に投与するべきであるか、またはその後にその患者に投与される多量体リガンドの投与量を調整するかを決定する工程
をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ５３のいずれかに記載の方法。
【０５４５】
Ａ５６．前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを含む情報を受け取る工程；および
その患者において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者への多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ５３またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５４６】
Ａ５７．前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
その被験体において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に移植片対宿主病の有無またはステージを伝える工程
をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ５３またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５４７】
Ａ５８．前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
その被験体において特定された移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者に投与される多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ５３またはＡ５９のいずれかに記載の方法。
【０５４８】
Ａ５９．細胞治療を受けた患者における移植片対宿主病を処置する方法であって、ここで、その治療のために導入された細胞の１つ以上は、キメラタンパク質を発現し、そのキメラタンパク質は、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含み、その方法は、その多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドをその患者に投与する工程を含む、方法。
【０５４９】
Ａ６０．前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドの投与の後に、アロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、実施形態Ａ１〜Ａ５９のいずれかに記載の方法。
【０５５０】
Ａ６１．細胞分裂を起こしていないアロ反応性Ｔ細胞が、消失される、実施形態Ａ６０に記載の方法。
【０５５１】
Ａ６２．前記多量体リガンドの投与の２時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が、消失される、実施形態Ａ６０に記載の方法。
【０５５２】
Ａ６３．前記多量体リガンドの投与の１時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が、消失される、実施形態Ａ６０に記載の方法。
【０５５３】
Ａ６４．前記多量体リガンドの投与の３０分以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が、消失される、実施形態Ａ６０に記載の方法。
【０５５４】
Ａ６５．前記多量体リガンドの投与の２４時間以内に、その多量体リガンドの投与の３０分後のＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の量と比べてＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞のさらなる対数減少が存在する、実施形態Ａ６２〜Ａ６４のいずれかに記載の方法。
【０５５５】
Ａ６６．前記多量体リガンドの投与後の２４時間以内の皮膚ＧｖＨＤおよび肝ＧｖＨＤの消散をさらに含む、実施形態Ａ６２〜Ａ６５のいずれかに記載の方法。
【０５５６】
Ｂ１．患者における移植された治療用細胞の生存をコントロールする方法であって、その方法は、
ａ）治療用細胞を調製するかまたは入手する工程；
ｂ）プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でその治療用細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程（ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）；
ｃ）その形質導入されたまたはトランスフェクトされた治療用細胞をその患者に移植する工程；および
ｄ）工程ｃ）の後、多量体リガンドをその患者に投与する工程（ここで、その多量体リガンドは、多量体リガンド結合領域に結合する）
を含み、ここで、カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する移植された治療用細胞は、多量体リガンドの投与後に殺傷される、方法。
【０５５７】
Ｂ２．ヒト患者において治療用細胞を移植する方法であって、その方法は、
ａ）移植のための細胞を調製するか入手する工程；
ｂ）プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でその細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程；および
ｃ）その形質導入されたまたはトランスフェクトされた治療用細胞をそのヒト患者に移植する工程
を含む、方法。
【０５５８】
Ｂ３．患者において移植のための治療用前駆細胞を調製する方法であって、その方法は、
ａ）移植のための細胞を調製するか入手する工程；および
ｂ）プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でその細胞をトランスフェクトするかまたは形質導入する工程（ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）
を含む、方法。
【０５５９】
Ｂ３．５．前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａのアミノ酸置換を含む、実施形態Ｂ１またはＢ３に記載の方法。
【０５６０】
Ｂ３．６．前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、実施形態Ｂ１またはＢ３に記載の方法。
【０５６１】
Ｂ３．７．前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａのアミノ酸置換およびＮ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、実施形態Ｂ１またはＢ３に記載の方法。
【０５６２】
Ｂ４．前記患者が、ヒト患者である、実施形態Ｂ１またはＢ３に記載の方法。
【０５６３】
Ｂ５．多量体リガンドが、前記患者に投与され、その多量体リガンドは、前記多量体リガンド結合領域に結合する、実施形態Ｂ２に記載の方法。
【０５６４】
Ｂ６．前記多量体リガンドが、移植された治療用細胞を殺傷するために投与される、実施形態Ｂ１またはＢ３に記載の方法。
【０５６５】
Ｂ７．前記治療用細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれかに記載の方法。
【０５６６】
Ｂ８．前記治療用細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ６のいずれかに記載の方法。
【０５６７】
Ｂ９．前記治療用細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ１〜Ｂ２のいずれかに記載の方法。
【０５６８】
Ｂ１０．前記治療用細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、実施形態Ｂ９に記載の方法。
【０５６９】
Ｂ１１．前記治療用細胞が、前駆細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１０のいずれかに記載の方法。
【０５７０】
Ｂ１２．前記治療用細胞が、造血性前駆細胞である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１１のいずれかに記載の方法。
【０５７１】
Ｂ１３．前記治療用細胞が、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞からなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ１２のいずれかに記載の方法。
【０５７２】
Ｂ１４．前記プロモーターが、発生的に制御され、前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、発生的に分化した細胞において発現される、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれかに記載の方法。
【０５７３】
Ｂ１５．前記プロモーターが、組織特異的であり、前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、その特異的な組織において発現される、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれかに記載の方法。
【０５７４】
Ｂ１６  前記患者が、癌を有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１５のいずれかに記載の方法。
【０５７５】
Ｂ１７  前記患者が、固形腫瘍を有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１６のいずれかに記載の方法。
【０５７６】
Ｂ１８  前記癌が、前記患者の血液中または骨髄中に存在する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１７のいずれかに記載の方法。
【０５７７】
Ｂ１９  前記患者が、血液または骨髄の疾患を有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１８のいずれかに記載の方法。
【０５７８】
Ｂ２０  前記患者が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害を有する、実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれかに記載の方法。
【０５７９】
Ｂ２１  前記患者が、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーと診断されている、実施形態Ｂ１〜Ｂ１９のいずれかに記載の方法。
【０５８０】
Ｂ２２．前記キメラタンパク質が、マーカーポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２１のいずれかに記載の方法。
【０５８１】
Ｂ２３．前記マーカーポリペプチドが、ＣＤ１９ポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれかに記載の方法。
【０５８２】
Ｂ２４．前記マーカーを発現する細胞が前記患者への投与のために選択される選択工程をさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれかに記載の方法。
【０５８３】
Ｂ２５．前記細胞が、免疫磁気選択によって選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ２４のいずれかに記載の方法。
【０５８４】
Ｂ２６．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｂ１〜Ｂ２５のいずれかに記載の方法。
【０５８５】
Ｂ２７．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、カスパーゼ動員ドメインを欠く、実施形態Ｂ２６に記載の方法。
【０５８６】
Ｂ２８．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントによってコードされる、実施形態Ｂ２６に記載の方法。
【０５８７】
Ｂ２９．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれかに記載の方法。
【０５８８】
Ｂ３０．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２９のいずれかに記載の方法。
【０５８９】
Ｂ３１．前記多量体リガンドが、ＦＫ５０６二量体または二量体のＦＫ５０６様アナログリガンドである、実施形態Ｂ１またはＢ５に記載の方法。
【０５９０】
Ｂ３２．前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３である、実施形態Ｂ１またはＢ５に記載の方法。
【０５９１】
Ｂ３３．２以上の用量の前記多量体リガンドが、投与される、実施形態Ｂ１またはＢ５に記載の方法。
【０５９２】
Ｂ３４．前記治療用細胞が、レトロウイルスベクターで形質導入されるかまたはトランスフェクトされる、実施形態Ｂ１〜Ｂ３３のいずれかに記載の方法。
【０５９３】
Ｂ３５．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｂ３４に記載の方法。
【０５９４】
Ｂ３６．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｂ３４に記載の方法。
【０５９５】
Ｂ３７．前記トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞が、遺伝子発現ベクターでさらにトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３６のいずれかに記載の方法。
【０５９６】
Ｂ３８．前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、その患者における状態の有無を特定する工程；および
その患者において特定された状態の有無に基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者へのその多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、またはその多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれかに記載の方法。
【０５９７】
Ｂ３９．前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、その患者における状態の有無を特定する工程；および
その患者において特定された状態の有無に基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドをその患者に投与するべきであるか、またはその後にその患者に投与される多量体リガンドの投与量を調整するかを決定する工程
をさらに含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれかに記載の方法。
【０５９８】
Ｂ４０．前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、その患者における状態の有無を含む情報を受け取る工程；および
その患者において特定された状態の有無に基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者へのその多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、またはその多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれかに記載の方法。
【０５９９】
Ｂ４１．前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、その患者における状態の有無を特定する工程；および
その患者において特定された状態の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者に投与されるその多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、またはその多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者にその患者において特定された状態の有無またはステージを伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれかに記載の方法。
【０６００】
Ｂ４２．前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、その患者における状態の有無を特定する工程；および
その患者において特定された状態の有無またはステージに基づいて、前記多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、その患者に投与されるその多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、またはその多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、実施形態Ｂ１またはＢ２のいずれかに記載の方法。
【０６０１】
Ｂ４３．前記治療用細胞に、第２の異種タンパク質をコードする第２の核酸が形質導入されるかまたはトランスフェクトされる、実施形態Ｂ１〜４２のいずれかに記載の方法。
【０６０２】
Ｂ４４．前記治療用細胞に、キメラ抗原レセプターを発現する異種遺伝子が形質導入される、実施形態Ｂ１〜４２のいずれかに記載の方法。
【０６０３】
Ｂ４５．前記治療用細胞に、改変されたＴＧＦ−βレセプターを発現する異種遺伝子が形質導入される、実施形態Ｂ１〜Ｂ４２のいずれかに記載の方法。
【０６０４】
Ｂ４６．前記治療用細胞に、多量体リガンド結合領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核酸が形質導入される前、形質導入されるのと同時、または形質導入された後に、前記異種遺伝子が形質導入される、実施形態Ｂ４３、Ｂ４４またはＢ４５に記載の方法。
【０６０５】
Ｃ１．プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞であって、ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、その細胞は、骨髄または臍帯血から得られるかまたは調製される、細胞。
【０６０６】
Ｃ１．５．前記アミノ酸置換が、Ｄ３３０Ａである、実施形態Ｃ１に記載の細胞。
【０６０７】
Ｃ１．６．前記アミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑである、実施形態Ｃ１に記載の細胞。
【０６０８】
Ｃ１．７．前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａのアミノ酸置換およびＮ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、実施形態Ｃ１に記載の細胞。
【０６０９】
Ｃ２．前記細胞が、ヒト細胞である、実施形態Ｃ１に記載の細胞。
【０６１０】
Ｃ３．前記細胞が、前駆細胞である、実施形態Ｃ１〜Ｃ２のいずれかに記載の細胞。
【０６１１】
Ｃ４．前記細胞が、造血性前駆細胞である、実施形態Ｃ１〜Ｃ２のいずれかに記載の細胞。
【０６１２】
Ｃ５．前記細胞が、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞からなる群より選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれかに記載の細胞。
【０６１３】
Ｃ６．前記プロモーターが、発生的に制御され、前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、発生的に分化した細胞において発現される、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれかに記載の細胞。
【０６１４】
Ｃ７．前記プロモーターが、組織特異的であり、前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、その特異的な組織において発現される、実施形態Ｃ１〜Ｃ５のいずれかに記載の細胞。
【０６１５】
Ｃ８．前記キメラタンパク質が、マーカーポリペプチドをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれかに記載の細胞。
【０６１６】
Ｃ９．前記マーカーポリペプチドが、ＣＤ１９ポリペプチドである、実施形態Ｃ８に記載の細胞。
【０６１７】
Ｃ１０．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドである、実施形態Ｃ１〜Ｃ９のいずれかに記載の細胞。
【０６１８】
Ｃ１１．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、カスパーゼ動員ドメインを欠く、実施形態Ｃ１０に記載の細胞。
【０６１９】
Ｃ１２．前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むか、または配列番号８のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントによってコードされる、実施形態Ｃ１１に記載の細胞。
【０６２０】
Ｃ１３．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体、ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される、実施形態Ｃ１〜Ｃ１２のいずれかに記載の細胞。
【０６２１】
Ｃ１４．前記多量体リガンド結合領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、実施形態Ｃ１〜Ｃ１３のいずれかに記載の細胞。
【０６２２】
Ｃ１５．前記細胞が、レトロウイルスベクターで形質導入されるかまたはトランスフェクトされる、実施形態Ｃ１〜Ｃ１４のいずれかに記載の細胞。
【０６２３】
Ｃ１６．前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、実施形態Ｃ１５に記載の細胞。
【０６２４】
Ｃ１７．前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、実施形態Ｃ１６に記載の細胞。
【０６２５】
Ｃ１８．前記トランスフェクトされたまたは形質導入された細胞が、遺伝子発現ベクターでさらにトランスフェクトされるかまたは形質導入される、実施形態Ｃ１〜Ｃ１７のいずれかに記載の細胞。
【０６２６】
Ｄ１．ドナーＴ細胞をヒト患者に投与する方法であって、その方法は、
ａ）ドナー細胞培養物中の同種異系枯渇されていないヒトドナーＴ細胞を、プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトするかまたは形質導入する工程（ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）；および
ｂ）その形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞をそのヒト患者に投与する工程
を含む、方法。
【０６２７】
Ｄ２．ドナーＴ細胞移植後のヒト患者における移植片対宿主病の影響を減少させる方法であって、その方法は、
ａ）ドナー細胞培養物中の同種異系枯渇されていないヒトドナーＴ細胞を、プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトするかまたは形質導入する工程（ここで、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）；
ｂ）その形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞をその患者に投与する工程；
ｃ）（ｂ）の後の患者における移植片対宿主病の有無を検出する工程；および
ｄ）多量体リガンド結合領域に結合する多量体リガンドを、移植片対宿主病の存在が検出された患者に投与する工程
を含む、方法。
【０６２８】
Ｄ３．幹細胞移植の方法であって、その方法は、
ａ）ハプロタイプ一致幹細胞移植片をヒト患者に投与する工程；および
ｂ）同種異系枯渇されていないハプロタイプ一致ドナーＴ細胞をその患者に投与する工程（ここで、そのＴ細胞は、ハプロタイプ一致ドナー細胞培養物において、プロモーター領域、ならびに多量体リガンド結合領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸でトランスフェクトされるかまたは形質導入され、その改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ｌ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｔ３１７Ａ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｓ３０７Ａ、Ｙ１５３ＡおよびＹ１５３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む）
を含む、方法。
【０６２９】
Ｄ４．少なくとも１×１０６細胞／ｋｇ体重が、前記患者に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれかに記載の方法。
【０６３０】
Ｄ５．少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ体重が、前記患者に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれかに記載の方法。
【０６３１】
Ｄ６．少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ体重が、前記患者に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれかに記載の方法。
【０６３２】
Ｄ７．少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ体重が、前記患者に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれかに記載の方法。
【０６３３】
Ｄ８．少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ体重が、前記患者に投与される、実施形態Ｄ１〜Ｄ３のいずれかに記載の方法。
【０６３４】
本明細書中で参照された特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照により援用される。上記特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のいずれかが、関連する従来技術であることを自認するものでもないし、これらの刊行物または文書の内容または日付に関する自認するものである性質でもない。
【０６３５】
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つ以上の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に説明されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更が行われ得るが、これらの改変および改善が本技術の範囲内および精神内であることを認識するだろう。
【０６３６】
本明細書中に例証的に記載された技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意のエレメントの非存在下において、適切に実施され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、用語「〜を含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用されてきた用語および表現は、限定の用語ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されたおよび記載された特徴またはそれらの一部のいかなる等価物も排除せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変が可能である。エレメントのうちの１つまたはエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈から明らかでない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、それが修飾するエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つ以上の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される用語「約」は、基となるパラメータの１０％以内の値（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）のことを指し、一続きの値の始めに用語「約」を使用することにより、それらの値の各々が修飾される（すなわち、「約１、２および３」は、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値のリストが、本明細書中に記載されるとき（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）、そのリストには、それらのすべての中間値および分数値（例えば、５４％、８５．４％）が含まれる。したがって、本技術は、代表的な実施形態および随意の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書中に開示された概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられることがあり、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であるとみなされると理解されるべきである。
【０６３７】
本技術のある特定の実施形態が、以下の請求項に示される。
本発明の実施形態において、例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
多量体化領域および改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞であって、ここで、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４ＳおよびＦ４０６Ｌからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、細胞。
（項目２）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目４）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙである、項目１に記載の細胞。
（項目５）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙである、項目１に記載の細胞。
（項目６）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１３３およびＳ１９６Ｄからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目７）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目８）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｄ３３０Ａである、項目１に記載の細胞。
（項目９）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｄ３３０Ｅである、項目１に記載の細胞。
（項目１０）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑである、項目１に記載の細胞。
（項目１１）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔ、Ｄ３１５Ａ−Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ｆ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ｅ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＣＩＶＳＭ（ＣＡＳＰ−３）、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＡＡＡＡＡ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＹＣＳＴＬ（ＣＡＳＰ−２）および４０２ＧＦＮＦ４０６ＱＰＴＦＴ（ＣＡＳＰ−８）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１に記載の細胞。
（項目１２）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１に記載の細胞。
（項目１３）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）および３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１に記載の細胞。
（項目１４）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏおよび４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１に記載の細胞。
（項目１５）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４ＡｃｏおよびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１に記載の細胞。
（項目１６）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目１７）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目１８）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目１９）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２０）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４ＹおよびＮ４０５Ｑからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２１）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４ＳおよびＦ４０６Ｌからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２２）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２３）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２４）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２５）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２６）
前記ポリヌクレオチドが、前記カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする最適化されたコドンを含む、項目１〜２５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２７）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑのアミノ酸置換を含む、項目２６に記載の細胞。
（項目２８）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、配列番号３９の核酸配列によってコードされる、項目２６に記載の細胞。
（項目２９）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目１〜２８のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３０）
前記細胞が、前駆細胞である、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３１）
前記細胞が、造血性前駆細胞である、項目１〜３０のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３２）
前記細胞が、間葉系ストローマ細胞、胚性幹細胞および誘導可能な多能性幹細胞からなる群より選択される、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３３）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３４）
前記細胞が、骨髄から得られるかまたは調製される、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３５）
前記細胞が、臍帯血から得られるかまたは調製される、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３６）
前記細胞が、末梢血から得られるかまたは調製される、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３７）
前記細胞が、末梢血単核球から得られるかまたは調製される、項目１〜２９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３８）
前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されている、項目１〜３７のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３９）
前記プロモーターが、発生的に制御され、前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、発生的に分化した細胞において発現される、項目３８に記載の細胞。
（項目４０）
前記プロモーターが、組織特異的であり、前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、特異的な組織において発現される、項目３８または３９に記載の細胞。
（項目４１）
前記プロモーターが、活性化Ｔ細胞において活性化される、項目３８または３９に記載の細胞。
（項目４２）
前記プロモーターが、５’ＬＴＲ配列を含む、項目３８〜４１に記載の細胞。
（項目４３）
前記キメラタンパク質が、マーカーポリペプチドをさらに含む、項目１〜４３のいずれか１項に記載の細胞。
（項目４４）
前記マーカーポリペプチドが、ΔＣＤ１９ポリペプチドである、項目４３に記載の細胞。
（項目４５）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、切断型カスパーゼ−９ポリペプチドである、項目１〜４５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目４６）
前記カスパーゼ−９ポリペプチドが、カスパーゼ動員ドメインを欠く、項目１〜４６のいずれか１項に記載の細胞。
（項目４７）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｎ４０５Ｆ、Ｆ４０６Ｔ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５ＡおよびＮ４０５Ｔからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目４８）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目４９）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９Ｅ、Ｔ３１７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｔ３１７Ｅ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９ＫおよびＡ３３１Ｋからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目５０）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９ＥおよびＴ３１７Ａからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目５１）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３ＦおよびＳ３０７Ａからなる群より選択される、項目１に記載の細胞。
（項目５２）
前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ、シクロフィリンレセプター、ステロイドレセプター、テトラサイクリンレセプター、重鎖抗体サブユニット、軽鎖抗体サブユニット、可撓性リンカードメインによって分断された重鎖可変領域および軽鎖可変領域をタンデムで含む一本鎖抗体ならびにそれらの変異された配列からなる群より選択される、項目１〜５１のいずれか１項に記載の細胞。
（項目５３）
前記多量体化領域が、ＦＫＢＰ１２領域である、項目１〜５２のいずれか１項に記載の細胞。
（項目５４）
前記ＦＫＢ１２領域が、ＦＫＢ１２ｖ３６領域である、項目５３に記載の細胞。
（項目５５）
前記多量体化領域が、Ｆｖ’Ｆｖｌｓである、項目１〜５２のいずれか１項に記載の細胞。
（項目５６）
前記多量体化領域が、ＦＫ５０６二量体および二量体のＦＫ５０６アナログリガンドからなる群より選択されるリガンドに結合する、項目１〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目５７）
前記リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目１〜５６のいずれか１項に記載の細胞。
（項目５８）
前記多量体化領域が、配列番号２９のアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する、項目１〜５１のいずれか１項に記載の細胞。
（項目５９）
前記多量体化領域が、配列番号３０の中のヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントによってコードされる、項目１〜５１のいずれか１項に記載の細胞。
（項目６０）
前記多量体化領域が、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目５８に記載の細胞。
（項目６１）
前記多量体化領域が、配列番号３１の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目５９に記載の細胞。
（項目６２）
前記多量体化領域が、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目６０に記載の細胞。
（項目６３）
前記多量体化領域が、配列番号３１の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目６１に記載の細胞。
（項目６４）
前記多量体化領域が、配列番号２９もしくは配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目５８、６０または６２のいずれかに記載の細胞。
（項目６５）
前記多量体化領域が、配列番号３０もしくは配列番号３１の中のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをさらに含む、項目５９、６１または６３のいずれかに記載の細胞。
（項目６６）
前記細胞が、レトロウイルスベクターで形質導入されているかまたはトランスフェクトされている、項目１〜６５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目６７）
前記レトロウイルスベクターが、マウス白血病ウイルスベクターである、項目６６に記載の細胞。
（項目６８）
前記レトロウイルスベクターが、ＳＦＧベクターである、項目６６に記載の細胞。
（項目６９）
前記細胞が、アデノウイルスベクターで形質導入されているかまたはトランスフェクトされている、項目１〜６５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７０）
前記細胞が、レンチウイルスベクターで形質導入されているかまたはトランスフェクトされている、項目１〜６５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７１）
前記細胞が、遺伝子発現ベクターでさらにトランスフェクトされているかまたは形質導入されている、項目１〜７０のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７２）
前記細胞が、前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、異種ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む、項目７１に記載の細胞。
（項目７３）
前記異種ポリペプチドが、キメラ抗原レセプターである、項目７２に記載の細胞。
（項目７４）
前記細胞が、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドまたは第２の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、第１および第２のカスパーゼ−９ポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を含み、異なる基底活性または異なるＩＣ５０を有する、項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７５）
ａ）前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドおよび前記カスパーゼ−９ポリペプチド；または
ｂ）前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドおよび前記第２の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド
が、多量体リガンドに対して、異なるＩＣ５０もしくは異なる広範囲の用量反応曲線、または異なるＩＣ５０および異なる広範囲の用量反応曲線を有する、項目７４に記載の細胞。
（項目７６）
単離されている、項目１〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７７）
ヒト被験体内に存在する、項目１〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７８）
ヒト被験体に移植される、項目７７に記載の細胞。
（項目７９）
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与する方法であって、前記方法は、項目１〜７８のいずれか１項に記載の細胞をヒト患者に投与する工程を含み、ここで、前記細胞は、ヒトドナーＴ細胞である、方法。
（項目８０）
前記細胞が、ドナー細胞培養物において形質導入されるかまたはトランスフェクトされる、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
ａ）前記患者に前記細胞を投与した後に前記患者における移植片対宿主病の存在を検出する工程；および
ｂ）多量体化領域に結合する多量体リガンドを、移植片対宿主病の存在が検出された前記患者に投与する工程
をさらに含む、項目７９または８０に記載の方法。
（項目８２）
前記移植片対宿主病の影響が、前記多量体リガンドの投与後に減少する、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
幹細胞移植の方法であって、前記方法は、
ａ）幹細胞移植片をヒト患者に投与する工程；および
ｂ）項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞を前記患者に投与する工程であって、前記細胞は、ドナーＴ細胞である、工程
を含む、方法。
（項目８４）
前記幹細胞移植片が、マッチした移植片、部分的にマッチした移植片、ハプロタイプ一致移植片およびＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植片からなる群より選択される、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ヒトドナーＴ細胞が、前記患者のＴ細胞とマッチしているか、部分的にマッチしているか、またはハプロタイプ一致である、項目７９〜８４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
前記患者が、癌を有する、項目７４〜８５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８７）
前記患者が、固形腫瘍を有する、項目７９〜８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
前記癌が、前記患者の血液中または骨髄中に存在する、項目８６または８７に記載の方法。
（項目８９）
前記患者が、血液または骨髄の疾患を有する、項目７９〜８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記患者が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害と診断されている、項目７９〜８９のいずれか１項に記載の方法。
（項目９１）
前記患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、項目７９〜８５または９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目９２）
前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
マーカーを発現する細胞が前記患者への投与のために選択される選択工程をさらに含む、項目７９〜９２のいずれかに記載の方法。
（項目９４）
前記細胞が、骨髄サンプルから調製されるドナー細胞培養物においてトランスフェクトされる、項目７９〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
前記細胞が、末梢血から調製されるドナー細胞培養物においてトランスフェクトされる、項目７９〜９３に記載の方法。
（項目９６）
前記ドナー細胞培養物が、ドナー末梢血単核球から調製される、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
トランスフェクションまたは形質導入の前に、前記ドナーＴ細胞が、前記ドナー細胞培養物から同種異系枯渇される、項目７９〜９６のいずれか１項に記載の方法。
（項目９８）
トランスフェクションまたは形質導入の前に、前記ドナーＴ細胞が、前記ドナー細胞培養物から同種異系枯渇されない、項目７９〜９６のいずれか１項に記載の方法。
（項目９９）
形質導入されたまたはトランスフェクトされた前記Ｔ細胞が、前記患者への投与の前に、ＩＬ−２の存在下において培養される、項目９７〜９８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１００）
前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与する工程をさらに含む、項目７９〜９８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０１）
前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８７である、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記多量体リガンドが、移植片対宿主病を処置するために投与される、項目１００または１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記多量体リガンドが投与される前に、前記患者が、移植片対宿主病の症状を示す、項目８１、８２または１００〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記患者が、ステージ０の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記患者が、ステージ１の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
前記患者が、ステージ２の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、項目１０３に記載の方法。
（項目１０７）
前記患者が、ステージ３の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、項目１０３に記載の方法。
（項目１０８）
前記患者が、ステージ４の移植片対宿主病の１つ以上の症状を示す、項目１０３に記載の方法。
（項目１０９）
２以上の用量の前記多量体リガンドが、投与される、項目８１、８２または１００〜１０８のいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
前記多量体リガンドの投与の後に、アロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、項目８１、８１または１００〜１０９のいずれかに記載の方法。
（項目１１１）
前記アロ反応性Ｔ細胞が、前記マーカーおよびＣＤ３を発現する、項目８１、８２または１００〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１２）
前記アロ反応性Ｔ細胞の数が、前記多量体リガンドの投与後に約９０％以上減少する、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
増殖可能でありウイルスおよび真菌に反応性であるドナーＴ細胞が、前記多量体リガンドの投与の後に前記患者内で生き残る、項目８１、８２または１００〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１４）
増殖可能であり前記患者内の腫瘍細胞に反応性であるドナーＴ細胞が、前記多量体リガンドの投与の後に前記患者内で生き残る、項目８１、８２または１００〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
前記患者が、前記ドナーＴ細胞の投与の前または投与と同時に幹細胞移植片を受容している、項目７９〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１６）
前記患者における移植片対宿主病の症状の出現に基づいて、前記患者に追加の用量の前記多量体リガンドを投与するか否か決定する工程をさらに含む、項目８１、８２または１００〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１７）
少なくとも１×１０６個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記患者に投与される、項目７９〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１８）
少なくとも１×１０７個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記患者に投与される、項目７９〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１９）
少なくとも１×１０８個の形質導入されたまたはトランスフェクトされたドナーＴ細胞が、前記患者に投与される、項目７９〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２０）
前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
前記患者において特定された前記移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者への前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、項目７９〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２１）
前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
前記患者において特定された前記移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを前記患者に投与するべきであるか、またはその後に前記患者に投与される前記多量体リガンドの投与量を調整するかを決定する工程
をさらに含む、項目７９〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２２）
前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを含む情報を受け取る工程；および
前記患者において特定された前記移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者への前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、項目７９〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２３）
前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
前記被験体において特定された前記移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者に投与される前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に前記移植片対宿主病の有無またはステージを伝える工程
をさらに含む、項目７９〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
前記患者における移植片対宿主病の有無またはステージを特定する工程、および
前記被験体において特定された前記移植片対宿主病の有無またはステージに基づいて、前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者に投与される前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、項目７９〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
細胞治療を受けた患者における移植片対宿主病を処置する方法であって、ここで、前記治療のために導入された細胞の１つ以上は、項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞であり、前記方法は、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを前記患者に投与する工程を含む、方法。
（項目１２６）
前記多量体結合領域に結合する多量体リガンドの投与の後に、アロ反応性Ｔ細胞の数が減少する、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
細胞分裂を起こしていないアロ反応性Ｔ細胞が、消失される、項目１２５に記載の方法。
（項目１２８）
前記多量体リガンドの投与の２時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が、消失される、項目１２５に記載の方法。
（項目１２９）
前記多量体リガンドの投与の１時間以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が、消失される、項目１２５に記載の方法。
（項目１３０）
前記多量体リガンドの投与の３０分以内に、ＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の少なくとも９０％が、消失される、項目１２５に記載の方法。
（項目１３１）
前記多量体リガンドの投与の２４時間以内に、前記多量体リガンドの投与の３０分後のＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞の量と比べてＣＤ３＋ΔＣＤ１９＋細胞のさらなる対数減少が存在する、項目１２５〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３２）
前記多量体リガンドの投与後の２４時間以内の皮膚ＧｖＨＤおよび肝ＧｖＨＤの消散をさらに含む、項目１２５〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３３）
患者における移植された治療用細胞の生存をコントロールする方法であって、前記方法は、項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞をヒト患者に投与する工程および多量体リガンドを前記患者に投与する工程を含み、ここで、前記多量体リガンドは、前記多量体化領域に結合し、前記カスパーゼ−９ポリペプチドを発現する投与された細胞は、前記多量体リガンドの投与後に殺傷される、方法。
（項目１３４）
ヒト患者において治療用細胞を移植する方法であって、前記方法は、項目１〜７３に記載の細胞を移植のために調製する工程および前記治療用細胞を前記ヒト患者に投与する工程を含む、方法。
（項目１３５）
前記患者が、ヒト患者である、項目１３３〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３６）
前記多量体リガンドが、移植された治療用細胞を殺傷するために投与される、項目１３３〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３７）
前記患者が、癌を有する、項目１３３〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３８）
前記患者が、固形腫瘍を有する、項目１３３〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３９）
前記癌が、前記患者の血液中または骨髄中に存在する、項目１３３〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４０）
前記患者が、血液または骨髄の疾患を有する、項目１３３〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４１）
前記患者が、幹細胞移植によって緩和され得る任意の状態または障害を有する、項目１３３〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４２）
前記患者が、原発性免疫不全障害、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）または他の血球貪食障害、遺伝性骨髄不全障害、異常ヘモグロビン症、代謝障害および破骨細胞障害からなる群より選択される状態と診断されている、項目１３３〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４３）
前記状態が、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、複合免疫不全症（ＣＩＤ）、先天性Ｔ細胞欠損／欠損症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、慢性肉芽腫症、ＩＰＥＸ（免疫不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖）またはＩＰＥＸ様、ウィスコット・オールドリッチ症候群、ＣＤ４０リガンド欠損症、白血球接着不全、ＤＯＣＫ８欠損症、ＩＬ−１０欠損症／ＩＬ−１０レセプター欠損症、ＧＡＴＡ２欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖性疾患（ＸＬＰ）、軟骨毛髪形成不全、シュバッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンドブラックファン貧血、先天性角化異常症、ファンコニー貧血、先天性好中球減少症、鎌状赤血球症、サラセミア、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシスおよび大理石骨病からなる群より選択される、項目１４２に記載の方法。
（項目１４４）
マーカーを発現する細胞が前記患者への投与のために選択される選択工程をさらに含む、項目１３３〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４５）
前記多量体リガンドが、ＡＰ１９０３またはＡＰ２０１８６７である、項目１３３〜１４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４６）
２以上の用量の前記多量体リガンドが、投与される、項目１３３〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４７）
前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、前記患者における状態の有無を特定する工程；および
前記患者において特定された前記状態の有無に基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者への前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、項目１３３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４８）
前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、前記患者における状態の有無を特定する工程；および
前記患者において特定された前記状態の有無に基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを前記患者に投与するべきであるか、またはその後に前記患者に投与される前記多量体リガンドの投与量を調整するかを決定する工程
をさらに含む、項目１３３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４９）
前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、前記患者における状態の有無を含む情報を受け取る工程；および
前記患者において特定された前記状態の有無に基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者への前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する工程
をさらに含む、項目１３３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５０）
前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、前記患者における状態の有無を特定する工程；および
前記患者において特定された前記状態の有無またはステージに基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者に投与される前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する意思決定者に前記患者において特定された前記状態の有無またはステージを伝える工程
をさらに含む、項目１３３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５１）
前記患者からのトランスフェクトされたまたは形質導入された治療用細胞の除去を必要とする、前記患者における状態の有無を特定する工程；および
前記患者において特定された前記状態の有無またはステージに基づいて、前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを投与するか、前記患者に投与される前記多量体リガンドのその後の投与量を維持するか、または前記多量体リガンドのその後の投与量を調整する指示を伝える工程
をさらに含む、項目１３３〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５２）
前記治療用細胞に、第２の異種タンパク質をコードする第２の核酸が形質導入されるかまたはトランスフェクトされる、項目１３３〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５３）
前記治療用細胞に、キメラ抗原レセプターを発現する異種遺伝子が形質導入される、項目１３３〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５４）
前記治療用細胞に、改変されたＴＧＦ−βレセプターを発現する異種遺伝子が形質導入される、項目１３３〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５５）
前記治療用細胞に、多量体化領域およびカスパーゼ−９ポリペプチドを含むキメラタンパク質をコードする核酸が形質導入される前、形質導入されるのと同時、または形質導入された後に、前記異種遺伝子が形質導入される、項目１５２〜１５４のいずれかに記載の方法。
（項目１５６）
ドナーＴ細胞をヒト患者に投与する方法であって、前記方法は、項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞をヒト患者に投与する工程を含み、ここで、前記細胞は、同種異系枯渇されていないヒトドナーＴ細胞である、方法。
（項目１５７）
項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞の投与後のヒト患者における移植片対宿主病の影響を減少させる方法であって、ここで、前記細胞は、ドナーＴ細胞であり、前記方法は、
ｅ）前記ドナーＴ細胞の投与後の前記患者における移植片対宿主病の有無を検出する工程；および
ｆ）前記多量体化領域に結合する多量体リガンドを、移植片対宿主病の存在が検出された患者に投与する工程
を含む、方法。
（項目１５８）
幹細胞移植の方法であって、前記方法は、
ｃ）幹細胞移植片をヒト患者に投与する工程；および
ｄ）項目１〜７３のいずれか１項に記載の細胞を前記患者に投与する工程であって、前記細胞は、ドナーＴ細胞である、工程
を含む、方法。
（項目１５９）
少なくとも１×１０６細胞／Ｋｇ体重が、前記患者に投与される、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６０）
少なくとも３×１０６細胞／Ｋｇ体重が、前記患者に投与される、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６１）
少なくとも５×１０６細胞／Ｋｇ体重が、前記患者に投与される、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６２）
少なくとも７×１０６細胞／Ｋｇ体重が、前記患者に投与される、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６３）
少なくとも９×１０６細胞／Ｋｇ体重が、前記患者に投与される、項目１５６〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６４）
配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４ＳおよびＦ４０６Ｌからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１６５）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１６６）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１６７）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１６８）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１６９）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１３３およびＳ１９６Ｄからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７０）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７１）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｄ３３０Ａである、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７２）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｄ３３０Ｅである、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７３）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑである、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７４）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔ、Ｄ３１５Ａ−Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｙ１５３Ｆ、Ｄ３３０Ａ−Ｔ３１７Ｅ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＣＩＶＳＭ（ＣＡＳＰ−３）、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＡＡＡＡＡ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＹＣＳＴＬ（ＣＡＳＰ−２）および４０２ＧＦＮＦ４０６ＱＰＴＦＴ（ＣＡＳＰ−８）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７５）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）、３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）およびＤ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｔからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７６）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏ、４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）および３１６ＡＴＰＦ３１９ＡＶＰＩ（ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７７）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｄ３３０Ａ−Ｎ４０５Ｑ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１４４Ｄ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１８３Ａ、Ｄ３３０Ａ−Ｓ１９６Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１９６Ｄ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓ、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４Ａｃｏ、Ｎ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏおよび４０２ＧＣＦＮＦ４０６ＩＳＡＱＴ（ＣＡＳＰ−１０）からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７８）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、Ｎ４０５Ｑ−Ｓ１４４ＡｃｏおよびＮ４０５Ｑ−Ｔ３１７Ｓｃｏからなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１７９）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４ＹＮ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８０）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８１）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｓ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３１９Ｗ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔである、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８２）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３Ｆ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ３０７Ａ、Ｄ３１５Ａ、Ａ３１６Ｇ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｗ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４Ｔ、Ｆ４０４Ｗ、Ｆ４０４Ｙ、Ｎ４０５Ｆ、Ｎ４０５ＱおよびＦ４０６Ｔである、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８３）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｔ３１７Ａ、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｆ４０４ＹおよびＮ４０５Ｑからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８４）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｗ、Ｆ４０６Ｙ、Ｇ４０２Ａ、Ｇ４０２Ｉ、Ｇ４０２Ｑ、Ｇ４０２Ｙ、Ｃ４０３Ｐ、Ｆ４０４Ａ、Ｆ４０４ＳおよびＦ４０６Ｌからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８５）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｔ３１７Ｅ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｆ３２６Ｋ、Ｄ３２７Ｇ、Ｄ３２７Ｋ、Ｄ３２７Ｒ、Ｑ３２８Ｋ、Ｑ３２８Ｒ、Ｌ３２９Ｅ、Ｌ３２９Ｇ、Ｌ３２９Ｋ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ａ３３１Ｋ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｎ４０５Ｔ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８６）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｔ３１７Ｃ、Ｐ３１８Ａ、Ｆ３１９Ａ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｃ４０３Ａ、Ｃ４０３Ｓ、Ｃ４０３Ｔ、Ｎ４０５Ａ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８７）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６Ｔ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８８）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１９６Ｄ、Ｌ３２９Ｅ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１８９）
前記ポリヌクレオチドが、前記カスパーゼ−９ポリペプチドをコードする最適化されたコドンを含む、項目１６４〜１８８のいずれか１項に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１９０）
配列番号３９の核酸配列を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１９１）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｎ４０５Ｑ、Ｆ４０４Ｙ、Ｆ４０６Ａ、Ｆ４０６ＷおよびＦ４０６Ｙからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１９２）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｔ３１７Ｓ、Ｄ３３０Ａ、Ｄ３３０Ｅ、Ｄ３３０Ｇ、Ｄ３３０Ｎ、Ｄ３３０Ｓ、Ｄ３３０Ｖ、Ｌ３２９ＥおよびＴ３１７Ａからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１９３）
前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、Ｓ１４４Ａ、Ｓ１４４Ｄ、Ｓ１９６Ｄ、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１９５Ａ、Ｓ１９６Ａ、Ｙ１５３Ａ、Ｙ１５３ＦおよびＳ３０７Ａからなる群より選択される、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
（項目１９４）
多量体化領域および項目１６４〜１９３のいずれか１項に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドを含む、キメラポリペプチド。
（項目１９５）
項目１６４〜１９３のいずれか１項に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
（項目１９６）
項目に記載のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
（項目１９７）
前記幹細胞移植片が、ハプロタイプ一致である、項目１５８に記載の方法。
（項目１９８）
前記ドナーＴ細胞が、ハプロタイプ一致であり、前記患者への投与の前に同種異系枯渇されない、項目１５８または１９７に記載の方法。
（項目１９９）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、表５または表６におけるカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、項目１に記載の細胞。
（項目２００）
前記改変されたカスパーゼ−９ポリペプチドが、表５または表６におけるカスパーゼバリアントからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む、項目１６４に記載の改変されたカスパーゼ−９ポリペプチド。
【図１Ａ】
0006537984.tif 000044
【図１Ｂ】
0006537984.tif 000045
【図２−１】
0006537984.tif 000046
【図２−２】
0006537984.tif 000047
【図３Ａ】
0006537984.tif 000048
【図３Ｂ】
0006537984.tif 000049
【図３Ｃ】
0006537984.tif 000050
【図３Ｄ】
0006537984.tif 000051
【図４】
0006537984.tif 000052
【図５Ａ】
0006537984.tif 000053
【図５Ｂ】
0006537984.tif 000054
【図５Ｃ】
0006537984.tif 000055
【図６】
0006537984.tif 000056
【図７】
0006537984.tif 000057
【図８】
0006537984.tif 000058
【図９】
0006537984.tif 000059
【図１０】
0006537984.tif 000060
【図１１−１】
0006537984.tif 000061
【図１１−２】
0006537984.tif 000062
【図１２】
0006537984.tif 000063
【図１３−１】
0006537984.tif 000064
【図１３−２】
0006537984.tif 000065
【図１３−３】
0006537984.tif 000066
【図１３−４】
0006537984.tif 000067
【図１４】
0006537984.tif 000068
【図１５】
0006537984.tif 000069
【図１６Ａ−１６Ｂ】
0006537984.tif 000070
【図１７】
0006537984.tif 000071
【図１８】
0006537984.tif 000072
【図１９】
0006537984.tif 000073
【図２０】
0006537984.tif 000074
【図２１】
0006537984.tif 000075
【図２２】
0006537984.tif 000076
【図２３】
0006537984.tif 000077
【図２４】
0006537984.tif 000078
【図２５】
0006537984.tif 000079
【図２６】
0006537984.tif 000080
【図２７】
0006537984.tif 000081
【図２８】
0006537984.tif 000082
【図２９】
0006537984.tif 000083
【図３０】
0006537984.tif 000084
【図３１】
0006537984.tif 000085
【図３２】
0006537984.tif 000086
【図３３】
0006537984.tif 000087
【図３４】
0006537984.tif 000088
【図３５】
0006537984.tif 000089
【図３６】
0006537984.tif 000090
【図３７】
0006537984.tif 000091
【図３８】
0006537984.tif 000092
【図３９】
0006537984.tif 000093
【図４０】
0006537984.tif 000094
【図４１】
0006537984.tif 000095
【図４２】
0006537984.tif 000096
【図４３】
0006537984.tif 000097
【図４４】
0006537984.tif 000098
【図４５】
0006537984.tif 000099
【図４６】
0006537984.tif 000100
【図４７】
0006537984.tif 000101
【図４８】
0006537984.tif 000102
【図４９Ａ】
0006537984.tif 000103
【図４９Ｂ】
0006537984.tif 000104
【図５０】
0006537984.tif 000105
【図５１】
0006537984.tif 000106
【図５２】
0006537984.tif 000107
【図５３】
0006537984.tif 000108
【図５４】
0006537984.tif 000109
【図５５】
0006537984.tif 000110
【図５６】
0006537984.tif 000111
【図５７】
0006537984.tif 000112
【図５８】
0006537984.tif 000113
【図５９】
0006537984.tif 000114
【図６０】
0006537984.tif 000115
【図６１】
0006537984.tif 000116
【図６２】
0006537984.tif 000117
【配列表】
0006537984000001.app