(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー−フラボノイド接合体であって、前記ポリマーが、チオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合しており、前記ポリマーが、多糖類、ポリヌクレオチド、合成ポリマーおよびそれらの混合物からなる群の中から選択されたものであり、
前記チオールリンカーは、−ＮＨ−、−Ｓ−および前記−ＮＨ−と前記−Ｓ−との間に結合しているアルキル基を有し、前記チオールリンカーの前記−ＮＨ−は、前記ポリマーに結合しており、前記チオールリンカーの前記−Ｓ−は、前記フラボノイドに結合しているポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項２】
前記多糖類が、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギナート、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェランガム、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタンおよびキシログルカンからなる群の中から選ばれたものである請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、アプタマー、ＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群の中から選ばれたものである請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項４】
前記合成ポリマーが、アルケン、エーテル、カルボン酸、イミン、アミド、アミン、酸無水物、カーボネート、エステル、オルトエステル、およびウレタンからなる群の中から選ばれたモノマーを含む請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項５】
前記合成ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ酸無水物、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（ブチレンスクシナート）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリエチレンイミン、ポリ（グリセロール）、ポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシプロピオン酸）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（テレフタレート−ｃｏ−ホスフェート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの組み合わせからなる群の中から選ばれたものである請求項４に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項６】
前記ポリマーが、ポリアクリル酸及びヒアルロン酸から選ばれたものである請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項７】
前記フラボノイドが、フラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジンおよびアントシアニジン、並びにそれらの混合物からなる群の中から選択されたものである請求項１から請求項６までのいずれか１項に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項８】
前記フラバンが、（−）−エピカテキン、（＋）−エピカテキン、（−）−カテキン、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキンガレート、（＋）−エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール（fisetinidol）、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール（mesquitol）およびロビネチニドール（robinetinidol）、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン（oolongtheanin）、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラビン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシン（theasinensin）およびそれらの混合物からなる群の中から選ばれたものである請求項７に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項９】
前記アルキル基が、１〜１０個の炭素原子を有する請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１０】
前記アルキル基が、エチル基である請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１１】
前記ポリマー又はフラボノイドが、さらに、治療剤に結合又は接合されているか、治療剤を含んでいる請求項１から請求項１０までのいずれか１項に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１２】
前記治療剤が、小分子薬物およびナノ医薬からなる群の中から選択されたものである請求項１１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１３】
前記ナノ医薬が、ポリマーミセル、リポソーム及びデンドリマーからなる群の中から選択されたものである請求項１２に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１４】
前記ポリマー−フラボノイド接合体が、
【化１】
0006484633.tif 000006
式（Ｉ）、及び
【化２】
0006484633.tif 000007
式（ＩＩ）
（式中、
各ｎは、独立に、０から１５０００までの整数であり、各ｍは、１から１５０００までの整数である）からなる群の中から選ばれるヒアルロン酸−ＥＧＣＧ接合体である請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１５】
前記ポリマー−フラボノイド接合体が、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表され、０．０１から１００％までの接合度を有する請求項１４に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体を生成するための方法であって、前記フラボノイドを塩基性条件下での求核付加により前記ポリマーと接合させる工程を含み、前記ポリマーは、遊離チオール基で修飾されている前記方法。
【請求項１７】
（ａ）チオール又はジスルフィドを含有する化合物を、還元剤の存在下に、前記ポリマーに結合させる工程、及び
（ｂ）前記ジスルフィド含有化合物をジスルフィド結合において開裂させ、それにより末端チオール基を有する前記ポリマーを生成する工程
をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム及び水素化アルミニウムリチウムからなる群の中から選ばれたものである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接合工程を、１〜２４時間の反応時間で行う請求項１６から請求項１８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
チオール又はジスルフィドを含有する化合物を、カップリング剤の存在下に、前記ポリマーにカップリングさせる工程をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記カップリング剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、塩酸塩１−エチル−３−（３−ジメチルジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、カルボニルジイミダゾール、アジプイミド酸ジメチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル及び１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾールからなる群の中から選ばれたものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記カップリング剤が、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選ばれたものである請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記求核付加において消去剤を添加する工程をさらに含む請求項１６から請求項２２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記消去剤が、ピルビン酸ナトリウム及びスーパーオキシドジスムターゼからなる群の中から選ばれたものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記求核付加における前記塩基性条件が、約７．０〜１０．０のｐＨ範囲内にある請求項１６から請求項２４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリマー−フラボノイド接合体から得られるヒドロゲル。
【請求項２７】
前記ポリマー−フラボノイド接合体が、式（ＩＩ）
【化３】
0006484633.tif 000008
で表され、０．０１〜１００％の接合度を有する請求項２６に記載のヒドロゲル。
【請求項２８】
請求項１から請求項１５までのいずれか１項に記載のポリマー−フラボノイド接合体を、塩基性条件下に、自動酸化により架橋する工程を含む、ヒドロゲルの生成方法。
【請求項２９】
前記架橋工程が、酸化剤の存在下に酵素を添加する工程をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素が、ペルオキシダーゼである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ヒトミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、プロスタグランジンＨシンターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、ヘミン、ヘマチン及びマイクロペルオキシダーゼ−１１からなる群の中から選ばれたものである請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記酸化剤が、過酸化物である請求項２９から請求項３１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記過酸化物が、過酸化水素である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記架橋工程を、約２分間〜４５時間の反応時間で行う請求項２８から請求項３３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記架橋工程を、約３５℃〜３９℃の範囲から選ばれた温度で行う請求項２８から請求項３４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２６又は２７に記載のヒドロゲルの、バイオメディカル製品を作るための使用。
【請求項３７】
前記バイオメディカル製品が、関節内補充薬、癒着防止フィルム又は皮膚充填剤である請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にポリマー−フラボノイド接合体に関し、ここでは前記ポリマーがチオール結合を介して前記フラボノイドに接合されている。本発明は、また、前記接合体の製造方法、並びにそれを含有するヒドロゲル、該ヒドロゲルを製造する方法、およびバイオメディカル用途におけるその使用方法に関する。
【０００２】
背景
フラボノイドは、インビトロ試験において、広範囲の生物学的および薬理学的活性を有することが示されている。その例には、抗アレルギー、抗炎症、抗酸化、抗菌、抗細菌、抗真菌、抗ウイルス、抗癌および抗下痢活性が含まれる。過去数十年にわたり、例えば緑茶カテキンは、冠状動脈性心疾患および癌に対する保護剤として大きな注目を浴びてきた（Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｊ．Ｌ．、ヒトにおける緑茶および癌：文献の検討、Ｎｕｔｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  ３１：１５１−９；１９９８、およびＺａｖｅｒｉ、Ｎ．Ｔ．緑茶およびそのポリフェノールカテキン：癌および癌以外の医薬用途、ライフサイエンス７８：２０７３〜８０；２００６）。緑茶カテキンは、フラボノイド群に属する。
【０００３】
特に、（−）−エピガロカテキン３−ガレート（ＥＧＣＧ）は、緑茶中で最も豊富なカテキンであり、その強力な抗酸化活性および遊離基スカベンジ活性故に広くの研究されてきた（Ｗａｎｇ  Ｙ．；Ｈｏ  Ｃ．Ｔ．  茶およびコーヒーのポリフェノール化学：１世紀の進歩、Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ５７：８１０９−８１１４；２００９）。
【０００４】
これらの望ましい特性にも拘らず、ＥＧＣＧのようなフラボノイドの臨床使用は、その乏しい安定性と、制限された経口での生体利用性により限定されてきた。例えば、ＥＧＣＧは、生理的温度およびｐＨにおいて不安定であり、３０分未満の半減期で容易に分解する。また、ＥＧＣＧの胃液中での迅速な加水分解および胃腸管における代謝分解のために、その経口での生体利用性は乏しい。これらの制限を克服するために、多くの努力が、フラボノイドの安定性、生体利用能および生物学的活性を増強するための化学修飾に捧げられてきた。
【０００５】
最近、ＥＧＣＧは、例えばシステイン、グルタチオン、およびタンパク質のような種々のタイプのチオール含有化合物を用いて共有結合的に修飾されてきたが、制御された方法でＥＧＣＧの複合チオール接合体を合成するのは極めて困難である。１つの重要な理由は、ＥＧＣＧの化学的不安定性である。例えば、ＥＧＣＧは、中性およびアルカリ性の溶液中で容易に自動酸化を受け、二量体化および分解を生じる。
【０００６】
さらに、ＥＧＣＧの（−）−ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）へのエピマー化は、スーパーオキシドジスムターゼを添加することによりまたは窒素ガスでフラッシュすることによりＥＧＣＧの自動酸化が阻害される場合には増加する傾向にある。ＥＧＣＧへのチオールの共有結合はまた、自動酸化プロセスの際に発生される過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）によって妨げることができる。Ｈ2Ｏ2は遊離のチオール基をジスルフィド結合またはスルフェン酸（Ｒ−ＳＨ）へと酸化させるので、それはチオール−ＥＧＣＧ接合に関与する遊離チオール基の濃度を低下させることができる。これは、チオール接合体を製造する反応において、低収率、および望ましくない未反応のジスルフィドまたはスルフェン酸副生成物をもたらす。高い収率および純度で所望の接合体を得るためには、複雑な精製工程が必要とされる。
【０００７】
従って、ＥＧＣＧのようなフラボノイドを、チオール含有化合物を用いて高い選択性の様態で修飾するための効果的な方法を見いだすことが必要とされている。
【０００８】
さらに、現在のところ、安定したポリマー−フラボノイド接合体を製造する方法は存在しない。フラボノイドの乏しい安定性を改善して、例えば、ゲル等のバイオメディカル用途においてそれらを利用可能にするために、そのような接合体を製造することが必要とされている。
【０００９】
概要
第１の側面によれば、ポリマー−フラボノイド接合体が提供され、ここで前記ポリマーは、チオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合されている。
【００１０】
有利なことに、接合体は、ポリマーを安定な方法で、チオール結合を介してフラボノイド部分に結合している。フラボノイドの改善された生体利用能および生物活性を備えたフラボノイド末端ポリマーおよびフラボノイドグラフト化ポリマーを得ることが可能である。
【００１１】
さらに有利なことに、バイオメディカル用途での潜在的使用の可能性をもった、生体適合性および生分解性ポリマーへの接合が達成された。
【００１２】
第２の側面によれば、ポリマー−フラボノイド接合体を生成するための方法であって、前記フラボノイドを塩基性条件下での求核付加により前記ポリマーに接合させる工程を含んでなり、前記ポリマーは遊離チオール基で修飾されている方法が提供される。
【００１３】
有利なことに、この開示された方法は、非常に高い接合度で当該反応を可能にし、これは面倒な分離プロセスを回避する。このチオール接合は、開示された方法を用いて、フラボノイド構造の特定の点において達成することができる。
【００１４】
第３の側面によれば、ポリマー−フラボノイド接合体を含むヒドロゲルであって、前記ポリマーがチオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合されているヒドロゲルが提供される。
【００１５】
有利なことに、特に自動酸化または酵素的架橋反応が用いられるときには、ここに開示された接合体のフラボノイド部分を単純に架橋することによって、前記ヒドロゲルを製造できるであろう。得られたヒドロゲルは、約２００パスカル超、さらに多くの場合には３９０パスカル超の良好な貯蔵弾性率をする。
【００１６】
従って、第４の側面によれば、塩基性条件下での自動酸化を介して、本発明のポリマー−フラボノイド接合体を架橋する工程を含む、ヒドロゲルを生成する方法が開示される。これは、任意に酵素および酸化剤を添加することによって促進される。
【００１７】
第５の側面によれば、バイオメディカル製品を製造するための、開示されたヒドロゲルの使用が提供される。
【００１８】
有利なことに、前記ヒドロゲルは注射可能なヒドロゲルシステムで使用することができ、これは必要に応じて、接合体中のフラボノイド部分とポリマーの種類を選択することにより、多様なバイオメディカル用途のために、種々の生物活性および治療剤を投与するための効果的かつ便利な方法を提供する。
【００１９】
［定義］
本明細書において他に定義しない限り、本願で使用される科学技術用語は当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。一般的に、ここで記載される化学に関連して使用される命名法および技術は、当該技術において周知であり、かつ普通に使用されているものである。
【００２０】
文脈が他のことを必要とし、または特に逆のことを述べない限り、ここに記載する本発明の整数、工程、または要素は、記載された整数、工程または要素の単数形態および複数形態の両方を包含するものである。
【００２１】
本明細書で使用する場合、特に断らない限り、以下の用語は以下の意味を有し、また特に断らない限り、個々の用語は、該用語が個別的にまたは他の用語の一部として使用されるときにも適用される（例えば、アリールの定義は、アリールについても、アリールアルキル、アルキルアリール、アリールアルキニル等のアリール部分についても同じである）
本明細書で用いるとき、用語「フラボノイド」は、限定されることなく、典型的なフラボノイド（バイオフラボノイドとも称される）、３−フェニルクロメン−４−オン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造から誘導されるイソフラボノイド、４−フェニルクマリン（４−フェニル−１，２−ベンゾピロン）構造および同様のポリフェノール化合物から誘導されるネオフラボノイド、並びにこれらの混合物を含む広範なクラスの植物の二次代謝物を意味する。典型的には、フラボノイドは、例えばフラボン類、フラボノール類、フラボノン類、ブラボノノール類、フラバン類、プロアントシアニジン類、およびアントシアニジン類の群に属する。典型的には、イソフラボノイドは、例えば、イソフラバン類、イソフラバンジオール類、イソフラベン類、クーメスタン類、およびプテロカルパン類の群に属する。列挙できる幾つかのポリフェノール化合物は、メスキトール（mesquitol）およびロビネチニドール（robinetinidol）、エラギタンニン、ガロタンニン、ウーロンタンニン（oolongtheanin）、フロロタンニン、タンニン、テアチトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラビン、テアナフトキノン、テアルビギン、テアシネンシン（theasinensin）である。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「接合体」は、二つの化合物の合体により形成された部分、または他の部分と合体された部分をいう。本発明によれば、接合は、硫黄原子を介した共有化学結合によるものである。
【００２３】
本明細書で使用する用語「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＲａ−アルキル−の形態の基を意味し、ここでＲａは水素、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルケニル、および任意に置換されていてもよいアリール基含む群の中から選択されるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する用語「アミン」は、−ＮＲａＲｂ−アルキル−の形態の基を意味し、ここでＲａおよびＲｂは、個別に、水素、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルケニル、および任意に置換されていてもよいアリール基含む群の中から選択されるが、これらに限定されるものではない。「アミド」および「アミン」におけるアルキル基は、任意に置換されることができ、好ましくは２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素原子、最も好ましくは２個の炭素原子を有する。
【００２４】
本明細書で使用する用語「アルキル」は、その意味の中に、１〜１０の炭素原子、例えば１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を有する、二価（「アルキレン」）の直鎖もしくは分枝鎖の飽和脂肪族基を含んでいる。例えば、用語アルキルには、メチル、エチル、１−プロピル、イソプロピル、１−ブチル、２−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、４−メチルペンチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、ヘプチル、１−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，４−ジメチルペンチル、１，２，３−トリメチルブチル、１，１，２−トリメチルブチル、１，１，３−トリメチルブチル、５−メチルヘプチル、１−メチルヘプチル、オクチル、ノニル、デシル基等が含まれるが、これらに限定されない。用語「アルケニル基」は、その意味の中に、２〜１０個の炭素原子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を有し、また適用可能な場合には、当該アルキル鎖の何処かにＥ、Ｚ、シスもしくはトランスの立体化学の少なくとも一つの二重結合を有する、二価（「アルケニレン」）の直鎖もしくは分枝鎖の不飽和脂肪族炭化水素基を含んでいる。アルケニル基の例としては、エテニル、ビニル、アリル、１−メチルビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１，３−ペンタジエニル、２，４−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、２−メチルペンテニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、３−ヘプテニル、１−オクテニル、１−ノネニル、１−デセニル等が挙げられる。本明細書で使用される用語「アリール」は、６〜１０個の炭素原子を有する芳香族炭化水素の二価（「アリーレン」）の、単核、多核、共役もしくは縮合した残基を意味する。このような基には、例えば、フェニル、ビフェニル、ナフチル、フェナントレニル等が含まれる。アリール基は任意に置換されてよい。用語「エステル」は、その意味の中に、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−アルキル−、および−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル基を含んでいる。用語「カーボネート」は、その意味の中に、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル基を含んでいる。用語「エーテル」語は、その意味の中に、−Ｏ−アルキル−および−アルキル−Ｏ−アルキル−基を含んでいる。用語「カルバメート」は、その意味の中に、−Ｏ−（ＣＯ）−ＮＲａ、−Ｏ−（ＣＯ）−ＮＲａ−アルキル−基を含んでおり、前記Ｒａは、水素、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルケニル、および任意に置換されていてもよいアリール基を含む群の中から選択されるが、これらに限定されない。用語「アセタール」は、その意味の中に、−Ｏ−Ｃ（Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキル）−、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキル）−アルキル−基を含んでいる。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「任意に置換されていてもよい」は、この用語が言及する基が、無置換であってもよく、または下記から独立して選択される１以上の基で置換されてもよいことを意味する：即ち、アルキル、アルケニル、アルキニル、チオアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、ハロ、カルボキシル、ハロアルキル、ハロアルキニル、ヒドロキシル、アルコキシ、チオアルコキシ、アルケニルオキシ、ハロアルコキシ、ハロアルケニルオキシ、ニトロ、アミノ、ニトロ、ニトロアルケニル、ニトロアルキニル、ニトロヘテロシクリル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルケニルアミン、アルキニルアミノ、アシル、アルケノイル、アルキノイル、アシルアミノ、ジアシルアミノ、アシルオキシ、アルキルスルホニル、ヘテロシクロ、ヘテロシクロアミノ、ハロヘテロシクロアルキル、アルキルスルフェニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルチオ、アシルチオ、ホスホノおよびホスフィニルのような燐含有基、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）、および−Ｃ（Ｏ）（アルキル）2である。これらの基が炭素原子を含む場合、通常、それらは１〜１０個の炭素原子を有する。
【００２６】
特に断りのない限り、「含んでなる」および「含む」の用語、並びにその文法的変形は、それらが引用された要素を含むだけでなく、追加の、列記されていない要素の包含を可能にするように、「開かれた」または「包括的な」言葉を表すことを意図している。
【００２７】
本明細書で使用される場合、製剤の成分の濃度との関連において、「約」との用語は、典型的には、述べられた値の＋／−  ５％を意味し、より典型的には、述べられた値の＋／−  ４％、より典型的には、述べられた値の＋／−  ３％、より典型的には、述べられた値の＋／−  ２％、より典型的には、述べられた値の＋／−  １％、さらにより典型的には、述べられた値の＋／−０．５％を意味する。
【００２８】
本開示を通して、一定の実施形態は範囲形式で開示され得るものである。範囲形式での記載は便宜性および簡潔性のためだけであり、開示された範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことを理解すべきである。従って、範囲の記載は、具体的には開示された全ての可能なサブ範囲、並びに該範囲内の個々の数値を開示していると看做されるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記載は、具体的に開示されたサブ範囲、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、並びに該範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６を有すると考えるべきである。このことは、範囲の広さに関係なく適用されるものである。
【００２９】
一定の実施形態はまた、本明細書では広くかつ一般的に記載され得るものである。属概念開示の範囲内に入るより狭い種概念および亜属概念の各々もまた、当該開示の一部をなす。これは、摘出された材料が本明細書に具体的に列挙されているか否かとは無関係に、何れかの主題を包括概念から除去する但し書きまたは消極的限定を伴った実施形態の一般的な説明を含むものである。
【００３０】
開示の詳細な説明
１つの側面において、ポリマー−フラボノイド接合体が提供され、ここで前記ポリマーはチオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合されている。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、前記ポリマーは、多糖類、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、合成ポリマーおよびそれらの混合物からなる群の中から選択することができる。好ましい多糖類としては、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギナート、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェランガム、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタンおよびキシログルカンが挙げられる。ヒアルロン酸は、特に好ましいものとして挙げることができる。好ましいポリヌクレオチドとしては、アプタマー、ＤＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。好ましいポリペプチドとしては、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプチド（aptide）、ペプチドおよびポリ（アミノ酸）が挙げられる。好ましい合成ポリマーとしては、アルケン、エーテル、カルボン酸、イミン、アミド、アミン、酸無水物、カーボネート、エステル、オルトエステル、およびウレタンからなる群の中から選択されるモノマーを含むポリマーを挙げることができる。さらに挙げることができるより好ましい合成ポリマーは、ポリアクリル酸、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ酸無水物、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（ブチレンスクシナート）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリエチレンイミン、ポリ（グリセロール）、ポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシプロピオン酸）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（テレフタレート−ｃｏ−ホスフェート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。最も好ましいものとしては、ポリアクリル酸を挙げることができる。
【００３２】
ポリマーは、該ポリマー鎖の末端で単一のフラボノイドに連結された（フラボノイド末端ポリマー）、またはポリマー骨格内の幾つかの場所においてそこから単一のフラボノイドに連結されることができる（フラボノイドグラフト化ポリマー）であることができる。フラボノイド末端ポリマーについての接合度は、利用可能な反応場所、すなわち還元基の利用可能性に応じて変化する。これは、使用されるポリマーに依存して広範に変化することができる。フラボノイド末端ポリマー接合体に使用されるポリマーは、異なる分子量のものであってよく、好ましくは、約０．１〜１０００ｋＤａ、より好ましくは０．１〜５００ｋＤａ、最も好ましくは０．１〜１５０ｋＤａの範囲内である。
【００３３】
フラボノイドグラフト化ポリマーの接合度は、カルボキシ基のシステアミン接合体への置換の度合によって決定される（例えば、ポリマーの１００繰り返し単位当たりのチオール基の数として決定される）。これは、使用するポリマーに依存して広く変化することができる。典型的には、１００モノマー単位当たりのチオール基の数は、約１〜４０、好ましくは約５〜２５、最も好ましくは５〜２２である。
【００３４】
フラボノイドグラフト化ポリマー接合体に使用されるポリマーは、異なる分子量のものであることができ、好ましくは約１〜１０００ｋＤａ、より好ましくは１〜５００ｋＤａ、最も好ましくは１〜１５０ｋＤａの範囲内であることができる。
【００３５】
好ましい実施形態によると、前記ポリマーまたはフラボノイドは、さらに治療剤に結合し、または治療剤に接合されることができる。
【００３６】
前記治療剤は、小分子薬物およびナノ医薬からなる群の中から選択することができ、該ナノ医薬自身は、ポリマーミセル、リポソーム及びデンドリマーからなる群の中から選択することができる。
【００３７】
好ましい実施形態によると、フラボノイドは、フラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジンおよびアントシアニジン、並びにそれらの混合物からなる群の中から選択することができる。特に、フラバンは、下記からなる群の中から選択されるフラバンから選択されるフラボノイドとして列記することができる：（−）−エピカテキン、（＋）−エピカテキン、（−）−カテキン、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキンガレート、（＋）−エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール（fisetinidol）、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール（mesquitol）およびロビネチニドール（robinetinidol）、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン（oolongtheanin）、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラビン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシン（theasinensin）及びそれらの混合物。特に言及しない場合、本発明は、ここに開示した化合物の全ての異性体をその範囲内に含み、全てのジアステレオマー異性体、ラセミ体およびエナンチオマーを含むものである。従って、特に言及していなくても、フラボノイドは、それぞれの場合に適切なときは、例えば、Ｅ、Ｚ、シス、トランス、（Ｒ）、（Ｓ）、（Ｌ）、（Ｄ）、（＋）または（−）の化合物の形態を含むものと理解すべきである。
【００３８】
チオールリンカーとは、チオール基を反応させることにより導入される硫黄原子を介した共有結合を意味する。
【００３９】
好ましい実施形態によると、チオールリンカーは、前記ポリマーに結合したチオール部分から誘導することができ、ここでの該チオール部分は、アミド、アミン、アルキル、アルケニル、アリール、エステル、カーボネート、エーテル、アミド、アミド、エステル、カルバメート、およびアセタール基からなる群の中から選択される。この部分は、前記ポリマーと架橋硫黄原子を連結するものである。アミドおよびアミンは、チオール基と共に接合体を作るために特に好ましい。最も好ましくは、チオール部分はアミノエチルチオール基（システアミン由来）である。
【００４０】
本発明によると、チオール基を介したヒアルロン酸（ＨＡ）−ＥＧＣＧ接合体が、特に好ましい。特に、この方法は、ＥＧＣＧのＢ環のＣ２’位でのポリマーの効率的な結合を可能する。本発明に従って、ＥＧＣＧの二つのタイプのヒアルロン酸（ＨＡ）接合体を調製することができる：即ち、ＥＧＣＧ末端ＨＡおよびＥＧＣＧグラフト化ＨＡである。ＨＡは、結合組織の細胞外マトリックス中に豊富にみられる天然の多糖類である。これは、細胞増殖、形態形成、炎症、および創傷修復に重要な役割を果たしている。ＨＡは、生体適合性および生分解性である。この実施形態において、ＨＡは、ＥＧＣＧに結合される骨格ポリマーとして選択された。接合体は、ＥＧＣＧ−末端型またはＥＧＣＧグラフト化型であることができる。従って、接合体はヒアルロン酸−ＥＧＣＧ接合体であることができ、これは下記からなる群の中から選択される：
【化１】
0006484633.tif 000002
【００４１】
式（Ｉ）；および
【化２】
0006484633.tif 000003
【００４２】
式（ＩＩ）
ここで、
各ｎは、独立に、０〜１５，０００の整数であり、各ｍは、独立に１〜１５，０００の整数である。
【００４３】
好ましくは、ｎは０〜１，０００の整数である。好ましくは、ｍは１〜１０００の整数である。より好ましくは、ｎは０〜３００の整数である。より好ましくは、ｍは１〜３００の整数である。
【００４４】
特に好ましいのは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）のヒアルロン酸（ＨＡ）−ＥＧＣＧ接合体であり、これらは０．０１〜１００％の接合度を有する。
【００４５】
第２の側面によれば、ポリマー−フラボノイド接合体を生成するための方法であって、前記フラボノイドを、塩基性条件下での求核付加を介して前記ポリマーに接合する工程を具備し、ここで前記ポリマーは遊離チオール基で修飾されている方法が提供される。
【００４６】
本方法は、ポリマーに導入されたチオール基のフラボノイドとの求核反応を含む。この反応は、塩基性条件下で行われる。このことは、ｐＨが、ｐＨ７．０よりも低くないことを意味する。求核反応は、高いｐＨで行うことができるが、好ましいｐＨは、ｐＨ７．０〜１０．０である。これが、フラボノイド中の選択された基（例えば、ＥＧＣＧにおけるガロイル基）との反応の特異性を増加させるからである。
【００４７】
好ましくは、本反応は、７．０〜９．０のｐＨでのわずかに塩基性の条件下で行われる。約７．２〜８．２のｐＨが最も好ましい。好ましくは、反応を厳密に制御するために、緩衝液例えばリン酸緩衝液が使用される。
【００４８】
上記反応は、種々の温度で行うことができるが、２０〜３０℃の周囲温度が好ましい。約２５℃が最も好ましい。溶媒の選択は様々であり得る。反応を水性溶媒、任意に有機溶媒例えばＤＭＳＯとの混合物において行うことが好ましい。接合工程は、好ましくは、１〜３６時間、より好ましくは２〜２４時間の反応時間で行われる。３〜６時間の反応時間が最も好ましい。
【００４９】
本方法の好ましい実施形態によると、消去剤が、方法に添加される。この消去剤は、ピルビン酸ナトリウム及びスーパーオキシドジスムターゼからなる群の中から選ばれ得る。有利には、消去剤は、副反応を引き起こす望ましくないＨ2Ｏ2を効率的に消去できるものである。消去剤、特にピルビン酸ナトリウムは、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜２５ｍＭの濃度で使用することができる。
【００５０】
上記反応において、フラボノイドは、好ましくは、チオール基を持つポリマーに対して過剰に使用される。この過剰は、２〜２００倍、好ましくは４０〜１００倍であり得る。
【００５１】
本発明によると、ポリマーは、フラボノイドへ連結するためにチオール基で修飾される。本発明の好ましい実施形態によると、上記方法は、さらに、
（ａ）還元剤の存在下に、チオール又はジスルフィドを含有する化合物をポリマーに結合する工程、及び
（ｂ）ジスルフィド結合におけるいずれもの生成したジスルフィドを開裂させ、それによりチオール基を持つ前記ポリマーを生成する工程
を含む。
【００５２】
この方法は、例えば、フラボノイド末端ポリマー接合体を作るために適している。接合体は、高純度及び高収率（９０％超）で得られる。本方法は、実施及びスケールアップが容易である。これは、複雑な生成を必要としない、非酵素的方法である。
【００５３】
チオール又はジスルフィドを含有する化合物は、例えば、アミノアルキルチオール誘導体、例えばシステアミン塩酸塩及びシスタミン二塩酸塩であり得る。
【００５４】
好ましい実施形態によると、結合工程（ａ）は、還元的アミノ化であり得る。
【００５５】
工程（ａ）のための好適な還元剤として、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウムを挙げることができる。シアノ水素化ホウ素ナトリウムが特に好ましい。
【００５６】
結合工程（ａ）は、好ましくは、塩基性条件下で行われる。このことは、ｐＨがｐＨ７．０よりも低くないことを意味する。好ましくは、反応は、７．５〜９．０、好ましくは７．５〜８．９のｐＨでの塩基性条件下で行われる。約８．５のｐＨが最も好ましい。好ましくは、反応を厳密に制御するために、緩衝液、例えばホウ酸緩衝液及びリン酸緩衝液が使用される。
【００５７】
工程（ａ）の反応は、種々の温度で行うことができるが、３０〜４５℃の高められた温度が好ましい。約３７℃が最も好ましい。溶媒の選択は様々であり得る。反応を水性溶媒中で行うことが好ましい。
【００５８】
上記反応において、チオール又はジスルフィドを含有する化合物を、対応する還元反応における還元剤とほぼ等モル量で用いることができる。しかしながら、還元剤は、過剰に用いることもできる。通常、工程（ａ）での反応時間は、広い範囲にわたって変わり得るが、数日、好ましくは１〜７日、最も好ましくは４〜６日という長い反応時間を持つことが好ましくあり得る。
【００５９】
開裂工程（ｂ）において、ジスルフィド結合を開裂させ得る好適な還元剤を使用することができる。かかる還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む。開裂工程のためには、方法工程（ａ）におけると同じ溶媒及びｐＨを用いることができる。反応時間は、完全開裂を達成するためには、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは１２〜３６時間である。還元反応において、還元剤は、好ましくは、ジスルフィド基を有するポリマーに対して過剰に使用される。開裂後、所定の分画（例えば、約１０００〜５０００Ｄａ）をもって、窒素雰囲気下での透析による精製を採用することができ、得られた生成物を本発明による最終接合体を作るための反応において使用するために凍結乾燥することができる。エルマンアッセイにより測定して９０％超のチオール末端修飾を得ることができる。
【００６０】
ポリマーは、フラボノイドへ結合させるために他の方法によりチオール基で修飾することができる。本発明の他の好ましい実施形態によると、接合体を作るための方法は、チオール又はジスルフィドを含有する化合物を、カップリング剤の存在下に、前記ポリマーにカップリングさせる工程をさらに含む。
【００６１】
この方法は、例えば、フラボノイドグラフト化ポリマー接合体を作るために適している。チオール又はジスルフィドを含有する化合物は、例えば、アミノアルキルチオール誘導体例えばシステアミン塩酸塩及びシスタミン二塩酸塩であり得る。
【００６２】
カップリング剤は、カルボン酸をアミド又はエステルの生成に向けて活性化させるための脱水剤であり得る。これは、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、塩酸塩１−エチル−３−（３−ジメチルジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、カルボニルジイミダゾール、アジプイミド酸ジメチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル及び１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾールからなる群の中から選ぶことができる。また、好ましいカップリング剤として特に挙げるものは、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）又は４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）である。この活性エステルの安定性を向上させるために、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を追加的に使用することができる。
【００６３】
カップリング工程は、好ましくは、水溶液中で行われ、ｐＨは、例えば約ｐＨ４．０〜６．５の、酸性範囲に制御される。好ましくは、反応のために窒素雰囲気が用いられる。
【００６４】
カップリング工程は、種々の温度で行うことができるが、２０〜３０℃の周囲温度が好ましい。約２５℃が最も好ましい。
【００６５】
上記反応において、カップリング剤は、カップリング反応におけるポリマーのＣＯＯＨ含有量とほぼ等モル量で用いることができる。ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳもほぼ等モル量で用いることができる。通常、カップリング工程における反応時間は広い範囲にわたり得るが、数日、好ましくは１〜２日という長い反応時間を持つことが好ましい。
【００６６】
反応生成物はジスルフィド橋を含み得るので、開裂工程を用いることができる。開裂工程は、ポリマーをチオール基で修飾する他の方法のために記載した開裂工程（ｂ）と同一であるか、実質的に同一であり得る。精製も同様であり得る。
【００６７】
本発明の第３の側面によると、ポリマー−フラボノイド接合体を含み、前記ポリマーがチオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合しているヒドロゲルが提供される。
【００６８】
０．０１から１００％までの、好ましくは２〜４０％の、より好ましくは、次の値２％、５％、７．５％、１０％、２０％、３０％及び４０％のいずれかの接合度を有する式（ＩＩ）のポリマー−フラボノイド接合体が、ヒドロゲルにおいて好適であり得、具体的に挙げておく。
【００６９】
本発明の第４の側面によると、ポリマー−フラボノイド接合体を塩基性条件下での自動酸化により架橋する工程を含む、本発明によるヒドロゲルを生成するための好ましい方法が開示される。
【００７０】
ポリマー−フラボノイド接合体は、上記した本発明によるポリマー−フラボノイド接合体である。
【００７１】
ヒドロゲルを生成させるための方法は、好ましくは、塩基性条件下で行われる。このことは、ｐＨがｐＨ７．０よりも低くないことを意味する。好ましくは、反応は、７．０〜８．０、好ましくは約７．４のｐＨでの塩基性条件下で行われる。好ましくは、反応を厳密に制御するために、緩衝液例えばリン酸緩衝液が用いられる。カップリング工程は、種々の温度で行うことができるが、３０〜４０℃の高められた温度が好ましい。約３５〜３９℃が最も好ましい。反応時間は、好適なヒドロゲルを得るための必要性に合せて調節することができる。好適な反応時間は、２分間〜４５時間、好ましくは１０分間〜２４時間であり得る。
【００７２】
ヒドロゲル生成の自動酸化は、本方法の他の実施形態により酸化剤の存在下に酵素を添加することを含む工程によりさらに支援され得る。これは、ヒドロゲルを生成する酸化を促進する。
【００７３】
酵素は、ペルオキシダーゼであり得る。そのようなペルオキシダーゼは、好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ヒトミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、プロスタグランジンＨシンターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、ヘミン、ヘマチン及びマイクロペルオキシダーゼ−１１からなる群の中から選ぶことができる。酸化剤は、例えば、過酸化物例えば特に好ましい過酸化水素であり得る。過酸化物及び酸化剤の濃度は、重要ではなく、既知の範囲内で選択することができる。酵素は、例えば、数単位／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０単位／ｍＬ、より好ましくは０．１〜２単位／ｍＬの量で用いることができる。酸化剤は、ｍＭのレベルで用いることができ、好ましくは約０〜５０ｍＭ、より好ましくは０．５〜１０ｍＭであり、０．５〜３ｍＭが最も好ましい。
【００７４】
好適なヒドロゲルは、単に酵素の濃度又は使用する酸化剤の量を変更することによって調整することができる。
【００７５】
本発明の第５の側面によると、開示したヒドロゲルの、バイオメディカル製品を作るための使用が提供される。挙げることができるそのようなバイオメディカル製品は、関節内補充薬、癒着防止フィルム又は皮膚充填剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
添付の図面は、開示した実施形態を図解し、開示した実施形態の原理を説明するために役立つものである。しかしながら、図面は、図解のみを目的として設計されたものであり、本発明の制限の定義としてのものではないことを理解すべきである。
【図１】図１は、ＥＧＣＧ末端ＨＡの合成スキームを示す。ＨＡ分子の還元性末端が、還元的アミノ化及びその後のジスルフィド結合の開裂によりチオール基で修飾される。得られるチオール末端修飾ＨＡは、塩基性ｐＨにおいてＥＧＣＧへ接合される。
【図２】図２は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で蒸留水に溶解したＨＡと、ＥＧＣＧ末端ＨＡのＵＶ−可視スペクトルを示す。
【図３】図３は、ＥＧＣＧと、ＥＧＣＧ末端ＨＡのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。上及び下の矢印は、それぞれ、ＥＧＣＧ及びＥＧＣＧ末端ＨＡのピークを示す。
【図４】図４は、反応時間の関数としてＥＧＣＧ末端ＨＡの接合度を示す。
【図５】図５は、８ｋＤａの分子量を有するＥＧＣＧ末端ＨＡの1Ｈ ＮＭＲを示す。
【図６】図６は、ＥＧＣＧグラフト化ＨＡの合成スキームを示す。ＨＡ中のカルボキシル基は、シスタミン分子との接合及びその後のジスルフィド結合の開裂によりチオール基で修飾される。得られたチオール官能化ＨＡは、塩基性ｐＨにおいてＥＧＣＧに接合される。
【図７】図７は、０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で蒸留水に溶解したＥＧＣＧグラフト化ＨＡのＵＶ−可視スペクトルを示す。
【図８】図８は、９０ｋＤａの分子量を有するＥＧＣＧグラフト化ＨＡの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】図９は、Ｈ2Ｏ2濃度の関数としてＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの貯蔵弾性率及びゲル化点を示す。ＨＲＰの濃度は、０．１６単位／ｍＬに固定した。
【図１０】図１０は、異なる濃度のＨＲＰを用いて調製したＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの貯蔵弾性率及びゲル化点を示す。Ｈ2Ｏ2の濃度は、０．９１ｍｍｏｌ／Ｌに固定した。
【図１１】図１１は、１２５単位／ｍＬのヒアルロニダーゼの存在下でのＨＡ−ＥＧＣＧ及びＨＡ−チラミンヒドロゲルの標準化重量の経時変化を示す。両ヒドロゲルは、同じ貯蔵弾性率（１ｋＰａ）を持った。ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルは、０．１６単位／ｍＬのＨＲＰ及び１．１４ｍｍｏｌ／ＬのＨ2Ｏ2を用いて生成した。
【００７７】
図面の詳細な説明
図１は、単一のＥＧＣＧ分子がＨＡの末端位置に結合したＥＧＣＧ末端ＨＡの合成スキームを示す。ほとんどの多糖類（例えば、ＨＡ、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン）は、環状ヘミアセタール基を有する還元性末端を１つだけ含有することが知られている。ＥＧＣＧ末端ＨＡの合成のために、まず、ＨＡ分子の元々の還元性末端を還元的アミノ化によりシスタミンで修飾する。その後、シスタミン中のジスルフィド結合を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）により開裂して、ＨＡの末端に遊離チオール基を生成させる。エルマンアッセイにより決定したチオール化度は、９８％よりも高かった。ついで、チオール末端修飾ＨＡを、過剰量のＥＧＣＧを用いてｐＨ７．４でインキュベートした。図に示されているように、ＨＡは、弱塩基性ｐＨにおいて、ＥＧＣＧのＢ環に特異的に接合できた。接合反応は、ピルビン酸ナトリウムの存在下で行ったことに注意すべきである。生成したＥＧＣＧ末端ＨＡは、単に、窒素雰囲気下での蒸留水に対する透析により精製することができた。
【００７８】
図２は、ＥＧＣＧ末端ＨＡが、２７４ｎｍにＥＧＣＧの特徴的なＵＶ吸収ピークを持ったことを示している。ＥＧＣＧ末端ＨＡについては、４２５ｎｍでのＵＶ吸収帯は観察されず、ＥＧＣＧ二量体及び他の酸化生成物の不存在を示している。ＥＧＣＧの成功した接合を、さらに、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって確認した。
【００７９】
図３は、ＥＧＣＧ末端ＨＡがＥＧＣＧよりも短い保持時間で溶出したことが示されたことを示している。特に、ＥＧＣＧ二量体は、ＨＰＬＣクロマトグラムには検出されなかった。
【００８０】
図４は、反応時間を２時間から６時間に増加することで、接合度が２０％から１００％に増加したことを示す。接合度は、ＨＡの分子量には依存しなかった。これらの結果から、最適な反応時間は、この事例の場合、約４時間であると決定された。
【００８１】
図５は、1Ｈ ＮＭＲ分光分析によるＥＧＣＧ末端ＨＡの構造の評価を示す。1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ａ環（δ＝６．１〜６．３にＨ−６及びＨ−８）、Ｃ環（δ＝５．６０〜５．８５にＨ−２及びＨ−３）、及びＤ環（δ＝６．９５にＨ−２”及びＨ−６”）についてプロトンシグナルを示した。Ａ、Ｃ及びＤ環から生じるプロトンシグナルは、無修飾のＥＧＣＧのそれらに類似しているので、これらの構造が接合反応に関与しなかったことが考えられた。対照的に、Ｂ環についてのプロトンシグナルは、明らかに、接合反応後に変化していた。ＥＧＣＧ末端ＨＡは、ＥＧＣＧの２つのプロトンについての一重項シグナルの代わりに、δ＝６．７ｐｐｍにＢ環の１つだけのプロトンについての一重項シグナルを示した。この結果は、Ｂ環のＣ２’位におけるチオール末端修飾ＨＡの結合による１つのプロトン（Ｈ−２’）の消失によって説明することができる。さらに、Ｈ−６’原子のプロトンシグナル（δ＝６．７）は、無修飾ＥＧＣＧのそれに比べて０．２ｐｐｍの低磁場シフトを示した。併せると、これらの結果は、ただ１つのＨＡ分子が、部位特異的な様態で、Ｂ環のＣ２’位に結合したことを立証している。
【００８２】
本発明のコンセプトを立証するために、本発明により上記部位特異的接合方法に基づいて他のタイプのＨＡ−ＥＧＣＧ接合体を合成した。
【００８３】
図６は、ＨＡ骨格に複数のＥＧＣＧ分子が結合してなるＥＧＣＧグラフト化ＨＡの合成スキームを示す。まず、シスタミン分子を、トリアジン媒介反応を用いて、ＨＡのカルボキシル基にカップリングさせる。その後、シスタミンにおけるジスルフィド結合をＴＣＥＰにより開裂して、遊離チオール基を生成する。得られたＨＡ−システアミン接合体は、典型的に８．４の置換度（１００の繰り返し二糖単位当たりのチオール基の数）を有する。ついで、ＨＡ−システアミン接合体を、ｐＨ７．４で過剰量のＥＧＣＧとともにインキュベートして、ＥＧＣＧのチオール基への接合を行わせる。遊離チオール基のＨ2Ｏ2媒介酸化を防止するためにピルビン酸ナトリウムを添加したことは注目に値する。また、ＥＧＣＧの溶解性を増大するために少量のＤＭＳＯを添加した。２５℃で２４時間のインキュベーション後、接合反応を停止するために、混合物のｐＨを６にした。生成したＥＧＣＧグラフト化ＨＡを、単に窒素雰囲気下での蒸留水に対する透析により精製した。
【００８４】
特に、ＨＡ−システアミン接合体における置換度は、カップリング剤（ＤＭＴＭＭ）対ＨＡ中のカルボキシル基のモル比を変えることによって制御した。例えば、ＤＭＴＭＭ対カルボキシル基のモル比を０．５：１から１．５：１に増加すると、置換度は２．８から８．４に増加した。置換度５．７及び８．４のＨＡ−システアミン接合体の使用は、置換度それぞれ５．８及び１１のＥＧＣＧグラフト化ＨＡの生成をもたらした。この結果は、単に異なる置換度のＨＡ−システアミン接合体を用いることによりＥＧＣＧ接合の程度を調整することができることを示唆している。加えて、ポリアクリル酸は、ＤＭＴＭＭを用いて、制御された様態で、システアミン基により修飾することができた。例えば、置換度は、ＤＭＴＭＭ対カルボキシル基のモル比を０．０４：１から０．１５：１に増加すると、０．３から１．４に増加した。置換度１．０と１．４のポリアクリル酸−システアミン接合体の使用は、置換度それぞれ０．０３５及び０．０７のＥＧＣＧグラフト化ポリアクリル酸の生成をもたらした。
【００８５】
図７は、得られたＥＧＣＧグラフト化ＨＡが、ＥＧＣＧの成功裏の接合を示す、２７４ｎｍにＵＶ吸収のピークを示したことを示す。４２５ｎｍに吸収帯がないことから明らかなように、ＥＧＣＧ二量体及び他の酸化生成物は、生成しなかった。
【００８６】
図８は、ＥＧＣＧグラフト化ＨＡの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。Ａ環（δ＝６．１〜６．３にＨ−６及びＨ−８）、Ｃ環（δ＝５．６０〜５．８５にＨ−２及びＨ−３）及びＤ環（δ＝６．９８にＨ−２”及びＨ−６”）についてのプロトンシグナルは、無修飾ＥＧＣＧのそれらと同様であり、これらの部位は、接合反応中に変化を受けなかったことを示唆している。重要なことに、Ｂ環についてのプロトンシグナルは、無修飾ＥＧＣＧ（δ＝６．５）のそれと比べて、δ＝６．７ｐｐｍへと有意にシフトした。さらに、Ｂ環シグナルのＮＭＲピークは、Ｄ環シグナルのピーク下の領域の半分を有することが示され、接合反応後にＢ環から１つのプロトン（Ｈ−２’）が消失したことを示している。したがって、上記結果は、ＨＡ−システアミン接合体の部位特異的結合がＥＧＣＧのＢ環のＣ２’位だけに生じたことを明らかにした。
【００８７】
得られたＥＧＣＧグラフト化ＨＡは、水溶液に容易に可溶であり、ＥＧＣＧ部位の架橋によりヒドロゲルを生成するために利用することができる。本発明により、ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルは、自動酸化又は酵素的架橋反応のいずれかにより生成することができる。自動酸化によりＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルを生成するために、２ｗｔ％ＨＡ−ＥＧＣＧ溶液を３７℃、ｐＨ７．４でインキュベートした。ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの自動酸化媒介生成が、ゆっくり生じた。ゲル化時間は、ほぼ２時間であった。
【００８８】
本発明により、ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの生成がＨＲＰを用いた酵素的架橋反応により促進できることがわかった。
【００８９】
図９は、ＨＲＰを０．１６単位／ｍＬの濃度で添加したとき、ゲル化時間が２時間から２分へと激烈に減少したことを示す。この結果は、ＨＲＰが、ＥＧＣＧの酸化を触媒することにより、ＥＧＣＧの生成を促進したことを示している。
【００９０】
図９は、種々のＨ2Ｏ2濃度におけるＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの貯蔵弾性率の測定結果を示す。貯蔵弾性率は、Ｈ2Ｏ2の濃度の増加とともに徐々に増加した。例えば、貯蔵弾性率は、Ｈ2Ｏ2の濃度が０．６８ｍＭから１．１４ｍＭへと増加するにつれ、３６６Ｐａから９２４Ｐａへ増加した。特に、ヒドロゲルのゲル化点は、２分で不変のままであった。この結果は、ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの貯蔵弾性率がそのゲル化速度に影響することなく制御できることを示している。
【００９１】
図１０は、ＨＲＰの濃度が増加するにつれ、ゲル化速度が速くなったことを示す。０．１５単位／ｍＬのＨＲＰを用いて生成したヒドロゲルのゲル化点は、４．１分であったが、０．１６単位／ｍＬのＨＲＰを用いて生成したヒドロゲルのそれは、１．６分であった。ゲル化速度は異なっていたものの、生成したヒドロゲルは、同様の貯蔵弾性率を持った。これらの結果は、ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルのゲル化速度を単にＨＲＰの濃度を変えることにより調整することができることを示している。
【００９２】
図１１は、１２５単位／ｍＬのヒアルロニダーゼの存在下でのＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの分解プロファイルを調べた結果を示す。比較のため、同一の貯蔵弾性率（１ｋＰａ）を有するＨＡ−チラミンヒドロゲルを調製した。ヒト体内において、ヒアルロニダーゼは、多くの器官例えば肝臓、脾臓及び腎臓に存在している。ヒアルロニダーゼは、ＨＡ骨格におけるグリシド結合の開裂を引き起こす。予期したとおり、ＨＡ−チラミンヒドロゲルは、ヒアルロニダーゼにより６時間以内に迅速に分解された。対照的に、ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルは、５日間でわずか最低限レベルの分解（約６％）を示した。ＥＧＣＧ部位は、ヒアルロニダーゼ活性の阻害の原因である。これらの結果は、ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルが通常のＨＡヒドロゲルと比べて、体内において長時間にわたって延長した滞在を示すことを示唆している。したがって、制御可能なゲル化速度及び機械強度を有するＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルを生体組織工学及び生物活性剤の制御放出のための注射可能なスキャフォールドとして利用できると期待することができることを示唆している。
【００９３】
例
本発明の合成／調製例及び非限定的例を、具体的な例を参照してより詳細に記載するが、これは、いかなる様態においても、本発明の範囲を制限するものとして解すべきではない。
【００９４】
材料。ＨＡ（Ｍｗ＝８及び１７ｋＤａ）を、ライフコア・バイオメディカル（Lifecore Biomedical）（チャスカ、ＭＮ）から購入した。ＨＡ（Ｍｗ＝９０ｋＤａ）は、親切にも、ＪＮＣ社（東京、日本）により寄贈された。（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ、＞９５％純度）は、栗田工業（東京、日本）から得た。ポリアクリル酸（ＰＡＡ、Ｍｗ＝１００ｋＤａ）、シスタミン二塩酸塩、システアミン塩酸塩、四ホウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ3ＣＮ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）及びＬ−システインは、シグマ−アルドリッチ（ミネソタ、ＵＳＡ）から購入した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）は、東京化成工業（東京、日本）から購入した。ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ溶液）は、インビトロゲン（Invitrogen）（カールスバッド、ＣＡ）から得た。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、１９０単位／ｍｇ）は、和光純薬工業（大阪、日本）から購入した。過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）は、ランカスター（Lancaster）から得た。他のすべての薬品は、分析等級のものであった。
【００９５】
合成例１：
ＥＧＣＧ末端ＨＡの合成
まず、ＨＡ（８及び１７ｋＤａ）を、還元性末端において、若干の修飾をした以前の報告（Ｌｅｅ, Ｈ.； Ｌｅｅ, Ｋ.； Ｋｉｍ, Ｉ. Ｋ.； Ｐａｒｋ, Ｔ. Ｇ.  ヒアルロン酸固定金ナノプローブの合成、特性決定及びインビボ診断応用。Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９：４７０９−４７１８；２００８）に従って、チオール基で修飾した。典型的に、ＨＡ（８ｋＤａ、５００ｍｇ）及びシスタミン二塩酸塩（１．２ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの、０．４ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶かした。この反応混合物を、２５℃で２時間撹拌した。この溶液に、２０ｍＬの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶かしたＮａＢＨ3ＣＮ（６２８ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。この混合物を、撹拌しながら、３７℃で５日間インキュベートした。次いで、１５ｍＬの、０．５ＭのＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７）を加え、２５℃で２時間撹拌して、遊離チオール基を生成させた。得られた混合物を、１０００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを０．１ＭのＮａＣｌ溶液に対して２日間、２５％エタノールに対して１日間、そして蒸留水に対して２日間、窒素雰囲気下で透析した。精製した溶液を凍結乾燥して、チオール末端修飾ＨＡを得た。凍結乾燥後、最終生成物を暗所で−２０℃に保った。ＨＡ中の遊離チオール基の量を、標準としてＬ−システインを用いたエルマンアッセイにより測定した（Ｅｌｌｍａｎ, Ｇ. Ｌ. メルカプタンの低い濃度を決定するための比色法。Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ. ７４：４４３−５０；１９５８）。ＨＡのチオール末端修飾の効率は、エルマンアッセイで測定して、９８％よりも高かった。収率：９３％。
【００９６】
接合反応のために、ＥＧＣＧ（４４０ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を、２ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有する６０ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶かした。チオール末端修飾ＨＡ（１００ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を、２ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有する１０ｍＬのＰＢＳ溶液に溶かした。ついで、この溶液を、撹拌したＥＧＣＧ溶液に滴下した。この混合物を、２５℃で４時間撹拌した。得られた溶液を、２０００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを、窒素パージした蒸留水に対して徹底的に透析した。精製した溶液を凍結乾燥して、ＥＧＣＧ末端ＨＡを得た。生成物の構造を、1Ｈ ＮＭＲ分光分析により確認した。収率：９３％。1H NMR (D2O): δ 2.1 (s, HAからの-C=OCH3), 2.9-3.0 (d, C環のH-4), 3.3-4.0 (m, HAのプロトン), 4.45及び4.55 (d, HAアノマープロトン), 5.60-5.85 (s, C環のH-2及びH-3), 6.1-6.3 (s, A環のH-6及びH-8), 6.7 (s, B環のH-6’), 6.95 (s, D環のH-2"及びH-6")。
【００９７】
合成例２：
ＥＧＣＧグラフト化ＨＡの合成
異なるチオール化度を有するチオール化ＨＡ誘導体を、ＨＡ骨格中のカルボキシル基をチオール基で修飾することによって合成した。典型的に、１ｇのＨＡ（９０ｋＤａ、２．５ｍｍｏｌ  −ＣＯＯＨ）を１００ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶かした。この溶液に、１．０３７ｇ（３．７５ｍｍｏｌ）のＤＭＴＭＭを添加した。ついで、１０ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶かしたシスタミン二塩酸塩（８４４．５ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）を添加して、接合反応を開始させた。この反応混合物を２５℃で２４時間撹拌した。ついで、１５ｍＬの０．５ＭのＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７）を添加し、２５℃で１時間撹拌して、遊離チオール基を生成した。この溶液を３５００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを、０．１ＭのＮａＣｌ溶液に対して２日間、２５％エタノールに対して１日間、そして蒸留水に対して２日間、連続して透析した。すべての透析は、窒素雰囲気下で行った。精製した溶液を凍結乾燥して、ＨＡ−システアミン接合体（０．８７ｇ）を得た。置換度（ＤＳ）は、ＨＡ中の１００の繰り返し二糖当たりの置換基の数と定義される。ＤＳは、エルマンアッセイにより８．４と決定された。
【００９８】
乾燥したＨＡ−システアミン接合体（０．５ｇ、１０５μｍｏｌ −ＳＨ）を、７０ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶かした。この溶液に、２．５ｍＬの０．５ＭのＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７）を添加した。ＥＧＣＧ（１．５４７ｇ、３．３７５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、事前混合溶媒（２３ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）、５ｍＬのＤＭＳＯ、及び２ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム）に溶かした。ついで、この溶液を、ポリマーがチオールリンカーを介してアボニオドに接合した接合体に添加した。
【００９９】
溶液。この反応混合物を２５℃で２４時間撹拌した。ついで、この混合物のｐＨを、１０％酢酸を添加することにより、６にしてから、３５００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを、窒素雰囲気下、蒸留水に対して５日間透析した。精製した溶液を凍結乾燥して、ＥＧＣＧグラフト化ＨＡ（０．４８ｇ）を得た。ＤＳを、２７４ｎｍでのＥＧＣＧの吸光度を測定することにより決定した。ＤＳは、１１であった。生成物の構造を、1Ｈ ＮＭＲ分光分析により確認した。1H NMR (D2O): δ 2.0 (s, HAからの-C=OCH3), 3.3-4.0 (m, HAのプロトン), 4.51及び4.54 (d, HAアノマープロトン), 5.60-5.85 (s, C環のH-2及びH-3), 6.1-6.3 (s, A環のH-6及びH-8), 6.7 (s, B環のH-6’), 6.98 (s, D環のH-2"及びH-6")。
【０１００】
合成例３：
ＥＧＣＧグラフト化ＰＡＡの合成
異なるチオール化度を有するチオール化ＰＡＡ誘導体を、ＰＡＡ骨格中のカルボキシル基をチオール基で修飾することによって合成した。典型的に、１０ｇのＰＡＡ（９０ｋＤａ、１３８．８ｍｍｏｌ −ＣＯＯＨ）を２５０ｍＬの脱イオン水に溶かした。この溶液のｐＨを、１０ＭのＮａＯＨ溶液を添加することによって５にした。この溶液に、５．８ｇ（２１ｍｍｏｌ）のＤＭＴＭＭを添加した。ついで、システアミン二塩酸塩（２３８９ｍｇ、２１ｍｍｏｌ）を添加して、接合反応を開始させた。この反応混合物を２５℃で２４時間撹拌した。この溶液を３５００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを、窒素雰囲気下で、０．１ＭのＮａＣｌ溶液に対して１日間透析した。ついで、５ｍＬの水に溶かしたＴＣＥＰ（３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）（ｐＨ５）を添加し、２５℃で１時間反応させて、遊離チオール基を生成した。次に、この溶液を、３５００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを０．１ＭのＮａＣｌ溶液に対して２日間、２５％エタノールに対して１日間、そして蒸留水に対して２日間、連続的に透析した。すべての透析は、窒素雰囲気下で行った。精製した溶液を凍結乾燥して、ＰＡＡ−システアミン接合体（８．７ｇ）を得た。置換度（ＤＳ）は、ＰＡＡ中の１００繰り返し単位当たりの置換基の数と定義される。ＤＳは、エルマンアッセイにより１．４と決定された。
【０１０１】
乾燥したＰＡＡ−システアミン接合体（０．５ｇ、１００μｍｏｌ −ＳＨ）を７０ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に溶かした。この溶液に、１．５ｍＬの０．５ＭのＴＣＥＰ溶液（ｐＨ７）を添加した。ＥＧＣＧ（１．５４７ｇ、３．３７５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下に、事前混合した溶媒（２３ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）、５ｍＬのＤＭＳＯ及び２ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム）に溶かした。ついで、この溶液を、ＰＡＡ−システアミン接合体の撹拌した溶液に添加した。この混合物のｐＨを、１０ＭのＮａＯＨ溶液を添加することによって、７．４にした。この反応混合物を２５℃で２４時間撹拌した。ついで、この混合物のｐＨを、１０％酢酸を添加することにより、６にしてから、３５００Ｄａの分画分子量を有する透析チューブに移した。これらのチューブを、窒素雰囲気下、蒸留水に対して５日間透析した。精製した溶液を凍結乾燥して、ＥＧＣＧグラフト化ＰＡＡ（０．４８ｇ）を得た。ＤＳを、２７４ｎｍでのＥＧＣＧの吸光度を測定することにより決定した。ＤＳは、０．０７であった。
【０１０２】
合成例４：
ＨＡ−ＥＧＣＧ接合体の特性決定
ＨＡ−ＥＧＣＧ接合体のＵＶ−可視スペクトルを日立Ｕ−２８１０分光光度計で測定した。ＥＧＣＧ接合の程度を、２７４ｎｍでのＥＧＣＧの吸光度を測定することによって決定した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、ＳｐｉｒｉｔTM Ｃ１８有機カラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ i.d.、ＡＡＰＰＴｅｃ）を備えたウォーターズ２６９５セパレーションズモジュールを用いて行った。ＥＧＣＧ及びＨＡ−ＥＧＣＧ接合体を１ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン水に溶かした。これらの試料を、水中１％酢酸とアセトニトリル中１％酢酸の溶媒混合物（６：４、ｖ／ｖ）により、１．０ｍＬ／分の流量で、２５℃で溶出させた。溶出プロファイルを２８０ｎｍにおいてモニターした。
【０１０３】
合成例５：
自動酸化によるＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの生成
ＨＡ−ＥＧＣＧ接合体（９０ｋＤａ）の原液を、当該接合体を２５℃で２２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で蒸留水に溶かすことによって調製した。典型的に、４ｍＬの原液を、０．５ｍＬの９０ｍＭのＰＢＳ溶液（最終イオン強度：０．１６Ｍ、ｐＨ７．４）で希釈して、最終ＨＡ−ＥＧＣＧ濃度２０ｍｇ／ｍＬを得た。自動酸化によりＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルを生成するために、２７０μＬのＨＡ−ＥＧＣＧ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を３７℃でインキュベートした。ゲル化時間を、バイアル転倒法により決定した。ヒドロゲルを収容するバイアルの反転後１分以内に明らかな流動が観察できなかったとき、ゲル化状態とみなした。
【０１０４】
合成例６：
ＨＲＰ媒介架橋反応によるＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルの生成
上に記載したように、ＨＡ−ＥＧＣＧ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ溶液（最終イオン強度：０．１６Ｍ、ｐＨ７．４）中で調製した。ヒドロゲルを生成するために、２７０μＬのＨＡ−ＥＧＣＧ溶液を、異なる濃度（最終ＨＲＰ濃度：０．１５及び０．１６単位／ｍＬ）を有する３μＬのＨＲＰ溶液と混合した。その後、３μＬのＨ2Ｏ2溶液を、０．６８から１．１４ｍＭまでにわたる最終濃度で添加し、穏やかなボルテックスにより均質に混合した。ゲル化を３７℃で行わせた。ゲル化時間を、バイアル転倒法により決定した。ヒドロゲルを収容するバイアルの反転後１分以内に明らかな流動が観察できなかったとき、ゲル化状態とみなした。
【０１０５】
ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルのレオロジー特性決定。レオロジー特性決定のために、２７０μのＨＡ−ＥＧＣＧ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、異なる濃度（最終ＨＲＰ濃度：０．１５及び０．１６単位／ｍＬ）を有する３μＬのＨＲＰ溶液と混合した。その後、３μＬのＨ2Ｏ2溶液を、０．６８ｍＭから１．１４ｍＭまでにわたる最終濃度で添加した。この混合物を、すぐにボルテックスし、その２１０μＬを、ハッケ（HAKKE）のレオスコープ１レオメータ（カールスルーエ、ドイツ）の底板に適用した。レオロジー測定を、直径３．５ｃｍ、円錐角０．９４９°の平板円錐形状を用いて、１％の一定変形及び１Ｈｚの周波数での動的振動モードで、３７℃で行った。貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ”）の進展を、時間の関数としてモニターした。測定は、Ｇ’がプラトーに達するまで行った。Ｇ’とＧ”の交差が生じた時間をゲル化点として記録した。
【０１０６】
ＨＡ−ＥＧＣＧ及びＨＡ−チラミンヒドロゲルの酵素分解。分解の分析のために、２７０μＬのＨＡ−ＥＧＣＧ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、それぞれ３μＬのＨＲＰ及びＨ2Ｏ2溶液と混合した。ＨＡ−ＥＧＣＧヒドロゲルを生成するために使用したＨＲＰ及びＨ2Ｏ2の最終濃度は、それぞれ、０．１６単位／ｍＬ及び１．１４ｍＭであった。この混合物を、すぐにボルテックスし、その２１０μＬを１．５ｍｍ間隔で互いにクランプした２つの平行ガラス板の間に注入した。ゲル化を、５０ｒｐｍのオービタルシェーカー上で３７℃で２時間行わせた。比較のため、１ｋＰａの貯蔵弾性率を有するＨＡ−チラミンヒドロゲルを先に報告した方法（Ｌｅｅ, Ｆ.； Ｃｈｕｎｇ, Ｊ. Ｅ.； Ｋｕｒｉｓａｗａ, Ｍ. 機械的強度及びゲル化率の独立の調整を有する注射可能な酵素的架橋ヒアルロン酸−チラミンヒドロゲルシステム。Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ４, ８８０−８８７；２００８）に従って調製した。ＨＡ−ＥＧＣＧ及びＨＡ−チラミンヒドロゲルを、１２５単位／ｍＬのウシ精巣ヒアルロニダーゼを含有する２０ｍＬのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に浸漬した後、振盪インキュベータ中で３７℃でインキュベートした。示した時点で、ヒドロゲルを溶液から取り出し、秤量した。標準化したゲル重量を、ヒドロゲルの初期重量及び分解後の残存重量から次式に従って決定した：標準化ゲル重量＝Ｗｔ／Ｗ０（式中、Ｗ０は、ヒドロゲルの初期重量、Ｗｔは、分解後のヒドロゲルの残存重量）。
【０１０７】
用途
開示したフラボノイド−ポリマー接合体は、フラボノイドの生体利用能及び安定性を増大させる。
【０１０８】
有利なことに、それらは、バイオメディカル用途において当該分子を効果的にさせるために該分子のより長い寿命を必要とする用途においてフラボノイドを利用可能とさせるために使用することができる。
【０１０９】
さらに有利なことには、本ヒドロゲルは、フラボノイド−ポリマー接合体から容易に生成することができる。これらのヒドロゲルは、バイオメディカル用途を有し得る。
【０１１０】
そのような用途領域は、組織被覆剤のための非癒着性フィルム及び注射可能なゲルの製造を含む。挙げることのできる典型的な用途は、関節内補充薬又は皮膚充填剤である。
【０１１１】
さらに有利には、上記ゲルは、それら及び接合体を作るための本発明の方法により変えることができる。したがって、本発明は、異なる特性が必要とされる新しいクラスの用途を切り開くものである。
【０１１２】
本発明の種々の他の修飾及び適合化は、上記開示を読んだ後なら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、明らかであろうし、すべてのそのような修飾及び適合化は添付の特許請求の範囲の範囲内のものであることが意図されている。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ポリマー−フラボノイド接合体であって、前記ポリマーが、チオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合しているポリマー−フラボノイド接合体。
［２］
前記ポリマーが、多糖類、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、合成ポリマーおよびそれらの混合物からなる群の中から選択されたものである［１］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［３］
前記多糖類が、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギナート、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェランガム、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタンおよびキシログルカンからなる群の中から選ばれたものである［２］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［４］
前記ポリヌクレオチドが、アプタマー、ＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群の中から選ばれたものである［２］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［５］
前記ポリペプチドが、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、アプチド（aptide）、ペプチドおよびポリ（アミノ酸）からなる群の中から選ばれたものである［２］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［６］
前記合成ポリマーが、アルケン、エーテル、カルボン酸、イミン、アミド、アミン、酸無水物、カーボネート、エステル、オルトエステル、およびウレタンからなる群の中から選ばれたモノマーを含む［２］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［７］
前記合成ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ酸無水物、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（ブチレンスクシナート）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリエチレンイミン、ポリ（グリセロール）、ポリグリコール酸、ポリ（３−ヒドロキシプロピオン酸）、ポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリ（セバシン酸）、ポリ（テレフタレート−ｃｏ−ホスフェート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびこれらの組み合わせからなる群の中から選ばれたものである［６］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［８］
前記ポリマーが、ポリアクリル酸及びヒアルロン酸から選ばれたものである［２］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［９］
前記フラボノイドが、フラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジンおよびアントシアニジン、並びにそれらの混合物からなる群の中から選択されたものである［１］から［８］までのいずれか１つに記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１０］
前記フラバンが、（−）−エピカテキン、（＋）−エピカテキン、（−）−カテキン、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキンガレート、（＋）−エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、フィセチニドール（fisetinidol）、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、メスキトール（mesquitol）およびロビネチニドール（robinetinidol）、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン（oolongtheanin）、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラビン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシン（theasinensin）およびそれらの混合物からなる群の中から選ばれたものである［９］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１１］
前記チオールリンカーが、さらに、前記ポリマーに結合したチオール部分から誘導されたものであり、前記チオール部分が、アミド、アミン、アルキル、アルケニル、アリール、エステル、カーボネート、エーテル、アミド、アミドエステル、カルバメート、およびアセタール基からなる群の中から選択されたものである［１］から［１０］までのいずれか１つに記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１２］
前記アミド、アミン又はアルキル基が、１〜１０個の炭素原子を有する［１１］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１３］
前記アルケニル基が、２〜１０個の炭素原子を有する［１１］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１４］
前記アリール基が、６〜１０個の炭素原子を有する［１１］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１５］
前記ポリマー又はフラボノイドが、さらに、治療剤に結合又は接合されているか、治療剤を含んでいる［１］から［１４］までのいずれか１つに記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１６］
前記治療剤が、小分子薬物およびナノ医薬からなる群の中から選択されたものである［１５］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１７］
前記ナノ医薬が、ポリマーミセル、リポソーム及びデンドリマーからなる群の中から選択されたものである［１５］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１８］
前記ポリマー−フラボノイド接合体が、
【化３】
0006484633.tif 000004
式（Ｉ）、及び
【化４】
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式（ＩＩ）
（式中、
各ｎは、独立に、０から１５０００までの整数であり、各ｍは、１から１５０００までの整数である）からなる群の中から選ばれるヒアルロン酸−ＥＧＣＧ接合体である［１］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［１９］
前記ポリマー−フラボノイド接合体が、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表され、０．０１から１００％までの接合度を有する［１８］に記載のポリマー−フラボノイド接合体。
［２０］
ポリマー−フラボノイド接合体を生成するための方法であって、前記フラボノイドを塩基性条件下での求核付加により前記ポリマーと接合させる工程を含み、前記ポリマーは、遊離チオール基で修飾されている前記方法。
［２１］
（ａ）チオール又はジスルフィドを含有する化合物を、還元剤の存在下に、前記ポリマーに結合させる工程、及び
（ｂ）前記ジスルフィド含有化合物をジスルフィド結合において開裂させ、それにより末端チオール基を有する前記ポリマーを生成する工程
をさらに含む［２０］に記載の方法。
［２２］
前記還元剤が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム及び水素化アルミニウムリチウムからなる群の中から選ばれたものである［２１］に記載の方法。
［２３］
前記接合工程を、１〜２４時間の反応時間で行う［２０］から［２２］までのいずれか１つに記載の方法。
［２４］
チオール又はジスルフィドを含有する化合物を、カップリング剤の存在下に、前記ポリマーにカップリングさせる工程をさらに含む［２０］に記載の方法。
［２５］
前記カップリング剤が、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、塩酸塩１−エチル−３−（３−ジメチルジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、カルボニルジイミダゾール、アジプイミド酸ジメチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル及び１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾールからなる群の中から選ばれたものである［２４］に記載の方法。
［２６］
前記カップリング剤が、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）から選ばれたものである［２４］に記載の方法。
［２７］
前記求核付加において消去剤を添加する工程をさらに含む［２０］から［２６］までのいずれか１つに記載の方法。
［２８］
前記消去剤が、ピルビン酸ナトリウム及びスーパーオキシドジスムターゼからなる群の中から選ばれたものである［２７］に記載の方法。
［２９］
前記求核付加における前記塩基性条件が、約７．０〜１０．０のｐＨ範囲内にある［２０］から［２８］までのいずれか１つに記載の方法。
［３０］
ポリマー−フラボノイド接合体から得られ、前記ポリマーがチオールリンカーを介して前記フラボノイドに接合されているヒドロゲル。
［３１］
前記ポリマー−フラボノイド接合体が、式（ＩＩ）で表され、０．０１〜１００％の接合度を有する［３０］に記載のヒドロゲル。
［３２］
［１］から［１９］までのいずれか１つに記載のポリマー−フラボノイド接合体を、塩基性条件下に、自動酸化により架橋する工程を含む、ヒドロゲルの生成方法。
［３３］
前記架橋工程が、酸化剤の存在下に酵素を添加する工程をさらに含む［３２］に記載の方法。
［３４］
前記酵素が、ペルオキシダーゼである［３２］に記載の方法。
［３５］
前記ペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ヒトミエロペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、プロスタグランジンＨシンターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、ヘミン、ヘマチン及びマイクロペルオキシダーゼ−１１からなる群の中から選ばれたものである［３４］に記載の方法。
［３６］
前記酸化剤が、過酸化物である［３２］から［３５］までのいずれか１つに記載の方法。
［３７］
前記過酸化物が、過酸化水素である［３６］に記載の方法。
［３８］
前記架橋工程を、約２分間〜４５時間の反応時間で行う［３２］から［３７］までのいずれか１つに記載の方法。
［３９］
前記架橋協定を、約３５℃〜３９℃の範囲から選ばれた温度で行う［３２］から［３８］までのいずれか１つに記載の方法。
［４０］
［３０又は３１］に記載のヒドロゲルの、バイオメディカル製品を作るための使用。
［４１］
前記バイオメディカル製品が、関節内補充薬、癒着防止フィルム又は皮膚充填剤である［４０］に記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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