(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の共焦点観察のための装置であって、
第１および第２の照明波長を備える照明放射（１２）を生成する照明装置（１０）と、
少なくとも１つのマスク領域（４８、４９）における前記照明放射（１２）によって照らされ、少なくとも１つのマスクパターンで前記照明放射（１２）を空間的に変調するマスクデバイス（１６）と、
前記少なくとも１つのマスクパターンから生成された少なくとも２つの異なるマスクパターン像を前記試料（３４）の試料領域（３２）上に結像し、第１および第２の発光波長を備え、前記照明放射（１２）の前記２つの異なる波長に応じて前記試料（３４）によって放出される、発光放射（３８、３９）を、前記少なくとも１つのマスク領域（４８、４９）上に結像するための対物レンズ（２６）と、
マスクデバイス（１６）を通過した後で発光放射（３８、３９）を受け取る検出デバイス（４２）と、前記試料領域（３２）にわたる前記マスク領域（４８、４９）のイメージを走査するスキャナ（３３）とを備え、
前記マスクデバイス（１６）および前記対物レンズ（２６）との間に位置づけられる第１のビーム・スプリッタ・デバイス（２２）によって特徴づけられ、
前記第１のビーム・スプリッタ・デバイス（２２）は、異なる波長によって生成された前記少なくとも２つの異なるマスクパターン像が前記第１および前記第２の照明波長によってそれぞれ前記試料領域（３２）に結像されるように、第１の偏向角で前記第１の照明波長および前記対応する第１の発光波長を偏向し、第２の照明波長および前記対応する第２の発光波長を通すか、または第２の偏向角で偏向させ、前記少なくとも２つの異なるマスクパターン像は、互いに照明位置が重なり合わないか、わずかにしか重ならないように前記試料領域（３２）上に結像されることを可能にする試料の共焦点観察のための装置。
【請求項２】
前記少なくとも２つの異なるマスクパターン像が、前記照明放射（１２）で単一のマスク領域（４８）を照らすことによって生成され、前記第１のビーム・スプリッタ・デバイス（２２）は、前記第１の照明波長によって作り出された前記試料領域（３２）における前記マスク領域（４８）のイメージが、水平方向に変位されるか、または光学軸の周りを回転させられるか、または前記第２の照明波長によって作り出されたイメージに対して反射されるように、前記第１の照明波長を偏向することを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記少なくとも２つの異なるマスクパターン像が、前記第１の照明波長で第１のマスク領域（４８）を、および前記第２の照明波長で第２のマスク領域（４９）を照らすことによって生成され、前記第１のビーム・スプリッタ・デバイス（２２）が、前記第１および第２のマスク領域（４８、４９）のイメージを同じ試料領域（３２）に結合することを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記マスクデバイス（１６）が、各マスク領域に対して別々のマスクを備えることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記マスクデバイス（１６）が、前記マスクパターンを生成するために異なるマスク領域（４８、４９）において照らされるただ１つのマスクを備える、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記発光波長が、前記対応する照明波長と同一となるよう選択され、前記試料（３４）によって散乱された光の検出を可能にする、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記発光波長が、前記対応する照明波長と異なるよう選択され、前記試料（３４）によって放出された蛍光光の検出を可能にする、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記検出デバイス（４２）が、前記波長に応じて、複数の検出器（４３）に前記発光放射（３８、３９）を分割するための第２のビーム・スプリッタ・デバイス（６２）を備える、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記第１の照明波長により前記試料領域（３２）に結像された前記マスクパターンが、前記第２の照明波長により前記試料領域（３２）に結像された前記マスクパターンと一致するが、前記第２の照明波長により前記試料領域（３２）に結像された前記マスクパターンに向けて水平方向に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記第１の照明波長により前記試料領域（３２）に結像された前記マスクパターンが、前記第２の照明波長により前記試料領域（３２）に結像された前記マスクパターンと一致しない、請求項３に記載の装置。
【請求項１１】
前記スキャナ（３３）が、前記マスクデバイス（１６）を動かすための、および／または前記試料（３４）を動かすための機構を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記スキャナ（３３）が、前記マスクデバイス（１６）および前記試料（３４）との間に位置づけられる可変偏向デバイスを備え、前記照明放射（１２）および前記発光放射（３８、３９）を偏向する、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記マスクデバイス（１６）が、回転可能であり、任意選択的に、Ｎｉｐｋｏｗディスクを備えることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
ビーム収束デバイス（１４）が、前記マスクデバイス（１６）における開口（４４）に前記照明放射（１２）を収束するために、前記マスクデバイス（１６）の上流に配置されることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記検出デバイス（４２）が、発光波長ごとに別々の検出器（４３）を備えることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
ビーム偏向デバイス（３０）が、前記試料（３４）および前記マスクデバイス（１６）との間に、任意選択的に、前記対物レンズ（２６）および前記マスクデバイス（１６）の間に配置され、前記ビーム偏向デバイス（３０）が、前記発光放射（３８、３９）の移動経路長の、および異なる波長の前記照明放射（１２）の違いを補償するために提供されることを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
回転可能なマスクデバイス（１６）の回転軸によって座標系が定義され、前記回転可能なマスクデバイス（１６）が、開口（４４）を備え、前記開口（４４）が、歪んだらせんパターンで配置され、歪んだらせんパターンが、ある角度および／または半径方向に、および前記個々の開口（４４）の前記角度および／または動径座標に応じて、完全ならせんパターンから前記個々の開口（４４）の前記位置を変位することによって作り出されることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
前記個々の開口（４４）の前記位置が、前記マスクデバイス（１６）の表面領域ごとの前記開口（４４）の数の局所変動を５％以下、および、例えば、１％以下にするように、前記角度および半径方向に、前記完全ならせんパターンから変位させることを特徴とする、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記個々の開口（４４）の前記位置は、量
【数１】
0006484234.tif 000004
による前記角度方向に、および
【数２】
0006484234.tif 000005
による前記半径方向に、前記完全ならせんパターンから変位し、ここで、θは角度座標を意味し、γは動径座標を意味し、高調波含有率ｊおよびｋは任意の自然数であり、振幅ａ１ならびにａ２および位相φは任意の実数であることを特徴とする、請求項１７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の共焦点観察のための装置に関し、ここで、試料は、特に、生物学的物質および／または化学物質を備える。
【背景技術】
【０００２】
既知の共焦点顕微鏡は、例えば、レーザ等の照明装置を備える。照明装置を用いて、まず、例えば、スリットまたはピンホール等の、複数の開口を備えるマスク上に向けられて照明放射が生成され、対物レンズを介して、マスクが試料に結像される。
この処理において、マスクのイメージは、試料、すなわち、試料領域の明確に定義された面に生成される。
【０００３】
照明放射は、試料において反応を引き起こし、発光放射を生成する。前記反応は、例えば、試料に含まれるマーカの蛍光励起とすることができ、または照明放射の単純な反射ともすることができる。
試料によって放出された発光放射は、前記対物レンズを再び介して、マスクに戻され、マスクの対応する開口を通過する。発光放射は、マスクデバイスを通過後、ビーム・スプリッタ・デバイスを用いて、例えば、ＣＣＤセンサ等の検出デバイスに向かう光路から外れて誘導される。
非常に小さな開口を伴うマスクデバイスを使用する場合、少量の照明放射のみが、マスクデバイスを通過し、試料に到達するという問題が存在する。この問題に対処するための既知の手法は、マスクデバイスの開口の上流にマイクロレンズを設置することであり、マイクロレンズは、ビームを収束し、それぞれが、マスクデバイスの開口に向けてビームを誘導する。この構成において、発光放射を出力結合するためのビーム・スプリッタ・デバイスが、マスクデバイスと前記ビーム収束デバイス、例えば、レンズとの間に配置される。
【０００４】
調査対象の試料について取得可能な情報を増やすために、異なる波長の照明放射を当てることが望ましい。これは、異なる波長の発光放射も生成することを可能にするためである。これにより、例えば、単一の実験で、異なる照明波長で励起されるよう、ならびに／もしくは異なる発光波長で光を放出するよう選択することができる、および生物学的試料における異なる機能構造に特に結合するようさらに選択することができる、複数の種類の蛍光マーカの観測が可能となる。試料の対応する照明または検査が、例えば、同時に異なる波長の照明放射を使用することによって、および同時に異なる波長の発光放射を検出することによって、実行される。各複数の波長で連続的な照明および検出を比較し、この同時検査が、測定を著しく加速することができる。光退色または光傷害による測定結果の潜在的な誤差も避ける。そのような誤差は、試料またはある蛍光マーカが、第１の照明波長での第１の観測の間、退色または傷害された場合、連続的な照明および検出の間発生し、したがって、第２の照明波長を使用した連続的な第２の観測の間に減少および変更信号を放出するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
複数の照明および発光波長で同時に照明および検出することの欠点は、発光放射の間のクロストークの、すなわち、異なる波長のビームの相互干渉の危険性に存在する。例えば、第１の蛍光マーカは、第１の照明波長で励起されて、第１の発光波長で光を放出するよう設計され、充分広範な発光スペクトルを有し、第２の蛍光マーカの観測のための第２の発光波長での発光放射の放出に影響する。これにより、第１の蛍光マーカが試料に存在する場合、第２の蛍光マーカの放出が、並列観測実験において意図的に過大評価される。第１の照明波長で励起されるよう設計された蛍光マーカもまた第２の波長の照明放射によって励起される場合、対応するクロストークが、蛍光マーカの励起の間に発生する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、良好な品質の検査結果をもたらしながら、異なる波長の照明放射の使用による試料の同時検査に適合する、試料の共焦点観察のための装置を提供することである。
本発明によれば、上記の目的は、請求項１で定義される特徴によって達成される。
本発明による試料の共焦点観察のための装置は、例えば、レーザなどの、照明装置を備える。複数の照明要素、例えば、レーザも備えることができる、照明装置を用いて、少なくとも２つの異なる波長または波長範囲の照明放射を生成することができる。照明放射は、少なくとも１つのマスク領域におけるマスクデバイス上に照射され、マスクデバイスは、少なくとも１つのマスクパターンで照明放射を空間的に変調する。この少なくとも１つのマスクパターンから生成された２つの異なるマスクパターン像は、対物レンズを使用することにより、試料の試料領域上に結像される。試料から戻る、対応する発光放射もまた、異なる波長または波長範囲を有する。第１のビーム・スプリッタ・デバイスを用いて、試料によって放出された発光放射が、波長に応じて分割される。その場合、検出デバイスを使用して、発光放射が、この場合も波長に応じて、検出される。マスクデバイスを通過した後で発光放射を受け取るために使用される検出デバイスに加え、本装置は、試料領域にわたってマスク領域のイメージを走査するためのスキャナを備える。
【０００７】
本発明により、第１のビーム・スプリッタ・デバイスが、マスクデバイスと対物レンズとの間に位置づけられる。第１のビーム・スプリッタ・デバイスは、例えば、第１の照明波長および対応する第１の発光波長を、第１の偏向角で偏向する。さらに、第１のビーム・スプリッタ・デバイスは、例えば、第２の照明波長および対応する第２の発光波長が、第１のビーム・スプリッタ・デバイスを通ることを可能にする。あるいは、第２の照明波長および対応する第２の発光波長は、第１の偏向角とは異なる第２の偏向角で検出することができる。本発明により、第１のビーム・スプリッタ・デバイスでの異なる偏向のため、第１および第２の照明波長により生成される少なくとも２つの異なるマスクパターンが、それぞれ、試料領域に結像され、検出デバイスによって検出される少なくとも２つの異なる発光放射を生成する。
一実施形態において、各マスクイメージにおける照明位置が互いに重ならず、またはわずかに重なるだけの方法で配置される、複数のマスクイメージの本発明の規定により、異なる波長の発光放射を同時に検出することができ、一方で、望まないスペクトルクロストークを避けることができる。本発明により、以下のようにクロストークを回避する。
【０００８】
試料領域内の位置の第１のパターンが、第１の照明波長のみの照明放射によって照らされ、対応する第１の発光波長での発光放射が、位置のこのパターンから収集され、検出デバイスによって検出される。これにより、例えば、第１の照明波長で検出されるよう設計されて、第１の発光波長で光を放出する、第１の蛍光マーカの観測が可能になる。あるいは、第１の発光波長は、第１の照明波長と本質的に同じとしてもよく、そのような波長で試料から散乱された光を観測してもよい。
同時に、試料領域内の位置の第２の異なるパターンが、第２の照明波長の照明放射によって照らされ、対応する第２の発光波長での発光放射が、位置のこの第２のパターンから収集され、検出デバイスによって検出される。これにより、例えば、第２の照明波長で検出されるように設計されて、第２の発光波長で光を放出する、第２の蛍光マーカの観測が可能になる。先行技術の既知の構成とは対照的に、第１および第２の蛍光マーカの発光スペクトルが著しいスペクトルオーバーラップを示す場合でも、クロストークを効果的に抑制する。これは、対象の蛍光マーカのみが、第１および第２の波長の蛍光マーカがそれぞれ収集される間、試料内の位置の各第１および第２のパターンにおける第１または第２の照明放射によって励起されるためである。したがって、蛍光マーカの励起スペクトルがスペクトル的に分離される限り、位置の第１および第２のパターンそれぞれにおける対象の蛍光マーカを観測しながら、望まない蛍光マーカからのどんな蛍光発光放射も取得しない。
したがって、試料で実行される１つの検査ステップで得られる情報内容は、スペクトルクロストークによる結果の誤差を引き起こさずに、増大される。このことは、検査によって破壊されるか、または少なくとも損傷される試料において特に利点となる。
【０００９】
本発明の第１の実施形態によれば、少なくとも２つの異なるマスクパターン像が、照明放射で単一マスク領域を照明することによって生成され、ここで、照明放射は、少なくとも２つの異なる波長を備える。異なる波長によってそれぞれ投影された少なくとも２つの異なるマスクパターン像は、試料領域内のマスク領域のイメージが互いに水平方向に変位されるように、第１のビーム・スプリッタ・デバイスによって偏向される。ビーム・スプリッタ・デバイスは、例えば、波長依存ビームスプリッタである。２つの異なるマスクパターン像が生成された場合、ビーム・スプリッタ・デバイスは、第１の照明波長によって作り出された試料領域内のマスク領域のイメージが、第２の照明波長によって作り出されたイメージに対して横方向に変位されるように、第１の照明波長を偏向する。例えば、ビーム・スプリッタ・デバイスは、偏向角で第１の照明波長を偏向するよう配置することができ、一方、第２の照明波長が、偏向無しにビーム・スプリッタ・デバイスを通り、次いで、同じ偏向角で第２の照明波長を偏向するようビーム・スプリッタ・デバイスから下流に配置された鏡によって偏向される。第１および第２の照明波長は、ここで互いに対して水平方向に変位されており、次いで、チューブレンズおよび対物レンズ上に入射し、マスク領域の対応するイメージを、互いに対して水平方向に変位された試料領域に投影される。
【００１０】
本発明の第２の例示的実施形態によれば、少なくとも２つの異なるマスクパターン像が、少なくとも２つの異なるマスク領域を照らすことによって生成される。２つの異なるマスクパターン像が生成された場合、第１のマスク領域は、第１の照明波長で照らされ、第２のマスク領域は、第２の照明波長で照らされる。第１のビーム・スプリッタ・デバイスを使用することによって、マスク領域の異なるイメージ、特に、第１および第２のマスク領域の２つのイメージが、同じ試料領域に組み合わされる。例えば、ビーム・スプリッタ・デバイスは、波長依存ビームスプリッタとすることができ、第２の照明波長を通過させながら、第１の照明波長を偏向するよう設計される。このビーム・スプリッタ・デバイスは、マスクデバイスの第１のマスク領域から下流の、第１の照明波長の光路に配置され、第１の偏向角で第１の照明波長を偏向する。第２の照明波長は、第２のマスク領域内のマスクデバイスを通過した後、マスクデバイスから下流の別々の光路に沿って移動し、第２の照明放射をビーム・スプリッタ・デバイスに向けて導くよう配置される鏡によって偏向される。偏向されることなくビーム・スプリッタ・デバイスを通過した後、第２の照明波長は、第１の照明波長と同じ対物レンズに向かう光路に従う。対物レンズは、第１および第２のマスク領域の対応するイメージを、同じ試料領域に投影する。
【００１１】
本発明の例示的な実施形態によれば、マスクデバイスは、少なくとも２つの別々のマスクを備え、これらマスクのそれぞれが、マスクパターン像を生成する。有利には、このような方法で、マスクパターン像は、各マスク領域のイメージにおける照明位置が互いに重ならないか、またはほんのわずかだけ重なるように、互いに合わせることができる。
あるいは、マスクデバイスはまた、ただ１つのマスクのみを備えるよう設計することができるが、一方、マスクイメージを生成するために、前記ただ１つのマスクは、その異なる領域で照らされる。このことは、例えば２つのレーザを備える照明装置を使用する場合に有利であり、というのも、各レーザが、それぞれの波長を生成する照明放射を有し、マスクの異なる空間領域に向けられ得るためである。
特に、３つ以上のマスクイメージが生成される場合、２つの上記オプションの組み合わせが、空間的に小型の共焦点顕微鏡を実現するために有利である。
【００１２】
一実施形態において、発光波長が、対応する照明波長と同一となるよう選択され、試料によって散乱された光の検出を可能にする。例えば、発光波長は、検出デバイスの一部として設けられる波長選択光学要素によって選択される。これらの波長選択光学要素は、照明波長領域と重なるか、または同一の１つまたは複数の波長を選択するよう選ばれる。例えば、検出デバイスは、複数の検出器と、所望の発光波長の１つをそれぞれ各検出器に選択的に透過するよう設計される異なるスペクトル・バンドパス・フィルタとを備える。例えば、発光放射は、波長依存の第２のビーム・スプリッタ・デバイスによって分割され、対応する検出器に導かれる。あるいは、波長分散素子、例えば、プリズムまたは回折格子を使用して、発光放射を複数のスペクトル成分に分けることができ、その場合、複数の個々の検出器または多素子検出器アレイを、所望のスペクトル成分を受けるように配置することができる。
あるいは、発光波長は、対応する照明波長と異なるよう選択され、試料によって放出される蛍光の検出を可能にすることができる。この目的を達成するために、蛍光マーカが、所望の照明波長で励起され得、さらに検査中の試料に誘導され得るよう選択される。この場合も、検出デバイスは、波長選択光学要素を備え、上記のように、発光波長を選択する。散乱光を検出するよう構成された上記実施形態とは対照的に、波長選択光学要素は、蛍光マーカの蛍光発光波長範囲と重なるか、または同一の、１つまたは複数の波長を選択するよう選ばれる。
【００１３】
別の実施形態において、第１の照明波長により試料領域に結像されたマスクパターン像は、第２の照明波長により試料領域に結像されたマスクパターン像と一致する。この実施形態において、結像されたマスクパターン像は、互いに水平方向に変位される。あるいは、一方または両方のマスクパターン像が、試料への結像中に、反射、回転、または湾曲され得る。この実施形態において、２つの異なるマスクパターン像が存在するが、互いに対して変位された多数のマスクパターン像を使用することも可能である。
さらに別の実施形態において、結像されたマスクパターン像は、互いに一致しない。この実施形態において、マスクパターンイメージを互いに対して水平方向に必ずしも変位する必要はないが、変位することも可能である。
さらに、試料を共焦点観察するための装置は、試料領域にわたりマスク領域のイメージを走査するためのスキャナを備える。スキャナの機能は、試料内の照明放射の移動を実現することである。このことが、マスク領域イメージが試料全体で走査される間に時間列で検出された発光放射強度を記録することによって、またはマスク領域イメージが試料全体で走査される間に空間解像度をもたらす検出器、例えば、ＣＣＤカメラで発光放射信号を統合することによって、試料の完全な共焦点イメージを取得することを可能にする。このことは、マスクデバイスを移動するための、および／または試料を移動するための手段によって行うことができる。あるいは、またはこれらの移動手段に加えて、移動鏡のような可変偏向手段を使用することもできる。
【００１４】
さらなる実施形態によれば、マスクデバイスは、例えば、Ｎｉｐｋｏｗディスクなどの回転可能なマスクデバイスを備える。マスクデバイスの回転により、単純な方法でマスクデバイスが移動され、したがって、マスク領域のイメージが試料領域全体で走査される。
この例において、マスクデバイスは、照明放射を反射するか、または吸収する表面の小開口を備え、高い軸分解能で共焦点イメージを取得する。このことは、マスクデバイスに入射する空間的に均一な照明放射が、マスクデバイスを通過し、試料に到達することができることを意味する。照明収率を改善するために、照明放射の伝搬方向に関して見た場合、照明放射をマスクデバイスの開口部に収束するためのビーム収束デバイスが、マスクデバイスの上流に配置される。ビーム収束デバイスは、例えば、マイクロレンズのアレイとすることができ、１つのマイクロレンズが各ピンホールに空間的に対応するよう、マスクデバイスに配置されたピンホール開口のアレイと同じパターンで配置される。マスクデバイスが回転可能である場合、収束デバイスは、例えば、同じ回転軸の両方に取り付けることにより、マスクデバイスと同期して回転する必要がある。
照明放射および発光放射は、１つの共通の対物レンズを通るよう誘導される。この共通の対物レンズを通り、全てのマスクイメージが、試料に結像される。これにより、装置のコストを相当に下げ、配置を容易にすることを可能にすることができる。あるいは、別々の対物レンズを、それぞれ照明放射ならびに発光放射のために、または照明放射ならびに対応する発光放射のそれぞれの組のために、使用することができる。
【００１５】
本発明の装置の検出デバイスは、各波長に対する別々の検出器を備える。したがって、検出デバイスは、発光放射を、波長に応じて複数の検出に分割するための第２のビーム・スプリッタ・デバイスを備える。
さらに、本発明の装置は、ビーム偏向デバイスを備える。後者は、異なる波長の照明放射および発光放射の移動経路の長さの違いを補償するよう機能する。試料を検査する場合に、異なる波長の照明放射および発光放射の移動経路長の間に違いが存在しない場合、有益である。この目的のために、前記ビーム偏向デバイスが、試料とマスクデバイスとの間に、特に、対物レンズとマスクデバイスとの間に配置される。試料とマスクデバイス、およびそれぞれの個々のマスクもしくはマスク上のイメージとの間の移動経路の長さは、可能な限りの最大長と同じでなければならない。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態によれば、さらなるビーム・スプリッタ・デバイスが、マスクデバイスと照明装置との間に、およびマスクデバイスとビーム収束デバイスとの間に、配置される。このビーム・スプリッタ・デバイスは、照明放射から発光放射を分離するよう機能する。
【００１７】
本発明は、添付図面を参照しながら、実施形態により以下でさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本装置の第１の実施形態の模式図である。
【図２】図１に示す実施形態で使用されるマスクデバイスの略平面図である。
【図３】本装置の第２の実施形態の模式図である。
【図４】本装置の第３の実施形態の模式図である。
【図５】本装置の第４の実施形態の模式図である。
【図６】本装置の第５の実施形態の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のさまざまな実施形態の以下の説明全体を通して、同様または同一の構成要素には、同じ参照番号を付す。
図１による実施形態において、２つの光源１０を備える照明装置を使用する。各光源１０は、レーザビームを、異なる波長または波長範囲の２つの照明放射１２に伸長および再平行化するよう配置される、レーザおよび望遠鏡光学系（どちらも図示せず）を備える。２つの照明放射１２は、オプションのビーム収束デバイス１４に入射する。図示した実施形態において、前記ビーム収束デバイス１４は、複数のマイクロレンズを備えるディスクの形式で設けられ、前記ディスクは、軸１８の周りを回転するよう配置される。ビーム収束デバイス１４と平行であるように、図示した実施形態では、Ｎｉｐｋｏｗディスク１６であるマスクデバイスが配置される。Ｎｉｐｋｏｗディスク１６の個々の開口のそれぞれに対して、ビーム収束デバイス１４の各マイクロレンズが割り当てられる。
【００２０】
図１の左手側の照明放射１２は、マスクデバイス１６を通過した後に、鏡２０によって偏向される。次いで、前記放射は、ビームが偏向されることなく、ビーム・スプリッタ・デバイス２２を通過する。その後、ビームは、レンズ２４を介して対物レンズ２６に入る。
ビーム・スプリッタ・デバイス２２は、波長依存ビームスプリッタである。その表面の１つの適切に設計された多層薄膜コーティングのため、図１の左手側に示した第１の照明放射１２および対応する第１の発光放射を透過し、右手側に示した第２の照明放射１２および対応する第２の発光放射を反射する。
他の照明放射１２、すなわち、図１の右手側の照明放射は、マスクデバイス１６を通過した後、２つの鏡２８に、次いで、その上のビーム・スプリッタ・デバイス２２に入射し、この照明放射の波長のため、このビームは、ビーム・スプリッタ・デバイス２２によってレンズ２４に向けて偏向される。第２の照明放射は、レンズ２４を通り、第１の照明放射と共に、対物レンズ２６に向かう。
鏡２８およびビーム・スプリッタ・デバイス２２によって、移動経路長の違いを補償するよう機能するビーム偏向デバイス３０を作り出す。それにより、マスクデバイス１６によって生成される２つのマスクイメージ像が、試料３４内の試料領域を規定する同じイメージ面３２に結像されることの予防策となる。
【００２１】
まず、試料３４内のイメージ面３２に生成された発光放射の両方が、対物レンズ２６を通り、レンズ２４に入るが、その場合、それらは、ビーム・スプリッタ・デバイス２２によって互いから分離される。図１の左側の照明放射に対応する発光放射は、ビーム・スプリッタ・デバイス２２を通過し、鏡２０に入射する。右側の照明放射に対応する発光放射は、ビーム・スプリッタ・デバイス２２を通過せず、鏡２８に向けて偏向される。
鏡２０から、図１の左側に示した発光放射は、ビーム・スプリッタ・デバイス３６に到達する。ビーム・スプリッタ・デバイス３６は、発光放射３８を、対応する照明放射１２から分離する。図１の装置を使用して、試料３４から蛍光発光放射の観測を行う場合、対象の発光放射３８は、照明放射１２とは異なる波長を有し、ビーム・スプリッタ・デバイス３６は、例えば、波長依存ビームスプリッタである。他方で、本装置が試料３４からの散乱放射の観測をするために使用される場合、対象の発光放射３８は、照明放射１２と波長が同一であり、ビーム・スプリッタ・デバイス３６は、例えば、部分的反射鏡または偏光依存ビームスプリッタである。
レンズ構成４０を介して、発光放射３８は、次いで、検出器４２に到達する。検出器４２は、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、またはＳＣＭＯＳカメラセンサの形式で設けることができる。さらに、検出器４２は、波長依存フィルタ、例えば、バンドパスフィルタを備え、検出される発光放射のスペクトル成分を制限する。
【００２２】
第１のビーム・スプリッタ・デバイス２２によって分離された第２の発光放射は、鏡２８を介して、図１の右手側に示したさらなるビーム・スプリッタ・デバイス３６に移動する。後者は、図１における右手側の照明放射１２から発光放射３８を分離し、この場合も、レンズ構成４０を通り、検出器４２に向かって、図１における右手側に向けてこの発光放射を導く。
スキャナは、試料３４内の照明放射の相対移動を実現するよう使用される。このことは、軸１８の周りを回転することなどによって、および／または図１において矢印３３として示した試料３４を移動するための手段によって、マスクデバイス１６を移動するための移動手段によって、実現することができる。
【００２３】
図２において、Ｎｉｐｋｏｗディスク１６が、平面図に示される。前記ディスクは、照明放射１２を反射するか、または吸収する材料から作られるか、またはガラスもしくは別の透明材料から作られるが、反射もしくは吸収表面層でコーティングされる。ディスクおよび／または前記表面層は、らせん状の線に配置される、複数の開口４４を備える。開口４４に対応して、各マイクロレンズが、開口４４の上に配置されるビーム収束デバイス１４の各開口４４に対して配置される。
Ｎｉｐｋｏｗディスク１６の上側では、各照明領域４８、４９が、２つの平行光源１０のそれぞれによって照らされる。それに対応して、試料領域３２における試料３４に結像される２つのマスクパターン像が生成される。２つのマスクパターン像は、次いで、互いに重ね合わされる。２つのイメージ内に、次いで、互いに逆方向に配置された照明点のらせん状の列が設けられる。この実施形態において、Ｎｉｐｋｏｗディスク１６は、ビーム収束デバイスと共に回転するので、マスクイメージもまた、試料３４に対して移動する。
【００２４】
マスク領域４８、４９のイメージが試料３４に対して移動している場合、場合によっては、領域４８、４９のそれぞれにおける個々の開口４４が、同時に、試料領域３２における同じ位置に結像される。左手および右手照明放射１２の両方が同時に存在することで、発光放射３８における一時的および局所的スペクトルクロストーク寄与をもたらす。開口４４の単一の一致からのクロストーク寄与は、本発明の構成を有さない従来の顕微鏡で発生するスペクトルクロストークと比べて無視できるほど小さいので、これは問題にならない。しかしながら、開口４４のらせんパターンの準周期的構造のため、マスクデバイス１６がフル回転する間、領域４８、４９のそれぞれにおけるさらなる開口４４のイメージが、試料領域３２内の同じ領域で一致する確率が高まる。このことは、前記位置において、クロストーク寄与の繰り返しを引き起こし、前記位置における潜在的に顕著な総クロストーク信号をもたらし、したがって、望ましくない。
【００２５】
本発明の一実施形態において、開口４４は、したがって、歪んだらせんパターンで配置され、ある角度ならびに／もしくは半径方向に、および／または個々の開口４４の角度ならびに／もしくは動径座標に応じて、完璧ならせんパターンから個々の開口の位置を変位することによって作り出され、ここで、座標系は、回転可能なマスクデバイス１６の回転軸によって定義される。このことは、マスクデバイス１６がフル回転する間ずっと、イメージ４８、４９のそれぞれにおける個々の開口４４のイメージが一致する位置が、試料領域３２にわたってより均一に分散し、したがって、ある位置におけるクロストーク寄与の増加を避けることを確実にする。
照明強度および検出効率が試料領域３２全体で一定になることを維持することを確実にするために、個々の開口４４の位置は、マスクデバイス１６の表面領域ごとの開口４４の数の局所変動を５％以下、および１％以下にするように、角度および半径方向に、完全ならせんパターンから変位させる。特定の実施形態において、個々の開口４４の位置は、量
【数１】
0006484234.tif 000002
による角度方向に、および
【数２】
0006484234.tif 000003
による半径方向に、完全ならせんパターンから変位し、ここで、θは角度座標を意味し、γは動径座標を意味し、高調波含有率ｊおよびｋは任意の自然数であり、振幅ａ１ならびにａ２および位相φは任意の実数である。具体例において、振幅ａ１およびａ２は、隣り合う開口４４の間の距離よりも小さい。
【００２６】
別の実施形態において、領域４８、４９のそれぞれにおける個々の開口４４が同時に試料領域３２の同じ位置に結像されることは、領域４８または領域４９を試料領域３２上に結像するため、ビーム経路に光学軸の周りの１８０°回転を引き起こすことによって避けられる。そのような回転は、当分野で既知の鏡またはプリズム構成によって実現することができる。この実施形態において、試料領域３２における領域４８および４９でのらせんパターンのイメージは、反対方向よりもむしろ平行に配向され、マスクデバイス１６の回転時に平行に移動する。したがって、試料領域３２における領域４８および４９のイメージの相対的位置の適切な配列によって、領域４８および４９における個々の開口４４のイメージは、それぞれ、互いから離れて位置づけることができ、マスクデバイス１６の回転時にそれらの距離を維持する。左および右の照明放射１２の両方で照らされる試料領域３２における位置での発生は、したがって、完全に回避される。
あるいは、２つの異なるマスクパターン像を、照明放射により単一のマスク領域４８を照明することによって生成することができる。マスク領域４８の２つの異なるイメージを生成するために、ビーム・スプリッタ・デバイス２２は、第１の照明波長によって作り出された試料領域３２内のマスク領域４８のイメージが、同じマスク領域４８を使用することにより、第２の照明波長によって作り出されたイメージに対して横方向に変位されるように、第１の照明波長を偏向する。
【００２７】
図３は、図１による実施形態に実質的に対応する一実施形態を示す。これら２つの実施形態間の唯一の違いは、ビーム偏向デバイス３０の設計にある。以下において、ビーム偏向デバイスの機能は、異なる波長の発光放射によってとられる経路に対して説明される。対応する照明放射は、ビーム偏向デバイスが通るのと同じ経路に従う。
まず第１に、鏡２０がＮｉｐｋｏｗディスク１６の下側に配置され、レンズ５０を通過した後に２つの発光放射３８が、ビーム・スプリッタ・デバイス２２に入射する。ビーム・スプリッタ・デバイス２２は、図１による実施形態におけるような波長依存ビームスプリッタである。図３における左手側の発光放射は、２つの鏡５２を介してＮｉｐｋｏｗディスク１６に誘導され、次いで、この場合も、ビーム・スプリッタ・デバイス３６を通り、検出器４２に向かう。
対応するように、図３における右手側の発光放射３８は、ビーム・スプリッタ・デバイス２２から、鏡５４に向けて、および後者から右手ビーム・スプリッタ・デバイス３６に向けられる。ビーム・スプリッタ・デバイス３６から、発光放射３８は、次いで、右手検出器４２に到達する。
【００２８】
図４に示した実施形態において、重要な違いは、マスクデバイスが２つの別々のＮｉｐｋｏｗディスク１６を備える点にある。２つのＮｉｐｋｏｗディスク１６のそれぞれは、各光源１０による伸長および平行化された照明放射１２で照らされる。２つの照明放射１２は、波長依存ビームスプリッタとすることができる第１のビーム・スプリッタ・デバイス２２を介して結合され、次いで、レンズ２４を通過し、鏡５６を介して、対物レンズ２６に到達する。対物レンズ２６を介して、Ｎｉｐｋｏｗディスク１６によって生成されたマスクイメージは、試料３４の面３２に結像される。
発光放射は、ビーム・スプリッタ・デバイス２２によって分割され、ビーム・スプリッタ・デバイス３６を介して左手側の検出器４２に、またはビーム・スプリッタ・デバイス５８を介して右手側の検出器４２に向かう。
図４に示した実施形態において、本構成は、移動経路長の違いを補償するための追加のビーム偏向デバイス３０の必要性を無くすという効果のために設計される。
【００２９】
図４による実施形態において、試料領域３２にわたるマスク領域のイメージを走査するためのスキャナは、両方のマスクデバイス１６を動かすための手段として、そのそれぞれの軸１８の周りをそれぞれが回転することによって実現される。あるいは、鏡５６に作用する傾斜機構を組み込むことができる。このことは、マスクデバイス１６と試料３４との間に位置する可変偏向デバイスとして鏡５６を動作させ、照明および発光放射の両方を偏向し、試料領域３２にわたるマスク領域のイメージを走査する。
【００３０】
図５に示すさらなる実施形態において、４つのマスクイメージが試料３４の面３２に生成されることが提供される。この目的のために、レーザと望遠鏡光学系とを備える、それぞれが異なる波長の２つの伸長および平行化された照明放射を生成する２つの光源１０が、異なる波長の４つの照明放射の統合を生成する。図３で示したように、これらの照明放射は、ビーム収束デバイス１４のレンズを介して、Ｎｉｐｋｏｗディスク１６上に収束される。さらに、図３で示したように、照明放射１２の第１の組は、鏡５２、ビーム・スプリッタ・デバイス２２、レンズ５０、および鏡２０を介して、対物レンズ２６に向かう。照明放射１２の他の組は、鏡５４、ビーム・スプリッタ・デバイス２２、レンズ５０、および鏡２０を介して、対物レンズ２６に向かう。ビーム・スプリッタ・デバイス２２によって、試料により放出された４つの発光放射は、２つの組の発光放射に分割され、マスクデバイス１６を通過した後、ビーム・スプリッタ・デバイス３６によって偏向される。結果としての発光放射３８、３９のそれぞれは、傾斜鏡６０を介して、さらなるビーム・スプリッタ・デバイス６２にそれぞれ誘導される。このビーム・スプリッタ・デバイス６２は、各２つの発光放射３８、３９を分割し、それらを、レンズ６４、６６を通して、４つの異なる検出器デバイス４３に誘導し、前記検出器デバイス４３のそれぞれは、１つの波長を検出するよう機能する。
【００３１】
図６は、照明放射１２で単一マスク領域を照らすことによって２つの異なるマスクパターンを生成する、別の実施形態を示す。照明放射１２は、光源１０によって生成される、少なくとも２つの異なる波長を備える。光源１０は、例えば、複数レーザ、発光ダイオード、または他の光源からの光を接合出力に結合するマルチラインレーザまたは光エンジンとすることができる。照明放射１２は、両方の波形を備え、ビーム・スプリッタ・デバイス５２に到達する前に、ビーム収束デバイス１４およびマスクデバイス１６を通過する。
ビーム・スプリッタ・デバイス５２は、波長依存ビームスプリッタである。その表面の１つに適切に設計された多層薄膜コーティングのため、図６の左手側に示した第１の波長の照明放射１２および対応する第１の発光放射を透過する。ビーム・スプリッタ・デバイス５２は、左手側に示した、第２の波長の照明放射１２および対応する第２の発光放射を反射する。第２の波長の照明放射１２は、ビーム・スプリッタ・デバイス５２によって反射された後、鏡５４によってさらに反射される。照明放射の両方の成分は、レンズ５０に向けて、平行経路に沿って進む。対物レンズ２６と共にレンズ５０は、マスクデバイス１６を試料３４内のイメージ面３２に結像する光学結像システムを形成する。ビーム・スプリッタ・デバイス５２および鏡５４によって引き起こされる変位のため、第１および第２の照明波長によって投影されるマスクイメージは、互いに向かって水平方向に変位される。
【００３２】
試料３４内のイメージ面３２において生成された発光放射は、対物レンズ２６を通過し、レンズ５０を通る。上記した波長依存反射特性のため、ビーム・スプリッタ・デバイス５２は、第１および第２の波長の発光放射を、それぞれ、共通の光学軸に結合する。結合された発光放射は、マスクデバイス１６を通り、上記した他の実施形態のように、照明放射１２を透過して発光放射を反射する波長依存ビームスプリッタとすることができる、ビーム・スプリッタ・デバイス３６によって反射される。さらなる波長依存ビームスプリッタ５８が、第１の波長の発光放射を第２の波長の発光放射から分離し、２つの放射成分を、レンズ４０を介して、検出器４２に導く。
【図１】
0006484234.tif 000006
【図２】
0006484234.tif 000007
【図３】
0006484234.tif 000008
【図４】
0006484234.tif 000009
【図５】
0006484234.tif 000010
【図６】
0006484234.tif 000011