(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患の診断及び／又は予後判定において使用するための、抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記医薬組成物が、心血管疾患の診断及び／又は予後判定において使用するためのものであり、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが検出可能標識とカップリングされている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記検出可能標識が放射性核種である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
非侵襲性生体内医用イメージングにおいて造影剤として使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記心血管疾患がアテローム性動脈硬化症である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
脆弱性動脈硬化プラークを標的化し及び／又は検出するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
動脈硬化プラークの脆弱性の程度及び／又は動脈硬化プラークの脆弱性の程度の経時的変化のモニタリングにおいて使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
梗塞後に心血管疾患の診断及び／又は予後判定において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記心血管疾患が心臓リモデリング又は心不全である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、
以下の式（１）：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）；
に従う４つのフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含むアミノ酸配列
又はその任意の好適な断片、ここで前記断片は前記ＣＤＲループの少なくとも１つを含む、
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがラクダ科動物抗体に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記免疫グロブリン単一可変ドメインがナノボディ配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管疾患の分野に関する。詳細には、心血管疾患の診断、予後判定及び／又はモニタリングにおいて又は治療薬として使用することのできる、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）に対して指向した免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。また、本発明の抗マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインは、梗塞後心血管イベントを含め、心血管疾患の様々なステージで有用である。さらに、本発明の抗マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインは、脆弱性動脈硬化プラークの生体内ターゲティング及び／又はイメージングに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患は最も多い死亡原因であり、それらの死亡の半数以上が冠動脈心疾患単独によるものである。冠動脈イベントの発生は、ほとんどの場合が脆弱性又は不安定性冠動脈プラークの破裂に起因し、脳、肺又は心臓の重要な動脈における突然の血流遮断を引き起こす。これらの患者の一部は、冠動脈疾患のいかなる症状又は診断もなしに、初回の心筋梗塞又は心停止により突然死する（Ｎａｇｈａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：１６６４−１６７２）。現在、脆弱性プラークの検出又は特徴付けに利用可能な一般的診断方法はない。冠動脈疾患の診断の標準方法である冠動脈造影法（ｃｏｒｏｎｏｇｒａｐｈｙ）は、「狭窄」と呼ばれる動脈内径の異常な縮小を可視化することができるが、非狭窄性プラークを同定することはできない。核イメージングは、脆弱性動脈硬化プラークを分子イメージングし得る可能性を有する。アテローム性動脈硬化症の分子イメージングに向けて、様々な化学的性質を持つ多数のトレーサー、例えば、リポタンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、抗体、糖類、アンチセンスヌクレオチド及びナノ粒子が実験的に評価された（Ｒｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１６：１４９９−１５１１）。評価の主な標的は、酸化ＬＤＬ及びそれらの受容体、マクロファージ細胞イメージングによる炎症過程又はこの細胞型によって発現する受容体又は酵素のイメージング、アポトーシス現象及び血管新生現象であった。炎症過程を標的化するトレーサーの中では、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピュータ断層撮影法）による核イメージング用の９９ｍ  Ｔｃ−ＭＣＰ−１及びＰＥＴ（陽電子放射断層撮影法）イメージング用の［１８Ｆ］−ＦＤＧが、実験的アテローム硬化性病変におけるマクロファージ集積の生体内非侵襲イメージングに使用されている。臨床レベルでは、［１８Ｆ］−ＦＤＧ及び９９ｍＴｃアネキシンＡ５が、症状を示す患者の頸動脈硬化プラークにおいてそれぞれマクロファージの集積及びアポトーシス細胞の非侵襲イメージングを可能にした。しかしながら、これらの放射性トレーサーはいずれも、現在ルーチンの臨床実践では用いられておらず、これは主に、放射性トレーサーに病変と冠動脈病変のバックグラウンドノイズレベルとの十分な比に達する能力がないことが理由である。実際、病変の容積が小さく、且つ循環する未結合のトレーサーを含有する血液に近接しているため、冠動脈における脆弱性プラークの核イメージングは特に困難である。
【０００３】
理想的なトレーサーは、高い親和性及び特異性、優れた溶解度及び安定性並びに効率的な放射標識と、投与直後にハイコントラスト画像を入手し得るようなサイズの小ささ及び速い血中クリアランスとを合わせ持つものでなければならない。ナノボディは、これらの条件を満たし得る有望な新規の放射性トレーサークラスを成す。ナノボディは、元来ラクダ科動物に存在するユニークな重鎖のみの抗体から誘導され、可能な限りで最も小さい（１０〜１５ｋＤａ）機能性の免疫グロブリン様抗原結合断片に相当する。癌抗原、上皮成長因子受容体、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、又はヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を（サブ）ナノモル濃度の親和性で標的化するナノボディベースのトレーサーについて、マウス腫瘍モデルで癌細胞の非侵襲生体イメージングの高度に特異的なコントラスト画像を作成するその能力が既に証明されている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ．１０：１６７−１７５；Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．５１：１０９９−１１０６；Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２５：２４３３−２４４６）。近年、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルに相当する高コレステロール血症ＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）を標的化するナノボディを使用したＳＰＥＣＴイメージングによりハイコントラスト画像並びに高い病変対心臓比及び病変対血液比を達成可能であったことが報告された（Ｂｒｏｉｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １１０：９２７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、心血管疾患又はそれに付随する疾患徴候の診断又は予後判定に特に好適な新規放射性トレーサーがいまだ必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
分子イメージングに理想的な放射性トレーサーは、その標的に対する高い親和性及び特異性、効率的な放射標識と、ハイコントラストの画像をトレーサーの投与後速やかに入手し得るようなサイズの小ささ並びに急速な血中クリアランスとによって特徴付けられる。後者は特に、プラークの場合に、そのサイズの小ささ及びその血管内位置に起因して、極めて重要である。本発明は、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ又はＣＤ２０６）を認識する一組の免疫グロブリン単一可変ドメイン、詳細にはナノボディが、上記に定義した理想的な分子イメージングトレーサーの特徴を全て呈したとともに、脆弱性動脈硬化プラークのターゲティング及び生体内イメージングに用いることができるという、本発明者らの意外な発見に基づいている。詳細には、抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを、脆弱性動脈硬化プラークの検出ツール、動脈硬化プラークの脆弱性の程度の判断ツール及び／又は動脈硬化プラークの脆弱性の程度の経時的変化のモニタリングツールとして使用することができる。本発明者らはまた、抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを、梗塞後イベントを含めた心血管イベントの様々なステージにおける分子イメージングトレーサーとして使用し得ることも見出した。
【０００６】
従って本発明は、心筋梗塞及び虚血性脳卒中、並びに心臓リモデリング及び心不全などの梗塞後イベントを含めた心血管疾患又はそれに付随する疾患徴候の診断又は予後判定のコンテクストで、ナノボディを含めた、ＭＭＲに対する特異的免疫グロブリン単一可変ドメインを、分子イメージングのトレーサーとして利用する適用を想定する。このように、抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインは、疾患転帰を予測し及び治療法の決定をガイドするための重要な臨床ツールであり得る。
【０００７】
ナノボディを含めた特異的抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、治療薬の標的送達用ベクターとして使用されることも見込まれ得る。
【０００８】
以下の説明から本発明の目的が明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】野生型及びＭＭＲノックアウトＣ５７ｂｌ／６マウスにおけるＮｂ  ＭＭＲ  Ｃｌ１の体内分布。トレーサー取り込みは投与活性（ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）毎グラム（％ＩＡ／ｇ）として表される。
【図２】９９ｍＴｃ標識抗ＭＭＲ  Ｎｂクローン１の注入１時間後におけるナイーブＷＴ又はＭＭＲ−／−マウスのピンホールＳＰＥＣＴ及びマイクロＣＴ合成画像の冠状断像及び矢状断像。（Ａ）ＷＴマウスにおいて、抗ＭＭＲ  Ｎｂは腎臓／膀胱排泄及びいくつかの臓器における取り込みを示す。（Ｂ）ＭＭＲ−／−マウスにおいて、抗ＭＭＲ  Ｎｂは主に腎臓／膀胱排泄を示す。
【図３】ヒトＭＭＲに対するＰＥ−ＥＬＩＳＡ。選択された抗ヒトＭＭＲ  Ｎｂクローンの概要。無関係のブロッキング乳タンパク質と比較して特異的抗原に対するＯＤ４０５ｎｍが少なくとも３倍高いとき、クローンを選択した。
【図４】ヒトＭＭＲに対するＰＥ−ＥＬＩＳＡ。選択された抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂクローンの概要。無関係のブロッキング乳タンパク質と比較して特異的抗原に対するＯＤ４０５ｎｍが少なくとも３倍高いとき、クローンを選択した。
【図５】マウスＭＭＲに対するＰＥ−ＥＬＩＳＡ。選択された抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂクローンの概要。無関係のブロッキング乳タンパク質と比較して特異的抗原に対するＯＤ４０５ｎｍが少なくとも２倍高いとき、クローンを選択した。
【図６】複数の選択されたＮｂクローンの精製。Ａ．ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８ペリプラズム抽出物のＩＭＡＣ精製後のタンパク質画分をロードしたクーマシー染色１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１、カラム素通り、レーン２、洗浄画分、レーン３及び４、溶出画分、Ｍは分子量ラダーを示す。Ｂ．ＰＢＳ中Ｓ７５ゲルろ過カラムに流したＩＭＡＣ精製Ｎｂ５．３８試料のクロマトグラム。実線はＯＤ  ２８０ｎｍを示し、点線は伝導度を示し、破線はｐＨを示す。画分３０前後の主Ｎｂピークにおける画分のみを、さらなる実験用に確保した。Ｃ．ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１（レーン１）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４（レーン２）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８（レーン３）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０（レーン４）及びＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９（レーン５）のゲルろ過後のタンパク質画分をロードしたクーマシー染色１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｍは分子量ラダーを示す。Ｎｂは全て、＞９５％純度であり、１３〜１５ｋＤａのサイズを有することが確認された。
【図７】組換えヒト及びマウスＭＭＲに結合したＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９の表面プラズモン共鳴センサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。３５００ＲＵの組換えヒト（Ａ）又はマウス（Ｂ）ＭＭＲでコーティングしたＣＭ５センサーチップ上に、３０μｌ／分で複数の濃度のＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９を注入した。ソノグラム（ｓｏｎｏｇｒａｍ）が８００秒間にわたる会合及び解離段階を示す。
【図８】ＭＭＲ特異的Ｎｂは、エキソビボ単離マクロファージ上で発現するマウスＭＭＲに結合する。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて３×１０６癌細胞を皮下注入することにより３ＬＬ−Ｒ腫瘍を誘導した。１５日間の腫瘍成長後、腫瘍を単離し、フローサイトメトリーによる分析のため単細胞懸濁液を調製した。ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭＨＣＩＩ発現でさらにゲーティングした。ヒストグラムは、ＭＨＣＩＩｌｏｗ及びＭＨＣＩＩｈｉｇｈ  ＴＡＭ上のＮｂ結合によって定義されるとおりのＭＭＲ発現を示す。網掛けのヒストグラムは陰性対照Ｎｂ  ＢＣＩＩ１０の結合を示す。
【図９】ＭＭＲ特異的Ｎｂは、誘導樹状細胞上で発現するヒトＭＭＲに結合する。抗ｈＭＭＲ  ＮｂはヒトｉＤＣ単細胞懸濁液中のＣＤ１１ｃ＋サブセットに結合する。網掛けのヒストグラムは陰性対照Ｎｂ  ＢＣＩＩ１０の結合を示す。
【図１０】ＷＴ  Ｃ５７／ｂｌ６マウスにおけるＭＭＲ  Ｎｂの組織分布実験。抗ＭＭＲ  Ｎｂを９９ｍＴｃで標識し、Ｃ５７／ｂｌ６マウス（ｎ＝３）の尾静脈に注入した。３時間後、マウスを解剖し、主要臓器の放射能を計測した。陰性対照Ｎｂ  ｃＡｂＢｃＩＩ１０の取り込み値を、一般的な非特異的Ｎｂ分布の測定値として供した。
【図１１】ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＮｂ  ＭＭＲ  ｃｌ１大動脈分布。陰性対照ナノボディｃＡｂ  ＢＣＩＩ１０及び陽性対照ナノボディｃＡｂ  ＶＣＡＭ１−５と比較した、病変拡大指数に従い順位付けしたＡｐｏＥ−／−マウス由来の動脈セグメントにおけるＮｂ  ＭＭＲ  ｃｌ１の取り込み。病変拡大指数は、差込み図に示されるとおりの各セグメントによるものであった：（−）病変なし（対照セグメント）、（＋）動脈セグメント長さの最大５０％までに広がる病変、（＋＋）動脈セグメント長さの＞５０％に広がる病変、及び（＋＋＋）セグメント全長にわたって広がる病変。
【図１２】ＷＨＨＬＭＩウサギにおける抗ＭＭＲナノボディのインビボ交差反応性。パネルＡ：９９ｍＴｃ標識Ｎｂ  ＭＭＲ  ｃｌ１（Ａ１）、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９（Ａ２）及びＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４（Ａ３）の注入後６０分のプラナー画像。パネルＢ：解剖した臓器中の放射能、これは臓器当たりの投与活性パーセンテージ（Ｂ１）又は（組織活性／組織重量）／（投与活性／動物体重）として計算される示差取り込み比（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｒａｔｉｏ：ＤＵＲ；％ＩＤ／ｇ／ｋｇ）（Ｂ２）として表される。
【図１３】心筋梗塞を起こし易い渡辺遺伝性高脂質血症ウサギの腹部大動脈におけるアテローム硬化性病変の抗マクロファージマンノース受容体ナノボディによるＰＥＴベースの生体内イメージング。１８Ｆ標識抗ＭＭＲナノボディ（クローン３．４９；ｎ＝３；左欄）又は１８Ｆ標識対照ナノボディｃＡｂＢＣＩＩ１０（ｎ＝２；右欄）のいずれかを注入した個々のウサギについて、ＰＥＴ画像及びＰＥＴ／ＣＴ合成画像を示す。矢印はアテローム硬化性病変を示す。
【図１４】心筋梗塞を起こし易い渡辺遺伝性高脂質血症ウサギの頸動脈におけるアテローム硬化性病変の抗マクロファージマンノース受容体ナノボディによるＰＥＴベースの生体内イメージング。１８Ｆ標識抗ＭＭＲナノボディ（クローン３．４９；ｎ＝３；左欄）又は１８Ｆ標識対照ナノボディｃＡｂＢＣＩＩ１０（ｎ＝２；右欄）のいずれかを注入した個々のウサギについて、ＰＥＴ画像及びＰＥＴ／ＣＴ合成画像を示す。矢印はアテローム硬化性病変を示す。
【図１５】心筋虚血／再灌流傷害後の９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込みの経時的プロファイル。下壁基部セグメント（対照領域）の９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込み平均値に対する心筋の前側壁セグメントのインビボ定量化９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込み平均値の比。対数変換データに関する反復計測ＡＮＯＶＡは、５日目から１６日目までの虚血／再灌流傷害に供された動物群における偽手術動物と比較した９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込み平均値の有意な差を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図１６】心筋虚血／再灌流傷害後の種々の時点における９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込みのインビボ絶対定量化。データは群平均±標準偏差として提示する。赤色の線（四角）は、梗塞部位（前側壁）における９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂの絶対取り込みを示し、青色は（丸）、偽手術動物の前側壁における９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂの滞留を示し、緑色の線（三角）は、ＩＲＩに供された動物の梗塞部位における対照ナノボディ（ｃＡｂＢＣＩＩ１０−Ｎｂ）の滞留プロファイルを表す。
【図１７】平均抗ＭＭＲ−Ｎｂ取り込み比と２日目の全潅流欠損との間の相関。全ての利用可能な時間点の９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ比の平均値（平均ＭＭＲ取り込み）を、２日目に９９ｍＴｃテトロホスミン走査によって評価した対応する全潅流欠損（ＴＰＤ  Ｄ２）に対してプロットする。青色の丸は偽手術ラットを表し、一方、赤色の丸はＩＲＩに供したラットを示す。最小二乗回帰直線及びその方程式もまた示す。
【図１８】心筋虚血／再灌流傷害後の心臓凍結切片に対するエキソビボ免疫蛍光染色。Ａ．凍結切片化した心臓組織に対するＣＤ２０６（ＭＭＲ、赤色）とＣＤ６８（マクロファージ系統マーカー、緑色）との二重免疫蛍光染色。動物はＩＲＩの誘導から１２日後に犠牲にした。梗塞領域近傍で切片を得た。Ｂ．上側のパネルは、ＭＭＲ（ＣＤ２０６；赤色）とＣＤ６８（緑色）との二重免疫蛍光染色を示す。ＩＲＩの誘導から１２０日後に、対応する９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取得のガイダンスに基づき梗塞の境界で切片を取る。Ｃ．同じ動物の横断、冠状断及び矢状断ピンホールＳＰＥＣＴ／マイクロＣＴ合成画像。ＮＩＨカラーテーブルを使用して９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取得を示す。心筋における９９ｍＴｃ−テトロホスミン取り込みは濃緑色として示す。９９ｍＴｃ−テトロホスミンの取り込みが存在しないことは心筋梗塞を示唆し、傷害部位（白色矢印）に対する９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ滞留の位置特定の正しい解釈を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本発明は、詳細な実施形態に関連して、且つ特定の図面を参照して記載されるが、本発明はそれらに限定されることなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲内の任意の参照符号がその範囲を限定するものと解釈されてはならない。示される図面は概略的且つ非限定的なものに過ぎない。図面では、一部の要素のサイズが例示を目的として誇張され、一定の縮尺で描かれていない場合もある。用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、それは他の要素又はステップを除外しない。単数名詞を参照するときに不定冠詞又は定冠詞、例えば「ａ」又は「ａｎ」、「ｔｈｅ」が使用される場合、これには、特に別のことが述べられない限り、当該名詞の複数形が含まれる。さらに、本明細書及び特許請求の範囲において用語の第１、第２、第３などは、同様の要素間を区別するために使用され、必ずしも逐次的又は時間的順序を記載するために使用されるわけではない。そのように使用される用語は適切な状況下で互いに置き換え可能であること、及び本明細書に記載される発明の実施形態が本明細書に記載又は例示される以外の順番で動作可能であることが理解されるべきである。
【００１１】
本明細書において特に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語及び語句は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。概して、本明細書に記載される分子細胞生物学、構造生物学、生物物理学、薬理学、遺伝学及びタンパク質及び核酸化学に関連して使用される命名法、及びその技術は、当該技術分野で周知された、一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技術は概して、特に指示されない限り、当該技術分野において周知の従来方法に従い、且つ本明細書全体にわたり引用及び考察される様々な一般的及びより専門的な参考文献に記載されるとおり実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２、及び２００２年の補遺）；Ｒｕｐ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＬＬＣ，ａｎ  ｉｎｆｏｒｍａ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，３ｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００４）を参照のこと。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「ペプチド」は、本明細書では同義的に使用され、コードされたアミノ酸及びコードされていないアミノ酸、化学的に又は生化学的に修飾され又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を指す。
【００１３】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸」は同義的に使用され、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。核酸分子は直鎖状又は環状であってもよい。
【００１４】
用語「配列同一性」は、本明細書で使用されるとき、比較ウィンドウにわたりヌクレオチド毎又はアミノ酸毎に配列が同一である範囲を指す。従って、「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適に整列した配列を比較ウィンドウにわたり比較し、両方の配列で同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が現れる位置の数を決定して一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較ウィンドウ内にある位置の総数（即ち、ウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることにより計算される。配列同一性パーセンテージの決定は手動で行うか、又は当該技術分野で利用可能なコンピュータプログラムを利用して行うことができる。有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１（１９８９）、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）である。ＢＬＡＳＴ解析の実行用ソフトウェアは国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公的に利用可能である。
【００１５】
「欠失」は、ここでは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のいずれかにおいて親ポリペプチド又は親核酸のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較してそれぞれ１つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基が存在しない変化と定義される。タンパク質の文脈の範囲内では、欠失には、約２個、約５個、約１０個、最大約２０個、最大約３０個又は最大約５０個又はそれ以上のアミノ酸の欠失が含まれ得る。タンパク質又はその断片は２つ以上の欠失を含み得る。
【００１６】
「挿入」又は「付加」は、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列において親タンパク質のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較してそれぞれ１つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基の付加をもたらした変化である。「挿入」は、概して、ポリペプチドのアミノ酸配列内における１つ以上のアミノ酸残基への付加を指し、一方で「付加」は挿入であってもよく、又はＮ末端若しくはＣ末端又は両方の末端に付加されたアミノ酸残基を指すこともできる。タンパク質又はその断片の文脈の範囲内で、挿入又は付加は通常、約１個、約３個、約５個、約１０個、最大約２０個、最大約３０個又は最大約５０又はそれ以上のアミノ酸である。タンパク質又はその断片は２つ以上の挿入を含み得る。
【００１７】
「置換」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを、それぞれ親タンパク質又はその断片のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列と比較して異なるアミノ酸又はヌクレオチドに置き換えることにより生じる。タンパク質又はその断片は、タンパク質の活性に実質的に効果を及ぼさない保存的アミノ酸置換を有し得ることが理解される。保存的置換とは、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；ｃｙｓ、ｍｅｔ；及びｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐなどの組み合わせが意図される。
【００１８】
本明細書で使用されるとき、用語「決定する」、「計測する」、「評価する」、及び「アッセイする」は同義的に使用され、定量的決定及び定性的決定の両方を含む。
【００１９】
詳細な説明
本願の一態様は、アテローム性動脈硬化症並びに梗塞後イベント、例えば心臓リモデリング及び心不全を含めた心血管疾患の診断、予後判定、予防及び／又は治療において使用するための、マクロファージマンノース受容体に対して指向した及び／又はそれに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。より詳細には、この文脈の範囲内で、対象における動脈硬化プラーク、好ましくは冠動脈及び頸動脈硬化プラークを含む大動脈硬化プラークを可視化するため抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインを医用イメージング方法における造影剤として使用すること、及び適切であるならば、これらの抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを治療薬の標的送達に使用することが想定される。さらにまた、この文脈の範囲内で、心筋梗塞発生後の（従って梗塞後ステージにおける）心血管イベント、例えば心臓リモデリング及び心不全の発症を予測するため抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインを医用イメージング方法における造影剤として使用することも想定される。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、用語「医用イメージング」は、臨床目的（例えば疾患診断、予後判定又は治療モニタリング）又は医科学（例えば解剖学及び生理学研究）のため、生物の体内（又はその一部及び／又は機能）を可視化するために用いられる技術及び方法を指す。医用イメージング方法の例としては、血管内超音波法（ＩＶＵＳ）などの侵襲的技法、並びに磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波（ＵＳ）及び核イメージングなどの非侵襲的技法が挙げられる。核イメージングの例としては、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）及び単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。
【００２１】
従って本願は、心血管疾患の分野における医学適用に鑑みて、マクロファージマンノース受容体を特異的に標的化する新規放射性トレーサークラスを提供する。以下の節では、初めに、放射性トレーサーとしての抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインに関する詳細な説明を提供する。
【００２２】
抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメイン
本願の文脈の範囲内では、免疫グロブリン単一可変ドメインを利用することにより、細胞表面に発現するマクロファージマンノース受容体を特異的に標的化することが想定される。マクロファージマンノース受容体の性質は本発明にとって重要でない。具体的な実施形態によれば、標的化されるマクロファージマンノース受容体は哺乳類起源である。好ましくは、標的化されるマクロファージマンノース受容体はヒトマクロファージマンノース受容体（配列番号１４１）である。或いは、標的化されるマクロファージマンノース受容体はマウスマクロファージマンノース受容体（配列番号１４３）である。標的化されるマクロファージマンノース受容体はまた、ラットマクロファージマンノース受容体（配列番号１４７）、又はウサギマクロファージマンノース受容体（配列番号１４８）であってもよい。本願は、その最も広義の意味において、免疫グロブリン単一可変ドメインを指向させる又は免疫グロブリン単一可変ドメインが特異的に結合するマクロファージマンノース受容体、詳細にはヒトマクロファージマンノース受容体（配列番号１４１）、又はマウスマクロファージマンノース受容体（配列番号１４３）、又はラットマクロファージマンノース受容体（配列番号１４７）、又はウサギマクロファージマンノース受容体（配列番号１４８）の特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又はコンホメーションに特に限定されず、又はそれらにより定義されない。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、用語「マクロファージマンノース受容体」（ＭＭＲ）は、当初哺乳類組織マクロファージに同定され、後に樹状細胞並びに種々の内皮及び上皮細胞に同定されたＩ型膜貫通タンパク質を指し、当該技術分野において周知されている。マクロファージは、自然及び適応免疫反応の中心的な働きを担うものである。マクロファージは多くの臓器に散在し、感染病原体を内部に取り込み且つほとんどの場合に死滅させることによってその侵入を防ぐ。マクロファージ上に存在する表面受容体の中でも、マンノース受容体は、微生物に一般的な種々の分子パターンを認識する。ＭＭＲは、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化を含む単一のサブユニットで構成され、且つ以下の５つのドメインからなる：末端硫酸化糖残基を認識するＮ末端システインリッチ領域；機能不明のフィブロネクチンＩＩ型ドメイン；病原体のエンベロープ上又は内因性糖タンパク質上のマンノース、フコース、又はＮ−アセチルグルコサミン残基のＣａ２＋依存性認識に関与する一連の８個のＣ型レクチン様炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）、ＣＲＤ４〜８はインタクトなＭＭＲのリガンドと同等のリガンドに親和性を示す；１回膜貫通ドメイン；及びＭＭＲ媒介性エンドサイトーシス及びエンドソームにおける選別に決定的に重要なモチーフを含有する４５残基長の細胞質テール（Ｃｈｉｅｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：４５５２−６０）。本願で言及するとおりのマクロファージマンノース受容体にはＭＭＲタンパク質の種間変異体（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒト等由来）が含まれ、これは、本明細書では、マクロファージマンノース受容体の「ホモログ」と称される。従って、本願で言及するとおりのマクロファージマンノース受容体には、完全長ＭＭＲタンパク質のホモログが含まれる。ＭＭＲのホモログの非限定的な例としては、ヒトＭＭＲ（同義語：Ｍｒｃ１又はＣＤ２０６；受託番号ヌクレオチド配列：ＮＭ＿００２４３８．２；受託番号タンパク質配列：ＮＰ＿００２４２９．１及び配列番号１４１のとおり）、マウスＭＭＲ（同義語：ＭＲＣ１又はＣＤ２０６；受託番号ヌクレオチド配列：ＮＭ＿００８６２５．２；受託番号タンパク質配列：ＮＰ＿０３２６５１．２及び配列番号１４３のとおり）、ラットＭＭＲ（同義語：ＭＲＣ１；受託番号ヌクレオチド配列：ＮＭ＿００１１０６１２３．１；受託番号タンパク質配列：ＮＰ＿００１０９９５９３．１及び配列番号１４７のとおり）、ウサギＭＭＲ（同義語：ＭＲＣ１；受託番号ヌクレオチド配列：ＮＣ＿０１３６８４．１；受託番号タンパク質配列：ＸＰ＿００２７１７４０２．１及び配列番号１４８のとおり）が挙げられる。説明のための例として、マウスマンノース受容体の推定アミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴｐアラインメント（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）で容易に計測し得るとおり、ヒトマンノース受容体と全体で８２％の相同性を有する。本発明で言及するとおりのマクロファージマンノース受容体にはまた、完全長ＭＭＲタンパク質の断片も含まれる。完全長ＭＭＲタンパク質の断片の非限定的な例としては、特定のＭＭＲの外部ドメインが挙げられる��「外部ドメイン」は、本明細書で使用されるとき、システインリッチのＮ末端と、続いてフィブロネクチンＩＩ型ドメイン及び８個の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含むＭＭＲの断片を指す。８個のＣＲＤは全て、特にＣＲＤ４が、特に良好に保存されている。例えば、マウスＣＲＤ４はヒトタンパク質の相当する領域と９２％の相同性を示す。詳細には、マウスマクロファージマンノース受容体の外部ドメインは、ＮＰ＿０３２６５１．２（配列番号１４３）に定義されるとおりの対応する完全長マウスＭＭＲアミノ酸配列のＡＡ１９〜ＡＡ１３８８断片（配列番号１４６）として定義される。或いは、ヒトマクロファージマンノース受容体の外部ドメインは、ＮＰ＿００２４２９．１（配列番号１４１）に定義されるとおりの対応する完全長ヒトＭＭＲアミノ酸配列のＡＡ１９〜ＡＡ１３８３断片（配列番号１４５）として定義される。明確にする目的から、特定のＭＭＲの外部ドメインは１回膜貫通ドメインも、ＭＭＲの細胞質テール（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｅ  ｔａｉｌ）も含まない。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、語句「抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、選択のマクロファージマンノース受容体を特異的に認識する免疫グロブリン単一可変ドメイン（本明細書にさらに定義するとおり）を指す。本明細書で使用されるとき、用語「〜を特異的に認識する」又は「〜に特異的に結合する」又は単に「〜に特異的」とは、免疫グロブリン単一可変ドメインがある抗原（この場合マクロファージマンノース受容体）に、別の抗原と比べて優先的に結合する能力を指し、必ずしも高親和性を含意するものではない。特定の実施形態において、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを、一部の実施形態では約１０〜１００倍超又はそれ以上（例えば、約１０００倍又は１０，０００倍超）判別し得る。用語「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「優先的に結合する」、及びその文法上の等価語は、本明細書では同義的に使用される。用語「親和性」は、本明細書で使用されるとき、免疫グロブリン単一可変ドメインが抗原に結合することで抗原と免疫グロブリン単一可変ドメインとの平衡が、それらの結合によって形成される複合体が存在する方にシフトする程度を指す。従って、例えば、抗原及び抗体（断片）が比較的等濃度で合わされる場合、高親和性の抗体（断片）は利用可能な抗原と結合し、従って得られる複合体が高濃度になる方に平衡がシフトすることになる。抗体（断片）と抗原性標的との間の親和性を記述するには、解離定数が一般的に用いられる。典型的には、解離定数は１０−５Ｍより低い。好ましくは、解離定数は１０−６Ｍより低く、より好ましくは１０−７Ｍより低い。最も好ましくは、解離定数は１０−８Ｍより低い。特定の抗原又は抗原決定基（例えばエピトープ）に特異的に結合し得る及び／又はそれに親和性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインは、前記抗原又は抗原決定基「に対する」又はそれ「に対して指向した」と言われる。本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つ以上の異なる抗原又は抗原決定基（ヒトＭＭＲ及びマウスＭＭＲなど、哺乳動物の２つの異なる種由来のマクロファージマンノース受容体）に対して、それらの異なる抗原又は抗原決定基の両方に特異的である場合に「交差反応性」であると言われる。従って、本発明によれば、ある種由来のマクロファージマンノース受容体に対して指向した免疫グロブリン単一可変ドメインが別の種由来のマクロファージマンノース受容体との交差反応性を示す場合も又は示さない場合もあることが理解されるであろう。例えば、ＭＭＲ、詳細にはヒトＭＭＲ（配列番号１４１）に対して指向した免疫グロブリン単一可変ドメインが、疾患の動物モデルに用いられることの多い動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）の１つ以上の他の種由来のＭＭＲとの交差反応性を示すことも又は示さないこともある。当業者には、かかる交差反応性は、存在する場合に、かかる疾患モデルにおける免疫グロブリン単一可変ドメインの試験が可能となるため、診断及び／又は治療の開発に利点を有し得ることは明らかであろう。本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインは、概して、本明細書に言及されるＭＭＲの全ての天然に存在する又は合成の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子に結合し得ることが予想される。
【００２５】
具体的な実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、マクロファージマンノース受容体の外部ドメイン、詳細にはマウスマクロファージマンノース受容体の外部ドメイン、ラットマクロファージマンノース受容体の外部ドメイン、ウサギマクロファージマンノース受容体の外部ドメイン及び／又はヒトマクロファージマンノース受容体の外部ドメインに特異的に結合する（表１１を参照のこと）。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、及びそれにより形成される分子を定義する（これは、典型的には２つの免疫グロブリン可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する従来の免疫グロブリン又はその断片と異なる）。しかしながら、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」が実に、抗原結合部位が単一可変ドメインにより形成される従来の免疫グロブリンの断片を含むことは明らかであろう。概して、免疫グロブリン単一可変ドメインは、好ましくは以下の式（１）：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（１）に従う４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とを含むアミノ酸配列、又はその任意の好適な断片（このときこれは、通常、相補性決定領域の少なくとも１つを形成するアミノ酸残基の少なくとも一部を含み得る）であり得る。４つのＦＲ及び３つのＣＤＲを含む免疫グロブリン単一可変ドメインは当業者に公知であり、非限定的な例として、Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８，１５７−１７４に記載されている。
【００２７】
免疫グロブリン単一可変ドメインの典型的ではあるが、しかし非限定的な例としては、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬドメイン配列）又はその好適な断片、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨドメイン配列又はＶＨＨドメイン配列）又はその好適な断片が、それが単一の抗原結合単位を形成する能力を有する限りにおいて含まれる。従って、好ましい実施形態によれば、結合ドメイン部分は、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬドメイン配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨドメイン配列）である免疫グロブリン単一可変ドメインであり；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であるか、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列である。免疫グロブリン単一可変ドメインは、ドメイン抗体、又は単一ドメイン抗体、又は「ｄＡＢ」又はｄＡｂ、又はナノボディ（本明細書に定義するとおり）、又は別の免疫グロブリン単一可変ドメイン、又はそのいずれか一つの任意の好適な断片であってもよい。単一ドメイン抗体の概要に関しては、以下の書籍が参照される：“Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｓａｅｒｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１２，Ｖｏｌ  ９１１。免疫グロブリン単一可変ドメインは、概して、４つの「フレームワーク配列」即ちＦＲ’と３つの「相補性決定領域」即ちＣＤＲ’と（以上に定義したとおり）を含むものと見なし得る単一アミノ酸鎖を含む。免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク領域もまたそれらの抗原の結合に寄与し得ることは明らかであろう（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２３６４５−５０；Ｋｏｒｏｔｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １７：２５５−６５）。ＣＤＲ配列（ひいてはＦＲ配列もまた）の記述は、Ｖドメイン及びＶ様ドメインに関するＩＭＧＴ独自の付番方式に基づき得る（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｃｏｍｐａｒａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７）。或いは、ＦＲ配列及びＣＤＲ配列の記述は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４０：１８５−１９５の論文中でラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるとおりＫａｂａｔの付番方式を用いて行われてもよい。
【００２８】
免疫グロブリン単一可変ドメインは、その最も広義の意味において、特定の生物学的供給源又は特定の調製方法に限定されないことに留意しなければならない。用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、サメ、ラクダ科動物の可変ドメインを含む種々の起源の可変ドメインを包含する。具体的な実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、サメ抗体（いわゆる免疫グロブリン新規抗原受容体又はＩｇＮＡＲ）、より具体的には軽鎖を欠く天然に存在する重鎖サメ抗体に由来し、ＶＮＡＲドメイン配列として知られる。好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインはラクダ科動物抗体に由来する。より好ましくは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖を欠く天然に存在する重鎖ラクダ科動物抗体に由来し、ＶＨＨドメイン配列又はナノボディとして知られる。
【００２９】
本願の範囲内にある好ましい免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（本明細書にさらに定義するとおり、及び限定はされないがＶＨＨを含む）である。用語「ナノボディ」（Ｎｂ）は、本明細書で使用されるとき、単一ドメイン抗原結合断片である。これは特に、天然に存在する重鎖抗体に由来する単一可変ドメインを指し、当業者には公知である。ナノボディは、通常、ラクダ科動物に見られる重鎖のみの抗体（軽鎖を欠いている）に由来し（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８；Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ８０３−８１１）、結果的に多くの場合にＶＨＨ抗体又はＶＨＨ配列と称される。ラクダ科動物には、旧世界ラクダ科動物（フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）及びヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ））及び新世界ラクダ科動物（例えばアルパカ（Ｌａｍａ  ｐａｃｃｏｓ）、リャマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、グアナコ（Ｌａｍａ  ｇｕａｎｉｃｏｅ）及びビクーニャ（Ｌａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ））が含まれる。ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）及びＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））は、Ａｂｌｙｎｘ  ＮＶ（ベルギー）の登録商標である。ＶＨＨ又はナノボディのさらなる説明に関しては、書籍「Ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｓａｅｒｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１２，Ｖｏｌ  ９１１、詳細にはＶｉｎｃｋｅ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２０１２）による章、並びに特許出願の非限定的なリストが参照され、これらの特許出願は一般的背景技術として言及されるもので、Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｂｒｕｓｓｅｌの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Ｕｎｉｌｅｖｅｒの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１  １３４  ２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Ｖｌａａｍｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ  ｖｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット；Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット、及びＡｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．によるさらなる公開特許出願が挙げられる。当業者には公知であろうとおり、ナノボディは、特に、例えば参照により本明細書に援用される国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの７５頁、表Ａ−３に記載されるとおり）、フレームワーク配列（Ｋａｂａｔ付番に従う）の１つ以上における１つ以上のラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）「ホールマーク残基」の存在によって特徴付けられる。本発明のナノボディは、その最も広義の意味において、特定の生物学的供給源又は特定の調製方法に限定されないことに留意しなければならない。例えば、ナノボディは、概して以下により得ることができる：（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離する；（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現させる；（３）天然に存在するＶＨＨドメインを「ヒト化」するか、又はかかるヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸を発現させる；（４）任意の動物種由来、詳細には哺乳類種由来、例えばヒト由来の天然に存在するＶＨドメインを「ラクダ化」するか、又はかかるラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させる；（５）当該技術分野で記載されるとおりの「ドメイン抗体」又は「Ｄａｂ」を「ラクダ化」するか、又はかかるラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させる；（６）それ自体公知のタンパク質、ポリペプチド又は他のアミノ酸配列を調製するための合成又は半合成技術を用いる；（７）それ自体公知の核酸合成技術を用いてナノボディをコードする核酸を調製し、続いて、そのようにして得られた核酸を発現させる；及び／又は（８）前述の１つ以上の任意の組み合わせ。ナノボディのさらなる説明は、ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化を含め、例えば国際公開第０８／１０１９８５号パンフレット及び国際公開第０８／１４２１６４号パンフレット、並びにさらに本明細書を参照することができる。
【００３０】
本願の範囲内において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、「ヒト化された」又は「ラクダ化された」可変ドメイン、詳細には「ヒト化された」又は「ラクダ化された」ナノボディもまた包含する。例えば「ヒト化」及び「ラクダ化」はいずれも、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメイン又はＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供し、次に、それ自体公知の方法で、新規ヌクレオチド配列が本発明のそれぞれ「ヒト化された」又は「ラクダ化された」免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするように前記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変化させることにより実施することができる。この核酸は、次にそれ自体公知の方法で発現させることができ、それにより所望の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。或いは、天然に存在するそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列に基づき、それぞれヒト化された又はラクダ化された所望の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列を設計し、次にそれ自体公知のペプチド合成技術を用いてデノボ合成することができる。また、天然に存在するそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に基づき、本発明の所望のそれぞれヒト化された又はラクダ化された免疫グロブリン単一可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を設計し、次にそれ自体公知の核酸合成技術を用いてデノボ合成することができ、その後、そのようにして得られた核酸を、それ自体公知の方法で発現させることができ、それにより本発明の所望の免疫グロブリン単一可変ドメインが提供される。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれをコードする核酸を得るための、天然に存在するＶＨ配列又は好ましくはＶＨＨ配列から出発する他の好適な方法及び技術は、当業者から明らかであろうとともに、例えば、１つ以上の天然に存在するＶＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列など）、１つ以上の天然に存在するＶＨＨ配列の１つ以上の部分（１つ以上のＦＲ配列又はＣＤＲ配列など）、及び／又は１つ以上の合成又は半合成配列を好適な方法で組み合わせ、それにより本発明のナノボディ又はそれをコードするヌクレオチド配列又は核酸を提供することが含まれ得る。
【００３１】
本願の範囲内におけるナノボディの非限定的な例は本明細書に記載されるとおりであり、抗ヒト、抗マウス及び交差反応性抗ヒト／抗マウスＭＭＲナノボディが含まれる。例えば表１、詳細には配列番号１〜７；表１０、詳細には配列番号８〜３７）。具体的な実施形態において、本発明のナノボディは、本明細書に記載されるとおりの相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば配列番号３８〜６９（ＣＤＲ１）、配列番号７０〜１０１（ＣＤＲ２）、配列番号１０２〜１３３（ＣＤＲ３）（表１、表１０を参照のこと）から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。好ましくは、本発明のナノボディは、上述の式（１）に係る配列番号３８〜１３３からなる群から選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。より具体的には、ナノボディは、配列番号１〜３７、又はその機能的断片を含む群から選択され得る。「機能的断片」又は「好適な断片」は、本明細書で使用されるとき、例えば、ＣＤＲループの１つを含み得る。好ましくは、前記機能的断片はＣＤＲ３を含む。より具体的には、前記ナノボディは配列番号１〜３７のいずれかからなる。
【００３２】
また、本明細書に定義するとおりの免疫グロブリン単一可変ドメイン、詳細にはナノボディの天然又は合成類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、部分又は断片（本明細書では、まとめて「変異体」と称される）、詳細には配列番号１〜３７の免疫グロブリン単一可変ドメインの変異体（表１、表１０を参照のこと）も本適用の範囲内にある。従って、本発明の一実施形態によれば、用語「本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「本発明のナノボディ」は、その最も広義の意味において、かかる変異体もまた包含する。概して、かかる変異体では、本明細書に定義するとおりの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して１つ以上のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。かかる置換、挿入又は欠失は、ＦＲの１つ以上及び／又はＣＤＲの１つ以上、配列番号１〜３７の免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ及びＣＤＲの特定の変異体に作製され得る（表１、表１０を参照のこと）。変異体は、本明細書で使用されるとき、各々又は任意のフレームワーク領域及び各々又は任意の相補性決定領域が、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴ（５０、５１）などのアルゴリズムを利用することにより電子的に計測し得るとおりの参照配列の対応する領域（即ちＦＲ１＿変異体に対してＦＲ１＿参照、ＣＤＲ１＿変異体に対してＣＤＲ１＿参照、ＦＲ２＿変異体に対してＦＲ２＿参照、ＣＤＲ２＿変異体に対してＣＤＲ２＿参照、ＦＲ３＿変異体に対してＦＲ３＿参照、ＣＤＲ３＿変異体に対してＣＤＲ３＿参照、ＦＲ４＿変異体に対してＦＲ４＿参照）と少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、さらにより好ましくは９５％の同一性、又はなおもさらにより好ましくは９９％の同一性を示す配列である。ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に利用可能である。免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上の配列のＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定する際には、フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基が無視されることは理解されるであろう。同様に、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの１つ以上の配列のＦＲのアミノ酸配列のアミノ酸同一性の程度を決定する際には、相補性領域を形成するアミノ酸残基が無視される。免疫グロブリン単一可変ドメインのかかる変異体は、向上した効力／親和性を有し得るため、特定の利点があり得る。
【００３３】
非限定的な例として、置換は例えば保存的置換であってもよく（本明細書に記載されるとおり）及び／又はアミノ酸残基が、別のＶＨＨドメイン中の同じ位置に天然に存在する別のアミノ酸残基によって置き換えられてもよい。従って、本発明のナノボディの特性を向上させるか、或いは本発明のナノボディの所望の特性又は平衡又は所望の特性の組み合わせを少なくとも過剰に（即ち、ナノボディがそれ以上その使用目的に適しなくなる程度まで）損なうことのない任意の１つ以上の置換、欠失又は挿入、又はそれらの任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれる。当業者は、概して、本明細書の開示に基づき、及び場合により、例えば限られた数の可能な置換を誘導すること及びそのように得られたナノボディの特性に対するそれらの影響を決定することを含み得る限られた程度のルーチン実験の後に、好適な置換、欠失又は挿入、又はそれらの好適な組み合わせを決定し及び選択することができるであろう。
【００３４】
特に好ましい実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメインの変異体、詳細には本願のナノボディは、表１０に掲載されるとおり、ＣＤＲのうちの１個、２個又は３個、より具体的には（ｉ）ＣＤＲ１又はＣＤＲ２又はＣＤＲ３；（ｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ１及びＣＤＲ３、若しくはＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３に、１個、２個又は３個のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を有し得る。より好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの変異体、詳細にはナノボディは、表１０に掲載されるとおり、ＣＤＲのうちの１個、２個又は３個、より具体的には（ｉ）ＣＤＲ１又はＣＤＲ２又はＣＤＲ３；（ｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ１及びＣＤＲ３、若しくはＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２及びＣＤＲ３に、１個、２個又は３個のアミノ酸の保存的置換（本明細書に定義するとおり）を有し得る。
【００３５】
また、本願の範囲内には、「多価」形態の、２つ以上の一価の免疫グロブリン単一可変ドメインを共に化学的に又は組換えＤＮＡ技法によって結合させることにより形成される免疫グロブリン単一可変ドメインも包含される。多価構築物の非限定的な例としては、「二価」構築物、「三価」構築物、「四価」構築物などが挙げられる。多価構築物内に含まれる免疫グロブリン単一可変ドメインは同じであっても、又は異なってもよい。別の詳細な実施形態において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは「多重特異的」形態であり、少なくとも１つが異なる特異性を有する２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを共に結合させることにより形成される。多重特異性構築物の非限定的な例には、「二重特異性」構築物、「三重特異性」構築物、「四重特異性」構築物などが含まれる。これをさらに説明すると、本発明の任意の（本明細書に定義するとおりの）多価又は多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインは、好適には同じ抗原上の２つ以上の異なるエピトープ、例えばＭＭＲの２つ以上の異なるエピトープに対して指向することができ；又は２つ以上の異なる抗原、例えばＭＭＲのエピトープ及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）のエピトープに対して指向することができる。詳細には、本発明の一価免疫グロブリン単一可変ドメインは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で標的に結合し得るようなものである。本発明の多価又は多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、所望のＭＭＲについて、及び／又はかかる多価又は多重特異性免疫グロブリン単一可変ドメインの使用によって達成され得る任意の他の所望の特性又は所望の特性の組み合わせについて、アビディティの増加及び／又は選択性の向上も有し得る（又はそのように操作され及び／又は選択され得る）。
【００３６】
さらに、及び免疫グロブリン単一可変ドメインを発現させるために用いられる宿主生物に依存して、免疫グロブリン単一可変ドメイン内の欠失及び／又は置換を、当業者の能力の範囲内であろうとおり、例えば１つ以上の翻訳後修飾部位（１つ以上のグリコシル化部位など）が取り除かれるように設計し得る。或いは、置換又は挿入は、官能基の１つ以上の結合部位（本明細書にさらに記載されるとおり）を導入するように設計してもよい。
【００３７】
好適な免疫グロブリン単一可変ドメインのスクリーニング及び選択
免疫グロブリン単一可変ドメインの好ましいクラスは、ＭＭＲに対して指向し及び／又はそれを特異的に結合する（前述のとおり）。免疫グロブリン単一可変ドメインはいくつかの方法で同定することができ、以下に非限定的な形でＶＨＨについて例示する。ＶＨＨ配列は、概して、ラクダ科動物の種をＭＭＲで好適に免疫し（即ちそれにより免疫応答を上昇させ及び／又は重鎖抗体をＭＭＲに対して指向させる）、前記ラクダ科動物から好適な生体試料（血液試料など、又は任意のＢ細胞試料）を得て、且つ前記試料から出発し、それ自体公知の任意の好適な技術を用いて、ＭＭＲに対して指向したＶＨＨ配列を作成することにより作成し又は得てもよい。かかる技術は当業者には明らかであろう。或いは、ＭＭＲに対するかかる天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科動物ＶＨＨ配列の天然ライブラリから、例えばかかるライブラリを、それ自体公知の１つ以上のスクリーニング技術を用いてＭＭＲ又はその少なくとも１つの部分、断片、抗原決定基又はエピトープを使用してスクリーニングすることにより得てもよい。かかるライブラリ及び技術は、例えば国際公開第９９３７６８１号パンフレット、国際公開第０１９０１９０号パンフレット、国際公開第０３０２５０２０号パンフレット及び国際公開第０３０３５６９４号パンフレットに記載されている。或いは、天然ＶＨＨライブラリに由来する改良された合成又は半合成ライブラリ、例えば国際公開第００４３５０７号パンフレットに記載されるとおりの、ランダム突然変異生成及び／又はＣＤＲシャッフリングなどの技術によって天然ＶＨＨライブラリから得られたＶＨＨライブラリを使用してもよい。ＭＭＲに対して指向したＶＨＨ配列を得るためのさらに別の技術には、重鎖抗体の発現能を有するトランスジェニック哺乳動物を好適に免疫し（即ちそれにより免疫応答を上昇させ及び／又は重鎖抗体をＭＭＲに対して指向させる）、前記トランスジェニック哺乳動物から好適な生体試料（血液試料など、又は任意のＢ細胞試料）を得て、次に前記試料から出発し、それ自体公知の任意の好適な技術を用いて、ＭＭＲに対して指向したＶＨＨ配列を作成することが関与する。例えば、この目的上、国際公開第０２０８５９４５号パンフレット及び国際公開第０４０４９７９４号パンフレットに記載される重鎖抗体を発現するマウス並びにさらなる方法及び技術を用いることができる。
【００３８】
従って、本願は、本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインを作成する方法を包含する。非限定的な例として、マクロファージマンノース受容体に対して指向し又はそれを特異的に結合するナノボディ（本明細書に記載されるとおりの）を作成する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）動物をＭＭＲ、詳細にはマウス（配列番号１４３）又はヒトＭＭＲ（配列番号１４１）、又はその断片で免疫するステップ；及び
（ｉｉ）前記ＭＭＲに特異的に結合するナノボディをスクリーニングするステップ
を含む。
【００３９】
ＭＭＲによる動物の免疫化のため、宿主細胞における組換え型のＭＭＲの発現及びアフィニティークロマトグラフィー及び／又は抗体ベースの方法を用いたＭＭＲの精製を用い得る従来の方法を用いてＭＭＲを作製及び精製し得る。任意の好適な動物、例えば、温血動物、詳細にはウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、雌ウシ、サメ、ブタなどの哺乳動物、又はニワトリ若しくはシチメンチョウなどのトリを、免疫応答を生じさせるのに好適な当該技術分野において周知の技法のいずれかを用いて免疫することができる。非限定的な例として、ＭＭＲに特異的に結合するナノボディのスクリーニングが、例えば、その表面上に重鎖抗体を発現する細胞（例えば好適に免疫したラクダ科動物から得られるＢ細胞）又はｇｅｎＩＩＩとナノボディとの融合物をその表面に提示するバクテリオファージのセット、集合又はライブラリをスクリーニングすることによるか、ＶＨＨ配列又はナノボディ配列の（ナイーブ又は免疫）ライブラリをスクリーニングすることによるか、又はＶＨＨ配列又はナノボディ配列をコードする核酸配列の（ナイーブ又は免疫）ライブラリをスクリーニングすることにより行われてもよく、これらは全てそれ自体公知の方法で行うことができ、その方法は、場合により、１つ以上の他の好適なステップ、例えば限定なしに、親和性成熟ステップ、所望のアミノ酸配列を発現させるステップ、所望の抗原（この場合、ＭＭＲ）に対する結合及び／又は活性をスクリーニングするステップ、所望のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を決定するステップ、１つ以上のヒト化置換を導入するステップ、好適な多価及び／又は多重特異性フォーマットにフォーマットするステップ、所望の生物学的及び／又は生理学的特性を（即ち当該技術分野で公知の好適なアッセイを用いて）スクリーニングするステップ、及び／又はかかるステップの１つ以上の任意の組み合わせを、任意の好適な順序でさらに含み得る。
【００４０】
抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインの修飾
本願の範囲内における免疫グロブリン単一可変ドメインは、本明細書にさらに記載されるとおり、さらに修飾されてもよく、及び／又は他の部分を含んでもよい（又はそれとさらに融合することができる）。修飾の例、並びに修飾することが（即ちタンパク質骨格上、しかしながら好ましくは側鎖上のいずれかに）できる免疫グロブリン単一可変ドメイン、好ましくはナノボディ配列内のアミノ酸残基の例、かかる修飾を導入するために用いることのできる方法及び技術並びにかかる修飾の潜在的な用途及び利点は、当業者には明らかであろう。例えば、かかる修飾には、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインの中への又はその上への１つ以上の官能基、残基又は部分の（例えば共有結合によるか又は別の好適な方法での）導入、詳細には、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに１つ以上の所望の特性又は機能性を付与する１つ以上の官能基、残基又は部分の導入が含まれ得る。かかる官能基及びそれらを導入する技術の例は、当業者には明らかであろうとともに、概して、以上に引用した一般的背景技術の中で言及されているあらゆる官能基及び技術、並びに医薬用タンパク質の修飾用、詳細には抗体又は抗体断片（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）修飾用のそれ自体公知の官能基及び技術を含むことができ、それらについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）が参照される。かかる官能基は、やはり当業者には明らかであろうとおり、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインに直接（例えば共有結合的に）連結されてもよく、又は場合により好適なリンカー又はスペーサーを介して連結されてもよい。医薬用タンパク質の半減期を増加させ及び／又は免疫原性を低下させるために最も広く用いられている技術の１つには、好適な薬理学的に許容可能なポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧなど）の結合が含まれる。概して、当該技術分野で抗体及び抗体断片（限定はされないが（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含む）に使用されるペグ化などの、任意の好適な形態のペグ化を用いることができる；例えばＣｈａｐｍａｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４，５３１−５４５（２００２）；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓによる，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５３−４５６（２００３）、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｓｓによる，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，２，（２００３）及び国際公開第０４０６０９６５号パンフレットが参照される。タンパク質をペグ化するための様々な試薬もまた、例えば、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、米国から市販されている。好ましくは、詳細にはシステイン残基を介した部位特異的ペグ化が用いられる（例えばＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１６，１０，７６１−７７０（２００３）を参照のこと。例えば、そのために、免疫グロブリン単一可変ドメインに天然に存在するシステイン残基とのＰＥＧの結合、又はＰ��Ｇが結合する１つ以上のシステイン残基を好適に導入するための免疫グロブリン単一可変ドメインの修飾、又はＰＥＧが結合する１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列と免疫グロブリン単一可変ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端との融合を、全て当業者にはそれ自体公知のタンパク質工学の技術を用いて行ってもよい。好ましくは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインには、５０００より大きい、例えば、１０，０００より大きく且つ２００，０００より小さい、例えば１００，０００より小さい；例えば２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧが用いられる。別の、通常好ましさに劣る修飾は、通常は同時翻訳修飾及び／又は翻訳後修飾の一部としての、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの発現に用いられる宿主細胞に依存したＮ結合型又はＯ結合型グリコシル化を含む。免疫グロブリン単一可変ドメインの半減期を増加させるための別の技法は、二機能性構築物（例えば、標的ＭＭＲに対する１つのナノボディと、アルブミンなどの血清タンパク質に対する１つのナノボディ）又は免疫グロブリン単一可変ドメインとペプチド（例えば、アルブミンなどの血清タンパク質に対するペプチド）との融合物となるように操作することを含み得る。
【００４１】
さらに別の修飾は、標識した免疫グロブリン単一可変ドメインの使用目的に応じた、１つ以上の検出可能標識又は他のシグナル発生基又は部分の導入を含み得る。それらを結合し、使用し及び検出するのに好適な標識及び技法は当業者には明らかであろうとともに、例えば限定はされないが、蛍光標識（ＩＲＤｙｅ８００、ＶｉｖｏＴａｇ８００、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、及びフルオレサミン及びＥｕなどの蛍光金属又はランタニド系列の他の金属など）、リン光標識、化学発光標識又は生物発光標識（ルミナール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタン又はＧＦＰ及びその類似体など）、放射性同位元素、金属、金属キレート又は金属カチオン或いはインビボ、インビトロ又はインサイチュ診断及びイメージングにおける使用に特に適した他の金属又は金属カチオン、並びに発色団及び酵素（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼなど）が挙げられる。他の好適な標識が当業者には明らかであろうとともに、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲ分光法を用いて検出し得る部分が挙げられる。本発明のかかる標識されたナノボディ及びポリペプチドは、具体的な標識の選択に応じて、例えばインビトロ、インビボ又はインサイチュアッセイに（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等のそれ自体公知のイムノアッセイを含む）、並びにインビボ診断及びイメージング目的で用いられ得る。当業者には明らかであろうとおり、別の修飾には、キレート基の導入、例えば上記で言及した金属又は金属カチオンの１つをキレート化することを含む。好適なキレート基としては、例えば、限定なしに、２，２’，２”−（１０−（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸（ＤＯＴＡ）、２，２’−（７−（２−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−２−オキソエチル）−１，４，７−トリアゾナン−１，４−ジイル）二酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対などの、特異的結合対の一方のパートである官能基の導入を含み得る。かかる官能基は、免疫グロブリン単一可変ドメインを、結合対のもう一方に結合する別のタンパク質、ポリペプチド又は化学的化合物と、即ち��合対の形成によって連結させるために用いられ得る。例えば、本発明のナノボディをビオチンにコンジュゲートし、アビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートした別のタンパク質、ポリペプチド、化合物又は担体に連結し得る。例えば、かかるコンジュゲートしたナノボディを、例えば検出可能なシグナルを生成する薬剤がアビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートしている診断システムにおいてレポーターとして使用し得る。かかる結合対は、例えば、本発明のナノボディを、製薬目的に好適な担体を含めた担体に結合させるためにも用いられ得る。一つの非限定的な例は、Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ，８，４，２５７（２０００）により記載されるリポソーム製剤である。かかる結合対はまた、治療上活性な薬剤を本発明のナノボディに連結するためにも用いられ得る。
【００４２】
好ましい実施形態によれば、本願で使用されるとおりの抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインは、直接、或いはリンカーを介して、検出可能標識とカップリングされ又は融合される。好ましくは、検出可能標識は放射性同位元素、詳細には生体内核イメージングなどの医学適用に好適な放射性トレーサーである。例としては、限定的であることを目的とすることなしに、テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ジルコニウム８９（８９Ｚｒ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、フッ素１８（１８Ｆ）、銅６４（６４Ｃｕ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、及び動物、詳細にはマウス、ウサギ又はヒトにおいて使用し得る任意の他の放射性同位元素が挙げられる。具体的な実施形態によれば、検出可能標識は９９ｍＴｃである。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、本発明において使用されるとおりの免疫グロブリン単一可変ドメインは、直接、或いはリンカーを介して、部分、詳細には治療上活性な薬剤とカップリングされ又は融合される。本明細書で使用されるとき、「治療上活性な薬剤」は、心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症、好ましくは脆弱性プラークの治療、又は心臓リモデリング若しくは心不全などの梗塞後イベントの治療というコンテクストで治療上の効果（即ち治療効果又は安定化効果）を有する又は有し得る任意の分子を意味する。
【００４４】
好ましくは、治療上活性な薬剤は疾患修飾剤であり、これは、細胞傷害性薬剤、例えば毒素、又は細胞傷害性薬物、又はプロドラッグを細胞傷害性薬物に変換する能力を有する酵素、又は放射性核種、又は細胞傷害性細胞であってもよく、又は非細胞傷害性薬剤であってもよい。さらにより好ましくは、治療上活性な薬剤は疾患に対して治療効果を有する。
【００４５】
或いは、治療上活性な薬剤は、疾患安定化剤、詳細には心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症の進展に対して安定化効果を有し、より具体的には、脆弱性動脈硬化プラークに対して安定化効果を有する分子である。安定化剤の例としては、抗炎症剤、詳細には非ステロイド系抗炎症分子が挙げられる。
【００４６】
一つの具体的な実施形態によれば、治療上活性な薬剤は細胞傷害性薬剤ではない。
【００４７】
リンカー分子
好ましい「リンカー分子」又は「リンカー」は、１〜２００アミノ酸長のペプチドであり、必須ではないが、典型的には、構造化されていない柔軟なものであるように選択又は設計される。例えば、特定の二次構造を形成しないアミノ酸を選択することができる。或いは、アミノ酸は、それが安定した三次構造を形成しないように選択することができる。或いは、アミノ酸リンカーはランダムコイルを形成し得る。かかるリンカーとしては、限定はされないが、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕリッチな合成ペプチド、又は天然タンパク質の構造化されていない領域と高頻度で関連付けられるさらなるアミノ酸が挙げられる（Ｄｏｓｚｔａｎｙｉ，Ｚ．，Ｃｓｉｚｍｏｋ，Ｖ．，Ｔｏｍｐａ，Ｐ．，＆  Ｓｉｍｏｎ，Ｉ．（２００５）．「ＩＵＰｒｅｄ：タンパク質の本質的に構造化されていない領域を推定エネルギー含量に基づき予測するためのウェブサーバ（ＩＵＰｒｅｄ：ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｔｅｎｔ）」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２１（１６），３４３３−４）。好適なリンカー配列の非限定的な例としては、（ＧＳ）５（ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ；配列番号１４９）、（ＧＳ）１０（ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ；配列番号１５０）、（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１５１）、ラマＩｇＧ２ヒンジ（ＡＨＨＳＥＤＰＳＳＫＡＰＫＡＰＭＡ；配列番号１５２）又はヒトＩｇＡヒンジ（ＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＡＳ；配列番号１５３）リンカーが挙げられる。好適なリンカー配列の他の非限定的な例が、実施例の節にも記載される。
【００４８】
従って、具体的な実施形態によれば、アミノ酸（ＡＡ）リンカー配列は、０〜２００ＡＡ、０〜１５０ＡＡ、０〜１００ＡＡ、０〜９０ＡＡ、０〜８０ＡＡ、０〜７０ＡＡ、０〜６０ＡＡ、０〜５０ＡＡ、０〜４０ＡＡ、０〜３０アミノ酸、０〜２０ＡＡ、０〜１０アミノ酸、０〜５アミノ酸のペプチドである。短鎖リンカーの配列の例としては、限定はされないが、ＰＰＰ、ＰＰ又はＧＳが挙げられる。
【００４９】
ある種の適用については、リンカー分子が１つ以上の特定の配列モチーフを含むか又はそれからなることが有利であり得る。例えば、検出可能標識又は部分が放出され得るように、リンカー分子にタンパク質分解切断部位を導入することができる。有用な切断部位は当該技術分野において公知であり、プロテアーゼ切断部位、例えば、配列ＩＥＧＲ（配列番号１５４）を有する第Ｘａ因子切断部位、配列ＬＶＰＲ（配列番号１５５）を有するトロンビン切断部位、配列ＤＤＤＤＫ（配列番号１５６）を有するエンテロキナーゼ切断部位、又はＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１５７）が挙げられる。
【００５０】
或いは、免疫グロブリン単一可変ドメインが化学酵素的なタンパク質修飾方法を用いて検出可能標識又は部分に連結される場合、共有結合的にカップリングした分子をインビボ又はインビトロで作製するために用いられる酵素又は合成化学に応じて、種々の化学成分のリンカー部分が存在し得る（Ｒａｂｕｋａ  ２０１０，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １４：７９０−７９６でレビューされている）。
【００５１】
心血管疾患の診断、予後判定及び治療のモニタリング
本願の一態様は、心血管疾患の診断又は予後判定において使用するための抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。好ましい実施形態において、本願は、アテローム性動脈硬化症又は冠動脈心疾患の診断又は予後判定において使用するための抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを想定する。
【００５２】
本発明の文脈の中で、用語「心血管疾患」は、心血管系を侵すアテローム生成プロセスに関係する病気、傷害、又は症状を指す。これは、動脈硬化プラーク、並びに動脈硬化プラークの形成（狭窄、虚血）及び／又は動脈硬化プラークの破裂（血栓症、塞栓症、心筋梗塞、動脈破裂、急性虚血性脳卒中）に起因する合併症の発生を特徴付ける種々のステージを含む（プラークの種々のステージは、アメリカ心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）などによるガイドラインに従い分類される：新生内膜病変、アテローム性病変、フィブロアテローム性病変及びコラーゲンリッチ病変）。心血管疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化プラーク、特に脆弱性プラーク、冠動脈心疾患、血栓症、脳卒中、心筋梗塞、血管狭窄症を指す。心血管疾患はまた、心臓リモデリング及び心不全を含め、破裂したプラークに起因する心筋梗塞の下流の合併症又は「梗塞後」合併症も指す。
【００５３】
「アテローム性動脈硬化症」は、本明細書では、動脈血管を侵す疾患を指す。アテローム性動脈硬化症は、主にマクロファージの集積に起因する動脈壁の慢性炎症反応によって特徴付けることができ、低密度リポタンパク質によって促進される。動脈硬化プラークの出現はアテローム性動脈硬化症（動脈硬化性血管疾患又はＡＳＶＤとしても知られる）のマーカーであり、これはそれ自体が典型的な心血管疾患であり、種々の心血管系合併症（本明細書にさらに記載されるとおり）を引き起こし得る。本明細書で使用されるとき、用語「動脈硬化プラーク」は、動脈壁の内膜に蓄積する脂肪及び他の物質の沈着を指す。用語「脆弱性動脈硬化プラーク」又は「不安定性動脈硬化プラーク」は、本明細書では同義的に使用され、高確率での急速な進行並びに心筋梗塞及び／又は急性虚血性脳卒中を含めた心血管疾患徴候を伴う動脈硬化プラークを指す。不安定性プラークは、細胞外脂質を含有し且つ薄い線維性被膜で覆われた大きく柔らかい脂質コア、並びに多量のマクロファージなどの侵入性炎症細胞によって特徴付けられる。対照的に安定性プラークは、小さい脂質コア、厚い線維性被膜を有し、且つマクロファージ侵入はほとんど又は全くなく、線維組織の発達により血管内膜肥厚がもたらされる。血管病変部の脂質蓄積によって形成される動脈硬化プラークは、安定性から不安定性にまで及ぶ種々の特徴を有する。不安定性プラークは破裂と、それに続く血栓形成、血管狭窄、及び閉塞を生じ易く、多くの場合に急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び脳梗塞を引き起こす。従って、不安定性プラークの特異的診断は、ＡＭＩ及び脳梗塞の予防的治療を可能にし得るものであり、臨床状況における有望な診断目標となる。
【００５４】
「冠動脈心疾患」は、心血管疾患の最も一般的な徴候である。これは心筋の灌流不良に起因する進行性疾患であり、１つ以上の冠動脈の狭小化（狭窄）又は石灰化（硬化症）に関連する。１つ以上の冠動脈の完全な閉塞により、心筋梗塞が引き起こされる。
【００５５】
用語「梗塞」は、動脈閉塞に起因する限局した巣状壊死を指す。より具体的には、心筋梗塞は心筋壊死であり、これは通常、プラーク（通常は脆弱性プラーク）が破裂した後の急性冠動脈血栓症によって生じ、血小板凝集及び冠動脈閉塞を引き起こす。
【００５６】
冠動脈プラークの存在は、特に不安定性プラークである場合、対象を心筋梗塞のリスクに曝す。従って、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、患者における心筋梗塞の発生リスクを検出するために用いられ得る。
【００５７】
「発生リスク」は、本明細書では、個体が疾患を発症する確率として定義される。
【００５８】
「急性虚血性脳卒中」は、体のある範囲への動脈血供給の低下を指す。その主因は局所的な血栓症及び塞栓症である。
【００５９】
用語「血栓症」は、血栓の形成を引き起こす血管腔（動脈、静脈、毛細血管及び心腔）における血液凝固を指す。
【００６０】
「塞栓症」は、通常血餅（血栓）によって形成される物体が移動し、それを通過させるには直径が不十分な血管内でそれが突然止まることである。塞栓症の局所的な帰結は血管閉塞に関連する循環障害であり、ほとんどの場合に心臓発作を引き起こす。
【００６１】
プラークはまた、頸動脈にあることもある。こうした病変は脳卒中、出血性イベント（動脈瘤）又は虚血性イベント（脳梗塞）を引き起こす。従って、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、患者における脳卒中の発症リスクを検出するために用いられ得る。
【００６２】
プラークはまた、腎動脈にあることもあり、腎臓はアテローム性動脈硬化症の標的臓器の１つである。重篤な狭窄により高血圧症及び／又は腎不全が引き起こされ得る。アテローム性腎動脈はまた、急性血管イベント又は腎塞栓症も引き起こし得る。従って、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインはまた、患者における腎塞栓症の発生リスクを検出するためにも用いられ得る。
【００６３】
動脈硬化プラークはまた、下肢の動脈（急性肢虚血のリスク）又は大動脈（動脈瘤／解離のリスク）にあることもある。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、患者における肢虚血又は大動脈瘤破裂の発生リスクを検出するために用いられ得る。
【００６４】
用語「心臓リモデリング」又は「心室リモデリング」は、心筋傷害後の心臓のサイズ、形状、構造及び生理の変化を指す。傷害は、典型的には急性心筋梗塞に起因するが、心臓に対する圧力又は容量過負荷（歪みの形態）の増加をもたらすいくつかの原因によることもある。心臓リモデリングは機能の低下を含意する。心臓リモデリングは、心不全の臨床経過の決定要因として一般に認められている。
【００６５】
用語「心不全（ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）」又は「心不全（ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ）」は多くの場合にうっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）又はうっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ）と呼ばれ、血流を維持して身体の要求に応えるのに十分なポンプ作用を心臓が供給できなくなるときに起こる。心不全の一般的な原因には、心筋梗塞及び他の形態の冠動脈疾患、高血圧症、心臓弁膜症、及び心筋症が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「診断する」又は文法的に等価な表現は、対象が特定の疾患又は障害に罹患しているか否かを決定することを意味する。本明細書で使用されるとき、「予後判定する」又は文法的に等価な表現は、対象が特定の疾患又は障害を発症するリスクを有するか否かを決定することを意味する。
【００６７】
本文脈の範囲内では、前述のとおりの抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインは、非侵襲性生体内医用イメージングにおける、詳細には脆弱性動脈硬化プラークを標的化し及び／又は検出するための造影剤として特に有用である。好ましくは、核イメージング手法が用いられる。一つの具体的な実施形態によれば、標識された抗ＭＭＲ抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインによる生体内イメージングに、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）が用いられる。或いは、生体内イメージング手法として単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が用いられる。従って、一実施形態において、前述のとおりの抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインは検出可能標識、好ましくは放射性同位元素とカップリングされる。一実施形態によれば、心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症の診断及び／又は予後判定は、好ましくは、動脈硬化プラーク、詳細には脆弱性動脈硬化プラークの存在又は非存在を検出することにより行われ得る。動脈硬化プラークの脆弱性の程度の変化を経時的にモニタし得ることは、さらなる利点であり得る。より具体的には、本発明によれば、動脈硬化プラークの脆弱性の進行又は消失を経時的にモニタすることが可能になる。これによってプラークの種々のステージが、アメリカ心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）などによるガイドラインに従い分類される：新生内膜病変、アテローム性病変、フィブロアテローム性病変及びコラーゲンリッチ病変。本発明のさらなる利点は、前述のとおりの抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインを利用することにより、治療法がアテローム性動脈硬化症及び／又は動脈硬化プラークの脆弱性の程度及び／又は動脈硬化プラークの脆弱性の程度の経時的変化に及ぼす影響を評価可能であることである。
【００６８】
また、心血管疾患を診断又は予後判定する方法も提供され、この方法は、抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、検出可能標識で標識されている免疫グロブリン単一可変ドメインを対象に投与するステップを含む。詳細な実施形態によれば、この方法は、以下のステップの１つ以上をさらに含み得る：
ａ．動脈硬化プラークの脆弱性の程度及び／又は動脈硬化プラークの脆弱性の程度の経時的変化をモニタするステップ、
ｂ．治療法が動脈硬化プラークの脆弱性の程度及び／又は動脈硬化プラークの脆弱性の程度の経時的変化に及ぼす影響を評価するステップ。
【００６９】
上述の方法の一実施形態によれば、抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインは、心筋梗塞の発生後、従って梗塞後ステージで対象に投与される。
【００７０】
また、対象における脆弱性動脈硬化プラークの生体内イメージング方法も想定され、この方法は、抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメインであって、検出可能標識で標識されている免疫グロブリン単一可変ドメインを対象に投与するステップと、対象における脆弱性動脈硬化プラークをイメージングするステップとを含む。
【００７１】
種々の対象又は個体が時宜を得て診断又は予後判定又はモニタされ得る。概して「対象」は哺乳動物又は哺乳類であり、ここでこれらの用語は、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、ウサギ、ヒト、チンパンジー、サル等を含め、哺乳綱に含まれる生物を表して広義に用いられる。特に好ましい実施形態において、対象はマウス、ラット、ウサギであり得る。他の好ましい実施形態において、対象はヒトであり得る。
【００７２】
心血管疾患の治療
本願の詳細な態様は、心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症の予防及び／又は治療において使用するための抗マクロファージマンノース受容体（抗ＭＭＲ）免疫グロブリン単一可変ドメイン又はそれを含む医薬組成物に関する。
【００７３】
従って、また、心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症の予防及び／又は治療方法も提供され、この方法は、それを必要としている対象に、抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインの治療有効量、又は抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインの治療有効量と、薬学的に許容可能な担体、補助剤若しくは希釈剤のうちの少なくとも１つとを含む医薬組成物を投与するステップを含む。具体的な実施形態として、上記の方法は、治療上活性な薬剤にカップリングされた抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインの治療有効量、又は治療上活性な薬剤にカップリングされた抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインの治療有効量と、薬学的に許容可能な担体、補助剤又は希釈剤のうちの少なくとも１つとを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」、「治療有効用量」及び「有効量」は、１つ又は複数の所望の結果を達成するために必要な量を意味する。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能」は、生物学的に又は他の形で望ましくないものでない、即ちその材料が、何らかの望ましくない生物学的作用を引き起こしたり又はそれを含有する医薬組成物の他の構成成分のいずれかと有害な形で相互作用したりすることなしに抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインと共に個体に投与し得る材料を意味する。
【００７５】
「担体」、又は「補助剤」、詳細には「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能な補助剤」は、それ自体はその組成物の投与を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導せず、また防御を誘発することもない、任意の好適な賦形剤、希釈剤、担体及び／又は補助剤である。従って、薬学的に許容可能な担体は本質的に非毒性且つ非治療的であり、当業者に公知である。好適な担体又は補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔｉａ）は、典型的には以下の非網羅的なリストに含まれる化合物の１つ以上を含む：大型の緩徐に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子。担体又は補助剤は、非限定的な例として、リンゲル液、デキストロース溶液又はハンクス液であってもよい。固定油及びオレイン酸エチルなどの非水溶液もまた使用することができる。好ましい賦形剤は、生理食塩水中５％デキストロースである。賦形剤は、緩衝剤及び保存剤を含め、等張性及び化学安定性を増強する物質などの少量の添加剤を含有し得る。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、語句「疾患を予防する」は、概して、疾患の発生を阻止し又は逆転させること、疾患の初期徴候を阻止し又は逆転させること、疾患の臨床症状の出現を阻止することを意味する。本明細書で使用されるとき、語句「疾患を治療する」又は「疾患を有する対象又は個体を治療する」は、概して、疾患を実質的に阻止すること、疾患の進行を実質的に遅らせ又は逆転させること、疾患の臨床症状を実質的に改善すること又は疾患の臨床症状の出現を実質的に予防することを意味する。治療は、死亡率及び／又は罹患率の低下がある場合に治療的と見なされ、予防的に、或いは治療的に実施され得る。種々の対象又は個体が治療可能である。概して「対象」は哺乳動物又は哺乳類であり、ここでこれらの用語は、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ラット、ウサギ、ヒト、チンパンジー、サル等を含め、哺乳綱に含まれる生物を表して広義に用いられる。特に好ましい実施形態において、対象はマウス、ラット、ウサギであり得る。他の好ましい実施形態において、対象はヒトであり得る。
【００７７】
具体的な実施形態によれば、標的にされる疾患は、以上に定義するとおり心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症である。詳細には、これは脆弱性動脈硬化プラークの減少又は好ましくは消失、及び／又はアテローム性動脈硬化症の症状の改善又は軽減を含む。
【００７８】
本発明の治療方法が、心血管疾患、詳細にはアテローム性動脈硬化症に対する別の治療法又は治療レジメンと併用されることが有利であり得る。従って、併用療法もまた本発明に包含される。非限定的な例として、本発明の治療法を、コレステロール値を低下させる薬物及び心血管疾患の予防又は治療に有効な薬物の投与と併用することが有用であり得る。例としては、スタチン系薬剤又はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬が挙げられ、そのうちの多くが市販されている：アトルバスタチン（リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ）及びトルバスト（Ｔｏｒｖａｓｔ））、フルバスタチン（レスコール（Ｌｅｓｃｏｌ））、ロバスタチン（メバコール（Ｍｅｖａｃｏｒ）、アルトコール（Ａｌｔｏｃｏｒ）、アルトプレブ（Ａｌｔｏｐｒｅｖ））、ピタバスタチン（リバロ（Ｌｉｖａｌｏ）、ピタバ（Ｐｉｔａｖａ））、プラバスタチン（プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、セレクチン（Ｓｅｌｅｋｔｉｎｅ）、リポスタット（Ｌｉｐｏｓｔａｔ））、ロスバスタチン（クレストール（Ｃｒｅｓｔｏｒ））、シンバスタチン（ゾコール（Ｚｏｃｏｒ）、リペックス（Ｌｉｐｅｘ））。スタチン系薬剤と別の薬剤とのいくつかの併用製剤、例えばエゼチミブ／シンバスタチンもまた利用可能である。
【００７９】
投与経路
場合により治療上活性な薬剤にカップリングされた抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメイン（それを含む医薬組成物を含む）は、経口、吸入又は詳細には静脈注入による非経口投与を用いて、当業者の知識の範囲内の任意の好適な方法により投与され得る。抗ＭＭＲ免疫グロブリン単一可変ドメインは単独で投与されてもよく、又は好ましくは医薬組成物として製剤化されてもよい。免疫グロブリン単一可変ドメインにより認識される抗原を発現する特定の疾患又は障害を治療するのに有効な量は、治療される障害の性質及び重症度、哺乳動物の体重、及び該当する場合、治療上活性な薬剤の性質などの、一般的な要因に依存する。しかしながら、単位用量は、通常、０．０１〜５０ｍｇ、例えば０．０１〜１０ｍｇ、又は０．０５〜２ｍｇの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はその薬学的に許容可能な塩の範囲であり得る。単位用量は、通常、１日１回又はそれ以上、例えば１日２回、３回、又は４回、より一般的には１日１〜３回投与され、例えば総１日用量は通常０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であり；従って７０ｋｇ成人に好適な総１日用量は０．０１〜５０ｍｇ、例えば０．０１〜１０ｍｇ又はより一般的には０．０５〜１０ｍｇである。免疫グロブリン単一可変ドメイン又はその薬学的に許容可能な塩が、単位用量組成物、例えば単位用量経口、非経口、又は吸入組成物の形態で投与されることが非常に好ましい。かかる組成物は混合により調製されて、経口、吸入又は非経口投与に好適に適合され、従って錠剤、カプセル、経口液体製剤、散剤、顆粒、ロゼンジ、再構成可能粉末、注入用及び輸液用溶液又は懸濁液又は坐薬又はエアロゾルの形態であり得る。経口投与用の錠剤及びカプセルは、通常は単位用量で提供され、従来の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、潤滑剤、崩壊剤、着色料、香味料、及び湿潤剤を含有する。錠剤は、当該技術分野で周知されている方法に従いコーティングされてもよい。使用に好適な充填剤としては、セルロース、マンニトール、ラクトース及び他の同様の薬剤が挙げられる。好適な崩壊剤としては、デンプン、ポリビニルピロリドン及びデンプングリコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）などのデンプン誘導体が挙げられる。好適な潤滑剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。好適な薬学的に許容可能な湿潤剤としては、ラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。これらの固体経口組成物は、ブレンド、充填、打錠などの従来方法によって調製され得る。多量の充填剤を用いる組成物の全体にわたり活性薬剤を分布させるには、反復ブレンド操作が用いられ得る。かかる操作は、当然ながら、当該技術分野の従来法である。経口液体製剤は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、エマルション、シロップ、又はエリキシル剤の形態であってもよく、或いは使用前に水又は他の好適な媒体で再構成される乾燥生成物として提供されてもよい。かかる液体製剤は、従来の添加剤、例えば、懸濁剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は食用硬化脂、乳化剤、例えばレシチン、モ��オレイン酸ソルビタン、又はアカシア；非水性媒体（食用油を含み得る）、例えば、アーモンド油、分留ヤシ油、油性エステル、例えばグリセリン、プロピレングリコール、又はエチルアルコールのエステル；保存剤、例えばパラオキシ安息香酸メチル若しくはプロピル又はソルビン酸、及び必要であれば従来の香味剤又は着色剤を含有し得る。経口製剤はまた、従来の徐放製剤、例えば腸溶性コーティングを有する錠剤又は顆粒も含む。好ましくは、気道に投与するための吸入用組成物が、嗅薬又はネブライザー用のエアロゾル若しくは溶液として、又はインサフレーション用の超微粒子として、単独で、又はラクトースなどの不活性担体との組み合わせで提供される。そのような場合、活性化合物の粒子は好適には、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば１〜５ミクロン、例えば２〜５ミクロンなどの直径を有する。好ましい吸入用量は、０．０５〜２ｍｇ、例えば０．０５〜０．５ｍｇ、０．１〜１ｍｇ又は０．５〜２ｍｇの範囲であり得る。非経口投与には、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインと無菌媒体とを含有する流体単位用量形態が調製される。媒体及び濃度に応じて免疫グロブリン単一可変ドメインを懸濁するか、或いは溶解させてもよい。非経口溶液は、通常、化合物を媒体中に溶解させてろ過滅菌し、その後好適なバイアル又はアンプルに充填してシーリングすることにより調製される。有利には、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤などの補助剤もまた媒体中に溶解される。安定性を増強するため、バイアルに充填して水を真空除去した後、組成物を凍結することができる。非経口懸濁液も実質的に同じように調製され、但し、化合物は媒体中に溶解させる代わりに懸濁され、エチレンオキシドに曝露することにより滅菌してから無菌媒体に懸濁される。有利には、組成物には界面活性剤又は湿潤剤が含まれ、活性化合物の一様な分布が促進される。適宜、少量の気管支拡張薬、例えば交感神経様作用アミン、例えば、イソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリン及びエフェドリン；キサンチン誘導体、例えば、テオフィリン及びアミノフィリン及びコルチコステロイド、例えば、プレドニゾロン及び副腎刺激薬、例えばＡＣＴＨが含まれてもよい。慣行どおり、組成物には通常、当該の医学的処置において使用するための文書による又は印刷された指示書が添付されることになる。これらの薬剤は全て、ヒト又は動物への使用が意図され得る。
【００８０】
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、及びそれを含む組成物の有効性は、関わる具体的な疾患又は障害に応じて、それ自体公知の任意の好適なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ及び／又は動物モデル、又はそれらの任意の組み合わせを用いて試験することができる。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインの作製方法に関し、前記方法は、
−好適な宿主細胞又は発現系において、本発明に係る免疫グロブリン単一可変ドメインをコードする核酸配列を発現させるステップ；及び場合により
−前記免疫グロブリン単一可変ドメイン又は前記ポリペプチドを単離及び／又は精製するステップ、を含む。
【００８２】
好適な発現系としては、細菌若しくは酵母における構成的及び誘導性発現系、バキュロウイルス、セムリキ森林ウイルス及びレンチウイルスなどのウイルス発現系（ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、又は昆虫細胞若しくは哺乳類細胞における一過性トランスフェクションが挙げられる。好適な宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが挙げられる。好適な動物宿主細胞としては、ＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ、Ｓ２、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＤＴ４０などが挙げられる。免疫グロブリン単一可変ドメインのクローニング、発現及び／又は精製は、当業者に公知の技法に従い行われ得る。
【００８３】
以下の例は、本発明の好ましい特徴をさらに詳しく説明するが、いかなる形であれ本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野の通常の技能を有し且つ本明細書の教示を利用し得る当業者は、その範囲内にあるさらなる改良例及び実施形態を認識するであろう。従って、本発明は、本明細書に添付される特許請求の範囲によってのみ限定される。以下に開示する出発物質及び試薬は全て当業者に公知であり、市販されているか、又は周知の技法を用いて調製することができる。
【実施例】
【００８４】
実施例の材料及び方法
マウス及びウサギ
ナイーブ動物における体内分布実験用の雌性Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスはＨａｒｌａｎから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ＭＭＲ欠損マウスはＥｔｉｅｎｎｅ  Ｐａｙｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌｉｂｒｅ  ｄｅ  Ｂｒｕｘｅｌｌｅｓ）から提供を受けた。雌性ＡｐｏＥ−／−及び対照Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。ＡｐｏＥ−／−マウスには０．２５％コレステロール含有Ｗｅｓｔｅｒｎ食（Ｓａｆｅ）を１８週間与え、一方、対照マウスは標準的な固形飼料食のままとした。心筋梗塞を起こし易い渡辺遺伝性高脂質血症ウサギは塩見雅志博士（神戸大学医学部附属動物実験施設、日本）から提供を受けた。
【００８５】
全ての動物試験は施設内審査委員会によって承認され、そのガイドラインに従い実施した。
【００８６】
一価及び二価抗マウスＭＭＲナノボディの作成及び産生
抗ＭＭＲナノボディ（Ｎｂ）クローン１を、以前の記載と同様の方法で免疫ファージライブラリから単離した（Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９：５１９６５−７２；Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３２９：１３８−５０）。端的には、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）を１００μｇ組換えマウスＭＭＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって週１回の間隔で６回免疫した。末梢血リンパ球から調製したｍＲＮＡを使用して、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  Ｙｏｕ−ｐｒｉｍｅ−ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でｃＤＮＡを作製した。ＶＨＨをコードする遺伝子配列を、ＣＡＬＬ００１／ＣＡＬＬ００２及びＡ６Ｅ／３８プライマー対を使用してＰＣＲ増幅した。これらのＰＣＲ断片をＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩ制限酵素で消化した後、ｐＨＥＮ４ファージミドベクターにライゲートした。Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ感染を用いてＶＨＨライブラリをファージ上で発現させ、特異的ナノボディ−ファージを、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）での数回の連続するインビトロ選択ラウンドによって高濃度化した。個々のコロニーを、陰性対照として供する非特異的ファージ粒子と共に抗原認識についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ＥＬＩＳＡで陽性スコアであったクローンのＶＨＨ遺伝子を、制限酵素ＰｓｔＩ及びＢｓｔＥＩＩを使用して発現ベクターｐＨＥＮ６にリクローニングした。ペリプラズムにおける発現、及びＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）での固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）と、続くリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨＲ  １０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ペリプラズム抽出物からのナノボディの精製を、以前に記載されるとおり実施した（Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５，２８０７−２８１２）。
【００８７】
ＰＣＲプライマーｂｉＮｂＦ（５’−ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ−３’；配列番号１５８）及び（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１６２）、ラマＩｇＧ２ヒンジ（ＡＨＨＳＥＤＰＳＳＫＡＰＫＡＰＭＡ；配列番号１６３）又はヒトＩｇＡヒンジ（ＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＡＳ；配列番号１６４）リンカーをそれぞれコードするプライマーｂｉＮｂＧ４ＳＲ（５’−ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  Ｃ−３’；配列番号１５９）、ｂｉＮｂｇ２ｃＲ（５’−ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  Ｃ−３’；配列番号１６０）、ｂｉＮｂＩｇＡＲ（５’−ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＴＧＣ  ＣＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  Ｃ−３’；配列番号１６１）を使用してＶＨＨ配列の３’にリンカー配列を組換えによって結合することにより、二価ナノボディを生成した。これらのＰＣＲ断片を、ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ制限消化で元のＶＨＨ発現ベクター中のＶＨＨ遺伝子の５’に挿入した。ライゲーション後、得られた二価抗ＭＭＲナノボディを発現させて、上記に記載したとおり精製した。
【００８８】
抗ヒトＭＭＲ及び抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディの作成
抗ヒトマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）及び抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディ（Ｎｂ）を、以前の記載と同様の方法で免疫ファージライブラリから単離した（Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７９：５１９６５−７２；Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３２９：１３８−５０））。しかしながら、交差反応性Ｎｂを作成するためには、交互の免疫スケジュールを行った。アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）を１００μｇヒトＭＭＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２５３４）で免疫し、続いて１週間後に１００μｇマウスＭＭＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２５３５）で免疫した。この交互のスケジュールを全６週間にわたり維持し、両方のタンパク質とも注入前にゲルブアジュバントと混合した。免疫後、血液を採取し、末梢血リンパ球を単離した。これらの細胞からＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって製造者の指示に従い逆転写した。可変ドメイン（ＶＨＨ）をコードする遺伝子配列を、リーダー配列特異的ＣＡＬＬ００１（５’−ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  Ｇ−３’；配列番号１６５）及びＣＨ２エクソン特異的ＣＡＬＬ００２（５’−ＧＧＴ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＣＣ−３’；配列番号１６６）プライマーでＰＣＲ増幅した。１％アガロースゲル分離後、６００ｂｐ断片のＶＨＨ−ＣＨ２断片をゲルから単離し、それぞれフレームワーク−１領域及びフレームワーク−４領域に特異的なネステッドプライマーＡ６Ｅ（５’−ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＲ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号１６７）及びＰＭＣＦ（５’−ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  Ｔ−３’；配列番号１６８）を使用して再増幅した。これらのＰＣＲ断片をＰｓｔＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した後、ｐＨＥＮ４の変異体であるファージミドベクターｐＭＥＣＳにライゲートした（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−６）。ｐＭＥＣＳは、ＨＡタグのみの融合物の代わりに、ＮｂのＣ末端にあるＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳ；配列番号１６９）と６×ヒスチジンタグとの融合物をコードする点でｐＨＥＮ４と異なる。ライゲートした材料を、新しく調製した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞に形質転換し、アンピシリン含有ＬＢプレートにプレーティングした。コロニーをプレートから擦り取り、洗浄し、及びグリセロール（５０％終濃度）を補足したＬＢ培地中に−８０℃で保存した。Ｍ１３ＶＣＳヘルパーファージ感染を用いてＶＨＨライブラリをファージ上に発現させた。特定のナノボディ−ファージを、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）のウェルにコーティングした抗原上での数回の連続インビトロ選択ラウンドによって高濃度化した。ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂを単離するため、ヒトＭＭＲとマウスＭＭＲとを交互に使用してスクリーニングを実施した。結合したファージ粒子を１０��ｍＭトリエチルアミン（ｐＨ１１．０）で溶出させ、直ちに１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和し、それを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞を感染させた。個々のコロニーをピッキングし、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより組換えナノボディ−Ｍ１３タンパク質ＩＩＩを発現させた。続いて各クローンのペリプラズム抽出物をヒトＭＭＲ認識についてＥＬＩＳＡで試験し、非特異的抗原をコーティングしたウェルを陰性対照として供した。ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂもまた同様の方法でマウスＭＭＲに対してスクリーニングし、ヒト抗原及びマウス抗原の両方に反応性を示すクローンのみを交差反応性Ｎｂとして残した。各ＥＬＩＳＡは、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液ｐＨ＝８．８中の１μｇ／ｍｌ  ＭＭＲでコーティングしたプレート上で実施した。コーティング後、プレートはＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋２％脱脂粉乳（Ｎｅｓｔｌｅ）（ＰＢＳＭ）で２時間ブロックする。次にＰＥ抽出物をプレート上で１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＭ中０．５μｇ／ｍｌマウス抗ＨＡタグ抗体（１６Ｂ１２、Ｃｏｖａｎｃｅ）を１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳＭ中１．５μｇ／ｍｌアルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）をプレートに１時間加え、続いてＰＢＳＴで洗浄する。最後に、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  トリスｐＨ＝９．５）中２ｍｇ／ｍｌアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｓｅ）基質（Ｓｉｇｍａ）を使用してＥＬＩＳＡを発色させ、４０５ｎｍの光学濃度シグナルを計測する。
【００８９】
抗ヒトＭＭＲ及び抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディの発現及び精製
ＥＬＩＳＡで陽性スコアであったクローンのｐＭＥＣＳ−Ｎｂプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＷＫ６細胞に形質転換した。この細胞はＴＡＧコドンで翻訳を停止し、従ってファージタンパク質融合物なしにＮｂを発現する。組換えＶＨＨの作製を振盪フラスコ内で、０．１％グルコース及びアンピシリンを補足したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス中、６００ｎｍの吸光度が０．６〜０．９に達するまで細菌を成長させることにより実施した。次にＶＨＨ発現を１ｍＭ  ＩＰＴＧによって２８℃で１６時間誘導した。細胞をペレット化した後、浸透圧ショックによってペリプラズムタンパク質を抽出した。このペリプラズム抽出物をニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、洗浄後、結合したタンパク質を５００ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ中に溶出させた。この固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の溶出画分を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の最終純度を調べた（図６Ａ）。２８０ｎｍの紫外吸収から、ＶＨＨの計算された理論上の吸光係数を使用して最終収率を決定した。
【００９０】
ＨＡタグは、フローサイトメトリーによるナノボディの検出に有用であるが、隣接するＨｉｓタグ上の９９ｍＴｃ標識に干渉することが示されている。従って、９９ｍＴｃ標識が関わる実験的試験については、ナノボディをｐＨＥＮ６ｃベクターにリクローニングした。これによりＨＡタグが取り除かれ、ナノボディのＣ末端にある６×Ｈｉｓタグのみが融合する。加えて、ペリプラズム発現及びＩＭＡＣ精製後、９９ｍＴｃ標識が関わる実験で使用するナノボディを、上記に抗マウスＭＭＲナノボディについて記載したとおりサイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製ステップに供した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。
【００９１】
表面プラズモン共鳴
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水流動緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で親和性分析を実施した。ＭＲＲを酢酸塩緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ５．０）中のＣＭ５チップに固定化し、チップ上にコーティングされた２１００ＲＵ  ＭＭＲを得た。同じチップの第２のチャネルを同じように活性化／不活性化し、陰性対照として供した。ＭＭＲナノボディを、１〜２０００ｎＭの範囲の１１種の異なる濃度の分析物として、１０ｍｌ／分の流量で使用した。溶出にはグリシン−ＨＣｌ  ５０ｍＭ（ｐＨ２．０）を使用した。全ての濃度を合わせたセンサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）から、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア２．０２（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して動態及び平衡パラメータ（ｋｄ、ｋａ及びＫＤ）値を計算した。
【００９２】
細胞調製及びフローサイトメトリー
フローサイトメトリー染色に用いるナノボディは元のｐＭＥＣＳファージベクターから作製した。従って各ナノボディがＣ末端ＨＡ及び６×Ｈｉｓタグを有する。
【００９３】
マウスＭＭＲに対する抗ＭＭＲナノボディの特異的結合を調べるため、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて３Ｅ６癌細胞を皮下注入することにより３ＬＬ−Ｒ腫瘍を誘導した。腫瘍を１５日間成長させた後、腫瘍を分離して細断し、１０Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩ型、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ型及び３０Ｕ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）と２５分間（３７℃）インキュベートした。密度勾配（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて組織残屑及び死細胞を除去した。チューブ当たり１Ｅ６細胞になるように１０μｇ／ｍｌのナノボディを添加した。抗ＭＭＲナノボディ又は対照ナノボディと少なくとも１時間インキュベートした後、細胞を氷冷ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液（０．７４ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ及び０．５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清を含有）で２回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗ＨＡタグモノクローナル抗体（クローン１６Ｂ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。細胞表面染色に使用される市販の抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート抗マウスＬｙ６Ｃモノクローナル抗体（クローンＥＲ−ＭＰ２０、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５コンジュゲート抗マウスＭＨＣＩＩモノクローナル抗体（クローンＭ５／１１４．１５．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスＬｙ６Ｇモノクローナル抗体（クローン１Ａ８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。フローサイトメトリー計測のため、ＭＨＣＩＩｌｏｗ  ＴＡＭがＭＭＲを高度に発現することに伴い、ＭＨＣＩＩ発現でＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ腫瘍関連マクロファージをゲーティングした。抗ＭＭＲナノボディの結合プロファイルを記録した。
【００９４】
ヒトＭＭＲに対するナノボディの結合を調べるため、ヒト未熟樹状細胞を使用した。健康ヒトドナー単球に由来する凍結保存された未熟樹状細胞は、Ｋａｒｉｎｅ  Ｂｒｅｃｋｐｏｔ博士（Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｂｒｕｓｓｅｌ、Ｊｅｔｔｅ、ベルギー）から供与された。未熟樹状細胞を調製するため、血液から白血球アフェレーシスによって末梢血単核細胞を取り出し、プラスチック製Ｎｕｎｃｌｏｎディッシュ（Ｎｕｎｃ、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｉｎｅ、Ｓｌａｎｇｅｒｕｐ、デンマーク）に付着させることにより単球を分離した。非付着細胞を取り除いた後、未熟樹状細胞を、５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｔａｕｒ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で単球から６日間分化する間にインビトロで生じさせた。６日目に細胞を回収し、計数し、１Ｅ７細胞／バイアルでアリコートに分けた。細胞を８５％自己血清、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５％グルコステリル（Ｇｌｕｃｏｓｔｅｒｉｌ）４０％（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ、Ａｌｂｅｒｔｓｌｕｎｄ、デンマーク）中に凍結保存した。フローサイトメトリー解析のため、細胞を氷上で解凍し、５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｔａｕｒ）を補足した予冷ＲＰＭＩ  １６４０培地によって室温で２時間以上インキュベートした。次に、１０％正常ウサギ血清を添加して抗体の非特異的Ｆｃ媒介性結合を防止した。３０分後、チューブ当たり２Ｅ５細胞となるように１０μｇ／ｍｌのナノボディを添加した。抗ＭＭＲナノボディ又は対照ナノボディと少なくとも１時間インキュベートした後、細胞を、１％正常ウサギ血清を補足した氷冷ＨＢＳＳ緩衝液で２回洗浄し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０−Ｒ遠心機、８分、１４００ｒｐｍ、４℃）、０．５μｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗ＨＡタグモノクローナル抗体（クローン１６Ｂ１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。アロフィコシアニンコンジュゲート（ＡＰＣ）がコンジュゲートした抗ヒトＣＤ１１ｃモノクローナル抗体（クローンＢ−ｌｙ６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＣＤ１１ｃ染色に使用した。染色した細胞を、１％正常ウサギ血清を補足した氷冷ＨＢＳＳ緩衝液でもう１度洗浄し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０−Ｒ遠心機、８分、１４００ｒｐｍ、４℃）、フローサイトメトリーによって分析した。
【００９５】
ナノボディ標識及び９９ｍＴｃ標識ナノボディのインビトロ特徴付け
ナノボディをそのヘキサヒスチジンテールで９９ｍＴｃによって標識するため、１ｍＬの９９ｍＴｃＯ４−（０．７４〜３．７ＧＢｑ）を、４．５ｍｇのナトリウムボラノカーボネート、２．８５ｍｇのナトリウムテトラボレート・１０Ｈ２Ｏ、８．５ｍｇの酒石酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、及び７．１５ｍｇの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５を含有するＩｓｏｌｉｎｋキット（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＢＶ）に加えることにより、［９９ｍＴｃ（Ｈ２０）３（ＣＯ）３］＋を合成した。バイアルを沸騰浴中１００℃で２０分間インキュベートした。新しく調製した［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋を室温に５分間放冷し、１２５μＬの１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７〜８に中和した。［９９ｍＴｃ（Ｈ２Ｏ）３（ＣＯ）３］＋を５０μＬの１ｍｇ／ｍＬ一価ナノボディ又は２ｍｇ／ｍｌ二価ナノボディに、５０μＬのカーボネート緩衝液、ｐＨ８と共に添加した。混合物を水浴中５２℃で９０分間インキュベートした。標識効率を移動相としてのアセトン中におけるインスタント薄層クロマトグラフィーにより決定し、放射クロマトグラムスキャナ（ＶＣＳ−２０１；Ｖｅｅｎｓｔｒａ）を使用して分析した。標識収率が９０％未満であった場合、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で予め平衡化したＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で９９ｍＴｃ−ナノボディ溶液を精製し、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通過させて、可能性のある凝集物を除去した。
【００９６】
ピンホールＳＰＥＣＴ−マイクロＣＴイメージング手順
マウスに１００〜２００μｌ  ４５〜１５５ＭＢｑ（約５〜１０μｇ）の９９ｍＴｃ−ナノボディを静脈内注入した。マウスはピンホールＳＰＥＣＴ取得の１０〜１５分前に１８．７５ｍｇ／ｋｇ塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ  １０００（登録商標）、ＣＥＶＡ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ベルギー）と０．５ｍｇ／ｋｇ塩酸メデトミジン（ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ベルギー）との混合物で麻酔した。
【００９７】
別々のイメージングシステムでマイクロＣＴイメージングの後にピンホールＳＰＥＣＴを続けた。マイクロＣＴは、６０ｋＶ及び６１５ｍＡのデュアルソースＣＴスキャナ（Ｓｋｙｓｃａｎ  １１７８、Ｓｋｙｓｃａｎ、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ、ベルギー）を使用して、８３μｍの分解能で実施した。全身スキャン時間は２分であった。フィルター補正逆投影法（Ｎｒｅｃｏｎ、Ｓｋｙｓｃａｎ、Ａａｒｔｓｅｌａａｒ、ベルギー）を用いて画像の再構成を実施した。注入（ｐ．ｉ．）後６０分又は１８０分に、２個のマルチピンホールコリメータ（各コリメータに３個の１．５ｍｍピンホール、２００ｍｍ焦点距離、８０ｍｍ回転半径）を備えたデュアルヘッドガンマカメラ（ｅ．ｃａｍ１８０  Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＩＬ、米国）を使用して全身ピンホールＳＰＥＣＴを実施した。画像は１２８×１２８マトリックスとなる１０秒の６４画像で３６０度にわたり取得し、総イメージング時間は１４分となった。３ピンホール配置用に改良した、且つ６個の５７Ｃｏランドマークに基づきＣＴとの融合のため自動で方向を変える反復再構成アルゴリズム（ＯＳＥＭ）を使用して、ＳＰＥＣＴ画像を再構成した。
【００９８】
画像解析
ＡＭＩＤＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｄａｔａ  Ｅｘａｍｉｎｅｒソフトウェアを使用して画像観察及び定量化を実施した。腫瘍及び主要臓器の周りに楕円体の関心領域（ＲＯＩ）を描いた。取り込みは、組織のカウントを投与活性カウントで除し、ＲＯＩサイズについて正規化したもの（％ＩＡ／ｃｍ３）として計算した。ＯｓｉｒｉＸイメージングソフトウェアを使用して高分解能画像３Ｄ再構成を作成した。
【００９９】
体内分布分析
マイクロＣＴ／ＳＰＥＣＴ取得の３０分後、マウスを致死量のペントバルビタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ；ＣＥＶＡ）で犠牲にした。大動脈、腎臓、肝臓、肺、筋肉、脾臓、リンパ節、骨、心臓、及び血液を取り出して秤量し、自動γ−カウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  ５００３；Ｃａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して放射能を計測した。減衰を補正した投与活性毎組織グラム（％ＩＡ／ｇ）として組織及び臓器内取り込みを計算した。大動脈ターゲティングの分析のため、大動脈を１２個のセグメントに切断し、各セグメントの放射能を個別に計測した。病変拡大指数は、図Ｘの差込み図に示されるとおり各セグメントによるものであった：（−）病変なし（対照セグメント）、（＋）動脈セグメント長さの５０％までに広がる病変、（＋＋）動脈セグメント長さの５０％より多くに広がる病変、及び（＋＋＋）セグメント全長にわたって広がる病変。大動脈病変及び対照の取り込みは、それぞれ（＋＋＋）又は（−）と順位付けされた全てのセグメントの平均取り込みとして定義した。
【０１００】
ウサギにおける交差反応性のインビボ評価
ウサギにおける交差反応性をインビボで評価するため、上記に記載したとおりトリカルボニル化学によって抗ＭＭＲナノボディを９９ｍＴｃで標識した。ＷＨＨＬＭＩウサギ（雄性、±２月齢、１．５〜１．９ｋｇ）を３５ｍｇ／ｋｇケタミン及び５ｍｇ／ｋｇキシラジンの筋肉内注入によって麻酔した。９９ｍＴｃ−ナノボディ（３００±６５ＭＢｑ）を辺縁耳静脈から静脈内注入した。動物を直ちに、以下のカメラ設定：２５６×２５６マトリックス及びズーム比１．７８で６０分間にわたり１０秒毎の取得を行うγ−カメラ（ｅ．ｃａｍ１８０  Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｗｈｅａｔｏｎ、ＩＬ、米国）を使用したダイナミックプラナーイメージングに供した。終了時、動物を１００ｍｇ／ｋｇペントバルビタールの静脈注入により殺処分し、全ての主要臓器及び組織を回収した。臓器及び組織を秤量し、γウェルカウンター（Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  ５００３、Ｃａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋａｒｄ）で代表的な試料の放射能をカウントした。結果はバックグラウンド及び減衰を補正し、臓器当たりの投与活性パーセンテージとして表すか又は示差取り込み比（ＤＵＲ、（組織活性／組織重量）／（投与活性／動物体重）（％ＩＤ／ｇ／ｋｇ）として計算される）として表した。
【０１０１】
統計
統計的有意性はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ又はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０ソフトウェアを使用してスチューデントｔ検定により決定した。Ｐ≦０．０５のとき差は有意であると見なした。幾何平均及び信頼区間はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して決定した。
【０１０２】
ナノボディの１８Ｆ標識
１８ＭｅＶ加速陽子をＣＧＲ  ５６０サイクロトロンにおいて＞９５％１８Ｏ濃縮水（Ｃａｍｐｒｏ、オランダ）に衝撃させることにより、核反応１８Ｏ（ｐ，ｎ）１８Ｆによって［１８Ｆ］−フッ化物を得た。ＳｙｎｔｈＥＲＡ（登録商標）モジュール（ＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、ベルギー）に移した後、得られた［１８Ｆ］−フッ化物を、ＳｅｐＰａｋ（商標）Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌ  ｐｌｕｓ  ＱＭＡ陰イオン交換カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、米国）で１８Ｏ−濃縮水と分離した。陰イオン交換カートリッジは、順次５ｍｌの８．４％  ＮａＨＣＯ３（ＶＷＲ、ベルギー）及び５ｍｌの脱イオン水で予めコンディショニングした。アセトニトリル／水（１：１）中に４．２ｍｇ  Ｋ２ＣＯ３及び２２．６ｍｇ  Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２．２．２（Ｋ２２２）を含有する６００μｌの溶液（バイアル１）（ＡＢＸ、独国）を使用して、［１８Ｆ］をカートリッジから溶出させた。１１０℃の窒素流下で溶媒を蒸発させると、無水Ｋ２２２／Ｋ［１８Ｆ］Ｆ複合体が生成された。
【０１０３】
補欠分子族Ｎ−スクシンイミジル−４−［１８Ｆ］フルオロベンゾエート（［１８Ｆ］−ＳＦＢ）を使用してナノボディの１８Ｆ標識を実施した。［１８Ｆ］−ＳＦＢ補欠分子族は使い捨て１８Ｆ−ＦＤＧカセット（ＩＦＰ（商標）求核性、ＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して作製した。２ｍｌ  ＤＭＳＯ中４ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）エチル４−［トリメチルアンモニウム］ベンゾエート（ＡＢＸ、独国）の溶液（バイアル２）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ベルギー）を、反応バイアル内の乾燥した［１８Ｆ］複合体に添加し、それを１１０℃に１５分間加熱することにより、エチル−４−［１８Ｆ］フルオロ安息香酸を作製した。この中間体を、０．５ｍｌ  ＤＭＳＯ中２０μｌ（０．０２ｍｏｌ）の０．１Ｍテトラプロピルアンモニウムヒドロキシド（ＴＰＡＯＨ）水溶液（バイアル３）を添加して加水分解し、続いて１ｍｌ  ＣＨ３ＣＮ中２６ｍｇ（０．０７２ｍｍｏｌ）のカップリング剤Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＳＴＵ）（バイアル４）で活性化してＮ−スクシンイミジル４−［１８Ｆ］フルオロベンゾエート（［１８Ｆ］−ＳＦＢ）を形成した。未精製［１８Ｆ］−ＳＦＢを、４ｍｌ  ５％酢酸溶液及び８ｍｌ  ０．９％ＮａＣｌ溶液が入ったバイアルに移した。精製は、１つの固相のみの抽出カートリッジを使用して最適化した。この精製は、第２のＳｙｎｔｈＥＲＡ（登録商標）モジュールでインハウス製自動三方弁を使用することにより希釈［１８Ｆ］−ＳＦＢ及び洗浄溶液を移して実施した。その後［１８Ｆ］−ＳＦＢを円錐形バイアル内において窒素環境中で穏やかに加熱することにより乾燥させた。蒸発後、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液中のナノボディ溶液を反応槽中の乾燥した残渣に添加し、室温で２０分間反応させた。ナノボディの標識及びＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによる精製を、ＳｙｎｔｈＥＲＡ（登録商標）モジュールに接続した半自動インハウス製システムで実施し、０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通過させた後、バイアルに移した。最終的な精製１８Ｆ−ＦＢ−抗ＭＭＲをリン酸緩衝生理食塩水溶液ｐＨ７．４に回収した。
【０１０４】
総じて、２つのＳｙｎｔｈＥＲＡモジュール（ＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を使用して［１８Ｆ］−ＳＦＢを合成及び精製し、放射化学的収率は５０〜６０％（減衰補正）であった。２００〜５００ＭＢｑの１８Ｆ−ＦＢ−抗ＭＭＲナノボディが得られ、完全に自動化されたプロトコルを使用して放射化学的純度は９７％超であり、全体的な放射化学的収率は５％であった。
【０１０５】
ＰＥＴ／ＣＴイメージング手順
ＰＥＴイメージングには１３〜１６月齢の雄性渡辺ウサギを使用した。１８Ｆ標識ナノボディを辺縁耳静脈から注入した。注入時の用量は以下であった：０．５〜１ｍＣｉ（５０〜１００μｇナノボディ）。注入２時間〜２．５時間後にＰＥＴ／ＣＴイメージングを実施した。
【０１０６】
Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＴＦ６４  ＰＥＴ／ＣＴでＰＥＴスキャンを実施した；ＰＥＴ画像は２４〜２８分にわたり取得し（６〜７ベッド位置、各位置４分）、（２ｍｍ等方ボクセルサイズで）２８８×２８８ピクセルの３００〜３４２スライスに再構成し、ＣＴデータに基づき減衰補正した。ＣＴスキャンのパラメータは以下であった：約３０ｍＡで１２０ｋＶ、ボクセルサイズ２ｍｍ、フィルター補正逆投影法を使用。総ＣＴスキャン時間は約２０秒間であった。ＣＴ造影剤としてキセネティクス（Ｘｅｎｅｔｉｘ）を使用し、これはＣＴの直前、スカウトスキャン後に手動で辺縁耳静脈に注入した。
【０１０７】
心筋虚血／再灌流傷害（ＩＲＩ）ラットモデル
１７匹のウィスターラットにおいて左前下行枝冠動脈を６０分間結紮し、続いて縫合を緩めることにより、心筋ＩＲＩを誘導した。７匹の動物を偽手術した。２日目に９９ｍＴｃ−テトロホスミン走査によって梗塞サイズを評価した。ベースライン、ＩＲＩ後日数（Ｄ）５、９、１２、１６、２１、２８日目及び３ヶ月目に９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−ＮｂのピンホールＳＰＥＣＴ／μＣＴ取得を行った。等しいサイズの関心容積の前側壁セグメントの絶対取り込み平均値を計測することにより、梗塞域（ＩＺ）における９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂの取り込みの定量化を実施した。抗ＭＭＲ抗体及び抗ＣＤ６８抗体で免疫蛍光染色を実施した。対数変換データに反復測定ＡＮＯＶＡを用いて統計的分析を実施した。データは平均値±標準偏差として示し、有意性は０．０５に設定した。対照として、９９ｍＴｃ標識対照Ｎｂ（ｃＡｂＢＣＩＩ１０）のインビボ定量化を実施中である。
【０１０８】
実施例１．マウスマクロファージマンノース受容体（ＣＤ２０６−ＭＭＲ）に対するナノボディの作成
インビボでＭＭＲ陽性細胞を標的化するため、利用可能な中で最小の抗原結合実体である抗ＣＤ２０６（抗ＭＭＲ）ナノボディ（Ｎｂ）を作成した。材料及び方法に記載されるとおり（表１も参照）、ＭＭＲの組換え細胞外部分に対するナノボディを産生した。一価抗ＭＭＲナノボディの結合特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を用いて比較した（表２）。ナノボディクローン１は固定化した組換えＭＭＲに対してナノボディクローン３と比較して８倍高い見かけの親和性を実証し（それぞれＫＤ＝２．３１×１０−８Ｍ対１．９１×１０−７Ｍ）、ひいては残りの本研究に選択されるナノボディとなった。加えて、ＳＰＲ競合試験は、ナノボディクローン１による前治療がナノボディクローン３の結合を妨げず、及び逆も然りであることを実証しており、抗ＭＭＲ  Ｎｂクローン１及びＮｂクローン３が非重複エピトープに結合することが示唆される（データは示さず）。
【０１０９】
実施例２．ピンホールＳＰＥＣＴ／マイクロＣＴ分析を用いたナイーブマウスにおける抗マウスマクロファージマンノース受容体ナノボディによる生体内イメージング
次のステップにおいて、本発明者らは、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）標的化ナノボディクローン１を使用した生体内イメージングを実施した。ナノボディは、そのヘキサヒスチジンテールを高温下トリカルボニル化学によって９９ｍＴｃで標識した。精製した９９ｍＴｃ標識ナノボディをマウスに静脈内注入し、ピンホールＳＰＥＣＴ及びマイクロＣＴを使用して全身スキャンを行った。
【０１１０】
インビボ評価の最初のステップは、健常マウスの体内分布を調べることであった。これにより生理学的な特異的集積部位を評価し、イメージングプローブの薬物動態特性を決定することが可能になる。ＭＭＲナノボディは、肺、脾臓及び肝臓などの臓器で取り込みを示す。血中クリアランスは速く、注入後１時間３０分で血中に残るのは１％ＩＡ（投与活性）／ｍｌ未満である。本発明者らはまた、ＭＭＲノックアウトマウスにおけるＭＭＲナノボディも試験し、ここでは肝臓及び脾臓における取り込みが１％ＩＡ／ｇ未満に下がった（図１）。これらのデータは、肝臓及び脾臓などの臓器における集積がＭＭＲ発現に関係し、従って特異的であることを示している。肺における集積に限り、ＭＭＲと無関係であるように見える。
【０１１１】
実施例３：抗ＭＭＲ二価ナノボディの作成
（Ｇ４Ｓ）３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号１５１）、ラマＩｇＧ２ヒンジ（ＡＨＨＳＥＤＰＳＳＫＡＰＫＡＰＭＡ；配列番号１５２）又はヒトＩｇＡヒンジ（ＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＡＳ  配列番号１５３）リンカーを使用して２つの抗ＭＭＲナノボディ１実体を連結することにより、二価ナノボディを構築した。これらの二価抗ＭＭＲ分子は、一価クローン１ナノボディと比較して５倍高いアビディティを示した。これは概してＫＤの３倍の増加によるものであり得る。二価ナノボディ構築に使用した種々のリンカーは、ＭＭＲ抗原に対する分子の親和性に大きい効果は有しないものと見られた。全ての実験において陰性対照ナノボディとして、本発明者らは一貫して、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のβ−ラクタマーゼＢＣＩＩ酵素の結合剤であるα−ＢＣＩＩ１０  Ｎｂを使用した。
【０１１２】
実施例４：ピンホールＳＰＥＣＴ／マイクロＣＴ分析を用いたナイーブマウスにおける抗ＭＭＲナノボディクローン１及びその二価誘導体の体内分布及び特異性の評価
次に、本発明者らは、抗ＭＭＲ  Ｎｂクローン１及びその二価誘導体をインビボでＭＭＲ発現細胞のターゲティング及びイメージングに用い得るかどうかを評価しようと考えた。そのため、抗ＭＭＲ一価Ｎｂを９９ｍＴｃで標識し、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注入した。注入３時間後、ピンホールＳＰＥＣＴ及びマイクロＣＴを使用して全身スキャンを取得し（図２）、画像を定量化して、トレーサー取り込みをパーセンテージ投与活性毎グラム立方センチメートル（％ＩＡ／ｃｍ３）として表した（表３）。抗ＭＭＲ  Ｎｂの特異性を確かめ、任意の潜在的なターゲティングが非特異的滞留によるものでないことを証明するため、ナイーブＣ５７ＢＬ／６ＭＭＲ−／−マウスにも抗ＭＭＲ  Ｎｂを注入した。ＭＭＲ−／−マウスでは、ＳＰＥＣＴ／マイクロＣＴ画像は、腎クリアランスの指標となる腎臓における高いトレーサー取り込み及び膀胱の尿活性を示すが、他の臓器では低いバックグラウンドレベルの滞留が見られるのみである（図２；表３）。唯一の例外は肺であったことから、肺のターゲティングが非特異的であることが示唆される。対照的に、ＷＴマウスは、心臓、骨、脾臓及び肝臓を含めたいくつかの臓器における抗ＭＭＲ  Ｎｂの滞留の増加を示し、脾臓及び肝臓の２つは最も強いシグナルを示した（図２）。これらの結果は、抗ＭＭＲ一価Ｎｂが高いインビボ特異性を有し、肝臓及び脾臓などの臓器を効率的に標的化し得ることを示している。種々の二価抗ＭＭＲ  Ｎｂ構築物で同様の実験を実施し、その全てが一価分子と比較して肝臓における取り込みのさらなる増加、及び同時に起こる腎臓を介したクリアランスの減少を示した（表４）。この場合もまた、肺を除く全ての臓器における二価抗ＭＭＲ  Ｎｂの滞留はＭＭＲ特異的であり、ＭＭＲ−／−マウスには存在しない。予想されたとおり、全ての臓器において対照ｃＡｂＢＣＩＩ１０  Ｎｂの滞留は極めて低く、腎臓を介した大量のクリアランスをもたらす（表４）。
【０１１３】
実施例５．抗ヒトＭＭＲ  Ｎｂの選択
次に、抗ヒトＭＭＲナノボディを作成した（材料及び方法の節も参照のこと）。ヒトＭＭＲに対する抗ヒト／抗マウスＭＭＲファージバンクの４ラウンドのパニング後、パニングラウンド当たり最大１００倍のｈＭＭＲ反応性ファージの高濃度化が観察された。従って、全てのラウンドからＰＥ発現用に１８８個のコロニーを選択した。これらのＰＥ抽出物をＰＥ−ＥＬＩＳＡで使用して、どのクローンがｈＭＭＲに効果的に反応するかを決定した。それらの結果に基づき合計１００個のクローンを選択した（図３）。加えて、選択したクローンのＤＮＡ及びタンパク質配列を決定し（表５）、二重クローン又は途中で停止するクローンを廃棄した。
【０１１４】
実施例６．抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂの選択
次に、抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性ナノボディを作成した（材料及び方法の節も参照のこと）。抗ヒト／抗マウスＭＭＲファージバンクを合計４ラウンドにわたりヒトＭＭＲ及びマウスＭＭＲに対して交互にスクリーニングし、２回目のパニングラウンドからｈＭＭＲ／ｍＭＭＲ反応性ファージの最大１００倍の高濃度化が得られた。従って、ＰＥ発現用に第２及び第３ラウンドから１８８個のコロニーを選択した。これらのＰＥ抽出物をＰＥ−ＥＬＩＳＡで使用してどのクローンがＭＭＲと効果的に反応するかを決定し、ｈＭＭＲに対するＥＬＩＳＡ後にクローンを選択した（図４）。次にこれらのクローンを、マウスＭＭＲに対する結合についてスクリーニングした（図５）。両方の抗原に反応したクローン（４２個）のみを真の交差反応性Ｎｂとして残した。これらのクローンを配列決定し（表６）、そのＣＤＲ３領域に基づきファミリーに分けた。
【０１１５】
実施例７．代表的な抗ヒト又は抗ヒト／マウスＭＭＲ  Ｎｂセットの作製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＮｂ産生に関して一組の代表的なクローンを選択した：（１）抗ヒトＮｂ：ＮｂｈＭＭＲｍ１．３３，ＮｂｈＭＭＲｍ４．８３，ＮｂｈＭＭＲｍ１０．１９，ＮｂｈＭＭＲｍ２３．３０，ＮｂｈＭＭＲｍ２．１５，ＮｂｈＭＭＲｍ３．１，ＮｂｈＭＭＲｍ５．３８，ＮｂｈＭＭＲｍ１２．６，ＮｂｈＭＭＲｍ１１．５，ＮｂｈＭＭＲｍ１５．４３，ＮｂｈＭＭＲｍ１６．９５；；（２）抗ヒト／マウスＮｂ：ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４，ＮｂｈｍＭＭＲｍ６．７１，ＮｂｈｍＭＭＲｍ２４．３１，ＮｂｈｍＭＭＲｍ２０．５２，ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９，ＮｂｈｍＭＭＲｍ２２．８４，ＮｂｈｍＭＭＲｍ１９．５２，ＮｂｈＭＭＲｍ２１．２２，ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．９３，ＮｂｈｍＭＭＲｍ１５．４９，ＮｂｈｍＭＭＲｍ１７．７２，ＮｂｈｍＭＭＲｍ１０．７９，ＮｂｈｍＭＭＲｍ７．６７，ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０。各クローンを２リットル培養液で成長させた。発現及び浸透圧ショック後、得られた抽出物を１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂上で精製した。得られた５ｍｌの溶出ＮｂをＰＢＳで透析し、その後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ装置を使用して濃度を決定し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで純度を評価した（図６ＡにＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８の例）。ナノボディは全て、０．７〜９ｍｇのＮｂ／ｌ大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）培養物を生じた（表７）。
【０１１６】
実施例８．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による代表的な抗ヒト又は抗ヒト／マウスＭＭＲ  Ｎｂセットの反応速度定数の決定
組換えｈＭＭＲ及び組換えｍＭＭＲ抗原に対する選択されたＮｂの結合特性及び親和性を、表面プラズモン共鳴を用いてさらに詳細に調べた。各Ｎｂについて合成センサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を記録し（図７にＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９の例）、動態及び平衡パラメータ（ｋｄ、ｋａ及びＫＤ）値を計算した（表８及び表９）。このＳＰＲ解析から得られたマウス又はヒトｒＭＭＲとの結合に関するほとんどの結果が、全てではないが、ＰＥ−ＥＬＩＳＡによって得られた結果と一致する。
【０１１７】
動態及び平衡パラメータ（ｋｄ、ｋａ及びＫＤ）値に基づき、交差反応性抗ｈｍＭＭＲ  Ｎｂのうちの５個をさらなる分析用に選択した（表８及び表９に太字で示される）。これらの５個のＮｂ（ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０及びＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９）はやや低い解離速度定数を示したことから、それらのＮｂは生体内イメージングに好適である。これらのナノボディの対応するＫＤ値は６８ｎＭ〜２ｎＭの範囲であった。表８及び表９のデータから、Ｎｂが好ましいＭＭＲ抗原を有することが明らかに認められ得る：ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８及びＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は、ｍＭＭＲ  Ａｇと比較してｈＭＭＲ  Ａｇに対してより高い親和性を有する。対照的に、最初の免疫化及びパニングラウンドがｈＭＭＲ抗原を使用して実施された場合であっても、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０はｈＭＭＲ  Ａｇと比較してｍＭＭＲ  Ａｇにより良好に結合する。
【０１１８】
実施例９．フローサイトメトリーによる細胞上に発現したＭＭＲに対する代表的な抗ヒト又は抗ヒト／マウスＭＭＲ  Ｎｂセットの結合の決定
細胞上に発現したＭＭＲに対する５個の選択されたＮｂの結合特異性を確かめるため、フローサイトメトリー分析を実施した。
【０１１９】
細胞によって発現されるマウスＭＭＲに対する結合を、前臨床マウス腫瘍モデルに由来する腫瘍関連マクロファージで、ＭＭＲの発現の点で異なる分子的及び機能的に特徴のあるサブセットがＴＡＭに含まれるという既報告の知見を利用して決定した：ＭＭＲはＭＨＣ  ＩＩｌｏｗ  ＴＡＭで高発現であり、一方、ＭＨＣ  ＩＩｈｉｇｈ  ＴＡＭについてはＭＭＲ発現は低い（Ｍｏｖａｈｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。図８に示すとおり、ＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０及びＮｂｈＭＭＲｍ３．４９のＭＨＣＩＩｌｏｗＴＡＭに関して、抗ｍＭＭＲ  Ｎｂクローン１のシフトと同等の蛍光強度の明らかなシフトを検出することができる。顕著には、ＴＡＭに対するＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８の結合は検出することができなかった。
【０１２０】
ヒトＭＭＲに対する選択されたＮｂの結合特異性を調べるため、ヒト未熟単球由来樹状細胞を作成し、ＣＤ１１ｃ＋細胞でゲーティングした。図９に示すとおり、未熟樹状細胞上に発現したｈＭＭＲに対するＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８及びＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９の結合が明らかに検出され、一方でＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０については蛍光強度の有意なシフトは検出することができなかった。
【０１２１】
総じて、フローサイトメトリー解析は、ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８が、細胞によって発現されるヒトＭＭＲに結合するが、マウスＭＭＲには結合しないことを示す。対照的に、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０は元の抗マウスＭＭＲクローン１と同様の結合パターンを有し、マウスに結合するが、ヒトＭＭＲには結合しない。ＮｂｈＭＭＲｍ３．１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４及びＮｂｈＭＭＲｍ３．４９は、細胞上で発現するマウスＭＭＲ及びヒトＭＭＲの両方に結合する。
【０１２２】
実施例１０．ナイーブマウスにおける抗ヒトマクロファージマンノース受容体ナノボディによる組織分布実験
次のステップにおいて、本発明者らは、選択された抗ヒトＭＭＲ  ＮｂをＭＭＲ発現細胞の生体内ターゲティングに用い得るかどうかを評価しようと考えた。ヒト未熟樹状細胞に対するフローサイトメトリー解析により、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０はヒトＭＭＲに結合しないことが分かっているため、ＮｂｈｍＭＭＲｍ２６．７０はこの時点では評価しなかった。ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１及びＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は同じＣＤＲ３ループを共有するが、しかしＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９はＮｂｈｍＭＭＲｍ３．１と比較したとき組換えＭＭＲに対してより良好な親和性を有し、これらの２つのナノボディのうちＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９を生体内ターゲティング用に選択した。またＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４及びＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８も、この例に用いる選択の中に含めた。ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８はフローサイトメトリー分析によればマウスＭＭＲに結合しなかったため、これを組織における非特異的結合及び集積の除外に用いることができた。
【０１２３】
選択されたナノボディを９９ｍＴｃで標識し、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注入した。注入３時間後、マウスを解剖し、主要臓器の放射能を計測した。図１０に示すとおり、ＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４及びＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９は元の抗マウスＭＭＲナノボディクローン１と同様の組織分布を呈し、肺、脾臓及び肝臓などの臓器で取り込みが高かった。対照的に、陰性対照ＮｂｈｍＭＭＲｍ５．３８及びＮｂ  ｃＡｂＢｃＩＩ１０は主に、腎クリアランスの指標となる腎臓における高いトレーサー取り込みを示した。
【０１２４】
実施例１１．ＡｐｏＥ−／−マウスにおけるＮｂ  ＭＭＲ  ｃｌ１大動脈分布
動脈硬化プラークの生体内ターゲティングのため抗ＭＭＲナノボディを使用することの最初の予備的評価を実施するため、「Ｗｅｓｔｅｒｎ食」で飼育されたＡｐｏＥ−／−マウスをアテローム性動脈硬化症のモデルとして使用した。抗ＭＭＲ  Ｎｂクローン１を９９ｍＴｃで標識し、３匹のマウスに静脈内注入した。図１１には、病変拡大指数に従い順位付けした大動脈セグメントにおけるＮｂ  ＭＭＲクローン１の取り込みを、陰性対照ナノボディｃＡｂ  ＢＣＩＩ１０及び陽性対照ナノボディｃＡｂ  ＶＣＡＭ１−５と比較して示す。プラーク含有大動脈切片で得られたシグナルは、抗ＶＣＡＭ１ナノボディと比べて抗ＭＭＲナノボディについて、より高かった。この実験で試験した３匹のマウスは非常に進行したアテローム硬化性疾患を有し、事実上これらのマウスには無病変大動脈切片が存在しなかったことに留意されたい。従って、アテローム硬化性病変で得られたシグナルが対照の大動脈切片上のバックグラウンドシグナルより高いかを確認するには、さらなる実験が必要となり得る。
【０１２５】
実施例１２．心筋梗塞を起こし易い渡辺遺伝性高脂質血症ウサギにおける抗マクロファージマンノース受容体ナノボディによる生体内ターゲティング
心筋梗塞を起こし易い渡辺遺伝性高脂質血症ウサギ（ＷＨＨＬＭＩウサギ）は、低密度リポタンパク質受容体の欠損に起因する高コレステロール血症、ヒトと極めて類似したリポタンパク質代謝並びに進行性冠動脈硬化症及び心筋梗塞の自然発症を示す。従ってＷＨＨＬＭＩウサギはアテローム性動脈硬化症の理想的な動物モデルとなる。
【０１２６】
抗ＭＭＲナノボディのうちどれがウサギにおいて交差反応性であるか、従ってＷＨＨＬＭＩウサギにおける生体内イメージング実験に使用し得るかを評価するため、生体内実験を実施し、ここではリード抗ＭＭＲナノボディ（ＭＭＲ  Ｎｂ  ｃｌ１、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９及びＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４）の３つを前述のとおりトリカルボニル化学によって９９ｍＴｃで標識し、ＷＨＨＬＭＩウサギに静脈内注入した。３つのナノボディは全てが腎臓及び尿によってクリアランスされた。ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９及びＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４については肝臓及び骨髄における高い取り込みもまた観察することができ、一方でＭＭＲ  Ｎｂ  ｃｌ１についてはこれら又は臓器における取り込みは見られなかった（図１２）。従って、ウサギにおいてＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９及びＮｂｈｍＭＭＲｍ１４．４は交差反応性であるが、ＭＭＲ  Ｎｂ  ｃｌ１は交差反応性でないように思われる。
【０１２７】
次に交差反応性ナノボディを９９ｍＴｃ標識し、種々のアテローム性動脈硬化症発症ステージにある１２〜２０月齢のＷＨＨＬＭＩウサギに注入する。注入３時間後に動物を安楽死させ、大動脈を摘出し、１〜２ｃｍ長のセグメントに切断する。セグメントを秤量し、γ−ウェルカウンターで放射能をカウントする。各大動脈セグメントについて、プラークをアメリカ心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＡＨＡ）の推奨に基づき４群に分類する：新生内膜病変、アテローム性病変、フィブロアテローム性病変及びコラーゲンリッチ病変。この分類は組織学的評価（ＨＥＳ染色及びトリクローム染色）の後に達成する。免疫組織学（ＭＭＲ、ＶＣＡＭ−１、Ｌｏｘ−１の発現、マクロファージ浸潤、脂質浸潤、出血、石灰化等）によってさらなる特徴を評価する。次に放射性シグナルを組織学的知見と相関付けることにより、抗ＭＭＲナノボディに関して得られたシグナルとプラークのステージ及び脆弱性との関連性を評価する。
【０１２８】
実施例１３．動脈硬化プラークのヒト臨床試料に対する抗ＭＭＲナノボディベースの免疫組織化学
ヒト脆弱性動脈硬化プラークのターゲティングに関する抗ＭＭＲナノボディの妥当性を試験するため、動脈硬化プラークのヒト臨床試料に対して免疫組織化学分析を実施する。準備ステップとして、抗ＭＭＲナノボディを使用した免疫組織化学を実施するための条件を、対照ＭＭＲ陽性組織試料（ヒト肝臓など）を使用して最適化する。詳細には、ヒトＭＭＲを認識するナノボディクローンをサブクローニングし、二次（ｓｅｃｕｎｄａｒｙ）抗ＨＡ試薬による検出用のヘマグルチニン（ＨＡ）などの検出タグとの融合物として産生する。また、抗ＭＭＲナノボディクローンのうちどれが免疫組織化学に最適であるかも評価する。
【０１２９】
最適化した試薬を使用して、次に全載頸動脈内膜切除標本のヒト臨床試料で免疫組織化学分析を実施し、抗ＭＭＲナノボディを使用して得たシグナルを様々なプラークのステージ及び脆弱性と相関付ける。
【０１３０】
実施例１４．心筋梗塞を起こし易い渡辺遺伝性高脂質血症ウサギにおける抗マクロファージマンノース受容体ナノボディによる生体内ターゲティング及びＰＥＴ／ＣＴベースの生体内イメージング
アテローム硬化性病変の最適な生体内イメージングに必要な分解能を考慮して、抗ＭＭＲナノボディＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９及び対照ナノボディｃＡｂＢｃＩＩ１０をＰＥＴイメージング用に１８Ｆ標識した。１３〜１６月齢の雄性ＷＨＨＬＭＩウサギに１８Ｆ標識ナノボディを辺縁耳静脈から注入した。対照ナノボディについては、シグナルは腎臓及び膀胱においてのみ検出された（図１３及び図１４；右欄）。抗ＭＭＲナノボディを注入したウサギは、さらに肝臓及び皮膚において顕著なシグナルを呈した。興味深いことに、ウサギの腹部大動脈（図１３；左欄）及び頸動脈（図１４；左欄）のアテローム硬化性病変は、ＮｂｈｍＭＭＲｍ３．４９を使用して容易に可視化された。
【０１３１】
実施例１５．心筋虚血／再灌流傷害（ＩＲＩ）ラットモデルにおける抗マクロファージマンノース受容体ナノボディによる生体内ターゲティング及びＰＥＴ／ＣＴベースの生体内イメージング
欧州では、急性心筋虚血（ＭＩ）の管理の改善によって早期死亡率が低下している。しかしながら、虚血性心疾患は依然として先進国における罹患率及び死亡率の最も重要な原因である。諸研究から、ＭＩ後の炎症過程が、心臓リモデリング及び／又は心不全の発症リスクの評価などの患者転帰の予測及び治療法の決定にとって関心が持たれ得ることが示されている。従って、ＭＩ後の免疫応答の種々のサブセットのインビボ評価方法が必要とされている。ここで、心筋虚血／再灌流傷害（ＩＲＩ）ラットモデルにおいて、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ、ＣＤ２０６＋）を標的化する放射性標識ナノボディ（Ｎｂ）を使用してＭ２炎症の経時的発現プロファイルをイメージングした（材料及び方法の節を参照）。
【０１３２】
１７匹のウィスターラットにおいて左前下行枝冠動脈を６０分間結紮し、続いて縫合を緩めることにより、心筋ＩＲＩを誘導した。７匹の動物を偽手術した。２日目に９９ｍＴｃ−テトロホスミン走査によって梗塞サイズを評価した。ベースライン、ＩＲＩ後日数（Ｄ）５、９、１２、１６、２１、２８日目及び３ヶ月目に９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−ＮｂのピンホールＳＰＥＣＴ／μＣＴ取得を行った。４匹の動物が手技中に死亡し、４匹の動物がその直後に死亡した。全潅流欠損（ＴＰＤ）として表される梗塞域（ＩＺ）は１１．７２±５．５０であった。ＩＲＩラットと偽手術ラットとの９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込みの比は、時間の経過に伴い有意に異なった（Ｆ（６，４８）＝２．５７、ｐ＝０．０３）（図１５）。偽とＩＲＩとの間にはＤ５、Ｄ９、Ｄ１２及びＤ１６に有意差があった（ｐ＜０．０５）が、ベースライン及びＤ１６以降は差は認められなかった（図１６）。インビボで定量化した平均９９ｍＴｃ−ＭＭＲ−Ｎｂ取り込み比とＴＰＤとの間にもまた有意な相関が存在した（ｒ＝０．８２４、ｎ＝１２、ｐ＜０．００１）（図１７）。
【０１３３】
心臓凍結切片に対するエキソビボ免疫蛍光染色から、ＩＺ及び周囲心膜にＭＭＲが存在することが実証され、これは生体内取り込みの位置特定に一致した。さらに、二重免疫蛍光染色でＭＭＲはＣＤ６８と共存した（図１８〜図１９）。
【０１３４】
【表１−１】
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【０１３５】
【表１−２】
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【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
表３．注入後１時間のピンホール  ＳＰＥＣＴ／マイクロＣＴに基づくナイーブ及びＭＭＲ−／−マウスにおける９９ｍＴｃ標識抗ＭＭＲ  Ｎｂクローン１の取り込み値
トレーサー取り込みはパーセンテージ投与活性毎グラム立方センチメートル（％ＩＡ／ｃｍ３）として表される。
【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
表４．注入後１時間のピンホールＳＰＥＣＴ／マイクロＣＴに基づくナイーブ及びＭＭＲ−／−マウスにおける９９ｍＴｃ標識二価抗ＭＭＲ  Ｎｂ構築物  （（Ｇ４Ｓ）３、ラマＩｇＧ２ヒンジ又はヒトヒンジリンカーを有する）、一価抗ＭＭＲ  Ｎｂクローン１、及び対照ｃＡｂＢＣＩＩ１０  Ｎｂの取り込み値
トレーサー取り込みはパーセンテージ投与活性毎グラム立方センチメートル（％ＩＡ／ｃｍ３）として表される。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
表５．ファージディスプレイから単離した単一Ｎｂクローン由来のＰＥ抽出物のヒトＭＭＲに対するＥＬＩＳＡ後に選択された抗ヒトＭＭＲ  Ｎｂ。ここに示す狭義のＮｂ配列に加え、全てのクローンが、ＨＡ及び６ｘＨｉｓタグ（ＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ；配列番号１７０）を含むＣ末端伸長も有する。ＣＤＲ１（赤色）、ＣＤＲ２（緑色）及びＣＤＲ３（青色）ドメインもまた示され、これらは表１０に別途掲載する。
【０１４２】
【表５】
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【０１４３】
表６．ファージディスプレイから単離した単一Ｎｂクローン由来の抽出物のヒトＭＭＲ及びマウスＭＭＲに対するＥＬＩＳＡ後に選択された抗ヒト／マウスＭＭＲ交差反応性Ｎｂ。ここに示す狭義のＮｂ配列に加え、全てのクローンが、ＨＡ及び６ｘＨｉｓタグ（ＡＡＡＹＰＹＤＶＰＤＹＧＳＨＨＨＨＨＨ；配列番号１７０）を含むＣ末端伸長も有する。ＣＤＲ１（赤色）、ＣＤＲ２（緑色）及びＣＤＲ３（青色）ドメインもまた示され、これらは表１０に別途掲載する。
【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
【表７−１】
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【０１４６】
【表７−２】
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【０１４７】
【表８】
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【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
【表１０−１】
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【０１５０】
【表１０−２】
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【０１５１】
【表１１−１】
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【０１５２】
【表１１−２】
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【０１５３】
【表１１−３】
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【０１５４】
【表１１−４】
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【０１５５】
【表１１−５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＣ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８ＢＣ】
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【配列表】
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