(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生仔哺乳類における下痢を治療又は予防する方法のために用いられる組成物であって、
以下からなる群より選択される細菌の１種又は複数種の株を含む組成物：
ａ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６３の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０４）、
ｂ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６５の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０６）、
ｃ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６４の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０９）、及び、
ｄ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６６の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ１０）、
ｅ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４７の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ１２）、
ｆ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４８の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ１７）、
ｇ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４９の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ５５）、及び、
ｈ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３５０の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ５９）。
【請求項２】
前記下痢が細菌感染症によって起こるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記方法が、イノシシ亜目の動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、家禽、ヒツジ、又はヤギを治療する方法であり、好ましくは前記方法が、子ブタ又はイヌを治療する方法である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
各株が、ｐＨ３．５で３時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
各株が、０．４５％の胆汁抽出物の存在下で４時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
生後最初の７日間以内に、好ましくは生後最初の２日間以内に投与されるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
各株が、菌叢上スポットアッセイにより決定される阻止帯によって証明される以下の抗菌活性の全てを有するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物：（ｉ）サルモネラ菌について１０ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｉ）リステリア・モノサイトゲネスについて１０ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウスについて１０ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｖ）エシェリキア・コリについて１０ｍｍ以上の阻止帯。
【請求項８】
少なくとも１種の株、好ましくは全ての株が、抗生物質耐性を有さないものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
以下の株から選択される、少なくとも２種の乳酸菌を含むものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物：
ａ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６３の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０４）、
ｂ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６５の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０６）、
ｃ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６４の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０９）、及び、
ｄ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６６の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ１０）、
ｅ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４７の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ１２）、
ｆ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４８の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ１７）、
ｇ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４９の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ５５）、及び、
スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３５０の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ５９）。
【請求項１０】
少なくとも１種のプレバイオティクス生成物を更に含み、該少なくとも１種のプレバイオティクス生成物が、好ましくは下記化合物及び組成物：ベータグルカン、マンナンオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクツロース、乳果オリゴ糖、ガラクトトリオース、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、セロビオース、セロデキストリン、シクロデキストリン、マルチトール、ラクチトール、グリコシルスクロース、ビタミンＥ又はその変形（該変形は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタトコフェロール、トコトリエノール及びトコモノエノールから選択される）から選択され、マンナンオリゴ糖及び／又はイヌリンが好ましい、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
経口投与用のものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記方法が、細菌感染症（大腸菌症を含む）、クロストリジウム・ディフィシル新生仔下痢、クロストリジウム・パーフリンジェンスＡ型菌及びＣ型菌に起因する下痢等の細菌感染症を治療又は予防する方法である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、各株が少なくとも以下の条件を満たすものである、組成物：
ａ．  菌叢上スポットアッセイにより決定される阻止帯によって証明される、以下の抗菌活性の全てを有すること：（ｉ）サルモネラ菌について１０ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｉ）リステリア・モノサイトゲネスについて１０ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウスについて１０ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｖ）エシェリキア・コリについて１０ｍｍ以上の阻止帯、
ｂ．  ｐＨ３．５で３時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できること、及び、
ｃ．  ０．４５％の胆汁抽出物の存在下で４時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できること。
【請求項１４】
以下の株から選択される乳酸菌：
ａ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６３の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０４）、
ｂ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６５の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０６）、
ｃ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６４の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０９）、及び、
ｄ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６６の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ１０）、
ｅ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４７の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ１２）、
ｆ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４８の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ１７）、
ｇ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３４９の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ５５）、及び、
ｈ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８３５０の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎＪ５９）。
【請求項１５】
少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種の、請求項１４に記載の細菌株を含む組成物。
【請求項１６】
少なくとも１種のプレバイオティクス生成物を更に含み、該少なくとも１種のプレバイオティクス生成物が好ましくは下記化合物及び組成物：ベータグルカン、マンナンオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクツロース、乳果オリゴ糖、ガラクトトリオース、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、セロビオース、セロデキストリン、シクロデキストリン、マルチトール、ラクチトール、グリコシルスクロース、ビタミンＥ又はその変形（該変形は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタトコフェロール、トコトリエノール及びトコモノエノールから選択される）から選択され、マンナンオリゴ糖及び／又はイヌリンが好ましい、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ヒト又は動物を治療する方法のために用いられる請求項１５又は１６のいずれか一項に記載の組成物であって、該ヒト又は該動物が好ましくは哺乳類及び／又は飼育動物であり、より好ましくはブタである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
新生仔動物、及び特に（集約）農業における新生仔動物は、細菌感染症及びその他の感染症にかかりやすい。これらの感染症は、体重減少を伴う下痢を引き起こす可能性があり、重篤な症例においては、新生仔の死をもたらす可能性すらある。例えば、数年前、新生仔子ブタにおける下痢の症例が、スペインにおける異なる地理的状況からのブタ農場において報告されている。該下痢はこれらの動物における徴候であると考えられているが、一方、該徴候の原因因子を突き止めることは困難であることがある。新生仔ブタにおける下痢の多数の症例において、例えば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）等のおそらく好ましくない／望まれない細菌株を、単独で、又はクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）若しくはクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）と組み合わせて単離することが可能であるが、下痢は通常、出生直後に検出され、ルーチン的な治療及び予防手技は有効ではないことが多い。
【０００２】
いずれの特定の理論にも拘束される意図はないが、腸内毒素症（細菌叢異常症とも称される）が原因因子である可能性があると考えられている。腸内毒素症とは、体表又は体内での微生物不均衡を伴う状態のことをいう。農業動物、特にブタにおいて、腸内毒素症は、新生仔子ブタの腸管細菌叢を変化させる、雌ブタの維持の際の抗生物質の乱用によって起こる可能性がある。
【０００３】
抗生物質の使用のこれらの不利益に鑑み、畜産における抗生物質の使用を低減することが推奨されている。他方で、一般的に使用されている抗生物質にとって代わる新生仔動物の治療の代替方法がそれゆえ必要とされている。
【０００４】
ＥＵが２００５年からブタの飼育における成長促進剤としての抗生物質の使用を低減することを推奨しているため（２００５年３月４日の（ＥＣ）Ｎｏ３７８／２００５規則改正（Amended by Regulation））、動物飼育者らは、特に生後早い段階で（農場）動物の全般的健康状態を向上させることができる代替手段を切望している。本発明者らはこの問題の解決手段を提供するものであり、該解決手段は以下に記載されている。本発明はしたがって現行の技術水準の方法によって起こるいくつかの問題を解決し、その有利な効果は以下に記載される。
【発明の概要】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、少なくとも１種、例えば１種、好ましくは少なくとも２種、例えば２種、より好ましくは少なくとも３種、例えば３種、より好ましくは少なくとも４種、例えば４種、代替的には少なくとも５種、例えば５種、代替的には少なくとも６種、例えば６種、代替的には少なくとも７種、例えば７種、代替的には少なくとも８種、例えば８種の、微生物、好ましくは細菌、より好ましくは乳酸菌を含む組成物に関する。乳酸菌は理想的には以下の株から選択される：全てＣＥＣＴに寄託された、ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。１つの実施の形態において、組成物は、各株が少なくとも以下の条件ａ.、好ましくは条件ａ.及びｂ.の両方、最も好ましくは条件ａ.、ｂ.及びｃ.の全てを満たす、１又は複数の株を含む：
ａ．  以下の阻止帯の少なくとも１つによって証明される抗菌活性を示すこと：（ｉ）サルモネラ菌（Salmonella）について、１０ｍｍ以上、例えば１４ｍｍ以上、（ｉｉ）リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）について、９ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上、（ｉｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウスについて、９ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上、（ｉｖ）エシェリキア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）について、１０ｍｍ以上、例えば１８ｍｍ以上；
ｂ．  ｐＨ＝３．５で、又は、代替的にはｐＨ＝２．５で、３時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できること；
ｃ．  ０．４５％の胆汁抽出物（bile extract）の存在下で、好ましくはｐＨ＝８で、４時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できること。
【０００６】
本発明の組成物は、新生仔哺乳類（好ましくは子ブタ）の、細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する、及び／又は体重を増加させる方法のために用いられるものとすることができる。この方法において、組成物は哺乳類に投与される。
【０００７】
本発明はまた、微生物、好ましくは細菌、より好ましくは乳酸菌も提供する。乳酸菌は、理想的には以下の株から選択される：全てアキロン  セイエレ  エス．  エル．によってＣＥＣＴ（スペイン微生物株保護機関）に寄託された、ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。
【０００８】
株のそれぞれについて同義的に使用することができる括弧内のＡｑＳｙｎ番号は、本発明者らが株に割り当てたものである。
【０００９】
ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）及びＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）は、２０１２年６月２０日に寄託した。ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）は、２０１３年５月１６日に寄託した。
【００１０】
特定の実施の形態において、組成物は、以下の３種の株の、少なくとも１種、例えば１種、好ましくは２種、例えば２種、より好ましくは少なくとも３種、例えば３種を含む：ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）及びＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）。代替的な実施の形態において、組成物は、ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；及びＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）の４種全てを含む。
【００１１】
代替的な実施の形態において、組成物は、ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の１種又は複数種、例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種を含む。
【００１２】
代替的な実施の形態において、組成物は、ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の、少なくとも１種、例えば１種、好ましくは少なくとも２種、例えば２種、より好ましくは少なくとも３種、例えば３種、より好ましくは少なくとも４種、例えば４種を含む。
【００１３】
代替的な実施の形態において、組成物は以下の３種の株を含む：ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）及びＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）。代替的な実施の形態において、組成物は以下の３種の株を含む：ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。代替的な実施の形態において、組成物は以下の３種の株を含む：ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。代替的な実施の形態において、組成物は以下の３種の株を含む：ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。好ましい実施の形態において、組成物はＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の４種全てを含む。
【００１４】
本発明の１つの実施の形態において、組成物に含まれる株の少なくとも１種、例えば１種、及び／又は２種、及び／又は３種、及び／又は４種、及び／又は５種、及び／又は６種、及び／又は７種、及び／又は８種、好ましくは組成物に含まれる株の全ては、抗生物質耐性を有さないもの、すなわち、適切な標準的抗生物質治療に曝された後は生存することができないものである。
【００１５】
いずれの場合も、「含む（comprises）」は、更なる細菌株が存在するか、又は更なる細菌株が存在しないと任意に理解することができる。更なる細菌株が存在しない場合であっても、「含む」は、更なる別の成分、即ち、細菌以外のいずれかの成分が存在することを任意に意味することができる。
【００１６】
１種の別の成分（又は複数の別の成分）はいかなるようにも限定されない。好ましい態様において、少なくとも１種のプレバイオティクス化合物が本発明の組成物に、即ち別の成分として含まれる。
【００１７】
異なる株の組成物に関して、あらゆる混合比が可能である。混合比は以下においてコロニー形成単位（ＣＦＵ）によって示され、ＣＦＵは好適には個々の株を混合する前に決定される。１つの実施の形態において、株の比は、同じであっても同じでなくてもよく、例えば、３種の株の組成物について１：（０．１〜１０）：（０．１〜１０）、４種の株の組成物について１：１：（０．１〜１０）：（０．１〜１０）：（０．１〜１０）等である。別の実施の形態において、株の比は、およそ同じであるか又は実質的に同じであり、例えば３種の株の組成物について１：１：１、４種の株の組成物について１：１：１：１等である。組成物は（コロニー数によって決定される）組成物に組み入れられる各株のそれぞれの細菌の量を混合することによって調製することができる。組み入れられる株は、個々の株のストックとして提供することができ、それらのそれぞれは、例えば凍結乾燥物の形態である。異なるストックが異なる濃度（ＣＦＵ／ｇ）を有する場合、所望の組成物が株のそれぞれの所望のＣＦＵを有するように、適量（ｇ）の各ストックが使用される。その例は以下に示される。
【００１８】
プレバイオティクスは当該技術分野においてよく知られており、本発明において用いられる場合、プレバイオティクス自体に特に制限はない。しかしながら、好ましい実施の形態において、組成物における少なくとも１種のプレバイオティクス生成物（prebiotic product）は、以下の化合物及び組成物から選択される：ベータグルカン、マンナンオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース（oligofructose）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクツロース、乳果オリゴ糖、ガラクトトリオース（galactotriose）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、セロビオース、セロデキストリン、シクロデキストリン、マルチトール、ラクチトール、グリコシルスクロース、ビタミンＥ又はその変形（変形は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタトコフェロール、トコトリエノール及びトコモノエノール（tocomonoenols）から選択される）。任意に、マンナンオリゴ糖及び／又はイヌリンが好ましい可能性がある。
【００１９】
本発明はまた、ヒト又は動物を治療する方法における、上記の組成物の使用も提供する。動物、特に、哺乳類及び／又は飼育動物の治療が好ましい可能性がある。動物は好ましくは、非ヒト動物であり、より好ましくは、動物はイノシシ亜目（suborder Suina）（イノシシ亜目（猪豚亜目（Suiformes）としても知られている）はイノシシ科及びペッカリー科のブタ及びペッカリーを含む哺乳類の系統である）由来のものである。野生又は飼育動物のブタ（Swine or pig）は、特に好ましい可能性がある。別の実施の形態において、組成物はヒトに投与される。
【００２０】
本発明はまた、新生仔哺乳類、好ましくは子ブタの、細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する、及び／又は体重を増加させる方法のために用いられる微生物、好ましくは細菌、より好ましくは乳酸菌を含む組成物も提供する。代替的には、組成物は、新生仔哺乳類、好ましくは子ブタの成長を促進する方法のために用いられるものである。
【００２１】
細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する、及び／又は、体重を増加させる、及び／又は、成長を促進する方法のために用いられる上記組成物は、細菌株ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の少なくとも１種を含むことができる。いくつかの実施の形態において、細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する、及び／又は、体重を増加させる、及び／又は、成長を促進する方法のために用いられる上記組成物は（記載されたいずれかの実施の形態における）上記の特定の組成物である。
【００２２】
細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する、及び／又は、体重を増加させる、及び／又は、成長を促進する方法のために用いられる組成物は、生後最初の１４日間以内（より好ましくは生後最初の１３日間以内、１２日間以内、１１日間以内、１０日間以内、９日間以内、８日間以内、７日間以内、６日間以内、５日間以内、４日間以内、３日間以内又は２日間以内、最も好ましくは生後最初の２日間以内又は生後最初の１日間（２４時間）以内）に投与することができる。
【００２３】
この目的のために、組成物は、例えば、経口投与することができる。組成物は、凍結乾燥形態、液体形態又は噴霧形態等のいずれかの形態とすることができる。例えば、凍結乾燥された細菌を、組成物を作るのに使用する場合、凍結乾燥された細菌の予備的な組成物を、例えば、無菌等張生理食塩溶液により再水和することができ、それにより所望の総濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を有する最終組成物を得ることができる。
【００２４】
使いやすさを提供するために、組成物は投与形態（dosed form）とすることができる。例えば、各投与量（dose）は、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１１以上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌（１０９以上が好ましい可能性がある）を含む。投与量は、０．１ｍｌ〜１００ｍｌの範囲、好ましくは０．２ｍｌ〜５０ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｌ〜２０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌ〜１０ｍｌ、より好ましくは１．５ｍｌ〜５ｍｌ、更により好ましくは（実質的に）２ｍｌの体積を有することができる。１０９以上のＣＦＵを有する２ｍｌの投与量が特に好ましい可能性がある。
【００２５】
あらゆる数の投与量を投与することができ、当業者であれば、それぞれの農場における必要性に従って治療の長さを選択することができる。特定の実施の形態において、動物に投与される投与量の総数は、１０以下であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択されるあらゆる数、又はこれらの数のいずれか１つ（１０を除く）とこれらの数のいずれか１つとを組み合わせたあらゆる範囲であるが、ただし、２番目の数の方が大きいものとする（例えば、１〜３の投与量等）。１頭の動物あたり合計２つの投与量が特に好ましい可能性がある。
【００２６】
好ましい実施の形態において、第１の投与量が、生後最初の２４時間で投与され、第２の投与量が続く２４時間で投与される。任意に、これらは２つだけの投与量である。別の選択肢において、更なる投与量がその後に投与される。
【００２７】
本発明の組成物は、細菌感染症等の哺乳類における病態を治療又は予防するのに特に好適である。いくつかの実施の形態において、病態は、細菌感染症（大腸菌症を含む）、クロストリジウム・ディフィシル新生仔下痢、クロストリジウム・パーフリンジェンスＡ型菌及びＣ型菌（Clostridium perfringens A and C type）に起因する下痢から選択することができる。（細菌）感染症が（まだ）下痢の原因因子であることが判明していない場合であっても、該下痢を患っている動物に、組成物を投与することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】異なるＰＣＲパターンは通常、実施例１に記載するように特徴的な細菌種を示す（レーン１〜５、７：ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、レーン８〜１１：エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、レーン６：分子量マーカー）。
【図２】阻止帯の具体例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の詳細な説明は本発明の個々の特徴の特定の及び／又は好ましい変形形態を開示する。本発明はまた、特に好ましい実施形態として、２つ以上の本発明の特徴について記載された、２つ以上の特定の及び／又は好ましい変形形態を組み合わせることによって作られる実施形態も考慮する。
【００３０】
特に明示的に断りのない限り、「含む（comprising）」という用語は、本文書の文脈において、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて更なるメンバーが任意に存在することができることを示すために用いられる。しかしながら、本発明の特定の実施形態として、「含む」という用語は更なるメンバーが存在しない可能性を包含することが考慮され、即ち、この実施形態の目的では、「含む」は、「のみからなる」の意味を有するものとして理解される。
【００３１】
特に明示的に断りのない限り、本出願における相対量の全ての表示は重量／重量ベースでなされる。総称によって特徴づけられる成分の相対量の表示は、該総称に包含される全ての具体的な変形又はメンバーの総量のことをいう意図である。総称によって規定される或る特定の成分が或る特定の相対量で存在すると特定される場合であって、かつ、この成分が更にその総称に包含される具体的な変形又はメンバーであると特徴づけられる場合、その総称に包含される成分の合計相対量がその特定の相対量を超えるように、その総称に包含されるその他の変形又はメンバーが更に存在しないことが意図され、より好ましくはその総称に包含されるその他の変形又はメンバーは全く存在しないことが意図される。
【００３２】
本発明は、プロバイオティクスとプレバイオティクスとの概念を統合し、それによりシンバイオティクスを提供するものである。本発明者らは免疫調節効果を有する細菌及び組成物の新規な治療ウィンドウを開く。微生物又は組成物は、子ブタ等の動物の初期ライフステージに投与することができる。したがって、本発明は、畜産において有益なものである可能性のある生成物及び組成物に関する。実施例によって証明されるように、現実の重要な観察結果は、生産性の点で、プロバイオティクス治療が、抗生物質による治療と少なくとも同等に有効であり、（標準的抗生物質治療と比較して）より良好である可能性が高いということである。本発明者らの貢献は、全体的な治療コストと、法的圧力及び環境影響との両方の理由から、巨大な経済効果を有する。
【００３３】
本発明により使用することができる微生物、好ましくは、細菌は有益な効果を有する微生物である。微生物は乳酸菌であるのが好ましい。非細菌種の微生物であっても、以下の選択基準ａ．〜ｃ．を満たす限り本発明により使用することができる。例えば、いくらかの酵母もまたプロバイオティクス特性を有している可能性があることが知られている。
【００３４】
微生物の種に関する限りは、本明細書に記載する機能的パラメーターが最も重要な選択基準であるが、乳酸菌が好ましい。乳酸菌（ＬＡＢ）は、それらの共通の代謝的及び生理的特徴によって関連付けられる、グラム陽性、酸耐性の細菌の系統群を含む。腐敗している植物及び乳酸製品（lactic products）、並びに動物の糞便において天然にみられるこれらの細菌は、炭水化物発酵の主な代謝最終産物として乳酸を産生する。乳酸菌は、それらの食物中の広範な出現及び哺乳類の粘膜表面の健康な細菌叢への貢献に起因して、一般に安全（ＧＲＡＳステータス）と考えられている。乳酸菌は、好ましくはラクトバチルス（Lactobacillus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、アエロコッカス（Aerococcus）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus）、オエノコッカス（Oenococcus）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）、バゴコッカス（Vagococcus）、及びワイセラ属から選択される。ラクトバチルス及び／又はエンテロコッカスが好ましい可能性がある。ラクトバチルスが好ましい。本明細書において好ましい細菌は、好ましくはグラム陽性であるとともにカタラーゼ陰性である。細菌がグラム陽性であるか否かは、当該技術分野において既知の標準的技術に従って試験することができる。グラム染色は、異なる「着色剤」（染色剤）による連続する染色と、サンプルが陽性であるか陰性であるかを調べるためのサンプルの洗浄とからなる。細菌がカタラーゼ陰性であるか否かは、以下のように試験される：カタラーゼ試験は、過酸化水素を培養物サンプル又は寒天斜面に添加することを含む。対象の細菌がカタラーゼを産生すれば、それらは過酸化水素を変換し、酸素ガスが発生するであろう。ガスの発生は泡を形成させ、これらの泡は陽性の試験（カタラーゼ陽性細菌）を示す。
【００３５】
本明細書において好ましい乳酸菌は、好ましくはＭＲＳ培地において増殖することができるものであり、より好ましくは以下に記載するような酸性化ＭＲＳ寒天において増殖することができるものである。ＭＲＳ培地は、乳酸菌、特にラクトバチルス属の一種の増殖に好都合であるように作られた。それは大多数のグラム陰性細菌の増殖に不都合であると考えられている。しかしながら、乳酸菌以外の細菌も最終的にはＭＲＳにおいて増殖できる可能性があり、それゆえコロニーがグラム陽性に属するか、そしてカタラーゼ陰性細菌であるかを調べることが推奨でき、又は必要でさえある。
【００３６】
本明細書において好ましい乳酸菌はおそらくプロバイオティクス細菌である可能性がある。「プロバイオティクス」の最も一般的に受け入れられている定義はFuellerによって１９９８年に与えられたものであり、Fuellerはプロバイオティクスを「宿主動物の腸管内微生物バランスを改善することにより、宿主動物に有益に影響を及ぼす、生きた微生物の飼料補助剤」として記述した。一般に、プロバイオティクスは生きた微生物である。異なるプロバイオティクスは腸内で異なる作用を有し、異なるプロバイオティクスはそれゆえ一緒に作用して有益な効果を提供する可能性があると考えられている。その他の出所は、プロバイオティクスを、ヒト又は動物に対する健康上の利点が既に判明している微生物であるとして定義している。プロバイオティクスについての選択基準は、"Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria", Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization, 2001, Cordoba, Argentinaにおいて公表されている。生菌の使用の利点は既に広く開示されている。
【００３７】
近年、「プレバイオティクス」の概念が導入された。プレバイオティクスは、胃腸管中の特定の微生物の増殖を増加させる消化できない食物成分である。「シンバイオティクス」は、少なくとも１種のプロバイオティクスと少なくとも１種のプレバイオティクスとを含む組成物である。かかる組成物は、有益な細菌（例えば、プロバイオティクス）の増殖を促進すると理解される。具体例として、発酵乳製品は、生菌及び生菌に必要な食物源を含有するため、しばしばシンバイオティクスであるとみなされる。プレバイオティクス及びプロバイオティクスに伴う利点は有益であるが、研究者らは、利点は、消費されるプレバイオティクス及びプロバイオティクスのタイプ及び量、並びに特定のプロバイオティクスと特定のプレバイオティクスとの特定の組合せに応じて変動するため、一般的な結論を導き出すことについては慎重である。したがって、強力なシンバイオティクスは、プロバイオティクス細菌の特定の株と注意深く選択されたプレバイオティクスとの組合せに基づく。それらは哺乳類に重要な健康上の利点をもたらすことができる。
【００３８】
特定のプロバイオティクス、プレバイオティクス及びシンバイオティクスがヒトにおける使用のために提案されており、プロバイオティクスについての選択基準は例えば、"Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria", Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization, 2001, Cordoba, Argentinaに開示されている。
【００３９】
本発明は、動物、特に家畜に対して健康上の利点を示す潜在力を有する、微生物、特に細菌を使用する。好ましくは、動物は飼育動物、飼い慣らされた動物又はそれ自体飼育動物若しくは飼い慣らされた動物ではないが（即ち、野生）、飼育動物と同じ種若しくは属に属する動物である。例えば、野生のブタは飼育ブタと同じ種に属するために、この定義に含まれるであろう。治療することができる飼育動物のいくつかの例としては、限定されないが、イヌ、ネコ及びその他の愛玩動物、ウマ、ウシ、ニワトリ及びその他の家禽、ブタ、ヒツジ、ヤギが挙げられる。好ましくは、動物は家畜であり、家畜としては限定されないが、ウマ、ウシ、ニワトリ及びその他の家禽、ブタ、ヒツジ、ヤギが挙げられる。より好ましくは、動物はイノシシ亜目からのものである。イノシシ亜目（猪豚亜目としても知られる）はイノシシ科及びペッカリー科のブタ及びペッカリーを含む哺乳類の系統である。野生又は飼育されたブタ（swine or pig）が特に好ましい可能性がある。
【００４０】
本発明に好適な株は以下のように同定することができる。
【００４１】
本発明の株に到達するための第１工程：単一株の単離
第１工程において、微生物（好ましくは細菌）を含有するサンプルを単離する。あらゆる微生物源が好適である可能性があり、広義には自然からのあらゆる非無菌サンプルとすることができる。微生物源は、（飼育）動物からとすることができ、例えば、生後最初の３０日間の若い動物、又はそれら若い動物の雌親からとすることができる。代替的には、微生物源は野生動物（例えば、イノシシ）からとすることができ、例えば、捕獲されたイノシシから採取したサンプルからとすることができる。好適な微生物源としては、雌親（例えば、雌ブタ）からの初乳、新生仔動物（例えば、子ブタ）からの胎便サンプル、飼育動物若しくは野生動物からの腸壁洗浄液（washes）又は天然腸内乳酸菌が挙げられる。サンプル中に含有される微生物（例えば、細菌）は、腸内微生物の増殖に好適であることが当該技術分野においてよく知られている増殖培地、例えば、ＭＲＳ培地で増殖させることができる。微生物を画線することができ、それによりシングルコロニーの単離が可能となる。シングルコロニーを採取することができ、それぞれの株を更に好適な増殖培地（例えば、最初に使用したものと同じ培地）で増殖させることができる。
【００４２】
これらのシングルコロニーの株を、当該技術分野において既知の方法によってグラム染色により任意に試験する（及びそれらがグラム陽性であれば選択する）及び／又は上記のようにカタラーゼ活性の存在について試験する（及びそれらがカタラーゼ陰性であれば選択する）。
【００４３】
本発明の株に到達するための第２工程：イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験
本発明に有用であるとして選択されるためには、好ましくは上記の第１工程に起源をもつ微生物株は、まずここに列挙し、次いで後で詳細に記載する、以下の基準の少なくとも１つを満たさなければならない：
ａ．  望まれない細菌に対する活性；
ｂ．  耐酸性；
ｃ．  胆汁酸塩耐性。
【００４４】
項目ａ．からｃ．は、優先順位を表す。即ち、基準ａ．を満たすことが最も望ましく、基準ａ．及びｂ．を満たすことが次に望ましく、基準ａ．〜ｃ．の全てを満たすことが最も好ましい。選択基準を以下に詳細に記載する。
【００４５】
（ｉ）望まれない細菌に対する活性
望まれない細菌に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングを行う。「望まれない」のは、以下の１又は複数から選択される細菌である：サルモネラ属の一種、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス及びエシェリキア・コリ。好ましくはサルモネラ属の一種はサルモネラ・エンテリカ（Salmonella Enterica）であり、より好ましくはサルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Typhimurium）である。
【００４６】
望まれない細菌に対する活性は以下に記載する菌叢上スポット試験に従って試験する。試験される各株の液体一晩培養液（ＭＲＳ）をＭＲＳ寒天上に１０μｌの単一スポットとしてアプライし、嫌気条件中３０℃で２４時間インキュベートする。インキュベーションの後、プレートを望まれない細菌（１％；１００ｍｌの培地中１ｍｌの一晩培養液）の１種を接種した７ｍｌの半固体ＢＨＩ寒天（０．７％）で被覆する。試験される１つの特定の株を含有する別々のプレートに、それぞれ望まれない細菌種の１種をオーバーレイする。かかる試験のそれぞれを三連で行う。望まれない細菌の最適増殖温度での、又は最適増殖温度付近での（最適増殖温度は本明細書において言及する望まれない細菌のそれぞれについて当該技術分野において既知である）２４時間のインキュベーションの後、サンプルを阻止の痕跡について調べる。この目的のため阻止帯が存在するかをまず調べる。阻止帯が存在すれば、阻止帯の直径を光学的に測定する。阻止帯が正確に円形ではないように見える場合は、阻止帯の測定は阻止帯の最短直径を測定するルールによって行う。最後に、三連の実験の算術平均を決定し、以下の基準を満たすかを調べる。
【００４７】
基準：以下の条件［（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）］の少なくとも１つを、株が陽性として選択されるために満たさなければならない：
（ｉ）サルモネラ菌について、１０ｍｍ以上の、例えば１４ｍｍ以上の阻止帯。
（ｉｉ）リステリア・モノサイトゲネスについて、９ｍｍ以上の、好ましくは１０ｍｍ以上の阻止帯。
（ｉｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウスについて、９ｍｍ以上の、好ましくは１０ｍｍ以上の阻止帯。
（ｉｖ）エシェリキア・コリについて、１０ｍｍ以上の、例えば１８ｍｍ以上の阻止帯。
【００４８】
９ｍｍ以上には、１０ｍｍ以上、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、１７ｍｍ以上、１８ｍｍ以上、１９ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２１ｍｍ以上、２２ｍｍ以上、２３ｍｍ以上、２４ｍｍ以上、２５ｍｍ以上が含まれる。
【００４９】
１０ｍｍ以上には、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、１７ｍｍ以上、１８ｍｍ以上、１９ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２１ｍｍ以上、２２ｍｍ以上、２３ｍｍ以上、２４ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、２６ｍｍ以上、２７ｍｍ以上、２８ｍｍ以上、２９ｍｍ以上、３０ｍｍ以上、３５ｍｍ以上が含まれる。
【００５０】
１４ｍｍ以上には、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、１７ｍｍ以上、１８ｍｍ以上、１９ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、３０ｍｍ以上が含まれる。
【００５１】
１８ｍｍ以上には、１９以上、２０ｍｍ以上、２１ｍｍ以上、２２ｍｍ以上、２３ｍｍ以上、２４ｍｍ以上、２５ｍｍ以上、２６ｍｍ以上、２７ｍｍ以上、２８ｍｍ以上、２９ｍｍ以上、３０ｍｍ以上、３５ｍｍ以上が含まれる。
【００５２】
数個の株を含む組成物もまた、上記基準について試験することができ、かかる組成物が、本明細書に記載する医学的利用のいずれかに好適であるとして選択されるためには、基準［（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）］の全てを満たさなければならない。かかる組成物は、そのいずれもが基準（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）の少なくとも１つを満たす個々の微生物株を組み合わせることによって好適に調製することができることもまた予想することができるが、これが本当にそうであるかどうかは実験的に試験しなければならない。
【００５３】
代替的には、寒天ウェル拡散アッセイを使用して阻止帯を求めることができる。このプロセスは無細胞上清を中和することにより低グルコースＭＲＳブロス中に産生される可能性があるいかなる微量の乳酸も除去する。嫌気条件下で増殖させた試験される種の定常期培養物を、遠心分離（５０００ｇ／２０分／４℃）により収集し、無細胞上清のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨを用いて６．５に調整する。上清をフィルター滅菌する（０．２０ｍｍ；Millipore Ltd.、Hertfordshire、England）。無細胞上清（３０μｌ）を［およそ］１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）に列挙した望まれない細菌を接種した寒天プレート中へ切られた７ｍｍの直径のウェルに添加する。寒天プレートを次いで３０℃で２４時間インキュベートする。ウェルの周囲の阻止帯の直径を測定し、選択基準は上記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）に示される通りであり、その中の少なくとも１つは、株が陽性であるとして選択されるために満たされなければならない。
【００５４】
参考：上記のアッセイは、Kawai et al., 2004. Applied and Environmental Microbiology 70(5): 2906-2911、Dortu et al. 2008. Letters in Applied Microbiology, 47: 581-586、Hata et al., 2009. International Journal of Food Microbiology, 137: 94-99, Awaisheh 2009. Food Pathogens and Disease 6 (9): 1125-1132.)によって記載されたものに基づく。
【００５５】
（ｉｉ）耐酸性
酸は胃液を模倣するとみることができ、酸に対する耐性は以下のように試験する。各株の６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜８×１０８ＣＦＵ／ｍｌを有する１００μｌのＭＲＳ中の最初の懸濁液を酸性化ＭＲＳ（適量の１２Ｎ  ＨＣｌの添加により酸性化されており、ｐＨ＝３．５、又は代替的にはｐＨ＝２．５）に懸濁し、３７℃で１１０ｒｐｍの撹拌下でインキュベートする。サンプルを０時間、３時間及び６時間にコロニー数（ＣＦＵ／ｍｌ）によって試験する。
【００５６】
基準：株は上記培地中での３時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率（試験後に試験前と比較して、少なくとも５０％のＣＦＵ、又は少なくとも５５％のＣＦＵ、又は少なくとも６０％のＣＦＵ、又は少なくとも７０％のＣＦＵ、又は少なくとも７５％のＣＦＵ、又は少なくとも８０％のＣＦＵ、又は少なくとも９５％のＣＦＵ、最も好ましくは試験後に試験前と比較して、少なくとも５０％のＣＦＵ）を保持できなければならない。参考：類似のプロトコルがHuang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260）によって簡単に記載されている。
【００５７】
（ｉｉｉ）胆汁酸塩耐性
哺乳類の天然の小腸の状態の模擬実験
【００５８】
６×１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜８×１０８ＣＦＵ／ｍｌの細菌株を有する１００μｌのＭＲＳ中の最初の懸濁液を、模擬小腸溶液（例えば、ｐＨ＝８のＭＲＳ（ｐＨはＮａＯＨの添加により調整）及び０．４５％の胆汁抽出物（ブタ胆汁抽出液、Ｂ８６３１−１００Ｇ．SIGMA-ALDRICH））中に懸濁し、３７℃で１１０ｒｐｍの撹拌下でインキュベートする。サンプルを、１時間、２時間及び４時間にコロニー数（ＣＦＵ／ｍｌ）によって試験した。
【００５９】
基準：模擬小腸分泌液（０．４５％の胆汁酸塩、任意にｐＨ＝８）への４時間の暴露の後に、生存率の減少が無いこと（又は本質的に生存率の減少が無いこと、即ち、好ましくは５０％以上のＣＦＵ、例えば、５０％、又は６０％、又は７０％、又は７５％、又は８０％、又は９５％以上のＣＦＵ）。同様のプロトコルがHuang et al., International Journal of Food Microbiology 91: 253-260によって簡単に記載されている。
【００６０】
任意に、上記基準ａ．〜ｃ．によって陽性であると同定された株はまた、上皮表面へのそれらの付着及び動物（例えば、ブタ）胃腸管における持続についても試験することができる。良好な付着特性を有する株は最良に働くと考えられている。
【００６１】
任意に、上記基準ａ．〜ｃ．によって陽性であると同定された株を、それらの抗生物質耐性プロファイルについて、例えば最小抗生物質濃度試験（ＶｅｔＭＩＣマイクロプレート試験）により更に試験する、及び／又は、遺伝子型耐性試験を異なる耐性遺伝子についてＰＣＲを行うことにより実施する（例えば、Egervaern et al., 2010. Antonie van Leeuwenhoek 97: 189-200）。抗生物質耐性を有さない細菌（耐性遺伝子の非存在又は不活性／機能欠失）は家畜への適用に最も適していると考えられている。
【００６２】
本発明の乳酸菌は、以下の株から選択することができる：ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。これらの全ての株はプロバイオティクス特性を有すると考えられており、それゆえ本明細書においてプロバイオティクスと称することができる。それぞれの株は本発明者らが上記の選択基準に従って単離した。ＣＥＣＴとはスペイン微生物株保護機関のことをいい、株のそれぞれについて同義的に使用することができる括弧内のＡｑＳｙｎ番号は、本発明者らが株に割り当てたものである。各細菌は試験により、上記基準ａ．〜ｃ．の少なくとも１つを満たすことが判明した。本発明による有益な特性を有する更なる株を見出す場合、かかる株のいずれかが、本発明にとって好適なものとして選択されるためには、上記基準ａ．〜ｃ．の少なくとも１つを満たすことが十分である可能性がある。本発明はまた、これらの株の少なくとも１種、例えば１種、好ましくは少なくとも２種、例えば２種、より好ましくは少なくとも３種、例えば３種、より好ましくは少なくとも４種、例えば４種、代替的には少なくとも５種、例えば５種、代替的には少なくとも６種、例えば６種、代替的には少なくとも７種、例えば７種、代替的には少なくとも８種、例えば８種を含む組成物も提供する。異なる株は、腸内で異なる作用を有すると考えられており、それゆえ異なる株は一緒に作用して有益な効果を提供することができる。
【００６３】
特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１種、例えば１種、好ましくは２種、例えば２種、より好ましくは以下の３種の株を含む：ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）及びＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）。代替的な実施形態において、組成物は以下の株を含む：ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）及びＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）。
【００６４】
代替的な実施形態において、組成物は、ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の１種又は複数種、例えば１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種を含む。
【００６５】
代替的な実施形態において、組成物は、ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の、少なくとも１種、例えば１種、好ましくは少なくとも２種、例えば２種、より好ましくは少なくとも３種、例えば３種、より好ましくは少なくとも４種、例えば４種を含む。
【００６６】
代替的な実施形態において、組成物は以下の３つの株を含む：ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）及びＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）。代替的な実施形態において、組成物は以下の３つの株を含む：ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。代替的な実施形態において、組成物は以下の３つの株を含む：ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。代替的な実施形態において、組成物は以下の３つの株を含む：ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。代替的な実施形態において、組成物はＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の４つ全てを含む。
【００６７】
本発明の１つの実施形態において、組成物に含まれる株の少なくとも１種、例えば組成物に含まれる株の１種、及び／又は２種、及び／又は３種、及び／又は４種、及び／又は５種、及び／又は６種、及び／又は７種、及び／又は８種、好ましくは組成物に含まれる株の全ては、抗生物質耐性を有さず、すなわちそれらは適切な標準的抗生物質治療への曝露の後に生存することができないものである。
【００６８】
抗生物質耐性を評価する目的の最小阻害濃度（ＭＩＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を、示唆される全ての株について行うことができる。評価する抗生物質は以下のものとすることができる：
アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール。
【００６９】
耐性株を感受性株から区別する目的のために、the European Food Safety Authority (EFSA) Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP)は、微生物学的カットオフ値を規定している。微生物学的カットオフ値は、単一の分類学的単位（種又は属）に属する細菌集団における選択された抗菌剤のＭＩＣの分布を研究することにより設定される。正常感受性集団から明らかに逸脱する集団の部分は耐性であるとして分類される。本発明の株の抗生物質耐性を評価するのに使用することができる微生物学的カットオフ値は、"Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance", EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy.  EFSA Journal 2012;10(6):2740において規定されているものである。
【００７０】
いずれの場合も「含む」は、任意に、更なる細菌株が存在するか、又は更なる細菌株が存在しないということであると理解することができる。更なる細菌株が存在しない場合であっても、「含む」は、任意に、更なるその他の成分、即ち、細菌以外のなんらかの成分が存在することを意味することができる。
【００７１】
１種の別の成分（又は複数の別の成分）はいかなるようにも限定されない。好ましい態様において、少なくとも１種のプレバイオティクス化合物が本発明の組成物に、即ち別の成分として含まれる。非常に広い概念において、プレバイオティクスは、プロバイオティクスによって代謝されることができる全ての食物源である。好ましくは、プレバイオティクスは哺乳類によって消化できないか又は難消化性のものである。したがって、哺乳類による摂取の後、消化できないプレバイオティクスは小腸を通過して大腸に入り、この区画においてプロバイオティクスの成長を刺激することができる。プレバイオティクスはしたがってプロバイオティクスのための食物源として役立つことができる。その多くが消化できない炭水化物であるプレバイオティクスは、腸の内側でプロバイオティクスの増殖を促進すると考えられている。プレバイオティクスは、例えば、タマネギ、全粒粉、バナナ、ニンニク、ハチミツ、ニラ、チョウセンアザミ、栄養強化食品及び飲料、並びに栄養補助食品において天然にみられる。プレバイオティクスは当該技術分野においてよく知られており、本発明において使用する場合、プレバイオティクス自体の特別な制限はない。しかしながら、好ましい実施形態において、組成物中の少なくとも１種のプレバイオティクス生成物は以下の化合物及び組成物から選択される：消化できない炭水化物、ベータグルカン、マンナンオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクツロース、乳果オリゴ糖、ガラクトトリオース、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、セロビオース、セロデキストリン、シクロデキストリン、マルチトール、ラクチトール、グリコシルスクロース、ビタミンＥ又はその変形（変形は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタトコフェロール、トコトリエノール及びトコモノエノールから選択される）。任意に、マンナンオリゴ糖及び／又はイヌリンが好ましい可能性がある。
【００７２】
異なる株の組成物に関して、あらゆる混合比が可能である。混合比はコロニー形成単位（ＣＦＵ）で示され、コロニー形成単位（ＣＦＵ）は個々の株を混合する前に好適に決定される。１つの実施形態において、株の比は、同じであっても同じでなくてもよく、例えば、３つの株の組成物について１：（０．１〜１０）：（０．１〜１０）、４つの株の組成物について１：（０．１〜１０）：（０．１〜１０）：（０．１〜１０）等とすることができる。別の実施形態において、株の比は、およそ又は実質的に等しく、例えば、３つの株の組成物について１：１：１、４つの株の組成物について１：１：１：１等である。組成物は、（コロニー数によって決定される）組成物に組み入れられる株のそれぞれの細菌の量を混合することによって調製することができる。
【００７３】
本発明はまた、ヒト又は動物を治療する方法における組成物の使用も提供する。動物、特に、哺乳類及び／又は飼育動物の治療が好ましい可能性がある。好ましくは、動物はイノシシ亜目（イノシシ亜目はイノシシ科及びペッカリー科のブタ及びペッカリーを含む哺乳類の系統である）からのものである。野生又は飼育動物のブタ（swine or pig）が特に好ましい可能性がある。これはまた、部分的に野生の状態において生存するブタ、即ち、１年のほとんどを野外で過ごし、自らの食物を見つける飼育ブタの品種も含む。組成物は、上記の寄託した株の少なくとも１種を含む組成物とすることができる。
【００７４】
本発明はまた、新生仔哺乳類、好ましくは子ブタの体重を増加させる方法のために用いられる乳酸菌を含む組成物も提供する。代替的には、組成物は、新生仔哺乳類、好ましくは子ブタの成長を促進する方法のために用いられるものである。代替的には、組成物は、新生仔哺乳類、好ましくは子ブタにおける細菌感染症によって起こる下痢を治療又は予防する方法のために用いられるものである。少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、例えば４種、又は５種以上の異なる乳酸菌の株が、組成物に含まれる。このパラグラフに記載される使用のための組成物の場合、各乳酸菌は、上記の基準ａ．〜ｃ．（望まれない細菌に対する活性；耐酸性；胆汁酸塩耐性）の少なくとも１つを満たさなければならない。基準ａ．に関して、上記の最小阻止帯が典型的には、望まれない細菌（ｉ）〜（ｉｖ）の全てについて観察される。好ましくは、組成物は上記基準（ａ．〜ｃ．）の複数（例えばａ．及びｂ．）を満たすべきであり、好ましくは上記基準（ａ．〜ｃ．）の全てを満たすべきである。上記方法において、抗生物質を動物に投与しないことも可能である。プロバイオティクス組成物又はシンバイオティクス組成物のいずれかを上記方法において使用することができる（即ち、少なくとも１種のプレバイオティクス化合物を含む組成物）。
【００７５】
本発明の組成物は、生きた微生物、好ましくは細菌を含む。特に、体重を増加させる及び／又は成長を促進する及び／又は細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する方法のために用いられる該組成物は、細菌株ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）の少なくとも１種、例えば１種、及び／又は２種、及び／又は３種、及び／又は４種、及び／又は５種、及び／又は６種、及び／又は７種、及び／又は８種を含むことができる。いくつかの実施形態において、体重を増加させる及び／又は成長を促進する及び／又は細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する方法のために用いられる該組成物は、上記の（記載されたいずれかの実施形態における）特定の組成物である。
【００７６】
体重を増加させる及び／又は成長を促進する及び／又は細菌感染症によって起こる下痢を治療若しくは予防する方法のために用いられる組成物は、生後最初の１４日間以内（より好ましくは生後最初の１３日間以内、又は１２日間以内、又は１１日間以内、又は１０日間以内、又は９日間以内、又は８日間以内、又は７日間以内、又は６日間以内、又は５日間以内、又は４日間以内、又は３日間以内、又は２日間以内、最も好ましくは生後最初の２日間以内又は生後最初の１日間（２４時間）以内）に投与することができる。
【００７７】
あらゆる投与経路が好適であるが、経口投与が好ましい可能性がある。最も典型的には、投与量を直接各動物の口の中に与えて、確実に動物がその投与量を嚥下するようにする。代替的には、組成物はまた、栄養補助食品として提供することもでき、即ち、動物の日々の餌に添加することもできる。
【００７８】
組成物は、凍結乾燥形態、液体形態又は噴霧形態等のあらゆる形態とすることができる。例えば、凍結乾燥された細菌を、組成物を作るために用いる場合、該凍結乾燥された細菌の予備的組成物を、例えば、無菌等張生理食塩溶液又は滅菌水又は滅菌増殖培地により再水和することができ、それにより所望の総濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を有する最終組成物を得ることができる。
【００７９】
使いやすさを提供するために、組成物は、投与形態におけるものとすることができる。例えば、各投与量は、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１１以上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の微生物（細菌）を含むことができ、１０９以上の投与量が好ましい可能性がある。投与量は、０．１ｍｌ〜１００ｍｌの範囲、好ましくは０．２ｍｌ〜５０ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｌ〜２０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌ〜１０ｍｌ、より好ましくは１．５ｍｌ〜５ｍｌ、更により好ましくは（実質的に）２ｍｌの体積を有することができる。１０９以上のＣＦＵを有する２ｍｌの投与量が特に好ましい可能性がある。
【００８０】
あらゆる数の投与量を投与することができ、当業者であればそれぞれの農場における必要性に応じて治療の長さを選択することができる。特定の実施形態において、動物に投与される投与量の総数は１０以下であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択されるあらゆる数、又はこれらの数のいずれか１つ（１０を除く）とこれらの数のいずれか１つとを組み合わせたあらゆる範囲であるが、ただし、２番目の数の方が大きいものとする（例えば、１〜３の投与量等）。１頭の動物あたり合計２つの投与量が特に好ましい可能性がある。
【００８１】
本発明者らはしたがって、任意にプロバイオティクス組成物又はシンバイオティクス組成物を初期ライフステージにおいて用いることにより、かかる組成物のための新しい使用を提供する。好ましい実施形態において、第１の投与量が生後最初の２４時間で投与され、第２の投与量が続く２４時間で投与される。任意に、これらは２つだけの投与量である。別の選択肢において、更なる投与量がその後に投与される。
【００８２】
本発明の組成物は、細菌感染症又は腸内毒素症等の哺乳類における病態を治療又は予防するのに特に好適である。感染症は、消化管の感染症であることができるか、又は消化管の感染症を含むことができる。かかる感染症は、例えば、単独の、又は、クロストリジウム・パーフリンジェンス又はクロストリジウム・ディフィシルと組み合わせた、エシェリキア・コリ等のいずれかの細菌によって起こる可能性がある。その他の原因因子には、サルモネラ菌、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウスが含まれる可能性がある。いくつかの実施形態において、病態は、細菌感染症（大腸菌症を含む）、クロストリジウム・ディフィシル新生仔下痢、クロストリジウム・パーフリンジェンスＡ型菌及びＣ型菌に起因する下痢から選択することができる。連鎖球菌性髄膜炎もまた治療することができる。（細菌）感染症が（まだ）下痢の原因因子であることが判明していない場合であっても、該下痢を患っているか、又は該下痢を患うリスクのある動物に、組成物を投与することも可能である。下痢を患うリスクのある動物は、最近１２カ月、６カ月、３カ月又は１カ月の間に下痢が観察されたという前提上に生きている（又は生まれた）動物であるとみなすことができる。
【００８３】
本発明者らの結果は、本発明の生成物及び組成物の使用の有利な効果を確認する。以下の概念実証の実施例に示すように、死亡率パーセンテージは単にルーチン的な抗生物質管理による他の週よりも明らかに低かった（実施例を参照されたい）。したがって、好ましくは本発明の組成物は、抗生物質（複数の場合もあり）によって同時に治療されていない動物に投与される。
【００８４】
本発明はまた、微生物、好ましくは細菌、より好ましくは乳酸菌も提供する。乳酸菌は理想的には以下の株から選択される：全てＣＥＣＴに寄託された、ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）；ＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）；ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）。
【００８５】
本出願は以下の項を含む：
１．新生仔哺乳類（好ましくは子ブタ）の体重を増加させる方法のために用いられる微生物の１種又は複数種の株を含む組成物であって、各株が少なくとも以下の条件ａを満たし、好ましくは条件ａ及びｂの両方を満たし、最も好ましくは条件ａ．、ｂ．及びｃ．の全てを満たす、組成物：
ａ．  菌叢上スポットアッセイ（spot on lawn assay）により決定される阻止帯によって証明される、以下の抗菌活性の少なくとも１つを有すること：（ｉ）サルモネラ菌について１４ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｉ）リステリア・モノサイトゲネスについて９ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｉｉ）スタフィロコッカス・アウレウスについて９ｍｍ以上の阻止帯、（ｉｖ）エシェリキア・コリについて１８ｍｍ以上の阻止帯；
ｂ．  ｐＨ２．５で３時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できること；
ｃ．  ０．４５％の胆汁抽出物の存在下及びｐＨ＝８で４時間のインキュベーションの間に本質的に同じ生存率を保持できること。
２．以下の株から選択される乳酸菌：
ａ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６３の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０４）、
ｂ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６５の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０６）、
ｃ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６４の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ０９）、及び、
ｄ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６６の受託番号で寄託されている株（ＡｑＳｙｎ１０）。
３．少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種、より好ましくは少なくとも３種、より好ましくは全ての、項２に記載の細菌株を含む組成物。
４．以下の３つの株を含む、又は以下の３つの株からなる、項３に記載の組成物：
ｉ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６３の受託番号で寄託されている前記株（ＡｑＳｙｎ０４）、
ｉｉ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６４の受託番号で寄託されている前記株（ＡｑＳｙｎ０９）、
ｉｉｉ．  スペイン微生物株保護機関に、ＣＥＣＴ８１６６の受託番号で寄託されている前記株（ＡｑＳｙｎ１０）。
５．項１の４つ全ての株を含む、又は以下の４つの株からなる、項４に記載の組成物。
６．少なくとも１種のプレバイオティクス生成物を更に含む、項３〜５のいずれか一項に記載の組成物。
７．上記少なくとも１種のプレバイオティクス生成物が、ベータグルカン、マンナンオリゴ糖、イヌリン、オリゴフルクトース、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、ラクツロース、乳果オリゴ糖、ガラクトトリオース、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、セロビオース、セロデキストリン、シクロデキストリン、マルチトール、ラクチトール、グリコシルスクロース、ビタミンＥ又はその変形（該変形は、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタトコフェロール、トコトリエノール及びトコモノエノールから選択される）から選択され、マンナンオリゴ糖及び／又はイヌリンが好ましい、項６に記載の組成物。
８．ヒト又は動物を治療する方法のために用いられる項３〜７のいずれか一項に記載の組成物であって、前記ヒト又は動物が好ましくは哺乳類及び／又は飼育動物であり、より好ましくはブタである、組成物。
９．項１に記載の使用のための組成物であって、前記組成物が項３〜７のいずれか一項に記載の組成物である、組成物。
１０．生後最初の１４日間以内に、より好ましくは生後最初の１３日間、１２日間、１１日間、１０日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間以内に、最も好ましくは生後最初の２日間以内に、投与される、項１又は９に記載の使用のための組成物。
１１．経口投与用の、項１又は９又は１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
１２．凍結乾燥、液体又は噴霧形態である、項１又９〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
１３．前記組成物が投与形態において提供され、各用量（dosage）が１０９以上のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、項１〜９又は１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
１４．２つの投与量での投与用の、項１３に記載の使用のための組成物。
１５．最初の投与量が生後最初の２４時間で投与され、２回目の投与量が続く２４時間で投与される、項１４に記載の使用のための組成物。
１６．細菌感染症（大腸菌症を含む）、クロストリジウム・ディフィシル新生仔下痢、クロストリジウム・パーフリンジェンスＡ型菌及びＣ型菌に起因する下痢等の細菌感染症の治療又は予防用の、項１又は９〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【００８６】
材料及び方法
ＭＲＳ培地：ＭＲＳ培地処方を以下の通りのスペイン微生物株保護機関（ＣＥＣＴ；www.cect.org）から得た処方に従って調製した：ペプトン  １０．０ｇ、牛肉エキス  １０．０ｇ、酵母エキス  ５．０ｇ、グルコース  ２０．０ｇ、クエン酸アンモニウム  ２．００ｇ、酢酸ナトリウム  ５．００ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２０ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ２．００ｇ、［寒天末（固体培地についてのみ）１５ｇ］、蒸留水１Ｌ。
【００８７】
ＢＨＩ（脳心臓浸出物）培地処方を以下の通りのスペイン微生物株保護機関（ＣＥＣＴ；www.cect.org）から得た処方に従って調製した：仔ウシ脳浸出（infusion）固体  １２．５ｇ、ウシ心臓浸出固体  ５．０ｇ、プロテオースペプトン  １０．０ｇ、グルコース  ２．０ｇ、ＮａＣｌ  ５．０ｇ、ＨＮａ２ＰＯ４  ２．５ｇ、蒸留水  １Ｌ、［寒天末（固体培地についてのみ）１５ｇ］。
【００８８】
抗生物質治療：典型的には、各ブタ農場は、新生仔子ブタを、抗生物質と場合によって鉄補給剤とで治療する。一般的に、各ブタ農場は、農場の動物のために異なる「標準的」治療を有している（農場は通常、出生時より（by birth）、抗生物質投与量及び鉄補給剤を注入する）。以下の実験において、それぞれの農場の標準的治療を用いた。抗生物質はまた一般的に、下痢、跛行、呼吸器症状及び子ブタにおける十分な確立されたプロトコルがない多くのその他の日々の状況によっても散発的に用いる。
【実施例】
【００８９】
実施例１Ａ：株の起源
細菌株を以下のようにして単離し、同定した。
【００９０】
ＣＥＣＴ８１６３（ＡｑＳｙｎ０４）；ＣＥＣＴ８１６５（ＡｑＳｙｎ０６）；ＣＥＣＴ８１６４（ＡｑＳｙｎ０９）及びＣＥＣＴ８１６６（ＡｑＳｙｎ１０）細菌株の単離を、雌ブタからの初乳及び新生仔子ブタからの胎便サンプルから行った。サンプリングはスペインにおける衛生的に高品質のブタ農場において行った。
【００９１】
サンプルを好気的及び嫌気的にＤｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）寒天プレートで２４時間３７℃にて増殖させ、異なる形態のグラム陽性、カタラーゼ陰性コロニーを単離した。全てのコロニーは細菌株に属していた。より正確には、６１の異なる細菌株を単離した。各個々をBerthier and Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106に記載されているようにして１６Ｓ／２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域を標的とするＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。
【００９２】
増幅及び電気泳動の後、明らかに区別されるバンドを精製し、配列決定した。異なるＰＣＲパターンを図１に示す。配列決定により、株をいくつかの細菌種に割り当てた。
【００９３】
１．１  株の特徴決定
特定の理論に拘束される意図はないが、かなりの株の間の差（strain differences）が存在する可能性があると考えられている。同じ種の株を区別するために、ＡＰＩ  ５０  ＣＨ試験（Biomerieux、ＲＥＦ  ５０  ３００）を製造業者の指示に従って、基質の炭水化物発酵パターンを説明するために行い、これにより同じ種の株の間の相違を確認する。
【００９４】
６１の株から、１０の異なる群が、炭水化物発酵パターンにより観察することができ、１０の異なる株の存在が確認された。各群の１つを例として取り、以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に供した。
【００９５】
１０の株は、ラクトバチルス・ロイテリ及びエンテロコッカス・フェシウム種に属していた。
【００９６】
１．ラクトバチルス・ロイテリ
２．ラクトバチルス・ロイテリ
３．ラクトバチルス・ロイテリ
４．ラクトバチルス・ロイテリ（ＡｇＳｙｎ０４）
５．ラクトバチルス・ロイテリ
６．ラクトバチルス・ロイテリ（ＡｇＳｙｎ０６）
７．エンテロコッカス・フェシウム
８．エンテロコッカス・フェシウム
９．エンテロコッカス・フェシウム（ＡｇＳｙｎ０９）
１０．エンテロコッカス・フェシウム（ＡｇＳｙｎ１０）
【００９７】
動物（特にブタ）の健康を改善することにおけるこれらの１０の株の可能な使用を調べるために、これらを更に試験した（以下のセクション１．２を参照されたい）。
【００９８】
１．２  株の選択
セクション１．１において記載されたようにして同定した１０の株を更に試験した。抗菌剤と耐性基準との組合せが先の株のなかから好適な株を見出すことの助けになることができると仮定した。したがって、株のそれぞれを別々に上記の「選択ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験」に記載された試験ａ．〜ｃ．のそれぞれに供した。
【００９９】
本発明者らの熱心な研究により、上記の「選択ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験」に記載の基準ａ．〜ｃ．が、本発明に好適な株の同定のために好適であることが示された。したがって、株を該基準ａ．〜ｃ．に従って試験した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により特に有益な特性を有する４つの株が明らかになった。結果を以下に列挙する。
【０１００】
【表１】
0006452607.tif 000002
【０１０１】
上記の表においてみることができるように、上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の後、４つの株（２株のラクトバチルス・ロイテリ（ＡｑＳｙｎ０４、ＡｑＳｙｎ０６）及び２株のエンテロコッカス・フェシウム（ＡｑＳｙｎ０９、ＡｑＳｙｎ１０））が同定された。［残りの６つの株、即ち、基準ａ．〜ｃ．の少なくとも１つを満たさなかった株についての結果は、上記の表に示していない］。
【０１０２】
これらの株の組成物を実施例２Ａに記載されているようにしてそれらから調製した。
【０１０３】
実施例１Ｂ：株の起源
細菌株を以下のようにして単離し、同定した。
【０１０４】
ＣＥＣＴ８３４７（ＡｑＳｙｎＪ１２）；ＣＥＣＴ８３４８（ＡｑＳｙｎＪ１７）；ＣＥＣＴ８３４９（ＡｑＳｙｎＪ５５）及びＣＥＣＴ８３５０（ＡｑＳｙｎＪ５９）細菌株の単離はイノシシの腸の腸壁洗浄液から行った。
【０１０５】
サンプルを好気的及び嫌気的にＤｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）寒天プレートで２４時間３７℃にて増殖させ、異なる形態のグラム陽性、カタラーゼ陰性コロニーを単離した。全てのコロニーは細菌株に属していた。より正確には、６１の異なる細菌株を単離した。各個々をBerthier and Ehrlich, 1998. FEMS Microbiology Letters 161: 97-106に記載されているようにして１６Ｓ／２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー領域を標的とするＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。
【０１０６】
増幅及び電気泳動の後、明らかに区別されるバンドを精製し、配列決定した。配列決定により、株をいくつかの細菌種に割り当てた。
【０１０７】
１．１  株の特徴決定及び選択
１．  ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）（ＡｑＳｙｎＪ１２）
２．  ラクトバチルス・ロイテリ（ＡｑＳｙｎＪ１７）
３．  ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）（ＡｑＳｙｎＪ５５）
４．  ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）（ＡｑＳｙｎＪ５９）
【０１０８】
上記の「選択ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験」に記載された基準ａ．〜ｃ．に従うｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により、特に有益な特性を有する４つの株が明らかになった。結果を以下に列挙する。
【０１０９】
【表２】
0006452607.tif 000003
【０１１０】
上記表にみることができるように、イノシシからの株は選択基準を満たす。さらに、上記の同定された株は抗生物質耐性を有さない。
【０１１１】
抗生物質耐性を評価する目的の最小阻害濃度（ＭＩＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を上記株（ＡｑＳｙｎＪ１２、ＡｑＳｙｎＪ１７、ＡｑＳｙｎＪ５５、ＡｑＳｙｎＪ５９）について行った。評価した抗生物質は以下の通りであった：
アンピシリン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコール。
【０１１２】
本発明の株の抗生物質耐性を評価するために用いた微生物学的カットオフ値は、"Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance", EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP), European Food Safety Authority (EFSA), Parma, Italy.  EFSA Journal 2012;10(6):2740に記載されているものである。
【０１１３】
これらの株の組成物を実施例２Ｂに記載されているようにしてそれらから調製した（組成物Ｄ及びＥ）。
【０１１４】
実施例２Ａ：本発明によるプロバイオティクス組成物及び本発明によるシンバイオティクス組成物の調製
株ＡｑＳｙｎ０４、ＡｑＳｙｎ０６、ＡｑＳｙｎ０９、ＡｑＳｙｎ１０のそれぞれを発酵によりＭＲＳブロス培養液中で増殖させ、収集し、凍結乾燥した。最終産物の生存率をコロニー数により調べた。プレバイオティクス化合物を任意に添加して、これら株の４つ全てを含有する組成物を調製した。以下の組成物を調製した：
【０１１５】
【表３】
0006452607.tif 000004
【０１１６】
【表４】
0006452607.tif 000005
【０１１７】
さらに、以下のように、４つの細菌株のうち３つのみ（ＡｑＳｙｎ０４、ＡｑＳｙｎ０９、ＡｑＳｙｎ１０）を含有する組成物Ｃを調製した。
【０１１８】
【表５】
0006452607.tif 000006
【０１１９】
組成物は、組成物に組み入れられる各株の同じ細菌量（コロニー数により決定（それぞれの値は上記に示すｇ単位のものである））を混合することにより調製し、示される更なる成分を添加し（例えば、組成物Ｂ、組成物Ｃ）、こうして得たそれぞれの組成物を等張生理食塩溶液により再水和することにより、２ｍｌの投与量中に１０９ＣＦＵ（組成物中に含有される全ての株の総量）を含有する最終組成物を得た。
【０１２０】
実施例２Ｂ：本発明によるプロバイオティクス組成物及び本発明によるシンバイオティクス組成物の調製
株ＡｑＳｙｎＪ１２、ＡｑＳｙｎＪ１７、ＡｑＳｙｎＪ５５、ＡｑＳｙｎＪ５９のそれぞれをＭＲＳブロス培養液中で発酵により増殖させ、収集し、凍結乾燥した。最終産物の生存率をコロニー数により調べた。プレバイオティクス化合物を任意に添加して、これらの株の４つ全てを含有する組成物を調製した。以下の組成物を調製した：
【０１２１】
【表６】
0006452607.tif 000007
【０１２２】
【表７】
0006452607.tif 000008
【０１２３】
実施例３：抗生物質の投与なしでの子ブタへの投与（第１概念実証）
第１概念実証を２４００頭の雌ブタ及び新生仔子ブタにおける慢性下痢問題を有する、サモラ地方（スペイン）に位置する農場の隣のブタ農場において行った。７つの同腹仔（７８頭の子ブタ）には組成物Ａを与え（実施例２Ａを参照されたい）、別の７つの同腹仔（８１頭の子ブタ）は以下のように対照として維持した。
【０１２４】
組成物Ａを投与された子ブタには１つの投与量（実施例２Ａを参照されたい）を出生から生後１４日目まで毎日、抗生物質治療なしに与えた。
【０１２５】
対照群の治療は、１５０ｍｇのアモキシシリン及び４００００ＵＩのゲンタマイシンを含有する市販品１ｍｌの筋肉内注射とした。この群内の下痢の子ブタにはこの治療をそれらが下痢を示した日数の間１日１回与えた。
【０１２６】
【表８】
0006452607.tif 000009
【０１２７】
この第１概念実証の結果は、非常に注目すべきものであり、本発明の治療の予期せぬ有効性を示している。これらの結果をみて、本発明者らは、病原菌の菌叢における予想された効果だけでなく、子ブタの天然の免疫系の刺激も推定した。特定の理論に拘束される意図はないが、投与した組成物は、消化性病原菌及びおそらくこれらの消化性感染症に対する子ブタの天然の応答に対する直接的効果を有していたということが理解できる。
【０１２８】
実施例４：異なる投与計画における子ブタへの投与（第２概念実証）
この実験はサモラ（スペイン）の実施例３と同じ農場にて行った。簡単に説明すると、本発明者らは、組成物Ａの新生仔子ブタの自然免疫系に対する影響を実証することを目的としていた。子ブタの若齢期の異なる段階での投与もまた研究した。子ブタの若齢期において、動物の菌叢はまだ未成熟であるということが理解されている。
【０１２９】
組成物Ａを７つの同腹仔（６５頭の子ブタ）に出生した日に与え、第２群の７つの同腹仔（８４頭の子ブタ）には組成物Ａを出生後１日目及び２日目に与え（いずれかの抗生物質適用）、及び第３群の７つの同腹仔（８０頭の子ブタ）は実施例３におけるように対照とした。対照群のみが抗生物質治療を受け、組成物Ａを与えられた群はいずれの抗生物質の適用も受けなかったということに留意することが重要である。本発明者らは、対照群におけるものと同様の体重増加を達成することができるということを実証する。
【０１３０】
【表９】
0006452607.tif 000010
【０１３１】
結果は２つの投与量の投与が有益であることを示す。特に、子ブタの出生後非常に初期段階での２回の適用は、抗生物質を使用せずに消化器疾患に対して動物を保護することができ、死亡率を低減することができる。
【０１３２】
この点における更に重要な観察結果は、試験したプロバイオティクス投与は、生産性に関して抗生物質による治療と少なくとも同等に有効であるということである。
【０１３３】
実施例５：子ブタへの投与及び免疫系に対する影響（第３概念実証）
第３概念実証をムルシア地方に位置する農場にて行った。この農場は、２，４００頭の雌ブタ及び出生直後の子ブタにおける下痢の問題を有していた。これらの消化性の問題は、エシェリキア・コリ及びクロストリジウム・ディフィシルにより引き起こされていると診断された。
【０１３４】
この農場における子ブタの通常の治療（この実験における対照子ブタ）は、出生直後の１００ｍｇのツラスロマイシンの注入であった。その後、授乳の間に下痢を有していた子ブタもまた、スピラマイシン（２５ｍｇ／ｋｇ生体重）及びコリスチン（５ｍｇ／ｋｇ生体重）で、それら子ブタが下痢を有していた日数の間、１日１回経口的に治療した。
【０１３５】
この実験において、抗生物質治療をせずに、組成物Ａを２９の同腹仔に２回、即ち、（１）出生直後及び（２）出生第２日目に、投与した。３４の同腹仔は通常の農場の手技の通りに取り扱った。
【０１３６】
【表１０】
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【０１３７】
この概念実証は、特に抗生物質を使用しない場合の、新生仔子ブタにおける初期消化器障害の管理を改善する可能性を証明した。
【０１３８】
実施例６：子ブタへの投与及び免疫系に対する影響（第４概念実証）
次の概念実証は、農場のルーチンにおける通常の業務としての生成物を試験することを目的としていた。この実験はウエスカの地域の５，５００頭の雌ブタの農場において行った。物流の事実に起因して、対照群を維持することは不可能であった。組成物Ｂを或る特定の週に生まれた全ての子ブタに与えて（２０１２年の第１３週）、実験前及び実験後の週における生産性指標を比較した。この農場では、下痢を有する子ブタの通常の治療は、１００ｍｇのアンピシリン及び２５００００ＩＵのコリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（methanesulphonate sodium collistin）を含有する市販品の１日あたり１ｍｌの３日間の投与であった。
【０１３９】
【表１１】
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【０１４０】
（Ａ）下痢の症例は、初産雌ブタの８０％（組成物Ｂによる治療なしの通常の通り）、及びいくらかの経産雌ブタで観察された。子ブタは３日齢〜５日齢であった。全ての下痢症例は抗生物質治療なしで消失した。
【０１４１】
本発明者らの結果は、本発明の生成物及び組成物の使用の有利な効果を確認する。死亡率パーセンテージは単なるルーチン的な抗生物質管理による別の週と比較して明らかに低かった。
【０１４２】
実施例７：
組成物Ｅによるｉｎ  ｖｉｖｏ実験を、１，２００頭の超多産雌親（hyper prolific mothers）（１回の出産あたり平均１４頭の子ブタが生きて生まれる）及び１週間あたり５６の出生（１週間あたり７８４頭の子ブタ）を有するサラゴサ（スペイン）の農場にて行い、この農場は、生後１週間未満の子ブタにおける授乳期における下痢の定期的問題を有する子ブタを２０ｋｇまで生育させ、次いで別の農場に供給することを目的とする。農業家は子ブタを標準的方法で管理し、出生時及び出生後２日目に全ての同腹仔に生成物（上記の組成物Ｅ）を投与した。組成物Ｅによる治療の結果は組成物Ａ、Ｂ及びＣにより得られた結果と同様であった。
【受託番号】
【０１４３】
ＣＥＣＴ  ８１６３
ＣＥＣＴ  ８１６４
ＣＥＣＴ  ８１６５
ＣＥＣＴ  ８１６６
ＣＥＣＴ  ８３４７
ＣＥＣＴ  ８３４８
ＣＥＣＴ  ８３４９
ＣＲＣＴ  ８３５０
【図１】
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【図２】
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