(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
後記液体クロマトグラフィの状態及び後記超臨界クロマトグラフィの状態のいずれにおいても後記分析流路に接続されており、超臨界流体となる溶媒を第１ポンプにより送液する第１溶媒送液部と、
前記溶媒に対して相溶性をもち極性をもつ有機溶媒を第２ポンプにより送液する第２溶媒送液部と、
前記第１溶媒送液部と前記第２溶媒送液部との合流部の下流の分析流路に配置された分離カラムと、
前記分析流路において前記合流部と前記分離カラムとの間に配置され前記分析流路に試料を注入する試料注入部と、
前記分析流路の移動相の流れに対して前記分離カラムの下流に配置され、後記液体クロマトグラフィの状態及び後記超臨界クロマトグラフィの状態のいずれにおいても前記分析流路に接続されており、前記分析流路内の移動相を超臨界流体状態に維持する圧力に保つ加圧状態とすることのできる背圧弁と、
前記分析流路における前記分離カラムと前記背圧弁の間、及び前記背圧弁の大気への開放口の外側の少なくとも一方に配置され前記分離カラムから溶出した試料成分を検出する検出器と、
前記第１ポンプ、前記第２ポンプ及び前記背圧弁の動作を制御する制御部とを備え、
前記背圧弁は前記加圧状態と大気に解放する解放状態との間で切り換えるように構成されたものであり、
前記制御部は、前記第１ポンプ及び前記第２ポンプを作動状態とするとともに前記背圧弁を前記加圧状態に維持した超臨界流体クロマトグラフィの状態から、前記第１ポンプを停止させ、前記第２ポンプを継続して作動させるとともに前記背圧弁を解放状態とすることによって前記分析流路を液体状態の移動相が流れる液体クロマトグラフィの状態へと切換えを行うように構成されたものである超臨界流体−液体クロマトグラフ。
【請求項２】
前記制御部は時間に対して前記第１ポンプ、前記第２ポンプ及び前記背圧弁の作動条件を設定した分析プログラムを格納した分析プログラム格納部を備えており、
前記超臨界流体クロマトグラフィの状態から液体クロマトグラフィの状態への切換えを前記分析プログラムに基づいて実行する請求項１に記載の超臨界流体−液体クロマトグラフ。
【請求項３】
前記有機溶媒とともに液体クロマトグラフィの移動相を構成することのできる第３溶媒を第３ポンプにより供給する第３溶媒送液部を前記合流部に接続し、
前記分析プログラム格納部は前記液体クロマトグラフィにおけるグラジエント分析のための分析プログラムも格納しており、
前記制御部は前記液体クロマトグラフィにおいて前記第２ポンプと第３ポンプを制御して高圧グラジエント分析を行うように構成されている請求項２に記載の超臨界流体−液体クロマトグラフ。
【請求項４】
前記第２溶媒送液部は前記第２ポンプにより前記有機溶媒のほかに、前記有機溶媒とともに液体クロマトグラフィの移動相を構成することのできる第３溶媒も供給できるように構成されており、
前記分析プログラム格納部は前記液体クロマトグラフィにおけるグラジエント分析のための分析プログラムも格納しており、
前記制御部は前記超臨界流体クロマトグラフィのにおいては前記第２溶媒送液部からは前記有機溶媒のみを供給するように前記第２溶媒送液部の動作を制御し、前記液体クロマトグラフィにおいては前記第２溶媒送液部から前記有機溶媒と前記第３溶媒を供給して低圧グラジエント分析を行うように構成されている請求項２に記載の超臨界流体−液体クロマトグラフ。
【請求項５】
分離カラムを備えた分析流路と、超臨界流体となる溶媒を送液する第１ポンプ及び前記溶媒に対して相溶性をもち極性をもつ有機溶媒を送液する第２ポンプを備えて前記分析流路に移動相を供給する移動相送液部と、前記分析流路において前記分離カラムと前記移動相送液部との間に試料を注入する試料注入部と、前記分析流路の移動相の流れに対して前記分離カラムの下流に配置され、前記分析流路内の前記溶媒を超臨界流体状態に維持する圧力に保つ加圧状態とすることのできる背圧弁と、前記分析流路における前記分離カラムと前記背圧弁の間、及び前記背圧弁の大気への開放口の外側の少なくとも一方に配置され前記分離カラムから溶出した試料成分を検出する検出器と、を備えた分析装置を用いた分析方法であって、以下のステップ（Ａ）から（Ｃ）のステップを含む分析方法。
（Ａ）前記移動相送液部から前記溶媒を含む移動相を供給し、前記背圧弁により前記分析流路内の移動相を超臨界流体状態に維持しながら前記試料注入部から試料を注入して超臨界流体クロマトグラフィ分析を開始するステップ、
（Ｂ）前記移動相が前記溶媒と前記有機溶媒との混合溶液である超臨界流体クロマトグラフィ分析の後、前記第１ポンプが前記分析流路に接続された状態を維持しながら前記第１ポンプを停止させることによって前記移動相送液部から供給する移動相を前記有機溶媒のみに切り換えるとともに前記分析流路に接続された状態の前記背圧弁を大気圧に解放することにより、超臨界流体クロマトグラフィの状態から前記分析流路を液体状態の移動相が流れる液体クロマトグラフィの状態へと切り換えるステップ、及び
（Ｃ）その後、前記有機溶媒を含む移動相による液体クロマトグラフィ分析を行うステップ。
【請求項６】
前記ステップ（Ｃ）は、移動相として前記有機溶媒に他の溶媒を混合するグラジエント分析である請求項５に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移動相として超臨界流体を使用した超臨界流体クロマトグラフィ（ＳＦＣ）に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、質量分析計をはじめとした検出器の高感度化、および検出時の分子の選択性の向上といった技術革新にともない、各種クロマトグラフィと検出器を連結させることによって低分子化合物（おおよそ分子量が１０００以下のもの）の網羅的定量分析が可能となってきた。例えば、生体内の代謝物総体に基づくオーム科学であるメタボロミクス研究においては、微生物・植物・動物、あるいは食品試料中の複雑な表現型を高解像度かつ定量的に解析できることから、基礎科学研究に貢献するだけではなく、創薬支援や毒性評価、食品機能解析など産業上の実用的研究においても強力な解析ツールとして使用されはじめている。また、残留農薬試験や残留薬物試験の分野においても必須の技術となっている。
【０００３】
一般的に、低分子化合物は物理化学的特性が多様であることから、包括的にそれらを測定するためには様々な分離技術が必要となる。
【０００４】
ＳＦＣは超臨界流体を移動相に用いる（特許文献１参照。）。超臨界流体は臨界温度、臨界圧力を超えた状態の物質であり、低粘性、高拡散性というクロマトグラフィとして好ましい性質をもっている。ＳＦＣは、高流速分析においても高い分離能を保ち、極性溶媒（モディファイア）の添加や温度、背圧を変化させることで、幅広い分離モードを選択できる可能性をもっている。ＳＦＣにおいて一般的に用いられる二酸化炭素は、臨界圧力が７.３８ＭＰａであり、臨界温度が３１.１℃と比較的常温に近く、引火性や化学反応性がなく、純度の高いものが安価に手に入ることなどから、ＳＦＣに最もよく利用されている。超臨界二酸化炭素（ＳＣＣＯ2）はヘキサンに近い低極性の物性をもっており、メタノールのような極性有機溶媒をモディファイアとして添加することによって、移動相の極性を大きく変化させることができる。よって、ＳＦＣは、これまで疎水性代謝物の代表である脂質類の高速分離分析に有用な分離分析手法として応用されてきた。
【０００５】
一方、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）は代謝物の分析には共通に使用されており、最も広く使用されているクロマトグラフィの手法と言えるが、測定対象によって測定条件が異なっており、広い範囲の代謝物を１台のＬＣで同時に分離することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−５２９６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
超臨界流体クロマトグラフィと液体クロマトグラフィはそれぞれに適した分析対象化合物があるので、両方の分析方法を組み合わせることができれば広い範囲の化合物を網羅することができる。
【０００８】
そこで、超臨界流体クロマトグラフィと液体クロマトグラフィを１台の分析装置で実行することができれば好都合である。例えば、１台の分析装置で超臨界流体クロマトグラフィから液体クロマトグラフィへ切り換えることを考えてみる。超臨界流体クロマトグラフィによる分析中は、移動相を超臨界状態に保つために背圧がかけられている。分析中にモディファイヤである有機溶媒の添加量を増やしていって移動相をその有機溶媒のみとすれば、その有機溶媒による液体クロマトグラフィに切り換えられたことになるが、モディファイヤの添加量が増すとともに移動相の粘性が増加するため、送波ポンプやカラム、検出器のセル部へかかる圧力が増加する。圧力が増加することに伴い、送液ポンプやカラム、検出器セル部の耐圧オーバにより、送液ポンブのシール漏れ、カラムや検出器セルの耐久性の低下を引き起こす可能性がある。つまり、超臨界流体クロマトグラフィからモディファイヤのみの液体クロマトグラフィへの分析モードの切換えは、現状の超臨界流体クロマトグラフを用いて超臨界流体クロマトグラフィの延長を考えたのでは容易にできないことがわかる。
【０００９】
本発明は、上記の問題があるにも関わらず、超臨界流体クロマトグラフィと液体クロマトグラフィを１台の分析装置で実行できるようにする装置とその方法を実現することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の超臨界流体−液体クロマトグラフは、超臨界流体となる溶媒を第１ポンプにより送液する第１溶媒送液部と、前記溶媒に対して相溶性をもち極性をもつ有機溶媒を第２ポンプにより送液する第２溶媒送液部と、前記第１溶媒送液部と前記第２溶媒送液部との合流部の下流の分析流路に配置された分離カラムと、前記分析流路において前記合流部と前記分離カラムとの間に配置され前記分析流路に試料を注入する試料注入部と、前記分析流路の移動相の流れに対して前記分離カラムの下流に配置され、前記分析流路内の移動相を超臨界流体状態に維持する圧力に保つ加圧状態とすることのできる背圧弁と、前記分析流路における前記分離カラムと前記背圧弁の間、及び前記背圧弁の大気への開放口の外側の少なくとも一方に配置され前記分離カラムから溶出した試料成分を検出する検出器と、前記第１ポンプ、前記第２ポンプ及び前記背圧弁の動作を制御する制御部とを備えている。
【００１１】
そして、前記背圧弁は前記加圧状態と大気に解放する解放状態との間で切り換えるように構成されたものであり、前記制御部は、前記第１ポンプ及び前記第２ポンプを作動状態とするとともに前記背圧弁を前記加圧状態に維持した超臨界流体クロマトグラフィから、前記第１ポンプを停止させ、前記第２ポンプを継続して作動させるとともに前記背圧弁を解放状態とした液体クロマトグラフィへと切換えを行うように構成されたものである。
【００１２】
本発明の分析方法は、分離カラムを備えた分析流路と、前記分析流路に移動相を供給する移動相送液部と、前記分析流路において前記分離カラムと前記移動相送液部との間に試料を注入する試料注入部と、前記分析流路の移動相の流れに対して前記分離カラムの下流に配置され、前記分析流路内の移動相を超臨界流体状態に維持する圧力に保つ加圧状態とすることのできる背圧弁と、前記分析流路における前記分離カラムと前記背圧弁の間、及び前記背圧弁の大気への開放口の外側の少なくとも一方に配置され前記分離カラムから溶出した試料成分を検出する検出器と、を備えた分析装置を用い、以下のステップ（Ａ）から（Ｃ）のステップを含む。
【００１３】
（Ａ）前記移動相送液部から移動相として超臨界状態になりうる移動相を供給し、前記背圧弁により前記分析流路内の移動相を超臨界流体状態に維持しながら前記試料注入部から試料を注入して超臨界流体クロマトグラフィ分析を開始するステップ、
（Ｂ）前記移動相が超臨界流体となる溶媒と該溶媒に対して相溶性をもち極性をもつ有機溶媒との混合溶液である超臨界流体クロマトグラフィ分析の後、前記移動相送液部から供給する移動相を前記有機溶媒のみに切り換えるとともに前記背圧弁を大気圧に解放することにより、超臨界流体クロマトグラフィの状態から液体クロマトグラフィの状態へと切り換えるステップ、及び
（Ｃ）その後、前記有機溶媒を含む移動相による液体クロマトグラフィ分析を行うステップ。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、超臨界流体クロマトグラフにおける背圧弁として加圧状態と大気に解放する解放状態との間で切り換えるように構成されたものを使用し、超臨界流体クロマトグラフィ分析の状態から超臨界流体を供給するポンプを停止させ、モディファイアとして使用した溶媒を供給するポンプを継続して作動させることにより液体クロマトグラフィへと切換えを行うように構成されているので、超臨界流体クロマトグラフィと液体クロマトグラフィを１台の分析装置で実行できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一実施例の超臨界流体クロマトグラフィ−液体クロマトグラフィ分析装置を示す概略構成図である。
【図２】同実施例において背圧弁として使用される圧力制御バルブの一例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）はバルブ機構部分を拡大して示す断面図、（Ｃ）は同圧力制御バルブの凹部の形状を弁体部材及び押付部材を取り外した状態で示す断面図、（Ｄ）は同圧力制御バルブの凹部内を上から見た図である。同実施例におけるクロマトグラムを示す図である。
【図３】同実施例の動作の一例を示すタイムチャートである。
【図４】同動作を示すフローチャートである。
【図５】他の実施例における移動相送液部をを示す流路図である。
【図６】同実施例の動作の一例を示すタイムチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一実施形態では、制御部は時間に対して前記第１ポンプ、第２ポンプ及び背圧弁の作動条件を設定した分析プログラムを格納した分析プログラム格納部を備えている。そして、制御部は超臨界流体クロマトグラフィから液体クロマトグラフィへの切換えをその分析プログラムに基づいて実行するように構成されている。
【００１７】
他の実施形態では、モディファイアとなる有機溶媒とともに液体クロマトグラフィの移動相を構成することのできる第３溶媒を第３ポンプにより供給する第３溶媒送液部が前記合流部に接続されている。そして、制御部の分析プログラム格納部は液体クロマトグラフィにおけるグラジエント分析のための分析プログラムも格納しており、制御部は液体クロマトグラフィにおいて第２ポンプと第３ポンプを制御して高圧グラジエント分析を行うように構成されている。
【００１８】
さらに他の実施形態では、第２溶媒送液部は第２ポンプによりモディファイアとなる有機溶媒のほかに、その有機溶媒とともに液体クロマトグラフィの移動相を構成することのできる第３溶媒も供給できるように構成されている。そして、制御部の分析プログラム格納部は液体クロマトグラフィにおけるグラジエント分析のための分析プログラムも格納しており、制御部は超臨界流体クロマトグラフィにおいては第２溶媒送液部からはモディファイアとなる有機溶媒のみを供給するように２溶媒送液部の動作を制御し、液体クロマトグラフィにおいては第２溶媒送液部からその有機溶媒と第３溶媒を供給して低圧グラジエント分析を行うように構成されている。
【００１９】
分析方法の一実施形態では、ステップ（Ｃ）は、移動相として有機溶媒に他の溶媒を混合するグラジエント分析となっている。
【００２０】
超臨界流体−液体クロマトグラフの一実施例を図１に示す。移動相を供給するために、ボンベ２に収容された超臨界流体を第１ポンプ（ＳＦＣポンプ）４により送液する第１溶媒送液部と、モディファイア溶液８を第２ポンプ（モディファイアポンプ）１０により送液する第２溶媒送液部が設けられている。第１溶媒送液部の送液流路６と第２溶媒送液部の送液流路１２が合流部に配置されたミキサ１４に接続されている。
【００２１】
ミキサ１４から移動相が送られる流路が分析流路１６である。分析流路１６上には、移動相の流れに対する上流側から、この分析流路１６に試料を注入する試料注入部１８、分離カラム２０、第１検出器２２、背圧弁２４及び第２検出器２６が配置されている。分離カラム２０はカラムオーブン（図示略）内に収容されて一定温度に保たれる。
【００２２】
超臨界流体としては、例えば液体状態の二酸化炭素を使用し、モディファイアとしては、例えばメタノール又はメタノール溶液を使用することができる。試料注入部１８は例えばオートサンプラである。
【００２３】
背圧弁２４は、移動相が超臨界流体状態になる得るものであるときに分析流路１６内の移動相を超臨界流体状態に維持するために、分析流路１６内を一定圧力（加圧状態）に保つことができるものであり、かつその加圧状態と大気に解放する解放状態との間で切り換えるように構成されたものである。
【００２４】
分離カラム２０と背圧弁２４の間に配置される第１検出器２２としては、例えば紫外可視吸光光度計を使用する。試料注入部１８から分析流路１６に導入された試料は、分離カラム２０で分離され、検出器２２で電気信号に変換される。
【００２５】
背圧弁２４の下流側に配置される第２検出器２６としては、例えば質量分析計やＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器：Evaporated Light Scattering Detector）といった、移動相の除去が必要な検出器を使用する。背圧弁２４の上流側の分析流路１６内では移動相は超臨界状態又は液体状態であるが、背圧弁２４の下流側では移動相は大気圧下に放出されるため、分離カラム２０で分離されて溶出した試料成分は背圧弁２４の下流側で移動相とともに霧状になって放出される。
【００２６】
検出器２６として質量分析計を使用する場合には、背圧弁２４の下流の移動相の放出口と質量分析計のイオン化室の間に電圧（エレクトロスプレー電圧）を印加することにより、溶出した試料成分がイオン化され、質量分析計により分析される。
【００２７】
検出器２２と２６は、両方を設けてもよいが、用途によっては一方だけでもよい。例えば、分析のみを行う場合にはいずれか一方のみでよい。また例えば分取を行う場合には検出器２２のみを設ける。
【００２８】
第１ポンプ４、第２ポンプ１０及び背圧弁２４の動作を制御するために制御部６０が設けられている。制御部６０は、第１ポンプ４及び第２ポンプ１０を作動状態とするとともに背圧弁２４を加圧状態に維持した超臨界流体クロマトグラフィから、第１ポンプ４を停止させ、第２ポンプ１０を継続して作動させるとともに背圧弁２４を解放状態とした液体クロマトグラフィへと切換えを行うように構成されている。
【００２９】
制御部６０にはデータ処理部６２が接続されている。データ処理部６２は検出器２２、２６による検出信号を取り込み、制御部６０とともにクロマトグラムやマススペクトログラムを作成する。制御部６０にはさらに分析条件などを入力するキーボードなどの操作部６４と、分析結果のクロマトグラムやマススペクトログラムを表示する液晶ディスプレイなどの表示部６６が接続されている。
【００３０】
制御部６０の一例は、時間に対して第１ポンプ４、第２ポンプ１０及び背圧弁２４の作動条件を設定した分析プログラムを格納した分析プログラム格納部６８を備えており、超臨界流体クロマトグラフィから液体クロマトグラフィへの切換えをその分析プログラムに基づいて実行するように構成されたものである。
【００３１】
制御部６０とデータ処理部６２はコンピュータであり、この超臨界流体−液体クロマトグラフの専用のコンピュータであってもよく、汎用のパーソナルコンピュータであってもよい。制御部６０とデータ処理部６２は共通のコンピュータにより実現してもよく、別々のコンピュータにより実現してもよい。
【００３２】
背圧弁２４の一例を図２（Ａ）から（Ｄ）に示す。ただし、背圧弁２４は図２に示すものに限定されるものではなく、分析流路１６内を一定圧力に保つことができ、かつその加圧状態と解放状態との間で切り換えることができるものであれば他の構造のものであってもよい。
【００３３】
図２に示される背圧弁２４では、圧力制御ブロック３０の互いに対向する側面に配管を接続するための配管接続部３１及び３２が設けられている。両配管接続部３１と３２は圧力制御ブロック３０内に設けられた１本の内部流路４０によって互いに接続されている。圧力制御ブロック３０の材質は耐薬品性及び耐圧力性に優れた材料、例えばステンレス（ＳＵＳ３１６）である。内部流路４０の内径は例えば０．１〜０．３ｍｍ程度である。
【００３４】
配管接続部３１には分析流路１６の一部をなす配管３３が挿入されメイルナット３４によって固定されており、配管接続部３２には配管３６が挿入されメイルナット３８によって固定されている。配管３３は圧力制御室をなす内部流路４０への入口流路であり、配管３６は出口流路である。移動相は配管３３から内部流路４０に入り、配管３６から外部へ排出される。
【００３５】
圧力制御ブロック３０には内部流路４０上の位置に、内部流路４０が延びる方向に対して垂直な方向に掘り込まれた掘込穴４６が設けられている。掘込穴４６の底面は内部流路４０近傍に達している。掘込穴４６の底面４７（凹部形成面）に凹部４２が形成されている。凹部４２はその開口４８から底部に向かって収束する円錐形状に形成されている。凹部４２は内部流路４０を横切って内部流路４０を２本の流路に分断しており、図２（Ｄ）に示されているように、凹部４２内を開口部４８上から見ると、凹部４２によって切り取られた流路４０の２つの端部４０ａが凹部４２の内側に見える。なお、凹部４２の形状は円錐形状に限定されるものではなく、底部に向かって収束する形状であればよい。
【００３６】
掘込穴４６の底部に弁体部材４４が配置されている。弁体部材４４は平面形状が掘込穴４６の平面形状とほぼ同じ大きさの円形である封止部４４ａと、その封止部４４ａの一平面の中央部から突起して凹部４２と嵌合する形状の突起部４４ｂとを備えている。ここで、弁体部材４４の突起部４４ｂ側の面を前面、それとは反対側の面を背面とする。弁体部材４４は前面が凹部４２側を向き、突起部４４ｂが凹部４２に嵌め込まれている。封止部４４ａの突起部４４ａの周囲の面は掘込穴４６の底面４７に密着し、開口部４８を封止している。
【００３７】
圧力制御ブロック３０には、弁体部材４４を掘込穴４６の底面４７に押し付ける押付部材５０がネジ５２により装着されている。押付部材５０は、平面形状が掘込穴４６よりも大きい円形のフランジ部５０ａと、フランジ部５０ａの一平面の中央部から突起して掘込穴４６と嵌合する円柱形状の先端部５０ｂを備えている。先端部５０ｂは掘込穴４６内に挿入され、フランジ部５０ａの周縁部はネジ５２によって圧力制御ブロック３０に固定されている。先端部５０ｂの先端面は弁体部材４４の背面に接し、ネジ５２の締結具合によって弁体部材４４を掘込穴４６の底面４７側へ押し付ける力が調節される。
【００３８】
押付部材５０の中央部にフランジ部５０ａ及び先端部５０ｂを貫通する貫通孔５１が設けられている。貫通孔５１の内側を円柱形状の押圧棒５４が貫通し、押圧棒５４の先端が弁体部材４４の背面中央部に接している。押圧棒５４は例えばピエゾアクチュエータなどのアクチュエータ５６によって一方向（図において上下方向）に駆動される。押圧棒５４がアクチュエータ５６によって駆動されることで、押圧棒５４の先端面が弁体部材４４を押圧して弁体部材４４を変形させ、それによって突起部４４ｂが凹部４２内で変位する。凹部４２内において突起部４４ｂが変位することで、凹部４２と突起部４４ｂとの間の隙間の大きさが調節され、それによって内部流路４０の一端から他端へと通じる開口面積の大きさが調節される。
【００３９】
図２に示される背圧弁２４は、超臨界流体クロマトグラフィ分析を実行するときはアクチュエータ５６によって押圧棒５４を押して凹部４２と突起部４４ｂとの間の隙間の大きさを所定の圧力がかかるように調節して移動相を超臨界流体状態にし、超臨界流体クロマトグラフィから液体クロマトグラフィに切り換えるときは、アクチュエータ５６による押圧棒５４の押圧を解除することにより内部流路４０の一端から他端へと通じる開口面積を広げて背圧弁２４を大気圧に解放する。
【００４０】
次にこの実施例の装置を用いた超臨界流体クロマトグラフィ−液体クロマトグラフィ分析の一実施例を図３と図４を参照して説明する。
【００４１】
（１）超臨界流体クロマトグラフィから分析を開始する。そのため、第２溶媒送液部のポンプ１０を停止させた状態で第１溶媒送液部のポンプ４を作動させ、移動相としては液体二酸化炭素のみを供給し、試料注入部１８から試料を注入する。背圧弁２４には例えば１５ＭＰａがかかるように背圧弁２４を設定しておく。
【００４２】
（２）分析開始から第２溶媒送液部のポンプ１０の作動を開始し、モディファイアとして例えばメタノールを供給する。液体二酸化炭素とメタノールとの比率は、液体二酸化炭素とメタノールの合計流量を所定の一定流量に保ちながら図３に示されるようにメタノールの割合が徐々に増加するようにポンプ４と１０の動作を制御する。メタノールとの比率は、分析開始から設定時間（例えば１０分）後に例えば５０％となるように制御する。このとき、移動相は液体二酸化炭素中のメタノールの割合が増加するにつれて粘性が増加するため、分離カラム２０における圧力が上昇していく。
【００４３】
（３）その設定時間後、第１溶媒送液部のポンプ４を停止させ第２溶媒送液部のポンプ１０によりメタノールの流量を所定の一定流量にするとともに、背圧弁２４の圧力設定を解除して大気圧に解放する。
【００４４】
その後は、メタノールを移動相とする液体クロマトグラフィ分析を所定の時間（例えば２０分間）まで続ける。
【００４５】
以上の動作は制御部６０の分析プログラム格納部６８に格納された分析プログラムに基づいて制御部６０が実行する。
【００４６】
以上の実施例では、超臨界流体クロマトグラフィにおいてモディファイアであるメタノールの割合を時間に対して徐々に増加させるグラジエント分析を行っているが、モディファイアの割合は階段状に増加するように設定したり、常に一定割合になるように設定してもよい。
【００４７】
また、以上の実施例では、液体クロマトグラフィ分析を均一組成の移動相で行っているが、液体クロマトグラフィをグラジエント分析としてもよい。そのような例を図５に示す。図５において、（Ａ）は高圧グラジエントの場合、（Ｂ）は低圧グラジエントの場合を示している。
【００４８】
図５（Ａ）は高圧グラジエントの場合である。液体クロマトグラフィの移動相を構成する溶媒として、例えばメタノール８Ａと水８Ｂを用意する。メタノール８Ａは超臨界流体クロマトグラフィにおいてはモディファイアとして使用されるものであり、ポンプ１０Ａにより供給し、水８Ｂはポンプ１０Ｂにより供給し、ミキサ１４で混合して移動相とする。メタノール８Ａと水８Ｂの割合はそれぞれのポンプ１０Ａとポンプ１０Ｂの流量により調節する。
【００４９】
図５（Ｂ）は低圧グラジエントの場合の場合である。この場合も、一例として、液体クロマトグラフィの移動相を構成する溶媒として、メタノール８Ａと水８Ｂを用意する。メタノール８Ａと水８Ｂの割合はポンプ１０との間に配置されたそれぞれの開閉バルブの開閉動作により調節する。
【００５０】
この実施例における超臨界流体クロマトグラフィ−液体クロマトグラフィ分析の一実施例は図６に示されるものである。超臨界流体クロマトグラフィ分析の動作は図３、図４に示したものと同じである。
【００５１】
超臨界流体クロマトグラフィ分析に続く液体クロマトグラフィでは、移動相は最初はメタノールが１００％であり、徐々に水の割合が増加するようグラジエントとなる。
【００５２】
この実施例でも動作は制御部６０の分析プログラム格納部６８に格納された分析プログラムに基づいて制御部６０が実行する。
【００５３】
実施例に示した移動相の割合、背圧弁２４による設定圧力、超臨界流体クロマトグラフィから液体クロマトグラフィに切り換える時間などは単なる一例であり、本発明はそれらの例に限定されるものではない。
【００５４】
液体クロマトグラフ用の移動相となる溶媒は、ポンプにより吸引される前に脱気装置を経て溶媒中に気体を除去するのが好ましい。
【符号の説明】
【００５５】
４、１０、１０Ａ、１０Ｂ      ポンプ
１４      ミキサ
１６      分析流路
１８      試料注入部
２０      分離カラム
２４      背圧弁
２２、２６      検出器
６０      制御部
６８      分析プログラム格納部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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