(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療のための組成物であって、前記組成物は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含み、治療を必要とする被験体に、ＰＫＵの少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度、もしくは頻度において減少するか、または発症が遅延されるような有効用量及び投与間隔で投与されることを特徴とし、前記ｍＲＮＡがコドン最適化され、前記ｍＲＮＡがリポソーム内に封入され、前記リポソームが、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１つ以上のカチオン性脂質が、以下のｃＫＫ−Ｅ１２を含む、請求項２に記載の組成物。
【化１０】
0006506749.tif 000015
【請求項４】
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）  ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールまたはＰＥＧ化コレステロールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０〜６０％を構成する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０％、４０％、５０％、または６０％を構成する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ４０：３０：２０：１０である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ４０：３０：２５：５である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ４０：３２：２５：３である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ５０：２５：２０：５である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リポソームが、約１００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡが、約０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の有効用量で投与されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ｍＲＮＡが、約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の有効用量で投与されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、静脈内投与されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、週に１回投与されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、２週間に１回投与されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、月に２回投与されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、月に１回投与されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物の前記投与が、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、及び血清において検出可能なＰＡＨタンパク質の発現をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物の前記投与が、約１００ｎｇ／ｍｇ（前記肝臓中総タンパク質）以上のＰＡＨタンパク質レベルの発現をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物の前記投与が、血清ＰＡＨタンパク質レベルの増加をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物の前記投与が、前記治療前の基準フェニルアラニンレベルと比較して、前記血清中のフェニルアラニンレベルの減少をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物の前記投与が、前記血清中約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下までフェニルアラニンレベルの減少をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物の前記投与が、前記血清中約５００μｍｏｌ／Ｌ以下までフェニルアラニンレベルの減少をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物の前記投与が、前記血清中約１２０μｍｏｌ／Ｌ以下までフェニルアラニンレベルの減少をもたらすことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号７、または配列番号８を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ｍＲＮＡが、配列番号４の５’ＵＴＲ配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５または配列番号６の３’ＵＴＲ配列を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ｍＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ｍＲＮＡが、未修飾である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物であって、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡがコドン最適化され、前記リポソームが、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
【請求項３７】
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記１つ以上のカチオン性脂質が、以下のｃＫＫ−Ｅ１２を含む、請求項３６または３７に記載の組成物。
【化１１】
0006506749.tif 000016
【請求項３９】
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）  ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ４０：３０：２０：１０である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ４０：３０：２５：５である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ４０：３２：２５：３である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ５０：２５：２０：５である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、請求項３６〜４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記リポソームが、約１００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、静脈内投与用に製剤化される、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号７、または配列番号８を含む、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ｍＲＮＡが、配列番号３を含む、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ｍＲＮＡが、配列番号４の５’ＵＴＲ配列を含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ｍＲＮＡが、配列番号５または配列番号６の３’ＵＴＲ配列を含む、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物であって、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡが、配列番号３を含み、
さらに、前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
【請求項５４】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物であって、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡが、配列番号７または配列番号８を含み、
さらに、前記リポソームが、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１３年１０月２２日に出願された米国仮出願第６１／８９４，３０３号に対する優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本明細書は、配列表（「２００６６８５−０６９２＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称の．ｔｘｔファイルとして２０１４年１０月２２日に電子的に提出された）を参照する。．ｔｘｔファイルは、２０１４年１０月２０日に生成され、大きさは１８，４５５バイトである。配列表の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝子においてそれを機能不全にする変異を特徴とする常染色体劣性代謝遺伝障害である。ＰＡＨは、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアミノ酸チロシンに代謝するために必要である。ＰＡＨの活性が減少すると、フェニルアラニンが蓄積し、フェニルピルビン酸塩（フェニルケトンとしても知られる）に変換される。治療されないと、ＰＫＵは、知能障害、痙攣、及び他の重度の医学的問題をもたらす可能性がある。現在、疾患の治療法はなく、標準治療は、食事を管理し、大量のタンパク質を含有する食事を最小限にすることである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、特に、ｍＲＮＡ療法に基づくフェニルケトン尿素（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｅａ）（ＰＫＵ）の効果的な治療のための方法及び組成物を提供する。本発明は、一部、ＰＫＵ疾患モデルを使用した成功した動物試験に基づく。例えば、以下の実施例のセクションでより詳細に記載されるように、リポソーム内に封入されたヒトＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡの投与は、血清、肝臓、及び他の臨床的に意味のある組織においてインビボで効率的なタンパク質産生をもたらした。さらに重要かつ驚いたことに、ＰＡＨ  ｍＲＮＡを用いたＰＫＵ疾患モデルのＰＡＨノックアウトマウスの治療は、投薬の６時間以内にフェニルアラニンのレベルを野生型レベルに効率的に引き下げることができる。よって、本発明の発明者は、本明細書に記載するｍＲＮＡ療法がＰＫＵの治療に非常に有効であり得ることを示した。
【０００５】
一態様では、本発明は、治療を必要とする被験体に、ＰＫＵの少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度、もしくは頻度において減少するか、または発症が遅延されるような有効用量及び投与間隔でフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、ＰＫＵを治療する方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本発明は、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含むフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入される。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、式Ｉ−ｃ１−ａ：
【化１】
0006506749.tif 000002
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ２は、独立して、水素またはＣ１〜３アルキルであり、
各ｑは、独立して、２〜６であり、
各Ｒ’は、独立して、水素またはＣ１〜３アルキルであり、
各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、以下のｃＫＫ−Ｅ１２を含む。
【化２】
0006506749.tif 000003
【００１１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物から選択される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、１つ以上のコレステロール系脂質は、コレステロール、ＰＥＧ化コレステロール、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジンから選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、リポソームは、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］などの誘導体化されたセラミドである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）−ＰＥＧ−２Ｋである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、リポソームは、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、モル比でリポソームの約３０〜６０％（例えば、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％を構成する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、およそ４０：３０：２０：１０である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、およそ４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、およそ４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、およそ５０：２５：２０：５である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ未満の大きさを有する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、または６０ｎｍ未満の大きさを有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、提供される組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、肺動脈送達を介して投与される。ある特定の実施形態では、肺動脈送達は、エアロゾル化、吸入、噴霧、または滴下により行われる。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、呼吸域粒子、噴霧可能脂質、または吸入可能乾燥粉末として製剤化される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、提供される組成物は、１日１回、週に１回、２週間に１回、月に２回、月に１回投与される。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、または３０日に１回投与される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．１〜５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．１〜４．５、０．１〜４．０、０．１〜３．５、０．１〜３．０、０．１〜２．５、０．１〜２．０、０．１〜１．５、０．１〜１．０、０．１〜０．５、０．１〜０．３、０．３〜５．０、０．３〜４．５、０．３〜４．０、０．３〜３．５、０．３〜３．０、０．３〜２．５、０．３〜２．０、０．３〜１．５、０．３〜１．０、０．３〜０．５、０．５〜５．０、０．５〜４．５、０．５〜４．０、０．５〜３．５、０．５〜３．０、０．５〜２．５、０．５〜２．０、０．５〜１．５、または０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）以下の用量で投与される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液において検出可能である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、提供される組成物の投与は、約１００ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇまたは約１４００ｎｇ／ｍｇ（肝臓中総タンパク質）以上のＰＡＨタンパク質レベルの発現をもたらす。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、及び／または７２時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与１日、２日、３日、４日、５日、６日、及び／または７日後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与１週間、２週間、３週間、及び／または４週間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の発現は、投与１ヶ月後に検出可能である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血清ＰＡＨタンパク質レベルが増加する。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療前の基準ＰＡＨタンパク質レベルと比較して、血清ＰＡＨタンパク質レベルが少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療前の基準フェニルアラニンレベルと比較して、血清中のフェニルアラニンレベルが減少する。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血清または血漿中のフェニルアラニンレベルが約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約９００μｍｏｌ／Ｌ以下、約８００μｍｏｌ／Ｌ以下、約７００μｍｏｌ／Ｌ以下、約６００μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約４００μｍｏｌ／Ｌ以下、約３００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下、または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下に減少する。  特定の実施形態では、規則的に投与された場合の治療有効用量は、血清または血漿中のフェニルアラニンレベルを約１２０μｍｏｌ／Ｌ以下に減少させる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療前の基準フェニルアラニンレベルと比較して、生体試料（例えば、血清、血漿、または尿試料）中のフェニルアラニンレベルが少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、コドン最適化ｍＲＮＡは、配列番号３（コドン最適化ヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列に相当する）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号４の５’ＵＴＲ配列（５’ＵＴＲ配列Ｘに相当する）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５の３’ＵＴＲ配列（３’ＵＴＲ配列Ｙに相当する）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号６の３’ＵＴＲ配列（３’ＵＴＲ配列Ｙに相当する）を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化ｍＲＮＡは、配列番号７または配列番号８（５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列を有するコドン最適化ヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列に相当する）を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾ヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、未修飾である。
【００２９】
特定の実施形態では、本発明は、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含むフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物を提供し、ｍＲＮＡは、配列番号３を含み、さらにリポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明は、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含むフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物を提供し、ｍＲＮＡは、配列番号７または配列番号８を含み、さらにリポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００３１】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、及び
特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、発明を実施するための形態、図面
、及び特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すが、単に例示のためであり、制限する
ものではないことを理解するべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、当業
者には明らかとなろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療方法であって、治療を必要とする被験体に、ＰＫＵの少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度、もしくは頻度において減少するか、または発症が遅延されるような有効用量及び投与間隔でフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
（項目２）
前記ｍＲＮＡが、リポソーム内に封入される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記リポソームが、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、以下のｃＫＫ−Ｅ１２を含む、項目４に記載の方法。
【化１０】
0006506749.tif 000004
（項目６）
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）  ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目３〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールまたはＰＥＧ化コレステロールである、項目３〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目３〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０〜６０％を構成する、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記カチオン性脂質が、モル比で前記リポソームの約３０％、４０％、５０％、または６０％を構成する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ４０：３０：２０：１０である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ４０：３０：２５：５である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ４０：３２：２５：３である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール脂質：ＰＥＧ化脂質の比率が、モル比でおよそ５０：２５：２０：５である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記リポソームが、約１００ｎｍ未満の大きさを有する、項目２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ｍＲＮＡが、約０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の有効用量で投与される、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記ｍＲＮＡが、約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の有効用量で投与される、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物が、静脈内投与される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が、週に１回投与される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が、２週間に１回投与される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、月に２回投与される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物が、月に１回投与される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物の前記投与が、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、及び血清において検出可能なＰＡＨタンパク質の発現をもたらす、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記組成物の前記投与が、約１００ｎｇ／ｍｇ（前記肝臓中総タンパク質）以上のＰＡＨタンパク質レベルの発現をもたらす、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記組成物の前記投与が、血清ＰＡＨタンパク質レベルの増加をもたらす、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記組成物の前記投与が、前記治療前の基準フェニルアラニンレベルと比較して、前記血清中のフェニルアラニンレベルの減少をもたらす、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物の前記投与が、前記血清中約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下までフェニルアラニンレベルの減少をもたらす、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記組成物の前記投与が、前記血清中約５００μｍｏｌ／Ｌ以下までフェニルアラニンレベルの減少をもたらす、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記組成物の前記投与が、前記血清中約１２０μｍｏｌ／Ｌ以下までフェニルアラニンレベルの減少をもたらす、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記ｍＲＮＡがコドン最適化される、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号７、または配列番号８を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記コドン最適化ｍＲＮＡが、配列番号３を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記ｍＲＮＡが、配列番号４の５’ＵＴＲ配列を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記ｍＲＮＡが、配列番号５または配列番号６の３’ＵＴＲ配列を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記ｍＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記１つ以上の修飾ヌクレオチドが、プソイドウリジン、Ｎ−１−メチル−プソイドウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び／または２−チオシチジンを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ｍＲＮＡが、未修飾である、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物であって、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含む、前記組成物。
（項目４０）
前記リポソームが、１つ以上のカチオン性脂質、１つ以上の非カチオン性脂質、１つ以上のコレステロール系脂質、及び１つ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、及びＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記１つ以上のカチオン性脂質が、以下のｃＫＫ−Ｅ１２を含む、項目４０または４１に記載の組成物。
【化１１】
0006506749.tif 000005
（項目４３）
前記１つ以上の非カチオン性脂質が、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）  ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、及びＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））から選択される、項目３９〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４４）
前記１つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールである、項目３９〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
前記１つ以上のＰＥＧ修飾脂質が、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合される、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、項目３９〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ４０：３０：２０：１０である、項目３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ４０：３０：２５：５である、項目３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ４０：３２：２５：３である、項目３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ修飾脂質の比率が、およそ５０：２５：２０：５である、項目３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記リポソームが、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを含む、項目３９〜４９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５１）
前記リポソームが、約１００ｎｍ未満の大きさを有する、項目３９〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５２）
前記組成物が、静脈内投与用に製剤化される、項目３９〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５３）
前記ｍＲＮＡが、配列番号３、配列番号７、または配列番号８を含む、項目３９〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５４）
前記ｍＲＮＡが、配列番号３を含む、項目３９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記ｍＲＮＡが、配列番号４の５’ＵＴＲ配列を含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５６）
前記ｍＲＮＡが、配列番号５または配列番号６の３’ＵＴＲ配列を含む、項目５４に記載の組成物。
（項目５７）
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物であって、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡが、配列番号３を含み、
さらに、前記リポソームが、カチオン性または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
（項目５８）
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための組成物であって、リポソーム内に封入された有効用量のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡが、配列番号７または配列番号８を含み、
さらに、前記リポソームが、カチオン性または非カチオン性脂質、コレステロール系脂質、及びＰＥＧ修飾脂質を含む、前記組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
図面は、単に例示の目的であり、制限するためではない。
【００３３】
【図１】提供されるリポソームによるトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞における例示的なＰＡＨタンパク質レベルを示す。
【図２】投与後の様々な時間点での、提供された脂質ナノ粒子で処置された野生型マウスの肝臓において検出されたＰＡＨタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【図３】未処置野生型マウス及び未処置ＰＡＨ  ＫＯマウスと比較した、投与６、１２、及び２４時間後の、提供された脂質ナノ粒子で処置されたＰＡＨ  ＫＯマウスの肝臓において検出されたＰＡＨタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【図４】未処置野生型マウス及び未処置ＰＡＨ  ＫＯマウスと比較した、提供された脂質ナノ粒子で処置された６、１２、及び２４時間後のＰＡＨ  ＫＯマウスにおける血清フェニルアラニンレベルの例示的なグラフを示す。
【図５Ａ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｂ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｃ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｄ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｅ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｆ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｇ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｈ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図５Ｉ】１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で処置した（Ａ）３０分、（Ｂ）３時間、（Ｃ）６時間、（Ｄ）１２時間、（Ｅ）２４時間、（Ｆ）４８時間、（Ｇ）７２時間、または（Ｈ）７日後のマウス、または未処置マウス（Ｉ）からの肝臓組織におけるヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡのその場検出を示す。
【図６】０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、または１．０ｍｇ／ｋｇの単回投与のｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子、または生理食塩水で処置されたＰＡＨノックアウトマウスの肝臓において検出されたヒトＰＡＨタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【図７】０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、または１．０ｍｇ／ｋｇの単回投与のｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で、または生理食塩水で処置される前、及び処置された後のＰＡＨノックアウトマウスの血清において検出されたフェニルアラニンレベルの例示的なグラフを示す。
【図８】１ヶ月間、週に１回、０．５ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で、または１ヶ月間、隔週で、１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で、あるいは生理食塩水で処置されたＰＡＨノックアウトマウスの肝臓において検出されたヒトＰＡＨタンパク質レベルの例示的なグラフを示す。
【図９】１ヶ月間、週に１回、０．５ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で、または１ヶ月間、隔週で、１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子で、あるいは生理食塩水で処置される前、及び処置された後のＰＡＨノックアウトマウスの血清において検出されたフェニルアラニンレベルの例示的なグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本発明をより容易に理解するために、ある特定の用語を以下に最初に定義する。以下の用語及び他の用語のさらなる定義は、本明細書全体を通して記載される。本発明の背景を説明し、その実践に関するさらなる詳細を提供するための本明細書に言及される刊行物及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
アルキル：本明細書で使用される、「アルキル」は、１〜１５個の炭素原子を有する直鎖または分枝状飽和炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ１〜１５アルキル」）。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を有する  （「Ｃ１〜３アルキル」）。Ｃ１〜３アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、ｎ−プロピル（Ｃ３）、及びイソプロピル（Ｃ３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アルキル基は、８〜１２個の炭素原子を有する（「Ｃ８〜１２アルキル」）。Ｃ８〜１２アルキル基の例としては、ｎ−オクチル（Ｃ８）、ｎ−ノニル（Ｃ９）、ｎ−デシル（Ｃ１０）、ｎ−ウンデシル（Ｃ１１）、ｎ−ドデシル（Ｃ１２）などが挙げられるが、これらに限定されない。接頭辞「ｎ−」（ノルマル）は、非分枝状アルキル基を指す。例えば、ｎ−Ｃ８アルキルは、−（ＣＨ２）７ＣＨ３を指し、ｎ−Ｃ１０アルキルは、−（ＣＨ２）９ＣＨ３等を指す。
【００３６】
アミノ酸：本明細書で使用される、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得るいずれの化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準的なアミノ酸」は、天然に存在するペプチドに通常見られる２０個の標準的なｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準的なアミノ酸」は、それが合成により、または自然源から得られるか否かに関わらず、標準的なアミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。本明細書で使用される、「合成アミノ酸」は、これらに限定されないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／または置換を含む化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチドにおけるカルボキシ及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／またはその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変更することができる他の化学基との置換により修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関わる場合がある。アミノ酸は、１つ以上の化学成分（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）との結合など、１つまたは翻訳後の修飾を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指す場合がある。これは、遊離アミノ酸またはペプチドの残基を指すか否かに関わらず、用語が使用される文脈から明らかであろう。
【００３７】
動物：本明細書で使用される、用語「動物」は、動物界のいずれのメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達のいずれかの段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達のいずれかの段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／または蠕虫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。  
【００３８】
およそまたは約：本明細書で使用される、用語「およそ」または「約」は、関心の１つ以上の値に適用される場合、記述される参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特に記述されない限り、ないしは特に文脈から明らかでない限り、記述される参照値のいずれかの方向（〜を超えるまたは〜未満）の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下に入る値の範囲を指す（そのような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００３９】
生体活性：本明細書で使用される、句「生体活性」は、生体系、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対して生体作用を有する作用物質は、生体活性と考えられる。
【００４０】
送達：本明細書で使用される、用語「送達」は、局所及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が発現し、標的組織内で保持される（「局所分布」または「局所送達」とも称される）状態、及びｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が発現し、患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、系統的に分布し、他の組織によって取り込まれる（「全身分布」または「全身送達」とも称される）状態を包含する。
【００４１】
発現：本明細書で使用される、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、複数のポリペプチドの無傷タンパク質（例えば、酵素）への組み立て、及び／またはポリペプチドもしくは完全に組み立てられたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾を指す。この用途において、用語「発現」及び「産生」ならびに文法的等価物は、互換的に使用される。
【００４２】
機能：本明細書で使用される、「機能」生体分子は、それが特徴付けられる特性及び／または活性を呈する形態の生体分子である。
【００４３】
半減期：本明細書で使用される、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質濃度または活性などの量が時間期間の開始時において測定されるその値の半分に下がるのに必要とされる時間である。
【００４４】
改善する、増加する、または減少する：本明細書で使用される、用語「改善する」、「増加する」、もしくは「減少する」、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体の測定値、または本明細書に記載される治療の不在下の対照被験体（または複数の対照被験体）の測定値など、基準測定値に対する値を示す。「対照被験体」は、治療される被験体とほぼ同じ年齢の治療される被験体と同じ形態の疾患に罹患する被験体である。
【００４５】
インビトロ：本明細書で使用される、用語「インビトロ」は、多細胞生物内ではなく、人工的環境、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中等で生じる事象を指す。
【００４６】
インビボ：本明細書で使用される、用語「インビボ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞系の文脈において、本用語は、生細胞（例えば、インビトロ系ではなく）内で生じる事象を指すように使用され得る。
【００４７】
単離された：本明細書で使用される、用語「単離された」は、（１）最初に産生された（自然界及び／または実験的環境かに関わらず）ときに結合する構成成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって産生、調製、及び／もしくは製造された物質ならびに／または成分を指す。単離された物質及び／または成分は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の、それらが最初に結合した他の構成成分から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される、単離された物質及び／または成分のパーセント純度の計算は、賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水等）を含むべきではない。
【００４８】
局所分布または送達：本明細書で使用される、用語「局所分布」、「局所送達」、または文法的等価物は、組織特異的送達または分布を指す。典型的には、局所分布または送達は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質（例えば、酵素）が細胞内でまたは患者の循環系に入るのを避ける制限された分泌で翻訳され、発現されることを必要とする。
【００４９】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾及び未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、自然源から精製され得る、組換え発現系を用いて産生され、任意に精製され得る、化学合成され得る等である。適切な場合、例えば、化学合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、特に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生体修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；層間塩基；修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト連結）であるか、またはこれらを含む。
【００５０】
核酸：本明細書で使用される、用語「核酸」は、その最も広い意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル連結を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる化合物及び／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに１本鎖及び／もしくは２本鎖ＤＮＡならびに／またはｃＤＮＡを包含する。
【００５１】
患者：本明細書で使用される、用語「患者」または「被験体」は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的のために投与され得るあらゆる生物を指す。典型的な患者は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）を含む。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。
【００５２】
薬学的に許容される：本明細書で使用される、用語「薬学的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なく、ヒト及び動物の組織との接触に使用するのに適し、妥当な利益／リスク比に相応する物質を指す。
【００５３】
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１−１９に詳細に薬学的に許容される塩を記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、好適な無機及び有機酸ならびに塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される非毒性の酸添加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、またはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を使用することにより形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、及びＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩を含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらなる薬学的に許容される塩は、適切な場合、非毒性アンモニウム、４級アンモニウム、ならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成されたアミンカチオンを含む。さらなる薬学的に許容される塩は、４級化アルキル化アミノ塩を形成するために、適切な求電子物質、例えば、アルキルハロゲン化物を使用するアミンの４級化から形成された塩を含む。
【００５４】
全身分布または送達：本明細書で使用される、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物全体に影響を及ぼす送達もしくは分布メカニズムまたはアプローチを指す。典型的には、全身分布または送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して達成される。「局所分布または送達」の定義と比較。
【００５５】
被験体：本明細書で使用される、用語「被験体」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態では、被験体はヒトである。被験体は、患者であってよく、これは、疾患の診断または治療のために医療提供者に提示されるヒトを指す。用語「試験体」は、本明細書において「個体」または「患者」と互換的に使用される。被験体は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性であるが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００５６】
実質的に：本明細書で使用される、用語「実質的に」は、関心の特徴または特性の完全もしくはほぼ完全な範囲または程度を示す質的状態を指す。生物分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、あるとしても、完結する、及び／もしくは完結に進む、または絶対的な結果を達成する、または回避することはほとんどないことを理解する。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完結の欠如を捕捉するために使用される。
【００５７】
標的組織：本明細書で使用される、用語「標的組織」は、治療される疾患の影響を受ける任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、疾患関連病態、症状、または特徴を表すそれらの組織を含む。
【００５８】
治療有効量：本明細書で使用される、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは状態に罹患する、またはそれに感受性である被験体に投与される場合、疾患、障害、及び／または状態の症状（複数可）を治療する、診断する、防止する、及び／またはその開始を遅延するのに十分である量を意味する。当業者は、治療有効量が典型的には少なくとも１つの単位用量を含む投薬レジメンを介して投与されることを理解するだろう。
【００５９】
治療：本明細書で使用される、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、特定の疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に軽減する、寛解する、緩和する、阻害する、防止する、その開始を遅延する、その重篤度を減少させる、及び／またはその発症を減少させるために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病態を発達させるリスクを減少させる目的のために、疾患の兆候を呈さない、及び／または疾患の初期の兆候のみを呈する被験体に投与される場合がある。
【００６０】
本発明は、特に、ｍＲＮＡ療法に基づくフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するための方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、治療を必要とする被験体に、ＰＫＵの少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度、もしくは頻度において減少するか、または発症が遅延されるような有効用量及び投与間隔でフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡを含む組成物を投与することによりＰＫＵを治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入される。本明細書で使用される、用語「リポソーム」は、任意の層状、多層状、または固形脂質ナノ粒子小胞を指す。典型的には、本明細書において使用されるリポソームは、１つ以上の脂質を混合することにより、または１つ以上の脂質とポリマー（複数可）とを混合することにより形成され得る。よって、本明細書において使用される用語「リポソーム」は、脂質及びポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なリポソームは、カチオン性または非カチオン性脂質（複数可）、コレステロール系脂質（複数可）、及びＰＥＧ修飾脂質（複数可）を含む。
【００６１】
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）
本発明は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患する、またはそれに感受性である被験体を治療するために使用され得る。ＰＫＵは、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝子においてそれを機能不全にする変異を特徴とする常染色体劣性代謝遺伝障害である。ＰＡＨは、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアミノ酸チロシンに代謝するために必要である。ＰＡＨ活性が減少すると、フェニルアラニンが蓄積し、尿において検出され得るフェニルピルビン酸塩（フェニルケトンとしても知られる）に変換される。
【００６２】
フェニルアラニンは、大きい中性のアミノ酸（ＬＮＡＡ）である。ＬＮＡＡは、大型中性アミノ酸輸送体（ＬＮＡＡＴ）を介して血液脳関門（ＢＢＢ）にわたって輸送を競合する。血液中の過剰なＰｈｅは、輸送体を飽和し、脳中の他のＬＮＡＡのレベルを減少させる傾向がある。これらの他のアミノ酸のいくつかはタンパク質及び神経伝達物質合成に必要であるため、Ｐｈｅの蓄積は、脳の発達を妨害し、知能障害を引き起こす可能性がある。
【００６３】
脳発達の妨害に加えて、本疾患は、臨床的に、痙攣、白化症機能亢進（ａｌｂｉｎｉｓｍ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ）、発育不全、皮膚発疹（湿疹）、小頭症、及び／またはケトンが産生するものの１つである）フェニルアセテートによる乳児の汗及び尿に対する「カビ」臭を含む様々な症状を提示する。未治療の小児は、典型的には、出生時には正常であるが、知的及び社会的技能が遅れ、頭部の大きさが正常を著しく下回り、また多くの場合、脳機能の進行性障害を示す。小児が成長し、発達するにつれて、機能亢進、腕または脚の痙動、ＥＥＧ異常、皮膚発疹、振戦、痙攣、及び重度の学習障害を含むさらなる症状が発達する傾向にある。しかしながら、ＰＫＵは、典型的には出生後２〜７日後に行われる大半の国の日常的な新生児スクリーニングパネルに通常含まれる。
【００６４】
ＰＫＵが十分に早期に診断される場合、影響を受けた新生児は、比較的正常な脳発達を伴って成長することができるが、食事、または食事と薬物治療との組み合わせを通してＰｈｅレベルを管理し、制御することによってのみ可能である。全てのＰＫＵ患者は、最適な脳発達のために、Ｐｈｅが低い特別な食事を遵守しなければならない。食事は、肉、鶏、魚、卵、ナッツ類、チーズ、豆類、牛乳、及び他の乳製品などのＰｈｅが高い食品を厳しく制限または排除することが要求される。ジャガイモ、パン、パスタ、及びトウモロコシなどのデンプン質食品は、監視されなければならない。幼児はまだ母乳の全ての利益を提供するために授乳されてよいが、その量も監視されなければならず、欠落する栄養素の補充を必要とする。アスパルテームはフェニルアラニンを含むため、多くの食品及び清涼飲料に含まれる甘味料のアスパルテームも避けなければならない。
【００６５】
一生を通して、患者は、低フェニルアラニンの食事においてさもなければ不十分であろうアミノ酸及び他の必要な栄養素を摂取するために、補助的な乳児用調製粉乳、ピル、または特別に調製された食品を使用することができる。一部のＰｈｅは、多くのタンパク質の合成に必要であり、適切な成長に必要であるが、そのレベルはＰＫＵ患者において厳しく制御されなければならない。加えて、ＰＫＵ患者は、通常フェニルアラニンに由来するチロシンのサプリメントを摂取しなければならない。他のサプリメントは、標準的なＰｈｅを含まない食事に欠落する長鎖脂肪酸に取って代わり、神経発達を改善する魚油、及び鉄またはカルニチンを含み得る。ＰＫＵの別の潜在的な療法は、特定の患者のＰｈｅの血液レベルを減少させることができるＰｈｅの酸化のための補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）である。ＢＨ４療法に応答する患者は、摂ることができる天然のタンパク質の量を増加することもできる。
【００６６】
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）
いくつかの実施形態では、本発明は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療のために、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡを被験体に送達するための方法及び組成物を提供する。好適なＰＡＨ  ｍＲＮＡは、天然に存在するＰＡＨタンパク質の活性を置換する、かつ／またはＰＫＵに関連する１つ以上の症状の強度、重篤度、及び／もしくは頻度を減少させることができるＰＡＨタンパク質の任意の完全長、断片、または一部分をコードする。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明の好適なｍＲＮＡ配列は、ヒトＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む。天然に存在するヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡ及び対応するアミノ酸配列は、表１に示される。
【表１−１】
0006506749.tif 000006
【表１−２】
0006506749.tif 000007
【００６８】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、野生型ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、以下に示される配列などのコドン最適化ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ配列であってよい。
【化３】
0006506749.tif 000008
【００６９】
さらなる例示的なｍＲＮＡ配列は、配列番号７及び配列番号８など、実施例のセクションに記載され、その両方は、コドン最適化ｍＲＮＡ配列をフレームする５’及び３’非翻訳領域を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、ヒトＰＡＨの相同体または類似体をコードするｍＲＮＡ配列であってよい。本明細書で使用される、ヒトＰＡＨタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＰＡＨタンパク質活性を維持するが、野生型または天然に存在するヒトＰＡＨタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含む修飾されたヒトＰＡＨタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＰＡＨタンパク質に実質的に同一なタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＰＡＨタンパク質の断片または一部分をコードする。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＰＡＨタンパク質の断片または一部分をコードし、タンパク質の断片または一部分は尚も、野生型タンパク質に類似するＰＡＨ活性を保持する。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号１、配列番号３、配列番号７、または配列番号８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合した（例えば、ＮまたはＣ末端融合）ＰＡＨタンパク質の完全長、断片、または一部分を含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質の完全長、断片、または一部分をコードするｍＲＮＡに融合されたタンパク質は、シグナルまたは細胞標的配列をコードする。
【００７２】
送達ビヒクル
本発明によると、本明細書に記載されるＰＡＨタンパク質（例えば、ＰＡＨタンパク質の完全長、断片、または一部分）をコードするｍＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡ（パッケージされない）として、または送達ビヒクルを介して送達され得る。本明細書で使用される、用語「送達ビヒクル」、「伝達ビヒクル」、「ナノ粒子」、または文法的等価物は、互換的に使用される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡは、単一の送達ビヒクルを介して送達され得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡは、各々が異なる組成の１つ以上の送達ビヒクルを介して送達され得る。様々な実施形態によると、好適な送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子、及びリポソームなどのポリマー系担体、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成由来両方のエキソソーム、天然、合成、及び半合成層状体、ナノ微粒子、カルシウムリン−ケイ酸塩ナノ微粒子、リン酸カルシウムナノ微粒子、二酸化ケイ素ナノ微粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ微粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプン系送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の方向性タグを含むが、これらに限定されない。
【００７４】
リポソーム送達ビヒクル
いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、リポソーム送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される、リポソーム送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子は、通常、１つ以上の２層の膜によって外側培地から隔離された内部水空間を有する微細小胞として特徴付けられる。リポソームの２層膜は、典型的には、空間的に離れた親水性及び疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの２層膜は、両染性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソーム等）によっても形成され得る。本発明の文脈では、リポソーム送達ビヒクルは、典型的には、所望のｍＲＮＡを標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。所望のｍＲＮＡをリポソーム内に組み込むプロセスは、多くの場合、「装填」と称される。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム組み込み核酸は、完全に、または部分的にリポソームの内部空間、リポソームの２層膜内に位置するか、またはリポソーム膜の外表面と結合し得る。核酸のリポソーム内への組み込みは、本明細書において、「封入」とも称され、核酸がリポソームの内部空間内に完全に格納される。ｍＲＮＡをリポソームなどの伝達ビヒクル内に組み込む目的は、多くの場合、核酸の迅速な排出をもたらす、核酸及び／もしくは系または受容体を分解する酵素または化学物質を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるｍＲＮＡの安定性を強化することができ、かつ／またはｍＲＮＡの標的細胞もしくは組織への送達を容易にする。
【００７５】
カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質を含み得る。本明細書で使用される、句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法に使用するのに特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号（具体的には、段落［００２２５］に記載されるＣＩ  ２−２００）及び同第ＷＯ２０１２／１７０９３０号に記載されているものを含み、その両方は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）など、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を採用する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、提供されるリポソームは、第ＷＯ２０１３０６３４６８号及び「Ｌｉｐｉｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｅｒｎｇｅｒ  ＲＮＡ」と題される、同日付けで本願と同時に出願された米国仮出願に記載されるカチオン性脂質を含み、その両方は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ−ｃ１−ａ：
【化４】
0006506749.tif 000009
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ２は、独立して、水素またはＣ１〜３アルキルであり、
各ｑは、独立して、２〜６であり、
各Ｒ’は、独立して、水素またはＣ１〜３アルキルであり、
各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、独立して、水素、メチル、またはエチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、水素である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、各ｑは、独立して、３〜６である。いくつかの実施形態では、各ｑは、独立して、３〜５である。いくつかの実施形態では、各ｑは、４である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素、メチル、またはエチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ１０アルキルである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、独立して、水素またはメチルであり、各ｑは、独立して、３〜５であり、各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルであり、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、水素であり、各ｑは、独立して、３〜５であり、各Ｒ’は、水素であり、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、水素であり、各ｑは、４であり、各Ｒ’は、水素であり、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ−ｇ：
【化５】
0006506749.tif 000010
の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各ＲＬは、独立して、Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ８〜１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ−Ｃ９〜１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、ｎ−Ｃ１０アルキルである。
【００８５】
特定の実施形態では、提供されるリポソームは、カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２または（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）を含む。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造は、下に示される。
【化６】
0006506749.tif 000011
【００８６】
以下の実施例のセクションに記載されるように、本発明の発明者は、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するもの（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）など、特定のクラスのカチオン性脂質に基づくリポソームが、予想外にも、インビボでのｍＲＮＡの送達、及びコードされたタンパク質の産生に有効であることを観察した。ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡは本出願において例として使用されるが、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するこのクラスのカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は高効率及び持続的なインビボでのタンパク質（例えば治療用タンパク質）の産生のための任意のｍＲＮＡの送達に有用であり得ることが想定される。例えば、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、１つ以上の天然に存在するペプチドまたは１つ以上の修飾されたもしくは非天然のペプチドをコードするｍＲＮＡを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、これらに限定されないが、細胞質タンパク質（例えば、シャペロンタンパク質、細胞内酵素（例えば、尿素回路またはリソソーム蓄積障害に関連する酵素をコードするｍＲＮＡ））、アクチン細胞骨格に関連するタンパク質、形質膜に関連するタンパク質、核周囲タンパク質、核タンパク質（例えば、転写因子）、及び細胞代謝、ＤＮＡ修復、転写及び／または翻訳）に関与する任意の他のタンパク質を含む、細胞内タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、イオンチャネルタンパク質などの膜貫通型タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される式Ｉ−ｃ１−ａまたは式Ｉ−ｇの構造を有するカチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、これらに限定されないが、細胞外マトリックスに関連するタンパク質、分泌されたタンパク質（例えば、ホルモン及び／または神経伝達物質）を含む細胞外タンパク質をコードするｍＲＮＡを送達するために使用され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明に好適な１つ以上のカチオン性脂質は、Ｎ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＴＭＡ」であってよい。（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化されるか、または中性脂肪、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンもしくは「ＤＯＰＥ」、または他のカチオン性もしくは非カチオン性脂質と共にリポソーム伝達ビヒクルもしくは脂質ナノ粒子内にまとめることができ、そのようなリポソームは、核酸の標的細胞内への送達を強化するために使用され得る。他の好適なカチオン性脂質は、例えば、５−カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）もしくは「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウム、もしくは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンもしくは「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンもしくは「ＤＯＴＡＰ」を含む。
【００８８】
さらなる例示的なカチオン性脂質は、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンもしくは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドもしくは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドもしくは「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−β−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンもしくは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−［５’−（コレスト−５−エン−３−β−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンもしくは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンもしくは「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンもしくは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノレオイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンもしくは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−−ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソランもしくは「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照）、またはこれらの混合物も含む。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザへキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（第ＷＯ２０１２／１７０８８９号、その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＩＣＥ（第ＷＯ２０１１／０６８８１０号、その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、第ＷＯ２０１０／０５３５７２号に開示されるものなどのアミノアルコール脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．「Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．「Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）から選択され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の百分率は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であってよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（複数可）は、リポソームの約３０〜５０重量％（例えば、約３０〜４５重量％、約３０〜４０重量％、約３５〜５０重量％、約３５〜４５重量％、または約３５〜４０重量％）を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。
【００９１】
非カチオン性／ヘルパー脂質
いくつかの実施形態では、提供されたリポソームは、１つ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含む。本明細書で使用される、句「非カチオン性脂質」は、任意の中性、双極性イオン、またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される、句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたＨで正味の負電荷を保有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
いくつかの実施形態では、そのような非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソームに存在する総脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜約７０％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化及び／または投与される条件下で正味の電荷を保有しない脂質である。いくつかの実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の百分率は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であってよい。
【００９３】
コレステロール系脂質
いくつかの実施形態では、提供されるリポソームは、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥを含む。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソームに存在する総脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％のモル比を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の百分率は、５、％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であってよい。
【００９４】
ＰＥＧ化脂質
いくつかの実施形態では、提供されるリポソームは、１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、カチオン性脂質のうちの１つ以上、及びいくつかの実施形態では、リポソームを含む他の脂質と一緒に組み合わせた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、及びＮ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含む誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化された脂質の使用も、本発明により想定される。想定されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６〜Ｃ２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合された長さが最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。そのような構成成分の付加は、複合体の凝集を阻止することができ、また循環寿命を増加し、脂質−核酸組成物の標的細胞への送達を増加させるための手段も提供するか（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）、またはそれらは、インビボで製剤の外に迅速に交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照）。
【００９５】
いくつかの実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化された脂質は、リポソームに存在する総脂質の約０％〜約１５％、約０．５％〜約１５％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル比を含み得る。
【００９６】
ポリマー
いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、単独で、または本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて、担体としてポリマーを使用して製剤化される。よって、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される、リポソーム送達ビヒクルは、ナノ粒子を含むポリマーも包含する。好適なポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み得る。ＰＥＩが存在する場合、１０〜４０ｋＤＡの範囲の分子量の分枝状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  ＃４０８７２７）であり得る。
【００９７】
様々な実施形態によると、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び／または脂質ナノ粒子を含むポリマー、ならびに互いに対するそのような脂質の相対モル比の選択は、選択された脂質（複数可）／ポリマーの特徴、意図する標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特徴に基づく。考慮すべき追加事項は、例えば、選択された脂質（複数可）のアルキル鎖の飽和、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性を含む。よって、モル比は、それに応じて調節され得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、及び／またはＰＥＧ修飾脂質は、様々な相対モル比で組み合わせることができる。例えば、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００等）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ等）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００等）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ等）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、およそ４０：３０：２０：１０である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００等）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ等）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、およそ４０：３０：２５：５である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００等）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ等）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、それぞれ、およそ４０：３２：２５：３である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００等）：非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥ等）：コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）：ＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ）の比率は、およそ５０：２５：２０：５である。
【００９９】
ｍＲＮＡの合成
本発明によるｍＲＮＡは、様々な既知の方法のいずれかにより合成することができる。例えば、本発明によるｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。簡潔に、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、３リン酸化リボヌクレオチドのプールを含む線状または環状ＤＮＡテンプレート、ＤＴＴ及びマグネシウムイオンを含み得る緩衝液系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ  Ｉ、ピロホスファターゼ、及び／もしくはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途により変動する。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡの調製に関して、ＤＮＡテンプレートは、インビトロで転写される。好適なＤＮＡテンプレートは、典型的には、インビトロ転写に関してプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーター、続いて所望のｍＲＮＡ及び停止シグナルに関して所望のヌクレオチド配列を有する。
【０１０１】
本発明による所望のｍＲＮＡ配列（複数可）は、標準的な方法を使用して、決定され、ＤＮＡテンプレート内に組み込まれる。例えば、所望のアミノ酸配列（例えば、酵素配列）から開始して、変性された遺伝コードに基づき仮想逆翻訳が行われる。次いで、好適なコドンを選択するために最適化アルゴリズムが使用され得る。典型的には、Ｇ／Ｃ含量は、一方では、可能な最高のＧ／Ｃ含量を達成するために最適化され得、もう一方では、コドン使用によりｔＲＮＡの頻度を可能な限り最良に考慮する。最適化されたＲＮＡ配列は、例えば、適切な表示装置の補助により確立及び表示され、元（野生型）の配列と比較され得る。二次構造も、ＲＮＡの安定化及び不安定化特性、またはそれぞれ、安定化及び不安定化領域を計算するために分析され得る。
【０１０２】
修飾されたｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本発明によるｍＲＮＡは、未修飾または修飾されたｍＲＮＡとして合成することができる。典型的には、ｍＲＮＡは、安定性を強化するために修飾される。ｍＲＮＡの修飾は、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。よって、本発明による修飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））もしくはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むがこれらに限定されない天然に存在するヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から、ならびにプリン及びピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体もしくは誘導体（例えば、１−メチル−アデニン、２−メチル−アデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオシトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチル−シュードウラシル、キューオシン、．β．−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、及びホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンならびにイノシン）として合成することができる。そのような類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び同第５，７００，６４２号により当業者に公知であり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＡＨコードｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ骨格修飾を含み得る。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾は、典型的には、これらに限定されないが、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオリン酸塩））、ボラノリン酸塩、正荷電グアニジウム基等からなる群からの修飾を含み、これは、ホスホジエステル連結を他のアニオン性、カチオン性、または中性基に置き換えることによることを意味する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＡＨコードｍＲＮＡ）は、糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、糖が含有するヌクレオチドの糖の化学修飾であり、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−３リン酸塩、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−３リン酸塩）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−３リン酸塩、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−３リン酸塩）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−３リン酸塩、２’−メチルウリジン５’−３リン酸塩）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−３リン酸塩、２’−アラウリジン５’−３リン酸塩）、またはアジド３リン酸塩（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−３リン酸塩、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−３リン酸塩）からなる群から選択される糖修飾を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＡＨコードｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドの塩基の修飾を含み得る（塩基修飾）。塩基修飾を含む修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。そのような塩基修飾ヌクレオチドの例としては、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−３リン酸塩、２−アミノアデノシン５’−３リン酸塩、２−チオシチジン５’−３リン酸塩、２−チオウリジン５’−３リン酸塩、４−チオウリジン５’−３リン酸塩、５−アミノアリルシチジン５’−３リン酸塩、５−アミノアリルウリジン５’−３リン酸塩、５−ブロモシチジン５’−３リン酸塩、５−ブロモウリジン５’−３リン酸塩、５−ヨードシチジン５’−３リン酸塩、５−ヨードウリジン５’−３リン酸塩、５−メチルシチジン５’−３リン酸塩、５−メチルウリジン５’−３リン酸塩、６−アザシチジン５’−３リン酸塩、６−アザウリジン５’−３リン酸塩、６−クロロプリンリボシド５’−３リン酸塩、７−デアザアデノシン５’−３リン酸塩、７−デアザグアノシン５’−３リン酸塩、８−アザアデノシン５’−３リン酸塩、８−アジドアデノシン５’−３リン酸塩、ベンゾイミダゾールリボシド５’−３リン酸塩、Ｎ１−メチルアデノシン５’−３リン酸塩、Ｎ１−メチルグアノシン５’−３リン酸塩、Ｎ６−メチルアデノシン５’−３リン酸塩、Ｏ６−メチルグアノシン５’−３リン酸塩、プソイドウリジン５’−３リン酸塩、ピューロマイシン５’−３リン酸塩、またはキサントシン５’−３リン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）上への「キャップ」及びＣ末端（３’）上への「テイル」の付加を含む。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テイル」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。
【０１０７】
よって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＡＨコードｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸塩基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸塩を残し、次に、グアノシン３リン酸塩（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸塩に付加されて５’５’５  ３リン酸塩連結を産生し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＡＨコードｍＲＮＡ）は、３’ポリ（Ａ）テイル構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリ−Ａテイルは、典型的には、約１０〜３００のアデノシンヌクレオチド（配列番号９）（例えば、約１０〜２００のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０のアデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テイル構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリ−Ｃテイルは、典型的には、約１０〜２００のシトシンヌクレオチド（配列番号１０）（例えば、約１０〜１５０のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリ−Ｃテイルは、ポリ−Ａテイルに付加されるか、またはポリ−Ａテイルを置換し得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０〜５００ヌクレオチドであってよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが約５０〜５００ヌクレオチド、またはそれ以上であってよい。
【０１１１】
キャップ構造
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸塩基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸塩を残し、次に、グアノシン３リン酸塩（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸塩に付加されて５’５’５  ３リン酸塩連結を産生し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
天然に存在するキャップ構造は、３リン酸塩ブリッジを介して最初の転写ヌクレオチドの５’端に連結され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす、７−メチルグアノシンを含む。インビボにおいて、キャップは、酵素的に付加される。キャップは、核に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼにより触媒される。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に生じる。末端ヌクレオシドは、典型的には、グアノシンであり、全ての他のヌクレオチドに対して逆の方向に向いている、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
【０１１３】
インビトロ転写により産生されたｍＲＮＡの一般的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これは、それらの５’末端でキャップ構造を有するＲＮＡを得るために、インビトロでＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写においてジヌクレオチドキャップとして使用されてきた。キャップされたｍＲＮＡのインビトロ合成のための一般的な方法は、転写の開始因子として形態ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）の予め形成されたジヌクレオチドを採用する。
【０１１４】
現時点でのインビトロ翻訳実験に使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常形態は、２’または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される、一般的に、修飾されたキャップ類似体であるアンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡである。
【０１１５】
さらなるキャップ類似体は、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ、非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ、ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの４リン酸塩誘導体）からなる群から選択される化学構造を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照）。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、好適なキャップは、３リン酸塩ブリッジを介して最初の転写ヌクレオチドの５’端に連結され、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）もたらす、７−メチルグアニレート（「ｍ７Ｇ」）である。本発明の実施形態に利用されるｍ７Ｇキャップの好適な実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、キャップは、Ｃａｐ０構造である。Ｃａｐ０構造は、塩基１及び２に結合されたリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く。いくつかの実施形態では、キャップは、Ｃａｐ１構造である。Ｃａｐ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。いくつかの実施形態では、キャップは、Ｃａｐ２構造である。Ｃａｐ２構造は、塩基２及び３の両方に結合された２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【０１１８】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体が当該技術分野において既知であり、その多くは市販されている。これらは、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ  ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体を含む（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用するためのさらなるキャップ類似体は、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド４リン酸塩類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載される）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載される）、ならびに米国特許第８，０９３，３６７号及び同第８，３０４，５２９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるキャップ類似体（ビオチニル化キャップ類似体を含む）を含む。
【０１１９】
テイル構造
典型的には、「テイル」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。ポリＡテイルは、天然のメッセンジャー及び合成センスＲＮＡを安定させると考えられている。したがって、ある特定の実施形態では、長いポリＡテイルは、ｍＲＮＡ分子に付加され、よって、ＲＮＡにより安定性を付与することができる。ポリＡテイルは、様々な当該技術分野において認識される技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテイルは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成またはインビトロ転写ＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターは、長いポリＡテイルもコードすることができる。加えて、ポリＡテイルは、ＰＣＲ産物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’端に連結することもできる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テイル構造を含む。典型的には、ポリＡテイルの長さは、少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチド（配列番号１１）であり得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端のポリ−Ａテイルは、典型的には、約１０〜３００のアデノシンヌクレオチド（配列番号９）（例えば、約１０〜２００のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０のアデノシンヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テイル構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリ−Ｃテイルは、典型的には、約１０〜２００のシトシンヌクレオチド（配列番号１０）（例えば、約１０〜１５０のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリ−Ｃテイルは、ポリ−Ａテイルに付加されるか、またはポリ−Ａテイルを置換し得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ポリＡまたはポリＣテイルの長さは、本発明の修飾されたセンスｍＲＮＡ分子の安定性、よってタンパク質の転写を制御するために調節される。例えば、ポリＡテイルの長さは、センスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテイルの長さは、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性のレベルを修正し、それにって、標的細胞におけるポリヌクレオチド発現及び／またはポリペプチド産生の時間経過を制御するために調節され得る。
【０１２２】
５’及び３’非翻訳領域
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０〜５００ヌクレオチドであってよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが約５０〜５００ヌクレオチド、またはそれ以上であってよい。
【０１２４】
例示的な３’及び／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）に由来し得る。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するため、及び／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定させるために、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはその断片をコードする配列を含むことも想定される。一般に、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの未修飾の対応物に対して改善し、例えば、インビボヌクレアーゼ消化に対するそのようなポリヌクレオチドの耐性を改善するように行われる修飾を含む。
【０１２５】
リポソームの形成
本発明に使用するためのリポソーム伝達ビヒクルは、現在当該技術分野において既知の様々な技術により調製することができる。提供される組成物に使用するためのリポソームは、現在当該技術分野において既知の様々な技術により調製することができる。例えば、多層小胞（ＭＬＶ）は、適切な溶媒に脂質を溶解することにより、好適な容器または器の内壁に選択された脂質を堆積させ、次いで、溶媒を蒸発させて器の内側に薄いフィルムを残すか、噴霧乾燥させることなどによる、従来の技術により調製され得る。次いで、ＭＬＶの形成をもたらす渦動運動により水相が器に添加され得る。次いで、単層小胞（ＵＬＶ）は、多層小胞の均質化、音波処理、または押し出しにより形成され得る。加えて、単層小胞は、界面活性剤除去技術により形成することができる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、提供される組成物は、ｍＲＮＡがリポソームの表面に結合し、かつ同じリポソーム内に封入される、リポソームを含む。例えば、本発明の組成物の調製中、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりｍＲＮＡと結合し得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、リポソームに封入されたｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ種は、同じリポソームに封入され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡ種は、異なるリポソームに封入され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のリポソームに封入され、これは、それらの脂質組成物、脂質構成成分のモル比、大きさ、電荷（ゼータ電位）、標的リガンド、及び／またはこれらの組み合わせにおいて異なる。いくつかの実施形態では、１つ以上のリポソームは、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び／またはこれらの組み合わせの異なる組成物を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のリピソーム（ｌｉｐｉｓｏｍｅｓ）は、リポソームを作製するために使用されるカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ修飾脂質の異なるモル比を有し得る。
【０１２８】
所望のｍＲＮＡをリポソーム内に組み込むプロセスは、多くの場合、「装填」と称される。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム組み込み核酸は、完全に、または部分的にリポソームの内部空間、リポソームの２層膜内に位置するか、またはリポソーム膜の外表面と結合し得る。核酸のリポソーム内への組み込みは、本明細書において、「封入」とも称され、核酸がリポソームの内部空間内に完全に格納される。ｍＲＮＡをリポソームなどの伝達ビヒクル内に組み込む目的は、多くの場合、核酸の迅速な排出をもたらす、核酸及び／もしくは系または受容体を分解する酵素または化学物質を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、いくつかの実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるｍＲＮＡの安定性を強化することができ、かつ／またはｍＲＮＡの標的細胞もしくは組織への送達を容易にする。
【０１２９】
リポソームの大きさ
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。いくつかの実施形態では、提供されるリポソームは、以前に知られるｍＲＮＡ封入リポソームより小さく作製され得る。いくつかの実施形態では、リポソームの大きさの減少は、ｍＲＮＡのより効率的な送達に関連する。適切なリポソームの大きさの選択は、標的細胞または組織の部位、及びある程度リポソームが作製される用途を考慮し得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、適切なリポソームの大きさは、ｍＲＮＡによりコードされるＰＫＵタンパク質の全身分布を容易にするように選択される。いくつかの実施形態では、ある特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを制限することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓より小さいように寸法決定され得、そのような場合、リポソームは、そのような内皮開窓を容易に貫通し、標的肝細胞に達することができる。
【０１３１】
あるいは、または加えて、リポソームは、リポソームの寸法がある特定の細胞もしくは組織内への分布を制限する、または明確に避けるために十分な直径のものであるように寸法決定され得る。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きいように寸法決定され得、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。いくつかの実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜１００ｎｍの範囲（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５ｎｍの範囲）の大きさを有する。
【０１３３】
リポソーム集団の寸法決定に関して、当該技術分野において既知の様々な代替方法が利用可能である。そのような寸法決定の方法の１つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。浴またはプローブ音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の音波処理は、直径が約０．０５ミクロン未満の小さいＵＬＶまで漸進的な大きさの減少をもたらす。均質化は、大きいリポソームをより小さいものに断片化するために剪断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均質化手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１〜０．５ミクロンが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを通して再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定され得る。平均リポソーム直径は、形成されたリポソームの音波処理によって減少させることができる。効率的なリポソーム合成を導くために、断続的な音波処理サイクルがＱＥＬＳ評価と交互に行われ得る。
【０１３４】
薬学的組成物
インビボでのｍＲＮＡの発現を容易にするために、リポソームなどの送達ビヒクルは、１つ以上の追加の核酸、担体、標的リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または好適な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化され得る。薬物の製剤化及び投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎに見出すことができる。
【０１３５】
提供されるリポソームにより封入された、または結合されたｍＲＮＡ、及びそれを含む組成物は、現在の医療行為により投与及び投薬され、被験体の臨床状態、投与の部位及び方法、投与スケジュール、被験体の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関係のある他の要因を考慮する。本明細書において、目的の「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医療の分野の当業者に既知である、そのような関連のある考慮すべき事項により決定され得る。いくつかの実施形態では、投与される量は、症状、及び当業者により疾患の進行、退行、または改善の適切な対策として選択される他の指標の少なくともいくらかの安定化、改善、または排除を達成するのに有効である。例えば、好適な量及び投薬レジメンは、少なくとも一時的なタンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
【０１３６】
好適な投与経路は、例えば、経口、直腸、膣、経粘膜、気管内もしくは吸入を含む肺動脈、または腸投与、皮内、経皮（局所）、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻孔内を含む非経口送達を含む。
【０１３７】
代替的に、または加えて、本発明のリポソームにより封入されたｍＲＮＡ及び組成物は、全身的様式ではなく、局所に、例えば、薬学的組成物の標的組織への直接注射、好ましくは持続放出性製剤で投与され得る。局所送達は、標的とされる組織により、様々な方法で影響を受け得る。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルは吸引され得る（鼻、気管、または気管支送達に関して）、本発明の組成物は、例えば、損傷、疾患の出現、または痛みの部位内に注射され得る、組成物は、経口、気管、または食道用途のためにロゼンジで提供され得る、胃もしくは腸への投与用に液体、錠剤、またはカプセル形態で供給され得る、直腸もしくは膣用途のために坐剤形態で供給され得る、またはクリーム、液滴、さらには注射を使用することにより眼にさえも送達することができる。治療用分子またはリガンドと複合される提供される組成物を含む製剤は、例えば、組成物が移植の部位から周囲細胞に拡散することができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と結合して、外科的に投与することさえもできる。あるいは、これらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用され得る。
【０１３８】
本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療有効量の治療剤（例えば、ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の単回ならびに複数回投与を想定する。治療剤は、被験体の状態（例えば、ＰＫＵ）の性質、重篤度、及び程度により、規則的な間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療有効量の治療剤（例えば、ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡ）は、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（例えば、２ヶ月に１回）、毎月（例えば、毎月１回）、週２回（例えば、２週間に１回、隔週）、毎週、毎日、または連続して）、周期的に髄腔内に投与され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、提供されるリポソーム及び／または組成物は、その中に含まれるｍＲＮＡの徐放に適するように製剤化される。そのような徐放性組成物は、投薬間隔を延長して被験体に適宜投与することができる。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、毎日、または１日おきに被験体に投与される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、週に２回、週に１回、７日毎、１０日毎、１４日毎、２８日毎、３０日毎、２週間毎（例えば、隔週）、３週間毎、より好ましくは４週間毎、１ヶ月に１回、６週間毎、８週間毎、隔月、３ヶ月毎、４ヶ月毎、６ヶ月毎、８ヶ月毎、９ヶ月毎、毎年、被験体に投与される。長期間にわたってｍＲＮＡを送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下）用に製剤化される組成物及びリポソームも想定される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにｍＲＮＡに行われる修飾と組み合わされる。
【０１４０】
本明細書で使用される、用語「治療有効量」は、主として、本発明の薬学的組成物に含まれる治療剤の総量に基づき決定される。一般に、治療有効量は、被験体に対して意義のある利益を得る（例えば、ＰＫＵを治療する、調節する、治癒する、防止する、及び／または寛解させる）のに十分である。例えば、治療有効量は、所望の治療及び／または予防作用を得るのに十分な量であり得る。一般に、治療剤（例えば、ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡ）を必要とする被験体に投与されるその量は、被験体の特徴に依存する。そのような特徴は、被験体の状態、疾患の重篤度、一般的な健康状態、年齢、性別、及び体重を含む。当業者は、これらの及び他の関連する要因により適切な投薬量を容易に決定することができるだろう。加えて、最適な投薬量の範囲を特定するために、客観的及び主観的アッセイの両方が任意に採用され得る。
【０１４１】
治療有効量は、一般的に、複数単位用量を含み得る投薬レジメンで投与される。任意の特定の治療用タンパク質に関して、治療有効量（及び／または有効投薬レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の薬学的薬剤との組み合わせにより変動し得る。また、任意の特定の患者の特定の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重篤度、採用される特定の薬学的薬剤の活性、採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事、投与時間、投与経路、及び／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度、治療期間、ならびに医療の分野において周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存し得る。
【０１４２】
本発明によると、提供される組成物の治療有効用量は、規則的に投与される場合、治療前の基準レベルと比較して、肝ＰＡＨタンパク質の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、提供される組成物の投与は、約１００ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇまたは約１４００ｎｇ／ｍｇ（肝臓中総タンパク質）以上のＰＡＨタンパク質レベルの発現をもたらす。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血清ＰＡＨタンパク質レベルが増加する。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療前の基準ＰＡＨタンパク質レベルと比較して、血清ＰＡＨタンパク質レベルが少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増加する。典型的には、血清中の基準ＰＡＨタンパク質レベルは、治療直前に測定される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、生体試料中のフェニルアラニンレベルが減少する。好適な生体試料は、例えば、全血、血漿、血清、尿、または脳髄液を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、治療前の基準レベルと比較して、生体試料（例えば、血清、血漿、または尿試料）中のフェニルアラニンレベルが少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。典型的には、基準フェニルアラニンレベルは、治療直前に測定される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、提供される組成物の治療有効用量は、規則的に投与される場合、治療直前の基準フェニルアラニンレベルと比較して、血清または血漿中のフェニルアラニンレベルの減少をもたらす。いくつかの実施形態では、提供される組成物の治療有効用量は、規則的に投与される場合、治療されない被験体の基準フェニルアラニンレベルと比較して、血清または血漿中のフェニルアラニンレベルの減少をもたらす。いくつかの実施形態では、提供される組成物の治療有効用量は、規則的に投与される場合、血清または血漿中のフェニルアラニンレベルを約１５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約９００μｍｏｌ／Ｌ以下、約８００μｍｏｌ／Ｌ以下、約７００μｍｏｌ／Ｌ以下、約６００μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約４００μｍｏｌ／Ｌ以下、約３００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下、または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下に減少させる。特定の実施形態では、規則的に投与された場合の治療有効用量は、血清または血漿中のフェニルアラニンレベルを約１２０μｍｏｌ／Ｌ以下に減少させる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、尿中のフェニルアラニンのレベル、及び／またはフェニルアラニンの代謝産物（例えば、フェニルケトン、フェニルピルビン酸塩）が減少する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、治療有効用量を決定するために、１つ以上の精神神経試験が使用され得る。いくつかの実施形態では、治療前の個体、または未治療対照個体のいずれかと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の１つ以上の精神神経試験の改善は、特定の用量が治療有効量であることを示す。いくつかの実施形態では、好適な精神神経試験は、注意欠陥及び多動性障害評価尺度（ＡＤＨＤ−ＲＳ）の不注意部分ならびに／または気分状態のプロファイル（ＰＯＭＳ）であってよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約０．００５〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．１〜５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．１〜４．５、０．１〜４．０、０．１〜３．５、０．１〜３．０、０．１〜２．５、０．１〜２．０、０．１〜１．５、０．１〜１．０、０．１〜０．５、０．１〜０．３、０．３〜５．０、０．３〜４．５、０．３〜４．０、０．３〜３．５、０．３〜３．０、０．３〜２．５、０．３〜２．０、０．３〜１．５、０．３〜１．０、０．３〜０．５、０．５〜５．０、０．５〜４．５、０．５〜４．０、０．５〜３．５、０．５〜３．０、０．５〜２．５、０．５〜２．０、０．５〜１．５、または０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の用量で投与される。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、治療有効用量は、または（ｏｒ）約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約３ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、または約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）以上である。  いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．８、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）以下の用量で投与される。
【０１５０】
本明細書に開示されるリポソームのうちの１つ以上を含む凍結乾燥された薬学的組成物、及び例えば、２０１１年６月８日に出願された米国仮出願第６１／４９４，８８２号（その教示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、そのような組成物を使用するための関連方法も、本明細書において想定される。例えば、本発明による凍結乾燥された薬学的組成物は、投与前に再構成されるか、またはインビボで再構成され得る。例えば、凍結乾燥された薬学的組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってインビボで経時的に再水和されるように投与され得る。
【０１５１】
提供されるリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。いくつかの実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達されたｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織で発現される。いくつかの実施形態では、送達されたｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されたｍＲＮＡが送達及び／または発現され得る例示的な組織としては、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
様々な実施形態によると、送達されたｍＲＮＡの発現の時期は、特定の医学的要求に合うように調整することができる。いくつかの実施形態では、送達されたｍＲＮＡによってコードされるＰＡＨタンパク質の発現は、提供されるリポソームまたは組成物の単回投与の１、２、３、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、及び／または７２時間後に血清または標的組織において検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるＰＡＨタンパク質の発現は、提供されたリポソームまたは組成物の単回投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、及び／または７日後に血清または標的組織において検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるＰＡＨタンパク質の発現は、提供されるリポソームまたは組成物の単回投与の１週間、２週間、３週間、及び／または４週間後に血清または標的組織において検出可能である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の発現は、提供されるリポソームまたは組成物の単回投与の１ヶ月以上後で検出可能である。
【実施例】
【０１５３】
本発明のある特定の化合物、組成物、及び方法がある特定の実施形態により具体的に説明されてきたが、以下の実施例は、単に、本発明の化合物を例示するのに役立ち、それを制限することを意図しない。
【０１５４】
実施例１．ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤
この実施例は、インビボでのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの有効な送達及び発現のための例示的なリポソーム製剤を提供する。
【０１５５】
脂質材料
以下の実施例に記載される製剤は、特に記載しない限り、１つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質及び／またはコレステロール脂質）、ならびにフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡを封入するように設計されたＰＥＧ化脂質を採用する様々な比率の多構成成分脂質混合物を含む。特に記載しない限り、以下の実施例において使用された多構成成分脂質混合物は、ｃＫＫ−Ｅ１２（カチオン性脂質）、ＤＯＰＥ（非カチオン性脂質）、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋのエタノール溶液であった。
【０１５６】
メッセンジャーＲＮＡ材料
コドン最適化ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）メッセンジャーＲＮＡは、遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡテンプレートからインビトロ転写により合成され、これに、５’キャップ構造（キャップ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９−１２４９）、及びゲル電気泳動により決定された、長さがおよそ２５０ヌクレオチド（配列番号１２）の３’ポリ（Ａ）テイルの付加が続いた。各ｍＲＮＡ産物に存在する５’及び３’非翻訳領域は、それぞれ、Ｘ及びＹと表され、記載される通りに定義される（下記参照）。
【化７】
0006506749.tif 000012
【０１５７】
例えば、コドン最適化ヒトＰＡＨメッセンジャーＲＮＡは、
【化８】
0006506749.tif 000013
【０１５８】
別の例では、コドン最適化ヒトＰＡＨメッセンジャーＲＮＡは、
【化９】
0006506749.tif 000014
【０１５９】
合成コドン最適化ヒトＰＡＨ  ｍＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、２４時間後に分析された。細胞溶解及び処理により、ヒトＰＡＨは、ウエスタンブロット分析を介して良好に検出された（図１を参照）。
【０１６０】
製剤プロトコル
５０ｍｇ／ｍＬのｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋのエタノール溶液のアリコートを混合し、エタノールで３ｍＬの最終容量に希釈した。別に、１ｍｇ／ｍＬのストックからＰＡＨ  ｍＲＮＡの水性緩衝溶液（１０ｍＭのクエン酸塩／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を調製した。脂質溶液を水性ｍＲＮＡ溶液に迅速に注入し、振盪させ、２０％エタノール中の最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析濾過し、濃縮し、２〜８℃で保管した。最終濃度＝１．２８ｍｇ／ｍＬ  ＰＡＨ  ｍＲＮＡ（封入）。Ｚ平均＝７９ｎｍ；ＰＤＩ＝０．１２。
【０１６１】
実施例２．ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填リポソームナノ粒子の投与
本実施例は、ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填リポソームナノ粒子を投与する例示的な方法、ならびにインビボの様々な標的組織で送達されたｍＲＮＡ、及びその後に発現したｈＰＡＨタンパク質を分析するための方法を例示する。
【０１６２】
全ての試験は、各実験の開始時におよそ６〜８週齢の雄のＣＤ−１マウスまたはＰＡＨノックアウトマウスを使用して行われた。試料は、１．０ｍｇ／ｋｇ（ないしは別の方法で特定される）の当量総用量の封入されたＰＡＨ  ｍＲＮＡの単回ボーラス尾静脈注射により導入された。マウスは、指定された時間点で屠殺され、生理食塩水で灌流された。
【０１６３】
分析用の臓器組織の単離
各マウスの肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓を採取し、個別の部分に分配し、分析用に１０％の中性緩衝ホルマリン中に保管するか、または瞬間凍結し、−８０℃で保管するかのいずれかであった。
【０１６４】
分析用の血漿の単離
全ての動物は、用量投与後の指定された時間点でＣＯ２致死（±５％）により安楽死され、続いて、開胸及び末端心血採取を行った。全血（最大取得可能容量）を、安楽死させた動物の心臓穿刺を介して血清分離管内に採取し、少なくとも３０分間、室温で凝固させ、２２℃±５℃で、１０分間９３００ｇで遠心分離し、血清を抽出した。中間採血に関して、およそ４０〜５０μＬの全血が、顔面静脈穿刺、または尾切除により採取された。未処置動物から採取された試料は、動物を試験するために、比較のための基準フェニルアラニンレベルとして使用された。
【０１６５】
フェニルアラニン分析
フェニルアラニンのレベルは、市販のキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＥＰＨＥ−１００）を使用し、製造者のプロトコルに従い測定された。
【０１６６】
酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）分析−ｈＰＡＨ  ＥＬＩＳＡ
捕捉抗体としてヤギポリクローナル抗ｈＰＡＨ抗体（Ｎｏｖｕｓ  ＮＢＰ１−５２０８４）と、二次（検出）抗体としてウサギ抗ｈＰＡＨポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ（ＨＰＡ０２８０７）を採用する標準的なＥＬＩＳＡ手順に従った。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液の活性のために使用された。２０分後に２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応をクエンチした。検出は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ機器で、吸収（４５０ｎｍ）を介してモニターされた。未処置マウスの肝臓及びヒトｈＰＡＨタンパク質は、それぞれ、陰性及び陽性対照として使用された。
【０１６７】
実施例３．インビボタンパク質産生及び臨床有効性
本実施例は、ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの投与がインビボで良好なタンパク質産生及び臨床有効性をもたらすことを示す。
【０１６８】
送達されたｍＲＮＡがインビボで良好にタンパク質に翻訳されたかを決定するために、処置されたマウスの肝臓で検出されたヒトＰＡＨタンパク質の定量化が、ＥＬＩＳＡに基づく方法を介して達成された（図２）。図３は、未処置の野生型マウスの肝臓により確認されたように、マウス相同体との交差反応なく、ヒトＰＡＨタンパク質の明らかな産生が観察されたことをさらに示す。投与６〜１２時間後、１ｍｇ当たりおよそ３００ｎｇ（試料中総タンパク質）のｈＰＡＨタンパク質が検出された（図３を参照）。
【０１６９】
臨床有効性を決定するために、我々は、ＰＫＵ疾患モデルのＰＡＨノックアウトマウスの血清フェニルアラニンレベルにおいて、ｍＲＮＡ送達の効果を評価した。未処置ＰＡＨノックアウトマウスのフェニルアラニンレベルは、野生型マウスと比較して非常に高かった（約１４５０ｕＭ対約５０ｕＭ）。図４に示されるように、これらのノックアウトマウスをＰＡＨ  ｍＲＮＡで治療したとき、フェニルアラニンのレベルは、投薬の６時間以内に野生型のレベルに下がった。このデータは、ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ療法がＰＫＵの治療に非常に有効であることを示す。
【０１７０】
実施例４．インビボでのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの検出
本実施例は、ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの投与後、ＰＡＨ  ｍＲＮＡが少なくとも７２時間の間、マウスの肝臓において検出可能であることを示す。
【０１７１】
実施例２に上述されるように、単回用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子または生理食塩水（すなわち、対照）をマウスに投与した。ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの投与３０分、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日後にマウスを屠殺し、肝臓を採取した。ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの存在を検出するために、肝臓のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが行われた（図５Ａ〜５Ｉ）。ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの存在は、投与後少なくとも７２時間の間、観察可能であった（図５Ａ〜５Ｇ）。ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡは、類洞細胞ならびに肝細胞において検出可能であった。これらのデータは、ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡが投与後少なくとも７２時間の間、肝臓において検出され得ることを示す。
【０１７２】
実施例５．ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡを用いた用量応答治療後のＰＡＨノックアウトマウスにおけるヒトＰＡＨタンパク質レベル及び血清フェニルアラニンレベル
本実施例は、投与されたｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの量と、肝臓において発現されたヒトＰＡＨタンパク質及び血清フェニルアラニンレベルの両方の量との間の用量応答を示す。
【０１７３】
ＰＡＨノックアウトマウスは、実施例２に上述されるように、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５０ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、または１．０ｍｇ／ｋｇの単回用量のｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子または生理食塩水（すなわち、対照）を投与された。血清試料は、投薬前及び投薬６時間後（すなわち、投与後）にマウスから採取された。マウスを投与６時間後に屠殺し、肝臓を採取した。
【０１７４】
肝臓におけるヒトＰＡＨタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。これらのデータは、全ての用量で、対照に対して、増加したレベルのｈＰＡＨタンパク質が検出されたことを示す（図６）。これらのデータは、投与されたｈＰＡＨ  ｍＲＮＡの量と、肝臓において発現されたＰＡＨタンパク質の量との間の用量応答を示す。例えば、１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡを投与されたマウスは、およそ１０００ｎｇのＰＡＨ／ｍｇの総タンパク質を発現した一方、０．２５ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡを投与されたマウスは、およそ２００ｎｇのＰＡＨ／ｍｇの総タンパク質を発現した。
【０１７５】
フェニルアラニンの血清レベルは、処置前及び処置後の試料において定量化された（図７）。これらのデータは、投薬前対照に対して、全ての治療用量で、血清フェニルアラニンの減少ならびに用量応答を示す。例えば、１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡを投与されたマウスは、０．２５ｍｇ／ｋｇを投与されたもの（すなわち、１５００μＭ未満）より低レベルのフェニルアラニン（すなわち、５００μＭ未満）を示した。
【０１７６】
実施例６．１ヶ月間ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡで処置された後のＰＡＨノックアウトマウスにおけるヒトＰＡＨタンパク質及び血清フェニルアラニンレベル
本実施例は、１ヶ月にわたるｈＰＡＨ  ｍＲＮＡでの処置が肝臓においてｈＰＡＨタンパク質レベルの増加、及び血清フェニルアラニンレベルの減少をもたらすことを示す。
【０１７７】
ＰＡＨノックアウトマウスは、実施例２に上述されるように、１ヶ月間、週に１回、０．５ｍｇ／ｋｇもしくは１．０ｍｇ／ｋｇの単回用量のｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子、または１ヶ月間、隔週で１回、１．０ｍｇ／ｋｇのｈＰＡＨ  ｍＲＮＡ装填ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子、または生理食塩水（すなわち、対照）を投与された。血清は、初回投薬前（すなわち、投薬前）、及び各投薬の６時間後にマウスから採取された。マウスを２９日目の最終用量の投与６時間後に屠殺し、肝臓を採取した。
【０１７８】
肝臓におけるヒトＰＡＨタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。これらのデータは、全ての用量で、対照に対して、増加したレベルのｈＰＡＨタンパク質が検出されたことを示す（図８）。
【０１７９】
フェニルアラニンの血清レベルは、処置前及び処置後の試料において定量化された（図９）。これらのデータは、投薬前対照試料に対して、全ての治療用量で、血清フェニルアラニンの減少を示す。これらのデータはまた、ｈＰＡＨ  ｍＲＮＡが隔週で投与されたときでも、高用量（すなわち、１．０ｍｇ／ｋｇ）が血清フェニルアラニンのレベルのより低下をもたらしたことを示す。
等価物
【０１８０】
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、または把握することができるだろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図せず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述される通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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