(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素源を少なくとも含む原料を用いて、アノキシバチルス・フラビサーマス、アノキシバチルス・コンタミナンス、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミスから選択される１種以上のバクテリアを５０〜８０℃の温度で培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とするメナキノン−７の製造法。
【請求項２】
請求項１記載の工程において、培養物中にメナキノン−７を生成させた後、該培養物を回収するか又はさらに加工する、メナキノン−７含有培養物の製造法。
【請求項３】
該培養物からさらにメナキノン−７を精製する、請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
培養物が、窒素源を含む微生物培養用の培地を用いて培養されたものである、請求項１〜３の何れか１項記載の培養物の製造法。
【請求項５】
培養物が、豆類を該バクテリアで発酵させて得られる豆類発酵物である、請求項２記載の培養物の製造法。
【請求項６】
培養物が、蛋白質含有食品副産物を該バクテリアで発酵させて得られる発酵物である、請求項２記載の培養物の製造法。
【請求項７】
蛋白質含有食品副産物が、大豆ホエー、オカラ、大豆蛋白質加水分解物の高分子画分又は大豆胚軸である、請求項６記載の培養物の製造法。
【請求項８】
培養物が、蛋白質を含む発酵原料を該バクテリアで発酵させて得られる固形分中３０重量％以上の蛋白質を含有する発酵蛋白質組成物である、請求項２記載の培養物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メナキノン−７含有培養物及びメナキノン−７の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、脂溶性ビタミンの一種で、血液凝固を正常に維持する機能や骨の形成促進、動脈硬化の予防など様々な効果があることが知られている重要なビタミンである。自然界には植物にビタミンＫ１（フィロキノン）が、バクテリア等にビタミンＫ２（メナキノン）が存在し、ビタミンＫには骨粗鬆症や動脈硬化等の予防又は治療効果が期待できるため日常的に摂取することが望ましい。また新生児・乳児出血症がビタミンＫの欠乏から起こることなどからも注目されている。【０００３】
従来、ビタミンＫ２の一種であるメナキノン−７の製造は、高いメナキノン−７の生成能を有するバチルス・ズブチリス菌株（いわゆる納豆菌）が使用されてきた（特許文献１，２）。バチルス・ズブチリス菌株以外のバクテリアを用いた例として乳酸菌や大腸菌を用いた製造方法も知られている（特許文献３，４）。【０００４】
一つの側面として、骨粗鬆症や動脈硬化の予防には豆類に豊富に含まれるタンパク質，ビタミン，ミネラル等の栄養素と、ビタミンＫの摂取が非常に効果的であるため、ビタミンＫを摂取する形態としては、豆類を基質としてビタミンＫを摂取することは望ましい形態の一つである。豆類はイソフラボン，サポニン，ポリフェノール等の生理機能成分も豊富に含まれているため、この点でもビタミンＫと豆類は一緒に摂取されるのが望ましい。このような摂取形態に合致したものが、伝統的に食されてきた「納豆」である。また、分離大豆蛋白や乳ホエー蛋白濃縮物などの蛋白質を豊富に含む蛋白質組成物は、各種の蛋白質強化飲料や蛋白質強化食品、濃厚流動食等の高栄養食品の蛋白質源として使用されているが、これらの高栄養食品では健康を増進するため様々な栄養成分や機能性成分がバランス良く配合されており、これらの蛋白質と共に骨粗鬆症や動脈硬化の予防にも有効なビタミンＫを摂取することも非常に効果的である。【０００５】
他の一つの側面として、食品加工業においては食品の製造において様々な食品副産物が生成され、その中には蛋白質が含まれる食品副産物もあり、これらを廃棄することは環境負荷が高い点で問題である。【０００６】
例えば大豆ホエーは分離大豆蛋白や豆腐の製造工程において副生する蛋白質含有食品副産物であり、大豆少糖類や酸可溶性の大豆蛋白質等を含み、濃縮すると粘度の高い液状乃至ペースト状になる。しかし大豆ホエーを乳酸菌などで発酵させる試みが一部でなされている（特許文献５、６）ものの、多くは飼料として利用されるか、廃棄されており、食品として未だ高度利用されておらず環境負荷が高いのが現状である。【０００７】
またオカラは、大豆から豆腐や豆乳あるいは分離大豆蛋白を製造する際に副生する繊維質、蛋白質、油分を含む蛋白質含有食品副産物である。また大豆以外の植物種子から蛋白質を分離した際に副生するオカラ、例えば胡麻、落花生、菜種、ヒマワリ、綿実等の蛋白に富む油糧種子や、えんどう豆、インゲン豆、そら豆等の蛋白含量の多い豆類から、蛋白質を分離した種々の残渣もオカラとされる。
このオカラについても有効利用のための種々の試みがなされている。例えばオカラを納豆菌で発酵させビタミンＫ類を製造する方法が開示されている（特許文献７）。またオカラなどを含む海産物残渣などを特定の菌種を使用して発酵させ、飼料添加物を製造する方法（特許文献８）や、オカラなどを含む魚介類加工残渣を発酵させ、家畜飼料又は養殖餌料を製造することが開示されている（特許文献９）。【０００８】
また大豆蛋白質加水分解物の高分子画分は、大豆蛋白質をプロテアーゼによって分解し、低分子の蛋白質加水分解物（大豆ペプチド）を製造する際、加水分解過程で比較的高分子の蛋白質加水分解物が低分子にまで分解しきらずに凝集した不溶性画分として副生されるものである。大豆ペプチドについては近年、発泡性アルコール飲料の発酵原料として利用が進んでいる（特許文献１０）が、この不溶性の高分子画分の多くは廃棄されているのが現状である。【０００９】
また大豆胚軸は、大豆の発芽時に幼芽、幼根となる部分であり、蛋白質、オリゴ糖などの他、イソフラボンやサポニンなどの微量栄養成分が豊富に含まれている。そのため大豆胚軸からアルコールや水などで抽出して必要により精製した大豆胚軸抽出物や、大豆胚軸そのままの形態で健康食品素材としても利用されているが、独特の苦味あるいは収斂味のある風味を有しており、そのままでは食品として供しにくい難点を有する。一方、大豆胚軸を麹菌などで発酵させ、大豆胚軸の品質を改善する試みがなされている（特許文献１１）。また、大豆胚軸に含まれる大豆イソフラボンの生理作用の活性本体がダイゼインの代謝物のエクオールである可能性が指摘されて、エクオール産生微生物で大豆胚軸を発酵させる試みも提案されている（特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−３４５５４号公報
【特許文献２】特開平８−７３３９６号公報
【特許文献３】特開平１０−５６９５９号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６０８０３号公報
【特許文献５】特開２０１１−９７８６５号公報
【特許文献６】特開２０１１−１４７３９８号公報
【特許文献７】特開平１１−１９６８２０号公報
【特許文献８】特開２０００−３４２１９０号公報
【特許文献９】特開２００７−３００８８３号公報
【特許文献１０】特開２００７−１１０９１０号公報
【特許文献１１】特開昭６３−２３００５０号公報
【特許文献１２】特開２０１２−１６１３２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１〜４に開示される納豆菌や乳酸菌、大腸菌等のバクテリアの培養に適した温度帯は、通常30〜45℃付近の中温域であるが、他の多くの雑菌もこの中温域が最適増殖温度域となっており、培養中に雑菌が増殖することが懸念される。雑菌が増殖した場合には、メナキノン−７の安定な生産に影響を及ぼすため、雑菌が増殖しないように生産管理に留意が必要である。
また、メナキノン−７の製造に最も一般的に使用される納豆菌は独特の風味を培養物に付加し、またγ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）の放出によるネバネバとした粘質を付加することから、用途の汎用性を高めるにはメナキノン−７を高度に精製しなければならない。【００１２】
ビタミンＫと豆類、あるいはビタミンＫと蛋白質とを一緒に摂取する形態として代表的な「納豆」は、納豆菌が発酵中に生成するγ−ポリグルタミン酸に起因する糸曳き性があるため、粘ついた食感が特徴である。しかし、それゆえに食べにくさや口中に残留する糸曳き感を有することや、また、納豆菌の発酵による特有の発酵臭を有することから嫌厭されることがある。最近では発酵臭が改良された納豆が開発されているものの、万人に食生活に取り入れられにくいのが現状である。【００１３】
別の側面として、食品産業においては多くの蛋白質含有食品副産物が発生し、廃棄されているのが現状であり、飼料としての利用もごく一部に限られており、大きな環境負荷がかかっている。特許文献５〜９に開示される微生物により大豆ホエーやオカラを原料として発酵させているが、よりこれらの副産物を高度に利用するためには、さらに付加価値を高めることが必要である。【００１４】
そこでメナキノン−７はビタミンＫとして栄養価値が高いため、食品副産物を発酵させてメナキノン−７を効率良く産生することができれば非常に有用である。しかし特許文献１，２のような納豆菌を用いた場合、前出の糸曳き性や特有の発酵臭の問題があり、高度利用において汎用性が低いのが現状である。また飼料として用いる場合も糸曳き性や納豆菌の発酵臭は嗜好性に乏しく、摂食性が低下したりする場合がある。【００１５】
また特許文献１１で得られる大豆胚軸を麹菌で作用させた発酵物は糠のようなクセのある発酵臭があり、メナキノン−７の生成についても言及されていない。特許文献１２でも大豆胚軸を乳酸菌で作用させた発酵物を得ているが、これは大豆胚軸に含まれるイソフラボンを発酵によってさらに有用なエクオールを産生させることを目的としており、メナキノン−７の産生については言及されていない。【００１６】
そこで、本発明の目的は、メナキノン−７の製造において新規な製造技術を提供することである。そして該技術を利用してメナキノン−７を含有する食品を提供することも目的とする。【００１７】
また納豆のように豆類のバランスのとれた栄養素や生理機能成分と共にメナキノン−７を一緒に摂取することのできる、新たなメナキノン−７の摂取形態を提供することも目的とする。また必須の栄養素である蛋白質と共にメナキノン−７を一緒に摂取することのできる、新たなメナキノン−７の摂取形態を提供することも目的とする。【００１８】
また蛋白質含有食品副産物を利用してビタミンＫ２として有用なメナキノン−７を生成させ、メナキノン−７を含有しかつ風味も良好な蛋白質含有食品副産物の発酵物を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
前記課題を解決するために、本発明者は広範な種類の微生物を様々な環境下で培養して鋭意検討を行った。そうした中、意外にも高温環境下で増殖可能なバクテリアの中で、高いメナキノン−７の発現率を有するバクテリアを見出し、本菌を種々の培養原料で培養することで前記種々の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２０】
すなわち、本発明は以下のような構成を包含する。
（１）５０℃以上の高温下で増殖可能であってかつメナキノン−７生成能を有するバクテリア、及び、メナキノン−７を含有することを特徴とする、メナキノン−７含有培養物、
（２）メナキノン−７が、該バクテリアを培養させることにより生成したものである、前記（１）記載の培養物、
（３）該バクテリアが、アノキシバチルス属細菌である、前記（１）又は（２）記載の培養物、
（４）該バクテリアが、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・シュレゲリ、バチルス・アシドカルダリウス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・バディウス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ファームス、デサルフォトマキュラム・ニグリフィカンス、サリニビブリオ・コスティコラ、サーモプラズマ・アシドフィラム、サーマス・アクアティカス及びサーマス・サーモフィラスからなる群より選択される１種以上である、前記（１）〜（３）の何れか１項記載の培養物、
（５）培養物が窒素源を含む微生物培養用の培地を用いて培養されたものである、前記（１）〜（４）の何れか１項記載の培養物、
（６）培養物が豆類発酵物である、前記（１）〜（４）の何れか１項記載の培養物、
（７）培養物が蛋白質含有食品副産物の発酵物である、前記（１）〜（４）の何れか１項記載の培養物、
（８）蛋白質含有食品副産物が、大豆ホエー、オカラ、大豆蛋白質加水分解物の高分子画分又は大豆胚軸である、前記（７）記載の培養物、
（９）培養物が、蛋白質を固形分中３０重量％以上含有する発酵蛋白質組成物である、前記（１）〜（４）の何れか１項記載の培養物、
（10）窒素源を少なくとも含む原料を用いて、５０℃以上の高温下で増殖可能であってかつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とするメナキノン−７の製造法、
（11）前記（10）記載の工程において、培養物中にメナキノン−７を生成させた後、該培養物を回収するか又はさらに加工する、メナキノン−７含有培養物の製造法、
（12）該培養物からさらにメナキノン−７を精製する、前記（10）又は（11）記載の製造法、
（13）培養を５０〜８０℃の温度で行う、前記（10）〜（12）の何れか１項記載の製造法、
（14）前記バクテリアが、メナキノン−７を５０℃以上の高温下で２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産するバクテリアである、前記（10）〜（13）の何れか１項記載の製造法、
（15）該バクテリアが、アノキシバチルス属細菌である、前記（14）記載の製造法、
（16）該バクテリアが、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・シュレゲリ、バチルス・アシドカルダリウス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・バディウス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ファームス、デサルフォトマキュラム・ニグリフィカンス、サリニビブリオ・コスティコラ、サーモプラズマ・アシドフィラム、サーマス・アクアティカス及びサーマス・サーモフィラスからなる群より選択される１種以上である、前記（14）又は（15）記載の製造法、
（17）培養物が、窒素源を含む微生物培養用の培地を用いて培養されたものである、前記（11）〜（16）の何れか１項記載の培養物の製造法、
（18）培養物が、豆類を該バクテリアで発酵させて得られる豆類発酵物である、前記（11）〜（16）の何れか１項記載の培養物の製造法、
（19）培養物が、蛋白質含有食品副産物を該バクテリアで発酵させて得られる発酵物である、前記（11）〜（16）の何れか１項記載の培養物の製造法、
（20）培養物が、蛋白質を含む発酵原料を該バクテリアで発酵させて得られる固形分中３０重量％以上の蛋白質を含有する発酵蛋白質組成物である、前記（11）〜（16）の何れか１項記載の培養物の製造法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、高温下でも増殖可能で、かつメナキノン−７を生成しうるバクテリアを選択して種々の培養原料で培養することにより、中温域で増殖する一般的な菌の増殖が抑制され、雑菌の増殖を制御しつつ安定的に大量のメナキノン−７の製造が可能となる。これらのバクテリアは納豆菌のように納豆の独特の風味を呈したり、粘質性を示したりすることがなく、嗜好性に優れ、発酵後に消臭工程を行うなどの手間も不要である。したがって、メナキノン−７を高度に精製せず培養物のままであっても、あるいは、低い精製度であっても、品質に優れたメナキノン−７含有組成物として利用することができる。【００２２】
また、本発明の一形態として、メナキノン−７が多量に蓄積し、かつ糸曳き性や特有の発酵臭が少ない豆類発酵物を得ることができる。そして該豆類発酵物によれば、豆類に由来する豊富な栄養素や生理機能成分と、メナキノン−７を一緒に摂取することができ、骨粗鬆症，動脈硬化や脳卒中の予防にも有用なメナキノン−７の新たな摂取形態を提供することができる。【００２３】
また、本発明の別の一形態として、メナキノン−７が多量に蓄積し、かつ糸曳き性や特有の発酵臭が少ない発酵蛋白質組成物を得ることができる。そして該発酵蛋白質組成物によれば、必須の栄養素である蛋白質と、メナキノン−７を一緒に摂取することができ、骨粗鬆症，動脈硬化や脳卒中の予防にも有用なメナキノン−７の新たな摂取形態を提供することができる。【００２４】
さらに本発明の別の一形態として、メナキノン−７を発酵により生成させ高度に含有させ、かつ納豆のような独特の発酵臭がなく風味も良好な蛋白質含有食品副産物の発酵物を提供することができる。そして大部分が廃棄されていた蛋白質含有食品副産物の付加価値を高め、高度利用を促進させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のメナキノン−７含有培養物は、高温下で増殖可能であってかつメナキノン−７生成能を有するバクテリア、及び、メナキノン−７を含有することを特徴とする。また本発明のメナキノン−７の製造法は、窒素源を少なくとも含む原料を用いて、高温下で増殖可能であってかつメナキノン−７生成能を有するバクテリアを培養し、培養物中にメナキノン−７を生成させることを特徴とする。なお、本明細書においては「培養」及び「発酵」の用語は限定的な意味で区別をしているものではなく、いずれも広義に微生物を増殖させる意味として用いており、相互に適宜読み替えることができる。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２６】
（培養原料）
本発明において、バクテリアを培養するための原料は、通常バクテリアの培養に必要な窒素源や炭素源を含むものであれば特に限定されない。窒素源としてはタンパク質やタンパク質加水分解物、アミノ酸、アンモニア、硫酸アンモニウムや塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等を含有させることができる。タンパク質としては動物性、植物性の何れを問わず使用することができ、例えば市販の乳タンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質、コラーゲンや、これらの加水分解物などを用いることができる。また、これらのタンパク質を含む乳原料や小麦、あるいは大豆や緑豆などの豆類、該豆類から取り出した子葉や胚軸などの天然原料を用いることもできる。また豆類の場合はそれから調製した豆乳や、副産物のオカラを用いることもできる。なお培地成分として一般に使用されるコーンスティープリカー、ポリペプトン、ペプトン、酵母エキス、小麦ふすま等も使用することができる。
本発明では、培養原料として窒素源の他に炭素源、無機塩、ビタミン類も適宜含めることができる。炭素源としては、グルコース、シュークロース等の糖類、有機酸、ｎ−パラフィン等を使用することができる。無機塩としては、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩、リン酸塩、重炭酸塩等を使用することができる。
以下、培養原料として用いることができる具体例を説明するが、本発明はこれらの培養原料に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（１）豆類
本発明において、原料となる豆類は、本発明で使用される微生物で発酵できるものであればよく、特に限定されない。豆類としては例えば大豆、小豆、緑豆、インゲンマメ、ササゲ、エンドウマメ、ソラマメ、ヒヨコマメ、ヒラマメ、ブラックチャナ、ムンクダル、ブラックアイ、レッド・レンティル、カナリオビーンズ、カリオキーナ、ブラックマッペ、ライマメ、タケアズキ、バンバラマメ、レンズマメ、ガラスマメ、ナタマメ、ハッショウマメ、クラスタマメ、シカクマメ、フジマメ、ベニバナインゲン、キマメ、ケツルアズキ、ハウチワマメ、ハマエンドウ、イナゴマメ、デイゴ、クズなどを用いることができる。これらのうち、大豆は本発明の微生物の発酵によるメナキノン−７の生成量が高いため、メナキノン−７高含有の大豆発酵物として好ましい。
また、これらの豆類は枝豆のように完熟していないものでもよく、あるいは発芽大豆のように発芽処理を施したものでもよい。
【００２８】
前記豆類は、微生物により発酵させる前に、脱皮，脱胚軸，粗砕，粉砕，加水，混合，浸漬，磨砕，蒸煮，糖化，加温，殺菌等の前処理をしておくことができる。一つの好ましい前処理例としては、脱皮後に水で浸漬し蒸煮して煮豆を得る前処理工程や、脱皮後にさらに粗砕し、水で浸漬し蒸煮して粗砕した煮豆を得る前処理工程や、脱皮後に水で浸漬し磨砕して得られる懸濁液を加温する前処理工程や、脱皮後粉砕したものに加水し混合して得られる懸濁液を加温する前処理工程などが挙げられる。
【００２９】
（２）蛋白質含有食品副産物
本発明における蛋白質含有食品副産物は、食品産業において天然原料から目的の食品を製造する際に生成する副産物であって蛋白質を含有する物をいう。例えば、大豆の場合、大豆油を抽出した粕である脱脂大豆、みそや煮豆等の製造時の副産物である大豆の煮汁、醤油粕、豆腐の副産物である大豆ホエーやオカラ、豆乳の副産物であるオカラ、分離大豆蛋白の副産物である大豆ホエーやオカラ、濃縮大豆蛋白の副産物である大豆ホエー、大豆ペプチドの製造時の副産物である大豆蛋白質加水分解物の高分子画分（HMF）、大豆胚軸等が例示される。
大豆以外にも、エンドウや小豆等の他の豆類から生成する副産物、菜種やひまわり等の油量種子から生成する油の抽出粕、トウモロコシや芋類等から生成する澱粉の抽出粕、サトウキビやテンサイ等から生成する砂糖の抽出粕、糖蜜、米糠、酒粕など、蛋白質を含む様々な副産物を利用できる。これらのうち、いくつかの副産物の例をより具体的に説明する。
【００３０】
一つの例として大豆ホエーは、脱脂大豆や大豆から水抽出時又は水抽出後に、大豆の主要な貯蔵蛋白質である７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンが除去され、蛋白質としてレクチンやトリプシンインヒビターなどの微量成分が含まれるものである。例えば脱脂大豆を水性溶媒で抽出しオカラを除いて豆乳を得、等電点沈殿（ｐＨ４〜５）により７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンを主成分とする分離大豆蛋白を回収し、副産物として得られる淡黄色の液体を大豆ホエーと称する。脱脂大豆を酸性水溶液やアルコールで洗浄して濃縮大豆蛋白を得る際に副産物として得られる大豆ホエーや、あるいは豆腐や油揚などの製造段階で生じる大豆ホエー、即ち、大豆から得た豆乳に凝固剤を加え、豆乳を凝固させ生じた豆腐を絞った（圧密）後に、生じる淡黄色の上澄み液も大豆ホエーも用いることができ、特に限定はされない。
【００３１】
別の一つの例としてオカラは、大豆から豆腐や豆乳あるいは分離大豆蛋白を製造する際に副生する繊維質、蛋白質、油分を含む蛋白質含有食品副産物である。大豆以外の植物種子から蛋白質を分離した際に副生するオカラ、例えば胡麻、落花生、菜種、ヒマワリ、綿実等の蛋白に富む油糧種子や、えんどう豆、インゲン豆、そら豆等の蛋白含量の多い豆類から、蛋白質を分離した種々のオカラも本発明において用いられる。
【００３２】
別の一つの例として大豆蛋白質加水分解物の高分子画分は、大豆蛋白質をプロテアーゼによって加水分解して低分子の蛋白質加水分解物（大豆ペプチド）を製造する際に、加水分解の過程で比較的高分子の蛋白質加水分解物が低分子にまで分解しきらずに凝集した不溶性画分として廃棄される蛋白質含有食品副産物である。この不溶性画分を以下「ＨＭＦ」（High Molecular weight Fraction）と称する場合がある。
【００３３】
さらに別の例として大豆胚軸は、丸大豆を脱皮して子葉部分を分ける過程で副生する繊維質、蛋白質、油分を含む蛋白質含有食品副産物である。生の大豆胚軸のままで使用することができるが、適宜後述する前処理を行うことができ、また水やアルコール類などの水性溶媒に接触させ、イソフラボン、オリゴ糖、サポニンなどの可溶性成分を除去した後の大豆胚軸抽出残渣も使用することができる。一つの好ましい前処理例としては、大豆胚軸を水で浸漬し蒸煮して蒸煮大豆胚軸を得る前処理工程や、大豆胚軸を粗砕し、水で浸漬し蒸煮して粗砕した蒸煮大豆胚軸を得る前処理工程や、大豆胚軸を水で浸漬し磨砕して得られる懸濁液を加温する前処理工程や、大豆胚軸を粉砕したものに加水し混合して得られる懸濁液を加温する前処理工程などが挙げられる。
【００３４】
（３）蛋白質組成物
本発明において蛋白質組成物は、蛋白質含量が固形分中３０重量％以上、又は５０重量％以上、又は７０重量％以上、又は８０重量％以上の蛋白質主体の組成物を意味する。そして本発明の発酵蛋白質組成物は、該蛋白質組成を有しかつ発酵された形態のものをいう。蛋白質組成物を調製するための原料となる蛋白質含有原料は、微生物の発酵に通常必要な蛋白質を含むものであれば特に限定されない。動物性又は植物性の何れでもよく、乳，卵，魚肉，畜肉等の動物原料や、小麦，大麦，米，とうもろこし等の穀物、大豆，エンドウ，緑豆等の豆類、菜種，ひまわり，綿実等の種子類などの植物原料が例示される。これらは予め脱脂して蛋白質含量を高めたものであってもよい。
このように蛋白質の起源は特に限定されないが、例えば脱脂粉乳、ホエー蛋白濃縮物や酸カゼインやカゼインナトリウム等の乳蛋白質組成物、卵白，卵黄等の卵蛋白質組成物、グルテン等の小麦蛋白質組成物、全脂豆乳，脱脂豆乳，濃縮大豆蛋白，分離大豆蛋白等の大豆蛋白質組成物や、これらの加水分解物などを用いることができ、これらを複数組み合わせることもできる。
【００３５】
（バクテリア）
本発明のメナキノン−７の製造において、培養に使用するバクテリアは、50℃以上の高温環境下で増殖可能であり、かつメナキノン−７を産生する能力を有するものを用いることが重要である。これら二つの特徴を併せ持ったバクテリアを下記の通り本発明者らは見出した。
これらバクテリアの中でもメナキノン−７産生能がより高い菌種を選択することが望ましい。当業者は適宜産生能の高い菌種、さらには菌株を培養試験によりスクリーニングして用いることができる。
【００３６】
本発明者らが見出した、５０℃以上の高温下で増殖可能でかつメナキノン−７生成能を有するバクテリアの菌種は、一つの選択肢としては「アノキシバチルス属細菌」が挙げられる。例えばアノキシバチルス・アミロリティカス、アノキシバチルス・アイデレンシス、アノキシバチルス・ボグロベンシス、アノキシバチルス・カルディプロテオリティカス、アノキシバチルス・コンタミナンス、アノキシバチルス・エリュアネンシス、アノキシバチルス・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・フラビサーマス、アノキシバチルス・フラビサーマス・サブスピーシーズ・ユナネンシス、アノキシバチルス・ゴネンシス、アノキシバチルス・カムチャツケンシス、アノキシバチルス・ケスタンボレンシス、アノキシバチルス・モンゴリエンシス、アノキシバチルス・プシュチネンシス、アノキシバチルス・プシュチノエンシス、アノキシバチルス・ルピエンシス、アノキシバチルス・サラバトリエンシス、アノキシバチルス・テンチョンエンシス、アノキシバチルス・テピダマンス、アノキシバチルス・サーマラム、アノキシバチルス・ボイノスキエンシス等が挙げられる。
【００３７】
またアノキシバチルス属細菌以外の菌種の選択肢としては、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・シュレゲリ、バチルス・アシドカルダリウス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・バディウス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ファームス、デサルフォトマキュラム・ニグリフィカンス、サリニビブリオ・コスティコラ、サーモプラズマ・アシドフィラム、サーマス・アクアティカス、サーマス・サーモフィラス等が挙げられる。
【００３８】
当業者はこれらの菌種から選択されるいずれか一種又は二種以上を選択することができる。さらに前者（アノキシバチルス属）及び後者（アノキシバチルス属以外）の菌種を組み合わせてもよい。
なお、後述した実施例ではアノキシバチルス属細菌、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミスの４種類の菌種による培養例を記載している。これら以外の上記の菌種もまた、いずれも高温域で増殖可能な菌種であり、これらのバクテリアは電子伝達系の補酵素として自らの菌体内に保有しているキノン類の主要なものにメナキノン−７を含む菌種であることから、後述の実施例による新規知見を踏まえれば、これらの菌種もメナキノン−７生成能を有するものであることが把握できる。そして製造者はこれらの市販の菌種を入手して使用することもできる。
【００３９】
特に、メナキノン−７を５０℃以上、好ましくは５０〜８０℃の高温下で２４時間以内に培養液100mlあたり10μg以上生産する、高温下での生産能の高い菌種を選択して使用することが好ましい。そのスクリーニング方法としては、例えば試験菌株を10cfu/mlになるようにトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）に接種し、その菌株に適した５０℃以上の温度で２４時間培養したときの培養液100ml中のメナキノン−７の含量を測定する方法で行うことができる。特に好ましい菌種としては、例えばアノキシバチルス・フラビサーマス、アノキシバチルス・コンタミナンス、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミスが挙げられる。
【００４０】
（培養温度）
一般のバチルス属を含む多くのバクテリアの最適増殖温度域が30〜45℃であるのに対し、本発明で用いられる特定のバクテリアは高温菌であり、最適増殖温度域が50〜80℃である。30〜45℃では多くのバクテリアが活発に増殖可能なため、培養中に雑菌が増殖してしまう可能性があるが、５０℃以上の高温域では他のバクテリアが増殖しにくいため純化培養に適している。
【００４１】
したがって、発酵温度は50℃以上に設定することが雑菌の増殖を抑制しつつメナキノン−７を培養物中に生成させるのに適している。より好ましくは55℃以上の高温域で培養することが好ましい。また培養温度の上限は該バクテリアが死滅しない常識的な範囲とすればよく、通常は80℃以下、好ましくは70℃以下、より好ましくは60℃以下とすることで効率良くメナキノン−７を生成蓄積させることができる。また、該バクテリアの増殖に必要な倍化時間が15分〜30分程度と非常に短いため（参考文献１：The formation of thermophilic spores during the manufacture of whole milk powder : SCOTT et al., Int. J. Dairy Tech., 60 (2), p109-117 (2007)）、本菌のみを効率良く純化培養させるのに適している。
【００４２】
（その他の各種培養条件）
培養は好気的条件、微好気的条件、嫌気的条件など目的のバクテリアが増殖する条件で行うことが好ましい。培養時のpHは通常６〜１１が好適であるが酸性下が適している場合もある。
培養方法は特に限定されず、窒素源等の培養原料を含有する微生物培養用の培地を用いて培養する場合には、一般的に知られている液体培養や平板培養などの公知の方法を用いると良いが、一例としてトリプチケース・ソイブロス液体培地（ベクトン・ディッキントン社製）等の大豆由来成分を含むものが使用できる。ただしこのような培地を用いて培養する方法のみに限定されず、培養原料の種類に合わせた適当な培養方法を用いれば良い。例えば各種発酵食品の製造過程で行われる発酵工程による方法なども適宜取り入れられる。また培養原料の種類によっては必要により、脱皮，脱胚軸，粗砕，粉砕，加水，混合，浸漬，蒸煮，糖化，加温，殺菌，ろ過，磨砕などの前処理工程を経てから、菌体を接触させて発酵を開始することができる。
培養工程において用いられるバクテリアは予備培養しておくこともできる。予備培養後は菌液をそのまま培養原料に加えるか、菌体を遠心分離やフィルターを用いて回収し工程中に加えることができる。
培養工程における初期菌数は、１０の１乗〜１０の６乗cfu/ml、好ましくは１０の３乗〜１０の５乗cfu/mlあればより効率的に発酵させることができる。
前記条件下で例えば４〜２４時間、好ましくは４〜１２時間程度培養するとメナキノン−７が培養物中に生成されるので、生成量が最大になった時点、例えば細菌数が１０の６乗〜１０の８乗cfu/ml程度まで十分増殖した時点で培養を停止すればよい。
【００４３】
（培養物の加工）
得られた培養物中のバクテリアは、培養に利用された後は、該培養物中において最終的に生存状態であってもよいし、必要であれば加熱殺菌や紫外線殺菌等の殺菌処理を経て死滅状態であってもよい。すなわち、該培養物に含まれるバクテリアは、生菌体又は死菌体のいずれであってもよく、該培養物が最終的に加熱や紫外線等により殺菌処理されたものも包含される。製造者は本培養物の各種利用形態に応じて殺菌処理の有無をいずれか選択することができる。
そして該培養物をそのまま回収して、あるいは該培養物を必要により乾燥、濃縮、粉砕、圧搾、蒸煮、熟成、凍結するなどして加工することにより、メナキノン−７含有培養物（メナキノン−７含有組成物）を得ることができる。またさらにこれを添加した食品又は食品素材、あるいは薬剤や飼料を製造することができる。なお、ここでいう食品には飲料も包含される。
これらの食品や食品素材、あるいは薬剤は、メナキノン−７で知られている生理機能の用途、例えば骨粗鬆症、動脈硬化、脳卒中等の疾病の予防用又は治療用の用途として、あるいは抗酸化作用の用途として用いることができる。
なお、該培養物に含まれるメナキノン−７は、前記特定のバクテリアで培養原料を培養することにより生成したものであるが、該培養物中に含まれるメナキノン−７の全量が該培養により生成したものでなくてもよい。該培養物中のメナキノン−７の含量は特に限定されないが、栄養機能的には高い方が好ましく、乾物100g中に１μg以上含有することがより好ましく、10μg以上がさらに好ましい。
【００４４】
なお、該培養物からメナキノン−７を抽出、分離等することによりさらに精製し、得られたメナキノン−７の純品もしくはこれを含有する組成物を添加した食品又は食品素材、あるいは薬剤とすることもできる。培養物からのメナキノン−７の抽出方法は、培養物に対して最も効果的な方法を選択すればよく、特に限定されるものではない。例えば水、あるいはメタノールやエタノール等の有機溶剤を用いて抽出し、メナキノン−７含有組成物を得ることができる。具体的な態様として、例えば大豆などの豆類を原料として培養した場合には、該培養物に水を加え、蛋白質や糖質などの他の成分と共にメナキノン−７を抽出し、不溶物を除去してメナキノン−７が富化された豆乳を得るような態様も含まれる。
また必要により有機溶剤による分配抽出やカラムクロマトグラフィーなどを行ってさらにメナキノン−７含量を高純度に精製したメナキノン−７含有組成物を得ることができる。また培養物から菌体そのものを回収し、乾燥することでも高濃度のメナキノン−７含有組成物として回収できる。
【００４５】
（メナキノン−７含有培養物）
以上の通り、本発明のメナキノン−７含有培養物は、前記の特定のバクテリア及びメナキノン−７を含有するものである。以下、前記バクテリアを各種培養原料で培養して得られる、メナキノン−７含有培養物の具体的態様をいくつか示す。
【００４６】
（１）豆類発酵物
本発明で得られる培養物の一態様として、メナキノン−７含有豆類発酵物は、アノキシバチルス属等の前記に示した特定のバクテリア及びメナキノン−７を含有することを特徴とする。該豆類発酵物は、前記豆類を前記特定のバクテリアで発酵させ、該豆類中にメナキノン−７を生成させる工程を経て製造することができる。
【００４７】
本発明の豆類発酵物の形態は、例えば、納豆のように丸豆や半割れ豆の状態でもよいし、顆粒状、粉末状、懸濁液状のいずれであってもよい。大豆を用いれば納豆と同様の形態で製品とすることができる。本豆類発酵物は納豆のような独特の発酵臭を有さずまろやかな風味であり、また粘質物質の生成もないため粘ついた性状を示さない。
【００４８】
そのため、得られた本豆類発酵物は高い汎用性を有し、さらに加工して豆類発酵物の各種加工品を製造したり、得られた該豆類発酵物を用いた各種食品を製造することができる。より具体的には、例えば得られた該豆類発酵物を加工して煮豆、豆ペースト、豆粉末、豆乳、豆腐、オカラ、醤油に加工して加工品を製造したり、得られた該豆類発酵物をそのまま用いて豆入りのスープやシチュー等を製造することもできる。
【００４９】
（２）蛋白質含有食品副産物の発酵物
本発明で得られる培養物の別の一態様として、メナキノン−７を含有する蛋白質含有食品副産物の発酵物は、アノキシバチルス属等の前記に示した特定のバクテリア及びメナキノン−７を含有することを特徴とする。該発酵物は、前記蛋白質含有食品副産物を前記特定のバクテリアで発酵させ、該食品副産物中にメナキノン−７を生成させる工程を経て製造することができる。
【００５０】
本発明の蛋白質含有食品副産物の発酵物の形態は、例えばそのままの状態でも良いし、適宜顆粒状、粉末状、懸濁液状とすることができる。本発酵物は納豆菌で発酵させたときのような独特の発酵臭を有さず、まろやかな風味であり、また粘質物質の生成もないため粘ついた性状を示さない。
そのため、得られた本発酵物は高い汎用性を有し、さらに加工して蛋白質含有食品副産物の発酵物の各種加工品を製造したり、得られた本発酵物を用いて各種食品、薬剤や飼料を製造することができる。
【００５１】
（３）発酵蛋白質組成物
本発明で得られる培養物のさらに別の一態様として、メナキノン−７を含有する発酵蛋白質組成物は、蛋白質を固形分中３０重量％以上含有するものであって、さらにアノキシバチルス属等の前記に示した特定のバクテリア及びメナキノン−７を含有することを特徴とする。蛋白質含量はさらに固形分中５０重量％以上、又は７０重量％以上、又は８０重量％以上であってもよい。該発酵物は、蛋白質を含む発酵原料を前記特定のバクテリアで発酵させ、メナキノン−７を生成させる工程を少なくとも経て製造することができる。該発酵原料としては、例えば上記の蛋白質組成物を利用することができ、該蛋白質組成物は市販品を用意して用いてもよいし、蛋白質含有原料から蛋白質組成物を製造してこれを用いてもよい。蛋白質は蛋白質含有原料に由来する蛋白質であればよく、発酵工程の順序は任意であり、工程を簡略化するために蛋白質含有原料から蛋白質組成物を製造する中間段階に設けることもできる。
【００５２】
本発明の発酵蛋白質組成物の形態は、例えば、顆粒状、粉末状、懸濁液状とすることができる。本組成物は納豆菌で発酵させたときのような独特の発酵臭を有さず、まろやかな風味であり、また粘質物質の生成もないため粘ついた性状を示さない。
そのため、得られた本組成物は高い汎用性を有し、さらに副原料を添加したり酵素分解したりして加工し、発酵蛋白質組成物の各種加工品を製造したり、得られた本組成物を用いて各種食品や飲料、薬剤や飼料を製造することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例及び比較例等によって本発明をより詳しく説明する。なお、以下の記述において「％」及び「部」は特に断りがない限り「重量％」及び「重量部」を表すものとする。また実施例においてメナキノン−７含量の測定は佐藤らの方法（参考文献２）に従って実施した。
参考文献２: Production of Menaquinone (Vitamin K2)-7 by Bacillus subtilis (2001) J.B.B., 91(1) 16-20【００５４】
＜Ａ．メナキノン−７の製造＞
■実施例Ａ１
「トリプチケース・ソイブロス」培地（ベクトン・ディッキントン社製）３０ｇを蒸留水1000mlに溶解し、オートクレーブにより滅菌し、液体培地を得た。無菌環境ではない開放環境下において、この液体培地にアノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種のバクテリアをそれぞれ１０cfu/mlになるように接種して５５℃で培養し、定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。両者のメナキノン−７産生量は30μg/100mlおよび25μg/100mlであった。【００５５】
■実施例Ａ２
ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（NBRC 12550）を実施例Ａ１と同様の方法及び条件で、６０℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。本菌のメナキノン−７産生量は25μg/100mlであった。【００５６】
■実施例Ａ３
バチルス・コアギュランス（NBRC 12583）を実施例Ａ１と同様の方法及び条件で、５５℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。本菌のメナキノン−７産生量は20μg/100mlであった。【００５７】
■実施例Ａ４
バチルス・リケニフォルミス（NBRC 12200）を実施例Ａ１と同様の方法及び条件で、５０℃で培養して定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた後、産生されたメナキノン−７の含量を測定した。本菌のメナキノン−７産生量は20μg/100mlであった。【００５８】
■実施例Ａ５
アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を実施例Ａ１と同様の方法及び条件で、５５℃で6.5時間培養した（最終菌数：１０の７乗cfu/ml）。アノキシバチルス・フラビサーマスは短時間でメナキノン−７を蓄積し、その含量は13μg/100mlであった。【００５９】
■比較例Ａ１
バチルス・ズブチリス（NBRC 3013）を実施例Ａ１と同様の方法及び条件で、４０℃で6.5時間培養した（最終菌数：１０の５乗cfu/ml）。蓄積されたメナキノン−７含量は３μg/100mlと低いレベルであった。さらに定常期（１０の８乗cfu/ml）まで１０時間かけて十分増殖させたところ、蓄積されたメナキノン−７含量は20μg/100mlであった。【００６０】
■比較例Ａ２
実施例Ａ１において、液体培地にバクテリアを接種することなく、無菌環境ではない開放環境下において、該液体培地を４０℃で培養し、雑菌を定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分増殖させた。この培養液のメナキノン−７の含量を測定したが、検出されなかった。【００６１】
■実施例Ａ６
実施例Ａ１と同様にして滅菌された液体培地を得た。次に無菌環境下において、この液体培地に標準菌株アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を接種して５５℃で前培養した。次に培養原料として、市販の粉末状大豆タンパク「フジプロＲ」（不二製油(株)製、固形分中蛋白質含量：90.8％）100gを水900mlに分散させた。得られた大豆タンパク質溶液に前培養液を１０の３乗cfu/mlの濃度になるよう接種した。次に無菌環境ではない開放環境下において、この溶液を５５℃で８時間培養した後（最終菌数：１０の８乗cfu/ml）、加熱殺菌して培養物を得た。得られた培養物のメナキノン−７含量は固形分100gあたり300μgであった。【００６２】
（品質比較）
実施例Ａ１〜Ａ４及び比較例Ａ１，Ａ２で得られた各培養物の品質を表１で比較した。実施例Ａ１〜Ａ４はいずれも無菌環境ではない開放環境下で培養したにもかかわらず、雑菌は増殖せず、接種したバクテリアの増殖によりメナキノン−７が生成されており、物性は納豆のような粘性物質を産生することなく低粘度の溶液であった。また風味は納豆のような独特の異臭はなく、バクテリアを培養したときの特有の発酵臭のみが感じられたが、総じて良好であった。特に実施例Ａ１、Ａ２は発酵臭も少なくさらに良好であった。
比較例Ａ１ではメナキノン−７が生成されたが、納豆臭が発生しており粘ついた溶液となっていた。また比較例Ａ２ではメナキノン−７は生成されず、雑菌が増殖して腐敗臭を感じた。
以上の結果から、実施例Ａ１〜Ａ４で用いた菌種の菌学的特徴を考察すると、いずれも５０℃以上の高温下で増殖が可能な高温菌であり、さらにいずれも電子伝達系の主要な補酵素としてメナキノン−７を菌体内に有するものであった。【００６３】
（表１）
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【００６４】
以上の通り、通常の雑菌が増殖できない５０℃以上の高温下で増殖可能であり、かつ電子伝達系の補酵素としてメナキノン−７を持つバクテリアを培養すれば、培養物中に他の雑菌が増殖せずに該バクテリアが優勢となり、風味や物性に影響を与えることなくメナキノン−７を有意に生成することが示された。【００６５】
＜Ｂ．豆類発酵物の製造＞
■実施例Ｂ１（大豆発酵物）
大豆を脱皮し３倍加水して一晩静置した。次にこれを蒸煮して得られた蒸煮大豆に、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ１０cfu/gとなるように接種し、５５℃で発酵させて定常期（１０の８乗cfu/g）まで十分微生物を増殖させ、大豆発酵物を得た。そして大豆発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で870μg/100ｇおよび後者で560μg/100gであった。【００６６】
■実施例Ｂ２（ソラマメ発酵物）
実施例Ｂ１において、大豆の代わりにソラマメを使用し、その他は実施例Ｂ１と同様にしてソラマメ発酵物を得た。そしてソラマメ発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定した。各菌種のメナキノン−７産生量は前者（NBRC 15317）で330μg/100ｇおよび後者（DSM 15866）で250μg/100gであった。【００６７】
■実施例Ｂ３（エンドウマメ発酵物）
実施例Ｂ１において、大豆の代わりにエンドウマメを使用し、その他は実施例Ｂ１と同様にしてエンドウマメ発酵物を得た。そしてエンドウマメ発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定した。両者のメナキノン−７産生量は前者（NBRC 15317）で350μg/100ｇおよび後者（DSM 15866）で227μg/100gであった。【００６８】
■比較例Ｂ１（納豆菌による大豆発酵物）
大豆を脱皮し３倍加水して一晩静置した。次にこれを蒸煮して得られた蒸煮大豆に、バチルス・ズブチリス（NBRC 3013）を１０cfu/gになるように接種し、４０℃で発酵させた（最終菌数：１０の８乗cfu/g）。蓄積されたメナキノン−７含量は800μg/100 gであった。【００６９】
（品質比較）
実施例Ｂ１〜Ｂ３及び比較例Ｂ１で得られた各豆類発酵物の品質を表２で比較した。実施例Ｂ１〜Ｂ３はいずれもメナキノン−７が生成されており、物性は納豆のような粘つきがなく発酵前の物性とほとんど変化がなかった。また風味は納豆のような独特の発酵臭はなく、豆本来の味がまろやかに感じられる風味となっていた。豆類の中でも、特に大豆の発酵物がメナキノン−７の生成量が高かった。【００７０】
（表２）
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【００７１】
＜Ｃ．蛋白質含有食品副産物の発酵物の製造＞
■実施例Ｃ１（大豆ホエー発酵物）
低変性脱脂大豆に１２倍量の水を加え、室温（約２０℃）で、ｐＨ７において抽出後、遠心分離し、脱脂豆乳とオカラに分けた。
この脱脂豆乳に塩酸を加えてｐＨ４．５とし、遠心分離して等電点沈殿した不溶性画分を回収し、これを分離大豆蛋白の製造に利用する一方で、水溶性性画分である大豆ホエーが蛋白質含有副産物として生成された。この大豆ホエーにはｐＨ４．５の酸性下で可溶性のホエー蛋白質が固形分中約20％含まれている。
この大豆ホエーを苛性ソーダでｐＨ７に中和したものを２分割して、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ10cfu/gとなるように接種し、５５℃で１８時間発酵させて定常期（１０の８乗cfu/g）まで十分微生物を増殖させ、大豆ホエー発酵物を得た。そして該大豆ホエー発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で390μg/100gおよび後者で260μg/100gであった。得られた発酵物は納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００７２】
■実施例Ｃ２（オカラ発酵物）
次に、実施例Ｃ１で得られたオカラを蛋白質含有副産物として用いた。このオカラには蛋白質が固形分中約25％含まれている。
このオカラを10倍加水しオートクレーブで殺菌した後、２分割して、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ10cfu/mlになるように接種し、実施例Ｃ１と同様にして発酵させ、オカラ発酵物を得た。そして該オカラ発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で310μg/100gおよび後者で200μg/100gであった。得られた発酵物は実施例Ｃ１と同様に納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００７３】
■比較例Ｃ１（納豆菌によるオカラ発酵物）
実施例Ｃ２において、微生物をバチルス・ズブチリス（NBRC 3013）に代えて４０℃で発酵する以外は同様にしてオカラ発酵物を得た。蓄積されたメナキノン−７含量は400μg/100gであった。また風味は納豆のような独特の発酵臭が感じられた。【００７４】
■実施例Ｃ３（ＨＭＦ発酵物）
分離大豆蛋白（不二製油(株)製；商品名『フジプロ−Ｒ』）５％（Ｗ／Ｖ）水溶液１０００ｍｌに、プロテアーゼ（大和化成(株)製；商品名『プロチンＡＣ１０Ｆ』）を２ｇ加え、５０℃，５時間、酵素分解反応を実施した。反応後、１００℃で５分間加熱し酵素を失活させ、室温まで冷却後、８０００Ｇ×１０分間で遠心分離して比較的高分子の大豆蛋白質加水分解物が凝集した不溶性画分（ＨＭＦ）１００ｇを得た。
このHMFを２分割して、それぞれにアノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）を10cfu/mlになるように接種し、実施例Ｃ１と同様にして発酵させ、HMF発酵物を得た。そして該HMF発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で760μg/100gおよび後者で500μg/100gであった。得られた発酵物は実施例Ｃ１と同様に納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００７５】
■実施例Ｃ４（大豆胚軸発酵物）
大豆胚軸を３倍加水して一晩静置した。次にこれを蒸煮して得られた蒸煮大豆胚軸に、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ１０cfu/gとなるように接種し、５５℃で発酵させて定常期（１０の８乗cfu/g）まで十分微生物を増殖させ、大豆胚軸発酵物を得た。そして大豆胚軸発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で1295μg/100ｇおよび後者で850μg/100gであった。得られた大豆胚軸発酵物は納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００７６】
■実施例Ｃ５（大豆胚軸発酵物２）
生の大豆胚軸を１０倍の８０％エタノールに浸漬してイソフラボンやサポニンなどのエタノール可溶性成分を抽出し、該抽出液を濾過により除去し、残った残渣を乾燥して大豆胚軸抽出残渣を得た。この大豆胚軸抽出残渣を３倍加水して実施例Ｃ４と同じ微生物２種をそれぞれ１０cfu/gになるように接種し、その他は実施例Ｃ４と同様にして大豆胚軸発酵物を得た。そして大豆胚軸発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定した。各菌種のメナキノン−７産生量は前者（NBRC 15317）で1115μg/100ｇおよび後者（DSM 15866）で750μg/100gであった。得られた大豆胚軸発酵物は実施例Ｃ４と同様に納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００７７】
■比較例Ｃ２（納豆菌による大豆胚軸発酵物）
大豆胚軸を３倍加水して一晩静置した。次にこれを蒸煮して得られた蒸煮大豆胚軸に、バチルス・ズブチリス（NBRC 3013）を１０cfu/gになるように接種し、４０℃で発酵させた（最終菌数：１０の８乗cfu/g）。蓄積されたメナキノン−７含量は760μg/100mlであった。得られた発酵物は納豆臭が強く感じられた。【００７８】
（品質比較）
実施例Ｃ４，Ｃ５及び比較例Ｃ２で得られた各大豆胚軸発酵物の品質を表３で比較した。実施例Ｃ４，Ｃ５はいずれもメナキノン−７が生成されており、物性は納豆菌で発酵させた比較例Ｃ２のような粘つきがなく発酵前の物性とほとんど変化がなかった。また風味は比較例Ｃ２のような独特の発酵臭はなく、まろやかで良好な風味となっていた。【００７９】
（表３）
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【００８０】
以上の実施例Ｃ１〜Ｃ５の結果から、蛋白質を含む大豆由来の食品副産物からメナキノン−７を高度に含む発酵物を得ることができた。【００８１】
■実施例Ｃ６（菜種粕の発酵物）
大豆以外の食品副産物として菜種粕（粗蛋白質が固形分中約３０％含まれる）を５倍加水後、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を接種し、実施例Ｃ１と同様にして発酵させ、菜種粕発酵物を得た。そして該菜種粕発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、メナキノン−７産生量は250μg/100gであった。得られた発酵物は実施例Ｃ１と同様に納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００８２】
■実施例Ｃ７（脱脂米糠の発酵物）
大豆以外の食品副産物として脱脂米糠（粗蛋白質が固形分中約１５％含まれる）を５倍加水後、アノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）を接種し、実施例Ｃ１と同様にして発酵させ、菜種粕発酵物を得た。そして該菜種粕発酵物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、メナキノン−７産生量は200μg/100gであった。得られた発酵物は実施例Ｃ１と同様に納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００８３】
以上の実施例Ｃ６、Ｃ７の結果から、大豆以外に由来する食品副産物でも蛋白質が含まれていればメナキノン−７を高度に含む発酵物を得ることができた。【００８４】
■実施例Ｃ８（飼料の調製）
実施例Ｃ２で得たオカラ発酵物及びＣ３で得たＨＭＦ発酵物を用いて、表４の配合で飼料を調製し、採卵用鶏種１０羽に給餌した。給餌後１４日後に採取した鶏卵の卵黄中のメナキノン−７濃度を測定した。その結果、メナキノン-７は卵黄中に約100μg/100g含まれていた。
黄は鶏卵（生卵）１個あたり約１５ｇであるので、本発明の発酵物を含有させた飼料を使用して生産された卵を１個摂取すると約１５μｇのメナキノン-７が摂取されることとなる。【００８５】
（表４）飼料配合
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【００８６】
■実施例Ｃ９
実施例Ｃ２で得たオカラ発酵物及びＣ３で得たＨＭＦ発酵物を用いて、表５の配合で養鰻用配合飼料を混合し、等量の水を加えて調製した。上記養鰻用配合飼料を使用して養殖を実施した。１０ｍ２の飼育池に平均体重約３０ｇの鰻１００匹を入れ、２ヵ月間飼育した。飼育期間中の換水率は、毎時約２％で、水温の平均は約２２℃であった。【００８７】
（表５）飼料配合
0006477710.tif 000006
【００８８】
飼育結果を表６に示す。飼育後の鰻のメナキノン−７濃度を測定したところ、12μg/100gであった。これらの結果から、本発明の蛋白質含有食品副産物の発酵物を使用することにより、生残率、生育や飼料効率も良く、メナキノン―７が富化された鰻が得られることが明らかとなり、養殖産業に寄与するところが大である。【００８９】
（表６）
0006477710.tif 000007
【００９０】
＜Ｄ．発酵蛋白質組成物の製造＞
■実施例Ｄ１（発酵大豆蛋白質組成物）
市販の分離大豆蛋白「フジプロＲ」（不二製油(株)製、固形分中蛋白質含量：90.8重量％）を用意した。
この分離大豆蛋白を水２％に溶解したものにアノキシバチルス・フラビサーマス（NBRC 15317）、アノキシバチラス・コンタミナンス（DSM 15866）の２種をそれぞれ１０cfu/mlになるように接種し、５５℃で発酵させて定常期（１０の８乗cfu/ml）まで十分微生物を増殖させ、発酵物を得た。次いで該発酵物を20％水酸化ナトリウム溶液でpHを7.0に調整し、直接加熱式蒸気殺菌機を用いて140℃、10秒間加熱殺菌処理し、噴霧乾燥により粉末化し、発酵大豆蛋白質組成物を得た。
該組成物中に産生されたメナキノン−７の含量を測定したところ、各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で870μg/100ｇおよび後者で560μg/100gであった。得られた組成物は納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００９１】
■実施例Ｄ２（発酵エンドウ蛋白質組成物）
実施例Ｄ１において、分離大豆蛋白の代わりに市販のエンドウ蛋白「ニュートラリスF85M」（ロケットジャパン製、固形分中蛋白質含量：86.0％）を用い、同様に２種の微生物を接種して発酵させ、粉末状の発酵エンドウ蛋白質組成物を得た。各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で342μg/100ｇおよび後者で300μg/100gであった。得られた組成物は納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００９２】
■実施例Ｄ３（発酵大豆ペプチド組成物）
実施例Ｄ１において、分離大豆蛋白の代わりに市販の大豆ペプチド「ハイニュートＡＭ」（不二製油(株)製、固形分中蛋白質含量：92.1％）を用い、同様に２種の微生物を接種して発酵させ、粉末状の発酵大豆ペプチド組成物を得た。各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で756μg/100ｇおよび後者で625μg/100gであった。【００９３】
■実施例Ｄ４（発酵乳蛋白質組成物）
実施例Ｄ１において、分離大豆蛋白の代わりに市販の乳蛋白「ＷＰＣ352」（フォンテラジャパン(株)製、固形分中蛋白質含量：71.6％）を用い、同様に２種の微生物を接種して発酵させ、粉末状の発酵乳蛋白質組成物を得た。各菌種でのメナキノン−７産生量はそれぞれ前者で330μg/100ｇおよび後者で287μg/100gであった。得られた組成物は納豆臭が無く、良好な風味であり、納豆に特有の粘つきもなかった。【００９４】
■比較例Ｄ１（納豆菌による発酵大豆蛋白質組成物）
実施例Ｄ１において、微生物をバチルス・ズブチリス（NBRC 3013）に代えて４０℃で発酵する以外は同様にして粉末状の発酵大豆蛋白質組成物を得た。蓄積されたメナキノン−７含量は200μg/100mlであった。また風味は納豆のような独特の発酵臭が感じられた。【００９５】
■試験例Ｄ１（プロテインドリンクの調製と風味比較）
実施例Ｄ１のアノキシバチルス・フラビサーマスと比較例Ｄ１のバチルス・ズブチリスを発酵させた発酵大豆蛋白質組成物を用い、表７の配合でプロテインドリンクを調製した。このドリンクの風味について１０人のパネラーに「良い」「普通」「悪い」の３段階で感想を添えて評価してもらった。結果を表８に示した。【００９６】
（表７）プロテインドリンク配合
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【００９７】
（表８）パネラー評価結果
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【００９８】
パネラー評価の結果から、実施例Ｄ１で得られたアノキシバチルス・フラビサーマス発酵品は比較例Ｄ１のバチルス・ズブチリス発酵品に比べて風味的にも優れており、好感が持たれ、飲みやすいものとなっていた。アノキシバチルス・フラビサーマス発酵品は発酵後に消臭工程を行うなどの手間も不要であり、飲料の用途にも適していると考えられる。