(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）タンパク質複合体形成色素、
ｂ）環状オリゴマー、及び
ｃ）酒石酸
を含むタンパク質を検出するための組成物。
【請求項２】
さらにセルロース誘導体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記セルロース誘導体が２−ヒドロキシエチルセルロースである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記２−ヒドロキシエチルセルロースが０．１〜０．５％ｗ／ｖの量で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記環状オリゴマーが、シクロデキストリンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記シクロデキストリンが、０．１〜１０％ｗ／ｖの量で存在する、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記シクロデキストリンが、１〜３％ｗ／ｖの量で存在する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
さらにアルコールを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルコールがエタノールである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記エタノールが１〜３％ｗ／ｖの量で存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
タンパク質複合体形成色素がクマシー色素である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
水性溶液である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
タンパク質含有サンプルを請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物に接触させること、及び色素／タンパク質複合体の形成を検出及び／又は定量すること
を含む、タンパク質を検出及び／又は定量する方法。
【請求項１５】
前記タンパク質を含むサンプルがタンパク質を含む支持体の形態である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記支持体が電気泳動ゲルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉ）タンパク質を含むゲルを準備するステップ、
ｉｉ）該ゲルに電場を印加するステップ、
ｉｉｉ）該ゲルを請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物に晒すステップ、及び
ｉｖ）色素／タンパク質複合体の形成を検出及び／又は定量するステップ
を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲルを、ステップｉｉ）の後であってステップｉｉｉ）の前に洗浄しない、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤からタンパク質を分離するための試薬、洗剤の存在下でタンパク質を検出するための試薬、及びこれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は一般的に洗剤とともに存在する。例えば、洗剤はしばしば、細胞からタンパク質を抽出する際に、細胞膜を破壊してそれらを分離するために用いられる。また、洗剤は、典型的にはゲル電気泳動を用いてタンパク質混合物を分離する際に用いられる。洗剤は、クマシー色素がタンパク質に結合する際の色変化に悪影響を及ぼすため、複数の洗浄ステップにより除去されなければならず、染色手順が長時間にわたる複雑なものとなっている。ドデシル硫酸ナトリウムなどの一部の洗剤はタンパク質を変性させることも知られている。したがって、多くの場合、その後の使用前にタンパク質を洗剤から分離することが望ましい。
【０００３】
国際公開第２００７／１２５３７２号（特許文献１）には、シクロデキストリンなどのデキストリンとともにクマシー色素を含むタンパク質検出試薬が開示されている。これによれば、デキストリンが存在することで、クマシー色素とともに存在する洗剤の難点が克服される。その結果、一般的に必要とされる手間のかかる洗浄ステップを行う必要がない。しかし、特許文献１に開示のリン酸などの酸を含む試薬はしばしば、安定性が低く、望ましくない沈殿に起因してバックグラウンド染色が高いことが分かってきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／１２５３７２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質を洗剤から分離するためのさらなる試薬を提供することが要望されている。さらに、感度及び安定性が向上した、タンパク質を検出するためのさらなる試薬の提供が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
ａ）セルロース誘導体、及び
ｂ）環状オリゴマー
を含む、洗剤からタンパク質を分離するための組成物（以下「分離用組成物」という。）を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、洗剤からタンパク質を分離する方法（以下「分離方法」という。）であって、
１）タンパク質及び洗剤を含むサンプルを、
ａ）セルロース誘導体、及び
ｂ）環状オリゴマー
を含む溶液に接触させるステップ、並びに
２）洗剤からタンパク質を分離するステップ
を含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、
ｉ）タンパク質含有サンプルを、環状オリゴマーを含む第一の溶液と接触させるステップ；
ｉｉ）該タンパク質含有サンプルを、タンパク質複合体形成色素を含む第二の溶液と接触させるステップ；及び
ｉｉｉ）色素／タンパク質複合体の形成を検出及び／又は定量するステップ
を含む、タンパク質を検出及び／又は定量する方法（以下「染色方法」という。）を提供する。
【０００９】
好ましくは、第一又は第二の溶液の少なくとも一方は、ｐＫａが４以下である酸を含む。
【００１０】
好ましくは、第一の溶液はセルロース誘導体を含む。
【００１１】
本発明はさらに、
ａ）タンパク質複合体形成色素；
ｂ）環状オリゴマー；及び
ｃ）ヒドロキシカルボン酸
を含む、タンパク質を検出するための組成物（以下「染色用組成物」という。）を提供する。
【００１２】
好ましくは、染色用組成物中のヒドロキシカルボン酸は酒石酸である。
【００１３】
好ましくは、染色用組成物はセルロース誘導体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は製剤Ａ（図１ａ）とインスタントブルー（図１ｂ）の入ったバイアルを示す。
【図２】図２は、製剤Ａで染色した未洗浄ゲルを示す。
【図３】図３は、インスタントブルーで染色した未洗浄のゲルを示す。
【図４】図４は、実施例２ａで得られたゲルを示す。
【図５】図５は、実施例２ｂで得られたゲルを示す。
【図６】図６は、実施例２ｃで得られたゲルを示す。
【図７】図７は、実施例３ａで得られたゲルを示す。
【図８】図８は、実施例３ｂで得られたゲルを示す。
【図９】図９は、実施例３ｃで得られたゲルを示す。
【図１０】図１０は、実施例３ｄで得られたゲルを示す。
【図１１】図１１は、製剤Ｂで染色したゲルのスキャンを示す。
【図１２】図１２は、製剤Ｃで染色したゲルのスキャンを示す。
【図１３】図１３は、製剤Ｄで染色したゲルのスキャンを示す。
【図１４】図１４は、製剤Ａ及びインスタントブルーで染色したゲルのシグナル・ノイズ比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の組成物は典型的にはセルロース誘導体を含む。
【００１６】
「本発明の組成物」とは、上記の「染色用組成物」及び／又は「分離用組成物」を意味する。同様に「本発明の方法」とは、上記の「染色方法」及び／又は「分離方法」を意味する。
【００１７】
「セルロース誘導体」とは、フリーのヒドロキシル基の少なくとも一部が、アルキル基、ヒドロキシアルキル基又はカルボキシアルキル基で官能化されたセルロースを意味する。
【００１８】
好ましくは、セルロース誘導体には、２個又は３個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基又はカルボキシアルキル基が含まれる。したがって、好ましいセルロース誘導体としては、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、カルボキシメチル及びカルボキシエチルが含まれる。
【００１９】
好ましいセルロース誘導体は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースから選択される。
【００２０】
好ましくは、セルロース誘導体は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択される。したがって、本発明で用いられる好ましいセルロース誘導体は、以下の一般式で表される繰り返し単位を含む：
【００２１】
【化１】
0006475671.tif 000002
【００２２】
式中、Ｒは、Ｒ'、Ｒ''又はＲ'''であり、
Ｒ'は、Ｈ又はＣＨ2ＣＨ2ＯＨ（すなわち、ヒドロキシエチルセルロース）を表し、
Ｒ''は、Ｈ又はＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3（すなわち、ヒドロキシプロピルセルロース）を表し、
Ｒ'''は、Ｈ、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ3（すなわち、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を表す。
【００２３】
特に好ましいセルロース誘導体はヒドロキシエチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（すなわち、ＲがＲ'又はＲ''である）から選択される。最も好ましいセルロース誘導体は、２−ヒドロキシエチルセルロースなどのヒドロキシエチルセルロース（すなわち、ＲがＲ'である）である。
【００２４】
本発明の組成物はさらに環状オリゴマーを含む。
【００２５】
「環状オリゴマー」とは、環（又は大員環）を形成しているオリゴマーを意味する。言い換えると、「環状オリゴマー」は環状モノマー単位のオリゴマー（これらは環状オリゴ糖などの用語に包含され得るが）を意味するのではなく、モノマー単位の連続した環の形態であるオリゴマーを意味する。
【００２６】
好適な環状オリゴマーは、それを水溶液に可溶化するヒドロキシルなどの親水性基を有する。環状オリゴマーはリング状であり、内部空洞を有する。好ましくは、環状オリゴマーは、内部空洞が色素、界面活性剤、又は洗剤などの分子を収容できるようなサイズである。
【００２７】
好ましい環状オリゴマーは、環状オリゴ糖、カリックスアレーン、ククルビツリル、ピラーアレーン、又はその誘導体から選択される。
【００２８】
「環状オリゴ糖」とは、環（又は大員環）を形成する、糖分子で構成される化合物であるオリゴ糖を意味する。原則としてあらゆる種類の環状オリゴ糖を用いることができるが、１種類の糖分子のみを含む環状オリゴ糖を用いることが好ましい。
【００２９】
好ましくは、環状オリゴ糖は、環中に５〜１２個の糖分子、より好ましくは６〜８個の糖分子、最も好ましくは６個の糖分子を含む。
【００３０】
好ましい環状オリゴ糖は、シクロデキストリン（すなわち、シクロ−α（１→４）−グルコシド）、シクロデキストラン（シクロ−α（１→６）−グルコシド）、シクロカードラン（シクロ−β（１→３）−グルコシド）、シクロマンニン（シクロ−α（１→４）−マンノシド）、シクロフルクチン（シクロ−β（１→２）−フルクトシド）及びシクロガラクチン（シクロ−β（１→４）−ガラクトシド）から選択される。
【００３１】
本発明の組成物中に用いることができる特に好ましいシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン（シクロ−α（１→４）−グルコヘキサオシド）、β−シクロデキストリン（シクロ−α（１→４）−グルコヘプタオシド）及びγ−シクロデキストリン（シクロ−α（１→４）−グルコオクタオシド）から選択され、α−シクロデキストリン（シクロ−α（１→４）−グルコヘキサオシド）が最も好ましい。
【００３２】
好ましいカリックスアレーンはカリックス［４］アレーン、カリックス［６］アレーン、及びカリックス［８］アレーンから選択される。
【００３３】
好ましいククルビツリルは、ククルビト［６］ウリル及びククルビト［８］ウリルから選択される。
【００３４】
好ましいピラーアレーンはピラー［５］アレーン及びピラー［６］アレーンから選択される。
【００３５】
「環状オリゴマー」及び「環状オリゴ糖」という用語並びに上記特定の環状オリゴマー／オリゴ糖のそれぞれは、これらの化合物の誘導体、例えば、フリーのヒドロキシル基が官能化されたオリゴ糖、又は親水性基及び／又は水と水素結合できる基を有する環状オリゴマーをも包含する。これらの種類の誘導体は、環状オリゴマーの水への溶解度を向上させるため好ましい。
【００３６】
好適な誘導体としては、環状オリゴマー、例えば、フリーのヒドロキシル基の１個以上がＣ1-4アルキル、カルボキシメチル、スルホニル、アセチル、ヒドロキシエチル、又はヒドロキシプロピルで官能化された前述の特定の環状オリゴマー又は環状オリゴ糖のいずれかが含まれる。親水性であり且つ／又は水に水素結合できる誘導体基には、カルボキシメチル、スルホニル、ヒドロキシエチル又はヒドロキシプロピルが含まれる。
【００３７】
本発明の組成物は典型的には水溶液である。タンパク質はイオン強度に感応性が高いため、本発明の組成物の形成には脱イオン水を用いることが好ましいが、これは必須ではない。
【００３８】
分離用組成物は、典型的にはタンパク質を遊離させてその後の使用を可能にし、例えばタンパク質−色素複合体の形成を可能にする。したがって、分離用組成物は、如何なるタンパク質複合体形成色素も含まないことが好ましい。
【００３９】
「タンパク質複合体形成色素」とは、タンパク質−色素複合体の形成により光学的性質の変化、例えば、吸収スペクトルの変化又は発光スペクトルの変化を示す部分を意味する。
【００４０】
本発明の組成物中のさらなる任意成分として、洗剤−環状オリゴマー複合体が形成された後のタンパク質の凝集を防止するのに役立つ可溶化剤が含まれる。使用できる好適な可溶化剤としてはメタノール、エタノール及びイソプロパノールなどのアルコールがあり、エタノールが特に好ましい。
【００４１】
本発明の分離用組成物中の各構成要素の典型的な量を以下の表にまとめる（全ての量は百分率ｗ／ｖ、すなわちグラム毎ｍｌで表されている）。
【００４２】
【表１】
0006475671.tif 000003
【００４３】
上記表中の量は互いに独立しており、本発明の分離用組成物中に含まれる各構成要素の典型的な量及び好ましい量を表している。
【００４４】
環状オリゴマーのその他の好ましい範囲としては、０．１〜１０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜４％ｗ／ｖ、より好ましくは０．５〜４％ｗ／ｖ、例えば１〜３％ｗ／ｖが含まれる。
【００４５】
可溶化剤のその他の好ましい範囲としては０〜５％ｗ／ｖが含まれる。
【００４６】
分離用組成物は、洗剤からのタンパク質の分離に用いることができる。したがって、分離用組成物自体は如何なる洗剤／界面活性剤も含まないことが好ましい。
【００４７】
分離用組成物は、単に成分同士を混合して、例えば、水溶液を調製することができる。しかし、次の成分を添加する前に各成分が完全に溶解するようにしておくことが望ましい。これには、適度な加熱、例えば約４０〜５０℃に加熱することが含まれる。典型的には、環状オリゴマーを脱イオン水に溶解して均一な溶液が得られるまで（例えば、約３０分〜１時間、必要に応じてそれより長時間）混合する。この時点で、例えばセルロース誘導体を含む脱イオン水の溶液を形成し、環状オリゴマーを含む溶液にこれを加えることにより、セルロース誘導体を加えることができる。ただし、当然その他の添加順序も可能である。
【００４８】
最近、シクロデキストリンなどのオリゴ糖を用いることにより、タンパク質−染色色素の色変化を妨げる洗剤及び界面活性剤に関わる困難が克服されることが示唆されている。理論により限定されるものではないが、洗剤は本発明の分離用組成物中に存在する環状オリゴマーと複合体を形成すると考えられる。一又は複数の環状オリゴマーを好適な量で用いることで、洗剤をオリゴマー−洗剤複合体中にトラップすることができ、その結果、これをタンパク質から分離することが可能になる。
【００４９】
本発明の分離用組成物は、洗剤／界面活性剤をトラップしてこれをタンパク質から容易に分離することを可能にする。分離用組成物は、タンパク質／洗剤混合物が電気泳動ゲルに含まれる場合に特に有用である。そのような場合、洗剤がしばしばタンパク質凝集を軽減してゲル中でタンパク質が効果的に分離できるようにする。分離後、環状オリゴマーを含む溶液にゲルを晒して洗剤をトラップすることができる。次いで、電気泳動を続けることによりタンパク質を洗剤から分離することができる。
【００５０】
したがって、本発明はまた、洗剤からタンパク質を分離する方法（以下「分離方法」という。）であって、
１）タンパク質及び洗剤を含むサンプルを、
ａ）セルロース誘導体、及び
ｂ）環状オリゴマー
を含む溶液と接触させるステップ、並びに
２）洗剤からタンパク質を分離するステップ
を含む、方法を提供する。
【００５１】
本発明の分離方法では、環状オリゴマー及び洗剤は、タンパク質から分離することが可能な複合体を形成する。洗剤からタンパク質を分離する好適な方法は当業者に公知であろう。好適な方法としては、限定されるものではないが、遠心分離；サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー；並びに電気泳動が含まれる。
【００５２】
好ましい実施形態では、タンパク質を含むサンプルは電気泳動ゲルであり、方法のステップ２）は、ゲルに電位を印加してタンパク質を分離することを含む。
【００５３】
本発明の分離用組成物は通常はタンパク質と洗剤を分離するために用いられるが、特にタンパク質複合体形成色素を用いた染色の前の前処理としても用いることができる。したがって、本発明の分離用組成物は、好ましくは、
ｉ）
ａ）セルロース誘導体、及び
ｂ）環状オリゴマー
を含む第一の溶液、並びに
ｉｉ）タンパク質複合体形成色素を含む第二の溶液
を含むキットの一部を形成する。
【００５４】
好ましくは、第一の（又は分離用）溶液はタンパク質複合体形成色素を含まない。
【００５５】
タンパク質複合体形成色素は当該技術分野で周知である。一般的に、あらゆるブラッドフォードアッセイ試薬又は他のクマシータンパク質染色試薬を本発明の分離用組成物と組み合わせて使用することができる。使用できる市販のタンパク質複合体形成色素の例としては、シグマ  アルドリッチ社から入手可能なクマシーブリリアントブルーＧ−２５０及びクマシーブリリアントブルーＲ−２５０がある。
【００５６】
一部のタンパク質染色色素、例えば、特にクマシー色素では、色素がタンパク質と複合体形成した時に所望の色変化が得られるようにｐＨを低くする必要がある。典型的には、タンパク質染色試薬のｐＨは約４未満、例えば、おおよそｐＨ１〜２である必要がある。これらの低いｐＨ値はしばしばリン酸などの無機酸を添加することにより達成される。
【００５７】
しかしながら、環状オリゴマー及びタンパク質複合体形成色素を含むタンパク質染色試薬はリン酸などの酸を用いた場合に高レベルの望ましくない沈殿を生じ得ることが見出されている。この沈殿は高いバックグラウンド・ノイズを生じさせ、これが少量のタンパク質の検出を不可能ではなくとも困難にしている。したがって、シクロデキストリン、クマシー色素及びリン酸を含む「洗剤耐性」試薬の典型的な検出レベルは、タンパク質約２０〜３０ｎｇ（ナノグラム）である。
【００５８】
驚くべきことに、本発明の分離用組成物は、リン酸などの酸をタンパク質複合体形成色素と組み合わせて使用した際に形成される沈殿の量を低減することが見出された。実施例に示されるように、沈殿を含まないタンパク質検出システムを提供するために、本発明の分離用組成物中に、及び／又は、タンパク質複合体形成色素と組み合わせて（すなわち、本発明のキット中の第一及び／又は第二の溶液中に）リン酸を含めることができる。
【００５９】
タンパク質−染色色素と組み合わせて使用される酸のｐＫａは４以下、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜３．５である。本発明の分離用組成物中に含まれ得る又はタンパク質複合体形成色素と組み合わせて使用できる好適な酸としては、リン酸、亜リン（ホスホン）酸、過ヨウ素酸、セレン酸、マレイン酸、シュウ酸、ジクロロ酢酸及びヒドロキシカルボン酸（例えば、α−ヒドロキシカルボン酸）が含まれる。好ましい酸は、リン酸、及びα−ヒドロキシカルボン酸、例えば、酒石酸である。
【００６０】
好ましくは、本発明の分離用組成物にはα−ヒドロキシカルボン酸が用いられる。
【００６１】
好ましいα−ヒドロキシカルボン酸は酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、グリコール酸及び乳酸から選択される。特に好ましいα−ヒドロキシカルボン酸は酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、及びイソクエン酸から選択され、酒石酸が最も好ましい。
【００６２】
α−ヒドロキシカルボン酸は、一般的にリン酸などの酸より毒性が低いので、好ましく使用される。さらに、酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸は、沈殿に起因する高バックグラウンド・ノイズから生じる問題がなく、４ｎｇという少量のタンパク質を検出できる非常に感度の高い染色システムを提供することが見出されている。
【００６３】
典型的には、存在する場合、本発明のキットの第一及び／又は第二の溶液中の酸の量は１〜３０％ｗ／ｖ（すなわち、ｇ／ｍｌ）、好ましくは５〜２５％ｗ／ｖ、最も好ましくは１５〜２５％ｗ／ｖである。当業者には、ｐＨが低過ぎるとタンパク質複合体形成色素が適切に機能しないことがあることは知られているであろう。したがって、第一及び／又は第二の溶液には、典型的にはリン酸などの強酸が５〜１５％ｗ／ｖしか含まれないが、酒石酸などのより弱い酸はそれより多い量、例えば１５〜２５％ｗ／ｖで存在することができる。
【００６４】
驚くべきことに、２−ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体を含めることにより、本発明の分離用又は染色用組成物で処理されたタンパク質ゲルの染色のコントラストが大幅に改善されることが見出された。この効果をもたらす正確なメカニズムは完全には理解されていない。しかしながら、セルロース誘導体が環状オリゴマー−洗剤複合体を安定化し、さらにフリーの洗剤の量を低減し、洗剤がタンパク質−色素複合体に与え得る妨害を軽減している可能性がある。
【００６５】
本発明はまた、
ｉ）タンパク質含有サンプルを、環状オリゴマーを含む第一の溶液と接触させるステップ、
ｉｉ）タンパク質含有サンプルを、タンパク質複合体形成色素を含む第二の溶液と接触させるステップ、及び
ｉｉｉ）色素／タンパク質複合体の形成を検出及び／又は定量するステップを含む、タンパク質を検出及び／又は定量する方法（以下「染色方法」という。）を提供する。
【００６６】
好ましい本発明の染色方法では、第一の溶液としての本発明の好ましい分離用組成物と、染色方法における第一の溶液に対応するキットの構成要素（ｉ）及び染色方法における第二の溶液に対応するキットの構成要素（ｉｉ）を含む本発明の好ましいキットとが用いられ、前記好ましい組成物及びキットは上記に説明されており、請求項に記載されている。
【００６７】
特に、本発明の染色方法における第一の溶液は好ましくは前述したセルロース誘導体などのセルロース誘導体を含む。さらに、第一又は第二の溶液の少なくとも一方が、前述した好ましい酸のように、ｐＫａが４以下の酸を含むことが好ましい。
【００６８】
好ましくは、第一及び第二の溶液は水溶液である。
【００６９】
本発明の染色方法のステップ（ｉ）では、環状オリゴマーが、タンパク質含有サンプル中に存在し得る洗剤と複合体を形成する。したがって、ステップ（ｉｉ）でタンパク質複合体形成色素が添加された時、洗剤はタンパク質−色素複合体形成を妨害することができない。したがって、この染色方法では、最初のタンパク質含有サンプル中に相当な量の洗剤が存在する場合でも、非常に低レベルのタンパク質を検出することが可能である。
【００７０】
その結果、タンパク質染色色素と組み合わせてシクロデキストリンなどの環状オリゴマーを使用することにより、存在し得る洗剤を除去するための手間のかかる洗浄ステップが不要な「洗剤抵抗性」のタンパク質染色システムが得られる。これらの試薬は電気泳動中にタンパク質を染色するために用いられるプロトコルを大幅に単純化する。
【００７１】
本発明の染色方法で使用される第二の溶液は任意の種類のタンパク質複合体形成色素であり得るが、クマシー色素が特に好ましい。市販のタンパク質複合体形成色素を、供給されている状態のまま、あるいはｐＫａが４以下の酸の添加などの好適な変更を加えて、本発明の染色方法における第二の溶液として用いることができる。
【００７２】
第一の（又は分離用）溶液は、存在する洗剤を除去する（又はその影響を無効にする）ための「前処理」として働く。次いで、第二の溶液が、色素の通常の手法に従ってタンパク質を染色するために用いられる。本発明に係る前処理（すなわち第一の溶液）を用いることの利点は自明であり、通常必要な洗剤除去ステップを省略できることである。
【００７３】
タンパク質含有サンプルは、水溶液（溶解されている又は懸濁液として）などの溶液の形態であってもよく、沈殿などの固体であってもよく、タンパク質を含む支持体の形態であってもよい。
【００７４】
タンパク質を含む典型的な支持体としてはクロマトグラフィープレート、濾紙、ニトロセルロースのメンブレン若しくは樹脂、又はゲルマトリックス、例えば電気泳動ゲルが含まれる。好適なゲルマトリックスは当業者に周知であり、ポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲルが含まれる。
【００７５】
タンパク質含有サンプルがタンパク質の溶液又は懸濁液である場合、通常、形成後に溶液から環状オリゴマー／洗剤複合体を分離する必要はなく、その代わりに、染色方法のステップ（ｉ）で形成された溶液に単にタンパク質複合体形成色素を加えるだけでよい。
【００７６】
タンパク質含有サンプルがタンパク質を含む支持体の形態である場合、支持体は、ステップ（ｉ）の後、ステップ（ｉｉ）で第二の溶液を添加する前に（例えば、第一の溶液を流して捨てることにより）第一の溶液から除去することができる。これにより、タンパク質複合体形成色素を含む溶液の過度な希釈が回避され、タンパク質−色素複合体の形成に必要な時間を最小限に維持し易くなる。必要に応じて、ステップ（ｉｉ）の前に支持体をすすいでもよい。しかし、第一及び第二の溶液は互いに相溶性があるため、これは必要ではない。
【００７７】
典型的には、本発明の染色及び分離方法は室温で行われるが、必要であれば、わずかに高い温度、例えば最大５０℃で行われる。
【００７８】
環状オリゴマー／洗剤複合体形成の速度はタンパク質含有サンプルの正確な形態に依存する。例えば、タンパク質含有サンプルが溶液であれば、形成速度はほぼ瞬間的である。しかし、電気泳動ゲルのようにタンパク質がマトリックス内にトラップされている場合、タンパク質含有サンプルを第一の溶液と接触させるステップの時間は通常ほとんどの場合１５分までであるが、タンパク質含有サンプル中の洗剤の濃度によっては１時間かかることもある。ステップ（ｉｉ）でタンパク質−色素複合体を形成するためにも同様なタイムスケールが必要である。
【００７９】
第一の溶液は、電気泳動ゲルなどのゲルを染色するために使用される場合、好ましくはマイクロ波でゲルと共に最大３０秒間、例えば２０秒間加熱される。これらの値は典型的な１０００Ｗのマイクロ波の場合である。マイクロ波処理後、組成物及びゲルを通常、例えば１５分間、室温（例えば２０〜２５℃）下、又は、例えば５０℃の高温下に置いておく。高温はウォーターバス又は任意の他の好適な手段を用いて維持することができる。このプロトコルは、必要に応じて、ステップ（ｉｉ）でも繰り返してよい。しかし、ステップ（ｉｉ）のプロトコルは、使用されるタンパク質複合体形成色素に応じてわずかに変わり得る。当業者であれば、所与のタンパク質複合体形成色素に用いるべき好適なプロトコルが分かるであろう。
【００８０】
これらは好ましいプロトコルであるが、実施例には、本発明の染色キットを用いれば、室温下でたった１５分で電気泳動ゲルを染色できることを示されている。典型的には、本発明の方法は、電気泳動ゲルを第一の溶液に最大３０分間、例えば５〜１５分間晒すこと；第一の溶液を流して捨てること；及び電気泳動ゲルを第二の溶液に最大３０分間、例えば５〜１５分間晒すことを含む。当然ながら、ゲルを第一及び第二の溶液に長く晒すほど、特に、前述したようにゲルを高温で染色する場合に、方法の感度は高くなる。
【００８１】
したがって、好ましい実施形態（特に、タンパク質含有サンプルが電気泳動ゲルであり、高い感度が要求される場合）では、本発明の染色方法は、第一の溶液をタンパク質含有サンプルと接触させるステップ、第一の溶液及びタンパク質含有サンプルを加熱する（例えばマイクロ波により１０〜３０秒間、好ましくは１５〜２０秒間加熱する）ステップ、並びに溶液及びサンプルを２０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の温度で最大１時間、好ましくは５〜３０分間、より好ましくは５〜２０分間維持するステップを含む。
【００８２】
好ましくは、環状オリゴマーの使用は、タンパク質を検出する前に洗剤及び／又は界面活性剤を除去する必要がないことを意味する。したがって、ゲルを泳動した後に洗浄することなく本発明の組成物を用いて電気泳動ゲルを染色することができる。したがって、好ましい態様では、本発明は、
ａ）タンパク質を含むゲルを準備するステップ、
ｂ）該ゲルに電場を印加するステップ、
ｃ）該ゲルを、環状オリゴマーを含む第一の溶液に晒すステップ、
ｄ）必要に応じて、該ゲルを第一の溶液から取り出すステップ、
ｅ）タンパク質含有サンプルを、タンパク質複合体形成色素を含む第二の溶液に晒すステップ、及び
ｆ）色素／タンパク質複合体形成を検出及び／又は定量するステップ
を含む、タンパク質を検出及び／又は定量する方法に関する。
【００８３】
このような方法では、ステップ（ｂ）の後、ステップ（ｃ）の前にゲルを洗浄しないことが好ましい。ポリアクリルアミド又はアガロースゲルなどの任意の好適な電気泳動ゲルをこの方法に用いることができる。
【００８４】
ステップ（ｄ）の「必要に応じて、該ゲルを第一の溶液から取り出すステップ」とは、ゲルと第一の溶液が任意の手段によって分離されて、ステップ（ｅ）でゲルを第二の溶液に晒すときに第一の溶液が存在しないようにすることを意味する。実施上、電気泳動ゲルは通常非常に脆いので、ステップ（ｄ）の間に実際にゲルを動かすのは望ましくないことがある。その代わりに、ステップ（ｄ）は通常、第一の溶液を流して捨て、方法に用いられている容器中にゲルを残すようにすることを含む。
【００８５】
本発明の染色方法では、タンパク質／色素複合体の検出は、存在するタンパク質／色素の量を定量することによりタンパク質の量又は濃度を決定することを含む。典型的には、タンパク質−色素複合体の形成は色素の分光学的性質を変化させ、これを公知の方法で検出及び分析することができる。例えば、定量は、色素／タンパク質複合体の吸収又は発光スペクトルの変化を測定することを含む方法で行うことができる。定量は、例えば色変化の測定を含む。ほとんどのタンパク質複合体形成色素で、一般的に約４００〜約７００ｎｍの波長の吸光度が測定される。
【００８６】
好適なリアルタイム分光手段を用いて、経時的な吸光度変化を測定することができる。クマシーブリリアントブルーＧ−２５０の場合、吸光度は、タンパク質と複合体形成した時のこの色素の吸収極大である約５９５ｎｍの波長で測定される。クマシーブリリアントブルーＧ−２５０を用いる場合、色素／タンパク質複合体形成による５９５ｎｍの吸光度の増大をモニタリングすることによりタンパク質を検出することができる。
【００８７】
タンパク質濃度を決定するために、測定された吸光度又は発光を、標準値、標準値セット、又は標準曲線と比較することができる。
【００８８】
本発明の方法は、自動化及び多数サンプルの分析に非常に適している。好適なハイスループット装置は市販されており、当業者に公知である。
【００８９】
前述したように、本発明の分離用組成物を使用することにより、タンパク質複合体形成色素及びシクロデキストリンなどの環状オリゴマーと組み合わせてリン酸などの無機酸を用いた時に生じる問題が回避される。驚くべきことに、これらの欠点は、「オールインワン」の染色用組成物中にヒドロキシカルボン酸を用いた時にも克服できることが見出された。
【００９０】
したがって、本発明は、
ａ）タンパク質複合体形成色素；
ｂ）環状オリゴマー；及び
ｃ）ヒドロキシカルボン酸
を含む、タンパク質を検出するための組成物（本明細書中では、「染色用組成物」と呼ぶ）に関する。
【００９１】
いくつかの実施形態では、染色用組成物中の環状オリゴマーはα−シクロデキストリン（シクロ−α（１→４）−グルコヘキサオシド）ではない。
【００９２】
好ましくは、染色用組成物中のヒドロキシカルボン酸はα−ヒドロキシカルボン酸、例えば酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、グリコール酸、又は乳酸である。最も好ましいヒドロキシカルボン酸は酒石酸である。
【００９３】
好ましくは、染色用組成物はさらに、セルロース誘導体、例えば分離用組成物との関係において前述した好ましいセルロース誘導体のいずれかを含む。最も好ましいセルロース誘導体は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースであり、ヒドロキシエチルセルロース、具体的には２−ヒドロキシエチルセルロースが特に好ましい。
【００９４】
本発明の染色用組成物中の種々の構成要素の典型的な量を以下の表に示す（全ての量はｗ／ｖ百分率、すなわちグラム毎ｍｌで表されている）。
【００９５】
【表２】
0006475671.tif 000004
【００９６】
本発明の染色用組成物は、水溶液などの溶液の形態であってもよく、組み合わせて本発明の染色用組成物を形成する二種以上の溶液を含むキットも本発明に含まれる。したがって、本発明はさらに、
ａ）タンパク質複合体形成色素、
ｂ）環状オリゴマー、及び
ｃ）ヒドロキシカルボン酸
を含むキットであって、構成要素（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、組み合わされた時にタンパク質検出用組成物を形成する２つ以上の別個の組成物中に存在する、キットを提供する。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態では、キットは、
ｉ）タンパク質染色色素を含む組成物、並びに
ｉｉ）環状オリゴマー及びヒドロキシカルボン酸を含む組成物
を含み、構成要素（ｉ）及び（ｉｉ）は、組み合わされた時、タンパク質を検出するための組成物を形成する。
【００９８】
そのようなキットでは、第一の溶液はさらに、好ましくは、α−ヒドロキシカルボン酸などのヒドロキシカルボン酸を含む。好ましいα−ヒドロキシカルボン酸は前述した通りであり、酒石酸が最も好ましい。
【００９９】
キットの形態で染色用組成物を提供することは、全体としての組成物の安定性及び有効期間を向上させることができるため、好ましい。
【０１００】
このようなキットはさらに、第二の溶液中にセルロース誘導体を含むことが好ましい。好ましいセルロース誘導体は前述した通りであり、２−ヒドロキシエチルセルロースが最も好ましい。
【０１０１】
そのようなキットはさらに、第二の溶液中に可溶化剤を含むことが好ましい。好ましい可溶化剤は前述した通りであり、エタノールが最も好ましい。
【０１０２】
環状オリゴマー、α−ヒドロキシカルボン酸、所望により用いてもよいセルロース誘導体、及び所望により用いてもよい可溶化剤の好ましい種類及び量は、本発明の分離用組成物との関連で前述した通りである。
【０１０３】
本発明の染色用組成物はさらに、本発明の別の方法において、タンパク質含有サンプルに直接アプライされてもよい。
【０１０４】
したがって、本発明はさらに、タンパク質含有サンプルを、
ａ）タンパク質複合体形成色素、
ｂ）環状オリゴマー、及び
ｃ）ヒドロキシカルボン酸
を含む溶液と接触させるステップ、並びに
色素／タンパク質複合体形成を検出及び／又は定量するステップ
を含む、タンパク質を検出及び／又は定量する方法を提供する。
【０１０５】
好ましくは、タンパク質を含むサンプルは、電気泳動ゲルなどの、タンパク質を含む支持体の形態である。
【０１０６】
したがって、染色用組成物を用いる特に好ましい方法は、
ｉ）タンパク質を含むゲルを用意するステップ、
ｉｉ）ゲルに電場を印加するステップ、
ｉｉｉ）ゲルを本発明の染色用組成物に晒すステップ、並びに
ｉｖ）色素／タンパク質複合体形成を検出及び／又は定量するステップ
を含む。
【０１０７】
このような方法では、好ましくは、ステップ（ｉｉ）の後、ステップ（ｉｉｉ）の前にゲルを洗浄しない。ポリアクリルアミド又はアガロースゲルなどの任意の好適な電気泳動ゲルをこの方法で使用することができる。
【０１０８】
前述したように、色素／タンパク質複合体形成の速度はタンパク質含有サンプルの正確な形態に依存する。例えば、タンパク質が電気泳動ゲルなどのマトリックス内にトラップされている場合、タンパク質含有サンプルを本発明の染色用組成物と接触させるステップは通常、ほとんどの場合最大１５分であるが、非常に低濃度でのみ存在するタンパク質を効果的に染色するために最大１時間かかることもある。
【０１０９】
典型的には、上記で分離用組成物について説明したのと同じ方法を用いて、染色用組成物を電気泳動ゲルにアプライしてタンパク質を染色する。したがって、電気泳動ゲルなどのゲルを染色するために用いる場合、本発明の染色用組成物は、好ましくは、ゲルと一緒にマイクロ波中で最大３０秒間、例えば２０秒間加熱される。これらの値は典型的な１０００Ｗのマイクロ波の場合のものである。マイクロ波処理後、組成物及びゲルを通常、室温（例えば２０〜２５℃）又は５０℃などの高温のいずれかで例えば１５分間置く。高温は、ウォーターバス又は任意のその他の好適な手段を用いて維持することができる。
【０１１０】
前述したように、本発明のキット中の第一（すなわち、分離用）及び第二の溶液を使用することにより、タンパク質を含むサンプルとタンパク質複合体形成色素とを接触させた時に形成される沈殿の量が低減される。そうであっても、酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸を用いた時に最良の結果が得られる。さらに、セルロース誘導体を用いることにより、特に電気泳動ゲル中に存在する時、色素／タンパク質複合体のコントラストが向上する。
【０１１１】
したがって、本発明はさらに、タンパク質複合体形成色素を含む酸性化された溶液中での沈殿の量を低減するためのヒドロキシカルボン酸、特に酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸の使用に関する。
【０１１２】
本発明はさらに、色素／タンパク質複合体の染色を強化するためのヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体の使用に関する。
【０１１３】
本発明はさらに、色素／タンパク質複合体の染色を強化するための、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体とシクロデキストリン（例えば、α−、β−、又はγ−シクロデキストリン）などの環状オリゴマーとを組み合わせて使用することに関する。
【０１１４】
明らかに、タンパク質を検出するための組成物中の沈殿は、必然的に、染色された混合物、例えば染色された電気泳動ゲルの不明瞭なバックグラウンドを生じさせる。
【０１１５】
したがって、本発明は、色素／タンパク質複合体の染色を強化するための、ヒドロキシカルボン酸、特に酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸と、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体とを組み合わせて使用することに関する。
【０１１６】
本発明はさらに、色素／タンパク質複合体の染色を強化するための、ヒドロキシカルボン酸、特に酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸と、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体と、シクロデキストリン（例えばα−、β−、又はγ−シクロデキストリン）などの環状オリゴマーとを組み合わせて使用することに関する。
【０１１７】
「染色を強化する」とは、例えばタンパク質複合体形成色素に晒したタンパク質を含むゲル中のコントラストを向上させることにより、染色混合物中で色素／タンパク質複合体を特定し易くすることを意味する。この向上は、色素／タンパク質複合体形成を向上させること、タンパク質を含まない領域におけるバックグラウンドの量を低減すること、又はその両方によるものであってもよい。染色強化の向上は、例えばデンシトメトリーを用いて、シグナル・ノイズ比を計算することにより決定することができる。
【０１１８】
したがって、別の観点から見ると、本発明は、好ましくはデンシトメトリーにより決定される、ゲル中の染色された色素／タンパク質複合体のシグナル・ノイズ比を向上させるための、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体の使用に関する。
【０１１９】
本発明はさらに、好ましくはデンシトメトリーにより決定される、ゲル中の染色された色素／タンパク質複合体のシグナル・ノイズ比を向上させるための、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体とシクロデキストリン（例えば、α−、β−、又はγ−シクロデキストリン）などの環状オリゴマーとの組み合わせの使用に関する。
【０１２０】
本発明はさらに、好ましくはデンシトメトリーにより決定される、ゲル中の染色された色素／タンパク質複合体のシグナル・ノイズ比を向上させるための、ヒドロキシカルボン酸、特に酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸と、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体とを組み合わせて使用することに関する。
【０１２１】
本発明はさらに、好ましくはデンシトメトリーにより決定される、ゲル中の染色された色素／タンパク質複合体のシグナル・ノイズ比を向上させるための、ヒドロキシカルボン酸、特に酒石酸などのα−ヒドロキシカルボン酸と、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、２−ヒドロキシエチルセルロース）などのセルロース誘導体と、シクロデキストリン（例えば、α−、β−、又はγ−シクロデキストリン）などの環状オリゴマーとを組み合わせて使用することに関する。
【０１２２】
上記の使用において、セルロース誘導体は好ましくは溶液の一部として存在する（すなわち、セルロース誘導体は固体マトリックスではない）。したがって、本発明は、好ましくは、前述の効果を実現するための、ヒドロキシカルボン酸及び／又は環状オリゴマーと組み合わされてもよい、セルロース誘導体の溶液の使用に関する。
【０１２３】
シグナル・ノイズ比の向上は、本発明の方法において第二の溶液を添加する前に第一の溶液が除去された場合でも達成可能である。これは、本発明の方法のステップ（ｉ）の間にゲルに浸透する又はコーティングされるセルロース誘導体によると考えられる。したがって、第一の溶液が除去されてステップ（ｉｉ）の前にゲルがすすがれる場合でも、セルロース誘導体の少なくとも一部はゲル中に保持され、シグナル・ノイズ比が向上する。
【０１２４】
同じ考察が、第一及び／又は第二の溶液中に存在し得るα−ヒドロキシカルボン酸にも当てはまる。したがって、α−ヒドロキシカルボン酸が第一の溶液中にのみ含まれる場合でも、第一の溶液が除去される場合でも、酸はゲルに浸透して保持される。したがって、酸は、第二の溶液に含まれてなくてもシグナル・ノイズ比を向上させ得る。当然ながら、第一及び第二の溶液の両方の中にα−ヒドロキシカルボン酸を用いた場合に最良の結果が得られる。
【実施例】
【０１２５】
以下に非限定的な実施例及び図を用いて本発明をさらに説明する。
【０１２６】
［実施例１］
脱イオン水中で原料を混合することにより、以下の製剤を調製した。
【０１２７】
製剤Ａ：
酒石酸                          ２０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン            ２％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
Ｇ２５０色素                      ０．００１５％Ｗ／ｖ
比較として、国際公開第２００７／１２５３７２号の実施例に基づいてリン酸、α−シクロデキストリン、エタノール及びクマシー色素を含むと考えられる「インスタントブルー」をエクスぺディオン社から入手した。
【０１２８】
図１ａは製剤Ａの入ったバイアルを示し、図１ｂはインスタントブルーの入ったバイアルを示す。これらの図から、本発明の染色用製剤は透明で沈殿がなく、明るい青緑色であったことが明確にわかる。これに対し、インスタントブルーは濁った茶色で、かなりの量の浮遊した粒子／沈殿物を生じていた。
【０１２９】
これらの製剤は種々の濃度のＢＳＡを含むＰＡＧＥゲルを染色するために使用された。１時間染色した後の未洗浄ゲルを図２及び３に示す。インスタントブルー中の沈殿物は高レベルのため、バックグラウンドに対する濃度の低いＢＳＡを観察することは困難であった。
【０１３０】
本実施例は、リン酸と共にシクロデキストリンなどの環状オリゴマーを含有するタンパク質染色溶液における高レベルの沈殿物を明確に示している。
【０１３１】
［実施例２］
脱イオン水中で原料を混合することにより、以下の製剤を調製した。
【０１３２】
製剤Ｉ−１
酒石酸                        ２０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン          ４％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
製剤Ｉ−２
リン酸                          １０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン            ４％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
製剤Ｉ−３
α−シクロデキストリン            ４％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
製剤ＩＩ−１
Ｇ２５０色素                      ０．０１３％ｗ／ｖ
酒石酸                          ２０％ｗ／ｖ
製剤ＩＩ−２
Ｇ２５０色素                      ０．０１３％ｗ／ｖ
リン酸                          １０％ｗ／ｖ
種々の濃度のＢＳＡを含むＰＡＧＥゲルを、上記製剤Ｉ及びＩＩを以下のように組み合わせて使用して染色した。
【０１３３】
【表３】
0006475671.tif 000005
【０１３４】
最初にＰＡＧＥゲルを用いて室温で１０分間、前処理Ｉを行った。前処理後、処理溶液を捨て、染色溶液ＩＩを加えた。それからゲルをさらに室温に５分間置いた後、染色溶液を除去した。
【０１３５】
２ａ、２ｂ及び２ｃの染色ゲルをそれぞれ図４、５及び６に示す。これらのゲルは、本発明のキットが沈殿の問題を生じることなくリン酸などの酸とともに使用できることを明確に示している。さらに、図４と５／６との比較から、染色バンドは酒石酸を用いた場合に非常に鮮明になることがわかる。
【０１３６】
［実施例３］
脱イオン水中で原料を混合することにより、以下の製剤を調製した。
【０１３７】
製剤Ｉ−４
α−シクロデキストリン            ４％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
製剤Ｉ−５
酒石酸                          ２０％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
製剤Ｉ−６
酒石酸                          ２０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン            ４％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
種々の濃度のＢＳＡを含むＰＡＧＥゲルを、上記製剤Ｉ及びＩＩを以下のように組み合わせて使用して染色した。
【０１３８】
【表４】
0006475671.tif 000006
【０１３９】
最初にＰＡＧＥゲルを用いて室温で１０分間、前処理Ｉを行った。前処理後、処理溶液を捨て、染色溶液ＩＩを加えた。ゲルをさらに室温で５分間置いた後、染色溶液を除去した。
【０１４０】
実施例３ａ、３ｂ、３ｃ及び３ｄの染色ゲルをそれぞれ図７、８、９及び１０に示す。図７及び８のゲルは、酒石酸を第一の溶液に含める（すなわち、前処理を行う）必要がないことを示している。図９は、環状オリゴマーについて前処理を行わないとバンドが見えないことを示している。さらに、図１０は、セルロース誘導体について前処理を行わないと、バンドがほとんど見えないこと示している。
【０１４１】
［実施例４］
脱イオン水中で種々の原料を溶解させることにより、以下の製剤を調製した。
【０１４２】
製剤Ｂ
リン酸                          ２０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン            ２％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
Ｇ２５０色素                      ０．００４５％ｗ／ｖ
製剤Ｃ
酒石酸                          ２０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン            ２％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
Ｇ２５０色素                      ０．００４５％ｗ／ｖ
製剤Ｄ
酒石酸                          ２０％ｗ／ｖ
α−シクロデキストリン            ２％ｗ／ｖ
エタノール                        ２％ｗ／ｖ
２−ヒドロキシエチルセルロース    ０．３ｗ／ｖ
Ｇ２５０色素                      ０．００４５％ｗ／ｖ
ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は標準条件下で市販のゲル製品を使用して完成された。市販品のサンプルと購入したウシ血清アルブミン（標準）とを作製し、ゲル上で実行した。市販のマーカーも添加した。電気泳動が完了した後、ゲルをプラスチックの覆いから除去し、上記製剤の一つを含む小さな容器に入れた。同一ゲルが実行され、各製剤を使って試された。染色時間は、図１１から１３が染色ゲルのスキャンを示す各製剤に対して同一とした。
【０１４３】
ゲル中の真ん中の４つのバンドが興味のあるテストバンドであり、外側のレーンは標準マーカーである。ゲル像はスキャナーで得られるもので、ゲルとスキャナーのガラススクリーンとの間に水層が閉じ込められた薄灰色か、ゲルとスクリーンとの間に空気層（又は泡）があって白いかのどちらかであるゲルバックグラウンドとなっている。
【０１４４】
ゲルとスキャナーのガラス板との間の水層の有無によってバックグラウンドに差異があるにしても、図１１〜１３の結果は、リン酸の代わりに酒石酸を用いることによって、４つのテストバンドのコントラストを改善し、これらの識別を容易にした（図１１及び１２参照）。さらに、図１２及び１３は、２−ヒドロキシエチルセルロースを添加することで、染色タンパク質試料とバックグラウンドとの間のコントラストが一層大きくなることを示している。
【０１４５】
［実施例５］
上記製剤Ａ及びインスタントブルーを用いて種々の濃度のＢＳＡを含むＰＡＧＥゲルを染色した。バックグラウンドに対する染色タンパク質の比率は、デンシトメトリーにより測定した。結果を図１４ａ−ｃに示す。
【０１４６】
図１４ｃは製剤Ａが濃度２０ｎｇ未満でタンパク質を検出できることを明確に示している。さらに、図１４ａ、１４ｂ及び１４ｃのそれぞれは、本発明の染色用組成物を使用することにより、得られるシグナル・ノイズ比を著しく改善することを示している。
【図１】
0006475671.tif 000007
【図２】
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【図３】
0006475671.tif 000009
【図４】
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【図５】
0006475671.tif 000011
【図６】
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【図７】
0006475671.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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