(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
油中における均等で相が安定した懸濁液の形態である生物学的療法の抗炎症局所組成物であって、該組成物は、酸果桜桃の種子から予め分離されたフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物からなる第１の成分と、酸果桜桃の種子から予め分離された酸果桜桃の種子油である別の第２の成分との混合物を含み、前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物及び前記酸果桜桃の種子油は、抗炎症効果をもたらす量で存在し、前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物及び前記酸果桜桃の種子油はそれぞれ、全組成物のおおよそ３〜５重量％であり、前記組成物は、親油性成分と、親水性成分と、前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物と、前記酸果桜桃の種子油との混合物を含み、前記組成物は、おおよそ５重量％のラノリンと、おおよそ５重量％のセチル及びステアリルアルコールと、おおよそ１０重量％のステアリンと、おおよそ５重量％のミリスチン酸イソプロピルと、おおよそ０．８重量％のビタミンＣと、おおよそ２重量％のラウリル硫酸ナトリウムと、おおよそ５重量％のグリセリンと、おおよそ５重量％のプロピレングリコールと、おおよそ５２．２重量％の水と、おおよそ５重量％の前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物と、おおよそ５重量％の前記酸果桜桃の種子油とからなり、前記組成物は、局所適用された際に、ＣＤ３＋Ｔリンパ球による疾患に関連する炎症性サイトカインの産生を阻害し、前記ＣＤ３＋Ｔリンパ球による疾患に関連する炎症性サイトカインは、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性糖尿病（１型、ＩＤＤＭ）、２型糖尿病（メタボリックシンドローム）、気管支ぜんそく、尋常性乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円形脱毛症、橋本甲状腺炎、ＩｇＡ腎症、水腫、ケル胎児赤芽球症及び天疱瘡からなる疾患の群から選ばれる疾患による、生物学的療法の抗炎症局所組成物。
【請求項２】
前記親油性成分と前記親水性成分との組み合わせはクリーム基剤となり、該クリーム基剤に前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物及び前記酸果桜桃の種子油が与えられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物及び前記酸果桜桃の種子油の添加前に前記クリーム基剤を形成するために、前記クリーム基剤は、溶けた又は液状の状態になるまで前記親油性成分と前記親水性成分のそれぞれを別々に加熱し、溶けた又は液状の前記親油性成分と前記親水性成分とを混合し、前記親油性成分と前記親水性成分との混合物を冷却させて生じた生成物である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
油中における均等で相が安定した懸濁液の形態である生物学的療法の抗炎症組成物の製造方法であって、該組成物は、酸果桜桃の種子から予め分離された、粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物と、酸果桜桃の種子から予め分離された酸果桜桃の種子油との混合物を含み、前記粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物及び前記酸果桜桃の種子油は、抗炎症効果をもたらす量で存在し、前記組成物は、局所適用された際に、ＣＤ３＋Ｔリンパ球による疾患に関連する炎症性サイトカインの産生を阻害し、前記方法は、
（ａ）親油性成分を提供するステップと、
（ｂ）親水性成分を提供するステップと、
（ｃ）酸果桜桃の種子からフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物を分離して、粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物を提供するステップと、
（ｄ）酸果桜桃の種子から酸果桜桃の種子油を分離して、酸果桜桃の種子油を提供するステップと、
（ｅ）前記親油性成分及び前記親水性成分を混合する前に、前記親油性成分及び前記親水性成分を溶かす又は液状にする十分な温度まで前記親油性成分及び親水性成分を加熱するステップと、
（ｆ）加熱された前記親油性成分及び加熱された前記親水性成分を混合するステップと、
（ｇ）混合及び加熱された前記親油性成分及び前記親水性成分を冷却させてクリーム基剤を形成するステップと、
（ｈ）前記酸果桜桃の種子油及び前記粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物を前記クリーム基剤に混合するステップと、
を含み、前記ＣＤ３＋Ｔリンパ球による疾患に関連する炎症性サイトカインは、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性糖尿病（１型、ＩＤＤＭ）、２型糖尿病（メタボリックシンドローム）、気管支ぜんそく、尋常性乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円形脱毛症、橋本甲状腺炎、ＩｇＡ腎症、水腫、ケル胎児赤芽球症及び天疱瘡からなる疾患の群から選ばれる疾患による、方法。
【請求項５】
前記酸果桜桃の種子油及び前記粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物を前記クリーム基剤に混合するステップは、前記酸果桜桃の種子油が前記組成物のおおよそ３〜５重量％であり、前記粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物が前記組成物のおおよそ３〜５重量％であるようにして、前記酸果桜桃の種子油の量と、前記粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物の量とを混合することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記親油性成分を提供するステップは、ラノリンと、セチル及びステアリルアルコールと、ステアリンと、ミリスチン酸イソプロピルとを混合するステップを含み、前記親水性成分を提供するステップは、ビタミンＣと、ラウリル硫酸ナトリウムと、グリセリンと、プロピレングリコールと、水とを混合するステップを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記親油性成分を提供するステップは、前記親油性成分を生成するためにおおよそ２０重量％のラノリンと、おおよそ２０重量％のセチル及びステアリルアルコールと、おおよそ４０重量％のステアリンと、おおよそ２０重量％のミリスチン酸イソプロピルとを混合するステップを含み、前記親水性成分を提供するステップは、前記親水性成分を生成するためにおおよそ１．２重量％のビタミンＣと、おおよそ３．１重量％のラウリル硫酸ナトリウムと、おおよそ７．７重量％のグリセリンと、おおよそ７．７重量％のプロピレングリコールと、おおよそ８０．３重量％の水とを混合するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記親油性成分を提供するステップ、前記親水性成分を提供するステップ、前記粉末状のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物を提供するステップ、及び前記酸果桜桃の種子油を提供するステップは、前記組成物に対しておおよそ５重量％のラノリンと、おおよそ５重量％のセチル及びステアリルアルコールと、おおよそ１０重量％のステアリンと、おおよそ５重量％のミリスチン酸イソプロピルと、おおよそ０．８重量％のビタミンＣと、おおよそ２重量％のラウリル硫酸ナトリウムと、おおよそ５重量％のグリセリンと、おおよそ５重量％のプロピレングリコールと、おおよそ５２．２重量％の水と、おおよそ５重量％のフラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の固体抽出物と、おおよそ５２．２重量％の酸果桜桃の種子油とを提供することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記親油性成分及び親水性成分を加熱するステップは、おおよそ５０〜６０℃の温度で水浴で加熱することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記クリーム基剤は、前記フラボノイドが豊富な酸果桜桃の種子の粉末抽出物及び前記酸果桜桃の種子油の添加前に、溶けた又は液状の状態になるまで前記親油性成分と前記親水性成分のそれぞれを別々に加熱し、溶けた又は液状の前記親油性成分と前記親水性成分とを混合し、前記親油性成分と前記親水性成分との混合物を冷却させて生じた生成物である、請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／０５９，２３２の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、概して生物学的療法の局所製剤、その製剤の製造方法、並びにヒトの変形性膝関節症及び他の炎症性疾患の治療方法に関する。より具体的には、本発明は、酸果桜桃（サワーチェリー）の種子から抽出された組成物を利用したそのような製剤及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
変形性膝関節症（ＯＡ）の治療は、痛みに対処するがＯＡの病因にある異化及び同化作用の間における不均衡を回復しない鎮痛薬に頼っている。酸化窒素及び炎症性サイトカインなどの異化作用因子の活性を変えて組織再生を可能にするこれまでに開発された生物学的療法の薬物（生物製剤又はバイオ医薬品としても知られる）は、ＯＡ治療での有効性について評価された。これらの研究では、そのような薬物によるＯＡの症状の劇的な軽減を示さなかった。
【０００４】
変形性膝関節症（ＯＡ）は、関節に影響を与える変形性の加齢に伴う病気であり、最も一般的なヒトの筋骨格障害であり、世界中の高齢者での身体障害の主要原因である。ＯＡの発症は、典型的には継続した生物力学的外傷によって引き起こされ、軟骨細胞を介した軟骨破壊をもたらす。
【０００５】
この変形過程によって生じる酸化ストレスは、老化した変形性関節症の骨芽細胞の出現を促進し、それは次に炎症性シグナル伝達の調節異常及び機能関節細胞のアポトーシスでの枯渇を増大し、不十分な軟骨修復及び細胞外マトリックスの異常な再形成をもたらす。組織の損傷は、健全な関節恒常性の正常な維持の外傷性調節異常によって悪化される。この混乱は、重症な炎症（滑膜炎）をますます促進し、関節液の組成での有害な変化、細胞外マトリックス材料の分解、及び正常な組織修復障害に至る。
【０００６】
ＯＡの病理学的機序は、全身的に及び罹患した関節組織において主にマクロファージ及びＴリンパ球によって産生される炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、並びにインターロイキン（ＩＬ）のＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ−８の次第に高められたレベルによって促進される。これらのサイトカインの下流へのシグナル伝達系もまた、間葉細胞による酸化窒素（ＮＯ）の発現を増加させる。集合的に、これらの要因のそれぞれが、軟骨の喪失、軟骨細胞アポトーシス、進行性関節機能不全、及び極度の慢性痛と共に、関節包の肥厚をもたらす。
【０００７】
非常に興味を引く治療標的を示すＯＡの疾患過程のいくつかの周知の特徴が、図１に示される。例えば、活性化されたＣＤ３＋Ｔリンパ球による炎症性サイトカインの産生は、ＯＡの病因への治療介入のための優れた「関門」を提供する。これは、疾患に関連した痛み及び関節組織破壊におけるこれらのメディエータの重要な役割に起因する。多くの治療は、炎症性サイトカインをそれらの通常の生理的受容体とのそれらの相互作用の段階で妨げて、調節不全の炎症を含め、下流でのシグナル伝達過程を遮断する。しかし、生物学的療法の薬物として知られる薬剤の種類は、疾患進行を妨げる細胞内シグナル伝達経路を調節し、健全な恒常性に寄与する活性を促進する機序によって区別される。これらのアプローチは、痛み及び他の症状を改善するかもしれないがＯＡの根本的な病理学的機序にごくわずかな影響しか及ぼさない、臨床診療において現在支持されている鎮痛薬及び関連する薬剤の使用とは異なる。
【０００８】
別の研究者によって報告された炎症性サイトカイン阻害薬の以前の臨床試験は、ＯＡ予後の劇的な改善をもたらさなかった。ＴＮＦ及びＩＬ−１βの両方の阻害薬は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗体のＦｃ（定常）部に接合された、ＴＮＦ又はＩＬ−１βのコグネイトレセプターの遺伝子の一部を含有する合成遺伝子要素の融合生成物として構成された。それによって生じた融合タンパク質はそれぞれのサイトカインに結合し、それらの生理学的効果を競合的に減少させ、それによってそれらの炎症誘発作用を阻害する。ＯＡでは、これは関節組織の破壊を含む（図１）。膝及び手の両方で罹患したＯＡ患者に全身投与又は関節内注射されたこれらの薬剤は、構造劣化又は症状の重症度を停止させなかった。更に、遺伝子操作されたサイトカイン阻害薬は、極めて費用が掛かる。例えば、炎症性疾患での幅広い用途を備えたＴＮＦ阻害融合タンパク質であるエタネルセプトの１年の治療計画についての患者当たりの費用は、おおよそ２０，０００ドルである。この種の薬物及び関連産物はまた、癌及び時に致命的な免疫障害を含む重度の副作用を伴う。
【０００９】
ＯＡ管理のための有効なバイオ医薬品戦略の欠如は、臨床医をコルチコステロイド及び非ステロイド系の抗炎症薬にひどく依存したままにしている。炎症の抑制における高い有効性にも拘わらず、これらの薬物は、特に長期間ではしばしばひどく有毒である。逆に言うと、生物学的療法の戦略は、費用が高く、毒性であり、そして僅かな効果のみであり得る炎症性シグナル伝達系の小分子阻害剤を避ける。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、関節痛及び炎症性サイトカインを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を有意に低下させ（ｐ＜０．０５）、末梢血のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を有意に減らし、白血球のＨＯ−１を有意に増やす（ｐ＜０．０５）ために、酸化ストレスに対する主要な生理的な防止物質であるヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の誘導物質として、酸果桜桃の種子の抽出物（ＳＣＥ）と酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）の組み合わせを含む物質の新しい製剤又は組成物を提供することを目的とする。その組成物は、関節を損傷する炎症性メディエータの産生を阻害し、それによって生物学的療法としての分類の主要な基準、すなわち、単に痛みに対処する又は症状を減らすよりも疾病病因を阻害する薬剤に適合する。本発明の更なる目的は、製造方法を提供し、それによってその組成物が局所クリームとして製剤にされることである。更なる目的は、その組成物の局所適用による治療方法を提供することであり、そこでは生物活性化合物の体内濃度が経皮的に投与されて、炎症を改善する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１つの態様又は実施形態では、本発明は酸果桜桃の種子の抽出物（ＳＣＥ）と酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）の安定した混合物を含む局所クリーム組成物であり、酸果桜桃の種子の油画分に懸濁された酸果桜桃（スミノミザクラ）の種子のフラボノイドが豊富な固体画分を含むエマルションである。フラボノイドが豊富な固体画分（ＳＣＥ）、及び油画分（ＳＣＯ）は、当分野における既知の方法によって別々の成分として得られる。新たな製造方法は、異なった溶解性である複数の化合物の、油中における均等で相が安定した懸濁液としての局所組成物を製造することを必要とする。この組成物は、オレイン酸などの天然の賦形剤を含有し、この賦形剤は生物活性化合物の経皮移動を促進して、所望の生理的効果を引き起こすのに十分に高いこれらの化合物の体内濃度をもたらす。
【００１２】
別の実施形態の態様では、本発明は、酸果桜桃の種子のフラボノイドが豊富な固体画分（ＳＣＥ）とその種子の油（ＳＣＯ）との混合物を含むその種子の仁のエマルションの局所適用される生物学的療法の組成物を使用して、症状が調節不全の炎症から生じるあらゆる病状において組織の損傷を防ぐ又は緩和する程度まで、脊椎動物（哺乳動物又はヒト）において炎症性シグナル伝達を全身的に制御する方法である。
【００１３】
別の態様又は実施形態では、本発明は、酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）及びヒトの化粧用途に適した他の選択された油を含む油相中に酸果桜桃（スミノミザクラ）の種子の仁（ＳＣＥ）での固体画分の生理活性成分を分散させた、相が安定したエマルションを製造する方法である。簡潔には、クリーム基剤を作るために、親油性成分及び別の親水性成分が調製され、別々に溶かされて、溶けた状態で組み合わされる。クリーム基剤が冷却された後に、ＳＣＥ及びＳＣＯ活性成分が添加されて混合される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトの関節においてＯＡに関連した関節組織損傷をもたらす主要な病理学的機序の図である。物理的損傷及び内因性の酸化ストレス因子が、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６の滑膜細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージでの発現を増加させて、異常な軟骨細胞の活性及び損傷した軟骨をもたらす。増加したマクロファージＴＧＦ−βの発現は、骨組織の骨棘を刺激して、関節炎を促進する。病的に高められたマクロファージの活性はまた、新血管形成を増加させて、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＰｒｏＭＭＰ）の産生を増加し、ＰｒｏＭＭＰは自己触媒的切断によってそのコラゲナーゼ機能を活性化し、それがＯＡに関連したコラーゲン基質破壊をもたらすことを可能にする。
【図２】ＯＡに伴う痛みに関する酸果桜桃の組成物の局所適用の効果を示すグラフである。
【図３】ＯＡ患者のＰＢＭＣにおけるリンパ球関連のＨＯ−１産生に関する酸果桜桃の組成物の局所適用の効果を示すグラフである。
【図４】ＯＡ患者における血清中Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度に関する酸果桜桃の組成物の局所適用の効果を示すグラフである。
【図５Ａ】ＯＡ患者におけるＩＬ−８、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γのＣＤ４＋Ｔリンパ球発現に関する酸果桜桃の組成物の局所適用の効果を示すグラフである。
【図５Ｂ】ＯＡ患者におけるＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６のＣＤ４＋Ｔリンパ球発現に関する酸果桜桃の組成物の局所適用の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
概して本発明の組成物は、局所適用される、生物学的療法の植物化学物質の混合であり、その植物化学物質は、活性化されて疾患に関連する炎症性サイトカインを産生するＴリンパ球の数を低下させることによってＯＡの病因を妨げる。酸果桜桃の種子の抽出物（ＳＣＥ）と酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）の組み合わせは、天然に存在する抗酸化防御酵素であるＨＯ−１の活性を全身的に高め、ＯＡ症状を改善し、そして炎症性サイトカインを発現するＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化を阻害する。ＨＯ−１は、活性酸素分子を直接的に不活性化しない。むしろ、抗酸化防御へのその寄与は、ＨＯ−１活性の２つの主要なヘム分解産物、ビリルビン及び一酸化炭素（ＣＯ）により間接的に生じる。その酵素は組織に蓄積したヘムを代謝し、結果として赤血球をＣＯ、遊離鉄、及びビリベルジンに変える。ビリベルジンは、遍在的に発現したビリベルジン還元酵素によって急速に反応されてビリルビンになり、そしてナノモル細胞内濃度において、活性酸素分子の強力なスカベンジャーとしての機能を果たす。ＣＯは、グアニル酸シクラーゼの活性の上昇を通してその細胞保護効果を発揮し、複数の細胞内標的と相互作用して酸化ストレスを低下させる二次メッセンジャーのサイクリックグアノシン３′，５′−一リン酸（ｃＧＭＰ）のレベルを増加させる。ＳＣＥ／ＳＣＯ誘発ＨＯ−１は、ヒトの関節リウマチ及び２型糖尿病患者からの培養された白血球で、健康な対照の対象からの細胞よりも著しく高いレベルでＣＤ３＋ＴＮＦ−α＋及びＣＤ３＋ＩＬ−８＋細胞が現れることを阻害する。この知見は、関節リウマチ及び２型糖尿病のいずれもが、ＯＡと共通した病因の多くの特徴−特に炎症性組織破壊−を備えた慢性炎症性疾患であるので、大いに望みを与えるものである。
【００１６】
用語「生物学的療法」、「生物製剤」又は「バイオ医薬品」は、単に一時的に症状を治療するのでなく、疾患の根本にある原因を改める薬剤を定義する。この定義は、本明細書で使用されるそれらの用語について与えられる。
【００１７】
本明細書に記載される局所投与のＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、疾患への中心となる因子である炎症性サイトカインの活性を直接的に阻害するので、生物学的療法とみなされる。ＳＣＥ／ＳＣＯ組成物の構成要素は、高められた組織のＨＯ−１活性によってＴ細胞によるサイトカインの発現を抑制する。研究は、この酵素の植物化学物質誘導因子は、コグネイトレセプターとの相互作用の段階でサイトカインの活性を阻害する融合タンパク質のバイオ医薬品よりも潜在的に優れていることを示唆する。
【００１８】
本発明は、様々な疾患に特徴的な組織損傷をもたらすようにして調節不全になった炎症を、抑制することに関する。本発明は、皮膚を通り抜けて有効濃度で全身的に生物学的に利用可能になり、炎症性疾患の症状の原因となる主要な免疫活性化を著しく阻害する、植物化学物質のエマルションの形態での局所製剤である。本発明の治療効果が明らかになった特徴を示す疾患は、限定ではないが、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性糖尿病（１型、ＩＤＤＭ）、２型糖尿病（メタボリックシンドローム）、気管支ぜんそく、尋常性乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円形脱毛症、橋本甲状腺炎、ＩｇＡ腎症、水腫、ケル胎児赤芽球症及び天疱瘡の代表的な疾患を含む。
【００１９】
調節不全の炎症過程によって引き起こされる潜在する病理学的機序を含む全ての疾患は、予防及び治療のための戦略で利用され得る共通の特徴を示す。本明細書で記載されるＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、ヒトのＯＡ患者での関節痛及び疾患に関連するバイオマーカーを著しく改善した方法で、ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化に影響を与えることが明らかにされた。変形性関節症は、様々な疾患と共通する中心となる病理学的機序を有するので、本発明の実証のためのモデル疾患として選択されたが、本発明は他の炎症誘導疾患にも同様に適用可能である。
【００２０】
ＯＡは、関節に影響を与える変形性の加齢に伴う病気であり、最も一般的なヒトの筋骨格障害であり、世界中の高齢者での身体障害の主要原因である。ＯＡの発症は、典型的には継続した生物力学的外傷によって引き起こされ、軟骨細胞を介した軟骨破壊をもたらす。この変形過程によって生じる酸化ストレスは、老化した変形性関節症の骨芽細胞の出現を促進し、それは次に炎症性シグナル伝達の調節異常及び機能関節細胞のアポトーシスでの枯渇を増大し、不十分な軟骨修復及び細胞外マトリックスの異常な再形成をもたらす。組織の損傷は、健全な関節恒常性の正常な維持の外傷性調節異常によって悪化される。この混乱は、重症な炎症（滑膜炎）をますます促進し、関節液の組成での有害な変化、細胞外マトリックス材料の分解、及び正常な組織修復障害に至る。ＯＡの病理学的機序は、全身的に及び罹患した関節組織において主にマクロファージ及びＴリンパ球によって産生される炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、並びにインターロイキン（ＩＬ）のＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＩＬ−８の次第に高められたレベルによって促進される。これらのサイトカインの下流へのシグナル伝達系もまた、間葉細胞による酸化窒素（ＮＯ）の発現を増加させる。集合的に、これらの要因のそれぞれが、軟骨の喪失、軟骨細胞アポトーシス、進行性関節機能不全、及び極度の慢性痛と共に、関節包の肥厚をもたらす。
【００２１】
１つの態様又は実施形態では、本発明は酸果桜桃の種子の抽出物（ＳＣＥ）と酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）とを含む局所クリーム組成物であり、酸果桜桃の種子の油画分に懸濁された酸果桜桃（スミノミザクラ）の種子のフラボノイドが豊富な固体画分を含むエマルションとして提示される。フラボノイドが豊富な固体画分（ＳＣＥ）、及び油画分（ＳＣＯ）は、当分野における既知の方法によって、その後の混合のために別々の成分として得られる。特に、ＳＣＥ及びＳＣＯを得るための方法は、バク  アイほか（２０１０年）「酸果桜桃（スミノミザクラ）の種子の仁での生物活性成分の分離及び分析；新たな機能性食品」、J. Med Food 13:905-910に記載されており、その開示は参照によて本明細書に援用される。
【００２２】
新たな製造方法は、これまでの取り組みでは望ましくない沈殿物を生じたので、異なった溶解性である複数の化合物の、油中における均等で相が安定した懸濁液としてのＳＣＥ／ＳＣＯ組成物を製造することを必要とする。この組成物は、オレイン酸などの天然の賦形剤を含有し、この賦形剤は生物活性化合物の経皮移動を促進して、所望の生理的効果を引き起こすのに十分に高いこれらの化合物の体内濃度をもたらす
【００２３】
別の実施形態の態様では、本発明は、酸果桜桃の種子のフラボノイドが豊富な固体（すなわち粉末形態）画分（ＳＣＥ）と、その種子の油画分（ＳＣＯ）と、他の選択された化合物との混合物を含む局所適用される生物学的療法の組成物を使用して、症状が調節不全の炎症から生じるあらゆる病状において組織の損傷を防ぐ又は緩和する程度まで、椎動物において炎症性シグナル伝達を全身的に制御する方法である。
【００２４】
別の態様又は実施形態では、本発明は、酸果桜桃（スミノミザクラ）の種子の生理活性成分ＳＣＥ及びＳＣＯを分散させた、相が安定したエマルションを製造する方法である。酸果桜桃の種子の仁の含有物の抽出、局所用製造物を調製するために使用される油画分の分離及び粉末抽出物の調製のための工程は、当分野で既知である。
【００２５】
製造方法は、
（ａ）様々な原料の混合物を含む親油性成分を生成するステップと、
（ｂ）様々な原料の混合物を含む親水性成分を生成するステップと、
（ｃ）全ての原料が溶けるか又は液状になり、親油性成分及び親水性成分がほぼ同じ温度になるまで両成分を別々に加熱するステップと、
（ｄ）同じ温度でかつ全ての成分が溶けた又は液状の状態で両成分を組み合わせて混合し、混合された成分を常温まで冷却させてクリーム基剤を形成するステップと、
（ｅ）酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）をクリーム基剤に添加して混合するステップと、
（ｆ）粉末形態である酸果桜桃の種子の抽出物（ＳＣＥ）をクリーム基剤に添加して混合するステップと、
を含む。
【００２６】
好ましい実施形態では、上記２つの成分は、おおよそ５０〜６０℃の温度で水浴で別々に加熱される。ＳＣＥ／ＳＣＯ局所組成物は、暗く、涼しい場所において、おおよそ２〜８℃で保管されるべきである。好ましくは、酸果桜桃の種子の固体抽出物（ＳＣＥ）及び酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）は、それぞれがおおよそ３〜５重量％（ｗｔ％）でＳＣＥ／ＳＣＯ組成物中に存在する。
【００２７】
フラボノイドが豊富な固体画分（ＳＣＥ）と油画分（ＳＣＯ）とを混合するこれまでの試みは、高い安定性の混合物を生成することにおいてうまくいかなかった。しかし、上記の方法は、均等に混合された酸果桜桃の種子の脂溶性成分及び水溶性成分を備えた高い安定性のエマルション組成物を生成する。そのようにして生成されたＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、非常に効率的かつ効果的な生物学的療法、抗炎症の局所クリーム基剤組成物である。
【００２８】
代表的かつ有効な生物学的療法のＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、以下の原料を含み得る。それは、重量パーセント及び５０００グラム（ｇ）の組成物の生成に対する例示の重量で示される。重量パーセント及び重量は、おおよそ次のとおりである。
【表１】
0006592096.tif 000002
【００２９】
この例での親油性成分は、ラノリンと、セチル及びステアリルアルコールと、ステアリンと、ミリスチン酸イソプロピルとの混合物からなる。上記の重量パーセントに基づいて、親油性成分は、おおよそ２０ｗｔ％のラノリンと、おおよそ２０ｗｔ％のセチル及びステアリルアルコールと、おおよそ４０ｗｔ％のステアリンと、おおよそ２０ｗｔ％のミリスチン酸イソプロピルとを含む。この例での親水性成分は、ビタミンＣと、ラウリル硫酸ナトリウムと、グリセリンと、プロピレングリコールと、蒸留水との混合物からなる。親水性成分は、おおよそ１．２ｗｔ％のビタミンＣと、おおよそ３．１ｗｔ％のラウリル硫酸ナトリウムと、おおよそ７．７ｗｔ％のグリセリンと、おおよそ７．７ｗｔ％のプロピレングリコールと、おおよそ８０．３ｗｔ％の蒸留水とを含む。
【００３０】
記載されたようなＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、ヒトを含む脊椎哺乳動物に局所適用された時に、以下を提供することが分かった。
（ａ）変形性関節症に伴う関節痛の有意な抑制（ｐ＜０．０５）
（ｂ）炎症に関連する血清の炎症バイオマーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の有意な阻害（ｐ＜０．０５）
（ｃ）末梢血の白血球によって治療レベルまで有意に増加された（ｐ＜０．０５）ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の発現
（ｄ）変形性関節症の症状を改善することができる濃度での、ＣＤ３＋Ｔリンパ球による疾患に関連する炎症性サイトカインの産生の有意な阻害（ｐ＜０．０５）
【００３１】
治療方法は、上記のかつ上述されたようにして製造されたＳＣＥ／ＳＣＯ組成物を、ＳＣＥ及びＳＣＯの成分が皮膚へ移動し、そして皮膚を通って炎症部へ移動するようにして、繰り返しの塗布で脊椎哺乳動物の皮膚に局所適用するステップを含む。
【００３２】
ＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性糖尿病（１型、ＩＤＤＭ）、２型糖尿病（メタボリックシンドローム）、気管支ぜんそく、尋常性乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、円形脱毛症、橋本甲状腺炎、ＩｇＡ腎症、水腫、ケル胎児赤芽球症及び天疱瘡に関連する炎症のタイプに適用される。
【００３３】
本明細書に記載されるＳＣＥ／ＳＣＯ組成物の局所適用の有益かつ有効な結果は、以下の変形性関節症（ＯＡ）の治療に向けられた代表の臨床試験において実証された。
【００３４】
研究の被験者
被験者は、米国リウマチ学会によって定められたＯＡについての基準に従って膝の炎症性ＯＡと診断された、４０歳以上の３０人の患者を含む。研究において被験者に選ばれた患者は、非ステロイド系の抗炎症薬を含む治療計画を受けていた。ＯＡの病因とは又は病態についての日常治療とは無関係である、結果判定に影響するおそれがある病態の人は除かれた。本研究は、クウェート大学のヒト対象保護基準に適合し、大学の施設内治験審査委員会（ＩＢＲ）／倫理委員会によって承認された。インフォームドコンセントの同意を全ての被験対象から得た。
【００３５】
それぞれの対象を、５ｍｌのＳＣＥ／ＳＣＯ組成物で１日２回２ヶ月に亘って局所的に治療した。治療は、各被験者の両膝に２．５ｍｌのクリームを塗布し、次に円を描くようにして膝蓋骨全体及び周囲の皮膚に分散させ、５ｍｌが完全に吸収されるまで続けることによって行われた。プラセボグループの患者には、フラボノイド画分を含まない種子油から作られた様々なスキンクリームを５ｍｌ投与した。ＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、上述したようにして種子の仁から調製された。
【００３６】
治療グループ及び結果評価
被験者を次の２つの治療グループの１つに無作為に割り当てた。ＳＣＥグループ：ＳＣＥ／ＳＣＯ組成物を１日２回２ヶ月に亘って投与する２０人の対象。対照（プラセボ）グループ：固体のフラボノイド画分（ＳＣＥ）を含まない酸果桜桃の油ベースの賦形剤を１日２回２ヶ月に亘って投与する１０人の対象。
【００３７】
患者を、基準値と８週の治療で、（ｉ）ＷＯＭＡＣの痛みのサブスケール（ベラミーら、１９８８年）を用いての指標膝の痛み、（ii）血清中ＨＯ−１、（iii）血清中Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、（iｖ）炎症性サイトカインＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を発現するＴリンパ球の活性化、について評価した。血液採取及び分析は、この研究室によって用いられた以前に公表された方法に従って行った。データの統計分析を、Windows（登録商標）Norusis/SPSSバージョン１７を使用して行った。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとした。
【００３８】
臨床及び実験結果
研究の記録の前に、各患者を試験対象／除外基準に従って選別した。評価されるパラメータは、病歴、現在の健康状態（検診による）、実験室及びＸ線写真評価、並びに現在の投薬を含んだ。実験結果のそれぞれの測定方法は、次のように要約される。
【００３９】
（ａ）痛みの評価：指標膝での自己申告の痛みを、ＷＯＭＡＣの痛みのサブスケールに関して１００−ｍｍ視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）を用いて測定した。
【００４０】
（ｂ）瀉血及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の抽出：ナトリウムヘパリン抗凝固処理された末梢静脈血の１０ｍｌの試料を、研究の被験者からバキュテイナ採血管（Becton Dickinson Biosciences Inc.、米国  ニュージャージー州  ラザフォード）中に採取し、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において１：１に希釈し、その後直ぐにFicoll-Hypaque gradients（Pharmacia社、スウェーデン  ウプサラ）での密度遠心分離法、及びCentra-CL-2遠心分離機（MidAtlantic Diagnostics, Inc.、米国  ニュージャージー州  ０８０５４  マウントローレル）を用いてＰＢＭＣを分離した。
【００４１】
（ｃ）細胞培養：ＰＢＭＣをFicoll-paque（Pharmacia社、スウェーデン  ウプサラ）で密度勾配遠心分離法によって分けた。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco BRL社、米国  メリーランド州  ゲイザースバーグ）に１×１０（６）細胞／セルの密度で懸濁した。５％のＣＯ2雰囲気中において加湿条件下で３７℃で６時間に亘って９６ウェルプレートで２００μｌの培養物を培養した。５０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ、Sigma社、ミズーリ州  セントルイス）、１ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Sigma社）及び２ｍＭのモネンシン（Sigma社）の存在下でＰＢＭＣを刺激した。ここで、モネンシンは、各標的サイトカインの細胞内蓄積を可能にして、それによりフローサイトメトリーによる分析の間にそのシグナルを増強する糖タンパク質輸送阻害剤として細胞に添加される。
【００４２】
（ｄ）炎症性サイトカインについてのフローサイトメトリーによる分析：各細胞培養刺激条件について、新たに採取された末梢血のＣＤ３＋ＣＤ４＋リンパ球でのＩＬ−８、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の発現を分析した。簡潔には、各培養から取り出された細胞を、最初にフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ヒトＣＤ３＋（Dakopatts,A/S、デンマーク  グロストラップ）と共に室温で１５分間に亘って培養し、次にFix & Perm細胞透過処理キット（Life Technologies Inc.、米国  オレゴン州  ユージーン）を用いて固定及び透過処理した。透過処理された細胞の炎症性サイトカインについての細胞内標識を、ヒトＩＬ−８、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６に対するフィコエリトリン（ＲＤ１）標識モノクローナル抗体（BD PharMingen社、ドイツ  ハイデルベルク）と共に、室温で３０分培養することによって行った。次にＰＢＭＣを洗浄し、ＦＣ−５００フローサイトメータ（Beckman Coulter Corporation、米国  フロリダ州  ハイアリア）を用いて、それぞれの選択されたサイトカインの発現について、２色のフローサイトメトリーによって評価した。サイトカインの発現を検知するために使用される抗体についてのイソタイプの対照を、それぞれの細胞調製について設定した。選択されたＣＤ（分化抗原）の免疫表現型マーカー及びサイトカインを発現する細胞についての実証分析領域を対照について設定し、そしてメーカーによって推奨される標準方法に従って蛍光標識抗体の特異的結合を分析した。リンパ球亜集団を前方及び側方散乱光の散布図において位置によって特定した。フローサイトメトリーの準備において細胞表面及び関心の内部抗原の染色を、メーカーのプロトコル（InVitrogen Molecular Probesマニュアル: DETECTION OF INTRACELLULAR ANTIGENS BY FLOW CYTOMETRY (Rev 03/10) DCC-10-0815 (PN 624923BD). Issue A Initial Issue, 8/03 Rev Issue BD 10/11, Cytomics FC 500 CXP Software IFU Manual, Running Samples Sec 4.1 & Creating Protocols Section 1-19）に従って行った。
【００４３】
（ｅ）ＨＯ−１発現についてのＥＬＩＳＡ解析。StressXpress（商標）ヒトＨＯ−１ＥＬＩＳＡキット（Enzo Life Sciences International, Inc.、米国  ペンシルベニア州  プリマスミーティング）を使用してＨＯ−１のリンパ球発現を測定した。簡潔には、細胞から作られた溶解物を、抗ヒトＨＯ−１抗体でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートで培養し、次に二次／検出抗体及びキットで提供される関係する試薬で処理した。細胞に関連するＨＯ−１の発現は、４５０ｎｍで現像されたキット試薬の吸光度を通してBiotek ELX 808 マイクロプレートリーダにおいて評価した。結果を各患者グループのリンパ球溶解物におけるＨＯ−１の平均値ｎｇ／ｍｌ±標準誤差（ＳＥＭ）で示す。
【００４４】
（ｆ）Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）濃度についてのＥＬＩＳＡ解析。Active US（登録商標）CRP ELISA Kit（Diagnostic System Laboratories, Inc.、米国  テキサス州  ウェブスター）を使用してＣＲＰの測定を行った。簡潔には、抗凝固処理がされていないバキュテイナ採血管（Becton Dickinson Inc.）で末梢血を採取し、室温で２時間に亘って静置して血塊を形成し、そこから滅菌アプリケータで血清を抽出した。続いて血清試料を抗ＣＲＰ抗体でコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレートで培養し、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＣＲＰで処理した。発色基質のＨＲＰ媒介変換に比例した各試料におけるＣＲＰ濃度を、Synergy HTマルチモードマイクロプレートリーダを使用して、４５０及び６２０ｎｍでの二波長吸光度の観察によって推定した。
【００４５】
（ｇ）統計分析。ウィルコクソンの符号順位検定を使用して、治療前後での各グループでの変化を比較した。各グループ内の変化の間での相関を、スピアマンの順位相関検定を用いて行った。分析は、Windows（登録商標）用のSPSS統計パッケージバージョン１７（Norusis/SPSS, Inc.）を使用して行った。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとした。
【００４６】
結果
臨床結果
選択された指標膝におけるＯＡ患者による自己申告での関節痛に関するＳＣＥ／ＳＣＯ局所治療の効果を図２に示す。治療前に測られた痛みのスコア（基準値）と比較すると、ＳＣＥ／ＳＣＯ治療患者の報告では、製造物での２ヶ月の毎日の適用後に有意に痛みが低下した（ｐ＜０．００１）。対照的に、基準値でプラセボグループでの患者によって報告された痛みのスコアと、プラセボのスキンクリームでの２ヶ月の治療後のスコアとの比較は、有意でない相違であることのみを明らかにした（ｐ＝０．１３９）。
【００４７】
図３は、試験及び対照被験者での白血球に関連するＨＯ−１の発現を示す。両グループから得たＰＢＭＣ溶解物のＨＯ−１含有量の測定は、基準レベルに対する２ヶ月の治療後のＥＬＩＳＡによる評価によって、ＳＣＥ／ＳＣＯで治療されたＯＡ患者からの細胞におけるリンパ球の酵素含有量の有意の増加を明らかにする（ｐ＜０．０５）。基準値対治療後のＰＢＭＣのＨＯ−１濃度における有意でない相違が、プラセボの患者について明らかにされた（ｐ＝０．２２０）。
【００４８】
２ヶ月の局所ＳＣＥ治療後のＯＡ患者での末梢血の血清におけるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の評価は、基準値での同じグループで取られた試料よりも、この炎症性バイオマーカーが有意に低いレベルであることを明らかにした（ｐ＜０．００５、図４）。プラセボで治療された対象における血清のＣＲＰの比較は、基準値と治療後の値との間での有意でない相違のみを示した（ｐ＝０．９５７）。
【００４９】
末梢血の白血球の活性化に関するＳＣＥ／ＳＣＯ治療の効果を図５に示す。ここでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＯＡの病因となる炎症性サイトカインの主要源であるので、ＣＤ４＋Ｔ細胞に関する治療の効果が示される。それにもかかわらず、ＳＣＥ／ＳＣＯはまた、マクロファージ及び他の組織による炎症性シグナル伝達を変えることが予想される。進行中の研究は、他の細胞型においてＳＣＥ／ＳＣＯを介した効果の範囲を評価しているところである。基準値測定に関して、ＰＭＡ／Ｉで培養された、ＳＣＥ／ＳＣＯで治療されたＯＡ患者からのＰＢＭＣは、ＣＤ４＋ＩＬ−８＋（ｐ＜０．００１）、ＣＤ４＋ＴＮＦ−α＋（ｐ＜０．００５）、及びＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋（ｐ＜０．００５）（５Ａ）、ＣＤ４＋ＩＬ−１α＋（ｐ＜０．００５）、ＣＤ４＋ＩＬ−１β＋（ｐ＜０．００５）（ＣＤ４＋ＩＬ−６＋（ｐ＝０．４９４）は除く）（５Ｂ）の有意に低い治療後の提示を含んだ。これらの実験では、基準値で採取されたＯＡ患者対プラセボで治療された患者の血液からの細胞の比較は、ＩＬ−８（ｐ＝０．７３０）、ＴＮＦ−α（ｐ＝０．１６５）、及びＩＦＮ−γ（ｐ＝０．１６０）（５Ａ）、ＩＬ−１α（ｐ＝０．６２０）、ＩＬ−１β（ｐ＝０．４０６）、及びＩＬ−６＋（ｐ＝０．２４０）（５Ｂ）を発現する活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の提示において有意でない相違を示す。
【００５０】
ヒトの予備試験の暗示
上述された代表の調査は二重盲検臨床試験であり、局所投与される上記のＳＣＥ／ＳＣＯ組成物は、関節痛を減らし、そしてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１βを発現する活性化されたＴ細胞の数の減少を伴う、ＯＡの病因を促進する炎症性サイトカインの発現を全身的に阻害するという仮説を評価した。これらの結果は、酸果桜桃の種子の固体抽出物（ＳＣＥ）及び酸果桜桃の種子油（ＳＣＯ）の両方を含むが果実自体ではない、酸果桜桃の種子での仁の抽出物を投与された人によって得られた。
【００５１】
これまでの調査、及びＳＣＥで治療された患者において分かった基準値及びプラセボに対して有意に増加したリンパ球のＨＯ−１発現（図３）に基づくと、治療の機序は、おそらく炎症性活性酸素種のＨＯ−１を介した抑制を含む。この研究において、本発明者は、組織への酸化ストレス負担を治療的に減少させるＨＯ−１の誘導因子を含む酸果桜桃のフラボノイドのＳＣＥ／ＳＣＯ製剤でのＯＡ患者の局所治療が、主要なＯＡの症状を有意に緩和したことを観察した。これらの効果は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の炎症性サイトカイン発現の阻害によって生じ、したがって疾患の進行についての主要な内在する因子を変えることによってＯＡの重症度を改善するこの植物物質の能力を実証した。
【００５２】
ＳＣＥ／ＳＣＯ治療対象でのＨＯ−１増加の妥当性：上述された代表のヒトでの研究では、図３に示されたＳＣＥで治療された対象の血液から分離されたＰＢＭＣによるＨＯ−１の有意に増加した発現（ｐ＜０．０５）は、酵素の全身的な上方制御を達成するのに十分なレベルでのＨＯ−１誘導因子の経皮送達の期待された効果と一致する。実際に、ＣＰＲ濃度はＯＡを含む炎症性疾患の重症度の周知の関連要因であるので、免疫細胞（及びおそらく他の組織）におけるＨＯ−１の高められた活性は、図４に示される血清のＣＲＰでの有意なＳＣＥ治療に関連する低下（ｐ＜０．０５）の主要因であろう。これらの観察は、多くの臨床現場での治療可能性を備えた、調節不全の炎症への包括的に適応可能な応答としての疾患又は外傷に関連するＨＯ−１発現の役割を更に裏付ける。したがって、ＳＣＥ／ＳＣＯによって誘導されるＨＯ−１発現の増加は、図５Ａ、５Ｂに示される炎症性サイトカインＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６を発現する活性化されたＣＤ３＋亜集団の提示における有意な治療に関連する減少（ｐ＜０．０５）の重要なメディエータであることを推測させる。
【００５３】
上述した特定の要素及びステップの均等物並びに置換は、当業者には明らかであり、したがって本発明の本来の範囲及び指定は、特許請求の範囲に記載された通りであることが理解される。上述した実施例及びいずれの好ましい実施態様も、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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