(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体の生体液サンプルにおける内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出する方法であって、
（ａ）哺乳動物被験体由来の生体液サンプルを用意する工程と、
（ｂ）前記生体液サンプルを、少なくとも１つのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）のエピトープの模倣ペプチドがカップリングされた固体マトリックスと接触させる工程であって、
ここで、前記模倣ペプチドが、配列番号：９、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０であり、
少なくとも１つの前記模倣ペプチドの配列が、少なくとも２つの非連続アミノ酸間の内部架橋を有する工程と、
（ｃ）前記固体マトリックスの表面から未結合の抗体を除去する工程と、そして
（ｄ）前記固体マトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在を検出する工程と
を少なくとも含んでなり、
前記複合体の存在により、前記生体液サンプルが内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を含むことが示されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記抗原抗体複合体の存在が、前記被験体が心血管疾患を患っていることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原抗体複合体の存在が、前記被験体が、急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っていることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するための模倣ペプチドの使用であって、
当該模倣ペプチドが、配列番号：９、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、または配列番号：２０からなり、かつ少なくとも１つの前記アミノ酸配列が少なくとも２つの非連続アミノ酸間の内部架橋を有し、
さらに、当該模倣ペプチドは、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に特異的に結合することができるものであることを特徴とする、使用。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、配列番号：９である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記内部架橋が、前記ペプチド配列のｎ位およびｎ＋４位の２つのアミノ酸Ｘａａ間に形成されるラクタム架橋であり、ｎ位のＸａａが、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋４位の後続残基に連結するラクタム架橋−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である）の修飾アミノ酸であり、ｎ＋４位のＸａａが、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、前記ｎ位のＸａａからラクタム架橋に連結する単結合である）の修飾アミノ酸である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記内部架橋が、前記ペプチド配列のｎ位およびｎ＋７位の２つのアミノ酸Ｘａａを連結する炭化水素ステープルであり、ｎ位のＸａａが、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋７位の後続Ｘａａに連結する炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、ｎ＋７位のＸａａが、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、前記ｎ位のＸａａから炭化水素ステープルに連結する単結合である）の修飾アラニンである、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記内部架橋が、前記ペプチド配列のｎ位およびｎ＋４位の２つのアミノ酸Ｘａａを連結する炭化水素ステープルであり、ｎ位のＸａａが、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋４位の後続Ｘａａに連結する炭化水素ステープル−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、ｎ＋４位のＸａａが、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、前記ｎ位のＸａａから炭化水素ステープルに連結する単結合である）の修飾アラニンである、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
模倣ペプチドが下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つである、請求項４に記載の使用：
（ｉ）アミノ酸配列が配列番号：１９からなり、内部架橋が、１９位のグルタミン酸（Ｅ）および２３位のリジン（Ｋ）を連結するラクタム架橋であり、前記位置が、アミノ酸配列に関するものである；
（ｉｉ）アミノ酸配列が配列番号：１５からなり、内部架橋が、１６位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび２３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する炭化水素ステープルであり、前記位置が、アミノ酸配列に関するものである；
（ｉｉｉ）アミノ酸配列が配列番号：１６からなり、内部架橋が、１３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび１７位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する炭化水素ステープルであり、前記位置が、アミノ酸配列に関するものである；
（ｉｖ）アミノ酸配列が配列番号：１７からなり、内部架橋が、９位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび１６位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する炭化水素ステープルであり、前記位置が、アミノ酸配列に関するものである。
【請求項１０】
模倣ペプチドのアミノ酸配列が配列番号：１９である、請求項４に記載の使用。
【請求項１１】
模倣ペプチドのＮ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されてなる、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体に関連する疾患の予防または治療に用いるための医薬としての模倣ペプチドの使用であって、当該模倣ペプチドが配列番号１９からなるものであることを特徴とする、使用。
【請求項１３】
治療有効量の模倣ペプチドを成分として含む、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体に関連する疾患の予防または治療に用いるための医薬組成物であって、当該模倣ペプチドが配列番号１９からなるものであることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１４】
心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するためのキットであって、配列番号：９、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０の少なくとも１つの模倣ペプチドを含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管疾患の予後予測、診断または治療に有用なペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の最も豊富なタンパク質（７０％）であり、その濃度は、心血管リスクと逆相関することが知られている。ＨＤＬ結合ＡｐｏＡ−Ｉは、逆コレステロール輸送を調節し、それを肝臓に送達することによって、コレステロール恒常性において重要な役割を果たす（Ｙａｎｃｅｙ  ｅｔ  ａ，；２００３，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２３：７１２−７１９）。ＨＤＬ結合ＡｐｏＡ−Ｉはまた、抗炎症特性を有し、抗酸化特性を有する。
【０００３】
心血管疾患（ＣＶ）を高いリスクで伴う自己免疫症状である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を患っている患者において、ＡｐｏＡ−Ｉに対するＩｇＧサブクラスの自己抗体（抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ）が高レベルであることが報告されている（Ｄｉｎｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｌｕｐｕｓ  ７：３５５−３６０）。心筋梗塞（ＭＩ）の患者（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０ａ，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３１：８１５−８２３）、関節リウマチ（ＲＡ）を有する患者（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０ｂ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．６２：２６４０−２６５０）、急性胸痛を有する患者（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２７１：４５１−４６２）および重度の頸動脈狭窄症を有する患者（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３２：４１２−４２１）を含む他の高ＣＶリスク集団においても、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体について報告されている。ＭＩ患者およびＲＡ患者において、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体は、高ＣＶリスク集団におけるＣＶ疾患のリスク増加に独立して関連することが示されている（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０ａ  ａｎｄ  ｂ，上記；Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，上記）。また、重度の頸動脈狭窄症を有する患者において、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体は、アテローム動脈硬化性プラークの脆弱性の増大に関連していた（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．３２：４１２−４２１）。最後に、最近の直接比較研究において、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体は、ＭＩ後のＣＶ予後にとって最良の体液性自己免疫マーカーであり（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ，２０１１，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２：６９）、ＲＡ患者におけるＣＶリスク層別化のために、追加の予後情報を伝統的な心血管リスク因子に提供する唯一のバイオマーカーである（Ｆｉｎｃｋｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｓ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）６４：８１７−８２５）ことが示されている。
【０００４】
病態生理学的観点から、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体は、ＡｐｏＥ欠損マウスに投与した場合にアテローム性動脈硬化の病変サイズおよび脆弱性を増大させることによって、アテローム生成および関連合併症の潜在的なメディエータであることが示されている（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，上記）。これらのアテローム生成促進効果は完全には理解されていないが、それらはいくつかの異なるレベルにおいて相乗的に作用するという証拠がある。抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ自己抗体は、（ｉ）高密度リポタンパク質のアテローム生成抑制効果を減退させ（Ｂａｔｕｃａ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）４８：２６−３１）、（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２／ＣＤ１４複合体を介して無菌性炎症を促進し（Ｐａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１３６５−２７９６）、（ｉｉｉ）Ｌ型カルシウムチャネルのミネラルコルチコイド受容体の下流活性化を介して催不整脈促進因子（ｐｒｏ−ａｒｒｙｔｈｍｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ）として作用し（Ｒｏｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５３：１２６９−１２７８）、（ｉｖ）好中球走化性を促進する（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，上記）ことが示されている。
【０００５】
被験体における抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体の存在を評価することに基づく心血管障害の予後予測／診断方法が開発されている。
【０００６】
しかしながら、これらの方法は、一般に、前記抗体と完全長ＡｐｏＡ−Ｉとの間の免疫学的反応に基づくものである（Ｄｉｎｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，上記；Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０ａ，上記；Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，上記，Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，上記；Ｂａｔｕｃａ  ｅｔ  ａｌ，２００９，上記）。このような診断的イムノアッセイにおいて完全長ＡｐｏＡ−Ｉを使用することの主な制限は、大量かつ不安定性のタンパク質を生産するコストに関するものであり、これがアッセイの効率を損なう。従来技術の予後予測／診断方法の問題を解決するために、本発明は、より低コストに生産され、より安定であり、心血管疾患を患っている患者由来の抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体に特異的に結合するペプチドに基づく新規診断的イムノアッセイを提供する。本発明の方法は、高い心血管リスクを有する患者のサブ集団において最初のまたは再発性の心血管事象を防ぎ、患者の特定の要求に適した治療を選択するために、および心血管障害の発症を予防する措置を講ずるために特に有用である。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）のエピトープの模倣ペプチドであって、当該ペプチドが、
（ａ）１５〜８０アミノ酸長のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）下記：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４；またはそれらの変異体、
（ｉｉ）前記模倣ペプチドの抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体への特異的結合能が損なわれることなく、前記（ｉ）の配列の１、２、３、４、５または６アミノ酸が置換、欠失、挿入および／または化学修飾されていること以外は、前記（ｉ）の配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）のアミノ酸配列の２つの任意の組み合わせ
のいずれか１つを含むアミノ酸配列を有し、かつ
（ｃ）前記ｂ）のアミノ酸配列の少なくとも２つの非連続アミノ酸間の内部架橋を有し、
さらに、当該模倣ペプチドは、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に特異的に結合することができるものであることを特徴とする、模倣ペプチドに関する。
【０００８】
第二の態様において、本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）のエピトープの模倣ペプチドであって、当該ペプチドが、
（ａ）１５〜８０アミノ酸長のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）下記：
（ｉ）配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３；またはそれらの変異体、
（ｉｉ）配列番号：８、配列番号：９もしくは配列番号：２５；またはそれらの変異体、
（ｉｉｉ）前記模倣ペプチドの抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体への特異的結合能が損なわれることなく、前記（ｉｉｉ）の配列の１、２、３、４、５または６アミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは化学修飾されていること以外は、前記（ｉ）および／または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）のアミノ酸配列の２つの任意の組み合わせ
のいずれか１つ配列を含むアミノ酸配列を有し、
さらに、当該模倣ペプチドは、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に特異的に結合することができるものであることを特徴とする、模倣ペプチドに関する。
【０００９】
本発明の第三の態様は、前記模倣ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む宿主細胞、前記模倣ペプチドの調製方法であって、培養培地において前記宿主細胞を培養し、該培養培地から、または宿主細胞溶解後の宿主細胞溶解物から前記ペプチドを分離する工程と、場合により、ジスルフィド架橋、ラクタム架橋または炭化水素ステープルを介して、得られたペプチドの２つの非連続アミノ酸残基を架橋する工程とを含む方法に関する。
【００１０】
本発明の第四の態様は、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドを含む診断組成物、イムノアッセイ調製物またはイムノアッセイプレートに関する。
【００１１】
第五の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
第六の態様において、本発明は、心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するためのキットであって、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその組み合わせを含むキットに関する。
【００１３】
本発明の第七の態様は、哺乳動物被験体の生体液サンプルにおける内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出する方法であって、
（ａ）哺乳動物被験体由来の生体液サンプルを用意する工程と；
（ｂ）前記生体液サンプルに存在する抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体が、抗原−抗体相互作用により、少なくとも１つの前記模倣ペプチドに結合するのに十分な条件下において、前記生体液サンプルを、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドがカップリングされた固体マトリックスと接触させる工程と；
（ｃ）前記固体マトリックスの表面から未結合の抗体を除去する工程と；
（ｄ）前記固体マトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在を検出する工程と
を少なくとも含み、
前記複合体の存在により、前記生体液サンプルが内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を含むことが示される方法に関する。
【００１４】
第八の態様は、哺乳動物被験体の生体液サンプルから心血管疾患またはリスクプロファイルを検出する方法であって、
（ａ）哺乳動物被験体由来の生体液サンプルを用意する工程と；
（ｂ）前記生体液サンプルに存在する抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体が、抗原−抗体相互作用により、少なくとも１つの前記模倣ペプチドに結合するのに十分な条件下において、前記生体液サンプルを、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドがカップリングされた固体マトリックスと接触させる工程と；
（ｃ）前記固体マトリックスの表面から未結合の抗体を除去する工程と；
（ｄ）前記固体マトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在を検出する工程と
を少なくとも含み、
前記複合体の存在により、前記生体液サンプルが１つ以上の心血管疾患に関連する抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体を含むことが示される方法に関する。
【００１５】
第九の態様は、それを必要とする被験体における心血管疾患を予防および／または治療する方法であって、前記模倣ペプチド、その医薬製剤、または前記模倣ペプチドの三次元構造類似体を前記被験体に投与することを少なくとも含むことを特徴とする方法に関する。
【００１６】
第十の態様は、急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている被験体における心血管疾患を予防および／または治療する方法であって、
（ａ）本発明の方法によって、哺乳動物被験体の生体液サンプルにおける内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出する工程と；
（ｂ）（ｉ）本発明の模倣ペプチドまたはその医薬製剤、（ｉｉ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の模倣ペプチドの三次元構造類似体、（ｉｉｉ）ＡｐｏＡ−Ｉを含む医薬組成物、ならびに（ｉｖ）心血管疾患の予防および／または治療に適切な薬剤から選択される少なくとも１つの薬剤を投与する工程と
を少なくとも含むことを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ＡＢ】溶液中の本発明のペプチド内にジスルフィド架橋を形成するための化学反応（Ａ）、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成を使用して本発明のペプチド内に炭化水素ステープルを形成するための化学反応（Ｂ）。「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドである。大カッコの隣のｍ、ｋおよびｌは、ペプチド配列におけるアミノ酸の位置を指す。
【図１Ｃ】固相上の本発明のペプチド内にラクタム架橋を形成するための化学反応（Ｃ）。「ＰｙＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートであり、「ＤＩＥＡ」はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、「アロック基」はアリルオキシカルボニル基であり、「アリル基」は構造式Ｈ２Ｃ＝ＣＨ−ＣＨ２−を有する。
【図２】本発明のペプチド内の内部架橋の例の展開化学式（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａ）：ジスルフィド架橋（Ａ）、炭化水素ステープル（Ｂ）、ラクタム架橋（Ｃ）。（Ａ）において、ｋは３または６であり、Ｒは任意のアミノ酸側鎖である；（Ｂ）において、ｎ位およびｎ＋４位の残基間の架橋については、ｋは３であり、ｎは１であり、＊は（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンであり；ｎ位およびｎ＋７位の残基間の架橋については、ｋは６であり、ｎは４であり、＊は（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンであり；Ｒは任意のアミノ酸側鎖である；（Ｃ）において、Ｘが−ＣＯ−ＮＨ−である場合、ｎは２であり、ｐは４であり、ｋは３であり；Ｘが−ＮＨ−ＣＯ−である場合、ｎは４であり、ｐは２であり、ｋは３であり；Ｒは任意のアミノ酸側鎖である；大カッコの隣のｍ、ｋおよびｌは、ペプチド配列におけるアミノ酸の位置を指す。
【図３ＡＢ】模倣ペプチドＦ３Ｌ１およびＦ３Ｓ２Ａ（Ｆ３Ｓ２Ａ＝Ｆ３Ｓ２）（Ａ）、Ｆ３Ｓ１ＢおよびＦ４Ｓ２Ｂ（Ｂ）、Ｆ３Ｌ１およびＦ４Ｌ１（Ｃ）のＣＤ分光法は、α−ヘリックス含量が非ステープル対照Ｆ３ペプチドと比較して増加していることを示す。
【図３Ｃ】図３ＡＢと同様。
【図４】競合ＥＬＩＳＡは、模倣ペプチドＦ３Ｌ１が、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に対する結合について、インタクトなＡｐｏＡ−Ｉと有効に競合することを示す。抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陽性であることが公知の患者由来の血清を、図に示されている濃度の模倣ペプチドＦ３Ｌ１と共にプレインキュベートし、次いで、インタクトなＡｐｏＡ−ＩによってコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、続いて、標準的なプロトコールにしたがってアッセイ工程を行った（Ａ）。競合としてＡｐｏＡ−Ｉを用いて行った競合ＥＬＩＳＡアッセイの比較結果（Ｂ）。
【図５Ａ】競合ＥＬＩＳＡは、模倣ペプチドＦ３Ｌ１が、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に対する結合について、インタクトなＡｐｏＡ−Ｉと有効に競合することを示す。抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陽性（＋）であることが公知の３人の患者由来の血清を、図に示されている濃度の模倣ペプチドＦ３Ｌ１（Ａ）、Ｆ３（Ｂ）またはスクランブルＦ３（Ｃ）と共にプレインキュベートし、次いで、インタクトなＡｐｏＡ−ＩによってコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、続いて、標準的なプロトコールにしたがってアッセイ工程を行った。対照は、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陰性（−）であることが公知の３人の患者由来の血清である。
【図５Ｂ】図５Ａと同様。
【図５Ｃ】図５Ａと同様。
【図６Ａ】模倣ペプチドＦ３Ｌ１は、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の炎症促進性応答を阻害する。抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ（Ａ）によって、または抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陽性である患者由来のＩｇＧのプール（Ｂ）によって誘導されるマクロファージによるＴＮＦ−α産生に対する効果。
【図６Ｂ】図６Ａと同様。
【図７】模倣ペプチドＦ３Ｌ１は、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の変時応答を阻害する。
【図８】リジン（Ｋ）残基における消化を使用したＡｐｏＡ−Ｉエピトープの同定。各収集画分中に存在するペプチドに対する、陽性（Ａ）および陰性（Ｂ）患者血清由来の自己抗体の免疫反応性。
【図９】アルギニン（Ｒ）残基における消化を使用したＡｐｏＡ−Ｉエピトープの同定。各収集画分中に存在するペプチドに対する、陽性（Ａ）および陰性（Ｂ）患者血清由来の自己抗体の免疫反応性。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において「ＡｐｏＡ−Ｉ」および「ＡｐｏＡ−１」とも称される「アポリポタンパク質Ａ−１」は、ヒトにおいてはＡＰＯＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ヒトにおいて、ＡｐｏＡ−Ｉは、２８ｋＤａのタンパク質である（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ０２６４７）。成熟ヒトＡＰＯ−Ａ１は、２４３アミノ酸を含む（配列番号：１）。ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質は、脂質代謝において特定の役割を有する。アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主なタンパク質成分である。このタンパク質は、排泄のため組織から肝臓へのコレステロール流出を促進する。それは、ほとんどの血漿コレステリルエステルの形成に関与するレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の補因子である。ＡｐｏＡ−Ｉはまた、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）安定化因子として単離されたため、抗凝固効果を有し得る。それをコードする遺伝子の欠陥は、タンジール病を含むＨＤＬ欠乏症および全身性非神経障害性アミロイドーシスに関連する。ＡｐｏＡ−Ｉは、少なくとも２つの極めて異なるコンホメーション（脂質非結合型コンホメーションおよび脂質結合型コンホメーション）間を切り替わることができる立体構造的に柔軟で動的なタンパク質である。インタクトな脂質非結合型アポリポタンパク質Ａ−１の構造研究は、以下のように６つのαヘリックスが存在することを示す：配列番号：１の１０位のアルギニンから３９位のグリシンまでのヘリックスＡ；配列番号：１の４８位のアスパラギンから８４位のグルタミンまでのヘリックスＢ；配列番号：１の９４位のリジンから１３６位のグルタミン酸までのヘリックスＣ；配列番号：１の１４６位のグルタミン酸から１８７位のアラニンまでのヘリックスＤ；配列番号：１の１９６位のアラニンから２１２位のグルタミン酸までのヘリックスＥ；配列番号：１の２２０位のプロリンから２４３位のグルタミンまでのヘリックスＦ。
【００２０】
本明細書において使用される「エピトープの模倣ペプチド」（「ミモトープ」とも称される）という用語は、標的タンパク質のエピトープを模倣するペプチドを指す。前記模倣ペプチドは、ネイティブなエピトープに対する特異的な抗体によって認識され得る標的タンパク質のネイティブなエピトープに十分に類似し（したがって、抗原特性を有する）、おそらくは、ネイティブなエピトープに対して特異的な免疫反応も誘導する（したがって、免疫特性を有する）。より具体的には、「ＡｐｏＡ−Ｉのエピトープの模倣ペプチド」という用語は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉの抗原決定基を模倣するペプチドであって、したがって、アポリポタンパク質Ａ−Ｉに特異的に結合する抗体（ＡｐｏＡ−Ｉ抗体とも称される）によって認識されるペプチドを指す。
【００２１】
本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とも称される「エピトープ」という用語は、免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞によって認識される抗原の一部である。
【００２２】
「抗原性」はエピトープの抗原特性を指し、分泌された抗体および／またはＴ細胞上の表面受容体などの免疫反応の最終産物にエピトープが結合する能力に対応する。「免疫原性」はエピトープの免疫原特性を指し、体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応を誘導するエピトープの能力に対応する。免疫原特性を有するすべてのエピトープは抗原特性も有するが、その逆は真ではない。
【００２３】
アミノ酸配列に適用される「２つの非連続アミノ酸」という表現は、本明細書において、前記アミノ酸配列を有するペプチドの一次構造において連続的ではない（すなわち、互いに隣接していない）２つのアミノ酸を表す。
【００２４】
本明細書において使用される「ＡｐｏＡ−Ｉ抗体」または「抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体」という用語は、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質、例えば脂質非結合型ＡｐｏＡ−Ｉまたはその断片に選択的に結合することができる抗体断片、ドメイン抗体または一本鎖抗体を含む任意の抗体またはその変異体形態を指すが、これらに限定されない。特に、ＡｐｏＡ−Ｉ抗体としては、哺乳動物（特に、ヒト）ＡｐｏＡ−Ｉ（特に、配列番号：１のアミノ酸配列のＡｐｏＡ−Ｉ）のエピトープ、または特に配列番号：２〜配列番号：９もしくは配列番号：２３のアミノ酸配列のいずれか１つからなる領域内に局在する任意のエピトープに結合することができるＡｐｏＡ−Ｉ抗体が挙げられる。ＡｐｏＡ−Ｉ抗体としては、ＡｐｏＡ−Ｉタンパク質またはその断片などに対するマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体、遺伝子操作抗体または二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体およびそれらの断片、例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはドメイン抗体が挙げられる。抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または実質的に同じ抗原特異性を有するそれらの断片もしくは誘導体であり得る。特に、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体は、高い心血管リスクを有する患者、特に、急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っているものなどの患者集団において産生される自己抗体（内因性抗体とも称される）であり得る。「選択的に」という用語は、抗体が、すなわち任意の他の抗原またはエピトープに対するよりも高い親和性によって、標的ポリペプチドもしくはエピトープを優先的に認識し、および／または標的ポリペプチドもしくはエピトープに優先的に結合することを示す（すなわち、標的ポリペプチドに対する結合は、他の抗原に対する非特異的結合と区別され得る）。当業者であれば、例えば、スキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９４９，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．１９４９．５１，６６０−６７２）によって抗体の結合親和性を容易に決定し得る。
【００２５】
「薬学的に許容され得る」という用語は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない物質から構成される担体を指す。
【００２６】
「担体」という用語は、医薬製剤中に存在する活性剤以外の任意の成分を指し、したがって、希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、充填剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤などが挙げられる。
【００２７】
本明細書において使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などは、一般に、所望の薬理学的および生理学的な効果を得ることを意味する。効果は、疾患、その症候もしくは症状を予防もしくは部分的に予防する点から予防的なものでもよいし、および／または疾患、症状もしくは症候もしくは該疾患に起因する有害効果の部分的もしくは完全な治癒の点から治療的なものでもよい。本明細書において使用される「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、例えば家族歴に基づいてそれを有するとまだ診断されていない被験体において疾患が発症するのを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止すること；または疾患を緩和すること、すなわち、疾患および／またはその症候もしくは症状の退縮を引き起こすこと、例えば、損傷の改善または修復を含む。
【００２８】
特に、心血管疾患の治療は、例えば、一般集団（一次予防）における、またはこのような事象を既に患っていた患者（二次予防）における心筋梗塞脳卒中または末梢動脈疾患の有病率および罹患率を低下させることによって、疾患または障害の症候を予防、低減またはさらには根絶することを含む。
【００２９】
「心血管疾患」という用語は、本明細書において、心臓または血管に影響を与える疾患または障害と定義される。心血管疾患または心血管障害の非限定的な例としては、主に、動脈硬化症の急性徴候および慢性徴候、例えば急性冠症候群、脳卒中、一過性脳虚血発作、不整脈、心不全および末梢動脈疾患が挙げられる。
【００３０】
「心血管疾患リスク」または「心血管リスク」という用語は、本明細書において、主なアテローム性動脈硬化症をまだ発症していない被験体に関する心血管疾患を発症する確率と定義される。この確率は、典型的には、フラミンガムリスクスコアなどのリスクスコア表としても公知の様々な伝統的な心血管リスク因子、例えば性別、年齢、家族歴、喫煙、糖尿病、高血圧（高血圧症）、高コレステロール（脂質異常症）、肥満、運動不足および不健康な食事の観察に基づいて評価される（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１７：７４３−５３）。１０年グローバルフラミンガムリスクスコアに基づいて、心血管疾患を発症する１０年リスクが１０％超である場合に、被験体は、「高い心血管リスク」を有する資格がある（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１７：７４３−５３）。
【００３１】
本明細書において使用される「被験体」という用語は、哺乳動物を指す。例えば、本発明によって意図される哺乳動物としては、ヒト、霊長類、家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、実験用齧歯類などが挙げられる。
【００３２】
「生体液サンプル」という表現は、哺乳動物由来の体液、例えば唾液、血液および尿から採取された試験用の臨床液体サンプルを指す。例えば、生体液サンプルは、ヒト被験体由来の血清サンプルである。
【００３３】
「対照サンプル」という表現は、陽性対照サンプルまたは陰性対照サンプルを指す。陰性対照サンプルとしては、ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体についてアッセイすべき被験体と同種または同族種の被験体であって、正常な生物学的状態を有する（例えば、ＡｐｏＡ−Ｉに対する検出可能な自己抗体を有しないか、またはＡｐｏＡ−Ｉと免疫反応性のある抗体を含有しない溶液を有する）ことが公知の被験体から採取された体液サンプルが挙げられる。陽性対照サンプルとしては、自己抗体についてアッセイすべき被験体と同種または同族種の被験体であって、ＡｐｏＡ−Ｉに対する検出可能な自己抗体を有するか、またはＡｐｏＡ−Ｉと免疫反応性のある抗体を含有する溶液を有することが公知の被験体から採取された体液サンプルが挙げられる。
【００３４】
本明細書において言及されるペプチドまたはポリペプチドに適用される「変異体」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドが参照ペプチド配列と実質的に相同であるが、１つ以上のアミノ酸欠失、挿入および／または置換のために参照配列のものと異なるアミノ酸配列を有することを意味する。実質的に相同とは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を除いて参照ペプチド配列と同一の変異アミノ酸配列を意味する。２つのアミノ酸配列の同一性は、目視検査および／もしくは数学的計算によって、またはより容易には、配列比較に使用される公知のコンピュータプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌ  ｐａｃｋａｇｅバージョン１．８３を使用して配列情報を比較することによって決定され得る。変異体は、少なくとも１つの保存的に置換されたアミノ酸（これは、所定のアミノ酸残基が、類似の物理化学的特徴を有する残基によって置換されていることを意味する）を有する配列を含み得る。一般に、元のポリペプチド中に存在する１つ以上のアミノ酸の置換は、保存的になされるべきである。保存的置換の例としては、ある脂肪族残基の別のものによる置換、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＡｌａの別のものによる置換、またはある極性残基の別のものによる置換、例えばＬｙｓおよびＡｒｇ間の置換；ＧｌｕおよびＡｓｐ間の置換；もしくはＧｌｎおよびＡｓｎ間の置換が挙げられる。他のこのような保存的置換、例えば類似の疎水性特性を有する領域全体の置換が周知である（Ｋｙｔｅ，ｅｔ  ａｌ，１９８２，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１）。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響がほとんどないかまたは全くないように、非ネイティブな残基によってネイティブなアミノ酸残基を置換することを含み得る。当業者であれば、このような置換が望まれる場合に、所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）を決定し得る。例示的なアミノ酸置換を以下の第１表に示す。「変異体」という用語はまた、参照ペプチド配列と実質的に相同であるが、１つ以上のアミノ酸が化学修飾されているかまたはアミノ酸類似体によって置換されているために、参照配列のものと異なるアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、１、２、３、４、５または６アミノ酸が化学修飾されている。１つ以上のアミノ酸残基の化学修飾は、炭化水素ステープルを確立するための修飾、例えば配列の任意の残基を（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンまたは（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンに化学修飾することを含む。したがって、本明細書において定義される変異体はまた、炭化水素ステープルを確立するために、配列の１つ以上のアミノ酸残基が（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンまたは（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンによって置換された参照ペプチド配列を含む。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
変異体はまた、α−ヘリックス構造を安定化するためのα，α−ジアルキル化残基、例えば２−アミノイソ酪酸を含有する本発明の模倣ペプチドを包含する。α，α−ジアルキル化残基を付加するための好ましい位置は、固有の区別可能なヘリックス形成傾向を有しない残基、例えばプロリン、グリシンまたはバリンの位置に関し、後者は、シート構造を安定化する固有の傾向を有する。本明細書において記載される炭化水素ステープルを形成するのに使用され得る（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンはまた、この化合物ファミリーに属する。前記ペプチドに関する任意の治療用途がある場合、このような残基はまた、ペプチドのタンパク質分解的切断を受けやすい位置に組み込まれ得る。α，α−ジアルキル化残基がＡｐｏＡ−Ｉアミノ酸配列に付加され得る位置の例としては、Ｆヘリックス領域内の位置、例えば２２９位のプロリン、２２０位のバリン、２２１位のフェニルアラニン、２２５位のリジン、２２６位のバリンまたは２２８位のフェニルアラニンが挙げられ、前記位置は、配列番号：１の成熟ＡｐｏＡ−Ｉアミノ酸配列に関するものである。
【００３７】
「固体マトリックス」という用語は、本発明のイムノアッセイまたは方法を実施するのに適切な任意の固相支持体を含む。固体マトリックスとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、石英、セラミック、デキストランまたは他の物質から形成されたかまたはこれらによってコーティングされたビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、チューブ、繊維またはプレート、フィルム、スライド、ウェルが挙げられる。例えば、固体マトリックスは、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイターウェルの形態である。
【００３８】
「キット」という用語は、固体マトリックスにカップリングされるかまたは固体マトリックスに既にカップリングされた本明細書において記載される少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその変異体またはそれらの組み合わせと、場合により取扱説明材料とを含む。
【００３９】
本発明の治療または方法の「有効性」という用語は、本発明の使用または方法に応じて、疾患または症状の経過の変化に基づいて測定され得る。例えば、本発明の治療または方法の有効性は、ｉ）様々な関連する臨床エンドポイント（例えば：全死亡率、心血管関連の死亡率、急性冠症候群または脳卒中の再発、入院．．．）および／またはｉｉ）代理マーカーに対するその影響、例えば様々な動物またはインビトロ系における治療化合物の影響によって測定され得る。
【００４０】
本明細書において使用される「有効量」という用語は、前記模倣ペプチドが投与される被験体における心血管疾患の症候の検出可能な軽減を誘発する少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその医薬製剤の量を指し、これらの症候としては、全死亡率、心血管関連の死亡率、急性冠症候群または脳卒中の再発、ＣＶ関連の入院が挙げられ得る。
【００４１】
ＡｐｏＡ−Ｉのエピトープの模倣ペプチド
本発明の一つの態様は、脂質非結合型アポリポタンパク質Ａ−１コンホメーションのエピトープを模倣するペプチドであって、心血管疾患または心血管障害を患っている患者由来の抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体に特異的に結合することができるペプチドに関する。
【００４２】
第一の態様において、模倣ペプチドは、内部架橋を有する。
【００４３】
一つの態様において、本発明は、ＡｐｏＡ−Ｉのエピトープの模倣ペプチドであって、当該ペプチドが、
（ａ）１５〜８０アミノ酸長のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）下記：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２５、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４；またはそれらの変異体、
（ｉｉ）前記模倣ペプチドの抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体への特異的結合能が損なわれることなく、前記（ｉ）の配列の１、２、３、４、５または６アミノ酸が置換、欠失、挿入および／または化学修飾されていること以外は、前記（ｉ）の配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）のアミノ酸配列の２つの任意の組み合わせ
のいずれか１つの配列を含むアミノ酸配列を有し、かつ
（ｃ）前記ｂ）のアミノ酸配列の少なくとも２つの非連続アミノ酸間の内部架橋を有し、
さらに、当該ペプチドは、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に特異的に結合することができるものであることを特徴とする模倣ペプチドに関する。
【００４４】
一つの態様において、上記模倣ペプチドは、２０〜５５、特に２５〜５５、より具体的には２５〜４０アミノ酸長を有する。
【００４５】
別の態様において、上記模倣ペプチドは、２０〜４０；２１〜４０；２２〜４０；２３〜４０；２４〜４０；２５〜４０；２６〜４０；２７〜４０；２８〜４０；または３０〜４０アミノ酸長を有する。
【００４６】
別の態様において、上記模倣ペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０アミノ酸長を有する。特に、本発明の模倣ペプチドは、１７、１８、２２、２６、２８、３２、３７、３８、３９、４０、４２、４４または５５アミノ酸を有する。
【００４７】
一つの態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９もしくはそれらの変異体のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９もしくはそれらの変異体から選択される２つの配列の組み合わせを含む。
【００４８】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４および配列番号：１８もしくはそれらの変異体のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４；もしくはそれらの変異体から選択される２つの配列の組み合わせを含む。
【００４９】
一つの態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９もしくはそれらの変異体のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９もしくはそれらの変異体から選択される２つの配列の組み合わせからなる。
【００５０】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、（ｉ）配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４および配列番号：１８もしくはそれらの変異体のいずれか１つ、または（ｉｉ）配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２および配列番号：２４；もしくはそれらの変異体から選択される２つの配列の組み合わせからなる。
【００５１】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：８もしくは配列番号：９；またはそれらの変異体のいずれか１つを含む。
【００５２】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２５；またはその変異体を含む。
【００５３】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：８もしくは配列番号：９；またはそれらの変異体のいずれか１つからなる。
【００５４】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２５；またはその変異体からなる。
【００５５】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５；またはその変異体を含む。
【００５６】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５のＣ末端部における最後の２つのアミノ酸ＥおよびＮが欠失した配列番号：５を含む。
【００５７】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２１；またはその変異体を含む。
【００５８】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５；またはその変異体からなる。
【００５９】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５のＣ末端部における最後の２つのアミノ酸ＥおよびＮが欠失した配列番号：５からなる。
【００６０】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２１；またはその変異体からなる。
【００６１】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２３を含むかもしくは配列番号：２３からなるか、または１、２、３、４、５または６アミノ酸、特に５アミノ酸が付加された配列番号：２３からなる。
【００６２】
また他の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０；またはそれらの変異体のいずれか１つを含む。
【００６３】
また他の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１９；またはその変異体を含む。
【００６４】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０；またはそれらの変異体いずれか１つからなる。
【００６５】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１９；またはその変異体からなる。
【００６６】
また他の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１３、配列番号：２２もしくは配列番号：２４またはそれらの変異体を含む。
【００６７】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１３、配列番号：２２もしくは配列番号：２４またはそれらの変異体のいずれか１つからなる。
【００６８】
また他の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１３を含むか、または配列番号：１３からなる。
【００６９】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１８またはその変異体を含む。
【００７０】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１８またはその変異体からなる。
【００７１】
別の態様において、本発明のペプチドは、前記模倣ペプチドの抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体への特異的結合能が損なわれることなく、前記アミノ酸配列の１、２、３、４、５または６アミノ酸が置換、欠失および／または挿入されていること以外は前記アミノ酸配列を有する。
【００７２】
本発明の特定の態様において、前記配列の１、２、３、４、５または６アミノ酸は、内部架橋を設けるのに適切なアミノ酸残基、例えばラクタム架橋を設けるためのグルタミン酸（Ｅ）残基および／もしくはリジン（Ｋ）残基、または例えばジスルフィド架橋を設けるためのシステイン（Ｃ）残基によって置換される。
【００７３】
場合により、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列に含まれる２、４または６アミノ酸は、前記模倣ペプチドの抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体への特異的結合能が損なわれることなく、内部架橋を設けるために化学修飾される。例えば、特定の態様において、本発明のペプチドのアミノ酸配列に含まれる少なくとも２つ、例えば２つまたは４つのアミノ酸残基、例えばフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、リジン（Ｋ）およびチロシン（Ｙ）をアラニン残基に置換し、前記アラニン残基を（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンまたは（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンに化学修飾して、２つの化学修飾アラニン残基間に炭化水素ステープルを設ける。
【００７４】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端は、それぞれ遊離アミノ末端および／または遊離カルボキシ末端に存在し得る電荷が除去されるようにさらに修飾される。特定の態様において、前記ペプチドのＮ末端の遊離アミノ基は、アシル基（例えば、アセチル、プロピオニル、パルミトイルなど）に共有結合される。別の態様において、前記ペプチドのＣ末端の遊離カルボキシ基は、アミド化される。さらなる態様において、模倣ペプチドのＮ末端およびＣ末端は両方とも修飾され、特に、前記ペプチドのＮ末端の遊離アミノ基は、アシル基（例えば、アセチル、プロピオニル、パルミトイルなど）に共有結合され、前記ペプチドのＣ末端の遊離カルボキシ基は、アミド化される。
【００７５】
本発明のさらなる態様において、上記模倣ペプチドのアミノ酸配列内に含まれる２つの非連続アミノ酸間の内部架橋は、ラクタム架橋、炭化水素ステープル、ジスルフィド架橋などの共有結合、または前記２つの非連続アミノ酸残基間の任意の他の強固なリンカー、例えば主鎖水素結合代替安定化によって作製されたもの（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，２００４，１２６：１２２５２−１２２５３）もしくは図１および２に示されているものを介して行われる。
【００７６】
本発明の一つの態様において、架橋されたペプチドのアミノ酸残基は、ｎ位と、ｎ＋３位、ｎ＋４位、ｎ＋５位、ｎ＋６位、ｎ＋７位、ｎ＋８位、ｎ＋９位、ｎ＋１０位、ｎ＋１１位の各位置とにある。前記位置は、ペプチドの一次アミノ酸配列（すなわち、ペプチドの一次構造におけるアミノ酸残基の各位置）を指し、「ｎ」は、アミノ酸残基のうちの１つの位置を示し、「ｎ＋３」は、他のアミノ酸残基が、当該ペプチドのアミノ酸配列のｎ位に対して３アミノ酸離れた位置にあることを示し、「ｎ＋４」は、他のアミノ酸残基が、当該ペプチドのアミノ酸配列のｎ位に対して４アミノ酸離れた位置にあることを示し、「ｎ＋５」は、他のアミノ酸残基が、当該ペプチドのアミノ酸配列のｎ位に対して５アミノ酸離れた位置にあることを示すなどと理解される。
【００７７】
本発明の特定の態様において、ジスルフィド架橋は、ペプチド配列内のｎ位のシステイン（Ｃ）残基と、前記ペプチド配列のｎ＋３位の別のシステイン（Ｃ）残基との間に設けられる。溶液中のペプチド内にジスルフィド架橋を形成するための化学反応を図１Ａに表す。ペプチド内のジスルフィド架橋を図２Ａに表す。
【００７８】
本発明の別の特定の態様において、炭化水素ステープルは、ペプチド配列内のｎ位の化学修飾アラニン（Ａ）と、前記ペプチド配列のｎ＋４位またはｎ＋７位の別の化学修飾アラニン（Ａ）との間において設けられる。特に、炭化水素ステープルは、α−二置換アミノ酸、例えば２−アミノイソ酪酸、（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンを含む修飾アラニン残基間に設けられる。さらなる態様において、内部架橋は、１つの（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンと１つの（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンとの間の炭化水素ステープルである。別の態様において、内部架橋は、２つの（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニン間の炭化水素ステープルである。代替的な態様において、炭化水素ステープルは、ペプチド配列内のｎ位の化学修飾アラニン（Ａ）と、前記ペプチド配列のｎ＋３位の別の化学修飾アラニン（Ａ）との間に設けられる。
【００７９】
Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成を使用してペプチド内に炭化水素ステープルを形成するための化学反応を図１Ｂに表す。ペプチド内の炭化水素ステープルを図２Ｂに表す。
【００８０】
本発明において有用な炭化水素ステープルの例としては、図２Ｂに示されているものが挙げられる。例えば、炭化水素ステープルは、ｎ位およびｎ＋７位の２つのアミノ酸Ｘａａを連結し得、ｎ位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋７位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、ｎ＋７位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義したｎ位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである。他の例として、炭化水素ステープルは、ｎ位およびｎ＋４位の２つのアミノ酸Ｘａａを連結し得、ｎ位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋４位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、ｎ＋４位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義したｎ位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである。
【００８１】
本発明の特定の態様において、ラクタム架橋は、ペプチド配列内のｎ位のグルタミン酸（Ｅ）残基と、前記ペプチド配列のｎ＋４位またはｎ＋７位、好ましくはｎ＋４位のリジン（Ｋ）残基との間に設けられる。
【００８２】
別の態様において、ラクタム架橋は、ペプチド配列内のｎ位のリジン（Ｋ）残基と、前記ペプチド配列のｎ＋４位またはｎ＋７位、好ましくはｎ＋４位のグルタミン酸（Ｅ）残基との間に設けられる。
【００８３】
固相上のペプチド内にラクタム架橋を形成するための化学反応を図１Ｃに表す。ペプチド内のラクタム架橋を図２Ｃに表す。
【００８４】
本発明において有用なラクタム架橋の例としては、図２Ｃに示されているものが挙げられる。例えば、ラクタム架橋は、ペプチド配列のｎ位およびｎ＋４位の２つアミノ酸Ｘａａ間に形成され、ｎ位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋４位の後続残基に連結されたラクタム架橋−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である）の修飾アミノ酸であり、ｎ＋４位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義したｎ位のＸａａからラクタム架橋に連結された単結合である）の修飾アミノ酸である。別の例は、ペプチド配列のｎ位およびｎ＋４位の２つアミノ酸Ｘａａ間において形成されたラクタム架橋であり、ｎ位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、ｎ＋４位の後続残基に連結されたラクタム架橋−（ＣＨ２）４−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−である）の修飾アミノ酸であり、ｎ＋４位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義したｎ位のＸａａからのラクタム架橋に連結された単結合である）の修飾アミノ酸である。
【００８５】
さらなる態様において、本発明の模倣ペプチドは、以下の表２に表されるペプチドの中から選択され、内部架橋は、下線付のグルタミン酸（Ｅ）残基およびリジン（Ｋ）残基間のラクタム架橋を介して、またはＲ８およびＳ５（Ｒ８は（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンに対応し、Ｓ５は（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンに対応する）間の炭化水素ステープルを介して実施される。
【００８６】
【表２】
0006499967.tif 000003
【表３】
0006499967.tif 000004
【表４】
0006499967.tif 000005
【００８７】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：８もしくは配列番号：９；またはそれらの変異体を含む。
【００８８】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２５；またはその変異体を含む。
【００８９】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５；またはその変異体を含む。
【００９０】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５のＣ末端部における最後の２つのアミノ酸ＥおよびＮが欠失した配列番号：５を含む。
【００９１】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：２１もしくは配列番号：２３；またはそれらの変異体を含む。
【００９２】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９もしくは配列番号：２０；またはそれらの変異体を含む。
【００９３】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：１５を含む。
【００９４】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：１６を含む。
【００９５】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：１７を含む。
【００９６】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：１９を含む。
【００９７】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２０を含む。
【００９８】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１３、配列番号：２２または配列番号：２４を含む。
【００９９】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：１３を含む。
【０１００】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２２を含む。
【０１０１】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２４を含む。
【０１０２】
さらなる特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、以下のいずれか１つを含む：
（ｉ）１９位のＥおよび２３位のＫを連結する図２Ｃのラクタム架橋を有する配列番号：１９；
（ｉｉ）１６位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび２３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１５；
（ｉｉｉ）１３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび１７位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１６；
（ｉｖ）９位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび１６位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１７。
【０１０３】
さらなる特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９もしくは配列番号：２０；またはそれらの変異体のいずれか１つを含む。
【０１０４】
さらなる特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１３、配列番号：２２もしくは配列番号：２４；またはそれらの変異体のいずれか１つを含む。
【０１０５】
またさらなる特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、以下のいずれか１つからなる：
（ｉ）１９位のＥおよび２３位のＫを連結する図２Ｃのラクタム架橋を有する配列番号：１９；
（ｉｉ）１６位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび２３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１５；
（ｉｉｉ）１３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび１７位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１６；
（ｉｖ）９位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび１６位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１７。
【０１０６】
さらなる特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９もしくは配列番号：２０；またはそれらの変異体のいずれか１つからなる。
【０１０７】
さらなる特定の態様において、本発明の模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１３、配列番号：２２もしくは配列番号：２４；またはそれらの変異体のいずれか１つからなる。
【０１０８】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドは、内部架橋を有しない。
【０１０９】
一つの態様において、本発明は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡｐｏＡ−Ｉ）のエピトープの模倣ペプチドであって、当該ペプチドが、
（ａ）１５〜８０アミノ酸長のアミノ酸配列を有し、
（ｂ）下記：
（ｉ）配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３；またはそれらの変異体、
（ｉｉ）配列番号：８、配列番号：９、配列番号：２５；またはそれらの変異体、
（ｉｉｉ）前記模倣ペプチドの抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体への特異的結合能が損なわれることなく、前記（ｉ）または（ｉｉ）の配列の１、２、３、４、５または６アミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは化学修飾されていること以外は、前記（ｉ）または（ｉｉ）の配列のいずれか１つと同一のアミノ酸配列、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）のアミノ酸配列の２つの任意の組み合わせ
のいずれか１つの配列を含むアミノ酸配列を有し、
さらに、当該模倣ペプチドは、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に特異的に結合することができるものであることを特徴とする模倣ペプチドに関する。
【０１１０】
一つの態様において、上記模倣ペプチドは、２０〜５５、特に２５〜５５、より具体的には２５〜４０アミノ酸長を有する。
【０１１１】
別の態様において、上記模倣ペプチドは、２０〜４０；２１〜４０；２２〜４０；２３〜４０；２４〜４０；２５〜４０；２６〜４０；２７〜４０；２８〜４０；または３０〜４０アミノ酸長を有する。
【０１１２】
別の態様において、上記模倣ペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０アミノ酸長を有する。特に、本発明の模倣ペプチドは、１７、１８、２２、２６、２８、３２、３７、３８、３９、４０、４２、４４または５５アミノ酸を有する。
【０１１３】
別の態様において、本発明の模倣ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端は、それぞれ遊離アミノ末端および／または遊離カルボキシ末端に存在し得る電荷が除去されるようにさらに修飾される。特定の態様において、前記ペプチドのＮ末端の遊離アミノ基は、アシル基（例えば、アセチル、プロピオニル、パルミトイルなど）に共有結合される。別の態様において、前記ペプチドのＣ末端の遊離カルボキシ基は、アミド化される。さらなる態様において、模倣ペプチドのＮ末端およびＣ末端は両方とも修飾され、特に、前記ペプチドのＮ末端の遊離アミノ基は、アシル基（例えば、アセチル、プロピオニル、パルミトイルなど）に共有結合され、前記ペプチドのＣ末端の遊離カルボキシ基は、アミド化される。
【０１１４】
特定の態様において、前記本発明の模倣ペプチドは、配列番号：５、配列番号：２１または配列番号：２３を含む。
【０１１５】
別の態様において、前記模倣ペプチドは、配列番号：５のＣ末端部における最後の２つのアミノ酸ＥおよびＮが欠失した配列番号：５を含む。
【０１１６】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：５またはその変異体を含む。
【０１１７】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２１またはその変異体を含む。
【０１１８】
特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２３またはその変異体を含む。
【０１１９】
特定の態様において、前記模倣ペプチドは、配列番号：８、配列番号：９または配列番号：２５を含む。
【０１２０】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：８またはその変異体を含む。
【０１２１】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：９またはその変異体を含む。
【０１２２】
別の特定の態様において、本発明の模倣ペプチドは、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、および／またはアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有し、より具体的には、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、およびアミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２５またはその変異体を含む。
【０１２３】
別の態様によれば、本発明は、診断組成物として使用するための本発明の模倣ペプチドを提供する。
【０１２４】
特に、本発明は、心血管疾患の診断および／または予後予測に使用するための本発明の模倣ペプチドを提供する。
【０１２５】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の模倣ペプチドを提供する。
【０１２６】
別の態様において、本発明は、心血管疾患の治療に使用するための本発明の模倣ペプチドを提供する。
【０１２７】
別の態様によれば、心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するのに有用なイムノアッセイ調製物であって、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその変異体を含むイムノアッセイ調製物が提供される。
【０１２８】
さらなる態様によれば、心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するのに有用なイムノアッセイ調製物であって、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその変異体を含むイムノアッセイ調製物が提供される。
【０１２９】
別の態様によれば、イムノアッセイを実施するための固体マトリックスのコーティングのための、本発明のイムノアッセイ調製物の使用が提供される。
【０１３０】
さらなる態様によれば、心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するのに有用なイムノアッセイプレートであって、固体マトリックス上にカップリングおよび／またはコーティングされた少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその変異体を含むイムノアッセイプレートが提供される。
【０１３１】
本発明の模倣ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、本発明の模倣ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１３２】
特定の態様において、本発明は、本発明の模倣ペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、内部架橋が、前記模倣ペプチドのアミノ酸配列の２つの非連続システイン残基間のジスルフィド架橋である、単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１３３】
本発明のペプチドの生産および精製
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【０１３４】
染色体、エピソームおよび誘導型ウイルスを含む多数の発現系が使用され得るが、これらに限定されない。より具体的には、使用される組換えベクターは、細菌性プラスミド、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パピローマウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、キツネポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスに由来し得る。
【０１３５】
これらの組換えベクターは、等しく、コスミドまたはファージミド誘導体であり得る。ヌクレオチド配列は、当業者に周知の方法、例えばＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１に記載されているものなどによって組換え発現ベクターに挿入され得る。
【０１３６】
組換えベクターは、ポリヌクレオチド発現の調節を制御するヌクレオチド配列、ならびに本発明のポリヌクレオチドの発現および転写と、本発明のポリペプチドの翻訳とを可能にするヌクレオチド配列を含み得、これらの配列は、使用される宿主細胞に応じて選択される。
【０１３７】
したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが小胞体の内腔に向かうように、ペリプラズム空間に向かうように、膜上に向かうように、または細胞外環境に向かうように、適切な分泌シグナルを組換えベクターに組み込み得る。適切な分泌シグナルの選択は、後のタンパク質精製を容易にし得る。
【０１３８】
さらなる態様において、本発明の組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０１３９】
宿主細胞内への組換えベクターの導入は、当業者に周知の方法、例えばＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２ｎｄ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９５，ａｎｄ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（上記）に記載されているもの、例えばリン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染によって行われ得る。
【０１４０】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、真菌細胞、例えば酵母細胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの細胞、昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、Ｃ１２７マウス細胞株、シリアンハムスター細胞のＢＨＫ細胞株、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞であり得る。
【０１４１】
宿主細胞は、例えば、本発明の模倣ペプチドを発現させるのに使用され得る。標準的な方法による精製後、本発明のペプチドは、以下において記載される方法に使用され得る。
【０１４２】
本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドを調製するための方法であって、培養培地において上記宿主細胞を培養し、該培養培地から、または宿主細胞溶解後の宿主細胞溶解物から前記ペプチドを分離することを含む方法を提供することである。上記方法において得られたペプチドの２つの非連続アミノ酸残基の内部架橋が、２つのシステイン残基間のジスルフィド架橋の形成を介して行われる場合、前記架橋は、ペプチドの合成および精製の工程、またはさらなる独立した工程のいずれかにおいて行われ得る。
【０１４３】
本発明のペプチドの２つの非連続アミノ酸残基の内部架橋が、ラクタム架橋の組み込みを介してまたは炭化水素ステープルの形成を介して行われ、ペプチドが、上記方法のような組換え技術により生産される場合、本発明の模倣ペプチドの調製は、ペプチドの前記内部架橋が本明細書において記載されるように行われるさらなる工程を必要とし得る。
【０１４４】
あるいは、本発明の模倣ペプチドは、固相ペプチド合成などの化学合成法によって調製され得る。これらのペプチドの精製は、タンパク質／ペプチド精製の分野において公知の任意の技術によって行われ得る。例示的な技術としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび免疫親和性法が挙げられる。
【０１４５】
フルオレニルメチル−エステル／カルバメート保護基を２０％ピペリジン塩基を媒介させて１時間切断した後、Ｂｏｃ化学反応において進行させ、ラクタム架橋を樹脂上に形成する場合、本発明のペプチドの内部架橋は、オルトゴナル保護（Ｏ−ＦｍおよびＦｍｏｃ）を使用して、ペプチドのグルタミン酸残基およびリジン残基間のラクタム架橋形成を介して行われ得る。Ｆｍｏｃ化学反応において進行させる場合、オルトゴナル保護は、例えばＯ−アリルおよびアロックであり、３倍過剰のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｏ）のＣＨＣｌ３／ＡｃＯＨ／ＮＭＭ溶液を用いて、２時間樹脂上において切断される。３当量のＰｙｃｌｏｃｋおよび９当量のＤＩＥＡを用いて、ペプチドのラクタム環化を２日間行い、カイザーニンヒドリン試験（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４：５９５−５９８）によってモニタリングし得る。
【０１４６】
別の態様において、本発明のペプチドの内部架橋は、固相ペプチド合成における鎖伸長中に２つのα−メチル，α−アルケニルアミノ酸が組み込まれたペプチドの閉環メタセシス（ＲＣＭ）を使用して、炭化水素ステープル形成を介して行われる。ＲＣＭは、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ６：７６１−７７１）に記載されているように、触媒としてジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニルメチレン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）を用いて、ＭＢＨＡ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上のＦｍｏｃ保護ペプチドに対して実施される。実施例の欄に記載されているプロトコールを使用して、最後の脱保護（およびアセチル化）およびそれに続く樹脂からの本発明の模倣ペプチドの切断を実施し得る。
【０１４７】
本発明の組成物およびキット
本発明は、本発明の模倣ペプチドを含む組成物を提供する。
【０１４８】
一つの態様によれば、本発明は、診断組成物またはイムノアッセイ調製物として使用するための、本発明の模倣ペプチドを含む組成物を提供する。
【０１４９】
特に、本発明は、心血管疾患の診断および／または予後予測に使用するための、本発明の模倣ペプチドを含む組成物を提供する。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明の模倣ペプチドを含む組成物（特に、医薬組成物）を提供する。
【０１５１】
本発明はまた、心血管疾患の治療に使用するための、本発明の模倣ペプチドを含む組成物を提供する。
【０１５２】
本発明の別の態様によれば、心血管疾患用バイオマーカーとして、生体液サンプルにおける抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出するためのキットであって、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチド、その変異体またはそれらの組み合わせを含むキットが提供される。
【０１５３】
特定の態様において、本発明のキットは、そのアミノ酸配列が配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４および配列番号：１８またはそれらの変異体のいずれか１つを含む少なくとも１つの模倣ペプチドを含む。
【０１５４】
別の特定の態様において、本発明のキットは、そのアミノ酸配列が配列番号：８、配列番号：９またはそれらの変異体のいずれか１つを含む少なくとも１つの模倣ペプチドを含む。
【０１５５】
別の特定の態様において、本発明のキットは、そのアミノ酸配列が配列番号：２５を含む少なくとも１つの模倣ペプチドを含む。
【０１５６】
別の特定の態様において、本発明のキットは、そのアミノ酸配列が配列番号：５またはその変異体を含む少なくとも１つの模倣ペプチドを含む。
【０１５７】
特に、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：５のＣ末端部における最後の２つのアミノ酸ＥおよびＮが欠失した配列番号：５を含む。
【０１５８】
別の特定の態様において、本発明のキットは、そのアミノ酸配列が配列番号：２１を含む少なくとも１つの模倣ペプチドを含む。
【０１５９】
別の特定の態様において、本発明のキットは、そのアミノ酸配列が配列番号：２３を含む少なくとも１つの模倣ペプチドを含む。
【０１６０】
またさらなる態様において、本発明のキットは、下記から選択される少なくとも１つの模倣ペプチドを含む：
（ｉ）配列番号：１９を含むアミノ酸配列を有し、かつ１９位のグルタミン酸（Ｅ）および２３位のリジン（Ｋ）を連結する図２Ｃのラクタム架橋である内部架橋を有する模倣ペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１５を含むアミノ酸配列を有し、かつ１６位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび２３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルである内部架橋を有する模倣ペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１６を含むアミノ酸配列を有し、かつ１３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび１７位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルである内部架橋を有する模倣ペプチド；
（ｉｖ）配列番号：１７を含むアミノ酸配列を有し、かつ９位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび１６位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルである内部架橋を有する模倣ペプチド。
【０１６１】
またさらなる態様において、本発明のキットは、下記から選択される少なくとも１つの模倣ペプチドを含む：
（ｉ）配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２０を含むアミノ酸配列を有する模倣ペプチド；
（ｉｉ）配列番号：１３、配列番号：２２または配列番号：２４を含むアミノ酸配列を有する模倣ペプチド。
【０１６２】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
【０１６３】
本発明のキットは、本明細書に記載されるように、固相支持体として固体マトリックスにカップリングするための、または固体マトリックスに既にカップリングされた、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその変異体またはそれらの組み合わせを含む。
【０１６４】
ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、石英、セラミック、デキストランまたは他の物質を含む様々な固体マトリックスが使用され得るが、これらに限定されない。固体マトリックスの適切な形態としては、これらの物質から形成されたかまたはこれらの物質でコーティングされたビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、チューブ、繊維またはプレート、フィルム、スライド、ウェルが挙げられる。典型的には、固体マトリックスは、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイターウェルを含む。
【０１６５】
本発明のキット内の固体マトリックスへの本発明の模倣ペプチドのカップリングまたは固定は、固相支持体への吸着または化学的カップリングによって行われ得る。タンパク質またはペプチドを固体支持体に固定化するための当技術分野において公知の任意の手段が使用され得る。本発明のペプチドは、アミド結合もしくはエステル結合または吸着を介して共有結合などの技術によって、固体マトリックスに共有結合または非共有結合され得る。ビオチンおよびアビジンまたは抗体および抗原などの結合対を使用して、ペプチドを結合させ得る。ペプチドを固体マトリックスに付加した後、固体マトリックスを（ウシ血清アルブミンなどのブロッキングタンパク質を含有する）ブロッキング溶液と共にインキュベートして、試験サンプル中の抗体の支持体表面への非特異的吸着を減少させ得る。一つの態様によれば、本発明の模倣ペプチドは、本発明のキットの固体マトリックス上において直接合成され得る。
【０１６６】
一つの態様によれば、キットが、固相支持体としての固体マトリックスにカップリングするための少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドまたはその変異体またはそれらの組み合わせを含む場合、キットは、イムノアッセイを実施するためのカップリング試薬および／または固体マトリックスを場合によりさらに含んでいてもよい。
【０１６７】
別のさらなる態様によれば、バックグラウンドノイズの検出を回避するために、本発明のキットは、検出前に未結合の物質を洗浄するための少なくとも１つの洗浄試薬をさらに含む。典型的には、洗浄試薬は、当技術分野において公知の標準的な緩衝液を含む。
【０１６８】
別のさらなる態様によれば、本発明のキットは、検出された抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体の定量に関する較正情報と場合により一緒に、少なくとも１つの対照サンプルをさらに含む。
【０１６９】
別の態様によれば、本発明は、固相支持体としての固体マトリックスにカップリングされた少なくとも１つの本発明の模倣ペプチド、その変異体またはそれらの組み合わせを含むイムノアッセイプレートを提供する。
【０１７０】
本発明の使用および方法
一つの態様によれば、本発明は、哺乳動物被験体の生体液サンプルにおける内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を検出する方法であって、
（ａ）哺乳動物被験体由来の生体液サンプルを用意する工程と；
（ｂ）前記生体液サンプルに存在する抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体が、抗原−抗体相互作用により、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドに結合するのに十分な条件下において、前記生体サンプルを、前記少なくとも１つの模倣ペプチドがカップリングされた固体マトリックスと接触させる工程と；
（ｃ）前記固体マトリックスの表面から未結合の抗体を除去する工程と；
（ｄ）前記固体マトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在を検出する工程と
を少なくとも含み、
前記複合体の存在により、前記生体液サンプルが内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を含むことが示される方法を提供する。
【０１７１】
別の態様によれば、本発明は、哺乳動物被験体の生体液サンプルから心血管疾患を検出する方法であって、
（ａ）哺乳動物被験体由来の生体液サンプルを用意する工程と；
（ｂ）前記生体液サンプルに存在する抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体が、抗原−抗体相互作用により、少なくとも１つの本発明の模倣ペプチドに結合するのに十分な条件下において、前記生体液サンプルを、前記少なくとも１つの模倣ペプチドがカップリングされた固体マトリックスと接触させる工程と；
（ｃ）前記固体マトリックスの表面から未結合の抗体を除去する工程と；
（ｄ）前記固体マトリックスに結合している抗原−抗体複合体の存在を検出する工程と
を少なくとも含み、
前記複合体の存在により、前記生体液サンプルが１つ以上の心血管疾患に関連する抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体を含むことが示される方法を提供する。
【０１７２】
さらなる態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４および配列番号：１８およびそれらの任意の変異体から選択されるアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１７３】
特定の態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９およびそれらの任意の変異体から選択されるアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１７４】
特定の態様において、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：８、配列番号：９およびそれらの任意の変異体から選択されるアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１７５】
特定の態様において、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１７６】
別の特定の態様において、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：５のアミノ酸配列およびその任意の変異体、特に、配列番号：５のＣ末端部における最後の２つのアミノ酸ＥおよびＮが欠失した配列番号：５を含む変異体を含む本発明の方法が提供される。
【０１７７】
特定の態様において、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１７８】
特定の態様において、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１７９】
別の特定の態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４および配列番号：１８およびそれらの任意の変異体から選択されるアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１８０】
さらなる態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０およびそれらの任意の変異体から選択されるアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１８１】
さらなる態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１３、配列番号：２２または配列番号：２４およびそれらの任意の変異体から選択されるアミノ酸配列を含む本発明の方法が提供される。
【０１８２】
またさらなる態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドが、下記のいずれか１つを含む本発明の方法が提供される：
（ｉ）その配列の１９位のＥおよび２３位のＫを連結する図２Ｃのラクタム架橋を有する配列番号：１９のアミノ酸配列；
（ｉｉ）その配列の１６位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび２３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１５のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号：１６のアミノ酸配列であって、ｃ）の内部架橋が、前記配列の１３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび１７位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルであるもの；
（ｉｖ）配列番号：１７のアミノ酸配列であって、ｃ）の内部架橋が、前記配列の９位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび１６位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルであるもの。
【０１８３】
またさらなる態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドが、下記のいずれか１つを含む本発明の方法が提供される：
（ｉ）配列番号：１３、配列番号：２２または配列番号：２４のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９または配列番号：２０のアミノ酸配列。
【０１８４】
別の態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドが、下記のいずれか１つからなる本発明の方法が提供される：
（ｉ）その配列の１９位のＥおよび２３位のＫを連結する図２Ｃのラクタム架橋を有する配列番号：１９のアミノ酸配列；
（ｉｉ）その配列の１６位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび２３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルを有する配列番号：１５のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）ｂ）のアミノ酸配列が配列番号：１６を含み、ｃ）の内部架橋が、前記配列の１３位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンおよび１７位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルであるもの；
（ｉｖ）ｂ）のアミノ酸配列が配列番号：１７を含み、ｃ）の内部架橋が、前記配列の９位の（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンおよび１６位の（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンを連結する図２Ｂの炭化水素ステープルであるもの。
【０１８５】
またさらなる態様によれば、前記少なくとも１つの模倣ペプチドが、下記のいずれか１つからなる本発明の方法が提供される：
（ｉ）配列番号：１３、配列番号：２２、配列番号：２４のアミノ酸配列；またはそれらの変異体；
（ｉｉ）配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２０のアミノ酸配列またはそれらの変異体。
【０１８６】
別のさらなる態様によれば、少なくとも１つの模倣ペプチドまたはその変異体がカップリングされた工程（ｂ）の前記固体マトリックスと、前記生体液サンプルとを接触させる本発明の方法が提供される。
【０１８７】
別のさらなる態様によれば、検出工程（ｄ）において得られたシグナルを、少なくとも１つの対照サンプルについて得られた同じシグナルと比較する工程をさらに含む本発明の方法であって、前記少なくとも１つの対照サンプルについて得られたシグナルを、前記生体液サンプルの検出工程（ｄ）の前に、それと同時にまたはその後に収集する本発明の方法が提供される。
【０１８８】
工程（ｄ）における捕捉／結合抗体の検出は、表面上の捕捉抗体またはタンパク質を検出するための当技術分野における公知の任意の適切な方法、例えば光学的な検出（例えば、ＥＬＩＳＡ）、質量変化の検出（例えば、表面プラズモン共鳴、質量分析）、電気的な検出（例えば、インピーダンス分光法、電気化学的方法）技術によって行われ得る。
【０１８９】
アッセイの結果は、定性的または定量的であり得る。固体マトリックスに結合した捕捉／結合抗体の量を、陽性対照および陰性対照と比較し得る。対照については、典型的には、試験すべきサンプルと同時に行われる。陽性対照は、ＡｐｏＡ−Ｉと免疫反応性のある抗体を含む血清または溶液であり得る。陰性対照は、ＡｐｏＡ−Ｉと免疫反応性のある抗体を含まない血清または溶液であり得る。定量のために、既知量の抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を使用した較正曲線を作成および／または使用し得る。陽性対照として使用するための抗体は、ＡｐｏＡ−Ｉのアミノ酸配列の全体または断片を使用して生産され得る。
【０１９０】
正常で健常な生体液サンプルとの比較は、様々な方法によって達成され得る。一つの態様によれば、それは、非罹患血液サンプルとの対照反応を含むことによって行われ得る。別の態様によれば、それは、健常被験体由来の典型的な生体液サンプルの内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体濃度の値を用いることによって行われ得る。典型的には、調査中のサンプル中に存在する内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体レベルの比較は、各単一試験手順において決定された値または所定値に対して実施され得る。所定値は、一般の試験手順のために決定されたものでもよいし、あるいはこの値は、試験試薬の特定のバッチについてのみ有効であり得る。例えば、基準値は、規定の較正期間のみ有効でもよいし、試験過程の較正時に再定義してもよい。
【０１９１】
本発明の方法、キットおよび使用は、スクリーニング目的および診断目的に適切であり得、一次診断において、および治療中または治療後の疾患経過のモニタリングにおいて適用され得る。
【０１９２】
特に、本発明の方法、キットおよび使用は、以下のものに適切であり得る：
ｉ）心筋虚血を除外または考慮するための急性胸痛患者における診断目的、したがって急性冠症候群の診断のため、
ｉｉ）本発明は、高い心血管リスクを有する患者のサブセットの同定を可能にし、したがって、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体の有害効果を減弱させることを目的とする（本明細書において記載される）特定治療から利益を受け得る患者のサブセットの同定を可能にするので、急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を有する患者における予後予測および場合により治療目的。
【０１９３】
上記診断目的、予後予測目的および治療目的は、一次予防および二次予防に適用され得る。
【０１９４】
本発明の方法、キットおよび使用は、特に、急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている患者であって、通常の心血管リスク因子（タバコの使用、アルコールの使用、高血圧、高コレステロール、肥満、運動不足、不健康な食事を含む）が観察されない患者が、それにもかかわらず、本発明の少なくとも１つの模倣ペプチドを投与することを含む方法などの心血管疾患の予防療法または治療法から利益を受け得るかを決定するのにも適切であり得る。
【０１９５】
本明細書に記載される予後予測および／または診断アッセイは、被験体が、心血管疾患を予防および／または治療するための薬剤（例えば、薬物）の投与から利益を得るかを決定するのに使用され得る。例えば、このようなアッセイは、心血管疾患を治療するのに適切な治療剤、例えばＡｐｏＡ−Ｉ、本発明の模倣ペプチド、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｉｎｏｕｓ）免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）またはエプレレノンの投与が被験体に有益であり得るかを決定するのに使用され得る。
【０１９６】
静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、静脈内投与される血液製剤である。それは、１０００人を超える血液ドナーの血漿から抽出されたプールされた多価ＩｇＧ免疫グロブリンを含有する。典型的には、ＩＶＩＧの投与量は、症状に依存する。一次免疫不全の場合、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重が３〜４週間毎に施される。神経学的疾患および自己免疫疾患の場合、２グラム／キログラム体重が３〜６カ月にわたって月１回５日間施される。次いで、３〜４週間毎の１００〜４００ｍｇ／ｋｇ体重の維持療法が続く。
【０１９７】
エプレレノン（系統ＩＵＰＡＣ名：プレグン−４−エン−７，２１ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ、γ−ラクトン、メチルエステル（７α、１１α、１７α）は、慢性心不全の管理における補助薬として使用されるアルドステロンアンタゴニストである。それは、特に、心筋梗塞後の患者における心血管リスクを減少させるために市販されている。
【０１９８】
したがって、本発明の別の態様は、被験体、特に、急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている被験体が、心血管疾患を予防および／または治療するための治療剤の投与から利益を受け得るかを決定する方法である。
【０１９９】
本発明の別の態様は、治療中または治療後の被験体における心血管疾患の経過をモニタリングする方法である。この目的のために、被験体の生物学的サンプル中の抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体の検出は、治療を受ける前、治療を受けている間または治療を受けた後の被験体由来の生物学的サンプルにおいて決定され得る。治療後に検出された抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体の量の減少は、同じ治療によって被験体をさらに治療し得ることを示す。治療後の抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体の非存在は、治療を中断し得るか、またはより低頻度および／もしくはより低投与量において継続し得ることを示す。
【０２００】
上記アッセイの実施から得られた情報は、個体の健康状態に影響を与える疾患および他の有害な症状の予後予測、進行の判定および臨床管理に有用である。この情報は、より具体的には、特に急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている患者のサブ集団における心血管疾患を治療するための治療法または他の治療計画を臨床医が決定するのを支援する。
【０２０１】
本発明の別の態様において、それを必要とする被験体における心血管疾患または心血管障害を予防および／または治療するための方法であって、本発明の模倣ペプチドまたはその医薬製剤を前記被験体に投与することを含む方法が提供される。
【０２０２】
本発明の別の態様において、それを必要とする被験体における心血管疾患または心血管障害を予防および／または治療するための方法であって、本発明の模倣ペプチドの三次元構造類似体を投与することを含む方法が提供される。
【０２０３】
本発明に関し、模倣ペプチドの三次元構造類似体は、化学ライブラリーにおいて見出されたか、または前記模倣ペプチドの三次元構造と類似の三次元構造を示すように設計された任意の化学分子、特に任意の低分子であり得る。
【０２０４】
特定の態様において、本発明は、被験体における心血管疾患を予防および／または治療するための方法であって、（ｉ）本発明の模倣ペプチドまたはその医薬製剤、（ｉｉ）本発明の模倣ペプチドの三次元構造類似体、（ｉｉｉ）ＡｐｏＡ−Ｉを含む医薬組成物、ならびに（ｉｖ）心血管疾患の予防および／または治療に適切な薬剤、例えば静脈内免疫グロブリンまたはエプレレノンの少なくとも１つを、本発明の方法によって内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を有すると診断された被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０２０５】
特定の態様において、上記方法は、特に急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている被験体に適用される。
【０２０６】
さらなる態様において、心血管疾患を予防および／または治療するための本発明の方法は、特に急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている被験体であって、本発明の検出方法後に内因性抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体を有すると診断された被験体において行われる。
【０２０７】
またさらなる態様において、被験体は、通常観察される心血管リスク因子、例えばタバコの使用、アルコールの使用、高血圧、高コレステロール、肥満、運動不足、不健康な食事を示さない。
【０２０８】
別の態様において、本発明は、医薬の調製のための、特に、心血管疾患を予防および／または治療するための医薬の調製のための、本発明の模倣ペプチドの使用を提供する。さらなる態様において、本発明は、診断組成物またはイムノアッセイ調製物の調製のための、特に心血管疾患を診断するための、本発明の模倣ペプチドの使用を提供する。
【０２０９】
投与形態
本発明の組成物、特に医薬組成物およびその製剤は、経口、非経口、静脈内、皮下、直腸またはそれらの組み合わせを含む任意の方法によって投与され得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、皮内および筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物はまた、組成物の徐放および持続制御静脈内（ｉ．ｖ．）注入を可能にするインプラントの形態において投与され得る。
【０２１０】
特に、本発明の化合物、組成物、特に医薬組成物およびその製剤は、皮下投与される。
【０２１１】
本発明の一つの態様において、本発明の組成物の投与は、複数回の連続注射を必要とする。
【０２１２】
本発明の特定の態様において、医薬組成物は、反復投与または連続投与され得る。医薬組成物は、少なくとも１週間、２週間、３週間もしくは４週間；２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、８カ月間、１０カ月間もしくは１２カ月間；または２年間、３年間、４年間もしくは５年間の期間にわたって反復投与または連続投与され得る。
【０２１３】
組み合わせ
本発明によれば、本発明の模倣ペプチドまたはその医薬組成物は単独で、または心血管疾患の予防および／もしくは治療に有用な助剤と組み合わせて投与され得る。
【０２１４】
別の態様において、医薬組成物は、心血管疾患を予防または治療するのに有用な別の治療剤、例えばアスピリン、β−遮断薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤およびスタチンと共に投与され得る。
【０２１５】
本発明は、心血管疾患の予防および／または治療に有用な他の治療計画または助剤（例えば、複数の薬物計画）の前に、これらと同時に、またはこれらの後に、治療有効量において模倣ペプチドが個体に投与される本発明の模倣ペプチドの投与を包含する。前記助剤と同時に投与される本発明の模倣ペプチドは、同じ組成物または異なる組成物において、および同じ投与経路または異なる投与経路によって投与され得る。
【０２１６】
患者
一つの態様において、本発明の患者は、心血管疾患を患っているか、またはこのような疾患を患っていると疑われる患者である。
【０２１７】
特定の態様において、本発明の患者は、急性胸痛によって救急科に入院したものである。
【０２１８】
別の態様において、本発明の患者は、急性胸痛によって救急科に入院した患者であって、本発明の予後予測および／または診断アッセイ後に心血管疾患を患っていると診断された患者である。
【０２１９】
また他の態様において、本発明の患者は、特に急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている患者である。
【０２２０】
またさらなる態様において、本発明の患者は、通常観察される心血管リスク因子、例えばタバコの使用、アルコールの使用、高血圧、高コレステロール、肥満、運動不足、不健康な食事を示さない。
【０２２１】
さらなる態様において、本発明の患者は、特に急性胸痛、急性冠症候群、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重度の頚動脈狭窄症、末期腎疾患または歯周炎を患っている患者であって、本発明の予後予測および／または診断アッセイ後に心血管疾患を患っていると診断された患者である。
【０２２２】
本明細書において引用されている参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、本明細書において記載される特定の態様による範囲内に限定されるものではなく、これらは本発明の個々の態様の一例示を意図するものであり、機能的に同等な方法および成分は本発明の範囲内である。実際、上記説明および添付の図面から、当業者であれば、本明細書において示され記載されているものに加えて、本発明の様々な改変が明らかであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものである。
【０２２３】
説明した本発明、すなわち以下の実施例は、限定ではなく例示目的で示されているものである。
【実施例】
【０２２４】
以下の略語は、それぞれ以下の定義を指す：
ａａ（アミノ酸）；ＡＵＣ（曲線下面積）、ｈ（時間）、μｌ（マイクロリットル）、μＭ（マイクロモル）、ｍＭ（ミリモル）、ｍｇ（ミリグラム）、ｍｉｎ（分）、ｎｍ（ナノメートル）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＣＩ（信頼区間）、ＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＨＣＴＵ（２−（６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−アミニウムヘキサフルオロ−ホスフェート）、ＨｏＢｔ（Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール）、ＯＲ（オッズ比）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロ−ホスフェート）、ＰｙＣｌｏｃｋ（６−クロロ−ベンゾトリアゾール−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）。
【０２２５】
材料および方法
ペプチド合成
Ｂｏｃ化学反応（Ｗｉｌｋｅｎ  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ，１９９８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：４１２−４２６）に適合されているＡＢＩ  ４３３Ａペプチドシンセサイザーにおいて、Ｂｏｃベースのメリフィールド固相ペプチド合成を使用することによって、ネイティブケミカルライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）用のＣ末端チオエステル誘導体である直鎖状ペプチドおよび特定のラクタム架橋類似体（Ｆ３Ｌ１）を合成した。フッ化水素を用いて、樹脂からの切断を実施した。
【０２２６】
ラクタム架橋の組み込みの場合、オルトゴナル保護（Ｏ−ＦｍおよびＦｍｏｃ）をそれぞれＧｌｕおよびＬｙｓに使用し、フルオレニルメチル−エステル／カルバメート保護基を２０％ピペリジン塩基を媒介させて１時間切断した後、ラクタム架橋を樹脂上に形成した。３当量のＰｙｃｌｏｃｋおよび９当量のＤＩＥＡを用いて、ペプチドのラクタム環化を２日間にわたって行い、カイザーニンヒドリン試験（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９７０，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４：５９５−５９８）によってモニタリングした。
【０２２７】
ペプチドＥＦ（Ａｌａ１９０−Ｔｈｒ２４２  ＡｐｏＡ−Ｉ、すなわち５３残基）の長さは、ネイティブケミカルライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）によってアセンブルした２つの断片（Ａｌａ１９０−Ａｒｇ２１５およびＧｌｎ２１６−Ｔｈｒ２４２）を介した合成を必要とした。このアプローチは、Ｃ末端断片上にＮ末端Ｃｙｓを必要とするので、ＡｐｏＡ−Ｉ配列内のＧｌｎ２１６をＣｙｓ残基によって置換する必要があった。ライゲーション工程後にヨードアセトアミドによってこの残基をアルキル化して、Ｇｌｎ類似体（側鎖はＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２ではなくＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２）を得た。さらに、ペプチドの末端がジスルフィド架橋によって環化されたので、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）残基をＡｌａ１９０−Ａｒｇ２１５のＮ末端およびＧｌｎ２１６−Ｔｈｒ２４２のＣ末端に付加した。ライゲーション生成物のアルキル化後にＨｇＯＡｃによってこれらを脱保護し、Ｈ２Ｏ２によって酸化した。ｐＨ７．０において３０分間にわたって２０当量のＨ２Ｏ２を使用し、その直後にＲＰ−ＨＰＬＣによって精製したところ、環化について最良の結果が得られた。
【０２２８】
ラクタム架橋を有する直鎖状ペプチドのいくつかを作製するために、Ｆｍｏｃベースの固相合成も使用した。この場合、オルトゴナル保護基のペア（アリル／アロック）をグルタミン酸およびリジン残基に使用した。ペプチドの環化前に、Ｋａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（３０）の手順にしたがって、２時間にわたって３当量のＰｄ（ＰＰｈ３）４のＣＨＣｌ３−ＡｃＯＨ−Ｎ−メチルモルホリン（３７：２：１）溶液を用いて、これらの保護基を除去した。
【０２２９】
Ｐｒｅｌｕｄｅシンセサイザー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて、１００μｍｏｌスケールのＭＢＨＡ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５６ｍｍｏｌ／ｇローディング）上において標準的なＦｍｏｃ化学反応を使用して、すべての炭化水素ステープルペプチドを合成した。ペプチド伸長の１サイクルは、以下の工程から構成されていた：（ｉ）最初に、ロードした樹脂をＤＭＦ（３×３０秒間）によって洗浄し、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（２×１０分間）によって末端Ｆｍｏｃ保護基を除去した；（ｉｉ）次いで、脱保護した樹脂をＤＭＦ（６×３０秒間）によって洗浄し、５当量の適切なＦｍｏｃ−アミノ酸、５当量のＨＣＴＵおよび１０当量のＤＩＰＥＡを含有する溶液によって３０分間処理した；（ｉｉｉ）次いで、樹脂をＮＭＰ（３×３０秒間）によって３回洗浄し、１０％ｖ／ｖ無水酢酸のＤＭＦ溶液による処理（１×１０分間）によって未反応のアミノ基をアセチル化し、キャップした樹脂をＤＭＦによって洗浄した（６×３０秒間）。ペプチド配列が完成するまでこれらの工程を繰り返した。
【０２３０】
少し改変した以外は先に記載されているように（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ６：７６１−７７１）、α−メチル，α−アルケニルグリシンのカップリングを手動で実施した。２当量のアミノ酸、２当量のＰｙｃｌｏｃｋおよび４当量のＤＩＰＥＡを含有する溶液によって、脱保護した樹脂を２時間処理した。二重カップリングが必要な場合、この工程を繰り返した。５当量のアミノ酸、５当量のＰｙＣｌｏｃｋおよび１５当量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いた１時間にわたる二重カップリング工程において、配列内の以下のアミノ酸も手動で組み込んだ。
【０２３１】
最後のＦｍｏｃ保護基を除去したら、１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および１％（ｖ／ｖ）ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液によって樹脂を処理（１×１０分間）して、アセチル−キャップＮ末端を得た。続いて、ＤＭＦ（５×３０秒間）およびＣＨ２Ｃｌ２（５×３０秒間）によって樹脂を洗浄し、真空下で２０分間乾燥し、次いで、２．５％（ｖ／ｖ）水、２．５％（ｖ／ｖ）トリイソプロピルシランおよび５％フェノールＴＦＡ溶液を含有する切断溶液によって９０分間処理した。
【０２３２】
閉環メタセシス
先に記載されているように（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ６：７６１−７７１）、触媒としてジクロロ（ｏ−イソプロポキシフェニルメチレン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）を用いて、ＭＢＨＡ−Ｒｉｎｋアミド樹脂上のＦｍｏｃ保護ペプチドに対して、オレフィンアミノ酸誘導体を含有するすべてのペプチドの閉環メタセシス（ＲＣＭ）を実施した。ＤＣＭおよびＤＣＥによって樹脂を順次洗浄し、グラブス第一世代触媒の６ｍＭ  ＤＣＥ溶液（樹脂置換に関して４．９ｍｇ／ｍｌ、０．２当量）によって２時間処理したところ、溶液全体に少量だが継続的なＮ２バブリングが伴った。ＲＣＭを２回繰り返した。樹脂から小サンプルを切断する際に、ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳによって、メタセシス反応の進行をモニタリングした。上記プロトコールを使用して、最後の脱保護（およびアセチル化）およびそれに続く樹脂からのペプチドの切断を実施した。
【０２３３】
ペプチドの精製および分析
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ−Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＬＣＺ質量分析計において、質量スペクトルを取得した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ａｅｒｉｓ  ｗｉｄｅｐｏｒｅ，３．６μｍ  ＸＢ  Ｃ８，４．６ｍｍ×１１５０ｍｍカラムを使用して、２１４ｎｍ  ＵＶ検出器と接続されたＷａｔｅｒｓ２７９５  ＨＰＬＣモジュールにおいて、分析的逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施した。Ｖｙｄａｃ  Ｃ８カラム（内径（ｉ．ｄ．）２５０×２２ｍｍ、粒径１０μｍ）を使用して、２４８７ＵＶ検出器と接続されたＤｅｌｔａ６００モジュールにおいて、分取ＨＰＬＣを実施した。溶離液は、０．１％含水ＴＦＡおよび０．１％ＴＦＡのアセトニトリル：水（９：１、ｖ：ｖ）溶液であった。
【０２３４】
粗反応混合物のＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ分析によって、各合成の収率を最初に評価した。次いで、逆相ＨＰＬＣによって、ペプチドを均一になるまで精製した。分析的ＨＰＬＣおよび質量分析によって、精製ペプチドの同一性および純度を評価した。
【０２３５】
抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体を有するまたは有しない急性胸痛患者由来の血清のスクリーニング
使用した血清サンプルは、急性胸痛によって救急科（ＥＤ）に入院した１３８人の患者を対象にした以前に発表された研究に記載されているものと同じである（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２７１：４５１−４６２）。本研究の目的は、（ｉ）非ＳＴ部分上昇型心筋梗塞（ＮＳＴＥＭＩ）および（ｉｉ）それに続くトロポニンＩの上昇のために、ＥＤにおいて採取された最初の血漿サンプル中のＡｐｏＡ−Ｉに対するＩｇＧ免疫反応性の診断精度を決定することであった。サンプルの採取および処理、エンドポイントの定義ならびに対象／除外基準の詳細は、Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１２，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２７１：４５１−４６２）に記載されている。６人の患者については材料不足であったので、残りの１３２人の患者由来のサンプルに対して、ペプチドの分析を実施した。
【０２３６】
患者血清の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
先に記載されているように（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ３１：８１５−８２３）、ＥＬＩＳＡによって、患者血清との免疫反応性を測定した。簡潔に言えば、精製ヒト由来脱脂ＡｐｏＡ−Ｉ（２０μｇ／ｍＬ；５０μＬウェル）または合成ＡｐｏＡ−Ｉ由来ペプチド（２０μｇ／ｍＬ；５０μＬウェル）のいずれかによって、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ（商標），Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を３７℃で１時間コーティングした。洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳによって、ウェルを３７℃で１時間ブロッキングした。次いで、１／５０希釈したデュプリケイトの血清サンプルをウェルに加え、１時間インキュベートした。血清サンプルを非コーティングウェルにも加えて、個々の非特異的結合を評価した。６回洗浄した後、ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液によって１／１０００希釈した（５０μＬウェル）アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。再度６回洗浄した後、ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶解したアルカリホスファターゼ基質のｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって、ウェルを展開した。３７℃で２０分間インキュベートした後、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖｅｒｓａ  Ｍａｘ（商標）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＥＬＩＳＡシグナル（吸光度ＯＤ４０５ｎｍ）を測定した。対応する非特異的結合を、各サンプルの平均吸光度から差し引いた。
【０２３７】
選択した合成ペプチドを使用して競合ＥＬＩＳＡ実験も行った。様々な濃度の合成ペプチド（２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳに溶解したもの）を、高レベルの抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧを含有する患者血清と共に室温で２時間コインキュベートしてから、上記アッセイの展開前に、上記のように精製ヒト由来脱脂ＡｐｏＡ−Ｉによってコーティングしたウェルに追加した。
【０２３８】
統計分析
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ（商標）ソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ，ＵＳＡ）を使用して、分析を実施した。適切な場合には、フィッシャー両側直接確率検定およびマンホイットニーＵ検定を使用した。異なるペプチドに対する免疫反応性と研究のエンドポイントとの間の関連性は、オッズ比（ＯＲ）および対応する９５％信頼区間（９５％ＣＩ）として示される。多変量ロジスティック回帰分析を使用して、変数間の関連性を評価した。このモデルにおいては、サンプルサイズが制限されているので、エンドポイントを従属変数として設定し、（単一連続変数内において１４日時点の患者転帰の主なＣＶ決定因子の調整を可能にする）ＮＳＴＥＭＩ−ＴＩＭＩスコア（Ａｎｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０００，ＪＡＭＡ  ２８４：８３５−８４２）を特有の交絡因子として設定した。Ｅｘｃｅｌ用のａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ（商標）ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＯＣ分析を実施した。ＤｅＬｏｎｇら（１９８８，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ４４：８３７−８４５）によって提案されたノンパラメトリック法にしたがって、曲線下面積（ＡＵＣ）の比較を実施した。
【０２３９】
細胞ベースの実験：抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の炎症促進性応答
先に記載されているように（Ｐａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ）、インターフェロン（ＩＦＮ）−γによりヒト単球を２４時間処理することによって、ヒト単球由来マクロファージ（ＨＭＤＭ）を得た。次いで、９６ウェルトレイにおいて、漸増濃度（５〜４０μｇ／ｍＬ）のポリクローナル抗ヒトＡｐｏＡ−Ｉ（Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）または対照抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｃｏ，ＭＥ，ＵＳＡ）、すなわち、プール＋またはプール−からのＩｇＧ（５００μｇ／ｍＬ）のいずれかによってＨＭＤＭを２４時間刺激した。このモデルにおいては、４０μｇ／ｍｌの最適刺激によって、ＬＰＳフリー抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生を用量依存的に促進することが示されている（Ｐａｇａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ）。
【０２４０】
競合阻害実験のために、合成ペプチドを４０μｇ／ｍｌのポリクローナル抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧと共に室温で２時間コインキュベートしてから、９６ウェルプレート中のＨＭＤＭに加え、続いて、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭＡＰ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して細胞上清中のＩＬ−６およびＴＮＦ−αのレベルを評価した。３人の異なるドナー由来の血液を用いて、実験を実施した。
【０２４１】
細胞ベースの実験：抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の変時応答
低トリプシンＥＤＴＡおよび２型コラゲナーゼによる消化によって、１〜２日齢ウィスターラットの心室から、新生仔ラット心室心筋細胞（ＮＲＶＣ）を単離した。ＮＩＨ刊行のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ８５−２３）および地方動物局（ｌｏｃａｌ  ｃｏｕｎｔｙ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｏｆｆｉｃｅ）の承認（１０１２／３１３４／０−Ｒ）にしたがって、いかなる麻酔も鎮痛も神経筋遮断薬の投与も行わずに断頭によって、動物を殺処分した。新たに単離した細胞をプラスチックフラスコに播種して、心臓線維芽細胞の選択的な接着を可能にした。その後、フラスコから心筋細胞をデカントし、ラミニンコーティング９０ｍｍペトリ皿に分配した。
【０２４２】
１〜２日間培養した後、無血清ＤＭＥＭ中において、適切な濃度のモノクローナル抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）またはビヒクルと共に、細胞を時間間隔毎にインキュベートした。プレインキュベーション期間の終了時（ｔ＝０）および様々な物質を加えた後の異なる時点において、自然に収縮する小細胞単層の拍動回数を直ぐに測定した。（実験条件を把握していない）技術者が光学顕微鏡を使用して、皿の３つの異なる位置における単位時間当たりの収縮数をカウントすることによって、回数測定を実施した。蛍光カルシウムプローブを用いて細胞質ゾルの遊離カルシウムの変動をモニタリングすることによって、細胞収縮の規則性が以前に評価されている（Ｍａｔｕｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １５０：３７２６−３７３４）。抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧの最大変時作用は、１０μｇ／ｍｌにおいて達成されることが以前に実証されているため（Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ３１：８１５−８２３）、すべての実験において、この抗体濃度を維持した。同じ実験条件を使用して、合成ペプチドとの競合阻害実験を実施した。合成ペプチドを１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗ＡｐｏＡ−Ｉ（Ａｂｃａｍ，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）と共に室温で２時間コインキュベートしてから、皿内のＮＲＶＣに加え、上記のように拍動回数を測定した。
【０２４３】
ヘリックス含量を測定するためのＣＤ分光法
Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５分光偏光計において、２０℃での１８５〜２４０ｎｍにおける円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを収集した。凍結乾燥ペプチドを２５％トリフルオロエタノール水溶液に溶解して２ｍＭの濃度を得、次いで、この溶液を水で２０倍希釈し、石英キュベット（路長０．２ｃｍ）にロードすることによって、典型的なサンプルを調製した。１．２５％ＴＦＥ水溶液のベースラインＣＤスペクトルを実験スペクトルから差し引いた。波長２２２ｎｍにおける平均残基楕円率（θ）ｍｒｗ，λを計算することによって、データを正規化した。
【０２４４】
実施例１：本発明の模倣ペプチドの例
上記材料および方法の欄に記載されているように、以下の表３に記載されている模倣ペプチドを合成し、質量分析によってさらに特性決定した。
【表５】
0006499967.tif 000006
【表６】
0006499967.tif 000007
【０２４５】
上記のラクタム架橋に加えて、模倣ペプチドＥＦＬ１は、非常に近接しているＡｐｏ−ＡＩヘリックスＥおよびＦ由来の２つの領域を架橋するためのジスルフィド架橋も含んでいた。ＥＦＬ１の場合におけるジスルフィド架橋を介したペプチドの環化は、２Ｄａの損失および分析的ＨＰＬＣにおけるピークシフトによって確認された。これは、ラクタム架橋形成および閉環メタセシスの場合も同様であり、質量損失はそれぞれ１８Ｄａ（Ｈ２Ｏの脱離）および２８Ｄａ（エチレンの除去）であった。
【０２４６】
断片Ｃ１Ｓ２の閉環メタセシスの間に、質量は予想通りだがＲＰ−ＨＰＬＣ移動度が異なる２つの異性体が得られた。これらを別々に精製し、独立に試験した。
【０２４７】
ＡｐｏＡ−ＩのヘリックスＦ由来のペプチドＦ３を、実施例の欄における対照として選択した。ペプチドＦ３は、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、アミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：９のアミノ酸配列を有し、いかなる内部架橋も含んでいない。
配列番号：９：ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴ
【０２４８】
実施例２：本発明の模倣ペプチドのα−ヘリックス含量
上記材料および方法の欄に記載されているように、ＣＤ分光法によって、模倣ペプチドＦ３Ｌ１、Ｆ３Ｓ２Ａ、Ｆ３Ｓ１Ｂ、Ｆ４Ｓ２ＢおよびＦ４Ｌ１（第３表を参照のこと）のα−ヘリックス含量を評価した。図３に示されている結果は、ステープルＦ３Ｓ２Ａ、架橋Ｆ３Ｌ１および架橋Ｆ４Ｌ１、ならびにステープルＦ３Ｓ１ＢおよびステープルＦ４Ｓ２Ｂが、非ステープル対照ペプチドＦ３と比較して増加したα−ヘリックス含量（２０８および２２２ｎｍにおける特徴的なトラフ型）を示すことを示している。
【０２４９】
実施例３：本発明の模倣ペプチドの抗原性および診断性能
患者血清ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、１３２人の急性胸痛患者コホート由来の血清との反応性について、模倣ペプチドＦ３Ｌ１、Ｆ３Ｓ２Ａ、Ｆ３Ｓ１ＢおよびＦ４Ｓ２Ｂ（第３表を参照のこと）を評価し、結果を統計分析に付した。第４表に示されている結果は、炭化水素ステープルＦ３Ｓ２Ａ、Ｆ３Ｓ１ＢおよびＦ４Ｓ２Ｂ模倣ペプチド、並びにラクタム架橋Ｆ３Ｌ１模倣ペプチドによってもたらされる診断精度が、非ステープル対照ペプチド（Ｆ３）と比べて増加していることを明らかに示している。実際、これらの模倣ペプチド、特にＦ３Ｌ１の統計パラメータはコペプチンの統計パラメータと有利に匹敵し、インタクトなＡｐｏ−Ａ−１を用いて得られる統計パラメータに近い。コペプチンは内部対照であり、使用した患者コホートが実際に、典型的な急性胸痛患者であることを立証する（Ｒｅｉｃｈｅｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．５４（１）：６０−８）。ｃ−ｔｅｒプロバソプレシンとしても公知のコペプチンは、水分の恒常性において重要なホルモンであるバソプレッシンの前駆体であり、急性冠症候群においては、その循環レベルから強力な予後予測値が得られることが示されている（Ｌｉｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．５０（２）：２４３−５）。
【０２５０】
【表７】
0006499967.tif 000008
【０２５１】
図３に示されているように、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陽性であることが知られている患者由来の血清を、様々な濃度のペプチドＦ３Ｌ１と共にプレインキュベートし、次いで、インタクトなＡｐｏＡ−ＩによってコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、続いて、標準的なプロトコールにしたがってアッセイ工程を行った。結果は、模倣ペプチドＦ３Ｌ１が、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陽性であることが知られている患者血清由来のＩｇＧのインタクトなＡｐｏＡ−Ｉに対する結合を用量依存的に競合阻害することができたことを実証している（図４）。
【０２５２】
Ｆ３、スクランブルＦ３およびＦ３Ｌ１を用いて行った競合ＥＬＩＳＡアッセイの結果（図５）は、スクランブルペプチドについては用量依存的な阻害がないことを示しており、これは、Ｆ３Ｌ１と、ラクタム架橋を含まない対応するペプチドとを用いて観察された効果の特異性を裏付けている。より一般的には、それは、ヘリックスＦ由来の対応する領域の適切な二次構造の重要性を強調している。スクランブルＦ３：Ａｃ−ＫＥＬＹＬＬＫＦＴＶＥＳＫＶＧＳＴＥＬＰＬＮＦＳＬＡ−ＮＨ２は、アセチル化Ｎ末端に遊離アミノ基を有し、アミド化Ｃ末端に遊離カルボキシ基を有する配列番号：２６のアミノ酸配列に対応する。
【０２５３】
実施例４：本発明の模倣ペプチドＦ３Ｌ１は、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の炎症促進性応答を阻害する
４０μｇ／ｍｌの最適濃度において適用したポリクローナル抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ（Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）は、単球由来ヒトマクロファージによるＴＮＦ−α産生の有意な増加を誘発した（図６Ａ）。細胞培養培地へ加える前に、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧをペプチドＦ３Ｌ１と共に室温で２時間プレインキュベートすると、この産生が抑制された。抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体について陽性であることが知られている患者から得られたＩｇＧのプールを使用する第二の実験において、同じ効果が観察されたが（図６Ｂ）、プールしたＩｇＧによって誘発されたＴＮＦ−α産生のレベルは、ポリクローナル抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧによって誘発されたものよりも有意に低かった。
【０２５４】
これらの結果は、模倣ペプチドＦ３Ｌ１が、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の炎症促進性応答を阻害することを示している。
【０２５５】
実施例５：模倣ペプチドＦ３Ｌ１は、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の変時応答を阻害する
培養ラット心筋細胞において、抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体の添加は強い変時応答を誘発した（図７の左の最初のバーの群）。培養細胞へ加える前に、抗体を模倣ペプチドＦ３Ｌ１（７５μｇ／ｍｌ）と共に室温で２時間プレインキュベートすると、この応答は完全に抑制された（図７の左から２番目のバーの群）。最後に、単独で加えると、ペプチドＦ３Ｌ１は、基本収縮頻度率および１０ｎＭアルドステロンの存在下における収縮率をいずれも変化させなかったが（図７の右の最後のバーの群）、これは、Ｆ３Ｌ１の抗ａｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の変時応答を抑制する能力が、Ｆ３Ｌ１の抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体と相互作用する能力に直接関係することを示唆している。
【０２５６】
これらの結果は、模倣ペプチドＦ３Ｌ１が、抗ＡｐｏＡ−Ｉ  ＩｇＧ関連の変時応答を阻害することを示している。
【０２５７】
実施例３および４に記載されている結果は、Ｆ３Ｌ１が、心血管疾患の治療に有益な効果を有し得ることを示している。
【０２５８】
実施例６．抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に対して免疫反応性のあるＡｐｏＡ−Ｉのエピトープの質量分析による同定
ＡｐｏＡ−Ｉの特定の内在性エピトープ同定するために、精製ＡｐｏＡ−Ｉを酵素消化に付して、リジンのカルボキシル側またはアルギニンのカルボキシル側特異的にタンパク質を加水分解し、続いて、逆相高速液体クロマトグラフィーによってペプチドを分離および精製し、質量分析によってペプチドを同定した。自己抗体の力価が高い３人の患者由来の血清サンプル、および自己抗体の力価が低い３人の患者由来の血清サンプルを使用して、ＥＬＩＳＡによって消化タンパク質および各画分に対する免疫反応性を試験した。
【０２５９】
リジン残基において消化されたＡｐｏＡ−Ｉの場合、酵素エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した（酵素量１：５０はタンパク質重量で１／５０であった。インキュベーションは３７°Ｃで１８時間、ｐＨ８．５）。Ｌｙｓ−ＣによるＡｐｏＡ−Ｉ消化により、配列番号：１のＡｐｏＡ−Ｉの成熟アミノ酸配列を基準にしてアミノ酸残基１４１〜１８２に対応するアミノ酸配列のこれまで未報告の免疫反応性ペプチドエピトープであって、配列番号：５の最後の２つのアミノ酸が欠失した配列番号：５のヘリックスＤ由来の領域を含む免疫反応性ペプチドエピトープを含む画分７０および７１（図８）を同定することができた。このエピトープのアミノ酸配列は、配列番号：２１である。
【０２６０】
アルギニン残基において切断されたペプチド断片を作製するために、従来の方法は酵素ＡｒｇＣを使用するであろう。しかしながら、ＡｒｇＣ酵素は特異性の欠如が認められており、トリプシンペプチドが生成されて免疫反応性が無くなった。これを克服するために、消化前に、無水マレイン酸によってＡｐｏＡ１をリジン残基において可逆的に遮断し、アルギニン特異的な切断を達成した（Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０３（３）：７８Ｐ−７９Ｐ；Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１１２（５）：６７９−６８９）。このアプローチにより、配列番号：１のＡｐｏＡ−Ｉの成熟アミノ酸配列を基準にしてアミノ酸残基２１６〜２４３に対応するアミノ酸配列の別の免疫反応性ペプチドエピトープであって、配列番号：８のヘリックスＦ由来の領域１を含む免疫反応性ペプチドエピトープを含む画分７４および８０（図９）を同定することができた。このエピトープのアミノ酸配列は、配列番号：２５である。
【０２６１】
実施例６に記載されている結果は、本実施例において同定された特定のエピトープ、より一般的には、配列番号：５のヘリックスＤ由来の領域、ならびにそれぞれ配列番号：８および配列番号：９のヘリックスＦ由来の領域１および領域２が、免疫反応性がより低かった配列番号：１の成熟ＡｐｏＡ−１のアミノ酸残基１８９〜２１５に対応するペプチドに含まれる他のヘリックス、特にヘリックスＥを含む他のＡｐｏＡ−Ｉ断片に比べて抗ＡｐｏＡ−Ｉ抗体に対してより免疫反応性が高かったことを示している。したがって、そのアミノ酸配列がこれらの領域の少なくとも１つを含むペプチドを有利に使用して、抗ＡｐｏＡ−Ｉ自己抗体を検出し得る。
【０２６２】
より多くのサンプル（ｎ＝９）を用いて、実施例４および５に記載されているのと同様の実験を繰り返して、上記実施例に示されている結果を確認している。
【０２６３】
配列表
ヒトＡｐｏＡ−Ｉ：配列番号：１
ＤＥＰＰＱＳＰＷＤＲＶＫＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫＤＳＧＲＤＹＶＳＱＦＥＧＳＡＬＧＫＱＬＮＬＫＬＬＤＮＷＤＳＶＴＳＴＦＳＫＬＲＥＱＬＧＰＶＴＱＥＦＷＤＮＬＥＫＥＴＥＧＬＲＱＥＭＳＫＤＬＥＥＶＫＡＫＶＱＰＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥＬＱＥＫＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬＲＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫＥＮＧＧＡＲＬＡＥＹＨＡＫＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫＰＡＬＥＤＬＲＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＱ
ヘリックスＡ由来の領域：配列番号：２：
ＶＫＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫＤＳＧＲＤＹＶＳＱＦＥＧＳＡＬ
ヘリックスＢ由来の領域：配列番号：３：
ＤＳＶＴＳＴＦＳＫＬＲＥＱＬＧＰＶＴＱＥＦＷＤＮＬＥＫＥＴＥＧＬ
ヘリックスＣ由来の領域：配列番号：４：
ＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＭＥＬＹＲＱＫＶＥＰＬＲＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥ
ヘリックスＤ由来の領域：配列番号：５：
ＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬＲＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫＥＮ
ヘリックスＥ由来の領域１：配列番号：６：
ＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫＰＡＬＥ
ヘリックスＥ由来の領域２：配列番号：７：
ＬＡＥＹＨＡＫＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫＰＡＬＥＤＬＲ
ヘリックスＦ由来の領域１：配列番号：８：
ＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴ
ヘリックスＦ由来の領域２：配列番号：９：
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴ
アセチル化およびアミド化を含まないＡ１Ｓ２：
ＶＫＤＬＲ８ＴＶＹＶＤＶＳ５ＫＤＳＧＲＤＹＶＳＱＦＥＧＳＡＬ
前記配列の５位のＲ８および１２位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＶＫＤＬＸａａＴＶＹＶＤＶＸａａＫＤＳＧＲＤＹＶＳＱＦＥＧＳＡＬ（配列番号：１０、５位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１２位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンに置換されており、１２位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した５位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＢ１Ｓ２：
ＤＳＶＴＳＴＲ８ＳＫＬＲＥＱＳ５ＧＰＶＴＱＥＦＷＤＮＬＥＫＥＴＥＧＬ
前記配列の７位のＲ８および１４位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＤＳＶＴＳＴＸａａＳＫＬＲＥＱＸａａＧＰＶＴＱＥＦＷＤＮＬＥＫＥＴＥＧＬ（配列番号：１１、７位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１４位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、１４位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した７位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＣ１Ｓ２：
ＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＲ８ＥＬＹＲＱＫＳ５ＥＰＬＲＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥＬ
前記配列の１３位のＲ８および２０位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＹＬＤＤＦＱＫＫＷＱＥＥＸａａＥＬＹＲＱＫＸａａＥＰＬＲＡＥＬＱＥＧＡＲＱＫＬＨＥＬ（配列番号：１２、１３位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、２０位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、２０位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１３位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＤ１Ｓ２Ａ：
ＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＲ８ＤＡＬＲＴＨＳ５ＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫＥＮ
前記配列の１１位のＲ８および１８位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＸａａＤＡＬＲＴＨＸａａＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫＥＮ（配列番号：１３、１１位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１８位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、１８位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１１位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＥ１Ｓ２：
ＡＴＥＨＲ８ＳＴＬＳＥＫＳ５ＫＰＡＬＥＤ
前記配列の５位のＲ８および１２位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＡＴＥＨＸａａＳＴＬＳＥＫＸａａＫＰＡＬＥＤ（配列番号：１４、５位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１２位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、１２位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した５位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＦ３Ｌ１：
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴ
前記配列の１９位のＥおよび２３位のＫを連結するラクタム架橋を有し、
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＸａａＹＴＫＸａａＬＮＴ（配列番号：１９、１９位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、２３位の後続Ｘａａに連結されたラクタム架橋−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である）の修飾アミノ酸であり、２３位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１９位のＸａａからラクタム架橋に連結された単結合である）の修飾アミノ酸である）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＦ３Ｓ２Ａ：
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＲ８ＬＥＥＹＴＫＳ５ＬＮＴ
前記配列の１６位のＲ８および２３位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＸａａＬＥＥＹＴＫＸａａＬＮＴ（配列番号：１５、１６位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、２３位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、２３位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１６位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＦ３Ｓ１Ｂ：
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＳ５ＬＳＡＳ５ＥＥＹＴＫＫＬＮＴ
前記配列の１３位のＳ５および１７位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＸａａＬＳＡＸａａＥＥＹＴＫＫＬＮＴ（配列番号：１６、１３位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１７位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、１７位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１３位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＦ４Ｓ２Ｂ：
ＶＬＥＳＦＫＶＳＲ８ＬＳＡＬＥＥＳ５ＴＫＫＬＮＴ
前記配列の９位のＲ８および１６位のＳ５を連結する炭化水素ステープルを有し、
ＶＬＥＳＦＫＶＳＸａａＬＳＡＬＥＥＸａａＴＫＫＬＮＴ（配列番号：１７、９位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１６位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、１６位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した９位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである）によって表される。
アミド化を含まない直鎖状ＥＦＬ１：
ＣＡＥＹＨＡＫＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫＰＡＬＥＤＬＲＸＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＣ、
２８位のＸ＝Ｇｌｎ類似体（側鎖はＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２ではなくＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２）、および前記配列の４７位のＥおよび５１位のＫを連結するラクタム架橋を有し、
ＣＡＥＹＨＡＫＡＴＥＨＬＳＴＬＳＥＫＡＫＰＡＬＥＤＬＲＸａａＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＸａａＹＴＫＸａａＬＮＴＣ（配列番号：１８、２８位のＸａａは、側鎖としてＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２を有するＧｌｎ類似体であり、４７位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、５１位の後続Ｘａａに連結されたラクタム架橋−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である）の修飾アミノ酸であり、５１位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した４７位のＸａａからラクタム架橋に連結された単結合である）の修飾アミノ酸である）によって表される。
アセチル化およびアミド化を含まないＦ４Ｌ１：配列番号：２０：
ＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＸａａＹＴＫＸａａＬＮＴ
１５位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１９位の後続Ｘａａに連結されたラクタム架橋−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である）の修飾アミノ酸であり、１９位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１５位のＸａａからラクタム架橋に連結された単結合である）の修飾アミノ酸である。
Ｄ２（ａａ１４１−１８２）：配列番号：２１：
ＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬＲＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫ
Ｄ２Ｓ２Ａ：配列番号：２２：
ＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＸａａＤＡＬＲＴＨＸａａＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫ
１６位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、２３位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、２３位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１６位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである。
Ｄ３：配列番号：２３：
ＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＶＤＡＬＲＴＨＬＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫ
Ｄ３Ｓ２Ａ：配列番号：２４：
ＥＥＭＲＤＲＡＲＡＨＸａａＤＡＬＲＴＨＸａａＡＰＹＳＤＥＬＲＱＲＬＡＡＲＬＥＡＬＫ
１１位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒは、１８位の後続Ｘａａに連結された炭化水素ステープル−（ＣＨ２）６−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）３−である）の修飾アラニンであり、１８位のＸａａは、式（Ｉ）：−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）（Ｒ’）−Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ’は、上において定義した１１位のＸａａから炭化水素ステープルに連結された単結合である）の修飾アラニンである。
Ｆ５：配列番号：２５：
ＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫＬＮＴＱ
アセチル化およびアミド化を含まないスクランブルＦ３：配列番号：２６：
ＫＥＬＹＬＬＫＦＴＶＥＳＫＶＧＳＴＥＬＰＬＮＦＳＬＡ
本配列表において、Ｒ８は、（Ｒ）−２−（７’−オクテニル）−アラニンに対応し、Ｓ５は、（Ｓ）−２−（４’−ペンテニル）−アラニンに対応する。
【図１ＡＢ】
0006499967.tif 000009
【図１Ｃ】
0006499967.tif 000010
【図２】
0006499967.tif 000011
【図３ＡＢ】
0006499967.tif 000012
【図３Ｃ】
0006499967.tif 000013
【図４】
0006499967.tif 000014
【図５Ａ】
0006499967.tif 000015
【図５Ｂ】
0006499967.tif 000016
【図５Ｃ】
0006499967.tif 000017
【図６Ａ】
0006499967.tif 000018
【図６Ｂ】
0006499967.tif 000019
【図７】
0006499967.tif 000020
【図８】
0006499967.tif 000021
【図９】
0006499967.tif 000022
【配列表】
0006499967000001.app