(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用フォーム装置を製造する方法であって、
（ａ）哺乳動物組織から得られた脱水細胞外マトリックス材料を、４．０未満のｐＨ又は９．０を超えるｐＨを含む溶液で可溶化するステップと、
（ｂ）前記酸性（ｐＨ＜４）又は塩基性（ｐＨ＞９）の可溶化細胞外マトリックス材料を、産業用ブレンダーにおいて、約５００ＲＰＭから２５００ＲＰＭの範囲の速度で混合して泡沫状細胞外マトリックス材料スラリーを形成するステップと、
（ｃ）一つ以上のカルシウム塩又はリン酸塩をステップ（ｂ）中に加えることにより鉱化するステップと、
（ｄ）前記混合された泡沫状細胞外マトリックス材料を緩衝液に混ぜて前記泡沫状細胞外マトリックス材料スラリーを約ｐＨ７に中和するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記泡沫状細胞外マトリックス材料スラリーを型に導入するステップと、
（ｆ）前記中和され、型に導入された泡沫状細胞外マトリックス材料スラリーを、予冷された凍結乾燥機の棚で凍結乾燥させるステップと、
（ｇ）０℃から−４０℃の間の温度範囲において、０分から２４０分の間の範囲の期間にわたって、氷晶をステップ（ｆ）の前記泡沫状細胞外マトリックス材料に導入するステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）で導入された前記氷晶を、６０〜１２０ｍｍＨｇの範囲の真空圧力で昇華させて前記医療用フォーム装置を製造するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記凍結乾燥機の棚は、０．０１℃／分から１℃／分の温度変化の速度で２５℃から−４０℃の範囲の温度にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞外マトリックス材料が、粘膜下層、上皮基底膜、上皮基底膜及び固有層、真皮、並びに肝臓基底膜からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｈ）の後に、前記医療用フォーム装置を特殊化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
４．０未満のｐＨを含む前記溶液は、ＨＣｌ、リン酸、酢酸からなる群から選択される酸性溶液であり、９．０を超えるｐＨを含む前記溶液は、水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムからなる群から選択される塩基性溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）の前記中和溶液が、ＮａＯＨ、ＮａＨＣＯ３及びＫＣｌからなる群から選択される塩基、又は、混合するために塩基が使用される場合には、酢酸及び塩酸からなる群から選択される酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記型がシート状の形状を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｅ）の前に、
（ｇ）ステップ（ｄ）の前記細胞外マトリックス材料スラリーを３次元（３Ｄ）プリンターに導入するステップと、
（ｈ）前記医療用フォーム装置を前記３Ｄプリンターによって印刷するステップと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
医療用ゲルを製造する方法であって、
請求項１に記載の方法に従って医療用フォーム装置を製造するステップと、
前記医療用フォーム装置を粉砕して粉末を形成するステップと、
前記粉末を水溶液と混合して前記医療用ゲルを形成するステップと、を含む方法。
【請求項１０】
前記多孔質細胞外マトリックス材料が、約１ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の細孔径を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記医療用フォーム装置は、患者の組織傷害の部位に植え込まれるように構成された形状を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記医療用フォーム装置は、３次元（３Ｄ）印刷によって製造される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一つ以上のカルシウム塩又はリン酸塩は、カルシウム、リン酸塩、カルシウム塩及びリン酸塩、硝酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸、脱塩又は脱細胞骨マトリックス、粉末同種骨、ヒドロキシアパタイト、及びリン酸三カルシウムからなる群から選択される鉱物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｇ）に続いて、前記医療用フォーム装置を可溶化し、一つ以上のカルシウム塩又はリン酸塩を更に加え、再凍結乾燥させるステップを更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記医療用フォーム装置は、約１ミクロン〜５００ミクロンの範囲の直径を有する複数の孔を備える、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１４年９月２５日出願の米国仮特許出願第６２／０５５，０５６号の優先権及び利益を主張するものである。
【０００２】
本明細書に記載される本発明は、哺乳動物組織の細胞外マトリックス材料由来の組織修復多孔質フォーム、それから製造される医療装置、並びに、それらの使用方法及び製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する、創傷の修復に有用な材料が、限定されるものではないが、あらゆる目的のためにそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第６，５７６，２６５号、米国特許第４，９０２，５０８号、米国特許第４，９５６，１７８号、米国特許第５，５５４，３８９号及び米国特許第６，３７９，７１０号に記載されているＥＣＭを含め、様々な刊行物に記載されている。ＥＣＭは、限定されるものではないが、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）、膀胱マトリックス（ＵＢＭ；上皮基底膜を含む）、真皮（ＰＤ）及び肝臓基底膜（ＬＢＭ）が挙げられる。創傷治癒材料として創傷の回復に有用なＥＣＭは、典型的には、シート、ゲル、様々なサイズの粉末若しくは微粒子、液体又は３次元非シート状の形状として適用される。
【０００４】
先行技術におけるＥＣＭ由来創傷治癒材料の形態の不都合な点は、それらの相対的２次元（平面）の性質である。他の先行技術の創傷治癒材料は、空隙、例えば外傷性創傷の空隙の充填の適用例に使用するのが困難であり、且つ、止血剤としての使用が困難であるシート、粉末又はゲルである。さらに、直接創傷送達又は他の合成ポリマー足場の被覆に有用な流動性ＥＣＭ足場は、多くの場合、流動性ＥＣＭ足場の生成のためのＥＣＭ足場の酵素分解を必要とする。ヒトに導入される医用材料から酵素を除去することが望ましいため、酵素分解は望ましくない。医療装置の酵素の除去は技術的に困難である。
【０００５】
従って、流動性が改善され、被覆特性が改善され、空隙充填などの適用例のための３次元構造への成形性が改善され、創傷に対する複数回の適用から低頻度の適用例、例えば創傷への１回の適用までの使いやすさが改善され、且つ、治癒が促進される新規なＥＣＭ組成物が再生医療の分野で要望されている。加えて、流動性及び被覆特性が改善された新規なＥＣＭ組成物は、製造可能性の観点からのさらなる利点、例えば酵素分解の中止を実現し得る調製技術に対応することができる。加えて、新規なＥＣＭ組成物は、先行技術で示されている組成物よりも、その担体、例えば生理食塩水から分離されにくくするべきである。既知のＥＣＭ組成物は、数時間以内に担体から沈降する傾向にあるが、本ＥＣＭ組成物は、長期間、例えば１週間を超える期間にわたって懸濁を維持する。以下に記載される本発明は、既知のＥＣＭの上記の問題を解消するため、既知のＥＣＭ創傷組成物よりも有利である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の前述及び他の目的、特徴及び利点は、本発明の好ましい実施形態の以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【０００７】
一態様では、本発明は、医療用フォーム装置を製造する方法に関する。一実施形態では、この方法は、細胞外マトリックス材料、例えば、ＵＢＭ、ＬＢＭ、ＵＢＳ、又はＳＩＳなどで開始し、ＥＣＭを脱水し、続いて脱水したＥＣＭを、例えば、４．０未満のｐＨ又は９．０を超えるｐＨを含む溶液で可溶化する。可溶化ＥＣＭを、例えば、産業用ブレンダーにおいて５００ＲＰＭ〜２５００ＲＰＭの速度で混合して泡沫状細胞外マトリックススラリーを形成する。次に、泡沫状ＥＣＭスラリーを、酸又は塩基の添加によって溶液中で要求される約ｐＨ７に中和して混合する。一実施形態では、泡沫状ＥＣＭスラリーは、３次元医療装置を製造する３次元プリンターで「インク」として使用し、３次元の物体、例えば、外科用インプラントに被覆し、且つ脱水することができる。別法では、ＥＣＭスラリーを型に加えて、続いて成形されたスラリーを脱水して医療装置を形成することができる。
【０００８】
脱水スラリーを特殊化して、医療用途に使用することもできる。医療用ゲルを、脱水特殊化スラリーを溶液中で混合することによって脱水特殊化スラリーから製造することができる。
【０００９】
別の態様では、本発明は、上記のようにＥＣＭから製造される医療装置に関する。この装置は、１つ以上の次の材料を含む鉱化装置であり得る：カルシウム、リン酸塩、カルシウム塩及びリン酸塩、硝酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸、脱塩又は脱細胞骨マトリックス、粉末同種骨、ヒドロキシアパタイト、及びリン酸三カルシウム。
【００１０】
本発明の医療装置は、ゲル、シート形状、若しくは解剖学的構造を模倣する３次元形状であり得るか、又は、非限定の例として間隙を充填する形状にされ得るか、又は、他に外傷部位に植え込まれるように構成され得る。医療装置は、例えば、１ミクロン〜５００ミクロン、１００ミクロン〜２５０ミクロン、又は１００〜１５０ミクロンの範囲の細孔径を有する脱水泡沫状細胞外マトリックス材料を少なくとも含む。
【００１１】
本発明の一実施形態では、医療装置は成形される。代替の実施形態では、医療装置は３Ｄ印刷される（３次元印刷プリンターから印刷される）。
【００１２】
なお別の実施形態では、本発明の医療装置は、泡沫状細胞外マトリックススラリー材料で被覆された従来の医療装置である。この医療装置は、少数の適用例及び形状を挙げると、充填されるべき組織空隙、増強を必要とする組織、傷害組織の形状及び大きさ、並びに、特定の適用例に必要な多孔性、例えばスポンジ状に応じて様々な形状を取り得る。加えて、泡沫状細胞外マトリックス材料は、抗炎症性、鎮静性及び抗菌性を有する。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、脱水細胞外マトリックススラリー材料を特殊化して、溶液、例えば水、生理食塩水又は他の生理学的緩衝液に添加して、ゲル、組織接着剤又は本明細書に記載の本発明によるＥＣＭスラリーから形成されたＥＣＭの他の可溶化形態に形成することができる。
【００１４】
本発明は、特に添付の特許請求の範囲に関して説明される。本明細書に記載される本発明のさらなる利点は、添付の図面と共に以下の説明を参照することによってより良く理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態による多孔質立方体状ＥＣＭフォームを例示する。
【図２Ａ】本発明によるメッシュの様々な実施形態を例示する。
【図２Ｂ】本発明によるメッシュの様々な実施形態を例示する。
【図２Ｃ】本発明によるメッシュの様々な実施形態を例示する。
【図３】本発明の一実施形態による身体部分の形状の多孔質ＥＣＭフォームを例示する。
【図４】創傷がブタの背中の皮膚に導入された後の様々な時点での、MicroMatrix  １回（１回の適用）、MicroMatrix  ４回（０日目、４日目、７日目、及び１４日目の無傷ＵＢＭ微粒子の反復適用）、及び湿潤包帯と比較した多孔質ＥＣＭフォームの創傷治癒を比較する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
先行技術の創傷治癒ＥＣＭ由来材料と比較すると、以下に記載される本発明による多孔質ＥＣＭ由来フォームは、少なくとも以下の利点を有する。
（１）医療装置用の３次元多孔質構造を形成するための出発材料としてのシート状構造の使用、
（２）ＥＣＭ由来フォームの制御された細孔径、
（３）空隙率が選択可能な鉱化ＥＣＭ、
（４）流動性マトリックスを形成するのに十分に長い懸濁状態を維持する高い能力、
（５）ＥＣＭフォームの流動性スラリーでの医療装置の高い被覆性、
（６）３次元形状、例えば、非限定の例として、例えば、ピン、ラップ、チューブ、又は他の管状構造、スプリント、弁、ステープル、スポンジ、骨インプラント、又はメッシュが挙げられる医療装置の形状の形成、
（７）迅速な内因性創傷治癒を促進する高い能力、
（８）抗炎症性、鎮静性、及び抗菌性、
（９）非酵素的分解、
（１０）開示される多孔質ＥＣＭフォームの単一の適用は、先行技術のＥＣＭ創傷治癒製品の単一の適用よりも迅速な治癒を促進する、
（１１）高い流動性、
（１２）印刷可能性（３次元印刷）、
（１３）成形性。
【００１７】
一態様では、図１を参照すると、本発明は、多孔質ＥＣＭフォームを形成するために加工される、例えば、ＳＩＳ、ＵＢＳ、ＵＢＭ及びＬＢＭに限定されない細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含む創傷治癒材料１０に関する。フォームは、３次元フォームの体積の大部分が、空であるか又は空気などの気体若しくは流体で充填することができる空隙（孔）２０を含む場合に多孔質と定義される。これらの空隙は、例えば、体液、例えば、血液、又は他の溶液、例えば、成長因子カクテル、血管内皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、又は生理食塩水で満たすことができる。多孔質ＥＣＭフォームは、凍結乾燥又は空気乾燥によって部分的又は完全に固化してシート、即ち、平面形状、又は他の３次元（即ち、非平面）医療装置を形成することができる。多孔質ＥＣＭフォームは、限定されるものではないが、外科用ステープルの厚みの補償及び補強のための立方体状ＥＣＭフォーム、多孔質骨インプラント及びスポンジ、神経移植片若しくは人工動脈として適用される多孔質チューブ形状、又は多孔質創傷治癒マトリックス及び多孔質真皮修復足場としての様々な厚みの多孔質シート、並びに組織欠損部を充填するため及び／又は組織切開若しくは整形手術後の組織増強のために特別に整形された材料を含む任意の形状を形成するために整形することができる。
【００１８】
図１を参照すると、本発明による多孔質ＥＣＭフォーム１０の内部の細孔２０の径は、多孔質ＥＣＭフォームの外部に現れる細孔２０の径と異なり得る。細孔の内径は、約１ミクロン〜５００ミクロン、約１００ミクロン〜２５０ミクロン、特に、例えば、約１００〜１５０ミクロンの範囲である。この範囲の細孔径は、細胞浸潤、並びに体液又は細胞培地及びこれらの液体に関連した栄養物の交換に理想的である。
【００１９】
本発明の特定の一実施形態では、多孔質フォームは、例えば、カルシウム塩又はリン酸塩、硝酸カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、及び他のカルシウム塩、又はリン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、及びリン酸からのリン酸塩、及びこれらの組み合わせの追加によって鉱化される。鉱化フォームは、骨の整形外科的外傷の修復、例えば、通常であれば空隙を埋めるために患者の他の部位から骨を採取する必要があり得る患者の骨折での空隙の充填、脊椎損傷、又は頭部（頭蓋）損傷に適用可能である。
【００２０】
本発明による多孔質ＥＣＭフォームの別の実施形態では、固化多孔質ＥＣＭフォームを粉砕して、微細な多孔質ＥＣＭフォーム微粒子又は粉末を形成する。このような粉末化多孔質ＥＣＭフォームは、例えば、患者の組織傷害部位に創傷治癒組成物として注入するためにシリンジ内に吸引することができる。粒子状多孔質ＥＣＭフォームの微粒子の径は、例えば、約１ｎｍ〜１ミリメートル、特に１ミクロン〜１ミリメートルと様々である。特に、１００ミクロン〜５００ミクロンの範囲の微粒子径が、微粒子の流動混合物に好ましい。微粒子は、適量の注入用の液体、例えば、水、生理食塩水、又はリン酸緩衝生理食塩水と混合されると、流動性混合物、例えば、ゲルなどを形成することができる。本明細書で使用される「流動性」という語は、室温で注ぐ又は押し出すことができることを意味する。多孔質ＥＣＭフォーム微粒子を含む流動性混合物の典型的な適用例としては、限定されるものではないが、創傷治癒、真皮充填剤、骨及び脊椎適用例（特に鉱化フォーム）、及び関節炎の処置用の適用例を含む関節内適用例が挙げられ、このような関節炎としては、限定されるものではないが、変形性関節症、関節リュウマチ、他の炎症性関節炎のタイプ、変性性関節炎、限定されるものではないがライム病を含む敗血症性関節炎、痛風、及び外傷性関節炎が挙げられる。
【００２１】
本発明による多孔質ＥＣＭフォームの別の実施形態では、この多孔質フォームは、例えば、限定されるものではないが、外科用メッシュ、縫合材料、並びに他の平面及び実質的に３次元の医療装置構造の被覆を含む被覆によって医療装置に適用することができる。本明細書で使用される「医療の」という語は、薬物療法又は外科手術の実施に関連することを意味する。被覆は、例えば、吹き付け、浸漬、ブラシでの塗布、又はローリングによって達成することができる。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、本発明による多孔質フォームスラリーを、チューブの内腔又は他の形状に充填してＥＣＭロッドを形成することができる。多孔質ＥＣＭフォームスラリー充填ロッドは、適用例、例えば、神経線維の再生又は瘻孔の閉鎖に使用することができる。非限定の一実施形態では、ロッドは、例えば、例としてＥＣＭ、ＵＢＭのシート若しくは多層シート、又はＥＣＭスラリーから形成されたシートから形成することができる。ロッドは、シートを円筒状に丸めて、そのチューブ内に多孔質ＥＣＭフォームスラリーを充填することによって形成される。別法では、多孔質ＥＣＭフォームスラリーを、ＥＣＭシートが丸められる前に塗って、次いで円筒状に丸めて多孔質ＥＣＭスラリーを封入することができる。
【００２３】
神経再生の適用例では、例えば、切断された神経の一端をＥＣＭロッドの一端に接合することができ、切断された神経の他端をＥＣＭロッドの他端に接合することができ、従って、神経発生を促進する誘導チャネルとして機能する。
【００２４】
瘻孔修復の適用例では、例えば、ＥＣＭシート及びフォームを円筒状に丸めて形成されるロッドを瘻孔内に挿入することができる。本発明の一実施形態では、瘻孔経路内に挿入された後、例えば、生理食塩水で水和されたときにロッドが膨張して不規則な形状を満たすように、ＥＣＭ組成物を改変することができる。
【００２５】
メッシュ３０に関する本発明の別の実施形態では、図２Ａを参照すると、本発明による多孔質ＥＣＭフォームを、図２Ａに示されているようにメッシュ３０の空間１２内に埋め込んでもよく、図２Ｂに示されているように被覆としてメッシュの縦糸及び／又は横糸１４、１６に塗ってもよく、又は図２Ｃに示されているように空間１２内に埋め込み、且つ、メッシュ３０の縦糸１４及び／又は横糸１６に被覆してもよい。埋め込まれた多孔質ＥＣＭフォームメッシュは、例えば、上記のようにフォームスラリーの２つの層間のメッシュの層を挟んで形成して、凍結乾燥させることができる。得られる凍結乾燥フォームを、水又は生理食塩水での水和後に又は水和なしで真空プレスすることができ、真空プレスによって１つの連続した積層メッシュ状構築物が得られる。このアプローチにより、フォームの一方の側のＥＣＭが、メッシュの孔内に入り込むことによって他方の側のＥＣＭと一体化する。
【００２６】
このような多孔質ＥＣＭフォーム強化医療装置の典型的な適用例としては、限定されるものではないが、ヘルニア修復、感染した領域への適用例、合成メッシュへの組織の接着の最少化、乳房再建、組織拡張器及び／又は組織増強、抗炎症又は抗菌の適用例、及び鎮痛が挙げられる。
【００２７】
なお別の実施形態では、本発明による多孔質ＥＣＭフォームは、生物活性分子、薬物、及び他の医薬品の担体として機能する。例えば、本発明による多孔質ＥＣＭフォームは、腫瘍切除後の欠損部充填剤として組織空隙に充填される。化学療法薬を、これらのフォームに添加することができる。例えば、多孔質ＥＣＭフォームは、成長因子、疾患、例えば、癌及び糖尿病の処置を目的とする小分子及び他の分子、抗炎症薬、例えば、ステロイド及び非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、抗菌薬、及び痛みを軽減するための鎮痛薬の担体である。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ＥＣＭ由来の多孔質フォームを製造する方法に関する。ＥＣＭの供給源は、限定されるものではないが、上記のＵＢＳ、ＵＢＭ、ＳＩＳ及びＬＢＭを含む。
【００２９】
本発明の製造方法の一実施形態では、ＵＢＭは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第６，５７６，２６５号に記載されているように調製される。簡単に述べると、膀胱を、哺乳動物、例えば、ブタ、ヒツジ、又はウシから取り出し、及び膀胱壁を、例えば、限定されるものではないが、膀胱を高張食塩液に１０分〜１２０分浸漬することによって管腔上皮細胞から剥離する。浸漬により、上皮細胞を下層の上皮基底膜から除去する。この最初のステップの後に残る上皮組織の層は、上皮基底膜並びに上皮基底膜の反管腔側の全ての層、即ち、少なくとも固有層、粘膜下層、筋層、及び漿膜である。１つ以上の組織層、例えば、固有層、筋層粘膜、粘膜下層、筋層、及び漿膜は、ＵＢＭマトリックスを形成するために機械的アブレーション又は他の軽度の化学処理によって選択的に除去される。
【００３０】
１つ以上の反管腔側の層が膀胱又は他の上皮組織から選択的に除去された後、得られるマトリックスは、マトリックスの管腔表面を補強する上皮基底膜（上皮細胞及び実質的に全ての細胞要素が除去されている）、及び１つ以上の組織層、例えば、上皮基底膜の反管腔側の筋層粘膜、固有層、粘膜下層、筋層、及び漿膜を含む。
【００３１】
ＥＣＭ、例えば、上記のＵＢＭを約１Ｎ〜０．００１Ｎの濃度の塩酸又は水酸化ナトリウム、好ましくは０．１〜０．０１Ｎ  ＨＣｌ、より好ましくは０．０１Ｎ  ＨＣｌで約５分間再水和し、及び混合ステップで、約５００ＲＰＭ〜２５００ＲＰＭ、好ましくは２０００ＲＰＭの速度で産業用ブレンダーにおいて混合して泡沫状流動性ＥＣＭスラリーを形成する。次いで、このフォームＥＣＭスラリーを、例えば、約０．０１Ｎ〜１Ｎ、好ましくは０．１Ｎ〜１Ｎの濃度範囲、より好ましくは１Ｎの塩基、例えば、ＮａＯＨで室温において中和することができる。他の塩基、例えば、ＫＣｌ又はＮａＨＣＯ３も、泡沫状ＥＣＭスラリーを形成するために使用される酸を中和するのに有用である。塩基、例えば、ＮａＯＨが酸性泡沫状ＥＣＭスラリーに添加されたら、このスラリーを、足場の形成前に再び簡単に混合してスラリーを均一に中和する。次いで、典型的には、泡沫状ＥＣＭスラリーを型に注いで、予想される創傷治癒の適用例に基づいた平面又は解剖学的形状の３次元多孔質ＥＣＭフォームを形成する。例えば、３次元多孔質の硬質又は半硬質ＥＣＭフォームを、円柱ロッド、チューブ、キューブ、又は身体部分１０、例えば、図３に示されているような鼻、又は耳、乳房、心臓弁、歯槽、及び他の複雑な３次元組織として整形することができる。上記のように、特定の装置の適用例の型としては、例えば、限定されるものではないが、ステープラー留めされた外科用ステープルの厚みの補償及び補強のための立方体状多孔質ＥＣＭフォーム用の立方体の型、骨インプラント及びスポンジ用、神経移植片、人工静脈若しくは動脈、人工気管、食道若しくは腸の置換術若しくは吻合術のような適用例のための多孔質ＥＣＭチューブを形成するためのチューブ形状の型、又は多孔質ＥＣＭ局所創傷治癒若しくはヘルニア修復マトリックスとしての多孔質ＥＣＭシートの形成用及び／若しくは多孔質ＥＣＭ真皮修復足場用のシートの型が挙げられる。
【００３２】
フォームＥＣＭスラリーが型内に導入されたら、スラリーを、以下に記載される特定の条件下で凍結乾燥又は空気乾燥させて、成形固体又は成形半固体、即ち、非流動性の多孔質ＥＣＭフォーム装置を形成する。多孔質ＥＣＭフォーム装置の内部及び多孔質ＥＣＭフォーム装置の外部の細孔径は、凍結乾燥温度によって、及び型として使用される材料によって制御することができる。以下に記載されるプロセスを用いて、例えば、１ミクロン（μＭ）〜５００ミクロン、１００ミクロン〜２５０ミクロン、又は１００〜１５０ミクロンの範囲の、フォーム装置の外部から内部の細孔径を得ることができる。細孔径は、溶液中のＥＣＭの濃度によって、及び凍結の速度によって異なり得る。
【００３３】
ＥＣＭスラリーの一般的な凍結乾燥ステップは、凍結乾燥機の棚の２５℃〜−４０℃、４℃〜−２０℃、又は特に−１０℃〜−２０℃の範囲の予冷を含む。予冷に続いて、例えば、０分〜２４０分、０分〜１２０分、又は６０分〜１２０分の範囲の期間にわたって０℃〜−４０℃、０℃〜−２０℃、特に−１０℃〜−２０℃の範囲の温度で成形スラリーを安定させて氷晶を生じさせる。このステップの間、凍結乾燥機の棚は、例えば、０．０１℃／分〜１℃／分、又は０．１℃／分〜１℃／分の速度で冷却される。次いで、このステップ中にＥＣＭスラリーから形成された氷が、上記の成形多孔質ＥＣＭフォームスラリーを安定させるための温度で真空によって昇華される。使用される真空圧力は、典型的には１００〜１２０ｍｍＨｇの範囲である。
【００３４】
多孔質ＥＣＭフォームを製造する方法の特定の一実施形態では、硝酸カルシウムから、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、及び他のカルシウム塩に至るカルシウム及びリン酸塩、並びにリン酸ナトリウムから、リン酸二水素ナトリウム、及びリン酸に至るリン酸塩を上記の混合ステップに加えて、鉱化多孔質ＥＣＭフォームを形成した。上記の塩の比率は、特に、in vivoの天然骨を模倣するために当技術分野で公知のリン酸カルシウム濃度を得るために、モル比を変更することによって変更することができる。これらの塩は、in situで反応して、上記のように鉱化３次元フォームを形成する。酸（例えば、リン対塩化水素）、カルシウム塩とリン酸塩とのモル比及びｐＨの選択により、フォームの鉱物成分、例えば、ブルシャイト、アパタイト、モネタイトの微細構造の変化をもたらし得る。別法では、フォームは、鉱物の成分の１つ、例えば、カルシウムイオン又はリン酸イオンが添加された水酸化ナトリウムでも形成することができ、まず凍結乾燥させ、凍結乾燥の直後に溶液に別の塩（カルシウムが最初のステップで使用される場合にはリン酸）を溶液に含めることができ、フォームでの鉱化が可能となる。これに続いて、再凍結乾燥により鉱化フォームを得る。
【００３５】
さらに、鉱物の他の供給源、特にチタン若しくはマグネシウム由来、又は「骨状」再吸収性ケイ酸金属塩由来鉱物を、単純なカルシウムリン酸塩の代替として使用することもできる。また、脱塩又は脱細胞骨基質、粉末同種骨、ヒドロキシアパタイト、及びリン酸三カルシウムを、足場調製のための混合中にリン酸カルシウム源として使用することができる。
【００３６】
例えば、リン酸三カルシウムで上記のフォームの１つを製造するために、０．３Ｍ硝酸カルシウムが上記の混合プロセス中に０．２Ｍリン酸アンモニウムナトリウムと共に添加される。別法では、０．０１Ｍ〜１Ｍの様々なリン酸溶液を０．１Ｍ〜１Ｍ、例えば、０．１Ｍ〜０．５Ｍの濃度のいくつかのカルシウム源、例えば、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム、又はこれらの組み合わせと反応させることにより、他の組み合わせを得ることができる。硝酸カルシウムと水酸化カルシウムとの比率は、前述のように得るべき鉱物の種類によって１：１〜１０：１に調整することができる。
【００３７】
別の実施形態では、多孔質ＥＣＭフォーム装置は、粉砕されて微粉末（例えば、２５０ミクロン未満）にされ、シリンジに充填される。粉砕プロセスは、モルタル接合及びすり潰しから、凍結粉砕、ブレード粉砕、及びワイヤ粉砕（wire milling）まで様々であり得る。必要な多孔質ＥＣＭフォーム粒子の径及び体積に応じて、使用される粉砕プロセスが決まる。粉砕される粒子の径は、約１ｎｍ〜１ミリメートル、特に約１ミクロン〜１ミリメートルの範囲である。多孔質ＥＣＭ微粒子の流動性混合物では、１０ミクロン〜５００ミクロンの範囲の粒径が好ましい。粒子状多孔質ＥＣＭフォームの溶液を調製するために、例えば、適切な量の水、生理食塩水、又はリン酸緩衝液を使用して、長い時間（例えば、７日以上、１〜７日、２〜５日、又は３〜４日）が経過しても異なる相に分離しない流動性混合物を調製する。典型的には、１０〜１０００ｍｇの多孔質ＥＣＭフォーム粉末では、１００マイクロリットル〜１ミリリットルの範囲の生理食塩水又は他の流体により、異なる適用例に合った異なる特性を有する流動性混合物が得られる。典型的な適用例としては、創傷治癒、真皮充填剤、植毛用の充填剤、関節炎の処置用の適用例を含む骨及び脊椎適用例（特に鉱化フォームの）が挙げられる。
【００３８】
この方法の別の実施形態では、上記の多孔質ＥＣＭフォームを、医療装置、例えば、メッシュ、縫合糸、及び他の平面又は３次元構造に適用することができる。このような医療装置への適用は、瘢痕を軽減し、治癒を促進する。一実施形態では、メッシュ及び同様の構造が、多孔質ＥＣＭ泡沫状スラリーの凍結乾燥前にＥＣＭ泡沫状スラリーの両側に埋め込まれるか、又は配置される。別法では、医療装置の構造を、ＥＣＭ泡沫状スラリーの凍結乾燥前にこのＥＣＭ泡沫状スラリーに浸漬するか、このスラリーを塗るか、又は吹き付けることができる。なお別の実施形態では、ＥＣＭ泡沫状スラリーは、平面又は３次元医療装置の製造に使用される３Ｄ印刷プロセスの「インク」である。同様に、多孔質ＥＣＭフォームは、３次元メッシュに形成することができる。このような多孔質ＥＣＭフォームメッシュの典型的な適用例としては、限定されるものではないが、ヘルニア修復、瘻孔修復、汚染部位への適用、付着防止剤の適用、乳房再建、並びに組織拡張器及び組織増強の適用例が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
本発明の例示
多孔質フォームを、上記のように膀胱からのＵＢＭとして形成した。ＵＢＭのシートを、０．０１Ｍ塩酸に３０分浸漬して、均一なＥＣＭスラリーを得た。このスラリーを型に注ぎ、凍結乾燥させて均一な多孔質フォームを得た。約６ｍｍの厚みの凍結乾燥多孔質フォームが形成され、これを、生検パンチを用いて２０ｍｍの直径に切断してフォームディスクを形成した。フォームディスクをダブルピールTyvekパウチに入れて、３匹の成体ブタの背中の皮膚の全層創傷の管理における評価のために電子ビーム照射で最終滅菌した。
【００４０】
ブタ１匹当たり少なくとも１０の凍結乾燥フォームディスクを、１つの欠損部位当たり１つのフォームディスクで背側の皮膚欠損部に植え込んだ。フォームディスクは、乾燥した状態で植え込み、次いで、生理食塩水湿潤ガーゼで覆ってフォームディスクに水分を浸み込ませた。生理食塩水浸漬ガーゼを接着防止包帯で覆った。創傷の寸法を、植え込み直後、１日目、２日目、１２日目、１４日目、１８日目、及び２１日目を含む複数の時点で測定した。同じ動物の対照創傷を、生理食塩水湿潤ガーゼ、無傷ＵＢＭ微粒子（MicroMatrix（登録商標）、ACell, Inc.）（１回）の１回の適用、又は０日目、４日目、７日目、及び１４日目（４回）の無傷ＵＢＭ微粒子の反復適用のいずれかで処置した。創傷サイズを、キャリパーで測定し、Aranz Silouetteカメラで撮影した画像を用いて数値化した。例えば、治癒を１００％（創傷直径の１００％が残存）及び０％（創傷が完全に治癒して欠損部が残っていない）と表した。組織学的検査も行い、治癒の見込み及びフォーム適用後の治癒の質を評価した。
【００４１】
図４は、凍結乾燥フォームディスク、１回（１日適用されたＵＢＭ微粒子）、４回（４日適用されたＵＢＭ微粒子）、及び対照で処置された創傷についての、時間０、１日目、１２日目、１４日目、１８日目、及び２１日目に残った欠損部の直径のパーセンテージを比較する棒グラフである。
【００４２】
凍結乾燥ＵＢＭフォームディスクで処置された全層創傷は、１８日目及び２１日目に創傷欠損部の肉眼的又は組織学的に完全な治癒を示した。フォームディスク処置創傷の組織学的検査により、治癒が２１日目までに完了したことが示された。フォームディスクの１回の適用で処置された創傷は、ＵＢＭ微粒子の複数回の適用よりも僅かに速く、且つＵＢＭ微粒子の１回の適用よりも著しく速い治癒を示した。処置された創傷部位は、感染の兆候を示さなかった。欠損部における血管新生、脂肪顆粒、及び上皮形成が、フォームと共に植え込まれたサンプルで観察された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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