(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
麻酔と臓器保護とを、それを必要とする対象に提供するためのキットであって、
常圧条件において、臓器保護を提供するのに有効な量のアルゴンである非麻酔性保護ガスと、麻酔を提供するのに有効な量の液体麻酔薬とを含む、キット。
【請求項２】
アルゴンが、1%から79%の間の濃度で投与される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
液体麻酔薬が、液体の形態で投与される、請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
液体麻酔薬が、チオペンタール、プロポフォール、ケタミン、ヒプノミデート、バルビツレート、ブプレノルフィン又はデクスメデトミジンである、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
液体麻酔薬が、静脈内に投与される、請求項３または４に記載のキット。
【請求項６】
液体麻酔薬が、蒸気の状態で投与される、請求項１または２に記載のキット。
【請求項７】
液体麻酔薬が、セボフルラン、イソフルラン又はデスフルランである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
液体麻酔薬が、セボフルランである、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬が、膜型装置によって対象に投与される、請求項６から８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬が、人工呼吸器によって対象に投与される、請求項６から８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
人工呼吸器が、対象により吐き出された空気から非麻酔性保護ガスを選択的に保持、隔離又は排気する1つ又は複数のガス分離膜を備え、場合により、i)非麻酔性保護ガスが保持される場合には、非麻酔性保護ガスは、患者における更なる使用に利用可能であり、ii)非麻酔性保護ガスが隔離又は排気される場合には、非麻酔性保護ガスは、後の使用のためにその後に再捕捉される、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスの投与が、脳、脊髄、腎臓、肝臓及び/又は心臓に対する損傷を減少させる、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスの投与が、低血糖症、低酸素血症、低酸素症、虚血、脳浮腫又は軸索切断により生じる損傷を減少させる、請求項１から１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬が、同時又は連続的に投与される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
液体麻酔薬及び非麻酔性保護ガスが、脳卒中のために挿管及び人工呼吸を施されている患者、心臓手術、神経系手術、場合により、全身手術又は外傷手術、場合により、衝撃性外傷、例えば、外傷性CNS傷害(脳傷害又は脊髄傷害)若しくは胴体の臓器に対する外傷性傷害を処置する外傷手術を含む手術を受けている患者に投与される、請求項１から１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬が、キセノンが存在しない状態で投与される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬が、亜酸化窒素が存在しない状態で投与される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬が、正常体温条件下において投与される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2013年8月19日に出願した米国仮出願第61/867,367号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
臓器への血流は、各種の外科的及び非外科的な条件及び手技において損なわれうる。死亡等の虚血性合併症が起こりうる。
【０００３】
例えば、外傷性脳傷害(TBI)及び/又は脊髄傷害の十分な処置は、主要な未対処の臨床的要求を表す。毎年、米国単独で、約150万人がTBIを被っているであろうと推定されている。その少なくとも15%は入院し、3%が死亡するであろう。入院し且つ生存している約80,000人は、傷害により、長期の障害の開始が告げられであろう。傷害を負っているが、入院していない相当数の人々も、おそらく、著しい健康管理上の問題に苦しんでもいる。
【０００４】
脳又は脊髄の傷害を処置する戦略を開発する上で困難なことの1つは、初期傷害とその後の病理学的進行との両方における非常に異質な性質である。重度の生死に関わる頭部外傷は、傷害進行のメカニズムを当然伴うであろう。このメカニズムは、軽度の挫傷後に生じるメカニズムとは異なる。それにも関わらず、いくつかの共通する神経的及び生化学的メカニズムが関与していると考えられる。一次傷害は、血管系及び神経組織の両方に対する直接的な機械的損傷を生じさせるであろうが、中でも、虚血、脳浮腫及び脊髄浮腫並びに軸索切断により引き起こされる複雑な一連の相互作用性傷害カスケードが続くことは、一般的に同意されるであろう。これらのプロセスが進行性の「二次」傷害をもたらすという事実は、傷害の進行を停止させ、その影響を最小化する介入が発明されうるといういくらかの望みを与えている。同様のメカニズムは、破壊的影響を伴う他の臓器の虚血についても説明されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第20100031961号
【特許文献２】WO2007006377 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
下記の概要は、後に続くより詳細な検討に読み手を誘導するために提供される。概要は、特許請求の範囲を限定又は定義することを意図していない。
【０００７】
保護戦略の重要性が高くなっているため、下記開示は、現在の液体麻酔薬の副作用並びに/又はグルコース及び/若しくは酸素の欠乏の破壊的影響からの、ヒト及び動物の臓器保護に関する。液体麻酔薬の特定の副作用は、Tang等、2013年;Kundra等、2011年;Regueiro-Purrinos等、2011年;Tetrault等、2008年;Hu等、2014年;Liu等、2010年及びTong等、2013年において議論されている。
【０００８】
麻酔の実現は、鎮静作用、睡眠及び疼痛制御の少なくとも1つの実現に基づいている。麻酔薬は、ガス(例えば、キセノン及び/又は亜酸化窒素)でもよいし、又は、液体(すなわち、ブプレノルフィン、プロポフォール、バルビツレート、セボフルラン、イソフルラン、デスフルラン)でもよい。液体麻酔薬は、溶液、エマルジョン又は任意の他の液体組成物の形態が可能である。液体麻酔薬は、経口、血流に直接又は吸入により送達されうる。このような液体麻酔薬を吸入により投与するために、それらは気化される。気化されて吸入により投与される液体麻酔薬のサブセットは、麻酔薬蒸気と呼ばれる。
【０００９】
本出願は、常圧において麻酔作用を提供しない保護ガス(本願明細書において、非麻酔性保護ガスと言う)、例えば、アルゴン、硫化水素と、液体麻酔薬との相乗的適用に関し、臓器は、非麻酔性保護ガスにより保護され、液体麻酔薬は、非麻酔性保護ガスにはない麻酔成分を提供する。
【００１０】
非麻酔性保護ガスは、液体麻酔薬の副作用並びに酸素及びグルコースの欠乏における有害作用に対するいくらかの保護を提供しうる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様に基づいて、麻酔と臓器保護とを、それを必要とする対象に提供する方法は、常圧条件において、臓器保護を提供するのに有効な量の非麻酔性保護ガスと、麻酔を提供するのに有効な量の液体麻酔薬とを、対象に共投与する工程を含む。
【００１２】
別の態様に基づいて、常圧条件における、液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスの使用が提供される。液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスは、麻酔と臓器保護とを、それを必要とする対象に提供するためのものである。
【００１３】
別の態様に基づいて、臓器保護を、それを必要とする対象に提供する方法は、常圧条件において、臓器保護を提供するのに有効な量で、非麻酔性保護ガスと液体麻酔薬とを対象に共投与する工程を含む。
【００１４】
一部の例では、非麻酔性保護ガスは、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン又はラドンでありうる。一部の特定の例では、非麻酔性保護ガスは、アルゴンでありうる。アルゴンは、場合により、1%から79%の間の濃度で投与されうる。
【００１５】
一部の例では、非麻酔性保護ガスは、硫化水素でありうる。硫化水素は、1000ppm未満のレベルで投与されうる。
【００１６】
一部の例では、液体麻酔薬は、液体の形態で投与されうる。例えば、液体麻酔薬は、静脈内に投与されうる。一部のこのような例では、液体麻酔薬は、チオペンタール、プロポフォール、ケタミン、ヒプノミデート、バルビツレート、ブプレノルフィン又はデクスメデトミジンでありうる。
【００１７】
一部の例では、液体麻酔薬は、蒸気の状態で投与されうる。一部のこのような例では、液体麻酔薬は、セボフルラン、イソフルラン又はデスフルランでありうる。一部の特定の例では、液体麻酔薬は、セボフルランでありうる。
【００１８】
一部の例では、液体麻酔薬は、局所麻酔又は部位麻酔を達成するために局所投与されうる。
【００１９】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、人工心肺、膜型装置及び/又は体外膜酸素供給(ECMO)装置の酸素供給器により対象に投与されうる。
【００２０】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、人工呼吸器により対象に投与されうる。
【００２１】
一部の例では、人工呼吸器は、対象により吐き出された空気から非麻酔性保護ガスを選択的に保持、隔離又は排気する1つ又は複数のガス分離膜を備えてもよく、場合により、i)非麻酔性保護ガスが保持される場合には、非麻酔性保護ガスは、患者における更なる使用に利用可能であり、ii)非麻酔性保護ガスが隔離又は排気される場合には、非麻酔性保護ガスは、後の使用のためにその後に再捕捉される。
【００２２】
一部の例では、液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスの投与は、脳、脊髄、腎臓、肝臓及び/又は心臓に対する損傷を減少させうる。
【００２３】
一部の例では、液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスの投与は、低酸素血症、低酸素症、虚血、脳浮腫又は軸索切断により生じる損傷を減少させうる。
【００２４】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、同時又は連続的に投与されてもよい。
【００２５】
一部の例では、液体麻酔薬及び非麻酔性保護ガスは、手術、場合により、全身手術又は外傷手術、場合により、衝撃性外傷、例えば、外傷性CNS傷害(脳傷害又は脊髄傷害)又は胴体の臓器に対する外傷性傷害を処置する外傷手術を受けている患者に投与されうる。
【００２６】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、キセノンが存在しない状態で投与されうる。
【００２７】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、亜酸化窒素が存在しない状態で投与されうる。
【００２８】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、正常体温条件下において投与される。
【発明の効果】
【００２９】
本開示のこれら及び他の目的、利点並びに特徴は、以下により十分に説明されるように、当業者に明らかとなるであろう。
【００３０】
本願明細書に含まれる図面は、本明細書の物品、方法及び装置の種々の例を例証するためのものであり、教示されるものの範囲を限定することを何ら意図していない。図面において、
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】以下の実施例セクションの実験計画マトリクスを示すグラフであり、同グラフは、各条件に使用したマウス数(n)の概要を含む。
【図２】(上段)は、傷害後24、48及び72時間での分析から得られたデータの概要である。差分スコアの平均及び標準誤差(YFP集団内のアネキシンV標識細胞の未傷害数-傷害数)がプロットされる。傷害後24時間において、早発性傷害が、負の差分スコアにより明らかにされたように、対照マウスに示される。アルゴンによる神経保護のピークは、48時間において観察され、72時間において保持される。(下段)傷害に対するRGC応答に関するアルゴンによる神経保護についての結果を説明する模式的概要である。アポトーシスの初期誘導中に、アネキシンV結合に応答性のRGC数は、その最高にあり、アポトーシス性カスケードの進展と共に減少する。傷害網膜における初期段階の差分スコアは、アポトーシス誘導中でのアネキシンV標識の増大を反映する。細胞がアポトーシスに進展する際、それらは、アネキシンVへの結合能を失うため、アネキシンV感受性細胞のプールは減少する。
【図３】(上段)は、以下の実施例セクションに記載されているデータについての記述統計表である。(下段)72時間データについての独立したサンプルにおけるt-検定の概要である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、常圧条件に関し、特に、麻酔及び臓器保護を提供する非麻酔性保護ガスと液体麻酔薬との共投与に関する。臓器保護は、制限されず、脳、脊髄、腎臓、肝臓、肺、心臓及び他の組織を、例えば、局所性又は全身性の低酸素血症、炎症及びその後の血管漏出、脳における血圧の自己調節を失わせる麻酔薬並びに麻酔薬が麻酔回路に使用される化学吸収体と反応する際に形成される副産物(例えば、ホルムアルデヒド)の有害作用により生じる損傷に対して保護しうる。任意の実施形態では、臓器保護は、対象の胴体の臓器、例えば、腎臓、肝臓及び心臓を保護することに注目している(胴体又は非神経性臓器保護)。非麻酔性保護ガスは、液体麻酔薬の副作用に対して、及び、酸素欠乏の有害作用に対しても、いくらかの保護を提供しうる。
【００３３】
本願明細書で使用する場合、用語「液体麻酔薬」は、液体の形態、例えば、水溶液又は脂質エマルジョンで提供される(すなわち、流通する及び/又は投与される)麻酔薬を意味する。液体麻酔薬の例としては、制限されず、液体の形態で流通し、蒸気の状態で投与される薬剤が挙げられる。例えば、セボフルラン、イソフルラン及びデスフルランは、液体として典型的に流通し、ついで、吸入による患者への投与のために(例えば、加熱により)蒸気の状態に気化される。患者への投与のために蒸気の状態に気化される液体麻酔薬のサブセットは、「麻酔薬蒸気」とも呼ばれうる。液体麻酔薬の更なる例としては、制限されず、固体の形態で(例えば、固体中に結合又は封入されている状態で)流通し、例えば、静脈内注射により液体の形態で投与される薬剤が挙げられる。例えば、チオペンタールは、粉末として流通し、ついで、患者に投与するために水溶液に構成される。液体麻酔薬の更なる例としては、液体の形態で流通し、かつ投与される麻酔薬、例えば、ブプレノルフィン、バルビツレート、プロポフォール、ケタミン、ヒプノミデート、デクスメデトミジンが挙げられる。
【００３４】
用語液体麻酔薬は、気体の形態で流通し、投与される麻酔薬を除外する。気体の形態で流通し、投与される麻酔薬の例としては、キセノン及び亜酸化窒素が挙げられる。
【００３５】
本願明細書で使用する場合、用語「非麻酔性保護ガス」は、臓器保護を提供し、常圧条件下において、麻酔作用、例えば、鎮静作用、睡眠及び疼痛制御の作用を提供する能力を有さないガスを意味する。非麻酔性保護ガスの例としては、キセノンを除く希ガスが挙げられる。キセノンは、常圧条件において、麻酔を提供することが公知である。麻酔作用を提供しうるガス、例えば、キセノン及び亜酸化窒素は、非麻酔性保護ガスの定義から除外される。
【００３６】
本願明細書で使用する場合、用語「常圧」は、約1atmの圧力(海面における通常の気圧;約0.1MPa)を意味する。常圧条件は、場所によって変動するであろうと理解され、したがって、「約」1atmは、1atm前後の大気圧における自然発生的な変動を含むと理解されるであろう。
【００３７】
本願明細書で使用する場合、用語「常圧条件下における投与」は、常圧環境に曝されながらの、患者への投与を意味する。常圧環境は、心肺バイパス内の典型的な麻酔装置又はECMO装置により生じた圧力を含む。典型的には、これは、外因性圧力が装置、例えば、圧力チャンバにより、環境に印加されていないことを意味する。
【００３８】
本願明細書で使用する場合、用語「臓器保護」は、臓器又は臓器群、例えば、脳、脊髄、腎臓等を、有害なプロセス、例えば、低酸素血症、衝撃性外傷等に対して保護することを意味する。
【００３９】
本願明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物の両方、例えば、哺乳類を含み、生きている生物及び脳死を宣告されている生物(例えば、臓器提供前)を含む。一部の例では、用語「対象」は、全身又は身体の一部、例えば、臓器を含む。例えば、臓器ドナーから取り出された後でレシピエントへの移植前の臓器は、「対象」と考えられうる。一部の例では、用語「対象」は、成体を意味してもよい。一部の例では、用語「対象」は、代替的又は付加的に、小児を意味してもよい。一部の例では、用語「対象」は、代替的又は付加的に、幼児を意味してもよい。一部の例では、用語「対象」は、代替的又は付加的に、新生児を意味してもよい。
【００４０】
本開示は、臓器保護を提供するために、常圧における、共投与用の液体麻酔薬と組み合わせた非麻酔性保護ガスの使用を提供する。共投与は、典型的には、前投与、同時投与及び/又は後投与である。これらの場合、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、典型的には、相乗的な方法で麻酔効果及び臓器保護を提供するのに有効な量で、対象に存在する。
【００４１】
上記されたように、非麻酔性保護ガスとしては、(麻酔作用を有する)キセノンを除く希ガスが挙げられる。希ガスは、周期表の第18族に見出されるそれらの元素である。現在公知の希ガスは、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン及びラドンである。
【００４２】
常圧条件下において、アルゴンを投与することが、顕著な神経保護作用を提供することが見出されている。更に、キセノン以外の希ガス、例えば、アルゴンの高吸気濃度での投与は、常圧条件下において、麻酔作用を提供しない。これは、i)非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬の共投与の相乗的臓器保護作用と、ii)常圧条件下において、大部分の希ガスが麻酔を提供できないことを克服するこのような組合せの能力との最初の開示であると考えられる。71%でのキセノンは、麻酔を提供する能力を有する。
【００４３】
非麻酔性保護ガスとしては、硫化水素も挙げられる。硫化水素の特定の臨床作用は、Kimura及びKimura、2004年;Elrod等、2007年;Sivarajah等、2009年;Chen等、2010年;King及びLefer、2011年;Marutani等、2012年;Liu等、2014年;Zhong、2010年;Wang等、2014年;Gong等、2010年;並びにTang等、2013年に開示されている。
【００４４】
非麻酔性保護ガスは、酸素を含む混合ガスの一部として、患者に投与されてもよい。例えば、アルゴンについての濃度は、酸素中において、79%以下、70%以下、60%以下又は50%以下でありうる。一部の例では、アルゴンについての濃度は、約79%から約1%の間でありうる。更なる例について、硫化水素についての濃度は、約1000ppm未満又は約500ppm未満でありうる。
【００４５】
一部の例では、液体麻酔薬は、吸入又は模擬吸入による投与により、処置を必要とする対象の処置に使用するために、蒸気の状態で投与されうる。麻酔薬蒸気の例としては、セボフルラン、イソフルラン及びデスフルランが挙げられる。
【００４６】
本願明細書で使用する場合、用語「模擬吸入」は、患者が自身の肺を使用して十分なガス交換を行えないか、又は、同ガス交換を行いえないため、人工心肺(心肺バイパス装置としても知られている)、膜型装置が血流と膜の他方側に供給された混合ガスとの間で、例えば、ガス及び蒸気を交換可能な、体外膜酸素供給(ECMO)装置又は類似する装置を取り付けられている、そのような状況を意味する。このような状況において、非麻酔性保護ガスは、人工心肺の酸素供給器に投与される。人工心肺は、患者から引き出された血液に酸素(及び保護ガス/麻酔薬蒸気)を拡散させる(及び、二酸化炭素を外へ拡散させる)患者の肺の機能を模倣する。ついで、酸素リッチな血液は、患者に戻される。このような例では、液体麻酔薬は、模擬吸引によっても投与されてもよいし、又は、静脈内に投与されてもよい。
【００４７】
本開示は、少なくとも21%の酸素において吸入された非麻酔性保護ガスと、麻酔を達成するために静脈内経路でそれを必要とする対象に投与された液体麻酔薬、例えば、プロポフォールとの使用を含む臓器保護を提供する方法も提供する。静脈内経路での投与に適した液体麻酔薬の他の例としては、ケタミン、ヒプノミデート及びデクスメデトミジンが挙げられる。
【００４８】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、正常体温条件下において投与される。例えば、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、低体温を引き起こすことなく、室温で投与されうる。
【００４９】
一部の例では、非麻酔性保護ガス及び液体麻酔薬は、任意の麻酔ガス、例えば、キセノン又は亜酸化窒素が存在していない状態で投与されうる。例えば、微量のキセノン及び亜酸化窒素が環境空気に存在してもよいが、キセノン又は亜酸化窒素は、患者に能動的に投与されない。
【００５０】
本願明細書に記載された方法は、米国特許出願公開第20100031961号、表題「膜分離による人工呼吸患者の呼気中における希ガスの保持」に開示された装置により行われうる。この公報には、人工呼吸患者のための、特に呼吸ガスの混合ガスの処理が記載されている。本開示に基づく処理は、特に、人工呼吸患者の呼気中における希ガスを保持するための選択的ガス分離膜の使用に関する。ガス分離膜は、人工呼吸器又は麻酔装置に一体化されたセパレータである。分離膜は、所望に応じて、希ガスを選択的に保持、隔離又は排気することにより、残留する呼気の残り部分から希ガスを分離する。このため、非麻酔性保護ガス、特に制限されず、好ましくは、低損失で可能な限り単純なアルゴンの適用を可能にする人工呼吸器を提供可能である。
【００５１】
その方法は、US20070017516としても公開されたWO2007006377 A1、表題「混合ガスを調製するための装置及び方法」に開示された装置によっても行われうる。同公報は、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【００５２】
一実施形態では、上記された非麻酔性保護ガスの送達は、酸素中における非麻酔性保護ガスと、麻酔薬蒸気とを組み合わせた適用を意味する。これは、典型的には、非麻酔性保護ガス及び蒸気としての液体麻酔薬の吸入により達成される。
【００５３】
別の実施形態では、非麻酔性保護ガスの送達は、対象への投与まで加圧容器に保存された非麻酔性保護ガスの投与と、静脈内経路による液体麻酔薬、例えば、プロポフォールの同時又は連続的な適用を含む。
【００５４】
更なる実施形態では、非麻酔性保護ガス/麻酔薬蒸気の送達装置は、人工心肺を含む。このような装置の操作は、簡潔に上記されている。
【００５５】
他の例では、非麻酔性保護ガスは、化合物に封入又は結合されてもよい。例えば、硫化水素は、硫化水素ナトリウムとしてナトリウムに結合していてもよい。硫化水素ナトリウムは、水に溶解されうる固体であり、身体中にある場合、硫化水素を放出する。この形態の硫化水素は、例えば、血流中に、経口で又は直腸に投与されうる。
【００５６】
上記されたように、本開示において、用語「対象」は、一部の例では、生体外の臓器を意味しうる。例えば、臓器は、レシピエントへの移植のために、臓器ドナーから取り出されうる。臓器が輸送中にある際(すなわち、取り出し後で移植前)、液体麻酔薬及び非麻酔性保護ガスが、その臓器に投与されうる。例えば、臓器は、麻酔薬蒸気及び非麻酔性保護ガスを含む雰囲気下で保存されうる。このような例では、液体麻酔薬は、非麻酔性保護ガスによる相乗的な臓器保護作用を提供するのに投与されうる。
【００５７】
本開示に記載された実施形態は、本主題の代表例である。本主題は、本発明により広く考慮される。本発明の範囲は、他の実施形態を十分に包含し、特許請求の範囲の範囲は、発明を実施するための形態及び実施例で説明された実施形態により限定されるべきでなく、全体として発明を実施するための形態と一致する最も広い解釈を与えられるべきである。
【実施例】
【００５８】
方法
B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/Jマウス
Thy1-YFPマウスを、麻酔導入チャンバ中で、蒸気麻酔薬(イソフルラン又はセボフルラン)に曝した。動物の体温を調査し、角膜損傷を防止するために滅菌した眼用潤滑剤を適用した。眼窩縁付近に切り目を形成した。左の眼窩を露出させ、涙腺をゆっくり切除し、生理食塩水に浸したガーゼで覆った。ついで、上外眼筋を使用して、眼を回転させ、視神経を露出させた。マイクロシザーズを使用して、硬膜を切除し、視神経を眼球の後面から約0.5mm切開した。血液供給の維持を、散瞳により焦点合わせされた解剖顕微鏡及びカバーガラスにより評価した。皮膚を縫合クリップで閉じ、鎮痛剤(生理食塩水におけるブプレノルフィン)を投与し、マウスを、アルゴン(70%)/酸素(30%)かん流空気チャンバに、保温マット上に移した。マウスをモニターし、傷害後24又は72時間通気ラックに収容した。対照マウスは、傷害後に常圧条件に曝した(図1を参照のこと)。内部手術対照は、反対側の眼の未傷害網膜とした。
【００５９】
網膜切除、分離及び細胞染色
マウスをイソフルランで軽く麻酔し、頸椎脱臼で屠殺した。直ちに眼を取り出し、氷冷したハンクス平衡塩類溶液(HBSS)に入れた。結膜に1つの孔を開け、角膜を顕微解剖により除去した。ついで、毛様体上皮及びレンズを切除した。吸引及び顕微解剖による除去を助けるために、トリアムシノロンアセトニド液を使用して、硝子体液を可視化した。ついで、浮動性の網膜を、氷上の新鮮なHBSSに移し、ついで、トリプシン(MACS-Miltenyi Biotec社)を含む1mlの酵素溶液に移した。周期的に振動させながら、37℃での15分のインキュベート後、網膜を、火仕上げピペットで分離させ、遠心分離した。ペレットを、アネキシンV結合バッファーで洗浄し、遠心分離した。ペレットを、DNase含有結合バッファー中で再度分離させ、アネキシンV-PeCy7プローブで染色した。細胞を洗浄し、細胞を引っ張り(40um)、BD FacsAria IIIフローサイトメトリを使用して分析した。
【００６０】
フローサイトメトリ及びデータ分析
未染色、YFPのみ、アネキシンVのみ及び二重標識の細胞サンプルを使用して、補償及びゲーティングを確立した。ヨウ化プロピジウム及び7-AAD DNAインターカレート染料を使用して、死細胞アッセイ(図示せず)も行った。前方及び側方の散乱ゲーティングを使用して、残渣を除外した。YFP陽性細胞をゲートし、参照集団として使用した。象限分析を使用して、群間のYFP発現細胞内のアネキシンV標識を特定及び定量した。同じ動物からの傷害網膜と未傷害網膜を比較することにより、対象内比較を行った。右眼におけるアネキシンVバックグラウンド標識を正規化するために、差分スコア(未傷害-傷害アネキシンV細胞数)を生成した。全てのデータを、平均の+/-1.0平均標準誤差として表現した。
【００６１】
網膜の組織学
眼を取り出し、角膜及びレンズを除去し、氷冷した4%のパラホルムアルデヒドに25分間浸漬した。30%のスクロース凍結保護後、眼を、OCT媒体に導入し、包埋し、クライオスタットにおいて、14ミクロンに切断し、スライドに載せた。Topro-3ヨウ化物及びDRAQ5核標識を使用して、網膜の構造及び完全性を評価した。YFP及び開裂したカスパーゼ-3の免疫標識を使用して、Thy-1レポータ動物の神経節細胞層におけるアポトーシスの初期誘導を評価した。全ての画像化を、Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡で行った。
【００６２】
結果
傷害網膜神経節細胞における初期アポトーシスのアネキシンV-PeCy7評価により、アルゴンの傷害後処置についての神経保護の役割が明らかにされる。
【００６３】
神経傷害に続く初期アポトーシスイベントを評価するために、片側網膜視神経軸索切断を受けたThy-1-YFPレポータマウスから、アネキシンV染料の選択により、分離した網膜を探した。これらの染料は、初期アポトーシスに伴うホスファチジルセリンへの曝露/外在化した、内部小葉と結合する。フロー細胞測定数(ランあたりに、500,000から1,000,000イベント)を使用した未傷害及び傷害網膜の比較を、YFP陽性集団内の未傷害網膜から得られた数から、傷害したアネキシンV陽性数を差し引くことにより達成した。24時間において、対照における僅かな負の平均差分スコアは、初期アネキシンV結合イベントが、RGC傷害の開始を反映する証拠であることを示した(図2及び図3)。対照網膜とは対照的に、アルゴンに曝された傷害網膜は、正の差分スコアにより示されたように、より低いレベルのアネキシンV感受性を示す。このことは、アルゴンの神経保護機能が、このタイミングで存在していることを示唆する。48時間までに、対照網膜における強力な負の差分スコアにより、傷害網膜におけるアネキシンV結合のピークが示される。対照網膜とは対照的に、アルゴンに曝された傷害網膜は、アネキシンV結合に対する強力な抵抗性を維持する。このことは、神経保護作用サイズのピークが傷害後48時間付近にあることを示唆する。傷害後72時間において、対照網膜における正の差分スコアは明らかである。この観察は、このタイミングでのサンプル調製により生じるバックグラウンド標識が優勢であること、及び、それらが既に初期アポトーシスに進展しているため、アネキシンV結合に感受性でありうる利用可能なRGCが減少していることを、おそらく表している。
【００６４】
考察
これらのデータは、液体麻酔薬と組み合わせて投与された場合、アルゴンが、中枢神経系内での神経保護作用を提供することを示す。この作用は、アルゴンが液体麻酔薬と同時、液体麻酔薬の前、及び/又は、液体麻酔薬に続けて投与された場合に、生じるであろうと期待される。
【００６５】
これらのデータから、RGCのより大きな集団が、長期間にわたってうまく生存していることが考えられる。より後の時点は、アルゴン曝露に基づいて生存しているRGCの持続的な集団を明らかにするであろうことが期待される。
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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