(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法であって、
ａ）マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞、及び天然コラーゲンとアテロコラーゲン（Atelocollagen）の組み合わせを含む組成物を培養皿に接種して固化させることにより真皮層を作製するステップであって、アテロコラーゲンと天然コラーゲンの組み合わせ比率が１：１〜１：１０であるステップと、
ｂ）前記ａ）ステップで作製された真皮層の上層にケラチン細胞を接種して細胞シート（cell sheet）を形成するまで培養するステップと、
ｃ）前記ｂ）ステップで形成された細胞シートを空気中に露出して培養することにより表皮層を形成するステップとを含み、
前記天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせにより形成された真皮層が、アテロコラーゲンを単独で用いる場合に比べて、次の特性の少なくとも１つ：
ｉ）真皮層収縮現象の抑制
ｉｉ）表皮層分化能の増加
ｉｉｉ）基質分解酵素（Matrix Metalloproteinase）発現量の減少
ｉｖ）コラーゲン層分解現象の抑制
を有する方法。
【請求項２】
前記ａ）ステップにおいて、天然コラーゲンは、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるα１鎖（alpha-1 chain）及び配列番号２のアミノ酸配列で構成されるα２鎖（alpha-2 chain）を含み、アテロコラーゲンは、配列番号３のアミノ酸配列で構成されるα１鎖（alpha-1 chain）及び配列番号４のアミノ酸配列で構成されるα２鎖（alpha-2 chain）を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ａ）ステップにおいて、マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞、及び天然コラーゲンとアテロコラーゲン（Atelocollagen）の組み合わせを含む組成物は、１ｃｍ２当たりマウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞を１×１０４〜１×１０７個含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ａ）ステップにおいて、組成物は、毛乳頭細胞（Dermal Papilla cell）、内皮細胞（Endothelial cell）、脂肪細胞（Adipocyte）及び間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ａ）ステップは、１時間〜４８時間行うものである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｂ）ステップは、ａ）ステップで作製された真皮層１ｃｍ２当たり１×１０４〜１×１０７個のケラチン細胞を接種するものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｂ）ステップにおいて、ケラチン細胞は、皮膚、粘膜、角膜、又は毛嚢由来ケラチン細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｂ）ステップにおいて、ケラチン細胞の接種は、メラニン細胞（Melanocyte）、メルケル細胞（Merkel cell）及びランゲルハンス細胞（Langerhans cell）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞の接種をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｃ）ステップは、７日〜２１日間行うものである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞、及び天然コラーゲンとアテロコラーゲン（Atelocollagen）の組み合わせを含む真皮層と、ケラチン細胞を含む表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルであって、アテロコラーゲンと天然コラーゲンの組み合わせ比率が１：１〜１：１０であり、前記天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む真皮層が、アテロコラーゲンを単独で含む場合に比べて、次の特性の少なくとも１つ：
ｉ）真皮層収縮現象の抑制
ｉｉ）表皮層分化能の増加
ｉｉｉ）基質分解酵素（Matrix Metalloproteinase）発現量の減少
ｉｖ）コラーゲン層分解現象の抑制
を有する、三次元培養皮膚モデル。
【請求項１１】
前記三次元培養皮膚モデルは、医薬品又は化粧品の毒性及び効能試験に用いられることを特徴とする請求項１０に記載の三次元培養皮膚モデル。
【請求項１２】
前記三次元培養皮膚モデルは、動物実験代替用であることを特徴とする請求項１０に記載の三次元培養皮膚モデル。
【請求項１３】
前記三次元培養皮膚モデルは、皮膚移植及び創傷治療用であることを特徴とする請求項１０に記載の三次元培養皮膚モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン（Native collagen）又は天然コラーゲンとアテロコラーゲン（Atelocollagen）の組み合わせを含む組成物を用いて真皮層を作製するステップと、ケラチン細胞を用いて表皮層を形成するステップとを含む、真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法に関する。また、本発明は、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物により作製された真皮層と、ケラチン細胞により形成された表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、人体の体表面全体を覆っている最大の臓器であり、体温調節や外部環境に対する障壁としての機能などの様々な機能を有し、成人においてはその面積が約１．２〜２．３ｍ２に達する。皮膚は表皮（epidermis）と真皮（dermis）とから構成されており、真皮層はコラーゲン（collagen）と線維芽細胞（fibroblast）とからなり、表皮層はケラチン細胞やメラニン形成細胞などからなる。比較的一律な厚さを有する表皮層に比べて、真皮層の厚さには部位によって大きな差があることが知られており、表皮の約３倍の厚さを有することが知られている。
【０００３】
表皮層は基底膜、有棘層、顆粒層、角質層に階層化されており、皮膚表面には最終分化した死んだ細胞が幾重にも積層されて保護膜機能を果たしている。基底膜はＩＶ型コラーゲン格子（lattice）にラミニン及び様々な細胞外基質が沈着した薄膜の形態に基底層の細胞が付着しており、傷が生じると基底膜の分解を伴って基底層の細胞が真皮のＩ型コラーゲンに接し、その際に表皮細胞が側面に移動して再上皮化（re-epithelialization）が誘導される。
【０００４】
真皮層は、線維芽細胞が豊富で微細血管が分布する真皮乳頭層（papillary dermis）と、厚いコラーゲン線維が豊富な真皮網状層（reticular dermis）とから構成されている。毛嚢及び様々な皮膚付属器官は真皮の奥に位置しており、部分層創傷（partial thickness wound）のように表皮層が消失した場合も毛嚢から表皮細胞が成長して再上皮化を誘導する。
【０００５】
一方、人工的に皮膚組織を構成しようとする試みがあり、このような人工皮膚は、一般に自己細胞による再生能力を失った皮膚損傷や皮膚潰瘍、医薬品や化粧品の毒性及び効能実験などに用いられる。人工皮膚は、損傷したヒトの皮膚を代替する皮膚代用品として皮膚治療やそのための医薬品開発に用いられたり、皮膚に接触する医療機器、生活必需品、化粧品などの毒性及び効能を試験するための実験材料として非常に重要である。
【０００６】
よって、これらの活用のために、自然皮膚層を模倣した構造を有する人工皮膚の開発が求められており、ヨーロッパにおいては２０１３年から動物実験を行って製造した化粧品の販売が全面禁止されているので、有名な海外の化粧品メーカーは人工皮膚の開発に多大な投資をしている現状である。例えば、フランスのロレアル社が開発した「エピスキン」は、動物実験を完全に代替できる人工皮膚としてヨーロッパ標準に合格しており、米国のマーテック社が開発した「エピダーム」は、実際のヒトの皮膚に比べて非常に敏感な反応を示すため、条件付きで承認されている状態である。現在までに開発されている人工培養皮膚モデルのうち代表的な方法としては、表皮が除去された真皮上にヒトケラチン細胞を三次元的に培養する方法（Reconstructed epidermis on de-epidermized dermis, RE-DED）や、線維芽細胞を含むコラーゲン基質上でヒト角質形成細胞を三次元的に培養する方法（Living Skin Equivalent, LSE）が挙げられる。
【０００７】
しかし、現在までに開発されている三次元培養皮膚においては、真皮を模倣したコラーゲンゲルと表皮を模倣した表皮層の間に基底膜が十分に形成されないという欠点があり、培養過程において真皮層が収縮する真皮層収縮現象が生じるので、自然皮膚層に類似した三次元培養皮膚を製造する技術が依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、医薬品や化粧品の毒性及び効能実験に活用できるヒトの皮膚層に類似した三次元培養皮膚モデルを開発すべく鋭意研究を重ねた結果、マウス由来３Ｔ３細胞を利用して、アテロコラーゲンと天然コラーゲンを混合して使用することにより真皮層の収縮現象を克服できることを確認し、動物実験を代替できる三次元培養皮膚モデルを製造することにより、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン（Native collagen）又は天然コラーゲンとアテロコラーゲン（Atelocollagen）の組み合わせを含む組成物を培養皿に接種して固化させることにより真皮層を作製するステップと、前述したように作製された真皮層の上層にケラチン細胞を接種して細胞シート（cell sheet）を形成するまで培養するステップと、前述したように形成された細胞シートを空気中に露出して培養することにより表皮層を形成するステップとを含む、真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物により作製された真皮層と、ケラチン細胞により形成された表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルを提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の三次元培養皮膚モデルは、製造時にマウス由来３Ｔ３細胞を利用して、アテロコラーゲンと天然コラーゲンを混合して使用することにより、真皮層と表皮層の形成及び分化に優れ、真皮層のコラーゲン収縮及び分解現象を抑制し、自然皮膚層に類似した構造を有するので、医薬品や化粧品の毒性及び効能実験、動物実験の代替実験の分野において広く用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】真皮層作製にマウス由来線維芽細胞３Ｔ３細胞（Ｂ）又はヒト由来線維芽細胞（Ａ）をそれぞれ用いて製造した三次元培養皮膚モデルにおいて、Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin & Eosin）組織染色によりその構造を確認した図である。
【図２】真皮層作製にマウス由来線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＭＦ）又はヒト由来線維芽細胞（ＨＦ）をそれぞれ用いて製造した三次元培養皮膚モデルにおいて、基質分解酵素であるＭＭＰ−１の発現量を確認した図である。
【図３】真皮層作製にマウス由来線維芽細胞３Ｔ３細胞（Ｂ）又はヒト由来線維芽細胞（Ａ）をそれぞれ用いて製造した三次元培養皮膚モデルにおいて、ケラチン細胞の細胞シート形成能を確認した図である。
【図４】真皮層作製時にアテロコラーゲンのみを用いた実験群１、天然コラーゲンのみを用いた実験群２、及びアテロコラーゲンと天然コラーゲンを１：５の比率で混合して用いた実験群３において、Ｈ＆Ｅ組織染色によりその構造を確認した図である。コラーゲンが収縮する現象を▲で表示した。
【図５】真皮層作製時にアテロコラーゲンのみを用いた実験群１、天然コラーゲンのみを用いた実験群２、及びアテロコラーゲンと天然コラーゲンを１：５の比率で混合して用いた実験群３の三次元培養皮膚組織を培養した培養液において、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現量を分析した図である。
【図６】真皮層作製時にアテロコラーゲンと天然コラーゲンの混合比率を１：１、１：５又は１：１０として製造した三次元培養皮膚モデルにおいて、Ｈ＆Ｅ組織染色によりその構造を確認した図である。
【図７】表皮層作製時にメラニン細胞が追加された三次元培養皮膚モデルにおいて、Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin & Eosin）組織染色によりその構造を確認した図である。
【図８】表皮層作製時に角膜由来ケラチン細胞を用いて製造した三次元培養モデルにおいて、Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin & Eosin）組織染色によりその構造を確認した図である。
【図９】表皮層作製時に口腔粘膜由来ケラチン細胞を用いて製造した三次元培養モデルにおいて、Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin & Eosin）組織染色によりその構造を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上記目的を達成するための本発明の一態様は、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン（Native collagen）又は天然コラーゲンとアテロコラーゲン（Atelocollagen）の組み合わせを含む組成物を用いて真皮層を作製するステップと、ケラチン細胞を用いて表皮層を形成するステップとを含む、真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法を提供する。
【００１４】
具体的には、本発明は、ａ）マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物を培養皿に接種して固化させることにより真皮層を作製するステップと、ｂ）前述したように作製された真皮層の上層にケラチン細胞を接種して細胞シートを形成するまで培養するステップと、ｃ）前述したように形成された細胞シートを空気中に露出して培養することにより表皮層を形成するステップとを含む、真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、真皮層及び表皮層を含む三次元培養皮膚モデルを製造する過程において、真皮層作製時にマウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物を用いることにより、真皮層と表皮層の形成及び分化に優れ、真皮層のコラーゲン収縮現象を抑制し、実際のヒトの皮膚層に類似した構造を有することを特徴とする。
【００１６】
本発明における「線維芽細胞」とは、線維性結合組織の重要な成分となる細胞であり、特に本発明に関する皮膚においては真皮層を構成する主要細胞を意味する。本発明における線維芽細胞は、ヒト、マウス、ラットなどに由来するものであるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的上、本発明の三次元培養皮膚モデルを製造する過程において真皮層作製時に用いる線維芽細胞は、特にマウス由来線維芽細胞であり、例えば３Ｔ３−Ｊ２、ＮＩＨ３Ｔ３、３Ｔ６、３Ｔ１２、３Ｔ１２Ａ又は６Ｔ６細胞株であり、代表的にはマウス由来線維芽細胞３Ｔ３−Ｊ２細胞株である。また、本発明の線維芽細胞は、正常組織由来又は化学物質、熱傷、創傷、瘢痕、潰瘍などの病症組織由来線維芽細胞であるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明における「ケラチン細胞」とは、表皮細胞において角質化能力を有する細胞を意味し、表皮細胞の大部分を占める細胞であり、一般にケラチノサイトと同じ細胞を示すものである。本発明におけるケラチン細胞は、ヒト、マウス、ラットなどに由来するものであるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的上、本発明の三次元培養皮膚モデルを製造する過程において表皮層作製時に用いるケラチン細胞は、特にヒト由来ケラチン細胞であり、正常組織由来又は化学物質、熱傷、創傷、瘢痕、潰瘍などの病症組織由来ケラチン細胞であるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の具体的な実施例においては、マウス由来線維芽細胞（代表的には、３Ｔ３−Ｊ２細胞株を用いる）又はヒト由来線維芽細胞を用いて三次元培養皮膚モデルの真皮層を作製した（実施例２−１）。その結果、マウス由来線維芽細胞を用いた場合、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合より、真皮層の厚さが約２倍の厚さに形成されたことが確認され、組織も均一な厚さになって安定した皮膚モデルが形成されたことが確認された。また、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合、真皮層のコラーゲンが分解され、マウス由来線維芽細胞で作製した真皮層に比べて、厚さが薄くなり、真皮層の形成が十分でなかった。さらに、表皮層には基底、有棘、顆粒、角質層が形成されなければならないが、マウス由来線維芽細胞を用いた場合は、明確な基底層の境界が確認され、表皮層に各層が安定して形成されていることが確認された（図１）。
【００１９】
また、本発明の具体的な実施例においては、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合でのみＭＭＰ−１（５４ｋＤａ）の発現が観察されたのに対して、マウス由来線維芽細胞を用いた場合はＭＭＰ−１の発現が観察されず（図２）、マウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成した場合は、ヒト線維芽細胞を用いた場合より、細胞シート形成速度がはるかに速いことが確認された（図３）。
【００２０】
なお、本発明における細胞シート（cell sheet）とは、少なくとも１層の細胞であり、細胞間の強力な結合により培養表面が全て覆われた状態を示すものである。
本発明の具体的な実施例により、マウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成すると、ヒト線維芽細胞を用いた場合より、ｉ）真皮層形成能に優れ、ｉｉ）初期供給したコラーゲンが保持されるので真皮層保持能に優れ、ｉｉｉ）表皮層形成速度が速くなることが確認された。これは、マウス由来線維芽細胞を用いると、自然皮膚組織に類似した形態となるだけでなく、三次元培養皮膚モデルを製造するのにかかる時間が短縮されることを示すものである。
【００２１】
本発明において、特に医薬品及び化粧品の毒性及び効能実験に用いるための三次元培養皮膚モデルは大量生産が求められることが多いので、前述したように求められるケラチン細胞が少数であることや、三次元培養皮膚モデルを製造するのにかかる時間が短縮されることは意味が大きいといえる。また、本発明により製造された三次元培養皮膚モデルは、毒性及び効能実験だけでなく、皮膚移植及び創傷治療用の医薬品としても用いられる。
【００２２】
本発明の三次元培養皮膚モデル製造方法は、本発明のマウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成することにより、ヒト由来線維芽細胞を用いる場合に比べて、次の特性の少なくとも１つを有する方法である。
【００２３】
ｉ）真皮層形成能の増加
ｉｉ）表皮層形成能の増加
ｉｉｉ）表皮層分化能の増加
ｉｖ）コラーゲン収縮現象の抑制
ｖ）コラーゲン層分解現象の抑制
ｖｉ）基質分解酵素（Matrix Metalloproteinase）発現量の減少
ｖｉｉ）細胞シート（cell sheet）形成速度の増加
本発明における「コラーゲン」とは、植物と動物の両方に存在する硬タンパク質であり、動物の骨や皮膚に主に存在するが、軟骨、臓器膜、毛髪などにも分布しており、膠原質とも呼ばれる。コラーゲンは、三重螺旋構造からなるタンパク質であり、三重螺旋構造の両末端には非螺旋構造のテロペプチドを有する。本発明におけるコラーゲンは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ラットなどに由来するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明におけるコラーゲンは、天然コラーゲンだけでなく、生物工学的変異や生物工学的又は化学的処理が施された変形コラーゲンであってもよいが、由来及び変形の有無により限定されるものではない。
【００２４】
本発明における「アテロコラーゲン（Atelocollagen）」とは、前述したコラーゲンから免疫反応を起こす主な原因として知られているテロペプチドを除去したコラーゲンを意味する。ウシやブタの膠質から抽出したコラーゲンに対してテロペプチドを除去する酵素で処理することにより生産することもでき、組換え技術を用いて生産することもできる。アテロコラーゲンは、免疫原性を減少させたコラーゲンであり、抗原性がなく、生体適合性がよく、短期間で代謝、吸収される。よって、生体物質として知られており、人工皮膚、人工血管、組織培養担体、化粧品への応用分野に広く用いられている。
【００２５】
本発明の目的上、本発明の三次元培養皮膚モデルの真皮層に含まれるコラーゲンは、天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせであってもよく、前記天然コラーゲンは、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるα１鎖（alpha-1 chain）及び配列番号２のアミノ酸配列で構成されるα２鎖（alpha-2 chain）を含むものであってもよく、アテロコラーゲンは、配列番号３のアミノ酸配列で構成されるα１鎖（alpha-1 chain）及び配列番号４のアミノ酸配列で構成されるα２鎖（alpha-2 chain）を含むものであってもよい。また、本発明におけるアテロコラーゲンと天然コラーゲンの組み合わせは、組み合わせ比率が１：０．１〜１：２０であってもよく、１：０．５〜１：１５であることが好ましい。
【００２６】
本発明の具体的な実施例によれば、アテロコラーゲン単独、天然コラーゲン単独及びそれらの組み合わせを用いて三次元培養皮膚モデルの真皮層を作製した（実施例３−１）。具体的には、アテロコラーゲンのみ用いた実験群１、天然コラーゲンのみ用いた実験群２、及びアテロコラーゲンと天然コラーゲンを１：５の比率で混合して用いた実験群３を作製した。その結果、アテロコラーゲンを単独で用いることによるコラーゲン収縮現象と表皮層形成及び分化の減少という従来の問題を天然コラーゲン（アテロコラーゲン：天然コラーゲン＝１：５）の添加により克服できることが確認された（図４）。また、アテロコラーゲンのみ用いた実験群１はＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現が実験群２及び３に比べて２倍以上と著しく高いのに対して、アテロコラーゲンと天然コラーゲンを混合した実験群３は天然コラーゲンのみ用いた場合と同程度の低いＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９発現量であった（図５）。
【００２７】
また、本発明の具体的な実施例によれば、アテロコラーゲンと天然コラーゲンの混合比率を様々に変えて三次元培養皮膚モデルを製造した結果、混合比率が１：１〜１：１０であれば、真皮層の収縮現象が発生することなく人工皮膚組織が安定して作製されることが確認された（図６）。
【００２８】
本発明の三次元培養皮膚モデル製造方法は、天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを用いて真皮層を形成することにより、アテロコラーゲンを単独で用いる場合に比べて、次の特性の少なくとも１つを有する方法である。
【００２９】
ｉ）コラーゲン収縮現象の抑制
ｉｉ）表皮層分化能の増加
ｉｉｉ）基質分解酵素（Matrix Metalloproteinase）発現量の減少
ｉｖ）コラーゲン層分解現象の抑制
本発明における「三次元培養皮膚モデル」とは、動物などから収集したものや、得たものでなく、人工的な培養過程により作製した、自然皮膚層に類似した皮膚層モデルを意味する。それを構成する細胞の由来は限定されるものではない。本発明の目的上、本発明の三次元培養皮膚モデルは、コラーゲン及び線維芽細胞からなる真皮層と、ケラチン細胞を含む表皮層とを含むものであれば限定されるものではない。
【００３０】
本発明の三次元培養皮膚モデル製造方法は、前記ａ）ステップにおいて、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物が、１ｃｍ２当たりマウス由来線維芽細胞を１×１０４〜１×１０７個含むものであってもよく、特に１×１０５〜１×１０６個含むものであってもよい。また、前記ａ）ステップにおいて、組成物は、ヒト線維芽細胞（Human Fibroblast）、毛乳頭細胞（Dermal Papilla cell）、内皮細胞（Endothelial cell）、脂肪細胞（Adipocyte）及び間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞をさらに含むものであってもよい。
【００３１】
本発明の具体的な一実施例においては、三次元培養皮膚モデル製造方法の真皮層を作製するステップにおいて、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物が、１ｃｍ２当たりマウス由来線維芽細胞を０．５×１０５個含むように作製された。
【００３２】
また、本発明の三次元培養皮膚モデル製造方法の前記ａ）ステップは、１時間〜４８時間行うものであってもよい。本発明の具体的な一実施例においては、前記ａ）ステップに該当する、マウス由来線維芽細胞とコラーゲンとを含む組成物を６ウェルプレートに接種して固化させるステップを一晩（約１２時間）行った。
【００３３】
本発明の三次元培養皮膚モデル製造方法の前記ｂ）ステップは、ａ）ステップで作製された真皮層１ｃｍ２当たり１×１０４〜１×１０７個のケラチン細胞を接種するものであってもよい。本発明の具体的な一実施例においては、前記ｂ）ステップに該当する、真皮層の上層にケラチン細胞を接種して細胞シートを形成するまで培養するステップにおいて、６ウェルプレート１ウェル当たり（４．７ｃｍ２）約２．５×１０５個のケラチン細胞を接種した。
【００３４】
また、前記ｂ）ステップにおいて、ケラチン細胞の接種は、皮膚、粘膜、角膜、毛嚢又は上皮組織由来のケラチン細胞の接種であってもよいが、これらに限定されるものではない。ケラチン細胞の接種は、メラニン細胞（Melanocyte）、メルケル細胞（Merkel cell）及びランゲルハンス細胞（Langerhans cell）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞の接種をさらに含むものであってもよく、疾病に関する三次元培養皮膚モデルのために、正常細胞だけでなく、疾病由来細胞を用いることもできる。
【００３５】
本発明の具体的な一実施例においては、表皮層を作製するｃ）ステップにおいて、角膜由来ケラチン細胞又は口腔粘膜由来ケラチン細胞を接種した場合と、ケラチン細胞と共にメラニン細胞を同時に接種した場合に、本発明の三次元培養モデルを製造した結果、安定した三次元皮膚モデルを製造できることが確認された（図７〜図９）。
【００３６】
また、前記ｂ）ステップは約２日〜７日間行うものであってもよいが、これは接種されるケラチン細胞や真皮層の面積などにより異なり、特に限定されるものではない。
本発明においては、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む真皮層を用いることにより、該当する細胞シート形成期間を短縮することができる。本発明の具体的な一実施例においては、マウス由来線維芽細胞を用いると、ヒト由来線維芽細胞に比べて、細胞シート形成能に優れることが確認された（図３）。これらの結果から、ヒト由来線維芽細胞を用いて表皮層を作製すると、細胞シートを形成してエアーリフティング（air-lifting）する時点がマウス由来線維芽細胞を用いる場合より遅延し、ケラチン細胞の初期接種細胞数が多量に必要であるため、マウス由来線維芽細胞を用いる本発明のほうが優れることを確認することができる。
【００３７】
本発明の三次元培養皮膚モデル製造方法の前記ｃ）ステップは、７日〜２１日間行うものであってもよい。本発明の具体的な一実施例においては、前記ｃ）ステップに該当する、ケラチン細胞からなる細胞シートを空気中に露出して培養することにより表皮層を形成するステップを約１２日間行った（実施例２−２）。
【００３８】
本発明の細胞の分離及び培養方法は特に制限されず、通常知られているあらゆる方法を用いることができる。例えば、前記ケラチン細胞培養ステップにおける培養条件は一般的な生体内細胞条件に基づき、培地及び培養温度も生体内細胞培養が可能であれば特に制限されない。
【００３９】
本発明の他の態様は、マウス由来線維芽細胞、及び天然コラーゲン又は天然コラーゲンとアテロコラーゲンの組み合わせを含む組成物により作製された真皮層と、ケラチン細胞により形成された表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルを提供する。
【００４０】
本発明における線維芽細胞、コラーゲン、三次元培養皮膚モデルなどは前述した通りである。
本発明による三次元培養皮膚モデルは、ヒトを含む動物の皮膚に関する生理学的、分子生物学的、生化学的研究を行う上で有用である。また、通常皮膚に接触することが期待される物質に対する効能又は毒性検査に用いられる。前記皮膚に接触することが期待される物質とは、医薬品（特に、外用製剤）、化粧品、繊維、洗剤などのあらゆる物質を総称するものであり、代表的には医薬品又は化粧品の効能又は毒性検査に用いられる。また、本発明による三次元培養皮膚モデルは、正常な皮膚状態における効能又は毒性検査だけでなく、化学物質、熱傷、創傷、瘢痕、潰瘍などにより皮膚が損傷した場合の病症モデルとしても用いられる。さらに、本発明による三次元培養皮膚モデルは、動物実験代替用に用いられる。さらに、本発明により製造された三次元培養皮膚モデルは、単なる実験用ではなく、移植及び創傷治療用医薬品としても用いられる。
【００４１】
本発明による三次元培養皮膚モデルは、ヒト皮膚層に近い構成を有するので、全世界的な動物実験代替モデルに対する要求において皮膚モデルの代案として用いられる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
真皮層と表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルの製造に用いた材料
本発明においては、真皮層と表皮層とを含み、その形態が自然皮膚層に類似するように構成された三次元培養皮膚モデルを製造するために実験を行った。三次元培養皮膚モデルの製造に用いた基本的な材料は次の通りである。
【００４４】
※実験材料
マウス由来線維芽細胞（mouse fibroblast 3T3 cell line）又はヒト由来線維芽細胞（human fibroblast）
ヒトケラチン細胞（Human keratinocytes）
コラーゲン（アテロコラーゲン及び／又は天然コラーゲン）
トランスウェルインサート−６ウェル
三次元培養専用容器
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液
表皮成長因子（Epidermal Growth Factor, EGF）
上記材料を用いて、真皮層と表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルを次の実験により製造した。
【実施例２】
【００４５】
真皮層と表皮層とを含む三次元培養皮膚モデルの製造
２−１．真皮層（Collagen dermis）の作製
マウス由来線維芽細胞３Ｔ３細胞又はヒト由来線維芽細胞を２．０ｍｇ／ｍＬコラーゲン溶液と１０Ｘ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（0.2M sodium biocarbonate, 0.2M HEPES, 0.05N NaOH）と混合して細胞数１×１０５／ｍｌの濃度となるように細胞混合溶液を作製し、その後６ウェル−トランズウェルインサートに細胞混合溶液を２ｍｌずつ添加した。３７℃１０％ＣＯ２インキュベータで一晩（１〜２４時間）固化した。
【００４６】
２−２．表皮層（Epidermis setting）の作製
実施例２−１で作製した真皮層上にケラチン細胞を２．５×１０５ずつ接種して培養した。２日間隔で１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む培養液に交換し、ケラチン細胞がシート（sheet）を形成するまで３７℃の１０％ＣＯ２インキュベータで約５日〜６日間培養した。ケラチン細胞が真皮層上にシートを形成したら、空気露出（air-lift）のために６ウェルタイプの三次元培養専用容器に移した。その後、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む培養液を容器に充填し、次いで前述したように作製した真皮−表皮層を空気に露出させた。
【００４７】
一方、表皮層作製時に角膜由来ケラチン細胞又は口腔粘膜由来ケラチン細胞を接種した場合と、ケラチン細胞と共にメラニン細胞を同時に接種した場合の本発明の三次元培養モデルを製造した。
【００４８】
その後、４日間隔で１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む培養液に交換し、全１４日間培養した。
２−３．組織染色（H&E staining）
実施例２−２で作製した真皮−表皮層三次元培養皮膚モデルにおいて、Ｈ＆Ｅ（Hematoxylin & Eosin）組織染色によりその構造を確認した。
【００４９】
Ｈ＆Ｅ組織染色は当業界で周知の実験過程で行われた。
その結果、図１から分かるように、マウス由来線維芽細胞を用いた場合、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合より真皮層形成が約２倍厚くなり、組織も均一な厚さで安定した皮膚モデルが形成されたことが確認された。ヒト由来線維芽細胞を用いた場合は、初期コラーゲンの厚さが維持されずに分解され、厚さが大幅に薄くなる現象を示す。
【００５０】
それに対して、マウス由来線維芽細胞は、表皮層と真皮層の比率が１：１と厚く形成され、表皮層も均一で安定した形態を有することが確認された。また、表皮層には基底、有棘、顆粒、角質層が形成されなければならないが、マウス由来線維芽細胞を用いた場合は、明確な基底層の境界が確認され、表皮層に各層が安定して形成されていることが確認された。
【００５１】
また、表皮層作製時に角膜由来ケラチン細胞又は口腔粘膜由来ケラチン細胞を接種した場合と、ケラチン細胞と共にメラニン細胞を同時に接種した場合に、前述したようにさらに接種した細胞を含んで安定した三次元皮膚モデルを製造できることが確認された（図７〜図９）。
【００５２】
これは、マウス由来線維芽細胞を真皮層の作製に用いると、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合より均一で安定した皮膚モデルを製造できることを示す結果である。そこで、このような安定した真皮層の厚さに差が生じる原因を確認しようと試みた。
【００５３】
２−４．ＭＭＰ−１発現量の確認
実施例２−３で組織染色により確認した組織学的な差異の原因を分析するために、前記マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞を用いた三次元培養皮膚モデルの製造時に２日間培養した培養液において、コラーゲンなどを分解する基質分解酵素のうちＭＭＰ−１（Matrix Metalloproteinase-1）の発現量を測定した。
【００５４】
ＭＭＰ−１の発現量はウェスタンブロッティングにより測定し、ウェスタンブロッティングは当業界で周知の方法で行った。
その結果、図２から分かるように、ヒト由来線維芽細胞を用いた場合でのみＭＭＰ−１（５４ｋＤａ）の発現が観察され、マウス由来線維芽細胞を用いた場合はＭＭＰ−１の発現が観察されなかった。よって、実施例２−３で確認した真皮層の収縮現象は、ＭＭＰ−１により真皮層のコラーゲンが分解されることによるものであることが確認された。
【００５５】
２−５．表皮層形成に及ぼす影響−シート（Sheet）形成能の比較
マウス由来線維芽細胞又はヒト由来線維芽細胞を共培養（co-culture）したケラチン細胞の細胞シート形成能を比較した。具体的には、容器面積５８ｃｍ２の細胞培養容器に前記マウス由来又はヒト由来線維芽細胞を接種し、その後その上層に１×１０５のケラチン細胞を接種した。培養１１日目にローダミン（rhodamine）溶液で染色して細胞シート形成の有無を確認した。
【００５６】
その結果、図３から分かるように、マウス由来線維芽細胞（Ｂ）を用いた場合は、培養容器全面が染色され、接種１１日目に細胞シートを形成したと観察されたのに対して、ヒト由来線維芽細胞（Ａ）を用いた場合は、完全な細胞シートを形成できないことが確認された。
【００５７】
これらの結果から、ヒト由来線維芽細胞を用いて表皮層を作製すると、細胞シートを形成してエアーリフティングする時点がマウス由来線維芽細胞を用いる場合より遅延し、ケラチン細胞の初期接種細胞数が多量に必要であることを確認することができる。
【００５８】
２−６．小括
前述したように、マウス由来線維芽細胞を用いて真皮層を形成すると、ヒト線維芽細胞を用いた場合より、ｉ）真皮層形成能に優れ、ｉｉ）表皮層形成能及び分化能に優れ、ｉｉｉ）初期供給したコラーゲンが保持されるので真皮層保持能に優れ、ｉｖ）表皮層形成速度が速くなることが確認された。これは、マウス由来線維芽細胞を用いると、自然皮膚組織に類似した形態となるだけでなく、三次元培養皮膚モデルを製造するのにかかる時間が短縮されることを示すものである。
【００５９】
本発明において、特に医薬品及び化粧品の毒性及び効能実験に用いるための三次元培養皮膚モデルは大量生産が求められることが多いので、前述したように求められるケラチン細胞が少数であることや、三次元培養皮膚モデルを製造するのにかかる時間が短縮されることは意味が大きいといえる。
【実施例３】
【００６０】
コラーゲンの種類に応じた三次元培養皮膚モデル製造の最適化
実施例２においては、本発明の三次元培養皮膚モデルを製造する際にマウス由来線維芽細胞を用いることが好ましいことが確認された。本発明者らは、さらに三次元培養皮膚モデル製造を最適化するために、真皮層を形成する他の要素であるコラーゲンを最適化しようと試みた。
【００６１】
３−１．天然コラーゲンとアテロコラーゲンを用いた最適化
コラーゲンとしては、天然コラーゲンと、天然コラーゲンに比べて免疫原性が低いアテロコラーゲンとを用いた。具体的には、アテロコラーゲンのみ用いた実験群１、天然コラーゲンのみ用いた実験群２、及びアテロコラーゲンと天然コラーゲンを１：５の比率で混合して用いた実験群３を作製して比較した。
【００６２】
その結果、図４から分かるように、アテロコラーゲンのみ用いて真皮層を形成した実験群１は、肉眼でもコラーゲン層が収縮する現象（▲表示）が確認された。それに対して、アテロコラーゲンと天然コラーゲンを混合した実験群３は、コラーゲン収縮現象を示さず、天然コラーゲンのみ用いた場合と同程度に表皮層が形成され、全ての層が分化することが確認された。
【００６３】
これらの結果は、三次元培養皮膚モデルの製作時に免疫原性のないアテロコラーゲンを用いることが有用であるが、激しいコラーゲン収縮現象とそれに伴う表皮層形成及び分化の減少という従来の問題を天然コラーゲン（アテロコラーゲン：天然コラーゲン＝１：５）の添加により大部分克服できることを示すものである。
【００６４】
上記結果の原因を確認するために次の実験を行った。
３−２．コラーゲンの種類に応じたＭＭＰ発現量の測定
コラーゲン収縮現象は、一般に基質分解酵素（Matrix Metalloproteinase, MMP）を発現するか否か又は発現量に関連するので、実施例３−１でコラーゲンの種類に応じて作製した実験群１〜３の三次元培養皮膚組織を培養した培養液において、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現量を分析した。それぞれの基質分解酵素の発現量はＥＬＩＳＡ法を用いて定量分析した。
【００６５】
その結果、図５から分かるように、アテロコラーゲンのみ用いた実験群１の場合、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現が実験群２及び３に比べて２倍以上と著しく高いことが確認された。それに対して、アテロコラーゲンと天然コラーゲンを混合した実験群３は、天然コラーゲンのみ用いた場合と同程度のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９発現量を示した。
【００６６】
これらの結果から、三次元培養皮膚モデル製造時に用いるコラーゲンの種類に応じて真皮層のコラーゲン収縮現象が異なることは、単に異なるコラーゲンが分解される特異性の差異だけでなく、コラーゲンが細胞に特定の刺激を与えて基質分解酵素の発現量を変化させることによっても起こることを確認することができる。僅かな天然コラーゲンを添加するだけでこのような差異が生じ得ることは本発明者らが初めて明らかにしたことである。
【００６７】
３−３．コラーゲンの混合比率に応じた三次元培養皮膚モデルの製造
アテロコラーゲンと天然コラーゲンの混合比率を様々に変えて三次元培養皮膚モデルを製造した。具体的には、アテロコラーゲンと天然コラーゲンの比率を１：１とした実験群Ａ、１：５とした実験群Ｂ、及び１：１０とした実験群Ｃを作製した。
【００６８】
その結果、図６から分かるように、全ての実験群で表皮層と真皮層が１：１の比率で安定して構成されることが確認された。肉眼的にもコラーゲン収縮現象は観察されなかった。よって、混合比率が１：１〜１：１０であれば、真皮層の収縮現象が発生することなく人工皮膚組織が安定して作製されることを示す。
【００６９】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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