(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎に各画素が輝度値で表された画像を撮像する撮像部と、
該撮像部によって撮像された前記撮像領域の細胞画像内に含まれる前記細胞群の領域の境界を表す画素の座標値及び前記細胞群の領域に含まれる全ての画素の座標値の何れか一方の情報を前記細胞群の領域の情報として取得する領域情報取得部と、
前記領域情報取得部によって取得された前記細胞群の領域の情報により特定される前記細胞群の領域毎に、前記細胞群の領域の輝度値の平均値が、予め設定された範囲内に収まる露光条件、及び前記細胞群の領域の輝度値の最大値が予め設定された閾値以下となる露光条件の何れか一方の露光条件を取得する露光条件取得部とを備え、
前記撮像部が、前記細胞群の領域の情報及び前記露光条件取得部で取得された露光条件に基づいて、前記細胞群の領域の情報により特定される前記細胞群の領域毎に、前記細胞群内の複数の前記撮像対象範囲を前記細胞群の領域毎の露光条件によって撮像することを特徴とする撮像装置。
【請求項２】
前記露光条件取得部が、前記細胞群毎の細胞画像の輝度値のヒストグラムに基づいて、輝度値の分布集合から外れている輝度値を孤立点の輝度値として特定し、該特定した輝度値を除外して前記露光条件を取得するか、又は前記ヒストグラムのうちの予め設定された範囲内の輝度値のみを用いて前記露光条件を取得する請求項１記載の撮像装置。
【請求項３】
前記露光条件取得部が、前記細胞群毎の細胞画像の空間周波数分布に基づいて、空間周波数成分が、予め設定された高周波成分の閾値以上である領域の輝度値を除外して前記露光条件を取得するか、又は空間周波数成分が、予め設定された低周波成分の閾値以下である領域の輝度値を抽出し、前記領域内の輝度値の最大値に基づいて前記露光条件を取得する請求項１記載の撮像装置。
【請求項４】
前記露光条件取得部が、前記細胞群毎の細胞画像に含まれる領域であって、輝度値の分散値が閾値以上である領域を除いた細胞画像の輝度値に基づいて、前記露光条件を決定する請求項１から３いずれか１項記載の撮像装置。
【請求項５】
前記撮像部が、前記撮像対象範囲内に複数の細胞群が含まれる場合には、面積が最も大きい細胞群の露光条件で前記撮像対象範囲を撮像する請求項１から４いずれか１項記載の撮像装置。
【請求項６】
前記撮像部が、前記細胞群を含む撮像領域を経時的に複数回撮像し、
前記露光条件取得部が、Ｎを１以上の自然数としたとき、Ｎ回目までに撮像された過去の細胞群毎の細胞画像に基づいて、Ｎ＋１回目の前記細胞群毎の露光条件を決定する請求項１から５いずれか１項記載の撮像装置。
【請求項７】
前記撮像部が、前記細胞群の領域の情報を取得するための前記細胞画像を撮像する場合の倍率よりも、前記細胞群毎の露光条件によって撮像を行う場合の倍率を高くして前記撮像を行う請求項１から６いずれか１項記載の撮像装置。
【請求項８】
前記露光条件が、前記撮像部が有する撮像素子の露光時間および入射光量のうちの少なくとも１つである請求項１から７いずれか１項記載の撮像装置。
【請求項９】
前記撮像対象範囲毎の画像を結合することによって前記撮像領域の細胞画像を生成する画像結合部を備えた請求項１から８いずれか１項記載の撮像装置。
【請求項１０】
細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎に各画素が輝度値で表された画像を撮像する撮像方法であって、
前記撮像領域を撮像した細胞画像内に含まれる前記細胞群の領域の境界を表す画素の座標値及び前記細胞群の領域に含まれる全ての画素の座標値の何れか一方の情報を前記細胞群の領域の情報として取得し、
取得された前記細胞群の領域の情報により特定される前記細胞群の領域毎に、前記細胞群の領域の輝度値の平均値が、予め設定された範囲内に収まる露光条件、及び前記細胞群の領域の輝度値の最大値が予め設定された閾値以下となる露光条件の何れか一方の露光条件を取得し、
前記細胞群の領域の情報及び取得された前記露光条件に基づいて、前記細胞群の領域の情報により特定される前記細胞群の領域毎に、前記細胞群内の複数の前記撮像対象範囲を前記細胞群の領域毎の露光条件によって撮像することを特徴とする撮像方法。
【請求項１１】
撮像部を制御することによって、細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、
撮像対象範囲毎に各画素が輝度値で表された画像を撮像する撮像制御部と、
前記撮像部によって撮像された前記撮像領域の細胞画像内に含まれる前記細胞群の領域の境界を表す画素の座標値及び前記細胞群の領域に含まれる全ての画素の座標値の何れか一方の情報を前記細胞群の領域の情報として取得する領域情報取得部と、
取得された前記細胞群の領域の情報により特定される前記細胞群の領域毎に、前記細胞群の領域の輝度値の平均値が、予め設定された範囲内に収まる露光条件、及び前記細胞群の領域の輝度値の最大値が予め設定された閾値以下となる露光条件の何れか一方の露光条件を取得する露光条件取得部としてコンピュータを機能させる撮像制御プログラムであって、
前記撮像制御部が、前記細胞群の領域の情報及び取得された前記露光条件に基づいて、前記細胞群の領域の情報により特定される前記細胞群の領域毎に、前記細胞群内の複数の前記撮像対象範囲を前記細胞群の領域毎の露光条件によって撮像することを特徴とする撮像制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎の画像を撮像する撮像装置および方法並びに撮像制御プログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態などを判定する方法が提案されている。
【０００３】
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。
【０００４】
一方、上述したように細胞を顕微鏡で撮像する際、高倍率な広視野画像を取得するため、たとえばウェルなどの撮像領域を複数の撮像対象範囲に分割し、その撮像対象範囲を高倍率でそれぞれ撮像した後、撮像対象範囲毎の画像を結合する、いわゆるタイリング撮影を行うことが提案されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−７６０８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、タイリング撮影を行う際、各撮像対象範囲について自動露光制御を行う場合がある。自動露光制御とは、各撮像対象範囲の本撮影の前に、複数の露光条件で各撮像対象範囲を撮像して複数の画像を取得し、その複数の画像に基づいて、各撮像対象範囲の適切な露光条件を設定する方法である。
【０００７】
しかしながら、たとえば複数の細胞が密集した細胞群（細胞コロニーともいう）を撮像する場合、細胞群が成熟し、細胞が積層化された領域が細胞群内に存在する場合や細胞群内において局所的に細胞分化が発生する場合がある。
【０００８】
細胞群内に細胞が積層化された領域が存在する場合、たとえば位相差顕微鏡で撮像を行った場合には、細胞によって発生した回折光が細胞群の中で多重散乱を起こし、直接光と同じ光路を伝搬するため、その結果、積層化された領域が局所的に高輝度領域となる。また、細胞群内において局所的に細胞分化が発生した場合、その領域が局所的に低輝度領域となる。
【０００９】
上述したように細胞群内に局所的な高輝度領域や低輝度領域が存在する場合に、自動露光制御を行った場合、高輝度領域または低輝度領域以外の領域と比較すると、これらの領域の露光条件が不適切な露光条件となってしまう場合がある。その結果、撮像対象範囲毎の画像を結合してタイリング画像を生成した際、同じ細胞群の中で輝度ムラを発生する問題がある。
【００１０】
上記のような問題を回避するため、タイリング撮影を行う際には、撮影前に手動で露光時間を設定し、撮像領域全体を同じ露光条件で撮像を行う方法が考えられる。
【００１１】
しかしながら、撮像領域内に存在する細胞群毎に細胞の成長度が異なる場合があり、すなわち細胞群毎に適切な露光条件が異なる場合がある。そのような場合に、撮像領域全体を同じ露光条件で撮像すると全ての細胞群を適切な露光条件で撮像することは難しい。
【００１２】
本発明は、上記の問題に鑑み、同じ細胞群の画像内において輝度ムラを生じることなく、かつ各細胞群をそれぞれ適切な露光条件で撮像することができる撮像装置および方法並びに撮像制御プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の撮像装置は、細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎の画像を撮像する撮像部と、撮像部によって撮像された撮像領域の細胞画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得する領域情報取得部と、細胞群毎の露光条件を取得する露光条件取得部とを備え、撮像部が、細胞群の領域の情報に基づいて、細胞群内の複数の撮像対象範囲を細胞群毎の露光条件によって撮像することを特徴とする。
【００１４】
また、上記本発明の撮像装置において、領域情報取得部は、細胞画像に基づいて、細胞群の領域の情報を取得することができる。
【００１５】
また、上記本発明の撮像装置において、露光条件取得部は、細胞画像に基づいて、細胞群毎の露光条件を決定することができる。
【００１６】
また、上記本発明の撮像装置において、露光条件取得部は、細胞群毎の細胞画像の画像信号のヒストグラムに基づいて、露光条件を決定することができる。
【００１７】
また、上記本発明の撮像装置において、露光条件取得部は、細胞群毎の細胞画像の空間周波数分布に基づいて、露光条件を決定することができる。
【００１８】
また、上記本発明の撮像装置において、露光条件取得部は、細胞群毎の細胞画像に含まれる領域であって、画像信号の分散値が閾値以上である領域を除いた細胞画像の画像信号に基づいて、露光条件を決定することができる。
【００１９】
また、上記本発明の撮像装置において、撮像部は、撮像対象範囲内に複数の細胞群が含まれる場合には、面積が最も大きい細胞群の露光条件で撮像対象範囲を撮像することができる。
【００２０】
また、上記本発明の撮像装置において、撮像部は、細胞群を含む撮像領域を経時的に複数回撮像することができ、露光条件取得部は、Ｎを１以上の自然数としたとき、Ｎ回目までに撮像された過去の細胞群毎の細胞画像に基づいて、Ｎ＋１回目の細胞群毎の露光条件を決定することができる。
【００２１】
また、上記本発明の撮像装置において、撮像部は、細胞群の領域の情報を取得するための細胞画像を撮像する場合の倍率よりも、細胞群毎の露光条件によって撮像を行う場合の倍率を高くして撮像を行うことができる。
【００２２】
また、上記本発明の撮像装置において、露光条件は、撮像部が有する撮像素子の露光時間および入射光量のうちの少なくとも１つであることが望ましい。
【００２３】
また、上記本発明の撮像装置において、撮像対象範囲毎の画像を結合することによって撮像領域の細胞画像を生成する画像結合部を備えることができる。
【００２４】
本発明の撮像方法は、細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎の画像を撮像する撮像方法であって、撮像領域を撮像した細胞画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得し、細胞群毎の露光条件を取得し、細胞群の領域の情報に基づいて、細胞群内の複数の撮像対象範囲を細胞群毎の露光条件によって撮像することを特徴とする。
【００２５】
本発明の撮像制御プログラムは、撮像部を制御することによって、細胞群を含む撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎の画像を撮像する撮像制御部と、撮像部によって撮像された撮像領域の細胞画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得する領域情報取得部と、細胞群毎の露光条件を取得する露光条件取得部としてコンピュータを機能させる撮像制御プログラムであって、撮像制御部が、細胞群の領域の情報に基づいて、細胞群内の複数の撮像対象範囲を細胞群毎の露光条件によって撮像することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の撮像装置および方法並びに撮像制御プログラムによれば、細胞群を含む撮像領域を撮像し、その撮像領域の細胞画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得し、その細胞群毎の露光条件を取得する。そして、撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎の画像を撮像する際、細胞群の領域の情報に基づいて、細胞群内の複数の撮像対象範囲を細胞群毎の露光条件によって撮像するようにしたので、同じ細胞群の画像内において輝度ムラを生じることなく、かつ各細胞群をそれぞれ適切な露光条件で撮像することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の撮像装置の一実施形態を用いた細胞観察システムの概略構成を示すブロック図
【図２】図１に示す細胞観察システムの撮像部の概略構成を示す図
【図３】細胞群を含む撮像領域およびその撮像領域内における撮像対象範囲の一例を示す模式図
【図４】低倍率撮像の場合の撮像対象範囲と高倍率撮像の場合の撮像対象範囲の一例を示す図
【図５】本発明の撮像装置の一実施形態を用いた細胞観察システムの作用を説明するためのフローチャート
【図６】過去に撮像した細胞群の画像信号値から次回撮像される細胞群の画像信号値を推定する方法を説明するための図
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の撮像装置および方法並びに撮像制御プログラムの一実施形態を用いた細胞観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、細胞観察システム１の概略構成を示すブロック図である。
【００２９】
本実施形態の細胞観察システム１は、図１に示すように、撮像部１０と、撮像制御装置２０と、表示装置３０と、入力装置４０とを備えている。
【００３０】
撮像部１０は、培養された細胞群の位相差画像を撮像するものである。また、撮像部１０は、細胞群を経時的に複数回撮像する、いわゆるタイムラプス撮影を行うものである。撮像対象の細胞としては、具体的には、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。
【００３１】
図２は、撮像部１０の概略構成を示す図である。撮像部１０は、図２に示すように、白色光を出射する白色光源１１と、リング形状のスリットを有し、白色光源１１から出射された白色光が入射されて、いわゆる位相差計測のためのリング状の照明光Ｌ１を出射するスリット板１２と、スリット板１２から出射されたリング状の照明光Ｌ１が入射され、その入射されたリング状の照明光Ｌ１を、細胞群Ｓを含む撮像領域に対して照射する対物レンズ１３とを備えている。
【００３２】
スリット板１２は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌ１が形成される。
【００３３】
また、撮像部１０は、位相差レンズ１４と、結像レンズ１５と、撮像素子１６とを備えている。
【００３４】
位相差レンズ１４は、対物レンズ１４ａおよび位相板１４ｂを備えている。位相板１４ｂは、照明光Ｌ１の波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１２のスリットの大きさは、この位相リングと共役な関係にある。
【００３５】
位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、細胞群Ｓによって回折された回折光は大部分が位相板１４ｂの透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。
【００３６】
位相差レンズ１４は、後述する撮像制御部２５から出力された制御信号に基づいて、図示省略した光学系駆動部によってＺ方向（矢印Ａ方向）に移動するものである。この位相差レンズ１４のＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像素子１６によって撮像される画像のコントラストが調整される。
【００３７】
また、本実施形態の撮像部１０は、倍率の異なる複数の位相差レンズ１４を交換可能に構成されている。位相差レンズ１４の交換については、ユーザからの指示入力に応じて自動的に行う構成としてもよいし、ユーザが手動で交換するようにしてもよい。
【００３８】
本実施形態においては、撮像領域内に含まれる細胞群の領域を特定するための低倍率撮像と観察用の位相差画像を取得するための高倍率撮像とが行われるが、低倍率撮像の際には１倍〜４倍の位相差レンズ１４が用いられ、高倍率撮像の際には１０倍〜２０倍の位相差レンズ１４が用いられる。ただし、低倍率撮像と高倍率撮像とは相対的に倍率が異なっていればよく、これらの倍率に限定されるものではない。
【００３９】
結像レンズ１５は、位相差レンズ１４を通過した回折光および直接光が入射され、これらを撮像素子１６に結像するものである。
【００４０】
撮像素子１６は、結像レンズ１５によって結像された回折光および直接光を検出して位相差画像を撮像するものである。撮像素子１６としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。なお、本実施形態においては、位相差画像が、本発明の細胞画像に相当するものである。
【００４１】
対物レンズ１３と位相差レンズ１４との間には、ステージ５１が設けられている。そして、このステージ５１上に、観察対象Ｓおよび培養液Ｃが収容された培養容器５０が設置される。ステージ５１は、後述する撮像制御部２５から出力された制御信号に基づいて、図示省略したステージ駆動部によって互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動するものである。培養容器５０としては、シャーレ、ディッシュまたはウェルプレートなどを用いることができる。
【００４２】
そして、ステージ５１がＸ方向およびＹ方向へ移動することによって、観察対象Ｓを含む撮像領域内で撮像対象範囲が移動して変更される。図３は、観察対象Ｓとして細胞群Ｓ１〜Ｓ３を含む撮像領域Ｒおよびその撮像領域Ｒ内における撮像対象範囲ＩＲ１の一例を模式的に示した図である。ステージ５１のＸ方向およびＹ方向への移動によって撮像対象範囲ＩＲ１の位置が変更され、撮像対象範囲ＩＲ１毎の位相差画像が撮像される。
【００４３】
また、本実施形態においては、上述したように低倍率撮像と高倍率撮像とが行われるが、低倍率撮像の場合の撮像対象範囲よりも高倍率撮像の場合の撮像対象範囲の方が狭い範囲となる。図４は、低倍率撮像の場合の撮像対象範囲と高倍率撮像の場合の撮像対象範囲の一例を示したものである。図４において実線で示される矩形範囲が低倍率撮像の場合の撮像対象範囲ＩＲ１であり、点線で示される矩形範囲が高倍率撮像の場合の撮像対象範囲ＩＲ２である。
【００４４】
図１に戻り、撮像制御装置２０は、細胞画像取得部２１と、画像結合部２２と、領域情報取得部２３と、露光条件取得部２４と、撮像制御部２５と、表示制御部２６とを備えている。
【００４５】
撮像制御装置２０は、コンピュータに対して本発明の撮像制御プログラムの一実施形態がインストールされたものである。
【００４６】
撮像制御装置２０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の撮像制御プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような細胞画像取得部２１、画像結合部２２と、領域情報取得部２３、露光条件取得部２４、撮像制御部２５および表示制御部２６が動作する。
【００４７】
細胞画像取得部２１は、撮像部１０において経時的に複数回撮像された位相差画像を取得して記憶するものである。また、本実施形態の撮像部１０は、上述したように撮像領域Ｒ内で撮像対象範囲ＩＲ１，ＩＲ２を移動させて、撮像対象範囲ＩＲ１，ＩＲ２毎の位相差画像を撮像するものであるが、細胞画像取得部２１は、撮像領域Ｒ内の撮像対象範囲ＩＲ１，ＩＲ２毎の位相差画像に対して、撮像領域Ｒ内におけるその位置情報を付加し、かつ同じ撮像領域Ｒに含まれる複数の撮像対象範囲ＩＲ１または複数の撮像対象範囲ＩＲ２の位相差画像を対応付けて記憶するものである。
【００４８】
画像結合部２２は、撮像対象範囲毎の位相差画像を結合することによって、撮像領域全体の１枚の位相差画像を生成するものである。
【００４９】
領域情報取得部２３は、撮像部１０によって撮像された位相差画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得するものである。なお、細胞群とは、複数の細胞が一つに密集した細胞集合であり、細胞コロニーともいう。
【００５０】
具体的には、領域情報取得部２３は、たとえば図３に示すような撮像領域Ｒの位相差画像が撮像された場合には、位相差画像に含まれる細胞群Ｓ１〜Ｓ３の領域情報を取得するものである。本実施形態の領域情報取得部２３は、低倍率撮像によって取得された位相差画像に含まれる細胞群の領域情報を取得する。低倍率撮像は、高倍率撮像と比較すると高速に行うことができるので、より早く細胞群の領域の情報を取得することができる。
【００５１】
なお、細胞群の領域情報とは、細胞群の領域を特定できる情報であればよく、細胞群の境界を表す画素の座標値でもよいし、細胞群の領域に含まれる全ての画素の座標値でもよい。また、細胞群の領域を含む撮像対象範囲ＩＲ１の撮像領域Ｒ内における位置情報でもよい。
【００５２】
細胞群Ｓ１〜Ｓ３の領域の特定方法としては、たとえば位相差画像を２値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞群を自動的に検出するようにすればよい。また、細胞群の領域の特定方法については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。また、本実施形態においては、位相差画像の特徴に基づいて、自動的に細胞群の領域情報を取得するようにしたが、これに限らず、低倍率撮像によって取得された位相差画像を表示装置３０に表示させ、その表示された位相差画像に含まれる細胞群の領域をユーザが入力装置４０を用いて特定してもよい。すなわち、ユーザが手動で細胞群の領域情報を取得するようにしてもよい。
【００５３】
露光条件取得部２４は、領域情報取得部２３によって特定された細胞群毎の露光条件を取得するものである。具体的には、本実施形態の露光条件取得部２４は、低倍率撮像によって取得された位相差画像およびその位相差画像に含まれる各細胞群の領域情報を取得し、細胞群毎の低倍率の位相差画像に基づいて、各細胞群に適した露光条件をそれぞれ取得するものである。本実施形態の露光条件取得部２４は、露光条件として、撮像素子１６の露光時間および入射光量のうちの少なくとも１つを取得する。
【００５４】
露光条件の決定方法としては、たとえば各細胞群の位相差画像の画像信号の平均値、最大値、最小値、最頻値および平均値と分散値の組み合わせなどの統計値に基づいて、各細胞群の撮像に適した撮像素子１７の露光時間または入射光量を決定するようにすればよい。より具体的には、たとえば細胞群の位相差画像の画像信号の平均値が、予め設定された範囲内に収まる露光条件を決定したり、細胞群の位相差画像の画像信号の最大値が予め設定された閾値以下となる露光条件を決定したりすればよい。
【００５５】
また、細胞群の中にたとえば死細胞などのゴミが含まれている場合など、細胞群の位相差画像内に、周囲と比較すると明らかに輝度が高くなっている孤立点が存在する場合がある。このような場合に、この孤立点の画像信号も含めて露光条件を取得すると適切な露光条件を取得できない場合がある。そこで、たとえば細胞群の位相差画像の画像信号のヒストグラムを生成し、画像信号の分布集合から外れている画像信号を孤立点の画像信号として特定し、その特定した画像信号を除外して露光条件を取得するようにしてもよい。また、ヒストグラムのうちの予め設定された範囲内の画像信号のみを用いて露光条件を決定するようにしてもよい。
【００５６】
また、細胞群の増殖が進むと細胞が積層化し、これにより細胞群の中に周囲よりも明るくなる領域が発生する場合がある。このような場合に、たとえば細胞群の画像信号の平均値に基づいて露光条件を取得して撮像を行った場合、積層化された領域が白く飽和し、細胞の状態を観察できない場合がある。そこで、上述したような積層化された領域の画像信号の最大値などに基づいて露光条件を取得するようにしてもよい。なお、積層化された領域については、たとえば予め設定された信号閾値以上の画像信号が、予め設定された面積閾値以上の領域に分布する場合に、その領域を積層化された領域として検出するようにすればよい。
【００５７】
また、細胞群に含まれる細胞の分化が進むと、細胞群内に周囲よりも暗いホールが形成される場合がある。このような場合に、たとえば細胞群の画像信号の平均値に基づいて露光条件を取得して撮像を行った場合、ホールの領域が暗すぎて、細胞の状態を観察できない場合がある。そこで、上述したようなホールの領域の画像信号の最小値などに基づいて露光条件を取得するようにしてもよい。なお、ホールの領域については、たとえば予め設定された信号閾値以下の画像信号が、予め設定された面積閾値以上の領域に分布する場合に、その領域をホール領域として検出するようにすればよい。
【００５８】
また、細胞群の増殖が進むと、細胞群に周縁部においてハロが発生し、周囲よりも明るい白スジが発生する場合がある。ハロとは、細胞間を通過した回折光に起因して発生するものである。このような場合に、この白スジの領域の画像信号も含めて露光条件を決定した場合、適切な露光条件を取得できない場合がある。そこで、上述したような白スジの領域の画像信号を除外して露光条件を取得するようにしてもよい。なお、白スジの領域については、たとえば予め設定された閾値以上の画像信号を有する画素を検出することによって検出してもよいし、フィルタ処理などによって白い線を検出するようにしてもよい。
【００５９】
また、細胞群の位相差画像の空間周波数分布を算出し、その空間周波数分布に基づいて露光条件を取得するようにしてもよい。具体的には、細胞群内に上述したような白スジや死細胞などのゴミが存在する場合、これらは明るい画像信号となるので高周波成分の分布として現れる。したがって、空間周波数成分が、予め設定された高周波成分の閾値以上である領域の画像信号を除外して露光条件を取得するようにしてもよい。また、細胞群内に積層化された領域が存在する場合、この領域は低周波成分の分布として現れる。したがって、空間周波数成分が、予め設定された低周波成分の閾値以下である領域の画像信号を抽出し、その領域内の画像信号の最大値などに基づいて露光条件を取得するようにしてもよい。
【００６０】
また、細胞群内の所定の領域毎の位相差画像の画像信号の分散値を算出し、その分散値が予め設定された分散閾値以上である場合には、その分散値を有する領域にはゴミなどによって発生する高輝度な孤立点が存在するものとして、その領域の画像信号を除外して露光条件を取得するようにしてもよい。なお、分散値は、たとえば撮像対象範囲毎に算出するようにしてもよい。
【００６１】
また、露光条件の決定方法としては、上記のような方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。また、上記説明では、細胞群毎の位相差画像に基づいて、自動的に各細胞群の露光条件を取得するようにしたが、これに限らず、ユーザが入力装置４０を用いて各細胞群の領域情報および露光条件を手動で設定入力するようにしてもよい。
【００６２】
撮像制御部２５は、撮像部１０を制御することによって、上述した低倍率撮像と高倍率撮像とを行うものである。撮像制御部２５は、低倍率撮像を行う場合には、予め設定された初期露光条件に基づいて、撮像領域Ｒ内の撮像対象範囲ＩＲ１毎の位相差画像を撮像する。また、撮像制御部２５は、高倍率撮像を行う場合には、各細胞群の領域情報および各細胞群の露光条件を取得し、その露光条件に基づいて、撮像部１０を制御するものである。具体的には、撮像制御部２５からの制御信号に応じて、撮像部１０は、細胞群の領域を含む複数の撮像対象範囲をその細胞群に対応する露光条件を用いて撮像する。
【００６３】
図４に示す例の場合、たとえば細胞群Ｓ１の領域を含む撮像対象範囲ＩＲ２を撮像する場合には、細胞群Ｓ１に対応する露光条件を用いて撮像が行われる。また、同様に、細胞群Ｓ２の領域を含む撮像対象範囲ＩＲ２（点線の矩形範囲）を撮像する場合には、細胞群Ｓ２に対応する露光条件を用いて撮像が行われ、細胞群Ｓ３の領域を含む撮像対象範囲ＩＲ２（点線の矩形範囲）を撮像する場合には、細胞群Ｓ３に対応する露光条件を用いて撮像が行われる。なお、細胞群Ｓ１〜Ｓ３以外の領域の露光条件としては、たとえば細胞群Ｓ１〜細胞群Ｓ３についてそれぞれ取得された露光条件の平均値を用いるようにしてもよいし、低倍率撮像を行う際に用いた初期露光条件をそのまま用いるようにしてもよい。
【００６４】
また、細胞群の領域を含む撮像対象範囲は、領域情報取得部２３によって取得された細胞群の領域情報に基づいて特定される。この際、細胞群の境界を表す画素の座標値または細胞群の領域に含まれる全ての画素の座標値を用いるようにしてもよいし、もしくは低倍率撮像の際の撮像対象範囲ＩＲ１であって細胞群の領域を含む撮像対象範囲ＩＲ１に含まれる撮像対象範囲ＩＲ２を特定するようにしてもよい。
【００６５】
また、たとえば、１つの撮像対象範囲ＩＲ２の中に、複数の細胞群の領域が含まれる場合には、面積が最も大きい細胞群に対応する露光条件で撮像することが望ましい。
【００６６】
また、露光条件としては、上述したように撮像素子１６の露光時間および撮像素子１６への入射光量とがあるが、本実施形態においては、白色光源１１からの出射光量を制御することによって撮像素子１６への入射光量を制御する。なお、撮像素子１６への入射光量への制御は、白色光源１１から出射光量の制御に限らず、たとえば、撮像部１０が、白色光源１１から出射された白色光の光量を制限する絞りなどの光量制限部を備えたものである場合には、その光量制限部を制御することによって撮像素子１６への入射光量を制御するようにしてもよい。撮像素子１６の露光時間および撮像素子１６への入射光量との両方を制御するようにしてもよい。
【００６７】
そして、上記のようにして細胞群毎の露光条件に基づいて、高倍率撮像によって取得された撮像対象範囲毎の位相差画像は、画像結合部２２によって結合され、撮像領域全体の１枚の位相差画像が生成される。
【００６８】
表示制御部２６は、上述したようにして高倍率撮像によって取得された撮像領域全体の位相差画像を、観察用の位相差画像として表示装置３０に表示させるものである。また、表示制御部２６は、低倍率撮像によって取得された撮像領域全体の位相差画像も表示装置３０に表示させるようにしてもよい。また、露光条件取得部２４において取得された細胞群毎の露光条件を、細胞群に付加された名称や細胞群の領域情報などといった細胞群を特定する情報とともに表示装置３０に表示させるようにしてもよい。
【００６９】
表示装置３０は、上述したように画像結合部２２によって生成された位相差画像や細胞群毎の露光条件などを表示するものであり、たとえば液晶ディスプレイなどを備えたものである。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用するようにしてもよい。
【００７０】
入力装置４０は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。本実施形態の入力装置４０は、たとえば上述した細胞群毎の露光条件の設定入力を受け付けるものである。
【００７１】
次に、本実施形態の細胞観察システム１の作用について、図５に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００７２】
まず、ユーザによって入力装置４０を用いて初期露光条件が設定される。撮像制御部２５は、初期露光条件に基づいて撮像部１０を制御し、低倍率撮像を行って撮像領域Ｒの撮像対象範囲ＩＲ１毎の位相差画像を取得する（Ｓ１０）。
【００７３】
低倍率撮像によって取得された撮像対象範囲ＩＲ１毎の位相差画像は細胞画像取得部２１に記憶された後、画像結合部２２に入力される。画像結合部２２は、撮像対象範囲ＩＲ１毎の位相差画像を結合し、撮像領域Ｒ全体の１枚の位相差画像を生成する。
【００７４】
そして、画像結合部２２によって生成された１枚の位相差画像は領域情報取得部２３に入力され、領域情報取得部２３は、その位相差画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得する（Ｓ１２）。
【００７５】
領域情報取得部２３によって取得された細胞群の領域情報は露光条件取得部２４に出力される。露光条件取得部２４は、各細胞群の領域情報に基づいて、低倍率撮像によって取得された位相差画像の中から各細胞群の位相差画像を抽出し、その各細胞群の位相差画像に基づいて、細胞群毎の露光条件を取得する（Ｓ１４）。
【００７６】
そして、露光条件取得部２４によって取得された細胞群毎の露光条件と各細胞群の領域情報とが撮像制御部２５に入力される。撮像制御部２５は、各細胞群の領域情報および各細胞群の露光条件に基づいて撮像部１０を制御し、撮像部１０は、細胞群の領域を含む複数の撮像対象範囲をその細胞群の露光条件を用いて高倍率で撮像する（Ｓ１６）。
【００７７】
高倍率撮像によって取得された撮像対象範囲ＩＲ２毎の位相差画像は細胞画像取得部２１に記憶された後、画像結合部２２に入力される。画像結合部２２は、撮像対象範囲ＩＲ２毎の位相差画像を結合し、撮像領域Ｒ全体の１枚の位相差画像を生成する。
【００７８】
画像結合部２２によって生成された高倍率撮像の位相差画像は表示制御部２６に出力され、表示制御部２６は、その高倍率撮像の位相差画像を表示装置３０に表示させる（Ｓ１８）。
【００７９】
上記実施形態の細胞観察システム１によれば、撮像領域を撮像した細胞画像内に含まれる細胞群の領域の情報を取得し、その細胞群毎の露光条件を取得する。そして、撮像領域内で撮像対象範囲を移動させ、撮像対象範囲毎の画像を撮像する際、細胞群の領域の情報に基づいて、細胞群内の複数の撮像対象範囲を細胞群毎の露光条件によって撮像するようにしたので、同じ細胞群の画像内において輝度ムラを生じることなく、かつ各細胞群をそれぞれ適切な露光条件で撮像することができる。
【００８０】
なお、上記実施形態の細胞観察システム１は、上述したようにタイムラプス撮影を行うものであるが、上述した細胞群毎の露光条件の取得については、各撮影の度に毎回行うようにしてもよいし、たとえばＮ回目（Ｎは１以上の自然数）までは上記実施形態の細胞観察システム１のように低倍率撮像を行って細胞群毎の露光条件を決定し、Ｎ＋１回目以降の撮像については、Ｎ回目までに撮像された細胞群毎の画像信号に基づいて、Ｎ＋１回目以降の細胞群毎の画像信号を推定し、その推定した画像信号に基づいて高倍率撮像の露光条件を決定するようにしてもよい。すなわち、Ｎ＋１回目以降は、低倍率撮像を行わないようにしてもよい。
【００８１】
たとえば、図６に示すように３回目の撮像までは、上記実施形態のように低倍率撮像を行って細胞群毎の露光条件を決定し、４回目以降の撮像については、１回目から３回目までの高倍率撮像によって取得された細胞群の画像信号値の平均値ａ１〜ａ３に基づいて、４回目の細胞群の画像信号の平均値ａ４を推定し、この推定したａ４の値に基づいて、４回目の高倍率撮像の露光条件を決定するようにしてもよい。
【００８２】
４回目以降の撮像の画像信号の推定については、たとえば細胞群の画像信号値の平均値ａ１〜ａ３に基づいて、近似関数ｆ（ｔ）を決定し、この近似関数ｆ（ｔ）に基づいて４回目以降の画像信号を推定するようにすればよい。
【００８３】
近似関数ｆ（ｔ）としては、たとえば２次関数や４次関数などの偶関数を用いるようにしてもよいし、１次関数を用いるようにしてもよいし、指数関数を用いるようにしてもよい。また、多項式近似を用いて近似関数ｆ（ｔ）を取得するようにしてもよい。近似関数ｆ（ｔ）を求める方法としては、その他の公知の方法を用いることができる。
【００８４】
また、近似関数ｆ（ｔ）については、露光条件取得部２４に、初期設定関数ｆａ（ｔ）を予め記憶しておき、Ｎ回目までに撮像された位相差画像に基づいて、その初期設定関数ｆａ（ｔ）を変更することによって近似関数ｆ（ｔ）を求めるようにしてもよい。具体的には、たとえば初期設定関数ｆａ（ｔ）として２次関数ｆａ（ｔ）＝ａｔ２＋ｂｔ＋ｃを予め記憶しておき、Ｎ回目までに撮像された位相差画像に基づいて係数ａ，係数ｂおよび係数ｃを変更することによって近似関数ｆ（ｔ）を求めるようにしてもよい。なお、初期設定関数としては、２次関数に限らず、４次関数などの偶関数および指数関数を用いるようにしてもよい。
【００８５】
さらに、初期設定関数を、細胞群をなす細胞の種類毎または培養条件毎にそれぞれ記憶しておくようにしてもよい。細胞の種類または培養条件によって細胞の成長度が異なるので、上述したように細胞の種類毎または培養条件毎に初期設定関数を予め記憶しておくことによって、Ｎ＋１回目に撮像される細胞群の画像信号の推定をより高精度に行うことができる。より具体的には、たとえば細胞の成長度が相対的に早い細胞または培養条件の場合には２次関数を用い、細胞の成長度が相対的に遅い細胞または培養条件の場合には指数関数を用いるようにしてもよい。または、細胞の種類毎または培養条件毎に、初期設定関数に設定する係数を変更するようにしてもよい。なお、培養条件としては、培地の種類、成長因子の種類または量および培養期間などがあるが、細胞の成長速度に影響する条件であればその他の条件でもよい。
【００８６】
また、上記実施形態の細胞観察システム１においては、細胞群の領域を特定するための位相差画像の撮像を低倍率で行い、細胞群毎の露光条件を用いた位相差画像の撮像を高倍率で行うようにしたが、これらの撮像を同じ倍率で行うようにしてもよい。
【００８７】
また、上記実施形態の細胞観察システム１においては、撮像部１０によって位相差画像を撮像するようにしたが、位相差画像に限らず、たとえば明視野画像、微分干渉画像または蛍光画像を細胞画像として撮像するものとしてもよい。
【符号の説明】
【００８８】
１     細胞観察システム
１０   撮像部
１１   白色光源
１２   スリット板
１３   対物レンズ
１４   位相差レンズ
１４ａ 対物レンズ
１４ｂ 位相板
１５   結像レンズ
１６   撮像素子
１７   撮像素子
２０   撮像制御装置
２１   細胞画像取得部
２２   画像結合部
２３   領域情報取得部
２４   露光条件取得部
２５   撮像制御部
２６   表示制御部
３０   表示装置
４０   入力装置
５０   培養容器
５１   ステージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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