(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ流体分析システムであって：
長さが５００μｍ〜１０ｃｍの反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルと前記反応ナノチャネルとの間の界面位置において前記検出ナノチャネルにマージし、前記界面位置において前記検出ナノチャネルのサイズは前記反応ナノチャネルに比して縮小し、制限酵素断片を生成する制限エンドヌクレアーゼによってＤＮＡが前記反応ナノチャネル内において消化され、輸送を駆動する力は前記反応ナノチャネルにおいてよりも前記検出ナノチャネルにおいて大きく、各制限酵素断片が前記界面位置に到達する際の輸送速度の上昇と、隣接する制限酵素断片からの各制限酵素断片の分離を引き起こす、前記反応ナノチャネル；
前記反応ナノチャネルの進入部分と連通するマイクロ流体チャネル；
前記マイクロ流体チャネルと連通する第１の電極；
前記反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記反応ナノチャネルから延在し、且つ前記反応ナノチャネルと流体連通する、第１の横向き流体チャネル；
前記第１の横向き流体チャネルと連通する第２の電極；
前記第１の横向き流体チャネルの下流において前記反応ナノチャネルから延在し、且つ前記反応ナノチャネルと流体連通する、第２の横向き流体チャネル；
前記第２の横向き流体チャネルと連通する第３の電極；
前記検出ナノチャネルと連通する第４の電極；
前記第１の電極、前記第２の電極、前記第３の電極及び前記第４の電極の動作を制御して、制限酵素断片の不規則化を防止する前記反応ナノチャネルの内部で、制限酵素断片を生成する前記制限エンドヌクレアーゼによって、ＤＮＡを制御自在に導入し、装填し、消化するよう構成される、回路；並びに
隣接する制限酵素断片から分離された前記制限酵素断片を含む前記検出ナノチャネルと連通するものであって、分離された前記制限酵素断片の各々のサイズを測定することによって、リアルタイムで又は略リアルタイムでの染色体ＤＮＡの規則正しい制限マップを実現できるようように構成された、少なくとも１つの電気的な又は光学的な検出器、
を含む、ナノ流体分析システム。
【請求項２】
前記マイクロ流体チャネルは、前記マイクロ流体流路を部分的に塞ぐよう構成される、離間した複数のポストのアレイを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記システムは、前記マイクロ流体チャネルを流体輸送ナノチャネルの進入部分と接続するナノファンネルを更に備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記第１の横向き流体チャネル及び前記第２の横向き流体チャネルは、深さ約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、幅約２０ｎｍ〜約２０００ｎｍの流体ナノチャネルであり、前記反応ナノチャネルは、１ｎｍ〜５００ｎｍの幅及び深さを有し、前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きく、前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、長さが約１０倍〜約１０００倍大きい、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
（i）前記システムは、カバーで密封された、ビアを通して各前記流体チャネルへの供給を行う複数の外部アクセス可能なリザーバを有する基板上の、複数の前記反応ナノチャネル、前記検出ナノチャネル並びに前記第１の横向き流体チャネル及び前記第２の横向き流体チャネルで構成され、及び／又は、
（ii）前記マイクロ流体チャネルは、１つ又は複数のリザーバと流体連通し、
前記１つ又は複数のリザーバのうちの少なくとも１つは、分析用の細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースを含み、及び／又は、
（iii）前記反応ナノチャネルの前記進入部分と連通する前記マイクロ流体チャネルは、ＤＮＡを有する細胞全体を含み、
前記第２の横向き流体チャネルは、前記反応ナノチャネルから離間した端部において第２の流体リザーバにマージし、前記第２の流体リザーバは、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の溶液を含み、及び／又は、
（iv）前記検出ナノチャネルは真っ直ぐであり、約５００μｍ〜約２ｃｍの長さを有し、前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、長さが約１０倍〜約１０００倍、並びに深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きい、
請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
分析チップであって：
ポストのアレイを有するマイクロ流体チャネルを用いて、細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースからゲノムＤＮＡを抽出するよう適合される、マイクロ流体入口；
長さ５００μｍ〜１０ｃｍの第１の反応ナノチャネルであって、前記第１の反応ナノチャネルは、前記マイクロ流体入口に接続する進入部分を有し、前記制限酵素断片が第１の検出ナノチャネルの中に注入される際に元の順序のままとなるようにサイズ設定及び構成される、第１の反応ナノチャネル；
ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、前記第１の反応ナノチャネルの放出端部とマージする、前記第１の検出ナノチャネルであって、制限エンドヌクレアーゼによってＤＮＡが前記第１の反応ナノチャネル内において消化されて制限酵素断片となり、輸送を駆動する力は前記第１の反応ナノチャネルにおいてよりも前記第１の検出ナノチャネルにおいて大きく、各制限酵素断片が前記交点に到達する際の輸送速度の上昇と、隣接する制限酵素断片からの各制限酵素断片の分離を引き起こす、前記第１の検出ナノチャネル；
前記第１の反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記第１の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第１の反応ナノチャネルと流体連通する、第１の横向き流体チャネル；並びに
前記第１の横向き流体チャネルの下流において前記第１の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第１の反応ナノチャネルと流体連通する、第２の横向き流体チャネル
を備える、分析チップ。
【請求項７】
（i）前記第１の反応ナノチャネルと前記マイクロ流体入口との間に存在し、前記反応ナノチャネルを前記マイクロ流体入口と接続する、ナノファンネルを更に備え、及び／又は、
（ii）前記チップによって保持される複数のリザーバを更に備え、前記複数のリザーバは、前記マイクロ流体入口と流体連通する少なくとも１つのリザーバ、前記第１の横向き流体チャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバ、前記第２の横向き流体チャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバ、及び前記第１の検出ナノチャネルの端部と流体連通する少なくとも１つのリザーバを含み、及び／又は、
（iii）前記チップと連通する輸送システムと組み合わされ、前記輸送システムは、界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも１つを印加することによって、ゲノムＤＮＡ分子及び前記ゲノムＤＮＡ分子の前記制限酵素断片の、前記第１の検出ナノチャネルの中への前記第１の反応ナノチャネルを通した輸送を引き起こすよう構成され、
前記第１の反応ナノチャネルは、１ｎｍ〜５００ｎｍの幅及び深さを有し、前記第１の反応ナノチャネルは、前記第１の検出ナノチャネルより、深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きい、
請求項６に記載のチップ。
【請求項８】
長さ５００μｍ〜１０ｃｍの第２の反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、前記マイクロ流体入口に接続する進入部分を有する、第２の反応ナノチャネル；
ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、前記第２の反応ナノチャネルの放出端部とマージする、第２の検出ナノチャネル；
前記第２の反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記第２の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第２の反応ナノチャネルと流体連通する、第３の横向き流体チャネル；並びに
前記第３の横向き流体チャネルの下流において前記第２の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第２の反応ナノチャネルと流体連通する、第４の横向き流体チャネル
を更に備える、請求項６に記載の分析チップ。
【請求項９】
細胞全体から抽出されるゲノムＤＮＡの規則正しい制限酵素マップを生成する方法であって：
反応ナノチャネルにマージする流体マイクロチャネルを有するデバイスを提供するステップであって、前記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルに、ナノチャネル直径のサイズが５０〜９９％だけ減少する界面においてマージする、ステップであって、制限エンドヌクレアーゼによってＤＮＡが前記反応ナノチャネル内において消化されて制限酵素断片となり、輸送を駆動する力は前記反応ナノチャネルにおいてよりも前記検出ナノチャネルにおいて大きく、各断片が前記界面に到達する際の輸送速度の上昇と、隣接する制限酵素断片からの各制限酵素断片の分離を引き起こす、前記ステップ；
細胞全体を溶解させ、前記マイクロチャネル内でＤＮＡの剪断を最小限に抑えながらＤＮＡを染色質除去するステップ；
続いて前記反応ナノチャネルにＤＮＡの無傷分子を導入するステップ；
続いて制限エンドヌクレアーゼを使用した制限消化によって前記反応ナノチャネル内で前記無傷ＤＮＡを断片化するステップであって、前記反応ナノチャネルは、前記制限酵素断片が前記検出ナノチャネルの中に注入されるまで元の順序のままとなるようにサイズ設定及び構成される、ステップ；並びに
前記検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所で信号を検出して、長鎖ＤＮＡ分子に沿って前記制限酵素断片が発生する順序で前記制限酵素断片をマッピングするステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
前記デバイスは、前記反応ナノチャネルにマージする前記流体マイクロチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバを備え、
前記導入するステップは、細胞全体を、前記リザーバを使用する分析のために導入することによって実施され、
前記方法は更に：
前記細胞全体を不動化するためのゲルマトリックス及び／又は高密度ポストアレイを提供するステップ；
続いて前記細胞を溶解するステップ；
ＤＮＡを抽出するステップ；
任意選択で、前記ＤＮＡの無傷分子を前記反応ナノチャネルの中に導入するステップの前に、前記ＤＮＡを染色するステップ、
を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（i）前記ＤＮＡの無傷分子を導入するステップは、前記反応ナノチャネルの進入部分の近傍において、制御された電圧の勾配又は濃度分極の勾配を使用して実施され、これにより前記ＤＮＡ分子は初め、ＤＮＡ引張り強さを超える歪みに曝されず、機械的に破損せず、及び／又は、
（ii）制限酵素消化の反応は、前記反応ナノチャネル及び横向き流体チャネルに印加される前記電圧を変更して、前記反応ナノチャネル内に含まれる前記ＤＮＡに前記制限エンドヌクレアーゼ及び／又は補因子分子を導入することによって実施され、次いで反応を、全ての制限酵素部位が消化されるまで進行させることができ、及び／又は、
（iii）前記反応ナノチャネル及び横向き流体チャネルに印加される電圧は、制限エンドヌクレアーゼ及び／又は補因子の前記流体マイクロチャネルへの導入を防止し、従って前記反応ナノチャネル外部の前記ＤＮＡ分子の消化を防止する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応ナノチャネル及び横向き流体チャネルに印加される電圧を変更して、前記反応ナノチャネルと前記検出ナノチャネルとの間の界面へと前記制限酵素断片を移行させることによって実施され、
分離された前記制限酵素断片の、前記検出ナノチャネルを通した輸送を検出するために、検出ステップが実施され、
前記反応ナノチャネルは、１ｎｍ〜５００ｎｍの幅及び深さを有し、前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きい、
請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記導入、前記断片化、及び前記信号の検出は、定義済みの入力で定常電圧を連続して印加することによって、複数の分子を連続して分析するために実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記信号の検出は、前記検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所において光学的又は電気的に前記制限酵素断片から信号を検出することによって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、検出された信号持続時間又は統合された振幅を分析することによって前記制限酵素断片のサイズを決定するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応ナノチャネルは、第１の反応ナノチャネルであり、
前記システムは、長さ５００μｍ〜１０ｃｍの第２の反応ナノチャネルを備え、
前記第２の反応ナノチャネルは前記第１の反応ナノチャネルの下流に存在し、
前記第２の反応ナノチャネルは、前記第２の反応ナノチャネルと第２の検出ナノチャネルとの間の第２の界面位置において、前記第２の検出ナノチャネルにマージし、
前記第２の界面位置において、前記第２の検出ナノチャネルのサイズは前記第２の反応ナノチャネルに比して縮小する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第１の反応ナノチャネルと流体連通する廃棄物リザーバを更に備え、
前記回路は、前記制限酵素断片を、前記廃棄物リザーバに入るよう、又は前記第２の反応ナノチャネルに入るよう選択的に輸送するように構成されている、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
第２の反応ナノチャネルを更に備える、請求項６に記載のチップであって、
前記第２の反応ナノチャネルは長さ５００μｍ〜１０ｃｍであり、前記第１の反応ナノチャネルと流体連通し、前記第１の反応ナノチャネルの下流において前記第２の横向き流体チャネルの後に存在し、
前記チップは、前記制限酵素断片を前記第１の反応ナノチャネルから、流動的に廃棄物出口経路に入るよう、又は流動的に前記第２の反応ナノチャネルに入るよう選択的に配向する回路と連通する、請求項６に記載のチップ。
【請求項１９】
廃棄物出口経路と、前記第２の横向き流体チャネルの下流に延在する関連付けられた出口チャネルを有する複数の収集リザーバとを更に備え、
前記チップは、前記制限酵素断片を前記第１の反応ナノチャネルから、前記廃棄物出口経路に又は前記収集リザーバのうちの１つに入るよう選択的に配向する回路と連通する、請求項６に記載のチップ。
【請求項２０】
関心対象の領域がリアルタイムで又は略リアルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別するステップ、並びに
前記制限酵素断片を選択的に且つ自動的に第２の反応ナノチャネルに流動的に輸送するステップであって、前記第２の反応ナノチャネルにおいて、前記制限酵素断片は、制限酵素消化又はプローブ結合及び後続の第２の検出ナノチャネルにおける検出を含む二次反応を受ける、ステップ
を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
関心対象の領域がリアルタイムで又は略リアルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別し、後の分析のために関心対象の前記制限酵素断片の一部を自動的且つ選択的に各収集リザーバ内への各出口チャネルに流動的に輸送し、他の前記制限酵素断片を廃棄物出口チャネルに流動的に輸送するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７７８，７４６号の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、上記米国仮特許出願は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。
【０００２】
（連邦政府支援のステートメント）
本発明は、国立衛生研究所によって与えられる助成金番号第ＨＧ００２６４７号の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明はポリ核酸のゲノム特徴決定に関する。
【背景技術】
【０００４】
近年、ラボオンアチップ流体デバイス（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ）にナノスケールの構成要素を組み込むことに対する多大な関心がある。この関心の元は、ミクロンスケールからナノスケールへの移動における幾つかの利点（及び有利に利用され得る相違点）に起因している。これらの相違点は、例えば二層重なり（ｄｏｕｂｌｅ−ｌａｙｅｒ  ｏｖｅｒｌａｐ）（ＤＬＯ）並びに電気浸透及び電荷選択透過性に対するその影響、電場の局所的な増大、より高い表面積対体積率、大きな合成ポリマー及びバイオポリマーに対する閉じ込め効果、並びにエントロピー効果の新しく出現した重要性を含む。例えば：ユアン（Ｙｕａｎ）ら著、電気泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ）、２００７年、２８、５９５−６１０；ショッチ（Ｓｃｈｏｃｈ）ら著、レビューズ  オブ  モダン  フィジックス（Ｒｅｖ．  Ｍｏｄ．  Ｐｈｙｓ．）、２００８年、８０、８３９−８８３：及びコバリック（Ｋｏｖａｒｉｋ）ら著、アナリティカル  ケミストリ（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２００９年、８１、７１３３−７１４０を参照されたい。ナノスケールデバイスの歴史的な例は、クロマトグラフ分離における多孔質媒体及び多孔質ゲルの、並びにナノスケール細孔を有する濾過膜の使用を含む。例えば：ラーマン（Ｌｅｒｍａｎ）ら著、バイオポリマー（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、１９８２年、２１、９９５−９９７；及びトング（Ｔｏｎｇ）ら著、ナノ  レターズ（Ｍ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）、２００４年、４、２８３−２８７を参照されたい。しかしながら最近の取り組みは、流体及び分析物の輸送用の幾何学的に明確に定義済みの導管を加工すること、及び上記導管をデバイスに継ぎ目なく統合することに集中している。例えば：ボルクムス（Ｖｏｌｋｍｕｔｈ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９２年、３５８、６００−６０２；及びストリーマー（Ｓｔｒｉｅｍｅｒ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００７年、４４５、７４９−７５３を参照されたい。係る整った構造の利点は、圧力勾配及び場勾配、流体の流れ並びに上記構造内に含まれる分子運動が、より入り組んだネットワークにおけるこれらの特性とは対照的に比較的簡潔になることである。これらのシステムを定義し、特徴決定し、容易にモデル化できることにより、例えば分離メカニズム及び単一分子の物理的特性のよりよい理解を可能とすることができる。例えば：ボルクムス（Ｖｏｌｋｍｕｔｈ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９２年、３５８、６００−６０２；レイスナー（Ｒｅｉｓｎｅｒ）ら著、フィジカル  レビュー  レターズ（Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．）、２００５年、９４、１９６１０１；及びサリーブ‐ブーゲラー（Ｓａｌｉｅｂ−Ｂｅｕｇｅｌａａｒ）ら著、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ）２００９年、９、２５０８−２５２３を参照されたい。
【０００５】
最近では、ナノ流体デバイスを形成する為にＦＩＢ切削技法が説明されている。メナード（Ｍｅｎａｒｄ）ら著「集束イオンビーム加工を用いた、絶縁基板におけるサブ‐５ｎｍのナノチャネルの製作（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂ−５  ｎｍ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｍｉｌｌｉｎｇ）」、ナノレター（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）、２０１１年、１１、５１２−５１７（２０１０年１２月１０日出版）；並びに「ナノチャネルを形成する為の方法、システム及び装置（Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ）」と題する２０１０年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３８４，７３８号（及び関連するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５２１２７号）を参照されたい。これらの文献は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。ＦＩＢ切削技法に加えて、例えば電子ビームリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、フォトリソグラフィ、テンプレート製作又は成形方法、及び当業者によって理解される他の方法を含む、ナノチャネル製作に適した様々な他の方法を使用できる。
【０００６】
単一分子検知及び／又は核酸シークエンシング用の集積小型電極（ナノスケール又はマイクロスケール）を有するデバイスを含む、多数のナノ流体デバイスが提案されている。或いは、完全に流動性の構成要素から成る集積デバイスは、単一分子の輸送及び検出のより大きな制御を提供できる。メナード（Ｍｅｎａｒｄ）ら著「個々の二本鎖ＤＮＡ分子に対して横方向コンダクタンス測定を実行する為のデバイス（Ａ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｆｅｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｌｅｓ）」、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２０１２年、１２、９８０７−９０９４（２０１２年９月５日に出版）；「流体感知ナノチャネルによって横断される流体輸送ナノチャネルを有するデバイス及び関連する方法（Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｆｌｕｉｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｆｌｕｉｄ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題する、２０１１年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５３３，５２３号（及び対応する係属ＰＣＴ／ＵＳ１３／０５４１２８号）；並びに「マクロ分子の制御された取り込み、トラップ及び輸送の為の集積構成要素を有するナノ流体デバイス、並びに関連する分析方法（Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ，  Ｔｒａｐｐｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」と題する、２０１３年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７７０，５８６号を参照されたい。これらの文献は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。単一のモノリシックデバイス上に構成要素をこのように集積することにより、例えばＤＮＡシークエンシング及び医療診断等の分野での現在の分析ニーズに対処する新しい方法及びシステムを可能にすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／３８４，７３８号
【特許文献２】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５２１２７号
【特許文献３】米国仮特許出願第６１／５３３，５２３号
【特許文献４】ＰＣＴ／ＵＳ１３／０５４１２８号
【特許文献５】米国仮特許出願第６１／７７０，５８６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ユアン（Ｙｕａｎ）ら著、電気泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ）、２００７年、２８、５９５−６１０
【非特許文献２】ショッチ（Ｓｃｈｏｃｈ）ら著、レビューズ  オブ  モダン  フィジックス（Ｒｅｖ．  Ｍｏｄ．  Ｐｈｙｓ．）、２００８年、８０、８３９−８８３
【非特許文献３】コバリック（Ｋｏｖａｒｉｋ）ら著、アナリティカル  ケミストリ（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．）、２００９年、８１、７１３３−７１４０
【非特許文献４】ラーマン（Ｌｅｒｍａｎ）ら著、バイオポリマー（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、１９８２年、２１、９９５−９９７
【非特許文献５】トング（Ｔｏｎｇ）ら著、ナノ  レターズ（Ｍ．  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）、２００４年、４、２８３−２８７
【非特許文献６】ボルクムス（Ｖｏｌｋｍｕｔｈ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９２年、３５８、６００−６０２
【非特許文献７】ストリーマー（Ｓｔｒｉｅｍｅｒ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００７年、４４５、７４９−７５３
【非特許文献８】レイスナー（Ｒｅｉｓｎｅｒ）ら著、フィジカル  レビュー  レターズ（Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．）、２００５年、９４、１９６１０１
【非特許文献９】サリーブ‐ブーゲラー（Ｓａｌｉｅｂ−Ｂｅｕｇｅｌａａｒ）ら著、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ）２００９年、９、２５０８−２５２３
【非特許文献１０】メナード（Ｍｅｎａｒｄ）ら著「集束イオンビーム加工を用いた、絶縁基板におけるサブ‐５ｎｍのナノチャネルの製作（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂ−５  ｎｍ  Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｍｉｌｌｉｎｇ）」ナノレター（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）、２０１１年、１１、５１２−５１７（２０１０年１２月１０日出版）
【非特許文献１１】メナード（Ｍｅｎａｒｄ）ら著「個々の二本鎖ＤＮＡ分子に対して横方向コンダクタンス測定を実行する為のデバイス（Ａ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｆｅｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｌｅｓ）」、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）、２０１２年、１２、９８０７−９０９４（２０１２年９月５日に出版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記背景技術の課題を解決するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の実施形態は、染色体ＤＮＡの高スループット制限酵素マッピングを容易にするデバイスを提供するよう構成される。
【００１１】
本発明の実施形態はナノ流体分析システムを含む。上記システムは：（ａ）長さが５００μｍ〜１０ｃｍの反応ナノチャネルであって、上記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルと反応ナノチャネルとの間の界面位置において検出ナノチャネルにマージし、上記界面位置において検出ナノチャネルのサイズは反応ナノチャネルに比して縮小する、反応ナノチャネル；（ｂ）反応ナノチャネルの進入部分と連通するマイクロ流体チャネル；（ｃ）マイクロ流体チャネルと連通する第１の電極；（ｄ）反応ナノチャネルの進入部分から離間しているものの近接している場所において反応ナノチャネルから延在し、且つ反応ナノチャネルと流体連通する、第１の横向き流体チャネル；（ｅ）第１の横向き流体チャネルと連通する第２の電極；（ｆ）第１の横向き流体チャネルの下流において反応ナノチャネルから延在し、且つ反応ナノチャネルと流体連通する、第２の横向き流体チャネル；（ｇ）第２の横向き流体チャネルと連通する第３の電極；（ｈ）検出ナノチャネルと連通する第４の電極；（ｉ）第１の電極、第２の電極、第３の電極及び第４の電極の動作を制御して、断片の不規則化を防止する反応ナノチャネル（例えばＤＮＡは反応ナノチャネルで反応して規則正しい断片を生成する）の内部でＤＮＡを制御自在にスレッディング（ｔｈｒｅａｄ）し、装填し、消化するよう構成される、回路；並びに（ｊ）断片サイズを空間的に且つ時間的に分解することによって、リアルタイムで又は略リアルタイムでの染色体ＤＮＡの規則正しい制限酵素マップを実現できるよう構成される、検出ナノチャネルと連通する電気的な又は光学的な検出器を含む。
【００１２】
マイクロ流体チャネルは、マイクロ流体流路を部分的に塞ぐよう構成される、離間した複数のポストのアレイを含んでよい。
【００１３】
システムは、マイクロ流体チャネルを流体輸送ナノチャネルの進入部分と接続するナノファンネル（ｎａｎｏｆｕｎｎｅｌ）を含んでよい。
【００１４】
ナノ流体反応チャネルは、「Ｕ」字型のセグメントにより接続される、狭い間隔の略平行な複数のセグメントを有する蛇行形状を有してよい。
【００１５】
マイクロ流体チャネル、反応ナノチャネル、検出ナノチャネル、並びに第１及び第２の流体横向きチャネルは、流体チップ上にモノリシックに集積できる。
【００１６】
第１の横向き流体チャネル及び／又は第２の横向き流体チャネルは、深さ約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、幅約２０ｎｍ〜約２０００ｎｍの流体ナノチャネルであってよい。
【００１７】
反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルよりも長さが１０倍〜１０００倍、並びに深さ及び／又は幅が２倍〜１０倍大きくてよい。
【００１８】
マイクロ流体チャネルは、１つ又は複数のリザーバと流体連通してよく、上記リザーバのうちの少なくとも１つはＤＮＡ分析用の細胞全体を含む。
【００１９】
分析用の細胞全体は、ゲノムＤＮＡの抽出用のゲルマトリックスにより抑制され得る。
【００２０】
分析用の細胞全体を、マイクロ流体チャネル内の少なくとも１つの高密度ポストアレイ及び／又は低密度ポストアレイによって抑制することによって、ゲノムＤＮＡの抽出を促進できる。
【００２１】
マイクロ流体進入チャネルはＤＮＡを有する細胞全体を含む。第２の横向き流体チャネルは、反応ナノチャネルから離間した端部において第２の流体リザーバにマージする。第２の流体リザーバは、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の溶液を保持する。
【００２２】
反応ナノチャネルは真っ直ぐとすることができ、また長さ約５００μｍ〜約２ｃｍの長さとすることができる。反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルより、長さが約１０倍〜約１０００倍、並びに深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きくてよい。
【００２３】
システムは第２の反応ナノチャネルを含んでよく、この第２の反応ナノチャネルは、上記第２の反応ナノチャネルの進入端部において流体マイクロチャネルと流体連通し、第２の反応ナノチャネルの対向する放出端部においてそれぞれの第２の検出ナノチャネルにマージする。
【００２４】
他の実施形態はナノ流体分析チップを対象にしている。チップは：（ａ）ポストのアレイを有するマイクロ流体チャネルを用いて、細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースからゲノムＤＮＡを抽出するよう適合される、マイクロ流体入口；（ｂ）マイクロ流体入口に接続する進入部分を有する、長さ５００μｍ〜１０ｃｍの反応ナノチャネル；（ｃ）ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、反応ナノチャネルの放出端部とマージする、検出ナノチャネル；（ｄ）反応ナノチャネルの進入部分から離間しているものの近接している場所において反応ナノチャネルから延在し、且つ反応ナノチャネルと流体連通する、第１の横向きナノチャネル；並びに（ｅ）第１の横向き流体ナノチャネルの下流において反応ナノチャネルから延在し、且つ反応ナノチャネルと流体連通する、第２の横向き流体ナノチャネルを含む。
【００２５】
また、チップは、反応ナノチャネルとマイクロ流体入口との間に存在し、反応ナノチャネルをマイクロ流体入口と接続する、ナノファンネルも含んでよい。
【００２６】
チップは複数のリザーバを含んでよく、上記複数のリザーバは、マイクロ流体入口と流体連通する少なくとも１つのリザーバ、第１の横向きナノチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバ、第２の横向きナノチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバ、及び検出ナノチャネルの端部と流体連通する少なくとも１つのリザーバを含むリザーバ。
【００２７】
マイクロ流体チャネル内のポストのアレイは、軸に沿って離間しているアレイの複数のセグメントを含むことができる。
【００２８】
ポストのアレイは、マイクロ流体チャネルの略全幅を横切って延在するよう構成できる。
【００２９】
更に他の実施形態は、細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースから抽出されるゲノムＤＮＡの規則正しい制限酵素マップを生成する方法を対象とする。方法は：（ａ）反応ナノチャネルにマージする流体マイクロチャネルを有するデバイスを提供するステップであって、上記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルに、ナノチャネル直径のサイズが減少する界面においてマージする、ステップ；（ｂ）細胞全体を溶解させ、マイクロチャネル内での最小の断片化によってＤＮＡを染色質除去するステップ；次いで（ｃ）反応ナノチャネルにＤＮＡの無傷分子を導入するステップ；次いで（ｄ）制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して反応ナノチャネル内で上記無傷ＤＮＡを断片化するステップを含む。反応ナノチャネルは、断片が検出ナノチャネルの中に注入されるまで元の順序のままとなるようにサイズ設定及び構成される。方法は、（ｅ）検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所で信号を検出して、長鎖ＤＮＡ分子に沿って断片が発生する順序で断片をマッピングするステップを更に含む。
【００３０】
デバイスは、反応ナノチャネルにマージする流体マイクロチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバを含んでよい。上記導入するステップは、細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースを、リザーバを使用する分析の為に導入することによって実施できる。また、方法は：細胞全体を不動化する為のゲルマトリックス及び／又は高密度ポストアレイを提供するステップ；次いで細胞を溶解するステップ；ＤＮＡを抽出するステップ；任意選択でＤＮＡを染色するステップと；次いでＤＮＡの無傷分子を反応ナノチャネルの中に導入するステップを含むことができる。
【００３１】
デバイスは、反応ナノチャネルの進入端部と流体連通するポストのアレイを有するマイクロ流体チャネル、及びマイクロ流体チャネルの下流で反応チャネルと流体連通する第１の横向きチャネルを含んでよい。
【００３２】
方法は、マイクロ流体チャネル及び横向きチャネルに電圧を印加して、反応ナノチャネルの進入領域でバイアスを生成することによって試料をスレッディングし、装填するステップを含む場合がある。
【００３３】
スレッディングステップは、反応チャネルの入口の近傍において、制御された電圧勾配又は濃度分極勾配を使用して実施でき、これによりＤＮＡ分子は初め、ＤＮＡ引張り強さを超える歪みに曝されず、機械的に破損しない。
【００３４】
スレッディングステップの後、装填は、反応ナノチャネル及び横向きナノチャネルに印加される電圧を変更して、毎秒約１μｍ〜毎秒約１ｍｍの速度で反応ナノチャネルの中に完全なＤＮＡ分子を引き入れることによって実施でき、これによりＤＮＡ分子の終端はいずれのポストの絡み合いから拡散して係合解除するのに十分な時間を有し、機械的な破損は回避される。
【００３５】
制限酵素消化の反応は、反応ナノチャネル及び横向きナノチャネルに印加される電圧を変更して、反応ナノチャネル内に含まれるＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を導入することによって実施でき、次いで反応を、全ての制限酵素部位が消化されるまで進行させることができる。
【００３６】
反応ナノチャネル及び横向きナノチャネルに印加される電圧は、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子のマイクロ流体チャネルへの導入を阻止又は防止でき、従って反応ナノチャネル外部のＤＮＡ分子の消化を防止できる。
【００３７】
規則正しい制限酵素断片の検出は、反応ナノチャネル及び横向きナノチャネルに印加される電圧を変更して、反応ナノチャネルと検出ナノチャネルとの間の界面へと断片を移行させることによって実施できる。
【００３８】
幾つかの実施形態では、スレッディング、装填、制限酵素消化、及び制限酵素断片サイズの規則正しい検出は、連続して印加される定常電圧を使用して実現できる。
【００３９】
検出ナノチャネル直径は、反応ナノチャネルから５０％〜９９％だけサイズを減少させることができ、これにより、各断片が交点に到達する際の輸送速度の上昇、及び各隣接する断片の分離が得られる。次いで、分離された断片の、検出ナノチャネルを通した輸送を検出する為に、検出ステップを実施できる。
【００４０】
検出ステップは、検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所において光学的又は電気的に断片を検出することによって実施できる。
【００４１】
方法は、検出された信号持続時間又は統合された振幅を分析することによって断片サイズを決定するステップを含むことができる。
【００４２】
デバイスは流体分析チップとすることができる。
【００４３】
チップは、チップと連通する輸送システムと組み合わせて使用することができ、輸送システムは界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも１つを印加することによって、ゲノムＤＮＡ及びその断片の検出ナノチャネルの中への反応ナノチャネルを通した輸送を引き起こすよう構成される。
【００４４】
更に他の実施形態は、流体分析チップとインタフェース接続する為の方法を対象にする。方法は：（ａ）試料導入、細胞溶解、並びにＤＮＡ抽出及び染色を制御するステップ；（ｂ）ＤＮＡスレッディング及び抽出されたＤＮＡの反応ナノチャネルへの装填、反応ナノチャネル内での制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を用いた制限酵素消化、並びに検出ナノチャネルを通した制限酵素断片の規則正しい輸送；（ｃ）検出ナノチャネルを通した輸送中に制限酵素断片を電気的に検出するステップ；（ｄ）リアルタイム又は略リアルタイムの分析を使用してＤＮＡ分子からの制限酵素断片サイズを電気的に分析するステップと；並びに（ｅ）複数のＤＮＡ分子から共通制限酵素マップを電気的に生成し、マップの質を評価して、追加のサンプリングの必要を評価するステップを含む。
【００４５】
本発明の更に他の態様は、流体分析チップとインタフェース接続する為のシステムを対象とする。システムは：（ａ）試料導入、細胞溶解、並びにＤＮＡ抽出及び染色を制御する為の手段；（ｂ）ＤＮＡスレッディング及び反応ナノチャネルへの装填、反応ナノチャネル内での制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の制限酵素消化、並びに検出ナノチャネルを通した制限酵素断片の規則正しい輸送を制御する為の手段；（ｃ）検出ナノチャネルを通した輸送中に制限酵素断片を検出する為の手段；（ｄ）リアルタイムの又は略リアルタイムの分析を使用してＤＮＡ分子から制限酵素断片サイズを分析する為の手段；並びに（ｅ）複数のＤＮＡ分子から共通制限酵素マップを生成し、マップの質を評価して追加のサンプリングの必要性を評価する為の手段を含む。
【００４６】
更に他の実施形態は、流体分析デバイスを対象とする。デバイスは：反応ナノチャネルにマージする流路を有するマイクロ流体チャネル；反応ナノチャネルの上流においてマイクロ流体チャネルと流体連通するＤＮＡリザーバ；反応ナノチャネルの入口の近傍に存在する、反応ナノチャネルと流体連通するスレッディングリザーバ；反応ナノチャネルよりも小さい直径並びに／又は小さい幅及び深さを有する反応ナノチャネルの放出端部に接続される検出ナノチャネル；並びに検出ナノチャネルの近傍に存在する、反応ナノチャネルと流体連通する、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を含むリザーバを含む。
【００４７】
デバイスは第２の反応ナノチャネルを任意選択で含んでよく、上記第２の反応ナノチャネルは長さ約５００μｍ〜１０ｃｍであり、第１の反応ナノチャネルと流体連通し、第１の反応ナノチャネルの下流において第２の横向き流体ナノチャネルの後に存在する。チップは、制限酵素断片を第１の反応ナノチャネルから、流動的に廃棄物出口経路に入るよう、又は流動的に第２の反応ナノチャネルに入るよう選択的に配向する回路と連通してよい。
【００４８】
チップは、廃棄物出口経路と、第２の横向き流体ナノチャネルの下流に延在する関連付けられた出口チャネルを有する複数の収集リザーバとを含んでよい。チップは、リザーバ制限酵素断片を第１の反応ナノチャネルから、廃棄物出口経路に又は収集リザーバのうちの１つに入るよう選択的に配向する回路と連通してよい。
【００４９】
チップは第２の反応ナノチャネルを含むことができ、上記第２の反応ナノチャネルは長さ５５０μｍ〜１０ｃｍであり、第１の反応ナノチャネルと流体連通し、第１の反応ナノチャネルの下流において第２の横向き流体ナノチャネルの後に存在する。チップは、制限酵素断片を第１の反応ナノチャネルから、流動的に廃棄物出口通路に入るよう、又は流動的に第２の反応ナノチャネルに入るよう選択的に配向する回路と連通できる。
【００５０】
チップは、廃棄物出口経路と、第２の横向き流体ナノチャネルの下流に延在する関連付けられた出口チャネルを有する複数の収集リザーバとを含むことができる。チップは、リザーバ制限酵素断片を第１の反応ナノチャネルから、廃棄物出口経路に又は収集リザーバのうちの１つに入るよう選択的に配向する回路と連通できる。
【００５１】
方法は、関心対象の領域がリアルタイムで又は略リルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別し、関心対象の領域がマッピングされているものとして検出された場合に、制限酵素断片を選択的に且つ自動的に第２のナノ反応チャネルに流動的に輸送するステップを含んでよい。
【００５２】
方法は、関心対象の領域がリアルタイムで又は略リアルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別し、後の分析の為に関心対象の制限酵素断片を自動的且つ選択的に各収集リザーバ内への各出口チャネルに流動的に輸送し、他の制限酵素断片を廃棄物出口チャネルに流動的に輸送するステップを含んでよい。
【００５３】
一実施形態に関して説明される本発明の態様は、それに関して具体的に説明されていなくても、異なる実施形態に組み込んでよいことに留意されたい。即ち、全ての実施形態及び／又はいずれ実施形態の特徴は、任意の方法で及び／又は任意の組み合わせで結合できる。出願人は、最初に出願された請求項を変更する及び／又はいずれの新規請求項を出願する権利を留保し、上記権利は、最初に出願されたいずれの請求項を、最初にそのように請求されていなくても、任意の他の１つ又は複数の請求項の任意の特徴に従属する及び／又は上記任意の特徴を援用するよう補正できる権利を含む。本発明のこれらの及び他の目的及び／又は態様は、以下に記載される明細書において詳細に説明される。本発明の追加の特徴、利点及び詳細は、以下に続く好ましい実施形態の図及び詳細な説明を読むことから当業者によって理解され、係る説明は本発明の単なる例示である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】本発明の実施形態による流体分析デバイスの概略図である。
【図１Ｂ】本発明の実施形態に従って図１Ａに示すデバイスにカバープレートを結合できることを示す図である。
【図１Ｃ】本発明の幾つかの実施形態に従って図１Ｂに示すデバイスにリザーバを取り付けることができることを示す図である。
【図２Ａ】乃至
【図２Ｄ】本発明の実施形態によるＤＮＡ抽出のオンチッププロセスを示す図である。
【図３Ａ】乃至
【図３Ｃ】本発明の実施形態による細胞全体の取り込み、染色質除去されたＤＮＡの溶解及び染色を示す、装置のマイクロ流体部分の概略拡大図である。
【図４Ａ】本発明の実施形態による、ナノ流体反応チャネルに繋がる試料入口の例示的なパターンを有する流体分析デバイスの概略図である。
【図４Ｂ】本発明の幾つかの実施形態による、それを通して試料ＤＮＡ分子が導入される共通マイクロチャネルと流体連通する、複数の反応ナノチャネル及びそれぞれの検出ナノチャネルを有する流体分析デバイスの概略図である。
【図５】本発明の実施形態による、マイクロ流体チャネルとナノ流体反応チャネルとの間の界面の大幅に拡大された「正確な縮尺の」図である。
【図６Ａ】乃至
【図６Ｄ】本発明の実施形態による、例示的な電圧及び操作シーケンスを有する流体分析デバイスの概略図である。
【図６Ｅ】本発明の実施形態による、（図６Ｄの一点回路ではなく）多点検出回路を有する検出ナノチャネルの拡大図である。
【図６Ｆ】本発明の代替実施形態による、電圧駆動システムの代わりに圧力輸送システムを利用する、図６Ａ〜図６Ｅに示すデバイスに類似する分析デバイスの概略図である。
【図６Ｇ】図６Ａ〜図６Ｆに示すデバイスに類似する分析デバイスの概略図であり、本発明の実施形態によるいずれの適切な駆動（「Ｄ」）輸送システム又は駆動輸送システムの組み合わせの使用を概略的に示す。
【図７Ａ】乃至
【図７Ｄ】図６Ａ〜図６Ｄに類似する例示的な電圧及び操作シーケンスを有するものの、本発明の実施形態による代替検出回路を有する、流体分析デバイスの概略図である。
【図７Ｅ】本発明の実施形態による、（図７Ｄの一点回路ではなく）多点検出回路を有する検出ナノチャネルの拡大図である。
【図８】ＦＩＢ切削を使用して製作されるプロトタイプ流体デバイスの画像であり、流体構造を示す（拡大インサートは、本発明の実施形態による反応ナノチャネルと検出ナノチャネルとの間の交点である）。
【図９Ａ】本発明の実施形態による、反応ナノチャネルとＭｇ２＋を導入する為のナノチャネルとの交点の明視野の光学像である。
【図９Ｂ】本発明の実施形態による、Ｍｇ２＋イオンの電圧ゲート式導入時のマグネシウムグリーン（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）蛍光の増加を示す図９Ａに示すデバイスの領域の差異画像である。
【図９Ｃ】本発明の実施形態による、開ゲート電圧が印加されたものの側部ナノチャネルにＭｇ２＋が存在しなかった場合のＭａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ蛍光の最小変化を示す、図９Ａに示すデバイスの領域の異なる画像である。
【図１０Ａ】反応ナノチャネル内でのλ‐ＤＮＡの拡散を示す一連の蛍光画像の図である。
【図１０Ｂ】Ｍｇ２＋の存在下の制限エンドヌクレアーゼによる約１．５分の消化後に３つの断片が観察可能であることを示す一連の蛍光画像である。断片の順序は、断片の高い拡散性にも関わらず保持された。
【図１１】４００ｎｍＸ４００ｎｍの反応ナノチャネル内で断片化され、２００ｎｍＸ２００ｎｍの検出チャネルの中に注入され、断片が輸送中に空間的に十分に分解される、蛍光染色されたＴ４−ファージＤＮＡ分子を示す一連のフレーム（下部の２つの拡大されたフレームｃ及びｄ）の画像である。中央差込図は、反応ナノチャネルセグメントと検出ナノチャネルセグメントとの間の界面のＳＥＭ画像を示す。矢印は時間を示す。
【図１２】本発明の実施形態による、染色体ＤＮＡの制限酵素マッピング用のシステムの概略図である。
【図１３Ａ】反応ナノチャネルの中にスレッディングするＤＮＡの光学的な検出の概略図である。
【図１３Ｂ】反応ナノチャネルの中にスレッディングするＤＮＡの電気的な検出の概略図である。
【図１３Ｃ】スレッディング検出回路及び断片検出回路によって開始されるトリガによる、ＤＮＡ分子のスレッディング、装填、反応及び検出の為の代表的な電圧プログラムを示す図である。
【図１３Ｄ】輸送駆動入力（例えば電圧及び／又は圧力等の力）が一定である連続動作モードを示す図である。
【図１４】本発明の実施形態による、ＤＮＡ断片をマッピングする為に実施できる例示的な操作のフローチャートである。
【図１５】、
【図１６】、
【図１８】、及び
【図１９】本発明の実施形態による、直列に配設された複数の反応ナノチャネルを有するデバイスの概略図である。
【図１７】本発明の実施形態による、例えば図１５、図１６、図１８及び図１９に示すデバイスを使用して断片上で実施できる（典型的には選択的な）追加処理のフローチャートである。
【図２０】本発明の実施形態による追加の後続の処理の為の制限酵素断片の選択的な収集のフローチャートである。
【図２１】本発明の実施形態による図２０に示す方法を実施する為に使用できるデバイスの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
これより、本発明の実施形態を示す添付の図面を参照して、本発明をより完全に説明する。但し、本発明は多くの異なる形式で具現化されてよく、本明細書に明記される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。全体を通して、同様の番号は同様の要素を指す。図面において、特定の層、構成要素又は特徴は明確化の為に誇張されることがあり、破線は、そうでないことが明記されていない限り、任意選択の特徴又は操作を示す。更に、操作（又はステップ）のシーケンスは、そうでないことが具体的に指示されない限り、図面及び／又は特許請求の範囲に提示される順序に限定されない。図面において、線、層、特徴、構成要素及び／又は領域の厚さは明確化の為に誇張されることがあり、破線は、そうでないことが明記されていない限り、任意選択の特徴又は操作を示す。
【００５６】
本出願で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図したものではない。本出願で使用される、単数形「ある（ａ、ａｎ）」、及び「上記（ｔｈｅ）」は、文脈上明確に他の意味を示している場合を除いて、複数形も含むことを意図している。更に、本明細書中で使用される場合、用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び／又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、述べられている特徴、領域、ステップ、操作、要素及び／又は構成要素の存在を明示する一方で、１つ又は複数の他の特徴、領域、ステップ、操作、要素、構成要素及び／又はこれらの群の存在又は追加を除外しない。本出願で使用される用語「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」は、関連する列挙された用語のうちの１つ又は複数の、いずれの及び全ての組み合わせを含む。本出願で使用される「Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」及び「約Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」等の表現は、Ｘ及びＹを含むと解釈されるものとする。本出願で使用される「約Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  Ｙ）」等の表現は、「約Ｘ〜約Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ａｎｄ  ａｂｏｕｔＹ）」を意味する。本出願で使用される「約ＸからＹ（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  Ｙ）」等の表現は「約Ｘから約Ｙ（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  Ｘ  ｔｏ  ａｂｏｕｔ  Ｙ）」を意味する。
【００５７】
層、領域又は基板等の特徴が別の特徴又は要素「の上に（ｏｎ）」あると言及される場合、上記特徴は、上記別の特徴若しくは要素の上に直接的にあることができる、又は介在する特徴及び／若しくは要素も存在してよいものと理解されることになる。対照的に、要素が別の特徴又は要素「の上に直接的に（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｏｎ）」あると言及される場合、介在する要素は存在しない。特徴又は要素が別の特徴又は要素に「接続（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「取り付け（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、又は「結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）」されていると言及される場合、上記特徴又は要素は、上記別の要素に直接的に接続する、取り付ける若しくは結合することができる、又は介在する要素が存在してよいものと理解されることになる。対照的に、特徴又は要素が別の要素に「直接的に接続（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」されている、「直接的に取り付けられ（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）」ている、又は「直接的に結合（ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ）」されていると言及される場合、介在する要素は存在しない。このように説明又は図示される特徴は、一実施形態に関して説明又は図示されている場合であっても、他の実施形態に適用できる。
【００５８】
（技術用語及び科学用語を含む）本出願で使用される全ての用語は、それ以外の定義がされない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。一般的に使用される辞書に定義される用語等の用語は、本出願及び関連技術の文脈におけるこれら用語の意味と矛盾しない意味を有するものとして解釈されるべきであり、本出願において明示的に定義されない限り、理想化された又は過度に形式的な意味に解釈されるべきではないことも更に理解される。周知の機能又は構造は、簡略化及び／又は明確化の為に詳細に説明されないことがある。
【００５９】
「下に（ｕｎｄｅｒ）」、「下側に（ｂｅｌｏｗ）」、「下部（ｌｏｗｅｒ）」、「上に（ｏｖｅｒ）」、「上部（ｕｐｐｅｒ）」等の空間に関する相対的な用語は、説明を容易にする為に、ある要素又は特徴の１つ若しくは複数の別の要素又は１つ若しくは複数の別の特徴に対する、図示されている通りの関係性を説明する為に本明細書で使用され得る。空間に関する相対的な用語は、図示されている配向に加えて、使用中又は動作中のデバイスの異なる複数の配向を包含することを意図していることを理解されたい。例えば、図中のデバイスを反転させると、他の要素又は特徴の「下に」又は「下方に（ｂｅｎｅａｔｈ）」として説明される要素は、上記別の要素又は特徴の「上に（ｏｖｅｒ）」配向されることになる。従って、例示的な用語「下に」は、上及び下の両方の配向を包含し得る。デバイスはそれ以外に配向されてよく（９０度又は他の配向に回転されてよく）、本出願で使用される空間に関する相対的な説明はこれに従って解釈されてよい。同様に、用語「上向きに（ｕｐｗａｒｄｌｙ）」、「下向きに（ｄｏｗｎｗａｒｄｌｙ）」、「垂直な（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」、「水平な（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」等は、文脈上明確に他の意味を示す場合を除いて、説明のみを目的として本出願で使用される。
【００６０】
用語「第１の（ｆｉｒｓｔ）」、「第２の（ｓｅｃｏｎｄ）」等は、様々な要素、構成要素、領域、層及び／又はセクションを説明する為に本出願において使用され得るが、これらの要素、構成要素、領域、層及び／又はセクションはこれらの用語によって制限されるべきではないことを理解されたい。これらの用語は、ある要素、構成要素、領域、層又はセクションを、別の領域、層又はセクションから区別する為に使用されるにすぎない。従って、以下に説明される第１の要素、第１の構成要素、第１の領域、第１の層又は第１のセクションを、本発明の教示から逸脱することなく、第２の用語、第２の構成要素、第２の領域、第２の層又は第２のセクションと呼ぶこともできる。
【００６１】
用語「ナノチャネル（ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ）」は、ナノメートルスケールである限界寸法を有するチャネル又はトレンチを指す。ナノチャネルは、側壁及び床面を有する。ナノチャネルは、開放された上面及び閉鎖された下面を有し、側壁が上面と下面との間に延在するように、固体基板上に形成できる。カバーを用いて、１つ又は複数のナノチャネルの上部表面を密封する、又はそれ以外の様式で閉鎖してよい。用語「一次寸法（ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）」は、幅及び／又は深さ寸法を指す。流体輸送ナノチャネルの一次寸法は、約１ｎｍ〜約５００ｎｍであってよい。異なるナノチャネルは異なる一次寸法を有してよい。反応ナノチャネルの一次（「限界（ｃｒｉｔｉｃａｌ）」としても知られる）寸法は、約３００〜４００ｎｍであってよく、反応ナノチャネルは約１０ｎｍ〜約３００ｎｍであってよい。
【００６２】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、＋／−１０％等、＋／−２０％以下で変動し得るパラメータを指す。
【００６３】
用語「横向き（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ）」ナノチャネルは、それぞれの流体輸送ナノチャネルを横断する流体ナノチャネルを指す。
【００６４】
用語「流体輸送ナノチャネル（ｆｌｕｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ）」は、分析物が分析の為にそれを通って流れるナノチャネルを指す。特定の実施形態では、流体輸送ナノチャネルは２つの一次セグメント、つまり反応ナノチャネル及び検出ナノチャネルを有することができる。分析物は例えば、合成高分子及び生体高分子を含む単一分析物分子、ナノ粒子、小分子、ＤＮＡ、核酸／ポリ核酸、ペプチド、蛋白質等を含む、いずれの関心対象の分析物とすることができる。ナノチャネルを通る輸送は、界面動電、濃度分極及び／又は油圧（強制圧力若しくは圧力勾配）を使用して実施できる。
【００６５】
用語「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」は、流体輸送ナノチャネル又は反応チャネルの進入部分により近い相対的な位置を示す。用語「下流」は流体輸送ナノチャネル又は反応チャネルの放出部分により近い相対的な位置を示す。
【００６６】
用語「浅い（ｓｈａｌｌｏｗ）」は、輸送ナノチャネルよりも小さい深さを有し、分析物マクロ分子の流体力学的サイズよりも小さい、ナノチャネル深さを指す。反応ナノチャネルの深さに関して、浅いナノチャネルは典型的には、例えば２〜１００Ｘ等、少なくとも２倍小さい深さを有する。従って例えば、浅いナノチャネルセグメントは、１０ｎｍ以下、通常約０．１ｎｍ〜９ｎｍであってよい。一方、輸送ナノチャネルは、例えば２０〜１００ｎｍ等、２０ｎｍ以上の（少なくとも浅いセグメントに隣接する）深さを有してよい。
【００６７】
反応ナノチャネル２０に関する用語「長い（ｌｏｎｇ）」は、反応ナノチャネルが検出ナノチャネル４０よりも長さが１０倍〜１０００倍長いことを意味する。反応ナノチャネル２０は、長さが検出ナノチャネル４０よりも長く、深さ及び／又は幅が検出ナノチャネル４０よりも２倍〜１０倍大きくてよい。幾つかの実施形態では、反応ナノチャネル２０は約５００μｍ〜１０ｃｍの長さを有してよい。
【００６８】
用語「幅広い（ｗｉｄｅ）」は、ナノチャネルが、分析を実行する（例えば、駆動電圧を提供する）為にこのナノチャネルが協働する輸送ナノチャネルの幅の少なくとも２Ｘ（２倍、「Ｘ」は「乗数」又は「掛ける」を意味する）、より典型的には上記隣接した協働する反応ナノチャネルの幅の、例えば３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、約１０Ｘ、約２０Ｘ、約４０Ｘ、約５０Ｘ、約６０Ｘ、約７０Ｘ、約８０Ｘ、約９０Ｘ又は約１００Ｘ等、３Ｘ〜１００Ｘである幅を有することを意味する。
【００６９】
用語「回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）」は、全体がハードウェアの実施形態、又はソフトウェア及びハードウェアを組み合わせた実施形態を指す。
【００７０】
ポストに関する用語「高密度（ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ）」は、アレイがマイクロチャネルの全幅に亘って延在し、ポストが縁部間の間隔約１０μｍ未満で配設されることを意味する。用語「低密度（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ）」は、ポストが、典型的には約５０μｍ超の縁部間の間隔で配列されることを意味する。
【００７１】
用語「低速度（ｌｏｗ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）」は、マクロ分子が約１μｍ／秒〜約１ｍｍ／秒の速度でナノチャネルを通って移動することを意味する。
【００７２】
用語「大幅に異なる電界強度（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」は、流体輸送ナノチャネルの片側が、同じチャネルの第２のセグメントよりも１０Ｘ〜１０００Ｘ、典型的には１００Ｘ〜２００Ｘ大きい又は小さい電圧／ｃｍ電界強度を有してよいことを意味する。
【００７３】
用語「スレッド（ｔｈｒｅａｄ）」及びその派生語は、初めに分析物分子を反応ナノチャネル２０に導入し、マイクロチャネル又はリザーバ内で実現される無作為のコイル型立体構造からのマクロ分子の線形化を提供するプロセスを意味する。用語「装填（ｌｏａｄ）」は、反応ナノチャネル２０への１つ又は複数の出入口にアクセスするマイクロチャネル又はリザーバ内に存在する分析物分子が、その全体として、及び線形のスレッド後の構成で反応ナノチャネルに無事に導入されることを意味する。
【００７４】
用語「反応する（ｒｅａｃｔ）」及びその派生語は、ＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼ及び任意選択の補因子を使用して断片化されることを意味する。従って、例えば反応ナノチャネル内部でのＤＮＡの制限酵素消化により、断片の不規則化が防止される（例えばＤＮＡは反応ナノチャネル内で反応して規則正しい断片を生成する）。例えば、Ｍｇ２＋は、本発明の実施形態に特に好適であり得る制限エンドヌクレアーゼのタイプＩＩクラスの補因子である。補因子が帯電しているという事実により、第２の横向きチャネル３２の電圧ゲート制御を支援できる。利用可能な制限エンドヌクレアーゼの大多数はタイプＩＩである。他のタイプ（タイプＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）も好適であり得、同様に制御し得る異なる補因子（ＡＴＰ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）を有してよい。従って、本発明の実施形態は、Ｍｇ２＋補因子を有するタイプＩＩが好ましいもののこれに制限されない。
【００７５】
用語「サイズ（ｓｉｚｅ）」は、断片が検出ナノチャネルの中に引き入れられ、電気信号又は光学信号の持続時間又は振幅を検出することによって断片のサイズを決定する為に、隣接する断片からの分離が生成されることを意味する。
【００７６】
用語「染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ）」は、染色体全体のＤＮＡ又はＤＮＡの断片の補体を意味する。
【００７７】
本発明の実施形態は、ナノ流体デバイスにおけるＤＮＡのゲノムマッピングを対象とする。
【００７８】
図１Ａ〜図１Ｃは例示的なナノ流体分析デバイス１０を示す。本実施形態では、デバイス１０は、マイクロチャネル１５並びにナノチャネル２０、３０、３２及び４０のパターンを有するチップであってよい。図１Ｂは、チャネルのパターンを有する基板１２に取り付けることができる（典型的には接着できる）カバー１１を示す。図１Ｃは、リザーバ５０又は「Ｒ」をデバイス１０に取り付けることができることを示す。図示したように、デバイス１０は、（長い）反応ナノチャネル２０の進入端部に接続するマイクロ流体チャネル１５を含む。検出ナノチャネル４０は、反応チャネル２０と一列になっている必要はなく、反応ナノチャネルから離れるように角度を有するか、又はそれ以外の様式で反応ナノチャネルから延在してよい。反応チャネル２０の他端は、例えばナノチャネルの幅／深さ及び／又は直径等のサイズの縮小によって定義される界面Ｉにおいて、検出ナノチャネル４０にマージする。第１の横向きチャネル３０は、典型的には（使用される場合）ナノファンネル及び／又は反応ナノチャネル１５ｅの進入部分の下流約１０〜５００μｍの範囲内で、反応ナノチャネルの進入端部に近接して、反応ナノチャネル２０から離れるように延在する。
【００７９】
第２の横向きチャネル３２は、第１の横向きチャネル３０の下流において及び界面Ｉの前において、反応ナノチャネル２０から離れるように延在する。
【００８０】
幾つかの実施形態では、幾つかのナノ流体構成要素のモノリシック統合が、ナノ流体デバイス１０を使用して細胞全体から抽出されるＤＮＡのゲノムレベルマップの高速作成につながる。
【００８１】
概説すると、細胞全体の懸濁液を、デバイス１０上のマイクロ流体入力（リザーバ５０のうちの１つ又は複数）に導入できる。細胞は溶解され、ＤＮＡは染色質除去され、幾つかの実施形態では蛍光染色される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ抽出要素及び／又は反応ナノチャネルの下流に位置するマイクロ流体要素又はナノ流体要素を使用して、制限酵素消化の前の無傷ＤＮＡに又は制限酵素消化後の規則正しい断片に蛍光染色液を導入できる。続いて染色体ＤＮＡを長い反応ナノチャネル２０に導入し、この反応ナノチャネル２０は分子を拡張し、後続ののステップで生成される断片の拡散混合を防止する。その後、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の溶液を反応ナノチャネル２０に導入して、配列特異的制限酵素部位におけるＤＮＡの消化を引き起こす。次に、反応ナノチャネル２０に含まれる規則正しい断片を、反応ナノチャネル２０が検出ナノチャネル４０とインタフェース接続する界面Ｉに輸送することによって、これらの断片の長さを分析する。輸送を駆動する力（例えば、静電力、圧力又は求心的）は、反応ナノチャネル２０においてよりも検出ナノチャネル４０において大きく、各断片が交点に到達する際の輸送速度の上昇、及び隣接する断片からの各断片の分離を引き起こす。空間的に且つ時間的に分解される断片は、撮像又は一点若しくは多点検出（電気的又は光学的）を使用して、検出ナノチャネル４０内で下流で検出され、得られた信号を分析して断片サイズを決定する。このようにして、染色ＤＮＡの規則正しい制限酵素マップをリアルタイムで又は略リアルタイムで作成できる。用語「略リアルタイム（ｎｅａｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ）」は、動作システムの帯域幅又は他の分析関係の計算若しくは遅延時間の為、リアルタイムから約１分以内である時間内を意味する。
【００８２】
本明細書に記載の幾つかの実施形態では、デバイス動作は、多様な流体入口で印加される電圧を使用して主に静電的に制御されるが、当業者には理解されるように、他の力（例えば圧力又は求心力）も使用できる。
【００８３】
デバイスの製作
流体デバイスは、シリコン、ガラス（シリカ）、石英、プラスチック、熱可塑性物質及びエラストマ、又はこれらの組み合わせを含む様々な基板内で製作できる。図１Ａ〜図１Ｃは、例示的なデバイス製作作業フローを示す。ＤＮＡの抽出を容易にし、デバイスのナノ流体要素に界面を提供する、より大きい／より幅広い／より太い線で示されるマイクロ流体構成要素２５は、フォトリソグラフィ及びウェットエッチング若しくはドライエッチング、成形、エンボス加工、又は機械加工等の確立された方法を使用してパターン化できる。ナノ流体要素２０、３０、３２、４０は、エッチング、集束イオンビーム加工、電子ビーム加工、成形又はエンボス加工が後に続くフォトリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ又はナノインプリントリソグラフィを含む様々な方法を使用して製作できる。流体要素が基板１２の上面に製作したら、カバープレート１１を基板に取り付ける、典型的には接着することにより、例えば融着、陽極接合、又は下部基板とカバープレートとの間の接着膜との接合を使用して、封入された流体ネットワークを形成できる。マイクロチャネルは、底部の基板及び／又は上部のカバープレートを通過するビアを通ってアクセスできる。リザーバビア５０ｖを覆うようにリザーバ５０をデバイスに固着することにより、液体処理を促進できる。電極５０ｅは、全ての又は選択されたリザーバ５０の中に挿入できる。リザーバ５０はビア５０ｖを有する。電極５０ｅは、様々な流体要素に電圧を印加する。送気管又は真空ラインはリザーバ又はビアに結合して、正の圧力又は真空を流体要素に印加し、圧力駆動の流体の流れを駆動できる。
【００８４】
ＤＮＡ抽出
細胞の流体デバイスへの導入の又はナノメートル若しくはマイクロメートルのスケールで製作された構造のネットワークの中での細胞の取り込みの前又は間の、ゲル化媒体中での細胞のカプセル化により、断片化が殆ど又は全く行われていない細胞からの染色体ＤＮＡの抽出が可能となる。例として、細胞の操作の為の低融点アガロースゲルの使用を図２Ａ〜図２Ｄに示す。低融点アガロース中の細胞をマイクロ流体リザーバに導入し（図２Ａ）、続いて、アガロースがまだ溶解状態である間に、チャネル出口から引き出すシリンジポンプを使用して入口マイクロ流体チャネルの中に引き入れる（図２Ｂ）。アガロースはゲル化し、後続のの処理の間にＤＮＡをカプセル化し、保護できる。溶液を導入することにより、（微生物及び植物細胞の為の）細胞壁を消化し、次いでプロテイナーゼＫ等の作用物質を組み込んだ洗浄液を使用して細胞を化学的に溶解して、天然ヌクレアーゼ活性を阻止する（図２Ｃ）。ゲルをバッファで完全に濯ぎ、その後にはインタカレート染料の溶液が続く。これらのタスクをチップ上に組み込むことにより、流量の正確な制御を可能にし、そうでなければＤＮＡ剪断の一因となる可能性がある乱流を排除する。ゲルは、デバイスを加熱することによって溶解され（酵素アガラーゼを添加することによってゲルを更に破壊してよい）、染色質除去されたＤＮＡがマトリックスから電気泳動的に抽出される（図２Ｄ）。帯電していないアガロースは、電気浸透流によってデバイスのナノ流体領域から排除される。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡが別個の入口マイクロチャネル（不図示）を通ってナノ流体チャネルに遭遇する前にＤＮＡに添加できる。
【００８５】
ここに示すアガロースカプセル化の代替の方式は：圧力駆動流れを使用しデバイスに導入される細胞をトラップする為に微細加工された高密度ポストアレイ１６を使用すること；細胞を溶解すること；次いでポストアレイの中での絡み合いによってＤＮＡを取り込むことを含む（図３Ａ〜図３Ｃ）。図３Ａは、細胞全体の取り込みを示す。図３Ｂは、低流量及び／又は試薬の拡散混合を使用する、細胞の溶解及び染色質除去されたＤＮＡデバイスの染色を示す。図３Ｃは、印加電圧を使用するポストアレイ１６からＤＮＡの抽出を示す。ポスト１６は円形であってよく、又は典型的には鋭利な端縁を有しない他の幾何学形状を有してよい。ポスト１６は、流体マイクロチャネル１５の深さと同じ高さを有してよい。ポストはその間に小さい空間を有し、これによりＤＮＡの非コイル長部分がポスト間で移動できるようになる。幾つかの実施形態では、ポスト１６は約１〜１０μｍ、典型的には約５μｍの幅を有してよく、ポスト間の間隔はポストの幅、典型的には約２〜５０μｍ、例えば約１０μｍより多い又は少ない。
【００８６】
マイクロ流体チャネル１５ｃ及びリザーバ５０の複数の流体入力１５ａのパターンも、より多くの材料を必要とする分析の為の試料の導入及びＤＮＡの抽出に使用できる（図４Ａ）。
【００８７】
図４Ｂは、デバイス１０が、処理速度を加速する為に、単一マイクロチャネル１５から複数の反応ナノチャネルによって供給されるＤＮＡを含むことを示す。２つの反応ナノチャネル２０１、２０２がそれぞれ検出ナノチャネル４０１、４０２にマージし、かつそれぞれ横向きチャネル３０１、３０２、３２１、３２２と連通するものとして図示されているが、例えば単一チップ上で２〜１００個等、３つ以上の輸送ナノチャネル及び関連する構成要素を使用してよい。
【００８８】
反応ナノチャネルへの長鎖ゲノムＤＮＡ分子の導入
ＤＮＡ閉じ込めに対するエントロピーベースのエネルギ障壁を克服する為に、かなりの力を大きなＤＮＡ分子に印加して上記分子をナノチャネルの中に導入できる。剪断を用いずに反応ナノチャネル２０の中へのＤＮＡスレッディングを促進する為の戦略は、勾配構造及び／又は分子に対する応力を削減する為にスレッディングが開始された後に迅速に電界強度を削減する手段の組込みを含む。一例として、集束イオンビーム（ＦＩＢ）切削を使用して、継ぎ目なく接続されるナノチャネルへのＤＮＡ導入用の導管として役立つ為の、幅及び深さが徐々に減少する構造（ナノファンネル）を製作できる。ナノファンネルの追加の説明は、米国仮特許出願第６１／５９７，３６４号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０２５０７８号に記載されており、上記米国仮特許出願は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。別の例では、米国仮特許出願第６１／７７０，５８６号（この出願は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される）において説明されるように、ナノ流体要素に交差することがＤＮＡ輸送のより大きな制御を得る為に使用できる。図５は、ＤＮＡ線形化を促すポスト１６の低密度アレイと共に、単一のデバイスでのこれらの技術の両方の組込みを示す。同じ又は異なるポストアレイサイズ及び／又は構成のより多くの又はより少ないセグメントを使用して移動経路を部分的に塞ぎ、ＤＮＡを隣接するポスト間で強制的に移動させることができるが、これらのポスト１６は、複数の軸に沿って離間されたアレイセグメント又はポストのグループ１６１〜１６４として設けることができる。ポストセグメント間の軸に沿った距離又は間隔は、２０〜２００μｐｍ、通常は約１００μｍであってよい。図５に示すナノチャネル２０の高電界セクションＦＨの長さが分子にかかる力を決定し、上記長さは、ＤＮＡにかかる不当な応力を防止する為に比較的短い。同様に、ポストの最後の列とナノチャネル出入口との間の距離は、ＤＮＡを強く引っ張ることなくＤＮＡの初期スレッディングを実施できるよう十分に大きい。完全ＤＮＡ分子の装填は、分子の終端があらゆるポストの絡み合いから拡散して係合解除するのに十分な時間を有するように、低速度で行われる。但し電界強度は、スレッディング解除（ｄｅ−ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）に有利な拡散及びエントロピーリコイルを無効にできるよう、十分に高くなくてはならない。図５に示すマイクロ流体／ナノ流体界面は、反応ナノチャネルへのＤＮＡの制御された導入の為に設計できる多くの構造のうちの一例にすぎない。
【００８９】
制限酵素断片化及び断片サイズ設定
図６Ａ〜図６Ｅは、規則正しい制限酵素マップの生成に繋がる、デバイス１０のナノ流体チャネル２０、３０、３２、４０において実施される例示的な分析ステップを示し、上述のようにゲノムＤＮＡのスレッディング及び装填で始まる（図６Ａ〜図６Ｂ）。この後には、拡張されたＤＮＡ分子の断片への制限酵素消化が続く（図６Ｃ）。ＤＮＡ分子を消化する制限エンドヌクレアーゼ酵素は、図６Ｃの第２の横向きチャネル３２に接続される下部マイクロチャネルに含まれ（例として単に「Ｍｇ２＋」として標識する）、図６Ｃの左側に示す反応ナノチャネルへの出入口を通してＤＮＡと導入することもできる。補因子（例えばＭｇ２＋イオン）を必要とする制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ断片化が、反応ナノチャネル内に完全に閉じ込められている平衡化されたＤＮＡ分子のみに起こることを保証する為に使用できる。これは、最も容易には図６Ａ〜図６Ｅ及び図７Ａ〜図７Ｅに示す４つのチャネル入口Ｖ０、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３内の適切な電圧の印加による、制限酵素消化に影響を及ぼす為に適切な時点における、補因子の制御下での導入によって実施される。各動作モード中の各チャネルにおける電界の極性及び大きさは、図６Ａ〜図６Ｅでの矢印によって示される。この例では、補因子は正に帯電したイオンであるので、補因子は電気泳動的に反応ナノチャネル２０から排除できるか又は反応ナノチャネル２０へ導入できる。図６Ｄは、ポスト１６のアレイ及びナノファンネル１７を用いたＤＮＡ断片の検出ナノチャネル４０への注入を示す。この例では、検出ナノチャネル４０の有効径は反応ナノチャネル２０の有効径よりも小さい。反応ナノチャネル２０は、検出ナノチャネル４０よりも１０倍〜１０００倍長く、深さ及び／又は幅で２倍〜１００倍大きくてよい。例えば、反応ナノチャネル２０は、約３００ｎｍの幅及び深さを有してよい。一方、検出ナノチャネルは、例えば約１００ｎｍの幅及び深さ等、より小さい幅及び深さを有してよい。幾つかの実施形態では、検出ナノチャネル４０は、反応ナノチャネル２０の直径から５０％〜９９％だけサイズが縮小した直径を有し、その結果、各断片が交点に到達する際の輸送速度の上昇、及び隣接する各断片の分離が得られる。
【００９０】
このチャネル狭窄の結果として、検出ナノチャネル４０内の電界は反応ナノチャネル２０内の電界よりも大きくなり、ＤＮＡ制限酵素断片は、上記交点に到達すると、検出ナノチャネルの中に迅速に引き入れられる。断片間のある期間の後に、次の断片が交点に移行し、検出ナノチャネル４０の中に引き入れられる。断片が検出ナノチャネル４０を通して位置を変えるにつれ、断片は下流で検出され、断片サイズを決定する為に信号持続時間又は積分強度が分析される。図６Ａ〜図６Ｄでは、これは、アバランシェフォトダイオード１０２（図６Ｄ）を使用する集束レーザスポット、又は例えば単一の対物レンズ（レーザ１及びレーザＢ）を通る２つのレーザ１０３を使用する、若しくは追加の対物レンズ（レーザ３）を使用する多点検出（図６Ｅ）を通過する染色されたＤＮＡ断片の蛍光を検出する為の回路１００によって達成される。また、検出は、蛍光撮像用の回路１００’を使用して達成することもできる。
【００９１】
図７Ａ〜図７Ｅでは、（例えば、断片によって誘発されるコンダクタンスの変化を検出する為に、検出ナノチャネル及び電流計１０１と統合された対向する１組の電極を使用する）電気的な一点（図７Ｄ）検出及び多点（図７Ｅ）検出が示される。
【００９２】
図６Ｆは、本発明の代替実施形態によると、ＤＮＡ分子及び断片のスレッディング、装填及び／又は輸送を引き起こす為に、デバイス１０を、リザーバ５０を介して圧力／真空５０ｐの圧力駆動輸送システムを使用して動作するよう構成できることを示す。デバイスは、圧力源に接続し、界面動電システム又は電圧システムについて示される線に沿った自動動作を可能にする導管又は管を含んでよい。図７Ａに示す、及び他の実施形態を示す図について図示されるデバイスの動作は、圧力又は他の輸送システムにより動作できる。従ってデバイス１０は、例えばゲノムＤＮＡ及びその断片の、検出ナノチャネルへの反応ナノチャネルを通る輸送を発生させる為に印加できる界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも１つ等の、図６Ｇに示す異なる輸送駆動システム「Ｄ」又は異なる輸送駆動システムの組み合わせと動作できる。
【００９３】
図６Ａ〜図６Ｅ及び図７〜図７Ｅに示す反応ナノチャネルと検出ナノチャネルとの間の界面も、断片輸送を駆動する力の突然の変化が、断片の空間的及び／又は時間的な分解を発生させる構造のクラスの一例と見なされるべきである。
【００９４】
図６Ａ〜図６Ｄ及び図７Ａ〜図７Ｄに示す反応ナノチャネル２０は、「Ｕ」字型のセグメントによって接続される複数の平行する脚部のある蛇行形状を有するものとして示される。但し、通常約５００μｍ〜２ｃｍのより短いチャネルの真っ直ぐな長さを含む、他のナノチャネル形状が使用できる。蛇行形状は、モノリシックチップ上でのより長いチャネルに特に適してよい。
【００９５】
制限酵素消化の要素、検出ナノチャネルの中への注入を通した断片分解、及び図６Ｃ〜図６Ｄに示す断片サイジングが、プロトタイプデバイス上で実証される（図８）。これらのプロトタイプデバイスは、集束イオンビーム加工を使用して製作され、ウィルス染色体ＤＮＡ又は細菌染色体ＤＮＡの分析に適した比較的短い反応ナノチャネルを有する。
【００９６】
単一入力及び単一出力を有するナノチャネル上の統合ナノ流体ネットワークの利点は、様々な場所で電圧を使用して流体流量を制御できることである。制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの消化では、補因子（例えばＭｇ２＋イオン）の濃度及び場所を制御して、まだ反応ナノチャネルに導入されていないＤＮＡの消化を防止しながら、閉じ込められているＤＮＡの消化を保証することが重要となり得る。この能力を実証する為に、電気泳動バッファ内のＭｇ２＋に敏感な染料（マグネシウムグリーン）が、プロトタイプデバイスのナノ流体反応チャネル及び検出チャネルに導入された。図９に示すに示すように、塩化マグネシウム（１０ｍＭ）を有するバッファが下部チャネルに追加された。「マグネシウムゲート」が、反応ナノチャネルが接地で保持されている間に、それぞれ小さい負の電圧又は正の電圧をＭｇ２＋リザーバに印加することによって閉鎖状態と開放状態との間で切り替えられた。蛍光画像は、マグネシウムゲートが閉鎖された状態で２秒の曝露を使用して収集され、その後にゲートが開放された状態の画像が続いた。マグネシウムグリーンの輝度は、Ｍｇ２＋イオンが反応チャネルを下って移行するにつれて増加した。図９Ｂは、実験中の蛍光の増加を示す。このパネルは、（マグネシウムゲート閉鎖時に収集された）記録されたシリーズの最初のフレームを、ゲート開放状態での最終フレームから差し引くことによって生成された。蛍光の増加が染料の濃度分極−ナノ流体実験で観察された現象−に起因しなかったことを保証する為に、下部チャネル内のバッファにはＭｇ２＋イオンが使われていなかった制御実験が実施された。図９Ｃは、電圧が「開放」状態に切り替えられた時に蛍光輝度の僅かな変化だけが観察されたことを示す。第１の横向きチャネル３０を通る反応チャネルの他端で上部「スレッディングリザーバ」の中へＭｇ２＋流を配向し、マッピング実験でのソースＤＮＡリザーバとして役立つマイクロチャネルへのＭｇ２＋流の導入を防止することも可能であった。
【００９７】
プロトタイプデバイスの反応ナノチャネルでの制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ分子の消化も実証された。ラムダファージＤＮＡ（λ−ＤＮＡ）は、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩを使用する消化に適したバッファ内でのインタカレート染料ＹＯＹＯ−１（５：１の塩基対：染料分子）で染色された。また、バッファは、ＤＮＡを含むマイクロチャネルを害する可能性があるいずれのＭｇ２＋及びラジカル捕捉剤としてのメルカプトエタノール（４容量パーセント）を隔離する為にＥＤＴＡ（２ｍＭ）も含んでいた。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩがＤＮＡ溶液に添加され、この溶液は反応ナノチャネル出入口にアクセスするＤＮＡリザーバの中に装填される。ＥＤＴＡはないが、１０ｍＭの塩化マグネシウム、４％のメルカプトエタノール、及びＨｉｎｄＩＩＩを有する反応バッファを含む第２の溶液が、Ｍｇ２＋リザーバに追加された。（図８で「スレッディング」及び「出口」と名前が付けられた）残りのリザーバは、４％のメルカプトエタノールを含有するバッファ（つまり、Ｍｇ２＋、ＥＤＴＡ、又はＨｉｎｄＩＩＩなし）で充填された。プラチナ電極がリザーバ内に浸漬され、図８に見られる４つの入口での電圧の独立した制御を可能にする。ＤＮＡ分子は、Ｍｇ２＋流電圧ゲートが閉じられている間に高電界強度を使用して反応ナノチャネルに導入された。λ−ＤＮＡ分子が顕微鏡の視界に入ったとき、ＤＮＡ移行が減速し、Ｍｇ２＋電圧ゲートが開放され、ＤＮＡ分子を越えてＭｇ２＋イオンを駆動するように、電圧はより低い値に切り替えられた。数秒後、電圧は、反応ナノチャネルの電界強度が略ゼロになるように調整された。２００ｍｓ毎に画像が取得された。１０〜１５秒の初期撮像期間の後、光で誘起された断片化が発生しなかったことを保証する為に蛍光励起源のシャッターが閉じられた。反応の〜１分後、消化の範囲を決定する為にシャッターが開けられた。図１０は、１．５分のＭｇ２＋への曝露後のλ−ＤＮＡの消化を示すフレームの代表的なシリーズを示す。この場合、３つの断片が観察され、ＨｉｎｄＩＩＩによるＤＮＡ分子の部分的な消化を示す。
【００９８】
また、検出ナノチャネルの中へのＤＮＡ断片の規則正しい注入によるＤＮＡ断片の、空間及び時間に関して隣接した断片からの分解も、プロトタイプデバイスで実証された。蛍光染色されたＴ４ファージＤＮＡ分子を、４００ｎｍ  ｘ  ４００ｎｍ〜２００ｎｍ  ｘ  ２００ｎｍへ削減された寸法（幅ｘ深さ）のナノチャネルに注入した。２つのセグメントの同等の長さを考えれば、これはより小さいナノチャネルでの電界での４倍の増加に相当した。図１１は、より大きい反応ナノチャネルでの単一ファージ分子の複数の断片の拡散を示す。（この相対的に小さいＤＮＡ分子の場合、断片は図中に表される観察期間に亘って分解できる。但し、より大きい視野での複数の大きい制限酵素断片の分解は、観察期間の延長を必要とし、より大きな不確実性に曝されることになる。）この観察期間の後に、検出チャネルの中への断片の注入を行った。この動的プロセスは、事実上、各断片の、隣接する断片からの完全な分解を発生させた。
【００９９】
ゲノムレベルの制限酵素マップの生成
図１２は、１つ又は複数の低コストの単回使用デバイス１０を連続的に又は並列で試験できるコンピュータ制御９０によるベンチトップ装置１５０を使用して、多様なデバイス動作を実施する方法の例を提供する、システム２００を示す。通常、細胞全体の試料がデバイス１０に導入されてから、上記デバイスが装置１５０の中に挿入される。但し、デバイス１０は、装置１５０に置かれた後で細胞を装填されてよい。デバイス１０でＤＮＡの抽出及び染色を達成する為に細胞を越えて試薬が流される時限プログラムが開始できる。染色体ＤＮＡの第１の部分をスレッディングする為に、所定の電圧プログラム９０ｐが開始される。（光学的に又は電気的に検出される）スレッディングされたＤＮＡの存在が、反応ナノチャネル２０にＤＮＡ分子を完全に装填する為に電圧プログラムの変化をトリガする。（光学的な検出又は電気的な検出を使用して決定されるように）これが達成されるとき、電圧プログラム９０ｐはエンドヌクレアーゼ消化反応を開始する為に再び変更される。このステップの間、デバイス１０は装置１５０内で加熱されて還元反応速度を強化してよい。所定の反応時間に続き、電圧は検出ナノチャネル４０の中への断片の規則正しい注入を駆動する為に使用される値に自動的に変更される。測定された信号は、それが回路１００、１００’を介して収集されるにつれて分析でき（図６Ｄ、図６Ｅ、図７Ｄ、図７Ｅ）、これによってリアルタイムで又は略リアルタイムで制限酵素部位のマップが生成される。断片の検出が終わると、回路１００、１００’はコンピュータ９０に対し、ＤＮＡ分子全体がサンプリングされて「読取り」が完了したことを示すことができる。電圧は、電圧プログラム９０ｐを介してその「スレッディング」値に変更されて、染色体ＤＮＡの次の部分を読み取る。
【０１００】
図１３Ａ〜図１３Ｂは、ＤＮＡ分子のスレッディングを検出する為に使用できる例示的な要素及び回路１０５、１０５’を示し、図１３Ｃは、例えば１００、１００’、１０５、及び／又は１０５’等の１つ又は複数の回路からの入力によって命令される電圧プログラム９０ｐのトリガによるタイミング／電圧制御プログラムを示す。電圧プログラムでのトリガされた変更は、垂直矢印によって示される。（例えば、制限酵素消化反応を完了するのに十分な時間を提供する為の）遅延は、水平矢印によって示される。プロセスは、デバイスに初期に導入された複数の細胞から発した染色体ＤＮＡの複数のコピーを読み取る為に複数回繰り返すことができる。或いは図１３Ｄに示すに示すように、デバイスは、定電圧、一定圧力、若しくは他の駆動力又はその組み合わせを使用して操作できる。図１３Ｄの上部グラフは、検出された信号を示す。一方、下部グラフは上部グラフの検出時間に相当する時間に亘る一定の４つの入力値を示す。それぞれの駆動力入力に関して使用される用語「一定の」は、定められた期間に亘って平均の値が＋／−１０％の範囲内まで一定であることを意味する（例えば、電圧及び／又は圧力は、分析期間に亘って値の＋／−１０％である）。別の言い方をすれば、駆動力入力は連続流対停止流を有するほど十分に一定であるが、流量は、連続しているが、経時的に変化してよい。一連の制限酵素断片は、検出可能信号なし又は検出可能信号の削減によって示される分子分離による制限酵素断片のクラスタ化によって単一のＤＮＡ分子から発するとして識別される。クラスタ間の遅延は染色体ＤＮＡ分子間のサンプリング遅延から生じ、各クラスタがそれぞれの分子にとって一意の読取りとして特徴付けられることを示す。図１３Ｄは、分子１の為の第１のクラスタ、次いで分子２の為の第２のクラスタを識別し、２つの隣接するクラスタが、例えば検出された信号期間がない（又は非常に低い）ことによって分離される連続流検出を示す。各読取りの完了時、その読取りはコンピュータ的に一意である（つまり、染色体が実験実行中にマッピングされるのが初めてである）と決定できる、又は既存のマップデータ、つまり「読取り」１６０に位置合わせされて読取り有効範囲を増加する（つまり、染色体の他のコピーが実験ランで以前に読み取られたことがある）。この技術によって生じる長い読取り長さは、マッピング実験中にこのプロセスを完了できるようにする。その結果として、連続的に更新される品質スコアが生じ、分析は、マップ有効範囲及び品質のユーザによって定義されるベンチマークが達成された後に終了できる。或いは、追加の制限エンドヌクレアーゼを使用する制限酵素マッピングは、多様な制限酵素部位の高い情報コンテンツマップを生成する為に開始できる。
【０１０１】
図１２は、電源１５０ｐ、流体接続部、及びリザーバ５０の為の多様な化学薬品（例えば、溶解試薬、リンス剤バッファ、染色質除去試薬、ＤＮＡ染色溶液（所望される場合））を含んでよい制御された環境ハウジング１５０を有する自動分析システム２００を示す。システムは、流体接続部を通して流体を注入する又は引き出すことによって、並びに例えばチャネル２０、３０、３２及び４０と連通する電極に、電圧等の電気的なバイアス（例えば、図６Ａ〜図６Ｄ及び図７Ａ〜図７ＤのＶ０、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３）を電気的に印加することによって動作を制御できる。マイクロ流体チャネル１５、流体相互チャネル３０、３２及び検出ナノチャネル４０は、流体（電解質）等の流動性を有する物質を保持するよう構成されるリザーバ５０にマージできる。リザーバ流体は、例えば、高イオン強度電解質溶液等の電解質溶液を含んでよい。適切な溶液の例は、約３５ｍＭ〜約１Ｍの濃度の塩化カリウム溶液を含むが、これに限定されるものではない。
【０１０２】
図１２を参照すると、システム２００は、Ｖ０、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３を制御自在に印加する為の電極５０ｅ（図１Ｃ）に対する電圧入力２５１〜２５４を含んでよい。システム２００は、検出回路１００、１００’と通信する又は検出回路１００、１００’を含む（図６Ｄ、図６Ｅ、図７Ｄ、図７Ｅ）回路９０ｃ及びスレッディング検出回路１０５、１０５’（図１３Ａ、図１３Ｂ）による、所望される電圧タイミングプログラム、つまりアルゴリズム９０ｐを有する少なくとも１台のプロセッサ９０ｐの指図を受けて電気的バイアスを印加できる電源１５０ｐ（例えば、電圧源及び／又は電流源）を含んでよい。システム２００は、分析中の分子をスレッディングする、装填する、反応させて輸送する、及び検出する、又は図１３Ｄに関して上記に示すに示すように電圧が一定に保持されるモードで動作する為に適時に電圧Ｖ０、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３を印加し、制御できる。或いは幾つかの機能は、タイミングプログラムつまりアルゴリズム９０ｐに従ってデバイス１０に対する流体接続を通して溶液を注入する又は引き出すことによって、圧力によって駆動される流れを使用して達成できる。
【０１０３】
図７Ａ〜図７Ｄは、電圧変化を電気的にトリガし、電流計１０１を使用して横向きコンダクタンスを測定する回路１００’を用いた検出システムを示し、図６Ａ〜図６Ｄはアバランシェフォトダイオード１０２及びレーザ１０３及び電圧変化の電気的なトリガを使用する検出システム１００を示す。
【０１０４】
図１２は、システム２００が、回路、及び／又は検出ナノチャネル４０でＤＮＡ断片の為の分析データを入手できる少なくとも１台のプロセッサ９０ｐを有するコンピュータ９０を含んでよいことを示す。用語「コンピュータ」は、動作を制御するために回路１００、１００’及び／又はデバイス１５０の制御並びに回路１００、１００’及び／又はデバイス１５０との通信を可能にする少なくとも１つのデジタルシグナルプロセッサを典型的に備える、いずれの電子デバイスを含むよう、広範な意味で使用される。コンピュータは、ローカル又はデバイス１５０のある部位から離間していてよい。
【０１０５】
システムは、検出チャネル４０で分析物分子の一連の画像を撮影できる、検出器１０２及び励振源１０３（図６Ｄ）を有する撮像システムを含んでよい。上記撮像システムは、任意の適切な撮像システムであってよい。図示したように、システム１００は、（通常、蛍光的に分類される分子を励起する光を生成する為の）（任意選択で、鏡、ビームスプリッタ、偏光板、レンズ、及び／又は他の光学素子を含んでよい）励起光源１０３、及び例えばカメラ、光電子増倍管、又はフォトダイオードのうちの１つ又は複数等の画像生成装置又は検出器１０２を含んでよい。使用される場合、対物／レンズは、デバイス１０の一次表面の下又は上に常駐してよい。電気入力／出力、及び流れ動作は、デバイス１０の反対側に常駐してよい。また、デバイス１０は、実質的に水平よりむしろ（平らな一次表面が直立又は斜めの状態で）デバイス側で動作する為に反転されてもよい。
【０１０６】
図１４は、本発明の実施形態による、細胞全体から抽出されるゲノムＤＮＡの規則正しいＤＮＡ制限酵素マップを提供する為に使用できる例示的な動作を示す。ナノチャネル直径のサイズが減少する界面において検出ナノチャネルにマージする反応ナノチャネルにマージする流体マイクロチャネルを有するデバイスを提供する（ブロック３００）。任意選択で、サイズ縮小は、反応ナノチャネルのサイズの５０％〜９９％であってよい（ブロック３０２）。細胞全体は、マイクロチャネル内での最小の断片化によってＤＮＡを生じさせる為に溶解され、染色質除去することができる（ブロック３１０）。次に、無傷のＤＮＡの分子を反応ナノチャネルの中に導入できる（ブロック３１５）。続いて、制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して、無傷ＤＮＡを反応ナノチャネル内で断片化できる。反応ナノチャネルは、断片が検出ナノチャネルの中に注入されるまで断片が元の順序のままとなるようにサイズ設定及び構成される（ブロック３２０）。検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所における信号を検出して、長鎖ＤＮＡ分子に沿って断片が発生する順序で断片をマッピングできる（ブロック３２５）。
【０１０７】
デバイスは、デバイスと連通する輸送システムと共に使用でき、それにより輸送システムを、界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも１つを印加することによって、ゲノムＤＮＡ及びその断片の、検出ナノチャネルの中への反応ナノチャネルを通る輸送を発生させるように構成できる（ブロック３２１）。
【０１０８】
この技術により、完全染色体からナノチャネルへのＤＮＡの制御された導入、制限酵素によるその消化、及び制限酵素断片の規則正しいマッピングが可能となる。隣接する断片を分解する為の、注入をベースにした断片の分離によって、拡散に起因する分解の損失を最小化でき、ナノファブリケーション方法の現在の限界に近いか又はこれを超える限界寸法（幅及び深さ）を有するナノチャネルに対する依存を削減又は排除できる。
【０１０９】
有利なことに、必要な最小のナノチャネル幅は典型的には約１００ｎｍである。従ってデバイスは、様々な所定の方法を使用して多様な基板内に製作できる。例えば：ミジャトビック（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ），Ｄ、エイジケル（Ｅｉｊｋｅｌ），Ｊ．Ｃ．Ｔ．、ファンデンベルグ（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ），Ａ．著「ナノ流体システムの為の技術：トップダウン対ボトムアップ−レビュー（Ａ．  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  ｔｏｐ−ｄｏｗｎ  ｖｓ．  ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ?  ａ  ｒｅｖｉｅｗ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ）、２００５年、５、４９２−５００；ペリー（Ｐｅｒｒｙ），Ｊ．Ｌ．、カンドリカー（Ｋａｎｄｌｉｋａｒ），Ｓ．Ｇ著「単一相液体流の為のナノチャネルの製作の検討（Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｆｌｏｗ）」、マイクロ流体、ナノ流体（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ．Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ）、２００６年、２、１８５−１９３；シャンティワズ（Ｃｈａｎｔｉｗａｓ），Ｒら著「ポリマーナノチャネル及びナノスリットの柔軟な製作及び応用（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｓｌｉｔｓ）」、ケミカル  ソサエティ  レビュー（Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｒｅｖ．）、２０１１年、４、３６７−３７０２；及びウトコ（Ｕｔｋｏ），Ｐ．、パーソン（Ｐｅｒｓｓｏｎ），Ｆ．、クリステンセン（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ），Ａ．、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ），Ｎ．Ｂ．著「射出成形されたナノ流体チップ：単一分子ＤＮＡ実験を使用した製作方法及び機能試験（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｌｄｅｄ  ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈｉｐｓ：  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｅｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）」、ラボ  オン  ア  チップ（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ）２０１１年、１、３０３−３０８を参照されたい。これらの文献は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。ウェハスケール処理を使用できることにより、高インパクト低コストの技術を提供できる。
【０１１０】
制限酵素消化及び断片サイジングの為に、染色体ＤＮＡをチップ上の細胞から抽出して、分子間の絡み合いなしにナノチャネルの中に導入できる。これによって最小ＤＮＡ剪断が保証され、多くの小さい重複コンティグ（ＤＮＡの隣接共通領域）からの光学的なマップのアセンブリの必要が低減される。オンチップ処理の結果としての剪断が発生する場合、調査対象の染色体ＤＮＡ分子は、長さが５０万塩基対よりも大きく、より典型的には長さが５０００万塩基対よりも大きくてよい。これが、低い入力材料要件で、スループットを高め、計算コストを削減し、有効範囲が広いマップを可能にすると期待される。
【０１１１】
断片サイズは、撮像又は信号の持続時間若しくは統合された振幅を使用する一点検出によって測定できる。ＤＮＡ速度は、これらの測定に関しては長さに依存しないものとなることができあってよく、このことは理論的に期待され、かつこのサイズのチャネルにおいて実験的に検証されてきた。データ分析は、リアルタイムで又は略リアルタイムで進行し、所望の有効範囲及びマップ品質が達成されるまで、データを単一ランで収集できることが保証される。大きな視野の画像の記憶及び分析の排除により、計算コストを削減できる。
【０１１２】
追加の機能性の統合が可能である。例えば、追加分析の為に、選択された断片を検出後に並べ替えることができる。ＤＮＡは、制限酵素消化と、例えば分類され為チル―ＣｐＧ結合ドメイン蛋白質又はペプチドとの反応等の二次アッセイとの両方を受けることになり得る。例えば、リム（Ｌｉｍ），Ｓ．Ｆ．、カルプセンコ（Ｋａｒｐｕｓｅｎｋｏ），Ａ．、サコン（Ｓａｋｏｎ），Ｊ．Ｊ．、フック（Ｈｏｏｋ），Ｊ．Ａ．、ラマー（Ｌａｍａｒ），Ｔ．Ａ．、リーエン（Ｒｉｅｈｎ），Ｒ．著「ナノチャネルにおけるＤＮＡメチル化プロファイリング（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌｓ）」、バイオマイクロ流体（Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）２０１１年、５、０３４１０６を参照されたい。上記文献は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。従って、２色検出は、配列コンテキストによる単一分子後生的分析を提供できる。
【０１１３】
例えば、本発明の実施形態は、関心対象の断片を識別して、上記断片を追加分析の為に下流チャネルの中に並べ替えるよう構成できる。これらの構成は、ゲノムの特定の領域での後生的修正の標的分析の為に、又はＤＮＡの選択された断片を順序付け、発見及び診断の可能性を高める為に重要となり得る。図１５〜図２１は、オンボード型リザーバ又は遠隔型リザーバＲを用いる分析構成、及び関連する方法の例を示す。これらの図は、多様な構成要素を界面動電的に駆動することによって実施される、デバイスを通る分子輸送を示すが、例として図６Ｆ及び図６Ｇに示すに示すように、例えば、圧力、電気泳動力、求心力等のうちの１つ又は組み合わせを含む駆動システムＤを含む他の輸送力を、上述のように個別に又は組み合わせて使用できる。
【０１１４】
図１５は、一方が他方の下流に位置する２つの異なる反応ナノチャネル２０１、２０２を使用して、連続して２つの制限酵素消化を実施できるよう構成される、デバイス１０の例である。第１の制限酵素消化からの規則正しい断片（典型的には全ての規則正しい断片）は、任意選択で第２の制限酵素による消化の為に第２の反応ナノチャネル２０２の中に導入できる。第１の検出チャネル及び第２の検出チャネル（それぞれ４０１及び４０２）からのデータの組み合わせにより、ゲノム構造についての情報の増加又は追加情報が提供される。
【０１１５】
或いは、図１６に示すに示すように、第２の反応ナノチャネル２０２は、第１の検出ナノチャネル４０１から出る規則正しい断片に分類されたプローブを結合する為に構成できる。他の実施形態も可能であるが、例は、ＤＮＡのメチル化された領域又は損傷を受けた領域に結合できる標識された蛋白質を含み、それによってＤＮＡ試料についての追加の情報を提供する。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、本出願のデバイス、システム及び／又は方法は、断片をマッピングした後に、断片を選択的にサンプリングできる。分析はリアルタイムで（又は略リアルタイムで）実施できる為、例えば断片の定義済みのパターンの検出といった、観察又は検出された定義済みのトリガイベントは、一時操作モードからの動作パラメータの変更を自動的にトリガでき、例えば輸送システムの電圧、圧力等は、少なくとも２つの定義済みの操作モード、つまりより少ない分析時間を使用する「正常」モードの為のモードと、第２の反応ナノチャネルを使用する追加分析の為のより特異的な関心対象の断片の為のモードとを有してよい。従って、例えば、デフォルトで、初期制限酵素消化からの断片は、「廃棄物」Ｗと見なされる出口リザーバの中に輸送される可能性がある（つまり、追加の分析はＤＮＡに対して実行されないことになる）。しかしながら、システム及び方法は、トリガされると、ゲノム内の関心対象の領域を表す一連の断片を二次反応ナノチャネル２０２に再配向して、リザーバＲ（Ｖ４とも標識される）が二次反応に材料を提供できるよう構成できる。
【０１１７】
図１７は、例示的なトリガプロセスを示す。２つの例示的な選択的トリガシステム／構成を図１８及び図１９に示す。
【０１１８】
図１７に示すに示すように、規則正しい断片はリアルタイムで（又は略リアルタイムで）分析できる（ブロック３５０）。パターン認識を使用して、関心対象の領域がマッピングされる時点を識別できる（ブロック３５５）。プロセスは、決定ノードを有してよい（ブロック３６０）。追加の分析が必要である場合、定義済みのトリガイベント又は検出に基づいて、１つ又は複数の断片を、後続の反応ナノチャネル２０２に流動的に伝達／輸送できる（ブロック３７０）。追加の分析が必要ない場合、１つ又は複数の断片を廃棄物リザーバＷに輸送できる（ブロック３６５）。
【０１１９】
図１８は、電圧（又は他の駆動力）を適切にトリガすることによって、選択された断片が第２の反応ナノチャネル２０２内での第２の制限酵素消化に導入される一方、大部分の制限酵素断片が廃棄物リザーバＷ（「Ｖ６」とも標識される）に輸送される、デバイス１０の例を示す。廃棄物リザーバＷは、図示したように第２のナノチャネル２０２のすぐに上流に又は他の場所に常駐できる。
【０１２０】
図１９は、電圧（又は他の駆動力）を適切に調整することによって、選択された断片が第２の反応ナノチャネル２０２内での第２の制限酵素消化に導入される一方、典型的には大部分の制限酵素断片が廃棄物リザーバＷ（「Ｖ６」とも標識される）に輸送され、上記選択された断片は、ＤＮＡのメチレン化した領域又は損傷を受けた領域に結合できる、例えばリザーバＲからの蛋白質（Ｖ４としても示される）等の標識されたプローブに結合される、デバイス１０の例を示す。
【０１２１】
デバイス１０（例えばチップ）においてオンボードで実行される二次反応に加えて、又はその代わりに、ゲノムの選択された領域からの断片は、後続のの収集及びオフチップ分析（例えばシークエンシング）の為にインデックス付きのリザーバに選択的に輸送できる。複数の標的断片は、それぞれが固有の出口チャネルに並べ替えられることになる。標的染色体の複数のコピーのマッピング及び並べ替えにより、分析の為に十分な材料の収集が可能となる。幾つかの実施形態では、十分な材料を収集した後に、一意のバーコードを有するアダプタを各出口リザーバに付加して、その中に含まれた断片の端部に取り付けることができる。続いて断片をプール（及び潜在的に増幅）し、ライブラリ作成の為に提出し、順序付けすることができる。図２０は、例示的な断片分析、識別及びトリガプロセスを示し、図２１は、このプロセスを実施及び／又は実装できる例示的なデバイス１０を示し、複数の収集リザーバ「Ｃ」（Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９．．．Ｖｎとして標識される）を示す。規則正しい断片のサイズは、リアルタイムで（又は略リアルタイムで）分析できる（ブロック３７５）。定義済みのトリガイベント又は例えばパターン認識等の調査対象の断片の決定は、関心対象の領域がマッピングされる時点を識別できる（ブロック３７７）。プロセス決定ノード（ブロック３８０）は、制限酵素断片の順序付けが所望されているかどうかを自動的に評価し、廃棄物リザーバＷに断片を輸送する（ブロック３８２）か、又はプールリザーバ、典型的には後の分析用のインデックス付きのプールリザーバへ選択された１つ若しくは複数の断片を輸送する（ブロック３８５）かのどちらかの為に、関連する輸送アクションを実施できる。
【０１２２】
図２１は、制限酵素断片がデフォルトで（「Ｖ３」と名前が付けられる）「廃棄物」リザーバに輸送されるが、識別された関心対象の断片が出口チャネル４１に配向され、それぞれの収集リザーバＣ（Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９、．．．、Ｖｎ）で収集されるデバイス１０の例を示す。
【０１２３】
本発明の実施形態は、主に構造変異種遺伝子型決定、及びデノボシーケンスアセンブリの分野での高い影響力の可能性を有する。現在、高い疾患感受性を評価する利用可能な遺伝子検査は概して、通常は単一遺伝子のコーディングの誤りである、希少でかつ影響が大きい一塩基多型（ＳＮＰ）を識別する。しかしながらＳＮＰは病原性である唯一の変異種ではなく、遺伝的評価は、構造変異種（新規挿入、削除、複製、反転及びトランスロケーション）を包含することから利益を得ることになる。疾病表現型に対する構造変異種（ＳＶ）の寄与は、ＳＮＰの寄与よりもよく理解されていない。既知の例は、ＳＶと統合失調症、自閉症及びクローン病との間の関連を含む。従って、ＳＶを識別できる高スループットで低コストの方法は、ＳＮＰに基づいた関連研究に対する重要な補足となる。ＳＶを識別する為の現在の方法（例えば、ハイブリダイゼーションベースのアレイ方法、及び次世代シークエンシングデータを分析する為の計算方法）は、検出される変異種のサイズ及びクラスの偏向を示し、大局的な発見を妨げている。それぞれの方法に固有の偏向に加えて、ＳＶの検出には〜３００塩基対〜１００００塩基対の大きなギャップが存在する。染色体ＤＮＡの高解像度制限酵素マップは、個人のゲノムに存在する全てのクラスのＳＶを識別する為の簡単な方法を提供する。
【０１２４】
光学マップは、ＳＶを検出するにあたってのその有用性に加えて、次世代シークエンシングコンティグのアセンブリ用の骨格としても役立ち得る。例えば：ラム（Ｌａｍ）ら著「構造変異分析及びシーケンスアセンブリの為のナノチャネルアレイ上でのゲノムマッピング（Ｇｅｎｏｍｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｎ  ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）」、ネイチャー  バイオテクノロジ（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２０１２年、３０、７７１−７７６；ジョウ（Ｚｈｏｕ）ら著「ロドバクタ・セファロイデス２．４．１型の全ゲノムショットガン光学マッピング及び全ゲノムショットガンシーケンスアセンブリの為のその使用（Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ２．４．１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）」、ゲノム  リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、２００３年、１３、２１４２〜２１５１；及びジョウ（Ｚｈｏｕ）ら著「エルシニアペスティス型ＫＩＭの全ゲノムショットガン光学マップ（Ａ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｐ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＫＩＭ）」、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジ（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２００２年、６８、６３２１−６３３１を参照されたい。これらの文献は、その内容があたかも本明細書に完全に詳述されたかのように、参照により本出願に援用される。
【０１２５】
スループットを高め、制限酵素部位マッピングのコストを削減する戦略は、比較ゲノミクス研究に対して相当に有用であり得る。更に、制限酵素マッピングが、大型で非常に反復が多い領域に及ぶことができることは、ヘテロクロマチンＤＮＡ及び植物ゲノム等の困難なアセンブリを支援する為に役立つ。
【０１２６】
本発明の実施形態は、断片が大きなＤＮＡ分子に沿って発生する順序で断片を正確にマッピングできる。これは、チャネル直径が検出ナノチャネルにおいて大幅に減少する（図１１）ナノチャネル構造によって促進される。図１１では、これを画像の左側の一連のフレームに示す。幾つかのフレームでは、上記連続の上部に４つの断片があることが明らかであるが、他のフレームでは、それは明白ではない。従って、断片サイズの推定値を得ることができるが、推定値は正確ではない。断片間が有意に分離され、かつ断片サイズの決定する上での精度がより高い、上記一連のフレームの内の下３分の２のフレームと、上記推定値を比較する。
【０１２７】
また、本発明の実施形態は、一列の断片を、断片がＤＮＡ分子内で発生するのと同じ順序で検出構造に導入するよう構成される。これを達成する為に、一続きの無傷ＤＮＡを反応ナノチャネル２０に導入し、次いで、制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用してその反応ナノチャネル内でＤＮＡを断片化できる。これらの酵素は、特定の配列を有する部位でのみＤＮＡを断片化し（例えばＨｉｎｄＩＩＩ酵素は塩基配列ＡＡＧＣＴＴを認識し、２つのＡの間でＤＮＡを切断し）、ＤＮＡの分子に沿ったこれらの部位のマップを生成する。反応ナノチャネルは、断片が混ざり合わないよう十分に小さい直径を有し、つまり断片は、断片が検出ナノチャネル４０に注入されるまで元の順序のままである。
【０１２８】
上記は、例えば長さが約５０万塩基対等の長鎖ＤＮＡ分子の導入に特に適している。長さが２億５０００万塩基対である無傷ＤＮＡ（つまりＤＮＡ相当のヒト染色体全体）を反応チャネル２０に導入できれば、分析時間、必要とされる試料及びマッピングエラーを大幅に削減できると考えられる。しかしながら本発明の実施形態は、高インパクト診断及び研究ツール等の他の用途にも有益となり得る。
【０１２９】
ＦＩＢ切削は、完璧を期して説明され、ナノチャネルを形成する為に特に適していると考えられているが、他の実施形態は、上述のように、例えば電子ビームリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、フォトリソグラフィ、テンプレート戦略又は成形戦略、及び当業者により理解される他の方法を含む、他の形成技法を対象とする。
【０１３０】
上記は本発明の例示であり、本発明を制限するものと解釈されるべきではない。本発明の幾つかの例示的な実施形態が説明されているが、当業者は、本発明の新規の教示及び利点から著しく逸脱することなく、多くの修正形態が例示的な実施形態において可能であることを容易に理解するだろう。従って、全ての係る修正形態は。特許請求の範囲において定義される本発明の範囲内に含まれることを意図する。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、請求項の均等物は本発明に含まれる。
〔付記１〕
ナノ流体分析システムであって：
長さが５００μｍ〜１０ｃｍの反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルと前記反応ナノチャネルとの間の界面位置において前記検出ナノチャネルにマージし、前記界面位置において前記検出ナノチャネルのサイズは前記反応ナノチャネルに比して縮小する、反応ナノチャネル；
前記反応ナノチャネルの進入部分と連通するマイクロ流体チャネル；
前記マイクロ流体チャネルと連通する第１の電極；
前記反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記反応ナノチャネルから延在し、且つ前記反応ナノチャネルと流体連通する、第１の横向き流体チャネル；
前記第１の横向き流体チャネルと連通する第２の電極；
前記第１の横向き流体チャネルの下流において前記反応ナノチャネルから延在し、且つ前記反応ナノチャネルと流体連通する、第２の横向き流体チャネル；
前記第２の横向き流体チャネルと連通する第３の電極；
前記検出ナノチャネルと連通する第４の電極；
前記第１の電極、前記第２の電極、前記第３の電極及び前記第４の電極の動作を制御して、断片の不規則化を防止する前記反応ナノチャネルの内部でＤＮＡを制御自在にスレッディングし、装填し、消化するよう構成される、回路；並びに
断片サイズを空間的に且つ時間的に分解することによって、リアルタイムで又は略リアルタイムでの染色体ＤＮＡの規則正しい制限酵素マップを実現できるよう構成される、前記検出ナノチャネルと連通する少なくとも１つの電気的な又は光学的な検出器
を含む、ナノ流体分析システム。
〔付記２〕
前記マイクロ流体チャネルは、前記マイクロ流体流路を部分的に塞ぐよう構成される、離間した複数のポストのアレイを備える、付記１に記載のシステム。
〔付記３〕
前記システムは、前記マイクロ流体チャネルを流体輸送ナノチャネルの進入部分と接続するナノファンネルを更に備える、付記１又は２に記載のシステム。
〔付記４〕
前記ナノ流体反応チャネルは、「Ｕ」字型のセグメントにより接続される、狭い間隔の略平行な複数のセグメントを有する蛇行形状を有する、付記１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記５〕
前記マイクロ流体チャネル、前記反応ナノチャネル、前記検出ナノチャネル、並びに前記第１の流体横向きチャネル及び前記第２の流体横向きチャネルは、流体チップ上にモノリシックに集積される、付記１〜４のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記６〕
前記第１の横向き流体チャネル及び前記第２の横向き流体チャネルは、深さ約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、幅約２０ｎｍ〜約２０００ｎｍの流体ナノチャネルであり、前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、長さが約１０倍〜約１０００倍、並びに深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きい、付記１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記７〕
前記第１の横向き流体チャネルは、マイクロチャネル若しくはナノ流体チャネルであるか、又はマイクロチャネル及びナノ流体チャネルの両方のセグメントを含み、
前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルの約１０倍〜約１０００倍の長さである、付記１〜６のいずれか１項に記載の方法。
〔付記８〕
前記システムは第２の反応ナノチャネルを備え、
前記第２の反応ナノチャネルは、前記第２の反応ナノチャネルの進入端部において前記流体マイクロチャネルと流体連通し、前記第２の反応ナノチャネルの対向する放出端部においてそれぞれの前記第２の検出ナノチャネルにマージする、付記１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記９〕
前記システムは、カバーで密封された、ビアを通して各前記流体チャネルへの供給を行う複数の外部アクセス可能なリザーバを有する基板上の、複数の前記反応ナノチャネル、前記検出ナノチャネル並びに前記第１の横向き流体チャネル及び前記第２の横向き流体チャネルで構成される、付記１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記１０〕
前記マイクロ流体チャネルは、１つ又は複数のリザーバと流体連通し、
前記１つ又は複数のリザーバのうちの少なくとも１つは、分析用の細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースを含む、付記１〜９のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記１１〕
分析用の前記細胞全体は、ゲノムＤＮＡの抽出用のゲルマトリックスにより抑制される、付記１０に記載のシステム。
〔付記１２〕
分析用の前記細胞全体は、ゲノムＤＮＡの抽出用の少なくとも１つの高密度ポストアレイ及び／又は低密度ポストアレイにより抑制される、付記１０に記載のシステム。
〔付記１３〕
前記マイクロ流体進入チャネルは、ＤＮＡを有する細胞全体を含み、
前記第２の横向き流体チャネルは、前記反応ナノチャネルから離間した端部において前記第２の流体リザーバにマージし、
前記第２の流体リザーバは、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の溶液を含む、付記１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記１４〕
前記検出ナノチャネルは真っ直ぐであり、約５００μｍ〜約２ｃｍの長さを有し、
前記反応ナノチャネルは、前記検出ナノチャネルより、長さが約１０倍〜約１０００倍、並びに深さ及び／又は幅が約２倍〜約１０倍大きい、付記１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
〔付記１５〕
分析チップであって：
ポストのアレイを有するマイクロ流体チャネルを用いて、細胞全体、核、染色体全体、又は長鎖ＤＮＡ分子の他のソースからゲノムＤＮＡを抽出するよう適合される、マイクロ流体入口；
長さ５００μｍ〜１０ｃｍの第１の反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、前記マイクロ流体入口に接続する進入部分を有する、第１の反応ナノチャネル；
ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、前記第１の反応ナノチャネルの放出端部とマージする、第１の検出ナノチャネル；
前記第１の反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記第１の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第１の反応ナノチャネルと流体連通する、第１の横向きナノチャネル；並びに
前記第１の横向き流体ナノチャネルの下流において前記第１の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第１の反応ナノチャネルと流体連通する、第２の横向き流体ナノチャネル
を備える、分析チップ。
〔付記１６〕
前記反応ナノチャネルと前記マイクロ流体入口との間に存在し、前記反応ナノチャネルを前記マイクロ流体入口と接続する、ナノファンネルを更に備える、付記１５に記載のチップ。
〔付記１７〕
前記チップによって保持される複数のリザーバを更に備え、
前記複数のリザーバは、前記マイクロ流体入口と流体連通する少なくとも１つのリザーバ、前記第１の横向きナノチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバ、前記第２の横向きナノチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバ、及び前記検出ナノチャネルの端部と流体連通する少なくとも１つのリザーバを含む、付記１５又は１６に記載のチップ。
〔付記１８〕
前記マイクロ流体チャネル内のポストのアレイは、軸に沿って離間している前記アレイの複数のセグメントを備える、付記１５〜１７のいずれか１項に記載のチップ。
〔付記１９〕
前記ポストのアレイは、前記マイクロ流体チャネルの略全幅を横切って延在するよう構成される、付記１５〜１８のいずれか１項に記載のチップ。
〔付記２０〕
前記チップと連通する輸送システムと組み合わされ、
前記輸送システムは、界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも１つを印加することによって、ゲノムＤＮＡ分子及び前記ゲノムＤＮＡ分子の断片の、前記検出ナノチャネルの中への前記反応ナノチャネルを通した輸送を引き起こすよう構成される、付記１５〜１９のいずれか１項に記載のチップ。
〔付記２１〕
長さ５００μｍ〜１０ｃｍの第２の反応ナノチャネルであって、前記反応ナノチャネルは、前記マイクロ流体入口に接続する進入部分を有する、第２の反応ナノチャネル；
ナノチャネルサイズの縮小によって画定される交点において、前記第２の反応ナノチャネルの放出端部とマージする、第２の検出ナノチャネル；
前記第２の反応ナノチャネルの前記進入部分から離間しているものの近接している場所において前記第２の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第２の反応ナノチャネルと流体連通する、第３の横向きナノチャネル；並びに
前記第３の横向き流体ナノチャネルの下流において前記第２の反応ナノチャネルから延在し、且つ前記第２の反応ナノチャネルと流体連通する、第４の横向き流体ナノチャネル
を更に備える、付記１５〜２０のいずれか１項に記載の分析チップ。
〔付記２２〕
細胞全体から抽出されるゲノムＤＮＡの規則正しい制限酵素マップを生成する方法であって：
反応ナノチャネルにマージする流体マイクロチャネルを有するデバイスを提供するステップであって、前記反応ナノチャネルは、検出ナノチャネルに、ナノチャネル直径のサイズが５０〜９９％だけ減少する界面においてマージする、ステップ；
細胞全体を溶解させ、前記マイクロチャネル内での最小の断片化でＤＮＡを染色質除去するステップ；
続いて前記反応ナノチャネルにＤＮＡの無傷分子を導入するステップ；
続いて制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用して前記反応ナノチャネル内で前記無傷ＤＮＡを断片化するステップであって、前記反応ナノチャネルは、前記断片が前記検出ナノチャネルの中に注入されるまで元の順序のままとなるようにサイズ設定及び構成される、ステップ；並びに
前記検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所で信号を検出して、長鎖ＤＮＡ分子に沿って前記断片が発生する順序で前記断片をマッピングするステップ
を含む、方法。
〔付記２３〕
前記デバイスは、前記反応ナノチャネルにマージする前記流体マイクロチャネルと流体連通する少なくとも１つのリザーバを備え、
前記導入するステップは、細胞全体を、前記リザーバを使用する分析のために導入することによって実施され、
前記方法は更に：
前記細胞全体を不動化するためのゲルマトリックス及び／又は高密度ポストアレイを提供するステップ；
続いて前記細胞を溶解するステップ；
ＤＮＡを抽出するステップ；
任意選択で前記ＤＮＡを染色するステップ；
続いて前記ＤＮＡの無傷分子を前記反応ナノチャネルの中に導入するステップ
を更に含む、付記２２に記載の方法。
〔付記２４〕
前記デバイスは、前記反応ナノチャネルの進入端部と流体連通するポストのアレイを有するマイクロ流体チャネル、及び前記マイクロ流体チャネルの下流で前記反応チャネルと流体連通する第１の横向きチャネルを備え、
前記方法は、前記マイクロ流体チャネル及び前記横向きチャネルに電圧を印加して、前記反応ナノチャネルの前記進入領域でビアを生成することによって試料をスレッディングし、装填するステップを更に含む、付記２２又は２３に記載の方法。
〔付記２５〕
前記スレッディングステップは、前記反応チャネルの前記進入部分の近傍において、制御された電圧勾配又は濃度分極勾配を使用して実施され、これにより前記ＤＮＡ分子は初め、ＤＮＡ引張り強さを超える歪みに曝されず、機械的に破損しない、付記２４に記載の方法。
〔付記２６〕
前記スレッディングステップの後、前記装填ステップは、前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される電圧を変更して、毎秒約１μｍ〜毎秒約１ｍｍの速度で前記反応ナノチャネルの中に完全な前記ＤＮＡ分子を引き入れることによって実施され、これにより前記ＤＮＡ分子の終端はいずれの前記ポストの絡み合いから拡散して係合解除するのに十分な時間を有し、機械的な破損が回避される、付記２４に記載の方法。
〔付記２７〕
制限酵素消化の反応は、前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される前記電圧を変更して、前記反応ナノチャネル内に含まれる前記ＤＮＡに制限エンドヌクレアーゼ及び／又は補因子分子を導入することによって実施され、次いで反応を、全ての制限酵素部位が消化されるまで進行させることができる、付記２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
〔付記２８〕
前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される前記電圧は、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の前記マイクロ流体チャネルへの導入を防止し、従って前記反応ナノチャネル外部の前記ＤＮＡ分子の消化を防止する、付記２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
〔付記２９〕
規則正しい制限酵素断片の検出は、前記反応ナノチャネル及び前記横向きナノチャネルに印加される前記電圧を変更して、前記反応ナノチャネルと前記検出ナノチャネルとの間の界面へと前記断片を移行させることによって実施され、
前記検出ナノチャネルの直径は、前記反応ナノチャネルから５０％〜９９％だけサイズが減少され、これにより、各前記断片が交点に到達する際の輸送速度の上昇、及び各隣接する前記断片の分離が得られ、
分離された前記断片の、前記検出ナノチャネルを通した輸送を検出するために、検出ステップが実施される、付記２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
〔付記３０〕
前記スレッディング、前記装填、前記制限酵素消化、及び前記規則正しい制限酵素断片のサイズ設定操作は、定義済みの入力で定常電圧を連続して印加することによって、複数の分子を連続して分析するために実施される、付記２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
〔付記３１〕
前記検出ステップは、前記検出ナノチャネルに沿った１つ又は複数の場所において光学的又は電気的に前記断片を検出することによって実施される、付記２９に記載の方法。
〔付記３２〕
前記方法は、検出された信号持続時間又は統合された振幅を分析することによって前記断片のサイズを決定するステップを更に含む、付記２９に記載の方法。
〔付記３３〕
前記デバイスは流体分析チップである、付記２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
〔付記３４〕
流体分析チップとインタフェース接続するための方法であって：
試料導入、細胞溶解、並びにＤＮＡ抽出及び任意選択で染色を制御するステップ；
ＤＮＡスレッディング及び抽出されたＤＮＡの反応ナノチャネルへの装填、前記反応ナノチャネル内での制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を用いた制限酵素消化、並びに検出ナノチャネルを通した制限酵素断片の規則正しい輸送を、電気的に制御するステップ；
前記検出ナノチャネルを通した輸送中に前記制限酵素断片を電気的に検出するステップ；
リアルタイム又は略リアルタイムの分析を使用してＤＮＡ分子からの前記制限酵素断片のサイズを電気的に分析するステップ；並びに
複数の前記ＤＮＡ分子から共通制限酵素マップを電気的に生成し、前記マップの質を評価して、追加のサンプリングの必要を評価するステップ
を含む、方法。
〔付記３５〕
流体分析チップとインタフェース接続するためのシステムであって：
試料導入、細胞溶解、並びにＤＮＡ抽出及び任意選択で染色を制御するための手段；
ＤＮＡスレッディング及び抽出したＤＮＡの反応ナノチャネルへの装填、前記反応ナノチャネル内での制限エンドヌクレアーゼ及び補因子の制限酵素消化、並びに検出ナノチャネルを通した制限酵素断片の規則正しい輸送のための手段；
前記検出ナノチャネルを通した輸送中に前記制限酵素断片を検出するための手段；
リアルタイムの又は略リアルタイムの分析を使用してＤＮＡ分子から前記制限酵素断片のサイズを分析するための手段；並びに
複数の前記ＤＮＡ分子から共通制限酵素マップを生成し、前記マップの質を評価して追加のサンプリングの必要性を評価するための手段
を備える、システム。
〔付記３６〕
流体分析デバイスであって：
少なくとも１つの反応ナノチャネルにマージする流路を有するマイクロ流体チャネル；
前記少なくとも１つの反応ナノチャネルの上流において前記マイクロ流体チャネルと流体連通する、少なくとも１つのＤＮＡリザーバ；
前記少なくとも１つのＤＮＡリザーバの入口と前記少なくとも１つの反応ナノチャネルとの間に存在する、前記マイクロ流体チャネルと流体連通するスレッディングリザーバ；
前記少なくとも１つの反応ナノチャネルそれぞれの放出端部に接続される、少なくとも１つの検出ナノチャネルであって、各前記検出ナノチャネルは、対応する前記反応ナノチャネルよりも小さい直径並びに／又は小さい幅及び深さを有する、検出ナノチャネル；並びに
前記検出ナノチャネルの近傍に存在する、前記少なくとも１つの反応ナノチャネルと流体連通する、制限エンドヌクレアーゼ及び補因子を含む少なくとも１つのリザーバを含む。
〔付記３７〕
前記デバイスは、各前記検出ナノチャネルの中へとマージする、離間した複数の前記反応ナノチャネルを備える、付記３６に記載のデバイス。
〔付記３８〕
前記デバイスと連通する輸送システムと組み合わされ、
前記輸送システムは、界面動電、圧力又は求心力のうちの少なくとも１つを印加することによって、ゲノムＤＮＡ及び前記ゲノムＤＮＡの断片の、前記検出ナノチャネルの中への前記反応ナノチャネルを通した輸送を引き起こすよう構成される、付記３６又は３７に記載のデバイス。
〔付記３９〕
前記デバイスは、長さ５００μｍ〜１０ｃｍの第２の反応ナノチャネルを備え、
前記第２の反応ナノチャネルは前記第１の反応ナノチャネルの下流に存在し、
前記第２の反応ナノチャネルは、前記第２の反応ナノチャネルと第２の検出ナノチャネルとの間の第２の界面位置において、前記第２の検出ナノチャネルにマージし、
前記第２の界面位置において、前記第２の検出ナノチャネルのサイズは前記第２の反応ナノチャネルに比して縮小する、付記１に記載のデバイス。
〔付記４０〕
前記第１の反応ナノチャネルと流体連通する廃棄物リザーバを更に備え、
前記デバイスは、制限酵素断片を、前記廃棄物リザーバに入るよう、又は前記第２の反応ナノチャネルに入るよう選択的に輸送する回路と連通する、付記３９に記載のデバイス。
〔付記４１〕
第２の反応ナノチャネルを更に備える、付記１５に記載のチップであって、
前記第２の反応ナノチャネルは長さ約５００μｍ〜１０ｃｍであり、前記第１の反応ナノチャネルと流体連通し、前記第１の反応ナノチャネルの下流において前記第２の横向き流体ナノチャネルの後に存在し、
前記チップは、前記制限酵素断片を前記第１の反応ナノチャネルから、流動的に廃棄物出口経路に入るよう、又は流動的に前記第２の反応ナノチャネルに入るよう選択的に配向する回路と連通する、付記１５に記載のチップ。
〔付記４２〕
廃棄物出口経路と、前記第２の横向き流体ナノチャネルの下流に延在する関連付けられた出口チャネルを有する複数の収集リザーバとを更に備え、
前記チップは、前記制限酵素断片を前記第１の反応ナノチャネルから、前記廃棄物出口経路に又は前記収集リザーバのうちの１つに入るよう選択的に配向する回路と連通する、付記１５に記載のチップ。
〔付記４３〕
関心対象の領域がリアルタイムで又は略リルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別するステップ、並びに
制限酵素断片を選択的に且つ自動的に第２のナノ反応チャネルに流動的に輸送するステップであって、前記第２のナノ反応チャネルにおいて、制限酵素断片は、制限酵素消化又はプローブ結合及び後続の第２の検出ナノチャネルにおける検出等の二次反応を受ける、ステップ
を更に含む、付記２２に記載の方法。
〔付記４４〕
関心対象の領域がリアルタイムで又は略リアルタイムでマッピングされる時点を電気的に又は光学的に識別し、後の分析のために関心対象の制限酵素断片を自動的且つ選択的に各収集リザーバ内への各出口チャネルに流動的に輸送し、他の制限酵素断片を廃棄物出口チャネルに流動的に輸送するステップを更に含む、付記２２に記載の方法。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006499638.tif 000004
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
0006499638.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0006499638.tif 000008
【図３Ｃ】
0006499638.tif 000009
【図４Ａ】
0006499638.tif 000010
【図４Ｂ】
0006499638.tif 000011
【図５】
0006499638.tif 000012
【図６Ａ】
0006499638.tif 000013
【図６Ｂ】
0006499638.tif 000014
【図６Ｃ】
0006499638.tif 000015
【図６Ｄ】
0006499638.tif 000016
【図６Ｅ】
0006499638.tif 000017
【図６Ｆ】
0006499638.tif 000018
【図６Ｇ】
0006499638.tif 000019
【図７Ａ】
0006499638.tif 000020
【図７Ｂ】
0006499638.tif 000021
【図７Ｃ】
0006499638.tif 000022
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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