(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２に分類されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼの触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項２】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、真正細菌の生物種としてＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素である請求項１に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項３】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｐｌｕｒａｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ属、Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ属、Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｐａｎｄｏｒａｅａ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ属、Ｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、またはＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属からなる群より選択されるいずれか一種の菌株由来の酵素である請求項１または２に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項４】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来の酵素である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項５】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ由来またはＶｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来の酵素である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項６】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項７】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示される前記ペプチドからなる酵素である請求項６に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項８】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む酵素である請求項１乃至５のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項９】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、遺伝子工学的手法により合成した酵素である請求項１乃至８のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１０】
遺伝子工学的手法により前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼを合成する工程をさらに含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１１】
アスパラギン酸デカルボキシラーゼを合成する前記工程が、前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼを形成するペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を取得する工程を含む、請求項１０に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１２】
前記遺伝子が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１３】
前記遺伝子が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む請求項１１に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１４】
アスパラギン酸デカルボキシラーゼを合成する前記工程が、前記遺伝子を保有するベクターを製造する工程を含む、請求項１１乃至１３いずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１５】
アスパラギン酸デカルボキシラーゼを合成する前記工程が、前記遺伝子を含む形質転換体を製造する工程を含む、請求項１１乃至１３いずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１６】
前記形質転換体の宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌または酵母からなる群より選択される１種の菌体である請求項１５に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
【請求項１７】
Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２に分類されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼを用いてグルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する、アスパラギン酸デカルボキシラーゼの使用方法。
【請求項１８】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ由来またはＶｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来の酵素である請求項１７に記載の使用方法。
【請求項１９】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む請求項１７または１８に記載の使用方法。
【請求項２０】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む請求項１７または１８に記載の使用方法。
【請求項２１】
前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドからなる請求項１７または１８に記載の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２−アミノブタン酸の製造方法およびアスパラギン酸デカルボキシラーゼ使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−アミノ酸である２−アミノブタン酸（ホモアラニン）は、抗てんかん薬や血圧降下薬等の医薬または農薬の原料として幅広い利用が期待されている。
【０００３】
α−アミノ酸の合成方法としては、たとえば、ストレッカー反応を利用する方法、α−アミノ酸のヒドロキシ体に脱アミノ酵素（デアミナーゼ）を作用させ得られたケト体に対し、脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）を作用させる方法、すなわち２種の酵素を作用させる方法（非特許文献１および２）等がある。
【０００４】
また、２−アミノブタン酸の製造方法としては、たとえば以下のものがある。
【０００５】
特許文献１には、光学活性２−アミノブタン酸と光学活性２−フェノキシプロピオン酸誘導体で構成される複合体である光学活性２−アミノブタン酸のジアステレオマーを、水と水に難溶性の有機溶媒との混合液に溶解または懸濁させて攪拌してジアステレオマーを分解させ、水層から光学活性２−アミノブタン酸を回収する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１６９１５８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，  １１，(２００１)，  ｐｐ．１９９−２０５
【非特許文献２】ＰＮＡＳ，  Ｖｏｌ．１０７， Ｎｏ．１４． ｐｐ．６２３４−６２３９
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ｖｏｌ．２２，  Ｎｏ．１６，  ｐｐ．４０２７−４０３７，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１や非特許文献１および２に記載の方法は、多段階反応であるため、目的物質の収率低下、設備費用がかさむ等の不都合があり、コストアップの要因となりうる。
そして、２−アミノブタン酸を一段階の反応で合成する酵素は、これまでに報告されていなかった。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を脱離して２−アミノブタン酸と二酸化炭素に変換する反応に触媒作用を示す酵素を獲得し、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができることを見出し、本発明に至った。
【００１１】
本発明によれば、Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２に分類されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼの触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する、２−アミノブタン酸の製造方法が提供される。
【００１５】
さらに、本発明によれば、Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２に分類されるアスパラギン酸デカルボキシラーゼを用いてグルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する、アスパラギン酸デカルボキシラーゼの使用方法が提供される。
【００１８】
さらに、本発明によれば、上記遺伝子を保有するベクターが提供される。
【００１９】
さらに、本発明によれば、上記遺伝子を含む、形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成する方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本実施形態に係る２−アミノブタン酸の製造方法について説明する。
【００２２】
＜２−アミノブタン酸の製造方法＞
本実施形態に係る２−アミノブタン酸の製造方法は、脱炭酸酵素の触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する構成を採用している。上記構成によれば１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができる。本実施形態に係る２−アミノブタン酸の合成方法は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を脱離して２−アミノブタン酸と二酸化炭素に変換する反応を利用するものである。
【００２３】
脱炭酸酵素としては、たとえば、アスパラギン酸のβ位のカルボキシル基を脱離してアラニンと二酸化炭素に変換する反応に対して触媒作用を示すアスパラギン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ.Ｃ.４．１．１．１２）（非特許文献４）や、グルタミン酸のα位のカルボキシル基を脱離してγアミノ酪酸と二酸化炭素に変換する反応に対して触媒作用を示すグルタミン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１５）等がある。
【００２４】
そして、これまでに、脱炭酸酵素がグルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示すことについては、知られていなかった。
【００２５】
従来、２−アミノブタン酸等のα−アミノ酸を合成する場合、上記背景技術の項で説明したように、多段階の有機合成反応を利用する方法や、２種の酵素反応を組み合わせて利用する方法が考えうる。これに対し、本実施形態では、脱炭酸酵素の触媒作用により１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができる。すなわち、グルタミン酸を直接、２−アミノブタン酸に転化することができる。本実施形態によれば、１段階の酵素反応で安価に２−アミノブタン酸を得ることができる。
【００２６】
そして、本実施形態に係る２−アミノブタン酸の合成方法におけるグルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応液のｐＨは、特に限定されないが、たとえば、ｐＨ４以上１０以下であることが好ましく、ｐＨ５以上９以下であるとさらに好ましい。なお、反応中にｐＨが変動する場合は、適宜調整すればよい。
【００２７】
また、本実施形態に係る２−アミノブタン酸の合成方法におけるグルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応温度は、脱炭酸酵素の酵素活性を維持できる温度であれば特に限定されないが、たとえば、２０℃以上６０℃以下であることが好ましく、２５℃以上５０℃以下であるとさらに好ましい。
【００２８】
＜２−アミノブタン酸＞
本実施形態に係る２−アミノブタン酸は、上記２−アミノブタン酸の製造方法によって得られたものである。
【００２９】
＜脱炭酸酵素＞
本実施形態に係る２−アミノブタン酸の製造方法は、脱炭酸酵素の触媒作用を利用することを特徴としている。そして、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に対して触媒作用を示すものである。なお、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸の合成に使用されるものである。
【００３０】
本実施形態に係る脱炭酸酵素は、真正細菌の生物種としてＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素であることが好ましい。さらに好ましくは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門のＢａｃｉｌｌｉ網またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ網に分類されている菌株由来の酵素、またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門のＡｌｐｈａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ網、ＢｅｔａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ網、ＧａｍｍａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ 網、ＤｅｌｔａＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ またはＥｐｓｉｌｏｎＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ網に分類されている菌株由来の酵素であることがより好ましい。
【００３１】
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素の中では、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＨａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属からなる群より選択されるいずれか１種の菌株由来の酵素であるとさらに好ましい。
【００３２】
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素の中では、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｐｌｕｒａｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ属、Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ属、Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属 、Ｐａｎｄｏｒａｅａ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ属、Ｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、またはＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属からなる群より選択されるいずれか１種の菌株由来の酵素であるとさらに好ましい。
【００３３】
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来の酵素であることが好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の中でもＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来の酵素、またはＶｉｂｒｉｏ属の中でもＶｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｉｉ由来の酵素であるとさらに好ましい。本実施形態に係る脱炭酸酵素は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼまたはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼであることが好ましい。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼまたはＶｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼであるとさらに好ましい。
【００３４】
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、アスパラギン酸デカルボキシラーゼであることが好ましい。なお、従来、アスパラギン酸デカルボキシラーゼの反応基質となる化合物としては、たとえば、Ｌ−アスパラギン酸、アミノマロン酸、β−クロロ−Ｌ−アラニン、エリトロ−β−ヒドロキシアスパラギン酸、Ｌ−システインスルフィン酸またはトレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸等の化合物が知られていたが、グルタミン酸が反応基質となることは知られていなかった。
【００３５】
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素、または配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む酵素であることが好ましい。
【００３６】
ここで、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、天然に存在する菌体が保持する脱炭酸酵素であってもよく、遺伝子工学的手法により合成した脱炭酸酵素であってもよい。
【００３７】
また、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を脱離して２−アミノブタン酸と二酸化炭素に変換する反応に対して触媒作用を示すものであれば、融合蛋白質として発現させたり、タグを付加して発現させたりする場合のように、本実施形態に係る脱炭酸酵素のＮ末端やＣ末端に数残基のアミノ酸が結合していたとしても、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成することができれば使用することができる。
【００３８】
上述の本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する際に用いるものである。このとき、本実施形態に係る脱炭酸酵素は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に対して触媒作用を示すため、１段階の酵素反応で２−アミノブタン酸を合成することができる。
【００３９】
＜脱炭酸酵素の使用方法＞
本実施形態に係る脱炭酸酵素の使用方法は、本実施形態に係る脱炭酸酵素そのものだけでなく、脱炭酸酵素産生能を有する微生物、または高等生物由来の細胞、脱炭酸酵素をコードする遺伝子が形質転換された細胞そのもの、またはこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物、または該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した脱炭酸酵素活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用することもできる。
【００４０】
＜脱炭酸酵素の製造方法＞
本実施形態に係る脱炭酸酵素を製造する方法は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に対して触媒作用を示す酵素が得られる方法であれば、特に限定されないが、たとえば、以下の方法がある。
【００４１】
本実施形態に係る脱炭酸酵素は、公知の遺伝子工学的手法により取得することができる。上記微生物が産生する脱炭酸酵素の分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酵素をコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子や発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、脱炭酸酵素を産生する遺伝子組換え体を作出することができる。
【００４２】
ここで、本実施形態に係る宿主細胞としては、特に限定されないが、たとえば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属の菌株、放線菌、乳酸菌または酵母等の微生物菌株等を利用することができる。
【００４３】
また、本実施形態に係る形質転換体には、２−アミノブタン酸合成において有効な複数のプラスミドが宿主内に存在してもよい。
【００４４】
また、脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）には、形質転換体内で当該脱炭酸酵素の発現に必要な制御領域が挿入されている。ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、及び転写終結配列等を示している。
【００４５】
本実施形態に係る制御領域としては、特に限定されないが、下記公知例があげられる。
【００４６】
宿主細胞として大腸菌や枯草菌などのバクテリアを用いる場合、ベクターに挿入するプロモーター配列は、特に限定されないが、たとえば、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、λファージ由来のＰＬプロモーター、λファージ由来のＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター、または独自に改変・設計されたｔａｃプロモーター等の配列等を利用することができる。
【００４７】
宿主細胞として大腸菌や枯草菌などのバクテリアを用いる場合、ベクターに挿入するリボソーム結合配列は、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されないが、たとえば、１６ＳリボソームＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列や、脱炭酸酵素をコードする遺伝子の上流に位置するＳＤ配列等を利用することができる。
【００４８】
ベクターに挿入する転写終結配列は、必ずしも必要ではないが、たとえば、リポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等のρ因子非依存性の配列等を利用することができる。
【００４９】
脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）において、上述した制御領域の配列順序は、５'末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、脱炭酸酵素をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並べて利用することができる。
【００５０】
このような脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）の作成に用いるクローニングベクターは、特に限定されないが、たとえば、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３―３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５、さらには２種類以上の宿主内で自律複製が可能なｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７またはｐＢＳ７等を利用することができる。
【００５１】
脱炭酸酵素をコードする遺伝子に変異を加える方法としては、特に限定されないが、たとえば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法、ファージを用いる方法、シャペロンを用いる方法等を利用することができる。
【００５２】
＜遺伝子＞
本実施形態に係る遺伝子は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればよい。
【００５３】
本実施形態に係る遺伝子は、上記本実施形態に係る脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードするものである。このため、本実施形態に係る遺伝子は、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子、または配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む遺伝子であることが好ましい。
【００５４】
＜ベクター＞
本実施形態に係る脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含む、本実施形態に係る遺伝子を保有するものである。
【００５５】
＜形質転換体＞
本実施形態に係る形質転換体は、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含む、本実施形態に係る遺伝子を含むものである。
【００５６】
本実施形態に係る形質転換体は、宿主細胞中に上記脱炭酸酵素合成用プラスミド（ベクター）を保有するものである。
【００５７】
ここで、本実施形態に係る形質転換体の宿主細胞としては、特に限定されないが、たとえば、大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌または酵母等を利用することができる。
【００５８】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下、参考形態の例を付記する。
１．脱炭酸酵素の触媒作用により、グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する２−アミノブタン酸の製造方法。
２．前記脱炭酸酵素が、真正細菌の生物種としてＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に分類されている菌株由来の酵素またはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に分類されている菌株由来の酵素である１．に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
３．前記脱炭酸酵素が、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｐｌｕｒａｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｇｉｌｌｉａｍｅｌｌａ属、Ｆｒｉｓｃｈｅｌｌａ属、Ｓｎｏｄｇｒａｓｓｅｌｌａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｐａｎｄｏｒａｅａ属、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ属、Ｍｉｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ属、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、またはＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属からなる群より選択されるいずれか一種の菌株由来の酵素である１．または２．に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
４．前記脱炭酸酵素が、アスパラギン酸デカルボキシラーゼである１．乃至３．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
５．前記脱炭酸酵素が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＶｉｂｒｉｏ属の菌株由来の酵素である１．乃至４．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
６．前記脱炭酸酵素が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ由来またはＶｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来の酵素である１．乃至５．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
７．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素である１．乃至６．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
８．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示される前記ペプチドからなる酵素である７．に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
９．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む酵素である１．乃至６．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
１０．前記脱炭酸酵素が、遺伝子工学的手法により合成した酵素である１．乃至９．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法。
１１．１．乃至１０．のいずれか一項に記載の２−アミノブタン酸の製造方法により得られた、２−アミノブタン酸。
１２．グルタミン酸からの２−アミノブタン酸の合成に使用される脱炭酸酵素。
１３．当該脱炭酸酵素がアスパラギン酸デカルボキシラーゼである１２．に記載の脱炭酸酵素。
１４．前記アスパラギン酸デカルボキシラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｋｅｉ由来またはＶｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来の酵素である１３．に記載の脱炭酸酵素。
１５．配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む１２．乃至１４．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素。
１６．配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチドを含む１２．乃至１４．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素。
１７．配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドからなる脱炭酸酵素。
１８．１２．乃至１７．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素を用いてグルタミン酸から２−アミノブタン酸を製造する、脱炭酸酵素の使用方法。
１９．１２．乃至１７．のいずれか一項に記載の脱炭酸酵素を製造する工程を含む、脱炭酸酵素の製造方法。
２０．脱炭酸酵素を製造する前記工程が、遺伝子工学的手法により脱炭酸酵素を合成する工程を含む、１９．に記載の脱炭酸酵素の製造方法。
２１．グルタミン酸から２−アミノブタン酸を合成する反応に触媒作用を示す脱炭酸酵素を形成するペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子。
２２．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドを含む酵素である２１．に記載の遺伝子。
２３．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列で示されるペプチドからなる酵素である２２．に記載の遺伝子。
２４．前記脱炭酸酵素が、配列番号１、２、３、４または５のアミノ酸配列において１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを含む２１．に記載の遺伝子。
２５．２１．乃至２４．のいずれか一項に記載の遺伝子を保有するベクター。
２６．２１．乃至２４．のいずれか一項に記載の遺伝子を含む形質転換体。
２７．宿主細胞が、大腸菌、枯草菌、放線菌、乳酸菌または酵母からなる群より選択される１種の菌体である２６．に記載の形質転換体。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例、参考例および比較例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
[参考例１]
＜Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するベクターの製造（脱炭酸酵素合成用ベクターの製造）＞
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＮＢＲＣ３５４１を２５ｍＬのＮＢＲＣ培地Ｎｏ．８０４に植菌し、３０℃で数日嫌気培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。次に、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ由来アスパラギン酸デカルボキシラーゼ配列の公知情報（２３Ｋ：ＮＣＢＩ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＹＰ＿３９４９２０.１）をもとに配列番号６および配列番号７に示した２種のプライマーを作製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒間、４０℃で３０秒間、６８℃で１．６分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った。その結果、約１．６ｋｂｐの増幅断片を得た。
【００６１】
次に、得られた増幅断片を制限酵素処理（ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ）し、ｐＵＣ１８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＬＳと命名した。
【００６２】
次に、ｐＬＳを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＬＳ／ＤＨ５α）を作製した。作製した形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌して３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。菌体よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサンプルを調製し、３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により塩基配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００６３】
[参考例２]
＜Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するベクターの製造（変異型脱炭酸酵素合成用ベクターの製造）＞
参考例１で獲得したｐＬＳを鋳型として、配列番号８と配列番号９のプライマーペアで、ＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９６℃で１分間保持した後、９６℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で５分間のサーマルサイクルを１６サイクル行った。得られたＰＣＲ反応液をＤｐｎＩ処理することで、鋳型としたｐＬＳを分解し、ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡを精製、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種した。得られた形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌して３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、得られた菌体からプラスミドを回収し、塩基配列の解析を行い、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異体を含む約４．５ｋｂのプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＬＳ１と命名した。同様に、ｐＬＳを鋳型として、配列番号１０と配列番号１１のプライマーペアで、ＰＣＲ、その後の処理および塩基配列の解析を行い、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異体を含む約４．５ｋｂのプラスミドを作製した。このプラスミドを、ｐＬＳ２と命名した。
【００６４】
次に、ｐＬＳ１を鋳型として、配列番号１０と配列番号１１のプライマーペアで、同様にＰＣＲ、その後の処理および塩基配列の解析を行い、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異体を含む約４．５ｋｂのプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＬＳ３と命名した。
【００６５】
上記３種のプラスミド（ｐＬＳ１、ｐＬＳ２、ｐＬＳ３）をそれぞれ、宿主細胞である大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＬＳ１／ＤＨ５α、ｐＬＳ２／ＤＨ５α、ｐＬＳ３／ＤＨ５α）を作製した。
【００６６】
上記３種の形質転換体（ｐＬＳ１／ＤＨ５α、ｐＬＳ２／ＤＨ５α、ｐＬＳ３／ＤＨ５α）それぞれを、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって、菌体を回収した。
菌体よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサンプルを調製し、３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により塩基配列を解析した。ｐＬＳ１を用いて合成されるペプチドのアミノ酸配列を、配列番号３に、ｐＬＳ２を用いて合成されるペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４に、ｐＬＳ３を用いて合成されるペプチドのアミノ酸配列を、配列番号５に示す。
【００６７】
[参考例３]
＜Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を有するベクターの製造（脱炭酸酵素合成用ベクターの製造）＞
Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ  ＢＡＡ−９１を２５ｍＬのＡＴＣＣ培地＃２に植菌し、２６℃で数日嫌気培養を行い、遠心分離により菌体を回収した。次に、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。
Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ由来アスパラギン酸デカルボキシラーゼ配列の公知情報（ＮＣＢＩ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＺＰ＿０１８６６６４５.１）をもとに配列番号１２および配列番号１３に示した２種のプライマーを作製し、得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃で２分間保持した後、９４℃で１５秒間、４０℃で３０秒間、６８℃で１．６分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った。その結果、約１．６ｋｂｐの増幅断片を得た。
【００６８】
次に、得られた増幅断片を制限酵素処理（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ）し、ｐＵＣ１８（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＶＳと命名した。
【００６９】
次に、ｐＶＳを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＶＳ／ＤＨ５α）を作製した。作製した形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌して３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。菌体よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてサンプルを調製し、３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ社製）により塩基配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００７０】
[参考例４]
＜アスパラギン酸デカルボキシラーゼ合成用大腸菌の製造＞
アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む５種の形質転換体（ｐＬＳ／ＤＨ５α、ｐＬＳ１／ＤＨ５α、ｐＬＳ２／ＤＨ５α、ｐＬＳ３／ＤＨ５αおよびｐＶＳ／ＤＨ５α）から抽出した５種のプラスミド（ｐＬＳ、ｐＬＳ１、ｐＬＳ２、ｐＬＳ３およびｐＶＳ）を、それぞれ、宿主細胞である大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）に形質転換し、アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０、ｐＬＳ１／Ｗ３１１０、ｐＬＳ２／Ｗ３１１０、ｐＬＳ３／Ｗ３１１０、ｐＶＳ／Ｗ３１１０）を作製した。作製した形質転換体をそれぞれ、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。
【００７１】
[参考例５]
＜アスパラギン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を有さない大腸菌の製造＞
大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）に、ｐＵＣ１８を形質転換し、形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を作製した。作製した形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ  ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、３０℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。
【００７２】
＜グルタミン酸からの２−アミノブタン酸の合成＞
[実施例１]
上記方法により得た形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いて、グルタミン酸を原料として２−アミノブタン酸の合成を行った。
グルタミン酸（ＳＩＧＭＡ社製）０．０２ｍｍｏｌ／ｇ、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）０．０６ｍｍｏｌ／ｇ、リン酸ピリドキサール（第一製薬社製）０．０００８ｍｍｏｌ／ｇに、形質転換体の１０％菌体懸濁液０．１gを添加して、２８℃で反応した。反応液はＬＣ-ＭＳおよびＨＰＬＣを用いて分析した。
【００７３】
[実施例２]
＜ＬＣ-ＭＳ分析＞
上記反応液を純水に溶解した後、ＬＣ−ＭＳ分析に供し、マススペクトルを取得した。ＬＣ−ＭＳ分析は、以下の条件で行った。２−アミノブタン酸の標品は、ＳＩＧＭＡ社製Ａ１８７９を用いた。
カラム：Ｘ−ＴｅｒｒａＭＳ１８  ５０×２．１ｍｍＩ．Ｄ．（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３５℃
キャリア：Ａ：ＣＨ３ＣＮ、Ｂ：Ｈ２Ｏ、Ｃ：２ｍＭＩＣＰＰ-ＭＳ-７含有１０ｖｏｌ％ＣＨ３ＣＮａｑ
グラジエント：Ａ／Ｂ／Ｃ＝０／５０／５０〜１５／３５／５０
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
検出：質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＳＱｄｅｔｅｃｔｏｒ）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化法
【００７４】
得られたマススペクトルより、定性分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いた反応液のマススペクトルには標品と同等のｍ／ｚ値および同位体比を示すピークが検出され、グルタミン酸から、形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いて、２−アミノブタン酸が合成されたことが示された。
【００７５】
[実施例３]
＜ＨＰＬＣ分析＞
上記反応液を、ＨＰＬＣ分析に供し、クロマトグラムを取得した。ＨＰＬＣ分析は、以下の条件で行った。２−アミノブタン酸の標品は、ＳＩＧＭＡ社製Ａ１８７９を用いた。
カラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ３  ２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
カラム温度：４０℃
キャリア：０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ：ＣＨ３ＣＯＯＨ＝２：３  ５ｍＭ  ＣＨ３(ＣＨ２)７ＳＯ３Ｎａ
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ（キャリア）、０．４ｍｌ／ｍｉｎ（ＯＰＡ）
検出：蛍光検出器（オルトフタルアルデヒドを用いたポストカラム誘導体化法、ＪＡＳＣＯ社製、Ｘ−ＬＣ３１２０ＦＰ）
【００７６】
得られたクロマトグラムより定量分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＬＳ／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、４．８μｇ/ｇの２−アミノブタン酸が生成していることが示された。
【００７７】
[実施例４]
実施例１、２および３と同様の方法で、３種の形質転換体（ｐＬＳ１／Ｗ３１１０、ｐＬＳ２／Ｗ３１１０、ｐＬＳ３／Ｗ３１１０）を用いてそれぞれ反応およびＬＣ-ＭＳ分析、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＬＳ１／Ｗ３１１０、ｐＬＳ２／Ｗ３１１０、ｐＬＳ３／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、いずれの反応液においても実施例１、２および３と同程度の２−アミノブタン酸が生成していることが示された。
【００７８】
[実施例５]
実施例１、２および３と同様の方法で、形質転換体（ｐＶＳ／Ｗ３１１０）を用いて、反応およびＬＣ-ＭＳ分析、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＶＳ／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、７．８μｇ/ｇの２−アミノブタン酸が生成していることが示された。
【００７９】
[比較例１]
実施例１、２および３と同様の方法で、形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を用いて、反応およびＬＣ-ＭＳ分析、ＨＰＬＣ分析を行った。その結果、形質転換体（ｐＵＣ１８／Ｗ３１１０）を用いた反応液には、２−アミノブタン酸が生成していないことが示された。
【配列表】
0006484467000001.app