(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が牛乳に対してアレルギーであるかどうかを判定するための方法であって、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドを提供するステップであって、別々に識別可能な固体支持体に各ペプチドがコンジュゲートされる、ステップ；
ｂ）各固体支持体上の前記ペプチドへの血清中のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）の結合を可能にするのに十分な条件下で各固体支持体と前記対象から取得された血清を接触させてペプチド−ＡＡＩ複合体を形成させるステップ；
ｃ）前記ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ−特異的標識試薬を結合させるステップ；及び
ｄ）各ペプチド−ＡＡＩ複合体への前記標識試薬の結合を分析して、前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドを特定するステップ；
を含み、
前記対象の血清中のＡＡＩによる少なくとも１つのペプチドの認識は、前記対象が牛乳に対してアレルギーであることを示す、
方法。
【請求項２】
前記ＡＡＩがＩｇＧ及び／又はＩｇＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩｇＧがＩｇＧ４である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のペプチドが、配列番号１〜９、配列番号１０〜１５、配列番号１６〜２３、配列番号２４〜２７、配列番号番２８〜３３、またはこれらの組み合わせによって表される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
牛乳にアレルギーを示す対象において牛乳に対する臨床耐性の発生を検出するための方法であって、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドに対する前記対象の血清のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）反応性の初期プロファイルであって、前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの初期数又は各ペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩの初期濃度を規定する初期プロファイルを提供するステップ；
ｂ）別々に識別可能な固体支持体に各々がコンジュゲートされた前記複数のペプチドを提供するステップ；
ｃ）前記初期プロファイルに続く時点において、各固体支持体上の前記ペプチドへの血清中のＡＡＩの結合を可能にするのに十分な条件下で各固体支持体と前記対象から取得された血清を接触させてペプチド−ＡＡＩ複合体を形成させるステップ；
ｄ）前記ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ−特異的標識試薬を結合させるステップ；及び
ｅ）各ペプチド−ＡＡＩ複合体への前記標識試薬の結合を分析して、前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数又は各ペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度を特定するステップ；
を含み、
前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの前記その後の数が、前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの前記初期数よりも少ない場合、又は少なくとも１つのペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩの前記その後の濃度が、前記少なくとも１つのペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩの前記初期濃度よりも低い場合に、牛乳に対する臨床耐性の発生が示される、
方法。
【請求項６】
前記複数のペプチドが、配列番号１〜９、配列番号１０〜１５、配列番号１６〜２３、配列番号２４〜２７、配列番号番２８〜３３、またはこれらの組み合わせによって表される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
選択されるペプチドとのＡＡＩ反応性の定量的減少パターンを用いて、前記対象における牛乳に対する臨床耐性の発生を予測する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
牛乳にアレルギーを示す対象において経時的な牛乳アレルギー強度の増加を検出するための方法であって、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドに対する前記対象の血清のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）反応性の初期プロファイルであって、前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの初期数又は各ペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩの初期濃度を規定する初期プロファイルを提供するステップ；
ｂ）別々に識別可能な固体支持体に各々がコンジュゲートされた前記複数のペプチドを提供するステップ；
ｃ）前記初期プロファイルに続く時点において、各固体支持体上の前記ペプチドへの血清中のＡＡＩの結合を可能にするのに十分な条件下で各固体支持体と前記対象から取得された血清を接触させてペプチド−ＡＡＩ複合体を形成させるステップ；
ｄ）前記ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ−特異的標識試薬を結合させるステップ；及び
ｅ）各ペプチド−ＡＡＩ複合体への前記標識試薬の結合を分析して、前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数又は各ペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度を特定するステップ；
を含み、
前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの前記初期数と比較した場合の前記対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの前記その後の数の増加、又は少なくとも１つのペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩの前記初期濃度と比較した場合の少なくとも１つのペプチドを認識する前記対象の血清中のＡＡＩの前記その後の濃度の増加は、前記対象における牛乳に対するアレルギー反応の強度の増加を示す、
方法。
【請求項９】
前記複数のペプチドが、配列番号１〜９、配列番号１０〜１５、配列番号１６〜２３、配列番号２４〜２７、配列番号番２８〜３３、またはこれらの組み合わせによって表される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
選択されるペプチドとのＡＡＩ反応性の定量的増加パターンを用いて、牛乳に対するアレルギーの強度の増加を予測する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１〜３３によって表されるペプチドからなる群から選択される複数のペプチド及び／又は配列番号１〜３３の１２個以上の連続したアミノ酸によって表されるペプチドからなる群から選択される複数のペプチドを含む、牛乳アレルギーの検出のためのアレルゲンエピトープ含有ペプチドのセット。
【請求項１２】
配列番号１〜９、配列番号１０〜１５、配列番号１６〜２３、配列番号２４〜２７、配列番号番２８〜３３、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのセット。
【請求項１３】
牛乳アレルギーの検出、牛乳アレルギーの強度の経時的な増減の検出、又は牛乳に対する臨床耐性の発生の検出のためのキットであって、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドと；
ｂ）第１のレポーター部分にコンジュゲートされた抗アレルギー関連免疫グロブリン抗体（抗ＡＡＩ）を含む標識試薬と；
ｃ）必要に応じて、前記標識試薬に特異的に結合する第２のレポーター部分と；
ｄ）使用説明書と；
を含む、キット。
【請求項１４】
前記使用説明書が、治療に対する患者の自然耐性、反応性を予測するか、又はアレルギー反応の増加を予測する前記キットの使用のためのものである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのセットを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
フローサイトメトリー分析用の多重ペプチド−ビーズアッセイ、または側方流動アッセイである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギーを診断し、かつアレルギーの対象がそのアレルギーを克服する可能性があるかどうかを決定するためのペプチドバイオマーカーに関する。本発明はまた、ペプチドバイオマーカーを用いた診断方法及び診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
配列表の相互参照
２０１５年３月１８日に作成され、「ＤＳＣ００５６−００ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１４１．１  ＫＢ）と特定される配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
食物アレルギーは大人と子供の間の共通の問題であり、症状は、軽度の経口そう痒症から潜在的に生命を脅かすアナフィラキシーショックに及び得る。食物アレルギーは、現在、皮膚プリック検査又は経口誘発、及び特異的ＩｇＥの血清レベル、場合によっては、ＩｇＧ４などの他の血清抗体の測定により診断されている。これらの検査は、臨床反応の可能性を示すが、食物アレルギーの異なる表現型を区別しないか、又は予後情報を提供しない。それらはまた、患者に対してある程度のレベルのリスクを伴う。現在のＩｇＥ検査と患者の実際の臨床的感度との関係は、通常、反応の重症度と反応を引き起こすアレルゲンの量の組み合わせとして定義される弱いものである。現在の検査のもう１つの制限は、小児患者が小児期にアレルギーを克服するかどうかを判断することができないことである。この場合、特異的ＩｇＥレベルと臨床アレルギーの期間との間に正の弱い相関がある。
【０００４】
さらに最近では、食物アレルゲンに対する臨床的反応性がエピトープ認識レベルでアレルゲン特異的ＩｇＥとより良好に相関し得ることが示唆されている。持続的な又はより重度のアレルギー反応を有する患者は、より多数のＩｇＥエピトープを認識することが報告されており、アレルギーの診断及び予測のための追加のツールとして、エピトープマッピングが示唆されている。エピトープマッピング用のスポット膜ベースのイムノアッセイが使用されている。このシステムでは、ペプチドは、膜上で合成され、患者の血清とインキュベートされる。このプロセスは、多数のペプチドを必要とし、そのため、誤りがちで、時間がかかり、労働集約的で、かつ高価である。このフォーマットのイムノアッセイはまた、多量の患者の血清を必要とする。
【０００５】
マイクロアレイなどの多重アッセイ技術の開発、及びペプチド合成技術の進歩は、食物アレルゲンのエピトープマッピングを向上させた。マイクロアレイフォーマットのイムノアッセイは、少量の希釈した血清を用いて、平行して数千の標的ペプチドをアッセイし、大幅にコストを削減し、分析に対して良好な再現及び統計的なアプローチを可能にすることができる。残念ながら、マイクロアレイに基づく検査は、スループットは高くないが、再現性の制限を克服するために複数回の反復を頻繁に必要とする。
【０００６】
ハイスループットアッセイフォーマットは、自動化された方法で複数の患者の検体を迅速に処理する利点を有し、多重化スクリーニング法への適用のために開発された。ＬＵＭＩＮＥＸ／ｘＭＡＰ技術などのビーズベースの多重化には、赤色蛍光体及び赤外蛍光体で染色した５．６μｍのポリスチレンビーズが使用される。それぞれ異なる量の２種類の蛍光体を使用して、最大５００個の異なる特定のスペクトルシグネチャが生成され得、単一の反応容量で、理論的に５００個までの検査が可能である。典型的なタンパク質アッセイでは、抗体は、ビーズの表面にコンジュゲートされ、目的の分析物を捕捉する。その後、目的の分析物に特異的なビオチン化検出抗体が結合し、抗体−抗原サンドイッチを形成する。フィコエリトリンにコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）とビオチンの相互作用を用いて、複合体を標識する。分析物を検出するために、ビーズは、デュアルレーザーフローベースの検出器で読み取られる。１つのレーザーは、取り込まれた色素に応じてビーズを分類し、検出されている分析物を決定する。第２のレーザーは、結合した分析物の量に正比例するＰＥ由来のシグナルの大きさを決定する。このようなアッセイは、ＥＬＩＳＡプレートアッセイと比較して、必要な捕捉抗体及び試料の量を減らし、ひいては、コストを削減し、希少な又は取得困難な試料材料を節約する。一般的に、アッセイのダイナミックレンジ及び感度も改善される。
【０００７】
牛乳アレルギー（ＣＭＡ）は、子供たちの中で最も一般的な食物アレルギーの１つである。牛乳アレルギーは、典型的には、牛乳のいくつかの成分タンパク質に対する感受性を伴う。これらには、カゼイン画分中のタンパク質（αｓ−１−カゼイン、αｓ−２−カゼイン、β−カゼイン、及びκ−カゼイン）、α−ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンが含まれる。エピトープの構造及び配列の両方が、抗体反応を惹起し得る。子どもたちの大半は最終的にはＣＭＡを克服する（すなわち、彼らは臨床的に耐性になる）が、いく人かは、その後の人生において感受性を維持する。臨床耐性の発生に寄与するメカニズムは十分に理解されていないが、持続的なＣＭＡを有する子どもたちのＩｇＥ抗体は、アレルギーを克服する可能性がある患者のＩｇＥ抗体によって認識されない牛乳タンパク質の特定のエピトープを認識することができると仮定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エピトープ配列の認識などのエピトープ分析は、ＣＭＡの持続性に関する有用な情報を提供することができる。ペプチドマイクロアレイの結果は、牛乳アレルギーの臨床的特徴との相関を示し、すなわち、牛乳アレルギーを有する患者と牛乳耐性の患者は、異なるエピトープ認識パターンを証明した。牛乳ペプチドへのＩｇＥ及びＩｇＧ４の相対的結合の変化は、アレルギーの存在又は臨床的改善と相関することも実証された。
【０００９】
しかしながら、ＣＭＡを診断し、ＣＭＡの臨床転帰を予測するのに有用である有益なエピトープを特定する必要がある。マイクロアレイイムノアッセイの欠点を克服し、同様のワークフローで高スループット、柔軟性の向上、試料の量の低減、及び低コストを提供する新たなアッセイプラットフォームも必要である。本発明は、これらの必要性に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の実施形態において、本発明は、ＣＭＡの診断、牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生の検出、及びアレルギー反応の強度の増減の監視に有用である牛乳タンパク質のアレルゲンエピトープを含有するペプチドに関する。
【００１１】
第１の実施形態の具体的な態様において、アレルゲンエピトープ含有ペプチドは、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、β−ラクトグロブリン及びκ−カゼインのアレルゲンペプチドエピトープからなる群から選択される複数のペプチドである。さらなる特定の実施形態において、アレルゲンエピトープ含有ペプチドは、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドである。
【００１２】
【表１】
0006452718.tif 000002
【００１３】
ＣＭＡの診断、牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生の検出、及びアレルギー強度の増減の検出のための方法に有用であるペプチドには、牛乳タンパク質の非反応性エピトープを含有するペプチドも含まれ得る。これらのペプチドは、陰性対照として有用である。特定の態様において、陰性対照エピトープを含有するペプチドは、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、及びβ−ラクトグロブリンの非反応性ペプチドエピトープからなる群から選択される１以上のペプチドである。さらなる特定の実施形態において、非反応性エピトープ含有ペプチドは、以下からなる群から選択される１以上のペプチドである：
【００１４】
【表２】
0006452718.tif 000003
【００１５】
第２の実施形態において、本発明は、前述の複数（すなわち、２種以上）のアレルゲンエピトープ含有ペプチドを用いてＣＭＡを診断する方法に関する。特定の態様において、対象中のＣＭＡは、
ａ）各ペプチドが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドを提供すること；
ｂ）各固体支持体上のペプチドへの血清中のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）の結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＡＡＩ複合体を形成するために、各固体支持体と対象から得た血清を接触させること；
ｃ）該ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ−特異的標識試薬を結合させること；及び
ｄ）該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドを特定するために、各ペプチド−ＡＡＩ複合体への標識試薬の結合を分析すること；
を含み、該対象の血清中のＡＡＩによる少なくとも１つのペプチドの認識は、該対象が牛乳に対してアレルギーであることを示す方法によって診断される。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、前述の複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドを用いて、ＣＭＡを有する対象における臨床耐性の発生を検出する方法に関する。特定の態様において、ＣＭＡを有する対象における牛乳に対する臨床耐性の発生は、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドへの該対象の血清中のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）の反応性の初期プロファイルであって、該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの初期数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩの初期濃度を規定する初期プロファイルを提供すること；
ｂ）各ペプチドが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドを提供すること；
ｂ）各固体支持体上のペプチドへの血清中のＡＡＩの結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＡＡＩ複合体を形成するために、初期プロファイルに続く時点で各固体支持体と該対象から得た血清とを接触させること；
ｃ）該ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ−特異的標識試薬を結合させること；及び
ｄ）該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度を特定するために、各ペプチド−ＡＡＩ複合体への標識試薬の結合を分析すること；
を含み、該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数が、該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの初期数よりも少ない場合、又は少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度が、少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩ初期濃度よりも低い場合に、牛乳に対する臨床耐性の発生が示される方法によって検出される。
【００１７】
別の実施形態において、臨床耐性の発生の最初の検出は、患者がアレルギーに対する自然耐性を発生させるか、又は治療に反応するかのいずれかを予測するために使用される。この実施形態において、アレルギーの対象は、初期プロファイルを分析する前に、免疫原（免疫療法）に暴露される。その後の時点で、初期プロファイル中のペプチドとの反応性が高い全てのＡＡＩの血清濃度において少なくとも２倍の低下がある場合、該対象は、牛乳に対する臨床耐性又は自然耐性のいずれかを発生する可能性がある。その後の時点で、初期プロファイル中のペプチドとの反応性が高い全てのＡＡＩより少ないＡＡＩの血清濃度において少なくとも２倍の低下がある場合、該対象は、牛乳に対するわずかな部分的臨床耐性又は自然耐性を発生する可能性がある。
【００１８】
他の実施形態において、本発明の方法を用いて、ある期間にわたって、対象における牛乳に対するアレルギー反応の強度（ＣＭＡ強度）の増加（又は減少）を検出することができる。特定の態様において、アレルギー反応の強度の増加の検出は、以前に牛乳耐性になった対象におけるＣＭＡの発生に対応し得る。あるいは、アレルギー反応の強度の増加の検出は、以前からＣＭＡを有することが知られている対象におけるアレルギー強度の増加に対応し得る。上記のように、牛乳に対するアレルギー反応の強度の減少の検出は、牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生の一態様である。
【００１９】
具体的な態様において、対象における牛乳アレルギーの強度の経時的な増加は、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドへの該対象の血清中のアレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）反応性の初期プロファイルであって、該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの初期数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩの初期濃度を規定する初期プロファイルを提供すること；
ｂ）各ペプチドが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドを提供すること；
ｂ）各固体支持体上のペプチドへの血清中のＡＡＩの結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＡＡＩ複合体を形成するために、初期プロファイルに続く時点で各固体支持体と該対象から得た血清を接触させること；
ｃ）該ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ−特異的標識試薬を結合させること；及び
ｄ）該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度を特定するために、各ペプチド−ＡＡＩ複合体への標識試薬の結合を分析すること；
を含み、該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドの初期数と比較した場合の該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数の増加、又は少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩ初期濃度と比較した場合の少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度の増加は、該対象における牛乳に対するアレルギー反応の強度の増加を示す方法によって検出される。
【００２０】
本発明の方法の前述の実施形態及び態様のいずれも、複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのそれぞれが、マイクロタイタープレートの別々のウェルに結合し、血清と反応して、ＡＡＩと結合するマイクロアレイイムノアッセイの形態であってよい。結合したＡＡＩは、ＡＡＩ特異的標識試薬、例えば、蛍光標識などのレポーター部分にコンジュゲートされた抗ＡＡＩ抗体の結合によって検出される。結合標識試薬の蛍光は、ウェルに結合したペプチドに含有されるアレルゲンエピトープに対する抗体の血清中の存在を示す。複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、各ペプチドが多孔性又はクロマトグラフィー支持体上の別々の領域内で固定され、ＡＡＩを該ペプチドに結合させるために、血清が支持体を通って流れ、該ペプチドと接触する側方流動免疫アッセイ形式で使用されてもよい。このアッセイでは、ＡＡＩ特異的標識試薬は、抗ＡＡＩ抗体にコンジュゲートされた発色団又は色素を含んでもよい。標識試薬の複合体への結合のために、標識試薬も、支持体を通って流れ、ペプチド−ＡＡＩ複合体と接触し、この結合は、支持体のそれぞれ別々の位置で固定されたペプチド中に含有されるアレルゲンエピトープに対する抗体の血清中の有無を示す。
【００２１】
他の態様において、本発明の方法の前述の実施形態及び態様のいずれも、それぞれのアレルゲンエピトープ含有ペプチドが、ビーズなどの、フローサイトメトリーによる分析に適する別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされているフローサイトメトリーアッセイの形態であってよい。典型的には、該ペプチドは、固体支持体上でのペプチド特異的捕捉抗体への結合によって又は固体支持体への化学結合によって固体支持体にコンジュゲートされる。この態様において、コンジュゲートされたアレルゲンエピトープ含有ペプチドを有するビーズは、対象の血清と接触して、ビーズに存在する任意のペプチド特異的ＡＡＩと結合し、ビーズ上でペプチド−ＡＡＩ複合体を形成する。次いで、蛍光レポーター部分を含むＡＡＩ−特異的標識試薬は、このペプチド−ＡＡＩ複合体に結合し、ビーズは、フローサイトメトリーにより定量的又は定性的に分析される。これは、アレルゲンエピトープ含有ペプチドがコンジュゲートする各ビーズに関連する結合標識試薬からの蛍光を検出し、それによって、ペプチド及びそれと反応するＡＡＩの血清中の存在を特定する。配列番号１〜３３の中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドの少なくとも１つに反応するＡＡＩの存在は、対象が牛乳アレルギーであることを示し、反応性ペプチドの数の経時変化、又は１以上のペプチドに反応するＡＡＩの濃度の経時変化は、その期間にわたるアレルギー強度の増加、アレルギー強度の減少、又は臨床耐性の発生を示す。
【００２２】
さらなる態様において、フローサイトメトリーアッセイは、ペプチド及びタンパク質の定量並びに検出のためのマイクロスフィアアレイプラットフォームを使用するＬＵＭＩＮＥＸ  ｘＭＡＰ技術などの多重アッセイであってよい。複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのそれぞれは、関連するアレルゲンエピトープ含有ペプチドをフローサイトメトリーによって特定するために使用することができる異なるスペクトル特性を有するビーズのセットに結合される。次いで、このビーズのセットは対象の血清と接触し、ペプチド認識ＡＡＩと各ビーズが結合して、ビーズ上でペプチド−ＡＡＩ複合体を形成し、蛍光レポーター部分を含むＡＡＩ特異的標識試薬がこの複合体のＡＡＩに結合する。これらのビーズは、各ビーズのスペクトル特性及び結合標識試薬からの関連する蛍光量を監視することによって分析される。このプロセスは、ビーズ上のペプチド、及びそれに反応する血清ＡＡＩの有無の特定を可能にする。このアッセイの結果は、上記のように解釈される。
【００２３】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＭＡの検出、ＣＭＡ強度の増減の検出、又は牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生の検出のためのキットであって、
ａ）配列番号１〜３３の中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチド；
ｂ）第１のレポーター部分にコンジュゲートされた抗アレルギー関連免疫グロブリン（ＡＡＩ）抗体を含む標識試薬；及び
ｃ）必要に応じて、標識試薬に特異的に結合する第２のレポーター部分、
を含み、共に包装され、使用説明書を含むキットに関する。
【００２４】
標識試薬は、蛍光色素、放射性標識、又は着色色素などの、直接検出可能である第１のレポーター部分にコンジュゲートされてもよい。具体例として、フィコエリトリン（ＰＥ）分子は、抗アレルギー関連免疫グロブリンに直接結合して、検出のために使用され得る。あるいは、第１レポーター部分は、間接的に検出可能なレポーター部分（例えば、発色性色素の酵素標識）であり得、該キットは、必要に応じて、直接検出可能な標識にコンジュゲートされた第１のレポーター部分に特異的な結合パートナー（第２のレポーター部分）を含んでもよい。例えば、該キットは、ビオチンコンジュゲート抗ＡＡＩ抗体及びビオチンコンジュゲート抗ＡＡＩを検出するためのストレプトアビジンコンジュゲート蛍光色素を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＣＭＡのための免疫療法を受けている牛乳耐性個体の、配列番号１〜３３のペプチドパネルへの経時的な血清反応性を示す。
【図２】ＣＭＡのための免疫療法に反応して脱感作になったＣＭＡを有する個体の、配列番号１〜３３のペプチドパネルへの経時的な血清反応性を示す。
【図３】ＣＭＡのための免疫療法に部分的に反応したＣＭＡを有する個体の、配列番号１〜３３のペプチドパネルへの経時的な血清反応性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
図面において、「ａ」で始まる特定されたペプチドは「アルファ」を表し、「ｂ」で始まる特定されたペプチドは「ベータ」を表し、「κ」で始まる特定されたペプチドは「カッパ」を表す。
【００２７】
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、以下の説明に記載された構成又はプロセスステップの詳細に限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、かつ様々な方法で実施又は実行できる。
【００２８】
本明細書を通して「一実施形態」、「特定の実施形態」、「１以上の実施形態」又は「１つの実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、材料、又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な箇所での「１以上の実施態様において」、「特定の実施形態において」、「一実施形態において」、又は「１つの実施形態において」などの語句の出現は、必ずしも本発明の同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、材料、又は特性は、１以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【００２９】
本明細書で使用される用語「アレルギー関連免疫グロブリン」及び「ＡＡＩ」は、食物アレルゲンに対する過敏症を媒介する血清中の免疫グロブリンを指す。これらは、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＧ（ＩｇＧ４を含む）のうちの１以上を含む。
【００３０】
本明細書で使用される「反応性の」、「反応性」、及び「認識する」などの用語は、アレルゲンエピトープ含有ペプチドに結合するアレルギー関連免疫グロブリンの能力を指す。反応性のレベルは血清中のＡＡＩの濃度を示し、高い反応性は高いＡＡＩ濃度と関連し、低い反応性は低いＡＡＩ濃度と関連する。相対ＡＡＩ濃度（すなわち、相対的血清反応性）は、アッセイで検出されたシグナルの量によって決定される。アレルゲンエピトープ含有ペプチドに対するＡＡＩの反応性のレベルもアレルギー反応の強度を示し、すなわち、より高い反応性は、より強いアレルギー反応と関連する。
【００３１】
本明細書で使用される用語「臨床耐性」は、アレルゲンに対する曝露の結果としてアレルギー対象で発生した食物アレルゲンに対する免疫寛容、すなわち、免疫療法の結果として発生した耐性を指す。
【００３２】
本明細書で使用される用語「自然耐性」は、生存期間中のアレルゲンに対する自然暴露の結果として、又は暴露の非存在下で、生化学的プロセスとして経時的にアレルギー対象で発生した食物アレルゲンに対する免疫寛容を指す。
【００３３】
本明細書で開示されるアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、特定のアミノ酸配列を有する特定の実施形態として説明されるが、当業者なら、そのようなペプチドのそれぞれが、なおも関連エピトープを含有するが、関連エピトープが指定されたものとは異なるアミノ酸と隣接している関連ペプチド配列を得るために導き出されるタンパク質のＮ末端又Ｃ末端方向のいずれかにシフトされ得ることを認識すると理解されたい。したがって、全ての実施形態及び態様において、本発明は、８個以上連続するアミノ酸によって、開示されるペプチド配列と重複するアミノ酸配列を有するアレルゲンエピトープ含有ペプチドを含む。
【００３４】
配列番号１〜３３によって表されるアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、１０人を超える高アレルギー個体においてＺ−スコアを有するものとして、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、β−ラクトグロブリン、及びκ−カゼイン由来のペプチドライブラリー中で特定された。高アレルギー対象において、配列番号１〜３３の全３３種のペプチドは血清と反応する。逆に、非アレルギー対象において、配列番号１〜３３の３３種のペプチドはいずれも血清と反応しない。配列番号１〜３３の個々のペプチドは、個体におけるＣＭＡ強度を決定するのに、かつＣＭＡ強度の経時変化を監視するのに有用である反応性の連続も提供する。非反応性と最高の反応性の間に入る牛乳アレルギー強度を有する個体は、配列番号１〜３３の中のペプチドの全てではないがいくつかと反応する血清を有する。一般的に、これらの個体の血清と反応する配列番号１〜３３の中のペプチドの数は、アレルギー強度と正に相関しており、すなわち、アレルギー強度が高いほど、配列番号１〜３３の中のより多くのペプチドが血清と反応する。軽度のアレルギーを有する個体の血清は、より強いアレルギーを有する個体の血清よりも少ないペプチドと反応する。したがって、本発明は、ＣＭＡを診断する方法を提供するだけでなく、牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生の検出を含む、アレルギー強度を決定する方法、及びアレルギー強度の経時変化を決定する方法を提供する。
【００３５】
本発明の特定の態様において、ＣＭＡ対象の血清と反応する配列番号１〜３３のグループ内のアレルゲンエピトープ含有ペプチドの数は、アレルギー反応の強度と正の相関を有し、すなわち、より少ないペプチドとの反応性は、牛乳に対してより軽度のアレルギー反応を示し、より多くのペプチドとの反応性は、対象が牛乳に対してより高度にアレルギーであることを示す。本発明の別の態様において、配列番号１〜３３によって表されるペプチドへの血清ＩｇＥの結合強度（血清中のＩｇＥ濃度の測定）は、アレルギー反応の強度と相関し、すなわち、全３３種のペプチド又は３３種のペプチドのサブセットとのより弱い反応性は、全３３種のペプチド又はペプチドのサブセットとのより強い反応性と比較してより中程度のアレルギー反応を示す。本明細書で使用される場合、アレルゲンエピトープ含有ペプチドとの「非反応性」又は「負」の反応性への言及は、約２未満のアッセイにおけるシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を意味する。典型的なバックグラウンドシグナル（Ｎ）は、非アレルギー性個体からの血清のプールによって生成されたシグナルである。あるいは、本発明は、バックグラウンドシグナルを確立するためのベースとして負のペプチドの使用を企図する。本明細書で使用される場合、アレルゲンエピトープ含有ペプチドとの「弱い」又は「中程度」「中程度」の反応性への言及は、約２〜１０のＳ／Ｎを意味するが、この値は、ペプチド及びアレルギーに応じて変化し得る。本明細書で使用される場合、アレルゲンエピトープ含有ペプチドとの「高い」又は「強い」反応性への言及は、約１０より大きいＳ／Ｎを意味する。
【００３６】
牛乳タンパク質中のペプチドエピトープの分析に基づくこれまでに知られているＣＭＡのアッセイは、エピトープへのＩｇＥ及びＩｇＧ４の結合の相対的親和性の分析に依存する競合イムノアッセイである。抗体結合の親和性は、対象が牛乳に対する臨床耐性を発生するかどうかに関連していると考えられる。対照的に、一態様において、本発明は、ＣＭＡの診断、アレルギー反応の強度、及び耐性を発生するか、又は対象の血清中のＩｇＥと結合したエピトープ（すなわち、ペプチド）の数に基づくアレルギー反応の増加を経験する患者の可能性と相関する、重要な牛乳タンパク質エピトープのセット内の各個々のペプチドへのＡＡＩ結合の有無の分析に基づく。第２の態様において、本発明は、アレルギー反応の強度とも相関する、アレルゲンエピトープ含有ペプチドのそれぞれと反応する血清中のＡＡＩの濃度分析に基づく。
【００３７】
本発明の一実施形態は、各ペプチドが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドを提供すること、、各固体支持体上のペプチドへの血清中のＡＡＩの結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＡＡＩ複合体を形成するために、各固体支持体と対象から得た血清を接触させること、、各ペプチド−ＡＡＩ複合体にＡＡＩ特異的標識試薬を結合させること、及び該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドを特定するために、各ペプチド−ＡＡＩ複合体への標識試薬の結合を分析することを含む、対象におけるＣＭＡを診断する方法に関する。牛乳アレルゲンへの曝露後に、少なくとも１つのペプチドが、中程度又は高度に血清ＡＡＩ（Ｓ／Ｎ＞２）と反応し、反応性ペプチドの１以上の反応性が、約６カ月以内に少なくとも２倍減少しない場合に、該対象は、ＣＭＡを有すると診断される。
【００３８】
ＣＭＡ免疫療法の投与後の牛乳耐性個体の血清反応性を図１に示す。この実験では、牛乳耐性個体がＣＭＡのための免疫療法で治療され、血清試料を６〜１２カ月間隔をあけて採取した。免疫療法に対する初期反応は、約１１種のペプチドとの中程度から高い反応性（青いバー、Ｓ／Ｎ＞２）をもたらすことが分かる。６カ月以内（オレンジ色のバー）に、これらのペプチドの全てに対する反応性に少なくとも約２倍の減少があった。ｋｃａｓ−０４は、反応性にわずか２倍未満の範囲の減少があったが、最も反応性の高いペプチド（例えば、ａｓ  １−０９、ａｓ  １−４４）は、６カ月以内に実質的に２倍より大きく、少なくとも５倍の範囲内で反応性の減少を示した。さらに、反応性ペプチドのいずれも（Ｓ／Ｎ＞２）、６カ月の時点で反応性を減少しなかったものはない。
【００３９】
本方法の別の態様において、各ペプチド−ＡＡＩ複合体への標識試薬の結合の分析は、血清中の各ペプチド特異的ＡＡＩの濃度を示す結合の程度の分析を含み得る。配列番号１〜３３のペプチドの全て、又はそのサブセットとの低い血清反応性から中程度の血清反応性は、血清中のペプチド特異的ＡＡＩの濃度が低いこと、かつＣＭＡが軽度から中程度であることを示し、ペプチドの全て又はそのサブセットとの高い血清反応性は、血清中のペプチド特異的ＡＡＩの濃度が高いこと、かつＣＭＡがより重篤であることを示す。ＣＭＡの診断のための結合分析には、血清と反応するペプチドの数、該ペプチドへの血清ＡＡＩの結合の程度、又はその両方が使用され得る。
【００４０】
特定の態様において、本発明はさらに、対象が高度にアレルギーの表現型を示す場合であっても、牛乳アレルギーである対象の血清と反応しないエピトープを含有する牛乳タンパク質のペプチドに関する。非アレルギー対象の血清も、これらのペプチドと反応しない。これらのペプチドは、配列番号３４、３５及び３６によって表され、ＣＭＡの診断のためのアッセイの具体的な実施形態において負の対照として有用である。この目的のために利用可能な信頼性の高い負の対照を有することは、偽陽性の診断の可能性及び反応性ＡＡＩ濃度の偽の高い測定値を低下させる。
【００４１】
具体的な実施形態において、配列番号１〜３３の中から選択される複数（２以上）のペプチドを使用して対象におけるＣＭＡを診断する方法には、固相アッセイが含まれる。固相アッセイで使用するために選択される複数のペプチドは、配列番号１〜３３の全３３種のペプチド、５〜１０種のペプチドのサブセット、１０〜１５種のペプチドのサブセット、又は１５〜２０種のペプチドのサブセットを示し得る。本方法は、ペプチドの２種以上のそのようなサブセットを使用してもよい。配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドのそれぞれは、ビーズ、マイクロタイタープレート、クロマトグラフィー材料（例えば、フィルター）、又は任意の他の適切な固体支持体などの固体支持体にコンジュゲートされて提供される。クロマトグラフィー材料上の各ビーズ、マイクロタイタープレートウェル、又は別々の位置は、配列番号１〜３３の中から選択される単一のペプチドによって占められている。次いで、固体支持体は、各固体支持体又は固体支持体上の別々の場所にあるペプチドへの血清中の抗ペプチドＡＡＩＥ特異的結合（存在する場合）に適する条件下で対象から得た血清と接触して、固体支持体上のペプチド−ＡＡＩ複合体を形成する。
【００４２】
次いで、固体支持体上に形成された任意のペプチド−ＡＡＩ複合体は、各固体支持体又は固体支持体上の別々の場所にある複合体と、この複合体に特異的に結合する標識試薬とを接触させることによって、典型的には固定化された血清ＡＡＩ抗体に結合することによって検出される。一般的に、単一標識試薬が全複合体の一般的検出に使用される。次いで、特異的ペプチド−ＡＡＩ複合体は、マイクロタイタープレート又はクロマトグラフィー支持体上の位置によって識別することができる。各ペプチドがコンジュゲートされた固体支持体が異なるスペクトル特性を有する場合、複合体の存在が複合体に結合した標識試薬からの検出可能なシグナルを介して特定された時点で、特異的ペプチド−ＡＡＩ複合体は、ペプチド−ＡＡＩ複合体に関連する固体支持体のスペクトル特性の分析によって特定することができる。一例として、マイクロタイタープレートの各ウェル中のペプチド−ＡＡＩ複合体の有無は、蛍光色素、発色性色素、酵素標識又は放射性標識などのレポーター部分にコンジュゲートされた抗ヒトＡＡＩ抗体が複合体に結合することにより決定することができる。あるいは、標識試薬への第２の直接検出可能なレポーター部分の特異的結合が結合分析に必要であるので、抗ヒトＡＡＩ抗体は、直接検出できないレポーター部分にコンジュゲートされてもよい。
【００４３】
特定の態様において、ＣＭＡの診断方法は、定性的な方法、すなわち、選択される各ペプチドに反応するＡＡＩの有無にのみ基づく。任意の選択されるペプチドと中程度又は高度に反応するＡＡＩの存在は、ある程度のＣＭＡを示すと考えることができるが、その反応性は、約６カ月などの短い期間内に実質的に減少しないことを条件とする。本方法は、半定量的であってもよく、すなわち、対象の血清と反応するペプチドの数が多いほど、アレルギーの強度が相対的に高く、逆に、反応性ペプチドの数が少ないほど、アレルギーの強度が相対的に低い。配列番号１〜３３のペプチドのうちの５〜１５種との血清反応性は、軽度から中程度のＣＭＡを示すことができ、この範囲の下端内の反応性は、一般的に、軽度のＣＭＡとして特徴づけられる。配列番号１〜３３の１６〜３３、１６〜３０、１６〜２５、１６〜２０、１６〜１８又は全３３種のペプチドとの血清反応性は、中程度から重度のＣＭＡを示すことができ、この範囲の下端内の反応性は、一般的に、中程度のＣＭＡとして特徴づけられる。配列番号１〜３３のペプチドの１０〜２０、１２〜１８又は１４〜１６種との血清反応性は、一般的に、中程度のＣＭＡを示すと考えられ得る。一般的に、約８〜１０種以下は、非アレルギー性個体の血清との反応性が高く（Ｓ／Ｎ＞１０）、したがって、診断アッセイの結果において従来のアッセイよりも高い信頼性レベルを提供することは、配列番号１〜３３のペプチドの特に有用な特徴である。
【００４４】
他の態様において、ＣＭＡの診断方法は、定量的な方法、すなわち、選択される各ペプチドへのＡＡＩの反応性レベルの定量に基づく。この例では、反応性のレベルは、ペプチド−ＡＡＩ複合体に結合した標識試薬の量と相関し、レポーター部分からのより高いレベルのシグナルは、血清中の特定のペプチド特異的ＡＡＩの濃度がより高いことを示す。特定のペプチド−ＡＡＩ複合体に結合したレポーター部分の量又は濃度を得るために、蛍光色素からの蛍光量、着色色素もしくは発色色素もしくは酵素標識からの色の強度、又は放射性標識からの放射能の量は、複合体中の結合ＡＡＩの量、ひいてはその濃度と正に相関する。これらのパラメータを測定する方法は、当技術分野で知られている。該ペプチドのいずれかと反応するＡＡＩの相対量は、ＣＭＡの程度又は強度を示すものと考えることができる。すなわち、複数の選択されるペプチド又は選択されるペプチドの中の１種以上のペプチドの反応性のレベルが高いほど、アレルギー強度が高い。逆に、複数の選択されるペプチド又は選択されるペプチドの中の１種以上のペプチドの反応性のレベルが低いほど、アレルギー強度は低い。
【００４５】
本発明の方法のいずれかにおいて使用するのに特に有用な定量アッセイは、ＥＬＩＳＡの代替である高スループットのＬＵＭＩＮＥＸ  ｅｘＭＡＰ多重ビーズアッセイなどの、フローサイトメトリー分析用の多重ペプチド−ビーズアッセイである。このアッセイでは、異なる割合の赤色蛍光体及び近赤外蛍光体で染色されたポリスチレンビーズ（マイクロスフェア）が、固体支持体として使用される。該ペプチドは、化学的にビーズに連結されるか、又はビーズ上にコーティングされたペプチド特異的捕捉抗体を介してそれに結合されてもよい。蛍光体の割合は、デジタルシグナル処理を用いてフローサイトメーターによって特定することができる各ビーズ集団について「スペクトルアドレス」を定義する。第三の蛍光色の検出は、ビーズに結合した標識試薬のレポーター部分の蛍光強度の測定に使用される。複数の分析物は、特異的な「スペクトルアドレス」を有するビーズへの、配列番号１〜３３の中から選択される各ペプチドの結合によって同時に検出することができる。ビーズとビーズに結合したペプチドに特異的なＡＡＩを含有する血清を接触させた後、レポーター部分にコンジュゲーされた抗ヒトＡＡＩ抗体が添加される。一例では、抗ヒトＡＡＩのレポーター部分はビオチンであり、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートストレプトアビジンへの結合は、検出のための蛍光シグナルを提供する。標識試薬の結合後、これらのビーズは、ＬＵＭＩＮＥＸ  ２００又はＢｉｏ−Ｒａｄ社製ＢＩＯ−ＰＬＥＸアナライザなどのデュアルレーザーフローベースの検出器で分析される。１つのレーザーは、ビーズを分類し、ビーズに結合したペプチドを特定する。第２のレーザーは、結合した血清ＡＡＩの量に正比例するレポーター由来のシグナルの大きさを決定する。
【００４６】
固体支持体上のペプチド−ＡＡＩ複合体への各ペプチド特異的ＡＡＩの結合の程度を定量化することができるので、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択される複数のペプチドは、ＣＭＡと診断された対象における経時的なＣＭＡ強度の増加、又は最初はアレルギーではないと診断された対象における経時的なＣＭＡの発生を検出する方法においても有用である。上記のように、反応性ペプチドの初期数又は各ペプチド特異的ＡＡＩ初期濃度を提供するために、最初のアッセイは、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドで実行される。最初のアッセイに続く時点で、反応性ペプチドのその後の数又はペプチド特異的ＡＡＩのその後の濃度を得るために、初期プロファイルと同じ、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドを用いて、分析が繰り返される。本方法は、次のように要約することができる：配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドに対する対象の血清ＡＡＩの反応性の初期プロファイルであって、対象の血清中のＡＡＩによって認識される（に結合する）ペプチドの初期数、又は各ペプチドを認識する（に結合する）対象の血清中のＡＡＩの初期濃度を示す初期プロファイルを提供すること；初期プロファイルに続く時点で、各固体支持体上のペプチドへの血清中のＡＡＩの結合を可能にするのに十分な条件下で、別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートさせた同じ複数のペプチドの各ペプチドと対象の血清とを接触させ、ペプチド−ＡＡＩ複合体を形成すること；該複合体にＡＡＩ特異的標識試薬を結合させること；及び、該対象の血清中のＡＡＩによって認識されるペプチドのその後の数又は選択された各ペプチドと反応する対象の血清中のＡＡＩのその後の濃度を特定するために、各ペプチド−ＡＡＩ複合体への標識試薬の結合を分析すること。
【００４７】
本発明で有用な代替アッセイ形式は、側方流動アッセイ又は免疫クロマトグラフィーアッセイである。そのようなアッセイにおいて、選択されるアレルゲンエピトープ含有ペプチド（複数可）が多孔性支持体上に固定化され、ＡＡＩを含有する血清を流し、該ペプチド（複数可）と接触して、免疫複合体を形成する。多孔性支持体を介して免疫複合体がさらに移行すると、適切な検出試薬を用いて免疫複合体を検出するための特異的捕捉試薬と接触することになる。
【００４８】
アレルギー強度の増加を検出する方法は、上記のものを含む、任意の適切なアッセイ形式を利用することができる。標識試薬の結合を分析するのに利用可能な分析の種類の例も上記のとおりである。初期プロファイルと比較した場合のその後の時点でのＡＡＩと反応するペプチドの数の増加（初期プロファイル内のＡＡＩと反応しないペプチドと比較した増加を含む）、又は初期プロファイルと比較した場合のその後の時点でのペプチドのいずれかへのＡＡＩの結合強度の増加（初期プロファイル内の特定のペプチドへの結合がない状態から、その後の時点での検出可能な結合への増加を含む）は、ＣＭＡと以前に診断された対象におけるＣＭＡ強度の増加、又は以前はアレルギーではなかった対象におけるＣＭＡの発生を示す。上記のように、対象の初期プロファイルとその後の時点のプロファイルの比較を用いて、対象における特定のアレルギーの重症度の増加又は低い耐性を予測するか、又はアレルゲンに対する臨床耐性もしくは自然耐性の発生の可能性を予測することができる。
【００４９】
配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択される複数のペプチドは、ＣＭＡと診断された対象における牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生を検出する方法にも有用である。これらの実施形態において、アレルギー強度の増加を検出するための上記の一般的アッセイは、配列番号１〜３３の中から選択される複数のペプチドとの血清ＡＡＩ反応性の初期プロファイルを確立するために最初の時点で最初に実行される。上記のように、初期プロファイルは、選択されるペプチドとの血清反応性の半定量的又は定量的な分析に基づく。次いで、固体支持体にコンジュゲートされた選択ペプチドは、初期プロファイルに続く時点で得られた対象からの血清と接触し、このアッセイは、その後の時点でＣＭＡ強度の半定量又は定量により上記のように実施される。初期プロファイルと比較した場合のその後の時点でＡＡＩと反応するペプチドの数の減少、又は初期プロファイルと比較した場合のその後の時点でのペプチドのいずれかへのＡＡＩの結合強度の低下、特に少なくとも２倍の低下は、牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生を示す。以前にＣＭＡと診断された対象における牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生は、初期プロファイルとその後の時点の間の期間にわたってアレルギー強度の減少も示し、アレルギー強度を検出し、アレルギー強度のそのような経時的な減少を予測することもできることが理解されるであろう。
【００５０】
一例として、ＣＭＡアレルギー個体の血清反応性を図２に示す。この実験では、牛乳に対するアレルギーを有する個体をＣＭＡのための免疫療法で治療し、血清試料を、６カ月及び１２カ月後に採取した。免疫療法に対する初期反応は、約１５〜１７種のペプチドとの中程度から高い反応性（すなわち、Ｓ／Ｎ＞２、青いバー）を伴ったことが分かる。６ヵ月の時点で、血清反応性は、最も反応性のあるペプチドの全てについて２倍を超えて減少した（オレンジ色のバー）。特定のペプチドに対する反応の減少は、４倍〜７倍の範囲内であった（例えば、ａｓ１−０３、ａｓ１−０９、ａｓ１−５７、ａｓ１−４４、ｂｃａｓ−０１）。反応性がほとんどなくなるか、又はさらなる低下がないことが、１２カ月の時点（灰色のバー）で観察され、最初の最も反応性のあるペプチドのいずれも、非反応レベルに戻らなかった（Ｓ／Ｎ＜２）。この個体は、免疫療法の過程で牛乳に対して脱感作し、これは、本アッセイが、ＣＭＡと診断された対象における牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生の検出の成功を示す。
【００５１】
パネル中のいくつかのペプチドは、図２に示す個体の血清と反応性が高かった（Ｓ／Ｎ＞１０）。同様に、図３で試験した個体の血清は、少なくとも約１５種のペプチドとの反応性が中程度から高度であり、牛乳アレルギーを示す。しかし、対照的に、６カ月の時点（オレンジ色のバー）で、最初に最も反応性のあるペプチドの全てよりも少ない数のペプチドが、少なくとも２倍の反応性の減少を示した。２倍未満の反応性の最小減少の例は、例えば、ａｓ１−６１、ｂｃａｓ−２５、及びｂｃａｓ−５３で見られる。図３に示す個体は、わずかに部分的に免疫療法に反応し、最も反応性の高いペプチドのいくつかとの反応性において２倍を超える減少があったものの、これらの反応性の高いペプチドのいくつかが反応性の同様の減少を示さなかったという知見は、免疫療法が完全な脱感作をもたらす可能性が低いこと、又は完全な脱感作が免疫療法によるより長い治療を必要とする可能性を示し得る。
【００５２】
配列番号１〜３３によって表されるペプチドの全３３種の分析は、本発明の前述の方法で有用な結果を得るのに必ずしも必要ではないことも認識されるであろう。統計的に信頼性のある結果を提供するために、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択されるペプチドの十分な数を使用することが唯一必要である。例えば、対象のＣＭＡの状態が不明である場合、配列番号１〜３３によって表されるペプチドのわずか数種との反応性を伴い得る軽度から中程度のＣＭＡが検出可能であることを保証するために、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択されるアレルゲンエピトープ含有ペプチドの大多数を分析することが一般的に望ましい。逆に、対象が高い強度のＣＭＡを有することが知られている場合には、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの多数が、最初は反応性を示すので、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択される少数のアレルギーエピトープ含有ペプチドは、アレルギー強度の変化又は臨床耐性の発生を検出するのに十分であり得る。しかし、アレルギー強度の変化及び臨床耐性の発生は、血清と反応するペプチドの数の変化だけでなく、特定のペプチドと反応する血清ＩｇＥの濃度の変化によって証明されるので、特定の対象についての診断であるペプチドに対する変化が見逃されないことを保証するために、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択されるペプチドの十分に大きなセットをアッセイに含めることが特に望ましい。したがって、前述の方法のいずれかで使用するための、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、配列番号１〜３３の全３３種のペプチド、２０〜２５種のペプチドのサブセット、１５〜２０種のペプチドのサブセット、１０〜１５種のペプチドのサブセット、５〜１０種のペプチドのサブセット又は２〜５種のペプチドのサブセットを代表し得る。例として、多くの場合、ベータｌａｃペプチド（配列番号２４〜２７）は、アレルギー性個体の血清との反応性が実質的に低いか、又は反応しないことが判明した。したがって、特定の用途のために、配列番号１〜２３（ａｌｐｈａＳ１、ａｌｐｈａＳ２、及びベータｃａｓペプチド）を単独で又は配列番号２８〜３３（カッパｃａｓペプチド）と共に使用することが望ましい場合がある。所望であれば、これらのサブグループのそれぞれも本発明で単独で用いてもよい。
【００５３】
ユーザの利便性のために、前述の方法のいずれかにおいて使用するための試薬は、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチド、又は有用なサブグループのいずれか、第１のレポーター部分にコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体を含む標識試薬、及び必要に応じて（間接的な検出のために必要な場合）、その標識試薬に特異的に結合する第２のレポーター部分を含むキットの形態で共に包装されてよい。このキットは、典型的には、上記の本発明の方法の１以上におけるこれらの試薬の使用説明書を含む。
【００５４】
特定のキットの実施形態において、並びに本発明の方法において、抗ヒトＡＡＩ抗体は、直接検出することができるレポーター部分にコンジュゲートされて提供されてもよい。直接的に検出可能なレポーター部分は、特異的結合パートナーへの結合を必要とすることなく、特定するか、かつ／又は定量することができるものである。抗ヒトＡＡＩ抗体にコンジュゲートされ得る直接検出可能なレポーター部分の例としては、その後の化学反応によって検出することができる蛍光色素、着色色素、発色色素及び酵素標識、並びに放射性標識が挙げられる。他のキットの実施形態において、本発明の方法として、抗ヒトＡＡＩ抗体は、間接的に検出可能なレポーター部分、すなわち、それ自体は検出できないが、直接検出可能な標識にコンジュゲートされたレポーター部分に特異的な結合パートナーなどの、直接検出可能なレポーター部分を含む第２のレポーター部分と反応するか、又は相互作用するレポーター部分にコンジュゲートされて提供されてもよい。間接的に検出可能なレポーター部分の例としては、直接検出のために標識される二次抗体（例えば、抗ジゴキシゲニン）、又は他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）とのその後の結合の際に検出可能なビオチン、ジゴキシゲニン、及び他のハプテンが挙げられる。これらの標識試薬及びレポーター部分のいずれも、本発明の前述の方法において、適切なアッセイフォーマットにおいて、かつキットの成分として有用であることが理解されるであろう。上記のフローサイトメトリー多重アッセイを実行するためのキットの具体的な例において、キットの構成要素は、配列番号１〜３３によって表されるペプチドの中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチド、ビオチン化抗ヒトＡＡＩ抗体（第１レポーター部分を有する標識試薬）、ＰＥにコンジュゲートされたストレプトアビジン（第２レポーター部分）を含み得る。
【００５５】
前述のキットのいずれかに含めるための、配列番号１〜３３の中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドは、配列番号１〜３３の全３３種のペプチド、２０〜２５種のペプチドのサブセット、１５〜２０種のペプチドのサブセット、１０〜１５種のペプチドのサブセット、５〜１０種のペプチドのサブセット又は２〜５種のペプチドのサブセットを代表し得る。前述のキットのいずれかに含めるための、配列番号１〜３３の中から選択される複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチドも、関連するペプチドサブグループ（すなわち、ａｌｐｈａＳ１、ａｌｐｈａＳ２、ベータｃａｓ、ベータｌａｃ及びカッパｃａｓのペプチド）のうちの１以上を代表し得る。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、前述の方法、ペプチドパネル及びキットで使用するための、牛乳タンパク質由来の追加のアレルゲンエピトープ含有ペプチドを提供する。これらのペプチド及びそのサブセットは、上記の任意の態様及び／又は実施形態において、配列番号１〜３３のいずれか又は全てと置換することができる。さらに、ペプチド及びそのサブセットは、配列番号１〜３３に加えて、上記の任意の態様及び／又は実施形態において使用することができる。牛乳タンパク質由来の追加のアレルゲンエピトープ含有ペプチドには、以下のものが含まれる：
【表３】
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【００５７】
実施例
血清を、ＣＭ耐性及びＣＭＡの個体から入手し、ＬＵＭＩＮＥＸアッセイでアッセイして、図１〜３に示す代表的な結果を得た。洗浄緩衝液、血清、ビーズ及び抗体希釈物を、製造業者の指示に従って調製した。フィルタープレートを１分間、緩衝液で予め湿らせ、緩衝液を真空除去した。１００μｌのビーズカクテルを各ウェルに添加し、緩衝液を真空除去して、ビーズを１００μｌの緩衝液で２回洗浄した。１００μｌの血清希釈液を各ウェルに添加し、振盪しながら２時間インキュベートした。液体を除去するために、真空を適用した。再度、ビーズを緩衝液で２回洗浄した。５０μｌの抗体希釈液を各ウェルに添加し、振盪しながら３０分間インキュベートした。真空をした後、ウェルを３回洗浄した。１００μｌの緩衝液をウェルに添加し、試料を固定プレートに移した。ウェルをＬＵＭＩＮＥＸ装置で読み取った。結果を、上記の図１〜３に示す。
【００５８】
方法の追加の適用
牛乳由来のアレルゲンエピトープ含有ペプチドに関する本発明の概念、並びにＣＭＡの診断のため、牛乳タンパク質に対する臨床耐性の発生を検出するため、及びアレルギー強度の増減を検出するためのそれらの使用は、他のアレルゲンエピトープ含有ペプチドのパネルの開発、並びに診断、耐性の検出、及び他のアレルゲンタンパク質に対する耐性の増加及び発生の検出におけるそれらの使用に適用することもできる。
【００５９】
例えば、アレルギーピーナッツタンパク質、特に、Ａｒａ  ｈタンパク質ファミリーに由来するアレルゲンエピトープ含有ペプチドのパネルを、上記の方法と同様の方法で利用してもよい。このようなパネルは、以下のリスト（配列番号６９〜２７７）からの１以上のペプチドを含んでもよい：
【表４】
0006452718.tif 000005
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0006452718.tif 000007
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【００６０】
さらなる実施例において、卵アレルゲンタンパク質、特に、オボアルブミン（ｏｖａ）及び／又はオボムコイド（ｏｖｍ）に由来するアレルゲンエピトープ含有ペプチドのパネルを、上記の方法と同様の方法で利用してよい。このようなパネルは、以下のリスト（配列番号２７８〜４６０）からの１以上のペプチドを含んでもよい：
【表５】
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【００６１】
さらなる実施例において、エビアレルゲンタンパク質、特に、アルギニンキナーゼ（ａｋ）、ミオシン軽鎖（ｍｌｃ）、筋形質カルシウム結合タンパク質（ｓｃｐ）、トロポミオシン（ｔｍ）及びトロポニンＣ（ｔｐｃ）に由来するアレルゲンエピトープ含有ペプチドのパネルを、上記の方法と同様の方法で利用してもよい。このようなパネルは、以下のリスト（配列番号４６１〜６８３）からの１以上のペプチドを含んでもよい：
【表６】
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【００６２】
したがって、本発明は、対象における食物アレルギーを診断する方法であって、
ａ）各ペプチドが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた、食物中に見られる１種以上のアレルゲンタンパク質由来の複数のペプチドを提供すること；
ｂ）各固体支持体上のペプチドへの血清中のＩｇＥの結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＩｇＥ複合体を形成するために、各固体支持体と対象から得た血清を接触させること；
ｃ）該ペプチド−ＩｇＥ複合体にＩｇＥ特異的標識試薬を結合させること；及び
ｄ）該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドを特定するために、各ペプチド−ＩｇＥ複合体への標識試薬の結合を分析すること；
を含み、該対象の血清中のＩｇＥによる少なくとも１つのペプチドの認識は、該対象がその食物にアレルギーであることを示す方法を包含する。
【００６３】
別の態様において、本発明は、最初は食物にアレルギーを示していた対象におけるその食物に対する臨床耐性の発生を検出する方法であって、
ａ）食物中に見られる１種以上のアレルゲンタンパク質由来の複数のペプチドへの対象の血清ＩｇＥ反応性の初期プロファイルであって、該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドの初期数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥの初期濃度を規定する初期プロファイルを提供すること；
ｂ）それぞれが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた複数のペプチドを提供すること；
ｃ）各固体支持体上のペプチドへの血清中のＩｇＥの結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＩｇＥ複合体を形成するために、初期プロファイルに続く時点で各固体支持体と該対象から得た血清を接触させること；
ｄ）該ペプチド−ＩｇＥ複合体にＩｇＥ特異的標識試薬を結合させること；及び
ｅ）該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドのその後の数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥのその後の濃度を特定するために、各ペプチド−ＩｇＥ複合体への標識試薬の結合を分析すること；
を含み、該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドのその後の数が、該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドの初期数よりも少ない場合、又は少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥのその後の濃度が、少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥの初期濃度よりも低い場合に、その食物に対する臨床耐性の発生が示される方法を提供する。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、対象における牛乳アレルギー強度の経時的な増加を検出する方法であって、
ａ）食物中に見られる１種以上のアレルゲンタンパク質由来の複数のペプチドへの対象の血清ＩｇＥ反応性の初期プロファイルであって、該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドの初期数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥ初期濃度を規定する初期プロファイルを提供すること；
ｂ）それぞれが別々に識別可能な固体支持体にコンジュゲートされた複数のペプチドを提供すること；
ｃ）各固体支持体上のペプチドへの血清中のＩｇＥの結合を可能にするのに十分な条件下で、ペプチド−ＩｇＥ複合体を形成するために、初期プロファイルに続く時点で各固体支持体と該対象から得た血清を接触させること；
ｄ）該ペプチド−ＩｇＥ複合体にＩｇＥ特異的標識試薬を結合させること；及び
ｅ）該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドのその後の数又は各ペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥのその後の濃度を特定するために、各ペプチド−ＩｇＥ複合体への標識試薬の結合を分析すること；
を含み、該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドの初期数と比較した場合の該対象の血清中のＩｇＥによって認識されるペプチドのその後の数の増加、又は少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥの初期濃度と比較した場合の少なくとも１つのペプチドを認識する該対象の血清中のＩｇＥのその後の濃度の増加は、該対象におけるその食物に対するアレルギー反応の強度の増加を示す方法を提供する。
【００６５】
前述の方法のうちのいずれかにおいて使用される試薬及び材料は、複数のアレルゲンエピトープ含有ペプチド、第１のレポーター部分にコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＥ抗体を含む標識試薬、及び必要に応じて、その標識試薬に特異的に結合する第２のレポーター部分が共に包装されるキットの形態で包装されてもよい。
【００６６】
本発明の方法において有用である、本明細書に開示されるペプチドパネル及びそのサブセットのいずれも、本発明の一態様であることも理解されるであろう。
【００６７】
本発明を本明細書で特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態は、本発明の原理及び用途の単なる例示であることを理解されたい。様々な修正及び変形を本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の方法及び装置に対して行うことができることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある修正及び変形を含むことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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