(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を含有する生体物質の１以上の試料を保存するための平固形培地であって、固形培地が、アルギン酸塩を含む組成物が収着又は導入された固形マトリックスを含み、固形マトリックスが、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択され、
ａ）タンパク質分解試薬をさらに含む、固形培地。
【請求項２】
生体分子を含有する生体物質の１以上の試料を保存するための平固形培地であって、固形培地が、アルギン酸塩を含む組成物が収着又は導入された固形マトリックスを含み、固形マトリックスが、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択され、
ｂ）ラジカル捕捉剤、ｃ）キレート剤、及び／又はｄ）カオトロピック塩をさらに含む、固形培地。
【請求項３】
ｂ）ラジカル捕捉剤、ｃ）キレート剤、及び／又はｄ）カオトロピック塩をさらに含む、請求項１に記載の固形培地。
【請求項４】
アルギン酸塩が、ａ）アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸リチウム及びアルギン酸銀からなる群から選択されるもの、ｂ）抗菌活性を有するもの、及び／又はｃ）アルギン酸銀である、請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
固形マトリックスがセルロースマトリックスである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の固形培地。
【請求項６】
生体物質の試料が、ａ）真核細胞、原核細胞及びプリオン細胞からなる群から選択されるもの、ｂ）血液、血漿、唾液、尿及び口内細胞からなる群から選択されるもの、及び／又はｃ）核酸、タンパク質、バイオ医薬品及び多糖類からなる群から選択される生体分子を含有するものである、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の固形培地。
【請求項７】
固形培地上に保存された生体物質の試料をさらに含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の固形培地。
【請求項８】
生体分子を含有する生体物質の試料を平固形培地上で保存するための方法であって、
ａ．請求項１乃至６のいずれか１項に記載の平固形培地に生体物質の試料を塗布する工程と、
ｂ．生体物質の試料を固形培地上で保存する工程と
を含む、方法。
【請求項９】
試料が、固形培地上で１日以上の期間、或いは１週間以上、１か月以上、６か月以上、９か月以上、１年以上、２年以上、５年以上、１０年以上、１５年以上及び２０年以上からなる群から選択される期間保存される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
固形マトリックスが、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択される、請求項８又は請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の平固形培地上で保存される生体分子を含有する生体物質の試料を分析する方法であって、平固形培地がアルギン酸塩を含む組成物が収着又は導入された固形マトリックスを含んでおり、当該方法が、生体分子の存在及び／又はレベルについて生体物質を分析する工程を含んでおり、生体分子の存在及び／又はレベルについて生体物質を分析する工程が、任意には、固形培地又はその一部で直接実施される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質の試料の保存のための平固形培地、及び保存の後に試料内に含まれる生体分子を分析する方法に関する。特に、本発明は、タンパク質、酵素及び核酸などの生体分子の保存、回収及び更なる処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血液などの生体物質の回収及び分析のための固形培地又は濾紙などの支持体の使用は、１９６０年代初期に、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｇｕｔｈｒｉｅ博士がフェニルケトン尿症の検出のために新生児において生体分子フェニルアラニンを測定するために乾燥血液スポット（ＤＢＳ）検体を使用した時に遡る（Ｍｅｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１３１：１６３１Ｓ−１６３６Ｓ）。血液を収集するためのこの新規な応用は、治療可能な遺伝性の代謝疾患の検出のための新生児の集団スクリーニングにつながった。ＤＢＳは、広い範囲の新生児の酵素、タンパク質を含む代謝障害、及び核酸分析を用いる遺伝性疾患をスクリーニングするために４０年以上にわたって今でも使用され続けている。
【０００３】
ＤＢＳ検体などの生体物質の採集は、静脈血から、又は直接に指又はかかと穿刺からの全血を、例えば、固相支持体、例えば膜、ガラスファイバー又は紙などの上にスポットすることによって実施されるので、この方法は周辺の診療所から中央の研究所への検体の輸送に特に適したものとなる。さらに、ジップロック・ビニール袋の中に乾燥剤とともに充填されたＤＢＳは、周囲温度で貯蔵及び輸送されることができ、従ってｉ）低温流通貯蔵及びｉｉ）迅速な専門化輸送の必要がない。Ｗｈａｔｍａｎ  ９０３  Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＳＴＤ紙などの吸収材料の上に一滴の血液を垂らすことによって回収されたＤＢＳは、ＩＡＴＡ危険物規則書（Ａｄｄｅｎｄｕｍ  ＩＩ，Ｍａｒ  ２００５）の対象でない。
【０００４】
一般に、ＤＢＳの分析は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はその他の病原体の存在のためなどの感染性病原体の存在のために実施される。一般に、血清学的試験又は核酸試験はこの応用のために実施される。
【０００５】
ＤＢＳと内在性タンパク質生体分子の検出との組合せは、文献に記載されている。例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）のバイオマーカーは、免疫反応性トリプシン（ＩＴ）である。ＣＦスクリーニングのためのＤＢＳからの内在性ＩＴの最初に報告された使用は、１９８１年にＲｙｌｅｙらによって発表されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３４，９０６−９１０）。それ以来、それは新生児由来のＤＢＳを用いる、ＣＦの指標として常套的に使用されてきた。いくつかの商業的組織は、この応用のためのＦＤＡ認可の免疫測定キットを供給する。多くは単に、ＤＢＳを含有する紙パンチを免疫測定に直接塗布し、目的の分析物を原位置で抽出する、「ペーパー・イン」アプローチを使用する。近年（Ｌｉｎｄａｕ−Ｓｈｅｐａｒｄ  ＆  Ｐａｓｓ，２０１０，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．５６，４４５−４５０）は、ＩＴが２つの異なるアイソフォームに存在することを示した。これらの著者は、ＩＴの２つの異なるアイソフォームを用いる、ＣＦの診断のための懸濁液（又はペーパー・イン）アレイに基づく免疫測定法の開発を報告している。全てのこれらのタンパク質に基づく研究は、コートされていないＧｕｔｈｒｉｅカード（Ｗｈａｔｍａｎ９０３紙）で実施されている。
【０００６】
匿名のヒト免疫不全症（ＨＩＶ）スクリーニングの開始以来、１２０万回を超えるＤＢＳ試験が妊婦からの血液中の内在性抗ＨＩＶ抗体血清学的検出のために実施されてきた。これらの研究では、ｉ）目的の血液及び任意の関連タンパク質の長期保存に関する懸念は根拠がないことが証明されたこと、及びｉｉ）ＤＢＳ中のヘムの存在はアッセイ成績に干渉しないことが示されている。
【０００７】
新生児及び新生児スクリーニング目的のために、ＤＢＳ及びその他の体液を収集、輸送及び貯蔵するために使用される更なる固体の紙支持体としては、
１．Ａｈｌｓｔｒｏｍ２２６
２．Ｍｕｎｋｔｅｌｌ  ＴＦＮ（ＣＥマーク付き）
３．Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉグレード５４５、アドバンテック東洋（東京）（Ｅｌｖｅｒｓ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００７；Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｄｔａｂ  Ｄｉｓ  ３０，４，６０９参照）
が挙げられる。
【０００８】
高い相対湿度条件下での遅い乾燥又は小さい程度の再水和でさえ、生体分子を破壊するミクロフローラの成長を許容する。タンパク質を変性しない種類の静菌剤が存在する場合でさえ、生体分子の酵素自己融解分解及び生体分子の一部の非酵素分解を許容する条件が存在する（酵素自己融解分解では、乾燥又は損傷組織は、ヒト細胞であれ寄生虫細胞であれ、それら自体の構成成分を分解する酵素を活性化する）。核酸を用いて、非常に高い分子量のＤＮＡを紙マトリックスから脱着することもかなり困難である。表面吸着作用は、ＤＮＡの損失を引き起こし得、このことは最も分解されていない、すなわち最も望ましいクラスのＤＮＡ分子の優先的損失を引き起こす。従って生体分子の長期アーカイビングが貯蔵媒体の望ましい特徴である。
【０００９】
分子及び核酸分析
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において核酸を増幅するために使用される一般的なツールである。米国特許第４６８３２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）には、核酸又はこの混合物に含まれる任意の望ましい特定の核酸配列を増幅するための方法について記載されている。
【００１０】
さらに、米国特許第５５９３８２４号及び米国特許第５７６３１５７号（Ｔｒｅｍｌ）には、ＰＣＲ反応に有用な生物学的試薬球体について記載されている。加えて、この発明では、ＰＣＲなどの下流の遺伝子分析で用いられる試薬の保存に有用な適した炭水化物を含む賦形剤ミックスを用いる簡便なアプローチが記載されている。炭水化物は、好ましくはフィコール及びメレジトースである。この技術は、すぐ使える（ＲＴＧ）ＰＣＲ形式で商業化されている（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
【００１１】
濾紙又は化学修飾マトリックス上での核酸の長期の保存、輸送及びアーカイビングは、ＤＮＡ又はＲＮＡが、ＰＣＲなどの遺伝子解析で使用されるための形態で抽出され、単離される前に遺伝物質を保存するための周知の技術である。例えば、欧州特許第１５６３０９１号（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｈａｔｍａｎ）には、細胞又は細胞可溶化物などの試料から核酸を保存するための方法に関する。核酸は、単離され、幅広い種類のフィルタ及びその他の種類の固相媒体上で室温及び室内湿度で長期間保存される。この文献には、チューブ、カラム、又はマルチウェルプレートの広範囲の固相マトリックス上で核酸含有試料を保存するための方法について記載されている。
【００１２】
セルロースから誘導される固相支持体は、以下の先行技術に記載されている。
【００１３】
国際公開第９０／００３９５９号（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）には、マトリックスに取り込まれているか又はマトリックスに吸収されているＤＮＡを分解から保護する化合物又は組成物を有する固形マトリックスからなる、血液ＤＮＡを含むＤＮＡの保存のための固形培地について記載されている。この文献には、この固形培地を用いるＤＮＡの保存のための、さらにＤＮＡの回収或いはＤＮＡ又はＲＮＡの原位置での使用のための方法も開示されている。
【００１４】
法医学的用途及び人物同定用途
ＤＮＡ鑑定（ＤＮＡ検査、ＤＮＡタイピング、又は遺伝子フィンガープリント法とも呼ばれる）は、個人のそれぞれのＤＮＡプロファイルによって個人の同定を援助するために法医学科学者が用いる技術である。ＤＮＡプロファイルは、人物のＤＮＡの構成を反映する数字の暗号化されたセットであり、それは人物の識別子として使用されることもできる。ＤＮＡ鑑定は、完全なゲノム配列決定と混同されてはならない。それは例えば、親子鑑定及び犯罪捜査で使用される。
【００１５】
ＤＮＡ鑑定の方法は、ヌクレオチド配列の短いタンデムリピートを用いるＰＣＲに基づく。この方法は、ＤＮＡの短い反復配列を有する非常に多形性の領域を使用する（最も一般的なものは４塩基反復であるが、３塩基及び５塩基を含むその他の長さも使用される）。血縁でない人はほぼ確実に異なる数の繰り返し単位を有するので、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）は、血縁でない個人を識別するために使用されることができる。これらのＳＴＲの遺伝子座（染色体上の位置）は、配列特異的プライマーによって標的化され、ＰＣＲを用いて増幅される。結果として生じるＤＮＡ断片は、次に分離され、電気泳動を用いて検出される。分離及び検出には２つの一般的な方法、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）とゲル電気泳動がある。
【００１６】
臨床用途
乳児の血液試料から作成されたＤＮＡデータベースもいくつか存在する。重篤な状態をスクリーニングするためにかかと穿刺試験で採取された血液試料は、一部の病院で数年間保管され、その後、警察によって犯罪に関与した人物を特定するためにアクセスされることができる。また、試料は多様な目的のために検死官及び医学研究者によって使用されることもできる。血液スポットスクリーニングは、癌、腫瘍マーキング及びアーカイビング、鎌状赤血球、ＰＫＵ及び嚢胞性線維症などの多様な重篤な状態について試験するために、５〜８日齢の新生児で実施される。政府ガイドラインは、病院に試料を破壊するまで５年以上は保存することを助言する。
【００１７】
例えば、デンマークでは、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  ＩｎｓｔｉｔｕｔのＤａｎｉｓｈ  Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｂｉｏｂａｎｋは、１９８１年以降に生まれたすべての新生児の血液試料を保持する。目的は、ＰＫＵ及びその他の疾患について試験することである。このデータベースはまた、死亡した犯罪者及び犯罪容疑者を特定するためのＤＮＡ検査にも使用される。
【００１８】
しかし、上に概説した全ての用途で、簡便で、安全であり、分析する生体分子に安定性を付与する改良された不活性マトリックスには、新しい進歩に対する必要性が大いにある。例えば、Ｂｕｒｇｏｙｎｅ（米国特許第５７５６１２６号）は、遺伝物質の分析のための培地を記載するが、その他の生体分子、例えばタンパク質、ポリペプチド及び代謝産物などへの言及はない。
【００１９】
病原体及び感染性因子
伝染性疾患又は伝達性疾患としても公知であり、伝染病を含む感染性疾患は、個々の宿主生物における病原性生物学的因子の感染、存在及び増殖に起因する、臨床的に明白な病気（すなわち、特徴的な医学的徴候及び／又は疾患症状）を包含する。特定の例では、感染性疾患は、多く又はその全経過について無症候性でありうる。感染性病原体には、ウイルス、細菌、細菌胞子、真菌、原虫、及び、多細胞寄生虫が含まれる。病原体がないと感染性流行病は起こらないという意味で、これらの病原体は疾患の流行の原因である。感染性病原体の一般的な例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）並びに性行為感染症又は敗血症を引き起こすものが挙げられる。臨床スワブを用いて創傷から常套的に単離される一般的な微生物には、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、コリネバクテリウム・エスピー（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が含まれる。
【００２０】
原体の伝達は、物理的接触、汚染食物、体液、物、空気伝染吸入を含む様々な方法、又はベクター生物を通じて起こり得るので、感染病原体の安全な捕捉は、どの診断ワークフローの間でも顕著な価値がある。特に感染性である感染性疾患は、伝染性と呼ばれる場合もあり、病人又はその分泌物との接触によって容易に伝達され得る。より特殊な感染経路、例えばベクター感染又は性行為感染などによる感染性疾患は、通常伝染性とみなされる。従って標的病原体の不活性化は、診断検査の前に有用でありうる。試料のタイプには以下のものが含まれてよい。ヒト由来の病理学的検体又は獣医学由来の試料、例えば、血液、尿、精液、膣分泌物、糞便試料、ＣＳＦ、組織、肺洗浄、痰、鼻咽頭試料、細胞培養、土壌、貯蔵水、小川又は川の試料、空気中試料（ａｅｒｉａｌ）。
【００２１】
乾燥すると、試料は暗く乾燥した環境で輸送及び貯蔵することができた。これらの簡単な条件は、固形培地／カード上の生体試料の完全性が維持されることを確実にする。保存も輸送も室温で行われるので、特定の温度制御は保存にも輸送にも必要とされない。
【００２２】
アルギン酸塩
アルギン酸の塩であるアルギン酸塩は、海ケルプ（海藻）から抽出される。アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、及びアルギン酸アンモニウムは、吸収性のある縫合剤用のフォーム、布、及びガーゼで使用されている。可溶性のアルギン酸塩、例えばナトリウム、カリウム、又はマグネシウムのアルギン酸塩などは、硫酸カルシウムなどの化合物との化学反応によってゲルに変化することのできる、粘稠なゾルを生じる。アルギン酸と一価の陽イオンとの塩（Ｎａ塩、Ｋ塩、ＮＨ４塩）並びにアルギン酸エステルは、全て冷水及び熱水に可溶性であり、ロングフロー性（ｌｏｎｇ−ｆｌｏｗ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）をもつ粘稠な水溶液を生成する。アルギン酸及びアルギン酸カルシウムは水不溶性である。
【００２３】
アルギン酸は、実質的に水に不溶性である。それは、アルカリ金属、例えばナトリウム、カリウム、及び、リチウムなど、マグネシウム、アンモニウム、並びに、低級アミン、例えばメチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミンなどから誘導される置換アンモニウム陽イオンと水溶性の塩を形成する。
【００２４】
アルギン酸塩は、水を素早く吸収し（そのことはアルギン酸を脱水製品中の添加剤として有用にする）、インク及び／又は染料製品での印刷を容易にするための紙及び織物の製造における添加剤として周知である。したがって、紙生産者は、製造及び加工中のアルギン酸塩成分、例えばアルギン酸ナトリウムなどの使用に精通している。アルギン酸ナトリウムは、紙を光沢があり滑らかにし、印刷用インクに対する紙の吸収性を高め、その柔軟性及び靭性を増加させる。
【００２５】
アルギン酸塩の包帯材は、異なる種類の藻類及び海藻に由来する天然の創傷被覆材である。これらの種類の包帯材は、大量の浸出液がある創傷に最もよく使用され、また、通常の生理食塩水が最初に適用部位に適用された後に、乾燥した創傷の上にも適用されてもよい。
【００２６】
米国特許第５８２０９９８号（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  Ｍａｕｄｉｔ  Ｉｎｔ  Ｉｎｃ．）には、１）パルプ繊維と多価金属陽イオンを含む粒子状材料との混合物からなる紙層を提供する工程、２）この紙の少なくとも一部分を覆うように、アルギン酸の塩及び誘導体から選択される材料の酸性化したアルギン酸塩溶液を塗布する工程、３）アルギン酸の塩及び／又は誘導体を紙内の多価金属陽イオンと反応させて、ポリマーコーティングを形成する工程、及び４）紙とポリマーコーティングを乾燥させる工程を含む、喫煙物品で使用される包装紙用のコート紙を作成する方法について記載されている。このコート紙の透過性は、通常、同一の紙の非コート部分の透過性よりも少なくとも約７５パーセント小さい。
【００２７】
Ｂｏｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１  Ｃａｒｂｏｈｙｄａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８５，１１１−１１９）には、アルギン酸塩に基づくナノ繊維の電界紡糸について記載されている。
【００２８】
米国特許第５４８２９３２号（Ｃｏｕｒｔａｕｌｄｓ  Ｆｉｂｒｅｓ（Ｈｏｌｄｉｎｇｓ）  Ｌｔｄ）には、繊維状ペーストの形態を有し、特に、２〜１１重量％の範囲のアルギン酸塩含有量（アルギン酸として表示）を有するアルギン酸塩ゲルについて記載されている。このゲルは、水不溶性又は水膨潤性のアルギン酸塩繊維、例えばアルギン酸カルシウム繊維を、可溶化塩、例えば塩化ナトリウムの水溶液で処理することによって調製されてよい。新しいゲルは、既知のアルギン酸塩ゲルよりも取り扱いが容易であり、創傷被覆材用途において有用である。
【００２９】
アルギン酸カルシウムは、塩化カルシウム水溶液をアルギン酸ナトリウム水溶液に添加することによって作成することのできる、水不溶性でゼラチン状のクリーム色の物質である。アルギン酸カルシウムは、酵素の捕捉及び植物組織培養で人工種子を形成することに使用することができる。また、それは恒常性維持剤として創傷被覆材に組み込まれている。
【００３０】
アルギン酸ナトリウムは、ゴムであり、褐藻類の細胞壁から抽出される。風味のないゴムとして、それは粘度を増加させるために、乳化剤として食品産業に使用されている。また、それは消化不良用の錠剤及び歯科印象の調製物に使用されている。その他の用途としては、織物スクリーン印刷、及びカーペット・インクジェット印刷における、反応性染料印刷の反応性染料の増粘剤としての使用が挙げられる。
【００３１】
アルギン酸カリウムは、アルギン酸のカリウム塩である。それは海藻の抽出物であり、食品において安定剤、増粘剤、及び乳化剤として広く使用されている。医薬賦形剤としてのその使用は、現在、実験用のヒドロゲル系に制限されている。アルギン酸カリウムヒドロゲルの粘度、接着性、弾性、剛性、及び凝集性は、決定され、一連のその他のヒドロゲル形成材料からの値と比較されている。
【００３２】
アルギン酸銀は、抗菌活性を有することが公知である。例えば、一部のアルギン酸塩創傷被覆材は、アルギン酸銀を含有する。アルギン酸銀は抗菌剤保護をもたらし、感染した創傷用と考えられてよい。
【００３３】
米国特許第６６９６０７７号（Ｓｃｈｅｒｒ）は、アルギン酸銀及びその誘導体から調製されるセルロース系発泡体製品の調製物及びそれらを調製するための方法に関する。
【００３４】
米国特許第７３４４７２６号（Ｃｈｉｔｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ）は、原子／金属銀を懸濁液中に含有するポリマー溶液を含むか、又はポリマーと錯化している、接触殺菌性を有する物品の調製のための方法を開示する。
【００３５】
Ｐｅｒｃｉｖａｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１１  Ｉｎｔ．  Ｗｏｕｎｄ  Ｊ．  ８（３）  ２３７−２４３）には、広範囲の臨床的に関連した創傷分離菌に対するアルギン酸銀包帯材の抗菌効力について記載されている。
【００３６】
Ｃｌｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０（１０）：３８３８−３８４０）は、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）培養及びＰＣＲに提出される検体を収集するために常套的に使用される様々なスワブ及び輸送媒体の性能を比較した。著者らは、カルシウム−アルギン酸塩スワブがＰＣＲを阻害したことを報告し、カルシウム−アルギン酸塩スワブは百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のＰＣＲ検出に使用するべきでないと勧告した。
【００３７】
Ｅｉｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８４，８７８３−８７８９）は、電気膜抽出及び液体クロマトグラフィー−質量分析による分析を用いて、ＤＢＳをスポットしたアルギン酸ナトリウム発泡体からのモデル物質（シタロプラム、ロペラミド、メソドン（ｍｅｔｈｏｄｏｎｅ）及びセルトラリン）の保存及び回収を実証した。著者らは、アルギン酸塩発泡体での回収と比較して、大部分のモデル物質について、市販のカード（すなわち、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ  ＤＭＰＫ及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＤＭＳ）では回収がより少なかったことを報告した。
【００３８】
本発明は、生体物質の試料中に存在する生体分子の室温乾燥保存及びその後の分析に関連する問題に取り組み、公知であるか又は先行技術によって提案される問題に対する代替解決策を提供する。さらに、本発明は、生体物質に存在する可能性のある病原性微生物を不活性化するための手段をさらに提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０９９５６７号明細書
【発明の概要】
【００４０】
本発明の第１の態様では、生体分子を含有する生体物質の１以上の試料を保存するための平固形培地が提供され、固形培地は、アルギン酸塩を含む組成物が収着又は導入された固形マトリックスを含み、固形マトリックスは、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択される。
【００４１】
例えば繊維として存在する、アルギン酸塩の組成物が、固形マトリックス全体を通して織られていてよいことは理解されるであろう。
【００４２】
本発明は、粗生体試料から誘導された、低コピー数の遺伝子又は低発現ｍＲＮＡ、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）、対立遺伝子、遺伝子座、又はその他の遺伝物質の増幅による、遺伝子型判定、診断法及び、主に、法医学的用途に特に有用である。
【００４３】
一態様では、固形培地は、タンパク質分解試薬をさらに含む。タンパク質分解試薬は、細胞膜を溶解することができ、従って抗菌活性を提供することができ、かつ／又は、生体分子及び細胞成分を固形培地上に放出し、それにより酵素活性による生体物質の分解を防ぐ。タンパク質分解試薬は、イオン性であってもよいし、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はナトリウムラウリルサルコシネートなどの陰イオン性洗剤であってもよい。
【００４４】
１つの好ましい実施形態では、本発明のイオン性洗剤は、その外膜又はキャプシッドにタンパク質又は脂質を有する微生物、例えば、真菌、細菌又はウイルスの不活性化を引き起こす。これには、ヒトに対して病原性でありうるか、又は生体分子の分解を引き起こす可能性のある微生物が含まれる。
【００４５】
別の態様では、固形培地は、ラジカル捕捉剤をさらに含む。ラジカル捕捉剤の例としては、尿酸又は尿酸塩が挙げられる。一般に、フリーラジカルは、存在する基の自発的酸化により、例えば、血液の変性血清タンパク質において生成されると考えられる。フリーラジカルは、紫外線、ｘ線及び高エネルギー粒子などの放射線によっても生成されることがある。
【００４６】
更なる態様では、固形培地は、キレート剤をさらに含む。本明細書において、キレート剤は、第ＩＩ族及び第ＩＩＩ族の多価金属イオン及び遷移金属イオン（例、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、など）を含む多価イオンをキレート化することのできる任意の化合物である。本発明では、好ましいキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの強いキレート剤である。クエン酸塩又はシュウ酸塩などのキレート剤も本発明に適している。
【００４７】
本発明のキレート剤の一つの機能は、多価イオンと結合することであると考えられる。これは存在する場合、保存した生体分子とともに生体分子、特に核酸への損傷を引き起こすことがある。キレート剤によってキレート化されうるイオンとしては、多価活性金属イオン、例えば、マグネシウム及びカルシウム、及び遷移金属イオン、例えば、鉄が挙げられる。カルシウムとマグネシウムの両方は、核酸を破壊する酵素（例、最も公知のヌクレアーゼ）の補因子として作用することによって核酸分解を促進することが知られている。その上、遷移金属イオン、例えば鉄などは、容易に酸化及び還元を受け、フリーラジカルの産生によるか直接酸化によって核酸を損傷することがある。
【００４８】
一態様では、固形培地は、カオトロピック塩をさらに含む。グアニジン塩がカオトロピック塩の一例である。
【００４９】
更なる態様では、アルギン酸塩は、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸リチウム及びアルギン酸銀からなる群から選択される。
【００５０】
一態様では、アルギン酸塩は抗菌活性を有する。
【００５１】
好ましい態様では、アルギン酸塩はアルギン酸銀である。
【００５２】
病原体の不活性化又は生体分子の保存を促進する同時コーティング目的の候補物質には、中性洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）及び、安定性を促進し、ラジカル捕捉剤の働きをするために、尿酸又は尿酸塩が含まれる。
【００５３】
紙又は不活性マトリックスは、特定の生体分子の溶離（必要な場合）を支える化学基で直接に修飾される（又は単にコーティングされる）ことがあり得る。この選択的溶離は、例えば、イオン交換機構（アルギン酸塩は生物担体として主に帯電した化学部分に頼る）に基づくものであり得る。
【００５４】
アルギン酸塩を加水分解する酵素は公知であり、その酵素は、コーティングされた支持体上で捕捉された核酸、タンパク質又はその他の生体分子を遊離させるために有用となる。培養したバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）からのアルギン酸塩の酵素産生は、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７（４）：７０４−７０９）に記載されている。
【００５５】
紙又はその他の適したマトリックスは、アルギン酸塩で同時コーティングされ、かつ／又はいくつかの異なる化学製品で修飾されることができ、その全ては表面の性質を変化させるので、それは不可逆性の生体分子吸収に対して抵抗性となり、それによって目的の生体分子のその溶離を促進する。
【００５６】
同時コーティングの更なる候補としては、以下が挙げられる。
ａ）アルカンチオールの自己組織化単層。
ｂ）生体医用器具のコーティングとして使用されているポリエチレングリコール。
ｃ）タンパク質吸着に抵抗するその他の表面グラフトポリマーとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチルオキサゾリン（ＰＥＯＸ）、ポリ（ビニルピロリドン）、（ＰＶＰ）及びポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）が挙げられる。
ｄ）代案は、疎水性表面を有する紙の調製である。
ｅ）更なる精製には、上記の表面グラフトポリマーの１つをタンパク質（例えば、ウマＩｇＧ、アルブミン）で同時コーティングして、生体分子の溶離をさらに向上させることが含まれる。
【００５７】
好ましい態様では、固形マトリックスは、セルロースマトリックスである。
【００５８】
特に好ましい態様では、固形マトリックスはセルロースマトリックスであり、アルギン酸塩はアルギン酸銀である。
【００５９】
一態様では、生体物質の試料は、真核細胞、原核細胞及びプリオン細胞からなる群から選択される。特に、生体物質の試料は、血液、血漿、唾液、尿及び口内細胞からなる群から選択される。
【００６０】
別の態様では、生体物質の試料は、核酸、タンパク質、バイオ医薬品及び多糖類からなる群から選択される生体分子を含有する。
【００６１】
更なる態様では、固形培地は、その上に保存された生体物質の試料をさらに含む。
【００６２】
一態様では、固形培地は、分析処理の試料をさらに含む。例えば、試料は液体クロマトグラフィー分析、又はＨＰＬＣ分析である。
【００６３】
本発明の第２の態様では、生体分子を含有する生体物質の試料を平固形培地で保存するための方法が提供され、その方法は以下の工程を含む。
ａ．生体分子を含有する生体物質の試料を、アルギン酸塩を含む平固形培地又はアルギン酸塩を含む組成物が収着又は導入された固形マトリックスを含む平固形培地に塗布する工程、及び
ｂ．生体物質の試料を平固形培地で保存する工程。
【００６４】
第２の態様の平固形培地が、完全にアルギン酸塩からなっていてもよいし、アルギン酸塩繊維で構成されていてもよいことは理解される。別の実施形態では、例えば繊維として存在する、アルギン酸塩の組成物は、固形マトリックス全体を通して織られていてよい。
【００６５】
一態様では、試料は冷蔵せずに乾燥固形培地上で保存される。
【００６６】
別の態様では、試料は４℃〜５０℃の範囲内の温度の乾燥固形培地上で保存される。一般に水性生体試料は、細胞の分解及び微生物の増殖を防ぐために冷凍庫又は冷蔵庫内で低温で保存される。
【００６７】
本発明の方法は、冷蔵庫及び冷凍庫を購入し運転するコストに関して、そのような設備の必要スペースと共に、低温保存及び輸送に関連する問題を回避する。乾燥固形培地は冷却する必要なく郵便によって送ることができるので、試料の輸送も容易になる。
【００６８】
一態様では、試料は、固形培地上で１日以上の期間保存される。実際に、試料は乾燥固形培地上で１週間以上、１か月以上、６か月以上、９か月以上、１年以上、２年以上、５年以上、１０年以上、１５年以上及び２０年以上からなる群から選択される期間保存されることができる。
【００６９】
別の態様では、固形マトリックスは、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択される。
【００７０】
本発明の第３の態様では、生体分子の存在及び／又はレベルについて生体物質を分析する工程を含む、平固形培地上で保存される生体分子を含有する生体物質の試料を分析する方法が提供される。該平固形培地はアルギン酸塩を含むか、或いはアルギン酸塩を含む組成物がそれに収着しているか又はその中に組み込まれている固形マトリックスを含む。
【００７１】
第３の態様の平固形培地が、完全にアルギン酸塩からなっていてもよいし、アルギン酸塩繊維で構成されていてもよいことは理解される。別の実施形態では、例えば繊維として存在する、アルギン酸塩の組成物は、固形マトリックス全体を通して織られていてよい。
【００７２】
一態様では、固形マトリックスは、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択される。
【００７３】
生体物質中に存在する生体分子を分析するための方法には、例えば、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅、ヒト同定目的の短いタンデムリピート及びＤＮＡ鑑定、等温増幅、抗体を用いる更なる血清学的試験、側方流動、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの抗体に基づく試験、ウエスタンブロット法、蛍光エネルギー共鳴転移、質量分析、ＧＣ／ＭＳ及びタンデム質量分析が含まれる。
【００７４】
生体分子は、核酸、タンパク質、バイオ医薬品及び多糖類からなる群から選択される。
【００７５】
一態様では、生体分子の存在及び／又はレベルについて生体物質を分析する工程は、固形培地又はその部分で直接実施される。例えば、該部分は、固体支持体から試験管又はマルチウェルプレートのウェルに切り出すか打抜くことができ、その後生体分子の存在及び／又はレベルについてアッセイすることができるディスクであってよい。この処理は、手動で又は標準的なロボット実験用機器を用いて自動で実施されてよい。
【００７６】
別の態様では、方法は、生体物質を生体分子の存在及び／又はレベルについて分析する前に、生体物質を固形培地から溶離する工程をさらに含む。この処理が、手動で又は標準的なロボット実験用機器を用いて自動で実施されてよいことは理解される。
【００７７】
更なる態様では、固形培地は、タンパク質分解試薬をさらに含む。タンパク質分解試薬は、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムなどの洗剤であり得る。
【００７８】
さらに別の態様では、固形培地は、ラジカル捕捉剤をさらに含む。例えば、乾燥固形培地は、尿酸又は尿酸塩を含んでよい。
【００７９】
一態様では、固形培地は、キレート剤をさらに含む。ＥＤＴＡは、適したキレート剤の一例である。
【００８０】
別の態様では、固形培地は、カオトロピック塩をさらに含む。適したカオトロピック塩の一例は、グアニジン塩である。
【００８１】
更なる態様では、アルギン酸塩は、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸リチウム及びアルギン酸銀からなる群から選択される。
【００８２】
一態様では、アルギン酸塩は抗菌活性を有する。
【００８３】
好ましい態様では、アルギン酸塩はアルギン酸銀である。
【００８４】
更なる態様では、固形マトリックスは、セルロースマトリックス、ニトロセルロースマトリックス、カルボキシメチルセルロースマトリックス、ポリエステルマトリックス、ポリアミドマトリックス、ポリテトラフルオロエチレンマトリックス、ファイバーガラスマトリックス及び多孔質セラミックマトリックスからなる群から選択される。
【００８５】
一態様では、固形マトリックスは、セルロースマトリックスである。
【００８６】
好ましい態様では、固形マトリックスはセルロースマトリックスであり、アルギン酸塩はアルギン酸銀である。
【００８７】
別の態様では、生体物質の試料は、真核細胞、原核細胞及びプリオン細胞からなる群から選択される。特に、生体物質は、血液、唾液、血漿、尿及び口内細胞からなる群から選択される。
【００８８】
更なる態様では、生体物質の試料は、核酸、タンパク質、バイオ医薬品、多糖類及び細胞成分からなる群から選択される生体分子を含有する。
【００８９】
本発明の第４の態様では、上述の平固形培地及び取扱説明書を含むパーツキットが提供される。
【００９０】
本発明の第５の態様では、生体物質の試料を収集又は保存又は分析するための、上述の平固形培地の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】細菌増殖抑制試験の結果を示す図である。アルギン酸塩とＦＴＡディスクは抑制ゾーンを示したが、９０３（非コート紙）は示さなかった。対照ディッシュは典型的な菌叢を示した。
【図２】病原体複製試験の抑制の結果を示す図である。アルギン酸塩は、細菌（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））複製の抑制を示したが、未処理（９０３紙）固形培地は示さなかった。
【図３Ａ】アルギン酸塩でコーティングされたマトリックスから得たプロファイルを示す、ＳＴＲ／ＤＮＡ鑑定実験のデータを示す図である。
【図３Ｂ】ＦＴＡ紙から得たプロファイルを示す、ＳＴＲ／ＤＮＡ鑑定実験のデータを示す図である。
【図３Ｃ】９０３紙から得たプロファイルを示す、ＳＴＲ／ＤＮＡ鑑定実験のデータを示す図である。
【図４Ａ】ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを標的分子として用いてタンパク質及び酵素検出を検出する実験の結果を示す。アルギン酸塩、９０３及びＦＴＡマトリックスに添加したＤＮａｓｅ（０．１２５〜０．５Ｕ）の検出を示す図である。
【図４Ｂ】ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを標的分子として用いてタンパク質及び酵素検出を検出する実験の結果を示す。天然ＤＮａｓｅ（０．５Ｕ）を、アルギン酸塩、９０３及びＦＴＡマトリックスに適用したヒト胚性幹（１０6）細胞を有するマトリックスに添加した後の、ＤＮａｓｅ活性の検出を示す図である。
【図４Ｃ】ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを標的分子として用いてタンパク質及び酵素検出を検出する実験の結果を示す。天然ＲＮａｓｅ（１０μＵ）を、アルギン酸塩、９０３及びＦＴＡマトリックスに適用したヒト胚性幹細胞（１０6）を有するマトリックスに添加した後の、ＲＮａｓｅ活性の検出を示す図である。
【図５】ヒト胚性幹細胞由来のβ−グロブリン遺伝子断片のＲＴ  ＰＣＲの結果を示す図である。結果は、ＲＴ−増幅産物のアガロースゲル（２％）電気泳動として示される。図中、レーン１：鋳型対照なし。レーン２：ＲＮＡスピンを用いてアルギン酸塩マトリックスから単離されたＲＮＡ鋳型、増幅されたβ−グロビン遺伝子断片。レーン３：陰性対照−未抽出の全血試料。レーン４：陰性対照−未抽出の全血試料。レーン５：陰性対照−未抽出の全血試料。レーン６：内部対照試料。レーン７：鋳型対照なし。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
定義
特許請求される本発明の主題をより明白かつ簡潔に記載し示すために、以下の説明及び添付される特許請求の範囲で使用される特定の用語に対して以下の定義が与えられる。明細書全体を通して、特定の用語の例示は、限定されない例と考慮されるべきである。
【００９３】
用語「平らな」とは、本明細書において、通常、水平方向に平らな、滑らかで平坦なシート又はカードのような構造を意味する。
【００９４】
本明細書において、用語「生体物質」には、生物源に起源をもつ、生物源に由来する、又は生物源から得られる、あらゆる材料又は試料が含まれる。例には、ヒト又は動物起源の試料、例えば唾液、血液、血漿、尿及び口内細胞などが含まれる。その他の例には、動物、植物、細菌、真菌又はウイルス起源の細胞培養由来の試料が含まれる。さらに他の例には、病原体を含有する試料、例えば唾液、血液、血漿、尿及び口内細胞などが含まれる。更なる例には、細胞成分、例えば、オルガネラが含まれる。
【００９５】
用語「生体分子」とは、本明細書において、任意の「生体分子」又は下に定義されるような「合成生体分子」を意味する。
ｉ）生体分子は、生きている生物によって産生される任意の有機分子であり、それにはタンパク質、多糖類、及び核酸などの大型ポリマー分子並びに一次代謝産物、二次代謝産物、及び天然物などの低分子量分子が含まれる。
ｉｉ）合成生体分子は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されたか、又はその他の非生存インビトロ方法によって化学的に合成された、上のｉ）に定義されるような「生体分子」である。
ｉｉｉ）用語「核酸」は、本明細書において用語「ヌクレオチド」と同義的に使用され、それにはＤＮＡ、例えばプラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡなど、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ及びＲＮＡｉなど、及びタンパク質核酸、ＰＮＡが含まれる。
ｉｖ）「バイオ医薬品」は、上のｉ）〜ｉｉｉ）に定義される生体分子であり、薬剤又は薬剤候補物質として設計又は生成される。
【００９６】
本明細書において、用語「収着」とは、収着した組成物を固形マトリックスから除去するために意図的に又は不注意に実施される状況にさらされない限り、マトリックスから容易に除去されないような方法で、本発明の組成物が固形マトリックス中又は上に吸収、吸着、塗工その他の方法で導入されていることを意味する。
【００９７】
「アルギン酸塩」は、本明細書において、アルギン酸の塩に通常使用される用語であるが、それは全てのアルギン酸の誘導体及びアルギン酸自体をさすことができる。
【００９８】
本明細書において、用語「室温」は、４〜５０℃の温度を意味する。
【００９９】
材料
アルギン酸塩マトリックス（Ｕｒｇｏｓｏｒｂ、アルギン酸銀創傷被覆材、ロット３６９４３）は、Ｕｒｇｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｕｒｇｏ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｓｕｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓｈｅｐｓｈｅｄ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，英国，ＬＥ１２  ９ＪＧ）より入手し、９０３（Ｗ１０１、ロット６８９１７１１）及び指示薬付ＦＴＡカード（ＷＢ６５００６０、ロットＦＴＡ６９０３３１１）はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｌａｃｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＨＰ７  ９ＮＡ  英国）より入手した。
【０１００】
アルギン酸塩マトリックスを調製するための代替法
当技術分野で周知のその他の方法を用いて、本発明に従う固相支持体を調製することができる。
【０１０１】
例えば、１０ｍｌのエチルアルコールに、撹拌しながら、２ｇのアルギン酸ナトリウム及び１ｇの次亜塩素酸ナトリウムを添加する。１０ｍｌの脱イオン水を添加し、得られる混合物を室温で２４時間インキュベートする。固相支持体を、アルギン酸ナトリウムを含有する液体に浸漬し、アルギン酸ナトリウムをアルギン酸カルシウムに変換するために使用される５％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム水溶液に素早く浸漬する。固相支持体を取り出し、過剰な液体を絞り出し、固相支持体を蒸留水で洗浄する。洗浄の後、固相支持体を熱いローラーの上に通過させることによって乾燥させる。乾燥した、コーティングされた材料を機械によって柔らかくして（マイクレックス処理して）、プレーンな（ｐｌａｉｎｔ）材料を生成する。アルギン酸カルシウムはヒドロゲルを形成する。固相支持体に添加したアルギン酸塩の量は、２〜１００％（ｗ／ｖ）の間で変動し得る。
【０１０２】
或いは、溶液のアルギン酸ナトリウム／アルギン酸カルシウムを、湿潤剤としてのグリセリン及びゲル形成を防ぐためのエチルアルコールの存在下で固相支持体に直接添加してもよい。コーティングされた材料は上記のように乾燥させる。
【０１０３】
アルギン酸銀を含むマトリックスを調製するために、例えば硝酸銀、銀タンパク質化合物、スルファジアジン銀、又は酢酸銀を含有する混合物を用いてアルギン酸カルシウムを調製し、この混合物を上記のような固相支持体に添加する。
【０１０４】
抑制試験のゾーン
ディスク拡散抗生物質感受性試験は、特定の細菌が特定の薬剤に影響されやすいかどうかを試験するために、抗菌剤を含浸させたディスクを使用する試験である。既知量の細菌を、関連する抗菌剤を含有するディスクの存在下、寒天プレート上で増殖させる。細菌が特定の抗菌剤に対して感受性である場合、細菌が増殖することができないディスクをクリーニング領域が取り囲む（抑制ゾーンと呼ばれる）。これは、抗菌剤の拡散速度とともに特定の抗菌剤に対する細菌の感受性を評価するために使用される。概して、より大きいゾーンは、その細菌のより小さい最小抑制濃度（ＭＩＣ）に相関する。
【０１０５】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ２５９２３、ロット５７９４１６０５）を、滅菌ペトリ皿のトリプトン大豆寒天中、３７℃で一晩培養した。アルギン酸塩でコーティングされた不活性マトリックス（ＦＴＡ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び９０３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の６ｍｍのディスクを培養の寒天表面に適用し、培養物を再び３５℃で一晩インキュベートした。各々の菌叢を、各々のディスクの周囲の増殖抑制（抑制ゾーン）について調べた。対照培養は、６ｍｍディスクの添加を行わない菌叢から成る。
【０１０６】
抑制実験のゾーンから得られる結果を図１に示す。アルギン酸塩及びＦＴＡディスクは、抑制ゾーンを示し、９０３（非コート紙）は、細菌増殖の抑制を示さなかった。対照ディッシュは典型的な菌叢を示した。
【０１０７】
この実験は、アルギン酸塩でコーティングされたマトリックスの細菌増殖に対する抑制性を示す。
【０１０８】
病原体複製の抑制
抗菌剤試験も以下の手順を用いて実施した。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ２５９２３、ロット５７９４１６０５）を、トリプトン大豆ブロス中、振盪せずに３５℃で一晩培養した。翌日、１００μｌの生の（ｎｅａｔ）培養物を、アルギン酸塩でコーティングされたマトリックス、又は９０３紙の６ｍｍパンチを含有するＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓ緩衝液に添加した。生の（ｎｅａｔ）培養物を混合してマトリックスを破壊した。生物の希釈系列を１０-4〜１０-7ｃｆｕでＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓ緩衝液に構築し、各々の試料を周囲温度で１０分間インキュベートした。その後、各々の試料の０．５ｍｌ量をトリプトン大豆寒天に播種し、プレートを１０分間周囲温度で乾燥させた。プレートを反転させ、３５℃で一晩培養した。コロニーカウントを翌日に実施し、アルギン酸塩マトリックスから得た結果を対照プレート（非コート９０３紙）と比較した。
【０１０９】
病原体不活性化実験から得られる結果を図２に示す。アルギン酸塩は、病原体増殖の抑制を示し、９０３（非コート紙）は、細菌複製の抑制を示さなかった。対照ディッシュは典型的な菌叢を示した。
【０１１０】
この実験は、アルギン酸塩でコーティングされたマトリックスの細菌増殖に対する抑制性を示す。
【０１１１】
増幅ＤＮＡ配列の短いタンデムリピート（ＳＴＲ）鑑定
この実験は、アルギン酸塩マトリックスに対して直接ＤＮＡを増幅し、ＦＴＡ及び９０３（対照）などの確立されたマトリックスでの結果と比較するために実施された。ＤＮＡ鑑定は本明細書に記載したＤＮＡの塩基対の短い反復配列である、短いタンデムリピート（ＳＴＲ）を用いるＰＣＲに基づく。この方法は、ＤＮＡの短い反復配列を有する非常に多形性の領域を使用する（最も一般的なものは４塩基反復である）。血縁でない人はほぼ確実に異なる数の繰り返し単位を有するので、ＳＴＲは、血縁でない個人を識別するために使用されることができる。これらのＳＴＲの遺伝子座（染色体上の位置）は、配列特異的プライマーによって標的化され、ＰＣＲを用いて増幅される。結果として生じるＤＮＡ断片は、次に分離され、キャピラリー電気泳動を用いて検出される。従って、ＳＴＲ遺伝子座は、３〜７塩基対の長さの短い反復配列要素からなる。これらの反復は、ヒトゲノム全体によく分布しているので、ＰＣＲを用いて検出されてよい非常に多形性のマーカーの豊富な供給源である。ＳＴＲ遺伝子座の対立遺伝子は、増幅領域内に含まれる反復配列のコピー数だけ分化し、電気泳動分離の後に蛍光検出を用いて互いに区別される。
【０１１２】
保存カードパンチからのＤＮＡの直接増幅を続いて行った。直接ＳＴＲプロファイリングを、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍ（製品コードＤＣ８９０２、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を用いて２８増幅サイクルを超えて二重のパンチで行った。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍは、Ｄ１Ｓ１６５６、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ６Ｓ１０４３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１２Ｓ３９１、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ１９Ｓ４３３、Ｄ２１Ｓ１１、アメロゲニン、ＣＳＦ１ＰＯ、ＦＧＡ、Ｐｅｎｔａ  Ｄ、Ｐｅｎｔａ  Ｅ、ＴＨ０１、ＴＰＯＸ及びｖＷＡを含む、２１個の遺伝子座（２０個のＳＴＲ遺伝子座及びアメロゲニン）の共増幅及び４色蛍光検出を許容した。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍは、ホットスタート熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マスターミックス及びプライマーを含む、ヒトゲノムＤＮＡのＳＴＲ領域を増幅するために必要なすべての材料を提供し、このキットを用いて、１．２ｍｍのパンチから、アルギン酸塩をコーティングしたマトリックス、ＦＴＡ及び９０３紙に塗布した１０6ヒト胚性幹細胞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７ＧＥＨＣ２８）からＤＮＡを直接増幅する。取扱説明書（ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  ２１  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）に概説される手順に正確に従った。
【０１１３】
２８サイクルを超える熱サイクル条件は以下の通りであった。
９６℃で１分間、次いで
９４℃で１０秒間
５９℃で１分間
７２℃で３０秒間
を２８サイクル、次いで
６０℃で２０分間
４℃で保持。
【０１１４】
得られるＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＭＡＰＰＥＲ（商標）ｖ３．２ソフトウェア（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）を備えたＡＢＩ（商標）３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒキャピラリー電気泳動システムで分析した。パンチから生成したＳＴＲプロファイルを得、試料の結果を比較した。
【０１１５】
アルギン酸塩でコーティングしたマトリックス、ＦＴＡ及び９０３紙から得たＤＮＡ増幅およＤＮＡ鑑定の結果を図３に示す。完全なＤＮＡプロファイルがアルギン酸塩でコーティングしたマトリックス（図３Ａ）、ＦＴＡ紙（図３Ｂ）及び９０３紙（図３Ｃ）から得られた。アルギン酸塩でコーティングしたマトリックス（図３Ａ）の結果は、ＤＮＡがこのマトリックスから保存され増幅されてよいことを示した。
【０１１６】
タンパク質及び酵素の検出
タンパク質及び酵素試験は、完全に構成されたＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（ＤＮａｓｅ＆ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログコードＡＭ１９７０＆ＡＭ１９６６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造業者の説明書に従って実施した。
【０１１７】
最初の一連の実験では、０．１２５〜０．５ＵのＤＮａｓｅを、アルギン酸塩でコーティングしたマトリックスＦＴＡ及び９０３紙に１０μｌ量で塗布した。ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ活性を下に概説するように測定した。
【０１１８】
２回目の一連の実験では、１０6ヒト胚性幹細胞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）から１．２ｍｍパンチを取り、それをアルギン酸塩でコーティングしたマトリックス、ＦＴＡ及び９０３紙に上記のように１０μｌ量で塗布した。ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ活性を下に概説するように測定した。
【０１１９】
３回目の一連の実験では、１０6ヒト胚性幹細胞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）（これらの細胞に添加された、０．５ＵのＤＮａｓｅか又は１０μＵのＲＮａｓｅのいずれかを含有）から１．２ｍｍパンチを取り、それをアルギン酸塩でコーティングしたマトリックス、ＦＴＡ及び９０３紙に１０μｌ量で塗布した。
【０１２０】
ＤＮａｓｅ活性の検出を、切断可能な蛍光標識ＤＮａｓｅ基質を用いて以下の通り実施した。各々のパンチは、９６ウェルプレートの別々のウェルに押し出した。凍結乾燥したＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを、ＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェルに分配した（１０μｌ）。１０Ｘ  ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０μｌ）及びヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）を添加し、試験液（１００μｌ）を３７℃で６０分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、ＤＮａｓｅによって切断されるとピンク色の蛍光を発する修飾されたＤＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関して、蛍光はＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（ミディアム・ゲイン（ｍｅｄｉｕｍ  ｇａｉｎ）を用いて励起／発光  ５３５／５９５ｎｍ）で測定した。ＤＮａｓｅ活性を含有する溶液はピンク色の蛍光を生じたが、ＤＮａｓｅ活性を含まない溶液は蛍光を発しなかった。従って、ＤＮａｓｅのより高いレベルは、光出力量の増加に一致した。陰性対照は、試料の代わりにヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）から成った。図４．１は、アルギン酸塩、９０３又はＦＴＡ紙を用いて、ＤＮＡアーゼ活性が率依存的な方法で検出され定量化され得ることを示す。
【０１２１】
ＲＮａｓｅの検出は、切断可能な蛍光標識ＲＮａｓｅ基質を用いて以下の通り実施した。各々のパンチは、９６ウェルプレートの別々のウェルに押し出した。凍結乾燥したＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを、ＴＥバッファー（１ｍｌ）に溶解し、９６ウェルプレートの試験ウェルに分配した（１０μｌ）。１０Ｘ  ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０μｌ）及びヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）を添加し、試験液（１００μｌ）を３７℃で６０分間インキュベートした。ＲＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ  ＱＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅは、ＲＮａｓｅによって切断されると緑色の蛍光を発する修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このアッセイに関して、蛍光はＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ（ミディアム・ゲイン（ｍｅｄｉｕｍ  ｇａｉｎ）を用いて励起／発光  ４８５／５３５ｎｍ）で測定した。ＲＮａｓｅを含有する溶液は緑色の蛍光を生じたが、ＲＮａｓｅ活性を含まない溶液は蛍光を発しなかった。従って、ＲＮａｓｅのより高いレベルは、光出力量の増加に一致した。陰性対照は、試料の代わりにヌクレアーゼフリー水（８０μｌ）から成った。図４．２は、アルギン酸塩、９０３又はＦＴＡ紙を用いて、ＲＮＡアーゼ活性が率依存的な方法で検出され定量化され得ることを示す。
【０１２２】
全ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ
逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡ鋳型から、逆転写と呼ばれるプロセスである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素である。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型から一本鎖ＤＮＡを作成する。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＰＣＲの多くの変形形態の１つである。この技術は、ＲＮＡ発現レベルを検出するために分子生物学において慣用されている。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡからの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）転写物の作成によって遺伝子発現を定量的に検出するために使用される。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡからのｃＤＮＡ転写物の作成によって遺伝子発現を定量的に検出するために使用される。アガロースゲルに組み込まれた蛍光染料の使用による遺伝子発現レベルの検出を必要とするエンドポイントＲＴ−ＰＣＲを用いる技術がここに報告される。
【０１２３】
１０7ヒト胚性幹細胞（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、細胞株参照番号：ＷＣＢ３０７  ＧＥＨＣ２８）を、アルギン酸塩でコーティングしたマトリックスに塗布した。全ＲＮＡを、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ＲＮＡ単離キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品コード２５−０５００−７０）を用いてこのマトリックスから抽出した。全ＲＮＡを、取扱説明書に記載されるように正確に調製した。収量は、３１２ｎｇ／μｌであった。ＮａｎＶｕｅ分光光度計で測定した２６０／２８０ｎｍでの純度は１．９５であった。
【０１２４】
直接ＲＴ  ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、１．５ｍＭＭｇＣｌ2、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、安定剤及び４０ｎｇ鋳型ＲＮＡからなるｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ−ＲＴ  ＰＣＲビーズ２．０単位を用いて、９６ウェルクラスタープレートで実施された。上記は取扱説明書に概説されるツーステップ法に従ってＲＴ−ＰＣＲを５０μｌ量で実施して調製された。
【０１２５】
２００μＭ  ｄＮＴＰを添加した後、反応物を４２℃で３０分インキュベートし、これに続いてβ−グロビンプライマー配列を添加した。
β−グロビンプライマー配列（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）は以下の通りであった。
β−グロビン−エキソンＩ：配列（５’．．．．．．３’）
ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＴＧ（配列番号１）
β−グロビン−エキソンＩＩＩ：配列（５’．．．．．．３’）
ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  Ｔ（配列番号２）。
【０１２６】
熱サイクル条件は以下の通りであった。
９４℃、３分
９４℃  ３０秒
５５℃、１分
７２℃  ３０秒
７２℃  ５分
４２サイクル
常に４℃。
【０１２７】
ＲＮａｓｅフリーアガロースゲル電気泳動（２％ｗ／ｖ）を、１μｌの６Ｘ添加液を用いて実施して生成物を分析した。結果を図５に示す。レーン２は、アルギン酸塩でコーティングしたマトリックスから抽出されたＲＮＡから得た、増幅されたβ−グロビン遺伝子断片を示す。これらのデータは、アルギン酸塩でコーティングしたマトリックスからＲＮＡを抽出及び増幅することが可能であることを示す。
【０１２８】
本発明の好ましい実例となる実施形態が記載されるが、当業者は、本発明が、説明目的のためだけに示されるものであって制限目的でない、記載される実施形態以外によって実践されることができることを理解するであろう。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【配列表】
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