(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンから選択される化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンから選択される化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記化合物が、（Ｒ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンを実質的に含まない、請求項２に記載の前記化合物及びその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
前記化合物が、約９５％を超える鏡像体過剰率を有する、請求項２に記載の前記化合物。
【請求項５】
（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン。
【請求項６】
前記化合物が、（Ｒ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オンを実質的に含まない、請求項５に記載の前記化合物。
【請求項７】
前記化合物が、約９５％を超える鏡像体過剰率を有する、請求項５に記載の前記化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
細胞内に存在するＰＩ３δキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、前記組成物。
【請求項１０】
細胞内に存在するＰＩ３γキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、前記組成物。
【請求項１１】
細胞内に存在するＰＩ３δキナーゼ及びＰＩ３γキナーゼの触媒活性を阻害するための組成物であって、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、前記組成物。
【請求項１２】
前記阻害が、癌、骨障害、炎症性疾患、免疫疾患、神経系疾患、代謝性疾患、呼吸器疾患、血栓症、及び心疾患から選択される疾患、障害、または病態を患う対象において生じる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の前記組成物。
【請求項１３】
白血病の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、前記組成物。
【請求項１４】
喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、前記組成物。
【請求項１５】
リウマチ性関節炎、乾癬、ループス、または実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を含む、前記組成物。
【請求項１６】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、または緩徐進行性非ホジキンリンパ腫（Ｉ−ＮＨＬ）疾患の治療を必要とする患者においてそれを治療するための組成物であって、前記組成物が、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む、前記組成物。
【請求項１７】
ＰＩ３δ／γキナーゼの触媒活性の阻害による、疾患、障害、または病態の治療のための薬物の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態の治療のための組成物であって、有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記化合物を含む、前記組成物。
【請求項１９】
抗癌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、鎮痛剤、及びこれらの混合物から選択される更なる活性剤を更に含む、請求項１８に記載の前記組成物。
【請求項２０】
前記ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態が、免疫系関連疾患、炎症を伴う疾患もしくは障害、癌もしくは他の増殖性疾患、肝臓疾患もしくは障害、または腎臓疾患もしくは障害である、請求項１８に記載の前記組成物。
【請求項２１】
前記ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態が、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病、乾癬、リウマチ性関節炎、骨関節炎、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー性鼻炎、ならびにループスエリテマトーデスから選択される、請求項１８に記載の前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年６月７日に出願されたインド特許出願番号第２５０１／ＣＨＥ／２０１３号、及び２０１３年１２月３日に出願された同第５５６７／ＣＨＥ／２０１３号の利益を主張し、そのそれぞれは、これによりその全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、二重デルタ（δ）及びガンマ（γ）ＰＩ３Ｋタンパク質キナーゼ調節剤、それらを調製する方法、それらを含有する薬学的組成物、ならびにそれらでのＰＩ３Ｋキナーゼ媒介疾患または障害の治療、予防、及び／または寛解の方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、ホスホイノシチド脂質（ＰＩ）のイノシトール環３位のヒドロキシル基をリン酸化して脂質セカンドメッセンジャーを産生する、細胞内脂質キナーゼのクラスに属する。アルファ及びベータアイソフォームがそれらの分布において遍在性である一方で、デルタ及びガンマの発現は循環する血行性細胞及び内皮細胞に限定される。ＰＩ３Ｋアルファまたはベータとは異なり、ガンマまたはデルタの発現を欠如するマウスは、これらの特異的アイソフォームの標的化が明らかな毒性につながらないことを示す、いかなる有害な表現型も示さない。
【０００４】
近年、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）パスウェイの標的化阻害剤が、免疫調節剤として示されている。この目的は、ＰＩ３Ｋパスウェイが、主に膜結合セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰＩＰ３）の産生を通して、免疫細胞のシグナル伝達において複数の機能を果たすという事実に由来する。ＰＩＰ３は、タンパク質キナーゼ及びＧＴＰアーゼを含むタンパク質を脂質二重層の細胞質側に対して動員し、免疫細胞接着、遊走、及び細胞間情報伝達の制御において重要な下流のシグナル伝達カスケードの複雑なネットワークを開始する。
【０００５】
４つのクラスＩ  ＰＩ３Ｋアイソフォームは、それらの組織分布において著しく異なる。ＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβは遍在性であり、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の下流で活性化される一方で、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγは主に造血性及び内皮細胞に限定され、それぞれＲＴＫの下流及びＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の下流で活性化される。マウス遺伝子研究は、ＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβが正常な発達のために必須である一方で、ＰＩ３Ｋδ及び／またはＰＩ３Ｋγの喪失が選択的免疫欠損を有する生存可能な子孫をもたらすことを明らかにしている。
【０００６】
ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの発現パターン及び機能は、リウマチ性関節炎、アレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、及び多発性硬化症を含む多くの疾患のための薬剤としての、ＰＩ３Ｋδ／γ阻害剤の開発において大きな関心を生み出した（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１８，１９２−２０５，２００８、Ｍａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１７８４，１５９−１８５，２００８、Ｒｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１９１−２０１，２００７、Ｒｕｃｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，５，９０３−９１８，２００６）。薬理的及び遺伝子的方法の両方を使用する研究は、これらの２つのアイソフォームが、しばしば互いとの相乗的な相互作用を実証することを示している（Ｋｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，３３２９６−３３３０３，２００８、Ｌａｆｆａｒｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２）。例えば、マスト細胞において、ＰＩ３ＫδはＦｃ受容体のＩｇＥ架橋に反応する脱顆粒のために必須である（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０，２５３８−２５４４，２００８）が、ＰＩ３Ｋγは反応の増幅において重要な役割を果たす（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２）。同様の効果が、ＰＩ３Ｋγが重要な役割を果たし、ＰＩ３Ｋδが各プロセスを増幅する、リンパ球ホーミング及び好中球呼吸バーストを含む他の細胞機能において見られている。ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの非冗長性であるが関連する役割は、２つのアイソフォームのうちのどちら（単独または組み合わせ）が特定の炎症性障害において最良に標的化されるかを決定することを困難にしている。ＰＩ３Ｋδ及び／またはＰＩ３Ｋγを欠如するか、またはＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγのキナーゼ死バリアントを発現するマウスを使用する研究は、それらの役割を理解することにおいて貴重な手段となっている。例えば、ＰＩ３Ｋδノックアウトマウスは、減少した好中球走化性、減少した抗体生成（Ｔ細胞依存及び非依存の両方）（Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２）、及びより少ない数の成熟Ｂ細胞（Ｃｌａｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６，７５３−７６３，２００２、Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２）、及びそれらの抗ＩｇＭに反応する増殖における減少（Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を実証した。この表現型は、ＰＩ３Ｋδキナーゼ死バリアントにおいて、ＰＩ３Ｋδ選択的阻害剤及び減弱したアレルギー反応とともに、減少した数のマスト細胞及びマスト細胞の増殖とともに複製された。ＰＩ３Ｋγノックアウトは、より多い数の、しかしより反応性でない好中球、より少ない数かつより反応性でないマクロファージを含有し、樹状細胞は減少したマスト細胞脱顆粒（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、より高い割合のＣＤ４＋〜ＣＤ８＋Ｔ細胞、増大した胸腺細胞アポトーシス、活性化Ｔ細胞上へのＣＸＣＲ３の減少した誘導、及び減少した心臓収縮力を示した。心臓組織に対するこの後者の効果は、ＰＩ３Ｋγ阻害剤を有する患者の慢性投薬に対する懸念であった。しかしながら、この懸念は、（タンパク質の喪失よりもむしろキナーゼの阻害をより良く模倣する）ＰＩ３Ｋγキナーゼ死バリアントが同様の免疫細胞表現型を示したが、重要なことに心臓異常を有さなかったとき、大きく軽減された。心臓効果は、その後ＰＩ３Ｋγの触媒活性よりもむしろ足場効果によるものであることが示された。二重ＰＩ３Ｋδ／ＰＩ３Ｋγノックアウトは生存可能であるが、Ｔ細胞の発達及び胸腺細胞の生存において深刻な異常を呈した。ＰＩ３Ｋγノックアウト／ＰＩ３Ｋδキナーゼ死の組み合わせは、少なくとも免疫系において、ＰＩ３Ｋδの役割が触媒的なもののみであることを示す同様の表現型を生成した。ノックアウト及びキナーゼ死マウスを使用する研究の解釈は、これらのモデルは免疫系の定常状態の描写のみを提供し、経時的及び用量対照を欠如し、動的免疫反応が可逆的阻害に対してどのように反応するのかについての完全な理解を許容しないため、困難であり得る。異なるプロファイル（ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋγ、及びＰＩ３Ｋδ／γ）を有する選択的阻害剤は、免疫細胞活性化に対するそれぞれのＰＩ３Ｋの相対的な寄与を評価するための、白血球シグナル伝達の研究のために必要である（Ｏｌｕｓｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１２３−１３４（２０１０）、その中で引用される参照を含む）。
【０００７】
δ／γの二重阻害は、気道のアレルギー性炎症及び非アレルギー性炎症、ならびに他の自己免疫疾患における介入計画と強く関係付けられる。喘息及びＣＯＰＤの根底にある、様々な細胞プロセスにおけるＰＩ３Ｋδ及びγガンマの関与の科学的根拠は、阻害剤研究及び遺伝子標的化アプローチに由来する。また、いくつかのＣＯＰＤ患者におけるコルチコステロイド等の従来の治療法に対する抵抗は、ＰＩ３Ｋδ／γパスウェイの上方制御に起因する。したがって、ＰＩ３Ｋ−δ／γシグナル伝達の破壊は、免疫炎症反応に対抗することを目的とする新規の計画を提供する。白血球遊走及び活性化等の炎症性細胞の機能性を媒介することにおける、ＰＩ３Ｋ−δ及びγによって果たされる中心的な役割、ならびにマスト細胞脱顆粒のために、これらのアイソフォームを遮断することもまた、リウマチ性関節炎の治療のための有効な計画であり得る。免疫監視におけるこれらのアイソフォームの確立された重要性を考慮すると、δ及びγアイソフォームを特異的に標的化する阻害剤は、気道炎症及びリウマチ性関節炎において遭遇される免疫反応の進行を減弱することが期待される（Ｗｉｌｌｉａｍ  ｅｔ．ａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０、及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１０１−１０２，２０１０）。
【０００８】
ＰＩ３Ｋ及び関連するタンパク質キナーゼパスウェイに関する審査及び研究は、Ｌｉｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，８，６２７−６４４，２００９）、Ｎａｔｈａｎ  Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，８（１），２００９、Ｍａｒｏｎｅ  ｅｔ，ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７８４，１５９−１８５，２００８、及び２００９年８月に出版されたＭａｒｋｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓによって与えられる。同様に、ＰＩ３Ｋδ及びγの役割に関する審査及び研究は、Ｗｉｌｌｉａｍ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０、及びＴｉｍｏｔｈｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５５（２０），８５５９−８５８１，２０１２によって与えられる。これらの文献開示の全ては、これによりそれらの全体が参照によって組み込まれる。
【０００９】
ＩＰＩ−１４５及びＣＡＬ１３０等の化合物は、ＰＩ３Ｋδ／γの二重阻害剤として報告されている。ＩＰＩ−１４５は、癌、喘息、及びリウマチ性関節炎の臨床研究下にある。ＩＰＩ−４５は、７５ｍｇのＢＩＤの最大許容用量（ＭＴＤ）を有すると報告されている（５５ｔｈ  ＡＳＨ（登録商標）Ａｎｎｕｌａ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ−ＬＡ，Ｄｅｃ７−１０，２０１３）。ＣＡＬ−１３０が臨床目的のために研究されているという報告は存在しない。
【００１０】
δ／γＰＩ３Ｋキナーゼ媒介事象に関連する疾患及び障害の治療のための、二重δγＰＩ３Ｋ調節剤の満たされていない必要性が依然存在する。
【００１１】
本明細書において、国際公開第ＷＯ１１／０５５２１５号及び同第ＷＯ１２／１５１５２５号、ならびに米国公開第２０１１／０１１８２５７号及び同第２０１２／０２８９４９６号に対する更なる参照がなされ、そのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】インド特許出願番号第２５０１／ＣＨＥ／２０１３号
【特許文献２】インド特許出願番号第５５６７／ＣＨＥ／２０１３号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ１１／０５５２１５号
【特許文献４】国際公開第ＷＯ１２／１５１５２５号
【特許文献５】米国公開第２０１１／０１１８２５７号
【特許文献６】米国公開第２０１２／０２８９４９６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１８，１９２−２０５，２００８
【非特許文献２】Ｍａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１７８４，１５９−１８５，２００８
【非特許文献３】Ｒｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１９１−２０１，２００７
【非特許文献４】Ｒｕｃｋｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，５，９０３−９１８，２００６
【非特許文献５】Ｋｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，３３２９６−３３３０３，２００８
【非特許文献６】Ｌａｆｆａｒｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２
【非特許文献７】Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０，２５３８−２５４４，２００８
【非特許文献８】Ｊｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１，２００２
【非特許文献９】Ｃｌａｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６，７５３−７６３，２００２
【非特許文献１０】Ｏｌｕｓｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１２３−１３４（２０１０）
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｉａｍ  ｅｔ．ａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１２３−１３４，２０１０
【非特許文献１２】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１０１−１０２，２０１０
【非特許文献１３】Ｌｉｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，８，６２７−６４４，２００９
【非特許文献１４】Ｎａｔｈａｎ  Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，８（１），２００９
【非特許文献１５】Ｍａｒｋｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ａｃｃｅｓｓ, ２００９年８月
【非特許文献１６】Ｔｉｍｏｔｈｙ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５５（２０），８５５９−８５８１，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマタンパク質キナーゼの選択的二重阻害剤を対象とする。これらの化合物は、例えば、癌等の増殖性疾患等の、ＰＩ３Ｋ関連疾患、障害、または病態の治療のための薬学的組成物における使用のために好適である。ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマタンパク質キナーゼの両方の阻害は、特定の疾患及び障害の治療において有益な効果を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の選択的二重阻害剤は、以下の化合物、その薬学的に許容される塩、及びそのプロドラッグを含む。
（ＲＳ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン。（化合物Ａ）
（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン。（化合物Ａ１）
（Ｒ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン。（化合物Ａ２）
【００１６】
本発明の化合物の化学的構造は、以下に示される。
【化１】
0006499165.tif 000002
【００１７】
一実施形態において、本発明は、化合物（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１８】
一実施形態において、化合物（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、またはその薬学的に許容される塩は、（Ｒ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、及びその薬学的に許容される塩を実質的に含まない（例えば、約５重量％未満、約２．５重量％未満、約１重量％未満、約０．１重量％未満等の約１０重量％未満を含有するか、またはそれを含まない）。
【００１９】
別の実施形態において、化合物（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン、またはその薬学的に許容される塩は、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、約９９．５％超、約９９．９％超、または約９９．９９％超等の約９０％を超える鏡像体過剰率を有する。
【００２０】
好ましい一実施形態において、本発明は、化合物（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（化合物Ａ１）に関する。
【００２１】
本発明は、薬学的に許容される担体とともに、本発明の１つ以上の化合物（化合物Ａ１等）を含む薬学的組成物を更に提供する。薬学的組成物は、１つ以上の更なる活性剤（以下に説明する抗癌剤及び活性剤等）を更に含み得る。一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の１つ以上の化合物を含む。
【００２２】
別の実施形態は、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を患者に投与することによって、患者においてＰＩ３Ｋデルタ及びガンマを阻害する方法である。
【００２３】
更に別の実施形態は、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を患者に投与することによって、患者においてＰＩ３Ｋタンパク質キナーゼ媒介疾患、障害、または病態（癌あるいは他の増殖性疾患または障害等）を治療、予防、及び／または阻害する方法である。
【００２４】
本発明の更に別の実施形態は、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を患者に投与することによって、患者においてＰＩ３Ｋ、特にＰＩ３Ｋデルタ及びガンマキナーゼを阻害する方法である。
【００２５】
本発明の更に別の実施形態は、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を、そのような治療を必要とする患者に投与することによって、タンパク質キナーゼ（ＰＩ３デルタ及びガンマキナーゼ等）の調節を介して、炎症性疾患、自己免疫疾患、または増殖性疾患を治療する方法である。一実施形態において、本発明の化合物は、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマタンパク質キナーゼの両方を阻害する。
【００２６】
本発明の更に別の実施形態は、少なくとも１つの他の抗炎症剤、免疫調節剤、または抗癌剤（あるいはこれらの組み合わせ）との組み合わせ（同時または経時に）で、有効量の本発明の少なくとも１つの化合物を、そのような治療を必要とする患者に投与することによって、タンパク質キナーゼ（ＰＩ３デルタ及びガンマキナーゼ等）の調節を介して、炎症性疾患、自己免疫疾患、または増殖性疾患を治療する方法である。一実施形態において、本発明の化合物は、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマタンパク質キナーゼの両方を阻害する。
【００２７】
本発明の化合物は、
【００２８】
膀胱癌腫、乳癌腫、結腸癌腫、腎臓癌腫、肝臓癌腫、小細胞肺癌を含む肺癌腫、食道癌腫、胆嚢癌腫、卵巣癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、子宮頸癌腫、甲状腺癌腫、前立腺癌腫、及び扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌腫、を含むが、これに限定されない癌腫、
【００２９】
白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、及びバーキットリンパ腫を含むが、これに限定されないリンパ球系統の造血性腫瘍、
【００３０】
急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病を含むが、これに限定されない骨髄系統の造血性腫瘍、
【００３１】
線維肉腫及び横紋筋肉腫を含むが、これに限定されない間葉起源の腫瘍、
【００３２】
星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含むが、これに限定されない中央及び抹消神経系の腫瘍、ならびに、
【００３３】
黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、及びカポジ肉腫を含むが、これに限定されない他の腫瘍、を含むが、これに限定されない様々な癌の治療において有用である。
【００３４】
一実施形態において、本発明の化合物は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに前骨髄球性白血病を治療するために投与される。
【００３５】
一般的な細胞増殖の制御におけるタンパク質キナーゼの重要な役割のために、本発明のタンパク質キナーゼ阻害剤は細胞分裂阻害剤として作用し得、したがって、例えば、前立腺肥大症、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節炎、乾癬、糸球体腎炎、血管形成または血管手術後の再狭窄、肥厚性瘢痕形成、炎症性腸疾患、移植片拒絶、内毒素ショック、及び真菌症等の異常な細胞増殖を特徴とする任意の疾患プロセスの治療において有用であり得る。
【００３６】
アポトーシスの調節剤としての本発明の化合物は、（本明細書に上述の型を含むが、これに限定されない）癌、（ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、シンドビスウイルス、及びアデノウイルスを含むが、これに限定されない）ウイルス性感染症、（全身性ループス、エリテマトーデス、自己免疫媒介糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、乾癬、炎症性腸疾患、及び自己免疫真性糖尿病を含むが、これに限定されない）自己免疫疾患、（アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性、脊髄性筋萎縮症、及び小脳変性症を含むが、これに限定されない）神経変性障害、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、心筋梗塞、脳卒中、及び再灌流損傷に関連する虚血損傷、不整脈、アテローム性動脈硬化症、毒素誘導またはアルコール関連肝臓疾患、（慢性貧血及び再生不良性貧血を含むが、これに限定されない）血液病、（骨粗鬆症及び関節炎を含むが、これに限定されない）筋骨格系の変性疾患、アスピリン敏感副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎臓疾患、ならびに癌性疼痛の治療において有用である。本発明の化合物はまた、ＨＩＶに感染した個体におけるＡＩＤＳ発症の予防、阻害、または抑制において有用である。
【００３７】
本発明の化合物は、細胞ＲＮＡ及びＤＮＡ合成のレベルを調節し得る。したがって、これらの薬剤は、ＨＩＶ、ヒトパピローマウイルス感染症、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタイン−バーウイルスシンドビスウイルス、及びアデノウイルスを含むが、これに限定されないウイルス性感染症の治療において有用である。
【００３８】
本発明の化合物は、癌の化学予防において有用である。化学予防は、開始する変異原性事象を遮断すること、あるいは、既に侵襲を患っている前悪性細胞の進行を遮断すること、または腫瘍再発を阻害することのいずれかによって、浸潤性癌の発達を阻害することとして定義される。本発明の化合物はまた、腫瘍の血管形成及び転移の阻害において有用である。本発明の一実施形態は、有効量の本発明の１つ以上の化合物を投与することによって、それを必要とする患者において、腫瘍の血管形成または転移を阻害する方法である。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、免疫系関連疾患（例えば、自己免疫疾患）、炎症を伴う疾患または障害（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、神経炎症性疾患、多発性硬化症、ブドウ膜炎、及び免疫系の障害）、癌または他の増殖性疾患、肝臓疾患または障害、腎臓疾患または障害を治療する方法である。本方法は、有効量の本発明の１つ以上の化合物を投与することを含む。
【００４０】
免疫障害の例は、乾癬、リウマチ性関節炎、脈管炎、炎症性腸疾患、皮膚炎、骨関節炎、喘息、炎症性筋肉疾患、アレルギー性鼻炎、腟炎、間質性膀胱炎、強皮症、骨粗鬆症、湿疹、同種または異種移植片（器官、骨髄、幹細胞、ならびに他の細胞及び組織）拒絶、移植片対宿主病、ループスエリテマトーデス、炎症性疾患、Ｉ型糖尿病、肺線維症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、甲状腺炎（例えば、橋本甲状腺炎及び自己免疫甲状腺炎）、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、多発性硬化症、嚢胞性線維症、慢性再発肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性結膜炎ならびにアトピー性皮膚炎を含むが、これに限定されない。
【００４１】
一実施形態において、本明細書に記載される化合物は、移植片拒絶、同種または異種移植片拒絶（器官、骨髄、幹細胞、ならびに他の細胞及び組織）、及び移植片対宿生疾患を予防するための免疫抑制剤として有用である。他の実施形態において、移植片拒絶は、組織または器官移植に起因する。更なる実施形態において、移植片対宿生疾患は、骨髄または幹細胞移植に起因する。一実施形態は、有効量の本発明の１つ以上の化合物を投与することによって、移植片拒絶、同種または異種移植片拒絶（器官、骨髄、幹細胞、ならびに他の細胞及び組織）、あるいは移植片対宿生疾患のリスクを予防または減少させる方法である。
【００４２】
本発明の化合物はまた、放射線治療法等の既知の抗癌治療、あるいは、例えば、シスプラチンまたはドキソルビシン等のＤＮＡ相互作用剤；エトポシド等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；ＣＰＴ−１１またはトポテカン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；天然に存在する、または合成のいずれかのパクリタキセル、ドセタキセル、またはエポチロン（例えば、イクサベピロン）等のチューブリン相互作用剤；タモキシフェン等のホルモン剤；５−フルオロウラシル等のチミジル酸合成酵素阻害剤；メトトレキサート等の代謝拮抗薬、ならびにイレッサ及びＯＳＩ−７７４等の他のチロシンキナーゼ阻害剤；血管形成阻害剤；ＥＧＦ阻害剤；ＶＥＧＦ阻害剤；ＣＤＫ阻害剤；ＳＲＣ阻害剤；ｃ−ｋｉｔ阻害剤；Ｈｅｒ１／２阻害剤；及びアービタックス（ＥＧＦ）及びハーセプチン（Ｈｅｒ２）等の増殖因子受容体に対して向けられたモノクローナル抗体、ならびに他のタンパク質キナーゼ調節剤等の、細胞分裂阻害剤または細胞毒性剤または抗癌剤との組み合わせ（ともにまたは経時的に投与される）において有用である。
【００４３】
本発明の化合物はまた、１つ以上のステロイド性抗炎症性薬物、非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）、または免疫選択的抗炎症性誘導体（ＩｍＳＡＩＤ）との組み合わせ（ともにまたは経時的に投与される）において有用である。
【００４４】
本発明は、薬学的に許容される担体とともに、本発明の１つ以上の化合物を含む薬学的組成物を更に提供する。薬学的組成物は、他の抗癌剤等の、上記に特定される１つ以上の更なる活性成分を更に含み得る。
【００４５】
更に別の実施形態は、治療有効量の本発明の化合物を投与することによって、それを必要とする患者において白血病を治療する方法である。例えば、本発明の化合物は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及び緩徐進行性非ホジキンリンパ腫（Ｉ−ＮＨＬ）の治療のために有効である。
【００４６】
更に別の実施形態は、治療有効量の本発明の化合物を投与することによって、それを必要とする患者において白血病を治療する方法である。例えば、本発明の化合物は、喘息、ＣＯＰＤ、リウマチ性関節炎、乾癬、ループス、及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）等の自己免疫障害の治療のために有効である。
【００４７】
更に別の実施形態は、治療有効量の本発明の化合物を投与することによって、それを必要とする患者においてアレルギー性鼻炎を治療する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】アッセイ７に記載されるリポ多糖誘導肺好中球増加症モデルに従う、０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１（経口）で処理した動物からの、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球数の棒グラフを図示する。
【図２】アッセイ８に記載されるリポ多糖誘導ラット空気嚢炎症モデルに従う、０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１（経口）で処理した動物からの、腹膜洗浄液中の好中球数の棒グラフを図示する。
【図３】アッセイ９に記載される手順に従う、０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１（経口）の投与後の、絶食時の雌のウィスターラットにおけるリポ多糖誘導血漿ＴＮＦ−α濃度の棒グラフを図示する。
【図４Ａ】アッセイ１０Ａにおける手順に従う、メタコリン負荷、及びＯＶＡ／ＳＡＬまたはＯＶＡ／ＯＶＡ、あるいは０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理後の、感作された雄のモルモットにおけるエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）またはＰＥＦ／ＰＩＦ（最大呼気流量／最大吸気流量）割合それぞれのグラフを図示する。
【図４Ｂ】アッセイ１０Ａにおける手順に従う、メタコリン負荷、及びＯＶＡ／ＳＡＬまたはＯＶＡ／ＯＶＡ、あるいは０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理後の、感作された雄のモルモットにおけるエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）またはＰＥＦ／ＰＩＦ（最大呼気流量／最大吸気流量）割合それぞれのグラフを図示する。
【図４Ｃ】アッセイ１０Ａにおける手順に従う、０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理し、卵白アルブミンで感作された雄のモルモットにおけるＢＡＬＦ中の好酸球数、ＢＡＬＦ中の総細胞数、及び好酸球のパーセンテージそれぞれの棒グラフを図示する。
【図４Ｄ】アッセイ１０Ａにおける手順に従う、０ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理し、卵白アルブミンで感作された雄のモルモットにおけるＢＡＬＦ中の好酸球数、ＢＡＬＦ中の総細胞数、及び好酸球のパーセンテージそれぞれの棒グラフを図示する。
【図５Ａ】アッセイ１０Ｂにおける手順に従う、メタコリン負荷、及びＳＡＬ／ＳＡＬ、ＯＶＡ／ＳＡＬ、またはＯＶＡ／ＯＶＡ、あるいは３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理後の、卵白アルブミンで感作されたマウスにおけるＰｅｎｈまたはＰＥＦ／ＰＩＦ割合それぞれのグラフを図示する。
【図５Ｂ】アッセイ１０Ｂにおける手順に従う、メタコリン負荷、及びＳＡＬ／ＳＡＬ、ＯＶＡ／ＳＡＬ、またはＯＶＡ／ＯＶＡ、あるいは３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理後の、卵白アルブミンで感作されたマウスにおけるＰｅｎｈまたはＰＥＦ／ＰＩＦ割合それぞれのグラフを図示する。
【図５Ｃ】アッセイ１０Ｂにおける手順に従う、０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理し、卵白アルブミンで感作されたマウスにおけるＢＡＬＦ中の好酸球数、ＢＡＬＦ中の総細胞数、及び好酸球のパーセンテージそれぞれの棒グラフを図示する。
【図５Ｄ】アッセイ１０Ｂにおける手順に従う、０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での処理し、卵白アルブミンで感作されたマウスにおけるＢＡＬＦ中の好酸球数、ＢＡＬＦ中の総細胞数、及び好酸球のパーセンテージそれぞれの棒グラフを図示する。
【図６Ａ】アッセイ１１に記載される手順に従う、対照または１５ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤの化合物Ａ１で処理したルイスラットを使用するコラーゲン誘導関節炎における、足首及び膝それぞれの個々の病理組織学的点数の棒グラフを図示する。
【図６Ｂ】アッセイ１１に記載される手順に従う、対照または１５ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤの化合物Ａ１で処理したルイスラットを使用するコラーゲン誘導関節炎における、足首及び膝それぞれの個々の病理組織学的点数の棒グラフを図示する。
【図６Ｃ】アッセイ１１に記載される手順に従う、ビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤの化合物Ａ１で処理したルイスラットを使用するコラーゲン誘導関節炎モデルにおける、足首及び膝それぞれの合計の病理組織学的点数の棒グラフを図示する。
【図６Ｄ】アッセイ１１に記載される手順に従う、ビヒクルまたは１５ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤの化合物Ａ１で処理したルイスラットを使用するコラーゲン誘導関節炎モデルにおける、足首及び膝それぞれの合計の病理組織学的点数の棒グラフを図示する。
【図７Ａ】アッセイ１５に記載されるようなタバコ煙誘導細胞浸潤モデルにおける、雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける、０．３ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤ、１ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤ、または３ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤの化合物Ａ１の投与後の、ＢＡＬＦ中のマクロファージ及び好中球細胞数それぞれの棒グラフを図示する。
【図７Ｂ】アッセイ１５に記載されるようなタバコ煙誘導細胞浸潤モデルにおける、雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける、０．３ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤ、１ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤ、または３ｍｇ／ｋｇ／ＢＩＤの化合物Ａ１の投与後の、ＢＡＬＦ中のマクロファージ及び好中球細胞数それぞれの棒グラフを図示する。
【図８】アッセイ３における手順に従う、化合物Ａ１による、白血病細胞系統（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、及びＨｕＴ−１０２）におけるＡＫＴリン酸化の阻害を示すグラフを図示する。
【図９】アッセイ４における手順に従う、化合物Ａ１による、人全血中のｆＭＬＰまたは抗ＦｃεＲ１によって誘導されたＣＤ６３陽性細胞のパーセンテージにおける阻害を示すグラフを図示する。
【図１０】アッセイ６Ｄに従う、化合物Ａ１による、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８誘導サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ２）の阻害を示すグラフを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本明細書で使用される場合、別段示されない限り以下の定義が適用されるべきである。更に、本明細書に定義される基のうちの多くは任意で置換され得る。本定義における置換基の一覧表は例示的なものであり、本明細書の他で定義される置換基を限定すると解釈されるべきではない。
【００５０】
本明細書に記載される特定の化合物は、１つ以上の不斉中心を含み、したがってエナンチオマー、ジアステレオマー、及び絶対立体化学の観点で（Ｒ）−または（Ｓ）−と定義され得る他の立体異性形態を生じさせ得る。別段指定されない限り、本化学実体、薬学的組成物、及び方法は、ラセミ混合物、任意で純粋形態及び中間体混合物を含む、全てのそのような可能性のある異性体を含むことが意図される。例えば、中間体混合物の非限定な例は、１０：９０、１３：８７、１７：８３、２０：８０、または２２：７８の割合のＲ：ＳまたはＳ：Ｒ異性体の混合物を含む。光学活性（Ｒ）−及び（Ｓ）−異性体は、キラル合成素子またはキラル試薬を使用して調製され得、または従来技術を使用して分離され得る。本明細書に記載される化合物が、オレフィン性二重結合または他の幾何的不斉の中心を含有するとき、かつ別段指定されない限り、化合物がＥ及びＺ幾何的異性体の両方を含むことが意図される。
【００５１】
用語「互変異性体」は、平衡での異性体形態の相対的に容易な相互変換を特徴とする化合物を指す。これらの異性体は、本発明によって網羅されることが意図される。「互変異性体」は、互変異性化によって相互変換する構造的に異なる異性体である。「互変異性化」は、異性体化の形態であり、酸塩基化学のサブセットであると見なされるプロトトロピーまたはプロトン移動互変異性化を含む。「プロトトロピー互変異性化」または「プロトン移動互変異性化」は、結合次数の変化、しばしば単結合の隣接する二重結合との相互交換を伴うプロトンの遊走を伴う。互変異性化が可能であるとき（例えば、溶液中）、互変異性体の化学平衡が達成され得る。互変異性体化の例は、ケト−エノール互変異性化である。ケト−エノール互変異性化の具体的な例は、ペンタン−２，４−ジオン及び４−ヒドロキシペント−３−エン−２−オン互変異性体の相互変換である。互変異性化の別の例は、フェノール−ケト互変異性化である。フェノール−ケト互変異性化の具体的な例は、ピリジン−４−オール及びピリジン−４（１Ｈ）−オン互変異性体の相互変換である。
【００５２】
用語「プロドラッグ」は、正常な代謝性プロセスによって体内でその活性形態に変換される化合物の不活性前駆体である化合物を指す。プロドラッグの設計は、Ｈａｒｄｍａ，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  ｅｄ．，ｐｐ．１１−１６（１９９６）において一般的に説明される。完全な説明は、Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４，ＡＳＣＤ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，ａｎｄ  ｉｎ  Ｒｏｃｈｅ（ｅｄ．），Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）において提供される。説明すると、プロドラッグは、例えば、エステルまたはアミド連鎖の加水分解により、得られた生成物上に官能基を導入または暴露することを通して、薬理的に活性な形態に変換され得る。プロドラッグは、内因性化合物と反応して、化合物の薬理的特性、例えば、増大した循環半減期を更に強化する水溶性接合体を形成するように設計され得る。あるいは、プロドラッグは、例えば、グルクロン酸、硫酸、グルタチオン、アミノ酸、または酢酸を有する官能基上での共有結合的修飾を受けるように設計され得る。得られた接合体は、尿中に非活性化及び排出され得る、または親化合物より強力になり得る。高分子量接合体はまた、胆汁中に排出され、酵素切断に供され、循環中に再放出され得、これにより最初に投与された化合物の生物学的半減期を効果的に増大させる。
【００５３】
用語「エステル」は、酸とアルコールとの間の水の排除を有する反応によって形成される化合物を指す。エステルは、一般式ＲＣＯＯＲ’（式中、Ｒは薬物であり、Ｒ’は化学基である）によって表され得る。
【００５４】
これらのプロドラッグ及びエステルは、本発明の範囲内に網羅されることが意図される。
【００５５】
更に、本発明はまた、例えば、水素の重水素またはトリチウムとの置換、あるいは炭素の１３Ｃまたは１４Ｃ濃縮炭素による置換等の、１つ以上の同位体濃縮原子の存在においてのみ異なる化合物を含む。
【００５６】
本発明の化合物はまた、そのような化合物を構成する１つ以上の原子で非天然の比率の原子同位体を含有し得る。例えば、化合物は、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、または炭素１４（１４Ｃ）等の放出性同位体で放出性標識され得る。放出性であるか、そうでないかに関わらず、本発明の化合物の全ての同位体の変種は、本発明の範囲内に包含される。
【００５７】
本発明の一部を形成する薬学的に許容される塩は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、及びＭｎ等の無機基に由来する塩；Ｎ，Ｎ’−ジアセチルエチレンジアミン、グルカミン、トリエチルアミン、コリン、水酸化物、ジシクロヘキシルアミン、メトホルミン、ベンジルアミン、トリアルキルアミン、及びチアミン等の機基の塩；アルキルフェニルアミン、グリシノール、フェニルグリシノール等のキラル基；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、オミチン、リジン、アルギニン、及びセリン等の天然アミノ酸の塩；Ｍｅｌ及び（Ｍｅ）２ＳＯ４等のハロゲン化アルキル、硫酸アルキルを有する本発明の化合物の四級アンモニウム塩；Ｄ異性体または置換アミノ酸等の非天然アミノ酸；グアニジン；ならびに置換基が、ニトロ、アミノ、アルキル、アルケニル、アンモニウム、または置換アンモニウム塩及アルミニウム塩から選択される、置換グアニジンを含む。塩は、適切な場合、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、ハロゲン化水素酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、パルモ酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩、グリセロリン酸塩、及びケトグルタル酸塩であり得る酸付加塩を含み得る。
【００５８】
分子量等の物理的特性、または化学式等の化学的特性について本明細書で範囲が使用される場合、その中の範囲及び特定の実施形態の全ての組み合わせ及び部分的組み合わせが含まれることが意図される。数または数の範囲に言及する場合の「約」という用語は、言及される数または数の範囲が、実験のばらつき内（または統計的な実験誤差内）の近似値であり、したがって、数または数の範囲が、例えば、記載される数または数の範囲の１％〜１５％変動し得ることを意味する。用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有している（ｈａｖｉｎｇ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の関連する用語）は、記載される特徴から「なる」または「本質的になる」実施形態、例えば、任意の組成物、組成、方法、またはプロセス等の実施形態を含む。
【００５９】
以下の略語及び用語は、本明細書を通して示された意味を有する：ＰＩ３−Ｋ＝ホスホイノシチド３−キナーゼ、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、ＡＩＤＳ＝後天性免疫不全症候群、ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス、ＭｅＩ＝ヨウ化メチル、ＮＤ：判定せず。
【００６０】
本明細書で使用される略語は、化学及び生物学分野内でのそれらの従来の意味を有するものとする。
【００６１】
用語「細胞増殖」は、分裂の結果として細胞数が変化する現象を指す。この用語はまた、増殖シグナルと一致して、それによって細胞形態が変化している（例えば、サイズにおいて増大している）細胞増殖を包含する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「同時投与」、「との組み合わせで投与される」及びそれらの文法的等価物は、薬剤及び／またはそれらの代謝物の両方が同時に動物内に存在するための、２つ以上の薬剤の動物に対する投与を包含する。同時投与は、別個の組成物における同時投与、別個の組成物における異なる時間の投与、または両方の薬剤が存在する組成物における投与を含む。
【００６３】
用語「有効量」または「治療有効量」は、後に定義されるような疾患の治療に限定されないが、疾患の治療を含む意図する用途を達成するのに十分な、本明細書に記載される化合物の量を指す。治療有効量は、意図する用途（インビトロもしくはインビボ）、または治療を受ける対象及び病態、例えば、対象の体重及び年齢、病態の重症度、及び投与様式等に応じて変化してもよく、それは当業者によって容易に決定され得る。またこの用語は、標的細胞における特定の反応、例えば、血小板粘着及び／または細胞遊走の減少を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択される具体的な化合物、従うべき投与計画、他の化合物と併用投与されるかどうか、投与のタイミング、投与される組織、及び運ばれる物理的な送達系に応じて変化する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、または「寛解する」は、互換的に使用される。これらの用語は、治療的有用性及び／または予防的有用性を含むが、これに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的有用性とは、治療される基礎疾患の根絶または寛解を意味する。また、治療的有用性は、基礎疾患に関連する生理的症状のうちの１つ以上の根絶または寛解によって得られるため、患者が依然として基礎疾患に苦しめられている場合でも、その患者において改善が観察される。予防的有用性の場合、たとえこの疾患の診断が下されていない場合であっても、特定の疾患を発症するリスクのある患者、または疾患の生理的症状のうちの１つ以上を報告する患者に、組成物を投与することができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合の「治療効果」は、前述の治療的有用性及び／または予防的有用性を包含する。予防効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発現を遅延させるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅らせる、停止する、もしくは逆転させること、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００６６】
用語「対象」または「患者」は、哺乳動物等の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、またはブタ）、例えばヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒトの治療用途及び獣医学的用途の両方において有用であり得る。いくつかの実施形態において、患者は哺乳動物であり、いくつかの実施形態において、患者はヒトである。
【００６７】
「放射線治療法」とは、当業者に既知である通例の方法及び組成物を使用して、アルファ粒子放出放射性核種（例えば、アクチニウム及びトリウム放射性核種）、低線エネルギー付与（ＬＥＴ）放射線放出体（すなわち、ベータ放出体）等の放射線放出体、変換電子放出体（例えば、ストロンチウム８９及びサマリウム１５３−ＥＤＴＭＰ）、またはＸ線、ガンマ線、及び中性子を無制限に含む高エネルギー放射線に患者を暴露することを意味する。
【００６８】
「シグナル伝達」は、細胞内反応を誘発するために、刺激的または阻害的シグナルが細胞の中へ、及び細胞内で伝達される間のプロセスである。シグナル伝達パスウェイの調節剤は、同一の特定のシグナル伝達パスに位置付けられる１つ以上の細胞タンパク質の活性を調節する化合物を指す。調節剤は、シグナル伝達分子の活性を増強（作用薬）または抑制（拮抗薬）し得る。
【００６９】
生物学的に活性な薬剤に対して適用される用語「選択的阻害」または「選択的に阻害する」は、標的との直接的または間接的な相互作用を介して、非特異的なシグナル伝達活性と比較して標的シグナル伝達活性を選択的に減少させる薬剤の能力を指す。
【００７０】
用語「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、１つ以上の好適な希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、湿潤剤、制御放出マトリックス、着色剤／香味剤、担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、及びこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない。あらゆる従来の培地または薬剤が活性成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療組成物におけるその使用が企図される。補足的活性成分はまた、本組成物中に組み込まれ得る。
【００７１】
特定の実施形態において、本明細書に記載される化合物のうちの１つ以上は、ｍＴｏｒ、ＤＮＡ依存タンパク質キナーゼ（Ｐｕｂｍｅｄタンパク質受入番号（ＰＰＡＮ）ＡＡＡ７９１８４）、ＡｂＩチロシンキナーゼ（ＣＡＡ５２３８７）、Ｂｃｒ−Ａｂｌ造血性細胞キナーゼ（ＰＰＡＮＣＡＩ１９６９５）、Ｓｒｃ（ＰＰＡＮ  ＣＡＡ２４４９５）、血管性内皮増殖因子受容体２（ＰＰＡＮ  ＡＢＢ８２６１９）、上皮性増殖因受容体（ＰＰＡＮ  ＡＧ４３２４１）、ＥＰＨ受容体Ｂ４（ＰＰＡＮ  ＥＡＬ２３８２０）、幹細胞因子受容体（ＰＰＡＮ  ＡＡＦ２２１４１）、チロシン−タンパク質キナーゼ受容体ＴＩＥ−２（ＰＰＡＮ  Ｑ０２８５８）、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＰＰＡＮ  ＮＰ＿００４１１０）、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＰＡＮ  ＮＰ＿９９００８０）、ＲＥＴ（ＰＰＡＮ  ＣＡＡ７３１３１）、及び任意の他の関連するタンパク質キナーゼ、ならびにその任意の機能的変異体からなる群から選択されるＰＩ３キナーゼまたはタンパク質キナーゼに特異的に結合する。
【００７２】
他の実施形態において、ｐｉ１０α、ｐｉ１０β、ｐｉ１０γ、またはｐｉ１０δの本明細書に記載される化合物のＩＣ５０は、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満である。いくつかの実施形態において、ｍＴｏｒの本明細書に記載される化合物のＩＣ５０は、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満である。いくつかの他の実施形態において、本明細書に記載される化合物のうちの１つ以上は、二重結合特異性を呈し、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＩＣ５０値を有するＰＩ３キナーゼ（例えば、クラスＩ  ＰＩ３キナーゼ）及びタンパク質キナーゼ（例えば、ｍＴｏｒ）を阻害することができる。
【００７３】
更なる実施形態において、本発明の化合物は、本明細書に開示される１つ以上の機能的特徴を呈する。例えば、本明細書に記載される化合物のうちの１つ以上は、ＰＩ３キナーゼに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、ｐｉ１０α、ｐｉ１０β、ｐｉ１０γ、またはｐｉ１０δの本明細書に記載される化合物のＩＣ５０は、約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約５０ｐＭ未満である。
【００７４】
他の実施形態において、本発明の化合物は、インビトロキナーゼアッセイにおいて測定される、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下のＩＣ５０値を有するＩ型またはクラスＩホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）の１つ以上のメンバーを選択的に阻害する。
【００７５】
更に別の態様において、Ｉ型ＰＩ３−キナーゼのうちの１つ以上のメンバーを選択的に阻害する阻害剤、または１つ以上のＩ型ＰＩ３−キナーゼ媒介シグナル伝達パスウェイを選択的に阻害する阻害剤は、代替的に、残りの他のＩ型ＰＩ３−キナーゼに関する、阻害剤のＩＣ５０より少なくとも１０倍低い、少なくとも２０倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも１０００倍低い、所与のＩ型ＰＩ３−キナーゼに関して５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）を呈する化合物を指すと理解され得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ阻害剤」及び「二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤」は、ＰＩ３キナーゼδ及びγアイソザイムの両方の活性をＰＩ３Ｋファミリーの他のアイソザイムよりも効果的に阻害する化合物を指す。したがって、二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ阻害剤は、非選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＣＡＬ−１３０、ワートマニン、及びＬＹ２９４００２等の従来のＰＩ３Ｋ阻害剤よりもＰＩ３−キナーゼδ及びγに対してより選択的である。
【００７７】
ＰＩ３−キナーゼδ及びγの阻害は、様々な病態、例えば、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、及び関節炎疾患を含むが、これに限定されない炎症反応を特徴とする病態の治療において、治療的に有用であり得る。重要なことに、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ機能の阻害は、生存能及び受精能等の生物学的機能に影響を及ぼさないようである。
【００７８】
「炎症反応」は、本明細書で使用される場合、赤み、熱、腫脹、及び疼痛（すなわち、炎症）を特徴とし、典型的には組織損傷または組織破壊を伴う。炎症反応は、通常、組織の損傷または破壊によって誘発される局所的な防御反応であり、傷害性物質及び損傷組織の両方を破壊するか、希釈するか、または囲む（隔絶する）役割を果たす。炎症反応は、とりわけ、白血球の流入及び／または白血球（例えば、好中球）の走化性の流入に関連している。炎症反応は、病原体及びウイルスによる感染、心筋梗塞または脳卒中後の外傷または再灌流等の非感染性手段、外来抗原に対する免疫応答、ならびに自己免疫疾患等に起因し得る。本発明による方法及び化合物を用いた治療に適した炎症反応は、特定の防御システムの反応に関連する状態だけでなく、非特定の防御システムの反応に関連する状態も包含する。
【００７９】
本発明の治療方法は、炎症性細胞の活性化に関連する病態の寛解のための方法を含む。「炎症性細胞の活性化」は、増殖細胞応答の刺激（サイトカイン、抗原、もしくは自己抗体を含むが、これに限定されない）、可溶性メディエーター（サイトカイン、酸素ラジカル、酵素、プロスタノイド、もしくは血管作動性アミンを含むが、これに限定されない）の産生、または炎症細胞（単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球（好中球、好塩基球、及び好酸球を含む多形核白血球）、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、及び内皮細胞を含むが、これに限定されない）中の新しいまたは数の増加したメディエーター（主要組織適合抗原もしくは細胞接着分子を含むが、これに限定されない）の細胞表面発現による誘導を指す。当業者は、これらの細胞におけるこれらの表現型のうちの１つまたは組み合わせの活性化が、炎症性病態の開始、永続化、または増悪に寄与し得ることを理解するであろう。
【００８０】
「自己免疫疾患」は、本明細書で使用される場合、組織損傷が体自身の成分に対する液性反応または細胞媒介反応と関連する障害の任意の群を指す。
【００８１】
「移植拒絶」は、本明細書で使用される場合、移植された細胞（移植された組織及び周囲の組織の機能の喪失、疼痛、腫、白血球増加、及び血小板減少を特徴とする器官または細胞（例えば、骨髄）を含む）に対して向けられるあらゆる免疫反応を指す。
【００８２】
「アレルギー性」疾患は、本明細書で使用される場合、アレルギーに起因するあらゆる症状、組織損傷、または組織機能の喪失を指す。
【００８３】
「関節炎疾患」は、本明細書で使用される場合、様々な病因に起因する関節の炎症性病変を特徴とするあらゆる疾患を指す。
【００８４】
「皮膚炎」は、本明細書で使用される場合、様々な病因に起因する皮膚の炎症を特徴とする大きな一群の皮膚疾患のいずれかを一般的に指す。
【００８５】
既に説明したように、用語「二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤」は、ＰＩ３−キナーゼδ及びγアイソザイムの活性をＰＩ３Ｋファミリーの他のアイソザイムよりも効果的に阻害する化合物を一般的に指す。酵素活性（または他の生物学的活性）の阻害剤としての化合物の相対的有効性は、各化合物が活性を所定の程度まで阻害する濃度を決定し、結果を比較することによって確立され得る。典型的に、好ましい決定は、生化学的アッセイにおいて活性の５０％を阻害する濃度、すなわち、５０％の阻害濃度、または「ＩＣ５０」である。ＩＣ５０決定は、当該技術分野において既知である従来の技術を使用して達成され得る。一般的に、ＩＣ５０は、様々な濃度の研究下の阻害剤の存在下で、所与の酵素の活性を測定することによって決定され得る。その後、酵素活性の実験的に取得された値を、使用された阻害剤濃度に対してプロットする。（いかなる阻害剤も不在下での活性と比較して）５０％の酵素活性を示す阻害剤の濃度を、ＩＣ５０値として取得する。類似して、他の阻害濃度は、活性の適切な決定を通して定義され得る。例えば、いくつかの設定において、９０％の阻害濃度、すなわち、ＩＣ９０を確立すること等が望ましくあり得る。
【００８６】
したがって、二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤は、代替的に他のクラスＩ  ＰＩ３Ｋファミリーメンバーのうちのいずれかまたは全てに関するＩＣ５０値よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍低い、ＰＩ３−キナーゼδ及びγに関する５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）を呈する化合物を指すと理解され得る。本発明の代替的な実施形態において、用語、二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤は、ＰＩ３ＫクラスＩファミリーメンバーのうちのいずれかまたは全てに関するＩＣ５０よりも少なくとも３０倍低い、少なくとも５０倍低い、少なくとも１００倍低い、少なくとも２００倍低い、または少なくとも５００倍低い、ＰＩ３−キナーゼδ及びγに関するＩＣ５０を呈する化合物を指すと理解され得る。二重ＰＩ３−キナーゼδ／γ選択的阻害剤は、前述のように、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ活性の両方を選択的に阻害する量で典型的に投与される。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の化合物は、ほぼ等しく（約１：１）または１：５の最大割合で、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ阻害を呈する。すなわち、本発明の化合物は、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ酵素の両方についてほぼ等しいＩＣ５０値を呈するか、または最大でも２つの間で３〜８倍の差を呈する。
【００８８】
本発明の方法は、インビボまたはエクスビボの細胞集合に適用され得る。「インビボ」は、動物またはヒト内、あるいは対象の体内等の、生きている個体内を意味する。この文脈において、本発明の方法は、個体内で治療的または予防的に使用され得る。「エクスビボ」または「インビトロ」は、生きている個体外を意味する。エクスビボ細胞集合の例は、個体から取得された液体または組織を含むが、これに限定されないインビトロ細胞培養及び生物学的試料を含む。そのような試料は、当該技術分野において既知である方法によって取得され得る。例示的な生物学的液体試料は、血液、脳脊髄液、尿、及び唾液を含む。例示的な組織試料は、腫瘍及びその生検を含む。この文脈において、本発明は、治療的及び実験的目的を含む様々な目的のために使用され得る。例えば、本発明は、所与の兆候、細胞型、個体、及び他のパラメータのための、ＰＩ３−キナーゼδ選択的阻害剤の投与の最適な予定及び／または投薬を決定するために、エクスビボまたはインビトロで使用され得る。そのような使用から収集される情報は、実験的または診断的目的のために、あるいはインビボ治療のための手順を設定するために診療所において使用され得る。本発明が好適であり得る他のエクスビボでの使用は、以下に記載されるか、または当業者に明らかになるであろう。
【００８９】
本発明の化合物は、その全てがこれにより参照によって組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１１／０５５２１５号、同第ＷＯ２０１２／１５１５２５号、及び同第ＷＯ２０１３／１６４８０１号に記載されるもの等の、当該技術分野において既知である方法によって調製され得る。
【００９０】
薬学的組成物
本発明は、本発明の１つ以上の化合物及び１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の本発明の化合物を含む。薬学的組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上の更なる活性成分を含み得る。
【００９１】
薬学的担体及び／または賦形剤は、希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、湿潤剤、制御放出マトリックス、着色剤、香味剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、及びそれらの組み合わせから選択され得る。
【００９２】
一実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、約１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、または約２０ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約６００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約６００ｍｇ等の、約０．１ｍｇ〜約１，０００ｍｇの本発明の１つ以上の化合物を含有する。１００ｍｇ〜約４００ｍｇの本発明の１つ以上の化合物。
【００９３】
本発明の薬学的組成物は、単独で、または１つ以上の他の活性剤と組み合わせて投与され得る。所望である場合、対象化合物及び他の薬剤（複数可）は調製物内に混合され得るか、あるいは両方の成分はそれらを組み合わせで別個に、または同時に使用するために、別個の調製物内に製剤化され得る。
【００９４】
本発明の化合物及び薬学的組成物は、経口的に、鼻腔内に、局所的に（例えば、経皮的に）、十二指腸内に、非経口的に（静脈内に、動脈内に、筋肉内に、血管内に、腹腔内に、または注射もしくは注入によるものを含む）、皮内に、乳房内に、髄腔内に、眼内に、眼球後に、肺内に（例えば、エアロゾル化した薬物）、または皮下に（例えば、脾膜下、脳、または角膜内に埋め込まれた長期放出のためのデポー投与を含む）、舌下に、経肛門的に、経直腸的に、経膣的に、または外科的移植によって（例えば、脾膜下、脳、または角膜内に埋め込まれる）によって等、作用部位に化合物を送達することができる任意の経路によって投与され得る。
【００９５】
組成物は、固体、半固体、液体、もしくは気体の形態で投与することができるか、または凍結乾燥形態等の乾燥粉末として投与されてもよい。薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、サシェ剤、カシェ剤、ゼラチン剤、シート剤、錠剤、坐剤、ペレット剤、丸剤、トローチ剤、及びロゼンジ剤等の個体剤形を含む、送達に都合のよい形態に充填することができる。包装の種類は、一般的に、所望の投与経路に依存する。移植可能な徐放製剤、同様に経皮製剤もまた企図される。
【００９６】
治療の方法
投与される化合物の量は、治療される哺乳動物、障害または病態の重症度、投与速度、化合物の処分、及び処方する医師の裁量に依存する。しかしながら、有効投与量は、単回用量または分割用量で、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。７０ｋｇのヒトにおいて、これは約０．０５〜７ｇ／日、好ましくは約０．０５〜約２．５ｇ／日に達する。本発明の化合物の有効量は、単回用量または複数用量（例えば、１日２回または３回）で投与され得る。
【００９７】
本発明の化合物は、１つ以上の抗癌剤（例えば、化学療法剤）、治療抗体、及び放射線治療との組み合わせで使用され得る。
【００９８】
本発明の化合物は、脳脊髄炎、喘息、及び本明細書に記載される他の疾患等の炎症性病態の症状を軽減するように作用する他の薬剤との組み合わせで製剤化または投与され得る。これらの薬剤は、非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）を含む。
【００９９】
実施例
以下に提供される実施例及び調製物は、本発明の化合物及びそのような化合物を調製する方法を更に例証及び図示する。本発明の範囲は、以下の実施例及び調製物の範囲によって決して限定されないことが理解されるべきである。以下の実施例において、別段記述されない限り、単一キラル中心を有する分子はラセミ混合物として存在する。別段記述されない限り、２つ以上のキラル中心を有するこれらの分子はジアステレオマーのラセミ混合物として存在する。単一エナンチオマー／ジアステレオマーは、当該技術分野において既知である方法によって取得され得る。
【０１００】
本明細書で使用される場合、上付き文字１は国際公開第ＷＯ１１／０５５２１５号を指し、上付き文字２は国際公開第ＷＯ１２／１５１５２５号を指す。これらの参照は、様々な中間体がどのように調製されるのかを記載する。
中間体
中間体１：３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシプロピル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：ＤＭＳＯ（８５ｍｌ）中、２−（１−ブロモプロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン１（８．８０ｇ、２４．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−ブタノール（５ｍｌ）を添加し、１２０℃まで３時間加熱した。反応混合物を、室温（ＲＴ）まで冷却し、水で急冷し、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル：石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色固体（２．１０ｇ、２９％）として得て、これを更に精製せずに次のステップにおいて使用した。
中間体２：３−（３−フルオロフェニル）−２−プロピオニル−４Ｈ−クロメン−４−オン：ＤＭＳＯ（１．９０ｍｌ、２６．８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７０ｍｌ）に添加し、−７８℃まで冷却した。その後、塩化オキサリル（１．１４ｍｌ、１３．４１ｍｍｏｌ）を添加した。１０分後、ジクロロメタン（２０ｍｌ）中、中間体１（２．００ｇ、６．７０ｍｍｏｌ）を液加し、２０分間撹拌した。トリエチルアミン（７ｍｌ）を添加し、１時間撹拌した。反応混合物を、水で急冷し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル：石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色液体（１．２０ｇ、６０％）として得て、これを次のステップにおいて使用した。
中間体３：（＋）／（−）−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシプロピル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：窒素パージ下、ＤＭＦ（７．６５ｍｌ）中、中間体２（０．６００ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）の溶液に、ギ酸：トリエチルアミン５：２共沸混合物（１．８０ｍｌ）を添加し、［（Ｓ，Ｓ）ｔｅｔｈＴｓＤｐｅｎＲｕＣｌ］（３．０ｍｇ）を続けた。反応混合物を、連続的な窒素パージ下、８０℃で１．５時間加熱した。反応混合物を、水で急冷し、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。酢酸エチル：石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色固体（０．４５０ｇ、７４％）として得た。質量：２９９．０（Ｍ＋）。鏡像体過剰率：７８％、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム上、ＨＰＬＣによって決定される遅く溶出する異性体（保持時間：９．７２分）において濃縮する。
中間体４：（＋）／（−）−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシプロピル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：中間体３について記載されたものと同様の手順を使用することによって、中間体２（０．６００ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（７．６５ｍｌ）、ギ酸：トリエチルアミン５：２共沸混合物（１．８０ｍｌ）、及び［（Ｒ，Ｒ）ｔｅｔｈＴｓＤｐｅｎＲｕＣｌ］（３．０ｍｇ）を使用して、表題の化合物を黄色固体（０．６００ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）として取得した。質量：２９８．９（Ｍ＋）。鏡像体過剰率：７４．８％、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム上、ＨＰＬＣによって決定される速く溶出する異性体（保持時間：８．５２分）において濃縮する。
中間体５：（Ｒ）−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシプロピル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：
ステップ１：（Ｒ）−２−（１−（ベンジルオキシ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：ジクロロメタン（２０ｍｌ）中、２−（３−フルオロフェニル）−１−（２−ヒドロキシフェニル）エタノン（２．１５ｇ、９．３６ｍｍｏｌ）に、ＨＡＴＵ（４．２７ｇ、１１．２３ｍｍｏｌ）、Ｒ−（＋）２−酪酸ベンジルオキシ（２．００ｇ、１０．２９ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間撹拌し、その後トリエチルアミン（１４．０ｍｌ１０１．１ｍｍｏｌ）を液加し、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を、水で急冷し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル：石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を黄色固体（１．６５ｇ、４５％）として得た。１Ｈ−ｎＭＲ（δｐｐｍ、ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：８．２４（ｄｄ，Ｊ＝７．９、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７４（ｄｔ，Ｊ＝７．１、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．３、０．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４−７．０６（ｍ，１０Ｈ）、４．５１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．３４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５（ｄｄ，Ｊ＝７．８、６．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．１７−１．９０（ｍ，２Ｈ）、０．９５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）。質量：３８９．０（Ｍ＋）。
ステップ２：（Ｒ）−３−（３−フルオロフェニル）−２−（１−ヒドロキシプロピル）−４Ｈ−クロメン−４−オン：０℃に冷却したジクロロメタン（１５ｍｌ）中、（Ｒ）−２−（１−（ベンジルオキシ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン（１．５０ｇ、３．８６ｍｍｏｌ）に、塩化アルミニウム（１．００ｇ、７．７２ｍｍｏｌ）を液加し、室温で６時間撹拌した。反応混合物を、２Ｎ  ＨＣｌ溶液で急冷し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。酢酸エチル：石油エーテルを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物をを精製し、表題の化合物を黄色固体（０．５５２ｇ、４８％）として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（δｐｐｍ、ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：．８．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．０、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７２（ｍ，，１Ｈ）、７．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．４、０．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．１２−７．０１（ｍ，３Ｈ）、４．４９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．９４（ｍ，２Ｈ）、０．９３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、３Ｈ）。質量：（２９９．０（Ｍ＋）。純度：９６．９３％。［α］２５Ｄ−１４．７３（ｃ＝ＣＨＣｌ３）。鏡像体過剰率：８５．９２％、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＳ−３Ｒカラム上、カラムＨＰＬＣによって決定される速く溶出する異性体（保持時間：８．５７分）において濃縮する。
化合物Ａ
（ＲＳ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン
ＴＨＦ（２５ｍｌ）中、中間体１（２．５０ｇ、８．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル９−トリチル−９Ｈ−プリン−６−カルバミン酸イル（４．８１ｇ、１０．０９ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３．３１ｇ、１２．６２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５分間撹拌した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（２．５ｍｌ、１２．６２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル：石油エーテルとともにカラムクロマトグラフし、黄色の中間体として得た。中間体に、ジクロロメタン（６５ｍｌ）及びトリフルオロ酢酸（９．９ｍｌ）を添加し、得られた混合物を室温で１２時間撹拌した。その後、反応混合物を、水溶性重炭酸ナトリウム溶液で塩基化し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール：ジクロロメタンを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を淡褐色固体（１．０５ｇ、３０％）として得た。ＭＰ：１４８〜１５０℃。質量：４１５．６（Ｍ＋）。
化合物Ａ１
（Ｓ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン
方法Ａ：ＴＨＦ（５ｍｌ）中、中間体３（０．２５０ｇ、０．８３８ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル９−トリチル−９Ｈ−プリン−６−カルバミン酸イル（０．４７９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（０．３２９ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で５分間撹拌した。その後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．２５ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル：石油エーテルとともにカラムクロマトグラフし、黄色の中間体として得た。ジクロロメタン（６ｍｌ）中、中間体に、トリフルオロ酢酸（１．２ｍｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を、水溶性重炭酸ナトリウム溶液で塩基化し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール：ジクロロメタンを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を灰白色固体（０．０１５ｇ、４％）として得た。ＭＰ：１３７〜１４０℃．１Ｈ−ＮＭＲ（δｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ６、４００ＭＨｚ）：１２．９４（ｓ，１Ｈ）、８．１２−８．１０（ｍ，４Ｈ）、７．８４−７．８０（ｍ，１Ｈ）、７．６１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．５０−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．２８−７．１８（ｍ，３Ｈ）、５．２０−５．０６（ｍ，１Ｈ）、２．１０−１．９０（ｍ，２Ｈ）、０．８４（ｔ，Ｊ＝３．７Ｈｚ、３Ｈ）。鏡像体過剰率：７７．４％、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム上、ＨＰＬＣによって決定され、速く溶出する異性体（保持時間：７．９０分）において濃縮する。
方法Ｂ：ＴＨＦ（５２ｍｌ）中、中間体５（２．６０ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル９−トリチル−９Ｈ−プリン−６−カルバミン酸イル（４．９６ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（２．７６ｇ、１３．０３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で５分間撹拌した。その後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．２５ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチル：石油エーテルとともにカラムクロマトグラフし、黄色の中間体として得た。ジクロロメタン（５５ｍｌ）中、中間体に、トリフルオロ酢酸（１４．２ｍｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を、水溶性重炭酸ナトリウム溶液で塩基化し、ジクロロメタンで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。メタノール：ジクロロメタンを有するカラムクロマトグラフィーによって粗生成物を精製し、表題の化合物を淡黄色固体（１．００ｇ、２７％）として得た。ＭＰ：１６８〜１７０℃。質量：４１６．５（Ｍ＋＋１）鏡像体過剰率：８６．５％、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム上、ＨＰＬＣによって決定され、速く溶出する異性体（保持時間：７．９０分）において濃縮する。
方法Ｃ：メタノール：ＣＯ２（３５：６５）を８０ｇ／分の流量の移動相として使用して、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＹ−Ｈカラム（２５０×３０ｍｍ、５μＭ）上、調製用ＳＦＣ条件によって、化合物Ａ（１．０９０ｇ）から表題の化合物を分離した。灰白色固体（０．３７８ｇ）。鏡像体過剰１００％。Ｒｔ：２．３７分。質量：４１６．１（Ｍ＋＋１）。ＭＰ：１４９〜１５２℃。
化合物Ａ２
（Ｒ）−２−（１−（９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル）−３−（３−フルオロフェニル）−４Ｈ−クロメン−４−オン
方法Ａ：ｔｅｒｔ−ブチル９−トリチル−９Ｈ−プリン−６−カルバミン酸イル（０．４７９ｇ、１．００ｍｍｏｌ）、中間体４（０．２５０ｇ、０．８３８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．３２９ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（５ｍｌ）、及びアゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．２５ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）を使用する、化合物Ａ１について記載された手順（方法Ａ）と同様の手順を使用することによって、表題の化合物を灰白色固体（０．０１５ｇ、４％）として取得し、トリフルオロ酢酸（１．２ｍｌ）及びジクロロメタン（６ｍｌ）で中間体の切断を続けた。ＭＰ：１３９〜１４１℃。質量：４１５．６（Ｍ＋）。鏡像体過剰率：８１．６％、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈカラム上、ＨＰＬＣによって決定され、遅く溶出する異性体（保持時間：１０．８１分）において濃縮する。
方法Ｂ：メタノール：ＣＯ２（３５：６５）を８０ｇ／分の流量の移動相として使用して、Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＹ−Ｈカラム（２５０×３０ｍｍ、５μＭ）上、調製用ＳＦＣ条件によって、化合物Ａ（１．０９０ｇ）から表題の化合物を分離した。灰白色固体（０．４３４ｇ）。鏡像体過剰９８％。Ｒｔ：３．７１分。質量：４１６．１（Ｍ＋＋１）。ＭＰ：１６２〜１６４℃。
【０１０１】
生物学的アッセイ
本明細書に記載される化合物の薬理的特性は、いくつかの薬理的アッセイによって確認され得る。本発明に従う化合物及び／またはそれらの薬学的に許容される塩とともに実施された薬理的アッセイは、以下に例証される。
【０１０２】
アッセイ１：ＰＩ３キナーゼ酵素活性の蛍光決定
ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、いくつかの重要な細胞プロセスの制御において重要な役割を果たす、脂質キナーゼのクラスに属する。ＰＩ３Ｋは、ホスホイノシトールの３−ヒドロキシ位置をリン酸化し、これにより下流シグナル伝達事象に関与するセカンドメッセンジャーを産生することができる。均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイは、α、β、γ、またはδ等のＰＩ３Ｋアイソフォームによるホスホチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）のリン酸化の結果として形成される、３，４，５−三リン酸エステル（ＰＩＰ３）の検出を可能にする。
【０１０３】
α、β、γ、またはδのＰＩ３Ｋアイソフォーム活性は、修正を有するＰＩ３ＫヒトＨＴＲＦ（商標）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して決定される。全てのインキュベーションを、室温で実施した。簡潔には、０．５μｌの４０×阻害剤（１００％のＤＭＳＯ中）または１００％のＤＭＳＯを、酵素を含む、または含まない、１４．５μｌの１×反応緩衝剤／ＰＩＰ２（１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ、１．３８μＭのＰＩＰ２）混合物を含有する、３８４ウェル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）の各ウェルに添加し、５μｌ／ウェルの４００μＭのＡＴＰを続け、更に３０分間インキュベートした。５μｌ／ウェルの停止溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を添加することによって、反応を終了させた。その後、５μｌの検出混合物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を各ウェルに添加し、６〜１８時間暗所でインキュベートした。ＨＲＴＦ割合を、５０ミリ秒の遅延を計数する４００ミリ秒の統合時間を有する、３３７ｎＭの励起波長及び６６５及び６１５ｎＭの放出波長のマイクロプレート読み取り装置（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で測定した。化合物Ａ１及びＡ２の結果を、以下の表１に示す。化合物Ａ１及び国際公開第ＷＯ１１／０５５２１５号の実施例４７の比較データを、表２に提供する。
【表１】
0006499165.tif 000003
【表２】
0006499165.tif 000004
【０１０４】
アッセイ２：白血病細胞株におけるインビトロ細胞増殖アッセイ
１０％のＦＢＳ補足培地を使用して、増殖阻害アッセイを実施した。９６ウェルプレート内に５０００〜２０，０００個の細胞／ウェルの濃度で、細胞を播種した。０．０１〜１００００ｎＭの濃度範囲の試験化合物を、２４時間後に添加した。０時間（試験化合物の添加前）及び試験化合物の添加の７２時間後で、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）色素還元試験を使用して、増殖を評価した。４５０ｎｍの波長で、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で吸光度を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してデータを分析し、対照と比較した、試験化合物による阻害パーセントをそれに従って計算した。
【０１０５】
化合物Ａ１は、試験された用量範囲についてＧＩ５０値が１〜５μＭの範囲内で、Ｔリンパ腫（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、及びＨｕＴ−１０２）細胞生存能における減少を引き起こした。更に、化合物は、最大１０μＭまで、７２時間のインキュベーション期間にわたっていかなる明らかな細胞毒性も示さなかった。
【０１０６】
アッセイ３：白血病細胞株におけるＡＫＴリン酸化の阻害
ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、ＨｕＴ−１０２、Ｓｅｚ４、及びＨＨ細胞を所望の濃度の化合物とともに４８時間インキュベートした。細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによってｐＡＫＴ決定した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンドを定量化し、アクチンに正規化した。
【０１０７】
化合物Ａ１は、試験された用量範囲についてＥＣ５０値が０．５〜２μＭの範囲内で、Ｔ−リンパ腫（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、及びＨｕＴ−１０２）細胞株内のｐＡＫＴ発現における減少を引き起こした。結果を図８に示す。
【０１０８】
アッセイ４：ヒト全血からの好塩基球におけるＰＩ３Ｋδ及びγシグナル伝達の阻害
抗ＦｃεＲ１またはｆＭＬＰ誘導ＣＤ６３発現の変化によって明示される、好塩基球におけるＰＩ３Ｋδ及びγシグナル伝達は、Ｆｌｏｗ２ＣＡＳＴ（登録商標）キット（Ｂｕｈｌｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して決定される、有用な薬力学的標識である。簡潔には、それは以下のステップを伴う。
●静脈穿刺管を何回か反転させることによって、抗凝血血液試料を混合する、
●フローサイトメトリー測定に好適な、新しくかつ発熱物質を含まない３．５ｍｌのポリプロピレンまたはポリスチレン管を調製する、
●４９μｌの患者の全血を各管に添加する、
●１μｌの１０％のＤＭＳＯ（バックグラウンド）または化合物（１０％のＤＭＳＯ）を指定された管に添加し、穏やかに混合する、室温で１５分間インキュベートする、
●５０μｌの刺激緩衝剤（バックグラウンド）あるいは抗ＦｃεＲＩ  ＡｂまたはｆＭＬＰを各管にピペッティングする、
●１００μｌの刺激緩衝剤を各管に添加する、
●穏やかに混合する、２０μｌの染色試薬（ＦＩＴＣ−ＣＤ６３及びＰＥ−ＣＣＲ３の１：１混合物）を各管に添加する、
●穏やかに混合し、管を覆い、水浴中３７℃で１５分間インキュベートする、（インキュベーターを使用すると、より効率的でない熱伝達のために、約１０分間長いインキュベーション時間がかかる）
●２ｍｌの余熱（１８〜２８℃）した溶解試薬を各管に添加し、穏やかに混合する、
●１８〜２８℃で５〜１０分間インキュベートする、
●５００×ｇで管を５分間遠心分離する、
●ブロッティング紙を使用することによって、上清を傾瀉する、
●３００〜８００μｌの洗浄緩衝剤で細胞ペレットを再懸濁する、及び
●穏やかにボルテックスし、同一日内にフローサイトメーター上でデータを取得する。
【０１０９】
ゲートされた好塩基球集合内のＣＤ６３陽性細胞パーセントを、異なる治療群において決定し、ビヒクル対照に正規化した。
【０１１０】
化合物Ａ１は、ＦｃεＲ１（ＰＩ３Ｋδ）について４０ｎＭ未満のＥＣ５０、及びｆＭＬＰ（ＰＩ３Ｋγ）について４０ｎＭ未満のＩＣ５０を呈した（ｎ＝１０）。結果を図９に示す。
【０１１１】
アッセイ４Ａ：ＰＩ３Ｋデルタ及びＰＩ３Ｋガンマアイソフォームについての化合物Ａ１の選択性を実証する、細胞活性
アッセイ４Ａ１：（ＰＩ３Ｋδ選択性のための）抗ＩｇＭ誘導Ｂ細胞増殖
本研究の目的は、抗ＩｇＭ誘導ヒトＢ細胞増殖に対する、化合物Ａ１の阻害潜在力を評価することであった。
プレーティング及び処理
●単離したＢ細胞を１ｍｌ当たり１．０×１０６個の細胞に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。３連を維持した。
●５０μｌの薬物希釈液を添加し、よく混合した。ＤＭＳＯブランク及び誘導因子ブランクを維持した。
●処理したプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし、その後５０μｌの４×誘導因子を添加し、ピペッティングによって混合した。
●プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
●培地を吸引し、１５０μｌのＤＭＳＯを添加して、ホルマザン結晶を溶解させた。
●Ａ５６０及びＡ６４０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１１２】
データは、ヒトＢ細胞増殖のＰＩ３Ｋδ媒介誘導に対する、化合物Ａ１の阻害潜在力を実証した。例えば、Ｂａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３４：３５３２−３５３８，１９８５を参照されたい。
【０１１３】
アッセイ４Ａ２：（ＰＩ３Ｋβ選択性のための）３Ｔ３線維芽細胞におけるＬＰＡ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化
本研究の目的は、３Ｔ３線維芽細胞におけるＰＩ３Ｋβキナーゼ媒介ＬＰＡ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化に対する化合物Ａ１の効果を決定することであった。
●３Ｔ３細胞を所望の濃度の試験化合物で１５分間処理した。最終濃度が５μＭであるように、１ｍｌの２×ＬＰＡを添加し、５分間インキュベートした。
●培地を処分し、１ｍｌの氷冷１×ＰＢＳで洗浄した。
●２５０μｌの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
●試料を遠心分離し、上清は分析まで−８０℃であった。
●ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）を一次抗体として、及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
●ＩｍａｇｅＪ１．４２ｑ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して、バンドの強度を決定し、アクチン（負荷対照）に正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。
【０１１４】
結果は、ＰＩ３Ｋのベータアイソフォームに対する化合物Ａ１の選択性を実証する。Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３９８３０−３９８３８，２００３を参照されたい。
【０１１５】
アッセイ４Ａ３：（ＰＩ３Ｋγ選択性のための）ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるｃ５ａ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化
本研究の目的は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおけるＰＩ３Ｋγキナーゼ媒介ｃ５ａ誘導ＡｋｔＳ４７３リン酸化に対する化合物Ａ１の効果を決定することであった。
●ＲＡＷ２６４．７細胞を所望の濃度の試験化合物で１５分間処理した。最終濃度が５０ｎｇ／ｍｌであるように、１ｍｌの２×ｃ５ａを添加し、１５分間インキュベートした。
●培地を処分し、１ｍｌの氷冷１×ＰＢＳで洗浄した。
●２５０μｌの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
●試料を遠心分離し、上清を分析まで−８０℃で保管した。
●ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）を一次抗体として、及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
●ＩｍａｇｅＪ１．４２ｑ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して、バンドの強度を決定し、アクチン（負荷対照）に正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。
【０１１６】
ｐＡｋｔＳ４７３の阻害、ＰＩ３Ｋδシグナル伝達の下流標識は、ｃ５ａ誘導ＲＡＷ２６４．７細胞内でＡｋｔによって制御される発癌パスウェイにおける化合物Ａ１の役割を示す。Ｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１８２，８９７−９０４，２０１０を参照されたい。
【０１１７】
アッセイ４Ａ４：（ＰＩ３Ｋα選択性のための）３Ｔ３細胞におけるＤＧＦ誘導Ａｋｔリン酸化
本研究の目的は、ＰＤＧＦ誘導３Ｔ３線維芽細胞におけるＰＩ３Ｋαキナーゼ媒介ＡｋｔＳ４７３リン酸化に対する化合物Ａ１の効果を決定することであった。
●３Ｔ３細胞を所望の濃度の試験化合物で１５分間処理した。最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌであるように、１ｍｌの２×ＰＤＧＦを添加し、１０分間インキュベートした。
●培地を処分し、１ｍｌの氷冷１×ＰＢＳで洗浄した。
●２５０μｌの細胞溶解緩衝剤を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。
●試料を遠心分離し、上清を収集し、分析まで−８０℃で保管した。
●ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）を一次抗体として、及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを二次抗体として使用するウェスタンブロットによって試料を分析した。
●ＩｍａｇｅＪ１．４２ｑ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）を使用して、バンドの強度を決定し、アクチン（負荷対照）に正規化した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。
【０１１８】
１０μＭの化合物Ａ１で阻害は観察されず、ＰＩ３Ｋのアイソフォームに対する化合物Ａ１の選択性を実証した。Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３９８３０−３９８３８，２００３を参照されたい。
【０１１９】
以下の表は、アッセイ４Ａ１〜４Ａ４からの結果を要約する。
【表３】
0006499165.tif 000005
【０１２０】
アッセイ５：白血病細胞株におけるアポトーシスの阻害
以下に概要を述べるように、ｉｎ−ｓｉｔｕ  Ｃａｓｐａｓｅ３キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）を使用して、白血病細胞におけるアポトーシスを決定した。
●６ウェルプレート内に１×１０６個の細胞／ウェルの密度で、白血病細胞を播種する
●所望の濃度の試験化合物／ＤＭＳＯを添加する
●プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２４時間インキュベートする
●２ｍｌの遠心分離管内に細胞を収集する
●１．６μｌの新しく調製された５×ＦＬＩＣＡ試薬を添加し、管をわずかに弾くことによって、細胞を混合する
●５％ＣＯ２下、３７℃で管を１時間インキュベートする
●２ｍｌの１×洗浄緩衝剤を各管に添加し、混合する
●細胞を、＜４００×ｇ、室温で５分間遠心分離する。
●上清を慎重に除去及び処分し、細胞ペレットを穏やかにボルテックスして、いかなる細胞間凝集塊も破壊する。
●３００ｕｌの１×洗浄緩衝剤中で細胞ペレットを再懸濁する
●１００μｌの各細胞懸濁液を、黒色マイクロタイタープレートの２つのウェルのそれぞれの中に定置する。気泡の形成を避ける。
●４９０ｎＭの励起波長及び５２０ｎＭの放出波長を使用して、各マイクロウェルの吸光度を読み取る
●対照ブランクと比較した、蛍光における増大によって明示される、カスパーゼ−３活性における増大パーセントを計算する。
【０１２１】
化合物Ａ１は、Ｔ−リンパ腫（ＭＯＬＴ−４、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｈｕｔ−７８、及びＨｕＴ−１０２）細胞株内のカスパーゼ−３活性における用量依存誘導を引き起こした。
【０１２２】
アッセイ６：ヒト一次ＣＴＣＬ細胞におけるｐＡＫＴ阻害の選別
ｐＡＫＴ阻害のフローサイトメトリー分析：精製された悪性Ｔ細胞をドナーから単離し、ＲＰＭＩ／１％ＢＳＡ内で一晩培養した。細胞を、試験化合物とともに１．５時間インキュベートし、最後の３０分間にサイトカイン混合物を添加した。サイトカイン混合物の組成物は、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ２＋５ｎｇ／ｍｌのＩＬ７＋１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１５＋１０％ＦＢＳであった。フローサイトメトリーによって、ＡＫＴリン酸化を決定した。
【０１２３】
化合物Ａ１での処理は、ＥＣ５０値が４０〜３００ｎＭの範囲内で、用量依存減少ＡＫＴリン酸化を引き起こした（阻害％データ）。
【０１２４】
アッセイ６Ａ：ヒトＣＬＬ細胞における抗癌活性の選別
一般的に＞９７％のＢ細胞／ＣＬＬ細胞の純度を生じる、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＲｏｓｅｔｔｅ−Ｓｅｐ  Ｂ細胞を使用して、一次ＣＬＬ細胞を濃縮した。細胞を、所望の濃度の試験化合物の存在下、無血清培地（ＳＦＭ）またはＳＦＭ＋１０％の熱非活性ウシ胎児血清（体積１００マイクロリットル）のいずれかを有する９６ウェル内に１ウェル当たり、２．５×１０５個で播種し、二酸化炭素インキュベーター内で、３７℃で３日間培養した。ＭＴＳアッセイを使用して、細胞毒性を決定した。
【０１２５】
化合物Ａ１は、無血清培地内で＜１００ｎＭ、及び１０％のＦＢＳ培地内で＜７００ｎＭのＥＣ５０の中央値で、ＣＬＬ細胞において細胞毒性を誘導する。
【０１２６】
アッセイ６Ｂ：患者由来Ｂリンパ腫細胞における抗癌活性の選別
リンパ球系腫瘍からの一次細胞を、試験化合物［化合物Ａ１］に暴露して、細胞死の誘導を評価した。細胞は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、脾性辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＥＭＺＬ）、または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ、ｎｏ．＝１）に由来した。細胞を、所望の濃度の化合物で処理し、４８時間のインキュベーション期間の後、フローサイトメトリーによってアポトーシス（アネキシンＶ／ＰＩ）を評価した。
【０１２７】
４μＭの濃度の試験化合物（化合物Ａ１）に対して暴露されるとき、Ｂ細胞リンパ腫に由来するほとんど全ての一次細胞は、細胞死の増大を受けた。この現象は、小細胞リンパ腫（ＭＺＬ、ＭＣＬ、及びＣＬＬ）に由来する一次細胞の中でより明らかであるようだった。
【０１２８】
アッセイ６Ｃ：Ｂリンパ腫細胞株におけるＡＫＴリン酸化の阻害
ＬＹ−１、ＬＹ−１０、Ｄａｕｄｉ、ＪＥＫＯ、ＲＥＣ、及びＭＡＶＥＲ細胞を、所望の濃度の［化合物Ａ１］とともに４８時間インキュベートした。細胞を溶解させ、ウェスタンブロットによってｐＡＫＴを決定した。ＩｍａｇｅＪを使用してバンドを定量化し、アクチンに正規化した。
【０１２９】
化合物Ａ１は、試験されたＢリンパ腫細胞株にわたって、２０〜２００ｎＭのＥＣ５０を呈した。
【０１３０】
アッセイ６Ｄ：抗ヒトＣＤ３及びＣＤ２８同時刺激一次Ｔ細胞におけるサイトカインアッセイ
本研究の目的は、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８同時刺激一次Ｔ細胞によって生成されるサイトカインに対する、化合物Ａ１の阻害潜在力を評価することであった。
プレーティング及び処理
●プレートを、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の５０μｌの抗ヒトＣＤ３で、４℃で一晩または３７℃で２時間のいずれかでコーティングした。インキュベーション後、無菌ＰＢＳでプレートを２回洗浄して、未結合の抗体を除去した。
●単離ヒトＴ細胞を、１．５ｍｌの管中、１ｍｌ当たり０．６２５×１０６個の細胞に再懸濁し、１μｌの薬物希釈液（１０００×）を添加した。ＤＭＳＯブランク及び未誘導ブランクを維持した。
●細胞を、化合物とともに室温で３０分間インキュベートし、それぞれ２４０μｌの９６ウェルプレートの、抗ヒトＣＤ３をコーティングしたウェルに添加した。１ウェル当たり１０μｌ（２５×）で抗ヒトＣＤ２８を直ちに添加した。
●プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
●プレートを４０００ｒｐｍ、室温で遠心分離し、上清を収集し、−２０℃で保管した。
●商業的ＥＬＩＳＡキットを使用して、吸光度を４５０ｎＭ及び５７０ｎＭで読み取って、サイトカインを決定した。
【０１３１】
８つの独立した実験からＩＣ５０値を計算した。化合物Ａ１は、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ２について、それぞれ２４ｎＭ、９．５４ｎＭ、及び２０．６ｎＭのＩＣ５０で、抗ヒトＣＤ３−ＣＤ２８誘導Ｔ細胞サイトカインを阻害した。結果を図１０に示す。
【０１３２】
アッセイ７：雌のウィスターラットモデルにおけるリポ多糖誘導肺好中球増加症
過剰動員及びそれに続く好中球の活性化は、重度の喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、及び急性呼吸促迫症候群等の、気道及び肺におけるいくつかの炎症性疾患の発症及び経過にとって重要である可能性が高い。好中球がこれらの疾患に寄与する機序は、好中球エラスターゼ等のタンパク質分解酵素、及び酸素フリーラジカルの放出に関与し得る。これらの化合物は、放出されると、気道において気管支収縮、気管支過敏症、分泌過多、上皮損傷、及び組織のリモデリングを引き起こす可能性がある。
【０１３３】
隔離期間後、絶食させた動物をランダム化し、それらの体重に応じて様々な群に分けた。０．５％のメチルセルロースからなるビヒクル中の懸濁液（Ｔｗｅｅｎ８０を懸濁剤として）として試験化合物［化合物Ａ１］を調製した。体積１０ｍＬ／ｋｇの強制経口投与によって化合物またはビヒクルを投与した。ケタミンを用いて雌のウィスターラットを麻酔し、化合物Ａの投与から１時間後に、１ｍｇ／ｋｇの用量でＬＰＳ溶液を気管内に投与した。ＬＰＳの滴下注入の６時間後、動物を麻酔下で失血させ、その後気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の５ｍｌアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄した（総容量２０ｍｌ）。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保存した。気管支肺胞液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁した。血液細胞計数器を使用することによってＢＡＬ液または血液中の白血球の総数を決定し、１×１０６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算した。サイトスピン３を使用して１００マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製した。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、スライドを顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定した。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定し、パーセンテージとして表した。それぞれのＢＡＬｆまたは血液中の好酸球の数を計算した。
【０１３４】
化合物Ａ１は、６．５ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０での、好中球浸潤の肺内への用量依存減少を示し、これは炎症性障害における治療的役割を示す。結果を図１に示す。
【０１３５】
アッセイ８：リポ多糖誘導ラット空気嚢の炎症のモデル
白血球動員、及び異なるサイトカインを含む炎症促進性媒介物の形成が、炎症反応の特質である。空気嚢モデルは、リウマチ性関節炎（ＲＡ）において発生する炎症性プロセスの研究のために、最初に模倣滑膜として開発された。モデルは、空気嚢壁（組織）内に蓄積する白血球種、及び空気嚢腔（肺胞）内に遊出する白血球種の分画定量を可能にし、それは、様々な炎症性刺激によって誘導される血管外漏出に対して反応性の、ケモカイン及び接着分子の特徴付けを可能にする。
【０１３６】
雌のウィスターラット（１７５〜２００ｇ）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付けた。動物をエーテルで麻酔し、２０ｍｌの無菌空気を皮下の肩甲骨内領域に注入する（０日目）ことによって皮下空気嚢を作製し、４日目に無菌濾過空気の第２の１０ｍｌの注入によって維持した。６日目に、６日目のＬＰＳ溶液の皮下注入による炎症の誘導前に、経口処理を開始した無菌食塩水（１００μｇ／ｋｇ）中に溶解した５ｍｌのＬＰＳ溶液の体積を、各嚢に注入した。ＬＰＳの投与の６時間後に、５ｍｌの無菌食塩水で嚢を流し、４ｍｌの液体を取り除くことによって嚢液の試料を取得した。嚢液中に存在する白血球の数を、血球計算器を使用して顕微鏡的に決定した。Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色された液体スメアの顕微鏡検査によって、分画細胞内容物を決定した。
【０１３７】
化合物Ａ１は、２．６ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０での、好中球遊走のラット空気嚢内への用量依存減少を引き起こし、これはリウマチ性関節炎における治療的役割を示す。結果を図２に示す。
【０１３８】
アッセイ９：リポ多糖誘導ＴＮＦ−α生成
絶食時の雌のウィスターラットを、それらの体重に応じて異なる群にランダム化した。０．５％のメチルセルロースからなるビヒクル中の懸濁液として試験化合物（化合物Ａ１）を調製した。体積１０ｍＬ／ｋｇの強制経口投与によって化合物またはビヒクルを投与した。０．３ｍｇ／ｋｇの用量での化合物投与の１時間後に、ＬＰＳ溶液を腹腔内投与した。ＬＰＳ注入の９０分後に、心臓穿刺によって血清分離管内に血液を収集した。血清を分離し、−２０℃で保管し、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦαについて分析する。
【０１３９】
化合物Ａ１は血漿ＴＮＦα濃度を減少させ、これは炎症性障害における治療的役割を示す（１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇで観察された阻害パーセントは、それぞれ５％、１５％、及び４０％であった）。結果を図３に示す。
【０１４０】
アッセイ１０Ａ：雄のモルモットにおける卵白アルブミン誘導肺好酸球増加症
気道炎症及び気道過敏性（ＡＨＲ）は、気管支炎の特質であり、際立った特徴である。同一のアレルゲンを有する事前感作されたマウスの誘発は、優先的好酸球性浸潤を有する気道炎症、結果として、ＡＨＲを誘導する。気道音の変更された神経系細胞の制御、及び気道上皮剥離との組み合わせでの肺好酸球増多症及び気道の再モデル化は、喘息におけるＡＨＲに寄与し得る。
【０１４１】
隔離期間後、後眼窩叢法によって各個々の動物から眼窩静脈から０．３ｍＬの血液試料を収集し、細胞分析器（ＡＤＶＩＡ２１２０，Ｓｉｅｍｅｎｓ）上で分析した。それらの総細胞数に基づいて、モルモットをランダム化し、様々な群に分けた。同定のために、難消標識ペンで耳介を標識化した。０日目に、重量を記録し、５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）及び１０ｍｇのミョウバン溶液（１ｍＬ）で動物を腹腔内に感作させた。７日目及び１４日目に、上記の感作手順を反復した。疾病または感作に対する反応のあらゆる徴候について、１９日目まで動物を観察し、もしあれば記録した。１９、２０、及び２１日目に、強制経口投与による試験化合物での処理後、３０分後に動物を０．５％ｗ／ｖ、０．５％、及び１％の卵白アルブミン負荷にそれぞれ暴露した。対照及び偽群の動物を、０．５％ｗ／ｖのメチルセルロース（ビヒクル）で処理した。偽対照群を、０、７、及び１４日目に１０ｍｇのミョウバンで感作させ、１９、２０、及び２１日目に同一の噴霧速度で食塩水溶液（ＳＡＬ）に暴露した。ＯＶＡ負荷の２０時間後、メタコリン負荷の累積用量（７５、１００、１２５、及び１５０μｇ／ｍｌ）に対する全身プレチスモグラフによって気道過敏性を測定し、気道反応を測定した後、血液試料及びＢＡＬ液を収集した。顕微鏡下で、ノイバウアー室を使用することによって総細胞数について試料を分析し、白血球分画の計数を手動で行った。
【０１４２】
図４Ａ及び４Ｂに図示するように、化合物Ａ１は、感作されたモルモットのメタコリン負荷に対する気道過敏性において、有意な用量依存減少を引き起こした。
【０１４３】
図４Ｃ〜４Ｅに図示するように、化合物Ａ１は、感作されたモルモットの気管支肺胞洗浄液への好酸球浸潤において、有意な用量依存減少を引き起こした。
【０１４４】
アッセイ１０Ｂ：マウス喘息モデル
気道炎症及び気道過敏性（ＡＨＲ）は、気管支炎の特質であり、際立った特徴である。同一のアレルゲンを有する事前感作されたマウスの誘発は、優先的好酸球性浸潤を有する気道炎症、結果として、ＡＨＲを誘導する。気道音の変更された神経系細胞の制御、及び気道上皮剥離との組み合わせでの肺好酸球増多症及び気道の再モデル化は、喘息におけるＡＨＲに寄与し得る。隔離期間後、それらの体重に基づいて、マウスをランダム化し、４つの群に分けた（ｎ＝７）。同定のために、難消標識ペンで尾を標識化した。０日目に、重量を記録し、１００μｇの卵白アルブミン及び１０ｍｇのミョウバン溶液（０．２ｍＬ）で動物を腹腔内に感作させた。７日目及び１４日目に、上記の感作手順を反復した。疾病または感作に対する反応のあらゆる徴候について、２４日目まで動物を観察し、もしあれば記録した。２４、２５、及び２６日目に、強制経口投与による試験化合物での処理後、３０分後に動物を１０％ｗ／ｖの卵白アルブミン負荷に暴露した。対照及び偽群の動物を、０．５％ｗ／ｖのメチルセルロース（ビヒクル）で処理した。偽対照群を、０、７、及び１４日目に１０ｍｇのミョウバンで感作させ、２４、２５、及び２６日目に同一の噴霧速度で食塩水溶液に暴露した。ＯＶＡ負荷の４８時間後、メタコリン負荷の累積用量（２．５、１０、５０、及び１００ｍｇ／ｍｌ）に対する全身プレチスモグラフによって気道過敏性を測定し、気道反応を測定した後、血液試料及びＢＡＬ液を収集した。顕微鏡下で、ノイバウアー室を使用することによって総細胞数について試料を分析し、白血球分画の計数を手動で行った。図５Ａ及び５Ｂに図示するように、３ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａ１は、卵白アルブミン感作されたマウスのメタコリン負荷に対する気道過敏性において、有意な減少を引き起こした。
【０１４５】
図５Ｃ〜５Ｅに図示するように、３ｍｇ／ｋｇの用量の化合物Ａ１は、卵白アルブミン感作されたマウスの気管支肺胞洗浄液への好酸球浸潤の、有意な阻害を引き起こした。
【０１４６】
アッセイ１１：ルイスラットにおけるコラーゲン誘導関節炎
雌のウィスターラットを、実験の開始前に７日間気候順応させ、それらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付けた。０日目に、尾の付け根で送達される、ＭＴＢ（４ｍｇ／ｍＬ）を含有する完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させた、５００μｇのウシコラーゲンＩＩ型の皮内注入によって動物を処理した。７日目の一次免疫化の後、尾の付け根での皮内注入による、不完全なフロイントアジュバント中、３００μｇのＣＩＩの追加免疫注入によって動物を処理した。足首の関節における関節炎の発現は、通常１２〜１４日目の間に視覚的に明らかになった。関節炎の発現後の日から実験の終了（２８日目）まで、治療群として試験化合物またはビヒクル（経口投与）で、動物を処理した。研究期間中にわたって定期的に、関節炎の徴候について視覚的検査によって関節炎点数を取得した。体重及び足の体積、足の厚さを、０、３、７、１０、１２、１４、１７、２１、２４、及び２８日目に取得した。２８日目、研究の終了時に、剖検で血液を回収し、血清または血漿に処理し、全ての関節を取得し、組織の小片を各関節から取得した後、病理組織学的分析のために前足及び後足の両方を１０％のホルマリン内に固定し、組織ホモジネート内のサイトカイン分析のために−８０℃で保管した。前足及び後足の臨床点数化判断基準は、０＝正常、１＝１つの後足または前足の関節に発症、もしくは最小のびまん性紅斑、及び腫脹、２＝２つの後足または前足の関節に発症、もしくは中度のびまん性紅斑、及び腫脹、３＝３つの後足または前足の関節に発症、もしくは最小のびまん性紅斑、及び腫脹、４＝４つの指関節に発症、５＝足全体に重度のびまん性紅斑及び重度の腫脹、指を曲げることができない、である。
【０１４７】
ラットＣＩＡモデルにおいて治療的に投薬された化合物Ａ１は、膝及び足首の腫脹の減少における有意な有効性を実証する。
【０１４８】
研究の終了時の関節の組織学的分析は、１５ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１での完全な構造的保存を実証する。比較のために、ビヒクル投薬した動物は、滑膜（Ｓ）炎及び骨再吸収、パンヌス形成、及び軟骨分解の有意な証拠を示し、図６Ａ〜６Ｄに図示するように、化合物Ａ１は、膝及び足首の両方の、個々の及び合計の病理組織学的点数における有意な減少を示す。
【０１４９】
アッセイ１２：雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける急性ＣＳＥ誘導細胞浸潤
動物（雄のＢａｌｂ／ｃマウス）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。１日目に、経口／鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、試験化合物投与の１時間後に、動物をエーテルで麻酔し、５０μｌ／マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、４日間（１日目〜４日目）の試験化合物投与の後、毎日動物に対するＣＳＥ暴露を反復する。５日目、最終ＣＳＥ暴露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌのアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄した（総体積２ｍｌ）。ＢＡＬは、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保管した。気管支肺胞液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁しなくてはならない。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を決定し、１×１０６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、好酸球をその形態学的特徴に従って同定するために、顕微鏡的に観察しなくてはならない。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定し、パーセンテージとして表し、各ＢＡＬｆ中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
【０１５０】
アッセイ１３：雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける亜慢性ＣＳＥ誘導細胞浸潤
動物（雄のＢａｌｂ／ｃマウス）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。１日目に、動物をエーテルで麻酔し、５０μｌ／マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、８日間（１日目〜８日目）毎日動物に対するＣＳＥ暴露を反復する。９日目に、経口／鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、試験化合物投与の１時間後に、動物をエーテルで麻酔し、５０μｌ／マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、その後の３日間（９日目〜１１日目）の試験化合物投与の後、毎日動物をＣＳＥに対して暴露し、１２日目、最終ＣＳＥ暴露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌのアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄する（総体積２ｍｌ）。ＢＡＬは、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保管した。気管支肺胞液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁する。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を決定し、１×１０６個の細胞／ｍｌに調節する。細胞分画数を手動で計算した。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定する。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定し、パーセンテージとして表さなくてはならず、各ＢＡＬｆ中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
【０１５１】
アッセイ１４：タバコ煙抽出物誘導肺炎（ＣＯＰＤ）モデルにおけるコルチコステロイド非感受性の逆転
雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、実験の開始前に７日間気候順応させた。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。１日目に、動物をエーテルで麻酔し、５０μｌ／マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、その後の５日間（１日目〜６日目）毎日動物をＣＳＥに暴露する。７日目に、経口／鼻腔内経路によって、１０ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを強制経口投与によってマウスに投与し、６０分後、鼻腔内経路によってＣＳＥをマウスに投与し、これをその後の４日間（７日目〜１１日目）反復しなければならない。９日目〜１１日目まで、経口／鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルを動物に投与し、デキサメタゾン投与の３０分後に、３０分後に、動物をエーテルで麻酔し、５０μｌ／マウスの体積のタバコ煙抽出物を、鼻腔内経路によって投与し、その後の２日間（すなわち、９日目〜１１日目）の試験化合物投与の後、毎日動物をＣＳＥに対して暴露し、１２日目、最終ＣＳＥ暴露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌのアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄する（総体積２ｍｌ）。ＢＡＬは、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保管しなければならない。気管支肺胞液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁しなくてはならない。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を決定し、１×１０６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、好酸球をその形態学的特徴に従って同定するために、顕微鏡的に観察しなくてはならない。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各ＢＡＬ液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
【０１５２】
アッセイ１５：雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける急性タバコ煙誘導細胞浸潤
動物（雄のＢａｌｂ／ｃマウス）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。１日目に、経口／鼻腔内経路によって、試験化合物またはビヒクルをマウスに投与し、試験化合物投与の１時間後、動物を全身曝露用ボックスに定置する。１日目及び２日目に６本、３日目に８本、４日目に１０本のタバコの主流煙にマウスを曝露する。各タバコの煙への曝露を１０分間継続し（最初の２分間でタバコを完全に燃やした後、動物用換気装置を用いて気流を発生させた）、次の２０分間は室内の新鮮な空気に曝露する。２本のタバコごとに室内の新鮮な空気に曝露することで更に２０分間休憩させる。対照動物は、室内空気室に曝露する。１日目〜４日目まで、経口経路または鼻腔内経路により動物に試験化合物を投与する。５日目に、最後のタバコ煙（ＣＳ）曝露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄する（総体積２ｍｌ）。採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保存する。ＢＡＬ液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁する。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を決定し、１×１０６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定する。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各ＢＡＬ液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
結果：図７Ａ及び７Ｂに図示するように、化合物Ａ１は、マクロファージ及びＢＡＬＦへの好中球浸潤を減少させ、これにより慢性閉塞性肺疾患における治療的役割を示す。
【０１５３】
アッセイ１６：マウスにおける卵白アルブミン誘導鼻好酸球及び好中球蓄積
動物（マウス）を、実験の開始前に７日間気候順応させる。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。１及び５日目に、動物をＯＶＡ（４０μｇ／ｋｇ腹腔内）で免疫化する。鼻内の局所炎症反応を誘発するために、１２〜１９日目に、マウスをＯＶＡ（食塩水中３％のＯＶＡ）で鼻腔内に繰り返し負荷（１つの鼻孔当たり１０μｌ）する。１９日目、最終ＯＶＡ負荷の開始前に、非絶食時のマウスに、ビヒクルまたは試験化合物のいずれかを鼻腔内（１つの鼻孔当たり１０μｌ）に投薬する。２時間後、各動物に、最終鼻腔内ＯＶＡ（３％）負荷を受けさせる。更に８時間後、各動物を麻酔し、後鼻孔前の約１ｍｍの位置に伸長する、吻側移植した気管カニューレによって、ｍｌのＰＢＳを後鼻孔内に滴下注入することによって鼻洗浄を実施する。この手順は、約２ｍｌの洗浄液の収率を生じさせるために反復しなければならない。鼻洗浄液試料中の総細胞数を、血球計算器を使用して測定する。室温、１２００ｒｐｍで２分間遠心分離することによって、鼻洗浄液試料のサイトスピンスメアを調製し、細胞分画数のために、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色システム（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を使用して染色する。油浸顕微鏡を使用して細胞を計数する。
【０１５４】
アッセイ１７：マウスにおけるポリ−Ｉ：Ｃ誘導細胞蓄積
特異的病原体を含まないＡ／Ｊマウス（雄、生後５週間）を、実験の開始前に７日間気候順応させた。その後、動物をそれらの体重に基づいて様々な群にランダムに割り付ける。ポリ（Ｉ：Ｃ）−ＬＭＷ（ポリ−ＩＣ、１ｍｇ／ｍＬ、４０μｌ）を、３％のイソフルランでの麻酔下、動物に１日２回、３日間鼻腔内投与する。各ポリ−Ｉ：Ｃ処理の２時間前に、鼻腔内（５０％のＤＭＳＯ／ＰＢＳ中、３５μｌの溶液）によって、試験化合物で動物を処理する。最終ポリ−Ｉ：Ｃ負荷の２４時間後、動物を麻酔し、気管にカニューレを挿入しなければならず、ＢＡＬＦを収集する。血液細胞計数器を使用することによって、ＢＡＬＦ中の肺胞マクロファージ及び好中球の濃度を決定し、１×１０６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算する。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製する。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、顕微鏡的に観察して、好酸球をその形態学的特徴に従って同定する。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各ＢＡＬ液中の好中球及びマクロファージの数を計算する。
【０１５５】
本明細書に記載の本発明を、特定の実施形態を参照して記載してきたが、これらの実施形態は、本発明の原則及び用途の例に過ぎないことを理解されたい。したがって、前述の本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に数多くの修正がなされ得ること、及び他の構成が考案され得ることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義すること、そして、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物が、それによって包含されることが意図される。
【０１５６】
化合物Ａ１の薬学的組成物
実施例Ｉ
５または１０ｍｇの化合物Ａ１を含有する、以下に記載されるカプセルを調製する。
【表４】
0006499165.tif 000006
【０１５７】
実施例ＩＩ
２５、５０、または１００ｍｇの化合物Ａ１を含有する、以下に記載されるカプセルを調製する。
【表５】
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【０１５８】
本出願に引用される全ての刊行物及び特許、及び／または特許出願は、参照により、各個々の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に具体的かつ個々に組み込まれていることが示されているのと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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