(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄吸引液を処理するためのデバイスであって、
第１のチャンバであって、前記第１のチャンバは、前記第１のチャンバの中に受容された骨髄吸引液の、脂肪層上清画分を含む複数の層への分画を提供する、第１のチャンバと、
前記第１のチャンバと流体連通する第２のチャンバであって、前記脂肪層上清画分は、前記第２のチャンバの中に傾瀉される、第２のチャンバと、
前記脂肪層上清画分を乳化するために、前記第２のチャンバから前記脂肪層上清画分を受け取るように前記デバイスに一体化された機械的乳化システムと
を備える、骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項２】
前記第２のチャンバは、前記脂肪層上清画分と流体連通する注射器、ピペット、またはチューブのうちの少なくとも１つを備える、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項３】
前記第１のチャンバは、円板状体積を備え、前記円板状体積は、前記円板状体積の直径に垂直な中心軸の周囲での前記第１のチャンバの回転に応じて、前記円板状体積の中心領域に前記脂肪層上清画分の収集を提供する、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項４】
前記第１のチャンバは、前記第１のチャンバ内に留置される骨髄吸引液の分画に応じて、前記脂肪層上清画分の場所と対応するように位置付けられている制限された直径の一部を備える、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項５】
前記第１のチャンバは、浮動式円板を備え、前記円板は、前記骨髄吸引液の分画に応じて、実質的に血清層と前記脂肪層上清画分との間で前記円板を浮動させるように選択された密度を有する、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項６】
前記第１のチャンバは、前記骨髄吸引液の分画に応じて、前記脂肪層上清画分の分離を提供する、多孔質親油性膜を備える、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項７】
前記第１のチャンバは、前記骨髄吸引液の分画に応じて、前記脂肪層上清画分と流体連通する１つ以上のポートを備える、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項８】
前記乳化システムは、第１の乳化チャンバと第２の乳化チャンバとを備え、前記第１の乳化チャンバおよび前記第２の乳化チャンバは、前記第１の乳化チャンバと前記第２の乳化チャンバとの間の前記脂肪層上清画分の通過に応じて、乳化を提供するようにサイズ決定された開口を通して相互に流体連通する、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項９】
前記乳化システムは、第１の乳化チャンバと第２の乳化チャンバとを備え、前記第１の乳化チャンバおよび前記第２の乳化チャンバは、前記第１の乳化チャンバと前記第２の乳化チャンバとの間の脂肪層上清画分の通過に応じて、前記脂肪層上清画分の乳化を提供する乳化スクリーンを通して、相互に流体連通する、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項１０】
前記乳化システムは、前記脂肪層上清画分に対して移動可能である乳化スクリーンを備え、前記脂肪層上清画分の乳化を提供する、請求項１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
【請求項１１】
骨髄吸引液を処理する方法であって、
請求項１−１０のいずれか１項に記載のデバイスを用いて、骨髄吸引液を処理することと、
前記処理された骨髄吸引液から前記脂肪層上清画分を収集することと
を含む、方法。
【請求項１２】
前記脂肪層上清画分を処理し、間充織幹細胞を収集することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記骨髄吸引液に二次物質を添加することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記二次物質は、生物学的不活性流体、ＣａＣｌ２、トロンビン、凝固剤、または重合剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
消化剤を前記収集された脂肪層上清画分に添加することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記消化剤は、コラゲナーゼまたはレシチンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
音響エネルギーまたは振動のうちの少なくとも１つを前記脂肪層上清画分に印加することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
治療システムであって、
請求項１−１０のいずれか１項に記載の骨髄吸引液から前記脂肪層上清画分を単離するためのデバイスと、
前記単離された脂肪層上清画分の一部または全てをヒトまたは動物の患者の体内に再導入するための注射器と
を備える、治療システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
成人の間充織幹細胞（ＭＳＣ）は、安定性の高い組織修復が可能である。ＭＳＣは、２つの最も一般的な源（脂肪組織および骨髄）を伴う多くの自己移植組織源から単離されることができる。脂肪幹細胞採取が、皮下脂肪組織の脂肪吸引術を通して実施され、これは、次いで、通常、化学的消化技術で処理される。骨髄吸引液は、最初に、骨皮質を通して挿入されるトローカルを通して患者から取得されたとき、赤い液体である。吸引流体は、次いで、典型的には、種々の骨髄画分（本明細書では、画分または層と称される）を取り出すために、遠心分離で処理される。軟膜は、血清成分の下方かつ赤血球成分の上方に位置付けられる、遠心分離された骨髄の中間の画分である。軟膜は、有核細胞、前駆細胞、および幹細胞が豊富である。
【０００２】
最近まで、分画された骨髄吸引液の軟膜のみが、有用な量のＭＳＣを含むとして知られていた。したがって、治療的に有意な量のＭＳＣを単離するように設計される典型的な骨髄分画および濃縮システムが、種々の手段を通して軟膜を単離かつ処理することに焦点を当てている。従来の方法およびデバイスは、特に、骨髄吸引液が分画されるとき、血清層の上方に位置付けられる骨髄脂肪層上清である、ＭＳＣを含有することが現在知られている、他の骨髄画分の単離または後続の処理を提供しない。したがって、従来の技術によると、骨髄脂肪上清層は、廃棄物として廃棄される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
分画された骨髄吸引液の脂肪層上清が、現在、ＭＳＣを含むことが知られているが、使用可能なＭＳＣ収率を最大限にするために、脂肪層上清を効率的に収集し、それを処理するための技術が、知られていない。
【０００４】
本明細書に開示される実施形態は、上記に議論される問題の１つ以上を克服することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（実施形態の要約）
本明細書に開示される実施形態は、概して、骨髄吸引液の脂肪上清層の分画、単離、抽出、および処理のためのシステム、デバイス、および方法に関する。特に、種々の実施形態は、間充織幹細胞の源として、骨髄吸引液の脂肪上清層を取得する、利用する、かつ処理するシステム、デバイス、および方法に関する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
骨髄吸引液を処理するためのデバイスであって、
第１のチャンバであって、前記第１のチャンバは、前記第１のチャンバの中に受容された前記骨髄吸引液の分画を提供する、第１のチャンバと、
前記第１のチャンバと流体連通する第２のチャンバであって、分画された骨髄吸引液の１つ以上の層は、前記第２のチャンバの中に傾瀉される、第２のチャンバと
を備える、骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目２）
前記第１のチャンバと流体連通する第２のチャンバであって、血清層、軟膜層、または赤血球層のうちの１つ以上は、前記第２のチャンバの中に傾瀉され得る、第２のチャンバと、
第３のチャンバであって、脂肪層上清は、前記第３のチャンバの中に傾瀉され得る、第３のチャンバと
をさらに備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目３）
前記第２のチャンバは、前記脂肪層上清と流体連通する注射器、ピペット、またはチューブのうちの少なくとも１つを備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目４）
前記第１のチャンバは、流体アクセスポートを備えるキャップを備え、前記流体アクセスポートは、前記第２のチャンバを前記脂肪層上清と流体連通して留置されるように提供する、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目５）
前記第１のチャンバは、前記第１のチャンバから前記分画された骨髄吸引液の選択された部分の排出を提供するプランジャを備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目６）
前記第１のチャンバは、円板状体積を備え、前記円板状体積は、中心軸の周囲での前記第１のチャンバの回転に応じて、前記円板状体積の中心領域に脂肪層上清画分の収集を提供する、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目７）
前記第１のチャンバは、前記第１のチャンバ内に留置される骨髄吸引液の分画に応じて、前記脂肪層上清画分の場所と対応するように位置付けられている制限された直径の一部を備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目８）
前記第１のチャンバは、前記骨髄吸引液の分画に応じて、血清層と脂肪層上清画分との間に、円板を実質的に浮動させるように選択された密度を有する、浮動式円板を備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目９）
前記第１のチャンバは、前記骨髄吸引液の分画に応じて、前記脂肪層上清画分の分離を提供する、多孔質親油性膜を備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目１０）
前記第１のチャンバは、前記骨髄吸引液の分画に応じて、脂肪層上清画分と流体連通する１つ以上のポートを備える、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目１１）
前記第２のチャンバと流体連通する乳化システムをさらに備え、前記乳化システムは、前記第１のチャンバ内に受容された前記骨髄吸引液から分離された脂肪層上清画分を乳化する、項目１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目１２）
前記乳化システムは、第１の乳化チャンバと第２の乳化チャンバとを備え、前記第１の乳化チャンバおよび前記第２の乳化チャンバは、前記第１の乳化チャンバと前記第２の乳化チャンバとの間の前記脂肪層上清の通過に応じて、乳化を提供するようにサイズ決定された開口を通して相互に流体連通する、項目１１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目１３）
前記乳化システムは、第１の乳化チャンバと第２の乳化チャンバとを備え、前記第１の乳化チャンバおよび前記第２の乳化チャンバは、前記第１の乳化チャンバと前記第２の乳化チャンバとの間の脂肪層上清の通過に応じて、前記脂肪層上清の乳化を提供する乳化スクリーンを通して、相互に流体連通する、項目１１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目１４）
前記乳化システムは、前記脂肪層に対して移動可能である乳化スクリーンを備え、前記脂肪層上清の乳化を提供する、項目１１に記載の骨髄吸引液を処理するためのデバイス。
（項目１５）
骨髄吸引液を処理する方法であって、
項目１−１４のいずれかの１項に記載のデバイスを用いて、骨髄吸引液を処理することと、
前記処理された骨髄吸引液から脂肪層上清を収集することと
を含む、方法。
（項目１６）
前記脂肪層上清を処理し、間充織幹細胞を収集することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記骨髄吸引液に二次物質を添加することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記二次物質は、生物学的不活性流体、ＣａＣｌ２、トロンビン、凝固剤、または重合剤のうちの少なくとも１つを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
消化剤を前記収集された脂肪層上清に添加することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記消化剤は、コラゲナーゼまたはレシチンのうちの少なくとも１つを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
音響エネルギーまたは振動のうちの少なくとも１つを前記脂肪層上清に印加することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
治療システムであって、
項目１−１４のいずれかの１項に記載の骨髄吸引液から脂肪層上清を単離するためのデバイスと、
前記単離された脂肪層上清の一部または全てをヒトまたは動物の患者の体内に再導入するための装置と
を備える、治療システム。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、分画された骨髄吸引液内に存在する選択された層を示す、概略図である。
【図２】図２は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの一実施形態の概略図である。
【図３】図３は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図４】図４は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図５】図５は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図６】図６は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図７】図７は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図８】図８は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図９】図９は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１０】図１０は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１１】図１１は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１２】図１２は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１３】図１３は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１４】図１４は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１５】図１５は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１６】図１６は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１７】図１７は、骨髄吸引液の脂肪上清層の収集、単離、および／または処理のために有用なデバイスの別の実施形態の概略図である。
【図１８】図１８は、軟膜および脂肪上清層から取得された全ての細胞に関する、骨髄吸引液１０ｃｃあたりの単核細胞の手集計を示す、データのグラフ表現である。
【図１９】図１９は、軟膜および脂肪上清層から取得されたＭＣＳに関する、合計細胞集計数に対するＭＳＣのパーセンテージを示す、フローサイトメトリデータのグラフ表現である。
【図２０】図２０は、軟膜および脂肪上清層から取得されたＭＣＳに関する、骨髄吸引液１０ｃｃあたりのＭＳＣの全体量を示す、データのグラフ表現である。
【図２１】図２１は、軟膜と脂質層画分との両方からの骨髄１０ｃｃから最初に取得されたＭＳＣの数を示す、データのグラフ表現である。
【図２２】図２２は、継代培養に必要である１０ｃｃ骨髄から導出される脂肪および軟膜ＭＳＣの量を取得するために要求される、培養下の日数を示す、データのグラフ表現である。
【図２３】図２３は、１０ｃｃ骨髄から導出される脂肪および軟膜ＭＳＣに関する、ＭＳＣ集合の倍加時間のグラフ表現である。
【図２４】図２４は、同一の患者から取得された乳化および非乳化サンプルを比較する、Ｐ０ＭＳＣ収率の増加のグラフ表現である。
【図２５】図２５は、同一の患者から取得された乳化および非乳化サンプルを比較する、ＭＳＣ収率の増加のグラフ表現である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
別様に示されない限り、本明細書および請求項に使用される成分、寸法、および反応条件等の量を表す全ての数が、用語「ａｂｏｕｔ（約）」によって全ての事例において修飾されるものとして理解されたい。
【０００８】
本願および請求項では、単数形の使用は、別様に具体的に述べられない限り、複数形を含む。加えて、「ｏｒ（または）」の使用は、別様に述べられない限り、「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を意味する。さらに、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含んでいる）」、ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」および「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」等の他の形態の使用は、限定ではない。また、「ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」または「ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（構成要素）」等の用語は、別様に具体的に述べられない限り、１つのユニットを備える要素および構成要素と、２つ以上のユニットを備える要素および構成要素との両方を包含する。
【０００９】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）が、分画された骨髄吸引液から取得されることができる。骨髄吸引液は、吸引流体を密度傾斜層に分離する、遠心分離ベースまたは類似する技術を使用して、分画されてもよい。図１に示されるように、分画された骨髄吸引液１００は、典型的には、少なくとも、よりも大きい密度からより少ない密度に順序付けられた、赤血球（ＲＢＣ）層１０２、軟膜層１０４、血清層１０６、および脂肪上清層１０８の層を含む。骨髄吸引液からのＭＳＣの抽出のための従来の技術は、典型的には、軟膜層１０４の単離および処理を特徴とする。多くの異なる方法が、軟膜を単離するために使用されている。従来の軟膜分離および処理方法は、脂肪層上清１０８を廃棄する。
【００１０】
Ｃ．  Ｌ．  Ｉｎｓａｕｓｔｉ、Ｍ．  Ｂ．  Ｂｌａｎｑｕｅｒ、Ｌ．  Ｍ．  Ｏｌｍｏ、Ｍ．  Ｃ．  Ｌｏｐｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ、Ｘ．  Ｆ．  Ｒｕｉｚ、Ｆ．  Ｊ．  Ｌｏｚａｎｏ、Ｖ．  Ｃ．  Ｐｅｒｉａｎｅｓ、Ｃ．  Ｆｕｎｅｓ、Ｆ．  Ｊ．  Ｎｉｃｏｌａｓ、Ｍ．  Ｊ．  Ｍａｊａｄｏ、およびＪ．  Ｍ．  Ｊｉｍｅｎｅｚによる「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｆａｔ  Ｌａｙｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓｅｐａｒａｔｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ」、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ，２１（２０１２），２６０−７２．（Ｉｎｓａｕｓｔｉ）は、最初に、分画された骨髄吸引液の脂肪層がＭＳＣを含有していたことを２０１２年に開示した。軟膜とともに脂肪層を処理することが、約５０％と同量まで骨髄採取からの幹細胞収率を増加させる場合があることがＩｎｓａｕｓｔｉによって推定された。本明細書に開示される方法および装置は、軟膜の共処理を用いて、または用いずに、分画された骨髄吸引液の脂肪層１０８を単離、収集、かつ処理するために使用されてもよい。代替として、本明細書に開示される装置および方法は、脂肪組織の他の非骨髄源からＭＳＣを取得するために使用されてもよい。驚くことに、かつ有利には、出願者は、軟膜を単独で処理する際に取得されたＭＳＣ収率と比較したとき、５０％を有意に上回って量が増加される、骨髄吸引液の脂肪層からのＭＳＣ収率を実証している。
【００１１】
上記に留意されるように、Ｉｎｓａｕｓｔｉは、軟膜とともに脂肪層を処理することが、約５０％と同量まで骨髄採取から幹細胞収率を増加させる場合があると推定した。この比較的あまり多くない収率は、部分的に、囲繞脂肪組織からＭＳＣを抽出する際に直面される困難によってもたらされた。特に、出願者は、分画された骨髄吸引の脂肪層上清１０８中のＭＳＣ（または他の脂肪組織内のＭＳＣ）が、微細なコラーゲン基質中に係止され得ると考えている。例えば、腹部皮下脂肪は、生幹細胞が取得され得る前に、化学的消化に伴って分裂されるはずである、強固なコラーゲン基質を有する。出願者は、骨髄吸引液の脂肪画分の機械的乳化が、Ｉｎｓａｕｓｔｉによって推定された５０％増加を有意に上回る値にＭＳＣ収率を大幅に増加させることができると判断している。
【００１２】
具体的には、下記に詳述されるように、機械的乳化を脂肪層上清に印加する新規のステップは、収率約７００％までＭＳＣの増加をもたらした。出願者は、Ｉｎｓａｕｓｔｉ  ｅｔ．  ａｌ．と比較したときのＭＳＣ収率の増加が、この組織のより微細なコラーゲン基質から幹細胞の機械的解離に起因すると考える。
【００１３】
したがって、本開示は、全骨髄吸引液の幹細胞が豊富な脂肪層上清１０８（代替として、本明細書では、脂肪ＬＳ１０８と称される）を単離するためのデバイス実施形態、システム、および方法を提供する。実施形態は、随意に、軟膜層１０４の単離かつ共処理することを含んでもよい。実施形態はまた、ある事例において、脂肪組織の他の源に適用されてもよい。
【００１４】
システム実施形態の一分類は、患者から骨髄の採取の後に、脂肪ＬＳ１０８の略同時の迅速な単離と、組織修復を向上させるために、そこから単離された脂肪ＬＳ１０８またはＭＳＣの患者の体内への再注入または外科手術的留置とが続く、医師の診察所内における使用に好適な閉鎖システムを特徴とする。実施形態の別の分類では、本システムは、そこから単離された脂肪ＬＳまたはＭＳＣが、治療目標を達成するために、患者の体内に再導入される前に、拡張または別様に処理されるように、開放型または部分的に開放型であってもよい。
【００１５】
デバイス実施形態は、単独で、または全骨髄吸引の軟膜１０４と組み合わせて、脂肪ＬＳ１０８を単離するために使用されてもよい。デバイスの実施形態はまた、脂肪ＬＳ１０８と、血清層１０６、血清層および／または軟膜１０４の単離された画分、および／または血小板あるいは白血液細胞等のＲＢＣ層１０２等の骨髄吸引液の１つ以上の成分と組み合わせてもよい。
【００１６】
方法の実施形態は、適切なデバイスを用いて、手動で、または自動的に、または半自動的に、実施されてもよい。したがって、ある自動デバイスは、脂肪ＬＳ１０８、血清１０６、軟膜１０４、またはＲＢＣ層１０２等の着目される種々の骨髄画分を識別するために、光センサまたは他の検出器を組み込む。
【００１７】
一具体的なデバイス実施形態では、図２に示されるように、下記に説明されるような複数のチャンバを有するように加工された遠心分離チューブ１１０が、５−１０分間、１００−５００ｇで遠心分離される。遠心分離チューブ１１０は、複数のチャンバが提供される。第１のチャンバ１１２は、上部１０８上に脂肪ＬＳ、脂肪ＬＳの下方にある血清層１０６、血清層の下方にある軟膜１０４、および軟膜の下方にあるＲＢＣ層１０２を伴う、分画された骨髄吸引液を生成するための典型的な遠心分離チャンバとして機能する。遠心分離チューブ１１０はまた、少なくとも二次チャンバ１１４および三次チャンバ１１６を含み、これらは、例えば、血清層１０６を二次チャンバ１１４の中に傾瀉させ、かつ脂肪ＬＳ１０８を三次チャンバ１１６の中に収集させる。
【００１８】
使用時、遠心分離チューブ１１０は、図２Ａに例証されるように、骨髄吸引液を層に分離するために、上記に説明されるように遠心分離される。第２の遠心分離実行は、図２Ｂに例証されるように、血清層１０６を二次チャンバ１１４の中に傾瀉するように実施される。直立位置で実施される第３の遠心分離実行が、次いで、脂肪ＬＳ１０８および軟膜１０４を三次チャンバ１１６の中に吐出してもよい。
【００１９】
代替デバイスの実施形態が、図３−４に例証される。この代替実施形態では、ある層（例えば、脂肪ＬＳ１０８、血清１０６、および軟膜１０４）は、二段チャンバ遠心分離チューブ１１０の二次チャンバ１１４内に収集され、次いで、脂肪ＬＳ１０８（軟膜とともに、または伴わずに）は、脂肪ＬＳと軟膜との間の血清層が、限定ではないが、従来の注射器であり得る、採取チャンバ１２４の中に収集される、または引き込まれるように、チューブ、カテーテル、またはニードル１２２の挿入を介して二次チャンバ１１４の中に単離される。血清１０６は、次いで、採取チャンバ１２４から放出されることができ、同一のチャンバ１２４は、脂肪ＬＳ１０８および／または軟膜１０４を収集するために使用されることができる、または第４のチャンバが、脂肪ＬＳまたは軟膜収集のために使用されることができる。図３および４に示されるように、密度調整された浮動式要素１２６が、効率的な採取のために、脂肪ＬＳ（または、密度調整された浮動式要素１２６の密度に応じて、他の層）を二次チャンバ１１４内に収集させるように使用されてもよい。密度調整された浮動式要素１２６の使用は、下記により詳細に説明される。
【００２０】
図３の実施形態に関して、第１の遠心分離実行が、上記に説明されるような骨髄吸引液を分画するために実施されることができる。次いで、図３Ａに示されるように、第２の遠心分離実行（遠心分離チューブ１１０への密度調整された浮動式要素１２６の添加とともに、または伴わず、実施される）が、軟膜層１０４、血清層１０６、および脂肪ＬＳ１０８を二次チャンバ１１４内に分離してもよい。図３Ｂに示されるように、脂肪ＬＳ１０８と軟膜層１０４との間に位置付けられる血清層１０６は、採取チャンバ１２４の中で採取されてもよい。このステップは、図３Ｃに示されるような貴重な脂肪ＬＳ１０８および軟膜層１０４の採取が後に続いてもよい。
【００２１】
代替デバイス実施形態では、図５に示されるように、上記に説明されるような最初の遠心分離実行の後に、遠心分離チューブ１２８は、遠心分離チューブ１２８から脂肪ＬＳ１０８を収集するために、正確な深度に挿入されたチューブ１３２を支持する新規キャップ１３０が提供される。したがって、脂肪ＬＳ１０８は、採取チャンバ１２４の中に採取され得る。ルアーロックによって遠心分離チャンバ１２８に接続される、または別様にチューブ１３２に堅固に取着される、採取チャンバ１２４は、注射器であってもよく、後に治療目的のために脂肪ＬＳ１０８の直接注入のために使用される。チューブ１３２の深度は、ある実施形態では、脂肪ＬＳ１０８回収を最適化するために、正確な深度に手動で、または自動的に調節されてもよい。
【００２２】
さらに別のデバイス実施形態では、図６に示されるように、遠心分離チューブ１３４は、プランジャ１３６（着脱可能であってもよい、またはそうでなくてもよい）が提供される。図６Ａ−６Ｃに示されるように、プランジャが装備される遠心分離チューブ１３４は、チューブ１３４の下端からＲＢＣ画分１０２、軟膜１０４、および血清１０６を放出するために使用されてもよい。これは、脂肪ＬＳ１０８がチャンバ１３４内に留まることを可能にする。ある実施形態では、遠心分離チューブ１３４は、血清とともに、または伴わずに、患者の体内に単離された脂肪ＬＳ１０８の直接臨床注入を提供する、好適にサイズ決定された注射器が実装されてもよい。
【００２３】
図７Ａおよび７Ｂの代替実施形態では、第１のチャンバ１３８が、中心軸の周囲で高速回転することによって、全体骨髄を分画する円板の形態内に提供される。脂肪ＬＳ１０８（最も密度が低い画分である）は、円板の中央部内に収集され、次いで、また、脂肪ＬＳ１０８の直接臨床使用を提供するであろう注射器であり得る、またはあり得ない、第２の収集チャンバ１４０の中に採取されてもよい。ある実施形態では、収集チャンバ１４０は、図７Ｂに示されるような第１のチャンバ１３８に接続されてもよい。そして、開口部またはゲートが、脂肪ＬＳ１０８が、分画プロセスの間、チャンバ１４０の中に押勢される、放出される、または別様に採取され得るように、チャンバ１３８とチャンバ１４０との間に提供されてもよい。図８に例証される、類似する実施形態が、脂肪ＬＳ１０８がくぼみの中心に単離される流体メニスカスの付加的産出を伴い、上記に説明されるような分画パターンをもたらすその垂直軸を中心に回転する、第１の垂直分離チューブ１４２を含む。脂肪ＬＳは、次いで、上記に説明される方法のいずれかを使用して、単離され、採取されてもよい。
【００２４】
図９−１０は、上記に説明されるある実施形態との併用のために好適である遠心分離チューブの代替タイプを例証する。例えば、図９Ａの遠心分離チューブは、下部１４８に対して直径が限定される上部１４６を含む、特殊なチューブ状のチャンバ１４４として実装される。この構成は、上部脂肪ＬＳ層１０８が、より容易な手動または自動除去のための分画の後に、伸長されることを可能にする。このシステムは、脂肪ＬＳ１０８の直接治療用使用を提供する閉鎖システムの一部であってもよい、または、いったん単離されると、脂肪ＬＳ１０８が治療用使用の前の処理のためのものである、開放システムの一部であってもよい。
【００２５】
さらに別の遠心分離チューブ実施形態（図９Ｂ）では、分画の後に、円板１２６が、脂肪ＬＳ１０８の真下に、かつ血清１０６の上方に浮動させる、選択された比重を有する、特別加工の密度調整された浮動式円板１２６が、提供され、脂肪ＬＳ１０８のより容易な手動または自動除去を可能にする。図１０に例証される類似する実施形態では、２つのチャンバの遠心分離チューブ１１０が、比重または密度調整された円板１２６を利用し、円板１２６が血清層１０６の真上に、かつ脂肪ＬＳ１０８の下方に浮動した後に、遠心分離チューブ１１０の主要チャンバ１１２の側壁に添着されることができる、止め具として作用する。脂肪ＬＳ１０８は、次いで、単離のために二次チャンバ１１４の中に手動で、または自動的に傾瀉されることができる。
【００２６】
図１１に例証される代替デバイス実施形態では、遠心分離チューブは、下部プランジャ１５６を伴う上部テーパ状チューブ１５４として実装される。上部テーパ状チューブ１５４は、採取チャンバ１２４に、直接またはチューブ１５８を介して取着される。チューブ１５４の上部テーパ状部１６０は、脂肪ＬＳ１０８を下部プランジャ１５６を介して伸長させ、かつ選択的に押動させる、または単離のために採取チャンバ１２４の中への吸引を通して採取させる。各チューブまたはチャンバ１５４および１２４は、ある実施形態では、脂肪ＬＳ１０８の直接閉ループ臨床使用を提供する、注射器として実装されてもよい。
【００２７】
図１２に例証される代替デバイス実施形態では、遠心分離チューブ１１０は、上端部上にキャップ１３０と、キャップ１３０の上端部またはその近傍に位置付けられる高親油性多孔質膜１６８とが実装される。使用時、ポートおよび採取チューブ１７０が、採取チャンバに接続され、可能性として、脂肪ＬＳ１０８が多孔質高親油性膜１６８に対向する分画された溶液から外へ持ち上げられ得るように、注射器または真空ラインとして実装されてもよい。
【００２８】
随意に、図１３に示されるように、生理食塩水１７２または別の生物学的不活性流体が、遠心分離チューブ１１０を浮動させ、親油性膜１６８に接触する脂肪ＬＳ１０８を持ち上げるために、脂肪ＬＳ１０８に添加されてもよい。次いで、図１４に示されるように、親油性膜１６８は、次いで、脂肪ＬＳ１０８が、脂肪ＬＳ１０８の直接臨床使用を提供する注射器が実装され得る、採取チャンバ１２４の中への採取によって収集され得る、脂肪ＬＳ１０８を空チューブ１１０の中に変位させるために洗浄されることができる。
【００２９】
図１５に例証される別のデバイス実施形態では、脂肪ＬＳ１０８（随意に、フィブリノゲンが豊富な血清１０６とわずかに混ぜられることができる）は、トロンビン、ＣａＣｌ２、または別の凝固剤１７４の添加を介して重合される。次いで、重合された脂肪ＬＳ１７６は、血清層の上部から手動または自動的のいずれかで除去される、または採取チャンバ１２４の中にチューブを通して採取される。
【００３０】
図１６に例証されるさらに別のデバイス実施形態では、遠心分離チューブ１１０は、注射器が実装され得る、採取チャンバ１２４に接続するニードル１２２または他の導管に取着される、またはそれによって穿孔されることができる、側面ポート１７８または複数の側面ポートが提供される。側面ポート１７８または複数の側面ポートは、脂肪ＬＳが分画の後に単離のために採取チャンバ１２４の中に採取されることができるように、脂肪ＬＳ１０８境界に、またはその真下に位置する。
【００３１】
上記に説明される実施形態のいずれかでは、本デバイスはまた、幹細胞および他の細胞成分が脂肪組織内に存在する微細なコラーゲン基質から分離されるように、単離された脂肪ＬＳが、処理されることを可能にする、一体型または別個の乳化システムを含有してもよい。乳化は、機械的または化学的手段によって達成され得る。例えば、図１７Ａに示されるように、乳化システム１８０が、デバイスと関連付けられる１つ以上の付加的チャンバとして提供されてもよい、または患者に臨床使用を提供する注射器等の別個の装置内に位置してもよい。一代表的であるが非限定的実施形態では、乳化システム１０８は、乳化処理を達成するために、２つ以上のチャンバ、あるいは単一のチャンバを使用してもよい。例えば、乳化は、脂肪ＬＳ１０８が、第１の乳化チャンバ１８４と第２の乳化チャンバ１８６との間の小さな開口１８２を通して押勢されるにつれて生じ得る。脂肪ＬＳ１０８は、乳化の所望の程度を達成するために、開口１８２を通して、繰り返して押勢されてもよい。
【００３２】
代替として、図１７Ｂおよび図１７Ｃに示されるように、微細な乳化格子１８８が、１つのチャンバ内に位置し、単離された脂肪ＬＳ１０８を通して物理的に通過されてもよい（図１７Ｂ）。代替として、脂肪ＬＳ組織は、乳化格子１８８を通して１つのチャンバから別のものへ通過されてもよい。代替として、格子は、単一チャンバの一部分から同一のチャンバの別の部分までを通過する脂肪ＬＳ１０８で固定されてもよい。
【００３３】
代替デバイス実施形態では、脂肪ＬＳは、脂肪ＬＳ１０８のコラーゲン基質から細胞を解離するために、コラゲナーゼまたはレシチン等の消化剤を用いて、上記に説明されるチャンバまたはデバイス外容器のうちのいずれか１つの中で処理されることができる。他の実施形態では、脂肪ＬＳは、細胞成分を解離するために、音響エネルギーまたは振動を使用して、処理されることができる。
【００３４】
他の代替デバイス実施形態では、解離された細胞に加えて、残りの脂肪ＬＳ構造上の組織（コラーゲンおよび油）はさらに、細胞ペレットを単離するために、遠心分離されることができ、これは、次いで、洗浄されることができる。このペレットは、次いで、臨床使用のために、単離された骨髄血清、血小板、ＲＢＣ、軟膜、間充織幹細胞、他の成人の幹細胞、あるいは有核細胞混合物および／または単離される有核細胞タイプに添加されることができる。
【００３５】
本明細書に開示される代替実施形態は、骨髄吸引液を処理する方法、および／あるいは動物またはヒト患者の体内に間充織幹細胞を収集する、調製する、または再導入する方法を含む。本方法の実施形態は、骨髄吸引液を収集することと、少なくとも脂肪層上清１０８の形成をもたらすために骨髄吸引液を分画することとを含む。脂肪層上清は、次いで、上記に説明されるデバイスのうちの１つ以上、または脂肪層上清を単離するために好適な類似するデバイスを利用して、単離されてもよい。例えば、上記に説明される技術または他の好適な技術によって、骨髄吸引液は、分画をもたらすように遠心分離され、脂肪層上清は、採取または傾瀉されてもよい。
【００３６】
本方法はさらに、脂肪層を処理し、ＭＳＣを収集することを含んでもよい。例えば、脂肪層は、乳化される、機械的に乳化される、化学的に消化される、重合される、音響または振動エネルギーに曝される、遠心分離される、あるいは別様に脂肪層組織または流体からＭＳＣの抽出または収集を補助するために処置されてもよい。
【００３７】
収集に応じて、脂肪層上清１０８またはそこから収集されたＭＳＣは、治療目標を達成するために、動物またはヒト患者の体内に再導入されてもよい。ある実施形態では、骨髄は、採取されてもよく、収集された脂肪層上清１０８およびＭＳＣが、単一の閉ループ治療セッションにおいて、そこから抽出され、患者の体内に再導入されてもよい。代替として、ＭＳＣまたは脂肪層上清は、後続の使用のために、収集かつ貯蔵される、または処理されてもよい。例えば、本明細書に説明されるような収集かつ単離されたＭＳＣは、治療目的のために、患者の体内への再導入に先立って、培養下で拡張されてもよい。
【００３８】
（実施例）
以下の実施例は、例証目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。上記に留意されるように、出願者は、同様に取得された軟膜組織から収集されたＭＳＣの量と比較したとき、骨髄から導出の脂肪組織から驚くほど大量のＭＳＣを収集することが可能であった。予備実験調査の結果は、下記に説明され、図１８−２３に図的に表される。
【００３９】
（実施例１）
１０ｃｃの骨髄吸引液が、数名の患者から採取された。２００ｘ  ｇの滅菌円錐形チューブ内の全体骨髄吸引液の短い遠心分離ステップに続いて、浮揚性脂肪層は、骨髄吸引液血清の一部とともに、血清学用ピペットを介して、手動で収集された。この骨髄画分の最初の播種では、天然脂質層内の細胞残屑および「油性」物質から成る「汚染」培養物が、観察された。これらの成分は、後の培地変更において除去することが困難であった。さらに、脂質懸濁液を含有する培地の後続の再播種が、ＭＳＣであると考えられる細胞内の多数の線維芽細胞状の形態の確立をもたらした。これは、最初の播種が、準最適であり、潜在的に、標的細胞を廃棄することをもたらし、再播種されない場合、それによって、付加的資源および時間を消費することを示した。
【００４０】
（実施例２）
１０ｃｃの骨髄吸引液が、７名の患者から採取された。脂肪血漿溶液は、関連付けられたＭＳＣから脂肪細胞を解離するために、数回、小ゲージ乳化剤を通して通過された。この調製は、細胞集計、流動サイトメトリ分析、および細胞増殖のためのインビトロ播種のために使用された。
【００４１】
乳化は、脂質層基質を歪曲し、最初の播種効率性を増加させる試みとして採用された。乳化および播種は、同一の脂質サンプルから導出された乳化されないものと比較して、接着細胞の明白な増加をもたらした（実施例１参照）。加えて、培養２日後の上清の再播種は、適切な形態の細胞の確立をもたらさず、最初の培養物は、天然層内の説明される特徴を容易に洗浄した。したがって、乳化を介した脂質層の機械的中断は、潜在的に、疑わしいＭＳＣを環境に暴露し、接着を可能にすることによって、脂質層の最初のインビトロ播種のために最適であると考えられる。
【００４２】
幹細胞マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のために陽性に染料された、細胞の数およびパーセンテージの非常に有意な差異が、軟膜からの単離を脂肪層と比較するとき、観察された。例えば、図１８は、７人の患者に関する手動細胞集計数の結果を例証し、軟膜層（棒グラフ２０２）と比較した、脂肪層内のより少ない単核細胞集計数（ＭＮＣ）（棒グラフ２００）を示す。しかしながら、図１９に示されるように、汚染細胞背景と比較したとき、乳化の後の脂肪層は、合計細胞集合の約５％を占めるＭＳＣを実証した（棒グラフ２０４）。対照的に、軟膜は、フローサイトメトリ分析によって判定されるようなわずか０．０１−０．００１％ＭＳＣを含む（棒グラフ２０６）。
【００４３】
さらに、図２０に示されるように、軟膜から取得された全ＭＳＣ集計数（棒グラフ２０８）は、骨髄の１０ｃｃあたりの約５０−３００細胞に及んだ一方、上記に説明されるように、収集かつ処理された脂肪層から取得された全ＭＳＣ集計数（棒グラフ２１０）は、骨髄の１０ｃｃあたり約５００−４０００細胞に及ぶことが判定された。
【００４４】
したがって、骨髄の軟膜層内の非ＭＳＣ「汚染細胞」の数は、脂肪層内のものよりも有意により高く、軟膜内のＭＳＣのパーセンテージは、典型的には、範囲が３％−１５％の間にあると考えられる脂肪層と比較して、０．０１−０．００１％に及ぶ。図１９および図２０に表されるデータに基づいて、脂肪層内のＭＳＣの数は、それぞれの領域内に存在するＭＳＣのパーセンテージの大きな差異に起因して、軟膜層のものを優に超えると考えられる。
【００４５】
図２１−２３に示されるように、インビトロ研究は、ＭＳＣの上昇レベルが、本明細書に説明されるデバイスおよび方法対軟膜導出ＭＳＣの比較可能なレベルを用いて、骨髄吸引液を処理した後に、骨髄脂肪層から取得されることができることを確認する。図２１は、骨髄から導出される脂肪組織の１０ｃｃからのＭＳＣ拡張エキソビボの数（棒グラフ２１２）対骨髄から導出される軟膜層の１０ｃｃからのＭＳＣ拡張エキソビボの数（棒グラフ２１４）を描写する。このデータは、図１９および２０の前述のフローサイトメトリデータを支持し、有意により多い数のＭＳＣが、説明される方法を使用して、軟膜層と比較した脂肪層から拡張されたことが明確である。
【００４６】
加えて、図２２は、より大きい血管へのさらなる継代培養のための適切な細胞密度に到達するために、各層からのＭＳＣに必要である時間を例証する。概して、出願者は、脂肪層から導出されるＭＳＣ内のこの重大な密度（７０％集密度）に到達するために必要とされる日数（棒グラフ２１６）が、軟膜のものよりも有意により少ない（棒グラフ２１８）ことを観察し、脂肪層内の既存のＭＳＣの数が、軟膜よりもよりも多いことを示した。
【００４７】
図２３に示されるように、付加的継代培養は、脂肪から導出されるＭＳＣ（棒グラフ２２０）もまた、同一の細胞密度で（棒グラフ２２２）播種された軟膜から導出されるＭＳＣと比較したとき、分割率の増加から結果として生じるより少ない倍加時間を特徴とすることを明らかにした。これは、固有の分割率が、脂肪から導出されるＭＳＣと軟膜から導出されるＭＳＣとの間で異なることを示し、脂肪から導出されるＭＳＣからの治療の利点を示唆する。
【００４８】
（実施例３）
骨髄吸引液サンプルは、乳化の効果を調査するために、３人の患者から採取され、等しい体積のサブサンプルに分割された。各患者からの１個のサブサンプルが、本明細書に説明されるように、乳化された。第２のサブサンプルは、乳化されなかった。細胞は、６日間、Ｔ−２５フラスコ内に播種され、１０％ＦＢＳ／９０％ＤＭＥＭ成長培地下で増大された。図２４−２５に示されるように、患者毎に、乳化培養物（棒グラフ２２４）からの細胞は、増殖を開始し、非乳化培養物から増大された細胞と比較したとき、急速により高速増殖する。加えて、乳化サンプルから調製された細胞培養物は、継代培養に伴って、残屑の、より清潔に、かつより容易に浄化されたものが観察された。したがって、非乳化サンプルは、より長い期間、「汚染」して現れた。
【００４９】
本開示の種々の実施形態はまた、各従属請求項が前述の独立請求項ならびに従属請求項のそれぞれの限定を組み込む複数の従属請求項のように、請求項に列挙される種々の要素の順列を含み得る。そのような順列は、本開示の範囲内で明示的である。
【００５０】
開示される実施形態は、特に、実施形態の番号を参照して、示されかつ説明されているが、形態および詳細の変更が、本開示の実施形態の精神および範囲から逸脱せずに、本明細書に開示される種々の実施形態に行われ得、本明細書に開示される種々の実施形態が、請求項の範囲に限定として作用することを意図しないことが当業者によって理解されるであろう。本明細書に引用される全ての参照が、参照することによって全体として組み込まれる。
【００５１】
種々の実施形態の説明は、例証および説明の目的のために提示されているが、開示される形態に対して、網羅的である、または実施形態の限定を意図されない。本開示の範囲は、以下の請求項の範囲によってのみ限定される。多くの修正および変形例が、当業者に明白であろう。図に説明かつ示される本実施形態は、本開示の実施形態の原理、実践的な用途、および当業者に、想定される特定の使用に適した種々の修正を用いて、種々の実施形態を理解することを可能にすることを最良に説明するために選ばれ、かつ説明される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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