(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子を含む、磁気共鳴画像法又は磁気共鳴血管撮影のためのT1造影剤であって、
該ナノ粒子の無機コアが、2.5〜4nmのサイズを有し、
該ナノ粒子が、5nm未満の流体力学的直径を有し、かつ
該ナノ粒子が、超常磁性である、
前記T1造影剤。
【請求項２】
前記無機コアが、2.5〜3.5nmのサイズを有する、請求項1記載のT1造影剤。
【請求項３】
前記ナノ粒子の表面が、双性イオンドーパミンスルフォネートリガンドを含む、請求項1記載のT1造影剤。
【請求項４】
前記ナノ粒子の表面が、DSリガンドを含む、請求項1記載のT1造影剤。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、酸化鉄を含む、請求項1記載のT1造影剤。
【請求項６】
磁気共鳴画像法又は磁気共鳴血管撮影のための方法であって、
ナノ粒子を含むT1造影剤が導入された対象の画像信号を生成することであって、該ナノ粒子が、2.5〜4nmの無機コアを有し、5nm未満の流体力学的直径を有し、かつ超常磁性である、前記生成することを含む、前記方法。
【請求項７】
前記無機コアが、2.5〜3.5nmのサイズを有する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ粒子の表面が、双性イオンドーパミンスルフォネートリガンドを含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ粒子の表面が、DSリガンドを含む、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、酸化鉄を含む、請求項6記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張）
本出願は、2014年9月15日に出願された米国仮特許出願第62/050,477号の優先権を主張し、その全体が、引用により組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府による支援）
本発明は、アメリカ国立衛生研究所からの助成金番号R01 CA126642及びU54 CA151884、アメリカ国立科学財団からの助成金番号CHE−0714189、及びアメリカ陸軍研究事務所からの契約番号W911NF−13−D−0001の下で、政府支援を得てなされたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、画像法用途のためのナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００４】
(背景)
ナノメートルサイズの粒子は、多くの場合、その粒子のバルク対応物では達成し得ない興味深い電気的、光学的、磁気的、及び化学的性質を示す。磁性ナノ粒子は、磁気メモリーデバイス、強磁性流体、冷凍システム、医用画像法、薬物ターゲティング、及び触媒作用に用途を見出し得る。磁性酸化物ナノ粒子は、マイクロエマルション及び他の方法を用いて合成し得る。
【発明の概要】
【０００５】
(概要)
一態様において、被覆ナノ粒子を製造する方法は、酸を含む溶媒中で化合物を分解して、ナノ粒子を生成させること、該ナノ粒子を試薬を用いて酸化して、酸化ナノ粒子を生成させること、及び該酸化ナノ粒子を双性イオンリガンドで被覆して、該被覆ナノ粒子を生成させること、を含み得る。
【０００６】
ある実施態様において、前記被覆ナノ粒子は、磁性を有し得る。
【０００７】
ある実施態様において、前記酸は、オレイン酸を含み得る。前記酸は、ステアリン酸を含み得る。前記溶媒は、1−ヘキサデセン、1−オクタデセン、1−エイコセン、1−ドコセン、もしくは1−テトラコサン、又はそれらの混合物を含み得る。
【０００８】
ある実施態様において、前記化合物は、オレイン酸鉄を含み得る。前記被覆ナノ粒子は、酸化鉄を含み得る。前記試薬は、アルキルアミンオキシドを含み得る。前記被覆ナノ粒子の流体力学的直径は、5nm〜10nmであり得る。サイズは、前記ナノ粒子の直径である。
【０００９】
ある実施態様において、前記被覆ナノ粒子は、2.5nm〜3nmのサイズを有し得る。前記被覆ナノ粒子の無機コアは、2.5nm〜7nmのサイズを有し得る。前記被覆ナノ粒子は、5nm未満の流体力学的直径を有し得る。
【００１０】
ある実施態様において、前記双性イオンリガンドは、双性イオンドーパミンスルフォネートリガンドを含み得る。前記双性イオンリガンドは、ドーパミンスルフォネートリガンドに切り替え得る。
【００１１】
別の態様において、磁気共鳴画像法又は磁気共鳴血管撮影のためのT1造影剤は、ナノ粒子を含み得、ここで、該ナノ粒子の無機コアは、2.5〜4nmのサイズを有し得、該ナノ粒子は、5nm未満の流体力学的直径を有し得、かつ該ナノ粒子は、磁性を有し得る。
【００１２】
ある実施態様において、前記無機コアは、2.5〜3.5nmのサイズを有し得る。前記ナノ粒子の表面は、双性イオンドーパミンスルフォネートリガンドを含み得る。前記ナノ粒子の表面は、ドーパミンスルフォネート(「DS」)リガンドを含み得る。前記ナノ粒子は、酸化鉄を含み得る。
【００１３】
別の態様において、磁気共鳴画像法又は磁気共鳴血管撮影のための方法は、その無機コアが2.5〜4nmのサイズを有し、5nm未満の流体力学的直径を有し、かつ磁性を有するナノ粒子を含むT1造影剤を、対象に導入すること;及び該対象の画像信号を生成すること、を含み得る。ある実施態様において、前記ナノ粒子の前記無機コアは、2.5〜3.5nmのサイズを有し得る。前記ナノ粒子の表面は、双性イオンドーパミンスルフォネートリガンドを含み得る。前記ナノ粒子の表面は、DSリガンドを含み得る。前記ナノ粒子は、酸化鉄を含み得る。
【００１４】
他の態様、実施態様、及び特徴が、以下の明細書、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1(A)は、一連のサイズの単分散酸化鉄ナノ粒子(「NP」)の合成経路を示し;図1(B)〜1(E)は、それぞれ、7.0、5.5、3.0、及び2.5nmの無機コア直径を有する酸化鉄NPのHR TEM画像を示す。
【図２】図2は、一連の酸化鉄NPのr1及び r2緩和度測定値を示す。
【図３】図3は、マウスにおけるインビボでの酸化鉄NPの腎クリアランスを示すマウスの尿である。
【図４】図4は、マウス及びラットにおけるインビボでのT1強調MRIを示す。
【図５】図5は、ES−SPIONが、Magnevistと比較して有意に長い血中半減期及びMRIコントラスト向上を示すことを示す。
【図６】図6は、ES−SPIONが、臨床的磁場強度(1.5T)でのT1強調磁気共鳴血管撮影のための強力な造影剤であることを示す。
【図７】図7は、T1強調MR画像法を用いて、ES−SPIONが、進行脳腫瘍(U87神経膠腫モデルマウスにおけるもの)内へ漏出することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
(詳細な説明)
磁気共鳴画像法(MRI)は、1980年代に開発されて以来、臨床画像法及び診断において重要な役割を果たしてきており、最近では、生体医学研究ドメインにおいて優れたツールとして役立てられている。例えば、その全体が、引用により組み込まれているGore, J. C.らの文献(Magnetic Resonance Imaging  2011, 29, 587)を参照されたい。30年間の急速かつ着実な進歩の後で、今日においては、T1及びT2強調MRI技術が、高い空間分解能、かなりの組織及び細胞コントラスト、生動物における器官(例えば脳)の機能のイン・サイチュ可視化、並びに三次元的かつ非侵襲的な検出能力という利点を有している。例えば、それぞれその全体が引用により組み込まれている、Na, H. B.; Song, I. C.; Hyeon, T.の文献(Adv. Mater. 2009, 21, 2133−2148);Zhu, D. R.; Liu, F. Y.; Ma, L. N.; Liu, D. J.; Wang, Z. X.の文献(International Journal of Molecular Sciences 2013, 14, 10591)を参照されたい。より最近では、このT1強調MRI研究及び応用は、T1造影剤が、ブリーディングを免れ得る明るいシグナルを示すという理由、又は金属付着及びT1強調MRIが、一般に、T2強調MRIにおいて呼吸又は空気/組織境界によって引き起こされるアーティファクトを減少させることにより、より高い空間分解能を示すという理由で、非常に有望となっている。例えば、その全体が、引用により組み込まれているKim, B. H.; Lee, N.; Kim, H.; An, K.; Park, Y. I.; Choi, Y.; Shin, K.; Lee, Y.; Kwon, S. G.; Na, H. B.; Park, J. G.; Ahn, T. Y.; Kim, Y. W.; Moon, W. K.; Choi, S. H.; Hyeon, T.の文献（Journal of the American Chemical Society  2011, 133, 12624)を参照されたい。水のプロトン緩和時間を変更させることにより、MRIのコントラストを向上させる造影剤の使用は、高コントラストのT1強調MR画像の取得に不可欠である。例えば、その全体が、引用により組み込まれている、Harisinghani, M. G.; Barentsz, J.; Hahn, P. F.; Deserno, W. M.; Tabatabaei, S.; van de Kaa, C. H.; de la Rosette, J.; Weissleder, R.の文献(New England Journal of Medicine  2003, 348, 2491)を参照されたい。
【００１７】
r2/r1比は、造影剤の評価において重要な値である。すなわち、低い(高い)r2/r1比は、良好なT1(T2)強調MR画像をもたらす。r2は、飽和磁化(「Ms」)及び流体力学的直径(「HD」)の増加とともに増大し得る。故に、高品質のT1強調MRIのために低いr2/r1比を達成するには、磁性コアは、低いMsを確保するために小さい必要があり、かつシェルを被覆するリガンドは、小さいr2のためには、薄いものである必要がある。疎水性及び親水性のGd系キレート及び酸化ガドリニウムナノ粒子は、診療所においてT1造影剤として用い得るとともに、これらの高いr1及び低いr2(すなわち、低いr2/r1比)のために、高いT1コントラストを有し得る。しかしながら、最近、Gd系化合物が、高齢の成人及び腎機能が不十分な患者に対する長期的かつ重篤な毒性を示した。例えば、それぞれその全体が引用により組み込まれる、Bruns, O. T.らの文献(Nature Nanotechnology  2009, 4, 193);Penfield, J. G.らの文献(Nat. Clin. Pract. Nephrol. 2007, 3, 654)を参照されたい。これらの症例において、ガドリニウムは、腎性全身性線維症と関連付けられている。例えば、その全体が、引用により組み込まれている、Bennett, Charles L.;らの文献(Clin Kidney J  2012, 5, 82 82)を参照されたい。また、このガドリニウムの高い毒性は、それを、造影剤が人体に延長された期間残存するインビボでの特異的ターゲティングに用いることを不可能とする。r2/r1比及び毒性が無いことに加えて、腎クリアランスもまた、臨床的使用において造影剤の利益となり得る重要な性質である。造影剤の腎クリアランスは、迅速な尿中排泄を可能とし得るために、造影剤への人体の曝露の最小化及び非特異的造影剤としてのより効率的なインビボでの特異的ターゲティングを可能とすることがクリアされる。
【００１８】
NPは、水性の生体液において高いコロイド安定性を与えて凝集を回避する適切なリガンドと交換し得る疎水性リガンドで被覆し得る。ナノ粒子の流体力学的直径は、動的な水和された/溶媒和された粒子の見かけのサイズとして定義し得、かつ生物学的防衛システム及び血管障壁を効果的に乗り越えるための能力と高度に関連付けることが可能である。例えば、大きな流体力学的直径(例えば、>100nm)を有するNPは、食細胞により取り込まれ得る。より小さなNP(例えば、1〜30nm)は、食細胞から逃れて血管を移動し得る。小さいサイズのNPは、癌性組織近傍の血管のより大きな開窓を容易に通過できるために、標的組織における向上した透過及び滞留効果を有し得る。
【００１９】
超常磁性酸化鉄ナノ粒子(SPION)は、そのサイズが、数ナノメートルから数十ナノメートルである単一ドメイン磁性酸化鉄粒子である。例えば、それぞれその全体が、引用により組み込まれている、Harisinghani, M. G.; Barentsz, J.; Hahn, P. F.; Deserno, W. M.; Tabatabaei, S.; van de Kaa, C. H.; de la Rosette, J.; Weissleder, R.の文献(New Engl. J. Med. 2003, 348, 2491); Hyeon, T.; Lee, S. S.; Park, J.; Chung, Y.; Bin Na, H.の文献(J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12798); Jun, Y. W.; Lee, J. H.; Cheon, J.の文献(Angewandte Chemie−International Edition  2008, 47, 5122)を参照されたい。酸化鉄磁性ナノ粒子(例えば、マグネタイト及びマグヘマイト)は、合成における単分散性、有機溶媒及び水性媒体に対する優れた安定性、高い飽和磁気モーメント、及び生動物に対する明確な無毒性により知られている。例えば、その全体が、引用により組み込まれているLatham A. H.; Williams, M. E.の文献(Accounts of Chemical Research  2008, 41, 411)を参照されたい。その結果、酸化鉄ナノ粒子系のFeridex（商標）及びResovist（商標）は、双方とも、臨床的に承認された商業的に入手可能なT2造影剤であり、Feraheme（商標）は、臨床的に承認された商業的に入手可能な鉄サプリメントである。従って、依然として、酸化鉄ナノ粒子系T1造影剤の開発の必要性がある。3nmの無機コア直径及び15nmのHDを有し、かつ3Tでr2/r1=6.1であるポリエチレングリコール(PEG)により被覆された酸化鉄ナノ粒子を製造し得る。更に、4nmの無機コア直径及び7nmのHDを有し、かつ1.5Tでr2/r1=2.1であるクエン酸塩により被覆された超常磁性酸化鉄ナノ粒子(VSOP)を製造し得る。例えば、その全体が、引用により組み込まれているSchnorr, J.らの文献(Cardiac Magnetic Resonance  2012, 184, 105 105)を参照されたい。しかしながら、これらの酸化鉄ナノ粒子は、ナノ粒子が腎臓で除去される閾値である5.5nmを超えるHDを有している。例えば、その全体が、引用により組み込まれているChoi, H. S.; Liu, W.; Misra, P.; Tanaka, E.; Zimmer, J. P.; Kandapallil, B.; Bawendi, M. G.; Frangioni, J. V.の文献(Nature Biotechnology  2007, 25, 1165)を参照されたい。
【００２０】
酸化鉄は、ガドリニウム系又はマンガン系材料よりも生体適合性が高い。これは、これらの鉄の種が、ヒトの血液に豊富に存在するためである。理想的なT1造影剤は、高いr1値及び低いr2/r1比を有することで、T1コントラスト効果を最大化するべきである。5つの不対電子を有する第二鉄(Fe3+)イオンは、r1値を増加させるものの、固有の高い磁気モーメント由来の酸化鉄ナノ粒子の高いr2が、それらのT1造影剤としての利用のための妨げとなる。この問題は、磁性ナノ粒子のサイズを減少させることにより解決し得る。磁性ナノ粒子の磁気モーメントは、サイズが減少するにつれて急速に減少する。この小サイズの酸化鉄ナノ粒子は、T1造影剤として用い得る。磁気共鳴画像法用のT1造影剤は、その無機コアが2〜4nmのサイズを有し、5nm未満の流体力学的直径を有し、かつ磁性を有するナノ粒子を含み得る。
【００２１】
3nmという極小の無機直径及び5nmのHDを有する酸化鉄ナノ粒子を製造可能であり、これにより高T1造影剤としてのより低いr2/r1値及び腎クリアランス特性が付与される。
【００２２】
被覆ナノ粒子を製造する方法は、酸を含む溶媒中で化合物を分解して、ナノ粒子を生成させること、該ナノ粒子を試薬を用いて酸化して、酸化ナノ粒子を生成させること、及び該酸化ナノ粒子を双性イオンリガンドで被覆して、該被覆ナノ粒子を生成させること、を含み得る。前記被覆ナノ粒子は、酸化鉄を含み得る。前記試薬は、トリメチルアミンN−オキシドなどのアルキルアミンオキシドを含み得る。
【００２３】
ナノ粒子を製造する方法は、溶媒中で、290℃〜390℃の温度で、化合物を分解すること、酸を該溶媒に添加して、反応混合物を形成させること、該反応混合物の温度を、該反応混合物の沸点まで上昇させること、及び該反応混合物を、該沸点で60〜120分間加熱して、該ナノ粒子を生成させることを含み得る。
【００２４】
無機ナノ粒子用の小さい双性イオンリガンドは、小さいHD、低いレベルの非特異的相互作用、並びに時間、pH、及び塩分に関する安定性を有する生体適合性ナノ粒子を提供し得る。一般に、ナノ粒子用のリガンドは、前記ナノ粒子の表面に対する親和性を有する部位;1以上のリンカー部位;及び水溶液中、少なくともいくつかの条件下(例えば、少なくともいくつかのpH値)にある場合、逆の電荷を帯びる、電荷を帯びた又はイオン化可能な2つ以上の基を含み得る。いくつかの実施態様において、前記逆の電荷は、永久電荷である。言い換えれば、前記リガンドは、前記ナノ粒子に結合し得るとともに、双性イオンの性質を有し得る。好ましくは、前記リガンドは、リガンドが結合した無機ナノ粒子のHDが、該ナノ粒子の無機部分の直径を超えてそれほど増加しない程度に小さくすることができる。場合によっては、前記リガンドは、1,000Da以下、500Da以下、400Da以下、300Da以下、又は200Da以下の分子量を有し得る。
【００２５】
双性イオンリガンドは、第1の電荷を帯びた又はイオン化可能な基を含み得る。双性イオンリガンドは、第2の電荷を帯びた又はイオン化可能な基を含み得る。水溶液中で、少なくともいくつかの条件下(例えば、少なくともいくつかのpH値)にある場合、前記第1及び第2の電荷を帯びた又はイオン化可能な基は、逆の電荷を帯びることができ、それにより双性イオンの性質が付与される。双性イオンリガンドに正電荷を提供するのに適した基は、アミン、例えば、一級アミン、二級アミン、三級又は四級アミンを含み得る。負電荷を提供するのに適した基は、アルコール、チオール、カルボキシレート、ホスフェート、ホスホネート、スルフェート、又はスルホネートを含み得る。いくつかの実施態様において、前記基は、−NR2−、−NR2R3−(すなわち、四級アミン)、又はそのイオン化形態を含み得る。いくつかの実施態様において、前記基は、−OH、−SH、−CO2H、−OPO3H2、−PO3H、−OSO3H、−SO3H、又はそのイオン化形態を含み得る。
【００２６】
双性イオンリガンドは、アルキレン基;アルケニレン基;アルキニレン基;シクロアルキレン基;シクロアルケニレン基;ヘテロシクロアルキレン基;アリーレン基;又はヘテロアリーレン基を含み得る。双性イオンリガンドは、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール基を含み得る。双性イオンリガンドは、−C(O)−、−C(O)NRc−、−O−、−OC(O)−、−OC(O)O−、−OC(O)NRc−、−NRc−、−NRcC(O)−、−NRcC(O)O−、−NRcC(O)NRc−、又は−S−のうちの1以上を含み得る。
【００２７】
粒子を製造する方法は、高温の配位性溶媒に注入された試薬、例えば、オレイン酸鉄の熱分解を含む。このことは、個々に分離した核形成を可能とし、巨視的な量のナノ粒子の制御された成長をもたらす。ナノ粒子の製造及び取扱いは、例えば、それぞれその全体が、引用により組み込まれている米国特許第6,322,901号及び第6,576,291号、並びに米国特許出願第60/550,314号に記載されている。ナノ粒子を生産する方法は、コロイド成長プロセスである。コロイド成長は、Mドナー及びXドナーを、高温の配位性溶媒に素早く注入することにより生じる。この注入により、制御された様式で成長してナノ粒子を形成し得る核が生成される。この反応混合物を、穏やかに加熱して、ナノ粒子を成長させ、かつアニールすることができる。サンプル中の前記ナノ粒子の平均サイズとサイズ分布の双方は、成長温度に依存する。安定的な成長を維持するために必要となる成長温度は、増加する平均結晶サイズと共に上昇する。前記ナノ粒子は、ナノ粒子の集団の一員である。個々に分離した核形成及び制御された成長の結果として、得られるナノ粒子の集団は、狭い単分散の直径分布を有する。該単分散の直径分布もまた、サイズと称し得る。核形成に続く配位性溶媒中でのナノ粒子の制御された成長及びアニーリングのプロセスもまた、一様な表面誘導体化及び規則的なコア構造をもたらし得る。サイズ分布がシャープになるにつれて、温度を上昇させることで、安定的な成長を維持し得る。より多くのMドナー又はXドナーを加えることにより、成長期間を短縮し得る。
【００２８】
Mドナーは、無機化合物、有機金属化合物、又は元素状金属であり得る。Mは鉄、カドミウム、亜鉛、マグネシウム、水銀、アルミニウム、ガリウム、インジウム、又はタリウムである。Xドナーは、Mドナーと反応して一般式MXを有する材料を形成し得る化合物である。典型的には、Xドナーは、カルコゲニドドナー又はプニクチドドナー、例えば、ホスフィンカルコゲニド、ビス(シリル)カルコゲニド、酸素分子(dioxygen)、アンモニウム塩、又はトリス(シリル)プニクチドであり得る。適当なXドナーとしては、酸素分子、ビス(トリメチルシリル)セレニド((TMS)2Se)、トリアルキルホスフィンセレニド、例えば、(トリ−n−オクチルホスフィン)セレニド(TOPSe)又は(トリ−n−ブチルホスフィン)セレニド(TBPSe)、トリアルキルホスフィンテルリド、例えば、(トリ−n−オクチルホスフィン)テルリド(TOPTe)又はヘキサプロピルリントリアミドテルリド(HPPTTe)、ビス(トリメチルシリル)テルリド((TMS)2Te)、ビス(トリメチルシリル)スルフィド((TMS)2S)、トリアルキルホスフィンスルフィド、例えば、(トリ−n−オクチルホスフィン)スルフィド(TOPS)、アンモニウム塩、例えば、ハロゲン化アンモニウム(例えば、NH4Cl)、トリス(トリメチルシリル)ホスフィド((TMS)3P)、トリス(トリメチルシリル)アルセニド((TMS)3As)、又はトリス(トリメチルシリル)アンチモニド((TMS)3Sb)が挙げられる。ある実施態様において、前記Mドナー及び前記Xドナーは、同一分子内の部位であり得る。
【００２９】
配位性溶媒は、前記ナノ粒子の成長を制御するのに役立ちうる。配位性溶媒は、ドナーローンペアーを有する化合物であり、例えば、成長するナノ粒子の表面へ配位するのに利用可能な孤立電子対を有する。溶媒の配位は、成長するナノ粒子を安定化し得る。典型的な配位性溶媒としては、アルキルホスフィン、アルキルホスフィンオキシド、アルキルホスホン酸、又はアルキルホスフィン酸が挙げられるが、他の配位性溶媒、例えば、ピリジン類、フラン類、及びアミン類もまた、ナノ粒子の製造に適することもある。適当な配位性溶媒の例としては、ピリジン、トリ−n−オクチルホスフィン(TOP)、トリ−n−オクチルホスフィンオキシド(TOPO)、及びトリス−ヒドロキシルプロピルホスフィン(tHPP)が挙げられる。工業品グレードのTOPOを使用し得る。1−ヘキサデセン、1−オクタデセン、1−エイコセン、1−ドコセン、1−テトラコサン、オレイン酸、ステアリン酸、又はそれらの混合物を使用し得る。
【００３０】
反応の成長段階中のサイズ分布は、粒子の吸収線幅をモニターすることにより推定し得る。粒子の吸収スペクトルの変化に応じて反応温度を調節することは、成長の間シャープな粒子サイズ分布を維持することを可能とする。結晶成長の間に、反応物を、核形成溶液(nucleation solution)に添加して、より大きな結晶を成長させ得る。前記ナノ粒子は、50nm未満の直径を有する。ナノ粒子の集団は、1nm〜35nmの範囲の平均直径を有し得る。前記ナノ粒子は、35nmを超える平均直径を有し得る。
【００３１】
前記ナノ粒子は、狭いサイズ分布を有するナノ粒子の集団の一員であり得る。前記ナノ粒子は、球状、棒状、円盤状、又は他の形状であり得る。前記ナノ粒子は、材料のコアを含み得る。前記ナノ粒子は、式MX(式中、Mは、カドミウム、鉄、ガドリニウム、亜鉛、マグネシウム、水銀、アルミニウム、ガリウム、インジウム、タリウム、又はそれらの混合物であり、Xは、酸素、硫黄、セレン、テルル、窒素、リン、ヒ素、アンチモン、又はそれらの混合物である)を有するコアを含み得る。
【００３２】
前記コアは、該コアの表面上にオーバーコーティングを有し得る。該オーバーコーティングは、前記コアの組成とは異なる組成を有する材料であり得る。前記ナノ粒子の表面上の材料のオーバーコートは、I族化合物、IX−VI族化合物、II−VI族化合物、II−V族化合物、III−VI族化合物、III−V族化合物、IV−VI族化合物、I−III−VI族化合物、II−IV−VI族化合物、及びII−IV−V族化合物、例えば、Cu、CoO、MnO、NiO、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdO、CdS、CdSe、CdTe、MgO、MgS、MgSe、MgTe、HgO、HgS、HgSe、HgTe、AlN、AlP、AlAs、AlSb、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb、TlN、TlP、TlAs、TlSb、TlSb、PbS、PbSe、PbTe、又はそれらの混合物を含み得る。オーバーコーティングプロセスは、例えば、米国特許第6,322,901号に記載されている。オーバーコーティングの間に反応混合物の温度を調節すること、及び前記コアの吸収スペクトルをモニターすることにより、高い発光量子効率及び狭いサイズ分布を有するオーバーコートされた材料が得られる。前記オーバーコーティングは、1〜10層の単層の厚さ(between 1 and 10 monolayers thick)であり得る。
【００３３】
粒子サイズ分布は、米国特許第6,322,901号に記載されるように、前記ナノ粒子に対する貧溶媒、例えばメタノール/ブタノールを用いたサイズ選択的沈殿により更に改良し得る。例えば、ナノ粒子は、ヘキサン中の10%ブタノール溶液に分散することができる。メタノールは、乳光が持続するようになるまで、撹拌されたこの溶液に滴加し得る。遠心分離による上清と凝集物との分離により、サンプル中の最大の結晶子に富んだ沈澱物が生成する。この手法を、光吸収スペクトルがそれ以上シャープとならなくなるまで繰り返し得る。サイズ選択的沈殿は、ピリジン/ヘキサン及びクロロホルム/メタノールを含む多様な溶媒/非溶媒対中で実施し得る。サイズ選択されたナノ粒子集団は、平均直径から僅かに15%rmsの偏差、好ましくは10%rms以下の偏差、より好ましくは5%rms以下の偏差を有し得る。
【００３４】
前記ナノ粒子の外表面は、成長プロセスの間に使用された配位性溶媒由来の化合物を含み得る。該表面は、過剰の競争的配位性基(competing coordinating group)へ繰り返し曝露することにより修飾し得る。例えば、キャッピングされたナノ粒子の分散液を、配位性の有機化合物、例えば、ピリジンで処理して、ピリジン、メタノール、及び芳香族中では容易に分散するが、脂肪族溶媒にはもはや分散しない結晶子を生成させ得る。このような表面交換プロセスは、例えば、ホスフィン、チオール、アミン、及びホスフェートを含む、前記ナノ粒子の外表面に配位し得る、又は前記ナノ粒子の外表面と結合し得る任意の化合物を用いて実施し得る。前記ナノ粒子は、該表面に対する親和性を示し、かつ懸濁媒又は分散媒に対する親和性を有する部位で終端している短鎖ポリマーに曝露し得る。このような親和性は、前記懸濁液の安定性を向上させ、かつ前記ナノ粒子の凝集を妨げる。ナノ粒子配位性化合物は、例えば、その全体が、引用により組み込まれている米国特許第6,251,303号に記載されている。
【００３５】
より詳細には、前記配位性リガンドは、以下の式を有し得る:
【化１】
0006471227.tif 000002
(式中、kは、2、3、又は5であり、かつnは、1、2、3、4、又は5である、但しk−nは、ゼロ以上である;Xは、O、S、S=O、SO2、Se、Se=O、N、N=O、P、P=O、As、又はAs=Oである;Y及びLは、それぞれ独立して、アリール、ヘテロアリール、又は少なくとも1つの二重結合、少なくとも1つの三重結合、もしくは少なくとも1つの二重結合及び1つの三重結合を任意に含む線状又は分岐C2−12炭化水素鎖である)。該炭化水素鎖は、1以上のC1−4アルキル、C2−4アルケニル、C2−4アルキニル、C1−4アルコキシ、ヒドロキシル、ハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、C3−5シクロアルキル、3〜5員のヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、C1−4アルキルカルボニルオキシ、C1−4アルキルオキシカルボニル、C1−4アルキルカルボニル、又はホルミルで任意に置換され得る。また、該炭化水素鎖は、−O−、−S−、−N(Ra)−、−N(Ra)−C(O)−O−、−O−C(O)−N(Ra)−、−N(Ra)−C(O)−N(Rb)−、−O−C(O)−O−、−P(Ra)−、又は−P(O)(Ra)−で任意に中断されていてもよい。Ra及びRbは、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシル、又はハロアルキルである。
【００３６】
アリール基は、置換又は無置換の環状芳香族基である。例としては、フェニル、ベンジル、ナフチル、トリル、アントラシル(anthracyl)、ニトロフェニル、又はハロフェニルが挙げられる。ヘテロアリール基は、環内に1以上のヘテロ原子を有するアリール基、例えば、フリル、ピリジル(pyiridyl)、ピロリル、フェナントリルである。
【００３７】
双性イオンドーパミンスルフォネート(ZDS)リガンドに関しては、ドーパミン部位は、酸化鉄表面への強い配位を提供し得るとともに、スルフォネート基は、高い水溶性を与え得る。また、四級アミン基と該スルフォネート基との組合せは、リガンドに、pH安定性を与え、かつタンパク質との非特異的相互作用を最小化する双性イオンの性質を提供し得る。
【００３８】
該ZDSリガンドは、商業的に入手可能なドーパミンから2工程の反応を介して合成し得る:先ず、ドーパミンのスルホン化が、1,3−プロパンスルトンの開環により達成され、それに続きヨードメタンを添加することによりアミノ基がメチル化された(サポーティングインフォメーション)。
【００３９】
ZDS、ドーパミンスルフォネート(DS)、又はZDSとチオール末端カテコール誘導体(TD)との混合物で、前記ナノ粒子、例えば酸化鉄ナノ粒子の表面上の前記リガンドを置き換え得る。
【００４０】
結果として生じる水溶性ZDSリガンド交換ナノ粒子(ZDS−NP)は、溶媒、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で、高いNP濃度で、安定であり得、かつよく分散可能である。加えて、ZDS−NPのHDは、6.0〜8.5のpH範囲にわたるpHに対し非感受性であり得る。このことは、生理学的なpH範囲での良好なコロイド安定性を示している。
【００４１】
負に帯電したDS−NPは、血清タンパク質に対する高い非特異的親和性を有し得る。前記DSリガンド上のスルフォネート基由来の負電荷は、FBS中のタンパク質の一部と静電的に相互作用し得る。また、静電相互作用は、酸化鉄NPとウシ血清アルブミンとの結合に重要であると考えられている。DS−NPと比較して、ZDS−NPは、血清タンパク質に対する減少した非特異的親和性を示し得る。ZDSリガンドは、良好な溶解性及び小さいサイズを、酸化鉄NPに提供し得るとともに、それのほぼ中性の総電荷を確実なものとすることができ、このことは、次に、NPと血清タンパク質との間の非特異的相互作用を減少し得る。双性イオンZDS−NPは、インビボでの実験においてDS−NPよりもより適する可能性があり、かつそれの全体として電気的に中性の(例えば双性イオンの)性質はその設計に重要となりる。
【００４２】
ZDSリガンドが水溶性を提供し得ると共に、短鎖リガンドが機能性を提供し得る2成分コーティングを使用し得る。短鎖リガンド(TDリガンド)は、カテコール、ポリアルキレングリコール、及びチオールを含み得る。85%ZDSリガンド及び15%TDリガンド(mol%)の混合物を用いたリガンド交換後、結果として得られるTD/ZDS−NPを、チオール−マレイミドコンジュゲーションスキームを介して、色素及びストレプトアビジン−マレイミド(SA)によりコンジュゲートし得る。
【００４３】
超常磁性(uperparamagnetic)酸化鉄ナノ粒子上の双性イオンドーパミンスルフォネートリガンドコーティングを用いることにより、水溶性、小型、かつ容易に機能化される水性酸化鉄ナノ粒子を製造し得る。双性イオンの性質のため、ZDS−NPは、血清タンパク質への減少した非特異的結合を有し得る。機能化酸化鉄ナノ粒子は、ターゲティング及び画像法のために、抗体、ペプチド、又はアプタマーをTD/ZDS−NPとコンジュゲートし得る、また、金属結合性タンパク質と組み合わせた場合に、TD/ZDS−NPが、MRIベースの金属イオンセンサーとして役立ち得るインビボ及びインビトロ用途に適し得る。
【実施例】
【００４４】
(実施例)
(小さい酸化鉄ナノ粒子)
図1aに示されるように、オレイン酸の存在下、1−テトラデセン、1−ヘキサデセン、及び1−オクタデセンの混合溶媒中で、鉄前駆体(例えば、オレイン酸鉄又は鉄ペンタカルボニル)を分解し、それに続きトリメチルアミンN−オキシドにより酸化することで一連のサイズの単分散酸化鉄ナノ粒子を合成した。溶媒混合物の沸点を、その成分比を変化させて調節することで、反応混合物を、1〜2時間の反応時間、270℃〜300℃の高い温度に保った。結果として生じる疎水性ナノ粒子を、先ず、2−[2−(2−メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸(MEAA)とリガンド交換して、ジメチルホルムアミド(DMF)及び水の混合物中での水溶性を確保した。該混合物中で、これらをさらに、ドーパミンスルフォネート(DS)又は双性イオンドーパミンスルフォネート(ZDS)とリガンド交換した。ドーパミンスルフォネート(DS)リガンドもまた、DSが双性イオンではないことを除けば、水への高い溶解性及び酸化鉄表面への強い結合親和性を有する。透過型電子顕微鏡(TEM)画像(図1B〜1E)及びサイズ排除カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC、図3)により、これらのナノ粒子が、それぞれ7.0、5.5、3.0、2.5nmの無機コアを有すること、及び最小のナノ粒子が、3.0nmの無機コア及び5.0nmのHDを有し得ることが明らかとなった。図2において、ZDS被覆ナノ粒子が、7テスラにおいて11という低いr2/r1比(商業的に入手可能なFeraheme（商標）のr2/r1比よりも2倍低い)、及び0.5テスラ(T)において1.5という低いr2/r1比を有し得ることが示される。このことは、高コントラストのT1強調MR画像法に繋がり得る。承認されたMassachusetts Institute of Technology (MIT)組織内プロトコールに従い、ZDS被覆ナノ粒子を、マウス及びラットに注射し、マウスの尿を一連の時点(図3)で採取し、ラットのT1強調MR画像を取得した(図4)。ZDS被覆ナノ粒子の迅速な腎クリアランスが観察され、注射されたZDS被覆ナノ粒子のサイズは、インビボでは影響を受けなかった(図3)。図4はまた、ラットに注射されたZDS被覆ナノ粒子が、T1コントラスト及び腎クリアランスを示したことを実証した。図4において、赤い丸は、膀胱中の尿におけるZDS被覆ナノ粒子の蓄積を示している。
【００４５】
血液中でのMagnevist(登録商標)(最も一般的に使用されているガドリニウム系造影剤、GBCA)及びES−SPIONのMRIコントラスト向上を、経時的に比較した。承認された動物プロトコールに従い、マウスを1.5Tの臨床MRI装置でスキャンした。Magnevist又はES−SPIONの静注後、臨床MRIシークエンス(〜3.5分の時間長)を用いて、マウスの脳内の単一スライスのT1強調画像を取得し、その後、両試薬のコントラスト向上の半減期を並べて比較した。図5は、ES−SPIONが、Magnevistと比較して、有意に長い血中半減期及びMRIコントラスト向上を示すことを示す。図5に示されるように、Magnevistが、〜2分の半減期を有する一方で、ES−SPIONは、一定のコントラスト向上を、少なくとも〜3.5分間提供する。この結果は、ES−SPIONが、Magnevistの血中半減期よりも有意に長い血中半減期を有すること、及びES−SPIONが、臨床MRIスキャン時間の期間内でより安定なMRIコントラスト向上を提供することを示す。更に、MR血管造影(MRA)用血液プール造影剤としてのES−SPIONの性能を実証するために、マウスを、T1強調3D MRAシークエンスを用いてマウスの脳を画像化する1.5Tの臨床的MRI装置でスキャンした。図6は、ES−SPIONが、臨床的磁場強度(1.5T)でのT1強調MRA用の強力な造影剤であることを示す。左及び右の画像は、中央の画像に対応する側面図を示す。図6では、脳における血管をハイライトする三次元プロファイルが生成されたことが分かる。ES−SPIONが、特に、2分を超えて継続されるMRAに対して、より長続きするコントラスト向上を提供するために、ES−SPIONを用いたマウスのMRAは、Magnevist（登録商標）を用いたマウスのMRAと比較して向上することが期待される。
【００４６】
また、ES−SPIONが脳腫瘍に漏出することができ、脳腫瘍のMRコントラストを向上することができるかどうかを試験した。血液脳関門が、脳腫瘍により損なわれているU87神経膠腫マウスモデルを使用した。承認された動物プロトコールに従い、これらのマウスを、9.4Tの小動物用MRI装置でスキャンした。T1強調MRIシークエンスを使用して、ES−SPIONの静注前後でのマウスの頭部を画像化し、その後、静注前画像を、静注後画像から差し引いて、コントラスト向上をハイライトした。図7は、T1強調MR画像法を用いて、ES−SPIONが、進行脳腫瘍(マウスにおけるU87神経膠腫モデル)中に漏出することを示す。左上から右下の画像は、マウスの頭部の空間的に連続した横方向スライスを示す。図7に示されるように、ES−SPIONは、首尾よくU87腫瘍中に漏出し、その後、マウスの脳におけるU87腫瘍領域のT1コントラストを向上する。この結果は、ES−SPIONが、GBCAが診療所において用いられる主要な適応症である神経膠腫をハイライトする無毒性MRI試薬として役立ち得ることを示唆する。
【００４７】
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
0006471227.tif 000003
【図１Ｂ−１Ｅ】
0006471227.tif 000004
【図２】
0006471227.tif 000005
【図３】
0006471227.tif 000006
【図４】
0006471227.tif 000007
【図５】
0006471227.tif 000008
【図６】
0006471227.tif 000009
【図７】
0006471227.tif 000010