(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを含む、早産の判定をする為の方法：
（Ａ）妊産婦の尿から分離した細胞外ベシクルから１６ｓ  ｒＤＮＡを抽出するステップ；
（Ｂ）前記１６ｓ  ｒＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および
（Ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列解析を通して、バシラス属細菌由来の細胞外ベシクルの分布が正常妊産婦に比べて２倍以上低い場合、早産の危険性が高いと判定するステップ。
【請求項２】
前記（Ａ）ステップで細胞外ベシクルの分離は下記のステップを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
（ａ）尿を１０分ないし３０分の間、沸かした後、冷却するステップ；
（ｂ）前記冷却した産物を遠心分離して上澄み液を得るステップ；および
（ｃ）前記上澄み液を０．４５μｍフィルターと０．２２μｍフィルターで順に濾過するステップ。
【請求項３】
前記細胞外ベシクルは平均直径が２０〜３００ｎｍであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は妊娠関連疾患の治療用の組成物に関するもので、より詳しくはバシラス属細菌から由来する細胞外ベシクルを有効成分として含む早産または乳がんの予防または治療用の薬学的組成物、および早産を診断するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細菌は細胞の間の情報交換のためにナノメートルサイズの細胞外ベシクル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶｓ）を細胞外の環境に分泌する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の細胞外ベシクル、または外膜小胞（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＯＭＶｓ）は球形の二重膜構造のたんぱく質脂質で、よくナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）とも呼ばれて、内毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけではなく、毒性たんぱく質と細菌の核酸であるＤＮＡとＲＮＡも有している。グラム陽性菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）由来の細胞外ベシクルは毒性たんぱく質と核酸以外にも細菌の細胞壁の構成成分であるペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）およびリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）も含有している。最近の研究によると、このような細菌由来の細胞外ベシクルが、以前に非感染性と信じていた炎症性疾患の発生に重要な役割をすることが報告された。
【０００３】
一方、全世界的に毎年一千五百万の新生児が早熟児で生まれて、これは全世界の新生児の１／１０以上を占めることと知られている。このような早産は、感染（尿路感染症、膣感染症）、子宮と子宮頸部の奇形、体外受精、母親の栄養、遺伝学的因子が原因として知られている。また、多くの研究者は、子宮内感染が早産の２５〜４０％を説明する重要な機転と提示している。妊産婦はホルモンと物理的な変化による大きな解剖学的、生理学的、生化学的な変化を経験することになる。例えば、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が増加した結果で膣の分泌物が増加し、質のｐＨが減少することになる。したがって、妊娠関連の微生物の研究を通じ、妊産婦と非妊産婦の膣と羊水のサイトカインの程度、ｐＨの変化、感染への脆弱性の違いなどについての情報を得ることができる。
【０００４】
女性の乳がんは韓国女性に二番目に多く発生するがんであり、１９９９年から２００２年まで年平均がん発生の中、乳がんが約１５％で２位を占めていた。全世界的にはアメリカ、ヨーロッパ、オーストラリアを中心とした西洋人での発生が東洋人に比べて非常に高い特徴を示している。韓国女性の乳がんは、西洋人に比べて、はるかに低いレベルにあるが、大都市のいわゆる西洋化された環境の中で居住している女性の発生率が高いという事実と乳がんの発生が過去に比べて増加し続けている傾向にあるという力学的な現象は、韓国女性の人口集団内に乳がんの発生を誘発する要因が継続的に内在していて、がんの発生を加速させていることを意味すると見ることができる。初経年齢（ａｇｅ  ａｔ  ｍｅｎａｒｃｈｅ）が早い場合、または閉経年齢（ａｇｅ  ａｔ  ｍｅｎｏｐａｕｓｅ）が遅ければ遅いほど、規則的な生理周期に伴う血中のエストロゲン濃度が高く維持されるため、乳がんの危険性が高いと知られている。また、最初の臨月分娩の年齢が早い女性の場合、出産の１０年以降から乳がん発生の危険は減少することが知られており、出産力が高い女性も乳がんの危険が低くなる。一方、出産の機会を一度も有していない女性の場合、乳がんの危険が最も高いと知られているが、妊娠の乳がんの予防効果に対する正確な機転は知られていない。乳がんの発生そのものを防止するための一次予防は、発がん環境の抑制、個人の健康行態および習慣の変化を含んでいる。例えば、肥満を抑制し初経が始まる年齢を可能な限り遅らせる方案またはホルモンなどの薬物による積極的な予防法も考慮されることができる。
【０００５】
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノム学は、環境から採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に関する解析学ということができる。最近１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ  ｒＲＮＡ）の塩基配列をベースにした方法で、人間の微生物叢の細菌構成をリスト化することができるようになり、１６ｓリボソームＲＮＡは４５４ＦＬＸ  ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｐｌａｔｆｏｒｍを用いて配列を解析する。これまで妊産婦から便、膣分泌物、羊水で解析したメタゲノムに関するの研究があったが、尿は無菌とされてきたため、尿では、妊娠中の細菌のメタゲノム解析研究がなかった。
【０００６】
また、これまで細菌由来の細胞外ベシクルを用いて、妊娠誘導あるいは早産の予防を目的に用いる場合、また、乳がんの予防または治療のために用いた場合は、一度もないのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、上記のような従来の問題点の解決のために妊娠していない女性と妊産婦女性の尿から細胞外ベシクルのＤＮＡを用いて、メタゲノム解析を行った結果、妊産婦女性、特に正常的に分娩した女性にバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルが確実に増加されていることを確認することによって本発明を完成した。
それで、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、早産または乳がんのような妊娠関連疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供することを目的にする。
【０００８】
また、本発明は早産の診断方法を提供することを目的にする。
しかし、本発明が解決しようとする技術的な課題は以上で言及した課題に制限されなく、言及されていない他の課題は以下の記載から当業者に明確に理解されることができるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、妊娠関連疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１０】
本発明の一具現例で、上記の細胞外ベシクルはバシラス属細菌の培養液または醗酵食品から分離されることができる。
【００１１】
本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルはバシラス属細菌から自然的にまたは人工的に分泌されることを特徴とする。
【００１２】
本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルは平均直径が２０〜３００ｎｍであることを特徴とする。
【００１３】
本発明の他の具現例で、上記の妊娠関連疾患は早産であることができる。
【００１４】
本発明の他の具現例で、上記の妊娠関連疾患は乳がんであることができる。
また、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む、正常妊娠誘導用の組成物を提供する。
【００１５】
本発明の一具現例で、上記の細胞外ベシクルはバシラス属細菌の培養液または醗酵食品から分離されることができる。
【００１６】
本発明の他の具現例として、上記の細胞外ベシクルはバシラス属細菌から自然的にまた人工的に分泌されることを特徴とする。
【００１７】
本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルは平均直径が２０〜３００ｎｍであることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は下記のステップを含む、早産の診断方法を提供する。
（Ａ） 妊産婦の尿から分離した細胞外ベシクルから１６ｓ  ｒＤＮＡを抽出するステップ；
（Ｂ）上記の１６ｓ  ｒＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および
（Ｃ）上記のＰＣＲ産物の配列解析を通して、バシラス属細菌由来の細胞外ベシクルの分布が正常妊産婦に比べて２倍以上低い場合、早産の危険性が高いと判定するステップ。
本発明の一具現例として、上記の（Ａ）ステップで細胞外ベシクルの分離は下記のステップを含むことができる。
（ａ） 尿を１０分ないし３０分の間、沸かした後、冷却するステップ；
（ｂ）上記の冷却した産物を遠心分離して上澄み液を得るステップ；および
（ｃ）上記の上澄み液を０．４５μｍフィルターと０．２２μｍフィルターで順に濾過するステップ。
本発明の他の具現例で、上記の細胞外ベシクルは平均直径が２０〜３００ｎｍであることを特徴とする。
また、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物を個体に投与するステップを含む、妊娠関連疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルの妊娠関連疾患の予防または治療用途を提供する。
また、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルの早産診断用途を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む薬学的組成物は妊娠を誘導したり妊産婦の早産を予防することができ、乳がんのような妊娠関連疾患を予防または治療するのに用いることができ、妊産婦でバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルの量を測定することにより、早産の危険性を診断するのに有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】図１ａおよび図１ｂはグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）とグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の細胞外ベシクルをマウスに筋肉注射で注入した後、尿に排泄されるかを確認するためのものであり、図１ａは全身体内の蛍光イメージ、図１ｂはベシクルの投与の２１時間以後に摘出したマウス臓器の特異的な体内の蛍光イメージを撮影した写真である。
【図１ｂ】図１ａおよび図１ｂはグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）とグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来の細胞外ベシクルをマウスに筋肉注射で注入した後、尿に排泄されるかを確認するためのものであり、図１ａは全身体内の蛍光イメージ、図１ｂはベシクルの投与の２１時間以後に摘出したマウス臓器の特異的な体内の蛍光イメージを撮影した写真である。
【図２】図２は妊産婦（左側）と正常対照群である非妊産婦（右側）の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの様々な分類群を示す結果である。
【図３ａ】図３ａないし図３ｄは正常対照群である非妊産婦（青い下線、右側）と妊産婦（赤い下線、左側）の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの構成成分を解析した結果であり、門（ｐｈｙｌｕｍ）（図３ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図３ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図３ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図３ｄ）の階級で解析した結果である。
【図３ｂ】図３ａないし図３ｄは正常対照群である非妊産婦（青い下線、右側）と妊産婦（赤い下線、左側）の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの構成成分を解析した結果であり、門（ｐｈｙｌｕｍ）（図３ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図３ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図３ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図３ｄ）の階級で解析した結果である。
【図３ｃ】図３ａないし図３ｄは正常対照群である非妊産婦（青い下線、右側）と妊産婦（赤い下線、左側）の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの構成成分を解析した結果であり、門（ｐｈｙｌｕｍ）（図３ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図３ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図３ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図３ｄ）の階級で解析した結果である。
【図３ｄ】図３ａないし図３ｄは正常対照群である非妊産婦（青い下線、右側）と妊産婦（赤い下線、左側）の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの構成成分を解析した結果であり、門（ｐｈｙｌｕｍ）（図３ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図３ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図３ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図３ｄ）の階級で解析した結果である。
【図４】図４は正常分娩群と早産分娩群の妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を示す結果である。
【図５】図５は正常分娩群と早産分娩群の妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を要約した結果である。
【図６ａ】図６ａないし図６ｄは早産分娩群（緑下線、左側）と正常分娩群（紫下線、右側）妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を解析した結果であり、門 （ｐｈｙｌｕｍ）（図６ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図６ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図６ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図６ｄ）の階級で解析した結果である。
【図６ｂ】図６ａないし図６ｄは早産分娩群（緑下線、左側）と正常分娩群（紫下線、右側）妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を解析した結果であり、門 （ｐｈｙｌｕｍ）（図６ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図６ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図６ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図６ｄ）の階級で解析した結果である。
【図６ｃ】図６ａないし図６ｄは早産分娩群（緑下線、左側）と正常分娩群（紫下線、右側）妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を解析した結果であり、門 （ｐｈｙｌｕｍ）（図６ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図６ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図６ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図６ｄ）の階級で解析した結果である。
【図６ｄ】図６ａないし図６ｄは早産分娩群（緑下線、左側）と正常分娩群（紫下線、右側）妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を解析した結果であり、門 （ｐｈｙｌｕｍ）（図６ａ）、綱（ｃｌａｓｓ）（図６ｂ）、目（ｏｒｄｅｒ）（図６ｃ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）（図６ｄ）の階級で解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む妊娠関連疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
本発明で用いられる用語、「予防」とは本発明による薬学的組成物の投与による妊娠関連疾患を抑制させたり、発病を遅延されるすべての行為を意味する。
本発明で用いられる用語、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与によって妊娠関連疾患による症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明の上記のバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルは自然的に分泌されたり、または人工的に分泌される細胞外ベシクルを含めて、バシラス属細菌の培養液から分離されたり、またはバシラス属細菌で醗酵させた食品から分離されることができる。上記の細菌培養液または上記の細菌添加醗酵食品から細胞外ベシクルを分離する方法は、細胞外ベシクルを含めば、特に制限されなく、たとえば、培養液や醗酵食品から、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによる濾過、ゲルろ過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、キャピラリー電気泳動などの方法およびこれらの組み合わせを用いて細胞外ベシクルを分離することができる。または、不純物の除去のための洗浄、得られた細胞外ベシクルの濃縮などの過程を追加に含むことができる。
【００２２】
上記の方法により分離された細胞外ベシクルは平均直径２０〜３００ｎｍであることができ、望ましくは５０〜２００ｎｍであることができるが、これに制限されるものではない。
【００２３】
本発明の上記の妊娠関連疾患は妊娠と関連されて妊娠中あるいは妊娠後に発生されたり、または妊娠の結果として抑制される疾患を総称する。妊娠中に発生する代表的な例では早産があり、妊娠により発生が抑制される疾患として乳がんを挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００２４】
また、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む正常妊娠誘導用の組成物を提供する。
【００２５】
本発明では正常分娩をした妊産婦と早産をした妊産婦、および正常対照群である非妊産婦を研究対照群にして、一般的な特徴を調査して統計的な有意性を解析した。本発明の一実施例では、研究対照群の特徴調査結果、正常分娩群と早産分娩群で妊娠週数が有意な違いを示したし、早産群でアプガー指数（ａｐｇａｒ  ｓｃｏｒｅ）が有意に低いことを確認した（実施例１参考）。
【００２６】
本発明で用いられた用語、「アプガー指数（ａｐｇａｒ  ｓｃｏｒｅ）」とは、１９５２年、麻酔科医者であるヴァージニア・アプガーにより考案されたもので、生まれたばかりの新生児の健康状態を迅速に評価するために作成されたスコアシステムを意味する。つまり、分娩時の麻酔が新生児にどのような影響があるか調べるためのスコアとして、一般的に出産の１分後と５分後に行われて、肌の色、脈拍、反射と過敏性、筋の緊張度、および呼吸の５つの基準を有してスコアを付ける。出生の１分後に検査する際に低い点数を受ける場合、新生児は、医学的に助けが必要であるが、長期的な問題が生じることを意味することではない。
【００２７】
本発明の他の実施例では、尿に細菌由来の細胞外ベシクルが排泄されるかどうかを確認するためにグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）とグラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から分離した細胞外ベシクルをマウスに筋肉注射で注入した。注入の３、６時間の後、マウスの尿を通して細胞外ベシクルが排泄されることを確認したし、臓器を摘出して解析した結果、二つの細菌由来の細胞外ベシクルが肝と腎臓に存在することを確認した（実施例２参考）。
【００２８】
本発明の他の実施例では、実施例２の結果を基に、上記の正常分娩群および早産分娩群の妊産婦と非妊産婦の尿を採取して尿内の細胞外ベシクルからＤＮＡを抽出した後メタゲノム解析を行った（実施例３参考）。
【００２９】
その結果、非妊産婦からなる正常対照群と妊産婦の尿から分離した細胞外ベシクルの分布の差を解析した場合、正常対照群にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の細胞外ベシクルが多く分布したし、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来のベシクルは正常対照群に比べて妊産婦に非常に高く分布することを確認した（実施例４参考）。
【００３０】
本発明の他の実施例では、妊産婦の中で正常分娩群と早産分娩群の尿から分離した細胞外ベシクルの分布の差を解析した。その結果、早産をした妊産婦の尿でメチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、およびベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）菌から由来した細胞外ベシクルが増加されている一方、正常分娩をした妊産婦の尿にはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来の細胞外ベシクルが多量に分布していることを確認した（実施例５参考）。
【００３１】
本発明による薬学的な組成物はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含めて、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。上記の薬学的に許容可能な担体は製剤の際に通常的に用いられることで、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。適切な薬学的に許容される担体と製剤化に関しては、レミントンの文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を用いて各成分に基づいて望ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤などに製剤化することができる。
【００３２】
本発明の薬学的組成物は目的にする方法により経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与の経路および時間により異なるが、当業者により適切に選択されることができる。
【００３３】
本発明による組成物は薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は医学的な治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味して、有効容量のレベルは患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与の時間、投与の経路および排出の比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素および他の医学分野でよく知られている要素により決定されることができる。本発明による組成物は個別の治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次に、または同時に投与されることができ、単一または多重投与されることができる。上記した要素をすべて考慮して副作用なしの最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定されることができる。
【００３４】
詳しくは、本発明による組成物の有効量は患者の年齢、性別、体重により異なることができ、一般的には体重１ｋｇ当たり０．００１ないし１５０ｍｇ、望ましくは０．０１ないし１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１ないし３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などにより増減されることができるので、上記の投与量がどのような方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
本発明の他の様態として、本発明はバシラス属細菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与するステップを含む妊娠関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【００３６】
本発明で「個体」とは疾病の治療を必要とする対象を意味し、より詳しくは、ヒトまたは非−ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬および牛などの哺乳類を意味する。
【００３７】
本発明の他の様態として、本発明は妊産婦の尿から分離した細胞外ベシクルから１６ｓ  ｒＤＮＡを抽出するステップ；上記の１６ｓ  ｒＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行うステップ；および上記のＰＣＲ産物の配列解析を通して、バシラス属細菌由来の細胞外ベシクルの分布が正常妊産婦に比べて２倍以上低い場合、早産の危険性が高いと判定するステップを含む早産の診断方法を提供する。
【００３８】
本発明で上記の妊産婦の尿から分離した細胞外ベシクルからＤＮＡを抽出する方法は尿を１０分ないし３０分の間、沸かした後、冷却するステップ；上記の冷却した産物を遠心分離して上澄み液を得るステップ；および上記の上澄み液を０．４５μｍフィルターと０．２２μｍフィルターで順に濾過するステップを含むが、これに制限されるものではない。
【００３９】
以下、本発明の理解を助けるために、望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をよりわかりやすくするために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１．研究対象群の一般的な特徴
本発明の実施例では２００６年から２００８年まで檀国大学校と梨花女子大学校の梨花医療院に登録された７３人の非妊産婦と７４人の妊産婦（正常分娩３９人、早産分娩３５人）を対象に研究を行った。檀国大学校の病院で健康診断を受けた非妊産婦を正常対照群に設定し、実験群である７４人の妊産婦の中、正常分娩と早産分娩は３７週を基準に分類した。病院で分娩した３７週未満の早産妊産婦を集め、正常分娩は病院で産前検診を受けた３７週以上の妊娠期間を経て分娩した母親を対象にした。妊産婦の登録基準は、単生児であり、妊娠週数が２５週間以上４２週間未満の場合にし、登録の除外の基準は多生児、死産児、先天性奇形、慢性高血圧、前置胎盤、胎盤早期剥離である場合とした。
【００４１】
上記の非妊産婦および妊産婦は研究に参加する前、同意書に署名したし、熟練された調査者らが参加者らの力学的、臨床的な情報を収集した。体重、身長、血液は標準化された手順に従って収集し、ボディマス指数は体重を身長の二乗で割り算して計算した（ｋｇ／ｍ２）。また、血液は夜間空腹状態で肘の内側の中間静脈から採血してＥＤＴＡチューブや血清チューブ（ｓｅｒｕｍ  ｔｕｂｅ）に入れて、自動分析装置（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｏｄｅｌ７１８０；  Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて、コレステロール、白血球、ヘモグロビン、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、アラニンアミノ基転移酵素、高密度リポタンパク質、空腹時の血糖、クレアチニンを測定した。尿サンプルは、きれいな中間尿を用いており、無菌の尿容器に入れて保管した。妊産婦で妊娠週数の測定は最後の生理周期または最後の生理周期が明確ではない場合、最初の超音波測定を基準にしており、出産の情報はカルテを解析した。
【００４２】
下記の表１に研究対象者である非妊産婦および妊産婦の一般的な特徴を示した。妊産婦で正常分娩群と早産分娩群を比べると、妊娠週数で有意な差を見せて（３９．７３  ｖｓ．  ３３．５７  ｗｅｅｋｓ、ｐ＝０．０００）、新生児の出生時の体重も早産群で有意に低かった（３３４２．１３ｇ  ｖｓ．  ２１７９．１７ｇ、ｐ＝０．０００）。または、早産群で正常対照群よりアプガー指数（ａｐｇａｒ  ｓｃｏｒｅ）が有意に低いことを確認した（ｐ＜０．０５）。しかし、二つの群の間に妊産婦の年齢（歳）は有意な違いを見せていなかった（ｐ＞０．０５）。
【００４３】
【表１】
0006475853.tif 000002
【００４４】
実施例２．細菌由来の細胞外ベシクルの排泄の確認
尿から細菌由来の細胞外ベシクルが排泄されるかを確認するためにグラム陰性菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）から由来する細胞外ベシクルをマウスに筋肉注射で注入して、毎時間ごとに映像を撮影した。
【００４５】
上記の細菌の培養液から細胞外ベシクルを分離するために、まず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）と黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地の上に３０℃で培養した。その後、培養液を３０分間５，０００ｇで遠心分離して、上澄み液は０．４５μｍフィルターを用いて濾過して、ＱｕｉｘＳｔａｎｄTM（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）で濃縮した。濃縮されたサンプルは０．２２μｍフィルターで再び１回濾過して細胞外ベシクルを分離した後、細胞外ベシクルのたんぱく質の濃度をＢＣＡ  ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）方法で測定した。大腸菌と黄色ブドウ球菌由来の細胞外ベシクルはｃｙ７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１時間室温で表示した後、２０μｇ／ｍｏｕｓｅでマウスに筋肉注射で注入した。定められた時間にＩＶＩＳ¢c  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴ（ＳｅｌｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅ¢c）を用いて７８０〜８００ｎｍの波長でマウスをスクリーニングした。臓器は摘出してＩＶＩＳ¢c  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＣＴを用いて蛍光を測定した。
【００４６】
その結果、図１ａに示すように、上記の二つの細菌由来の細胞外ベシクル、すべて注入３、６時間以後、尿で排泄された。また、図１ｂに示すように、注入１２時間の後、臓器を摘出した際に、大腸菌と黄色ブドウ球菌由来の二つの細胞外ベシクル、すべて肝と腎臓に存在することを確認した。結論的に、上記の結果を通して、細菌由来の細胞外ベシクルが部分的には尿で排泄されることを分かることができる。
【００４７】
実施例３．尿サンプル内の細胞外ベシクルでＤＮＡメタゲノム解析
３−１．尿からＤＮＡの分離
正常分娩の妊産婦と早産分娩の妊産婦、非妊産婦の女性の尿内に存在する細胞外ベシクルからＤＮＡを分離した。
各正常対照群および実験群の女性の尿１ｍｌを採取して１００℃で１５分間沸かした。沸かした尿サンプルを氷に５分間置いてから、１０，０００ｇで４℃に２０分間遠心分離した。上澄み液は４℃に保管して、分離したＤＮＡはメタゲノム解析を行う前にｎａｎｏ−ｄｒｏｐで分離されたＤＮＡの量と質を測定した。
【００４８】
３−２．尿内のベシクルから分離したＤＮＡメタゲノム解析
実施例３−１の尿から分離した細胞外ベシクルのＤＮＡでメタゲノム解析を実施した。
【００４９】
まず、それぞれのクローンをＶ１−Ｖ３  ｒｅｇｉｏｎ増幅のため１６ｓ  ｒＤＮＡ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒとＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＤＮＡ解析のためにポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。上記の１６ｓ  ｒＤＮＡ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒの配列は下記の表２に示した。
【００５０】
【表２】
0006475853.tif 000003
＊Ｍ：ＡまたはＣ
＊Ｗ：ＡまたはＴ
【００５１】
ＰＣＲを通した増幅反応はエマルジョン状態（オイルとａｍｐｌｉｃｏｎが混合された状態）で行われて、ＧＳ−ＦＬＸ  ｐｌｕｓ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）で増幅混合物と単独粒子を含むマイクロリアクター（「ｍｉｃｒｏ−ｒｅａｃｔｏｒｓ」）を作るために実施した。エマルジョンは９６−ｗｅｌｌプレートに分けて盛って、メーカーから提案されたプロトコルに従いＰＣＲを行った（９４℃で３分間、次に９４℃で１５秒間３５サイクル、５５℃で４５秒間、そして７２℃で１分間、最後のステップは７２℃で８分間実施）。それぞれのＤＮＡサンプル２０ｎｇを５０μｌＰＣＲ反応に用いた。エマルジョンＰＣＲ（ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ＰＣＲ；ｅｍＰＣＲ）を行って、各ＤＮＡを増幅の後、ａｍｐｌｉｃｏｎはＡＭｐｕｒｅ  Ｂｅａｄ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製して、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量化した。その後、ａｍｐｌｉｃｏｎを希釈してＧＳ−ＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて解析した。ＰＣＲ増幅の後、エマルジョンは化学的に分解されて、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙを有するビーズ（ｂｅａｄ）は濾過を通して洗浄した。陽性であるビーズ（ｂｅａｄ）はｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  Ａ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ａｄａｐｔｏｒ  Ａ）を用いて精製したし、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓに付けるようにした。その後、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓに付いたＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｂｅａｄｓを二重螺旋構造を溶かしてｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓから分離して一本鎖ＤＮＡは流れるようにした。塩基は列ｐｒｉｍｅｒは再び増幅された一本鎖ＤＮＡに作った。最後に、増幅された一本鎖ＤＮＡを有しているビーズはＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて個数を数えた。塩基配列の解析はＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  ｔｉｔａｎｉｕｍ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にして、それぞれのサンプルは７０ｍｍ−７５ｍｍ  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のそれぞれにロードした。
【００５２】
生物情報学を通したメタゲノム解析のために品質点数（平均Ｐｈｒｅｄ点数＞２０）とｒｅａｄ  ｌｅｎｇｔｈ（＞３００ｂｐ）をチェックして高品質の配列を集めた。ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨ（Ｅｄｇａｒ、２０１０）を用いてＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｕｎｉｔ（ＯＵＴ）を解析したし、系統学的な分類はＱＩＩＭＥ（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ、ｅｔ  ａｌ．、２００６）を用いて解析した。類似性に基づいて、すべて１６ｓ  ＲＮＡの配列は次の系統学的な階級により分類した：種（ｓｐｅｃｉｅｓ）＞９７％の類似性；属（ｇｅｎｕｓ）＞９４％の類似性；科（ｆａｍｉｌｙ）＞９０％の類似性；目（ｏｒｄｅｒ）＞８５％の類似性；綱（ｃｌａｓｓ）＞８０％の類似性；門（ｐｈｙｌｕｍ）＞７５％の類似性。属（ｇｅｎｕｓ）の階級の細菌構成は妊産婦と正常対照群の間に２倍以上の有意な構成の差が見える場合、ｈｅａｔｍａｐを画いた。階層的なクラスタリングは属（ｇｅｎｕｓ）の階級で妊産婦と正常対照群の間に２倍以上の有意な構成の差が見せたり、１％以上の平均構成を見せる場合、実施した。
【００５３】
実施例４．メタゲノム解析を通じた細菌由来の細胞外ベシクルの分布差の解析
実施例３−２の方法で正常対象群である非妊産婦および実験群である正常分娩群と早産分娩群の妊産婦の尿から細胞外ベシクルからＤＮＡを分離してメタゲノム解析を行った。
【００５４】
その結果、図２に示すように、サンプルは二つの群に分類することができたが、一番目の群は妊産婦の尿サンプル群（左側）であって、二番目の群はほとんど正常対照群の尿サンプル群（右側）であった。図の右側には妊産婦と正常対照群で２倍以上の差を見せた分類群であり、１％以上の平均構成を見せた群である。また、属名のない分類の場合、科（ｆａｍｉｌｙ、ｆ）または目（ｏｒｄｅｒ、ｏ）の名前を用いた。また、下記の表３に示すように、細菌構成で１３個の分類の差が観察された。一番目の群（妊産婦）は二つのクラスターを、二番目の群（正常対照群）は三つのクラスターを作った。一番目の群は主にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌とその細胞外ベシクルで構成された。
【００５５】
【表３】
0006475853.tif 000004
【００５６】
上記の表３の結果を通して、バシラス属細菌由来のベシクルは正常対照群（平均構成＝０．１２％）に比べて妊産婦（平均構成＝４５．６１％）で最も多い細菌由来の細胞外ベシクルであって、逆にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の細胞外ベシクルは妊産婦（平均構成＝４．０９％）に比べて非妊産婦（平均構成＝１４．２３％）で最も多い細菌由来の細胞外ベシクルであることを確認した。
【００５７】
図３ａないし図３ｄには、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）の階級で妊産婦（赤い下線）と正常対照群（青い下線）の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布解析結果を示した。
【００５８】
実施例５．メタゲノム解析を通した正常分娩群と早産分娩群の妊産婦の尿からの細菌由来の細胞外ベシクルの分布差の解析
実施例３−１で正常分娩群と早産分娩群の妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルＤＮＡを実施例３−２の方法でメタゲノム解析を行った。図４に正常分娩群と早産分娩群の妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を示したし、図５に上記の細胞外ベシクルの分布を要約して示した。また、図６ａないし図６ｄに早産分娩群（緑下線、左側）と正常分娩群（紫下線、右側）の妊産婦の尿から分離した細菌由来の細胞外ベシクルの分布を門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、および科（ｆａｍｉｌｙ）の階級で解析して示した。
【００５９】
図４ないし図６の結果を総合して解析した結果、様々な細菌由来の細胞外ベシクルが正常分娩群と早産分娩群の尿に存在することを分かることができた。メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来の細胞外ベシクルは非妊産婦と早産をした妊産婦の尿に多かったし、代わりにバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来の細胞外ベシクルが減った。一方、正常分娩をした妊産婦ではメチロバクテリウム属由来の細胞外ベシクルがほとんど発見されなかった。また、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）とベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）由来の細胞外ベシクルである場合も正常分娩の母親より早産分娩の母親でよく発見された。
上記の結果を通して、早産分娩をした妊産婦より正常分娩をした妊産婦で他の細菌由来の細胞外ベシクルと異なりバシラス細菌由来の細胞外ベシクルが多いことを分かることができた。
【００６０】
上記のような本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有するものは本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなく、他の具体的な形態に容易に変形することができることを理解することができるだろう。したがって、上で技術した実施例はすべての点において例示的なものであり、限定的ではないものと理解するべきである。
【図１ａ】
0006475853.tif 000005
【図１ｂ】
0006475853.tif 000006
【図２】
0006475853.tif 000007
【図３ａ】
0006475853.tif 000008
【図３ｂ】
0006475853.tif 000009
【図３ｃ】
0006475853.tif 000010
【図３ｄ】
0006475853.tif 000011
【図４】
0006475853.tif 000012
【図５】
0006475853.tif 000013
【図６ａ】
0006475853.tif 000014
【図６ｂ】
0006475853.tif 000015
【図６ｃ】
0006475853.tif 000016
【図６ｄ】
0006475853.tif 000017
【配列表】
0006475853000001.app