(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iで表される抗体薬物複合体。
【化１】
0006471263.tif 000041
ただし、Lは抗体、抗体断片、又はタンパク質であり；Tはトリマレイミド型リンカー部分であり；Aは他のリンカー部分であり；Dは薬物部分であり；nは1〜8の範囲内の整数であり、
前記トリマレイミド型リンカー部分の構造は式IIで表され、
【化２】
0006471263.tif 000042
ただし、
ZはO、S、NR2、NR3C(=O)、C(=O)NR4、C(=O)O、OC(=O)、 C(=S)O、 OC(=S)、C(=S)NR5、NR6C(=S)、C(=S)S、SC(=S)、NR7C(=O)NR8、NR9C(=S)NR10、OC(=O)NR11、NR12C(=O) Oからなる群より選ばれ；
R1はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH2CH2O)t-、 -(OCH2CH2)w-、又はその任意の組み合わせからなる群より選ばれ、ただし、t、wはそれぞれ1〜18の範囲内の整数から選ばれ；
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；
rは0又は1であり；
sは0〜8の範囲内の整数から選ばれ；
XはNR13、O、S、C(=O)、C(=S)、C(=O)NR14、NR15C(=O)、NR16C(=S)、C(=S) NR17、OC(=O)、 C(=O)O、OC(=S)、C(=S)Oからなる群より選ばれ；ただし、R13、R14、R15、R16及びR17は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；
o、p、qはそれぞれ0〜8の範囲内の整数から選ばれ、且つo、p、qの中の一つが0である場合、他の二つは0ではない。
【請求項２】
前記Ａが切断可能性リンカーの組み合わせ又は切断不可能性リンカーであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３】
前記Aの構造が式III又はIVで表されることを特徴とする、請求項２に記載の抗体薬物複合体。
【化３】
0006471263.tif 000043
ただし、Cは切断可能性リンカーであり；E、Fは自殺性リンカーであり；e、ｆはそれぞれ０〜５の範囲内の整数から選択され；Gは切断不可能性リンカーであり；ｇは０〜５の範囲内の整数である。
【請求項４】
前記抗体薬物複合体の構造が式Ｖ又はＶＩで表されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載された抗体薬物複合体。
【化４】
0006471263.tif 000044
ただし、
Ｌは抗体、抗体断片、又はタンパク質であり；
ZはO、S、NR2、NR3C(=O)、C(=O)NR4、C(=O)O、OC(=O)、C(=S)O、OC(=S)、C(=S)NR5、NR6C(=S)、C(=S)S、SC(=S)、NR7C(=O)NR8、NR9C(=S)NR10、OC(=O)NR11、NR12C(=O) Oからなる群より選ばれ；
R1はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH2CH2O)t-、-(OCH2CH2)w-、又はその任意の組み合わせからなる群より選ばれ、ただし、t、wはそれぞれ1〜18の範囲内の整数から選ばれ；
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；
rは0又は 1であり；
sは0〜8の範囲内の整数から選ばれ；
XはNR13、O、S、C(=O)、C(=S)、C(=O)NR14、NR15C(=O)、NR16C(=S)、C(=S) NR17、OC(=O)、C(=O)O、OC(=S)、C(=S)Oからなる群より選ばれ；ただし、R13、R14、R15、R16及びR17は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；
o、p、qはそれぞれ0〜8の範囲内の整数から選ばれ、且つo、p、qの中の一つが0である場合、他の二つは0ではない。
【請求項５】
前記抗体が細胞表面の受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
前記薬物が細胞毒性薬であり、自己免疫疾患の治療のための薬物及び抗炎症薬であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７】
前記トリマレイミド型リンカーの構造が下記式で表されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体。
【化５】
0006471263.tif 000045
【化６】
0006471263.tif 000046
【請求項８】
抗体薬物複合体の製造のための式VIIで表される構造を有するトリマレイミド型リンカーの使用。
【化７】
0006471263.tif 000047
ただし、
ZはO、S、NR2、NR3C(=O)、C(=O)NR4、C(=O)O、OC(=O)、C(=S)O、OC(=S)、C(=S)NR5、NR6C(=S)、C(=S)S、SC(=S)、NR7C(=O)NR8、NR9C(=S)NR10、OC(=O)NR11、NR12C(=O) Oからなる群より選ばれ；
R1はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH2CH2O)t-、-(OCH2CH2)w-、又はその任意の組み合わせからなる群より選ばれ、ただし、t、wはそれぞれ1〜18の範囲内の整数から選ばれ；
R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；
r は0又は1であり；
sは0〜8の範囲内の整数から選ばれ；
QはNHR13、OH、SH、COOH、C(=S)OH、NR14COOH、NR15C(=S)OH、NCO、NCSからなる群より選ばれ；ただし、R13、R14及びR15は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；
o、p、qはそれぞれ0〜8の範囲内の整数から選ばれ、且つo、p、qの中の一つが0である場合、他の二つは0ではない。
【請求項９】
前記トリマレイミド型リンカーの構造が下記式で表されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【化８】
0006471263.tif 000048
【化９】
0006471263.tif 000049
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍又は他の疾患の治療のための抗体薬物複合体の応用に関し、特に、薬物/抗体比（Drug/Antibody Ratio、DAR）を制御する抗体薬物複合体を製造するための特定のトリマレイミド型リンカーの応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体薬物複合体（Antibody-Drug Conjugates, ADCs）は、主に癌、自己免疫及び他の治療領域で使用される一類の新規な標的治療薬である。最初、その基本的な設計思想は、Paul Ehrlichが1913年に初めて提案した「魔法の弾丸(magic bullet)」と適切な担体を介して病気の部位への薬剤の送達を目標とした薬剤ターゲティングの概念から起源した。しかしながら、抗体及び高活性細胞毒性薬の技術的な制限により、2000年に第一の急性骨髄性白血病（AML）の治療のための抗体薬物複合体（MylotargTM））がFDAによって承認され上場した。最近、シアトルジェネティクス社（Seattle Genetics）により開発されたホジキンリンパ腫（HL）/再発性未分化大細胞リンパ腫（ALCL）の治療に用いられる新薬AdcetrisTM (2011)、及びジェネンテック社(Genentech)により開発された乳癌の治療に用いられる新薬KadcylaTM (2013)が相次いでFDAによって承認され上場し、これは抗体薬物複合体が腫瘍治療の分野で急速な発展段階に入ったことを表わす。
【０００３】
伝統的な抗体薬物複合体の構造において、高活性な細胞毒性薬は、通常、二官能性リンカーにより抗体表面のリシン残基、又は鎖間ジスルフィド結合の還元によって得られるシステイン残基に結合し、好ましいDARは2〜4である。リシン残基を選択してカップリング部位とする場合、抗体の表面に多数のリシン残基（80を超える）が存在すること、及びカップリング反応の非選択性により、カップリングの数及び部位の不確定性を招き、更に生成される抗体薬物複合体の重度の不均一性を招く。例えば、T-DM1の平均DARは3.5であり、DAR分布(DAR Distribution)は0〜8である（Rapid Commun.Mass Spectrom.2005、19、1806〜1814）。同様に、システイン残基を選択してカップリング部位とする場合、抗体の鎖間ジスルフィド結合が4（IgG1）しかないが、最適な平均DAR（2〜4）の要件を満たすために、鎖間ジスルフィド結合の一部分の還元を必要とする（Bioconjugate Chem.2005、16、1282〜1290）。既存の還元剤（DTT、TCEPなど）は鎖間ジスルフィド結合を選択的に還元することができないため、生成される複合体も均質な生成物ではなく、複数組成からなり、主な組成のDARは0、2、4、6、8である。同時に、特定のDAR値に対する各成分は、異なる結合部位により形成された異性体が存在して、ある程度の不均一性を生じる。抗体薬物複合体の製品の不均一性は、各成分間の薬物動態学的特性、効力及び毒性の不均一性をもたらす。例えば、より高いDAR値を有する成分は体内でより速く除去され、より高い毒性を招く（Bioconjugate Chem. 2011、22、1994〜2004）。
【０００４】
前記伝統的なリンカー技術の欠点に対して、固定点カップリングの目的を達成するために、本分野において新規なリンカー技術を開発することが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、化学カップリング法による抗体薬物複合体の製造に用いられる新規なトリマレイミド型リンカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の方面において、式Iで表される抗体薬物複合体を提供する。
【０００７】
【化１】
0006471263.tif 000002
【０００８】
ただし、Lは抗体、抗体断片、又はタンパク質であり；Tはトリマレイミド型リンカー部分であり；Aは他のリンカー部分であり；Dは薬物部分であり；nは1〜8の範囲内の整数であり、1、2、3、4、5、6、７及び8を含む。
【０００９】
前記トリマレイミド型リンカー部分の構造は式IIで表される：
【００１０】
【化２】
0006471263.tif 000003
【００１１】
ただし、ZはO、S、NR2、NR3C(=O)、C(=O)NR4、C(=O)O、OC(=O)、C(=S)O、OC(=S)、C(=S)NR5、NR6C(=S)、C(=S)S、SC(=S)、NR7C(=O)NR8、NR9C(=S)NR10、OC(=O)NR11、NR12C(=O) Oからなる群より選ばれ；R1 はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH2CH2O)t-、 -(OCH2CH2)w-、又はその任意の組み合わせからなる群より選ばれ、ただし、t、wはそれぞれ1〜18の範囲内の整数から選ばれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及び18を含み；R2、 R3、R4、 R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；rは0又は1であり；sは0〜8の範囲内の整数から選ばれ、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含み；XはNR13、O、S、C(=O)、C(=S)、C(=O)NR14、NR15C(=O)、NR16C(=S)、C(=S)NR17、OC(=O)、 C(=O)O、OC(=S)、C(=S)Oからなる群より選ばれ；ただし、R13、R14、R15、R16及びR17は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；o、p、qはそれぞれ0〜8の範囲内の整数から選ばれ、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含み、且つo、p、qの中の一つが0である場合、他の二つは0ではない。
【００１２】
他の好ましい例において、前記Aは切断可能性リンカーの組み合わせ又は切断不可能性リンカーであり、より好ましくは、前記Aの構造は式III又はIVで表される。
【００１３】
【化３】
0006471263.tif 000004
【００１４】
ただし、Cは切断可能性リンカーであり；E、Fは自殺性リンカーであり；e、ｆはそれぞれ０〜５の範囲内の整数から選択され、0、1、2、3、4及び５を含み；Gは切断不可能性リンカーであり；ｇは０〜５の範囲内の整数から選択され、0、1、2、3、4及び５を含む。
【００１５】
他の好ましい例において、前記抗体薬物複合体の構造は、式Ｖ、ＶIで表される：
【００１６】
【化４】
0006471263.tif 000005
【００１７】
ただし、Ｌは抗体、抗体断片、又はタンパク質であり；ZはO、S、NR2、NR3C(=O)、C(=O)NR4、C(=O)O、OC(=O)、C(=S)O、OC(=S)、C(=S)NR5、NR6C(=S)、C(=S)S、SC(=S)、NR7C(=O)NR8、NR9C(=S)NR10、OC(=O)NR11、NR12C(=O)Oからなる群より選ばれ；R1 はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH2CH2O)t-、-(OCH2CH2)w-、又はその任意の組み合わせからなる群より選ばれ、ただし、t、wはそれぞれ1〜18の範囲内の整数から選ばれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及び18を含み；R2、 R3、R4、 R5、R6、 R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；rは0又は1であり；s は0〜8の範囲内の整数から選ばれ、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含み；XはNR13、O、S、C(=O)、C(=S)、C(=O)NR14、NR15C(=O)、NR16C(=S)、C(=S) NR17、OC(=O)、C(=O)O、OC(=S)、C(=S)Oからなる群より選ばれ；ただし、R13、R14、R15、R16及びR17は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；o、p、qはそれぞれ0〜8の範囲内の整数から選ばれ、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含み、且つo、p、qの中の一つが0である場合、他の二つは0ではない。
【００１８】
他の好ましい例において、前記抗体は細胞表面の受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体である。
【００１９】
他の好ましい例において、前記薬物は、細胞毒性薬であり、自己免疫疾患の治療のための薬物及び抗炎症薬である。
【００２０】
本発明の第二の方面において、構造が下記式で表されるトリマレイミド型リンカーを提供する。
【００２１】
【化５】
0006471263.tif 000006
【００２２】
【化６】
0006471263.tif 000007
【００２３】
本発明の第3の表面において、抗体薬物複合体の製造のための式VIIで表される構造を有するトリマレイミド型リンカーの応用を提供する。
【００２４】
【化７】
0006471263.tif 000008
【００２５】
ただし、ZはO、S、NR2、NR3C(=O)、C(=O)NR4、C(=O)O、OC(=O)、C(=S)O、OC(=S)、C(=S)NR5、NR6C(=S)、C(=S)S、SC(=S)、NR7C(=O)NR8、NR9C(=S)NR10、OC(=O)NR11、NR12C(=O) Oからなる群より選ばれ；R1 はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH2CH2O)t-、-(OCH2CH2)w-、又はその任意の組み合わせからなる群より選ばれ、ただし、t、wはそれぞれ1〜18の範囲内の整数から選ばれ、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及び18を含み；R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及びR12は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；rは0又は1であり；sは0〜8の範囲内の整数から選ばれ、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含み；QはNHR13、OH、SH、COOH、C(=S)OH、NR14COOH、NR15C(=S)OH、NCO、NCSからなる群より選ばれ；ただし、R13、R14及びR15は独立にH、アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；o、p、qはそれぞれ0〜8の範囲内の整数から選ばれ、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含み、且つo、p、qの中の一つが0である場合、他の二つは0ではない。
【００２６】
他の好ましい例において、前記トリマレイミド型リンカーの構造は下記式で表される。
【００２７】
【化８】
0006471263.tif 000009
【００２８】
【化９】
0006471263.tif 000010
【００２９】
従って、本発明は、効果的で、簡単で、実用的な化学的なカップリング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明に係る１０個典型的なトリマレイミド型リンカー構造を示す。
【図２】図２は、抗体薬物複合体H-トリマレイミド型リンカー-vcMMAEのポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）の測定結果を示し、番号１〜１０は、それぞれH-1-vcMMAE〜H-10-vcMMAEに対応する。
【図３】図３は、抗体薬物複合体H-トリマレイミド型リンカー-vcMMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）の測定結果を示し、ただし、aはH-2-vcMMAEであり、bはH-6-vcMMAEである。
【図４】図４は、抗体薬物複合体H-トリマレイミド型リンカー-vcMMAEのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）の測定結果を示し、ただし、aはH-2-vcMMAEであり、bはH-6-vcMMAEである。
【図５】図５は、抗体薬物複合体H-5-vcMMAEの非変性質量分析（Native MS）の測定結果を示し、ただし、aは質量スペクトルの原始データであり、bはデコンボリューション質量スペクトルである。
【図６】図６は、抗体薬物複合体H-トリマレイミド型リンカー-vcMMAEの酵素結合免疫吸着法（ELISA）の測定結果を示す。
【図７】図7は、抗体薬物複合体H-トリマレイミド型リンカー-vcMMAEの細胞増殖阻害実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明者は、数年間深く掘り下げて研究した後、新規なトリマレイミド型リンカーを開発した。そのようなリンカー構造は、同時に抗体鎖間のシステイン残基又は他の残基をカップリングすることができる3つのマレイミド基を含む。 トリマレイミド型リンカーが抗体とカップリングした産物の主な成分は、DAR-3成分（90％以上になる）であり、普遍的であり、ほとんどの抗体に適用することができるため、広い応用見通しを持つ。
【００３２】
具体的に、本発明により提供される「トリイミド型リンカー」は、三つのマレイミド単位及び第4の結合基を含む。 3つのマレイミド単位は、抗体鎖間のチオール基（還元後）又は他の基の架橋に用いられ、第4の結合基は、小分子薬物又は薬物-リンカー単位とのカップリングに用いられる：
【００３３】
【化１０】
0006471263.tif 000011
【００３４】
得られた抗体薬物複合体は、腫瘍細胞のような標的細胞群への薬物送達を標的化するために使用することができる。抗体薬物複合体は、細胞表面タンパク質に特異的に結合することができ、次いで、得られた結合体は、細胞によってエンドサイトーシスされる。細胞内で、薬剤は活性薬剤の形態で放出されて有効性が生じる。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体；抗原に結合可能な抗体フラグメント;又は抗体Fc融合タンパク質；又はタンパク質を含む。薬物は、メイタンシノイド（Maytansinoids）、オーリスタチン(Auristatins)、カリケアマイシン (Calicheamicins)、ドキソルビシン (doxorubicins)、ベンゾジピロール系抗生物質（デュオカルマイシン（Duocarmycins）及びCC-1065）、ピロロベンゾジアゼピンダイマー類（PBDダイマー）、チューブリシン系（tubulysin）などの高活性薬物を含むが、これらの限定されない。場合によっては、薬物はポリエチレングリコールであってもよい。薬物又は薬物-リンカー単位は、トリマレイミド型リンカーにより抗体にカップリングして、鎖間が架橋された複合体を生成する。伝統的な抗体薬物複合体と比較して、本発明の方法によって製造された抗体薬物複合体の主成分はDAR-3の成分であり、DAR値の分布はより狭く、製品の均質性及び薬理学特性の均一性を大きく改善した。
【００３５】
略語
Ab            抗体
Ac            アセチル
ACN           アセトニトリル       
BOC (Boc)     tert-ブトキシカルボニル
t-Bu             ｔert-ブチル
oC                  セルシウス度
DCM           ジクロロメタン
DIEA             ジイソプロピルエチルアミン
DMF           N,N-ジメチルホルムアミド
Elisa            酵素結合免疫吸着法
EtOAc            酢酸エチル
Eq            当量
g                グラム
h                時間
HOSu             N-ヒドロキシスクシンイミド
HIC           疎水性相互作用クロマトグラフィー
HPLC             高速液体クロマトグラフィー
LC-MS            液体クロマトグラフ質量分析計
Linker            リンカー
MeOH                 メタノール
mAb           モノクローナル抗体
min           分間
mL            ミリリットル
MS            質量分析法
nm            ナノメートル
μg             マイクログラム
μL             マイクロリットル
PE            石油エーテル
prep-RP-HPLC  分取逆相-高速液体クロマトグラフ
rt            室温
Rt            保持時間
SDS-PAGE         ポリアクリルアミドゲル電気泳動
SEC           サイズ排除クロマトグラフィー
TEA           トリエチルアミン
TFA           トリフルオロ酢酸
THF           テトラヒドロフラン
TLC           薄層クロマトグラフィー
TsCl             塩化パラトルエンスルホニル
定義
本文に用いた用語「アルキル基」は、ノルマル、第２級、第３級又は環状炭素原子を含む飽和炭化水素基であり、例えば、メチル基、エチル基、1-プロピル基、２-プロピル（イソプロピル基）、シクロヘキシル基などである。
【００３６】
「アルケニル基」は、ノルマル、第２級、第３級又は環状炭素原子を含む不飽和炭化水素基であり、少なくとも１つの炭素-炭素sp2二重結合(C=C)を含み、例えば、ビニル基、アリル基などである。
【００３７】
「アルキニル基」は、ノルマル、第２級、第３級又は環状炭素原子を含む不飽和炭化水素基であり、少なくとも１つの炭素-炭素sp三重結合(C≡C)を含み、例えば、エチニル基、プロパルギル基などである。
【００３８】
「アリール基」は母体芳香環系から１つの炭素原子上の１つの水素原子を除去して得られた６〜１２個炭素原子の１価芳香族炭化水素基であり、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセン基、ビフェニル基などである。
【００３９】
「ヘテロアリール基」は、前記「アリール」骨格上の１つ又は複数の炭素原子が、ヘテロ原子N、O、P及びSにより置換されて形成されたものであり、例えば、ピリジニル基、チオフェニル基、フラニル基などである。
【００４０】
「ヘテロ環」は、母体芳香環又は非芳香環系の１つ又は複数の炭素原子が、ヘテロ原子N、O、P及びSに置換されて形成されたものであり、例えば、ピリジン、チオフェン、フラン、ヘキサヒドロピリジン（ピペリジン）、及びテトラヒドロフランなどである。
【００４１】
「ヘテロ環基」は、前記「ヘテロ環」の骨格上の１つの炭素原子又はヘテロ原子上の水素原子を除去して形成された炭化水素基であり、例えば、ピリジニル基、チオフェニル基、フラニル基、ヘキサヒドロピリジニル基（ピペリジニル基）、テトラヒドロフラニル基などである。
【００４２】
「アリールアルキル基」は、末端又はsp3炭素原子に連結された１つの水素原子がアリール基に置換された脂肪族アルキル基であり、例えば、ベンジル基、3-フェニルプロピル基などである。アリールアルキル基のアルキル基部分はアルケニル基又はアルキニル基を含んでもよい。
【００４３】
「ヘテロアリールアルキル基」は、末端又はsp3炭素原子に連結された１つの水素原子がヘテロアリール基により置換された脂肪族アルキル基であり、例えば、2-ピリジニルエチル基、3-フラニルプロピル基などである。ヘテロアリールアルキル基のアルキル基部分はアルケニル基又はアルキニル基を含んでもよい。
【００４４】
「アルキレン基」は、直鎖状、分岐状又は炭素環を含む飽和炭化水素基であり、母体アルキルの同じ又は二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの一価基のラジカルセンターが生成される。例えば、メチレン基(-CH2-)、1,2-エチレン基(-CH2CH2-)、1,3-プロピレン基（-CH2CH2CH2-)などである。
【００４５】
「アルケニレン基」は、直鎖状、分岐状又は炭素環を含む不飽和炭化水素基であり、母体アルケンの同じ又は二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの一価基のラジカルセンターが生成される。例えば、1,2-エチレン基(-CH=CH-)、1,3-プロピレン基(-CH2CH=CH-)などである。
【００４６】
「アルキニレン基」は、直鎖状、分岐状又は炭素環を含む不飽和炭化水素基であり、母体アルキンの同じ又は二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの一価基のラジカルセンターが生成される。例えば、アセチレン基(-CH≡CH-)、1,3-プロパルギル基(-CH2C≡CH-)などである。
【００４７】
「アリーレン」は、６〜１２炭素原子の芳香族炭化水素基であり、母体芳香族系の二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの１価ラジカルセンターが生成され、例えば、1,2-フェニレン基、1,3-フェニレン基、1,4-フェニレン基などである。
【００４８】
「置換アルキル基」、「置換アルケニル基」、「置換アルキニル基」、「置換アリール基」、「置換ヘテロアリール基」、「置換ヘテロ環基」、「置換アリールアルキル基」、「置換ヘテロアリールアルキル基」は、それぞれ「アルキル基」、「アルケニル基」、「アルキニル基」、「アリール基」、「ヘテロアリール基」、「ヘテロ環基」、「アリールアルキル基」、「ヘテロアリールアルキル基」の１つ又は複数の水素原子がそれぞれ独立に置換基により置換されたものである。置換基は、一般的に-X、-OR、-NR2、-NO2、-CN、-SO3R、-CO2Rなどを含むが、これらに限定されない。ただし、Xはハロゲン原子である；RはH、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、保護基又はプロドラッグ部分である。前記アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンも同じように置換されてもよい。
【００４９】
「その中の任意の組み合わせ」は、二つ又は複数の置換基が所定の連結方法により組み合わせて形成された１つの新規な置換基であり、例えば、ベンジル基(フェニル基+メチレン基)、3-フェニルプロピル基(フェニル基+1,3-プロピレン基)、2-シクロヘキシルプロピル基(シクロヘキシル基+1,2-プロピレン基)、及び3-(3-ピリジニル基)プロピル基(3-ピリジニル基+1,3-プロピレン基)などである。
【００５０】
本明細書で使用される用語「薬物/抗体比（Drug/Antibody Ratio、DAR）」は、各抗体分子に結合した薬物の数を指す。 抗体薬物複合体試料は多数の異なるDAR値の成分を含むので、「平均DAR値」及び「DAR値分布」という2つの概念は、抗体薬物複合体の組成を記述することに対してより適している。 平均DAR値は、試料中の抗体の総数に対する薬物分子の総数の比であり、DAR値分布は、試料中の異なるDAR値の成分の含有量分布を指す。
【００５１】
本文で使用されるように、「抗体」又は「抗体単位」はその属する範囲内で抗体構造の任意の部分を含む。この単位は、受容体、抗原、又は標的細胞群が有する他の受容体単位と結合、反応的に関連、又は複合することができる。 抗体は、治療又は生物学的に改変しようとする細胞群の一部と結合、複合又は反応することができる任意のタンパク質又はタンパク質類分子である。
【００５２】
本明細書において、抗体薬物複合体を構成する抗体は、元々の野生状態時の抗原結合能を保持していることが好ましい。従って、本発明における抗体は、好ましくは特異的に抗原に結合することができる。関連する抗原は、例えば、、腫瘍関連抗原（TAA）、細胞表面受容体タンパク質及び他の細胞表面分子、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織増殖及び分化に関連する分子（例えば、既知又は予測機能性）、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、血管新生に関与する分子、及び血管新生に関連する分子（例えば、既知又は予測機能性）を含む。腫瘍関連因子は、クラスター分化因子（例えば、CDタンパク質）であることができる。 本発明に記載される抗体に結合する抗原は、上記分類の1つ又はサブセットであることができるが、他のサブセットは、（標的抗原と比較して）特定の性質の他の分子/抗原を含む。
【００５３】
抗体薬物複合体に使用される抗体には、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体が含まれるが、これらに限定されない。このような腫瘍関連抗原は本分野で周知であり、本分野の周知の抗体調製方法及び情報により調製することができる。癌の診断及び治療のための有効な細胞レベルの標的を開発するために、研究者らは、膜貫通又は他の腫瘍関連ポリペプチドの発見を試みた。これらの標的は、1つ又は複数の癌細胞表面上で特異的に発現することができ、1つ又は複数の非癌細胞の表面上にほとんど又は全く発現しない。一般的に、このような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌細胞の表面に比べて、癌細胞表面上でより過剰発現される。このような腫瘍関連因子を同定することにより、腫瘍の抗体治療に基づく特異的な標的特性を大幅に高めることができる。
【００５４】
腫瘍関連抗原には、以下に列挙する腫瘍関連抗原（1）〜（36）が含まれるが、これらに限定されない。便宜上、業界に知られている抗原関連情報は以下のように、名称、他の名称、ジェンバンク（Genbank）登録番号を含む。腫瘍関連抗原に対応する核酸及びタンパク質の配列は、Genbankなどの公開データベースを参照することができる。抗体標的が対応する腫瘍関連抗原には、参考文献で同定された配列と少なくとも70％、80％、85％、90％又は95％の相同性を有する全てのアミノ酸配列変異体及び相同体が含まれ、或いは引用文献中の腫瘍関連抗原配列と完全に一致した生物学的性質及び特徴を有する。
【００５５】
腫瘍関連抗原（１）〜（36）：
（1）BMPR1B(骨形態形成タンパク質受容体-1B、Genbank登録番号 NM_001203)；
（2）E16 (LAT1、SLC7A5、Genbank登録番号NM_003486)；
（３）STEAP1（6つの膜貫通前立腺上皮抗原、Genbank登録番号NM_012449）；
（４）0772P (CA125、MUC16、Genbank登録番号AF361486)；
（５）MPF (MPF、MSLN、SMR、巨核球増強剤、メソテリン、Genbank登録番号NM_005823)；
（6）Napi3b (NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアファミリー34（リン酸ナトリウム）メンバー2、タイプIIナトリウム依存性リン酸トランスポーター3b、Genbank登録番号NM_006424)；
（７）Sema 5b (FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン5b Hlog，semaドメイン、7つのトロンボスポンジンリピート（タイプ1及びタイプ1類）、膜貫通ドメイン（TM）及び短い細胞質内ドメイン（セマフォリン）5B、Genbank登録番号AB040878)；
（８）PSCA hlg (2700050C12Rik、C530008016Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、 RIKEN cDNA 2700050C12遺伝子、Genbank登録番号AY358628)；
（9）ETBR (エンドセリンペプチドタイプB受容体、Genbank登録AY275463);
（10）MSG783 (RNF124、偽タンパク質FLJ20315、Genbank登録番号NM_017763)；
（１１）STEAP2 (HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、 前立腺癌関連遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、6つの膜貫通前立腺上皮抗原2、6つの貫通前立腺タンパク質、Genbank登録番号AF455138)；
（12）TrpM4 (BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーM、メンバー4、Genbank登録番号NM_017636)；
（13）CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、テラトカルシノーマ由来増殖因子、Genbank登録番号NP_003203又はNM_003212)；
（1４）CD21(CR2(補体受容体2)又はC3DR(C3d/EBウイルス受容体)又はHs.73792, Genbank登録番号M26004)；
（1５）CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫グロブリン関連β)、B29、Genbank登録番号NM_000626)；
（16）FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(ホスファターゼアンカータンパク質1a含有SH2ドメイン)、SPAP1B、SPAP1C、Genbank登録番号NM_030764)；
（17）HER2(ErbB2、Genbank登録番号M11730)；
（1８）NCA(CEACAM6, Genbank登録番号M18728)；
（1９）MDP(DPEP1, Genbank登録番号BC017023)；
（２０）IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7、Genbank登録番号AF184971)；
（２１）ブレビカン(BCAN、BEHAB、Genbank登録番号AF229053)；
（２２）EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5、Genbank登録番号NM_004442)；
（２３）ASLG659(B7h、Genbank登録番号AX092328)；
（２４）PSCA(前立腺幹細胞抗原前駆体、Genbank登録番号AJ297436)；
（２５）GEDA(Genbank登録番号AY260763)；
（２６）BAFF-R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3、Genbank登録番号AF116456)；
（27）CD22(B細胞受容体CD22-Bアイソフォーム、Genbank登録番号AK026467)；
（28）CD79a(CD79A、CD79α、免疫グロブリン関連α、Igβ(CD79B)と共有結合役割を果たし、表面でIgM分子と複合体を形成することができ、B細胞分化シグナルの形質導入に関与するB細胞特異的タンパク質、Genbank登録番号NP_001774.1)；
（29）CXCR5(バーキット（Burkitt’s）リンパ腫受容体1、CXCL13ケモカインにより活性化されたGタンパク質共役受容体、リンパ球遊走及び体液性防御において役割を果たし、HIV-2感染及びAIDS、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病で作用を発揮する、Genbank登録番号NP_001701.1)；
(30)HLA-DOB（MHCII系分子のβサブユニット（Ia抗原）、これはペプチドと結合してCD4+Tリンパ細胞に呈する、Genbank登録番号NP_002111.1）；
（31）P2X5（プリン受容体P2Xリガンド開口性イオンチャネル5、細胞外ATP開口性イオンチャネルによってシナプス伝達及び神経発生に関与し、その欠陥によって特発性排尿筋不安定の病態生理学的状態の発生可能性がある、Genbank登録番号NP_002552.2）；
（32）CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb-2、Genbank登録番号NP_001773.1)；
（33）LY64（リンパ球抗原64（RP105）、ロイシンリッチリピートのI型膜タンパク質（LRR）ファミリー、B細胞の活性化及びアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性エリテマトーデスの患者の疾病の活動の増加に関連する、Genbank登録番号 NP_005573.1）；
（34）FcRHl（Fc受容体タンパク質1、C2型Ig様及びITAMドメインを含む推定上の免疫グロブリンFcドメイン受容体、Bリンパ球分化において役割を果たす可能性がある、Genbank登録番号NP_443170.1）；
（35）IRTA2（転座関連免疫グロブリンスーパーファミリーの受容体2、推定上の免疫受容体、B細胞の発達及びリンパ腫の生成において役割を果たす可能性がある；転座により引き起こされる遺伝子障害は、あるB細胞悪性疾患で発生する、Genbank登録番号NP_112571.1）；
（36）TENB2（推定上の膜貫通型プロテオグリカン、成長因子EGF/ヘレグリン（heregulin）ファミリー及びフォリスタチン(follistatin)と関連する、Genbank登録番号AF179274）；
本文で使用されるように、「薬物」又は符号「D」は、一般的に所望の生物活性を有し、且つ反応性官能基を有するので本発明の前記複合物の化合物を容易に製造できるものを指す。所望の生物活性は、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療、予防を含む。従って、必要な反応性官能基を具備することであれば、用語「薬物」に係る化合物は、公式の国家薬局方、及び例えば米国公式の同種療法薬局方、公式の全国処方集、又は他の任意の増補版などで確認された薬物を含む。典型的な薬物は医師用卓上参考書（PDR）及び米国食品医薬品局（FDA）のオレンジブックに掲載されている。 新薬の途切れない発見及び開発により、本特許はこれらの薬物も本発明の前記複合体薬物のプロドラッグに組み込むべきであると規定している。
【００５６】
好ましくは、薬物は下記のものを指す。つまり、癌治療のための細胞毒性薬；所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチド、例えば、アブリン、リシンA、緑膿菌外毒素、ジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子及び、リンホカイン、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）のような生物応答調節剤、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子、又は他の成長因子を含む他の適切なタンパク質。
【００５７】
一方では、薬物は、メイタンシン(maytansine)又はメイタンシノイド(maytansinoids)である。メイタンシン化合物は、微小管蛋白質の微小管形成を阻害することによって細胞増殖を阻害する（Science 1975,189,1002-1005; US 5208020）。メイタンシノイドはメイタンシンの誘導体である。メイタンシンとメイタンシノイドは、いずれも高い細胞毒性を持つが、癌の臨床治療において大きな制限があり、これはこれらの分子の腫瘍に対する低い選択性に起因する。しかしながら、この高い細胞毒性は、抗体薬物複合体の好ましい薬物部分とするように促す。以下は、メイタンシン、メイタンシノイド、及び抗体薬物複合体の応用で常に使用される3つのメイタンシノイド分子の構造である。
【００５８】
【化１１】
0006471263.tif 000012
【００５９】
合成メイタンシノイドの主な原料は、主にアンサマイトシン（ansamitocins）によって加水分解されるメイタンシノール(maytansinol)である。アンサマイトシンは発酵によって調製することができる。報告によると、アンサマイトシン誘導体(WO2012/061590)とアラニルメイタンシノール（US 2012/0121615）も抗体薬物複合体としての薬物「弾頭」とすることができる（これらの2種類の分子構造は以下の図を参照する）。
【００６０】
【化１２】
0006471263.tif 000013
【００６１】
一方では、薬物は、オーリスタチン類(auristatins)薬物である。オーリスタチン系薬物はドラスタチン１０（dolastatin 10）の誘導体であり、後者は海洋軟体動物である海兎体内から単離された生物活性を有するポリペプチドである（US7498298）。 ドラスタチン１０はチューブリン（ビンクリスチンと同じ結合領域）を結合することによってチューブリン重合を阻害する。ドラスタチン１０、オーリスタチンPE、オーリスタチンEは、何れも線状ポリペプチドであり、４つのアミノ酸（その中の3つのアミノ酸は、ドラスタチン類化合物の特有のものである）とC-末端アミド基を含む。２つの代表的なオーリスタチン系化合物であるモノメチルオーリスタチンE (MMAE)及びモノメチルオーリスタチンＦ(MMAF)は、いずれも抗体薬物複合体の好ましい薬物部分である。
【００６２】
【化１３】
0006471263.tif 000014
【００６３】
一方では、薬物はツブリシン（Tubulysins）系薬物である。ツブリシンは、粘液細菌から抽出された天然産物の一種であり、チューブリンの重合を効果的に阻害することができるため、抗細胞有糸分裂の活性を有し、その中でツブリンジンDの活性が最も優れている。ツブリシンDは複雑なテトラペプチド化合物であり、その構造にO-アシル/N、O-アセタール官能基が含まれるため、酸性及びアルカリ性の条件下で何れも不安定である。US2011/0021568とUS2013/0224228は、それぞれ一連のツブリシンの類似体を開示しており、その構造で上記不安定な官能基が除去されると共に、高い細胞活性も有する。
【００６４】
【化１４】
0006471263.tif 000015
【００６５】
一方では、薬物はカリケアミシン系(calicheamicins)薬物である。カリケミシリン系薬物は抗腫瘍抗生物質であり、DNA小溝結合と結合し、特異的部位の二重らせんDNA切断を促進することにより、アポトーシスを引き起こす。カリケミシリン系薬物は、in vitroサブピコモル級別の高活性を有するが、低い治療指数は、臨床適用の見通しを排除した。しかしながら、このような高活性により、これらは抗体薬物複合体のための理想的な候補薬物（例えば、イノツズマブ オゾガマイシン（Inotuzumab Ozogamicin））となる。
【００６６】
【化１５】
0006471263.tif 000016
【００６７】
一方では、薬物はドキソルビシン系(doxorubicins)である。ドキソルビシンはDNA二重らせん構造に挿入することによりDNA複製を阻止するため、化学療法剤として使用される。しかしながら、ドキソルビシン系の低い細胞毒性（ヒト癌細胞株について、半数阻害濃度は0.1〜0.2マイクロモルであり、抗体薬物複合体に利用される細胞毒性薬の活性は通常サブナノモル級である）のため、抗体薬物複合体における応用が一般的ではない。
【００６８】
【化１６】
0006471263.tif 000017
【００６９】
一方では、薬物はベンゾジピロール系抗生物質（デュオカルマイシン（duocarmycins）、CC-1065など）と他のシクロプロパピロロインド-4-オン(cyclopropapyrroloind-4-one、CPI)誘導体である。この種類の化合物は効率的なDNA小溝結合-アルキル化剤である。シクロプロパベンズインドール-4-オン（cyclopropabenzindol-4-one、CBI）類似体の化学構造はより安定で、生物学的活性もより高く、天然CPIアルキル化サブユニットを含むそれらの親化合物よりも容易に合成できる。 １つの代表的なCBI誘導体は、フェノール性ヒドロキシル保護誘導体CBI（下記の図を参照）であり、弱化されたプロドラッグ毒性及び増加された水溶性を有する。
【００７０】
【化１７】
0006471263.tif 000018
【００７１】
一方面で、薬物はピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン系(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines,PBDs）又はPBD二量体（PBD  dimers）である。 PBDはストレプトマイセス（Streptomyces）によって産生される天然産物であり、そのユニークな特徴は、DNA小溝で、正確にはプリン-グアニン-プリン配列で曲がっていない共有結合を形成することである。PBDの使用で一部分の小分子戦略としてDNA配列を標的としてロッキングし、及び新規な抗癌剤及び抗菌剤として、ますます関心を集めている（Biochemistry 2008,47,11818〜11829）。柔軟な炭素鎖を使用して2つのPBDユニットのC8/C8'ヒドロキシル基を連結し、得られる二量体は増加された生物活性を有する（WO2011/130616）。 PBD二量体は、逆順の5'-Pu-GATC-Py-3¢鎖間架橋のような配列選択可能なDNA損傷を生じることにより、その生物学的活性をもたらすと考えられる。これらの化合物は、非常に強力な細胞毒性薬であることが証明されており、抗体薬物複合体の代替薬物とすることができる。
【００７２】
【化１８】
0006471263.tif 000019
【００７３】
他の方面で、薬物は上記の種類のみに限定されず、抗体薬物複合体に用いることができる全ての薬物も含む。
【００７４】
本文で使用する用語「リンカー」又は「抗体薬物複合体のリンカー」は二官能基又は多官能基を有する分子を指し、それぞれタンパク質/抗体分子及び薬物分子と反応することができるため、「リンク」としてタンパク質/抗体を薬物分子に結合させる。細胞内での薬物放出の機序に応じて、「リンカー」又は「抗体薬物複合体のリンカー」は、切断不可能性リンカー（(non-cleavable linker)）及び切断可能性リンカー（cleavable linker）の2つの種類に分けることができる。
【００７５】
切断不可能性リンカーは比較的安定なリンカーであり、その構造は体内環境で分解しにくい。切断不可能性リンカーを含む抗体薬物複合体において、薬物放出機序は、複合体が抗原に結合し、細胞によってエンドサイトーシスされた後、抗体はリソソームで消化されて、小分子薬物、リンカー及び抗体アミノ酸残基からなる活性分子を放出する。これによる薬物分子構造の変化はその細胞毒性を減少させないが、活性分子が電荷を帯びる（アミノ酸残基）ため、隣接する細胞に浸透することが困難である。従って、このような活性薬物は、隣接した標的抗原を発現しない（抗原陰性細胞）腫瘍細胞を殺すことが困難である（傍観者効果、bystander effect）（Bioconjugate Chem. 2010,21,5-13）。一般的なリンカーは、例えばＭＣリンカー及びMCCリンカーなどがあり、下記図に示す。
【００７６】
【化１９】
0006471263.tif 000020
【００７７】
切断可能性リンカーは、読んで字のごとく、標的細胞内で切断され、活性薬物（小分子薬物自体）を放出することができる。切断可能性リンカーは、化学的に不安定なリンカーと酵素不安定なリンカーの2つの主な種類に分けることができる。
【００７８】
化学的に不安定なリンカーは、血漿及び細胞質特性の差異により選択的に切断することができる。そのような特性には、pH、グルタチオン濃度などが含まれる。
【００７９】
pH感受性リンカーは、一般的に酸分解リンカーとも称する。このようなリンカーは、血液の中性環境で比較的安定である（pH7.3〜7.5）が、弱酸性エンドソーム（pH5.0〜6.5）及びリソソーム（pH4.5〜5.0）で加水分解される。第1世代抗体薬物複合体は、例えばヒドラゾン、カーボネート、アセタール、ケタールのようなリンカーを主に使用している。酸切断リンカーの血漿安定性が限られているため、このようなリンカーに基づく抗体薬物複合体は、一般により短い半減期（2〜3日）を有する。このような短い半減期は、新世代の抗体薬物複合体におけるpH感受性リンカーの使用をある程度制限している。
【００８０】
グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィドリンカーとも称する。薬物放出は、細胞内グルタチオンの高濃度（ミリモル範囲）と血液内比較的低いグルタチオン濃度（マイクロモル範囲）の差異により引き起こす。これは特に腫瘍細胞に当てはまり、その低い酸素含有量はレダクターゼ活性を増加させ、より高いグルタチオン濃度をもたらす。ジスルフィド結合は、熱力学的安定性を有するため、血漿中で良好な安定性を有する。
【００８１】
ペプチドリンカーのような酵素不安定なリンカーは、薬物放出をより良好に制御することができる。ペプチドリンカーは、カテプシンB(Cathepsin B)又はプラスミン（ある腫瘍組織において、このような酵素の量が増加される）のようなリソソームエンドプロテアーゼによって効果的に切断される。このペプチド結合は、細胞外の不適切なpH及び血清プロテアーゼインヒビターによって、プロテアーゼが細胞外側では生存できないため、血漿循環において非常に安定であると考えられる。高い血漿安定性及び良好な細胞内切断の選択性と有効性の観点から、酵素不安定リンカーは、抗体薬物複合体の切断可能性リンカーとして広く使用されている。典型的な酵素不安定性リンカーは、例えばvcリンカーなどである。
【００８２】
【化２０】
0006471263.tif 000021
【００８３】
自殺性リンカーは、一般的に切断可能性リンカーと活性薬物との間にはめ込まれる、又はその自体が切断可能性リンカーの一部である。自殺性リンカーの作用機序は下記のようである。つまり、切断可能性リンカーが適切な条件下で切断された後、自殺性リンカーが自発的に構造の再配列を行って、それが結合している活性薬物を放出することができる。一般的な自殺性リンカーは、例えばp-アミノベンジルアルコール（PAB）などがある。
【００８４】
【化２１】
0006471263.tif 000022
【００８５】
抗体薬物複合体
本発明によって提供される抗体薬物複合体は、抗体、トリマレイミド型リンカー、他のリンカー及び薬物からなり、前記リンカーは、切断可能性リンカーの組み合わせ又は切断不可能性リンカーを含む。
抗体は、薬物-リンカーのカップリングに使用できる一連のアミノ酸部位を含むグロブリンである。その三次及び四次構造のために、溶媒に接近可能なアミノ酸残基のみがカップリングに利用可能である。実際、高い収率のカップリングは、通常、リシン残基のe-アミノ基又はシステイン残基のチオール基上で生じる。
【００８６】
抗体タンパク質の表面上の大量のリシン側鎖は、薬物カップリングに利用可能な大量の部位をもたらして、得られた抗体薬物複合体は混合物であり、異なる薬物カップリング量（薬物/抗体比、DAR）とカップリング部位を含む。
【００８７】
本発明のトリマレイミド型リンカーを用いて得られるカップリング生成物は、伝統的なカップリング法により得られた抗体複合体と比較して、平均DAR値が３に近接して、最適の抗体薬物複合体の平均DAR値（2〜4）の範囲内にあるばかりでなく、そのDAR値分布範囲も非常に狭く、主成分はDAR 3の成分（90％以上）である。さらに、カップリング生成物は、ヌード抗体（DAR = 0）を含まないので、この成分は細胞毒性に影響を及ぼさない。同時に、カップリング生成物は重カップリング生成物（例えば、DAR = 8）を含有しなく、この成分は体内で除去される速度が（DAR低い成分に対して）非常に速い。従って、本発明により提供される抗体薬物複合体生成物の不均一性は大幅に改善される。
【００８８】
トリマレイミド型リンカーにおいて、マレイミド基間の距離（炭素鎖長）は、トリマレイミド型リンカーの抗体鎖間への架橋効率に影響を与える可能性がある。他のリンカー-薬物をカップリングするために使用される側鎖の長さ及び組成も、抗体薬物複合体の特性及び薬物の活性に影響することもある。本発明者らは、上記因子を研究するために、一連の異なる「サイズ」を有するトリマレイミド型リンカーを合成した。
【００８９】
トリマレイミド型リンカー
【００９０】
【化２２】
0006471263.tif 000023
【００９１】
抗体薬物複合体
【００９２】
【化２３】
0006471263.tif 000024
【００９３】
製造方法
方法1：以下に示すように、工程Ａにおいて、一つのリンカー（L）をトリマレイミド型リンカー（T）とカップリングさせて、トリマレイミド型リンカー-リンカー（T-L）を得る。工程Bにおいて、T-Lを薬物分子（D）とカップリングさせて、トリスマレイミド型リンカー-リンカー-薬物（T-L-D）を得る。工程Cにおいて、抗体鎖間のジスルフィド結合が還元されて合計8個のチオール基が生成される。工程Dにおいて、T-L-Dは、還元された抗体のチオール基と架橋されて、抗体薬物複合体を得る。
【００９４】
【化２４】
0006471263.tif 000025
【００９５】
方法2：以下に示すように、工程Aにおいて、リンカー（L）を薬物分子（D）にカップリングさせて、リンカー-薬物（L-D）を得る。工程Bにおいて、トリマレイミド型リンカー（T）をリンカー-薬物分子（L-D）にカップリングさせて、トリマレイミド型リンカー-リンカー-薬物（T-L-D）を得る。工程Cにおいて、抗体鎖間のジスルフィド結合が還元されて合計8個のチオール基が生成される。工程Dにおいて、T-L-Dは、還元された抗体チオール基と架橋されて、抗体薬物複合体を得る。
【００９６】
【化２５】
0006471263.tif 000026
【００９７】
使用
本発明は、特定の細胞群を標的として、細胞表面の特異的なタンパク質（抗原）に結合し、結合体はエンドサイトーシスされて、薬物が活性形態で細胞に放出される抗体薬物複合体を提供する。
【００９８】
本発明は、特定の細胞群を標的として、細胞表面の特異的タンパク質（抗原）に結合して効果を生じさせ、又は細胞外で薬剤を放出し、薬物が細胞内に浸透して効果が発生する抗体薬物複合体を提供する。
【００９９】
本発明は、有効量の薬物複合体及び薬学的に許容される担体又は媒体を含む複合体を提供する。
【０１００】
本発明は、治療有効量の本発明により提供される抗体薬物複合体を癌又は他の腫瘍に罹患している動物に投与する、動物体内の癌又は他の腫瘍を治療する方法を提供する。
【０１０１】
本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に罹患している患者に治療有効量の本発明により提供される抗体薬物複合体を投与する、自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療する治療方法を提供する。
【０１０２】
上述の特徴又は実施例で述べた特徴は、任意に組み合わせることができる。本明細書に開示された全ての特徴を任意の組成物の形態と併用して使用することができ、明細書に開示された各特徴は、同様、同等或いは類似した目的の代わりの特徴により置換されることができる。従って、特に説明しない限り、開示された特徴は、同等又は類似の特徴の一般的な一例に過ぎない。
【０１０３】
本発明のメリットは下記のようである。
【０１０４】
1.本発明は、初めて抗体薬物複合体の平均DARを３に制御できるカップリング技術を提供した。
【０１０５】
2.本発明により提供されるカップリング方法は、大部分の抗体に適しているので、各抗体に対して複雑な形質転換の修飾により固定点カップリング部位を導入することを回避して、広範な適用見通しを有する。
【０１０６】
3.本発明により提供される3つのマレイミド基を含む新規なトリマレイミド型リンカーは、同時に抗体鎖間のシステイン残基又は他の残基をカップリングすることができ、簡単な化学方法により抗体とカップリングする。しかしながら、伝統的なカップリング法と比較すると、このようなリンカーを用いて得られた複合体の主成分はDAR〜3（90％以上である）の成分であり、DAR値の分布が非常に狭いため、得られる生成物の均質性が大幅に改善された。
【０１０７】
以下、具体的な実施例を組み合わせて、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるべきである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、普通の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。全ての反応は、何れも窒素保護下で実施した（水素化反応以外に）ため、実施例には示されていない。
【０１０８】
別途に定義しない限り、文中に使用される全ての専門・科学用語は、本分野の熟練者によく知られる意味と同じである。また、記載される内容に類似或は同等の方法及び材料はいずれも本発明に使用することができる。文中に記載の好ましい実施形態及び材料は例示だけのためである。
【０１０９】
本発明の以下の実施例において使用される一般的な工程は下記のようである。
【０１１０】
一般的な工程A
抗体薬物複合体の調製
抗体溶液（2〜10mg/mL、25mMホウ酸-ホウ酸ナトリウム緩衝液、25mM塩化ナトリウム、1mMジエチレントリアミン五酢酸、pH7.0〜8.0）にトリ（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（10当量、ストック溶液濃度10mM）を加える。反応液を37℃の シェイキングバスで2時間インキュベートした。反応液を〜10℃に冷却し、限外ろ過置換緩衝液（100mMリン酸二水素カリウム-リン酸水素二カリウム、100mM塩化ナトリウム、1mMジエチレントリアミン五酢酸、pH7.0〜8.0）を経て、反応溶液におけるジメチルスルホキシドの体積が約15％になるように、ジメチルスルホキシドと5-100当量の四歯型リンカーー（リンカー）-薬物化合物（ジメチルスルホキシドストック溶液）を加える。カップリング反応は10℃で0.5時間行う。
【０１１１】
過剰のシステイン溶液を反応溶液に添加して、未反応のトリマレイミド型リンカー-リンカー-薬物化合物をクエンチする。クエンチ反応は10℃で30分間行う。反応液を先ず限外ろ過によりトリマレイミド型リンカー-（リンカー）-薬物-システイン付加体と過剰のシステインを除去した後、0.2μmの孔径のろ過装置で滅菌し、4℃で保存する。
【０１１２】
一般的な工程B
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）
SDS-PAGEは、XCell SureLock(登録商標) Mini-Cellタンパク質垂直電気泳動タンク上でNuPAGE、4〜12％、Bis-Trisゲルを用いて測定したものである：10μg以上のサンプルを対応するローディング緩衝液を混合し、70℃水浴で10分間加熱した。サンプルと標準タンパク質（5μL/ウェル）を濃縮ゲル化ウェルに順次に加え、ゲルを200ｖで50分間泳動した。泳動したゲルを取り出して、脱イオン水で１回洗浄し、次に、クーマシーブリリアントブルーG250色素溶液を添加し、振盪機で16時間染色する。染色されたゲルを脱イオン水で3回洗浄し、振盪機で4時間脱色した後、脱色後のゲルを取り出し、撮影装置に移動させてゲル画像を記録する。
【０１１３】
一般的な工程C
疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）の分析
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、アジレント1100（Agilent 1100）クロマトグラフで測定する。固定相は、TSKgelブチル-NPRカラム（4.6×35mm、2.5μm、東曹（上海）生物科技有限会社）を用いた。溶出勾配は直線勾配であって、２５分間かけて100％緩衝液A[50mMリン酸カリウム（pH7.0）+1.5M硫酸アンモニウム]から100％緩衝液B [80％v/v 50mMリン酸カリウム（pH7.0）、20％v/vイソプロパノール]に置換した。流速は0.8mL/分間、カラム温度は30℃、検出波長は230nmと280nmに設定する。
【０１１４】
一般的な工程D
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析
サイズ排除クロマトグラフィーは、アジレン 1100（Agilent 1100）クロマトグラフで測定する。固定相にTSKgel G3000SWXLカラム（7.8×300mm、5μm、東曹（上海）生物科技有限会社）を用いた。溶出液は、0.1mol/L硫酸ナトリウム/0.1mol/Lリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.6（0.05％アジ化ナトリウムを含有）である。流速は1.0mL/分間、カラム温度は25℃、検出波長は280nmと設定する。
【０１１５】
一般的な工程E
平均DAR値の測定
平均DAR値は紫外線吸収（Clin.Cancer Res.2004、10、7063〜7070； WO2011/039721）によって測定する。
DAR =（εAb248-R*εAb280）/（R*εD280-εD248）
ただし、εAb248及びεAb280は、それぞれ248nm及び280nmにおける抗体のモル吸光係数であり、εD280及びεD248は、それぞれ248nm及び280nmにおけるvcMMAEのモル吸光係数である。R=A248/A280、ここで、A248及びA280は、それぞれ248nm及び280nmにおけるADCの吸光度である（本発明では、SECクロマトグラム上のモノマーピーク面積を用いる）。
【０１１６】
一般的な工程F
非変性質量分析法（ネイティブMS）
50μgのADCサンプルを取り、1μLのグリコシダーゼPNGase F（New England Biolabs、米国）を添加し、37℃で2時間インキュベートする。変異したADCサンプルを酢酸アンモニウム緩衝液（10mM、pH7.5）に置換し、この緩衝液置換工程を10回繰り返す。実験に使用した質量分析計は高分解能Orbitrap Exactive Plus EMR（Thermo Fisher Scientific、ドイツ）であり、イオン源はエミッタを備えたNanoFlex Source（New Objective、USA）である。試料濃度を5μMに調整し、陽イオンモードの質量分析データを直接注入法で収集した。収集した非変性質量分析データを、ソフトウェアProtein Deconvolution 3.0（Thermo Fisher Scientific、ドイツ）を用いて分析する。
【０１１７】
一般的な工程G
酵素結合免疫吸着法（ELISA）
テスト抗体又は抗体薬物複合体と対応する抗原の結合能力は、間接ELISAによって考察する。Her2抗原を固相担体（96ウェルプレート）と連結して固相抗原を形成し、未結合抗原を洗浄して除去する。勾配希釈抗体又は被験抗体薬物複合体を加え、その中で特異的な抗体が抗原と結合して固相抗原-抗体複合体を形成し、固相抗原と結合しない抗体又は抗体薬物複合体を洗浄して除去する；酵素標識抗抗体を加えて、固体抗原に結合した抗体又はADC抗体を結合させ、結合していない抗抗体を洗浄して除去する;基質溶液を添加し、450nm/630nmにおける光学密度をマイクロプレートリーダーで読み取り、曲線を作成して、EC50を計算した。
【０１１８】
一般的な工程H
細胞増殖アッセイ(Cell Proliferation Assay)
一般に、抗体又は抗体薬物複合体の細胞抑制活性は、下記の方法により測定する。即ち、腫瘍関連抗原又は受容体タンパク質を発現する哺乳動物細胞を、細胞培養培地で抗体又は抗体薬物複合体と接触させる、 2〜5日間インキュベートする、細胞数を測定し、曲線を作成して、IC50を計算する。
【０１１９】
特に明記しない限り、全ての無水試薬は、供給元から直接に購入したものであり、窒素下で保管する。購入した他のすべての試薬及び溶媒は高純度であり、使用前にさらに精製する必要がない。
【０１２０】
核磁気共鳴スペクトルは、Bruker Avance III 500-M核磁気共鳴分光計で収集する。化学シフト（δ）の単位はppmであり、テトラメチルシランを基準系（化学シフトは0である）とし、カップリング定数（J）単位はHzである。 
【０１２１】
液体クロマトグラフ質量分析法において、低分解能質量分析データは、HP Agilent 1200高速液体クロマトグラフとインターフェースしたAgilent 6110（酸性）又は6120B（アルカリ性）質量分析計で収集した。
【０１２２】
方法一（方法1）：酸性の高速液体クロマトグラフィーとして、WatersのSunfire  C18逆相カラム（4.60×50mm、3.5μm）を用いて分離し、溶離液の勾配は、1.4分間で5％〜95％のB相（アセトニトリル、0.01％TFA含有）がA相（0.01％TFAを含有する水相）中にあることであり、流速は2.3mL/分で、カラム温度は50℃である。
【０１２３】
方法二（方法2）：アルカリ性高速液体クロマトグラフィーとして、WatersのXbridge  C18逆相カラム（4.60×50mm、3.5μm）を用いて分離し、溶離液の勾配は、1.5分で5％〜95％のB相（アセトニトリル）がA相（10mMの炭酸水素アンモニウムを含む水相）中にあることであり、流速は2.0mL/分で、カラム温度は４0℃である。
【０１２４】
逆相-高速液体クロマトグラフィー精製（分取-RP-HPLC）は、ギルソン（Gilson）機器で実施し、使用される分離カラムは、Waters Sunfire  C18逆相カラム（250×19mm、10μm）である。
【０１２５】
方法三(方法3) 酸性法で調製する。移動相：A：0.1％TFAを含む水相; B：ACN。流速：20mL /分。
【０１２６】
方法四(方法4) アルカリ性法で調製する。 移動相：A：10mM炭酸水素アンモニウムを含む水相; B：ACN。流速：20mL/分。
【０１２７】
使用した細胞系はSK-BR-3ヒト乳癌細胞である。当該細胞株はATCCから得たものである。Her2抗原は義翹神州会社（Sino Biological Inc.、北京）から購入した。抗体H（ハーセプチンバイオシミラー）は、嘉和生物薬業有限会社（Jiahe Biological Pharmaceutical Co.、Ltd.、上海）から購入した。酵素結合抗抗体はSigma（上海）から購入した。基質溶液は、Decent生物技術会社（上海）から購入した。Cell Counting Kit-8（CCK-8）の細胞増殖-毒性検出キットは、同仁堂化学社（Dojindo上海）から購入した。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
化合物1の合成
【０１２９】
【化２６】
0006471263.tif 000027
【０１３０】
合成工程1
化合物11（1.4g、7.1mmol、合成はUS6841690を参照）とブロモ酢酸tert-ブチル（2.86mL、17.8mmol）を無水THF（5mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（60％鉱油中に分散させた、1.28g、32.0mmol）を１時間かけて徐々に加えた。反応液を室温で1時間撹拌し、次いでセライトを通してろ過した。ろ液を濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 20：1→10：1）で精製して淡黄色油状物12（2.0g）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ4.13 (s, 2 H), 3.51 (s, 6 H), 1.49 (s, 9 H)。
【０１３１】
合成工程2
化合物12（1.4g、4.5mmol）をDCM（10mL）に溶解し、次いでTFA（5mL）を加えた。反応液を室温で3時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去して、粗生成物13（1.3g）を得、これを次の工程で直接に使用する。
【０１３２】
合成工程3
化合物13（1.3g、5.1mmol）をTHF（10mL）/H2O（1mL）の混合溶液に溶解し、次いでトリフェニルホスフィン（4.8g、18.3mmol）を加えた。反応液を室温で一晩撹拌し、ろ過して固体を除去した。ろ液に水（20mL）を加えた後、エチルエーテルで抽出した。水相に2M希塩酸（5mL）を加えた後、濃縮して溶媒を除去した。残留物にアセトニトリルを添加しスラリーと調製してろ過し、ろ過ケーキを乾燥して白色固体14（1.0g）を得た。1H NMR (500 MHz, D2O) δ3.49 (s, 2 H), 3.38 (d, 2 H), 3.23 (d, 2 H)。
【０１３３】
合成工程4
化合物14（1.0g、3.5mmol）に飽和重炭酸ナトリウム（20mL）及びTHF（20mL）を加え、溶液を0℃に冷却した。 N-（メトキシカルボニル）マレイミド（1.95g、12.6mmol）を少しずつ加え、反応液を0℃で10分間撹拌し、次いで室温で3時間撹拌した。塩酸溶液を加えて溶液のpHを2〜3に調整し、次いでEtOAc（50mL×3）を加えて抽出した。有機相を合わせ、順次に飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で10％〜35％B→4分間で95％B）により精製して白色固体1（17mg）を得た。      
【０１３４】
LC-MS (方法1): Rt = 1.45 min; m/z (ES+) 418.1 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ7.05 (s, 6 H), 4.19 (s, 2 H), 3.64 (s, 6 H)。
【０１３５】
実施例2
化合物2の合成
【０１３６】
【化２７】
0006471263.tif 000028
【０１３７】
合成工程1
化合物15（0.35g、1.55mmol、合成はSynthesis of Bioorganic and Medicinal Chemistry 1999,7,2303〜2311を参照）をTHF（5mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（60％鉱油中に分散させた、6.6mg、 0.17mmol）及びt-ブチルアクリレート（480μL、3.31mmol）を順次に加えた。反応液を室温で6時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 10：1）で精製して淡黄色油状物16（0.45g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 2.36 min; m/z (ES+) 362.3 (M+Na)+。
【０１３８】
合成工程2
化合物16（0.45g、1.33mmol）をエタノール（5mL）に溶解し、次いで窒素下で炭素上のパラジウム（10％、0.1g）を加えた。反応系を水素で3回置換し、反応液を室温で窒素下で8時間撹拌した。混合物をセライトで濾過し、濾過ケーキをDCMで洗浄した。ろ液を濃縮して、粗生成物17（0.38g）を得、これを次の工程で直接に使用する。LC-MS(方法2): Rt = 1.39 min; m/z (ES+) 262.3 (M+H)+。
【０１３９】
合成工程3
化合物17（0.38g、1.45mmol）を酢酸（5mL）に溶解し、次いで無水マレイン酸（0.71g、7.24mmol）を加えた。反応液を室温で窒素下で16時間撹拌し、次いで高真空下で濃縮した。粗生成物18を次の工程で直接に使用する。LC-MS(方法1): Rt= 1.64 min; m/z (ES+) 556.3 (M+H)+。
【０１４０】
合成工程4
合成工程3で得られた粗生成物18を無水酢酸（15mL）に溶解し、次いで酢酸ナトリウム（48mg、0.58mmol）を加えた。反応液を100℃で1時間撹拌し、次いで粉砕した氷上に注いだ。水相を酢酸エチルで抽出し、得られた有機相を飽和重炭酸ナトリウム溶液、塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 2：1）で精製して、粗生成物を得、次いで分取-RP-HPLC（方法3：8分間で35％〜55％B→4分間で95％B）で精製して無色油状物19（30mg）を得た。LC-MS (方法1): Rt=1.86 min; m/z (ES+) 524.2 (M+Na)+。
【０１４１】
合成工程5
化合物19（30mg、0.06mmol）をDCM（3mL）に溶解し、次いでTFA（1mL）を加えた。反応液を室温で1時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物にメタノールを加え、白色沈殿物を沈殿させ、ろ別し、洗浄し、乾燥して、白色固体2（12mg）を得た。LC-MS (方法 1): Rt = 1.51 min; m/z(ES+) 446.1 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.11 (s, 1 H), 7.04 (s, 6 H), 3.44 (s, 6 H), 3.25 (t, 2 H), 3.08 (s, 2 H), 2.28 (t, 2 H)。
【０１４２】
実施例3
化合物3の合成
【０１４３】
【化２８】
0006471263.tif 000029
【０１４４】
合成工程1
化合物20（500ｍｇ、2.55mmol、合成はJournal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 2004, 42, 4392〜4403を参照）、モノ-tert-ブチルサクシネート（666mg、3.83mmol）及びHATU（1.94g、5.1mmol）をDCM（10mL）に溶解し、DIEA（986mg、7.65mmol）を添加した。反応液を室温で4時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物にEtOAcを加え、有機相を水、飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 10：1）で精製して無色油状物21（810mg）を得た。LC-MS(方法 2): Rt = 2.14 min; m/z(ES+) 297.1 (M+H)+。
【０１４５】
合成工程2
化合物21（225mg、0.64mmol）をTHF（10mL）に溶解し、次いで水（1mL）及びトリフェニルホスフィン（1.0g、3.84mmol）を加えた。反応液を室温で一晩撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物に水（10mL）を加えた後、濾過により固体を除去した。ろ液を濃縮して、黄色固体22（160mg）を得、粗生成物を次の工程で直接に使用する。LC-MS(方法2): Rt = 1.34 min; m/z(ES+) 275.2 (M+H)+。
【０１４６】
合成工程3
化合物22（153mg、0.56mmol）を酢酸（5mL）に溶解し、次いで無水マレイン酸（384mg、3.92mmol）を加えた。反応液を室温で2日間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。分取RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜45％B→4分間で95％B）を使用して、粗生成物から白色固体23（60mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.26 min; m/z(ES+) 569.2 (M+H)+。
【０１４７】
合成工程4
化合物23（160mg、0.28mmol）を無水酢酸（10mL）に溶解し、次いで酢酸ナトリウム（12mg）を加えた。反応液を100℃で1時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物に水（20mL）を加え、次いでEtOAc（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を順次に飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。分取RP-HPLC（方法3：9.5分間で35％〜55％B→3分間で95％B）を使用して、粗生成物から茶褐色固体24（20mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.42 min; m/z(ES+) 515.2 (M+H)+。
【０１４８】
合成工程5
化合物24（20mg、0.039mmol）をDCM（3mL）に溶解し、次いでTFA（89mg、0.78mmol）を加えた。反応液を室温で2時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：6.5分間で20％〜37％B→5分間で95％B、Rt：分間）により精製して、白色固体3（5mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.44 min; m/z (ES+) 459.1 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.02 (s, 1 H), 7.38 (s, 1 H), 7.05 (s, 6 H), 3.78 (s, 6 H), 2.43 (t, 2 H), 2.24 (t, 2 H)。
【０１４９】
実施例4
化合物4の合成
【０１５０】
【化２９】
0006471263.tif 000030
【０１５１】
合成工程1
30％水酸化ナトリウム溶液（1.73g、13mmol）、25％ホルムアルデヒド溶液（4.2g、35mmol）及びアセトニトリル（5 mL）からなる混合溶液に、化合物25（1.16g、10mmol、合成はJournal of Medicinal Chemistry 2010, 53, 8747〜8759を参照）を加えた。反応液を室温で1時間撹拌し、次いで60℃まで昇温させて4時間攪拌した。混合物を室温に冷却した後、ギ酸を加えて中性に中和し、次いで濃縮して揮発性溶媒を除去した。残留物にn-ブタノール（10mL）を加え、反応液を一晩還流させた。沈殿をろ別により除去し、ろ液を農縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 8：1）で精製して、白色固体26（1.0g）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 0.26 min; m/z(ES+) 179.1 (M+H)+。
【０１５２】
合成工程2
化合物26（267mg、1.50mmol）をピリジン（8mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却した。これにtert-ブチルジフェニルクロロシラン（413mg、1.5mmol）を加え、室温で一晩攪拌した。濃縮して溶媒を除去した後、残留物をEtOAcに溶解し、水、塩酸溶液及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄した。有機相を乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 25：1）で精製して、黄色油状物27（700mg）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.63-7.59 (m, 5 H), 7.48-7.41 (m, 5 H), 4.19 (t, 3 H), 3.63 (t, 2 H ), 3.26 (d, 6 H ), 1.50-1.45 (m, 2 H), 1.31-1.23 (m, 2H), 1.17-1.13 (m, 2 H), 0.99 (s, 9 H)。
【０１５３】
合成工程3
化合物27（700mg、1.68mmol）をピリジン（10mL）に溶解し、次いで0℃に冷却した。これにTsCl（1.92g、10.1mmol）を添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物をEtOAcに溶解し、次いで水、塩酸及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄した。有機相を乾燥し、濃縮した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して、白色固体28（1.10g）を得た。
【０１５４】
合成工程4
化合物28（1.10g、1.25mmol）をDMF（20mL）に溶解し、次いでアジ化ナトリウム（406mg、6.25mmol）を添加した。反応液を100℃で一晩撹拌し、冷却し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 10：1）で精製して、黄色油状物29（580mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 2.19 min; m/z(ES+) N/A。
【０１５５】
合成工程5
化合物29（540mg、1.10mmol）をTHF（10mL）に溶解し、次いでフッ化テトラブチルアンモニウム（THF中で1M、1.65mL、1.65mmol）を加え、反応液を室温で一晩撹拌した。水（20mL）を混合物に加え、次いでEtOAc（20mL×3）で抽出した。有機相を合わせた後、飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE / EtOAc 3：1）で精製し、無色油状物30（222mg）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 4.38 (t, 1 H), 3.40-3.37 (m, 2 H), 3.34 (s, 6 H), 1.40-1.38 (m, 2 H), 1.27-1.23 (m, 4 H).
【０１５６】
合成工程6
化合物30（172mg、0.68mmol）をアセトン（5mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却し、ジョーンズ試薬（0.38mL、1.02mmol）を加えた。反応液を0℃で1時間撹拌し、次いでイソプロピルアルコールを加えて溶液の色が緑色になるまで過剰のジョーンズ試薬をクエンチした。混合物をエチルエーテル（50mL×3）で抽出し、合わせた有機相を水及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 1：1）で精製して、黄色油状物31（150mg）を得た。LC-MS(方法 1): Rt = 1.50 min; m/z(ES+) 290.1 (M+Na)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ3.28 (s, 6 H), 2.38 (t, 2 H), 1.61-1.55 (m, 2 H), 1.37-1.34 (m, 2 H)。
【０１５７】
合成工程7、 8
化合物31（100mg、0.37mmol）をTHF（5mL）に溶解し、次いでトリフェニルホスフィン（490mg、1.87mmol）及び水（34μL、1.87mmol）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去し、次いで10mLの水で希釈し、エチルエーテル（10mL×3）で抽出した。水相を分離した後、2mLの濃塩酸を添加して酸性化し、次いで濃縮して溶媒を除去した。残留物にエタノールを加えてスラリーと調製し、濾過し、洗浄し、乾燥して、薄茶色の固体を得た。固体を酢酸（5mL）に溶解し、次いで無水マレイン酸（183mg、1.87mmol）及び酢酸ナトリウム（153mg、1.87mmol）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で5％〜30％B→4分間で95％B）で精製して、白色固体33（110mg）を得た。LC-MS(方法 1): Rt = 1.38 min; m/z(ES+) 484.2 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.54 (t, 3 H), 6.48 (d, 3 H), 6.20 (d, 3 H), 3.14 (d, 6 H), 2.14 (t, 2 H), 1.23-1.19 (m, 4 H)。
【０１５８】
合成工程9
化合物33（100mg、0.21mmol）をDMF（2mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却し、2,4,6-トリメチルピリジン（0.14mL、1.04mmol）を加えた。この溶液をAとした。N-ヒドロキシスクシンイミド（0.95g、8.26mmol）をDMF（10mL）に溶解し、次いで0℃に冷却し、無水トリフルオロ酢酸（1.17mL、8.30mmol）を滴下した。反応液を10分間撹拌した後、2,4,6-トリメチルピリジン（1.09mL、8.30mmol）を滴下し、反応液を続いて10分間攪拌した後、混合物を0.5時間かけて溶液Aに滴下した。滴下終了後、反応液を室温まで昇温して一晩攪拌した。 30mLの水で希釈し、次いでEtOAc（20mL×2）で抽出した。有機相を合わせ、次いで水（20mL×2）で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜50％B→4分間で95％B）で精製して、白色固体34（50mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.70 min; m/z(ES+) 527.2 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ6.75 (s, 6 H), 3.61 (s, 6 H), 2.81 (s, 4 H), 2.51 (t, 2 H), 1.96-1.93 (m, 2 H), 1.36-1.33 (m, 2 H)。
【０１５９】
合成工程10
化合物34（6mg、0.011mmol）をTHF（2mL）に溶解し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（2mL）を加えた。反応液を室温で1時間撹拌し、pH2〜3になるように塩酸溶液を加えた。水相を酢酸エチル（10mL×2）で抽出し、次いで合わせた有機相を乾燥し、濃縮した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜50％B→４分間で95％B）で精製して化合物4を得た。LC-MS(方法1): Rt= 1.61 min; m/z (ES+) 430.2 (M+H)+。
【０１６０】
実施例5
化合物5の合成
【０１６１】
【化３０】
0006471263.tif 000031
【０１６２】
合成工程1
化合物11（0.50g、2.54mmol）を無水THF（5mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（60％鉱油中に分散された、122mg、3.05mmol）を加えた。反応液を室温で3時間撹拌し、化合物35（2.85g、5.67mmol）の無水THF溶液（5mL）を加え、反応液を還流下で16時間加熱した。混合物をセライトで濾過し、濾過ケーキをDCMで洗浄した。ろ液を濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して、無色油状物36（0.95g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 2.19 min; m/z(ES+) 545.3 (M+NH4)+。
【０１６３】
合成工程2
化合物36（0.95g、1.8mmol）を1,4-ジオキサン（10mL）に溶解し、次いで水酸化ナトリウム溶液（30％、5mL）を加え、反応液を16時間還流した。室温に冷却した後、混合物をEtOAc（20mL）で抽出し、有機相を乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 1：1〜1：2）で精製して、淡黄色油状物37（0.38g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 1.84 min; m/z (ES+) 391.3 (M+NH4)+。
【０１６４】
合成工程3
化合物37（0.38g、1.025mmol）をTHF（5mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（60％鉱油中に分散された、4.0mg、0.1mmol）及びt-ブチルアクリレート（296μL、2.04mmol）を順次に加えた。反応液を室温で4時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して、無色油状物38（0.13g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 2.21 min; m/z(ES+) 519.3 (M+NH4)+。
【０１６５】
合成工程4
化合物38（0.13g、0.26mmol）をTHF（5mL）に溶解し、次いで水（23.4μL、1.3mmol）及びトリフェニルホスフィン（0.34g、1.3mmol）を加えた。反応液を室温で8時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。水（10mL）を添加し、次いでエチルエーテル（5mL×3）で洗浄した。水相を凍結乾燥して無色の油状物39（0.10g）を得、これを次の工程で直接に使用する。
【０１６６】
合成工程5
化合物39（0.1g、0.24mmol）を酢酸（3mL）に溶解し、次いで無水マレイン酸（0.12g、1.18mmol）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜40％B→4分間で95％B）で精製して、40（95mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.68 min; m/z(ES+) 740.3 (M+Na)+。
【０１６７】
合成工程6
化合物40（95mg、0.13mmol）を無水酢酸（3mL）に溶解し、次いで酢酸ナトリウム（4.3mg、0.053mmol）を加えた。反応液を100℃で1.5時間撹拌し、次いで粉砕した氷上に注いだ。水相をEtOAcで抽出して、有機相を飽和炭酸ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 1：1）で精製して、無色油状物41（80mg）を得た。LC-MS (方法 1): Rt = 1.87 min; m/z(ES+) 686.2 (M+Na)+。
【０１６８】
合成工程7
化合物41（80mg、0.13mmol）をDCM（3mL）に溶解し、次いでTFA（1mL）を加えた。反応液を室温で3時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で25％〜45％B→4分間で95％B）で精製して、無色粘性固体5（30mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.55 min; m/z(ES+) 608.2 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ6.75 (s, 6 H), 3.81-3.77 (m, 10 H), 3.65-3.58 (m, 12 H), 3.45 (t, 2 H), 2.62 (t, 2 H)。
【０１６９】
実施例6
化合物6の合成
【０１７０】
【化３１】
0006471263.tif 000032
【０１７１】
合成工程1
化合物15（1.0g、4.74mmol）を無水THF（10mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（60％鉱油中に分散された、380mg、9.5mmol）を加えた。反応液を室温で30分間撹拌し、次いで混合物をテトラエチレングリコールジ-p-トルエンスルホネート（11.9g、23.7mmol）の無水THF（20mL）溶液に加えた。反応液を還流下で16時間加熱し、室温に冷却し、セライトで濾過し、濾過ケーキをDCMで洗浄した。ろ液を濃縮して、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して、無色油状物42（8.0g）を得た。LC-MS(方法2): Rt= 2.28 min; m/z (ES+) 559.3 (M+NH4)+。
【０１７２】
合成工程2、3
化合物42（2.20g、4.06mmol）をDMF（20mL）に溶解し、次いで酢酸ナトリウム（3.33g、40.6mmol）を加えた。反応溶液を100℃で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をEtOAc(50mL)に溶解し、ろ過して固体を除去し、ろ液を順次に飽和塩化ナトリウム溶液（20mL×2）で洗浄し、乾燥し、濃縮して粗生成物43を得、次の工程で直接に使用した。LC-MS (方法 2): Rt= 2.11 min; m/z (ES+) 447.3 (M+NH4)+。
【０１７３】
粗生成物43をメタノール（10mL）に溶解し、次いで2.0M水酸化ナトリウム溶液（10mL）を加えた。反応液を室温で1時間撹拌し、次いでEtOAcで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮して、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 1：1→1：2）で精製して、無色油状物44（1.26g）を得た。LC-MS (方法 2): Rt = 1.95 min; m/z(ES+) 405.3 (M+NH4)+。
【０１７４】
合成工程4
化合物44（1.26g、3.25mmol）をTHF（10mL）に溶解し、水素化ナトリウム（60％鉱油中に分散させた、13mg、0.33mmol）及びt-ブチルアクリレート（944μL、6.5mmol）を順次に加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して、無色油状物45（1.45g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 2.31 min; m/z (ES+) 533.3 (M+NH4)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.70 (t, 2 H), 3.65-3.59 (m, 16 H), 3.33 (m, 8 H), 2.50 (t, 2 H), 1.44 (s, 9 H)。
【０１７５】
合成工程5, 6
化合物45（200mg、0.39mmol）をTHF（5mL）に溶解し、次いでトリフェニルホスフィン（509mg、1.94mmol）及び水（35μL、1.94mmol）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物に水10mLを加え、エチルエーテル（10mL×3）で抽出し、水相を凍結乾燥して無色油状物を得た。この油状物を酢酸（5mL）に溶解し、次いで無水マレイン酸（190mg、1.94mmol）を添加した。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取-RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜40％B→4分間で95％B）で精製して、無色油状物47（140mg）を得た。LC-MS (方法 1): Rt = 1.95 min; m/z(ES+) 700.3 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ8.59 (s, 3 H),  6.47 (d, 3 H), 6.36 (d, 3 H), 3.71-3.59 (m, 18 H), 3.36-3.35 (m, 8 H), 2.50 (t, 2 H), 1.44 (s, 9 H)。
【０１７６】
合成工程7
化合物47（140mg、0.19mmol）をDMF（2mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却し、2,4,6-トリメチルピリジン（0.13mL、0.96mmol）を加え、溶液をAとした。 N-ヒドロキシスクシンイミド（0.88g、7.65mmol）をDMF（10mL）に溶解し、次いで0℃に冷却し、無水トリフルオロ酢酸（1.08mL、7.65mmol）を滴下した。反応液を10分間撹拌した後、2,4,6-トリメチルピリジン（1.01mL、7.65mmol）を滴下し、反応液を10分間続いて攪拌した後、混合物を0.5時間かけて溶液Aに滴下した。滴下終了後、反応液を室温まで昇温させて一晩攪拌した。30mLの水で希釈し、次いでEtOAc（20mL×2）で抽出した。有機相を合わせ、順次に水（20mL×2）で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で40％〜60％B→４分間で95％B）で精製して、白色固体48（77mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.70 min; m/z (ES+) 527.2 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.72 (s, 6 H), 3.68 (t, 2 H), 3.62-3.54 (m, 18 H), 3.47 (t, 2 H), 3.29 (t, 2 H), 3.18 (s, 2 H), 2.48 (t, 2 H), 1.42 (s, 9 H)。
【０１７７】
合成工程8
化合物48（77mg、0.11mmol）をDCM（6mL）に溶解し、次いでTFA（2mL）を添加した。反応液を室温で2時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜50％B→4分間で95％B）で精製して、無色ゲル状物6（50mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.66 min; m/z (ES+) 622.2 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.73 (s, 6 H), 3.74 (t, 2 H), 3.62-3.55 (m, 18 H), 3.50 (t, 2 H), 3.29 (t, 2 H), 3.18 (s, 2 H), 2.60 (t, 2 H)。
【０１７８】
実施例7
化合物7の合成
【０１７９】
【化３２】
0006471263.tif 000033
【０１８０】
合成工程1
シアノ酢酸エチル（1.1g、9.7mmol）及び水酸化トリメチルフェニルアンモニウム（40％水溶液、0.1mL）をジメトキシエタン（5mL）に加え、次いでその中に３０分間かけてアクリロニトリル（1.03g、19.4mmol）を徐々に滴下した。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をDCM（30mL）に溶解し、希塩酸溶液（0.5N、10mL）、飽和塩化ナトリウム溶液（15mL）で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 4：1）で精製して、無色油状物49（2.18g）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ4.38 (q, 2 H), 2.69-2.63 (m, 2 H), 2.57-2.50 (m, 2 H), 2.44-2.38 (m, 2 H), 2.22-2.16 (m, 2 H), 1.39 (t, 3 H)。
【０１８１】
合成工程2
化合物49（0.22g、1.0mmol）を無水THF（5mL）に溶解し、次いでボラン・テトラヒドロフラン付加物（1.0MTHF溶液、10mL、10.0mmol）を添加した。反応物を加熱して16時間還流し、室温に冷却した。 MeOH（3mL）を加えて反応をクエンチし、次いでジ-tert-ブチルジカーボネート（1.1g、5mmol）及びTEA（0.7mL、5mmol）を加えた。反応液を還流下で6時間加熱し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をEtOAc（30mL）に溶解し、有機相を希塩酸（0.5N）、飽和食塩水で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1→1：1）で精製して、無色油状物50（0.15g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 2.13 min; m/z (ES+) 512.4 (M+Na)+。
【０１８２】
合成工程3
化合物50（0.15g、0.31mmol）をTHF（5mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（60％鉱油に分散、2.4mg、0.06mmol）及びt-ブチルアクリレート（89μL、0.61mmol）を順次に加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 5：1→3：1）で精製して、無色油状物51（0.12g）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ6.64 (t, 2 H), 6.42 (t, 1 H), 3.51 (t, 2 H), 3.05 (s, 2 H), 2.90-2.78 (m, 6 H), 2.41 (t, 2 H)，1.45-1.20 (m, 40 H), 1.15-1.00 (m, 4 H)。
【０１８３】
合成工程4
化合物51（115mg、0.19mmol）を1,4-ジオキサン（4mL）に溶解し、次いで濃塩酸（2mL）を添加した。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去し、アセトニトリル（20mL）を加え、再び濃縮して粗生成物52を得、これを次の工程で直接に使用した。
【０１８４】
合成工程5
前の工程で得られた粗生成物52に飽和重炭酸ナトリウム溶液（2.5mL）及びTHF（2.5mL）を加え、0℃に冷却した。N-（メトキシカルボニル）マレイミド（144mg、0.93mmol）を少しずつ加え、反応液を0℃で10分間撹拌し、次いで室温で3時間撹拌した。この混合溶液に希塩酸を加えてpHを2〜3に調整した後、EtOAc（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮し、残留物を分取-RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜50％B→4分間で95％B）で洗浄して7（10mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.33 min; m/z(ES+) 502.1 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ6.98 (s, 4 H), 6.96 (s, 2 H), 3.35-3.25 (m, 6 H), 3.21 (s, 2 H), 3.04 (s, 2 H), 1.45-1.39 (m, 4 H)，1.11-1.00 (m, 4 H)。
【０１８５】
実施例8
化合物8の合成
【０１８６】
【化３３】
0006471263.tif 000034
【０１８７】
合成工程1
化合物53（1.40g、3.48mmol、合成はUS2006/0189603を参照）をTHF（5mL）に溶解し、次いで水素化ナトリウム（7.0mg、0.17mmol）及びt-ブチルアクリレート（202μL、1.39mmol）を順次に加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 50：1→20：1）で精製して無色油状物54（0.48g）を得た。LC-MS(方法2): Rt= 2.56 min; m/z (ES+) 553.3 (M+Na)+。
【０１８８】
合成工程2
化合物54（0.48g、0.90mmol）及び酢酸（78μL、1.36mmol）をTHF（10mL）に加え、溶液を0℃に冷却した。フッ化テトラブチルアンモニウム（THFで1.0M、1.36mL、1.36mmol）を加え、反応液を室温で16時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 10：1）で精製して無色油状物55（0.20g）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 1.60 min; m/z(ES+) 315.3 (M+Na)+。
【０１８９】
合成工程3
化合物55（0.20g、0.69mmol）をピリジン（5mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却し、TsCl（0.65g、3.42mmol）を添加した。反応溶液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して無色油状物56（0.17g）を得た。LC-MS(方法2): Rt= 2.43 min; m/z (ES+) 772.2 (M+Na)+。
【０１９０】
合成工程4
化合物56（0.17g、0.23mmol）をDMF（5mL）に溶解し、次いでアジ化ナトリウム（73mg、1.13mmol）を加えた。反応液を100℃で24時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 10：1）で精製して、無色油状物57（57mg）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ3.65 (t, 2 H), 3.28-3.25 (m, 8 H), 2.47 (t, 2 H), 1.60-1.50 (m, 2 H), 1.46 (s, 9 H), 1.40-1.35 (m, 2 H)。
【０１９１】
合成工程5
化合物57（57mg、0.16mmol）をDCM（3mL）に溶解し、次いでTFA（1mL）を添加した。反応液を室温で3時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して化合物58（41mg）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 1.61 min; m/z(ES+) 310.2 (M-H)+。
【０１９２】
合成工程5，6
化合物58（41mg、0.13mmol）をTHF（5mL）に溶解し、次いでトリフェニルホスフィン（173mg、0.66mmol）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、水（10mL）を加え、混合物をエチルエーテル（10mL×3）で抽出した。水相を凍結乾燥した後、残留物を飽和重炭酸ナトリウム（2.5mL）とTHF（2.5mL）の混合溶液に溶解し、溶液を0℃に冷却した。 N-（メトキシカルボニル）マレイミド（102mg、0.66mmol）を少しずつ加え、反応液を0℃で10分間撹拌し、次いで室温まで昇温させて3時間撹拌した。溶液のpHを希塩酸で2〜3に調整し、次いでEtOAc（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮し、残留物を分取-RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜40％B→4分間で95％B）で精製して8（3mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt= 1.27 min; m/z (ES+) 474.2 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.11 (br s, 1 H), 7.02 (s, 4 H), 6.99 (s, 2 H), 3.37-3.21 (m, 8 H), 3.13 (s, 2 H), 2.32 (t, 2 H), 1.57-1.51 (m, 2 H)，1.16-1.13 (m, 2 H)。
【０１９３】
実施例9
化合物9の合成
【０１９４】
【化３４】
0006471263.tif 000035
【０１９５】
合成工程1
超音波浴中で、二塩化ニッケル（317mg、2.45mmol）をメタノール（30mL）に溶解し、次いで水素化ホウ素ナトリウム（278mg、7.34mmol）を添加した。得られた黒色懸濁液を30分間超音波処理した後、化合物60（2.40g、4.89mmol、合成の参考文献Chemical Communications 2010、46、6075〜77）のメタノール溶液（30mL）及び水素化ホウ素ナトリウム（556mg、14.7mmol））を順次に加えた。反応液を30分間超音波処理した後、セライトでろ過し、ろ液を濃縮して溶媒を除去した。残留物に水（100mL）及びDCM（200mL）を加えて抽出した。水相をさらにDCM（100mL×3）で抽出し、有機相を合わせて、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH/TEA 100：4：1）で精製して白色泡状固体61（1.73g）を得た。LC-MS (方法 1): Rt = 1.80 min; m/z(ES+) 461.4 (M+H)+。
【０１９６】
合成工程2
化合物61（100mg、0.22mmol）、62（110mg、0.33mmol、合成はBioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2007、17、501〜506を参照）をDCM(3mL)に溶解し、DIEA（(152μL、0.87mmol）及びHATU（161mg、0.42mmol）を順次に加えた。反応液を室温で2時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 1：1→DCM/MeOH 25：1）で精製して、無色油状物63（158mg）を得た。LC-MS (方法 2): Rt = 2.26 min; m/z(ES+) 779.5 (M+H)+。
【０１９７】
合成工程3
化合物63（158mg、0.20mmol）を1,4-ジオキサン（4mL）に溶解し、次いで濃塩酸（2mL）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。粗生成物64を次の工程で直接に使用する。
【０１９８】
合成工程4
前の工程で得られた粗生成物64に飽和重炭酸ナトリウム（2.5mL）及びTHF（2.5mL）を添加した。溶液を0℃に冷却した後、N-（メトキシカルボニル）マレイミド（158mg、1.02mmol）を少しずつ加えた。反応液を0℃で10分間撹拌し、次いで室温で3時間撹拌した。混合溶液を希塩酸でpH2〜3に調整し、EtOAc（50mL×2）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 1：1→DCM/MeOH 25：1）で精製して、無色油状物9（10mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.52 min; m/z(ES+) 663.3 (M+H)+。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ6.80 (s, 1 H), 6.71 (s, 6 H), 4.04 (s, 2 H), 3.78-3.72 (m, 6 H), 3.65-3.61 (m, 14 H), 2.59 (t, 2 H), 2.13-2.10 (m, 6 H)。 
【０１９９】
実施例10
化合物10の合成
【０２００】
【化３５】
0006471263.tif 000036
【０２０１】
合成工程1
化合物65（200mg、0.40mmol、合成は、文献 Journal of the American Chemical Society 2012、134、9898-9901を参照）、及び62（202mg、0.60mmol）をDCM（6 mL）に溶解し、次いでDIEA(180μL、0.16mmol)及びHATU（304mg、0.80mmol）を順次に加えた。反応液を室温で2時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc1:1→DCM/MeOH  25：1）で精製して、淡黄色油状物66（200mg）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 2.30 min; m/z(ES+) 838.5 (M+NH4)+。
【０２０２】
合成工程2，3
化合物66（200mg、0.24mmol）を1,4-ジオキサン（4mL）中に溶解し、次いで濃塩酸（2ml）を加えた。反応液を室温で16時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物に飽和炭酸水素ナトリウム（2.5 mL）及びTHF（2.5ml）を加え、次いで混合物を0oCに冷却し、その中にN-（メトキシカルボニル）マレイミド（189mg、1.22mmol）を少しずつ添加した。反応液を0oCで10分間撹拌し、次いで室温で3時間撹拌した。濃塩酸で溶液のpHを2〜3に調整し、次いで酢酸エチル（50mL×2）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮して、残留物を分取RP-HPLC（方法4：８分間で20％〜45％B→４分間で95％B）で精製して、無色油状物10（5 mg）を得た。LC-MS(方法2): Rt = 1.50 min; m/z(ES+) 703.0 (M-H)+。 
【０２０３】
実施例11
リンカー-薬物5-vcMMAEの合成
【０２０４】
【化３６】
0006471263.tif 000037
【０２０５】
化合物5（20.0mg、32.9μmol）及びNH2-vcMMAE（TFA塩、25mg、20.2μmol、合成は文献WO2013/173337を参照）をDMF（1.5mL）に溶解し、DIEA（14.1μL、81.8μmol）及びHATU（15.4mg、40.4μmol）を順次に加えた。反応液を室温で2時間撹拌し、次に分取RP-HPLC（方法3：８分間で40〜60％B→４分間で95％B）で精製して、白色粉末状固体5-vcMMAE（29.5mg）を得た。LC-MS(方法1): Rt = 1.89 min; m/z (ES+) 857.0 [1/2(M+2H)]+。
【０２０６】
実施例12
他のリンカー-薬物の合成は5-vcMMAEと類似した合成工程を用い、生成物のLC-MS特性データは表１に記載された。
【０２０７】
【表１】
0006471263.tif 000038
【０２０８】
実施例13
抗体薬物複合体の合成、特徴、及び細胞増殖阻害の実験結果
抗体薬物複合体の合成は、一般的工程Aによって行われ、精製後の生成物の特徴付け方法は、SDS-PAGE（一般的な工程B）、HIC（一般な工程C）、SEC（一般的な工程D）、平均DAR値の計算（一般的な工程E）、非変性質量分析（一般的な工程F）、ELISA（一般的な工程G）、及び細胞増殖阻害アッセイ（一般的な工程H）を含む。
【０２０９】
抗体薬物複合体の平均DAR値の結果（表2）から分かるように、本発明のトリマレイミド型リンカーを用いて得られた抗体薬物複合体の平均DAR値はよく約3に制御することができ、この結果は、本発明のリンカーが結合部位及び数量を正確に制御できるに起因する。抗体薬物複合体H-5-vcMMAEの非変性質量分析（Native MS、図5）の測定結果も、DAR=3の成分が主成分であることを示している
【０２１０】
【表２】
0006471263.tif 000039
【０２１１】
細胞増殖障害実験結果は表３に記載された。
【０２１２】
【表３】
0006471263.tif 000040
【０２１３】
各文献が独立に引用されて参照になるように、本発明で言及された全ての文献は、参照により本明細書に引用される。当業者であれば、本発明の教示を読んだ後に本発明に対して様々な変更や修正を行うことができ、これらの等価形態も本明細書に添付された特許請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図１】
0006471263.tif 000050
【図２】
0006471263.tif 000051
【図３Ａ】
0006471263.tif 000052
【図３Ｂ】
0006471263.tif 000053
【図４Ａ】
0006471263.tif 000054
【図４Ｂ】
0006471263.tif 000055
【図５】
0006471263.tif 000056
【図６】
0006471263.tif 000057
【図７】
0006471263.tif 000058