(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された糖タンパク質と、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、及びマレイミド誘導体のうち少なくとも１つである標識剤と、を含むｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の溶液に１００〜１３０℃の温度でマイクロ波を照射する工程を含む、
試料中の修飾された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから修飾基を遊離し、標識するための方法。
【請求項２】
前記溶液のｐＨは、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾基が遊離されたセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つが標識される、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識剤は、ピラゾロン誘導体である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
標識剤とともにチオール化合物を用いる、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾基は、翻訳後修飾基である、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記翻訳後修飾基は、Ｏ−結合型糖鎖である、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項の方法により試料中の修飾された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから遊離され、標識された修飾基を分析する、
ことを特徴とする修飾基の解析方法。
【請求項９】
遊離糖鎖と、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、及びマレイミド誘導体のうち少なくとも１つである標識剤と、を含むｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の溶液に１００〜１３０℃の温度でマイクロ波を照射する工程を含む、
遊離糖鎖の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾基を遊離し、標識するための方法及びキット、修飾基の解析方法及びキット、並びに遊離糖鎖の標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内において、セリン及びスレオニンは、リン酸化、硫酸化、糖鎖修飾（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ型、Ｏ−Ｆｕｃ型、Ｏ−Ｍａｎ型、Ｏ−Ｘｙｌ型、Ｏ−Ｇａｌ型、Ｏ−Ｇｌｃ型）等の多様な翻訳後修飾を受けるアミノ酸残基であり、これらの翻訳後修飾は、シグナル伝達や分化制御等の様々な生命の高次機能調節において重要な役割を担っている。【０００３】
このような翻訳後修飾を医療の分野に利用しようとする動きがある。例えば、特定のタンパク質のリン酸化を担うキナーゼを阻害する薬剤が既に医薬品として上市されており、また、Ｏ−結合型糖鎖の定性、定量的な変動をみることで、種々の疾患の診断が可能であることがわかっている。【０００４】
セリン及びスレオニンの翻訳後修飾のうち、Ｏ−リン酸化、Ｏ−硫酸化、及びＯ−ＧｌｃＮＡｃ化は、それぞれリン酸基、硫酸基、及びＯ−ＧｌｃＮＡｃ基が単独で結合するものであるが、一方で、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ化、Ｏ−Ｆｕｃ化、Ｏ−Ｍａｎ化、Ｏ−Ｘｙｌ化等のＯ−結合型糖鎖修飾は、一般に、糖鎖がさらに伸長して多様な構造をとる。【０００５】
リン酸化されたセリン及びスレオニンのリン酸化結合部位の解析手法の一法として、β脱離・マイケル付加法（ＢＥＭＡ法）が知られている。この方法は、塩基性条件下に、リン酸基がβ脱離し、不飽和カルボニルが生成され、これがマイケル反応受容体となることを応用したものである（特許文献１及び２、非特許文献１）。ＢＥＭＡ法の応用についてもいくつか報告されており、例えば、ジチオトレイトールのようなチオール基を有する化合物をマイケル供与体として作用させることで、リン酸化部位を標識し、ペプチドの精製やオンビーズ、オンチップ上の蛍光標識などに用いられている（特許文献３）。【０００６】
ＢＥＭＡ法は、タンパク質のリン酸化に関わる研究に貢献し、広く使われる手法となっているが、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化を含めた、セリン及びスレオニンの他の翻訳後修飾もまた、ＢＥＭＡ法で遊離されるため、本法ではセリン及びスレオニンにおいてどのような種類の翻訳後修飾があったのかを区分することができない。また、ＢＥＭＡ法におけるマイケル供与体としては、チオール基を有する化合物が一般的であり、他のマイケル供与体の応用例はほとんど報告されていなかった。【０００７】
セリン及びスレオニンの糖鎖部分の多様な構造（Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ型、Ｏ−Ｆｕｃ型、Ｏ−Ｍａｎ型、Ｏ−Ｘｙｌ型、Ｏ−Ｇａｌ型、Ｏ−Ｇｌｃ型）を解析する場合、タンパク質から多様な構造を有する糖鎖を効率的に切り出す有効な酵素が発見されていないため、強アルカリ下（ｐＨ約１１．５〜１２．５）のβ脱離反応による化学的手法が広く用いられてきた。この場合、糖タンパク質及び糖ペプチドより遊離した糖鎖についても、糖鎖の還元末端側から順次β脱離を受けて分解（ピーリング反応）を起こし得るため、高濃度の還元剤を加えて、β脱離反応と同時に還元末端を糖アルコールに還元する方法が開発された。この方法は１９６８年にＣａｒｌｓｏｎによって報告されたものであり、昨今でも、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を遊離するための標準的な方法となっている（非特許文献２）。しかし、この方法には、（１）還元剤存在下のβ脱離はペプチド部分の分解を引き起こすため、タンパク質部分の解析を行うことが困難である、（２）還元により糖鎖の還元末端が失われるため、糖鎖の分離や高感度分析のための誘導体化が困難になる、という２つの欠点があった。【０００８】
これらの問題を克服するために、セリン及びスレオニンの翻訳後修飾をβ脱離反応で遊離する際にピラゾロン試薬をはじめとする標識剤を共存させる方法（ＢＥＰ法）が、本発明者らや、他の研究グループにより報告された（特許文献４及び５、非特許文献３−５）。このＢＥＰ法によれば、遊離した糖鎖が速やかに標識剤（ピラゾロン誘導体）と反応し、遊離した糖鎖やペプチド部分の分解をほぼ完全に回避することができる。【０００９】
一方、Ｒｅｉｎｈｏｌｄらは、有機アミンを用いるＣａｒｌｓｏｎ法の変法（マイクロ波照射、ｐＨ条件：ｐＨ約１２．５（追試）、反応温度：７０℃）により、β脱離反応の反応時間を短縮できることを示した（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００７−５１５６２５号公報
【特許文献２】米国特許第７８０３７５１号明細書
【特許文献３】特開２００９−１９００２号公報
【特許文献４】国際公開第２０１２／１１１７７５号
【特許文献５】国際公開第２０１１／０３８８７４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】“Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｅ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１），１９（４），３７９−３８２．
【非特許文献２】Ｄｏｎ  Ｍ．  Ｃａｒｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｉｇ  Ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ  Ｍｕｃｉｎｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８，２４３：６１６−６２６．
【非特許文献３】Ｊｕｎ−ｉｃｈｉ  Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，“Ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  β−Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１１，８３：９０６０−９０６７．
【非特許文献４】Ｚａｕｎｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  １−ｐｈｅｎｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ”，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１２，１８２０，１４２０−１４２８．
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，”Ｏｎｅ−ｐｏｔ  ｎｏｎｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  １−ｐｈｅｎｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ＥＳＩ−ＭＳ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１１，１１，４２２９−４２４２．
【非特許文献６】Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，“Ｒａｐｉｄ  Ｄｅ−Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎ  Ａｌｋｙｌ  Ａｍｉｎｅ  Ｂａｓｅ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０，８２：２４２１−２４２５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、Ｃａｒｌｓｏｎ法やＢＥＰ法を含めて、β脱離反応に基づく翻訳後修飾基の遊離には長い反応時間（１０〜２４時間）を要しており、翻訳後修飾基の大規模解析を制限する一つの要因となっていた。また、ＢＥＰ法におけるマイクロ波照射についてはこれまで報告がなされていない。【００１３】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、効率良くかつ短時間に、修飾基を遊離し、標識することのできる方法及びキットを提供することを目的とする。また本発明は、前記方法を用いた修飾基の解析方法及びキットを提供することを目的とする。また本発明は、効率良くかつ短時間に、遊離糖鎖を標識することのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る試料中の修飾された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから修飾基を遊離し、標識するための方法は、
修飾された糖タンパク質と、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、及びマレイミド誘導体のうち少なくとも１つである標識剤と、を含むｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の溶液にマイクロ波を照射する工程を含む。【００１５】
前記溶液のｐＨは、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．０であってもよい。【００１６】
修飾基が遊離されたセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つが標識されてもよい。【００１７】
前記標識剤は、ピラゾロン誘導体であってもよい。【００１８】
標識剤とともにチオール化合物を用いてもよい。【００１９】
前記修飾基は、翻訳後修飾基であってもよい。【００２０】
前記翻訳後修飾基は、Ｏ−結合型糖鎖であってもよい。【００２１】
本発明の第２の観点に係る修飾基の解析方法は、本発明の第１の観点に係る方法により試料中の修飾された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから遊離され、標識された修飾基を分析する、
ことを特徴とする。【００２２】
本発明の第３の観点に係る、本発明の第１の観点に係る方法のためのキットは、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、及びマレイミド誘導体のうち少なくとも１つである標識剤を含む溶液を備える。【００２３】
本発明の第４の観点に係る修飾基を解析するためのキットは、本発明の第３の観点に係るキットを備える。【００２４】
本発明の第５の観点に係る遊離糖鎖の標識方法は、遊離糖鎖と、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、及びマレイミド誘導体のうち少なくとも１つである標識剤と、を含むｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の溶液にマイクロ波を照射する工程を含む。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、効率良くかつ短時間に、修飾基を遊離し、標識することのできる方法及びキットを提供することができる。また本発明によれば、前記方法を用いた修飾基の解析方法及びキットを提供することができる。また本発明によれば、効率良くかつ短時間に、遊離糖鎖を標識することのできる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】遊離糖鎖のピラゾロン誘導体による反応に対して、反応溶液のｐＨが与える影響について検討した図である。（ａ）は０．３Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ８．０）、（ｂ）は０．４Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ８．３）、（ｃ）は０．５Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ１１．４）、（ｄ）は０．６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ１１．８）での結果である。
【図２】遊離糖鎖のピラゾロン誘導体による反応に対して、マイクロ波照射による加熱の有無が与える影響について検討した図である。（ａ）はヒートブロックにより加熱した比較例、（ｂ）はマイクロ波発生装置により加熱した実施例のスペクトルである。
【図３】マイクロ波発生装置により加熱した実施例とヒートブロックにより加熱した比較例とで、標識された糖鎖の回収量を比較したグラフの図である。
【図４】Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質のピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、マイクロ波照射による加熱の有無が与える影響について検討した図である。（ａ）はヒートブロックにより加熱した比較例、（ｂ）はマイクロ波発生装置により加熱した実施例のスペクトルである。
【図５】マイクロ波発生装置により加熱した実施例とヒートブロックにより加熱した比較例とで、遊離標識された糖鎖の回収量を比較したグラフの図である。
【図６】Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質のピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、反応溶媒の種類の違いが与える影響について検討した図である。（ａ）はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた場合、（ｂ）はメタノールを用いた場合である。
【図７】Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドのピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、ペプチド分解がみられるか検討した図である。
【図８】Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質のピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、マイクロ波照射による加熱温度の違いが反応効率に与える影響について検討した図である。（ａ）は加熱温度８５℃、（ｂ）は加熱温度１００℃、（ｃ）は加熱温度１１０℃、（ｄ）は加熱温度１２０℃、（ｅ）は加熱温度１３０℃、（ｆ）は加熱温度１４０℃である。
【図９】各温度の反応において遊離標識された糖鎖の回収量を比較したグラフの図である。
【図１０】糖タンパク質であるブタ胃ムチンのピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、遊離標識された糖鎖総量の経時変化を評価したグラフの図である。
【図１１】細胞ペレットを用いて、ピラゾロン誘導体を用いた遊離標識反応により、Ｏ−結合型糖鎖を検出できるか検討したスペクトルの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２８】
本発明による、試料中の修飾された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから修飾基を遊離し、標識するための方法（以下、本明細書において「遊離標識方法」といい、この反応を「遊離標識反応」という）は、修飾された糖タンパク質と、標識剤と、を含むｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の溶液にマイクロ波を照射する工程を含む。
【００２９】
本発明による遊離標識方法は、（修飾された）糖タンパク質におけるセリン残基及びスレオニン残基の酸素原子を介して結合した修飾基を、タンパク質から遊離して（以下、この反応を「遊離反応」という）、標識剤により標識する（以下、この反応を「標識反応」という）ものである。
【００３０】
前述の“試料”とは、後述する糖タンパク質を含む試料であれば特に制限されず、化学合成由来の試料でも、生体由来の試料でもよい。生体由来の試料の場合には、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジー等、又はこれらの免疫不全動物等の動物由来の試料が挙げられる。また、試料は植物由来のものであってもよい。
【００３１】
前述の“修飾された糖タンパク質”とは、生体内で翻訳後修飾を受けた糖タンパク質であってもよく、合成由来の糖タンパク質であってもよいが、好ましくは翻訳後修飾を受けた糖タンパク質である。より具体的には、セリン残基及びスレオニン残基の酸素原子を介して、修飾基としてリン酸基、硫酸基、グリカン等、又はこれらの１若しくは２以上の基が結合した糖タンパク質を“修飾された糖タンパク質”と称する。なお、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質の場合、本明細書において、後述する翻訳後修飾基として酸素原子を介して結合したリン酸基を“Ｏ−リン酸基”といい、翻訳後修飾基として酸素原子を介して結合した硫酸基を“Ｏ−硫酸基”といい、翻訳後修飾基として酸素原子を介して結合したグリカンを“Ｏ−結合型糖鎖”という。また、本明細書において、糖タンパク質には、糖ペプチドを含むものとして理解される。言い換えると、本明細書において、糖タンパク質とは、糖タンパク質及び糖ペプチドのうち少なくとも１つであると理解される。
【００３２】
前述の“Ｏ−結合型糖鎖”において、セリン残基及びスレオニン残基の酸素原子と結合する糖としては、Ｎ−アセチルガクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、グルコースのいずれかから始まるものや、Ｎ−アセチルガクトサミン、マンノース、フコース、キシロース、グルコースのいずれかから始まり、さらに糖が結合して伸長したものでもよい。
【００３３】
前述の“修飾基を遊離し、標識する”とは、糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから、修飾基（リン酸基、硫酸基、糖鎖等、又はこれらの１若しくは２以上の基）をβ脱離反応により遊離し、β脱離反応で遊離する際に生成した二重結合に対してマイケル付加反応により、後述する標識剤によって標識することを意味する。なお、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質を用いる場合、修飾基は、翻訳後修飾基（Ｏ−リン酸基、Ｏ−硫酸基、Ｏ−結合型糖鎖等、又はこれらの１若しくは２以上の基）となる。修飾基は、糖タンパク質からの遊離と同時に、又は遊離に引き続いて、標識剤により標識される。
【００３４】
本発明の遊離標識方法においては、修飾基が遊離された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つが標識されてもよい。該標識は、修飾基への標識と同様に、標識剤によりなされる。
【００３５】
以下に、翻訳後修飾基としてＯ−結合型糖鎖が糖タンパク質から遊離され標識された反応と、糖タンパク質側が修飾された反応と、が、両方生じた場合の一例を示す（標識剤として、後述するピラゾロン誘導体（３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）を用いている）。
【００３６】
【化１】
0006499580.tif 000002
【００３７】
前述の“標識剤”は、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、及びマレイミド誘導体のうち少なくとも１つである。該標識剤は、これらのうち１種であってもよく、又は２種若しくは３種以上であってもよい。標識剤に用いられるピラゾロン誘導体としては、ピラゾロン基を有する化合物であれば適宜選択され得、例えば、３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）、１，３−ジメチル−ピラゾロン（ＤＰ）、３−メチル−１−ｐ−トリル−５−ピラゾロン（ＭＴＰ）、３−メチル−１−（キノリン−８−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン等が挙げられる。また、標識剤に用いられるイソキサゾロン誘導体としては、例えば、３（２Ｈ）−イソキサゾロン、５−メチル−３（２Ｈ）−イソキサゾロン、２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−イソキサゾロン等が挙げられる。また、標識剤に用いられるヒダントイン誘導体としては、例えば、２，４−イミダゾリジンジオン、３−メチル−２，４−イミダゾリジンジオン、３−（２−プロピン−１−イル）−２，４−イミダゾリジンジオン等が挙げられる。また、標識剤に用いられるローダニン誘導体としては、２−チオキソ−４−チアゾリジノン、３−メチル−２−チオキソ−４−チアゾリジノン等が挙げられる。本発明の遊離標識方法においては、ピラゾロン誘導体を好適に用いることができる。
【００３８】
本発明の遊離標識方法においては、標識剤とともにチオール化合物を用いてもよい。このチオール化合物としては、チオール基を有する化合物であれば、特に制限されることなく用いることができ、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−アミノエタンチオール、チオコリン、２−（ピリジン−４−イル）エタンチオール等を挙げることができる。例えば、翻訳後修飾基としてＯ−結合型糖鎖を糖タンパク質から遊離させ標識させる場合に、標識剤とともにチオール化合物を用いると、例えば、Ｏ−結合型糖鎖側を標識剤により標識させ、糖タンパク質側をチオール化合物により標識させること等が可能となり、Ｏ−結合型糖鎖側の解析に有利に働く場合がある。
【００３９】
本発明による遊離標識方法で用いる、糖タンパク質と標識剤とを含む溶液については、糖タンパク質と標識剤とを溶媒中に溶解させた状態でもよいし、糖タンパク質と標識剤とを溶媒中に分散させた状態でもよい。本発明による遊離標識方法は、効率良く反応を進める観点から、好ましくは、糖タンパク質と標識剤とを溶媒中に溶解させた状態で行われる。溶媒としては、例えば、水、メタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジオキサン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロパノール等を使用することができる。本発明の効果を奏する溶媒であれば、適宜選択され得る。
【００４０】
前述の溶液のｐＨは、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲である。このｐＨの範囲は、従来の方法（Ｃａｒｌｓｏｎの方法を含む）によるβ脱離反応のｐＨ条件（ｐＨ１１．５〜１２．５）より穏和（ｐＨが低い）であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の範囲では、糖タンパク質の分解（ペプチド分解）を低減しつつ、効率良く修飾基を遊離して標識することができる。なお、該溶液のｐＨは、より好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ９．０であり、さらにより好ましくはｐＨ８．０〜ｐＨ９．０である。なお、該溶液のｐＨの調節は、例えば、溶液に水酸化ナトリウム溶液を加えることで行うことができる。
【００４１】
本発明による遊離標識方法は、前述の溶液にマイクロ波を照射する工程を含む。
【００４２】
前述の“マイクロ波を照射する”とは、マイクロ波として波長１ｍｍ〜１ｍ、周波数３００ＭＨｚ〜３００ＧＨｚの電波を溶液に照射することをいう。マイクロ波照射は、公知のマイクロ波発生装置を用いて行うことができ、例えば、マグネトロン発振により周波数１０００〜５０００ＭＨｚ程度のマイクロ波出力が得られるマイクロ波発生装置を用いることができる。マイクロ波発生装置としては、例えば、マグネトロン発振により周波数２４５５ＭＨｚ、最大圧力３０バールで、最大８５０Ｗのマイクロ波出力が得られるＭｏｎｏｗａｖｅ３００（アントン・パール社）を用いることができる。
【００４３】
前述の“マイクロ波を照射する工程”における溶液の温度は、４℃〜１３５℃が好ましい。４℃〜１３５℃の範囲では、効率良く修飾基を遊離して標識することができ、かつ、糖タンパク質の分解（ペプチド分解）を低減させることができる。なお、溶液の温度は、より好ましくは３５℃〜１３５℃であり、さらにより好ましくは８５℃〜１３０℃である。
【００４４】
本発明による遊離標識方法によって、糖タンパク質からどのような修飾基が、どれくらいの量で遊離されたかについては、遊離されて標識剤により標識された修飾基（以後、本明細書において「標識化修飾基」という）を後述する分析方法により分析することで、確認することができる。
【００４５】
本発明の遊離標識方法によれば、β脱離反応の反応速度を向上させるとともに、修飾基の修飾剤による修飾の反応速度をも向上させることができるため、効率良くかつ短時間に、修飾基を遊離し、標識することができる。それに伴い、標識化修飾基の回収量を向上させることができる。
【００４６】
また、本発明の遊離標識方法では、従来のβ脱離反応におけるｐＨ条件（ｐＨ１１．５〜ｐＨ１２．５）のような強アルカリ性ではなく、より弱アルカリ性の条件下で反応させるため、糖タンパク質の分解（ペプチド分解）を低減させることができる。
【００４７】
次に、本発明による、修飾基を遊離し、標識するためのキットについて、説明する。
【００４８】
上述の本発明のキットは、前述の標識剤を含む溶液を備え、遊離標識方法を行うためのものである。標識剤、ｐＨ条件（溶液のｐＨをｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０に調節する）、マイクロ波照射、温度条件等については、すべて前述と同様である。本キットは、前述の標識剤を含む溶液が入っている容器を備える。該容器に糖タンパク質を含む試料（例えば、細胞破砕液を精製したサンプル）を入れて溶液と混合させて、混合溶液のｐＨを例えば水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０に調節し、該容器に直接マイクロ波を照射してもよいし、該容器から容器中の溶液を別の容器に移し替えて糖タンパク質との混合液を作製し（ｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０に調節する）、マイクロ波を照射してもよい。したがって、該容器の素材としては、前者の場合にはマイクロ波を照射しても容器内の溶液に悪影響を及ぼさない素材（例えば、ポリプロピレン等のプラスチック、ガラス）を用い、後者の場合には安定的に溶液を保存し得る素材であれば特に制限されずに用いることができる。上述の本発明のキットによれば、効率良くかつ短時間に、修飾基を遊離し、標識することができる。
【００４９】
次に、本発明による修飾基の解析方法について、詳述する。
【００５０】
本発明による修飾基の解析方法は、前述の遊離標識方法により試料中の修飾された糖タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のうち少なくとも１つから遊離され、標識された修飾基（標識化修飾基）を分析することにより行われる。
【００５１】
標識化修飾基の分析は、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。また、目的分子の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、質量分析（ＭＳ）（エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）等）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、紫外線吸光光度計（ＵＶ）、エバポレイティブ光散乱検出器（ＥＬＳ）、電気化学検出器等を用いることができる。いずれかの方法で分析してもよく、２つ以上を組み合わせて分析してもよい。本発明の効果を奏する分析方法であれば、適宜選択され得る。なお、生体試料中の糖タンパク質を用いて分析する場合、公知の方法により糖タンパク質の抽出及び精製を行った後に、分析に供することができる。
【００５２】
前述の遊離標識方法では、効率良くかつ短時間に標識化修飾基を得ることができるため、該遊離標識方法により得られた標識化修飾基を分析することによる本発明の解析方法では、より迅速に試料中の修飾基の定量的、定性的分析を行うことが可能となり、また、より多くのサンプルについて効率良く分析することができる。
【００５３】
また、前述の遊離標識方法では、標識化修飾基の回収量を向上させることができるため、該遊離標識方法により得られた標識化修飾基を分析することによる本発明の解析方法では、より高感度に修飾基の分析を行うことができる。例えば、修飾基を高感度に構造解析、定量分析することができる。
【００５４】
試料中のＯ−結合型糖鎖を解析する場合、本発明の解析方法によれば、細胞や組織中に含まれるＯ−結合型糖鎖を高感度に分析することができるため、例えば、従来困難であった細胞破砕液中の網羅的なＯ−結合型糖鎖の解析が可能となる。また、例えば、細胞中のＯ−グライコームなどの微量にしか存在しない生体由来糖鎖の解析が可能となる。
【００５５】
また、Ｏ−結合型糖鎖は、近年、ｉＰＳ細胞をはじめとする幹細胞のマーカーとして用い得ることがわかってきている。したがって、本発明の解析方法によれば、例えば、再生医療の現場にて、移植に用いるｉＰＳ細胞由来の組織において、目的の細胞に分化しているかのチェックや、ｉＰＳ細胞が残っていないかのチェックを効率良くかつ短時間に行うことができる。このように、本発明の解析方法によれば、再生医療に用いる試料をより多くかつ迅速に解析でき、再生医療の治療ストラテジーの決定に大いに役立てることができる。
【００５６】
次に、本発明による修飾基を解析するためのキットについて、説明する。
【００５７】
本発明による修飾基を解析するためのキットは、前述の遊離標識方法のためのキットを備える。該キットにより、前述の修飾基の解析方法と同様に、効率良くかつ短時間に、修飾基を解析することができる。
【００５８】
次に、本発明による遊離糖鎖の標識方法について、詳述する。
【００５９】
本発明による遊離糖鎖の標識方法は、遊離糖鎖と、標識剤と、を含むｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０の溶液にマイクロ波を照射する工程を含む。
【００６０】
前述の“遊離糖鎖”は、Ｎ−アセチルガクトサミン、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、グルコースのいずれかから始まるものや、Ｎ−アセチルガクトサミン、マンノース、フコース、キシロース、グルコースのいずれかから始まり、さらに糖が結合して伸長したものでもよい。なお、標識剤、ｐＨ条件、温度条件、マイクロ波照射の詳細については、前述と同様である。
【００６１】
以下に、標識剤としてピラゾロン誘導体（３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ））を用いた場合の遊離糖鎖の標識反応の一例を示す。
【００６２】
【化２】
0006499580.tif 000003
【００６３】
本発明の遊離糖鎖の標識方法によれば、修飾基の修飾剤による修飾の反応速度を向上させることができるため、効率良くかつ短時間に、遊離糖鎖を標識させることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６５】
（実施例１）
遊離糖鎖の標識剤（ピラゾロン誘導体）による反応に対して、反応溶液のｐＨが与える影響について検討した。【００６６】
マルトテトラオース（東京化成工業、１ｍｍｏｌ／ｍＬ、１０μＬ）に、各々２０μＬの０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ及び０．６Ｍ水酸化ナトリウムと、２０μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液と、を加え（反応溶媒：水）、ヒートブロックにより加熱温度８５℃に維持し、６０分反応させて、マルトテトラオースをＰＭＰで標識化した。反応溶液のｐＨについては、０．３Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液ではｐＨ８．０、０．４Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液ではｐＨ８．３、０．５Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液ではｐＨ１１．４、０．６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液ではｐＨ１１．８（従来の方法（Ｃａｒｌｓｏｎの方法を含む）によるβ脱離反応のｐＨ条件とほぼ同じ）であった。【００６７】
反応終了後、キトテトラオーズ（生化学工業）により調整した１０ｎｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオースを添加し、その後、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。【００６８】
マルトテトラオースのＰＭＰによる標識の反応式を下記に示す。【００６９】
【化３】
0006499580.tif 000004
【００７０】
図１に、ＰＭＰによって標識された標識化マルトテトラオースのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。図１（ａ）は０．３Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ８．０）、図１（ｂ）は０．４Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ８．３）、図１（ｃ）は０．５Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ１１．４）、図１（ｄ）は０．６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた反応溶液（ｐＨ１１．８）での結果である。０．６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた場合（ｐＨ１１．８（図１（ｄ）））では、Ｃａｒｌｓｏｎ法をはじめとする従来のβ脱離反応の方法と同等のｐＨ条件であるが、標識化マルトテトラオースのシグナルは出現しなかった。一方、０．３Ｍ、０．４Ｍ及び０．５Ｍの水酸化ナトリウムを加えた場合（ｐＨ８．０（図１（ａ））、ｐＨ８．３（図１（ｂ））、及びｐＨ１１．４（図１（ｃ）））では、標識化マルトテトラオースのシグナルが出現し、０．４Ｍ水酸化ナトリウムを加えた場合（ｐＨ８．３（図１（ｂ）））で最も高い標識化マルトテトラオースのシグナルが出現した。【００７１】
以上より、マルトテトラオースのピラゾロン誘導体による反応においては、Ｃａｒｌｓｏｎ法をはじめとする従来のβ脱離反応の方法での反応条件とは異なり、反応溶液のｐＨ条件がｐＨ８．３の場合に、最も反応効率が高いことが示された。【００７２】
（実施例２）
遊離糖鎖のピラゾロン誘導体による標識反応に対して、マイクロ波照射による加熱の有無が与える影響について検討した。【００７３】
マルトヘキサオース（東京化成工業、１ｍｍｏｌ／ｍＬ、１００μＬ）に、２００μＬの０．４Ｍ  ＮａＯＨ、及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、実施例ではマイクロ波発生装置（Ｍｏｎｏｗａｖｅ３００、アントン・パール社）により加熱温度８５℃に維持し、比較例ではヒートブロックにより加熱温度８５℃に維持し、１０分、２０分、３０分又は６０分静置した。各々の反応溶液のｐＨは８．３であった。【００７４】
反応終了後、５００ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオース（実施例１と同様）を添加した後、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【００７５】
図２に、ＰＭＰによって標識された標識化マルトヘキサオースのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。図２（ａ）はヒートブロックにより加熱した比較例、図２（ｂ）はマイクロ波発生装置により加熱した実施例によるスペクトルである。いずれにおいても、標識化マルトヘキサオースのシグナルが出現していた。【００７６】
図３に、標識化されたマルトヘキサオースの回収量を、外部標準により比較した結果を示す。比較例（ヒートブロックにより８５℃に加熱）では、マルトヘキサオースの標識化の立ち上がりが遅く、反応開始６０分後でも緩やかな回収量の増加がみられた。一方、実施例（マイクロ波照射により８５℃に加熱）では、反応開始１０分後にはマルトヘキサオースの標識化がほぼ完了しており、反応開始６０分後の反応効率は比較例（マイクロ波照射無し）と比較して２０％高かった。【００７７】
以上より、マイクロ波照射により加熱することで、マルトヘキサオースのピラゾロン誘導体による標識の反応効率が向上し、標識化されたマルトヘキサオースの回収量が増加することが示された。【００７８】
（実施例３）
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質のピラゾロン誘導体による遊離標識反応に対して、マイクロ波照射による加熱の有無が与える影響について検討した。【００７９】
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質であるブタ胃ムチン（シグマアルドリッチ、１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に、２００μＬの０．４Ｍ  水酸化ナトリウム、及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、実施例ではマイクロ波発生装置（実施例２と同様）により加熱温度８５℃に維持し、比較例ではヒートブロックにより加熱温度８５℃に維持し、２時間静置した。各々の反応溶液のｐＨは８．３であった。【００８０】
反応終了後、１００ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオース（実施例１と同様）を添加した後、１Ｍ塩酸で中和し、反応液をイアトロビーズカラム（イアトロン社）により精製し、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【００８１】
ムチンのＰＭＰによる遊離標識の反応式を下記に示す。【００８２】
【化４】
0006499580.tif 000005
【００８３】
図４に、検出された糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。図４（ａ）はヒートブロックにより加熱した比較例、図４（ｂ）はマイクロ波発生装置により加熱した実施例のスペクトルである。いずれにおいてもタンパク質の分解物のピークは検出されておらず、ＰＭＰによって標識された糖鎖のシグナルが出現していた。【００８４】
図５に、検出された糖鎖のヒストグラムを示す。外部標準により回収量を比較した結果、実施例（マイクロ波照射により８５℃に加熱）では、比較例（ヒートブロックにより８５℃に加熱）に比して、標識化されたＯ−結合型糖鎖の総量が約４倍に増加していた。【００８５】
以上より、マイクロ波照射を照射することにより、Ｏ−結合型糖鎖のβ脱離反応及びピラゾロン誘導体による遊離糖鎖の標識反応の反応効率が向上し、標識化されたＯ−結合型糖鎖を高い効率で回収できることが示された。【００８６】
（実施例４）
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質のピラゾロン誘導体による遊離標識反応に対して、反応溶媒の種類の違いが与える影響について検討した。【００８７】
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質であるブタ胃ムチン（実施例３と同様）（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に、反応溶媒としてＤＭＳＯ又はメタノールを用いて、２００μＬの０．４Ｍ  ＮａＯＨ、及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）を加え、マイクロ波発生装置（実施例２と同様）により加熱温度１２０℃で２時間静置した。各々の反応溶液のｐＨは８．３であった。【００８８】
反応終了後、１００ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオース（実施例１と同様）を添加した後、１Ｍ塩酸で中和し、クロロホルムで洗浄した後、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【００８９】
図６に、検出された糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。反応溶媒がＤＭＳＯ（図６（ａ））及びメタノール（図６（ｂ））のいずれにおいても、同程度の糖鎖の回収が確認された。【００９０】
以上より、ムチンのピラゾロン誘導体による遊離標識反応の反応溶媒として、ＤＭＳＯ及びメタノールが使用可能であることが示された。【００９１】
（実施例５）
Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドのピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、ペプチド分解がみられるか検討した。【００９２】
Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する合成糖ペプチド（２０μｇ／１００μＬ）に、２００μＬの０．４Ｍ  ＮａＯＨ、２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、マイクロ波発生装置（実施例２と同様）により加熱温度１２０℃に維持し、２時間静置した。反応溶液のｐＨは８．３であった。【００９３】
反応終了後、１Ｍ塩酸で中和し、反応液をクロロホルムで洗浄し、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【００９４】
図７に、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの遊離標識反応後のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。ＰＭＰによって標識された糖鎖及びペプチドのシグナルが出現し、ペプチドの分解したピークは検出されなかった。【００９５】
以上より、Ｏ−ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドのピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、ペプチドの分解はほとんど検出されず、反応が２時間で完了することが示された。これは、Ｃａｒｌｓｏｎ法をはじめとする従来のβ脱離反応の方法とは異なるｐＨ条件下（水素イオン濃度で＞１０３）で遊離標識反応を行うことで、ペプチドの分解が抑制され、それに伴う反応性の低下がマイクロ波照射にて補償されたことによると考えられる。【００９６】
（実施例６）
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質のピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、マイクロ波照射による加熱温度の違いが反応効率に与える影響について検討した。【００９７】
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質であるブタ胃ムチン（実施例３と同様）（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に、２００μＬの０．４５Ｍ  ＮａＯＨ、及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、マイクロ波発生装置（実施例２と同様）により加熱温度８５℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃及び１４０℃にて、２時間静置した。反応溶液のｐＨは８．３であった。【００９８】
反応終了後、１００ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオース（実施例１と同様）を添加した後、１Ｍ塩酸で中和し、反応液をイアトロビーズカラム（実施例３と同様）により精製し、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【００９９】
図８に、糖タンパク質糖鎖のＭＡＬＤＩスペクトルを示す。図８（ａ）は加熱温度８５℃、図８（ｂ）は加熱温度１００℃、図８（ｃ）は加熱温度１１０℃、図８（ｄ）は加熱温度１２０℃、図８（ｅ）は加熱温度１３０℃、図８（ｆ）は加熱温度１４０℃である。加熱温度１２０℃では、ＰＭＰよって標識された糖鎖の回収量が最も多かった（図８（ｄ））。一方で、加熱温度１４０℃では、タンパク質の分解物と思われるピークが検出された（図８（ｆ））。【０１００】
図９に、検出された糖鎖のヒストグラムを示す（外部標準により回収量を比較した）。マイクロ波照射による加熱温度１２０℃において、ピラゾロン誘導体によって標識されたＯ−結合型糖鎖の回収量が最も多かった。【０１０１】
以上より、ムチンのピラゾロン誘導体による遊離標識反応においては、マイクロ波照射による加熱温度１２０℃で最も反応効率が高いことが示された。【０１０２】
（実施例７）
糖タンパク質であるブタ胃ムチンのピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、遊離標識された糖鎖総量の経時変化を評価した。【０１０３】
Ｏ−結合型糖鎖を有する糖タンパク質であるブタ胃ムチン（実施例３と同様）（１ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）に、２００μＬの０．４Ｍ  ＮａＯＨ、及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、マイクロ波発生装置（実施例２と同様）により加熱温度１２０℃にて、０．５時間、１時間、２時間、及び４時間静置した。反応溶液のｐＨは８．３であった。【０１０４】
比較例においては、前述同様のブタ胃ムチン（１０ｍｇ／ｍＬ、１０μＬ）に、２０μＬの０．４Ｍ  ＮａＯＨ、及び２０μＬの０．５Ｍ  ＰＭＰのメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、サーマルサイクラーにより加熱温度８５℃にて、２時間、４時間、８時間、及び１６時間静置した。反応溶液のｐＨは８．３であった。【０１０５】
反応終了後、１００ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオース（実施例１と同様）を添加した後、１Ｍ塩酸で中和し、反応液をイアトロビーズカラム（実施例３と同様）により精製し、２，５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【０１０６】
図１０に、ブタ胃ムチンより遊離され、ＰＭＰにより標識された糖鎖総量の経時変化を示す（実施例（マイクロ波照射により１２０℃に加熱）及び比較例（サーマルサイクラーにより８５℃に加熱））。比較例（サーマルサイクラーにより８５℃に加熱）では、立ち上がりが遅く、反応開始１６時間後においても回収量は１０００ｐｍｏｌに満たなかった。一方で、実施例（マイクロ波照射により１２０℃に加熱）では、反応開始２時間後で回収量が最大となり、比較例に比して、約７倍の回収量が得られた。【０１０７】
以上より、ムチンのピラゾロン誘導体による遊離標識反応において、マイクロ波照射による加熱を行うことにより、遊離標識された糖鎖が効率良くかつ短時間に回収されることが示された。【０１０８】
（実施例８）
細胞ペレットを用いたピラゾロン誘導体による遊離標識反応により、Ｏ−結合型糖鎖を検出できるか検討した。【０１０９】
ヒトｉＰＳ細胞（ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ、理化学研究所）の細胞ペレット（１×１０６個）を、２％ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス酢酸緩衝液中（１００μＬ）で、超音波処理（５秒照射＋１０秒インターバルを４セット）により溶解した。可溶化した細胞破砕液に、２μＬの０．５Ｍトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（終濃度約１００ｍＭ）及び２００ｍＭのヨードアセトアミド（終濃度約２０ｍＭ）を加え、タンパク質のジスルフィド結合を還元アルキル化した（室温、３０分）。反応液に４７２μＬ（４倍量）の氷冷エタノールを加えてエタノール沈殿（−３０℃、２時間）を行い、遠心分離（２００００×ｇ、１０分、４℃）により、沈殿（タンパク質画分）と上清とに分けた。沈殿の方をＯ−結合型糖鎖解析に供した。沈殿に超純水を加えて溶解し、Ａｍｉｃｏｎ（ミリポア社）を用いて、分子量３０００以上の糖タンパク質濃縮画分とした。【０１１０】
回収した糖タンパク質濃縮画分１００μＬに、２００μＬの０．４Ｍ水酸化ナトリウム及び２００μＬの０．５Ｍ  ３−メチル−１−フェニル−５−ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え（反応溶媒：水）、マイクロ波発生装置（実施例２と同様）により加熱温度１２０℃で２時間静置した。反応溶液のｐＨは８．３であった。【０１１１】
反応終了後１００ｐｍｏｌのｂｉｓＰＭＰ標識キトテトラオース（実施例１と同様）を添加した後、１Ｍ  ＨＣｌにより中和し、クロロホルムを加え洗浄することで過剰試薬を除去した後、グラファイトカーボン及びイアトロビーズ（実施例３と同様）により糖鎖部分を精製した。精製したサンプルを２、５−ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）（実施例１と同様）により解析を行った。【０１１２】
図１１に、検出されたＯ−結合型糖鎖のマススペクトルを示す。細胞ペレットから、各種のＯ−結合型糖鎖が高感度に検出された。【０１１３】
以上より、ピラゾロン誘導体による遊離標識反応を利用することで、細胞ペレットからＯ−結合型糖鎖を高感度に解析できることが示された。【０１１４】
なお、本発明は、本発明の広義の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１１５】
本発明は、２０１３年５月３１日に出願された日本国特許出願２０１３−１１５７８２号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１３−１１５７８２号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明によれば、効率良くかつ短時間に、試料中の修飾基の定量的、定性的分析を行うことが可能であり、修飾基の高感度な構造解析や定量分析も可能である。このように、本発明によりＯ−結合型糖鎖をはじめとする修飾基の網羅的な解析が可能となり、生物学や医学への貢献が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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