(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒化生ＰＲＲＳウイルスおよび不活化ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原を組み合わせて含むワクチンであって、該不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原が、殺菌全細胞細菌ローソニア・イントラセルラリスを含むことを特徴とするワクチン。
【請求項２】
ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染に対するブタの保護のための、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染に起因する臨床疾患に対するブタの保護のための、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
ワクチンが一回投与後のＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染に対するブタの保護用であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
ワクチンがアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
アジュバントが鉱油を含むことを特徴とする、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
ワクチンが用量当たり１×１０７個の細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に相当するローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原を含むことを特徴とする、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
ワクチンが用量当たり４．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンを動物に投与することを含む、ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染に対してブタを保護するための方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のワクチンを動物に投与することを含む、ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染に対してブタを保護するための方法。
【請求項１１】
方法がワクチンの一回投与後に保護をもたらすことを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の一般分野
本発明は、概ねブタの健康分野に関する。ブタは、多くの病原性微生物に罹り易い。感染の制御は通常、安定した管理および飼料管理、抗ウイルス剤および抗生物質等の薬剤による処置、またはワクチンを使用する予防処置によって行われる。
【発明の概要】
【０００２】
発明の目的
ブタの健康を管理するための簡便で、安全かつ有効な方法に対する継続的な必要性が存在する。
【０００３】
発明の概要
本発明の目標を達成するために、種々の疾病を引き起こす微生物による感染に対する、組み合された（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）ブタの保護のための新規なワクチンが考案され、該ワクチンは弱毒化生ＰＲＲＳ（豚繁殖・呼吸障害症候群）ウイルスおよび不活化ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原を組み合わせて（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）含む。ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）は、双方ともブタの健康への悪影響に起因して、本質的な経済損失に対する要因である。双方の種類の微生物に対する薬剤ならびにワクチンは知られかつ市販されているが、これらの病原菌の感染または臨床疾患に対する組み合された（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）保護に適した、有効で、高品質（例えば、安定、非抗原干渉）かつ同時に幼若動物での使用に対して安全である混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）は市販されていない。周知の通り熟慮されたまたは提案された抗原の全ての組み合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が、安全でかつ有効な混合ワクチンをもたらすわけではない。事実、単独（一価）ワクチンが安全かつ有効である場合でも、混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）の安定性、安全性および有効性に関する高いレベルの不確実性が存在する。
【０００４】
ここで用語「混合（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、例えば別々の二つのワクチンを一つの注射部位に注射することによって被験動物に投与して、初めて抗原が生ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の殺菌全細胞の混合形態（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆｏｒｍ）として提供されることを除外しないことに留意されたい。
【０００５】
欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ）の動物用医薬品委員会は、その刊行物「指針の注意事項：動物用混合製品（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の要件」（ＥＭＥＡ、２０００年、ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７‐最終）において、「混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）の開発は容易ではない。それぞれの混合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、品質、安全性および有効性に関して独立して開発され研究されなければならない」と言明した（２／６ページ）。委員会は、優れた混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）の探索には、例えば保存剤、賦形剤および安定剤、賦活化剤およびアジュバントを含む、混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）中の個々の成分間の安定性および適合性が典型的に含まれるということをさらに表明する。３ページの一番上の段落において「混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）において二以上の成分の存在は、しばしば相互作用を引き起こし、特定の成分が単独で投与される場合に比較して、個々の成分に対する減少したまたは増大した反応をもたらす．．．．．該相互作用はしばしば事実上免疫学的であるが、しかしまた、免疫系への直接的影響は少ない他の要因によっても引き起こされ得る」、また「混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）に対する免疫応答を増強させるためにアジュバントが使用される場合、特別な問題が現れ得る」と述べられている。
【０００６】
合衆国保健福祉省、食品医薬品局、生物学的製剤評価研究センターは、１９９７年４月に「産業界のための、予防可能な疾病用の混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）の評価用の産業界のための指針：生産、試験および臨床研究」を出版し、該指針において「経験は一価ワクチンを混合すること（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）が、望ましい安全性または有効性を満たさない新規な混合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）をもたらし得ることを示してきた。時々不活化ワクチンの成分が、一または複数の活性成分に有害に作用し得る」と述べられており（３ページ、「成分の適合性」）、例えば低下した百日咳の効果しか有さないワクチンをもたらす、生百日咳ワクチンと不活化ポリオウイルスワクチンを混合する場合に生じる例のように、特に不活化ワクチンが生ワクチンの効果に悪影響を及ぼし得る、ということを示している。ワクチンにおけるいかなる追加の成分も、個々のワクチンと比較した場合、最終製品の安全性および効果を悪化させ得ることが示されている。
【０００７】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全性の基礎」と称するｅラーニングコースを公開し、そのモジュール２において混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）を考慮している。このモジュールは「認可された混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）」は、製品が安全、有効および受け入れ可能な品質であることを保証するために、承認前に国内当局によって厳しい試験を受ける」で始まる。それはまた「全ての混合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に関し製造業者はそれ故に、各抗原成分の効力、免疫を誘導するために混合される場合のワクチン成分の有効性、毒性への復帰の可能性のリスクおよび他のワクチン成分との反応を評価しなければならない」とも述べている。
【０００８】
本発明はまた、本ワクチンそれ自身に次いで、前記ワクチンを投与することを含む、ＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染症からブタを保護する方法にも関する。
【０００９】
定義
ワクチンは、ワクチン接種後の病原性微生物による感染に対し保護する組成物（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、すなわち、典型的にはワクチン接種した宿主内で例えば抗体により微生物自身を妨げることによって、微生物による感染を予防または低減し、または感染から引き起こされる臨床症状を予防または低減する組成物である。従ってワクチン接種は、感染のレベルを予防もしくは少なくとも軽減しおよび／または該感染に起因する臨床疾患のレベルを予防もしくは少なくとも軽減する。
【００１０】
野生型細菌の不活化抗原は、対応する病原性細菌または一または複数のその病原性因子が、この免疫反応の結果として宿主の免疫系によって認識され、最終的に少なくとも中和されるように、それに対して免疫反応が誘発され得る、生細菌それ自体以外のあらゆる物質または化合物である。野生型細菌の不活化抗原の典型的な例は、殺菌された全細菌（用語「全（ｗｈｏｌｅ）」は、細菌細胞が少なくとも一部が殺菌工程中に破裂させられること、または殺菌全細胞細菌の抽出物または破砕物が「殺菌全細胞細菌」ワクチンにおいて実際に抗原として提供されることを除外しない）、表面発現タンパク質等の細菌のサブユニットおよび毒素である。後二者は、組換えで発現されるとは限らない。ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に関して数種類の不活化抗原が当該技術分野において知られており、例えばＷＯ２００９／１４４０８８（殺菌全細胞細菌、実施例１および２）、ＷＯ２００５／０７０９５８（サブユニット）およびＷＯ９７／２００５０（殺菌全細胞）から知ることができる。
【００１１】
弱毒化生ウイルスは、それ自体複製可能であるが、しかし通常その病原性の（しばしば野生型の）病原性カウンターパートに伴う疾病の一連の症状を誘発することが可能でないウイルスである。典型的に生ウイルスは、標的宿主の中で複製せず、または宿主細胞に対しそれほど有害でない速度で複製し、または有害な宿主反応を誘発しない。ＰＲＲＳウイルスに関して当該技術分野で、インビトロで培養された宿主細胞系において、多数回継代によって弱毒化される野生型ウイルス由来の弱毒化生ウイルス、例えばＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ａｍｅｒｖａｃ−ＰＲＲＳ（Ｈｉｐｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｙｒｓｖａｃ‐１８３（登録商標）（Ｈｉｐｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＦｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＲＲＳ（Ｚｏｅｔｉｓ）等を含む、いくつかのワクチンが知られている。当該技術分野において他の弱毒化生ＰＲＲＳウイルスが、例えばＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３８巻、１‐２号、２００９年７月２日、３４‐４０ページ；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１０６巻、３‐４号、２００５年７月１５日、３０９‐３１９号およびＶａｃｃｉｎｅ、２６巻、２９‐３０号、２００８年７月４日、３５９４‐３６００ページに記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、攻撃感染後の体温を示す。
【図２】図２は、攻撃感染後の一日平均体重増加（ＡＤＷＧ）を示す。
【図３】図３は、攻撃感染後のＰＰＲＳウイルスの血清学検査を示す。
【図４】図４は、攻撃感染後のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の血清学検査を示す。
【図５】図５は、攻撃感染後のＰＲＲＳウイルス血症を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の実施形態
一実施形態においてワクチンは、一回の投与後のＰＲＲＳウイルスおよび細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）による感染に対するブタの保護用である。ブタは、ワクチンの一回の投与後でさえ双方の病原菌に対し保護されることが有利にも見出だされた。この実施形態は、例えば保護レベルを再生するために最初のワクチン接種の６ないし１２か月後に、引き続く（ｆｏｌｌｏｗ  ｕｐ）ワクチン接種が与えられることを除外しない。この引き続くワクチン接種は、保護が追加ワクチン接種後にのみ獲得される、初回‐追加（ｐｒｉｍｅ‐ｂｏｏｓｔ）ワクチン接種スキームにおける追加ワクチン接種とは異なる。初回‐追加スキームにおいて二つのワクチン接種は、典型的には２~３週間離れている。
【００１４】
一実施形態においてワクチンは、アジュバントを含む。不活化抗原の免疫反応を改善するために典型的に使用されるアジュバントは、ＷＨＯがワクチン安全性基礎コース（上記参照）におけるコースの１ページ、最後の二行（章「混合ワクチン」）においてこの種類の妨害および反応性について明確に警告しているにもかかわらず、弱毒化生ＰＲＲＳウイルスを負に妨害しないし、他の抗原に対する反応性を過度に増強もしないことが見出された。さらなる実施形態においてアジュバントは、例えばＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌから入手可能である飽和炭化水素油（Ｍｒｃｏｌ（登録商標）５２）等の鉱油を含む。
【００１５】
また別の実施形態において不活化ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原は、殺菌全細胞細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を、好ましくはワクチンが用量当たり１×１０７個の細菌ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に相当する、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原を含むような負荷で含む。本実施形態において除外されない高度の抗原負荷は、免疫保護および免疫持続期間のレベルに正の影響を及ぼし得る。
【００１６】
ワクチンのＰＲＲＳｖ負荷に関して、一実施形態においてワクチンは、用量当たり４．０ｌｏｇ１０（１０ｌｏｇの４単位）ＴＣＩＤ５０の弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含む。本実施形態において除外されない高度の抗原負荷は、免疫保護および免疫持続期間のレベルに正の影響を及ぼし得る。
【００１７】
本発明を以下の実施例および図を使用してさらに説明する。
【００１８】
実施例１は、ＰＲＲＳウイルスおよびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）混合ワクチンに関する研究を記載する。
【００１９】
図１は、攻撃感染後の体温を示す。
【００２０】
図２は、攻撃感染後の一日平均体重増加（ＡＤＷＧ）を示す。
【００２１】
図３は、攻撃感染後のＰＰＲＳウイルスの血清学検査を示す。
【００２２】
図４は、攻撃感染後のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）の血清学検査を示す。
【００２３】
図５は、攻撃感染後のＰＲＲＳウイルス血症を示す。
【００２４】
実施例２は、ＰＲＲＳウイルスおよびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）混合ワクチンに関する第二の研究を記載する。
【００２５】
実施例１
研究計画
本試験には５匹の雌ブタの子孫（子ブタ２３匹）を使用した。子ブタがおよそ二週齢のときに、以下の通りワクチン接種した：
‐第一群（第１群、８匹）を、Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（登録商標）（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用して溶解した、凍結乾燥Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳワクチン（オランダＢｏｘｍｅｅｒのＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）により接種した（ＩＭ）。単一用量は、２ｍｌ（投与量）中に計算量で４ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０のウイルスを含み、首の右側に投与した。
【００２６】
‐第二群を（第２群、９匹）を、既成のローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）ワクチンに溶解した、同一のＰＲＲＳワクチンにより接種した（ＷＯ２００９／１２７６８４の抗原に関する実施例２を参照されたい：本実験において殺菌全細胞を、１２．５％（ｖ／ｖ）（＝ワクチンの全量に対する油量））の鉱油Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ）、０．７５％（ｗ／ｖ）のビタミンＥアセテートおよび０．８０％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および注射用水を含む、水中油型エマルジョン中で製剤した）。ワクチンを室温で混合し、投与前３０分まで放置した。単一用量は、２ｍｌ（投与量）中に計算量で４ｌｏｇ１０ＴＣＤ５０のウイルスおよび２×１０７個の細菌細胞を含み、首の右側に投与した。
【００２７】
‐第三群（第３群、６匹）中の子ブタはワクチン接種せず、ワクチン非接種の攻撃感染の対照とした。病原性ＰＲＲＳ攻撃ウイルスを使用して鼻腔内経路により、攻撃感染をワクチン接種の４週間後に実施した。
【００２８】
ワクチン接種および攻撃感染後に、全ての子ブタの臨床症状を毎日観察した。体温を感染の一日前および当日およびその後十日間、毎日測定した。体重を攻撃感染前の当日、攻撃感染の十日後および実験の終了の一日前（攻撃感染２７日後）に測定した。血液試料を攻撃感染時および３、５、７、１０、１４、２１および２８日後に採取した。
【００２９】
実験手順
獣医学的試験
ワクチン接種の一日前に、子ブタの総体的な健康を検査した。
【００３０】
臨床症状の観察
到着の日に始めて毎日、全てのブタの臨床症状を観察した。攻撃感染の日に始めて、起こり得る全身性反応、例えば食欲不振、動きを拒否する仕草、横臥性行、気力低下または嗜眠、震え、剛毛および特に目の周りの可能な浮腫、嘔吐および下痢または頻呼吸および腹式呼吸等を個別に記録した。
【００３１】
体温の測定
全動物の体温を、攻撃感染の一日前および当日およびその後１０日間毎日（日の同時刻に）測定した。
【００３２】
体重の測定
子ブタの体重を、攻撃感染の一日前、攻撃感染の１０および２７日後に測定した。
【００３３】
血液の試料採取
陰性の状態を確認するために、全ての雌ブタ由来の血液試料を、ワクチン接種の一日前に採取した。攻撃感染時および３、５、７、１０、１４、２１および２８日後に、血液試料を子ブタから採取した。血清試料のＰＲＲＳウイルスの存在可能性およびＰＲＲＳＶ特異的抗体およびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）特異的抗体の存在可能性を試験した。
【００３４】
結果
臨床症状
実験の経過期間中にワクチン接種または攻撃感染後の臨床反応は認められなかった。特にブタにとって鉱油が重い局所部位反応をもたらしうる非常に過酷なアジュバントでない限り、本アジュバントの使用は、新規な混合ワクチンにとって安全であると思われる。従ってより穏やかなアジュバントについても、安全性はまったく問題が無いことが分かる。
【００３５】
体温
攻撃感染の一日前および当日に測定された攻撃感染前の平均体温を各群について計算した。図１は、攻撃感染前の平均体温に関して、１０ｐｃ日（攻撃感染後１０日）までの平均体温の上昇を示す。２ｐｃ日にワクチン非接種の対照の群においてのみ、平均体温が１℃だけ上昇した。他の全ての攻撃感染後の時点において、ワクチン接種群においても対照群の子ブタにおいても上昇は測定されなかった。
【００３６】
体重および体重増加
実験開始時に、子ブタを開始時体重および性別に関係なくランダムに群に割り当てた。図２から明らかなように、第２群の混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）は、対照よりも高い単独のＰＲＲＳＶワクチンと同じＡＤＷＧ（一日平均体重増加）をもたらす傾向にある。
【００３７】
ＰＲＲＳＶ血清学検査
ＰＲＲＳワクチンを投与されたブタのみが、攻撃感染時に陽性であった。図３から明らかなように（結果をＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳ  Ｘ３  ＥＬＩＳＡを使用して「陽性試料すなわちＳ／Ｐ」比として示す）、抗ＰＲＲＳ力価はローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原によって負の影響を受けないように思われる。これに反して各時点においてＰＲＲＳ力価は、混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）を投与された動物に対してより高いので、抗ＰＲＲＳ力価に対し予想外の正の影響があると思われる。このことはまだ解明されていない理由で、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原が生ＰＲＲＳウイルスに対する免疫反応を増強することを示唆する。
【００３８】
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）血清学検査
図４は、ローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）血清学検査の結果を示す。明らかなように、第１群の動物は実験を通して陰性のままであった。第２群の動物の中で８０~９０％は、病原性のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）攻撃感染に対し保護された動物に相当する転換に匹敵する良好な血清転換を示した。
【００３９】
攻撃感染後のＰＲＲＳＶウイルス血症
良く知られているようにウイルス血症は、ＰＲＲＳウイルス感染および結果として生じる臨床疾患に対する保護のための主な読み出し情報である。結果を図５に示す。第１群および第２群の双方は、ウイルス血症において非常に高くかつ同等の低減を示す。
【００４０】
実施例２
研究計画
本研究は、本混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）がアジュバントの種類および生ＰＲＲＳ菌株の種類に依存しないことを確認するために計画した。このために代替アジュバントであるＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（オランダＢｏｘｍｅｅｒのＭＤＳ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）およびＣａｒｂｏｐｏｌ（ＵＳＡオハイオ州ＣｌｅｖｅｌａｎｄのＬｕｂｒｉｚｏｌからＣａｒｂｏｐｏｌ９７４Ｐとして入手可能）を使用した。代替ＰＲＲＳｖ菌株は、現在市販されているワクチンＰｒｉｍｅ  Ｐａｃ  ＰＲＲＳ（ＵＳＡデラウェア州ＭｉｌｌｓｏｂｒｏのＭｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）のような、（実施例１において使用された１型菌株の代わりに）２型菌株である。
【００４１】
数匹の雌ブタの子孫を使用して、１５匹の子ブタを５匹の子ブタからなる３の処理群に割り当てた。およそ１週齢時に第１群および第２群の子ブタを、下記の表１に示したようにＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（ＤＦ）またはＣａｒｂｏｐｏｌ（０．８％（ｗ／ｖ））中で再構成した、凍結乾燥不活化ローソニ（Ｌａｗｓｏｎｉａ）アワクチン（実施例１で使用したのと同一の抗原であるが、凍結乾燥されて、従って凍結乾燥安定剤との混合（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）である）により接種した。ワクチンを首の左側の筋肉内（ＩＭ）に投与した。およそ５週齢時に子ブタを、ＤＦかＣａｒｂｏｐｏｌ（０．８％（ｗ／ｖ））のいずれかでの抗原の再構成によって一つのワクチンに混合された（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）二つの異なる生ＰＲＲＳＶ菌株およびローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）抗原により接種した。ＰＲＲＳＶ２型ワクチンであるＰｒｉｍｅ  Ｐａｃ  ＰＲＲＳを、２ｍｌ中に１０４．５ＴＣＩＤ５０量のウイルスを含むように溶解し、ならびにＰＲＲＳＶ１型ワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳを２ｍｌ中に１０４．０ＴＣＩＤ５０量のウイルスを含むように溶解した。第二のワクチン接種のために、ワクチンを首の右側の筋肉内（ＩＭ）に投与した。第３群の子ブタはワクチン接種せず、ワクチン非接種の対照とした。
【表１】
0006484241.tif 000002
【００４２】
第一のワクチン接種後、子ブタの臨床症状を毎日観察した。全ての子ブタから血液試料を、第一のワクチン接種前、第二のワクチン接種前および第二のワクチン接種の２、４および６週間後に採取した。血清試料のＰＲＲＳウイルスおよびローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）に対する抗体を調べた。
【００４３】
結果
実験期間中に臨床反応は観察されなかった。すべての動物のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＲＲＳに対する抗体は、第二のワクチン接種日に陰性であった。対照を除きすべての動物のローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）およびＰＲＲＳｖ特異抗体は、第二のワクチン接種の６週間後に陽性であった。これは、混合ワクチン（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ）が安全であり、かつローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）およびＰＲＲＳウイルスに対する能動免疫化をもたらしたことを証明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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