(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）野生型ヒトＩＬ−１βと比較して、その受容体に対する低下した親和性を特徴とする変異体ヒトＩＬ−１βであって、前記変異体ヒトＩＬ−１βは、Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３１Ｇ、Ｈ１４６Ａ、Ｑ１４８Ｇ、Ｋ２０８Ｅ、Ｋ２０９Ａ、Ｈ１４５Ａ及びＬ１４７Ａ、Ｆ１６２Ａ及びＱ１６４Ｅ、Ｑ１４８Ｇ及びＫ２０８Ｅ、Ｒ１２０Ｇ及びＱ１３１Ｇ、Ｒ１２０Ｇ及びＨ１４６Ａ、Ｒ１２０Ｇ及びＫ２０８Ｅ、並びにＲ１２０Ｇ、Ｆ１６２Ａ、及びＱ１６４Ｅから選択される一つの変異を含む、変異体ヒトＩＬ−１β、及び、
（２）ラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）または新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）を含む標的化部分であって、標的細胞において前記変異体ヒトＩＬ−１βの活性を回復する標的化部分、
を含む標的化構築物を含む組成物。
【請求項２】
前記標的化部分が、ＩＬ−１ファミリーサイトカイン受容体を発現する細胞上に発現したマーカーを標的とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記標的化部分が、ＩＬ−１Ｒ１及び／またはＩＬ−１ＲａｃＰを発現する細胞上に発現したマーカーを標的とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的化部分が、組織特異的マーカーに指向される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記標的化部分が、Ｈｅｒ２またはレプチン受容体に指向される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記変異体ヒトＩＬ−１βが、Ｑ１３１ＧおよびＱ１４８Ｇを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記標的化部分が、抗Ｈｅｒ２またはレプチン受容体ＶＨＨを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記変異体ヒトＩＬ−１βが、Ｑ１４８ＧおよびＫ２０８Ｅを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記標的化部分が、抗Ｈｅｒ２またはレプチン受容体ＶＨＨを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記変異体ヒトＩＬ−１βが、Ｒ１２０ＧおよびＱ１３１Ｇを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記標的化部分が、抗Ｈｅｒ２またはレプチン受容体ＶＨＨを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記変異体ヒトＩＬ−１βが、Ｒ１２０ＧおよびＨ１４６Ａを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記標的化部分が、抗Ｈｅｒ２またはレプチン受容体ＶＨＨを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記変異体ヒトＩＬ−１βが、Ｒ１２０ＧおよびＫ２０８Ｅを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的化部分が、抗Ｈｅｒ２またはレプチン受容体ＶＨＨを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記変異体ヒトＩＬ−１βが、Ｒ１２０Ｇ、Ｆ１６２Ａ、およびＱ１６４Ｅを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記標的化部分が、抗Ｈｅｒ２またはレプチン受容体ＶＨＨを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬品として使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫応答を刺激することにおいて使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
ＮＦκＢの活性化において使用するための、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
癌を治療することにおいて使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン受容体を媒介して低下した活性を有し、修飾されたインターロイキン−１ファミリーメンバーサイトカインが標的細胞に特異的に送達される、修飾インターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーメンバーサイトカインに関する。好ましくは、ＩＬ−１ファミリーメンバーサイトカインは変異体であり、より好ましくはＩＬ−１受容体に対して低い親和性を有する変異体ＩＬ−１であり、この変異体ＩＬ−１は標的細胞に特異的に送達される。標的化は、修飾ＩＬ−１ファミリーメンバーサイトカインの、標的化部分、好ましくは抗体または抗体様分子への融合により実現されることが好ましい。本発明は更に、このような標的修飾ＩＬ−１ファミリーメンバーサイトカインの、疾患を治療するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーは、１１種類の構造的に関連したファミリーメンバー（ＩＬ−１α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３及びＩＬ−１Ｆ５からＩＬ−１Ｆ１０）で構成され、密接に関連した受容体のグループを介して作用する最も強力な免疫系シグナル伝達分子に含まれる。すべてのＩＬ−１受容体は、類似した活性化の機序を有する：一次受容体サブユニットにリガンドが結合すると（すなわち、ＩＬ−１α及びβに対してＩＬ−１Ｒ１、ＩＬ−１８に対してＩＬ−１８Ｒ並びにＩＬ−３３に対してＳＴ２）、二次受容体サブユニットを動員し（すなわち、ＩＬ−１α及びβに対してＩＬ−１ＲＡＰ、ＩＬ−１８に対してＩＬ−１８ＲＡＰ並びにＩＬ−３３に対してＩＬ−１ＲＡＰ）、並列した受容体サブユニットの細胞質内Ｔｏｌｌ/ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）ドメインを媒介してシグナル伝達が開始される。二量体化したＴＩＲドメインは、ＭＹＤ８８アダプタータンパク質に対してドッキングプラットフォームを提供し、その他の媒介を動員することで、炎症性核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化させる。ＩＬ−１ファミリーメンバーは、主に先天性免疫細胞により産生され、免疫応答の間に様々な細胞型に作用する（Ｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２０１０を参照）。
【０００３】
Ｔリンパ球は、主なＩＬ−１ファミリー標的細胞の１つであり、異なるＴ細胞サブセット、特にＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ，２０１１；Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ，２０１３）及びＴｈ１７細胞（Ｓｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ａｃｏｓｔａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｄｕｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）の増殖及び分化に対する、特にＩＬ−１α及びＩＬ−１βの増強効果が、しっかりと確立されている。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７の産生を特徴とし、自己免疫疾患及び慢性炎症において重要な役割を果たす（Ｗｉｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１にて参照される）。Ｔ細胞サブセットの中で、Ｔｈ１７細胞が最も高いレベルでＩＬ−１Ｒを発現し、ＩＬ−１はＴｈ１７プライミングにおいて重要な役割を果たす。
【０００４】
ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対して強力に作用するＩＦＮγ誘導サイトカインとして最もよく知られている（Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。加えて、ＩＬ−１８は好中球の機能を増強させる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。いくつかの報告で、動物モデルにおけるＩＬ−１８抗腫瘍作用（Ｍｉｃａｌｌｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を実証し、組換えヒトＩＬ−１８治療は、進行癌の治療に対するその効果を評価するために、近年臨床試験に入った（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＩＬ−１８とは対照的に、ＩＬ−３３は主に、Ｔｈ２細胞（Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）及び肥満細胞（Ａｌｌａｋｈｖｅｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に作用し、近年、抗ウイルス応答を促進させるためにＣＤ８＋Ｔ細胞に作用することが分かった（Ｂｏｎｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。その他のＩＬ−１ファミリーメンバーにはあまり特徴はないが、要するに、異なるＩＬ−１ファミリーメンバーが、異なるＴ細胞サブセットまたはその他の細胞型に対して特異性を有し、それゆえ異なる治療応用に特異性を有する。
【０００５】
Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化による、間接的な抗腫瘍活性を有することの他に、ＩＬ−１ファミリーメンバーは直接的な細胞増殖抑制特性を有することが分かり、ヒトメラノーマ細胞での実証が最も納得のいくものであった（Ｍｏｒｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｕｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｒａｎｇｎｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０００６】
いくつかのＩＬ−１ファミリーメンバーの炎症プロセスへの関与を考慮して、臨床的関心が主にＩＬ−１拮抗方法の開発へと向けられてきた（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。それにもかかわらず、制御されたＩＬ−１アゴニスト活性の利用が、異なる生理学的／病理学的プロセスに応用することができ、免疫賦活効果が望まれた。免疫賦活療法におけるＩＬ−１の使用に関する主な懸念の１つは、全身投与した場合の、その強い毒性である。しかしながら、ＩＬ−１作用が選択した細胞集団に限られる場合、毒性問題は解決し、治療の展望を開く。
【０００７】
例えば、多発性硬化症、関節リウマチ及び炎症性腸疾患などの自己免疫状態における病因的役割を考慮すると（Ｗｉｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、Ｔｈ１７応答のブロッキングに多大な関心があったが、正常なＴｈ１７機能は、ヒト型結核菌（Ｋｈａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、肺炎桿菌（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）及び百日咳菌（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を含む、様々な病原体に対する防御免疫に不可欠である。ＩＬ−１βはＴｈ１７機能を刺激するので、この考えを取り上げて、弱毒化ワクチンへの応答を促進させるＴ細胞アジュバントとしてＩＬ−１βを使用した（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。その他の用途は、抗ウイルス応答を促進させるために、ＩＬ−１βもしくはＩＬ−３３の、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団への標的化、または抗腫瘍活性を促進させるために、ＩＬ−１８の、Ｔｈ１細胞もしくはＮＫ細胞への標的化であり得る。
【０００８】
驚くべきことに、ＩＬ−１ファミリー受容体の活性化を欠くＩＬ−１ファミリー修飾を設計することが可能であるが、標的化部分に融合した場合、細胞表面上の濃度効果によって、選択した細胞型に対するその活性を回復させることが可能であることを見出した。ＩＬ−１変異体は、その同族受容体に対して低下した親和性を有し、それゆえその受容体に効率的に結合及び活性化させることができない。しかしながら、標的化部分（ナノボディなど）に変異体を融合することにより、変異体ＩＬ−１ファミリーメンバーの活性が、標的化部分に認識される細胞表面標的を発現する細胞上で回復する。この活性化は選択した標的細胞のみに限られるので、主要な全身毒性を生じることはない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の第１の態様は、サイトカイン受容体に対する低下した親和性を特徴とする修飾ＩＬ−１ファミリーメンバーサイトカイン、及び標的化部分を含む、標的化構築物である。ＩＬ−１ファミリーメンバーサイトカインは、当業者に既知であり、このサイトカインとしてＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ−３６Ｒａ、ＩＬ−３６α、ＩＬ−３７、ＩＬ−３６β、ＩＬ−３６γ、ＩＬ−３８及びＩＬ−３３（それぞれ、ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−１Ｆ５、ＩＬ−１Ｆ６、ＩＬ−１Ｆ７、ＩＬ−１Ｆ８、ＩＬ−１Ｆ９、ＩＬ−１Ｆ１０及びＩＬ−１Ｆ１１としても示される）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＬ−１ファミリーの確認には、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（２０１１）を参照する。修飾ＩＬ−１ファミリーサイトカインとは、ＩＬ−１ファミリーサイトカインを改変して、その受容体への親和性を変化させ、最終的に修飾ＩＬ−１ファミリーサイトカインが、受容体に正常に結合する内因性野生型サイトカインと比較して、受容体に対して低下した親和性を有し、その結果低下した生物活性を有することを意味する。このような修飾は、正常な野生型サイトカインの活性を低下させる修飾であり得、または相同な非内因性ＩＬ−１ファミリーサイトカイン（これらに限定されないが、ヒトＩＬ−１ファミリーサイトカイン受容体に対して活性でない別種のＩＬ−１ファミリーサイトカインなど）の親和性を増加させる修飾であり得る。修飾は、当業者に既知の、活性を減少または増加させる任意の修飾であり得、この修飾としては、ＰＥＧ化及びグリコシル化などの化学及び／または酵素修飾、その他タンパク質への融合並びに突然変異が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、この修飾は突然変異であり、更により好ましくは、ＩＬ−１ファミリーサイトカインの親和性を低下させる突然変異である。本明細書で使用する場合、低下した親和性及びその結果として低下した生物活性とは、修飾ＩＬ−１ファミリーサイトカインが、受容体に正常に結合するＩＬ−１ファミリーサイトカインと比較して、ＩＬ−１ファミリーサイトカインの生物活性の、７０％未満の生物活性を有すること、更により好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの６０％未満の生物活性を有すること、より好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの５０％未満の生物活性を有すること、より好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの４０％未満の生物活性を有すること、より好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの３０％未満の生物活性を有すること、より好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの２０％未満の生物活性を有すること、より好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの１０％未満の生物活性を有すること、最も好ましくはＩＬ−１ファミリーサイトカインの１％未満の生物活性を有することを意味する。好ましくは、修飾ＩＬ−１ファミリーサイトカインは、野生型ＩＬ−１ファミリーサイトカインの変異体であり、その活性は野生型ＩＬ−１ファミリーサイトカインと比較される。親和性及び／または活性は、当業者に既知の任意の方法によって測定することができる。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態は、インターロイキン−１受容体Ｉ型（ＩＬ−１ＲＩ）及び／またはインターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）受容体に対する低下した親和性を特徴とする変異体ＩＬ−１β、並びに標的化部分を含む、標的化構築物である。本明細書で使用する場合、変異体ＩＬ−１βは、受容体に対するより低い親和性、及びその結果として炎症性転写因子ＮＦκＢの低下した活性を有する、任意の変異型であり得る。野生型ＩＬ−１βの受容体に対する親和性と比較した、変異体ＩＬ−１βの受容体に対する親和性は、スキャッチャードプロット解析及び結合データのコンピュータフィッティング（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，１９４９）により、またはＢｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）で記載されているように、フロースルー条件下で反射型干渉分光法により測定することができる。変異体ＩＬ−１βの活性は通常、バイオアッセイ（例えば、細胞死の誘導により）を使用して測定する、または受容体下流でのシグナル伝達事象を測定する。このようなシグナル伝達事象は、ＮＫ−κＢの修飾もしくは核転座、または選択したレポーター遺伝子の誘導であり得る。変異体は、点変異体、欠失もしくは挿入変異体、またはこれらの組み合わせであってよい；いくつかの突然変異は、１つのタンパク質中に存在してよい。好ましくは、この変異体ＩＬ−１βは、これらに限定されないがポリメラーゼ連鎖反応増幅による部位特異的突然変異誘発などの活性化突然変異誘発により得られる。好ましくは、この変異体ＩＬ−１βは、野生型ＩＬ−１βの生物活性の、７０％未満の生物活性を有する、更により好ましくは野生型ＩＬ−１βの６０％未満の生物活性を有する、より好ましくは野生型ＩＬ−１βの５０％未満の生物活性を有する、より好ましくは野生型ＩＬ−１βの４０％未満の生物活性を有する、より好ましくは野生型ＩＬ−１βの３０％未満の生物活性を有する、より好ましくは野生型ＩＬ−１βの２０％未満の生物活性を有する、より好ましくは野生型の１０％未満の生物活性を有する、最も好ましくは推定された野生型（すなわち、野生型ＩＬ−１βのコード配列を突然変異させて変異体ＩＬ−１βを得たような、野生型ＩＬ−１β）の１％未満の生物活性を有する。好ましくは、この変異体は、Ａ１１７Ｇ／Ｐ１１８Ｇ、Ｒ１２０Ｘ、Ｌ１２２Ａ、Ｔ１２５Ｇ／Ｌ１２６Ｇ、Ｒ１２７Ｇ、Ｑ１３０Ｘ、Ｑ１３１Ｇ、Ｋ１３２Ａ、Ｓ１３７Ｇ／Ｑ１３８Ｙ、Ｌ１４５Ｇ、Ｈ１４６Ｘ、Ｌ１４５Ａ／Ｌ１４７Ａ、Ｑ１４８Ｘ、Ｑ１４８Ｇ／Ｑ１５０Ｇ、Ｑ１５０Ｇ／Ｄ１５１Ａ、Ｍ１５２Ｇ、Ｆ１６２Ａ、Ｆ１６２Ａ／Ｑ１６４Ｅ、Ｆ１６６Ａ、Ｑ１６４Ｅ／Ｅ１６７Ｋ、Ｎ１６９Ｇ／Ｄ１７０Ｇ、Ｉ１７２Ａ、Ｖ１７４Ａ、Ｋ２０８Ｅ、Ｋ２０９Ｘ、Ｋ２０９Ａ／Ｋ２１０Ａ、Ｋ２１９Ｘ、Ｅ２２１Ｘ、Ｅ２２１Ｓ／Ｎ２２４Ａ、Ｎ２２４Ｓ／Ｋ２２５Ｓ、Ｅ２４４Ｋ、Ｎ２４５Ｑ（ここで、Ｘはアミノ酸における任意の変化、好ましくは非保守的変化であり得る）から成る群から選択される変異体である。更により好ましくは、この変異体は、Ｒ１２０Ａ、Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３０Ａ、Ｑ１３０Ｗ、Ｈ１４６Ａ、Ｈ１４６Ｇ、Ｈ１４６Ｅ、Ｈ１４６Ｎ、Ｈ１４６Ｒ、Ｑ１４８��、Ｑ１４８Ｇ、Ｑ１４８Ｌ、Ｋ２０９Ａ、Ｋ２０９Ｄ、Ｋ２１９Ｓ、Ｋ２１９Ｑ、Ｅ２２１Ｓ及びＥ２２１Ｋから成る群から選択される。最も好ましくは、この変異体は、Ｒ１２０Ｇ、Ｈ１４６Ｎ、Ｈ１４６Ｒ、Ｑ１４８Ｅ、Ｑ１４８Ｇ及びＫ２０９Ａから成る群から選択される。（ヒトＩＬ−１β配列に基づいた番号、ジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＮＰ＿０００５６７、バージョンＮＰ＿０００５６７．１、ＧＩ：１０８３５１４５）。
【００１１】
ＩＬ−１８の突然変異の好ましい領域は、Ｙ３７−Ｋ４４、Ｒ４９−Ｑ５４、Ｄ５９−Ｒ６３、Ｅ６７−Ｃ７４、Ｒ８０、Ｍ８７−Ａ９７、Ｎ１２７−Ｋ１２９、Ｑ１３９−Ｍ１４９、Ｋ１６５−Ｋ１７１、Ｒ１８３及びＱ１９０−Ｎ１９１である。最も好ましいのは、領域Ｅ６７−Ｃ７４及びＭ８７−Ａ９７である（ヒト配列に基づいた番号、ジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＡＡＶ３８６９７、バージョンＡＡＶ３８６９７．１、ＧＩ：５４６９６６５０）。
【００１２】
ＩＬ−３３の突然変異の好ましい領域は、Ｉ１１３−Ｙ１２２、Ｓ１２７−Ｅ１３９、Ｅ１４４−Ｄ１５７、Ｙ１６３−Ｍ１８３、Ｅ２００、Ｑ２１５、Ｌ２２０−Ｃ２２７及びＴ２６０−Ｅ２６９である（ヒト配列に基づいた番号、ジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＮＰ＿２５４２７４、バージョンＮＰ＿２５４２７４．１、ＧＩ：１５５５９２０９）
【００１３】
好ましくは、標的化部分は、ＩＬ−１β受容体を発現する細胞、好ましくはＩＬ１−ＲＩを発現する細胞上に発現したマーカーを標的としている。１つの好ましい実施形態では、標的化部分は、組織特異的マーカーに指向される。
【００１４】
修飾ＩＬ−１ファミリーメンバーは、標的化部分に連結される。本明細書で使用する場合、“連結される”とは、共有結合によるものであっても、または親和性結合によるものであってもよい。本明細書で使用する場合、“標的化部分”とは、ＩＬ−１ファミリーメンバーの受容体を発現する細胞上の結合部位に対して、結合部位及び結合分子間の特異的相互作用によって融合タンパク質を指向させることのできる結合分子である。１つの好ましい実施形態では、この結合分子は、細胞の外側に位置する分子に特異的に結合する小さな化合物である。別の好ましい実施形態では、この分子は、細胞壁上に発現したレクチン様分子に対して指向される糖構造である。別の好ましい実施形態では、この結合分子は、腫瘍または炎症環境を標的とするペプチドである。このようなペプチドは当業者に既知であり、ＮＧＲ及びＲＧＤペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；ＷＯ２００５０５４２９３）。更に別の好ましい実施形態では、この結合分子は、結合ドメインを含むタンパク質である。このドメインとしては、炭水化物結合ドメイン（ＣＢＤ）（Ｂｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００６）、レクチン結合タンパク質、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ラクダ科動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、新規抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）（ＷＯ２０１００６６７４０）、設計されたアンキリン反復ドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ノッティン（ｋｎｏｔｔｉｎｓ）（Ｋｏｌｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）及び操作したＣＨ２ドメイン（ナノ抗体；Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，２００９）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、この標的化部分は、単一のポリペプチド鎖で構成され、翻訳後修飾されない。更により好ましくは、この標的化部分はナノボディである。
【００１５】
この標的化部分は、当業者に既知の任意の標的化部分であり得る。非限定的な例では、標的化部分は、一方の特異性として標的細胞上の結合部位に指向され、もう一方の特異性として標的サイトカインに、またはそのサイトカインに融合したタグに指向される二重特異性抗体であってよい。別の非限定的な例では、標的化部分は変異体インターロイキン−１に化学的に連結してよく、または組換え融合タンパク質であってよい。好ましくは、この標的化構築物は、組換え融合タンパク質である。標的化部分は、変異体ＩＬ−１βに直接融合してよく、またはリンカー断片、好ましくはＧＧＳリンカーの助けにより融合してよい。標的化部分は、変異ＩＬ−１βのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合してよい；好ましくは、この標的化部分は、変異ＩＬ−１β分子のカルボキシ末端で融合される。標的化構築物は、これらに限定されないが、タグ配列、シグナル配列、別のサイトカインまたは抗体などのその他のドメインを更に含んでよい。
【００１６】
本発明の別の態様は、医薬品として使用するための本発明による標的化構築物である。１つの好ましい実施形態は、免疫応答刺激にて使用するための本発明による標的化構築物である。事実、ＩＬ−１治療によってＢ細胞上で抗原の発現を誘導することが可能である（Ｋｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）ことが知られている；同様に、ＩＬ−１８治療によって細胞性及び体液性免疫を増大させている（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。同様の方法で、ＩＬ−１がＴ細胞に作用して、インビボ免疫応答の規模を増大させることが実証されてきた（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｅｎ  Ｓａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。従って、本発明の好ましい１つの態様は、ワクチン接種におけるアジュバントとして使用するための、本発明による標的化構築物である。本発明による標的化構築物は、この点が特に興味深く、その理由とは、正常な野生型ＩＬ−１の炎症誘発効果では、そのようなＩＬ−１の用途を不可能にさせるからである。
【００１７】
本発明の更に別の態様は、癌治療にて使用するための本発明による標的化構築物である。事実、Ｍｏｒｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｕｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１及びＲａｎｇｎｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２では、ＩＬ−１ファミリーメンバーが直接的な細胞増殖抑制特性を有し、ヒトメラノーマ細胞での実証が最も納得のいくものであったことを示した。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＩＬ−１βナノボディ融合タンパク質の略図。
【図２−１】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、野生型及び変異体Ｑ１４８Ｇ  ＩＬ−１  Ｈｅｒ２ナノボディ融合（Ａ）並びにその他の選択した変異体（Ｂ）によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。
【図２−２】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、野生型及び変異体Ｑ１４８Ｇ  ＩＬ−１  Ｈｅｒ２ナノボディ融合（Ａ）並びにその他の選択した変異体（Ｂ）によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。
【図２−３】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、野生型及び変異体Ｑ１４８Ｇ  ＩＬ−１  Ｈｅｒ２ナノボディ融合（Ａ）並びにその他の選択した変異体（Ｂ）によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。
【図３】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、内因性ＮＦ−κＢ  ｐ６５の核転座に対する野生型及び変異体（Ｑ１４８Ｇ、Ｌ１４５Ａ／Ｌ１４７Ａ、Ｆ１６２Ａ／Ｑ１６４Ｅ）ＩＬ−１  Ｈｅｒ２ナノボディ融合の効果。
【図４】マウスレプチン受容体を発現する（ｍＬＲ）または発現しない（ｍＬＲ無し）細胞上での、抗マウスレプチン受容体ナノボディに融合した、野生型及び５つの異なるＩＬ−１変異体によるＮＦκＢ活性の誘導。
【図５−１】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、Ｈｅｒ２ナノボディに融合したＩＬ１二重変異体によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。
【図５−２】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、Ｈｅｒ２ナノボディに融合したＩＬ１二重変異体によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。
【図５−３】ｍｏｃｋトランスフェクト細胞、またはシグナル伝達欠損Ｈｅｒ２でトランスフェクトした細胞における、Ｈｅｒ２ナノボディに融合したＩＬ１二重変異体によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
実施例
実施例における材料及び方法
ＩＬ−１ナノボディ融合タンパク質のクローニング。
マウスレプチン受容体に対して指向される４−１０ナノボディは、Ｚａｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）及び特許ＷＯ２００６／０５３８８３に記載されている。抗Ｈｅｒ２ナノボディ１Ｒ５９Ｂは、Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）に記載されている。ナノボディの両方を、ｐＭＥＴ７真核生物発現ベクターにおいてＣ末端Ｈｉｓタグでクローニングした。ＳｉｇＫリーダーペプチドが先行し、Ｎ末端ＨＡタグを持つ、成熟ＩＬ−１βタンパク質をコードするコドン最適化配列を、遺伝子合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ）によって生成した。ＩＬ−１βナノボディ融合タンパク質を生成するために、ＩＬ−１β配列は、サイトカインとナノボディ部分を隔てるＧＧＳリンカーｘ１３を用いて、ｐＭｅｔ７にて５’からナノボディ配列へとクローニングした。（図１）
ＩＬ−１β変異体。
【００２０】
ＩＬ−１Ｒに対して低下した結合親和性を有すると期待されるＩＬ−１β変異体は、その受容体と複合させたヒトＩＬ−１βの公開された結晶構造の文献及び解析に基づいて選択された。ｈＩＬ−１β部分での突然変異は、表Ｉに示す通り、突然変異誘発プライマーを使用して部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ、ストラタジーン社）によって生成した：
【表１】
0006475713.tif 000002
0006475713.tif 000003
0006475713.tif 000004
0006475713.tif 000005
ＩＬ−１β融合タンパク質の産生。
【００２１】
ＩＬ−１β融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生した。小規模産生のため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中において４００，０００細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を低血清（ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ）培地と置き換え、線状ＰＥＩを使用して細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、ＰＥＩトランスフェクション混合液は、１６０μｌのＤＭＥＭ中にて、１μｇ発現ベクターと５μｇＰＥＩを混合することにより調製し、室温にて１０分間インキュベートして、ウェルに滴下添加した。２４時間後、トランスフェクト細胞をＤＭＥＭで洗浄し、タンパク質産生のために１．５ｍｌ  ＯｐｔｉＭｅｍ／ウェルで積層した。４８時間後に馴化培地を回復させ、０．４５μフィルターに通して濾過し、−２０℃にて保存した。馴化培地中のＩＬ−１β含有量は、メーカーの指示に従ってＥｌｉｓａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によって決定した。
ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイ。
【００２２】
ＩＬ−１Ｒ活性化を評価するために、ＩＬ−１Ｒを安定的に発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）を使用し、その細胞をＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子で一過性トランスフェクトした。簡潔に述べると、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞を９６ウェルプレートにて培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）に播種して（１０，０００細胞／ウェル）、表示量の発現プラスミド及び５ｎｇ／ウェルの３κＢ−Ｌｕｃレポーター遺伝子プラスミド（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を用いたリン酸カルシウム沈降法を使用して、翌日トランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、培地を飢餓培地（ＤＭＥＭ）と置き換え、トランスフェクション後４８時間で、細胞を融合タンパク質で６時間誘導した。誘導後、細胞を溶解させて、溶解物中のルシフェラーゼ活性を、ベルトールド社ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ９６０ルミノメーター上で、プロメガ社Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して決定した。
共焦点顕微鏡によるＮＦ−κＢ核転座解析。
【００２３】
共焦点イメージングのために、１０５ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞／ウェル（６ウェルプレートにて）を、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ社）でコーティングしたカバーガラス（Ｚｅｉｓｓ社）上に播種した。その翌日、細胞をリン酸カルシウム沈降法を使用して、２００ｎｇ／ウェルの空ベクターまたはＨＥＲ２Δｃｙｔ発現プラスミドでトランスフェクトした。４８時間後、細胞をビヒクル（培地）またはＩＬ1−Ｈｅｒ２ナノボディ融合タンパク質（１０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理した。次に、細胞を１ｘＰＢＳですすぎ、４％パラホルムアルデヒド中で室温にて１５分間固定した。１ｘＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を１ｘＰＢＳ中にて０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理し、１ｘＰＢＳの１％ＢＳＡ中で室温にて更に１０分間ブロッキングした。次いで、サンプルをウサギ抗ｐ６５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社Ｃ２０、希釈１：８００）及びマウス抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社Ｍ２、１：２０００）で、３７℃にて１時間インキュベートした。１ｘＰＢＳで４回洗浄した後、細胞を抗ウサギＡｌｅｘａ４８８及び抗マウスＡｌｅｘａ５９４蛍光色素結合二次抗体（両方とも希釈１：８００）で、室温にて１時間インキュベートした。二次抗体インキュベーション後、細胞を１ｘＰＢＳ中で４回洗浄し、細胞核をＤＡＰＩ（２μｇ／ｍｌ）で染色した。１ｘＰＢＳでの最終洗浄ステップ後、没食子酸プロピルを使用してカバーガラスを載せた。オリンパス社ＩＸ−８１レーザー走査型共焦点顕微鏡で６０倍１．３５ＮＡ対物レンズを使用して画像を得て、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ１０００ソフトウエアを使用して解析した。
実施例１：ＩＬ−１βリガンド及びＩＬ−１βナノボディ融合タンパク質。
【００２４】
図１は、ＷＴ  ｈＩＬ−１βまたは表Ｉに記載されているｈＩＬ１β変異体のいずれかで構築されたＩＬ−１βナノボディ融合タンパク質の図解を示す。
実施例２：選択した変異体ＩＬ−１βナノボディ融合のＩＬ−１β活性を、Ｎｂ標的を発現する細胞上で回復させる。
【００２５】
野生型ＩＬ−１β及び４５ＩＬ−１β変異体（表Ｉ）を、Ｈｅｒ２を認識するよう十分に特徴付けされたナノボディ（１Ｒ５９Ｂ）に融合させた。ＩＬ−１βナノボディ融合タンパク質を、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子プラスミド（５ｎｇ／ウェル）及びＨｅｒ２Δｃｙｔ（シグナル伝達欠損）発現プラスミド（２ｎｇ／ウェル）で一過性トランスフェクトしたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞にて試験した。細胞は、ＩＬ−１β−Ｈｅｒ２ナノボディ融合で６時間処理した（０，４〜２５０ｎｇ／ｍｌまでの用量反応）。図２Ａに示した通り、ＩＬ−１β−Ｑ１４８Ｇ−Ｈｅｒ２ナノボディ融合は、ＷＴ  ＩＬ−１β−Ｈｅｒ２ナノボディ融合と比較して、ＮＦ−κＢを活性化させる能力の低下を示した。重要なのは、Ｑ１４８Ｇ変異体のＨｅｒ２Δｃｙｔ発現細胞への標的化は、その活性を回復し、ｍｏｃｋトランスフェクト細胞上のＷＴ  ＩＬ−１βの曲線と完全に平行なＮＦ−κＢ活性の用量反応曲線を生成した。また、この図から明らかなのは、ＷＴ  ＩＬ−１β  Ｈｅｒ２ナノボディ融合に対する強力な標的化効果である。類似の“標的化による活性化”効果が、Ｈｅｒ２ナノボディに融合した６つのその他ＩＬ−１β変異体（Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３１Ｇ、Ｈ１４６Ａ、Ｈ１４５Ａ／Ｌ１４７Ａ、Ｆ１６２Ａ／Ｑ１６４Ｅ及びＫ２０８Ｅ）で観察された（図２Ｂ）。
【００２６】
“標的化による活性化”構想の更なる証拠を得るために、次にＩＬ−１β−Ｈｅｒ２ナノボディ融合によるＨｅｒ２発現細胞でのＮＦ−κＢの選択的活性化を、共焦点顕微鏡によって可視化できるか否かについて調査した。ＮＦ−κＢ核転座アッセイにより、内因性ＮＦ−κＢの活性化を測定した。図３から明らかな通り、ＷＴ  ＩＬ−１β−Ｈｅｒ２ナノボディ融合のみが、Ｈｅｒ２を発現しない細胞において内因性ＮＦ−κＢの転座を促進させた。ｍｏｃｋトランスフェクト細胞において検出可能なＮＦ−κＢ転座を促進させなかったのに対して、試験した３つの変異体ＩＬ−１β−Ｈｅｒ２ナノボディ融合は、Ｈｅｒ２に対して陽性を示すようにも染色された細胞においてＮＦ−κＢ核転座を誘発し、これらの変異体が、標的細胞にのみ作用することを示した。
【００２７】
“標的化による活性化”構想が、ナノボディを使用して関連のない膜タンパク質にも同様に作用するか否かを評価するために、ＷＴ  ＩＬ−１β及び５つの機能しないＩＬ−１β変異体（Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３１Ｇ、Ｈ１４６Ａ、Ｑ１４８Ｇ、Ｋ２０９Ａ）を、ｍＬＲを認識するよう事前に特徴付けたナノボディ（４−１０）に融合した。ＩＬ−１β−Ｈｅｒ２ナノボディ融合（図２）について報告したのと同様の実験を、ｍＬＲ発現プラスミド（１０ｎｇ／ウェル）で一過性トランスフェクトしたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ−１β細胞を使用して実施した。Ｈｅｒ２ナノボディ融合タンパク質で得られた結果と同様に、調査したすべての変異体ＩＬ−１βナノボディ融合（１２．５ｎｇ／ｍｌで試験した）で、ＷＴ融合と比較して、ｍＬＲを発現しない細胞上でＮＦ−κＢを活性化させる能力の低下を示した。しかしながら、ｍＬＲナノボディ部分による標的化は、選択した変異体の活性を部分的に回復させた（図４）。
【００２８】
上記ＩＬ−１β変異体は、重要な生物活性を残したままであったので、異なる変異体を合成し、低下した基本活性を有する二重／三重変異体を得た。９つの二重／三重変異体を試験した（表Ｉの変異体４６〜５４を参照）。これらからの、６つの変異体タンパク質（Ｑ１３１Ｇ／Ｑ１４８Ｇ、Ｑ１４８Ｇ／Ｋ２０８Ｅ、Ｒ１２０Ｇ／Ｑ１３１Ｇ、Ｒ１２０Ｇ／Ｑ１３１Ｇ、Ｒ１２０Ｇ／Ｈ１４６Ａ、Ｒ１２０Ｇ／Ｋ２０８Ｅ、Ｒ１２０Ｇ／Ｆ１６２Ａ／Ｑ１６４Ｅ）は、Ｈｅｒ２陰性細胞に対して（図２における様なＮＦ−κＢを測定する同様のアッセイを使用して）活性の残りを示さなかったが、部分的に保持された活性が、Ｈｅｒ２Δｃｙｔを過剰発現する細胞上で見られた（図５）。
【００２９】
これらのデータはすべて、細胞表面受容体を認識するナノボディに変異体を融合することによる、部分的に不活性な変異体ＩＬ−１βの標的化が、恐らく膜の濃度効果による強制的な受容体相互作用によって、ナノボディ標的細胞に対してその活性を回復することができることを示している。標的化による活性化が、異なる分類の膜タンパク質を認識するナノボディを使用して達成することができるという事実は、“標的化による活性化”構想の幅広い応用性を示している。
【００３０】
これらのデータは、選択した細胞型への、これらの標的細胞のみに活性を保持する変異体ＩＬ−１ファミリーメンバーの標的化能力に対する構想の証拠を提供するので、ＩＬ−１ファミリーメンバーの、生理学的に関連のあるＩＬ−１β標的細胞への標的化を可能にするナノボディを生成する。Ｔ細胞及びＮＫ細胞活性化因子としてのＩＬ−１ファミリーメンバーの重要な役割を考慮して、ナノボディは、ＩＬ−１をＴ細胞及びＮＫ細胞へ特異的に標的化するよう設計する。より具体的には、Ｔｈ１７細胞上で優勢に発現されるＣＣＲ６を標的とするナノボディに加えて、細胞傷害性Ｔ細胞上でＣＤ８を標的とするナノボディを開発し、ＩＬ１ファミリーメンバー、好ましくはＩＬ−１βに融合する。
実施例３：初代ヒトＴ細胞によるＩＬ−１７産生に対するＩＬ−１βナノボディ融合の効果。
【００３１】
初代ヒトＴ細胞は、軟膜から単離した。最初に、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離し、回復のために０．５ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２でＯ／Ｎインキュベートした。次に、Ｔ細胞をメーカーの指示に従って、ｐａｎ−Ｔ  ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用して単離した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を１０％ＦＣＳ及びＣＤ３／ＣＤ２８活性化マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁（１ｘ１０６／ｍｌ）した。次に、細胞（１００μｌ／ウェル）をＵ底９６ウェルプレートに播種し、表示濃度のＩＬ−１β変異型で９６時間刺激した。ＰＭＡ／イオノマイシン（両方とも１００ｎＭにて）で更に６時間刺激した後、上清を回収して、ＩＬ−１７レベルをＥｌｉｓａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によって決定した。追加のサイトカインは、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術によって評価する。
【００３２】
選択した変異体ＩＬ−１βナノボディ融合（例えば、ＣＣＲ６を標的としたナノボディを有する）のために、標的細胞特異的ＩＬ−１７及びＩＦＮγの産生を、フローサイトメトリーアプローチを使用して細胞内染色によって評価する。
【００３３】
また、Ｔｈ１７集団の選択性を裏付けるために、Ｆｌａｇタグを使用した二重染色によってＰＢＭＣ亜集団への結合を測定して、ＣＤマーカーを選択し、続いてフローサイトメトリー解析を行う。
【００３４】
最後に、臨床的に関連するヒトＴｈ１７細胞機能のインビトロモデルにおいて、ＩＬ−１βナノボディ融合のアジュバント活性を評価する。百日咳菌に対するより効果的なワクチン（または既存ワクチンのアジュバント）の必要性を考慮して、選択した融合タンパク質が、百日咳菌処理単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）を用いたナイーブＴ細胞の共培養モデルにおいて、ヒトＴｈ１７応答を増大させるか否かを決定した。ヒトＭＤＤＣは、軟膜から単離し（ｍｏｎｏｃｙｔｅアイソレーションキットＩＩを使用、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）、異なる比率の百日咳菌で４８時間処理し、次いで同種ナイーブＴ細胞と１２日間共培養する。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８での再刺激後、上清中のサイトカインプロファイルを、Ｅｌｉｓａ／Ｌｕｍｉｎｅｘ技術（上記参照）を使用して決定する。
実施例４：ＣＴＬに対するＩＬ−１βナノボディ融合の効果
【００３５】
ＩＬ−１β−ＣＤ８ナノボディ融合が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を特異的に高めることができるか否かを評価するために、ヒトＰＢＭＣを、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配遠心分離によって軟膜から単離し、ｗｔまたは変異体ＩＬ１β−ＣＤ８Ｎｂ融合と組み合わせたＣＤ３／ＣＤ２８活性化マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）で２４時間刺激する。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に対するこれらの融合タンパク質の効果を、活性な（リン酸化）ＮＦ−κＢ及びＩＦＮγの細胞内染色を実施することにより評価する。加えて、ＩＬ−１βナノボディ融合がＣＴＬ脱顆粒に影響を及ぼすか否かを調査するために、ＰＢＭＣ（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、漸増用量のＩＬ−１β融合タンパク質と組み合わせたフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ、１μｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下において、４８時間分化させる。次に、脱顆粒を誘導するために、細胞をＣＤ３／ＣＤ２８  ｄｙｎａｂｅａｄｓで３時間刺激して、フローサイトメトリーによって解析する。脱顆粒は、ナチュラルキラー活性の十分に確立されたマーカーである、細胞表面ＣＤ１０７ａを検出して測定する。白血球プールでのすべてのフローサイトメトリー解析では、抗ＣＤ８染色を、ＩＬ−１β−ＣＤ８Ｎｂ効果の細胞型特異性のモニタリングができるようにするために含む。
【００３６】
最後に、ＩＬ−１β−ＣＤ８ナノボディ融合が、インビボでの抗腫瘍活性を促進するか否かを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＨＰＶ１６からＥ６及びＥ７抗原癌タンパク質を生成するＴＣ１腫瘍細胞を、皮下注射する。このモデルは、ＩＬ−１βがＣＤ８＋Ｔ細胞媒介、抗原特異的、抗腫瘍応答を促進させることを実証するのにこれまで使用された（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ，２０１３）。簡潔に述べると、腫瘍注入後の４日間で、ＷＴもしくは変異体ＩＬ−１β−ＣＤ８  Ｎｂ融合もしくはＩＬ−１β−ＧＦＰ  Ｎｂ融合を使用または使用せずに、ＤＯＴＡＰ及びＬＰＳを組み合わせたＨＰＶ１６Ｅ７４９−５７ペプチド含有ワクチンでマウスを免疫化する。腫瘍サイズは、免疫付与後１８日間モニタリングする。
実施例５：インビボ実験−ワクチンアジュバント効果。
【００３７】
最初の一連の実験では、急性毒性をモニタリングするために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、異なる用量のＷＴ及び変異体ＩＬ−１βナノボディ融合及び非融合ＩＬ−１βでｉｖ／ｉｐ（静脈内／腹腔内）にて処理する。静脈血は、処理後の異なる時間で尾静脈穿刺により収集し、血清中のサイトカインプロファイルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより決定する。加えて、フローサイトメトリー解析により、細胞内サイトカインレベル（ＩＬ−１７、ＩＦＮγ）及びＩＬ−１Ｒの活性化（リン酸化ＮＦ−κＢレベルの測定により評価したように）を、選択した白血球サブセットで決定する。
【００３８】
至適用量を確立した場合、マウスワクチン接種プロトコルにおいてそのアジュバント活性を評価する。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｉｐにて無細胞百日咳ワクチン（Ｐａ）で免疫化する。Ｐａワクチンは、５μｇ／マウスの精製した組換え無毒化百日咳毒素（ＰＴ９Ｋ／１２９Ｇ）＋線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１による組成物）で構成される。免疫付与後２４時間で、選択した変異体ＩＬ１β−ＮｂまたはＰＢＳをｉｐまたはｉｖにて投与する。動物は、２８日後に追加免疫化する。１組みの動物を、２回目の免疫付与後１４日で犠牲死させ、脾細胞を単離し、培地またはＦＨＡでインビトロにて３日間再刺激する。培地上清中のサイトカインレベル（ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４など）を、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術によって決定する。２組目のマウスは、免疫付与後１４日目に百日咳菌を投与し、その投与後２時間及び５日及び１０日で犠牲死させる。肺を単離し、肺ホモジネートのＣＦＵをボルデー−ジャング寒天プレート上で定量化する。肺ホモジネート中のサイトカインレベルを、脾細胞上清において決定する。
【００３９】
加えて、免疫付与前、次いで１４日毎に、血清中の百日咳菌特異的ＩｇＧレベルを定量するために血液を（尾静脈から）サンプリングする。
実施例６：ＩＬ−１βナノボディ融合の直接的な抗腫瘍効果
【００４０】
選択したＩＬ１ナノボディ融合の直接的な抗腫瘍活性を調査するために、ＩＬ−１誘導細胞増殖抑制効果の感受性が非常に高いことが示された（Ｍｏｒｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ヒトＡ３７５メラノーマ細胞を使用する。変異体ＩＬ−１ファミリーメンバーの、Ａ３７５細胞への標的化を可能にするために、すでに高親和性ナノボディの利用が可能な細胞表面マーカー（すなわち、ＣＤ２０）を発現する安定したＡ３７５クローンを産生する。変異体ＩＬ１ナノボディ融合の抗増殖効果に対する、Ａ３７５親細胞と比較したクローン細胞株の感受性を、ＸＴＴ増殖アッセイを使用してインビトロで調査する。変異体ＩＬ−１ナノボディ融合のインビボ抗腫瘍活性は、Ａ３７５異種移植モデルを使用して調査する。簡潔に述べると、Ａ３７５細胞（親細胞または標的化のために表面マーカーを発現する細胞）を無胸腺ヌードマウスに皮下接種し、腫瘍増殖を、ＰＢＳまたは変異体ＩＬ１ナノボディ融合で処理した動物で、４週間モニタリングする。
実施例７：ＩＬ１８への効果拡大：腫瘍モデルにおける応用
【００４１】
ＩＬ１ファミリーメンバーの間接的な抗腫瘍活性を評価するために、ＩＬ−１８の抗腫瘍活性を実証するのにこれまで使用されたプロトコル（Ｍｉｃａｌｌｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に従って、Ｍｅｔｈ  Ａ同系マウス肉腫モデルを使用して、選択した変異体ＩＬ−１８ナノボディ融合の有効性を確認する実験を行う。これらの実験で使用したＩＬ１８変異型は、殺腫瘍特性を持つ免疫細胞（すなわち、ＣＴＬ、ＮＫ細胞）を標的とするナノボディに融合した変異体ＩＬ−１８で構成される。マウスをこの構築物で処理すると、ｍｏｃｋ処理コントロールと比較した場合、腫瘍の有意な減少を示す。
参考文献
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Ｂｏｎｉｌｌａ  ＷＶ，  Ｆｒｏｈｌｉｃｈ  Ａ，  Ｓｅｎｎ  Ｋ，  Ｋａｌｌｅｒｔ  Ｓ，  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｍ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ，  Ｋｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｍ，  Ｈｅｇａｚｙ  ＡＮ，  Ｓｃｈｒｉｃｋ  Ｃ，  Ｆａｌｌｏｎ  ＰＧ，  Ｋｌｅｍｅｎｚ  Ｒ，  Ｎａｋａｅ  Ｓ，  Ａｄｌｅｒ  Ｈ，  Ｍｅｒｋｌｅｒ  Ｄ，  Ｌｏｈｎｉｎｇ  Ｍ，  Ｐｉｎｓｃｈｅｗｅｒ  ＤＤ．（２０１２）．  Ｔｈｅ  ａｌａｒｍｉｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３３  ｄｒｉｖｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３５：９８４−９．
Ｂｒｅｃｈｔ  Ａ．，  Ｇａｕｇｌｉｔｚ  Ｇ．，  Ｐｏｌｓｔｅｒ  Ｊ．  （１９９３）．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｉｎ  ａ  ＦＩＡ−ｓｙｓｔｅｍ  −  Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｉｎｇ．，  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ８：３８７−３９２．
Ｂｒｅｒｅｔｏｎ  ＣＦ，  Ｓｕｔｔｏｎ  ＣＥ，  Ｒｏｓｓ  ＰＪ，  Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙ，  Ｐｉｚｚａ  Ｍ，  Ｒａｐｐｕｏｌｉ  Ｒ，  Ｌａｖｅｌｌｅ  ＥＣ，  Ｍｉｌｌｓ  ＫＨ．  （２０１１）．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｔｈ１７  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｉｎｎａｔｅ  ＩＬ−１  ａｎｄ  ＩＬ−２３  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１１  Ｍａｙ  １５；１８６（１０）：５８９６−９０６．
Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，  Ｄ．Ｓ．  （２００９）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＣＨ２  ｄｏｍａｉｎｓ  （ｎａｎｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）．  ｍＡｂｓ  １，  ２６−２８．
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ，  Ｓｉｍｏｎ  Ａ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ＪＷ．  （２０１２）．  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｉｎ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １１：６３３−５２．
Ｄｕｎｎｅ  Ａ，  Ｒｏｓｓ  ＰＪ，  Ｐｏｓｐｉｓｉｌｏｖａ  Ｅ，  Ｍａｓｉｎ  Ｊ，  Ｍｅａｎｅｙ  Ａ，  Ｓｕｔｔｏｎ  ＣＥ，  Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙ，  Ｔｓｃｈｏｐｐ  Ｊ，  Ｓｅｂｏ  Ｐ，  Ｍｉｌｌｓ  ＫＨ．  （２０１０）．  Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｔｏｘｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｓ  Ｔｈ１７  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８５：１７１１−９．  
Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＳＣ，  Ｊａｒｎｉｃｋｉ  ＡＧ，  Ｌａｖｅｌｌｅ  ＥＣ，  Ｍｉｌｌｓ  ＫＨ．  ＴＬＲ４  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−１７−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００６  Ｄｅｃ  １；１７７（１１）７９８０−９．
Ｋｈａｄｅｒ  ＳＡ，  Ｂｅｌｌ  ＧＫ，  Ｐｅａｒｌ  ＪＥ，  Ｆｏｕｎｔａｉｎ  ＪＪ，  Ｒａｎｇｅｌ−Ｍｏｒｅｎｏ  Ｊ，  Ｃｉｌｌｅｙ  ＧＥ，  Ｓｈｅｎ  Ｆ，  Ｅａｔｏｎ  ＳＭ，  Ｇａｆｆｅｎ  ＳＬ，  Ｓｗａｉｎ  ＳＬ，  Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ＲＭ，  Ｈａｙｎｅｓ  Ｌ，  Ｒａｎｄａｌｌ  ＴＤ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＡＭ．  （２００７）．  ＩＬ−２３  ａｎｄ  ＩＬ−１７  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７  ８：３６９−７７．
Ｋｉｌｌａｒ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｈａｔｆｉｅｌｄ，  Ｃ．Ａ．，  Ｃａｒｄｉｎｇ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｐａｎ，  Ｍ．，  Ｗｉｎｔｅｒｒｏｗｄ，  Ｇ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，  Ｋ．  （１９８９）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｅｌｅｃｉｔｓ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈｔ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９，  ２２０５−２２１０．
Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，  Ｍ．，  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｈ．，  Ｏｎｏ，  Ｓ．，  Ｉｎａｔｓｕ，  Ａ．，  Ｎａｋａｓｈｉｍａ，  Ｈ．，  Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｓｈｉｎｏｍｉｙａ，  Ｎ．，  Ｓａｉｔｏｈ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｓｅｋｉ，  Ｓ．  （２０１１）．  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １８  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｂｕｒｎ−ｉｎｊｕｒｅｄｆ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７９，  ２６７０−２６８０．
Ｋｏｌｍａｒ，  Ｈ．  （２００８）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｋｎｏｔ  ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５，  ２６８４−２６９０．
Ｌｅｕｎｇ  ＢＰ，  Ｃｕｌｓｈａｗ  Ｓ，  Ｇｒａｃｉｅ  ＪＡ，  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｄ，  Ｃａｎｅｔｔｉ  ＣＡ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｃ，  Ｃｕｎｈａ  Ｆ，  Ｌｉｅｗ  ＦＹ，  Ｍｃｌｎｎｅｓ  ＩＢ．  （２００１）．  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＩＬ−１８  ｉｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：２８７９−８６．
Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  Ｍ，  Ｌｅ’Ｎｅｇｒａｔｅ  Ｇ，  Ｋｒａｊｅｗｓｋａ  Ｍ，  Ｒｅｅｄ  ＪＣ．  （２００８）．  ＩＬ−１８−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １５：７８７−９４．
Ｍｉｃａｌｌｅｆ  ＭＪ，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｋｏｈｎｏ  Ｋ，  Ｉｋｅｄａ  Ｍ，  Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  Ｍ．  （１９９７）．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １８  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔｈ  Ａ  ｓａｒｃｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ；５７：４５５７−６３．
Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｙ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｈ，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ａ，  Ｏｎｏｚａｋｉ  Ｋ．  （１９９０）．  Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  （ＩＬ−１）  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  Ｇ０−Ｇ１  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂｙ  ＩＬ−１．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  １７３：１８６−９２．
Ｎｙｇｒｅｎ，  Ｐ−Ａ．  （２００８）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５，  ２６６８−２６７６．
Ｏｋａｍｕｒａ  Ｈ，  Ｔｓｕｔｓｉ  Ｈ，  Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｔ，  Ｙｕｔｓｕｄｏ  Ｍ，  Ｈａｋｕｒａ  Ａ，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｔｏｒｉｇｏｅ  Ｋ，  Ｏｋｕｒａ  Ｔ，  Ｎｕｋａｄａ  Ｙ，  Ｈａｔｔｏｒｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３７８：８８−９１  ．
Ｒａｎｇｎｅｋａｒ  ＶＶ，  Ｗａｈｅｅｄ  Ｓ，  Ｒａｎｇｎｅｋａｒ  ＶＭ．  （１９９２）．  ｌｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  “ｅａｒｌｙ”  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６７：６２４０−８．
Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＭＪ，  Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ＪＭ，  Ｌｏｇａｎ  ＴＦ，  Ｋｏｃｈ  ＫＭ，  Ｋａｔｈｍａｎ  Ｓ，  Ｋｉｒｂｙ  ＬＣ，  Ｂｅｌｌ  ＷＮ，  Ｔｈｕｒｍｏｎｄ  ＬＭ，  Ｗｅｉｓｅｎｂａｃｈ  Ｊ，  Ｄａｒ  ＭＭ．  （２００８）．  Ａ  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４：３４６２−９
Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｇ．  （１９４９）．  Ａｎｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ５１，  ６６０−７２．
Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｊ，  Ｏｗｙａｎｇ  Ａ，  Ｏｌｄｈａｍ  Ｅ，  Ｓｏｎｇ  Ｙ，  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｅ，  ＭｃＣｌａｎａｈａｎ  ＴＫ，  Ｚｕｒａｗｓｋｉ  Ｇ，  Ｍｏｓｈｒｅｆｉ  Ｍ，  Ｑｉｎ  Ｊ，  Ｌｉ  Ｘ，  Ｇｏｒｍａｎ  ＤＭ，  Ｂａｚａｎ  ＪＦ，  Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ  ＲＡ．  （２００５）．  ＩＬ−３３，  ａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  −ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＴ２  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  ２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２３：４７９−９０．
Ｓｈａｗ  ＭＨ，  Ｋａｍａｄａ  Ｎ，  Ｋｉｍ  ＹＧ，  Ｎｕｎｅｚ  Ｇ．  （２０１２）．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＩＬ−１β，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＩＬ−６，  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ＴＨ１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０９：２５１−８．
Ｓｉｍｓ  ＪＥ，  Ｓｍｉｔｈ  ＤＥ．  Ｔｈｅ  ＩＬ−１  ｆａｍｉｌｙ：  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  （２０１０）．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０：８９−１０２．
Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．  （２００８）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ  −  ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｐｏｃｋｅｔ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５，  ２６７７−２６８３．
Ｓｔｕｍｐ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｂｉｎｚ，  Ｈ．Ｋ．，  Ａｍｓｔｕｔｚ，  Ｐ．  （２００８）  ＤＡＲＰｉｎｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｄｒｕｇ  ｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  １３，  ６９５−７０１．
Ｓｕｔｔｏｎ  Ｃ，  Ｂｒｅｒｅｔｏｎ  Ｃ，  Ｋｅｏｇｈ  Ｂ，  Ｍｉｌｌｓ  ＫＨ，  Ｌａｖｅｌｌｅ  ＥＣ．  （２００６）．  Ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  （ＩＬ）−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１７−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０３：１６８５−９１．
Ｔａｋｅｄａ  Ｋ，  Ｔｓｕｔｓｕｉ  Ｈ，  Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ａｄａｃｈｉ  Ｏ，  Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｎ，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｏｋａｍｕｒａ  Ｈ，  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ，  Ａｋｉｒａ  Ｓ．  （１９９８）．  Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｈ１  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＩＬ−１８−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ８：３８３−９０．
Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，  Ａ．，  Ｂｉａｎｃｈｉ，  Ｅ．，  Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ，  Ｓ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｆ．，  Ｐｅｓｓｉ，  Ａ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌａｚｚｏ，  Ｍ．  （１９９４）  Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ：  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ７，  ９−２４．
Ｕｓｕｉ  Ｎ，  Ｍｉｍｎａｕｇｈ  ＥＧ，  Ｓｉｎｈａ  ＢＫ．  （１９９１）．  Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９１  ５１：７６９−７４．
Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  Ｗ，  Ｐｌａｉｓａｎｃｅ  Ｓ，  Ｂｏｏｎｅ  Ｅ，  Ｄｅ  Ｂｏｓｓｃｈｅｒ  Ｋ，  Ｓｃｈｍｉｔｚ  ＭＬ，  Ｆｉｅｒｓ  Ｗ，  Ｈａｅｇｅｍａｎ  Ｇ．  （１９９８）．  ｐ３８  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ｐ６５  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７３：３２８５−９０．
Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ  Ｉ，  Ｄｅｖｏｏｇｄｔ  Ｎ，  Ｖａｎ  Ｇａｓｓｅｎ  Ｎ，  Ｖｉｎｃｋｅ  Ｃ，  Ｘａｖｉｅｒ  Ｃ，  Ｗｅｒｎｅｒｙ  Ｕ，  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，  Ｌａｈｏｕｔｔｅ  Ｔ，  Ｃａｖｅｌｉｅｒｓ  Ｖ．  （２０１１）．  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２５：２４３３−４６．
Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ  ＪＭ，  Ｌｅｅ  ＪＫ，  Ｗｉｌｔｒｏｕｔ  ＴＡ，  Ａｌｖｏｒｄ  ＷＧ，  Ｈｉｘｏｎ  ＪＡ，  Ｓｕｂｌｅｓｋｉ  Ｊ，  Ｂａｃｋ  ＴＣ，  Ｗｉｌｔｒｏｕｔ  ＲＨ．  （２００２）．  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  Ｆａｓ−ｌｉｇａｎｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１８  ａｎｄ  ＩＬ−２．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：４４６７−７４．
Ｗｉｌｋｅ  ＣＭ，  Ｂｉｓｈｏｐ  Ｋ，  Ｆｏｘ  Ｄ，  Ｚｏｕ  Ｗ．  （２０１１）．  Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：６０３−１１．
Ｙｅ  Ｐ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＦＨ，  Ｋａｎａｌｙ  Ｓ，  Ｓｔｏｃｋｉｎｇ  ＫＬ，  Ｓｃｈｕｒｒ  Ｊ，  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｐ，  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｐ，  Ｈｕａｎｇ  Ｗ，  Ｚｈａｎｇ  Ｐ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｓｈｅｌｌｉｔｏ  ＪＥ，  Ｂａｇｂｙ  ＧＪ，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｓ，  Ｃｈａｒｒｉｅｒ  Ｋ，  Ｐｅｓｃｈｏｎ  ＪＪ，  Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ．  （２００１）．  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌｕｎｇ  ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９４：５１９−２７．
Ｚａｂｅａｕ  Ｌ，  Ｖｅｒｈｅｅ  Ａ，  Ｃａｔｔｅｅｕｗ  Ｄ，  Ｆａｅｓ  Ｌ，  Ｓｅｅｕｗｓ  Ｓ，  Ｄｅｃｒｕｙ  Ｔ，  Ｅｌｅｗａｕｔ  Ｄ，  Ｐｅｅｌｍａｎ  Ｆ，  Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ  Ｊ．  （２０１２）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｌｅｐｔｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒａｎｄｏｍ  ｎａｎｏｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ４４１：４２５−３４．
Ｚａｋｉ  ＭＨ，  Ｖｏｇｅｌ  Ｐ，  Ｂｏｄｙ−Ｍａｌａｐｅｌ  Ｍ，  Ｌａｍｋａｎｆｉ  Ｍ，  Ｋａｎｎｅｇａｎｔｉ  ＴＤ．  （２０１０）．  ＩＬ−１８  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｌｒｐ３  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８５：４９１２−２０．
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【配列表】
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