(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬理学的に許容される塩を含むＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置用の医薬。
【請求項２】
｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、リンパ球減少を誘導しないＡＫＩ保護用量で投与されるか又は、限定されたリンパ球減少を誘導する、ＡＫＩ保護用量より高い用量で投与される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩が非リンパ球減少剤である請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩がリンパ球減少効果を有しないＡＫＩ保護用量で投与される、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項５】
｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、ＡＫＩ保護性の非リンパ球減少用量で投与される、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を含む、ＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置用の医薬であって、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、受容体脱感作を誘導しない選択的Ｓ１Ｐ1アゴニストである、前記医薬。
【請求項７】
治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を含む、リンパ球減少効果なしで使用するための、ＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置用の医薬。
【請求項８】
活性成分として治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を含むＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置用の医薬。
【請求項９】
活性成分として治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む、ＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性腎障害（ＡＫＩ）の予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩およびその医薬組成物に関する。化合物｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩およびその製造方法は、特許文献１に記載されている。この化合物は、Ｓ１Ｐ１／ＥＤＧ１受容体に対する親和性を有する。
【０００２】
以前は「急性腎不全」として知られていた急性腎障害（ＡＫＩ）は、血清クレアチニン（ＳＣｒ）の一過性の上昇から無尿性の完全な腎不全までの範囲の臨床症状を伴うさまざまな状況で起こる頻度の高い、かつ潜在的に重度の障害である。ＡＫＩは、伝統的に血清クレアチニンの増加によって測定されるような腎機能の急激な（４８時間以内）低下といわれてきた。最近のＫＤＩＧＯ（Kidney Disease Improving Global Outcomes）ガイドラインでは、以下に記載された検査値および臨床値に基づく診断基準あたりで合意が確立された（非特許文献１）。ＡＫＩは、以下のいずれかとして定義され、段階分けされている：
・４８時間以内にＳＣｒにおける≧０．３ｍｇ／ｄＬ（≧２６．５μｍｏｌ／Ｌ）の上昇；または
・７日前以内に起こっていることが知られている、または推測される、ＳＣｒにおけるベースラインの≧１．５倍の上昇；または
・６時間で＜０．５ｍＬ／ｋｇ／時の尿量。
【０００３】
使用する定義にもよるが、ＡＫＩは、すべての入院患者の約７％（非特許文献２）、そして危篤患者の最大３６〜６７％で起こる。重度のＡＫＩは、すべての集中治療室（ＩＣＵ）入院患者の４〜２５％で起こり、ＡＫＩを有するＩＣＵ患者の約５％は腎代替療法を必要とする（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。ＡＫＩの最もよくみられる原因は、敗血症、大手術、血液量減少および薬物療法である。ＡＫＩの発生に対する危険因子としては、老齢（＞７５歳）、慢性腎疾患（ＣＫＤ、ｅＧＦＲ（推算糸球体濾過量）＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）、アテローム硬化性末梢血管疾患、心不全、肝疾患、真性糖尿病および腎毒性薬物が挙げられる。
【０００４】
予防戦略および支援手段の進歩にもかかわらず、ＡＫＩは、特にＩＣＵに収容された人では高い罹患率および死亡率との関連が続いており、その場合、院内死亡率が５０％を超えることもありうる。死亡率に加えて、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を発症する高いリスクおよび末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の早期発症を含む長期的な因果関係がある（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。また、罹患率は、費用増加および入院期間の延長とも関連がある。
【０００５】
病因が何であれ、ＡＫＩの予防または処置の承認された治療法がないため、医学的な必要性が明らかに満たされていない。状態の管理は主に支持的であり、重度のＡＫＩ患者に対する医療の主要な構成要素として腎代替療法（ＲＲＴ）を用いる。水分補給は、依然として造影剤腎症（ＣＩＮ）に対する最も適当な予防的手段となっている。
【０００６】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、Ｓ１Ｐ１−５と称する５つのＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）に結合する脂質メディエーターである（非特許文献１０）。循環Ｓ１Ｐは、主に内皮細胞、血小板および赤血球から生じ、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）中のＡｐｏＭ（アポリポタンパク質Ｍ）（非特許文献１１）およびアルブミンを含む血漿タンパク質に高度に結合されることがわかっている。Ｓ１Ｐ１は、内皮細胞、免疫細胞および腎臓上皮細胞中を含めて広範に発現される。Ｓ１Ｐ１は、内皮障壁完全性の維持（細胞骨格再構築）、細胞増殖、生存、分化、血管新生および免疫細胞輸送を含む多くの生理学的機能を調節する。Ｓ１Ｐ１は、特に尿の濃縮のためにできている尿細管−血管の解剖学的構造によって血流および酸素供給が制限される腎臓の領域、腎髄質中で高度に発現される（非特許文献１２）。この領域の細胞は高い酸素消費量を有するため、髄質は低酸素性障害に特に敏感である。腎皮質尿細管障害は、髄質損傷および近位尿細管細胞における直接傷害の両方の結果である。Ｓ１Ｐ１は、腎虚血再灌流障害後に上方制御され（非特許文献１３）、その活性化により、３つの主要機構によって腎機能を保つことが期待される：
・内皮障壁機能の維持。この障壁はＡＫＩにおいて損傷を受け、血管透過性および接着性が損なわれる。
・近位尿細管上皮細胞のアポトーシスの制限。
・炎症性細胞浸潤の減少。
【０００７】
ＡＫＩにおける炎症は、尿細管上皮細胞および内皮障壁に対する複合的な損傷の結果であることが多い。内皮障壁完全性の調節におけるＳ１Ｐ−Ｓ１Ｐ１経路の役割は、広く実証されている（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。Ｓ１Ｐ１の活性化は、ＰＬＣ／Ｃａ２＋／ＦＡＫ／ｐＲａｃ経路の活性化を通して内皮障壁機能を改善する（非特許文献１７）。ＨＤＬ−ＡｐｏＭに結合したＳ１Ｐは、ｅＮＯＳ活性化を通して内皮障壁機能を延長することが示された（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。これに関して、低い血漿ＨＤＬ値は、血管手術を受けた患者のＡＫＩの発症リスクと関連づけられている（非特許文献２１；非特許文献２２）。
【０００８】
Ｓ１Ｐ１の全身のまたは内皮特異的欠失は、複数の器官に影響を及ぼしている大量出血により胚子致死性を誘導する（非特許文献２３）。同一の欠陥は、Ｓ１Ｐ生合成に関与する酵素（スフィンゴシンキナーゼ１および２）が欠失したノックアウトマウスで見られる（非特許文献２４）。同様に、Ｓ１Ｐ１アンタゴニストも血管透過性を高める。ＡＫＩモデルにおけるＳ１Ｐ１機能性アンタゴニストの急性保護効果にもかかわらず（非特許文献２５；非特許文献２６）、これらのＳ１Ｐ１機能性アンタゴニストによる長期処置は、肺損傷モデルにおける血管漏出を劇的に悪化させ、インビトロで内皮障壁完全性を破壊する（非特許文献２７）。同様の内皮欠陥は、Ｓ１Ｐのないマウスでも類似している（非特許文献２８）。
【０００９】
患者およびＡＫＩモデルでは、内皮細胞からＴＮＦ−αのようなサイトカインが放出され、尿細管間質性実質（tubulo-interstitial parenchyma）への炎症性細胞浸潤に関与するＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＰ／Ｅ−セレクチンのような接着分子を上方制御する（非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１）。そのうえ、培養されたヒト内皮細胞では、低酸素／再酸素化の後、これらの内皮接着分子のいくつかが上方制御される（非特許文献３２）。Ｓ１Ｐ１の活性化は、これらの接着分子を下方制御し、それによって炎症性細胞浸潤を低減する（非特許文献３３）。急性腎障害において内皮機能を保存する際のＳ１Ｐの重要な役割は、マウスにおける内皮Ｓ１Ｐ１受容体の条件付き欠失を用いて示されている（非特許文献３４）。
【００１０】
Ｓ１Ｐ１の刺激は、Ａｋｔリン酸化を通して内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）を活性化し、それは、ＮＯの産生を介して局所的な血管弛緩を調節している重要な酵素である（非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７）。したがって、Ｓ１Ｐは、内皮およびＮＯ依存的に血管弛緩を誘導する（非特許文献３８）。Ｉ／Ｒ−誘導ＡＫＩの動物のモデルにおいて、ＮＯは腎機能の保護効果を有する（非特許文献３９）。ラットでは、ｅＮＯＳ阻害により腎血流量が３５％だけ減少し、それに伴ってＧＦＲが減少し、腎血管抵抗が増加した（非特許文献４０）。Ｓ１Ｐは、内皮一酸化窒素の最も有効な活性化因子の１つとしてみなされ、それは局所血流を改善するが、また特に脆弱な皮質−髄様領域において血小板活性化および血管のうっ血を制限することも知られている。この機構は、ＡＫＩにおいて腎機能を保つために重要となりうる。重要なことに、一酸化窒素生物学的利用能の低下は、心肺バイパス（ＣＰＢ）および敗血症患者のＡＫＩと関連がある（非特許文献４１；非特許文献４２）。興味深いことに、ヒトｅＮＯＳプロモーターの７８６Ｃ多型は、転写活性の低下を示し、心肺バイパスの心臓手術患者における腎機能障害と関連がある（非特許文献４３；非特許文献４４）。多型頻度は、約５０％であり、そしてＡＫＩを発症するリスクがより高くなるだけでなく、また例えばＳ１Ｐ１の活性化を通して局所ＮＯレベルを修復する処置に対してより反応性である重要な亜集団を表すこともありうる。
【００１１】
さらに、Ｓ１Ｐ１の活性化は、ｐＥＲＫおよびｐＡｋｔ生存経路を活性化することによって近位尿細管上皮細胞のアポトーシスを直接制限する。近位尿細管上皮細胞のＳ１Ｐ１の特異的欠失は、虚血再灌流障害後の腎機能障害（非特許文献４５）だけでなく尿細管壊死を悪化させており、これらは再灌流障害の重症度を緩和する内在性Ｓ１Ｐ緊張の重要性を示している。これらのデータは、内皮軸および上皮軸の両方での、ＡＫＩにおけるＳ１Ｐ−Ｓ１Ｐ１システムの保護的役割の重要性を強調している。
【００１２】
Ｓ１Ｐは、Ｓ１Ｐ１活性化を通してリンパ節から血液へのリンパ球の放出に関与している。このＳ１Ｐ１活性化により、受容体内部移行、続いて細胞表面に戻る受容体のリサイクリングが起こり、再活性化が可能となる。しかしながら、Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニストまたはアンタゴニストは、内部移行したＳ１Ｐ１受容体が細胞表面に戻るリサイクリングを阻害するか、またはＳ１Ｐ１活性化を遮断するかのいずれかによってリンパ球減少を生じ、それによって細胞表面Ｓ１Ｐ１の劇的かつ持続性の減少が生じると考えられる。その結果、前臨床的および臨床的に観察されるように、後者の因子は、血液リンパ球における多大な、かつ持続性の降下を示す。
【００１３】
いくつかの報告は、Ｔリンパ球が急性腎障害に関与することを示している。損傷が、Ｔ細胞の減少によって改善され、ＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入により再構成されるという観察は、それがＣＤ４＋Ｔ細胞に依存性であるという証拠である（非特許文献４６；非特許文献４７）。したがって、フィンゴリモドおよびＳＥＷ２８７１を含む、Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニストがリンパ球減少用量で急性腎障害モデルにおいて保護剤となることは驚くべきことではない（非特許文献４８）。
【００１４】
しかし、特にＡＫＩの危険性が高い患者のような非常に過敏な衰弱した患者（老齢、心臓病、糖尿病および慢性腎疾患）では、リンパ球減少は日和見感染症の素因となる。従って、限定されたリンパ球減少または最良の場合、非リンパ球減少を誘導し、かつＡＫＩの処置における治療的有用性を有する選択的Ｓ１Ｐ１アゴニストの必要性がある。驚くべきことに、化合物｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸は、非リンパ球減少性（non-lymphopenic）である用量で哺乳動物においてＡＫＩ保護を生じる事実によって他のＳ１Ｐ１モジュレーターと異なる。｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸のこの性質は、最小限の機能的拮抗作用または脱感作効果を有する、Ｓ１Ｐ１受容体におけるその偏ったアゴニズム（biased agonism）と関連がありうると考えられる。これは、ＡＫＩの処置における｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸の使用に関する有意な臨床的安全性の利点となるであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０８６０７９
【非特許文献】
【００１６】
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【非特許文献６】Ostermann et al., 2007, Crit Care Med 35: 1837-1843
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【非特許文献３６】Igarashi et al, 2000, JBC 275: 32363-32370
【非特許文献３７】Igarashi et al, 2008, BBA 1781: 489-495
【非特許文献３８】Roviezzo et al., 2006, FASEB J 20: 340
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【非特許文献４２】Sadik et al., 2012, Mol Cell Biochem 359: 73-81
【非特許文献４３】Popov et al., 2009, Eur J Cardio-Thorac Surgery 36: 651-656
【非特許文献４４】Nakayama et al., 1999, Circulation 99: 2864-2870
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【非特許文献４７】Ysebaert et al., 2004, Kidney Int 66: 491-496
【非特許文献４８】Lien et al., 2006, Kidney Int 69: 1601-1608
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１８】
また、本発明は、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、ＡＫＩ保護用量で投与されたときにリンパ球減少を誘導せず、より高い用量で投与されたときに限定されたリンパ球減少を誘導する使用のための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００１９】
また、本発明は、ＡＫＩの予防または処置において非リンパ球減少剤として使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２０】
また、本発明は、ＡＫＩ保護用量で投与されたときにリンパ球減少効果なしでＡＫＩの予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２１】
また、本発明は、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、非リンパ球減少用量で投与されたときにＡＫＩ保護剤となる上記のような使用のための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２２】
また、本発明は、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が受容体脱感作を誘導しない選択的Ｓ１Ｐ１アゴニストである、ＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２３】
また、本発明は、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、ＡＫＩ保護用量で非リンパ球減少性となる選択的Ｓ１Ｐ１アゴニストである、ＡＫＩ（急性腎障害）の予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２４】
また、本発明は、ＡＫＩの予防または処置においてリンパ球減少効果なしで使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩に関する。
【００２５】
また、本発明は、活性成分として｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を含む薬剤に関する。
【００２６】
また、本発明は、ＡＫＩの予防または処置に使用するための、活性成分として｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００２７】
また、本発明は、
・包装材；
・活性成分として｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物；
および
・ＡＫＩに関して該医薬組成物により患者を処置できることを示す、包装材中に含まれるラベルまたは添付文書
を含む製品に関する。
【００２８】
また、本発明は、ＡＫＩの処置を必要とする患者に治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、上記患者のＡＫＩを処置する方法に関する。
【００２９】
また、本発明は、ＡＫＩの処置を必要とする患者に治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、上記患者のＡＫＩを処置する方法であって、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸がリンパ球減少効果を有しない方法に関する。
【００３０】
また、本発明は、ＡＫＩの処置を必要とする患者に治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、上記患者のＡＫＩを処置する方法であって、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、ＡＫＩ保護用量で投与された時にリンパ球減少効果を有しない方法に関する。
【００３１】
また、本発明は、ＡＫＩの処置を必要とする患者に治療有効量の｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、上記患者のＡＫＩを処置する方法であって、該処置が予防である方法に関する。
【００３２】
また、本発明は、包装材中に含まれるラベルまたは添付文書がＡＫＩに関してリンパ球減少効果のない上記の医薬組成物により患者を処置できることを示している製品に関する。
【００３３】
本発明は、包装材中に含まれるラベルまたは添付文書がＡＫＩに関してリンパ球減少効果のない上記の医薬組成物により患者を処置できることを示している製品であって、該処置が予防である製品に関する。
【００３４】
定義
便宜的な理由で、そして理解を容易にするため、本願の章および図中では、化合物｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸を「化合物Ａ」と新たに称している。本発明に関して以下の用語は、以下のとおり理解することになっている：
・選択的Ｓ１Ｐ１アゴニストは、他の４つのＳ１Ｐ受容体Ｓ１Ｐ２−５と比較してＳ１Ｐ１においてより強力である化合物である。さらに、その化合物は、広範囲の受容体、酵素およびイオンチャネルアッセイにおいてほとんどまたは全く活性を有していないはずである。
・リンパ球減少は、免疫系における重要な機能を有する白血球、血液リンパ球の異常な降下がある状態である。成人では、１，５００細胞／マイクロリットル未満のリンパ球レベルが診断確定（状態の証拠）となり、小児では、３，０００細胞／マイクロリットル未満のリンパ球レベルが診断確定となる。
Ｓ１Ｐ１活性化によって仲介されたリンパ球減少とは、Ｓ１Ｐ１モジュレーターを用いることによって生じたリンパ球減少状態のことをいう。Ｓ１Ｐは、リンパ節から血液へのリンパ球のＳ１Ｐ１介在性放出に関与しているため、後者の因子は、内部移行したＳ１Ｐ１受容体が細胞表面に戻るリサイクリングを阻害するか、またはＳ１Ｐ１活性化を遮断するかのいずれかによってリンパ球減少を生じると考えられる。
・限定されたリンパ球減少は、血液リンパ球の一過性減少（絶対リンパ球数が処置前の正常範囲外にある）である。一過性とは、２４時間または４８時間以内に正常範囲に戻るリンパ球の時間変化のことをいう。
・非リンパ球減少性またはリンパ球減少なしとは、血液リンパ球の一過性または持続性低下（絶対リンパ球数が処置前の正常範囲外にある）がないことをいう。一過性とは、２４時間以内に正常範囲に戻るリンパ球の時間変化のことをいうが、持続性とは、２４時間を超えて持続する減少のことをいう。
・ＡＫＩ保護用量：少なくとも３０％の血漿クレアチニンの有意な低下をもたらす｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸の用量。
・治療有効量は、本明細書に用いるとき、ＡＫＩにおいて効果を生じる｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸のような薬学的化合物の量を意味する。
・患者は、ヒト患者を意味する。
・予防：これは望ましくない効果を防ぐか、またはそれから保護するのに役立ち、医学的状態、特に疾患が起こるのを防ぐことを目的とする。
【００３５】
第１の実施態様は、｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸が、ＡＫＩ保護用量で非リンパ球減少性である、ＡＫＩの予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩である。
【００３６】
第２の実施態様は、保護効果がリンパ球減少を誘導することなくＳ１Ｐ１活性化によって仲介される、ＡＫＩの予防または処置に使用するための｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸またはその薬学的に許容される塩である。
【００３７】
別の実施態様は、包装材中に含まれるラベルまたは添付文書が、ＡＫＩに関して上記の医薬組成物による処置を受けている患者を、リンパ球減少を誘導することなく処置できることを示す、上記のような製品である。
【００３８】
略語
ＡＫＩ          急性腎障害
ＡｐｏＭ        アポリポタンパク質Ｍ
ＣＩＮ          造影剤腎症
ＣＫＤ          慢性腎疾患
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＥＲＢＰ        European Renal Best Practice
ｅＧＦＲ        推算糸球体濾過量
ｅＮＯＳ        内皮一酸化窒素合成酵素
ＥＳＲＤ        末期腎疾患
ＦｌｉｐＲ      蛍光イメージングプレートリーダー
ＧＰＣＲ        Ｇタンパク質共役受容体
ＨＤＬ          高密度リポタンパク質
ＨＤＭＥＣ      ヒト皮膚微小血管内皮細胞
ＨＳＣ          肝星細胞
ＩＣＵ          集中治療室
Ｉ／Ｒ          虚血／再灌流
ＫＤＩＧＯ      Kidney Disease Improving Global Outcomes
ＰＢＳ          リン酸緩衝生理食塩水
ＲＲＴ          腎代替療法
Ｓ１Ｐ          スフィンゴシン−１−リン酸
Ｓ１Ｐ１        スフィンゴシン−１−リン酸１
ＳＣｒ          血清クレアチニン
ｓ．ｅ．ｍ      平均値の標準誤差
【実施例】
【００３９】
以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、それによって本発明が限定されるわけではない。便宜的な理由で、そして理解を容易にするため、図および結果では、化合物｛４−［５−（３−クロロ−フェノキシ）−オキサゾロ［５,４−ｄ］ピリミジン−２−イル］−２,６−ジメチル−フェノキシ｝−酢酸を「化合物Ａ」として新たに称している。
【００４０】
統計的解析およびｐ値の計算を実施しており、図中では実験条件に応じて「＊」または「＃」のいずれかの記号によって表している。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１−１】ラット虚血−再灌流（Ｉ／Ｒ）モデルにおける化合物Ａおよび／またはＢＡＦ−３１２の単回または反復投与の効果。フィッシャーラットをシャム手術または２５分の両側腎動脈閉塞にかけ、２４時間再灌流後に血漿クレアチニンを測定した。（図１−Ａ）化合物Ａは、経口０．３、１および３ｍｇ／ｋｇで閉塞１時間前に与えて評価した。（図１−Ｂ）ＢＡＦ−３１２は、経口３、１０および３０ｍｇ／ｋｇで閉塞１時間前に与えて評価した。化合物なしの対照群には閉塞１時間前にビヒクルを与えた。＊＊＊ｐ＜０．００１  Ｉ／Ｒ−ビヒクル群対シャム群。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．０１化合物処置群対ビヒクル群。バーは、平均＋／−標準誤差である。（図１−Ｃ）ラットＩ／Ｒ損傷後の皮質アルブミン含量における化合物Ａの効果を評価するため腎臓サンプルを集めた。シャム手術ラット、Ｉ／Ｒ−ビヒクル処置ラットまたはＩ／Ｒ−化合物Ａ（経口３ｍｇ／ｋｇ）−処置ラットから代表的な腎臓の皮質領域におけるウエスタンブロットによってアルブミンを測定した。（図１−Ｄ）化合物Ａ（経口３ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを１日２回５日間投与した。最終投与を閉塞１時間前に行った。＊＊ｐ＜０．０１  Ｉ／Ｒ−ビヒクル群対シャム群。＃＃＃ｐ＜０．００１  化合物Ａ処置群対ビヒクル群。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】マウスの横紋筋融解誘導性ＡＫＩ障害における化合物Ａの効果。雄ＣＤ１マウスにおいて、化合物Ａ（０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを経口投与して１時間後、８ｍＬ／ｋｇのグリセロール（ＰＢＳ中５０％ｖ／ｖ）を筋肉内投与（後肢）した。シャム群には、対応する体積のＰＢＳを投与した。血漿クレアチニンを２４時間後に評価した。＊＊ｐ＜０．０１  グリセロール−ビヒクル群対シャム群。＃ｐ＜０．０５  化合物Ａ処置群対ビヒクル群。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図３−１】単回投与後のフィッシャーラット（図３Ａ）または単回投与（図３Ｂ）もしくは反復投与（図３−Ｃ）後のスプレーグドーリーラットにおける末梢血リンパ球。フィッシャーラットには１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇのいずれか、またはスプレーグドーリーラットには３ｍｇ／ｋｇで化合物Ａを経口投与した。フィッシャーラットには１および１０ｍｇ／ｋｇのいずれか、またはスプレーグドーリーラット（ｎ＝８）には３ｍｇ／ｋｇでＢＡＦ−３１２を経口的に与えた。反復投与プロトコールでは、化合物を１日２回５日間投与した。血液リンパ球は、曲線下面積（ＡＵＣ）（図３Ａ）または各時点での総白血球数のパーセンテージ（図３Ｂ／Ｃ）のいずれかで表し、平均＋／−標準誤差として表す。＊＊ｐ＜０．０１対ベースライン。（図３−Ｄ）フィッシャーラットにおけるＡＫＩ保護とリンパ球減少との間の関係。囲み線に注目すると、これは３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａに関しては、リンパ球減少の欠如および十分なＡＫＩ保護を示しているが、ＢＡＦ−３１２はリンパ球減少性であり、部分的なＡＫＩ保護を示している。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４】Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの末梢血リンパ球。化合物Ａを１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇで経口投与した（ｎ＝８）。各時点での血液リンパ球を総白血球数のパーセンテージとして表し、平均＋／−標準誤差として表す。＊＊＊ｐ＜０．００１対ベースライン。
【図５】ビーグル犬における末梢血リンパ球。ベースラインリンパ球数を得、次いで犬に３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）の化合物Ａ、または１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝４）のＢＡＦ−３１２の単回経口投与を行った。動物を７日間（図５−Ａ）、ＢＡＦ−３１２の場合、最大６６日間（図５−Ｂ）モニターした。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対ベースライン。バーは、平均＋／−標準誤差である。３ｍｇ／ｋｇの投与に関して測定したいずれの時点でも化合物Ａはなんら有意なリンパ球減少を誘導しなかったことに注目のこと。
【図６】健康なＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスおよびフィッシャーラットにおける肺血管漏出。化合物Ａ（経口３および１０ｍｇ／ｋｇ、１日２回）、ＢＡＦ−３１２（経口１および３ｍｇ／ｋｇ、１日２回）およびフィンゴリモド（経口０．１および１ｍｇ／ｋｇ、１日２回）、ｎ＝５−８でマウスを７日間処置した。（図６−Ａ）エバンスブルー血管外遊出を用いて血管透過性を評価した。（図６−Ｂ）肺質量。化合物Ａ（経口１、３、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ、１日２回）およびＢＡＦ−３１２（経口０．０３、０．１、０．３、３および３０ｍｇ／ｋｇ、１日２回）ラットを７日間処置した。（図６−Ｃ）エバンスブルー血管外遊出を用いて血管透過性を評価した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対マウスでは対照（化合物なし）またはラットではビヒクル（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図７】インピーダンスアッセイを用いたヒト皮膚の微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）におけるＳ１Ｐ１受容体脱感作。Ｓ１Ｐ（１μＭ）、フィンゴリモド（１００ｎＭ）または化合物Ａ（１μＭ）のいずれかを用いてＨＤＭＥＣに１回目の刺激を１時間与え、その後、３０分間のウォッシュアウト期間とした。Ｓ１Ｐ（３つの濃度）の第２の刺激を用い、生成したインピーダンス（ｎ＝３実験）を測定して受容体脱感作における１回目の刺激の効果を評価した。１回目の刺激濃度は、すべて＞ＥＣ９０であった。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図８】インピーダンスアッセイを用いたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳ１Ｐ１受容体脱感作。Ｓ１Ｐ（１μＭ）、化合物Ａ（１μＭ）、フィンゴリモド（１００ｎＭ）またはＳＥＷ２８７１（１μＭ）のいずれかを用いてＨＵＶＥＣに１回目の刺激を１時間与え、その後、３０分間のウォッシュアウト期間とした。Ｓ１Ｐ（４つの濃度）の２回目の刺激を用い、生成したインピーダンス（ｎ＝３実験）を測定して受容体脱感作における１回目の刺激の効果を評価した。１回目の刺激濃度は、すべて＞ＥＣ９０であった。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図９】ＦｌｉｐＲアッセイを用いたＳ１Ｐ１（Ｇ−融合）を過剰発現しているＣＨＯ細胞におけるＳ１Ｐ１受容体脱感作。（図９−Ａ）プロトコールは、Ｓ１Ｐ（１００ｎＭ）、化合物Ａ、フィンゴリモド、ＢＡＦ−３１２、ポネシモドによる指示濃度での５分間の１回目の刺激を含んだ。１回目の刺激濃度は、すべて＞ＥＣ９０となるように選択した。ウォッシュアウト期間を変えた後、Ｓ１Ｐ（１００ｎＭ）による２回目の刺激を用いて受容体脱感作を評価した。（図９−Ｂ）基礎反応のパーセンテージとして表されたＳ１Ｐ誘導性ＦｌｉｐＲ反応を、各化合物についてウォッシュアウト期間を変えて（１５〜６０分、ｎ＝４実験）示す。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図１０】ＦｌｉｐＲアッセイを用いたヒト肝星細胞（ＨＳＣ）のＳ１Ｐ１受容体脱感作。（図１０−Ａ）プロトコールは、化合物Ａ（１０μＭ）またはＢＡＦ−３１２（３００ｎＭ）による１回目の刺激を含んだ。１回目の刺激濃度は、すべて＞ＥＣ９０となるように選択した。１時間または３時間のいずれかのウォッシュアウト期間後、同じ化合物による２回目の刺激を用いて受容体脱感作を評価した。（図１０−Ｂ）蛍光単位として表された、化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２によって誘導されたＦｌｉｐＲ反応を、各化合物についてウォッシュアウト期間（ｎ＝３実験）を変えて示す。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【図１１】Ｃ５７Ｂｌ６／ＪマウスにおけるＩ／Ｒ損傷後の血漿Ｓ１Ｐの時間経過。シャム手術後、または２２分間の両側腎動脈閉塞、続いて再灌流後、血漿Ｓ１Ｐレベル（エシュロン（Echelon）からのエリサ（Elisa）キット）を評価した。対照群（ＣＴＲＬ）は、手術を受けなかった。＃＃＃ｐ＜０．００１対シャム群（時間対応のある（time-paired））。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照（ＣＴＲＴ）。バーは、平均＋／−標準誤差である。
【００４２】
方法
物質：
フィンゴリモドおよびＳＥＷ２８７１は、商業的に入手可能である。
ＢＡＦ−３１２およびポネシモドは、公開された方法に従って合成した：
・ＢＡＦ−３１２についてはＷＯ０４／１０３３０６、
・ポネシモドについてはＷＯ０５／０５４２１５。
化合物Ａは、文献ＷＯ２０１１／０８６０７９に記載された方法に従って合成した。
【００４３】
すべてのインビボ研究は、実験動物の管理と使用における欧州共同体の基準（European
Community Standards on the Care and Use of Laboratory Animals）に従って実施し、サノフィリサーチ＆デベロップメントの動物実験委員会（Animal Care and Use Committee of Sanofi Research & Development）によって承認された。
【００４４】
統計解析：
分布の正規性および分散の均一性（ルビーン検定）に基づいて、評価されたパラメータにおける違いを調べるため、シャム／対照群とビヒクル処置群との比較にスチューデント検定またはウィルコクソン検定を用いた。次いで、ビヒクル処置基を化合物処置群と比較するためEverst@t V6ソフトウェアを用いて一元配置分散分析法（ＡＮＯＶＡ）または二元配置ＡＮＯＶＡを実施した。この主要解析の後、必要に応じてダネットポストホック検定を続けた。分散の不均一性の場合、クラスカル・ワリス検定を適用した。ｐ＜０．０５の場合、群間の差が有意であるとみなした。
【００４５】
１．心血管機能安全性
ａ）ｈＥＲＧアッセイ
ヒトＥＲＧ（ether-a-go-go関連遺伝子）カリウムチャネル（サイトミックス（Cytomyx）カタログ番号：ＣＹＬ３００２）を発現する組換えＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系を、以下のプロトコールに従って培養した。必要に応じて、凍結したアリコートから培養を再開した。凍結細胞のアリコート（１ｍＬ）を３７℃まで急速に温め、最初に７５ｃｍ２のフラスコ（コーニング（Corning））中で再培養した。次いで、１０％ウシ胎児血清を含有するα−最小必須培地（ギブコ（Gibco）３２５７１−０２８）を用いて体積を１０ｍＬに調整した。２４時間後、培地を新たにし、１％ジェネティシン（Ｇ４１８、ギブコ１０１３１）を加えて細胞誘導を防止する。２または３日後、Ｔ２５フラスコによって１．５×１０６細胞で細胞を播種した。フラスコを３７℃５％ＣＯ２インキュベーター中に１時間間置いた。その後、それを５％ＣＯ２インキュベーター中２８℃で２日間置いた。２８℃で２日インキュベーション後、細胞単離の手順を実施した。細胞をアキュマックス（Accumax）（シグマ（Sigma）；１：４）またはベルセネ（versene）（ギブコ（Gibco））で回収し、細胞外培地に置いた。
【００４６】
細胞を細胞外溶液ＰＡＴＣＨ（ＮａＣｌ、１３８ｍＭ；ＫＣｌ、４ｍＭ；ＣａＣｌ２、１．８ｍＭ；ＭｇＣｌ２、１ｍＭ；グルコース、５．６ｍＭ、ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ）で灌流させた。ｐＨは、ＮａＯＨで７．３に調整する。モル浸透圧濃度は、２８５ｍＯｓｍに調整する。内部溶液は、以下のように調製した：ＫＣｌ、６０ｍＭ；ＫＦ、７０ｍＭ；ＮａＣｌ、１５ｍＭ；ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ；ＥＧＴＡ（Ｋ）、５ｍＭ；ｐＨは、ＫＯＨで７．２５に調整した。モル浸透圧濃度は、２９０ｍＯｓｍに調整する。
【００４７】
ｈＥＲＧ電流は、−８０ｍＶの保持電位から＋２０ｍＶの試験電位へ、続いて−１００ｍＶへの再分極の電圧ステップ（２秒）に応じて活性化した。電圧ステップを２０秒間隔で適用した。ｈＥＲＧ電流を−１００ｍＶでのテール不活性化電流として測定した。ベースライン測定のための３分間の後、溶液の変更４〜６分後、化合物Ａの効果を測定した。各実験終了後、１０μＭ濃度の特異的ｈＥＲＧ遮断薬、すなわちリスペリドン（これは０．７μＭあたりでＩＣ５０を示す）の灌流により、ｈＥＲＧの１００％阻害を測定することができた。
【００４８】
データベースおよび分析ソフトウェアデータエクスプレス１．０（DataXpress 1.0）（アキソン・インスツルメンツ（Axon Instruments）/モレキュラーデバイス（Molecular Devices））を用いて電流を分析した。電流の直線的減弱は、ベースライン測定期間から外挿し、薬物効果後のｈＥＲＧ電流阻害のパーセンテージは、以下のように算出している：ｈＥＲＧ電流阻害のパーセンテージ（％）＝１００−［（（Ｉ−Ｉリスペリドン）／（Ｉベースライン−Ｉリスペリドン））×１００］。
【００４９】
「Ｉ」が、薬物効果の後、測定された電流であった場合、「Ｉリスペリドン」は、特異的ｈＥＲＧ遮断薬の効果後に測定された電流であり、「Ｉベースライン」は、薬物の灌流前に測定された電流であった。
【００５０】
ｂ）ウサギプルキンエ線維アッセイ
単離されたウサギプルキンエ線維（雄、ニュージーランドウサギ；１．３〜１．５ｋｇ；９〜１２週齢）から記録された静止膜電位および活動電位パラメータにおける化合物Ａの効果を、微小電極技術を通して評価した。以下のパラメータを測定した：静止電位（ｍＶでのＲＰ）、活動電位振幅（ｍＶでのＡＰＡ）、活動電位の最大立ち上がり速度（Ｖ／秒でのＶｍａｘ）、再分極の５０％および９０％の活動電位持続期間（ミリ秒でのＡＰＤ５０およびＡＰＤ９０）。線維を、ＮａＣｌ、１２０；ＫＣｌ、４；ＭｇＣｌ２、１；ＮａＨ２ＰＯ４、１．８；ＮａＨＣＯ３、２５；グルコース、１１；ＣａＣｌ２、１．８を含有する（ｍｍｏｌ／Ｌで）含酸素生理溶液、ｐＨ＝７．４を３６±１℃で灌流させた。化合物ＡをＤＭＳＯに最初に溶解して１２ｍｍｏｌ／Ｌ保存溶液を得た。この溶液をＤＭＳＯ中にさらに希釈し、次いで、生理溶液に加えて０．３、１、３、１０および３０μｍｏｌ／Ｌの適当な名目濃度（すなわち、それぞれ、活性成分０．１、０．５、１．４、４．５および１３．６μｇ／ｍＬ）を得た。試験製剤中のＤＭＳＯの最終濃度を生理溶液中で０．２５％（ｖ／ｖ）の一定に保持した。最初にプルキンエ線維（ｎ＝４）を生理溶液によって灌流させた。３０分の対照期間後、試験化合物を、３０分毎に順に濃度を高めて評価した。各試験濃度に関して、１秒当たり１パルス（１Ｈｚ）の基本頻度で線維を刺激した。さらに、刺激頻度は、下記のように、１秒当たり１パルス（１Ｈｚ）から４秒毎に１パルス（０．２５Ｈｚ）へ３分間低下させ、１秒当たり１パルスに１分間再び上昇させ、最後にさらに２分間（１９分目と２５分目の間で）１秒当たり３パルス（３Ｈｚ）に上昇させた：
【表１】
0006458016.tif 000002
【００５１】
低い刺激頻度は、活動電位の再分極相の間、異常な電気事象の発生を支持するため、そして早期後脱分極（ＥＡＤ）の発生を促進するために用いた。高い刺激頻度は、使用依存性ナトリウムチャネル遮断を評価するために用いた。最も高い濃度の後、生理溶液を再び灌流させて薬物効果の可逆性を評価した（ウォッシュアウト）。
【００５２】
ｃ）イヌ遠隔測定研究
本研究の目的は、投与後２４時間にわたる覚醒遠隔測定イヌの心血管機能（血圧、心拍数およびＥＣＧ）における化合物Ａの潜在的効果を評価することであった。覚醒自由行動イヌ（conscious freely moving dogs）（マーシャルファームズ（Marshall Farms）、ｎ＝４、雄２匹および雌２匹、体重６．９〜１０．８ｋｇおよび４４〜６４ヵ月）に、陰性対照物品（すなわち、経口経路では０．５％（ｗ／ｗ）ヒドロキシエチルセルロース／０．６％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０の水溶液、または２０％カプチゾール（Captisol）の水溶液、ｐＨ７．５〜８）の経口または静脈内用量、続いて経口経路では陰性対照物品の懸濁液として３０および１００ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ、または静脈経路では陰性対照物品の溶液として１０および３０ｍｇ／ｋｇを投与し、各投与の間には少なくとも４日のウォッシュアウト期間を有する用量上昇研究デザインに従った（経口経路では５ｍＬ／ｋｇまたは３０分間、頸静脈への注入）。動脈血圧および誘導ＩＩ ＥＣＧシグナル（Transmitters from Data Science、米国）それぞれの処置日において、投与約２時間前から投与最大２４時間後まで連続的に記録した。以下のパラメータをいくつかの時点で分析した：動脈血圧（収縮期、拡張期および平均）、心拍数、ＲＲ、ＰＱ（＝ＰＲ）、ＱＴ間隔持続期間およびＱＲＳ群持続期間の心電図パラメータならびに体温。フリデリシア（Fridericia）式およびヴァン・デ・ウォーター（van de Water）式の両方に従ってＱＴ間隔を心拍数の変化に関して補正した。全ＥＣＧシグナルにより、３０分から投与後６時間までの任意のリズムの乱れおよび波形形態に関して心拍間隔を調べた。各処置日に、臨床観察を実施した。肉眼による潜在的な行動に関する変化および心血管パラメータによる潜在的干渉を確認するためビデオ録画をチェックした。投与後の分析時点は、以下の通りであった：０．５、１、２、３、４、６、８、１２、１６および２４時間。
【００５３】
２．内皮障壁完全性における差異
ａ）マウスの肺血管性の漏出研究
雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（ｎ＝５〜８、２５〜３０ｇ）（チャールスリバー研究所（Charles River Laboratory）、フランス）を、３および１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ、１および３ｍｇ／ｋｇのＢＡＦ−３１２、０．１および１ｍｇ／ｋｇのフィンゴリモドまたは１０ｍＬ／ｋｇの投与体積内のビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）により経口的に１日２回７日間処置した。各群に含まれるマウスの数は、５〜８匹であった。７日後、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（xylasine）（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内注射を用いてマウスに麻酔をかけた。エバンスブルーを１ｍＬ／ｋｇ中に１５ｍｇ／ｋｇで頸静脈に静脈注射した。１０分後、生理血清を左心室経由で注射して体から残留血管内エバンスブルーをすすいだ。肺組織を集めて計量し、次いで、２４時間の間、純粋なホルムアミド溶液中に浸漬して組織エバンスブルーを抽出し、それによって血管透過性を評価した。エバンスブルー濃度は、検量線を用いて６３０ｎＭで評価し、肺質量により標準化した。結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００５４】
ｂ）ラットにおける肺血管漏出研究
雄フィッシャーラット（ｎ＝４８、２８０〜３５０ｇ）（チャールスリバー研究所（Charles River Laboratory）、フランス）を、化合物Ａ（１、３、１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＦ−３１２（０．０３、０．１、０．３、３および３０ｍｇ／ｋｇ）または２ｍＬ／ｋｇの投与体積内のビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）により経口的に１日２回７日間処置した。７日後、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いてラットに麻酔をかけた。エバンスブルーを１ｍＬ／ｋｇ中の３０ｍｇ／ｋｇで後眼窩静脈叢（retro-orbital sinus）に静脈注射した。１５分後、生理血清を左心室経由で注射して体から残留血管内エバンスブルーをすすいだ。肺組織を集めて計量し、次いで、２４時間の間、純粋なホルムアミド溶液中に浸漬して（４ｍＬ／ｇの組織質量）組織エバンスブルーを抽出し、それによって血管透過性を評価した。エバンスブルー濃度は、検量線を用いて６３０ｎＭで評価した。
結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００５５】
３．リンパ球減少性活性における差異
ａ）ラットリンパ球減少研究
雄スプレーグドーリーラット（ｎ＝８、２５０〜３５０ｇ）（チャールスリバー研究所、フランス）に、３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２または２ｍＬ／ｋｇの投与体積内のビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）の経口投与を行った。２つのプロトコール：単回投与または１日２回連続５日間の反復投与を用いた。血液分析では、全血リンパ球数を決定するため、化合物投与（反復プロトコールでは最終投与）の２、６および２４時間後に血液を採取した。結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００５６】
雄フィッシャーラット（ｎ＝８、２５０〜３５０ｇ）（チャールスリバー研究所、フランス）に、化合物Ａ（１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ）、ＢＡＦ−３１２（１および１０ｍｇ／ｋｇ）または２ｍＬ／ｋｇの投与体積内のビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）による単回経口投与を行った。血液分析では、全血リンパ球数を決定するため、化合物投与の２、６および２４時間後に血液を採取した。結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００５７】
ｂ）マウスリンパ球減少研究
雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（ｎ＝８、２５〜３０ｇ）（チャールスリバー研究所、フランス）に、１、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａまたは１０ｍＬ／ｋｇの投与体積内のビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）の単回経口投与を行った。血液分析では、全血リンパ球数を決定するため、化合物投与の２、６および２４時間後に血液を採取した。結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００５８】
ｃ）イヌリンパ球減少研究
覚醒自由行動雄イヌ（マーシャルファーム、ｎ＝８、体重１０．５〜１４．３ｋｇ）に、陰性対照物品（すなわち、０．５％（ｗ／ｗ）ヒドロキシエチルセルロース／０．６％（ｗ／ｗ）ポリソルベート８０の水溶液）または陰性対照物品の懸濁液として３、１０および３０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａもしくは１０ｍｇ／ｋｇのＢＡＦ−３１２の経口投与を、各投与（５ｍＬ／ｋｇ）間に少なくとも７日のウォッシュアウト期間を有する用量上昇研究デザインに従って行った。血液分析では、全血リンパ球数を決定するため、両化合物に関して０．５、１、２、３、４、５、６、２４、４８および１６８時間で（そしてＢＡＦ−３１２に関しては最大６６日）血液を採取した。結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００５９】
４．インビトロ薬理学
ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃｈｅｍ細胞およびＨＳＣにおけるカルシウム動員（ＦｌｉｐＲ）アッセイ
１．ＣＨＯ細胞
化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドの活性を、ＣＨＯ細胞中のｈＳ１Ｐ１−Ｇ−融合構築物（専売）によるＦｌｐ−Ｉｎ安定トランスフェクションにおいて試験し、選択性をｈＳ１Ｐ２およびｈＳ１Ｐ３−Ｇ−融合構築物（専売）と比べて試験した。細胞系生成は、ＷＯ２０１１／０８６０７９に記載されている。
【００６０】
化合物によるＳ１Ｐ１受容体の活性化は、ヒトＳ１Ｐ１受容体が安定して過剰発現されるＣＨＯ細胞の使用によって、細胞ベースカルシウム蛍光アッセイでのＳ１Ｐ１受容体関連のカルシウム遊離におけるその効果によって定量化した（Ｆｌｐ−Ｉｎシステム、インビトロゲン（Invitrogen））。Ｇ−タンパク質結合を強化するため、かつシグナル伝達をＣａ２＋遊離に向けるため、過剰発現された受容体は、修飾されたＧ−タンパク質のＣ末端配列（Ｇαｉ４ｑｉ４）（ＷＯ０２／０４６６５）をさらに有した。細胞内カルシウムの変化は、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦｌｉｐＲ、モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics））におけるカルシウム感受性色素ｆｌｕｏ−４（インビトロゲン）を用いた蛍光測定によって決定した。
【００６１】
ヒトＳ１Ｐ１受容体を安定して過剰発現するＣＨＯ細胞を、実験約１８〜２４時間前に黒色クリアボトムポリ−Ｄ−リジンコート９６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、Biocoat cellware）中に播種した（ウェル当たり４０．０００）。３７℃、二酸化炭素５％および湿度９５％のインキュベーター中、１％（体積／体積）ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＮ、＃Ｐ０６−０７１００）、１０％（体積／体積）ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ハクローンチャコール（Hyclone Charcoal）／デキストラン処置ＦＢＳ＃ＳＨ３００６８）およびハイグロマイシンＢ（インビトロゲン（Invitrogen）、＃１０６８７−０１０）３００ｍｇ／Ｌ（最終濃度）を補充したＦ−１２グルタマックス培地（ギブコ（Gibco）＃３１７６５）に基づく細胞培地中で細胞を増殖させた。
【００６２】
ＦｌｉｐＲ実験前に、３７℃、二酸化炭素５％および湿度９５％のインキュベーター中、２μＭのｆｌｕｏ−４ＡＭ（すべてのデータは、最終濃度について記載されている）、０．０５％（体積／体積）プルロニック（登録商標）Ｆ−１２７（インビトロゲン（Invitrogen）、＃Ｐ−３０００ＭＰ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ギブコ（Gibco）＃１５６３０）、２．５ｍＭのプロベネシド（シグマ（Sigma）＃Ｐ−８７６１）および０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ（Sigma）＃Ａ−６００３）を補充して水酸化ナトリウムでｐＨ７．５に調整されたハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；インビトロゲン＃１４０６５０４９）からなる色素ローディングバッファー中で６０分間、ｆｌｕｏ−４アセトキシメチルエステル（ｆｌｕｏ−４ＡＭ、インビトロゲン（Invitrogen）、＃Ｆ１４２０２）を細胞に装填した。細胞装填中に、細胞内エステラーゼによってｆｌｕｏ−４ＡＭが切断されて、細胞内でｆｌｕｏ−４色素の捕捉が起こる。細胞洗浄器（テカンパワー（Tecan Power）洗浄器）中で、先に明記されたがｆｌｕｏ−４ＡＭおよびＢＳＡを含まないバッファーで細胞を３回洗浄することによって装填を終結した。この後者のバッファーは、その後の細胞蛍光測定のバッファーとしても用いた。
【００６３】
次いで、色素装填および洗浄された細胞を、ＤＭＳＯ中の溶液として添加されたさまざまな濃度を有するそれぞれの化合物（ＤＭＳＯの最大最終濃度０．３％体積／体積）、またはそれぞれの濃度のみ（陽性対照）のＤＭＳＯ中のＳ１Ｐ（最終濃度１００ｎＭ）で刺激した。Ｓ１Ｐ受容体を活性化した化合物は、内部ストアから細胞内カルシウムの遊離を導き、ｆｌｕｏ−４蛍光シグナルの大きな一過性増加が起こり、これは約３分にわたってモニターされた。試験化合物によって生じるパーセント活性化は、Ｓ１Ｐ陽性対照に対する最大蛍光反応と比較して最大蛍光反応から決定した。すべての蛍光値を、ＤＭＳＯのみでプレインキュベートし、Ｓ１Ｐで処置しなかった細胞で得られたベースライン蛍光値（ベースライン対照）に対して補正した。すべての測定は、３通り実施した。さまざまな濃度での活性化から、ＥＣ５０値を算出した。
【００６４】
２．Ｃｈｅｍ細胞
Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４またはＳ１Ｐ５受容体における化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドのＥＣ５０活性を決定するため、ミリポア（Millipore）からのＧＰＣＲＰｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）アッセイを用いた。これらのアッセイでは、ＣｈｅｍｉＳｃｒｅｅｎ  ＧＰＣＲ安定細胞系を用いた。
【００６５】
３．ＨＳＣ
ヒトＨＳＣ（サイエンセル（Sciencell））を９６マルチウェルプレート中ウェル当たり２５×１０３細胞、１００μＬ／ウェルで播種し、１％補充物（サイエンセル（Sciencell）ＳＣ５３５２）および２％ＦＣＳを含む完全培地（サイエンセル（Sciencell）ＳＣ５３０１）中で２４時間付着させた。さらに２４時間、２％ＦＣＳを含むが、補充物を含まないサイエンセル（Sciencell）培地によって培地を取り換えた。細胞を洗浄し、アッセイバッファー（ＨＢＳＳ、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭヘペス、３．３ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０％ＢＳＡ）１００μＬ中に置いた。暗所にてプルロニック酸の存在下３７℃で１時間、細胞にＦｌｕｏ４−ＡＭを装填した。装填培地を除去し、２００μＬ／ウェルのアッセイバッファーと取り換えた。細胞を暗所にて室温で２０分間安定化させた。培養プレートをＦｌｉｐＲ機器中に置き、５０μｌの体積（５×溶液、最終濃度１０μＭ）下で化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２を加え、カルシウム蛍光を連続的に６分間記録した。脱感作実験では、化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２の１回目の注射後
、培養プレートを１回洗浄し、化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２の２回目の添加前にアッセイバッファー中で１または３時間回復させた。対照実験では、化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２の１回目の注射をアッセイバッファーで置き換え、化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２による２回目の注射を参照として採用した。結果を蛍光単位（ＦＵ）として表す。
【００６６】
ｂ）β−アレスチンアッセイ
Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４またはＳ１Ｐ５受容体における化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドのＥＣ５０活性を決定するため、ディスカバーＸ（DiscoverX）からのパスハンター（登録商標）β−アレスチンアッセイ（PathHunter（登録商標） β-Arrestin Assay）を用いた。０．５％ＦＢＳを含有するアッセイ培地中で化合物を試験した。
【００６７】
ｃ）ＧＴＰγＳアッセイ
この方法は、ＷＯ２０１１／０８６０７９に記載されている。
【００６８】
ｄ）内部移行アッセイ
Ｓ１Ｐ１受容体における化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドのＥＣ５０活性を決定するためディスカバーＸ（DiscoverX）からのパスハンター（登録商標）活性化ＧＰＣＲ内部移行アッセイ（PathHunter（登録商標） Activated GPCR Internalization Assay）を用いた。０．５％ＦＢＳを含有するアッセイ培地中で化合物を試験した。
【００６９】
ｅ）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびＨＵＶＥＣにおけるｃＡＭＰアッセイ
１．ＣＨＯ細胞
Ｓ１Ｐ１における化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドのＥＣ５０活性を決定するため、ディスカバーＸ（DiscoverX）からのヒットハンター（登録商標）ｃＡＭＰアッセイ（Hit Hunter（登録商標） cAMP Assay）を用いた。０．５％ＦＢＳを含有するアッセイ培地中で化合物を試験した。
【００７０】
２．ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）
化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２またはフィンゴリモドに対する反応におけるサイクリックＡＭＰをフォルスコリン処置ＨＵＶＥＣ細胞においてｃＡＭＰ ＨＴＲＦ（登録商標）キット（シスバイオ（Cisbio））の平均によって評価した。簡潔には、ＨＵＶＥＣ（ロンザ（Lonza））を、ウェル当たり５×１０３細胞で白色９６マルチウェルプレート（半分の体積）中のＥＧＭ２培地（ロンザ（Lonza））に２４時間播種した。実験の開始時に、ＥＧＭ２培地を、ヘペス（Hepes）（１０ｍＭ）、ＢＳＡ（０．１％）およびＩＢＭＸ（０．５ｍＭ）を含有するＨＢＳＳで構成されるアッセイバッファーと取り換えた。細胞を１５分間、回復させた（recover）。化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２またはフィンゴリモド（１０ｎＭ〜１００μＭ）を細胞に１５分間加え、続いてフォルスコリン（ＦＳＫ、１０μＭ）を加えた。４５分のＦＳＫ処置後、ＭＡｂ抗−ｃＡＭＰ−クリプテートおよびｃＡＭＰ−Ｄ２の添加によって反応を１時間停止した。インキュベーション終了後、蛍光を読み取り（エンビジョン（Envision）、パーキンエルマー（Perkin Elmer））、アッセイキットプロトコールに従ってＦＲＥＴ比を算出した。ロジスティック方程式モデルによるサノフィBIOST@T-SPEEDソフトウェアを用いて化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２またはフィンゴリモド（ＥＣ５０）の効力を算出した。
【００７１】
ｆ）ＲＰＴＥＣ細胞アッセイにおけるＡｋｔおよびＥＲＫ１／２リン酸化（基礎条件下またはツニカマイシン挑戦後）
ＲＰＴＥＣ細胞（ロンザ（Lonza））をウェル当たり０．３×１０６細胞で６マルチウェルプレート中、ウェル当たり２ｍＬの完全ＲＥＢＭ／ＲＥＧＭ培地（ロンザ（Lonza））に２４時間播種した。さらに２４時間の間、９００μＬの休止培地（quiescent medium）中で細胞を血清飢餓にした。濃度を高めた化合物Ａ（１０×）を、３７℃で１０分間、各ウェル中１００μＬの体積下で加えた。使用時、化合物Ａの添加３０分前にツニカマイシン（１００μＬ）を加えた。培地除去後、細胞を冷ＰＢＳですすぎ、氷上で１％トリトン、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する冷ＲＩＰＩバッファー１００μＬ中に溶解させた。ウエスタンブロットのため、全タンパク質溶解物３０μｇを４〜１２％ビス−トリスゲル（インビトロゲン（Invitrogen））中に装填した。移動および転写後、ニトロセルロース膜を抗ホスホＡｋｔ（ホスホ−Ｓｅｒ４７３、Ｃｓｔ＃９２７１）および抗ホスホ−Ｅｒｋ１／２（ホスホ−Ｔｙｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｃｓｔ＃４３７７）で精査した。膜の濃度測定分析後の標準化のため、抗α−チューブリン（Ｃｓｔ＃２１４４）によるチューブリン標識化を用いた。
【００７２】
ｇ）ＨＵＶＥＣ細胞アッセイ（飢餓下）におけるＡｋｔおよびＥＲＫ１／２リン酸化
６マルチウェルプレート中、ウェル当たり２ｍＬの完全ＥＧＭ２培地（ロンザ（Lonza））中で、ＨＵＶＥＣ細胞（ロンザ（Lonza））をウェル当たり０．３×１０６の細胞で２４時間播種した。９００μＬの休止培地中でさらに２４時間の間、細胞を血清飢餓にした。濃度を高めた化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２またはフィンゴリモド（１０×）を３７℃で各ウェル中に１００μＬの体積下で１０分間加えた。培地を取り出した後、細胞を冷ＰＢＳですすぎ、氷上で、細胞を１％トリトン、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する１００μＬのＲＩＰＡバッファー中に溶解した。ウエスタンブロットのため、全タンパク質溶解物３０μｇを４〜１２％ビス−トリスゲル（インビトロゲン）中に装填した。移動および転写後、ニトロセルロース膜を抗ホスホＡｋｔ（ホスホ−Ｓｅｒ４７３、Ｃｓｔ＃２９６５）および抗ホスホ−Ｅｒｋ１／２（ホスホＴｙｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｃｓｔ＃４３７７）で精査した。膜の濃度測定分析後の標準化のため抗α−チューブリン（Ｃｓｔ＃２１４４）で標識化されたチューブリンを用いた。
【００７３】
ｈ）ツニカマイシン誘導アポトーシスアッセイ
ＲＰＴＥＣのツニカマイシン（ＴＮ）誘導アポトーシスにおける化合物Ａの効果は、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイキット（プロメガ（Promega））の平均によって測定した。簡潔には、ＲＰＴＥＣ細胞（ロンザ（Lonza））を９６マルチウェル白色プレート中、ウェル当たり３０×１０３細胞でＲＥＧＭ（ＲＥＢＭ培地および０．５％ＦＣＳおよびシングルクォート（Single quots）、ロンザ（Lonza））中に播種し、２４時間付着させた。２４時間後、完全培地を、血清および補充物を含まない培地（５６μＬ／ウェル）と取り換えた。細胞を化合物Ａ（最終濃度０．３〜３０μＭ、７μＬ）で３０分間前処理し、続いてツニカマイシン（ＴＮ、最終濃度、０．１μｇ／ｍＬ、７μＬ）を加えた。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間後、７０μＬのカスパーゼ−Ｇｌｏ試薬を加え、培養プレートを振盪下に１時間置いた。発光は、エンビジョン（Envision）リーダー（パーキンエルマー（Perkin Elmer））の平均によって記録した。結果をＴＮ−誘導アポトーシスのパーセント阻害として表す。
【００７４】
ｉ）接着分子アッセイのＴＮＦα−誘導過剰発現
ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＰ／Ｅ−セレクチン発現を、ＥＬＩＳＡによってＨＵＶＥＣ中で測定した。ＨＵＶＥＣ細胞を、９６マルチウェルプレート中、ウェル当たり２５×１０３細胞でＥＧＭ２培地（ロンザ（Lonza））中１００μＬの体積下で播種し、２４時間付着させた。２４時間後、完全培地を、休止培地（補充物および血清を含まないＥＧＭ２）で３時間取り換えた。この後、細胞を化合物ＡまたはＢＡＦ−３１２（１〜３０μＭ）で１８時間前処置した。次いで、さらに６時間、増殖因子を含まない培地中で細胞をＴＮＦ−α（３ｎｇ／ｍＬ）により処置した。培地を取り出し、細胞を洗浄し、ウェル当たり１００μＬのＲＬＣ２溶液（Ａｌｐｈｅｌｙｓ＃０１−ＲＬＣ２−ＲＴＵ３０）を用いて４℃で２０分間固定した。固定された細胞を１００μＬのＨＢＳＳで２回洗浄した後、抗体抗ＩＣＡＭ−１（＃ＢＢＡ３、Ｒ＆Ｄシステム（R&D System））、抗ＶＣＡＭ−１（＃ＢＢＡ５、Ｒ＆Ｄシステム（R&D System））、および抗Ｐ／Ｅ−セレクチン（＃ＢＢＡ１、Ｒ＆Ｄシステム（R&D system））を１時間加えた。十分に洗浄した後、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（＃ＮＡ９３１、アマシャム（Amersham））を２時間加えた。洗浄およびＨＲＰ基質（ＯＰＤ、シグマ（Sigma）＃Ｐ９１８７）の添加後、光学濃度を４５０ｎｍで読み取った（エンビジョン（Envision））。結果を、ＴＮＦ−α−誘導接着分子発現のパーセント阻害として表した。
【００７５】
ｊ）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）および内皮細胞のインピーダンス測定アッセイ
１．ＣＨＯ細胞
Ｓ１Ｐ１における化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドのＥＣ５０活性を決定するためＣＥＲＥＰからのインピーダンスアッセイを用いた。
【００７６】
２．内皮細胞
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の両方におけるＳ１Ｐ１受容体脱感作をモニターするため、化合物Ａ、ＢＡＦ−３１２、フィンゴリモド、ＳＥＷ２８７１およびＳ１Ｐ（陽性対照として用いた）について、電気インピーダンス（X-celligence system）の変化によって検出される形状変化におけるそれらの効果を、濃度依存的に試験した。１日目に、コラーゲン−Ｉでプレコートされた９６ウェルｅプレートに一次細胞をウェル当たり２０，０００細胞で播種した。２４時間の付着および増殖後、Ｓ１Ｐ（１μＭ）、化合物Ａ（ＨＤＭＥＣに関して１μＭ；ＨＵＶＥＣに関して０．１、１、１０μＭ）、ＢＡＦ−３１２（ＨＵＶＥＣ中のみ１、１０、１００ｎＭ）、フィンゴリモド（ＨＤＭＥＣに関して１００ｎＭ；ＨＵＶＥＣに関して１、１０、１００ｎＭ）またはＳＥＷ２８７１（ＨＵＶＥＣ中のみ０．１、１、１０μＭ）のいずれかによりＨＤＭＥＣおよびＨＵＶＥＣに１回目の刺激を１時間与えた。Ｓ１ＰＲアゴニストと共にインキュベーション後、細胞を培地で注意深く２回洗浄し、その後、５．５時間の回復期間とした。次いで、Ｓ１Ｐ濃度を高めた２回目の刺激（０．１、１および１０μＭ）を用い、生成したインピーダンスを測定して、受容体脱感作における上記の１回目の刺激の効果を評価した。すべての測定は、少なくとも３通り行った。すべての第１の刺激濃度は、ＨＤＭＥＣにおいて＞ＥＣ９０であった。結果を平均＋／−標準誤差として任意のインピーダンス単位で表す。
【００７７】
５．インビボ薬理学
ａ）腎虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害のラットモデル
腎虚血の１時間前に、雄フィッシャーラット（ｎ＝３〜９、２５０〜３００ｇ）（チャールスリバー研究所（Charles River Laboratory）、フランス）に０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａまたは３、１０および３０ｍｇ／ｋｇのＢＡＦ−３１２または２ｍＬ／ｋｇの投与体積内でビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）の経口投与を行った。第２セットの実験では、潜在的タキフィラキシーを評価するため、化合物Ａを１日２回５日間投与した。簡潔には、動物をシャム手術（すなわち開腹術、腎動脈隔離）またはペントバルビタール（腹腔内５０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で２５分の両側腎動脈閉塞にかけた。手術手順を標準化し、個体間のばらつきを制限するため、体温（３７℃〜３８℃）および水分補給（生理学的血清の腹膜注射）を注意深くモニターした。虚血期間の終了後、クランプを除去して腎臓を再灌流させ、筋肉および皮膚を縫合するプラン（plan）の前に再灌流の質を制御した（再灌流の不十分な動物は、直ちに排除した）。２４時間後、血液および腎臓を集めた。血液を遠心分離し（３０００ｇ、１０分）、生化学的分析器（Ｐ４００、堀場製作所（Horiba）、フランス）を用いたクレアチニン評価のためヘパリン添加血漿を凍結した。一方の腎臓を、組織アルブミン（抗アルブミン、サンタクルス（Santa Cruz））および組織ＨＳＰ７０（サンタクルス＃ＳＣ３２２３９からのモノクローナル抗ＨＳＰ７０抗体）評価のためのウエスタンブロット分析のために凍結し、そして二つ目のものを、５μｍ厚切片の組織学的分析（古典的なヘマトキシリン−エリスロシン−サフラン（Saffran）を用いる急性尿細管壊死定量、変法マッソントリクロームおよび過ヨウ素酸−シッフ関連のブルーアルシン）および免疫組織化学分析（アクリス（Acris）＃ＢＭ４０００からのモノクローナル抗ＣＤ６８抗体によるマクロファージ染色、およびベンタナ（Ventana）ロボット、ＶＭＳ社を用いる、サンタクルス＃ＳＣ１５０６からのモノクローナルａｎｔ−ＰＥＣＡＭ抗体による毛細血管染色）のために固定し（１０％中性緩衝ホルマリン）、パラフィン包埋した。急性尿細管壊死は、腎皮質髄様部の１２〜１５領域（field）で細胞壊死を示した尿細管のパーセンテージとして表す。ＣＤ６８およびＰＥＣＡＭ免疫標識を、切片全体における陽性画素数（アペリオ（Aperio）アルゴリズム）のパーセンテージとして表す。血漿クレアチニンを平均＋／−平均誤差として表す。
【００７８】
ｂ）横紋筋融解誘導腎障害
スイス雄（ＣＤ１）マウス（ｎ＝５〜１５、１３〜１４週齢）（チャールスリバー研究所（Charles River Laboratory）、フランス）のマウスモデルにグリセロール注射の１時間前に、０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａまたは１０ｍＬ／ｋｇの投与体積内のビヒクル物品（水中の０．６％メチルセルロース−０．５％ツイーン８０）の経口投与を行った。グリセロール（ＰＢＳ中５０％ｖ／ｖ）またはビヒクル物品（ＰＢＳ）の筋肉内投与を、ペントバルビタール（３３ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下、８ｍＬ／ｋｇで後肢（脚当たり２回の注射、腓腹筋および大腿直筋）に実施した。２４時間後、血液を採取し、遠心分離し（３０００ｇ、１０分）、生化学的分析器（Ｐ４００、堀場製作所（Horiba）、フランス）を用いたクレアチニン評価のためヘパリン添加血漿を凍結した。結果を平均＋／−標準誤差として表す。
【００７９】
結果
本発明による化合物、すなわち化合物Ａは、ＡＫＩ状況におけるその活性、およびＳ１Ｐ１機能性アンタゴニストを超えるその差異を立証するためのさまざまなインビトロおよびインビボでの実験の対象であった。
【００８０】
１−心血管機能安全性
化合物Ａは、機能的拮抗作用がないＳ１Ｐ１アゴニストであるが、潜在的標的に基づく懸念は、Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニストと類似しているはずである。これまでの最大の臨床経験は、混合型Ｓ１Ｐ１／３／４／５化合物、フィンゴリモドにより得られており、これは房室ブロックおよび徐脈を誘導する（Schmouder et al., 2006, J Clin Pharmacol 46: 895-904）。これらの心毒性所見にＳ１Ｐ３が関与するというかなりの前臨床的証拠があり、したがって、当該分野では、これらの制限を克服するために、選択的Ｓ１Ｐ１化合物の同定へと移っている。しかし、臨床段階に入っている選択的Ｓ１Ｐ１化合物も、また、徐脈を誘導するようであるが（Gergely et al., 2012, BJP 167: 1035-1047）、しかし、房室ブロックにおけるそれらの効果は、現在知られていない。したがって、通常の研究に加えて、化合物Ａの潜在的心毒性を評価するために多くの研究が実施された。ｈＥＲＧアッセイでは、化合物ＡのＩＣ５０は、＞３０μＭであった。ウサギプルキンエ線維アッセイでは、試験した０．３μＭから１０μＭまでの化合物Ａについて、活動電位の短縮が２６μＭで認められたにもかかわらず、有意な効果はなかった。
【００８１】
イヌ遠隔測定研究では、経口３０または１００ｍｇ／ｋｇおよび静脈内１０または３０ｍｇ／ｋｇ（３０分にわたる注入）で、心拍数もしくは房室ブロックまたは他のいずれのＥＣＧパラメータにおける効果も認められなかった。両用量では、血圧における有意な変化がなかった。
【００８２】
２−インビトロでの腎臓薬理学
患者の心臓手術後に生じる腎障害を模倣するため、腎虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害のラットモデルを用いた。このモデルにおいて、化合物Ａは、ＡＫＩの重症度を著しく低減しており（８５〜９０％）、これは血清クレアチニン（臨床的に検証されたバイオマーカー）の上昇を限定することによって反映されている（図１Ａは、５つの独立した研究の代表例である）。その効果は用量依存的であり、経口１および３ｍｇ／ｋｇで統計的に有意であった（図１Ａ）。組織学的の分析は、化合物Ａがアルブミン血管外遊出（図１Ｃ）を予防し、かつ毛細血管を保護することによって血管系における直接効果を有することを示した。また、化合物Ａは、腎近位尿細管を壊死から保護し、マクロファージ浸潤を低減し、腎ＨＳＰ７０タンパク質（腎虚血障害後の修復に関連するマーカー）を増加させた。同様の活性が単回投与と比較して１日２回５日間の反復投与後に保持されていたので、化合物Ａはタキフィラキシーの徴候を示さなかった（図１Ｄ）。
【００８３】
横紋筋融解は、患者のＡＫＩのもう一つの重大な原因であり、グリセロールの筋肉内投与によってマウスで再現される。グリセロールは、ミオグロビンの放出およびその後の腎機能障害により進行性筋障害を誘導する。Ｉ／Ｒモデルで認められるように、化合物Ａは、このモデルにおいて著しく（経口１０ｍｇ／ｋｇで約８５％）かつ用量依存的に腎機能の悪化を予防した（ｎ＝３  独立した研究）（図２）。
【００８４】
腎虚血再灌流モデルにおいて、化合物Ａの効果を、Ｓ１Ｐ１選択的機能性アンタゴニスト、ＢＡＦ−３１２と比較した。ＢＡＦ−３１２は、インビトロアッセイ（内皮アッセイを含む−表１参照）のほとんどのＳ１Ｐ１において少なくとも１０倍もより強力であり、ラットにおいて化合物Ａと同様の血漿／腎臓曝露を有する。しかし、ＢＡＦ−３１２の改善された効力／曝露性にもかかわらず、経口で最大３０ｍｇ／ｋｇまでの用量でさえ虚血再灌流モデルの血清クレアチニンにおいて４０％を超える低下を示すことに失敗した（図１Ｂ）。
【００８５】
３−リンパ球減少活性における差異
Ｓ１Ｐは、Ｓ１Ｐ１活性化を通してリンパ節から血液へのリンパ球の放出に関与している。このＳ１Ｐ１活性化は、受容体内部移行、続いて細胞表面に戻る受容体のリサイクリングを引き起こし、再活性化を可能にする。しかし、Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニスト（フィンゴリモド、ＢＡＦ−３１２）は、内部移行したＳ１Ｐ１の分解を引き起こし、それによって細胞表面Ｓ１Ｐ１の劇的かつ持続性の低下が生じる。その結果、Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニストは、前臨床的におよび臨床的に認められるように、血液リンパ球における大きなかつ持続性の降下を示す（Mandala et al., 2002, Science 296: 346-349；Gergely et al., 2012, BJP 167: 1035-1047）。
【００８６】
予想通り、ＢＡＦ−３１２は、ラットにおける著明な（約８０％）かつ持続性のリンパ球減少を誘導した（図３Ａ、３Ｂ）。これは、経口１ｍｇ／ｋｇの低い用量（試験した最少用量）でさえ明白であった。ラットＡＫＩモデルにおいて部分的に有効であった２つの用量は、より高い用量（経口１０および３０ｍｇ／ｋｇ、図１Ｂ）であり、高リンパ球減少用量を表している。対照的に、経口１および３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａは、ラットにおける１日２回５日間の反復投与（経口３ｍｇ／ｋｇ）の後でさえリンパ球減少を示さなかった（図３Ｃ）。より高い用量の化合物Ａは用量依存的なリンパ球減少を示したが、しかし、これらは十分なＡＫＩ保護に必要な用量よりも高くなっている。
【００８７】
同様に、グリセロール−誘導横紋筋融解モデル（図２）において活性であった用量、３および１０ｍｇ／ｋｇ（図４）で、マウスにおいて、化合物Ａのリンパ球減少活性は認められなかった。
【００８８】
化合物Ａは、経口３ｍｇ／ｋｇでイヌにおいて非リンパ球減少性であった（図５Ａ）。イヌにおけるこの非リンパ球減少用量は、すでにラットにおける十分なＡＫＩ保護に必要である曝露（３ｍｇ／ｋｇ）（表４）を超える曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣ）をもたらす。イヌにおける経口１０および３０ｍｇ／ｋｇのより高い用量で、化合物Ａは、一過性のリンパ球減少を誘導した（図５Ａ）。対照的に、ＢＡＦ−３１２は、経口３ｍｇ／ｋｇでリンパ球の著明な（Ｉｍａｘ約８０％）減少を誘導し、それは回復するのに少なくとも６０日かかった（図５Ｂ）。
【００８９】
化合物Ａは、非リンパ球減少用量で初めて強いＡＫＩ保護を示す（図３Ｄ）ため、独特のＳ１Ｐ１アゴニストである。他のＳ１Ｐ１化合物、例えばフィンゴリモドおよびＳＥＷ２８７１も、ＡＫＩモデルにおいて活性であるが、それらの効果は、リンパ球減少用量で起こる（Awad et al., 2006, Am J Physiol Renal Physiol 290: F1516-F1524; Sanna et
al., 2004, JBC 279: 13839-13848; Lai et al., 2007, Kidney Int 71: 1223-1231）。
【００９０】
これらのインビボデータは、化合物Ａは、非リンパ球減少用量でＡＫＩ保護を誘導するＳ１Ｐ１アゴニストとして作用することを支持している。化合物Ａは、本明細書に記載されたように、ＢＡＦ−３１２だけでなく、例えば自己免疫疾患に対するリンパ球減少剤となるように特別に設計された他のＳ１Ｐ１機能性アンタゴニストと著しく異なる。
【００９１】
４−内皮障壁完全性における差異
Ｓ１Ｐ１機能性拮抗作用は、内皮損傷効果と関連している。黄斑および肺浮腫は、フィンゴリモドで処置された多発性硬化症患者における顕著な有害事象である（Jain and Bhatti, 2012, 78: 672-680）。
【００９２】
本発明者らは、健康なマウスにおけるフィンゴリモドの長期経口投与が有意な血管漏出を生じうることを見いだし（図６Ａ、６Ｂ）、臨床的な所見と合致している。選択的Ｓ１Ｐ１アゴニスト、ＢＡＦ−３１２は、１日２回１および３ｍｇ／ｋｇで肺中にいっそう大きな血管漏出を誘導した（図６Ａ、６Ｂ）。これらの所見は、Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニストが内皮障壁完全性を変え、肺中の血管性タンパク質血管外遊出を促進したことを示す以前の報告と一致する（Shea et al., 2010, Am J Respir Cell Mol Biol 43: 662-673）。対照的に、化合物Ａは、（３および１０ｍｇ／ｋｇ（マウスで十分なＡＫＩ保護効果をもたらす用量を表す）で血管漏出の増加を示さなかった（図６Ａ、６Ｂ）。同様に、フィッシャーラットにおいて、化合物Ａは、１および３ｍｇ／ｋｇ（ＡＫＩ有効量を表す）またはより高い単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）ですら肺血管漏出を誘導しなかった。対照的に、ＢＡＦ−３１２は、ラットにおいて３ｍｇ／ｋｇ（有効でないＡＫＩ用量）および３０ｍｇ／ｋｇ（部分的に有効なＡＫＩ用量）の両方で血管漏出を誘導した。
【００９３】
ＢＡＦ−３１２の認められた内皮損傷性（図６）があるとすれば、ＢＡＦ−３１２の保護性は、その内皮有害効果によって打ち消された可能性があり、その結果、認められた部分的な保護効果を生じる（図１Ｂ）。内皮障害は、複数のＳ１Ｐ１機能性アンタゴニストの注目すべき特徴である（図６および公開されたデータ）。したがって、化合物Ａの新規なプロファイルは、損傷を与えるよりも内皮保護となる用量で急性腎障害から保護する好機を提供する。
【００９４】
５−インビトロ薬理学
化合物Ａは、強力なＳ１Ｐ１アゴニストであることが示された。ヒトＳ１Ｐ１を過剰発現するＣＨＯ細胞（Ｇ−融合）において、ＥＣ５０は、カルシウム動員アッセイでは３１ｎＭ、β−アレスチンアッセイでは６５６ｎＭ、ＧＴＰγＳアッセイでは２０６ｎＭ、そして内部移行アッセイでは２１３ｎＭであった（表１）。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
化合物Ａは、機能的拮抗性を示さず、受容体脱感作も誘導しなかった（図７〜１０）。この差異は、４つの独立したインビトロシステム、内皮細胞ＨＤＭＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）におけるインピーダンス測定を用いる２つのシステム、ならびにＣＨＯ細胞およびＨＳＣ細胞（肝星細胞）におけるＦｌｉｐＲアッセイを用いる２つのシステムで示された。化合物Ａによるプレインキュベーション（その後に洗浄ステップが続く）は、Ｓ１Ｐ（図７〜９）または化合物Ａ（図１０）によるほぼ完全な２回目の刺激が可能であった。しかし、機能性アンタゴニストによるプレインキュベーションは、Ｓ１Ｐ（図７〜９）またはＢＡＦ−３１２（図１０）による十分な２回目の刺激を防いだ。ＨＵＶＥＣインピーダンスアッセイでは、各化合物がＳ１Ｐ１−誘導インピーダンス反応の脱感作を開始する濃度を、アッセイにおけるその絶対ＥＣ５０と比較した。ＢＡＦ−３１２は５×ＥＣ５０で、ＳＥＷ２８７１は２０×ＥＣ５０で脱感作を開始したのに対して、化合物Ａに関しては最大６０×ＥＣ５０まで脱感作が認められなかった。
【００９７】
図７〜１０のデータは、機能性アンタゴニスト（フィンゴリモド、ＢＡＦ−３１２、ＳＥＷ２８７１およびポネシモド）が持続性の受容体脱感作を誘導したことを示す。
【００９８】
化合物Ａは、ＢＡＦ−３１２またはフィンゴリモドと比較してＳ１Ｐ１シグナル伝達経路において異なる相対効力（表１）を示した。タンパク質に関するアッセイ条件が試験間で異なっていたので、本発明者らは、同じ培地条件を用いるｃＡＭＰ、ベータアレスチンおよび内部移行に関するＣＨＯアッセイにおける効力を比較することによって相対効力におけるタンパク質結合の可能な影響を排除した。表２に示すように、化合物Ａ（ＢＡＦ−３１２およびＳ１Ｐとの関連）では、内部移行またはβ−アレスチンと比較してｃＡＭＰのその活性化においてより偏っている。
【００９９】
【表３】
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【０１００】
化合物Ａは、基礎条件下、ＥＣ５０約３μＭで、またはツニカマイシン損傷（ＥＣ５０約１０μＭ）後、ヒト腎尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）中の生存マーカー、ｐＥＲＫおよびｐＡＫｔを濃度依存的に誘導した。これらの生存促進効果は、血清飢餓後のヒト内皮細胞においてより強力であり、Ｐ−Ａｋｔにおいて１０１ｎＭ、およびＰ−ＥＲＫ１／２において１９０ｎＭのＥＣ５０であった。さらに化合物Ａは、ＥＣ５０約３〜１０μＭでカスパーゼ３／７活性によって評価されたＲＰＴＥＣにおけるツニカマイシン−誘導アポトーシスを阻害した。
【０１０１】
化合物Ａは、ＢＡＦ−３１２と異なり、３つのヒト内皮細胞タイプ（ＨＰＡＥＣ、ＨＵＶＥＣおよびＨＲＧＥＣ）における、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＶＣＡＭ−ＩおよびＰ／Ｅセレクチンを含む、接着分子のＴＮＦ−誘導過剰発現を低減した。これらの内皮機能不全マーカーは、ＡＫＩ患者の血漿サンプルにおいて上方制御され（Sadik et al., 2012, Mol Cell Biochem 359:73-81）、尿細管−間質間隙中への炎症細胞の浸潤過程に関与していることが知られている。
【０１０２】
化合物Ａは、Ｓ１ＰＲファミリーの他の受容体（表３）において、ＣＥＲＥＰパネルの１１０を超える標的において、２１６を超えるキナーゼにおいて、そしてイオンチャネルパネルの５つを超える標的において魅力的な選択性プロファイルを有した。表３に示すように、化合物Ａは、フィンゴリモドと比較してより選択的なＳ１Ｐ１アゴニストである。Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３における活性の欠如は、これらの受容体が内皮細胞においてＳ１Ｐ１の機能に対抗することが報告されているため特に重要である。
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
化合物Ａ（例えばｃＡＭＰ）によるいくつかのシグナル伝達経路の選択的な活性化は、他のもの（例えば内部移行、β−アレスチン）におけるより弱い効力を有しながら、ＡＫＩに関する所望のプロファイル（すなわち最小限の受容体脱感作、持続性リンパ球減少なし、内皮保護）を提供する。これは、多発性硬化症においてＳ１Ｐ１機能性アンタゴニストＢＡＦ−３１２およびフィンゴリモドに望まれるものと対照的である（高い受容体脱感作、強力なリンパ球減少−内皮損傷は望ましくない副作用である）。このプロファイルにより、化合物Ａは、新規な種類の偏りのあるＳ１Ｐ１アゴニストとして定義される。
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
結論
これらの前臨床データは、内皮障壁機能の顕著な維持、ならびに尿細管壊死およびマクロファージ炎症の軽減を含むＡＫＩの複数の機構的エンドポイントにおける化合物Ａの重大な影響を示している。化合物ＡのすべてのＡＫＩ保護用量（マウスおよびラットの両方における）は、非リンパ球減少性であり、対応する曝露をイヌで達成したときにも、化合物Ａはなお非リンパ球減少性であった。化合物ＡがすべてのＡＫＩ保護用量で非リンパ球減少性であったため、ＡＫＩ保護のその機構はリンパ球減少と関係がない。化合物Ａは、内皮および上皮細胞における直接保護効果を示し、それはおそらくＡＫＩの作用機序である。
【０１０７】
これは、異なるシグナル伝達プロファイルを有する既存のＳ１Ｐ１化合物と対照的であり、ｉ）Ｓ１Ｐ１機能性アンタゴニストであり、ｉｉ）内皮損傷性でありかつｉｉｉ）リンパ球減少性である用量でＩ／Ｒ誘導ＡＫＩにおける限定された活性しか示さない。
【０１０８】
化合物Ａは、リンパ球減少を誘導することなく、そのため、対応する副作用（感染を含む）が回避される、ＡＫＩ患者を処置する新規な好機を提供する。その結果、この化合物は、現在、患者に使用できる薬物がない分野において斬新な療法となる可能性がある。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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