(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ流体バイオセンサシステム（２００）であって、入力用の側方開口部（２１０）が間に画成される底部基材（１２０）および上部基材（１１０）と、少なくとも１つの機能化された領域（２３１）を含むナノスリット（２３０）と、出力用の側方開口部（２２０）または内部リザーバ（２２１）とを含み、該ナノ流体バイオセンサシステム（２００）が、生体分子（３２０）を含む溶液が入力用の側方開口部（２１０）に入り、続いて前記ナノスリット（２３０）、および前記出力用の側方開口部（２２０）または内部リザーバ（２２１）を通過するように適用され；該ナノ流体バイオセンサシステム（２００）が、前記ナノスリット（２３０）とバイオセンサの外部環境との間に配置された気体排出サブシステム（１５０〜１５５）をさらに含み；該気体排出サブシステムが、液体によって完全に充填されるよう適合された複数の横断貫通する孔（１５１、１５３、１５４、１５５）を含む前記ナノ流体バイオセンサシステム。
【請求項２】
前記ナノスリット（２３０）と前記気体排出サブシステム（１５０〜１５５）との間に配置された液体駆動サブシステム（１４０）をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項３】
前記気体排出サブシステム（１５０〜１５５）は、前記基材（１１０、１２０）の一方または両方の中に含まれる、請求項１または２に記載のバイオセンサシステム。
【請求項４】
基材（１１０、１２０）は、ケイ素、ガラス、ブラスチックおよび酸化物化合物からなる群から選択される材料で作られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ（２００）。
【請求項５】
側方開口部（２１０、２２０）は、１００ｎｍ２から１００ｍｍ２の面積を有し、ナノスリット（２３０）は、２ｎｍから１０００ｎｍの間の高さ、２ｎｍから２０ｍｍの間の幅、および２ｎｍから２０ｍｍの間の長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ（２００）。
【請求項６】
ナノ流体システムから気体を排出する方法であって：
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのバイオセンサ（２００）；
ｂ）光学システム（５００）；
ｃ）生体分子（３２０）に取り付けられた蛍光体を定量することによる、前記ナノスリット（２３０）内部のバイオマーカ（３１０）に固定された特異的な生体分子（３２０）の検出
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの側方開口部（ｌａｔｅｒａｌ  ａｐｅｒｔｕｒｅ）を備えたナノ流体バイオセンサ（ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）に関する。この種のバイオセンサは、有利には生物医学および生物学の試料の正確で迅速な定量化に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
ナノ流体バイオセンサは、ナノメートルサイズの拘束部（ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）および／または側方開口部を備えた流体システムとして規定される。用途は、溶液中の生体分子の存在の定量化を含む。現在のナノ流体バイオセンサの開発の大半は、生体工学および生命工学の用途向けである。本発明の範囲において、バイオセンサは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断の用途について溶液中の生体分子の存在を定量するために用いられる。
【０００３】
特許文献１は、生体分子の相互作用の検出のための側方開口部を備えたバイオセンサを開示し、特許文献２は、単純な光学システムを用いたその使用を開示し、特許文献３は、培養時間を短縮し、前述のバイオセンサの感度を高める方法を開示している。これらの構成における生体分子の拡散は遅く、安定した測定条件に達するまでの長い待ち時間、または生体分子の相互作用の観察のための高濃度の溶液を必要とする。
【０００４】
生物学的マーカとも呼ばれるバイオマーカ（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）は、生体分子の存在を検出するための特異的なインジケータとして使用される物質である。生物学的過程、発病過程（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、または治療的介入に対する薬理学的応答のインジケータとして客観的に測定および評価される特徴がある。
【０００５】
特異的な生体分子の検出に関する現在の手法は、（ａ）標識化技術（ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、および（ｂ）無標識技術（ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）の２種類に分けることができる。
【０００６】
標識化技術の中で広く用いられているのは、蛍光発光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、比色定量（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）、放射活性（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、燐光（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）および化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）である。機能化された（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）磁気ビーズも標識化技術と考えられる。標識化技術の利点は、無標識の方法と比べた感度および特異的な標識化による分子認識である。
【０００７】
無標識技術の中で広く用いられているのは、電流測定センサ（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）、容量センサ、伝導度センサまたはインピーダンスセンサ（ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ）を指す電気化学的バイオセンサであり、迅速かつ安価であるという利点を有する。それらは、生体分子が電極上もしくは電極の近くに捕捉または固定されるようになったときの電極構造の電気特性の変化を測定するが、こうした概念はすべて、分子の特異的な対比、感度および信頼性を欠いている。
【０００８】
酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）は、主に血清中の可溶性生体分子の存在を検出するために用いられる重要な生化学的技術であり、したがって、医学における診断ツール、および様々な産業における品質管理チェックに広く用いられている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ分析は高価であり、大量の溶液を必要とし、時間がかかる。
【０００９】
生体分子の診断用の他の重要な技術は、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）およびノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）、タンパク質の電気泳動、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。しかしながら、これらの方法では、高濃度の分析物が必要であり、高スループットの試料試験ができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】スイス特許出願ＣＨ０１８２４／０９
【特許文献２】ＰＣＴ出願ＩＢ２０１０／０５０８６７
【特許文献３】ＰＣＴ出願ＩＢ２０１２／０５０５２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の一目的は、複雑な操作が不要である、迅速なナノ流体バイオセンサのばらつき（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を改善することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、分析のために溶液によって充填する間、バイオセンサの内部に捕捉される可能性がある気体の排出を可能にする、横断貫通する経路（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｇａｌｌｅｒｙ）を作成することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、溶液に対しより大きいボリュームをバイオセンサの入口（ナノスリット（ｎａｎｏｓｌｉｔ））を通して流すことによって検出の感度を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、充填の前部が完全に均一ではない場合、ナノ流体バイオセンサ内に複数の気泡が現れる可能性があるという発見に基づく。捕捉された空気を排出するために、空気がバイオセンサから出ることを可能にする気体排出サブシステムが考案されている。
【００１５】
本発明はまた、気泡の除去がバイオセンサ間のばらつきならびに感度を大きく改善するという発見に基づく。
【００１６】
本発明によるこの気体排出サブシステムは、多孔性材料で作ることができる。
【００１７】
さらに本発明は、気体排出サブシステムを画成するために、バイオセンサの基材の一方または両方を局所的に構造化することの可能性を強調する。
【００１８】
本文書において、用語「気体排出サブシステム」は、意図される目的に用いることができる任意のシステムと理解しなければならない。たとえば、それは、細孔、横断貫通する孔またはスリットで作ることができる。
【００１９】
本発明の範囲ではナノ流体が使用されるが、その理由は表面と体積の比率が高いためであり、これは、検出ボリューム中に含まれる表面によって、生体分子と表面上の固定されたバイオマーカとの間の相互作用の確率が最大になることを意味する。それはまた、検出ボリューム内にある基材の割合が小さいため、溶液のバックグラウンド信号を大きく低減する。
【００２０】
したがって、本発明は、特許請求の範囲に規定されるバイオセンサに関する。
【００２１】
本発明はまた、前記バイオセンサを使用する組立体および方法に関する。
【００２２】
以下の部分では、本発明のいくつかの非限定的な例を示す。そうした例のいくつかについて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１ａ】底部基材１２０、スペーサ層１３０、および構造化されたまたは構造化されていない横断する細孔を含む上部基材１１０、ならびに側方開口部２１０からなるナノ流体バイオセンサシステムの斜視図である。蛍光標識された生体分子を含む溶液３００が、ピペットシステム４００によって、側方開口部２１０からバイオセンサの内部に入るように配置される。測定には通常、レーザビーム５１０に基づく光学システム５００が用いられる。
【図１ｂ】底部基材１２０、スペーサ層１３０、および構造化されたまたは構造化されていない横断する細孔を規定の位置１５０に含む上部基材１１１、ならびに側方開口部２１０からなるナノ流体バイオセンサシステムの斜視図である。蛍光標識された生体分子を含む溶液３００が、ピペットシステム４００によって、側方開口部２１０からバイオセンサの内部に入るように配置される。測定には通常、レーザビーム５１０に基づく光学システム５００が用いられる。
【図２ａ】ナノ流体バイオセンサを構成する基材１１１の上面視断面図（ｔｏｐ  ｖｉｅｗ  ｃｒｏｓｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ）である。入力用の側方開口部２１０、ナノスリット２３０および出力用の開口部２２０が、流体システムを構成する。ナノスリットの内部に測定領域が画成される。システムがその平衡に達すると、溶液が、入力用の側方開口部３０１、ナノスリット３０２および出力用の側方開口部３０３に見られるようになる。液体駆動用の構成要素によって動かされた溶液の流れの前部（ｆｌｏｗ  ｆｒｏｎｔ）が完全に均一ではない場合、気泡３５０が形成される可能性がある。
【図２ｂ】ナノ流体バイオセンサを構成する基材１１１の上面視断面図である。入力用の側方開口部２１０、ナノスリット２３０および出力用の開口部２２０が、流体システムを構成する。測定領域がナノスリット２３０の内部に画成され、基材を横断貫通する細孔１５０が、出力用の側方開口部２２０の内部に直接画成される。出力用の側方開口部２２０の内部には、液体駆動用の構成要素も存在する。システムがその平衡に達すると、溶液が、入力用の側方開口部３０１、バイオセンサの入口（ナノスリット）３０２および出力用の側方開口部３０３に見られるようになる。細孔システム１５０を通して気体が排出されるため、気泡は存在しない。
【図３ａ】２つの基材１１０および１２０によって画成され、ナノスリット２３０によって互いに連結された入力用の側方開口部２１０および出力用の側方開口部２２０により構成されるナノ流体バイオセンサの横断面図である。出力用の側方開口部２２０は、液体駆動システム１４０を含むことができる。基材１１０は、全体的に横断貫通する細孔を伴う多孔性である。
【図３ｂ】２つの基材１１１および１２０によって画成され、ナノスリット２３０によって互いに連結された入力用の側方開口部２１０および出力用の側方開口部２２０により構成されるナノ流体バイオセンサの横断面図である。出力用の側方開口部２２０は、液体駆動システム１４０を含むことができる。基材１１１は、局所的に横断貫通する細孔１５０を伴う多孔性であるように構造化することができる。
【図３ｃ】２つの基材１１１および１２０によって画成され、ナノスリット２３０によって互いに連結された入力用の側方開口部２１０および内部リザーバ２２１により構成されるナノ流体バイオセンサの横断面図である。内部リザーバ２２１は、液体駆動システム１４０を含むことができる。基材１１１は、局所的に横断貫通する細孔１５０伴う多孔性であるように構造化することができる。
【図３ｄ】２つの基材１１１および１２０によって画成され、ナノスリット２３０によって互いに連結された入力用の側方開口部２１０および出力用の側方開口部２２０により構成されるナノ流体バイオセンサの横断面図である。出力用の側方開口部２２０は、液体駆動システム１４０を含むことができる。基材１１１は、局所的に横断貫通する孔またはスリット１５１を伴って構造化することができる。
【図３ｅ】２つの基材１１２および１２１によって画成され、ナノスリット２３０によって互いに連結された入力用の側方開口部２１０および出力用の側方開口部２２０により構成されるナノ流体バイオセンサの横断面図である。出力用の側方開口部２２０は、液体駆動システム１４０を含むことができる。基材１２１は、局所的に横断貫通する細孔１５０を伴う多孔性であるように構造化することができる。
【図４】２つの基材１１１および１２０によって画成され、ナノスリット２３０によって互いに連結された入力用の側方開口部２１０および出力用の側方開口部２２０により構成されるナノ流体バイオセンサの横断面図である。基材の一方のみが、バイオマーカ３１０によって機能化された領域２３１、およびそうした機能化を妨げる他の領域２０３によって局所的に構造化される。生体分子を含む試薬の溶液３００が、入力用の側方開口部２１０からナノスリット２３０に入り、出力用の側方開口部２２０へ向かい、内部駆動用の構成要素１４０によって動かされる。出力用の側方開口部２２０に達すると、検出予定の分子３２０および他の分子３３０を含む溶液３００が、構造化された横断貫通する細孔１５２を充填する。図は、完全に充填された細孔１５３、充填されつつある細孔１５４、および充填予定の細孔１５５を示している。レーザビームが、検出ボリューム５２０内の固定された生体分子３４０の濃度をモニターする。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書において使用するとき、用語「生体分子」は、たとえば（それだけに限らないが）抗体またはサイトカインなどのタンパク質、ペプチド、核酸、脂質分子、多糖およびウィルスを含む総称的な用語であることが意図される。
【００２５】
本明細書において使用するとき、用語「ナノスリット」は、少なくとも１つのナノメートルサイズの寸法を有する、明確な微細加工された構造体を意味する総称的な用語であることが意図される。スリットの中に入らなければならず、かつ同程度の大きさである最小の検出予定の生体分子のサイズによって、ナノスリットのナノメートルサイズの寸法は、２ｎｍより大きくなるように規定される。通常は同程度の大きさである光学システムの検出ボリュームの範囲によって、本発明は、数ミクロン未満の高さを有するナノスリットに限定される。
【００２６】
本明細書において使用するとき、用語「側方開口部」は、たとえば（それだけに限らないが）入力および出力用のチャネルを含む総称的な用語であることが意図される。
【００２７】
本明細書において使用するとき、用語「内部リザーバ」は、たとえば（それだけに限らないが）側方開口部への直接的な経路を有してはいないが、気体排出システムと接触する空間を含む総称的な用語であることが意図される。
【００２８】
本発明は、生体分子の濃度測定についてバイオセンサ間のばらつきが小さいことを保証する気体排出システムによって、出力用の側方開口部２２０または内部リザーバ２２１の充填を高めることを目的とする。図１ａおよび図１ｂに示すように、スペーサ１３０と共に挟まれた基材１１０または１１１および基材１２０からなり、入力用の側方開口部２１０を有するナノ流体バイオセンサが、光学ユニット５００より上に固定される。ナノ流体バイオセンサの充填中に気体の排出を可能にするために、基材１１０は多孔性とし、基材１１１は局所的に構造化された横断貫通する細孔を有することができる。基材は、例えば、ケイ素、ガラス、ブラスチックおよび酸化物化合物からなる群から選択される材料で作られる。対象の生体分子を含む混合溶液３００が、ピペットシステム４００によって入力用の側方開口部２１０に配置される。最後に、光学ユニット５００を用い、バイオセンサのナノスリット内にレーザビーム５１０を集中させることによって、バイオセンサ２００内の生体分子の相互作用を測定する。
【００２９】
図２ａおよび図２ｂは、互いにナノスリット２３０によって連結された入力用の側方開口部２１０および出力用の側方開口部２２０を含む基材１１１からなる、半分のナノ流体バイオセンサの上面図を示している。図２ａでは、出力用の側方開口部２２０は気体排出システムを用いずに設計されているが、図２ｂでは、出力用の側方開口部２２０は気体排出システム１５０を用いて構成され、気体排出システム１５０は、横断貫通する細孔または孔を得るために、局所的なドライまたはウェット化学エッチング法を用いて実現することができる。生体分子を含む溶液が入力用の側方開口部２１０に配置されると、溶液は、最初に入力用の側方開口部３０１を充填し、ナノスリット３０２を充填し、最後に出力用の側方開口部３０３を充填する。優れた液体駆動システム１４０にもかかわらず、出力用の側方開口部２２０の充填は、めったに均一にならない。通常、溶液は開口部２２０の境界に均一に到達することができるが、表面張力の釣り合いによって停止した後、気体を出力用の側方開口部２２０内に封じ込める可能性がある。これにより、気体が側方開口部２１０または２２０によって排出されなくなるため、気泡３５０が現れる可能性がある。図２ｂに示すように、気体は横断貫通する細孔１５０を通ってシステムから排出され、気泡の出現が避けられ、出力用の側方開口部の完全な充填が保証され、したがって、バイオセンサ間のばらつきが確実に小さくなる。
【００３０】
図３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄおよび３ｅは、本発明による側方開口部および気体排出システムを備えたナノ流体バイオセンサの様々な構成を示している。横断面図として示されるシステムは、入力用の側方開口部２１０を出力用の側方開口部２２０または内部リザーバ２２１と連結するナノスリット２３０からなる。側方開口部は、例えば、１００ｎｍ2から１００ｍｍ2の面積を有し、ナノスリットは、例えば、２ｎｍから１０００ｎｍの間の高さ、２ｎｍから２０ｍｍの間の幅、および２ｎｍから２０ｍｍの間の長さを有する。駆動用の構成要素１４０が、出力用の側方開口部２２０の隣または内部に構成される。図３ａでは、バイオセンサは、横断貫通する経路を伴う完全な多孔性である基材１１０からなる。図３ｂは、基材１１１が多孔性の横断貫通する経路１５０を伴って局所的に構造化される別法を示している。図３ｃは、溶液がシステムを充填するとき、基材１１１内に局所的に構造化された多孔領域１５０を通って気体が排出されるため、出力用の側方開口部がない場合を示している。図３ｄは、基材１１１がナノメートル、マイクロメートルまたは
ミリメートルの寸法を有する横断貫通する孔１５１によって局所的に構造化される場合を示している。最後に図３ｅは、気体排出システム１５０を、他の基材１２１、または基材１１２と１２１の両方に構成することが可能であることを示している。
【００３１】
図４は、本発明による側方開口部および気体排出システムを備えたバイオセンサの検出の原理、ならびに断面を示している。横断面図として示されるシステムは、入力用の側方開口部２１０を出力用の側方開口部２２０と連結するナノスリット２３０からなる。液体駆動用の構成要素１４０が、出力用の側方開口部２２０の隣または内部に配置される。出力用の側方開口部２２０には、気体排出システム１５２も存在する。最初に、基材１１１および１２０の一方または両方の選択的に機能化されたナノスリットの表面に、バイオマーカ３１０が固定される。非特異的になることを防止するために、他のナノスリットの表面および側方開口部の表面を、機能化されていない層２０３を付着させることによって保護することができる。蛍光標識された特異的な生体分子３２０および非特異的な生体分子３３０を含む溶液３００が入力用の側方開口部に配置されると、溶液３００は、ナノスリット２３０を通り、入力用の側方開口部２１０から出力用の側方開口部２２０までシステムを充填する。溶液３００は、ナノスリット２３０の充填後、液体駆動用の構成要素１４０に達すると、出力用の側方開口部２２０を充填する。特異的な生体分子３２０は、ナノスリット２３０を通って流れるとき、ブラウン運動によって、ナノスリット２３０の内部に固定されたバイオマーカ３１０と相互作用し、分子錯体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）３４０を形成する。非特異的な生体分子３３０もナノスリット２３０を通って流れるが、固定されたバイオマーカ３１０と分子錯体を形成せず、引き続き、出力用の側方開口部２２０に入る。溶液３００が気体排出システム１５２と接触すると、液体は横断貫通する細孔１５５の中に入るが、細孔を完全に充填する（１５３）までには、過渡的な充填状態１５４を伴う。最後に、平衡状態に達した後、固定された蛍光発光する錯体３４０、および光学的な検出ボリューム全体に拡散する、拡散し蛍光発光する生体分子３３０が、レーザビーム５１０によって励起され、両方が光学システムによって検出される。
【００３２】
本発明によれば、デバイスは、他の固定された生体分子と相互作用するまたは相互作用しない生体分子の検出、計数、同定および特徴付けについて、ばらつきおよび感度に大きい改善をもたらす。本発明の用途は、生物医学的分析、生物学的分析または食品分析、ならびに分析化学および生物分析化学における基礎研究にわたることが可能である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４】
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