(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試薬流体を有する反応チャンバにおいて化学反応を光学的に制御するための装置であって、
基板の第一の面上に少なくとも一つの分子を結合するための当該基板であって、当該第一の面は前記反応チャンバの壁である、基板と、
光化学切断反応を光学的に誘導するために前記基板へ切断光を向けるように構成される光学構成と、
前記反応チャンバの両端を接続するチャネルを有する循環構成であって、前記チャネルを通して前記試薬流体を前記反応チャンバ内で循環させるための循環構成を有し、前記基板がワイヤグリッドとして構成される、装置。
【請求項２】
前記試薬流体が前記基板の第一の面に沿って循環される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記循環構成が、前記試薬流体を能動的にポンプするためのポンプ素子及び／又は前記試薬流体を冷却するための冷却素子を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記循環構成が少なくとも一つの空気圧駆動アクチュエータを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記循環構成が前記試薬流体の循環を前記切断光の照射と同期させるように構成される、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記化学反応が核酸シークエンシングを決定する反復段階反応を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光学構成が、前記基板の第一の面上に結合した分子に組み込まれた第一のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起するために少なくとも第一の励起波長λＥＸ１の励起光を前記基板へ向けるように構成され、
前記光学構成がさらに、前記結合した分子に組み込まれた第一のヌクレオチドの蛍光ラベルによって発せられる蛍光を受信及び検出するように構成される、
請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記切断光、好適にはＵＶ光が、前記組み込まれた第一のヌクレオチドからブロッキング部分と前記蛍光ラベルを切断する光化学切断反応を前記組み込まれた第一のヌクレオチドにおいて光学的に誘導する切断波長λＣＬを持つ、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記基板が前記励起光を閉じ込めるように構成され、前記基板の第一の面において前記励起光のエバネセント波をもたらすように構成され、及び／又は、
前記基板が前記切断光を閉じ込めるように構成され、前記基板の第一の面において前記切断光のエバネセント波をもたらすように構成される、
請求項１又は７に記載の装置。
【請求項１０】
前記基板の第一の面に結合した分子と、
複数のヌクレオチド及び酵素を伴う溶液と
をさらに有し、
前記ヌクレオチドがそれぞれブロッキング部分を有し、
前記ブロッキング部分は、各ヌクレオチドが前記第一の面に結合した分子に組み込まれるときに前記酵素の合成活性をブロックするように構成される、
請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
試薬流体を有する反応チャンバにおいて化学反応を光学的に制御するための方法であって、
基板を設けるステップであって、当該基板の第一の面上に分子が結合し、当該第一の面は前記反応チャンバの壁である、ステップと、
光学構成によって、切断波長λＣＬの切断光、好適にはＵＶ光で前記基板を照射し、それにより光化学切断反応を光学的に誘導するステップと、
前記反応チャンバの両端を接続するチャネルを通して前記試薬流体を前記反応チャンバ内で循環させるステップと
を有する方法。
【請求項１２】
前記基板の第一の面に沿って前記反応チャンバにおいて前記試薬流体を循環させるステップ、並びに／或いは、前記試薬流体の能動的ポンプ及び／又は冷却ステップをさらに有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬流体の循環が前記切断光の照射と同期される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記切断光の強度が０．１ｍＷ／ｃｍ２よりも大きい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
光学構成によって、少なくとも第一の励起波長λＥＸ１の励起光で前記基板を照射し、それにより前記基板上に結合した分子に組み込まれる第一のヌクレオチドの蛍光ラベルを光学的に励起するステップと、
前記基板によって前記励起光を閉じ込め、それにより前記基板の第一の面において前記基板により前記励起光のエバネセント波をもたらすステップと、
前記光学構成によって、前記組み込まれた第一のヌクレオチドの励起された蛍光ラベルの蛍光を受信及び検出するステップと、
前記切断光で前記基板を照射し、それにより前記組み込まれた第一のヌクレオチドにおいて光化学切断反応を光学的に誘導するステップと、
前記基板によって前記切断波長λＣＬの切断光を閉じ込め、それにより前記基板の第一の面において前記基板によって前記切断光のエバネセント波をもたらすステップと
をさらに有する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試薬流体を有する反応チャンバにおいて化学反応を光学的に制御するための装置と方法に関する。特に、本発明は核酸のシーケンスを決定する反復段階反応を光学的に制御するための装置、及び核酸のシーケンスを決定する反復段階反応を光学的に制御するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
引用により本文に組み込まれるＷＯ２０１３／１０５０２５Ａ１は、ワイヤグリッド基板の面に付着した分子への蛍光標識核酸の反復組み込みを光学的に制御するための装置と方法を記載する。エバネセント波による励起光及び切断光の強力な光閉じ込めに基づき、面を洗うことなくシークエンシング反応が読み出されることができる。光学的に切断可能なブロッキング部分を持つヌクレオチドを用いることによって段階的シークエンシングが実現される。読み出し後、組み込みヌクレオチドは同じ基板を通る切断光によってデブロッキングされる。これは結合ヌクレオチドのみがアンブロッキングされることを保証する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
スループットが増大した、光学的に制御される化学反応、特に核酸シークエンシング反応を可能にする手順を持つことが有利であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この懸念は請求項１に記載の装置及び請求項１１に記載の方法によって対処される。好適な実施形態は従属請求項に開示される。
【０００５】
第一の態様によれば、本発明の一実施形態は試薬流体を有する反応チャンバにおいて化学反応を光学的に制御するための装置に関する。装置は以下の構成要素を有する：
‐基板の第一の面上に少なくとも一つの分子を結合するための基板。当該第一の面は反応チャンバの壁（境界）である。基板は特にワイヤグリッドであり得る。
‐光化学切断反応を光学的に誘導するために基板へ光を向けるように構成される光学構成。その効果のために、この光は以下"切断光"とよばれる。
‐反応チャンバにおいて試薬流体を循環させるための循環構成。
【０００６】
"反応チャンバ"は典型的には開いたキャビティ、閉じたキャビティ、若しくは流体接続チャネルによって他のキャビティに接続されるキャビティである。
【０００７】
第二の態様によれば、本発明の一実施形態は試薬流体を有する反応チャンバにおいて化学反応を光学的に制御するための方法に関し、当該方法は以下のステップを有する：
‐分子が基板の第一の面上に結合した基板を設けるステップ。当該第一の面は反応チャンバの壁である。
‐光学構成によって、切断波長λＣＬの切断光、好適にはＵＶ光で基板を照射し、それにより光化学切断反応を光学的に誘導するステップ。
‐反応チャンバにおいて、好適には基板の第一の面に沿って、試薬流体を循環させるステップ。
【０００８】
方法に関する本発明の全実施形態は記載のステップの順序で実行され得るが、それでもなおこれは方法のステップの唯一かつ必須の順序である必要はないことが留意されるものとする。方法ステップの全ての異なる順序及び組み合わせが本明細書で記載される。
【０００９】
記載の装置及び方法は同じ基本的アイデアに、すなわち切断光で照射される反応面に沿った試薬流体の循環に基づく。従って装置について記載される説明と実施形態は方法についても類似して有効であり、逆もまた同様である。
【００１０】
装置と方法は（光）化学反応が基板の面において高スループットで起こることを可能にする。これは面に沿った試薬流体の循環が、切断光の照射によって生成される熱が運び去られることを保証するためである。従って高強度の切断光が面における材料を損傷することなく適用されることができ、これはより高い反応速度を可能にする。
【００１１】
以下、（装置及び方法の一方についてのみ説明される場合であっても）装置とだけでなく方法との組み合わせの両方において実現され得る、様々な好適な実施形態がより詳細に記載される。実施形態の異なる組み合わせから相乗効果が生じ得るが、それらは詳細に記載されない可能性がある。
【００１２】
反応チャンバにおける試薬流体の循環は好適には（過剰な）熱が第一の面から除去されるようになされる。これは例えば第一の面にすぐ接している及び／又は近いボリュームにおける試薬流体が循環によって交換される（動かされる）場合に実現され得る。特に、循環の少なくとも一部は基板の第一の面に沿って配向され得る。しかしながら、例えば流体フローが第一の面に垂直である、及び／又は第一の面から離れる、循環の他のパターンも可能である。
【００１３】
試薬流体の循環は受動的に起こり、例えば重力、対流、及び／又は毛細管力によって駆動され得る。好適な実施形態において、試薬流体は能動的にポンプされる。これは特に循環構成にポンプ素子を設けることによって実現され得る。従って試薬循環のタイミング及び／又は強度がユーザによって及び／又は自動コントローラによって制御及び調節され得る。ポンプは例えば、反応面における温度が常に所与の閾値未満に維持されるように（例えば試薬流体の）検出温度に基づくフィードバックループにおいて制御され得る。
【００１４】
別の実施形態において、試薬流体は冷却され得る。循環構成は例えばこの目的で冷却素子を有し得る。冷却は例えば熱交換面に沿って試薬流体をガイドすることによって実現され得、これを通して過剰な熱が冷却媒体（例えば周辺空気）に伝達され得る。付加的に若しくは代替的に、試薬流体を能動的に冷却するための手段、例えばペルチェ素子が設けられてもよい。
【００１５】
循環構成は好適には少なくとも一つの空気圧駆動アクチュエータ、例えば空気圧駆動ポンプを有し得る。これは空気圧作動（マイクロ）流体デバイスとの装置の容易な統合を可能にする。
【００１６】
別の実施形態において、試薬流体の循環は切断光の照射と同期され得る。この文脈において、"同期"という語は一方では循環、他方では照射の任意の協調されたタイミングをあらわすものとする。具体的な場合において、循環は切断光の照射と同時に（オプションとしていくらかの時間シフト及び／又は時間的遅延を伴って）起こり得る。
【００１７】
試薬流体の循環が基板の面におけるボリュームの過熱を防止することは既に述べた。従って、比較的高強度の切断光が適用されることができる。好適な実施形態において、切断光の強度は約０．１ｍＷ／ｃｍ２よりも大きく、約０．５ｍＷ／ｃｍ２よりも大きく、約１ｍＷ／ｃｍ２よりも大きく、若しくは約５ｍＷ／ｃｍ２よりも大きい。
【００１８】
以下、本発明のさらなる実施形態が説明され、それについて追加情報がＷＯ２０１３／１０５０２５Ａ１に見られ得る。
【００１９】
本発明の文脈において、"ブロッキング部分"という語は、酵素が合成処理を実行する分子にブロッキング部分が組み込まれる場合に酵素の合成活性をブロックする部分と理解される。ブロッキング部分は例えばブロッキング分子であり得る。
【００２０】
本発明の文脈において、"切断可能"という語は波長λＣＬの切断光を吸収することによって切断されることを可能にすることと理解されるべきである。
【００２１】
本発明の文脈において、本明細書に開示の光学構成の全実施形態は、偏光励起光と偏光切断光を発するように構成され得ることが理解されるべきである。従って、偏光子若しくは既に偏光された光源が使用され得る。詳細は後ほど記載される。
【００２２】
さらに、本発明の文脈における"励起光"という語は、それぞれ波長λＥＸ１、λＥＸ２、λＥＸ３、及びλＥＸ４に適用される。
【００２３】
本発明の一実施形態例によれば、核酸シーケンスを光学的に制御するための上記類の装置が提示される。特に、装置は合成により核酸のシーケンスを決定する反復段階反応を光学的に制御するように構成される。代替的に、合成によるシークエンシングの代わりに、ライゲーションによる合成も本発明の範囲内と理解される。提示される装置は基板の第一の面上に少なくとも一つの分子を結合するための基板を有する。装置は、基板の第一の面上に結合される分子に組み込まれる第一のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起するために基板へ少なくとも第一の励起波長λＥＸ１の励起光を向けるように構成される光学構成をさらに有する。光学構成は結合分子に組み込まれる第一のヌクレオチドの蛍光ラベルによって発せられる蛍光を受信及び検出するようにさらに構成される。さらに、光学構成は、ブロッキング部分と蛍光ラベルを第一の組み込まれたヌクレオチドから切断するために第一の組み込まれたヌクレオチドにおいて光化学切断反応を光学的に誘導するよう、切断波長λＣＬの切断光、好適にはＵＶ光を基板へ向けるように構成される。さらに、基板は励起光を閉じ込めるように構成され、従って基板の第一の面において励起光のエバネセント波をもたらすように構成される。さらに、基板は励起光、好適にはＵＶ光を閉じ込めるように構成され、さらに基板の第一の面において切断光のエバネセント波をもたらすように構成される。装置はアンサンブルベースの容易な読み出しを可能にするが、もはや洗浄ステップは必要なくなるか若しくはその回数が削減され、これは全読み取りのために単一の試薬充填を意味する。
【００２４】
段階的シークエンシングは光学的に切断可能なブロッキング基を持つヌクレオチドを用いることによって実現される。読み出し後、組み込みヌクレオチドは同じナノフォトニック基板を通る例えばＵＶ放射のような切断光によってアンブロッキングされる。これは結合ヌクレオチドのみがアンブロッキングされることを保証する。
【００２５】
以下詳細に説明される通り、光学構成は基板の第一の面上に結合した分子に組み込まれる第一のヌクレオチドの蛍光ラベルを励起するために、第一、第二、第三及び第四の励起波長λＥＸ１、λＥＸ２、λＥＸ３、及びλＥＸ４の励起光を基板へ向けるようにも構成され得る。それによって、例えばアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）若しくはウラシル（Ｕ）及びシトシン（Ｃ）のような、例えば四つの異なるヌクレオチドが、各ヌクレオチドが特異的な差別化された蛍光ラベルを使用するとき、区別され得ることが保証され得る。しかしながら、必要であれば、上記四つの励起波長λＥＸ１、λＥＸ２、λＥＸ３、及びλＥＸ４のうち二つ若しくは三つのみが、分子を、すなわち結合分子に組み込まれるヌクレオチドの蛍光ラベルを励起するために装置によって基板の方へ向けられてもよい。上記ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴ若しくはＵに対する四つの異なる蛍光ラベルが使用される四色システムについての詳細は、以下図１及び２に関してより詳細に以下説明される。結合分子は核酸フラグメントであり得、そのヌクレオチドのシーケンスが本発明によって決定される核酸と理解されることができ、これはＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは任意の他の核酸であり得る。
【００２６】
さらに、シークエンシング若しくはＤＮＡシークエンシングの当業者は、例えばヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴ若しくはＵに対して使用される四つの蛍光ラベルと組み合わせて波長λＥＸ１、λＥＸ２、λＥＸ３、及びλＥＸ４が選ばれるという事実を知っている。言い換えれば、使用される蛍光ラベルが各励起光によって光学的に励起され得るように波長が選ばれる。さらに、波長λＣＬは使用されるヌクレオチドの所望の切断反応が上記切断光を照射することによって光学的に生じ得るように選ばれる。
【００２７】
基板の第一の面において結合される分子は例えばＤＮＡフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは別の核酸であり得ることが留意されるべきである。さらに、本明細書で後述される、酵素も基板の第一の面に結合され得る。本発明の文脈において、"結合"という語は要素が基板の第一の面に固定化される状態と理解されるものとする。
【００２８】
加えて、基板は蛍光を検出することによって受信される光学信号を増すために、同一分子のクローンでカバーされ得るスポットを提供する。従って、基板はシークエンシングのスループットが増大されるように各々異なるクローンを伴うこうしたスポットのアレイとして設けられ得る。
【００２９】
切断光のエバネセント波及び励起光のエバネセント波はワイヤグリッドを設けることによって提示された装置の基板によって生成されることができる。これはフォトオプティカル反応が面に非常に近い非常に限られたエリア内で高速で起こるように高強度の集束ビームを用いることを可能にし得る。光学構成は蛍光の励起及び検出、すなわち読み出しのための各光学素子と、アンブロッキング、すなわち活性化のための各光学素子を単一の光学構成ユニットにおいて有し得るか、又は物理的に区別される素子に含まれてもよい。
【００３０】
さらに、各励起光源が光学構成によって含まれ得る。さらに、切断光を発するための光源が光学構成によって含まれ得る。切断、すなわちアンブロッキング、及び読み出し、すなわち蛍光の励起と検出のための照射は、オプションとして同じレンズを通じて起こり得る。しかしながら、必要であれば、アンブロッキングと読み出しのための二つの異なる光学セットアップも提示され得る。
【００３１】
さらに基板はポリマー、例えばポリ‐（シクロ‐）オレフィン、ポリカーボネート、ポリエステル若しくはＰＭＭＡから作られ得る。金属及び半導体も使用され得る。
【００３２】
本発明の別の実施形態例によれば、装置は基板の第一の面に結合される分子をさらに有する。装置は複数のヌクレオチドと酵素を伴う溶液（"試薬流体"）をさらに有する。その中で、ヌクレオチドはそれぞれブロッキング部分を有する。ブロッキング部分は、各部分が装置の第一の面に結合される分子に組み込まれるときに酵素の合成活性をブロックするように構成される。
【００３３】
必要であれば、ブロッキング部分は蛍光ラベルを有する。しかしながら、ブロッキング部分と蛍光ラベルは異なる位置において第一のヌクレオチドにおいて組み込まれるか若しくは位置付けられ得る。それらは単一の切断プロセスにおいて若しくは異なる切断プロセスにおいて切断され得る。これは本発明の全実施形態に当てはまる。
【００３４】
実施形態例として、ブロッキング部分は、"Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ"ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｌ．Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１（２０１０）３１‐４６に記載及び定義の通り３'‐ブロックリバーシブルターミネーター若しくは３'‐アンブロックリバーシブルターミネーターとして具体化され得る。その中で、"アンブロック"ともよばれる上記ブロッキング部分３'‐アンブロックリバーシブルターミネーターは酵素の活性をブロックするものとして使用され得る。リバーシブルターミネーターは組み込み後に任意の後続ヌクレオチドの組み込みを停止するヌクレオチド／リボース単位に付着したリガンドと理解され得る。それらは化学若しくは光化学的手段による切断時にこのプロセスが元に戻されることができ、ポリメラーゼが次のヌクレオチドを組み込むことができるとき、可逆的である。さらに、Ｍｅｔｚｋｅｒらの３'‐ブロックリバーシブルターミネーターは例えばそれらを光切断可能にするために化学的に修飾され得る。そして、切断光での光切断が本発明の手段によって実行され得る。加えて、後述される通り他の複合体が各酵素と組み合わせてブロッキング部分として使用され得る。当業者は酵素とブロッキング部分のどの組み合わせが酵素の合成活性をブロックする所望の効果につながるかを知っている。
【００３５】
別の実施形態例によれば、基板は励起光及び切断光のためのワイヤグリッドとして構成される。
【００３６】
ワイヤグリッドは例えばガラス基板上に金属ワイヤのパターンを有し得る。ワイヤ間の間隔はメタルクラッドスラブ型導波路として機能し、その中で主要な寄与は二つの基本モードとなる。例えば、本発明の基板のワイヤ上に入射するＴＥ偏光励起光の場合、ワイヤ間に結果として生じるモードは例示的にλ＝６３０ナノメートルについて１６．８ナノメートルの減衰長を持つエバネセントモードである。その中で基板のワイヤが水の屈折率ｎ＝１．３３を持つ媒体で充填されると仮定する。ＴＭ偏光の場合、ワイヤグリッドについて結果として得られるモードはこの実施例では１．２μｍの減衰長を持つ伝搬モードとよばれる。例えば、ワイヤ高さは一実施例において６０ナノメートルであり得る。その中でＴＭ偏光モードは１０％若しくはそれ以下のオーダーの光の損失を伴って透過されるが、ＴＥ偏光モードはエバネセントに減衰している。
【００３７】
ワイヤグリッドを理解する異なる方法は、ワイヤに平行な偏光（ＴＥ偏光）で励起光を反射し、ワイヤに直交する偏光（ＴＭ偏光）を透過する金属として例えばアルミニウムワイヤを考えることである。ＴＭ偏光の最大透過は９５％よりも高くなり得る。入射ＴＥ励起光の場合のエバネセント場はＷＯ２０１３／１０５０２５Ａ１の図３ａ及び３ｂの両方に描かれる。本発明の光学構成によって照射される励起光と切断光は本発明のこの、及び他の全実施形態においてこのような偏光であり得る。
【００３８】
提示される装置のワイヤグリッド基板の使用は極度の光閉じ込めを提供する。次のヌクレオチドの組み込みの継続を防止するヌクレオチド上のいわゆるブロッキング部分をデカップリングするために使用される、高速光化学切断と組み合わせて、示された利点が実現される。ワイヤグリッドの使用は入射時の角度から大きく独立しているという追加の利点を持つ。従って、これは残りの部分は暗いままにしながら局所的に高強度を実現するために集束ビームと組み合わせて使用されることができる。言い換えれば、ワイヤグリッドはエバネセント場における面に非常に近い分子、例えばＤＮＡフラグメントのみを励起し、それらにのみ感受性であることを可能にし、従ってエバネセント場の外側のいかなるラベルヌクレオチドの検出若しくはそれらに対する影響も生じない。例えば、エバンセント場は基板の第一の面から約２０ナノメートル延在し得る。これは励起光と切断光の両方に当てはまり得る。
【００３９】
ワイヤグリッド基板は第一の面の反対の第二の面を有し、光学構成は励起光と切断光で基板の第二の面を照射するように構成される。言い換えれば、基板は光学構成において切断光と励起光が基板の第二の面の方へ直接向けられるように相互に対して位置付けられる。これは基板の逆放射とみなされ得る。前面、第一の面上で、規則的ワイヤ構造がワイヤグリッドによって提示される。規則的金属ワイヤ間に、すなわちワイヤグリッド間の間隔において、分子、例えばＤＮＡフラグメントが結合若しくは固定化される。
【００４０】
本発明の文脈において"励起光"という語はそれぞれ波長λＥＸ１、λＥＸ２、λＥＸ３、及びλＥＸ４に適用される。結果として、四つの励起波長全てについて基板は各光のエバンセント波の閉じ込めと生成が生じることを保証する。必要であれば、より多くの若しくは少ない光源及び／又は蛍光ラベルが本発明から逸脱することなく使用されることができる。
【００４１】
本発明の別の実施形態例によれば、切断反応は照射された切断光の強度に依存する時間ｔ切断かかる。さらに、結合分子への第二のヌクレオチドの組み込みは時間ｔ組み込みかかる。本明細書で提示される装置はｔ切断＜ｔ組み込みとなるような強度で照射される切断光を提供するように構成され調節される光学構成を有する。
【００４２】
光切断は既に組み込まれて面に結合している分子においてのみ起こるべきである。バルク中の反応はアンブロッキングされた試薬につながり、これは気付かずに組み込まれる可能性があり、このようにしてシークエンシング結果にエラーを導入する。従って、酵素によるヌクレオチドの組み込みの速度と比較して切断反応を速くするように局所的に短期間だけ照射することが有益である。酵素とブロッキング部分の作用原理は既に上記されている。その開示は本明細書に記載の実施形態例の範囲内で適用される。提示される実施形態は次のヌクレオチドの組み込みを同期させることを可能にし、検出される蛍光信号が高信頼性であることを保証する。
【００４３】
切断光が基板に対してエバネセントモードであるという事実は、繰り返しの暴露が、溶液中の蛍光ラベルが脱色されてその機能を失うことにつながらないという利点を提供する。言い換えれば、提示される実施形態はこうした溶液中の蛍光ラベルの脱色と機能喪失を回避する。
【００４４】
複数の結合分子における複数のヌクレオチドの組み込みの改良された同期化のために、切断光でのアンブロッキングステップは可能な限り速く、すなわち可能な最高切断光強度で実行されるべきである。これは切断光、好適にはＵＶ光をレンズでフォーカスし、レンズ若しくは基板を動かすことによって面をスキャンすることによって実現され得る。アンブロッキングステップはシークエンシングステップの読み取り後に実行され得る。この読み取りはフォーカスビームをスキャンすること、又はフィールド照射でのステップアンドスキャンによって実行されることができる。全面に対して例えばＵＶ光の単一フラッシュとして切断光を具体化することも可能であり得る。シークエンシング反応のための塩基組み込みのための反応速度を考慮して、局所切断光照射時間は例えば１分未満であるべきである。
【００４５】
本発明の実施形態例は以下の図面に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施形態例にかかる第一の装置を概略的に示す。
【図２】本発明の実施形態例にかかる第二の装置を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
図１は化学反応、この場合特に合成によって核酸のシーケンスを決定する反復段階反応を光学的に制御するための装置１００を描く。装置は基板の第一の面１０３上に少なくとも一つの分子１０２を結合するための基板１０１を有する。基板１０１の第一の面若しくは前面１０３上に結合する分子１０２は例えばＤＮＡのフラグメントであり得る。第一の面１０３は処理される流体（以下より詳細に記載される溶液１１４）が中に収容されることができる"反応チャンバ"１４９の壁若しくは境界を構成する。反応チャンバは典型的にはより詳細に示されないより大きな（マイクロ）流体デバイス若しくはカートリッジの一部である。
【００４８】
さらに、光学構成１０４が図１に示される。図１は光学構成が例えば第一の励起波長λＥＸ１の励起光１１０を基板へ向けるように構成されることを概略的に示す。さらに、四つの異なるヌクレオチドが参照符号１０９、１１６、１１７及び１１８で概略的に示され描かれる。例えば、第一のヌクレオチド１０９はチミンＴとして示される。ヌクレオチド１０９はブロッキング部分１１９を有する。さらに、ブロッキング部分１１９は第一の蛍光ラベル１０５を有する。同様に、第二のヌクレオチド１１６が図１に概略的に描かれ、そこからブロッキング部分１１９と第二の蛍光ラベル１０６が含まれることも推測され得る。第三のヌクレオチド１１７もブロッキング部分と第三の蛍光ラベル１０７を有する。付加的に、同様にブロッキング部分と第四の蛍光ラベル１０８を有する第四のヌクレオチド１１８が概略的に描かれる。しかしながら、サンプル１１４はもっと多くの複数のこうしたヌクレオチドを有してもよく、ヌクレオチド１０９、１１６、１１７及び１１８はここで象徴的描写として示されるに過ぎない。
【００４９】
さらに、図１は反応チャンバ１４９を満たす溶液１１４を示し、その中にヌクレオチドと酵素１１５が含まれる。図示の四つのヌクレオチドのうち一つが結合分子１０２に組み込まれる場合、提示される装置１００は以下の利点を提供する。光学構成は結合分子１０２に組み込まれる第一のヌクレオチドの蛍光ラベルによって発せられる蛍光を受信して検出するように構成される。
【００５０】
図１からさらに推測され得る通り、光学構成は基板へ切断波長λＣＬの切断光１１２を向けるように構成される。これは第一の組み込まれたヌクレオチドから各蛍光ラベルを切断するために第一の組み込まれたヌクレオチドにおいて光化学切断反応を光学的に誘導することを可能にする。さらに、基板１０１は基板の第一の面において励起光のエバネセント波が作られるように励起光を閉じ込めるように構成される。さらに、基板は基板の第一の面において切断光のエバネセント波が作られるように切断光も閉じ込めるように構成される。
【００５１】
図１の実施形態において、基板１０１は励起光１１０のため及び切断光１１２のためのワイヤグリッド１１３として構成される。従って、ワイヤグリッド１１３は例えば規則的金属ワイヤ構造のような規則的パターンを有する。図１から推測され得る通り、スリット状の開口が規則的パターンの間に設けられ、この開口の中で結合分子１０２は基板１０１の第一の面１０３において固定化される。
【００５２】
さらに、図１はコンピュータプログラム要素１２２が格納されるコンピュータ可読媒体１２１を有する処理ユニット１２０を描く。当該プログラム要素１２２は処理ユニット１２０に指示して、さらに装置１００に、合成によって核酸のシーケンスを決定する反復段階反応を光学的に制御するための上記及び下記の方法を実行するように指示するのに適している。図１の装置１００は結合分子１０２のヌクレオチドのシーケンスに対応するシーケンスとのヌクレオチド１０９、１１６、１１７、１１９の組み込みを段階的に及び光学的に誘導するように構成される。分子１０２がＤＮＡフラグメントである場合、サンプル１１４によって含まれるヌクレオチドは分子１０２のヌクレオチドシーケンスに対応するシーケンスにおいて分子１０２に組み込まれる。
【００５３】
装置はさらに、組み込まれたヌクレオチド各々の蛍光ラベルによって発せられる、受信され検出された反応蛍光に基づいて、組み込まれたヌクレオチドのシーケンスを決定するように構成される。従って、図１の提示される装置１００は第一に、励起光のエバネセント波の使用により結合分子１０２に組み込まれるヌクレオチドのみが励起光１１０によって読み出されることを保証する。第二に、図１の装置１００は結合ヌクレオチドのみが切断光によってアンブロッキングされることを保証し、これはまだ含まれていない、すなわち分子１０２によって組み込まれていないヌクレオチドの脱色及び機能喪失を回避する。結果として、検出される蛍光信号１００は光１１１として見られ、核酸のシーケンスの決定にとって高信頼性である。
【００５４】
結果として、図１の装置１００で実行される、例えばＤＮＡシークエンシングのような核酸シークエンシングのコストとスピードが両方とも改良される。洗浄ステップが必要ないのでより少ない試薬と酵素が必要になる。図１の装置はシークエンシングの単純化とコスト削減を示す。提示される図１の装置１００は、全読み取りのために単一の試薬充填を意味する、いかなる洗浄ステップも伴わないアセンブルベースの容易な読み出しを可能にすることによって新たな処理の組み合わせを可能にする。例示的なヌクレオチド１０９、１１６、１１７、１１８内で使用されるブロッキング部分は例えば光切断可能な３'‐アンブロックリバーシブルターミネーターであり得る。しかしながら、例えば立体障害を用いる他のブロッキング部分も所望の上記効果に達するために使用され得る。
【００５５】
さらに、光学構成１０４は図１に示す通り、切断反応時間ｔ切断が、第二のヌクレオチドを分子１０２に組み込むのにかかる時間よりも小さくなるような強度で照射される切断光を提供するように構成され得る。切断反応時間ｔ切断は照射される切断光の強度に依存するので、図１は切断光の強度に関して光学構成の構成と特異的ブロッキング部分を伴うヌクレオチドとの選択された組み合わせを提供し得る。言い換えれば、図１の装置の切断光の強度は使用されるヌクレオチドとブロッキング部分の組み合わせについて切断反応時間ｔ切断がｔ組み込みよりも小さくなるように適応される。
【００５６】
必要であれば、付加的に若しくは代替的に、装置１００の以下のセットアップがユーザに提供され得る。試薬流体が動かず、分子の動きが拡散によって駆動される場合、滞留は非組み込みヌクレオチドの切断光のスポットにおける平均滞留時間とみなされ得る。光学構成はさらにｔ切断がｔ滞留よりも小さくなるような強度で照射される切断光を提供するように構成され得る。結果として、望ましくない切断反応に起因する遊離した非結合ヌクレオチドの分解が起こらない。従って、ｔ切断がｔ滞留よりも小さくなるように装置を構成することによって、非組み込みヌクレオチドが切断によって影響を受ける確率が低減若しくは除外される。言い換えれば、バルク中の切断反応を回避するために、ワイヤグリッドのエバネセント場における分子の平均滞留時間は、適切な強度における切断のために必要な反応時間よりも小さいか若しくはかなり小さいべきである。２５ｎｍ若しくはそれ以下のオーダーのエバネセント場の深さと１ｅ−１０ｍ２／ｓのオーダーのヌクレオチドの拡散係数で、分子がエバネセント場の内外に拡散するためにかかる時間は（５ｅ−８ｍ）２／１ｅ−１０＝２５μｓと推定され得る。結合分子をアンブロッキングするために必要な照射時間に依存して、損傷の確率が導出され得る。０．１ｓの照射時間を仮定するとこれは１：４０００であり得、１０ｍｓの照射時間ではこれは１：４００などとなり得る。
【００５７】
同様に総損傷は試薬溶液の総体積に対するエバネセント場における体積分率に比例する。１００μｍのチャンバ高さで比率は１：４０００である。これはエバネセント場における全分子を損傷する最悪の場合において分子の０．０２５％のみが損傷されることを意味する。１００の読み取り長では最終的に溶液中の分子の２．５％が損傷され得るが（最悪の場合）、これはシークエンシングの観点から依然許容可能である。
【００５８】
上記考察は反応チャンバ１４９内の静止流体に有効である。しかしながら試薬流体が反応チャンバ内で循環される場合（以下より詳細に説明される）、分子の動きは拡散によってよりも能動的ポンプによって支配される。流体循環による冷却をもたらすために、励起ボリューム内の流体を繰り返し、例えば切断光の二つのパルスの開始間の間隔あたり１０から１００回の間で、交換することが望ましい。こうした状況下で、実現したい冷却効果と、あまりに多くの非結合ヌクレオチドを切断しないこととのバランスが考慮されなければならない（ＤＮＡに組み込まれた切断された非結合ヌクレオチドは、塩基を同定するフルオロフォアをもはや持たないので検出されることができないため）。特に、励起ボリューム中の液体の滞留時間はＵＶ切断時間よりも短いべきであり、さもなければ（ＵＶ切断中に）さらなる冷却が実現されない。
【００５９】
切断光によって励起されるボリュームが約１００ｎｍの直径と約２５ｎｍの高さを持つ円筒であると仮定される場合、約２×１０＾（−８）μｌすなわち０．０２ｐｌの非常に小容量となる（典型的に約１‐５ｍｌの溶液の総体積と比較して）。従って標識ヌクレオチドの濃度とリフレッシュ速度を考慮しなければならず、これは約２から１０回の間のボリューム交換、場合により約２から５回の間になり得る。そのため実際には全部で１０ｍｌの溶液に対する５×交換の場合、ＵＶブロッキング光で照射される体積とスポットあたりの総体積の間に１０＋１１の倍数がある。
【００６０】
以下、図１（及び図２）の装置を使用するための情報が提供される。改良された同期化のために、アンブロッキングステップは可能な限り速く、すなわち可能な最高強度で実行されるべきである。これはＵＶ光をレンズでフォーカスすること、及びレンズ若しくは基板を動かすことによって面をスキャンすることによって実現されることができる。アンブロッキングステップはシークエンシングステップの読み取り後に実行される。この読み取りは集束ビームをスキャンすること若しくはフィールド照射でのステップアンドスキャンによって実行されることができる。好適な実施形態において、読み取りスキャンはアンブロッキングスキャンに、単一アクチュエータにおいて、場合により光ビームをアラインすることによって単一レンズにおいても、両光ビームを統合することによって、結合され得る。代替的に、二つのレンズは単一ステージに統合され得るか、又は二つの個別のステージが同期して作動し得る。これはステップアンドスキャン読み取りアプローチにおいても実施されることができ、ここではリーダと同じフィールドを照射することによってＵＶステップもステップアンドスキャンモードで実行される。好適な実施形態は利用可能なＵＶ光源とそのパワーに依存する。十分なパワーが利用可能である、及び／又はシークエンシング面の面積が限られる場合、全面に対してＵＶの単一フラッシュも想定することができる。シークエンシング反応のための塩基組込のための反応速度を考慮して、局所ＵＶ照射時間は１分をはるかに下回るべきである。
【００６１】
ワイヤグリッドを用いる単一流体シークエンシングだけでなく、単一分子シークエンシングも上記されている。アプローチはいわゆる３'‐アンブロックリバーシブルターミネーターを使用し、そこではフルオロフォアが付着した次の標識ヌクレオチドがポリメラーゼによって組み込まれることができるよう、ヌクレオチドをデブロッキングするためにＵＶ光のフラッシュが必要である。組み込まれたヌクレオチドの色を読み出すことで、組み込まれた塩基が決定され、従ってシークエンシングがなされることが可能になる。
【００６２】
記載の手順では高強度ＵＶ光が必要である。典型的な強度値は約４ｍＷ／ｃｍ２から約１Ｗ／ｃｍ２に及ぶ。これはワイヤグリッド及び試薬を含むバッファにおいて加熱を生じ得る相当な量のエネルギーに対応する。
【００６３】
システム性能を改良し、ワイヤグリッド／局所液体及びさらにカートリッジの過熱を回避するために、試薬液体（ここではバッファ及び所要の酵素／ヌクレオチド）を、例えば空気圧作動カートリッジ設計の液体の空気圧駆動ポンプを用いることによってポンプすることによって、試薬液体を循環させることが提案される。これは冷却効果を生じ、局所過熱を回避するのに役立つ。
【００６４】
上述の提案は、反応チャンバ１４９の両端を接続するチャネル１５１として概略的に示される"循環構成"１５０によって図１の装置１００において実現される。図示の実施形態において、チャネル１５１はポンプ素子１５２を有し、それによってチャネル１５１内の流体が能動的に及び制御可能に（矢印で示される方向に）ポンプされることができる。これは試薬流体のフローが面１０３に沿った反応チャンバ１４９内の強制循環を誘導する。従って、過剰な熱、特に切断光によって生成される熱は過熱を回避するために面から運び去られながら、分子１０２はそれらが必要とする化学物質によって常に囲まれる。
【００６５】
上述の過剰な熱は典型的には試薬流体によってカートリッジの他の構成要素を通るその循環中に環境へ放出される。このプロセスを支援するために、ヒートシンクとして機能する冷却素子１５３が設けられ得る。これは例えば周囲の空気による冷却効果を可能にするために環境への密接な熱的接触を伴うエリア若しくは領域であり得る。付加的に若しくは代替的に、冷却素子１５３はペルチェ素子などの何らかの能動的冷却ユニットを有し得る。
【００６６】
好適な実施形態において、循環構成１５０による試薬流体の（能動的な、制御された）循環は面１０３における熱の生成と、特に切断光１１２の照射と同期され得る。能動的循環は例えばＵＶデブロッキングパルスの間隔に限られ得る。
【００６７】
従って、ＵＶ光を用いてデブロッキングしながらシステムの過熱を回避するために、試薬を含むバッファの循環と組み合わせてワイヤグリッドを用いてシークエンシングがなされる、シークエンシングシステムが提供される。
【００６８】
図２は合成により核酸のシーケンスを決定する反復段階反応を光学的に制御するように構成される装置１００を示す。図１と同様に、複数の分子１０２がその上に固定化される、すなわち結合されるワイヤグリッド基板１１３が示される。図２から見られる通り、規則的パターン２１４はスリット状開口２１５を提供し、その中で分子２０２が第一の面１０３上に結合される。基板は第一の方向２１３に沿って第一の面に分子を結合するための複数の隣接した結合位置２０９、２１０、２１１及び２１２を有する。当該結合位置は、生成される光学信号が増大され得るように、同一分子のクローンでカバーされ得るスポットとみなされ得る。そして基板１０１はそれぞれ異なるクローンを伴う、こうしたスポットの、すなわちこうした結合位置のアレイを提供する。これはスループットを向上させ得る。図１及び２の装置１００は両方とも、一つの液体のみで核酸シークエンシングを可能にし、それにより溶液液体が交換される洗浄ステップを設ける必要性を回避する。
【００６９】
さらに、光学構成１０４は五つの異なる光源２０１〜２０５を有する。光源２０１〜２０４は前記の通り四つの異なる励起波長λＥＸ１〜λＥＸ４を提供するための励起光源とみなされ得る。光源２０５は波長λＣＬで切断光を提供する。例えば、光源２０５はＵＶ光を発し得る。参照番号２０６は光学構成１０４が五つの波長λＥＸ１〜λＥＸ４及びλＣＬを切り替えることを可能にする切り替え装置を象徴的に描く。さらに、上記光源２０１〜２０５の少なくとも一つによって発せられる光は偏光フィルタ２００の方へ向けられる。さらに、光源２０１〜２０５の放射光を基板１０１の方へ伝達するダイクロイックミラー２０７が示される。蛍光ラベルが励起光（波長λＥＸ１〜λＥＸ４の少なくとも一つ）のエバネセント波によって励起された後、一つ若しくは複数の蛍光ラベルによって発せられる蛍光光子がダイクロイックミラー２０７の方へ向けられ、蛍光検出器２０８の方へ向けられる。図２から見られる通り、光学構成１０４は方向２１３に沿ってスキャンされ得る。結果として、図２の装置１００は基板１０１及び光学構成１０４を第一の方向２１３に沿って相互に対して動かすことによって光学スキャンを実行するように構成される。結果として、装置は、第一の方向２１３に沿った動きにおいて、各結合位置が第一に励起光で照射され、その後第二に切断波長の切断光で照射されるように、光学スキャンを実行することを可能にする。従って切断光を用いるアンブロッキングステップは、励起された組み込まれたヌクレオチドの蛍光を読み取った後に実行され得る。
【００７０】
図２は図１に関して上記した循環構成１５０をさらに示し、これは反応チャンバ１４９を通る、及び分子１０２、２０９、２１０、２１１、２１２との反応面に沿った、試薬流体の制御された循環を可能にする。試薬流体のフローは一般にワイヤグリッド１１３に対して任意の配向を持ち得ることが留意されるべきである。これは例えば図示の通り方向２１３に平行であるか、又は垂直であるか、又は手元の場合に便利である任意の他の配向を持ち得る。
【００７１】
さらなる詳細と他の例示的な装置及び方法は、引用により本文に全体が組み込まれるＷＯ２０１３／１０５０２５Ａ１に見られ得る。
【００７２】
本発明は図面と先の説明において詳細に図示され記載されているが、かかる図示と記載は例示若しくは説明であって限定ではないとみなされるものとする。本発明は開示の実施形態に限定されない。開示の実施形態への他の変更は、図面、開示及び添付の請求項の考察から、請求される発明を実施する上で当業者によって理解されもたらされることができる。請求項において、"有する"という語は他の要素若しくはステップを除外せず、不定冠詞"ａ"若しくは"ａｎ"は複数を除外しない。単一のプロセッサ若しくは他のユニットは請求項に列挙される複数の項目の機能を満たし得る。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されるという単なる事実は、これら手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示さない。コンピュータプログラムは、他のハードウェアと一緒に若しくはその一部として供給される光学記憶媒体若しくはソリッドステート媒体などの適切な媒体上に格納／分散され得るが、インターネット又は他の有線若しくは無線通信システムなどを介して他の形式で分散されてもよい。請求項における任意の参照符号は範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【図１】
0006502349.tif 000002
【図２】
0006502349.tif 000003