(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかのＦａｂ領域結合性ペプチド。
（１）  プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）において、第１３位の位置のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換されているアミノ酸配列を有し、
前記アミノ酸配列の第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が更に置換されていても良く、
且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が置換導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチドであって、
前記第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されており、
前記第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されており、
前記第３３位のアミノ酸残基がＰｈｅに置換されているＦａｂ領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１３位、第１９位、第３０位および第３３位を除く領域中で１個以上、５個以下のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；または
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１３位、並びに第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【請求項２】
上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置が、第２位、第１０位、第１５位、第１８位、第２１位、第２２位、第２３位、第２４位、第２５位、第２７位、第２８位、第３１位、第３２位、第３５位、第３６位、第３９位、第４０位、第４２位、第４５位、第４７位および第４８位から選択される１以上である請求項１に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項３】
上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１または２に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項４】
上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である請求項１〜３のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とするＦａｂ領域結合性ペプチド多量体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド、または請求項５に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
【請求項７】
Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項６に記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と、
アフィニティー分離マトリックスに結合したＦａｂ領域を含むタンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合能が極めて優れているＦａｂ領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いるＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達で重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と省略する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。【０００３】
抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、免疫グロブリンのＦａｂ断片からなる抗体医薬が複数上市された（非特許文献３）。【０００４】
抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム化の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティー分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。【０００５】
ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するタンパク質はすでに複数知られている（非特許文献４）。しかし、そのようなタンパク質をリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスが、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスと同様に、抗体医薬の精製のため標準的に産業利用されているという事実はない。【０００６】
例えば、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）は、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品もある（ＧＥヘルスケア社製，製品名「Protein-G Sepharose 4 Fast Flow」，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合するが、Ｆａｂ領域にも弱いながら結合することが分かっている（非特許文献４，５）。しかし、ＳｐＧのＦａｂ領域への結合力は弱いので、ＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品は、Ｆｃ領域を含まずＦａｂ領域のみを含む断片抗体の保持性能は低いと言える。そこで、ＳｐＧに変異を導入することでＦａｂ領域への結合力を向上する取組みもなされている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表昭６３−５０３０３２号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１８４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁
【非特許文献２】Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁
【非特許文献３】Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁
【非特許文献４】Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁
【非特許文献５】Derrick J．P．，Nature，1992，359巻，752-754頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来、抗体を吸着して精製するためのアフィニティーリガンドとしてはプロテインＡ（ＳｐＡ）が実用化されているが、ＳｐＡはＩｇＧのＦｃ領域にのみ特異的な親和性を示す。しかし近年、抗体の断片を医薬として利用する技術が開発されていることから、ＩｇＧのＦａｂ領域にも親和性を有するリガンドが求められている。Ｆｃ領域のみならずＦａｂ領域に親和性を示すタンパク質としてプロテインＧ（ＳｐＧ）が知られているが、Ｆｃ領域に比べてＦａｂ領域に対する親和性は低い。そこで、特許文献２に記載の発明のとおり、ＳｐＧに変異を導入してＦａｂ領域に対する親和性を高めることも検討されている。しかし、特許文献２に記載の変異型ＳｐＧに関して、Ｆａｂ領域に対する親和性が５倍以上高い変異型ＳｐＧは得られておらず、野生型ＳｐＧのＦａｂ領域に対する親和性が決して高いものではないため、例えばＦｃ領域を含まない抗体断片を精製するためのリガンドとして十分なものとは言えない。【００１０】
そこで本発明は、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合能が極めて優れているＦａｂ領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、および当該アフィニティー分離マトリックスを用いたＦａｂ領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、遺伝子工学的手法を用いて数多くのプロテインＧ変異体を得て、Ｆａｂ型断片抗体に対する結合力を比較検討することにより、当該結合力を高められる変異位置を特定することに成功して、本発明を完成した。【００１２】
本発明を以下に示す。【００１３】
［１］  下記（１）〜（３）の何れかのＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１４】
（１）  プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）において、第１３位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が置換導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；
（２）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１３位、第１９位、第３０位および第３３位を除く領域中で１個以上、２０個以下のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；または
（３）  上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１３位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。【００１５】
［２］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１３位の位置のアミノ酸残基が置換されている上記［１］に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１６】
［３］  第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換されている上記［２］に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１７】
［４］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１８】
［５］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている上記［１］〜［４］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００１９】
［６］  上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３３位のアミノ酸残基がＰｈｅに置換されている上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００２０】
［７］  上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置が、第２位、第１０位、第１５位、第１８位、第２１位、第２２位、第２３位、第２４位、第２５位、第２７位、第２８位、第３１位、第３２位、第３５位、第３６位、第３９位、第４０位、第４２位、第４５位、第４７位および第４８位から選択される１以上である上記［１］〜［６］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００２１】
［８］  上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］〜［６］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００２２】
［９］  上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である上記［１］〜［８］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド。【００２３】
［１０］  上記［１］〜［９］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とするＦａｂ領域結合性ペプチド多量体。【００２４】
［１１］  上記［１］〜［９］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチド、または上記［１０］に記載のＦａｂ領域結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。【００２５】
［１２］  Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［１１］に記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と、
アフィニティー分離マトリックスに結合したＦａｂ領域を含むタンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。【００２６】
［１３］  上記［１］〜［９］のいずれかに記載のＦａｂ領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。【００２７】
［１４］  上記［１３］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。【００２８】
［１５］  上記［１４］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して十分に高い親和性を示すので、通常の抗体のみならず、Ｆａｂ領域を有するがＦｃ領域を有さない抗体断片にも親和性を示す。よって、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを不溶性担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスにより、抗体断片医薬の効率的な精製も可能になる。このように、近年、低コストで製造できるなどの理由から抗体断片医薬の開発が盛んであり、本発明は、抗体断片医薬の実用化に寄与し得るものとして、産業上非常に有用である。【００３０】
より具体的には、本発明では、驚くべきことに、Ｆａｂ領域に対する親和性が１０倍程度高くなった変異型ＳｐＧが複数得られ、さらに驚くべきことに５０倍以上高くなった変異型ＳｐＧも得られた。このように、本発明は、Ｆｃ領域を含まない抗体断片を精製するためのリガンドとして、実用に耐え得る親和性の獲得に成功しただけでなく、様々なレベルの親和性を実現する多様な変異手法を示した。また、本発明で得られた変異型ＳｐＧは、解離速度定数が野生型に比べて有意に小さくなっており、１／２以下になった変異型ＳｐＧが複数得られ、驚くべきことに、１／１０になった変異体も得られた。リガンドの解離速度定数が向上すると、当該リガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスのＦａｂ領域を含むタンパク質の保持性能の向上が期待できる。それらの点で、本発明は、特許文献２に記載の発明よりも優れた効果を示していると言える。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、野生型ＳｐＧ−β１の発現プラスミドの作製方法を示す図である。
【図２】図２は、Ｗ：野生型ＳｐＧ−β１と、Ｖ：本発明で得られた変異型ＳｐＧ−β１の、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する結合反応曲線チャートである。
【図３】図３は、Ｗ：野生型ＳｐＧ−β１の二量体と、Ｖ：本発明で得られた変異型ＳｐＧ−β１の二量体の、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する結合反応曲線チャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）は、プロテインＧ（ＳｐＧ）のβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号１）において、第１３位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が置換導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチドである。
【００３３】
「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００３４】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク質分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域（断片）と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分（ドメイン）は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。ＳｐＧ−βのＩｇＧへの結合は、より詳細には、ＩｇＧのＣＨ１領域（ＣＨ１γ）とＣＬ領域への結合であり、特にＣＨ１への結合が主要である（非特許文献５）。
【００３５】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＦａｂ領域含有タンパク質は、Ｆａｂ領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧ分子であってもよいし、ＩｇＧ分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドが結合するＩｇＧ分子誘導体は、Ｆａｂ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、ＩｇＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、ヒトＩｇＧの一部のドメインを他生物種のＩｇＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型ＩｇＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えたＩｇＧ、薬剤を共有結合したＦａｂ断片などを挙げることができる。
【００３６】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合などによって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。
【００３７】
「プロテインＧ（ＳｐＧ）」は、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）の細胞壁に由来するタンパク質である。ＳｐＧは、ほとんどの哺乳類のＩｇＧと結合する能力を有しており、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、ＩｇＧのＦａｂ領域にも弱く結合する。
【００３８】
ＳｐＧのＩｇＧ結合性を示す機能ドメインは、βドメイン（ＳｐＧ−β）と呼ばれる。なお、β（Ｂ）ドメインと呼ぶ場合と、Ｃドメインと呼ぶ場合の２通りがあり（Akerstrom et al．，J．Biol．Chem．，1987，28，13388-，Fig．5参照）、本明細書では、Fahnestockらの定義に従ってβドメインと呼ぶ（Fahnestock et al．，J．Bacteriol．，1986，167，870-）。
【００３９】
ＳｐＧ−βのアミノ酸配列は、由来する細菌種や細菌株によって細部が異なっている。代表的なアミノ酸配列として、グループＧの連鎖球菌のＧＸ７８０９株由来の２つのβドメイン（β１とβ２）について、β１ドメイン（ＳｐＧ−β１）の第１位のＡｓｐをＴｈｒに置換したアミノ酸配列を配列番号１に、β２ドメイン（ＳｐＧ−β２）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＳｐＧの各βドメインのアミノ酸配列は互いに配列相同性が高く、これらを一括りとしてプロテインＧ−βドメイン（ＳｐＧ−β）と呼ぶ。なお、ＧＸ７８０９株由来のＳｐＧ−β２の第１位はＴｈｒである。また、文献によっては配列番号１および配列番号２の第２位以降をＳｐＧの各ドメインのアミノ酸配列としているものもあり、上記の置換は配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドのＦａｂ領域への親和性には影響を与えない。
【００４０】
なお、ｐＨ５．４における変性中点温度が、ＳｐＧ−β１が８７．５℃で、ＳｐＧ−β２が７９．４℃であることが、Alexanderらによって示されている（Alexander et al．，Biochemistry，1992，31，3597-）。したがって、本発明における好適な形態の１つとして、ペプチドの熱安定性の観点から、ＳｐＧ−β１（配列番号１）を変異導入対象にすることが挙げられる。しかし、アミノ酸配列に変異を加えることにより最終的に得られるアミノ酸配列が本発明の範囲に含まれるのであれば、変異導入対象はＳｐＧ−β１（配列番号１）に限定されない。例えば、ＳｐＧ−β２（配列番号２）、グループＧの連鎖球菌であるＧ１４８株やＧＸ７８０５株由来のＳｐＧに含まれる３個のＩｇＧ結合性ドメインのＮ末端側から２番目のドメイン（ＳｐＧ−Ｃ２）、熱安定性に優れた公知のＳｐＧ変異体（国際公開第１９９７−０２６９３０号公報、特開２００３−８８３８１号公報を参照）などを変異導入対象としてもよい。
【００４１】
「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
【００４２】
タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠損が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。
【００４３】
本発明は野生型ＳｐＧ−βに変異を導入した配列を有するペプチドに関するが、その変異導入前のアミノ酸配列は、配列番号１で示されるＳｐＧ−β１のアミノ酸配列である。但し、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）〜（３）の何れかの範囲に含まれれば、配列番号２のアミノ酸配列を変異させた結果得られたペプチドであっても、本発明範囲に含まれるものとする。
【００４４】
アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸残基を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸残基を付して表記する。例えば、第２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
【００４５】
本発明は、野生型のＳｐＧのβ１ドメインに対し、アミノ酸置換変異を導入することによって、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が、アミノ酸変異導入前よりも高い変異体を創製する技術である。本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は、配列番号１のアミノ酸配列において、第１３位（Ｌｙｓ）、第１９位（Ｇｌｕ）、第３０位（Ｐｈｅ）または第３３位（Ｔｙｒ）のいずれかの部位である。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が８０％以上である場合に、配列番号１の第１３位、第１９位、第３０位または第３３位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。
【００４６】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）は、プロテインＧのβ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）において、第１３位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。上記位置のアミノ酸残基が置換されたペプチドでＦａｂ領域結合力の向上が見られれば、置換アミノ酸をさらに上記分類と同類のアミノ酸に変異させたペプチドでも、同様にＦａｂ領域結合力の向上が見られる可能性が高い。
【００４７】
本発明における置換変異に関し、第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換された変異、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換された変異、および／または、第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換された変異を含むことが好ましい。さらに、第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換された変異を含み、かつ、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換された変異、および／または、第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換された変異を含むことがより好ましい。さらに、第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換された変異を含み、かつ、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換された変異、および／または、第１９位のアミノ酸残基がＩｌｅまたはＶａｌに置換された変異を含み、かつ、第３３位のアミノ酸残基がＰｈｅに置換された変異を含むことがより好ましい。第３０位のアミノ酸残基はＬｅｕに置換されることがより好ましく、第１９位のアミノ酸残基はＶａｌまたはＩｌｅに置換されることがより好ましい。
【００４８】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）は、ＩｇＧのＦａｂ領域への結合力が、アミノ酸置換導入前よりも高いという特徴を示す。ＩｇＧのＦａｂ領域に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
Ｆａｂ領域に対する結合性の測定条件としては、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合した時の結合シグナルが検出できればよく、２０〜４０℃の一定温度にて、ｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
【００５０】
結合相手のＩｇＧ分子は、Ｆａｂ領域への結合が検出できれば特に限定はされないが、Ｆｃ領域を含むＩｇＧ分子を用いるとＦｃ領域への結合も検出されるので、Ｆｃ領域を除くようにＦａｂ領域を断片化し、分離精製したＦａｂフラグメントを用いることが好ましい。親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じＩｇＧ分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、変異を導入する前のペプチドと変異を導入した後のペプチドとを比較することで当業者が容易に検証することができる。
【００５１】
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。親和定数は、結合速度定数（ｋon）を解離速度定数（ｋoff）で割った値である（ＫA＝ｋon／ｋoff）。したがって、結合速度定数がより大きな値となった場合や解離速度定数がより小さな値になった場合に、親和定数は大きくなる。特に解離速度定数は、相互作用している２つの分子の離れやすさを示す指標であるので、解離速度定数が小さい場合には、本発明ペプチドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスのＦａｂ断片の保持性能が高いといえる。よって、本発明に係る変異を導入した配列を有するペプチドについて、変異を導入する前の配列を有するペプチドに比べて、解離速度定数（ｋoff）が１／２以下になったペプチドを好適に用いることができ、より好ましくは１／３以下、さらにより好ましくは１／４以下、さらにより好ましくは１／５以下、特に好ましくは１／１０以下になったペプチドを好適に用いることができる。
【００５２】
本発明に係る変異体とＦａｂ断片の親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦａｂ断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係る変異を導入した配列を有するペプチドについて、親和定数（ＫA）が、該変異を導入する前の配列を有するペプチドに比べて２倍以上向上したペプチドを好適に用いることができ、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、さらに好ましくは６倍以上、さらに好ましくは７倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上、特に好ましくは５０倍以上向上したペプチドを好適に用いることができる。
【００５３】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（２）は、上記Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１３位、第１９位、第３０位および第３３位を除く領域中で１または数個のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチドである。
【００５４】
「１または数個のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１または数個」の範囲は、欠損等を有するＦａｂ領域結合性ペプチドがＩｇＧのＦａｂ領域への高い結合力を有する限り特に限定されるものではない。前記「１または数個」の範囲は、例えば、１個以上、２０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、１５個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、または１個程度であることができる。
【００５５】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠損、置換および／または付加の位置は、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）で規定された第１３位、第１９位、第３０位および第３３位以外であれば、特に制限されない。例えば、第２位、第１０位、第１５位、第１８位、第２１位、第２２位、第２３位、第２４位、第２５位、第２７位、第２８位、第３１位、第３２位、第３５位、第３６位、第３９位、第４０位、第４２位、第４５位、第４７位および第４８位から選択される１以上の部位が好ましく、これら部位は特に置換される位置として好ましい。
【００５６】
上記部位のアミノ酸残基を置換するアミノ酸の種類は特に限定はされないが、例えば、第２位はＡｒｇが好ましく、第１０位はＡｒｇが好ましく、第１５位はＧｌｎおよびＴｈｒなどの中性の極性アミノ酸類が好ましく、第１８位はＡｌａが好ましく、第２１位はＩｌｅ、ＡｌａまたはＡｓｐが好ましく、第２２位はＡｓｎまたはＧｌｕが好ましく、第２３位はＴｈｒまたはＡｓｐが好ましく、第２４位はＴｈｒが好ましく、第２５位はＳｅｒまたはＭｅｔが好ましく、第２７位はＡｓｐまたはＧｌｙが好ましく、第２８位はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＩｌｅが好ましく、第３１位はＡｒｇが好ましく、第３２位はＡｒｇが好ましく、第３５位はＰｈｅ、Ｔｙｒなどの芳香族アミノ酸類が好ましく、第３６位はＧｌｙが好ましく、第３９位はＬｅｕまたはＩｌｅが好ましく、第４０位はＶａｌまたはＧｌｕが好ましく、第４２位はＬｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｎが好ましく、第４５位はＰｈｅが好ましく、第４７位はＨｉｓ、Ａｓｎ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｙｒが好ましく、第４８位はＴｈｒが置換するアミノ酸として好ましい。特に、第２位はＡｒｇが好ましく、第１０位はＡｒｇが好ましく、第１５位は中性極性アミノ酸類が好ましく、第１８位はＡｌａが好ましく、第２１位はＡｌａまたはＡｓｐが好ましく、第３９位はＬｅｕまたはＩｌｅが好ましく、第４７位はＡｌａが好ましい。
【００５７】
それ以外にも、野生型ＳｐＧ−βや公知のＳｐＧ−β変異体の間でアミノ酸の種類が異なる部位である、第６位、第７位、第２４位、第２８位、第２９位、第３１位、第３５位、第４０位、第４２位および第４７位から選択される１以上の部位も、置換される部位として挙げられる。
【００５８】
また、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠損、置換および／または付加の位置としては、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠損および／または付加の部位として好ましい。
【００５９】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（２）のＩｇＧのＦａｂ領域への結合力は、上記Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）と同様に測定することができる。
【００６０】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（３）は、上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンのＦａｂ領域への結合力が配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１３位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）である。
【００６１】
上記配列同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上が特に好ましい。
【００６２】
上記配列同一性は、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）で説明したとおり、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。また、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（３）のＩｇＧのＦａｂ領域への結合力も、上記Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）と同様に測定することができる。
【００６３】
ＳｐＧは、免疫グロブリン結合性ドメインが２個または３個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該Ｆａｂ領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００６４】
本発明によって得られる単量体ペプチドの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法や、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。好ましくは、野生型ＳｐＧのβ１とβ２の間を連結している配列を利用するのがよい。また、別の観点からは、単量体ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００６５】
また、実施形態の１つとして、本発明により得られるＦａｂ領域結合性ペプチド、または、当該ペプチドが２個以上連結されたペプチド多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
【００６６】
本発明は、上記の本発明ペプチドを、ＩｇＧやその断片、特にＦａｂ領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、ＩｇＧに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同義である。
【００６７】
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００６８】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００６９】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してもよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００７０】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＦａｂ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００７１】
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、ＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドをアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドの精製法は、ＩｇＧのアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、ＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドを含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、ＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドを吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドはカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドを吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望のＩｇＧのＦａｂ領域を含むペプチドを溶出することにより、高純度な精製が達成される。
【００７２】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
【００７３】
本発明は、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【００７４】
また、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【００７５】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
【００７６】
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００７７】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
【００７８】
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【００７９】
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【００８０】
本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【００８１】
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、前記した形質転換体を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明ペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換体を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
【００８２】
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００８３】
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００８４】
さらに、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる）。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン０．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
【００８６】
また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより、本発明ペプチドを培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）または培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【００８７】
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００８８】
本願は、２０１３年８月３０日に出願された日本国特許出願第２０１３−１８０２４９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年８月３０日に出願された日本国特許出願第２０１３−１８０２４９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００８９】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９０】
以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ドメイン−導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型は「ドメイン−Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号１で示される野生型ＳｐＧのβ１ドメインは「β１−Ｗｉｌｄ」、変異Ｋ１３Ｔを導入したＳｐＧ−β１ドメイン変異体は「β１−Ｋ１３Ｔ」と表記する。【００９１】
２種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｋ１３ＴおよびＥ１９Ｉを導入したＳｐＧ−β１ドメイン変異体は、「β１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ」と表記する。【００９２】
また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｋ１３ＴおよびＥ１９Ｉを導入したＳｐＧβ１ドメイン変異体を２連結したタンパク質は、「β１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ．２ｄ」と表記する。【００９３】
さらに、例えば、水不溶性基材にタンパク質を固定化するために、Ｃ末端に固定化用官能基を有するＣｙｓ残基（Ｃ）を導入した場合、「ｄ」の後ろに導入したアミノ酸の１文字表記を付与する。例えば、変異Ｋ１３ＴおよびＥ１９Ｉを導入したＳｐＧβ１ドメイン変異体を２連結してＣ末端にＣｙｓを付与したタンパク質は、「β１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ．２ｄＣ」と表記する。【００９４】
実施例１：各種ＳｐＧ−β１変異体の調製
（１）  各種ＳｐＧ−β１変異体の発現プラスミド調製
発現プラスミドの調製方法に関し、野生型ＳｐＧ−β１を例に示す。野生型ＳｐＧ−β１（配列番号１）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号３）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。野生型ＳｐＧ−β１をコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込む。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２、または、ｆ２−１／ｆ２−２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号４）／ｆ１−２（配列番号５）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号６）／ｆ２−２（配列番号７）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。【００９５】
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＳｐＧ−β１を産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製，「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製，「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製，「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Applied Biosystems社製，「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。【００９６】
各種ＳｐＧ−β１変異体をコードするＤＮＡに関しても、所望のアミノ酸配列から逆翻訳を行って当該ペプチドをコードする塩基配列を設計し、上記と同様の方法でコードＤＮＡを含む発現プラスミドと形質転換細胞を調製した。現在は、外注によって２００塩基程度のＤＮＡ（６０残基程度のタンパク質をコード可能）を外注で全合成することが可能である（例えば、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）。従って、コードする変異体のアミノ酸配列に対応付ける形で後述の表に配列番号を付した上で、得られた最終的なコードＤＮＡ配列のみを配列表に記載する。【００９７】
２ドメイン型発現プラスミドに関しても、野生型ＳｐＧ−β１を例に調製方法を示す。調製した単ドメイン型ＳｐＧ−β１の発現プラスミドのコードＤＮＡ部分を鋳型とし、５’側にＢａｍＨ  Ｉ認識サイトが付与されたプライマー（配列番号８）と、３’側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識サイトが付与されたプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行い、二本鎖ＤＮＡ（ｆ−Ｎ）を合成した。同様に、５’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトが付与されたプライマー（配列番号１０）と、３’側にＥｃｏＲＩ認識サイトを付与するプライマー（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行い、二本鎖ＤＮＡ（ｆ−Ｃ）を合成した。なお、１０位に変異を導入したＳｐＧ−β１変異体については、５’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトが付与された別のプライマー（配列番号１２）を使用した。ＰＣＲ反応のポリメラーゼにはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、反応生成物はアガロース電気泳動にかけて、目的の二本鎖ＤＮＡを抽出した。ｆ−Ｎは制限酵素ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで、ｆ−ＣはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１は制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、先述と同様の手法の三断片ライゲーションによって、発現プラスミドを調製した。その後の形質転換と塩基配列確認は、先述と同様の手法にて実施した。各種２ドメイン型のＳｐＧ−β１変異体の発現プラスミドは、同様の手法にて調製した。【００９８】
（２）  各種ＳｐＧ−β１変異体の調製
上記（１）で得られた、各種ＳｐＧ−β１変異体遺伝子を導入した各形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド）を添加し、さらに、３７℃にて１８時間培養した。【００９９】
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。なお、分子量はほぼ同様であるが、変異体の種類によってバンドの位置は違った。【０１００】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。後の実施例で、ＧＳＴを融合したままでアッセイに利用したサンプルは、この溶出液を遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて、濃縮した形で標準緩衝液に置換したペプチド溶液を用いた。【０１０１】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。ＧＳＴと分子量が近い２ドメイン型のＳｐＧ−β１変異体については、溶出画分を同様の方法でリクロマトすることで分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のタンパク質に関して、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳｅｒがＮ末端側に付加された配列となる。【０１０２】
実施例２
（１）  ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ−Ｆａｂ）の調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。ここでは、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体（一般名「トラスツズマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆａｂの調製方法を示すが、基本的には他のＩｇＧ−Ｆａｂ、例えば、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（一般名「アダリムマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆａｂも同様の方法で調製した。【０１０３】
具体的には、ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤（抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体の場合には、中外製薬社製の「ハーセプチン」）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐａｐａｙａ  ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＫａｎＣａｐＡカラム（カネカ社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を得た。なお、実施例１（１）と同様に、クロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。【０１０４】
（２）  各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種ＳｐＧ−β１変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．１〜１００μＭの範囲で適宜調製し、各々のペプチド溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで６０秒間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，６０秒間）、および、添加終了後（解離相，６０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、２０ｍＭ  ＮａＯＨ（３０秒間）を添加してセンサーチップを再生した。この操作は、センサーチップ上に残った添加ペプチドの除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。結果を表１に示す。【０１０５】
【表１】
0006506691.tif 000002
表１に示した結果の通り、本発明で得られた変異体は、野生型と比較して、ＩｇＧ−Ｆａｂへの結合定数が向上していること、すなわちＩｇＧ−Ｆａｂへの結合力が強くなっていることを確認した。また、２種類のＩｇＧ−Ｆａｂに対する結合力が向上する傾向が似ていることより、本発明で得られた変異体は、ＩｇＧ−Ｆａｂの抗原結合領域（抗体の種類によって配列が大きく異なる部分）ではなく、定常領域など様々な抗体で共通の領域に対して結合していると考えることができる。従って、本発明で得られた変異体の、アフィニティーリガンドとしての汎用性の高さを裏付ける結果と捉えることができる。【０１０６】
ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに対して、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ．１ｄが２倍以上のＩｇＧ−Ｆａｂ結合力を示していることから、変異Ｋ１３Ｔは、単独でＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に寄与する変異であるといえる。その他、変異Ｆ３０Ｌが複数の変異体で見られるので、今回の変異体に導入された変異の中で、Ｋ１３Ｔ以外では、変異Ｆ３０ＬがＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に特に寄与が大きい可能性がある。【０１０７】
実施例３
上記実施例２の実験と同様にして、ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を測定した。ＩｇＧ−Ｆａｂについては、上記実施例２の実験において、１種類のＩｇＧ−Ｆａｂで見た結果について、他の種類のＩｇＧ−Ｆａｂでも概ね同様の傾向が見られることを確認したので、１種類のみについて実験を行った。結果を表２に示す。【０１０８】
【表２】
0006506691.tif 000003
表２に示した結果の通り、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ／Ｆ３０Ｌ／Ｄ３６Ｇ．１ｄは、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄと比較して、ＩｇＧ−Ｆａｂへの結合力が６倍程度であった。この結果は、上記実施例２の実験では５倍程度であったことに矛盾しないといえる。なお、センサーチップ上のＩｇＧ−Ｆａｂの繰り返し再生に伴う劣化や、濃度調整等のマニュアル操作に伴う誤差によって、実験間でこの程度の結合パラメータの数値上のズレが生じるのは自然なことといえる。【０１０９】
また、変異Ｋ１３Ｔについては、先と同様にＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上への高い寄与が見られ、変異Ｋ１３Ｓも近い効果があると考えられる。また、変異Ｆ３０Ｌ、変異Ｅ１９ＩおよびＥ１９Ｖも、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力が５倍以上を示す変異体に概ね共通して見られる変異であり、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上への寄与が高いといえる。特に、変異Ｋ１３ＴおよびＫ１３Ｓと協奏的に、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に寄与しているともいえる。【０１１０】
それら以外では、Ｙ３３Ｆも比較的多くの変異体に見られる変異であり、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に寄与していると考えられる。他の変異も総じてＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に寄与している可能性がある。また、第１３位、第１９位、第３０位および第３３位における変異は、ＳｐＧ−β１と配列同一性が８０％以上であれば、基本的には同様の機能を発揮できると考えられる。【０１１１】
実施例４
上記実施例３の実験と同様にして、ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を測定した。この実験では、ＧＳＴを切断したＧＳＴ切断型（Ｐｅｐ−）で測定を実施した。また、１ドメイン型（Ｐｅｐ．１ｄ）だけでなく、Ｃ末端にＣｙｓが結合した１ドメイン型（Ｐｅｐ．１ｄＣ）とＣ末端にＣｙｓが結合した２ドメイン型（Ｐｅｐ．２ｄＣ）を用いて実験を行った。その結果を表３に示す。【０１１２】
【表３】
0006506691.tif 000004
表３に示した結果の通り、これまでと同様に、本発明によって得られた変異体は、野生型に比べて優位に高いＩｇＧ−Ｆａｂ親和性を示した。なお、ＧＳＴを切断したＰｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄは、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄと比較して、解離速度定数が大きいために結合定数が小さくなっている。アフィニティーリガンドとして工業的に生産することを意識した場合、ＧＳＴを融合する必要性は特にないので、このＧＳＴを切断した条件での比較の方が実使用条件に近い条件での比較であると言える。【０１１３】
Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．１ｄは、実施例３のときと同様に、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに比べて有意に高いＩｇＧ−Ｆａｂ親和性を示した。その親和性の向上は、ＧＳＴを切断したＰｅｐ型の場合、結合定数にして３０倍近い値となった。【０１１４】
また、本発明で得られた別の変異体であるＰｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ａ／Ｋ２８Ｉ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｖ３９Ｉ．１ｄ、および、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．１ｄも、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに比べて有意に高いＩｇＧ−Ｆａｂ親和性を示した。【０１１５】
さらに、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．１ｄは、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに比べて、８０倍以上高い結合定数を示しており、ＫAにして１０7Ｍ-1オーダーを示した。【０１１６】
１ドメイン型でＣ末端にＣｙｓを結合させたコンストラクトで比較した際も同様の結果となった。２ドメイン型でＣ末端にＣｙｓを結合させたコンストラクトで比較した際も同様の結果となったが、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．２ｄＣは、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．２ｄＣに比較して、２００倍以上高い結合定数を示した。【０１１７】
参考までに、同じタイプのコンストラクト（Ｐｅｐ．１ｄまたはＰｅｐ．２ｄＣ）を用いて、同じタンパク質濃度（２μＭ）における、野生型ＳｐＧ−β１と、Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａの、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＩｇＧ−Ｆａｂに対するビアコア結合反応曲線を重ねて比較したチャートを図２として示す。また、これらの二量体の、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＩｇＧ−Ｆａｂに対するビアコア結合反応曲線を重ねて比較したチャートを図３として示す。図２および図３のとおり、ドメイン単量体型ペプチドでもドメイン二量体型ペプチドでも、本発明に係る変異型ペプチドは、野生型ＳｐＧ−β１に比べ、Ｆａｂ領域に対して高い結合能を有することが分かる。【０１１８】
また、図２の野生型ＳｐＧ−β１の結合反応曲線は、結合速度定数が大きい（相互作用の解離が速い）ときに見られる典型的な“箱型”の形状を示している。“箱型”とは、サンプル添加時（結合相）のシグナルの立ち上がりが速く、すぐに結合が平衡状態（シグナルがベースラインに平行）となり、サンプル添加停止時（解離相）のシグナル低下も早いときに見られる形状を指す。それに比較して、本発明で得られた変異型ＳｐＧ−β１は、解離速度定数が小さいために、サンプル添加停止時のシグナル低下が緩やかな形状を示している。したがって、本発明に係る変異型ＳｐＧ−β１が固定化されたアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域を含むタンパク質の保持性能が極めて高いと期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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