(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え標的化−バクテリオファージおよびカチオン性ポリマーを含む、標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスであって、
前記組み換えバクテリオファージが前記組み換えバクテリオファージのカプシドコートで発現されうるタンパク質リガンドをコードする、および標的細胞または組織への標的化デリバリを可能にするために、前記標的細胞または組織で発現したタンパク質に特異的でもある、核酸配列を含み、
前記カチオン性ポリマーがポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）からなる群から選択され、
前記コンプレックスが正味の正電荷を有し、約１００ｎｇ〜４００ｎｇのポリマー：１μｇファージ（重量：重量比）を含み、前記バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスのζ電位が生理学的ｐＨで少なくとも５ｍＶである、コンプレックス。
【請求項２】
前記リガンドがＲＧＤ４Ｃリガンドを含む腫瘍−標的化リガンドである、請求項１に記載のコンプレックス。
【請求項３】
前記バクテリオファージが導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子が標的細胞への治療効果を発揮するおよび／もしくは前記導入遺伝子が単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ遺伝子を含む、ならびに／または前記バクテリオファージが繊維状バクテリオファージである、もしくはＦ１、ＦｄもしくはＭ１３である、請求項１または２に記載のコンプレックス。
【請求項４】
前記バクテリオファージ−カチオン性ポリマーコンプレックスがリン酸カルシウムを含む、および／または前記カチオン性ポリマーが、ファージカプシドタンパク質とコンプレックスを形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンプレックス。
【請求項５】
前記コンプレックスが、前記ポリマーと前記バクテリオファージ内のタンパク質との間の静電引力によって生成される、ならびに／または前記ポリマーが、バクテリオファージ上の外膜を形成する、および／もしくは前記バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスのζ電位が、生理学的ｐＨで少なくとも１０ｍＶまたは１５ｍＶである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンプレックス。
【請求項６】
組み換え標的化−バクテリオファージをカチオン性ポリマーと接触させて安定したコンプレックスを形成することを含み、
前記コンプレックスは、正味の正電荷を有し、生理学的ｐＨで少なくとも５ｍＶのζ電位を有し、
前記バクテリオファージおよびカチオン性ポリマーは、請求項１〜５のいずれか１項に記載のものであり、
前記コンプレックスは、約１００ｎｇ〜４００ｎｇのポリマー：１μｇファージ（重量：重量比）を含む、標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスの製造方法。
【請求項７】
前記バクテリオファージおよびカチオン性ポリマーが、前記バクテリオファージを、約１５〜３０℃、または約１８〜２５℃の温度で、少なくとも５分間、１０分間または１５分間、カチオン性ポリマーとインキュベートする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスの複数を含む、アグリゲート。
【請求項９】
前記アグリゲートの平均粒子径が、約６００ｎｍ〜２５００ｎｍ、または約６００ｎｍ〜１５００ｎｍ、または約７００ｎｍ〜１２００ｎｍである、請求項８に記載のアグリゲート。
【請求項１０】
治療もしくは診断、または遺伝子治療技術に使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または請求項８もしくは９に記載のアグリゲート。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または請求項８もしくは９に記載のアグリゲートを含む、ワクチン。
【請求項１２】
遺伝−分子イメージング技術における、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または請求項８もしくは９に記載のアグリゲートの使用。
【請求項１３】
前記導入遺伝子が、ＨＳＶｔｋおよび／またはナトリウム／ヨウ素シンポーター（ＮＩＳ）をコードする、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または請求項８もしくは９に記載のアグリゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージ、特には新規バクテリオファージコンプレックスに関する。本発明は、バクテリオファージおよびそのコンプレックスの調製方法、および様々な遺伝子治療への応用における導入遺伝子のデリバリのためのそれらの使用にまで及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
全身投与後のｉｎ  ｖｉｖｏでの望ましいターゲット部位への導入遺伝子のデリバリの成功は、医療活動、特に遺伝子治療、遺伝的イメージングおよびＤＮＡワクチン使用の発展に大きな影響を与えるであろう。加えて、病変組織への全身遺伝子デリバリをターゲットにすることは、「セラグノスティック（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」（すなわち、一つのベクターシステムへ統合された遺伝子治療と遺伝的イメージング）への効率的で安全なアプローチを提示する。現在までの遺伝子デリバリにおける最大の進歩は、優れた遺伝子デリバリベクターを提供する、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスのような、真核生物ウイルスを用いてなされている。しかし、これらの真核生物ウイルスを用いる全身投与は、肝臓および細網内皮系での望ましくない取込、挿入突然変異、補体または既存の抗体との反応に起因する免疫原性、ならびに哺乳類の組織への広い親和性により成功が限られている。
【０００３】
バクテリオファージ（すなわち、バクテリアウイルス）は、哺乳類細胞レセプターへの固有の親和性を有さず、ウイルスの構造を破壊することなく、コートタンパク質上の組織特異的なリガンドをディスプレイするために改変できるため、導入遺伝子の標的化全身デリバリのための安全なベクターとして注目されている。このようなベクターは、多くの望ましい特性により動物ウイルスベクターおよび既存の遺伝子デリバリシステムに対して多くのアドバンテージを有する。例えば、バクテリオファージは、効率的にＤＮＡを濃縮およびパッケージングできるナノサイズの天然のシステムである。ファージコートタンパク質変異への高い耐性は、カプシドタンパク質への外来ペプチドの挿入を可能とし、よってバクテリアへの生来の親和性を排除せずに望ましい細胞型をターゲットにすることができる。加えて、バクテリオファージは、安全であり、長い間予防および細菌感染の治療のために、大人および子供において、安全上の懸念を確認されることなく、用いられている。バクテリオファージはまた、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ−ＦＤＡ）により承認されており、安全な抗菌性食品添加物として用いられている。ファージベクターの大規模生産および精製は、単純であり、経済的である。最後に、バクテリオファージは、外来ＤＮＡの挿入するための大きなキャパシティを有している。
【０００４】
最近、本発明者らは、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）から逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）により隣接した哺乳類導入遺伝子カセットと互換性のある部位でのバクテリオファージゲノムとが組み込まれた、Ｍ１３ファージに基づくベクターの改良版を導入した。このベクターは、全身投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期間の遺伝子発現を有する通常のファージベクターと比較して優れた遺伝子デリバリを示した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのこの改良されたファージの有効性を示すために、環状ＲＧＤ４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）ペプチドリガンドをディスプレイするファージを用いて、腫瘍において発見された過剰発現のαｖインテグリンレセプターをターゲットとした。米国の国立癌研究所の指示の下で行われた最近の研究は、かかるファージ技術のポテンシャルを優雅に確認している。標的化ＲＧＤ４Ｃ−ファージは、サイトカイン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）を、ペットの犬で診断された癌にデリバリするために用いられた。反復した投与は、安全を証明し、標的化腫瘍におけるＴＮＦαの効率的な発現をもたらし、いくつかの個体において、悪性腫瘍の完全な根絶を導いた。したがって、バクテリオファージは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの全身投与後、標的組織への導入遺伝子の安全で効率的なデリバリを提供することを実験的に示した最初のシステムである。
【０００５】
しかし、残念ながら、ファージ粒子は、バクテリアのみに感染するために進化し、また真核生物のウイルスとは異なり、バクテリオファージは、遺伝子を哺乳類細胞へデリバリするための本質的な戦略を有さないため、比較的貧弱なベクターである。結果として、この生得な制限のため、ファージ由来のベクターは、広く臨床的に応用するのであるならば、改良される必要がある。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける目的の細胞へ導入遺伝子を効率よく特異的にデリバリする、改良された遺伝子デリバリシステムを提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、カチオン性ポリマー、および腫瘍−標的化リガンドをディスプレイする、および導入遺伝子カセットを運ぶために遺伝的に操作された、バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３）からなる新規ハイブリットベクターシステムを開発している。
【０００７】
したがって、第１の態様において、組み換え標的化−バクテリオファージおよびカチオン性ポリマーを含む標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスを提供し、前記コンプレックスは、正味の正電荷を有する。
【０００８】
実施例で記載したように、本発明者らは、驚くことに、組み換えバクテリオファージをカチオン性ポリマーとインキュベートし、かなり意外なことに、例えば、全身投与の際、バクテリオファージの能力を促進し、ターゲット−特異的な細胞の形質導入を行う、生理的ｐＨ下で正味の正電荷を有する新規標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックス（または「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」）の形成をもたらすことを示した。したがって、本発明のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスは、例えば、癌治療における、広範囲の遺伝子治療での適用に用いるための、新規ハイブリットベクタープラットフォームを提供する。
【０００９】
バクテリオファージは、バクテリア内に感染し複製するウイルス（すなわち、ファージ）であることを理解されたい。その他の通常のウイルスとは対照的に、遺伝子デリバリベクターとしてバクテリオファージを用いることの利点は、遺伝的に改変され、特異的にそうするようにしないのならば、哺乳類細胞のような、非バクテリア細胞に自然感染しないことである。
【００１０】
したがって、本発明に係るコンプレックスの組み換えバクテリオファージは、カプシドコートで発現されうるタンパク質リガンドをコードする、および標的細胞／組織への標的化デリバリを可能にするために、標的細胞／組織に発現したタンパク質（例えば、レセプター）に特異的である、核酸配列を含むために遺伝的に改変することができる。例えば、バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスが癌を治療するために用いられる実施形態において、リガンドは、腫瘍−標的化リガンドでありうる。一例として、一実施形態において、リガンドは、当業者に公知であろう、ＲＧＤ４Ｃリガンド（実施例参照）を含むことができる。環状ＲＧＤ４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）ペプチドリガンドをディスプレイするファージが、腫瘍で見られる過剰発現したαＶインテグリンレセプターをターゲットにすることは当然であろう。
【００１１】
同じまたは追加の核酸配列はまた、本発明に係る組み換えバクテリオファージポリマーコンプレックスで形質導入された標的細胞へ生物学的および好ましくは治療効果をもたらすタンパク質をコードすることができる。したがって、バクテリオファージは、例えば、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ遺伝子（実施例５参照）をコードする、導入遺伝子を含むことができ、その後、導入遺伝子は、標的細胞への生物学的または治療効果を発揮することができる。組み換えバクテリオファージは、プロモーター、および治療効果を発揮する能力があるタンパク質をコードするコード配列に加えて、様々な他の機能的要素を含むことができる。また、組み換えファージは、宿主細胞のゲノムに統合するように設計することができる。この場合、標的化統合に都合のよい（例えば、相同的組み換えにより）、ＤＮＡ配列が想定される。
【００１２】
バクテリオファージは、ベクターがｉｎ  ｖｉｖｏでの被験体へ全身または局所投与されるにかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の混合物へ適用された、またはｅｘ  ｖｉｖｏでの器官へ適用された、組織特異的なターゲットへの所望の核酸配列（例えば、導入遺伝子）のデリバリのための組み換えベクターとして用いることができる。本発明の一実施形態において、核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡでありうる、ＤＮＡであろう。他の実施形態において、核酸は、アンチセンスＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのような、ＲＮＡであろう。
【００１３】
前記コンプレックスを生成するのに用いることができる、バクテリオファージの例は、いかなる負に帯電したバクテリオファージ、好ましくは、Ｆ１、ＦｄまたはＭ１３のような、繊維状ファージを含む。本発明に係る好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３である。一実施形態において、バクテリオファージは、好ましくは、導入遺伝子を運ぶ組み換えゲノムカセットを含む。もっとも好ましくは、Ｍ１３は、導入遺伝子を運ぶ組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムカセットを含む。
【００１４】
好ましくは、カチオン性ポリマーは、生理的ｐＨで正味の正電荷を有する任意のポリマー化合物である。例えば、ポリマーは、複数の正に帯電した繰り返しユニットを含むことができる。カチオン性ポリマーは、キトサン；ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）；ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ポリブレン；プロタミンサルフェート；およびカチオン性脂質からなる群から選択することができる。例えば、カチオン性脂質は、ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、およびＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート）からなる群から選択することができる。
【００１５】
好ましくは、カチオン性ポリマーの分子量は、少なくとも４ｋＤ、６ｋＤ、１０ｋＤ、５０ｋＤ、１００ｋＤまたは５００ｋＤである。例えば、前記ポリマーの分子量は、ＰＤＬでは約５００ｋＤ、ＤＥＡＥ．ＤＥＸでは７０〜１５０ｋＤ、ＰＥＩでは７５０ｋＤ、ポリブレンでは４ｋＤ〜６ｋＤ、プロタミンサルフェートでは５．１ｋＤである。本発明者らは、カチオン性ポリマーの分子量が低くなればなるほど、より多くのポリマーが生理的ｐＨで正となるように負に帯電したファージを変換するためにコンプレックス内で必要とされると考える。
【００１６】
好ましくは、カチオン性ポリマーは、ＤＥＡＥ、より好ましくはＤＥＡＥ．ＤＥＸを含む。好ましくは、ポリマーはＰＤＬを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性ポリマーは、ＤＥＡＥ．ＤＥＸおよびＰＤＬのような、本明細書に記載の任意のポリマーの組み合わせを含むことができる。
【００１７】
好ましくは、前記コンプレックスは、約５０ｎｇ〜５００ｎｇのポリマー：１μｇファージ、より好ましくは約１００ｎｇ〜４００ｎｇのポリマー：１μｇファージ、およびさらにより好ましくは１３０ｎｇ〜３２０ｎｇのポリマー：１μｇファージの重量：重量比を含む。ポリマーがＰＤＬである実施形態において、前記コンプレックスは、好ましくは、約５０ｎｇ〜３００ｎｇのポリマー：１μｇファージ、より好ましくは約１００ｎｇ〜２００ｎｇのポリマー：１μｇファージ、およびさらにより好ましくは約１２０ｎｇ〜１５０ｎｇのポリマー：１μｇファージの重量：重量比を含む。ポリマーがＤＥＡＥである実施形態において、前記コンプレックスは、好ましくは、約１００ｎｇ〜５００ｎｇのポリマー：１μｇファージ、より好ましくは約２００ｎｇ〜４００ｎｇのポリマー：１μｇファージ、およびさらにより好ましくは約２５０ｎｇ〜３５０ｎｇのポリマー：１μｇファージの重量：重量比を含む。
【００１８】
他の実施形態において、バクテリオファージ−カチオン性ポリマーコンプレックスは、リン酸カルシウムを含むことができる。有利には、リン酸カルシウムは、本発明に係るバクテリオファージ−カチオン性ポリマーコンプレックスの細胞取込を増加させる（実施例７に示す）。
【００１９】
実施例で説明するように、カチオン性ポリマーは、バクテリオファージと、好ましくはファージカプシドタンパク質とコンプレックスを形成する。好ましくは、前記コンプレックスは、前記ポリマーと前記バクテリオファージ内のタンパク質との間の静電引力によって生成される。好ましくは、前記ポリマーは、バクテリオファージ上の、好ましくはそのカプシド上の外膜を形成する。
【００２０】
好ましくは、バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスのζ電位は、生理学的ｐＨで少なくとも５ｍＶ、１０ｍＶまたは１５ｍＶである。図４ｂに示すように、コンプレックスでのポリマーの存在は、結果として得られたバクテリオファージの正味の電荷における著しい増加を引き起こす。本発明者らは、このζ電位における増加は、生理学的ｐＨでのバクテリオファージ粒子の生来の負の帯電を打ち消すバクテリオファージ上のポリマーの表面吸着に帰することができるとの仮説を立てている。
【００２１】
本発明者らは、第１の態様のコンプレックスを調製するための新たな方法を開発した。
【００２２】
したがって、本発明の第２の態様において、正味の正電荷を有する、組み換え標的化−バクテリオファージをカチオン性ポリマーと接触させて安定したコンプレックスを形成することを含む、標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスの製造方法を提供する。
【００２３】
第２の態様の方法で用いられるバクテリオファージおよびカチオン性ポリマーは、任意の、第１の態様の組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスを形成するために選択されたものでありうる。実施例で説明するように、本発明者らは、組み換えバクテリオファージが、使用に先立ち、カチオン性ポリマーとプレインキュベートした場合、バクテリオファージの形質導入の効率を促進する、安定で活性のあるバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスを優先的に形成することを観察した。バクテリオファージは、約１５〜３０℃、もしくは約１８〜２５℃、または好ましくは約２０〜２３℃の温度でカチオン性ポリマーとインキュベートすることができる。好ましくは、バクテリオファージは、少なくとも５分間、１０分間または１５分間、カチオン性ポリマーとインキュベートされる。好ましくは、バクテリオファージは、３時間、２時間または１時間未満、カチオン性ポリマーとインキュベートされる。このファージとポリマーとのプレインキュベーション工程は、活性のあるバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスの製造のために重要であると考えられる。
【００２４】
当業者は、バクテリオファージがポリマーとインキュベートされる長さが、インキュベーションをする温度、ポリマーのタイプおよびバクテリオファージのタイプによることを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の任意の温度が、本明細書に記載の任意の時間と組み合わせることができる。例えば、２５〜３０℃のようなより高い温度では、インキュベーション工程は、少なくとも１０分であろうし、一方、２０〜２５℃のようなより低い温度では、インキュベーション工程は、少なくとも１５分であろう。
本発明者らは、第１の態様のコンプレックスが、共にアグリゲートでき、複数のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスを含む、より大きく、安定な粒子または「アグリゲート（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）」を形成すること、およびこれらのアグリゲートが、全体として、生理学的ｐＨで全体の正味の正電荷をディスプレイすることを観察している。
【００２５】
したがって、第３の態様において、複数の第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスを含むアグリゲートを提供する。
【００２６】
実施例で示すように、本発明のアグリゲートは、そのままでファージよりも大きい（少なくとも６〜７倍大きい）。例えば、アグリゲートの平均粒子径は、約６００ｎｍ〜２５００ｎｍでありうる。好ましくは、アグリゲートの平均粒子径は、約６００ｎｍ〜１５００ｎｍであり、または好ましくは約７００ｎｍ〜１２００ｎｍである。アグリゲートは、少なくとも、５、１０、５０または１００のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスを含むことができる。
【００２７】
本発明者らは、本発明のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスが、その後死滅される腫瘍細胞を効率的にターゲットとし、形質導入することができることを示している。しかし、コンプレックスによりターゲットとされる、細胞のタイプが、バクテリオファージの表面で発現した細胞−標的化リガンドのタイプによることは、当然であろう。実施例において、腫瘍細胞は、本発明のコンプレックスが著しく改良された形質導入を示すことを図示的に表すために用いられる。
【００２８】
したがって、第４の態様において、治療または診断に使用される、第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたは第３の態様に係るアグリゲートを提供する。
【００２９】
本発明は、標的特異的な性質および本発明の組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスの改善した形質導入の効率によって多種多様な疾患の治療のために用いることができる。結果として、遺伝子治療に用いられる組み換えバクテリオファージの治療の機会は、（ｉ）組み換えバクテリオファージのオフターゲット効果によって起こるであろう、いかなる副作用の最小化、および（ｉｉ）著しく改良された標的特異的な細胞の形質導入のため、本発明により著しく増加するであろう。本発明は、予防的に疾患を予防するため、または疾患の発症後、それを改善／治療するために用いることができる。
【００３０】
したがって、第５の態様において、遺伝子治療技術に使用される、第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたは第３の態様に係るアグリゲートを提供する。
【００３１】
第６の態様において、治療を必要とする被験体への投与、治療上有効な量の第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたは第３の態様に係るアグリゲートの投与を含む、遺伝子治療技術を用いて被験体の疾患を治療、予防または改善する方法を提供する。
【００３２】
本発明がまた、使用される組み換えバクテリオファージおよびカチオン性ポリマーの性質によって、様々な疾患の治療および／または診断のために用いることができる様々な異なるバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスベクターを生成するために用いることができることは、当然であろう。例えば、バクテリオファージが腫瘍−標的化リガンドを含むおよび／または抗腫瘍タンパク質（例えばＨＳＶｔｋ遺伝子）を発現する導入遺伝子を含む実施形態において、その時、癌を治療するために用いることができる。したがって、遺伝子治療技術における標的細胞は、好ましくは、真核生物、好ましくは哺乳類である。
【００３３】
本発明者らは、本発明の多機能なバクテリオファージが、形質導入された標的細胞において、上昇した導入遺伝子発現を示すことを明確に明らかにしている。したがって、本発明者らは、ファージがワクチンのデリバリにおいて、重要な商業的価値を有するであろうと考えている。
【００３４】
したがって、第７の態様において、第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または第３の態様に係るアグリゲートを含むワクチンを提供する。
【００３５】
第８の態様において、ワクチンデリバリーのための、第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または第３の態様に係るアグリゲートの使用を提供する。
【００３６】
前記ワクチンは、好ましくはＤＮＡワクチンである。ワクチンは、好ましくは、適切なアジュバントを含む。一実施形態において、バクテリオファージベクターは、身体の免疫システムを刺激するために抗原をコードする導入遺伝子またはＤＮＡカセットを運ぶために用いることができる。ファージはまた、直接的に目的の抗原をディスプレイおよび発現するために用いることができ、したがって、単一のファージ粒子により、ワクチンＤＮＡワクチンまたはファージ表面で容易に発現したタンパク質としての多くの抗原の同時デリバリのためのユニークなプラットホームを提供する。
【００３７】
本発明者らは、本発明のバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートがまた、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴイメージングのような、様々な異なる遺伝−分子イメージング技術において用いることができると考える。
【００３８】
したがって、第９の態様において、遺伝−分子イメージング技術における、第１の態様に係る標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックス、または第３の態様に係るアグリゲートの使用を提供する。
【００３９】
導入遺伝子は、ＨＳＶｔｋおよび／またはナトリウム／ヨウ素シンポーター（ＮＩＳ）をコードすることができ、コンプレックスまたはアグリゲートは、好ましくは、放射線標識した基質と組み合わせて用いられる。例えば、ヒトナトリウム／ヨウ素シンポーター（ＮＩＳ）イメージング遺伝子は、好ましくは、臨床的に適用可能なポジトロン断層法（ＰＥＴ）イメージングのためにＩ１２４または臨床的に適用可能なＳＰＥＣＴイメージングのためのＩ１２５／９９ｍＴｃ−過テクネチウムと組み合わせて用いられる。
また、ＨＳＶｔｋ遺伝子は、好ましくは、２０−［１８Ｆ］−フルオロ−２０−デオキシ−１−ｂ−Ｄ−アラビノ−フラノシル−５−エチルウラシル（［１８Ｆ］ＦＥＡＵ）のような放射線標識したヌクレオシド類似体と組み合わせて用いられる。
【００４０】
第１の態様に係る組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたは第３の態様に係るアグリゲート（すなわち、以下共に「剤（ａｇｅｎｔｓ）」と称する）が、単剤療法において、または癌のような、疾患を治療、改善、もしくは予防するための公知の療法の補助として、もしくは公知の療法と組み合わせて用いられうる薬剤において使用することができることは、当然であろう。本発明に係る剤は、特に、組成物が使用される方法に応じて多くの異なる形態を有する組成物に組みこむことができる。したがって、例えば、組成物は、パウダー、タブレット、カプセル、液体などの形態、または治療を必要とするヒトまたは動物へ投与することができる任意の他の形態でありうる。本発明に係る薬剤の賦形剤が、与えられた被験体への良好な耐容性を示すものであるべきことは、当然であろう。
【００４１】
本発明に係る剤を含む薬剤（すなわち、コンプレックスまたはアグリゲート）は、複数の方法で用いることができる。例えば、経口投与が必要な場合があり、この場合、剤は、例えば、タブレット、カプセルまたは液体の形態で経口摂取できる組成物中に含まれうる。本発明の剤を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）により投与することができる。組成物はまた、局所使用のために処方することができる。例えば、クリームまたは軟膏は、皮膚へ適用することができる。
【００４２】
本発明の剤はまた、持続放出性または遅延放出性デバイスに組み込むことができる。かかるデバイスは、例えば、皮膚上または皮膚下に挿入することができ、薬剤は、数週間または数ヶ月にわたって放出することができる。前記デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して位置するであろう。かかるデバイスは、本発明に係る剤を用いた長期治療を必要とし、通常、頻繁な投与（例えば、少なくとも連日注射）を必要とする場合、特に有利であろう。
【００４３】
好ましい実施形態において、本発明に係る剤および組成物は、血流へのまたは治療を必要とする部位への注入によって被験体に投与することができる。注入は、静脈内（ボーラスもしくは点滴）または皮下（ボーラスもしくは注入）、または皮内（ボーラスもしくは点滴）でありうる。
【００４４】
必要とされる剤の量がその生物学的活性および生物学的利用能により、同様に、投与方法、剤の物理化学的特性、および単剤療法として、または併用療法で用いるかに応じて決定されることは、当然であろう。投与の頻度はまた、治療される被験体での剤の半減期により影響されるであろう。投与される最適な投与量は、当業者により決定することができ、使用する特定の剤、医薬組成物の強さ、投与方法、および疾患の進行によって変化するであろう。治療される特定の被験体に応じた追加の要素は、被験体の年齢、体重、性、食生活、および投与の時間を含む、用量を調節する必要をもたらすであろう。
【００４５】
一般的に、本発明に係る剤の体重あたり０．０１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの日用量が用いられるであろう。より好ましくは、日用量は、体重あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、体重あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇである。
【００４６】
実施例で説明したように、組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートは、発病前、発病の間または発病後に投与することができる。例えば、組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートは、被験体が発病した後すぐに投与することができる。１日用量は、単一投与（例えば、１日１回の注射）として全身的に与えることができる。また、組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートは、１日に２回以上の投与を必要とするであろう。一例として、組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートは、２５ｍｇ〜７０００ｍｇ（体重７０ｋｇと仮定して）の２（または治療する疾患の重篤度に応じてそれ以上）日用量として投与することができる。治療を受ける患者は、起床時１回目の用量をとり、その後、夜に、または３もしくは４時間のインターバルで２回目の用量をとるであろう。また、持続放出性デバイスは、本発明に係る組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートの最適な用量を、反復して用量を投与する必要なく患者へ与えるために用いることができる。
【００４７】
製薬業界で一般的に採用されている方法（例えば、生体実験、臨床試験など）ような、公知の方法は、本発明に係るコンプレックスまたはアグリゲートを含む特定の製剤を形成および正確な治療計画（例えば、コンプレックスまたはアグリゲートの日用量および投与の頻度）を作成するために用いることができる。
【００４８】
したがって、本発明の第１０の態様において、第１の態様の標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたは第３の態様のアグリゲート、および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００４９】
前記組成物は、癌のような、遺伝子治療で治療可能な被験体における任意の疾患の治療的改善、予防または治療において用いることができる。
【００５０】
本発明はまた、第１１の態様において、第１０の態様に係る医薬組成物の製造方法を提供する。前記方法は、第１の態様の標的化バクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたは第３の態様のアグリゲート、および薬学的に許容される賦形剤を接触させることを含む。
【００５１】
「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、脊椎動物、哺乳類、または家畜でありうる。したがって、本発明に係る剤、組成物および薬剤は、任意の哺乳類、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために用いることができる、またはその他の獣医学の用途に用いることができる。しかし、最も好ましくは、被験体は、ヒトである。
【００５２】
「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」の剤は、被験体へ投与された際、標的の疾患を治療するために、または所望の効果をもたらす、例えば、腫瘍根絶をもたらすために、必要とされる薬剤の量である、任意の量である。
【００５３】
例えば、用いられる剤の治療上有効な量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇでありうる。
【００５４】
本明細書において、「薬学的に許容される賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、任意の公知の化合物または医薬組成物を処方するのに有用であることが当技術分野で公知である公知の化合物の組み合わせである。
【００５５】
一実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、固体であろうし、組成物は、パウダーまたはタブレットの形態であろう。固体の薬学的に許容される賦形剤は、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、防腐剤、染料、コーティング、またはタブレット崩壊剤としても作用できる１以上の物質を含むことができる。賦形剤はまた、封入材料でありうる。パウダーにおいて、賦形剤は、本発明に係る微粉化した活性剤との混合物である微粉化した固体である。タブレットにおいて、活性剤（例えば、本発明の組み換えバクテリオファージ−ポリマーハイブリッドベクターまたはアグリゲート）は、適切な割合で必要な圧縮特性を有する賦形剤と混合することができ、所望の形状およびサイズに圧縮することができる。パウダーおよびタブレットは、好ましくは、９９％までの活性剤を含む。適切な固体の賦形剤は、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む。他の実施形態において、薬学的な賦形剤は、ゲルであろうし、組成物は、クリームなどの形態であろう。
【００５６】
しかし、薬学的な賦形剤は、液体であろうし、医薬組成物は、溶液の形態であろう。液体賦形剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤および加圧組成物を調製する際に用いられる。本発明に係る組み換えバクテリオファージ−ポリマーベクターは、水、有機溶媒、両方の混合物または薬学的に許容される油もしくは脂肪のような薬学的に許容される液体賦形剤に溶解または懸濁することができる。液体賦形剤は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定化剤または浸透圧調整剤のようなその他の適切な薬学的な添加剤を含むことができる。経口および非経口投与のための液体賦形剤の適切な例は、水（上記の添加剤を一部含む、例えば、セルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコールを含む、例えばグリコール）およびそれらの誘導体、並びに油（例えば、分画されたヤシ油およびラッカセイ油）を含む。非経口投与のために、賦形剤はまた、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような油性エステルでありうる。滅菌の液体賦形剤は、非経口投与のための滅菌の液体形態組成物において有用である。加圧組成物のための液体賦形剤は、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的に許容される推進剤でありうる。
【００５７】
滅菌溶液または懸濁液である、液体の薬学的な組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、特に皮下注射によって利用することができる。組み換えバクテリオファージ−ポリマー（ハイブリッド）ベクターは、滅菌水、生理食塩水、またはそのたの適切な滅菌の注射可能な媒体用いて投与時に溶解または懸濁することができる滅菌の固体組成物として調製することができる。
【００５８】
本発明の組み換えバクテリオファージ−ポリマーコンプレックスまたはアグリゲートおよび医薬組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）を含む滅菌溶液または懸濁液、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合したソルビトールのオレイン酸エステルおよびその無水物）などの形態で経口投与することができる。本発明に係る組み換えバクテリオファージ−ポリマー（ハイブリッド）ベクターはまた、液体または固体組成物の形態のいずれかで経口投与することができる。経口投与に適切な組成物は、錠剤、カプセル、粒状、タブレット、およびパウダーのような、固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤、および懸濁液のような、液体形態を含む。非経口投与に有用な形態は、滅菌の溶液、エマルジョン、および懸濁液を含む。
【００５９】
本明細書に記載の全ての要素（添付の特許請求の範囲、要約および図のいずれを含む）および／または開示した方法またはプロセスのいずれの工程の全ては、少なくともいくつかのかかる要素および／または工程が相互に排他的である組み合わせを除き、いかなる組み合わせにおいて、上記態様のいずれとも組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
本発明のよりよい理解のため、およびどのように本発明の実施形態を効果的に実施できるかを示すため、例として、添付した図面を参照する。
【図１】図１は、本発明における、カチオン性バクテリオファージ／ポリマーハイブリッドの一実施形態の概略図である。図１ａ）は、ハイブリッドバクテリオファージ／ポリマーコンプレックスを形成するために、静電的にカチオン性ポリマーと集合した負に帯電したバクテリオファージベクターを示す。ハイブリッドベクターは、繊維状Ｍ１３バクテリオファージとカチオン性ポリマーとからなる。前記ファージは、導入遺伝子キャリアまたは真核細胞へ侵入するためのファージカプシド上の腫瘍標的ペプチドをディスプレイするベクターとして機能する。前記ポリマーは、ファージ粒子の固有の負の帯電を相殺する。図１ｂ）は、遺伝的に改変されたゲノムを有する組み換え繊維状バクテリオファージを示す。
【図２】図２は、本発明のバクテリオファージ／ポリマーハイブリッドを用いて、哺乳動物細胞の形質導入の特性評価の結果を示す。図２ａ）は、ポリマーのタイプおよび濃度の最適化を示す。Ｍ２１および９Ｌ細胞は、増加した濃度のポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）およびＤＥＡＥ．ＤＥＸとあらかじめ混合したＬｕｃ遺伝子を運ぶＲＧＤ４Ｃ−ファージで処理され、Ｌｕｃ遺伝子発現は、形質導入の３日後にルシフェラーゼアッセイを用いて測定された。図２ｂ）は、Ｍ２１および９Ｌ細胞株両方における増加した濃度のカチオン性ポリマーとコンプレックスを形成したＲＧＤ４Ｃ−ファージの細胞毒性を示す。細胞生存性（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）細胞生存性アッセイを用いて測定された。細胞生存性の割合（％）は、コントロール（［Ａ］ｔｅｓｔ／［Ａ］ｃｏｎｔｒｏｌ×１００）（ｎ＝３）のパーセンテージとして計算された。
【図３−１】図３は、本発明のバクテリオファージ／ポリマーハイブリッドがファージの遺伝子導入効率を向上させることを示す。図３ａ）は、ＰＤＬまたはＤＥＡＥ．ＤＥＸ（それぞれ、ＲＧＤ４Ｃ−ＰＤＬおよびＲＧＤ４Ｃ−ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）とあらかじめ混合されたＲＧＤ４Ｃ−ファージ、ＲＧＤ４Ｃファージのみ（ＲＧＤ４Ｃ）、および非標的化ファージ（ＮＴ）によるＭ２１および９Ｌ細胞の形質導入後のＬｕｃ遺伝子発現のキネティックを示す。ルシフェラーゼアッセイは、ベクター形質導入後５日間の時間経過にわたり、毎日行われた。図３ｂ）は、異なるベクターにより形質導入された９Ｌ（上）およびＭ２１（下）ＧＦＰ−ポジティブ細胞の数がＦＡＣＳ分析により定量化されたことを示す。ゲーティングは、選択した集団において、合計１００００イベントに設定された。
【図３−２】図３は、本発明のバクテリオファージ／ポリマーハイブリッドがファージの遺伝子導入効率を向上させることを示す。図３ｃ）は、上記の異なるベクターによる形質導入後５日目の９Ｌ細胞の代表的な蛍光画像を示す。
【図４−１】図４は、本発明のバクテリオファージ／ポリマーハイブリッドの物理化学的特性評価の結果を示す。図４ａ）は、バクテリオファージベクターの表面の化学的性質を示す。バクテリオファージのζ電位（下）は、ファージ力価（上）およびｐＨ（下）を変化させた場合について、ゼータサイザーにより計測された。図４ｂ）は、ファージ粒子サイズおよびζ電位へのＰＤＬおよびＤＥＡＥ．ＤＥＸの効果を示す。図４ｃ）は、ＲＧＤ４Ｃ−ファージおよびポリマーとコンプレックスを形成したＲＧＤ４Ｃ−ファージのサイズ分布を示す。
【図４−２】図４は、本発明のバクテリオファージ／ポリマーハイブリッドの物理化学的特性評価の結果を示す。図４ｄ）は、バクテリオファージ／ポリマーハイブリッドコンプレックスの形態を示し、ファージ単独は、共焦点顕微鏡画像を用いて分析された。バクテリオファージ粒子は、抗Ｍ１３ファージ一次抗体、その後二次ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４抗体を用いて免疫蛍光染色された。
【図５−１】図５は、バクテリオファージ／ポリマーハイブリッドの細胞形質導入のポテンシャルの特性評価の結果を示す。図５ａ）は、標的細胞へのポリマーおよびファージの個別の適用は、バクテリオファージによる遺伝子導入に何ら影響を与えないことを示す。ｂ）形質導入した細胞の上清からのファージ粒子の欠乏。
【図５−２】図５は、バクテリオファージ／ポリマーハイブリッドの細胞形質導入のポテンシャルの特性評価の結果を示す。ｃ）異なるベクターで処理した後の９Ｌ細胞の共焦点顕微鏡画像。細胞は、まず透過処理の前に、抗Ｍ１３ファージ一次およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４二次抗体を用いて、細胞外ファージのために免疫蛍光染色され、同じ一次およびヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体を用いて細胞内ファージのために染色された。
【図６−１】図６は、標的化ＲＧＤ４Ｃ−バクテリオファージ／ポリマーコンプレックスによる細胞形質導入の特異性の評価である。ａ）ＲＧＤ４Ｃ−ファージ／ポリマーによる９Ｌ腫瘍細胞への標的化遺伝子導入は、標的化するためのネガティブコントロールとして用いられる非標的化ファージ／ポリマーまたは突然変異によるＲＧＤ４Ｃ／ファージ／ポリマーのいずれかのものと比較された。ｂ）ＲＧＤ４Ｃ−ファージ／ポリマーコンプレックスによる標的化遺伝子導入は、ＰＤＬまたはＤＥＡＥ．ＤＥＸカチオン性ポリマーの濃度の増加を用いて、正常なＣ２Ｃ１２筋芽細胞の細胞株において評価された。
【図６−２】図６は、標的化ＲＧＤ４Ｃ−バクテリオファージ／ポリマーコンプレックスによる細胞形質導入の特異性の評価である。ｃ）αＶインテグリンレセプターの発現は、抗インテグリン一次およびＡｌｅｘａｓＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体を有する９Ｌ腫瘍細胞およびＣ２Ｃ１２筋芽細胞の細胞株において調査された。
【図７−１】図７は、本発明のハイブリッドファージ／ポリマーコンプレックスが、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ媒介ガン細胞の死を誘導することを示す。ａ）明視野顕微鏡で可視化された、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ（ガンシクロビル）治療後の９Ｌ細胞の形態学的特徴。ＧＳＶまたは非標的化ファージおよびＧＳＶで処理された細胞の非存在下でのコンフルエント細胞は、通常の形態を示す。
【図７−２】図７は、本発明のハイブリッドファージ／ポリマーコンプレックスが、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ媒介ガン細胞の死を誘導することを示す。ｂ）ＧＣＶの非存在または存在下での９Ｌ細胞におけるＲＧＤ４Ｃ−ファージ／ポリマーコンプレックス、ＲＧＤ４Ｃ−ファージ、および非標的化ファージによる腫瘍細胞死滅の評価。細胞生存性は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）細胞生存性アッセイによって決定された。
【図８】図８は、ハイブリッドバクテリオファージ／ポリマーベクター細胞形質導入の提唱されたメカニズムを示す。バクテリオファージカプシドは、正に帯電したポリマーと相互作用し、標的細胞へより「好ましい（ｐａｌａｔａｂｌｅ）」ものであるコンプレックスを形成する。結果として得られたコンプレックスは、正電荷を保持し、負に帯電した細胞膜表面へ結合する。ファージ／ポリマーベクターは、その後、ＲＧＤ４ＣリガンドとαＶインテグリンレセプターとの間の特異的な相互作用を通じ、レセプター介在エンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれる。
【図９】図９は、ルシフェラーゼアッセイを用いるＨＥＫ２９３細胞のＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰトランスフェクションの最適化を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、０μｇから４００μｇの範囲の、増加した濃度のＬｕｃ遺伝子を運ぶＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰで処理された。ＡＡＶＰ媒介Ｌｕｃ遺伝子発現の定量分析は、ベクターの形質導入後の３日目に行われた。結果は、３通りのウェルからの平均相対発光ユニット（ＲＬＵ）を示し、エラーバーは、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を示す。
【図１０−１】図１０は、ルシフェラーゼアッセイを用いるＨＥＫ２９３細胞における化学的に修飾されたＡＡＶＰの特徴を示す。細胞は、Ａ）Ｆｕｇｅｎｅ、Ｂ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｃ）ＤＯＴＡＰ、Ｄ）ＰＥＩ、およびＥ）塩化カルシウムの増加する濃度でのＬｕｃ遺伝子を運ぶＣＴ−ＡＡＶＰで形質導入された。Ｌｕｃ遺伝子発現は、形質導入後３日目に測定された。Ｆ）ＡＡＶＰのみ（赤）、ＡＡＶＰとＰＥＩ（１６０ｎｇ／μｇ、緑）またはＣａｐｉ共沈（３００ｍＭ  ＣａＣｌ２、紫）と組み合わせでの、５日にわたるルシフェラーゼ遺伝子発現の経時変化。３通りのサンプルが、各々の処理から得られた。実験全体は、少なくとも２回、繰り返され、同様の結果であった。代表的な結果を示す。統計は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１により作成された。
【図１０−２】図１０は、ルシフェラーゼアッセイを用いるＨＥＫ２９３細胞における化学的に修飾されたＡＡＶＰの特徴を示す。細胞は、Ａ）Ｆｕｇｅｎｅ、Ｂ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｃ）ＤＯＴＡＰ、Ｄ）ＰＥＩ、およびＥ）塩化カルシウムの増加する濃度でのＬｕｃ遺伝子を運ぶＣＴ−ＡＡＶＰで形質導入された。Ｌｕｃ遺伝子発現は、形質導入後３日目に測定された。Ｆ）ＡＡＶＰのみ（赤）、ＡＡＶＰとＰＥＩ（１６０ｎｇ／μｇ、緑）またはＣａｐｉ共沈（３００ｍＭ  ＣａＣｌ２、紫）と組み合わせでの、５日にわたるルシフェラーゼ遺伝子発現の経時変化。３通りのサンプルが、各々の処理から得られた。実験全体は、少なくとも２回、繰り返され、同様の結果であった。代表的な結果を示す。統計は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１により作成された。
【図１０−３】図１０は、ルシフェラーゼアッセイを用いるＨＥＫ２９３細胞における化学的に修飾されたＡＡＶＰの特徴を示す。細胞は、Ａ）Ｆｕｇｅｎｅ、Ｂ）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｃ）ＤＯＴＡＰ、Ｄ）ＰＥＩ、およびＥ）塩化カルシウムの増加する濃度でのＬｕｃ遺伝子を運ぶＣＴ−ＡＡＶＰで形質導入された。Ｌｕｃ遺伝子発現は、形質導入後３日目に測定された。Ｆ）ＡＡＶＰのみ（赤）、ＡＡＶＰとＰＥＩ（１６０ｎｇ／μｇ、緑）またはＣａｐｉ共沈（３００ｍＭ  ＣａＣｌ２、紫）と組み合わせでの、５日にわたるルシフェラーゼ遺伝子発現の経時変化。３通りのサンプルが、各々の処理から得られた。実験全体は、少なくとも２回、繰り返され、同様の結果であった。代表的な結果を示す。統計は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１により作成された。
【図１１】図１１は、ＰＥＩコンプレックスおよびＣａＰｉ共沈がＡＡＶＰ媒介遺伝子導入を促進するメカニズムに関する。Ａ）ＰＥＩでのＡＡＶＰのコンプレックスまたはＣａＰｉでの共沈の形成のインキュベーション時間。Ｂ）ＣＴ−ＡＡＶＰのみ、およびＰＥＩまたはＣａＰｉのいずれかとの組み合わせにより形質導入されたＨＥＫ２９３細胞の上清からの遊離細胞−非結合ＡＡＶＰ粒子のディプリーションアッセイ分析。細胞結合（左）の割合およびＥ．Ｃｏｌｉ細胞のコロニーカウントの写真を示す代表的な結果。Ｃ）ＣＴ−ＡＡＶＰのみ、ＰＥＩまたはＣａＰｉのいずれかとの組み合わせ、およびＰＢＳ溶液（コントロール）で処理されたＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析。固定化は、処理の４時間後に行われ、免疫蛍光は、材料および方法セクションで記載したように行われた。内在化（左）の割合およびＡＡＶＰのみ（赤）およびＣａＰｉ（青）で共沈されたＡＡＶＰとの間のＡＡＶＰポジティブ細胞カウントを示す代表的な結果。Ｄ）ＡＡＶＰのみ（ピンク）、ＰＥＩ（青）、ＡＡＶＰ−ＰＥＩ（緑）、およびｐＨ１０から３のブランク（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、赤）溶液の酸塩基滴定曲線。
【図１２−１】図１２は、ＡＡＶＰベクターの化学的修飾が、細胞表面吸着を促進することを示す。ＡＡＶＰ−ＰＥＩ／ＣａＰｉおよびＨＥＫ２９３細胞の共局在は、免疫蛍光染色により調査された。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉ、ＡＡＶＰ−ＰＥＩまたはＡＡＶＰのみの最適化された比率で形質導入された。４時間後、細胞は、固定化され、ウサギ抗Ｍ１３ファージ一次抗体で染色された。細胞は、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ−５９４二次抗体および核を染色するためのＤＡＰＩ（青）でファージ粒子を検出するために、対比染色された。
【図１２−２】図１２は、ＡＡＶＰベクターの化学的修飾が、細胞表面吸着を促進することを示す。ＡＡＶＰ−ＰＥＩ／ＣａＰｉおよびＨＥＫ２９３細胞の共局在は、免疫蛍光染色により調査された。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉ、ＡＡＶＰ−ＰＥＩまたはＡＡＶＰのみの最適化された比率で形質導入された。４時間後、細胞は、固定化され、ウサギ抗Ｍ１３ファージ一次抗体で染色された。細胞は、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ−５９４二次抗体および核を染色するためのＤＡＰＩ（青）でファージ粒子を検出するために、対比染色された。
【図１２−３】図１２は、ＡＡＶＰベクターの化学的修飾が、細胞表面吸着を促進することを示す。ＡＡＶＰ−ＰＥＩ／ＣａＰｉおよびＨＥＫ２９３細胞の共局在は、免疫蛍光染色により調査された。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉ、ＡＡＶＰ−ＰＥＩまたはＡＡＶＰのみの最適化された比率で形質導入された。４時間後、細胞は、固定化され、ウサギ抗Ｍ１３ファージ一次抗体で染色された。細胞は、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ−５９４二次抗体および核を染色するためのＤＡＰＩ（青）でファージ粒子を検出するために、対比染色された。
【図１２−４】図１２は、ＡＡＶＰベクターの化学的修飾が、細胞表面吸着を促進することを示す。ＡＡＶＰ−ＰＥＩ／ＣａＰｉおよびＨＥＫ２９３細胞の共局在は、免疫蛍光染色により調査された。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉ、ＡＡＶＰ−ＰＥＩまたはＡＡＶＰのみの最適化された比率で形質導入された。４時間後、細胞は、固定化され、ウサギ抗Ｍ１３ファージ一次抗体で染色された。細胞は、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ−５９４二次抗体および核を染色するためのＤＡＰＩ（青）でファージ粒子を検出するために、対比染色された。
【図１３−１】図１３は、化学的および遺伝的修飾の組み合わせがＡＡＶＰ媒介遺伝子導入をブーストすることを示す。Ａ）ＨＥＫ２９３細胞は、最適化された比率のＣａＰｉまたはＰＥＩのいずれかでプレミックスされたＬｕｃレセプター遺伝子を運ぶ、標的化ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰまたはＣＴ−ＡＡＶＰベクターで処理された。Ｌｕｃ発現は、形質導入の３日後に分析された。結果は、代表的な３通りの各処置の形質導入であり、実験は、２回繰り返された。統計は、二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、＊、ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００１により作成された。
【図１３−２】図１３は、化学的および遺伝的修飾の組み合わせがＡＡＶＰ媒介遺伝子導入をブーストすることを示す。Ｂ）ＧＦＰリポーター遺伝子を運ぶＡＡＶＰベクターで処理されたＨＥＫ２９３細胞の蛍光イメージング。
【図１４−１】図１４は、ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスを用いるＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７安定発現株の生成を示す。ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞は、最適化されたＰＥＩでプレミックスされた、ｐｕｒｏ遺伝子およびＧＦＰリポーター遺伝子を運ぶＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶベクターで処理された。安定的な形質導入細胞は、ピューロマイシン耐性を用いて選択され、コロニーで増殖された。安定な形質導入を示す、ＧＦＰポジティブ細胞は、５から１０パッセージまで培養された。Ａ）ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩとコントロールＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰとを比較するためのコロニーカウント。
【図１４−２】図１４は、ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスを用いるＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７安定発現株の生成を示す。ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７細胞は、最適化されたＰＥＩでプレミックスされた、ｐｕｒｏ遺伝子およびＧＦＰリポーター遺伝子を運ぶＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶベクターで処理された。安定的な形質導入細胞は、ピューロマイシン耐性を用いて選択され、コロニーで増殖された。安定な形質導入を示す、ＧＦＰポジティブ細胞は、５から１０パッセージまで培養された。Ｂ）ＧＦＰポジティブコロニーの形成を表す蛍光イメージング。Ｃ）５から１０パッセージでのＧＦＰポジティブ安定発現株の蛍光イメージング。
【図１５】図１５は、化学試薬と組み合わせた後のファージ遺伝子デリバリの有効性の最適化を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、４８ウェルプレートで培養され、ＲＧＤペプチドをディスプレイする標的化ファージおよびＲＧＤ４Ｃを有さないコントロールファージ（ＣＴ）で処理された。ファージは、ルシフェラーゼ遺伝子発現カセットを運び、増加する比率の化学試薬でプレミックスされた。図で示されるファージあたりの、Ａ）リン酸カルシウムおよびＢ）ＰＥＩ。ルシフェラーゼ活性は、ファージ形質導入の３日後に分析された。
【図１６】図１６は、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞株におけるファージ／ＰＥＩカチオン性ポリマーコンプレックスの最適化を示す。細胞は、４８ウェルプレートで培養され、Ｌｕｃ遺伝子発現カセットを運ぶファージで処理され、ファージあたりの、増加する比率のＰＥＩでプレミックスされた。ルシフェラーゼ活性は、形質導入の３日後に分析された。
【実施例】
【００６１】
実施例
本発明者らは、彼らが、バクテリオファージによる標的細胞への導入遺伝子の導入の最初の律速段階であると考えること、すなわち、ファージの標的細胞の表面への到達性および細胞への侵入を開始するためのレセプターへの結合、ならびにそれに続く導入遺伝子のデリバリを調査した。本発明者らは、ファージが、ファージの負に帯電した標的細胞膜への静電結合を向上するであろう、カチオン性ポリマーシステムと組み合わされた場合、ファージ媒介の遺伝子導入の有効性が向上するであろうことを提案した。本発明者らはまた、カチオン性コンポーネントが、細胞膜への結合をアシストするバクテリオファージの電荷を切りかえるためにファージカプシドと電荷的に結合し、その結果、細胞への侵入が増加し、遺伝子導入を促進するであろうことを提案した。したがって、彼らは、一般的に負に帯電しているファージのカプシドタンパク質シェルを実質的に正に帯電した表面へと作り変えた。
【００６２】
概念研究の証拠として、本発明者らは、新規ハイブリットベクター標的化プラットホーム、すなわちバクテリオファージ／カチオン性ポリマーハイブリットの実施例（下記参照）を提供する。本発明は、合成カチオン性ポリマーに結合された、ＲＧＤ４Ｃ−標的リガンドをディスプレイし、真核生物の導入遺伝子カセットを含む、組み換えＭ１３バクテリオファージからなる自己組織化したコンプレックスを含む（図１参照）。本発明者らは、ファージ−ポリマーハイブリットの物理化学的特性（表面ケミストリー、導電的な挙動、サイズ、形態）および生物学的な活性（導入遺伝子発現、細胞毒性、細胞−ベクター相互作用、およびデリバリメカニズム）を調査している。本発明者らは、驚くことに、カチオン性ポリマーとファージとの統合が、真核細胞の表面へ結合するための増加した電位および実質的に改善した遺伝子導入の有効性を示す、正に帯電したファージ粒子を正常に生成したことを観察した。重要なことに、ハイブリッドベクターによる遺伝子デリバリは、標的化および特異性を維持し、ガン細胞の標的とした消滅を完全に誘発した。
【００６３】
材料および方法
バクテリオファージベクターの構築と作製
標的化遺伝子デリバリのためのバクテリオファージ由来のベクターを生成するために、ファージは、遺伝的に操作され、（１）ｐＩＩＩマイナーコートタンパク質の、ＲＧＤ４Ｃ−腫瘍−ホーミングペプチドのコピーをディスプレイし、（２）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター駆動の導入遺伝子をコードする哺乳類の発現カセットを運ぶ。ファージウイルス粒子は、増幅され、単離されおよびＨａｊｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＡＡＶＰ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２，５２３−５３１の方法に従って、宿主細菌（大腸菌Ｋ９１）の培養上清から精製された。ファージウイルスは、０．４５μｍのフィルターを通してろ過滅菌され、その後、抵抗パルスセンシングとしても知られるコルター（ｃｏｕｌｔｅｒ）技術に基づくｑＮａｎｏ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＩＺＯＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．Ｔ．）を用いて滴定された。
【００６４】
ハイブリッドバクテリオファージ／ポリマーコンプレックスの調製
カチオン性ポリマーは、所望の濃度で、ファージベクター調製物に加えられ、穏やかに混合され、そして１５分間室温でインキュベートされ、結果として得られる本発明のバクテリオファージ／カチオン性ポリマーハイブリッドコンプレックスを形成した。ζ電位の測定は、１ｍＭ  ＫＣＬ電解質溶液中で、電気泳動に基づくＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて行われた。ζ電子のｐＨ依存性は、０．１Ｎ  ＨＣｌまたはＮａＯＨの滴定を通じて電解質溶液のｐＨを変えることにより測定された。サイズ分布はまた、ｑＮａｎｏアナライザーを用いて評価された。
【００６５】
細胞培養
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入し、ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫから購入した。ヒトＭ２１メラノーマ細胞は、Ｄｒ  Ｄａｖｉｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）から提供された。ラット９Ｌ神経膠芽腫細胞は、Ｄｒ  Ｈｒｖｏｊｅ  Ｍｉｌｅｔｉｃ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）から譲り受けた。マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞株は、Ｄｒ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍｕｎｔｏｎｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から提供された。すべての細胞株は、５％のＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気で維持され、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を追加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）で培養された。Ｃ２Ｃ１２細胞は、２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）中で増殖された。前記細胞は、７０から８０％のコンフェルトであった場合、３から４日ごとにパッセージされた。
【００６６】
ファージ由来ベクターによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞形質導入
細胞は、４８ウェルプレートに播種され、４８時間増殖し、６０％〜８０％のコンフルエンスに到達した。最適な比率で、またはファージベクターのみ（コントロールとして）で調製された、ファージ／ポリマーハイブリッドコンプレックスは、無血清培地中の細胞へ適用され、その後、３７℃で４時間インキュベートされた。培地は、その後、新たな血清含有培地と置き換えられ、細胞は、その後、導入遺伝子の発現を可能にするため３７℃でインキュベートされた。
【００６７】
通常は、ＣＴ−ＡＡＶＰをネガティブコントロールとした。ＧＦＰ発現は、Ｎｉｋｏｎデジタルカメラ（ＤＸＭ１２００Ｆ）を取り付けたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｓ蛍光顕微鏡を用いて調べられた。ファージベクターによる細胞形質導入効率の決定は、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター導入遺伝子を運ぶファージを用いることで行われた。形質導入細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現は、製造者のプロトコルに従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｓｔｅａｄｙ−ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイキットで決定され、その後、Ｐｒｏｍｅｇａプレートリーダーを用いて定量化され、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより決定されるように１００μｇのタンパク質レベルにノーマライズされた。ＧＦＰ発現は、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ蛍光顕微鏡を用いることにより毎日モニターされた。形質導入の５日後、細胞は、採取され、ＧＦＰポジティブ細胞は、標準ゲーティング技術によりＦＡＣＳフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いてカウントされた。細胞生存性は、製造者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｌｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）細胞生存性アッセイキットにより決定され、Ｐｒｏｍｅｇａプレートリーダーを用いて定量化された。すべての実験は、３回行われた。
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞死滅の決定
９Ｌ細胞は、４８ウェルプレートに播種され、６０％〜８０％のコンフルエンスに到達するために、４８時間インキュベートされた。次に、細胞は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を運ぶハイブリッドコンプレックスまたはファージベクターのみ（コントロールとして）で形質導入された。ＧＣＶは、ベクターの形質導入の３日後、細胞に加えられ（１０μＭ）、毎日置き換えられた。生存可能な細胞は、顕微鏡によりモニターされ、細胞生存性は、ＣｅｌｌＴｉｔｌｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）細胞生存性アッセイキットを用いることでＧＣＶ処理の５日後、測定された。
【００６９】
共焦点顕微鏡検査
ＨＥＫ２９３細胞は、１２ウェルプレート中の１８ｍｍ２のカバースリップに播種された。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＴ−ＡＡＶＰベクターとインキュベートされ、適切な比率の形質導入サポート試薬とコンプレックスを形成した。ＣＴ−ＡＡＶＰ単独は、ネガティブコントロールとして用いられた。４時間のインキュベーション後、約５０〜６０％のコンフルエンスで、ＨＥＫ２９３細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、１０から１５分間、室温で４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー中で固定され、αＶインテグリンを染色した。ファージ染色のために、細胞は、４時間３７℃でファージベクターとインキュベートされ、その後、ＰＢＳで洗浄され、４％のＰＦＡで固定された。固定後、次に細胞は、固定から遊離のアルデヒド基をクエンチするために、５分間、５０ｍＭアンモニウムクロリドで処理され、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で透過処理され、洗浄され、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックされた。次に、細胞は、一次抗体：ウサギ抗αＶインテグリン（１：５０希釈）、ウサギ抗Ｍ１３バクテリオファージ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）で１時間インキュベートされ、その後４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１％ＢＳＡ中１：２０００希釈）を含む／含まない二次ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲート抗体（１％のＢＳＡ−ＰＢＳ中１：７５０希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１時間室温でインキュベートされた。最後に、細胞は、ＤＡＰＩの存在下、Ｍｏｗｉｏｌマウンティング培地にマウントされた。
【００７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ディプリケーションアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞は、４８ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの密度で播種され、７０〜８０％コンフルエントまで成長させ、最適な比率に調製されたＡＡＶＰで処理された。プレートは、ＡＡＶＰ内在化を抑制するために１時間、氷上に置かれた。上清は、抽出され、１×ＰＢＳで段階希釈された。ＡＡＶＰ粒子の数は、Ｋ９１  Ｋａｎバクテリア感染法を用いておよび既に報告された［１１］、形質導入ユニットをカウントすることで定量化された。
【００７１】
フローサイトメトリー
ＨＥＫ２９３細胞は、１２ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェルの密度で播種され、７０〜８０％コンフルエントまで増殖された。細胞は、次に、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉ共沈物、ＡＡＶＰ−ＰＥＩまたはＡＡＶＰのみで処理され、２時間３７℃でインキュベートされた。エンドサイトーシスは、氷上に細胞を置くことにより停止され、非結合ファージを除去するためにＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞は、表面結合ファージを除去するために５分間トリプシン処理され（ｔｒｙｐｉｎｉｓｅｄ）、５分間２００ｒｐｍの遠心分離によりペレット化され、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、１０分間室温で固定された。ＡＡＶＰ内在化を調べるために、細胞は、３０分間、２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中の０．１％サポニンでブロックされた。細胞は、その後、１時間室温で１％ＢＳＡ−ＰＢＳの０．１％サポニン中、ウサギ抗Ｍ１３ファージ抗体（１：１０００希釈）でインキュベートされた。細胞ペレットは、１％ＢＳＡ−ＰＢＳの０．１％サポニンに再懸濁されることにより洗浄され、３回遠心分離され、その後、暗闇の中、１時間室温でヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７（１：５００希釈）とインキュベートされた。最後に細胞は、０．１％サポニン−ＰＢＳで２回洗浄され、分析前ＰＢＳに再懸濁された。
【００７２】
ＦＡＣＳ分析は、アルゴンイオンレーザー（４８８ｎｍ）および赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）を備えたＢＤ  ＦＡＣｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｎｃｅｓ）を用いて行われた。平均蛍光強度は、３重ウェルあたり少なくとも１０，０００ゲート細胞について測定された。結果は、Ｆｌｏｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアを用いて分析された。
【００７３】
エンドソーム緩衝能測定
酸塩基滴定法は、合計２０ｍｌ、水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ）でｐＨ１０に調整されたｐＨの滅菌水中の最適化された比率に調製されたＡＡＶＰ−ＰＥＩのエンドソーム緩衝能を決定するために用いられた。塩化水素溶液（ＨＣｌ）のその後の添加は、ｐＨの変化をｐＨメーターを用いて記録しながらｐＨ３まで溶液を滴定するために用いられた。塩化ナトリウム溶液（ＮａＣｌ）、ポリマー溶液およびＡＡＶＰ溶液の滴定は、コントロールとして用いられた。天然のエンドソームｐＨ範囲７．４〜５．１は、ＡＡＶＰ／ポリマーコンプレックスのエンドソーム緩衝能を算出するために用いられた。
【００７４】
統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０）を用いて行われた。エラーバーは、標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を示す。Ｐ値は、ＡＮＯＶＡにより生成され、以下のように表される：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
実施例１−ファージとカチオン性ポリマーの融合は、ファージベースベクターによる哺乳類細胞への遺伝子導入をブーストする
本発明者らは、ファージウイルス粒子がカチオン性ポリマーと統合した場合、ＲＧＤ４Ｃファージによる真核細胞への導入遺伝子デリバリの効率が改良できるかどうかを評価した。したがって、本発明者らは、本発明に係るＲＧＤ４Ｃ−ファージ／ポリマーコンプレックス（図１参照）がＲＧＤ４Ｃリガンドの高レベルのαＶインテグリンレセプターを発現すると知られる、ヒトＭ２１メラノーマ細胞を形質導入する効率を研究した。観察された効果が細胞または種特異的ではないという可能性を除外するために、本発明者らはまた、以前にＲＧＤ４Ｃファージにより形質導入されることが示された、ラット９Ｌ神経膠芽腫細胞での新規ファージ生成物の有効性を評価した。本発明者らは、最初に、細胞あたり１０５粒子に固定したＲＧＤ４Ｃファージを保持し、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター遺伝子を運ぶＲＧＣ４Ｃファージベクターを用いて増加する濃度のカチオン性ポリマーを加えることによりカチオン性ポリマーとＲＧＤ４Ｃファージとの最適な比率を決定しようとした。本発明者らはまた、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）、ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリブレンおよびプロタミンサルフェートのような、様々なカチオン性ポリマーの適合性を評価した。形質導入の７２時間後のＭ２１および９Ｌ細胞におけるルシフェラーゼ活性の定量は、図２ａに示すように、ＲＧＤ４Ｃファージのみ（０μｇ／ｍｌのポリマー）と比較して、ＲＧＤ４ＣファージによるＬｕｃ遺伝子発現がＰＤＬおよびＤＥＡＥ．ＤＥＸの増加した濃度で飛躍的に向上したことを示した。最大遺伝子導入レベルは、Ｌｕｃ遺伝子発現の徐々に減少させた後（図２ａ参照）、それぞれＰＤＬでは７μｇ／ｍｌおよびＤＥＡＥ．ＤＥＸでは１５μｇ／ｍｌのポリマー濃度でＭ２１および９Ｌ細胞の両方において達成された。高比率のカチオン性ポリマーで減少した導入遺伝子発現がＰＤＬおよびＤＥＡＥ．ＤＥＸ細胞毒性に関連するかどうかを決定するために、本発明者らは、細胞生存性アッセイを行い、この範囲のポリマー濃度がいかなる毒性効果と関連しないことを示した（図２ｂ参照）。
【００７５】
次に、本発明者らは、Ｍ２１および９Ｌ細胞の形質導入後の５日間の期間にわたってハイブリッドＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスによる遺伝子導入の有効性を評価するために適切な濃度のＰＤＬおよびＤＥＡＥ．ＤＥＸポリマーを用いた（図３ａ参照）。４つの異なるベクターシステム：非標的化ファージ（ＮＴ）、ｐＩＩＩマイナーコートタンパク質上の腫瘍標的化リガンドをディスプレイする標的化ＲＧＤ４Ｃファージ（ＲＧＤ４Ｃ）、ＰＤＬとコンプレックスを形成したＲＧＤ４Ｃファージ（ＲＧＤ４Ｃ−ＰＤＬ）、およびＤＥＡＥ．ＤＥＸとコンプレックスを形成したＲＧＤ４Ｃファージ（ＲＧＤ４Ｃ−ＤＥＡＥ．ＤＥＸ）が評価された。Ｌｕｃ導入遺伝子の発現における大幅な増加は、図３ａにおいて示されるように、ハイブリッドＲＧＤ４Ｃ−ＰＤＬおよびＲＧＤ４Ｃ−ＤＥＡＥ．ＤＥＸファージ／ポリマーコンプレックスで形質導入されたＭ２１および９Ｌ細胞において検出された。Ｌｕｃ遺伝子発現がＲＧＤ４Ｃファージ単独によって形質変換された細胞内で低く維持され、Ｌｕｃ遺伝子発現がコントロールの非標的化ファージでインキュベートされた細胞において検出されなかった一方、Ｌｕｃ遺伝子発現は、継時的に急速に増加した。
【００７６】
カチオン性ポリマーと組み合わされたＲＧＤ４Ｃファージベクターの優位性を探るために、本発明者らは、ＧＦＰリポーター導入遺伝子を運ぶファージを用いた。形質導入の５日後、Ｍ２１および９Ｌ細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析および顕微鏡イメージングは、ファージ／ポリマーコンプレックスで処理したものでのＧＦＰ発現において大幅な増加を明らかにした（図３ｂ、ｃで示す）。ＧＦＰ発現は、コントロールの非標的化ファージで処理された細胞において検出されなかった。これらのデータは、カチオン性ポリマーとバクテリオファージとの統合が、遺伝子導入の効率を有意にブーストすることを裏付ける。
【００７７】
実施例２−ハイブリッドファージ／ポリマーコンプレックスの物理的特性
実施例１で示したハイブリッドファージ／ポリマーコンプレックスによる改善した遺伝子導入のメカニズムへの洞察を得るために、本発明者らは、ファージカプシド上の静電荷を探った。本発明者らは、最初に、電気泳動を用いてζ電位を測定することによってバクテリオファージのウイルス粒子の帯電特性を調査した（図４ａ参照）。本発明者らは、バクテリオファージが生理学的ｐＨで負に帯電していることを発見した。データは、ＲＧＤ４Ｃファージがζ電位＝ｆ（ｐＨ）から決定されるｐＨ＝３の等電点をもつ酸性表面を有することを示す。次に、本発明者らは、カチオン性ポリマーＰＤＬおよびＤＥＡＥ．ＤＥＸとのハイブリダイゼーション後、バクテリオファージベクターのζ電位を分析した（図４ｂ参照）。本発明者らは、この電位が、非修飾バクテリオファージの、負の値からポリマーとコンプレックスが形成されたファージの、正の値へシフトすることを発見した。これは、ポリマーが関連するバクテリオファージの帯電を変更することを強く示唆する。このζ電位の増加は、バクテリオファージ粒子の固有の負電荷を打ち消すポリマーの表面吸着に帰することができる。
【００７８】
カチオン性ポリマーがより大きな粒子の形成をもたらすファージウイルスのアグリゲーションを導くという仮説を証明するために、本発明者らは、第２のセットの実験を行った。最適なポリマー濃度（７μｇ／ｍｌ）でのファージ／ＰＤＬコンプレックスのサイズ測定は、図４ｂ、４ｃに示すように、ファージ単独より７倍である粒子の平均直径を明らかにした。さらに、サイズ分布は、ＲＧＤ４Ｃファージおよびカチオン性ポリマーの自己組織化が単分散生成物を生みだすことを示す（図４ｃ参照）。本発明者らはまた、共焦点顕微鏡によりファージ／ポリマーコンプレックスの外観を調べた。図４ｄに示すように、ファージがＰＤＬポリマーと混合された場合、２つの形態が観察された一方、繊維状ファージ形態の単一粒子は、非コンプレックスファージで観察された。これらは、多くのファージ粒子を含むコンプレックス種、または個々のファージウイルス粒子のいずれかから構成された。
【００７９】
実施例３−ファージ／ポリマー細胞到達性および侵入の調査
ファージ／ポリマーコンプレックスによる改善した遺伝子デリバリ有効性へのさらなる洞察を得るために、本発明者らは、コンプレックス形成が細胞の処理に先駆けて必要かどうかを調査した。したがって、９Ｌ細胞は、３０分間カチオン性ポリマーのみで処理され、その後、ＲＧＤ４Ｃファージの添加前、過剰なポリマーを除去し、洗浄された。本発明者らは、ＲＧＤ４Ｃファージに続くカチオン性ポリマーの分離適用が、あらかじめ形成したファージ／ポリマーコンプレックスと比較して遺伝子デリバリの有効性に有意な影響を与えないことを発見した（図５ａ参照）。これらのデータは、ファージとポリマーとをあらかじめインキュベーションすることが本発明にかかるファージ／ポリマーハイブリッドコンプレックスのアクティブな形成のために必要とされることを示唆する。
【００８０】
本発明者らはまた、ＲＧＤ４Ｃファージによる遺伝子デリバリの効率が非効率なアクセスおよび細胞表面への結合により限定されるかどうかを決定した。本発明者らは、上清−ティプリーションアッセイを行い、接着細胞層の上の外部の液体相における遊離細胞−非結合ファージは、宿主のバクテリアの感染によって定量され、その後コロニーがカウントされた。多量の遊離ファージ（インプットファージ粒子の９０％）は、ＲＧＤ４Ｃファージベクターで処理された細胞の上清から回収され（図５ｂ参照）、ごく一部（インプットファージの１０％）が細胞表面に結合したことを示す。対照的に、ファージのほんの少し（６％）が、ＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスでインキュベートされた細胞の上清から回収され、ＲＧＤ４Ｃファージの大部分（９４％）が細胞の表面に結合したことを示す。ファージのディプリーションは、コントロールの非標的化ファージで処理した細胞の上清では観察されなかった。抗ファージ抗体との免疫蛍光に続き、共焦点顕微鏡イメージングは、非コンプレックス形成ファージでインキュベートされたものよりもファージ／ポリマーコンプレックスで処理した細胞において、より多くの細胞表面に結合することを明らかにした。ファージは、コントロールの非標的化ファージでインキュベートされた細胞上には観察されなかった（図５ｃ参照）。これらのデータは、カチオン性ポリマーへの組み込みによるファージカプシド電位の変化が確かに細胞表面への増加したファージの結合であり、また静電反発力による細胞外の到達性バリアを乗り越えるのに役立つことを強く示唆する。
【００８１】
実施例４−ファージ／ポリマーハイブリッドコンプレックスは標的化および遺伝子導入の特異性を維持する
本発明者らは、ＲＧＤ４Ｃファージベクターの標的化特性がファージ／ポリマーコンプレックスにおいて無傷のまま維持され、細胞の形質導入が特異的であり、ＲＧＤ４ＣリガンドのαＶインテグリンレセプターへの結合によって媒介されたことを確認した。ＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスの細胞形質導入の有効性は、前記ポリマーおよび非標的化ファージまたはＲＧＤ４Ｃの変異バージョン（ＲＧＥ４Ｃ、Ｄ−−−Ｅ）をディスプレイするファージのいずれかとの間のコンプレックスのものと比較された。図６ａに示すように、ＲＧＥ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスで処理した細胞におけるＬｕｃ遺伝子発現は、非特異的であって、非特異的ファージ／ポリマーコンプレックスのものと同質である。次に、αＶインテグリンレセプターを欠如する通常細胞ではなく、特異的に腫瘍細胞への遺伝子デリバリを標的とするＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスの能力を確認するために、本発明者らは、ＰＤＬまたはＤＥＡＥ．ＤＥＸカチオン性ポリマーのいずれかの増加する濃度と混合されたＲＧＤ４Ｃファージを用いて９Ｌ腫瘍細胞および通常のＣ２１２筋芽細胞マウス細胞株の形質導入の有効性を比較した。ＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスが９Ｌ細胞におけるＬｕｃ導入遺伝子発現の予測されたパターンを再現する一方、導入遺伝子発現は、図６ｂに示すように、ＲＧＤ４Ｃ／ファージおよびＰＤＬまたはＤＥＡＥ．ＤＥＸポリマーのいずれかの両方の任意の比率によりＣ２Ｃ１２細胞において誘発されなかった。最後に、本発明者らは、９Ｌ腫瘍細胞でのαＶインテグリンレセプターの発現を確認した。一方、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞マウス細胞株は、このインテグリンを発現しない（図６ｃ参照）。これらの発見は、ＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスによる遺伝子デリバリが標的化され、特異的であり、αＶインテグリンレセプターに依存することを確認する。
【００８２】
実施例５−ハイブリッドバクテリオファージ／ポリマーコンプレックスによるＨＳＶｔｋガンシクロビル（ＧＣＶ）媒介細胞死の促進
カチオン性ポリマーとバクテリオファージベクターとの統合が、上記のとおり、実質上遺伝子導入の効率を増加することを確立した後、本発明者らは、その後、ファージの特異的な臨床応用、すなわち遺伝子治療へのポリマーの効果を評価した。ＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスの腫瘍細胞根絶の有効性をテストするために、本発明者らは、導入遺伝子として働く、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を運ぶＲＧＤ４Ｃファージベクターを構築した。ＧＣＶプロドラッグと組み合わせた際、この遺伝子は、自殺遺伝子として機能することができる。本発明者らは、腫瘍タイプが非常に攻撃的であり、主要な臨床課題であるため、９Ｌグリオブラストーマモデルにおいて実験を行うことを選択した。本発明者らは、ＲＧＤ４Ｃファージベクター単独（コントロールとして）と本発明に係るＲＧＤ４Ｃファージ／ポリマーコンプレックスとを比較した。ＨＳＶｔｋ自殺遺伝子治療は、５日間のＧＣＶでの毎日の処理による形質導入の３日後に誘発された。ＧＣＶ処置後３日の９Ｌ細胞の形態学的特徴は、明視野顕微鏡によって視覚化された。図７は、全ての処理における、ＧＣＶの不在下で、および非標的化ファージとＧＣＶとの組み合わせで処理した細胞における、コンフルエント細胞の通常の形態を示す。コンプレックスを形成しないＲＧＤ４Ｃファージと比較して、ＧＣＶ処理時、ＲＧＤ４Ｃ／ファージポリマーにより基質から離れた細胞の数における劇的な増加があった。ＧＣＶ処理の５日後、細胞生存性アッセイ（図７ｂ参照）は、コンプレックスを形成しないＲＧＤ４Ｃファージで形質導入された細胞における７５％の細胞死を明らかにしたが、ＰＤＬまたはＤＥＡＥ．ＤＥＸポリマーのいずれかとコンプレックスを形成したＲＧＤ４Ｃ／ファージによって腫瘍細胞の完全な根絶を明らかにした。細胞死は、ＧＣＶの不在下、または非標的化ファージで処理された細胞において検出されなかった。これらの発見は、バクテリオファージとカチオン性ポリマーとの組み合わせが遺伝子治療ベクターとしてのポテンシャルを大幅に増加することを明確に証明する。
【００８３】
実施例６−トランスフェクション試薬は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶＰ媒介遺伝子導入を促進する
細胞を形質転換する場合、比較的高い力価のＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ（細胞あたり１×１０６粒子まで）が必要とされる（図９参照）。これらのベクターの比較的低い形質導入効率は、少なくとも部分的に、ＡＡＶＰにより標的化されるレセプターの能力から生じうる。細胞表面レセプターの数およびそれらの有用性は、標的化化合物のホーミング効率を決定する。本発明者らは、増加する量のＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰの形質導入効率が濃度依存的に増加しないが、代わりに約１．５×１０５ＲＬＵまたは３００倍超のＣＴ−ＡＡＶＰベクターで２５ｍｇ  ＡＡＶＰの遺伝子発現の飽和につながることを見出した。この現象は、ＡＡＶＰにより媒介された効率的な導入遺伝子デリバリを制限する。
【００８４】
導入遺伝子発現が化学修飾により改善しうるかどうかを決定するために、形質導入支持剤は、Ｌｕｃ遺伝子を運ぶＣＴ−ＡＡＶＰベクターとあらかじめ混合された。形質導入の３日後のルシフェラーゼ活性の分析は、Ｌｕｃ発現がＣＴ−ＡＡＶＰ単独と比較して試薬の増加した濃度で大幅に改善したことを明らかにした（図１０参照）。ＣＴ−ＡＡＶＰおよび脂質ベースの試薬の混合物を有するＨＥＫ２９３細胞を感染させることは、用量依存的にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬｕｃ発現を促進した（図１０Ａから１０Ｃ）。Ｌｕｃ発現の最大レベルで、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬は、１μｌ／μｇで、導入遺伝子活性を７０倍改善した；リポフェクタミン（図１０Ａ参照）は、１μｌ／μｇで、導入遺伝子活性を８０倍改善した（図１０Ｂ参照）；ＤＯＴＡＰは、４，２００ｎｇ／μｇで、導入遺伝子活性を２０倍増やした（図１０Ｃ参照）。カチオン性ポリマー、ＰＥＩ、およびＣａＰｉ（それぞれ図１０Ｄおよび１０Ｅ）のために、Ｌｕｃ発現は、最大ＰＥＩで１６０ｎｇ／μｌおよびＣａＣｌ２で３００ｍＭに到達する試薬の増加する濃度で増加し、その後徐々に減少した。最適な比率で、明らかな細胞毒性は、光学顕微鏡および細胞生存性アッセイを用いて検出されなかった（データ示さず）。試薬のＰＥＩおよびＣａＰｉは、２０〜８０倍と比較して１，３００から１，４００倍に至る脂質ベース試薬と比較してより高い形質導入効率を誘導した。したがって、ＰＥＩおよびＣａＰｉは、ＡＡＶＰ媒介遺伝子デリバリのさらなる研究のために選択された。
【００８５】
次に、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション後５日間の期間にわたってＡＡＶＰによる遺伝子導入の効率を評価するために最適な比率のＰＥＩおよびＣａＰｉを用いた（図１０Ｆ参照）。Ｌｕｃ発現の有意な増加は、かろうじて検出可能なレベルの遺伝子発現を誘発した、ＣＴ−ＡＡＶＰ単独と比較して経時変化で急速に増加したＡＡＶＰ−ＰＥＩおよびＡＡＶＰ−ＣａＰｉで形質導入された細胞において検出された。したがって、ＰＥＩおよびＣａＰｉは、化学的に修飾されたＡＡＶＰベクターによって媒介された形質導入の明白なメカニズムを決定するためにその後の研究で選択された。
【００８６】
実施例７−ＰＥＩコンプレックスおよびＣａＰｉ共沈物がＡＡＶＰ媒介遺伝子導入を促進するメカニズム
ＣａＰｉおよびＰＥＩは、ウイルスと細胞膜との間の相互作用を促進する
細胞表面への結合の欠如は、ＡＡＶＰ媒介遺伝子導入を制限する重要な要素である。以前の研究では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞への結合および取り込みのためにＡＡＶＰカプシドでディスプレイされた、ＲＧＤ４Ｃリガンドの重要な役割を明らかにしている。したがって、本発明者らは、共沈されたＡＡＶＰベクターによる導入遺伝子の促進された効率は、細胞膜および増加した内在化をターゲットにするためのウイルス吸着への影響による可能性が高いという仮説をさらにテストした。
【００８７】
ＨＥＫ２９３細胞は、最適化した濃度のＰＥＩおよびＣａＰｉであらかじめ混合されたＣＴ−ＡＡＶＰで処理され、ＣＴ−ＡＡＶＰ単独と比較された（図１１参照）。抗Ｍ１３ファージ染色（赤）を用いた免疫蛍光イメージングは、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉ沈殿物およびＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスが、共沈物またはコンプレックスが観察されないコントロールのＣＴ−ＡＡＶＰ単独と比較して増加した細胞吸着を示す細胞表面膜で共局在することを明らかにした。
【００８８】
この結果は、外部の水相における遊離細胞非結合ＡＡＶＰ粒子が宿主バクテリアの感染およびコロニー解析を通じてカウントされた、上清−ティプリーションアッセイを行うことにより定量された。ＡＡＶＰ単独で処理されたＨＥＫ２９３細胞において、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉおよびＰＥＩとコンプレックスを形成したベクターで共沈化されたＡＡＶＰベクターで処理された細胞の上清から回収されたたった９％のＡＡＶＰとは対照的に、１００％の遊離した非結合ＡＡＶＰは、上清から回収され、ＡＡＶＰ−ＣａＰｉおよびＡＡＶＰ−ＰＥＩの大部分が細胞の表面に結合したことを示している（図１２Ｂ参照）。このデータは、ＣａＰｉまたはＰＥＩを有するＡＡＶＰとコンプレックスとの統合が少なくとも一部において、ＡＡＶＰを細胞表面へ結合できることおよび細胞外到達性バリアを克服することにより哺乳類細胞への遺伝子導入を媒介することを強く示唆する。
【００８９】
次に、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞を用いるＣａＰｉおよびＰＥＩでの化学修飾後、ＡＡＶＰの増加した細胞への取り込みがあるかどうかを決定することを開始した。ＡＡＶＰ内在化アッセイは、細胞内ＡＡＶＰが染色され、その後定量化フローサイトメトリーにより行われた。ＰＥＩおよびＣａＰｉ共沈物の添加は、増加したＡＡＶＰカウント／１０，０００細胞と同様に、より高い細胞内ＡＡＶＰシグナルにより示されるように、ＡＡＶＰ内在化を増加することが可能であった（図１２Ｃ参照）。したがって、これらの結果は、細胞内の区画での内在化ＡＡＶＰの蓄積を強調している。
【００９０】
緩衝能
エンドソーム脱出は、遺伝子デリバリベクターのデザインのために考慮される重要な要素である。このメカニズムは、ベクターが酸性化エンドソーム区画における細胞外環境から輸送される、７．４から５．０のｐＨ範囲での遺伝子ベクターの緩衝能と関連する。高い緩衝能を有するポリカチオンは、「プロトンスポンジ効果」と呼ばれるメカニズムを介して酸性エンドソームによりトリガーとされたエンドソームから細胞質ゾルへの効率的な脱出を媒介することができる。エンドソーム−リソソーム経路は、酸性環境に隔離および分解された、ＡＡＶＰ粒子への細胞内バリアとして確認され、核内へのＤＮＡをデリバリする能力を減少させる。以前には、ＰＥＩのようなカチオン性ポリマーはエンドソーム脱出を誘導する能力により非ウイルスベクターの遺伝子導入の効率を増加することが報告されていた。したがって、本発明者らは、ＡＡＶＰ−ＰＥＩの増加した遺伝子導入デリバリに寄与する、増加した表面吸着から離れ、潜在的な第２のメカニズムがあるのかどうかを調査した。我々のＡＡＶＰ−ＰＥＩがこの特性を有するかどうかを評価するために、酸塩基滴定は、ＡＡＶＰ単独、ＰＥＩ単独およびコントロールの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液のＡＡＶＰ−ＰＥＩと比較するために行われた（図１２Ｄ参照）。ＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスは、ＰＥＩポリマー単独と同様に、緩衝能を誘発し、７．４から５．１へのｐＨを低下するためにコントロールのＮａＣｌと比較して余分な〜０．２ｍｌ  ＨＣＬを必要とした（図１２Ｄ参照）。ＰＥＩの非存在下におけるＡＡＶＰは、ＮａＣｌと同様の滴定曲線を示し、したがってポリマーの存在なしでは緩衝能を有さない。
【００９１】
実施例８−組み合わせられた遺伝的および化学的修飾は、ＡＡＶＰの遺伝子導入をさらに促進する
ＣａＰｉおよびＰＥＩポリマーを有するＡＡＶＰベクターの化学的修飾が遺伝子デリバリの効率を増加することは明らかである；本発明者らは、次に、ベクターコンプレックスへの遺伝子ターゲッティングの取込がさらなる促進を導くかどうかを決定しようとした。ＡＡＶＰベクターは、標的化癌遺伝子治療への応用のために哺乳類細胞をターゲットにするために元来開発された。標的のペプチドリガンド、環状ＲＧＤ４Ｃは、マイナーコートタンパク質ＰＩＩＩ上にディスプレイされるために操作されることにより、ベクター（ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ）が癌細胞で高く発現された、αＶインテグリンレセプターを発現する哺乳類細胞へ侵入することを可能にした。したがって、本発明者らは、増加する濃度のＣａＣｌ２およびＨＥＫ２９３細胞において、Ｌｕｃレポーター遺伝子を運ぶ、標的化ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰベクターを有するカチオン性ポリマーＰＥＩの統合の影響を調査した。ＨＥＫ２９３細胞は、それらがαＶインテグリンをディスプレイし、以前標的化ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰの統合のために用いられていることから、選択された。
【００９２】
ＣａＰｉまたはＰＥＩのいずれかを有する、ＡＡＶＰベクターの遺伝子導入の効率は、最適化された比率の各トランスフェクション試薬を用いて評価された。標的化ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰベクターで処理されたＨＥＫ２９３細胞は、ＰＥＩのみがＣＴ−ＡＡＶＰ単独と比較した場合、遺伝子発現を優位に増加させたことおよび５，５００倍の増加をもたらしたことを明らかにした（図１３参照）。ＣａＰｉは、標的化ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰと共沈化した際、有意な増加をもたらさなかった（図１３Ａ参照）。図１３Ｂは、ＧＦＰレポーター遺伝子を運ぶ、ＣＴ−ＡＡＶＰおよびＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰの代表的なデータを提供し、ＰＥＩとコンプレックスを形成したまたはＣａＰｉと共沈化した際、ＡＡＶＰベクターの優位性をさらに強調する。
【００９３】
これらのデータは、標的化リガンドの取り込まれたカチオン性ポリマーＰＥＩがＡＡＶＰ媒介形質導入のための最も高い効率を提供することを明らかに示す。したがって、ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰとＰＥＩとの組み合わせは、ＭＣＦ−７乳癌細胞株の形質導入のために選択された（図１６参照）。
【００９４】
実施例９−応用：安定発現株生産
ＡＡＶＰベクターの化学的および遺伝的修飾の両方の組み合わせが遺伝子導入効率を大きく促進することは示されており、我々は、どのように我々の新規ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスが科学的研究に利用できるのかを明らかにすることを最後に試みた。本発明者らは、安定発現株生産のために用いることによりＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスにより媒介された導入遺伝子発現の有効性を決定することを目的とした。新規ベクターシステムが特定の細胞株に特異的ではないことを示すために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞と同様にヒトＭＣＦ−７細胞株を形質導入することにした。ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ−７細胞は、クローンを単離するためにピューロマイシン耐性を用いることにより、安定的に形質導入された細胞株を生産するためにＧＦＰレポーター遺伝子およびピューロ遺伝子を運ぶ、ＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩベクターで形質導入された（図１４参照）。ＰＥＩとＲＧＤ４Ｃ−ＡＡＶＰとの組み合わせは、ＣＴ−ＡＡＶＰ−ＰＥＩコンプレックスと比較して得られたクローンの数を著しく増加した（図１４Ａ参照）。クローンがピューロマイシン耐性により単離されるとすぐに、それらは、分割され、培養され、継代された。図１４Ｃは、ＧＦＰポジティブ細胞が５〜１０パッセージを通じて維持された、ＨＥＫ２９３およびＭＣＦ７安定発現株の成功した生産を示す。ＡＡＶゲノムがいったん核内に入るとエピソーム形態において長期間の導入遺伝子発現を与えるため、安定細胞株生産は、ＡＡＶＰベクターにより可能である。
【００９５】
考察
いくつかの魅力的な特徴にもかかわらず、バクテリオファージウイルスは、遺伝子導入のための貧弱なベクターであるといまだ考えられており、このことは、ナノテクノロジー、生物学および医学のような、専門分野の広い範囲におけるそれらの適用を制限する。しかし、本発明者らは、ファージ遺伝子導入効率がバクテリオファージと動物ウイルスの性状とを組み合わせることにより改善できることを以前報告している。これは、動物ウイルスＡＡＶ−２からの遺伝子のシスエレメント（ＩＴＲｓ）のファージゲノムへの取り込みにより示されており、変化した導入遺伝子カセットおよびそれに続く改善した遺伝子デリバリ効率をもたらした。かかる遺伝的な改善のみは、ゲノムの核への移行に続き関連している。したがって、ベクターの結合、侵入、および細胞内移動は、律速を維持する。第１の、および間違いなく最も重要なこれらのステップは、内在化および遺伝的荷重の核への転送に先立つベクターの標的細胞表面への結合である。本発明者らは、この最初の律速を改善するために非常に効果的な方法を現在示している。細胞への結合を妨げるように思われる１つの要因は、ファージおよび細胞表面の両方により通常帯びている負電荷の間の静電反発力である。本発明者らは、改良したファージとカチオン性ポリマーとのコンプレックスを形成することによりこれを弱めている。したがって、この新規バクテリオファージ由来ベクタープラットホームは、遺伝的および化学的修飾の組み合わせに基づいている。
【００９６】
本発明者らは、適切な比率でのあるタイプのカチオン性ポリマーの遺伝子組み換えファージへの添加が導入遺伝子発現を著しく改善できる自己組織化コンプレックスの形成を導くことを示している。かかるファージ／ポリマーコンプレックスによる哺乳類細胞への形質導入は、特異性および標的化を維持し、ＲＧＤ４ＣリガンドのαＶインテグリンレセプターへの結合を通じて起こる。プレインキュベーションおよびアグリゲーション工程は、重要であると思われる。減少した導入遺伝子発現は、非常に高いポリマー濃度で観察されたが、このことはいかなる検出可能な細胞毒性活性と関連していなかった；それは、細胞内在化の有効性を減少するより大きなアグリゲートの形成に起因する可能性がある。
【００９７】
本発明者らは、細胞表面への非コンプレックスファージベクターの親和性が静電効果によって弱められることを確認している。メジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩの負に帯電したアミノ酸残基（Ｇｌｕ２、Ａｓｐ４、およびＡｓｐ５）は、標的細胞の細胞膜での同じ電荷によってある程度結果的に反発された、非コンプレックスファージウイルス粒子上の全体的に大きな負の電荷の原因となっている。しかし、正に帯電したポリマーの添加は、これをうまく弱め、ベクター−細胞結合を大幅に改善する全体的に正の電荷を与える。
【００９８】
本発明者らはまた、臨床応用のために、この新たに開発されたファージ−ポリマーベクターの可能性を示した。癌遺伝子治療のためのプロドラッグＧＣＶと組み合わせて用いられる、自殺ＨＳＶｔｋ遺伝子の移行を著しく改善している。酵素のチミジンキナーゼは、プロドラッグＧＣＶをＧＣＶモノフォスフェートへとリン酸化し、その後さらに細胞毒性ＧＣＶトリフォスフェートへリン酸化され、ＤＮＡポリメラーゼの阻害を介してプログラムされた細胞死を導く。ハイブリッドファージ／ポリマーコンプレックスを用いるＨＳＶｔｋ遺伝子導入後のＧＣＶの添加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの癌細胞の完全な根絶に繋がった。
【００９９】
さらに、すべてのカチオン性トランスフェクション試薬が同じ程度、遺伝子導入を増加するわけではない。ＣａＰｉと同じく、カチオン性ポリマー、ＰＥＩは、最大の増加をもたらし、カチオン性脂質ベース試薬が続くことは明らかである。これらの結果を基にして（実施例６）および脂質ベース試薬の価格を考慮すると、この方法は、好ましくないと思われる。
【０１００】
ＰＥＩおよびＣａＰｉは、化学的に修飾されたＡＡＶＰベクターにより媒介された形質導入の明白なメカニズムを決定するためのその後の研究のために選択された。カチオン性ポリマーとアデノウイルス、レトロウイルスおよびＡＡＶとのコンプレックス化は、増加した細胞吸収および特異的なウイルスレセプターの欠如による感染への耐性があるいくつかの細胞タイプにおける取り込みによって形質導入効率を改善することが報告されている。さらに、これらのウイルスベクターの形質導入効率は、共沈物を形成するためにウイルスとリン酸カルシウム（ＣａＰｉ）を有するウイルスの取り込みにより増加された。これらの研究は、ＣａＰｉ共沈物がウイルス結合および細胞による取り込みを増加することを示した。同様に、本発明者らは、ＡＡＶＰベクターの形質導入効率がカチオン性ポリマーおよびＣａＰｉの共沈によってもたらされた改善した細胞表面吸着および細胞侵入に起因して増加することを示した。
【０１０１】
これらの結果は、増加したＡＡＶＰ媒介形質導入効率がファージと細胞膜との間の引力相互作用により起こるだけではなく、エンドソームから脱出するＡＡＶＰ粒子をアシストできるＰＥＩの高い緩衝能によっても起こることを示す。ＰＥＩは、分子に存在する遊離アミノ基の存在によって引き起こされた、エンドソームの緩衝能に起因するエンドソーム脱出を引き起こす可能性を有することが以前示されている。
【０１０２】
興味深いことに、本発明者らは、細胞接着を促進するためのカチオン性ポリマーの取り込みと同じく、レセプター媒介エンドサイト―シスを誘導するために標的化リガンドのコートタンパク質への挿入を含む、ＡＡＶＰの２つのカプシドの修飾が形質導入効率をさらに改善することを示した。本研究において、ＲＧＤ４ＣをディスプレイするＡＡＶＰベクターとコンプレックスを形成したカチオン性ポリマーＰＥＩの使用は、αＶインテグリン発現細胞株におけるＡＡＶＰ媒介形質導入のための最高の効率を提供する。
【０１０３】
参考文献
【０１０４】
【化１】
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【０１０５】
【化２】
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【０１０６】
【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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