(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO: 5に示されるアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110をそれぞれ含む重鎖可変領域配列の重鎖相補性決定領域（H-CDR）1、H-CDR2、およびH-CDR3、ならびにSEQ ID NO: 6に示されるアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97をそれぞれ含む軽鎖可変領域配列の軽鎖相補性決定領域（L-CDR）1、L-CDR2、およびL-CDR3（m830）
を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、TEM8に特異的に結合し、かつ中和する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
重鎖可変領域が、SEQ ID NO: 5に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO: 6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、
それぞれ、SEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6
に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントがヒトフレームワーク領域を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
IgGである、請求項1〜5のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項記載の抗原結合フラグメント。
【請求項８】
Fv、Fab、F(ab')2、scFv、またはscFV2フラグメントである、請求項7記載の抗原結合フラグメント。
【請求項９】
エフェクター分子または検出可能マーカーにコンジュゲートされている、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
エフェクター分子が、抗血管新生剤、化学療法剤、および／または毒素である、請求項9記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
毒素が、メイタンシノイド毒素またはオーリスタチン毒素である、請求項10記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
メイタンシノイド毒素が、DM1であり；かつ／または
オーリスタチン毒素が、モノメチルオーリスタチンE（MMAE）もしくはモノメチルオーリスタチンF（MMAF）である、
請求項11記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
リンカーによりエフェクター分子にコンジュゲートされている、請求項9〜12のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
リンカーが、選択的に切断可能なペプチドリンカーなどの切断可能リンカーである、請求項13記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
リンカーがカテプシン切断可能リンカーである、請求項14記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
リンカーが切断不能リンカーである、請求項13記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
検出可能マーカーが、蛍光マーカー、酵素マーカー、重金属マーカー、または放射性マーカーである、請求項16記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１９】
キメラ抗原受容体をコードする、請求項18記載の核酸分子。
【請求項２０】
請求項18または請求項19記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２１】
キメラ抗原受容体T細胞の作製における使用のための、請求項20記載のベクター。
【請求項２２】
請求項18〜21のいずれか一項記載の核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２３】
T細胞である、請求項22記載の宿主細胞。
【請求項２４】
有効量の請求項1〜23のいずれか一項記載の抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、または抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項２５】
治療有効量の請求項1〜24のいずれか一項記載の抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物
を含む、腫瘍を有する対象を処置するための薬学的組成物であって、
免疫複合体を形成するために十分な条件下での該組成物の投与による免疫複合体の形成により、対象における腫瘍が処置される、薬学的組成物。
【請求項２６】
治療有効量の追加の剤をさらに含む、請求項25記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
追加の剤が抗血管新生剤である、請求項26記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
追加の剤が化学療法剤である、請求項26記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
腫瘍が、結腸直腸がん、皮膚がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、または頭頸部がんである、請求項25〜28のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
腫瘍量の減少のために有効である、請求項25〜28のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
腫瘍成長の減少のために有効である、請求項25〜28のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
腫瘍が、TEM8の細胞表面発現が増大した細胞を含む腫瘍微小環境にある、請求項25〜28のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記細胞が、内皮細胞または間質細胞である、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
有効量の請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメントと対象由来の細胞とを、免疫複合体を形成するのに十分な条件下でインビトロで接触させる工程；および
対象由来の細胞上の免疫複合体の存在を検出する工程であって、対象由来の細胞上の免疫複合体の存在が、対象におけるTEM8の細胞表面発現を有する細胞の存在を示す、工程
を含む、対象におけるTEM8の細胞表面発現を有する細胞の存在を検出する方法。
【請求項３５】
内皮細胞が、対象由来の生物学的サンプル中にある、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、内皮細胞、腫瘍間質細胞、および／または腫瘍細胞である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が内皮細胞であり、対象におけるTEM8を発現する内皮細胞の存在の検出が、対象における病的な血管新生を検出する、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
対象におけるTEM8を発現する内皮細胞の存在の検出が、対象における腫瘍を検出する、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
有効量の請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗原結合フラグメント
を含む、細胞に対する炭疽防御抗原の結合を低減させるための薬学的組成物であって、
免疫複合体を形成するために十分な条件下での該組成物と細胞との接触による免疫複合体の形成により、細胞に対する炭疽防御抗原の結合が低減する、薬学的組成物。
【請求項４０】
対象における病的な血管新生を検出するか、対象における腫瘍を処置するか、または細胞に対する炭疽防御抗原の結合を低減させるためのキットであって、請求項1〜24のいずれか一項記載の抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物を含む容器と、該キットを使用するための指示とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2013年10月11日に出願された米国仮出願第61/889,958号に対する優先権を主張し、その全体を参照により組み入れる。
【０００２】
開示の分野
本願は、がんの分野に関連し、特にTEM8に特異的に結合する抗体、抗原結合フラグメント、およびコンジュゲート、ならびにそれらの使用に関連する。
【０００３】
共同研究協定関係者
本発明は、National Institutes of Health National Cancer InstituteとBiomed Valley Discoveries, Inc.の間のPublic Health Service Cooperative Research and Development Agreement (PHS-CRADA)第02744号の下でなされたものである。
【背景技術】
【０００４】
背景
既存の血管から血液血管網を発生させるプロセスである血管新生は、固形腫瘍の成長に必須であり、かつ正常な創傷治癒および成長プロセスの一要素である。それは、アテローム発生、関節炎、乾癬、角膜新血管形成および糖尿病性網膜症を含む多くの疾患および状態の病態生理学にも関与する。血管新生因子は、悪性腫瘍の進展に重要な役割を果たしている。
【０００５】
腫瘍内皮マーカー8（TEM8）は、炭疽毒素受容体1（ANTXR1）としても公知の、1回貫通型の細胞表面糖タンパク質であり、元々は、多くの他の関連しない腫瘍内皮マーカーと共に、ヒト結腸直腸がんの腫瘍血管系に沿って並ぶ内皮細胞におけるその過剰発現に基づき同定された。TEM8はまた、炭疽毒素の細胞表面受容体として機能し、炭疽毒素タンパク質にとっての第2の受容体であるCMG2（ANTXR2としても公知）と58%のアミノ酸同一性を共有している。VEGF、VEGFRおよび多くの他の重要な血管新生調節因子と異なり、TEM8は、発生上の血管新生、創傷治癒または黄体の正常な生理学的血管新生には必要とされない。TEM8は、マウスおよびヒトの両方において、様々な腫瘍タイプの腫瘍血管で上方調節され、いくつかの腫瘍では、腫瘍細胞によっても発現される。TEM8を標的とする化学療法剤および細胞表面上のTEM8に特異的に結合する高親和性抗体に対する要望が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
概要
細胞表面上のTEM8に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル中和抗体、そのような抗体の抗原結合フラグメント、そのコンジュゲート、開示されている抗体またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメインを含むCARを発現するキメラ抗原受容体（CAR）T細胞、およびこれらの分子を使用する方法が提供される。いくつかの態様において、このコンジュゲートは、TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに共有結合により連結されたエフェクター分子または検出可能マーカーを含む。いくつかの態様において、この抗体またはコンジュゲートは、TEM8を発現する対象由来の内皮細胞を検出する方法において使用される。いくつかの態様において、TEM8を発現する対象由来の内皮細胞の検出は、対象における病的な血管新生を検出する。他の態様において、この抗体およびコンジュゲートは、腫瘍、例えばがん腫を検出および／または処置する方法において使用される。さらに他の態様において、この抗体およびコンジュゲートは、細胞に対する炭疽防御抗原（PA）の結合を低減させる方法において使用される。
【０００７】
この抗体、コンジュゲート、CAR T細胞、およびそれらの使用方法は、本明細書に詳細に記載されている個別の状況を超えて有用であることが理解されるであろう。例えば、本方法は、様々な場面で、例えば対象においてTEM8を発現する内皮細胞を検出する上で、対象において腫瘍を処置する上で、または細胞に対する炭疽PAの結合を低減させる上で、有用であると考えられる。
【０００８】
[本発明1001]
（a）SEQ ID NO: 1に示される重鎖可変領域の重鎖相補性決定領域（H-CDR）1、H-CDR2、およびH-CDR3、ならびにSEQ ID NO: 2に示される軽鎖可変領域の軽鎖相補性決定領域（L-CDR）1、L-CDR2、およびL-CDR3（m825）；
（b）SEQ ID NO: 3に示される重鎖可変領域配列のH-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3、ならびにSEQ ID NO: 4に示される軽鎖可変領域配列のL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3（m822）；
（c）SEQ ID NO: 5に示される重鎖可変領域配列のH-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3、ならびにSEQ ID NO: 6に示される軽鎖可変領域配列のL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3（m830）；または
（d）SEQ ID NO: 7に示される重鎖可変領域配列のH-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3、ならびにSEQ ID NO: 8に示される軽鎖可変領域配列のL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3（m863）
のうちの1つを含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、TEM8に特異的に結合し、かつ中和する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
[本発明1002]
（a）H-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106を含み、かつL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 2のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97を含む（m825）か；
（b）H-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 3のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106を含み、かつL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 4のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97を含む（m822）か；
（c）H-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 5のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110を含み、かつL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 6のアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97を含む（m830）か；または
（d）H-CDR1、H-CDR2、およびH-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 7のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110を含み、かつL-CDR1、L-CDR2、およびL-CDR3が、それぞれ、SEQ ID NO: 8のアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97を含む（m863）、
本発明1001の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1003]
重鎖可変領域が、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、またはSEQ ID NO: 7に示されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または本発明1002の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1004]
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、またはSEQ ID NO: 8に示されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または本発明1002の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1005]
重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、
（a）それぞれ、SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2；
（b）それぞれ、SEQ ID NO: 3およびSEQ ID NO: 4；
（c）それぞれ、SEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6；または
（d）それぞれ、SEQ ID NO: 7およびSEQ ID NO: 8
に示されるアミノ酸配列を含む、本発明1001または本発明1002の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1006]
モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントがヒトフレームワーク領域を含む、本発明1001〜1005のいずれかの抗体。
[本発明1007]
IgGである、本発明1001〜1006のいずれかの抗体。
[本発明1008]
本発明1001〜1006のいずれかの抗原結合フラグメント。
[本発明1009]
Fv、Fab、F(ab')2、scFv、またはscFV2フラグメントである、本発明1008の抗原結合フラグメント。
[本発明1010]
エフェクター分子または検出可能マーカーにコンジュゲートされている、本発明1001〜1009のいずれかの抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1011]
エフェクター分子が、抗血管新生剤、化学療法剤、および／または毒素である、本発明1010の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1012]
毒素が、メイタンシノイド毒素またはオーリスタチン毒素である、本発明1011の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1013]
メイタンシノイド毒素が、DM1であり；かつ／または
オーリスタチン毒素が、モノメチルオーリスタチンE（MMAE）もしくはモノメチルオーリスタチンF（MMAF）である、
本発明1012の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1014]
リンカーによりエフェクター分子にコンジュゲートされている、本発明1010〜1013のいずれかの抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1015]
リンカーが、選択的に切断可能なペプチドリンカーなどの切断可能リンカーである、本発明1014の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1016]
リンカーがカテプシン切断可能リンカーである、本発明1015の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1017]
リンカーが切断不能リンカーである、本発明1014の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1018]
検出可能マーカーが、蛍光マーカー、酵素マーカー、重金属マーカー、または放射性マーカーである、本発明1017の抗体または抗原結合フラグメント。
[本発明1019]
本発明1001〜1009のいずれかの抗体または抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
[本発明1020]
キメラ抗原受容体をコードする、本発明1019の核酸分子。
[本発明1021]
本発明1019または本発明1020の核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1022]
キメラ抗原受容体T細胞の作製における使用のための、本発明1021のベクター。
[本発明1023]
本発明1019〜1022のいずれかの核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1024]
T細胞である、本発明1023の宿主細胞。
[本発明1025]
式Iの抗体薬物コンジュゲートであって、
0006502931.tif 000002
式中、Aは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（H-CDR）1、H-CDR2、およびH-CDR3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 2のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（L-CDR）1、L-CDR2、およびL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、TEM8に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであり；
Sは、該抗体の硫黄原子であり；かつ
nは、1〜10の整数である、
抗体薬物コンジュゲート。
[本発明1026]
重鎖可変領域が、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域が、SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列を含む、本発明1025の抗体薬物コンジュゲート。
[本発明1027]
nが2〜8の偶数である、本発明1025または本発明1026の抗体薬物コンジュゲート。
[本発明1028]
nが2〜4の偶数である、本発明1025または本発明1026の抗体薬物コンジュゲート。
[本発明1029]
有効量の本発明1001〜1028のいずれかの抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、または抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
[本発明1030]
腫瘍を有するかまたは腫瘍の危険がある対象を選択する工程；および
治療有効量の本発明1001〜1029のいずれかの抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物を、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で対象に投与する工程であって、免疫複合体の形成が対象における腫瘍を処置する、工程
を含む、腫瘍を有する対象を処置する方法。
[本発明1031]
治療有効量の追加の剤を対象に投与する工程をさらに含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
追加の剤が抗血管新生剤である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
追加の剤が化学療法剤である、本発明1031の方法。
[本発明1034]
腫瘍が、結腸直腸がん、皮膚がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、または頭頸部がんである、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
腫瘍の処置が、腫瘍量の減少を含む、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1036]
腫瘍の処置が、腫瘍成長の減少を含む、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1037]
腫瘍が、TEM8の細胞表面発現が増大した細胞を含む腫瘍微小環境にある、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記細胞が、内皮細胞または間質細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
有効量の本発明1001〜1009のいずれかの抗体または抗原結合フラグメントと対象由来の細胞とを、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程；および
対象由来の細胞上の免疫複合体の存在を検出する工程であって、対象由来の細胞上の免疫複合体の存在が、対象におけるTEM8の細胞表面発現を有する細胞の存在を示す、工程
を含む、対象におけるTEM8の細胞表面発現を有する細胞の存在を検出する方法。
[本発明1040]
接触させる工程がインビボである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
接触させる工程がインビトロである、本発明1039の方法。
[本発明1042]
内皮細胞が、対象由来の生物学的サンプル中にある、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記細胞が、内皮細胞、腫瘍間質細胞、および／または腫瘍細胞である、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記細胞が内皮細胞であり、対象におけるTEM8を発現する内皮細胞の存在の検出が、対象における病的な血管新生を検出する、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1045]
対象におけるTEM8を発現する内皮細胞の存在の検出が、対象における腫瘍を検出する、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1046]
有効量の本発明1001〜1009のいずれかの抗体または抗原結合フラグメントと細胞とを、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程であって、免疫複合体の形成が細胞に対する炭疽防御抗原の結合を低減させる、工程
を含む、細胞に対する炭疽防御抗原の結合を低減させる方法。
[本発明1047]
有効量の抗体または抗原結合フラグメントと細胞とを接触させる工程が、該細胞を含む対象への治療有効量の抗体または抗原結合フラグメントの投与を含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
対象における病的な血管新生を検出するか、対象における腫瘍を処置するか、または細胞に対する炭疽防御抗原の結合を低減させるためのキットであって、本発明1001〜1029のいずれかの抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物を含む容器と、該キットを使用するための指示とを含む、キット。
[本発明1049]
対象において腫瘍を処置するための、本発明1001〜1029のいずれかの抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物の使用。
[本発明1050]
対象においてTEM8を発現する内皮細胞の存在を検出するための、本発明1001〜1029のいずれかの抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物の使用。
[本発明1051]
細胞に対する炭疽防御抗原の結合を阻害するための、本発明1001〜1029のいずれかの抗体、抗原結合フラグメント、核酸分子、ベクター、宿主細胞、抗体薬物コンジュゲート、または組成物の使用。
前述のおよび本願開示の特徴および利点は、添付図面を参照しつつ進められる下記の詳細な説明からより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】TEM8またはCMG2を発現する細胞に対するヒトTEM8抗体m825およびm822の結合のフローサイトメトリーアッセイの結果を示す、一連のグラフである。CMG2は、TEM8の最も近いヒトホモログである。
【図１Ｂ】TEM8またはCMG2を発現する細胞に対するヒトTEM8抗体m830およびm863の結合のフローサイトメトリーアッセイの結果を示す、一連のグラフである。CMG2は、TEM8の最も近いヒトホモログである。
【図２】ヒトIgG1形式のm825抗体を用いた腫瘍血管の免疫蛍光染色を示す、一連のデジタル画像を示している。野生型（WT）およびTEM8ノックアウト（TEM8 KO）マウスに、DLD-1結腸がん細胞を皮下接種した。異種移植腫瘍の形成後に、腫瘍由来のサンプルを取得して、CD31抗体（血管に特異的）およびm825抗体（TEM8に特異的）で染色した。m825抗体は、免疫蛍光によりDLD-1腫瘍血管を染色した。
【図３】胸腺欠損ヌードマウスにおけるUACC黒色腫細胞異種移植片の成長の、m825抗体による阻害を示すグラフである。マウスに、UACC黒色腫細胞を皮下接種し、m825抗体、対照IgG、または対照ビヒクルを、グラフ上に矢印により示されている各々の日に、20または40 mg/Kgの用量でマウスに投与した。
【図４】m825抗体が、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させたHCT116結腸がん細胞異種移植片の成長を阻害することを示すグラフである。マウスに、HCT116結腸がん細胞を皮下接種し、m825抗体、対照IgG、または対照ビヒクルを、グラフ上に矢印により示されている各々の日に、15 mg/Kgの用量でマウスに投与した。
【図５】胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させたUACC黒色腫細胞異種移植片の成長の、抗TEM8抗体による阻害を示すグラフである。マウスに、UACC黒色腫細胞を皮下接種し、完全ヒトIgG1形式のm825、m822、m830、およびm863抗体を、1週間に3回、15 mg/Kgの用量でマウスに投与した。
【図６Ａ】m830抗体での処置が、動物モデルにおいて肝臓への結腸がんの転移を阻害することを示す一連のデジタル画像である。図6Aは、ヒト結腸がん細胞の脾臓内注射を施された胸腺欠損ヌードマウスの生物発光画像化を示す。
【図６Ｂ】m830抗体での処置が、動物モデルにおいて肝臓への結腸がんの転移を阻害することを示すグラフである。生物発光シグナルを定量した（図6B）。
【図７】MMAE毒素にコンジュゲートされた完全ヒトm825抗体を含む抗体薬物コンジュゲートの、組み換えTEM8（AP-TEM8）およびTEM8を過剰発現するCHO細胞（CHO TEM8）に対する結合を示すグラフである。TEM8を発現しないCHO細胞（CHO）を、陰性対照として使用した。
【図８】MMAE毒素にコンジュゲートされた完全ヒトm825抗体を含む抗体薬物コンジュゲートが、TEM8発現細胞に対して選択的に細胞傷害性であることを示すグラフである。HEK 293細胞（293）またはTEM8をトランスフェクトしたHEK 293細胞（293/TEM8）を、MMAE単独（MMAE）、m825単独（抗TEM8）、またはMMAEにコンジュゲートされた完全ヒトm825抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（抗TEM8-MMAE）で処置した。MMAE毒素は、293および293/TEM8細胞の両方に対して細胞傷害性であったが、抗体薬物コンジュゲートは、293/TEM8細胞に対して選択的に細胞傷害性であった。
【図９】MMAEにコンジュゲートされた完全ヒトm825抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（m825-MMAE）での処置後の、ヒト結腸がん異種移植片の退縮を示すグラフである。結腸がん異種移植片（HCT116細胞）を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させた。マウスに、示された量（mg/kg、mpk）のビヒクル、m825抗体単独（M825）、またはm825-MMAEを、1週間に2回、3週間にわたって投与した。
【図１０】MMAEにコンジュゲートされた完全ヒトm825抗体を含む抗体薬物コンジュゲートでの処置後の、ヒト卵巣がん異種移植片の退縮を示すグラフである。卵巣がん異種移植片（OVCAR3細胞）を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させた。マウスに、示された量（mg/kg、mpk）のビヒクル、m825抗体単独（M825）、MMAE単独、またはm825-MMAEを、1週間に2回、3週間半にわたって投与した。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
添付の配列表に列挙されている核酸およびアミノ酸の配列は、37 C.F.R. 1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基については標準的な文字略記、アミノ酸については3文字記号を用いて示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、表示されている鎖に対するあらゆる参照にはその相補鎖も含まれることを理解されたい。配列表は、2014年10月1日に作製された「Sequence.txt」という名のファイルの形式においてASCIIテキストファイルとして提出されており（およそ28 kb）、これは参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表において、
SEQ ID NO: 1は、m825 mAbの重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000003
SEQ ID NO: 2は、m825 mAbの軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000004
SEQ ID NO: 3は、m822 mAbの重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000005
SEQ ID NO: 4は、m822 mAbの軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000006
SEQ ID NO: 5は、m830 mAbの重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000007
SEQ ID NO: 6は、m830 mAbの軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000008
SEQ ID NO: 7は、m863 mAbの重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000009
SEQ ID NO: 8は、m863 mAbの軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
0006502931.tif 000010
SEQ ID NO: 9は、ヒトTEM8タンパク質をコードする例示的なcDNA配列である（GENBANK（登録商標）アクセッション番号NM_032208.2、2013年9月10日にデータベース中に存在したものが参照により本明細書に組み入れられる）。
SEQ ID NO: 10は、ヒトTEM8のタンパク質配列である（GENBANK（登録商標）アクセッション番号NP_115584.1、2013年9月10日にデータベース中に存在したものが参照により本明細書に組み入れられる）。
SEQ ID NO: 11は、m825 mAbの重鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000011
SEQ ID NO: 12は、m825 mAbの軽鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000012
SEQ ID NO: 13は、m822 mAbの重鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000013
SEQ ID NO: 14は、m822 mAbの軽鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000014
SEQ ID NO: 15は、m830 mAbの重鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000015
SEQ ID NO: 16は、m830 mAbの軽鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000016
SEQ ID NO: 17は、m863 mAbの重鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000017
SEQ ID NO: 18は、m863 mAbの軽鎖可変領域をコードする例示的なcDNA配列である。
0006502931.tif 000018
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
I．用語一覧
別途記載されない限り、技術用語は、従来的な使用法にしたがって使用される。分子生物学の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press発行, 1999；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.発行, 1994；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.発行, 1995；ならびに他の類似した参照文献において見出され得る。
【００１２】
本明細書において使用される際、単数形「1つの（a、an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに別の方法で示さない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、「抗原」という用語は、単一または複数の抗原を含み、「少なくとも1つの抗原」という句と同等と考えられ得る。本明細書において使用される際、「含む（comprises）」という用語は、「含む（includes）」を意味する。したがって、「抗原を含む（comprising）」は、他の要素を排除することなく「抗原を含む（including）」ことを意味する。「および／または」という句は、「および」もしくは「または」を意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる任意のおよびすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびにすべての分子量（molecular weightまたはmolecular mass）の値は、近似値であり、別の方法で示されない限り、説明の目的で提供されることが、さらに理解されるべきである。本明細書に記載されているものと類似または等価の多くの方法および材料を、使用することができるが、特定の適した方法および材料を下記で説明する。矛盾する場合は、本明細書が、用語の説明を含めて、支配することになる。加えて、材料、方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。様々な態様の閲覧を容易にするため、以下の用語の説明を提供する。
【００１３】
投与：任意の有効な経路によって、剤、例えば、TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体、例えばコンジュゲート、を含む組成物、を対象に提供または与えること。例示的な投与経路には、経口、注射（例えば、皮下、筋内、皮内、腹腔内および静脈内）、舌下、直腸、経皮（例えば、局所）、鼻腔内、膣内および吸入経路が含まれるがこれらに限定されない。
【００１４】
剤：ある目的または結果を達成するために有用な任意の物質または物質の任意の組み合わせ；例えば、対象における病的な血管新生を低減または減少させるのに有用な物質または物質の組み合わせ。剤には、エフェクター分子および検出可能マーカーが含まれる。いくつかの態様において、剤は、検出可能マーカー、化学療法剤、毒素または抗血管新生剤である。当業者は、特定の剤が、2以上の結果を達成するのに有用であり得ること；例えば、ある剤が、検出可能マーカーおよび抗血管新生剤の両方として有用であり得ることを理解しているであろう。
【００１５】
血管新生：既存の血管からの出芽または成長を通じて新しい血管を生成する生物学的プロセス。このプロセスは、既存の管からの内皮細胞の遊走および増殖を伴う。血管新生は、出生前および出生後の発達の間にならびに成体において起こる。血管新生は、メスの生殖器系の正常な周期の中で、創傷治癒、および固形腫瘍の成長のために必須となる病的プロセス、例えばがんにおいて起こる（見直しをする場合には、Battegay, J. Molec. Med., 73(7): 333-346, 1995; Shchors and Evan, Cancer Res., 67:1630-1633. 2007を参照のこと）。
【００１６】
炭疽：炭疽菌（Bacillus anthracis）という細菌、特にそれが産生する毒素によって引き起こされる急性の疾患。炭疽毒素は、3つのタンパク質成分：（i）防御抗原（PA）、（ii）浮腫因子（EF）および（iii）致死因子（LF）、の混合物である。炭疽毒素の細胞侵入には、PAが、宿主細胞上のその2つの細胞表面受容体であるANTXR1（aka TEM8）またはANTXR2（CMG2受容体としても公知）の一方に結合することが必要となる（例えば、Van der Goot and Young, Mol. Aspects Med. 30(6): 406-412, 2009; Moayeri and Leppla, Curr Opin Microbiol 7(1): 19-24, 2004を参照のこと）。
【００１７】
炭疽防御抗原（PA）：炭疽菌によって分泌される、浮腫因子（EF）および致死因子（LF）と共に炭疽毒素を形成するタンパク質。炭疽毒素の細胞侵入には、PAが、宿主細胞上のその2つの細胞表面受容体であるANTXR1（TEM8としても公知）またはANTXR2（CMG2受容体としても公知）の一方に結合することが必要となる（例えば、Van der Goot and Young, Mol. Aspects Med. 30(6): 406-412, 2009; Moayeri and Leppla, Curr Opin Microbiol 7(1): 19-24, 2004を参照のこと）。プロテアーゼ切断の後、PAは、2つの有毒な酵素（EFおよびLF）に結合し、それらが病原性の効果を発揮する場所である細胞質ゾルへのそれらの移動を媒介する（Bradley et al., Nature 414: 225, 2001）。小さな切断された63 kDのPAレムナント（PA63）はオリゴマー化し、第2結合ドメインを露出し、89 kDタンパク質のEFと結合して浮腫毒素を形成するかまたは90 kDタンパク質のLFと結合して致死毒素（LeTx）を形成し（Leppla et al., Salisbury Med. Bull. Suppl. 68: 41-43, 1990）、そしてこの複合体が細胞にインターナライズされ、エンドソーム系に進入する（Singh et al., Infect. Immun. 67: 1853, 1999; Friedlander, J. Biol. Chem. 261: 7123, 1986）。これらのエンドソームから、PA63チャネルは、pHおよび電位依存的メカニズムによって、LFおよびEFを細胞質ゾルに移行させることができる（Zhao et al., J. Biol. Chem., 270: 18626, 1995）。いくつかの態様において、本明細書に開示されるTEM8特異的抗体またはTEM8特異的抗体を含むコンジュゲートは、TEM8に対するPAの結合をブロックすることができる。1つの例において、PAは、2013年9月19日にアクセスした時点でGENBANK（登録商標）アクセッション番号AAF86457で示されていたアミノ酸配列を含む。
【００１８】
抗血管新生剤：血管新生を低減または減少させる分子、例えば、病的な血管新生を低減する分子。いくつかの例において、TEM8に特異的に結合する抗体またはそのような抗体を含むコンジュゲートが、病的な血管新生を低減する抗血管新生剤である。さらなる抗血管新生剤には、血管内皮成長因子（VEGF）抗体（例えば、ベバシズマブ）および血管内皮成長因子受容体（VEGFR2）抗体（例えばDC101ハイブリドーマ（ATCC No. HB-11534）によって産生されるDC101）、または低分子（例えば、DMXAA（バジメザンまたは5,6-ジメチル-9-オキソ-9H-キサンテン-4-イル）-酢酸としても公知、Novartis International AG, Basal, CHおよびSigma Corp., St. Louis, MOから入手可能）が含まれるがこれらに限定されない（Albini et al., Nat. Rev. Clin. Oncol., 9:498-509, 2001も参照のこと）。
【００１９】
抗体：TEM8タンパク質またはTEM8の抗原性フラグメントなどの非分析物（抗原）に特異的に結合して認識するポリペプチド。「抗体」という用語は、最も広い意味で本明細書において使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、包含する。
【００２０】
抗体の非限定的な例には、例えば、インタクトの免疫グロブリン、ならびに、抗原に対する結合親和性を保持する、当技術分野において公知のその変種およびフラグメントが含まれる。抗体フラグメントの例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体フラグメントには、全抗体の修飾によって製造された抗原結合フラグメント、または組み換えDNA方法論を用いて新規合成されたもののいずれかが含まれる（例えば、Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010を参照のこと）。
【００２１】
一本鎖抗体（scFv）は、遺伝学的に融合された単一鎖分子として適当なポリペプチドリンカーによって連結された1つまたは複数の抗体のVHおよびVLドメインを含有する、遺伝子操作された分子である（例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426, 1988；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5879-5883, 1988；Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250；Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010を参照のこと）。scFvにおけるVHドメインおよびVLドメインの分子内配向は、典型的には、scFvにとって決定的ではない。したがって、両方の可能な配置（VHドメイン-リンカードメイン-VLドメイン； VLドメイン-リンカードメイン-VHドメイン）を有するscFvが、使用され得る。
【００２２】
dsFvにおいては、重鎖および軽鎖の可変鎖に、鎖の会合を安定化させるジスルフィド結合を導入するように変異が加えられている。VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間での対形成ができない程度に十分短いリンカーが用いられており、そのためこれらのドメインが別の鎖の相補的ドメインと対形成するように強制され、2つの抗原結合部位が作製される、二価の二重特異性抗体であるダイアボディもまた、含まれる。（例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6444-6448, 1993；Poljak et al., Structure, 2: 1121-1123, 1994を参照のこと）。
【００２３】
抗体にはまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体（ヒト化マウス抗体など）およびヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体など）も含まれる。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)；Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997も参照のこと。
【００２４】
参照抗体としての「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照抗体の結合を50％またはそれより多くブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいてその抗原に対する抗体の結合を50％またはそれより多くブロックする。抗体競合アッセイは公知であり、例示的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００２５】
抗体は、1つまたは複数の結合部位を有し得る。1つより多い結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であってもよいし、または異なっていてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、2つの同一の結合部位を有し、一本鎖抗体またはFabフラグメントは、1つの結合部位を有するが、二重特異性または二機能性抗体は、2つの異なる結合部位を有する。
【００２６】
典型的に、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続されている重（H）鎖および軽（L）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに、無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。2つのタイプの軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する、5つの主要な重鎖のクラス（またはアイソタイプ）：IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEが存在する。
【００２７】
各重鎖および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメイン；例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6.sup.th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと）を含有する。様々な態様において、重鎖および軽鎖の可変領域は、組み合わさって、抗原に特異的に結合する。追加の態様においては、重鎖可変領域のみが必要とされる。例えば、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科動物の抗体は、軽鎖の非存在下で機能的でありかつ安定である（例えば、Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993；Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996を参照のこと）。「VH」または「VH」への言及は、Fv、scFv、dsFvまたはFabなどの抗原結合フラグメントのものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「VL」または「VL」への言及は、Fv、scFv、dsFvまたはFabのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
【００２８】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域によって分断されている「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、CDRを3次元空間において配置し、整列させる役割を有する。
【００２９】
CDRは、主として、抗原のエピトープに対する結合を担っている。所与のCDRのアミノ酸配列の境界は、Kabatら（"Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991；「Kabat」ナンバリングスキーム）、Al-Lazikaniら（JMB 273, 927-948, 1997；「Chothia」ナンバリングスキーム）、およびLefrancら（"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003；「IMGT」ナンバリングスキーム）によって記載されているものを含む、数多くの周知のスキームのいずれかを用いて容易に決定することができる。各鎖のCDRは、典型的に、CDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ（N末端からC末端へ）、かつまた、典型的に、個々のCDRが位置する鎖によっても同定される。したがって、VHCDR3は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン由来のCDR3であるのに対して、VLCDR1は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のCDR1である。軽鎖CDRは、時には、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と呼ばれる。重鎖CDRは、時には、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と呼ばれる。
【００３０】
「モノクローナル抗体」は、単一クローンのBリンパ球によって、または単一の抗体（もしくはその抗原結合フラグメント）の抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がその中にトランスフェクトされている細胞、またはその子孫によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッドの抗体形成細胞を作製することによって産生される。これらの融合細胞およびその子孫は、「ハイブリドーマ」と呼ばれる。いくつかの例において、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響しない保存的アミノ酸置換を有し得る（例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)を参照のこと）。
【００３１】
「ヒト化」抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトのフレームワーク領域、および非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）の抗体または抗原結合フラグメント由来の1つまたは複数のCDRを含む。CDRを提供する非ヒトの抗体または抗原結合フラグメントは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒトの抗体または抗原結合フラグメントは、「アクセプター」と呼ばれる。1つの態様において、すべてのCDRは、ヒト化免疫グロブリン中で、ドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要がないが、存在する場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば少なくとも約85〜90％、例えば約95％またはそれより多く同一であることができる。したがって、おそらくCDRを除いて、ヒト化抗体または抗原結合フラグメントのすべての部分は、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。
【００３２】
「キメラ抗体」とは、典型的には異なる種である、2つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。いくつかの例において、キメラ抗体は、1つのヒト抗体由来の1つまたは複数のCDRおよび／またはフレームワーク領域、ならびに別のヒト抗体由来のCDRおよび／またはフレームワーク領域を含む。
【００３３】
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」とは、ヒトゲノムの（またはそれに由来する）配列に基づくものを含み、別の種の配列を含まない抗体である。いくつかの態様において、ヒト抗体は、ヒトゲノムの（またはそれに由来する）CDR、フレームワーク領域、および（存在する場合は）Fc領域を含む。ヒトゲノムに由来する配列に基づいて抗体を作製するための技術を用いて、例えば、ファージディスプレイによってまたはトランスジェニック動物を用いて、ヒト抗体を、同定および単離することができる（例えば、Barbas et al. Phage display: A Laboratory Manuel.  1st Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. Print.；Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005；Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008を参照のこと）。
【００３４】
結合親和性：抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性。1つの態様において、親和性は、Frankel et al., Mol. Immunol., 16: 101-106, 1979によって記載されているScatchard法の改変によって計算される。別の態様において、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。さらに別の態様において、高い結合親和性は、競合放射免疫アッセイによって測定される。様々な例において、高い結合親和性は、少なくとも約1 x 10-8 Mである。他の態様において、高い結合親和性は、少なくとも約1.0 x 10-9、少なくとも約5.0 x 10-9、少なくとも約1.0 x 10-10、少なくとも約5.0 x 10-10、または少なくとも約1.0 x 10-11である。
【００３５】
生物学的サンプル：対象から得られるサンプル。生物学的サンプルには、細胞、組織および体液、例えば血液、血液の派生物および画分（例えば、血清）、脳脊髄液；ならびに生検されたまたは外科的に取り出された組織、例えば未固定の、凍結されたまたはホルマリンもしくはパラフィン固定された組織を含むがこれらに限定されない、対象における疾患または感染（例えば、がんまたは炭疽感染）の検出に有用なすべての臨床サンプルが含まれる。特定の例において、生物学的サンプルは、腫瘍を有するまたは有する疑いがある対象、例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは皮膚がんを有するまたは有する疑いがある対象から得られる。いくつかの例において、対象は、がん腫を有するまたは有する疑いがある。
【００３６】
二重特異性抗体：結果的に2つの異なる抗原性エピトープに結合する、2つの異なる抗原結合ドメインから構成される組み換え分子。二重特異性抗体は、2つの抗原結合ドメインの化学的にまたは遺伝学的に連結された分子を含む。抗原結合ドメインは、リンカーを用いて連結され得る。抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、抗原結合フラグメント（例えば、Fab、scFv）、eAd、二重特異性一本鎖抗体、またはこれらの組み合わせであり得る。二重特異性抗体は、1つまたは複数の定常ドメインを含み得るが、必ずしも定常ドメインを含まない。二重特異性抗体の例は、TEM8以外の抗原に特異的に結合するscFvに（ペプチドリンカーを介して）接続された、TEM8に特異的に結合するscFvを含む二重特異性一本鎖抗体である。別の例は、TEM8以外の抗原に特異的に結合するscFvに接続された、TEM8に特異的に結合するFabを含む二重特異性抗体である。
【００３７】
乳がん：悪性であるまたは潜在的に悪性である、乳房組織の新生物腫瘍。最も一般的なタイプの乳がんは、乳がん、例えば腺管がんである。インサイチューの腺管がんは、腺管の非侵襲性の新生物状態である。小葉がんは、侵襲性の疾患ではないが、がん腫が進展し得ることの指標となる。乳房の浸潤性（悪性）のがん腫は、病期（I、IIA、IIB、IIIA、IIIBおよびIV）で分類することができる。例えば、Bonadonna et al., (eds), Textbook of Breast Cancer: A clinical Guide the Therapy, 3rd; London, Tayloy & Francis, 2006を参照のこと。
【００３８】
がん腫：形質転換した上皮細胞を含む悪性腫瘍。がん腫の非限定的な例には、腺がん、扁平上皮がん、未分化がんならびに大細胞および小細胞がんが含まれる。いくつかの例において、がん腫は、乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは黒色腫である。
【００３９】
化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴づけられる疾患の処置において治療上の有用性を有する任意の化学剤。例えば、化学療法剤は、乳がん、結腸直腸がん、肺がんおよび皮膚がんを含むがんの処置に有用である。1つの態様において、化学療法剤は、がんの処置に使用する剤である。使用することができるさらなる治療剤の個別の例には、微小管結合剤、DNA挿入剤（intercalator）または架橋剤、DNA合成阻害剤、DNAおよびRNA転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節剤ならびに血管新生阻害剤が含まれる。1つの態様において、化学療法剤は、放射性化合物である。他の例には、抗新生物薬である5-フルオロウラシル（5-FU）およびIRTが含まれる。特定の例において、そのような化学療法剤は、血管新生を低減または減少させる処置と組み合わせて（例えば、TEM8に特異的に結合する治療有効量の1つもしくは複数の抗体またはそのコンジュゲートの投与前、投与中または投与後に）投与される。当業者は、使用する化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th editionのSlapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86; Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., (版権)2000 Churchill Livingstone, IncのPerry et al., Chemotherapy, Ch.17; Baltzer, L., Berkery, R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993; Chabner and Longo, Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice (4th ed.). Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins, 2005; Skeel,. Handbook of Cancer Chemotherapy (6th ed.). Lippincott Williams & Wilkins, 2003を参照のこと）。併用化学療法は、がんを処置するために2つ以上の剤を投与することである。
【００４０】
キメラ抗体：例えば異なる種由来の、2つの異なる抗体に由来する配列を含む抗体。いくつかの例において、キメラ抗体は、1つのヒト抗体由来の1つまたは複数のCDRおよび／またはフレームワーク領域、ならびに別のヒト抗体由来のCDRおよび／またはフレームワーク領域を含む。
【００４１】
キメラ抗原受容体（CAR）：T細胞受容体の1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインに接続された、細胞外の抗体由来標的化ドメイン（scFvなど）を有する、操作されたT細胞受容体。「キメラ抗原受容体T細胞」とは、CARを発現するT細胞であり、CARの抗体由来標的化ドメインによって決定される抗原特異性を有する。CARを作製する方法（例えば、がんの処置のために）が、利用可能である（例えば、各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPark et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011；Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013；Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013；PCT出願公開第WO2012/079000号、第WO2013/059593号；および米国特許出願公開第2012/0213783号を参照のこと）。
【００４２】
結腸直腸がん：悪性であるまたは潜在的に悪性である、結腸、直腸または肛門組織の新生物腫瘍。結腸直腸がんの主要なタイプには、結腸直腸がん、例えば腺がんおよび扁平上皮がんが含まれる。結腸の浸潤性（悪性）のがん腫は、病期（I、II、IIIおよびIV）で分類することができる。例えば、Blake et al. (eds.), Gastrointestinal Oncology: A practical Guide, Berlin: Springer-Verlag, 2011を参照のこと。
【００４３】
免疫複合体を形成するのに十分な条件：抗体またはその抗原結合フラグメントが、実質的にすべての他のエピトープに対する結合よりも検出可能に大きい程度まで、および／またはそれを実質的に排除して、その同起源のエピトープに結合することを可能にする条件。免疫複合体を形成するのに十分な条件は、結合反応の形式に依存し、典型的には、免疫アッセイプロトコルにおいて利用されるもの、またはインビボで遭遇されるそれらの条件である。免疫アッセイ形式および条件の説明については、下記のHarlow & Laneを参照のこと。方法において使用される条件は、生きている哺乳動物または哺乳動物細胞の内部で典型的である条件（例えば、温度、容量オスモル濃度、pH）への言及を含む「生理学的条件」である。いくつかの臓器は極端な条件に供されていることが認識されているが、生物内および細胞内の環境は、通常、約pH 7（例えば、pH 6.0〜pH 8.0、より典型的にはpH 6.5〜7.5）であり、主な溶媒として水を含有し、0℃より上かつ50℃より下の温度に存在する。容量オスモル濃度は、細胞生存および増殖を支持する範囲内である。
【００４４】
コンジュゲート：1つに連結された、例えば共有結合によって1つに連結された、2つの分子の複合体。1つの態様において、抗体は、エフェクター分子に連結される；例えば、エフェクター分子に共有結合により連結された、TEM8に特異的に結合する抗体。連結は、化学的手段または組み換え手段によるものであり得る。1つの態様において、連結は、抗体部分とエフェクター分子の間の反応が、2つの分子間で形成される共有結合を生成することで、1つの分子を形成する、化学的なものである。場合により、抗体とエフェクター分子の間にペプチドリンカー（短いペプチド配列）を含めることができる。コンジュゲートは別々の機能を有する2つの分子、例えば抗体およびエフェクター分子、から調製することができるので、それらはときどき「キメラ分子」とも称される。
【００４５】
保存的変種：「保存的」なアミノ酸置換は、抗原に対する抗体の結合親和性（例えば、TEM8に対する抗体の結合親和性）を実質的に低減しない置換である。例えば、TEM8に特異的に結合するヒト抗体は、最大約1個、最大約2個、最大約5個、最大約10個、最大約15個の保存的置換を含み得、かつTEM8ポリペプチドに特異的に結合し得る。保存的変更という用語は、その抗体がTEM8に対する結合親和性を保持する限り、未置換の親アミノ酸に代えて置換されたアミノ酸を使用することも包含する。非保存的置換は、TEM8に対する活性または結合を減少させる置換である。
【００４６】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の6つのグループは、相互に保存的置換であるとみなされるアミノ酸の例である：
1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
【００４７】
接触：直接的物理的会合に置くこと；インビボまたはインビトロのいずれでも起こり得る、固体形態および液体形態の両方におけるものを含む。接触には、1つの分子と別の分子との間の接触、例えば、抗体などの別のポリペプチドと接触する、抗原などの1つのポリペプチドの表面上のアミノ酸が含まれる。接触はまた、例えば、抗体を細胞との直接的物理的会合に置くことにより、細胞を接触させることも含み得る。
【００４８】
対照：参照標準。いくつかの態様において、対照は、がんを有さない患者から取得された組織サンプル、または非がん性である組織由来の組織サンプルなどの、陰性対照である。他の態様において、対照は、がんを有すると診断された患者から取得された組織サンプル、またはがん性組織由来の組織サンプルなどの、陽性対照である。さらに他の態様において、対照は、歴史的対照、または標準参照値もしくは値の範囲（例えば、既知の予後もしくは転帰を有するがん患者の群、またはベースラインもしくは正常値を表すサンプルの群などの、以前に試験された対照サンプル）である。
【００４９】
試験サンプルと対照との間の差は、増加または逆に低減であることができる。差は、質的差または量的差、例えば統計的有意差であることができる。いくつかの例において、差は、少なくとも約5％、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約250％、少なくとも約300％、少なくとも約350％、少なくとも約400％、または少なくとも約500％の、対照に対する増加または低減である。
【００５０】
低減または減少：何かの質、量または強度を減少させること；例えば、腫瘍量の減少。1つの例において、治療は、例えばその治療の非存在下での応答と比較して、腫瘍（例えば、腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移もしくはそれらの組み合わせ）または腫瘍に関連する1つもしくは複数の症候（例えば、腫瘍もしくは腫瘍群の病的な血管新生）を減少させる。特定の例において、治療は、その治療後に、腫瘍のサイズ、腫瘍の数、腫瘍の転移またはそれらの組み合わせを低減する、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%低減する。そのような低減は、本明細書の開示される方法を用いて測定することができる。
【００５１】
縮重変種：本願において、「縮重変種」は、遺伝子記号の結果として縮重している配列を含むタンパク質（例えば、TEM8に特異的に結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドを表す。天然アミノ酸は20種存在し、そのほとんどは2つ以上のコドンによって指定されている。したがって、そのヌクレオチド配列によってコードされるTEM8に結合する抗体のアミノ酸配列が変化しない限り、すべての縮重ヌクレオチド配列が包含される。
【００５２】
検出可能マーカー：第2の分子、例えば抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされ、その第2の分子の検出を容易にする、検出可能な分子（標識としても公知である）。例えば、検出可能マーカーは、ELISA、分光測定、フローサイトメトリー、顕微鏡観察または診断画像化技術（例えば、CTスキャン、MRI、超音波、ファイバー試験および腹腔鏡試験）によって検出できるものであり得る。検出可能マーカーの具体的で非限定的な例には、発蛍光団、化学発光剤、酵素的連結、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、MRIにより検出される超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。1つの例において、「標識抗体」とは、抗体における別の分子の組み込みを指す。例えば、標識は、検出可能マーカー、例えば、放射性標識アミノ酸の組み込み、または、マークされたアビジン（例えば、光学法もしくは比色法によって検出され得る蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの付加である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野において公知であり、使用されてもよい。ポリペプチドのための標識の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：放射性同位元素もしくは放射性核種（35Sもしくは131Iなど）、蛍光標識（フルオレセインイソチオシアナート（FITC）、ローダミン、ランタニド蛍光体など）、酵素標識（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）、またはガドリニウムキレートなどの磁性剤。いくつかの態様において、標識は、可能性のある立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって付加される。検出可能マーカーを使用する方法および各種目的に適した検出可能マーカーの選択の手引きについては、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 2012）およびAusubelら（In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 補遺104, 2013）で考察されている。
【００５３】
検出：何かの実在、存在または事実を同定すること。一般的な検出方法は、当業者に公知であり、それらは本明細書に開示されるプロトコルおよび試薬で補足され得る。例えば、本明細書には、対象においてTEM8を発現する内皮細胞を検出する方法が含まれる。いくつかの例において、TEM8を発現する内皮細胞の検出は、対象における病的な血管新生を検出する。
【００５４】
有効量：単独でまたは1つもしくは複数の追加の剤と共に、所望の応答、例えば、TEM8との検出可能な免疫複合体の形成、を誘導する剤（例えば、TEM8特異的抗体またはTEM8特異的抗体を含むコンジュゲート）の量。
【００５５】
エフェクター分子：所望の効果を有するまたは生じることが意図されている分子；例えば、エフェクター分子が標的とする細胞に対する所望の効果。エフェクター分子には、ポリペプチド、放射性同位元素および低分子等の分子が含まれる。エフェクター分子の非限定的な例には、毒素、化学療法剤および抗血管新生剤が含まれる。当業者は、いくつかのエフェクター分子が2つ以上の所望の効果を有し得るまたは生じ得ることを理解しているであろう。1つの例において、エフェクター分子は、キメラ分子、例えば、そのキメラ分子が標的とする細胞に対して所望の効果を有することが意図されている開示されている抗体またはそのフラグメントを含むキメラ分子、の一部分である。
【００５６】
内皮細胞：血管の内表面に並んでいる薄い細胞層である内皮由来の細胞。
【００５７】
エピトープ：抗原性決定基。これらは、抗原性の、すなわち特定の免疫応答を惹起する、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。いくつかの例において、開示されている抗体はTEM上のエピトープに特異的に結合する。
【００５８】
発現：核酸のタンパク質への翻訳。タンパク質は、発現されて細胞内にとどまり得るか、細胞表面膜の構成要素になり得るか、または細胞外マトリクスもしくは培地中に分泌され得る。
【００５９】
発現制御配列：それが機能的に連結されている異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列が、核酸配列の転写、および適宜、翻訳を制御および調節する場合に、発現制御配列は、核酸配列に機能的に連結されている。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ATG）、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの妥当な翻訳を可能にするその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および停止コドンを含むことができる。「制御配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に影響を与え得る構成要素を含むように意図され、かつまた、その存在が有利である追加の構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。発現制御配列は、プロモーターを含むことができる。
【００６０】
プロモーターは、転写を導くのに十分な最小の配列である。また、プロモーター依存性の遺伝子発現を細胞タイプ特異的、組織特異的、または外部のシグナルもしくは作用物質によって誘導性に制御可能にするのに十分なプロモーターエレメントも含まれ；そのようなエレメントは、遺伝子の5'または3'領域に位置していてもよい。構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987を参照のこと）。例えば、細菌システムにおけるクローニングの場合には、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）のような誘導性プロモーターなどが使用されてもよい。1つの態様において、哺乳動物細胞システムにおけるクローニングの場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスロングターミナルリピート；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）が使用され得る。組み換えDNAまたは合成技術によって製造されたプロモーターがまた、核酸配列の転写を提供するために使用されてもよい。宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含有する発現ベクター中に、ポリヌクレオチドを挿入することができる。発現ベクターは、典型的に、複製開始点、プロモーター、および形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特有の核酸配列を含有する。
【００６１】
発現ベクター：発現されるべきヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクター。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターには、当技術分野において公知のすべてのもの、例えば、組み換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソーム中に含有された）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
【００６２】
フレームワーク領域：抗体の重鎖または軽鎖可変領域においてCDRの間に介在するアミノ酸配列。可変軽鎖フレームワーク領域および可変重鎖フレームワーク領域を含む。フレームワーク領域は、CDRを適切な配向に保持する役割を有する。
【００６３】
IgA：認識されている免疫グロブリンα遺伝子によって実質的にコードされている抗体のクラスに属するポリペプチド。ヒトにおいて、このクラスまたはアイソタイプには、IgA1およびIgA2が含まれる。IgA抗体は、モノマー、主にダイマー形態のポリマー（pIgAと呼ばれる）、および分泌型IgAとして存在し得る。野生型IgAの定常鎖は、そのC末端にテールピース（tp）と呼ばれる18アミノ酸の伸長部を含有する。ポリマーIgAは、形質細胞によって分泌され、テールピース中の保存されたシステイン残基を通してIgAの2個のモノマーを連結する、J鎖と呼ばれる15kDaペプチドを有する。
【００６４】
IgG：認識されている免疫グロブリンγ遺伝子によって実質的にコードされている抗体のクラスまたはアイソタイプに属するポリペプチド。ヒトにおいて、このクラスには、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が含まれる。マウスにおいて、このクラスには、IgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3が含まれる。
【００６５】
免疫複合体：可溶性抗原に対する抗体または抗原結合フラグメント（scFvなど）の結合によって、免疫複合体が形成される。免疫複合体の形成は、当業者に公知の従来の方法、例えば、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査、ELISA、免疫ブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、磁気共鳴画像化、CTスキャン、X線、および親和性クロマトグラフィーを通して検出することができる。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量されてもよい。
【００６６】
疾患の阻害または処置：疾患または疾患に関連する病的状態（腫瘍または炭疽感染症など）の兆候または症候を減少させる治療的介入（例えば、治療有効量の、TEM8に特異的に結合する抗体またはそのコンジュゲートの投与）。処置はまた、腫瘍または炭疽感染症などの状態の寛解または治癒を誘導することもできる。特定の例において、処置は、例えば、腫瘍の完全な発生を阻害することによる、腫瘍の予防、例えば、転移の発生または原発腫瘍の発生の予防を含む。予防は、腫瘍の完全な消失を必要とはしない。
【００６７】
疾患または疾患に関連する病的状態の兆候または症候の減少とは、任意の観察可能な処置の有益な効果を指す。腫瘍と関連する兆候または症候（病的な血管新生など）の減少は、例えば、感受性を有する対象（まだ転移していない、腫瘍を有する対象など）における疾患の臨床症候の発症遅延、疾患のいくつかもしくはすべての臨床症候の重篤度の減少、疾患のより緩徐な進行（例えば、腫瘍を有する対象の寿命の延長による）、疾患の再発数の減少、対象の健康全体もしくは幸福の改善によって、または個々の腫瘍に対して特異的である当技術分野において周知の他のパラメータによって、証明され得る。「予防的」処置とは、病状を発生する危険性を低減する目的で、疾患の兆候を呈さないか、または初期兆候のみを呈する対象に施与される処置である。
【００６８】
単離：生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、例えば抗体）が、その成分を本来含んでいる生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体および染色体外DNAおよびRNAならびにタンパク質から実質的に分離されること、それとは別に生成されること、またはそれから精製されること。したがって、単離された核酸、ペプチドおよびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞中での組み換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も網羅する。単離された核酸、ペプチドまたはタンパク質、例えば抗体は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%純粋であり得る。
【００６９】
Kd：ポリペプチドリガンド相互作用または抗体抗原相互作用などの、所定の相互作用についての解離定数。例えば、抗体または抗原結合フラグメント（35O22またはその抗原結合フラグメントなど）と抗原（TWM8タンパク質など）との二分子相互作用について、これは、二分子相互作用の個別の構成要素の濃度、割る、複合体の濃度である。
【００７０】
リンカー：2つの分子を1つの連続する分子に連結するのに使用することができる、例えば、エフェクター分子を抗体に連結するのに使用することができる、二機能性の分子。いくつかの態様において、提供されるコンジュゲートは、エフェクター分子または検出可能マーカーと抗体の間にリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、選択的に切断可能、例えば、細胞内条件下で切断可能であり、細胞内環境中でのリンカーの切断によって抗体からエフェクター分子または検出可能マーカーが放出される。選択的に切断可能とは、あらかじめ選択された条件または刺激に応答して切断することを意味する。さらに他の態様において、リンカーは切断可能でなく、エフェクター分子または検出可能マーカーは、例えば抗体の分解によって放出され得る。いくつかの場合、リンカーは、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合する役割をする抗原結合フラグメント（例えばFvフラグメント）内のペプチドである。
【００７１】
「コンジュゲート」、「接続」、「接合」、または「連結」という用語は、2つの分子を1つの連続する分子にすること；例えば、2つのポリペプチドを1つの連続するポリペプチドに連結すること、またはエフェクター分子もしくは検出可能マーカーである放射性核種もしくはその他の分子をポリペプチド、例えばscFvに共有結合により付加すること、を表すことができる。個々の文脈で、この用語は、リガンド、例えば抗体部分、をエフェクター分子に接続することに対する参照を含む。連結は、化学的手段または組み換え手段のいずれかによるものであり得る。「化学的手段」は、抗体部分とエフェクター分子の間の、この2つの分子間に共有結合を形成し1つの分子を形成する反応を表す。
【００７２】
肺がん：悪性であるまたは潜在的に悪性である肺組織の新生物腫瘍。肺がんの主要なタイプは、肺がん：腺がん、小細胞がん、扁平上皮がんまたは非小細胞がんである。肺がんは、典型的に、I〜IVに病期分類されるが；他の分類も使用される、例えば小細胞肺がんは、それが胸部の半分に限られ、放射線単独療法の適用範囲内である場合、限局期に分類され得；それ以外は進展期である。例えば、Hansen (ed.), Textbook of Lung Cancer, 2nd, London: Informa Healthcare, 2008を参照のこと。
【００７３】
中和抗体：標的タンパク質に特異的に結合しその標的タンパク質に関連する生物学的機能を阻害することができる抗体。一般に、このタイプの特異的ブロッキング活性を発揮し得る任意のタンパク質が中和タンパク質とみなされ；したがって中和抗体は中和タンパク質の特定のクラスである。
【００７４】
新生物、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物性の成長は、腫瘍を発生させ得る。個体における腫瘍の量は「腫瘍量」であり、これは腫瘍の数、容積または重量として測定され得る。転移しない腫瘍は「良性」と称される。周囲の組織を侵襲するもしくは転移することができる（またはその両方である）腫瘍は、「悪性」と称される。
【００７５】
同一の組織タイプの腫瘍は、特定の臓器（例えば、結腸、皮膚、乳房、前立腺、膀胱または肺）を起源とする原発性腫瘍である。同一の組織タイプの腫瘍は、異なるサブタイプの腫瘍に分類することができる。例えば、肺がんは、腺がん、小細胞、扁平上皮細胞または非小細胞腫瘍に分類することができる。
【００７６】
固形腫瘍、例えば肉腫（結合組織がん）およびがん腫（上皮細胞がん）の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫およびその他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸直腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱がんならびにCNS腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（craniopharyogioma）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）が含まれる。
【００７７】
核酸：ホスホジエステル結合を介して連結された、ヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造変種、および合成の天然に存在しないそのアナログ）から構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造変種、および合成の天然に存在しないそのアナログ。したがって、用語には、ヌクレオチドおよびその間の連結が、例えば、非限定的に、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラル-メチルホスホナート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド-核酸（PNA）などのような天然に存在しない合成アナログを含む、ヌクレオチドポリマーが含まれる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成機を用いて合成することができる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、一般に約50ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がDNA配列（すなわち、A、T、G、C）によって表される場合には、「U」が「T」に置き換わるRNA配列（すなわち、A、U、G、C）も含むことが、理解されるであろう。
【００７８】
ヌクレオチド配列を記載するために、従来的な表記法が本明細書において使用され：一本鎖ヌクレオチド配列の左側の端は、5'端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左側の方向は、5'方向と呼ばれる。新生RNA転写物に対するヌクレオチドの5'から3'の付加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と呼ばれ；そのDNAから転写されたmRNAと同じ配列を有するDNA鎖上の、RNA転写物の5'端に対して5'に位置する配列は、「上流配列」と呼ばれ；RNAと同じ配列を有するDNA鎖上の、コードRNA転写物の3'端に対して3'である配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【００７９】
「cDNA」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおける、mRNAに相補的または同一であるDNAを指す。
【００８０】
「コードする」とは、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA）またはアミノ酸の定義された配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としての役割を有する、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどの、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子によって産生されるmRNAの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的システムにおけるタンパク質を生じる場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖、および、遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。別の方法で特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでいてもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドのポリマー形態を指す。組み換えポリヌクレオチドは、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいてそれが直接隣接しているコード配列の両方（5'端のものおよび3'端のもの）とは直接隣接していない、ポリヌクレオチドを含む。したがって、用語は、例えば、ベクター中に；自己的に複製するプラスミドもしくはウイルス中に；または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子（例えば、cDNA）として存在する、組み換えDNAを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であることができる。用語は、DNAの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
【００８２】
機能的に連結：第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関係の下に置かれているとき、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーター、例えばCMVプロモーターは、同プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は、連続的であり、2つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、同一のリーディングフレーム内に置かれる。
【００８３】
病的な血管新生：医学的に望ましくないまたは対象にとって有害な血管新生、例えば、腫瘍に関連するまたは腫瘍内もしくは腫瘍周囲での血管の発生に関連する血管新生。腫瘍血管系と正常血管系とは、腫瘍に関連する血管ではいくつかの遺伝子が示差的に発現し得るという点で区別できる（St.Croix et al., Science, 289, 1197-1202, 2000）。これらの遺伝子のうちの1つが腫瘍内皮マーカー8（TEM 8）であり、悪性固形腫瘍の血管系で上方制御され、正常組織では発現は限定的である。病的な血管新生の他の例には、（角膜移植または黄斑変性もしくは糖尿病を有する対象の網膜で見られるような）角膜または網膜血管新生が含まれる。
【００８４】
薬学的に許容される担体：使用される薬学的に許容される担体は、従来的なものである。E.W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995は、開示されている抗体の薬学的送達に適した組成および処方を記載している。
【００８５】
一般に、担体の性質は、利用される個々の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口処方物には通常、ビヒクルとして薬学的および生理学的に許容される液体、例えば水、生理食塩水、平衡塩溶液、含水デキストロース、グリセロール等を含む注射可能な液体が含まれる。固形の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形式）の場合、従来的な非毒性の固形担体には、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤およびpH緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含み得る。対象への投与に適する特定の態様において、担体は、滅菌であってもよく、かつ／または、所望の応答を誘導するのに適した組成物の1つまたは複数の測定された用量を含有する単位剤形に懸濁されていてもよい。担体はまた、処置目的での使用のための薬剤を伴っていてもよい。単位剤形は、例えば、滅菌内容物を含有する密封バイアル、または対象中への注射のための注射器であってもよい。
【００８６】
ポリペプチド：モノマーがアミノ酸残基であり、それらがアミド結合を通して互いに接続されているポリマー。アミノ酸が、α-アミノ酸である場合、L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれかを使用することができ、L-異性体が好ましい。本明細書において使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの修飾された配列を含むように意図される。ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、および、組み換えまたは合成で産生されているものの両方を含む。ポリペプチドは、アミノ末端（N-末端）の端およびカルボキシ末端の端を有する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、開示される抗体またはそのフラグメントである。
【００８７】
ポリペプチド修飾：ポリペプチドは、様々な化学的技術によって修飾して、無修飾ペプチドと本質的に同じ活性およびコンフォメーションを有し、任意で、他の望ましい特性を有する誘導体を製造することができる。例えば、タンパク質のカルボン酸基は、カルボキシ末端であろうとまたは側鎖であろうと、薬学的に許容される陽イオンの塩の形態で提供され得るか、またはエステル化されてC1-C16エステルを形成し得るか、または式NR1R2（式中、R1およびR2は、各々独立してHまたはC1-C16アルキルである）のアミドに変換され得るか、または化合して5員環もしくは6員環などの複素環を形成し得る。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端であろうとまたは側鎖であろうと、HCl、HBr、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、および他の有機塩などの薬学的に許容される酸付加塩の形態であり得るか、または、C1-C16アルキルもしくはジアルキルアミノに修飾されるか、またはさらにアミドに変換され得る。
【００８８】
ペプチド側鎖の水酸基は、十分に認識されている技術を用いて、C1-C16アルコキシまたはC1-C16エステルに変換することができる。ペプチド側鎖のフェニル環およびフェノール環は、F、Cl、Br、もしくはIなどの1つもしくは複数のハロゲン原子で、または、C1-C16アルキル、C1-C16アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、もしくはそのようなカルボン酸のアミドで置換することができる。ペプチド側鎖のメチレン基は、相同のC2-C4アルキレンに伸長させることができる。チオール類は、アセトアミド基などの、数多くの十分に認識されている保護基のうちの任意の1つで保護することができる。
【００８９】
精製：精製という用語は、絶対的な純度を必要とせず；むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物とは、ペプチドまたはタンパク質（抗体など）が、細胞内のその天然環境においてよりも濃縮されているものである。1つの態様において、調製物は、タンパク質またはペプチドが、調製物の全ペプチドまたはタンパク質含量の少なくとも50％、例えば、全ペプチドまたはタンパク質含量の少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、またはそれより多くに相当するように精製されている。
【００９０】
配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性によって表現されるか、さもなければ配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）によって頻繁に測定され；パーセンテージが高ければ高いほど、2つの配列はより類似している。ポリペプチドのホモログまたは変種は、標準的な方法を用いて整列させた際に、比較的高い程度の配列同一性を有するであろう。
【００９１】
比較のための配列の整列の方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよび整列アルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989；Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988；およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988に記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列整列法および相同性計算の詳細な考察を示している。
【００９２】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990）が、配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと関連した使用のために、National Center for Biotechnology Information（NCBI, Bethesda, MD）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。このプログラムを用いて配列同一性を判定する方法の説明は、インターネットのNCBIウェブサイト上で入手可能である。
【００９３】
ポリペプチドに特異的に結合する抗体のVLまたはVHのホモログおよび変種は、典型的に、関心対象のアミノ酸配列との完全長整列にわたってカウントされた少なくとも約75％、例えば、少なくとも約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性の所有によって、特徴づけられる。参照配列に対してさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価された際に、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性などの、増大するパーセンテージ同一性を示すであろう。配列全体に満たないものが、配列同一性について比較される場合、ホモログおよび変種は、典型的に、10〜20アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも80％の配列同一性を有し、参照配列に対するその類似性に応じて、少なくとも85％、または少なくとも90％もしくは95％の配列同一性を有し得る。そのような短いウィンドウにわたって配列同一性を判定するための方法は、インターネットのNCBIウェブサイトで入手可能である。これらの配列同一性範囲は、手引きのためだけに提供され；提供される範囲の外側に入る非常に有意なホモログが取得され得ることが全面的に可能であると、当業者は認識しているであろう。
【００９４】
2つ以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列関連性を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「から選択される」、「比較ウィンドウ」、「同一」、「配列同一性のパーセンテージ」、「実質的に同一」、「相補的」、および「実質的に相補的」が含まれる。
【００９５】
核酸配列の配列比較のためには、典型的に、1つの配列が、試験配列がそれに対して比較される参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる際は、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合はサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが使用される。比較のための配列の整列法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981の局地的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970の相同性整列アルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性についての探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行によって（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、または手動の整列および目視検査によって（例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012)およびAusubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013)を参照のこと）、実施することができる。有用なアルゴリズムの1つの例は、PILEUPである。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987の累進的整列法の単純化を用いる。用いられる方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989によって記載されている方法に類似している。PILEUPを使用し、以下のパラメータ：デフォルトギャップ重み（gap weight）（3.00）、デフォルトギャップ長重み（gap length weight）（0.10）、および重みづけエンドギャップ（weighted end gap）を用いて、参照配列を他の試験配列と比較して、パーセント配列同一性の関連性を判定する。PILEUPは、GCG配列解析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン7.0（Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984）から取得することができる。
【００９６】
パーセント配列同一性および配列類似性を判定するために適するアルゴリズムの別の例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990およびAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977に記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih.gov)を通して公的に入手可能である。BLASTNプログラム（核酸配列用）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、50の整列（B）、10の期待値（E）、M＝5、N＝-4、および両鎖の比較を用いる。BLASTPプログラム（アミノ酸配列用）は、デフォルトとして、3のワード長（W）、および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照のこと）を用いる。オリゴヌクレオチドは、長さが最大約100ヌクレオチド塩基の直鎖ポリヌクレオチド配列である。
【００９７】
皮膚がん：悪性であるまたは潜在的に悪性である皮膚組織の新生物腫瘍。黒色腫は、形質転換したメラニン細胞（メラニン色素を生成する細胞）の皮膚がんである。メラニン細胞は、主に皮膚で見出されるが、腸内または眼内にも存在している。皮膚の黒色腫には、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、末端黒子型黒色腫および悪性黒子（型黒色腫）が含まれる。上記のタイプはいずれも、メラニンを生成し得るかまたはメラニン欠乏性であり得る。同様に、任意のサブタイプが線維形成（神経向性の高密度線維反応）を示し得、これは攻撃的挙動および限局的再発傾向のマーカーである。他の黒色腫には、明細胞肉腫、粘膜黒色腫およびブドウ膜黒色腫が含まれる。黒色腫は、I〜IVに病期分類される。例えば、Thompson et al. (eds.), Textbook of Melanoma: Pathology, Diagnosis and Management, London: Taylor & Francis, 2004を参照のこと。
【００９８】
特異的に結合：抗体に言及する際は、タンパク質および他の生物製剤の不均質な集団の存在下で、標的タンパク質、ペプチド、または多糖の存在を判定する結合反応を指す。したがって、指定された条件下で、抗体は、特定の標的タンパク質、ペプチド、または多糖（TEM8のエピトープなど）に優先的に結合し、サンプルまたは対象に存在する他のタンパク質または多糖に有意な量で結合しない。特異的結合は、当技術分野において公知の方法によって判定することができる。抗体抗原複合体に関して、抗原と抗体の特異的結合は、約10-7モル濃度（M）未満、例えば、約10-8 M、10-9 M、10-10 M未満、またはさらに約10-11 M未満のKdを有する。
【００９９】
本明細書において開示される抗体は、定義された標的（または、二重特異性抗体の場合は、複数の標的）のみに特異的に結合する。したがって、TEM8に特異的に結合する抗体は、TEM8を発現する細胞もしくは組織、TEM8が付着されている基板、または生物学的検体中のTEM8を含む、TEM8に実質的に結合する抗体である。ある程度の非特異的相互作用が、抗体または抗体を含むコンジュゲート（TEM8に特異的に結合する抗体またはそのような抗体を含むコンジュゲートなど）と非標的（TEM8を発現しない細胞など）との間で起こり得ることが、当然認識される。典型的に、特異的結合は、抗体と抗原を保有するタンパク質または細胞との間に、抗体と抗原を欠如するタンパク質または細胞との間よりもずっと強い会合を結果としてもたらす。特異的結合は、典型的に、エピトープを含むタンパク質または標的エピトープを発現する細胞もしくは組織に対して、このエピトープを欠如するタンパク質または細胞もしくは組織と比較した際に、2倍より大きい、例えば、5倍より大きい、10倍より大きい、または100倍より大きい、（単位時間あたりの）結合する抗体の量の増大を、結果としてもたらす。そのような条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択されている抗体を必要とする。様々な免疫アッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体または他のリガンドを選択するために適切である。例えば、固相ELISA免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を判定するために使用され得る免疫アッセイ形式および条件の説明については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)を参照のこと。
【０１００】
対象：任意の哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ヒツジ、ウシ、げっ歯類など。2つの非限定的な例において、対象は、ヒト対象またはマウス対象である。したがって、「対象」という用語には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。
【０１０１】
T細胞：免疫応答に重要な白血球細胞。T細胞は、CD4＋ T細胞およびCD8＋ T細胞を含むが、これらに限定されない。CD4＋ Tリンパ球は、その表面上にCD4を発現する免疫細胞である。ヘルパーT細胞としても公知のこれらの細胞は、抗体応答およびキラーT細胞応答を含む、免疫応答を調整する手助けをする。Th1およびTh2細胞は、ヘルパーT細胞の機能的サブセットである。Th1細胞は、インターフェロン-γを含む一連のサイトカインを分泌し、その主要な機能は、特に細胞内微生物に関連して、感染に対する食細胞媒介性の防衛を刺激することである。Th2細胞は、インターロイキン（IL）-4およびIL-5を含む一連のサイトカインを分泌し、その主要な機能は、IgEおよび好酸球／肥満細胞媒介性の免疫反応を刺激すること、ならびにTh1応答を下方制御することである。
【０１０２】
治療剤：総称的な意味で使用され、処置剤、予防剤、および置換剤を含む。治療剤は、疾患または障害を有する対象において特有の一連の状態を改善するために使用される。
【０１０３】
治療有効量：単独でまたは1つもしくは複数の追加の剤と共に、対象において所望の応答、例えば、腫瘍の処置または炭疽の処置を誘導する剤（例えば、TEM8特異的抗体またはTEM8特異的抗体を含むコンジュゲート）の量。対象に投与される際、所望のインビトロ効果を達成することが明らかになっている標的組織濃度を達成する用量が一般に用いられる。理想的には、治療有効量は、対象において実質的な細胞傷害効果を生じさせずに治療効果を提供するものである。
【０１０４】
1つの例において、所望の応答は、対象における腫瘍のサイズ、容積または数（例えば、転移）の低減である。例えば、剤または剤群は、腫瘍のサイズ、容積または数を、その剤の非存在下での応答と比較して、所望の量、例えば少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%または少なくとも95%、低減することができる。
【０１０５】
本明細書に開示される様々な調製物が、治療有効量で投与される。ヒトまたは獣医学的対象に投与される、TEM8に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート（またはこれらの分子を1つもしくは複数含む組成物）の治療有効量は、その対象に関連する多くの要因、例えば対象の健康全般、に依存して変化するであろう。治療有効量は、用量を変えて得られる治療応答、例えば腫瘍の退縮を測定することによって、決定することができる。治療有効量はまた、様々なインビトロ、インビボまたはインサイチュー免疫アッセイを通じて決定することができる。開示される剤は、所望の応答を得るために必要なように、単回用量でまたは複数回分の用量で投与され得る。しかし、治療有効量は、適用される物質、処置される対象、処置される状態の重篤度およびタイプならびに投与様式に依存し得る。
【０１０６】
毒素：細胞と接触したときに細胞傷害性を誘導するエフェクター分子。毒素の具体的で非限定的な例には、アブリン、リシン、オーリスタチン（例えば、モノメチルオーリスタチンE（MMAE；例えば、Francisco et al., Blood, 102: 1458-1465, 2003を参照のこと））およびモノメチルオーリスタチンF（MMAF；例えば、Doronina et al., BioConjugate Chem., 17: 114-124, 2006を参照のこと）、メイタンシノイド（例えば、DM1；例えば、Phillips et al., Cancer Res., 68: 9280-9290, 2008を参照のこと）、緑膿菌外毒素（PE、例えばPE35、PE37、PE38およびPE40）、ジフテリア毒素（DT）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシンもしくはゲロニン、またはそれらの改変毒素、または直接的もしくは間接的に細胞成長を阻害もしくは細胞を殺傷するその他の毒性剤、が含まれるがこれらに限定されない。例えば、PEおよびDTは、典型的に肝臓毒性を通じて死に至らしめる高い毒性の化合物である。PEおよびDTは、しかし、その毒素のネイティブの標的化要素（例えば、PEのドメインIaおよびDTのB鎖）を取り除きこれを異なる標的化部分、例えば抗体で置き換えることによって免疫毒素として使用できる形態に改変することができる。
【０１０７】
形質転換：形質転換された細胞とは、その中に分子生物学技術によって核酸分子が導入されている細胞である。本明細書において使用される際、形質転換という用語は、ウイルスベクターのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、ならびに、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびパーティクルガン加速によるDNAの導入を含む、それによって核酸分子がそのような細胞中に導入され得るすべての技術を包含する。
【０１０８】
腫瘍量：対象における腫瘍または腫瘍群の総容積、数、転移、またはこれらの組み合わせ。
【０１０９】
腫瘍内皮マーカー8（TEM8）：炭疽毒素受容体1（ANTXR1）としても公知のタンパク質。TEM8は、元々はヒト結腸直腸がんの腫瘍血管系沿いの内皮細胞におけるその過剰発現に基づいて同定された細胞表面糖タンパク質である（St Croix et al., Science, 289(5482):1197-1202, 2000）。血管内皮成長因子（VEGF）、VEGF受容体（VEGFR）、および多くの他の鍵となる血管新生調節因子と異なり、TEM8は、発生上の血管新生、創傷治癒、または黄体の正常な生理学的血管新生には必要とされない（St Croix et al., Science, 289(5482):1197-1202, 2000；Nanda et al., Cancer Res., 64(3):817-820, 2004）。TEM8は、マウスおよびヒトの両方において、様々な腫瘍タイプの腫瘍血管で上方制御され（Nanda et al., Cancer Res., 64(3):817-820, 2004；Carson-Walter et al., Cancer Res., 61(18): 6649-6655, 2001）、いくつかの腫瘍においては、腫瘍細胞自体によっても発現されている（Carson-Walter et al. Cancer Res., 61(18):6649-6655, 2001；Yang et al., Biochim Biophys Acta, 1813(1):39-49, 2011）。TEM8はまた、炭疽毒素の細胞表面受容体としても機能し、炭疽毒素タンパク質の第2の受容体であるCMG2（ANTXR2としても公知）と58％のアミノ酸同一性を共有している（Scobie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100(9):5170-5174, 2003）。
【０１１０】
TEM8タンパク質の配列は、公知である（例えば、GENBANK（登録商標）アクセッション番号NP_115584.1を参照のこと、2013年9月10日にデータベース中に存在したものが参照により本明細書に組み入れられる）。加えて、TEM8タンパク質をコードする例示的な核酸配列が、公知である（例えば、GENBANK（登録商標）アクセッション番号NM_032208.2を参照のこと、2013年9月10日にデータベース中に存在したものが参照により本明細書に組み入れられる）。1つの例において、TEM8は、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【０１１１】
腫瘍微小環境：周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、シグナル伝達分子、および、間質細胞を含む細胞外マトリクス（ECM）を含む、腫瘍がその中に存在する細胞環境。腫瘍は、細胞外シグナルの放出、病的な血管新生の促進、および末梢免疫寛容の誘導によって、微小環境に影響を及ぼすことができ、他方、微小環境中の免疫細胞は、例えば、免疫エディティング（immuno-editing）において、がん性細胞の成長および進化に影響を与えることができる。
【０１１２】
に十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を説明するために使用される句。1つの例において、所望の活性は、免疫複合体の形成である。特定の例において、所望の活性は、腫瘍の処置である。
【０１１３】
ベクター：宿主細胞中に導入され、それにより形質転換された宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、複製開始点などの、それが宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子、および当技術分野において公知の他の遺伝学的エレメントを含んでもよい。
【０１１４】
II．いくつかの態様の説明
TEM8タンパク質上のエピトープに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントが、提供される。抗体および抗原結合フラグメントは、完全にヒトであることができる。様々な態様において、抗体および抗原結合フラグメントを、HIV-1感染症を中和するために用いることができる。また、抗体および抗原結合フラグメントと薬学的に許容される担体とを含む組成物も、本明細書において開示される。抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、および核酸を発現する単離された宿主細胞もまた、提供される。
【０１１５】
TEM8に特異的なモノクローナル抗体を含む組成物を、研究、診断および治療目的で用いることができる。例えば、病原性の血管新生を有する対象を診断または処置するために、モノクローナル抗体を用いることができる。
【０１１６】
A．抗体および抗原結合フラグメント
TEM8タンパク質上のエピトープに特異的に結合し、かつ中和する、単離されたモノクローナル抗体および抗原結合フラグメントが、提供される。様々な態様において、抗体および抗原結合フラグメントは、病的な血管新生の減少および／もしくは阻害、腫瘍成長の減少および／もしくは阻害、または、腫瘍転移の減少および／もしくは阻害を含むがこれらに限定されない、インビボのTEM8タンパク質の生物学的機能または特性を、中和することができる。
【０１１７】
様々な態様において、モノクローナル抗体は、重鎖相補性決定領域（HCDR）1、HCDR2、およびHCDR3を含む重鎖、ならびに、軽鎖相補性決定領域（LCDR）1、LCDR2、およびLCDR3を含む軽鎖を含む。開示される抗体は、TEM8のエピトープに特異的に結合し、かつ中和する。いくつかの態様において、TEM8特異的抗体は、可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）を含み、TEM8に特異的に結合する。様々な態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、m825、m822、m830、またはm863抗体のうちの1つの、それぞれ、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【０１１８】
下記のモノクローナル抗体の考察は、CDR1、CDR2、およびCDR3などの、少なくとも1つの相補性決定領域（CDR）を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離されたモノクローナル抗体に言及する。様々なCDRナンバリングスキーム（例えば、Kabat、Chothia、またはIMGTナンバリングスキーム）を用いてCDRの位置を決定できることを、当業者は理解するであろう。IMGTおよびKabatナンバリングスキームに準拠する、m825、m822、m830、およびm863モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびCDRの位置を、表1（IMGT）および表2（Kabat）に示す。本明細書において開示される抗体の特定のアミノ酸を参照する際の様々なCDRナンバリングスキームの使用を、当業者は容易に理解するであろう。
【０１１９】
（表１）TEM8特異的抗体のIMGT CDR配列
0006502931.tif 000019
【０１２０】
いくつかの態様において、抗体は、表1に列挙されるものなどの、IMGT CDRを含む。例えば、いくつかの態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 3のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 5のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 7のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。
【０１２１】
いくつかの態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 2のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 4のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 6のアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 8のアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１２２】
いくつかの態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 2のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 3のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 4のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 5のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 6のアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 7のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜110を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 8のアミノ酸27〜32、50〜52、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１２３】
（表２）TEM8特異的抗体のKabat CDR配列
0006502931.tif 000020
【０１２４】
いくつかの態様において、抗体は、表2に列挙されるものなどの、Kabat CDRを含む。いくつかの態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜106を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 3のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜106を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 5のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜110を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 7のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜110を含むHCDR1、HCDR2、および／またはHCDR3を含む、重鎖可変領域を含む。
【０１２５】
いくつかの態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 2のアミノ酸23〜33、49〜55、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 4のアミノ酸23〜33、49〜55、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 6のアミノ酸24〜34、50〜56、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 8のアミノ酸24〜34、50〜56、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、および／またはLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜106を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 2のアミノ酸23〜33、49〜55、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 3のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜106を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 4のアミノ酸23〜33、49〜55、および88〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 5のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜110を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 6のアミノ酸24〜34、50〜56、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、それぞれ、SEQ ID NO: 7のアミノ酸26〜32、52〜57、および99〜110を含むHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む、重鎖可変領域、ならびに、それぞれ、SEQ ID NO: 8のアミノ酸24〜34、50〜56、および89〜97を含むLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１２７】
いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 1（m825 VH）、SEQ ID NO: 3（m822 VH）、SEQ ID NO: 5（m830 VH）、またはSEQ ID NO: 7（m863 VH）のうちの1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、SEQ ID NO: 2（m825 VL）、SEQ ID NO: 4（m822 VL）、SEQ ID NO: 6（m830 VL）、またはSEQ ID NO: 8（m863 VL）のうちの1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１２８】
追加の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 1（m825 VH）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに、SEQ ID NO: 2（m825 VL）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、SEQ ID NO: 3（m822 VH）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに、SEQ ID NO: 4（m822 VL）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 5（m830 VH）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに、SEQ ID NO: 6（m830 VL）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、SEQ ID NO: 7（m863 VH）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに、SEQ ID NO: 8（m863 VL）に示されるアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１２９】
追加の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 1（m825 VH）、SEQ ID NO: 3（m822 VH）、SEQ ID NO: 5（m830 VH）、またはSEQ ID NO: 7（m863 VH）のうちの1つに示されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、SEQ ID NO: 2（m825 VL）、SEQ ID NO: 4（m822 VL）、SEQ ID NO: 6（m830 VL）、またはSEQ ID NO: 8（m863 VL）のうちの1つに示されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
【０１３０】
いくつかの態様において、抗体は、SEQ ID NO: 1（m825 VH）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、SEQ ID NO: 2（m825 VL）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらなる態様において、抗体は、SEQ ID NO: 3（m822 VH）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、SEQ ID NO: 4（m822 VL）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。追加の態様において、抗体は、SEQ ID NO: 5（m830 VH）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、SEQ ID NO: 6（m830 VL）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。まだ他にある態様において、抗体は、SEQ ID NO: 7（m863 VH）に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および、SEQ ID NO: 8（m863 VL）に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１３１】
1．抗体および抗原結合フラグメントの追加の説明
抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはそのフラグメントであることができる。キメラ抗体もまた、提供される。抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク領域などである（がこれに限定されない）、任意の適当なフレームワーク領域を含むことができる。ヒトフレームワーク領域、およびヒト抗体フレームワーク領域において行われ得る変異は、当技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,585,089号を参照のこと）。あるいは、マウスフレームワーク領域などであるがこれに限定されない、異種フレームワーク領域を、抗体の重鎖または軽鎖に含めることができる（例えば、Jones et al., Nature 321:522, 1986；Riechmann et al., Nature 332:323, 1988；Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988；Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285, 1992；Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992；およびSinger et al., J. Immunol. 150: 2844, 1993を参照のこと）。
【０１３２】
抗体は、任意のアイソタイプのものであることができる。抗体は、例えば、IgMまたはIgG抗体、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4であることができる。TEM8に特異的に結合する抗体のクラスは、別のものと交換することができる。1つの局面において、VLまたはVHをコードする核酸分子は、それぞれ、軽鎖または重鎖の定常領域をコードする核酸配列のいずれも含まないように、当技術分野において周知の方法を用いて単離される。特定の例において、VHアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 1、3、5、7のうちの1つに示される。他の例において、VLアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 2、4、6、8のうちの1つに示される。非限定的な例において、VHアミノ酸は、SEQ ID NO: 1に示され、VLアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 2に示される。VLまたはVHをコードする核酸分子を、次に、様々なクラスの免疫グロブリン分子由来のCLまたはCHをコードする核酸配列に機能的に連結させる。これは、当技術分野において公知のように、CLまたはCH鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成することができる。例えば、元々はIgMであった、TEM8に特異的に結合する抗体を、IgGにクラススイッチしてもよい。クラススイッチを用いて、1つのIgGサブクラスを別のものに、例えば、IgG1からIgG2、IgG3、またはIgG4に変換することができる。
【０１３３】
いくつかの例において、開示される抗体は、抗体のオリゴマー、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、セプタマー、オクトマーなどである。
【０１３４】
（a）結合親和性
様々な態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、1.0 x 10-8 M以下、5.0 x 10-8 M以下、1.0 x 10-9 M以下、5.0 x 10-9 M以下、1.0 x 10-10 M以下、5.0 x 10-10 M以下、または1.0 x 10-11 M以下の親和性（例えば、Kdによって測定される）で、TEM8タンパク質に特異的に結合することができる。Kdは、例えば、公知の方法を用いて、関心対象の抗体のFabバージョンおよびその抗原で行う、放射性標識抗原結合アッセイ（RIA）によって測定することができる。1つのアッセイにおいて、抗原に対するFabの溶液結合親和性を、Fabを最小濃度の(125I)-標識抗原と、無標識抗原の滴定シリーズの存在下で平衡化し、その後、結合した抗原を抗Fab抗体コーティングしたプレートで捕捉することによって、測定する（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと）。アッセイ用の条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、50 mM炭酸ナトリウム（pH 9.6）中の5μg/mlの捕捉抗Fab抗体（Cappel Labs）で一晩コーティングし、その後、PBS中の2％（w/v）ウシ血清アルブミンで2〜5時間、室温（およそ23℃）でブロッキングする。非吸着性プレート（Nunc #269620）において、100μMまたは26 pMの[125I]-抗原を、関心対象のFabの連続希釈液と混合する（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593−4599 (1997)における抗VEGF抗体Fab-12の評価と一致する）。関心対象のFabをその後、一晩インキュベーションする；しかしながら、平衡に達することを確実にするために、インキュベーションは、より長い時間（例えば、約65時間）継続してもよい。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。溶液をその後除去し、プレートを、PBS中の0.1％ポリソルバート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl／ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard）を添加し、プレートを、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター（Packard）で10分間カウントする。最大結合の20％以下をもたらす各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
【０１３５】
別のアッセイにおいて、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000（BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.）を、25℃で、約10レスポンス単位（RU）で固定化した抗原CM5チップと共に使用する表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、Kdを測定することができる。簡潔に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIACORE（登録商標）, Inc.）を、供給業者の指示にしたがって、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性化する。抗原を、5l/分の流速でのインジェクションの前に10 mM酢酸ナトリウム、pH 4.8で5μg/ml（約0.2μM）に希釈して、およそ10レスポンス単位（RU）の結合タンパク質を達成する。抗原のインジェクション後に、1Mエタノールアミンをインジェクションして、未反応基をブロッキングする。速度論測定のために、0.05％ポリソルバート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤を含むPBS（PBST）におけるFabの2倍連続希釈液（0.78 nM〜500 nM）を、25℃でおよそ25 l/分の流速でインジェクションする。会合速度（kオン）および解離速度（kオフ）を、単純な一対一ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン3.2）を用いて、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムを同時に適合させることにより計算する。平衡解離定数（Kd）は、kオフ／kオンの比として計算する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。オン速度が、上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより106 M-1 s-1を超える場合には、ストップフローを装備した分光光度計（Aviv Instruments）または撹拌キュベットを有する8000シリーズのSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）などの分光計において測定されるような、PBS、pH 7.2中の20 nM抗抗原抗体（Fab形態）の、増大する濃度の抗原の存在下での蛍光発光強度（励起＝295 nm；発光＝340 nm、16 nm帯域通過）の増大または減少を25℃で測定する蛍光消失技術を用いることによって、オン速度を測定することができる。
【０１３６】
（b）多重特異性抗体
いくつかの態様において、二重特異性抗体などの多重特異性抗体上の抗体または抗原結合フラグメントが含まれる。そのような多重特異性抗体は、公知の方法、例えば、同じタイプまたは異なるタイプの2つ以上の抗体、抗原結合フラグメント（scFvなど）の架橋によって、製造することができる。多重特異性抗体を作製する例示的な方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願公開第WO2013/163427号に記載されているものを含む。適当な架橋剤は、適切なスペーサーによって分離されている2個の明確な反応基を有するヘテロ二官能性であるもの（m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなど）、またはホモ二官能性であるもの（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）を含む。そのようなリンカーは、Pierce Chemical Company, Rockford, Illから入手可能である。
【０１３７】
いくつかの態様において、TEM8タンパク質に特異的に結合し、かつさらにCD3に特異的に結合する二重特異性抗体上の抗体または抗原結合フラグメントが含まれる。二重特異性抗体または抗原結合フラグメント上に含まれ得るCD3結合ドメインの例は、公知であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願公開第WO2013/163427号に開示されているものを含む。
【０１３８】
様々なタイプの多重特異性抗体が、公知である。二重特異性一本鎖抗体は、単一の核酸分子によってコードされ得る。二重特異性一本鎖抗体の例、およびそのような抗体を構築する方法は、当技術分野において公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,076,459号、第8,017,748号、第8,007,796号、第7,919,089号、第7,820,166号、第7,635,472号、第7,575,923号、第7,435,549号、第7,332,168号、第7,323,440号、第7,235,641号、第7,229,760号、第7,112,324号、第6,723,538号を参照のこと）。二重特異性一本鎖抗体の追加の例は、PCT出願公開第WO 99/54440号；Mack, J. Immunol., 158:3965-3970, 1997；Mack, PNAS, 92:7021-7025, 1995；Kufer, Cancer Immunol. Immunother., 45:193-197, 1997；Loffler, Blood, 95:2098-2103, 2000；およびBruhl, J. Immunol., 166:2420-2426, 2001において見出され得る。二重特異性Fab-scFv（「バイボディ（bibody）」）分子の製造は、例えば、Schoonjans et al. (J. Immunol. 165:7050-57, 2000)および Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003)に記載されている。バイボディについては、例えば、1つのscFvがFab鎖のC末端に融合されているバイボディを製造するために、scFv分子をVL-CL（L）またはVH-CH1鎖のうちの1つに融合させることができる。
【０１３９】
（c）フラグメント
重鎖および軽鎖可変領域を含み、TEM8タンパク質に特異的に結合するFab、F(ab')2、およびFvなどの抗原結合フラグメントが、本開示によって包含される。これらの抗体フラグメントは、抗原と選択的に結合する能力を保持しており、「抗原結合」フラグメントである。これらのフラグメントは、以下を含む：
（1）Fab、これは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントであり、全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖および1つの重鎖の一部分を生成することによって製造することができる；
（2）Fab'、この抗体分子のフラグメントは、全抗体をペプシンで処理し、その後に還元して、インタクトな軽鎖および重鎖の一部分を生成することによって取得することができ；抗体分子あたり2つのFab'フラグメントが取得される；
（3）(Fab')2、これは、その後の還元を伴わずに全抗体を酵素ペプシンで処理することによって取得することができる抗体のフラグメントであり；F(ab')2は、2つのジスルフィド結合によって1つに保たれている2つのFab'フラグメントのダイマーである；
（4）Fv、これは、2つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントである；ならびに
（5）一本鎖抗体（scFvなど）、これは、遺伝学的に融合された一本鎖分子として、適当なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子として定義される。scFvは、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域が、リンカーによって結合されている融合タンパク質である（例えば、Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250；Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010を参照のこと）。scFvにおけるVHドメインおよびVLドメインの分子内配向は、提供される抗体について（例えば、提供される多重特異性抗体について）決定的ではない。したがって、両方の可能な配置を有するscFv（VHドメイン-リンカードメイン-VLドメイン；VLドメイン-リンカードメイン-VHドメイン）が、使用され得る。
（6）一本鎖抗体のダイマー（scFV2）、これはscFVのダイマーとして定義される。これはまた、「ミニ抗体」とも呼ばれている。
【０１４０】
これらのフラグメントを作製する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013を参照のこと）。
【０１４１】
さらなる態様群において、抗体結合フラグメントは、典型的に約25 kDaであり、かつ、各重鎖および各軽鎖あたり3個のCDRを有する完全な抗原結合部位を含有する、Fv抗体であることができる。Fv抗体を製造するために、VHおよびVLを、宿主細胞において2種の個別の核酸構築物から発現させることができる。VHおよびVLが非連続的に発現される場合、Fv抗体の鎖は、典型的に、非共有結合性相互作用によって1つに保たれる。しかしながら、これらの鎖は、希釈時に解離する傾向があるため、グルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド、またはペプチドリンカーを通して鎖を架橋する方法が開発されている。したがって、1つの例において、Fvは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がジスルフィド結合によって化学的に連結されている、ジスルフィド安定化Fv（dsFv）であることができる。
【０１４２】
追加の例において、Fvフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたVH鎖およびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（scFv）は、オリゴヌクレオチドによってつながれたVHドメインおよびVLドメインをコードする核酸分子を構築することによって調製される。核酸分子を、発現ベクター中に挿入し、その後、哺乳動物細胞などの宿主細胞中に導入する。組み換え宿主細胞は、リンカーペプチドが2つのVドメインを架橋している単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを製造するための方法は、当技術分野において公知である（Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol.2, page 97, 1991；Bird et al., Science 242:423, 1988；米国特許第4,946,778号；Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993；Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250；Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010を参照のこと）。一本鎖抗体のダイマー（scFV2）もまた、想定されている。
【０１４３】
抗原結合フラグメントは、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、またはフラグメントをコードするDNAの宿主細胞（大腸菌（E.coli）細胞など）における発現によって調製することができる。抗原結合フラグメントはまた、従来的な方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって取得することもできる。例えば、抗原結合フラグメントは、F(ab')2と呼ばれる5Sフラグメントを提供するペプシンでの抗体の酵素切断によって、製造することができる。このフラグメントを、チオール還元剤、および任意でジスルフィド連結の切断により生じるスルフヒドリル基のためのブロッキング基を用いてさらに切断し、3.5S Fab' 一価フラグメントを製造することができる。あるいは、ペプシンを用いた酵素切断により、2つの一価Fab'フラグメントおよびFcフラグメントが直接製造される（米国特許第4,036,945号および米国特許第4,331,647号、ならびにこれらに含まれる参照文献；Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960；Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959；Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol.1, page 422, Academic Press, 1967；ならびにColigan et al.のセクション2.8.1〜2.8.10および2.10.1〜2.10.4を参照のこと）。
【０１４４】
抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽・重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技術もまた、そのフラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
【０１４５】
ドメイン抗体（dAb）と呼ばれる抗原結合単一VHドメインがまた、免疫化されたマウスのゲノムDNAから増幅されたマウスVH遺伝子のライブラリーより同定されている（Ward et al. Nature 341:544-546, 1989）。高親和性で抗原に結合することができるヒト単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドもまた、記載されている（例えば、PCT出願公開第WO 2005/035572号および第WO 2003/002609号を参照のこと）。本明細書において開示されるCDRはまた、dAbにも含まれ得る。
【０１４６】
いくつかの態様において、開示される抗体由来の重鎖および／または軽鎖相補性決定領域（CDR）の1つまたは複数が、骨格タンパク質などの別のタンパク質の表面上に発現される。骨格タンパク質の表面上での抗体のドメインの発現は、当技術分野において公知である（例えば、Liu et al., J. Virology 85(17): 8467-8476, 2011を参照のこと）。そのような発現によって、TEM8に対する結合を保持するキメラタンパク質が作製される。いくつかの具体的態様において、重鎖CDRの1つまたは複数、例えば、重鎖CDR1、CDR2、および／またはCDR3の1つまたは複数を、骨格タンパク質上に移植する。1つまたは複数のCDRはまた、ダイアボディまたは別のタイプの一本鎖抗体分子にも含まれ得る。
【０１４７】
（d）変種
ある特定の態様において、本明細書中に提供される抗体のアミノ酸配列変種が、想定される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが、望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変種は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、その中への挿入、および／またはその中の残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を有するとの条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを作製して、最終構築物に到達することができる。
【０１４８】
ある特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変種が提供される。置換による変異導入のための関心対象の部位は、CDRおよびフレームワーク領域を含む。アミノ酸置換が、関心対象の抗体中に導入されてもよく、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、またはADCCもしくはCDCの改善について、産物がスクリーニングされてもよい。
【０１４９】
変種は、典型的に、VH領域とVL領域との間の正確なフォールディングおよび安定化に必要なアミノ酸残基を保持し、かつ、分子の低いpIおよび低い毒性を保存するために残基の電荷特性を保持するであろう。収率を増大させるために、VH領域およびVL領域において、アミノ酸置換を行うことができる。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の表は、当業者に周知である。以下の6種のグループは、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
1）アラニン（A）、セリン（S）、スレオニン（T）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
【０１５０】
いくつかの態様において、抗体の重鎖は、SEQ ID NO: 1、3、5、または7のうちの1つに示されるアミノ酸配列と比較して、最大10個（例えば、最大1個、最大2個、最大3個、最大4個、最大5個、最大6個、最大7個、最大8個、または最大9個）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含む。いくつかの態様において、抗体の軽鎖は、SEQ ID NO: 2、4、6、または8のうちの1つに示されるアミノ酸配列と比較して、最大10個（例えば、最大1個、最大2個、最大3個、最大4個、最大5個、最大6個、最大7個、最大8個、または最大9個）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含む。
【０１５１】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、公知のフレームワーク領域と比較して、または本明細書において開示されるようなm825、m822、m830、もしくはm863抗体のフレームワーク領域と比較して、抗体の重鎖、または抗体の軽鎖、または抗体の重鎖および軽鎖のフレームワーク領域において、最大10個（例えば、最大1個、最大2個、最大3個、最大4個、最大5個、最大6個、最大7個、最大8個、または最大9個）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含み、かつ、TEM8タンパク質に対する特異的な結合活性を維持することができる。
【０１５２】
ある特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、1つまたは複数のCDR内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書において提供されるような保存的置換）が、CDRにおいて行われてもよい。上記で提供される変種VHおよびVL配列のある特定の態様において、各CDRは、変更されていないか、または、1個、2個、もしくは3個以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【０１５３】
抗体の結合親和性を増大させるために、天然の免疫応答中に抗体の親和性成熟を担うインビボ体細胞変異プロセスに類似しているプロセスにおいて、VLおよびVHセグメント、例えば、H-CDR3領域またはL-CDR3領域内を、ランダムに変異させることができる。したがって、インビトロ親和性成熟は、それぞれ、H-CDR3またはL-CDR3に相補的なPCRプライマーを用いて、VHおよびVL領域を増幅することによって、達成できる。このプロセスにおいて、プライマーは、結果として生じるPCR産物が、VHおよび／またはVL CDR3領域中にランダム変異が導入されているVHおよびVLセグメントをコードするように、ある特定の位置を4種のヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」されている。これらのランダムに変異したVHおよびVLセグメントを試験して、TEM8タンパク質に対する結合親和性を判定することができる。特定の例において、VHアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 1、3、5、または7のうちの1つである。他の例において、VLアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 2、4、6、または8である。インビトロ親和性成熟の方法は、公知である（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)、およびHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001))を参照のこと）。
【０１５４】
変異導入の標的とされ得る抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により記載されているように「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法においては、標的残基の1個の残基またはグループ（例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電残基）を同定し、中性または負の電荷を有するアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。最初の置換に機能的感受性を示すアミノ酸の場所に、さらなる置換を導入してもよい。あるいはまたは加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を用いて、抗体と抗原との間の接触点を同定する。そのような接触残基および近隣残基を、置換の候補として標的化または除去してもよい。変種をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを判定してもよい。
【０１５５】
ある特定の態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、その抗体または抗原結合フラグメントがグリコシル化される程度を増大または減少させるように変更される。グリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成され得る。
【０１５６】
抗体がFc領域を含む場合、それに付加される糖質が変更されてもよい。哺乳動物細胞により産生されるネイティブの抗体は、典型的に、Fc領域のCH2ドメインのAsn297に、N結合によって一般に付加されている、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照のこと。オリゴ糖は、様々な糖質、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のGlcNAcに付加されたフコースを含み得る。いくつかの態様において、ある特定の改善された特性を有する抗体変種を作製するために、抗体におけるオリゴ糖の修飾が行われてもよい。
【０１５７】
1つの態様において、Fc領域に（直接または間接的に）付加されるフコースを欠如している糖質構造を有する抗体変種が、提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であってもよい。フコースの量は、例えば、第WO 2008/077546号に記載されているように、MALDI-TOF質量分析法によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造（例えば、複合型、ハイブリッド型、および高マンノース型構造）の合計に対する、Asn297の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって、決定される。Asn297は、Fc領域中の約297位に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、Asn297はまた、抗体中の小さな配列変動のために、297位の約±3アミノ酸下流または上流、すなわち294位〜300位にも位置し得る。そのようなフコシル化変種は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第US 2003/0157108号（Presta, L.）；第US 2004/0093621号（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変種に関する刊行物の例には、第US 2003/0157108号；第WO 2000/61739号；第WO 2001/29246号；第US 2003/0115614号；第US 2002/0164328号；第US 2004/0093621号；第US 2004/0132140号；第US 2004/0110704号；第US 2004/0110282号；第US 2004/0109865号；第WO 2003/085119号；第WO 2003/084570号；第WO 2005/035586号；第WO 2005/035778号；第WO2005/053742号；第WO2002/031140号；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているLec 13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US 2003/0157108 A1号, Presta, L；および第WO 2004/056312 A1号, Adams et al., 特に実施例11）、ならびにα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；および第WO2003/085107号を参照のこと）などのノックアウト細胞株が含まれる。
【０１５８】
例えば、抗体のFc領域に付加された二分岐オリゴ糖がGlcNAcによってバイセクトされている（bisected）、バイセクトオリゴ糖を有する抗体変種が、さらに提供される。そのような抗体変種は、減少したフコシル化、および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変種の例は、例えば、第WO 2003/011878号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第6,602,684号（Umana et al.）；および第US 2005/0123546号（Umana et al.）に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1個のガラクトース残基を有する抗体変種もまた、提供される。そのような抗体変種は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変種は、例えば、第WO 1997/30087号（Patel et al.）；第WO 1998/58964号（Raju, S.）；および第WO 1999/22764号（Raju, S.）に記載されている。
【０１５９】
様々な態様において、抗体の定常領域は、抗体のインビボ半減期を最適化するために、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。IgG Abの血清半減期は、新生児Fc受容体（FcRn）によって調節されている。したがって、様々な態様において、抗体は、FcRnに対する結合を増大させるアミノ酸置換を含む。いくつかのそのような置換、例えば、IgG定常領域の置換であるT250QおよびM428L（例えば、Hinton et al., J Immunol., 176:346-356, 2006を参照のこと）；M428LおよびN434S（「LS」変異、例えば、Zalevsky, et al., Nature Biotechnology, 28:157-159, 2010を参照のこと）；N434A（例えば、Petkova et al., Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006を参照のこと）；T307A、E380A、およびN434A（例えば、Petkova et al., Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006を参照のこと）；ならびにM252Y、S254T、およびT256E（例えば、Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem., 281:23514-23524, 2006を参照のこと）が、当業者に公知である。
【０１６０】
いくつかの態様において、抗体の定常領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を最適化するために、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ADCCは、主として、一連の密接に関連したFcγ受容体を通して媒介される。いくつかの態様において、抗体は、FcγRIIIaに対する結合を増大させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかのそのような置換、例えば、IgG定常領域の置換であるS239DおよびI332E（例えば、Lazar et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 103:4005-4010, 2006を参照のこと）；ならびにS239D、A330L、およびI332E（例えば、Lazar et al., Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 103:4005-4010, 2006を参照のこと）が、当業者に公知である。
【０１６１】
FcRnおよびFcγRIIIaに対する結合が増大したIgG定常領域を生成するために、上記の置換の組み合わせもまた含まれる。組み合わせは、抗体半減期およびADCCを増大させる。例えば、そのような組み合わせには、Fc領域中に以下のアミノ酸置換を有する抗体が含まれる：
（1）S239D/I332EおよびT250Q/M428L；
（2）S239D/I332EおよびM428L/N434S；
（3）S239D/I332EおよびN434A；
（4）S239D/I332EおよびT307A/E380A/N434A；
（5）S239D/I332EおよびM252Y / S254T/T256E；
（6）S239D/A330L/I332EおよびT250Q/M428L；
（7）S239D/A330L/I332EおよびM428L/N434S；
（8）S239D/A330L/I332EおよびN434A；
（9）S239D/A330L/I332EおよびT307A/E380A/N434A；または
（10）S239D/A330L/I332EおよびM252Y/S254T/T256E。
いくつかの例において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、感染した細胞に対して直接細胞傷害性であるか、または、補体、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）、もしくはマクロファージによる食作用などの自然防御を用いるように、修飾される。
【０１６２】
ある特定の態様において、本明細書において提供される抗体は、当技術分野において公知であり、かつ容易に入手可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーが含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーもしくはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリルプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために、製造において利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってもよく、分岐型または非分岐型であってもよい。抗体に付加されるポリマーの数は、変動してもよく、1つより多いポリマーが付加される場合は、同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定された条件下で治療に使用されるかどうかなどを含むがこれらに限定されない考慮に基づいて判定することができる。
【０１６３】
抗体または抗原結合フラグメントは、誘導体化するか、または別の分子（別のペプチドもしくはタンパク質など）に連結することができる。一般に、抗体または抗原結合フラグメントは、TEM8への結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように、誘導体化される。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、1つまたは複数の他の分子体、例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ）、検出可能マーカー、エフェクター分子、または、抗体もしくは抗体部分と別の分子との会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチド（ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど）に、（化学的カップリング、遺伝学的融合、非共有結合性会合、または別の方法によって）機能的に連結することができる。
【０１６４】
本明細書に提供されるTEM8特異的抗体が結合するのと同一のTEM8上のエピトープに結合する抗体も含まれる。そのようなエピトープに結合する抗体は、TEM8結合アッセイ（例えば、実施例に記載されるもの）において本明細書に提供されるTEM8特異的抗体と交差競合する（例えば、統計的に有意な様式でその結合を競合的に阻害する）それらの能力に基づいて同定することができる。抗体は、それと競合する抗体が、競合抗体のKDよりも106 x 高い競合抗体濃度の存在下で本発明の抗体のTEM8結合を50%超阻害するとき、結合に関して「競合」する。特定の態様において、本発明の抗体と同一のTEM8上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるようにして調製および単離され得る。
【０１６５】
B．コンジュゲート
TEM8に特異的なヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、当業者に公知の任意の多くの手段を用いて、エフェクター分子または検出可能マーカーなどの剤にコンジュゲートすることができる。共有結合的付加および非共有結合的付加の両方の手段が使用され得る。コンジュゲートには、エフェクター分子または検出可能マーカーがTEM8に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントに共有結合的に連結されている分子が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、放射性物質、例えば125I、32P、14C、3Hおよび35Sならびにその他の標識、標的分子およびリガンド等を含む（がこれらに限定されない）様々なエフェクター分子および検出可能マーカーを使用できることを理解するであろう。
【０１６６】
個々のエフェクター分子または検出可能マーカーの選択は、個々の標的分子または細胞および所望の生物学的効果に依存する。したがって、例えば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を死亡させるのに使用される細胞毒であり得る。
【０１６７】
エフェクター分子および検出可能マーカーは、当業者に公知の任意の多くの手段を用いて関心対象の抗体または抗原結合フラグメントに連結することができる。共有結合的付加および非共有結合的付加の両方の手段が使用され得る。エフェクター分子または検出可能マーカーを抗体または抗原結合フラグメントに付加する手順は、そのエフェクターの化学的構造により異なる。ポリペプチドは、典型的に、様々な官能基；例えば、カルボン酸（COOH）、遊離アミン（-NH2）またはスルフヒドリル（-SH）基、を含んでおり、これらを、抗体の適当な官能基と反応させ、エフェクター分子または検出可能マーカーとの結合を生じさせるのに利用することができる。あるいは、抗体または抗原結合フラグメントは、追加の反応性官能基が露出するようまたはそれを付加するよう誘導体化される。誘導体化は、任意の多くの公知のリンカー分子、例えば、Pierce Chemical Company, Rockford, ILから入手可能なもの、の付加を伴うものであり得る。リンカーは、抗体または抗原結合フラグメントをエフェクター分子または検出可能マーカーに接続するのに使用される任意の分子であり得る。リンカーは、抗体または抗原結合フラグメントおよびエフェクター分子または検出可能マーカーの両方に対する共有結合を形成することができるものである。適当なリンカーは、当業者に周知であり、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが含まれるがこれらに限定されない。抗体または抗原結合フラグメントおよびエフェクター分子または検出可能マーカーがポリペプチドの場合、リンカーは、それらの側鎖基を通じて（例えば、システインに対するジスルフィド連結を通じて）構成アミノ酸に、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノおよびカルボキシル基に、接続され得る。
【０１６８】
あるいは、様々な態様において、リンカーは、スペーサー要素を含み得、これは存在する場合、エフェクター分子または検出可能マーカーと抗体または抗原結合フラグメントとの間の距離が長くなるようリンカーのサイズを大きくするものである。例示的なスペーサーは、当業者に公知であり、各々その全体が参照により組み入れられる米国特許第7,964,566号、同第7,498,298号、同第6,884,869号、同第6,323,315号、同第6,239,104号、同第6,034,065号、同第5,780,588号、同第5,665,860号、同第5,663,149号、同第5,635,483号、同第5,599,902号、同第5,554,725号、同第5,530,097号、同第5,521,284号、同第5,504,191号、同第5,410,024号、同第5,138,036号、同第5,076,973号、同第4,986,988号、同第4,978,744号、同第4,879,278号、同第4,816,444号および同第4,486,414号ならびに米国特許出願公開第20110212088号および同第20110070248号に列挙されているものが含まれる。
【０１６９】
したがって、様々な態様において、コンジュゲートは、エフェクター分子または検出可能マーカーをTEM8特異的抗体またはその抗原結合フラグメントにつなぐリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、細胞内条件下で切断可能なものであり、細胞内環境中でのリンカーの切断によって抗体または抗原結合フラグメントからエフェクター分子または検出可能マーカーが放出される。さらに他の態様において、リンカーは切断可能でなく、エフェクター分子または検出可能マーカーは、例えば抗体の分解によって放出される。いくつかの態様において、リンカーは細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能なものである。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。しかし、リンカーは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸長、例えば1〜2、1〜3、2〜5、3〜10、3〜15、1〜5、1〜10、1〜15アミノ酸長であり得る。プロテアーゼには、カテプシンBおよびDならびにプラスミンが含まれ得、これらはすべて、ジペプチド薬物誘導体を加水分解し、標的細胞内で活性薬物を放出させることが公知である（例えば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123を参照のこと）。例えば、チオール依存的プロテアーゼであるカテプシンBによって切断可能なペプチドリンカーが使用され得る（例えば、フェニルアラニン-ロイシンまたはグリシン-フェニルアラニン-ロイシン-グリシンリンカー）。そのようなリンカーの他の例は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,214,345号に記載されている。具体的な態様において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、バリン-シトルリンリンカーまたはフェニルアラニン-リジンリンカーである（例えば、バリン-シトルリンリンカーを含むドキソルビシンの合成について記載する米国特許第6,214,345号を参照のこと）。
【０１７０】
他の態様において、切断可能リンカーはpH感受性である、すなわち、特定のpH値で加水分解に感受性である。典型的に、pH感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能なものである。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス-アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）を使用することができる。（例えば、米国特許第5,122,368号；同第5,824,805号；同第5,622,929号；Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123；Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661を参照のこと。）そのようなリンカーは、中性pH条件、例えば血液中のpH条件の下では比較的安定であるが、ほぼリソソームのpHである、pH 5.5または5.0未満では不安定である。特定の態様において、加水分解可能リンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を通じて治療剤に付加されたチオエーテル）である（例えば、米国特許第5,622,929号を参照のこと）。
【０１７１】
さらに他の態様において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、SATA（N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート）、SPDP(N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート)、SPDB（N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチレート）およびSMPT（N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン）-、SPDBおよびSMPTを用いて形成できるものが含まれるがこれらに限定されない。（例えば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynezak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C.W.Vogel ed., Oxford U. Press, 1987); Phillips et al., Cancer Res. 68: 92809290, 2008を参照のこと。）米国特許第4,880,935号も参照のこと。
【０１７２】
さらに他の具体的な態様において、リンカーは、マロン酸リンカー（Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1299-1304）または3'-N-アミドアナログ（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10): 1305-12）である。
【０１７３】
さらに他の態様において、リンカーは切断可能でなく、エフェクター分子または検出可能マーカーは抗体の分解によって放出される（その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2005/0238649号を参照のこと）。
【０１７４】
様々な態様において、リンカーは、細胞外環境下で切断に対して耐性である。例えば、コンジュゲートが細胞外環境に（例えば、血漿中に）存在するときに、コンジュゲートのサンプル中のリンカーの約20%以下、約15%以下、約10%以下、約5%以下、約3%以下または約1%以下が切断される。リンカーが細胞外環境下で切断に対して耐性であるかどうかは、例えば、関心対象のリンカーを含むコンジュゲートを一定期間（例えば、2、4、8、16または24時間）血漿と共にインキュベートし、次いで血漿中に存在する遊離のエフェクター分子または検出可能マーカーの量を定量することによって決定することができる。コンジュゲートにおいて使用することができる様々な例示的なリンカーが、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2004-010957、米国特許出願公開第2006/0074008号、米国特許出願公開第20050238649号および米国特許出願公開第2006/0024317号に記載されている。
【０１７５】
本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、（同一タイプの、または、例えば二重特異性抗体を作製する場合は、異なるタイプの）2つまたはそれ以上の抗体を架橋することによって誘導体化され得る。適当な架橋剤には、適当なスペーサーによって隔てられた2つの異なる反応性基を有する、ヘテロ二機能性のもの（例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二機能性のもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が含まれる。そのようなリンカーは、市販されている。
【０１７６】
抗体への様々な放射線診断化合物、放射線治療化合物、標識（例えば、酵素または蛍光分子）、毒素およびその他の剤の付加に関しては多数の方法が報告されているので、当業者は、所与の剤を抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは他のポリペプチドに付加するのに適した方法を決定することができるであろう。例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、抗体薬物コンジュゲート（ADC）を作製するために、低分子量薬物、例えば、モノメチルオーリスタチンE（MMAE）、モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、メイタンシン、DM1として公知（メルタンシンとしても公知）のメイタンシンの誘導体を含むメイタンシン誘導体、またはその他の化学療法剤とコンジュゲートされ得る。様々な態様において、本明細書に記載される様々な化学療法剤が、コンジュゲートを生成するため、提供される抗体にコンジュゲートされ得る。
【０１７７】
様々な態様において、抗体または抗原結合フラグメントと1つまたは複数の低分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセンおよびCC1065ならびに毒物活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートが提供される。
【０１７８】
メイタンシノイド毒素部分として使用するのに適したメイタンシン化合物は、当技術分野で周知であり、これは公知の方法にしたがい天然供給源から単離することができ、遺伝子操作技術を用いて製造することができ（Yu et al (2002) PNAS 99: 7968-7973を参照のこと）またはメイタンシノールおよびメイタンシノールアナログを公知の方法にしたがい合成的に調製することができる。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂（mitototic）阻害剤である。メイタンシンは、東アフリカの灌木であるメイテナス・セラタ（Maytenus serrata）から最初に単離された（米国特許第3,896,111号）。その後、特定の微生物もメイタンシノイド、例えばメイタンシノールおよびC-3メイタンシノールエステルを産生することが発見された（米国特許第4,151,042号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,137,230号；同第4,248,870号；同第4,256,746号；同第4,260,608号；同第4,265,814号；同第4,294,757号；同第4,307,016号；同第4,308,268号；同第4,308,269号；同第4,309,428号；同第4,313,946号；同第4,315,929号；同第4,317,821号；同第4,322,348号；同第4,331,598号；同第4,361,650号；同第4,364,866号；同第4,424,219号；同第4,450,254号；同第4,362,663号；および同第4,371,533号に開示されている。メイタンシノイドを含むコンジュゲート、その製造法およびそれらの治療利用は、例えば、米国特許第5,208,020号；同第5,416,064号；同第6,441,163号および欧州特許第EP0 425 235 B1号に開示されており、これらの開示は明示的に参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７９】
1つの例において、コンジュゲートは、TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体（またはその抗原結合フラグメント）、非還元性チオエステルリンカーおよびメイタンシノイド毒素DM1を含み；例えば、コンジュゲートは：
0006502931.tif 000021
に示される構造（式中、「mAb」はモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを表す）を含み得る。
【０１８０】
いくつかの態様において、エフェクター分子は、オーリスタチン、例えば、オーリスタチンE（当技術分野ではドラスタチン-10の誘導体としても公知）またはその誘導体である。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンEとケト酸との間で形成されるエステルであり得る。例えば、オーリスタチンEは、AEBおよびAEVBを作製するため、それぞれ、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させることができる。他の例示的なオーリスタチンには、AFP、MMAF、およびMMAEが含まれる。例示的なオーリスタチンの合成および構造は、各々の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2003/0083263号；国際特許出願公開第WO 04/010957号、国際特許出願公開第WO 02/088172号ならびに米国特許第7,498,298号、同第6,884,869号、同第6,323,315号；同第6,239,104号；同第6,034,065号；同第5,780,588号；同第5,665,860号；同第5,663,149号；同第5,635,483号；同第5,599,902号；同第5,554,725号；同第5,530,097号；同第5,521,284号；同第5,504,191号；同第5,410,024号；同第5,138,036号；同第5,076,973号；同第4,986,988号；同第4,978,744号；同第4,879,278号；同第4,816,444号；および同第4,486,414号に記載されている。オーリスタチンMMAEを含む抗体薬物コンジュゲート、およびそのようなコンジュゲートを作製する方法、についてのさらなる記載は、例えば、各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0268751号、2008/0305044、2007/0258987に提供されている。オーリスタチンは、微小管のダイナミクスならびに核および細胞の分裂に干渉し、抗がん活性を有することが示されている。オーリスタチンは、チューブリンに結合し、細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用を発揮し得る。オーリスタチンまたは得られるコンジュゲートが所望の細胞株に対して細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用を発揮するかどうかを決定する上で使用することができる多くの様々なアッセイが、当技術分野で公知である。
【０１８１】
1つの例において、コンジュゲートは、TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体（またはその抗原結合フラグメント）、バリン-シトルリン（Val-Cit）ペプチド切断部位を含む切断可能リンカー、スペーサーおよび毒素MMAEを含み；例えば、コンジュゲートは：
0006502931.tif 000022
に示される構造（式中「mAb」は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを表す。）を含み得る。
【０１８２】
1つの好ましい態様において、コンジュゲートは、
0006502931.tif 000023
であってもよく、式中、nは、0〜10（例えば、0〜8、0〜4、2〜4、2〜8、1〜10、1〜8、または1〜4、または2、4、6、もしくは8）の整数（例えば、偶数）であり、Aは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（H-CDR）1、H-CDR2、およびH-CDR3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 2のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（L-CDR）1、L-CDR2、およびL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ、Sは、抗体由来の硫黄原子である。1つの態様において、好ましくは、nは、0〜8、好ましくは0〜4の偶数である。S部分は、抗体の鎖間ジスルフィドの還元または部分的還元によって（例えば、DTTまたはTCEPなどの還元剤での処理によって）曝露され得る。
【０１８３】
1つの非限定的な態様において、コンジュゲートは、
0006502931.tif 000024
であってもよく、式中、nは4であり、かつ、Aは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸26〜33、51〜58、および97〜106をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（H-CDR）1、H-CDR2、およびH-CDR3を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO: 2のアミノ酸26〜31、49〜51、および88〜97をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域（L-CDR）1、L-CDR2、およびL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかのそのような態様において、重鎖可変領域は、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO: 2に示されるアミノ酸配列を含み、かつ、Sは、抗体またはその抗原結合フラグメント由来の硫黄原子である。
【０１８４】
さらなる毒素を、TEM8に特異的に結合する抗体およびこれらの抗体の抗原結合フラグメントと共に利用することができる。例示的な毒素には、緑膿菌外毒素（PE）、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそれらのサブユニット、リボトキシン、リボヌクレアーゼ、サポリンおよびカリケアマイシン、ならびにボツリヌス毒素A〜Fが含まれる。これらの毒素は、当技術分野で周知であり、多くは商業的供給源（例えば、Sigma Chemical Company, St. Louis, MO）から容易に入手できる。想定されている毒素には、毒素の変種も含まれる（例えば、米国特許第5,079,163号および同第4,689,401号を参照のこと）。いくつかの態様において、これらのコンジュゲートは、がん腫、例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がんおよび黒色腫の処置に使用される。
【０１８５】
サポリンは、リボソーム複合体の60S部分を不活性化することによってタンパク質合成を撹乱する、サボンソウ（Saponaria officinalis）由来の毒素である（Stirpe et al., Bio/Technology, 10: 405-412, 1992）。しかし、この毒素は、細胞に独自に進入するメカニズムを有しておらず、したがって細胞によって効率的に取り込まれるようにするためには、インターナライズされる細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合フラグメントとのコンジュゲーションが必要となる。
【０１８６】
ジフテリア毒素は、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）から単離される。典型的に、免疫毒素として使用されるジフテリア毒素は、非特異的な毒性を減少または排除するよう変異させてある。完全な酵素活性を有するが非特異的な毒性が大きく減少している、CRM107として公知の変異体が、1970年代以降公知となっており（Laird and Groman, J. Virol. 19: 220, 1976）、ヒトの臨床試験において使用されている。米国特許第5,792,458号および米国特許第5,208,021号を参照のこと。
【０１８７】
リシンは、トウゴマ（Ricinus communis）（トウゴマの実）由来のレクチンRCA60である。リシンの例については、米国特許第5,079,163号および米国特許第4,689,401号を参照のこと。トウゴマ凝集素（RCA）は、それらのおよそ65および120 kDの分子量にしたがい、それぞれ、RCA60およびRCA120と呼ばれる2つの形態で存在する（Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 266: 543, 1972）。そのA鎖は、タンパク質合成の不活性化および細胞の殺傷を担っている。そのB鎖は、リシンを細胞表面ガラクトース残基に結合させ、細胞質ゾルへのA鎖の輸送を促進する（Olsnes et al., Nature 249: 627-631, 1974および米国特許第3,060,165号）。
【０１８８】
リボヌクレアーゼもまた、免疫毒素として使用するために標的化分子にコンジュゲートされる（Suzuki et al., Nat. Biotech. 17: 265-70, 1999を参照のこと）。例示的なリボトキシン、例えば、α-サルシンおよびレストリクトシンは、例えば、Rathore et al., Gene 190: 31-5, 1997；およびGoyal and Batra, Biochem. 345 Pt 2: 247-54, 2000で考察されている。カリケアマイシンは、ミクロモノスポラ・エチノスポラ（Micromonospora echinospora）から最初に単離された、DNAの2本鎖を分裂させアポトーシスを誘導するエンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（例えば、Lee et al., J. Antibiot. 42: 1070-87, 1989を参照のこと）。この薬物は、臨床試験中の免疫毒素の毒性部分である（例えば、Gillespie et al., Ann. Oncol. 11: 735-41, 2000を参照のこと）。
【０１８９】
アブリンには、トウアズキ（Abrus precatorius）由来の毒性レクチンが含まれる。毒性の主成分であるアブリンa、b、cおよびdは、約63〜67 kDの分子量を有し、2つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖AおよびBから構成される。A鎖はタンパク質合成を阻害し；B鎖（アブリン-b）はD-ガラクトース残基に結合する（Funatsu et al., Agr. Biol. Chem. 52: 1095, 1988；およびOlsnes, Methods Enzymol. 50: 330-335, 1978を参照のこと）。
【０１９０】
1つの態様において、毒素は、緑膿菌外毒素（PE）である（米国特許第5,602,095号）。本明細書で使用される場合、PEには、全長でネイティブの（天然に存在する）PEまたは修飾されたPEが含まれる。そのような修飾には、ドメインIaの除去、ドメインIb、IIおよびIIIにおける様々なアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換ならびにカルボキシル末端における1つまたは複数の配列の付加が含まれ得るが、これらに限定されない（例えば、Siegall et al., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261, 1989を参照のこと）。提供される抗体と共に利用されるPEには、ネイティブ配列、ネイティブ配列の細胞傷害性フラグメントならびにネイティブPEおよびその細胞傷害性フラグメントの保存的修飾変種が含まれ得る。PEの細胞傷害性フラグメントには、標的細胞中でのその後のタンパク質分解またはその他のプロセシングによって細胞傷害性となるまたはそれなしでも細胞傷害性であるPEが含まれる。PEの細胞傷害性フラグメントには、PE40、PE38およびPE35が含まれる。PEおよびその変種に関するさらなる説明については、例えば、米国特許第4,892,827号；同第5,512,658号；同第5,602,095号；同第5,608,039号；同第5,821,238号；および同第5,854,044号；PCT出願公開第WO 99/51643号；Pai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3358-3362, 1991；Kondo et al., J. Biol. Chem., 263: 9470-9475, 1988；Pastan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333: C1-C6, 1997を参照のこと。
【０１９１】
例えば、PE-LR、PE-6X、PE-8X、PE-LR/6XおよびPE-LR/8Xであるがこれらに限定されない、プロテアーゼ耐性のPE変種および低免疫原性のPE変種もまた、本願で想定されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Weldon et al., Blood 113(16): 3792-3800, 2009; Onda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(32): 11311-11316, 2008; ならびにPCT出願公開第WO 2007/016150号、同第WO 2009/032954号および同第WO 2011/032022号を参照のこと）。
【０１９２】
いくつかの例において、PEは、リソソーム分解に対して耐性の変種、例えば、PE-LR（Weldon et al., Blood 113(16): 3792-3800, 2009; PCT出願公開第WO 2009/032954号）である。他の例において、PEは、PE-LR/6Xと呼ばれる変種（PCT出願公開第WO 2011/032022号）である。他の例において、PEは、PE-LR/8Mと呼ばれる変種（PCT出願公開第WO 2011/032022号）である。
【０１９３】
TEM8に特異的に結合するモノクローナル抗体（またはその抗原結合フラグメント）はまた、検出可能マーカー、例えば、ELISA、分光測定、フローサイトメトリー、顕微鏡観察または診断画像化技術（例えば、コンピュータ断層撮影（CT）、コンピュータ体軸断層撮影（CAT）スキャン、磁気共鳴画像化（MRI）、核磁気共鳴画像化（NMRI）、磁気共鳴断層撮影（MTR）、超音波、ファイバー試験および腹腔鏡試験）によって検出できる検出可能マーカーとコンジュゲートされ得る。検出可能マーカーの具体的で非限定的な例には、発蛍光団、化学発光剤、酵素的連結、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、MRIにより検出される超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が含まれる。例えば、有用な検出可能マーカーには、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体等を含む蛍光化合物が含まれる。生物発光マーカー、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、もまた使用される。抗体または抗原結合フラグメントはまた、検出に有用な酵素、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等とコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合フラグメントが検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、それは、識別可能な反応産物を生成するためにその酵素が使用する追加の試薬を添加することによって検出され得る。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼという剤が存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により視覚的に検出可能な有色の反応産物が生じる。抗体または抗原結合フラグメントはまた、ビオチンとコンジュゲートされ、そしてアビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出され得る。アビジン自体も酵素または蛍光標識とコンジュゲートすることができることに留意されたい。
【０１９４】
抗体または抗原結合フラグメントは、常磁性剤、例えばガドリニウムとコンジュゲートされ得る。常磁性剤、例えば超常磁性酸化鉄も、標識として使用される。抗体はまた、ランタニド（例えば、ユーロピウムおよびジスプロシウム）ならびにマンガンとコンジュゲートされ得る。抗体または抗原結合フラグメントはまた、2次レポーターによって認識される規定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、2次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識され得る。
【０１９５】
抗体または抗原結合フラグメントはまた、放射性標識アミノ酸とコンジュゲートされ得る。放射性標識は、診断および治療の両方の目的で使用され得る。例えば、放射性標識は、TEM8およびTEM8発現細胞を、x線、発光スペクトルまたはその他の診断技術によって検出するために使用され得る。さらに、放射性標識は、対象における腫瘍の処置、例えば、乳がん、肺がん、結腸直腸がんまたは黒色腫の処置のための毒素として治療的に使用され得る。ポリペプチド用の標識の例には、以下の放射性同位元素または放射性核種が含まれるがこれらに限定されない：3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
【０１９６】
そのような検出可能マーカーを検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され得、蛍光マーカーは、発生した照光を検出する光検出装置を用いて検出され得る。酵素標識は、典型的に、その酵素に基質を提供し、基質に対するその酵素の作用によって生じる反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、単純にその有色の標識を視認することによって検出される。
【０１９７】
抗体または抗原結合フラグメントはまた、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、メチルもしくはエチル基、または炭水化物基で誘導体化され得る。これらの基は、抗体または抗原結合フラグメントの生物学的特徴を改善する、例えば、血清半減期を延長するまたは組織結合性を向上させるのに有用であり得る。
【０１９８】
コンジュゲート中の抗体または抗原結合フラグメントあたりのエフェクター分子または検出可能マーカー部分の平均数は、例えば、抗体または抗原結合フラグメントあたり1〜20部の範囲であり得る。いくつかのコンジュゲートでは、抗体または抗原結合フラグメントあたりのエフェクター分子または検出可能マーカー部分の平均数は、抗体または抗原結合フラグメント上の付加部位の数によって制限され得る。例えば、付加がシステインチオールである場合、抗体または抗原結合フラグメントは、システインチオール基を1もしくは数個のみ有し得るか、またはリンカーが付加され得る十分な反応性のチオール基を1もしくは数個のみ有し得る。特定の態様において、コンジュゲート中の抗体または抗原結合フラグメントあたりのエフェクター分子または検出可能マーカー部分の平均数は、1〜約8；約2〜約6；約3〜約5；約3〜約4；約3.1〜約3.9；約3.2〜約3.8；約3.2〜約3.7；約3.2〜約3.6；約3.3〜約3.8；または約3.3〜約3.7の範囲である。例えば、（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）米国特許第7,498,298号を参照のこと。コンジュゲート調製物中の抗体（または抗原結合フラグメント）あたりのエフェクター分子または検出可能マーカー部分の平均数は、従来手段、例えば、質量スペクトルおよびELISAアッセイによって特徴づけられ得る。コンジュゲートの負荷量（例えば、エフェクター分子／抗体比）は、様々な方法、例えば：（i）抗体に対してモル過剰のエフェクター分子・リンカー中間体またはリンカー試薬を制限すること、（ii）コンジュゲーション反応の時間または温度を制限すること、（iii）システインチオール修飾における部分的または限定的な還元条件、（iv）リンカー・エフェクター分子の付加の数または位置の制御のためにシステイン残基の数および位置が修飾されるよう抗体のアミノ酸配列を組み換え技術により改変すること（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2006/03448に開示されるようにして調製されるチオMabまたはチオFab）によって、制御され得る。
【０１９９】
C．キメラ抗原受容体（CAR）
膜貫通ドメインに連結され、1つまたは複数の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインに連結された、TEM8に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変フラグメント（scFv））を含む人工的に構築されたキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（CAR）もまた、本明細書において開示される。開示されるCARの特性は、MHC非拘束性様式でT細胞の特異性および反応性をTEM8発現細胞に対して向け直す能力を含む。MHC非拘束性のTEM8認識によって、開示されるCARを発現するT細胞は、抗原プロセシングとは独立して抗原を認識する能力が与えられる。
【０２００】
細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、例えば、T細胞受容体シグナル伝達ドメイン、T細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、または両方を含むことができる。T細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、CD3ζタンパク質の細胞内部分などの、T細胞受容体の細胞内ドメインを含むCARの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの一部分を指す。
【０２０１】
1．細胞外領域
様々な態様が、本明細書において開示されるようなTEM8に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むCARを提供する。例えば、抗原結合ドメインは、上記で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むscFvであることができる。
【０２０２】
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、（例えば、表1または表2に示されるような）m825、m822、m830、またはm863抗体のうちの1つの、それぞれ、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびにLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができる。
【０２０３】
いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、それぞれSEQ ID NO: 1および2；それぞれSEQ ID NO: 3および4；それぞれSEQ ID NO: 5および6；またはそれぞれSEQ ID NO: 7および8に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【０２０４】
様々な態様において、抗原結合ドメインは、scFvであることができる。いくつかの態様において、scFvは、
0006502931.tif 000025
に示されるアミノ酸配列を含むリンカーなどのペプチドリンカーによって接続された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【０２０５】
CARは、例えば、抗原結合ドメインのN末端の、シグナルペプチド配列を含むことができる。シグナルペプチド配列は、任意の適当なシグナルペプチド配列を含んでもよい。ある態様において、シグナルペプチド配列は、
0006502931.tif 000026
を含むかまたはそれからなるアミノ酸配列などの、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体配列である。シグナルペプチド配列は、細胞の表面上のCARの発現を容易にし得るが、発現されたCARにおけるシグナルペプチド配列の存在は、CARが機能するために必要ではない。細胞表面上のCARの発現時に、シグナルペプチド配列は、CARから切り離され得る。したがって、いくつかの態様において、CARは、シグナルペプチド配列を欠如している。
【０２０６】
CARの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に、ポリペプチド配列を含むスペーサードメインがあってもよい。スペーサードメインは、最大300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含んでもよい。いくつかの態様において、スペーサードメインは、ヒト免疫グロブリン配列などの免疫グロブリンドメインを含むことができる。ある態様において、免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンCH2およびCH3免疫グロブリンG（IgG1）ドメイン配列（CH2CH3）を含む。この点に関して、スペーサードメインは、SEQ ID NO: 21：
0006502931.tif 000027
に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、免疫グロブリンドメインを含むことができる。
【０２０７】
特定の理論に縛られることなく、CH2CH3ドメインは、CARの抗原結合ドメインをCAR発現細胞の膜から離して延ばし、ネイティブのTCRのサイズおよびドメイン構造をより正確に模倣し得ると考えられる。
【０２０８】
2．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、CARを、CARの細胞外ドメインに融合されている膜貫通ドメインを含むように設計することができる。1つの態様において、CAR中のドメインのうちの1つと天然で会合している膜貫通ドメインが、使用される。
【０２０９】
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。開示されるCARにおける使用のための例示的な膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα、β、またはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD154の少なくとも膜貫通領域を含むことができる。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、その場合、大抵、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むであろう。様々な態様において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各々の端に見出されるであろう。
【０２１０】
任意で、好ましくは長さが2〜10アミノ酸の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞内T細胞シグナル伝達ドメインおよび／またはT細胞共刺激ドメインとの間の連結を形成してもよい。例示的なリンカー配列には、1つまたは複数のグリシン-セリンダブレットが含まれる。
【０２１１】
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメインなどのT細胞受容体の膜貫通ドメインを含む。したがって、CARは、SEQ ID NO: 22：
0006502931.tif 000028
を含むかまたはそれからなる、CD8膜貫通ドメインを含むことができる。別の態様において、膜貫通ドメインは、CD137またはCD28などのT細胞共刺激分子の膜貫通ドメインを含む。したがって、CARは、SEQ ID NO: 23：
0006502931.tif 000029
を含むかまたはそれからなる、CD28膜貫通ドメインを含むことができる。
【０２１２】
3．細胞内領域
CARの細胞内領域は、CARが発現しているかまたは中にあるT細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う、1つまたは複数の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。例示的なT細胞シグナル伝達ドメインが、本明細書において提供され、かつ当業者に公知である。
【０２１３】
細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン全体をCARにおいて使用することができるが、多くの場合、鎖全体を用いることは必要ではない。細胞内T細胞シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる程度において、そのような切断部分が、関連するT細胞エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに用いられてもよい。
【０２１４】
CARにおける使用のための細胞内T細胞シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始するように協力して作用するT細胞受容体（TCR）および共刺激分子の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変種、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。
【０２１５】
T細胞受容体シグナル伝達ドメインは、刺激的様式、または阻害的様式のいずれかにおいて、T細胞受容体複合体の一次活性化を調節する。開示されるCARは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはITAMとして公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る、刺激的様式において作用する一次細胞質シグナル伝達配列を含むことができる。開示されるCARに含まれ得る、ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例は、CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dタンパク質由来のものを含む。様々な態様において、CAR中の細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζ由来の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１６】
CARの細胞内領域は、ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達ドメイン（CD3ζなど）を、単独で、またはCARの状況において有用な任意の他の望ましい細胞質ドメインと組み合わせて、含むことができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。共刺激シグナル伝達ドメインとは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの一部分を指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例は、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、およびB7-H3を含む。開示されるCARにおいて含まれ得るシグナル伝達ドメインの追加の例は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー18（TNFRSF18；グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質、GITRとしても公知である）シグナル伝達ドメインである。
【０２１７】
いくつかの態様において、CARは、CD3ζシグナル伝達ドメイン、CD8シグナル伝達ドメイン、CD28シグナル伝達ドメイン、CD137シグナル伝達ドメイン、またはその2つ以上の組み合わせを含むことができる。1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインおよびCD28のシグナル伝達ドメインを含む。別の態様において、細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインおよびCD137のシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の態様において、細胞質ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、ならびにCD28およびCD137のシグナル伝達ドメインを含む。CAR上の1つまたは複数のT細胞シグナル伝達ドメインの順序は、当業者によって必要とされるように変動させることができる。
【０２１８】
そのようなT細胞シグナル伝達ドメインについての例示的なアミノ酸配列が、提供される。例えば、CD3ζシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 24
0006502931.tif 000030
に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができ、CD8シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 25
0006502931.tif 000031
に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができ、CD28シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 26
0006502931.tif 000032
に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができ、CD137シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO: 27
0006502931.tif 000033
に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなることができる。
【０２１９】
本発明のCARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または特定の順序で互いに連結されてもよい。任意で、好ましくは長さが2〜10アミノ酸の短いポリペプチドリンカーが、連結を形成してもよい。グリシン-セリンダブレットが、特に適したリンカーを提供する。さらに、CARのシグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインとの間に、ポリペプチド配列を含むスペーサードメインがあってもよい。スペーサードメインは、最大300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含んでもよい。
【０２２０】
4．CARの追加の説明
本明細書に記載されているCARの機能的部分もまた、提供される。CARに関して用いられる場合の「機能的部分」という用語は、それが一部であるCAR（親CAR）の生物学的活性を保持している、CARの任意の一部またはフラグメントを指す。機能的部分は、例えば、親CARと類似した程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識するか、または、疾患を検出、処置、もしくは予防する能力を保持しているCARの一部を包含する。親CARに関して、機能的部分は、例えば、親CARの約10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％、またはそれより多くを含むことができる。
【０２２１】
CARまたはその機能的部分は、アミノ末端もしくはカルボキシ末端、または両方の末端に、親CARのアミノ酸配列においては見出されない追加のアミノ酸を含むことができる。望ましくは、追加のアミノ酸は、CARまたは機能的部分の生物学的機能、例えば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの処置または予防などを干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親CARの生物学的活性と比較した際に、その生物学的活性を増強する。
【０２２２】
本明細書に記載されているCARの機能的変種であって、親CARに対して実質的または有意な配列同一性または類似性を有し、それが変種であるCARの生物学的活性を保持している機能的変種もまた、提供される。機能的変種は、例えば、親CARと類似した程度、同じ程度、またはより高い程度まで、標的細胞を認識する能力を保持している、本明細書に記載されているCAR（親CAR）の変種を包含する。親CARに関して、機能的変種は、例えば、少なくとも約30％、約50％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、またはそれより多く、親CARに対してアミノ酸が同一であることができる。
【０２２３】
機能的変種は、例えば、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する、親CARのアミノ酸配列を含むことができる。あるいはまたは加えて、機能的変種は、少なくとも1つの非保存的アミノ酸置換を有する、親CARのアミノ酸配列を含むことができる。この場合、非保存的アミノ酸置換が、機能的変種の生物学的活性を干渉または阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変種の生物学的活性が親CARと比較した際に増大しているように、機能的変種の生物学的活性を増強してもよい。
【０２２４】
CAR（機能的部分および機能的変種を含む）は、任意の長さのものであることができ、すなわち、CAR（またはその機能的部分もしくは機能的変種）が、その生物学的活性、例えば、抗原に特異的に結合する能力、哺乳動物において罹患細胞を検出する能力、または哺乳動物において疾患を処置もしくは予防する能力などを保持しているとの条件で、任意の数のアミノ酸を含むことができる。例えば、CARは、約50〜約5000アミノ酸長、例えば、50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、またはそれより長いアミノ酸の長さであることができる。
【０２２５】
CAR（本発明の機能的部分および機能的変種を含む）は、1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。そのような合成アミノ酸は、当技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、a-アミノn-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-およびトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリンβ-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジル-リジン、6-ヒドロキシリジン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、oc-アミノシクロヘプタンカルボン酸、-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、ならびにα-tert-ブチルグリシンを含む。
【０２２６】
CAR（機能的部分および機能的変種を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、N-アセチル化、例えばジスルフィド結合を介した環化、または酸付加塩への変換、および／または任意でダイマー化もしくはポリマー化、またはコンジュゲート化をさせることができる。
【０２２７】
キメラ抗原受容体、そのような受容体を含むT細胞を生成する方法、およびそれらの使用（例えば、がんの処置のため）は、当技術分野において公知であり、さらに本明細書に記載されている（例えば、各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668；Morgan et al., 2010, Molecular Therapy,2010年2月23日にオンラインで公開、1-9ページ；Till et al., 2008, Blood, 1 12:2261 -2271；Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011；Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013；Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013；PCT出願公開第WO2012/079000号、第WO2013/126726号；および米国特許出願公開第2012/0213783号を参照のこと）。例えば、開示されるキメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子を、T細胞などの宿主細胞における発現用の発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）に含めて、開示されるCARを作製することができる。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体を用いる方法は、T細胞の対象からの単離、キメラ抗原受容体をコードする発現ベクター（レンチウイルスベクターなど）でのT細胞の形質転換、ならびに、処置、例えば、対象における腫瘍の処置のための、キメラ抗原受容体を発現する操作されたT細胞の対象への投与を含む。
【０２２８】
D．ポリヌクレオチドおよび発現
TEM8に特異的に結合する抗体、抗体結合フラグメント、コンジュゲート、およびCARのアミノ酸配列をコードする核酸が、提供される。これらの分子をコードする核酸は、本明細書において提供されるアミノ酸配列（CDR配列、重鎖および軽鎖配列など）、当技術分野において入手可能な配列（フレームワーク配列など）、ならびに遺伝子暗号を用いて、当業者によって容易に製造され得る。当業者は、配列が異なるが同じ抗体配列をコードするか、または、VLおよび／もしくはVH核酸配列を含むコンジュゲートもしくは融合タンパク質をコードする核酸などの、様々な機能的に等価の核酸を、容易に、遺伝子暗号を用いて構築することができる。
【０２２９】
TEM8に特異的に結合する抗体、抗体結合フラグメント、コンジュゲート、およびCARをコードする核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適当な方法によって、または、Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981のジエチルホスホラミダイト法；例えば、Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984に例えば記載されているような自動合成機を用いる、Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862, 1981により記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法；および、米国特許第4,458,066号の固体支持体法などの方法による直接化学合成によって、調製することができる。化学合成によって、一本鎖オリゴヌクレオチドが生じる。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として用いるDNAポリメラーゼでの重合によって、二本鎖DNAに変換することができる。DNAの化学合成は、一般に約100塩基の配列に限定されるが、より短い配列のライゲーションによってより長い配列が取得され得ることを、当業者は認識しているであろう。
【０２３０】
例示的な核酸を、クローニング技術によって調製することができる。適切なクローニングおよび配列決定技術の例、ならびに多くのクローニング練習を通して当業者を導くのに十分な指示が、公知である（例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012)およびAusubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013)を参照のこと）。生物学的試薬および実験器具の製造業者からの製品情報もまた、有用な情報を提供する。そのような製造業者には、SIGMA Chemical Company（Saint Louis, MO）、R&D Systems（Minneapolis, MN）、Pharmacia Amersham（Piscataway, NJ）、CLONTECH Laboratories, Inc.（Palo Alto, CA）、Chem Genes Corp.、Aldrich Chemical Company（Milwaukee, WI）、Glen Research, Inc.、GIBCO BRL Life Technologies, Inc.（Gaithersburg, MD）、Fluka Chemica-Biochemika Analytika（Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland）、Invitrogen（Carlsbad, CA）およびApplied Biosystems（Foster City, CA）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源が含まれる。
【０２３１】
核酸はまた、増幅法によって調製することもできる。増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、転写ベース増幅システム（TAS）、自家持続配列複製システム（3SR）が含まれる。多種多様のクローニング法、宿主細胞、およびインビトロ増幅の方法論が、当業者に周知である。
【０２３２】
いくつかの態様において、核酸分子は、キメラ抗原受容体T細胞を生成するT細胞における発現のために、本明細書において提供されるようなCARをコードする。キメラ抗原結合受容体をコードする核酸分子を、T細胞などの宿主細胞における発現のために、ベクター（レンチウイルスベクターなど）に含めることができる。例示的な細胞には、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、および制御性T細胞が含まれる。キメラ抗原受容体をコードする核酸分子、およびそのような受容体を含むT細胞を生成する方法は、当技術分野において公知である（例えば、各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668；Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, 2010年2月23日にオンラインで公開、1-9ページ；Till et al., 2008, Blood, 1 12:2261 -2271；Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011；Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013；Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013；PCT出願公開第WO2012/079000号、第WO2013/126726号；および米国特許出願公開第2012/0213783号を参照のこと）。
【０２３３】
核酸分子を、細菌、植物、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞などの組み換え操作された細胞において発現させることができる。抗体、抗原結合フラグメント、およびコンジュゲートは、個別のVH鎖および／もしくはVL鎖として（必要に応じてエフェクター分子もしくは検出可能マーカーに連結されて）発現させることができるか、または融合タンパク質として発現させることができる。抗体および抗原結合フラグメントを発現および精製する方法は、公知であり、さらに本明細書に記載されている（例えば、Al-Rubeai (ed), Antibody Expression and Production, Springer Press, 2011を参照のこと）。イムノアドヘシンもまた、発現させることができる。したがって、いくつかの例において、VHおよびVL、ならびにイムノアドヘシンをコードする核酸が、提供される。核酸配列は、任意で、リーダー配列をコードすることができる。
【０２３４】
scFvを作製するためには、VH配列およびVL配列を、VLドメインおよびVHドメインが可撓性リンカーによって接続されている連続する一本鎖タンパク質として発現させることができるように、VHおよびVLをコードするDNAフラグメントを、可撓性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする別のフラグメントに機能的に連結させることができる（例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988；McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990；Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010；Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013を参照のこと）。任意で、フーリン（furin）切断部位などの切断部位を、リンカー中に含めることができる。
【０２３５】
VHおよび／またはVLをコードする核酸は、任意で、Fcドメインをコードすることができる（イムノアドヘシン）。Fcドメインは、IgA、IgM、またはIgG Fcドメインであることができる。Fcドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2010/093979号に記載されているような、最適化されたFcドメインであることができる。1つの例において、イムノアドヘシンはIgG1 Fcである。
【０２３６】
一本鎖抗体は、単一のVHおよびVLのみが用いられる場合は、一価であり得、2つのVHおよびVLが用いられる場合は、二価であり得、または、2つより多いVHおよびVLが用いられる場合は、多価であり得る。TEM8、および、例えばCD3であるがこれに限定されない別の抗原に特異的に結合する、二重特異性抗体または多価抗体が、生成されてもよい。コードされるVHおよびVLは、任意で、VHドメインとVLドメインとの間にフーリン切断部位を含むことができる。
【０２３７】
当業者は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、ならびに、COS、CHO、HeLa、および骨髄腫細胞株などの種々の高等真核細胞を含む、タンパク質の発現に利用可能な多数の発現システムに精通している。
【０２３８】
抗体、抗体結合フラグメント、コンジュゲート、およびCARをコードする1つまたは複数のDNA配列は、適当な宿主細胞中へのDNA導入によってインビトロで発現させることができる。細胞は、原核生物または真核生物であり得る。用語はまた、対象宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に起こる変異が存在し得るため、すべての子孫が親細胞と同一ではない場合があることが、理解される。外来DNAが宿主において継続的に維持されることを意味する、安定的導入の方法が、当技術分野において公知である。関心対象の抗体を発現するハイブリドーマもまた、本開示に包含される。
【０２３９】
抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列に機能的に連結することができる。コード配列に機能的に連結される発現制御配列は、その発現制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、ライゲートされる。発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ATG）、イントロンのスプライシングシグナル、mRNAの妥当な翻訳を可能にするその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および停止コドンを含むが、これらに限定されない。
【０２４０】
クローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るためには、最低でも、転写を導く強いプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）、および転写／翻訳ターミネーターを含有する、発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌については、これは、T7、trp、lac、またはラムダプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終結シグナルを含む。真核細胞については、制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、HTLV、SV40、またはサイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含むことができ、かつさらに、スプライスドナーおよび／またはアクセプター配列（例えば、CMVおよび／またはHTLVのスプライスアクセプターおよびドナー配列）を含むことができる。大腸菌については形質転換またはエレクトロポレーション、哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、またはリポフェクションなどの周知の方法によって、選択された宿主細胞中にカセットを導入することができる。カセットにより形質転換された細胞を、amp、gpt、neo、およびhyg遺伝子などのカセットに含有されている遺伝子により与えられる抗生物質に対する抵抗性によって、選択することができる。
【０２４１】
抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくはコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列は、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルを含むがこれらに限定されない、配列の挿入もしくは組み込みを可能にするように操作され得、かつ原核生物もしくは真核生物のいずれかにおいて発現され得る発現ベクター中に、挿入することができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫、および哺乳動物の生物が含まれ得る。原核生物において真核生物またはウイルスの配列を有するDNA配列を発現させる方法は、当技術分野において周知である。宿主における発現および複製が可能である、生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドDNAベクターは、当技術分野において公知である。
【０２４２】
宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈殿のようなDNAのトランスフェクションの方法、マイクロインジェクションなどの従来的な機械的手順、エレクトロポレーション、リポソームに入れられたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターが、使用されてもよい。真核細胞はまた、抗体、標識抗体、またはそのHIV-1 Env結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、および単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第2の外来DNA分子で、同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス40（SV40）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを用いて、真核細胞を一過的に感染または形質転換させ、タンパク質を発現させることである（例えば、Viral Expression Vectors, Springer press, Muzyczka ed., 2011を参照のこと）。当業者は、COS、CHO、HeLa、および骨髄腫細胞株などの高等真核細胞を含む細胞においてタンパク質を産生するのに使用される、プラスミドおよびベクターなどの発現システムを容易に用いることができる。
【０２４３】
組み換えCARを産生する目的で、宿主細胞は哺乳動物細胞であってもよい。宿主細胞は、ヒト細胞であってもよい。いくつかの態様において、宿主細胞は、末梢血リンパ球（PBL）または末梢血単核細胞（PBMC）、またはT細胞であってもよい。T細胞は、培養T細胞、例えば、初代T細胞、もしくは培養T細胞株由来のT細胞、例えば、Jurkat、SupT1など、または哺乳動物から取得されたT細胞などの、任意のT細胞であることができる。哺乳動物から取得する場合、T細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない多数の供給源から取得することができる。T細胞はまた、濃縮または精製することもできる。T細胞は、ヒトT細胞であってもよい。T細胞は、ヒトから単離されたT細胞であってもよい。T細胞は、任意のタイプのT細胞であることができ、CD4＋/CD8＋二重陽性T細胞、CD4＋ヘルパーT細胞、例えば、Th1およびTh2細胞、CD8＋ T細胞（例えば、細胞傷害性T細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーT細胞、ナイーブT細胞などを含むがこれらに限定されない、任意の発生段階のものであることができる。T細胞は、CD8＋ T細胞またはCD4＋ T細胞であってもよい。
【０２４４】
本明細書に記載されている少なくとも1つの宿主細胞を含む細胞の集団もまた、提供される。細胞の集団は、少なくとも1つの他の細胞、例えば、組み換え発現ベクターのいずれも含まない宿主細胞（例えば、T細胞）、または、T細胞以外の細胞、例えば、B細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などに加えて、記載されている組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均質な集団であることができる。あるいは、細胞の集団は、集団が組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、それから本質的になる）、実質的に均質な集団であることができる。集団はまた、集団のすべての細胞が組み換え発現ベクターを含むように、集団のすべての細胞が組み換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである、細胞のクローン集団であることができる。本発明の1つの態様において、細胞の集団は、本明細書に記載されているような組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を含む、クローン集団である。
【０２４５】
本明細書に記載されているポリペプチドをコードする核酸に対して、その生物学的活性を減らすことなく、修飾を行うことができる。いくつかの修飾は、クローニング、発現、または標的分子の融合タンパク質への組み込みを容易にするために行うことができる。そのような修飾は、当業者に周知であり、例えば、終結コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端に追加されたメチオニン、好都合に位置する制限部位を作製するためにいずれかの末端に配置された追加のアミノ酸、または、精製工程を助けるための追加のアミノ酸（ポリHisなど）を含む。組み換え法に加えて、当技術分野において周知の標準的なペプチド合成を用いて、本開示の免疫コンジュゲート、エフェクター部分、および抗体を、全体的にまたは部分的に構築することもできる。
【０２４６】
抗体、抗原結合フラグメント、またはコンジュゲートは、発現させた後、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む当技術分野における標準的な手順にしたがって、精製することができる（一般に、Simpson ed., Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008を参照のこと）。抗体、抗原結合フラグメント、およびコンジュゲートは、100％の純度である必要はない。ポリペプチドは、部分的に、または治療的に使用される場合は望ましいような均質性まで精製された後、内毒素を実質的に含まないべきである。
【０２４７】
哺乳動物細胞、および大腸菌などの細菌からの、抗体、抗原結合フラグメント、およびコンジュゲートの発現、ならびに／または適切な活性型への再フォールディングのための方法は、記載されており、周知であり、本明細書において開示される抗体に適用可能である。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013、Simpson ed., Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008、およびWard et al., Nature 341:544, 1989を参照のこと。
【０２４８】
しばしば、大腸菌または他の細菌由来の機能的異種タンパク質は、封入体から単離され、強い変性剤を用いる可溶化およびその後の再フォールディングを必要とする。可溶化工程の間、当技術分野で周知のように、ジスルフィド結合を分離させるために還元剤が存在しなければならない。還元剤を含む例示的な緩衝液は：0.1M Tris pH 8、6Mグアニジン、2mM EDTA、0.3M DTE（ジチオエリトリトール）である。ジスルフィド結合の再酸化は、Saxena et al., Biochemistry, 9:5015-5021, 1970に記載されるように、特にBuchner et al.,前出に記載されるように、還元型および酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で起こり得る。
【０２４９】
組み換え法に加えて、抗体、抗原結合フラグメント、および／またはそれらのコンジュゲートは、全体または一部を標準的なペプチド合成を用いて構築することもできる。ポリペプチドの固相合成は、その配列のC末端アミノ酸を不溶性の支持体に付加し、その後にその配列の残りのアミノ酸を連続的に追加していくことによって達成することができる。固相合成の技術は、Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963およびStewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984に記載されている。より長いタンパク質は、短いフラグメントのアミノ末端およびカルボキシル末端の縮合によって合成され得る。カルボキシル末端の活性化によって（例えば、カップリング試薬N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用することによって）ペプチド結合を形成する方法が、当技術分野で周知である。
【０２５０】
E．検出方法
対象においてTEM8を発現する細胞の存在を検出する方法が提供される。いくつかの態様において、この方法は、対象由来の細胞を、TEM8に特異的に結合する1つまたは複数の抗体またはそのコンジュゲートと接触させて、免疫複合体を形成する工程を含む。その後、免疫複合体の存在（または非存在）が検出される。免疫複合体の存在は、対象におけるTEM8を発現する細胞の存在を示す。この検出方法は、免疫複合体のインビボ検出またはインビトロ検出を用いるものであり得る。様々な態様において、TEM8を発現する細胞の検出は、内皮細胞におけるTEM8の細胞表面発現の検出を含む。提供される方法の様々な態様において、対象におけるTEM8を発現する細胞の検出は、対象における病的な血管新生、例えば腫瘍の進展に関連する血管新生を検出する。細胞は、例えば内皮細胞または周皮細胞であり得る。
【０２５１】
したがって、TEM8を発現する細胞、例えば、TEM8を発現する内皮細胞またはTEM8を発現する周皮細胞を検出する方法が提供される。具体的で非限定的な例において、細胞は、内皮細胞である。いくつかの態様において、腫瘍、例えばがん腫を有する、有する疑いがある、または進展する危険のある対象が、選択される。例えば、対象は、乳がん、肺がん、結腸直腸がんまたは黒色腫を有する、有する疑いがあるまたは進展する危険がある。いくつかの例において、対象は、乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは皮膚がんを有する、有する疑いがあるまたは進展する危険がある。したがって、TEM8を発現する内皮細胞の存在が、これらの対象において検出され得る。いくつかの例において、TEM8を発現する内皮細胞の検出は、TEM8を発現する少なくとも1つの内皮細胞を含む血管を検出する。いくつかの例において、内皮細胞は、血管内皮細胞、例えば、腫瘍関連血管の血管内皮細胞である。
【０２５２】
1つの態様においては、サンプルが対象から取得され、そしてTEM8を発現する内皮細胞の存在がインビトロで評価される。例えば、そのような方法は、対象由来の生物学的サンプル中の内皮細胞を、TEM8に特異的に結合する1つまたは複数の本明細書に提供される抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートと接触させ、免疫複合体を形成する工程を含む。その後、免疫複合体の存在（または非存在）が検出される。対象由来の内皮細胞における免疫複合体の存在は、対象におけるTEM8を発現する内皮細胞の存在を示す。例えば、サンプル中の免疫複合体の存在が、対照サンプル中での免疫複合体の形成と比較して増加していることが、対象におけるTEM8を発現する内皮細胞の存在を示す。
【０２５３】
生物学的サンプルは、典型的に、関心対象の哺乳動物対象、例えばヒトから得られる。サンプルは、生検、部検および病理学的サンプル由来の組織を含むがこれらに限定されない任意のサンプルであり得る。生物学的サンプルには、組織の切片、例えば組織学的目的で採取された凍結切片も含まれる。
【０２５４】
開示される方法のいくつかの態様において、TEM8特異的抗体または抗原結合フラグメントは、検出可能マーカーにコンジュゲートされる。いくつかの例において、この方法はさらに、TEM8特異的抗体、その抗原結合フラグメントまたはこれらの分子を含むコンジュゲートに特異的に結合する2次抗体を、免疫複合体を形成するのに十分な時間接触させる工程およびこの免疫複合体を検出する工程を含む。（上記のような）選択された対象由来の生物学的サンプルにおいてこの免疫複合体の存在が対照サンプルまたはその他の標準における免疫複合体の存在と比較して増大することは、その生物学的サンプルにおけるTEM8を発現する内皮細胞の存在を検出する。いくつかの例において、2次抗体は、検出可能マーカーにコンジュゲートされる。
【０２５５】
抗体または2次抗体に適した検出可能マーカーは記載されており、当業者に公知である。例えば、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性剤および放射性物質である。適当な酵素の非限定的な例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適当な補欠分子族複合体の非限定的な例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適当な蛍光物質の非限定的な例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。非限定的、例示的な発光物質は、ルミノールであり；非限定的、例示的な磁性剤は、ガドリニウムであり、そして非限定的、例示的な放射性標識には、125I、131I、35Sまたは3Hが含まれる。
【０２５６】
TEM8に特異的に結合する抗体およびそのコンジュゲートは、免疫組織化学アッセイにおいて使用することができる。これらのアッセイは、当業者に周知である（免疫アッセイの形式の説明については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)を参照のこと）。
【０２５７】
本明細書に開示される抗体はまた、TEM8を発現する内皮細胞およびTEM8を発現する周皮細胞をインビボで検出するのに使用することができる。いくつかの例において、TEM8を発現する内皮細胞のインビボ検出は、対象における病的な血管新生を検出する。したがって、対象における病的な血管新生、例えば、腫瘍、例えばがん腫；例えば乳がん、肺がん、結腸直腸がんまたは黒色腫に関連する病的な血管新生、を検出する方法が開示される。1つの態様において、TEM8に特異的に結合する有効量の抗体（もしくはその抗原結合フラグメント）またはそのコンジュゲートは、その抗体または抗原結合フラグメントが後で検出できる免疫複合体を形成するのに十分な時間、対象に投与される。対象における免疫複合体の検出は、TEM8を発現する内皮細胞の存在を決定し、TEM8を発現する内皮細胞の存在は、対象における病的な血管新生を検出する。1つの具体的で非限定的な例において、免疫複合体の検出は、免疫シンチグラフィー（immunoscintography）によって行われる。免疫複合体検出の他の具体的で非限定的な例には、放射線局在化（radiolocalization）、放射線画像化、磁気共鳴画像化（例えば、ビオチニル化抗体およびアビジン-酸化鉄を用いるもの）、陽電子放出断層撮影（例えば、111インジウム標識モノクローナル抗体を用いるもの）または蛍光画像化（例えば、ルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質標識抗体を用いるもの）が含まれる。参照により本明細書に組み入れられる、Paty et al., Transplantation, 77: 1133-1137, 2004を参照のこと。様々な例において、開示される方法は、対象の腫瘍、例えば乳がん、肺がん、結腸直腸がんまたは黒色腫における、血管の内壁に並ぶ内皮細胞を検出する。
【０２５８】
磁気共鳴画像化の設定において、造影剤の検出は、磁気共鳴スキャナの磁界強度（field strength）によって大きく影響され得る。高い磁界強度は、造影剤の検出能力を大幅に改善する（Hu et al., Ann. Rev. Biomed. Eng., 6:157-184, 2004; Wedeking et al., Magn. Reson. Imaging., 17: 569-575, 1999）。例えば、2テスラ（T）でのガドリニウムの検出限界は、およそ30μMである。4Tでは、その検出限界は、およそ1μMまで低くなる。最近利用可能となった7〜12Tのスキャナを用いれば、この造影剤が低（10〜100）nM濃度で検出されると考えられる。同様の感度は、酸化鉄等の造影剤を用いても達成され得る。検出後、その試験結果は、腫瘍の外科的またはその他の切除を支援するまたは先導するために使用され得る。
【０２５９】
1つの態様において、TEM8に特異的に結合する有効量の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲートは、抗がん処置または抗血管新生処置後に腫瘍を有する対象に投与される。投与された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートが内皮細胞上のTEM8と免疫複合体を形成するのに十分な時間が経過した後、免疫複合体が検出される。例えば、TEM8に特異的に結合する抗体またはそのコンジュゲートは、腫瘍の処置の前または後に、対象に投与され得る。腫瘍は、乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは皮膚がんであり得る（がこれらに限定されない）。免疫複合体の存在（または非存在）は、処置の有効性を示す。例えば、免疫複合体が、処置前に試験された対照と比較して増加していることは、その処置が有効でないことを示し、免疫複合体が、処置前に試験された対照と比較して減少していることは、その処置が有効であることを示す。
【０２６０】
F．処置方法
TEM8に特異的に結合する治療有効量の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート、あるいはTEM8に特異的に結合する抗原結合フラグメントを発現するCAR T細胞は、病的な血管新生を処置するために、例えば、腫瘍、例えばがん腫を処置するために、対象に投与され得る。いくつかの態様において、TEM8に特異的に結合する治療有効量の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート、あるいはTEM8に特異的に結合する抗原結合フラグメントを発現するCAR T細胞の投与は、病的な血管新生、例えば、様々なタイプのがん、例えば乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは皮膚がんにおいて発生する、または黄斑変性症に伴う病的な血管新生を減少させる。したがって、腫瘍、例えばがん腫を有する、有する疑いがある、または進展する危険がある対象が、処置のために選択され得る。
【０２６１】
いくつかの例において、本明細書に開示される抗体、抗原結合フラグメント、CAR T細胞、組成物およびコンジュゲートは、対象において病的な血管新生を減少させるために、腫瘍の成長もしくは転移を遅らせるもしくは阻害するために、または角膜もしくは網膜変性を処置するために、対象に投与され得る。これらの適用において、TEM8に特異的に結合する治療有効量の抗体もしくは抗原結合フラグメント、コンジュゲート、CAR T細胞、または組成物は、TEM8との免疫複合体を形成しそれによって腫瘍の成長もしくは転移もしくはその他の病的な血管新生を遅らせるもしくは阻害するのに、またはがんの兆候もしくは症候を阻害するのに十分な量および条件の下で、対象に投与される。適当な対象の例には、がんを有すると診断されたまたは疑いがある対象（例えば、腫瘍を有する対象）、例えば、がん腫、例えば乳がん、肺がん、結腸直腸がんまたは黒色腫、を有する対象、が含まれる。
【０２６２】
治療有効量は、疾患の重篤度および患者の全般的な健康状態に依存するであろう。治療有効量は、症候の主観的な緩和または医師もしくはその他の有資格観察者により認識される客観的で同定可能な改善のいずれかを提供する量である。1つの態様において、治療有効量は、腫瘍の成長（例えば、乳がん、肺がん、結腸直腸がんもしくは黒色腫の成長）や病的な血管新生を阻害するのに必要な量、または腫瘍の兆候もしくは症候を減少させるのに効果的な量、である。投与される剤の治療有効量は、望まれる効果および処置される対象に依存して様々であり得る。いくつかの例において、治療量は、患者の腫瘍量を排除するもしくは減少させる量または転移性細胞の増殖を予防するもしくは減少させる量または病的な血管新生を予防するもしくは減少させる量である。
【０２６３】
開示される方法からの利益を享受することができる対象には、ヒト対象および獣医学的対象が含まれる。対象は、開示される治療を開始する前に、例えば、その対象が腫瘍もしくは病的な血管新生または両方を有するかどうかを決定するために、スクリーニングされ得る。腫瘍もしくは病的な血管新生または両方の存在は、その腫瘍または病的な血管新生が本明細書に提供される方法を用いて処置され得ることを示す。
【０２６４】
局部および全身投与を含む任意の投与方法を、開示される抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート、組成物および追加の剤に使用することができる。例えば、局所、経口、血管内、例えば静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下および皮下投与が使用され得る。個々の投与様式および投薬計画は、担当医が、治療の詳細（例えば、対象、疾患、関連する疾患状態、および処置が予防的かどうか）を考慮して選択するであろう。2つ以上の剤または組成物が投与される場合、1つまたは複数の投与経路が使用され得；例えば、化学療法剤は経口投与され得、抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートまたは組成物は静脈内投与され得る。投与方法には注射が含まれ、その場合、コンジュゲート、抗体、抗原結合フラグメント、または組成物は、非毒性の薬学的に許容される担体、例えば、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、5%ヒト血清アルブミン、固定油、オレイン酸エチルまたはリポソームに入れられて提供される。いくつかの態様においては、開示される化合物の局部投与が、例えば抗体または抗原結合フラグメントを腫瘍が取り除かれた組織の領域または腫瘍の進展の傾向が疑われる領域に適用することによって、使用され得る。いくつかの態様において、治療有効量の抗体または抗原結合フラグメントを含む薬学的調製物の持続的な腫瘍内（または腫瘍近傍）放出が有益であり得る。他の例において、コンジュゲートは、点眼剤として、角膜に局所適用または眼に硝子体内適用される。
【０２６５】
抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはそのコンジュゲート、またはCAR T細胞を含む組成物は、正確な用量の個別投与に適した単位剤形に処方され得る。加えて、組成物は、単回投薬または複数回投薬スケジュールで投与され得る。複数回投薬スケジュールは、初期処置過程が1回より多くの別個の投薬、例えば1〜10回の投薬によって行われ、その後の期間に組成物の作用を維持または増強するために必要な他の投薬が行われ得るスケジュールである。処置は、数日〜数ヶ月、さらには数年の期間にわたる、化合物の毎日の（daily）投薬または連日の（multi-daily）投薬を含み得る。したがって、投薬計画は、少なくとも部分的に、処置される対象の個々のニーズに基づいても決定され、それは投与担当者の判断に依存するであろう。
【０２６６】
抗体、コンジュゲート、組成物または追加の剤の典型的な用量は、約0.01〜約30 mg/kg、例えば約0.1〜約10 mg/kgの範囲であり得る。いくつかの例において、用量は、少なくとも約0.1 mg/kg、少なくとも約0.2 mg/kg、少なくとも約0.3 mg/kg、少なくとも約0.4 mg/kg、少なくとも約0.5 mg/kg、少なくとも約1 mg/kg、少なくとも約4 mg/kg、少なくとも約3 mg/kg、少なくとも約5 mg/kg、少なくとも約6 mg/kg、少なくとも約7 mg/kg、少なくとも約8 mg/kg、少なくとも約9 mg/kg、少なくとも約10 mg/kg、少なくとも約11 mg/kg、少なくとも約12 mg/kg、少なくとも約13 mg/kg、少なくとも約14 mg/kg、少なくとも約15 mg/kg、少なくとも約16 mg/kg、少なくとも約17 mg/kg、少なくとも約18 mg/kg、少なくとも約19 mg/kg、少なくとも約20 mg/kg、少なくとも約21 mg/kg、少なくとも約22 mg/kg、少なくとも約23 mg/kg、少なくとも約24 mg/kg、少なくとも約25 mg/kg、少なくとも約26 mg/kg、少なくとも約27 mg/kg、少なくとも約28 mg/kg、少なくとも約29 mg/kgまたは少なくとも約30 mg/kgである。
【０２６７】
特定の例において、対象は、1つまたは複数のコンジュゲート、抗体、組成物、CAR T細胞、または追加の剤を含む治療組成物を、例えば数週間、数ヶ月または数年の期間、連日投薬スケジュールで、例えば、少なくとも2日連続、10日連続等のスケジュールで、投与される。1つの例において、対象は、少なくとも30日、例えば少なくとも2ヶ月、少なくとも4ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも12ヶ月、少なくとも24ヶ月または少なくとも36ヶ月の期間、コンジュゲート、抗体、組成物または追加の剤を投与される。
【０２６８】
いくつかの態様において、開示される治療剤は、静脈内に、皮下に、または別の様式により、ある期間にわたって毎日または週に複数回投与され得、その後無処置の期間が続き、それからそのサイクルが繰り返される。いくつかの態様において、最初の処置（例えば、毎日または週に複数回の治療剤の投与）の期間は、3日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、または12週間である。関連する態様において、無処置の期間は、3日間、1週間、2週間、3週間、または4週間続く。ある特定の態様において、治療剤の投薬計画は、3日間毎日、その後3日休み；または、1週間毎日もしくは週に複数回、その後3日もしくは1週休み；または、2週間毎日もしくは週に複数回、その後1もしくは2週休み；または、3週間毎日もしくは週に複数回、その後1、2、もしくは3週休み；または、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12週間毎日もしくは週に複数回、その後1、2、3、もしくは4週休みである。
【０２６９】
追加の態様において、TEM8に特異的に結合する抗体、組成物およびコンジュゲートは、細胞に対する炭疽PAの結合を低減するために使用され得る。例えば、有効量の提供される抗体、組成物およびコンジュゲートが、TEM8との免疫複合体を形成しそれによって細胞に対する炭疽PAの結合を低減させるのに十分な条件下で、細胞と共にインキュベートされ得る。いくつかの例において、TEM8に特異的に結合する有効量の抗体、組成物およびコンジュゲートが、対象における細胞に対する炭疽PAの結合を低減するために、対象に投与され得る。適当な対象には、炭疽感染と診断されたもしくはその進展の危険があるまたは炭疽汚染が疑われる対象が含まれ得る。
【０２７０】
抗体、抗原結合フラグメント、コンジュゲート、CAR T細胞、または組成物の投与は、他の抗がん剤もしくは抗血管新生剤の投与または治療処置（例えば、腫瘍の外科的摘出もしくは放射線療法）を伴うものであり得る。例えば、治療量の抗体またはコンジュゲートの投与の前、同時または後に、対象は、1つまたは複数の追加の治療を受けることができる。1つの態様において、対象は、腫瘍または病的な血管新生の処置のための治療有効量の1つまたは複数の剤の投与の前に、腫瘍または病的な血管新生を除去するまたは減少させるための1つまたは複数の処置を受ける。例えば、追加の剤には、化学療法剤、抗血管新生剤またはそれらの組み合わせが含まれ得るがこれらに限定されない。別の例においては、治療有効量の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートの投与の前に、腫瘍の少なくとも一部が外科的にまたは他の方法で切除されるまたはサイズもしくは容積に関して減らされる。
【０２７１】
使用することができる追加の治療剤の特定の例には、微小管結合剤、DNA挿入剤または架橋剤、DNA合成阻害剤、DNAおよびRNA転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節剤、および血管新生阻害剤が含まれる。（治療有効量で投与される）これらの剤および処置は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、任意の適当な抗がん剤または抗血管新生剤を、本明細書に開示される抗体、コンジュゲートと組み合わせて投与することができる。そのような剤の方法および治療用量は、当業者に公知であり、かつ医師が決定することができる。1つの態様において、化学療法剤は、5-FUもしくはIRTまたは両方を含む。
【０２７２】
微小管結合剤は、チューブリンと相互作用して微小管形成を安定化または不安定化させそれによって細胞分裂を阻害する剤を表す。開示される治療と組み合わせて使用することができる微小管結合剤の例には、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン15、ノコダゾール、ポドフィロトキシンおよびリゾキシンが含まれるがこれらに限定されない。そのような化合物のアナログおよび誘導体もまた使用することができ、これらは当業者に公知である。例えば、適当なエポチロンおよびエポチロンアナログは、国際特許出願公開第WO 2004/018478号に記載されている。タキソイド、例えば、米国特許第6,610,860号；同第5,530,020号；および同第5,912,264号に教示されているパクリタキセルおよびドセタキセルならびにパクリタキセルのアナログを使用することができる。
【０２７３】
アクチノマイシンD、ダウノルビシン、ドキソルビシンならびにそれらの誘導体およびアナログを含むがこれらに限定されない適当なDNAおよびRNA転写調節剤もまた、開示される治療と組み合わせて使用するのに適している。対象に投与することができるDNA挿入剤および架橋剤には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミドならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない。治療剤として使用するのに適したDNA合成阻害剤には、メトトレキサート、5-フルオロ-5'-デオキシウリジン、5-FUおよびそれらのアナログが含まれるがこれらに限定されない。適当な酵素阻害剤の例には、カンプトテシン、エトポシド、フォルメスタン、トリコスタチンならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない。遺伝子調節に影響を及ぼす適当な化合物には、1つまたは複数の遺伝子の発現を増大または低減する剤、例えば、ラロキシフェン、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、タモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストンならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれる。
【０２７４】
一般的に使用される化学療法薬の例には、アドリアマイシン、アルケラン、Ara-C、BiCNU、ブスルファン、CCNU、カルボプラチナム（Carboplatinum）、シスプラチナム（Cisplatinum）、サイトキサン、ダウノルビシン、DTIC、5-FU、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはその他のタキサン、例えばドセタキセル）、ベルバン（Velban）、ビンクリスチン、VP-16が含まれ、いくつかのより新しい薬物には、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、IRT（カンプト（Camptosar）、CPT-11）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンSTI-571、タキソテレ、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼヴァリン（Zevelin）およびカルシトリオールが含まれる。
【０２７５】
使用することができる免疫修飾剤の非限定的な例には、AS-101（Wyeth-Ayerst Labs.）、ブロピリミン（Upjohn）、ガンマインターフェロン（Genentech）、GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Genetics Institute）、IL-2（CetusまたはHoffman-LaRoche）、ヒト免疫グロブリン（Cutter Biological）、IMREG（New Orleans, La.のImreg製）、SK&F 106528およびTNF（腫瘍壊死因子；Genentech）が含まれる。
【０２７６】
したがって、開示されるTEM8特異的抗体、抗原結合フラグメントまたはそれらのコンジュゲートと組み合わせて使用される化学療法剤の非限定的な例には、化学療法剤、例えば、エルロチニブ（TARCEVA（登録商標）、Genentech/OSI Pharm.）、ボルテゾミブ（VELCADE（登録商標）、Millenium Pharm.）、フルベストラント（FASLODEX（登録商標）、AstraZeneca）、スーテント（SU11248、Pfizer）、レトロゾール（FEMARA（登録商標）、Novartis）、メシル酸イマチニブ（GLEEVEC（登録商標）、Novartis）、PTK787/ZK 222584（Novartis）、オキサリプラチン（Eloxatin（登録商標）、Sanofi）、5-FU（5-フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、RAPAMUNE（登録商標）、Wyeth）、ラパチニブ（TYKERB（登録商標）、GSK572016、GlaxoSmithKline）、ロナファルニブ（SCH 66336）、ソラフェニブ（BAY43-9006、Bayer Labs.）およびゲフィチニブ（IRESSA（登録商標）、AstraZeneca）、AG1478、AG1571（SU 5271；Sugen）、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロホスファミド（cyclosphosphamide）；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；抗葉酸抗新生物剤、例えば、ペメトレキセド（ALIMTA（登録商標）Eli Lilly）、アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボクオン、メトウレドーパ（meturedopa）およびウレドーパ（uredopa）；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミン（trimethylomelamine）を含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン（methylamelamines）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるKW-2189およびCB1-TM1を含む）；エレウテロビン（eleutherobin）；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン（ranimnustine）；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質、カリケアマイシン、カリケアマイシンガンマIIおよびカリケアマイシンオメガII；ジネマイシンAを含む、ジネマイシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質であるエンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニシャー、例えば、フロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（elfornithine）；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラキュリンA（verracurin A）、ロリジンAおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（商標）クレモホールフリー、アルブミン、パクリタキセルのナノ粒子処方物（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill）およびTAXOTERE（登録商標）ドセタキセル（doxetaxel）（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロラムブシル（chloranbucil）；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商��）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体、が含まれる。
【０２７７】
抗血管新生剤の非限定的な例には、血管の成長を減少させるまたは阻害さえする機能を有するタンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、DNA、RNAおよび組み換えベクターならびに低分子等の分子が含まれる。適当な血管新生阻害剤の例には、アンギオスタチンK1〜3、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、メドロキシプロゲステロン、スラミン、インターフェロン-アルファ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板因子4、ソマトスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、サリドマイドならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない。例えば、いくつかの態様において、抗血管新生剤は、VEGF（例えば、AVASTIN（登録商標）、Roche）またはVEGF受容体（例えば、VEGFR2抗体）に特異的に結合する抗体である。1つの例において、抗血管新生剤には、VEGFR2抗体もしくはDMXAA（バディメザンまたはASA404としても公知；例えば、Sigma Corp., St. Louis, MOから市販されている）または両方が含まれる。例示的なキナーゼ阻害剤には、成長因子のリン酸化および活性化を防止するGLEEVAC（登録商標）、IRESSA（登録商標）およびTARCEVA（登録商標）が含まれる。使用することができる抗体には、成長因子および血管新生経路をブロックするHERCEPTIN（登録商標）およびAVASTIN（登録商標）が含まれる。
【０２７８】
いくつかの例において、追加の剤は、モノクローナル抗体、例えば、3F8、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（Alacizumab）、アレムツズマブ、ペンテト酸アルツモマブ（Altumomab pentetate）、アナツモマブ・マフェナトクス（Anatumomab mafenatox）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシンン（Bivatuzumab mertansine）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カプロマブ・ペンデチド（Capromab pendetide）、カツマキソマブ、CC49、セツキシマブ、シタツズマブ・ボガトクス（Citatuzumab bogatox）、シクスツムマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ（Detumomab）、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマクソマブ（Ertumaxomab）、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ・ベドチン（Glembatumumab vedotin）、イブリツモマブ・チウキセタン、イゴボマブ（Igovomab）、イムシロマブ、インテツムマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ・メルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ（Metelimumab）、ミラツズマブ、ミツモマブ（Mitumomab）、モロリムマブ（Morolimumab）、ナコロマブ・タフェナトクス（Nacolomab tafenatox）、ナプツモマブ・エスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ・メルペンタン（Nofetumomab merpentan）、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブ・モナトクス（Oportuzumab monatox）、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ（Pemtumomab）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（Pintumomab）、プリツムマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ・ペンデチド、シブロツズマブ（Sibrotuzumab）、ソネプシズマブ（Sonepcizumab）、ソラフェニブ、スニチニブ、タカツズマブ・テトラキセタン（Tacatuzumab tetraxetan）、タプリツモマブ・パプトクス（Taplitumomab paptox）、テナツモマブ（Tenatumomab）、TGN1412、チシリムマブ（＝トレメリムマブ）、チガツズマブ、TNX-650、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ・セルモロイキン（Tucotuzumab celmoleukin）、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブである。
【０２７９】
いくつかのタイプのがんに対する別の一般的な処置は、外科的処置、例えば、がんまたはその一部の外科的摘出である。処置の別の例は、放射線療法、例えば、腫瘍を根絶するまたは外科的摘出の前にそれを縮小するのを助ける腫瘍部位への放射性物質またはエネルギー（例えば、体外照射療法）の投与である。
【０２８０】
上記分類の1つまたは複数に包含される場合もされない場合もある他の治療剤、例えば、抗腫瘍剤もまた、開示される治療と組み合わせて投与するのに適している。例として、そのような剤には、アドリアマイシン、アピゲニン、ラパマイシン、ゼブラリン、シメチジンならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれる。
【０２８１】
追加の剤の調製および投薬スケジュールは、製造元の指示にしたがいまたは当業者によって経験的に決定されるように使用され得る。そのような化学療法の調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service, (1992) Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdにも記載されている。
【０２８２】
併用療法は、相乗作用を提供し、相乗作用性を示し得る、すなわち、活性成分が一緒に使用されたときに達成される効果が、それらの化合物を別々に使用することで得られる効果の和よりも大きくなる。相乗効果は、活性成分が：（1）同時処方（co-formulate）されそして組み合わされた単位投薬処方物として同時に投与または送達される；（2）別個の処方物として交互にもしくは並行して；または（3）いくつかの他の投薬計画によって、投与されるときに発揮され得る。交互に送達されるとき、相乗効果は、その化合物が、連続的に、例えば別の注射器による異なる注射によって投与または送達されるときに発揮され得る。一般に、交互の場合、有効用量の各活性成分は、連続的に、すなわち直列的に投与され、一方、併用療法では、有効用量の2つまたはそれ以上の活性成分は一緒に投与される。
【０２８３】
G．組成物
担体（例えば、薬学的に許容される担体）中に、TEM8に特異的に結合する開示されるコンジュゲート、抗体または抗原結合フラグメント、または核酸分子もしくはCARを、1つまたは複数含む組成物が提供される。組成物は、対象に投与するための単位剤形で調製することができる。所望の結果を達成するための投与の量およびタイミングは、処置担当医の裁量による。組成物は、全身（例えば、静脈内）または局部（例えば、腫瘍内）投与用に処方することができる。1つの例において、TEM8に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそのような抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートは、非経口投与、例えば静脈内投与用に処方される。本明細書に開示されるコンジュゲート、抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物は、例えば、腫瘍、例えば乳がん、結腸直腸がん、肺がんまたは皮膚がんにおいて発生する腫瘍の処置および検出のために使用される。いくつかの例において、組成物は、がん腫の処置または検出に有用である。本明細書に開示されるコンジュゲート、抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物はまた、例えば、病的な血管新生の検出のために使用される。本明細書に開示されるコンジュゲート、抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物はまた、例えば、TEM8に対する炭疽PAの結合を阻害するために使用される。
【０２８４】
投与用組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、水性担体中に溶解されたコンジュゲート、抗体または抗原結合フラグメントの溶液を含み得る。様々な水性担体、例えば緩衝生理食塩水等、を使用することができる。これらの溶液は、滅菌性であり、かつ一般に、望ましくない物質を含まないものである。これらの組成物は、従来的な周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、pH調整・緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等、を含み得る。これらの処方物中の抗体（もしくは抗原結合フラグメント）またはコンジュゲートの濃度は様々であり得、主として、選択される個々の投与様式および対象のニーズにしたがい、流体容積、粘度、体重等に基づき選択される。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかである。
【０２８５】
典型的な静脈内投与用組成物は、対象1人1日あたり約0.01〜約30 mg/kgの抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはコンジュゲート（または抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートの対応する用量）を含む。投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、そしてRemington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995)等の刊行物に詳細に記載されている。いくつかの態様において、組成物は、約0.1 mg/ml〜約20 mg/ml、または約0.5 mg/ml〜約20 mg/ml、または約1 mg/ml〜約20 mg/ml、または約0.1 mg/ml〜約10 mg/ml、または約0.5 mg/ml〜約10 mg/ml、または約1 mg/ml〜約10 mg/mlの濃度範囲で、1つまたは複数の抗体、抗原結合フラグメント（例えば、TEM8に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメント）を含む液体製剤であってよい。
【０２８６】
抗体、抗原結合フラグメント、またはコンジュゲートは、凍結乾燥形態で提供され、投与前に滅菌水で再水和され得るが、それらは既知濃度の滅菌溶液としても提供される。抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはコンジュゲートの溶液は、その後、0.9%塩化ナトリウム、USPを含む注入バッグに添加され、そしていくつかの場合では0.5〜15 mg/kg体重の用量で投与される。抗体もしくは抗原結合フラグメントおよびコンジュゲート薬物の投与に関して当技術分野の多くの経験を活かすことができ；例えば、抗体薬物は米国において1997年のRITUXAN（登録商標）の承認以来販売されている。抗体、抗原結合フラグメント、またはコンジュゲートは、静脈内へのプッシュまたはボーラスではなく、緩やかな注入により投与され得る。1つの例において、より多量の負荷用量が投与され、その後により低レベルの維持用量が投与される。例えば、4 mg/kgの抗体もしくは抗原結合フラグメント（または対応する用量の抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート）の初回の負荷用量が約90分間かけて注入され、その後に、4〜8週間、2 mg/kgの週ごとの維持用量が、前回の用量が十分に寛容化された場合に、30分間かけて注入され得る。
【０２８７】
制御放出非経口処方物は、インプラント、油性注射液または粒子系として製造され得る。タンパク質送達系の概要については、Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995)を参照のこと。粒子系には、マイクロスフィア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフィアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、中心コアとして、治療タンパク質、例えば、細胞毒または薬物を含む。マイクロスフィアでは、治療剤は、粒子全体に分散される。約1μmより小さい粒子、マイクロスフィアおよびマイクロカプセルは、一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフィアおよびナノカプセルと称される。キャピラリーは、ナノ粒子のみが静脈内投与されるよう、およそ5μmの直径を有する。マイクロ粒子は、典型的に、およそ100μm径であり、皮下または筋内投与される。例えば、Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994)；およびTice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339 (1992)を参照のこと。
【０２８８】
ポリマーは、本明細書に開示される抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはコンジュゲート組成物のイオン制御放出のために使用され得る。制御薬物送達に使用される様々な分解性および非分解性ポリマーマトリクスが、当技術分野で公知である（Langer, Accounts Chem. Res. 26: 537-542, 1993）。例えば、ブロックコポリマーであるポラキサマー（polaxamer）407は、低温では粘性であるが流動性の液体として存在するが、体温では半固形のゲルを形成する。これは、組み換えインターロイキン-2およびウレアーゼの処方および持続送達に効果的なビヒクルであることが示されている（Johnston et al., Pharm. Res. 9: 425-434, 1992；およびPec et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2): 58-65, 1990）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御放出のためのマイクロ担体として使用されている（Ijntema et al., Int. J. Pharm. 112: 215-224, 1994）。さらに別の局面においては、リポソームが、液体内包薬物の制御放出および薬物標的化のために使用される（Betageri et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)）。治療タンパク質の制御放出のための多くのさらなるシステムが公知である（米国特許第5,055,303号；米国特許第5,188,837号；米国特許第4,235,871号；米国特許第4,501,728号；米国特許第4,837,028号；米国特許第4,957,735号；米国特許第5,019,369号；米国特許第5,055,303号；米国特許第5,514,670号；米国特許第5,413,797号；米国特許第5,268,164号；米国特許第5,004,697号；米国特許第4,902,505号；米国特許第5,506,206号；米国特許第5,271,961号；米国特許第5,254,342号；および米国特許第5,534,496号を参照のこと）。
【０２８９】
いくつかの例において、例えば、対象の細胞機構を用いてインビボでの抗体産生を提供するために、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするDNAが対象に投与される。核酸構築物による免疫化は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,643,578号、および米国特許第5,593,972号、および米国特許第5,817,637号において教示されている。米国特許第5,880,103号には、コードする核酸の生物への送達のいくつかの方法が記載されている。方法には、核酸のリポソーム送達が含まれる。そのような方法は、当業者によって、抗体またはその抗体結合フラグメントの産生に適用され得る。
【０２９０】
核酸の投与のための1つのアプローチは、哺乳動物発現プラスミドなどのプラスミドDNAでの直接投与である。開示される抗体、またはその抗体結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を、プロモーターの制御下に置いて発現を増大させることができる。
【０２９１】
核酸の使用のための別のアプローチにおいて、開示される抗体、またはその抗体結合フラグメントを、弱毒化ウイルス宿主もしくはベクター、または細菌ベクターによって発現させることもできる。組み換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、または他のウイルスベクターを用いて、抗体を発現させることができる。例えば、ワクシニアベクターおよび方法、有用なプロトコルが、米国特許第4,722,848号に記載されている。BCG（カルメット・ゲラン桿菌（Bacillus Calmette Guerin））は、開示される抗体の発現のための別のベクターを提供する（Stover, Nature 351:456-460, 1991を参照のこと）。
【０２９２】
1つの態様において、開示される抗体、またはその抗体結合フラグメントをコードする核酸は、細胞中に直接導入される。例えば、核酸を、標準的な方法によって金マイクロスフィア上に負荷して、Bio-RadのHELIOS（商標） Gene Gunなどの装置によって皮膚中に導入することができる。核酸は、強いプロモーターの制御下のプラスミドからなり、「裸」であることができる。
【０２９３】
典型的に、DNAは、他の部位中に直接注射することもできるが、筋肉中に注射される。注射のための用量は、通常、およそ0.5μg/kg〜約50 mg/kgであり、典型的には、約0.005 mg/kg〜約5 mg/kgである（例えば、米国特許第5,589,466号を参照のこと）。
【０２９４】
H．キット
キットもまた、提供される。例えば、対象におけるTEM8を発現する細胞（例えば、内皮細胞または周皮細胞）を検出するため、対象における腫瘍を処置するため、または細胞に対する炭疽PAの結合を低減させるためのキット。キットは、典型的に、TEM8に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合フラグメント、および／またはそのコンジュゲートを含むことになる。
【０２９５】
TEM8に特異的に結合する1つより多いコンジュゲートまたは抗体または抗原結合フラグメントを、キットに含めることができる。したがって、キットは、TEM8に特異的に結合する2つ以上の抗体、またはTEM8に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合フラグメントおよびそのコンジュゲート、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様において、Fvフラグメントなどの、抗原結合フラグメント、または抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートが、キットに含まれる。インビボ用途のためなどの、1つの例において、抗体は、scFvフラグメントであることができる。
【０２９６】
キットは、容器、および、容器上または容器に付随した標識または添付文書を含むことができる。適した容器には、例えば、瓶、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、典型的に、開示されるTEM8特異的抗体、抗原結合フラグメント、またはコンジュゲートの1つまたは複数を含む組成物を保持する。様々な態様において、容器は、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穴をあけることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。標識または添付文書は、組成物が特定の状態を処置するために使用されることを示す。
【０２９７】
標識または添付文書は、典型的に、例えば、腫瘍を処置または予防する方法における、開示されるTEM8特異的抗体もしくはそのフラグメント、またはそのコンジュゲートの使用のための指示をさらに含むであろう。添付文書は、典型的に、そのような治療用製品の使用にかかわる適応、用法、用量、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含有する、治療用製品の商業用パッケージに慣例上含まれる指示を含む。指示資料は、電子形態（コンピュータディスケットまたはコンパクトディスクなど）に記述されていてもよく、または視覚的（映像ファイルなど）であってもよい。キットはまた、そのキットが設計されている個々の適用を容易にするための追加の構成要素を含み得る。したがって、例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）を、加えて含有し得る。キットは、個々の方法の実施のために通常使用される緩衝液および他の試薬を、加えて含み得る。そのようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【実施例】
【０２９８】
以下の実施例は、ある特定の態様の個々の特徴を解説するために提供されるが、特許請求の範囲は、例示されるそれらの特徴に限定されるべきではない。
【０２９９】
実施例1
TEM8特異的抗体
この実施例では、ヒトナイーブ酵母ディスプレイscFvライブラリーからの完全ヒト抗TEM8抗体のパネルの単離、およびそれらの抗体の特徴決定を解説する。選択戦略は、TEM8トランスフェクト哺乳動物細胞および哺乳動物細胞に由来する精製組み換えTEM8-EDタンパク質の両方に対するライブラリーの連続パンニングを含むものであり、結果としてm825、m822、m830、およびm863と呼ばれる4種のTEM8抗体を同定した。
【０３００】
4種の完全ヒトモノクローナル抗体であるm822、m825、m830、およびm863は、ヒトおよびマウスTEM8に対する選別、スクリーニング、および親和性成熟によって、ヒトナイーブ酵母ディスプレイscFvライブラリーから同定された。TEM8抗体は、ライブラリースクリーニングから同定された（ライブラリーの説明については、Puri et al., MAbs. 5:533-9, 2013を参照のこと）。同定された抗体の重鎖および軽鎖可変領域、ならびに重鎖および軽鎖のCDR（IMGTによって定義される）の配列を、下記の表3に提供する。
【０３０１】
組み換えヒトおよびマウスTEM8外部ドメインタンパク質を、選択用の標的として使用した。第1回の選択においては、ナイーブ抗体ライブラリー由来のおよそ5 x 1010細胞を、50 mlのPBSAと呼ばれる0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）-リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の10μgのビオチン化ヒトTEM8タンパク質と、室温で2時間、穏やかな回転とともにインキュベーションした。その後、混合物を3回、0.1％ PBSAで洗浄して、結合していない抗体フラグメントを除去した。結合した抗体フラグメントを一緒に伴うビオチン化TEM8を、続いて、100μlのストレプトアビジンコンジュゲートマイクロビーズ（Milenvi Biotec, Auburn, CA）とインキュベーションし、選別のためにAutoMACSシステム上に負荷した。TEM8に対して高親和性を有する抗体フラグメントを提示する細胞を回収し、後にSDCAA培地（1 Lの蒸留水に溶解させた20 gデキストロース、6.7 g Difco yeast nitrogen base without amino acids、5 g Bactoカザミノ酸、5.4 g Na2HPO4、および8.56 g NaH2PO4.H2O）において250 rpm、30℃で24時間、増幅した。その後、培養物を、SGCAA培地（1 Lの蒸留水に溶解させた20 gガラクトース、20 gラフィノース、1 gデキストロース、6.7 g Difco yeast nitrogen base without amino acids、5 g Bactoカザミノ酸、5.4 g Na2HPO4、および8.56 g NaH2PO4.H2O）において250 rpm、20℃で18時間、誘導した。得られたプールを、ビオチン化組み換えヒトTEM8に対する結合についてのもう1回の選択に供した。第2回および第3回のスクリーニング用に抗体フラグメントの十分な多様性を確保するために、前の回の選別由来のプールサイズの100倍を、インプット細胞数として使用した。
【０３０２】
第3回の選択には、Fc融合組み換えヒトTEM8を使用した。スクリーニングは、ヒトTEM8に対する事前の2回の選択と同様の方法で行った。最終的に、ヒトTEM8に結合した抗体フラグメントを、プロテインGコンジュゲートマイクロビーズによって引き下ろした。ヒトTEM8に対して高い結合親和性を有する抗体フラグメントを発現する酵母細胞を回収して、さらに特徴決定した。
【０３０３】
（表３）m825、m822、m830、およびm863抗体のVHおよびVLドメインのタンパク質配列（IMGT CDRは太字）
0006502931.tif 000034
【０３０４】
m822、m825、m830、およびm863抗体のTEM8との相互作用の結合親和性を、表面プラズモン共鳴によってアッセイした。アッセイは、IgG1形式のm822、m825、m830、およびm863抗体、ならびに組み換えヒトTEM8外部ドメインを用いて、実質的に記載されているように（例えば、Feng et al., Mol Cancer Ther. 2006 Jan;5(1):114-20.を参照のこと）、Biacore機器で行った。これらのアッセイによって決定された、m822、m825、m830、およびm863抗体のTEM8への結合についての見かけのKDを、表4に示す。
【０３０５】
（表４）表面プラズモン共鳴によって測定されたTEM8抗体の結合親和性
0006502931.tif 000035
【０３０６】
m825、m822、m830、およびm863は、標準的な方法にしたがってヒトIgG1に変換した（例えば、Zhu et al., J Virol. 2006 Jan;80(2):891-9を参照のこと）。
【０３０７】
ヒトIgG1形式のm825、m822、m830、およびm863抗体を用いて、これらの抗体が、可溶性形態およびまた細胞表面ネイティブ形態のヒトおよびマウスTEM8の両方に高親和性で結合できるが、炭疽毒素タンパク質に対する第2の受容体（ANTXR2）であるヒトまたはマウスCMG2には結合しないことを確認するために、スクリーニングアッセイを行った。スクリーニングアッセイは、各々、その全体が本明細書に組み入れられるChaudhary et al., Cancer Cell, 21:212-226, 2012、およびPCT出願公開第WO2012174160号に記載されているように、実質的に行った。簡潔に説明すると、ヒトTEM8（hTEM8）またはヒトCMG2（hCMG2）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはヒト胎児腎臓293（293）細胞を、m825、m822、m830、またはm863抗体とインキュベーションし、FACS解析を用いて結合をアッセイした。結果により、m825、m822、m830、およびm863抗体の各々は、細胞表面上のhTEM8に結合したが、hCMG2には結合しなかったことが示される（図1Aおよび図1Bを参照のこと）。
【０３０８】
m825、m822、m830、およびm863抗体が、以前に記載されている方法（各々、その全体が本明細書に組み入れられるChaudhary et al., Cancer Cell, 21:212-226, 2012、およびPCT出願公開第WO2012174160号）にしたがって、炭疽毒素の防御抗原（PA）サブユニットのTEM8に対する結合を阻害できるかどうかもまた、試験して判定した。m825、m822、m830、およびm863抗体の各々は、TEM8に対する（PA）結合を阻害した。
【０３０９】
m825、m822、m830、およびm863抗体が、腫瘍血管を標識するために使用できるかどうかもまた、試験して判定した。ヒトIgG1形式のm825抗体（ヒトm825-IgG1）が腫瘍血管を特異的に標識するかどうかを、免疫蛍光染色アッセイを行って判定した（図2）。アッセイは、以前に記載されているように、実質的に行った（各々、その全体が本明細書に組み入れられるChaudhary et al., Cancer Cell, 21:212-226, 2012、およびPCT出願公開第WO2012174160号）。簡潔に説明すると、野生型（WT）およびTEM8ノックアウトTEM8 KOマウスに、DLD-1細胞を皮下投与して、異種移植腫瘍を発生させた。腫瘍由来のサンプルを取得して、CD31抗体（血管に特異的）およびヒトm825-IgG1抗体で染色した。図2に示されるように、ヒトm825-IgG1は、腫瘍血管を特異的に染色した。この結果により、同定されたTEM8抗体は、腫瘍血管の検出のための診断試薬として使用できることが示される。
【０３１０】
抗体がインビボで腫瘍成長を阻害することを実証するために、動物研究を行った。
【０３１１】
まず、ヒトm825-IgG1抗体を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させたUACC黒色腫細胞異種移植片の阻害についてアッセイした。用いたアッセイ法は、以前に記載されている方法に、実質的にしたがった（各々、その全体が本明細書に組み入れられるChaudhary et al., Cancer Cell, 21:212-226, 2012、およびPCT出願公開第WO2012174160号）。簡潔に説明すると、ヒトm825-IgG1抗体、対照IgG、または対照ビヒクル（PBS）を、UACC細胞のマウスへの接種7日後に開始して20または40 mg/kgの用量でマウスにIP投与した（図3における処置日を示す矢印を参照のこと）。ヒトm825-IgG1での処置は、対照と比較して、実験の過程にわたって腫瘍体積を有意に減少させた（図3）。
【０３１２】
加えて、ヒトm825-IgG1を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させたHCT-116結腸がん細胞異種移植片の阻害についてアッセイした。用いたアッセイ法は、以前に記載されている方法に実質的にしたがって、行った（各々、その全体が本明細書に組み入れられるChaudhary et al., Cancer Cell, 21:212-226, 2012、およびPCT出願公開第WO2012174160号）。簡潔に説明すると、ヒトm825-IgG1抗体、対照IgG、または対照ビヒクル（PBS）を、HCT-116細胞のマウスへの接種後に15 mg/kgの用量でマウスにIP投与した（図4における処置日を示す矢印を参照のこと）。ヒトm825-IgG1での処置は、対照と比較して、実験の過程にわたって腫瘍体積を有意に減少させた（図4）。
【０３１３】
さらに、ヒトIgG1形式のm825、m822、m830、およびm863抗体を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させたUACC黒色腫細胞異種移植片の阻害について、各々アッセイした（図5）。用いたアッセイ法は、以前に記載されている方法に、実質的にしたがった（各々、その全体が本明細書に組み入れられるChaudhary et al., Cancer Cell, 21:212-226, 2012、およびPCT出願公開第WO2012174160号）。簡潔に説明すると、m825、m822、m830、もしくはm863抗体、または対照ビヒクル（PBS）を、UACC細胞のマウスへの接種後7日目に、15 mg/kgの用量でマウスにIP投与した。m825、m822、m830、およびm863抗体での処置は、対照と比較して、実験の過程にわたって腫瘍体積を有意に減少させた（図5）。
【０３１４】
加えて、抗TEM8抗体が動物モデルにおいて腫瘍転移を阻害できるかどうかを、アッセイを行って判定した（図6）。胸腺欠損ヌードマウスの脾臓内に、ヒト結腸がん細胞を注射した。マウスをその後、ヒトm830-IgG1抗体で処置して、マウスの肝臓への結腸がんの転移を、生物発光を用いて測定した。図6Aおよび図6Bに示されるように、ヒトm830-IgG1抗体での処置は、この動物モデルにおいて転移を劇的に減少させた。
【０３１５】
MMAEにコンジュゲートされた（ヒトIgG1形式の）m825抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（m825-MMAE）を、以前に記載されている方法に実質的にしたがって、生成させた（例えば、各々、その全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2011/0268751号、第2008/0305044号、第2007/0258987号を参照のこと）。簡潔に説明すると、精製されたm825抗体の鎖内ジスルフィド結合を、トリス(2-カルボキシエチル)-ホスフィンヒドロクロリド（TCEP HCL）で部分的に還元して、チオール基を形成させた。反応は、m825抗体に対して2.2モル等価物のTCEP濃度で、25℃で1.5時間行った。部分的に還元されたm825抗体を、ストレッチャー単位、Val-Citペプチド切断部位、および
0006502931.tif 000036
として示されるスペーサーに連結されたMMAE毒素とインキュベーションした。反応は、m825抗体に対して5.5モル等価物のMMAE化合物濃度で、25℃で1時間行った。MMAEリンカーの溶解性を維持するために、DMSOを10.5％ v/vで反応に含めた。コンジュゲーション反応をその後、m825抗体に対して10xモル濃度の割り当てのN-アセチル-L-システインを25℃で15分間、添加することによって消滅させた。結果として生じたm825-MMAEコンジュゲートを、標準的な方法を用いて緩衝液交換に供し、必要に応じて濃縮した。
【０３１６】
m825-MMAEコンジュゲートを、ヒトTEM8を発現するCHO細胞に対する結合をアッセイすることによって、細胞表面TEM8に対する結合について試験した。図7に示されるように、m825-MMAEコンジュゲートは、TEM8発現CHO細胞に特異的に結合したが、TEM8発現を欠如している対照CHO細胞には結合しなかった。
【０３１７】
TEM8発現細胞に対するm825-MMAEコンジュゲートの選択性を、インビトロでアッセイした（図8）。HEK 293細胞（対照）またはTEM8を発現するHEK 293細胞を、MMAE単独、ヒトm825-IgG1抗体、またはm825-MMAEコンジュゲートで処置した。図8に示されるように、MMAE毒素単独は、TEM8発現にかかわらずHEK 293細胞に対して細胞傷害性であったが、m825-MMAEコンジュゲートは、TEM8を発現するHEK-293細胞に対してのみ細胞傷害性であった。
【０３１８】
抗TEM8抗体およびその抗体-薬物コンジュゲートの抗がん活性をさらにアッセイするために、胸腺欠損ヌードマウスにおける異種移植片成長に対するこれらの化合物の効果を試験した（図9および図10）。ヒト結腸がん異種移植片（HCT116細胞）を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させた。マウスを、1、3、10、もしくは30 mg/kgの濃度のm825-MMAEコンジュゲート、または10もしくは30 mg/kgの濃度のヒトm825-IgG1抗体単独で、1週間に2回、3週間にわたって処置した。結果により、ヒトm825-IgG1抗体およびm825-MMAEコンジュゲートの両方が、この動物モデルにおいて腫瘍成長の減少に成功したことが示される。加えて、比較可能な用量で、m825-MMAEコンジュゲートは、腫瘍成長を減少させるのにm825抗体単独よりも有効であった。
【０３１９】
加えて、卵巣がん異種移植片（OVCAR3細胞）を、胸腺欠損ヌードマウスの皮下で成長させた。マウスを、m825-MMAEコンジュゲート（1、3、もしくは10 mg/kg）、ヒトm825-IgG1抗体単独（10 mg/kg）、またはMMAE単独（0.2 mg/kg）で、1週間に2回、3週間半にわたって処置した。結果により、m825-MMAEコンジュゲート（3および10 mg/kg）が、この動物モデルにおいて異種移植片成長を減少させたことが示される。加えて、比較可能な用量で、m825-MMAEコンジュゲートは、腫瘍成長を減少させるのにm825抗体単独よりも有効であった。
【０３２０】
これらのインビボアッセイにより、m825、m822、m830、およびm863抗体、ならびにその抗体-薬物-コンジュゲートを、がん治療法として使用できることが示される。
【０３２１】
実施例2
ヒトにおけるTEM8を発現する内皮細胞の検出
この実施例では、対象においてTEM8を発現する内皮細胞を検出するのに使用することができる特定の方法について記載する。しかし、当業者は、類似の方法を使用できることを理解するであろう。そのような検出は、例えば、TEM8に特異的に結合する抗体またはそのコンジュゲートによる対象の処置前、処置中もしくは処置後（またはその組み合わせ）に実施され得る。
【０３２２】
TEM8特異的モノクローナル抗体（例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸26〜33、51〜58および97〜106を含む、それぞれ、H-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含む重鎖可変領域ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜31、49〜51および88〜97を含む、それぞれ、L-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含む軽鎖可変領域を含むTEM8特異的モノクローナル抗体であるがこれに限定されない）または検出可能マーカーにコンジュゲートされたTEM8特異的モノクローナル抗体を、対象に投与する。投与は、当技術分野で公知の任意の十分な方法によって行うことができるが、典型的には静脈内投与である。典型的に、コンジュゲートは、当該コンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物の一成分として投与される。
【０３２３】
有効量の抗体またはコンジュゲートを対象に投与する。投与する抗体またはコンジュゲートの量は、対象においてTEM8と検出可能な免疫複合体を形成するのに十分なものとする。有効量は、例えば、用量応答曲線を作成する慣用的な試験を用いることで、当業者が容易に決定することができる。加えて、特定の例示的な用量が本明細書に提供されている。抗体またはコンジュゲートは、単回用量もしくは多用量送達によってまたは長期間の連続送達を通じて投与することができる。
【０３２４】
抗体の場合、対象における病的な血管新生を検出するのに利用される抗体は、診断画像化に有用な二次試薬（検出可能マーカーにコンジュゲートされた二次抗体など）で検出される。例えば、磁気共鳴画像化に使用される検出可能マーカー、例えば、超常磁性酸化鉄ナノ結晶である。個々の二次試薬は利用される個々の診断画像化のタイプに依存し、これは当業者に明らかであろう。
【０３２５】
コンジュゲートの場合、対象における病的な血管新生を検出するのに使用されるコンジュゲートは、典型的に、診断画像化に有用な検出可能マーカーを含む。例えば、磁気共鳴画像化に使用される検出可能マーカー、例えば、超常磁性酸化鉄ナノ結晶である。個々の検出可能マーカーは利用される個々の診断画像化のタイプに依存し、これは当業者に明らかであろう。
【０３２６】
TEM8を発現する内皮細胞の検出は、使用される検出可能マーカーに対応する診断画像化法を用いて対象において固定された抗体またはコンジュゲートを検出することによって達成される。例えば、検出可能マーカーが超常磁性酸化鉄ナノ結晶である場合、診断画像化法は、典型的に、磁気共鳴画像化を含むであろう。
【０３２７】
実施例3
ヒトにおけるがんの処置
この実施例では、ヒトにおける原発性または転移性腫瘍を、TEM8に特異的に結合する1つもしくは複数の抗体またはそのコンジュゲートの投与により処置するのに使用することができる特定の方法について記載する。特定の方法、用量および投与様式が提供されるが、当業者は、その処置に実質的な影響を与えずに変更を加えることができることを理解するであろう。
【０３２８】
ヒト患者は、少なくとも1μg（例えば、0.001〜1000mg）の、TEM8に特異的に結合する1つもしくは複数の抗体またはそのコンジュゲート（例えば、SEQ ID NO:1のアミノ酸26〜33、51〜58および97〜106を含む、それぞれ、H-CDR1、H-CDR2およびH-CDR3を含む重鎖可変領域ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸26〜31、49〜51および88〜97を含む、それぞれ、L-CDR1、L-CDR2およびL-CDR3を含む軽鎖可変領域を含むTEM8特異的モノクローナル抗体であるがこれに限定されない）を用いて、例えば、少なくとも1日、1週間、1ヶ月、少なくとも2ヶ月、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも1年、少なくとも2年もしくは少なくとも5年またはそれより長いもしくは短い期間、静脈内処置される。抗体またはコンジュゲートの投与は、通常のがん治療と併用して（例えば、その治療と置き換えるのではなく）使用することができる。したがって、抗体またはコンジュゲートを、個々の腫瘍タイプに対して従来的に使用されている常用および常套の抗血管新生、化学療法、外科、照射処置（またはそれらの組み合わせ）に追加することができる。抗体またはコンジュゲートの投与は、常套の治療を中止した後も継続することができ、かつ長期間（例えば、数ヶ月または数年）をかけて行うことができる。
【０３２９】
簡潔に説明すると、この方法は、対象が腫瘍、例えば原発性または転移性腫瘍を有するかどうかを決定するために対象をスクリーニングする工程を含む。腫瘍を有する対象が選択される。臨床試験においては、対象の半分が、既存の腫瘍処置プロトコル（例えば、通常の抗血管新生／化学療法／放射線療法／外科手術計画）を受けることになるであろう。残りの半分は、本明細書に記載される抗体またはコンジュゲートの投与と組み合わせて、既存の腫瘍処置プロトコル（例えば、通常の抗血管新生／化学療法／放射線療法／外科手術計画）を受けることになるであろう。いくつかの例において、腫瘍（の全体または一部）が、抗体またはコンジュゲートによる処置の前に外科的に切除される。
【０３３０】
対象のスクリーニング
対象は、最初に、腫瘍を有するかどうかを決定するためにスクリーニングされる。腫瘍についてスクリーニングするために使用することができる方法の例には、超音波、組織生検または腫瘍関連血管系の検出の組み合わせが含まれる。しかし、そのような事前スクリーニングは、本明細書に開示される抗体またはコンジュゲートの投与前に必要なものではない。
【０３３１】
対象の事前処置
対象は、TEM8に特異的に結合する抗体またはそのコンジュゲートの投与の前に処置される。しかし、そのような事前処置は、常に必要となるものではなく、担当医が決定できることである。例えば、1つまたは複数の抗体またはコンジュゲートの投与の前に、腫瘍（の全体または一部）を外科的に切除することができる。加えて、対象を、存在する特定の腫瘍の処置のための既存のプロトコル（例えば、通常の抗血管新生／化学療法／放射線療法計画）を用いて処置することができる。
【０３３２】
投与
投与は、当技術分野で公知の任意の十分な方法によって行うことができるが、典型的には静脈内投与である。典型的に、抗体またはコンジュゲートは、当該抗体またはコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含む組成物の一成分として投与される。
【０３３３】
治療有効量の抗体またはコンジュゲートが、対象に投与される。投与される抗体またはコンジュゲートの量は、腫瘍を有する対象を処置するのに十分なものである。治療有効量は、例えば、用量応答曲線を作成する慣用的な試験を用いることで、当業者が容易に決定することができる。加えて、特定の例示的な用量が上記されている。抗体またはコンジュゲートは、単回用量で毎日、または長期間にわたる連続送達を通じて、反復投与プロトコル（例えば、毎日、毎週もしくは毎月の反復投与プロトコル）により、投与することができる。
【０３３４】
評価
1つのまたは複数の治療の施行後、腫瘍を有する対象は、腫瘍の処置について、例えば退縮または腫瘍量の減少（例えば、転移性病巣の減少）について、観察され得る。特定の例において、対象は、処置7日後から1回または複数回分析される。
【０３３５】
対象は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて観察され得る。例えば、診断画像化（例えば、x線、CTスキャン、MRI、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡試験）ならびに対象由来の生物学的サンプルの分析（例えば、血液、組織生検またはその他の生物学的サンプルの分析）、例えば存在する細胞のタイプの分析または特定の腫瘍マーカーの分析、が使用され得る。1つの例において、対象が転移性腫瘍を有する場合、評価は、超音波、MRIまたはCATスキャンおよび組織生検に含まれる細胞のタイプの分析を用いて行われ得る。
【０３３６】
開示されている態様の原理が適用され得る多くの潜在的な態様に鑑みて、例示されている態様は本発明の好ましい例にすぎず、限定的であると解釈されるべきでないことが理解されるべきである。したがって本発明者らは、添付の特許請求の範囲の範囲および精神に包含されるすべてを特許請求する。
【図１Ａ】
0006502931.tif 000037
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
0006502931.tif 000045
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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