(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の細胞を含む、リウマチ関節炎治療用組成物：
（ｉ）軟骨細胞または軟骨前駆細胞；及び
（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨前駆細胞。
【請求項２】
（ｉ）軟骨細胞または軟骨前駆細胞と、（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨前駆細胞の組成比は１：１〜１００：１であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ｉ）軟骨細胞または軟骨前駆細胞と、（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨前駆細胞の組成比は１：１〜３：１であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインの発現または活性を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
下記の細胞を含む組成物の、リウマチ関節炎治療用の治療剤の製造のための使用：
（ｉ）軟骨細胞または軟骨前駆細胞；及び
（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞治療剤に関し、より詳しくは（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ）をコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含む、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患治療用細胞治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性関節炎は、老化によって関節を保護している軟骨が徐々に消失することによって発生する疾患で、体重の相当部分を支えなければならない膝関節に発生しやすい。
【０００３】
それに対して、自己免疫疾患であるリウマチ関節炎は、体の免疫細胞が関節を攻撃して炎症を誘発して、関節の炎症が継続的に関節軟骨と骨組織に浸潤されて組織の腐食を持ってくる疾患である。リウマチ関節炎は、主に指と手首に発生して、特に指の中間節において目立つ特性を示す。退行性関節炎が、主に５０代以後に発生するとは異なり、リウマチ関節炎は若年層でしばしば発病する。
【０００４】
退行性関節炎とリウマチ関節炎の発生原因、症状、発生部位及び発病年齢層を比較すると下記のとおりである（表１）。
【０００５】
【表１】
0006475847.tif 000002
【０００６】
リウマチ関節炎は、発病時関節内のマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）や繊維芽細胞でサイトカインの生成が増加して、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γ及びＴｈ１７細胞によるＩＬ−１７サイトカイン生成が増加すると報告されている。Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞で産生されたサイトカインは、関節炎症状を悪化させる反面、ＩＬ−４及びＩＬ−１０等のようなＴｈ２細胞によって産生されたサイトカインは、関節炎を予防または治療すると知られている。Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４またはＩＬ−１０遺伝子を含むウイルスベクターを関節炎を誘導したマウスの関節内に注射する場合、注射した脚だけでなく他の脚でも治療効果を示すとの報告がある（ＳＨ  Ｋｉｍ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：３４９９−３５０５（２００１））。
【０００７】
リウマチ関節炎の治療剤または軽減剤として現在まで開発されたｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅとしては、メトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）及びコルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）があって、生物学的製剤としてＴＮＦ−α拮抗剤であるエンブレル（成分名エタネルセプト）、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ；成分名インフリキシマブ）、ヒュミラ（成分名アアダリムマブ）等がある。今まで開発されたリウマチ関節炎治療剤の多くは、胃腸障害などの副作用があって、関節損傷の進行を大きく抑制できないのが現状である。
【０００８】
本発明の細胞治療剤成分中一つである、ＴＧＦ−β１は細胞成長及び分化に対する多機能調節子である。組換えＴＧＦ−β１を脊髄腔内注射すると、多分化能効果を有する様々な類型の細胞をターゲッティングすることで神経損傷による神経病症痛みを相当弱化させると報告されている。
【０００９】
最近ではＴＧＦ−β１を発現する軟骨細胞または繊維芽細胞が退行性関節炎治療に効果があると報告されたが（Ｌｅｅ  ＫＨ等，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００１；１２：１８０５−１８１３，ＳＵＮ  Ｕ．ＳＯＮＧ等，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００５；１１：１５１６−１５２６）、退行性関節炎と原因及び病理が異なるリウマチ関節炎の治療の可能性については報告されたことがない。
【００１０】
そこで、本発明者等は、抗炎症作用とリウマチ関節炎の治療効果を有する細胞治療剤を開発しようと努力した結果、軟骨細胞とＴＧＦ−β１を発現する軟骨細胞の混合細胞組成物をリウマチ関節炎誘発動物モデルに投与する場合、リウマチの症状が改善されることを確認して、本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、軟骨細胞または軟骨細胞に分化が可能な細胞と化学的合成薬物でないＴＧＦ−β１を発現する軟骨細胞またはＴＧＦ−β１を発現する軟骨細胞に分化が可能な特定細胞を利用して、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患の治療用途を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含む、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患治療用組成物を提供する。
【００１３】
本発明はまた、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含有する組成物を個体に投与する工程を含む、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患の治療方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含有する組成物の過免疫反応によって誘発される炎症性疾患治療剤としての用途を提供する。
【００１５】
本発明はまた、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含有する組成物を個体に投与する工程を含む、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αで構成された群から選択されるサイトカインの発現または活性を抑制する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の混合細胞組成物のリウマチ関節炎と退行性関節炎治療作用機序を図式化したものである。
【図２】退行性関節炎動物モデルで混合細胞投与後の痛み軽減効果をｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントテストを介して確認した結果を示したものである。
【図３】退行性関節炎動物モデルで混合細胞投与後膝関節の軟骨状態を確認するためにＨ＆Ｅ染色した結果を示したものである。
【図４】退行性関節炎動物モデルで混合細胞投与後膝関節の軟骨状態を確認するためにＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した結果を示したものである。
【図５】退行性関節炎動物モデルで混合細胞投与後軟骨内の第１型及び第２型コラーゲン含有量を確認するための免疫染色結果を示したものである。
【図６】退行性関節炎誘発動物モデルで滑液のＴＧＦ−β１とＩＬ−１０発現水準を分析した結果を示したものである。
【図７】退行性関節炎誘発動物モデルの細胞投与関節腔のマクロファージ状態を確認するために滑膜をマクロファージの表面抗原であるＣＤ６８の抗体及びＩＬ−１０抗体で免疫化学染色した結果を示したものである。
【図８Ａ】滑膜をＣＤ８６及びアルギナーゼ１（Ａｒｇｉｎａｓｅ１）に対する抗体で免疫化学染色した結果を示したものである。
【図８Ｂ】ＡのイメージをＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓを使用してＩｎｖｅｒｔ  ｖｅｒｓｉｏｎに転換したものである。
【図８Ｃ】ＣＤ８６及びアルギナーゼ１陽性細胞を計測してグラフで示したものである。
【図９】滑膜内遺伝子発現プロファイルのｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示したものである。
【図１０】リウマチ関節炎誘発動物モデルで混合細胞投与後１９日及び２６日目中足骨部位のむくみ減少量を測定した結果を示したグラフである。
【図１１】リウマチ関節炎誘発動物モデルで混合細胞投与後２８日目関節腔から滑液を摘出してサイトカインの変化を測定した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
同種（他家）軟骨細胞；及びＴＧＦ−βを発現する軟骨細胞；を含有する混合細胞は、退行性関節炎の細胞媒介遺伝子治療剤として知られている。骨関節炎患者を対象にした臨床２相研究で前記混合細胞は、骨関節炎患者の痛み、活動性及び軟骨構造を改善することが確認された。しかし、混合細胞がどのような機序で作用するのかについてはまだ明らかになっていない。
【００１８】
本発明者等は、骨関節炎動物モデルに混合細胞を投与した後、痛みと構造変形に対する効果を観察して、混合細胞が抗炎症環境を誘導するのか否かを確認した結果、混合細胞が処置された関節炎膝関節で抗炎症性サイトカイン及びＭ２マクロファージが増加することを確認することによって、痛みを緩和して関節再生を誘導する抗炎症性環境を誘導することを確認した。
【００１９】
従って、混合細胞が免疫抑制性特性を有するＭ２マクロファージが豊富な環境を誘導することが確認されたところ、過免疫反応による炎症性疾患にも効果があるとの仮定のもと、リウマチ関節炎動物モデルに軟骨細胞とＴＧＦ−βを発現する軟骨細胞を一定比率で混合して膝関節に投与した。その結果、混合細胞を投与した時、投与群で中足骨のむくみが減少することを確認し、また、滑液で炎症反応を誘導促進するサイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの発現が減少することを確認した。混合細胞１回投与で治療効果が２６日間維持された。
【００２０】
従来のリウマチ関節炎治療剤として使用されているＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）のような物質は、消化器系及び口腔潰瘍を起こすことがあり、肝毒性及び腎不全などを起こす危険がある。また、レミケードなどａｎｔｉ−ＴＮＦ−α抗体のような治療剤は、患者の先天免疫体系をかく乱させることによって結核保菌者から結核（ＴＢ）の発現をもたらすことが知られている。これに対して、本発明に係る細胞治療剤は、退行性関節炎に対する臨床試験結果、このような副作用が現れない長所がある。従って、本発明者等は混合細胞が従来のリウマチ関節炎治療剤の短所を克服した新しい治療剤となり得るとの可能性を確認することができた。
【００２１】
従って、一観点において、本発明は、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含む、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患治療用組成物に関する。
【００２２】
他の観点において、本発明は、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含有する組成物を個体に投与する工程を含む、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患の治療方法に関する。
【００２３】
さらに他の観点において、本発明は、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞；及び（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞を含有する組成物の過免疫反応によって誘発される炎症性疾患の療剤用途に関する。
【００２４】
本発明で、前記過免疫反応によって誘発される炎症性疾患は、リウマチ関節炎、多発性硬化症、全身性紅斑性ループス、筋無力症、大腸炎、第１型糖尿病及び脳炎などがあって、本発明の組成物はその中でリウマチ関節炎治療に特に効果的である。
【００２５】
本発明で、前記軟骨細胞に分化可能な細胞は、軟骨前駆細胞または幹細胞であってもよい。
【００２６】
本発明において、（ｉ）軟骨細胞または軟骨細胞に分化可能な細胞と、（ｉｉ）ＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞またはＴＧＦ−βをコードする遺伝子が導入された軟骨細胞に分化可能な細胞は、種々の混合割合で混合されることができ、好ましくはその組成比は１：１〜１００：１であってもよく、３：１であることがさらに好ましい。
【００２７】
本発明の一様態で、過免疫反応によって誘発される炎症性疾患治療用組成物は、形質導入されなかったヒト軟骨細胞（ｈＣｈｏｎＪ細胞）及びＴＧＦ−β１を発現する軟骨細胞（ｈＣｈｏｎＪｂ♯７）、より具体的にはヒト同種（他家）軟骨細胞（ｈＣｈｏｎＪ）及びヒトＴＧＦ−β１を発現する軟骨細胞を含む。この二種類の細胞は、様々な混合比で混合することができる。例えば、これらの二つの細胞は３：１の比、すなわちｈＣｈｏｎＪ細胞が３でｈＣｈｏｎＪｂ♯７が１の比で混合することができる。前記３：１の比の混合細胞及びこれの産生方法は、論文［Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２  Ｆｅｂ；１４（２）：２４７−２５６］及び米国特許第７００５１２７号と米国特許第７２８２２００号に開示されている。
【００２８】
本発明の一様態で、混合細胞を投与した関節炎ラットモデルは、投与後１５日が過ぎた後から痛みが緩和され始め、投与後５６日が過ぎた時点（実験終了日）まで痛み緩和効果が持続した。このような痛み軽減は、関節炎膝関節の構造的改善と関連があると確認されて、投与された混合細胞は、痛み軽減と軟骨再生に共に効果的であることが示された。すなわち、本発明で使用する混合細胞は、痛み緩和及び軟骨組織の再生のための細胞媒介遺伝子治療療法である。
【００２９】
本発明の他の様態では、混合細胞を投与した関節炎ラットモデルの軟骨組織に対して第１型コラーゲンと第２型コラーゲンに対する染色を行って組織学的に分析した結果、混合細胞が第２型コラーゲン陽性であるガラス質（ｈｙａｌｉｎｅ）軟骨組織を再生させることが確認された。
【００３０】
先天免疫細胞（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ）のマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は、活性化表現型により伝染症（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）特性を有する活性化された“Ｍ１マクロファージ”と免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）特性を有する活性化された“Ｍ２マクロファージ”に分類される。ＩＦＮ−γは、Ｍ１マクロファージの活性化と関連する核心サイトカインで、病原体認識によって誘導されたＴＬＲシグナルがＭ１マクロファージの分化に寄与する。Ｍ１マクロファージは、ＴＮＦα、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３の発現を高め、ＩＬ−１０の発現を低くし、組織損傷を招くＴｈ１及びＴｈ１７免疫反応を誘発することが知られている。これとは対照的に、Ｍ２マクロファージは、ＩＬ−１０の発現水準を高め、ＩＬ−１２の発現を低くすることによって炎症を減少させて、組織再生を促進させる。
【００３１】
本発明の一様態で、ＴＧＦ−β１を発現するヒト軟骨細胞であるｈＣｈｏｎＪｂ♯７で発現するＴＧＦ−βと通常のヒト軟骨細胞（ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）のｈＣｈｏｎＪを介して誘導されるＩＬ−１０が、Ｍ２マクロファージの生成を誘導すると見られ、生成されたＭ２マクロファージは、ＩＬ−１０を分泌して、混合細胞を投与された関節で抗炎症性環境を作ることと判断される。混合細胞が投与された動物モデルの滑膜を組織学的に分析した結果においてもＭ２マクロファージの増加を確認することができる（図８）。
【００３２】
また、本発明の組成物の免疫抑制効果は、ＴＧＦ−β１とアルギナーゼ１の発現増加によって誘導されると判断され、本発明の一様態では、混合細胞投与群動物モデルの膝関節滑膜でアルギナーゼ１の発現が増加した。
【００３３】
アルギナーゼ１の発現増加及びこれによるＬ−アルギニンの減少は、免疫システムで強力な免疫抑制効果を招くと知られていて、ＴＧＦ−βがアルギナーゼ１の転写及びアルギナーゼ活性を誘導することも報告されている（Ｄｕｒａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０３（８），１１２１−７，２００１）。従って、Ｍ２マクロファージは、ＴＧＦ−β１存在下でより効率よく免疫が調節できると判断される。
【００３４】
また、本発明の組成物の抗炎症効果は、混合細胞投与によって集中されたＭ２マクロファージで発現するＩＬ−１０が、ＳＴＡＴ３及びＰＩ３Ｋを活性化させて、これによって調節されるＨｍｏｘ−１によって抗炎症効果が現れると見られる。
【００３５】
一方、近年慢性リウマチ関節炎患者の滑膜と滑液で、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及び血小板で誘導された成長因子（ＰＤＧＦ）等のサイトカインと成長因子が検出された（Ｎｏｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：２７５−３７２，１９８４；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：７９−８６，１９９１；Ｓａｘｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３１：１０４１−１０４５，１９８８；Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：  ４６３−４６９，１９９１；Ｌａｆｙａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１１４２−１１４８，１９８９；Ｍｅｌｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３３：４９３−５００，１９９０）。
【００３６】
ＩＬ−６は、Ｂ−細胞刺激因子２またはインターフェロンβ２と知られるサイトカインである。ＩＬ−６は、Ｂリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子であって（Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４，７３−７６，１９８６）、様々な細胞の作用に影響を及ぼす多機能性サイトカインであることが明らかになった（Ａｋｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５４，１−７８，１９９３）。
【００３７】
慢性リウマチ関節炎患者の血清または滑液には過量のインターロイキン−６と可溶性ＩＬ−６受容体が存在すると報告されている（Ｈｏｕｓｓｉａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３１：７８４−７８８，１９８８；Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１７９７−１８０１、１９８８；Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｐｎ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。リウマチ関節炎の動物モデルでも類似の結果が得られたため（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｔ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３２：５９４−６００、１９８９；Ｌｅｉｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．５６：１０８−１１５，１９９０）、ＩＬ−６が慢性リウマチ関節炎に関連因子であることが分かった。
【００３８】
一方、リウマチ関節炎に対する臨床開発で、生物学的製剤であるセクキヌマブは、ＩＬ−１７Ａ活性を抑制する高−親和度ヒトモノクルローナル抗体である。ＲＡ概念実証（ＰｏＣ）研究で、安定した容量のＭＴＸを投与した活性ＲＡ患者にセクキヌマブを併用投与した。その結果、セクキヌマブを使用した治療群は、プラセボに比べてリウマチ関節炎の臨床兆候を速かに改善することを確認した（Ｈｕｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２（５２）：５２−７２）。これはＩＬ−１７Ａの中和が、リウマチ関節炎患者で効能を示す可能性があることを示すデータである。
【００３９】
本発明の他の様態では、ＣＦＡ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）投与によって、リウマチ関節炎が誘導されたラットの足の裏に混合細胞を投与して、中足骨（ｍｅｔａｔａｒｓａｌ）のむくみを２８日間確認した結果、混合細胞投与群で中足骨のむくみが減少することを確認して（図１０）、炎症反応を誘導促進するＰｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ項目であるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α分析結果、混合細胞投与群とＭＴＸ投与群で、対照群対比統計的に有意に減少することを確認した（図１１）。
【００４０】
従って、本発明の組成物は、リウマチ関節炎患者の関節滑液で過量に分泌される炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの発現を抑制して、浮腫を減少させる効果がある。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４２】
実施例１：関節炎動物モデルで混合細胞処理による痛み緩和及びＣｏｌ  ＩＩ陽性軟骨の再生誘導
関節炎患者を対象にした臨床２相で混合細胞を処理する場合、痛みを軽減して関節の環境を構造的に改善することを観察することができた。これに対する機序を確認するために、ＭＩＡで誘導した退行性関節炎動物モデルに混合細胞を処理して、関節組織学的検査とｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントテストを行った。
【００４３】
１−１：ＭＩＡ誘導関節炎動物モデル製作
動物モデル製作には６週齢雄ラット（Ｓｐａｒｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、２００〜２２５ｇ、ナラバイオテク、大韓民国）を使用して、動物実験はコーロン生命科学（大韓民国）実験動物運営委員会（ＩＡＣＵＣ  Ｎｏ．ＫＬＳ  ＩＡＣＵＣ  ２０１３−０４）の承認下獣医科的管理下で行った。
【００４４】
関節炎を誘導するために、６０ｍｇ／ｍＬ濃度のＭＩＡ（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）溶液５０ｕｌを３１Ｇ注射器を使用してラットの左側膝の関節腔内に投与した。
【００４５】
１−２：細胞治療のための細胞の準備
本発明で使用されたｈＣｈｏｎＪはヒト由来軟骨細胞で、ｈＣｈｏｎＪｂ♯７はＴＧＦ−βが分泌されるように形質転換された軟骨細胞である。これらの製作方法及び混合比は［Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２  Ｆｅｂ；１４（２）：２４７−２５６］及び米国特許第７００５１２７号と米国特許第７２８２２００号に開示されている。
【００４６】
ｈＣｈｏｎＪｂ♯７はＴＧＦ−βのｃＤＮＡを公示の方法により細胞に注入して製造することができる。たとえば、メタロチオネイン（ｍｅｔｈａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）等のプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）及びＴＧＦ−βのｃＤＮＡをアンピシリン、ネオマイシンなどの抵抗遺伝子を有する公示のベクター［例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社のｐＵＣ１９（アンピシリン抵抗遺伝子含有）］に含ませてＴＧＦ−βのｃＤＮＡを含むベクターを製造した後、軟骨細胞にリン酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）法またはリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）法などの公示の方法により注入することによって製造することができる。
【００４７】
１−３：混合細胞処理による痛み軽減及び軟骨再生効果確認
関節炎誘導ラットは、ＭＩＡ処理２週間後に混合細胞｛（１．２ｘ１０６細胞：ｈＣｈｏｎＪ（９ｘ１０５細胞）＋ｈＣｈｏｎＪｂ♯７（３．０ｘ１０５細胞）｝、ｈＣｈｏｎＪ（９ｘ１０５細胞）、ｈＣｈｏｎＪｂ♯７（３．０ｘ１０５細胞）または対照群｛ＣｒｙｏＳｔｏｒ−１０（ＣＳ−１０）｝を左側膝関節腔に投与して、症状を観察して、週１回体重を測定した。
【００４８】
ｖｏｎ  Ｆｒｅｙフィラメントテストを行って痛みの軽減を観察した結果、図２に示された通り、痛み数値は細胞投与後１５日後から減少して、そのような効果は観察が終わる日（投与後５６日目）まで持続した。ＴＧＦ−βを発現するｈＣｈｏｎＪｂ♯７（３．０ｘ１０５細胞）投与群の場合、痛み軽減は１５日から観察されたが、６週間後にはその効果がなくなることが確認された。これに対して、通常のヒト軟骨細胞であるｈＣｈｏｎＪ（９ｘ１０５細胞）を投与した群では痛み軽減効果が現れなかった。
【００４９】
混合細胞の痛み軽減効果が軟骨再生と関連があるか否かを確認するために、五つの実験グループの左側膝関節を摘出して、Ｈ＆Ｅ染色とＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を介して組織学的分析を行った（図３及び図４）。
【００５０】
対照群（ＣＳ−１０）とｈＣｈｏｎＪ投与群は、軟骨再生が確認されなかった。これとは対照的に、ｈＣｈｏｎＪｂ♯７投与群と混合細胞投与群は、他の対照群より軟骨が多く観察された。
【００５１】
また、免疫組織化学染色結果、図５に示された通り、混合細胞投与群の軟骨内タイプＩＩコラーゲン含有量がｈＣｈｏｎＪｂ♯７投与群より高いことを確認して、このような結果から混合細胞投与群の軟骨がガラス質軟骨に近いことが分かった。
【００５２】
関節状態向上程度を評価するために、論文［Ｋｏｂａｙａｓｉ，Ｋ．，Ｊ．等，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６５：１１９５−１１９９，２００３］に記載された方法でＨ＆Ｅ染色した関節組織の組織病理学的結果と病理学的点数を評価して、その結果を下記の表２にまとめた。下実験結果混合細胞処理群の軟骨が最も多く改善された。
【００５３】
【表２】
0006475847.tif 000003
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【００５４】
実施例２：混合細胞処理が抗炎症性サイトカイン分泌に及ぼす影響分析
動物モデルで、混合細胞の処理が関節腔内の滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ）のサイトカイン発現プロファイルに及ぼす影響を確認した。
【００５５】
細胞投与部位にマクロファージが誘導されるか否かを確認するために、滑膜でＣＤ６８陽性細胞の存在を確認した。
パラフィンで包埋した滑膜を４ｕｍ厚さで薄切りして組織スライドを製作した後、ＣＤ６８抗体（Ｎｏｖｕｓ，Ｃｏ，ＵＳＡ）を使用して免疫組織化学染色を実施した。
その結果、図７Ａに示された通り、ＣＤ６８陽性細胞が混合細胞投与群で大きく増加した。
【００５６】
ＩＬ−１０は痛み軽減効果を示すと知られている。前記報告に基づいて関節炎モデルを作った後、混合細胞を投与して、ＩＬ−１０の発現を確認した。ＩＬ−１０の発現は、関節炎誘発ラットの滑液でサイトカインマグネチックビーズパネル９６ウェルプレートアッセイ（＃ＲＥＣＹＴＭＡＧ−６５Ｋ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して測定した。
【００５７】
その結果、図６Ｂに示された通り、混合細胞投与群とｈＣｈｏｎＪ投与群で、ＩＬ−１０の発現が増加することを確認した。組織学的分析結果も混合細胞投与群でＩＬ−１０陽性細胞が増加することが確認された。このような結果は、関節炎膝関節で混合細胞の投与が抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を誘導することを示す。
【００５８】
実施例３：混合細胞のＭ２タイプマクロファージ豊富環境誘導確認
マクロファージには、Ｍ１タイプ及びＭ２タイプの二種類の形態があって、Ｍ１タイプマクロファージは、急性炎症を担って、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインを高水準で分泌して、Ｍ２マクロファージは、傷治癒と抗炎症調節機能において、重要な役割を果たす。
【００５９】
実施例２で、混合細胞投与群で高水準のＩＬ−１０発現を確認したため、混合細胞が関節炎誘導動物の膝でマクロファージを誘導するか否かを確認しようと、動物モデルの滑膜でＭ１マクロファージの標識因子であるＣＤ８６の発現とＭ２マクロファージ標識因子であるアルギナーゼ１の発現を確認した。
【００６０】
これのために、ＣＤ８６抗体（ＡｂＤ  ｓｅｒｏｔｅｃ，ＮＣ，ＵＳＡ）及びマウスアルギナーゼ１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用してパラフィン包埋した滑膜を薄切りして免疫組織化学染色を行った。
【００６１】
その結果、図８に示された通り、ＣＤ８６の発現は、対照群と混合細胞投与群で差がなく、アルギナーゼ１は混合細胞投与群で顕著に高く現れた。これは、混合細胞がＭ２マクロファージを誘導することを示している。
【００６２】
実施例４：混合細胞によるＭ２マクロファージ豊富環境誘導確認：ＲＮＡ
実施例３で確認したＭ２マクロファージの誘導を遺伝子発現で確認するために、動物モデルの滑膜から全体ＲＮＡを分離して、Ｍ１及びＭ２マクロファージの遺伝子の発現を確認した。
【００６３】
細胞処理ラットの滑膜でのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＳＡ）を使用して分離して、分離したＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用してｃＤＮＡを合成した。
【００６４】
その後ＡＢＩ７９００装備を使用してｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬ  ｃＤＮＡ、０．２μＭの各プライマー、１０μＬ  ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ、日本）で計５０μＬに合わせて使用して、反応条件は９５℃で１０秒、６０℃で３０秒で計４０サイクル行った。遺伝子発現水準は２−△△Ｃｔ法を使用してβ−アクチン遺伝子の発現量と比較して確認して、使用したｑＲＴ−ＰＣＲプライマーは表３の通りである。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
ｑＲＴ−ＰＣＲ結果現れたマクロファージ集中遺伝子発現プロファイルを図９に示した。混合細胞投与群に存在する多数のＣＤ６８陽性細胞によって、ＣＤ６８の発現は混合細胞投与群で高く示された。ＴＮＦ−αは対照群と混合細胞投与群で大差なかった。抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０は、混合細胞投与群で非常に高く発現した。
【００６７】
ＩＬ−１０のｍＲＮＡ発現増加が、タンパク質発現につながるのか否かを確認するために、滑膜の多重サイトカインアッセイを行った。その結果、図１０に示された通り、混合細胞投与群でＩＬ−１０タンパク質の水準が急激に増加することが確認された。追加的なマクロファージ標識因子であるＩＬ−１０ＲＡ（インターロイキン１０受容体アルファサブユニット）とＨｍｏｘ１（ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  １）のｍＲＮＡ水準も顕著に増加したことを確認した。
【００６８】
前記結果をまとめると、関節炎モデルで混合細胞を投与する場合、Ｍ２マクロファージの誘導が増加することがわかる。
【００６９】
実施例５：リウマチ関節炎動物モデルでの混合細胞効能確認
５−１：リウマチ関節炎動物モデルの製作
リウマチ関節炎誘導動物モデルの製作には、７週齢雌ラット（１６０〜１８０ｇ  Ｌｅｗｉｓ、中央実験動物、日本）を使用して、動物実験は、コーロン生命科学（大韓民国）実験動物運営委員会（ＩＡＣＵＣ  Ｎｏ．ＫＬＳ  ＩＡＣＵＣ  ２０１５−０７）の承認下に獣医科的管理下で行った。
【００７０】
リウマチ関節炎を誘導するために、５ｍｇ／ｍＬ濃度のＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、メーカー：Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．）溶液５０ｕｌを３１Ｇ注射器を使用してラットの足の裏皮下に投与した。３週間の後、ｃａｌｉｐｅｒｓを利用して中足骨むくみの大きさを測定して関節炎誘発を確認した後、むくみが最も深刻に誘導された時試験物質をＬｅｗｉｓ−ｒａｔ左側膝関節腔に投与した。
【００７１】
５−２：動物モデルに試験物質投与
リウマチ関節炎誘導ラットは、各群を６匹ずつにして、ＣＦＡ処理３週間後に、混合細胞｛（１．２ｘ１０６細胞：ｈＣｈｏｎＪ（９ｘ１０５細胞）＋ｈＣｈｏｎＪｂ♯７（３．０ｘ１０５細胞）｝、ｈＣｈｏｎＪ（９ｘ１０５細胞）、ｈＣｈｏｎＪｂ♯７（３．０ｘ１０５細胞）、陰性対照群（ＣＳ−１０）を左側膝関節腔に投与した。陽性対照群の場合、ＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）０．４ｍｇ／ｋｇを経口で１週間に１回ずつ、計３回投与した。３日毎に１回中足骨直径及び体重を測定した。
【００７２】
表４に各実験群の投与条件を示した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
５−３：リウマチ関節炎動物モデルでの混合細胞の効果
前記関節炎モデルに試験物質を投与して、ｃａｌｉｐｅｒを利用して中足骨（ｍｅｔａｔａｒｓａｌ）のむくみの大きさを測定した結果を図１０に示した。対照群（ＣＳ−１０）、ｈｃｈｏｎｊ、ｈＣｈｏｎＪｂ♯７、Ｉｎｖｏｓｓａ、ＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を投与後１９日目及び２６日目むくみの大きさ減少量を測定した結果、混合細胞投与群、ＭＴＸ投与群で対照群対比統計的に有意な減少量を示した。
【００７５】
５−４：混合細胞投与によるサイトカイン分泌プロファイル分析
関節炎モデルに試料を投与して、２８日目実験動物ラットの左側膝関節腔で滑液を摘出してサイトカインを分析して、その結果を図１１に示した。ラット関節腔で滑液摘出は、注射用食塩水を３１Ｇインスリン注射器で５０μＬ投与後、注射器を刺した状態で直ちに回収する方式で摘出した。サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αを分析して、分析はＲａｔ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（ＲＥＣＹＴＭＡＧ−６５Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して行った。炎症反応を誘導促進するＰｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ項目であるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α分析結果、混合細胞投与群とＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）投与群で対照群対比統計的に有意に減少することを確認した。
【００７６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の混合細胞組成物は、既存薬物治療による副作用なしに細胞治療だけでリウマチ関節炎をはじめとする炎症性疾患の症状を改善して、過免疫反応を抑制することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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