(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、検出器と、少なくとも一方の表面に金属膜を有する基板と、前記光源からの光線
を前記基板へ導入し、前記基板からの光線を前記検出器側へ導出する光学素子を備えた光
学的分析装置であって、
前記金属膜上には、試料を保持する試料領域が複数設けられ、
前記光源からの光線の一部は、複数設けられた前記試料領域のうちのいずれか一つの試
料領域に照射され、かつ、前記金属膜上で2回以上反射し、かつ、少なくとも１回は前記
基板における前記試料領域が設けられている側とは反対側の面で反射し、かつ、前記光学
素子によって導出されるまでの経路において複数設けられた前記試料領域のうち当該試料
領域以外の他の試料領域には照射されないことを特徴とする光学的分析装置。
【請求項２】
請求項１において、
試薬を保持する、複数の試薬保持部がさらに設けられており、それらさらに設けられた複数の前記試薬保持部のうちのいずれの試薬保持部からの試薬を前記試料領域に送液するかを切り替える複数のバルブを有することを特徴とする光学的分析装置。
【請求項３】
請求項１において、
隣接する前記試料領域の間には反射率が既知の物質が設けられている光学的分析装置。
【請求項４】
請求項１において、
隣接する前記試料領域の間には樹脂、金属、または金属酸化物が設けられている光学的
分析装置。
【請求項５】
請求項１において、
前記基板へＣＯ２を導入するガスボンベが設けられている光学的分析装置。
【請求項６】
請求項１において、
前記基板に対して接続され、前記基板上に流路を形成すべく溝が設けられた流路部品、
または液体を保持するウェルを形成するウェル部品を備えている光学的分析装置。
【請求項７】
請求項６において、
前記基板と、前記流路部品と、前記光学素子を互いに固定する、ホルダを備えている光
学的分析装置。
【請求項８】
請求項１において、
前記基板と前記光学素子が一体的な構造である光学的分析装置。
【請求項９】
請求項１において、
前記基板と前記光学素子との間にはマッチング液が設けられている光学的分析装置。
【請求項１０】
請求項１において、
前記基板と前記光学素子が同じ材料である光学的分析装置。
【請求項１１】
請求項１において、
前記光学素子は、プリズムである光学的分析装置。
【請求項１２】
請求項１において、
それぞれの前記試料領域に対応する、前記検出器における像は、互いに重ならない光学
的分析装置。
【請求項１３】
請求項１において、
前記光源からの光線の光線幅は、前記試料領域の幅よりも狭い光学的分析装置。
【請求項１４】
請求項１において、
前記光源からの光線の光線幅（D/cosθ）は、前記試料領域の幅よりも狭く，かつ，前
記検出器で検出される前記試料領域の幅の合計よりも広い光学的分析装置。
【請求項１５】
請求項１において、
前記光源からの光線の光線幅（D/cosθ）は、前記反対側の面で反射する反射領域の幅
よりも狭く，かつ，同時に測定される前記試料領域の幅の合計よりも広い光学的分析装置
。
【請求項１６】
請求項１４または１５のいずれかにおいて、
前記光源からの光は，少なくとも一時点では同時に前記試料領域の全領域を含む領域に
照射される光学的分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質や生体の性質を解析する装置に関する。特に細胞などの生体試料が、刺激に対してどのような応答を示すかを測定する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬のため、有効な薬物をスクリーニングするための方法として、生きた細胞が薬物に対して感受性があるか否かを判定する技術（セルベースアッセイ）が広まっている。従来は薬物の効果を簡便に評価する際には、標的分子と対象薬物が物理的に結合するか否かを判定する方法が用いられていた。これに対し、薬物の標的となる細胞の生理的な応答を直接測定することで、薬物の効果をより正確に評価できる。【０００３】
このセルベースアッセイの技術は、創薬のみならず、いろいろな分野に用いられている。例えば、アレルギー検査として、患者が特定のアレルゲンに反応するか判定したり、ある物質がアレルギー反応を引き起こす可能性について判定したりできる。また、抗がん剤などの薬物を投与する際に、最も効果的な薬物を選択して投与する、個別化医療にも適用可能である。【０００４】
セルベースアッセイの典型的な手順は以下の通りである。まず、測定試料となる細胞を培養したり、被験者から採取したりする。次に、細胞をセンサーチップなどの基板表面に固定する。そして、反応試薬を添加して測定試料に接触させ、蛍光顕微鏡などの手段を用いて観察、測定し、得られたデータを解析して細胞の変化の有無や大きさを得る。細胞の応答の観察，測定方法としては，上記に挙げた生物学では一般的な蛍光観察のほか、近年では表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）を利用した手法が用いられている。【０００５】
特許文献１には，セルベースアッセイの方法として、ＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法を細胞の応答の観察、測定に用いる技術が示されている。ガラス基板に入射したレーザ光は、ガラス基板と金属薄膜との間の界面Ｆに、全反射条件を満たし前記表面プラズモン共鳴現象を発生させる入射角θ＝５６°で入射する。界面Ｆで反射したレーザ光は、ガラス基板及びプリズムから出射して、対物レンズに入射する。この対物レンズは、物体像を所定の倍率で拡大して像面上に結像させる。対物レンズから出射されたレーザ光は、撮像部の撮像面に到達する。撮像部は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ又はＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサである。撮像部の撮像面に、プリズムの界面Ｆに入射した平行光束の反射光の２次元強度分布に相当する強度像、すなわち反射強度像が結像する。金属薄膜における界面Ｆの反対側の表面（一方の面）には、活性反応の計測対象である生細胞Ｃ１、Ｃ２が付着している。金属薄膜上には、液体を流す流路としてのフローセルが設けられている。フローセルとは、金属薄膜上にセットされた生細胞Ｃ１、Ｃ２に曝露させる液体を流す流路である。フローセルは、液体供給部に接続されている。この液体供給部からフローセル内に生細胞Ｃ１、Ｃ２に曝露させる液体が供給される。特許文献１の図４（Ａ）乃至図４（Ｃ）には、生細胞Ｃ１、Ｃ２を刺激していない状態における０分後、１０分後、２０分後の反射強度像の画像の変化が示されている。また、特許文献１の図５（Ａ）乃至図５（Ｃ）には、生細胞Ｃ１、Ｃ２を刺激した後における０分後、１０分後、２０分後の反射強度像の画像の変化が示されている。図４（Ａ）乃至図４（Ｃ）と図５（Ａ）乃至図５（Ｃ）を比較すると明らかなように、外部刺激に対して生細胞Ｃ１、Ｃ２が反応すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２に相当する箇所の輝度が変化しているのがわかる。【０００６】
また、特許文献１には，ＳＰＲイメージングの視野中にマルチウェルチャンバー中複数の細胞や複数の刺激を同時並列的に解析することでスループットを向上する技術も示されている。該好塩基球液を、特許文献１の図１１（Ａ）に示すようなマルチウェルチャンバー（例えば、注入した溶液が離隔されるようマトリクス状にウェルが空いたもの）に、外部刺激の吐出の際に述べたような液滴吐出装置、又は、ピペッティング等により注入する。更に、当該好塩基球液が注入されるマルチウェルチャンバーに合うよう設計されたアレルゲン投与用のマルチチャンバーも用意する。このアレルゲン投与用マルチチャンバーも上述したような液滴吐出装置のようになっており、血液が注入された各ウェルに、好ましくは同時に、異なるアレルゲンを投与する。そこで、本実施形態の細胞活性分析装置及び細胞活性分析方法を利用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−１９３７５２号公報
【特許文献２】特願２００２−８５０８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１に開示される技術では、ＳＰＲイメージングの視野中にマルチウェルチャンバー中を配置することで、複数ウェル中の条件の異なる細胞の同時観察を実現し、スループット向上を試みている。しかし、一度に観察されるウェルの数は、ＳＰＲイメージングの視野の大きさとウェルの大きさと間隔によって制限されてしまうため、十分なスループットの向上を得ることが難しかった。【０００９】
本発明の解決しようとする課題は、ＳＰＲなどの光学的測定手段に基づくセルベースアッセイの実質的なスループットを高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の光学的分析装置は、光源と、検出器と、少なくとも一方の表面に金属膜を有する基板と、光源からの光線を基板へ導入し、基板からの光線を検出器側へ導出する光学素子を備えた光学的分析装置であって、
金属膜上には、試料を保持する試料領域が複数設けれ、
光源からの光線の一部は、いずれか一つの試料領域に照射され、かつ、少なくとも１回は基板における試料領域が設けられている側とは反対側の面で反射し、かつ、光学素子によって導出されるまでの経路において当該試料領域以外の他の試料領域には照射されない。
【発明の効果】
【００１１】
上記のような構成にすることにより、複数の試料領域を並列して測定するために必要な光線束の幅を小さくできる。これにより、光源の大きさ，レンズの大きさ、検出器の大きさを小さくできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１記載の装置構成である。
【図２ａ】実施例１記載の測定領域周辺の構成の一例である。
【図２ｂ】実施例１記載の測定領域周辺の構成の一例である。
【図２ｃ】実施例１記載の測定領域周辺の構成の一例である。
【図２ｄ】実施例１記載の測定領域周辺の構成の一例である。
【図３】実施例１記載の測定領域周辺の構成の別の一例である。
【図４】実施例１記載のフローセル周辺の構成である。
【図５】実施例１記載の動作のフローチャートである。
【図６】実施例１記載の解析結果である。
【図７】実施例２記載の装置構成である。
【図８】実施例２記載のフローセル周辺の構成である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施例について以下説明する。
【実施例１】
【００１４】
（装置構成）
実施例１の装置構成を図１に示す。解析装置１０１は、照射部１０２、検出部１０３、フローセル１０４、基板１３３、プリズム１０５ａ、１０５ｂ、送液部１０６、からなる。基板１３３の表面には，金属膜１３６が設けられる。解析装置１０１の動作は制御ＰＣ１０８によって制御される。制御ＰＣ１０８にはモニタ１０９が接続され、解析結果等を表示する。また、解析装置１０１には温調装置１０７が設けられており、ＣＯ2ガスボンベ１１０から送られるＣＯ2ガスの温度を調整することで、解析装置１０１内部の一部または全体の温度およびＣＯ2濃度を任意に設定可能である。【００１５】
（照射部・検出部の構造説明）
照射部１０２および検出部１０３について説明する。照射部１０２は、光源１１１、光ファイバ１１２、集光レンズ１１３、偏光素子１１４などの部品で構成される。また検出部１０３は、結像レンズ１１５、イメージセンサ１１６などの部品で構成される。光源１１１はＳＰＲ観察のための励起光光源である。光ファイバ１１２から出射した励起光１１７は集光レンズ１１３によって集光され、平行ビームに成形される。平行ビームとなった励起光１１７は偏光素子１１４によってＳ偏光成分が除去され、Ｐ偏光成分のみとなる。Ｐ偏光となった励起光１１７はプリズム１０５ａに入射後、基板１３３の裏側から基板１３３内部に侵入し、基板１３３の表側で第1の測定領域１１８ａに接している部分で、角度θ1で入射する。励起光１１７は角度θ1で反射して、基板１３３の裏側に到達する。基板１３３の裏側面には，光を反射する特定の領域１３４が設けられる。これは例えば，基板１３３と周囲の媒質（例えば空気）の界面での全反射によって実現できる。具体的には，図１に示すように基板１３３の領域１３４には空気のみが接していて，マッチングオイルやプリズム等が存在しない構成であればよい。よってこの場合，光を反射する領域１３４に到達した光は角度θ1Rで全反射する。そして再び基板１３３表側に到達して、第２の測定領域１１８ｂに接している部分に角度θ2で入射し、やはり角度θ2にて反射し、反射光１１９となる。この反射光１１９は、再びフローセル１０４・プリズム１０５ｂを透過し、プリズム１０５ｂ外へ出射される。出射された反射光は結像レンズ１１５で集光され、イメージセンサ１１６上に２次元イメージとして結像される。イメージセンサ１１６は、画像を取得して、制御ＰＣ１０８に画像データを送信する。制御ＰＣ１０８には解析部１２１が存在し、イメージセンサ１１６より送られてきた画像データを解析し、その結果をモニタ１０９に表示する。また、集光レンズ１１３と偏光素子１１４の間には、励起光の照射範囲を変えるための絞りが設けられてもよいが、図１では省略した。【００１６】
照射部１０２と検出部１０３の配置は、基板１３３に対する励起光の入射角と、検出部１０３で検出される反射光の基板１３３に対する反射角を規定する。これらを調整するため、基板１３３に対して任意の角度をとることができる駆動ステージ上に配置してよい。これによってさまざまな入射角と反射角の条件で測定を行うことができる。ＳＰＲを用いた測定での好ましい入射角は、ＳＰＲによる光の吸収が最も大きくなる共鳴角（ディップ角ともいう）かその前後の角度を用いることが多く、これによって試料の屈折率に対して大きな感度を得られる。この好ましい入射角は、試料や試料の周囲の媒質、基板の材料、基板表面に設ける金属膜の構造や表面状態などの条件によって規定されうる。任意の入射角と反射角を得られる上記の構成によれば、前記の条件のさまざまな組合せに対応可能なシステムとなる。例えば、試料として細胞を分析システムにおいては、細胞の種類（好塩基球細胞や血管内皮細胞、ヒト由来細胞かラット由来細胞か、など）や状態、細胞の周囲のバッファー（ｐＨ緩衝液）の組成、細胞の測定したい特性の種類、などによって最適な角度が変わりうるため、予め想定する細胞の分析条件をカバーする角度の範囲を得られるようにステージを設計するとよい。または、想定する細胞の分析条件を予め装置に登録しておき、ユーザが分析条件を選択することで好ましい角度を自動的に設定する構成としてもよく、これによりユーザにとっての使い勝手を向上することができる。または、主な分析対象試料の条件に適した入射角および反射角が得られる配置に、予め調整して固定しておく構造をとることもできる。この場合には、駆動ステージを排することができるために構造がシンプルになり、また使用法もステージ操作が不要なためにシンプルで使いやすくなる。【００１７】
好ましくは基板１３３の表側面（図１中で上側）と裏側面（図１中で下側）は、ともに平坦で、かつ互いに平行である。この時、角度θ1＝角度θ1R＝角度θ2であり、これらの角度は基板１３３の表側面に垂直な中心線と各光線のなす角とみなせる。よって、（プリズムに入射する際の屈折を考慮する必要はあるものの）照射部１０２と検出部１０３の各光軸と基板１３３の表側面に垂直な中心線とのなす角のみによって、測定に用いる入射角（角度θ1＝角度θ1R＝角度θ2）を規定することができる。照射部１０２と検出部１０３が，必ず基板１３３の表側面に垂直な中心線に対して互いに線対称な位置に来るような機構や制御方法を用いることもでき，この場合，照射部１０２と検出部１０３を別々に操作したり制御したりする必要がないため扱いが容易になる。【００１８】
図２には，測定領域１１８周辺の構成の拡大図を示した。本実施例では，測定領域１１８は２つの部分測定領域（１１８ａ，１１８ｂ）からなる。金属膜１３６の裏側から照射された励起光１１７は，金属膜１３６で反射される。このとき，励起光１１７が照射された金属膜の領域の反対側（図２中の上側）の極近傍の領域が各部分測定領域（１１８ａ，１１８ｂ）である。各部分測定領域（１１８ａ，１１８ｂ）には，試料となる物質が存在しうる試料領域１３５ａ〜ｄが含まれており，各物質の性質（ＳＰＲにおいては屈折率または誘電率）は，光の反射率に影響を与える。よってイメージセンサ１１６で検出される反射光１１９の強度分布からこの反射率を測定することで，各部分測定領域（１１８ａ，１１８ｂ）に存在する試料１３５ａ〜ｄの性質を測定することができる。ここで，励起光１１７の各光線は複数の各部分測定領域（１１８ａ，１１８ｂ）に接する金属膜上で複数回反射されるため，反射光１１９の強度から各試料１３５ａ〜ｄに対応する反射率を求めることは容易でないように思われるが、以下に述べる方法によりこれは達成される。【００１９】
図２ａ中に励起光１１７の光線束を構成する部分光線束のうち１つ（１３７）を示した。この光線束１３７は、試料領域の１つ（１３５ａ）に接する金属膜１３６の部分で反射率Ｒ1にて反射された後、基板裏面の反射用領域１３４にて反射率Ｒ2にて反射され、図中に示したダミー試料領域１３８に接する金属膜１３６の部分で反射率Ｒ3にて反射される。ここで例えば、入射光１１７の部分光線束１３７の強度をＩin反射光１１９中の部分光線束１３７の強度をＩrefとすると、観測される総反射率Ｉref／Ｉinと各反射率の間には次式の関係がある。
Ｉref／Ｉin＝Ｒ1×Ｒ2×Ｒ3                      …式（１）
ただし、Ｒ2は定数（ここでは全反射なので常に１）とみなせる。さらに、ダミー試料領域１３８に存在する物質に変化がなければ、Ｒ3は定数となるので、当該試料領域１３５ａに接する金属膜１３６の部分での反射率Ｒ1は次式で求められる。
Ｒ1＝Ｉref／Ｉin／（Ｒ2×Ｒ3 ）＝Ｉref／（Ｉin×Ｒ2×Ｒ3 ）…式（２）
すなわち、各ダミー試料領域１３８ａ〜ｄに常に既知の物質が存在するようにすることで、式（２）を用いて必要な反射率を求めることが可能となる。
例えば，測定したい試料を試料領域１３５ａに導入する前に，予め既知の試料（例えば水）を参照試料として試料領域１３５ａに導入した状態で測定する。この時，入射光１１７の強度および分布は変わらないとすれば，
Ｒ1′＝Ｉref′／Ｉin′／（Ｒ2′×Ｒ3′ ）＝Ｉref′／（Ｉin′×Ｒ2′×Ｒ3′ ）…式（３）
式（２）と式（３）から，
Ｒ1／Ｒ1′＝｛Ｉref／（Ｉin×Ｒ2×Ｒ3 ）｝／｛Ｉref′／（Ｉin′×Ｒ2′×Ｒ3′ ）｝＝（Ｉref／Ｉref′）×（Ｉin′／Ｉin）×（Ｒ2′／Ｒ2）×（Ｒ3′／Ｒ3）＝Ｉref／Ｉref′      …式（４）
よって、参照試料に対する測定値を用いて、これと測定したい試料の測定との比をとるなど、ごく一般的な補正を行ってよい。また、このときＲ2とＲ3は既知の値であるか定数とみなせればよく、必ずしも反射率１（すなわち全反射）でなくともよい。
各ダミー試料領域１３８ａ〜ｄに常に既知の物質が存在するようにすることは例えば，試料領域１３５ａ〜ｄとダミー試料領域１３８ａ〜ｄのそれぞれに異なる液体を流せるように，測定領域１１８ａ〜ｂを複数の流路かウェルに区分けし，ダミー試料領域１３８ａ〜ｄには水や空気、オイル等の安定な流体を満たした状態で測定を行うことで実現してもよい。【００２０】
または，予め存在する物質が変化しないようにしてしまってもよい、具体的には，図３のような構成を用いてよい。流路部品１４０はフローセルとして複数の流路１３９ａ〜ｄを設け，各流路内に試料１３５ａ〜ｄを配置する。しかし，ダミー試料領域１３８ａ〜ｄに相当する箇所は，常に流路部品１４０の材料に対応した一定のＲ3が得られる。または、流路部品１４０のダミー試料領域１３８ａ〜ｄに相当する箇所にのみ、流路部品１４０のほかの部位とは異なる任意の材料を用いてもよい。一般に流路部品１４０には加工しやすい樹脂等の材料が用いられるが、ダミー試料領域１３８ａ〜ｄに相当する箇所を、より安定な樹脂や金属、金属酸化物などで構成することで、繰り返し使用に対してもより安定した測定を行うことができる。【００２１】
図２ｂと図２ｃには，反射用領域１３４を提供する別の構成を示した。図２ｂでは，基板１３３の裏側に光を反射させる部材１４１を設け，入射と反射兼用のプリズム１０５ｃを用いている。具体的には、基板の材料より屈折率が低く、ここでの入射角において光を全反射させるような樹脂やガラスなどの誘電体でよい。または、光を反射し得る金属体でもよく，例えばアルミ等の金属薄膜を蒸着してもよい。この場合，光は金属薄膜の鏡面で一定の反射率で反射される。この様な反射部材１４１を用いた構成では，プリズム１０５ｃが１個で済むため，部品点数を減らすことができる。また，図２ｃでは，プリズム１０５ｃの表面に凹部１４２を設けることで、プリズム１０５ｃと基板１３３との間のマッチングオイル１３２が入り込まない空間１４３を作っている。この空間１４３には屈折率の低い空気が存在するため、空間１４３に接する基板１３３の裏面の反射領域１３４では、光が全反射することとなる。ここで凹部１４２は反射領域１３４にマッチングオイル１３２が接しないようにする構造で代替してもよく，例えばマッチングオイル１３２が空間１４３に流れ込むのを防ぐ障壁となるＯリングの様な部材や，マッチングオイル１３２を撥くことで流れ込むのを防ぐようなプリズム１０５ｃ表面に設けられた膜構造や微細構造でも良い。なお，図２ｂ図２ｃどちらの構成でも，前述の式（２）において、反射用領域１３４の反射率Ｒ2は定数となるため上記と実質的に同じ議論が適用できる。【００２２】
なお、入射光１１７の強度Ｉinは各種の手段を用いて取得してよい。例えば、予め均一な物質を測定領域１１８に導入した状態で反射光１１９の強度を測定することで、Ｉin×Ｒ3を取得できる。または偏光素子１１４を切り替える機構などを用いて入射光をｓ偏光にした状態で反射光１１９の強度を測定することで、Ｉinの空間分布を取得できる。【００２３】
上記で述べたような、入射光１１７と各試料領域１３５ａ〜ｄの配置を得るために必要な、金属膜１３６上に投影された入射光１１７のビーム幅Ｄ・cosθは、好ましく試料領域１３５ａ〜ｄのすべてを覆う領域の幅（図２ｄ中のＷ）よりも小さい。すなわちＤ＜Ｗ／cosθでよい。このような幅の小さなビームを入射光１１７として用いても、上記の配置と手続きによれば各試料領域１３５ａ〜ｄのすべてに光を照射して反射光強度から反射率を測定することができる。これによって、測定に必要なビームの幅を小さくでき、ひいては用いる光学素子の口径を小さくすることができる。【００２４】
なお、ここで入射光１１７のビーム幅とは、主に入射光１１７と反射光１１９を含む平面による、入射光１１７のビームの断面の幅（図２ｄ中のＤ）を指す。【００２５】
また、この時、好ましい実施形態では、入射光１１７のビーム幅は、同時点で一度に測定される試料領域、例えば図２ｄにおける試料領域１３５ａ〜ｄの各々の幅Ｗ1〜Ｗ4の合計ΣＷiよりも大きく、Ｄ≧（ΣＷi）／ｃｏｓθでよい。これによって、一度に測定される試料領域１３５ａ〜ｄの全てに光を照射し、同時点に一度に反射光強度から各反射率を測定することができる。また、同様な実施形態の別の例では、試料領域１３５ａ，ｂをある時点に、また試料領域１３５ｃ，ｄを別の同時点に、それぞれ一度に測定する。この場合、入射光１１７の投影されたビーム幅Ｄ・ｃｏｓθはＷより小さく、Ｗ1+Ｗ2以上かつＷ3+Ｗ4以上であればよい。すなわち、Ｄ＜Ｗ／cosθかつ、Ｄ≧（Ｗ1＋Ｗ2）／cosθかつＤ≧（Ｗ1＋Ｗ2）／cosθでよい。  本実施例では、光源１１１としてＬＥＤ光源（波長６４０ｎｍ）を、光ファイバ１１２として石英コアファイバ（コア径６００μｍ、ＮＡ０．２２）を、集光レンズ１１３として球面アクロマティクレンズ（外径５０ｍｍ、焦点距離２５ｍｍ）を、偏光素子１１４として偏光フィルタ（適応波長４００〜７００ｎｍ）を、結像レンズ１１５として対物テレセントリックレンズ（倍率５倍）を、イメージセンサ１１６として１／２型ＣＭＯＳカメラ（有効画素数１２８０×１０２４（１３０万画素）、画素サイズ５．２μｍ）を、それぞれ用いた。集光レンズ１１３通過後の励起光１１７のスポット径はφ１０ｍｍである。本実施例では、光源１１１として波長６４０ｎｍのＬＥＤを用いたが、異なる波長の電磁波を発振する装置を用いても良い。選択できる波長の範囲は、例えば３００ｎｍ〜３００μｍである。ＬＥＤの他に、固体レーザやガスレーザ、半導体レーザなどが使用可能である。また、複数波長を発振する１つの光源１１１から、所望の波長成分をバンドパスフィルタ等によって取り出しても良い。光源１１１は、例えばキセノンランプなどである。本実施例では、偏光素子１１４として市販の偏光フィルタを用いたが、例えば偏光ビームスプリッターや、グラントムソンプリズムなど、同様の機能を有する部品が使用可能である。【００２６】
本実施例では、結像レンズとして対物テレセントリックレンズを用いたが、市販のマシンビジョンレンズ、ズームレンズ等が使用可能である。結像レンズの種類を交換することで、用途に合わせて低倍率〜高倍率の観察が可能となる。【００２７】
（送液部の構造説明）
次に、送液部１０６について説明する。送液部１０６は、試薬リザーバ１２３〜１２５、送液用チューブ１２６〜１２７、切り替えバルブ１２８〜１２９、送液ポンプ１３０、廃液タンク１３１によって構成される。各試薬リザーバ１２３〜１２５には送液チューブが接続され、切り替えバルブ１２８〜１２９を介して送液チューブ１２６に統合される。送液チューブ１２６は、フローセル１０４の開口部（導入用）に接続される。フローセル１０４には別の開口部（排出用）が設けられており、こちらにも別の送液チューブ１２７が接続される。送液チューブ１２７の末端部分は廃液タンク１３１に繋がっている。また、送液チューブ１２７には送液ポンプ１３０が取り付けられ、試薬リザーバ１２３〜１２５からフローセル１０４への液の移動を行う。リザーバ１２３〜１２５からフローセル１０４に送られる試薬の種類、液量、送液速度、送液のタイミング等は、制御ＰＣ１０８の送液系制御部１２０が、切り替えバルブ１２８〜１２９と送液ポンプ１３０に対して動作指示を出すことによって行われる。【００２８】
本実施例では、リザーバ１２３には測定試料を、リザーバ１２４には反応試薬を、リザーバ１２５にはバッファーをそれぞれ満たす。また本実施例では、送液チューブ１２６〜１２７としてＴＹＧＯＮ  Ｒ−３６０３（内径０．８ｍｍ、サンゴバン製）を、切り替えバルブ１２８〜１２９として３方ソレノイドバルブを、送液ポンプ１３０としてペリスタルティックポンプ（最大圧力０．１ＭＰａ）をそれぞれ用いた。なお個々の部品類はこの限りではなく、例えば切り替えバルブとして６方切り替えバルブを用いることで、部品点数を低減することができる。また、送液ポンプ１３０として、シリンジポンプ等の別の送液手段が選択可能である。【００２９】
（フローセルの構造説明）
フローセル１０４およびプリズム１０５ｃを保持する機構の構成を図４に示す。フローセル１０４は基板２０１、流路部品２０２からなる。フローセル１０４とプリズム１０５ｃは、ホルダ２０３によって保持される。基板２０１は、一般的なＳＰＲ基板同様、ガラス基板の測定試料を固定するための観察面（おもて面・図４における上側）に金の薄膜を形成することによって作製される。流路部品２０２には、表面に流路パターンとしての溝２０４が形成されている。前記基板２０１の金薄膜面と流路部品２０２の溝側平面とを密着させることによって、フローセル１０４として機能する。ホルダ２０３には、送液用チューブ１２６〜１２７を通すための開口部２０９〜２１０が設けられている。送液用チューブ１２６〜１２７はホルダの開口部２０９〜２１０を通り、それぞれ流路部品２０２上の開口部２０７〜２０８に接続される。またホルダ２０３には、温調されたＣＯ２ガス用配管２１１を通すための開口部２１２が設けられている。流路部品２０２として使用するＰＤＭＳは高いガス交換機能を有しており、基板２０１表面の温度およびＣＯ２濃度を一定に保つことが可能である。本実施例では、細胞が最も活発となるよう、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に調節されている。なお、ホルダ２０３には視野の移動やピント調整のための直動ガイドが取り付けられているが、図１では省略した。【００３０】
本実施例で用いた基板２０１の材質はＯｈａｒａ社製Ｓ−ＬＡＬ１０、形状は縦横２０×２０ｍｍ、厚さ１．０ｍｍの板状である。また表面に形成した金薄膜の厚みは５０ｎｍである。なお、ガラス基板と金薄膜の間には、厚み１ｎｍのクロムが接着層として存在する。また、本実施例で用いた流路部品２０２の材質はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で、形状は縦横１８ｍｍ、厚さ５ｍｍの板状である。溝２０４のサイズは幅２ｍｍ、深さ１ｍｍ、長さ１０ｍｍである。溝２０４の両端からは溝２０４と反対側の面まで伸びる垂直の流路２０５〜２０６が存在し、それぞれの末端には開口部２０７〜２０８が設けられている。また、本実施例で用いたプリズム１０５ｃの材質は基板２０１と同じＯｈａｒａ社製Ｓ−ＬＡＬ１０で、形状は一辺２０ｍｍの正三角形を底面とした高さ２０ｍｍの三角柱状である。基板２０１とプリズム１０５ｃ側面（正方形の面）との間には図示されないマッチングオイルによって光学的に接している。本実施例では、マッチングオイルとしてカーギル標準屈折液（屈折率１．７２）を用いている。【００３１】
基板２０１表面には測定試料の固定を促進するための処理がなされていても良い。例えば、ポリーL−リジンや、測定試料に応じた各種抗体などによって処理されていても構わない。その他、基板２０１表面に微小な凹凸などを設けることで、測定試料を保持しやすくすることも可能である。【００３２】
本実施例では基板２０１にＰＤＭＳ流路２０２を貼りつけたが、例えば薄いシート状のＰＤＭＳに流路パターンが形成されたものを、基板２０１およびカバーガラス等の部材で挟むような構造としても良い。【００３３】
フローセル１０４の溝２０４は複数本設けられていて良い。溝２０４の本数や幅、溝２０４同士の間隔等に制限は無いが、測定領域１１８が複数の溝２０４の一部または全部をカバーしており、かつ溝２０４同士がイメージセンサ１１６上で分離可能な条件で結像される条件であることが望ましい。【００３４】
本実施例ではプリズム１０５ｃと基板２０１の材料としてＳ−ＬＡＬ１０を用いたが、これらは光学的に透明であればどのような材料であっても良く、例えばガラス、サファイア、石英、アクリル樹脂などが使用可能である。またプリズム１０５ｃと基板２０１の材料については、両者間の光の移動の際に界面での反射を防ぐために同じ材質であることが望ましいが、界面で全反射しない条件であれば、異なる材質の組み合わせであっても構わない。プリズム１０５ｃの形状は三角プリズムに限らず、台形や四角形など別の形状としても良い。例えば半円柱状プリズムを用いれば、励起光１１７は入射角によらずプリズム１０５ｃに対して常に垂直に入射するようになり、反射による損失を最小限に抑えることができる。【００３５】
本実施例では金薄膜を形成した基板２０１を用いたが、プリズム１０５ｃ表面に直接金薄膜が形成し、そこで解析を行っても良い。基板２０１とプリズム１０５ｃを一体化することで、両者の界面における光の反射損失を低減できる。また部品点数が低減し、マッチングオイルが不要となるため、操作性が向上する。【００３６】
本実施例ではホルダ２０３内に温風を導入することで基板２０１表面を温調しているが、装置１０１全体を温調しても良い。また、例えばペルチェ素子などの温調部品を直接または間接的にプリズム１０５ｃ側面に接触させてもよい。またプリズム１０５ｃの側面にＩＴＯ等の導電性薄膜を形成し、通電することによって温調してもよい。【００３７】
本実施例ではホルダ２０３内のＣＯ２濃度を制御しているが、装置１０１全体のＣＯ２濃度を制御しても良い。【００３８】
（装置動作のフローチャート）
本実施例による一連の観察プロセスについて、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）の刺激に対する、ラット好塩基球由来の細胞株であるＲＢＬ−２Ｈ３細胞の応答機能の測定を例に説明する。【００３９】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞はその表面のＩｇＥ受容体が、受容体に結合したＩｇＥを介して抗原と結合することで活性化する。すると、細胞内のヒスタミンやタンパク質分解酵素などを含む顆粒を放出（脱顆粒）する。これがＩ型アレルギーの発症に重要な役割を果たすとされている。この、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の抗原刺激への応答現象は、アレルギー反応の評価方法として広く用いられている。例えば、食品や薬剤、環境中の物質（花粉やハウスダストなど）を抗原（反応試薬）とし、物質の抗原性（アレルギー反応を引き起こすか否か）を評価できる。または、抗原の他に加える物質の抗アレルギー効果を評価してもよい。すなわち、既に応答が見られることが分かっている細胞と抗原の組合せ、例えば（以下に述べるような）抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体で感作したＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原を用いた上で、ここにさらに被験物質を加えることで応答が抑制されるか、または増強されるか、否かを測定すればよい。【００４０】
図５は、本発明による観察のフローチャートである。以下、本発明による細胞機能観察方法について、図１〜６を用いて説明する。【００４１】
工程開始前に、測定試料や反応試薬等を準備する。まず、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔ/ｍＬ ペニシリン，１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地で培養（５％ＣＯ２、３７℃）した。次に細胞培養用ディッシュ（ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ、セルシード社）中で、５０ｎｇ/ｍＬのマウスモノクローナル抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体（Ｓｉｇｍａ社）を加えた培養液により２４時間培養（５％ＣＯ２、３７℃）することによって細胞を感作させた．その後，感作した細胞をＳｉｒａｇａｎｉａｎバッファー（１１９ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ，２５ｍＭ  ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ‘−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ），４０ｍＭ  ＮａＯＨ，ｐＨ７．２）中に濃度１×１０＾６個／ｍＬとなるよう再懸濁し、測定に用いる測定試料とした。装置にセットする前に、１０分間の予備加温（５％ＣＯ２、３７℃）を施した。反応試薬としては、５０ｎｇ/ｍＬ  ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原液を用いた。バッファーとしては、Ｓｉｒａｇａｎｉａｎバッファーを用いた。【００４２】
以上の手順によって調整した各種試薬および、フローセル１０４を装置１０１にセットした。なお、基板ホルダ２０３内部は予め温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に制御されている。【００４３】
工程Ｐ１で、入射角の調整を行う。送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４にバッファーを送った後、ポンプ１３０を停止し、フローセル１０４内部をバッファーで充填する。本実施例では、送液量５００μＬ、送液速度１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で送液を行った。バッファー充填後、光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、励起光１１７の入射角を連続的に変化させながらＳＰＲ観察を行う。本実施例では、入射角４５〜７０°の範囲を０．５°間隔で連続的変化させながら画像を取得した。イメージセンサ１１６の露光時間０．１秒である。画像データは制御ＰＣ１０８に逐次送信され、解析部１２１は送られた画像から反射光１１９の信号強度の解析を行う。本実施例では反射光１１９の強度として、バッファーが存在する領域の信号強度の和を、画素数で平均した値を用いた。解析部１２１は、励起光１１７の入射角をＸ軸、反射光１１９の信号強度をＹ軸としてプロットを作成し、極小値を示す点を後述の応答観察における入射角とする。本実施例では、入射角は５７．５°であった。【００４４】
工程Ｐ２で、観察時の細胞固定量の目標値を設定する。細胞固定量の目標値は、作業者が直接入力する。または、作業者が予め装置１０１に記録されている条件（例えば「高倍率観察」など）を選択することによって自動的に設定される。【００４５】
なお、細胞を１個単位で観察する場合、観察視野内にある程度の細胞が存在し、かつ細胞同士が重ならずに固定されている状態が望ましい。本実施例では、細胞固定量の指標として平均細胞密度を採用した。以下に、平均細胞密度の目標値を設定するための計算方法について説明する。【００４６】
細胞が基板上にランダムに固定されるものと仮定すると、平均細胞密度δのとき、面積ｓの範囲にｘ個の細胞が存在する確率Ｂ（ｘ）は、ポアソン分布に従って以下の式（５）で表わすことができる。
〔数１〕
Ｂ（ｘ）＝（ｓδ）ｘ／ｘ！ｅｘｐ（−ｓδ）      ・・・式（５）
面積ｓは、ある細胞を中心とした半径ｒの範囲（ｓ＝πｒ2）である。この範囲内に別の細胞が存在しない確率Ｂ（０）は以下の式（６）で表わすことができる。
〔数２〕
Ｂ（０）＝ｅｘｐ（−ｓδ）＝ｅｘｐ（−πｒ＾２δ）      ・・・式（６）
細胞が円形の場合、面積ｓを細胞の面積とすれば、Ｂ（０）は「細胞同士が重ならずに存在する確率」であると言える。このときのｒは、２個の細胞が接するときのそれぞれの細胞の中心間距離（細胞の直径）に等しい。平均細胞密度δとＢ（０）の関係は、以下の式（７）によって与えられる。
〔数３〕
δ＝−｛ｌｏｇＢ（０)｝／（πｒ＾２）      ・・・式（７）
例えば、直径１０μｍの細胞を用いて、５０％以上の細胞が重ならずに存在する条件を満たす平均細胞密度δは、式（７）をδについて解くことで得られる（式（８））。
〔数４〕
δ≦−｛ｌｏｇ０．５｝／（πｒ＾２）≦２２０６個／ｍｍ＾２      ・・・式（８）
平均細胞密度の目標値を２２０６個／ｍｍ2以下に設定することで、視野内において重なりの無い細胞の数が過半数となる。すなわち、重なりの無い細胞を選別するための作業量を低減することができ、解析の効率が向上する。好ましい平均細胞密度δは３３５個／ｍｍ2以下であり、このとき９０％の細胞が重ならずに存在する条件を満たす。より好ましい平均細胞密度δは１６３個／ｍｍ2であり、このとき９５％の細胞が重ならずに存在する条件を満たす。なお、前記条件において、視野内の重なりの無い細胞の数は、それぞれ４２７個、２１９個である。【００４７】
一方、平均細胞密度の目標値を３３５個／ｍｍ2以上に設定すると、重なりのある細胞の割合が１０％を超えるため、重なりの無い細胞の選別に時間を要するが、より多くの細胞を観察することが可能である。すなわち、観察する細胞の絶対数を大きくすることで、ばらつきの少ない解析結果を得ることができる。好ましい平均細胞密度は１１３５個／ｍｍ2以上であり、視野内の重なりの無い細胞の数は１１２６個である。より好ましい平均細胞密度は２２０６個／ｍｍ2以上であり、視野内の重なりの無い細胞の数は１５６３個である。なお平均細胞密度が３１８２個／ｍｍ2を超えると視野内の重なりの無い細胞の数は減少し、重なりのある細胞が多数を占める。このため、主に重なりのある細胞を観察する用途などにおいては、平均細胞密度が３１８２個／ｍｍ2以上であることが好ましい。【００４８】
以上の計算方法により、作業者は観察の用途に合わせ、最適な平均細胞密度を設定することが可能である。例えば、作業者にテキストボックス等から、希望する重なりのない細胞の割合（例えば９０％）を入力させ、これから適する平均細胞密度を算出し、目標値として設定してもよい。本実施例では、視野内に十分な数の細胞が存在し、かつ大部分の細胞が重ならない条件として、平均細胞密度の設定値を１００個/ｍｍ2とした。【００４９】
工程Ｐ３で、基板２０１表面に細胞を固定する。送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４に測定試料を送った後、ポンプを１３０停止し、フローセル１０４内部を測定試料で充填する。本実施例では、送液量５００μＬ、送液速度１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で送液を行った。【００５０】
工程Ｐ４で、基板２０１表面に付着した細胞数のモニタリングを行う。光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、本工程開始から一定時間経過後に画像を取得し、制御ＰＣ１０８に画像データを送る。本実施例では、工程開始後１０分で画像を取得するよう設定した。解析部１２１は画像を解析し、そのときの細胞の固定量を計算する。【００５１】
本実施例では、まず測定試料が存在する領域の画像データを切り出し、切り出した画像を二値化し、粒子数解析を行うことで細胞数を求め、切り出した画像データのピクセル数から面積を求め、細胞数を面積で除することによって細胞密度を計算した。そのほか、面積から計算する方法（バックグラウンド以外のピクセル数をカウントし、予め求めておいた細胞１個に相当するピクセル数で除することによって細胞数を求める）など、種々の方法によって計算が可能である。密度の計算を行わず、細胞数のみを固定量として用いても良い。また、固定量の指標として、細胞間の距離を用いてもよい。例えば、取得した画像から細胞同士の距離、例えば中心間距離または細胞同士の輪郭間の距離を算出し、全ての細胞間の距離の最大値、最小値、平均値、中央値などを固定量の指標として、制御してもよい。【００５２】
工程Ｐ５で、細胞固定量の判定を行う。解析部１２１は、工程Ｐ４で算出した固定量と、工程Ｐ２で設定した目標値を比較し、その結果に応じて送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示を出す。固定量と目標値の比較方法としては、値の大小、両者の差が基準値より大きいか否か、両者の比が基準値より大きいか否か、などを用いてよい。または、当該時点一点の固定量だけでなく、経時変化を用いてもよい。例えば、ある時点での微分値や、ある時間帯での平均的な増減量や増減率、積算値、積分値などを用いてもよい。比較に用いる際の基準値等のパラメータは、装置の製造や調整、設定時にあらかじめ設定しておいてもよく、解析フローの途中、例えば工程Ｐ２の固定量の目標値の設定時に併せて、ＧＵＩやコマンドラインから作業者に入力させたり、設定ファイル等から読み込んだりしてもよい。解析部１２１は、これらの比較方法を用いて、未だ固定量の調整の必要があるか、または固定量の調整が不要なので、次の工程Ｐ６へ進めばよいかを判定する。【００５３】
例えば、固定量が工程Ｐ２で設定した目標値に達していなかった場合、固定量を調整する必要があるため、解析部１２１は必要な処理を送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示し、再度工程Ｐ４に進む。指示の内容としては、例えば、単に一定時間待機する指示を出すことで、固定反応の進行を促してもよい。また、固定反応を促進するような条件、温度、液の撹拌、流速、その他の物理的な条件の変更を指示してもよい。または、工程Ｐ３の固定反応に進んでもよい。または、これらの指示を組み合わせたり、適宜これらのうちから選択したりしてもよい。【００５４】
例えば、固定量が工程Ｐ２で設定した目標値に達していた場合、固定量の調整が不要であるため工程６に進むが、必要に応じて固定反応停止のための処理を行う。具体的には、送液系制御部１２０がポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４にバッファーを送り、フローセル１０４内部の測定試料をバッファーに置換する。本実施例では、送液量５００μＬ、１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で送液を行った。固定反応の停止処理は本方法に限らず、各種の方法を用いることができる。固定反応を阻害もしくは停止するような薬剤を添加しても良い。温度やｐＨなどその他の物理条件を変えても良い。【００５５】
工程Ｐ６で、応答観察を行う。光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、一定の時間間隔で連続的に画像を取得する（タイムラプス撮影）。本実施例では露光時間０．１秒、撮影間隔を１０秒とした。撮影した画像データは制御ＰＣ１０８に逐次送信され、解析部１２１は送られた画像から反射光１１９の信号強度の解析を行う。本実施例では反射光１１９の信号強度として、バッファーが存在する領域の全画素の信号強度を平均した値を用いて解析を行ったが、例えば流路部品を含む全ての領域の全画素を用いて計算しても良い。また、１つ以上の任意の領域に限定して解析を行っても良い。解析部１２１は、経過時間をＸ軸、反射光の信号強度をＹ軸としてプロットを作成し、リアルタイムでモニタ１０９に表示する。【００５６】
タイムラプス撮影開始から一定時間経過後に、細胞に対し刺激物質を含む反応試薬を接触させる。送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４に反応試薬を送った後、ポンプ１３０を停止し、フローセル１０４内部を反応試薬で充填する。本実施例では、開始から６０秒経過後に、送液量５００μＬ、送液速度１．６μＬ/秒（１００μＬ/分）で反応試薬の送液を行った。【００５７】
反応試薬充填から一定時間経過後に、タイムラプス撮影を終了する。光学系制御部１２２は照射部１０２と検出部１０３を操作して、照射部１０２および検出部１０３の動作を停止し、測定が完了した旨をモニタ１０９に表示し作業者に告知する。本実施例では、反応試薬充填から１８００秒経過後に、タイムラプス撮影を終了した。【００５８】
最後に、送液系制御部１２０はポンプ１３０およびバルブ１２８〜１２９を操作してフローセル１０４にバッファーを送り、送液チューブ１２６〜１２７およびフローセル１０４内をバッファーで洗浄した後、ポンプ１３０を停止する。本実施例では、送液量４０００μＬ、送液速度３．２μＬ/秒（２００μＬ/分）で送液を行った。なお、バッファーによる洗浄前に、トリプシンを含む溶液を送液してもよい。前記プロセスを追加することで基板２０１表面に付着した細胞が脱落し、基板２０１表面が測定前の状態に戻るため、基板２０１を交換することなく繰り返し測定することが可能である。【００５９】
工程Ｐ５の内部または前後にタイムアウトエラーの判定を含んでもよい。この判定のタイミングは、例えば、固定量と目標値の比較の前または後でよく、または、固定反応の調整のための処理を送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示する前や後、または、固定反応の停止処理を送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に指示する前や後でもよい。タイムアウトエラーの判定基準は、所定の時間を超過した場合や所定の回数を超過した場合でよい。ここで回数とは固定量と目標値の比較、固定量の算出、固定量調整の実行や指示、などの回数を用いてよい。また、時間とは、測定試料の固定反応の開始時点、装置準備、測定試料や反応試薬等の設置や調製時から起算した経過時間を用いてよい。また、ここに挙げた複数の判定基準を組み合わせても良い。また、作業者に、これらの判定基準のいずれを採用するか、または判定を実施しないかを選択させてもよく、選択のタイミングは解析フローの開始前でも開始後（終了前）でもよい。タイムアウトエラーと判定された後の動作としては、解析フローの一時停止や中止、タイムアウトエラー時用の特殊な固定量調整、強制的な工程Ｐ６への移行、などを用いてよく、解析部１２１は送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に対し、適宜これらに必要な動作内容を指示する。解析フローを一時停止した場合は、例えば解析部１２１はその旨をモニタ１０８や音声等を介して作業者に告知し、作業者に次の動作の指示を促し、指示の手段をＧＵＩ、ＣＵＩ、ジェスチャ、音声等を介して提供してよい。動作の選択肢としては、フローの再開、フローの中止や、タイムアウトエラー時用の特殊な固定量調整、強制的な工程Ｐ６への移行、などを含んでよい。装置１０１は、作業者がフローの再開を選ぶ場合に、再開前に測定試料や反応試薬、各種設定値や装置設定を変更できる仕様であっても良い。フローの中止が選択された際は、解析部１２１は、必要に応じて送液系制御部１２０と光学系制御部１２２のいずれかもしくは両方に終了処理を指示してよい。【００６０】
なお、工程Ｐ２の目標値の設定は、工程Ｐ５以前であればよい。工程Ｐ２の目標値の設定は、好ましくは、工程Ｐ１の装置準備のあと、工程Ｐ３の固定反応開始の前である。この場合、例えば、まず実験開始時に測定試料や反応試薬類、装置を準備した後、実験条件としてある固定量の目標値を設定、解析を実施して得られた結果について考察を加え、その考察に基づいて新たな実験条件として固定量の目標値を修正して解析する、というような実験の進め方において、装置準備をやり直す必要がないため実験を効率的に進めることが可能になる。または、工程Ｐ２の目標値の設定を、工程Ｐ１の装置準備の前に実施してもよく、この場合には、ある固定量の目標値を設定した後、装置準備をして解析を進めた結果を見て設定を変更したり、各種試薬を交換、再調製して、改めて解析を実施する、という実験において、目標値設定をやり直す必要がないため、実験を効率的に進めることが可能になる。このようなケースとして、実験結果から、測定試料や反応試薬の不備が推測された場合や、実際に得られた固定量と目標値のかい離（誤差）が期待より大きかった場合や、タイムアウトエラー等で目標とする固定量が得られなかった場合、所望の固定量に到達するまでの時間が想定よりも長くかかりすぎて測定試料や解析結果に悪影響が認められた場合、などが挙げられる。【００６１】
以上の手段を用いて測定したＲＢＬ−２Ｈ３細胞の抗原応答反応の結果を図６に示す。測定開始から６０秒後に反応試薬の送液を開始し、その約５０秒後から、細胞の応答に伴うＳＰＲ反射光強度の上昇が確認することができた。
【実施例２】
【００６２】
図７に送液部１０６にピペッタ機構５０４を用い、フローセル１０４の代わりにウェル基板６０１を用いた例を示す。その他の構成は実施例１と同等である。ここでピペッタ機構とは、液体を指定した容積だけ吐出できるものである。吐出前に別個の液体リザーバから吸引した液体を吐出する方式や、ピペッタ機構に直結されたリザーバに予め液体を満たしておき必要に応じて断続的に吐出する方式などを用いてよい。【００６３】
（構造の説明）
本実施例の送液部１０６は、試薬リザーバ５０１〜５０３とピペッタ機構５０４からなる。ピペッタ機構５０４は、ノズル５０５、ロボットアーム５０６、配管５０７、シリンジポンプ５０８、送液ポンプ５０９、切り替えバルブ５１０、水タンク５１１、洗浄槽５１２、廃液タンク５１３からなる。【００６４】
ノズル５０５はロボットアーム５０６によって保持され、必要に応じて、ウェル基板６０１、試薬リザーバ５０１〜５０３、洗浄槽５１２、廃液タンク５１３などへ移動できる。ノズル５０５は配管５０７を介してシリンジポンプ５０８に接続されており、試薬リザーバ５０１〜５０３やウェル基板６０１などから指定容積の液体を吸引または吐出可能である。試薬リザーバ５０１〜５０３やウェル基板６０１などから吸引された不要な液体は、廃液タンク５０３へと吐出される。シリンジポンプ５０８には、送液ポンプ５０９が接続されており、水タンク５１１の水を充填できる。また、ノズル５０５を廃液タンク５１３に移動した上で、送液ポンプ５０９からシリンジポンプ５０８、ノズル５０５を介して水を吐出することで、流路内やノズル５０５内部を洗浄し、コンタミネーションや吸引吐出される液体のキャリーオーバーを防止、低減できる。さらに、ノズル５０５を洗浄槽５１２へ移動した上で、切り替えバルブ５１０を切り替えて、水を洗浄槽５１０に吐出し、ノズル５０５に水をかけることで、ノズル５０５の外側も洗浄可能であり、同じくコンタミネーションや吸引吐出される液体のキャリーオーバーを防止、低減できる。これらの動作は、本図では省略された送液系制御部からロボットアーム５０６、シリンジポンプ５０８、送液ポンプ５０９、切り替えバルブ５１０に動作指示が送られることによって行われる。【００６５】
ウェル基板６０１の構成図を図８に示す。ウェル基板６０１は、ウェル部品６０２、基板２０１、プリズム１０５ｃおよびこれらを一体に保持するためのホルダ６０３によって構成される。基板２０１、プリズム１０５ｃに関しては、基本的に実施例１と同様の構成を用いることができる。ウェル部品６０２は、１つ以上の液体保持サイト６０４を備える。ウェル部品６０２を基板６０１上に設置することで、前記の液体保持サイト６０４と基板２０１とで、１つ以上のウェル６０５を形成する。ホルダ６０３には、ノズル５０５を通すための開口部６０６が設けられている。開口部６０６にはセプタ６０７が設置されている。ノズル５０５は開口部６０６のセプタ６０７を貫通し、ウェル基板６０１上のウェル６０５に到達する。またホルダ６０３には、温調されたＣＯ２ガス用配管２１１を通すための開口部６０８が設けられている。これにより、ウェル基板６０１表面の温度およびＣＯ２濃度を一定に保つことが可能である。本実施例では、細胞が最も活発となるよう、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％に調節されている。なお、ホルダ６０３には視野の移動やピント調整のための直動ガイドが取り付けられているが、図８では省略した。【００６６】
１つのウェル基板６０１に複数のウェル６０５が存在する場合、一度のウェル基板６０１のセットアップで、複数条件での相互作用解析が可能となる効果がある。特に、照射部１０２および検出部１０３を含む光学系により、複数のウェル６０５を全時間帯または一時的に同時並行して観察可能である場合、複数条件を同時並行的に解析可能になる。各ウェル６０５は、その中または上に液体を保持し、ウェル６０５間の液が意図せず混ざったり移動したりすることを防ぐ機能をもつ。また、各ウェル６０５は、保持される液体を導入可能な開口部を少なくとも１つずつ持つ。ウェル部品６０２としては、このような機能を持つ各種の構造を用いてよい。各ウェル６０５に保持できる液体の量は、用途に応じて適宜変更可能であるが、好ましくは１ｎＬ〜１ｍＬ、より好ましくは１０ｎＬ〜１００μＬ、より好ましくは１００ｎＬ〜１０μＬである。【００６７】
ウェル部品６０２の別の形態としては、液体保持サイト６０４として貫通穴をもつ厚みを持った板状部材、液体保持サイト６０４として液を囲む壁面を持つ（例えば、マルチウェルプレートの底面をくり抜いたような）部材、保持する液体に対してはっ水性を示すシート状部材に液体保持サイト６０４として貫通穴を設けたシート状部材、または基板２０１表面に施される保持する液体に対してはっ水性や親水性を示す表面処理（および処理によって表面に導入される官能基や分子・原子の配列等）で液体保持サイト６０４として機能するパターンを持つものなどを用いることができる。前記のパターンとして例えば、各液体保持サイト６０４以外ははっ水性表面処理され、各液体保持サイト６０４内は未処理であるパターンや、比較的にはっ水性の基板２０１の表面上に各液体保持サイト６０４の外周だけ親水性表面処理を施したパターン、等を用いることができる。また、ウェル部品６０２の別の例としては、フローセル状の部材で、流路の末端もしくは途中に開口部が設けられたものを用いてもよい。この場合、液体の導入は、液を開口部に滴下したり、ノズル５０５を開口部に差し込んだ上で注入してもよい。各ウェル６０５の液体がウェル部品６０２内部に半ば閉じ込められており、雰囲気に直接触れる表面積が小さくなるため、液体が蒸発しにくく、より正確な解析を実現しやすいという効果がある。【００６８】
以上の様なピペッタ機構５０４を用いた場合、異なる測定試料や反応試薬が共通して触れる部分はノズル５０５のみ、またはノズル５０５近傍の配管５０４のみとなるため、キャリーオーバーを防止、低減する効果がある。【００６９】
その他、プリズム１０５ｃおよび基板２０１の材料や構造、温度およびＣＯ２濃度の制御方法などについては、実施例１に記載したとおり種々の方法が使用可能である。【００７０】
（動作の概要）
ピペッタ機構５０４とウェル基板６０１の組合せを用いたときの実際の解析例について説明する。ここで解析対象は、実施例１と同じく、ラット好塩基球由来の細胞株であるＲＢＬ−２Ｈ３細胞を測定試料、ＤＮＰ−ＨＳＡ抗原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を反応試薬として、細胞の抗原刺激への応答機能の測定を行った。試薬リザーバ５０１には測定試料を、試薬リザーバ５０２には反応試薬を、試薬リザーバ５０３にはバッファーを、それぞれ満たした。ウェル部品６０２として、板状のＰＤＭＳ（縦横１９×１９ｍｍ、厚み５ｍｍ）に、貫通穴（φ４ｍｍ）を開けたものを用い、実施例１と同じく金薄膜を設けた基板２０１の上面（金薄膜の存在する面）側に密着するよう、ホルダ６０３で保持した。【００７１】
なお、基本的な動作のフローチャートは、実施例１に示したものと同じものを用いることができるため、ここでは実施例１と異なる部分についてのみ、図５を引用しながら説明する。また、全ての動作は、実施例１で示した制御ＰＣ１０８内の送液系制御部１２０および光学系制御部１２２の指示に従って行われる。【００７２】
工程Ｐ１においてウェル６０５にバッファーを充填し、入射角の調整を行う。ノズル５０５は試薬リザーバ５０３に移動し、バッファーを吸引した後、ウェル基板６０１に移動し、ウェル６０５にバッファーを吐出する。本工程に用いたバッファーの液量は１０μＬである。バッファー吐出後、ノズル５０５は廃液タンク５１３に移動し、少量の水を吐出することにより、内部の洗浄を行う。その後ノズル５０５は洗浄槽５１２に移動し、外部を洗浄する。以上の動作の後、実施例１に示す手法により、入射角を調整する。なおウェル基板６０１に複数個のウェル６０５が存在している場合、特定の一箇所のみにバッファーを充填し、その領域のＳＰＲ反射光強度を測定することによって、入射角の調整が可能である。入射角の調整が完了後、ノズル５０５はウェル基板６０１に移動し、バッファーを吸引し、廃液タンク５１３に吐出する。その後、先程と同様の手順で洗浄動作を行う。【００７３】
工程Ｐ３において、測定試料の固定反応を行う。反応は、工程Ｐ１と同様の手順で測定試料をウェル６０５に吐出し、そのまま待機することでなされる。本工程に用いた測定試料の液量は１０μＬである。待機中、細胞が重力によってウェル６０５の底に沈む。ウェルの底には金薄膜が露出しており、細胞は生来の性質により金薄膜表面に接着する。その他、測定試料を吸引し、ウェル６０５に吐出した後に、図示されない別のリザーバから固定反応を開始または促進する別の薬剤を吸引し、同じウェル６０５に追加して吐出してもよい。【００７４】
工程Ｐ５の固定量判定において、固定量が目標値未満であった場合には、ウェル６０５から測定試料を５μＬ吸引し、廃液タンク５１３に廃棄した上で、試薬リザーバ５０１から測定試料５μＬを吸引し、ウェル６０５に吐出した。【００７５】
固定量が目標値以上であった場合には、まずウェル６０５から測定試料を５μＬ吸引し、廃液タンク５１３に廃棄した。試薬リザーバ５０３からバッファー１０μＬを吸引し、ウェル６０５に吐出し、同ウェル６０５から１０μＬを吸引して廃液タンク５１３に廃棄した。この操作を５回繰り返し、ウェル６０５中の液から、固定していない細胞を取り除き、固定反応を停止した。この操作の繰り返し回数は、あらかじめ決めておいても、また光学系制御部１２２および解析部１２１を用いて固定反応の進行をモニタすることで、固定反応の停止が確認されるまで継続してもよい。また、この際にも、タイムアウトや上限回数の設定により、繰り返しを止める条件を設けてもよい。【００７６】
工程Ｐ６で応答観察を行う。応答観察の手順は実施例１に示すとおりである。測定試料に対する反応試薬の添加方法については、まず工程Ｐ１と同様の手順で反応試料を吸引し、測定試料が固定されバッファーが充填されたウェル６０５に添加することでなされる。【００７７】
本工程に用いた反応試薬の液量は１０μＬである。反応試薬添加後に、ノズル５０５を用いてピペッティング動作を行うことで、反応試薬の混合を促進しても良い。またはノズル５０５でウェル６０５内部のバッファーを廃棄した後、反応試薬を添加しても良い。
【符号の説明】
【００７８】
１０１      解析装置
１０２      照射部
１０３      検出部
１０４      フローセル
１０５ａ    入射光用プリズム
１０５ｂ    反射光用プリズム
１０５ｃ    入射反射光兼用プリズム
１０６      送液部
１０７      温調装置
１０８      制御ＰＣ
１０９      モニタ
１１０      ＣＯ２ガスボンベ
１１１      光源
１１２      光ファイバ
１１３      集光レンズ
１１４      偏光素子
１１５      結像レンズ
１１６      イメージセンサ
１１７      励起光
１１８      測定領域
１１８ａ，ｂ  測定領域（部分）
１１９      反射光
１２０      送液制御部
１２１      解析部
１２２      光学系制御部
１２３      試薬リザーバ
１２４      試薬リザーバ
１２５      試薬リザーバ
１２６      送液チューブ
１２７      送液チューブ
１２８      切り替えバルブ
１２９      切り替えバルブ
１３０      送液ポンプ
１３１      廃液タンク
１３２      マッチングオイル
１３３      ＳＰＲ用基板
１３４      基板裏面の反射用領域
１３５ａ〜ｄ  個々の試料領域
１３６      金属膜
１３７      部分光線束
１３８ａ〜ｄ  ダミー試料領域
１３９ａ〜ｄ  フローセルの各流路
１４０      流路部品
１４１      反射膜
１４２      凹部
１４３      空気層２０１      基板
２０２      流路部品
２０３      ホルダ
２０４      溝
２０５      垂直流路
２０６      垂直流路
２０７      開口部
２０８      開口部
２０９      開口部
２１０      開口部
２１１      ＣＯ２ガス用配管
２１２      開口部
Ｐ１        装置準備
Ｐ２        固定量の目標値設定
Ｐ３        測定試料の固定反応
Ｐ４        固定量計測
Ｐ５        固定量判定
Ｐ６        応答観察
５０１      試薬リザーバ
５０２      試薬リザーバ
５０３      試薬リザーバ
５０４      ピペッタ機構
５０５      ノズル
５０６      ロボットアーム
５０７      配管
５０８      シリンジポンプ
５０９      送液ポンプ
５１０      切り替えバルブ
５１１      水タンク
５１２      洗浄槽
５１３      廃液タンク
６０１      ウェル基板
６０２      ウェル部品
６０３      ホルダ
６０４      液体保持サイト
６０５      ウェル
６０６      開口部
６０７      セプタ
６０８      開口部
７０１      光源
７０２      光源
７０３      ダイクロイックミラー
７０４      フィルタユニット
７０５      レンズ
７０６      対物レンズ
７０７      ダイクロイックミラー
７０８      バンドパスフィルタ
７０９      バンドパスフィルタ
７１０      レンズ
７１１      レンズ
７１２      イメージセンサ
７１３      イメージセンサ
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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