(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダーと、前記マイクロピペットホルダーを保持するホルダー保持具とを備える刃先付マイクロピペット保持装置であって、
前記ホルダー保持具は、ベース部材と、前記ベース部材に回動可能に保持され、かつ、前記マイクロピペットホルダーが挿通可能な筒状回動部材とを備え、さらに、前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材の側面かつ前記筒状回動部材の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔と、前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とからなるホルダー位置調整機構を備えていることを特徴とする刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項２】
前記刃先付マイクロピペット保持装置は、前記マイクロピペットを前記マイクロピペットホルダーに装着した状態にて、前記ホルダー位置調整機構を調整することにより、前記マイクロピペットの先端部の中心軸を前記筒状回動部材の回動時におけるほぼ中心に調整可能である請求項１に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項３】
前記ホルダー位置調整機構は、前記側孔と、前記ホルダー位置調整部材を構成する雄ねじ部材と、前記側孔付近もしくは前記側孔内に形成され、前記雄ねじ部材と螺合可能な雌ねじ部とからなるものである請求項１または２に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項４】
前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材を手動にて回動させるための操作用突出部を備えている請求項１ないし３のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項５】
前記マイクロピペット保持装置は、前記筒状回動部材を非手動にて回動させるための回動手段を備えている請求項１ないし３のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項６】
前記回動手段は、モータと、前記モータの回動軸と前記筒状回動部材とを連結し、かつ、前記回動軸の回転により前記筒状回動部材を回転させる回転力伝達機構を備えている請求項５に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項７】
前記ベース部材は、基盤部と、前記基盤部より起立する２つの側板部を備え、前記筒状回動部材は、両端部に設けられたボールベアリングを備え、前記筒状回動部材は、前記ボールベアリングを介して、前記２つの側板部に固定されることにより、前記ベース部材に回動可能に保持されたものとなっている請求項１ないし６のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項８】
前記筒状回動部材は、一端側および他端側の内部に収納された２つの弾性筒状部材を備え、前記弾性筒状部材は、前記マイクロピペットホルダーに密着可能かつ挿通可能である請求項１ないし７のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項９】
前記筒状回動部材は、第１の前記ホルダー位置調整機構と、前記第１のホルダー位置調整機構と所定長離間した位置に設けられた第２のホルダー位置調整機構を備えている請求項１ないし８のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項１０】
前記ホルダー位置調整機構は、向かい合うもしくは前記筒状回動部材の中心軸に対して等角度となるように設けられた複数の前記側孔と、各前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とを備えるものである請求項１ないし９のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項１１】
前記マイクロピペット保持装置は、前記ベース部材に設けられ、マニピュレーター装置に装着するための装着部を備えている請求項１ないし１０のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項１２】
前記マイクロピペットホルダーは、筒状本体と、前記筒状本体の先端部に設けられた先端側リング状部材と、前記筒状本体の基端側に設けられた基端側リング状部材と、前記先端側リング状部材内に収納され、かつ、前記先端側リング状部材と前記筒状本体の先端により押圧される筒状弾性体とを備え、前記筒状弾性体は、前記マイクロピペットの基端部を挿通可能かつ押圧時に前記マイクロピペットの基端部を保持可能である請求項１ないし１１のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【請求項１３】
前記マイクロピペット保持装置は、顕微授精用のマイクロピペットを保持するためのものである請求項１ないし１２のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微授精などにおいて用いられるマイクロピペットを保持し、生体細胞へのマイクロピペットの刃先の刺入操作に用いられる刃先付マイクロピペット保持装置および卵子細胞質内精子注入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー分野において、顕微鏡観察下で、卵子への精子および精細胞、細胞への核、細胞質およびＤＮＡの注入（インジェクション）操作が行われている。このような操作に用いられるマイクロマニピュレーションシステムとして、例えば、特開２００５−２５８４１３（特許文献１）が提案されている。顕微鏡画像観察下にて、マイクロマニピュレータを用いて微小針（刃先付マイクロピペット）を操作することにより、被検体に対して遺伝子組み換え操作や顕微受精操作等の操作が行われる。【０００３】
顕微授精におけるＩＣＳＩ（細胞質内精子注入法）は、生殖補助技術（ＡＲＴ）として、重度の精液所見不良例などを対象として施術される。顕微授精は、精子が雌性生殖路を遡上し、卵と受精、融合するまでの全ての過程を体外で行う方法である。この体外受精によれば、射精精液中に精子が極端に少ない症例や、精液中の精子が自力で卵子に侵入する能力（受精能）に欠けた症例であっても、受精が可能となる。【０００４】
そして、ＩＣＳＩ（細胞質内精子注入法）では、卵子の内部である細胞質内に精子を直接注入することが必要であり、このためには、刃先付マイクロピペットを卵子の透明帯、卵膜を刺通し、細胞質内に到達させることが必要である。マイクロピペットの刃先による卵子の透明帯の刺通は、比較的容易に行われるが、卵膜は、マイクロピペットの刃先の当接により、変性し硬化するため、その刺通は容易なものではない。【０００５】
特開２００７−６７７５（特許文献２）には、振動型マイクロインジェクション装置が開示されている。特許文献２の振動型マイクロインジェクション装置は、マイクロピペット８に直列に接続されるとともに、圧電アクチュエータ２９が装着されるハウジングを有する振動子２８と、圧電アクチュエータ２９に印加される電気信号を調節する信号調節装置２１とを備え、圧電アクチュエータ２９に電気信号を入力することにより、ハウジングを有する振動子２８を介してマイクロピペット８の軸方向に振動を付与する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２５８４１３
【特許文献２】特開２００７−６７７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献２のものによれば、受精卵などの透明帯、細胞膜、核膜といった性質の異なる膜を貫通させる場合の刺し入れがある程度良好に行われるとのことであるが、より、簡便にかつより確実にマイクロピペットの刃先を卵子の細胞質内に刺入可能なものが望まれていた。【０００８】
本発明の目的は、刃先付マイクロピペットを卵子の透明帯、卵膜を刺通し、細胞質内に容易かつ確実に到達させることができる刃先付マイクロピペット保持装置および卵子細胞質内精子注入方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するものは、以下のものである。
生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダーと、前記マイクロピペットホルダーを保持するホルダー保持具とを備える刃先付マイクロピペット保持装置であって、
前記ホルダー保持具は、ベース部材と、前記ベース部材に回動可能に保持され、かつ、前記マイクロピペットホルダーが挿通可能な筒状回動部材とを備え、さらに、前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材の側面かつ前記筒状回動部材の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔と、前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とからなるホルダー位置調整機構を備えている刃先付マイクロピペット保持装置。【００１０】
また、上記目的を達成するものは、以下のものである。
卵子細胞質内精子注入方法であって、卵子を吸引ピペットにて保持するステップと、前吸引ピペットに保持された前記卵子に、先端に刃先を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペットの先端部を当接させるステップと、前記マイクロピペットを前進させて、前記刃先を前記卵子の透明帯を刺通させるステップと、前記刃先を前記卵子の卵膜に当接させ、前記刃先により前記卵膜を押圧するステップと、前記マイクロピペットを回転させることにより、前記刃先の刃面を回転させて、前記刃先を前記卵膜を刺通させ、前記刃先を細胞質内に進入させるマイクロピペット回転ステップと、前記マイクロピペット内の精子を前記細胞質内にて放出する精子放出ステップとを行う卵子細胞質内精子注入方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置の一実施例の正面図である。
【図２】図２は、図１に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。
【図３】図３は、図１に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大平面図である。
【図４】図４は、図１に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大右側面図である。
【図５】図５は、図２のＡ−Ａ線断面図である。
【図６】図６は、図２のＢ−Ｂ線断面図である。
【図７】図７は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置に刃先付マイクロピペットを装着した状態の部分省略正面図である。
【図８】図８は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置に用いられるマイクロピペットホルダーの先端部の拡大断面図である。
【図９】図９は、図７の刃先付マイクロピペットおよびマイクロピペットホルダの先端部の拡大断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大断面図である。
【図１１】図１１は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大断面図である。
【図１２】図１２は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大断面図である。
【図１３】図１３は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。
【図１４】図１４は、図１３に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大平面図である。
【図１５】図１５は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。
【図１６】図１６は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。
【図１７】図１７は、図１６に示した刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大平面図である。
【図１８】図１８は、図１７の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具よりホルダー保持具を取り除いた状態の拡大平面図である。
【図１９】図１９は、本発明の他の実施例の刃先付マイクロピペット保持装置のホルダー保持具部分の拡大正面図である。
【図２０】図２０は、本発明の刃先付マイクロピペット保持装置の他の実施例を説明するための説明図である。
【図２１】図２１は、本発明の卵子細胞質内精子注入方法を説明するための説明図である。
【図２２】図２２は、本発明の卵子細胞質内精子注入方法を説明するための説明図である。
【図２３】図２３は、本発明の卵子細胞質内精子注入方法を説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置を図面に示した実施例を用いて説明する。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置１は、生体細胞（例えば、卵子、核移植細胞）に刺入するための刃先付マイクロピペット１５を先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダー５と、マイクロピペットホルダー５を保持するホルダー保持具２とを備える。ホルダー保持具２は、ベース部材２０と、ベース部材２０に回動可能に保持され、かつ、筒状マイクロピペットホルダー５が挿通可能な筒状回動部材３とを備え、さらに、筒状回動部材３は、筒状回動部材３の側面かつ筒状回動部材３の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔３５と、側孔３５より、筒状回動部材３内に侵入可能かつ、挿通するマイクロピペットホルダー５の外面に当接可能なホルダー位置調整部材６２，７２とからなるホルダー位置調整機構６，７を備えている。
【００１３】
本発明のマイクロピペット保持装置１を顕微授精用のマイクロピペットを保持するためのマイクロピペット保持装置に応用した実施例を用いて説明する。
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置１は、図１ないし図６に示すように、筒状マイクロピペットホルダー５と、マイクロピペットホルダー５を保持するホルダー保持具２とを備える。
【００１４】
筒状マイクロピペットホルダー５は、図１、図７ないし図９に示すように、筒状本体５１と、筒状本体５１の先端部に設けられた先端側リング状部材５２と、筒状本体５１の基端側に設けられた基端側リング状部材５３と、先端側リング状部材５２内に収納され、かつ、先端側リング状部材５２と筒状本体５１の先端により押圧される筒状弾性体５４とを備える。
【００１５】
筒状本体５１は、マイクロピペット１５の外径より大きな内径を有する筒状体であり、先端から基端まで貫通する内腔５６を備えている。また、筒状本体５１の先端部には、先端側リング状部材５２の内面に形成された雌ねじ部と螺合可能な雄ねじ部が形成されている。筒状本体５１の先端部は、マイクロピペット１５の基端部保持部を構成している。そして、先端側リング状部材５２内に収納されている筒状弾性体５４は、マイクロピペット１５の基端部を挿通可能かつ、筒状本体５１の先端と先端側リング状部材５２の内径小径部の基端間により押圧可能なものとなっており、かつ、押圧されることにより、内径が縮径し、マイクロピペット１５の基端部に密着し、保持可能なものとなっている。
【００１６】
また、筒状本体５１の後端部には、最も基端に位置し、外径が小径となった小径基端部と、この小径基端部より先端方向に延びる雄ねじ部を備えている。そして、基端側リング状部材５３は、小径基端部の被包部と、内面に形成され、上記の雄ねじ部と螺合可能な雌ねじ部を備えている。小径基端部は、図２１に示すように、マイクロピペット１５内への吸引および吐出のための気体もしくは液体を流動させるためのチューブ２４の接続部を構成している。
【００１７】
筒状マイクロピペットホルダー５に装着される刃先付マイクロピペット１５は、筒状本体５１内と連通可能かつ先端から基端まで貫通する内部通路１９を有し、かつ、先端に刃先１８を有する中空針である。特に、図９に図示するマイクロピペット１５は、刃先１８より所定長基端側に延びる細径部１７と、細径部１７の基端から後端まで延びる本体部１６とを備えている。刃先は、中心軸に対して斜めにカットされた刃面を備えている。刃先付マイクロピペット１５としては、通常、ガラス製の透明針が用いられる。
【００１８】
この実施例のマイクロピペット保持装置１では、ホルダー保持具２は、ベース部材２０と、ベース部材２０に回動可能に保持され、かつ、筒状マイクロピペットホルダー５が挿通可能な筒状回動部材３とを備える。
【００１９】
ベース部材２０は、図２ないし図６に示すように、基盤部２１と、基盤部２１より起立する２つの側板部２２，２３と、それぞれの側板部２２，２３に固定されたボールベアリング８ａ，８ｂとを備える。基盤部２１は、矩形状に形成された板状部であり、側板部２２，２３は、向かい合うように、かつ基盤部のそれぞれの側端部より起立している。また、側板部２２，２３は、ほぼ平行かつ同じ高さとなるように形成されている。さらに、２つの側板部２２，２３は、上部に設けられた凹部２２ａ，２３ａを備える。
【００２０】
筒状回動部材３は、図１ないし図６に示すように、筒状体３１の一端に固定されたボールベアリング８ａと、他端に固定されたボールベアリング８ｂを備えている。ボールベアリング８ａ、８ｂは、図５に示すように、外側リング状部材８１と、内側リング状部材８２と、２つのリング状部材に配置された複数のボール体８３を備えている。そして、ボールベアリング８ａの内側リング状部材８２は、筒状体３１の一端に固定され、ボールベアリング８ｂの内側リング状部材８２は、筒状体３１の他端に固定されている。そして、両端にボールベアリング８ａ，８ｂを備える筒状体３１は、ボールベアリング部分にて、ベース部材２０の側板部２２，２３の凹部２２ａ，２３ａに装着されている。
【００２１】
具体的には、ボールベアリング８ａ，８ｂの外側リング状部材８１が、ベース部材２０の側板部２２，２３の凹部２２ａ，２３ａに装着されている。これにより、筒状体３１は、ベース部材２０の２つの側板部２２，２３間に回転可能に保持されたものとなっている。さらに、ボールベアリング８ａ，８ｂの外側リング状部材８１は、側板部２２，２３に設けられた凹部の内径より大きい外径を有するフランジ部を備え、そのフランジ部が、側板部２２，２３の外側側面に当接するように設けられている。このため、ボールベアリング８ａ，８ｂが装着された筒状体３１の移動を阻止している。
【００２２】
また、筒状回動部材３は、筒状体３１の側面かつ筒状体３１（筒状回動部材３）の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔３５と、側孔３５より、筒状回動部材３内に侵入可能かつ、挿通するマイクロピペットホルダー５の外面に当接可能なホルダー位置調整部材６２，７２とからなるホルダー位置調整機構６，７を備えている。
【００２３】
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置１では、このホルダー位置調整機構を備えるため、刃先付マイクロピペット１５をマイクロピペットホルダー５に装着した状態にて、ホルダー位置調整機構６，７を調整することにより、マイクロピペット１５の先端部の中心軸を筒状回動部材３の回動時におけるほぼ中心に調整することが可能となっている。このため、マイクロピペットの刃先の刃面を良好に回転させることができる。
【００２４】
この実施例のマイクロピペット保持装置１では、筒状回動部材３は、第１のホルダー位置調整機構６と、第１のホルダー位置調整機構６と所定長離間した位置に設けられた第２のホルダー位置調整機構７を備えている。このように、２つのホルダー位置調整機構６、７を設けることが好ましいが、一つであってもよい。
【００２５】
そして、ホルダー位置調整機構６は、筒状体３１の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた複数（具体的には、４つ）の側孔３５と、ホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材６２と、側孔３５付近に設けられ、雄ねじ部材６２と螺合可能な雌ねじ部６１とにより構成されている。この実施例では、４つの側孔３５は、筒状体３１の中心軸に対して、ほぼ等角度間隔（具体的には、９０度間隔）となるように形成されている。
【００２６】
そして、ホルダー位置調整機構７もホルダー位置調整機構６と同様に、筒状体３１の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた複数（具体的には、４つ）の側孔３５と、ホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材７２と、側孔３５付近に設けられ、雄ねじ部材７２と螺合可能な雌ねじ部７１とにより構成されている。この実施例では、４つの側孔３５は、筒状体３１の中心軸に対して、ほぼ等角度間隔（具体的には、９０度間隔）となるように形成されている。
【００２７】
雌ねじ部６１、７１として、ナットが用いられており、ナットは、内部の雌ねじ部が側孔３５上となるように筒状体３１の外面に配置され、固定部（具体的には、溶接部）６４，７４により、筒状体３１に固定されている。雄ねじ部６２、７２は、筒状体３１に固定された雌ねじ部（ナット）６１、７１に螺合させることにより、その先端部は、雌ねじ部（ナット）６１、７１、側孔３５を貫通し、筒状体３１の内部に到達可能なものとなっている。さらに、筒状体３１の内部に到達したホルダー位置調整部材である各雄ねじ部６２、７２は、図６に示すように、筒状体３１内を挿通したマイクロピペットホルダー５の外面と当接可能なものとなっている。
【００２８】
そして、各雄ねじ部６２、７２の筒状体３１内での突出長を調整することにより、筒状体３１内を挿通したマイクロピペットホルダー５の筒状体３１内での位置を微調整することが可能となっている。例えば、図６における上下方向に向かいあう２つの雄ねじ部６２を調整することにより、筒状体３１内におけるマイクロピペットホルダー５の上下位置を調整することができ、図６における左右方向に向かいあう２つの雄ねじ部６２を調整することにより、筒状体３１内におけるマイクロピペットホルダー５の左右位置を調整することができる。
【００２９】
そして、この実施例のマイクロピペット保持装置１では、筒状回動部材３は、筒状回動部材３を手動にて回動させるための操作用突出部４を備えている。具体的には、筒状回動部材３は、筒状体３１の側面に設けられた回動操作用突出部４を備えている。回動操作用突出部４は、その先端部４ａが、筒状体３１の側部貫通口に挿入され、固定されている。回動操作用突出部４としては、丸棒、角柱などの棒状体が好適である。そして、この回動操作用突出部４を把持することにより、筒状回動部材３（筒状体３１）を容易に回転させることができる。また、この回動操作用突出部４は、回動の進行により、ベース部材２０の基盤部２１に当接する。このため、この実施例のマイクロピペット保持装置１では、筒状回動部材３は、３６０度回転するとができないものとなっている。よって、回動操作用突出部４は、筒状回動部材３の回転角度規制部材として機能する。
【００３０】
さらに、この実施例のマイクロピペット保持装置１では、筒状回動部材３は、筒状体３１の一端側および他端側の内部に収納された２つの弾性筒状部材３３，３４を備えている。弾性筒状部材３３，３４は、マイクロピペットホルダー５に密着可能かつ挿通可能である。この弾性部材３３，３４により、マイクロピペットホルダー５は、がたつくことなく、筒状回動部材３（筒状体３１）に保持されている。また、マイクロピペットホルダー５は、筒状体３１を貫通し、両端部が、筒状体３１より突出している。これにより、ホルダー保持具２がマイクロピペットホルダー５を保持するともに、マイクロピペットホルダー５の中間部に装着された状態となっている。
【００３１】
さらに、この実施例のマイクロピペット保持装置１は、ベース部材２０に設けられ、マニピュレーター装置に装着するための装着部９を備えている。
装着部９は、棒状に形成された装着本体部９１と、ベース部材２０への装着部９３と、両者間を接続するボールジョイント部９２とを備えている。ボールジョイント部９２は、装着本体部側のボール軸受け９２ａと、装着部９３の端部に設けられたボールジョイント９３ａと、固定調整部材９２ｂにより構成されている。固定調整部材９２ｂを緩めることにより、ボールジョイント９３ａ（ベース部材２０の基盤部２１）に対する装着本体部９１の角度を変更することができ、所望の角度に装着本体部９１を変更した後、固定調整部材９２ｂを締めることにより、その状態を維持することが可能である。
【００３２】
なお、上述した実施例のマイクロピペット保持装置において、筒状体３１への雌ねじ部（ナット）６１の固定形態は、図１０に示す実施例のマイクロピペット保持装置１ａのように、筒状体３１の外面に設けられた接着部材６４ａ，７４ａにより行うものであってもよい。この実施例のマイクロピペット保持装置１ａでは、筒状体３１には、側孔を取り囲むようにかつある程度の厚さを有するように、接着部材６４ａ、７４ａが設けられており、接着部材６４ａ、７４ａにある程度、雌ねじ部（ナット）６１、７１が埋設した状態となっている。なお、この実施例では、雌ねじ部（ナット）６１、７１は、筒状体３１の外面に実質的に接触しないものとなっている。よって、この実施例マイクロピペット保持装置１ａでは、ホルダー位置調整機構６、７は、側孔３５、雌ねじ部（ナット）６１、７１、雄ねじ部６２、７２および接着部材６４ａ，７４ａにより構成されている。
【００３３】
また、上述した実施例のマイクロピペット保持装置において、筒状体３１への雌ねじ部の形成形態は、図１１に示す実施例のマイクロピペット保持装置１ｂのように、ナットを備えず、筒状体３１ａの側孔の内面に、雄ねじ部６２，７２と螺合する雌ねじ部３６を形成したものであってもよい。この実施例では、筒状体３１ａは、少なくとも中央部分が、所定の厚さを有する肉厚部となっており、この肉厚部に、側孔が形成されている。このため、側孔は、所定の長さを備えている。さらに、その側孔の内面には、雌ねじ部３６が形成されたものとなっている。よって、この実施例マイクロピペット保持装置１ｂでは、ホルダー位置調整機構６、７は、内面に雌ねじを有する側孔３５、雄ねじ部６２、７２により構成されており、ナットおよび固着部を備えないものとなっている。
【００３４】
また、上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置において、側孔、雌ねじ部（ナット）および雄ねじ部は、図１２に示す実施例のマイクロピペット保持装置１ｃのように、筒状体３１の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた複数（具体的には、３つ）の側孔３５と、ホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材６２と、側孔３５付近に設けられ、雄ねじ部材６２と螺合可能な雌ねじ部６１とにより構成されているものであってもよい。この実施例では、３つの側孔３５は、筒状体３１の中心軸に対して、ほぼ等角度間隔（具体的には、１２０度間隔）となるように形成されている。
【００３５】
また、上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置において、側孔、雌ねじ部（ナット）および雄ねじ部は、図１３および図１４に示す実施例のマイクロピペット保持装置１ｄが備えるようなものであってもよい。マイクロピペット保持装置１ｄでは、筒状体３１の軸方向のほぼ同じ位置に設けられた向かい合う２つの側孔、２つのホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材６２、側孔付近に設けられ、雄ねじ部材６２と螺合可能な２つの雌ねじ部６１とにより構成された第１のホルダー位置調整機構６ａと、筒状体３１の中心軸に対して、第１のホルダー位置調整機構６ａの２つの側孔とほぼ９０度異なり、かつ、所長離間する位置に設けられた向かい合う２つの側孔、２つのホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材７２、側孔付近に設けられ、雄ねじ部材７２と螺合可能な２つの雌ねじ部７１とにより構成された第２のホルダー位置調整機構７ａとを有している。
【００３６】
この実施例のマイクロピペット保持装置１ｄでは、第１のホルダー位置調整機構６ａにより、図１３における筒状体３１内を挿通したマイクロピペットホルダー５の筒状体３１内での上下方向位置が調整可能であり、第２のホルダー位置調整機構７ａにより、図１３における筒状体３１内を挿通したマイクロピペットホルダー５の筒状体３１内での前後方向位置が調整可能となっている。
【００３７】
また、上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置において、側孔、雌ねじ部（ナット）および雄ねじ部は、図１５に示す実施例のマイクロピペット保持装置１ｅのように、筒状体３１の軸方向の異なる位置に設けられた４つの側孔、４つのホルダー位置調整部材を構成する複数の雄ねじ部材６２、側孔付近に設けられ、雄ねじ部材６２と螺合可能な４つの雌ねじ部６１とにより構成されたホルダー位置調整機構６ｃを有するものであってもよい。
【００３８】
この実施例のマイクロピペット保持装置１ｅでは、筒状体３１には、４つの側孔が、軸方向の基端側に向かって、筒状体３１の中心軸に対して、９０度ずつずれるように設けられている。言い換えれば、４つの側孔が、螺旋的に配置された状態となっている。このため、４つの側孔は、筒状体３１の軸方向の同じ位置に位置することなく、また、軸方向に複数の側孔が直線上に並ばないものとなっている。そして、この実施例のホルダー位置調整機構６ｃでは、図１５における左側から奇数番目に位置するホルダー位置調整機構（雄ねじ部材６２）により、図１５における筒状体３１内を挿通したマイクロピペットホルダー５の筒状体３１内での前後方向位置が調整可能であり、図１５における左側から偶数番目に位置するホルダー位置調整機構（雄ねじ部材６２）により、図１５における筒状体３１内を挿通したマイクロピペットホルダー５の筒状体３１内での上下方向位置が調整可能となっている。
【００３９】
上述したすべての実施例のマイクロピペット保持装置は、筒状回動部材３を操作用突出部４にて把持し、手動で回転させるものとなっているが、このようなものに限定されるものではない。
【００４０】
マイクロピペット保持装置としては、図１６ないし図１８に示す刃先付マイクロピペット保持装置１ｆのように、筒状回動部材３を非手動にて回動させるための回動手段４０を備えるものであってもよい。
この実施例のマイクロピペット保持装置１ｆでは、図１８に示すように、広い表面を有する基盤部２１ａを備えたベース部材２ａが用いられており、その上面にモータ４１が取り付けられている。
【００４１】
この実施例の刃先付マイクロピペット保持装置１ｆでは、回動手段４０は、モータ４１との回転軸４２の回転を筒状回動部材３に伝達し、筒状回動部材３を回転させる回転力伝達部を備えている。そして、この実施例では、回転力伝達部は、モーター４１の回転軸４２に設けられたウォームギア４３と、筒状体３１に設けられ、ウォームギア４３と噛合う平歯車３７により構成されている。ウォームギア４３と平歯車３７との組み合わせにより、モータ４１の回転軸の回転が、９０度変更され、筒状回動部材３は、その中心軸を中心に良好に回転する。また、ウォームギア４３と平歯車３７と組み合わせにより、モータ４１の回転軸４２の回転速度は、大きく減速されるため、筒状回動部材３は、ゆっくりと回転するものとなっている。
【００４２】
また、回転力伝達部としては、図１９に示す刃先付マイクロピペット保持装置１ｇの回動手段４０ａが備えるような回転力伝達部であってもよい。このマイクロピペット保持装置１ｇの回動手段４０ａでは、回転力伝達部が、プーリーとベルトを用いるものとなっている。具体的には、回動手段４０ａは、回転力伝達部として、モーター４１の回転軸４２に設けられた第１のプーリー４５と、筒状体３１に設けられた第２のプーリー３９と、第１のプーリー４５と第２のプーリー３９の各環状凹部間に掛け回された環状ベルト（無端ベルト）４６により構成されている。この実施例の装置１ｇでは、モータ４１は、筒状回動部材３と平行に配置されており、モータ４１の回転軸も筒状回動部材３と平行なものとなっている。
【００４３】
そして、モーター４１の回転軸４２に設けられた第１のプーリー４５と、筒状体３１に設けられた第２のプーリー３９も平行にかつ隣り合うように配置されている。さらに。第１のプーリー４５の環状凹部と第２のプーリー３９の環状凹部の隣り合い、かつ直線状に位置するものとなっている。そして、それらの凹部に環状ベルト（無端ベルト）４６が緩みなく掛け回されて、２つのプーリー３９，４５は、ベルト４６により連結されている。そして、モータ４１の回転軸４２が、回転することにより、プーリー４５が回転し、その回転力は、ベルト４６を介して、プーリー３９に伝達され、回動部材３は、その中心軸を中心に良好に回転する。なお、モータ４１には、回転軸の回転速度を減速させる減速ギアを取り付けてもよい。
【００４４】
また、この実施例のマイクロピペット保持装置１ｇでは、回動手段４０ａは、ベース部材２ｂの基盤部２１に固定されたモーター固定部材４７を備えている。この固定部材４７により、モータ４１は、回転可能に、ベース部材２ｂに取り付けられている。
【００４５】
次に、図２０に示す本発明の刃先付マイクロピペット保持装置の他の実施例を説明する。この実施例の刃先付マイクロピペット保持装置１ｈでは、筒状回動部材３を手動にて回動させるための回動機構４０ｂを備えている。
この実施例の刃先付マイクロピペット保持装置１ｈは、図２０に示すように、精子注入用マニピュレータ１０に組み込まれる。さらに、精子注入用マニピュレータ１０は、精子注入用マニピュレータ１０をＸＹＺ方向に移動させるための移動装置８０に装着される。このため、移動装置８０を駆動させることにより、精子注入用マニピュレータ１０は、前後、左右および上下に移動可能である。また、使用時には、図２０に示すように、顕微鏡装置５０の下方に、シャーレ３０が配置される。
【００４６】
この実施例の筒状回動部材回動機構４０ｂは、図２０に示すように、ワイヤーシース５７と、このワイヤーシース５７内を摺動可能に貫通する操作用ワイヤーとを備えている。そして、操作用ワイヤー５５は、先端に、操作用突出部４への装着部５５ａを備える。ワイヤー５５は、基端部に把持部（操作部）５５ｂを備えている。この実施例では、装着部５５ａは、操作用突出部４が挿通可能なリング状部材により形成されている。また、ワイヤーシース５７の基端には、筒状保持部５８が固定されており、筒状保持部５８内にて、ワイヤー５５の基端部は、シース５７より突出している。ワイヤーの基端部に固定された把持部５５ｂは、筒状保持部５８の上面に設けられた軸方向に延びるスリットより、突出している。このため、ワイヤー５５の後端部に固定された操作部５５ｂは、筒状保持部５８のスリット内を軸方向に移動可能である。そして、操作部５５ｂを軸方向に移動させることにより、ワイヤー５５の先端および装着部５５ａは、前後に動く。ワイヤの先端および装着部５５ａの前後の動きは、装着部５５ａが装着されている操作用突出部４に伝達され、これにより、筒状回動部材３は、回動する。
【００４７】
具体的には、図２０に示す状態において、操作部５５ｂを左方向に移動させると、シース５７の先端より突出するワイヤー５５の突出長が長くなり、操作用突出部４は、ワイヤー５５により下方に押され、筒状回動部材３は、下方向に回転する。逆に、操作部５５ｂを右方向に移動させると、シース５７の先端より突出するワイヤー５５の突出長が短くなり、操作用突出部４は、ワイヤー５５により上方に引かれ、筒状回動部材３は、上方向に回転する。
また、この実施例の筒状回動部材回動機構４０ｂは、図２０に示すように、ベース部５９を備え、筒状保持部５８は、装着部５９ａにより、ベース部５９に固定されている。さらに、この実施例では、シース５７は、固定部材８８により、移動装置８０に固定されている。そして、この実施例では、固定部材８８により、ワイヤーおよびシースが湾曲保持されている。これにより、ワイヤーおよびシースの先端部が向かう方向が、筒状回動部材３の回動軸とほぼ直交するものとなっている。このため、操作部５５ｂのスライド操作により、筒状回動部材３は、良好に回動する。
【００４８】
次に、本発明の卵子細胞質内精子注入方法について、図２１ないし図２３を用いて説明する。
本発明の卵子細胞質内精子注入方法では、卵子１００を吸引ピペット１２にて保持するステップと、吸引ピペット１２に保持された卵子に、先端に刃先１８を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペット１５の先端部を当接させるステップと、マイクロピペット１５を前進させて、刃先１８を卵子の透明帯１０１を刺通させるステップと、刃先１８を卵子１００の卵膜１０２に当接させ、刃先１８により卵膜１０２を押圧するステップと、マイクロピペット１５をマイクロピペットの軸をほぼ中心として回転させることにより、刃先１８の刃面を回転させて、刃先１８を卵膜１０２を刺通させ、刃先１８を細胞質１０３内に進入させるマイクロピペット回転ステップと、マイクロピペット１５内の精子を細胞質１０３内にて放出する精子放出ステップとが行われる。
【００４９】
本発明の卵子細胞質内精子注入方法における各ステップを説明する。
図２１に示すように、シャーレ３０内に培養液とともに卵子１００を収納したものを準備する。そして、顕微鏡装置５０の下方に、上記のシャーレ３０を配置し、シャーレ３０の一方には、精子を収納した刃先付マイクロピペット１５を保持した本発明のマイクロピペット保持装置１が組み込まれた精子注入用マニピュレータ１０を配置し、シャーレ３０の他方には、吸引ピペット１２を保持したマイクロピペット保持装置が組み込まれた卵子保持用マニピュレータ２５を配置する。
なお、図２１に示すシステムでは、精子注入用マニピュレータ１０は、精子注入用マニピュレータ１０をＸＹＺ方向に移動させるための移動装置８０に装着されている。このため、移動装置８０を駆動させることにより、精子注入用マニピュレータ１０は、前後、左右および上下に移動可能である。
【００５０】
同様に、卵子保持用マニピュレータ２５は、卵子保持用マニピュレータ２５をＸＹＺ方向に移動させるための移動装置９０に装着されている。このため、移動装置９０を駆動させることにより、卵子保持用マニピュレータ２５は、前後、左右および上下に移動可能である。また、卵子保持用マニピュレータ２５は、吸引ピペットホルダ２６、ホルダー保持部材２９を備え、ホルダー保持部材２９が、移動装置９０に装着されている。吸引ピペットホルダ２６は、上述したマイクロピペットホルダ５と同じ構成を備えている。具体的には、先端に、吸引ピペット１２を保持するための先端部材２７を備え、基端に、チューブ６０を保持するための基端部材２８を備えている。
【００５１】
本発明の卵子細胞質内精子注入方法では、最初に、図２１および図２２（Ａ）に示すように、卵子１００を吸引ピペット１２にて吸引し、保持するステップを行う。このステップでは、移動装置９０を作動させて、 卵子保持用マニピュレータ２５に保持されている吸引ピペット１２を卵子１００が培養液とともに収納されているシャーレ３０内に挿入する。続いて、卵子保持用マニピュレータ２５に接続されている吸引手段（図示せず）を作動させることにより、卵子１００を吸引ピペット１２の先端に吸引保持する。
【００５２】
次に、吸引ピペット１２に保持された卵子に、先端に刃先１８を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペット１５の先端部を当接させるステップを行う。このステップでは、移動装置８０を作動させて、 精子注入用マニピュレータ１０に保持されている精子を収納した刃先付マイクロピペット１５をシャーレ３０内に挿入し、図２２（Ａ）に示すように、刃先１８が、卵子１００に近接した状態とする。続いて、移動装置８０を作動させて、刃先付マイクロピペット１５をわずかに卵子方向に前進させ、図２２（Ｂ）に示すようにマイクロピペット１５の刃先１８を卵子に当接させる。この刃先１８の当接により、卵子は、若干窪むように変形する。
【００５３】
続いて、マイクロピペット１５を前進させて、刃先１８を卵子の透明帯１０１を刺通させるステップを行う。このステップでは、図２２（Ｃ）に示すように、刃先付マイクロピペット１５の刃先１８が、卵子１００内に刺入し、透明帯１０１を刺通するように、移動装置８０を作動させることにより行われる。
そして、刃先１８を卵子１００の卵膜１０２に当接させ、刃先１８により卵膜１０２を押圧するステップを行う。このステップは、移動装置８０を作動させて、刃先付マイクロピペット１５をわずかに卵子方向に前進させることにより行われる。なお、上記の刃先１８による卵子の透明帯１０１の刺通ステップの完了により、自然に刃先１８により卵膜１０２が押圧された状態となる場合がある。また、自然に刃先１８により卵膜１０２が押圧された状態となった場合においても、さらに、移動装置８０を作動させて、刃先付マイクロピペット１５をわずかに卵子方向に前進させ、より強く、押圧する状態としてもよい。このステップにより、図２２（Ｃ）に示すように、マイクロピペット１５の刃先１８は、透明帯１０１を刺通し、かつ、卵膜１０２は、刃先１８により押圧変形した状態となる。
【００５４】
続いて、図２３（Ｄ）に示すように、マイクロピペット１５をマイクロピペットの軸をほぼ中心として回転させることにより、刃先１８の刃面を回転させて、刃先１８を卵膜１０２を刺通させ、刃先１８を細胞質１０３内に進入させるマイクロピペット回転ステップを行う。
この回転ステップでは、マイクロピペット１５の位置は、変更せず、本発明のマイクロピペット保持装置１の筒状回動部材３の操作用突出部４を上もしくは下方向に動かすことにより行われる。このステップにより、刃先１８の刃面が回転するため、刃先１８は卵膜１０２を刺通する。これにより、図２３（Ｅ）に示すように、刃先１８は、細胞質１０３内に進入する。なお、このマイクロピペット回転ステップは、刃先付マイクロピペット１５をわずかに卵子方向に前進させながら行ってもよい。
【００５５】
また、このステップにおけるマイクロピペットの回転は、マイクロピペットの先端部の中心軸をほぼ中心として回転させることが好ましい。言い換えれば、本発明のマイクロピペット保持装置１には、精子を収納した刃先付マイクロピペット１５が、その先端部の中心軸をほぼ中心として回転するように保持された状態としたものと用いることが好ましい。
そして、図２３（Ｅ）に示すように、マイクロピペット１５内の精子を細胞質１０３内にて放出する精子放出ステップを行う。このステップは、精子注入用マニピュレータ１０に接続されている吐出手段（図示せず）を作動させることにより、精子をマイクロピペット１５より吐出することにより行われる。
そして、精子注入ステップが終了した後、移動装置８０を作動させて、刃先付マイクロピペット１５を後退させて、卵子１００より抜去する。これにより、卵子細胞質内精子注入方法は終了し、シャーレ３０内には、精子が注入された卵子が、吸引ピペット１２に吸引保持される。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の刃先付マイクロピペット保持装置は、以下のものである。
（１）  生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを先端部に装着可能な筒状マイクロピペットホルダーと、前記マイクロピペットホルダーを保持するホルダー保持具とを備える刃先付マイクロピペット保持装置であって、
前記ホルダー保持具は、ベース部材と、前記ベース部材に回動可能に保持され、かつ、前記マイクロピペットホルダーが挿通可能な筒状回動部材とを備え、さらに、前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材の側面かつ前記筒状回動部材の周方向に異なる位置に設けられた複数の側孔と、前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とからなるホルダー位置調整機構を備えている刃先付マイクロピペット保持装置。【００５７】
この刃先付マイクロピペット保持装置では、生体細胞に刺入するための刃先付マイクロピペットを装着可能な筒状のマイクロピペットホルダーを回動可能に保持するため、刃先付マイクロピペットの細胞内への刺入操作時、回動操作を容易に行うことがきでき、マイクロピペットの刃先の細胞内への刺入を容易に行うことができる。さらに、この刃先付マイクロピペット保持装置では、マイクロピペットホルダーが挿通される筒状回動部材が、ホルダー位置調整部材を備えているので、筒状部材の回動時における中心を調整可能、言い換えれば、装着された刃先付マイクロピペットの刃先における回転中心を調整可能であるため、良好な状態にて刃先付きマイクロピペットを回転させることができる。【００５８】
また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
（２）  前記刃先付マイクロピペット保持装置は、前記マイクロピペットを前記マイクロピペットホルダーに装着した状態にて、前記ホルダー位置調整機構を調整することにより、前記マイクロピペットの先端部の中心軸を前記筒状回動部材の回動時におけるほぼ中心に調整可能である上記（１）に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（３）  前記ホルダー位置調整機構は、前記側孔と、前記ホルダー位置調整部材を構成する雄ねじ部材と、前記側孔付近もしくは前記側孔内に形成され、前記雄ねじ部材と螺合可能な雌ねじ部とからなるものである上記（１）または（２）に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（４）  前記筒状回動部材は、前記筒状回動部材を手動にて回動させるための操作用突出部を備えている上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（５）  前記マイクロピペット保持装置は、前記筒状回動部材を非手動にて回動させるための回動手段を備えている上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（６）  前記回動手段は、モータと、前記モータの回動軸と前記筒状回動部材とを連結し、かつ、前記回動軸の回転により前記筒状回動部材を回転させる回転力伝達機構を備えている上記（５）に記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（７）  前記ベース部材は、基盤部と、前記基盤部より起立する２つの側板部を備え、
前記筒状回動部材は、両端部に設けられたボールベアリングを備え、前記筒状回動部材は、前記ボールベアリングを介して、前記２つの側板部に固定されることにより、前記ベース部材に回動可能に保持されたものとなっている上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（８）  前記筒状回動部材は、一端側および他端側の内部に収納された２つの弾性筒状部材を備え、前記弾性筒状部材は、前記マイクロピペットホルダーに密着可能かつ挿通可能である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（９）  前記筒状回動部材は、第１の前記ホルダー位置調整機構と、前記第１のホルダー位置調整機構と所定長離間した位置に設けられた第２のホルダー位置調整機構を備えている上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（１０）  前記ホルダー位置調整機構は、向かい合うもしくは前記筒状回動部材の中心軸に対して等角度となるように設けられた複数の前記側孔と、各前記側孔より、前記筒状回動部材内に侵入可能かつ、挿通する前記マイクロピペットホルダーの外面に当接可能なホルダー位置調整部材とを備えるものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（１１）  前記マイクロピペット保持装置は、前記ベース部材に設けられ、マニピュレーター装置に装着するための装着部を備えている上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（１２）  前記マイクロピペットホルダーは、筒状本体と、前記筒状本体の先端部に設けられた先端側リング状部材と、前記筒状本体の基端側に設けられた基端側リング状部材と、前記先端側リング状部材内に収納され、かつ、前記先端側リング状部材と前記筒状本体の先端により押圧される筒状弾性体とを備え、前記筒状弾性体は、前記マイクロピペットの基端部を挿通可能かつ押圧時に前記マイクロピペットの基端部を保持可能である上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。
（１３）  前記マイクロピペット保持装置は、顕微授精用のマイクロピペットを保持するためのものである上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の刃先付マイクロピペット保持装置。【００５９】
また、本発明の卵子細胞質内精子注入方法は、以下のものである。
（１４）  卵子細胞質内精子注入方法であって、卵子を吸引ピペットにて保持するステップと、前吸引ピペットに保持された前記卵子に、先端に刃先を有し、かつ内部に精子を保有するマイクロピペットの先端部を当接させるステップと、前記マイクロピペットを前進させて、前記刃先を前記卵子の透明帯を刺通させるステップと、前記刃先を前記卵子の卵膜に当接させ、前記刃先により前記卵膜を押圧するステップと、前記マイクロピペットを回転させることにより、前記刃先の刃面を回転させて、前記刃先を前記卵膜を刺通させ、前記刃先を細胞質内に進入させるマイクロピペット回転ステップと、前記マイクロピペット内の精子を前記細胞質内にて放出する精子放出ステップとを行う卵子細胞質内精子注入方法。【００６０】
本発明では、マイクロピペットの刃先の刃面を回転させることにより、刃先を卵膜に確実かつ容易に細胞質内に進入させることができ、マイクロピペットの刃先を確実に細胞質内に到達させることができる。【００６１】
また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
（１５）  前記マイクロピペットの回転は、前記マイクロピペットの先端部の中心軸をほぼ中心として回転させるものである上記（１４）に記載の卵子細胞質内精子注入方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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