(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0006458809.tif 000009
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物を少なくとも１種含む、免疫賦活剤。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３０アルキル基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項６】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項７】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項８】
α−シクロデキストリンを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項９】
α−シクロデキストリンを更に含み、且つ、Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項１０】
当該剤がアジュバントである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫賦活剤及び抗原を含有する、ワクチン。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）：
【化２】
0006458809.tif 000010
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物を少なくとも１種、及び
α−シクロデキストリンを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、請求項１２又は１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
一般式（Ｉ）：
【化３】
0006458809.tif 000011
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物（但し、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルを除く）。
【請求項１８】
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、請求項１７又は１８記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３０アルキル基である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる化合物。
【請求項２４】
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる化合物。
【請求項２５】
一般式（Ｉ）：
【化４】
0006458809.tif 000012
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物を少なくとも１種、及び
抗原を含有する、ワクチン。
【請求項２６】
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、請求項２５記載のワクチン。
【請求項２７】
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、請求項２５又は２６記載のワクチン。
【請求項２８】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２９】
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３０アルキル基である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３０】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３１】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３２】
皮下投与及び鼻腔投与からなる群より選ばれるルートにより投与される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた免疫賦活作用を有し、免疫賦活剤、特にアジュバントとして有用な化合物、当該化合物を含む組成物、及び、当該化合物と抗原を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンには病原体を弱毒化した生ワクチン、病原体を不活化した全粒子ワクチン、病原体を分解して特定の成分だけを抽出、精製したスプリットワクチンがある。この中でスプリットワクチンは、その免疫賦活能を高めるために、アジュバントと呼ばれる化合物・組成物を添加する必要がある。また、近年研究開発が進んでいる粘膜ワクチン、癌ワクチンやある種のアレルギーに対するワクチンでも、その効果の発現にはアジュバントの添加が必要だと言われている。国内で承認されているアジュバントとしては、現状、沈降性アジュバントとしてアルミニウム塩（水酸化アルミニウムゲル等）、油性アジュバントとしてスクアレン、そもそも免疫原性があるグラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であるリポ多糖ＬＰＳの改変体であるＭＰＬがある。世界レベルでのアジュバント研究開発でも、ＣｐＧやＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃなどに由来する核酸、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）を活性化するバクテリア構成成分の改変体や免疫系を刺激するサイトカイン類の改変体などに着目して進んでいる。しかし、国内承認済み、研究開発途上にあるものを含めて、これら既存のアジュバントには次のような課題があった。
【０００３】
沈降性アジュバントのアルミニウム塩では、インフルエンザＨＡワクチンや口蹄疫ワクチンなど、いくつかのワクチンでアジュバント効果に疑問が呈されている。また、アルミニウム塩は安全性の面からも、接種部位に肉芽形成がしばしば見られること、高ＩｇＥ血症を引き起こすことなどが知られている。また、スクアレンなどの油性アジュバントでは、乳化による粘性の増加により接種時に疼痛が起きたり、体内に分散しにくく接種部位に留まる性質を持つことから接種部位が硬結したりすることがある。一方、ＭＰＬは免疫原性を持つＬＰＳの改変体ゆえに、ワクチンとの同時接種により強い炎症反応を惹起したり、疼痛や発熱を伴ったりする場合がある。さらに、開発途上にあるアジュバントにおいても、アレルギー誘導や強い炎症反応、発熱の惹起など、安全性に課題があるとされる。また核酸アジュバントでは、医薬品として合成する際の課題、例えば、有効なアジュバント効果を奏することができるとされる鎖長まで化学合成することが困難であることなど、新たな課題が浮上している。このようにアジュバントでは、有効性と安全性を兼ね備えることが求められているが、従来の国内承認済み及び研究開発途上にあるアジュバントではそれらの要求を完全には満たしていないのが現状である。
【０００４】
一方、米国アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）では、ワクチンアジュバントの安全性について次の１２点を挙げている。１）自己免疫応答を誘導しない、２）ヒト抗原と交叉反応性をもつ抗原を含まない、３）アレルギー性過敏反応を誘発しない、４）化学的に純粋に合成されるべきである、５）発癌性を持たない、６）目的とする免疫応答以外は誘導しない、７）生体内で速やかに代謝されるべき物質であるべきである、８）接種方法に関わらず安全であるべきである、９）催奇形性・生殖毒性を持ってはならない、１０）一年以上の保存安定性を持つべきである、１１）目的に沿って選択されるべきである、１２）低い頻度で発生し得る副反応は受容されるべきである。また、欧州のワクチン審査担当機構であるＥＭＥＡ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｇｅｎｃｙ）によるガイドラインでは、非臨床のアジュバント単独毒性試験として、１）接種局所の組織傷害・肉芽腫形成、２）過敏性反応・アナフィラキシー、３）発熱、４）全身毒性、５）生殖機能毒性、６）遺伝毒性（合成アジュバントのみ）を挙げている。米国、欧州で共通する部分、しない部分はあるが、少なくともこれから開発されるワクチンアジュバントはこうした要求を満たすべきと考えられる。
【０００５】
これまでに免疫調節作用を有する化合物として、例えば、特許文献１〜７及び非特許文献１〜４に記載の化合物が報告されている。特許文献１の実施例２５には、下記一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がウンデシル基（Ｃ１１アルキル基）である化合物が開示されているが、当該化合物は一般式（Ｉ）で示される化合物とは異なり、またそのアジュバント活性は十分とは言えない。特許文献２の実施例３には、一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基が不飽和炭化水素基（Ｃ１７アルケニル基）である化合物が開示されているが、当該化合物も一般式（Ｉ）で示される化合物とは異なり、またそのアジュバント活性は十分とは言えない。特許文献３の表１及び２には、一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基が、ケト基又は水酸基で置換された長鎖アルキル基（Ｃ３５アルキル基）である化合物が開示されているが、当該化合物も一般式（Ｉ）で示される化合物とは異なり、更に当該化合物について生理食塩水等における分散性の検討は全くなされてなく、当該化合物をα−シクロデキストリンと組み合わせることにより分散性を改善し、その効果を高めることも一切報告されていない。
特許文献７には、ワクチンアジュバントに使用し得る化合物の合成中間体として、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１５アルキル基の化合物）が開示されているが、その免疫調節作用については全く報告されてなく、免疫賦活剤やアジュバントとしての使用を示唆する報告も一切なされていない。またＮ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１５アルキル基の化合物、ＣＡＳ登録番号：７３７９３−９２−７、非特許文献１記載）及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物、ＣＡＳ登録番号：１２１０７４−９１−７、及び、８９６４４２−５４−９、非特許文献２記載）は、いずれも既知の化合物であるが、これらも免疫調節作用について全く報告されてなく、免疫賦活剤やアジュバントとしての使用を示唆する報告も一切なされていない。
【０００６】
一方、非特許文献４には、フィトール及びその誘導体のアジュバント活性を評価した結果が報告されている。当該文献には、細胞増殖阻害アッセイにおいて、フィトールを溶解するためにβ−シクロデキストリンを使用したことが記載されているが、抗原特異的な抗体産生の評価においてはβ−シクロデキストリンは使用されていない。またα−シクロデキストリンについては、非特許文献４に記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平４−２３０３５９号公報
【特許文献２】特開昭５９−２１９２６２号公報
【特許文献３】特開昭６３−２６４４４４号公報
【特許文献４】特開昭６２−６３６００号公報
【特許文献５】特表平５−５０７７０５号公報
【特許文献６】特開平１１−３０２２５０号公報
【特許文献７】特開平５−１８６４１９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｙｂｕｌｌａ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １９８０，  ９２（４），１３８９−９６
【非特許文献２】Ｚｅｅｌｅｎ，  Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｕｅｉｌ  ｄｅｓ  Ｔｒａｖａｕｘ  Ｃｈｅｍｉｑｕｅｓ  ｄｅｓ  Ｐａｙｓ−Ｂａｓ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｂｅｌｇｉｑｕｅ  １９５８，  ７７（３），２６７−７２
【非特許文献３】Ｒｏｔｈ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ２００４，  １５，  ５４１−５５３
【非特許文献４】Ｙ．  Ａａｃｈｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７１  （２０１１）  ３０８−３１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、免疫賦活作用を有し、免疫賦活剤、特にアジュバントとして有用な化合物、当該化合物を含む組成物、及び、当該化合物と抗原を含むワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物（以下、本発明化合物又は化合物（Ｉ）と称することもある）が、ＩｇＥ抗体の産生を誘導することなく、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生を増強できるという優れた免疫賦活作用を有することを見出した。
また本発明者らは、化合物（Ｉ）について更なる研究を行っていたところ、アシル基の鎖長が長くなるにつれて、生理食塩水における溶解性及び分散性が低下する傾向があることを見出した。本発明者らは、この低下した分散性を改善すべく鋭意検討した結果、α−シクロデキストリンを加えることで、分散性を顕著に改善でき、更には、驚くべきことにその抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）までも向上させ得ることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
［１］一般式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
0006458809.tif 000002
【００１３】
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物を少なくとも１種含む、免疫賦活剤。
［２］Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、［１］記載の免疫賦活剤。
［３］Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、［１］又は［２］記載の免疫賦活剤。
［４］Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［５］Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３０アルキル基である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［６］一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［７］一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［８］α−シクロデキストリンを更に含む、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［９］α−シクロデキストリンを更に含み、且つ、Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［１０］当該剤がアジュバントである、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の免疫賦活剤及び抗原を含有する、ワクチン。
［１２］一般式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
0006458809.tif 000003
【００１５】
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物を少なくとも１種、及び
α−シクロデキストリンを含む、医薬組成物。
［１３］Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、［１２］記載の医薬組成物。
［１４］Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、［１２］又は［１３］記載の医薬組成物。
［１５］Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である、［１２］〜［１４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１６］一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、［１２］〜［１４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１７］一般式（Ｉ）：
【００１６】
【化３】
0006458809.tif 000004
【００１７】
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物（但し、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルを除く）。
［１８］Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、［１７］記載の化合物。
［１９］Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、［１７］又は［１８］記載の化合物。
［２０］Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である、［１７］〜［１９］のいずれか１つに記載の化合物。
［２１］Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３０アルキル基である、［１７］〜［２０］のいずれか１つに記載の化合物。
［２２］Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である、［１７］〜［１９］のいずれか１つに記載の化合物。
［２３］Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる化合物。
［２４］Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる化合物。
[２５]  一般式（Ｉ）：
【００１８】
【化４】
0006458809.tif 000005
【００１９】
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
で表される化合物を少なくとも１種、及び
抗原を含有する、ワクチン。
[２６]  Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルである、[２５]記載のワクチン。
[２７]  Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である、[２５]又は[２６]記載のワクチン。
[２８]  Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である、[２５]〜[２７]のいずれか１つに記載のワクチン。
[２９]  Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３０アルキル基である、[２５]〜[２８]のいずれか１つに記載のワクチン。
[３０]  一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、[２５]〜[２７]のいずれか１つに記載のワクチン。
[３１]  一般式（Ｉ）で表される化合物が、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
からなる群より選ばれる、[２５]〜[２９]のいずれか１つに記載のワクチン。
[３２]  皮下投与及び鼻腔投与からなる群より選ばれるルートにより投与される、[２５]〜[３１]のいずれか一つに記載のワクチン。
【発明の効果】
【００２０】
化合物（Ｉ）は、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）を有するので、免疫賦活剤として有用である。特に、化合物（Ｉ）は、従来のアルミニウムゲルアジュバントと同等かそれ以上の免疫賦活作用を有し、且つ、ＩｇＥ抗体の産生を誘導することがなく、従来のアルミニウムゲルアジュバントで課題となっているアレルギー誘導活性がほとんどないため、効果的で且つ安全なアジュバントとなり得る。
また本発明によれば、生理食塩水に容易に溶解又は分散し得る、化合物（Ｉ）を含む医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）に優れ、免疫賦活剤として用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果を示すグラフである。「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＳＺ２３」はＳＺ２３添加群を示し、「（ＣｙｓｓＯＭｅ）２」はシスチンジメチルエステル添加群を示し、「ＩＳＡ」はイソステアリン酸添加群を示し、「ＩＳＡ＋（ＣｙｓｓＯＭｅ）２」はシスチンジメチルエステルとイソステアリン酸の混合物添加群を示す。
【図２】実施例２における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果を示すグラフである。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は生理食塩水単独投与群を示し、「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＡＬＵＭ」は水酸化アルミニウムゲルアジュバント添加群を示し、「２．５６」はＳＺ２３；２．５６μｍｏｌ添加群を示し、「０．２５６」はＳＺ２３；０．２５６μｍｏｌ添加群を示し、「０．０２５６」はＳＺ２３；０．０２５６μｍｏｌ添加群を示す。
【図３】実施例３における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のアレルギー誘導活性の評価試験の結果を示すグラフである。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は生理食塩水単独投与群を示し、「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＡＬＵＭ」は水酸化アルミニウムゲルアジュバント添加群を示し、「２．５６」はＳＺ２３；２．５６μｍｏｌ添加群を示し、「０．２５６」はＳＺ２３；０．２５６μｍｏｌ添加群を示し、「０．０２５６」はＳＺ２３；０．０２５６μｍｏｌ添加群を示す。
【図４】実施例４における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）とＮ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１１アルキル基の化合物）とのアジュバント活性の比較試験の結果を示すグラフである。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は生理食塩水単独投与群を示し、「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＳＺ２３」はＳＺ２３添加群を示し、「ＳＺ２４」はＳＺ２４添加群を示す。
【図５】実施例５における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のヒト単球細胞株への免疫賦活効果の評価試験の結果を示すグラフである。
【図６】実施例６における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のマウスマクロファージ様株細胞（ＲＡＷ）への免疫賦活効果の評価試験の結果を示すグラフである。
【図７】実施例７における、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１５アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果を示すグラフである。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は生理食塩水単独投与群を示し、「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＳＺ２２」はＳＺ２２添加群を示し、「ＳＺ２３」はＳＺ２３添加群を示す。
【図８】実施例８における、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１２アルキル基の化合物）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ２９アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果を示すグラフである。「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＳＺ３４」はＳＺ３４添加群を示し、「ＳＺ３５」はＳＺ３５添加群を示し、「ＳＺ３６」はＳＺ３６添加群を示し、「ＳＺ２３」はＳＺ２３添加群を示す。
【図９】実施例９における、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３’：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果を示すグラフである。「ＯＶＡ」はＯＶＡ単独投与群を示し、「ＳＺ２３」はＳＺ２３添加群を示し、「ＳＺ２３’」はＳＺ２３’添加群を示す。
【図１０】実施例１０における、Ｎ，Ｎ’−ビス（リノレオイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２８：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルケニル基の化合物）及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果を示すグラフである。「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＯＶＡ単独投与群を示す。
【図１１】実施例１１における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ２９アルキル基の化合物）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ３７アルキル基の化合物）の分散性検討試験の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例１１において調製した各サンプルの攪拌後の写真である。
【図１３】実施例１２における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ２９アルキル基の化合物）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ３７アルキル基の化合物）の分散溶媒（１％βＣＤ添加生理食塩水、５％αＣＤ添加生理食塩水）の検討試験の結果を示すグラフである。
【図１４】実施例１３における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ２９アルキル基の化合物）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ３７アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果（生理食塩水時、５％αＣＤ添加生理食塩水時）を示すグラフである。「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＯＶＡ単独投与群を示す。
【図１５】実施例１４における、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１５アルキル基の化合物）、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１２アルキル基の化合物）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ２９アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果（５％αＣＤ添加生理食塩水時）を示すグラフである。「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＯＶＡ単独投与群を示す。
【図１６】実施例１５における、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果（５％αＣＤ添加生理食塩水時）を示すグラフである。「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＯＶＡ単独投与群を示す。
【図１７】実施例１６における、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）及びＮ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ６６：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ２１アルキル基の化合物）のアジュバント活性の評価試験の結果（５％αＣＤ添加生理食塩水時）を示すグラフである。「ｃｏｎｔｒｏｌ」はＯＶＡ単独投与群を示す。
【図１８】実施例１７における、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のマウスへのインフルエンザワクチン鼻腔投与における血清サンプルのＩｇＧ１サブクラス抗体産生の評価試験の結果を示すグラフである。「ＦｌｕＶａｃ（−）」「ＦｌｕＶａｃ（＋）」はそれぞれインフルエンザワクチン投与なし群、インフルエンザワクチン投与群を示す。
【図１９】実施例１７における、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のマウスへのインフルエンザワクチン鼻腔投与におけるＨＩ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）タイター評価試験（赤血球凝集抑制試験）の結果を示すグラフである。「ＦｌｕＶａｃ（−）」「ＦｌｕＶａｃ（＋）」はそれぞれインフルエンザワクチン投与なし群、インフルエンザワクチン投与群を示す。
【図２０】実施例１７における、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のマウスへのインフルエンザワクチン鼻腔投与における鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体産生評価試験の結果を示すグラフである。「ＦｌｕＶａｃ（−）」「ＦｌｕＶａｃ（＋）」はそれぞれインフルエンザワクチン投与なし群、インフルエンザワクチン投与群を示す。
【図２１】実施例１７における、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５：一般式（Ｉ）のＲ３及びＲ４に対応する基がＣ１７アルキル基の化合物）のマウスへのインフルエンザワクチン鼻腔投与における鼻腔洗浄液中のＩｇＧ抗体産生評価試験の結果を示すグラフである。「ＦｌｕＶａｃ（−）」「ＦｌｕＶａｃ（＋）」はそれぞれインフルエンザワクチン投与なし群、インフルエンザワクチン投与群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の免疫賦活剤は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物を少なくとも１種含む。
【００２３】
式（Ｉ）：
【００２４】
【化５】
0006458809.tif 000006
【００２５】
〔式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基を示し；
Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基を示し；
Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示し；
Ｘ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−を示す〕
【００２６】
以下、一般式（Ｉ）の各基について説明する。
【００２７】
一般式（Ｉ）におけるＲ１及びＲ２は、同一又は異なって、それぞれＣ１−６アルキル基である。
【００２８】
Ｒ１及びＲ２における「Ｃ１−６アルキル基」とは、直鎖又は分岐鎖の炭素原子数１〜６のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル等が挙げられる。中でも、安価で入手し易い観点から、Ｃ１−３アルキル基が好ましく、メチルが特に好ましい。
【００２９】
Ｒ１及びＲ２は、同一であっても又は異なってもよいが、同一であることが好ましい。
【００３０】
Ｒ１及びＲ２の好ましい態様としては、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）である。
【００３１】
一般式（Ｉ）におけるＲ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基である。
【００３２】
Ｒ３及びＲ４における「Ｃ１２−３７アルキル基」とは、直鎖又は分岐鎖の炭素原子数１２〜３７のアルキル基を意味し、例えば、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、２−ヘプチルデシル、４，６，６−トリメチル−１−（１，３，３−トリメチルブチル）ヘプチル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル、エイコシル、ヘンイコシル、ヘンエイコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、２−テトラデシルペンタデシル、トリアコンチル、ヘントリアコンチル、ドトリアコンチル、トリトリアコンチル、テトラトリアコンチル、ペンタトリアコンチル、ヘキサトリアコンチル、ヘプタトリアコンチル、２−オクタデシルノナデシル等が挙げられる。
一態様として、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基であってもよい。中でも、Ｃ１２−３２アルキル基が好ましく、Ｃ１２−３０アルキル基がより好ましい。具体的には、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１３アルキル基、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１６アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ１８アルキル基、Ｃ１９アルキル基、Ｃ２０アルキル基、Ｃ２１アルキル基、Ｃ２２アルキル基、Ｃ２３アルキル基、Ｃ２４アルキル基、Ｃ２５アルキル基、Ｃ２６アルキル基、Ｃ２７アルキル基、Ｃ２８アルキル基、Ｃ２９アルキル基又はＣ３０アルキル基が、より好ましい。ＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用に特に優れることから、Ｃ１２−２１アルキル基又はＣ２８−３０アルキル基が特に好ましい。例えば、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ２１アルキル基又はＣ２９アルキル基が、特に好ましい。
また本発明の剤が、後述するように、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含む場合、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基（例えば、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１３アルキル基、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１６アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ１８アルキル基、Ｃ１９アルキル基、Ｃ２０アルキル基、Ｃ２１アルキル基、Ｃ２２アルキル基、Ｃ２３アルキル基、Ｃ２４アルキル基、Ｃ２５アルキル基、Ｃ２６アルキル基、Ｃ２７アルキル基、Ｃ２８アルキル基、Ｃ２９アルキル基、Ｃ３０アルキル基、Ｃ３１アルキル基、Ｃ３２アルキル基、Ｃ３３アルキル基、Ｃ３４アルキル基、Ｃ３５アルキル基、Ｃ３６アルキル基又はＣ３７アルキル基）でよいが、Ｃ２９−３７アルキル基である場合により効果的で好ましい。具体的には、Ｃ２９アルキル基、Ｃ３０アルキル基、Ｃ３１アルキル基、Ｃ３２アルキル基、Ｃ３３アルキル基、Ｃ３４アルキル基、Ｃ３５アルキル基、Ｃ３６アルキル基又はＣ３７アルキル基が、より効果的で好ましい。
【００３３】
Ｒ３及びＲ４は、同一であっても又は異なってもよいが、同一であることが好ましい。
【００３４】
Ｒ３及びＲ４の好ましい一態様としては、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３５アルキル基である。
Ｒ３及びＲ４の好ましい他の態様としては、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３２アルキル基（より好ましくはＣ１２−３０アルキル基、特に好ましくはＣ１２−２１アルキル基又はＣ２８−３０アルキル基）である。具体的には、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１３アルキル基、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１６アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ１８アルキル基、Ｃ１９アルキル基、Ｃ２０アルキル基、Ｃ２１アルキル基、Ｃ２２アルキル基、Ｃ２３アルキル基、Ｃ２４アルキル基、Ｃ２５アルキル基、Ｃ２６アルキル基、Ｃ２７アルキル基、Ｃ２８アルキル基、Ｃ２９アルキル基又はＣ３０アルキル基が、より好ましい。
また本発明の剤が、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含む場合のＲ３及びＲ４の好ましい一態様としては、それぞれＣ２９−３７アルキル基である。
【００３５】
一般式（Ｉ）におけるＸ１は、−Ｏ−、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−である。
【００３６】
Ｒ５における「Ｃ１−６アルキル基」は、上述のＲ１及びＲ２における「Ｃ１−６アルキル基」と同義であり、その具体例及び好適な態様も同様である。
【００３７】
Ｘ１の好ましい態様としては、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である。
【００３８】
Ｘ１のより好ましい態様としては、−ＮＨ−である。
【００３９】
一般式（Ｉ）におけるＸ２は、−Ｏ−、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）又は−Ｓ−である。
【００４０】
Ｒ６における「Ｃ１−６アルキル基」は、上述のＲ１及びＲ２における「Ｃ１−６アルキル基」と同義であり、その具体例及び好適な態様も同様である。
【００４１】
Ｘ２の好ましい態様としては、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である。
【００４２】
Ｘ２のより好ましい態様としては、−ＮＨ−である。
【００４３】
好適な化合物（Ｉ）の一態様としては、
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）であり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基（より好ましくはＣ１２−３５アルキル基）であり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）であり、
Ｘ２が、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である化合物（Ｉ）であり、
より好適には、
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルであり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基（より好ましくはＣ１２−３５アルキル基）であり、
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である
化合物（Ｉ）である。
【００４４】
好適な化合物（Ｉ）の他の態様としては、
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）であり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３２アルキル基（より好ましくはＣ１２−３０アルキル基、特に好ましくはＣ１２−２１アルキル基又はＣ２８−３０アルキル基）であり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）であり、
Ｘ２が、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である
化合物（Ｉ）である。
【００４５】
より好適な化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルであり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３２アルキル基（より好ましくはＣ１２−３０アルキル基、特に好ましくはＣ１２−２１アルキル基又はＣ２８−３０アルキル基）であり、
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である
化合物（Ｉ）である。
【００４６】
好適な化合物（Ｉ）の具体例としては、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
等が挙げられる。
【００４７】
化合物（Ｉ）は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、又は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルがより好ましく、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、又は、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルが特に好ましい。
【００４８】
なお、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルを除く化合物（Ｉ）（例えば、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル等）は、新規化合物である。
【００４９】
（化合物（Ｉ）の合成）
以下、化合物（Ｉ）の製造法について説明する。
化合物（Ｉ）の製造法の例として、代表的な製造法を以下に述べるが、製造法はこれらに限定されない。
【００５０】
化合物（Ｉ）の中でも、Ｒ３とＲ４が同一である化合物（Ｉａ）は、例えば、下記反応式Ａまたはこれに準ずる方法を用いて製造することができる。
【００５１】
【化６】
0006458809.tif 000007
【００５２】
［式中、Ｒ３ａは、Ｒ３またはＲ４と同義であり、その他の記号は上記の定義の通りである。］
化合物（Ｉａ）は、化合物（ａ）を化合物（ｂ）と縮合剤の存在下にて反応させることにより製造することができる。
化合物（ｂ）の使用量は、化合物（ａ）１当量に対して、通常１．５〜１０当量、好ましくは２〜４当量である。
縮合剤としては、例えば、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−モルホリノエチルカルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（４−ジエチルアミノシクロヘキシル）カルボジイミド、１，３−ジエチルカルボジイミド、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド類またはその塩等が挙げられる。
縮合剤の使用量は、化合物（ａ）１当量に対して、通常１．５〜１０当量、好ましくは２〜４当量である。
本反応は、所望により塩基の存在下で行ってもよい。
塩基としては、例えば、水酸化アルカリ金属類（例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）、水酸化アルカリ土類金属類（例えば、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等）、炭酸アルカリ金属類（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、炭酸水素アルカリ金属類（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）、有機塩基類（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、ピコリン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］−５−ノネン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、テトラメチルグアニジン等）、有機リチウム類（例えば、メチルリチウム、ｎ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム等）、リチウムアミド類（例えば、リチウムジイソプロピルアミド等）等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物（ａ）１当量に対して、通常１．５〜１０当量、好ましくは２〜６当量である。
さらに、本反応は、所望により、縮合促進剤の存在下で行ってもよい。
縮合促進剤としては、例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）またはその水和物等が挙げられる。
縮合促進剤の使用量は、化合物（ａ）１当量に対して、通常０．０１〜１０当量、好ましくは１〜４当量である。
【００５３】
また、本反応では、化合物（ｂ）の代わりに化合物（ｂ）の混合酸無水物を用いてもよい。該混合酸無水物は、例えば、まず、化合物（ｂ）とクロロ炭酸アルキル（例えば、クロロ炭酸メチル、クロロ炭酸エチル、クロロ炭酸イソブチル）等とを塩基の存在下に反応させることにより得ることができる。
【００５４】
本反応は、反応に不活性な溶媒中で行うことが好ましい。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、エーテル類（例えば、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル）、エステル類（例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸ブチル）、ハロゲン化炭化水素類（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トリクロロエチレン）、炭化水素類（例えば、ヘキサン、ベンゼン、トルエン）、アミド類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）、スルホキシド類（例えば、ジメチルスルホキシド）等が挙げられる。これらの溶媒は、２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
反応温度は、通常、−８０〜１５０℃であり、好ましくは、１０〜１００℃である。
反応時間は、通常、０．５〜４８時間であり、好ましくは、１０〜３０時間である。
【００５５】
一方、化合物（Ｉ）の中でも、Ｒ３とＲ４が異なる化合物（Ｉｂ）：
【００５６】
【化７】
0006458809.tif 000008
【００５７】
［式中、Ｒ３ｂはＲ３と同義であり、Ｒ４ｂはＲ４と同義であり、その他の記号は上記の定義の通りである。］
を得る方法としては、例えば、上記反応式Ａと同様の方法により、化合物（ａ）とＲ３ｂＣＯＯＨおよびＲ４ｂＣＯＯＨの混合物とを反応させ、Ｒ３とＲ４が同一の化合物との混合物として得る方法、あるいは下記工程（１）〜（３）により得る方法等が挙げられる。
【００５８】
（１）化合物（ａ）のＸ２に保護基を導入した化合物を、上記反応式Ａと同様の方法により、Ｒ３ｂＣＯＯＨと反応させる工程；
（２）得られた化合物を脱保護する工程；および
（３）得られた化合物を、上記反応式Ａと同様の方法により、Ｒ４ｂＣＯＯＨと反応させる工程。
【００５９】
保護基はペプチド化学等で一般的に用いられるような保護基を用いればよく、保護基の導入方法あるいは除去方法としては、自体公知の方法を用いればよく、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８０）に記載の方法等に準じて行うことができる。
なお、化合物（ａ）は、市販されているものを容易に入手でき、あるいは自体公知の方法またはそれに準ずる方法に従って製造することもできる。例えば、Ｘ１又はＸ２が−ＮＨ−である化合物（ａ）は、システインアルキルエステルを酸化剤等の存在下において反応させ、それらのチオール基がジスルフィド結合を形成することによって製造することができる。自体公知の方法、例えば、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，６０（１１），ｐｐ．３２６６−３２６７（１９９５）に記載の方法を使用することができる。システインジアルキルエステルは、例えば、アルキルが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｉｓｏ−ヘキシル等である市販品として容易に入手できる。例えば、Ｘ１又はＸ２が−Ｏ−である化合物（ａ）は、前記の方法において、３−メルカプト乳酸アルキルエステルを、システインアルキルエステルの存在下で使用することにより製造することができる。３−メルカプト乳酸アルキルエステルは、例えば、アルキルが、メチル、エチル等である市販品として容易に入手できる。
【００６０】
Ｒ３とＲ４が異なる化合物（Ｉ）を得る他の方法としては、例えば、１）アシル基が異なる２種のアシルシステインを、これらのチオール基がジスルフィド結合を形成するように酸化剤等の存在下にて反応させる方法、２）アシルシステインのチオール基に、チオール基とジスルフィド結合を形成し得る官能基（例、ピリジンスルフェニル基等）を導入した化合物を、異なるアシル基を有するアシルシステインと反応させる方法、３）シスチンの２個のアミノ基に対し、それぞれ異なるアシル化剤等を用いて異なるアシル基を導入する方法等が挙げられる。
前記１）の方法は、例えば、国際公開第２００９／１４３２９９号に記載の方法等に準じて行うことができる。前記２）の方法のうち、アシルシステインのチオール基に、チオール基とジスルフィド結合を形成し得る官能基（例、ピリジンスルフェニル基等）を導入する工程は、例えば、ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（６），ｐｐ．１２８３−１２９０（２０１３）に記載の方法等に準じて行うことができ、該工程により得られた化合物をアシルシステインと反応させる工程は、例えば、国際公開第２０１０／１４７８３１号に記載の方法等に準じて行うことができる。前記３）の方法は、例えば、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，５２（１），ｐｐ．４２５−４４２（２０００）に記載の方法等に準じて行うことができる。
【００６１】
上記のような方法により生成した化合物（Ｉ）は、例えば、カラムクロマトグラフィー、再結晶、溶媒洗浄等の通常の分離手段により単離、精製することができる。
【００６２】
化合物（Ｉ）が、光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体を含有する場合には、これらも化合物（Ｉ）として含有されるとともに、自体公知の合成手法、分離手法（濃縮、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、再結晶、溶媒洗浄等）によりそれぞれを単品として得ることができる。例えば、化合物（Ｉ）に光学異性体が存在する場合には、該化合物から分割された光学異性体も化合物（Ｉ）に包含される。
【００６３】
光学異性体は自体公知の方法により製造することができる。具体的には、光学活性な合成中間体を用いる、又は、最終物のラセミ体を常法に従って光学分割することにより光学異性体を得る。
【００６４】
化合物（Ｉ）は結晶であってもよく、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても化合物（Ｉ）に包含される。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。
【００６５】
化合物（Ｉ）は、水和物、非水和物、溶媒和物、無溶媒和物のいずれであってもよい。
【００６６】
同位元素（例、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ）等で標識された化合物（Ｉ）も、本発明化合物に包含される。
【００６７】
化合物（Ｉ）は、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）を有するので、免疫賦活剤として有用である。本発明の免疫賦活剤（以下、単に「本発明の剤」と略記することがある）は、化合物（Ｉ）そのものであってよく、あるいは、化合物（Ｉ）を、薬理学的に許容し得る担体等を用いて製剤化することにより得られるものであってもよい。
【００６８】
本発明の剤が含有してもよい薬理学的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【００６９】
本発明の剤は、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含んでよい。本発明の剤は、α−シクロデキストリンを更に含む場合、化合物（Ｉ）の分散性が改善し、更には、驚くべきことにその抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）までも向上し得る。化合物（Ｉ）のうち、Ｒ３及びＲ４で示されるアルキル基の炭素原子数が１２以上３７以下（例えば、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１３アルキル基、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１６アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ１８アルキル基、Ｃ１９アルキル基、Ｃ２０アルキル基、Ｃ２１アルキル基、Ｃ２２アルキル基、Ｃ２３アルキル基、Ｃ２４アルキル基、Ｃ２５アルキル基、Ｃ２６アルキル基、Ｃ２７アルキル基、Ｃ２８アルキル基、Ｃ２９アルキル基、Ｃ３０アルキル基、Ｃ３１アルキル基、Ｃ３２アルキル基、Ｃ３３アルキル基、Ｃ３４アルキル基、Ｃ３５アルキル基、Ｃ３６アルキル基又はＣ３７アルキル基）であればよいが、特に、化合物（Ｉ）のうち、Ｒ３及びＲ４で示されるアルキル基の炭素原子数が２９以上のものと２９未満のものの分散性を比較すると、前者は後者に比べて生理食塩水等における分散性が低い傾向にあり、従ってＲ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である化合物（Ｉ）を含む本発明の剤の場合、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含むことがより効果的で好ましい。但し、α−シクロデキストリンの添加によるより良好な効果を得るために、本発明の剤が更にα−シクロデキストリンを化合物（Ｉ）に加えて含むとしても、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基であり、好ましくはＣ１２−３５アルキル基である。特にＣ１２−３２アルキル基が好ましく、Ｃ１２−３０アルキル基がより好ましい。具体的には、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１３アルキル基、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１６アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ１８アルキル基、Ｃ１９アルキル基、Ｃ２０アルキル基、Ｃ２１アルキル基、Ｃ２２アルキル基、Ｃ２３アルキル基、Ｃ２４アルキル基、Ｃ２５アルキル基、Ｃ２６アルキル基、Ｃ２７アルキル基、Ｃ２８アルキル基、Ｃ２９アルキル基又はＣ３０アルキル基が、より好ましい。ＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用に特に優れることから、Ｃ１２−２１アルキル基又はＣ２８−３０アルキル基が特に好ましい。例えば、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ２１アルキル基又はＣ２９アルキル基が特に好ましい。
【００７０】
本発明の剤が、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含む場合、好適な化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）であり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基であり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）であり、
Ｘ２が、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である化合物（Ｉ）であり、
より好適には、
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルであり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基であり、
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である化合物（Ｉ）である。
また、更に、より効果的である観点で、本発明の剤が、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含む場合、より一層好適な化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）であり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基であり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）であり、
Ｘ２が、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である化合物（Ｉ）であり、
更に好適には、
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルであり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基であり、
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である化合物（Ｉ）である。
【００７１】
本発明の剤が、化合物（Ｉ）に加え、α−シクロデキストリンを更に含む場合の好適な化合物（Ｉ）の具体例としては、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
等が挙げられ、
更に、より効果的である観点で、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
等が挙げられる。
【００７２】
本発明においてα−シクロデキストリンとは、６個のＤ−グルコースがα１→４結合で環状構造を形成してなる環状オリゴ糖をいう。
【００７３】
本発明において用いられるα−シクロデキストリンは、誘導体の形態であってもよい。そのような誘導体としては、α−シクロデキストリンの骨格を有するものであれば特に制限されないが、例えば、α−シクロデキストリンに、メチル化等の化学修飾やマルトシル化等の酵素修飾を施した誘導体等が挙げられる。
【００７４】
本発明において用いられるα−シクロデキストリンは、例えば、澱粉をシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼによって酵素変換すること等によって製造できるが、それに限定されるものでなく、自体公知の方法で製造すればよい。また市販品を用いてもよく、簡便であることから好ましい。
【００７５】
本発明の剤における化合物（Ｉ）とα−シクロデキストリンとの重量比（化合物（Ｉ）：α−シクロデキストリン）は、特に制限されないが、１：０．０００２〜２．００００が好ましく、１：０．００２〜０．２がより好ましい。
【００７６】
本発明の剤の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠を含む）、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の経口剤；及び注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、点滴剤）、外用剤（例、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤）、ペレット、点滴剤、点眼剤、経肺剤（吸入剤）等の非経口剤が挙げられる。また、これらの製剤は、速放性製剤または徐放性製剤などの放出制御製剤（例、徐放性マイクロカプセル）であってもよい。
【００７７】
本発明の剤を経口剤とする場合は、必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティングを行ってもよい。コーティングに用いられるコーティング基剤としては、公知の各種コーティング基剤が挙げられる。
【００７８】
本発明の剤は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、第十六改正日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。
【００７９】
本発明の剤は、成人用に加えて、小児用の製剤とすることもできる。
【００８０】
本発明の剤の投与対象は、免疫系を有する動物であれば特に制限されず、例えば、ほ乳類（例、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）、鳥類（例、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等）等が挙げられる。本発明の剤は、これらに対し、経口的または非経口的（例、局所、直腸、静脈投与）に安全に投与することができる。
【００８１】
化合物（Ｉ）の、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）のメカニズムは明らかでないが、後述の実施例に示されるように抗原提示細胞（例、単球細胞、マクロファージ、樹状細胞等）に作用し、その細胞増殖を促進することにより、抗原特異的なＩｇＧ１抗体産生を増強していると考えられる。従って本発明の剤は、抗原提示細胞の増殖促進剤として有用である。
【００８２】
化合物（Ｉ）は、後述の実施例に示されるように優れたアジュバント活性を有していることから、本発明の剤は、アジュバントとして有用である。
本発明において「アジュバント」とは、抗原と組み合わせることで抗体産生の増大、免疫応答の増強を起こす物質の総称である。
【００８３】
本発明の剤をアジュバントとして用いる場合、その剤形は、例えば、水性又は非水性（例、油性等）の溶液、懸濁液、エマルション等であってよい。これらは、化合物（Ｉ）と薬理学的に許容し得る担体（例、溶剤、懸濁化剤等）とを混合し、例えば、手振り、機械的振盪、超音波分散、ホモミキサーによる分散、自己乳化、膜乳化、Ｄ相乳化法、真空乳化法、超高圧乳化法等の方法により調製できる。
【００８４】
本発明の剤は、他のアジュバントと併用してもよい。他のアジュバントとしては、例えば、フロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、フロイント完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、微粒子（例えば、尿酸結晶、シリカ、水酸化アルミニウムゲル、ポリスチレン、アスベスト、二酸化チタン、黒酸化ニッケル等）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、フラジェリン、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、β−グルカン、キトサン、サポニン、スクアレン、α−ガラクトシルセラミド、リポペプチド（例、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ３ＣＳＫ４等）、リポソーム、核酸（例、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＣｐＧ、ポリイノシンポリシチジル酸Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）等)、プロバイオティクス乳酸菌（例、ラクトバチラス プランタルム、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチラス ラクティス等）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α等）等が挙げられる。
【００８５】
本発明は、本発明の剤（又は化合物）及び抗原を含有するワクチンも提供する。本発明のワクチンに含まれる化合物は、本発明の剤に含まれる化合物（Ｉ）と同様のものを用いてよい。本発明のワクチンが含有してもよい化合物の例としては、本発明の剤に含まれる化合物として例示したものと同様のものが挙げられる。
【００８６】
本発明において用いられる抗原は、免疫反応を誘導し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、アレルゲン、病原体抗原、生体内の自己抗原、腫瘍抗原等が挙げられる。
【００８７】
本発明において用いられるアレルゲンは、花粉アレルゲン、食物アレルゲン、又はハウスダストアレルゲンであり得る。花粉アレルゲンとしては特に制限されないが、例えば、スギ花粉アレルゲン、ヒノキ花粉アレルゲン、ブタクサアレルゲン、カモガヤアレルゲン等が挙げられる。食物アレルゲンとしては特に制限されないが、例えば、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミン等が挙げられる。ハウスダストアレルゲンとしては例えば特に制限されないが、例えば、ダニ類アレルゲン、ネコアレルゲン等が挙げられる。
【００８８】
本発明において用いられる病原体抗原は、病原性ウイルス抗原、病原性微生物抗原、又は病原性原生動物抗原であり得る。病原性ウイルス抗原としては特に限定されないが、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルス（例、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎ウイルス等）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイル熱ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例、ＨＴＬＶ−Ｉ等）、ポリオウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、ＲＳウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルス等のウイルスの抗原が挙げられるが、特にインフルエンザウイルスの抗原が好ましく用いられる。病原性微生物抗原としては特に制限されないが、例えば、病原性細菌（例、ヘモフィルスＢ型インフルエンザ菌（Ｈｉｂ）、肺炎球菌、破傷風菌、ジフテリア菌、百日咳菌、コレラ菌、サルモネラ菌、チフス菌、クラミジア、ミコバクテリア、レジオネラ等）、病原性酵母（例、アスペルギルス、カンジダ等）等に発現している抗原が挙げられる。病原性原生動物抗原としては特に制限されないが、例えば、マラリア、住血吸虫等に発現している抗原が挙げられる。
【００８９】
本発明において用いられる生体内の自己抗原としては特に制限はされないが、例えば、アルツハイマー病やクロイツ・フェルトヤコブ病等の神経疾患におけるアミロイドβ、プリオン；動脈硬化症や高血圧症等の循環器疾患におけるＡｐｏＢ１００、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ；Ｉ型糖尿病や気管支喘息等の自己免疫・アレルギー疾患におけるインスリン、ＩＬ−５；慢性関節リウマチにおけるＩＬ−６、ＴＮＦ−α等が挙げられる。
【００９０】
本発明において用いられる腫瘍抗原は、上皮性及び非上皮性腫瘍を含む固形腫瘍の抗原、又は造血組織における腫瘍の抗原であり得る。固形腫瘍抗原としては特に限定されないが、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質２（ｔｒｐ２）、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、ＴＡＧ−７２、ＡＥＳ、ＦＢＰ、Ｃ−レクチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｇａｌｅｃｔｉｎ−４／ＮＹ−ＣＯ−２７、Ｐｅｃ６０、ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ−２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、Ｇ２５０、Ｈｓｐ１０５、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、癌胎児性抗原等が挙げられる。造血組織における腫瘍（例、白血病）の抗原としては特に限定されないが、例えば、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ３、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴ、ＰＲＡＭＥ、ＰＭＬ／ＲＡＲ−ａ、ＤＥＫ／ＣＡＮ、シクロフィリンＢ、ＴＥＬ−ＭＡＬ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ｉｄｉｏｔｙｐｅ、Ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７、ＳＰＡＮ−Ｘｂ、ＣＴ−２７、ＭＵＣ１等が挙げられる。
【００９１】
本発明のワクチンは、経口投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、気管内投与、鼻腔投与（経鼻投与）、眼内投与、膣内投与、直腸投与、静脈内投与、小腸内投与及び吸入投与からなる群から選択されるルートにより投与され得、特に、皮下投与又は鼻腔投与（経鼻投与）投与が好ましい。
【００９２】
本発明のワクチンにおける抗原の含有量は、ワクチンとして機能する有効量であればよく、当該量は当業者であれば、例えば実験動物を使用する試験等に基づき、過度の実験を必要とすることなく決定することができる。具体的には、本発明のワクチンにおける抗原の含有量は、通常１〜１００μｇである。
【００９３】
本発明のワクチンにおける本発明の免疫賦活剤の含有量は、例えば抗原の種類、投与対象、投与形態及び投与ルート等に応じて適宜調節すればよく特に制限されないが、経口投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与の場合は、通常２μｇ〜２０ｍｇであり、好ましくは２０μｇ〜２００μｇである。気管内投与、鼻腔投与（経鼻投与）、眼内投与、膣内投与、直腸投与、静脈内投与、小腸内投与又は吸入投与の場合は、通常０．０１μｇ〜１ｍｇであり、好ましくは０．１μｇ〜１００μｇである。
【００９４】
本発明のワクチンは、本発明の免疫賦活剤及び抗原に加え、薬理学的に許容し得る担体を含有してもよい。本発明のワクチンが含有してもよい薬理学的に許容し得る担体の例としては、本発明の剤が含有してもよい薬理学的に許容し得る担体として例示したものと同様のものが挙げられる。
【００９５】
本発明のワクチンは、さらに他のアジュバントを含有してもよい。当該他のアジュバントの例としては、本発明の剤と併用し得るアジュバントとして例示したものと同様ものが挙げられる。
【００９６】
本発明のワクチンの剤形の例としては、本発明の剤の剤形として例示したものと同様のものが挙げられる。
【００９７】
本発明のワクチンは、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、第十六改正日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。例えば、本発明の剤と所望の抗原とを混合し、必要により乳化又は分散させること、或いは、所望の抗原を含有するワクチンに本発明の剤を添加し、必要により乳化又は分散させること等により調製することができる。
【００９８】
本発明のワクチンの投与対象は、免疫系を有する動物であれば特に制限されず、その例としては、本発明の剤の投与対象として例示したものと同様のものが挙げられる。
【００９９】
本発明のワクチンの投与は、単回投与であってよく、又は複数回の連続投与であってもよい。本発明のワクチンを連続投与する場合、投与期間は特に限定されず、例えば抗原の種類、投与対象、投与形態及び投与ルート等に応じて、適宜設定すればよいが、通常１〜９０日間の範囲であり、好ましくは１〜３０日間の範囲である。
【０１００】
本発明のワクチンを対象に投与することにより、アレルギー症、感染症又は腫瘍等を予防又は治療することができる。
【０１０１】
本発明は、化合物（Ｉ）及びα−シクロデキストリンを含む医薬組成物（以下、単に「本発明の組成物」と略記することがある）も提供する。
【０１０２】
本発明の組成物に含まれる化合物（Ｉ）は、本発明の剤に含まれる化合物（Ｉ）と同様のものを用いてよいが、α−シクロデキストリンによって分散性が改善し、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用が向上するという効果がより顕著に発揮され得る点で、Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基である化合物（Ｉ）が好ましい。但し、α−シクロデキストリンの添加によるより良好な効果を得るために、本発明の組成物が化合物（Ｉ）及びα−シクロデキストリンを含むとしても、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基であり、好ましくはＣ１２−３５アルキル基である。特にＣ１２−３２アルキル基が好ましく、Ｃ１２−３０アルキル基がより好ましい。具体的には、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１３アルキル基、Ｃ１４アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１６アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ１８アルキル基、Ｃ１９アルキル基、Ｃ２０アルキル基、Ｃ２１アルキル基、Ｃ２２アルキル基、Ｃ２３アルキル基、Ｃ２４アルキル基、Ｃ２５アルキル基、Ｃ２６アルキル基、Ｃ２７アルキル基、Ｃ２８アルキル基、Ｃ２９アルキル基又はＣ３０アルキル基がより好ましい。ＩｇＧ１サブクラス抗体産生増強効果に特に優れることから、Ｃ１２−２１アルキル基又はＣ２８−３０アルキル基が特に好ましい。例えば、Ｃ１２アルキル基、Ｃ１５アルキル基、Ｃ１７アルキル基、Ｃ２１アルキル基又はＣ２９アルキル基が特に好ましい。
【０１０３】
本発明の組成物に含まれる好適な化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）であり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基であり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）であり、
Ｘ２が、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である化合物（Ｉ）であり、
より好適には、
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルであり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ１２−３７アルキル基であり、
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である化合物（Ｉ）である。
【０１０４】
また、更に、より効果的である観点で、本発明の組成物に含まれるより一層好適な化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１及びＲ２が、同一又は異なって、それぞれＣ１−３アルキル基（例、メチル等）であり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基であり、
Ｘ１が、−ＮＲ５−（式中、Ｒ５は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）であり、
Ｘ２が、−ＮＲ６−（式中、Ｒ６は、水素原子又はＣ１−６アルキル基を示す）である化合物（Ｉ）である。
本発明の組成物に含まれる更に好適な化合物（Ｉ）としては、
Ｒ１及びＲ２が、それぞれメチルであり、
Ｒ３及びＲ４が、同一又は異なって、それぞれＣ２９−３７アルキル基であり、
Ｘ１及びＸ２が、それぞれ−ＮＨ−である
化合物（Ｉ）である。
【０１０５】
本発明の組成物に含まれる好適な化合物（Ｉ）の具体例としては、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、及び、
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
等が挙げられ、
更に、より効果的である観点で、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル、
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル
等が挙げられる。
【０１０６】
本発明の組成物に含まれるα−シクロデキストリンは、本発明の剤に含まれ得るα−シクロデキストリンと同様のものを用いてよい。
【０１０７】
本発明の組成物における化合物（Ｉ）の含有量は特に制限されないが、０．１〜９９．９重量％が好ましく、１〜９９重量％がより好ましい。
【０１０８】
本発明の組成物におけるα−シクロデキストリンの含有量は特に制限されないが、０．００５〜２０重量％が好ましく、０．０５〜５重量％がより好ましい。
【０１０９】
本発明の組成物における化合物（Ｉ）の含有量とα−シクロデキストリンの含有量の重量比（化合物（Ｉ）：α−シクロデキストリン）は特に制限されないが、１：０．０００２〜２．００００が好ましく、１：０．００２〜０．２がより好ましい。
【０１１０】
本発明の組成物は、化合物（Ｉ）及びα−シクロデキストリンに加え、薬理学的に許容し得る担体を含有してもよい。本発明の組成物が含有してもよい薬理学的に許容し得る担体の例としては、本発明の剤が含有してもよい薬理学的に許容し得る担体として例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１１１】
本発明の組成物の剤形の例としては、本発明の剤の剤形として例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１１２】
本発明の組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、第十六改正日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。
【０１１３】
本発明の組成物の投与対象の例としては、本発明の剤の投与対象として例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１１４】
本発明の組成物は、化合物（Ｉ）とα−シクロデキストリンとが分離されて包装されたキットの態様で提供されてもよい。
【０１１５】
本発明の組成物は、抗原特異的なＩｇＧ１サブクラス抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）を有し、例えば、免疫賦活剤等として用いてよい。
【実施例】
【０１１６】
以下に、合成例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの合成例及び実施例により限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【０１１７】
〔合成例１〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）の合成
パルミチン酸（９００ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７．４ｍｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７３ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（５３８ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて撹拌した。撹拌開始から１時間後と２時間後にそれぞれＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３．７ｍｌ）を追加し、室温にてさらに１９時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（４０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、トルエン（２００ｍｌ）で２回抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）、１５％食塩水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物をヘキサン（２０ｍｌ）でスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（８７４ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、収率８０％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝６．８  Ｈｚ），  １．２５−１．３０（ｍ，  ２４Ｈ），  １．６４（ｍ，  ２Ｈ），  ２．２５（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．３  Ｈｚ），  ３．１９（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．２２（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．７７（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８８（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ５．１  Ｈｚ），  ６．４０（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ７４５．６（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ７６７．５（［Ｍ＋Ｎａ］＋），  ７８３．５（［Ｍ＋Ｋ］＋）．
【０１１８】
〔合成例２〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）の合成
イソステアリン酸（９９９ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．８ｍｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７３ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（５３８ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて２０時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、酢酸エチル（１００ｍｌ、５０ｍｌ）で抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍｌ）、１５％食塩水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物をヘキサン（５０ｍｌ）でスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（７３８ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、収率６３％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８７（ｍ，  ６Ｈ），  １．２５−１．３０（ｍ，  ２４Ｈ），  １．４３（ｍ，  ２Ｈ），  １．５８（ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２（ｍ，  １Ｈ），  ３．１８（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２  Ｈｚ，  １４．１  Ｈｚ），  ３．２３（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．４  Ｈｚ，  １４．１  Ｈｚ），  ３．７７（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８７（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ５．３  Ｈｚ），  ６．４０（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ８０１．６（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ８２３．６（［Ｍ＋Ｎａ］＋）．
【０１１９】
〔合成例３〕
Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３’）の合成
５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタン酸（１．１４ｍｌ、３．５２ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．８ｍｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７３ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（５３８ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて１８時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（５０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、酢酸エチル（５０ｍｌ）で２回抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）、１５％食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物をヘキサンでスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル（５４１ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、収率４６％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８７−０．９２（ｍ，  ２４Ｈ），  ０．９６−１．９２（ｍ，  １１Ｈ），  ３．１３−３．２４（ｍ，  ２Ｈ），  ３．７６（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８５−４．８７（ｍ，  １Ｈ），  ６．３６−６．４１（ｍ，  １Ｈ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ８０１．８（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ８２３．９（［Ｍ＋Ｎａ］＋），  ８３５．８（［Ｍ＋Ｃｌ］−）．
【０１２０】
〔合成例４〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）の合成
ラウリン酸（７０５ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．８ｍｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７５ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４７６ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて１８時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、酢酸エチル（１００ｍｌ）で２回抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）、１５％食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物を酢酸エチル２０ｍｌでスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（３６５ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、収率３９％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ），  １．２６−１．３２（ｍ，  １６Ｈ），  １．６０−１．６８（ｍ，  ２Ｈ），  ２．２６（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．６  Ｈｚ），  ３．１８（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．２３（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．７７（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８８（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ５．１  Ｈｚ），  ６．４４（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ６３３．２（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ６５５．３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）．
【０１２１】
〔合成例５〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）の合成
トリデカン酸（７５５ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．８ｍｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７５ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４７６ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて１７時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出を行った。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）で２回、１５％食塩水（２０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物を酢酸エチル（２０ｍｌ）でスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（６３０ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、収率６５％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ），  １．２５−１．３２（ｍ，  １８Ｈ），  １．６０−１．６８（ｍ，  ２Ｈ），  ２．２６（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．６  Ｈｚ），  ３．１８（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．２３（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．７７（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８８（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．５  Ｈｚ，  ５．１  Ｈｚ），  ６．４４（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ６６１．５（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ６８３．５（［Ｍ＋Ｎａ］＋）．
【０１２２】
〔合成例６〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）の合成
ステアリン酸（１．００ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．８ｍｌ）、Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７５ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４７６ｍｇ、３．５２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて２３時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、酢酸エチル（１０００ｍｌ）を加え、沈殿を濾過した。濾別した固体を酢酸エチル（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（５４３ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ、収率４６％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ），  １．２５−１．３４（ｍ，  ２８Ｈ），  １．６０−１．６８（ｍ，  ２Ｈ），  ２．２６（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．６  Ｈｚ），  ３．１７（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．２３（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．８２（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８７（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ５．１  Ｈｚ），  ６．４２（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．７  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ８０１．６（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ８３５．５（［Ｍ＋Ｃｌ］−）．
【０１２３】
〔合成例７〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）の合成
Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）に対し、１，２−ジクロロエタン（２．９ｍｌ）、メリシン酸（３１９ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１３５ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（９５ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１６ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して７５℃にて１９．５時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾別した固体をヘキサン／酢酸エチル（１／３）、１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水で洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（２２９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、収率６９％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ），  １．２５−１．３８（ｍ，  ５２Ｈ），  １．５９−１．６４（ｍ，  ２Ｈ），  ２．３７（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．７  Ｈｚ），  ３．１７（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．５  Ｈｚ，  １４．５  Ｈｚ），  ３．２４（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．１  Ｈｚ，  １４．４  Ｈｚ），  ３．８２（ｓ，  ３Ｈ），  ４．９２（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ５．４  Ｈｚ），  ６．９４（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．７  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  １１３８．３（［Ｍ＋Ｈ］＋）．
【０１２４】
〔合成例８〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）の合成
Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（２５０．０ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）に対し、ジクロロメタン（４．９ｍｌ）、２−テトラデシルヘキサデカン酸（７９６．９ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３３７．４ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２３７．８ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．４１ｍｌ、２．９４ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて２２時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、ジクロロメタン（１００ｍｌ、５０ｍｌ）で抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）で２度洗浄し、水（３０ｍｌ）、１５％食塩水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物をジエチルエーテル（２０ｍｌ）でスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（５４６．１ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、収率６５％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｍ，  ６Ｈ），  １．２５（ｍ，  ４８Ｈ），  １．４０（ｍ，  ２Ｈ），  １．６０（ｍ，  ２Ｈ），  ２．１１（ｍ，  １Ｈ），  ３．１６（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．２４（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．５  Ｈｚ，  １４．４  Ｈｚ），  ３．７７（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８６（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．４  Ｈｚ，  ７．４  Ｈｚ），  ６．４０（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．５  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  １１３８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋）
【０１２５】
〔合成例９〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）の合成
Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（１００．０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）に対し、ジクロロメタン（２．０ｍｌ）、２−オクタデシルエイコサン酸（３９７．８ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１３５．０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（９５．１ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１６ｍｌ、１．１６ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて１７時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（１０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、ジクロロメタン（６０ｍｌ）で３度抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（６０ｍｌ）で２度洗浄し、水（６０ｍｌ）、１５％食塩水（６０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物をヘキサン（２０ｍｌ、５０ｍｌ）でスラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（２６２．０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、収率６６％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８８（ｍ，  ６Ｈ），  １．２５（ｍ，  ６４Ｈ），  １．４２（ｍ，  ２Ｈ），  １．６３（ｍ，  ２Ｈ），  ２．１２（ｍ，  １Ｈ），  ３．１６（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２  Ｈｚ，  １４．１  Ｈｚ），  ３．２４（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．４  Ｈｚ，  １４．１  Ｈｚ），  ３．７６（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８６（ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ５．３  Ｈｚ），  ６．４０（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ）．  
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  １３６２．４（［Ｍ＋Ｈ］＋）
【０１２６】
〔合成例１０〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（リノレオイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２８）の合成
Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩（５００ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（９．８ｍｌ）、リノール酸（１．１２ｇ、３．５１ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（６７３ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５３８ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．８２ｍｌ、５．８６ｍｍｏｌ）を加えた後、氷浴を外して室温にて２０時間撹拌した。１０％クエン酸水溶液（３０ｍｌ）を加えて反応を停止した後、酢酸エチル（３０ｍｌ）を用いて２度抽出を行った。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（４０ｍｌ）、１５％食塩水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて乾燥した後、濾過を行い、濾液を減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製した後、ヘキサンから再結晶することで、Ｎ，Ｎ’−ビス（リノレオイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（４５０．４ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、収率３９％）を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）δ：  ０．８９（ｔ，  ３Ｈ，  Ｊ＝６．９  Ｈｚ），  １．２７−１．３７（ｍ，  １４Ｈ），  １．６４（ｍ，  ２Ｈ），  ２．０５（ｍ，  ４Ｈ），  ２．２６（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝７．６  Ｈｚ），  ２．７７（ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝６．７  Ｈｚ），  ３．１８（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．２  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．２３（ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．０  Ｈｚ，  １４．２  Ｈｚ），  ３．７７（ｓ，  ３Ｈ），  ４．８８（ｄｔ，  １Ｈ、Ｊ＝７．４  Ｈｚ，  ５．１  Ｈｚ），  ５．２８−５．４２（ｍ，  ４Ｈ），  ６．３９（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ）．
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）：  ７９３．５（［Ｍ＋Ｈ］＋），  ８１５．５（［Ｍ＋Ｎａ］＋）．
【０１２７】
〔合成例１１〕
Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ６６）の合成
Ｌ−シスチンジメチルエステル塩酸塩 (２５０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）に対し、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）、ベヘン酸 (５９７ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）を室温にて加えた後、氷浴を用いて冷却した。得られた混合物に対し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３３６ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２３７ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．４１ｍｌ、２．９２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴を外して室温にて２０．５時間撹拌した。反応混合物に酢酸エチル（５０ｍｌ）を加えて濾過し、濾取した固体を酢酸エチル／ヘキサン（１／１、５０ｍｌ）でスラリー洗浄した。その後、得られた固体を酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解し、１０％クエン酸水溶液（５０ｍｌ）および水で洗浄し、有機層を濃縮した。得られた固体を酢酸エチル／ヘキサン（３／２、４０ｍｌ）で再度スラリー洗浄し、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル(ＳＺ６６) (３０７ｍｇ、０.３４ｍｍｏｌ、収率４６％)を白色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ: ０．８８（ｔ, ３Ｈ, ６．８Ｈｚ）, １．２５（ｍ，３６Ｈ）, １．６２(ｍ，２Ｈ),  ２．２５（ｔ, ２Ｈ,Ｊ＝７．６Ｈｚ）, ３．１８（ｄｄ, １Ｈ,Ｊ＝５．２Ｈｚ, １４．４Ｈｚ）, ３．２３（ｄｄ, １Ｈ,Ｊ＝５．２Ｈｚ, １４．２Ｈｚ）, ３．７７(s, ３Ｈ), ４．８７(ｄｔ, １Ｈ,Ｊ＝５．２Ｈｚ, ７．５Ｈｚ), ６．４０（ｄ, １Ｈ,Ｊ＝７．２Ｈｚ）. 
ＥＳＩＭＳ（ｍ／ｚ）: ９１３．７（［Ｍ＋Ｈ］＋）.
【０１２８】
（２）アジュバント活性試験
〔実施例１〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）のアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ＯＶＡ単独投与群）、（２）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）２．５６μｍｏｌ（水酸化アルミニウムゲルアジュバントに換算して０．２ｍｇ相当）（ＳＺ２３添加群）、（３）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びシスチンジメチルエステル（（ＣｙｓｓＯＭｅ）２）２．５６μｍｏｌ（シスチンジメチルエステル添加群）、（４）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びイソステアリン酸（ＩＳＡ）５．１２μｍｏｌ（イソステアリン酸添加群）、（５）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ、（ＣｙｓｓＯＭｅ）２２．５６μｍｏｌ及びＩＳＡ５．１２μｍｏｌ（シスチンジメチルエステルとイソステアリン酸の混合物添加群）を、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（５）と同様の溶液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて全採血、脾臓採取を実施し、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。実施例１、並びに下記の実施例２、４、７〜１０及び１３〜１６における抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定方法は以下のとおりである。
【０１２９】
〔抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定方法〕
９６ウェルプレートに５μｇ／ｍｌＯＶＡを１ウェルあたり１００μｌずつ加え、一晩４℃にてインキュベートした。インキュベート後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）にて３回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）／ＰＢＳ溶液にて室温で１〜２時間、ブロッキングした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの希釈済みの血清サンプルもしくはコントロールとして同量の５％ＦＣＳ／ＰＢＳ溶液を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの希釈済みのビオチン化抗マウスＩｇＧ１抗体を添加し、３７℃で４５分インキュベートした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの希釈済みの抗ビオチン−ＨＲＰ抗体を添加し、さらに３７℃で３０分インキュベートした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加し、室温にて１０〜１５分反応させた。その後、１ウェルあたり５０μｌの反応停止液（２Ｎ硫酸溶液）を加えて呈色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝４５０ｎｍ）を測定した。
【０１３０】
結果を図１に示す。
【０１３１】
図１に示される結果から明らかなように、ＳＺ２３添加群（図中：ＳＺ２３）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加した。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）にはアジュバント活性があることが確認された。また、シスチンジメチルエステル添加群（図中：（ＣｙｓｓＯＭｅ）２）、イソステアリン酸添加群（図中：ＩＳＡ）及びシスチンジメチルエステルとイソステアリン酸の混合物添加群（図中：ＩＳＡ＋（ＣｙｓｓＯＭｅ）２）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群と有意な差は見られなかった。これらの結果により、シスチンジメチルエステルとイソステアリン酸を縮合して得られるＮ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）に、アジュバント活性があることがわかった。
【０１３２】
〔実施例２〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）のアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ＯＶＡ単独投与群）、（２）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）２．５６μｍｏｌ（水酸化アルミニウムゲルアジュバントに換算して０．２ｍｇ相当）（ＳＺ２３；２．５６μｍｏｌ添加群）、（３）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びＳＺ２３；０．２５６μｍｏｌ（ＳＺ２３；０．２５６μｍｏｌ添加群）、（４）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びＳＺ２３；０．０２５６μｍｏｌ（ＳＺ２３；０．０２５６μｍｏｌ添加群）、（５）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及び水酸化アルミニウムゲルアジュバント２．５６μｍｏｌ（０．２ｍｇ）（ＡＬＵＭ添加群、陽性対照）、（６）生理食塩水（生理食塩水単独投与群）を、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（６）と同様の溶液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて全採血、脾臓採取を実施し、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。結果を図２に示す。
【０１３３】
図２に示される結果から明らかなように、ＳＺ２３；２．５６μｍｏｌ、０．２５６μｍｏｌ及び０．０２５６μｍｏｌ添加群（図中：２．５６、０．２５６及び０．０２５６）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、いずれも、ＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加し、ＡＬＵＭ添加群（図中：ＡＬＵＭ）と同程度であった。これらの結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）は、水酸化アルミニウムゲルアジュバントと同程度のアジュバント活性を有することが確認された。
【０１３４】
〔実施例３〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）のアレルギー誘導活性の評価試験
実施例２で得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の測定を行った。抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の測定方法は以下のとおりである。
【０１３５】
〔抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の測定方法〕
ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製のＤＳマウスＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  （ＯＶＡ）キットを用いた。プロトコールを以下に簡単に示す。
血清サンプルおよび検量線作成用の標準試薬に緩衝液を加えて希釈し、撹拌後、室温で１０分間静置する。ＩｇＥキャプチャー抗体が予め結合したプレートにサンプルおよび標準液を加え、撹拌後、室温で６０分間静置する。洗浄液で３回洗浄し、ＨＲＰ標識ＯＶＡを加えて、室温で３０分間静置する。洗浄液で３回洗浄し、基質液を加えて、暗所室温にて３０分間静置する。反応停止液を加えて撹拌し、直ちに吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝４５０ｎｍ）を測定する。
【０１３６】
結果を図３に示す。
【０１３７】
図３に示される結果から明らかなように、既報どおりＡＬＵＭ添加群（図中：ＡＬＵＭ）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加した。これに対し、ＳＺ２３；２．５６μｍｏｌ、０．２５６μｍｏｌ及び０．０２５６μｍｏｌ添加群（図中：２．５６、０．２５６及び０．０２５６）では、いずれも抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体産生の増加は観察されなかった。これらの結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）は、接種によるアレルギー誘発が課題となっている水酸化アルミニウムゲルアジュバントと比較して、アレルギー誘導活性が低いことが明らかとなった。
【０１３８】
〔実施例４〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）とＮ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）とのアジュバント活性の比較試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ＯＶＡ単独投与群）、（２）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）２．５６μｍｏｌ（ＳＺ２３添加群）、（３）生理食塩水に溶解したＯＶＡ１０μｇ及びＮ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）２．５６μｍｏｌ（ＳＺ２４添加群）、（４）生理食塩水（生理食塩水単独投与群）を、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（４）と同様の溶液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて全採血し、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。尚、ＳＺ２４は、特開平４−２３０３５９号公報に開示されている。結果を図４に示す。
【０１３９】
図４に示される結果から明らかなように、ＳＺ２３添加群（図中：ＳＺ２３）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加した。一方、ＳＺ２４添加群（図中：ＳＺ２４）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群と有意な差は見られなかった。これらの結果は、公知であるＮ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）に比べて、本発明のＮ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）のほうが、アジュバント活性が高いことを示している。
【０１４０】
〔実施例５〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）のヒト単球細胞株への免疫賦活効果の評価試験
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１を３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３時間インキュベートした。その後、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）を、最終濃度が４ｎＭ、４００ｎＭ、４μＭになるように添加し、２４時間培養した。ＴＨＰ−１の培養には、ＲＰＭＩ−１６４０にＦＢＳ（最終濃度１０％）、ペニシリン（最終濃度１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加したものを維持培地として用いた。継代は３日に一回行った。２４時間培養後、ＣＣＫ−８試薬（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、同仁化学社製）を各ウェルに１０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝４５０ｎｍ）を測定した。各ウェルの吸光度を培地のみを添加したウェルの吸光度で除したものを、Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）と定義し、当該ＳＩを用いて細胞増殖を評価した。結果を図５に示す。
【０１４１】
図５に示される結果から明らかなように、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルを最終濃度が４００ｎＭ、４μＭになるように添加したウェル（図中：ＳＺ２３  ４００ｎＭ、ＳＺ２３  ４μｍ）において、培地のみを添加したウェル（図中：Ｍｅｄｉｕｍｕ）に比べて有意な細胞増殖が見られた。この結果は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）には、単球細胞の増殖を促進させ、活性化する作用があることを示唆している。
【０１４２】
〔実施例６〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）のマウスマクロファージ様株細胞（ＲＡＷ）への免疫賦活効果の評価試験
マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷを３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３時間インキュベートした。その後、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）を、最終濃度が４ｎＭ、４００ｎＭ、４μＭになるように添加し、２４時間培養した。ＲＡＷの培養には、ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）にＦＢＳ（最終濃度１０％）、ペニシリン（最終濃度１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加したものを維持培地として用いた。継代は３日に一回行った。２４時間培養後、ＣＣＫ−８試薬（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、同仁化学社製）を各ウェルに１０μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの吸光度を培地のみ添加したウェルの吸光度で除したものを、実施例５と同様に、Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ）と定義し、当該ＳＩを用いて細胞増殖を評価した。結果を図６に示す。
【０１４３】
図６に示される結果から明らかなように、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステルを最終濃度が４ｎＭ、４００ｎＭ、４μＭになるように添加したウェル（図中：４ｎＭ、４００ｎＭ、４μＭ）において、培地のみを添加したウェル（図中：Ｍｅｄｉｕｍ）に比べて有意な細胞増殖が見られた。この結果は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）には、マクロファージの増殖を促進させ、活性化する作用があることを示唆している。
【０１４４】
〔実施例７〕Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）のアジュバント活性の評価試験
本試験は、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）に代えて、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）を使用したこと以外は、実施例４と同様の手順で行った。結果を図７に示す。
【０１４５】
図７に示される結果から明らかなように、ＳＺ２３添加群（図中：ＳＺ２３）及びＳＺ２２添加群（図中：ＳＺ２２）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、それぞれＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加した。これらの結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）も、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）と同様にアジュバント活性を持つことがわかった。
【０１４６】
〔実施例８〕Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）のアジュバント活性の評価試験
本試験は、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）に代えて、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）を使用したこと以外は、実施例４と同様の手順で行った。結果を図８に示す。
【０１４７】
図８に示される結果から明らかなように、ＳＺ３４添加群（図中：ＳＺ３４）、ＳＺ３５添加群（図中：ＳＺ３５）及びＳＺ３６添加群（図中：ＳＺ３６）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、それぞれＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加した。これらの結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）も、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）と同様にアジュバント活性を持つことがわかった。
【０１４８】
〔実施例９〕Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３’）のアジュバント活性の評価試験
本試験は、Ｎ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）に代えて、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３’）を使用したこと以外は、実施例４と同様の手順で行った。結果を図９に示す。
【０１４９】
図９に示される結果から明らかなように、ＳＺ２３’添加群の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ＯＶＡ）に比べて有意に増加した。これらの結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス［５，７，７−トリメチル−２−（１，３，３−トリメチルブチル）オクタノイル］−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３’）も、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）と同様にアジュバント活性を持つことがわかった。
【０１５０】
〔実施例１０〕Ｎ，Ｎ’−ビス（リノレオイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２８）及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）のアジュバント活性の評価試験
本試験は、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）及びＮ，Ｎ’−ビス（ドデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２４）に代えて、Ｎ，Ｎ’−ビス（リノレオイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２８）及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）を使用したこと以外は、実施例４と同様の手順で行った。結果を図１０に示す。
【０１５１】
図１０に示される結果から明らかなように、ＳＺ３５添加群（図中：ＳＺ３５）の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加したが、ＳＺ２８添加群の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生はＯＶＡ単独投与群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加しなかった。これらの結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）の方が、Ｎ，Ｎ’−ビス（リノレオイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２８）よりも、高いアジュバント活性を持つことがわかった。
【０１５２】
（３）分散性検討試験
〔実施例１１〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）の分散性検討試験
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）およびＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）０．２５６μｍｏｌをそれぞれジルコニアビーズ入りの２ｍＬのチューブに分取し、生理食塩水または５％α−シクロデキストリン（以下、単にαＣＤとも称する）添加生理食塩水を１ｍＬ加えて撹拌した。その後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝６５０ｎｍ）を測定し、分散性の指標として濁度を算出した。濁度の測定方法は以下の通りである。
【０１５３】
〔濁度の測定方法〕
ＳＺ３７およびＳＺ３８  ０．２５６μｍｏｌをジルコニアビーズ入りの２ｍＬのチューブに分取し、それぞれ生理食塩水または５％αＣＤ添加生理食塩水を１ｍＬ加えて６０００ｒｐｍで１回あたり３．１５秒間の条件で３回激しく撹拌した。その後、２００μＬずつ９６ウェルプレートに分取し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝６５０ｎｍ）を測定した。またコントロールとしてカオリナイト１ｍｇを蒸留水１Ｌに溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝６５０ｎｍ）を測定した後、その吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝６５０ｎｍ）を濁度１と定義し、各サンプルの濁度を、カオリナイトの測定値との比から算出した。
【０１５４】
結果を図１１に示す。また、攪拌後の各サンプルの写真を図１１に示す。
【０１５５】
図１１に示される結果から明らかなように、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ３７およびＳＺ３８の濁度は、生理食塩水で分散したＳＺ３７およびＳＺ３８の濁度よりも、有意に高値であった。図１２の写真からもわかるように、生理食塩水で分散できなかったＳＺ３７およびＳＺ３８は、５％αＣＤ添加生理食塩水で均一に分散できていることが確認できた。
【０１５６】
〔実施例１２〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）の分散溶媒の検討試験
ＳＺ３７およびＳＺ３８を分散する際に、分散溶媒によって分散状態が異なるかどうかを検討した。実施例１０と同様にしてＳＺ３７およびＳＺ３８を１％β−シクロデキストリン（以下、単にβＣＤとも称する）添加生理食塩水または５％αＣＤ添加生理食塩水を加えて撹拌後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝６５０ｎｍ）を測定し、分散性の指標として濁度を算出した。濁度の測定方法は実施例１１の通りである。結果を図１３に示す。
【０１５７】
図１３に示される結果から明らかなように、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ３７および、ＳＺ３８の濁度は、１％βＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ３７およびＳＺ３８の濁度よりも有意に高値であった。この結果は、１％βＣＤ添加生理食塩水よりも５％αＣＤ添加生理食塩水を用いたほうが、分散性が高いことを示している。
【０１５８】
（４）アジュバント活性試験
〔実施例１３〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）のアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ＯＶＡ単独投与群）、（２）生理食塩水に添加したＯＶＡ１０μｇ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）０．２５６μｍｏｌ、（３）生理食塩水に添加したＯＶＡ１０μｇ及びＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）０．２５６μｍｏｌ、（４）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＳＺ３７  ０．２５６μｍｏｌ、（５）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＳＺ３８  ０．２５６μｍｏｌを、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（５）と同様の溶液又は分散液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて採血を行い、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。結果を図１４に示す。
【０１５９】
図１４に示される結果から明らかなように、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ３７およびＳＺ３８を投与した群の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加した。一方、生理食塩水で分散したＳＺ３７およびＳＺ３８を投与した群の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意な増加は見られなかった。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−テトラデシルヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３７）とＮ，Ｎ’−ビス（２−オクタデシルエイコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３８）をアジュバントとして用いるためには、生理食塩水ではなく５％αＣＤ添加生理食塩水で分散することが好ましいことが確認された。
【０１６０】
〔実施例１４〕Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）のアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ＯＶＡ単独投与群）、（２）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＮ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）  ０．２５６μｍｏｌ、（３）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＮ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）  ０．２５６μｍｏｌ、（４）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）  ０．２５６μｍｏｌ、（５）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）  ０．２５６μｍｏｌ、を、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（５）と同様の溶液又は分散液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて採血を行い、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。結果を図１５に示す。
【０１６１】
図１５に示される結果から明らかなように、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ２２、ＳＺ３４、ＳＺ３５、ＳＺ３６の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ＯＶＡ単独投与群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加した。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヘキサデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２２）、Ｎ，Ｎ’−ビス（トリデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３４）、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）及びＮ，Ｎ’−ビス（トリアコンタノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３６）を５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したものにもアジュバント活性があることが確認された。
【０１６２】
〔実施例１５〕Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）及びＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）のアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ｃｏｎｔｒｏｌ群）、（２）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＳＺ２３  ０．２５６μｍｏｌ、（３）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ、ＳＺ３５  ０．２５６μｍｏｌを、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（３）と同様の溶液又は分散液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて採血を行い、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。結果を図１６に示す。
【０１６３】
図１６に示される結果から明らかなように、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ２３、ＳＺ３５の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ｃｏｎｔｒｏｌ群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加した。この結果から、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＮ，Ｎ’−ビス（２−ヘプチルウンデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ２３）にも、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）と同様にアジュバント活性があることが確認された。
【０１６４】
〔実施例１６〕Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）及びＮ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ６６）のアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）抗原として５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解した卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇ（ｃｏｎｔｒｏｌ群）、（２）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ及びＳＺ３５  ０．２５６μｍｏｌ、（３）５％αＣＤ添加生理食塩水に溶解又は分散したＯＶＡ１０μｇ、ＳＺ６６  ０．２５６μｍｏｌを、それぞれ背部皮下投与して、一次免疫を実施した。１週間後、上記（１）〜（３）と同様の溶液又は分散液を再度、背部皮下投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて採血を行い、得られた血清サンプルについて抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体の測定を行った。結果を図１７に示す。
【０１６５】
図１７に示される結果から明らかなように、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＳＺ３５、ＳＺ６６の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１サブクラス抗体産生は、ｃｏｎｔｒｏｌ群（図中：ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加した。この結果から、５％αＣＤ添加生理食塩水で分散したＮ，Ｎ’−ビス（ドコサノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ６６）にもアジュバント活性があることが確認された。
【０１６６】
（５）鼻腔インフルエンザワクチンアジュバントとしての評価試験
〔実施例１７〕Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）の鼻腔インフルエンザワクチンアジュバント活性の評価試験
８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを群分け（Ｎ＝６）した後、各群に対し、マウス１匹あたり（１）生理食塩水、（２）抗原として生理食塩水で希釈したインフルエンザワクチン（インフルエンザＨＡワクチン「生研」、デンカ生研株式会社）２０μｌ（インフルエンザワクチン単独投与群）、（３）生理食塩水で希釈したインフルエンザワクチン２０μｌ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）０．５５μｇ、（４）生理食塩水で希釈したインフルエンザワクチン２０μｌ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）１．６４μｇ、（５）生理食塩水で希釈したインフルエンザワクチン２０μｌ及びアジュバントとしてＮ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）４．９２μｇを、それぞれ鼻腔投与して、一次免疫を実施した。２週間後、上記（１）〜（５）と同様の溶液を再度、鼻腔投与し、二次免疫を実施した。二次免疫の２週間後に、麻酔下にて全採血、鼻腔洗浄を実施した。そして、得られた血清サンプルについて抗インフルエンザＩｇＧ１サブクラス抗体の測定およびＨＩタイターアッセイ（赤血球凝集抑制試験）を行った。鼻腔洗浄液は、マウスの胸部を開き気管を露出させて切開後、アトム静脈カテーテル節付を挿入し１ｍＬの生理食塩水を注入した。そして、鼻から出てきた液を１００００ｇで３分間遠心後、上清を回収し、これを鼻腔洗浄液サンプルとした。鼻腔洗浄液サンプルについては抗インフルエンザＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体の測定を行った。測定方法は以下のとおりである。
【０１６７】
〔抗インフルエンザＩｇＧ１サブクラス抗体、抗インフルエンザＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体の測定方法〕
９６ウェルプレートに０．５μｇ／ｍｌのインフルエンザワクチン（インフルエンザＨＡワクチン「生研」、デンカ生研株式会社）を１ウェルあたり１００μｌずつ加え、一晩４℃にてインキュベートした。インキュベート後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）にて３回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの５％ＦＣＳ／ＰＢＳ溶液にて室温で１〜２時間、ブロッキングした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの希釈済みの血清サンプル、鼻腔洗浄液サンプル、およびコントロールとして同量の５％ＦＣＳ／ＰＢＳ溶液を添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの希釈済みのビオチン化抗マウスＩｇＧ１抗体、ＩｇＡ抗体およびＩｇＧ抗体を添加し、３７℃で４５分インキュベートした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌの希釈済みの抗ビオチン−ＨＲＰ抗体を添加し、さらに３７℃で３０分インキュベートした。その後、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ−Ｔにて５回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加し、室温にて１０〜１５分反応させた。その後、１ウェルあたり５０μｌの反応停止液（２Ｎ硫酸溶液）を加えて呈色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（ＯＤ  Ｖａｌｕｅ＝４５０ｎｍ）を測定した。
【０１６８】
〔ＨＩタイターアッセイ〕
本アッセイは、「インフルエンザウイルスＨＩ試薬「生研」」のプロトコールに従って行った。まず、血清サンプル中の非特異的インヒビターを除去するため、血清サンプルおよびＨＩ抗血清（Ａ/カリフォルニア/７/２００９（Ｈ１Ｎ１）、血清対照）１００μｌにＲＤＥ（レセプター破壊酵素、デンカ生研株式会社）を３００μｌ加え、３７℃で一晩インキュベートした。その後、５６℃で６０分間加温してＲＤＥの反応を止め、その後ＰＢＳを６００μｌ加えた。これに、５０％に希釈したニワトリの赤血球浮遊液を５０μｌ加え、十分混和後、常温（１５℃〜２５℃）に６０分間静置した。これを９００ｇで５分間遠心し、上清を回収し、これをＨＩサンプルとした。次に、ＨＩアッセイで使用するＨＡ抗原量を決定するため、ＨＡ抗原（Ａ/カリフォルニア/７/２００９（Ｈ１Ｎ１））とニワトリの赤血球を以下のように混合した。まず、９６ウェル丸底プレートにＰＢＳで５倍に希釈したＨＡ抗原（Ａ/カリフォルニア/７/２００９（Ｈ１Ｎ１））を５０μｌ加え、これにＰＢＳを５０μｌに添加し、１０倍希釈液とした。次に、この１０倍希釈液をＰＢＳで２０倍、４０倍、８０倍、１６０倍、３２０倍、６４０倍、１２８０倍と段階的に希釈し、これらすべてのウェルにＰＢＳで０．５％に希釈したニワトリの赤血球浮遊液５０μｌを加え、どの希釈倍率まで赤血球の沈殿が生じないか観察した。今回は、８０倍希釈で沈殿が観察され、ＨＡ価は１：８０（８０ＨＡ/５０μｌ）であった。本ＨＩタイターアッセイでは、４ＨＡ/２５μｌの抗原液を用いるので、抗原液を１０倍希釈して使用することにした。
９６ウェル丸底プレートに、ＰＢＳで１０倍希釈した上記で調整したＨＩサンプル２５μｌ加え、これを１０倍希釈液とした。次に、この１０倍希釈液をＰＢＳで２０倍、４０倍、８０倍、１６０倍、３２０倍、６４０倍、１２８０倍と段階的に希釈し、これらすべてのウェルにＨＡ抗原（Ａ/カリフォルニア/７/２００９（Ｈ１Ｎ１））２５μｌを加え、室温（１５℃〜２５℃）で３０分間静置した。その後、赤血球の沈殿の観察を行った。８０倍まで赤血球の沈殿が観察された場合は、ＨＩ抗体価を８０とした。
【０１６９】
血清サンプル中のＩｇＧ１サブクラス抗体産生の評価結果を図１８に、血清サンプル中のＨＩタイター評価試験の結果を図１９に、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体産生の評価結果を図２０に、鼻腔洗浄液中のＩｇＧ抗体産生の評価結果を図２１に示す。
【０１７０】
図１８に示される結果から明らかなように、ＳＺ３５添加群（図中：ＳＺ３５  ０．５５μｇ、１．６４μｇ、４．９２μｇ）の血清中の抗インフルエンザＩｇＧ１サブクラス抗体の産生は、インフルエンザワクチン単独投与群に比べて有意に増加した。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）にはインフルエンザワクチンに対してアジュバント活性があることが確認された。
【０１７１】
図１９に示される結果から明らかなように、ＳＺ３５添加群（図中：ＳＺ３５  ０．５５μｇ、１．６４μｇ、４．９２μｇ）の血清中のＨＩ抗体価は、インフルエンザワクチン単独投与群に比べて有意に増加した。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）添加によって、インフルエンザワクチンに含まれる抗原であるＡ/カリフォルニア/７/２００９（Ｈ１Ｎ１）に対する抗体産生が増強されることが確認された。
【０１７２】
図２０に示される結果から明らかなように、ＳＺ３５添加群（図中：ＳＺ３５  ４．９２μｇ）の鼻腔洗浄液中の抗インフルエンザＩｇＡ抗体の産生は、インフルエンザワクチン単独投与群に比べて有意に増加した。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）は、投与部位の鼻粘膜上にインフルエンザワクチンに対するＩｇＡを誘導するアジュバントであることが確認された。
【０１７３】
図２１に示される結果から明らかなように、ＳＺ３５添加群（図中：ＳＺ３５  ４．９２μｇ）の鼻腔洗浄液中の抗インフルエンザＩｇＧ抗体の産生は、インフルエンザワクチン単独投与群に比べて有意に増加した。この結果から、Ｎ，Ｎ’−ビス（オクタデカノイル）−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＳＺ３５）は、投与部位の鼻粘膜上にインフルエンザワクチンに対するＩｇＧを誘導するアジュバントであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明化合物は、抗原特異的なＩｇＧ１抗体産生の増強作用（免疫賦活作用）を有するので、免疫賦活剤として有用である。特に、本発明化合物は、従来のアルミニウムゲルアジュバントと同等かそれ以上の免疫賦活作用を有しており、さらに、本発明化合物は、ＩｇＥ抗体の産生を誘導することがなく、従来のアルミニウムゲルアジュバントで課題となっているアレルギー誘導活性がほとんどないため、効果的で且つ安全なアジュバントとなり得る。さらに、粘膜上にＩｇＡ抗体産生を誘導し、かつ、血中のＩｇＧ抗体産生も増強することから、本発明化合物は現在研究開発が進んでいる粘膜ワクチンアジュバントにもなりうる。
【０１７５】
本出願は、日本で2014年4月25日に出願された特願2014-091142及び2015年2月27日に出願された特願2015-039593を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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