(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された接着系細胞である哺乳類動物の体細胞またはがん細胞の再プログラミングを誘導する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞支持体上で培養または維持された該細胞を細胞支持体から剥離する工程、および
（ｂ）工程（ａ）により得られた細胞を、原核生物又は真核性物から超遠心分離を含む精製手段を用いて調製された精製リボソーム分画を細胞の再プログラミングを誘導する物質として添加した培地中で培養する工程、
を含む該細胞の再プログラミングを誘導する方法、
ここで、前記精製リボソーム分画は、精製７０Ｓリボソーム分画、精製８０Ｓリボソーム分画、精製３０Ｓリボソーム分画、および精製５０Ｓリボソーム分画からなる群より選ばれる少なくとも一つの精製リボソーム分画である。
【請求項２】
前記体細胞またはがん細胞が、ヒト由来の細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞を剥離する工程がトリプシン処理により行われる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を剥離する工程が非酵素系細胞剥離液により行われる請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記精製リボソーム分画を添加した培地は、さらにメチル−β−シクロデキストリンが添加されている、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
前記リボソーム分画が精製８０Ｓリボソーム分画である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記リボソーム分画が精製３０Ｓリボソーム分画である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記リボソーム分画が精製５０Ｓリボソーム分画である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
生物由来のリボソーム分画からなる細胞再プログラミング誘導用組成物であって、前記リボソーム分画は、遠心分離を含む精製手段を用いて調製された、精製７０Ｓリボソーム分画、精製８０Ｓリボソーム分画、精製３０Ｓリボソーム分画、および精製５０Ｓリボソーム分画からなる群より選ばれる少なくとも一つのリボソーム分画である組成物。
【請求項１０】
ヒト由来の体細胞またはがん細胞の再プログラミング誘導のために用いられる請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらにメチル−β−シクロデキストリンを含む請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、精製８０Ｓリボソーム分画を含む、請求項９〜１１のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、精製３０Ｓリボソーム分画を含む、請求項９〜１１のいずれか一つに記載の組成物
【請求項１４】
前記組成物が、精製５０Ｓリボソーム分画を含む、請求項９〜１１のいずれか一つに記載の組成物
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか一つに記載の組成物を含む抗がん剤。
【請求項１６】
単離された哺乳類動物由来の体細胞またはがん細胞から多能性細胞を製造するための培地に用いるための請求項９〜１４のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項１７】
請求項９〜１４のいずれか一つに記載の組成物を含む、単離された哺乳類動物由来の体細胞またはがん細胞から多能性細胞を製造するための培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の再プログラミングを誘導する方法に関する。本発明はまた、そのような方法を用いて多能性細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳ細胞は、胚性幹細胞と呼ばれ、１９８１年にはマウスの胚から、１９９８年にはヒ卜の胚から発見された。ＥＳ細胞は胎盤を構成する細胞以外のさまざまな種類の細胞に変化する能力（多能性）を持つ細胞として、それを用いた組織や器官を構築する研究が主に行われてきた。しかしながら、ＥＳ細胞は順調に成長すれば生命になる受精卵を利用しているため、倫理的に大きな問題を抱えている。もうひとつの大きな問題として、拒絶の問題がある。ＥＳ細胞をもとに作製した分化細胞や臓器を患者に移植しても、免疫系はこれらを非自己と認識し攻撃する可能性がある。【０００３】
これらＥＳ細胞の問題を解決するために、京都大学の山中伸弥教授のグループは、通常は他の機能を持つ細胞に分化しない皮膚細胞からさまざまな種類の細胞に変化する能力を持つ細胞を開発し、ｉＰＳ細胞と名付けた。山中ファクターと呼ばれる４つの因子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ）をマウスやヒ卜の皮膚細胞にレ卜ロウイルスベクターを使って導入すると、細胞の初期化がおこり、ＥＳ細胞と同じく多能性を持つ細胞が作り出せることを示した［非特許文献１、および非特許文献２］。この時に用いる細胞は、患者自身の分化した皮膚などの体細胞に由来するため、ｉＰＳ細胞から分化させた細胞を患者に移植しても免疫系はその臓器を自己と認識し移植が拒絶されることはない。ｉＰＳ細胞の発見によりＥＳ細胞が抱えていた「生命倫理」と「拒絶反応」という２つの問題がクリアされたが、ｉＰＳ細胞を標準化するための技術は開発途上にあり、細胞の癌化の問題を完全には払拭できていない。【０００４】
また、特許文献１において、マイコバクテリウム・レプラエ菌またはその成分を用いて、再ブログラミングされた胚幹細胞（ＥＳ）様細胞を産生する方法が提案されている。特許文献１には、マイコバクテリウム・レプラエ菌そのものを、成人の分化細胞に接触・感染させることによる、再プログラミングされたＥＳ様細胞を産生する方法、この方法によって産生された細胞が記載されており、接触・感染させた菌は、産生されたＥＳ様細胞中に存在することが記載されている。しかしながら、マイコバクテリウム・レプラエ菌はらい菌であり、再生医療への応用には安全性の懸念がある。【０００５】
また、本発明者により、発酵能を有する細菌である乳酸菌や納豆菌を、体細胞に感染させて、体細胞から多能性細胞を製造する方法が報告されている（特許文献２、非特許文献３）。さらに、本発明者らにより、乳酸菌からの粗抽出成分による、体細胞から多能性細胞を製造する方法が、ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０５６９４８（国際公開公報ＷＯ２０１４／１６７９４３号公報）として特許出願されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開ＵＳ２００６／０２２２６３６Ａ１号明細書
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１３／００８８０３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Takahashi and Yamanaka, Cell 126,663-676, 2006.
【非特許文献２】Takahashi et al, Cell 131,861-872, 2007.
【非特許文献３】Ohta et al, PLoS ONE 7(12):e51866, 2012.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、細胞の再プログラミングを誘導する物質を含む組成物を提供することである。本発明の目的はまた、再生医療への応用において安全性が高い多能性細胞、およびその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、以前より乳酸菌や納豆菌などの発酵能を有する細菌に着目し、発酵能を有する細菌と細胞との関係を調べた結果、細胞分化を終えたヒ卜皮膚細胞に乳酸菌または納豆菌をそれぞれ感染させると、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のように細胞塊を形成し、アルカリホスファターゼ染色法で染色されることを見出した。さらに、本発明者は、生きた乳酸菌ではなく、死んだ乳酸菌からの粗抽出成分であっても、細胞分化を終えたヒ卜皮膚細胞を再プログラミングし、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のように細胞塊を形成できることを見出した。
そこで、本発明者らは、細胞の再プログラミングを誘導する物質を特定することにより、乳酸菌等の発酵能を有する細菌に限らず多くの生物に見出される物質が細胞の再プログラミングを誘導することを見出し、本発明を完成した。また、その物質を用いてヒト皮膚細胞やがん細胞から誘導された細胞塊を種々の細胞へと分化誘導させたところ、他の細胞への分化が確認された。【００１０】
即ち、以下の発明が提供される。
（１）（生体内または単離された）哺乳類動物（例えば、ヒト、マウス）の体細胞またはがん細胞に、生物由来のリボソーム分画を接触させることにより、該細胞の再プログラミングを誘導する方法。
（２）前記体細胞またはがん細胞が、ヒト由来の細胞である上記（１）に記載の方法。
（３）前記細胞が接着系細胞である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）さらに、リボソーム分画の細胞への接触の前に、前記接着系細胞を細胞支持体から剥離する工程を含む上記（３）に記載の方法。
（５）前記細胞を剥離する工程がトリプシン処理により行われる上記（４）に記載の方法。
（６）前記リボソーム分画の細胞への接触を、メチル−β−シクロデキストリンの存在下で行う、上記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法。
（７）前記リボソーム分画が、グラム陰性菌由来のリボソーム分画である上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の方法。
（８）前記リボソーム分画が、グラム陽性菌由来のリボソーム分画である上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の方法。
（９）前記リボソーム分画が、酵母由来のリボソーム分画である上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の方法。
（１０）前記リボソーム分画が、哺乳類動物由来のリボソーム分画である上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）前記リボソーム分画が、３０Ｓリボソーム分画である上記（７）または（８）に記載の方法。
（１２）前記リボソーム分画が、５０Ｓリボソーム分画である上記（７）または（８）に記載の方法。【００１１】
（１３）哺乳類動物（例えば、ヒトまたはマウス）の体細胞またはがん細胞から誘導された多能性細胞であって、以下の工程：
（ｉ）単離された体細胞またはがん細胞に、生物由来のリボソーム分画を接触させて培養または維持する工程、および
（ｉｉ）形成された細胞塊を回収する工程、
を含む工程により製造された多能性細胞。
（１４）前記体細胞またはがん細胞が、ヒト由来の細胞である上記（１３）に記載の多能性細胞。
（１５）前記体細胞が接着系細胞である、上記（１３）または（１４）に記載の多能性細胞。
（１６）さらに、工程（ｉ）の前に、前記接着系細胞を細胞支持体から剥離する工程を含む上記（１５）に記載の多能性細胞。
（１７）前記細胞を剥離する工程がトリプシン処理により行なわれる上記（１６）に記載の多能性細胞。
（１８）前記工程（ｉ）を、メチル−β−シクロデキストリンの存在下で行う、上記（１３）〜（１７）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（１９）前記リボソーム分画が、グラム陰性菌由来のリボソーム分画である上記（１３）〜（１８）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（２０）前記リボソーム分画が、グラム陽性菌由来のリボソーム分画である上記（１３）〜（１８）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（２１）前記リボソーム分画が、酵母由来のリボソーム分画である上記（１３）〜（１８）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（２２）前記リボソーム分画が、哺乳類動物由来のリボソーム分画である上記（１３）〜（１８）のいずれか一つに記載の多能性細胞。
（２３）前記リボソーム分画が、３０Ｓリボソーム分画である上記（１９）または（２０）に記載の多能性細胞。
（２４）前記リボソーム分画が、５０Ｓリボソーム分画である上記（１９）または（２０）に記載の多能性細胞。
（２５）上記（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の細胞の再プログラミングを誘導する方法を用いて製造された多能性細胞。
（２６）上記（１３）〜（２５）のいずれか一つに記載の多能性細胞を分化誘導培地で培養することにより分化誘導された細胞。
（２７）前記細胞が、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、または血球細胞である、上記（２６）に記載の細胞。【００１２】
（２８）生物由来のリボソーム分画を含む細胞再プログラミング誘導組成物。
（２９）ヒト由来の体細胞またはがん細胞の再プログラミング誘導のために用いられる上記（２８）に記載の組成物。
（３０）さらにメチル−β−シクロデキストリンを含む上記（２８）または（２９）に記載の組成物。
（３１）前記リボソーム分画が、グラム陰性菌由来のリボソーム分画である上記（２８）〜（３０）のいずれか一つに記載の組成物。
（３２）前記リボソーム分画が、グラム陽性菌由来のリボソーム分画である上記（２８）〜（３０）のいずれか一つに記載の組成物。
（３３）前記リボソーム分画が、酵母由来のリボソーム分画である上記（２８）〜（３０）のいずれか一つに記載の組成物。
（３４）前記リボソーム分画が、哺乳類動物由来のリボソーム分画である上記（２８）〜（３０）のいずれか一つに記載の組成物。
（３５）前記リボソーム分画が、３０Ｓリボソーム分画である上記（３１）または（３２）に記載の組成物。
（３６）前記リボソーム分画が、５０Ｓリボソーム分画である上記（３１）または（３２）に記載の組成物。
（３７）上記（２８）〜（３６）のいずれか一つに記載の組成物を含む抗がん剤。
（３８）生物由来のリボソーム分画を含む、単離された哺乳類動物由来の体細胞またはがん細胞から多能性細胞を製造するための培地。
（３９）さらにメチル−β−シクロデキストリンを含む上記（３８）に記載の培地。
（４０）上記（２８）〜（３６）のいずれか一つに記載の組成物を含む、単離された哺乳類動物由来の体細胞またはがん細胞から多能性細胞を製造するための培地。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、体細胞への遺伝子の導入および強制発現を用いることなく、体細胞から多能性細胞を製造することができる。本発明では、原核生物から真核生物に至るまで全ての生物において存在するリボソーム（リボソームＲＮＡとタンパク質で構成されている）の分画またはそれから得られる成分を含む組成物を用いて多能性細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１で調製した乳酸菌成分と一緒に培養したＨＤＦ細胞（培養３日後）を示す。
【図２】実施例３の３段階のクロマトグラフィーによる精製で得た活性フラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果、およびそれぞれのバンドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析してタンパク質を同定した結果を示す。
【図３】実施例４において同定されたタンパク質をグループ分けした結果である。
【図４】乳酸菌由来７０Ｓリボソーム分画と一緒に培養したＨＤＦ細胞（培養７日後）を示す。
【図５】乳酸菌由来７０Ｓリボソーム分画による細胞塊形成能の濃度依存性を確認した結果である。
【図６】乳酸菌由来の７０Ｓリボソーム分画からの５０Ｓリボソームおよび３０Ｓリボソームの精製、および各フラクションの細胞塊形成能を示した図である。
【図７】乳酸菌由来３０Ｓリボソーム分画または５０Ｓリボソーム分画と一緒に培養したＨＤＦ細胞の形態（４日目、１０日目）を示す。
【図８】乳酸菌由来の３０リボソームまたは５０Ｓリボソームで処理したＨＤＦ細胞を、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞へ分化誘導する培地で培養した後、それぞれの細胞を、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色（脂肪）、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ染色（骨）、またはＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色（軟骨）した結果を示す。
【図９】乳酸菌由来の７０Ｓリボソーム分画の細胞塊形成能に対するエンドサイトーシス阻害剤の影響を確認した図である。左図が、細胞塊数の変化を見たものであり、右図が細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定したものである。細胞生存率は、阻害剤なしを１００％とした。
【図１０】図９の結果を、各阻害剤について、細胞生存率と細胞塊形成能を同じグラフにプロットし直した図である。＊は、ｔ検定で０．０５以下、＊＊は、ｔ検定で０．０１以下を示す。
【図１１】粗精製リボソーム分画を用いて、非酵素系の細胞剥離液によりシャーレから剥がしたＨＤＦ細胞からの細胞塊形成を確認した結果である。Ａが粗精製リボソーム分画を含まない条件で培養した細胞であり、Ｂが粗精製リボソーム分画存在下で培養した細胞（培養３日後）である。
【図１２】トランスフェクションによる細胞塊形成を確認した結果である。トリプシン処理（Ｔｒｉｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）、トランスフェクション処理（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、およびトリプシン処理なし（Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のそれぞれでリボソーム分画を添加した結果を示している。
【図１３】ラット小腸細胞（ＩＥＣ−６）由来の粗精製リボソーム分画と精製８０Ｓリボソーム分画による、細胞塊形成能を確認した結果である。上段が粗精製リボソーム分画、下段が８０Sリボソーム分画の存在下で培養した細胞（培養３日後）である。左側がリボソーム分画を含まない条件で培養した対照である。
【図１４】各種生物由来の、粗精製リボソーム分画および、７０Ｓまたは８０Ｓ精製リボソーム分画（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＲＢＳ）の細胞塊形成能を確認した結果である。
【図１５】各種の細菌や細胞からの精製リボソーム分画（Ａ−Ｈ：精製７０Ｓ；Ｉ−Ｋ：精製８０Ｓ）の添加により形成された細胞塊の写真である。（Ａ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＪＣＭ １０２１，（Ｂ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＪＣＭ １１１２，（Ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ１１３４，（Ｄ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． １６８ ＪＣＭ１０６２９，（Ｅ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＪＣＭ２４１４，（Ｆ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＪＣＭ １３０６３， （Ｇ） Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＪＣＭ ２１５９０，（Ｈ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＥ２８，（Ｉ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ２０１１８，（Ｊ）Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＩＥＣ−６，（Ｋ）Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｃｅ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ。Ｂａｒ ｉｎｄｉｃａｔｅ：０．１ｍｍ。
【図１６】粗精製リボソーム分画の細胞塊形成能を浮遊細胞（マウスリンパ球：ＷＥＨＩおよびＢａ／Ｆ３）を用いて確認した結果である。Ａが粗精製リボソーム分画を含まない条件で培養した細胞であり、Ｂが粗精製リボソーム分画存在下で培養した細胞（培養４日後）である。
【図１７】精製リボソーム分画に対する加熱処理の影響を確認した結果である。左図が１００度で１０分加熱後すぐ氷上に置いたリボソーム分画を用いた結果、右図が１００度で１０分加熱後すぐに室温にして１０分間置いたリボソーム分画を用いた結果である。
【図１８】各種がん細胞（Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７）を乳酸菌７０リボソーム分画で処理して形成した細胞塊を、脂肪細胞または骨細胞に分化誘導する培地で培養した後、それぞれの細胞を、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色（脂肪）、またはＡｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色（軟骨）した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
【００１６】
本発明において、「細胞を再プログラミング誘導する」とは、哺乳類動物の体細胞またはがん細胞、例えば、上皮細胞を、生物由来のリボソーム分画または分画中に含まれる成分と接触させることにより、細胞を、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同様の、種々の細胞に分化する能力を有する多能性細胞へと形質を変換させることをいう。ここで接触とは、細胞がリボソーム分画または分画中に含まれる成分（以下、特に断りがない限り、あるいは文脈からその一方を意味していると明確でない限り、合わせてリボソーム分画という）と接触できる状態におくことを意味し、その態様は特に制限されないが、好ましくは、体細胞が生存する環境（例えば、培地）中にリボソーム分画を存在させることにより、それらが体細胞に作用できる状態におくことを言う。
【００１７】
哺乳類動物の体細胞へのリボソーム分画の接触においては、細胞の前処理を行うこともできる。例えば、接着系の体細胞を用いる場合は、体細胞を前処理して細胞の支持体（例えば、培養皿や細胞培養支持体）から細胞を剥離しておくのが好ましい。
リボソーム分画を接触させる前の細胞の前処理としては、例えば、消化酵素処理、具体的にはトリプシン処理、または、市販の細胞剥離液、例えば非酵素系の細胞剥離液による処理をあげることができるが、トリプシン処理が好ましい。
【００１８】
本発明において「リボソーム分画」が由来する生体とは、原核生物から真核生物までのいずれであってもよい。リボソームは、教科書的には、全ての生物で構造自体に大差なく、ｒＲＮＡとタンパク質で構成されており、ｒＲＮＡは触媒反応の活性中心、タンパク質はリボソームの構造安定化に関係しているとされている。機能としては、タンパク質の合成を担い、原核生物では、３０Ｓ（小サブユニット）がｔＲＮＡをｍＲＮＡに結合させ、５０Ｓ（大サブユニット）がペプチド形成を行っている（真核生物では、それぞれ４０Ｓと６０Ｓ）。
【００１９】
本発明で用いるリボソーム分画が由来する原核生物としては、グラム陽性菌およびグラム陰性菌をあげることができる。グラム陽性菌としては、例えば、乳酸菌、ブドウ球菌、ブドウ球菌近縁種、枯草菌（納豆菌）などをあげることができる。代表的な乳酸菌としては、ラク卜バシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラク卜コッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ス卜レプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などに属する乳酸菌が挙げられる。グラム陰性菌としては、例えば、大腸菌、緑膿菌近縁種、根粒菌（植物共生菌）をあげることができる。
【００２０】
本発明で用いるリボソーム分画が由来する真核生物としては、これに限定されないが、例えば、菌類、動物種をあげることができる。菌類としては、例えば、酵母、キノコ、カビをあげることができる。動物種としては、無脊椎動物と脊椎動物のいずれでもよく、脊椎動物としては、例えば哺乳類をあげることができる。動物種を用いる場合は、本発明の「生体由来のリボソーム分画」は、動物のいずれの器官、組織または細胞から由来するリボソーム分画であってもよい。
【００２１】
本発明で用いる「リボソーム分画」は、リボソームの粗精製分画であっても、精製分画であってもよく、さらには、小サブユニット分画（原核生物は３０Ｓ、真核生物は４０Ｓ）、大サブユニット分画（原核生物は５０Ｓ、真核生物は６０Ｓ）のいずれでもよい。また、それらの何れかの分画に対し任意の処理を施し、細胞の再プログラミングを誘導する成分の一部を抽出または分離することも可能であり、それらも本発明の「リボソーム分画」に含まれる。すなわち、生物から調製したリボソームの粗精製分画から調製されるいずれの分画も、細胞塊形成能を有する限り本発明のリボソーム分画に含まれる。例えば、リボソームの粗精製分画を緩衝液に懸濁し、さらに（超）遠心分離を行い、リボソームの精製分画（沈殿）と上清に分画できる。本発明において好ましいのはリボソームの精製分画であるが、かかる場合用いた分離条件では上清にもリボソームが含まれる結果、上清の分画も細胞塊形成能を有する場合は、それも本発明のリボソーム分画に含まれる。加えて精製リボソーム分画、例えば精製７０Ｓリボソーム分画を、濃度勾配（例えばスクロース濃度勾配）超遠心により、３０Ｓリボソーム画分と５０Ｓリボソーム分画に分離できるが、いずれも本発明のリボソーム分画に含まれる。
本発明で用いる「リボソーム分画」は、好ましくは、ｒＲＮＡがその高次構造が維持された状態で含まれている分画である。
本発明における「細胞再プログラミング誘導組成物」とは、上記した生物由来のリボソーム分画のいずれかを含むものである。
【００２２】
本発明で再プログラミングの誘導または多能性細胞の製造のために用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞のうち生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、一部分化が進んだ未分化の幹細胞でもよい。例えば、これに制限されないが、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、腸細胞、肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、毛細胞、筋肉細胞、脳細胞、肺細胞、脂肪細胞、および胃粘膜細胞等の分化した細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の一部分化が進んだ体性幹細胞、組織前駆細胞をあげることができる。これらの細胞は、一般に、接着系細胞として分類されている。体細胞の由来は、哺乳動物であれば特に限定されないが、好ましくはマウスなどのげっ歯類、またはヒ卜などの霊長類であり、特に好ましくはヒ卜またはマウスである。また、ヒ卜の体細胞を用いる場合、胎児、新生児または成人の何れの体細胞を用いてもよい。本発明の方法で製造される多能性細胞を再生医療など疾患の治療に用いる場合には、該疾患を患う患者自身から分離した体細胞を用いることが好ましい。また、本発明では細胞としてがん細胞を用いることができる。がん細胞に、リボソーム分画を接触させることによって、がん細胞から非がん細胞を製造することができる。本発明において、体細胞またはがん細胞に、リボソーム画分を接触させる工程は、インビトロでもまた生体内でも行うことができる。
【００２３】
本発明で言う多能性細胞とは、所定の培養条件下において自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において多種の細胞（外胚葉系の細胞、中胚葉系の細胞、または内胚葉系の細胞など）への多分化能を有する細胞（このような細胞のことは、幹細胞とも称する）のことを言う。
本発明の方法により誘導された多能性細胞は、所定の培養条件下において自己複製能を有するが、ｉＰＳ細胞のように無限増殖性を有することはないという特徴を有する。
本発明の方法により誘導された多能性細胞はまた、自己の細胞と差が無く、多能性付与によってがん化のリスクが高まることはないという特徴を有する。
【００２４】
本発明に従いリボソーム分画を体細胞に接触させて多能性細胞を製造する場合、メチル−β−シクロデキストリンの存在下で、リボソーム分画を体細胞に接触させることによって、細胞塊形成効率を高めることができる。
【００２５】
本発明においては、細胞培養用の通常の培地を用いて、リボソーム分画の存在下において体細胞の培養を行うことにより、本発明の多能性細胞または非がん細胞（がん細胞を再プログラミングして非がん化した細胞）を製造または培養できる。このような培地は特に制限されず、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の培養に用いることができる任意の培地を用いることができ、例えば、これに制限されないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最少必須（ＥＭＥ）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、アルファ−最少必須培地（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｈａｍ−Ｆ−１２、ＭＣＤＢ、およびそれらの改変培地をあげることができる。培地は、製造した多能性細胞のその後の使用や誘導効率の観点より、無血清培地が好ましく、さらには、必要に応じて、各種の成長因子、サイト力イン、ホルモンなど、例えば、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ−１、アクチビンＡ、ノギン（Ｎａｎｏｇｇｉｎ）、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−１、ＮＴ−２、ＮＴ−３等のヒ卜ＥＳ細胞の増殖・維持に関与する成分、を添加してもよい。リボソーム分画を含んだこのような培地も本発明の一部である。また、分離された多能性細胞の分化能および増殖能は、ＥＳ細胞について知られている確認手段を利用することにより確認することができる。
【００２６】
本発明の方法で製造される多能性細胞および非がん細胞の用途は特に限定されず、各種の試験・研究や疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた多能性細胞をレチノイン酸、ＥＧＦなどの増殖因子、またはグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、血球細胞など）を誘導することができ、そのようにして得られた分化細胞を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。
【００２７】
本発明の多能性細胞を用いて治療を行うことができる中枢神経系の疾患としてはパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷などが挙げられる。パーキンソン病の治療のためには、多能性細胞をドーパミン作動性ニューロンへと分化しパーキンソン病患者の線条体に移植することができる。ドーパミン作動性ニューロンへの分化は、例えば、マウスのストローマ細胞株であるＰＡ６細胞と本発明の多能性細胞を無血清条件で共培養することで進めることができる。アルツイハイマー病、脳梗塞、脊髄損傷の治療においては本発明の多能性細胞を神経幹細胞に分化誘導した後に、傷害部位に移植することができる。
【００２８】
また、本発明の多能性細胞は肝炎、肝硬変、肝不全などの肝疾患の治療に用いることができる。これら疾患を治療するには、本発明の多能性細胞を肝細胞あるいは肝幹細胞に分化し移植することができる。本発明の多能性細胞をアクチビンＡ存在下で５日間培養し、その後肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）で１週間程度培養することで肝細胞あるいは肝幹細胞を取得することができる。
【００２９】
さらに本発明の多能性細胞はＩ型糖尿病などの膵臓疾患の治療に用いることができる。Ｉ型糖尿病の場合には、本発明の多能性細胞を膵臓β細胞に分化させ、膵臓に移植することができる。本発明の多能性細胞を膵臓β細胞に分化させる方法は、ＥＳ細胞を膵臓β細胞に分化させる方法に準じて行うことができる。
【００３０】
さらに本発明の多能性細胞は虚血性心疾患に伴う心不全の治療に用いることができる。心不全の治療には、本発明の多能性細胞を心筋細胞に分化させた後に傷害部位に移植することが好ましい。本発明の多能性細胞は胚様体を形成させる３日前よりノギンを培地中に添加することで、胚様体形成後２週間程度で、心筋細胞を得ることができる。
【００３１】
また、本発明によれば、がん細胞に、リボソーム分画を接触させることによって、がん細胞から非がん細胞を製造することができる。従って、本発明で用いられるリボソーム分画を含む組成物は、抗がん剤として有用である。
さらに本発明により提供されるリボソーム分画は、分化した細胞やがん細胞などの異常分化を起こした細胞を再プログラミングできるので、医薬品や化粧品への添加物として用いることができる。
【００３２】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：乳酸菌成分の調製
乳酸菌は、理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から購入した。ＭＲＳ培地を高圧蒸気殺菌後、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ；ＪＣＭ１０２１：以下、Ｌａｃと呼ぶ）をＭＲＳ培地２０ｍｌに植菌し、３７℃で２〜３日間振盪培養した。次に、滅菌済みの前記培地１Ｌを含んだ３Ｌ振盪フラスコに植菌し、３７℃で３〜４日間、振盪培養した。得られた培養液１Ｌから遠心分離１０，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎにより菌体を集めた。ＰＢＳに懸濁、遠心分離を３回繰り返して菌体を洗浄後、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁した。菌体懸濁液をＢｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｃｃａｔｏｒ ２５０Ｄ超音波破砕装置（株式会社Ｂｒａｎｓｏｎ）でＯＵＴＰＵＴ ３ Ｄｕｔｙ ５０％にて氷上で３０分間破砕した。得られた細胞抽出液に３．４２ｇの硫酸アンモニウム（硫安）を添加し（硫安濃度２０％）、４℃で２時間冷却後、遠心分離８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、４℃により菌体残渣を除いた。上清を回収後、硫酸アンモニウム８．２８ｇ追加し、一晩冷蔵庫で冷却した。サンプルを遠心分離１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃により硫安濃度２０〜６０％飽和で沈殿するタンパク質画分を沈殿させた。沈殿を０．０２Ｍ Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＴＥＡ）緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに溶解し（全量で７．５ｍｌ前後になる）、透析膜（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｌｉｄｅ Ａ ｄｉａｌｙｚｅｒ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ２０，０００ ＭＷ）に入れ、一晩４℃で０．０２Ｍ ＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行い、低分子の物質を取り除いた。次いで、透析したサンプルを回収し、１００ＫＤａの限外ろ過フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過し、膜を透過しなかった濃縮サンプルを回収した。タンパク質画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社）を用いて定量し、「乳酸菌成分」として以下の実験に用いた。タンパク濃度は、５ｍｇ／ｍｌであった。【００３４】
実施例２：乳酸菌成分存在下でのＨＤＦ細胞の培養
１０ｃｍシャーレでＨＤＦ細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ， ＣＥＬＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ． Ｃａｔ Ｎｏ．１０６−０５ａ）をＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬ ＡＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＩＮＣ．）で培養した。１０ｍｌのＣＭＦ（Ｃａ2+ Ｍｇ2+フリーバッファー）で細胞を洗浄し、０．２５％トリプシン溶液（１ｍＭ ＥＤＴＡ含）を１ｍｌ加えて全体にいきわたらせた。細胞を、ＣＯ2インキュベーター（３７℃）に５分間入れた後、トリプシン阻害溶液（ＣＥＬＬ ＡＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＩＮＣ．）３ｍｌを加え懸濁し、細胞数をカウントした。あらかじめ２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり実施例１で得られたＬａｃ由来の乳酸菌成分（２０μｌ）を入れておき、１ｘ１０5 のＨＤＦ細胞を加えた。細胞をそのまま３４℃、５％ＣＯ2インキュベータで培養した。
その結果、数日後には細胞塊が観察できた。結果を図１に示す。この細胞塊形成アッセイを指標に、以下の実験で用いたカラムクロマトグラフィーにより分離された細胞塊形成能を有する画分を決定した。【００３５】
実施例３：クロマトグラフィーによる精製
実施例１で得られた濃縮乳酸菌成分（５０μｌ、タンパク量０．２５ｍｇ）をさらに陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉ Ｐｒｅｐ Ｑ ＦＦ １６／１０カラム（ＧＥヘルスケア））で分離した。０．０２Ｍ ＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したカラム（１６ｍｌ）に乳酸菌成分をチャージし、０〜１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、各フラクションを回収した。得られたフラクションについて、実施例２と同様にして、細胞塊形成能を確認した。
細胞塊形成能が確認されたフラクションを、次いで、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｈｉ Ｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア））にかけ（２０ｍＭ ＴＥＡ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ）、各フラクションの細胞塊形成能を実施例２と同様にして測定し、活性があるフラクションを回収した。
得られた活性フラクションをさらに、イオン交換クロマトグラフィー（ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＧＥヘルスケア））にて、０〜１Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、各フラクションを回収し、各フラクションの細胞塊形成能を確認した。活性が確認されたフラクションを、クロマトグラフィー精製分画とした。【００３６】
実施例４：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析
実施例３にて３段階のカラムクロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィー−ゲルろ過クロマトグラフィー−イオン交換クロマトグラフィー）で得られた活性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル）で分離した。ゲルから１０個のバンドを切り出し、ゲル内消化を行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ ＲＥＦＬＥＸTM ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）を用いてアミノ酸配列解析を行い、データベース検索によってタンパク質を同定した。結果を図２に示す。
得られたタンパク質をグループ分けした結果、大きく以下の３つのグループに分けることができた。グループ１：ｔＲＮＡ合成に関わる遺伝子群、グループ２：タンパク質の折り込みに関わる遺伝子群、グループ３：糖代謝、解糖系に関わる遺伝子群。グループ分けの結果を図３に示す。【００３７】
実施例５：タンパク質の過剰発現
決定したタンパク質の中から、３０〜１００ＫＤａ以上の分子（２量体等を含めて、１００ＫＤａ限外ろ過膜を通過できない分子）であり、微生物にしか存在しないタンパク質（７番のＣｌｐＥと５−２番のＴｒｉｇｇｅｒ ｆａｃｔｏｒ）をクローニングして、過剰発現後、Ｈｉｓ−ｔａｇを生成した。そのタンパクについて細胞塊形成能を計ったが、活性はなかった。【００３８】
実施例６：乳酸菌リボソームの調製および細胞塊形成能
実施例４における分析で見出されたグループはリボソームを精製する時によく検出される分子である。また、リボソームは、大腸菌の３０Ｓサブユニットの場合、約９００ＫＤａあるので１００ＫＤａ限外ろ過膜は通過できない。一方、リボソームタンパク質はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で検出されていなかったが、個々のリボソームタンパク質は１５ＫＤａ以下なので、電気泳動ではゲルの外に流出していたと考えられる。そこで、乳酸菌（Ｌａｃ）から、以下のようにしてリボソームを調製し、実施例２と同様にして、細胞塊形成能を測定した。
（材料）
ＴＭＡ−Ｉ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８，３０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，６ｍＭ ２−メルカプトエタノール）
Ｓｕｃ３０−ＴＭＡ−Ｉ（３０％ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＴＭＡ−Ｉ緩衝液）
（調製工程）
以下は、可能な限り４℃で行った。
１）集菌（１Ｌあたり２．５ｇ〜３．０ｇ）した菌をＴＭＡ−Ｉ緩衝液４０ｍｌに懸濁し、Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ（ＧＴＣ １時間 ｏｕｔｐｕｔ ４ ｄｕｔｙ ５０％）後、顕微鏡で細胞が壊れているのを確認した。
２）８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。
３）０．４５μｍフィルターを通した。
４）４℃にて、４２，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を回収した。
５）４℃にて、３６，０００ｒｐｍで６時間遠心し、上清を廃棄した。沈殿をＴＭＡ−Ｉ緩衝液５００μｌで溶解した（粗精製リボソーム分画）。
６）Ｓｕｃ３０−ＴＭＡ−Ｉ ３．５ｍｌに粗精製リボソーム溶液５００μｌを重層した。
７）４℃にて、３６，０００ｒｐｍで１５時間遠心し、上清を廃棄した。
８）沈殿を２ｍｌ ＴＭＡ−Ｉ緩衝液に溶解して、−７０℃で保存した（精製７０Ｓリボソーム分画）。
（結果）
上記のようにして得た、精製７０Ｓリボソーム分画を用いて、実施例２と同様にして細胞塊形成能を測定した結果、細胞塊が形成された。結果を、図４に示す。【００３９】
実施例７：細胞塊形成能の濃度依存性
実施例６で得た精製７０Ｓリボソーム分画を用いて、細胞塊形成が濃度依存的に行われるかを検討した。結果を図５に示す。図５に示すように、精製７０Ｓリボソーム分画の濃度依存的に細胞塊形成が確認された。【００４０】
実施例８：３０Ｓリボソームと５０Ｓリボソームの細胞塊形成能
実施例７において乳酸菌から精製した７０Ｓリボソーム分画を、さらに、以下のようにして、３０Ｓリボソーム分画と５０Ｓリボソーム分画に分けて精製した。
（試薬）
ＴＭＡ−ＩＩ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８，３０ｍＭ ＮＨ4Ｃｌ，０．３ｍＭ ＭｇＣｌ2，６ｍＭ ２−メルカプトエタノール）
Ｓｕｃ４０−ＴＭＡ−ＩＩ（４０％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＴＭＡ−ＩＩ緩衝液）
Ｓｕｃ１０−ＴＭＡ−ＩＩ（１０％ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎ ＴＭＡ−ＩＩ緩衝液）
（調整工程）
１）透析：ＴＭＡ−ＩＩ緩衝液、透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｃａｓｓｅｔｔｅ ２０，０００ ＭＷＣＯ ３ ｍｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）を用いて７０Ｓサンプルを一晩透析した。
２）遠心分離
遠心チューブグラジエントを以下のようにして作製した。
ローター：スイングＳＷ４１（最大１３．２ｍｌ）×６本；Ｒｍａｘ＝１５．３１ｃｍ；チューブ：ＵＣチューブ ３４４０５９（ＧＴＣで購入）。
ＵＣチューブにＳｕｃ４０−ＴＭＡ−ＩＩ ５ｍｌを入れ、Ｓｕｃ１０−ＴＭＡ ＩＩ ５ｍｌをその上に重層した。パラフィルムでしっかり蓋をし、チューブを横に寝せ室温で４時間置いた。ゆっくりとチューブを立て、４℃で一晩置いた。
５０％ ｓｕｃｒｏｓｅ（１００ｇ ｓｕｃｒｏｓｅ／２００ｍｌ Ｍｉｌｌｉ Ｑ水）を当日調整した。
透析したサンプル０．３ｍｌを前日用意したチューブに重層した。ＳＷ４１ローターにサンプルをセットし、３５０００ｒｐｍで３時間、４℃にて、遠心した（ａｃ９ ｂｒ０）。
３）フラクションコレクターによる分取
フラコレ  エッペンチューブ用をセットアップ（２００μｌ／ｔｕｂｅ）し、遠心したチューブを固定し、上部をフラクションコレクターにつなぎ、チューブ下部に１８Ｇニードルを刺して、ペリスタポンプで５０％ ｓｕｃｒｏｓｅを入れて上部から押し出されるサンプルをフラクションコレクターで回収した。回収したサンプルのＯＤ２６０／２８０を測定し、濃度、純度を調べた。
（結果）
結果を図６に示す。乳酸菌由来の３０Ｓリボソーム分画と５０Ｓリボソーム分画が精製された。【００４１】
実施例９：精製した乳酸菌３０Ｓリボソーム分画と５０Ｓリボソーム分画の細胞塊形成能
精製した乳酸菌３０Ｓリボソーム分画または５０Ｓリボソーム分画を用いて、実験２と同様にして、ＨＤＦ細胞を用いて細胞塊形成能を調べた。
結果を図７に示す。３０Ｓリボソーム分画、５０Ｓリボソーム分画のいずれを用いた場合でも、細胞塊が形成された。【００４２】
実施例１０：形成細胞塊からの分化誘導
ＨＤＦ細胞に乳酸菌（Ｌａｃ）由来の３０Ｓリボソーム分画または５０Ｓリボソーム分画を処理した後、２週間後に細胞塊をピックアップし、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞に分化誘導をうながす培養液（ＧＩＢＣＯ；Ａ１００７２−０１，Ａ１００７０−０１，Ａ１００７１−０１）に交換し、さらに３週間（３日間おきに培養液を半分量交換）培養した。
それぞれの分化誘導培地で培養後の細胞を、それぞれの細胞マーカーで染色した。結果を図８に示す。乳酸菌を感染させた細胞塊はＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色（脂肪）、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ染色（骨）、Ａｌｃｉａｎ Ｂｌｕｅ染色（軟骨）により染色され、それぞれの細胞への分化誘導が確認できた。【００４３】
実施例１１：細胞塊形成に対するエンドサイトーシス阻害剤の影響
以下の表に示したエンドサイトーシス阻害剤の存在下で、実施例６で調整した乳酸菌７０Ｓリボソーム分画を用いて細胞塊形成能を調べた。９６ウェルプレートに７０Ｓリボソーム分画を入れ（０．５μｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）、ＨＤＦ細胞（２０，０００ ｃｅｌｌｓ／１００μｌ）を加え、各々の阻害剤（５０μｌ）を加えた。ＣＯ2インキュベータで２日間培養し、形成された細胞塊数を測定した。阻害剤は、表中で示された濃度を基準濃度（図９中の濃度”５”）として用いた。従って、例えば、ＣＰの場合は、濃度”５”が１０μＭ、濃度”１０”が２０μＭとなる。また、ＭＴＴアッセイ（比色法による細胞死の測定）を行った。【００４４】
【表１】
0006592846.tif 000002
結果を図９および図１０に示す。ＭＣ存在下では濃度依存的に細胞塊の数が増加した。また、ＣＰとＮＹの存在下では、細胞塊の数が減少したがこれはこれらの試薬の毒性によるものと考えられる。他の阻害剤に関しては、一概に細胞塊の数が減少したことから、細胞塊形成にはエンドサイトーシスが関わっていると考えられる。【００４５】
実施例１２：非酵素系の細胞剥離液を用いた細胞塊形成
Ｍｕｓｅ細胞との違いを調べるために、非酵素系の細胞剥離液（Ｓｉｇｍａ，Ｃ１４１９）を用いて、製造者のプロトコールに従い細胞をシャーレから剥がし、次いで、実施例６に記載の粗精製リボソーム分画を用いて実施例２と同様の実験を行った。結果を図１１に示す。トリプシンを使わない方法で細胞を剥がしても、細胞塊が形成された。【００４６】
実施例１３：トリプシン処理によるエンドサイトーシス活性
トリプシン処理によってエンドサイトーシス活性があがるという報告例は存在するが、ＨＤＦで確かめられた報告はなく、また一般的に知られているエレクトロポレーションやトランスフェクションと異なり、トリプシン処理によってエンドサイトーシス活性をあげて、細胞内に巨大分子をいれる方法は報告されていない。そこで、実際にＨＤＦで細胞の取り込み活性があがるかをリボソームとほぼ同サイズの標識ナノラテックス粒子を用いて実験した。Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（２．５％ Ｓｏｌｉｄｓ−Ｌａｔｅｘ），０．０５μｍ ＹＧ（ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（株）社製）を用いた。リボソーム溶液の代わりに標識ナノラテックス粒子を１μｌ添加した。一晩インキュベートして細胞接着させたあと表面をＰＢＳで洗浄して観察した。その結果、トリプシン処理を行った細胞では、Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓの取り込みが観察され、リボソームのサイズ（２０ｎＭ）と近いサイズのものが取り込まれるようになっていたが、未処理の細胞では取り込みは僅かしか観察されなかった。これにより、トリプシン処理によりエンドサイトーシス活性があがったことが判った。【００４７】
実施例１４：トランスフェクションによる処理
トリプシン処理と同じ効果がトランスフェクションにより再現できるかＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検討した。方法は実施例２と同様にして行い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００を用いたトランスフェクションメーカーのプロトコールに従って実施した。リボソームは、Ｌａｃの精製７０Ｓリボソーム分画を用い、１μｇリボソーム／２ ｘ１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように加えた。結果を図１２に示す。トランスフェクションでは、細胞塊の形成が起こらないことが判った。【００４８】
実施例１５：哺乳類動物由来のリボソーム分画による細胞塊形成能
ラット小腸細胞（ＩＥＣ−６）から、Ａｎｇｅｒらの報告（ｎａｔｕｒｅ ２０１３, ｐ８０, ｖｏｌ．４９７）に従い粗精製リボソーム分画（濃度勾配超遠心処理前の分画）と８０Ｓリボソーム分画を精製し、実施例２と同様にしてＨＤＦ細胞を用いて細胞塊形成能を調べた。結果を図１３に示す。哺乳類動物由来の粗精製リボソーム分画と８０Ｓリボソーム分画により細胞塊が形成された。【００４９】
実施例１６：他の生物由来のリボソーム分画の細胞塊形成能
図１４に示した細菌や細胞から、粗精製リボソーム分画と７０Ｓリボソーム分画または８０Ｓリボソーム分画を精製し、実施例２と同様にしてＨＤＦ細胞を用いて細胞塊形成能を調べた。原核生物からのリボソーム分画の精製は、実施例６に従って行い、また、真核生物からのリボソーム分画の精製は、Ａｎｇｅｒらの報告（上記）に記載の方法に従って行った。図中のそれぞれの略号は以下の菌または細胞を示す；Ｌａｃ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＪＣＭ １０２１， Ｌｃａ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＪＣＭ１１３４， Ｌｒｅ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ＪＣＭ １１１２， Ｓｅｐ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＪＣＭ２４１４， Ｂｓｕ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． １６８ ＪＣＭ１０６２９， Ｅｃｏ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＥ２８， Ｐｐｕ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＪＣＭ １３０６３， Ｍｌｏ：Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ ＪＣＭ ２１５９０， Ｓｃｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ２０１１８， ＩＥＣ−６：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＩＥＣ−６。結果を図１４に示す。調べた全ての細胞腫に由来するリボソーム分画により細胞塊が形成された。また、ＨＤＦから精製したリボソーム分画を用いて同様にして細胞塊形成能を確認したところ、同様に細胞塊の形成が確認できた。それぞれの細胞塊形成の結果を図１５に示す。【００５０】
実施例１７：浮遊細胞に対するリボソーム分画の細胞塊形成能
浮遊性細胞への効果を調べるために、実施例６と同様にして、乳酸菌（Ｌａｃ）から、精製リボソーム分画を調整し、トリプシン処理を施したマウスリンパ球（ＷＥＨＩ、Ｂａ／Ｆ３）を用いて細胞塊形成能を調べた。
図１６に示すように、細胞塊は形成されなかった。
【００５１】
実施例１８：形成された細胞塊細胞における多能性マーカーの確認
乳酸菌（Ｌａｃ）の７０Ｓリボソーム分画を用いて細胞塊を形成し、３日目（Ａ）、７日目（Ｂ）、１０日目（Ｃ）にアルカリホスファターゼ染色を行った。アルカリホスファターゼは、ＢＭ ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅ（株）社製）を用いて、製造元のプロトコールに従って測定した。その結果、細胞塊は３日目から継続してアルカリホスファターゼ活性を示した。
次いで、乳酸菌７０Ｓリボソーム分画を用いて実施例２と同様にして細胞塊を形成した。培養２週間後、マウス抗α−Ｎａｎｏｇ抗体（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、ラット抗Ｏｃｔ３／４抗体（Ｒ＆Ｄ）、マウス抗ＴＲＡ−１−６０抗体（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マウス抗ＳＳＥＡ４抗体（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ラット抗Ｓｏｘ２抗体（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造元のプロトコールに従って染色した。その結果、細胞塊は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２を認識する抗体により染色された。また、培養１日目および２０日目の細胞塊を用いて、ＴＵＮＥＬ  ａｓｓａｙを行い、細胞死を調べた。結果、培養後１日、２０日後の細胞塊では細胞死は観察されなかった。【００５２】
実施例１９：リボソームの加熱処理の影響
精製した乳酸菌７０Ｓリボソーム分画を、１００度で１０分加熱後、すぐ氷上に置いた場合と室温で１０分間置いた場合のそれぞれについて、実施例２と同様にしてＨＤＦ細胞を用いて細胞塊形成能を調べた。その結果を図１７に示す。室温で１０分間おいた場合には細胞塊は形成されたが、加熱後すぐ氷上に置いた場合には細胞塊形成能は減少した。これにより、RＮＡの高次構造が細胞塊形成能に寄与していると判った。【００５３】
実施例２０：形成細胞塊細胞からの神経細胞の分化誘導
乳酸菌（Ｌａｃ）から７０Ｓリボソーム分画を調製し、実施例２と同様にして細胞塊を形成させた。培養２週間後、Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ミリポア）を用いて神経細胞の誘導と分化を行い、マウス抗α−Ｔｕｊ１抗体、ラット抗ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ抗体、マウス抗ＭＡＰ２抗体による免疫染色法を行った。その結果、細胞塊の一部の細胞は３つの神経細胞マーカー抗体により認識された。このことから、誘導した細胞塊から神経細胞への分化が観察された。【００５４】
実施例２１：形成細胞塊細胞からの心筋細胞の分化誘導
乳酸菌（Ｌａｃ）から７０Ｓリボソーム分画を調製し、実施例２と同様にして細胞塊を形成させた。培養２週間後、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ミリポア）を用いて心筋細胞の誘導と分化を行い、ウサギ抗α−ＮＫＸ２抗体とマウス抗ＴＮＮＴ２抗体による免疫染色法を行った。その結果、細胞塊の一部の細胞は２つの心筋細胞マーカー抗体により認識された。このことから、心筋細胞への分化が観察された。【００５５】
実施例２２：上皮間葉転換の確認
ＨＤＦ細胞をウサギ抗α−Ｓｎａｉｌ抗体（ａｂｃａｍ）とマウス抗α−Ｔｗｉｓｔ抗体（ａｂｃａｍ）を用いて免疫染色法を行った。
乳酸菌（Ｌａｃ）から７０Ｓリボソーム分画を調製し、実施例２と同様にして細胞塊を形成させた。培養２週間後、細胞塊をウサギ抗α−Ｓｎａｉｌ抗体、マウス抗α−Ｔｗｉｓｔ抗体、マウス抗α−Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ａｂｃａｍ）抗体を用いて免疫染色した。
その結果、ＨＤＦ細胞は抗α−Ｓｎａｉｌ抗体と抗α−Ｔｗｉｓｔ抗体ではほとんど染色されないが、細胞塊を形成した細胞はこれらの抗体で認識された。また、細胞塊を形成した細胞は抗α−Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体では、染色されなかった。これらの結果は、形成された細胞塊が上皮間葉転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を起こしたことを示すものである。【００５６】
実施例２３：がん細胞への適用
乳酸菌（Ｌａｃ）から７０Sリボソーム分画を調製し、理化学研究所バイオリソースセンターから肺がん細胞株（Ａ５４９；ＲＢＲＣ−ＲＣＢ００９８）、肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２；ＲＢＲＣ−ＲＣＢ１６４８）、および乳がん細胞株（ＭＣＦ７；ＲＢＲＣ−ＲＣＢ１９０４）を入手し、実施例２と同様の実験を行い、細胞塊を形成した。その後、細胞塊を２週間培養し、脂肪細胞、骨細胞に分化誘導をうながす培養液（ＧＩＢＣＯ；Ａ１００７０−０１，Ａ１００７２−０１）に交換し、さらに２−３週間培養した。
結果を図１８に示す。図に示すように、肺がん細胞、肝がん細胞、乳がん細胞は乳酸菌由来７０Ｓリボソーム分画を取り込むことにより再プログラミングされ、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色（脂肪）、Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ染色（骨）により染色され、脂肪細胞や骨細胞へと分化したことが確認された。【００５７】
実施例２４：形成細胞塊のゲノムＤＮＡ解析
乳酸菌（Ｌａｃ）由来７０Ｓリボソーム分画をＨＤＦ細胞に取り込ませて１６日後の細胞塊を用いて、ｃｙｔｏｓｃａｎによる染色体構造解析を行った。通常の多能性幹細胞ではＱ−ｂａｎｄ あるいはＧ−ｂａｎｄ観察による核型解析が一般的であるが、この細胞は細胞増殖していないため、開いた構造の染色体を観察することができない。そのため、ｃｙｔｏｓｃａｎ（マイクロアレイの一種で、ＳＮＰマーカー等、染色体構造を見るために必要な遺伝子を網羅してあるチップに対してゲノムＤＮＡをハイブリダイズして検出）解析を行った。
細胞塊からゲノムＤＮＡをｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ＆ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔでゲノムＤＮＡを抽出・精製した。精製したゲノムＤＮＡを徳島大学大学院 医歯薬学研究部 総合研究支援センター 先端医療研究部門に送付し、受託解析を行った。受託解析ではゲノムＤＮＡの品質チェック後、マイクロアレイ反応および検出を行った。
その結果、染色体１４と１７にトリソミーが検出されたが、１４のものはアルゴリズム上必ずでるので、１７だけがトリソミーとして確認された。今回作製した多能性細胞は、シングルセルクローンではなく集合体なので、ポピュレーション全体でトリソミーが発生している可能性がある。染色体１７のｑ２１．３１領域が３コピー存在するが、この領域は、ＥＳ細胞樹立時に比較的よく起きるトリソミーで特に問題にはならない。【００５８】
上記の記載は、本発明の目的および対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更および置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、体細胞の再プログラミングを誘導する方法として、さらには、体細胞から多能性細胞を製造する方法として有用である。また、本発明による多能性細胞の製造方法は、医療分野（創薬研究、並びに医薬品の安全性、有効性および副作用の試験）、疾患研究（難病の原因解明、治療法や予防法の開発）、再生医療（神経、血管、臓器の機能修復）、並びに食品分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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