(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、
ｉｉ）Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、
ｉｉｉ）５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）及び５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）から選ばれるシーケンスを有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、
及びｉｖ）必要ならば薬学的に許容される担体
を含み、
前記成分ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の間の相対重量比範囲が１：０．２〜５：１〜５０であり、
サポニンまたはサポニン誘導体を含まない、
医薬組成物。
【請求項２】
予防用または治療用ワクチンとして用いられる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＨＢｓＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるシーケンスを有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＨＢｃＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるシーケンスを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＣｐＧ−ＯＤＮが５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のシーケンスを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記成分ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の間の相対重量比範囲が１：１〜５：２〜１５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物及びその添付文書を含むキット。
【請求項８】
対象においてＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気、好ましくは、Ｂ型肝炎、肝硬変及び肝癌から選ばれるＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気を処置する医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
ＨＢＶに対する免疫応答を発生する医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
抗ＨＢｃＡｇ抗体に亜型変転を発生させる医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１】
Ｂ型肝炎ウイルス免疫寛容を突破する医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢ型肝炎ワクチンに関し、特に本発明はＢ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原及び免疫賦活活性を有するホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドを含むＢ型肝炎ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は世界的に重大な健康上の問題の１つである。ＨＢＶ感染は慢性Ｂ型肝炎、肝硬変及び肝細胞癌に至る重要要因である（Ｆａｔｔｏｖｉｃｈ Ｇ. Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００８；４８：３３５-３５２）。慢性ＨＢＶ感染を臨床治療するのに主に用いられる薬物はヌクレオシド類似体及びインターフェロンである。ヌクレオシド類似体は肝細胞内のｃｃｃＤＮＡを完全には除去できず、且つ長期に使用すれば薬剤耐性変異体の出現及び投与停止後のリバウンドを招きうる（Ｋｗｏｎ Ｈ, Ｌｏｋ ＡＳ. Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ. ２０１１； ８：２７５-２８４.）。インターフェロンは無症候性HBVキャリアーには適さない。慢性ＨＢＶ患者において、半年使用した後ＨＢｅＡｇ血清変換率はわずか３３％であり、且つインターフェロンの副作用が比較的大きいためその適用が制限されている(Ｔａｎｇ ＳＸ, Ｙｕ ＧＬ.Ｌａｎｃｅｔ １９９０；３３５(８６８４)： ３０２)。
【０００３】
現在汎用されているＢ型肝炎蛋白ワクチンは体液性免疫を誘導し、防御抗体を生成させることによって、予防の目的を達する。多くの研究は、防御抗体は細胞外のウイルス粒子のみ排除でき、細胞内の感染ウイルスは主に特異的細胞性免疫反応、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞により生成されたＩＦＮ−γ等Ｔｈ１型細胞因子、特にウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)によって排除されることを示している（Ｃｈｉｎ Ｒ，Ｌａｃａｍｉｎｉ Ｓ. Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｏｒｌ. ２００３：１３(４)：２５５−７２）。細胞性免疫反応の弱強が直接Ｂ型肝炎の予後を定める。そのため、理想的なＢ型肝炎ワクチンは特異的な体液性免疫と細胞性免疫を誘導し、Ｂ型肝炎の免疫寛容を突破する必要がある。
【０００４】
現在多くのＢ型肝炎治療用ワクチンの研究開発はＨＢｓＡｇに関してなされており、免疫寛容を克服し、抗ＨＢｓＡｇ抗体を生成することによって、免疫異物排除の効果を達し、例えば聞玉梅のＨＢｓＡｇ−免疫グロブリン複合物（Ｘｕ Ｄ Ｚ，Ｚｈａｏ Ｋ，ｅｔ ａｌ. ＰＬｏＳ ＯＮＥ,２００８,３：ｅ２５６５）、張宜俊の高作用量Ｂ型肝炎表面抗原ワクチン（Zeng Ying, Zhang Yijun, et al，広東医薬，２００３年２４卷０７期，７４０−７０６頁）等が前記原理に基づいている。その最新の臨床データから見れば、前記２つのワクチンの治療効果はまだ明白ではない。
【０００５】
研究により示されるように、慢性Ｂ型肝炎感染患者の抗ＨＢｓＡｇ抗体亜型がＩｇＧ４を主とし、Ｂ型肝炎感染治癒患者の抗ＨＢｓＡｇ抗体亜型が主にＩｇＧ１≧ＩｇＧ４であるので、Ｂ型肝炎感染の排除過程においてＴｈ１型抗体亜型ＩｇＧ１が重要な役割を果たすことが示唆される。Ｔｈ１型抗体亜型がＴｈ２型抗体亜型より高いか否かを評価することはＢ型肝炎治療に有用でありうる（Ｓ. Ｒａｔｈ, ｅｔ ａｌ. Ｃｌｉｎ.ｅｘｐ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.(１９８８)７２，１６４−１６７）。同時に、Ｂ型肝炎感染患者の抗ＨＢｃＡｇ型抗体亜型はＩｇＧ１>ＩｇＧ３>ＩｇＧ４であり、一方、Ｂ型肝炎感染治癒患者の抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型はＩｇＧ３>ＩｇＧ１>ＩｇＧ４と異なり、抗ＨＢｃＡｇ、特に抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型の変転がＢ型肝炎の治療に密に関わっている可能性がある（Ｃｈｉｅｎ−Ｆｕ Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ. Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ. ２００６；３(２)：９７−１０６.）。
【０００６】
また、さらに研究は、慢性Ｂ型肝炎ウイルスキャリアー及び慢性Ｂ型肝炎患者において樹状細胞（ｐＤＣ）表面受容体ＴＬＲ９発現がダウンレギュレートされ、それによって、体のＢ型肝炎表面抗原に対する免疫寛容が導かれ、Ｂ型肝炎表面抗体またはＢ型肝炎表面抗原に対する細胞性免疫を生成できないことを示している（Ｑ. Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ.  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ １１ (２００９) ５１５−５２３）。
【０００７】
特許ＵＳ４５４７３６７においてはＨＢｃＡｇ粒子を使用してＨＢＶ感染及びＨＢＶにより介在される病気が治療／予防される。ＨＢｃＡｇ粒子を用いてチンパンジーを免疫することにより、チンパンジーをＨＢＶ感染から保護できる。さらに、ＨＢｃＡｇ粒子およびＨＢｓＡｇ粒子を用いてＢ型肝炎キャリアーの母から生まれた新生児を免疫すると、高力価の抗ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｃＡｇ抗体が生成し、１８ヶ月の観察においてＨＢＶ感染が認められなかった。しかしながら、前記特許は抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型変転の証拠を示しておらず、ＨＢＶ感染及びＨＢＶ介在の病気の治療の直接の証拠も示していない。
【０００８】
特許ＷＯ２００７／０３１３３４には、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びサポニンアジュバントを含むＢ型肝炎治療用ワクチンの成分が記載されている。ＣｐＧ−ＯＤＮをアジュバントとして使用することができるが、前記Ｂ型肝炎治療用ワクチンはヌクレオシド類似体と組み合わせて使用しなければＢ型肝炎の免疫寛容を突破できず、且つｅ抗原陰性転化が僅か２５％しかなかった。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ｉｉ）Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ｉｉｉ）ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）及び／または必要ならばｉｖ）薬学的に許容される担体を含む薬物組成物に関する。特に、本発明の薬物組成物は予防用または治療用ワクチンとして用いることができる。一部の態様において、前記薬物組成物が前記成分ｉ）-- ｉｉｉ）及び必要ならばｉｖ）によって構成される。
【００１０】
本発明の一部の態様において、前記ＨＢｓＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるシーケンスを有する。
【００１１】
本発明の他の一部の態様において、前記ＨＢｃＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるシーケンスを有する。
【００１２】
本発明の他の一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮがチオリン酸エステル結合を含む。特に、前記ＣｐＧ−ＯＤＮがホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドで、好ましくはトータルホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の他の一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮが２つまたはより多くの５’−ＮＴＣＧＴＴ−３’配列モチーフを含む。
【００１４】
本発明の他の一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮの長さが１５〜３５のヌクレオチド、好ましくは２０〜２５のヌクレオチドである。
【００１５】
本発明の他の一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮが５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び５’−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）から選ばれるシーケンスを有し、好ましくは、前記ＣｐＧ−ＯＤＮが５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’のシーケンスを有する。
【００１６】
本発明の他の一部の態様において、前記薬物組成物の成分ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の間の相対重量比範囲が１：０．２〜５：１〜５０で、好ましくは１：１〜５：２〜１５である。
【００１７】
本発明はさらに、ｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ｉｉ）Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ｉｉｉ）ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）及び必要ならばｉｖ）薬学的に許容される担体を含むＢ型肝炎ワクチンに関する。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の薬物組成物またはＢ型肝炎ワクチン及び必要ならばその添付文書を含むキットに関する。
【００１９】
１つの側面において、本発明は、本発明に基づく薬物組成物の、対象においてＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気を処置する医薬の調製における用途に関し、好ましくは、前記ＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気がＢ型肝炎、肝硬変及び肝癌から選ばれる。
【００２０】
もう１つの側面において、本発明は、本発明に基づく薬物組成物の、対象においてＨＢＶに対する免疫応答を発生する（好ましくは、Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答を誘導する）医薬の調製における用途に関する。
【００２１】
他の１つの側面において、本発明は、本発明に基づく薬物組成物の、対象において抗ＨＢｃＡｇ抗体に亜型変転を発生させる医薬の調製における用途に関する。
【００２２】
もう１つの側面において、本発明は、本発明に基づく薬物組成物の、対象においてＢ型肝炎ウイルス免疫寛容を突破する医薬の調製における用途に関する。
【００２３】
もう１つの側面において、本発明は、本発明に基づく薬物組成物の、対象においてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答バランス（例えばほぼ相当にＴｈ１及びＴｈ２型免疫応答を誘導する）を実現する薬物の調製における用途に関する。
【００２４】
もう１つの側面において、本発明はｉ）Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ｉｉ）Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ｉｉｉ）ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）を含む薬物組成物に関する。特に、本発明の薬物組成物は、対象においてＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気の処置、対象におけるＨＢＶに対する免疫応答の発生（特に、Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答を誘導する）、対象における抗ＨＢｃＡｇ抗体における亜型変転の発生、対象における抗原特異的ＣＴＬ殺傷活性の誘導、及び対象におけるＢ型肝炎ウイルス免疫寛容の突破に用いることができる。
【００２５】
もう１つの側面において、本発明は、対象に対して処置有効量の本発明に基づく薬物組成物を施用することを含む、対象においてＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気を処置する方法に関する。
【００２６】
もう１つの側面において、本発明は、対象に対して処置有効量の本発明に基づく薬物組成物を施用することを含む、対象においてＨＢＶに対する免疫応答（好ましくは、Ｔｈ１及びＴｈ２型免疫応答を誘導する）を発生させる方法に関する。
【００２７】
もう１つの側面において、本発明は、対象に対して処置有効量の本発明に基づく薬物組成物を施用することを含む、対象においてＨＢｃＡｇ抗体に亜型変転を発生させる方法に関する。
【００２８】
もう１つの側面において、本発明は、対象に対して処置有効量の本発明に基づく薬物組成物を施用することを含む、対象においてＢ型肝炎ウイルス免疫寛容を突破する方法に関する。
【００２９】
もう１つの側面において、本発明は、対象に対して処置有効量の本発明に基づく薬物組成物を施用することを含む、対象において抗原特異的ＣＴＬ殺傷活性を誘導する方法に関する。
【００３０】
もう１つの側面において、本発明は、対象に対して処置有効量の本発明に基づく薬物組成物を施用することを含む、対象においてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答バランス（例えば、ほぼ相当にＴｈ１及びＴｈ２型免疫応答を誘導する）を実現する方法に関する。
【００３１】
一部の態様において、本発明の薬物組成物はサポニンアジュバントを含まない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、マウスのＢ型肝炎表面抗原特異的総ＩｇＧに関する免疫応答を増強することを示す。
【図２】図２は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、マウスの防御抗体免疫応答の発生を増強することを示す。
【図３】図３は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、体液性免疫レベルにおいてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ２免疫応答を増強することを示す。
【図４】図４は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、体液性免疫レベルにおいてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ１免疫応答を増強することを示す。
【図５】図５は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、体液性免疫レベルにおいてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答バランスを促進することを示す。
【図６】図６は本発明の組成物により生成された抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型がＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１であることを示す。
【図７】図７は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、細胞性免疫においてＨＢｓＡｇ ＣＴＬエピトープ特異的Ｔｈ１細胞分化を促進してＴｈ２細胞増殖を抑制することを示す。
【図８】図８は本発明の組成物においてＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧとの組み合わせが抗原特異的ＩｇＧ抗体産生レベルにおいて相乗作用を示すことを示す。
【図９】図９は本発明の組成物においてＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧの組み合わせがＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧと比べ、細胞性免疫レベルにおいてＨＢｓＡｇ特異的Ｔｈ１細胞分化を促進する能力を有することを示す。
【図１０】図１０は本発明の組成物が抗原特異的ＩｇＧ免疫応答の発生において、ＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスの免疫寛容を突破することを示す。
【図１１】図１１は本発明の組成物が中和抗体免疫応答の発生において、ＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスの免疫寛容を突破することを示す。
【図１２】図１２は本発明の組成物がＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスの免疫寛容を突破し、高力価抗ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ抗体を生成することを示す。
【図１３】図１３は本発明の組成物がＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスにおいて生成する抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型がＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１であることを示す。
【図１４】図１４は本発明の組成物が従来のワクチン組成と比べ、ＨＢＶ遺伝子導入マウスにおけるＨＢｓＡｇ抗原排除に、より高い能力を有することを示す。
【図１５】図１５は本発明の組成物がＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性を有し、本発明の組成物が慢性Ｂ型肝炎処置用ワクチンとして使用できること示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、図面および具体的な態様を通じて本発明をさらに説明するが、以下の詳細な説明は特定の態様または特定の使用に関して説明するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【００３４】
本発明の１つの目的は従来の技術におけるＢ型肝炎感染を処置する既知の薬物の欠陥を克服することにある。
【００３５】
特に、本発明の１つの目的は薬物組成物を提供することにあり、前記組成物は慢性ＨＢＶ感染患者において強い免疫応答を発生し、抗ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧ２ａ抗体亜型の分化を促進し、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ１とのバランスをとらせ、抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型に変転を発生させ及び／またはＨＢＶ感染患者の免疫寛容を突破することができる。
【００３６】
本発明の他の１つの目的は、前記組成物のＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気の処置における用途、及びＨＢＶ感染及び／またはＨＢＶ介在の病気を処置する方法を提供することにある。
【００３７】
前記目的を達成するため、本発明は薬物組成物を提供し、これは、
i）ＨＢｓＡｇ、前記抗原のフラグメント、前記抗原の変異体、またはその少なくとも２種の混合物、
ii）ＨＢｃＡｇ、前記抗原のフラグメント、前記抗原または前記抗原のフラグメントの変異体、またはその少なくとも２種の混合物、
iii）シーケンスには２つまたは２つ以上のコピーされた５’−ＮＴＣＧＴＴ−３’配列モチーフを有し、長さが２０〜２５の塩基である、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドであるＣｐＧ−ＯＤＮ
を含む。前記オリゴヌクレオチドは５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’、５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ−３’、５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ−３’または５’−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ−３’の塩基シーケンスから選ばれることが好ましく、５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’がより好ましい。
【００３８】
本発明の組成物は予想外の技術的効果を実現し、従来の市販Ｂ型肝炎ワクチンと比べ、マウス体内試験において、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、抗ａｄｒ血清型中和抗体を含む、より強い免疫応答を媒介でき、特にＴｈ１細胞性免疫応答を媒介し、ウイルス排除に関わるサイトカインＩＦＮ−γを生成し、抗ＨＢｓ−ＩｇＧ２ａ抗体亜型の分化及び成熟、抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型の変転を促進し、体液性免疫及び細胞性免疫のバランスを実現する。
【００３９】
従来の技術（特許ＣＮ１０１４９２６７２参照）には組成物ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧが既に開示されているが、本発明者は予想外に、本発明に基づく薬物組成物（ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ ＯＤＮの組み合わせ）がＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ組成物より顕著に優れて抗ＨＢｓＡｇ特異抗体を生成でき、予想外の相乗作用を示すことを発見した。
【００４０】
より予想外に、遺伝子導入マウス体内の実験は、本発明に基づく組成物は遺伝子導入マウスの免疫寛容を突破し、高力価の抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、中和抗体を生成し、Ｔｈ１細胞性免疫応答を媒介し、ＩｇＧ２ａ抗体亜型の分化及び成熟を促進できることを示した。同時に、血清におけるＢ型肝炎表面抗原発現レベルの測定によって、本発明に基づく組成物による複数回の免疫は遺伝子導入マウス体内のＢ型肝炎ウイルスを顕著に排除し、そのＢ型肝炎ウイルス発現レベルを下げさせることができることを示した。本発明の組成物はさらに、誘導する強い抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の体内殺傷活性、特にＨＢｓＡｇ ＣＴＬ及びＨＢｃＡｇ ＣＴＬの体内殺傷活性を示し、前記実験の証拠はさらに、本発明の組成物は大幅に従来の技術におけるワクチンのレベルを超え、より有効にＢ型肝炎（特に慢性Ｂ型肝炎）を処置できることを証明した。
【００４１】
また、ＢＡＬＢ／ｃマウス及びモデルマウスにおいて強い抗HBcAgの免疫応答を媒介でき、且つ抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型の変転を実現し、即ち表した抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型関係はＩｇＧ２ａ抗体レベルがＩｇＧ１より高く、治癒したＢ型肝炎感染患者の抗体亜型関係と一致する。前記有望な結果は、本発明に基づく組成物はＢ型肝炎処置ワクチンとして用いることができ、それによって、従来の課題を解決できることを示した。
【００４２】
定義
別に定義されない場合、本文に使用される全ての技術用語は当業者に理解される意味を有する。本分野の定義及び用語に関し、当業者はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参考にできる。アミノ酸残基の略号は２０の常用Ｌ−アミノ酸を指す標準的な３字及び／または１字のコードである。
【００４３】
本発明においては広義に数値範囲及びパラメータの近似値が示されるが、具体的な例に示される数値はできる限りに正確に記載される。然し、いずれの値もある程度の誤差を含み、それはそれぞれの測定において存在する標準偏差によるものである。さらに、本文に記載された全ての範囲はそのうちに含まれるいずれか及び全てのサブ範囲を含むものとして理解すべきである。例えば「１〜１０」と記載される範囲が最小値１と最大値１０を含むそれらの間のいずれか及び全てのサブ範囲を含むものとして理解すべきであり、即ち最小値１またはより大きい値から始まる全てのサブ範囲、例えば１〜６．１、及び最大値１０またはより小さい値で終わる全てのサブ範囲、例えば５．５〜１０を含むものとして理解すべきである。また、「本文の一部とする」と記載される参考文献はその全体が本文の一部として組み込まれるものとして理解すべきである。
【００４４】
また注意すべきなのは、本明細書に使用される単数形は、その対象に明確な限定がなされない限り、その対象の複数形を含むということである。また、別途明記されない限り、用語「または」は用語「及び／または」と相互に交換して使用されうる。
【００４５】
本文に使用される用語「ポリペプチド」はアミノ酸重合体を指し、且つ具体的なアミノ酸数に制限されない。そのため、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、オリゴマー、粒子等を含む。さらに、用語「ポリペプチド」はリボソームにおいて翻訳により得た純粋なアミノ酸重合体だけでなく、翻訳後修飾（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、チオ等）して得たポリペプチドを含む。
【００４６】
本文に使用される用語「抗原フラグメント」は、天然または合成ポリペプチドの抗原性を維持する天然または合成ポリペプチドのフラグメントを指し、即ち前記天然または合成ポリペプチドに対する免疫応答を誘導できる。
【００４７】
本文に使用される用語「Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓ）」は、天然ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇ抗原性フラグメント、ＨＢｓＡｇ機能性変異体及びその任意の組み合わせを包含する。特に、前記天然ＨＢｓＡｇが２２６のアミノ酸を含む天然ＨＢｓＡｇポリペプチドである。特に、前記天然ＨＢｓＡｇが既知のＨＢＶ標準遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及び／またはＨの天然ＨＢｓＡｇポリペプチドに由来する。一部の態様において、前記ＨＢｓＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるシーケンスを有する。
【００４８】
本文に使用される用語「ＨＢｓＡｇ抗原性フラグメント」は、天然ＨＢｓＡｇにおける２２６のアミノ酸より少ないアミノ酸の連続または不連続なフラグメントを有し、且つ天然ＨＢｓＡｇの抗原性を維持するポリペプチドを指す。
【００４９】
本文に使用される用語「ＨＢｓＡｇ機能性変異体」は、天然ＨＢｓＡｇまたはＨＢｓＡｇフラグメントに対して多くとも３０、多くとも２５、多くとも２０、多くとも１５、多くとも１０、多くとも５、多くとも４、多くとも３、多くとも２、多くとも１つのアミノ酸欠失、挿入、添加または置換を有し、且つ天然ＨＢｓＡｇの機能（例えば抗原性）を維持するポリペプチドを指す。
【００５０】
本文に使用される用語「Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ、ＨＢｃ）」は天然ＨＢｃＡｇ、ＨＢｃＡｇ抗原性フラグメント、ＨＢｃＡｇ機能性変異体及びその任意の組み合わせを包含する。特に、前記天然ＨＢｃＡｇが１８３のアミノ酸を含有する天然ＨＢｃＡｇポリペプチドである。特に、前記天然ＨＢｃＡｇが既知のＨＢＶ標準遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ及び／またはＨの天然ＨＢｃＡｇに由来する。一部の態様において、前記ＨＢｃＡｇがＨＢｃＡｇ１−ｘポリペプチドから選ばれ、それは天然ＨＢｃＡｇの位置1−Ｘのアミノ酸のフラグメントを表し、特に、Ｘが１４９〜１８３である。他の一部の態様において、前記ＨＢｃＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１４９のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５０のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５１のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５２のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５３のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５４のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５５のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５６のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５７のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５８のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５９のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６０のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６１のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６２のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６３のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６４のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６５のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６６のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６７のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６８のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１６９のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７０のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７１のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７２のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７３のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７４のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７５のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７６のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７７のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７８のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１７９のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１８０のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１８１のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１８２のアミノ酸及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１８３のアミノ酸のシーケンスを有するポリペプチドから選ばれる。一部の態様において、前記ＨＢｃＡｇがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるシーケンスを有する。
【００５１】
本文に使用される用語「ＨＢｃＡｇ抗原性フラグメント」は、天然ＨＢｃＡｇにおける１８３のアミノ酸より少ないアミノ酸の連続または不連続なフラグメントを有し、且つ天然ＨＢｃＡｇの抗原性を維持するポリペプチドを指す。
【００５２】
本文に使用される用語「ＨＢｃＡｇ機能性変異体」は、天然ＨＢｃＡｇまたはＨＢｃＡｇフラグメントに対して多くとも３０、多くとも２５、多くとも２０、多くとも１５、多くとも１０、多くとも５、多くとも４、多くとも３、多くとも２、多くとも１つのアミノ酸欠失、挿入、添加または置換を有し、且つ天然ＨＢｃＡｇの機能（例えば抗原性）を維持するポリペプチドを指す。
【００５３】
好ましくは、本発明において、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｓＡｇが本発明に基づく組成物において共に粒子の形態で存在する。
【００５４】
本文に使用される用語「薬物組成物」（「医薬組成物」）、「組み合わせ薬物」及び「薬物組み合わせ」は互換的に使用でき、それは一緒に組み合わせることによって所定の目的を実現する少なくとも１種の薬物及び必要ならば薬学的に許容される賦形剤または添加剤の組み合わせを表す。一部の態様において、前記薬物組成物は協同に作用することによって本発明の目的を実現できるならば、時間的及び／または空間的に分けられた組み合わせを含む。例えば、前記薬物組成物に含まれる成分（例えばＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮ）は全体で対象に施用してもよく、分けて対象に施用してもよい。前記薬物組成物に含まれる成分が分けて対象に施用される場合、前記成分は同時または順に対象に施用されて良い。
【００５５】
本文に使用される用語「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド 」または「ＣｐＧ−ＯＤＮ」は短い単鎖合成ＤＮＡ分子を指し、それには１つまたはより多くの「ＣｐＧ」ユニットが含有され、そのうちＣがシトシン 、Ｇがグアニン 、ｐがリン酸ジエステル結合を指す。特に、前記ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドはメチル化されていない。一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮはチオリン酸エステル結合またはチオリン酸エステル骨格を含む。即ち、一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮがチオリン酸エステルオリゴデオキシヌクレオチド（即ちホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチド）である。好ましくは、前記ＣｐＧ−ＯＤＮにおける全てのヌクレオチド間の結合がチオリン酸エステル結合であり、即ち前記ＣｐＧ−ＯＤＮがトータルホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドである。他の一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮが２つまたはより多くの５’−ＮＴＣＧＴＴ−３’配列モチーフを含む。他の一部の態様において、前記ＣｐＧ−ＯＤＮは長さが１５〜３５のヌクレオチド、好ましくは２０〜２５のヌクレオチドである。特に、前記ＣｐＧ−ＯＤＮが５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ Ｔ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及び５’−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）から選択されるシーケンスを有し、特に、前記ＣｐＧ−ＯＤＮが５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’のシーケンスを有する。
【００５６】
本文に使用される「処置有効量」（「治療有効量」）または「有効量」は施用（投与）対象に対し利点を十分に表す服用量を指す。実際の施用量、及び施用の速度及び時間過程が処置対象者の状況及び重篤度に応じて決められる。処置の処方（例えば服用量の決定等）は一般医及びその他の医者の責任で決定され、一般的に、治療される病気、患者個人の状況、送達部位、施用方法及び医者にとって既知のその他の要因が考慮される。
【００５７】
本文に使用される用語「ＨＢＶが介在する病気」は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により引き起こされ、誘発され、悪化される病気、またはそのリスク及び／または発生にＨＢＶが関与する病気、例えばＢ型肝炎ウイルスキャリアー、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓腹水、肝癌等を指す。
【００５８】
本文に使用される用語「抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型変転」は、対象における抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型関係がＢ型肝炎治癒患者における抗体亜型関係と一致する、即ちＢ型肝炎ウイルス感染治癒患者における抗体亜型関係と一致するように変えられることを意味する。特に、マウスにおいて、抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型がＩｇＧ１>ＩｇＧ２ａからＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ２ｂ>ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ>ＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１に変転し、例えばＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１に変転され、ヒトにおいて、抗ＨＢｃ抗体亜型がＩｇＧ１>ＩｇＧ３>ＩｇＧ４からＩｇＧ３>ＩｇＧ１>ＩｇＧ４に変転される。
【００５９】
本文に使用される用語「対象」は哺乳動物、例えば人類を指すが、その他の動物、例えば野生動物（例えばサギ、コウノトリ、ツル等）、家畜（例えばアヒル、ガチョウ等）または実験動物（例えばオランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、テンジクネズミ、プレーリードッグ、ジリス等）であっても良い。
【００６０】
本発明の組成物のもう１つの態様は、ｉ）ＨＢｓＡｇまたはその変異体、ｉｉ）ＨＢｃＡｇ１−１８３、ｉｉｉ）２１の塩基の含有し、そのシーケンスに２つまたは２つ以上のコピーされた５’−ＮＴＣＧＴＴ−３’配列モチーフを有するホスホロチオアートオリゴヌクレオチドＣｐＧ−ＯＤＮを含む。
【００６１】
一部の態様において、本発明の薬物組成物において成分ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）の間の相対重量比範囲が１：０．２〜５：１〜５０で、好ましくは１：１〜５：２〜１５で、より好ましくは１：１：２である。
【００６２】
他の一部の態様において、本発明の薬物組成物は、特にそれが医薬製剤の形で存在する場合、さらに別の添加剤、例えば薬物担体または添加剤を含む。
【００６３】
一部の態様において、本発明の薬物組成物はサポニンアジュバントを含まない。
【００６４】
好ましい薬物担体は、特に水、バッファ溶液、好ましくは等張塩溶液、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液）、葡萄糖、マンニトール、フィッシャー葡萄糖、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノールまたはポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、トリグリセリド等である。使用される薬物担体の種類は特に本発明に基づく組成物が経口、鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内のいずれで用いられるかによって定められる。本発明に基づく組成物は湿潤剤、乳化剤またはバッファ液を添加剤として含むことができる。
【００６５】
本発明に基づく組成物、ワクチンまたは薬物製剤は、いずれかの適当なルート、例えば経口、鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与により施用できる。
【実施例】
【００６６】
実施例１．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせによりＢ型肝炎表面抗原特異的総IgGの免疫応答を増強する。
【００６７】
ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物のＢ型肝炎表面抗原特異的総ＩｇＧ免疫応答を測定するため、本発明者はそれぞれＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮ、ＨＢｓＡｇ及びＡｌ(ＯＨ)３アジュバントを混合し、その混合物でマウスを免疫した。血清におけるＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧレベルを測定し、且つ統計学分析を行うことによって、ＨＢｓＡｇとＡｌ(ＯＨ)３の組み合わせと比較して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせのＨＢｓＡｇ特異的総ＩｇＧ免疫応答に対する作用を評価した。
【００６８】
本実施例に使用されるＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）は、上海斯莱克公司から購入した。本実施例に使用されるＨＢｓＡｇ抗原はProspecから購入した（ロット：１１１１ＰＨＡＤＷ２２、シーケンスがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される）。これはPichia発現のａｄｗ２亜型で、純度が９５％以上であり、使用まで４℃の冷蔵庫において保管した。本実施例に使用されるＨＢｃＡｇ抗原（シーケンスがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される）は発明者が調製した。これは大腸菌発現の天然Ｂ型肝炎コア蛋白であった。精製方法は李計来、徐静等の「中国生物製品学雑誌（Chinese Journal of Biologicals）」２０１１、第２４巻第１１２１〜１１２５ページを参照しうる。具体的なステップは次のとおりであった：菌体を収集した後１０ ｍＭリン酸ナトリウムバッファ液で再懸濁を行い、超音波破砕し、遠心分離して上澄み液を収集し、飽和硫酸アンモニウムを加え、その最終濃度を３３％とした；４℃で一夜よく混合した；次の日、遠心分離して、沈殿を１０ ｍＭリン酸ナトリウムバッファ液で再懸濁し、透析袋に入れ、４℃で２４ｈ透析した；透析した後の溶液をハイドロキシアパタイト・カラムクロマトグラフィーに付し、蛋白ピークを収集し、濃縮を行い、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ ＨＲゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、ターゲット蛋白ピークを収集した；使用まで４℃の冷蔵庫で保存した。本実施例に使用されるＣｐＧ−ＯＤＮのシーケンスは５’−ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＴＴ−３’であった。これはＣＮ２００８１０００４７３６．０特許に記載される固相ホスホラミダイトトリエステル法化学合成方法で調製される。この方法は、３’ターミナルから開始され、次のステップを含む：１）脱保護：まずトリクロロ酢酸で、ＣｐＧに結合するヌクレオチドの保護基ＤＭＴ(ジメトキシトリチル)を除去し、遊離の５’ヒドロキシル基を得る；２）活性化：ホスホラミダイトヌクレオチド単量体とテトラゾリウム活性化剤とを合成カラムに入れて混合して、テトラゾリルホスホラミダイト反応性中間体を形成し、前記中間体は脱保護されたヌクレオチドと縮合反応させる；３）結合：テトラゾリルホスホラミダイト反応性中間体をＣｐＧにおける保護基が除去されたヌクレオチドと合わせると、それの５’ヒドロキシル基と親和反応を起こして縮合してテトラゾールを脱離する。この時オリゴヌクレオチド鎖が１つの塩基を延長する；４）酸化：縮合反応時、ヌクレオチド単量体が亜リン酸エステル結合によってＣｐＧに結合されたオリゴヌクレオチドと結合するが、亜リン酸エステル結合は不安定であり、酸またはアルカリによって加水分解されやすい。この時、チオスルフェート試薬を使用してホスホラミダイトをs-p二重結合でリン酸トリエステルに酸化することによって、安定なオリゴヌクレオチドを得る；５）ブロッキング：縮合反応後、ＣｐＧに結合され、反応に参与しなかった５’ヒドロキシル基がその後の反応サイクルにおいて延伸されることを防止するため、アセチル化によって前記ターミナルのヒドロキシル基をブロックする。前記５つのステップを経て、１つのデオキシヌクレオチドがＣｐＧヌクレオチドに結合された。前記脱保護、活性化、結合、酸化、ブロッキング過���を繰り返すことによってＤＮＡフラグメント粗生成物を得、最後にそれに対して切断、脱保護、精製、定量等の合成後処理を行って適するＣｐＧ−ＯＤＮを得、使用まで−２０℃の冷蔵庫に保存した。
【００６９】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。Ａｌ(ＯＨ)３アジュバントは天壇生物から購入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して左後肢腓腹筋の免疫を行った。１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群に１０匹のマウスを用いた。ＨＢｓＡｇ＋ Ａｌ(ＯＨ)３群においては、マウス毎に１μｇの、Ａｌ(ＯＨ)３に吸着されたＨＢｓＡｇを注射した。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においては、マウス毎に１μｇ ＨＢｓＡｇ、１μｇ ＨＢｃＡｇ及び２μｇ ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回免疫を行い、２回目の免疫後１０日目に血液を採取して血清を分離した。ルーチンの方法に基づき、２％の脱脂乳で前記血清に対して１：３０の希釈比から始めて連続３倍希釈を行い、総抗原特異的ＩｇＧ抗体の測定に用いた。
【００７０】
具体的な総抗原特異的ＩｇＧ抗体の測定ステップは以下の通りであった：各ウェル２５ｎｇのＨＢｓＡｇで９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社）を被覆し、４℃で一夜置いた。プレートを２回洗浄した後、５％脱脂乳で３７℃で１ｈブロックし、プレートを２回洗浄した後、前記連続３倍希釈された測定対象血清を加え、３７℃で１ｈ作用させた。プレートを３回洗浄した後、各ウェル５０μｌの１：３００００希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗-マウスＩｇＧ（米国ＳＩＧＭＡ社）を加え、３７℃で４０分間作用させた。プレートを３回洗浄した後、各ウェル１００μｌのＴＭＢ（米国Ｔｈｅｒｍｏ社）で１５分間呈色させた。各ウェル１００μｌの２Ｍ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光値ＯＤ４５０ｎｍ（ＯＤ６３０ｎｍで校正）を測り、終点の力価を確定する。結果は図１に示す。
【００７１】
図１から分かるように、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群の免疫応答が顕著に増強され、ＨＢｓＡｇ特異的抗体力価が４．０の対数値にも達することができ、ＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群と比べ、統計学的に有意な差（Ｐ<０．００１）を示した。特異抗体価（力価）が約３倍も増加できる。前記結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物ワクチンはＡｌ(ＯＨ)３アジュバントＢ型肝炎ワクチンと比べ、Ｂ型肝炎表面抗原特異的総ＩｇＧの免疫応答を顕著に増強できることを示した。
【００７２】
実施例２．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせはＢ型肝炎表面抗原の防御抗体レベルを向上する。
【００７３】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗体を測定することにより、Ｂ型肝炎ワクチンの接種が成功したか否かを観測する。Ｂ型肝炎ワクチンが免疫システムを刺激して中和抗体に相当するＢ型肝炎ウイルス表面抗体を生成させ、その力価がワクチンの防御力に直接関連する。前記抗体の生成がＨＢＶ感染の防止に対して顕著な効果を有する。そのため、本発明者は国際通用のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  Ｂ型肝炎ウイルス表面抗体国際単位測定システム（化学発光微粒子免疫測定法、ＣＭＩＡ）を使用して免疫マウス血清におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（抗ＨＢｓＡｇ）の濃度を測定し、且つ統計学分析を行い、それによって防御抗体レベル向上に対するＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせの防御効果を、ＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３と比較して評価した。
【００７４】
本実施例に使用されるＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）は、上海斯莱克公司から購入した。本実施例に使用されるＨＢｓＡｇ抗原、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＡｌ(ＯＨ)３アジュバントは実施例１に記載の通りである。
【００７５】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して左後肢腓腹筋に免疫を行った。１匹毎の注射体積は１００ μｌで、各群１０匹のマウスを用いた。ＨＢｓＡｇ＋ Ａｌ(ＯＨ)３群においては、マウス毎に１μｇの、Ａｌ(ＯＨ)３に吸着されたＨＢｓＡｇを注射した。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においては、マウス毎に１μｇ ＨＢｓＡｇ、１μｇ ＨＢｃＡｇ及び２μｇ ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回免疫を行い、２回目の免疫後１０日目に血液を採取して血清を分離した。血清を元の倍数で混合するか、または個別の血液をＰＢＳ溶液で希釈（２５０<ＩＵ<１０００に対し、５００倍希釈の各血液サンプル、およびＩＵ>１０００に対し、５０００倍希釈の各血液サンプル）して東南大学第２付属病院に送って検査を行い、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  Ｂ型肝炎ウイルス表面抗体国際単位測定システム（化学発光微粒子免疫測定法、ＣＭＩＡ）を使用して免疫マウス血清におけるＢ型肝炎ウイルス表面抗体（ＡＢＢＯＴＴ社ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ システム測定）を測定した。結果は図２に示す。
【００７６】
図２から分かるように、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においては防御抗体レベルを顕著に高めることができ、特異的防御抗体力価が４．３の対数値にも達することができ、ＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群と比べ、統計学的に有意な差（Ｐ<０．０５）を示した。特異的防御抗体価（力価）が約５倍も増加できる。前記結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物ワクチンはＡｌ(ＯＨ)３アジュバントＢ型肝炎ワクチンと比べ、Ｂ型肝炎表面抗原防御抗体レベルを顕著に高め、ワクチン防御力を増強できることを示した。
【００７７】
実施例３．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは体液性免疫レベルにおいてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ２免疫応答を増強する。
【００７８】
実施例１に記載の方法に基づき、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物のマウスＴｈ２型免疫応答に対する作用を測定した。ただし、測定する時に使用される酵素標識抗体がホースラディッシュペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗-マウスＩｇＧ１（米国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）で、希釈倍数が１：２００００であった。結果が図３に示される。
【００７９】
抗原特異的免疫応答はＴｈ１とＴｈ２の２つの種類に分けられ、そのうち、Ｔｈ２型の応答が高レベルの抗原特異的ＩｇＧ１抗体力価と対応する。Ａｌ(ＯＨ)３は非常に強いＴｈ２型ワクチンアジュバントであり、免疫した後、Ｔｈ１型免疫応答を抑制し、高レベルの特異的ＩｇＧ１抗体を誘導しうる。本実施例において、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物により生成されたＩｇＧ１抗体レベルがＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群より顕著に高く（Ｐ<０．００１）、ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ１抗体価（力価）を約１０倍増加できた。前記結果は、本発明の組成物はＡｌ(ＯＨ)３アジュバント群より強くＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ１抗体を生成でき、Ｂ型肝炎表面抗原Ｔｈ２免疫応答を増強できることを示した。
【００８０】
実施例４．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは体液性免疫レベルにおいてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ１免疫応答を増強する。
【００８１】
実施例１に記載の方法に基づき、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物のマウスＴｈ１型免疫応答に対する作用を測定した。ただし、測定する時に使用される酵素標識抗体がホースラディッシュペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗-マウスＩｇＧ２ａ（米国ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）で、希釈倍数が１：６０００であった。結果が図４に示される。
【００８２】
実施例３に記載したように、Ａｌ(ＯＨ)３は非常に強いＴｈ２型ワクチンアジュバントであり、免疫した後、Ｔｈ１型免疫応答を抑制し、非常に低レベルの特異的ＩｇＧ２ａ抗体を誘導しうる。本実施例において、Ａｌ(ＯＨ)３がＨＢｓＡｇアジュバントとして誘導した特異的ＩｇＧ２ａ抗体価は２．１７の対数値に過ぎなかった。本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物を使用して免疫した時には、生成されたＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ２ａ抗体価は約２の対数値分増加し、即ち１００倍に増加した。前記結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせはＢ型肝炎表面抗原に対するＴｈ１免疫応答を非常に強く刺激することを示した。
【００８３】
実施例５．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは体液性免疫レベルにおいてＢ型肝炎表面抗原Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答バランスを促進する。
【００８４】
実施例３及び実施例４に記載したように、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はマウスに対して高いレベルのＴｈ２型免疫応答をもたらすだけではなく、同時に非常に高レベルのＴｈ１型免疫応答ももたらす。Ｔｈ１はＣＴＬ反応即ち細胞性免疫傾向を促進するが、Ｔｈ２は抗体の生成即ち所謂体液性免疫傾向を促進する。治療用Ｂ型肝炎ワクチンの１つの目的は血清におけるＨＢｓＡｇ抗原を排除することで、これには有効な防御抗体を生成することが必要で、主に体液性免疫がその役割を果たす。もう１つの目的はＨＢＶ感染したターゲット細胞を殺傷すること、即ちＣＴＬ反応であり、これには細胞性免疫が必要である。したがって、Ｔｈ１及びＴｈ２免疫応答が共に非常に重要である。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物及びＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３対照群によりもたらされたＴｈ１またはＴｈ２応答の傾向を直接説明するため、抗原特異的ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１力価比（Ｌｏｇ１０）を分析した結果を図５に示す。比が０より小さければ、免疫応答がＴｈ２に偏向することを表し、０より大きければ、免疫応答がＴｈ１に偏向することを表し、０に近ければ、免疫応答がバランスに接近することを表す。分析結果は、Ａｌ(ＯＨ)３をＨＢｓＡｇアジュバントとする対照群における免疫応答は主にＩｇＧ１でＴｈ２応答に偏向するが、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物群においては特異的ＩｇＧ１がＩｇＧ２ａと同等で、免疫応答がＴｈ１／Ｔｈ２バランスに接近することを示した。
【００８５】
実施例６．Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型のＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１をもたらす。
【００８６】
治癒したＢ型肝炎感染患者の抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型はＩｇＧ３>ＩｇＧ１>ＩｇＧ４を示す。マウスにおける対応する抗体亜型関係はＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ２ｂ>ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ>ＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１である。実施例３及び実施例４に記載の方法に基づき、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物のマウス抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１に対する効果を測定し、本組成物がマウス抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型のＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１への変転を促進しうるかを調べた。ただし、測定する時に使用される被覆抗原を１μｇ／ｍｌ ＨＢｃＡｇとした。結果が図６に示される。図６の結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物により生成された抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型がＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１で、有意な差であった（Ｐ<０．００１）ことを示した。前記組成物は、マウスの抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型において、Ｂ型肝炎感染の治癒患者の抗体亜型に変換するのを促進できることが示された。
【００８７】
実施例７．Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは顕著にＨＢｓＡｇ ＣＴＬエピトープ特異的Ｔｈ１細胞分化を促進し、Ｔｈ２細胞増殖を抑制する。
【００８８】
ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物の細胞性免疫における役割を説明するため、本発明者はそれぞれＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮ、ＨＢｓＡｇとＡｌ(ＯＨ)３アジュバントを混合してマウスを免疫した。ＥＬＩＳＰＯＴ実験を通じて、免疫マウスの脾細胞におけるＨＢｓＡｇ ＣＴＬエピトープ特異的刺激後のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の分泌レベルを測定し、且つ統計学分析を行うことによって、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせを、ＨＢｓＡｇとＡｌ(ＯＨ)３の組み合わせと比較して、抗原特異的Ｔｈ１細胞分化の促進に対する作用について評価した。
【００８９】
本実施例に使用されるＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）は、上海斯莱克公司から購入した。使用されるＨＢｓＡｇ抗原、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＡｌ(ＯＨ)３アジュバントは実施例１の記載のものと同様である。
【００９０】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈する。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して左後肢腓腹筋に免疫を行った。１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群５匹のマウスを用いた。ＨＢｓＡｇ＋ Ａｌ(ＯＨ)３群においては、マウス毎に１μｇの、Ａｌ(ＯＨ)３に吸着されたＨＢｓＡｇを注射した。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においては、マウス毎に１μｇ ＨＢｓＡｇ、１μｇ ＨＢｃＡｇ及び２μｇ ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回免疫を行い、２回目の免疫後１０日目に脾臓を採取してルーチンの方法に基づいて脾リンパ球細胞を調製した。具体的な手順は次のとおりであった：無菌操作で脾臓採集：無菌ピンセット及びはさみで脾臓を取り、７０μｍナイロン篩（ＢＤ Biosciences社）内に入れ、予め冷却された２％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）− ＰＢＳを含有する５ｍｌペトリ皿に入れた。研磨棒で脾臓を研磨し、脾臓細胞をペトリ皿内に篩過し、細胞懸濁液を得た。パスツールピペットで懸濁液を、４０μｍナイロン篩（ＢＤ Biosciences社）を通して５０ｍｌ無菌遠心管に入れ、３００ ×ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上澄み液を廃棄し、５ ｍｌ １×赤血球破砕剤（ＢＤ Biosciences社）を加えて細胞を再懸濁し、室温で５分間作用させることによって赤血球を破砕した。５ ｍｌ ２％ ＦＢＳ−ＰＢＳを加えて赤血球破砕反応を停止し、３００ ×ｇ、４℃で５分間遠心分離を行い、上澄み液を廃棄し、２ ｍｌ ２％ ＦＢＳ−ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁して使用に備えた。Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ／ＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ試薬キット（ＢＤ Biosciences社）を用いて、ＨＢｓＡｇペプチドライブラリーで刺激して、抗原特異的ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の分泌を測定した。試験完了時に、ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ Ｓｅｒｉｅｓ ３自動プレートリーダーでスポット数を読み取った。
【００９１】
ＨＢｓＡｇのペプチドライブラリーは１５アミノ酸の５４ポリペプチドフラグメントからなり、全ＨＢｓＡｇ全長シーケンスをカバーし、隣接するペプチドの各対が１１のアミノ酸の重複を有し、全ての可能なＨＢｓＡｇ ＣＴＬエピトープを表す。ＨＢｓＡｇのペプチドライブラリーのペプチドフラグメント設計はシーケンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示される通りである。全てのペプチドフラグメントがＣｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙによって合成、精製、分包及び凍結乾燥された。
【００９２】
具体的な、抗原特異的ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４分泌の測定ステップは以下の通りであった： ＰＢＳでＭｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４を希釈し(１：２００で希釈、ＢＤ Biosciences社)（１００ μl/ウェル）、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに加え、４℃で一夜置いて被覆した。被覆抗体を廃棄し、ブロッキング溶液 (１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０培養液を含有する) で１回ウェルを洗浄し、２００ μｌ／ウェルでブロッキング溶液を加え、室温で２ ｈインキュベートした。１０％ＦＢＳ−１６４０の培地でペプチドライブラリーを１０ μｇ／ｍｌまで希釈した。１０％ＦＢＳ−１６４０の培地でＣｏｎＡを２０ μｇ／ｍｌまで希釈して陽性対照とした。ブロッキング溶液を廃棄し、１×１０７ 細胞／ｍｌの脾リンパ球細胞懸濁液と調製されたペプチドライブラリーまたはＣｏｎＡ対照とを１００ μｌ／ウェルでそれぞれ９６ウェルプレート内に加えた（２ウェルで反復）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで２４ ｈインキュベートし、細胞懸濁液を廃棄し、脱イオン水でプレートを２回洗浄し（３−５ ｍ／回）、ＰＢＳＴで３回洗浄し（２００ μｌ／ウェル）、１０％ＦＢＳ ＰＢＳで希釈されたＭｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ／ＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ検出抗体(１：２５０希釈、ＢＤ Biosciences社)を加え（１００ μｌ／ウェル）、室温で２ ｈインキュベートした。検出抗体を廃棄し、ＰＢＳＴでプレートを４回洗浄した（２００ μｌ／ウェル）。１０％ＦＢＳ ＰＢＳで希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰ(１：１００希釈、ＢＤ Biosciences社)を加え（１００ μｌ／ウェル）、室温で１ ｈインキュベートした。その酵素コンジュゲートを廃棄し、ＰＢＳＴで４回洗浄し、さらにＰＢＳで３回洗浄し、ＡＥＣ基質１００ μｌ／ウェルを加えて呈色し、肉眼でスポットの形成を観察し、脱イオン水を加えて反応を停止させた。ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ Ｓｅｒｉｅｓ ３自動プレートリーダーでスポット数を読み取った。結果は図７に示す。
【００９３】
Ｔｈ１細胞の主要抗原はＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−β等を特異的に分泌させ、細胞傷害性及び局所炎症に関する免疫応答を媒介し、細胞性免疫及び遅延型過敏性炎症の形成に関与する。Ｔｈ２細胞の主要抗原が特異的に分泌させるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の主な機能は、Ｂ細胞の増殖及び抗体の産生を刺激することで、体液性免疫に関する。ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞分化を誘導できるが、Ｔｈ２細胞増殖は抑制する。ＩＬ−４はＴｈ２細胞分化を誘導する。本実施例において、ＥＬＩＳＰＯＴで、免疫マウスの脾細胞の抗原特異的ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の分泌レベルを測定した。その結果、Ａｌ(ＯＨ)３はＨＢｓＡｇアジュバントとして、ＨＢｓＡｇ特異的ＩＬ−４をＩＦＮ−γより多く分泌させたので、Ａｌ(ＯＨ)３アジュバントは主に抗体を産生するようB細胞の増殖を刺激したことが示された。本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ−γをＩＬ−４より大幅に多く分泌させたので、本発明の組成物は主にＨＢｓＡｇ特異的細胞性免疫に参与し、Ｔｈ１細胞分化を促進し、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞増殖バランスを達成し、そのため、ＨＢＶ感染肝細胞の殺傷と、遊離ＨＢＶウイルスの排除との潜在能力を兼備することが示された。
【００９４】
実施例８. ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせは抗原特異的ＩｇＧ抗体生成において相乗的に作用する。
【００９５】
ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせが相乗作用を有するか否かを調べるため、本発明者はそれぞれＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮ、ＨＢｓＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮを混合して、マウスを免疫し、血清におけるＨＢｓＡｇ特異的総ＩｇＧを測定し、且つ統計学分析を行うことによって、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせが抗原特異的ＩｇＧ抗体生成において相乗作用を示すかを調べた。
【００９６】
本実施例に使用されるＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）は上海斯莱克公司から購入した。使用されるＨＢｓＡｇ抗原、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＡｌ(ＯＨ)３アジュバントは実施例１に記載のものと同様である。
【００９７】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して左後肢腓腹筋に免疫を行った。１匹毎の注射体積は１００ μｌで、各群１０匹のマウスを用いた。
【００９８】
ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においては各マウスに１μｇ ＨＢｓＡｇ及び２μｇ ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においては各マウスに１μｇ ＨＢｓＡｇ、１μｇ ＨＢｃＡｇ及び２μｇ ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回免疫を行い、２回目の免疫後１０日目に血液を採取して血清を分離した。ルーチンの方法に基づいて２％脱脂乳で前記血清の希釈を１：３０の希釈倍数から始め、さらに連続３倍希釈し、総抗原特異的ＩｇＧ抗体の測定に用いた。
【００９９】
実施例１に記載の方法に基づいて、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群及びＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群における生成されたＨＢｓＡｇ特異的抗体価を測定した。結果は図８に示す。
【０１００】
図８から分かるように、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮ組み合わせ群においてはＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群と比較して、生成したＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧレベルがより高く、特異抗体価は４．０の対数値までも達することができ、その差は有意であり（Ｐ<０．０１）、特異抗体価（力価）が約３倍も増加できた。前記結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢｃＡｇを加えたことにより、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせと比べ、より顕著に高いＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ抗体レベルをもたらすことを示し、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮが相乗作用を有することが証明された。
【０１０１】
実施例９．ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせはＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮより、細胞性免疫においてＨＢｓＡｇ特異的Ｔｈ１細胞分化を促進する。
【０１０２】
実施例８においては体液性免疫に関してＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの相乗作用を調べたが、本発明者はさらに細胞性免疫に関してＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせがHBsAgによるTh1細胞分化を促進するか否かを分析し、それによって、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮの相乗作用をさらに検証した。
【０１０３】
それぞれＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮ、ＨＢｓＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮアジュバントを混合して、マウスを免疫した。ＥＬＩＳＰＯＴ実験によって免疫マウス脾細胞におけるＩＦＮ−γ及びＩＬ−４分泌レベルを測定し、ＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせがＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせと比べて、ＨＢｓＡｇによるＴｈ１細胞分化を促進することを調べた。
【０１０４】
本実施例に使用されるＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）は、上海斯莱克公司から購入した。使用されるＨＢｓＡｇ抗原、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮは実施例１に記載のものと同様である。
【０１０５】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して左後肢腓腹筋に免疫を行った。１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群１０匹のマウスを用いた。ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においてはマウス毎に１μｇのＨＢｓＡｇ及び２μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においてはマウス毎に１μｇのＨＢｓＡｇ、１μｇのＨＢｃＡｇ及び２μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回で免疫を行い、２回目の免疫後１０日目に脾臓を採取してルーチンの方法に基づいて脾リンパ球細胞を調製した。Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ／ＩＬ−４ ＥＬＩＳＰＯＴ試薬キット（ＢＤ Biosciences社）を用いて、ＨＢｓＡｇのペプチドライブラリー（具体的なシーケンスが実施例７に記載される）で刺激して、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を測定した。試験終了時に、ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ Ｓｅｒｉｅｓ ３自動プレートリーダーでスポット数を読み取った。
【０１０６】
実施例７に記載の方法に基づき、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物及びＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群における、脾細胞のＨＢｓＡｇエピトープ特異的ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の分泌レベルを測定した。結果は図９に示す。
【０１０７】
図９から分かるように、ＨＢｃＡｇとＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせ群においてはＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群におけるよりも、ＨＢｓＡｇ特異的ＩＦＮ−γ分泌レベルが高かったが、ＨＢｓＡｇ特異的ＩＬ−４レベルはより低かったので、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせよりも、細胞性免疫に関してＨＢｓＡｇ特異的Ｔｈ１細胞分化を促進できることが示され、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮは相乗作用を有することが示された。
【０１０８】
実施例１０. ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢＶ遺伝子導入マウス（ａｄｒ血清型）及び免疫寛容マウス（Ｂ１０.Ｍ）の免疫寛容を突破する。
【０１０９】
ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせがＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスにおいて免疫寛容を突破できるか否かを検証するため、本発明者はそれぞれＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮ、ＨＢｓＡｇとＡｌ(ＯＨ)３アジュバントを混合してマウスを免疫し、血清における総ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ及び防御抗体ＩＵレベルを測定し、且つ統計学分析を行い、それによってＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせについてＨＢｓＡｇとＡｌ(ＯＨ)３の組み合わせと比較して、免疫寛容の突破に対する影響を評価した。
【０１１０】
本実施例に使用される免疫寛容マウスは２種類で、第１種がＨＢＶ遺伝子導入マウスで（血清型がａｄｒ、オス、１０〜１２週齢）、上海南方モデル動物センタから購入し、第２種がＢ１０.Ｍマウスで（組織適合性であり、免疫寛容を有し、オス、６〜８週齢）、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。使用されるＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＡｌ(ＯＨ)３アジュバントは実施例１に記載のものと同様である。
【０１１１】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。マウスに対して左後肢腓腹筋の免疫を行い、１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群４匹のマウスを用いた。
【０１１２】
ＨＢｓＡｇ＋ Ａｌ(ＯＨ)３群においてはマウス毎に１μｇの、Ａｌ(ＯＨ)３に吸着されたＨＢｓＡｇを注射し、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においてはマウス毎に１μｇ ＨＢｓＡｇ、１μｇ ＨＢｃＡｇ及び１０μｇ ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回免疫を行い、毎回免疫の二週間後に採血し、総計６回免疫を行った。実施例２に記載の方法に基づいて総ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ抗体を測定した結果を図１０に示す。実施例２に記載の方法に基づいて生成されたＨＢｓＡｇ抗体を測定した結果を図１１に示す。
【０１１３】
図１０から分かるように、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物は２種類のモデルマウスの免疫寛容を突破でき、ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ抗体価が４．０の対数値以上にも達することができ、ＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群と比べ、有意な差（Ｐ<０．０５）を示した。ＨＢｓＡｇ特異的ＩｇＧ抗体価（力価）を１０〜２００倍も増加できた。図１１から分かるように、防御抗体レベルが２．５の対数値にも達することができ、ＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群と比べ、生成した防御抗体レベルは５−２０倍も増加できた。前記結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物ワクチンはＡｌ(ＯＨ)３アジュバントＢ型肝炎ワクチンと比べ、免疫寛容マウスにおいてＢ型肝炎表面抗原特異的総ＩｇＧ及び防御抗体の免疫応答を顕著に増加でき、免疫寛容をより有効に突破できることを示した。
【０１１４】
実施例１１. ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物がＨＢＶ遺伝子導入マウス（ａｄｒ血清型）及び免疫寛容マウス（Ｂ１０.Ｍ）において、高力価抗ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ抗体を生成する。
【０１１５】
ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせがＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスにおいて抗ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ抗体を生成できるか否かを検証するため、本発明者はＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮを混合してマウスを免疫し、血清における総ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧレベルを測定した。
【０１１６】
本実施例に使用される免疫寛容マウスは２種類で、実施例１０に記載のものと同様であった。使用されるＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮは実施例１に記載のものと同様であった。
【０１１７】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。マウス毎に左後肢腓腹筋に１μｇ  ＨＢｓＡｇ、１μｇ  ＨＢｃＡｇ及び１０μｇ  ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群４匹のマウスを用いた。３週間毎に１回免疫し、各回の免疫から二週間後に採血し、総計６回免疫した。実施例１に記載の方法に基づいて総ＨＢｃＡｇ抗原特異的ＩｇＧ抗体を測定した。ただし、被覆抗原を1μg ＨＢｃＡｇ抗原とした。結果は図１２に示す。
【０１１８】
図１２から分かるように、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物は２種類のモデルマウスにおいて、高力価の抗ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ抗体を生成でき、一次免疫二週後の抗体価が２.５の対数値以上にも達することができ、その後の抗体価が4.0の対数値以上にも達することができた。前記結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物は高力価の抗ＨＢｃＡｇ特異的ＩｇＧ抗体を生成することを示した。
【０１１９】
実施例１２. ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢＶ遺伝子導入マウス（ａｄｒ血清型）及び免疫寛容マウス（Ｂ１０.Ｍ）に抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型ＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１をもたらす。
【０１２０】
ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮの組み合わせがＨＢＶ遺伝子導入マウス及び免疫寛容マウスにおいて抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型ＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１をもたらすことを検証するため、本発明者はＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇとＣｐＧ−ＯＤＮを混合してマウスを免疫し、血清における抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の力価を測定した。
【０１２１】
本実施例に使用される免疫寛容マウスは２種類で、実施例１０に記載のものと同様であった。使用されるＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮは実施例１に記載のものと同様であった。
【０１２２】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１０ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２０ μｇ／ｍｌまで希釈した。マウス毎に左後肢腓腹筋に１μｇ  ＨＢｓＡｇ、１μｇ  ＨＢｃＡｇ及び１０μｇ  ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。１匹毎の注射体積は１００ μｌで、各群４匹のマウスを用いた。３週間毎に１回免疫し、各回の免疫から二週間後に採血し、総計６回免疫した。実施例６に記載の方法に基づいて血清中の抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１の力価を測定した。結果を図１３に示す。
【０１２３】
図１３の結果は、本発明のＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢＶ遺伝子導入マウス（ａｄｒ血清型）及び免疫寛容マウス（Ｂ１０.Ｍ）に抗ＨＢｃＡｇ抗体亜型ＩｇＧ２ａ>ＩｇＧ１をもたらし、その差が有意である（Ｐ<０．０１）ことを示す。
【０１２４】
実施例１３. ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢＶ遺伝子導入マウスにおいてＨＢｓＡｇ抗原を排除する傾向を有する。
【０１２５】
ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢＶ遺伝子導入マウスの免疫寛容を突破し、抗原特異的抗体を生成させた。本発明者はそれに対して分析を行い、体内のＨＢｓＡｇ発現量が低下傾向を示すか否かを研究し、血清における抗体によるＨＢｓＡｇ抗原排除を検証した。
【０１２６】
本実施例に使用されたのはＨＢＶ遺伝子導入マウスで（血清型がａｄｒ（Ｃ５７マウスから改造された）、オス、１０〜１２週齢）、上海南方モデル動物センタから購入した。使用されたＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ、ＣｐＧ−ＯＤＮ及びＡｌ(ＯＨ)３アジュバントは実施例１に記載のものと同様である。
【０１２７】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳ（Invitrogen Corporation）でそれぞれ１０ μｇ／ｍｌ及び１００ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳでそれぞれ２０ μｇ／ｍｌ及び２００ μｇ／ｍｌまで希釈した。マウスに対して左後肢腓腹筋に免疫を行い、１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群８匹のマウスを用いた。ＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群においてはマウス毎に１μｇの、Ａｌ(ＯＨ)３により吸着されたＨＢｓＡｇを注射し、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群は２群に分け、１群においてはマウス毎に1 μg ＨＢｓＡｇ、1 μg ＨＢｃＡｇ及び１０ μg  ＣｐＧ−ＯＤＮを注射し、他の１群においてはマウス毎に1 ０μg ＨＢｓＡｇ、1 ０μg ＨＢｃＡｇ及び２0 μg ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。３週間毎に１回免疫し、各回の免疫から二週間後に採血し、総計６回免疫した。ルーチン方法に基づいて２％脱脂乳で、免疫前及び６回目の免疫から２週間後の血清を１：２００希釈した。実施例１に記載のＨＢｓＡｇ抗原を標準品として用いた。Ｃ５７マウス（上海斯莱克社）の血清を１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ ｎｇ／ｍｌ、７．８ ｎｇ／ｍｌの初期濃度にしたがって希釈し、さらに２％脱脂乳で1:200希釈した。その後希釈されたサンプル及び標準品のＨＢｓＡｇ抗原濃度をＨＢｓＡｇ抗原測定試薬キット（上海科華公司）を用いて測定した。測定された標準曲線を使用して、免疫前及び６回目の免疫から二週間後のマウスの血清中のＨＢｓＡｇ抗原濃度を算出し、且つ６回目の免疫から二週間後のＨＢｓＡｇ抗原低下％を算出した。結果を図１４に示す。
【０１２８】
具体的なＨＢｓＡｇ抗原濃度測定ステップは次のとおりであった：予め被覆した抗ＨＢｓＡｇの反応プレートを取り出し、７５μｌの希釈された血清及び陰、陽性対照を反応ウェルに加えた；シール紙で反応プレートをカバーした後、反応プレートを３７℃で１ ｈインキュベートした。反応プレートを取り出し、シール紙を引き剥がし、測定対象サンプル及び陰、陽性対照のウェルに５０ μｌ酵素コンジュゲートを加えた；微細孔振盪器で１０ ｓ振盪した。シール紙で反応プレートをカバーした後、反応プレートを３７℃で３０ ｍインキュベートした。反応プレートを取り出し、シール紙を引き剥がし、反応プレートを５回洗浄した。洗浄した後直ちに全てのウェルにそれぞれ呈色剤Ａ、呈色剤Ｂ５０μｌずつを加え、混合して均一化した；微細孔振盪器で１０ ｓ振盪した。シール紙で反応プレートをカバーした後、反応プレートを３７℃で３０ ｍインキュベートした。全てのウェルに５０μｌの停止液を加えて５ ｓ振盪して反応させ、十分に混合して均一化した。酵素結合装置でＯＤ４５０ｎｍ値（ＯＤ６３０ｎｍで校正）を測定した。
【０１２９】
図１４に示すように、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物群においてはＨＢＶ遺伝子導入マウスにおけるＨＢｓＡｇ抗原濃度の低下％がＨＢｓＡｇ＋Ａｌ(ＯＨ)３群より大きく、その差は有意であった（Ｐ<０．０５）。ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮアジュバント量を高めると、ＨＢｓＡｇ抗原濃度の低下％がより顕著になり、平均で９０％以上にも達することができた。前記組成物がＨＢｓＡｇ抗原を排除し且つＨＢｓＡｇ抗原を陰性転化させることが示され、慢性Ｂ型肝炎処置用ワクチンのために確かな基盤を作った。
【０１３０】
実施例１４. ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性をもたらす。
【０１３１】
抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷は、処置用ワクチンの効果の最も直接的な証拠である。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物で免疫されたマウスにおけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性の測定を行い、そのＣＴＬ体内殺傷活性を検証し、ＣＴＬ殺傷率を算出した。
【０１３２】
本実施例に使用されたのはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（メス、６〜８週齢）で、上海斯莱克公司から購入した。使用されたＨＢｓＡｇ抗原、ＨＢｃＡｇ及びＣｐＧ−ＯＤＮアジュバントは実施例１に記載のものと同様である。
【０１３３】
ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇをＰＢＳで１００ μｇ／ｍｌまで希釈し、ＣｐＧ−ＯＤＮをＰＢＳで２００ μｇ／ｍｌまで希釈した。マウスに対して左後肢腓腹筋に免疫を行い、１匹毎の注射体積が１００ μｌで、各群８匹のマウスを用いた。ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ群においてはマウス毎に1０ μg ＨＢｓＡｇ、1 ０μg ＨＢｃＡｇ及び２０ μg ＣｐＧ−ＯＤＮを注射した。２週間毎に１回免疫し、総計３回免疫した。３回目の免疫から１０日後にＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性を測定した。結果を図１５に示す。
【０１３４】
具体的なＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性測定ステップは次のとおりであった：免疫されなかったマウスの脾臓を無菌で取り出し、スライドガラスにおいて摩砕し、３００×ｇ、４℃で５ ｍｉｎ遠心分離して、上澄み液を廃棄した。５ｍｌ赤血球溶解バッファー（ＢＤ Biosciences社）を加えて細胞を再懸濁し、室温で５ ｍｉｎ静置して赤血球を溶解し、１０ ｍｌ ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）で２回洗浄した。ＰＢＳでＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を４ μＭ及び０．４ μＭまで希釈し、それぞれ等容積の細胞懸濁液と混合して均一にし、室温で７ ｍｉｎ静置し、３００×ｇ、４℃で５ ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を廃棄した。ＰＢＳで２回洗浄した。それぞれＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ社）完全培地で細胞を再懸濁し、細胞濃度を２×１０７細胞／ｍｌとした。ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞にそれぞれ等容積のＨＢｓＡｇペプチドライブラリー（実施例７参照）及びＨＢｃＡｇペプチドライブラリーを加えた。ＣＦＳＥｌｏｗ細胞に等容積のＲＰＭＩ−１６４０完全培地を補充添加し、それぞれ細胞培養ボトルに移し、３７℃、５％ ＣＯ２で４ ｈインキュベートした；ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで細胞を再懸濁し計数を行った。計数結果に基づいてＰＢＳで細胞を２×１０７細胞／ｍｌに調整し、その後２群の細胞を等容積で混合した。調製した標識細胞混合液を、各マウス１００ μｌで、眼窩経由でＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮで免疫されたマウスに注射した。１５〜１７ ｈ後、マウス脾細胞懸濁液を調製し、２％ＦＢＳ−ＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーで測定を行い、抗原特異的CTL殺傷百分率を算出した。
【０１３５】
前記ＨＢｃＡｇペプチドライブラリーは15アミノ酸の43ポリペプチドフラグメントによって構成され、全ＨＢｃＡｇ全長シーケンスをカバーし、隣接ポリペプチドの各対は１１アミノ酸の重複を有し、全ての可能なＨＢｃＡｇ ＣＴＬエピトープを表し、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１〜１５、位置５〜１９、位置９〜２３……位置１６９〜１８３のアミノ酸のフラグメントであった。前記ＨＢｃＡｇペプチドライブラリーのペプチドフラグメント設計はシーケンスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に示すとおりであった。全てのペプチドフラグメントがＣｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙによって合成、精製、分包及び凍結乾燥された。
【０１３６】
図１５に示すように、ＨＢｓＡｇ＋ＨＢｃＡｇ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ組成物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性をもたらし、そのＣＴＬ殺傷率は約３０％であった。前記組成物はＨＢｓＡｇ及びＨＢｃＡｇ抗原特異的ＣＴＬ体内殺傷活性をもたらし、慢性Ｂ型肝炎処置用ワクチンの最も直接的な証拠を示した。
【０１３７】
本出願において、複数の出版物が引用される。そのため、これらの出版物の開示が全体に引用により本出願の一部とされて、本発明に関する従来技術をより十分に説明する。
【０１３８】
明確化および理解のため実施例を通じて本発明を説明したが、当業者に理解されるように、具体的な実施例及び前記説明は本発明の態様を説明するいくつかの方法および組成物の説明に過ぎず、本発明の主旨から逸脱することなく様々な変更を行うことができる。そのため、本発明は添付の請求項のみに制限される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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