(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養反応流体を分析するための方法であって、
細胞培養反応流体に動作可能に接触する検出領域と、流体の外部の複数のチューニング回路とを備えるセンサーで、複数の周波数を生成するステップと、
測定されるスペクトル周波数範囲にわたって細胞培養反応流体に動作可能に接触した検出領域のインピーダンススペクトルを代表するセンサーからの信号を受信するステップと、
インピーダンススペクトルを分析するステップと、
分析されたインピーダンススペクトルに基づいて細胞培養反応流体の１つ以上の特性を判断するステップと
を含む方法。
【請求項２】
インピーダンススペクトルは、共振インピーダンススペクトルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
チューニング回路は、インダクタを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の周波数は、細胞培養反応のスペクトルベータ分散の周波数範囲にわたってインピーダンス応答を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の周波数は、細胞培養反応のスペクトルアルファ、ベータ、ガンマ、及び／又はデルタ分散の周波数範囲にわたってインピーダンス応答を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
複数の周波数は、細胞培養反応のスペクトルベータ分散の周波数範囲にわたって共振応答を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数の周波数は、細胞培養反応のスペクトルベータ分散の周波数範囲にわたって３以上の周波数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出領域は、細胞培養反応流体に直接接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検出領域は、誘電保護層によって細胞培養反応から隔てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
誘電保護層は、１０ｎｍ〜１０ｍｍの厚さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インピーダンススペクトルの分析は、各インピーダンススペクトルの６以上のスペクトルパラメーターを分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
インピーダンススペクトルの分析は、共振パラメーターＦｐ、Ｚｐ、Ｆ１、Ｚ１、Ｆ２、Ｚ２を含む各インピーダンススペクトルの６以上のスペクトルパラメーターを分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
インピーダンススペクトルの分析は、少なくともインピーダンスの実部及び／又はインピーダンスの虚部を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
インピーダンススペクトルを分析するステップは、測定されたインピーダンススペクトルのスペクトルパラメーターの線形結合を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
インピーダンススペクトルを分析するステップは、インピーダンススペクトルを等価回路モデルにフィットさせるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞培養反応の特性を判断するステップは、細胞培養反応における生細胞の濃度及び生存不能細胞の濃度を判断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
細胞培養反応の特性を判断するステップは、細胞培養反応における生細胞の濃度、生存不能細胞の濃度、及び生細胞の直径を判断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞培養反応の特性を判断するステップは、生細胞の濃度及び生存不能細胞の濃度の測定における細胞培養の生産性を判断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示される主題は、細胞培養物における細胞の増殖並びにリアルタイムでの細胞培養物における生細胞（viable cell）と生存不能細胞（nonviable cell）との間の識別に関する。
【０００２】
生体系の自己複製の性質を、対象の物質を生成する個々の細胞又は生物を増殖させ、細胞培養物から所望の生成物を精製することによって、そのような物質の製造に役立てることができる。例えば、特定の薬物又は化合物を、細胞によって、細胞の天然の代謝産物として製造することができ、或いは組み換えたんぱく質を生成するように操作された細胞などの工学的に操作された細胞を介して製造することができる。これらの細胞を、高品質の生物医薬品を製造するために大規模なリアクターにおいて増殖させることができる。そのようなリアクターにおいては、製造パラメーターが、インラインセンサー及びオフライン（すなわち、インラインでなく、実験室において、リアクターに接続されていない）分析システムを使用して監視される。重要な製造パラメーターの監視を、上流（バイオリアクターの前）、バイオリアクター内、及び下流（バイオリアクターの後）で実行することができる。連続的な監視が典型的であるパラメーターとして、温度、溶液伝導度、圧力、ｐＨ、グルコース濃度、溶存酸素、及び生細胞の量など、増殖条件に影響を及ぼすパラメーターが挙げられ、使い捨て及び従来のステンレス鋼製造システムの両方において同様のやり方で監視される。細胞の生存能力、乳酸塩、グルタミン、オスモル濃度、ピルビン酸塩、アミノ酸、生成物の純度、及び微量元素などの他のパラメーターは、典型的には、既存のセンサーを用いた測定の難しさゆえに、インラインでは測定されない。代わりに、これらのパラメーターは、典型的には、リアクターからサンプルを抽出し、これらのサンプルを研究室の分析機器を使用してリアクターの外部でさらに分析することによって、「オフライン」で測定される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１０４９６５号パンフレット
【発明の概要】
【０００４】
一実施形態では、細胞培養反応を分析するための方法が提供される。本方法は、細胞培養反応流体に動作可能に接触する検出領域と、流体の外部の複数のチューニング回路とを備えるセンサーで、複数の周波数を生成するステップと、測定されるスペクトル周波数範囲にわたる細胞培養反応流体に動作可能に接触した検出領域のインピーダンススペクトルを代表するセンサーからの信号を受信するステップと、インピーダンススペクトルを分析するステップと、分析されたインピーダンススペクトルに基づいて細胞培養反応流体の１つ以上の特性を判断するステップとを含む。本方法は、１以上の共振回路を備えており、細胞培養反応流体に動作可能に接触するセンサーで、複数の周波数を生成するステップと、測定されるスペクトル周波数範囲にわたる細胞培養反応のインピーダンススペクトルを代表する信号をセンサーから受信するステップと、インピーダンススペクトルの３以上のスペクトルパラメーターを分析するステップと、３以上のスペクトルパラメーターをスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度へと相関付けるステップとを含む。
【０００５】
他の実施形態では、向上した選択性にて細胞培養反応を分析するための方法が提供される。本方法は、細胞培養反応流体に動作可能に接触する検出領域と、細胞培養物のスペクトルベータ分散の周波数範囲にわたる共振をもたらす細胞培養反応流体の外部の複数のチューニング回路とを備え、細胞培養反応に動作可能に接触するセンサーで、複数の周波数を生成するステップと、測定されるスペクトル周波数範囲にわたる細胞培養反応の共振インピーダンススペクトルを代表する信号をセンサーから受信するステップと、共振インピーダンススペクトルの６以上のスペクトルパラメーターを分析するステップと、スペクトルパラメーターの線形結合をスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度へと相関付けるステップとを含む。
【０００６】
別の実施形態では、細胞培養反応を分析するための方法が提供される。本方法は、誘電性の共形（conformal）層又は誘電保護層（例えば、これに限られるわけではない例においては、厚さ１０ｎｍ〜１０ｍｍ）の使用によって分析される流体との直接接触から保護された検出領域と、細胞培養物のスペクトル分散の周波数範囲にわたる共振をもたらす細胞培養反応流体の外部の複数のチューニング回路とを備え、誘電性の共形保護層にて細胞培養反応に接触するセンサーで、複数の周波数を生成するステップと、測定されるスペクトル周波数範囲にわたる細胞培養反応の共振インピーダンススペクトルを代表する信号をセンサーから受信するステップと、共振インピーダンススペクトルの６以上のスペクトルパラメーターを分析するステップと、スペクトルパラメーターの線形結合をスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度へと相関付けるステップとを含む。検出領域と１以上のチューニング回路とを備えるセンサーが、共振回路構造又は共振器を形成する。誘電性の共形層は、細胞培養反応の流体及び細胞培養物に生物学的に適合している。細胞の生存能力、乳酸塩、グルタミン、オスモル濃度、ピルビン酸塩、アミノ酸、生成物の純度、及び微量元素などの他のパラメーターも、評価することができる。例えば、抗体生産反応において、細胞の増殖の減少の文脈においてオスモル濃度の上昇が抗体の生産の増加において生じる。
【０００７】
別の実施形態では、使い捨てのセンサーを備える使い捨ての容器における細胞培養反応を分析するための方法が提供される。本方法は、既知の較正基準を使用してセンサーの製造バッチからの１以上のセンサーを較正するステップと、センサー製造の製造公差に基づいて製造バッチ内のセンサー間の較正伝達関係を確立させるステップと、製造バッチ内の各センサーのメモリへと較正係数を記録するステップと、センサーを使い捨ての容器へと一体化させるステップと、一体化されたセンサーを備える容器のための殺菌工程を適用するステップと、細胞培養のために容器を動作させるステップと、一体化されたセンサーを使用して細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度を監視するステップとを含む。他の実施形態では、センサーは、複数回使用されるセンサーであってよく、所望の用途に応じて１つ以上の培養基へとチューニングされてもよい。
【０００８】
別の実施形態では、細胞培養反応を分析するための方法が提供される。本方法は、１以上の共振回路を備えるセンサーを用意するステップと、センサーを細胞培養反応に暴露するステップと、センサーによって生成される１以上の共振で細胞培養反応を調べるステップと、センサーの測定スペクトル周波数範囲にわたるセンサー応答の１以上の共振インピーダンススペクトルを決定するステップと、センサー応答の１以上の共振インピーダンススペクトルに多変量統計解析を適用して多変量応答係数を求めるステップと、多変量応答係数を細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度に関係付けるステップとを含む。
【０００９】
別の実施形態では、細胞培養反応を分析するための方法が提供される。本方法は、１以上の共振回路を備えるセンサーを用意するステップと、センサーを細胞培養反応に暴露するステップと、センサーによって生成される１以上の共振で細胞培養反応を調べるステップと、センサーの測定スペクトル周波数範囲にわたるセンサー応答の１以上の共振インピーダンススペクトルを決定するステップと、センサー応答の１以上の共振インピーダンススペクトルに多変量統計解析を適用して多変量応答係数を求めるステップと、多変量応答係数を細胞培養反応における生細胞の濃度、生細胞のサイズ、及び生存不能細胞の濃度に関係付けるステップとを含む。
【００１０】
別の実施形態では、１以上の共振回路と２以上の電極とを備えるセンサーを含んでおり、センサーは、測定されるスペクトル周波数範囲にわたるインピーダンススペクトルを代表する信号を生成するように構成されているシステムが、提供される。２以上の電極が、検出電極構造を形成する。検出電極構造は、裸であって、細胞培養反応流体に直接接触でき、或いは検出電極構造は、誘電保護皮膜でぴったりと覆われてもよい。検出領域と１以上のチューニング回路とを備えるセンサーが、共振回路構造を形成する。さらにシステムは、生細胞及び生存不能細胞の定量のためのセンサーの較正係数を保存するメモリと、センサーから信号を受信し、信号に基づいてインピーダンススペクトルの２つ以上のスペクトルパラメーターを分析し、２つ以上のスペクトルパラメーターをスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度に相関付けるためのインストラクションを保存するメモリと、インストラクションを実行するように構成されたプロセッサとを含む。
【００１１】
別の実施形態では、１以上の検出領域と、細胞培養物のスペクトル分散の周波数範囲にわたる３以上の共振をもたらす複数のチューニング回路とを備えるセンサーを含んでおり、センサーは細胞培養反応に接触しているシステムが提供される。さらにシステムは、センサーで複数の周波数を生成し、測定されるスペクトル周波数範囲にわたる細胞培養反応の共振インピーダンススペクトルを代表する信号をセンサーから受信し、共振インピーダンススペクトルの６以上のスペクトルパラメーターを分析し、スペクトルパラメーターの線形結合をスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度へと相関付けるためのインストラクションを保存したメモリと、インストラクションを実行するように構成されたプロセッサとを含む。
【００１２】
別の実施形態では、反応における細胞に生物学的に適合した誘電性の共形層の使用によって分析される流体との直接接触から保護された１以上の検出領域と、細胞培養物のスペクトル分散の周波数範囲にわたる３以上の共振をもたらす複数のチューニング回路とを備えるセンサーと、共振の所定の周波数範囲を横断するセンサーの応答を読み取るためのセンサー読み取り機と、共振インピーダンススペクトルの６以上のスペクトルパラメーターを分析し、スペクトルパラメーターの線形結合をスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度へと相関付けるプロセッサとを含むシステムが提供される。
【００１３】
別の実施形態では、細胞培養反応を分析するためのシステムであって、１以上の共振回路と２以上の電極とを備える使い捨てのセンサーを含んでおり、センサーは、測定されるスペクトル周波数範囲にわたるインピーダンススペクトルを代表する信号を生成するように構成されているシステムが、提供される。さらにシステムは、生細胞及び生存不能細胞の定量のためのセンサーの較正係数を保存するメモリと、センサーから信号を受信し、信号に基づいてインピーダンススペクトルの２つ以上のスペクトルパラメーターを分析し、２つ以上のスペクトルパラメーターをスペクトルパラメーターに基づいて細胞培養反応における生細胞及び生存不能細胞の濃度に相関付けるためのインストラクションを保存するメモリと、インストラクションを実行するように構成されたプロセッサとを含む。
【００１４】
別の実施形態では、使い捨てのセンサーを備える使い捨ての容器（例えば、フラスコ、マイクロタイター穴プレート、など）における細胞培養反応を分析するためのシステムであって、検出領域を有する誘電体基板上の共振センサーアセンブリを含むシステムが提供される。センサーアセンブリは、検出領域に動作可能に結合した複数のチューニング要素をさらに備え、検出領域は、複数の共振回路を定めるように複数のチューニング要素に結合している。このシステムを、薬物のスクリーニング又は毒性のスクリーニングの用途に使用することができる。
【００１５】
本発明のこれらの特徴、態様、及び利点、並びに他の特徴、態様、及び利点が、以下の詳細な説明を添付の図面を参照して検討したときに、よりよく理解されるであろう。添付の図面において、類似の文字は、図面の全体を通して類似の部分を表している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態によるオフライン及びインライン測定の実行についての全体的な概略図である。
【図２】本発明の実施形態に従って細胞培養物において生細胞及び生存不能細胞を判断するためのシステムのブロック図である。
【図３】本発明の実施形態による共振センサーの概略図である。
【図４】本発明の実施形態による複数の周波数を用いた細胞培養反応流体のインライン検出に合わせて構成されたセンサーアセンブリを使用する典型的なセンサーシステムの一部分の概略図である。
【図５Ａ】生細胞及び生存不能細胞の検出のためのセンサーの検出領域であり、検出領域は、電極幅及び電極間間隔が２ｍｍであり、検出面積が２ｘ１ｃｍであるインターデジタル電極構造である。
【図５Ｂ】生細胞及び生存不能細胞の検出のためのセンサーの検出領域であり、検出領域は、電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、検出面積が２ｘ１ｃｍであるインターデジタル電極構造である。
【図５Ｃ】生細胞及び生存不能細胞の検出のためのセンサーの検出領域であり、検出領域は、電極幅及び電極間間隔が０．３０ｍｍであり、検出面積が２ｘ１ｃｍであるインターデジタル電極構造である。
【図６】本発明の実施形態による生細胞及び生存不能細胞の検出のためのバイオリアク
【図７】本発明の実施形態に従って細胞培養物において生細胞及び生存不能細胞をインラインで判断する方法のフロー図である。
【図８】５つの異なる共振周波数におけるセンサーの動作のプロットの例を示しており、差し込み図は、２つの最も高い共振周波数におけるセンサーの動作のプロットである。
【図９】本発明の技術の実施形態に従って共振センサーの実施形態について測定されたインピーダンスパラメーターのグラフである。
【図１０Ａ】従来の及び共振インピーダンス検出の比較の線形な縦軸でのプロットである。
【図１０Ｂ】従来の及び共振インピーダンス検出の比較の対数の縦軸でのプロットである。
【図１１】細胞培養物のオフライン分析のプロットである。
【図１２】本発明の実施形態による図１１の細胞培養物のインライン分析のプロットである。
【図１３Ａ】センサーを４つの溶液に暴露して従来のインピーダンス測定を実行したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１３Ｂ】センサーを４つの溶液に暴露して共振インピーダンス測定を実行したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１４Ａ】従来のインピーダンスを用いた４つの溶液の測定に関して、各々の因子（主成分）についての信号対雑音の評価のプロットを示している。
【図１４Ｂ】共振インピーダンスを用いた４つの溶液の測定に関して、各々の因子（主成分）についての信号対雑音の評価のプロットを示している。
【図１５】溶液の特性の変化を従来のインピーダンス（２本の点線）を使用し、さらには４つの共振器による共振インピーダンス（共振器ごとに２本の実線）を使用して測定したときの時間につれての溶液の動的な測定の結果を示している。
【図１６Ａ】電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、誘電保護皮膜を有していないインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、従来のインピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１６Ｂ】電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、厚さ０．２５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、従来のインピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１６Ｃ】電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、厚さ０．５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、従来のインピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１６Ｄ】電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、誘電保護皮膜を有していないインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、共振インピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１６Ｅ】電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、厚さ０．２５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、共振インピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１６Ｆ】電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、厚さ０．５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、共振インピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１７Ａ】電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、誘電保護皮膜を有していないインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、従来のインピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１７Ｂ】電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、厚さ０．２５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、従来のインピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１７Ｃ】電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、厚さ０．５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、従来のインピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１７Ｄ】電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、誘電保護皮膜を有していないインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、共振インピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１７Ｅ】電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、厚さ０．２５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、共振インピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【図１７Ｆ】電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、厚さ０．５μｍの誘電保護皮膜を有しているインターデジタル電極構造のセンサーを使用して、共振インピーダンスにて４つの溶液を測定したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の検出技術は、センサーを細胞培養物において直接使用する生細胞及び生存不能細胞の同時、独立、かつリアルタイムの判定を容易にする。バイオリアクターの定期的なサンプリングを必要とすることがないインラインのセンサーを使用するバイオリアクター内の生細胞及び生存不能細胞の両方のリアルタイムでの識別及び定量は、生物医薬のプロセスの運営にとって有益である。現時点において、細胞量などのパラメーターの評価は、生細胞についての情報だけをもたらし、細胞培養物中の生細胞及び生存不能細胞の集団及び濃度についての追加の情報はもたらさない細胞量センサーによって実行されている。さらに、インラインのセンサーに機能の向上を統合することで、無菌状態を向上させ、サンプリングのための反応容器の開放を減らすことができるという利益がもたらされる。図１に示されるとおり、反応容器（バイオリアクター）からのサンプリングが実行されるとき、サンプルは、オフラインでの分析のために、スタンドアロンのセンサーへとさらに運ばれる。オフラインでの分析は、定期的なサンプリングゆえに、反応容器の汚染の恐れを有する。また、オフラインでの分析は、特定の量の流体をオフラインでの分析のために反応容器から取り出すことを必要とする。オフラインでの分析におけるこれらの問題と異なり、インラインの分析は、これらの制限を有さず、定期的なサンプリングに起因する培養物の汚染の恐れを解消し、無菌状態の向上を促進する。
【００１８】
生細胞（細胞バイオマスとしても知られる）の濃度の従来からの測定は、所与の周波数における容量の測定に頼り、或いは走査誘電分光法（scanning dielectric spectroscopy）又は走査無線周波数分光法（scanning radio-frequency spectroscopy）に依拠している。生細胞は、損傷のない形質膜を有し、細胞のベータ分散周波数範囲の細胞培養物の比誘電率の変化に寄与する。対照的に、生存不能細胞は、細胞のベータ分散周波数範囲の細胞培養物の比誘電率の変化に寄与しない漏れのある膜を有し、したがって容量信号に変化を生じさせることがない。
【００１９】
生細胞の濃度を評価するための１つの技術は、容量又は比誘電率の変化である。比誘電率は、センサーの電極の物理定数を考慮に入れて、容量の測定値から算出される。他の技術は、電極がドーナツ形のコイルとして組み立てられ、液体によって互いに隔てられている誘導誘電分光法（inductive dielectric spectroscopy）である。ドーナツ形のコイルの幾何学的なパラメーターは、コイルの内径及び外径、コイルの厚さ、コイル−コイルの分離距離である。サンプルの誘電特性の測定のさらに他の技術は、共振法を含む。しかしながら、そのような技術は、生細胞及び生存不能細胞の濃度を定量化することができない。細胞培養物のバルク伝導度は、生細胞の濃度が飽和状態に達するとき、たとえ生細胞の濃度が一定であっても、多数の発酵の因子に左右される。
【００２０】
培養物における生細胞及び生存不能細胞の識別及び定量のための技術であって、細胞培養物に近接した１以上の共振器の共振インピーダンススペクトル応答を測定し、第１の測定された共振インピーダンスセンサー応答を細胞培養物における生細胞の濃度に相関させること、及び第２の測定されたセンサー共振インピーダンス応答を細胞培養物における生存不能細胞の濃度に相関させることを含む技術が、本明細書において提供される。
【００２１】
開示される実施形態を、あらゆる規模の細胞培養物における生細胞及び生存不能細胞の同時かつその場での独立した判定に使用することができる。細胞培養反応が、細胞培養物を形成するためのプロセスの下にある流体を意味することができ、したがって開示のとおりのセンサーを、反応プロセスの下にある流体に接触させることができる。細胞培養は、産業規模又は実験室規模のリアクター内であってよく、或いは小規模のリアクター又はマイクロタイター穴プレートにおいて行われてよい。細胞培養流体は、培地（例えば、アミノ酸、グルコース、塩、などの適切な栄養源を含んでいる液体又はゲル）及び細胞を含むことができる。細胞培養流体は、種々の細胞の発酵に関係することができる。細胞の発酵の例（ただし、これらに限られない）として、動物細胞、哺乳類細胞、植物細胞、細菌、酵母、真菌、が挙げられる。発酵は、バッチにて実行され、或いは連続的な態様で実行される。本発明の技術によれば、生細胞及び生存不能細胞の濃度についての情報が、発酵プロセスを乱すことなく、かつ細胞のオフライン分析のためのサンプルの採取を必要とすることなく得られる。例えば、実施形態を、バイオリアクターと、１以上の共振センサーと、センサー読み取り機と、データプロセッサとを含むシステムと併せて使用することができる。この目的のため、図２が、バイオリアクター１２と、インラインの共振センサー１４とを含む細胞を評価するためのシステム１０を示している。共振センサー１４を、バイオリアクター１２内又はバイオリアクター１２上に配置することができ、或いはバイオリアクター１２に連通したインラインの医療用チューブ又はコネクタに結合させることができる。特定の実施形態では、共振センサー１４は、バイオリアクターにおける細胞の増殖の連続的又は間欠的な監視を提供するように構成される。バイオリアクター１２は、細胞の増殖を促進する任意の適切な細胞培養反応容器であってよい。例えば、バイオリアクターは、大規模又は小規模リアクター、バッグリアクター、タンク型リアクターなどであってよい。
【００２２】
共振センサー１４は、１以上の共振器又は共振回路の共振インピーダンススペクトル応答を介してサンプルの化学的、物理的、又は生物学的パラメーターを検出するように構成される。単純なインピーダンス測定とは対照的に、開示される実施形態は、１以上の共振電気回路によって調べられるサンプルを使用する。サンプルに近接したセンサー（細胞培養反応流体に動作可能に接触したセンサー）の共振インピーダンススペクトルは、サンプルの組成に基づいて変化する。測定される共振インピーダンス値Ｚ’（インピーダンスの実部Ｚreである）及びＺ''（インピーダンスの虚部Ｚimである）は、共振電気回路の電界の刺激に対する細胞培養物サンプル（例えば、細胞培養物のうちのセンサー１４に近接している部分）の応答を反映している。電界を、サンプルに直接的又は間接的に電気接触してよい電極を介して、センサー１４によって印加することができる。例えば、共振センサーは、検出領域とチューニング回路との組合せであってよい。検出領域は、裸であり、或いは（例えば、図３の実施形態に示されるとおり）保護誘電体層で覆われる。どちらの場合も、検出領域を、細胞培養流体に「動作可能に接触」すると考えることができる。そのような実施形態では、チューニング回路は、細胞培養流体に動作可能に接触することはない。サンプルとの間接的な電気接触は、検出電極構造が誘電保護コーティングでぴったりと覆われ、電極間に生成される電界が誘電保護コーティングを貫いた後で細胞培養反応流体と相互作用する場合である。
【００２３】
共振センサー１４を、ここでの言及によってその全体があらゆる目的で本明細書に援用される２０１２年１２月２８日付のＰｏｔｙｒａｉｌｏらの米国特許出願第１３／７２９，８００号及び第１３／７２９，８５１号に開示のとおりに構成することができる。一実施形態では、共振センサー１４は、反応プロセスの全体又は一部において使用される使い捨てのセンサーであってよい。例えば、単一の反応の最中に、共振センサー１４は、細胞培養物に動作可能に接触でき、その結果として、他の反応における使用に不適となり得る。さらに、共振センサー１４は、特定のリアクターに組合せられてよく、保守の計画に従って清掃及び殺菌或いは交換されてよい。例えば、共振センサー１４は、１つ以上の電極ペアと、例えば１以上の共振周波数において動作するインダクタ−コンデンサ−抵抗器（ＬＣＲ）共振回路を形成するための抵抗器、コンデンサ、インダクタ、共振器、インピーダンス変成器、又はこれらの組合せなどの１つ以上のチューニング要素とを備えることができる。特定の実施形態では、共振センサー１４の複数の共振回路の異なる共振回路を、異なる周波数において共振するように構成することができる。
【００２４】
異なる共振回路を、バイオリアクター１２において増殖している細胞を複数の周波数で調べるように構成することができる。さらに、異なる周波数を、流体サンプルを異なる深さにおいて調べるために使用し、付着又は懸濁のいずれかの細胞培養システムの使用を可能にすることができる。特定の実施形態では、集積回路メモリチップを、共振センサー１４へと電気的に接続することができる。集積回路メモリチップは、さまざまな種類の情報を含むことができる。集積回路チップのメモリ内のそのような情報の例（ただし、これに限られるわけではない）として、センサーの較正係数、センサーのロット番号、製造日、エンドユーザ情報、などが挙げられる。別の実施形態では、共振センサー１４は、共振器の一部であるインターデジタル型構造であり、培養物中の細胞の検出のための検出領域を有している。再び図２に目を向けると、共振センサー１４からのデータを、センサー１４に組合せられてよく、或いはさらなる処理及び分析を実行することができるデータ処理回路を含むモニタ又はワークステーション２２などの制御システムに組合せられてよいデータ取得回路１６を介して、取得することができる。データ取得回路１６は、図２に示されるとおりのバイオリアクター１２内にあってよく、或いはワークステーション２２内にあってよい。さらに、ワークステーション２２を、全体としてのバイオ処理工場（図２には示されていない）の制御システムで置き換え、共振センサー１４及びそのデータ取得回路１６を、全体としてのバイオ処理工場の制御システムへと接続することができる。データ取得回路１６は、バイオリアクター１２及び／又はワークステーション２２と無線で通信するように構成されてよいセンサー読み取り機の形態であってよい。例えば、センサー読み取り機は、電池で動作する装置であってよい。
【００２５】
加えて、データ取得回路１６は、１つ以上の共振センサー１４（例えば、アレイに形成された複数のセンサー、或いはバイオリアクター１２内又はバイオリアクター１２の周囲の異なる位置に配置された複数のセンサー）のデータを受信することができる。データを、システム１０内に位置でき、もしくはシステム１０から離れて位置することができるアーカイビング通信システムなどの短期又は長期の記憶装置に保存することができ、さらには／或いは操作者ワークステーション２２などにおいて操作者のために再現及び表示することができる。本発明の技術のセンサー及びセンサーシステムの配置及び設置の例（ただし、これらに限られない）として、バイオリアクター、マイクロタイター穴プレートの個々の穴、コネクタ、フロースルー構成要素、及び任意の他の関連のバイオプロセス構成要素が挙げられる。
【００２６】
データの表示に加えて、操作者ワークステーション２２は、システム１０の上述の動作及び機能を制御することができる。操作者ワークステーション２２は、汎用又は特定用途向けのコンピュータ２４など、１つ以上のプロセッサにもとづく構成要素を含むことができる。プロセッサにもとづく構成要素に加えて、コンピュータ２４は、磁気及び光大容量記憶装置や、ＲＡＭチップなどの内部メモリなど、種々のメモリ及び／又は記憶構成要素を含むことができる。メモリ及び／又は記憶構成要素を、操作者ワークステーション２２によって実行され、或いはシステム１０の関連の構成要素によって実行される本明細書に記載の技術を実行するためのプログラム及びルーチンを保存するために使用することができる。或いは、プログラム及びルーチンを、操作者ワークステーション２２から離れているが、ネットワーク及び／又はコンピュータ２４上に存在する通信インターフェイスによってアクセスすることができるコンピュータにとってアクセス可能な記憶装置及び／又はメモリに保存することができる。コンピュータ２４は、種々の入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェイス並びに種々のネットワーク又は通信インターフェイスをさらに備えることができる。種々のＩ／Ｏインターフェイスは、設定情報の閲覧及び入力並びに／或いは撮像システム１０の操作に使用することができる表示装置２６、キーボード２８、マウス３０、及びプリンタ３２などのユーザインターフェイス装置との通信を可能にすることができる。種々のネットワーク及び通信インターフェイスは、ローカル及びワイドの両方のエリアのイントラネット及び記憶装置ネットワーク並びにインターネットへの接続を可能にすることができる。種々のＩ／Ｏ及び通信インターフェイスは、必要又は所望に応じて、有線、回線、又は適切な無線インターフェイスを利用することができる。
【００２７】
図３が、共振センサー１４の設計の例（ただし、これに限られるわけではない）を示している。センサーの検出電極構造３４が、チューニング回路（図４を参照）及びデータ取得回路１６に接続されている。検出電極構造３４は、裸であって、細胞培養反応流体に直接接触することができる。検出電極構造を、誘電保護コーティング３６でぴったりと覆うことができる。共形誘電保護コーティング３６を有さず、或いは有している検出電極構造３４が、検出領域３８を形成する。検出領域３８を形成する共形誘電保護コーティング３６を有さず、或いは有している検出電極構造３４は、細胞培養反応流体に動作可能に接触する。検出電極の細胞培養反応流体との「動作可能な接触」は、検出電極構造３４が共形誘電保護コーティング３６を有さない（裸である）実施形態、又は有する実施形態のいずれかを指すことができる。
【００２８】
検出電極構造３４が裸である場合、電極間に生成される電界は、細胞培養反応流体と直接的に相互作用する。検出電極構造が誘電保護コーティング３６でぴったりと覆われている場合、電極間に生成される電界は、誘電保護コーティング３６を貫いた後で細胞培養反応流体と相互作用する。
【００２９】
図４が、複数の周波数を使用して細胞培養反応流体などの流体サンプルを調べるように構成されたセンサーアセンブリ４０を利用する共振センサーシステムの一部分を示している。共振センサーアセンブリ４０は、共振センサー１４を含んでいる。センサーは、単一の検出領域３８を備えている。検出領域３８は、基板上に配置されてよい。いくつかの実施形態では、センサー１４の基板は、誘電体基板であってよい。基板は、マイクロタイター穴プレートであってよい。この実施形態では、電極を、マイクロタイター穴プレート上に配置することができる。マイクロタイター穴プレートの穴は、開いたサンプル容器又は開いた流路の例（ただし、これに限られるわけではない）である。
【００３０】
特定の実施形態では、センサーアセンブリ４０は、複数のチューニング要素４２をさらに含む。複数のチューニング要素を、複数の共振回路を定めるように単一の検出領域３８へと動作可能に接続することができる。チューニング要素４２は、単一の検出領域３８と協働して複数の共振回路を定めることができる。複数の共振回路のうちの各々の共振回路は、複数のチューニング要素のうちの１つ以上のチューニング要素を含むことができる。
【００３１】
図示の実施形態では、複数のチューニング要素４２は、センサー１４の外部にある。しかしながら、一実施形態では、チューニング要素４２を、センサー１４の基板上に配置することができる。別の実施形態では、複数のチューニング要素４２のうちのいくつかが、センサー基板の外部にあってよい一方で、他のチューニング要素４２を、基板上に配置することができる。チューニング要素４２は、抵抗器、コンデンサ、インダクタ、共振器、インピーダンス変成器、又はこれらの組合せを備えることができる。
【００３２】
各々の共振回路を、特定の周波数で共振するように構成することができる。１以上の共振回路を、他の共振回路の共振周波数とは異なる周波数で共振するように構成することができる。例として、検出領域３８が１対の電極を含む場合に、チューニング要素４２は、インダクタ−コンデンサ−抵抗器（ＬＣＲ）共振回路を形成するための抵抗器、コンデンサ、及びインダクタであってよい。チューニング要素４２を、検出領域３８へと電気的に接続することができる。一実施形態では、チューニング要素４２は、検出領域３８に並列に接続されてよい。特定の実施形態では、複数の共振回路のうちの異なる共振回路を、異なる周波数において共振するように構成することができる。異なる共振回路を、流体サンプルを複数の共振周波数で調べるように構成することができる。異なる共振周波数を、細胞培養物のスペクトル分散の周波数範囲にわたって流体サンプルを調べるために使用することができる。本発明のセンサーによって監視される細胞培養物のスペクトル分散は、０．１Ｈｚ〜１００ＧＨｚの周波数範囲にわたり、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタスペクトル分散を含む。
【００３３】
図示の実施形態では、センサーアセンブリ１０は、マルチプレクサ４４をさらに含むことができる。マルチプレクサ４４を、複数のチューニング要素４２の間の電子的な切り換えを容易にするように構成することができる。マルチプレクサ４４を、調査周波数に関連付けられた１つ以上の信号を選択し、選択された信号を出力装置又は読み取り機へと送るように構成することができる。一実施形態では、マルチプレクサ４４を、出力装置又は読み取り機へと信号を選択的に送信するように構成することができる。マルチプレクサ４４を、センサー読み取り機に複数の信号を同時に送信するように構成することができる。
【００３４】
図５Ａ、Ｂ、及びＣが、電極の設計の例（ただし、これらに限られるわけではない）を示している。これらの電極は、等しい電極幅と、技術的に周知のとおり異なる方向において同じでも、異なってもよい電極間間隔（すき間）とを有するインターデジタル（互いに入り込んだ）電極構造である。図５Ａは、生細胞及び生存不能細胞の検出のためのセンサーの検出領域を示しており、検出領域は、電極幅及び電極間間隔が２ｍｍであり、検出面積が２ｘ１ｃｍであるインターデジタル２電極構造である。図５Ｂは、生細胞及び生存不能細胞の検出のためのセンサーの検出領域を示しており、検出領域は、電極幅及び電極間間隔が０．４５ｍｍであり、検出面積が２ｘ１ｃｍであるインターデジタル２電極構造である。図５Ｃは、生細胞及び生存不能細胞の検出のためのセンサーの検出領域を示しており、検出領域は、電極幅及び電極間間隔が０．３ｍｍであり、検出面積が２ｘ１ｃｍであるインターデジタル２電極構造である。
【００３５】
使用可能なインターデジタル電極の他の公知の例として、変化する電極幅及び電極間間隔、テーパ状の電極、円形の電極、並びに技術的に公知の他の電極が挙げられる。提示のとおりのセンサーは、２以上の電極を有することができるが、４つの電極又はさらに多くの電極を有することもできる。
【００３６】
共振センサー１４は、細胞培養反応流体に動作可能に接触して位置する。複数の周波数を生成する１以上のセンサーが、センサーが容器の内部空間に無菌に保持され、容器内の流体に動作可能に接触するように、１以上のホースバーブ式ポート又は任意の他の取り付け装置を介して、非剛体の可撓容器へと挿入され、或いは取り付けられる。センサー１４は、直接的な電気接続又はリモート手段によって、非剛体の可撓容器の外部の読み取り装置へとさらに接続される。一実施形態では、非剛体の可撓容器は、バイオリアクターである。別の実施形態では、バイオリアクターが、剛直な非可撓容器である。
【００３７】
図６Ａ〜Ｄが、生細胞及び生存不能細胞の検出のためのバイオリアクターに一体化されたセンサーの例を示している。図６Ａに示される一実施形態では、共振センサー１４は、インサートへと組み込まれている。共振センサーのインサートとの組合せは、ホースバーブ式ポートを使用してバイオリアクターへとさらに一体化されている。このセンサーの検出領域は、望ましくは、バイオリアクターの中へと少なくとも１０ｍｍ延びる。
【００３８】
図６Ｂに示される別の実施形態では、共振センサーは、インサートへと組み込まれている。共振センサーのインサートとの組合せは、ホースバーブ式ポートを使用してバイオリアクターへとさらに一体化されている。このセンサーの検出領域は、望ましくは、バイオリアクターの中へと少なくとも２ｍｍ延びる。
【００３９】
図６Ｃに示される別の実施形態では、共振センサーは、インサートへと組み込まれている。共振センサーのインサートとの組合せは、パッチアセンブリ（ｐａｔｃｈ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）である。このセンサーの検出領域は、望ましくは、バイオリアクターの中へと少なくとも１０ｍｍ延びる。
【００４０】
図６Ｄに示される別の実施形態では、共振センサーは、インサートへと組み込まれている。共振センサーのインサートとの組合せは、パッチアセンブリである。このセンサーの検出領域は、望ましくは、バイオリアクターの中へと少なくとも２ｍｍ延びる。別の実施形態では、共振センサーが、インサートへと組み込まれてパッチを形成し、ここでパッチは、厚さに対する直径の非が少なくとも１０：１であり、一実施形態では少なくとも２０：１であり、別の実施形態では少なくとも５０：１である。センサーのバイオリアクターへの一体化のいくつかのさらなる例（ただし、これらに限られるわけではない）が、ここでの言及によってその全体があらゆる目的で本明細書に援用されるＰｏｔｙｒａｉｌｏらの米国特許第８５０８３６８号「無線周波数にもとづくセンサーを有する使い捨ての検出装置（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ  ｈａｖｉｎｇ  ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｎｓｏｒ）」に開示されている。
【００４１】
開示の実施形態のいずれにおいても、センサー信号は、適切なやり方でセンサーから伝えられる。例えば、一手法において、センサー信号は、有線リンクを介してセンサー読み取り機へと伝えられ、次いで有線リンク又は無線リンクを介してワークステーションへと伝えられる。別の手法において、センサー信号は、有線リンク又は無線リンクを介してセンサー読み取り機へと伝えられ、次いで有線リンク又は無線リンクを介してワークステーションへと伝えられる。「無線リンク」は、約３０ｋＨｚ〜３００ＧＨｚの無線周波数範囲の電波を使用する誘導結合、容量結合、又は電磁結合を介したアナログ又はデジタル信号の通信を指すことができる。
【００４２】
図７が、細胞培養物における生細胞及び生存不能細胞の同時かつ独立した判定及び定量のための方法５０のフロー図５０である。ステップ５２において、センサー１４が、細胞培養物に結合した（例えば、バイオリアクター１２に組合せられた）１以上の共振器の共振インピーダンススペクトル応答を測定する。共振器は、検出領域と、共振回路構造又は共振器を形成する１以上のチューニング回路とを備えるセンサーである。したがって、細胞培養物に結合した共振器は、検出領域が細胞培養反応流体に動作可能に接触している共振回路構造である。
【００４３】
方法５０は、ステップ５４において、測定されたインピーダンススペクトル応答の特徴選択を実行し、ステップ５６において、選択された特徴の分析を実行する。インピーダンススペクトル応答は、細胞培養流体内の細胞のアルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタスペクトル分散を含むことができる。分析にもとづき、センサー応答が、生存不能細胞の濃度（ステップ５８）及び生細胞の濃度（ステップ６０）に相関付けられる。方法５０を、生細胞のサイズについての情報をもたらすようにも構成することができる。生細胞のサイズについての情報は、例えばワクチンのためのたんぱく質の製造など、種々の用途において重要である。
【００４４】
方法５０を、下流の装置又はシステム１０の操作者への出力をもたらすように構成することができる。例えば、方法５０の結果にもとづき、システム１０は、細胞の総数、生細胞の数又は割合、生存不能細胞の数又は割合、生細胞に対する生存不能細胞の比、生細胞及び生存不能細胞の時間につれてのプロット又はグラフ、或いはこれらの任意の組合せの視覚的表示又は読み取り値を、エンドユーザへと提供することができる。
【００４５】
別の実施形態では、方法５０の結果を、バイオリアクター１２における反応条件を制御するために使用することができる。例えば、生存不能細胞の数が所定のしきい値を上回る場合に、方法５０は、警報を生じさせるステップをさらに含むことができる。別の実施形態では、細胞の総数及び生細胞の数の両方がしきい値を上回る場合に、システム１０を、細胞培養反応を収穫するための指示をもたらすように構成することができる。さらに、結果を、生細胞に対する生存不能細胞の所望の比を促進するように反応条件を制御する（例えば、ガス及び／又は供給混合物、温度、他の条件を変更する）ために使用することができる。
【００４６】
とくには、共振センサーから取得される信号は、各々の共振回路からのセンサーの共振インピーダンス応答スペクトルを含むことができる（例えば、センサー１４が単一の回路しか含まず、或いは単一の回路だけを動作させる場合、得られる信号は１つのスペクトルを含む）。複数のそのようなインピーダンス応答スペクトルを、複数の共振回路によって生成することができる。一実施形態では、生細胞は、細胞培養流体内の細胞のアルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタスペクトル分散を含むことができるインピーダンススペクトル応答に基づいて生存不能細胞の共振応答から区別することができる特徴的な共振応答を呈することができる。したがって、特徴的なパターンに関して取得された１つ以上のインピーダンススペクトルを、生細胞及び生存不能細胞の特定の割合に関連付けることができる。
【００４７】
図８が、検出領域と、細胞培養物のスペクトル分散の周波数範囲にわたって５つの共振を提供する複数のチューニング回路とを備えるセンサーの動作を示している。一例（ただし、これに限られるわけではない）において、単一の検出領域の５つの共振が、１００、１０、１、０．１、及び０．０１ｍＨという５つのチューニングされたインダクタ値を有するセンサーの電子回路によってもたらされる。これらのインダクタ値は、図８に示される周波数範囲にわたる単一の検出領域の共振をもたらす。
【００４８】
図９に示されるとおり、一実施形態では、システム１０を、センサーの共振インピーダンスＺ（ｆ）（式（１）によって表される）を測定するように構成することができる。
【００４９】
Ｚ（ｆ）＝Ｚre（ｆ）＋ｊＺim（ｆ）            式（１）
ここで、Ｚre（ｆ）は、共振インピーダンスの実部であり、Ｚim（ｆ）は、共振インピーダンスの虚部である。特定の実施形態では、センサーのインピーダンス応答は、２つ以上の周波数がセンサーの共振を横切ってセンサー応答を測定するために利用されうるため、多変数応答でありうる。特定の実施形態では、センサーのインピーダンス応答は、２つ以上の周波数がセンサーの共振ピークの外側のセンサー応答を測定するために利用されうるため、多変数応答でありうる。いくつかの実施形態では、センサー応答は、センサーの共振を横切って複数の周波数において測定される。例えば、センサーが約１ＭＨｚで共振する場合、測定周波数及び関連のセンサー応答は、約０．２５ＭＨｚから約２ＭＨｚまで測定される。この多変数応答が、多変量解析によって分析される。センサーの多変数応答は、センサーの全インピーダンススペクトル並びに／或いはＦp、Ｚp、Ｆz、Ｆ1、Ｆ2、Ｚ1、及びＺ2など（ただし、これらに限られるわけではない）のいくつかの個別に測定された特性を含む。図９が、本発明の技術の実施形態に従って共振センサーの実施形態について測定されたインピーダンスパラメーターのグラフを示している。これらの測定された特性及び他の測定された特性が、「スペクトルパラメーター」である。これらの特性は、インピーダンスの実部の最大値の周波数（Ｆp、共振ピーク位置）、インピーダンスの実部の大きさ（Ｚp、ピーク高さ）、ゼロリアクターンス周波数（Ｆz、インピーダンスの虚部がゼロである周波数）、インピーダンスの虚部の共振周波数（Ｆ1）及びインピーダンスの虚部の反共振周波数（Ｆ2）、インピーダンスの虚部の共振周波数（Ｆ1）における信号の大きさ（Ｚ1）、並びにインピーダンスの虚部の反共振周波数（Ｆ2）における信号の大きさ（Ｚ2）を含む。他のパラメーターを、例えば共振のＱ値、位相角、及びインピーダンスの大きさなど、全インピーダンススペクトルを使用して測定することができる。多変数応答スペクトルパラメーターは、ここでの言及によってその全体があらゆる目的で本明細書に援用される「ＲＦＩＤセンサーの較正のための方法及びシステム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＦＩＤ  ｓｅｎｓｏｒｓ）」という名称の米国特許第７９１１３４５号に記載されている。
【００５０】
Ｚ（ｆ）スペクトルの全スペクトルｚ及び／又は算出されたパラメーターの多変量解析を使用することによって、生細胞及び生存不能細胞の濃度の定量が実行される。また、Ｚ（ｆ）スペクトルの全スペクトル及び／又は算出されたパラメーターの多変量解析を使用することによって、生細胞のサイズの判定並びに生細胞及び生存不能細胞の濃度の定量が実行される。
【００５１】
図１０Ａ及び１０Ｂは、培養物中の細胞の変化する濃度のインライン測定における従来のインピーダンス検出及び共振インピーダンス検出の比較のプロットである。これらの測定の過程において、従来のインピーダンススペクトル及び共振インピーダンススペクトルを、ラピッドシーケンスで収集した。共振インピーダンススペクトルは、最小周波数から最大周波数の共振までの範囲のセンサー共振をそれぞれもたらす４つの異なるインダクタ１〜４を使用して生成した。この実験の時間につれて、多数のスペクトルが収集された。図１０Ａ及びＢにおいて、５つの時点を、培養物中の細胞の変化する濃度の監視において従来の及び共振インピーダンススペクトルのスペクトル特性を表すために選択した。分かりやすくするために、結果を、インピーダンスの実部Ｚ’（又はＺre）についてのみ示した。図１０Ａが、データを線形な縦軸にて示している一方で、図１０Ｂは、共振器３及び４の応答をよりよく示すために、データを対数の縦軸にて示している。従来のインピーダンス検出からのスペクトルは、Ｌ０と標記されている。インダクタ１〜４を用いた共振インピーダンス検出からのスペクトルは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４と標記されている。応答Ｌ０、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４の５つのスペクトルの個々のグループは、細胞培養物中の細胞の濃度が高くなるときのスペクトル強度（又はインピーダンス）の増加を示している。
【００５２】
共振インピーダンス検出は、細胞培養物における測定の高められた信号の多様性及び感度をもたらす。第１に、共振応答Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４の信号変化（データプロファイルとして表される）は、従来のインピーダンスデータＬ０プロファイルと比べて、あらゆる特定の周波数においてより大きい。第２に、共振応答は、共振Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４の形状の変化に示されるとおり、それらのプロファイルにおいてより多様である。
【００５３】
図１１が、典型的な細胞培養の実行における細胞の増殖のオフライン分析の結果を示している。この細胞培養の実行における細胞は、哺乳類の細胞であった。オフライン分析を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−１００を使用して実行し、開発したインラインセンサーの評価のための基準データとして役立てた。オフライン分析を、細胞培養物を定期的にサンプリングし、生細胞の濃度、生存不能細胞の濃度、細胞の総数（生細胞及び生存不能細胞を合計したもの）、及び細胞のパーセント生存能力（細胞の総数に対する生細胞の比に１００％を掛け算したもの）の測定を実行することによって行った。さらに、共振センサーを、この細胞培養物中に直接配置し、このセンサーでインライン測定を実行した。図１２が、共振センサーによって集められた細胞の増殖のインライン分析の結果を示している。生細胞の濃度、生存不能細胞の濃度、細胞の総数、及び細胞のパーセント生存能力の定量を、スペクトルの分析の周知の部分最小二乗（ＰＬＳ）技術を使用して実行した。ＰＬＳは、独立変数の最大分散を説明する計器応答の多次元空間における方向を発見することによって、独立変数と計器応答との間の相関を決定する。オフライン測定の結果（図１１）及びインライン測定の結果（図１２）の比較は、生細胞の濃度、生存不能細胞の濃度、細胞の総数、及び細胞のパーセント生存能力など、オフライン及びインライン計器によって行われた測定の間の所望の相関を示している。
【００５４】
過去において、ＰＬＳは、走査誘電分光法による細胞培養物のバイオマス監視のためのインラインセンサーからのデータの多変量解析に成功裏に使用されている。しかしながら、早期に報告されたセンサー並びにデータの単変量及び多変量解析を使用して、生細胞のみの濃度が、定量的に割り出されている。残念ながら、早期に報告されたセンサー並びにデータの単変量及び多変量解析を使用して、生存不能細胞の濃度は、定量的に割り出されていない。早期に報告されたセンサー及びデータの多変量解析を使用すると、集められたスペクトルデータが最大でも２つの多変数因子しか有さないため、定性的な情報だけしか得ることができない。走査誘電分光法データが測定された培養物の容量の変化にフィットさせられるとき、生細胞だけが定量され、生存不能細胞を定量化することができない。これらの早期の結果と対照的に、本発明の技術によるセンサー及びデータの多変量解析は、生細胞だけでなく、生存不能細胞についても定量的な情報をもたらす。
【００５５】
一実施形態では、共振センサー１４を、オフラインパラメーターの分析、或いは細胞を有さない細胞培地への暴露及び生細胞の濃度が既知である細胞培地への暴露における生細胞の割合が既知であるバイオリアクター１２への暴露に基づいて、較正することができる。１つ以上のセンサー１４の応答が測定され、環境パラメーターとセンサー応答との間の解析的関係が確立される。解析フィット係数を、多変量検量法を使用して算出することができる。多変量検量法において、センサー応答の２つ以上の特性が、対象の環境パラメーターの値へと関係付けられる。多変量検量法は、較正のために全インピーダンススペクトルを利用し、或いは個別に測定されたパラメーター（Ｚｐ、Ｆｐ、Ｆｚ、Ｆ１、Ｆ２、Ｚ１、Ｚ２）のうちの少なくとも２つ又はセンサー１４の共振回路の応答から抽出できる任意の他のパラメーターのうちの少なくとも２つを利用する。これらのさらなるパラメーターの例（ただし、これらに限られるわけではない）は、共振回路応答センサー１４の共振のＱ値、位相角、及びインピーダンスの大きさである。多変量解析ツールの例（ただし、これらに限られるわけではない）は、正準相関分析、回帰分析、非線形回帰分析、主成分分析、判別関数分析、多次元尺度構成法、線形判別分析、ロジスティック回帰、パターンマッチング、及び／又はニューラルネットワーク分析である。多変量検量法を、従来のインピーダンス測定からのスペクトルを使用し、共振インピーダンス測定からのスペクトルを使用し、さらには／或いはこれらの組合せを使用して、実行することができる。共振インピーダンス測定からのスペクトルは、すべての利用された共振器応答又はこれらの応答の部分集合のみを含むことができる。
【００５６】
従来のインピーダンス及び共振インピーダンス測定を、異なる溶液伝導度及び誘電率をモデル溶液においてセンサー応答を測定することによって比較した。そのような測定は、従来のインピーダンス測定モード及び共振インピーダンスモードにおけるセンサーの応答の定量的な比較の機会を提供した。これらの測定に関して、各々がセンサー応答の試験のための２００ｍＬの体積を有している４つのモデル溶液を用意した。溶液１は、２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する２００ｍＬの水を有した。溶液２は、１５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する２００ｍＬの水を有した。溶液３は、２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する１８０ｍＬの水及び２０ｍＬのエタノールを有した。溶液４は、１５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する１８０ｍＬの水及び２０ｍＬのエタノールを有した。室温（２０°Ｃ）における純水及び純エタノールの誘電率は、それぞれ８０．１及び２４．５である。水／エタノール混合物の誘電率は、それぞれ変化する誘電率を有する。したがって、これら４つのモデル溶液は、溶液伝導度及び誘電率の変化へのセンサーの応答を試験する能力をもたらした。すべてのインピーダンス測定を、１，０００Ｈｚ〜１０，０００，０００Ｈｚの範囲にわたって行った。４つの溶液におけるセンサー応答の実及び虚の従来のインピーダンス及び共振インピーダンススペクトルを、これらのスペクトルの間の類似及び相違を明らかにすべく、主成分分析（ＰＣＡ）などの周知の多変量解析ツールを使用してさらに処理した。多変量解析を、Ｍａｔｌａｂソフトウェア（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＴｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．）と動作する一般的なＰＬＳ＿Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェア（ワシントン州ＷｅｎａｔｃｈｅｅのＥｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を使用して実行した。ＰＣＡパターン認識法は、主成分（ＰＣ）又は因子として知られる元の変数の重み付け和としてデータの分散を説明する。過去において、ＰＣＡは、走査誘電分光法による細胞培養物のバイオマス監視のためのインラインセンサーからのデータの多変量解析に成功裏に使用されており、そこでは、わずかに２つのＰＣだけが測定されたスペクトルから観察されている。
【００５７】
図１３Ａ及びＢが、センサーを４つの溶液に暴露して従来の及び共振インピーダンス測定をそれぞれ実行したときのＰＣ１対ＰＣ２のＰＣＡスコアのプロットを示している。図１３Ａ及び図１３Ｂは、４つの溶液へのセンサー応答の４つの集団を示している。集団は、測定された溶液に対応して１、２、３、及び４と標記されている。各々の集団は、スペクトル測定の繰り返し（ｎ＝２）である２つのデータ点を有している。
【００５８】
図１３Ａは、従来のインピーダンスを用いた４つの溶液の測定が、低い伝導度及び高い伝導度の溶液間の良好な識別（溶液１及び２と溶液３及び４との間の識別）の能力を与えたことを示している。さらに、異なる誘電率の間の良好な識別の能力が、溶液の伝導度が低い場合に観測されている（溶液１及び３）。残念ながら、溶液の伝導度が高い場合の異なる誘電率の間の識別は、大きく低下している（溶液２及び４）。集団２及び４のデータ点は、他の集団と比べてＰＣＡプロットにおいてはるかに近接している。対照的に、共振インピーダンスを用いた４つの溶液の測定は、図１３Ｂに示されるとおり、４つのすべての溶液の間の良好な識別の能力を与えた。共振インピーダンスのスペクトル分析を、すべての測定された共振ピークについて実行した。重要なことに、異なる誘電率を有する溶液間の識別の品質が、それぞれの集団１、２、３、及び４の間の大きな距離（図１３Ｂ）によって明白であるとおり、溶液が低い誘電率（溶液１及び３）及び高い誘電率（溶液２及び４）の場合に同様であった。
【００５９】
従来のインピーダンス測定及び共振インピーダンス測定からの多変量データにおける重要因子（主成分）の数を、Ｍａｔｌａｂソフトウェア（マサチューセッツ州ＮａｔｉｃｋのＴｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．）と動作するＰＬＳ＿Ｔｏｏｌｂｏｘソフトウェア（ワシントン州ＷｅｎａｔｃｈｅｅのＥｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）の共通アルゴリズムを使用してさらに決定した。この共通アルゴリズムは、測定されたデータについての重要ＰＣＡ因子の数の評価を、それらの信号対雑音に基づいて提供し、各々の主成分（因子）について信号対雑音の評価のプロットを表示する。ＰＣの２以下の信号対雑音が、雑音によって支配されることが知られている一方で、ＰＣの３を上回る信号対雑音は、許容しうる。データの表現に必要な因子の数は、３以上の信号対雑音を有する固有ベクトルの数である。
【００６０】
図１４Ａが、従来のインピーダンスを用いた溶液１〜４の測定に関して、各々の因子（主成分）についての信号対雑音の評価のプロットを示している。このプロットは、最初の３つの因子（主成分）だけが、信頼できる多変量解析及び定量に関して容認可能な３以上の信号対雑音を有することを示している。
【００６１】
図１４Ｂが、共振インピーダンスを用いた溶液１〜４の測定に関して、各々の因子（主成分）についての信号対雑音の評価のプロットを示している。このプロットは、最初の５つの因子（主成分）が、信頼できる多変量解析及び定量に関して容認可能な３以上の信号対雑音を有することを示している。さらに、ＰＣ６及びＰＣ７などのさらなる因子（主成分）も、それらの信号対雑音が３であったがゆえに、多変量解析及び定量に使用することができる。
【００６２】
このように、従来のインピーダンス（図１４Ａ）及び共振インピーダンス（図１４Ｂ）を使用して実行された測定からの種々のＰＣの信号対雑音の比較は、共振インピーダンス測定の多変数応答の次元性（dimensionality）が、従来のインピーダンス測定と比べてより高いことを示した。センサーの多変数応答のより高い次元性は、多変数応答の次元性がより低いセンサーと比べて、センサーのより高い選択性並びにセンサーに影響を及ぼすより多数の独立環境条件をより選択的に決定するセンサーの能力に関係付けられる。
【００６３】
過去において、ＰＣＡは、走査誘電分光法による細胞培養物のバイオマス監視のためのインラインセンサーからのデータの多変量解析に成功裏に使用されており、そこでは、わずかに２つのＰＣだけが測定されたスペクトルから観察されている。それらのより早期の結果と異なり、センサーは、開示の実施形態によるセンサーを使用して収集された周波数スペクトルデータの多変量解析に有用な３つ（図１４Ａ）又は最大で７つ（図１４Ｂ）のＰＣを有することができる。
【００６４】
生細胞及び生存不能細胞の検出を、細胞の抵抗及び容量、二重層の抵抗及び容量、及び溶液のバルク抵抗、並びに初期のセンサーの抵抗、容量、及びインダクタンスを含むセンサーの等価回路モデルを使用することによって、説明することもできる。等価回路の構成要素の正確な値は、電極構造の設計並びにセンサー電極を溶液との直接接触から隔てる検出領域上の保護層の存在及び種類に関して変えられる。等価回路は、センサーの１以上の共振インピーダンススペクトルの実部及び虚部についての項を含む解析表現によって表される。導出された解析表現における項が、総細胞濃度及び生細胞の濃度に相関付けられる。導出された解析表現における項は、０．１Ｈｚ〜１００ＧＨｚの周波数範囲にわたる細胞培養物のスペクトル分散に関係付けられることができ、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタスペクトル分散を含むことができる。
【００６５】
共振インピーダンス測定の高い検出感度が、本発明において実証されている。従来のインピーダンス測定の検出感度と比べたとき、検出に用いられる共振器に応じて４５〜７４倍の感度向上が達成された。図１５が、溶液の特性の変化を従来のインピーダンス（２本の点線）を使用し、さらには４つの共振器による共振インピーダンス（共振器ごとに２本の点線）を使用して測定したときの時間につれての溶液の動的な測定の結果を示している。従来のインピーダンスに対する共振インピーダンスを使用した測定感度の向上が、特定の共振器を使用して測定された応答の間のインピーダンス応答Ｚｒｅの差を、共振器と同じ周波数範囲において従来のインピーダンスを使用して測定された応答の間の差によって割り算したものとして算出された。例えば、最小の共振周波数で動作した共振器が、実験の時間にわたって５８，０００オームから１２，５００オームまでの範囲のＺｒｅ応答を有した一方で、従来のインピーダンスを使用して測定されたＺｒｅ応答は、同じ実験時間において１，８００から８００オームまでの範囲にあった。したがって、従来のインピーダンス測定に対する共振インピーダンスの感度の向上は、（５８，０００−１２，５００）／（１，８００−８００）＝４５と算出された。他の共振器２、３、及び４について同様に算出された従来のインピーダンス測定に対する共振インピーダンスの感度の改善は、それぞれ６２、７４、及び４６倍であった。このように、共振インピーダンス測定の使用は、細胞のベータ分散周波数範囲の範囲にわたって測定の感度においてきわめて大きな向上をもたらした。共振インピーダンス測定の使用は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタスペクトル分散の範囲にわたる測定の感度の大きな向上をさらにもたらすことができる。この実験に用いられたセンサーは、誘電保護層で覆われたインターデジタル電極構造であった。電極構造の例（ただし、これらに限られるわけではない）として、２及び４電極構造が挙げられる。インターデジタル電極構造の例（ただし、これらに限られるわけではない）として、２及び４電極構造が挙げられる。電極の材料の例（ただし、これらに限られるわけではない）として、ステンレス鋼、白金、金、貴金属、などが挙げられる。誘電保護層の材料の例（ただし、これらに限られるわけではない）として、二酸化ケイ素、チッ化ケイ素、パリレン、シリコーン、フッ素化ポリマー、セラミックス、などが挙げられる。電極の製造法の例（ただし、これらに限られるわけではない）として、金属のエッチング及びマスクにもとづく金属の堆積が挙げられる。基板上に製造される電極の厚さは、１０ｎｍ〜１０００μｍの範囲にある。
【００６６】
検出電極の適切な形状及び関連の保護層の重要性を、さらに評価した。インターデジタル電極構造の２つの形状を、１ｘ２ｃｍの構造として製造した。電極のこれらの形状が、図５Ｂ及び図５Ｃに示されている。これら２つの種類の構造において、電極幅は、電極間間隔と同じであり、０．４５ｍｍ及び０．３０ｍｍであった。さまざまな厚さのパリレン皮膜を、電極へと適用した。皮膜の厚さは、０μｍ（皮膜なし）、０．２５μｍ、及び０．５μｍであった。これらの測定に関して、各々がセンサー応答の試験のための２００ｍＬの体積を有している４つのモデル溶液を用意した。溶液１は、２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する２００ｍＬの水を有した。溶液２は、１５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する２００ｍＬの水を有した。溶液３は、２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する１８０ｍＬの水及び２０ｍＬのエタノールを有した。溶液４は、１５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する１８０ｍＬの水及び２０ｍＬのエタノールを有した。従来のインピーダンス及び共振インピーダンスの測定を、これらのセンサーを使用して実行した。スペクトルを、ＰＣＡを使用して分析した。
【００６７】
図１６Ａ〜Ｆが、従来のインピーダンス（図１６Ａ、Ｂ、Ｃ）及び共振インピーダンス（図１６Ｄ、Ｅ、Ｆ）で測定された０．４５ｍｍの電極幅及び電極間間隔のインターデジタル電極構造についての結果を要約している。これらのインターデジタル電極構造は、０、０．２５、及び０．５μｍという３つのパリレン皮膜厚さを有していた。図１６Ａ、Ｄが、０μｍのパリレン皮膜厚さ（皮膜なし）についての結果を示している。図１６Ｂ、Ｅが、０．２５μｍのパリレン皮膜厚さについての結果を示している。図１６Ｃ、Ｆが、０．５μｍのパリレン皮膜厚さについての結果を示している。
【００６８】
同様に、図１７Ａ〜Ｆが、従来のインピーダンス（図１７Ａ、Ｂ、Ｃ）及び共振インピーダンス（図１７Ｄ、Ｅ、Ｆ）で測定された０．３ｍｍの電極幅及び電極間間隔のインターデジタル電極構造についての結果を要約している。これらのインターデジタル電極構造は、０、０．２５、及び０．５μｍという３つのパリレン皮膜厚さを有していた。図１７Ａ、Ｄが、０μｍのパリレン皮膜厚さ（皮膜なし）についての結果を示している。図１７Ｂ、Ｅが、０．２５μｍのパリレン皮膜厚さについての結果を示している。図１７Ｃ、Ｆが、０．５μｍのパリレン皮膜厚さについての結果を示している。
【００６９】
図１６Ａ〜Ｆ及び１７Ａ〜Ｆは、保護皮膜の適用が、測定された溶液の異なる誘電率及び伝導度に関係するスペクトル応答集団の間の分離を改善することを示している。
【００７０】
開示の実施形態の技術的効果は、細胞培養物における細胞の生存能力を評価するためのインラインかつリアルタイムの技術を含む。そのような技術は、生細胞と生存不能細胞との間の区別を容易にし、生細胞と生存不能細胞との間の区別を行わないバイオマス方式のセンサーを超える利益をもたらす。
【００７１】
本明細書は、最良の態様を含むいくつかの実施例を使用するとともに、あらゆる装置又はシステムの製作及び使用並びにあらゆる関連の方法の実行を含む実施形態の実施を、当業者にとって可能にしている。特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定められ、当業者であれば想到できる他の実施例も含むことができる。そのような他の実施例は、それらが特許請求の範囲の文言から相違しない構造要素を有しており、又は特許請求の範囲の文言から実質的には相違しない同等の構造要素を含むならば、特許請求の範囲の技術的範囲に包含される。
【符号の説明】
【００７２】
１０  システム
１２  バイオリアクター
１４  センサー
１６  データ取得回路
２２  ワークステーション
２４  コンピュータ
２６  表示装置
２８  キーボード
３０  マウス
３２  プリンタ
３４  検出電極構造
３６  誘電保護コーティング
３８  検出領域
４０  センサーアセンブリ
４２  チューニング要素
４４  マルチプレクサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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