(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＰ２５細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞又は請求項１に記載の細胞より産生されたＨＢＶを感染させた細胞と、被験物質を接触させることを含む、抗ＨＢＶ薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来公知のＨＢＶ産生細胞（より詳細には、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞）と比べて、顕著に高いＨＢＶ産生能を有する細胞、及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」と記載する。）は、ヘパドナウイルス族に属するウイルスであり、外被と不完全環状二本鎖ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを含むコアからなる、球状のＤＮＡウイルスである。
【０００３】
ＨＢＶは肝細胞に侵入すると、ウイルス遺伝子が肝細胞の核内に移動し、不完全環状二本鎖ＤＮＡは完全閉鎖二本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ）（以下、「ｃｃｃＤＮＡ」と記載する。）に転換される。ｃｃｃＤＮＡは核内にて転写・翻訳され、ウイルス粒子を形成する。全世界で３５０〜４００万人もの人々がＨＢＶに感染していると考えられ、そのうちの多くの人が将来的に非代償性肝硬変や肝細胞癌を発症するリスクを有する。
【０００４】
今日、ウイルスの複製や放出といったＨＢＶ生活環の研究や、ＨＢＶ感染の予防及び治療を目的とする抗ＨＢＶ薬剤の開発が進められている。しかしながら、ＨＢＶは限られた動物種の肝細胞にしか感染しないことから、利用できる培養細胞や実験動物が制限されており、これが研究や開発の足かせとなっている。
【０００５】
現在、ＨＢＶを恒常的に産生することが可能な培養細胞株として、ＨＢＶゲノムを含むＨＢＶ発現プラスミドをＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトして作製されたＨｅｐＧ２．２．１５細胞があり（非特許文献１）、研究や開発において広く一般的に利用されている。しかしながら、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞のＨＢＶ産生量は４Ｌｏｇコピー／ｍｌ程度と低く、高力価のＨＢＶを得るためには細胞の大量調製や、ウイルス濃縮等の操作を必要とする。したがって、研究や開発に必要な十分な量のＨＢＶを得ることは容易ではない。
【０００６】
一方、本発明者らはこれまでに、ＨＢＶゲノムを含むＨＢＶ発現プラスミドを、ＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトして作製した培養細胞よりＨＢＶを調製し、これを肝障害を有する免疫不全マウス（ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋）にヒト肝細胞が移植されたキメラマウスに接種することにより、ＨＢＶを感染させたヒト肝細胞キメラマウスを得ることができ、ＨＢＶ感染モデル動物として利用できることを報告している（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇ．ＡＣＳら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８４，ｐｐ．４６４１−４６４４，１９８７
【非特許文献２】Ｔｓｕｇｅ  Ｍ．ら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１０４６−１０５４，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり、今日、研究や開発において広く一般的に利用されているＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いて、高力価のＨＢＶを調製することは容易ではなく、当該分野においては、高力価のＨＢＶを簡便かつ効率的に得ることが可能な新たな手段が切望されている。
【０００９】
そこで、本発明は、従来公知のＨＢＶ産生細胞（より詳細には、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞）と比べて、顕著に高いＨＢＶ産生能を有する細胞、及びその作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、１．４倍長の大きさでＨＢＶゲノムを含むＨＢＶ発現プラスミドを宿主細胞にトランスフェクトして得られた細胞より、ＨＢＶマーカーの産生量の高い細胞を選抜することによって、より詳細には、少なくとも培養上清中のＨＢｓ抗原が２０ＩＵ／ｍＬ以上を示す細胞を選抜することによって、従来公知のＨＢＶ産生細胞と比べて、顕著に高いＨＢＶ産生能を有する細胞が得られることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を包含する。
［１］  高力価のＨＢＶを産生する細胞の作製方法であって、
（ａ）宿主細胞に、１．４倍長の大きさでＨＢＶゲノムを含むＨＢＶ発現プラスミドをトランスフェクションする工程、ならびに
（ｂ）得られた細胞について、ＨＢＶマーカーの産生量が高い細胞を選抜する工程であって、培養上清中のＨＢｓ抗原が２０ＩＵ／ｍＬ以上である細胞を選抜する、上記工程、を含む、上記方法。
［２］  宿主細胞がＨｅｐＧ２細胞である、［１］の方法。
［３］  ＨＢＶゲノムが
（ｉ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号１で表される塩基配列において１〜数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入を有し、かつＨＢＶ粒子の形成を可能とするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＨＢＶ粒子の形成を可能とするＤＮＡ、又は
（ｉｖ）配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつＨＢＶ粒子の形成を可能とするＤＮＡ、
である、［１］又は［２］の方法。
［４］  工程（ｂ）がさらに、薬剤選択及び／又は限外希釈により細胞を選抜する工程を含む、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  工程（ｂ）において、培養上清中のＨＢｓ抗原が２０ＩＵ／ｍＬ以上であり、かつ、該培養上清中のＨＢｅ抗原が５０Ｓ／ＣＯ以上である及び／又はＨＢＶ  ＤＮＡが８Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上である細胞を選抜する、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］  工程（ｂ）にて選抜された細胞が、培養上清中に少なくとも８Ｌｏｇコピー／ｍＬの量にてＨＢＶ粒子を産生する、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］  培養上清中に少なくとも８Ｌｏｇコピー／ｍＬの量にてＨＢＶ粒子を産生することができるＨＢＶ産生細胞。
［８］  ＨＢＰ２５細胞である、［７］の細胞。
［９］  ［７］もしくは［８］の細胞又は［７］もしくは［８］の細胞より産生されたＨＢＶを感染させた細胞と、被験物質を接触させることを含む、抗ＨＢＶ薬剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高力価のＨＢＶを持続産生する細胞及びその作製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、１．４倍長の大きさでクローニングされたＨＢＶゲノムの模式図（ａ）及びそれを挿入して構築したＨＢＶ発現プラスミドの模式図（ｂ）を示す。
【図２】図２は、核酸アナログ製剤（エンテカビル）及び／又はインターフェロン−αの存在下にて培養されたＨＢＰ２５細胞の培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量の測定結果（ａ）及び当該細胞内のウイルス複製中間体量の測定結果（ｂ）を示すグラフ図である。表中、「ＥＴＶ」は核酸アナログ製剤（エンテカビル）を示し、「ＩＦＮ」はインターフェロン−αを示す。結果は、未処理のＨＢＰ２５細胞（対照）にて得られた値を「１」とする相対値にて示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る高力価のＨＢＶを産生する細胞（以下、「本発明に係るＨＢＶ産生細胞」と記載する）は、ＨＢＶ発現プラスミドを、宿主となるヒト肝細胞にトランスフェクションし、高力価のＨＢＶを産生する細胞を選抜することにより作製することができる。
【００１５】
ＨＢＶ発現プラスミドはＨＢＶゲノムを含む。ＨＢＶは３２１５塩基の不完全二本鎖ＤＮＡをウイルスゲノムとして有しており、大きく４つのウイルス遺伝子（Ｓ遺伝子、Ｃ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｘ遺伝子）をコードしているが、各遺伝子はその他の遺伝子と一部重複して存在する。そのため、ＨＢＶ発現プラスミドには各遺伝子の全長がそれぞれ含まれるように、ＨＢＶゲノムを１倍長（３２１５塩基）を超える大きさ、例えば、少なくともおよそ１．２倍長、少なくともおよそ１．３倍長、少なくともおよそ１．４倍長、又は少なくともおよそ１．５倍長の大きさでクローニングされたものを含めることができる。好ましくは、本発明におけるＨＢＶ発現プラスミドにはＨＢＶゲノムを１．４倍長の大きさで含めることができる。ここで「１．４倍」には、より詳細には１．３５倍〜１．４４倍が含まれ、すなわち、１．４倍長の大きさのＨＢＶゲノムとは、４３４０塩基〜４６２９塩基から選択される大きさとすることができる。
【００１６】
１．４倍長の大きさを有するＨＢＶゲノムは、公開されたデータベースにその配列情報が登録されており（例えば、ＧｅｎＢａｎｋにＡＢ２０６８１６、ＡＢ２０６８１７として登録されている）、本発明においてはこれらの配列情報を利用することができる。
【００１７】
本発明において、ＨＢＶ発現プラスミドに含まれる「ＨＢＶゲノム」としては、配列番号１で表される塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるＤＮＡを利用することができる。なお、配列番号１で表される塩基配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋにＡＢ２０６８１６として登録されている。ＡＢ２０６８１６として登録されたＨＢＶゲノムと、ＡＢ２０６８１７として登録されたＨＢＶゲノムとはそれぞれ、ＨＢＶ感染が確認された異なる患者に由来する。
【００１８】
また、本発明において利用可能な「ＨＢＶゲノム」には、配列番号１で表される塩基配列において１〜数個の塩基の欠失、置換、付加または挿入を有し、かつＨＢＶ粒子の形成を可能とするＤＮＡや、配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、かつＨＢＶ粒子の形成を可能とするＤＮＡや、配列番号１で表される塩基配列とＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつＨＢＶ粒子の形成を可能とするＤＮＡも含まれる。ここで「１〜数個」とは特に限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個である。また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）溶液を用いて、６５℃で洗浄する条件をいう。
【００１９】
ＨＢＶ発現プラスミドは、当業者に周知である遺伝子工学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら、“ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ／ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））を用いて、適当なベクターに上記ＨＢＶゲノムを挿入することによって作製することができる。
【００２０】
ベクターには上記ＨＢＶゲノムと共に、プロモーターやエンハンサーを含めることができる。プロモーターやエンハンサーとしては、遺伝子発現ベクターにおいて一般的に使用されるものを利用することができ、例えば、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、薬剤誘導性プロモーターやそのエンハンサー等が挙げられ、より詳細には、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、β−アクチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２１】
ベクターにはさらに、形質転換体を同定するための選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子等）、宿主における複製を可能とする複製起点、ターミネーター領域等を含めることができる。
【００２２】
ベクターは市販のベクターを利用することができ、例えば、ｐＴＲＥベクター、ｐＣＡＧベクター、ｐｃＤＮＡ３ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター等を利用することができる。
【００２３】
本発明において宿主となる細胞は、ヒト肝細胞であり、当該細胞は初代培養細胞であってもよいし、株化細胞であってもよい。好ましくは、宿主となる細胞はヒト肝細胞癌由来の細胞であり、例えば、ＨｅｐＧ２細胞株、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株、ＰＬＣ細胞株、ＳＫ−Ｈｅｐ１細胞株、ＨＬＥ細胞株、ＨＬＦ細胞株、Ｃ３Ａ細胞株、Ｈｕｈ−６細胞株、Ｈｕｈ−７細胞株、ＦＬＣ−１細胞株、ＦＬＣ−２細胞株、ＦＬＣ−３細胞株、ＦＬＣ−４細胞株、ＦＬＣ−５細胞株、ＦＬＣ−６細胞株、ＦＬＣ−７細胞株等が挙げられるが、これらに限定はされない。特に好ましくは、ＨｅｐＧ２細胞株である。
【００２４】
宿主へのＨＢＶ発現プラスミドのトランスフェクションは、リン酸カルシウム法又は塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃等を用いる方法により行うことができる。好ましくは、細胞毒性が比較的低い、リン酸カルシウム法である。
【００２５】
高力価のＨＢＶを産生する細胞のスクリーニングは、細胞が産生するＨＢＶマーカー量を指標にして行うことができる。
【００２６】
ＨＢＶは、ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原、Ｘタンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＨＢＶ  ＤＮＡを保有しており、本発明においてはこれらより選択される１、２、３、４、５又はそれ以上をＨＢＶマーカーとして利用することができる。好ましくは、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原及びＨＢＶ  ＤＮＡより選択される１又は２以上をＨＢＶマーカーとして利用することができ、より好ましくは、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原及びＨＢＶ  ＤＮＡの組み合わせをＨＢＶマーカーとして利用することができる。
【００２７】
ＨＢＶマーカーの測定は、ＨＢＶのタンパク質又は核酸の検出・定量方法において一般的に用いられている手法を利用することができ、例えば、凝集法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、イムノクロマトグラフィー法（ＩＣＡ法）、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、アンプリコアモニター法、ＴＭＡ法等を挙げることができ（特にこれらに限定はされない）、これらの一又は複数の手法を利用することができる。
【００２８】
ＨＢＶマーカー量の測定は培養上清を検体として利用することができる。検体として使用する培養上清は、播種された細胞がおよそ８０％コンフルエントに達した段階、及び／又は培養開始からおよそ１２時間程度経過した段階の培養上清を利用することができる。例えば、６０ｍｍディッシュにておよそ８０％コンフルエントに達する細胞数の全部〜１／４の数、好ましくは１／２の数の細胞を９０ｍｍディッシュに継代して培養し、その細胞がおよそ８０％コンフルエントに達した段階の培養上清を利用することができる。
以下においても、ＨＢＶマーカー量の測定に用いられる「培養上清」とはこの意味で用いる。
【００２９】
ＨＢＶマーカー量を測定／定量することによって、細胞のＨＢＶ産生量を評価することができ、ＨＢＶ産生量の高い細胞を選択的に取得することができる。
例えば、下記実施例にて詳述する化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）を用いて、培養上清中のＨＢｓ抗原を測定／定量した場合において、１０ＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは２０ＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは２５ＩＵ／ｍＬ以上、特に好ましくは２８ＩＵ／ｍＬ以上を示す細胞を選択する。
【００３０】
加えて／あるいは、下記実施例にて詳述する化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）を用いて、培養上清中のＨＢｅ抗原を測定／定量した場合において、４０Ｓ／ＣＯ以上、好ましくは５０Ｓ／ＣＯ以上、より好ましくは５５Ｓ／ＣＯ以上、さらに好ましくは６０Ｓ／ＣＯ以上、特に好ましくは７０Ｓ／ＣＯ以上を示す細胞を選択する。
【００３１】
加えて／あるいは、下記実施例にて詳述するラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）を用いて、培養上清中のＨＢｅ抗原を測定／定量した場合において、６０Ｃ．Ｏ．Ｉ以上、好ましくは７０Ｃ．Ｏ．Ｉ以上、より好ましくは８０Ｃ．Ｏ．Ｉ以上、さらに好ましくは９０Ｃ．Ｏ．Ｉ以上、特に好ましくは９５Ｃ．Ｏ．Ｉ以上を示す細胞を選択する。
【００３２】
加えて／あるいは、下記実施例にて詳述するリアルタイムＰＣＲ法を用いて、培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡを測定／定量した場合において、７Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、好ましくは８Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、より好ましくは９Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上を示す細胞を選択する。
【００３３】
加えて／あるいは、下記実施例にて詳述するアンプリコアモニター法を用いて、培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡを測定／定量した場合において、５ＬＧＥ／ｍＬ以上、例えば、６ＬＧＥ／ｍＬ以上、好ましくは７ＬＧＥ／ｍＬ以上、より好ましくは８ＬＧＥ／ｍＬ以上、さらに好ましくは９ＬＧＥ／ｍＬ以上、よりさらに好ましくは１０ＬＧＥ／ｍＬ以上を示す細胞を選択する。
【００３４】
細胞のスクリーニングはさらに、薬剤選択及び／又は限外希釈を用いて行うことができる。
【００３５】
薬剤選択は、ＨＢＶ発現プラスミドが選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含む場合、スクリーニングに適切な抗生物質を添加した培地中で、トランスフェクションした細胞を培養することによって、ＨＢＶ発現プラスミドを有さない又は喪失した細胞を除去し、安定発現細胞株を選択的に取得することができる。例えば、ＨＢＶ発現プラスミドがハイグロマイシン耐性遺伝子を有する場合、培地中にハイグロマイシンを添加することによって、当該ＨＢＶ発現プラスミドを有さない又は喪失した細胞を除去することができ、ＨＢＶ発現プラスミドが安定にトランスフェクションされた細胞株を選択的に取得することができる。
【００３６】
限外希釈は多種類のクローン細胞の集団より、単一のクローンを分離する際に一般的に用いられる手法にしたがって行うことができ、例えば、一つのウェル又はシャーレ中に、およそ一個の細胞が入るように、細胞懸濁液又は細胞浮遊液を希釈して播種・培養することにより行うことができる。上記「薬剤選択」及び／又は「ＨＢＶマーカー量の測定」と組み合わせることにより、ＨＢＶ発現プラスミドが安定にトランスフェクションされた細胞及び／又はＨＢＶ産生量の高い細胞を選抜・クローン化することができる。
【００３７】
細胞のスクリーニングにおいて、上記のＨＢＶマーカー量の測定、薬剤選択、限外希釈の各手段は任意の順序で行うことができ、またそれぞれ任意の回数にて行うことができる。
【００３８】
一実施形態において、本発明に係るＨＢＶ産生細胞は、以下の工程を含む方法により作製することができる：
（ａ）選択マーカーとして抗生物質に対する耐性遺伝子を含むＨＢＶ発現プラスミドを、宿主となるＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションする工程、
（ｂ）トランスフェクションした細胞を、当該抗生物質を添加した培地中にて培養することによって、当該ＨＢＶ発現プラスミドを有さない又は喪失した細胞を除去し、ＨＢＶ発現プラスミドが安定にトランスフェクションされた細胞をクローニングする工程、
（ｃ）クローニングした細胞をさらに培養し、以下の（ｃ−１）〜（ｃ−３）の少なくとも一以上を示す細胞を採取する工程：
（ｃ−１）培養上清中のＨＢｓ抗原を化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）を用いて測定した場合に２５ＩＵ／ｍＬ以上を示す、
（ｃ−２）培養上清中のＨＢｅ抗原をラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）を用いて測定した場合に９０Ｃ．Ｏ．Ｉ以上を示す、
（ｃ−３）培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡをアンプリコアモニター法を用いて測定した場合に５ＬＧＥ／ｍＬ以上を示す、
（ｄ）採取した細胞を限外希釈後、さらに培養し、以下の（ｄ−１）〜（ｄ−３）の少なくとも一以上を示す細胞を採取する工程：
（ｄ−１）培養上清中のＨＢｓ抗原を化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）を用いて測定した場合に２０ＩＵ／ｍＬ以上を示す、
（ｄ−２）培養上清中のＨＢｅ抗原をラジオイムノアッセイ法（ＣＬＩＡ法）を用いて測定した場合に５０Ｓ／ＣＯ以上を示す、
（ｄ−３）培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した場合に８Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上を示す。
【００３９】
本発明に係るＨＢＶ産生細胞は、培養上清中に、８Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、好ましくは９Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、より好ましくは１０Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上のＨＢＶ粒子を産生することができる。
【００４０】
本発明に係るＨＢＶ産生細胞はさらに、以下に示す少なくとも一つ、好ましくは二つ、より好ましくは三つ以上の特性を有する：
培養上清中のＨＢｓ抗原を化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）を用いて測定した場合に２０ＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは２５ＩＵ／ｍＬ以上を示す、
培養上清中のＨＢｅ抗原をラジオイムノアッセイ法（ＣＬＩＡ法）を用いて測定した場合に５０Ｓ／ＣＯ以上、好ましくは６０Ｓ／ＣＯ以上を示す、
培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した場合に８Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、好ましくは９Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上、より好ましくは１０Ｌｏｇコピー／ｍＬ以上を示す。
【００４１】
本発明に係るＨＢＶ産生細胞としては、下記実施例にて具体的に記載される「ＨＢＰ２５細胞」（自己寄託細胞株）が挙げられる。
【００４２】
本発明に係るＨＢＶ産生細胞は、ＨＢＶ感染モデルとして利用することができる。また、本発明に係るＨＢＶ産生細胞より産生されたＨＢＶを他の細胞（例えば、ヒト肝細胞等）に感染させ、ＨＢＶ感染モデルを作製することができる。他の細胞は培養細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系）であってもよいし、あるいは実験動物の体内にある細胞又は実験動物に移植された細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏの系）であってもよい。このような実験動物には例えば、肝障害を有する免疫不全マウス（ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋）にヒト肝細胞が移植されたキメラマウス（Ｔｓｕｇｅｒａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．５，２００５）等が挙げられる。
【００４３】
ＨＢＶ感染モデルは、抗ＨＢＶ薬剤のスクリーニング方法に利用することができる。当該スクリーニングは、抗ＨＢＶ薬剤の候補物質（被験物質）の薬効試験、薬物代謝試験、毒性試験に基づいて行うことができる。
【００４４】
薬効試験、薬物代謝試験、毒性試験は、一般的な手法により行うことができる。すなわち、薬効試験は、ＨＢＶ感染モデルに、被験物質を添加／投与して接触させ、当該モデルにおけるＨＢＶの感染や複製の程度を指標にして評価することができる。薬物代謝試験は、ＨＢＶ感染モデルに、被験物質を添加／投与して接触させ、添加／投与された被験物質の代謝物の検出又は増減を指標にして評価することができる。毒性試験は、ＨＢＶ感染モデルに、被験物質を添加／投与して接触させ、その後のＨＢＶ感染モデルの細胞の状態を指標にして、又は細胞機能の指標となるタンパク質や化合物（例えば、肝細胞機能の指標となるタンパク質や化合物としては、アルブミン、コリンエステラーゼ、コレステロール、γ−グロブリン、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、血小板などが挙げられる）の検出又は増減を指標にして評価することができる。
【００４５】
「被験物質」としては、核酸、タンパク質、ポリペプチド、低分子化合物等が挙げられるが、これらに限定はされない。被験物質は、天然物であってもよいし、人工的に合成されたものであってもよく、また未精製のものであってもよいし、粗精製もしくは精製されたものであってもよい。
【００４６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１：ＨＢＶ発現プラスミドの作製
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノタイプＣ持続感染患者血清より、重複配列を含め１．４倍長のサイズでクローニングされたＨＢＶゲノム（図１（ａ）、４，３９６ｂｐ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２０６８１６）を、ｐＴＲＥ２ｈｙｇベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＨＢＶ発現プラスミド（図１（ｂ））を構築した。
【００４８】
実施例２：ＨＢＶ産生細胞株の作製
本実施例において、ＨＢＶマーカーの測定は以下の手法を用いて行った。
・ＨＢｓ抗原量の測定（ＣＬＩＡ法）：ＨＢｓ抗原量は、アーキテクト（登録商標）ＨＢｓＡｇ  ＱＴ（アボットジャパン社）をメーカーの指示書に従って使用し、測定した。
・ＨＢｅ抗原量の測定（ＲＩＡ法）：ＨＢｅ抗原量は、ルミパルス（登録商標）Ｉ  ＨＢｅＡｇ（富士レビオ株式会社）をメーカーの指示書に従って使用し、測定した。
・ＨＢｅ抗原量の測定（ＣＬＩＡ法）：ＨＢｅ抗原量はまた、アーキテクト（登録商標）ＨＢｅＡｇ（アボットジャパン社）をメーカーの指示書に従って使用し、測定した。
・ＨＢＶ  ＤＮＡ量の測定（アンプリコアモニター法）：ＨＢＶ  ＤＮＡ量は、コバスＴａｑＭａｎ（登録商標）ＨＢＶ「オート」ｖ２．０（ロシュ・ダイアグノスティックス社）をメーカーの指示書に従って使用し、測定した。
・ＨＢＶ  ＤＮＡ量の測定（リアルタイムＰＣＲ法）：ＨＢＶ  ＤＮＡ量はまた、アキュジーン（登録商標）ｍ−ＨＢＶ（アボットジャパン社）をメーカーの指示書に従って使用し、測定した。
【００４９】
実施例１で作製したＨＢＶ発現プラスミドを、２０μｇ／ディッシュの割合で、肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２細胞にリン酸カルシウム法にてトランスフェクションし、得られた細胞を翌日より、ハイグロマイシン（４００μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン／ストレプトマイシン）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養して薬剤選択を行い、細胞をクローニングした（６０クローン）。
【００５０】
クローニングした細胞は上記培地を入れた９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、上記と同じ条件下にて培養し、細胞がおよそ８０％コンフルエントに達したところで継代した。継代に際しては、９６ウェルプレートから１２ウェルプレートに、次いで１２ウェルプレートから３５ｍｍディッシュに、次いで３５ｍｍディッシュから６０ｍｍディッシュに順次スケールアップして継代していき、最終的に６０ｍｍディッシュに継代された細胞がおよそ８０％コンフルエントに達した段階で、その半分の数の細胞を９０ｍｍディッシュに播種した。９０ｍｍディッシュに播種した細胞を同様に培養して、細胞が８０％コンフルエントに達したところで（培養開始からおよそ１２時間）、培養上清中のＨＢｓ抗原量をＣＬＩＡ法にて、ＨＢｅ抗原量をＲＩＡ法にて、ＨＢＶ  ＤＮＡ量をアンプリコアモニター法にて、それぞれ測定した。
【００５１】
その結果、ＨＢｓ抗原量０．０５〜１００ＩＵ／ｍｌ、ＨＢｅ抗原量０．３〜１００Ｃ．Ｏ．Ｉ、及びＨＢＶ  ＤＮＡ量２．６〜７．１ＬＧＥ／ｍｌの範囲で示す複数の細胞を得ることができた。
【００５２】
このうち、ＨＢｓ抗原量について２８．１ＩＵ／ｍｌ（ＣＬＩＡ法）を示す細胞、ＨＢｅ抗原量について９６Ｃ．Ｏ．Ｉ（ＲＩＡ法）を示す細胞、ＨＢＶ  ＤＮＡ量について７．０ＬＧＥ／ｍｌ（アンプリコアモニター法）を示す細胞をそれぞれ採取した。
【００５３】
次いで、採取した細胞をそれぞれ、限外希釈後、上記と同様に、９６ウェルプレートに播種して培養を開始し、継代の度にスケールアップして最終的に６０ｍｍディッシュにて８０％コンフルエントに達した段階で、その半分の数の細胞を９０ｍｍディッシュに播種した。播種した細胞が８０％コンフルエントに達したところで、培養上清中のＨＢｓ抗原量をＣＬＩＡ法にて、ＨＢｅ抗原量をＣＬＩＡ法にて、ＨＢＶ  ＤＮＡ量をリアルタイムＰＣＲ法にて、それぞれ測定した。
【００５４】
その結果、ＨＢｓ抗原量について２０〜２５ＩＵ／ｍｌ（ＣＬＩＡ法）、ＨＢｅ抗原量について５０〜６０Ｓ／ＣＯ（ＣＬＩＡ法）、かつＨＢＶ  ＤＮＡ量について８〜１０Ｌｏｇコピー／ｍｌ（リアルタイムＰＣＲ法）を示す細胞を得ることができた。いずれのマーカー値も高い値を示すこの細胞を「ＨＢＰ２５細胞」と命名した。
【００５５】
ＨＢＰ２５細胞は、培養上清中に８〜９Ｌｏｇコピー／ｍｌ程度（リアルタイムＰＣＲ法にて測定）のＨＢＶ粒子を産生することが可能である。この産生量は、従来一般的に利用されていたＨＢＶ産生細胞株であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞のＨＢＶ産生量の約１０万倍にあたり、ＨＢＰ２５細胞が極めて高いＨＢＶ産生能を有することが示された。また、ＨＢＰ２５細胞は継代培養により、長期（少なくとも一年以上）にわたって高いＨＢＶ産生能を保持することが確認された。
【００５６】
なお、当該「ＨＢＰ２５細胞」は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）が受託を拒否する微生物に該当することから（受託拒否に関する証明書の通知年月日：平成２７年４月８日）、本発明者らは当該「ＨＢＰ２５細胞」を国立大学法人広島大学大学院  医歯薬保健学研究院  応用生命科学部門  消化器・代謝内科学（〒７３４−８５５１  広島県広島市南区霞一丁目２番３号）内において自己寄託し、維持・保存している。本発明者らは、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、ＨＢＰ２５細胞を第三者に分譲することを保証する。
【００５７】
実施例３：ＨＢＰ２５細胞を用いた抗ＨＢＶ薬剤のスクリーニング
ＨＢＰ２５細胞を５０〜６０％コンフルエントとなるようプレートに播種し、翌日から６日間にわたって、抗ＨＢＶ効果を有することが既知である核酸アナログ製剤（エンテカビル（ブリストル・マイヤーズ））及び／又はインターフェロン−α（中外製薬）を所定の用量にて添加したＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、２％ペニシリン／ストレプトマイシン）中にて培養した。
【００５８】
培養終了後、培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量及び細胞内のウイルス複製中間体量をリアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。
【００５９】
結果を図２に示す。結果は、核酸アナログ製剤及びインターフェロン−αで処理していないＨＢＰ２５細胞にて得られた値を「１」とする相対値にて示す。
【００６０】
図２に示す結果より明らかなとおり、培地に添加する薬物の濃度依存的に、培養上清中のＨＢＶ  ＤＮＡ量及び細胞内のウイルス複製中間体量の減少が認められた。
【００６１】
この結果は、ＨＢＰ２５細胞をＨＢＶ感染モデルとして利用することができ、抗ＨＢＶ薬剤のスクリーニングに利用できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、高力価のＨＢＶを持続産生する細胞を提供することができる。本発明に係るＨＢＶ産生細胞は、従来公知のＨＢＶ産生細胞株であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞のＨＢＶ産生量と比べて顕著に高いＨＢＶ産生量を有する。これにより、ウイルスの感染能を低下させ得る濃縮等の操作を経ることなく、高い濃度のＨＢＶを調製することが可能となる。また、従来公知のＨＢＶ産生細胞株を用いた場合と比べて、少数の細胞数でＨＢＶ感染モデルを構築することができ、抗ＨＢＶ薬の薬効試験、薬物代謝試験、毒性試験等においてハイスループットの評価系を提供することができる。したがって、本発明はＨＢＶの研究や、ＨＢＶに対する創薬研究の分野において大いに貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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