(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基配列が配列番号２２に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２３に示されるリバースプライマーからなるプライマー対と、
塩基配列が配列番号２４に示されるプローブと、
を備える血清型２のデングウイルス検出用キット。
【請求項２】
塩基配列が配列番号２８に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２９に示されるリバースプライマーからなる第１のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３４に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号３５に示されるリバースプライマーからなる第２のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３０に示される第１のプローブと、
塩基配列が配列番号３６に示される第２のプローブと、
を備える血清型３のデングウイルス検出用キット。
【請求項３】
塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２に示されるリバースプライマーからなる第１のプライマー対と、
塩基配列が配列番号１０に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号１１に示されるリバースプライマーからなる第２のプライマー対と、
塩基配列が配列番号２２に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２３に示されるリバースプライマーからなる第３のプライマー対と、
塩基配列が配列番号２８に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２９に示されるリバースプライマーからなる第４のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３４に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号３５に示されるリバースプライマーからなる第５のプライマー対と、
塩基配列が配列番号４９に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号５０に示されるリバースプライマーからなる第６のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３に示される第１のプローブと、
塩基配列が配列番号１２に示される第２のプローブと、
塩基配列が配列番号２４に示される第３のプローブと、
塩基配列が配列番号３０に示される第４のプローブと、
塩基配列が配列番号３６に示される第５のプローブと、
塩基配列が配列番号５１に示される第６のプローブと、
を備えるデングウイルス検出用キット。
【請求項４】
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが第１の蛍光色素で標識され、
前記第３のプローブが前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素で標識され、
前記第４のプローブ及び前記第５のプローブが前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素とは異なる第３の蛍光色素で標識され、
前記第６のプローブが前記第１の蛍光色素、前記第２の蛍光色素及び前記第３の蛍光色素とは異なる第４の蛍光色素で標識された、
請求項３に記載のデングウイルス検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清型２のデングウイルス検出用キット、血清型３のデングウイルス検出用キット及びデングウイルス検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
デングウイルスには、４つの血清型（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ−１、２、３、４)が存在する。各血清型がデング熱及び重篤なウイルス性出血熱であるデング出血熱の原因となる。日本国内においては、２０１４年８月に、約７０年ぶりにデングウイルスの発生が報告された。今後、日本国内におけるデングウイルスの感染拡大が懸念される。
【０００３】
デングウイルスの感染拡大に伴い、献血血液から製造される血液製剤へのデングウイルスの混入が危惧される。血液製剤用の原料に混入する恐れのある病原体については、病原体の有無を検査することで、血液製剤の安全性が担保されている。
【０００４】
デングウイルスを検出する方法には、血中のウイルス抗原又はウイルス特異的抗体を検出する方法と、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの核酸増幅法によってウイルス由来の核酸を直接検出する方法とが用いられている。核酸増幅法は、試料中におけるデングウイルスを検出する方法として最も高感度である。
【０００５】
例えば、特許文献１には、核酸増幅法としてＲＴ−ＰＣＲ法を用いて４つの血清型のデングウイルスを検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０６６７０５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｓｔｅｒ  Ｃ．Ｓａｂｉｎｏ、外１４名、「Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ  Ｄｅｎｇｕｅ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ２０１２  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｉｎ  Ｂｒａｚｉｌ」、［ｏｎｌｉｎｅ］、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２０１５年７月９日、［２０１５年９月２５日検索］、インターネット〈URL：http://jid.oxfordjournals.org/content/early/2015/07/09/infdis.jiv326.full.pdf+html〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の血液製剤の中でも、特に血漿分画製剤は多人数のプール血漿を原料として製造される。例えば、１万人分のプール血漿を原料とする場合、１×１０６コピー／ｍＬのデングウイルスを含む感染者の血液由来の血漿がプール血漿において１万分の１である１００コピー／ｍＬに希釈されると考えられる。このような低コピー数であっても、安全性を担保するためにプール血漿からデングウイルスを検出する必要がある。
【０００９】
また、非特許文献１では、デングウイルスの輸血感染例を調査したところ、ドナーの血漿中のデングウイルスが３６コピー／ｍＬでも、レシピエントにおいてデングウイルスの感染が成立することが報告されている。
【００１０】
したがって、血液製剤の製造のみならず、臨床においても、デングウイルスを十分に高い感度で検出することが求められている。上記の特許文献１に開示された方法は、全血、血漿及び血清などの試料におけるデングウイルスを検出できるが、含まれるデングウイルスが１００コピー／ｍＬ未満である試料からも検出できるか否かは明らかではない。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、デングウイルスをより高感度に検出できる血清型２のデングウイルス検出用キット、血清型３のデングウイルス検出用キット及びデングウイルス検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る血清型２のデングウイルス検出用キットは、
塩基配列が配列番号２２に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２３に示されるリバースプライマーからなるプライマー対と、
塩基配列が配列番号２４に示されるプローブと、
を備える。
【００１３】
本発明の第２の観点に係る血清型３のデングウイルス検出用キットは、
塩基配列が配列番号２８に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２９に示されるリバースプライマーからなる第１のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３４に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号３５に示されるリバースプライマーからなる第２のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３０に示される第１のプローブと、
塩基配列が配列番号３６に示される第２のプローブと、
を備える。
【００１４】
本発明の第３の観点に係るデングウイルス検出用キットは、
塩基配列が配列番号１に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２に示されるリバースプライマーからなる第１のプライマー対と、
塩基配列が配列番号１０に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号１１に示されるリバースプライマーからなる第２のプライマー対と、
塩基配列が配列番号２２に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２３に示されるリバースプライマーからなる第３のプライマー対と、
塩基配列が配列番号２８に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号２９に示されるリバースプライマーからなる第４のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３４に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号３５に示されるリバースプライマーからなる第５のプライマー対と、
塩基配列が配列番号４９に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号５０に示されるリバースプライマーからなる第６のプライマー対と、
塩基配列が配列番号３に示される第１のプローブと、
塩基配列が配列番号１２に示される第２のプローブと、
塩基配列が配列番号２４に示される第３のプローブと、
塩基配列が配列番号３０に示される第４のプローブと、
塩基配列が配列番号３６に示される第５のプローブと、
塩基配列が配列番号５１に示される第６のプローブと、
を備える。
【００１５】
この場合、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが第１の蛍光色素で標識され、
前記第３のプローブが前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素で標識され、
前記第４のプローブ及び前記第５のプローブが前記第１の蛍光色素及び前記第２の蛍光色素とは異なる第３の蛍光色素で標識され、
前記第６のプローブが前記第１の蛍光色素、前記第２の蛍光色素及び前記第３の蛍光色素とは異なる第４の蛍光色素で標識された、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、デングウイルスをより高感度に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＤＥＮＶ−１を標的とする検出結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例の増幅曲線及び実施例の増幅曲線を示す図である。（Ｃ）は各ウイルス株における比較例及び実施例のＣｔの差を示す図である。
【図２】ＤＥＮＶ−２を標的とする検出結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例の増幅曲線及び実施例の増幅曲線を示す図である。（Ｃ）は各ウイルス株における比較例及び実施例のＣｔの差を示す図である。
【図３】ＤＥＮＶ−３を標的とする検出結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例の増幅曲線及び実施例の増幅曲線を示す図である。（Ｃ）は各ウイルス株における比較例及び実施例のＣｔの差を示す図である。
【図４】ＤＥＮＶ−４を標的とする検出結果を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ比較例の増幅曲線及び実施例の増幅曲線を示す図である。（Ｃ）は各ウイルス株における比較例及び実施例のＣｔの差を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る実施の形態について添付の図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。
【００１９】
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係るプライマー対及びプローブは、試料に含まれるデングウイルス（以下、単に「ＤＥＮＶ」とする）を検出するために用いられる。
【００２０】
ＤＥＮＶのゲノムは、１本鎖ＲＮＡである。ＤＥＮＶのゲノムは、５’末端の非翻訳領域と３’末端の非翻訳領域との間に、３種の構造タンパク質と７種の非構造タンパク質をコードする。構造タンパク質をコードする遺伝子は、Ｃ、ｐｒＭ及びＥである。非構造タンパク質をコードする遺伝子は、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５である。
【００２１】
ＤＥＮＶとして、上述のように血清型１（ＤＥＮＶ−１）、血清型２（ＤＥＮＶ−２）、血清型３（ＤＥＮＶ−３）及び血清型４（ＤＥＮＶ−４）が知られている。
【００２２】
本実施の形態に係るプライマー対は、各血清型のＤＥＮＶそれぞれに対して設計されたものである。プライマー対は、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、核酸の断片である。ＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼがフォワードプライマー及びリバースプライマーを伸長することによって、鋳型の二本鎖ＤＮＡの所定の領域が増幅される。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、増幅対象の２本鎖ＤＮＡの両鎖それぞれの３’側と相補的な塩基配列からなる。
【００２３】
ＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型となるＤＮＡに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がフォワードプライマーの３’末端に付加されることによって、フォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に伸長される。ＰＣＲでは、反応温度の変化により、２本鎖の鋳型のＤＮＡが１本鎖にほどかれ、フォワードプライマーが鋳型のＤＮＡにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたフォワードプライマーと鋳型のＤＮＡとがほどかれる。リバースプライマーについても同様である。ＰＣＲは上記一連の反応を繰り返すことにより、目的の核酸を増幅することができる。
【００２４】
プライマー対がアニーリングする塩基配列に変異がある場合には、複数種のポリヌクレオチド、すなわちｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーが好ましい。ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーとは、所定の位置の塩基が相違する複数のポリヌクレオチドを含むプライマーをいう。ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーの塩基配列では、ＩＵＰＡＣが定める表記に基づいて、上記所定の位置の塩基が混合塩基で表記される。
【００２５】
ＤＥＮＶ−１〜ＤＥＮＶ−４の検出に好ましいプライマー対のフォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれの塩基配列を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0006592697.tif 000002
【００２７】
上記表１に挙げたプライマー対の中でも、ＤＥＮＶ−１に対するプライマー対としては、フォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）からなるＤＥＮ−１  ３６ならびにフォワードプライマー（配列番号１０）及びリバースプライマー（配列番号１１）からなるＤＥＮ−１  ｏｒｉが好ましい。ＤＥＮ−１  ３６は、ＮＳ１遺伝子の所定領域を増幅する。ＤＥＮ−１  ｏｒｉは、Ｅ遺伝子の所定領域を増幅する。
【００２８】
ＤＥＮＶ−２に対するプライマー対としては、フォワードプライマー（配列番号１９）及びリバースプライマー（配列番号２０）からなるＤＥＮ−２  ６５ならびにフォワードプライマー（配列番号２２）及びリバースプライマー（配列番号２３）からなるＤＥＮ−２  ７８が好ましい。ＤＥＮ−２  ７８は、ＮＳ５遺伝子の所定領域を増幅する。
【００２９】
ＤＥＮＶ−３に対するプライマー対としては、フォワードプライマー（配列番号２８）及びリバースプライマー（配列番号２９）からなるＤＥＮ−３  １６ならびにフォワードプライマー（配列番号３４）及びリバースプライマー（配列番号３５）からなるＤＥＮ−３  ６２が好ましい。ＤＥＮ−３  １６は、Ｅ遺伝子の所定領域を増幅する。ＤＥＮ−３  ６２は、ＮＳ５遺伝子の所定領域を増幅する。
【００３０】
ＤＥＮＶ−４に対するプライマー対としては、フォワードプライマー（配列番号４９）及びリバースプライマー（配列番号５０）からなるＤＥＮ−４  ＪＲＣが特に好ましい。ＤＥＮ−４  ＪＲＣは、Ｅ遺伝子の所定領域を増幅する。
【００３１】
上述の各プライマー対は、既知の方法で合成することができる。プライマー対は、例えば、固相ホスホルアミダイト法などを含む任意の核酸合成法により化学的に合成される。プライマー対は、トリエステル法でも合成できる。また、種々の自動オリゴヌクレオチド合成装置が市販されており、プライマー対は、当該自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる。また、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。
【００３２】
次に、上述の各プライマー対の使用方法について説明する。上記プライマー対は、ＤＥＮＶ由来の核酸を鋳型とするＰＣＲで使用する。ＤＥＮＶ由来の核酸は、例えば、血清試料から公知の方法でＤＥＮＶの全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によって合成したｃＤＮＡである。
【００３３】
ＰＣＲは、市販のＰＣＲ装置で行うことができる。増幅反応の条件は、例えば、５０℃で２０分、９５℃で１５分、続いて次のサイクル９４℃で４５秒→６０℃で４５秒を、４５サイクル繰り返せばよい。
【００３４】
ＰＣＲによる増幅産物を定量することで、試料に含まれるＤＥＮＶを検出できる。増幅産物の定量方法は、インターカレーション法及びハイブリダイゼーション法など、特に限定されない。インターカレーション法では、二本鎖ＤＮＡに特異的に挿入されて蛍光を発する色素として、例えばＳＹＢＲ（商標）  ｇｒｅｅｎを用いればよい。ハイブリダイゼーション法では、増幅産物の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いればよい。当該プローブとしてはＴａｑＭａn（登録商標）が特に好ましい。増幅産物を定量するために、好ましくは、ＰＣＲによる増幅産物を経時的に測定するリアルタイム定量ＰＣＲ法が用いられる。また、アガロースゲル電気泳動法などで増幅産物を定量してもよい。
【００３５】
ハイブリダイゼーション法におけるハイブリダイゼーションの条件は、プローブが、増幅産物とはハイブリダイズするが、他の塩基配列からなる核酸とはハイブリダイズしない、ストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）などに基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
【００３６】
本実施の形態に係るプローブは、上記プライマー対で増幅した増幅産物をハイブリダイゼーション法で定量するのに好適である。表１には、上記プライマー対ごとに本実施の形態に係るプローブの塩基配列が示されている。当該プローブは、プライマー対と同様に、既知の方法で合成することができる。
【００３７】
好ましくは、当該プローブは、蛍光色素や放射性物質などによって標識される。蛍光色素としては、ＦＩＴＣ、Ｂｏｄｉｐｙ４９３、ＮＢＤ、ＴＲＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＩＲ１４４、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ及びＮＥＤなどが挙げられる。
【００３８】
蛍光色素で標識したプローブとして、５’末端に蛍光色素が結合しており、蛍光共鳴エネルギー転移の原理によって該蛍光色素の消光を誘導するクエンチャーが３’末端に結合したプローブが特に好ましい。
【００３９】
本実施の形態に係るプライマー対及びプローブは、ＤＥＮＶ−１〜４のいずれをも検出するために、好適には、マルチプレックスＰＣＲで使用される。この場合、ＤＥＮＶ−１〜４に対するプローブ各々を異なる蛍光色素で標識すればよい。
【００４０】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るプライマー対は、ＤＥＮＶ−１〜４のゲノムの所定領域に対応する核酸を効率よく増幅することができる。また、本実施の形態に係るプローブは、上記プライマー対によって増幅された核酸に特異的にハイブリダイズする。したがって、上記プライマー対及びプローブを用いれば、ＤＥＮＶをより高感度に検出できる。
【００４１】
また、本実施の形態に係るプライマー対及びプローブは、標的とする血清型と異なる血清型の核酸に交差反応を示さずに標的の血清型に特異的に反応する。このため、マルチプレックスＰＣＲで使用することで、４つの血清型を簡便に低コストで、かつ高感度に検出することができる。
【００４２】
なお、本実施の形態に係るプライマー対及びプローブの塩基配列は、上記で特定した塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよい。また、当該プライマー対及びプローブの塩基配列は、上記で特定した塩基配列と配列同一性が９０％以上である塩基配列であってもよい。さらに、当該プライマー対及びプローブの塩基配列は、上記で特定した塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。
【００４３】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について詳細に説明する。本実施の形態に係るデングウイルス検出用キットは、上記実施の形態１に係るプライマー対と、プローブとを備える。当該キットは、検出対象である１種の血清型に対するプライマー対及びプローブを備えてもよいし、複数種の血清型各々に対するプライマー対及びプローブを備えてもよい。
【００４４】
例えば、検出対象をＤＥＮＶ−２とする場合、当該キットは、表１に記載のＤＥＮ−２  ７８のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを備える。また、検出対象をＤＥＮＶ−３とする場合、当該キットは、表１に記載のＤＥＮ−３  ６２のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを備える。
【００４５】
より多くの株のＤＥＮＶを検出するために、当該キットは、１種の血清型に対して複数のプライマー対及びプローブのセットを備えてもよい。具体的には、検出対象をＤＥＮＶ−３とする場合、当該キットは、表１に記載のＤＥＮ−３  ６２のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブに加え、ＤＥＮ−３  １６のフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブを備える。
【００４６】
４つの血清型の同時に検出するために、当該キットは、４つの血清型各々に対するプライマー対及びプローブを備えてもよい。この場合、当該キットは、ＤＥＮＶ−１に対する表１に記載のＤＥＮ−１  ３６のプライマー対（第１のプライマー対）及びプローブ（第１のプローブ）と、ＤＥＮ−１  ｏｒｉのプライマー対（第２のプライマー対）及びプローブ（第２のプローブ）と、ＤＥＮＶ−２に対するＤＥＮ−２  ７８のプライマー対（第３のプライマー対）及びプローブ（第３のプローブ）と、ＤＥＮＶ−３に対するＤＥＮ−３  １６のプライマー対（第４のプライマー対）及びプローブ（第４のプローブ）と、ＤＥＮ−３  ６２のプライマー対（第５のプライマー対）及びプローブ（第５のプローブ）と、ＤＥＮＶ−４に対するＤＥＮ−４  ＪＲＣのプライマー対（第６のプライマー対）及びプローブ（第６のプローブ）と、を備えるのが好ましい。
【００４７】
４つの血清型の同時に検出するための上記キットでは、例えば、ＤＥＮ−１  ３６及びＤＥＮ−１  ｏｒｉプローブをＦＡＭで標識し、ＤＥＮ−２  ７８のプローブをＶＩＣで標識し、ＤＥＮ−３  １６及びＤＥＮ−３  ６２のプローブをＮＥＤで標識し、ＤＥＮ−４  ＪＲＣのプローブをＣｙ５で標識すればよい。
【００４８】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るデングウイルス検出用キットによれば、ＤＥＮＶが１００コピー／ｍＬ未満である試料においてもＤＥＮＶをより確実に検出できる。したがって、血液製剤の製造におけるＤＥＮＶのスクリーニングに使用すれば、血液製剤の安全性を担保できる。また、輸血用の血液の検査に当該検出キットを使用することで、輸血感染のリスクを低下させることができる。
【００４９】
また、本実施の形態に係るデングウイルス検出用キットでは、ＤＥＮＶ−１〜４に対するプローブ各々を異なる蛍光色素で標識してもよいこととした。これにより、マルチプレックスＰＣＲによる１チューブ（１反応系）での４つの血清型すべてのＤＥＮＶを効率よく低コストで検出することができる。
【００５０】
なお、上記検出キットは、各種制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類を備えていてもよい。また、当該検出キットは、ＤＥＮＶを検出するための使用方法が記載されたマニュアルをさらに備えてもよい。
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１：プライマー対のスクリーニング）
ＤＥＮＶ１〜４のゲノムの塩基配列に基づいて、各血清型につき、７０〜１１０セットのプライマー対を設計した。既知の各株のゲノムの塩基配列を比較することで、増幅産物の塩基配列内に変異の多い領域を含むプライマー対を除き、ＤＥＮＶ−１について５８セット、ＤＥＮＶ−２について２６セット、ＤＥＮＶ−３について２７セット、ＤＥＮＶ−４について３４セットを同定し、プライマー対を合成した。
【００５３】
なお、以下の実施例において、すべてのＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、標準プログラムで実施した。データの解析には、付属の解析ソフト（７５００  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．３）を用いた。
【００５４】
（ＲＮＡ抽出）
ＤＥＮＶを感染させたＶｅｒｏ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。培養上清１ｍｌを採取し、ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｖｉｒｕｓ／Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）の推奨条件に従い、ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの内、濃度既知の検体を、１０ｎｇ／μl  ＰｏｌｙＡ  ＲＮＡ溶液で希釈し、１０００コピー／ｍｌから１コピー／ｍｌの濃度となる段階希釈系列を作製した。使用したＤＥＮＶ−１〜４の株は、それぞれ０１−４４、０１−４６、００−４０及び０８−１１である。
【００５５】
（一次スクリーニング）
効率よく増幅するプライマー対を、２段階でスクリーニング評価した。インターカレーション法（ＳＹＢＲ（商標）  ｇｒｅｅｎ法）による一次スクリーニングでは、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いた。ＰＣＲの条件は、キットの推奨条件とした。検体のＲＮＡのコピー数は１×１０４コピー／ｍｌである。
【００５６】
（結果）
一次スクリーニングの結果、ＤＥＮＶ−１について１７セット、ＤＥＮＶ−２について１６セット、ＤＥＮＶ−３について１８セット、ＤＥＮＶ−４について１８セットが極めて効率よく核酸を増幅させた。当該プライマー対で増幅される領域の塩基配列に基づいて、プローブを合成した。一次スクリーニングで選択したプライマー対及び当該プローブを用いて、二次スクリーニングを行った。
【００５７】
（二次スクリーニング）
二次スクリーニングには、ハイブリダイゼーション法（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法）を採用した。スクリーニングでは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いた。ＰＣＲの条件は、キットの推奨条件とした。検体のＲＮＡのコピー数は１×１０４コピー／ｍｌである。
【００５８】
（結果）
二次スクリーニングにおいて、極めて効率よく核酸を増幅させたプライマー対及びプローブを、ＤＥＮＶ−１について３セット（表１のＤＥＮ−１  ３６、ＤＥＮ−１  ５１及びＤＥＮ−１  ８３）、ＤＥＮＶ−２について４セット（表１のＤＥＮ−２  ２４、ＤＥＮ−２  ４６、ＤＥＮ−２  ６５及びＤＥＮ−２  ７８）、ＤＥＮＶ−３について４セット（ＤＥＮ−３  ０４、ＤＥＮ−３  １６、ＤＥＮ−３  ４９及びＤＥＮ−３  ６２）、ＤＥＮＶ−４について４セット（ＤＥＮ−４  ０２、ＤＥＮ−４  ２７、ＤＥＮ−４  ５３及びＤＥＮ−４  ５９）を同定した。表２は、各プライマー対及びプローブに関する情報を示す。
【００５９】
【表２】
0006592697.tif 000003
【００６０】
表２において、フォワードプライマーの位置は、フォワードプライマーがハイブリダイズするＤＥＮＶのゲノムのｃＤＮＡ上の領域を示し、ｃＤＮＡの５’末端から数えて「スタート」の塩基から「エンド」の塩基までの領域を意味する。リバースプライマーの位置及びプローブの位置も同様である。「Ｃｔ」は、蛍光強度が検出閾値を超えた際のサイクル数を示し、「Ｃｔ１」及び「Ｃｔ２」は、それぞれ１回目と２回目の結果を示す。
【００６１】
本実施例に示すように、ＤＥＮＶ１〜４の各血清型について、極めて効率よく核酸を増幅し、検出することができるプライマー対及びプローブを同定することができた。
【００６２】
（実施例２：複数のウイルス株における検出感度）
実施例１で同定したプライマー対及びプローブの検出感度を種々のウイルス株について評価した。評価は、実施例１と同様にハイブリダイゼーション法で行った。検体のＲＮＡのコピー数は１×１０３〜１×１０５コピー／ｍｌである。なお、比較のため、ＤＥＮＶ−１及びＤＥＮＶ−４では、表１のＤＥＮ−１  ｏｒｉ及びＤＥＮ−４  ＪＲＣを用いた。ＤＥＮＶ−２及びＤＥＮＶ−３では、ＤＥＮ−２  ｏｒｉ及びＤＥＮ−３  ｏｒｉを用いた。ＤＥＮ−２  ｏｒｉで特定されるフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列は、それぞれ配列番号５２、５３及び５４に示す。ＤＥＮ−３  ｏｒｉで特定されるフォワードプライマー、リバースプライマー及びプローブの塩基配列は、それぞれ配列番号５５、５６及び５７に示す。
【００６３】
（結果）
表３、表４、表５及び表６は、それぞれＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−３及びＤＥＮＶ−４のウイルス株の検出結果を示す。表中の「○」は極めて効率よく増幅することを示す。また、「＋＋」は効率よく増幅すること、「＋」は遅れて増幅することを示す。「−」はタイター次第で増幅することを示し、「ＵＤ」は検出できなかったことを示す。
【００６４】
【表３】
0006592697.tif 000004
【００６５】
【表４】
0006592697.tif 000005
【００６６】
【表５】
0006592697.tif 000006
【００６７】
【表６】
0006592697.tif 000007
【００６８】
ＤＥＮＶ−１に関しては、ＤＥＮ−１  ｏｒｉが広いウイルス株を効率よく検出するうえで最適であることが示された（表３）。ＤＥＮＶ−２に関しては、ＤＥＮ−２  ７８が最適であることが示された（表４）。ＤＥＮＶ−３に関しては、ＤＥＮ−３  １６及びＤＥＮ−３  ６２の組み合わせが好ましいことが示された（表５）。ＤＥＮＶ−４に関しては、ＤＥＮ−４  ＪＲＣが最適であることが示された（表６）。
【００６９】
（実施例３：マルチプレックスＰＣＲによる４つの血清型の同時検出）
利便性の向上と低コストを実現するために、マルチプレックスＰＣＲを用いて、４つの血清型の１反応での検出を試みた。マルチプレックスＰＣＲには、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。使用したプライマーは、ＤＥＮ−１  ３６のプライマー対及びプローブと、ＤＥＮ−１  ｏｒｉのプライマー対及びプローブと、ＤＥＮ−２  ７８のプライマー対及びプローブと、ＤＥＮ−３  １６のプライマー対及びプローブと、ＤＥＮ−３  ６２のプライマー対及びプローブと、ＤＥＮ−４  ＪＲＣのプライマー対及びプローブと、である。
【００７０】
反応液における各プライマー濃度は、それぞれ２５０ｎＭとした。また、各プローブ濃度はそれぞれ２５０ｎＭとした。各プローブの蛍光標識については、ＤＥＮ−１  ３６及びＤＥＮ−１  ｏｒｉをＦＡＭで、ＤＥＮ−２  ７８をＶＩＣで、ＤＥＮ−３  １６及びＤＥＮ−３  ６２をＮＥＤで、ＤＥＮ−４  ＪＲＣをＣｙ５で標識した。その他の条件はキットに付属の推奨条件に従った。ＰＣＲのサイクリング条件は、５０℃で２０分、９５℃で１５分、続いて次のサイクル９４℃で４５秒→６０℃で４５秒を、４５サイクル繰り返した。検体のＲＮＡのコピー数は１×１０３〜１×１０５コピー／ｍｌである。
【００７１】
比較例として、米国疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ＣＤＣ）で開発された「ＤＥＮＶ−１−４  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ」を行った（以下、単に「ＣＤＣ法」とする）。ＣＤＣ法には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＲＯＸ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。反応液における各プライマー濃度は、ＤＥＮＶ−１が１０００ｎＭ、ＤＥＮＶ−２が５００ｎＭ、ＤＥＮＶ−３が１０００ｎＭ、ＤＥＮＶ−４が５００ｎＭとした。反応液における各プローブ濃度は、それぞれ１８０ｎＭであった。各プローブの蛍光標識については、ＤＥＮＶ−１をＦＡＭでＤＥＮＶ−２をＨＥＸで、ＤＥＮＶ−３をＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで、ＤＥＮＶ−４をＣｙ５で標識した。その他の条件はキットに付属の推奨条件に従った。サイクリング条件は、５０℃で３０分、９５℃で２分、続いて次のサイクル９５℃で１５秒→６０℃で１分を、４５サイクル繰り返した。
【００７２】
（結果）
ＤＥＮＶ−１の各種ウイルス株を標的とするＣＤＣ法及び実施例のマルチプレックスＰＣＲの増幅曲線を、それぞれ図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示す。表７は、図１（Ａ）及び図１（Ｂ）から求めた各ウイルス株におけるＣｔの平均と、ＣＤＣ法のＣｔの平均及び実施例のＣｔの平均の差ΔＣｔとを示す。Ｃｔが低いほど高感度を意味するため、ΔＣｔが正であることは、実施例のほうがＣＤＣ法より感度に優れることを示す。図１（Ｃ）は、各ウイルス株におけるΔＣｔを示す。実施例は、１２−９１  ＪＲＣ、１３−２１３ＪＲＣ及び１０−１０９においてはＣＤＣ法よりも感度が良好であった。
【００７３】
【表７】
0006592697.tif 000008
【００７４】
ＤＥＮＶ−２の各種ウイルス株を標的とするＣＤＣ法及び実施例のマルチプレックスＰＣＲの増幅曲線を、それぞれ図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示す。表８は、図２（Ａ）及び図２（Ｂ）から求めたＣｔの平均とΔＣｔとを示す。図２（Ｃ）に示すように、実施例は、すべてのウイルス株においてＣＤＣ法よりも感度が優れていた。
【００７５】
【表８】
0006592697.tif 000009
【００７６】
次に、ＤＥＮＶ−３の各種ウイルス株を標的とするＣＤＣ法及び実施例のマルチプレックスＰＣＲの増幅曲線を、それぞれ図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示す。表９は、図３（Ａ）及び図３（Ｂ）から求めたＣｔの平均とΔＣｔとを示す。図３（Ｃ）に示すように、実施例は、１３−３１及び１３−１９３の２種の除くウイルス株においてＣＤＣ法よりも感度が優れていた。
【００７７】
【表９】
0006592697.tif 000010
【００７８】
ＤＥＮＶ−４に関して、同様にＣＤＣ法及び実施例のマルチプレックスＰＣＲの増幅曲線を、それぞれ図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す。表１０は、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）から求めたＣｔの平均とΔＣｔとを示す。図４（Ｃ）に示すように、実施例は、１３−２４４  ＪＲＣ及び１２−１３３においてはＣＤＣ法よりも感度が良好であった。
【００７９】
【表１０】
0006592697.tif 000011
【００８０】
なお、本実施例に係るマルチプレックスＰＣＲで使用したプライマー対及びプローブは、異なる血清型の間での交差反応及び非特異的な反応は見られなかった。各プライマー対及びプローブのセットは、単独で使用した場合と、マルチプレックスで使用した場合とで、同等の検出感度を有していた。また、本実施例に係るマルチプレックスＰＣＲで使用したプライマー対及びプローブは、ＤＥＮＶ以外の病原体で、同属のフラビウイルス族由来の試料に対して反応を示さなかったため、特異性が高いと言える。
【００８１】
（実施例４：ウイルス添加検体を用いた検出感度の比較検討）
本実施例では、ＤＥＮＶのコピー数が段階希釈された検体を対象として、ＤＥＮＶを検出することで、検出感度をより詳細に評価した。使用したＤＥＮＶ−１〜４の株は、それぞれ０１−４４、０１−４６、００−４０及び０８−１１である。
【００８２】
まず、上記ＤＥＮＶ−１〜４の段階希釈系列それぞれ１ｍｌから、上記実施例１と同様にＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｖｉｒｕｓ／Ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したそれぞれのＲＮＡを鋳型として、上記実施例３と同様に、ＣＤＣ法及び上記マルチプレックスＰＣＲを行った。各検体を独立に８回測定し、明確なシグナルが確認された場合を陽性とした。
【００８３】
（結果）
表１１は、ＣＤＣ法での陽性の回数を示す。ＣＤＣ法では、ＤＥＮＶ−１において、いずれのコピー数でも８回すべてで検出できた。ＤＥＮＶ−２では、コピー数が１０の場合に４回検出できず、コピー数が１の場合は１回も検出できなかった。ＤＥＮＶ−３では、コピー数が１００の場合に２回検出できず、コピー数が１０及び１の場合は１回も検出できなかった。ＤＥＮＶ−４では、コピー数が１０及び１の場合は１回も検出できなかった。
【００８４】
【表１１】
0006592697.tif 000012
【００８５】
一方、表１２は、実施例のマルチプレックスＰＣＲでの陽性の回数を示す。ＤＥＮＶ−１において、いずれのコピー数でも８回検出できた。ＤＥＮＶ−２では、コピー数が１の場合でも、７回検出できた。ＤＥＮＶ−３では、コピー数が１００の場合に８回とも検出でき、コピー数が１０の場合においても７回検出できた。ＤＥＮＶ−４では、コピー数が１０及び１の場合は１回も検出できなかった。
【００８６】
【表１２】
0006592697.tif 000013
【００８７】
以上により、実施例のマルチプレックスＰＣＲは、ＤＥＮＶ−２、３に関しては、ＣＤＣ法を上回る検出感度を示した。ＤＥＮＶ−１、４における実施例のマルチプレックスＰＣＲの検出感度は、ＣＤＣ法と同等であった。
【００８８】
（実施例５：ウイルス添加血漿検体を用いた検出感度の比較検討）
本実施例では、ＤＥＮＶを血漿検体に添加し、当該血漿検体を対象とするＤＥＮＶの検出感度を評価した。
【００８９】
まず、ＤＥＮＶ−１〜４のウイルス量が既知の検体を、所定の濃度（１０００コピー／ｍｌ、１００コピー／ｍｌ及び１０コピー／ｍｌ）となるように、健常者由来の血漿へ添加した。続いて、上記ウイルス添加検体それぞれ１ｍｌから、上記実施例４と同様に、ＣＤＣ法及び上記マルチプレックスＰＣＲにて検討した。使用したＤＥＮＶ−１〜４の株は、それぞれ０１−４４、０１−４６、００−４０及び０８−１１である。
【００９０】
（結果）
表１３は、ＣＤＣ法での陽性の回数を示す。ＣＤＣ法では、ＤＥＮＶ−１において、いずれのコピー数でも８回検出できた。ＤＥＮＶ−２では、コピー数が１０００の場合に２回検出できず、コピー数が１００の場合は６回検出できなかった。ＤＥＮＶ−２のコピー数が１０の場合では、１回も検出できなかった。ＤＥＮＶ−３では、コピー数が１００の場合に６回検出できず、コピー数が１０の場合は１回も検出できなかった。ＤＥＮＶ−４では、コピー数が１０００の場合に１回のみ検出できず、コピー数が１００及び１０の場合は１回も検出できなかった。
【００９１】
【表１３】
0006592697.tif 000014
【００９２】
表１４は、実施例のマルチプレックスＰＣＲでの陽性の回数を示す。ＤＥＮＶ−１において、いずれのコピー数でも８回検出できた。ＤＥＮＶ−２では、コピー数が１０００及び１００のいずれにおいても、８回すべて検出できた。ＤＥＮＶ−２のコピー数が１０の場合では、１回も検出できなかった。ＤＥＮＶ−３では、コピー数が１０００及び１００の場合に８回とも検出できた。ＤＥＮＶ−４では、コピー数が１０００の場合に８回すべてで検出できた。
【００９３】
【表１４】
0006592697.tif 000015
【００９４】
様々な成分を含む血漿検体から抽出できるＲＮＡ量は、同じコピー数を含む検体であっても、血漿を添加しない上記実施例４の検体と比較して低下する。このため、血漿検体からのＤＥＮＶの検出は、より困難である。このような検出が困難な条件において、ＤＥＮＶ−２、３に関しては、ＣＤＣ法ではほとんど検出できないコピー数１００といったかなりの低コピー数であっても、本実施例のマルチプレックスＰＣＲは確実に検出することができた。実施例のマルチプレックスＰＣＲの検出感度は、ＤＥＮＶ−１ではＣＤＣ法と同等で、ＤＥＮＶ−４ではＣＤＣ法をコピー数１０００において上回った。
【図１】
0006592697.tif 000016
【図２】
0006592697.tif 000017
【図３】
0006592697.tif 000018
【図４】
0006592697.tif 000019
【配列表】
0006592697000001.app