(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を混合した水溶液を凍結乾燥した混合物を含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤である、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤であって、
前記緩衝溶液がクエン酸塩緩衝溶液又は酢酸塩緩衝溶液であり、
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート系非イオン界面活性剤又はポロキサマー系非イオン界面活性剤であり、
前記糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体、及びアルブミン−非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体液状製剤である、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤であって、
前記製剤は、水溶性無機塩を含まず、
前記糖アルコールは、２％（ｗ／ｖ）〜４．５％（ｗ／ｖ）の範囲で含まれ、
前記緩衝溶液が、クエン酸塩緩衝溶液、酢酸塩緩衝溶液、又はヒスチジン緩衝溶液であり、
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベート系非イオン界面活性剤又はポロキサマー系非イオン界面活性剤であり、
前記糖アルコールがマンニトール又はソルビトールである、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項３】
前記緩衝溶液のｐＨは、５．０〜６．０である、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項４】
前記糖アルコールは、水溶液の総体積に対して１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で含まれる、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項５】
前記糖アルコールは、水溶液の総体積に対して２．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の範囲で含まれる、請求項４に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項６】
前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０である、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項７】
前記非イオン性界面活性剤の濃度は、水溶液の総体積に対して０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項８】
前記アルブミン−非含有水溶液は、糖類、多価アルコール及びアミノ酸で構成される群から選択された一つ以上をさらに含有する、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項９】
前記アミノ酸は、ヒスチジンまたはグリシンである、請求項８に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１０】
前記ヒスチジンの濃度は、水溶液の総体積に対して１〜１０ｍＭである、請求項９に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１１】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の濃度は、水溶液の総体積に対して１０〜１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１２】
前記アルブミン−非含有水溶液は、さらに等張化剤を含む、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１３】
前記等張化剤は、塩化ナトリウムである、請求項１２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１４】
前記塩化ナトリウムの濃度は、水溶液の総体積に対して０〜２００ｍＭである、請求項１３に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１５】
前記凍結乾燥製剤の容器は、バイアル、デュアルチャンバーカートリッジまたはデュアルチャンバーシリンジの形態である、請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１６】
前記製剤は、塩化ナトリウムを含有しない、請求項２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１７】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体は、５．０ｍｇ／ｍＬ〜６０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤に含まれる、請求項２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１８】
前記製剤は、さらに保存剤を含む、請求項２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項１９】
前記ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、天然型ヒト成長ホルモンと同一なアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ由来のＦｃ領域である、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来した異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項２０に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が同一な起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、請求項２０に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項２０に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト非糖鎖化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項２０に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２５】
前記結合体は、ヒト成長ホルモン及び免疫グロブリンＦｃが非ペプチド性重合体をリンカーにして連結された形態であるか、または遺伝子組換え技術を用いて連結された形態である、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２６】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、及びそれらの組み合わせで構成された群から選択された、請求項２５に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２７】
前記製剤は、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療のためのものである、請求項１または２に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２８】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体は、ヒト成長ホルモン及び免疫グロブリンＦｃがポリエチレングリコールを介して連結された形態であり、
前記緩衝溶液は、５．０〜６．０のｐＨを有するクエン酸塩緩衝溶液又は酢酸塩緩衝溶液であり、
前記非イオン性界面活性剤は、水溶液の総体積に対して０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０であり、
前記糖アルコールは、水溶液の総体積に対して２．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）のマンニトールまたはソルビトールであり、
塩化ナトリウムを含む請求項１に記載の持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤。
【請求項２９】
生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥する段階を含む、請求項１の凍結乾燥製剤の製造方法。
【請求項３０】
請求項１の凍結乾燥製剤に含まれた、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を混合した水溶液を凍結乾燥した混合物に再構築溶液を添加する段階を含む、請求項１の凍結乾燥製剤を再構築する方法。
【請求項３１】
前記再構築溶液は、注射用水である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記再構築溶液は、さらに保存剤を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記保存剤は、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾールまたはフェノールである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法で再構築された製剤は、持続型ヒト成長ホルモン結合体を１０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１の凍結乾燥製剤及び再構築溶液を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤、具体的には、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤及び液状製剤、前記凍結乾燥製剤の製造方法、前記凍結乾燥製剤を再構築する方法及び前記凍結乾燥製剤並びに再構築溶液を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ、以下、「ｈＧＨ」として引用される）は、ヒトの下垂体から生成される１９１個のアミノ酸で構成された分子量約２２，０００のポリペプチドホルモンであり、主に小児における下垂体性小人症の治療に使用されている。従来は、ヒトの下垂体から抽出したｈＧＨが使用されたが、その量が制限され、治療を受けることができるヒトが極めて制限された。また、下垂体から抽出したｈＧＨを使用した患者の一部で致命的神経疾患であるクロイツフェルト・ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｃｏｂ）疾病が発生した例が報告され、このような下垂体から抽出したｈＧＨの使用は中止された。最近では、遺伝子工学技術が発展するにつれて大腸菌、酵母などからｈＧＨの生産に成功し、このような遺伝子工学の方法で生産された組換えｈＧＨ製剤は、毒性及び臨床試験を経て１９８５年以降に諸国で許可を得て市販されている。
【０００３】
ｈＧＨのようなポリペプチドは、一般に安定性が低いため、容易に変性され、血液中のタンパク質加水分解酵素により分解され、腎臓や肝臓を通じて容易に除去されるので、薬理成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質の薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、大部分注射剤の形で患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことは、患者に苦痛を引き起こすようになる。このような問題を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。
【０００４】
最近、活性減少の最小化と安定性の増加を同時に実現する持続性タンパク質薬物製剤として、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドを結合させて製造した結合体が特許文献１（生体内の持続性が増加した生理活性ポリペプチド結合体）、及び特許文献２（免疫グロブリン断片を用いたタンパク質結合体及びその製造方法）に開示された。前記方法で生理活性ポリペプチドとしてｈＧＨを適用させて持続型ｈＧＨ結合体を製造することができるが、持続型ｈＧＨ結合体が含まれた薬物を製品として供給するためには、貯蔵、輸送の過程で光、熱、または添加剤内の不純物により誘導された劣化による変性、凝集、吸着、または加水分解などの物理化学的な変化を抑制しつつ生体内の効力を維持させることが必須である。特に、持続型ｈＧＨ結合体は、ポリペプチド上のｈＧＨに比べて体積が大きくなり、分子量が増加し、ポリペプチド上のｈＧＨに比べ製剤として安定化するのに非常に困難である。
【０００５】
凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定のタンパク質製剤から水分を除去してタンパク質を保存する方法として用いられている。このような凍結乾燥は、水溶液や多量の水分を含有した材料を凍結させ、減圧することにより、氷を昇華させて水分を除去して乾燥物を得る方法である。そのような凍結−乾燥の過程でタンパク質の安定性を維持または増加させたり、貯蔵期間内に凍結乾燥された物質を安定化させるために、賦形剤を含む前−凍結乾燥製剤（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を使用することができる。しかし、このような凍結乾燥製剤の組成は、保存しようとするタンパク質の種類に応じて、その特性の違いにより、一つのタンパク質に適用される製剤の組成が、他のタンパク質の製剤には適用されない場合が頻繁である。具体的には、異なるタンパク質は、それらの化学的な違いのため、貯蔵及び凍結乾燥過程、再構築時に異なる比率及び異なる条件の下で非活性化され得る。即ち、安定化のために用いられる物質による安定性増大の効果は、異なるタンパク質に対して同等でなく、これにより、貯蔵及び凍結乾燥、再構築時の安定性を付与するために用いられる安定化剤は、目的タンパク質の物理化学的特性に応じて適切な比率、濃度及び種類が多様である。安定化剤を併用する場合は、相互間の競争作用及び副作用により目的とすることと異なる逆効果をもたらすことができ、凍結乾燥工程または貯蔵期間中にタンパク質の性質が変化したり、濃度が変化するため、異なる効果を示すことができる。したがって、タンパク質を安定化するためには、多くの努力と注意が必要である。
【０００６】
製剤の開発において、生体内持続性及び安定性を高めた持続型ｈＧＨ結合体の場合、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された形態であるため、分子量及び体積が一般的なヒト成長ホルモンと明確に異なり、タンパク質を安定化するための特別な組成が要求される。また、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域は、それぞれ物理化学的特性が異なるペプチドまたはタンパク質であるため、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化しなければならない。しかし、前述したように、異なるペプチドまたはタンパク質は、それらの物理化学的な違いにより、異なる比率及び異なる条件の下で漸進的に非活性化され得、それぞれのペプチドまたはタンパク質に適した安定化剤を併用する場合、相互間の競争作用及び副作用により目的としたことと異なる逆効果をもたらし得る。したがって、持続型ｈＧＨ結合体の場合、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化することができる安定化剤の組成を見出すことには多くの困難が伴う。また、凍結乾燥製剤の場合、再構築時、タンパク質の安定性及び活性を維持するために、多様な方法で凍結乾燥及び再構築の方法も調節される必要があり、このような方法は、製剤の組成及びタンパク質の種類に応じて変わり得る。
【０００７】
また、凍結乾燥製剤において高濃度のタンパク質を含む場合には、その濃度により凍結乾燥過程中にタンパク質が凝集する傾向があるだけでなく、取り扱いにも困難な点がある。したがって、従来は高濃度のタンパク質を凍結乾燥させ、これを再構築することにより得るのではなく、低濃度のタンパク質を含む製剤を凍結乾燥させ、これを再構築する場合、小さな体積に再構築することにより、高濃度のタンパク質を得たりした。ただし、このように小さな体積で再構築するようになる場合、これに含まれていたタンパク質だけでなく、他の構成成分も濃縮され、高張性（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃ）になって体内投与にすぐに適用するには適しないことがあり、高濃度のタンパク質自体を凍結乾燥させることができる製剤の開発が求められてきた。
【０００８】
最近、患者の便宜性を高めた繰り返し使用可能なタンパク質及びペプチド剤形が開発されている。しかし、この多回使用剤形は、反復投与後に捨てるまで微生物の汚染を防止するために、必ず保存剤が含まれなければならない。保存剤が含まれた多回使用剤形は、単回使用剤形に比べていくつかの利点がある。例えば、単回使用剤形の場合、投与量の違いにより浪費される薬物の量が多いが、多回使用剤形の場合、捨てられる製品の量を減らすことができる。さらに、一定の期間、微生物の成長の心配なく、数回使用することができ、一つの容器で提供することができ、包装を最小限に抑えることができ、経済的である。しかし、保存剤の使用が、タンパク質の安定性に影響を与えることができる。保存剤を使用する場合、最も多く知られた問題は、沈殿の形成である。タンパク質の沈殿は、薬物の効果を減少させ、体内投与時に予期しない免疫反応を引き起こすことがある。したがって、保存剤の微生物防止力を維持しながら、タンパク質の安定性に問題とならない濃度及び保存剤の選択が重要である。
【０００９】
一般に、溶液状態の製剤は、注射器の形で開発され、この時、最も一般的にプレフィルドシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）が使用され、これをさらに便利に助ける自動注射器（ａｕｔｏ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）も多く使用されている。その他、カートリッジ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を装着し、注射量を患者に合わせて調節し、自動的に注射できるペン型注射器（ｐｅｎ  ｉｎｊｅｃｔｏｒ）は、成長ホルモンとインスリンなどに主に用いられている。しかし、このような注射道具は、溶液状態の剤形を便利に投与することができるが、安定性が低いため、凍結乾燥しなければならない製品には、使用することができない。
【００１０】
また、凍結乾燥製品は、強化ガラスでできたバイアルに凍結乾燥された製剤と溶解のための溶媒でそれぞれ製造され、使用する前に直接混合して溶解させた後、注射器に充填して注射する製品の形態が一般的である。最近、患者の便宜性を考慮し、凍結乾燥バイアルの形態（例えば、強化ガラスバイアル）で単回用の充填注射器または反復使用が可能な充填注射器の形に変更及び改善される傾向にある。そのような凍結乾燥製剤の形態としては、ドイツのベッター（Ｖｅｔｔｅｒ）社のデュアルチャンバーカートリッジ（ｄｕａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０５６７９０２号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０７２５３１５号公報
【特許文献３】国際特許公開第９７／３４６３１号
【特許文献４】国際特許公開第９６／３２４７８号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ.Ｌ.Ｈｉｌｌ、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような背景の下、本発明者らは、持続型ヒト成長ホルモン結合体を凍結乾燥過程中に安定性を維持することができながら、ウイルス汚染の心配なく安定的に長期間保管することができる凍結乾燥製剤、及び持続型ヒト成長ホルモン結合体を安定に保管できる液状製剤を開発するために鋭意努力した結果、緩衝溶液、糖アルコール及び非イオン性界面活性剤を含む安定化剤を用いる場合、持続型ｈＧＨ結合体の安定性及び凍結乾燥の過程における安定性を増大させることにより、経済的で、かつ安定な凍結乾燥製剤を提供することができ、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０〜５８．５ｍｇ／ｍＬで安定性に優れた塩化ナトリウムを含まない液状製剤を提供することができることを確認した。また、本発明の凍結乾燥製剤は、保管及び持ち運び時に安定しているだけでなく、再構築したとき、皮下注射製剤として適合した浸透圧及び安定性を有する剤形であることを確認した。また、保存剤を含めても安定性を維持し、多回用製剤として使用することができることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの目的は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を混合した水溶液を凍結乾燥した混合物を含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤を提供することにある。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体、及びアルブミン−非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体液状製剤を提供することにある。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記製剤の製造方法を提供することにある。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、前記凍結乾燥製剤に含まれた、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥した混合物に再構築溶液を添加する段階を含む、前記凍結乾燥製剤を再構築する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤を含む、キットを提供することにある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る持続型ｈＧＨ結合体の製剤は、ヒト血清アルブミン及び人体に潜在的に有害な因子を含まないため、ウイルス感染の恐れがなく、ｈＧＨポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域の結合で構成され、天然型に比べて分子量が大きく、生理活性期間が増大した持続型ｈＧＨ結合体に対して安定性を提供する。特に、前記凍結乾燥製剤は、凍結乾燥過程だけでなく、再構築後も優れた安定性を提供し、保存剤を含めても安定し、多回投与用製剤としても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に使用された凍結乾燥の温度勾配過程を示したものである。
【図２】本発明に使用された凍結乾燥の温度勾配過程を示したものであり、１次乾燥を二区間で設定された温度勾配の過程を表示したものである。
【図３ａ】本発明に使用された強化ガラスバイアルを示したものである。
【図３ｂ】ベッター（Ｖｅｔｔｅｒ）社のデュアルチャンバーカートリッジ（ｄｕａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
前記の目的を達成するための、本発明の一つの態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤である。
【００２３】
一つの具体的な態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ｈＧＨ結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を混合した水溶液を凍結乾燥した混合物を含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤である。
【００２４】
一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記緩衝溶液は、酢酸塩、ヒスチジンまたはクエン酸塩緩衝溶液であることを特徴とする。
【００２５】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記緩衝溶液は、酢酸塩緩衝溶液であることを特徴とする。
【００２６】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記酢酸塩は、酢酸ナトリウムであり、クエン酸塩は、クエン酸ナトリウムであることを特徴とする。
【００２７】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記緩衝溶液のｐＨは５．０〜６．０であることを特徴とする。
【００２８】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記糖アルコールは、マンニトールまたはソルビトールであることを特徴とする。
【００２９】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記糖アルコールは、水溶液総体積に対して１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で含まれることを特徴とする。
【００３０】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記糖アルコールは、２．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の範囲で含まれることを特徴とする。
【００３１】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０であることを特徴とする。
【００３２】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記非イオン性界面活性剤は、水溶液の総体積に対して０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度であることを特徴とする。
【００３３】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記アルブミン−非含有水溶液は、糖類、多価アルコール及びアミノ酸で構成される群から選択された一つ以上をさらに含有することを特徴とする。
【００３４】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記アミノ酸はヒスチジンまたはグリシンであることを特徴とする。
【００３５】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記ヒスチジンの濃度は、１〜１０ｍＭであることを特徴とする。
【００３６】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記持続型ｈＧＨ結合体は、１０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度であることを特徴とする。
【００３７】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記アルブミン−非含有水溶液は、さらに等張化剤を含むことを特徴とする。
【００３８】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記等張化剤は塩化ナトリウムであることを特徴とする。
【００３９】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤において、前記塩化ナトリウムは、０〜２００ｍＭであることを特徴とする。
【００４０】
もう一つの具体例として、前記凍結乾燥製剤の容器は、バイアル、デュアルチャンバーカートリッジまたはデュアルチャンバーシリンジの形態であることを特徴とする。
【００４１】
他の具体的な態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体、及びアルブミン−非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体の液状製剤である。
【００４２】
一つの具体例として、前記液状製剤は、等張化剤を含有しないことを特徴とする。
【００４３】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記緩衝溶液は、クエン酸塩、酢酸塩またはヒスチジン緩衝溶液であることを特徴とする。
【００４４】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記糖アルコールは、マンニトールまたはソルビトールであることを特徴とする。
【００４５】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記糖アルコールは、２％（ｗ／ｖ）〜４．５％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤に含まれることを特徴とする。
【００４６】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記糖アルコールは、４％（ｗ／ｖ）の濃度で製剤に含まれることを特徴とする。
【００４７】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記緩衝溶液のｐＨは、５．０〜６．０であることを特徴とする。
【００４８】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記緩衝溶液のｐＨは、５．２であることを特徴とする。
【００４９】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０であることを特徴とする。
【００５０】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記非イオン性界面活性剤は、製剤の総体積に対して０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度であることを特徴とする。
【００５１】
もう一つの具体例として、前記液状製剤において、前記持続型ｈＧＨ結合体は、５．０ｍｇ／ｍＬ〜６０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤に含まれることを特徴とする。
【００５２】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、天然型ｈＧＨと同一なアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００５３】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ由来のＦｃ領域であることを特徴とする。
【００５４】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【００５５】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一な起源のドメインからなる短鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体であることを特徴とする。
【００５６】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【００５７】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【００５８】
もう一つの具体例として、前記製剤において、前記結合体は、ヒト成長ホルモン及び免疫グロブリンＦｃが非ペプチド性重合体をリンカーにして連結された形態であるか、または遺伝子組換え技術を用いて連結された形態であることを特徴とする。
【００５９】
もう一つの具体例として、前記製剤に含まれる結合体の非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸、及びそれらの組み合わせで構成された群から選択されたことを特徴とする。
【００６０】
もう一つの具体例として、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【００６１】
もう一つの具体例として、前記製剤は、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療のためであることを特徴とする。
【００６２】
本発明の別の態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、酢酸緩衝溶液、ポリソルベート８０、及びマンニトールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥した混合物を含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤である。
【００６３】
本発明のもう一つの態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体、及びクエン酸塩緩衝溶液、ポリソルベート８０及びマンニトールを含むアルブミン−非含有安定化剤を含有し、前記安定化剤は、等張化剤を含まないことを特徴とする、持続型ヒト成長ホルモン結合体の液状製剤である。
【００６４】
本発明のもう一つの態様は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥する段階を含む、前記凍結乾燥製剤の製造方法である。
【００６５】
本発明のもう一つの態様は、前記凍結乾燥製剤に含まれた、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥した混合物に再構築溶液を添加する段階を含む、前記凍結乾燥製剤を再構築する方法である。
【００６６】
一つの具体例として、前記再構築溶液は注射用水であることを特徴とする。
【００６７】
他の具体例として、前記再構築溶液は、さらに保存剤を含むことを特徴とする。
【００６８】
もう一つの具体例として、前記保存剤は、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾールまたはフェノールであることを特徴とする。
【００６９】
もう一つの具体例として、前記方法で再構築された製剤は、持続型ｈＧＨ結合体を１０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含むことを特徴とする。
【００７０】
本発明のもう一つの態様は、前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤を含む、キットである。
【００７１】
本発明は、一つの様態として生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（Ｈｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する、持続型ヒト成長ホルモン結合体製剤を提供する。
【００７２】
本発明において、用語、「持続型ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ｈＧＨ）結合体」は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態のタンパク質であり、天然型ヒト成長ホルモンに比べて生理活性持続期間が増加された特徴を有する結合体を意味する。本発明において、用語、「持続型」とは、生理活性期間が天然型ヒト成長ホルモンに比べて増大されたことを意味し、「結合体」とは、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された形態を意味する。
【００７３】
前記製剤は、具体的には、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥した混合物を含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤であってもよい。
【００７４】
本発明において、用語、「持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」とは、持続型ｈＧＨ結合体を含む凍結乾燥製剤を意味する。これは、持続型ｈＧＨ結合体と、これを安定化させるための賦形剤などの物質を共に凍結乾燥させ、固体状態で存在する物質を含む形態をいう。本発明において、凍結乾燥製剤は、凍結乾燥物質自体を含む概念である。前記凍結乾燥物質は、凍結乾燥ケーキ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｃａｋｅ）とも呼ぶことができる。
【００７５】
前記凍結乾燥製剤は、持続型ｈＧＨ結合体を安定化させるための賦形剤を含む予備−凍結乾燥製剤（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と持続型ｈＧＨ結合体の両方が含まれた予備製剤形態において、水分を昇華させる凍結乾燥過程を経て製造される。本発明において、前記持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤は、治療学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体を含むことができ、ｈＧＨは治療学的有効量で単回用容器（ｓｉｎｇｌｅ−ｕｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）または多回用容器（ｍｕｌｔｉ−ｕｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）に含有され得るが、これに制限されない。
【００７６】
前記凍結乾燥製剤は、バイアル（例えば、強化ガラスバイアル）、デュアルチャンバーカートリッジまたはデュアルチャンバーシリンジの形態の容器に含有されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００７７】
本発明の凍結乾燥製剤は、持続型ｈＧＨ結合体を凍結乾燥過程で安定化させる組成を有し、これを保管した後、再構築する場合にも製剤の安定性を維持させる効果を示す。特に、本発明の凍結乾燥製剤は、１０  ｍｇ／ｍＬの〜１００  ｍｇ／ｍＬの高濃度の持続型ｈＧＨ結合体を含めても安定性を付与する効果を有する。
【００７８】
また、前記持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤は、容器に保管され、個体に投与が必要な場合などにおいて再構築することができる。
【００７９】
本発明において、用語、「再構築」とは、固体状態の前記凍結乾燥物質を液状化してｈＧＨ結合体を投与可能にすることを意味する。この時、本発明の凍結乾燥製剤に含まれる持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、再構築時に１  ｍｇ／ｍＬの〜１５０  ｍｇ／ｍＬの、好ましくは１０  ｍｇ／ｍＬの〜１２０  ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０  ｍｇ／ｍＬ〜１００  ｍｇ／ｍＬであるが、これに制限されない。
【００８０】
前記再構築は、凍結乾燥物質を含むバイアルに溶解するための溶媒を混合して溶解させる方法で行われるか、または単回用充填注射器または反復使用が可能な充填注射器の形で凍結乾燥物質に溶媒を加えて溶解させる方法で行われ得るが、特にこれに制限されるものではない。
【００８１】
本発明の前記持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤は、従来の液状製剤に比べてｈＧＨ結合体を安定的に保存する利点があり、有効な結合体の濃度を調節できる特徴を有する。一方、凍結乾燥の過程で予備製剤の濃度と再構築した後の濃度は、同一または異なってもよいが、これに制限されない。
【００８２】
このような本発明の凍結乾燥製剤は、持続型ｈＧＨ結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥した混合物を含むことを特徴とする。
【００８３】
本発明において、用語、「アルブミン−非含有水溶液」とは、持続型ｈＧＨ結合体が安定して保存され、凍結乾燥過程及び再構築時に安定性を維持できるようにする物質を意味する。特に、前記アルブミン−非含有水溶液は、持続型ｈＧＨ結合体及びこれを安定化させる賦形剤を含み、凍結乾燥過程の中で、持続型ｈＧＨ結合体の安定性を付与し、保管安定性を有する凍結乾燥製剤を製造可能にする水溶液を意味する。前記水溶液は緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤を含有することが望ましい。または浸透圧の調整のために等張化剤を追加することができる。持続型ｈＧＨ結合体のようなタンパク質において、保存安定性は、正確な投与量を保障するためだけでなく、持続型ｈＧＨ結合体に対する抗原性の形態の物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。また、前記アルブミン−非含有水溶液は、本発明における「予備製剤」と併用することができる。
【００８４】
凍結乾燥製剤に添加される再構築溶液の体積調節に応じて、持続型ｈＧＨ結合体の濃度を調節することができるため、前記アルブミン−非含有水溶液で持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、特に制限されるものではない。しかし、本発明の製剤は、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度持続型ｈＧＨ結合体を含むアルブミン−非含有水溶液も安定的に凍結乾燥することができ、製造された凍結乾燥製剤を３分以内に迅速に溶解させることができるだけでなく、再構築した溶液の持続型ｈＧＨ結合体も安定性を維持させることができるという利点を有する。
【００８５】
また、前記水溶液は、ヒト血清アルブミンを含まないことを特徴とする。タンパク質の安定化剤として用いられるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるため、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染の可能性が存在し、ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、または一部の患者の場合には、アレルギー反応を誘発する可能性がある。本発明のアルブミン−非含有安定化剤は、ヒトまたは動物由来の血清アルブミンまたは精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないため、ウイルス感染の恐れがない。
【００８６】
本発明において、用語、「緩衝溶液」とは、本発明のアルブミン−非含有水溶液に含まれ、持続型ｈＧＨ結合体が安定になるように凍結乾燥過程または再構築後に製剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持させる役割をする溶液を意味する。前記緩衝溶液は、アルカリ塩（ナトリウムまたはカリウムリン酸塩またはそれらの水素または二水素塩）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム／クエン酸）、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム／酢酸）、ヒスチジンを初めとして当業界に公知となった任意の他の製薬上許容可能なｐＨ緩衝剤を含むことができ、それら緩衝剤の混合物も使用することができるが、好ましくは、酢酸塩緩衝溶液、ヒスチジン緩衝溶液またはクエン酸塩緩衝溶液であり、さらに好ましくは酢酸塩緩衝溶液、またはクエン酸塩緩衝溶液であるが、これに制限されない。
【００８７】
前記緩衝溶液を構成するクエン酸塩または酢酸塩の濃度は、好ましくは５  ｍＭ〜１００  ｍＭであり、さらに好ましくは１０  ｍＭ〜５０  ｍＭであるが、これに制限されない。前記緩衝溶液のｐＨは、好ましくは４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．０であり、さらに好ましくは５．２〜６．０であるが、これに制限されない。
【００８８】
本発明において、用語、「糖アルコール」とは、本発明の凍結乾燥製剤に含まれ、凍結乾燥の過程で持続型ｈＧＨ結合体のタンパク質を保護し、再構築の後にも安定性を増大させる役割をする水素化炭水化物（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）を意味する。本発明で使用される糖アルコールの濃度は、好ましくは、全体の溶液に比べ１％〜１０％（ｗ／ｖ）であるが、これに制限されない。前記糖アルコールの濃度は、具体的には、２．５〜５％（ｗ／ｖ）であってもよく、前記糖アルコールの濃度が前記範囲である場合、予備製剤と同一な体積の再構築溶液で再構築したとき、等張液の範囲の浸透圧を有してもよいが、これに制限されるものではない。
【００８９】
また、本発明において、前記糖アルコールは、特にこれに制限されないが、マンニトール、及びソルビトールからなる群から選択された一つ以上を使用することができ、好ましくはマンニトールが使用することができる。マンニトールのような糖アルコールは、本発明の組成物に含まれ、浸透圧の調節に関与することができる。本発明の凍結乾燥製剤を再構築した製剤は、好ましくは、等張性（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）であるが、高張性または低張性製剤も本発明に適する。
【００９０】
本発明において、用語、「非イオン性界面活性剤」とは、タンパク質溶液の表面張力を下げて再構築した後、疎水性表面にタンパク質が吸着されたり凝集することを防止する物質を意味する。本発明に使用可能な非イオン界面活性剤の好ましい例としては、ポリソルベート系非イオン界面活性剤及びポロキサマー系非イオン界面活性剤などを挙げることができ、これらが一つまたは二つ以上の組み合わせの形で使用することができ、その中でもポリソルベート系非イオン界面活性剤がより好ましい。ポリソルベート系非イオン界面活性剤の例としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０などがあり、その中でもポリソルベート８０が好ましいが、これに制限されない。また、前記非イオン界面活性剤を製剤に高濃度で使用することは適切でない可能性があるが、高濃度の非イオン界面活性剤は、ＵＶ−分光法や同焦点法のような分析法でタンパク質の濃度測定や安定性を評価するときに干渉効果を誘発し、タンパク質の安定性を正確に評価することは困難なことがあるためである。したがって、本発明の凍結乾燥製剤は、前記非イオン界面活性剤が好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下の低濃度、より好ましくは０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００１％〜０．０５％（ｗ／ｖ）で含むことができるが、これに制限されない。
【００９１】
また、前記アルブミン−非含有水溶液は、さらに糖類、多価アルコール及びアミノ酸で構成される群から選択された一つ以上をさらに含有することができる。本発明の一具体例では、代表的なアミノ酸としてヒスチジンをさらに含む場合、溶解速度を改善させることができ、再構築時に泡の生成なしに再構築することができることを確認した。
【００９２】
持続型ｈＧＨ結合体の安定性を増大させるために、さらに含まれてもよい糖類及び多価アルコール中の糖類の好ましい例としては、マンノース、グルコース、フコース及びキシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類などが挙げられ、多価アルコールの好ましい例としては、プロピレングリコール及び低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどを挙げることができ、それらの一つまたは二つ以上の組み合わせの形で使用することができる。また、前記アミノ酸の例としては、ヒスチジンまたはグリシンがあるが、これに制限されない。ここで、前記ヒスチジンなどは、水溶液中に１〜１０ｍＭの濃度で存在することができるが、これに制限されない。
【００９３】
また、前記アルブミン−非含有水溶液は、さらに浸透圧の調節のために等張化剤を含むことができる。
【００９４】
本発明において、用語、「等張化剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体を再構築した後、体内に投与したときに、浸透圧を適切に維持する役割をする物質を意味する。また、前記等張化剤は、持続型ｈＧＨ結合体を溶液上で、さらに安定化させる付随的な効果も示すことができる。そのような等張化剤の代表的な例としては、水溶性無機塩を挙げることができ、好ましい例としては、塩化ナトリウムが挙げられるが、これに制限されない。本発明で使用される塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは０ｍＭ〜２００ｍＭであるが、これに限定されず、製剤に含まれた成分は、種類及び量に応じて、それぞれの混合物が含まれた溶液製剤が等張液になるように、適切な量で調節することができる。
【００９５】
このようなアルブミン−非含有水溶液は１／２倍、１／４倍、またはそれ以上に希釈された形で凍結乾燥することができる。本発明の一具体例では、アルブミン−非含有水溶液を１／２倍、１／４倍に希釈して凍結乾燥する場合、溶解時間を短縮することができることを確認した（試験例１−（５））。
【００９６】
このような凍結乾燥された混合物を含む本発明の凍結乾燥製剤は、溶解時間が優れた利点を有する。具体的には、凍結乾燥物質において重要な特性の一つは、溶解時間であるが、これは、溶解時間が長くなるほど、より一層濃縮された溶液にタンパク質が長くさらされながら、製品の品質が悪化するためであり、また、完全に溶解されていない製品は、個体に投与することができないため、短い溶解時間は、患者及び医師の両方に便利さを提供することができる。しかし、タンパク質の濃度が増加するほど、そのような溶解時間も増加するようになる。したがって、溶解時間を短縮させるための組成物を開発することも高濃度の凍結乾燥された製剤の製造において重要な問題になることができる。
【００９７】
本発明の一具体例によると、１０ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度の持続型ｈＧＨ結合体を含む本発明の凍結乾燥製剤の場合にも、最小１０秒、最大３分以内に溶解される結果を示した。
【００９８】
また、特にこれに制限されないが、凍結乾燥された製品において、目的とする服用量（ｄｏｓａｇｅ）は、標的タンパク質を所望の濃度で凍結乾燥し、これを再び予備−製剤の体積で再構成して得ることができる。また、予備−製剤を希釈して体積を増加させて凍結乾燥し、再構成時には、凍結乾燥当時の体積に比べて小さい体積の再構築溶液で希釈することもできる。ただし、予備−製剤を過度に希釈する場合には、凍結乾燥サイクルが長くなることがあり（特に、１次乾燥時間）、生産コストが増加することができる。したがって、本発明の製剤は、過度な希釈なしにも高濃度の持続型ｈＧＨ結合体を凍結乾燥することができるため、前記のようなコスト的利点も有することができる。
【００９９】
また、本発明の凍結乾燥製剤は、前記説明した緩衝溶液、等張化剤、糖アルコール、及び非イオン界面活性剤、または再構築溶液の保存剤の以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で当業界に公知となっているその他の成分乃至物質が選択的に、さらに含まれることができる。
【０１００】
本発明の一具体例では、持続型ｈＧＨ結合体、緩衝溶液、糖アルコール及び界面活性剤を含むアルブミン−非含有水溶液を予備剤形に凍結乾燥製剤を製造し、その安定性及び溶解速度を確認した。具体的には、ｐＨ  ５．２またはｐＨ  ５．６の２０ｍＭのクエン酸緩衝溶液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５％のマンニトール及び０．００５％のポリソルベート８０で構成された前−凍結乾燥製剤に１９．５ｍｇ／ｍＬ及び７８．０ｍｇ／ｍＬの濃度の持続型ｈＧＨ結合体を凍結乾燥し、蒸留水を用いて再構築した。その結果、前記濃度で安定性を付与し、特に７８．０ｍｇ／ｍＬの高濃度で安定性がさらに高い結果を示した。また、ｐＨ  ５．２及び５．６の両方で安定性を示す結果を示した（試験例１−（１））。また、ｐＨ  ５．２またはｐＨ  ５．６の２０ｍＭのクエン酸緩衝溶液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のマンニトール及び０．００５％のポリソルベート８０で構成された前−凍結乾燥製剤及びｐＨ  ５．６の２０ｍＭの酢酸緩衝溶液、４％のマンニトール及び０．００５％のポリソルベート８０で構成された前−凍結乾燥製剤の持続型ｈＧＨ結合体を溶解させた予備製剤に凍結乾燥した製剤に保存剤としてｍ−クレゾール、ベンジルアルコールまたはフェノールを含む再構築溶液を使用して再構築したとき、安定性が維持される結果を示した。そのような結果から、保存剤を含む再構築溶液に凍結乾燥物質を再構築し、活性が保存された再構築された製剤を製造することができることを確認した。特に、酢酸塩水溶液を使用する場合は、保存剤を含む再構築溶液で再構築した溶液の場合にも、沈殿が発生せず、安定性に優れた結果を示した（試験例１−（２））。また、１９．５ｍｇ／ｍＬ、３９．０ｍｇ／ｍＬ、５８．５ｍｇ／ｍＬまたは７０．０ｍｇ／ｍＬの結合体の濃度では、結合体の濃度の増加に応じて製造された凍結乾燥製剤の溶解時間が増加することを確認した（試験例１−（３））。また、前記アルブミン−非含有水溶液に含まれる持続型ｈＧＨ結合体の安定化剤において、塩を含まない場合でも、溶解時間及び安定度の両方が優れ、マンニトールの濃度を増加させるほど、溶解速度を増加させることができることを確認した。または、ヒスチジンを添加する場合、マンニトールの濃度を増加させなくても、溶解速度を短縮させることができることを示した（試験例１−（４））。また、予備製剤を希釈し、密度を低くする場合は、溶解速度がより改善されることを確認し（試験例１−（５））、凍結乾燥物質が完全に乾燥することができる最適な乾燥条件を設定した（試験例１−（６））。また、マンニトールの有無が溶解時間に影響を大きく与えることを確認し（試験例１−（７））、マンニトールの濃度が４〜４．５％であるとき、５８．５ｍｇ／ｍＬの高濃度持続型ｈＧＨ結合体であっても、溶解時間が３０秒以内でありながらも等張液の浸透圧を示す結果を見せた（試験例１−（８））。また、このように製造された凍結乾燥製剤が４℃及び２５℃の温度の両方で６ヶ月間保管しても安定性をほぼ同一に維持する結果を示し、再構築した物質を２週間２５℃で保管しても安定性を維持する結果を示した（試験例１−（９））。
【０１０１】
具体的には、前記製剤は、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体、及びアルブミン−非含有安定化剤を含み、前記安定化剤は、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有する持続型ヒト成長ホルモン結合体の液状製剤であってもよい。
【０１０２】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体については、先に説明した通りであり、詳細については後述する。
【０１０３】
本発明において、用語、「持続型ｈＧＨ結合体液状製剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体を含む液状製剤を意味する。前記液状製剤は、液状の内容製剤及び外用製剤の両方を含む概念である。本発明において、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、治療学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体を含むことができ、一般に、ｈＧＨの治療学的有効量は、１回用バイアル（ｓｉｎｇｌｅ−ｕｓｅ  ｖｉａｌ）内に約１〜３  ｍｇ程度が含有された量であるが、これに制限されない。
【０１０４】
また、本発明の液状製剤に含まれる持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、５．０〜６０．０ｍｇ／ｍＬであることが好ましいが、これに制限されない。
【０１０５】
本発明の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、薬理学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体、及びアルブミン−非含有安定化剤を含む。
【０１０６】
本発明において、用語、「安定化剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体が安定して貯蔵できるようにする物質を意味する。前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤を含有することが望ましい。持続型ｈＧＨ結合体のようなタンパク質において、保存安定性は、正確な投与量を確保するためだけでなく、持続型ｈＧＨ結合体の抗原性の形態の物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。
【０１０７】
本発明において、用語、「緩衝溶液」とは、本発明の安定化剤に含まれ、持続型ｈＧＨ結合体が安定になるように溶液製剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持させる役割をする溶液を意味する。前記凍結乾燥製剤で前述された緩衝溶液の具体的な内容は、ここでも適用される。
【０１０８】
前記緩衝溶液は、クエン酸塩、酢酸塩、またはヒスチジン緩衝溶液であってもよく、好ましくは、クエン酸塩緩衝溶液であるが、これに制限されない。前記緩衝溶液を構成する塩の濃度は、具体的には５  ｍＭ〜１００  ｍＭであり、より具体的には１０  ｍＭ〜５０  ｍＭであるが、これに制限されない。前記緩衝溶液のｐＨは、具体的には４．０〜７．０、より具体的には５．０〜６．０であり、さらに具体的には５．２〜６．０であり、最も具体的には５．２であるが、これに制限されない。
【０１０９】
本発明において、用語、「糖アルコール」とは、本発明の液状製剤に含まれ、持続型ｈＧＨ結合体の安定性を増大させる役割をする水素化炭水化物（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）を意味する。本発明に使用される糖アルコールの濃度は、好ましくは、製剤の総体積に対して１〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは２〜４．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは４％（ｗ／ｖ）であるが、これに制限されない。本発明では、前記糖アルコールは、特にこれに制限されないが、マンニトール、及びソルビトールからなる群から選択された一つ以上を使用することができ、好ましくはマンニトールを使用することができる。
【０１１０】
本発明において、用語、「非イオン界面活性剤」とは、タンパク質溶液の表面張力を下げて疎水性表面にタンパク質が吸着されたり凝集することを防止する物質を意味する。本発明に使用可能な非イオン界面活性剤の例としては、先に記述した通りである。
【０１１１】
また、本発明の製剤は、等張化剤を含有しないものであってもよい。
【０１１２】
前記等張化剤については、先に説明した通りである。
【０１１３】
本発明の一具体例によると、緩衝溶液としてｐＨ  ５．２である酢酸塩またはクエン酸塩水溶液を含む製剤であり、等張化剤を含有しないながら、マンニトールを４％（ｗ／ｖ）で含有する場合、安定性に優れた結果を示した。特に、ｐＨ  ５．２であるクエン酸塩水溶液を緩衝溶液として含み、等張化剤を含有しないながら、マンニトールを４％（ｗ／ｖ）で含有する製剤の場合、持続型ｈＧＨ結合体が１０．０ｍｇ／ｍＬである濃度で最も高い安定性をもたらした。
【０１１４】
持続型ｈＧＨ結合体の保存安定性を増大させるためにさらに含まれてもよい糖類及び多価アルコールの糖類については、先に記述した種類が適用される。また、本発明の液状製剤には、前記説明した緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン界面活性剤以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で当業界に公知となっているその他の成分から物質が選択的にさらに含まれてもよい。
【０１１５】
特に、本発明の液状製剤は、保存剤をさらに含むことができる。
【０１１６】
本発明の具体例では、等張化剤を含まない持続型ｈＧＨ結合体製剤の場合、ｐＨ  ５．２である緩衝溶液の条件で４％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含む場合、持続型ｈＧＨ結合体が最も安定な結果を示した。特に、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬであるとき、クエン酸塩緩衝溶液、酢酸塩緩衝溶液及びヒスチジン緩衝溶液を使用して比較したとき、安定性が最も優れた結果を示した（試験例２）。
【０１１７】
本発明の前記製剤は、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療のためのものであってもよく、再構築され、前記疾患の治療のために個体内に投与することができる。
【０１１８】
以下では、本発明の凍結乾燥製剤または液状製剤の安定化対象である持続型ヒト成長ホルモン結合体についてより詳しく説明する。
【０１１９】
本発明において、用語、「ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）」とは、ヒトの成長、細胞生殖（ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）及び再生を促進することができるペプチドホルモンを意味する。前記ｈＧＨ配列などの情報は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができ、ｈＧＨの活性を示す限り、天然型ヒト成長ホルモンの配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質も、本発明の範囲に含まれる。また、生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲で、アミノ酸の置換、除去、挿入による変異体も本発明の範囲に含まれる。
【０１２０】
また、本発明において有用なｈＧＨは、天然型ｈＧＨ、その変異体、その誘導体、またはそのような断片の配列であってもよい。
【０１２１】
本発明において、用語、「ｈＧＨ変異体」とは、天然型ｈＧＨとアミノ酸配列が一つ以上異なるペプチドであり、ｈＧＨの活性を示すことを意味する。前記ｈＧＨ変異体は、天然型ｈＧＨにおいて一部のアミノ酸が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、削除（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及び修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のいずれか一つの方法またはそれらの方法の組み合わせにより製造してもよい。
【０１２２】
本発明において、用語、「ｈＧＨ誘導体」とは、天然型ｈＧＨと比較するとき、少なくとも８０％以上のアミノ酸配列で相同性を示し、ｈＧＨの活性を示し、アミノ酸残基の一部のグループが、化学的に置換（例えば、ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、  ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）、削除（例えば、ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）または修飾（例えば、Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）された形態を意味する。
【０１２３】
本発明において、用語、「ｈＧＨ断片」とは、ｈＧＨのアミノ末端またはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が追加または削除された形態であり、ｈＧＨの活性を保有するペプチドを意味し、追加されたアミノ酸は、天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）も可能であり得る。
【０１２４】
また、本発明に使用されるｈＧＨは、天然または組換え起源の任意の方法で製造されたものすべて可能であり、好ましくは、大腸菌を宿主細胞として用いて製造した組換えｈＧＨであるが、これに制限されない。
【０１２５】
本発明において、用語、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた免疫グロブリンの一部分を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分であってもよく、前記重鎖不変領域にヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部分を含むことができるが、これに制限されない。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等または改善された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除いて、一部または全体の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に該当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。即ち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１つまたは２つの以上のドメインと免疫グロブリンのヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよいが、これに制限されない。
【０１２６】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（ｍｕｔａｎｔ）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはそれらの組み合わせにより異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合、結合に重要であると知られた２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基を変形のために適当な部位として利用することができる。
【０１２７】
また、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されるか、または天然型ＦｃからＮ−末端の一部のアミノ酸が除去されるか、または天然型ＦｃのＮ−末端にメチオニン残基が付加されることもできるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能をなくすために補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されることもでき、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されることもできる。そのような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献３、特許文献４などに開示されている。
【０１２８】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている（非特許文献１）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリレート化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）及びアミル化（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）などで修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）することもできる。前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一な生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどの構造的安定性を増大させた誘導体である。
【０１２９】
また、そのようなＦｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、またはモルモットピックなどの動物の生体内から分離した天然型から得られることもでき、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換えまたはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、ＦａｂとＦｃで切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ′ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などを用いてＦｃまたはｐＦ′ｃを分離することができる。好ましくは、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え免疫グロブリンＦｃ領域である。
【０１３０】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。そのような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を利用した遺伝子工学的方法のような通常の方法を用いることができる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により合致する形は、糖鎖が除去されたり非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言える。
【０１３１】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはそのような組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）またはそのような混成（ｈｙｂｒｉｄ）によるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、ヒト血液中の最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることと公知となったＩｇＧ由来である。免疫グロブリンＦｃは、天然のＩｇＧを、特定のタンパク質分解酵素で処理して製造してもよく、組換え技術を用いて形質転換された細胞からも製造してもよい。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉで製造した組換えヒト免疫グロブリンＦｃである。
【０１３２】
一方、本発明において「組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成する際に、同一な起源短鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＤ  Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【０１３３】
本発明において、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」とは、短鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。即ち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＥ  Ｆｃ及びＩｇＤ  ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなるグループから１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【０１３４】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、そのような組み合わせ、またはそのような混成化も可能である。好ましくは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も好ましくは補体依存毒性（ＣＤＣ、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などのエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。即ち、最も望ましい本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非−糖鎖化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体で抗原として作用し、これに対する新たな抗体を生成するなどの望ましくない免疫反応を引き起こす可能性がある非−ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【０１３５】
本発明の持続型ｈＧＨ結合体は、天然または組換え起源の任意の方法で製造されたｈＧＨと、天然ＩｇＧを、特定のタンパク質分解酵素で処理したり、遺伝子組換え技術を用い、形質転換細胞から製造した免疫グロブリンＦｃ領域を互いに結合させることにより製造してもよい。
【０１３６】
この時に使用される結合方法として、ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体を用いて架橋結合させたり、遺伝子組換え技術を用いてｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態の融合タンパク質として製造してもよい。すなわち、前記結合体は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃが非ペプチド性リンカーを介して連結された形態で製造するか、またはｈＧＨ及び免疫グロブリンＦｃの融合タンパク質の形態で製造してもよい。前記融合タンパク質は、ｈＧＨ及び免疫グロブリンＦｃがペプチド性リンカーを介して連結された形態を含むが、これに制限されない。
【０１３７】
本発明において、用語、「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性重合体を意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して相互に連結される。本発明では、前記非ペプチド性重合体は、非ペプチド性リンカーと混合して使用することができる。
【０１３８】
架橋結合の際に使用される非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びそれらの組み合わせで構成された群から選択することができ、好ましくは、ポリエチレングリコールであるが、これに制限されない。当該分野において既に知られているそのような誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【０１３９】
本発明で使用される持続型ｈＧＨ結合体の製造のために特許文献２などが参考文献として本発明に該当する。当業者は、前記の文献により本発明に使用される持続型ｈＧＨ結合体を製造することができるが、これに制限されない。
【０１４０】
本発明は、もう一つの様態として、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体、酢酸緩衝溶液、ポリソルベート８０、及びマンニトールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥した混合物を含む、持続型ヒト成長ホルモン結合体の凍結乾燥製剤を提供する。
【０１４１】
前記ヒト成長ホルモン、免疫グロブリンＦｃ領域、持続型ヒト成長ホルモン結合体、アルブミン−非含有水溶液、凍結乾燥及び凍結乾燥製剤については、先に説明した通りである。
【０１４２】
本発明は、もう一つの様態として、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ヒト成長ホルモン結合体、及びクエン酸塩緩衝溶液、ポリソルベート８０、及びマンニトールを含むアルブミン−非含有安定化剤を含有し、前記安定化剤は、等張化剤を含まないことを特徴とする、持続型ヒト成長ホルモン結合体液状製剤を提供する。
【０１４３】
前記ヒト成長ホルモン、免疫グロブリンＦｃ領域、持続型ヒト成長ホルモン結合体、アルブミン−非含有安定化剤、及び液状製剤については、先に説明した通りである。
【０１４４】
本発明は、もう一つの様態として、持続型ｈＧＨ結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤及び糖アルコールを含有するアルブミン−非含有水溶液を凍結乾燥する段階を含む、前記凍結乾燥製剤の製造方法を提供する。
【０１４５】
前記持続型ｈＧＨ結合体、緩衝溶液、非イオン性界面活性剤、糖アルコール、アルブミン−非含有水溶液、凍結乾燥及び凍結乾燥製剤については、先に説明した通りである。
【０１４６】
本発明は、もう一つの態様として、前記凍結乾燥製剤の再構築溶液を添加する段階を含む、前記凍結乾燥製剤を再構築する方法を提供する。
【０１４７】
前記凍結乾燥製剤及び再構築については、先に説明した通りである。
【０１４８】
本発明において、用語、「再構築溶液」とは、固体状態の凍結乾燥物質に添加して再構築する溶液を意味する。そのような再構築溶液は注射用水（ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）であってもよく、その例としては、滅菌された蒸留水があるが、特にこれに制限されるものではない。
【０１４９】
また、前記の再構築溶液は、さらに保存剤を含むことができる。
【０１５０】
本発明において、用語、「保存剤」とは、製剤においてバクテリア、カビの作用を実質的に減少させる物質であり、特に多回投与用製剤の製造を容易にするために製剤に含まれる化合物である。潜在的な保存剤の実例として、オクタデシルジメチル−ベンジルアンモニウムクロリド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ヘキサメトニウムクロリド（ｈｅｘａｍｅｔｈｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンザルコニウムクロリド（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、ベンゼトニウムクロリド（ｂｅｎｚｅｔｈｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などがあり、これと異なるタイプの保存剤は、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチル、ベンジルアルコール；  アルキルパラベン、例えば、メチルやプロピルパラベン；  カテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）、レゾルシノール（ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ）、シクロヘキサノール（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｌ）、３−ペンタノール（３−ｐｅｎｔａｎｏｌ）、ｍ−クレゾール（ｍ−ｃｒｅｓｏｌ）などがあるが、これに制限されない。本発明での保存剤は、その中でも、ベンジルアルコール、ｍ−クレゾールまたはフェノールがより好ましく、さらに好ましくは、ベンジルアルコールであるが、これに制限されない。保存剤の好ましい濃度は、０．００１〜０．９％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜０．９％（ｗ／ｖ）であるが、これに制限されるものではない。
【０１５１】
前記のような過程で再構築された本発明の製剤は、持続型ｈＧＨ結合体を１０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含むことができるが、これに制限されない。
【０１５２】
本発明のもう一つの態様として、前記凍結乾燥製剤及び再構築溶液を含む、キットを提供する。
【０１５３】
前記凍結乾燥製剤及び関連内容については、前述した通りである。
【０１５４】
前記キットは、凍結乾燥製剤及び再構築溶液を含み、再構築に適した一種類またはそれ以上の他の構成成分を有する組成物、溶液または装置をさらに含めて構成することができる。
【０１５５】
以下、本発明を下記例により、より詳しく説明する。ただし、下記例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらのみに制限されるものではない。
【実施例】
【０１５６】
製造例：持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体の製造
両末端にアルデヒド反応器を有する分子量約３．４  ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤをヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、分子量２２  ｋＤａ）と結合させ、これをヒトＩｇＧ４由来の非−糖鎖化されたＦｃ領域（約５０  ｋＤａ）Ｎ末端に結合させ、本発明の代表的な持続型ヒト成長ホルモン結合体であるｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（以下、「持続型ｈＧＨ結合体」と命名）を製造し、精製した。
【０１５７】
試験例１：持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤の評価
（１）濃度及び緩衝溶液による持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤の安定性の評価
持続型ｈＧＨ結合体を下記表１のような濃度で含む凍結乾燥製剤を製造した後、再構築（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）して物質の安定性を確認した。緩衝溶液とｐＨの変更に伴う持続型ｈＧＨ結合体の安定化を評価するために、緩衝溶液とｐＨを変更した製剤の安定性も確認した。
【０１５８】
下記表１のように凍結乾燥物質の安定化剤として、緩衝溶液と塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、及びポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）からなる製剤を前−凍結乾燥製剤（ｐｒｅ−ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として使用し、その濃度の持続型ｈＧＨ結合体を凍結乾燥し、蒸留水を用いて再構築した。凍結乾燥は、１次、２次乾燥に分けて進行し、凍結乾燥の温度勾配は、図１のように凍結−１次乾燥（４℃）−２次乾燥（２０℃）に設定した。再構築は、凍結乾燥前の製剤の体積と同一な量の蒸留水で凍結乾燥物質を溶解した。再構築した液状形態の製剤を４０℃で４週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて安定性の評価を行い、その結果を表２に示した。表２のＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は、分析の時点における持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。
【０１５９】
【表１】
0006549104.tif 000002
【０１６０】
【表２】
0006549104.tif 000003
【０１６１】
前記表２の結果から分かるように、持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を４０℃で４週間保管したとき、濃度に応じた安定性の差がなく維持されることが示され、高濃度の持続型ヒト成長ホルモンにも安定性を付与することができることを示した。また、表２の結果から、実施例２及び実施例３を比較したとき、緩衝溶液とｐＨを変更した製剤も安定性が維持されることを確認した。
【０１６２】
（２）保存剤の種類に応じた持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体の凍結乾燥製剤の安定性及び溶解度の評価
前記試験例１−（１）の製剤である実施例２（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．２、１５０  ｍＭの塩化ナトリウム、５％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０）、実施例３（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．６、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０）、及び実施例３を基本とした等張性製剤（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．６、４％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０）を基にして、持続型ｈＧＨ結合体を下記表３に示すように、６８．２５  ｍｇ／ｍＬ及び５８．５  ｍｇ／ｍＬの濃度で混合した後、凍結乾燥し、その後に表３の保存剤を含む再構築溶液を使用して溶解時間の測定及び安定性を確認した。製品性状は目視で確認して比較した。凍結乾燥及び再構築方法は、前記試験例１−（１）のように行った。再構築した液状形態の製剤を２５℃で４週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ−ＨＰＬＣ）及び目視で性状確認を用いて安定性の評価を行い、その結果を表４に示した。表４のＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は、分析の時点における持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。
【０１６３】
【表３】
0006549104.tif 000004
【０１６４】
【表４】
0006549104.tif 000005
【０１６５】
前記表４の結果から分かるように、実施例４及び５より、実施例６及び７において持続型ｈＧＨ結合体の安定性が維持される結果を確認することができた。しかし、実施例６〜９の結果から分かるように、保存剤の種類に応じた持続型ｈＧＨ結合体の安定性の差はない結果が示された。ただし、ｍ−クレゾールを含む再構築溶液を使用する場合は、溶解時、液状が白濁する現象が示された。
【０１６６】
（３）結合体の濃度に応じた持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤の溶解度の評価
持続型ｈＧＨ結合体を下記濃度別に含む凍結乾燥製剤を製造した後、凍結乾燥物質の製品性状及び再構築溶解度を確認した。前記試験例１−（１）の製剤である実施例１の組成（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．２、１５０  ｍＭの塩化ナトリウム、５％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０）を基にして、持続型ｈＧＨ結合体を下記表５のような濃度で混合した後、凍結乾燥し、その後、蒸留水を用いて再構築溶解時間を測定した。凍結乾燥及び再構築方法は、前記試験例１−（１）のように行った。製品性状は目視で確認して比較した。溶解は、自動シェーカーを使用し、振幅６０度、３０  ｒｐｍに設定して再構築した。下記の表６は、溶解が完了するまでにかかる時間を示す。
【０１６７】
【表５】
0006549104.tif 000006
【０１６８】
【表６】
0006549104.tif 000007
【０１６９】
凍結乾燥物質の製品性状は濃度に関係なく安定して形成されたが、濃度が高いほど、より堅いケーキを確認することができた。前記表６の結果から分かるように、濃度が高いほど溶解時間が増える結果を示した。
【０１７０】
（４）安定化剤の種類に応じた持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体の凍結乾燥製剤の安定性及び溶解度の評価
安定化剤の種類に応じた持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤を製造して溶解時間、溶解性状及び持続型ｈＧＨ結合体の安定性を確認した。凍結乾燥前の予備製剤は、下記表７のような組成で準備し、前記製剤で７８．０  ｍｇ／ｍＬの持続型ｈＧＨ結合体を凍結乾燥した後、蒸留水を用いて再構築し、この時の再構築に伴う溶解時間を評価した。凍結乾燥及び再構築方法は、前記試験例１−（１）のように行った。製品性状は目視で確認して比較した。溶解は、自動シェーカーを使用し、振幅６０度、３０  ｒｐｍに設定して再構築し、溶解時間を確認した結果を表８に示した。
【０１７１】
また、再構築した液状形態の製剤を４０℃で４週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて安定性の評価を行った。表９のＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は、分析の時点における初期結果値に対応した持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。
【０１７２】
【表７】
0006549104.tif 000008
【０１７３】
【表８】
0006549104.tif 000009
【０１７４】
【表９】
0006549104.tif 000010
【０１７５】
前記表８の結果から分かるように、マンニトールの濃度が高いとき、溶解速度が高いことが確認できた。そして、５  ｍＭのヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を添加したとき、溶解速度が改善されることが確認することができた。また、実施例１５及び１７番の製剤の場合、実施例１９番の製剤に比べて、再構築時の泡が多く生成されることを確認した。前記表９の結果から分かるように、溶解後の安定性は、各製剤で類似して示された。ただし、塩化ナトリウムを安定化剤として含む場合は、持続型ｈＧＨ結合体の安定性が少し高く示される結果が見られた。
【０１７６】
（５）凍結乾燥物質の密度と持続型ｈＧＨ結合体の濃度に応じた凍結乾燥製剤の溶解度の評価
前記試験例１−（４）で確認された製剤である実施例１９の組成（２０  ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．２、５％（ｗ／ｖ）のマンニトール、５  ｍＭのヒスチジン、０．００５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０）に基づいて、持続型ｈＧＨ結合体の濃度に応じた凍結乾燥物質の溶解度を確認した。下記表１０のような組成で予備製剤を製造して凍結乾燥した。凍結乾燥時、予備製剤を蒸留水を用い、それぞれ１倍、１／２倍、１／４倍に希釈して凍結乾燥物質を製造した。乾燥は、１次、２次乾燥に分けて進行し、凍結乾燥の温度勾配は、図１のように設定した。再構築は、希釈する前の体積の量に対応する蒸留水で溶解した。溶解は、自動シェーカーを使用し、振幅６０度、３０  ｒｐｍに設定して再構築した。表１１は、溶解が完了するまでにかかる時間を示す。
【０１７７】
【表１０】
0006549104.tif 000011
【０１７８】
【表１１】
0006549104.tif 000012
【０１７９】
前記表１１に見られるように、希釈して凍結乾燥物質の密度を少なくした場合、溶解速度が改善されることを確認した。また、前記製剤の組成（２０  ｍＭのクエン酸ナトリウム、５％のマンニトール、５  ｍＭのヒスチジン、０．００５％のポリソルベート８０）で持続型ｈＧＨ結合体の濃度を３９．０  ｍｇ／ｍＬから、４８．８ｍｇ／ｍＬ及び５８．５  ｍｇ／ｍＬに増加させても、溶解速度は、類似して増加した。
【０１８０】
（６）凍結乾燥過程の温度勾配設定
前記試験例１−（１）の温度勾配設定（図１）で１次乾燥時間を１０時間から２０時間に増加させ、１次乾燥温度を４℃の一区間を−２０℃、−５℃二区間に分けて設定した（図２）。既存の温度勾配の方法では、凍結乾燥物質に水分が３〜５％残っており、凍結乾燥物質が崩壊する現象を示した。温度勾配を、図２のように変更したとき、体積が大きくなっても（〜５ｍＬ）、乾燥が完全にされている凍結乾燥物質を確認することができた。
【０１８１】
（７）浸透圧を考慮した持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤の溶解度の評価
前記試験例１−（１）及び（２）で確認された製剤の組成（２０  ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．６、５％（ｗ／ｖ）のマンニトール、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．００５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０  ）に基づいて浸透圧を考慮した安定化剤の濃度を設定し、それに伴う凍結乾燥物質の溶解度を確認した。下記表１２のような組成で予備製剤を製造して凍結乾燥した。
【０１８２】
凍結乾燥時、予備製剤を蒸留水を用いて１／２倍に希釈して凍結乾燥物質を製造した。乾燥は、１次、２次乾燥に分けて進行し、凍結乾燥の温度勾配は、図２のように設定した。再構築は、希釈する前の体積に相当する量を有し、０．９％のベンジルアルコールを含む蒸留水を用いて溶解した。
【０１８３】
溶解は、自動シェーカーを使用し、振幅６０度、３０  ｒｐｍに設定して再構築した。表１３は、溶解が完了するまでにかかる時間及び凍結乾燥物質を再構築した後、サンプルの浸透圧を測定した結果を示す。
【０１８４】
【表１２】
0006549104.tif 000013
【０１８５】
【表１３】
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【０１８６】
前記表１３で見られるように、マンニトールを削除する場合は、溶解時間が大幅に増えることを確認することができた。浸透圧は、５％（ｗ／ｖ）のマンニトールの場合、等張液の範囲である２８０〜３２０  ｍＯｓｍ／Ｋｇよりも高く示されることが分かった。
【０１８７】
（８）マンニトールの濃度に応じた持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤の溶解度及び浸透圧を確認
前記試験例１−（７）で確認された製剤（２０  ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．６、５％（ｗ／ｖ）のマンニトール、０．００５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０）に基づいてマンニトールの濃度に応じた凍結乾燥物質の溶解度及び浸透圧を確認した。
【０１８８】
下記表１４と同様な組成で予備製剤を製造して凍結乾燥した。この時、凍結乾燥及び再構築の方法及び条件は、前記試験例１−（７）と同様であった。表１５は、溶解が完了するまでにかかる時間及び凍結乾燥物質を再構築した後、サンプルの浸透圧を測定した結果を示す。
【０１８９】
【表１４】
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【０１９０】
【表１５】
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【０１９１】
前記表１５で見られるように、マンニトールの濃度が４〜４．５％であるとき、等張液範囲の浸透圧を有することが分かった。マンニトールの濃度が低いほど溶解時間が長くなることを確認することができるが、塩化ナトリウムを含む場合よりは少なく示された。
【０１９２】
（９）持続型ｈＧＨ結合体の凍結乾燥製剤の４℃、２５℃保管安定性を確認
前記試験例１−（８）で確認された製剤（２０  ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．６、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール、０．００５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０）に基づいて凍結乾燥物質の４  ℃、２５℃保管安定性を確認した。安定性は、凍結乾燥状態で４℃、２５℃で６ヶ月間保管した後、再構築し、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて評価した。初期の再構築溶液は、液状の状態で、２５℃で４週間保管した後、再構築し、イオン交換クロマトグラフィー法（Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて評価した。表１６のＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は、分析の時点における凍結乾燥物質の持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。表１７のＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は、再構築液状形態の物質の持続型ｈＧＨ結合体の純度を示す。
【０１９３】
【表１６】
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【０１９４】
【表１７】
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【０１９５】
前記表１６で見られるように、凍結乾燥物質の場合、４℃、２５℃保管する場合には、６ヶ月になっても安定性を維持する結果を示した。また、再構築した物質の場合、２週間２５℃で保管しても安定性を維持することが分かった。
【０１９６】
試験例２：持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の開発及び評価
（１）ｐＨと緩衝溶液の種類及び等張化剤と糖アルコールの濃度に応じた持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の安定性の評価
本発明において安定化剤として緩衝溶液の種類及び等張化剤と糖アルコールの濃度が持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。下記表１８のような組成で、２５℃で０〜４週間保管した後、イオン交換クロマトグラフィー法、サイズ排除クロマトグラフィー法を用いて分析した。表１９及び２０では、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は、（Ａｒｅａ％／  Ｓｔａｒｔ  Ａｒｅａ％）であり、初期結果値に対応した持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。表１９は、保管した後、持続型ｈＧＨ結合体のＩＥ−ＨＰＬＣ残存率、表２０は、保管した後、持続型ｈＧＨ結合体のＳＥ−ＨＰＬＣ残存率をそれぞれ示す。
【０１９７】
【表１８】
0006549104.tif 000019
【０１９８】
【表１９】
0006549104.tif 000020
【０１９９】
【表２０】
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【０２００】
前記の結果から分かるように、ＩＥ−ＨＰＬＣの結果、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の条件のときに持続型ｈＧＨ結合体が安定した。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ  ５．２）、４％（ｗ／ｖ）のマンニトール条件のときに持続型ｈＧＨ結合体が最も安定した。
【０２０１】
（２）緩衝溶液の種類に応じた持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の安定性の評価
本発明において安定化剤として緩衝溶液の種類が持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。試験例２（１）を通じて、選択したｐＨ５．２、４％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０を基準にして、下記表２１のような組成で、２５℃で０〜４週間保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣとＳＥ−ＨＰＬＣを用いて分析した。表２２及び２３でＩＥ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は、（Ａｒｅａ％／  Ｓｔａｒｔ  Ａｒｅａ％）であり、初期結果値に対応した持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。表２２は、保管した後、持続型ｈＧＨ結合体のＩＥ−ＨＰＬＣ残存率、表２３は、保管した後、持続型ｈＧＨ結合体のＳＥ−ＨＰＬＣ残存率をそれぞれ示す。
【０２０２】
【表２１】
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【０２０３】
【表２２】
0006549104.tif 000023
【０２０４】
【表２３】
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【０２０５】
前記結果から分かるように、ＩＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬである場合、クエン酸ナトリウムの条件のときに最も安定した。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬである場合、ヒスチジン、クエン酸ナトリウムの条件の順で安定した。
【０２０６】
また、ＩＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムの条件の順で安定した。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、ヒスチジン、クエン酸ナトリウムの条件の順で安定した。
【０２０７】
持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ〜５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ  ５．２）、４％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０の条件のときに安定性に優れた結果を示した。
【０２０８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形で実施されることを理解することができる。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、制限的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、前述した詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に包摂されるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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