(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者においてＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍の転移を仲介する能力の阻害用の治療剤であって、
前記治療剤が、ＭＵＣ１に特異的なＩｇＥモノクローナル抗体を含み、該ＭＵＣ１は、使用において、ＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍上のＭＵＣ１及び腫瘍微小環境における宿主由来の骨髄細胞にＩｇＥモノクローナル抗体の定常領域を介して結合することにより三者複合体を形成し、
ＭＵＣ１に特異的なＩｇＥモノクローナル抗体は、配列番号１を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域及び配列番号２を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域を含み、
ＩｇＥモノクローナル抗体は、ＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍のサイトに引き寄せられた骨髄細胞を、前記ＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍により産出されたサイトカインによりリプログラミングすることにより、転移の発生に必要な微小環境を変化させる、治療剤。
【請求項２】
前記ＩｇＥ抗体が、キメラモノクローナル抗体である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記ＩｇＥ抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
ヒト由来の定常領域を有する、請求項１に記載の治療剤。
【請求項５】
前記固形腫瘍が、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、肺癌、および多発性骨髄腫から選択される、請求項１に記載の治療剤。
【請求項６】
患者においてＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍の転移を仲介する能力を、ＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍上のＭＵＣ１及び腫瘍微小環境における宿主由来の骨髄細胞にＩｇＥモノクローナル抗体の定常領域を介して結合して三者複合体を形成することにより、阻害するために使用する医薬の製造についてのＭＵＣ１に特異的な治療的ＩｇＥモノクローナル抗体の使用であって、
ＭＵＣ１に特異的なＩｇＥモノクローナル抗体は、配列番号１を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域及び配列番号２を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域を含み、
ＩｇＥモノクローナル抗体は、ＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍の部位に引き寄せられた骨髄細胞を、前記ＭＵＣ１を発現している確立された成長している固形腫瘍により産出されたサイトカインによりリプログラミングすることにより、転移の発生に必要な微小環境を変化させる、
治療的ＩｇＥモノクローナル抗体の使用。
【請求項７】
前記ＩｇＥ抗体が、キメラモノクローナル抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＩｇＥ抗体が、ヒト化モノクローナル抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
ヒト由来の定常領域を有する、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記固形腫瘍が、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、消化管癌、肺癌、および多発性骨髄腫から選択される、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０１３年６月１２日に出願された米国仮出願第６１／８３４、６９号の利益および２０１３年７月１１日に出願された米国特許出願第１３／９３７，７８１号の利益を請求する。前記出願の教示は全て、参照により、その全部が本明細書に援用される。
【０００２】
［政府支援］
本発明は、国立衛生研究所により授与された約定ＣＡ１１１６３９号の下、政府支援でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の背景］
ＩｇＥ抗体は、即時過敏症と、エフェクター細胞の漸増を要する炎症遅延型応答とによって特徴付けられる、アレルギー反応およびぜんそく反応を仲介する。ＩｇＥ抗体は、末梢循環系から組織へ輸送され、当該組織では、ＩｇＥ抗体が、肥満細胞、好塩基球、抗酸球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、単球、およびマクロファージのようなアレルギーエフェクター細胞に、３種類のＦｃ受容体：ＦｃεＲＩ（または高親和性ＦｃεＲ）（Ｋａ＝１０１１Ｍ−１）、ＦｃεＲII（または低親和性ＦｃεＲ、ＣＤ２３）（Ｋａ＜１０８Ｍ−１）、およびガレクチン３を介して結合することができる。ＩｇＧクラスの抗体とは異なり、ＩｇＥは、そのＦｃＲに極端に高い親和性で結合し、ＦｃεＲＩに対する場合はＩｇＧがそのＦｃＲ類（ＦｃγＲＩ−III）に対する親和性よりも約３桁高く、ＦｃεＲIIに対する場合はＩｇＧがそのＦｃγＲＩに対する親和性と同じ位高い（非特許文献１〜４）。
【０００４】
新たに生じたアレルギー腫瘍学（ＡｌｌｅｒｇｏＯｎｃｏｌｏｇｙ）の分野は、ＩｇＥ仲介性のアレルギーと癌との間の逆相関を示唆する所見および研究に基づいている（非特許文献５〜１２）。その結果、本技術分野の研究者達は、微生物／病原体の感染に対する適応応答として本来発達してきた免疫応答が悪性腫瘍に対して有用かもしれないという前提の下、特定の癌の予防および治療におけるＩｇＥ抗体クラスの治療上可能性を探求している。
【０００５】
癌の治療へのＩｇＥの応用は、ナジ（Ｎａｇｙ）らが先駆者であり（非特許文献１３）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）の主要なエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ３６）に特異的なマウスＩｇＥモノクローナル抗体を開発して、同系ＭＭＴＶ分泌性乳腺腺癌（Ｈ２７１２）に罹患しているＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいて有意な抗腫瘍活性を証明した（非特許先行文献１３）。カーショー（Ｋｅｒｓｈａｗ）らは、大腸癌細胞の表面上に発現した抗原決定基に特異的な、３０.６と名付けたマウスモノクローナルＩｇＥを開発した（非特許文献１４）。マウスＩｇＥ３０.６は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて皮下で増殖する確立されたヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５細胞の増殖を阻害したが、この効果は一時的であった。対照的に、マウスＩｇＧ３０.６は抗腫瘍効果を示さなかった。当該活性が非特異的マウスＩｇＥの事前投与によって特異的に抑制されたことから、当該マウスＩｇＥ特異的な効果は、抗体と、ＦｃεＲを持つエフェクター細胞との相互作用によるものと考えられた（非特許文献１４）。グールド（Ｇｏｕｌｄ）らは、卵巣癌の腫瘍関連抗原である葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）に特異的なマウス／ヒトキメラＩｇＥ（ＭＯｖ１８−ＩｇＥ）およびマウス／ヒトキメラＩｇＧ（ＭＯｖ１８−ＩｇＧ１）を開発した。ＭＯｖ１８−ＩｇＥおよびＭＯｖ１８−ＩｇＧ１の保護活性を、ヒト卵巣癌のＳＣＩＤマウス異種移植モデル（ＩＧＲＯＶ１）において比較した。ＭＯｖ１８−ＩｇＥの有益な効果は、ＭＯｖ１８−ＩｇＧ１のものよりも高く且つ長い持続期間であり、ＩｇＥ抗体の優れた抗腫瘍効果を証明した（非特許文献１５）。
【０００６】
近年、カラギヤニス（Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ）らは、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲIIを介して仲介される２つの異なった経路、ＡＤＣＣ（抗体依存的細胞性細胞毒性）およびＡＤＣＰ（抗体依存的細胞性食作用）による、単球仲介性ＩｇＥ依存的腫瘍細胞殺傷を証明した（非特許文献１６および１７）。また、あるグループも、このアッセイ系を用いて、抗Ｈｅｒ２ ＩｇＥがＡＤＣＣを介してインビドロで単球を活性化し腫瘍細胞を殺傷できることを証明した（非特許文献１８）。更なる例としては、すい臓癌患者から単離したＩｇＥクラスの抗体が癌細胞に対してＡＤＣＣを仲介することを証明したフゥ（Ｆｕ）らの例（非特許文献１９）や、単球を用いてインビドロで抗ＥＧＦＲ ＩｇＥが抗ＥＧＦＲ ＩｇＧと比較してヒト上皮性癌細胞株Ａ４３１に対する細胞毒性を最大９５％増加させたことを示したシュピルナー（Ｓｐｉｌｌｎｅｒ）らの例（非特許文献２０）が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】グールド(Gould), HJら、Annu. Rev. Immunol., 21: 579-628. (2003)
【非特許文献２】ガウニ(Gounni), ASら、Nature, 367: 183-186 (1994)
【非特許文献３】キネ(Kinet), JP, Annu. Rev. Immunol., 17: 931-72:931-972 (1999)
【非特許文献４】ラベッチ(Ravetch) JV,およびキネ(Kinet) JP, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991)
【非特許文献５】ターナー(Turner) MCら、Int. J. Cancer, 118: 3124-3132 (2006)
【非特許文献６】ワン(Wang) H & ディープゲン(Diepgen) TL, Allergy 60: 1098-1111, (2005)
【非特許文献７】ターナー(Turner) MCら、Am. J. Epidemiol., 162: 212-221 (2005)
【非特許文献８】ワン(Wang) Hら、Int. J. Cancer, 119: 695-701 (2006)
【非特許文献９】ミルズ(Mills) PKら、Am. J. Epidemiol., 136: 287-295 (1992)
【非特許文献１０】ウィーメルス(Wiemels) JLら、Cancer Res., 64: 8468-8473 (2004)
【非特許文献１１】ドディグ(Dodig) S.ら、Acta Pharm., 55: 123-138 (2005)
【非特許文献１２】ウェレンシュ(Wrensch) M.ら、Cancer Res., 66: 4531-4541 (2006)
【非特許文献１３】ナジ(Nagy), E.ら、Cancer Immunol. Immunother., 34: 63-69 (1991)
【非特許文献１４】カーショー(Kershaw), MHら、Oncol. Res., 10: 133-142 (1998)
【非特許文献１５】グールド(Gould), HJら、Eur. J. Immunol., 29: 3527-3537 (1999)
【非特許文献１６】カラギアニス(Karagiannis), SNら、Cancer Immunol. Immunother., 57: 247-263 (2008)
【非特許文献１７】カラギアニス(Karagiannis), SNら、J. Immunol., 179: 2832-2843 (2007)
【非特許文献１８】カラギアニス(Karragiannis) P.ら、Cancer Immunol. Immunother., 58: 915-930 (2009)、2008年10月22日にオンラインで公開
【非特許文献１９】フゥ(Fu)ら、Clin. Exp. Immunol., 153:401-409, 2008
【非特許文献２０】シュピルナー(Spillner)ら、Cancer Immunol. Immunother., 61: 1565-1573 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
新興分野のアレルギー腫瘍学における上記有望な発見にもかかわらず、転移性癌の治療における新規な治療法の開発が強く必要とされ続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、腫瘍の成長および転移を阻害するのに有用な新規ＩｇＥ抗体を提供する。ヒトεの定常領域と、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する結合特異性を具備する可変領域とを含む治療用モノクローナルＩｇＥ抗体が提供される。また、原発性固形腫瘍の微小環境に存在する少なくとも１個の宿主由来の非腫瘍細胞の活性をリプログラミングすることによって、腫瘍の成長および転移を促進する該被腫瘍細胞の能力を逆転させる方法も提供される。患者の転移性癌腫を治療する方法、患者の原発性腫瘍の転移を引き起こさせない方法、および患者の原発性または転移性腫瘍の成長速度を遅らせる方法が提供される。  
【００１０】
一実施形態において、本発明は、患者の固形腫瘍の微小環境に存在する、少なくとも１個の宿主由来の非腫瘍細胞の活性をリプログラミングして、該固形腫瘍の転移を仲介する該非腫瘍細胞の該活性を阻害するための方法であって、腫瘍関連抗原に対して特異的なＩｇＥ抗体を投与するステップを含み、該ＩｇＥ抗体が、該固形腫瘍の微小環境内部で三者複合体を形成し、該三者複合体が、該ＩｇＥ抗体と、該腫瘍関連抗原と、該固形腫瘍の環境にとって内在性である宿主由来の非腫瘍細胞とからなり、該ＩｇＥ抗体が、該腫瘍関連抗原と、該宿主由来の非腫瘍細胞の表面上に存在する、該ＩｇＥ抗体の定常領域に対して特異的な抗原受容体とに、特異的に結合する、方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、患者の固形腫瘍の転移を阻害する方法であって、該患者に、該固形腫瘍の微小環境内部で三者複合体を形成することができるＩｇＥ抗体を投与することを含み、該三者複合体が、腫瘍関連抗原に対して特異的な該ＩｇＥ抗体と、該腫瘍関連抗原と、該腫瘍の微小環境にとって内在性である宿主由来の非腫瘍細胞とからなり、該ＩｇＥ抗体が、該腫瘍関連抗原と、該宿主由来の非腫瘍細胞の表面上に存在する該ＩｇＥ抗体の定常領域に対して特異的な抗原受容体とに、特異的に結合し、該三者複合体の形成のときに、該非腫瘍細胞の転移を仲介する能力が阻害される、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明の上記その他の目的、特徴および利点は、異なる図や写真を通して同様な参照文字が同一要素に言及している添付図面で例示されるように、以下の本発明の好ましい実施形態のより詳細な説明から明らかであろう。当該図面は必ずしも縮尺通りでないが、その代わり本発明の原理を例示することに重点がおかれている。
【図１】キメラＩｇＥ抗体の構築および抗原特異性。（Ａ）ベクター構築物の図示。親ベクターは、ｐｃＤＮＡ３.１／ネオマイシン（ｐＥｐｓｉｌｏｎ Ｉ）、ｐＥＦ６／ブラスタサイジン(blastacidin)（ｐＥｐｓｉｌｏｎ ＩＩ）、ｐｃＤＮＡ３.１／ゼオシン（ｐＫａｐｐａ Ｉ）、およびｐｃＤＮＡ３.１／ハイグロマイシン（ｐＫａｐｐａ ＩＩ）であった。表１のハイブリドーマから重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子をクローニングし、ヒトε定常領域遺伝子またはヒトκ定常領域遺伝子の上流に挿入した。（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。形質移入ＣＨＯ−Ｋ１クローンから精製したキメラＩｇＥと、骨髄腫細胞株ＳＫＯ-００７から精製したコントロールのヒトＩｇＥとを、４〜１２％のアクリルアミドグラジエントゲル上で電気泳動によって分離し、クマシーブルーで染色した。（Ｃ）抗体特異性の解析。オーバーレイヒストグラムは、未形質移入細胞株と比較して、同種抗原を形質移入した細胞株に対するＩｇＥ結合のＦＡＣＳ解析を表す。１Ｆ５.ｈＩｇＥ（抗ｈＣＤ２０）はヒトＣＤ２０のｃＤＮＡを形質移入したＡ２０細胞に結合し、一方、３Ｃ６.ｈＩｇＥ（抗ｈＭＵＣ１、部分的グリコシル化形態）はｈＭＵＣ１のｃＤＮＡを形質移入したマウス乳癌細胞株４Ｔ−１上のヒトＭＵＣ１を検出した。線グラフは、４Ｈ５.ｈＩｇＥ（抗ｈＭＵＣ１タンパク質骨格）による合成ｈＭＵＣ１縦列反復ペプチド（５０ｍｅｒ）のＥＬＩＳＡ検出結果を示す。コントロールペプチドは、ｈＣＤ２０の第二細胞外ループから得た（４３ｍｅｒ）。
【図２】インビトロの肥満細胞および好酸球仲介性の腫瘍細胞毒性、ヒストグラムは、ＰＩ＋ＣＦＳＥ＋腫瘍細胞のパーセンテージを示す。１０−５ｍＭのＣＦＳＥで１５分間ＯＣＩ−Ｌｙ８ヒトＢ細胞リンパ腫細胞（ｈＣＤ２０＋）を標識した。１×１０５個の標識細胞を、未染色ＣＢＭＣおよび２．５μｇ／ｍＬのＩｇＥ（ＡおよびＢ）または臍帯血由来の好酸球および５μｇ／ｍＬのＩｇＥ（ＣおよびＤ）と混合し、次いで３７℃で２４時間インキュベーションした。その細胞混合物を、フローサイトメトリー分析の前にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＣＦＳＥｈｉ画分におけるＰＩ＋細胞のパーセンテージは総腫瘍細胞毒性を表し、結果をヒストグラム形態で示す。（Ａ）異なる比率のエフェクター：標的でのＣＢＭＣおよびｈＩｇＥ仲介性の腫瘍細胞毒性。（Ｂ）２μｇ／ｍＬのブロッキング抗体またはアイソタイプコントロールを添加した（Ｅ：Ｔ比は４：１）。（Ｃ）異なる比率のエフェクター：標的でのＣＢＥＯＳおよびｈＩｇＥ仲介性の腫瘍細胞毒性。（Ｄ）２μｇ／ｍＬのブロッキング抗体または１０Ｕ／ｍＬのへパリンを添加した（Ｅ：Ｔ比は２．５：１）。ここで、抗体のみによって（すなわち、エフェクター細胞の非存在下で）誘導された腫瘍の死のデータも示す。示された結果は、１つの代表的な実験の平均値±ＳＤである。スチューデントのｔ検定：＊はｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊はｐ＜０．００５。
【図３】腫瘍特異的ＩｇＥはインビトロの腫瘍成長を阻害する。０日目に１０５個の４Ｔ１.ｈＭＵＣ１腫瘍細胞をｈＦｃεＲＩマウスの脇腹の皮下に植え付けた。１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に、２０μｇのコントロールＩｇＥまたは３Ｃ６.ｈＩｇＥ（抗ｈＭＵＣ１）を投与した。腫瘍が面積で３００ｍｍ２を超えるまで、２次元キャリパー測定を行った。（Ａ）時間に対する腫瘍サイズ平均値のグラフ。エラーバーは各群の平均値±ＳＤを表す。最後の時点での各群あたりの生存マウス／総マウスの数を括弧内に示す。抗ｈＭＵＣ１群は、コントロール群とは有意に異なる（２元ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００１）。（ＢおよびＣ）（Ａ）に示す実験の３４日目に生存しているマウスから腫瘍を収穫し、薄片にして、肥満細胞を染色した。肥満細胞は、大部分が腫瘍の中心に無く、腫瘍周辺領域にあった。存在した肥満細胞（赤い矢印）は脱顆粒していなかった（Ｂ）。３Ｃ６.ｈＩｇＥ処理群のマウス由来の１つの腫瘍のみが、肥満細胞で浸潤された領域を含み、脱顆粒の証拠を示した（Ｃ）。
【図４】ｈＭＵＣ１に特異的なマウスＩｇＥは、ＦｃεＲＩにおいて完全な腫瘍拒絶を仲介する。０日目にｈＦｃεＲＩＴｇ＋マウスの脇腹に、ヒトＭＵＣ１、抗ｈＭＵＣ１ ＩｇＥ（３Ｃ６.ｈＩｇＥ）および／またはサイトカイン（ＭＣＰ、ＩＬ−５）を形質移入した４Ｔ１腫瘍細胞の４つの異なる組み合わせを皮下注射した。マウス１匹あたり合計１０５個の細胞を投与した（１群あたりｎ＝４）。（Ａ）４つの実験群の説明。（Ｂ）ＩｇＥ抗体と同種抗原（ＭＵＣ１）との相互作用を試験する実験を設計して、２種のサイトカインによって引き寄せられた骨髄細胞を試験した。注射直前に前記細胞を混合し、次いでｈＦｃεＲＩ ＫＯ／Ｔｇマウスの脇腹に皮下注射した（マウス１匹あたり細胞１００，０００個）。腫瘍の成長を２次元キャリパー成長によってモニターした。腫瘍が一時的に知覚できた後に持続的に退行したグループ４を除き、各グループで進行性の成長が観察された。示されたデータは、２つの別個の実験を代表する。エラーバーは平均腫瘍サイズ±ＳＤを表す。
【図５】ｈＭＵＣ１に特異的なマウスＩｇＥは、ｈＦｃεＲＩ ＫＯ／Ｔｇマウスにおいて完全な腫瘍拒絶を仲介する。図６に示されるうちの１つの反復実験の腫瘍測定値の個々の成長曲線および平均値。図６Ａに示されるように、３Ｃ６.ｍＩｇＥまたはサイトカインのいずれか一方を発現している４Ｔ１腫瘍細胞を混合した。データは、個々の腫瘍測定値のもの（Ａ、Ｃ）または腫瘍体積の平均値（Ｂ、Ｄ）である。ここで留意すべきは、反復実験で、非常に低下した成長速度ではあるが、成長を示したグループ４の腫瘍が１つ存在したことである。
【図６】ｈＭＵＣ１に特異的なマウスＩｇＥは、野生型マウスにおいて完全な腫瘍拒絶を仲介できないが、転移を予防する能力を示す。３Ｃ６.ｈＩｇＥまたはサイトカインのいずれか一方を発現している４Ｔ１腫瘍細胞の群を、図６Ａに示されるように混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射した。個々の腫瘍の成長曲線（Ａ、Ｂ）およびグループの平均値（Ｃ、Ｄ）を示す。ｈＦｃεＲＩ ＫＯ／Ｔｇトランスジェニックマウスでは成長しなかったグループ４の腫瘍は、野生型マウスでは、非常に低下した成長速度ではあるが成長した。ここで留意すべきは、グループ３の腫瘍（４Ｔ１／ｈＭＵＣ１およびサイトカインのみ）が中程度の成長速度を示したことである。この実験には３匹のｈＦｃεＲＩ ＫＯ／Ｔｇトランスジェニックマウスがポジティブコントロールとして含まれ、グループ４の腫瘍を注射した場合は３匹全てが腫瘍の成長を示せなかった（パネルＤ、□---□）。グループ３の腫瘍（ＭＵＣ１およびサイトカインのみ）の成長速度の低下は、これらマウスが腫瘍発生の過程の早期に転移を発症し、１０日目までに体重の減少が始まる（図７）という事実から起こり得る。グループ４の腫瘍（３Ｃ６−ｍＩｇＥおよびＭＵＣ１およびサイトカイン）を有するマウスは、その脇腹に小さな腫瘍を有するにも関わらず、体重減少を示さず、転移の他の明らかな兆候も示さない。
【図７】グループ３およびグループ４のマウスにおける体重減少速度。グループ３またはグループ４の腫瘍を注射した野生型マウスを５日ごとに体重測定して、平均値および標準偏差を算出した。ここで留意すべきは、２つのグループの間の平均体重の有意な違いは１０日目までに検出できたことである。グループ３のマウスは急速に体重が減少し、腹水を発症し、毛がくしゃくしゃになった。これら全身性転移の兆候は、グループ４の腫瘍を有する野生型マウスでは、発症しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、腫瘍の成長および転移の阻害または予防に有用な新規ＩｇＥ抗体を提供する。腫瘍の転移は、部分的には、腫瘍微小環境内部に存在する自然免疫系のサイトカイン類と骨髄（ミエロイド）由来細胞との相互作用によって引き起こされる。腫瘍細胞によるサイトカイン類の局所的な発現は、骨髄エフェクター細胞を、例えば、腫瘍微小環境へ引き寄せ、次いで、それら細胞によって追加のサイトカイン類の放出がもたらされる。このように、腫瘍微小環境内部のサイトカイン環境は複雑化し、数百とまではいかないが数ダースのサイトカイン類およびケモカイン類が癌関連炎症に寄与する。
【００１４】
腫瘍微小環境に蓄積するマクロファージおよび肥満細胞のような腫瘍関連骨髄由来細胞は、腫瘍の進行に関与するように見える（デパルマ(DePalm)ら、Cancer Cell 23(3)：277-286 (2013)； ダルトン(Dalto)ら、Cancer Immunol Immunother DOI 10.1007/s00262-012-1246-0、2012年４月１８日にオンライン上で公開）。この関連性は、腫瘍微小環境内部でみられる複雑なサイトカイン環境によって修飾される。例えば、哺乳動物癌腫の転移は、２種類のサイトカインの存在下でマクロファージによって増強される（ラッフェル(Ruffell) Bら、Trends Immunol. 33：119 (2012)）。また、サイトカインに応答して、単球、顆粒球および肥満細胞のような他の細胞が、細胞外基質（ＥＣＭ）を修飾するタンパク質分解酵素を分泌して、転移を促進するＥＣＭ結合増殖因子の放出をもたらす（ハナハン(Hanahan) D & クーセンス(Coussens) LM, Cancer Cell 21: 309 (2012); リュウ(Lu) Pら、Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 3: a005058 (2011)）。従って、“新生物組織で慢性的に活性化された骨髄細胞は、癌の多くの特等を裏付ける”ようである（クーセンス(Coussens) LMら、Science 339: 286-291 (2013)); (ハナハン(Hanahan) D & クーセンス(Coussens) LM, Cancer Cell 21: 309 (2012)）。
【００１５】
本発明者らは、本発明の抗体が二次腫瘍および高次腫瘍だけでなく原発性固形腫瘍の転移を阻害できることを、予期せず発見した。いかなる仮説にも拘束されないが、本発明のＩｇＥ抗体は、原発性腫瘍の微小環境における宿主由来の非腫瘍細胞をリプログラミングすることができ、腫瘍の転移を阻害するまたはその発生を予防する。本発明は、仲介者として宿主由来細胞を介して腫瘍細胞の挙動の修飾を提供する点で、ユニーク且つ予測し得ない。その結末は、原発性腫瘍が転移しないことである。このことは、抗体依存性細胞仲介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞仲介性食作用（ＡＤＣＰ）が癌の治療に用いられ癌細胞を直接殺傷するという、抗体に基づく癌治療で多く報告される周知の実施形態と対照的である（フゥ(Fu)ら、Clin. Exp. Immunol., 153:401-409, 2008; カラギアニス(Karagiannis) P.ら、Cancer Immunol. Immunother., 58: 915-930 (2009) 2008年10月22日にオンライン上で公開; カラギアニス(Karagiannis), SNら、Cancer Immunol. Immunother., 57: 247-263 (2008);およびカラギアニス(Karagiannis), SNら、J. Immunol., 179: 2832-2843 (2007)）。
【００１６】
本発明の一実施形態では、宿主由来の骨髄エフェクター細胞のような非腫瘍細胞のリプログラミングが、原発性固形腫瘍の腫瘍微小環境内部で起こる。宿主由来の非腫瘍細胞のリプログラミングは、被検者に有効量の腫瘍特異的ＩｇＥ抗体が投与された後に前記腫瘍微小環境内部で、例えば、サイトカイン類および腫瘍特異的ＩｇＥ抗体によって仲介される。一実施形態では、リプログラミングが、腫瘍微小環境内部の三者複合体の形成を含む。一実施形態では、腫瘍微小環境内部で形成された当該三者複合体が、ＩｇＥ抗体と、腫瘍細胞のような表面上に腫瘍関連抗原を持つ細胞または可溶性腫瘍関連抗原と、宿主由来の非腫瘍細胞とからなる。有効量の前記抗体が被検者に投与された後に、前記抗体は、腫瘍関連抗原と、宿主由来の非腫瘍細胞の表面上に存在する抗体受容体とに特異的に結合する。
【００１７】
「腫瘍微小環境」または「腫瘍間質」という用語は、腫瘍細胞を取り囲んで栄養を供給する組織、細胞、分子および血管を意味する。腫瘍の微小環境は動的であり、腫瘍はその微小環境を変化させることができ、当該微小環境は腫瘍がどのように成長し広がるかに影響を与え得る。
【００１８】
一実施形態では、宿主由来の非腫瘍細胞（１個または複数個）が、腫瘍微小環境に対して内在性の常在細胞である。本明細書中で用いられる「腫瘍微小環境に対して内在性」という用語は、「腫瘍間質に対して内在性」という用語と互換的に用いることができ、腫瘍病巣に介在するまたは腫瘍病巣を取り囲む細胞種の動的区画の１個以上の細胞を意味し、結合組織、血管系、および、時折変化するが腫瘍細胞それ自体をも含む炎症性細胞が挙げられるが、これらに限定されない。宿主由来の腫瘍間質の他の非腫瘍細胞としては、繊維芽細胞および血管細胞（例えば、間葉由来の細胞（繊維芽細胞、血管前駆細胞、内皮細胞、脂肪細胞およびその前駆体、ならびに血管内皮細胞など）が挙げられるがこれらに限定されない）、可変表現型の骨髄由来細胞（例えば、肥満細胞、好塩基球、単球マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、血小板、およびそれらの前駆体  が挙げられるがこれらに限定されない）、ならびに浸潤性リンパ球（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる）も挙げられる。本明細書中では、アレルギーエフェクター細胞および／または骨髄サプレッサー細胞も、まとめて骨髄由来細胞または骨髄系列細胞と呼ばれる。
【００１９】
好ましい実施形態では、抗体が、ヒトＦｃイプシロン定常領域を含む。好ましい一実施形態では、ＩｇＥ抗体が、ＣＡ１２５、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、およびＰＳＡに特異的な抗体である。
【００２０】
本明細書で用いられる「被検者」は、機能し得る肥満細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞を有する哺乳動物などの、ヒト患者またはその他の動物である。ヒトでは、これら細胞全部が、投与される本発明のＩｇＥ抗体に対する高親和性受容体を発現する。
【００２１】
時には、本発明のＩｇＥ抗体は、転移としても知られる、当該原発性腫瘍部位から離れた部位への原発性腫瘍からの拡散を阻害することにも用いることができる。このような追加の腫瘍部位は、それらが原発性腫瘍部位からの転移の結果である場合に、時に、二次腫瘍部位、三次腫瘍部位、四次腫瘍部位、または高次腫瘍部位と呼ばれる。原発性腫瘍は、肝臓、肺、および骨などの種々の組織および器官の内部に最初に微小環境を誘発するに違いない循環癌細胞を放出する。これらは、最終的に、臨床的におよびレントゲン写真上で顕在化する転移を引き起こす。主として血管区画内部に固有の生態環境の一部として留まるＩｇＧ抗体とは異なり、ＩｇＥ抗体は、脈管性間隙の外に出て、体内の全組織へ移動する。
【００２２】
一実施形態では、宿主由来の、腫瘍微小環境に対して内在性の非腫瘍細胞のリプログラミングは、循環癌細胞によって形成される二次、三次、四次、または高次の腫瘍部位の微小環境内部で起こる。第二の実施形態では、細胞のリプログラミングは、有効量の腫瘍特異的抗体が被検者に投与されると、二次、三次、四次、または高次の腫瘍部位の微小環境内部で腫瘍特異的抗体によって仲介される。
【００２３】
一実施形態では、宿主由来の非腫瘍細胞が、腫瘍微小環境に対して内在性である、骨髄由来サプレッサー細胞である。好ましい実施形態では、骨髄由来サプレッサー細胞が、肥満細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞から、独立して選択される。一実施形態では、宿主由来の非腫瘍細胞が、間葉由来のものであり、線維芽細胞、血管前駆細胞、内皮細胞、脂肪細胞、およびそれらの前駆体である。
【００２４】
本発明者らは、本発明の抗体が腫瘍拒絶を仲介することができることも見出した。その効果は、ＩｇＥおよび腫瘍関連細胞表面抗原によって活性化された骨髄由来細胞によって仲介されることが示された。腫瘍の殺傷は、ＩｇＥ抗体と、腫瘍微小環境における骨髄由来細胞の存在と、マクロファージ、好酸球に対するケモカイン走化性との局所的効果の結果であった。一実施形態では、本発明のＩｇＥ抗体を用いて、転移が起こった後に、二次、三次、四次、または高次微小環境部位で腫瘍細胞の死を誘導することができる。第二の実施形態では、二次、三次、四次、または高次微小環境部位での腫瘍細胞の死が、当該微小環境部位に存在するサイトカインのパターンの変化および非腫瘍細胞の活性化状態の変化によって仲介され、それら変化は全て、当該微小環境内部の腫瘍特異的抗体に応答して起こる。好ましい実施形態では、腫瘍細胞の死が、当該微小環境内部での三者複合体の形成を必要とし、該三者複合体は、ＩｇＥ抗体と、標的抗原を持つ腫瘍細胞と、非腫瘍細胞とからなる。具体的に、有効量の該抗体が被検者に投与されると、該ＩｇＥ抗体は、該腫瘍細胞の表面上に存在する抗原と、該非腫瘍細胞の表面上に存在する抗体受容体とに対して特異的に結合する。別の実施形態では、当該非腫瘍細胞が、骨髄由来サプレッサー細胞である。好ましい実施形態では、該骨髄由来サプレッサー細胞が、肥満細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞から独立して選択される。好ましい実施形態では、ＩｇＥ抗体が好ＭＵＣ１のＩｇＥである。
【００２５】
本発明者らは、更に、本発明の抗体を用いて、患者における、原発性固形腫瘍または転移した細胞または腫瘍の成長速度を低減することができることを見出した。一実施形態では、骨髄由来細胞のリプログラミングが、原発性固形腫瘍または転移した細胞群の腫瘍微小環境内部で起こる。第二の実施形態では、有効量の腫瘍特異的抗体が被検者に投与されると、当該リプログラミングが、前記腫瘍微小環境内部で腫瘍特異的抗原によって仲介される。好ましい実施形態では、当該リプログラミングが、固形腫瘍の微小環境または転移した細胞群または腫瘍の内部での三者複合体の形成を必要とし、該三者複合体は、抗体と、該固形腫瘍または転移した細胞または腫瘍の腫瘍細胞と、非腫瘍細胞とからなり、有効量の該抗体を被検者に投与すると、該抗体は、該腫瘍細胞の表面上に存在する抗原と、該非腫瘍細胞の表面上に存在する抗体受容体とに特異的に結合する。別の実施形態では、該非腫瘍細胞が骨髄由来細胞である。好ましい実施形態では、該骨髄由来細胞が、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞から独立して選択される骨髄系列の細胞である。好ましい実施形態では、該抗体がＩｇＥである。より好ましい実施形態では、該ＩｇＥ抗体が、抗ＭＵＣ１のＩｇＥである。本明細書中で用いられる「被検者」とは、投与された本発明のＩｇＥ抗体に対する受容体親和性を有する機能し得る肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびランゲルハンス細胞を有する、ヒト患者またはその他の動物である。
【００２６】
本明細書中で用いられる、原発性固形腫瘍または転移した細胞または腫瘍の、成長速度の低減または完全な排除は、本技術分野で理解されている通りのことを意味するものと定義される。例えば、成長速度の低減は、所定の腫瘍型についてインビボもしくはインビトロで通常観察される指数関数的成長、比増殖速度、または倍加時間に対する、原発性固形腫瘍、転移した細胞、または転移した腫瘍の指数関数的成長、比増殖速度、または倍加時間の低減を意味する。腫瘍の完全な排除は、症状、理学的検査、もしくはＸ線画像といった検出手法によって腫瘍が存在することが予め示されている場合に、ＩｇＥ抗体の存在下において、症状、理学的検査、もしくはＸ線画像のいずれかによって、腫瘍の存在がないことである。
【００２７】
本発明の「治療的ＩｇＥ抗体」（本明細書中では「本発明のモノクローナルＩｇＥ抗体」とも称される）は、ヒトイプシロン（ε）定常領域を含み、腫瘍微小環境に存在するかまたは治療される腫瘍にごく近接して存在する細胞表面抗原または可溶性癌抗原である腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な少なくとも１つの抗原結合領域も含む、モノクローナル抗体である。本発明のＩｇＥ抗体の治療用量は、癌に対するＩｇＧクラスの抗体療法（例えば、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標)）およびリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標)））に関連する治療用量よりも大幅に低く、これは、ＦｃεＲＩに対するＩｇＥの高親和性のためだけでなく、本発明の方法が、腫瘍微小環境に対して内在性の宿主由来の１個以上の非腫瘍細胞のリプログラミングを含むためでもある。当該ＩｇＥ抗体は、腫瘍環境内部で、固形腫瘍の転移の阻害を促進するカスケード効果を有するようである。このカスケード効果は、本発明のＩｇＥ抗体は標的抗原に対する薬理作用を仲介するために投与される必要がなく、よって、例えば従来のＩｇＧベースのモノクローナル癌療法の場合は必要な、例えばＤＣ２０受容体またはＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を飽和させることを必要としないことを意味する。ＩｇＥ抗体は、脈管性間隙の外に活発に運ばれ、骨髄細胞前駆体状に提示されたＦｃεＲに結合する。このことは、通常は脈管性間隙に留まり、質量作用によって、透過率変化を受けた血管を通過して脈管性間隙を脱出するのみであるＩｇＧ抗体とは対照的である。
【００２８】
本明細書中で用いられる「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）という用語は、本技術分野で既知の、腫瘍に関連し得るいずれかの種類の癌抗原であればよく、腫瘍細胞などの細胞表面上で見られる抗原、および可溶性癌抗原を含む。腫瘍および正常細胞に関して幾つかの細胞表面抗原は、可溶性対応物を有する。そのような抗原として、限定されないが、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）上、腫瘍内皮細胞（ＴＥＣ）上および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）上で見られるものが挙げられる。癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）標的抗原の例としては、限定されないが、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰα）；ならびに、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９などを含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が挙げられる。腫瘍内皮細胞（ＴＥＣ）標的抗原の例としては、限定されないが、ＶＥＧＦＲ−１、２および３を含む、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ＣＤ−１０５（エンドグリン）；ＴＥＭ１およびＴＥＭ８を含む、腫瘍内皮マーカー（ＴＥＭ）；ＭＭＰ−２；サバイビン；ならびに、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）が挙げられる。腫瘍関連マクロファージ抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ１０５；ＭＭＰ−９；ＶＥＧＦＲ−１，２，３およびＴＥＭ８が挙げられる。  
【００２９】
一実施形態では、治療的ＩｇＥ抗体は、非腫瘍細胞上に存在する癌抗原、例えば、ＶＥＧＦＲ−2，ＭＭＰ，サバイビン、ＴＥＭ８およびＰＭＳＡに特異的であってもよい。癌抗原は、上皮性癌抗原（例えば、乳癌、消化管癌、肺癌）、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱癌抗原、肺（例えば、肺小細胞）癌抗原、大腸癌抗原、卵巣癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、腎細胞癌抗原、膵臓癌抗原、肝臓癌抗原、食道癌抗原、または頭頚部癌抗原であってもよい。癌抗原は、リンパ腫抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）、Ｂ細胞リンパ腫癌抗原、白血病抗原、骨髄腫（即ち、多発性骨髄腫もしくは形質細胞骨髄腫）抗原、急性リンパ芽球白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原であってもよい。
【００３０】
その他の癌抗原としては、限定されないが、多発性骨髄腫および幾つかのＢ細胞リンパ腫を含む、膵臓、結腸、乳房、卵巣、肺、前立腺、頭頸部のヒト腺癌の大部分で見られるムチン１タンパク質もしくはペプチド（ＭＵＣ−１）；ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）抗原；肺癌、頭頸部癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、脳癌および膀胱癌に関連する上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗原；アンドロゲン非依存性前立腺癌で広く発現される、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および／または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；黒色腫癌胎児性（ＣＥＡ）抗原に関連するｇｐ−１００（糖タンパク質１００）；ルイスＡ血液型物質に関連し、大腸癌に伴う、糖鎖抗原１９．９（ＣＡ１９．９）；ならびに、ＭＡＲＴ−１のような黒色腫癌抗原が挙げられる。
【００３１】
その他の抗原としては、メソテリン、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、糖鎖抗原１２５（ＣＡ−１２５）およびＮＹＥＳＯ１のような黒色腫関連抗原が挙げられる。
【００３２】
一実施形態では、癌抗原が、細胞表面癌抗原の放出された可溶化型である。好ましい実施形態では、腫瘍関連標的抗原が、厳密には、腫瘍細胞の表面上に存在する細胞表面抗原である。好ましい一実施形態では、腫瘍関連抗原が、ＣＡ１２５、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＣＵ１、およびＰＳＡから選択される。
【００３３】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語または「（複数の）モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。被検宿主がヒトである場合にヒトＦｃイプシロン受容体に結合するために、本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である。ヒト化抗体および完全ヒト抗体は、宿主被検者がヒトである場合に、例えば、キメラ抗体のマウス成分に対する免疫原性を低減することにも有用である。モノクローナル抗体は、限定されないが、例えば、組換え技術および合成技術などの標準的な技術によって調製することができる。  
【００３４】
「キメラモノクローナル抗体」という用語は、１の抗体に由来する１以上の領域と別の抗体に由来する１以上の領域とを有し、単一の結合特異性を示す抗体を指す。本発明の一実施形態では、定常領域が、ヒトイプシロン（ε）定常領域（重鎖）およびヒトカッパまたはラムダ（軽鎖）定常領域に由来する。本発明のキメラＩｇＥモノクローナル抗体の可変領域は、典型的には、げっ歯類、例えば、マウス、ウサギ、ラットまたはハムスターなどの非ヒト由来のものである。
【００３５】
本明細書で用いられる「ヒト化」モノクローナル抗体は、ヒトイプシロン定常領域（重鎖）およびヒトカッパまたはラムダ（軽鎖）定常領域に由来する定常領域を含む。当該抗体の可変領域は、好ましくは、ヒト由来の骨格と非ヒト由来の抗原結合領域（ＣＤＲ）とを含む。
【００３６】
完全ヒト抗体またはヒト様抗体は、アブジェニックス（Ａｂｇｅｎｉｘ）社（カリフォルニア州サウザンドオークス）およびメダレックス（ＭｅｄａＲｅｘ）社（ニュージャージー州プリンストン）で作られているマウス系統などの遺伝子組み換え動物のワクチン接種によって産生してもよく、当該ワクチン接種は、ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーを含み、ワクチン接種に応答して完全ヒト抗体を産生する。更に、抗原スクリーニングアッセイで特定および選択され得るヒト可変領域のコード領域を組み込んだファージディスプレイライブラリーを使用して、標的抗原に結合するヒト免疫グロブリン可変領域を産生することができる。
【００３７】
「抗原結合領域」という用語は、本発明の抗体のうちの、抗原と相互作用して当該抗体に当該抗原に対する特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含有する部分を指す。当該抗体領域は、抗原結合残基の厳密な確認を維持するために必要な「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。
【００３８】
「抗原」は、抗体が結合することができ、さらには、動物に当該抗原のエピトープに結合することができる抗体の産生を誘導することが出来る、分子またはその一部である。抗原は、同一または異なる１以上のエピトープを有し得る。好ましい実施形態では、本発明の抗体が、ただ一つのエピトープに特異的である。好ましい一実施形態では、抗原は、本発明のＩｇＥ抗体によって結合されて、腫瘍微小環境をリプログラミングすることができる骨髄エフェクター細胞と組み合わさって免疫複合体を形成し、腫瘍の成長または転移を阻害または予防することができる。一実施形態では、抗原は、そのままでは、幾つかの理由、例えば、当該抗原が通常は免疫系によって応答が必要であると認識されない「自己」抗原であるため、あるいは免疫系が当該抗原に対して寛容性となり免疫応答を開始しないため、免疫応答を刺激できない場合がある。別の実施形態では、抗原がＭＵＣ１である。
【００３９】
「エピトープ」という用語は、抗体の１つ以上の結合領域で当該抗体が認識し結合することができる抗体の一部分を指すことを意図されている。エピトープは、一般に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団を含み、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。一実施形態では、抗原のエピトープが反復エピトープである。一実施形態では、抗原のエピトープが、非反復エピトープである。
【００４０】
「三者複合体」は、腫瘍の微小環境で形成される、本発明のＩｇＥ抗体と、細胞表面腫瘍関連標的抗原と、宿主由来の非腫瘍細胞とからなる複合体であり、そこでは本発明のＩｇＥ抗体が、腫瘍関連抗原と、非腫瘍細胞の表面に存在する抗体受容体とに特異的に結合している。
【００４１】
好ましい一実施形態では、抗原が、ＣＡ−１２５、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１またはＰＳＡである。一実施形態では、前記非腫瘍細胞がエフェクター細胞である。一実施形態では、前記エフェクター細胞が、骨髄系列のアレルギー性および／または抗寄生虫性エフェクター細胞である。好ましい実施形態では、ＩｇＥが抗ＭＵＣ１のＩｇＥである。好ましい実施形態では、抗体受容体がＦｃεＲＩである。
【００４２】
一実施形態では、三者複合体が、可溶性癌抗原に結合したＩｇＥ抗体と、宿主由来の非腫瘍細胞の表面に存在する抗体受容体とを含む。好ましい実施形態では、前記三者複合体が、腫瘍細胞の表面上に発現された腫瘍関連標的抗原に結合したＩｇＥ抗体と、腫瘍微小環境に対して内在性である、宿主由来の非腫瘍細胞とを含む。
【００４３】
抗原に対するマウス抗体などの抗体を産生する方法、および選択した抗体がユニークな抗原エピトープに結合するかを決定する方法は、本技術分野で周知である、
【００４４】
所望の抗体のスクリーニングは、本技術分野で既知の技術、例えば、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量検定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定法、インサイチュ免疫測定法（例えば、金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いるもの）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどによって、成し遂げることができる。本技術分野では免疫測定法における結合を検出する数多くの手法が既知であり、これらは本発明の範囲内に含まれる。
【００４５】
モノクローナル抗体の調製のために、培養物中の連続細胞株によって抗体分子の生産を提供するいずれの技術を用いてもよい（例えば、「抗体-研究室マニュアル」ハーローおよびレーン編、コールドスプリングハーバー研究所出版：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８８年）。これらとしては、特に限定されないが、元々はケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって開発されたハイブリドーマ技術（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズボー(Ｋｏｚｂｏｒ)ら、1983, Immunology Today, 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶハイブリドーマ技術（コール(Cole)ら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。本発明の更なる実施形態では、モノクローナル抗体が、最近の技術（PCT/US90/02545）を利用して無菌動物で生産することができる。本発明によると、ヒト抗体を使用してもよく、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを用いて（コート(Cote)ら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:2026-2030）またはインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することによって（コール(Cole)ら、1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96）得ることが出来る。事実、本発明によれば、ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生理学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（モリソン(Morrison)ら1984, J. Bacteriol. 159: 870; ニューベルガー(Neuberger)ら、1984, Nature 312:604-608; タケダ(Takeda)ら、1985, Nature 314: 452-454）を用いることができる；このような抗体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４６】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、配列番号２を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、およびそれらの組み合わせから選択される核酸配列を含むＩｇＥモノクローナル抗体であり、ここで前記重鎖および軽鎖は、それぞれヒトイプシロン重鎖遺伝子およびヒトカッパ軽鎖遺伝子につなぎ合わせられる。
【００４７】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号４の核酸によってコードされる軽鎖可変領域、配列番号４の核酸によってコードされる軽鎖可変領域、およびそれらの組み合わせから選択される核酸配列を含むＩｇＥモノクローナル抗体であり、前記重鎖および軽鎖は、それぞれ、ヒトイプシロン重鎖遺伝子およびヒトカッパ軽鎖遺伝子につなぎ合わせられる。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、ＶＵ−３Ｃ６ハイブリドーマからクローニングされ、ヒトＩｇカッパ軽鎖遺伝子およびヒトイプシロン重鎖遺伝子にそれぞれつなぎ合わされたＩｇＧの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体３Ｃ６.ｈＩｇＥを提供する。ＶＵ−３Ｃ６は、腺上皮から生じる腫瘍上に過剰発現されたムチンの低グリコシル化形態である、ヒトムチン１（ｈＭＵＣ１）を標的とする。一実施形態では、本発明は、３Ｃ６.ｈＩｇＥが特異的であるＭＵＣ１アイソフォームとは異なるＭＵＣ１のアイソフォームに特異的であるＩｇＥ抗体４Ｈ５.ｈＩｇＥを含む。
【００４９】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、配列番号２を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体３Ｃ６.ｈＩｇＥである。
【００５０】
一実施形態では、本発明の抗体は、モノクローナル抗体４Ｈ５.ｈＩｇＥである。当該抗体４Ｈ５.ｈＩｇＥは、ヒトカッパ軽鎖遺伝子およびヒトイプシロン重鎖遺伝子につなぎ合わされた、配列番号３の核酸によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号４の核酸によってコードされる軽鎖可変領域とを有する。
【００５１】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＭＵＣ１のエピトープに特異的なＩｇＥモノクローナル抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、ＭＵＣ１のアミノ酸STAPPAHGVTSAPDTRPAPG［配列番号５］を含むＭＵＣ１のエピトープに特異的である。正確なエピトープは、ＭＵＣ１の外部ドメインを特徴付ける前記２０アミノ酸の繰り返しのうちの１つにある。一実施形態では、本発明の抗体は、STAPPAHGVTSAPDTRPAPG［配列番号５］で規定されるエピトープでＭＵＣ１に結合することが出来る。
【００５２】
一実施形態では、本発明による抗体は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロットによって特定される陽性トランスフェクトーマによって発現される。前記陽性トランスフェクトーマは、最高の生産性のための制限希釈によってクローニングされ、抗体生産のために選択される。本明細書で用いられるように「トランスフェクトーマ」としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＮＳ／Ｏ骨髄細胞のような、抗体を発現している組換え真核生物宿主細胞が挙げられる。そのようなトランスフェクトーマ手法は、本技術分野で周知である（モリソン(Morrison), S. (1985) Science, 229:1202）。以前に出版された、マウス／ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体の作製に用いられた手法は、様々なヒトキメラ抗体または抗体融合タンパク質を良好な生産量で産生する（エルゲラ(Helguera)G, ペニチェット(Penichet) ML., Methods Mol. Med. (2005) 109:347-74）。
【００５３】
一般に、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体（すなわち、キメラ抗体）は、本技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化して、マウスＦｃをコードする領域を取り除き、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の等価部分で置き換える。（ロビンソン(Robinson)ら、PCT条約に基づく国際特許出願第PCT/US86/02269号公報; アキラ(Akira)ら、欧州特許出願公開第184,187号; タニグチ(Taniguchi), M., 欧州特許出願公開第171, 496号; モリソン(Morrison)ら、欧州特許出願公開第173,494号; ニューベルガー(Neuberger)ら、国際公開第86/01533号; キャビリー(Cabilly)ら、米国特許第4,816,567号; Cabillyら、欧州特許出願公開第125,023号; ベター(Better)ら、(1988 Science, 240:1041-1043); リュウ(Liu)ら、(1987) PNAS, 84:3439-3443; リュウら、1987, J. Immunol., 139:3521-3526; サン(Sun)ら、(1987) PNAS, 84:214-218; ニシムラ(Nishimura)ら、1987, Canc. Res., 47:999-1005; ウッド(Wood)ら、(1985) Nature, 314:446-449; およびショウ(Shaw)ら、1988, J. Natl Cancer Inst., 80:1553-1559を参照のこと。）
【００５４】
前記キメラ抗体は、抗原結合に直接は関与しない前記Ｆｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変領域由来の等価配列と置き換えることによって、更にヒト化することができる。ヒト化キメラ抗体の概評は、モリソン(Morrison), S. L.,(1985, Science, 229:1202-1207)およびオオイ(Oi)ら(1986, BioTechniques, 4:214)によって提供されている。これらの方法は、少なくとも重鎖または軽鎖の一方に由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全部または一部をコードする核酸配列の単離、操作、および発現を含む。これら核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば、７Ｅ３、抗ＧＰ ＩＩｂＩＩＩａ抗体産生ハイブリドーマから得てもよい。キメラ抗体をコードする組換えＤＮＡまたはその断片は、次いで適切な発現ベクターにクローニングすることができる。あるいは、適切なヒト化抗体をＣＤＲ置換（米国特許第5,225,539号; ジョーンズ(Jones)ら、1986 Nature, 321:552-525; ヴェルホーイェン(Verhoeyan)ら、1988 Science, 239:1534; およびベイドゥラー(Beidler)ら、1988 J. Immunol., 141:4053-4060）によって生産することができる。
【００５５】
一実施形態では、本発明のＩｇＥモノクローナル抗体の免疫原性は、例えば、様々な戦略を用いて、当該抗体を生成した親抗体と比較して低減されている。例えば、ヒトＦｃε定常領域とマウス可変領域とを含む本発明のキメラＩｇＥモノクローナル抗体は、ヒト被検者に対して、ヒトＦｃε由来の定常領域とヒト由来のフレームワークおよび非ヒト由来の抗原結合領域を含む可変領域とを含み親キメラ抗体と同じ抗原特異性を維持する遺伝子組換えヒト化抗体よりも、低減された免疫原性を有する場合がある。あるいは、親キメラＩｇＥモノクローナル抗体と同じ抗原特異性を持つ完全ヒト抗体またはヒト様抗体を、既知の手法を用いて遺伝子組み換えにより得ることもできる。        
【００５６】
本発明のＩｇＥモノクローナル抗体の免疫原性を低減する他の方法としては、限定されないが、ＤＥ−ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮなど（商標；英国アバディーンのＢｉｏｖａｔｉｏｎ社、および独国ダルムシュタットのメルクＫｇａＡ）の方法が挙げられる。この技術は、ヒトで「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）または「ヒト抗キメラ抗体」（ＨＡＣＡ）のような免疫原性を引き起こし得るマウスまたはキメラモノクローナル抗体上に存在するマウスエピトープを特定する方法である。この方法は、更に、これらエピトープを遺伝的に改変して、免疫原性を回避する、またはこの方法に供されなかった抗体と比較して免疫原性を少なくとも低減する。
【００５７】
モノクローナル抗体の免疫原性を低減する他の方法（ラザー(Lazar)ら、Mol Immunol., 44, 1986-1998 (2007)）は、フレームワークと、Ｔヘルパー細胞を活性化してＨＡＭＡ応答もしくはＨＡＣＡ応答をもたらし得る抗原結合領域ペプチドまたは立体構造モチーフとを特定する。この方法を用いると、マウス可変領域の「ヒトらしさ」を決定することに新規な定量パラダイムが用いられ、低いヒト同一性のマウス領域を高いヒト同一性の領域の代わりに用いることにより、当該抗体の免疫原性を低減することができる。  
【００５８】
本明細書で用いられるように、ＩｇＥ仲介性免疫応答の誘導は、下記の１つ以上を含む：
（ｉ）骨髄由来細胞のリプログラミングが腫瘍の転移を阻害または予防するように、骨髄由来細胞と腫瘍特異的抗原とに対するＩｇＥ抗体の結合を含む、腫瘍微小環境内部または腫瘍細胞上での三者複合体の形成；
（ｉｉ）前記抗原／ＩｇＥ免疫複合体によって、特に腫瘍微小環境で、刺激されて、そのような免疫複合体にＩｇＥ抗体受容体であるＦｃεＲＩおよび／またはＦｃεＲＩＩを介して結合した肥満細胞および好塩基球が分解し、例えば、ヒスタミンの放出をもたらすことによって証拠付けられる、過敏症型応答；
（ｉｉｉ）ＩｇＥ抗体受容体ＦｃεＲＩおよび／またはＦｃεＲＩＩを介して前記抗原／ＩｇＥ抗体免疫複合体に結合した場合に、好酸球、肥満細胞、好塩基球、およびその他の細胞を刺激して炎症性サイトカイン、プロテアーゼおよび血管作用性脂質メディエータ（例えば、ロイコトリエン、プロスタグランジンＤ２、および血小板活性化因子）を放出することによって証拠付けられる、前記抗原／ＩｇＥ免疫複合体に対する、特に腫瘍微小環境での、ＡＤＣＣ免疫応答、ＡＤＣＰ免疫応答、またはＡＤＣＣ免疫応答とＡＤＣＰ免疫応答との両方を介する、腫瘍細胞の直接ターゲティング；
（ｉｖ）抗原、抗原／ＩｇＥ抗体免疫複合体、またはＭＨＣと複合体形成している抗原のペプチドに特異的であるＴ細胞の産生によって一部証拠付けられる、適応細胞性応答；
（ｖ）例えば、腫瘍抗原および腫瘍に特異的なＣＤ８ＩＦＮガンマ陽性Ｔ細胞の産生によって証拠付けられる、抗原／ＩｇＥ抗体免疫複合体での曝露に応答した、Ｔｈ１／Ｔｃ１免疫応答；
（ｖｉ）抗原または抗原／ＩｇＥ免疫複合体に対する新規な内在性抗体の産生によって証拠付けられる、体液性応答。
【００５９】
本明細書で用いるように、本発明のＩｇＥモノクローナル抗体の「有効量」は、細胞表面抗原であるＴＡＡのエピトープを認識し結合して、本発明による当該免疫応答を誘導し、引き起こし、または強めることに充分な量である。
【００６０】
本発明は、循環腫瘍細胞上の細胞表面抗原に対するＩｇＥ仲介性免疫応答を、当該応答を開始することができる被検者において誘導する方法も提供する。前記方法は、循環腫瘍細胞抗原の表面のエピトープに特異的に結合して当該腫瘍に対するＩｇＥ仲介性免疫応答をもたらす有効量のＩｇＥモノクローナル抗体を被検者に投与することを含む。
【００６１】
本明細書中で用いるように、循環腫瘍細胞上の細胞表面抗原によって引き起こされるＩｇＥ仲介性免疫応答の誘導、または臨床上明らかでない転移は、下記のいずれか１つによって、一部証拠付けられる：
（ｉ）全体または一部において、腫瘍微小環境における骨髄由来細胞のリプログラミングによって生じる、腫瘍成長の阻害および／または腫瘍破壊の促進；
（ｉｉ）モノクローナルＩｇＥ抗体に結合できるヒトＦｃε受容体を持つエフェクター細胞、ならびに腫瘍微小環境の抗原に対する直接のＡＤＣＣ免疫応答、ＡＤＣＰ免疫応答、もしくはＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ両免疫応答の反応を介する、腫瘍環境における急性炎症およびそれに続く腫瘍の成長阻害および／または破壊；
（ｉｉｉ）標的腫瘍抗原または腫瘍に由来し腫瘍細胞上でＭＨＣとの関連で発現される二次的な追加抗原に対する特異性を示して、腫瘍の成長阻害もしくは溶解もしくは破壊を生じるＴ細胞の出現によって証拠付けられる、二次Ｔ細胞応答；または
（ｉｖ）上記（ｉｉ）で溶解された腫瘍細胞に関連する他の抗原に対するＴ細胞の産生によって証拠付けられる、腫瘍に対するＴ細胞応答。
【００６２】
本発明は、原発性腫瘍の表面上のＴＡＡに対して、もしくは循環転移腫瘍細胞の表面上のＴＡＡに対して、直接ＩｇＥ仲介性ＡＤＣＣ免疫応答、ＡＤＣＰ免疫応答、またはＡＤＣＣとＡＤＣＰ両免疫応答を、それら免疫応答を開始することが出来る被検者において誘導する方法も提供し、該方法は、循環抗原のただ１つのエピトープに特異的に結合する有効量のＩｇＥモノクローナル抗体を該被検者に投与することを含み、該抗原に対してＩｇＥ仲介性ＡＤＣＣ免疫応答と場合によりもしくは任意によりＡＤＣＰ免疫応答とが誘発される。好ましい実施形態では、腫瘍または腫瘍細胞の微小環境において、前記ＡＤＣＣ免疫応答と場合によりもしくは任意によりＡＤＣＰ免疫応答とが誘発される。別の実施形態では、前記ＡＤＣＣ免疫応答と場合によるもしくは任意によるＡＤＣＰ免疫応答とが、副次的バイスタンダー効果を介して腫瘍微小環境内部の腫瘍細胞または腫瘍細胞の溶解および殺傷を引き起こすことが出来る。
【００６３】
本発明は、腫瘍関連抗原の少なくとも１つの単一エピトープに特異的に結合する本発明のＩｇＥモノクローナル抗体を含む組成物を投与することによって、本発明の抗体が特異的である該抗原に関連する癌を治療する方法も提供する。そのような癌としては、限定されないが、膵臓癌、胃癌（胃の癌）、大腸癌、および肺癌が挙げられる。本発明の前記方法によって治療し得るその他の種類の癌としては、限定されないが、骨肉腫、食道癌、肺癌、中皮腫、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管癌、脳腫瘍、胆嚢癌、胆管腫、胆道癌、腎臓癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、喉頭癌、咽頭癌、筋肉腫、皮膚癌などが挙げられる。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、ＭＵＣ１のエピトープに特異的に結合する本発明の治療的ＩｇＥモノクローナル抗体を被検者に投与することによる、被検者における上皮由来の癌の治療方法を提供する。好ましい実施形態では、ＭＵＣ１のただ一つのエピトープに結合する本発明の前記治療的ＩｇＥモノクローナル抗体が、原発性腫瘍における腫瘍微小環境をリプログラミングすることによって腫瘍の転移を阻害もしくは予防し、または、腫瘍の原発組織の外側で腫瘍の成長を促進する宿主由来骨髄細胞のネットワークの確立を妨げることによって臨床上もしくはＸ線写真上明らかな転移の確立を予防する。
【００６５】
一実施形態では、「腫瘍微小環境をリプログラミングする」という用語は、腫瘍に内在する宿主由来骨髄細胞上、または続いて前記腫瘍内に引き込まれるアレルギー性エフェクター細胞上の、抗原結合ＩｇＥの、腫瘍の成長および転移に関する正味の効果を意味する。腫瘍微小環境の領域内に存在する抗原と宿主由来細胞上の高親和性ＦｃεＲＩとの両方に一旦結合すると、症状、理学的検査、もしくはＸ線画像によって証拠付けられるように、腫瘍が転移を形成しないように腫瘍の挙動が変化させられる。一実施形態では、腫瘍微小環境のリプログラミングは、三者複合体の形成によって促進される。一実施形態では、前記三者複合体が、ＩｇＥ抗体と、エフェクター細胞と、腫瘍関連抗原とからなる。
【００６６】
本発明は、医薬組成物も提供する。当該組成物は、治療上有効量の本発明の抗体と、医薬として許容される担体とを含む。好ましい一実施形態では、前記医薬組成物が、ＭＵＣ１のただ一つのエピトープに特異的に結合する本発明の治療的ＩｇＥモノクローナル抗体を含む。
【００６７】
一実施形態では、「医薬として許容される」という用語は、連邦もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または米国薬局方もしくは動物に、より具体的にはヒトに使用される他の一般的に承認された薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、それを用いて治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬上の担体は、水および油類（石油、動物、植物または合成由来の油類、例えば、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む）のような滅菌液とすることができる。前記医薬組成物が静脈内投与される場合は、水が好ましい担体である。生理食塩水ならびにブドウ糖およびグリセロール水溶液も、特に注射剤用の、液状担体として用いることができる。適切な医薬上の賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、演歌ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。前記医薬組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの医薬組成物は、液剤、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態をとることができる。前記医薬組成物は、トリグリセリドのような、既存のバインダーおよび担体を用いて、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．マーティン著「レミントンの薬学」に記載されている。このような医薬組成物は、患者にとって適性投与形態を提供できるように、治療上有効量の抗体またはその断片を、好ましくは精製形態で、適量の担体と一緒に含有する。処方は、投与方法に適合させるべきである。
【００６８】
本発明の方法によると、本発明のＩｇＥモノクローナル抗体を含む医薬組成物は、免疫学的に適切なあらゆる経路によって患者に投与することができる。例えば、前記抗体は、静脈内経路、皮下経路、腹腔内経路、髄腔内経路、膀胱内経路、皮内経路、筋肉内経路、またはリンパ管内経路によって、患者に導入することができる。前記医薬組成物は、液剤、錠剤、エアロゾル剤、または多相製剤の形態であってもよい。リポソーム、長期循環リポソーム、免疫リポソーム、生分解性ミクロスフェア、ミセルなどを、担体、ビヒクル、または送達システムとして用いることもできる。更に、本技術分野で周知のエクスビボ手法を用いて、患者の血液または血清を該患者から取り出すことができる；任意により、該患者の血液中の前記抗原を精製することが所望されてもよい；次いで、該血液または血清を、本発明の結合剤を含む組成物と混合することができる；このように処理した血液または血清を該患者に戻す。本発明は、結合剤を患者に導入する特定の方法のいずれにも限定されるべきでない。
【００６９】
好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、常法に従い、人間への静脈内投与に適した医薬組成物として調剤される。典型的には、静脈内投与用組成物は、無菌等張水性干渉液に含まれる液剤である。前記医薬組成物が点滴によって投与される場合、医薬品グレードの滅菌水または生理食塩水を含有する輸液ボトルで投与してもよい。前記医薬組成物が注射によって投与される場合、投与の前に前記成分を混合し得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを準備してもよい。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、中性型または塩形態として調剤してもよい。医薬として許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するような陰イオンで形成されるもの、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ化リンなどに由来するような陽イオンで形成されるものが挙げられる。
【００７１】
本発明の抗体が特異的である抗原に関連する腫瘍転移の治療、阻害および予防に有効であろう本発明の医薬組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。脈管性間隙外のＩｇＥ抗体の存在は、精製した抗原（例えば、ＭＵＣ１）の皮内投与に応答した、標準的な皮膚の膨疹および炎症応答によって検定することができる。更に、任意によりインビトロアッセイを用いて、最適用量の範囲を特定することに役立ててもよい。前記医薬組成物で用いられる正確な用量は、投与の経路および疾患または病状の重篤度にも依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定すべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験系から得られる用量−応答曲線から推定してもよい。
【００７２】
本発明の抗体について、患者に投与される用量は、典型的には、患者の体重に対して０．００１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される用量は、患者の体重に対して０．０１μｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは患者の体重に対して０．０２μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇである。一般に、本発明のＩｇＥモノクローナル抗体は、他の種由来の抗体よりも、ＦｃεＲに対して非常に高い親和性（例えば、ＩｇＧ抗体と比べて）と、ヒト体内での長い半減期とを有する。よって、多くの場合、低用量の本発明の抗体をより少ない頻度での投与が見込まれる。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち、他の薬剤と併用して投与することもできる。例えば、併用療法は、本発明の医薬組成物を、少なくとも１種の他の抗腫瘍薬、有効性増強剤、および／または安全性増強剤と共に含むことができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、インビトロおよびインビボの診断有用性および治療有用性を有する。例えば、これら分子を培養中の細胞に、例えば、インビトロもしくはエクスビボで、または被検者に例えばインビボで、投与して癌を治療することができる。本明細書中で用いられる「被検者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。好ましい被検者は、癌を患っている人間の患者である。本明細書中で用いられる、癌を「治療する」ならびに癌の「治療（法）」および「療法」という用語は、次のことを含む：患者の腫瘍の転移の出現を予防すること；患者の癌の発症を阻害すること；転移性癌または原発器官に局在した癌を患う患者の既存の全身腫瘍組織量を除去することまたは低減すること；癌患者の生存期間を延長すること；化学療法および／または外科手術での初期治療の後の癌患者の寛解期を延長すること；および／または患者において癌の寛解と癌の再発との間の期間を延長すること。
【００７５】
本明細書中で用いるように、本発明の文脈上「阻害する」、「阻害」または「阻害すること」は、遅らせること、妨げること、抑えること、低減すること、または防ぐことを意味する。例えば、原発性腫瘍細胞の「転移を阻害すること」は、本明細書中で、原発性腫瘍細胞が転移することを、遅らせること、妨げること、抑えること、低減すること、または防ぐことを意味する。
【００７６】
本明細書中で用いるように、「投与（すること）」は、本発明の抗体を含有する組成物を所定の細胞、細胞群、または組織へ曝露することまたは接触させることを生じるあらゆる動作を指す。本明細書中で用いるように、投与は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行われ得る。例えば、組成物は、注射または内視鏡によって投与されてもよい。本発明の組成物の細胞への直接施用は、投与も含む。例えば、外科手術の過程の間に腫瘍細胞を暴露させてもよい。本発明の実施形態によると、それら曝露された細胞（または腫瘍）は、例えば、該外科手術部位および／もしくは該細胞の洗浄もしくは灌注によって、またはＩｇＥ生成物それ自体の腫瘍内直接注射によって、本発明の組成物に直接的に曝露され得る。
【００７７】
癌の治療の治療法に用いられる場合、本発明の抗体は、治療上有効量（すなわち、原発部位または離れた部位のいずれかで、将来のいずれかの時点に、臨床的に明らかな腫瘍の治療または臨床的に明らかな腫瘍の出現の予防に必要な量）で患者に投与される。本発明の抗体およびそれを含む医薬組成物は、通常は非経口的に、または可能であれば、標的細胞部位で、または静脈内に投与され得る。
【００７８】
別の実施形態では、本発明のＩｇＥ抗体は、第二治療剤、例えば、化学療法剤と共に共投与することができる。そのような治療剤としては、中でも、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、パクリタキセル、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドのような抗腫瘍薬が挙げられる。これら治療剤は、それ単独では、患者にとって毒性または準毒性のレベルで有効であるだけである。更に、これら治療剤は、通常の、原発組織の外側に広がった固形腫瘍には治療効果がないと考えられている。腫瘍特異的ＩｇＥ抗体と通常の化学療法剤との共投与による目標は、化学療法耐性の発生を防ぐことにより、また後半では腫瘍微小環境内の宿主由来の非腫瘍細胞の生成物によって、該化学療法剤の活性を増強することであり得る。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、ナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミドおよびイフォスファミド）、アジリジン（例えば、チオテパ）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチンおよびストレプトゾシン）、白金錯体（例えば、カルボプラチンおよびシスプラチン）、非古典的アルキル化剤（例えば、ダカルバジンおよびテモゾラミド）、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、プリン類似体（例えば、フルダラビンおよびメルカプトプリン）、アデノシン類似体（例えば、クラドリビンおよびペントスタチン）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル（単独でまたはロイコボリンと組み合わせて）およびゲムシタビン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、抗腫瘍抗体（例えば、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、微小管薬（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、カンプトテシン類似体（例えば、イリノテカンおよびトポテカン）、酵素（例えば、アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターロイキン２およびインターフェロンα)、モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブおよびベバシズマブ）、組換え毒素および免疫毒素（例えば、組換えコレラ毒素ＢおよびＴＰ−３８）、癌遺伝子療法、物理的療法（例えば、温熱療法、放射線療法、および外科手術）ならびに癌ワクチン（例えば、テロメラーゼに対するワクチン）からなる群より選択される１種以上の化学療法剤を更に含むことができる。
【００８０】
本発明は、下記の非限定的実施例によって、更に説明される。
【実施例】
【００８１】
［実施例１：キメラＩｇＥ遺伝子ベクターの作製］
腺上皮から生じる癌上に過剰発現したムチンであるヒトムチン１（ｈＭＵＣ−１）の２つの異なるアイソフォームに対して、ハイブリドーマＶＵ−３Ｃ６およびＶＵ−４Ｈ５を確立した。抗体可変遺伝子セグメントを、各ハイブリドーマからクローニングしてシークエンシングし、標準的な手法を用いて、ヒトカッパ軽鎖遺伝子セグメントおよびヒトイプシロン重鎖遺伝子セグメントにつなぎ合わせた。ヒト末梢リンパ球からカッパｃＤＮＡをクローニングし、次いで、その配列をデータベースの配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ００２４１．１）と比較した。イプシロン定常領域ｃＤＮＡをＩｇＥ発現ハイブリドーマ（ＳＫＯ−００７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８０３３−１）からクローニングし、データベースのゲノム配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ００２２２．１）と比較した。これら最終ＩｇＥマウス−ヒトキメラ抗体を３Ｃ６.ｈＩｇＥおよび４Ｈ５.ｈＩｇＥと名付けた。これら最終プラスミドを図１Ａに示す。
【００８２】
ＩＦ５ハイブリドーマは、ｐａｎ−Ｂ細胞マーカーであり、Ｂ細胞リンパ腫および幾つかの自己免疫疾患の治療のための重要な治療標的である、ヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）を標的とする。抗体可変遺伝子セグメントを、１Ｆ５ハイブリドーマからクローニングして、上述するような標準的な手段を用いて、ヒトＩｇのカッパ軽鎖遺伝子およびイプシロン重鎖遺伝子につなぎ合わせた。最終ＩｇＥキメラ抗体を１Ｆ５.ｈＩｇＥと名付けた。最終プラスミドを図１Ａに示す。
【００８３】
抗体の生産および精製のため、前記最終プラスミドをＣＨＯ−Ｋ１細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関、バージニア州マナサス）に形質移入させた。ヒトＩｇＥを、高速タンパク質エキタイクロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）で抗ｈＩｇＥ親和性カラムを用いて精製した。図１Ｂは、精製したキメラＩｇＥと、ヒトＩｇＥアイソタイプコントロール（同様に精製した、ヒト骨髄ＳＫＯ−００７由来のＩｇＥ）とのＳＤＳ−ＰＡＧＥ比較を示す。キメラ抗体の全３サンプルは、精製され、コントロールｈＩｇＥと比較して少しのサイズの相違を有する（恐らくはグリコシル化パターンの相違に因る）。還元条件下では、イプシロン重鎖は７５ｋＤａに移動し、５０ｋＤａポリペプチドとして移動するガンマ重鎖とは異なる。
【００８４】
それら精製した抗体を、それらの各々の天然抗原（即ち、ＣＤ２０およびＭＵＣ１）に結合する能力について試験した。フローサイトメトリーで解析したように、１Ｆ５.ｈＩｇＥは、ヒトＣＤ２０を形質移入したＡ２０マウスＢ細胞リンパ腫に結合したが、野生型細胞株に結合しなかった（図１Ｃ左パネル）。同様に、３Ｃ６.ｈＩｇＥは、ヒトＭＵＣ１を形質移入した４Ｔ１マウス乳癌細胞に結合したが、未形質移入４Ｔ１細胞には結合しなかった（図１Ｃ中央パネル）。ＥＬＩＳＡで検出したように、４Ｈ５.ｈＩｇＥは、ヒトＭＵＣ−１のタンデムリピート細胞外ドメイン由来の５０ｍｅｒのペプチドに結合したが、コントロールペプチドには結合しなかった（図１Ｃ右パネル）。このように、ヒトイプシロン定常領域およびヒトカッパ定常領域の使用ならびに生産および精製プロトコルは、本来のマウス抗体の可変領域による抗原認識に影響しなかった。
【００８５】
［実施例２：１Ｆ５.ｈＩｇＥ（抗ｈＣＤ２０）によるＩｇＥ仲介性腫瘍細胞毒性］
抗ｈＣＤ２０キメラ抗体１Ｆ５.ｈＩｇＥが、機能し得るＩｇＥ Ｆｃ領域を有するかを決定するため、臍帯血由来の肥満細胞（ＣＢＭＣ）を活性化する能力を調べた。ＣＢＭＣ活性化の尺度としてインターロイキン８（ＩＬ−８）を用いて、１Ｆ５.ｈＩｇＥで予め被覆したＣＢＭＣは、ｈＣＤ２０形質移入マウスＢ細胞（Ａ２０.ｈＣＤ２０）の存在下でＩＬ−８を産生したが、未形質移入細胞の存在下では産生しなかったことを観察した。同様に、抗ｈＣＤ２０ ＩｇＥ（１Ｆ５.ｈＩｇＥ）で被覆したＣＢＭＣのみがｈＣＤ２０＋ヒトＢ細胞ＯＣＩ-Ｌｙ８に応答した一方で、コントロールＩｇＥ（ＳＫＯ）で被覆したＣＢＭＣはこれら条件化でＩＬ−８を産生できなかった。これらデータは、１Ｆ５.ｈＩｇＥが抗原依存的かつ抗原特異的な様式で肥満細胞を活性化することを証明する。
【００８６】
＜肥満細胞およびＩｇＥ仲介性の腫瘍細胞毒性＞
腫瘍特異的ＩｇＥによって仲介される細胞障害効果の可能性を試験するため、抗親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩを発現し応答することが知られているエフェクター細胞に焦点を当てた。以前の研究者らは、ヒト単球および腫瘍特異的ＩｇＥによって仲介される腫瘍細胞毒性を報告した（カラギアニス(Karagiannis)ら、(2003). Eur J Immunol 33:1030-1040）。本発明者らは、独自の系でＵ９３７単球を用いて同様な結果を観察した。この報告において、本発明者らは、ヒト肥満細胞およびヒト好酸球を用いて得られたデータ、２つの細胞種がアレルギーおよび喘息の発症ならびに観察される組織損傷に関与したこと（ローゼンバーグ(Rothenberg)ら、2006 Nat Rev Immunol 8:205-217; グールド(Gould)およびサットン(Sutton). 2008 Nat Rev Immunol 8:205-217; ツァイ(Tsai)ら、2005 Chem Immunol Allergy 87:179-197）に注目する。肥満細胞は、腫瘍が発生する組織に存在し、高レベルのＦｃεＲＩを発現し、活性化されると、潜在的に腫瘍の退縮を仲介し得る好酸球、好中球および他のエフェクターを補充する協調的炎症応答を引き起こす（テオハリデス(Theoharides)およびコンティ(Conti),  2004 Trends Immunol 25:235-241）ため、特に興味深かった。以前には、肥満細胞がＴＮＦおよびペルオキシダーゼ系によって殺腫瘍効果を発揮することが示されている（ヘンダーソン(Henderson)ら、1981 J Exp Med 153:520-533; ベニョン(Benyon)ら、1991 J Immunol 147:2253-2258; オズデミア(Ozdemir), O. 2007 J Immunol Methods 319:98-103）。
【００８７】
活性化した肥満細胞が直接的に腫瘍細胞死を誘導できるかを試験するため、精製し培養した肥満細胞を準備して、ＩｇＥおよび腫瘍と共にインキュベーションした。臍帯血由来の培養した肥満細胞（ＣＢＭＣ）は、組織から単離した新鮮なヒト肥満細胞と機能的に似ている（サイトウ(Saito)ら、1996 J Immunol 157:343-350）。ＣＢＭＣを、抗ＣＤ２０ ＩｇＥ（１Ｆ５.ｈＩｇＥ）またはコントロールＩｇＥ（ＳＫＯ−００７）の存在下で、ＯＣＩ−Ｌｙ８ Ｂ細胞と混合した。２４時間後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加えて死細胞を標識し、当該混合物をフローサイトメトリーによって分析した。ＰＩ＋でもあったＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージは、死んだ／死にかけている腫瘍細胞の画分の存在を示した。１Ｆ５.ｈＩｇＥを投与した場合に、コントロール抗体と比べて、腫瘍細胞毒性の増加が観察された（図２Ａ）。この効果の大きさは、エフェクター：標的比を２：１より増加させることによって増大しなかった。
【００８８】
出版された抗体依存性細胞食作用のアッセイ（カラギアニス、2003、同上）のメカニズムを調べるため、ｃ−ｋｉｔに対する抗体で肥満細胞を標識して、特異的ＩｇＥまたはコントロールＩｇＥの存在下でｃ−ｋｉｔ＋／ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージを測定した。ＣＢＭＣが腫瘍細胞死を誘導し得る肥満細胞による有意なＩｇＥ依存性食作用活性は観察されず、当該細胞混合物を一連のブロッキング抗体またはラットＩｇＧ１アイソタイプコントロールと共にインキュベーションした。抗ＴＮＦの添加は腫瘍細胞毒性を２４．２±３．５％から１４．０±０．３％まで低減した（図２Ｂ）。試験した他の抗体では僅かな減少がみられたが、これらの差は統計的に有意ではなかった。
【００８９】
＜好酸球およびＩｇＥ仲介性の腫瘍細胞毒性＞
腫瘍性好酸球増加症は、特に消化管の腫瘍で、良好な予後を伴ってきた（フェルナンデス・アセネロ(Fernandez-Acenero)ら、2000 Cancer 88:1544-1548; イワサキ(Iwasaki)ら、1986 Cancer 58:1321-1327; プルートロー(Pretlow)ら、1983 Cancer Res 43:2997-3000）。
【００９０】
以前に、カラギアニスらは、卵巣癌細胞株ＩＧＲＯＶで試験して、ヒト末梢血から単離した好酸球がＩｇＥ依存的な様式で細胞毒性を仲介することを報告していた（カラギアニス(Karagiannis)ら、2007 J Immunol 179:2832-2843）。十分な数の未感作ヒト好酸球を得るために、本発明者らは、臍帯血単核細胞をＩＬ−３およびＩＬ−５の存在下で分化させた。本プロトコルによって得られた好酸球は、末梢血好酸球に対して表現型的および機能的類似性を示す（ザルディーニ(Zardini)ら、1997 J Immunol Methods 205:1-9）。３週間後、フローサイトメトリーにより分析すると、培養物中の生細胞の９５％超が成熟好酸球と表現型的に（ＣＤ６６ｂ＋、ＣＤ１６−）似ていた。これらの細胞を臍帯血由来好酸球（ＣＢＥＯＳ）と名付けた。ＣＢＥＯＳをＯＣＬ−Ｌｙ８ Ｂ細胞と混合して、コントロールＩｇＥ抗体（ＳＫＯ）と腫瘍特異的ＩｇＥ抗体（１Ｆ５.ｈＩｇＥ）のいずれか一方を５．０μｇ／ｍＬ添加した。３７℃２４時間の後、ＰＩを加えて死細胞を標識し、この混合物をフローサイトメトリーで分析した（図２Ｃ）。ＣＢＭＣで観察されたように、ＣＢＥＯＳは、腫瘍特異的ＩｇＥの存在下でコントロールＩｇＥと比べて腫瘍細胞死の増加を引き起こした。興味深いことに、この効果の抗体依存性は、高いエフェクター−標的比では明らかでなく、腫瘍に対して高い好酸球比は、抗体非依存的な様式で細胞死をもたらし得ることを示唆していた。
【００９１】
ＣＢＥＯＳ仲介性腫瘍細胞毒性のメカニズムを調べるため、前記培養物を、幾つかのブロッキング抗体や阻害剤とインキュベーションした（図２Ｄ）。ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＩＬ）に対するブロッキング抗体では腫瘍死の小幅な低減が観察され、低濃度のヘパリン（１０Ｕ／ｍＬ）の添加ではより有意な効果が観察された。陰イオン性分子であるヘパリンは、好酸球により放出される陽イオン性タンパク質（好酸球陽イオンタンパク質（ＥＣＰ）、主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、好酸球ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）および好酸球由来神経毒（ＥＤＮ））を中和することによって、この効果を発揮する（スワミナサン(Swaminathan)ら、2005 Biochemistry 44:14152-14158）。これらの陽イオン性タンパク質は、負の電荷を帯びた細胞膜を破壊することによって真核細胞死を引き起こすことが示されてきた（カレーラス(Carreras)ら、2003 Biochemistry 42:6636-6644）。
【００９２】
＜活性化ＣＢＭＣのサイトカインプロフィール＞
ＩｇＥおよび抗原による肥満細胞の活性化の際、活性化した肥満細胞によって数多くの遺伝子がアップレギュレートされる（サヤマ(Sayama)ら、2002 Immunol 3:5）。主要特異的ＩｇＥによって活性化された肥満細胞によりサイトカイン／ケモカインが産生されることを調べるため、サイトカインの不偏スクリーニングを行った。ＩｇＥおよび腫瘍細胞との培養によって活性化した肥満細胞の上清を、多重ビーズベースのアッセイを用いて、３６種のサイトカインについて解析した。ＣＢＭＣを、次の２つの方法により３７℃２４時間にてＦｃεＲＩで活性化させた：ＩｇＥと抗ＩｇＥとの共培養、またはｈＣＤ２０発現腫瘍細胞と抗ｈＣＤ２０ ＩｇＥとの共培養。炎症因子、増殖因子および走化性因子のパネルを評価した。休止肥満細胞に対する活性化肥満細胞でのサイトカインの有意なアップレギュレートを特定するため、２クラスのマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）アルゴリズムを用いた（ｑ＜０．０５、比＞５．０）。ＳＡＭは、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＭＩＰ-１β、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、上皮好中球活性化ペプチド７８（ＥＮＡ７８）およびＩＬ−８などの炎症性サイトカインを同定した。予想されたように、肥満細胞が多価抗原（例えば、細胞表面抗原）で活性された場合は、単純な二価架橋（ＩｇＥ＋抗ＩｇＥ）によって活性化された場合よりも、応答の強度が高かった。
【００９３】
［実施例３：抗ＭＵＣ１ ＩｇＥ抗体はインビボで腫瘍の成長を阻害する］
抗ｈＭＵＣ１ ＩｇＥ（３Ｃ６.ｈＩｇＥ）のインビボでの抗腫瘍活性を試験するため、膜貫通型のｈＭＵＣ１を発現したマウス細胞株を作製した。完全長ｈＭＵＣ１ ｃＤＮＡをマウス乳癌４Ｔ１に形質移入させた。４Ｔ１は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの自然発生的な哺乳動物癌腫から単離され（デクスター(Dexter)ら、1978 Cancer Res 38:3174-3181）、乳癌の移植可能モデルとして用いられてきた（プラスキ(Pulaski)ら、2001 Curr Protoc Immunol Chapter 20:Unit 20 22）。４Ｔ１.ｈＭＵＣ１は、その細胞表面上に豊富なｈＭＵＣ１を発現し、親の４Ｔ１細胞株で観察されたのと同様な速度でｈＦｃεＲＩトランスジェニックマウスの皮下で成長した。
【００９４】
＜ヒトＦｃεＲＩマウスモデル＞
キメラヒトＩｇＥ抗体を用いた腫瘍の標的化のインビボでの効果を研究するため、ヒトＦｃεＲＩαトランスジェニックマウス（ｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋）を用いた。これらマウスでは、高親和性ＩｇＥ受容体のαサブユニットであるＦｃεＲＩαをコードしている内因性遺伝子が破壊されており、これらマウスは、ヒトＦｃεＲＩαプロモーターの制御下にあるＦｃεＲＩαヒト相同体トランスジェニックである（ドンブローヴィチ(Dombrowicz)ら、1996 J Immunol 157:1645-1651）。野生型マウスとは対照的に、ＦｃεＲＩαが発現しているのは肥満細胞および好塩基球に限定され、ｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋マウスにおけるｈＦｃεＲＩαの発現の範囲はヒトで見られるものと似ている。ｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋マウス（およびヒト）では、肥満細胞および好塩基球に加えて、ＦｃεＲＩが好酸球、単球、ランゲルハンス細胞、Ｂ細胞および好酸球上で発現されている（キネ(Kinet), J. P. 1999 Annu Rev Immunol 17:931-972; カヤバ(Kayaba)ら、2001 J Immunol 167:995-1003）。ｈＦｃεＲＩα遺伝子産物は、マウスベータサブユニットおよびマウスガンマサブユニットと複合して、機能し得る４鎖受容体（αβγ２）を形成する。ｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋マウスは、ヒトＩｇＥ抗体およびアレルゲンに対してアナフィラキシー応答を開始する（ドンブローヴィチ(Dombrowicz)ら、1996、同上）。
【００９５】
ヒトＩｇＥに対するこれらマウスの応答能力を確かめるため、４Ｔ１.ｈＭＵＣ１腫瘍細胞を腹膜に投与し、次いで９日目にコントロールＩｇＥ（ＳＫＯ−００７）または抗ｈＭＵＣ１ヒトＩｇＥ（３Ｃ６.ｈＩｇＥ）いずれか一方を投与した。２４時間後、腹膜洗浄を行い、細胞を収集して、遠心分離を行い、ヘマトキシリン、エオシンおよびトルイジンブルーで染色した。コントロール群由来の肥満細胞は変化がなかった一方で、抗ｈＭＵＣ１群由来の肥満細胞は脱顆粒の明らかな証拠を示した。このことは、ｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋マウス由来の肥満細胞は、抗原特異的な様式でヒトＩｇＥに応答することができることを示している。
【００９６】
＜腫瘍特異的ＩｇＥはインビボで腫瘍の成長を阻害する＞
インビボで４Ｔ１.ｈＭＵＣ１腫瘍の成長に対してｈＭＵＣ１特異的ＩｇＥが影響を及ぼす能力を、ｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋マウスで試験した。これら実験のため、ＩｇＥの静脈内および腹腔内送達を考えた。ＩｇＥがインビボで急速に取り除かれることを見いだした。この知見は、皮下腫瘍が十分に血管新生化されないという事実と一緒になって、薬剤を腹腔領域で投与させる。
【００９７】
４Ｔ１.ｈＭＵＣ１腫瘍細胞（合計１０５個）をマウスの剃毛した脇腹に皮下接種（ｓ．ｃ．）し、１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に２０μｇのＳＫＯまたは３Ｃ６.ｈＩｇＥで処理した（図３Ａ）。３Ｃ６.ｈＩｇＥで処理したマウスでは、腫瘍の成長の控えめな阻害が観察された（腫瘍サイズが２４％縮小、２元ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．００１）。また、コントロール群の８匹のマウスのうち３匹のみが３４日目に生存しており、一方、抗ｈＭＵＣ１群の８匹のマウスの内５匹が依然として生きていた。
【００９８】
３４日目に生存していたマウスから腫瘍サンプルを得て、トルイチンブルーを用いて存在する肥満細胞を染色した（図３Ｃ）。コントロールＩｇＥで処理したマウスの腫瘍において、腫瘍周辺肥満細胞および腫瘍内肥満細胞の存在を検出した。３Ｃ６.ｈＩｇＥ処理マウスでは、肥満細胞の脱顆粒の証拠を伴って一つの腫瘍区画で肥満細胞の浸潤を有する１匹のマウスを除いて、肥満細胞数または炎症性細胞数は有意に増加しなかったことが観察された。免疫組織化学によって分析すると、抗ｈＭＵＣ１ ＩｇＥ（３Ｃ６.ｈＩｇＥ）で処理した後でも、腫瘍はｈＭＵＣ１発現を保持した。
【００９９】
＜腫瘍特異的ＩｇＥおよびケモカインの局所的送達による腫瘍応答の増強＞
本発明者らのインビボモデルで明らかな抗腫瘍応答が無いのは、２つの要因：１つ目は、血管新生化が乏しく急速に成長している皮下腫瘍に適切な量の抗体を送達できないこと；２つ目は、これら移植された腫瘍の微小環境内に十分なエフェクター細胞を欠くこと、のためであろう。これらの変数を試験するため、抗ｈＭＵＣ１マウスＩｇＥ（ｍＩｇＥ）または化学誘因性サイトカインであるＭＣＰ−１およびＩＬ−５を産生する４Ｔ１細胞株を作製した。
【０１００】
【表１】
0006506745.tif 000002
【０１０１】
ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は、癌遺伝子の活性化に応答してこのサイトカインが腫瘍細胞によって産生され、腫瘍周辺間質への単球および肥満細胞の走化性に関与し得るため（ソウセック(Soucek)ら、2007 Nat Med 13:1211-1218）、選択される。インターロイキン５は、好酸球に対して増殖因子および走化性因子の双方である（サンダーソン(Sanderson), C. J. 1988 Dev Biol Stand 69:23-29）。抗原／サイトカイン産生４Ｔ１細胞とｍＩｇＥ産生４Ｔ１細胞とを組み合わせて混合し、それらをｈＦｃεＲＩ Ｔｇ＋マウスに皮下注射した（図４Ａ）。抗体産生腫瘍と抗原産生腫瘍との混合物は、腫瘍がそうであったように、次第に成長して、ＭＣＰ−１およびＩＬ−５の双方を発現したが、局所抗体産生を欠いた。対照的に、抗ｈＭＵＣ１マウスＩｇＥ、標的細胞、および両サイトカインを発現した腫瘍は、８匹のマウスのうち７匹で成長できなかった（図４Ｂ）。腫瘍が成長した１匹のマウスでは、８日目に代わって１９日目に開始が目に見えたのみであった。ＭＣＰ−１およびＩＬ−５を発現している腫瘍では、好酸球含有免疫浸潤が観察された。しかしながら、腫瘍特異的ＩｇＥも存在する場合にのみ、腫瘍の排除が観察された。これらデータは、アレルギー性エフェクター細胞の存在下で、十分な量の腫瘍特異的ＩｇＥが抗原を有する腫瘍に送達される場合に、完全かつ持続的な応答を観察できることを示唆する。
【０１０２】
興味深いことに、前記腫瘍に拒絶反応した７匹のマウスの反対側の脇腹に野生型４Ｔ１腫瘍細胞（ｈＩｇＥもケモカインも産生しない）を皮下注射すると、３０日後に野生型の腫瘍は発症しなかった。これらデータは、ＩｇＥおよびケモカインを形質移入した腫瘍細胞は、適切なＴ細胞応答を刺激することができ、メモリー応答を刺激する腫瘍ワクチンとして予防的にかつ間接的に使用できることを示唆する。
【０１０３】
この重要な知見を確かめるため、この実験を繰り返し、その結果を図５に示す（パネルＣ：個々の腫瘍の腫瘍体積、パネルＤ：腫瘍体積の平均値）。グループ４のマウスでは、他の腫瘍群と比べて非常に低下した速度で成長した１つの腫瘍が観察された。この反復実験で、腫瘍を有するグループ３のマウス（抗原およびサイトカインのみ）では、腫瘍の成長の過程の早期に転移の明らかな兆候を示した。グループ３に移植された腫瘍は、当該腫瘍が成長していたマウスが病気であり、前記実験の過程の早期に体重が減少したことから、グループ１または２よりもいくらか遅く成長したと推定した。
【０１０４】
［実施例４：ＩｇＥ抗体は腫瘍の転移を阻害する］
図４で説明した実施例３の実験を、実施例３で説明したヒトＦｃεＲＩαトランスジェニックマウスの代わりに野生型マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を用いて繰り返した。この実験は、観察される腫瘍応答の仲介において、野生型マウスと比べて、前記トランスジェニックマウスにおけるＦｃεＲＩの発現スペクトラムの寄与を評価するために行った。
【０１０５】
野生型マウスにおいて実施例３で説明した実験を繰り返して、本発明者らは異なる結果を観察した。グループ４の野生型マウスでは、前記トランスジェニックマウスで見られた、グループ４の腫瘍の完全な腫瘍拒絶反応（図４Ｂおよび５）の代わりに、非常に小さい腫瘍が非常に低下した成長速度で出現した（図６）。この実験には、ポジティブコントロールとして３匹のＦｃεＲＩαトランスジェニックマウスが含まれた。グループ４の腫瘍を移植した３匹のＴｇ＋マウスのうち１匹も（０／３）腫瘍の成長を示さなかった（図６Ｄ、□---□）。
【０１０６】
野生型マウスにおいてグループ４の腫瘍は、非常に低下した速度で成長したが、依然として徐々に成長した。Ｔｇ＋マウスを用いた先の実験で観察されたように、野生型マウスにおいてグループ３の腫瘍は実験の過程の非常に早期に転移を発症した。グループ３の野生型マウスは、体重が減少し、腹水を発症し、毛がくしゃくしゃになり、これらは全て、多様な器官および部位において広範囲におよび腫瘍の兆候であった。しかしながら、グループ４の野生型マウスでは、小さな腫瘍が発生はしたが、グループ１、２および３よりも成長および出現が遅く、グループ３の腫瘍を有するマウスで示されたような転移性疾患の兆候を示さなかった。つまり、全てのマウスで皮膚の下に腫瘍が存在したとしても、腫瘍の挙動（転移）に関するサイトカインＭＣＰ-１／ＩＬ−５の効果は、３Ｃ６−ｍＩｇＥの影響下と完全に逆であった。グループ４の腫瘍を有するマウスを１ヶ月間観察すると、当該マウスは、その脇腹に非常に小さな徐々に成長している腫瘍を有していても明らかな転移を発症しなかった。この重要な実験の結果を下記表２にまとめる。
【０１０７】
【表２】
0006506745.tif 000003
【０１０８】
グループ３の腫瘍を有するＴｇ＋マウスおよび野生型マウス双方で行った実験において、早期の転移が示された。これは、グループ４の腫瘍を有するマウスにおける場合と完全に逆であった。Ｔｇ＋マウスと野生型マウスとの間の相違は、Ｔｇ＋マウスでは、グループ４の腫瘍を注射したマウスでは触知できる腫瘍を発生しないことである。野生型マウスでは、グループ４の腫瘍は、ゆっくりではあるが成長する。従って、ｍＩｇＥ抗体に対する効果は、サイトカインによって腫瘍に引き寄せられた細胞のリプログラミングに関し、厳密には腫瘍の成長の阻害そのものではない。Ｔｇ＋マウスにおいてグループ４の腫瘍を有するマウスが転移を発症しない理由は、当該腫瘍がアレルギー性免疫応答によって注射の部位で排除されたためであるという妥当な説明をすることができる。しかしながら、野生型マウスでは、当該腫瘍の存在と無関係に、転移性の表現型がｍＩｇＥによって排除される。言い換えると、野生型マウスで実験を行った場合にのみ、腫瘍に対するサイトカインの効果が逆転したこと（図６）と、恐らくは、腫瘍の生着を予防すること（Ｔｇ＋マウスで）により、または腫瘍の成長を大きく減速させること（野生型マウス）により、しかし両事例において、腫瘍の転移を予防することにより、３Ｃ６−ｍＩｇＥ抗体が腫瘍の中および周囲で骨髄細胞をリプログラミングできることとを観察することができた。
【０１０９】
加えて、野生型マウスで行った実験は、野生型マウスで樹立した腫瘍の成長速度が飛躍的に低下させられるように、当該抗体が樹立された腫瘍を制御できることも示している（図６）。
【０１１０】
従って、本発明のＩｇＥ抗体の一つの特徴は、肝臓、肺および骨および皮膚において、原発性腫瘍からの明らかな転移の出現に先立って必要である必須の微小環境を、循環細胞に設定させないという能力である。ＩｇＥ抗体は、ＩｇＧ抗体と異なり、体内で脈管性間隙から出て全組織へ移動する。このように、ＩｇＥ抗体は、独自に配置されて、転移の支援に必要な微小環境の形成を循環細胞にさせないであろう。従って、このようなＩｇＥ抗体を用いた治療は、明らかな転移を出現させず、よって癌の再発を予防する。
【０１１１】
本明細書中で参照される特許文献および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書中で引用される全ての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書中で引用される全ての公開された外国特許および外国特許出願は、参照により本明細書に援用される。本明細書中で引用される他の公開された参考文献、書類、原稿および科学文献は全て、参照により本明細書に援用される。
【０１１２】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され説明される一方、添付される特許請求の範囲により包含される発明の範囲から離れることなく、本発明において形式および詳細における様々な変更を行い得ることが、当業者に理解されるであろう。また、本明細書中で説明された実施形態は、いずれも相互排他的でなく、添付される特許請求の範囲により包含される発明の範囲から離れることなく、様々なやり方で組み合わせ得ることも理解されるであろう。
【０１１３】
［配列表］
配列番号１
＜１２０＞３Ｃ６.ｈＩｇＥ重鎖可変領域：
＜２１２＞ＤＮＡ
GCCGCCACCATGTACTTGGGACTGAACTGTGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGTTTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGGGGGGGTACGGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGGTAAGTG
【０１１４】
配列番号２
＜１２０＞３Ｃ６.ｈＩｇＥ軽鎖可変領域：
＜２１２＞ＤＮＡ
GCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTAAGT
【０１１５】
配列番号３
＜１２０＞４Ｈ５.ｈＩｇＥモノクローナル抗体重鎖可変領域
＜２１２＞ＤＮＡ
GCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATGCTCTTTTTGGTAGCAACAGCAACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTATATGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTGACTTCAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCATACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGCGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGGGGGGGTGATTACCCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGGTAAGT
【０１１６】
配列番号４
＜１２０＞４Ｈ５.ｈＩｇＥモノクローナル抗体重鎖可変領域
＜２１２＞ＤＮＡ
GCCGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTAAGT  
【０１１７】
配列番号５
＜１２０＞ＭＵＣ１エピトープのアミノ酸配列
＜２１２＞アミノ酸
STAPPAHGVTSAPDTRPAPG
【図１】
0006506745.tif 000004
【図２】
0006506745.tif 000005
【図３】
0006506745.tif 000006
【図４】
0006506745.tif 000007
【図５】
0006506745.tif 000008
【図６】
0006506745.tif 000009
【図７】
0006506745.tif 000010
【配列表】
0006506745000001.app