(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号２０のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号６のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号８のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２２のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号２４のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
配列番号６のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号８のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２２のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号２４のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド
をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号２２のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、
配列番号１７のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；及び
配列番号１９のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド
からなる群から選択される、少なくとも１つのポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２２のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号２４のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、配列番号１０のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである５’末端のリーダー配列を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号５のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；
配列番号７のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；
配列番号２１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；及び
配列番号２３のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；
配列番号３のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；
配列番号２１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；及び
配列番号２３のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号２１のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドが、配列番号９のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドである５’末端のリーダー配列を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドがプラスミドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドがプラスミドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号１８のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号２０のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号１７のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド；及び
配列番号１９のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド
からなる群から選択される、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ＨＰＶの２つ以上のサブタイプに対する効果的な免疫反応を個体において誘導するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
電気穿孔法により前記個体に導入される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＨＰＶの２つ以上のサブタイプに対する効果的な免疫反応を個体において誘導するための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
電気穿孔法により前記個体に導入される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の改良型ワクチン、ＨＰＶに対する免疫反応を誘導するための改良法、ならびにＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化するための改良法に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは、最高で７つの初期遺伝子および２つの後期遺伝子を含む小さいＤＮＡウイルスである。一般に、パピローマウイルスの初期遺伝子はＥ１〜Ｅ７と命名され、パピローマウイルスの後期遺伝子はＬ１およびＬ２と命名される。いくつかの動物の種類に、パピローマウイルスファミリーの一員は感染することができる。
【０００３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は日常的であり、性的接触によって伝染され得る。ＨＰＶは、ＤＮＡ配列相同性に基づいて５６種類以上に分類された。上皮異形成および他の損傷を引き起こすＨＰＶの１６型および１８型は、多くの場合、癌、特に、子宮頸部、膣、外陰部および肛門管の上皮内癌および湿潤性癌のリスクの増加と関連する。世界的に、子宮頸癌のほぼ８８％が、ＨＰＶサブタイプ１６、１８、４５、３１、３３、５２および５８によるものである。さらに、様々な研究により、再発性呼吸器乳頭腫症のほとんどの発生においてＨＰＶ６およびＨＰＶ１１の存在が明らかになった。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、性器疣贅との関係が知られ、子宮頸癌の場合ではわずかな比率でのみ見られるが、軽度頸部病変の全ての場合の２．６〜５．２％に見られる。さらに、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、今日、グレード２およびグレード３の子宮頸部上皮内腫瘍ならびに軽度の子宮頸部異形成を含む、現在では子宮頸癌の前兆と考えられている軽度扁平上皮内病変の約２０％と関連している。研究が進むにつれ、これら２つの血清型が、性器疣贅、再発性呼吸器乳頭腫症、肺癌、扁桃癌、喉頭癌、および他の点では良性の腫瘍の他の悪性転換ならびに頭頸部の異形成を含む耳鼻科疾患の様々な形態と関連することが明らかになった。この研究の発見が、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１に対するコンセンサス配列ＤＮＡワクチンの使用を明らかにし、その将来の有望性を期待させる。
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、弱毒化生ウイルスワクチンおよび組み換えタンパク質に基づくワクチンなどの、より伝統的なワクチン接種法を上回る多くの概念的な利点を有する。ＤＮＡワクチンは、安全であり、安定であり、容易に産生され、かつヒトにおいて十分に耐容性を示し、前臨床試験はプラスミド組み込みの証拠を示さない（Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８：Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９）。さらに、ＤＮＡワクチンの有効性が、ベクターに対する、以前から存在する抗体力価によって影響されないという事実により、ＤＮＡワクチンは反復投与に十分に適する（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３）。しかし、大型動物に移行した時、ＤＮＡワクチンの臨床導入に対する１つの重大な障害は、プラットフォームとなる免疫原性の減少であった（Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０）。コドン最適化、ＲＮＡ最適化および免疫グロブリンリーダー配列の付加などの、ＤＮＡワクチン免疫原の遺伝子工学処理における最近の技術的進歩により、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性が改良され（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３；Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１；Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９；Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔ��ｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３）、かつ、近年、電気穿孔法などのプラスミド送達システムの技術が開発された（Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８；Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９；Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３）。さらに、コンセンサス免疫原を使用することで、天然の抗原のみと比較して、細胞性免疫反応の幅を拡大させることができる可能性があることを複数の研究が示唆した（Ｙａｎ．，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４）。
【０００５】
ＨＰＶ感染、特に、子宮頸癌ならびに／または肺癌、扁桃癌、および咽頭癌を引き起こす感染を予防および治療するための改良型ワクチンならびに方法に対するニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の態様は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。
【０００７】
別の態様は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列；配列番号２６をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードする核酸配列ヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。一部の実施形態において、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードするヌクレオチド配列には、配列番号１０をコードするヌクレオチド配列である５’末端のリーダー配列がない。
【０００８】
本発明の別の態様において、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号５と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号３の断片；配列番号５の断片；配列番号７の断片；配列番号１７の断片；配列番号１９の断片；配列番号２１の断片；配列番号２３の断片；配列番号１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号５の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；およびと配列番号２３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。一部の実施形態において、ＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードするヌクレオチド配列には、配列番号９のヌクレオチド配列を有する５’末端のリーダー配列がない。
【０００９】
提供されるヌクレオチド配列はプラスミドであり得る。
【００１０】
さらなる態様において、好ましくは複数の抗原を有する本開示のヌクレオチド配列を含む、医薬組成物を提供する。
【００１１】
一部の態様において、ＨＰＶの２つ以上のサブタイプに対する効果的な免疫反応を個体において誘導する方法であって、１つまたは複数の提供されるヌクレオチド配列を含む組成物を当該個体に投与することを含む方法が提供され、好ましくは、組成物は２つ以上の抗原を有する。この方法は、好ましくは、提供されるヌクレオチド配列を電気穿孔法により個体に導入する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】Ｅ６のアライメントの近隣結合評価に基づく系統樹である。アスタリスクは、各樹におけるコンセンサス配列の位置を示す。
【図１Ｂ】Ｅ７のアライメントの近隣結合評価に基づく系統樹である。アスタリスクは、各樹におけるコンセンサス配列の位置を示す。
【図１Ｃ】ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７コンセンサスに基づく融合免疫原の構造を示す。
【図２Ａ】ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７のインビボ発現を示すデータである。溶解したトランスフェクト２９３−Ｔ細胞から遺伝子産物を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通過させ、オートラジオグラフィーを用いて検出した。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７タンパク質の両方は、それぞれ約３２ｋＤａである（Ａ）。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞も、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７でトランスフェクトし、その後免疫蛍光染色を行った後に固定した。ＦＩＴＣ蛍光は、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の発現を裏付ける（Ｂ）。ＤＡＰＩ蛍光は、ヘキスト染色による核局在を裏付ける。
【図２Ｂ】ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７のインビボ発現を示すデータである。溶解したトランスフェクト２９３−Ｔ細胞から遺伝子産物を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに通過させ、オートラジオグラフィーを用いて検出した。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７タンパク質の両方は、それぞれ約３２ｋＤａである（Ａ）。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞も、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７でトランスフェクトし、その後免疫蛍光染色を行った後に固定した。ＦＩＴＣ蛍光は、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の発現を裏付ける（Ｂ）。ＤＡＰＩ蛍光は、ヘキスト染色による核局在を裏付ける。
【図３Ａ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｐ６Ｅ６Ｅ７（Ａ）およびｐ１１Ｅ６Ｅ７（Ｂ）による強い細胞性反応の誘導を示す。隔週で３回の免疫化後に、それぞれのグループのマウス（グループにつき５匹）から単離した脾細胞を用いてアッセイを行った。各免疫化は、コンストラクトあたり２０μｇからなっていた。組み合わせグループのマウスは、ワクチン接種あたり合計４０μｇのＤＮＡに関してコンストラクトあたり２０μｇでｐ６Ｅ６Ｅ７とｐ１１Ｅ６Ｅ７の両方を受け取った。ＤＮＡをＩＭ注射により投与し、その後、電気穿孔を行った（*はＰ＜０．０００１を示し、†はＰ＝０．０００１を示す）。
【図３Ｂ】ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｐ６Ｅ６Ｅ７（Ａ）およびｐ１１Ｅ６Ｅ７（Ｂ）による強い細胞性反応の誘導を示す。隔週で３回の免疫化後に、それぞれのグループのマウス（グループにつき５匹）から単離した脾細胞を用いてアッセイを行った。各免疫化は、コンストラクトあたり２０μｇからなっていた。組み合わせグループのマウスは、ワクチン接種あたり合計４０μｇのＤＮＡに関してコンストラクトあたり２０μｇでｐ６Ｅ６Ｅ７とｐ１１Ｅ６Ｅ７の両方を受け取った。ＤＮＡをＩＭ注射により投与し、その後、電気穿孔を行った（*はＰ＜０．０００１を示し、†はＰ＝０．０００１を示す）。
【図４Ａ】優性のエピトープを特徴づけるために、個々のペプチドを用いて追加のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。免疫したマウスから単離した脾細胞および陰性対照を、完全なＨＰＶ６  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質（Ａ）またはＨＰＶ１１  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質（Ｂ）にまたがる重複ペプチドで刺激した。
【図４Ｂ】優性のエピトープを特徴づけるために、個々のペプチドを用いて追加のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。免疫したマウスから単離した脾細胞および陰性対照を、完全なＨＰＶ６  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質（Ａ）またはＨＰＶ１１  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質（Ｂ）にまたがる重複ペプチドで刺激した。
【図５Ａ】細胞内サイトカイン染色によって特徴づけられる抗原特異的Ｔ細胞によるサイトカイン産生。ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスから単離した脾細胞を、Ｒ１０成長培地、ＰＭＡ、またはコンセンサス遺伝子のペプチドで４時間刺激し、その後、表面マーカーおよび細胞内マーカーで染色した。上のドットスポットは、バックグラウンドを差し引いた全ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞のいずれかが産生するＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αの割合の差異を示す。アスタリスクを有するプロットのＰ値は、陰性対照群の平均値が０であるために決定することができなかった。
【図５Ｂ】細胞内サイトカイン染色によって特徴づけられる抗原特異的Ｔ細胞によるサイトカイン産生。ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスから単離した脾細胞を、Ｒ１０成長培地、ＰＭＡ、またはコンセンサス遺伝子のペプチドで４時間刺激し、その後、表面マーカーおよび細胞内マーカーで染色した。上のドットスポットは、バックグラウンドを差し引いた全ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞のいずれかが産生するＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αの割合の差異を示す。アスタリスクを有するプロットのＰ値は、陰性対照群の平均値が０であるために決定することができなかった。
【図６】ＩｇＥリーダー配列（ＩｇＥＬ）、細胞内タンパク質分解切断部位ならびにＥ６およびＥ７ドメインを変異させて発現および免疫原性を増強した部位を示す注釈付きのＨＰＶ３１  Ｅ６／Ｅ７（配列番号１８）のアミノ酸配列を示す。
【図７】ＩｇＥリーダー配列（ＩｇＥＬ）、細胞内タンパク質分解切断部位ならびにＥ６およびＥ７ドメインを変異させて発現および免疫原性を増強した部位を示す注釈付きのＨＰＶ５２  Ｅ６／Ｅ７（配列番号２０）のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、限定することを意図するものではない。本明細書および添付の「特許請求の範囲」で使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き複数形の指示対象を包含する。
【００１４】
本明細書で数値の範囲を記述する場合、その間に介在する数値が同じ精度を有することが明確に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて数値７および８が企図され、また６．０〜７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６，９および７．０が明確に企図される。
【００１５】
ａ．アジュバント
本明細書で使用される「アジュバント」は、のちに記載するＤＮＡプラスミドによってコードされ、コード核酸配列１つまたは複数の抗原の抗原性を高めるために本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに付加される任意の分子を意味し得る。
【００１６】
ｂ．抗体
「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥクラスの抗体または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体およびそれらの誘導体を含めた上記抗体の断片または誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体または所望のエピトープもしくはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を示すそれらの混合物であり得る。
【００１７】
ｃ．抗原
「抗原」は、ＨＰＶのＥ６またはＨＰＶのＥ７ドメインおよび好ましくは、間に細胞内タンパク質分解切断部位があるＥ６とＥ７の融合物を有するタンパク質を表す。抗原には、配列番号２（サブタイプ６）、４（サブタイプ１１）、６（サブタイプ３３）、８（サブタイプ５８）、１８（サブタイプ３１）、２０（サブタイプ５２）、２２（サブタイプ１６）および２４（サブタイプ１８）；本明細書に記載される長さのそれらの断片、変異体、すなわち本明細書に記載される配列番号２、４、６、８、１８、２０、２２および２４と相同な配列のタンパク質、本明細書に記載される長さを有する変異体の断片ならびにそれらの組み合わせが含まれる。抗原は、配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を有するものであっても、あるいはＮ末端からかかる配列が除去されたものであってもよい。抗原は任意選択で、他のタンパク質に由来するシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含んでもよい。
【００１８】
ｄ．コード配列
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」は、上の節ｃ．に記載される抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味し得る。コード配列は、核酸を投与された個人または哺乳動物の細胞内での発現を指令することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントと作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列、例えば配列番号９などのＩｇＥリーダー配列をさらに含み得る。
【００１９】
ｅ．相補体
本明細書で使用される「相補体」または「相補的な」は、核酸が核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体同士のワトソン−クリック型塩基対形成（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン型塩基対形成を意味し得ることを意味し得る。
【００２０】
ｆ．断片
「断片」は、哺乳動物において抗原に対する免疫反応を引き起こすことができるその抗原のポリペプチド断片を意味し得る。抗原の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長抗原の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドの断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗原の断片と連結されていてよい。
【００２１】
抗原をコードする核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、特定の完全長コード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％を含み得る。断片は、好ましくは、抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片と連結されていてよい。
【００２２】
ｇ．同一
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列と関連して本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、それらの配列が特定の領域にわたって同じ残基の特定の百分率を有することを意味し得る。その百分率は、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたって両配列を比較し、両配列中に同一の残基がみられる位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致する位置の数をその特定領域内の位置の総数で除し、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を求めることによって計算され得る。２つの配列の長さが異なるか、整列させることによって１つまたは複数の末端がずれ、比較する特定の領域に１つの配列しか含まれない場合、その１つの配列の残基は計算の分母には含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等なものと見なしてよい。同一性は手作業で計算してもよく、またＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いて計算してもよい。
【００２３】
ｈ．免疫反応
本明細書で使用される「免疫反応」は、提供されるＤＮＡプラスミドワクチンによる１つまたは複数の抗原の導入に反応した宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫反応は細胞性反応、体液性反応またはその両方の形態であり得る。
【００２４】
ｉ．核酸
本明細書で使用される「核酸」、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。１本の鎖を記述することによりその相補鎖の配列も定まる。したがって、核酸は記述される１本の鎖の相補鎖も包含する。核酸の多数の変異体が同じ目的で所与の核酸として使用され得る。したがって、核酸は実質的に同一な核酸またはその相補体も包含する。１本の鎖からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブが得られる。したがって、核酸はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２５】
核酸は一本鎖または二本鎖であり得、また二本鎖配列および一本鎖配列の両方の一部分を含み得る。核酸はゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡをともに含めたＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドであってよく、この場合、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含み得る。核酸は化学合成法または組み換え法によって得ることができる。
【００２６】
ｊ．作動可能に連結された
本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、遺伝子の発現が空間的に連結されたプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’側（上流）にあっても３’側（下流）にあってもよい。プロモーターと遺伝子の間の距離は、そのプロモーターが由来する遺伝子内におけるプロモーターとそれが制御する遺伝子の間の距離にほぼ同じであり得る。当該技術分野で公知の通り、プロモーター機能を失わせることなくこの距離の変化を調整し得る。
【００２７】
ｋ．プロモーター
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞内での核酸の発現を付与、活性化または増強することができる合成または天然由来の分子を意味し得る。プロモーターは、その発現をさらに増強し、かつ／あるいはその空間的発現および／または時間的発現を変化させるために１つまたは複数の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターはほかにも、転写開始部位から数千塩基対も離れた位置にあり得る遠位エンハンサーまたは遠位リプレッサー要素を含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫および動物を含めた入手源に由来するものであり得る。プロモーターは、遺伝子要素の発現を構成的に、または発現が起こる細胞、組織もしくは器官に応じて差次的に、または発現が起こる発生段階に応じて、または生理学的ストレス、病原体、金属イオンもしくは誘発剤などの外部刺激に反応して調節し得る。プロモーターの代表的な例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターとＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００２８】
ｌ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、核酸の複雑な混合物中などで第一の核酸配列（例えば、プローブ）が第二の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境において様々である。ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５  １０℃低くなるよう選択され得る。Ｔｍは、標的と相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）であり得る（Ｔｍでは標的配列が過剰に存在するため、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）では少なくとも約６０℃となる条件であり得る。ストリンジェントな条件はこのほか、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルがバックグランドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として以下のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、６５℃の０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで洗浄。
【００２９】
ｍ．実質的に相補的である
本明細書で使用される「実質的に相補的である」は、第一の配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、第二の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、この２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００３０】
ｎ．実質的に同一である
本明細書で使用される「実質的に同一である」は、第一の配列と第二の配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または核酸に関して、第一の配列が第二の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味し得る。
【００３１】
ｏ．変異体
本明細書で核酸に関して使用される「変異体」は、（ｉ）言及されるヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）言及されるヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部分；（ｉｉｉ）言及される核酸と実質的に同一な核酸もしくはその相補体；または（ｉｖ）言及される核酸、その相補体もしくはそれと実質的に同一な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００３２】
アミノ酸の挿入、削除または保存的置換によってアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」。変異体はこのほか、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する言及されるタンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸をほぼ同じ特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）をもつ異なるアミノ酸に置き換えることが、当該技術分野で典型的に小さい変更を含むものとして認識されている。このような小さい変更は、部分的には当該技術分野で理解されているアミノ酸のハイドロパシー指標を検討することによって確認することができる（Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２））。アミノ酸のハイドロパシー指標は、その疎水性および電荷の検討に基づくものである。ほぼ同じハイドロパシー指標のアミノ酸であれば置換が可能であり、かつタンパク質の機能をなおも保持することが当該技術分野で公知である。一態様では、ハイドロパシー指標が±２のアミノ酸を置換する。このほか、アミノ酸の親水性を用いて、生物学的機能を保持するタンパク質が得られる置換を明らかにすることができる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討すれば、抗原性および免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である、そのペプチドの親水性の最大局所平均値の計算が可能になる（全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号）。当該技術分野で理解されているように、ほぼ同じ親水性値のアミノ酸同士を置換すれば、生物活性、例えば免疫原性を保持するペプチドを得ることができる。親水性値が互いに±２以内のアミノ酸を用いて置換を実施し得る。アミノ酸の疎水性指標および親水性値はともに、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察結果の通り、生物学的機能との両立が可能なアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさをはじめとする特性によって明らかにされるアミノ酸の相対的類似性、特にこれらのアミノ酸の側鎖によって決まると理解されている。
【００３３】
ｐ．ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含んでいる核酸配列を意味し得る。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、細菌、人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡベクターであってもＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製型の染色体外ベクターまたは宿主ゲノム内に組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００３４】
免疫原によって誘導される細胞性免疫反応を高めるための多面的戦略から生じる改良型ワクチンを開示する。改変したコンセンサス配列を作製した。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子改変も開示する。この新規の構築物を、対応するコドン最適化免疫原よりも強力で、広範な細胞性免疫反応を引き起こすように設計した。
【００３５】
改良型ＨＰＶワクチンは、抗ＨＰＶを誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物に基づく。したがって、ワクチンは治療的または予防的に免疫反応を誘導し得る。一部の実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。一部の実施形態において、このワクチンは、１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチンおよび１つ以上の不活化ワクチンからなる群から選択される組み合わせを含む。
【００３６】
一部の実施形態によると、ワクチンが個体に送達され、この個体の免疫システムの活性を調節し、それによって、ＨＰＶに対する免疫反応が高まる。このタンパク質をコードする核酸分子がこの個体の細胞に取り込まれると、このヌクレオチド配列がこれらの細胞において発現し、それによって、このタンパク質がこの個体に送達される。プラスミドなどの核酸分子上のこのタンパク質のコード配列を、組み換えワクチンの一部としておよび弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。
【００３７】
ＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法を提供する。
【００３８】
この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を送達するための組成物を、調節要素と作動可能に連結する。組成物には、この免疫原をコードするプラスミド、この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えワクチン、本発明のタンパク質をコードするおよび／もしくは本発明のタンパク質を含む弱毒化生病原体；本発明のタンパク質を含む不活化病原体；または本発明のタンパク質を含むリポソームもしくはサブユニットワクチンなどの組成物が含まれてもよい。本発明は、さらに、組成物を含む注射可能な医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明の態様は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物はＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８を含み得る。一部の実施形態において、組成物はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８を含み得る。一部の実施形態において、組成物はＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を含み得る。一部の実施形態において、組成物はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ５２を含み得る。
【００４０】
別の態様は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列；配列番号２６をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードする核酸配列ヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２５をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、組成物を提供する。
【００４１】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードする核酸配列ヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４２】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号６をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４３】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードする核酸配列ヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２４をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４４】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２２をコードするヌクレオチド配列の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４５】
本発明の別の態様において、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号５と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号３の断片；配列番号５の断片；配列番号７の断片；配列番号１７の断片；配列番号１９の断片；配列番号２１の断片；配列番号２３の断片；配列番号１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号５の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。
【００４６】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号５；配列番号７；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３；配列番号５と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号５の断片；配列番号７の断片；配列番号１７の断片；配列番号１９の断片；配列番号２１の断片；配列番号２３の断片；配列番号５の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４７】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号１；配列番号３；配列番号２１；配列番号２３；配列番号１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２３と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１の断片；配列番号３の断片；配列番号２１の断片；配列番号２３の断片；配列番号１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２３の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４８】
一部の実施形態において、組成物は、配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号１７と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号２１と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１７の断片；配列番号１９の断片；配列番号２１の断片；配列番号１７の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；配列番号１９の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列；および配列番号２１の断片と少なくとも９５％相同な核酸配列からなる群から選択されるＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原を含む。
【００４９】
一部の実施形態において、本明細書に記載のヌクレオチド配列はリーダー配列を欠く。ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８を含むヌクレオチド配列はリーダー配列を欠く。特に、配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号４をコードするヌクレオチド配列；配列番号６をコードするヌクレオチド配列；配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号１８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２０をコードするヌクレオチド配列；配列番号２２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２４をコードするヌクレオチド配列；および配列番号２５をコードするヌクレオチド配列を含むＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原は、５’末端のリーダー配列、例えば、配列番号１０をコードするヌクレオチド配列を欠く。特に、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号７；配列番号１７；配列番号１９；配列番号２１；配列番号２３のヌクレオチド配列を含むＨＰＶ  Ｅ６−Ｅ７融合抗原は、５’末端のリーダー配列、例えば、配列番号９のヌクレオチド配列を欠く。
【００５０】
一部の実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、提供されるヌクレオチド配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％または９８％もしくは９９％相同であり得る。
【００５１】
提供されるヌクレオチド配列は、プラスミド、ウイルスベクター、脂質ベクター、ナノ粒子を含めた様々な既知のベクターまたは送達系のうちの１つ、好ましくはプラスミド中に含まれ得る。
【００５２】
さらなる態様において、好ましくは複数の抗原を有する本開示のヌクレオチド配列を含む、医薬組成物を提供する。
【００５３】
一部の態様において、ＨＰＶの２つ以上のサブタイプに対する効果的な免疫反応を個体において誘導する方法であって、１つまたは複数の提供されるヌクレオチド配列を含む組成物を当該個体に投与することを含む方法を提供し、好ましくは、組成物は２つ以上の抗原を有する。この方法は、好ましくは、提供されるヌクレオチド配列を電気穿孔法により個体に導入する段階を含む。
【００５４】
配列番号１は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１は、配列番号１の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００５５】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号２または配列番号２をコードする核酸分子を含む。
【００５６】
配列番号２の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号２の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号２の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号２の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００５７】
配列番号１の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号１のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００５８】
一部の実施形態において、配列番号１の断片は、７８６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８３０以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８５６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８６５以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００５９】
一部の実施形態において、配列番号２の断片は、２５２以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７８以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００６０】
配列番号３は、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号３は、配列番号３の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号４は、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号４は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００６１】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号４または配列番号４をコードする核酸分子を含む。
【００６２】
配列番号４の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号４の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号４の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号４と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号４の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００６３】
配列番号３の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号３のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号４の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００６４】
一部の実施形態において、配列番号３の断片は、７８６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８３０以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８５６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８６５以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号３の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号３の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００６５】
一部の実施形態において、配列番号４の断片は、２５２以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７８以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００６６】
配列番号５は、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号５は、配列番号５の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号６は、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号６は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００６７】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号６または配列番号６をコードする核酸分子を含む。
【００６８】
配列番号６の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号６の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号６の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号６と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号６の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００６９】
配列番号５の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号５のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号６の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００７０】
一部の実施形態において、配列番号５の断片は、７４６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７８７以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８１２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８２０以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００７１】
一部の実施形態において、配列番号６の断片は、２３５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４８以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５９以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００７２】
配列番号７は、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号７は、配列番号７の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号８は、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号８は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００７３】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号８または配列番号８をコードする核酸分子を含む。
【００７４】
配列番号８の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号８の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号８の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号８と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号８の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００７５】
配列番号７の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号７のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号８の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００７６】
一部の実施形態において、配列番号７の断片は、７５２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７９４以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８１９以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８２７以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００７７】
一部の実施形態において、配列番号８の断片は、２３５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４９以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５７以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６０以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００７８】
配列番号１７は、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１７は、配列番号１７の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号１８は、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号１８は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００７９】
一部の実施形態において、ワクチンは配列番号１８または配列番号１８をコードする核酸分子を含む。
【００８０】
配列番号１８の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号１８の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号１８の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号１８と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号１８の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００８１】
配列番号１７の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号１７のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号１８の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００８２】
一部の実施形態において、配列番号１７の断片は、７１３以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７５２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７７６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７８４以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号１７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号１７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００８３】
一部の実施形態において、配列番号１８の断片は、２３６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４９以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５７以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５９以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００８４】
配列番号１９は、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１９は、配列番号１９の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２０は、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２０は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００８５】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号２０または配列番号２０をコードする核酸分子を含む。
【００８６】
配列番号２０の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号２０の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号２０の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２０と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号２０の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００８７】
配列番号１９の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号１９のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２０の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００８８】
一部の実施形態において、配列番号１９の断片は、７１３以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７５２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７７６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７８４以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号１９の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号１９の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００８９】
一部の実施形態において、配列番号２０の断片は、２３６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４９以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５７以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５９以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００９０】
配列番号２１は、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号２１は、配列番号２１の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２２は、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２２は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００９１】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号２２または配列番号２２をコードする核酸分子を含む。
【００９２】
配列番号２２の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号２２の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号２２の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２２と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号２２の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００９３】
配列番号２１の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号２１のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２２の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【００９４】
一部の実施形態において、配列番号２１の断片は、７３６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７７７以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８０２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号２１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号２１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【００９５】
一部の実施形態において、配列番号２２の断片は、２３８以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５１以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５９以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６１以上のアミノ酸を含んでもよい。
【００９６】
配列番号２３は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号２３は、配列番号２３の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２４は、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２４は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【００９７】
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号２４または配列番号２４をコードする核酸分子を含む。
【００９８】
配列番号２４の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンを含んでも、含まなくてもよい。配列番号２４の断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号２４の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２４と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同な配列番号２４の断片を含み、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、断片と連結されていてよい。
【００９９】
配列番号２３の核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１個のヌクレオチドが欠けていることを除いて完全長と１００％同一であってよく、いずれの場合もシグナルペプチドおよび／または１位のメチオニンをコードする配列を含んでも、含まなくてもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除いて、完全長の配列番号２３のコード配列の長さの６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上を含み得る。断片は、好ましくは、配列番号２４の抗原と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相同なポリペプチドをコードする断片を含み、任意選択で、パーセント相同性を計算する際に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または例えばＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドのような免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、断片と連結されていてよい。
【０１００】
一部の実施形態において、配列番号２３の断片は、７０５以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７４４以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７６７以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７７５以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号２３の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号２３の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。
【０１０１】
一部の実施形態において、配列番号２４の断片は、２３４以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４７以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５７以上のアミノ酸を含んでもよい。
【０１０２】
配列番号２５は、ＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２５は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【０１０３】
配列番号２６は、ＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２６は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。
【０１０４】
配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；配列番号２４；配列番号２５；もしくは配列番号２６；またはそれらと少なくとも９５％の相同性を有する断片；またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸配列を含む、組成物が提供される。一部の実施形態において、組成物は、配列番号２；配列番号４；配列番号６；配列番号８；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；および配列番号２４を含む。一部の実施形態において、組成物は、配列番号６；配列番号８；配列番号１８；配列番号２０；配列番号２２；および配列番号２４を含む。一部の実施形態において、組成物は、配列番号２；配列番号４；配列番号２２；および配列番号２４を含む。一部の実施形態において、組成物は、配列番号１８；配列番号２０；および配列番号２２を含む。
【０１０５】
アミノ酸配列は、アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９５％の相同性を有する断片であり得る。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも少なくとも９８％の相同性を有する断片であり得る。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９９％の相同性を有する断片であり得る。
【０１０６】
一部の実施形態によると、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、それらの機能的断片、ならびにそれらの発現できるコード配列をこの個体に投与することを含む。好ましくは、免疫原はコンセンサスＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８である。好ましくは、免疫原はコンセンサスＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２およびＨＰＶ５８である。好ましくは、免疫原はコンセンサスＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８である。好ましくは、免疫原はコンセンサスＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ５２である。
【０１０７】
一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片をコードする単離した核酸分子を含む。一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片をコードする組み換えワクチンを含む。一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片を含むサブユニットワクチンを含む。一部の実施形態は、ＨＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５２のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片を含む弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンを含む。
【０１０８】
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、本明細書に提供される核酸配列を含む組成物を当該個体に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、この方法はほかにも、核酸配列を電気穿孔法により個体に導入することを含む。
【０１０９】
一部の態様において、ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む組成物を当該個体に投与することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、この方法はほかにも、アミノ酸配列を電気穿孔法により個体に導入することを含む。
【０１１０】
一態様において、本明細書のワクチンは、頭頸部癌の形態、および耳鼻咽喉科疾患の他の形態と主に関連することが見出された、ＨＰＶサブタイプに対する免疫反応を引き起こすワクチンであり、特に、これらのワクチンには、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、好ましくはその両方が含まれる。
【０１１１】
別の態様において、本明細書のワクチンは、例えば、米国外の患者、より具体的には、アジアの患者の子宮頚癌の形態と主に関連することが見出された、ＨＰＶサブタイプに対する免疫反応を引き起こすワクチンであり、特に、これらのワクチンには、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、好ましくはその両方が含まれる。
【０１１２】
前癌病変を含めた子宮頚癌と関連することが見出されたＨＰＶサブタイプに対する免疫反応を引き起こすのに有用な好ましい組み合わせが提供され、このようなものとしては、ＨＰＶサブタイプ１６、１８、３１、３３、５２、５８、６、１１、３９および４５またはＨＰＶサブタイプ１６、１８、３１、３３、５２、５８、６および１１が挙げられる。この子宮頚癌に対するその他の部分的組み合わせとしては、
１６および１８；１６、１８および６；１６、１８および１１；１６、１８および３１；１６、１８および３３；１６、１８および５２；１６、１８および５８；１６、１８、６および１１；１６、１８、６および３１；１６、１８、６および３３；１６、１８、６および５２、１６、１８、６および５８；１６、１８、１１および３１；１６、１８、１１および３３、１６、１８、１１および５２；１６、１８、１１および５８；１６、１８、３１および３３；１６、１８、３１および５２；１６、１８、３１および５８；１６、１８、３３および５２；１６、１８、３３および５８；１６、１８、５２および５８；
６、１１および１６；６、１１および１８；６、１１および３１；６、１１および３３；６、１１および５２；６、１１および５８；６、１１、１６および３１；６、１１、１６および３３；６、１１、１６および５２；６、１１、１６および５８；６、１１、１８および３１；６、１１、１８および３３；６、１１、１８および５２；６、１１、１８および５８；６、１１、３１および３３；６、１１、３１および５２；６、１１、３１および５８；６、１１、３３および５２；６、１１、３３および５８；６、１１、５２および５８；
６、１６および３１；６、１６および３３；６、１６および５２；６、１６および５８；６、１６、３１および３３；６、１６、３１および５２；６、１６、３１および５８；６、１６、３３および５２；６、１６、３３および５８；６、１６、５２および５８；
６、１８および３１；６、１８および３３；６、１８および５２；６、１８および５８；６、１８、３１および３３；６、１８、３１および５２；６、１８、３１および５８；６、１８、３３および５２；６、１８、３３および５８；
６、３１および３３；６、３１および５２；６、３１および５８；６、３１、３３および５２；６、３１、３３および５８；
６、３３および５２；６、３３および５８；６、３３、５２および５８；
６、５２および５８；
１１、３１および３３；１１、３１および５２；１１、３１および５８；１１、３１、３３および５２；１１、３１、３３および５８；１１、３１、５２および５８；
１１、３１および５２；１１、３１および５８；１１、３１、５２および５８；
１１、５２および５８；
１６、３１および３３；１６、３１および５２；１６、３１および５８；１６、３１、３３および５２；１６、３１、５２および５８；
１６、３３および５２；１６、３３および５８；１６、３３、５２および５８；
１８、３１および３３；１８、３１および５２；１８、３１および５８；１８、３１、３３および５２；１８、３１、３３および５８；
３１、３３および５２；３１、３３および５８；３１、３３、５２および５８；ならびに
３１、５２および５８
が挙げられる。
【０１１３】
改良型ワクチンは、抗ＨＰＶ免疫反応を誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む。したがって、治療的または予防的に免疫反応を誘導するために、ワクチンを提供することができる。一部の実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。一部の実施形態において、このワクチンは、以下からなる群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、１つ以上の不活化ワクチン。
【０１１４】
本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上のタンパク質コード配列を、組み換えワクチンの一部として、弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。
【０１１５】
本発明の一部の態様によると、予防的におよび／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法が提供される。
【０１１６】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号および本明細書で引用する優先出願に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。それらの出願に記載される送達プロトコールに加えて、ＤＮＡを送達する代替方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
本発明は、改良型弱毒化生ワクチン、改良型不活化ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用する改良型ワクチン、さらにサブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンに関する。弱毒化生ワクチン、組み換えベクターを使用して外来抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
細胞に取り込まれると、この遺伝子構築物（複数可）は、機能している染色体外分子としてこの細胞内に存在したままであってもよく、かつ／またはこの細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。ＤＮＡは細胞内に導入されてもよく、そこで、１つまたは複数のプラスミドの形態の別々の遺伝物質として留まる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖ＤＮＡを、この細胞に導入してもよい。この細胞にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組み込みを促進する薬剤を加えてもよい。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列が、このＤＮＡ分子に含まれてもよい。あるいは、ＲＮＡをこの細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメアおよび複製開始点を含む直鎖ミニ染色体としてこの遺伝子構築物を提供することも企図される。遺伝子構築物は、細胞内で生存する弱毒化された生の微生物または組み換え微生物ベクターの遺伝物質の一部のままであってもよい。遺伝子構築物は、組み換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよく、ここで、この遺伝物質はこの細胞の染色体に組み込まれるかまたは染色体外に留まるかのいずれかである。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。これらの要素には、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、大抵、エンハンサーは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、およびこれらの調節要素は、これらが投与される個体において作動可能であることが必要である。
【０１１９】
開始コドンおよび終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかし、これらの要素は、この遺伝子構築物が投与される個体において機能的であることが必要である。開始および終止コドンはコード配列と共にフレームの中になければならない。
【０１２０】
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。
【０１２１】
本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＢＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、ＡＬＶプロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２２】
本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例として、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。特に、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）内に存在し、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用する。
【０１２３】
ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もこのＤＮＡ分子の中に含まれてもよい。かかる追加の要素はエンハンサーを含む。このエンハンサーは、以下を含む群から選択されてもよいがそれらに限定されない：ヒトアクチンエンハンサー、ヒトミオシンエンハンサー、ヒトヘモグロビンエンハンサー、ヒト筋肉クレアチンエンハンサーならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶのエンハンサーなどのウイルスエンハンサー。
【０１２４】
遺伝子構築物は、染色体外にこの遺伝子構築物を維持し、細胞内でこの構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類複製開始点が供給され得る。インビトロジェン（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、組み込まれることなく、高コピーのエピソーム複製を行うエプスタイン・バーウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。
【０１２５】
免疫化の適用に関連するいくつかの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および追加として、かかる標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子を含む核酸分子（複数可）を送達する。かかる遺伝子の例として、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびシグナル配列が除去され、任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５などの他のサイトカインならびにリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。有用であり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片をコードする遺伝子が含まれる。
【０１２６】
何らかの理由で、この遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望ましい場合、細胞破壊の標的として機能を果たす追加の要素を加えてもよい。発現できる形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、この遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガンシクロビルはこの個体に投与され得、かつこの薬剤はｔｋを産生する全細胞を選択的に死滅させるため、この遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段をもたらす。
【０１２７】
タンパク質産生を最大限するために、この構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列を選択してもよい。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能的なＤＮＡ構築物を作製することができる。
【０１２８】
一部の実施形態において、本明細書記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドと連結される遺伝子構築物を提供し得る。一部の実施形態において、本明細書記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドと連結される。
【０１２９】
タンパク質が用いられる一部の実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質を産生および単離することができる。タンパク質が用いられる一部の実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を昆虫細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。当業者は、これらの市販の発現ベクターおよび発現系または他のものを使用して、通例の技術およびすぐに入手できる出発物質によりタンパク質を産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）。従って、所望のタンパク質を原核細胞系および真核細胞系の両方において調製することができ、このタンパク質の一連のプロセシング型をもたらすことができる。
【０１３０】
当業者は、他の市販の発現ベクターおよび発現系を使用してもよく、または周知の方法およびすぐに入手できる出発物質を用いてベクターを産生してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、ならびに好ましくはエンハンサーなどの必須の制御配列を含む、様々な種類の宿主に対する発現系は、すぐに入手でき、当業で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。遺伝子構築物は、この構築物がトランスフェクトされる細胞株において機能的であるプロモーターと作動可能に連結されるタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例として、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０のプロモーターが挙げられる。誘導できるプロモーターの例として、マウス乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、すぐに入手できる出発物質から、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に作製することができる。このタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性宿主を形質転換し、その後、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【０１３１】
産生させたタンパク質を、必要に応じて、かつ当業者に知られるように、これらの細胞を溶解するまたは培地から回収することによって、培養物から回収した。当業者は、周知の方法を用いて、かかる発現系を用いて産生されるタンパク質を単離することができる。上記の特異的タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて天然源からタンパク質を精製する方法を、組み換えＤＮＡ法によって産生されるタンパク質の精製に同様に適用してもよい。
【０１３２】
組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動化ペプチド合成機も使用して、本質的には純粋な単離されるタンパク質を産生してもよい。かかる技術は当業者に周知であり、置換を有する誘導体がＤＮＡにコードされるタンパク質産生において供給されない場合に有用である。
【０１３３】
ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアなどの組み換えベクターを含むいくつかの周知の技術のいずれかを用いて、これらの核酸分子を送達してもよい。
【０１３４】
投与経路には、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼球内経路、および経口経路、ならびに粘膜組織への吸入剤もしくは坐薬による、例えば、膣、直腸、尿道、頬および舌下の組織への洗浄による局所的経路、経皮的経路が含まれるが、それらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、電気穿孔の方法および装置、従来の注射器、無針注射器具、または「微粒子衝撃遺伝子銃」を含むがそれらに限定されない手段により投与されてもよい。
【０１３５】
これらのＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号（これらの内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される例が含まれる。３５ＵＳＣ１１９（ｅ）条の下、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（これらの全ては、この全体が本明細書に組み込まれる）に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましい。
【０１３６】
以下は、電気穿孔技術を用いた実施形態の例であり、上記で論じた特許参考文献の中で詳細に論じられる：電気穿孔装置は、使用者により事前に設定された電流入力と同じような定電流を生み出すエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織へ送達するように配置され得る。この電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極集合体またはハンドル集合体を含む。この電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録装置、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記録構成要素、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、かつ組み込むことができる。この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、この電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。一部の実施形態において、この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能することができ、それは、この電気穿孔構成要素から分離する電気穿孔装置のさらに他の要素と連通することができる。これらの要素は１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能することができるので、改良型ＨＰＶワクチンを送達するためにこの電気穿孔技術を用いることは、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素に限定されない。この電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生み出すエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、ここで、この電極集合体は、この電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にエネルギーパルス送る。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、この電気穿孔構成要素へインピーダンスを伝える。このフィードバック機構は、測定されるインピーダンスを受け取ることができ、この電気穿孔構成要素によって送達されるエネルギーパルスを調節し、定電流を維持することができる。
【０１３７】
一部の実施形態において、複数の電極は、分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができる。一部の実施形態において、複数の電極は、プログラムされた順番の下で、電極制御を介して分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができ、使用者が、プログラムされた順番を電気穿孔構成要素に入力する。一部の実施形態において、プログラムされた順番は、順に送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。
【０１３８】
一部の実施形態において、このフィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行される。好ましくは、このフィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われる。好ましくは、このフィードバックは、毎５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓで生じるが、好ましくはリアルタイムなフィードバックつまり瞬間的（すなわち、反応時間を決定するために利用できる技術によって決定されるような事実上瞬間的）である。一部の実施形態において、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスをこのフィードバック機構へ伝達し、このフィードバック機構はインピーダンスに応答し、事前設定電流と同じような値で定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。一部の実施形態において、このフィードバック機構は、エネルギーパルス送達の間、連続的にかつ瞬間的に定電流を維持する。
【０１３９】
一部の実施形態において、この核酸分子を、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤の投与と併用して、これらの細胞に送達する。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号および１９９４年１月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に提出された米国特許第０２１，５７９号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子と併用して投与する助剤を、核酸分子の投与前後に、この核酸分子との混合物として投与するか、または別々に、同時に投与してもよい。さらに、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症性薬剤として機能し得、かつＧＶＦと一緒に投与され得る他の薬剤には、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などの増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、ならびに線維芽細胞増殖因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバンド、モノホスホリルリピドＡ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンスクアレンなどの小胞が含まれ、かつヒアルロン酸も、この遺伝子構築物と併用して投与に使用してもよい。一部の実施形態において、免疫調節タンパク質を、ＧＶＦとして使用してもよい。一部の実施形態において、この核酸分子はＰＬＧと関連して提供され、送達および取り込みを高める。
【０１４０】
本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、約５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１０ｎｇ〜約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約０．１〜約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１〜約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１００〜約２００μｇのＤＮＡを含む。
【０１４１】
本発明による医薬組成物を、使用する投与方法に従って処方する。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合において、注射可能な医薬組成物は無菌であり、発熱物質も粒子も含まない。好ましくは、等張製剤を使用する。一般に、等張にするための添加剤には、塩化ナトリウム、Ｄ型グルコース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖が含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。一部の実施形態において、血管収縮剤をこの製剤に加える。
【０１４２】
本発明の一部の実施形態によると、免疫反応を誘導する方法が提供される。このワクチンは、タンパク質に基づく、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組み換えワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンであってもよい。一部の実施形態において、粘膜免疫反応を誘導する方法を含む、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片またはそれらの発現できるコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換えワクチン、および／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンと組み合わせて、この個体に投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上を、免疫原をコードする単離した核酸分子；および／もしくは免疫原をコードする組み換えワクチンおよび／もしくは免疫原を含むサブユニットワクチンおよび／もしくは弱毒化生ワクチンおよび／もしくは不活化ワクチンの投与前に、それらの投与と同時に、またはそれらの投与の後に投与してもよい。一部の実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離した核酸分子を、この個体に投与する。
【０１４３】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すが、単なる説明の目的で与えられるということが理解されるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を突き止めることができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適用するために、本発明の様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載される改良に加えて、本発明の様々な改良は、先の記載から当業者に明らかになるであろう。かかる改良は、添付の特許請求の範囲に入ることも意図される。
【０１４４】
米国特許、米国特許出願、および本開示の全体を通して引用される参考文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
実施例
【０１４５】
本発明を、さらに以下の実施例で定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみの目的で与えられることを理解されたい。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の本質的特徴を確認することができ、様々な使用および条件に適合させるために、本発明の様々な変化および変更を行うことができる。したがって、本明細書に示し、記載したものに加えて、前述の記載から本発明の様々な変更が当業者には明らかであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内であることも意図される。
実施例１
【０１４６】
Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質をコードする新規な遺伝子組換えＨＰＶ−１６ＤＮＡワクチン
Ｅ６配列とＥ７配列がタンパク質分解切断部位によって分離されたポリタンパク質として発現されるように免疫原を設計した。ポリタンパク質はほかにも、ＩｇＥリーダー配列とともに発現される。ポリタンパク質の設計には、ｐ５３の結合および分解に重要なＥ６配列における削除または変異ならびにＥ７タンパク質上のリボソーム結合部位における変異が含まれる。
【０１４７】
ポリタンパク質（配列番号２２）をコードするＨＰＶ１６のＥ６／Ｅ７のコード配列（配列番号２１）をベクターｐＶＡＸに挿入して発現プラスミドを作製した。カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）とプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）とを含むｐＶＡＸ骨格を用いた、ウシ成長ホルモン３’末端およびポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を有するＣＭＶプロモーター（ＰＣＭＶ）によって駆動する最適化したヒトパピローマウイルス１６−６および７抗原（ＨＰＶ１６のＥ６および７）。
【０１４８】
ＨＰＶ１８のＥ６／Ｅ７ワクチンの設計および発現
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ウイルスタンパク質１８Ｅ６および７に対して最適化されたコンセンサス配列を調製した。この配列は高レベルの発現用に設計されたものである。この配列は本発明者らの遺伝子による免疫化技術に有用である。コンセンサス配列を用いて実施した実験の結果は肯定的なものであった。プラスミド構築物は、コンセンサスＨＰＶ１８−６および７の核酸配列（配列番号２３）を含む。プラスミド内に組み込まれたコンセンサスＨＰＶ１８−６および７の核酸配列は、コンセンサスＨＰＶ１８−６および７のコード配列と連結したＩｇＥリーダーペプチドのコード配列を含む。
【０１４９】
カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）とプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）とを含むｐＶＡＸ骨格を用いて、ウシ成長ホルモン３’末端およびポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を有するＣＭＶプロモーター（ＰＣＭＶ）によって駆動し、最適化されたヒトパピローマウイルス１８−６および７抗原（ＨＰＶ１８のＥ６および７）（配列番号２４）を発現する、発現プラスミドｐＧＸ３００２を作製した。
【０１５０】
ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７のワクチン設計ならびに発現
ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７コンセンサスに基づく融合免疫原の構築
ＨＰＶ６型またはＨＰＶ１１型のＥ６／Ｅ７遺伝子配列をＧｅｎｅＢａｎｋから収集し、コンセンサスＥ６およびＥ７のヌクレオチド配列を、多重アライメントを行った後に取得した。ＨＰＶ６のＥ６またはＥ７タンパク質のコンセンサス配列を、それぞれ９８個または２０個の配列から作製し、ＨＰＶ１１のＥ６またはＥ７タンパク質のコンセンサス配列を、それぞれ７６個または１３個の配列から作製した。系統発生的研究に適用される多重アライメント手順には、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（２．０版）の適用が含まれていた。図１Ａおよび図１Ｂに示す通り、ＨＰＶ株間であって、それらのＥ６およびＥ７タンパク質の同じ型に属するＨＰＶ株間で配列分散が約０〜２％存在した。しかし、遺伝距離は、ＨＰＶ６とＨＰＶ１１の間でＥ６タンパク質では１９．３％まで、Ｅ７タンパク質では１６．３％まで上げることができた。系統発生分析のこれらの結果に基づいて、２つの型特異的なＥ６／Ｅ７コンセンサスＤＮＡワクチンを開発した。
【０１５１】
コンセンサスＥ６／Ｅ７融合配列を作製した後に、いくつかの変更を行った（図１Ｃ）。発現を促進させるために、高性能リーダー配列を開始コドンの上流にインフレームで融合した。コドンおよびＲＮＡの最適化も、以前に記載されたとおりに行った（Ｊ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＰＶ１８ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ Ｅ６／Ｅ７ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ,Ｖａｃｃｉｎｅ.２６（２００８）５２１０−５２１５；およびＪ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＰＶ−１６ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ Ｅ６／Ｅ７ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ,Ｖａｃｃｉｎｅ.２７（２００９）４３１−４４０）。適切なタンパク質フォールディングおよび良好なＣＴＬプロセシングのために、細胞内タンパク質分解切断部位をＥ６およびＥ７タンパク質の間に導入した。遺伝子工学処理した合成６Ｅ６Ｅ７遺伝子と１１Ｅ６Ｅ７遺伝子の両方は、長さが８４０ｂｐであった。さらなる研究のために、配列を確認した合成遺伝子を、それぞれｐＶＡＸ発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。コンセンサスヌクレオチド配列を翻訳することによって、コンセンサスアミノ酸配列を取得した。
【０１５２】
ＨＰＶ６および１１のコンセンサスＥ６配列ならびにＨＰＶ６および１１のコンセンサスＥ７配列を取得した後に、コドン最適化およびＲＮＡ最適化を以前に記載された通りに行った（Ｊ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｖａｃｃｉｎｅ.２６（２００８）５２１０−５２１５；およびＪ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ,Ｖａｃｃｉｎｅ.２７（２００９）４３１−４４０）。ＨＰＶ６型または１１型のコンセンサスＥ６／Ｅ７融合タンパク質のいずれかをコードする融合遺伝子（６Ｅ６Ｅ７または１１Ｅ６Ｅ７）を合成し、配列を確認した。合成した６Ｅ６Ｅ７または１１Ｅ６Ｅ７を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下の発現ベクターｐＶＡＸ（インビトロジェン社）にクローニングし、これらのコンストラクトをｐ６Ｅ６Ｅ７またはｐ１１Ｅ６Ｅ７と命名した。
【０１５３】
２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートで培養し、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナ州インディアナポリス）を用いてｐＶＡＸ、ｐ６Ｅ６Ｅ７、またはｐ１１Ｅ６Ｅでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、これらの細胞を、改変ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液を用いて溶解させ、細胞可溶化液を回収した。抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）を用いてウエスタンブロット解析を行い、ＥＣＬＴＭウエスタンブロット解析システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）で可視化した。
【０１５４】
ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の発現を確認するために、ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）を用いて間接免疫蛍光アッセイを行った。チャンバースライドで培養したＲＤ細胞を、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ ８．０（Ｏｒｉｇｅｎｅ社、メリーランド州ロックビル）を用いてｐＶＡＸ、ｐ６Ｅ６Ｅ７またはｐ１１Ｅ６Ｅ７でトランスフェクトした。その後、これらの細胞をＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理した。これらの細胞を、１次抗体および２次抗体と１〜２時間それぞれインキュベートし、２回のインキュベーションの間に、グリシンおよびＢＳＡを補充したＰＢＳで洗浄した。使用した１次抗体および２次抗体は、それぞれモノクローナルマウス抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）であった。ヘキスト染色も行って、細胞核を識別し、ＲＤ細胞を局在化させた。全てのインキュベーションが完了した後に、これらの細胞をマウントとし、ガラススライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミンガム）で固定した。これらの試料を、共焦点顕微鏡（ＣＤＢ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ、ペンシルベニア大学、細胞発生生物学、ペンシルベニア州フィラデルフィア）を用いて観察し、撮像した。
【０１５５】
ＨＰＶ３１、３３、３９、４５、５２および５８のＥ６Ｅ７抗原
ＨＰＶ３１型、３３型、３９型、４５型、５２型および５８型のＥ６／Ｅ７遺伝子配列をＧｅｎｅＢａｎｋから別個に収集し、コンセンサスＥ６／Ｅ７ヌクレオチド配列を、多重アライメントを行った後に取得した（３１型−配列番号１８；３３型−配列番号６；５２型−配列番号２０；および５８型−配列番号８）。系統発生的研究に適用される多重アライメント手順には、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ（２．０版）の適用が含まれていた。系統発生分析の結果に基づいて、型特異的なＥ６／Ｅ７コンセンサスＤＮＡワクチンを開発した。
【０１５６】
コンセンサスＥ６／Ｅ７融合配列を作製した後に、いくつかの変更を行った。発現を促進させるために、高性能リーダー配列を開始コドンの上流にインフレームで融合した。コドンおよびＲＮＡの最適化も、以前に記載された通りに行った（Ｊ．Ｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＨＰＶ１８  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  Ｅ６／Ｅ７  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ．２６（２００８）５２１０−５２１５；およびＪ．Ｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＨＰＶ−１６  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  Ｅ６／Ｅ７  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ．２７（２００９）４３１−４４０）。適切なタンパク質フォールディングおよび良好なＣＴＬプロセシングのために、細胞内タンパク質分解切断部位をＥ６およびＥ７タンパク質の間に導入した。さらなる研究のために、配列を確認した合成遺伝子を、それぞれｐＶＡＸ発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。コンセンサスヌクレオチド配列を翻訳することによって、コンセンサスアミノ酸配列を取得した。
【０１５７】
カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ）とプラスミド複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）とを含むｐＶＡＸ骨格を用いて、ウシ成長ホルモン３’末端およびポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を有するＣＭＶプロモーター（ＰＣＭＶ）によって駆動され、最適化されたヒトパピローマウイルス３１、３３、５２および５８−Ｅ６および７抗原（ＨＰＶ３１のＥ６および７−配列番号１７、ＨＰＶ３３のＥ６および７−配列番号５、ＨＰＶ５２のＥ６および７−配列番号１９ならびにＨＰＶ５８のＥ６および７−配列番号７）を発現する、発現プラスミドを作製した。同様にして、最適化されたヒトパピローマウイルス３９および４５のＥ６およびＥ７抗原（配列番号２６をコードするＨＰＶ３９のＥ６およびＥ７配列；ならびに配列番号２５をコードするＨＰＶ４５のＥ６およびＥ７配列）である挿入断片を含む、発現プラスミドを作製した。
実施例２
【０１５８】
マウスおよび処置群の免疫化
６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをこの実験に用いた。マウスを、ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から入手した。これらのマウスを、米国国立衛生研究所およびペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）)の方針に従って、ペンシルベニア大学の動物資源研究所に収容し、維持した。これらの実験で用いたマウスを、免疫化のために４群に分けた。マウスをｐ６Ｅ６Ｅ７、ｐ１１Ｅ６Ｅ７、または両方のコンストラクトで免疫化し、ｐＶＡＸ群を陰性対照とした。
【０１５９】
ＤＮＡワクチン接種および電気穿孔法
各マウスに、１４日の間隔を空けて各ＤＮＡプラスミド２０μｇを３回投与した。ｐ６Ｅ６Ｅ７とｐ１１Ｅ６Ｅ７との両方を接種される群のマウスは、ワクチン接種あたり両方のプラスミド２０μｇ、合計４０μｇのＤＮＡを接種された。これらのＤＮＡコンストラクトを、右大腿四頭筋への筋肉注射により投与し、その後、短形波をＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）エレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ペンシルベニア州ブルーベル）により生成させた。このエレクトロポレーターを、５２ｍｓ／パルス、０．２アンペアで、１秒遅れの間隔で２つの電気パルスを送るように構成した。電気穿孔手順は、以前に記載された通りに行った（１２、１３）。
【０１６０】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
治療群と対照群との両方のマウスを、３回目の免疫化の１週間後に屠殺した。脾臓を各マウスから採取し、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ１０）に移した。ストマッカー（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ニューヨーク州ボヘミア）を用いて、脾臓を粉砕し、その後、セルストレーナーを通して移し、ＡＣＫ溶解緩衝液に懸濁させた。赤血球を除去した後、脾細胞を単離し、Ｒ１０培地に懸濁した。高タンパクＩＰ９６−ウェルマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）（商標）プレート（ミリポア社、マサチューセッツ州ベッドフォード）を、モノクローナルマウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）で予めコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、これらのプレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび５％スクロースで、周囲温度で２時間ブロッキングした。Ｒ１０培地中の単離した脾細胞を計数し、ウェル当たり２×１０5細胞で３連のウェルに添加した。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のコンセンサスＥ６／Ｅ７配列に及ぶ２組のペプチドを、ＤＭＳＯ（ＵＳＡ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で再構成した。これらのペプチドは１５個のアミノ酸配列を含み、そのうちの８残基が各シーケンシャルペプチドと重複していた。ＨＰＶ６および１１のペプチドを、それぞれＤＭＳＯ中２μｇ／ｍｌの濃度で２つのプール（一方のプールはＥ６、別のプールはＥ７）に分けた。陽性対照および陰性対照用のウェルに、それぞれ、ペプチドの代わりにコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）およびＲ１０培地を入れた。その後、プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーターに入れた。３７℃で２４時間インキュベーションした後、これらのウェルを１×ＰＢＳで洗浄した。ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ検出抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を各ウェルに添加し、次いで、４℃で一晩インキュベートした。その後、これらのプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴプラス（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、Ｒ＆Ｄシステムズが提供する発色プロトコールにより処理した。これらのウェルを一晩空気乾燥し、ウェル内部のスポットを、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーシステムによりＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）３およびＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）４のソフトウェアを用いてスキャンし、計数した（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ.、オハイオ州シェーカーハイツ）。報告されたスポット形成細胞数を変換し、演算を使用して、１×１０6個の脾細胞あたりのスポット形成単位を示した。
【０１６１】
それらの感度及びＴ細胞活性を示す能力を前提として、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＨＰＶ６または１１のＥ６およびＨＰＶ６または１１のＥ７ペプチドのいずれかでの刺激に反応して、抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞数を決定した。
【０１６２】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスのＳＦＵ／１０６脾細胞の平均数は１４４２．８であり、ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスのＳＦＵ／１０６脾細胞の平均数は２８４５であり、これらは全て、陰性対照群を著しく上回っていた。したがって、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の両方は、マウスにおいて強力な型特異的Ｅ６およびＥ７特異的免疫反応を誘発するのに有効であった。
【０１６３】
興味深いことに、交差反応性の細胞性免疫反応も、ｐ６Ｅ６Ｅ７またはｐ１１Ｅ６Ｅ７での免疫化により誘導された。ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫化したマウスにおけるＨＰＶ６のＥ６／Ｅ７ペプチドに対するＳＦＵ／１０６脾細胞の添加頻度は、５５２．８ＳＦＵ／１０６脾細胞であり、ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫化したマウスにおけるＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７特異的免疫反応は、８８８．３ＳＦＵ／１０６脾細胞であった。ＨＰＶ６または１１のＥ６タンパク質は、約８０％の同一性を共有し、ＨＰＶ６または１１のＥ７タンパク質は、約８４％の同一性を共有した。ＨＰＶ６または１１のＥ６抗原とＨＰＶ６または１１のＥ７抗原の間にはいくつかの共有免疫エピトープが存在し得る。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイから観察される交差反応性は、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６抗原とＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ７抗原との間に共有免疫エピトープがあることを示した。
【０１６４】
ｐ６Ｅ６Ｅ７とｐ１１Ｅ６Ｅ７（組み合わせ群）の両方を受け取ったマウスの脾細胞も、これらの２つのコンストラクトを一緒に免疫化する場合に、任意の免疫干渉があるか否かを調べるために、上記のＥＬＩＳｐｏｔアッセイに供した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７ペプチドに対する組み合わせ群の平均値は、１６７０ＳＦＵ／１０６脾細胞（σ＝５５．７、Ｐ＜０．００１）であった。ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７ペプチドに対する脾細胞の同じグループは、２０１０ＳＦＵ／１０６脾細胞（σ＝２４７．８、Ｐ＝０．００２）をもたらした。これらのデータは、２つのコンストラクトでの同時免疫化が、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１に対して統計的に有意なＥ６およびＥ７特異的細胞性反応を誘発することができ、これらの反応は互いに干渉しないことを示唆する。
【０１６５】
エピトープマッピング
Ｅ６／Ｅ７コンセンサス抗原内の免疫優性ペプチドを決定するために、エピトープマッピング試験を行い、ペプチドプール内の優性エピトープを決定した（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの試験は、前述のIＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイと同様に行った。プールの代わりに、個々のペプチドを用いて、脾細胞を刺激した。
【０１６６】
この単一ペプチド分析に用いた各ペプチドは、ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１のＥ６抗原およびＨＰＶ６またはＨＰＶ１１のＥ７抗原の部分的に重複する断片を示した。マッピングデータは、配列番号１１のペプチド７（ＴＡＥＩＹＳＹＡＹＫＱＬＫＶＬ）が、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７免疫原の優性エピトープであることを示した（図４Ａ）。配列番号１１のＴＡＥＩＹＳＹＡＹＫＱＬＫＶＬは、ＮＩＨ ＢＩＭＡＳによって入手可能なＨＬＡ結合予測ソフトウェアによって制限されるＨ２−Ｋｂであることが確認された８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒのアミノ酸エピトープをそれぞれ含んでいた。さらに、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７特異的Ｔ細胞免疫反応について記載する（図４Ｂ）。また、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７の重複断片を用いてペプチド分析も行った。エピトープマッピングにより、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７抗原の優性エピトープが、配列番号１２のペプチド７（ＴＡＥＩＹＡＹＡＹＫＮＬＫＶＶ）および配列番号１３のペプチド２７（ＨＣＹＥＱＬＥＤＳＳＥＤＥＶＤ）であることが示された。ＨＰＶ６エピトープマッピングアッセイにおけるペプチド７と同様に、ＢＩＭＡＳ ＨＬＡ結合予測ソフトウェアにより、配列番号１２のＴＡＥＩＹＡＹＡＹＫＮＬＫＶＶがＨ２−Ｋｂ制限エピトープであることが確認された。ＮＩＨ ＮＩＡＩＤが提供する別のＨＬＡ結合ペプチドデータベース、免疫エピトープデータベースおよび分析リソースは、配列番号１３のＨＣＹＥＱＬＥＤＳＳＥＤＥＶＤがＨ２−Ｋｂ制限エピトープであることを確認した。準有意の３つの免疫ペプチドである配列番号１４の番号６（ＦＣＫＮＡＬＴＴＡＥＩＹＳＹＡ）、配列番号１５の番号９（ＬＦＲＧＧＹＰＹＡＡＣＡＣＣＬ）、および配列番号１６の番号１３（ＹＡＧＹＡＴＴＶＥＥＥＴＫＱＤ）を、このエピトープマッピング研究を経て同定した。
【０１６７】
細胞内サイトカイン染色
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって示される高い免疫反応を考慮して、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７により誘導される細胞性反応のより包括的な概要を提供するために、細胞内サイトカイン染色アッセイを行った。免疫化したマウス群および未処理のマウス群の脾細胞を単離し、５％ＣＯ２環境中、３７℃で４時間、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６ならびにＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ７領域にまたがるペプチドで刺激した。このアッセイにおいて陽性対照および陰性対照を、それぞれ、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびＲ１０細胞培地中に細胞を入れることによって用いた。インキュベーション後、これらの細胞を最初にＶｉＶｉＤ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）で染色し、生細胞および死細胞を区別し、次いで、全細胞を、ＡＰＣ−Ｃｙ７ハムスター抗マウスＣＤ３ｅ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ラット抗マウスＣＤ４、およびＡＰＣラット抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、の表面マーカー抗体で染色した。その後、これらの細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて固定した。製造業者のプロトコールに従って固定した後、これらの細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００ラット抗マウスＩＦＮ−γ、ＰＥ−Ｃｙ７ラット抗マウスＴＮＦクローン、およびＰＥラット抗マウスＩＬ−２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の細胞マーカー抗体で染色した。染色後、これらの細胞を、２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液で固定した。調製した細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）が搭載されたＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて得た。取得したデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、オレゴン州アッシュランド）の最新バージョンを使用して分析した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のイベントを、ＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈからのシングレット、ＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａからの全脾細胞、ＶｉＶｉＤ染料（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ社）対ＳＳＣ−Ａからの生細胞、ＣＤ３（ＡＰＣ−Ｃｙ７）対ＳＳＣ−ＡからのＣＤ３＋細胞、ＣＤ４（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５：陽性−ＣＤ４＋、陰性−ＣＤ８＋）対ＳＳＣ−ＡからのＣＤ４＋またはＣＤ８＋というゲートの順番を用いて単離した。最後の２つの集団を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＰＥ−Ｃｙ７、およびＰＥに対してゲーティングし、それぞれＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生の変化を観察した。
【０１６８】
細胞内サイトカイン染色データが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の反応により区別することができるように細胞をゲーティングした。ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７特異的なペプチドで刺激した場合、ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生する全ＣＤ４＋細胞の平均値は、それぞれ０．１６３％（σ＝０．０９）、０．００３％（σ＝０．０７）、０．１８８％（σ＝０．２０）であった（図５Ａ）。マウスの同じグループのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生する全ＣＤ８＋細胞の平均値は、それぞれ３．３２３％（σ＝１．３９）、０．８３８％（σ＝０．３２）、および１．１７２％（σ＝１．８１）であった。同じ細胞内サイトカインデータを、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７抗原とのインキュベーション後にｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスの脾細胞を用いて収集した（図５Ｂ）。ｐ１１Ｅ６Ｅ７免疫化マウスの全ＣＤ４＋細胞のうち、ＩＦＮ−γを産生した細胞の平均値は０．０５１％（σ＝０．０４）、ＴＮＦ−αを産生した細胞の平均値は０．０６８％（σ＝０．０９）、ＩＬ−２を産生した細胞の平均値は０．０２６％（σ＝０．０３７）であった。さらに、ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスにおいて、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生した全ＣＤ８＋細胞の平均値は、それぞれ４．５２％（σ＝２．５３）、２．０８％（σ＝１．５６）、および０．２１％（σ＝０．２２）であった。いくつかのパネルを除いて、処理群対それらのそれぞれの未処理群のサイトカイン産生細胞の割合は、８９％以上の信頼水準で統計的に有意であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生の程度の観察により、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７によって誘発される免疫反応は、全てのモデルにおいてそれらの細胞クリアランスと関連付けられるＣＤ８＋リンパ球の駆動に向かって大きく偏っていると結論付けることができる。
【０１６９】
統計分析
スチューデントｔ検定を行い、この研究で生じた全ての定量的データの統計的有意性を解析した。特に明示しない限り、ｐ値を計算し、様々な信頼レベルで統計的有意性を決定した。
【０１７０】
この研究は、ＤＮＡワクチンが、実績があり従来から使用されている他のワクチンプラットフォームを用いた実験で見出された免疫原性のレベルを達成することができる可能性の説得力のある証拠を示した。他の類似のＥ６およびＥ７特異的ＨＰＶ ＤＮＡワクチン研究で測定された高レベルの細胞性反応は、予防的および治療的な抗腫瘍効果を示唆するデータと関連していた。ほとんどのＨＰＶ関連の研究および疾患の負荷モデルは、子宮頸癌に焦点を当てている。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１が、他のＨＰＶ血清型と同じくらい子宮頸癌と関係しないことを考慮すると、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の治療効果は、完全に従来のＨＰＶ疾患の負荷モデルを用いて評価することはできない。適切な疾患の負荷モデルが利用可能である場合、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の保護ならびに治療の可能性を判断することは洞察に満ちている。したがって、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび細胞内サイトカイン染色によって定量化される高レベルのＩＦＮ−γならびにサイトカイン産生を調べることにより、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の免疫原性の有効性を推測することができる。それにもかかわらず、そのようなレベルは、大きさが著しく強いこと、かつ２つのコンストラクトが、実質的なレベルの細胞性免疫反応を誘発するという見込みを示すことが見出された。ＨＰＶ関連の悪性腫瘍が、一般に、複数の血清型の同時感染に続発しているため、ウイルスの異なる血清型を対象としたワクチンを組み合わせることの実現可能性をさらに調べる必要性が大いに存在する。Ｔ細胞の動態およびワクチン競争を調べるさらなる研究は、これらの２つのプラスミドの同時免疫化の効果をさらに特徴づけることを保証する。
【０１７１】
細胞内サイトカイン染色により、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１１Ｅ６Ｅ７での免疫化は、かなりの割合のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生するＴ細胞を誘発することができることが示された。免疫系における現在知られている機能を考慮して、ＩＦＮ−γは、従来、細胞性免疫反応の指標として用いられてきた。これらの重要な役割のいくつかには、自然免疫および獲得免疫を調節し、刺激する能力が含まれる。さらに、ＩＦＮ−γの主な生産者は、ＩＦＮ−γ産生を、抗原に対する所定のワクチン曝露後の細胞免疫原性を測定するのに許容されるモードにさせるＴ細胞であることが広く認められている。ＴＮＦ−αは、免疫系の調節に関与する別のサイトカインである。アポトーシスを誘導し、腫瘍増殖を調節するＴＮＦ−αの既知の能力により、ＴＮＦ−αは、ワクチン接種後の免疫反応を特徴づける際に考慮すべき重要なパラメータになる。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１の潜在的な腫瘍増殖特性を考慮すると、ＴＮＦ−α産生はさらに興味深いものとなり得る。ＩＬ−２は、免疫系におけるＴ細胞の増殖および分化において中心的な役割を果たすことが観察されている別のシグナル伝達分子である。そのため、ＩＬ−２は、特定の免疫反応の程度および品質について更なる見解を得るために、他のサイトカインと組み合わせて検討される場合が多い。上記を考慮すると、ｐ６Ｅ６Ｅ７での免疫化後の顕著な割合のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生するＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋細胞は、このワクチンが、強力な免疫反応を誘導することに成功したことを示唆する。ＩＬ−２を分泌するＣＤ４＋細胞を除いて、ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫化したマウスから単離した細胞についても同じ傾向が当てはまる。さらに、ＣＤ８＋細胞が、免疫化マウスにおける免疫反応を著しく促進したこと（これらの２つのプラスミドの抗腫瘍効果を評価する上で重要である特性）を観察することは注目に値する。
実施例３
【０１７２】
マウスおよび処置群のワクチン接種
６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いることができる。マウスはジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から入手することができる。これらのマウスを免疫化のために４群に分けることができる。マウスを以下に挙げる組み合わせのうちの１つで免疫化することができ：ａ）ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ６Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ１１Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ３１Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ３３Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ５２Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミドおよびＨＰＶ５８Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド；ｂ）ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ３１Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミドをコードするプラスミド、ＨＰＶ３３Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ５２Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミドおよびＨＰＶ５８Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド；ｃ）ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ３１Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミドおよびＨＰＶ３３Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド；ｄ）ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ１８Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド、ＨＰＶ６Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミドおよびＨＰＶ１１Ｅ６Ｅ７をコードするプラスミド；ｐＶＡＸ群を陰性対照とした。
【０１７３】
ＤＮＡワクチン接種および電気穿孔法
入手した各マウスに、１４日の間隔を空けて各ＤＮＡプラスミド２０μｇを計３回投与する。ＤＮＡコンストラクトを、右大腿四頭筋への筋肉注射により投与し、その後、矩形波パルスをＣＥＬＬＥＣＴＲＡエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ペンシルベニア州ブルーベル）により生成させる。このエレクトロポレーターを、５２ｍｓ／パルス、０．２アンペアで、１秒遅れの間隔で２つの電気パルスを送るように構成する。電気穿孔手順は、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のＣＥＬＬＥＣＴＲＡ情報サービスにある通りに以前に記載された通りに行った。
【０１７４】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
治療群と対照群との両方のマウスを、３回目の免疫化の１週間後に屠殺した。脾臓を各マウスから採取し、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ１０）に移す。ストマッカー（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ニューヨーク州ボヘミア）を用いて、脾臓を粉砕し、その後、セルストレーナーを通して移し、ＡＣＫ溶解緩衝液に懸濁させる。赤血球を除去した後、脾細胞を単離し、Ｒ１０培地に懸濁させる。高タンパクＩＰ９６−ウェルマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）プレート（ミリポア社、マサチューセッツ州ベッドフォード）を、モノクローナルマウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）で予めコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、これらのプレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび５％スクロースで、周囲温度で２時間ブロッキングする。Ｒ１０培地中の単離した脾細胞を計数し、ウェル当たり２×１０５細胞で３連のウェルに添加する。各ＨＰＶプラスミドのコンセンサスＥ６／Ｅ７配列に及ぶ２組のペプチドを、ＤＭＳＯ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で再構成する。これらのペプチドは１５個のアミノ酸配列を含み、そのうちの８残基が各シーケンシャルペプチドと重複していた。各ＨＰＶプラスミドのペプチドを、それぞれＤＭＳＯ中２μｇ／ｍｌの濃度で２つのプール（一方のプールはＥ６、別のプールはＥ７）に分けた。陽性対照および陰性対照用のウェルに、それぞれ、ペプチドの代わりにコンカバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）およびＲ１０培地を入れる。その後、プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーターに入れる。３７℃で２４時間インキュベーションした後、これらのウェルを１×ＰＢＳで洗浄する。ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ検出抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を各ウェルに添加し、次いで、４℃で一晩インキュベートする。その後、これらのプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴプラス（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、Ｒ＆Ｄシステムズが提供する発色プロトコールにより処理する。これらのウェルを一晩空気乾燥し、ウェル内部のスポットを、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーシステムによりＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）３およびＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）４のソフトウェアを用いてスキャンし、計数する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．、オハイオ州シェーカーハイツ）。報告されたスポット形成細胞数を変換し、演算を使用して、１×１０６個の脾細胞あたりのスポット形成単位を示す。
【０１７５】
それらの感度及びＴ細胞活性を示す能力を前提として、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＨＰＶ６または１１のＥ６およびＨＰＶ６または１１のＥ７ペプチドのいずれかでの刺激に反応して、抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞数を決定する。
実施例４
【０１７６】
ヒトを対象としたＶＧＸ−３１００の第１相の結果
（ＨＰＶ１６のＥ６Ｅ７とＨＰＶ１８のＥ６Ｅ７との組み合わせ）
以前ＣＩＮ２／３の治療を受けた患者
ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流ＥＰ装置を用いたＶＧＸ−３１００組み合わせＤＮＡワクチンのＩＭ送達。
全体が本明細書に組み込まれるＢａｇａｒａｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ４，１５５ｒａ１３８（２０１２）を参照されたい。
【０１７７】
【表１】
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【０１７８】
抗体反応：
１８例中１５例（８３％）に全４種類の抗原に対しても高力価の抗体が認められ、いずれも９か月間、ウエスタンブロットによる確認が持続した。
ＨＰＶ１６、１８のＥ６、Ｅ７に対する抗原特異的細胞性反応：
−１８例中１４例（７８％）がＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔで陽性（５０超ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）
−投与量とともに１種類の抗原では最大２５００超ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ、全４種類の抗原では５，６７０超ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣに増加
−５例が全４種類の抗原に応答
−応答は最初のシリーズ後９か月間持続
−４回目の投与によりＴ細胞応答が最大２年超の間増強
−ＨＬＡ  ＤＲ＋／ＣＤ３８＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がグランザイムＢ／パーフォリンを放出して殺細胞作用を示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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