(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験室用機器のキャリブレーションのための方法であって、前記方法は、
光源を備える光学系を提供することであって、前記光学系は、前記光源による励起の際に複数の生体試料からの蛍光発光をイメージングすることができ、各生体試料は、サンプルウェルプレート上の複数のサンプルウェルのうちの１つ内に含まれている、ことと、
前記光学系を使用して、各サンプルウェルからの１つ以上の蛍光閾値に関連する、前記複数のサンプルウェルにおける蛍光発光を検出することによって、少なくとも１つの初期の関心領域（ＲＯＩ）を推定することと、
各ＲＯＩの１つ以上の中心位置を推定することと、
各ＲＯＩのサイズを推定することと、
前記複数のサンプルウェルから前記ＲＯＩの平均的サイズを決定することと、
１つ以上の広域グリッディングモデルを導出することであって、前記広域グリッディングモデルは、各ＲＯＩの前記推定された中心位置を分析する、ことと、
前記広域グリッディングモデルを適用して、前記推定された中心位置を前記サンプルウェルプレートのレイアウトの１つ以上の位置座標に関連付けることによって、前記ＲＯＩ中心位置の精度を向上させることと、
前記広域グリッディングモデルの１つ以上のマッピング関数を用いて、見落としていたＲＯＩを回復させることと、
前記ＲＯＩのサイズを調整することであって、前記調整は、前記光学系のシグナル対ノイズ比を向上させる、ことと
を含む、方法。
【請求項２】
各生体試料は、１つ以上のスペクトルで識別可能な色素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のスペクトルで識別可能な色素は、検出されることが可能なシグナルを発する１つ以上の蛍光色素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料は、前記励起に反応して所定の波長で蛍光を発する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記実験室用機器は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを通して前記１つ以上の生体試料を分析するように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光源は、レーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、または広域スペクトル光源を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記広域グリッディングモデルは、前記ＲＯＩ間の中心間距離をウェルプレートレイアウトのグリッド座標と比較して、各ＲＯＩに対するＸグリッド座標およびＹグリッド座標を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
マッピング関数を決定および適用して、各グリッド座標をＲＯＩの中心にマップすることをさらに備える、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
実験室用機器における１つ以上の生体試料に対して関心領域（ＲＯＩ）位置をキャリブレーションするためのシステムであって、前記システムは、
光学検出システムであって、前記光学検出システムは、
複数のフィルタと、
少なくとも１つの励起源と、
前記少なくとも１つの励起源による励起の際に前記１つ以上の生体試料からの蛍光発光の１つ以上のイメージを収集するように構成された少なくとも１つの検出器と、
複数のサンプルウェルを備えるマイクロウェルトレイであって、各生体試料は、サンプルウェル内に含まれている、マイクロウェルトレイと
を備える、光学検出システムと、
コンピュータシステムであって、
少なくとも１つのプロセッサであって、前記少なくとも１つのプロセッサは、
前記１つ以上の生体試料からの蛍光発光の前記１つ以上のイメージと、ユーザから受信される１つ以上の入力パラメータとに基づいて、１つ以上のＲＯＩ中心位置の推定値を設定することと、
各ＲＯＩのサイズを推定することと、
複数のサンプルウェルから前記ＲＯＩの平均的サイズを決定することと、
前記推定されたＲＯＩ中心位置を分析して、隣接するＲＯＩを求めることと、
１つ以上のマッピング関数を適用して、前記推定された中心位置を前記マイクロウェルトレイのレイアウトの１つ以上の位置座標に関連付けることによって、前記ＲＯＩ中心位置の精度を向上させることと、
前記１つ以上のマッピング関数を用いて、見落としていたＲＯＩを回復させることと、
前記ＲＯＩのサイズを調整することであって、前記調整は、前記光学検出システムのシグナル対ノイズ比を向上させる、ことと
を行うように構成されている、少なくとも１つのプロセッサと、
少なくとも１つのコンピュータ可読媒体と、
前記少なくとも１つのプロセッサに接続され、かつ前記ユーザからの前記１つ以上の入力パラメータを受信するように構成されている、少なくとも１つの入力装置と、
少なくとも１つのディスプレイと
を備える、コンピュータシステムと
を備える、システム。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのコンピュータ可読媒体は、前記プロセッサに接続されている、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記コンピュータ可読媒体は、前記プロセッサによって実行可能な命令を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記プロセッサによって実行される前記命令は、ＲＯＩを決定し、前記ＲＯＩ位置のキャリブレーションを自動化するための少なくとも１つのステップを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記複数のフィルタは、少なくとも１つの励起フィルタ、少なくとも１つの発光フィルタ、および少なくとも１つのビームスプリッタを含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの生体試料は、少なくとも１つの蛍光色素を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１５】
ユーザが前記１つ以上の入力パラメータを選択することを可能にするように構成されたグラフィックユーザインタフェース（ＧＵＩ）をさらに備える、請求項９に記載のシステム。
【請求項１６】
前記１つ以上の入力パラメータは、閾値範囲およびステップ、ウェルサイズ、ウェル中心間距離、サブアレイ間の間隔、ミリメータあたりの光学画素、およびプレートレイアウトのうちの１つ以上を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの入力装置は、前記プロセッサに情報を伝達するように構成されている英数字および他のキーを備える、請求項９に記載のシステム。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの入力装置は、前記プロセッサに方向情報を伝達するカーソル制御部をさらに備える、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記複数のサンプルウェルは、１つ以上のプレートレイアウトパラメータを備えるグリッドパターンに配置されている、請求項９に記載のシステム。
【請求項２０】
前記１つ以上のプレートレイアウトパラメータは、ウェルの数、列の数、および行の数を含み、各ウェルは、ＸＹ座標のセットを備える、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
実験室用機器の設置およびキャリブレーションは、時間がかかり高価な処理となる可能性がある。多くの場合、機器供給業者からの技術者は、現場にいてこれらの処理を行わなければならない。このコストは一般的にユーザに転嫁される。場合によっては、熟練したユーザが、多段階の手順を用いて、適切に製造された機器を首尾よくキャリブレーションすることができる。このようなキャリブレーションの間、手動での操作と組み合わせて物理的な標準器（ｓｔａｎｄａｒｄｓ）およびウェル・プレートを使用してもよい。手動でのキャリブレーション処理およびデータ検査は、誤差が生じやすい傾向にあり、特別であるか、あるいは主観的な基準に依存しがちである。最終的なシステム確認工程によって、次善の（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）キャリブレーションを承認しなおしてもよいが、自動化することによってこのような作業中の客観性および均一性が向上する。本教示は、合格状態／失敗状態を提供し、失敗が特定されるとトラブルシューティング・フィードバックを提供する自動化されたキャリブレーションおよび確認システムに、熟達者の知識を組み込むことができる。機器がキャリブレーション処理に失敗すると、ついで、サービスエンジニアを呼び出すことができる。本教示によって、設置およびキャリブレーション手順のコストと、それに必要な時間とを最小限に抑えることができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本教示は、実験室用機器内の１つ以上の生体試料に関する関心領域（ＲＯＩ）を測定する方法およびシステムに関する。本発明の一実施形態では、この方法が、複数のサンプル・ウェルからの蛍光発光をイメージングすることのできる光学系を含む。初期ＲＯＩは、その中心位置およびサイズを、各ウェルから検出される蛍光から推定可能である。この情報から、ＲＯＩの平均的サイズを測定可能であり、かつ、広域グリッディング・モデルを導出してＲＯＩのそれぞれをより良好に配置することが可能である。ついで、この広域グリッディング・モデルをＲＯＩに適用して、ＲＯＩの中心位置の精度を向上させることができる。マッピング関数を用いることにより本来蛍光ＲＯＩを示さないサンプル・ウェルを復元することができる。ついで、各ＲＯＩの半径を調整して、光学系のシグナル対ノイズ比を向上させることができる。
【０００３】
別の実施形態では、各サンプル・ウェルが生体試料を含む。
【０００４】
別の実施形態では、各生体試料が光源によって励起される。
【０００５】
別の実施形態では、生体試料が励起に反応して所定の波長で蛍光を発する。
【０００６】
別の実施形態では、蛍光が光学系によって検出される。
【０００７】
別の実施形態では、生体試料がスペクトルで識別可能な色素を含む。
【０００８】
別の実施形態では、広域グリッディング・モデルが、ＲＯＩ間の中心間距離とウェル・プレート・レイアウトのグリッド座標とを比較して、各ＲＯＩに対するＸグリッド座標およびＹグリッド座標を決定することを含む。
【０００９】
別の実施形態では、マッピング関数が決定され、各ＲＯＩに対するＸ座標およびＹ座標に適用されて、各座標を各ＲＯＩの中心にマップする。
【００１０】
さまざまな実施形態によると、関心領域（ＲＯＩ）の位置をキャリブレーションするためのシステムが示されている。このシステムは、少なくとも１つのプロセッサおよび少なくとも１つのコンピュータ可読媒体を備えるコンピュータ・システムを含んでいてもよい。このシステムは、少なくとも１つの入力装置と、少なくとも１つのディスプレイと、１つの光検出システムとをさらに備えていてもよい。光検出システムが、複数のフィルタと、少なくとも１つの励起源と、少なくとも１つの検出器と、１つのマイクロウェル・トレイとをさらに備えていてもよい。
【００１１】
さまざまな実施形態では、少なくとも１つのコンピュータ可読媒体が少なくとも１つのプロセッサに接続されており、プロセッサによって実行可能な命令を含む。
【００１２】
さまざまな実施形態では、プロセッサによって実行可能な命令が、ＲＯＩを測定する少なくとも１つの工程を含み、ＲＯＩのキャリブレーションを自動化する。
【００１３】
さまざまな実施形態では、複数のフィルタが、少なくとも１つの励起フィルタと、少なくとも１つの放出フィルタと、少なくとも１つの分光器とを含む。
【００１４】
さまざまな実施形態では、マイクロウェル・トレイが、少なくとも１つの蛍光色素を含む少なくとも１つの生体試料を含む。
【００１５】
別の実施形態では、少なくとも１つのディスプレイが、ユーザに情報を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、少なくとも１つの入力装置が、プロセッサに情報を伝達するように構成されている英数字および他のキーと、プロセッサに方向情報を伝達するカーソル制御部とを含む。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
実験室用機器のキャリブレーションの方法であって、
複数のサンプル・ウェルからの蛍光発光をイメージングすることのできる光学系を設けることと、
前記サンプル・ウェルのそれぞれからの蛍光閾値から初期の関心領域（ＲＯＩ）を推定することと、
前記ＲＯＩのそれぞれの中心位置を推定することと、
前記ＲＯＩのそれぞれのサイズを推定することと、
前記複数のサンプル・ウェルから前記ＲＯＩの平均的サイズを測定することと、
広域グリッディング・モデルを導出することであって、前記広域グリッディング・モデルが前記ＲＯＩのそれぞれの位置をより良好に配置することと、
前記広域グリッディング・モデルを前記ＲＯＩに適用することであって、前記広域グリッディング・モデルの適用が前記ＲＯＩの中心位置の精度を向上させることと、
マッピング関数を用いて、見落としていたＲＯＩを回復させることと、
前記ＲＯＩの半径を調整することであって、前記調整によって光学系のシグナル対ノイズ比を向上させることができる、方法。
（項目２）
前記サンプル・ウェルのそれぞれが生体試料を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生体試料が前記光源によって励起される、項目１および２に記載の方法。
（項目４）
前記生体試料が励起に反応して所定の波長で蛍光を発する、項目１から３に記載の方法。
（項目５）
前記蛍光が光学系によって検出される、項目１から４に記載の方法。
（項目６）
前記生体試料がスペクトルで識別可能な色素を含む、項目１および２に記載の方法。
（項目７）
前記広域グリッディング・モデルが、前記ＲＯＩ間の中心間距離とウェル・プレート・レイアウトのグリッド座標とを比較して、前記ＲＯＩのそれぞれに対するＸグリッド座標およびＹグリッド座標を決定することを含む、項目１から６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
マッピング関数を決定し適用して、各座標を各ＲＯＩの中心にマップすることをさらに備える、項目１および７に記載の方法。
（項目９）
関心領域（ＲＯＩ）をキャリブレーションするシステムであって、前記システムは、
コンピュータ・システムであって、
少なくとも１つのプロセッサと、
少なくとも１つのコンピュータ可読媒体と、を備えるコンピュータ・システムと、
少なくとも１つの入力装置と、
少なくとも１つのディスプレイと、
１つの光検出システムであって
複数のフィルタと、
少なくとも１つの励起源と、
少なくとも１つの検出器と、
１つのマイクロウェル・トレイと、を備える、１つの光検出システムと、
を備える、コンピュータ・システム。
（項目１０）
前記少なくとも１つのコンピュータ可読媒体が、前記プロセッサに接続されている、項目９に記載のシステム。
（項目１１）
前記少なくとも１つのコンピュータ可読媒体が、前記プロセッサによって実行可能な命令を含む、項目９および１０に記載のシステム。
（項目１２）
前記プロセッサによって実行可能な前記命令が、前記ＲＯＩを測定する少なくとも１つの工程を含み、前記ＲＯＩのキャリブレーションを自動化する、項目９から１１に記載のシステム。
（項目１３）
前記複数のフィルタが、少なくとも１つの励起フィルタと、少なくとも１つの放出フィルタと、少なくとも１つの分光器とを含む、項目９に記載のシステム。
（項目１４）
前記マイクロウェル・トレイが、少なくとも１つの蛍光色素を含む少なくとも１つの生体試料を含む、項目９に記載のシステム。
（項目１５）
前記少なくとも１つの検出器が、少なくとも１つの蛍光色素を含む前記少なくとも１つの生体試料をイメージングする、項目１４に記載のシステム。
（項目１６）
前記少なくとも１つのディスプレイが、ユーザに情報を提供する、項目９に記載のシステム。
（項目１７）
前記少なくとも１つの入力装置が、前記プロセッサに情報を伝達するように構成されている英数字および他のキーを備える、項目９に記載のシステム。
（項目１８）
前記少なくとも１つの入力装置が、前記プロセッサに方向情報を伝達するカーソル制御部をさらに備える、項目１７に記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本教示の実施形態が実施可能なコンピュータ・システムを示す図である。
【図２】本教示の実施形態が実施可能な実験室用機器を示す図である。
【図３】定量ＰＣＲ機器のキャリブレーションで使用される工程順序を示す図である。
【図４】図４は、９６ウェル・サンプル容器に対する関心領域を示す図である。
【図５】回転した９６ウェル・サンプル容器に対する関心領域を示す図である。
【図６】関心領域が不正確に配置されたサンプル・アレイを示す図である。
【図７】関心領域が正確に配置されたサンプル・アレイを示す図である。
【図８】関心領域が正確に配置されたサンプル・アレイのより近い図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
さまざまな実施形態の以下の記載は、本質的には単なる例示であり、本教示、応用分野、または用途を制限することを意図するものではない。本教示が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのポリヌクレオチド増幅に関連するような、いくつかの実施形態において考察されることがあっても、このような考察は、本教示をそれらの応用分野にのみ制限するとみなすべきでない。
【００１９】
図１は、本教示の実施形態が実行され得るコンピュータ・システム１００を示すブロック図である。コンピュータ・システム１００は、情報を伝達するバス１０２または他の伝達機構と、バス１０２に接続されており、情報を処理するプロセッサ１０４とを含む。コンピュータ・システム１００はまた、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）や他の動的記憶装置であってもよく、バス１０２に接続されているメモリ１０６と、プロセッサ１０４によって実行される命令とを含む。メモリ１０６はまた、方法および本教示に対応し、プロセッサ１０４によって実行される命令の実行中に、一時的変数または他の中間情報を記憶するために使用されてもよい。コンピュータ・システム１００は、プロセッサ１０４への静的情報および命令を記憶するバス１０２に接続されている読取り専用メモリ（ＲＯＭ）１０８または他の静的記憶装置をさらに含む。たとえば、固体ディスク、磁気ディスク、または光ディスクであるがこれらに限定されない記憶装置１１０が設けられており、情報および命令を記憶するためにバス１０２に接続されている。
【００２０】
コンピュータ・システム１００は、バス１０２を介して、陰極線管（ＣＲＴ）または液晶式表示装置（ＬＣＤ）などであるがこれらに限定されないディスプレイ１１２に、コンピュータユーザへの情報を表示するために接続されていてもよい。ユーザ入力装置１１４は、英数字および他のキーを含み、プロセッサ１０４に情報およびコマンド選択を伝達するためにバス１０２に接続されている。ユーザ入力装置の別のタイプは、たとえばマウス、トラックボール、またはカーソル方向キーなどであるが、これらに限定されないカーソル制御部１１６であり、プロセッサ１０４に方向情報およびコマンド選択を伝達し、かつディスプレイ１１２上でカーソル移動を制御する。この入力装置は、一般的に、２軸、すなわち第１の軸（ｘなど）および第２の軸（ｙなど）に２つの自由度を有し、この装置が平面上の位置を特定することができる。
【００２１】
本教示の特定の実施形態に一貫して、メモリ１０６に含まれている１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行するプロセッサ１０４に対応して、コンピュータ・システム１００によって実験室用機器の設定およびキャリブレーションを実行することができる。このような命令は、記憶装置１１０などの別のコンピュータ可読媒体からメモリ１０６に読み込まれてもよい。メモリ１０６に含まれている命令のシーケンスを実行することによって、プロセッサ１０４が本願明細書に記載されているプロセスの状態を実行する。あるいは、ハードワイヤード回路を、ソフトウェア命令の代わりに、あるいはそれと組み合わせて使用して、本教示を実施してもよい。したがって、本教示の実施は、ハードウェア回路とソフトウェアとの任意の特定の組合せに限定されるものではない
【００２２】
「コンピュータ可読媒体」という本明細書で用いられる用語は、実行するためにプロセッサ１０４に命令を送ることに関与する任意の媒体を指す。このような媒体は、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体などを含むが、これらに限定されない多くの様態を取ってもよい。不揮発性媒体は、記憶装置１１０などの光学ディスクや磁気ディスクを含んでいてもよいが、これらに限定されない。揮発性媒体は、メモリ１０６などの動的メモリを含んでいてもよいが、これに限定されない。伝送媒体は、バス１０２を備えたワイヤを含む同軸ケーブル、銅線、およびファイバー・オプティクスを含んでいてもよいが、これらに限定されない。伝送媒体はまた、電波および赤外線のデータ通信中に発生する音波または光波という形をとることもできる。
【００２３】
たとえば、コンピュータ可読媒体の共通の様態は、以下を含んでいてもよいが、これらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、またはその他の磁気媒体、ＣＤＲＯＭ、他のいかなる光媒体、せん孔カード、紙テープ、孔のパターンを備えたその他の物理的媒体、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、プログラマブル読出し専用メモリ（ＰＲＯＭ）、消去可能なプログラマブル読出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭ）、消去可能なプログラマブル読出し専用フラッシュメモリ（ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ）、ＵＳＢドライブ、ジャンプ・ドライブ、またはその他のメモリチップ、またはカートリッジ、搬送波、またはコンピュータ可読のその他の媒体。
【００２４】
コンピュータ可読媒体のさまざまな様態は、プロセッサ１０４への１つ以上の命令のうちの１つ以上のシーケンスを実行するために行うことに関係していてもよい。たとえば、命令は、遠隔コンピュータの磁気ディスクで最初に伝送されてもよい。遠隔コンピュータは、命令をその動的メモリに読み込ませて、モデムまたはワイヤレス・ネットワークを使用してたとえば電話線を通じて命令を送信してもよい。コンピュータ・システム１００に対してローカルなモデムは、電話線に関するデータを受信して、赤外線送信機を使用してそのデータを赤外線信号に変換してもよい。バス１０２に接続されている赤外線検出器が、赤外線信号に伝送したデータを受信して、そのデータをバス１０２に位置付けしてもよい。バス１０２はデータをメモリ１０６に伝送し、そこからプロセッサ１０４が命令を検索して実行する。メモリ１０６が受信した命令は、プロセッサ１０４による実行の前後のどちらかで、記憶装置１１０に任意選択的に記憶されてもよい。
【００２５】
本教示を、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）機器を参照しつつ記載する。特に、本教示の実施形態は、ウェル・プレートの光学イメージングを利用するＲＴ−ＰＣＲ機器に対して実施される。この種の機器は、分析目的のために、複数の試料またはスポットからシグナルを同時に、または順次に、測定することが可能となり得るものであり、たいてい、キャリブレーションを必要とする。このキャリブレーションは以下に関するプロセスを含むが、これらに限定されない：ＲＯＩ（関心領域）を識別することと、多成分分析のために、バックグラウンド・シグナル、均一性、および純色素スペクトル・キャリブレーションを測定すること。キャリブレーションはまた、予想される結果を備えた既知のサンプル・プレートを使用した、ＲＴ−ＰＣＲ確認反応を含んでいてもよい。当業者が理解するであろうことは、本教示がＲＴ−ＰＣＲ機器に関する例を用いて記載されてきたが、それらの原理は、結果の精度および／または最適性を確実にするためにキャリブレーションおよび確認が必要となり得る実験室用機器の他の様態に、広く適用可能であることである。
【００２６】
本教示は、ＲＴ−ＰＣＲ機器システムに適用可能である。このようなＲＴ−ＰＣＲ機器は、当業者に周知である。たとえば、本教示は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００／  ７９００／ＶｉｉＡ７、およびＱｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０  ＰＣＲ増幅検出システム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＭｙｉＱ  単色リアルタイムＰＣＲ検出システム、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＭｘ３０００Ｐ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムなどの機器に適用可能であるが、これらに限定されるものではない。このような機器は、一般にイメージング・システムのいくつかの様態を使用する。本教示がＣＣＤ（電荷結合素子）イメージング・システムに関連して述べられているが、本教示は、イメージング・システムの任意の様態に容易に適合可能である
【００２７】
ＣＣＤイメージング・システムを備えたシステムでは、ＣＣＤカメラが、ＰＣＲの動作中に、さまざまな選択された色素蛍光発光波長で、サンプル・プレート（他の数のウェルを備えたプレートが使用可能であり、あるいは、個々のチューブを含むサンプル・ブロックもまた使用可能であるが、一般的には９６ウェル・プレート）をイメージングする。このような機器では、通常、励起光によってそれぞれの色素に適切な波長でウェルが照射される。ＲＴ−ＰＣＲシステムを使用して、ウェル発光強度を用いたＰＣＲ増幅を正確にモニタするために、このシステムは、各色素発光に対してキャリブレーションされなければならない。
【００２８】
図２は、本発明の実施態様による、蛍光発光検出に使用されるシステムの概略図である。検出システム２００は、本発明の態様と組み合わせてＲＴ−ＰＣＲデータの収集および処理に使用可能なスペクトル検出システムの一例である。図示されているように、検出システム２００は、励起光源２０２と、タレット２０４として描かれている少なくとも１つのフィルタ・タレットと、検出器２０８と、マイクロウェル・トレイ２１０と、ウェル・オプティクス２１２とを含む。タレット２０４は、特定の色素のために対をなしている複数の励起フィルタ、または複数の放出フィルタ、または複数の励起放出フィルタを含んでいてもよい。図示されるように、タレット２０４はフィルタ・キューブ２０６を含む。第１のフィルタ・キューブ２０６Ａは、励起フィルタ２１４Ａと、分光器２１６Ａと、検出されるスペクトルで識別可能な種の組から選択される１つのスペクトル種に対応する放出フィルタ２１８Ａとを含んでいてもよい。第２のフィルタ・キューブ２０６Ｂは、励起フィルタ２１４Ｂと、分光器２１６Ｂと、検出されるスペクトルで識別可能な種の組から選択される異なるスペクトル種に対応する放出フィルタ２１８Ｂとを含んでいてもよい。
【００２９】
励起光源２０２は、たとえば以下であってもよいが、これらに限定されない：レーザ、広域スペクトル光源、ＬＥＤ、または、システム２００によって検出されるスペクトル種と相互作用する、スペクトルを発光させることのできる他のタイプの励起源。この図示されている例では、光源２０２は、励起フィルタ２１４Ａまたは励起フィルタ２１４Ｂによって濾波され、分光器２１６Ａまたは分光器２１６Ｂを通過して１つ以上のスペクトル種を含むマイクロウェル・トレイ２１０に到達する光の広域スペクトルを発する。
【００３０】
光源２０２が発する光は、励起フィルタ２１４Ａ、励起フィルタ２１４Ｂ、または１つ以上のスペクトル種に細密に対応している他のフィルタを通って濾波されてもよい。本教示は、たとえば、以下などのスペクトルで識別可能な複数の色素で使用可能であるが、これらに限定されない：ＦＡＭ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ、ＣＹ−３、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＣＹ−５、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｐｕｒｐｌｅ、ＲＯＸ（パッシブ・リファレンス）、または検出されることが可能なシグナルを発するその他の蛍光色素のうちの１つ以上。選択された励起フィルタのターゲット・スペクトル種が最大シグナル反応を示す一方で、他のフィルタの帯域通過領域にあるシグナル強度の低いスペクトル種は、シグナル反応にあまり寄与しない。複数の蛍光色素がこの重複する励起放出スペクトルを有していてもよいので、少量の「クロス・トーク」（１つを超えるフィルタセットで検出される１つの色素からのシグナル）を修正するために純色素マトリックスを適用することは有用である。このプロセスは、たいてい、マルチコンポーネンティングと称されている。
【００３１】
以上で示したように、本教示は、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）機器を参照しつつ記載されている。特に、本教示の一実施形態は、サンプル・ウェル・プレートの光学イメージングを利用して、ＲＴ−ＰＣＲ機器に対して実施される。このような機器は、分析目的で複数の試料またはスポットから同時にシグナルを測定することが可能となり得るものであり、たいてい、キャリブレーションを必要とする。キャリブレーションを必要とし得るプロセスの一例は、ＲＯＩ、すなわち関心領域の識別である。
【００３２】
通常、すべてのフィルタに対応しているそれぞれのセルにおいて強い色素発光があるサンプル・ウェル・プレートを使用して、ＲＯＩキャリブレーションを実行することが可能である。有用となる得る、というのは、ＲＯＩが色素フィルタごとに同じでなくてもよいからである。フィルタ間のＲＯＩの差異は、わずかなフィルタの角度差や、他のフィルタのスペクトル特性によって生じる可能性がある。したがって、さまざまな実施形態は、フィルタあたり／ウェルあたり（ＰＦＰＷ）のＲＯＩキャリブレーションを実行する。これらのＰＦＰＷ−ＲＯＩキャリブレーションは、各フィルタに対して、９６ウェル・プレート、３８４ウェル・プレート、または３０７２ウェル・アレイ内のウェルの位置を決定するのに有用である。ＲＯＩキャリブレーションは、米国特許第６，５１８，０６８号にて説明されているようなＡｄａｐｔｉｖｅ  Ｍａｓｋ  Ｍａｋｉｎｇ社の教示などの方法を使用して実行可能であり、米国特許第６，５１８，０６８号はその全体が参照により本願明細書に組み込まれている。本教示は、ユーザの相互干渉を最小化するかなくすことにより、ＲＯＩキャリブレーションを自動化することができる。さまざまな実施形態が、たとえばヒストグラム解析やバイナリー・サーチパターンを使用してフィルタあたりの最適露光時間を決定することが可能なソフトウェアを提供することによって、プロセスを自動化することができる。露光時間は、サンプル・ウェル・プレートの画像を取得するのに必要な時間である。さらに、この値は、フィルタのスペクトル特性によって可変である。通常、ＲＯＩキャリブレーションは、検出器の視野におけるウェルの位置を定義する情報を生成することができる。この情報は、グローバル・マスクまたは異なるフィルタに対応する複数マスクのどちらかを備えるマスク・ファイルとして記憶可能である。
【００３３】
上述のようなキャリブレーション・プロセスは、たとえば、行列のプロジェクションおよび強度プロファイルを使用してもよい。このことは、結果として、ＲＯＩの測定が、これらに限定されないが、たとえばアーチファクトおよびウェル内部の飽和度、グリッド回転、拡大倍率の変化および径方向の光学的歪みの影響を受けやすくなり得る。したがって、ＲＯＩをより頑健性をもって測定して、このような感受性を最小限に抑え、たとえば検出された発光データ中の歪みや他の不必要なバックグラウンド・ノイズを除去することが有利となり得る。
【００３４】
バックグラウンド・ノイズは、たとえば、固有のシステム・ノイズならびに他の不必要なシグナルを示す。たとえば、データにおけるバックグラウンド・ノイズのいくつかは、ダスト粒子またはすりきずなどの基板上の物理的原因に起因する可能性がある。バックグラウンド・ノイズが生じる別の物理的原因例は、ホルダや、ケースの保持またはサンプルの封入である。データ内の他のバックグラウンド・ノイズは、反射や自然蛍光などの、機器の表面からの自然な放射線に起因する可能性がある。他のバックグラウンド・ノイズもまた、たとえば発光データを検出する光学系または光源から生じる結果となる可能性がある。
【００３５】
この生物系は、数百または数千の試料を検出していてもよく、これらはすべて、１ナノリットル未満など極めて体積が小さくてもよい。よって、他のバックグラウンド・ノイズの除去方法は、単独で使用されてもよく、または、この文献に記載されているさまざまな実施形態によるキャリブレーション方法と組み合わせて使用されてもよく、サンプル体積から発光データを測定し分析することができる。いくつかの実施形態では、サンプルの位置を基板内でより正確に決定して、より正確な分析を実行することが可能である。たとえば、ディジタルＰＣＲ分析では、サンプル体積の反応対非反応をより正確に区別することができることによって、より正確な結果が得られる。さらに、本願明細書において記載されているさまざまな実施形態によると、空のウェルまたはスルーホールを、反応しなかったウェルまたはスルーホール内のサンプル体積と区別してもよく、反応したウェルまたはスルーホール内のサンプル体積と区別してもよい。
【００３６】
本願明細書において記載されているさまざまな実施形態によれば、バックグラウンド・ノイズ除去は、画像データの分析および処理を含んでいてもよい。この方法は、画像データの強度値を分析して、基板の画像から除去され得るバックグラウンド・ノイズを補間することを含んでいてもよい。このようにして、画像内の関心領域の位置を測定してもよい。バックグラウンド・ノイズ除去が、関心領域を含むと知られている画像の領域からデータを補間することを含んでいてもよい。画像にわたりバックグラウンド・ノイズを決定した後に、バックグラウンド・ノイズを画像データから差し引いてもよい。当業者には明らかなように、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、またはそれらの組み合わせを使用してさまざまな実施形態を適宜実施されてもよい。たとえば、ソフトウェア、ファームウェア、またはハードワイヤード・ロジックの制御下で、プロセッサまたは他のディジタル回路を用いて、いくつかのプロセスを実行することができる。（列挙された機能を実行するために当業者によって認識されるであろうように、本願明細書での「ロジック」という用語は、固定ハードウェア、プログラマブル・ロジック、および／またはそれらの適切な組み合わせに関する。）すでに定義されているように、ソフトウェアおよびファームウェアは、コンピュータ可読媒体に記憶されることができる。当業者にとって周知のように、いくつかの他のプロセスは、アナログ回路を使用して実施可能である。加えて、メモリまたは他の記憶装置、ならびに伝送要素を本発明の実施形態で利用してもよい。
【００３７】
図３は、本発明の一実施形態による例示的なインシリコ方法３０を示す図である。インシリコ方法３００は、コンピュータ可読フォーマットにおける、バイオテクノロジ・プロセス用サブルーチンを含んでいてもよい複数の設定ワークフロー・サブルーチンを含む。図３は、単なる例示的方法であり、当業者は、この開示の観点から、理解するであろうことは、サブルーチンの実際の数が、少なくとも２つのサブルーチンから多数まで（たとえば２−１０、２−２０、２−３０、２−ｎ（ただし、ｎは３−１００、３−１０００などの任意の数のサブルーチンであってもよい））可変なことである。各設定サブルーチン３１０〜３７０は、単一のステップまたはタスクを含んでいてもよく、あるいは、コンピュータ可読フォーマットにも、任意選択的に、１つを超えるステップまたはタスクを含んでいてもよく、各ステップは、さらなる任意選択的なカスタマイズ可能なステップまたはタスクをさらに含んでいてもよい。任意選択的／カスタマイズ可能なステップまたはタスクのそれぞれは、１つ以上の任意選択的パラメータ（オプション）を有していてもよく、このパラメータは、ユーザが確認したり見直したり設定したりカスタマイズすることができる。いくつかの実施形態では、本発明のインシリコ方法は、グラフィック・ユーザ・インタフェース（ＧＵＩ）を使用して、バイオテクノロジ・プロセスの各任意選択／カスタマイズ可能なステップのそれぞれに対する少なくとも１つのパラメータをユーザによって選択して、任意選択／カスタマイズ可能なステップごとに少なくとも１つのパラメータを選択することを含む。特定の実施形態では、ワークフローのサブルーチンのあらゆるステップおよびあらゆるパラメータは、確認し、任意選択的に編集するために、ユーザが利用可能である。従来技術において周知であるように、バイオテクノロジ・プログラムは、一般的に、これらのパラメータおよび／またはステップのいくつかをユーザから見えなくしており、それによって、特にコンピュータで設計された実験結果がユーザの予想した結果でない場合に、ユーザのフラストレーションを引き起こし、役に立たなくなる。
【００３８】
図３において概略的に示されている本開示のインシリコ方法は、以下によって、実行、実施、または履行することができる：コンピュータ・システム内の少なくとも１つの方法ファイルを生成することであって、この方法ファイルは、カスタマイズ可能な工程（Ａ、Ｂ、Ｃ）の複数のサブルーチン（１０、２０、３０．．）に対するコンピュータ可読命令を含み、その工程はそれぞれ、たとえば、調査したり選択したり変更したり入力したりできる１つ以上のパラメータを有していてもよく；コンピュータ・システムによるコンピュータ可読命令を備えた少なくとも１つの方法ファイルを実行することを含むインシリコでのバイオテクノロジ・プロセスを実施して、少なくとも１つのバイオテクノロジ生成物を得ること。
【００３９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのカスタマイズ可能／任意選択的パラメータは、デフォルトパラメータから選択され、このデフォルトパラメータは、コンピュータ・システムの構成要素（記憶装置、データベースなど）に記憶されている。
【００４０】
再度図３を参照する。ＲＯＩ位置を算出する第１の工程は、初期ＲＯＩの中心をステップ３１０の蛍光閾値から推定することである。複数の生体試料を含むよう構成されているサンプル・プレートを設け、ＰＣＲ処理によって生体試料を分析することが可能な分析機器に挿入する。各生体試料がサンプル・ウェルに含まれおり、光源によって励起することができ、励起に反応して、所定の波長で蛍光を発することができ、この波長は蛍光検出器によって検出可能である。図２に関して上述したように、光源２０２は、レーザ、ＬＥＤ、または、システム２００によって検出されるスペクトル種と相互作用するスペクトルを発光することが可能な他のタイプの励起源であってもよい。加えて、生体試料は、ＦＡＭ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＮＥＤ、ＣＹ−３、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＣＹ−５、ＲＯＸ（パッシブ・リファレンス）、または検出可能なシグナルを発するその他の蛍光色素のうちの１つ以上など、スペクトルで識別可能な色素を含んでいてもよい。
【００４１】
生体試料を励起させる前に、入力パラメータおよびアルゴリズム・パラメータを設定して、ＲＯＩ測定の開始点を設ける。入力パラメータは、たとえば、以下を含んでいてもよいが、以下に制限されない：閾値の範囲およびステップ、ウェルのサイズ、ウェルの中心間距離、サブアレイ間の間隔、ミリメータあたりの光学画素、およびプレート・レイアウト。プレート・レイアウトは、ウェルの総数およびサンプル・ウェルの構成を含んでいてもよい。頻繁に使用される構成は、複数行および複数列を含む矩形アレイあってもよいが、当業者が理解するであろうことは、この構成は、使用されている機器に適した任意の幾何学的形状であってもよいということである。さらに、ウェルの総数は可変である。当業者は、単一のサンプル・プレートまたはサンプル封入構造において合計で１つウェルから何千のウェルまでになる構成に精通しているであろう。このＲＯＩを求めるアルゴリズム・パラメータは、ウェルのサイズ、ウェルの中心間距離、および最小真円度に対する許容範囲を設定することができる。真円度は、算出値であり、たとえば外周と面積の比であってもよい。
【００４２】
一度入力パラメータおよびアルゴリズム・パラメータを決定すると、複数の試料を適切な光源からのエネルギによって励起することができ、サンプル・プレート内の各サンプル・ウェルから発される蛍光イメージを収集することができる。サンプル・プレートの蛍光イメージをさらに分析して、入力パラメータおよびアルゴリズム・パラメータに基づいて、ＲＯＩ候補を選択することができる。パラメータを満たすＲＯＩ候補は、さらに分析するために保存することが可能であり、各ウェルのサイズおよび真円度をステップ３２０で測定する。パラメータを満たさないＲＯＩ候補は、蛍光を発しなかった任意の位置とともに破棄可能である。この保持されたＲＯＩ候補をさらに評価して、ウェル間の間隔パラメータおよびウェル間の間隔に対する許容範囲パラメータに基づいて、ＲＯＩ間の距離を測定することができる。ＲＯＩには、ウェル間のパラメータに基づいて互いに近接している中心があるが、同じサンプル・ウェルであると考えることができ、最良の真円度を有するものをそのウェルのＲＯＩとして選択する。一度すべてのＲＯＩ候補を測定すると、平均的ウェル・サイズを計算することができ、その平均値は、ステップ３３０で各サンプル・ウェルＲＯＩに割当てることができ、初期推定ＲＯＩを保存することができる。
【００４３】
予想されるウェル位置をグリッド・パターンに配置することができる。グリッド・パターンは、プレート・レイアウト・パラメータに基づいて決定可能である。このパラメータは、ウェル数、および、プレートまたはサブアレイにおける列の数および行の数を含んでいてもよい。このプレートまたはサブアレイでは、各ウェルがプレート・レイアウト・パラメータに基づいて予想される１組のＸＹグリッド座標を有する。ここで、初期推定ＲＯＩのさらなる分析を開始して、各々初期ＲＯＩの位置をより正確に定義してもよく、広域グリッディング（ｇｌｏｂａｌ  ｇｒｉｄｄｉｎｇ）と称されてもよい。広域グリッディングの第１の工程は、初期推定ＲＯＩの中心を分析して、隣接するＲＯＩを求めることである。このことは、プレート・レイアウトに基づいて、ＲＯＩ間の中心間距離とグリッド座標とを比較することで測定可能である。ついで、ＲＯＩ間の空間的関係に基づいて、ＸＹグリッド座標を初期推定ＲＯＩのそれぞれに関して測定することができる。
【００４４】
ＲＯＩ位置の精度を向上させるために、有利となり得るのは、中心間ＲＯＩ座標をプレート・レイアウトのグリッド座標と関連付けることである。このことは、マッピング関数を決定し適用することによって、達成可能である。マッピング関数は、１対の多項式二次関数である。これらの関数は、Ｘ（またはＹ）グリッド位置をＸ（またはＹ）方向のＲＯＩ中心位置にマップするために算出される。一度マッピング関数が決定されると、これらを予想されるグリッド座標に適用していくつかの利益をもたらすことができる。まず、ＲＯＩ中心位置の精度を向上させることができる。第２に、初期ＲＯＩを求める間に見落としていたＲＯＩを回復することができ、イメージ内のウェル間の中心距離を計算することができ、これを、イメージ内の実際のウェルのサイズを測定するのに使用可能である。
【００４５】
ＲＯＩのさらに調整することによって、光学的性能にさらなる利益をもたらすことができる。発明者らが発見したのは、ＲＯＩのサイズと光学系のシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）と間にある関係が存在したことである。当業者が知っているであろうことは、電気光学系のＳＮＲを計算する数学的関数がいくつかあることである。この発明者らは、以下の方程式１を用いてＳＮＲを特徴づけた。
【数１】
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ただし、ＳＮＲ＝シグナル対ノイズ比
Ｓｄｙｅ  ｐｌａｔｅ＝Ｓｄｙｅ
ＳＢＧ＝バックグラウンド・イメージからのＲＯＩ内の全画素強度合計
Ｓｄｙｅ＝色素画像からのＲＯＩ内の全画素強度合計
Ｎ＝ＲＯＩ内の画素数
ｏｆｆｓｅｔ＝カメラオフセット
Ｇ＝カメラ利得
δ２Ｒ，ｙ＝リードノイズ
【００４６】
６対のフィルタを含む光学系を使用して、実験を行った。各フィルタ対は、励起フィルタ（Ｘｎ）および放出フィルタ（Ｍｎ）を含むものであった。各フィルタは、ＰＣＲプロセスと互換性のあるように構成されている蛍光色素に対応する励起周波数および放射周波数に対応する狭波長帯に対して感受性が高かった。さらに、この文献で示されている教示に従って、ＲＯＩを最適化した。シグナル対ノイズへのＲＯＩサイズの効果を研究するために、６対のフィルタを使用して、９６ウェルサンプル・プレートから蛍光を検出した。各ＲＯＩの半径を、逐次１画素だけ伸張した。等式１を使用して、６つのフィルタ対のそれぞれと各画素増分とに対するＳＮＲを計算した。実験の結果を、下記に表１で示す：
【表１】
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太字の記載は、６つのフィルタ対のそれぞれに対する最大ＳＮＲを特定し、半径を２画素伸張（△Ｒ＝２）すると、６つのフィルタ対全体にわたりＳＮＲが全体的に約６％改良される。
【００４７】
図４は、９６ウェル４１０を有するサンプル・プレートの画像を示す。９６ウェル４１０のそれぞれが、蛍光イメージを生成した。この文献の教示を適用した後、ＲＯＩを最適化した。青い円が、ウェル位置ごとにＲＯＩを識別する。本教示のロバストネスをテストするために、いくつかのテストケースを行った。
【００４８】
テストケース１を、図５に示す。ＲＯＩチャネル画像を手動で１度だけ反時計回りに回転し、ＲＯＩの教示をこの画像に適用した。図５の結果が示しているのは、回転にもかかわらず、ＲＯＩアルゴリズムが９６個のＲＯＩすべてを位置決めしたことである。
【００４９】
テストケース２が図６に示されており、照光が不均一であり光学的ひずみのために、３０７２個のウェル位置を備えたアレイに対するＲＯＩの測定の失敗を描いている。ＲＯＩの位置合わせの失敗は、ＲＯＩの列の右側への屈曲として画像の最上部に見られる。同じ画像が、本文献において教示されるアルゴリズムに送られ、その結果が図７に示されている。明らかに理解されるのは、本発明の本教示が前に図６で示す歪みを修正したことである。ＲＯＩ位置の精度もまた、図８に描かれている。
【００５０】
本願明細書および添付の特許請求の範囲のために、特に明記しない限り、成分量、材料の百分率または比率、反応条件を表現するすべての数、および明細書および請求項において使用される他の数値は、すべての例において「約」という用語によって修飾されていると理解するべきである。したがって、反対に示さなければ、明細書および添付の請求の範囲に記載されている数値パラメータは、本発明によって得られるべき所望の特性に依存して変動し得る概数である。少なくとも、請求項の範囲への均等論の適用に制限しようとするのではなく、報告される有効数字の数を考慮し、通常の端数計算技術を適用することによって、各数値パラメータを少なくとも解釈するべきである。
【００５１】
本発明の広い範囲を記載する数値範囲および数値パラメータが概数であるにもかかわらず、特定例に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。しかし、あらゆる数値は、本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有するものである。さらに、本願明細書において開示されるすべての範囲は、そこに包含される任意のあらゆるサブ範囲を含むと理解されるべきである。たとえば、「１〜１０」の範囲は、最小値の１と最大値の１との間の（およびそれを含む）ありとあらゆるサブ範囲を含む、すなわち、１以上の最小値および１０以下の最大値を有するすべてのサブ範囲を含み、たとえば５．５〜１０である。
【００５２】
留意されたいのは、本願明細書および添付の特許請求の範囲において用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が、明示的かつ明確に１つの指示物に制限されない限り、複数の指示物を含むことである。したがって、たとえば、「モノマー」に対する言及には、２つ以上のモノマーを含む。
【００５３】
当業者には、本願明細書に記載されているさまざまな実施形態に対して、本願明細書の教示の精神または範囲から逸脱することなくさまざまな改変、変更、および最適化をなし得ることが明らかであろう。したがって、本願明細書に記載されているさまざまな実施形態は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内における他の改変、変更、および最適化を網羅すると企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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