(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム酵素；及び
リソソーム標的化部分；
を含み、前記リソソーム標的化部分が、Ｍ６Ｐ基を含有する少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含有する、標的治療薬。
【請求項２】
前記リソソーム酵素が表２から選択される、請求項１に記載の標的治療薬。
【請求項３】
前記リソソーム酵素がＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質である、請求項１に記載の標的治療薬。
【請求項４】
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項５】
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項６】
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項７】
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項８】
前記リソソーム標的化部分が、プロサポシン、Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサー、白血病抑制因子、及びこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項９】
前記リソソーム標的化部分が配列番号４、６、または９と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項８に記載の標的治療薬。
【請求項１０】
前記リソソーム標的化部分が配列番号４、６、または９と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項８に記載の標的治療薬。
【請求項１１】
前記リソソーム標的化部分が配列番号４、６、または９と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項８に記載の標的治療薬。
【請求項１２】
前記リソソーム標的化部分が配列番号４、６、または９と同一の配列を含む、請求項８に記載の標的治療薬。
【請求項１３】
融合タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項１４】
前記リソソーム標的化部分が前記リソソーム酵素のＮ末端に融合している、請求項１３に記載の標的治療薬。
【請求項１５】
前記リソソーム標的化部分が前記リソソーム酵素のＣ末端に融合している、請求項１３に記載の標的治療薬。
【請求項１６】
前記リソソーム標的化部分及び前記リソソーム酵素がリンカーを介して融合している、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項１７】
前記リンカーがＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１５）の配列を含む、請求項１５に記載の標的治療薬。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と同一である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項２１】
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項２３】
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項２４】
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と同一の配列を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
【請求項２５】
請求項１３〜２４のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
細菌、酵母菌、昆虫または哺乳類細胞から選択される、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
哺乳類細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞株である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）を共発現する、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ＧＮＰＴをコードする外来性核酸を含む、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
内在性ＧＮＰＴの活性化発現を有する、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
ａ）請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含み、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）を共発現する細胞を培養すること；及び
ｂ）前記細胞によって産生された前記融合タンパク質を回収すること；
を含む標的治療用融合タンパク質の製造方法。
【請求項３６】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の標的治療薬、及び医薬品として許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３７】
リソソーム蓄積症の治療のための医薬の製造における、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の標的治療薬の使用。
【請求項３８】
前記リソソーム蓄積症がサンフィリッポ症候群Ｂ型である、請求項３７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照  
本出願は、２０１４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，０８２号に対する優先権を主張し、その開示全体を本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
４０種類を超えるリソソーム蓄積症は、１種以上のリソソーム酵素の欠如または欠損に直接的または間接的に起因している。サンフィリッポ症候群、すなわちムコ多糖症ＩＩＩ（ＭＰＳ  ＩＩＩ）は、そのような疾患の１種である。これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する酵素の欠損によって特徴づけられる稀な遺伝子疾患である。
【０００３】
ＭＰＳ  ＩＩＩＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤと呼ばれるＭＰＳ  ＩＩＩの４つの異なる型が認識されている。それぞれは、異なるリソソーム酵素の欠如または欠損によって特徴づけられている。ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（ＭＰＳ  ＩＩＩＢ；サンフィリッポＢ病）は、酵素α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）の欠損に起因する常染色体劣性疾患であり、特に脳のニューロン及びグリア細胞のリソソーム内にヘパラン硫酸の蓄積をもたらし、さらに他の場所でもヘパラン硫酸のリソソーム蓄積を生じさせる。ＭＰＳ  ＩＩＩＢは主として脳で発症する。
【０００４】
様々なリソソーム蓄積症の治療用酵素を送達するために酵素補充療法（ＥＲＴ）が用いられている。通常、リソソーム酵素はサイトゾル中で合成され、その後、小胞体（ＥＲ）を横切り、そこでＮ結合型高マンノース型炭水化物でグリコシル化される。糖タンパク質上の高マンノース炭水化物は、次にゴルジ体内で一連のグリコトランスフェラーゼによって修飾され、成熟Ｎ−グリカンとなる。この修飾のうちの１つがマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の付加である。そして、この修飾を担持するタンパク質は、Ｍ６Ｐ部分のカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）への結合を経てリソソームに標的化される。酵素補充療法の有効性は、補充酵素の適切なリソソーム標的化に大きく依存する。しかし、組換え製造されたＮａｇｌｕタンパク質は、Ｍ６Ｐリン酸化が非常に不十分であるという特徴があり、この酵素のリソソーム標的化及びＥＲＴに対するその効果的な使用を困難にしている。
【０００５】
したがって、効果的な酵素補充療法を確保するために、リソソーム標的化のための代替的方法を開発する必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、リソソーム酵素及びリソソーム標的化部分を含み、リソソーム標的化部分が少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含有するペプチドである標的治療薬を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ペプチドはＮ結合型グリコシル化を含有する。いくつかの実施形態において、ペプチドはＭ６Ｐ基を含有するＮ結合型グリコシル化を含有する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、リソソーム酵素は表２から選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素はＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｎａｇｌｕタンパク質は配列番号１と少なくとも８０％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｎａｇｌｕタンパク質は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、プロサポシン、白血病抑制因子、Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサー、及びこれらの断片からなる群から選択されるペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドは配列番号４、６、または９と少なくとも８０％、９０％または９５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは配列番号４、６、または９と同一の配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、標的治療薬は融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はリソソーム酵素のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はリソソーム酵素のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分及びリソソーム酵素はリンカーを介して融合している。いくつかの実施形態において、リンカーはＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１５）の配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％または９５％同一である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と同一である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、標的治療薬は融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はリソソーム酵素のＮ末端に融合している。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はリソソーム酵素のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分及びリソソーム酵素はリンカーを介して融合している。いくつかの実施形態において、リンカーはＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１５）の配列を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％または９５％同一である。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と同一である。
【００１２】
一態様において、本発明は、本明細書に開示の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。一態様において、本発明は、本明細書に開示する核酸の任意の１つを含むベクター、及び当該ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌、酵母菌、昆虫、哺乳類、またはヒト細胞から選択される。いくつかの実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞株である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、宿主細胞はＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）を共発現する。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＮＰＴをコードする外来性核酸を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は内在性ＧＮＰＴの活性化発現を有する。
【００１４】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含み、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）を共発現する細胞を培養すること、及び細胞によって産生された融合タンパク質を回収することを含む標的治療用融合タンパク質の製造方法を提供する。
【００１５】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の標的治療薬のいずれか及び医薬品として許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。一態様において、本発明は、治療を必要とする患者に本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを投与することによるリソソーム蓄積症の治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症はサンフィリッポ症候群Ｂ型である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は静脈内、皮下、髄腔内及び／またはこれらの組合せで投与される。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
リソソーム酵素；及び
リソソーム標的化部分；
を含み、前記リソソーム標的化部分が少なくとも１つのＮ結合型グリコシル化部位を含有するペプチドである、標的治療薬。
（項目２）
前記ペプチドがＮ結合型グリコシル化を含有する、項目１に記載の標的治療薬。
（項目３）
前記ペプチドがＭ６Ｐ基を含有するＮ結合型グリコシル化を含有する、項目１に記載の標的治療薬。
（項目４）
前記リソソーム酵素が表２から選択される、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目５）
前記リソソーム酵素がＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質である、項目１〜３のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目６）
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目７）
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目８）
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目９）
前記Ｎａｇｌｕタンパク質が配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目１０）
前記リソソーム標的化部分が、プロサポシン、Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサー、白血病抑制因子、及びこれらの断片からなる群から選択されるペプチドである、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目１１）
前記ペプチドが配列番号４、６、または９と少なくとも８０％同一の配列を含む、項目１０に記載の標的治療薬。
（項目１２）
前記ペプチドが配列番号４、６、または９と少なくとも９０％同一の配列を含む、項目１０に記載の標的治療薬。
（項目１３）
前記ペプチドが配列番号４、６、または９と少なくとも９５％同一の配列を含む、項目１０に記載の標的治療薬。
（項目１４）
前記ペプチドが配列番号４、６、または９と同一の配列を含む、項目１０に記載の標的治療薬。
（項目１５）
融合タンパク質である、先行項目のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目１６）
前記リソソーム標的化部分が前記リソソーム酵素のＮ末端に融合している、項目１５に記載の標的治療薬。
（項目１７）
前記リソソーム標的化部分が前記リソソーム酵素のＣ末端に融合している、項目１５に記載の標的治療薬。
（項目１８）
前記リソソーム標的化部分及び前記リソソーム酵素がリンカーを介して融合している、項目１５〜１７のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目１９）
前記リンカーがＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１５）の配列を含む、項目１７に記載の標的治療薬。
（項目２０）
配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２１）
配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２２）
配列番号１８、１９または２０のアミノ酸配列と同一である、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（項目２３）
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一の配列を含む、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目２４）
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目２５）
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目２６）
前記融合タンパク質が配列番号２３、２４または２５のアミノ酸配列と同一の配列を含む、項目１５〜１９のいずれか１項に記載の標的治療薬。
（項目２７）
項目１５〜２６のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（項目２８）
項目２７に記載の核酸配列を含むベクター。
（項目２９）
項目２８に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目３０）
細菌、酵母菌、昆虫または哺乳類細胞から選択される、項目２９に記載の宿主細胞。
（項目３１）
哺乳類細胞である、項目３０に記載の宿主細胞。
（項目３２）
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、項目３１に記載の宿主細胞。
（項目３３）
前記哺乳類細胞がＣＨＯ細胞株である、項目３１に記載の宿主細胞。
（項目３４）
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）を共発現する、項目２９〜３３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目３５）
ＧＮＰＴをコードする外来性核酸を含む、項目３４に記載の宿主細胞。
（項目３６）
内在性ＧＮＰＴの活性化発現を有する、項目３４に記載の宿主細胞。
（項目３７）
ａ）項目１５〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含み、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）を共発現する細胞を培養すること；及び
ｂ）前記細胞によって産生された前記融合タンパク質を回収すること；
を含む標的治療用融合タンパク質の製造方法。
（項目３８）
項目１〜２６のいずれか１項に記載の標的治療薬、及び医薬品として許容可能な担体を含む医薬組成物。
（項目３９）
治療を必要とする患者に項目３８に記載の医薬組成物を投与することを含むリソソーム蓄積症の治療方法。
（項目４０）
前記リソソーム蓄積症がサンフィリッポ症候群Ｂ型である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記医薬組成物を静脈内、皮下、髄腔内及び／またはこれらの組合せに投与する、項目３９または４０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ及びＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質のＭ６Ｐ受容体インビトロ結合アッセイを示す。
【図２】Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質のＭ６Ｐ受容体インビトロ結合アッセイを示す。
【図３】Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質のＭ６Ｐ受容体媒介細胞内取込を監視したインビトロアッセイの結果、ならびに同一のアッセイにより決定したＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞内取込との比較を示す。
【図４】抗Ｍ６Ｐ抗体を用いたウェスタンブロット解析であり、野生型ＨＴ１０８０細胞またはＮ−アセチルグコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅ）−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）過剰発現細胞株で産生した酸性α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）；Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質（Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ）；アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）；イズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）；ヘパラン−Ｎ−スルファミダーゼ（ＨＮＳ）；及びグルコセレブロシダーゼ（ＧＣＢ）タンパク質のＭ６Ｐの相対含有量を示す。ウェスタンブロット解析は、エンドグリコシダーゼＨを用いたＭ６Ｐの除去前（−）及び後（＋）に行った。
【図５】野生型ＨＴ１０８０細胞またはＮ−アセチルグコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅ）−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）過剰発現細胞株で産生した場合における、Ｍ６Ｐ受容体に結合するイズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）のインビトロ結合を示す。
【図６】野生型ＨＴ１０８０細胞またはＮ−アセチルグコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅ）−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）過剰発現細胞株で産生したイズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）のインビトロ細胞内取込を示す。
【図７】ＨＴ１０８０細胞またはＧＮＰＴ過剰発現細胞株（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｔ）で産生した組換えＮａｇｌｕタンパク質のインビトロＭ６Ｐ受容体結合を示す。
【図８】ＨＴ１０８０細胞またはＧＮＰＴ過剰発現細胞株（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ−Ｔ）で産生した様々なＮａｇｌｕ融合タンパク質のインビトロＭ６Ｐ受容体結合を示す。
【図９】Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦに由来のＭ６Ｐ単糖のＰＡＤ−ＨＰＬＣによる定量を示す。Ｉ２ＳのＭ６Ｐ含有量を対照として用いた。
【図１０】野生型ＨＴ１０８０細胞またはＮ−アセチルグコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅ）−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）過剰発現細胞株で産生したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣのインビトロ細胞内取込を示す。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞内取込を対照として用いた。
【図１１】野生型ＨＴ１０８０細胞またはＮ−アセチルグコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅ）−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）過剰発現細胞株で産生したＮａｇｌｕ−ＬＩＦのインビトロ細胞内取込を示す。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞内取込を対照として用いた。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｂは、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに髄腔内送達した後における、マウスの（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脳組織でのインビボＮａｇｌｕ酵素活性を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｂは、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに髄腔内送達した後における、マウスの（Ａ）肝臓及び（Ｂ）脳組織でのインビボＮａｇｌｕ酵素活性を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｆは、組織内のＮａｇｌｕタンパク質の免疫組織化学検出を示す。Ｎａｇｌｕタンパク質は、溶媒対照または（Ａ）Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくは（Ｃ）Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の髄腔内注入を週に３回受けたＮａｇｌｕノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳のニューロンで検出可能である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦを注入したマウスの大脳皮質中のＮａｇｌｕ＋染色ニューロンを円で囲んである（それぞれＢ及びＤ）。同様に、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ（Ｅ）もしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ（Ｆ）を週に３回髄腔内注入した後、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓でＮａｇｌｕが検出された。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｆは、組織内のＮａｇｌｕタンパク質の免疫組織化学検出を示す。Ｎａｇｌｕタンパク質は、溶媒対照または（Ａ）Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくは（Ｃ）Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の髄腔内注入を週に３回受けたＮａｇｌｕノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳のニューロンで検出可能である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦを注入したマウスの大脳皮質中のＮａｇｌｕ＋染色ニューロンを円で囲んである（それぞれＢ及びＤ）。同様に、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ（Ｅ）もしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ（Ｆ）を週に３回髄腔内注入した後、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓でＮａｇｌｕが検出された。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｆは、組織内のＮａｇｌｕタンパク質の免疫組織化学検出を示す。Ｎａｇｌｕタンパク質は、溶媒対照または（Ａ）Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくは（Ｃ）Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の髄腔内注入を週に３回受けたＮａｇｌｕノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳のニューロンで検出可能である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦを注入したマウスの大脳皮質中のＮａｇｌｕ＋染色ニューロンを円で囲んである（それぞれＢ及びＤ）。同様に、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ（Ｅ）もしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ（Ｆ）を週に３回髄腔内注入した後、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓でＮａｇｌｕが検出された。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜Ｆは、組織内のＮａｇｌｕタンパク質の免疫組織化学検出を示す。Ｎａｇｌｕタンパク質は、溶媒対照または（Ａ）Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくは（Ｃ）Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の髄腔内注入を週に３回受けたＮａｇｌｕノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳のニューロンで検出可能である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦを注入したマウスの大脳皮質中のＮａｇｌｕ＋染色ニューロンを円で囲んである（それぞれＢ及びＤ）。同様に、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ（Ｅ）もしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ（Ｆ）を週に３回髄腔内注入した後、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓でＮａｇｌｕが検出された。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜Ｆは、組織内のＮａｇｌｕタンパク質の免疫組織化学検出を示す。Ｎａｇｌｕタンパク質は、溶媒対照または（Ａ）Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくは（Ｃ）Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の髄腔内注入を週に３回受けたＮａｇｌｕノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳のニューロンで検出可能である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦを注入したマウスの大脳皮質中のＮａｇｌｕ＋染色ニューロンを円で囲んである（それぞれＢ及びＤ）。同様に、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ（Ｅ）もしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ（Ｆ）を週に３回髄腔内注入した後、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓でＮａｇｌｕが検出された。
【図１３Ｆ】図１３Ａ〜Ｆは、組織内のＮａｇｌｕタンパク質の免疫組織化学検出を示す。Ｎａｇｌｕタンパク質は、溶媒対照または（Ａ）Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣもしくは（Ｃ）Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の髄腔内注入を週に３回受けたＮａｇｌｕノックアウトマウスの大脳皮質及び小脳のニューロンで検出可能である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦを注入したマウスの大脳皮質中のＮａｇｌｕ＋染色ニューロンを円で囲んである（それぞれＢ及びＤ）。同様に、溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ（Ｅ）もしくはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ（Ｆ）を週に３回髄腔内注入した後、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓でＮａｇｌｕが検出された。
【図１４】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに髄腔内送達した後における、マウスの肝臓中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のインビボ濃度を示す。
【図１５】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに週に２回及び３回髄腔内注入した後における、マウスの脳内のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のインビボ濃度を示す。
【図１６】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに週に２回及び３回髄腔内注入した後における、マウスの脳内のヘパラン硫酸（ＨＳ）のインビボ濃度を示す。
【図１７】溶媒対照（ＰＢＳ）またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに髄腔内送達した後における、マウスの脳内での３種のＳａｎ  Ｂバイオマーカーのインビボ濃度を示す。
【図１８】溶媒対照（ＰＢＳ）またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに髄腔内送達した後における、マウスの脳内での３種のＳａｎ  Ｂバイオマーカーのインビボ濃度を示す。
【図１９】溶媒対照（ＰＢＳ）またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウトマウスに髄腔内送達した後における、マウスの脳内での３種のＳａｎ  Ｂバイオマーカーのインビボ濃度を示す。
【図２０】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの大脳皮質組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２１】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの小脳組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２２】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの視床組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２３】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの線条体組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２４】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの白質組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２５】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に３回髄腔内注入した後における、マウスの肝臓組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２６】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に３回髄腔内注入した後における、マウスの大脳及び小脳組織でのＧＦＡＰの免疫組織化学染色を示す。
【図２７】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を週に３回髄腔内注入した後における、マウスの小脳及び大脳組織でのＩｂａ−１の免疫組織化学染色を示す。
【図２８】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの大脳皮質組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図２９】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの小脳組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図３０】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの視床組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図３１】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの線条体組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図３２】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に２回または３回髄腔内注入した後における、マウスの白質組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図３３】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に３回髄腔内注入した後における、マウスの肝臓組織でのＬＡＭＰ−１免疫組織化学染色を示す。
【図３４】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に３回髄腔内注入した後における、マウスの大脳及び小脳組織でのＧＦＡＰの免疫組織化学染色を示す。
【図３５】溶媒対照またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を週に３回髄腔内注入した後における、マウスの大脳及び小脳組織でのＩｂａ−１の免疫組織化学染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本発明をより容易に理解するために、最初にある特定の用語を以下に定義する。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書全体を通して記載する。
【００１８】
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：本明細書で用いる場合、「α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ」という用語は、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド中の非還元性末端Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを加水分解可能な酵素のことをいう。α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、α−アセチグルコサミニダーゼ（ａｃｅｔｙ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−α−グルコサミニダーゼ及びα−Ｄ−２−アセトアミド−２−デオキシグルコシダーゼとしても知られる。
【００１９】
およそまたは約：本明細書で用いる場合、「およそ」または「約」という用語は、対象とする１つ以上の値に適用する場合、記載する参照値に近似の値を意味する。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、記載する参照値のいずれかの方向で（超えるまたは未満）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に収まる値の範囲を意味する（そのような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００２０】
寛解：本明細書で用いる場合、「寛解」という用語は、患者における状態の予防、軽減もしくは緩和、またはその状態の改善を意味する。寛解には、病状の完治または完全予防が含まれるが、必要ではない。いくつかの実施形態において、寛解には、関連する疾患組織で欠損している関連するタンパク質またはその活性のレベルの増加が含まれる。
【００２１】
アミノ酸：本明細書で用いる場合、「アミノ酸」という用語は最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込むことのできる任意の化合物及び／または物質のことをいう。いくつかの実施形態において、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｄ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸はｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、一般に天然に存在するペプチド中に見出される２０種の標準ｌ−アミノ酸のいずれかのことをいう。「非標準アミノ酸」とは、合成的に調製されたか、天然源から得られたかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸のことをいう。本明細書で用いる場合、「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、塩、アミノ酸誘導体（例えばアミドなど）、及び／または置換が含まれるがこれらに限定されない。アミノ酸は、ペプチド中のカルボキシ及び／またはアミノ末端アミノ酸を含め、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、及び／またはペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることのできる他の化学基での置換によって修飾することができる。アミノ酸はジスルフィド結合に関与していてもよい。アミノ酸は、１つ以上の翻訳後修飾、例えば１種以上の化学実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合などを含んでよい。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と同じ意味で用い、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指す場合もある。遊離アミノ酸を指すのか、ペプチドの残基を指すのかは、この用語が用いられる文脈から明らかであろう。
【００２２】
動物：本明細書で用いる場合、「動物」という用語は動物界の任意の成員のことをいう。いくつかの実施形態において、「動物」は任意の発達段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は任意の発達段階における非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫及び／または蠕虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は遺伝子導入動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであってもよい。
【００２３】
生物学的に活性：本明細書で用いる場合、「生物学的に活性」（または生物活性）という表現は、生物系、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特性のことをいう。例えば、生物に投与された場合に、その生物に生物学的影響を及ぼす作用物質は生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、そのタンパク質またはポリペプチドにおける、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有する部分を一般に「生物学的に活性」な部分と呼ぶ。
【００２４】
カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ）：本明細書で用いる場合、「カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ）」という用語は、ゴルジ体内でリソソームに輸送される予定である酸性加水分解酵素（例えばα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）前駆体上のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）タグと結合する細胞受容体のことをいう。マンノース−６−リン酸に加えて、ＣＩ−Ｍ６ＰＲは、ＩＧＦ−ＩＩを含めたある特定のタンパク質とも結合する。ＣＩ−Ｍ６ＰＲは、「ＣＩ−ＭＰＲ」、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＤ２２２」、「ＭＰＲ３００」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」または「ＩＧＦ２受容体」としても知られる。これらの用語及びその略号を本明細書では同じ意味で用いる。
【００２５】
希釈剤：本明細書で用いる場合、「希釈剤」という用語とは、医薬品として許容可能（例えばヒトへの投与において安全かつ無毒性）であり、再構成製剤の調製に有用な希釈物質のことをいう。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはブドウ糖液が挙げられる。
【００２６】
酵素補充療法（ＥＲＴ）：本明細書で用いる場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、不足する酵素を供給することにより酵素欠損を補正する任意の治療戦略のことをいう。いくつかの実施形態において、不足する酵素は髄腔内投与によって供給する。いくつかの実施形態において、不足する酵素は血流中に注入することによって供給する。酵素は、投与されると細胞に取り込まれてリソソームに輸送され、そこで酵素欠損のためにリソソーム内に蓄積した物質を除去するように働く。一般に、リソソーム酵素補充療法を効果的とするために、蓄積障害が発症している標的組織の適切な細胞内のリソソームに治療用酵素を送達する。
【００２７】
発現：本明細書で用いる場合、核酸配列の「発現」は以下の現象の１つ以上のことをいう。（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えばスプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）；（３）ポリペプチドもしくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；及び／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾。本出願において、「発現」及び「産生」という用語、ならびに文法的同義語を同じ意味で用いる。
【００２８】
グリカン：当該技術分野で公知であり、本明細書でも用いるように、「グリカン」は糖である。グリカンは糖残基のモノマーまたはポリマーであり得るが、一般には少なくとも３つの糖を含有しており、直鎖または分岐鎖であり得る。グリカンには、天然糖残基（例えば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）及び／または修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）が含まれ得る。「グリカン」という用語は糖残基のホモ及びヘテロポリマーを含む。「グリカン」という用語はまた、複合糖質（例えば糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなど）のグリカン成分も包含する。この用語はまた、遊離グリカンも包含し、複合糖質から切断された、または他の方法で遊離されたグリカンを含む。
【００２９】
複合糖質：本明細書で用いる場合、「複合糖質」という用語は、少なくとも１つの糖部分が少なくとも１つの他の部分に共有結合しているすべての分子を包含する。この用語は具体的には、共有結合している糖部分を有するすべての生体分子を包含し、例えばＮ結合型糖タンパク質、Ｏ結合型糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどを含む。
【００３０】
糖タンパク質：本明細書で用いる場合、「糖タンパク質」という用語は、１つ以上の糖部分（すなわちグリカン）に共有結合しているペプチド主鎖を含有するタンパク質のことをいう。当業者に理解されているように、ペプチド主鎖は一般にアミノ酸残基の直鎖を含む。ある特定の実施形態において、ペプチド主鎖は細胞膜にまたがっており、そのため、細胞外部分及び／または細胞内部分に加えて膜貫通部分を含む。ある特定の実施形態において、細胞膜にまたがる糖タンパク質のペプチド主鎖は、細胞内部分、膜貫通部分、及び細胞外部分を含む。糖部分は、単糖、二糖、オリゴ糖、及び／または多糖の形態であってよい。糖部分は、糖残基による単一の非分岐鎖を含んでもよく、１つ以上の分岐鎖を含んでもよい。ある特定の実施形態において、糖部分は硫酸基及び／またはリン酸基を含み得る。代替的にまたは追加的に、糖部分はアセチル、グリコリル、プロピル、または他のアルキル修飾を含んでもよい。代替的にまたは追加的に、糖部分はジアセチル化によって修飾されていてもよい。ある特定の実施形態において、糖タンパク質はＯ結合型糖部分を含有し；ある特定の実施形態において、糖タンパク質はＮ結合型糖部分を含有する。ある特定の実施形態において、糖部分は特にマンノース−６−リン酸残基を含有するＮ結合型グリカンである。ある特定の実施形態において、本明細書に開示の方法は、治療用糖タンパク質、細胞表面糖タンパク質の遊離断片（例えば糖ペプチド）、細胞表面糖タンパク質に結合している細胞表面グリカン、細胞表面糖タンパク質のペプチド主鎖、こうした糖タンパク質、グリカン及び／またはペプチド主鎖の断片、ならびにこれらの組合せを、それらのグリコシル化パターン及び／またはＭ６Ｐリン酸化度について解析するステップを含む。
【００３１】
高マンノース：本明細書で用いる場合、「高マンノース」という用語は、本明細書において１つ以上のＭａｎ９（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｍａｎ８（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｍａｎ７（ＧｌｃＮＡｃ）２、Ｍａｎ６（ＧｌｃＮＡｃ）２、及び／もしくはＭａｎ５（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｎ結合型オリゴ糖、またはこれらの組合せを含有するタンパク質（例えばＮａｇｌｕ）を表現するために用いる。
【００３２】
相同性：本明細書で用いる場合、「相同性」（または対応する形容詞「相同な」）という用語は、ポリマー分子、例えば核酸分子（例えばＤＮＡ分子及び／もしくはＲＮＡ分子）ならびに／またはポリペプチド間の全体的な関連性のことをいう。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに相同であるとみなされる。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似する場合、互いに相同であるとみなされる。
【００３３】
同一性：本明細書で用いる場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子、例えば核酸分子（例えばＤＮＡ分子及び／もしくはＲＮＡ分子）ならびに／またはポリペプチドの全体的な関連性のことをいう。２つの核酸配列の同一性％の計算は、例えば、最適比較のために２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適アラインメントのために第１及び第２核酸配列の一方または両方にギャップを挿入することができ、比較する上で非同一配列を無視することができる）。ある特定の実施形態において、比較するために整列させる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。そして、対応するヌクレオチド位のヌクレオチドを比較する。第１配列のある位置に、第２配列の対応する位置と同じヌクレオチドがある場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性％は、それらの配列によって共有される同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適アラインメントのために挿入する必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れている。配列の比較及び２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の一致率は、Ｍｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，  １９８９，  ４：  １１−１７）を用いて決定することができ、これはＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いたＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定することもできる。
【００３４】
改善する、増加する、または減少する：  本明細書で用いる場合、「改善する」、「増加する」もしくは「減少する」という用語または文法的同義語は、基準測定値、例えば、本明細書に記載の治療を開始する前の同一個体における測定値、または本明細書に記載の治療を施していない対照の対象（もしくは複数の対照の対象）における測定値などと比較した値であること意味する。「対照の対象」は、治療される対象と同一形態の疾患にかかっている対象であり、治療される対象とおよそ同じ年齢のものである。
【００３５】
インビトロ：本明細書で用いる場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的環境、例えば試験管または反応容器内、細胞培養内などで生じる現象のことをいう。
【００３６】
インビボ：本明細書で用いる場合、「インビボ」という用語は、多細胞生物、例えばヒト及び非ヒト動物などの内部で生じる現象のことをいう。細胞ベースの系との関連では、この用語は、（例えばインビトロ系と対照的なものとして）生細胞内で生じる現象のことをいうために用いられ得る。
【００３７】
髄腔内投与：本明細書で用いる場合、「髄腔内投与」または「髄腔内注入」という用語は、脊柱管（脊髄を取り囲むくも膜下腔）への注入のことをいう。穿頭孔を通した側脳室注入または大槽もしくは腰椎穿刺などを含めた様々な技術が用いられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明に従う「髄腔内投与」または「髄腔内送達」は、腰部または腰領域を介したＩＴ投与または送達、すなわち腰部ＩＴ投与または送達のことをいう。本明細書で用いる場合、「腰領域」または「腰部」という用語は、第３及び第４腰椎間の部分のことをいい、より包括的には脊椎のＬ２−Ｓ１領域のことをいう。
【００３８】
リンカー：本明細書で用いる場合、「リンカー」は、融合タンパク質中において、天然タンパク質の特定の位置に現れるもの以外のアミノ酸配列のことをいい、一般に柔軟であるように、または２つのタンパク質部分の間にａ−へリックスなどの構造を挿入するように設計される。リンカーはスペーサーとも呼ばれる。
【００３９】
リソソーム酵素：本明細書で用いる場合、「リソソーム酵素」という用語は、哺乳類のリソソーム内の蓄積物質を減少させることができるか、１種以上のリソソーム蓄積症の症状を救済または寛解させることができる任意の酵素のことをいう。本発明に好適なリソソーム酵素としては、野生型または修飾リソソーム酵素の両方が挙げられ、組換え及び合成方法を用いて製造することができるか、天然原料から精製することができる。例示的なリソソーム酵素を表１に示す。
【００４０】
リソソーム酵素欠損症：本明細書で用いる場合、「リソソーム酵素欠損症」は、リソソーム内で高分子（例えば酵素基質）をペプチド、アミノ酸、単糖、核酸及び脂肪酸に分解するのに必要な酵素のうち少なくとも１種の欠損に起因する一群の遺伝子疾患のことをいう。その結果、リソソーム酵素欠損症を患っている個体は、様々な組織中（例えばＣＮＳ、肝臓、脾臓、腸、血管壁及び他の器官）に蓄積物質を有する。
【００４１】
リソソーム蓄積症：本明細書で用いる場合、「リソソーム蓄積症」という用語は、天然高分子を代謝するのに必要な１種以上のリソソーム酵素の欠損に起因するあらゆる疾患のことをいう。こうした疾患は一般にリソソーム内における未分解分子の蓄積を招き、結果として貯蔵顆粒（貯蔵小胞とも称される）の数が増加する。
【００４２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で用いる場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことをいう。本明細書で用いる場合、ｍＲＮＡは修飾及び非修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは１つ以上のコーディング及び非コーディング領域を含有し得る。
【００４３】
部分：本明細書で用いる場合、「部分」という用語は、分子（例えばグリカンまたはタンパク質）の一部または官能基のことをいう。本明細書では「部分」を「残基」と同じ意味で用いる。
【００４４】
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）タンパク質：本明細書で用いる場合、「Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）タンパク質」という用語は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからリソソーム加水分解酵素（例えばα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）上のマンノース残基へのＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の転移を触媒可能な酵素のことをいう。
【００４５】
核酸：本明細書で用いる場合、「核酸」という用語は最も広い意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれている、または組み込むことのできる任意の化合物及び／または物質のことをいう。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれている、または組み込むことのできる化合物及び／または物質である。いくつかの実施形態において、「核酸」は個々の核酸残基（例えばヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」はＲＮＡならびに一本鎖及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、及び／または類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステル主鎖以外を有するアナログを含む。例えば、当該技術分野で公知であり、ホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を主鎖に有する、いわゆる「ペプチド核酸」も本発明の範囲内と考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いに縮重型である、及び／または同一のアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及び／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。核酸は、天然原料から精製することができるか、組換え発現系を用いて製造し、任意により精製、化学合成などを行うことができる。適切であれば、例えば化学合成分子の場合において、核酸は、化学修飾塩基または糖、主鎖修飾などを有するアナログなどのヌクレオシドアナログを含むことができる。核酸配列は特に断らない限り５’から３’の方向で表す。いくつかの実施形態において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニルシチジン、Ｃ−５プロピニルウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えばメチル化塩基）；介在塩基；修飾糖（例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；ならびに／または修飾リン酸基（例えばホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、本発明は特に、送達を促進または達成するための化学修飾がなされていない核酸（例えばポリヌクレオチドならびにヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含めた残基）を意味する「非修飾核酸」を対象とする。
【００４６】
患者：本明細書で用いる場合、「患者」または「対象」という用語は、例えば実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的で、提供される組成物が投与され得る任意の生物のことをいう。典型的な患者としては、動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）が挙げられる。いくつかの実施形態において、患者はヒトである。ヒトには出生前及び後の形態が含まれる。
【００４７】
医薬品として許容可能：本明細書で用いる場合、「医薬品として許容可能」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、毒性、刺激、アレルギー反応、または他の異常もしくは合併症を示さずにヒト及び動物の細胞に接触させて用いるのに適した、適正なベネフィット／リスク比に見合う物質のことをいう。
【００４８】
ポリペプチド：本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、一般的に言って、ペプチド結合によって互いに結合した少なくとも２つのアミノ酸の連なりである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは少なくとも３〜５アミノ酸を有する場合があり、それぞれは少なくとも１つのペプチド結合を介して他と結合している。当業者であれば、ポリペプチドは場合によっては、「非天然」アミノ酸または他の実体であって、それでもなお任意によりポリペプチド鎖に組み込み可能なものを含むと理解されよう。
【００４９】
タンパク質：本明細書で用いる場合、「治療用タンパク質」の「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわちペプチド結合によって互いに結合した少なくとも２つのアミノ酸の連なり）のことをいう。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含む場合があり（例えば糖タンパク質、プロテオグリカンなどである場合があり）、かつ／またはそれとは別に加工もしくは修飾される場合がある。当業者であれば、「タンパク質」は、細胞によって産生されるような完全なポリペプチド鎖（シグナル配列含有または非含有）であってもよく、その特性部分であってもよいと理解されよう。当業者であれば、タンパク質は場合によっては、例えば１つ以上のジスルフィド結合によって結合しているか、他の手段によって会合している１つより多いポリペプチド鎖を含み得ると理解されよう。ポリペプチドは、ｌ−アミノ酸、ｄ−アミノ酸、またはその両方を含有してもよく、当該技術分野において公知の様々なアミノ酸修飾またはアナログのいずれを含有してもよい。有用な修飾としては、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びこれらの組合せを含み得る。「ペプチド」という用語は概して、約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、または１０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドのことをいうために用いられる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、及び／またはその特性部分である。
【００５０】
組換え体：本明細書で用いる場合、「組換え体」という用語は、当業者によって一般に理解されているように、組換えＤＮＡ技術を用いて生成されたＤＮＡ分子、ペプチド、タンパク質または細胞のことをいう。
【００５１】
対象：本明細書で用いる場合、「対象」はヒトまたは任意の非ヒト動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）のことをいう。ヒトには出生前及び後の形態が含まれる。多くの実施形態において、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または治療のために医療提供者を受診するヒトのことをいう患者であり得る。本明細書においては、「対象」という用語を「個体」または「患者」と同じ意味で用いる。対象は、疾患または障害にかかっている、またはかかる可能性があるものであり得るが、疾患または障害の症状を示す場合もあれば、示さない場合もある。
【００５２】
実質的に：本明細書で用いる場合、「実質的に」という用語は、総量の８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える量のことをいう。
【００５３】
標的組織：本明細書で用いる場合、「標的組織」という用語は、治療しようとするリソソーム蓄積症の影響を受けている任意の組織、または欠損しているリソソーム酵素が通常であれば発現される任意の組織のことをいう。いくつかの実施形態において、標的組織には、リソソーム蓄積症を患っているか患う可能性のある患者における、例えば組織の細胞内リソソームに蓄積された酵素基質が検出可能な量または異常に多い量で存在する組織が含まれる。いくつかの実施形態において、標的組織には疾患に関連する病状、症状、または特徴を示す組織が含まれる。いくつかの実施形態において、標的組織には欠損しているリソソーム酵素が通常であれば高いレベルで発現される組織が含まれる。本明細書で用いる場合、標的組織は脳標的組織、脊髄標的組織及び／または末梢標的組織であり得る。例示的な標的組織は下で詳細に記載する。
【００５４】
治療用糖タンパク質：本明細書で用いる場合、「治療用糖タンパク質」という用語は、治療しようとする疾患で欠損または不足した酵素に、少なくとも部分的に取って代わるように働くことのできる任意の糖タンパク質のことをいう。いくつかの実施形態において、「治療用糖タンパク質」という用語は、局在化、輸送、加工され得るリソソームタンパク質（例えば酸性加水分解酵素）のことをいい、かつ／または細胞のリソソーム内に存在する。いくつかの実施形態において、治療用糖タンパク質は、治療しようとするリソソーム蓄積症で欠損または不足したリソソーム酵素に、少なくとも部分的に取って代わるように働くことのできる酵素活性を有する糖タンパク質（例えばリソソーム酵素）のことをいう。いくつかの実施形態において、治療用糖タンパク質は、哺乳類のリソソーム内の蓄積物質を減少させることができるか、１種以上のリソソーム蓄積症の症状を救済または寛解させることができる。本発明に好適な治療用糖タンパク質には、リソソーム酵素の野生型、修飾またはタンパク質融合の両方が含まれ、組換え法を用いて製造することができる。
【００５５】
治療的有効量：本明細書で用いる場合、治療薬の「治療的有効量」という用語は、疾患、障害、及び／または病気を患っているか患う可能性のある患者に投与した場合における、疾患、障害、及び／または病気の症状を治療、診断、予防、及び／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。治療的有効量は一般に少なくとも１単位用量を含む用法によって投与されると当業者には理解されよう。
【００５６】
治療：本明細書で用いる場合、「治療」（また「治療する」または「治療すること」）は、特定の疾患、障害、及び／または病気（例えばハンター症候群、サンフィリッポＢ症候群）の１つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に緩和、寛解、軽減、抑制、発症を遅延、重症度を減少、及び／または発生率を減少させる治療薬（例えばリソソーム酵素）の任意の投与のことをいう。こうした治療は、関連する疾患、障害及び／もしくは病気の徴候を示していない対象、ならびに／または疾患、障害及び／もしくは病気の早期徴候のみを示す対象に対するものであり得る。代替的にまたは追加的に、こうした治療は、関連する疾患、障害及び／または病気の１つ以上の確立した徴候を示す対象に対するものであり得る。
【００５７】
詳細な説明
本発明は、リソソーム蓄積症に対する効果的な酵素補充療法のための、リソソーム酵素を含有し、及びＮ結合型グリコシル化部位を含有するリソソーム標的化部分を含有する標的治療薬、ならびにその製造方法及びその使用方法を提供する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明は、Ｍ６Ｐ基を含有するＮ結合型グリコシル化を含有するペプチドであるリソソーム標的化部分を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、リソソーム酵素及びリソソーム標的化部分がリンカーを介して融合している標的治療薬を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、標的治療薬をコードする核酸を含むベクター、及びこれを含有し、かつ、ＧＮＰＴを共発現する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、リソソーム酵素はＮａｇｌｕである。
【００５９】
本発明の様々な態様を以下の小節でより詳細に記載する。小節を使用することにより本発明を限定する意図はない。各小節は本発明の任意の態様に適用され得る。本出願において、特に明記しない限り「ｏｒ」の使用は「ａｎｄ／ｏｒ」を意味する。
【００６０】
治療用リソソーム酵素−Ｎａｇｌｕタンパク質
本発明者らは、意外なことにリソソーム酵素にＮ結合型グリコシル化部位を含有する標的化部分を結合することによって、リソソーム酵素をリソソームに標的化できることを発見した。本発明は、リソソーム酵素を含有し、及びＮ結合型グリコシル化部位を含有するリソソーム標的化部分を含有する標的治療薬を提供する。いくつかの実施形態において、本発明との関係で好適な治療用リソソーム酵素は組換えヒトＮａｇｌｕタンパク質である。α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）は、リソソーム内のヘパラン硫酸の段階的な分解を、このグリコサミノグリカンの非還元性末端からＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）を除去することによって助ける。Ｎａｇｌｕの不足はヘパラン硫酸の不完全な分解につながり、それに続いて不完全な分解産物がリソソーム内に蓄積する。Ｎａｇｌｕの欠如は致死性の神経変性疾患であるサンフィリッポＩＩＩＢ型の原因となる。
【００６１】
本発明による好適なＮａｇｌｕタンパク質は、自然発生Ｎａｇｌｕタンパク質の作用の代わりとなることができるか、Ｎａｇｌｕ欠損に関連する１つ以上の表現型または症状を救済することができる任意の分子であり得る。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は、Ｎ末端及びＣ末端ならびに成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質と実質的に類似または同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００６２】
一般に、ヒトＮａｇｌｕは前駆体分子として産生されるが、これは処理された成熟形態とされるものである。このプロセスは一般に、タンパク質が小胞体に入った際に２３アミノ酸シグナルペプチドを除去することにより生じる。一般に、前駆体形態は全長前駆体または全長Ｎａｇｌｕタンパク質とも呼ばれ、７４３アミノ酸を含有する。前駆体タンパク質が小胞体に入ると、Ｎ末端２３アミノ酸が切断されて成熟形態となる。したがって、一般にＮ末端２３アミノ酸はＮａｇｌｕタンパク質活性に必要とされていないと考えられる。しかし、Ｎａｇｌｕタンパク質の全長前駆体の使用も本発明の範囲内であることを企図する。成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１）及び典型的な野生型または自然発生ヒトＮａｇｌｕタンパク質の全長前駆体（配列番号２）を下表１に示す。
【表１】
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【００６３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態において、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、別種（例えばマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、イヌなど）に由来する成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質のホモログまたはオーソログであってもよい。他の実施形態において、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質の機能的変異体であってもよい。成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質の機能的変異体は、野生型または自然発生Ｎａｇｌｕタンパク質（例えば配列番号１）に対して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有すると同時に、実質的にＮａｇｌｕタンパク質の生物活性を保持する修飾成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は成熟ヒトＮａｇｌｕタンパク質の断片または一部を含有する。
【００６４】
あるいは、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は全長Ｎａｇｌｕタンパク質である。いくつかの実施形態において、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、別種（例えばマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、イヌなど）に由来する全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質のホモログまたはオーソログであってもよい。いくつかの実施形態において、好適なＮａｇｌｕタンパク質は、野生型または自然発生全長Ｎａｇｌｕタンパク質（例えば配列番号２）に対して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有すると同時に、実質的なＮａｇｌｕタンパク質活性を保持する全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質の機能的変異体であってもよい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質（配列番号２）と実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＮａｇｌｕタンパク質は全長ヒトＮａｇｌｕタンパク質の断片または一部を含有する。本明細書で用いる場合、全長Ｎａｇｌｕタンパク質は一般にシグナルペプチド配列を含有する。
【００６５】
当該技術分野で公知なように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで使用可能なものを含めた様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５（３）：  ４０３−４１０，  １９９０；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗｉｌｅｙ，  １９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １３２），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９に記載されており、上記のすべてを参照により本明細書に援用する。相同な配列を特定することに加えて、上記のプログラムは一般に相同性の程度も示す。いくつかの実施形態において、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上が関連する一続きの残基にわたって相同である場合、実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態において、この関連する連なりは完全配列である。いくつかの実施形態において、この関連する連なりは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００、またはそれ以上の残基である。
【００６６】
「実質的な同一性」という表現は、本明細書においてアミノ酸または核酸配列間の比較のことをいうために用いる。当業者には理解されるように、２つの配列は、それらの対応する位置に同一の残基を含有する場合、「実質的に同一」であると一般にみなされる。当該技術分野で公知なように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで使用可能なものを含めた様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５（３）：  ４０３−４１０，  １９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２，  １９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗｉｌｅｙ，  １９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １３２），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９に記載されている。同一な配列を特定することに加えて、上記のプログラムは一般に同一性の程度も示す。いくつかの実施形態において、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上が関連する一続きの残基にわたって同一である場合、実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態において、この関連する連なりは完全配列である。いくつかの実施形態において、この関連する連なりは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００以上の残基である。
【００６７】
代替的治療用リソソーム酵素
本発明者らは、意外なことにリソソーム酵素にＮ結合型グリコシル化部位を含有する標的化部分を結合することによって、リソソーム酵素をリソソームに標的化できることを発見した。したがって、本発明は、リソソーム酵素を含有し、及びＮ結合型グリコシル化部位を含有するリソソーム標的化部分を含有する標的治療薬を提供する。本発明との関係において好適な治療用リソソーム酵素は、リソソーム蓄積症、特にＣＮＳ病因及び／または症状を有するリソソーム蓄積症に対する発展または治療の一翼を担うことが明らかにされている任意のタンパク質であり、リソソーム蓄積症としては、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、ウォルマン病、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪性肉芽腫症、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、グロボイド細胞白質ジストロフィー、クラッベ病、糖原病ＩＩ、ポンペ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ・サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、サンドホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型、Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラー・ポリジストロフィー、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩＡ型、サンフィリッポ症候群、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖症ＩＶＢ型、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖症ＩＸ型、多種スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、ＣＬＮ１バッテン病、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン・ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、濃化異骨症、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病及びシアル酸蓄積症が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
Ｓｃｒｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ７．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，  （１９９５）で、リソソーム蓄積症の遺伝的病因、臨床症状、及び分子生物学についての詳細な総説が詳述されている。上記の疾患で欠損している酵素は一般に当業者には公知であるが、そのいくつかを下表２に例示する。
【表２−１】
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【表２−２】
0006623213.tif 000004
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素はヒト野生型タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用リソソーム酵素は、別種（例えばマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、イヌなど）に由来するヒト野生型タンパク質のホモログまたはオーソログであってもよい。他の実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素はヒト野生型タンパク質の機能的変異体であってもよい。ヒト野生型タンパク質の機能的変異体は、野生型または自然発生タンパク質に対して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有すると同時に、実質的にヒト野生型タンパク質の生物活性を保持する修飾ヒト野生型タンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素はヒト野生型タンパク質と実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素は、ヒト野生型タンパク質と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素はヒト野生型タンパク質と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素は、ヒト野生型タンパク質と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用リソソーム酵素はヒト野生型タンパク質の断片または一部を含有する。
【００７０】
リソソーム標的化部分
本発明者らは、意外なことにリソソーム酵素にＮ結合型グリコシル化部位を含有する標的化部分を結合することによって、リソソーム酵素をリソソームに標的化できることを発見した。したがって、本発明は、リソソーム酵素を含有し、及びＮ結合型グリコシル化部位を含有するリソソーム標的化部分を含有する標的治療薬を提供する。
【００７１】
本発明は、ペプチドがＮ結合型グリコシル化部位を有する限り、本発明の範囲内では任意のペプチドを用い得ることを企図する。Ｎ結合型グリコシル化部位は、コンピュータアルゴリズム及びソフトウェアにより予測され得るが、その多くは当該技術分野において一般に公知である。あるいは、Ｎ結合型グリコシル化は、当該技術分野において一般に公知である多くのアッセイのうち任意の１つを用いて実験により決定してもよい。そのようなアッセイの非限定例を実施例の節に記載する。
【００７２】
好適な標的化部分は、限定はしないが、ＩＧＦ−Ｉ、Ｋｉｆ、ＡｐｏＥ、ＴＡＴ、ＲＡＰ、ｐ９７、プラスミノーゲン、白血病抑制因子ペプチド（ＬＩＦ）、Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサーペプチド（ＣＲＥＧ）、ヒトソルトリン（Ｓｏｒｔｌｉｎ）−１プロペプチド（ＳＰＰ）、ヒトプロサポシンペプチド（ＳａｐＤＣ）及びプログラニュリンを含めたタンパク質またはペプチドから誘導され得る。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、マンノース−６−リン酸に依存する形でＣＩ−Ｍ６ＰＲに結合する任意のタンパク質、ペプチド、またはこれらの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲのある領域、ドメイン及び／または細胞外部分に直接結合する任意のタンパク質、ペプチド、またはこれらの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲのある領域、ドメイン及び／または細胞外部分にＭ６Ｐ残基を介して直接結合する任意のタンパク質、ペプチド、またはこれらの断片である。
【００７３】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はヒトプロサポシン（配列番号３）から誘導される。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は野生型または自然発生ヒトプロサポシンタンパク質のプロサポシン配列である。いくつかの実施形態において、プロサポシンのＣ末端領域及びＤ機能ドメインを含むアミノ酸配列（配列番号４）を用いる。
【表３】
0006623213.tif 000005
【００７４】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する修飾ヒトプロサポシン配列である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ヒトプロサポシンの配列（配列番号３）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はヒトプロサポシンの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する修飾ヒトプロサポシンＤＣペプチド（ＳａｐＤＣ）配列である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ＳａｐＤＣ（配列番号４）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はＳａｐＤＣの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、１つ以上のＮ末端、Ｃ末端または内部欠失を有するヒトプロサポシン（配列番号３）またはＳａｐＤＣ（配列番号４）を含有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、受容体に対する結合親和性が減少した修飾ヒトプロサポシンまたはＳａｐＤＣペプチドである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はヒト白血病抑制因子（配列番号５）から誘導される。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、野生型または自然発生ヒト白血病抑制因子タンパク質の白血病抑制因子配列である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、白血病抑制因子のシグナルペプチド、グリコシル化部位、４ヘリックスバンドルのヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及び／またはＤならびにこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチド、グリコシル化部位、４ヘリックスバンドルのヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤならびに様々な変異を含むアミノ酸ペプチド配列（ＬＩＦ）を用いる（配列番号６）。
【表４】
0006623213.tif 000006
【００７６】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する修飾白血病抑制因子配列である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、白血病抑制因子の配列（配列番号５）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はヒト白血病抑制因子の断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する修飾ヒトＬＩＦ配列（配列番号６）である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ＬＩＦ（配列番号６）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はＬＩＦの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、１つ以上のＮ末端、Ｃ末端または内部欠失を有するヒト白血病抑制因子（配列番号５）またはＬＩＦ（配列番号６）を含有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ＬＩＦ受容体及び／または代わりとなる結合タンパク質、例えば限定はしないがｐｇ１３０などに対する結合親和性が減少した修飾ヒト白血病抑制因子またはＬＩＦペプチドである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ヒトのＥ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサータンパク質（配列番号７）から誘導される。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、野生型または自然発生ヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサータンパク質のＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサー配列である。
【００７８】
いくつかの実施形態において、Ｅ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサーのシグナルペプチドの配列を含まず、かつ、Ｅ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサーの配列ＤＰＱＳ（配列番号８）の内部ペプチドを含まないアミノ酸配列を用いる。すなわち、ヒトＥ１刺激遺伝子リプレッサーペプチド（ＣＲＥＧ）（配列番号９）を用いることとなる。
【表５】
0006623213.tif 000007
【００７９】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する修飾ヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサー配列である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサーの配列（配列番号７）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサーの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、アミノ酸置換、挿入または欠失を含有する修飾ヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサー配列である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、ヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサーペプチド（ＣＲＥＧ）（配列番号９）と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分はＣＲＥＧの断片である。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、１つ以上のＮ末端、Ｃ末端または内部欠失を有するヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサー（配列番号７）またはＣＲＥＧ（配列番号９）を含有する。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は、受容体に対する結合親和性が減少した修飾ヒトＥ１Ａ刺激遺伝子細胞リプレッサーまたはＣＲＥＧである。
【００８０】
様々な別のリソソーム標的化部分が当該技術分野において公知であり、本発明を実施するために用いることができる。例えば、米国特許第７，３９６，８１１号、同第７，５６０，４２４号、及び同第７，６２９，３０９号；米国特許出願公開第２００３−００８２１７６号、同第２００４−０００６００８号、同第２００３−００７２７６１号、同第２００４０００５３０９号、同第２００５−０２８１８０５号、同第２００５−０２４４４００号；ならびに国際公開第ＷＯ０３／０３２９１３号、ＷＯ０３／０３２７２７号、ＷＯ０２／０８７５１０号、ＷＯ０３／１０２５８３号、ＷＯ２００５／０７８０７７号、ＷＯ２００９／１３７７２１号に、ある特定のペプチド系リソソーム標的化部分についての記載があり、これらの開示全体を参照により本明細書に援用する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は細胞によってＭ６Ｐリン酸化された任意のポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＣＩ−Ｍ６ＰＲに結合可能である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、β−グルクロイダーゼ（Ｇｌｕｃｕｒｏｉｄａｓｅ）、β−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、アリールスルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホマンナン、潜在型ＴＧＦ−β、白血病抑制因子、プロリフェリン、プロレニン、単純ヘルペスウイルス、ＰＩ−ＬＬＣ切断ＧＰＩアンカー、レチノイン酸、ＩＧＦＩＩ、プラスミノーゲン、サイログロブリン、ＴＧＦ−βＲ−Ｖ、ＣＤ８７、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇｉ−１、Ｇｉ−２及びＧｉ３）、ＨＡ−Ｉアダプチン、ＨＡ−ＩＩアダプチンならびにこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質中に見出されるアミノ酸配列である。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、β−グルクロイダーゼ（Ｇｌｕｃｕｒｏｉｄａｓｅ）、β−マンノシダーゼ、α−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、アリールスルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホマンナン、潜在型ＴＧＦ−β、白血病抑制因子、プロリフェリン、プロレニン、単純ヘルペスウイルス、ＰＩ−ＬＬＣ切断ＧＰＩアンカー、レチノイン酸、ＩＧＦＩＩ、プラスミノーゲン、サイログロブリン、ＴＧＦ−βＲ−Ｖ、ＣＤ８７、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇｉ−１、Ｇｉ−２及びＧｉ３）、ＨＡ−Ｉアダプチン、ＨＡ−ＩＩアダプチンならびにこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のタンパク質のドメイン、断片、領域またはセグメントを含む。いくつかの実施形態では、合成によりポリペプチドを製造する。いくつかの実施形態では、組換えによりポリペプチドを製造する。両アプローチは、当該技術分野で広く用いられており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）に記載されている。
【００８２】
リソソーム標的化部分とリソソーム酵素との結合−融合タンパク質
リソソーム標的化部分は、当該技術分野において一般に公知の任意の方法でリソソーム酵素に結合され得る。非限定例としては、遺伝学的手段または化学的結合によって融合タンパク質を作製することが挙げられる。いくつかの実施形態では、リソソーム酵素のＮ末端にリソソーム標的化部分を融合させ、他の実施形態では、リソソーム酵素のＣ末端にリソソーム標的化部分を融合させる。いくつかの実施形態において、リソソーム標的化部分は内部に位置している、すなわちリソソーム酵素ポリペプチドの内部にある。融合タンパク質の作製は当該技術分野では標準的であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）で詳細に記載されている。本発明の範囲内では、１つより多いリソソーム標的化部分が好適なリソソーム酵素と結合され得ることを企図している。
【００８３】
本発明のいくつかの実施形態において、標的治療薬は融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つ以上のより小さなポリペプチドから生成されるポリペプチドである。融合タンパク質は組換えＤＮＡ技術によって作製してもよく、これは当該技術分野では標準的であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋらが詳細に記載している。
【００８４】
本発明の実施例の節で、本発明の範囲内における融合タンパク質の非限定例を開示する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は次のアミノ酸配列のうち１つを有する：配列番号２３、２４、２５または２６。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、これらの配列の任意の１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％同一である。
【００８５】
リンカーまたはスペーサー
リソソーム標的化部分は、好適なリソソーム酵素ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得るか、内部に挿入され得る。リソソーム標的化部分は、リソソーム酵素ポリペプチドに直接融合してもよく、リンカーまたはスペーサーによってリソソーム酵素ポリペプチドから分離してもよい。アミノ酸リンカーまたはスペーサーは、概して柔軟であるように、または２つのタンパク質部分の間にａ−へリックスなどの構造を挿入するように設計される。リンカーまたはスペーサーは、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号１０）のポリ「ＧＡＧ」配列、ＧＡＰ（配列番号１１）の「ＧＡＰ」配列、ＧＧＧＧＧＰ（配列番号１２）の「ポリＧＰ」配列などのように比較的短くてもよく、例えば１０〜５０（例えば１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０）アミノ酸の長さのようにより長くすることもできる。いくつかの実施形態において、様々な短いリンカー配列が縦列反復で存在してもよい。例えば、好適なリンカーは、縦列反復で存在するＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号１０）の「ＧＡＧ」アミノ酸配列を含有し得る。いくつかの実施形態において、そのようなリンカーは、１つ以上の「ＧＡＰ」配列をさらに含有してもよく、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号１０）の「ＧＡＧ」配列はその枠内に入る。例えば、いくつかの実施形態において、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１３）のように、それぞれが「ＧＡＰ」配列の枠に入っている２つの縦列「ＧＡＧ」反復を含有するＧＡＧ２リンカーを用いてもよい。いくつかの実施形態において、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１４）のように、それぞれが２つの「ＧＡＰ」配列の枠に入っている３つの縦列「ＧＡＧ」反復を含有するＧＡＧ３リンカーを用いてもよい。いくつかの実施形態において、好適なリンカーまたはスペーサーは、配列番号１４の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を含有し得る。
【００８６】
いくつかの実施形態において、好適なリンカーまたはスペーサーは次の配列を含有し得る：ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１５）。いくつかの実施形態において、好適なリンカーまたはスペーサーは、配列番号１５の配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である配列を含有し得る。
【００８７】
ベクター
一態様において、本発明は、本明細書に開示の融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。一態様において、本発明は、当該核酸を含むベクターを提供する。核酸という用語は本明細書の定義の節で詳細に記載している。本明細書に記載のタンパク質及び／または本発明の他の構成要素の発現用ベクターには、プラスミドベクター及び二本鎖または一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターが含まれる。ベクターは、ＤＮＡとして細胞に直接導入してもよく、ファージ及びウイルスの間接的使用により導入してもよい。ベクターは当該技術分野において一般に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）で詳細に記載されている。
【００８８】
宿主細胞
一態様において、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を提供する。好適な宿主細胞は、限定はしないが哺乳類、植物、鳥類（例えば鶏系）、昆虫、酵母菌、及び細菌を含めた様々な生物から取り出すことができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞である。細胞培養及びポリペプチドの発現がしやすい任意の哺乳類細胞が、宿主細胞として本発明に従って利用され得る。本発明に従って用いられ得る哺乳類細胞の非限定例としては、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ヒーラ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，  Ｌｅｉｄｅｎ，  オランダ））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト線維肉腫細胞株（ＨＴ−１０８０）；ヒト胎児腎臓株（２９３または浮遊培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６：５９  （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：４２１６  （１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．，  ２３：２４３−２５１  （１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ３８３：４４−６８  （１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト細胞株ＣＡＰ及びＡＧＥ１．ＨＮ、ならびにＧｌｙｃｏｔｏｐｅのパネルが挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は非哺乳類細胞である。好適な非哺乳類細胞としては、原核生物、古細菌、酵母菌及び他の真核細胞が挙げられる。本発明に好適な非哺乳類宿主細胞の非限定例としては、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ、及びヤロウィア・リポリティカに由来する酵母菌細胞及び細胞株；ソドプテラ・フルギペルダ（Ｓｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、トリコプルシス・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉ）、ドロソフィラ・メラノガスター及びマンデュカ・セクスタに由来する昆虫細胞及び細胞株；ならびにエシェリキア・コリ、サルモネラ・ティフィムリウム、バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス、クロストリジア・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジア・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に由来する細胞及び細胞株；ならびにゼノパス・ラエビスに由来する両生類細胞及び細胞株が挙げられる。
【００９０】
ＧＮＰＴ  
本発明のいくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＮＰＴを共発現する。一般に、治療用糖タンパク質、例えばリソソーム酵素などが適切な機能を確保するためには、翻訳後修飾に大きく影響される。明細書全体を通して記載しているように、リソソームタンパク質は酸性加水分解酵素として知られる酵素の分類に属し、粗面小胞体で可溶性または膜挿入型糖タンパク質として合成される。可溶性リソソーム酵素のＮ結合型オリゴ糖は、ゴルジ複合体に至り、通過する過程で修飾され、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）認識マーカーを露出する。こうしたＭ６Ｐ認識マーカーは、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）でカチオンマンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−Ｍ６ＰＲ）によって認識され、その結果、集合してＡＰ１−クラスリン被覆小胞中に包み込まれる。エンドソームと融合した後、受容体はリガンドを放出して、新たに形成されたリソソームにリソソーム酵素を送達する。ホスホトランスフェラーゼが欠損しているＩ細胞病の場合のように、リソソームタンパク質がトランスゴルジネットワークでＭ６Ｐ受容体に結合しなくなった場合、タンパク質は細胞から分泌され、その結果、血漿、脳脊髄液、涙及び尿などの体液中のリソソーム酵素の量が過剰となる。カチオンマンノース−６−リン酸受容体は、リソソーム酵素の細胞表面への及び細胞表面からの再循環及び逆行性移動に重要なので、ＣＩ−Ｍ６ＰＲは、酵素補充療法における治療用糖タンパク質のリソソーム媒介細胞内輸送に対する重要な標的として機能することができる。
【００９１】
細胞におけるタンパク質標的化の重要性を考慮すると、リソソーム酵素の場合では、マンノース−６−リン酸認識タグを露出させるためのＮ結合型オリゴ糖の修飾が緻密に制御されている。Ｍ６Ｐ残基は２段階プロセスで生成される。まず、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸がマンノースのＣ６−ヒドロキシル基に結合し、その後、Ｎ−アセチルグルコサミンが除去される。最初の反応はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：リソソーム酵素Ｎ−アセチルグコサミン（ａｃｅｔｙｌｇｕｃｏｓａｍｉｎｅ）−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴ）によって触媒され、一方で２番目はα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって触媒される。ＧＮＰＴ酵素は３つの異なるサブユニット（α、β、γ）を含有する六量複合体である。リソソームタンパク質はこの分子の活性クレフトの内部に結合し、そこでこの酵素がタンパク質へのＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の付加を触媒するが、この際、ウリジン二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を分子基質として利用する。
【００９２】
治療用糖タンパク質（すなわちリソソーム酵素）が細胞内外を行き来する能力は、一般にＭ６Ｐリン酸化度と正の相関がある。例えば、１種以上の治療用糖タンパク質（すなわちリソソーム酵素）のグリコシル化度及び交通能力は、Ｍ６Ｐリン酸化度（モノまたはビスリン酸化）に基づいて変化し得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明に好適なＧＮＰＴ酵素はヒトＧＮＰＴタンパク質（配列番号１６及び／または１７）である。いくつかの実施形態において、好適なＧＮＰＴ酵素は、成熟ヒトＧＮＰＴタンパク質のホモログまたはオーソログであってもよい。例えば、成熟ヒトＧＮＰＴタンパク質のホモログまたはオーソログは、野生型または自然発生ＧＮＰＴタンパク質（例えば配列番号１６及び／または１７）に対して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を含有すると同時に、実質的なＧＮＰＴタンパク質活性を保持する修飾成熟ヒトＧＮＰＴタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に好適なＧＮＰＴ酵素はヒトＧＮＰＴタンパク質（配列番号１６及び／または１７）と実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＧＮＰＴ酵素は、配列番号１６及び／または１７と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＧＮＰＴ酵素は成熟ヒトＧＮＰＴタンパク質（配列番号１６及び／または１７）と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＧＮＰＴ酵素は、配列番号１６及び／または１７と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＧＮＰＴ酵素は成熟ヒトＧＮＰＴタンパク質の断片または一部を含有する。
【表６】
0006623213.tif 000008
【００９４】
宿主細胞及び組織培養におけるＧＮＰＴを含めた酵素の過剰発現は日常的に行われており、Ｓａｍｂｒｏｏｋらが詳細に記載している。
【００９５】
培養条件
本発明は、ＧＮＰＴ細胞培養系を用いた組換え標的治療用糖タンパク質の製造方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療用糖タンパク質のマイクロスケール製造にこの細胞培養系を用いる。いくつかの実施形態において、大規模製造にこの細胞培養系を用いる。いくつかの実施形態において、製造する治療用糖タンパク質は組換えリソソーム酵素である。目的の組換えポリペプチドを製造する典型的な大規模製法としては、回分培養及び流加培養が挙げられる。回分培養プロセスは伝統的に、特定の細胞密度の種培養を大規模製造培養に接種すること、細胞増殖、生存力、及び／または生産力を促す条件（例えば好適な培地、ｐＨ、及び温度）の下で細胞を増殖させること、細胞が特定の細胞密度に達したら培養物を採取すること、ならびに発現したポリペプチドを精製することを含む。流加培養製法は、細胞の増殖中に消費される栄養及び他の成分を回分培養に補充する追加の１つまたは複数のステップを含む。いくつかの実施形態において、本発明に従う大規模製造方法は流加培養系を用いる。
【００９６】
バイオリアクター  
本発明はまた、組換え治療用糖タンパク質の製造に有用なバイオリアクターも提供する。バイオリアクターは、例えば灌流式、回分式、流加式、反復回分式、または連続式（例えば連続撹拌槽リアクターモデル）であり得る。一般に、バイオリアクターは、培地（例えば化学的組成が明らかな栄養培地）を入れるように設計及び構成された少なくとも１つの槽を備える。槽はまた一般に、新しい栄養培地を槽内に流すように設計及び構成された少なくとも１つの流入口を備える。槽はまた一般に、廃培地を槽外に流すように設計及び構成された少なくとも１つの流出口を備える。いくつかの実施形態において、槽は、槽内の孤立した細胞が廃培地とともに少なくとも１つの流出口を通って出てしまう程度を最小限にするように設計及び構成された少なくとも１つのフィルターをさらに備え得る。バイオリアクターには、細胞増殖に適した条件を維持するように設計された１つ以上の他の構成要素が取り付けられていてもよい。例えば、バイオリアクターには、栄養培地を槽内で循環またはかき混ぜるように設計及び構成された１つ以上の循環またはミキシング装置が取り付けられていてもよい。一般に、組換え治療用糖タンパク質を発現するように改変された孤立細胞は、栄養培地中に懸濁されている。したがって、場合によっては、循環装置で孤立細胞が確実に栄養培地中に懸濁され続けるようにする。場合によっては、細胞は基質に付着している。場合によっては、細胞は、栄養培地中に浮遊した１つ以上の基質（例えばマイクロビーズ）に付着している。バイオリアクターは、槽から細胞浮遊液の試料を得るための１つ以上のポートを備え得る。バイオリアクターは、気体含有量（例えば空気、酸素、窒素、二酸化炭素）、流量、温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度、ならびに攪拌速度／循環速度などの条件を含めた、培養の条件を監視及び／または制御するための１つ以上の構成要素によっても構成され得る。
【００９７】
任意の適切なサイズの槽がバイオリアクターに用いられ得る。典型的には、槽のサイズは組換えＩ２Ｓの製造に対する生産要求量を満たすのに好適なものである。いくつかの実施形態において、槽は、最大１Ｌ、最大１０Ｌ、最大１００Ｌ、最大５００Ｌ、最大１０００Ｌ、最大１５００Ｌ、最大２０００Ｌ、またはそれ以上の栄養培地が入るように設計及び構成される。いくつかの実施形態において、産生バイオリアクターの容積は、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、少なくとも２５００Ｌ、少なくとも５０００Ｌ、少なくとも８０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、もしくは少なくとも１２，０００Ｌ、またはそれ以上またはこれらの間の任意の容積である。産生バイオリアクターは、細胞増殖及び生存力を促し、産生される治療用糖タンパク質の発現または安定性もしくは活性を妨げない任意の材料で構成され得る。例示的な材料としては、ガラス、プラスチック、または金属が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００９８】
いくつかの実施形態において、細胞は、バイオリアクターの槽内に入れられた化学的組成が明らかな培地で培養され得る。培養方法は多くの場合、少なくとも１つの流入口を通して新しい栄養培地を灌流させること、及び少なくとも１つの流出口を通して槽から廃栄養培地を排出することを含む。排出は、最大約０．１槽容積／日、約０．２槽容積／日、約０．３槽容積／日、約０．４槽容積／日、約０．５槽容積／日、約１槽容積／日、約１．５槽容積／日またはそれ以上の流量で行う。この方法はまた、組換え糖タンパク質を含む栄養培地を採取することも伴う。いくつかの実施形態において、治療用糖タンパク質はリソソーム酵素であり得る。いくつかの実施形態において、治療用糖タンパク質は融合タンパク質であり得る。採取は、最大約０．１槽容積／日、約０．２槽容積／日、約０．３槽容積／日、約０．４槽容積／日、約０．５槽容積／日、約１槽容積／日、約１．５槽容積／日またはそれ以上の流量で行われ得る。典型的に、排出流量及び採取流量の合計に等しい流量で灌流も行う。例えば、灌流流量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０槽容積／日超であり得る。いくつかの実施形態において、灌流流量は、約５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５槽容積／日未満である。
【００９９】
培養条件の監視  
本発明のある特定の実施形態において、実施者は、増殖細胞培養の特定の条件を定期的に監視することが有益または必要であると認める場合がある。細胞培養条件を監視することにより、実施者は、細胞培養で組換えポリペプチドまたはタンパク質が準最適レベルで産生されているかどうか、または培養が準最適産生段階に入ろうとしているかどうかを確認することができる。ある細胞培養条件を監視するためには、分析用に培養物の少量アリコートを取り出す必要がある。
【０１００】
非限定的な例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存率、積算生細胞密度、オスモル濃度、または発現した治療用グリコプロテインタンパク質の力価もしくは活性を監視することが有益または必要であり得る。当業者がこれらの条件を測定することのできる多数の技術が当該技術分野において公知である。例えば、細胞密度は血球計算盤、コールターカウンター、または細胞密度試験（ＣＥＤＥＸ）を用いて測定され得る。生細胞密度は、培養試料をトリパンブルーで染色することによって測定され得る。死細胞のみがトリパンブルーを取り込むので、細胞の総数を数え、色素を取り込んだ細胞の数を細胞の総数で割り、逆数をとることによって生細胞密度を求めることができる。あるいは、標準的な分子生物学的技術、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色、ウエスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、及びＵＶ吸光度などによって、発現した治療用糖タンパク質の濃度を測定することができる。
【０１０１】
本出願の図９〜１０に示すように、Ｍ６Ｐリン酸化度及び／またはグリコシル化プロファイルを生成するグリカンパターンを監視することも有益または必要であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、グリカンの重要品質特性、例えばアンテナ状のフコシル化、ガラクトシル化、シアリル化、高マンノース構造及びリン酸化構造などを監視する分析を行うことができる。いくつかの実施形態において、組換え製造した糖タンパク質を参照試料との関係で分析を行うことができる。いくつかの実施形態において、同一条件の下で製造した試料タンパク質の前回ロットまたはバッチとの関係で、組換え製造した糖タンパク質の分析を行うことができる。いくつかの実施形態において、異なる条件の下で製造した試料タンパク質の前回ロットまたはバッチとの関係で、組換え製造した糖タンパク質の分析を行うことができる。いくつかの実施形態において、異なる製造段階で製造した試料タンパク質の前回ロットまたはバッチとの関係で、組換え製造した糖タンパク質の分析を行うことができる。
【０１０２】
Ｍ６Ｐリン酸化度が増加した治療用糖タンパク質を組換え製造するために、ＧＮＰＴ細胞株を用いることができる。いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した組換え治療用糖タンパク質は、自然発生治療用糖タンパク質よりも高いＭ６Ｐレベルを有する。いくつかの実施形態において、組換え治療用糖タンパク質は、非ＧＮＰＴ過剰発現細胞株で組換え製造した同じ治療用糖タンパク質よりも高いＭ６Ｐリン酸化度を有する。いくつかの実施形態において、非ＧＮＰＴ過剰発現細胞株での製造と比較したＭ６Ｐリン酸化の増加は少なくとも１倍である。いくつかの実施形態において、Ｍ６Ｐリン酸化の増加は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０倍の増加である。いくつかの実施形態において、Ｍ６Ｐリン酸化の増加は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の増加である。いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した組換え治療用糖タンパク質は、野生型治療用糖タンパク質よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＭ６Ｐレベルを有する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した組換え治療用糖タンパク質は、少なくとも１つのＭ６Ｐ残基を含有し得る。いくつかの実施形態において、組換え治療用糖タンパク質は複数のＭ６Ｐ残基を含有し得る。いくつかの実施形態において、組換え治療用糖タンパク質は、２つのＭ６Ｐ残基を有するビスリン酸化糖タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した組換え治療用糖タンパク質は、野生型タンパク質と比較して少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＭ６Ｐ残基を含有し得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、組換え治療用糖タンパク質は、野生型タンパク質と比較して増加した数及び／またはレベルの高マンノース構造、例えばＭ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７またはＭ８構造などを含有し得る。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質と比較して、Ｍ３構造が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％増加している。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質と比較して、Ｍ４構造が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％増加している。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質と比較して、Ｍ５構造が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％増加している。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質と比較して、Ｍ６構造が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％増加している。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質と比較して、Ｍ７構造が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％増加している。いくつかの実施形態では、野生型タンパク質と比較して、Ｍ８構造が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４，１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％増加している。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、組換え治療用糖タンパク質は、リン酸化構造を含有し、その総数及び／またはレベルが野生型タンパク質と比較して増加している場合もある。いくつかの実施形態において、野生型タンパク質と比較した全リン酸化構造の増加は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した組換え治療用糖タンパク質は、野生型タンパク質と比較してより高いレベルのアンテナ構造を含有し得る。特に、ＧＮＰＴ細胞株で製造した治療用糖タンパク質はより高いレベルのＡ０アンテナ性を有する場合があり、これはＭ６Ｐリン酸化されていることを示している。いくつかの実施形態において、野生型タンパク質と比較したＡ０レベルの増加は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０％である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本発明に好適な治療用タンパク質は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対してより高い結合親和性を有するビスリン酸化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態において、好適な酵素は、１酵素当たり最大でおよそ平均して少なくとも約２０％のビスリン酸化オリゴ糖を含有する。他の実施形態において、好適な酵素は、１酵素当たり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビスリン酸化オリゴ糖を含有し得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した結果としての、治療用糖タンパク質の増加したＭ６Ｐリン酸化度は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合のレベルを評価するための様々な公知の結合アッセイのいずれかを用いて試験され得る。いくつかの実施形態において、ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した治療用糖タンパク質は、天然タンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、または９０倍に増加したＣＩ−Ｍ６ＰＲを有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、Ｍ６Ｐリン酸化度は、様々な公知のインビトロ結合アッセイ、例えば限定はしないが放射標識ランオンアッセイ、放射標識結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴及び等温滴定熱量測定などのいずれかを用いて、ＣＩ−Ｍ６ＰＲへの治療用糖タンパク質の結合を観察することにより調べられ得る。いくつかの実施形態において、Ｍ６Ｐリン酸化度は、限定はしないが免疫組織化学染色、蛍光免疫組織化学染色及び共焦点顕微鏡検査などの方法を用いて細胞内取込を評価することにより、ＣＩ−Ｍ６ＰＲへの治療用糖タンパク質の結合を観察することによって調べられ得る。いくつかの実施形態において、Ｍ６Ｐリン酸化度は、限定はしないがグリコシダーゼ処理、質量分析及びＨＰＬＣなどの分析技術を用いてアッセイされ得る。
【０１１０】
治療用糖タンパク質の精製  
本明細書に記載の様々な方法に従って製造した治療用糖タンパク質を精製または単離するために、様々な方法が用いられ得る。いくつかの実施形態において、発現した治療用糖グリコプロテインタンパク質（例えばリソソーム酵素）は培地中に分泌され得、そのため、精製プロセスの第１ステップとして例えば遠心分離または濾過によるように、細胞及び他の固形分が除去され得る。代替的にまたは追加的に、発現した治療用糖タンパク質は宿主細胞の表面に結合し得る。この実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質を発現した宿主細胞（例えば酵母菌）を精製のために溶解させる。宿主細胞（例えば酵母菌）の溶解は、ガラスビーズによる物理的破砕及び高ｐＨ条件への曝露を含めた、当業者にとって公知の任意の数の手段により行うことができる。
【０１１１】
治療用糖タンパク質は、限定はしないが、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、サイズ排除、及びヒドロキシアパタイト）、ゲル濾過、遠心分離、もしくは溶解度差、エタノール沈殿を含めた標準的な方法、またはタンパク質の精製に利用可能な任意の他の技術によって単離及び生成され得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．  （ｅｄｓ．），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９；及びＤｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｎ．  （ｅｄｓ．），  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌ  １８２），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７を参照。すべて参照により本明細書に援用する）。特にイムノアフィニティークロマトグラフィーに関して、タンパク質は、そのタンパク質に対して生成し固定相支持体に固定化した抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより単離され得る。あるいは、アフィニティータグ、例えばインフルエンザ被覆配列、ポリヒスチジン、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどを標準的な組換え技術によってタンパク質に結合させることで、適切なアフィニティーカラムを通すことによる精製を容易にすることができる。精製プロセス中のポリペプチドまたはタンパク質の分解を低減または皆無にするために、プロテアーゼ阻害剤、例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ロイペプチン、ペプスタチンまたはアプロチニンを任意のまたはすべての段階で添加してもよい。プロテアーゼ阻害剤は特に、発現したポリペプチドまたはタンパク質を単離及び精製するために細胞溶解させなければならない場合に必要とされる。例示的な精製方法を下記の実施例の節に記載する。
【０１１２】
医薬組成物及び投与  
本発明は、本発明に従う標的治療薬を含有する医薬組成物をさらに提供する。典型的に、好適な医薬組成物は、少なくとも１種の医薬品として許容可能な添加物を含有し、ヒトへの投与に向けて配合される。
【０１１３】
例えば、本明細書に提供される医薬組成物は、無菌の注入可能形態（例えば皮下、静脈内、または髄腔内注入に適した形態）で供給され得る。例えば、いくつかの実施形態では、注入に適した液体剤形で医薬組成物を供給する。いくつかの実施形態において、任意で真空下で、医薬組成物を粉末（例えば凍結乾燥及び／または滅菌したもの）として供給し、注入前に水性希釈剤（例えば水、緩衝液、食塩水など）で再構成する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝生理食塩水などで希釈及び／または再構成する。いくつかの実施形態において、粉末は水性希釈剤で穏やかに混合するべきである（例えば、振り混ぜない）。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、提供される医薬組成物は、医薬品として許容可能な１種以上の賦形剤（例えば、保存剤、不活性希釈剤、分散剤、界面活性剤及び／または乳化剤、緩衝剤など）を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は１種以上の保存剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は保存剤を含まない。
【０１１５】
本明細書に記載の医薬組成物である組成物は、薬理学の分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、そのような調製方法は、有効成分を１種以上の賦形剤及び／または１種以上の他の副成分と一緒にするステップ、ならびにその後、必要であり、かつ／または望ましければ、製品を所望の単回または複数回用量単位に成形及び／または包装するステップを含む。
【０１１６】
本発明に従う医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、調製、包装、及び／または販売され得る。本明細書で用いる場合、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個々の量である。有効成分の量は概して、対象に投与されるであろう用量、及び／またはそのような用量の都合の良い小部分、例えばそのような量の半分もしくは３分の１などと等しい。
【０１１７】
本発明に従う医薬組成物中の有効成分、医薬品として許容可能な賦形剤、及び／または任意の追加成分の相対量は、治療される対象が何であるか、そのサイズ、及び／もしくは状態に応じて、ならびに／または組成物を投与する経路に応じて変化し得る。例として、組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、所望の特定の剤形に適した医薬品として許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよく、賦形剤は本明細書で用いる場合、溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体賦形剤、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などであり得るか、またはこれらを含み得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ，  ２００６）が、医薬組成物の製剤化に用いられる様々な賦形剤及びそれらを調製するための公知技術について開示している。任意の従来の賦形剤媒体は、医薬組成物の任意の他の成分に何らかの望ましくない生物学的影響をもたらすか、またはそれとは別に有害な形で相互作用するなどにより、ある物質またはその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用が本発明の範囲内であることを企図する。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本発明に従う医薬組成物は、限定はしないが、脳実質内、大脳内、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（例えばＩＴ腰部、ＩＴ大槽）投与ならびにＣＮＳ及び／またはＣＳＦに直接または間接的に注入する任意の他の技術及び経路を含めた様々な技術及び経路によるＣＮＳ送達に用いることができる。
【０１２０】
髄腔内送達
いくつかの実施形態において、本発明に従う医薬組成物を髄腔内投与に用いることができる。本明細書で用いる場合、髄腔内投与（髄腔内注入または髄腔内送達とも呼ぶ）は、脊柱管（脊髄を取り囲むくも膜下腔）への注入のことをいう。髄腔内投与のための様々な製剤がＷＯ／２０１１／１６３６５２に記載されており、その内容を参照により本明細書に援用する。
【０１２１】
本発明に従えば、標的治療薬を含有する医薬組成物は脊柱管周りの任意の領域に注入され得る。いくつかの実施形態において、標的治療薬を含有する医薬組成物を、腰部もしくは大槽に注入するか、または脳室腔に脳室内注入する。本明細書で用いる場合、「腰領域」または「腰部」という用語は、第３及び第４腰椎間の部分のことをいい、より包括的には脊椎のＬ２−Ｓ１領域のことをいう。一般に、腰領域または腰部を介した髄腔内注入は、「腰部ＩＴ送達」または「腰部ＩＴ投与」とも呼ばれる。
【０１２２】
様々な器具が本発明に従う髄腔内送達に用いられ得る。いくつかの実施形態において、髄腔内投与用の器具は、流体アクセスポート（例えば注入ポート）；流体アクセスポートと流体連通した第１流れ口及び脊髄に挿入するように構成された第２流れ口を有する中空体（例えばカテーテル）；ならびに中空体の脊髄への挿入を固定する固定機構を備える。非限定的な例として、好適な固定機構は、中空体（例えばカテ−テル）が脊髄から抜けるのを防止するために、中空体の表面に取り付けられた１つ以上のノブ及び１つ以上のノブ上で調節可能な縫合リングを備える。様々な実施形態において、流体アクセスポートはリザーバーを備える。いくつかの実施形態において、流体アクセスポートは機械式ポンプ（例えば注入ポンプ）を備える。いくつかの実施形態において、埋め込み型カテーテルをリザーバー（例えばボーラス送達用）、または注入ポンプのいずれかに接続する。流体アクセスポートは埋め込まれていてもよく、外部にあってもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、髄腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち低速ボーラス）またはポート−カテーテル送達システム（すなわち注入もしくはボーラス）のいずれかによって行われ得る。いくつかの実施形態において、腰椎の椎弓板間にカテーテルを挿入し、所望の高さ（一般にＬ３〜Ｌ４）まで先端を髄腔に通す。
【０１２４】
注入のために、本発明の製剤は溶液に製剤化することができる。さらに、酵素は固体形態に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥形態も同様に含まれる。注入は、例えば酵素のボーラス注入または連続注入（例えば注入ポンプを用いた）の形とすることができる。
【０１２５】
Ｓａｎ  Ｂ及び他のリソソーム蓄積症の治療
本発明を用いてサンフィリッポ症候群Ｂ型及び他のリソソーム蓄積症を効果的に治療することができる。サンフィリッポ症候群Ｂ型、またはムコ多糖症ＩＩＩＢ（ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｂ）は酵素Ｎａｇｌｕの欠損に起因する遺伝性代謝障害である。Ｎａｇｌｕはリソソームに局在化され、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の異化において重要な役割を果たす。酵素が欠如すると、これらの基質は細胞内に蓄積し、最終的に鬱血を引き起こし、続いて細胞死及び組織破壊が生じる。酵素は広範囲に及んで発現しているため、ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｂ患者では複数の細胞型及び器官系が侵される。
【０１２６】
この疾患を決定づける臨床的特徴は、中枢神経系（ＣＮＳ）の変性であり、これは認知障害（例えばＩＱの低下）につながる。さらに、罹患者のＭＲＩスキャンにより、白質病変；脳実質、神経節、脳梁、及び脳幹における拡大血管周囲腔；萎縮；ならびに脳室拡大が明らかにされている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ２００９）。この疾患は一般に、臓器巨大症及び骨格異常を伴い生後数年で発症する。罹患者の中には認知機能の喪失が進行するものもおり、ほとんどの罹患者は疾患に関連した合併症で１０歳または２０歳までに死亡する。
【０１２７】
本発明の組成物及び方法を用いて、サンフィリッポ症候群Ｂ型を患っているか患う可能性のある個体を治療することができる。「治療する」または「治療」という用語は、本明細書で用いる場合、疾患に関連する１つ以上の症状の寛解、疾患の１つ以上の症状の発症の予防もしくは遅延、及び／または疾患の１つ以上の症状の重症度もしくは頻度の軽減のことをいう。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、治療は、サンフィリッポ症候群Ｂ型患者における部分的または完全な緩和、寛解、軽減、抑制、発症の遅延、重症度の減少及び／または神経機能障害の発生率の減少のことをいう。本明細書で用いる場合、「神経機能障害」という用語は、中枢神経系（例えば脳及び脊髄）の機能障害に関連する様々な症状を含む。神経機能障害の症状としては、中でも例えば認知障害；白質病変；脳実質、神経節、脳梁、及び／もしくは脳幹における拡大血管周囲腔；萎縮；ならびに／または脳室拡大などが挙げられ得る。
【０１２９】
「改善する」、「増加する」または「減少する」という用語は、本明細書で用いる場合、対照に対する相対値を示す。いくつかの実施形態において、好適な対照は、基準測定値、例えば、本明細書に記載の治療を開始する前の同一個体における測定値、または本明細書に記載の治療を施していない対照個体（もしくは複数の対照個体）における測定値などである。「対照個体」は、リソソーム蓄積症（例えばサンフィリッポ症候群Ｂ型）にかかっている個体であり、同じリソソーム蓄積症を患っている治療されている個体とおよそ同じ年齢及び／または性別である（治療される固体及び対照固体における疾患の病気を確実に同等とするため）。
【０１３０】
治療されている個体（「患者」または「対象」とも呼ぶ）は、リソソーム蓄積症にかかっているかリソソーム蓄積症を発症する可能性のある個体（胎児、乳児、小児、青年、または成人）である。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症はサンフィリッポ症候群である。いくつかの特定の実施形態において、リソソーム蓄積症はサンフィリッポ症候群Ｂ型である。個体には、内在性Ｎａｇｌｕ発現及び／または活性が残っている場合もあり、測定可能な活性が全くない場合もある。例えば、サンフィリッポ症候群Ｂ型にかかっている個体は、通常のＮａｇｌｕ発現レベルの約３０〜５０％未満、約２５〜３０％未満、約２０〜２５％未満、約１５〜２０％未満、約１０〜１５％未満、約５〜１０％未満、約０．１〜５％未満のＮａｇｌｕ発現レベルを有し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、個体は、直近に疾患があると診断された固体である。典型的には、早期治療（診断後可能な限り早く開始する治療）が、疾患の影響を最小限にし、治療の恩恵を最大限にするのに重要である。
【０１３２】
以下の実施例を参照することによって、本発明がより深く理解されよう。しかし、実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書で引用するすべての参照文献は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【実施例】
【０１３３】
実施例１：Ｎａｇｌｕ融合タンパク質の生成
複数のタンパク質がＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体中の異なる細胞外領域／ドメインへの結合に関係があるとされており、例えば白血病抑制因子、Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサー及びサポシンなどはＭ６Ｐに依存する形で、また例えばインスリン様成長因子ＩＩなどはＭ６Ｐに依存しない形で結合する。したがって、以下に記載するように、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに結合し、したがってリソソームへのｒｈＮａｇｌｕのＣＩ−Ｍ６ＰＲ媒介送達を促進し得る一連のＮａｇｌｕ融合タンパク質を設計した。
【０１３４】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣタンパク質は、以下に記載するようにＮａｇｌｕ及びサポシンタンパク質の一部の融合体である。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質を生成するために、サポシンの保存Ｃ末端領域及びＤ機能ドメイン（ＳａｐＤＣ）をコードする配列にヒトＮａｇｌｕ遺伝子を結合させることによって、核酸構築物を生成した。ＧＡＧ３リンカーを２つの配列間に挿入して翻訳後の２つのペプチド間の回転を可能とした。得られた全長Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質（配列番号１８）において、全長ＮａｇｌｕはＮ末端を構成し、ＳａｐＤＣペプチドはＣ末端の配列を決定する。
【化１】
0006623213.tif 000009
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＳａｐＤＣ−下線
ＳａｐＤＣ配列中の部位
（Ｎ）−グリコシル化部位を表す
【０１３５】
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦタンパク質は、以下に記載するようにＮａｇｌｕ及び白血病抑制因子タンパク質の一部の融合体である。Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質を生成するために、白血病抑制因子（ＬＩＦ）のグリコシル化部位、ならびに４ヘリックスバンドルのヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む１０２アミノ酸配列をコードする配列にヒトＮａｇｌｕ遺伝子を結合することによって、核酸構築物を生成した。ＧＡＧ３リンカーを２つの配列間に挿入して翻訳後の２つのペプチド間の回転を可能とした。得られた全長Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質（配列番号１９）において、全長ＮａｇｌｕはＮ末端を構成し、ＬＩＦペプチドはＣ末端の配列を決定する。
【化２】
0006623213.tif 000010
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＬＩＦ−下線
ＬＩＦ配列中の部位
（Ｎ）−グリコシル化部位を表す
｛｝−受容体ｇｐ１３０の認識を変化させるために行った変異を表す；［［］］−ＬＩＦ受容体の認識を変化させるために行った変異を表す    
【０１３６】
Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ
Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧタンパク質は、以下に記載するように、Ｎａｇｌｕ及びＥ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサータンパク質の一部の融合体である。Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ融合タンパク質を生成するために、ＣＲＥＧアミノ酸配列をコードする配列にヒトＮａｇｌｕ遺伝子を結合することによって核酸構築物を生成した。ＧＡＧ３リンカーを２つの配列間に挿入して翻訳後の２つのペプチド間の回転を可能とした。得られた全長Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ融合タンパク質（配列番号２０）において、全長ＮａｇｌｕはＮ末端を構成し、ＣＲＥＧペプチドはＣ末端の配列を決定する。
【化３】
0006623213.tif 000011
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＣＲＥＧ−下線
ＣＲＥＧ配列中の部位
（Ｎ）−グリコシル化部位を表す
【０１３７】
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩタンパク質は、以下に記載するように、Ｎａｇｌｕ及びインスリン様成長因子ＩＩペプチドの一部の融合体である。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質を生成するために、インスリン様成長因子ＩＩペプチド（ＩＧＦＩＩ）のアミノ酸残基８〜６７（配列番号２２）をコードする配列にヒトＮａｇｌｕ遺伝子を結合することによって、核酸構築物を生成した。ＧＡＧ３リンカーを２つの配列間に挿入して翻訳後の２つのペプチド間の回転を可能とした。得られた全長Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ融合タンパク質（配列番号２１）において、全長ＮａｇｌｕはＮ末端を構成し、ＩＧＦＩＩペプチドはＣ末端の配列を決定する。全長ＩＧＦＩＩ分子と比較して、８〜６７ＩＧＦＩＩは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ  ＩＩ受容体に２〜１０倍高い親和力で結合し、一方でＩＧＦ  Ｉ受容体に結合する能力は３０倍減少することが報告されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｒ，  ＪＢＣ  １９９５  ２７０（３０）：１８０１３−１８０１８）。
【化４】
0006623213.tif 000012
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＩＧＦＩＩ−下線
ＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号２２）
【０１３８】
配列番号１８〜２１は、全長Ｎａｇｌｕ融合タンパク質のアミノ酸配列であり、細胞内プロセシング中に除去される全長Ｎａｇｌｕタンパク質の２３Ｎ末端アミノ酸をまだ含有している。以下に記載するアミノ酸配列（配列番号２３〜２６）は、これらの２３Ｎ末端アミノ酸を含まない対応する配列である。
【０１３９】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ：
【化５】
0006623213.tif 000013
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＳａｐＤＣ−下線
ＳａｐＤＣ配列中の部位
（Ｎ）−グリコシル化部位を表す
【０１４０】
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ：
【化６】
0006623213.tif 000014
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＬＩＦ−下線
ＬＩＦ配列中の部位
（Ｎ）−グリコシル化部位を表す
｛｝−受容体ｇｐ１３０の認識を変化させるために行った変異を表す；［［］］−ＬＩＦ受容体の認識を変化させるために行った変異を表す    
【０１４１】
Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ：
【化７】
0006623213.tif 000015
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＣＲＥＧ−下線
ＣＲＥＧ配列中の部位
（Ｎ）−グリコシル化部位を表す
【０１４２】
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ：
【化８】
0006623213.tif 000016
ヒト全長Ｎａｇｌｕ−イタリック体
ＧＡＧ３リンカー−太字
ＩＧＦＩＩ−下線
【０１４３】
実施例２：Ｎａｇｌｕ融合タンパク質のインビトロＭ６Ｐ受容体結合及び細胞内取込
標準的な技術を用いて、異なるＮａｇｌｕ融合タンパク質のそれぞれをコードする核酸を哺乳類発現ベクターにサブクローニングし、ＨＴ−１０８０細胞に形質移入した。その後、当該技術分野において一般に公知の技術を用いて、トランスフェクタントをスクリーニングしてＨＴ−１０８０過剰発現細胞株を生成した。インビトロタンパク質をベースとしたすべてのアッセイ及び受容体結合実験用には、哺乳類細胞培養発現系を用いて、ウェーブバイオリアクター内で組換えタンパク質を製造した。発現後、各融合タンパク質に対して３段階精製プロセスを施した。まず、限外濾過（ＵＦ）装置（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＮＹ  １１０５０）を用いて馴化培地を濃縮した。次に、濃縮した培地をブチルセファロースクロマトグラフィーカラム（ブチル）にかけ、その後、Ｑセファロースクロマトグラフィーカラム（Ｑ）を用いて、この精製段階の溶出液をさらに精製した。保存のために、精製したタンパク質をＰＢＳ（１１．９ｍＭのリン酸ナトリウム、２．７ｍＭのリン酸カリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウムでｐＨ７．４）中にバッファー交換した。得られた融合タンパク質は９０％を超える純度に精製された。
【０１４４】
精製後、様々な濃度の融合タンパク質でヒトＮａｇｌｕを対象とする抗体を用いてＥＬＩＳＡを行い、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質のＣＩ−Ｍ６ＰＲへの結合を評価した。このデータは、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質がＣＩ−Ｍ６ＰＲに結合できたことを示す（図１及び２）。４種の融合タンパク質のうち、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩが約０．２１ｎＭのＫＤで最も強い結合を示した。Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦもＣＩ−Ｍ６ＰＲへの強い結合（それぞれ１．２５、５．５及び３２．４ｎＭのＫＤ）を示したが、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩによる結合ほど強くはなかった（図１及び２）。
【０１４５】
各Ｎａｇｌｕ融合タンパク質のインビトロＣＩ−Ｍ６ＰＲ媒介標的化及び細胞内取込も評価した。簡潔に言うと、ＣＩ−Ｍ６ＰＲを過剰発現する細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、様々な濃度の組換えＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣまたはＮａｇｌｕ−ＬＩＦの溶液で処理した（図３）。ここで溶液には追加のマンノース−６−リン酸を入れたものと入れなかったものがある。所定時間後、上清を除去して細胞を繰り返し洗浄した。細胞を溶解させた後、細胞内Ｎａｇｌｕ酵素活性について各試料をアッセイした。このデータは、各融合タンパク質で処理した後、細胞内Ｎａｇｌｕ活性のレベルが上昇したことを示しており、４種の融合タンパク質がすべて細胞に内在化されたことを示唆している（図３）。このことはマンノース−６−リン酸の存在下でのＮａｇｌｕ融合タンパク質のインキュベーションとは全く対照的であり、マンノース−６−リン酸は細胞内在化を完全に阻害した（図３）。各Ｎａｇｌｕ融合タンパク質（Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ）のＣＩ−Ｍ６ＰＲ標的化及びリソソーム進入を阻止するマンノース−６−リン酸の能力は、マンノース−６−リン酸がＣＩ−Ｍ６ＰＲへのＮａｇｌｕ融合タンパク質結合に効果的に打ち勝つことが可能であると示している。これは、観察された各Ｎａｇｌｕ融合タンパク質の細胞内在化及びリソソーム進入がＣＩ−Ｍ６ＰＲの結果であったことを示す。アッセイに添加したＮａｇｌｕ融合タンパク質の濃度が増加するにつれて細胞内Ｎａｇｌｕ活性が増加したので、このデータは、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質の細胞内取込が用量に依存する形で生じることも示す（図３）。ＣＩ−Ｍ６ＰＲへのＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの結合は、ＩＧＦ−ＩＩドメインとＣＩ−Ｍ６ＰＲとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を介して媒介される。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞内取込はそれゆえに、マンノース−６−リン酸に依存せず、これに打ち負けない。
【０１４６】
実施例３：ＧＮＰＴ細胞株の生成
Ｎ結合型グリカンの翻訳後修飾においてＧＮＰＴが果たす重要な役割、具体的には、可溶性リソソーム酵素のＭ６Ｐリン酸化を考慮して、ＧＮＰＴ酵素の過剰発現がリソソーム酵素上のＭ６Ｐリン酸化度を増加させ得るかどうかを評価するために実験を行った。
【０１４７】
Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＴＰ）タンパク質は、３つの異なるサブユニット（α、β、γ）それぞれのコピーを２つずつ含有する六量複合体である。アルファ／ベータサブユニットの発現カセット及びガンマサブユニットの１つの発現カセットを含有した哺乳類発現ベクターに、ＧＮＴＰプロテインのアルファ／ベータサブユニット及びガンマサブユニットをコードする核酸をクローニングした。このベクターをヒトＨＴ−１０８０細胞に形質移入し、その後、組換えＧＮＴＰを過剰発現する細胞株を樹立させる選択圧の下で増殖させた。ＧＮＰＴを過剰発現する細胞株を選択して、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ、Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣまたはＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、または様々なリソソーム蓄積症酵素（ＡＲＳＡ、Ｉ２Ｓ、ＨＮＳ、ＧＡＡ、ＧＣＢ）のうちの１つの天然形態を発現する哺乳類発現ベクターでの二次形質移入に用いた。ＧＮＴＰの過剰発現及びそれぞれの共発現産生物は、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、リソソーム酵素活性アッセイ及び／またはウェスタンブロット解析によって確認した。
【０１４８】
ＧＮＰＴ酵素は、３つの異なるサブユニット（α、β、γ）それぞれのコピーを２つずつ含有する六量体タンパク質複合物として存在する。１つはアルファ／ベータサブユニットをコードし、もう１つはガンマサブユニットをコードする２つの発現カセットを含有する１種の構築体を生成した。
【０１４９】
ＧＮＴＰα／β
ＧＮＰＴのアルファ及びベータサブユニットの発現を促進させるために、配列番号２７の核酸配列を用いて核酸構築物を生成した。
atgctgttcaagctcctgcagagacagacctatacctgcctgtcccacaggtatgggctctacgtgtgcttcttgggcgtcgttgtcaccatcgtctccgccttccagttcggagaggtggttctggaatggagccgagatcaataccatgttttgtttgattcctatagagacaatattgctggaaagtcctttcagaatcggctttgtctgcccatgccgattgacgttgtttacacctgggtgaatggcacagatcttgaactactgaaggaactacagcaggtcagagaacagatggaggaggagcagaaagcaatgagagaaatccttgggaaaaacacaacggaacctactaagaagagtgagaagcagttagagtgtttgctaacacactgcattaaggtgccaatgcttgtcctggacccagccctgccagccaacatcaccctgaaggacctgccatctctttatccttcttttcattctgccagtgacattttcaatgttgcaaaaccaaaaaacccttctaccaatgtctcagttgttgtttttgacagtactaaggatgttgaagatgcccactctggactgcttaaaggaaatagcagacagacagtatggaggggctacttgacaacagataaagaagtccctggattagtgctaatgcaagatttggctttcctgagtggatttccaccaacattcaaggaaacaaatcaactaaaaacaaaattgccagaaaatctttcctctaaagtcaaactgttgcagttgtattcagaggccagtgtagcgcttctaaaactgaataaccccaaggattttcaagaattgaataagcaaactaagaagaacatgaccattgatggaaaagaactgaccataagtcctgcatatttattatgggatctgagcgccatcagccagtctaagcaggatgaagacatctctgccagtcgttttgaagataacgaagaactgaggtactcattgcgatctatcgagaggcatgcaccatgggttcggaatattttcattgtcaccaacgggcagattccatcctggctgaaccttgacaatcctcgagtgacaatagtaacacaccaggatgtttttcgaaatttgagccacttgcctacctttagttcacctgctattgaaagtcacattcatcgcatcgaagggctgtcccagaagtttatttacctaaatgatgatgtcatgtttgggaaggatgtctggccagatgatttttacagtcactccaaaggccagaaggtttatttgacatggcctgtgccaaactgtgccgagggctgcccaggttcctggattaaggatggctattgtgacaaggcttgtaataattcagcctgcgattgggatggtggggattgctctggaaacagtggagggagtcgctatattgcaggaggtggaggtactgggagtattggagttggacagccctggcagtttggtggaggaataaacagtgtctcttactgtaatcagggatgtgcgaattcctggctcgctgataagttctgtgaccaagcatgcaatgtcttgtcctgtgggtttgatgctggcgactgtgggcaagatcattttcatgaattgtataaagtgatccttctcccaaaccagactcactatattattccaaaaggtgaatgcctgccttatttcagctttgcagaagtagccaaaagaggagttgaaggtgcctatagtgacaatccaataattcgacatgcttctattgccaacaagtggaaaaccatccacctcataatgcacagtggaatgaatgccaccacaatacattttaatctcacgtttcaaaatacaaacgatgaagagttcaaaatgcagataacagtggaggtggacacaagggagggaccaaaactgaattctacagcccagaagggttacgaaaatttagttagtcccataacacttcttccagaggcggaaatcctttttgaggatattcccaaagaaaaacgcttcccgaagtttaagagacatgatgttaactcaacaaggagagcccaggaagaggtgaaaattcccctggtaaatatttcactccttccaaaagacgcccagttgagtctcaataccttggatttgcaactggaacatggagacatcactttgaaaggatacaatttgtccaagtcagccttgctgagatcatttctgatgaactcacagcatgctaaaataaaaaatcaagctataataacagatgaaacaaatgacagtttggtggctccacaggaaaaacaggttcataaaagcatcttgccaaacagcttaggagtgtctgaaagattgcagaggttgacttttcctgcagtgagtgtaaaagtgaatggtcatgaccagggtcagaatccacccctggacttggagaccacagcaagatttagagtggaaactcacacccaaaaaaccataggcggaaatgtgacaaaagaaaagcccccatctctgattgttccactggaaagccagatgacaaaagaaaagaaaatcacagggaaagaaaaagagaacagtagaatggaggaaaatgctgaaaatcacataggcgttactgaagtgttacttggaagaaagctgcagcattacacagatagttacttgggctttttgccatgggagaaaaaaaagtatttccaagatcttctcgacgaagaagagtcattgaagacacaattggcatacttcactgatagcaaaaatactgggaggcaactaaaagatacatttgcagattccctcagatatgtaaataaaattctaaatagcaagtttggattcacatcgcggaaagtccctgctcacatgcctcacatgattgaccggattgttatgcaagaactgcaagatatgttccctgaagaatttgacaagacgtcatttcacaaagtgcgccattctgaggatatgcagtttgccttctcttatttttattatctcatgagtgcagtgcagccactgaatatatctcaagtctttgatgaagttgatacagatcaatctggtgtcttgtctgacagagaaatccgaacactggctaccagaattcacgaactgccgttaagtttgcaggatttgacaggtctggaacacatgctaataaattgctcaaaaatgcttcctgctgatatcacgcagctaaataatattccaccaactcaggaatcctactatgatcccaacctgccaccggtcactaaaagtctagtaacaaactgtaaaccagtaactgacaaaatccacaaagcatataaggacaaaaacaaatataggtttgaaatcatgggagaagaagaaatcgcttttaaaatgattcgtaccaacgtttctcatgtggttggccagttggatgacataagaaaaaaccctaggaagtttgtttgcctgaatgacaacattgaccacaatcataaagatgctcagacagtgaaggctgttctcagggacttctatgaatccatgttccccataccttcccaatttgaactgccaagagagtatcgaaaccgtttccttcatatgcatgagctgcaggaatggagggcttatcgagacaaattgaagttttggacccattgtgtactagcaacattgattatgtttactatattctcattttttgctgagcagttaattgcacttaagcggaagatatttcccagaaggaggatacacaaagaagctagtcccaatcgaatcagagtatag（配列番号２７）
【０１５０】
得られたアミノ酸配列（配列番号２８）は、必須の切断認識部位とともにＧＮＰＴのアルファ及びベータサブユニットを含んでいた。
【化９】
0006623213.tif 000017
＊アルファ／ベータ切断認識部位−太字及び下線
【０１５１】
ＧＮＰＴγ
ＧＮＰＴのガンマサブユニットの発現を促進させるために、配列番号２９の核酸配列を用いて核酸構築物を生成した。
【化１０】
0006623213.tif 000018
【０１５２】
得られたアミノ酸配列（配列番号３０）はＧＮＰＴのガンマサブユニットを含んでいた。
【化１１】
0006623213.tif 000019
【０１５３】
実施例４：ＧＮＰＴ細胞株で産生したリソソーム酵素の評価
Ｎ結合型グリカンの翻訳後修飾においてＧＮＰＴが果たす重要な役割、具体的には、可溶性リソソーム酵素のＭ６Ｐリン酸化を考慮して、ＧＮＰＴ酵素の過剰発現がリソソーム酵素上のＭ６Ｐリン酸化度を増加させ得るかどうかを評価するために実験を行った。簡潔に言うと、標準的な方法を用いて、１種のみのリソソーム酵素（ＧＡＡ、ＬＡＬ、ＡＲＳＡ、Ｉ２Ｓ、ＨＮＳもしくはＧＣＢ）を過剰発現するか、またはリソソーム酵素及びＧＮＰＴ（ＧＡＡ−ＧＮＰＴ、ＡＲＳＡ−ＧＮＰＴ、Ｉ２Ｓ−ＧＮＰＴ、ＨＮＳ−ＧＮＰＴもしくはＧＣＢ−ＧＮＰＴ）を共過剰発現する組換えＨＴ−１０８０細胞株を生成した。Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦのみ（Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ）またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦ及びＧＮＰＴ（Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ−ＧＮＰＴ）を過剰発現する類似の細胞株を生成した。細胞株のそれぞれをコンフルエントになるまで増殖させ、馴化細胞培地を収集して記載したように濃縮した。その後、対照の目的で、濃縮した試料の小部分をエンドグリコシダーゼＨで処理し、処理した試料及び未処理の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して（タンパク質はＥＬＩＳＡまたは酵素活性アッセイにより定量し、各リソソーム酵素２５０ｎｇを添加した）、抗Ｍ６Ｐ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。図４に示すように、各リソソーム酵素とＧＮＰＴとの共発現の結果、リソソーム酵素単独での発現と比較してＭ６Ｐリン酸化シグナルが劇的に増加した。驚いたことに、単独で過剰発現したＮａｇｌｕ−ＬＩＦタンパク質ではいかなる形でもＭ６Ｐリン酸化が検出されないが、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦをＧＮＰＴと共発現させた結果、Ｍ６Ｐリン酸化が増加した（図４）。
【０１５４】
これらのデータは、融合タンパク質及び／またはＧＮＰＴの共発現を用いてリソソーム酵素（例えばＮａｇｌｕ）のＭ６Ｐリン酸化を増加させることが可能であると示している。
【０１５５】
実施例５：ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した組換えＩ２ＳのＭ６Ｐ受容体結合及び細胞内取込の増加
ＧＮＰＴ過剰発現細胞株での組換えリソソームタンパク質の発現の結果、Ｍ６Ｐリン酸化が増加するかどうかをさらに評価するために、リソソーム酵素Ｉ２Ｓに関してさらなる試験を行った。標準的な方法を用いて、Ｉ２Ｓのみを過剰発現するか、またはＩ２Ｓ及びＧＮＰＴを共過剰発現する組換えＨＴ−１０８０細胞株を生成した。細胞株のそれぞれをコンフルエントになるまで増殖させ、馴化細胞培地を収集して記載したように濃縮した。実施例４に記載のＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合アッセイを用いて、受容体親和性の何らかの変化について各タンパク質を試験した。この分析により、Ｉ２Ｓは、このたんぱく質のみを過剰発現した細胞から得られたものの方が、ＧＮＰＴも過剰発現した細胞から得られたＩ２Ｓよりも弱くＣＩ−Ｍ６ＰＲに結合することが明らかとなった。（図５）。
【０１５６】
組換え製造したＩ２Ｓタンパク質のインビトロＭ６Ｐ受容体媒介標的化及び細胞内取込も評価した。簡潔に言うと、ＣＩ−Ｍ６ＰＲを過剰発現する細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、組換えＩ２Ｓタンパク質のみを過剰発現するＨＴ−１０８０細胞で産生した組換えＩ２Ｓ、またはＧＮＰＴも過剰発現するＨＴ−１０８０細胞で産生した組換えＩ２Ｓの溶液で処理した。所定時間後、上清を除去して細胞を繰り返し洗浄した。溶解後、細胞内Ｉ２Ｓ酵素活性について各細胞試料をアッセイした。データは、ＧＮＰＴ過剰発現細胞株で産生したＩ２Ｓの方が、Ｉ２Ｓのみを過剰発現した細胞で産生したＩ２Ｓ（ＫＤ＝２７．８９ｎＭ）に比べて、より速く内在化され、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対してより高い親和性（ＫＤ＝１．６５ｎＭ）を示したことを実証している（図６）。これらを考え合わせると、この細胞内取込の増加は、観察されたＭ６Ｐリン酸化の増加（図４）及びより強固な受容体結合（図５）の両方と整合性が取れており、細胞によるＣＩ−Ｍ６ＰＲ媒介細胞内取込の向上は、Ｍ６Ｐリン酸化及びＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合親和性が増加した結果であることを示している。
【０１５７】
実施例６：ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造した天然及びＮａｇｌｕ融合タンパク質のＭ６Ｐ受容体結合の増加
上記のように、ＧＮＰＴ過剰発現細胞株を用いることによって、組換え製造した治療用糖タンパク質のＭ６Ｐリン酸化度を増加させることができた（図４）。特に、治療用融合糖タンパク質Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦに対して、Ｍ６Ｐリン酸化の増加が観察された（図４）。驚いたことに、ＬＩＦに融合した場合におけるＮａｇｌｕタンパク質のＭ６Ｐリン酸化のこの増加は、天然Ｎａｇｌｕタンパク質、またはＧＮＰＴを共過剰発現していない細胞で生成した非融合ｒｈＮａｇｌｕに対しては観察されなかったレベルのＭ６Ｐリン酸化をもたらした。この現象をさらに評価するために、ｒｈＮａｇｌｕ及びＧＮＰＴ過剰発現細胞株を用いて組換え製造した様々な融合タンパク質に対してさらなる試験を行い、Ｍ６Ｐリン酸化度を評価した。簡潔に言うと、標準的な製法を用いて、１種のみの組換えタンパク質（Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ、ｒｈＮａｇｌｕ、Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧもしくはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ）を発現するか、またはリソソーム酵素及びＧＮＰＴ（ＧＮＰＴ／Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ、ＧＮＰＴ／Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ、ＧＮＰＴ／ｒｈＮａｇｌｕ）を共発現するクローンＨＴ−１０８０細胞株を生成した。各細胞株をコンフルエントになるまで増殖させて馴化培地を収集し、９０％を超える純度にそれぞれのリソソームタンパク質及び／または融合タンパク質を精製した。
【０１５８】
最初の試験として、インビトロアッセイを用いてＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合を評価した。この分析により、ｒｈＮａｇｌｕ単独の過剰発現では、Ｋｄがアッセイの検出限界未満で、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性は極めて低い結果になることが明らかとなった（図７）。この結果は、ＨＴ−１０８０細胞での過剰発現によって生成された場合、ｒｈＮａｇｌｕ酵素のＭ６Ｐリン酸化がほぼ皆無であることを実証した本発明者らの以前の発見と一致する。対照的に、ＧＮＰＴ過剰発現細胞株を用いて生成したｒｈＮａｇｌｕは、初めて、約６５ｎＭのＫｄ値のＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する弱い結合親和性を示した。この結合親和性はＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩ（陽性対照として用いた）の結合親和性よりもはるかに低いが（図７）、後者の結合はＩＧＦ−ＩＩドメインとＣＩ−Ｍ６ＰＲとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を介して媒介される。したがって、本発明者らのデータは、特定の治療用糖タンパク質、例えばＮａｇｌｕなどの低いリン酸化度は、ＧＮＰＴ過剰発現細胞株でこうしたタンパク質を製造することによって向上させることができることを示している。さらに、本発明者らのデータは、融合領域がＮ結合型グリコシル化及びＭ６Ｐリン酸化可能である融合タンパク質を作製することによって、Ｍ６Ｐリン酸化度の低い治療用糖タンパク質をＣＩ−Ｍ６ＰＲ媒介リソソーム送達に標的化することができると示している。
【０１５９】
本発明者らの試験の第２段階では、上記と同じインビトロ結合アッセイを用いて、残りのＮａｇｌｕ融合タンパク質のＣＩ−Ｍ６ＰＲ結合を評価した。本発明者らの前の発見と一致して、データは、Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧ及びＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質の両方ともＣＩ−Ｍ６ＰＲに結合できたことを示している。これにより、治療用糖タンパク質は、ＣＩ−Ｍ６ＰＲへの結合を促進するリソソーム標的化部分を有する融合タンパク質として改変できることが実証された。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＣＲＥＧ融合タンパク質はそれぞれ２．９０ｎＭ及び２．５０ｎＭのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性を有し（図８）、ｒｈＮａｇｌｕ（検出されず）及びＧＮＰＴを過剰発現する細胞で産生したｒｈＮａｇｌｕ（６５ｎＭ）の結合親和性（図７）よりも大きかった。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩに関して観察された結合親和性（０．２４ｎＭ）とほぼ同等な、ＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する結合親和性の劇的な増加（ＧＮＰＴ／Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣでの０．２３ｎＭ及びＧＮＰＴ／Ｎａｇｌｕ−ＣＲＥＧでの０．４１ｎＭ）から明らかなように（図８）、ＧＮＰＴ過剰発現細胞での融合タンパク質の産生はそのＭ６Ｐリン酸化のさらなる増加につながる。
【０１６０】
実施例７：ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造したＮａｇｌｕ融合タンパク質のＭ６Ｐ修飾の増加
ＧＮＰＴとの共発現後のＮａｇｌｕ−ＬＩＦ及びＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ上のＭ６Ｐの増加をさらに確認するために、単糖Ｍ６Ｐ定量アッセイを行った。この方法では、酸性加水分解を用いて分析する糖タンパク質上のすべてのグリカンを分解し、その後、遊離した単糖、例えばＭ６ＰなどをＰＡＤ−ＨＰＬＣ（パルスドアンペロメトリック検出高速液体クロマトグラフィー）により検出及び定量した。簡潔に言うと、Ｍ６Ｐ二ナトリウム塩を用いて分析する試料から遊離したＭ６Ｐのピークを特定した。Ｍ６Ｐ標準試料の曲線下面積を用いて標準曲線を作成し、試料から遊離したＭ６Ｐの定量を可能とした。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣのＭ６Ｐ含有量はＧＮＰＴとの共発現後で０．７５から１．８４ｍｏｌ／ｍｏｌ（Ｍ６Ｐ／タンパク質）に増加し、またＮａｇｌｕ−ＬＩＦのＭ６Ｐ含有量はＧＮＰＴとの共発現後で１．０７に増加した（図９）。ＧＮＰＴ共発現Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＧＮＰＴ共発現Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦは両方とも、対照タンパク質のＭ６Ｐ含有量と非常に類似したＭ６Ｐ含有量を有していた（図９）。この結果は、ＧＮＰＴ共発現がＮａｇｌｕ融合タンパク質のＭ６Ｐ含有量を治療上有意なレベルまで増加させたことを示している。Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ及びＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ上のＭ６Ｐを定量するために用いた方法を以下でより詳細に記載する。
【０１６１】
ＰＡＤ−ＨＰＬＣによるマンノース−６−リン酸の定量手順は、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １５；３０６（２）：１６３−１７０から応用した。タンパク質試料を１３Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と混合してＴＦＡの最終濃度を６．７５Ｍとした。その後、混合物をスクリューキャップ付の０．５ｍｌガラス製バイアル瓶に移した。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ．  ＭＯ）から購入したマンノース−６−リン酸二ナトリウムを用いて標準試料を調製した。標準試料は、Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ中で５０〜１０００ｐＭの範囲の濃度に調製し、その後、スクリューキャップ付のガラス製バイアル瓶に移した。すべての試料を加熱ブロック中で１００℃にて１．５時間加熱した。加熱後、ガラス製バイアル瓶を５分間氷上に置き、試料をエッペンドルフチューブに移した。試料をＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）濃縮機内で１４，０００ｒｐｍにて２時間遠心分離し、その後、約１．５時間乾燥させた。その後、２００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を各試料に加え、上記と同様にして試料を再び乾燥させた。次に、１００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を各試料に加え、試料を０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）遠心式フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）に通して１４，０００ｒｐｍで５分間濾過した。各試料及び標準試料の２０μｌを、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１０分析カラムのライン上にホウ酸塩トラップカラムを備えたクロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ−３０００イオンクロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ））に注入した。溶出液Ａ（１００ｍＭのＮａＯＨ）を８０％及び溶出液Ｂ（１００ｍＭのＮａＯＨ中１ＭのＮａＡｃ）を２０％で１５分間、定組成勾配で推移させ、５分間で溶出液Ｂを７０％まで増加させ、その後、溶出液Ｂを２０％まで戻した。
【０１６２】
実施例８：ＧＮＰＴ細胞株を用いて製造したＮａｇｌｕ融合タンパク質の細胞内取込の増加
ＧＮＰＴ過剰発現細胞株で産生したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦのインビトロＣＩ−Ｍ６ＰＲ媒介標的化及び細胞内取込も評価した（図１０〜１１）。比較のためにＮａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの細胞内取込を測定した。得られるデータを比較可能とするために、すべての試料を並行して同一条件下で実験した。
【０１６３】
簡潔に言うと、ＣＩ−Ｍ６ＰＲを過剰発現する細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、ＨＴ−１０８０細胞で産生した組換えＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦ単独、またはＧＮＰＴも過剰発現するＨＴ−１０８０細胞で産生した組換えＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ及びＮａｇｌｕ−ＬＩＦのいずれかの溶液で処理した。所定時間後、上清を除去して細胞を繰り返し洗浄した。溶解後、細胞内Ｎａｇｌｕ酵素活性について各細胞試料をアッセイし、タンパク質総量をＢＣＡタンパク質アッセイにより測定した。図１０〜１１におけるグラフのｘ軸は、細胞に添加したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣまたはＮａｇｌｕ−ＬＩＦの量を表す。ｙ軸は、タンパク質総量で正規化した細胞内Ｎａｇｌｕ活性、またはＮａｇｌｕ酵素のナノグラム（ｎｇ）単位での相当する量（図１０の上パネルを参照）を表す。
【０１６４】
このデータは、ＧＮＰＴ過剰発現細胞で産生したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの方が、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣのみを発現する細胞で産生したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの親和性よりも１４倍高いＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性を有することを示す（それぞれ、ＫＤ＝１４．８８対ＫＤ＝２０８．７８ｎＭ）（図１０）。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性は、ＧＮＰＴ過剰発現細胞で産生したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの親和性より３．６倍高いにすぎない（それぞれ、４．０７と１４．８８ｎＭのＫＤ）（図１０）。Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ試料に外因的なＭ６Ｐを加えた場合ではＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの細胞内取込が観察されなかったことから、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの細胞内取込はＭ６Ｐ結合領域を介してＣＩ−Ｍ６ＰＲによって媒介されることがさらに確認された（図１０）。
【０１６５】
同様に、本発明者らのデータは、ＧＮＰＴ過剰発現細胞で産生したＮａｇｌｕ−ＬＩＦの方が、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦのみを発現する細胞で産生したＮａｇｌｕ−ＬＩＦの親和性よりも高いＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性を有することを示す（図１１）。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩのＣＩ−Ｍ６ＰＲに対する親和性は、ＧＮＰＴ過剰発現細胞で産生したＮａｇｌｕ−ＬＩＦの親和性とほぼ類似しているが（それぞれ、１８と１５ｎＭのＫＤ）、ＨＴ１０８０細胞で単独で発現したＮａｇｌｕ−ＬＩＦの親和性は、Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦＩＩの親和性よりも著しく低い（それぞれ、１７８ｎＭと２ｎＭのＫＤ）。Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ試料に外因的なＭ６Ｐを加えた場合ではＮａｇｌｕ−ＬＩＦの細胞内取込が観察されなかったことから、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦの細胞内取込はＭ６Ｐ結合領域を介してＣＩ−Ｍ６ＰＲによって媒介されることがさらに確認された。
【０１６６】
実施例９：Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質のインビボ送達
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの細胞内蓄積
ここに記載するインビボ実験では、ＧＮＰＴ過剰発現細胞で調製したＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣを用いた。
【０１６７】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質の細胞内蓄積をさらに評価するため、溶媒対照（ＰＢＳ）またはＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの髄腔内投与を施したＫＯマウスを用いて、表７に記載の実験条件に従ってインビボ試験を行った。
【表７】
0006623213.tif 000020
【０１６８】
それぞれの処置の後、最後の注入から２４時間後にＮａｇｌｕＫＯマウスを犠牲にして、様々な組織でのＮａｇｌｕ酵素活性についてアッセイした。十分に確立された酵素活性アッセイを用いて全Ｎａｇｌｕ活性をアッセイした。簡潔に言うと、組織ホモジネートをＮａｇｌｕ特異的基質メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサイニド（ｇｌｕｃｏｓａｉｎｉｄｅ）の存在下で所定時間インキュベートし、その後、蛍光プレートリーダーを用いて３６０／４６０（励起／発光）で蛍光強度を調べることによって、分解産物の蓄積を測定した。このデータは、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣでの処置の結果、溶媒対照と比較して、肝臓（図１２Ａ）及び脳（図１２Ｂ）両方の組織においてＮａｇｌｕ活性が劇的に増加したことを示す。この酵素活性の増加は３週間の処置期間にわたって観察された。
【０１６９】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質の体内分布
処置したマウスから組織試料も収集し、１０％のＮＢＦ中で固定してパラフィン包埋のために処理した。アッセイした各組織について、ヒトＮａｇｌｕに特異的な抗体を用いて５μｍパラフィン切片に免疫染色を施した。このデータは、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの大脳皮質ニューロンへのリソソーム送達をはっきりと示している（図１３Ａ、Ｂ）。最も際立ったことは、このデータが肝臓の肝細胞におけるＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣのリソソーム送達も示していることである（図１３Ｅ）。これは、髄腔内送達を介してＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣを投与したという点で驚くべきことであり、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣがその投与部位から遠くの標的に到達し、細胞に進入できることを示している。
【０１７０】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質の有効性
様々な糖タンパク質の細胞内蓄積及びそれらの対応する分解産物を調べることによって、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの髄腔内投与により処置したＮａｇｌｕノックアウトマウスにおけるＮａｇｌｕ酵素のインビボ活性を評価した。そのようなアッセイの１つでは、肝臓（図１４）及び脳組織（図１５）中のグルコソアミノグリカン（ｇｌｕｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（ＧＡＧ）の量を評価するように計画した。
【０１７１】
簡潔に言うと、肝臓組織をホモジナイズし、その後、Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ３８（６）：８０３−８０７，  １９９２）に従ってＧＡＧについてアッセイした。脳組織については、ホモジナイズした試料をさらに、プロナーゼ及びベンゾナーゼを用いて消化し、タンパク質及び核酸を分解した。その後、試料をＤＥＡＥカラムに通すことによってＧＡＧを抽出した。その後、脱塩カラムによって溶出液のバッファーを交換し、ジメチルメチレンブルー染色（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２  Ｊａｎ  ８；８（２）：１９７−２０４）を用いてＧＡＧの総量を測定した。図１４及び１５に示すように、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの髄腔内送達の結果、溶媒対照と比較して、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓及び脳内のＧＡＧ総濃度が著しく減少した。脳内のＧＡＧ総濃度の減少は３週間の処置期間全体にわたって維持された（図１５）。
【０１７２】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質の髄腔内送達後、第２のアッセイを行って脳組織におけるヘパラン硫酸の量を評価した。ヘパリン硫酸はＧＡＧの特定の種類であり、Ｓａｎ  Ｂ患者の脳内に蓄積することが示されている。脳組織内のヘパラン硫酸を測定するために、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２  Ｊａｎ  ８；８（２）：１９７−２０４）に記載の高感度ＬＣ／ＭＳ法を用いた。簡潔に言うと、ＤＥＡＥカラム及び脱塩カラムを用いて脳組織から全ＧＡＧを抽出し、その後、乾燥させて計量した。次に、ヘパラン硫酸から特有の単糖、二糖及び三糖を特異的に遊離させるヘパリンリアーゼで計量したＧＡＧを処理した。その後、ＬＣ／ＭＳ及び市販の二糖標準試料との比較により、遊離した二糖を分析、特定及び定量した。上記のＧＡＧ試験の場合と同様に、このデータは、溶媒対照と比較して、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣでの処置が、３週間の治療期間にわたって、脳におけるヘパラン硫酸蓄積の総量の顕著な減少につながることを示している（図１６）。
【０１７３】
最後に、上記のヘパリン硫酸組織含有量の測定に用いたのと同じＬＣ／ＭＳ法を用いて、Ｓａｎ  Ｂに関する様々なバイオマーカーの存在をアッセイすることによって、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの細胞内送達を評価した。Ｎａｇｌｕの欠損は、Ｎａｇｌｕの天然基質である組織内の異常ヘパラン硫酸分解産物（図１７〜１９に示す）の蓄積をもたらす。このデータは、ＮａｇｌｕノックアウトマウスへのＮａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの髄腔内送達の結果、分析した３種の異常ヘパラン硫酸分解産物すべての脳内における蓄積が劇的に減少することを示す（図１７〜１９）。これらを考え合わせると、これら３つの実験的アプローチはすべて、ＧＡＧ濃度及び分解産物の全体的な減少を示しており、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣが細胞のリソソームに効果的に内在化され、そこで酵素活性を維持することを示唆している。
【０１７４】
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣのリソソームへの細胞内送達をさらに解明及び確認するために、本発明者らは、各実験的治療群におけるリソソームマーカーＬａｍｐ−１の分布を調べた。溶媒対照マウスでは、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ治療マウスと比較して、大脳皮質（図２０）、小脳（図２１）、視床（図２２）、線条体（図２３）、白質（図２４）及び肝臓（図２５）の神経細胞及びグリア細胞における拡大したと見られるリソソームで、３週間の期間全体にわたって、Ｌａｍｐ−１に対する免疫組織化学染色の増加を示した。
【０１７５】
Ｌａｍｐ−１に加えて、２種のさらなる細胞バイオマーカーを用いて、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣのリソソーム標的化及び細胞内送達をさらに評価した。この調査では、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）をマーカーとして選択した。各タンパク質は、細胞炎症反応の十分に確立された指標であり、特定の細胞型における炎症のレベル及び強度を測定するために用いることができる。特に、ＧＦＡＰ染色は、アストロサイトにおけるサイズ及びプロセスの数を示すために広く用いられている一方で、Ｉｂａ−１染色は主にミクログリア細胞を評価するのに用いられる。図２６に示すように、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの髄腔内送達を施したマウスでは、調べた各神経組織においてＧＦＡＰ染色の量が減少しており、リソソームのサイズが減少したこと、及び突起の数が減少したことを示している。Ｉｂａ−１染色でも、分析した神経細胞試料それぞれで類似の傾向が観察された（図２７）。
【０１７６】
これらのデータは、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣがＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体に結合可能であるという有力なインビボ実証となるが、この結合が様々な組織型におけるリソソーム標的化及び進入を促進する。驚いたことに、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣの髄腔内送達から、体全体の広範囲に及ぶ生物学的利用能が得られ、神経組織及び体の様々な器官系、例えば肝臓などにおける局在化が示された。このデータは、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスにおけるグルコサミノグリカン、ヘパリン硫酸及びＳａｎ  Ｂ特有バイオマーカーの過剰蓄積の全体的な低減によって示されるように、細胞内に進入すると、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質は酵素活性及び適切な機能を維持することをさらに示す。この過剰蓄積がサンフィリッポＢ型疾患の特徴である。融合タンパク質の優れた有効性、体内分布及びＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体媒介経路を用いてリソソーム送達を標的化する能力から判断して、データはこうしたアプローチが酵素補充療法に対して極めて有効であり得ることを顕著に示している。ｒｈＮａｇｌｕではリン酸化がほぼ皆無にもかかわらず、Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ融合タンパク質は、Ｍ６Ｐリン酸化することができ、したがってＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体媒介リソソーム送達のために標的化することができる。本発明者らのデータは、記載したリソソーム標的化アプローチがサンフィリッポＢ型症候群の治療だけでなく、例えば、天然タンパク質に適切なＭ６Ｐリン酸化部位が欠如しているか、またはＧＮＰＴ酵素ポケットの競合阻害もしくは立体障害ゆえに、天然タンパク質が不十分にリン酸化されている任意の他のリソソーム蓄積症の治療にも適用可能であることをはっきりと示している。
【０１７７】
実施例１０：Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質のインビボ送達
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦの細胞内蓄積
ここに記載するインビボ実験では、ＧＮＰＴ過剰発現細胞で調製したＮａｇｌｕ−ＬＩＦを用いた。
【０１７８】
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の細胞内蓄積をさらに評価するため、溶媒対照（ＰＢＳ）またはＮａｇｌｕ−ＬＩＦの髄腔内投与を施したＫＯマウスを用いて、表８に記載の実験条件に従ってインビボ試験を行った。
【表８】
0006623213.tif 000021
【０１７９】
それぞれの治療の後、最後の注入から２４時間後にＮａｇｌｕＫＯマウスを犠牲にして、様々な組織でのＮａｇｌｕ酵素活性についてアッセイした。十分に確立された酵素活性アッセイを用いて全Ｎａｇｌｕ活性をアッセイした。簡潔に言うと、全細胞ライセートをＮａｇｌｕ特異的基質メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサイニド（ｇｌｕｃｏｓａｉｎｉｄｅ）の存在下で所定時間インキュベートし、その後、蛍光プレートリーダーを用いて３６０／４６０（励起／発光）で蛍光強度を調べることによって、分解産物の蓄積を測定した。このデータは、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦでの治療の結果、溶媒対照と比較して、肝臓及び脳両方の組織においてＮａｇｌｕ活性が劇的に増加したことを示す。この酵素活性の増加は３週間の治療期間にわたって観察された。
【０１８０】
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の体内分布
治療したマウスから組織試料も収集し、１０％のＮＢＦ中で固定してパラフィン包埋のために処理した。アッセイした各組織について、ヒトＮａｇｌｕに特異的な抗体を用いて５μｍパラフィン切片に免疫染色を施した。このデータは、脊髄、小脳の髄膜、大脳皮質の髄膜のニューロン及びグリア細胞、ならびに大脳皮質の限られた領域のニューロン及びグリア細胞（図１３Ｃ及びＤ）へのＮａｇｌｕ−ＬＩＦのリソソーム送達をはっきりと示している。最も際立っていることは、このデータは肝臓の肝細胞におけるＮａｇｌｕ−ＬＩＦのリソソーム送達も示していることである（図１３Ｆ）。これは、髄腔内送達を介してＮａｇｌｕ−ＬＩＦを投与したという点で驚くべきことであり、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦがその投与部位から遠くの標的に到達し、細胞に進入できることを示している。
【０１８１】
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質の有効性
Ｎａｇｌｕ−ＳａｐＤＣ治療ノックアウトマウスの分析に関連して上に記載したように、ＧＡＧ及びヘパリン硫酸細胞内蓄積を調べることによってＮａｇｌｕのインビボ活性を評価した。図１４及び図１５に示すように、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦの髄腔内送達の結果、溶媒対照と比較して、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスの肝臓及び脳内それぞれのＧＡＧ総濃度が著しく減少した。脳内のＧＡＧ総濃度の減少は３週間の治療期間全体にわたって維持された（図１５）。
【０１８２】
このデータはまた、溶媒対照と比較して、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦでの治療は、３週間の治療期間にわたって、脳におけるヘパラン硫酸蓄積の総量の顕著な減少をもたらすことも示している（図１６）。これらを考え合わせると、すべてのデータはＧＡＧ濃度の全体的な減少を示しており、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦが細胞のリソソームに効果的に内在化されることができ、そこで酵素活性を維持することを示唆している。
【０１８３】
Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦのリソソームへの細胞内送達をさらに解明及び確認するために、本発明者らは、各実験的処置群におけるリソソームマーカーＬａｍｐ−１の分布を調べた。溶媒対照マウスでは、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ治療マウスと比較して、大脳皮質（図２８）、小脳（図２９）、視床（図３０）、線条体（図３１）、白質（図３２）及び肝臓（図３３）の神経細胞及びグリア細胞における拡大したと見られるリソソームで、３週間の期間全体にわたって、Ｌａｍｐ−１に対する免疫組織化学染色の増加を示した。
【０１８４】
Ｌａｍｐ−１に加えて、２種のさらなる細胞バイオマーカーを用いて、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦのリソソーム標的化及び細胞内送達をさらに評価した。この試験では、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）をマーカーとして選択した。各タンパク質は、細胞炎症反応の十分に確立された指標であり、特定の細胞型における炎症のレベル及び強度を測定するために用いることができる。特に、ＧＦＡＰ染色は、アストロサイトにおけるサイズ及びプロセスの数を示すために広く用いられている一方で、Ｉｂａ−１染色は主にミクログリア細胞を評価するのに用いられる。図３４に示すように、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦの髄腔内送達を施したマウスでは、調査した各神経組織においてＧＦＡＰ染色の量が減少しており、リソソームのサイズが減少したこと、及び突起の数が減少したことを示している。Ｉｂａ−１染色でも、分析した神経細胞試料それぞれで類似の傾向が観察された（図３５）。
【０１８５】
これらのデータは、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦがＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体に結合可能であるという有力なインビボ実証となるが、この結合が様々な組織型におけるリソソーム標的化及び進入を促進する。驚いたことに、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦの髄腔内送達から、体全体の広範囲に及ぶ生物学的利用能が得られ、神経組織及び体の様々な器官系、例えば肝臓などにおける局在化が示された。このデータは、Ｎａｇｌｕノックアウトマウスにおけるグルコサミノグリカン及びヘパラン硫酸の過剰蓄積の全体的な低減によって示されるように、細胞内に進入すると、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質は酵素活性及び適切な機能を維持することをさらに示す。この過剰蓄積がサンフィリッポＢ型疾患の特徴である。融合タンパク質の優れた有効性、体内分布及びＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体媒介経路を用いてリソソーム送達を標的化する能力から判断して、データはこうしたアプローチが酵素補充療法に対して極めて有効であり得ることを顕著に示している。天然Ｎａｇｌｕの不十分なＭ６Ｐリン酸化及びｒｈＮａｇｌｕのほぼ皆無なＭ６Ｐリン酸化にもかかわらず、Ｎａｇｌｕ−ＬＩＦ融合タンパク質は、Ｍ６Ｐリン酸化することができ、したがってＣＩ−Ｍ６Ｐ受容体媒介リソソーム送達のために標的化することができる。本発明者らのデータは、記載したリソソーム標的化アプローチがサンフィリッポＢ型症候群の治療だけでなく、例えば、天然タンパク質に適切なＭ６Ｐリン酸化部位が欠如しているか、またはＧＮＰＴ酵素ポケットの競合阻害もしくは立体障害ゆえに、天然タンパク質が不十分にリン酸化されている任意の他のリソソーム蓄積症の治療にも適用可能であることをはっきりと示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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