(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリホスファターゼが結合した小分子を凍結乾燥した後、それを２回以上凍結乾燥することを特徴とする、アルカリホスファターゼ結合小分子の製造方法。
【請求項２】
小分子が甲状腺ホルモン、ステロイド又はビタミン類である、請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を結合した小分子の製造方法であって、酵素結合した小分子を凍結乾燥することによって、それを安定化させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素や、酵素が結合した抗体（以下、酵素標識抗体）もしくは小分子（以下、酵素標識小分子）は、臨床検査等の分野で広く利用されている。しかしながら酵素等の活性は温度の影響を受けやすく、活性を維持した状態で長期間保存することは困難である。このためこれらの活性を維持するために様々な安定化方法が提案されている。
【０００３】
特許文献１では、溶液中においてアミノ酸及びその誘導体を共存させることによって酵素標識抗体を安定性させることが報告されている。特許文献２では、二糖類以上の非還元糖類及び糖アルコール等を添加して凍結乾燥することで標識抗体を安定化させることが報告されている。特許文献３では、ガラクトース、ラクトース及びフルクトースからなる群より選ばれる糖とアルブミンあるいはデキストランとの存在下で凍結乾燥することでヒト由来アルカリホスファターゼを安定化させることが報告されている。しかしながら適切な化合物、糖や蛋白質などを選択しても臨床検査の分野で求められている安定性が得られない場合もある。また、凍結乾燥した後、再度凍結乾燥することについては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２４１２０６号公報
【特許文献２】特開昭６０−１４９９７２号公報
【特許文献３】特許第４１６９３４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臨床検査の分野において、試薬の長期間の安定性は種々の試薬で求められている。また試薬の使用や輸送時に室温条件下で取り扱われる場合も多々あり、冷蔵条件下でなくとも試薬中の酵素や酵素標識抗体及び酵素標識小分子の活性が維持されていることが必要となる。特に酵素標識小分子の活性の低下は測定試薬の変動に大きく関与する。
【０００６】
そこで本発明の目的は、酵素標識小分子を効果的に安定化することができる製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、酵素標識小分子を安定化するために、酵素標識小分子を複数回凍結乾燥して調製した免疫反応試薬が１回のみ凍結乾燥した場合より安定化していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）酵素が結合した小分子を凍結乾燥した後、それを再度凍結乾燥することを特徴とする、酵素結合小分子の製造方法。
（２）酵素が結合した小分子を凍結乾燥した後、それをいったん溶媒に溶解して溶液とした後に、再度凍結乾燥する、（１）に記載の製造方法。
（３）酵素がアルカリホスファターゼである、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）小分子が甲状腺ホルモン、ステロイド又はビタミン類である、（１）〜（３）いずれかに記載の製造方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明において、酵素が結合した小分子（酵素標識小分子）とは酵素標識された小分子のことで、小分子としては甲状腺ホルモン、ステロイド又はビタミン類などを例示することができる。甲状腺ホルモンとは、トリヨードサイロニン（Ｔ３）とサイロキシン（Ｔ４）等のことをいい、それらの遊離型（ＦＴ３，ＦＴ４）又は結合タンパクへの結合型のいずれであってもよい。ステロイドとは、エストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロンサルフェイト（ＤＨＥＡ−Ｓ）などのことをいう。ビタミン類とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ、ビタミンＢ１２又は葉酸等のことをいう。
【００１１】
また酵素としては特に限定されるものではないが、例えばアルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ等があげられ、特にアルカリホスファターゼが好ましい。
【００１２】
本発明では、酵素標識小分子の凍結乾燥時に糖、蛋白質、緩衝液や塩類を共有させてもよく、それらは特に限定されるものではないが、糖であれば例えばスクロース、マンニトール、トレハロースやイノシトール等を使用することができ、スクロース又はマンニトールが好ましい。蛋白質であれば、例えばウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド等を使用することができ、緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳやＭＥＳ等を使用することができ、塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を使用することができる。なお、凍結乾燥時にはこれら以外にも、必要に応じて他の試薬成分等を共存させることもできる。
【００１３】
本発明では、酵素標識小分子を凍結乾燥した後、再度凍結乾燥するものである。本発明ではこのように複数回の凍結乾燥を行うことが必須であり、２回以上行えばよく、必要に応じてさらに凍結乾燥を繰り返してもよい。凍結乾燥を行った後、そのまま再度凍結乾燥を行ってもよいが、いったん溶媒に溶かして溶液とした後に再度凍結乾燥することが好ましい。この時の溶媒としては特に限定されるものではなく、例えば水や水系の溶媒、例えば各種緩衝液を例示することができる。
【００１４】
このようにして得られた酵素標識小分子は、免疫測定に利用することができ、その原理としてはサンドイッチ法、競合法を使用することができる。中でも、原理は競合法で、酵素はアルカリホスファターゼをラベルとして用いるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、安定な酵素標識小分子を得ることが可能となり、酵素活性を維持した状態で長期間保存することができる。例えば、本発明で得られた酵素標識小分子を、免疫測定試薬として用いることにより長期間の保存が可能となる。さらに試薬の安定性が不十分で測定する場合、精度よく測定することは容易ではないが、本発明によって試薬が安定化されれば高精度な測定も実現できる。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製）と免疫測定用試薬として当該装置用免疫反応試薬を用い、Ｄｅｌａｙ  １ステップ競合法により各測定を行った。なお、各免疫反応試薬は後述したようにして調製した。
【００１７】
［実施例１］ＦＴ４免疫反応試薬
（１）固相懸濁液の調製
抗Ｔ４抗体固定化磁性微粒子をコラーゲンペプチド、糖、塩類等を含むＭＯＰＳ緩衝液で希釈し、固相懸濁液を作製した。
【００１８】
（２）検出用標識Ｔ４溶液の調製
糖としてスクロース、マンニトール、塩類として塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＴｒｉｓ緩衝液で保存しておいたアルカリホスファターゼ標識Ｔ４をガラスバイアルに入れ、凍結乾燥した。凍結乾燥後、純水で溶解したものをコラーゲンペプチド、糖としてスクロース、塩類として塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳ緩衝液で希釈し、検出用標識Ｔ４溶液を作製した。
【００１９】
また事前に凍結乾燥をしない比較例として、上述の糖、塩類を含むＴｒｉｓ緩衝液で保存しておいたアルカリホスファターゼ標識Ｔ４をそのまま上述のコラーゲンペプチド、糖、塩類を含むＭＯＰＳ緩衝液で希釈した検出用標識Ｔ４溶液も調製した。
【００２０】
（３）ＦＴ４免疫反応試薬の調製
固相懸濁液と検出用標識Ｔ４溶液それぞれを凍結乾燥し、ＦＴ４免疫反応試薬を調製した。アルカリホスファターゼ標識Ｔ４を事前に凍結乾燥しないＦＴ４免疫反応試薬を試薬Ａ（凍結乾燥を計１回行ったもの）、事前に凍結乾燥したＦＴ４免疫反応試薬を試薬Ｂ（凍結乾燥を計２回行ったもの）とした。
【００２１】
次に上記のように調製した試薬Ａ、Ｂに対して、３５℃で６、１３日間の加速劣化試験を実施した。尚、比較のための試薬は４℃で１３日間保存した。前記自動免疫測定装置で各試薬に対して血清サンプル２種類を測定し、アルカリホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。各血清サンプルは４回ずつ測定し、その平均値を測定値とした。
結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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凍結乾燥を１回実施した試薬Ａの場合は２サンプルの発光強度の残存率が４℃保存品と比較して、６日間で９６．０％、９４．８％、１３日間で９３．７％、８９．７％であったが、凍結乾燥を２回実施した試薬Ｂの場合、発光強度の残存率は６日間で９９．６％、９８．２％、１３日間で９９．１％、９４．９％であり、明らかに安定性が良くなる傾向が見られた。これはアルカリホスファターゼ標識Ｔ４を事前に凍結乾燥し、計２回の凍結乾燥を行ったことで、ＦＴ４免疫反応試薬の安定性が向上したことを示している。
【００２３】
［実施例２］Ｔ３免疫反応試薬
（１）固相懸濁液の調製
抗Ｔ３抗体固定化磁性微粒子をコラーゲンペプチド、糖、塩類等を含むＴｒｉｓ緩衝液で希釈し、固相懸濁液を作製した。
【００２４】
（２）検出用標識Ｔ３溶液の調製
糖としてスクロース、マンニトール、塩類として塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＴｒｉｓ緩衝液で保存しておいたアルカリホスファターゼ標識Ｔ３をガラスバイアルに入れ、凍結乾燥した。凍結乾燥後、純水で溶解したものをミートペプトン、糖としてスクロース、塩類として塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を含むＴｒｉｓ緩衝液で希釈し、検出用標識Ｔ３溶液を作製した。
【００２５】
また事前に凍結乾燥をしない比較例として前述の糖、塩類等を含むＴｒｉｓ緩衝液で保存しておいたアルカリホスファターゼ標識Ｔ３をそのまま前述のミートペプトン、糖、塩類等を含むＴｒｉｓ緩衝液で希釈した検出用標識Ｔ３溶液も調製した。
【００２６】
（３）Ｔ３免疫反応試薬の調製
固相懸濁液と検出用標識Ｔ３溶液をそれぞれ凍結乾燥し、Ｔ３免疫反応試薬を調製した。アルカリホスファターゼ標識Ｔ３を事前に凍結乾燥しないＴ３免疫反応試薬を試薬Ｃ（凍結乾燥を１回行ったもの）、事前に凍結乾燥したＴ３免疫反応試薬を試薬Ｄ（凍結乾燥を計２回行ったもの）とした。
【００２７】
次に上記のように調製した試薬Ｃ、Ｄに対して、３５℃で６、１３日間の加速劣化試験を実施した。尚、比較のための試薬は４℃で１３日間保存した。前記自動免疫測定装置で各試薬に対して血清サンプル２種類を測定し、アルカリホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。各血清サンプルは４回ずつ測定し、その平均値を測定値とした。
【００２８】
【表２】
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凍結乾燥を１回実施した試薬Ｃの場合は、２サンプルの発光強度の残存率が４℃保存品と比較して、６日間で９５．８％、９４．５％、１３日間で９５．５％、９１．０％であったが、凍結乾燥を２回実施した試薬Ｄの場合、発光強度の残存率は６日間で９８．７％、９９．３％、１３日間で９８．５、９６．７％であり、明らかに安定性が良くなる傾向が見られた。これはアルカリホスファターゼ標識Ｔ３を事前に凍結乾燥し計２回の凍結乾燥を行ったことでＴ３免疫反応試薬の安定性が向上したことを示している。