(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列において３０番目アミノ酸であるフェニルアラニン、９５番目アミノ酸であるロイシンまたは１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンからなるグループから選択される一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列において３０番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたか、あるいは９５番目アミノ酸であるロイシンがバリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたか、あるいは１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチド。
【請求項３】
さらに、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリンがメチオニンに置換された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１３３、１３４、１３７、１３８、１４１及び１４２のアミノ酸配列からなるグループから選択された、請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のＯ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３５、１３６、１３９、１４０，１４３及び１４４の核酸配列からなるグループから選択された、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列の変異体ポリペプチドが含まれるか過発現されており、前記変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において３０番目アミノ酸であるフェニルアラニン、９５番目アミノ酸であるロイシンおよび１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸の置換を有する、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属微生物。
【請求項８】
前記変異体ポリペプチドに関して、配列番号１のアミノ酸配列において３０番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたか、あるいは９５番目アミノ酸であるロイシンがバリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたか、あるいは１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換された、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属微生物。
【請求項９】
前記変異体ポリペプチドに関して、さらに、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリンがメチオニンに置換された、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項１０】
前記エシェリキア属微生物が、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項１１】
前記エシェリキア属微生物は、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）の活性がさらに不活性化された、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項１２】
前記エシェリキア属微生物は、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）の活性がさらに不活性化された、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項１３】
前記エシェリキア属微生物は、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase）の活性が非変異微生物に比べてさらに強化された、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項１４】
前記エシェリキア属微生物は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenase）、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（pyridine nucleotide transhydrogenase）またはこれらの組合わせの活性が非変異微生物に比べてさらに強化された、請求項７に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれか一項に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び
前記培養段階で培養された微生物または培地からＯ−アセチルホモセリンを回収する段階を含む、Ｏ−アセチルホモセリン生産方法。
【請求項１６】
請求項７〜１４のいずれか一項に記載のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び
前記培養段階で培養された微生物または培地に、または前記培養段階で培養された微生物または培地から回収されたＯ−アセチルホモセリンをメチルメルカプタンとメチオニン転換酵素とで処理してＯ−アセチルホモセリンをＬ−メチオニンに転換する段階を含む、Ｌ−メチオニン生産方法。
【請求項１７】
前記メチオニン転換酵素が、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼである、請求項１６に記載のＬ−メチオニン生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、Ｏ−アセチルホモセリンを排出することができるタンパク質及びその新規変異体、前記タンパク質の発現が強化されたＯ−アセチルホモセリン生産能を有する微生物及びそれを用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学合成と生物学的合成を介して生産されるメチオニンは飼料及び食品添加剤だけでなく輸液剤、医薬品の合成原料として使用される。最近は、発酵を通じて生産したＬ−メチオニン前駆体から酵素転換反応によりＬ−メチオニンを生産する２段階工法が公知された（特許文献１）。前記２段階工法ではメチオニン前駆体としてＯ−スクシニルホモセリン（O-succinyl homoserine）とＯ−アセチルホモセリン（O-acetyl homoserine）が使用されると開示し、メチオニンの経済的な大量生産のためにメチオニン前駆体を高収率で生産することが非常に重要である。
【０００３】
ＬｅｕＥはロイシン排出タンパク質（leucine export protein）と公知され、ホモセリン/ホモセリンラクトン排出タンパク質（Homoserine/homoserine lactone efflux protein、RhtB）ファミリーの一つで内膜に存在するタンパク質であり、推定上特徴付けられていない輸送タンパク質でロイシンとそのアナログ（analogue）を排出するものと知られている。
【０００４】
ＬｅｕＥと関連した従来技術ではｌｅｕＥ（ｙｅａＳ）遺伝子のアミノ酸配列またはこの変異体強化を介してプリンヌクレオシド（purine nucleoside）またはプリンヌクレオチド（purine nucleotide）を生産することができ、アミノ酸生産量が向上されることが公知された。また、システインの排出機能を有するｌｅｕＥ変異体が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ２００８/０１３４３２
【特許文献２】韓国登録特許第１０−１３３５８４１号
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０９０５３８１号
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ２０１２/０８７０３９
【特許文献５】韓国登録特許第１０−１１１７０１２号
【特許文献６】韓国登録特許第１０−１２５０６５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願の発明者らはＯ−アセチルホモセリンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、Ｏ−アセチルホモセリンを排出する活性を有するタンパク質及びその変異体を発掘することにより、本願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願の一つの目的は、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドを提供することにある。
本願の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【０００８】
本願のもう一つの目的は、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドが含まれるか、過発現されたＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア（Escherichia）属微生物を提供することにある。
【０００９】
本願のもう一つの目的は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び
前記培養段階で培養された微生物または培地でＯ−アセチルホモセリンを回収する段階を含む、Ｏ−アセチルホモセリン生産方法を提供することにある。
【００１０】
本願のもう一つの目的は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び
前記培養段階で培養された微生物または培地に、または前記培養段階で培養された微生物または培地から回収されたＯ−アセチルホモセリンにメチルメルカプタンとメチオニン転換酵素を処理してＯ−アセチルホモセリンをＬ−メチオニンに転換する段階を含む、Ｌ−メチオニン生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本願の内膜タンパク質ＬｅｕＥまたはＬｅｕＥ変異体を有する微生物はＯ−アセチルホモセリン排出能が増進されＯ−アセチルホモセリンの生産効率が向上され、本願の微生物はＯ−アセチルホモセリンを生産するのに効率的に使用されうる。また、高効率で生産されるＯ−アセチルホモセリンを利用するとＬ−メチオニンを経済的に大量生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記目的を達成するための本願の一様態は、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリン、３０番目アミノ酸であるロイシン、９５番目アミノ酸であるフェニルアラニンまたは１６５番目アミノ酸フェニルアラニンからなるグループから選択される一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドに関する。
【００１３】
本願で使用される用語、「Ｏ−アセチルホモセリン」は、微生物のメチオニン生合性経路上の特異的な中間体物質で、Ｌ−ホモセリンのアセチル誘導対を意味する。これはホモセリンとアセチル-ＣｏＡがホモセリンアセチルトランスフェラーゼによって反応が触媒されて生成されるものとして知られていて、Ｃ６Ｈ１１ＮＯ４の化学式を有する。
【００１４】
本願で使用される用語、「Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチド」は、微生物細胞内のＯ−アセチルホモセリンを細胞外に排出する機能を有するポリペプチドを意味する。具体的に、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するＬｅｕＥタンパク質及びその変異体を意味することができ、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有する限り、特に制限されない。
【００１５】
本願で使用される用語、「ＬｅｕＥ」は、アミノ酸伝達体（amino acid transporter）に対するホモセリン/ホモセリンラクトン排出タンパク質（Homoserine/homoserine lactone efflux protein、RhtB）ファミリーの一つで、内膜に存在するタンパク質として知られているが、正確な機能は知られていない。ここで、本願の発明者らは、最初にＬｅｕＥがＯ−アセチルホモセリンを特異的に排出することを確認した。
【００１６】
前記ＬｅｕＥは、エシェリキア属微生物から由来したものであってもよく、具体的な例として大腸菌由来のＬｅｕＥであってもよいが、Ｏ−アセチルホモセリンを排出することができる機能を有するものであれば、微生物由来に限定なく本願に含まれてもよい。
【００１７】
具体的に、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有し、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と同一または相応にＯ−アセチルホモセリンを排出する活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このような相同性を有する配列として、実質的に配列番号１のアミノ酸配列と同一または相応にＯ−アセチルホモセリンを排出する活性を有するアミノ酸配列で一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列であってもよく、この場合も本願の範囲に含まれるのは自明である。
【００１８】
本願で使用される用語、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドの「変異体」は、天然の自然状態または非変異状態でのポリペプチドが有する排出能に比べてＯ−アセチルホモセリンを排出する能力が向上されたポリペプチドを称する。具体的に、配列番号１のアミノ酸配列に一つ以上のアミノ酸変異により配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドより向上されたＯ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドである。
【００１９】
その例として、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリン、３０番目アミノ酸であるロイシン、９５番目アミノ酸であるフェニルアラニンまたは１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンからなるグループから選択される一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドであってもよい。  具体的に、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリンがメチオニンに置換されたり；３０番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、プロリン、チロシン、グルタミン、リシン、グルタミン酸、システイン、トレオニン及びアルギニンからなる群から選択されたものに置換されたり；９５番目アミノ酸であるロイシンがバリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、セリン、プロリン、チロシン、グルタミン、リシン、グルタミン酸、システイン、トリプトファン及びアルギニンからなる群から選択されたものに置換されたり；または１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、イソロイシン、プロリン、チロシン、グルタミン、リシン、グルタミン酸、システイン、トレオニン及びアルギニンからなる群から選択されたものに置換されたものであってもよい。より具体的に、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリンがメチオニンに置換されたり、３０番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、バリン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたり；９５番目アミノ酸であるロイシンがバリン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたり；または１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンがアラニン、トリプトファン、ロイシン、グリシン、セリン、アスパラギン、アスパラギン酸及びヒスチジンからなる群から選択されたものに置換されたものであってもよい。さらに具体的に、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸であるバリンがメチオニンに置換され、３０番目アミノ酸であるフェニルアラニン、９５番目アミノ酸であるロイシンまたは１６５番目アミノ酸であるフェニルアラニンが他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。よりさらに具体的に、配列番号２、１３３、１３４、１３７、１３８、１４１及び１４２のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。具体的に、前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有し、実質的に前記変異体のアミノ酸配列と同一または相応にＯ−アセチルホモセリン排出能が向上されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このような相同性を有する配列として、実質的に前記変異体のアミノ酸配列と同一または相応にＯ−アセチルホモセリン排出能が向上されたアミノ酸配列で、一部���列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列であってもよい。前記ポリペプチドは天然の自然状態または非変異状態でのポリペプチドに比べて、Ｏ−アセチルホモセリンを排出する能力が向上されたポリペプチドの変異体の例であり、これに限定されるものではない。本願で用語、「天然の自然状態または非変異状態」は、本願での該当ポリペプチドの導入や活性の変異を導入してない状態を意味する。
【００２０】
本願で使用される用語、「相同性」とは、タンパク質をコードする遺伝子のアミノ酸配列または核酸配列において、特定比較領域で両配列を最大限一致させるように整列（align）させた後、配列間の塩基またはアミノ酸残基の同一な程度を意味する。相同性が十分高い場合、該当遺伝子の発現産物は同一または類似な活性を有することができる。前記媒列同一性のパーセントは公知の配列比較プログラムを用いて決定されることができ、一例として、ＢＬＡＳＴ(ＮＣＢＩ), ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ (ＣＬＣ ｂｉｏ), ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ(ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ)などが挙げられる。
【００２１】
本願の一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本願で、前記Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドは前述したとおりである。
【００２２】
例えば、前記ポリヌクレオチドは開始コドンがＡＴＧに置換されたものであってもよく、配列番号４、１３５、１３６、１３９、１４０，１４３及び１４４の塩基配列であってもよいが、これに制限されない。また、前記ポリヌクレオチドは遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因し、同一アミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も本願に含まれる。例えば、用いられる微生物に応じて最適のコドンを有するように改変されているものであってもよい。
【００２３】
具体的に、前記塩基配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上の相同性を有し、実質的に前記塩基配列と同一または相応にＯ−アセチルホモセリンを排出する活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよい。または公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳しい条件下でハイブリッド化して、Ｏ−アセチルホモセリンの排出活性を有するタンパク質を暗号化する配列であってもよい。「厳しい条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例として、相同性が高い遺伝子同士、例えば、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ではハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には２回〜３回清浄する条件が挙げられる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)）。
【００２４】
前記ハイブリッド化に用いられるプローブは、塩基配列の相補配列の一部であってもよい。このようなプローブは、公知の配列に根拠し作製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、このような塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとしては、３００ｂｐ程度の長さの遺伝子断片を使用することができる。より具体的には、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さの遺伝子断片を使用する場合には、ハイブリッド化の洗浄条件としては、５０℃、２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳが列挙される。
【００２５】
本願で用いられる遺伝子、これらがコードするタンパク質配列及びプロモーター配列などは公知のデータベースから得ることができ、その例としてＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋなどから得ることができるが、これに制限されない。
【００２６】
本願の一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドが含まれるか過発現された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物に関する。具体的に、前記微生物は配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその変異体ポリペプチドが含まれたり過発現された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物であってもよい。
【００２７】
前記Ｏ−アセチルホモセリン排出能を有するポリペプチド及び変異体ポリペプチドは前述したとおりである。
本願で使用される用語、「Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物」とは、微生物が培地で培養される場合、生物体内でＯ−アセチルホモセリンを生産し培地内にこれを分泌する能力を有する微生物を意味する。Ｏ−アセチルホモセリン生産能力は、天然または人為的突然変異または種改良により付与または増進されうる。
【００２８】
具体的には、Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物はＯ−アセチルホモセリン生産能を有する限り、微生物由来に関係なくすべて含まれてもよい。一例として、エシェリキア（Escherichia）属であってもよく、さらに具体的には大腸菌（Escherichia coli）であってもよい。
【００２９】
一方、本願でＯ−アセチルホモセリンを生産する微生物は、前記ＬｅｕＥとは別にＯ−アセチルホモセリン生産能を増進させるためにホモセリン生合成関連経路やＯ−アセチルホモセリン排出能力関連機序などの関連機序に対して既存公知の変異がさらに導入された変異微生物であってもよい。
【００３０】
本願の他の具体的な一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物において、シスタチオニンシンターゼ（cystathionine synthase）の活性がさらに不活性化されたものであってもよい。具体的には、前記シスタチオニンシンターゼをコードする遺伝子（ｍｅｔＢ）が欠損されたり非変異微生物に比べて発現が弱化されたものであってもよいが、これに制限されない。前記ｍｅｔＢのアミノ酸配列は公知のデータベースから得ることができ、シスタチオニンシンターゼの活性を有するアミノ酸配列は制限なく含まれてもよいが、その例として、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００３１】
前記配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号６の塩基配列がコードするタンパク質であってもよいが、これに制限されない。
また、本願の他の具体的な一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物において、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）の活性がさらに不活性化されたものであってもよい。具体的には、前記ホモセリンキナーゼの活性が非変異微生物の内在的活性より減少または除去されたものであってもよい。例示的に、ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子（ｔｈｒＢ）が天然プロモーターに比べて弱いプロモーターに連結されるか弱い活性を有するように変異または欠損されたものであってもよいが、これに制限されない。
【００３２】
前記ｔｈｒＢのアミノ酸配列は公知のデータベースから得られ、ホモセリンキナーゼ活性を有するアミノ酸配列は制限なく含まれてもよいが、その例として、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号８の塩基配列がコードするタンパク質であってもよいが、これに制限されない。
【００３３】
本願で用語、前記タンパク質の「不活性化」は、本来微生物が天然または前記タンパク質の非変異状態で有している酵素の活性と比較する時、その活性が減少される場合、全く発現がされない場合及び発現されてもその活性がない場合を意味する。前記不活性化は、前記酵素をコードする遺伝子の変異などで酵素自体の活性が本来微生物が有している酵素の活性に比べて減少または除去された場合と、これをコードする遺伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が天然型菌株に比べて低いか除去された場合、前記遺伝子の一部または全体が欠失された場合、及びこれらの組み合わせも含む概念であって、これに限定されない。
【００３４】
このような酵素活性の不活性化は、当該分野でよく知られている多様な方法の適用により達成されることができる。前記方法の例として、前記酵素の活性が除去された場合を含み、前記酵素の活性が減少されるように突然変異された遺伝子で、染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子の発現調節配列を活性が弱いか、またはない配列に交替する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列前端にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造物を形成させ、リボゾーム（ribosome）の付着が不可能にする方法及び該当配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせでも達成することができるが、前記例により特に制限されるものではない。
【００３５】
前記発現調節配列を変形させる方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化させるように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列に交替することにより行うことができる。前記発現調節配列にはプロモーター、オペレーター配列、リボゾーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【００３６】
また、染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記酵素の活性をさらに弱化させるように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行ったり、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列に交替することによって行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
また、酵素をコードする遺伝子の一部または全体を欠失する方法は、細菌内染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより、行うことができる。このような遺伝子の一部または全体を欠失する方法の一例として、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００３８】
前記で「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相違するが、具体的には１〜３００個、より具体的には１〜１００個、よりさらに具体的には１〜５０個であってもよいが、特にこれに制限されるものではない。
【００３９】
前記で「相同組換え（homologous recombination）」とは、互いに相同性を有する遺伝子鎖の座位で連結交換を介して起こる遺伝子組換えを意味する。
また、本願の他の具体的な一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物において、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase）の活性が非変異微生物に比べてさらに強化されたものであってもよい。
【００４０】
具体的には、前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの活性が非変異微生物の活性より増加されるものであってもよく、特に、活性が強化されたホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｍｅｔＡ遺伝子が導入されたものであってもよい。前記変異型ｍｅｔＡ遺伝子はホモセリンアセチルトランスフェラーゼの１１１番アミノ酸をグルタミン酸に置換し、１１２番アミノ酸をヒスチジンに置換したものをコードする遺伝子であってもよいが、これに制限されない。前記変異型ｍｅｔＡは、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの活性が野生型より活性が強化されたアミノ酸配列は制限なく含まれてもよいが、その例として、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。このような変異型ｍｅｔＡ遺伝子の製造及びその活用、前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの強化菌株などに対する内容の一例は特許文献２に開示されており、前記特許の明細書全体は本願の参考資料として含まれることができる。
【００４１】
また、本願の他の一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenase）、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（pyridine nucleotide transhydrogenase）またはこれらの組合わせの活性が非変異微生物に比べてさらに強化された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物であってもよい。
【００４２】
また、本願の他の具体的様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産する微生物において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、アスパラテートアミノトランスフェラーゼまたはこれらの組み合わせの活性が、非変異微生物に比べてさらに強化されたものであってもよい。本願で使用される用語タンパク質活性の「強化」は、微生物が保有しているタンパク質の活性状態を向上させることを意味する。タンパク質の活性の強化は、目的タンパク質の活性の強化と共に各タンパク質の活性を天然の自然状態または当該タンパク質の非変異状態より強化させることができる限り、制限されない。その例として、ｉ）各タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、ｉｉｉ）各タンパク質の活性が強化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及びｉｖ）この組み合わせからなる群から選択される方法により行うことができる。
【００４３】
具体的には、各タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、各タンパク質をコードする塩基配列の上流に改良された活性を現れるプロモーターを導入するかプロモーターに変異をかけた各タンパク質を導入する方法、５’‐ＵＴＲ領域の塩基配列を変形させる方法及び各タンパク質をコードする塩基配列の変異体を導入する方法からなる群から選択される方法により行えるものであってもよいが、これに限定されない。
【００４４】
本願の一様態は、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階を含むＯ−アセチルホモセリン生産方法に関する。
具体的には、前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び前記培養段階で培養された微生物または培地でＯ−アセチルホモセリンを回収する段階を含む生産方法に関する。
【００４５】
本願で用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は当業界に知られた適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知された回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行うことができる。本願の微生物の培養に用いられる培地及びその他培養条件は通常のエシェリキア属微生物の培養に用いられる培地であれば、特に制限せずいずれも用いてもよいが、具体的には、本願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び/またはビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。
【００４６】
本願における前記炭素源としては、グルコース、プルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどのような炭水化物；糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのようなアルコール；有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジンなどのようなアミノ酸などが含まれてもよいが、これに限定されない。また、デンプン加水分解物、糖みつ、ブラックストラップ糖みつ、 米ぬか、カッサバ、サトウキビカス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を使用することができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖みつ（つまり、還元糖に転換された糖みつ）などのような炭水化物が使用されてもよく、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これら炭素源は、単独または２種以上が組み合わされて使用されてもよいが、これに制限されない。
【００４７】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺアミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用されてもよい。これら窒素源は、単独または２種以上が組み合わされて使用されてもよいが、これに限定されない。
【００４８】
前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはこれに対応するナトリウム含有塩などが含まれてもよい。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、その他にアミノ酸、ビタミン、及び/または適切な前駆体などが含まれてもよいが、これに限定されない。これら培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加されてもよく、これに限定されない。
【００４９】
本願で微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培養物に適切な方式で添加して、培養物のｐHを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するため、気体の注入することなくあるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。
【００５０】
培養物の温度は２７℃〜３７℃であってもよく、より具体的には３０℃〜３５℃であってもよいが、これに制限されない。培養期間は希望の有用物質の生成量が収得されるまで継続することができ、具体的に１０〜１００時間であってもよいが、これに制限されない。
【００５１】
前記Ｏ−アセチルホモセリンを回収する段階は本願の微生物の培養方法、例えば、 回分式、連続式または流加式培養方法などに応じて、当該技術分野に公知された適合した方法を利用して培養液から目的とするＯ−アセチルホモセリンを回収することができる。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよく、また当該分野に公知となった適合した方法を組合わせて使用されてもよい。
【００５２】
前記回収段階は、分離工程及び/または精製工程を含んでもよい。
本願の一様態は、前記本願のＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び前記培養段階で培養された微生物または培地に、または前記培養段階で培養された微生物または培地から回収されたＯ−アセチルホモセリンにメチルメルカプタンとメチオニン転換酵素を処理してＯ−アセチルホモセリンをＬ−メチオニンに転換する段階を含む、Ｌ−メチオニン生産方法に関する。
【００５３】
例えば、Ｏ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属微生物を培地で培養して回収されたＯ−アセチルホモセリンを２段階工法（特許文献３）を用いてメチオニンを生産することができる。
【００５４】
前記２段階工法はＯ−アセチルホモセリンとメチルメルカプタンを基質として利用してＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換する活性を有する酵素または前記酵素を含む菌株を利用した酵素反応を介してＬ−メチオニン及び有機酸を生産する工程を含む。
【００５５】
前記メチオニン転換酵素は、Ｏ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換する全ての酵素を含み、特にＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（Oacetylhomoserine sulfhydrylase）であってもよいが、これに制限されない。
【００５６】
具体的に、前記Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼは、レプトスピラ属（Leptospira sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium sp.）、ヒポモナス属（Hyphomonas sp.）に属する微生物菌株、より具体的にはレプトスピラ・メイエリー（Leptospira meyeri）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aurogenosa）、ヒポモナス・ネプツニウム（Hyphomonas Neptunium）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium Violaceum）に属する微生物菌株から由来されるＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼが使用されてもよい。
【００５７】
前記の反応は下記のようである。
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン  <＝>アセテート＋メチオニン
このような追加メチオニン生産工程に対しては特許文献３に開示されており、前記特許の明細書全体は本願の参考資料として含まれることができる。
【００５８】
（実施例）
以下、実施例により本願をより詳細に説明する。しかしこれら実施例は本願を例示的に説明するためのもので、本願の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００５９】
参考例１：Ｏ−アセチルホモセリン生産能を有する菌株の製作
１−１．野生型大腸菌でのｍｅｔＢ遺伝子欠損
Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株を製作するためにエシェリキア属微生物の中から代表的な微生物である大腸菌を使用した。このため、野生型大腸菌であるＥ. ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)を米国生物資源センター（American Type Culture Collection、ATCC）から入手して使用した。前記大腸菌Ｗ３１１０菌株にシスタチオニンγシンターゼをコードする遺伝子ｍｅｔＢ（配列番号６）及びホモセリンキナーゼをコードする遺伝子ｔｈｒＢ（配列番号８）が欠損された菌株を製作した。このように製作されたＯ−アセチルホモセリン生産菌株をＷ３−ＢＴと命名した。これらｍｅｔＢ及びｔｈｒＢ遺伝子欠失菌株のなどに対する内容の一例は特許文献３または特許文献１に開示されており（特に、特許文献３の実施例１−１及び１−２参考）、前記特許の明細書全体は本願の参考資料として含まれることができる。
【００６０】
１−２．ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する変異型ｍｅｔＡ遺伝子導入菌株の製作
前記参考例１−１から得られた菌株にホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyltransferase）活性を強化するために、菌株に強化された活性を有するホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする変異型ｍｅｔＡ遺伝子（配列番号１０）を導入しようとした。
【００６１】
菌株製作は特許文献２の実施例１及び実施例３に開示された方法によりｐＣＬ_Ｐｃｊ１_ｍｅｔＡ（ＥＨ）プラスミドを製作した。
次に、前記製作した変異型ｍｅｔＡ遺伝子を菌株内に導入して置換するための方法で交替カセットを製作するためにｐＫＤ３ベクターを鋳型とし、配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いたＰＣＲを通じて増幅及び収得した。具体的に、配列番号２３及び２４のプライマーを用いて、変性（denaturation）段階は９４℃で３０秒、アニーリング（annealing）段階は５５℃で３０秒、伸長（extension）段階は７２℃で２分間行い、これを３０回繰り返すＰＣＲ反応を進行した。
【００６２】
交替カセットのｍｅｔＡ（ＥＨ）部分はｐＣＬ_Ｐｃｊ１_ｍｅｔＡ（ＥＨ）を鋳型に配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用い、ｍｅｔＡ野生型部分は配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを用いてそれぞれのＰＣＲ産物を得た。３つのPCR産物を配列番号１９及び配列番号２２のプライマーを用いてクロラムフェニコールマーカー部分を含むｍｅｔＡ（ＥＨ）交替カセットを製作して、ｐＫＤ４６ベクターであらかじめ形質転換させた前記参考例１−１で製作されたＷ３‐ＢＴ菌株に電気穿孔を利用して導入した。
【００６３】
前記過程を通じて導入が確認された菌株は再びｐＣＴ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、クロラムフェニコールマーカーが除去されｍｅｔＡ遺伝子がｍｅｔＡ（ＥＨ）に交替された菌株をＷ３‐ＢＴＡと命名した。
【００６４】
このようなホモセリンアセチルトランスフェラーゼ強化菌株などに対する内容の一例は特許文献２または特許文献４に開示されており、前記特許の明細書全体は本願の参考資料として含まれることができる。
【００６５】
１−３．ｐｐｃ、ａｓｐＣ及びａｓｄ遺伝子を２コピー含む菌株の製作
前記参考例１−２で製作したＷ３−ＢＴＡ菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能を増加させるために、既存の知られている生合成経路強化戦略を導入した。ホスホエノールピルビン酸からオキサロアセテートへの生合成に関与するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase）、オキサロアセテートからアスパラギン酸への生合成に関与するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びβ−アスパルチルリン酸からホモセリンへの生合成に関与するアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate-semialdehyde dehydrogenase）、つまり、ｐｐｃ遺伝子、ａｓｐＣ遺伝子及びａｓｄ遺伝子を２コピーに増幅させた菌株を製作しようとした。
【００６６】
菌株製作は特許文献５の実施例１−１〜１−３に開示された方法でｐＳＧ−２ｐｐｃ、ｐＳＧ−２ａｓｐＣ、ｐＳＧ−２ａｓｄプラスミドを製作して、Ｗ３−ＢＴＡ菌株に前記のプラスミドを導入し、前記特許の実施例１−５の方法で前記３つの遺伝子を順次的に２コピー増幅された菌株を製作した。このように製作された菌株をＷ３−ＢＴＡ２ＰＣＤ（＝ＷＣＪＭ）と命名した。
【００６７】
このようなホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ強化菌株などに対する内容の一例は特許文献３または特許文献１に開示されており、前記特許明細書全体は本願の参考資料として含まれることができる。
【００６８】
１−４．フラスコ培養実験
前記参考例１−２及び１−３で製作した菌株のＯ−アセチルホモセリン生産量を実験するために、三角フラスコ培養を実施した。ＬＢ培地でＷ３１１０、Ｗ３−ＢＴＡ，ＷＣＪＭ菌株を接種して３３℃で一晩培養した後、単一コロニーを３ｍｌＬＢ培地に接種した後、３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌＯ−アセチルホモセリン生産培地を含む２５０ｍｌ三角プラス個で２００倍希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。ここで使用した培地組成は、下記表１にまとめた。
【００６９】
【表１】
0006543734.tif 000002
前記培地を用いて３０時間培養したＨＰＬＣ分析を通じてＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した結果は、下記表２にまとめた。
【００７０】
【表２】
0006543734.tif 000003
前記表２で確認したように、野生型Ｗ３１１０ではＯ−アセチルホモセリンが全く生成されなかったが、Ｗ３−ＢＴＡ菌株でＯ−アセチルホモセリン（Ｏ−ＡＨ）が０．９ｇ/Ｌ生成され、生合成経路が強化されたＷＣＪＭ菌株では１．２ｇ/Ｌが生成された。
【００７１】
実施例１：Ｏ−アセチルホモセリン生産能を増加させる膜タンパク質の選別
本願の発明者らは、膜タンパク質として開示されたがＯ−アセチルホモセリン排出能及びＯ−アセチルホモセリン生産能との連関性が開示されたことのない大腸菌由来ｌｅｕＥ（配列番号１）をＯ−アセチルホモセリン生産に適用して見た。
【００７２】
菌株におけるｌｅｕＥ遺伝子を強化するためにｌｅｕＥ遺伝子をｐＣＬベクターのｓｍａＩ制限酵素位置を利用してクローニングを行った。
まず、ｌｅｕＥ遺伝子を得るために配列番号１１及び１２のプライマーを用いて変性（denaturation）段階は９４℃で３０秒、アニーリング（annealing）段階は５５℃で３０秒、伸長（extension）段階は６８℃で１分間行い、これを３０回繰り返すＰＣＲ反応を進行した。その結果、得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、８００ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡを制限酵素ｓｍａＩで一晩３７℃で処理した後、もう一回精製した後、Ｔ４リガーゼ（ligase）を用いてｌｅｕＥとｐＣＬベクターをクローニングした。クローニングされたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した後、スペクチノマイシン（spectinomycin）５０μｇ/ｍｌを含むＬＢ平板培地から形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選別してプラスミドを獲得した。製作されたプラスミドをＯ−アセチルホモセリン生産株であるＷ３−ＢＴＡ及びＷＣＪＭに菌株を導入して、それぞれＷ３−ＢＴＡ/ｐＣＬ−ｌｅｕＥ及びＷＣＪＭ/ｐＣＬ−ｌｅｕＥと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能に対するフラスコ評価を行った。
【００７３】
また、対照群として、Ｗ３−ＢＴＡ及びＷＣＪＭ菌株に前記と同様の方法で空ベクターｐＣＬ１９２０を導入し、それぞれＷ３−ＢＴＡ/ｐＣＬ１９２０及びＷＣＪＭ/ｐＣＬ１９２０と命名し、前記Ｏ−アセチルホモセリンの生産能に対するフラスコ評価を行った。
【００７４】
具体的に、それぞれの菌株をＬＢ個体培地に塗抹した後、３３℃培養器で一晩培養した。ＬＢ平板培地に一晩培養した菌株の単一コロニーを３ｍｌＬＢ培地に接種した後、これを３３℃で５時間培養して、再び２５ｍｌＯ−アセチルホモセリン生産培地を含む２５０ｍｌ三角フラスコで２００倍希釈し３３℃、２００ｒｐｍの培養器で３０時間培養した。ＨＰＬＣ分析を通してＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。その結果をまとめると下記表３のとおりである。
【００７５】
【表３】
0006543734.tif 000004
前記表３で確認したように、ＷＣＪＭへのｌｅｕＥプラスミドの導入は空ベクターが入った対照群の菌株よりＯＤがもっと低く、グルコース消耗も向上した。しかし、Ｏ−アセチルホモセリンは１．５ｇ/Ｌが生産されｌｅｕＥの野生型導入によりＯ−アセチルホモセリンは生産能が向上されたという結果は得られなかったが、ＯＤが制御されて糖消耗の速度が向上されることから排出能の可能性を確認することができ、構造モデリングを通じて野生型よりＯ−アセチルホモセリンの排出能が強化されうる変異を選別しようとした。
【００７６】
実施例２：ｌｅｕＥ開始コドン変形プラスミドの製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
野生型のｌｅｕＥの開始コドンはｇｔｇであって、バリンであるアミノ酸コドンとして知られている。ｌｅｕＥタンパク質の強化効果を確認するために、開始コドンをメチオニンアミノ酸コドンであるａｔｇに変更しようと、実施例１で製作したプラスミドを基にして開始コドンを変更する実験を行った。具体的には、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を強化させるため、配列番号１のアミノ酸配列において１番目アミノ酸をメチオニンに置換した。
【００７７】
より具体的には、ｌｅｕＥ（ＡＴＧ）変異を製作した。ｌｅｕＥ（ＡＴＧ）変異を製作するために、配列番号１４５及び配列番号１４６プライマーを用い、部位特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit, stratagene、米国）を利用して変異型ｌｅｕＥ（ＡＴＧ）遺伝子を製造した。既存野生型プラスミドをＷＴ、開始コドン変異型プラスミドはＷＴ_ＡＴＧと命名して、製作されたプラスミドをＷＣＪＭに導入し、フラスコにおけるＯ−アセチルホモセリンの生産能を評価した。
【００７８】
具体的に、それぞれの菌株をＬＢ平板培地に塗抹した後、３３℃培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を前記で開示した２５ｍｌ力価培地に接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養し、その結果を表４に示した。
【００７９】
【表４】
0006543734.tif 000005
前記表４で確認したように、ｐＣＬ−ｌｅｕＥ ＷＴ（ＡＴＧ）開始コドンの変異プラスミドが導入された菌株は野生型よりＯＤが減少したが、早い糖消耗の速度を現し、Ｏ−アセチルホモセリンは２．６ｇ/Ｌ生産されて野生型に比べて約１７３％生産能が増加した。
【００８０】
実施例３：ｌｅｕＥ変異プラスミドの製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
３−１．ｌｅｕＥ変異プラスミドの製作
実施例１と２で製作したプラスミドｐＣＬ−ｌｅｕＥ ＷＴとｐＣＬ−ｌｅｕＥ ＷＴ（ＡＴＧ）の２種を基にして、ｌｅｕＥ野生型より排出能が強いと予想される３つの変異をそれぞれ製作する実験を行った。具体的には、Ｏ−アセチルホモセリン排出能を強化させるため構造モデリングを介してｌｅｕＥ変異位置を選別しており、配列番号１と２のアミノ酸配列で３０番目アミノ酸、９５番目アミノ酸、１６５番目アミノ酸を他のアミノ酸に置換した。
【００８１】
より具体的には、Ｌ９５Ｖ、Ｆ３０ＡまたはＦ１６５Ａ変異を製作した。Ｌ９５Ｖ変異を製作するために、配列番号１３及び配列番号１４のプライマーを用い、Ｆ３０Ａは配列番号２５及び配列番号２６のプライマー、Ｆ１６５Ａは配列番号２７及び配列番号２８のプライマーを用いた。前記それぞれのプライマーと共に部位特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit, stratagene、米国）を利用して、変異型ｌｅｕＥ遺伝子を製造した。既存の野生型プラスミドＷＴを基にした変異型プラスミドＬ９５Ｖは、ＷＴ_Ｍ３、Ｆ３０ＡはＷＴ_Ｍ４、Ｆ１６５ＡはＷＴ_Ｍ６と命名した。また、開始コドンが変更されたプラスミドＷＴ（ＡＴＧ）を基にした変異型プラスミドＬ９５Ｖは、ＷＴ（ＡＴＧ）_Ｍ３、Ｆ３０ＡはＷＴ（ＡＴＧ）_Ｍ４、Ｆ１６５ＡはＷＴ（ＡＴＧ）_Ｍ６と命名した。製作された変異型プラスミドをＷＣＪＭに導入して、フラスコにおけるＯ−アセチルホモセリンの生産能を評価した。
【００８２】
具体的に、それぞれの菌株をＬＢ平板培地に塗抹した後、３３℃培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を前記で開示した２５ｍｌ力価培地に接種した後、これを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養し、その結果を表５に示した。
【００８３】
【表５】
0006543734.tif 000006
前記表５で確認したように、ｌｅｕＥ変異プラスミドが導入された菌株の場合、３つの変異すべて野生型よりＯＤが減少したが、早い糖消耗の速度を現し、特にｌｅｕＥ ＷＴ（ＡＴＧ）_Ｍ６の場合、Ｏ−アセチルホモセリンが４．９ｇ/Ｌ生産されて、生産能が最も高かった。したがって、前記本願の変異型３種すべてＯ−アセチルホモセリンの生産能が増加されることを確認し、また、ｌｅｕＥ開始コドンを変更してタンパク質の発現量を増加させる時にＯ−アセチルホモセリンの生産能がさらに増加されうることを確認した。
【００８４】
３−２．生合成経路の遺伝子及び変異型プラスミドの製作
Ｏ−アセチルホモセリンの生産能を極大化させるためにホモセリンまでの生合成経路を強化させるプラスミドを製作した。アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenase）とピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（pyridine nucleotide transhydrogenase）とのＬｅｕＥ野生型及び変異体をｐＣＬベクターへクローニングするために、まずｐＣＬベクターに遺伝子ａｓｄとｐｎｔＡＢを導入した。
【００８５】
まず、ａｓｄとｐｎｔＡＢ遺伝子を収得するために、ａｓｄに対しては配列番号１５及び配列番号１６のプライマー、ｐｎｔＡＢに対しては配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを用いて、変性（denaturation）段階は９４℃で３０秒、アニーリング（annealing）段階は５５℃で３０秒、伸長（extension）段階は６８℃で３分間行い、これを３０回繰り返すＰＣＲ反応を進行した。その結果得られたそれぞれのＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．４ｋｂ（ａｓｄ）と３ｋｂ（ｐｎｔＡＢ）サイズのバンドからＤＮＡを精製した。
【００８６】
前記精製された２つの遺伝子をｓｅｗｉｎｇ ＰＣＲ（最初のステップではプライマーなしで２つの遺伝子のオーバーラップ部分を利用して連結した後、両末端のプライマーを用いて増幅するＰＣＲ技法）を介して連結した。ｓｅｗｉｎｇ ＰＣＲの条件は、最初のステップで前述したＰＣＲ反応を１０回行い、以後配列番号１５及び配列番号１８のプライマーを添加した後、ＰＣＲ反応を２０回行った。これを通して、ａｓｄ−ｐｎｔＡＢ遺伝子組み合わせ断片を製作し、これを電気泳動により精製した後、ｐＣＬベクターと一緒に制限酵素ｓａｍＩを一晩３７℃で処理した後、もう一回精製した後、Ｔ４リガーゼ（ligase）を用いて、ｐＣＬ−ａｓｄ−ｐｎｔＡＢプラスミドを製作した。
【００８７】
こうして製作されたプラスミドにｌｅｕＥ遺伝子をクローニングした。前記クローニングは、具体的に、ｌｅｕＥ遺伝子を得るために配列番号２９及び配列番号３０のプライマーを用いて、変性（denaturation）段階は９４℃で３０秒、アニーリング（annealing）段階は５５℃で３０秒、伸長（extension）段階は６８℃で１分間行い、これを３０回繰り返すＰＣＲ反応を進行した。
【００８８】
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、８００ｂｐサイズのバンドからＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡとプラスミドを制限酵素ｋｐｎＩで３７℃で一晩処理した後、もう一回精製した後、Ｔ４リガーゼ（ligase）を利用してｌｅｕＥとｐＣＬ−ａｓｄ−ｐｎｔＡＢベクターをクローニングした。クローニングされたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αで形質転換した後、スペクチノマイシン（spectinomycin）５０μｇ/ｍｌを含むＬＢ平板培地で形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選別してプラスミドを獲得した。製作されたプラスミドをＯ−アセチルホモセリンの生産株であるＷＣＪＭに導入して、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能に対するフラスコ評価を行った。
【００８９】
製作されたプラスミドは、すべて４種であって、実施例２−１で製作された野生型及び変異３種を用いた。４種プラスミドは、ＷＣＪＭ菌株に電気穿孔法を利用して導入し、実施例３−１と同様の方法でフラスコ評価を行い、その結果は次の表６のとおりである。
【００９０】
【表６】
0006543734.tif 000007
前記表６で確認したように、生合成経路とｌｅｕＥ変異とを同時に強化させた結果、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能がさらに向上された。特に、ｐＣＬ-ａｓｄ-ｐｎｔＡＢ-ｌｅｕＥ ＷＴ_Ｍ６プラスミドが導入された菌株の場合、野生型よりＯＤは減少されたが、早い糖消耗の速度を示し、Ｏ−アセチルホモセリンは５．９ｇ/Ｌ生産されて生産能が最も高かった。
【００９１】
実施例４：飽和突然変異（saturated mutagenesis）を介したｌｅｕＥ変異の製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
４−１：飽和突然変異（saturated mutagenesis）を介したｌｅｕＥ変異菌株の製作及び評価
Ｏ−アセチルホモセリン生産能が高かったｌｅｕＥ変異３種の異なるアミノ酸置換型を製作するため、飽和突然変異を介して変異を製作した。置換されるアミノ酸は、Ｍ３変異、Ｍ４変異及びＭ６変異、それぞれ１７種を実施例２で製作されたプラスミドを鋳型として製作した。そのリストは下記表７のとおりである。
【００９２】
【表７】
0006543734.tif 000008
0006543734.tif 000009
具体的に、前記表７で提示したプライマーを用いて、部位特異的突然変異キット（site-directed mutagenesis kit、Stratagene、米国）を行い、変異型ｌｅｕＥ遺伝子を製造した。製作された変異のプラスミドはＷＣＪＭ菌株に導入して、実施例３−１と同様の方法でフラスコ評価を行った。その結果は下記表８のとおりである。
【００９３】
【表８】
0006543734.tif 000010
0006543734.tif 000011
前記表８で確認したように、それぞれの変異体を評価した結果、ＯＤや糖消耗の速度においてわずかな差を示したが、前記すべての変異体は対照群として用いられた菌株ＷＣＪＭ/ｐＣＬ１９２０及びＷＣＪＭ/ｐＣＬ-ｌｅｕＥ ＷＴより、Ｏ−アセチルホモセリンの生産量が向上されたことを確認した。
【００９４】
４−２：Ｏ−アセチルホモセリン高収率の菌株におけるｌｅｕＥ変異強化菌株の製作及びＯ−アセチルホモセリン生産能の評価
既存に、野生型Ｗ３１１０由来のＮＴＧ変異を介してトレオニンを生産する能力を有する菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株を製作する方法が知られている（特許文献４）。この時製作された高収率のＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株は、韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１１４６Ｐとして寄託されている。
【００９５】
前記菌株を基に、本願のｌｅｕＥ遺伝子とその変異を導入してＯ−アセチルホモセリン生産能をさらに増進させることができるかどうかを確認してみた。
具体的に、ｌｅｕＥ遺伝子と変異体３種とをプラスミド形態と電気穿孔法を利用して導入した。導入された菌株は、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ/ｐＣＬ１９２０、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ/ｐＣＬ-ｌｅｕＥ ＷＴ、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ/ｐＣＬ-ｌｅｕＥ Ｍ３、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ/ｐＣＬ-ｌｅｕＥ Ｍ４またはＫＣＣＭ１１１４６Ｐ/ｐＣＬ-ｌｅｕＥ Ｍ６と命名した。前記ｌｅｕＥ遺伝子と変異体のＯ−アセチルホモセリン生産能を測定するためにフラスコ培養評価を行った。具体的には、ＬＢ培地に前記菌株４種を接種して３３℃で一晩培養した後、単一コロニーを３ｍｌＬＢ培地に接種した後、３３℃で５時間培養し、再び２５ｍｌＯ−アセチルホモセリン生産培地が添加された２５０ｍｌ三角フラスコに２００倍希釈して３３℃、２００ｒｐｍで３０時間培養し、ＨＰＬＣ分析によりＯ−アセチルホモセリン生産量を確認した。前記実験した結果をまとめると下記表９のとおりである。
【００９６】
【表９】
0006543734.tif 000012
前記表９で確認したように、ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株にｐＣＬ１９２０のみ導入された菌株からＯ−アセチルホモセリンは１４．２ｇ/Ｌ生成され、ｌｅｕＥ ＷＴの場合も、本来の菌株よりＯ−アセチルホモセリンの生産量が増加した。また、変異３種はすべてＯＤが減少し、Ｍ４の場合は１９．２ｇ/ＬとＯ−アセチルホモセリン生産量が最も高く、残りのＭ３、Ｍ６変異の場合もＯ−アセチルホモセリンの生産量が増加したことを確認した。
【００９７】
本願の発明者らはＫＣＣＭ１１１４６Ｐ菌株基盤のｌｅｕＥ３種変異Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６変異強化菌株である「ＫＣＣＭ１１１４６Ｐ/ｐＣＬ-ｌｅｕＥ Ｍ３、Ｍ４、Ｍ６」におけるＯ−アセチルホモセリン生産が増加することを確認し、前記菌株を「ＣＡ０５‐４００９」、「ＣＡ０５‐４０１０」、「ＣＡ０５‐４０１１」と命名した後、ブダペスト条約下２０１４年１２月１５日付で韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１６４５Ｐ、ＫＣＣＭ１１６４６Ｐ、 ＫＣＣＭ１１６４７Ｐを付与された。
【００９８】
実施例５：生産されたＯ−アセチルホモセリン培養液と転換酵素とを利用したＬ−メチオニン生産
前記実施例４で収得したＯ−アセチルホモセリンの培養液とそれをメチオニンに転換する活性を有する酵素であるＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを用いて、Ｌ−メチオニンを生産する実験を行った。
【００９９】
特許文献６の実施例１−２に提示された方法で転換酵素Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼを製作し、前記特許の実施例３に提示された方法で転換反応を行って生成されたＬ−メチオニンを測定した。基質として使用したＯ−アセチルホモセリンは、本願の前記実施例４で収得したＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ｐＣＬ−ｌｅｕＥ  Ｍ４の培養液（Ｏ−ＡＨ濃度１９．２ｇ/Ｌ）で行い、生成されたＬ−メチオニンの濃度は下記表１０のとおりである。
【０１００】
【表１０】
0006543734.tif 000013
前記表１０で確認したように、前記実施例４で収得したＫＣＣＭ１１１４６Ｐ−ｐＣＬ−ｌｅｕＥ  Ｍ４菌株の培養液に含まれたＯ−アセチルホモセリンが１０分間７９％の転換率でメチオニンに転換させることを確認した。これを通じて、本願の菌株を利用し、メチオニンを成功的に生産できることを確認した。
【０１０１】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
0006543734.tif 000014
0006543734.tif 000015
0006543734.tif 000016
【配列表】
0006543734000001.app