(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的物質を検出する方法であって、
試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブ及び第２のプローブを添加してインキュベーションするインキュベーション工程であって、第１のプローブは、カーボンナノチューブに固定された金属ナノ粒子に結合され、第２のプローブは、量子ドットに結合されている、工程と、
インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する判定工程と、
を含み、
第１のプローブ及び第２のプローブは、前記標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが前記標的物質と結合することにより、前記金属ナノ粒子及び前記量子ドットが近接し、それにより前記量子ドットの蛍光強度が増強する、方法。
【請求項２】
試料中の標的物質を定量する方法であって、
試料及び既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料のそれぞれに、第１のプローブ及び第２のプローブを添加してインキュベーションするインキュベーション工程であって、第１のプローブは、カーボンナノチューブに固定された金属ナノ粒子に結合され、第２のプローブは、量子ドットに結合されている、工程と、
インキュベーション工程後の試料及び複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
試料中の量子ドットの蛍光強度を、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度と比較して、試料中の標的物質を定量する定量工程と、
を含み、
第１のプローブ及び第２のプローブは、前記標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが前記標的物質と結合することにより、前記金属ナノ粒子及び前記量子ドットが近接し、それにより前記量子ドットの蛍光強度が増強する、方法。
【請求項３】
前記金属ナノ粒子は、金平糖状金属ナノ粒子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属ナノ粒子は、金ナノ粒子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記量子ドットは、可視光領域の蛍光を発するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１のプローブ及び第２のプローブは、抗原、抗体、レクチン、糖、レセプター、リガンド、アプタマー又は核酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試料中の標的物質の検出又は定量用キットであって、
カーボンナノチューブに固定された金属ナノ粒子に結合された、第１のプローブと、
量子ドットに結合された第２のプローブと、を含み、
第１のプローブ及び第２のプローブは、前記標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが前記標的物質と結合することにより、前記金属ナノ粒子及び前記量子ドットが近接し、それにより前記量子ドットの蛍光強度が増強する、キット。
【請求項８】
前記金属ナノ粒子は、金平糖状金属ナノ粒子である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記金属ナノ粒子は、金ナノ粒子である、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
前記量子ドットは、可視光領域の蛍光を発するものである、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
第１のプローブ及び第２のプローブは、抗原、抗体、レクチン、糖、レセプター、リガンド、アプタマー又は核酸である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、量子ドット蛍光増強免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、ナノ素材を用いた感染症の検出や診断に関する研究が多く行われている。特に、ナノ粒子の光学的特性、電気伝導性、蛍光特性及び磁性特性を利用し、標的細胞を検出又は診断する研究例が報告されている。例えば、金ナノ粒子に抗体を修飾させ、抗原の量に応じた金ナノ粒子凝集度の変化、これに伴う光学的特性の変化により抗原を検出する方法、また抗体を修飾した磁性ナノ粒子と金ナノ粒子を用いた磁気泳動、これに伴う金ナノ粒子の光学的特性の変化による結核の検出方法、疾病の相補的ＤＮＡをナノ粒子の表面に修飾して標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションを誘導し、電子的信号の変化による疾病を診断する方法など、ナノ粒子を用いた疾病の検出又は診断する方法が報告されている。例えば、非特許文献１には、ガラス様炭素電極にカーボンナノチューブを担持させ、該カーボンナノチューブにＣｄＴｅ量子ドットを介してメチルパラチオン分解酵素を固定化させたデバイスを用いて、メチルパラチオンの検出が増強されることを報告している。【０００３】
一方、本発明者らは、これまでに金属ナノ粒子に量子ドットをコーティングする技術について報告している。具体的には、非特許文献２では、酸化鉄Ｆｅ３Ｏ４の表面をＣｄＴｅ量子ドットでコーティングした蛍光磁性ナノ粒子を、静電的相互作用を利用して抗体に結合させ、結腸癌のイメージングを行うことを報告している。また、非特許文献３では、銀ナノニードルを有するフィルムの表面をＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットでコーティングすると、量子ドットの蛍光が増強されることを報告している。さらに、非特許文献４では、突起を有する金ナノ粒子の表面を、抗体を固定化したＣｄＴｅ量子ドットでコーティングしたナノ複合体を用いて、抗ネオスポラ抗体を検出できることを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２５（２０１０），  １３７０−１３７５．
【非特許文献２】Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１３，  １１，  ２８−３６．
【非特許文献３】Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１２，  ７，  ４３８−４４４．
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  １７８（２０１３），  １９２−１９９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
より多様な方法で試料中の標的分子を検出又は定量できれば、検出感度の向上、検出精度の向上、従来不可能であった測定が可能となる等の利点が得られる可能性がある。そこで、本発明は、試料中の標的物質を検出又は定量する新たな方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、試料中の標的物質を検出する方法であって、試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブ及び第２のプローブを添加してインキュベーションするインキュベーション工程であって、第１のプローブは、カーボンナノチューブに固定された金属ナノ粒子に結合され、第２のプローブは、量子ドットに結合されている、工程と、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する判定工程と、を含み、第１のプローブ及び第２のプローブは、上記標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが上記標的物質と結合することにより、上記金属ナノ粒子及び前記量子ドットが近接し、それにより上記量子ドットの蛍光強度が増強する方法を提供する。【０００７】
本発明により、試料中の標的物質を検出する新たな方法を提供することができる。この方法は、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接すると、量子ドットの蛍光強度が増強するという現象を利用するものである。試料中の標的物質と、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子及び第２のプローブを固定化した量子ドットとが結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが互いに近接し、量子ドットの蛍光強度が増強する。この蛍光強度の増強に基づいて試料中の標的物質を検出することができる。また、本発明の方法によれば、従来のＥＬＩＳＡ法では必要な工程である洗浄工程を行うことなく、試料中の標的物質を検出することができる。このため、簡便に標的物質を検出することができる。また、洗浄工程による標的物質の検出感度の低下を防止することができる。【０００８】
本発明はまた、試料中の標的物質を定量する方法であって、試料及び既知濃度の標的物質を含む複数の標準試料のそれぞれに、第１のプローブ及び第２のプローブを添加してインキュベーションするインキュベーション工程であって、第１のプローブは、カーボンナノチューブに固定された金属ナノ粒子に結合され、第２のプローブは、量子ドットに結合されている、工程と、インキュベーション工程後の試料及び複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、試料中の量子ドットの蛍光強度を、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度と比較して、試料中の標的物質を定量する定量工程と、を含み、第１のプローブ及び第２のプローブは、上記標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが上記標的物質と結合することにより、上記金属ナノ粒子及び前記量子ドットが近接し、それにより上記量子ドットの蛍光強度が増強する方法を提供する。【０００９】
本発明により、試料中の標的物質を定量する新たな方法を提供することができる。また、本発明の方法によれば、洗浄工程を必要とせずに、試料中の標的物質を定量することができるため、簡便に標的物質を定量することができる。【００１０】
本発明はまた、試料中の標的物質の検出又は定量用キットであって、第１のプローブ及び第２のプローブを含み、第１のプローブは、カーボンナノチューブに固定された金属ナノ粒子に結合され、第２のプローブは、量子ドットに結合され、第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合せず、第１のプローブ及び第２のプローブが標的物質と結合することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接し、それにより量子ドットの蛍光強度が増強する、キットを提供する。【００１１】
本発明のキットによれば、新たな原理に基づいて、標的物質を簡便に検出することができる。【００１２】
上記金属ナノ粒子は、金平糖状金属ナノ粒子であることが好ましい。【００１３】
金平糖状金属ナノ粒子を用いることにより、標的物質の検出感度を高めることができ、より正確に標的物質を定量することができる。【００１４】
上記金属ナノ粒子は、金ナノ粒子であることが好ましい。金ナノ粒子は、量子ドットの蛍光強度を効率よく増強することができる。【００１５】
上記量子ドットは、可視光領域の蛍光を発するものであってもよい。これにより、量子ドットの蛍光強度の増強を、肉眼で確認することができ、標的物質を容易に検出又は定量することができる。【００１６】
第１のプローブ及び第２のプローブは、抗原、抗体、レクチン、糖、レセプター、リガンド、アプタマー又は核酸であることが好ましい。【００１７】
第１のプローブ及び第２のプローブがこのようなものであれば、抗原、抗体、レクチン、糖、レセプター、リガンド、アプタマー又は核酸に結合可能な標的物質を検出又は定量することができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、洗浄工程を必要としない、試料中の標的物質を検出又は定量する新たな方法及びキットを提供することができる。【００１９】
また、本発明の方法及びキットによれば、カーボンナノチューブに、第１のプローブを固定化した金属ナノ粒子が固定化されており、さらに該金属ナノ粒子は標的物質を介して第２のプローブを固定化した量子ドットと結合することにより、カーボンナノチューブを中心に３次元的に配置された複合体を形成する。該複合体を形成することにより、金属ナノ粒子及び量子ドットが互いにより近接することができ、量子ドットの蛍光強度がさらに増強される。また、カーボンナノチューブの表面において、複数の金属ナノ粒子及び量子ドットが互いに近接することにより、量子ドットの蛍光強度がさらに増強される。すなわち、標的物質の有無の差によって生じる蛍光強度の差がより顕著となり、従来の検出方法よりもさらに簡便かつ高感度で標的物質を検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】第１のプローブ固定化カーボンナノチューブの作製方法の一実施形態を示す模式図である。
【図２】試料中の標的物質を検出する方法の一実施形態を説明する模式図である。
【図３】実施例１で得られたＡｕＣＮＴ及びカーボンナノチューブの紫外／可視光スペクトルである。
【図４】実施例１で得られたＡｕＣＮＴ及びカーボンナノチューブのＸ線回折パターンである。
【図５】実施例１で得られたＡｕＣＮＴ（図５Ｂ及び図５Ｃ）及びカーボンナノチューブ（図５Ａ）の透過型電子顕微鏡像を示す写真である。
【図６】システアミンで処理されたＡｕＣＮＴの赤外吸収スペクトルである。
【図７】抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴのＥＬＩＳＡ解析の結果を示すグラフである。
【図８】実施例１で得られた複合体の共焦点レーザー顕微鏡像（図８Ａ）及び微分干渉顕微鏡像（図８Ｂ）を示す写真であり、図８Ｃはこれらの像を重ねた写真である。
【図９】実施例１で得られた抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅを用いた複合体の蛍光強度を示すグラフである。
【図１０】実施例２で得られた抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅを用いた複合体の蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（原理）
量子ドットは数十ｎｍ以下の半導体結晶であり、励起光を照射すると蛍光を発する。本発明の検出方法及び定量方法は、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接すると、量子ドットの蛍光強度が増強するという現象を利用するものである。
【００２２】
本実施形態に係る試料中の標的物質を検出する方法は、試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブ及び量子ドットに固定化した第２のプローブを添加してインキュベーションするインキュベーション工程と、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する判定工程とを含む。
【００２３】
（第１のプローブ固定化カーボンナノチューブの作製方法）
図１は、カーボンナノチューブに金属ナノ粒子を固定化させ、さらに該金属ナノ粒子に第１のプローブを固定化させる方法の一実施形態を示す模式図である。試料中の標的物質を検出する方法の一実施形態を説明する模式図である。本実施形態では、カーボンナノチューブ１０を金属イオン２０で処理して、金属イオン処理カーボンナノチューブ１００を得た後に、還元剤による処理を行うことで、カーボンナノチューブ１０の表面に金属ナノ粒子３０を形成し、金属ナノ粒子３０を固定化したカーボンナノチューブ２００を得る。さらに、金属ナノ粒子３０の表面に第１のプローブ４０を固定化し、第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００を得る。また、同様の操作によって、量子ドット６０の表面に第２のプローブ６１を固定化する。
【００２４】
（試料中の標的物質を検出する方法）
図２は、試料中の標的物質を検出する方法の一実施形態を説明する模式図である。上記方法によって得られた第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００及び第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０を、標的物質５０を含む試料に添加することにより、第１のプローブ４０、標的物質５０及び第２のプローブ６１の順に結合した複合体４００を形成させる。上記複合体４００を形成させることにより、第１のプローブ４０に結合した金属ナノ粒子３０と、第２のプローブ６１に結合した量子ドット６０が互いに近接し、量子ドット６０の蛍光強度が増強される。一方、試料に代えて、標的物質５０を含まない陰性対照を用いた場合の量子ドット６０の蛍光強度と比較することにより、試料中の標的物質５０の存在をより簡便に検出することができる。
【００２５】
（標的物質及びプローブ）
本実施形態の方法では、標的物質として、抗原−抗体、レクチン−糖、レセプター−リガンド、アプタマー−アプタマーの標的物質、核酸−核酸等の、互いに特異的に結合する物質の組の一方を用い、他方をプローブとして用いることができる。より具体的には、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学物質、ホルモン、ウイルス、糖等を標的物質又はプローブに用いることができる。
【００２６】
ここで、第１のプローブ及び第２のプローブは、標的物質と結合するが互いに結合しないものを選択する。第１のプローブと第２のプローブが直接結合してしまうと、標的物質の存在の有無に関係なく金属ナノ粒子と量子ドットが近接してしまい、誤検出や誤判定の原因となる。例えば、標的物質がある抗原に特異的に結合する抗体である場合、第１のプローブ及び第２のプローブとしては、例えば、標的物質（抗体）が結合する抗原、及び、標的物質（抗体）に結合する２次抗体を組み合わせて使用することができる。これらは、いずれが第１のプローブであっても第２のプローブであってもよい。また、例えば、標的物質が抗原である場合、第１のプローブ及び第２のプローブとしては、標的物質（抗原）上のそれぞれ異なるエピトープに結合する２種類の抗体を使用してもよい。また、例えば、標的物質が抗原であり、抗原が近接して複数存在する場合、第１のプローブ及び第２のプローブとしては、標的物質（抗原）上の同一のエピトープに結合する抗体を使用してもよい。ここで、抗原が近接して複数存在する場合とは、例えば、抗原が多量体を形成している場合や、標的物質がウイルス、微生物、細胞等の表面に複数存在する抗原である場合が挙げられる。つまり、標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブが結合することにより、金属ナノ粒子と量子ドットが近接することができる限り、第１のプローブ及び第２のプローブの組み合わせに制限はない。
【００２７】
検出対象となる標的物質は、液体中に存在していてもよく、固体、粉末、流動体、気体等の試料中に存在していてもよい。本実施形態に係る、試料中の標的物質を検出する方法は、液体中で実施することが好ましい。このため、試料が液体以外である場合には、適切なバッファー等に試料を溶解又は懸濁し、液体にすることが好ましい。
【００２８】
（カーボンナノチューブ）
本発明の第１のプローブは、カーボンナノチューブに固定化された金属ナノ粒子の表面に固定化される。本発明に用いるカーボンナノチューブには、単層カーボンナノチューブ、二層カーボンナノチューブ、多層（Ｍｕｌｔｉ−ｗａｌｌｅｄ）カーボンナノチューブ等を用いることができる。カーボンナノチューブに金属ナノ粒子を固定化することにより、カーボンナノチューブを構成するベンゼン環に存在するπ電子の効果により、蛍光がより増強される。
【００２９】
（金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子としては、ナノオーダーの粒径を有する金、銀等のプラズモン現象を有する金属の粒子が挙げられる。なかでも、量子ドットの蛍光を増強させる効果が大きいことから、金属ナノ粒子は、金の粒子であることが好ましい。プラズモン現象とは、金属中の自由電子が集団的に振動して擬似的な粒子として振る舞う現象を意味する。
【００３０】
金属ナノ粒子の調製方法は特に制限されない。例えば、金ナノ粒子は、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）をクエン酸とタンニン酸で還元して調製することができ、塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）を没食子酸（Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）とイソフラボンで還元して調製することもできる。また、銀ナノ粒子は、硝酸銀水溶液をクエン酸等で還元することにより調製することができる。
【００３１】
（金平糖状金属ナノ粒子）
金平糖状金属ナノ粒子とは、表面に金平糖状の凹凸を有する金属ナノ粒子であり、海胆状（ｕｒｃｈｉｎ−ｌｉｋｅ）金属ナノ粒子ともいう。表面に凹凸を有するか否かは、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察することにより確認することができる。通常の金属ナノ粒子（表面が滑らかな金属ナノ粒子）がほぼ球状であるのに対し、金平糖状金属ナノ粒子は、金平糖又は海胆のような形状である。金平糖状金属ナノ粒子は、例えば、１０ｍＬの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に２５０μＬの２０ｍＭ塩化金酸溶液を添加した後、溶液の色が黄色から濁った青に変わるまで室温で３０分間静置することにより調製することができる。
【００３２】
（量子ドット）
量子ドットとは、直径が２〜１０ｎｍ程度の量子井戸構造を有するナノ結晶である。量子ドットには、コア構造のみのものと、コア／シェル構造のものが知られている。前者の例としては、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＣｄＳｅＴｅ等のＣｄ系量子ドット；ＰｂＳ、ＰｂＳｅ等のＰｂ系量子ドット；ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ等のＺｎ系量子ドット等が知られている。後者の例としてはＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳｅ／ＺｎＳ、ＧａＡｓ／ＡｌＧａＡｓ等の量子ドットが知られている。本実施形態においては、これらのいずれの量子ドットも使用することができる。
【００３３】
量子ドットの蛍光波長は、量子ドットの粒径に依存する。例えば、ＣｄＳｅ量子ドットでは、粒径を３〜５ｎｍに変化させることによって青緑から赤まで（波長５００〜６５０ｎｍ）の蛍光を発生させることができる。一般に、量子ドットの粒径は、合成反応の反応時間、合成に用いる有機金属化合物の熱分解反応の温度等により制御することができる。
【００３４】
また、量子ドットの蛍光波長は、量子ドットの材料の半導体の種類にも依存する。ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ等の半導体により、可視から近赤外（波長４００〜２０００ｎｍ）の蛍光を発する量子ドットを合成することができる。
【００３５】
量子ドットの合成法には、主にトップダウン法とボトムアップ法の２種類が存在する。トップダウン法においては、半導体基板に電子ビームリソグラフィーや分子線エピタキシー法等を用いて量子ドットを合成する。ボトムアップ法においては、液相で化学合成する。また、液相での化学合成には、主に水溶液中で合成するものと有機溶媒中で合成する方法の２種類が存在する。
【００３６】
水溶液中での合成では、例えば、チオール系化合物を保護剤として、カドミウム塩の水溶液にテルル化水素ナトリウム等を反応させることによってＣｄＴｅ量子ドットを合成することができる。
【００３７】
有機溶媒中での合成では、例えば、配位性有機化合物であるトリオクチルフォスフィン（ＴＯＰ）やトリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を溶媒として、ジメチルカドミウム及びＳ、Ｓｅ、ＴｅのＴＯＰ錯体あるいは有機金属化合物を約３００℃で熱分解し、量子ドットを合成することができる。
【００３８】
本実施形態においては、これらのいずれの方法で合成された量子ドットも使用することができる。
【００３９】
（金属ナノ粒子及び量子ドットへのプローブの固定方法）
金属ナノ粒子及び量子ドットへのプローブの固定方法は特に限定されないが、例えば、金属ナノ粒子又は量子ドットの表面にアミノ基、カルボキシ基、チオール基等の官能基を導入し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）等の化学架橋剤を用いてプローブを固定することができる。金属ナノ粒子又は量子ドットの表面に官能基を導入する方法としては、例えば、金属ナノ粒子又は量子ドットを、８−メルカプトオクタン酸、システアミン等の両親媒性のチオール化合物と反応させる方法等が挙げられる。金属ナノ粒子又は量子ドットの表面に官能基を導入する際、８−メルカプトオクタン酸を用いるとカルボキシ基を導入することができ、システアミンを用いるとアミノ基を導入することができる。本発明に使用するプローブの種類に基づいて、カルボキシ基、アミノ基、チオール基等の官能基を適宜選択することができる。
【００４０】
（インキュベーション工程）
インキュベーション工程では、試料及び標的物質を含まない陰性対照のそれぞれに、第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００及び第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０を添加してインキュベーションする。この工程により、試料中に標的物質が存在する場合には、標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブが結合し、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接する。金属ナノ粒子及び量子ドットの量は適宜設定すればよい。インキュベーション温度は、標的物質やプローブに応じて適宜選択できる。インキュベーション時間は、標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブの結合が平衡に達するのに要する時間に設定すればよく、例えば１時間である。
【００４１】
（蛍光測定工程）
蛍光測定工程では、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照中の量子ドットの蛍光強度を測定する。測定には、分光蛍光光度計等の一般的な蛍光測定機器を用いることができる。より具体的には、インキュベーション工程後の試料及び陰性対照に対して、量子ドットの励起光を照射し、発生する蛍光強度を測定すればよい。
【００４２】
例えば、量子ドットとして可視光領域の蛍光を発するものを使用した場合、励起光照射装置があれば、蛍光測定機器を使わなくても、肉眼で観察することにより、蛍光を検出することも可能である。これにより、標的物質の検出が必要な現場において、標的物質の存在をその場で検出することが容易になる。
【００４３】
（判定工程）
判定工程では、蛍光測定工程において測定された蛍光強度に基づいて、試料中に標的物質が存在するか否かを判定する。具体的には、試料中の量子ドットの蛍光強度が、陰性対照中の量子ドットの蛍光強度と比較して強い場合に、試料中に標的物質が存在すると判定する。また、上記したように、量子ドットとして可視光領域の蛍光を発するものを使用した場合には、蛍光測定機器を使わなくても肉眼で観察することにより、蛍光を検出することも可能である。そして、肉眼で蛍光強度の増強に基づいて、標的物質の存在又は不存在を判定することができる。
【００４４】
（試料中の標的物質を定量する方法）
試料中の標的物質を定量する方法は、基本的には試料中の標的物質５０を検出する方法と同様であり、試料と共に既知濃度の標的物質５０を含む複数の標準試料を用いる点が異なる。具体的には、試料及び既知濃度の標的物質５０を含む複数の標準試料のそれぞれに第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００及び第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０を添加して、上記と同様のインキュベーション工程及び蛍光測定工程を行う。続いて、次に説明する定量工程を行う。
【００４５】
（定量工程）
定量工程では、試料中の量子ドットの蛍光強度を、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度と比較することにより、試料中の標的物質の存在量を求める。例えば、複数の標準試料中の量子ドットの蛍光強度をもとに検量線を作成し、試料中の量子ドットの蛍光強度をこの検量線に当てはめることにより、試料中の標的物質の濃度を求めることができる。
【００４６】
（キット）
一実施形態において、試料中の標的物質の検出又は定量用キットは、第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００、及び、第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０を含む。上記第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００、及び、上記第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０は、溶液又は懸濁液の状態で供給されてもよいし、乾燥状態で供給され、使用時にバッファーに溶解又は懸濁させるものであってもよい。上記第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００及び上記第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０を用いて、上記のインキュベーション工程、蛍光検出工程、判定工程及び定量工程を実施することにより、試料中の標的物質を検出又は定量することができる。
【００４７】
別の実施形態に係る、試料中の標的物質の検出又は定量用キットにおいて、上記第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００、及び、第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０は、例えば、ろ紙などの媒体中に染みこませた状態で供給されてもよい。媒体は、使用に適した形状及びサイズに適宜調整されてよく、例えば短冊状であってよい。キットの使用時には、試料及び標的物質を含まない陰性対照を、第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ３００及び第２のプローブ６１を固定化した量子ドット６０が存在する媒体に滴下する。これにより、試料中に標的物質５０が存在する場合には、媒体中で標的物質、第１のプローブ及び第２のプローブが結合し、金属ナノ粒子及び量子ドットが近接する。蛍光検出工程において、媒体に励起光を照射することにより、量子ドットから蛍光が発生する。本実施形態のキットは、特に、標的物質の迅速な検出が必要な現場での簡易検出に適している。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて、本発明について説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００４９】
実施例では、本発明の方法の一例として、金ナノ粒子で表面処理したカーボンナノチューブ（ＡｕＣＮＴ）とＣｄＴｅ蛍光量子ドット（ＣｄＴｅ）を用いて、標的物質であるインフルエンザウイルスを検出する方法について説明する。【００５０】
（ＡｕＣＮＴの作製）
ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（０．０１ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と酸処理した多層カーボンナノチューブ（２ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を蒸留水（３０ｍＬ）に入れ、３０分間超音波処理によって分散し、ＣＮＴ溶液を得た。得られたＣＮＴ溶液（６００μＬ）を、没食子酸（０．０１Ｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とイソフラボン（１０ｍｇ、韓国産豆から直接抽出したもの）の混合液（１０ｍＬ）に入れて１時間激しく撹拌した。撹拌後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄みを除去し、粉末状態のＡｕＣＮＴを得た。【００５１】
（実施例１）
１．抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴの作製
得られたＡｕＣＮＴ（１ｍｇ）を蒸留水（１０ｍＬ）に入れ、５分間超音波処理によって分散し、ＡｕＣＮＴ溶液を得た。金ナノ粒子の表面にアミノ基を導入するため、システアミン（０．０１Ｍ、１ｍＬ）をＡｕＣＮＴ溶液に添加し、３０分間撹拌してから１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄みを除去し、アミン処理したＡｕＣＮＴを得た。一方、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；１００μＬ、１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；１００μＬ、１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、抗ヘマグルチニン（ＨＡ）抗体（１μＬ、Ａｂ６６１８９、Ａｂｃａｍ社製）を入れ、３０分間反応し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液にアミン処理したＡｕＣＮＴ（１ｍｇ／ｍＬ、３０μＬ）を混合し、３時間反応を行った。【００５２】
２．抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅの作製
抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴの作製と同様の操作によって、ＣｄＴｅの表面に抗ＨＡ抗体（Ａｂ６６１８９、Ａｂｃａｍ社製）を固定化させた。【００５３】
３．抗原−抗体反応によるインフルエンザウイルスの検出
抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅを混合した後、９６ウエルプレートに加え、インフルエンザウイルス（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、Ｈ１Ｎ１型、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社製）を添加後、１時間反応を行った。励起波長３８０ｎｍ、発光波長５１８ｎｍで蛍光強度を測定した。【００５４】
（実施例２）
１．抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴの作製
得られたＡｕＣＮＴ（１ｍｇ）を蒸留水（１０ｍＬ）に入れ、５分間超音波処理によって分散し、ＡｕＣＮＴ溶液を得た。金ナノ粒子の表面にアミノ基を導入するため、システアミン（０．０１Ｍ、１ｍＬ）をＡｕＣＮＴ溶液に添加し、３０分間撹拌してから１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄みを除去し、アミン処理したＡｕＣＮＴを得た。一方、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；１００μＬ、１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ；１００μＬ、１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、抗ノイラミニダーゼ（ＮＡ）抗体（１μＬ、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ｈ１Ｎ１型、Ｃｏｓｍｏ  ｂｉｏ社製）を入れ、３０分間反応し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液にアミン処理したＡｕＣＮＴ（１ｍｇ／ｍＬ、３０μＬ）を混合し、３時間反応を行った。【００５５】
２．抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅの作製
抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴの作製と同様の操作によって、ＣｄＴｅの表面に抗ＨＡ抗体（Ａｂ６６１８９、Ａｂｃａｍ社製）を固定化させた。【００５６】
３．抗原−抗体反応によるインフルエンザウイルスの検出
抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅを混合した後、９６ウエルプレートに加え、インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ＩｖＲ１１６、Ｈ１Ｎ１型、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社製）を添加後、１時間反応を行った。励起波長３８０ｎｍ、発光波長５１８ｎｍで蛍光強度を測定した。【００５７】
（紫外可視光スペクトル解析）
紫外可視光分光光度計（ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、ＡｕＣＮＴの吸光度を測定した結果を図３に示す。なお、図３において、横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は吸光度を示す。図３に示すように、実施例１で得られたＡｕＣＮＴは、約５５０ｎｍの波長において金ナノ粒子表面プラズモン共鳴による吸光ピークが観測された。また、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）を用いて同様に吸光度を測定すると、約５５０ｎｍの波長における吸光ピークは観測されなかった。【００５８】
（粉末Ｘ線回折パターン）
粉末Ｘ線回折装置（ＲＩＮＴ  ＵＬＴＩＭＡ、Ｒｉｇａｋｕ社製）を用いて、ＡｕＣＮＴのＸ線回折パターンを測定した結果を図４に示す。なお、図４において、横軸は２θを示し、縦軸は強度を示す。図４に示すように、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）では、（００２）面のみのパターンが観測されたが、実施例１で得られたＡｕＣＮＴでは、金ナノ粒子による多様な回折パターンが観測された。特に、炭素は金に比べて結晶性が低いので、回折パターンの強度が弱いことが確認できた。【００５９】
（透過型電子顕微鏡による観察）
透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−２１００Ｆ、ＪＥＯＬ社製）を用いて、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）及びＡｕＣＮＴを観察した結果を図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃに示す。カーボンナノチューブの場合は、図５Ａに示すように、直径１８０〜２００ｎｍ、長さ数マイクロメートルの透明なチューブ構造を示す像が得られた。一方、ＡｕＣＮＴの場合は、図５Ｂ及び図５Ｃに示すように、透明なチューブに直径１０〜１００ｎｍの黒色の粒子が固定されている像が得られた。さらに高い拡大倍率の像によれば、図５Ｂに示された黒色の粒子は、複数の金ナノ粒子の凝集体であり、個々の金ナノ粒子の粒子径は１０〜２０ｎｍであった。図５Ｃに示すＡｕＣＮＴでは、図５Ｂに示すＡｕＣＮＴと比較して、より小さな金ナノ粒子がカーボンナノチューブに数多く固定化されていた。【００６０】
（赤外吸収スペクトル解析）
実施例１で得られたアミン処理したＡｕＣＮＴについて、赤外吸収スペクトルを測定した結果を図６に示す。なお、図６において、横軸は吸収率（％）を示し、縦軸は波数（ｃｍ−１）を示す。図６に示すように、波数１４５０〜１５８０ｃｍ−１付近において、カーボンナノチューブを構成するベンゼン環（Ｃ６Ｈ６）の炭素−炭素二重結合の伸縮振動エネルギーを示す赤外吸収ピークが観測された。また、波数３４００〜３５００ｃｍ−１付近において、ＮＨ振動エネルギーを示す赤外吸収ピークが観測された。なお、実施例１では、金ナノ粒子を固定化したカーボンナノチューブとシステアミンとの反応により、システアミンのチオール基が金ナノ粒子表面に結合し、カーボンナノチューブに金ナノ粒子を介してアミノ基が導入される。【００６１】
（ＥＬＩＳＡ解析）
実施例１で得られた抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴと抗ＨＡ抗体を固定化していないＡｕＣＮＴとを用いて、それぞれＥＬＩＳＡ解析を行った。結果を図７Ａに示す。抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ（ＨＡ  Ａｂ／ＡｕＣＮＴ）の吸光度は、抗ＨＡ抗体を固定化していないＡｕＣＮＴの吸光度と比較して約４倍であり、抗ＨＡ抗体の抗原特異性が確認できた。また、抗原を添加しない場合、吸光度は検出できなかった。また、実施例２で得られた抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴを用いて、同様にＥＬＩＳＡ解析を行った。結果を図７Ｂに示す。抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴの場合（ＮＡ  Ａｂ／ＡｕＣＮＴ）も、抗ＮＡ抗体の抗原特異性が確認できた。【００６２】
また、実施例１で得られた抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴｅに、標的物質としてインフルエンザウイルス（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、Ｈ１Ｎ１型、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社製）を添加して振盪させた後に、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  マイクロスコピー  ＧｍｂＨ社製）及び微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ）を用いて抗ＨＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴを観察した。共焦点レーザー顕微鏡で得られた像を図８Ａに、微分干渉顕微鏡で得られた像を図８Ｂに示し、これらの像を重ねたものを図８Ｃに示す。図８Ｃに示すように、ＡｕＣＮＴに固定化された抗ＨＡ抗体とインフルエンザウイルスの抗原−抗体反応、及び、ＣｄＴｅに固定化された抗ＨＡ抗体とインフルエンザウイルスの抗原−抗体反応が進行することにより、ＣｄＴｅがＡｕＣＮＴの表面に集積し、ＣｄＴｅが蛍光を呈していた。【００６３】
次に、上記方法にしたがい、インフルエンザウイルス（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、Ｈ１Ｎ１型、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社製）の最終濃度（ウイルス濃度）を１０−３ｎｇ／ｍＬ（１ｐｇ／ｍＬ）〜１０３ｎｇ／ｍＬ（１μｇ／ｍＬ）の範囲で変化させ、実施例１で得られた複合体のＣｄＴｅの蛍光強度（ＰＬ強度）を測定した。横軸にウイルス濃度、縦軸に蛍光強度をプロットすると、図９に示すように、インフルエンザウイルスの濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの範囲では、ウイルス濃度の増加に伴いＣｄＴｅの蛍光強度が上昇した。なお、このときの蛍光の検出限界（下限値）は１ｎｇ／ｍＬであった。【００６４】
さらに、実施例２で得られた抗ＮＡ抗体固定化ＡｕＣＮＴ及び抗ＨＡ抗体固定化ＣｄＴＥと、標的物質としてインフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９ＩｖＲ１１６、Ｈ１Ｎ１型、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ社製）とを用いて、同様に、ウイルス濃度を１０−４ｎｇ／ｍＬ（０．１ｐｇ／ｍＬ）〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲で変化させ、実施例２で得られた複合体のＣｄＴｅの蛍光強度（ＰＬ強度）を測定した。横軸にウイルス濃度、縦軸に蛍光強度をプロットすると、図１０に示すように、相関係数０．９８以上の検量線が得られた。実施例２は、ＡｕＣＮＴに固定化した抗体とＣｄＴｅに固定化した抗体とが異なるため、さらに高感度でウイルスを検出できた。なお、このときの蛍光の検出限界（下限値）は０．１ｐｇ／ｍＬであった。【００６５】
したがって、本発明の検出方法によれば、標的物質の検出を簡便かつ非常に高感度に行うことができる。また、標的物質の濃度依存的に量子ドットの蛍光強度が上昇し、標的物質の濃度が０．１ｐｇ／ｍＬであっても、標的物質を検出することが可能である。さらに、従来の金属膜で行う検出方法と比較して、本発明の検出方法は、カーボンナノチューブを中心とした複合体を形成することによって、標的物質の有無による蛍光強度の差が大きくなり、標的物質の有無を判定することが極めて容易である。
【符号の説明】
【００６６】
１０…カーボンナノチューブ、２０…金属イオン、３０…金属ナノ粒子、４０…第１のプローブ、５０…標的物質、６０…量子ドット、６１…第２のプローブ、１００…金属イオン処理カーボンナノチューブ、２００…金属ナノ粒子を固定化したカーボンナノチューブ、３００…第１のプローブ固定化カーボンナノチューブ、４００…複合体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006593840.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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