(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞塊を培養容器内の載置面に平面的に配置し、上記細胞塊が培養されて相互に融合した細胞塊シートを作製する細胞塊シートの作製方法において、
細胞塊を個別に収容可能な大きさの収容部が規則的に形成されたガイド手段を、上記載置面上に設置するガイド設置工程と、
当該ガイド手段の上記収容部にそれぞれ細胞塊を収容し、上記載置面上に整列させる収容工程と、
上記載置面上に細胞塊が整列された後で、ガイド手段を退避させるガイド退避工程と、
上記載置面上に整列した細胞塊を培養して相互に融合させる培養工程とを有することを特徴とする細胞塊シートの作製方法。
【請求項２】
上記ガイド設置工程では、上記ガイド手段としての複数のピンを、上記載置面上に整列される各細胞塊の周囲に位置するように設けて、当該複数のピンとピンとの間によって上記収容部を構成し、
上記収容工程では、上記複数のピンとピンとの間に細胞塊を収容することを特徴とする請求項１に記載の細胞塊シートの作製方法。
【請求項３】
上記収容工程において、各収容部を構成する複数のピンとピンとの間に細胞塊が収容されると、隣接する収容部に収容された細胞塊同士が相互に接触することを特徴とする請求項２に記載の細胞塊シートの作製方法。
【請求項４】
上記ガイド退避工程の前に、上記ガイド手段の収容部に収容された状態で細胞塊を培養することを特徴とする請求項３に記載の細胞塊シートの作製方法。
【請求項５】
上記ガイド退避工程と培養工程の間に、整列した細胞塊を横方向から押圧して、隣接する細胞塊同士を接触させる押圧工程を有することを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の細胞塊シートの作製方法。
【請求項６】
上記載置面が細胞非接着性の性質を有することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の細胞塊シートの作製方法。
【請求項７】
上記収容工程において、細胞塊を上記収容部で複数個積層させることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の細胞塊シートの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞塊シートの作製方法および細胞塊シートに関し、詳しくは複数の細胞塊を培養容器内の載置面に平面的に配置し、上記細胞塊が培養されて相互に融合した細胞塊シートを作製する細胞塊シートの作製方法およびそのように作製した細胞塊シートに関する。
【背景技術】
【０００２】
損傷を受けた生体機能を幹細胞などを用いて復元させる再生医療においては、細胞を高密度に培養した細胞シートが使用されている。この細胞シートは極めて薄いため、何枚かの細胞シートを重ね合わせる積層化培養細胞シートの製造方法が知られている（特許文献１）。
また一方においては、予め細胞を略球状に培養した細胞塊（スフェロイド）を相互に接触した状態に並べて浮遊培養を行い、細胞塊同士が融合した５０〜３００μｍの厚みを有するシート状細胞塊（細胞塊シート）の作製方法が知られている（特許文献２）。
さらには、細胞塊を任意の空間に配置するための方法として、糸状体または針状体からなる支持体に細胞塊を貫通させる細胞の立体構造体の製造方法が知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４９２１３５３号公報
【特許文献２】特許第５５２３８３０号公報
【特許文献３】特許第４５１７１２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１のように細胞シートを積層化する場合、細胞シートは極めて薄いことから、取り扱いが難しく自動化することが困難であった。
また、特許文献２のように細胞塊を浮遊培養して細胞塊シートを得ようとした場合、細胞塊同士が不規則に融合するため、得られる細胞塊シートの形状が定まらず、厚さも不均一になるという問題があった。
さらに、特許文献３のように糸状体または針状体からなる支持体に細胞塊を貫通させる場合には、細胞にダメージを与えるおそれがあった。
このような問題に鑑み、本発明は形状が一定で厚さも均一にすることが可能で、自動化も容易な細胞塊シートの作製方法およびその方法で作製した細胞塊シートを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち請求項１の発明にかかる細胞塊シートの作製方法は、複数の細胞塊を培養容器内の載置面に平面的に配置し、上記細胞塊が培養されて相互に融合した細胞塊シートを作製する細胞塊シートの作製方法において、
細胞塊を個別に収容可能な大きさの収容部が規則的に形成されたガイド手段を、上記載置面上に設置するガイド設置工程と、
当該ガイド手段の上記収容部にそれぞれ細胞塊を収容し、上記載置面上に整列させる収容工程と、
上記載置面上に細胞塊が整列された後で、ガイド手段を退避させるガイド退避工程と、
上記載置面上に整列した細胞塊を培養して相互に融合させる培養工程とを有することを特徴としている。
【発明の効果】
【０００７】
上記請求項１の発明によれば、ガイド手段に形成された収容部に細胞塊を収容することで、細胞塊を培養容器の載置面上に規則的に整列させることができ、その際に細胞にダメージを与えることもない。
このように規則的に整列した状態で細胞塊を培養すれば、細胞塊が整列した状態で相互に融合し、ガイド手段で整列させた形状に細胞塊シートを作成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第１実施例にかかる細胞塊シート製造装置の構成図
【図２】収容容器および吸引ノズルについての断面図
【図３】培養トレイおよび培養容器についての斜視図
【図４】培養トレイおよび培養容器についての平面図
【図５】培養容器支持部についての側面図
【図６】検査手段についての側面図
【図７】培養液供給手段および細胞塊シート移動手段についての側面図
【図８】第１実施例で使用可能な培養トレイについての平面図
【図９】第１実施例で使用可能な培養トレイについての平面図およびピンの側面図
【図１０】第１実施例で使用可能な培養トレイについての平面図
【図１１】第１実施例で使用可能な培養トレイおよび培養容器についての側面図
【図１２】第１実施例で使用可能な培養液供給手段についての側面図
【図１３】第２実施例にかかる細胞塊シート製造装置の構成図
【図１４】培養容器の平面図
【図１５】培養容器の側面図
【図１６】ホルダを説明する平面図
【図１７】細胞塊シート移動手段についての側面図
【図１８】第２実施例で使用可能な培養容器の平面図
【図１９】細胞塊シート製造装置が設けられるアイソレータとインキュベータの正面図
【図２０】第３実施例にかかる細胞塊シート製造装置の構成図
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、図示実施例について説明すると、図１〜図７は第１実施例にかかる細胞塊シート製造装置１を説明するものであって、複数の細胞塊２（スフェロイド：図２参照）を培養容器３内に設けた平坦な載置面上に平面的に配置し、上記細胞塊２が培養されて相互に融合した細胞塊シート４（図６参照）を作製するものとなっている。
上記細胞塊２は、例えば特許第４５１７１２５号に開示される方法で作製することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで小さな細胞塊が形成され、これらがさらに融合することで外径寸法が５００μｍ程度までの略球状の細胞塊２が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル（略半球状の収容部）で培養することにより容易に細胞塊２を得ることができる。なお、細胞塊２の作製方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞塊２とは、細胞同士が集合し凝集化した１００〜５００μｍ程度の外径寸法を有した略球状の細胞集合体を指し、本発明における細胞塊シート４とは、このような細胞塊の複数を融合させてシート状に形成したものであり、厚さは用いる細胞塊２の寸法に応じて１００〜５００μｍ程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞塊２の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記細胞塊シート４は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。
【００１１】
本実施例の細胞塊シート製造装置１は、図１９に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ６１と、当該アイソレータ６１に接続可能に設けられたインキュベータ６２との内部に設けられている。また、アイソレータ６１には、搬入物を除染するためのパスボックス６３が設けられている。
図１は上記アイソレータ６１の内部に設けられた構成を示し、細胞塊２を収容する収容容器５を支持する収容容器支持部６と、細胞塊シート４の培養される培養容器３を支持する培養容器支持部７と、上記細胞塊２を保持する複数の保持手段としての吸引ノズル８と、上記吸引ノズル８を上記収容容器５および培養容器３に対して相対的に移動させる移動手段としてのノズル移動手段９と、上記培養容器３内の細胞塊シート４の培養状態を確認する検査手段１０（図６参照）とを備えている。
一方、図７は上記インキュベータ６２の内部に設けられた構成を示し、培養容器３上の細胞塊２もしくは細胞塊シート４に培養液を供給する培養液供給手段１１と、培養中の細胞塊シート４移動させる細胞塊シート移動手段１２とを備えている。このインキュベータ６２の内部では上記細胞塊２もしくは細胞塊シート４の培養が行われるため、これらインキュベータ６２の内部の構成は細胞塊培養装置もしくは細胞塊シート培養装置を構成するものとなっている。
なお、以下の説明において、図１における図示左右方向をＸ方向、前後方向をＹ方向、上下方向をＺ方向とし、図４では図示左右方向をＸ方向、上下方向をＹ方向とする。
【００１２】
上記アイソレータ６１は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ６１の正面には作業者が装着可能なグローブ６１ａが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ６１の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、これらの作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ６２は、内部が無菌環境に維持されるとともに、細胞塊シート４の培養に適した所定の温度および湿度に維持され、細胞塊２が培養されて融合し細胞塊シート４へと形成される間、上記インキュベータ６２を上記アイソレータ６１より分離して、当該アイソレータ６１より離れた場所で細胞塊２の培養を行うことが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ６１とインキュベータ６２とは接続手段６４によって接続されており、例えば特許第４６５６４８５号公報に記載されるような、インキュベータ６２とアイソレータ６１とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段を使用することができる。
【００１３】
図２は上記収容容器５の断面図を示し、収容容器５は平面視において縦横に複数の収容凹部５ａを備え、各収容凹部５ａの内部には培養液とともに略球状の細胞塊２が一個ずつ収容されている。
上記収容容器５の収容凹部５ａは、平面視におけるＸ方向およびＹ方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器３において作製する細胞塊シート４を構成する細胞塊２のＸ方向およびＹ方向の個数と同数、すなわちＸ方向に７個、Ｙ方向に７個それぞれ設けられている。
【００１４】
上記収容容器５を支持する収容容器支持部６は、位置決め片６ｂによってその上面で上記収容容器５を位置決めするとともに、上記ノズル移動手段９を構成するＹ方向テーブル６ａによって構成されている。
後述するように、本実施例の吸引ノズル８はＸ方向に７個設けられ、またＸ方向およびＺ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Ｙ方向テーブル６ａが収容容器５をＹ方向に移動させることで、吸引ノズル８と収容容器５とをＸＹＺの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に説明すると、最初に上記Ｙ方向テーブル６ａが収容容器５の１列目の収容凹部５ａを吸引ノズル８の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部５ａから吸引ノズル８が細胞塊２を吸着保持すると、Ｙ方向テーブル６ａが１列分だけＹ方向に収容容器５を移動させて、２列目の収容凹部５ａを吸引ノズル８の下方に位置させるようになっている。
【００１５】
図１に示すように、上記培養容器３内には昇降可能に培養トレイ１３が収容され、培養容器３は上記培養容器支持部７によって支持されるようになっている。
図３に示すように上記培養トレイ１３は略正方形の板状を有しており、図４に示すようにその上面は載置面１３ａとしてＸ方向およびＹ方向にそれぞれ７個の細胞塊２が相互に接触した状態で整列可能な大きさに設定されている。
細胞塊２を配置する培養トレイ１３の載置面１３ａは、細胞非接着性の性質を有しており、細胞塊２や細胞塊シート４が接着し難くなっている。細胞塊２が載置面１３ａに接着し難いため、隣接する細胞塊２同士が結びつこうとする働きが強くなり、細胞塊シート４の形成が促進される。
なお、細胞非接着性については、表面の性質を撥水性や超親水性とすることで得られ、これら性質を有する公知の材料を採用したり、表面処理やコーティング処理を施すことにより実現できる。また、その他に載置面１３ａの表面の性状としては、ＤＬＣ（ダイアモンド  ライク  カーボン）膜を形成することも可能である。
さらに、上記培養トレイ３は光を透過させる材料によって構成され、上記載置面１３ａにコーティング等を形成した場合には、当該コーティングも光を透過させるようになっている。
【００１６】
上記培養容器３は有底箱状を有するとともに内部には予め所定の深さで培養液が収容され、底面にはガイド手段Ｇとしての複数のピン１４が規則的に設けられている。
培養容器３の底面は上記培養トレイ１３と略同形に形成され、これにより上記培養トレイ１３の載置面１３ａ上に整列した細胞塊２のうち、外周側に位置する細胞塊２が培養容器３の内壁に接触し、これにより整列した細胞塊２を外側から移動しないように支持するようになっている。
また培養容器３は、透明な樹脂やガラスで形成され、光を透過させることが可能であり、培養容器３ごと上記検査手段１０において検査を行うことが可能となっている。
【００１７】
そして培養トレイ１３は培養容器３の底面に接触した下降位置と、当該下降位置に対して上昇した上昇位置とに位置するようになっている。
上記培養トレイ１３の四隅には支柱１５が設けられ、隣接する支柱１５同士はその上方に設けられた補強部材１６によって相互に連結されている。各支柱１５は上記培養容器３の内面に沿って上下方向（Ｚ方向）のみの移動が許容され、このため培養トレイ１３は水平状態を維持したまま上記培養容器３の内部を昇降可能となっている。
一方、上記培養容器３には、いずれかの支柱１５が通過する位置に設けられて、図示しないスプリング等によって出没するロック機構１７が設けられている。
上記支柱１５のうち、上記ロック機構１７を通過する支柱１５には上記ロック機構１７の係合する凹部１５ａが形成され、上記培養トレイ１３が上昇位置に位置すると上記ロック機構１７が突出して上記凹部１５ａに係合し、培養トレイ１３を上昇位置に保持するようになっている。
一方、この上昇位置から培養トレイ１３を上下に移動させる際には、上記支柱１５に対してＺ方向に所定の力を作用させればよく、これにより上記ロック機構１７がスプリングの付勢力に抗して退没し、上記凹部１５ａより離脱するようになっている。
【００１８】
上記ピン１４は培養容器３の底面に上方を向くように固定され、上記培養トレイ１３には上記ピン１４の位置に合わせて複数の貫通孔１３ｂが穿設されている。
従って、上記培養トレイ１３が下降位置に位置すると、上記ピン１４が上記貫通孔１３ｂを貫通して培養トレイ１３の上面に突出し、ガイド手段Ｇが培養トレイ１３上に設置された状態となる。
一方、培養トレイ１３が上昇位置に位置すると、培養トレイ１３が上記ピン１４の先端部よりも上方に位置して、ピン１４が貫通孔１３ｂより離脱するため、上記培養トレイ１３の載置面１３ａ上よりガイド手段Ｇが退避された状態となる。
【００１９】
次に、図４に示すように、本実施例では培養トレイ１３上にＸ方向およびＹ方向に向けて縦横に７個ずつの細胞塊２を整列させるようになっており、上記ピン１４を各細胞塊２の周囲に設けて、当該複数のピン１４とピン１４とによって形成された空間が、各細胞塊２を収容する収容部Ｇａを構成するようになっている。
具体的には、一個の細胞塊２の周囲を４本のピン１４によって囲繞し、また隣接するピン１４とピン１４との間隔を上記細胞塊２の直径よりも狭くなるようにする。
その結果、上記収容部Ｇａに細胞塊２を収容することで、隣接する収容部Ｇａに収容された細胞塊２同士を相互に接触させることができる。この時の細胞塊２同士の間隔や接触の程度はピン１４とピン１４との距離や、ピン１４の直径によって調整することができる。
そして本実施例のように、培養トレイ１３の載置面１３ａに細胞塊２を整列させた際に、上記細胞塊２と上記培養容器３の壁面とが接触するような場合には、当該壁面とピン１４とによっても上記収容部Ｇａが形成されることとなる。
【００２０】
図５に示すように、培養容器支持部７は、上記ガイド手段Ｇを移動させるガイド移動手段１８と、上記ノズル移動手段９を構成するＹ方向テーブル７ａとから構成されている。
上記ガイド移動手段１８は、培養トレイ１３に設けられた支柱１５の補強部材１６を保持して上記培養トレイ１３を所定高さに保持する保持手段１８ａと、上記培養容器３を支持して昇降させる昇降手段１８ｂとから構成されている。
上記保持手段１８ａが上記培養トレイ１３を保持した状態で、上記昇降手段１８ｂが培養容器３を昇降させることにより、培養容器３と培養トレイ１３とを相対的に昇降させ、培養トレイ３を下降位置および上昇位置に位置させることができる。
上記Ｙ方向テーブル７ａは、上記収容容器支持部６を構成するＹ方向テーブル６ａと同様、吸引ノズル８に吸着保持された細胞塊２が培養トレイ１３の上記収容部Ｇａに収容されるたびに、培養容器３ごと培養トレイ３の収容部Ｇａを上記Ｙ方向に一列ずつ移動させるものとなっている。
【００２１】
さらに、上記培養容器支持部７に隣接した位置には、上記培養トレイ１３上に整列した細胞塊２の上部に浮上防止手段としての押さえ蓋１９を供給する図示しない押さえ蓋供給手段が設けられている。
押さえ蓋供給手段としてはロボット等を用いることが可能であり、上記培養トレイ１３上に細胞塊２が整列されたら、当該整列した細胞塊２の上部に上記押さえ蓋１９を供給するようになっている。
上記押さえ蓋１９はメッシュ状もしくは多数の貫通孔が形成された部材となっており、当該押さえ蓋１９によって培養トレイ１３上の細胞塊２および細胞塊シート４への培養液の供給を阻害しないようになっている。
また押さえ蓋１９は培養トレイ１３と同様、光を透過させる材料によって構成され、また押さえ蓋１９における細胞塊２もしくは細胞塊シート４に接触する側は、上記培養トレイ１３の載置面１３ａと同様、細胞非接着性となっている。
【００２２】
次に、上記保持手段としての吸引ノズル８について説明すると、図２に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部８ａと、当該本体部８ａの下端部に設けられた管状の吸着部８ｂとを備えている。
上記吸着部８ｂの内径は上記細胞塊２より小径となっており、上記収容容器５の収容凹部５ａにおいて吸着部８ｂの先端に細胞塊２を吸着保持した際に、細胞塊２が当該吸着部８ｂの内部に吸い込まれないようになっている。
また培養トレイ１３の載置面１３ａにおいては、上記吸着部８ｂの中心位置をピン１４とピン１４とで形成した収容部Ｇａの略中央に位置させ、この状態で上記負圧発生手段による負圧を解消することで、当該収容部Ｇａに細胞塊２を配置することができる。
なお保持手段としては、細胞塊２を吸着保持する吸引ノズル８の他、グリッパなどによって細胞塊２を保持する等の構成を有したものであってもよい。
【００２３】
また上記吸引ノズル８を移動させる移動手段としてのノズル移動手段９は、上記収容容器支持部６および培養容器支持部７にかけてＸ方向に設けられたＸ方向レール２１と、当該Ｘ方向レール２１に沿って吸引ノズル８をＸ方向に移動させるＸ方向移動手段２２と、当該Ｘ方向移動手段２２に設けられてＺ方向に吸引ノズル８を昇降させるＺ方向移動手段２３と、上記収容容器支持部６および培養容器支持部７における上記Ｙ方向テーブル６ａ、７ａとによって構成されている。そして、これら吸引ノズル８のような保持手段とその移動手段とにより、細胞塊２の供給手段が構成されている。
また本実施例の吸引ノズル８はＸ方向に７個整列して設けられ、これら吸引ノズル８は間隔変更手段２４によってＸ方向にその間隔が変更されるようになっている。
具体的には、上記吸引ノズル８が収容容器支持部６の上方に位置した際には、間隔変更手段２４は上記収容容器５におけるＸ方向に整列した収容凹部５ａと同じ間隔に上記吸引ノズル８の間隔を変更する。
一方、吸引ノズル８が培養容器支持部７の上方に位置した際には、間隔変更手段２４は載置面１３ａ上に突出したピン１４によって形成された収容部ＧａにおけるＸ方向の間隔と同じ間隔に吸引ノズル８の間隔を変更する。
なお、吸引ノズル８についてはＹ方向に複数列設けることも可能であり、また収容容器支持部６の収容凹部５ａの間隔と、培養トレイ３上に形成された収容部Ｇａの間隔とが同じ場合には、上記間隔変更手段２４を省略することができる。
また例えば上記収容部Ｇａの間隔が狭い場合には、上記吸引ノズル８によって一つおきの収容部Ｇａに細胞塊２を収容させることも可能であり、その場合、最初に載置面１３ａにおける奇数番目の収容部Ｇａに細胞塊２を載置し、その後偶数番目の収容部Ｇａに細胞塊２を載置すればよい。
なお、吸引ノズル８は少なくとも１本備えられていれば良く、また、細胞塊２の供給手段としては、本実施例のように細胞塊２を移載する構成の他、多数の細胞塊２を収容した容器から１個ずつ繰り出すような構成であっても良い。
【００２４】
また上記Ｘ方向レール２１にはＸ方向に移動するカメラ２５が設けられており、上記カメラ２５は上記吸引ノズル８によって細胞塊２が培養トレイ１３上に配置されると、培養容器支持部７の上方まで移動して載置面１３ａを撮影するようになっている。
撮影された画像により、上記載置面１３ａにおける全ての収容部Ｇａに細胞塊２が配置されているか否かが確認され、必要に応じて細胞塊２の収容されていない収容部Ｇａに対して細胞塊２を収容するよう、指示することができる。
またカメラ２５は、上記ノズル移動手段９が吸引ノズル８を培養容器支持部７の上方に位置させる際には、吸引ノズル８との接触を避けるために培養容器支持部７の上方から退避するようになっている。
【００２５】
図６に示す検査手段１０は、下方に設けられた照明手段２６と、上方に設けられたカメラ２７とを備え、上記培養容器３は図示しないロボットやその他の手段によって照明手段２６とカメラ２７との間で保持されるようになっている。
上述したように、上記培養トレイ１３、培養容器３の底部、押さえ蓋１９はそれぞれ光透過性の材料によって構成されているため、上記照明手段２６が照射した光は、これら培養トレイ３や培養容器３の底部を透過し、培養トレイ１３上の細胞塊２もしくは細胞塊シート４を透過してカメラ２７に受光されるようになっている。
上記カメラ２７は撮影した細胞塊２もしくは細胞塊シート４から、これらの培養状態を確認し、その際培養状態の良否に応じて培養の継続や停止を判断することができる。
なお、本実施例では上記照明手段２６およびカメラ２７はアイソレータ６１の内部に設けられているが、上記アイソレータ６１の一部を外部に突出させるとともに、当該突出部の上部および下部を光透過性の部材として、これらの部材の間で上記培養容器３を保持するようにしてもよい。
【００２６】
図７はインキュベータ６２の内部に設けられた、上記細胞塊シート４に培養液を供給する培養液供給手段１１と、培養中の細胞塊シート４を上記培養トレイ１３上で移動させる細胞塊シート移動手段１２とを示している。
上記インキュベータ６２の内部に複数の培養容器３を収容する場合には、各培養容器３のそれぞれについて上記培養液供給手段１１および細胞塊シート移動手段１２を設けることができる。
上記培養容器３にはその下方に接続口３ａが設けられており、具体的には、接続口３ａは上記培養トレイ１３が上昇位置に位置した状態で、当該培養トレイ１３よりも下方に位置するように設けられている。
上記培養液供給手段１１は、一端が上記接続口３ａに接続され他端が上記培養容器３の上方から培養液の液面に挿入された配管３１と、当該配管３１に設けられた培養液を送液する送液ポンプ３２とから構成されている。
上記送液ポンプ３２は、上記培養容器３の上方側から培養液を吸引するとともに、当該培養液を上記接続口３ａを介して培養トレイ容器３の下方から流入させ、これにより培養容器３内において培養液を循環させるようになっている。
【００２７】
一方、上記培養トレイ１３は培養容器３内において上昇位置に位置した状態でインキュベータ６２に搬入され、このため上記培養トレイ１３の下方に上記ピン１４が位置している。
そして上記ピン１４の位置に合わせて培養トレイ１３には、上下に貫通する貫通孔１３ｂが穿設されており、具体的には上記培養トレイ１３の載置面１３ａ上に整列した上記細胞塊２と細胞塊２との間となる位置に穿設され、培養トレイ１３の載置面１３ａ側と下面側とを連通させている。
このような構成により、上記培養液供給手段１１が供給した培養液は、上記貫通孔１３ｂを通過して培養トレイ１３の下面側より載置面１３ａ側、すなわち載置面１３ａと上記細胞塊シート４の裏面側との間に供給されるようになっており、上記貫通孔１３ｂを培養液の供給孔として使用することができる。
その結果、細胞塊シート４における培養トレイ１３に接触する裏面側に培養液を供給して接触させることができ、培養トレイ１３に接触することで培養液の供給が不十分になりがちな、細胞塊シート４の裏面側の培養を良好に行うことができる。
なお、送液ポンプ３２の送液方向を逆にした場合は、貫通孔１３ｂを介して細胞塊シート４の裏面側から培養液が吸引されるため、細胞塊シート４の周囲から裏面側に培養液が流入して、培養液の供給が行われる。この場合、貫通孔１３ｂは排出孔として機能する。
【００２８】
上記細胞塊シート移動手段１２としては、上記培養トレイ１３に穿設した貫通孔１３ｂと、上記培養容器３に設けられて上記貫通孔１３ｂを貫通するピン１４とを使用することができる。
またインキュベータ内には、上記培養トレイ１３に設けられた支柱１５の補強部材１６を保持する保持部材３３と、当該保持部材３３を昇降させる昇降手段３４とが設けられ、上記昇降手段３４により保持部材３３が昇降することで上記培養容器３内を培養トレイ１３が昇降するようになっている。
図７（ｂ）に示すように、上記昇降手段３４が培養トレイ１３を下降させて上記ピン１４が培養トレイ１３の下方から貫通すると、当該ピン１４が培養トレイ１３より若干突出して細胞塊シート４を下方から押し上げるようになっている。
ここで培養トレイ３の載置面１３ａは非接着性に形成されているため、上記ピン１４によって細胞塊シート４を載置面１３ａから容易に剥離させることができる。
そして上記細胞塊シート移動手段１２は所定の間隔で作動し、このように作用することにより、培養が終了した際に細胞塊シート４を培養容器３から容易に回収することができ、また、培養中においては細胞塊２に刺激を与え、細胞塊２を活性化することが期待される。
なお、ピン１４は貫通孔１３ｂから完全に抜き出さなくても良い。
【００２９】
以下、上記構成を有する細胞塊シート製造装置１を用いた細胞塊シート４の作製方法を説明する。
最初に、上記パスボックス６３を介して上記細胞塊２が収容された収容容器５や、上記培養トレイ１３が収容された培養容器３を上記アイソレータ６１内に搬入したり、培養容器３に所定量の培養液を供給する準備工程を行う。
その際、アイソレータ６１の内部に上記収容容器５や培養容器３を複数搬入すれば、複数の培養容器３を用いて複数の細胞塊シート４を連続して作成することが可能となる。
【００３０】
次に、上記ガイド手段Ｇとしてのピン１４を上記培養トレイ１３の載置面１３ａに設置するガイド設置工程を行う。具体的には、上記培養容器支持部７において、上記ガイド移動手段１８が培養トレイ１３を下降位置に位置させ、これにより培養トレイ１３の上面に上記ピン１４が突出し、収容部Ｇａの形成されたガイド手段Ｇが載置面１３ａ上に設置されることとなる。
なお、このガイド設置工程については、予め培養トレイ１３を下降位置に位置させた培養容器３をアイソレータに搬入することで、上記準備工程と同時に行うことができる。
【００３１】
このようにして上記培養トレイ１３にガイド手段Ｇが設置されたら、続いて上記吸引ノズル８を移動させて、当該ガイド手段Ｇの上記収容部Ｇａにそれぞれ細胞塊２を収容する収容工程を行う。
上記ノズル移動手段９が吸引ノズル８を移動させ、また間隔変更手段２４が吸引ノズル８の間隔を変更しながら、収容容器５の収容凹部５ａから細胞塊２を吸着保持し、この整列した細胞塊２を培養容器３の培養トレイ１３に設置されたガイド手段Ｇの収容部Ｇａに収容する。
上記収容部Ｇａは細胞塊２の周囲を囲繞する４本のピン１４によって構成されていることから、当該収容部Ｇａに収容された細胞塊２の飛び出しが防止され、細胞塊２の整列状態が維持されるようになっている。
このようにして全ての収容部Ｇａに細胞塊２が収容されると、上記カメラ２５が培養容器支持部７の上方に移動して載置面１３ａ上の細胞塊２を撮影し、細胞塊２が全ての収容部Ｇａに収容されているか否かを確認する。
【００３２】
続いて、培養トレイ１３上に整列した細胞塊２の上部に押さえ蓋１９を配置する浮上防止工程を行う。
具体的には、図示しない押さえ蓋供給手段もしくはグローブ６１ａを装着した作業者が上記培養容器３の内部に押さえ蓋１９を投入し、当該押さえ蓋１９によって載置面１３ａ上の細胞塊２の浮き上がりを防止する。
【００３３】
次に、上記ガイド手段Ｇの収容部Ｇａに細胞塊２が収容された状態から、上記培養トレイ１３の載置面１３ａ上よりガイド手段Ｇとしてのピン１４を退避させるガイド退避工程を行う。
具体的には、培養容器支持部７の上記ガイド移動手段１８によって培養トレイ１３を培養容器３に対して上昇位置に位置させ、これにより上記載置面１３ａの上面から突出していたピン１４が載置面１３ａから退避された状態となる。
また上記収容部Ｇａに収容された際に隣接する細胞塊２同士が接触するようにされていることから、載置面１３ａ上には縦横に整列した細胞塊２が接触した状態を維持したまま残ることとなる。
【００３４】
このようにして培養トレイ１３上に細胞塊２が整列されると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養トレイ１３は培養容器３ごとインキュベータ６２に移送され、当該培養トレイ１３上に整列した細胞塊２を培養する培養工程が行われる。
まず上記培養トレイ１３がインキュベータ６２に移送されると、当該インキュベータ６２は上記アイソレータ６１より分離され、アイソレータ６１より離隔した位置に載置される。
そしてインキュベータ６２内は所定の温度、湿度に維持されるとともに所定の炭酸ガスや酸素の濃度が維持され、培養トレイ１３上の細胞塊２が培養されることにより、隣接する細胞塊２同士が融合して、最終的に一枚の細胞塊シート４を形成することとなる。
この時、細胞塊２は培養トレイ１３の載置面１３ａ上で整列し、かつ接触した状態を維持しているため、形成された細胞塊シート４は上記培養トレイ１３の載置面１３ａの形状と略同一の形状を有することとなり、かつその厚さを略均一のものとすることができる、
【００３５】
上記培養工程の間、インキュベータ６２内では所定の間隔で培養トレイ１３上の細胞塊２もしくは細胞塊シート４に培養液を供給する培養液供給工程と、培養トレイ１３上の細胞塊シート４移動させる細胞塊シート移動工程が行われる。
上記培養液供給工程として、培養液供給手段１１は所定の間隔で作動するようになっており、培養容器３内では下方から上方へと培養液の流れを発生させ、これにより細胞塊２もしくは細胞塊シート４に新たな培養液を供給するようになっている。
また培養トレイ１３は培養容器３内で上昇位置に位置し、また上記供給孔としての貫通孔１３ｂが穿設されていることから、当該貫通孔１３ｂを介して細胞塊シート４と載置面１３ａの間に培養液を供給することができ、細胞塊シート４の裏面側を効率的に培養することができる。
つまり、本実施例のように細胞塊２を整列させて細胞塊シート４を作製する場合、中央に位置する細胞塊２の裏面側には十分に培養液が行き渡らないという問題があったが、この培養液供給工程を行うことで、当該部分に位置する細胞も良好に培養することが可能となった。
【００３６】
そして隣接する細胞塊２同士が融合し、細胞塊シート４が形成されると、上記細胞塊シート移動工程として上記昇降手段３４により上昇位置に位置した培養トレイ３を下降させる。
すると培養トレイ３の上面に上記ピン１４が突出して、当該ピン１４により細胞塊シート４が下方から押し上げ、細胞塊シート４を培養トレイ３から剥離させる。その際、培養トレイ３の表面は非接着性に形成されているため、少ない押圧力で細胞塊シート４を剥離させ上方に移動させることが可能となっている。
この細胞塊シート移動工程を所定の間隔で行うことにより、細胞塊シート４が培養トレイ３に付着しない状態、もしくはより小さな力で培養トレイ３より剥離可能な状態を維持することができ、また適度な刺激を与えることができる。
【００３７】
上記培養工程により細胞塊シート４がある程度形成されると、一定の期間ごとにインキュベータ６２をアイソレータ６１に接続して、当該細胞塊シート４の培養状態を確認する検査工程を行う。
検査工程では接続されたインキュベータ６２からアイソレータ６１へと培養容器３が移送され、さらに図６に示す上記検査手段１０へと移送される。
検査手段１０では下方から照明手段２６が照射した光が上記培養容器３、培養トレイ１３、細胞塊シート４、押さえ蓋１９を透過し、カメラ２７が撮影した映像に基づいて細胞塊シート４の培養の良否が検査される。
そして当該検査工程において細胞塊シート４が十分に培養されていると判断された場合には、引き続き上記培養容器３より細胞塊シート４を回収する回収工程が行われる。
上記培養工程の間に上記細胞塊シート作用工程を行ったことにより、回収工程ではトリプシンなどの薬品を使用せずに細胞塊シート４を載置面１３ａより剥離させて回収することができ、細胞へのダメージを極力抑えることができる。
【００３８】
なお上記実施例におけるガイド退避工程は、培養トレイ３を上記インキュベータ６２に移送する前に行っているが、当該ガイド退避工程をインキュベータ６２の移送した後に行ってもよい。
具体的には、上記ガイド手段Ｇとしてのピン１４が培養トレイ１３の載置面１３ａ内に突出した状態のまま上記培養工程を行い、隣接する細胞塊２が融合して細胞塊シート４が形成されてから、ピン１４を形成された細胞塊シート４より抜くことが可能である。また、ある程度細胞塊２が培養した後でガイド退避工程を行い、培養を継続するようにしてもよい。
【００３９】
さらに上記実施例における培養液供給工程に対し、上記培養工程を行う間に上記培養トレイ１３を上下に移動させ、貫通孔１３ｂにピン１４を挿抜することで、当該ピン１４の動作によって貫通孔１３ｂ内に培養液を押し込み、または引き出して流通させ、細胞塊シート４の裏面側に培養液を供給するようにしてもよい。
【００４０】
そして上記実施例における細胞塊シート移動工程に対し、上記培養液供給手段１１によって培養液を所定の圧力で供給し、上記培養トレイ１３の貫通孔１３ｂから培養液を上方に向けて噴出させることで、細胞塊シート４を下方から押し上げるようにしてもよい。
その場合には上記細胞塊シート移動手段１２としての保持部材３３および昇降手段３４を省略して、当該細胞塊シート移動手段１２として上記培養液供給手段１１を使用することが可能となる。
【００４１】
図８は上記第１実施例の細胞塊シート製造装置１で使用可能な、培養トレイ１３およびガイド手段Ｇとしてのピン１４のバリエーションを説明するものである。
図８に示す培養トレイ１３には上記細胞塊２を千鳥状に載置するようになっており、具体的にはＸ方向において細胞塊２は直線状に整列され、Ｙ方向では細胞塊２が半個分ずれながら整列されるようになっている。
このように細胞塊２を整列させるため、上記培養トレイ１３に穿設される貫通孔１３ｂおよびガイド手段Ｇとしてのピン１４は、各細胞塊２の周囲に６本のピン１４を位置させて収容部Ｇａを形成するように配置される。
またこの培養トレイ１３においても、隣接するピン１４とピン１４との間で細胞塊２が接触するようになっており、上記実施例と同様、上記ピン１４を除去しても細胞塊２同士が接触した状態を維持することができる。
なお、図４や図８に示す培養トレイ１３における、上記貫通孔１３ｂおよびピン１４の配置に限らず、例えば円形の培養トレイ１３に同心円状に細胞塊２を配置する等、様々な態様で細胞塊２を整列させることができる。
【００４２】
図９も上記第１実施例の細胞塊シート製造装置１で使用可能な、培養トレイ１３およびガイド手段Ｇとしてのピン１４のバリエーションを説明するものである。
本実施例の培養トレイ１３には、図９（ａ）に示すように、上記第１の実施例同様、各細胞塊２の周囲に４本のピン１４を位置させて、細胞塊２を縦横に整列させるようになっている。
上記ピン１４は図４に示すピン１４よりも大径となっており、また上記貫通孔１３ｂはこのピン１４の直径よりも大きく形成され、ピン１４と貫通孔１３ｂの開口部との間に隙間が形成されるようになっている。また貫通孔１３ｂの４隅には、それぞれ細胞塊２の形状に合わせて４つの円弧状の逃がし部が形成されている。
このようにピン１４と貫通孔３ａの開口部との間に隙間が形成されるように貫通孔１３ｂを大きくすることで、培養液供給工程において上記供給孔としての貫通孔３ａからより多くの培養液を細胞塊２もしくは細胞塊シート４の裏面側に供給することが可能となる。
一方、図９（ｂ）に示すように上記ピン１４の先端部にはテーパ部１４ａが形成されており、当該テーパ部１４ａによってピン１４ａとピン１４ａとの間で細胞塊２同士の接触が妨げられないようになっている。
【００４３】
図１０も上記第１実施例の細胞塊シート製造装置１で使用可能な、培養トレイ１３のバリエーションを説明するものであり、ここでは図８で使用した培養トレイ１３を用いて説明する。
本実施例の培養トレイ１３は、上記ピン１４の貫通する貫通孔１３ｂに加えて、上記収容部Ｇａに該当する位置、すなわち細胞塊２が載置される位置に供給孔１３ｃを設けたものとなっている。
すなわち、上記培養液供給工程において、上記貫通孔３ａおよび上記供給孔３ｂからも培養液を細胞塊シート４の裏面側に供給することが可能となり、多くの培養液を流通させることが可能となっている。
上記いずれの実施例においても、整列された細胞塊２の外周側にはピン１４を配置していないが、外周側にもピン１４を配置して培養容器３の内壁に細胞塊２が触れないよう構成することもできる。
この場合には、この外周側のピン１４については、これ以外のピン１４をガイド手段退避工程において載置面１３ａ上から除去しても、載置面１３ａ上に残るように構成する。
より具体的には、外周側のピン１４をそれ以外のピン１４よりも長くし、上記ガイド移動手段１８によって培養トレイ１３を培養容器３に対して上昇位置に位置させた際に、外周側のピン１４は載置面１３ａに突出した状態を維持するようにする。これら外周側のピン１４も退避させる必要がある場合には、さらに培養トレイ１３を上記上昇位置よりさらに上昇できるよう、上昇位置を２段階に設定すればよい。
【００４４】
図１１は上記第１実施例の細胞塊シート製造装置１で使用可能な、培養トレイ１３および培養容器３のバリエーションを説明するものとなっている。
本実施例の培養トレイ１３は有底箱状を有しており、細胞塊２の載置される載置面１３ａと、これに隣接して設けられた側面１３ｃとを有しており、図３における培養トレイ１３および培養容器３と異なり、培養トレイ１３の側面１３ｃによって整列された細胞塊２を支持するようになっている。
培養容器３の底面は上記培養トレイ１３に対して一回り大きく形成され、このため培養トレイ１３の側面と培養容器３の内壁との間には隙間が形成されている。
上記隙間には、上記培養トレイ１３の側面に設けられたスライド部材４１と、培養容器３に上下方向に向けて設けられたガイドレール４２が備えられ、これにより培養トレイ１３はこのガイドレール４２に沿って培養容器３内を昇降するようになっている。
そして上記培養トレイ１３はヒンジ４３を介して揺動可能に設けられた係止部材４４を備えており、図１１（ｂ）に示すように培養トレイ１３が上昇位置に位置した状態で、上記ヒンジ４３により係止部材４４が外側に倒れ、培養容器３の上端部に係止されるようになっている。
上記ガイド手段Ｇとしては、図３に示す培養トレイ１３および培養容器３と同様、培養トレイ１３に設けた貫通孔１３ｂに、培養容器３の底面に設けたピン１４を貫通させることにより、当該ピン１４を培養トレイ１３の載置面１３ａ上に突出させる構成を有している。
そして上記培養トレイ１３を培養容器３の内部で移動させて、上記ピン１４を突出させるガイド移動手段１８としては、図５における保持手段１８ａ、昇降手段１８ｂに代えてロボット等を使用することができる。
【００４５】
図１２は上記第１実施例の細胞塊シート製造装置１で使用可能な、培養液供給手段１１のバリエーションを説明するものである。
図７に示す培養液供給手段１１は、上記配管３１および送液ポンプ３２を用いて培養容器３内の培養液を循環させて培養液の供給を行う構成となっているが、この図１２の培養液供給手段１１は上記培養容器３内に新鮮な培養液を供給可能な構成を有している。
具体的に説明すると、上記培養液供給手段１１は、新鮮な培養液を貯溜する培養液タンク５１と、当該培養液タンク５１と上記培養容器３の接続口３ａとの間に接続された供給配管５２と、当該供給配管５２に設けられた送液ポンプ５３と、一端が上記培養容器３の培養液に挿入され、他端が図示しない排液タンクに接続された排出配管５４と、当該排出配管５４に設けられた排液ポンプ５５とから構成されている。
上記構成によれば、上記送液ポンプ５３によって培養液タンク５１の新鮮な培養液を培養容器３に供給しつつ、培養容器３内の使用済みの培養液を上記排液ポンプ５５によって排出することで、培養容器３内に新鮮な培養液を流通させることができる。
この場合において、図示のように培養トレイ１３の下方に培養液を供給し、上方から排出させても良いが、逆に上方に供給して、下方から排出させるようにしても良い。
【００４６】
次に、図１３〜図１６は第２実施例にかかる細胞塊シート製造装置１および細胞塊シート４の製造方法を説明するものである。なお、第１実施例の構成と共通する構成についての説明は省略し、また共通する構成については同じ符号を付して説明する。
本実施例の培養容器１０３は、図１３、１４に示すように有底箱状を有するとともに予め培養液が収容されており、細胞塊２は当該培養容器１０３の底面である載置面１０３ａ上に載置されるようになっている。
図１３（ａ）に示す本実施例のガイド手段Ｇは、上記培養容器１０３の載置面１０３ａ上に載置されるとともに、当該載置面１０３ａ上から保持されて退避されるようになっている。
またガイド手段Ｇは、複数の収容部Ｇａが区画された区画部材１０４からなり、細胞塊２をＸ方向およびＹ方向の縦横にそれぞれ整列させるようになっている。
ここで、各収容部Ｇａの大きさは上記細胞塊２の外径寸法よりも若干大きく設定されている。
上記収容部Ｇａに細胞塊２を収容した後、上記ガイド手段Ｇを培養トレイ１０３より退避させることにより、当該培養容器１０３の載置面１０３ａ上に細胞塊２を整列した状態で配置することができる。
【００４７】
本実施例の培養容器１０３には、上記載置面１０３ａ上に整列された細胞塊２を横方向より押圧して、隣接する細胞塊２同士を接触させる押圧手段１０５が設けられている。
上記押圧手段１０５は、上記培養容器１０３上に整列された細胞塊２に対して相対する第１の対向方向（Ｙ方向）から相互に接近して、Ｙ方向から細胞塊２を押圧する第１押圧部材１１１と、上記Ｙ方向に直交する第２の対向方向（Ｘ方向）から相互に接近してＸ方向に細胞塊２を押圧する第２押圧部材１１２と、上記培養容器支持部７に設けられて上記第１、第２押圧部材１１１、１１２を進退動させる移動手段１１３とから構成されている。
上記培養容器１０３の４つの側面１０３ｂにはそれぞれ外部から内部に貫通する連結棒１１１ａ、１１２ａが摺動可能に設けられており、当該連結棒１１１ａ、１１２ａにおける培養容器１０３の内部側の端部にそれぞれ上記第１、第２押圧部材１１１、１１２が設けられている。
上記連結棒１１１ａ、１１２ａには上記培養容器１０３の側面１０３ｂを挟んで二つのストッパ部材１１１ｂ、１１２ｂが設けられており、当該ストッパ部材１１１ｂ、１１２ｂの間隔で連結棒１１１ａ、１１２ａのストローク量が定められている。
このような構成により、第１、第２押圧部材１１１、１１２はそれぞれ後退位置（図１４（ａ））もしくは前進位置（図１４（ｃ）（ｄ））に往復動可能となっている。なお、図１５にも示すように、第１、第２押圧部材１１１、１１２の上方は、押さえ蓋１９により覆われており、押圧動作中に細胞塊２が浮び上ることを防止している。
【００４８】
上記後退位置に位置した第１押圧部材１１１の間隔および第２押圧部材１１２の間隔は、それぞれ上記ガイド手段Ｇを構成する区画部材１０４のＸ方向およびＹ方向の長さと略同一に設定されている。
図１４（ｃ）に示すように第１押圧部材１１１を前進位置に移動させると、第１押圧部材１１１によって細胞塊２がＹ方向に押圧され、これにより整列した細胞塊２におけるＹ方向の隙間が解消される。
これと同様、図１４（ｄ）に示すように第２押圧部材１１２を前進位置に移動させると、第２押圧部材１１２によって細胞塊２がＸ方向に押圧され、これにより整列した細胞塊２におけるＸ方向の隙間が解消される。
ここで、第２押圧部材１１２を前進位置に移動させる際には、第１押圧部材１１１との接触を避けるため、上記第１押圧部材１１１を予め後退位置に移動させるようになっている。
そして、第１、第２押圧部材１１１、１１２によって細胞塊２をＹ方向およびＸ方向からそれぞれ押圧することにより、培養容器１０３上の細胞塊２は、隣接する細胞塊２同士が相互に接触した状態で整列することとなる。
【００４９】
このようにして押圧手段１０５によって隣接する細胞塊２同士が相互に接触した状態で整列すると、当該整列した細胞塊２の外縁には図１６に示すようなホルダ１１４が装着されるようになっている。
上記ホルダ１１４は相互に接触した細胞塊２におけるＸ方向およびＹ方向の幅と略同一に設定された枠状の部材となっており、細胞塊２の整列状態が崩れないように外側から支持するものとなっている。
またホルダ１１４は上面にメッシュが設けられており、当該ホルダ１１４の内部における細胞塊２の浮き上がりおよび移動が規制され、また培養液の流通を許容して内部の細胞塊２の培養を阻害しないようになっている。
【００５０】
図１７は上記インキュベータ６２の内部に設けられた細胞塊シート移動手段１２１を示し、上記培養トレイ１０３に設けられた上記第１、第２押圧部材１１１、１１２と、インキュベータの内部に設けられて上記第１、第２押圧部材１１１、１１２を往復動させる移動手段１１５とによって構成されている。
上記第１、第２押圧部材１１１、１１２は上記移動手段１１５によって往復動することで、上記ホルダ１１４の装着された細胞塊２を、当該ホルダ１１４ごと横方向から押圧するようになっている。
上記培養容器１０３の載置面１０３ａについても細胞非接着性とされていることから、横方向から押圧することで細胞塊シート４を移動させることができる。
また、培養容器１０３に接続口１０３ｃを設けて、第１実施例に記載した培養液供給手段１１と同様、培養容器１０３内の培養液を循環させるようにしてもよい。
【００５１】
上記構成を有する第２実施例の細胞塊シート製造装置１を用いた細胞塊シート４の作製方法について説明する。
まず、上記アイソレータ内に収容容器５や培養容器１０３を搬入する搬入工程、培養容器１０３に培養液を貯溜する準備工程を行う。上記培養容器１０３を培養容器支持部７に載置する際には、上記第１、第２押圧部材１１１、１１２の連結棒１１１ａ、１１２ａに、培養容器支持部７の移動手段１１３を連結する。
次に、図１４（ａ）に示すように上記培養容器１０３に上記ガイド手段Ｇを設置するガイド設置工程を行うとともに、上記吸引ノズル８により培養容器１０３に設置されたガイド手段Ｇの収容部Ｇａに細胞塊２を収容する収容工程を行う。
上記収容工程によりガイド手段Ｇの収容部Ｇａに細胞塊２を収容したら、図１４（ｂ）に示すように上記培養容器１０３からガイド手段Ｇを退避させるガイド退避工程を行い、さらに培養容器３上に整列した細胞塊２の上部に押さえ蓋１９を配置する浮上防止工程を行う。
なお、上記ガイド設置工程、ガイド除去工程、浮上防止工程については、作業者もしくはロボットによって行うことができる。
【００５２】
上記ガイド退避工程および浮上防止工程に続いて、上記培養容器支持部７において、培養容器１０３上の細胞塊２を横方向から押圧してこれらを相互に接触させる押圧工程を行う。
すなわち、上記ガイド退避工程においてガイド手段Ｇが退避された状態では、細胞塊２は整列しているものの、これらの間には隙間が形成される場合があり、この状態で培養を行っても、細胞塊２同士の融合が発生しない場合がある。
そこで、まず図１４（ｃ）に示すように、第１押圧部材１１１によって細胞塊２をＹ方向に移動させてから、図１４（ｄ）に示すように第２押圧部材１１２によって細胞塊２におけるＸ方向に移動させ、培養トレイ１０３上の細胞塊２が相互に接触した状態で整列させる。
【００５３】
上記押圧工程により細胞塊２同士が接触したら、上記整列した細胞塊２の上部に設けた押さえ蓋１９を除去し、また第２押圧部材１１２を後退位置に位置させてから、上記整列した細胞塊２の外周にホルダ１１４を装着するホルダ装着工程を行う。
上記ホルダ１１４が装着されることにより、当該ホルダ１１４の内部での細胞塊２の移動が阻止されることとなり、これにより細胞塊２は相互に接触した整列状態を維持することができる。
【００５４】
続いて、上記培養容器１０３は上記インキュベータ６２に移送され、インキュベータ６２内において培養工程が行われる。
培養工程が所定の期間行われて、ホルダ１１４の内部で細胞塊２同士が融合し、細胞塊シート４が形成されると、当該細胞塊シート４を移動させる細胞塊シート移動工程が行われる。
上記培養容器１０３にはホルダ１１４の装着された細胞塊シート４が位置しており、上記インキュベータ６２に設けられた移動手段１１５が上記第１、第２押圧部材１１１、１１２を移動させてホルダ１１４ごと細胞シート４を横方向から押圧する。
細胞塊シート移動工程により細胞塊シート４を移動させることにより、細胞塊シート４と培養容器１０３との間に培養液が入り込むため、細胞塊シート４の裏面側に位置する細胞に対して培養液を供給することが可能となっている。
なお、本実施例では第１、第２押圧部材１１１、１１２によってホルダ１１４内の細胞塊シート４をＸ方向およびＹ方向に移動させることができるが、第１押圧部材１１１もしくは第２押圧部材１１２の一方にのみ移動手段１１５を連結して、Ｘ方向もしくはＹ方向のいずれか一方向だけ移動させるようにしてもよい。
【００５５】
図１８は上記第２実施例における細胞塊シート製造装置１で使用可能な培養容器１０３を説明するものとなっており、上記第２実施例における培養容器１０３のバリエーションを説明するものである。
上記第１押圧部材１１１は、その両端部がスプリング等の付勢力によって伸縮可能に設けられており、当該第１押圧部材１１１が伸びた状態では、上記ガイド退避工程によってガイド手段Ｇが退避された状態における、相互に隙間の形成された細胞塊２の幅を有している。
従って、当該第１押圧部材１１１を前進位置に移動させることで、上記細胞塊２をＹ方向に押圧し、整列した細胞塊２におけるＹ方向の隙間を解消することができる。
上記第１押圧部材１１１は伸縮可能となっていることから、当該第１押圧部材１１１を前進位置に位置させたまま、第２押圧部材１１２を接近状態に位置させることができる。
すると第２押圧部材１１２は細胞塊２を押圧しながら、第１押圧部材１１１も押圧し、これにより上記第１押圧部材１１１を縮めることが可能となっている。
これにより、第１、第２押圧部材１１１、１１２をともに前進位置に位置させた状態で細胞塊２を整列させることができ、第２押圧部材１１２を前進位置に位置させる際に細胞塊２がＹ方向にずれて移動してしまうのを防止することができる。
【００５６】
なお、上記第１、第２実施例については、適宜その内容を組み合わせることができる。
例えば第２実施例における培養容器１０３を第１実施例における培養トレイ３に代えて培養容器３に収容し、上記培養容器１０３の底面に貫通孔を穿設するとともに培養容器３の底面に設けたピン１４を貫通させれば、当該ピン１４をガイド手段Ｇとして使用することができる。
この場合、上記培養容器１０３には押圧手段１０５が設けられているため、上記ガイド手段Ｇの収容部Ｇａに収容される細胞塊２同士を接触させる必要がなくなるため、容易にピン１４とピン１４とによって形成した収容部Ｇａに細胞塊２を収容させることができ、その後上記押圧手段押圧手段１０５を作動させて押圧工程を行えば、細胞塊２同士を接触した状態で整列させることができる、
またこのような構成にすれば、上記培養容器１０３に設けた貫通孔を供給孔として培養液を細胞塊シート４の裏面側に供給することで、当該裏面側に位置する細胞を良好に培養することができ、また上記ピンによって細胞塊シートを培養容器１０３から押し上げることができる。
つまり、細胞塊シート移動工程において、第２実施例のように細胞塊シートを横方向に移動させる必要がなくなることから、上記押圧工程において第１、第２押圧部材１１１、１１２を前進位置に位置させたまま、インキュベータに収容することができ、その場合ホルダ１１４の装着を省略することができる。
【００５７】
図２０は第３実施例に係る細胞塊シートの作製方法で使用する培養容器３を説明するものであって、例えば第１実施例で使用した細胞塊シート製造装置１で使用することができる。
本実施例の培養容器３は有底箱状を有するとともに、その底面が細胞塊２の載置面１３ａを構成し、上記実施例同様、載置面１３ａは細胞非接着性を有している。
本実施例のガイド手段Ｇは、格子状に設けられた支持枠２０１と、当該格子における交点部分より垂下して設けられたピン２０２とから構成され、上記格子の交点部分および上記ピン２０２の位置は第１実施例における図４に示すピン１４と同じ配置で設けられ、４本のピン２０２によって細胞塊２を収容する収容部Ｇａを構成するようになっている。
このようにピン２０２を配置することで、上記収容部Ｇａに細胞塊２を収容した場合には隣接する細胞塊２同士が相互に接触した状態で細胞塊２を整列させることが可能となる。
ここで、上記支持枠２０１を構成する各格子の大きさは、上記ピン２０２が上記配列で設けられていることから、細胞塊２の直径よりも若干小さく設定されているが、上記吸引ノズル８によって上方から細胞塊２を押し込むことが可能となっている。
そして、上記実施例同様、上記ガイド手段Ｇの収容部Ｇａに細胞塊２が収容されたら、ガイド退避工程として上記ガイド手段Ｇを直ちに取り出してもよく、またある程度細胞塊２の培養が進行してから退避させるようにしてもよい。
また本実施例の細胞容器３は、その上部に蓋２０３が設けられるようになっているが、上記実施例と同様、図示しない培養液供給手段１１の配管３１がこの蓋２０３に設けられており、培養液の供給を行うようになっている。
【００５８】
また上記各実施例では、上記培養トレイに細胞塊２を平面的に配置して１層の細胞塊シート４を培養するようになっているが、上記収容工程において細胞塊２を培養トレイ３上に複数個積層させれば、より厚みのある細胞塊シート４を培養することが可能となる。
さらに、上記各実施例において、上記ガイド手段Ｇの収容部Ｇａにはそれぞれ一個の細胞塊２を収容するようになっているが、一つの収容部Ｇａに複数、例えば２個ないし４個程度の予め設定した数の細胞塊２を収容するようにしてもよく、各収容部Ｇａ毎に、それぞれが個別に所定個数の細胞塊２を収容するようになっていればよい。
【符号の説明】
【００５９】
１  細胞塊シート製造装置      ２  細胞塊
３  培養容器                  ４  細胞塊シート
５  収容容器                  ８  吸引ノズル
９  ノズル移動手段            １０  検査手段
１１  培養液供給手段          １２  細胞塊シート移動手段
１３  培養トレイ              １３ａ  載置面
１３ｂ  貫通孔                １３ｃ  供給孔
１４  ピン                    １９  押さえ蓋
Ｇ  ガイド手段                Ｇａ  収容部
【図１】
0006593589.tif 000002
【図２】
0006593589.tif 000003
【図３】
0006593589.tif 000004
【図４】
0006593589.tif 000005
【図５】
0006593589.tif 000006
【図６】
0006593589.tif 000007
【図７】
0006593589.tif 000008
【図８】
0006593589.tif 000009
【図９】
0006593589.tif 000010
【図１０】
0006593589.tif 000011
【図１１】
0006593589.tif 000012
【図１２】
0006593589.tif 000013
【図１３】
0006593589.tif 000014
【図１４】
0006593589.tif 000015
【図１５】
0006593589.tif 000016
【図１６】
0006593589.tif 000017
【図１７】
0006593589.tif 000018
【図１８】
0006593589.tif 000019
【図１９】
0006593589.tif 000020
【図２０】
0006593589.tif 000021