(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バニリン、バニリルアルコール、バニリングルコシドおよび／またはバニリルアルコールグルコシドを製造する方法であって、
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸および／またはフェルラ酸グルコシドを生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり；および
ｂ）前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
（Ａ）配列番号１、配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
（Ｂ）切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
（Ｉ）配列番号１のａａ２２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩ）配列番号１のａａ６２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩＩ）配列番号１のａａ１３８〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＶ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（Ｖ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
（ＶＩ）（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を共有する（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。
【請求項２】
培養培地が、最大で１ｍＭの、例えば最大で０．５ｍＭの、例えば最大で０．０１ｍＭの、例えば検出不可能な、クマル酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物であって、
ｉ．フェルラ酸を生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素である、
ここで、前記バニリンシンターゼが、配列番号１、配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、
前記微生物。
【請求項４】
微生物が、細菌および真菌からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
微生物が酵母である、請求項１、２および４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
微生物が、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含む、請求項１、２、４および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
フェルラ酸の合成に関与する酵素が、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、クマル酸−ＣｏＡリガーゼ、シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、およびフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フェルラ酸の合成に関与する酵素が、バニリルアルコールオキシダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
微生物を、オイゲノールを含む培養培地中で培養することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バニリンを製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物がバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり；および
ｂ）前記微生物を、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること；および
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
（Ａ）配列番号１、配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
（Ｂ）切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
（Ｉ）配列番号１のａａ２２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩ）配列番号１のａａ６２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩＩ）配列番号１のａａ１３８〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＶ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（Ｖ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
（ＶＩ）（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を共有する（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
ステップｂ）が、微生物を、フェルラ酸の存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培養培地が、少なくとも１ｍＭ、好ましくは少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭのフェルラ酸を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
培地が、糖蜜を含むかこれからなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
バニリンおよび／またはバニリン誘導体の製造方法であって、
ａ）フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を提供すること、
ｂ）フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体をバニリンシンターゼと接触させること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができ、これによりバニリンおよび／またはバニリン誘導体を生成する酵素である、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
（Ａ）配列番号１、配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
（Ｂ）切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
（Ｉ）配列番号１のａａ２２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩ）配列番号１のａａ６２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩＩ）配列番号１のａａ１３８〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（ＩＶ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（Ｖ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
（ＶＩ）（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を共有する（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。
【請求項１５】
in vitroで実施される、請求項１〜２および４〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
フェルラ酸誘導体がフェルラ酸グルコシドであり、バニリン誘導体がバニリングルコシドである、請求項１４または１５に記載の方法。 
【請求項１７】
バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを製造する方法であって、
ａ）バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）バニリンを植物から単離すること、
ここで、前記バニリンシンターゼが、
（Ａ）配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
（Ｂ）切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
（Ｉ）配列番号１のａａ２２〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩ）配列番号１のａａ６２〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩＩ）配列番号１のａａ１３８〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＶ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（Ｖ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
（ＶＩ）（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を共有する（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。
【請求項１８】
バニリンシンターゼをコードする異種核酸およびグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含む植物であって、前記バニリンシンターゼが、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり、前記バニリンシンターゼが、配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、前記植物。
【請求項１９】
植物が双子葉植物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
植物がNicotiana tabacumである、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項２１】
植物が、ツユクサ類（commelinoids）およびアカザ科からなる群から選択される、請求項１７または１９に記載の方法。
【請求項２２】
動物飼料を製造する方法であって、
ａ）バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）植物を動物飼料に加工すること、 
ここで、前記バニリンシンターゼが、
（Ａ）配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
（Ｂ）切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
（Ｉ）配列番号１のａａ２２〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩ）配列番号１のａａ６２〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩＩ）配列番号１のａａ１３８〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＶ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（Ｖ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
（ＶＩ）（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を共有する（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの機能的相同体である、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
植物が、イネ科（Poaceae）またはイネ科（Gramineae family）のものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
食品を製造する方法であって、
ａ）可食部を含む植物を提供すること、ここで前記植物が、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸をバニリンに変換することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）前記可食部を収穫すること、 
ここで、前記バニリンシンターゼが、
（Ａ）配列番号２１のバニリンシンターゼであるか、またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、または
（Ｂ）切断型バニリンシンターゼであり、ここで切断型バニリンシンターゼが、
（Ｉ）配列番号１のａａ２２〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩ）配列番号１のａａ６２〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＩＩ）配列番号１のａａ１３８〜３５６からなるバニリンシンターゼ、
（ＩＶ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
（Ｖ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、または
（ＶＩ）（Ｉ）〜（Ｖ）のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を共有する（Ｉ）から（Ｖ）のいずれかの機能的相同体である、
を含み、これによりバニリンの味覚を有する食品を得る、前記方法。
【請求項２５】
植物がトマトである、請求項２４に記載の方法。 
【請求項２６】
バニリンシンターゼが、次の式：
［シグナルペプチド］−Ｘ−[切断部位]−[切断型バニリンシンターゼ]
式中、Ｘはリンカー配列である、
で表されるポリペプチドである、請求項１、２、４〜１７および１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
切断型バニリンシンターゼが、請求項１、１０、１４、１７、２２または２４に定義されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
シグナルペプチドが、宿主生物に内因性のタンパク質のシグナルペプチドである、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
切断部位が、宿主生物に内因性のタンパク質の切断部位である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
微生物または植物が、グルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸も含む、請求項１、２、４〜１７および１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
グルコシルトランスフェラーゼが、ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
グルコシルトランスフェラーゼが、グルコースのバニリンへの転移を触媒することができ、これによりバニリングルコシドを形成するグルコシルトランスフェラーゼである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号３のUGT72E2またはこれと少なくとも９０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
バニリンを製造する方法である、請求項１〜２、４〜１７および１９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
方法が、バニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から、および／または植物から単離するステップを含み、および方法が、前記バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップをさらに含む、請求項１〜２、４〜１７および１９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップが、バニリングルコシドをグルコシダーゼに接触させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
グルコシダーゼが、β−グルコシダーゼである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
バニリングルコシドを製造する方法である、請求項１〜２、４〜１７および１９〜３３のいずれか一項に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バニリンの製造方法ならびに、かかる製造に有用な、微生物または植物などの宿主生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
バニラは世界で最も人気のあるフレーバー化合物であり、多くの食品を含む多数の商用製品で使用されている。天然のバニラは、単子葉植物のラン目に含まれるラン属に属する、着生登攀性ランVanilla planifolia AndrewsおよびVanilla tahitensisの鞘から得られる。バニリン（３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド）が、発酵バニラ鞘から得られるバニラ抽出物中の主要なフレーバー化合物である。バニリンは、高濃度では生きている細胞に毒性である。鞘の中で、バニリンは非毒性のファイトアンティシピン（phytoanticipin）バニリングルコシドとして蓄積し、これは組織が損傷されると、活性な防御化合物に変換される。フレーバー成分として使用するためのバニラ鞘の発酵および保蔵処理中、バニリングルコシドの大部分は加水分解されて、遊離バニリンが提供される。バニリンについての推定の総世界市場は、年間１０５００トンである。バニラ鞘からの天然バニリンの生産は、困難で時間およびコストのかかるプロセスである。１ｋｇのバニリンの生産には約５００ｋｇのバニラ鞘が必要であり、これは約４０，０００の花の受粉に対応する。今日、世界のバニリン生産のわずか３％がバニラ鞘からのものである。大半はオイゲノールなどの異なる化石炭化水素から、またはリグニンの酸加水分解により、合成的に生産されている。バニラ蘭における経路をコードする遺伝子の異種発現を用いた、微生物における、バニリンの生物工学的生産は未だに達成されておらず、その理由は、遺伝子が同定されていないからである。代わりにバニリンは、酵母、真菌、細菌、およびin vitroの細胞培養物において、バニリンと構造的に関連する外因的に添加された基質から、組み合わせによりバニリンを形成するであろう酵素をコードする、他の生物からの遺伝子を発現させることによって、生産されている。
【０００３】
フェニルアラニン由来の揮発性物質は、その炭素骨格に基づいてＣ６−Ｃ１、Ｃ６−Ｃ２、Ｃ６−Ｃ３化合物として分類される。バニリングルコシドおよびｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドグルコシドの両方は、成熟したバニラ鞘に見出される最も豊富な化合物であり、Ｃ６−Ｃ１化合物である。
天然のバニラにおける２つの主要な芳香化合物は、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドとバニリンである。ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドはバニリンと同じ構造的要素の一部を含むため、バニリンの前駆体と考えられている。バニリンからの経路は、すべてがフェニルアラニン由来の代謝産物の代謝グリッドを構成すると仮定されている。US2003/0070188には、胚形成細胞培養においてVanilla planifoliaからｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドを生産する可能性のある方法が記載されている。US2003/0070188に記載された１つの方法は、ｐ−クマル酸の鎖短縮を触媒してｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドを生成することができると記載されている、４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドシンターゼ（4-HBS）を利用する。文献はさらに、クリーピングベントグラスでの4-HBSの発現を記載するが、しかし、かかる発現の結果に関してはいかなる情報も提供されていない。また４−ヒドロキシベンズアルデヒドは、4-HBSを発現する酵母において検出できなかったことが記載されている。
Podstolski et al., 2002には、４−ヒドロキシ−ベンズアルデヒドシンターゼ（4-HBS）が、チオール試薬の存在下で補因子を必要とすることなく、４−クマル酸を４−ヒドロキシベンズアルデヒドに非酸化的に変換することが記載されている。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、バニリンを製造する方法、および特に植物または微生物においてバニリンを製造する方法の必要性が存在する。
本発明は、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体をバニリンに変換することができる酵素（本明細書ではバニリンシンターゼと称する）を提供する。この酵素は、多数の異なる宿主生物およびin vitroにおいて、バニリンの製造に用いることができる。
したがって、本発明の一側面は、フェルラ酸からバニリンを製造する方法であって、ここで方法は、バニリンシンターゼを発現する宿主生物の使用を含み、およびフェルラ酸を前記宿主生物に添加してもよく、または前記宿主生物がフェルラ酸を生成することができる、前記方法を提供する。
【０００５】
したがって本発明は、バニリンを製造する方法であって、方法が、
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸を生成することができ；および
ｉｉ．配列番号１のバニリンシンターゼ（VpVAN）またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体をコードする異種核酸を含み；および
ｂ）前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリンおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること、
を含む、前記方法を提供する。
【０００６】
本発明はまた、バニリン、バニリルアルコール、バニリングルコシドおよび／またはバニリルアルコールグルコシドを製造する方法であって、方法が、
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリンおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること、
を含む、前記方法を提供する。
【０００７】
さらに本発明の一側面は、微生物を提供することであり、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸を生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１のVpVAN、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体である。
【０００８】
さらに本発明の一側面は、バニリンを製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下のステップを含む： 
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、配列番号１のバニリンシンターゼ（VpVAN）またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体をコードする異種核酸を含み；および
ｂ）前記微生物を、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること；および
ｃ）バニリンおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること。
【０００９】
さらに本発明の一側面は、バニリン、バニリルアルコール、バニリングルコシドおよび／またはバニリルアルコールグルコシドを製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下のステップを含む：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物はバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記微生物を、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること；および
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること。
【００１０】
さらに本発明の一側面は、バニリンを製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下：
ａ）フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を提供すること、
ｂ）前記フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を、バニリンシンターゼと接触させること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１の（VpVAN）、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり、これによりバニリンを製造する、
を含む。
【００１１】
さらに本発明の一側面は、バニリンを製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下：
ａ）配列番号１のVpVANまたはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体をコードする異種核酸を含む、植物を提供すること；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）バニリンを植物から単離すること、
を含む。
【００１２】
さらに本発明の一側面は、バニリン、バニリルアルコール、バニリングルコシドおよび／またはバニリルアルコールグルコシドを製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下：
ａ）バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、植物から単離すること、
を含む。
【００１３】
さらに本発明の一側面は、動物飼料を製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下：
ａ）バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物を提供すること、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１のVpVAN、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）植物を動物試料に加工すること、
を含む。
【００１４】
さらに本発明の一側面は、食品を製造する方法を提供することであり、ここで前記方法は、以下：
ａ）可食部を含む植物を提供すること、ここで前記植物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１のVpVAN、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）前記可食部を収穫すること；
を含み、これによりバニリンの味覚を有する食品を得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、VpVANのin vitro供給からのＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図では、酵素が、フェルラ酸のバニリンへの炭素２位切断（carbon two cleavage）を触媒できることを示している。この反応は、補因子としてＣｏＡＳＨ、ＡＴＰおよびＮＡＤ＋を必要としない。３０℃で２．５ｍＭのＤＴＴ中、１時間、５ｍＭのフェルラ酸を供給されたVpVANを有するタンパク質溶液のイオンクロマトグラム。さらに、VANは、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋の存在下でフェルラ酸ＣｏＡのバニリンへの炭素２位切断を触媒することができる。３０℃で２．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰおよび０．１ｍＭのＮＡＤ＋中、１時間、５ｍＭのフェルラ酸ＣｏＡと共にVANを供給されたタンパク質溶液の、抽出イオンクロマトグラム。（EIC153：抽出イオンクロマトグラムm/z（バニリンｍｗ＋Ｈ＋））（ａ）フェルラ酸を供給したVpVAN、フェルラ酸を供給した陰性対照（ｂ）フェルラ酸ＣｏＡを供給したVpVAN、フェルラ酸ＣｏＡを供給した陰性対照（ｃ）７．５分でのバニリン断片化パターン。
【００１６】
【図２】図２は、Arabidopsis thaliana UGT72E2と共に酵母染色体中安定的に組み込まれたVpVANを有する酵母株による、バニリングルコシドの形成を示す。酵母株は、８％糖蜜を補充したデルフト培地中で増殖させた後に、代謝産物プロファイルをＬＣ−ＭＳによって決定した。（EIC317−抽出イオンクロマトグラムm/zバニリングルコシドｍｗ＋２２）（ａ）Wt VpVAN（ｂ）コドン最適化されたVpVAN酵母（ｃ）陰性対照（酵母株Y06460）
【００１７】
【図３】図３は、以下を安定的に組み込んで含む酵母を用いて実施された、生合成試験の結果を示す：Wt VpVAN、酵母発現についてコドン最適化されたVpVAN、シグナルペプチドを欠く切断型VpVAN（wt vp Δsp van）、およびシグナルペプチドを欠き酵母発現についてコドン最適化された切断型VpVAN（vp Δsp van）。酵母株は、合成培地中で７２時間、異なる推定基質と共にインキュベートした後、代謝産物プロファイルをＬＣ−ＭＳによって決定した。バニリングルコシドの形成は、フェルラ酸を供給した酵母で観察された。（EIC337−抽出イオンクロマトグラムm/zバニリングルコシドｍｗ＋２２）。（a）Wt VpVAN（b）酵母発現についてコドン最適化されたVpVAN（c）wt vp Δsp van−シグナルペプチドを欠くWt VpVAN（d）vp Δsp van−シグナルペプチドを欠き酵母発現についてコドン最適化されたVpVAN（e）陰性対照（酵母株Y06460）
【００１８】
【図４】図４は、フェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドで試験したVpVANの基質特異性を示す。ＬＣ−ＭＳ抽出イオンクロマトグラムは、VpVANがフェルラ酸とフェルラ酸グルコシドの両方の鎖切断を触媒できることを示す。（EIC337−抽出イオンクロマトグラムm/zバニリングルコシドｍｗ＋２２）。（ａ）フェルラ酸供給陰性対照（ｂ）VpVAN::フェルラ酸供給VpUGT72U1（ｃ）フェルラ酸供給VpVAN（ｄ）VpVAN::フェルラ酸供給AtUGT72E2（ｅ）フェルラ酸グルコシド供給陰性対照（ｆ）VpVAN::フェルラ酸グルコシド供給VpUGT72（ｇ）フェルラ酸グルコシド供給VpVAN （ｈ）VpVAN::フェルラ酸グルコシド供給AtUGT72E2
【００１９】
【図５】図５は、Nicotiana benthamianaでの一過性発現後の、バニリンシンターゼの生物学的活性を示す。VpVANをAgrobacterium tumefaciensに移し、N. benthamianaの葉のp19遺伝子サイレンシングサプレッサーを有するA. tumefaciens株を共浸潤させた。接種後４日目、浸潤させたタバコの葉を採取し、ＬＣ−ＭＳによる代謝産物プロファイリングに供した。プロファイリングは、バニリルアルコールグルコシドの、VpVAN依存性の形成を示した。（EIC339−抽出イオンクロマトグラムm/zバニリンアルコールグルコシドｍｗ＋２２）。
【図６】図６は、in vitroの結合転写および翻訳（TNT）アッセイからのＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。図は、フェルラ酸グルコシドを用いたin vitroのインキュベーション後に、かなりの量のバニリングルコシドの生成を示す（ピークは６分）。（ａ）Wt VpVAN（配列番号１）（ｂ）wt vp Δsp van（配列番号１のａａ２２〜３５６）（ｃ）vp Δ137 van（配列番号１のａａ１３８〜３５６）（ｄ）vp Δ61 van（配列番号１のａａ６２〜３５６）（ｅ）陰性対照
【００２０】
【図７】図７Ａは、Nicotiana benthamianaの葉における一過性発現後の、バニリンシンターゼの生物学的活性を示す。Nicotiana benthamianaは、以下をコードする核酸で形質転換された：ａ）Wt VpVAN（配列番号１）ｂ）wt vp Δ137 van（配列番号１のａａ１３８〜３５６）ｃ）wt vp Δ66 van（配列番号１のａａ１３８〜３５６）ｄ）陰性対照（p19浸潤タバコの葉）図は、バニリルアルコールグルコシド（EIC339−抽出イオンクロマトグラムm/zバニリンアルコールグルコシドｍｗ＋２２）の、バニリンシンターゼまたは切断型バニリンシンターゼを発現する抽出物中での形成を示す。図７Ｂは、Nicotiana benthamianaの葉における一過性発現後の、野生型VpVANと比較したキメラバニリンシンターゼの生物学的活性を示す。Nicotiana benthamianaは、以下をコードする核酸で形質転換された：ａ）キメラバニリンシンターゼ（vp nb Δsp Δ137van）（例８参照）ｂ）Wt VpVAN（配列番号１）ｃ）陰性対照（p19浸潤タバコの葉）図は、バニリンシンターゼまたは切断型バニリンシンターゼを発現する抽出物のａ）（EIC 339−抽出イオンクロマトグラムm/zバニリンアルコールグルコシドｍｗ＋２２）における、ほとんどのバニリルアルコールグルコシドの形成を示す。
【００２１】
【図８】図８は、Nicotiana benthamianaの葉における一過性発現後の、Glechoma hederaceaのバニリンシンターゼ（GhVAN）の生物学的活性を示す。Nicotiana benthamianaは、GhVAN（上パネル）をコードする核酸で形質転換された。下のパネルは陰性対照を示す。図は、バニリンアルコールグルコシドの形成を示す。
【００２２】
【図９】図９は、VpVAN（配列番号１）を発現する酵母における４−ビニルグアイアコールグルコシドの生成、および、VpVAN（配列番号１）を発現しpad1およびfad1遺伝子を欠く酵母における、この望ましくない副生成物の不在を示す。
【図１０】図１０は、Nicotiana benthamianaのシステインプロテアーゼと、Vanilla planiforaのバニリンシンターゼ（VpVAN）の間のアラインメントを示す。２つの配列間のコンセンサス配列を以下に示す。非保存アミノ酸は、*でマークする。
【図１１】図１１は、はGlechoma hederaceaのバニリンシンターゼ（GhVAN）と、Vanilla planiforaのバニリンシンターゼ（VpVAN）の間のアラインメントを示す。２つの配列間のコンセンサス配列を以下に示す。非保存アミノ酸は、*でマークする。
【図１２】図１２は、Arabidopsis thaliana UGT72E2（配列番号３）を発現する酵母細胞が、２．５ｍＭのフェルラ酸を含む合成培地上で増殖させた場合に、フェルラ酸グルコシドを合成することを示す。
【００２３】
発明の詳細な説明
バニリンシンターゼ
本発明は、バニリンシンターゼおよびその使用に関する。したがって、本発明は特に、本発明のバニリンシンターゼを発現する宿主生物を用いて、バニリンまたはバニリングルコシドを製造する方法にも関する。宿主生物は、本明細書の以下の節「微生物」に記載の任意の微生物であってよく、または宿主生物は、本明細書の以下の節「植物」に記載の任意の植物であってよい。一般に宿主生物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸、および任意に、本明細書の以下に記載の１種または２種以上の追加の異種核酸を含む。
本発明のバニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素である。特に、本発明のバニリンシンターゼは、植物においてin vivoで、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であることが好ましい。また、バニリンシンターゼは、微生物においてin vivoで、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素であることも好ましい。
【００２４】
本明細書において使用する用語バニリンは、構造：
【化１】
0006594205.tif 000002
の３−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドを指す。
フェルラ酸の構造は、本明細書の以下の節「フェルラ酸」に提供される。
本発明で使用されるバニリンシンターゼは、任意の適当な起源からのバニリンシンターゼであってよく、好ましくはバニリンシンターゼは、植物のバニリンシンターゼであって、バニリン、バニリルアルコール、バニリングリコシドおよび／またはバニリルアルコールグリコシドを天然に生成するものである。したがって、一態様において、バニリンシンターゼはVanilla planifoliaのバニリンシンターゼである。
【００２５】
したがって、本発明で使用される好ましいバニリンシンターゼは、配列番号１のバニリンシンターゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するその機能的相同体である。好ましくは、バニリンシンターゼは、配列番号１のバニリンシンターゼである。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。与えられた配列のバニリンシンターゼの機能的相同体は、上記の配列同一性を有し、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる。
【００２６】
さらなる有用なバニリンシンターゼは、当業者に知られている任意の適切な方法により同定することができ、例えば、次のステップを含む方法によって同定される：
ａ）バニリン、バニリルアルコール、バニリングリコシドおよび／またはバニリルアルコールグリコシドを生成する植物を、提供すること、
ｂ）前記植物から核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を得ること、
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％の配列同一性の配列を有するポリペプチドをコードする核酸を同定すること、
ｄ）前記核酸によりコードされたポリペプチドが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができるかどうかを試験すること。
【００２７】
方法はさらに、次のステップを含んでもよい：
ｂ）バニリン、バニリルアルコール、バニリングリコシドおよび／またはバニリルアルコールグリコシドを生成する植物からの核酸の配列情報を提供すること、
ｃ）配列番号１と少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％の配列同一性の配列を有するポリペプチドをコードする核酸を同定すること、
ｄ）前記核酸によりコードされたポリペプチドが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができるかどうかを試験すること。
【００２８】
上記のステップd）のいずれかで試験したペプチドが、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる場合、前記ポリペプチドは、本発明に有用となり得る、バニリンシンターゼである。
本発明で使用される別のバニリンシンターゼは、配列番号２１のバニリンシンターゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するその機能的相同体である。好ましくは、バニリンシンターゼは、配列番号２１のバニリンシンターゼである。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。与えられた配列のバニリンシンターゼの機能的相同体は、上記の配列同一性を有し、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる。
【００２９】
上述の配列同一性を共有することに加えて、機能的相同体は、異なるバニリンシンターゼ間で保存されたアミノ酸の多くを保持することが好ましい。したがって、配列番号１の機能的相同体は、図１１のコンセンサス配列のアミノ酸の、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、例えばその全てを含み、図１１に示すアライメントにおいて*でマークされていないアミノ酸の、例えば少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、例えばその全てを含むことが、好ましい。同様に、配列番号２１の機能的相同体は、図１１のコンセンサス配列のアミノ酸の、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、例えばその全てを含み、図１１に示すアライメントにおいて*でマークされていないアミノ酸の、例えば少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、例えばその全てを含むことが、好ましい。
【００３０】
本発明で使用されるバニリンシンターゼはまた、シグナルペプチドを欠くバニリンシンターゼであってよい。これは特に、バニリンシンターゼをコードする核酸配列が微生物細胞内に導入される、本発明の態様にあてはまる。したがって、好ましい態様において、本発明で使用されるバニリンシンターゼは、タンパク質を植物の小胞体に方向付けるシグナルペプチドの、全てまたは少なくとも一部を欠くバニリンシンターゼである。したがって、バニリンシンターゼは、配列番号１の少なくともａａ２２〜３５６を含むかまたはこれからなるか、またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的相同体であってよい。一態様において、本発明で使用されるバニリンシンターゼは、配列番号１７のバニリンシンターゼ、またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を有するその機能的相同体である。
【００３１】
本発明で使用されるバニリンシンターゼはまた、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、切断型バニリンシンターゼであってもよい。したがって、バニリンシンターゼは、１または２以上のＮ末端アミノ酸を欠いてもよく、例えばバニリンシンターゼは以下であってよい：
ａ）最Ｎ末端の１〜１５０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｂ）最Ｎ末端の２１〜１３７個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｃ）最Ｎ末端の１２０〜１４０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｄ）最Ｎ末端の１３０〜１４０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
【００３２】
ｅ）最Ｎ末端の２１〜１４０個の範囲のアミノ酸を欠く、配列番号２１のバニリンシンターゼ、
ｆ）最Ｎ末端の２１個のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｇ）最Ｎ末端の６１個のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｈ）最Ｎ末端の１３７個のアミノ酸を欠く、配列番号１のバニリンシンターゼ、
ｉ）最Ｎ末端の２１個のアミノ酸を欠く、配列番号２１のバニリンシンターゼ、
ｊ）最Ｎ末端の１４０個のアミノ酸を欠く、配列番号２１のバニリンシンターゼ、
ｋ）上記ａ）からｊ）までのいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する機能的相同体であって、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、前記機能的相同体。
【００３３】
さらに本発明に含まれるのは、切断型バニリンシンターゼが以下であるものである：
ａ）配列番号１のａａ２２〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｂ）配列番号１のａａ１３８〜３５６を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｃ）配列番号２１のａａ２２〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｄ）配列番号２１のａａ１４１〜３５９を含むかこれからなるバニリンシンターゼ、
ｅ）ａ）からｄ）までのいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する機能的相同体であって、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる、前記機能的相同体。
本発明の別の態様において、バニリンシンターゼは、天然のバニリンシンターゼからの配列および他の配列を含むキメラタンパク質である。本発明のかかる態様において、バニリンシンターゼは次の式で表されるポリペプチドであってよい：
【００３４】
［シグナルペプチド］−Ｘ−[切断部位]−[切断型バニリンシンターゼ]
シグナルペプチドは、任意のシグナルペプチドであってよい。当業者はシグナルペプチドを、例えばSignalP 4.1.ソフトウェアを使用して同定することができ、このソフトウェアはTechnical University of DenmarkのCenter for Biological Sequence analysisから容易に入手可能である。
特に、シグナルペプチドは、宿主生物に内因性のシグナルペプチドであることが好ましい（すなわち、前記バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含有する宿主生物）。より好ましくは、シグナルペプチドは、宿主生物に内因性のシステインプロテアーゼからのシグナルペプチドである。さらにより好ましくは、シグナルペプチドは、クラン（Clan）ＣＡに属する、より好ましくはファミリーＣ１に属する、さらにより好ましくはサブファミリーＡに属するシステインプロテアーゼからのシグナルペプチドであり、ここで前記システインプロテアーゼは、宿主生物に内因性である。前記クラン、ファミリーおよびサブファミリーは、MEROPSデータベースで定義された通りである。例えば、システインプロテアーゼは、アリューレイン・システインプロテアーゼのクラスに属するシステインプロテアーゼであってよい。前述の、システインプロテアーゼからのシグナルペプチドであることについては、特に、宿主生物が植物である本発明の態様に適用可能である。
【００３５】
シグナルペプチドは、このように、以下のステップを含む方法によって同定することができる：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸の配列情報、または宿主生物のポリペプチドの配列情報を、提供すること、
ｂ）配列番号１と、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％の配列同一性を有し、およびシステインプロテアーゼである、ポリペプチドを同定すること、
ｃ）前記システインプロテアーゼのシグナルペプチドを、例えばSignalP 4.1.ソフトウェアを使用して同定すること、
これにより、シグナルペプチドを同定すること。
【００３６】
Ｘは、シグナルペプチドと切断部位を連結する任意のリンカー配列であってよい。一態様において、リンカー配列Ｘは、天然のバニリンシンターゼからの配列であってもよい。したがって、例えばＸは、配列番号１のａａ２２〜１３４、または全長にわたりこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
切断部位は、任意のプロテアーゼ切断部位であってよい。特に、切断部位は、宿主生物に対して内因性であることが好ましい。より好ましくは、切断部位は、宿主生物に内因性のシステインプロテアーゼからの切断部位である。さらにより好ましくは、切断部位は、クラン（Clan）ＣＡに属する、より好ましくはファミリーＣ１に属する、さらにより好ましくはサブファミリーＡに属するシステインプロテアーゼからの切断部位であり、ここで前記システインプロテアーゼは、宿主生物に内因性である。前記クラン、ファミリーおよびサブファミリーは、MEROPSデータベースで定義された通りである。例えば、システインプロテアーゼは、アリューレイン・システインプロテアーゼのクラスに属するシステインプロテアーゼであってよい。前述の、システインプロテアーゼからの切断部位であることについては、特に、宿主生物が植物である本発明の態様に適用可能である。
【００３７】
切断部位は、以下のステップを含む方法によって同定することができる：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸の配列情報、または宿主生物のポリペプチドの配列情報を、提供すること、
ｂ）配列番号１と、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％の配列同一性を有し、およびシステインプロテアーゼである、ポリペプチドを同定すること、
ｃ）配列番号１と、前記ｂ）で同定されたポリペプチドの間のアラインメントを調製すること、
ｄ）配列番号１のアミノ酸１３５〜１４１に対応する前記ポリペプチドのアミノ酸を同定すること、ここで配列番号１のアミノ酸１３５〜１４１に対応するアミノ酸は、切断部位である。
【００３８】
切断型バニリンシンターゼは、本明細書で上述した任意の切断型バニリンシンターゼであってよい。特に切断型バニリンシンターゼは、配列番号１のａａ１４２〜３５６を含むかもしくはこれからなるか、または全長にわたりこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するその機能的相同体であってよい。
異種核酸は、この節に記載された、バニリンシンターゼをコードする任意の異種核酸であってよい。例えば異種核酸は、配列番号２を含む核酸または配列番号２の相補的配列にハイブリダイズ可能な核酸であってよい。
【００３９】
しかしながら、本発明の好ましい態様において、異種核酸をコードするバニリンシンターゼは、異種核酸を含む特定の微生物について完全にまたは部分的にコドン最適化されている。いくつかのソフトウェアパッケージがこの目的のために公的に入手可能であり、例えば「Optimizer」は、Puigbo et al., 2007, OPTIMIZER: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences, Nucleic Acids Research, 35:W126-W131およびPuigbo et al., 2008, HEG-DB: a database of predict highly expressed genes in prokaryotic complete genomes under translational selection, Nucleic Acids Research. 36:D524-7に記載されており、または「JCat」は、Grote et al., 2005, JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host, Nucleic Acids Research, Volume 33, Issue suppl 2, Pp. W526-W531に、または「INCA」は、Supek F and Vlahovicek K: Comparison of codon usage measures and their applicability in prediction of microbial gene expressivity; BMC Bioinformatics (2005) 6:182に記載されている。
【００４０】
したがって、微生物の使用に関する本発明の態様において、バニリンシンターゼをコードする異種核酸は、使用する特定の微生物についてコドン最適化することができる。したがって、バニリンシンターゼをコードする異種核酸は、使用する特定の微生物のために部分的にコドン最適化されてもよく、またはバニリンシンターゼをコードする異種核酸は、使用する特定の微生物のために完全にコドン最適化されてもよい。例えば、S. cerevisiaeなどの酵母の使用に関する本発明の態様においては、バニリンシンターゼをコードする異種核酸は、例えばS. cerevisiaeなどの酵母での使用についてコドン最適化されてよく、例えば、バニリンシンターゼをコードする異種核酸は、配列番号１８を含むか、またはこれからなっていてもよい。
【００４１】
方法
したがって、本発明の一態様は、バニリン、バニリルアルコール、および／またはそのグルコシドを製造する方法に関し、ここで該方法は、以下のステップを含む：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１の（VpVAN）、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり；および
ｂ）前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること。
【００４２】
この態様において、微生物は、本明細書の以下の節「微生物」に記載の任意の微生物であってよい。前記微生物は、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体（例えば、フェルラ酸グルコシド）を生成することができる。好ましくは、微生物は、フェルラ酸を生成することができる。これは、様々な方法で達成することができる。例えば微生物は、フェルラ酸の合成に関与する1または２以上の酵素をコードする核酸配列を含有してもよく、酵素は例えば、本明細書の以下の節「フェルラ酸の合成に関与する酵素」に記載の任意の酵素である。バニリンシンターゼをコードする核酸は、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼをコードすることができる。方法は、バニリンを調製する方法であることが好ましい。
【００４３】
別の態様において、本発明は、バニリン、バニリルアルコールおよび／またはそのグルコシドを製造する方法に関し、ここで方法は、以下のステップを含む：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物はバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１の（VpVAN）、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり；および
ｂ）前記微生物を、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリンおよび／またはバニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること。
【００４４】
この態様において、微生物は、本明細書の以下の節「微生物」に記載の任意の微生物であってよい。バニリンシンターゼをコードする核酸は、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼを、コードすることができる。培養培地は、任意の適切な供給源由来のフェルラ酸を含んでいてもよく、および／または培養培地は、フェルラ酸グルコシドなどのフェルラ酸誘導体を含んでいてもよい。特にフェルラ酸は、本明細書の以下の節「フェルラ酸」に記載の任意の方法で提供することができる。好ましくは、本方法は、バニリンを製造する方法である。
【００４５】
さらに別の態様において、本発明は、バニリンを製造する方法に関し、ここで方法は、以下のステップを含む：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を生成することができ；および
ｉｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１の（VpVAN）、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり；および
ｂ）前記微生物を、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること；および
ｄ）前記バニリングルコシドを脱グルコシル化すること。
【００４６】
この態様において、微生物は、本明細書の以下の節「微生物」に記載の任意の微生物であってよい。前記微生物は、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体（例えば、フェルラ酸グルコシド）を生成することができる。好ましくは、微生物は、フェルラ酸を生成することができる。これは、様々な方法で達成することができる。例えば、微生物は、フェルラ酸の合成に関与する1または２以上の酵素をコードする核酸配列を含有してもよく、酵素は例えば、本明細書の以下の節「フェルラ酸の合成に関与する酵素」に記載の任意の酵素である。前記微生物はまた、バニリンをグルコシル化することができる。これは、様々な方法で達成することができる。例えば、微生物は、グルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含有してもよく、好ましくは、微生物は、本明細書の以下の節「グリコシルトランスフェラーゼ」に記載の任意のグルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む。バニリンシンターゼをコードする核酸は、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼをコードすることができる。前記バニリングルコシドの脱グルコシル化は、本明細書の以下に記載のようにして実施してよい。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、バニリンを製造する方法に関し、ここで方法は、以下のステップを含む：
ａ）微生物を提供すること、ここで前記微生物は、
ｉ．バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含み、ここで前記バニリンシンターゼは、フェルラ酸の側鎖切断を触媒してバニリンを形成することができる酵素、例えば、配列番号１の（VpVAN）、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体であり；および
ｉｉｉ．バニリンをグルコシル化することができ；および
ｂ）前記微生物を、フェルラ酸またはフェルラ酸誘導体の存在下で、前記微生物の増殖を支援する培養培地中で培養すること、
ｃ）バニリングルコシドを、微生物から、および／または培養培地から単離すること；および
ｄ）前記バニリングルコシドを脱グルコシル化すること。
【００４８】
この態様において、微生物は、本明細書の以下の節「微生物」に記載の任意の微生物であってよい。バニリンシンターゼをコードする核酸は、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼをコードすることができる。培養培地は、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体（例えば、フェルラ酸グルコシド）を含んでよい。好ましくは培養培地は、フェルラ酸を含む。前記フェルラ酸は、任意の適切な供給源由来であってよく、特に、フェルラ酸は、本明細書の以下の節「フェルラ酸」に記載の任意の方法で提供することができる。前記バニリングルコシドの脱グルコシル化は、本明細書の以下に記載のようにして実施してよい。
微生物は、微生物を培養するのに適した任意の培地で培養することができる。当業者は、特定の微生物に依存して、適切な培地を選択することができるであろう。特に、増殖条件は、バニリンシンターゼが前記微生物中で発現されるように、選択する必要がある。微生物は、流加培養または連続プロセスで増殖させることができる。典型的には、微生物は、所望の時間、所定の温度（単数または複数）で、発酵槽で増殖させる。この方法において使用される特定の微生物に依存して、フェルラ酸および／またはグルコシルトランスフェラーゼの合成に関与する酵素をコードする他の異種核酸もまた、存在することができ、発現されてよい。
【００４９】
いくつかの態様において、バニリンまたはバニリングルコシドは、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を供給された全細胞を用いて製造することができ、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体は、本明細書の以下の節「フェルラ酸」に記載の任意の方法で提供することができる。フェルラ酸は、培養培地に含まれることができ、細胞増殖の間または細胞増殖後に供給することができる。好ましくは、培養培地は、フェルラ酸を含む。微生物は、懸濁液中で増殖させるか、または固定化されてもよい。微生物が細菌または酵母などの真菌である本発明の態様において、続いて好ましくは、微生物は、懸濁液中で増殖される。
本発明の一態様において、培養培地は、クマル酸を高レベルで含有しないことが好ましく、例えば培養培地は、最大で１ｍＭ、例えば最大で０．５ｍＭ、例えば最大で０．０１ｍＭのクマル酸を含んでよく、例えば検出可能なクマル酸を含まない。
【００５０】
本発明の一態様において、バニリンは、過剰に還元されない条件下で製造されることが好ましい。したがって、一態様において、培養培地は、５ｍＭ未満、好ましくは３ｍＭ未満のＤＴＴを含むことが好ましい。バニリンがin vitroで調製される本発明の態様において、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体は、最大で５ｍＭの、好ましくは３ｍＭ未満のＤＴＴの存在下で、バニリンシンターゼを用いてインキュベートすることが好ましい。
この方法は、バニリングルコシドが好ましくはバニリンβ−Ｄ−グルコシドである、バニリンまたはバニリングルコシドの製造に関する。製造されるバニリンまたはバニリングルコシドの量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約１，５００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上であることができる。例えば、約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌのバニリンまたはバニリングルコシド、または、約２５０〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ、または約２０００〜約５００００ｍｇ／Ｌ、またはさらに約２，０００〜約１０００００ｍｇ／Ｌ、またはさらに約５，０００〜約２００，０００ｍｇ／Ｌを製造することができる。一般に、より長い培養時間は、より大量の生成物につながる。したがって微生物は、１日〜７日、１日〜５日、３日〜５日、約３日、約４日、または約５日、培養することができる。
【００５１】
微生物を所望の期間培養物中で増殖させた後、バニリン、バニリルアルコール、バニリルアルコールグルコシドおよび／またはバニリングルコシドはその後、当技術分野で知られている任意の有用な技術を用いて、培養物から回収することができる。例えば、バニリンおよび／またはバニリングルコシドを単離するための方法は、パーコレーション技術または超臨界二酸化炭素抽出、および濃度についての逆浸透を含む。バニリンおよび／またはバニリングルコシドはまた、水性溶液からの抽出、真空蒸留、および多段再結晶による単離および精製、および限外濾過を含む方法によって、回収してもよい（例えば、Boddeker, et al. (1997) J. Membrane Sci. 137:155-158; Borges da Silva, et al. (2009) Chem. Eng. Des . 87:1276-1292に記載のようにして）。ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、グルタチオン、またはＬ−システインなどのスルフヒドリル化合物（米国特許第5,128,253号）またはアルカリＫＯＨ溶液（WO 94/13614）のいずれかを用いる二相抽出法も、バニリンおよび／またはバニリングルコシドの回収および他の芳香性物質からのその分離に用いることができる。ポリエーテル−ポリアミド共重合体膜を使用する生物変換媒体からのバニリン吸着および浸透蒸発も、バニリンおよび／またはバニリングルコシドの単離に使用することができる（例えば、Boddeker, et al. (1997) supra; or Zucchi, et al. (1998) J. Microbiol. Biotechnol. 8 : 719- '22に記載のようにして）。架橋ポリスチレン骨格を有するマクロ多孔性吸着樹脂も、溶解したバニリンまたはバニリングルコシドを水性溶液から回収するために使用することができる（Zhang, et al. (2008) Eur. Food Res. Technol. 226:377-383）。限外濾過および膜接触器（ＭＣ）技術も、バニリンまたはバニリングルコシドの回収に有用である（Zabkova, et al. (2007) J. Membr. Sci. 301:221-237；Scuibba, et al. (2009) Desalination 241:357-364）。代替的に、パーコレーションまたは超臨界二酸化炭素抽出、および濃度についての逆浸透などの、従来の技術を使用することもできる。
【００５２】
組換え宿主が植物または植物細胞である場合、バニリンまたはバニリングルコシドは、当分野で知られた様々な技術を用いて、植物組織から抽出することができる。
いくつかの態様において、バニリンまたはバニリングルコシドを単離し、均質に精製する（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、または９８％純度）。他の態様において、バニリンまたはバニリングルコシドは、微生物からの抽出物として提供される。この点に関し、バニリンまたはバニリングルコシドは単離されるが、必ずしも均質に精製はされない。
単離され、必要に応じて精製されたバニリンまたはバニリングルコシドの抽出物は、例えば食品、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬組成物、歯科衛生組成物、および化粧品などのフレーバー消耗品において、使用が見出される。
【００５３】
本発明の態様において、微生物がバニリンをグルコシル化することが可能である場合、方法はしばしば、前記バニリングルコシドを脱グルコシル化するステップも含み得る。このステップは、バニリングルコシドの単離の前、またはバニリングルコシドの単離に続いて、行ってもよい。
これは、当技術分野で周知の方法による化学的加水分解によって、または例えばグルコシダーゼ活性を有する酵素の使用により酵素的に、実施することができる。特に、β−グルコシダーゼを使用することができる。多くの適切なβ−グルコシダーゼは、当業者に知られている。脱グルコシル化は、例えば、初めにバニリングルコシドを回収すること、例えばメタノールなどの適切な溶媒中での抽出、または生産する微生物や植物からの排出後のそれらの収集により、回収することによって、実施することができる。第２に、グルコシル化中間体を精製し、in vitroでβ−グルコシダーゼに暴露するか、または適切な化学的加水分解に供することができる。
【００５４】
グルコシダーゼは様々な形態で提供することができる；例えばグルコシダーゼは、前記グルコシダーゼを発現し、好ましくは前記グルコシダーゼを排出する微生物の形態で提供することができる。かかる微生物は、本発明のバニリンシンターゼを含む微生物と共に共培養してもよい。グルコシダーゼはまた、グルコシダーゼを発現する生物の抽出物の形態で提供することができる。該抽出物は、粗抽出物または部分的に精製された抽出物であってもよい。グルコシダーゼはまた、精製酵素として提供されてもよい。グルコシダーゼが抽出物、粗抽出物または精製酵素として提供される態様において、グルコシダーゼは、バニリンシンターゼを含む微生物の培養中に、培養培地に直接添加してもよい。しかし好ましくは、これは培養後に添加する。したがって、バニリンシンターゼを含む微生物の培養後の培養培地に直接添加してもよく、または部分的に精製されたバニリングルコシドに、あるいは精製されたバニリングルコシドにも、添加してよい。したがって、単離されたバニリングルコシドは、前記抽出物、前記部分的に精製された抽出物または前記精製されたグルコシダーゼで処理してもよい。
【００５５】
バニリンのグルコシル化はまた、単離を促進することができる：バニリングルコシドを蓄積した培養培地中の疎水性不純物を、バニリングルコシドを水性相に分配し、一方疎水性不純物は有機相に分配できる、二相分配法により除去することができる。例えばβ−グルコシダーゼ処理による脱グルコシル化（degycosylation）の後、二相分配法を、親水性汚染物質の除去を達成するために繰り返すことができる。
したがって、精製は、以下のステップを含むことができる：
ａ）培養培地および／または培養後のバニリングルコシドを含有する微生物の抽出物および／またはバニリングルコシドを含有する植物の抽出物を得ること：および
ｂ）前記培養培地または抽出物を、有機相と接触させ、混合すること、
ｃ）有機相から水相を分離すること；および
ｄ）有機相を廃棄すること；および
ｅ）バニリングルコシドを、本明細書で上述したグルコシダーゼ処理などのグルコシダーゼ処理により、脱グルコシル化して、これによりバニリンを含む液体を得ること；および
ｆ）前記バニリンを含む液体を、有機相と接触させ、混合すること；および
ｇ）バニリンを含む有機層を回収すること；および
ｈ）任意に、バニリンを前記有機層からさらに精製すること。
【００５６】
有機相は、任意の有用な有機層であってもよく、例えば有機相は、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムから構成されてよい。
一態様において、本発明は、バニリン、バニリルアルコール、および／またはそれらのグルコシドを製造する方法に関し、ここで該方法は、以下を含む：
ａ）配列番号１のVpVANをコードする異種核酸、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体を含む植物を提供すること；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）バニリン、バニリルアルコール、および／またはそれらのグルコシドを、植物から分離すること。
この態様において、植物は、本明細書の以下の節「植物」に記載の任意の植物であってよい。バニリンシンターゼをコードする核酸は、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼをコードすることができる。好ましい態様において、方法は、バニリンを製造する方法である。
【００５７】
別の態様において、本発明は、バニリングルコシドを製造する方法に関し、該方法は、以下を含む：
ａ）配列番号１のVpVANをコードする異種核酸、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するその機能的相同体を含む植物を提供すること；および
ｂ）前記植物を栽培すること；および
ｃ）バニリングルコシドを、植物から分離すること、
ｄ）前記バニリングルコシドを脱グルコシル化すること。
植物は、この植物を栽培するのに適した任意の様式で栽培することができる。当業者は、特定の植物を栽培するために適した条件を、選択することができるであろう。
【００５８】
バニリン、バニリルアルコールおよび／またはバニリングルコシドは、植物の任意の有用な部分から、例えば葉から、果実から、種子から、根から、または茎から、単離することができる。多くの場合、バニリン、バニリルアルコールまたはバニリングルコシドは、植物の葉、種子または果実から単離される。例えば本発明の態様において、植物がNicotiana tabacumである場合、バニリンまたはバニリングルコシドは、葉から単離することができる。一般に分離は、抽出のステップを含み、これには１または２以上の精製ステップが任意に続いてもよく、例えば本明細書のこの節に上記した任意の精製ステップである。バニリングルコシドの脱グルコシル化はまた、本明細書のこの節に上記したようにして実施してもよい。
一態様において、前記植物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含まない同一の植物と比較して、バニリンを、少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍多く生成することが好ましい。
本発明の記載のようにして調製された、バニリンまたは単離されたバニリンを含有する抽出物は、フレーバー消耗品において、例えば食品、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬組成物、歯科衛生組成物および化粧品などにおいて、例えば使用を見出す。かかる消耗品の有用な例は、WO2013/022881の段落[0030]から[0046]に記載されている。WO2013/022881は、本明細書中に参照により組み込まれる。
【００５９】
微生物
一側面において、本発明は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物（ここでバニリンシンターゼは、本明細書の上記の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼであってよい）、ならびにそれらの、バニリンおよび／またはバニリングルコシドの生成における使用に関する。
微生物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸に加えて、追加の異種核酸を含むことができ、例えば、フェルラ酸の合成に関与する１または２以上の酵素（例えば、本明細書の以下の節「フェルラ酸の合成に関与する酵素」に記載の、フェルラ酸の合成に関与する任意の酵素）を、またはグルコシルトランスフェラーゼ（本明細書の以下の節「グルコシルトランスフェラーゼ」に記載の任意のグルコシルトランスフェラーゼ）をコードする異種核酸である。
【００６０】
本明細書に記載の様々な遺伝子およびモジュールが、単一の微生物中ではなく、２種または３種以上の微生物中に存在し得ることが理解されるであろう。したがって例えば、1種の微生物は、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする１または２以上の異種核酸を含むことができ、これにより前記微生物がフェルラ酸を生成できるようにし、一方別の微生物はバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含むことができる。
微生物が複数使用される場合、それらは、バニリンおよびバニリングルコシドを生成するための混合培養中で増殖させることができる。このような場合には、適切なトランスポーターの共発現は、中間体を増殖培地中に輸送し、バニリンまたはバニリングルコシドを生成する微生物への取り込みを容易にすることにおいて、有利となり得る。
【００６１】
本発明の微生物細胞は、異種核酸の発現に適した任意の細胞であることができる。一態様において、本発明の微生物細胞は、真核細胞である。別の態様において、宿主細胞は原核細胞である。好ましい態様において、宿主細胞は酵母または糸状菌などの真菌細胞である。特に、宿主細胞は酵母細胞であってよい。
さらなる態様において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、およびCandida albicansからなる群から選択される。一般に、酵母および真菌は、本発明で使用するための優れた微生物細胞である。これらは、遺伝子操作の望ましい容易さおよび、安価な培地上で高い細胞密度への急速な増殖を提供する。例えば酵母は、広範囲の炭素源で増殖し、グルコースには限定されない。したがって、本発明で使用される微生物は、以下に記載の酵母の群から選択することができる：
【００６２】
Arxula adeninivorans（Blastobotrys adeninivorans）は、異常な生化学的特性を有する二形性酵母である（４２℃までの温度では、パン酵母のような出芽酵母として増殖し、この閾値以上では、糸状形で増殖する）。これは、広範囲の基質上で増殖することができ、硝酸塩を吸収することができる。これは、天然のプラスチックを生産することができる株の生成、または環境試料中のエストロゲンのためのバイオセンサーの開発に、成功して適用されている。
Candida boidiniiは、メチロトローフ酵母である（メタノールで増殖することができる）。Hansenula polymorphaおよびPichia pastorisなどの他のメチロトローフ種と同様に、異種タンパク質の生産のための優れたプラットフォームを提供する。分泌された外来タンパク質の複数グラム範囲の収率が報告されている。ＩＰＲＯの計算方法により、最近、Candida boidiniiキシロース還元酵素の補因子特異性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨに実験的に切り替える変異が予測された。Pythonに実装されたソフトウェアをダウンロードする方法および予測の実験的試験についての詳細は、以下の論文に概説されている。
【００６３】
Hansenula polymorpha（Pichia angusta）は、別のメチロトローフ酵母である（Candida boidiniiを参照）。これはさらに広範囲の他の基質で増殖することができる；熱耐性があり、硝酸塩を吸収することができる（Kluyveromyces lactisも参照）。これは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン、およびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンα−２ａの生産に、さらに技術的な酵素の範囲に適用されている。
Kluyveromyces lactisは、ケフィアの製造に通常に適用される酵母である。これはいくつかの糖で増殖することができ、最も重要なことには、牛乳および乳清中に存在する乳糖で増殖する。これは、チーズを製造するための、キモシン（子牛の胃の中に通常存在する酵素）の生産に特に適用されている。生産は、発酵槽にて４０，０００Ｌのスケールで行われる。
【００６４】
Pichia pastorisは、メチロトローフ酵母である（Candida boidiniiおよびHansenula polymorphaを参照）。これは、外来タンパク質の生産のための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォームの要素はキットとして入手可能であり、これはタンパク質の生成のために学界で世界的に使用されている。株が操作されて、複雑なヒトＮ−グリカンを生成できるようにされている（酵母グリカンは似ているが、ヒトに見られるものと同一ではない）。
Saccharomyces cerevisiaeは、醸造、およびベーキングおよびアルコールの生産においてその使用が知られている、伝統的なパン酵母である。タンパク質の工場として、これは、技術的酵素および、インスリンおよびＢ型肝炎ワクチンなどの医薬品の生産に、成功して適用されている。
Yarrowia lipolyticaは、広範囲の基質で増殖することができる二形性酵母である（Arxula adeninivoransを参照）。これは、産業用途に高い可能性を有しているが、商業的に利用可能な組換え産物はまだ存在しない。
【００６５】
別の態様において、宿主細胞は、クロレラおよびプロトテカなどの微細藻類である。
本発明の別の態様において、宿主細胞は、例えばアスペルギルスなどの糸状菌である。
さらに別の態様において、宿主細胞は植物細胞である。宿主細胞は高等植物の細胞であってもよいが、宿主細胞はまた、高等植物に属していない生物からの細胞であってもよく、例えばPhyscomitrella patens（コケニセツリガネゴケ）からの細胞である。
別の態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、ネズミ、ラット、マウスまたはウサギの細胞である。
宿主細胞はまた、CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、BHK細胞からなる群から選択することができる。
上述したように、宿主細胞はまた、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。細胞が原核細胞の場合、細胞は、限定はされないが、大腸菌、コリネバクテリウム属、バチルス属、シュードモナス属およびストレプトミセス属の細胞から選択してもよい。
【００６６】
植物
いくつかの態様において、本発明のバニリンシンターゼをコードする核酸は、植物または植物細胞に導入されて、バニリンまたはバニリングルコシドまたはバニリルアルコールまたはバニリルアルコールグルコシドを生成する。特に核酸は、Vanilla planifolia以外の植物に導入して、これらの植物においてバニリンの生成を得ることができる。
植物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸に加えて、追加の異種核酸、例えばフェルラ酸の合成に関与する1または２以上の酵素またはグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を含んでよい。
【００６７】
植物または植物細胞は、そのゲノムに組み込まれた異種核酸を有することによって形質転換することができ、すなわち、安定に形質転換することができる。安定に形質転換された細胞は、通常、各細胞分裂で導入された核酸を保持する。植物または植物細胞はまた、組換え遺伝子がそのゲノムに組み込まれないように、一過性に形質転換することができる。一過性に形質転換された細胞は、典型的には、導入された核酸の全てまたは一部を各細胞分裂で失って、導入された核酸は一定数の細胞分裂後に、娘細胞において検出できなくなる。一過性に形質転換されたトランスジェニック植物および植物細胞、および安定に形質転換されたトランスジェニック植物および植物細胞の両方は、本明細書に記載の方法において有用であり得る。
本明細書に記載の方法において使用されるバニリンシンターゼをコードする核酸を含む植物細胞は、植物全体の一部または全てを構成することができる。かかる植物は、考慮中の種のための適切な方法で、生育箱（グロースチャンバー）、温室、または野外のいずれかで、成長させることができる。植物は、子孫が異種核酸を継承するのであれば、バニリンシンターゼをコードする核酸を含む最初の植物の子孫であってもよい。トランスジェニック植物により生産された種子を成長させ、その後自家受粉させて（または外部交配および自家受粉させて）、核酸構築物についてホモ接合性の種子を得ることができる。
【００６８】
本発明で使用する植物は、懸濁培養物、または組織もしくは器官培養で成長させることができる。本発明の目的のために、固体および／または液体組織培養技術を使用することができる。固体培地を使用する場合、植物細胞は、培地上に直接配置するか、またはフィルター上に置いてその後これを培地と接触するように配置することができる。液体培地を使用する場合、トランスジェニック植物細胞は、浮遊装置、例えば液体培地に接触する多孔質膜上に配置することができる。
一過性に形質転換された植物細胞を使用する場合、レポーター活性を有するレポーターポリペプチドをコードするレポーター配列を、形質転換手順に含めることができ、レポーター活性または発現のためのアッセイは、形質転換後の適切な時間に行うことができる。アッセイを行うのに適した時間は、通常、形質転換後約１〜２１日、例えば、約１〜１４日、約１〜７日、または約１〜３日である。一過性アッセイの使用は、異なる種における迅速な分析のために、または特定のレシピエント細胞において発現が以前に確認されていない異種ポリペプチドの発現を確認するのに、特に便利である。
【００６９】
核酸を単子葉植物および双子葉植物に導入するための技術は、当技術分野で知られており、限定することなく以下を含む：アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換、エレクトロポレーション、および粒子銃形質転換、米国特許第5,538,880号、第5,204,253号、第6,329571号、および第6,013,863号。細胞または培養組織を形質転換のためのレシピエント組織として使用する場合、所望であれば、植物は、当業者に知られた技術によって、形質転換された培養物から再生することができる。バニリンシンターゼをコードする異種核酸は、穀類植物に、例えばオオムギに導入することができ、これはHebelstrup et al., (2010) UCE: A uracil excision (USER (TM))-based toolbox for transformation of cereals. Plant Methods, 6:15に、またはHolme et al. (2012) Cisgenic barley with improved phytase activity. Plant Biotechnol J 10, 237-247に記載されている。
【００７０】
植物の集団を、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を有する集団のメンバーについて、スクリーニングおよび／または選択することができる。例えば、単一の形質転換事象の子孫の集団を、バニリンシンターゼの所望のレベルの発現を有する植物についてスクリーニングすることができる。物理的および生化学的方法を使用して、発現レベルを同定することができる。これには以下が挙げられる：ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；ＲＮＡ転写物を検出するための、ノーザンブロット、S1 RNase保護、プライマー伸長、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素もしくはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ；およびポリペプチドを検出するための、タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合免疫測定法。その他の方法、例えばin situハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色もまた、ポリペプチドおよび／または核酸の存在または発現を検出するために、用いることができる。参照された技術の全てを実行するための方法が知られている。代替として、独立した形質転換事象を含む植物の集団を、すべての異なる異種核酸を有するかおよび／または発現するような植物について、スクリーニングすることができる。選択および／またはスクリーニングは、1または２以上の世代にわたって、および／または複数の地理的な位置で行うことができる。いくつかのケースでは、植物は、植物において所望の表現型を誘導するか、またはそうでなければ所望の表現型を生成するために必要な条件の下で、選択される。また、選択および／またはスクリーニングは、植物によって異種核酸が発現されることが予想される特定の発達段階の間に、適用することができる。選択および／またはスクリーニングを行って、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を欠く対照植物と比較して、バニリンまたはバニリンβ−Ｄ−グルコシドレベルの統計学的に有意な差を有するトランスジェニック植物を選択することができる。
【００７１】
本発明の植物細胞を含む植物は、該植物によって生産される種子としても提供される。
本発明で使用する、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物は、例えば以下から選択してよい：トウモロコシ（Zea. mays）、キャノーラ（Brassica napus、Brassica rapa ssp.）、アルファルファ（Medicago sativa）、イネ（Oryza sativa）、ライ麦（Secale cerale）、ソルガム（Sorghum bicolor、Sorghum vulgare）、 ヒマワリ（Helianthus annuas）、コムギ（Tritium aestivumおよび他の種）、ライコムギ、ライ麦（Secale）、大豆（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ピーナッツ（Arachis hypogaea)、綿（Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Impomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cofea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Anana comosus）、柑橘類（Citrus spp.)、ココア（Theobroma cacao）、茶（Camellia senensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifer indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシューナッツ（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia intergrifolia）、アーモンド（Primus amygdalus）、リンゴ（Malus spp）、セイヨウナシ（Pyrus spp）、プラムおよびサクラの木（Prunus spp）、リブス（currant etc.）、ブドウ、キクイモ（Helianthemum spp）、イネ科（Grass family）、砂糖および飼料用ビート（Beta vulgaris）、チコリ、オートムギ、オオムギ、野菜、および観葉植物。
【００７２】
本発明の一態様において、植物は、食用部分を含む植物である。特に、植物は風味のある植物であって、バニラ味との組み合わせが望ましいと想定することができるものであってよい。したがって、植物は、果実の天然の味に加えて、バニラフレーバーを含有することが所望される、食用果実を含む植物であってもよい。かかる植物の1つの非限定的な例は、トマトである。
例えば本発明の植物は、作物である（例えば、穀類および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、ソルガム、キビ、キャッサバ、オオムギ、エンドウマメ、テンサイ、サトウキビ、大豆、アブラナ、ヒマワリおよびその他の根、塊茎または種子作物）。その他の重要な植物は、スパイスまたは医薬品としての使用のために栽培された、果樹、樹木作物、森の樹木または植物であってもよい（ハッカ属（Mentha spp.）、クローブ、アルテミーシア属（Artemesia spp.）、胸腺属（Thymus spp.）、Lavendula spp.、アリウム属（Allium spp.）、オトギリソウ、ニチニチソウ属（Catharanthus spp.）、ビンカ属（Vinca spp.）、ケシ属（Papaver spp.）、ジギタリス属（Papaver spp.）、Rawolfia spp.、バニラ属、（Petrusilium spp.）、ユーカリ、ティーツリー、トウヒ属（Picea spp.）、マツ属（Pinus spp.）、モミ属（Abies spp.）、ビャクシン属（Juniperus spp.））。本発明と共に使用される園芸植物には、レタス、エンダイブ、ならびにキャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ニンジン、およびカーネーションおよびゼラニウムなどのアブラナ科野菜を含んでもよい。
【００７３】
植物はまた、タバコ、ウリ科植物、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、コショウおよびキクからなる群から選択してもよい。
植物はまた、例えば油糧種子植物またはマメ科植物などの穀物植物であってもよい。興味ある種子としては、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ソルガム、ライ麦などの穀物の種子を含む。油糧種子植物は、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナッツ等を含む。マメ科植物は、インゲンおよびエンドウを含む。インゲンは、グアー、イナゴマメ、コロハ種子、大豆、ソラマメ（garden beans）、ササゲ、緑豆、ライマメ、ソラマメ（fava beans）、レンズ豆、ヒヨコマメを含む。
本発明のさらなる態様において、前記植物は、次の群から選択される：トウモロコシ、イネ、コムギ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、アブラナ、ジャガイモ、および大豆。したがって植物は、例えばイネであってもよい。
【００７４】
Arabidopsis thaliana植物の全ゲノムは、配列決定されている（Paquette, S. et al, Phytochemistry 62 (2003) 399-413）。その結果、この植物については非常に詳細な知識が利用可能であり、したがってこれは、用いるのに有用な植物となり得る。
したがって、本発明で使用することができる1つの植物は、Arabidopsis、特にArabidopsis thalianaである。
興味深いことに、本発明は、Vanilla planifoliaとはかなり異なる植物であっても、バニリン、バニリルアルコールおよび／またはバニリングルコシドを生成するように操作できることを実証する。したがって、Vanilla planifoliaは単子葉植物であり、より具体的には着生登攀性ランであるが、本発明は驚くべきことに、双子葉植物でも、バニリン、バニリルアルコールおよび／またはバニリングルコシドを生成可能であることを実証する。このように、本発明の一態様において、宿主生物は双子葉植物である。本発明の好ましい態様において、植物はナス目の植物である。特に植物は、タバコ属の植物であってもよく、例えば植物は、Nicotiana tabacumであってよい。
【００７５】
一態様において本発明は、本発明のバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物に関し、ここで植物は、動物飼料として使用される植物である。動物飼料として使用される植物がバニリンを含むことは有利であり、その理由は、バニリンが動物の食欲を誘発することができ、植物から調製された飼料の嗜好性を向上させることができ、これによって動物による飼料摂取の増加を誘導するからである。さらに興味深いことには、本発明のバニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む植物は、リグニン含量が減少しているか、または異なる組成を有するリグニンを有しており、物理的な強さや生分解性などの良好な特性を提供することができる。理論に束縛されることなく、本発明のバニリンシンターゼの発現は、リグニンの生合成に利用可能なフェルラ酸のプールを減少させることが推測される。
動物飼料として使用される植物は、動物飼料として有用な任意の植物であってよい。一般に前記植物は、イネ科草本や豆類など草本植物であってよい。前記イネ科草本は、イネ科（Poaceae）やイネ科（Gramineae）の「イネ科植物（true grasses）」、ならびにカヤツリグサ科のスゲまたはイグサ科のイグサなどの任意のイネ科型草本であってもよい。有用なイネ科植物の例としては、例えば、穀物、竹および芝生の草（芝）および草原、例えばスイッチグラスが含まれる。
【００７６】
本発明の好ましい一態様において、植物は、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の高い内因含量の植物種の植物である。特に、植物は、フェルラ酸および／またはフェルラ酸グルコシドの高い内因含量の植物種であってよい。本発明の一態様において、植物は、高レベルの遊離および／またはアクセス可能なフェルラ酸またはフェルラ酸グルコシドを蓄積する、植物種である。単子葉植物のツユクサ目（commelinoid order）およびアカザ科（例えばサトウダイコンおよびホウレンソウ）の一次細胞壁は、それらの非木質化細胞壁内に、かなりの量のフェニルプロパノイドを含む。これらのフェニルプロパノイドの主要な画分は、フェルラ酸である。したがって、一態様において、植物は単子葉植物のツユクサ目またはアカザ科の植物であってもよい。一態様において、植物は、乾物１ｇ当たり少なくとも５０μｇの、例えば少なくとも１００μｇの、例えば少なくとも２００μｇのフェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を含む、植物である。
好ましくは、植物はVanilla planifoliaではなくてよい。また好ましくは、植物は、クリーピングベントグラスではなくてよい。
【００７７】
グルコシルトランスフェラーゼ
バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物はまた、バニリンをグルコシル化できてもよい。細菌および真菌などのほとんどの微生物は、天然ではバニリンをグルコシル化することができない。したがって微生物は、少なくとも１種の、好ましくはバニリンのグルコシル化を効率的に触媒するグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を、含むことができる。
バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む類似の植物はまた、バニリンをグルコシル化することが可能であり得る。前記植物は、バニリンをグルコシル化可能な内因性のグルコシルトランスフェラーゼ活性を含むことができる。しかし、好ましくは、植物は少なくとも、グルコシルトランスフェラーゼ、好ましくはバニリンのグルコシル化を効率的に触媒することができるグルコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸を、含むことができる。
【００７８】
バニリンのグルコシル化は、特に有用である。バニリン−β−Ｄ−グルコシドは、バニラ鞘に見出されるバニリンの貯蔵形態である。これは、酵母を含むほとんどの生物に無毒であり、水中でバニリンより高い溶解度を有する。これとは対照的にバニリンは、多くの宿主に対して毒性であり得る。さらに、バニリン−β−Ｄ−グルコシドの形成は、合成をさらに、バニリン生成の方向に引きよせる可能性が高い。また、バニリンのグルコシル化は、単離を容易にすることができる。
【００７９】
グルコシルトランスフェラーゼは、バニリンのグルコシル化を触媒することができる任意のグルコシルトランスフェラーゼであってよく、すなわち、グルコース残基のバニリンへの結合（conjugation）を触媒することができる。特に、グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−グルコース：アグリコン−グルコシルトランスフェラーゼであってよい。好ましくはグルコシルトランスフェラーゼは、バニリンのグルコシル化を触媒して、バニリンβ−Ｄ−グルコシドを生成することができる。このように、グルコシルトランスフェラーゼは、ファミリー１グルコシルトランスフェラーゼであってよい。本発明による好ましいグルコシルトランスフェラーゼは、EC 2.4.1に分類される酵素である。適当なグルコシルトランスフェラーゼとしては、UGT71C2、UGT72B1、UGT72E2、UGT84A2、UGT89B1、UGT85B1、およびアルブチンシンターゼポリペプチドが含まれる。したがって、本発明で使用されるグルコシルトランスフェラーゼは、例えば、GenBank受入番号AC0005496、NM_116337またはNM_126067を有するグルコシルトランスフェラーゼのいずれであってもよい。したがって、組換え宿主は、UGT71C2、UGT72B1、UGT72E2、UGT84A2、UGT89B1、UGT85B1、またはアルブチンシンターゼをコードする異種核酸、または前記の任意の機能的相同体であって、これと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するものを含んでよい。その他の有用なUGTは、WO 01/40491に、例えばWO 01/40491の２〜５ページに記載されている。
【００８０】
Arabidopsis thalianaのUGT72E2は、特に有用である。UGT72E2は、バニリンに対して高い基質特異性を示す。この観察と一致して、バニリン生成酵母におけるその発現は、ほぼすべてのバニリンがバニリン−β−Ｄ−グルコシドに変換されるという結果をもたらす。バニリンをバニリン−β−Ｄ−グルコシドにin vivoで変換する能力は非常に重要であり、その理由は、０．５〜１ｇ／Ｌ規模を超える非グルコシル化バニリンの微生物による生産は、遊離バニリンの毒性により妨害されるからである。グルコシル化は、阻害作用を回避するのに役立つ。
【００８１】
したがって、グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号３のUGT72E2、またはこれと少なくとも８０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。UGT72E2の機能的相同体はまた、バニリンのグルコシル化を触媒して、バニリン−β−Ｄ−グルコシドを形成することができる。グルコース以外の糖、例えばガラクトース、アラビノース、ラムノースおよびキシロースなどの転移を触媒するグリコシルトランスフェラーゼも知られており、バニリンの新規の糖誘導体を得るために導入することができる。
【００８２】
フェルラ酸の合成に関与する酵素
本発明は、バニリンをフェルラ酸から、バニリンシンターゼの支援により製造する方法に関する。方法は、フェルラ酸を生成する微生物または植物の使用を採用してもよく、またはフェルラ酸を、微生物または植物に外因的に添加してもよい。
一部の微生物および多くの植物は、フェルラ酸を天然に生成して蓄積する。しかし、例えばほとんどの細菌または真菌などの他の微生物は、フェルラ酸を天然に生成しない。したがって、フェルラ酸の内因性生成に必要なすべての酵素をコードする遺伝子を天然に発現しない細菌または真菌に関連する本発明の態様において、方法は、前記細菌または真菌を、フェルラ酸を増殖培地に添加することにより、フェルラ酸と接触させることを含んでよい。フェルラ酸を天然に生成しない細菌または真菌に関連する本発明の態様において、前記細菌または真菌は、フェルラ酸の合成に関与する1または２以上の酵素を発現するように操作することができる。さらに本発明に含まれるのは、フェルラ酸の合成に関与する1または２以上の酵素を発現するように操作された１種の微生物を、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物と共に用いることであり、例えば、これらは共培養される。
【００８３】
したがって、一態様において、本発明は、微生物および前記微生物を使用する方法であって、微生物が、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含む、前記微生物および方法に関する。
フェルラ酸の合成に関与する酵素は、例えば、以下からなる群から選択することができる：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、クマル酸−ＣｏＡリガーゼ、シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、およびフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ。これらの酵素の各々は、本明細書で以下により詳細に記載されている。
【００８４】
フェルラ酸を得るための別の経路が知られている。フェルラ酸を得るための多数の経路が、Schoch et al., 2006, Environ Chem Lett, 4:127-136の図６に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、宿主生物はSchoch et al., 2006の図６に示したフェルラ酸を得るための経路の１つの、全酵素を含むことができる。
フェルラ酸の生合成のための1つの経路（本明細書において、フェルラ酸経路１とする）は、以下の酵素を含む：
【００８５】
ステップ１：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってよい。
ステップ２：trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ（桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ）、これは、本明細書の以下に記載の任意のtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼであってよい。
ステップ３：４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼであってよい。
【００８６】
ステップ４：カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のカフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。
本発明の微生物、例えば酵母細胞または細菌は、フェルラ酸経路１の１つの酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含んでよく、例えば、それぞれがフェルラ酸経路１の異なる酵素をコードする少なくとも２種の異種核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路１の異なる酵素をコードする少なくとも３種の核酸を含んでよい。特に、微生物、例えば酵母細胞または細菌は、それぞれがフェルラ酸経路１の異なる酵素をコードする４種の異種核酸を含んでよい。
【００８７】
フェルラ酸の生合成のための別の経路（本明細書において、フェルラ酸経路２とする）は、以下の酵素を含む：
ステップ１＋２：チロシンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のチロシンアンモニアリアーゼであってよい。
ステップ３：４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼであってよい。
【００８８】
ステップ４：カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のカフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。
本発明の微生物、例えば酵母細胞または細菌は、経路２の１つの酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含んでよく、例えば、それぞれが経路２の異なる酵素をコードする少なくとも２種の異種核酸を含んでよい。特に、微生物、例えば酵母細胞または細菌は、それぞれがフェルラ酸経路２の異なる酵素をコードする３種の異種核酸を含んでよい。
【００８９】
フェルラ酸の生合成のためのさらに別の経路（本明細書において、フェルラ酸経路３とする）は、以下の酵素を含む：
ステップ１：フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってよい。
ステップ２：trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ（桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ）、これは、本明細書の以下に記載の任意のtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼであってよい。
【００９０】
ステップ３：４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼであってよい。
ステップ４：シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ５：４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼであってよい。
【００９１】
ステップ６：シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ７：カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。
【００９２】
本発明の微生物、例えば酵母細胞または細菌は、フェルラ酸経路３の１つの酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含んでよく、例えば、それぞれがフェルラ酸経路３の異なる酵素をコードする少なくとも２種の異種核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路３の異なる酵素をコードする少なくとも３種の核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路３の異なる酵素をコードする少なくとも４種の異種核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路３の異なる酵素をコードする少なくとも５種の核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路３の異なる酵素をコードする少なくとも６種の異種核酸を含んでよい。特に、微生物、例えば酵母細胞または細菌は、それぞれがフェルラ酸経路３の異なる酵素をコードする７種の異種核酸を含んでよい。
【００９３】
フェルラ酸の生合成のためのさらに別の経路（本明細書において、フェルラ酸経路４とする）は、以下の酵素を含む：
ステップ１＋２：チロシンアンモニアリアーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のチロシンアンモニアリアーゼであってよい。
【００９４】
ステップ３：４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼであってよい。
ステップ４：シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
【００９５】
ステップ５：４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意の４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼであってよい。
ステップ６：シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。
ステップ７：カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、これは、本明細書の以下に記載の任意のカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。
【００９６】
フェルラ酸の生合成のためのさらに別の経路（本明細書において、フェルラ酸経路５とする）は、以下の酵素を含む：
１）バニリルアルコールオキシダーゼ（ＶＡＯ）、これは、本明細書の以下に記載の任意のＶＡＯであってよい。
この経路は、オイゲノールから開始される。したがって微生物がオイゲノールを合成しない場合には、微生物をオイゲノールの存在下で培養することが好ましい。ＶＡＯに加えて、微生物は好ましくは、コニフェリルアルコールの転換を触媒してフェルラ酸を形成することができる酵素を含む。かかる酵素は、多くの微生物、例えばS. cerevisiaeにおいて、内因的に存在している。フェルラ酸経路５に関する詳細は、Lambert et al., 2013, Flavor and Fragrance Journal, DOI 10.1002/ffj.3171に記載されている。
【００９７】
本発明の微生物、例えば酵母細胞または細菌は、フェルラ酸経路４の１つの酵素をコードする少なくとも1種の異種核酸を含んでよく、例えば、それぞれがフェルラ酸経路４の異なる酵素をコードする少なくとも２種の異種核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路４の異なる酵素をコードする少なくとも３種の核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路４の異なる酵素をコードする少なくとも４種の異種核酸、例えばそれぞれがフェルラ酸経路４の異なる酵素をコードする少なくとも５種の核酸を含んでよい。特に、微生物、例えば酵母細胞または細菌は、それぞれがフェルラ酸経路４の異なる酵素をコードする６種の異種核酸を含んでよい。
【００９８】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ
本発明で使用されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、当業者に知られている任意のフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってよい。特に、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、EC 4.3.1.24に分類される酵素であってよい。
したがって、本発明によるフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、好ましくは、次の反応を触媒することができる酵素である：
【化２】
0006594205.tif 000003
【００９９】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、種々の供給源から、例えば植物からのフェニルアラニンアンモニアリアーゼであってよい。有用なフェニルアラニンアンモニアリアーゼの例は、Vannelli et al., 2006 and Shin et al 2012に記載されている。
したがって、フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
【０１００】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼの機能的相同体も、次の反応を触媒することができる：
【化３】
0006594205.tif 000004
【０１０１】
trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ
本発明で使用されるtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼは、当業者に知られている任意のtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼであってよい。trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼは、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼとも称される。特に、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼは、EC 1.14.13.11に分類される任意の酵素であってもよい。このように、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼは、好ましくは、次の反応を触媒することができる酵素である：
【化４】
0006594205.tif 000005
【０１０２】
trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼは、種々の供給源から、例えば植物からのtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼであってよい。有用なtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼの一例は、Arabidopsis thaliana CYP73A5（GenBank受入番号：U37235）である。したがって、trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼは、配列番号５のtrans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
【０１０３】
trans−桂皮酸４−モノオキシゲナーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる：
【化５】
0006594205.tif 000006
【０１０４】
チロシンアンモニアリーゼ
本発明で使用されるチロシンアンモニアリーゼは、当業者に知られている任意のチロシンアンモニアリーゼであってよい。特に、チロシンアンモニアリーゼは、EC 4.3.1.23に分類される任意の酵素であってよい。したがってチロシンアンモニアリーゼは、好ましくは、次の反応を触媒することができる酵素である：
【化６】
0006594205.tif 000007
【０１０５】
チロシンアンモニアリーゼは、種々の供給源から、例えば植物からのチロシンアンモニアリーゼであってよい。有用なチロシンアンモニアリーゼの例は、Vannelli et al 2006 and Shin et al 2012に記載されている。様々な粘菌からのチロシンアンモニアリーゼも、本発明で用いることができる。
したがって、チロシンアンモニアリーゼは、配列番号６のチロシンアンモニアリーゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
【０１０６】
チロシンアンモニアリーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる：
【化７】
0006594205.tif 000008
【０１０７】
４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ
本発明で使用される４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼは、当業者に知られている任意の４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼであってよい。特に、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼは、EC 1.14.-.-に分類される任意の酵素であってよい。
４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼは、種々の供給源から、例えば植物からの４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼであってよい。有用な４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼの例は、以下を含む：レッドクローバーのクマル酸３’−ヒドロキシラーゼ（CYP98A44）、Arabidopsis thalianaｐ−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（CYP98A3）（配列番号７）、Arabidopsis thalianaのCYP98A8ｐ−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（配列番号８）、またはArabidopsis thalianaのCYP98A9ｐ−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（配列番号９）。
【０１０８】
したがって、４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼは、配列番号７、配列番号８、配列番号９の４−クマリル−３−ヒドロキシラーゼ、または前述のいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
【０１０９】
カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
本発明で使用されるカフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のカフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。特に、カフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、EC 2.1.1.68に分類される任意の酵素であってよい。したがってカフェ酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である：
【化８】
0006594205.tif 000009
【０１１０】
フラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
本発明で使用されるフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。特に、フラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、EC 2.1.1.42に分類される任意の酵素であってよい。したがってフラボン３’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である：
【化９】
0006594205.tif 000010
【０１１１】
４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ
本発明で使用される４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼは、当業者に知られている任意の４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼであってよい。特に、４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼは、EC 6.2.1.12に分類される任意の酵素であってよい。したがって４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である：
【化１０】
0006594205.tif 000011
４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼは、種々の供給源から、例えば植物からの４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼであってよい。有用な４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼの例は、以下を含む：Arabidopsis thaliana４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ３（配列番号１０）またはタバコの４−クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（配列番号１１）。
【０１１２】
したがって、４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼは、配列番号１０、配列番号１１の４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼ、または前述のいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる：
【化１１】
0006594205.tif 000012
【０１１３】
シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ
本発明で使用されるシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。特に、シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、EC 2.3.1.133に分類される任意の酵素であってよい。したがってシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である：
【化１２】
0006594205.tif 000013
【０１１４】
シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、種々の供給源から、例えば植物からのシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼであってよい。有用なシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼの例は、以下を含む：Nicotiana tabacumシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（配列番号１２）、Coffea arabicaヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（配列番号１３）、またはPopulus trichocarpaヒドロキシシンナモイルＣｏＡシキミ酸／キナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（配列番号１４）。
【０１１５】
したがって、シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４のシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、または前述のいずれかと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
シキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる：
【化１３】
0006594205.tif 000014
【０１１６】
カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
本発明で使用されるカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、当業者に知られている任意のカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。特に、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、EC 2.1.1.104に分類される任意の酵素であってよい。したがってカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、好ましくは次の反応を触媒することができる酵素である：
【化１４】
0006594205.tif 000015
【０１１７】
カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、種々の供給源から、例えば植物からのカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼであってよい。有用なカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの例は、以下を含む：Arabidopsis thalianaカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（配列番号１５）、またはNicotiana tabacumのカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（配列番号１６）。
【０１１８】
したがって、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、配列番号６のカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼの機能的相同体もまた、次の反応を触媒することができる：
【化１５】
0006594205.tif 000016
【０１１９】
バニリルアルコールオキシダーゼ
本発明で使用されるバニリルアルコールオキシダーゼ（ＶＡＯ）は、当業者に知られている任意のＶＡＯであってよい。特に、ＶＡＯは、EC 1.1.3.38に分類される任意の酵素であってよい。ＶＡＯは、種々の供給源から、例えば真菌からのＶＡＯであってよい。有用なＶＡＯの例は、Penicillium simplicissimum ＶＡＯを含む。
したがって、ＶＡＯは、ＮＣＢＩデータベースの参照番号CAA75722の配列のＶＡＯ（２０１３年１１月５日から利用可能）、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％の配列同一性を共有する、その機能的相同体であってよい。配列同一性は、好ましくは、本明細書の以下の節「配列同一性」に記載のようにして算出される。
【０１２０】
配列同一性
高レベルの配列同一性は、第１の配列が第２の配列に由来する確度を示している。アミノ酸配列の同一性は、２つの整列した配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と８０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメントに従って、候補配列中のアミノ酸の８０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。本発明による同一性はコンピュータ解析の支援により決定され、これは例えば、限定はされないが、ClustalWコンピュータアラインメントプログラム（Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）、およびその中で示唆されているデフォルトのパラメータである。ClustalWソフトウェアは、European Bioinformatics Institute http://www.ebi.ac.uk/clustalwのClustalW WWW Serviceから入手可能である。デフォルト設定でこのプログラムを使用すると、クエリーおよび参照ポリペプチドの成熟（生物活性）部分が整列される。完全に保存された残基の数を数え、参照ポリペプチドの長さで除算する。
ClustalWアルゴリズムは、ヌクレオチド配列を整列させるために、同様に使用してもよい。配列同一性は、アミノ酸配列について示されるのと同様の方法で計算することができる。1つの重要な態様において、本発明の細胞は、本明細書で定義される、核酸配列コードを含む。
【０１２１】
プロモーター配列
本発明は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸および、任意に、フェルラ酸の合成に関与する酵素（単数または複数）および／またはグルコシルトランスフェラーゼをコードする１または２以上の追加の異種核酸配列を含む、微生物および植物に関する。前記異種核酸の適切な発現を確実にするために、前記コード異種核酸は、一般に、微生物細胞または植物における発現を指令するプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
【０１２２】
プロモーターは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域である。プロモーターは、それらが制御する遺伝子の近くに、同じ鎖上の一般的に上流に（センス鎖の５’領域に向かって）、位置している。転写を開始するためには、ＲＮＡポリメラーゼとして知られているＲＮＡを合成する酵素が、遺伝子近くのＤＮＡに付着しなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子と呼ばれるタンパク質のための確実な初期結合部位を提供する、特定のＤＮＡ配列および応答エレメントを含む。これらの転写因子は、特異的プロモーターに付着し、遺伝子発現を調節する、特定のアクチベーターまたは対応するヌクレオチドのリプレッサー配列を有する。
プロモーター配列は一般に、コード異種核酸に直接隣接して配置されてよい。
【０１２３】
本発明のプロモーター配列は一般に、適切に転写を開始するために必要なプロモーターの最小部分である、コアプロモーターを少なくとも含む。さらに、プロモーター配列は、次のプロモーターエレメントの１または２以上を含むことができる。
・転写開始部位（ＴＳＳ）
・ＲＮＡポリメラーゼの結合部位
・汎用転写因子結合部位
・主要な調節エレメントを含む傾向がある遺伝子の上流の、近位プロモーター配列
・特定の転写因子結合部位
・追加の調節エレメントを含み得る遺伝子の上流の、遠位プロモーター配列；多くの場合近位プロモーターよりも影響は弱い
・リプレッサータンパク質のための結合部位
【０１２４】
フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼの発現の低下
微生物または植物が、フェルラ酸を基質として用いて高レベルの酵素を発現する本発明の態様において、かかる酵素の発現を減少させることが有利となり得る。
酵母などのある種の微生物は、フェルラ酸の脱カルボキシル化を触媒して４−ビニルグアイアコールを得ることができるフェルラ酸デカルボキシラーゼを発現する。したがって、微生物がフェルラ酸デカルボキシラーゼを発現する場合、前記フェルラ酸デカルボキシラーゼの発現が低減されることが好ましい。
【０１２５】
発現の低下は、当業者に知られている種々の従来の技術を用いて実現することができる。例えば、核酸、例えばフェルラ酸デカルボキシラーゼの発現を阻害するアンチセンス核酸を、微生物に形質転換された組換え構築物に含めてもよい。代替的に、ＰＣＲベースの突然変異誘発技術を用いて、フェルラ酸デカルボキシラーゼの遺伝子における変異体を生成することができ、またはフェルラ酸カルボキシラーゼ遺伝子全体を、ＰＣＲベースの遺伝子欠失戦略を用いて、例えばBaudin et al., 1993に記載の戦略から採用して、除去することができる。簡単に言えば、ゲノムのフェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子に隣接する短い相同領域を有するマーカーカセットからなる、ＰＣＲ生成ＤＮＡ分子を、微生物に導入し、相同組換えによりゲノム中に組み込む。様々な生物由来のフェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のゲノム配列が利用可能である。例えば、フェルラ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のゲノム配列は、GenBank受入番号BK006938.2で利用することができる。
【０１２６】
フェルラ酸
本明細書において用いる用語フェルラ酸とは、次の構造：
【化１６】
0006594205.tif 000017
の化合物を指す。
本発明の一定の態様において、バニリンおよび／またはバニリングルコシドの製造方法は、生産する微生物または植物を、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体と接触させることを含む。前記微生物または植物は、フェルラ酸と接触させることが好ましい。特に、これは、微生物または植物が、フェルラ酸を生成することができない本発明の態様において適切である。ほとんどの細菌および真菌は、フェルラ酸を生成することができない。したがって、微生物が細菌または真菌、例えば酵母である本発明の態様において、微生物を、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体と接触させることが好ましい。
【０１２７】
好ましくは前記微生物は、フェルラ酸の存在下で培養され、例えば培養培地はフェルラ酸を含んでいてもよい。したがって培養培地は、好ましくは少なくとも１ｍＭの、好ましくは少なくとも３ｍＭの、例えば少なくとも５ｍＭのフェルラ酸を含んでもよい。
代替的に、前記微生物は、フェルラ酸誘導体または、フェルラ酸およびフェルラ酸誘導体の混合物の存在下で培養され、例えば培養培地は、フェルラ酸誘導体および／またはフェルラ酸を含んでいてもよい。したがって、培養培地は、好ましくは少なくとも１ｍＭの、好ましくは少なくとも３ｍＭの、例えば少なくとも５ｍＭのフェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を含んでよい。
【０１２８】
一態様においては、本発明は、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体を、本明細書の上の節「バニリンシンターゼ」に記載の任意のバニリンシンターゼであってよいバニリンシンターゼと接触させることによって、in vitroでバニリンを製造する方法に関する。前記バニリンシンターゼは、精製された形態または抽出物中で提供されてよく、例えば、例えば本明細書の上の節「微生物」に記載の任意の微生物などの、バニリン酸シンターゼを発現する微生物から調製した抽出物である。フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の任意の有用な濃度を使用してよく、例えば、フェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体の濃度は、１ｍＭ、好ましくは少なくとも３ｍＭ、例えば少なくとも５ｍＭのフェルラ酸および／またはフェルラ酸誘導体である。
フェルラ酸は、任意の有用な形態で提供することができる。例えば糖蜜は一般に多量のフェルラ酸を含み、したがって培養培地は、糖蜜を含むか、またはこれからなることができる。糖蜜は例えば、テンサイまたはサトウキビの糖蜜であってよい。
【０１２９】
フェルラ酸は、フェルラ酸またはその抽出物を含む植物または植物部分を提供することによって、提供されてもよい。
例えば、フェルラ酸はアギ、すなわちジャイアントフェンネルからの乾燥した乳液（latex）、またはその抽出物などの形態で提供することができる。フェルラ酸は、コーヒー、リンゴ、アーティチョーク、ピーナッツ、またはオレンジの種として、またはその抽出物として提供されてもよい。フェルラ酸はまた、ツユクサ類（commelinid）植物またはその一部として提供されてもよい。ツユクサ類植物は、例えばイネ、コムギ、オートムギ、大黒慈姑（Chinese water chestnut）またはパイナップルであってよい。フェルラ酸はまた、アサイーオイルの形態で提供することができる。
フェルラ酸は精製されたフェルラ酸であってもよく、例えば、前述のいずれかのソースから精製されてもよく、またはフェルラ酸は、有機化学の手順によって調製されてもよい。
【０１３０】
フェルラ酸は、フェルラ酸を生成することができる微生物から提供されてもよい。微生物等は、好ましくは、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする１また２以上の異種核酸を含有してもよく、例えば前記微生物は、本明細書の上の節「フェルラ酸の合成に関与する酵素」に記載の酵素をコードする核酸を含んでよい。フェルラ酸を生成することができる微生物は、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物と共に共培養してもよい。代替的に、粗培養培地、または、フェルラ酸を生成することができる微生物の培養からの、部分的に精製されたまたは精製された培養培地を、バニリンシンターゼをコードする異種核酸を含む微生物の増殖のための培養培地に添加してもよい。
【０１３１】
フェルラ酸誘導体は、バニリンシンターゼのための基質として役立つ、フェルラ酸の任意の誘導体であってもよい。好ましくは、フェルラ酸誘導体は、次の一般式で表される化合物である：
【化１７】
0006594205.tif 000018
式中、Ｒは例えば、Ｃ１〜６−アルキルなどのアルキル、Ｃ１〜６−アルコキシなどのアルコキシ、グルコースエステル、グリコシド、Ｓ−ＣｏＡ、シキミ酸またはキナ酸であってよい。
前記グリコシドエステルは、グルコースなどの任意の糖を含んでもよい。グリコシドは、好ましくはグルコシドである。
したがって、フェルラ酸誘導体は例えば、フェルラ酸グルコースエステル、フェルラ酸グルコシド、フェルロイル−ＣｏＡ、フェルラ酸、シキミ酸およびフェルロイル−キナ酸からなる群から選択してよい。
【０１３２】
配列リスト
【表１−１】
0006594205.tif 000019
【０１３３】
【表１−２】
0006594205.tif 000020
【実施例】
【０１３４】
例１
バニリンシンターゼ（VpVAN）
US2003/0070188から入手可能な配列情報に基づいて、4-HBSのコード配列を得た（配列番号２）。
ＰＣＲで生成されたＤＮＡのためのTNT Quick Coupled Transcription/Translation PROMEGAキットを用いて、単離された4-HBS ＰＣＲ生成遺伝子からタンパク質を生成した（発現されたタンパク質は、成功したin vitro翻訳をチェックするためにＳ３５で標識した）。この酵素の基質特異性を調べるために、２．５ｍＭのｐ−クマル酸、フェルラ酸、およびカフェ酸を、供給実験における推定基質として試験した。推定基質を有するタンパク質溶液をそれぞれ１時間および２４時間投与した後、4-HBSの存在下または不在下で得られた代謝プロファイルを、ＬＣ−ＭＳにより分析した。4-HBSはフェルラ酸のバニリンへの鎖短縮化を触媒したが、ｐ−クマル酸またはカフェ酸の鎖短縮化を触媒することはできなかったことが、明確に確認された。図１（ａ）は、４００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中の５ｍＭのフェルラ酸を、３０℃にて１時間供給したタンパク質溶液の、抽出イオンクロマトグラムを示す。バニリンピークは７．５分に観察され、これは、4-HBSなしのタンパク質溶液を同じ条件下で処理した陰性対照中には、存在しない（図１（ｂ）を参照）。図１（ｃ）は、２．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰおよび０．１ｍＭのＮＡＤ＋中の５ｍＭのＣｏＡフェルラ酸を、３０℃にて１時間供給したタンパク質溶液の、抽出イオンクロマトグラムを示す。ここでもまたバニリンピークが観察され、これは陰性対照中には存在しない（図１（ｄ）を参照）。図１（ｅ）は、７．５分におけるバニリン断片化パターン示す。
したがって、我々は4-HBSを、バニリンシンターゼまたはVpVANと再度名付けた。
【０１３５】
例２
VpVANの酵母での発現による、バニリングルコシドのフェルラ酸からの生成
この例では、酵母内で、V. planifoliaのVpVANの異種発現による、バニリングルコシドのフェルラ酸からの生合成を説明する。バニリンシンターゼの基質特異性は、S. cerevisiae株Fsb99における一過性の安定な発現によってさらに確認した。酵母は、Gal誘導性酵母発現ベクターP416 TEFに挿入した、配列番号１のVpVANをコードする核酸で形質転換した（前記細胞はまた、本明細書において、VpVAN形質転換酵母とも称される）。VpVAN形質転換酵母は、ガラクトースおよび５ｍＭの推定基質を含む合成培地で増殖させた。バニリン形成はフェルラ酸の投与後に観察され、一方、ｐ−クマル酸とカフェ酸の代謝は観察されなかった。独立したアプローチでは、配列番号１のVpVANがArabidopsis thalianaのUGT72E2（配列番号３）と共に、酵母で発現された。Arabidopsis thalianaのUGT72E2はフェルラ酸のグルコシル化を触媒し、バニリンシンターゼの、フェルラ酸グルコシドを基質として用いる能力の試験を可能とする。図１２は、Arabidopsis thalianaのUGT72E2（配列番号３）を発現する酵母が、２．５ｍＭのフェルラ酸を含む合成培地で増殖した場合に、フェルラ酸グルコシドを合成することを示す（図１２参照）。生合成試験を、酵母発現のためにコドン最適化された、安定に組み込まれたVANを保有する酵母、またはシグナルペプチドを欠く切断型VAN（配列番号１７；本明細書では、vp Δsp vanとも示す）、または酵母発現のためにコドン最適化されたシグナルペプチドを欠く切断型VANを用いて行った（図３）。酵母株は、異なる推定基質と共に７２時間インキュベートし、その後、代謝産物プロファイルをＬＣ−ＭＳによって決定した。バニリングルコシドの形成は、フェルラ酸を基質として、試験したVANの両方のバージョンで観察された。最高の変換は、Δsp vanの切断型を使用して得られた。いかなる場合にも、カフェ酸またはｐ−クマル酸の炭素鎖短縮は観察されなかった。結果を図３に示す。フェルラ酸を有する酵母の投与はまた、芳香化合物４−ビニルグアイアコールグルコシドの生成をもたらした。したがって、バニリングルコシドの酵母における生成を、２ステップで、フェルラ酸を供給するかまたはフェルラ酸を生成することにより、行うことができる。
【０１３６】
テンサイ、サトウキビまたはソルガムからの砂糖の製造において、糖蜜は、粘性の副産物として得られる。糖蜜は、フェルラ酸を含むヒドロキシ桂皮酸を含有することが知られている。この安価な廃棄物を、バニリングルコシド製造の出発物質として使用することができるかどうかを調べるために、安定に組み込まれ酵母用にコドン最適化されたVANを保有する酵母（すなわち、配列番号１のVpVANをコードする）を、糖蜜上で増殖させた。バニリングルコシドの形成が観察され、安価な出発物質を用いた、工業用天然バニリングルコシド生産のためのこの酵素の可能性が強調された（図２）。
VpVANの基質特異性を、フェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドを用いてさらに試験した。この実験は、バニリングルコシドの形成を検出するために行った。VpUGT72U1は、バニリンをグリコシル化することができるが、フェルラ酸をグリコシル化することはできない；一方、AtUGT72E2は、フェルラ酸およびバニリンの両方をグリコシル化することができる。VpUGT72U1を含有した酵母構築物は、フェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドに対するVpVAN基質特異性を試験することができる。ＬＣ−ＭＳ抽出イオンクロマトグラムは、VpVANがフェルラ酸およびフェルラ酸グルコシドの両方の鎖切断を触媒することができることを示す（図４参照）。
【０１３７】
例３
Nicotiana benthamianaにおけるVpVANの一過性発現による、バニリンの固有フェルラ酸からの生成
この例では、VpVANを、通常はバニリンを生成しない植物におけるバニリンの生成のために使用できることを示す。V. planifolia以外の植物におけるVpVAN活性を、Nicotiana benthamianaの葉における一過性発現により評価した。配列番号１のVpVANをコードする遺伝子発現構築物をAgrobacterium tumefaciensに移し、p19遺伝子サイレンシングサプレッサーを保有するA. tumefaciensと共に、N. benthamianaの葉に共浸潤させた。接種の４日後、浸潤させたタバコの葉を採取し、ＬＣ−ＭＳによる代謝産物プロファイリングに供した。結果を図５に示す。プロファイリングは、VpVANをコードする遺伝子発現構築物をトランスフェクトした植物からのタバコの葉のみに、バニリルアルコールグルコシドの形成を示した。バニリルアルコールは、生きている細胞における、バニリンの既知の代謝物であり、おそらくアルデヒドバニリンの細胞毒性を減少させるために生成される。したがってこれらの結果は、バニリンが、V. planifolia以外の植物におけるフェルラ酸から生成できることを示す。
【０１３８】
例４
バニリングルコシド生成のための、VpVANのタバコにおける安定発現
この例では、タバコNicotiana tabacumの安定に形質転換された株における、バニリングルコシドのde novo形成について記載する。植物において、バニリルアルコールグルコシドではなくバニリングルコシドの蓄積を確実にするために、VpVAN酵素と共に適切な高効率のバニリングリコシルトランスフェラーゼ酵素を共発現することが好適である。VpVAN（配列番号１）は、したがって、N. tabacumの形質転換株において、A. thalianaのUGT72E2（配列番号３）と安定して共発現される。まず、配列番号３のUGT72E2をコードする核酸を、pCAMBIAシリーズの１つなどの、強い構成的カリフラワーモザイクウイルスCaMV35Sプロモーターの制御下で植物における遺伝子発現を可能とする、植物形質転換ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングする。ベクターは、細菌選択遺伝子および植物選択遺伝子の両方を保有する。配列番号３のUGT72E2をコードする核酸を保有するベクターを、Agrobacterium tumefaciensのC58C1/pGV3850に、Wen-Jun et al., 1983に記載のようにして、エレクトロポレーションによって形質転換する。A. tumefaciens細胞を選択培地で増殖させ、陽性形質転換体を一晩増殖させる。プレートからの細菌を２０ｍＬの最少Ａ培地に懸濁し、密度を０．９〜１．０のOD600に調製し、および、約２０枚の０．５ｃｍの四角いN. tabacumの葉（４〜５週齢の組織培養成長植物）を、菌液（ディープウェルペトリ皿）に移す。四角い葉を溶液中で旋回させ、５分間放置し、その後それらを除去し、ブロット乾燥し、次に向軸側を固体RMOPに、プレート当たり約１０枚移す。プレートは、暗所２８℃にて、２〜３日間A. tumefaciensを５日間インキュベートし、その後葉片を、背軸側表面を培地に接触させて固体RMOP-TCHに移し、次に明所２８℃で２〜３週間、１日あたり日光で１６時間インキュベートする。材料は、苗条(シュート)が現れるまでほぼ２週間毎に継代培養し、その後苗木をMST-TCHポットに移し、１〜２週間、日光で１６時間インキュベートし、根の形成時に、植物を温室内の土壌に移す。UGT72E2を発現するトランスジェニックタバコ植物からの植物材料を、次の形質転換に使用する。配列番号１のVpVANをコードする核酸を、上記のように植物発現ベクターにクローニングし、全体の手順を繰り返して、最終的に、UGT72E2とVpVANを共発現するトランスジェニックタバコ植物を得る。最終的トランスジェニック植物からの植物材料を収穫し、溶解して、バニリングルコシド含有量を、トランスジェニック植物からの葉材料で決定する。バニリングルコシドは、野生型タバコ植物には見出されない。
【０１３９】
例５
バニリン生成の増加
例２に記載したフェルラ酸を有する酵母の投与は、酵母のフェルラ酸デカルボキシラーゼ活性のために、高濃度の芳香化合物４−ビニルグアイアコールの生成ももたらした。S. cerevisiaeフェルラ酸デカルボキシラーゼ（FADase）はＰＡＤのスーパーファミリーに属し、フェルラ酸の４−ビニルグアイアコールへの、非酸化的脱カルボキシル化を介した形質転換を触媒する。
バニリン生成を増加させるために、FADase遺伝子を、従来の技術を用いてVpVAN形質転換酵母においてノックアウトする。特にFADase遺伝子は、本明細書の例２に記載された酵母株において、ノックアウトされる。
【０１４０】
S. cerevisiaeの隣接するPAD1とFDC1遺伝子を、ＰＣＲ増幅したKlyveromyces lactisのLEU2（ロイシン栄養要求性選択マーカー）により、それぞれPAD1およびFDC1の前後端に相同な７４〜７７ｂｐのテールを有するプライマーを用いて、破壊する。酵母株をその後ＰＣＲ産物で形質転換し、PAD1およびFDC1活性を有しておらず、ロイシンの補足なしのプレート上で増殖可能な、形質転換体がもたらされる。
以下のプライマーを使用する：
LEU2Δpad1Δfad1_F AACATAATGCTGCAAATATAGATTGATTTCAATCTACGGAGTCCAACGCATTGAGCAGCTTCAATTGAGTAGATatgtctaagaatatcgttgtcctaccgg (配列番号１９)
LEU2Δpad1Δfad1_R CGTGGAGTATAAAAGTTCGGAAAATTTTATTTAAAATCTGATTATATGGTTTTTCTTCCGTAGAAAGTCTATGGCAAttaagccaagatttccttgacagccttggcgatagc (配列番号２０)
【０１４１】
VpVAN（配列番号１）およびUGT72E2（配列番号３）両方を発現するが、PAD1およびFDC1遺伝子が破壊されている酵母（この酵母株はまた、本明細書においてVpVAN+AtUGt72E2 Δpad1 Δfad1とも称される）における、４−ビニルグアイアコールグルコシドの生成を決定した。結果を図９に示す。VpVAN+AtUGt72E2 Δpad1 Δfad1酵母株は４−ビニルグアイアコールグルコシドを生成せず、一方VpVAN（配列番号１）およびUGT72E2（配列番号３）を発現する酵母（VpVAN+AtUGt72E2と称する）は、高発現を有する。
【０１４２】
例６
酵母におけるバニリンの生成
フェルラ酸を培地に添加することなく、バニリンの生成を可能にするため、VpVANで形質転換された酵母をさらに、フェルラ酸の合成に関与する酵素をコードする核酸で形質転換する。
株１
配列番号１のVpVANをコードする核酸および、配列番号３のArabidopsis thalianaのUGT72E2をコードする核酸で形質転換されたS. cerevisiaeを、例３に記載のようにして、次の核酸を用いて、それぞれS. cerevisiaeにおける発現を指向するプロモーターの制御下で調製する：
１．フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Vannelli et al 2006, Shin et al 2012）
２．Arabidopsis thaliana CYP73A5（GenBank受入番号：U37235）
３．チロシンアンモニアリアーゼ（Vannelli et al 2006, Shin et al 2012）
４．４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼArabidopsis thaliana４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ３（GenBank受入番号AF106088_1）
５．Nicotiana tabacumシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（GenBank受入番号Q8GSM7）
６．Arabidopsis thaliana ｐ−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（CYP98A3）（GenBank受入番号：AEC09893.1）
７．Arabidopsis thalianaカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（GenBank受入番号Q9C5D7）
【０１４３】
株２
配列番号１のVpVANをコードする核酸および、配列番号３のArabidopsis thalianaのUGT72E2をコードする核酸で形質転換されたS. cerevisiaeを、例３に記載のようにして、次の核酸を用いて、それぞれS. cerevisiaeにおける発現を指向するプロモーターの制御下で調製する：
１．フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Vannelli et al 2006, Shin et al 2012）
２．Arabidopsis thaliana CYP73A5（GenBank受入番号：U37235）
３．４−クマル酸−ＣｏＡリガーゼArabidopsis thaliana４−クマル酸：ＣｏＡリガーゼ３（GenBank受入番号AF106088_1）
４．Nicotiana tabacumシキミ酸Ｏ−ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（GenBank受入番号Q8GSM7）
５．Arabidopsis thaliana ｐ−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（CYP98A3）（GenBank受入番号：AEC09893.1）
６．Arabidopsis thaliana ｐ−クマル酸３−ヒドロキシラーゼ（CYP98A3）（配列番号７）
形質転換された酵母細胞は、ガラクトースを含有する合成培地で増殖され、バニリングルコシドは増殖培地から単離される。
【０１４４】
例７
推定プレペプチドの存在下および不在下での、バニリンシンターゼの触媒活性
GenBankを用いた一般的な配列同一性検索によれば、VpVan配列は、システインプロテイナーゼに対して高い配列同一性を示した。最も高い配列同一性（７７％）は、システインプロテイナーゼ（MEROPS−ペプチダーゼデータベース）のアリューレイン・クラスに属するElaeis guineensisシステインプロテイナーゼで見出された。興味深いことに、アラインメントは明白に、VpVan配列がプロテイナーゼ活性に必要な３つの主要な活性部位残基を含有することを実証した（Fan, J. et al. Expression of a senescence-associated cysteine protease gene related to peel pitting of navel orange (Citrus sinensis L. Osbeck. Plant Cell Tiss Org 98, 281-289 (2009)）。酵素の活性がプレペプチドの不在下で強化されるか、または基質特異性を変化させるかを試験するために、VpVanから最初の１３７ａａ（VPΔ137van）、およびVpVANから最初の６１ａａを切断した。酵素の活性は、結合転写／翻訳（ＴＮＴ）アッセイを用いてin vitroで試験した。したがって、Wt VpVANは配列番号１のポリペプチドをコードし、wt vp Δspは配列番号１７のポリペプチドをコードし、vp Δ137 vanは配列番号１のａａ１３８〜３５６をコードし、およびvp Δ61 vanは配列番号１のａａ６２〜３５６をコードする。
【０１４５】
ＰＣＲで生成されたＤＮＡのためのTNT（登録商標）Quick Coupled Transcription/Translationキット（Promega）を使用して、ＰＣＲ産物から直接、目的のタンパク質を生成した。Ｌ−［３５Ｓ］−メチオニンを含有させて、SDS-PAGEによる分離後に形成された放射性標識タンパク質のモニタリングを可能とし、乾燥させたゲルを４８時間、STORM 860分子イメージャ（Molecular Dynamics）でスキャンしたホスホイメージャースクリーンでインキュベートすることによって、可視化した。
結合in vitro転写／翻訳アッセイで生成されたタンパク質を、それらの酵素の触媒能力について、アリコート（１０μl）を０．５ｍＭ〜５ｍＭの次の基質でインキュベーションすることによって分析した：４００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および２．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）(総容量：５０μｌ)中の、フェルラ酸（Sigma）、ｐ−クマル酸（Sigma）、カフェ酸（Sigma）、フェルラ酸グルコシド、ｐ−クマル酸グルコシド、カフェ酸グルコシド、カフェオイル−コエンザイムＡ（MicroCombiChem e.K.）、ｐ−クマリル−コエンザイムＡ（MicroCombiChem e.K.）、フェルロイル−コエンザイムＡ（MicroCombiChem e.K.）またはシナピル−コエンザイムＡ（MicroCombiChem e.K.）。酵素アッセイは、２．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭのＡＴＰおよび０．１ｍＭのＮＡＤ＋の存在下および不在下で行った。アリコート（１０μｌ）を特定の時点で回収し、酵素活性をＭｅＯＨの添加（２５μｌ、２５％（ｖ／ｖ）で）によって停止させ、加熱した（４５℃、１５分）。試料を氷で冷却し（３０分）、マイクロタイターフィルタープレート（Merck Millipore）で遠心分離し（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）、ろ液を最終的にＬＣ−ＭＳにより分析した。
結果を図６に示す。実験は、VpVanのＮ末端配列を除去することによる処理は、フェルラ酸グルコシドに対する活性に必要ではないことを示す（図６参照）。
【０１４６】
例８
タバコでの一過性発現の後に分析した、推定プレペプチドの存在下および不在下におけるin vivoのバニリンシンターゼの触媒活性
VpVAN（ER標的化シグナルペプチドを含む）の発現後に観察される生物学的活性を、in vivoにおいて、任意の外因的に添加された基質の不在下で、N. benthamianaの葉における一過性発現によって評価した。遺伝子構築物をAgrobacterium tumefaciensに移し、p19遺伝子サイレンシングサプレッサーを有するA. tumefaciens株に共浸潤させた。ＬＣ−ＭＳプロファイリングは、バニリルアルコールグルコシドのVpVAN依存形成を示した。バニリルアルコールグルコシドは、アルコールデヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.1）によるバニリンの還元およびその後のバニリルアルコールの第一アルコール基のグルコシル化により生じる。バニラ種以外の植物における、バニリンシンターゼの導入によるバニリングルコシドの生物工学的生産のためには、宿主生物が、形成された遊離バニリンをバニリルアルコールへの還元前に対応するグルコシドへと効果的にグルコシル化するＵＧＴを共発現することが、好ましい。
【０１４７】
さらに、wt vp Δ137 van（配列番号１のａａ１３８〜３５６をコードする）およびwt vp Δ66 van（配列番号１のａａ６７〜３５６をコードする）もまた、VANの二次修飾の重要性を調べるために、この研究に含めた。
上記Nicotiana benthamianaの葉におけるVpVANおよびその切断型の一過性の発現は、次のようにして得た。目的のｃＤＮＡ（Wt VpVANまたはwt vp Δ137 vanまたはwt vp Δ61 van）を保有する再結合されたpJAM1502ベクターを含有する、Agrobacterium tumefaciens株AGL1、および、遺伝子サイレンシング阻害タンパク質19（p19）を保有する再結合されたpJAM1502ベクターを保有するA. tumefaciens株AGL1の、一晩培養物を、遠心分離によって回収し、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１００μＭのアセトシリンゴンに再懸濁した（ＯＤ６００＝２．０）。インキュベーション（４時間、ＲＴ）の後、２つのA. tumefaciens株を用いて、２４℃（日中）および１７℃（夜間）で成長させた３週齢のNicotiana benthamiana植物の葉に、共浸潤させた。４または５日後、葉のディスク（直径１ｃｍ）を浸潤された葉から打ち抜き、代謝産物をＬＣ−ＭＳ分析のために６０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨに抽出した。結果を図７Ａ）に示す。
【０１４８】
全３つの構築物の導入は、バニリルアルコールグルコシドの生成をもたらすことが見出された。
VpVan配列は、ファミリーシステインプロテイナーゼ（上記参照）に属するタンパク質と高い配列同一性を示した。我々は、VpVanに対するアミノ酸配列同一性が７１％である、タバコのシステインプロテイナーゼのファミリーに属するタンパク質を同定した（配列番号２２）。アラインメントを調製した（図１０参照）。VpVanシグナルペプチド（配列番号１のａａ１〜２１）を、SignalP 4.1ソフトウェア（Center for Biological Sequence analysis,Technical University of Denmarkから入手可能）を使用して同定した、配列番号２２のシグナルペプチドに置き換えた構築物を調製した。このシグナルペプチドは、配列番号２１のａａ１〜２２である。切断部位は、配列番号１のａａ１３５〜１４１にて、残基１３７の位置（DGV/LPVT）の後ろの切断として同定された。配列番号１のａａ１３５〜１４１に対応する配列番号２２のアミノ酸は、図１０のアライメントを使用して、配列番号２２のａａ１４０〜１４６として同定され、配列番号１のａａ１３５〜１４１を、配列番号２２のａａ１４０〜１４６で置き換えた。こうして、シグナルペプチドおよびプロテアーゼ切断部位を、タバコシステインプロテアーゼのシグナルペプチドおよびプロテアーゼ切断部位で置き換えた。こうして得られたポリペプチドは、[配列番号２２のａａ１〜２１]−[配列番号１のａａ２２〜１３４]−[配列番号２２のａａ１４０〜１４６]−[配列番号１のａａ１４２〜３５６]から構成される。このタンパク質をコードする核酸は、本明細書においてvp nb Δsp Δ137vanと呼ばれ、配列番号２４として提供される。この遺伝子構築物をA. tumefaciensに移し、野生型VpVANについてのこの例の上の記載と本質的に同様にタバコに浸潤させ、バニリンアルコールグルコシドの生成をＬＣ−ＭＳプロファイリングによって分析した。結果を図７Ｂに示す。
【０１４９】
タバコにおける一過性発現後にin vivoでモニタリングした、GhVAN（Glechoma hederaceaからのバニリンシンターゼ）の触媒活性
VpVanの配列は、シソ科に属するGlechoma hederacea（カキドウシ）からクローニングされた新規遺伝子GhVANと７１％のアミノ酸配列同一性を示すことが見出された。GhVANの配列は配列番号２１として提供される。G. hederaceaによって放出される揮発性成分の研究では、この植物が微量のバニリンを放出することが示された（N Radulovic 2010）。
基本的に例８の記載のように実施された、タバコにおけるGhVANの一過性の発現は、この遺伝子の発現が、タバコでのバニリンアルコールグルコシドの蓄積をもたらすこと、すなわち、この酵素が、VpVANと類似の機能特性を有することを実証した（図８参照）。
【０１５０】
参考文献
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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