(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）DNAバーコード配列への相補鎖配列、 
（ii）第一のステム部分の配列、 
（iii）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および 
（iv）第一および第二の２つのステム部分を連結するループ部分の配列
を含むRNAプローブを複数含んでなるプローブ群であって、
前記複数のRNAプローブ間において、前記（ii）及び（iii）が同一であり、前記（i）及び（iv）の配列が異なり、前記（i）を特定することにより前記（iv）が特定可能に構成され、
前記複数のRNAプローブにおいて、前記DNAバーコード配列が、クロスハイブリダイゼーションがないように選択される、プローブ群。
【請求項２】
前記ループ部分の配列が、Pre-miRNAに含有されるループ部分の配列である、請求項１に記載のRNAプローブ群。 
【請求項３】
3’末端を蛍光標識された、請求項１または２に記載のRNAプローブ群。 
【請求項４】
前記Pre-miRNAが、ヒトまたはマウスのPre-miRNAである、請求項２または請求項３に記載のRNAプローブ群。 
【請求項５】
DNAバーコード配列を付加されたスライドの前記DNAバーコード配列に、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のRNAプローブ群をハイブリダイズさせることを含む、RNAと結合するタンパク質を検出するために用いられるRNAマイクロアレイの製造方法。 
【請求項６】
DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび前記DNAバーコード配列にハイブリダイズさせた、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のRNAプローブ群を含む、RNAマイクロアレイ。 
【請求項７】
前記スライドに前記DNAバーコード配列がスポット状に配置され、スポット部位により前記RNAプローブが特定可能に構成される、請求項６に記載のRNAマイクロアレイ。 
【請求項８】
以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法； 
（１）請求項６に記載のRNAマイクロアレイおよびRNAプローブをハイブリダイズしていないDNAバーコード配列を付加されたスライドと蛍光標識された対象タンパク質と接触させる工程、 
（２）当該対象タンパク質と結合したRNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、および 
（３）工程（２）で特定されたDNAバーコード配列と対応する相補鎖を有するRNAプローブを工程（２）で特定されたRNAプローブから削除して得られたRNAプローブに含まれるループ部分の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。 
【請求項９】
前記RNAが、Pre-miRNAである、請求項８に記載の方法。 
【請求項１０】
以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法； 
（１）請求項１から４のいずれか１項に記載のRNAプローブ群および対象タンパク質を接触させる工程、 
（２）工程（１）で得られた対象タンパク質をRNAプローブとの結合を保持したまま単離する工程、 
（３）工程（２）で得られた対象タンパク質からRNAプローブを抽出する工程、 
（４）工程（３）で得られたRNAプローブとDNAバーコード配列を付加されたスライドを接触させる工程、 
（５）前記DNAバーコード配列を付加されたスライドとハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および 
（６）工程（５）で特定されたRNAプローブに含まれる（iv）の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。 
【請求項１１】
前記RNAが、Pre-miRNAである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記RNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、または前記RNAプローブを特定する工程が、前記（i）と前記（iv）との対応関係により実施される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意のタンパク質と相互作用するPre-miRNAを検出するためのRNAマイクロアレイに関する。【０００２】
RNA−タンパク質（RNP）相互作用は遺伝子発現における主要な制御因子であり、特異的なRNP相互作用が細胞運命や疾患を決定することが示されている（非特許文献１）。【０００３】
例えば、Pre-let7 miRNAのloop-stem-loop構造の2のloop部位とLin28Aタンパク質は2か所で結合するように（非特許文献２）、10塩基以上の鎖長を持つRNAは、DNAよりも複雑な立体構造を自己形成する性質を持ち、多くの場合、この構造形成されたRNAがタンパク質との特異的な相互作用に必須となる。【０００４】
最近のRNAタンパク質相互作用解析研究によって、7~9塩基程度のランダム配列から既知のRNA結合タンパク質に対して結合親和性の高い配列を特定する網羅的な研究がされているが、これらの短いRNA配列に結合するタンパク質はハウスキーピング遺伝子が多く、特異的な応答をもたらすような特性は少ないことが確認されている（非特許文献３）。細胞運命制御の因子としての潜在性がある10塩基以上の構造を持ったRNA配列とタンパク質の大規模相互作用解析は依然進んでいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Keene, J.D. (2007) Nature reviews. Genetics 8, 533-543.
【非特許文献２】Nam, Y., Chen, C., Gregory, R.I. et al. (2011) Cell 147, 1080-1091.
【非特許文献３】Ray, D., Kazan, H., Cook, K.B. et al. (2013) Nature 499, 172-177.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
任意のタンパク質と高次構造を含むRNAの相互作用を網羅的に解析する方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、既存の方法で予想されたPre-miRNAの二次構造のうちループ部位を有するRNAプローブを網羅的に作製し、これらのRNAプローブを有するRNAマイクロアレイによって、対象タンパク質と相互作用するPre-miRNAを特定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
[１]以下の配列を含むRNAプローブ；
（i）DNAバーコード配列への相補鎖配列、
（ii）第一のステム部分の配列、
（iii）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および
（iv）第一および第二の２つのステム部分を連結するループ部分の配列。
[２]前記ループ部分の配列が、Pre-miRNAに含有されるループ部分の配列である、[１]に記載のRNAプローブ。
[３]3’末端を蛍光標識された、[１]または[２]に記載のRNAプローブ。
[４]前記Pre-miRNAが、ヒトまたはマウスのPre-miRNAである、[２]または[３]に記載のRNAプローブ。
[５]DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび[１]から[４]のいずれか１項に記載のRNAプローブをハイブリダイズさせることを含む、RNAと結合するたんぱく質を検出するために用いられるRNAマイクロアレイの製造方法。
[６]DNAバーコード配列を付加されたスライドおよび[１]から[４]のいずれか１項に記載のRNAプローブをハイブリダイズさせることによって製造される、RNAマイクロアレイ。
[７]前記（i）の配列が異なり、前記（ii）の配列、（iii）および（iv）の配列が同一である２種以上のRNAプローブを有する、[６]に記載のRNAマイクロアレイ。
[８]以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法；
（１）[６]または[７]に記載のRNAマイクロアレイおよびRNAプローブをハイブリダイズしていないDNAバーコード配列を付加されたスライドと蛍光標識された対象タンパク質と接触させる工程、
（２）当該対象タンパク質と結合したRNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、および
（３）工程（２）で特定されたDNAバーコード配列と対応する相補鎖を有するRNAプローブを工程（２）で特定されたRNAプローブから削除して得られたRNAプローブに含まれるループ部分の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
[９]前記RNAが、Pre-miRNAである、[８]に記載の方法。
[１０]以下の工程を含む、タンパク質と結合するRNAを検出する方法；
（１）[１]から[４]のいずれか１項に記載のRNAプローブおよび対象タンパク質を接触させる工程、
（２）工程（１）で得られた対象タンパク質をRNAプローブとの結合を保持したまま単離する工程、
（３）工程（２）で得られた対象タンパク質からRNAプローブを抽出する工程、
（４）工程（３）で得られたRNAプローブとDNAバーコード配列を付加されたスライドを接触させる工程、
（５）前記DNAバーコード配列を付加されたスライドとハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および
（６）工程（５）で特定されたRNAプローブに含まれる（iv）の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
[１１]前記RNAが、Pre-miRNAである、[１０]に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、DNAバーコード配列を利用することで既存のマイクロアレイ技術を利用したままRNAをスライドの所望の位置に設置することができるため、網羅的に任意のタンパク質と相互作用するRNAを特定することができる。本発明による方法は、Pre-miRNAのループ部位の二次構造を保持したまま当該ループ部位と相互作用するタンパク質を検出することができる点で特に有利である。【００１０】
さらに、本発明では、DNAバーコード配列に対して対象となるタンパク質が結合することによるノイズが発生することを防ぐため、当該タンパク質が結合するDNAバーコード配列を検出結果から除去することにより、所望のタンパク質が結合するRNAの二次構造のみを正確に検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、RNAプローブを転写する鋳型DNAの設計の模式図を示す。
【図２】図２は、Pre-miRNAのループ部位の設計の模式図を示す。
【図３】図３は、RNAアレイの作製方法のプロトコールの模式図を示す。
【図４】図４は、PoP_00001_KtとCy3-L7Aeの相互作用をゲルシフトアッセイにて確認した結果を示す。
【図５】図５は、PoP_00001およびPoP_000018-28とCy3-L7Aeの相互作用をRNAマイクロアレイで検出した結果を示す。
【図６】図６は、PoP_00024とCy3-L7Aeの相互作用をゲルシフトアッセイにて確認した結果を示す。
【図７】図７は、PoP_00010_U1A2、PoP_00014_U1Aなど１８種のRNAプローブとCy3-U1Aの相互作用をRNAマイクロアレイで検出した結果を示す。
【図８】図８は、RNAプローブ(RNP_00001-06500) とDNA鋳型のハイブリダイズを調べた結果を示す。
【図９】図９は、Cy3-L7Aeとの相互作用するRNAプローブ(RNP_00001-06500) をマイクロアレイで検出した結果を示す。
【図１０】図１０は、共沈法によるタンパク質-RNA相互作用の検出方法の模式図を示す。
【図１１】図１１は、Lin28Aと相互作用するRNAプローブ(RNP_00001-06500) をLin28Aと共沈させてマイクロアレイで検出した結果を示す。縦軸は、Lin28Aと共沈させた場合のCy5の蛍光強度を示し、横軸は、beadsのみと共沈させた場合のCy5の蛍光強度を示す。
【図１２】図１２は、U1Aと相互作用するRNAプローブ(RNP_00001-06500) をU1Aと共沈させてマイクロアレイで検出した結果を示す。縦軸は、U1Aと共沈させた場合のCy5の蛍光強度を示し、横軸は、beadsのみと共沈させた場合のCy5の蛍光強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
【００１３】
本発明は、以下の配列を含むRNAプローブを提供する；
（i）DNAバーコード配列への相補鎖配列、
（ii）第一のステム部分の配列、
（iii）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および
（iv）２つのステム部分を連結するRNAに含有されるループ部分の配列。
【００１４】
本発明のRNAプローブとは、対象となる物質と相互作用する可能性がある配列を有する核酸分子、より好ましくは、RNAである。本発明において、対象となる物質は、好ましくは、タンパク質である。当該RNAプローブは、検出に用いるため、放射性同位体、ジゴキシゲニン (DIG) 、蛍光色素（例えば、FITC、PE、Cy3およびCy5）、ビオチンなどの分子（抗原）を取り込ませることで標識しても良い。標識に際しては、予め標識した核酸をプローブ合成時に取り込ませることによって行うことも可能であり、例えば、第一のステム部分の5’側に設置されたG基（グアニン基）に対して相補的であるC基（シチジン基）を標識した後（例えば、3′, 5′-cytidine bisphosphate-Cy5（pCp-Cy5））、3’末端に取り込ませることによって標識する方法である。
【００１５】
本発明において、RNAプローブは、上記に従って配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。好ましくは、RNAプローブは、合成の受託業者に委託して合成されたDNAを転写することによって作製することができる。DNAからのRNAへの転写を行うため、RNAプローブの配列を含むDNAは、プロモーター配列を有していても良い。特に限定されないが、好ましいプロモーター配列として、T7プロモーター配列が例示される。T7プロモーター配列を用いた場合、例えば、ライフテクノロジーズ社より提供されるMEGAshortscript（商標） T7 Transcription Kitを用いて所望のRNAプローブ配列を有するDNAよりRNAを転写行うことができる。本発明において、RNAは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルのみならず、修飾RNAであってもよい。修飾RNAは、例えば、プソイドウリジン、５−メチルシトシン、５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、およびＮ６−メチルアデノシンが例示される。
【００１６】
本発明では、RNAプローブを有するマイクロアレイを準備するためには、多種のRNAプローブを同時に用意することが好ましく、効率的にRNAプローブを含有するオリゴ核酸ライブラリ合成（Oligonucleotide Library Synthesis）技術を用いて行うことが好ましく、この場合、全てのRNAプローブ配列を含有するDNAを特定の塩基長（200塩基以下が望ましく、例えば、180塩基）にて合成するため、RNAプローブおよび前記プロモーター配列以外に、調節配列を有していても良い。当該調節配列は、機能的な配列、例えば、プロモーター配列、ポリA配列、他の配列と相補的な配列でなければ良く、例えば、配列番号１から適宜選択される所望の塩基長分の配列を用いても良い。本発明において特に限定されないが、Oligonucleotide Library Synthesisは、Agilent Technologies社に委託することによって作製することができる。
【００１７】
本発明のDNAバーコード配列とは、タグ（特表平１０−５０７３５７号公報、特表２００２−５１８０６０号公報）、ジップコード（特表２００１−５１９６４８号公報）もしくは正規直交化配列（特開２００２−１８１８１３号公報）、バーコード配列（Xu, Q., Schlabach, M.R., Hannon, G.J. et al. (2009) PNAS 106, 2289-2294）などと呼ばれる配列であり、交差反応性（クロスハイブリダイゼーション）が少ないことが望ましい。また、DNAバーコード配列は、２０〜３０塩基の配列であり、好ましくは、25塩基である。本発明では、マイクロビーズまたはスライドガラス等の固定化用支持体上に当該DNAバーコード配列をスポットしたマイクロアレイに対してハイブリダイズさせることによって、特定の部位にRNAプローブを設置することを目的とするため、当該RNAプローブには、DNAバーコード配列に対する相補鎖の配列を有することが好ましい。
【００１８】
本発明において、ステムとは、任意の核酸配列と当該核酸配列に対して相補的な配列とが、二重らせん構造を取る部位を意味し、第一のステムとは、任意の核酸配列であり、第二のステムとは当該第一のステムと相補的な配列を言う。本発明において、相補的とは、２つの核酸配列がハイブリダイズする能力を意味し、２つの配列がハイブリダイズすればよいことから、本発明において、第二のステムが第一のステムに相補的であるとは、第二のステム部分は第一のステム部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列相補性を持てば良い。第一のステム部分は、配列番号３が例示され、第二のステム部分は、配列番号４が例示される。本発明では、上記のとおりRNAプローブの3’末端に蛍光色素標識されたシチジン（pCp-Cy5）を付加させることが好適であることから、第一のステムの5’末端にはグアニン基を付加することが望ましい。蛍光色素標識をシチジン以外の塩基に対して標識する場合、第一のステムの5’末端には、対合する塩基を選択して付加することが望ましい。
【００１９】
本発明において、「２つのステム部分を連結する」とは、第一のステムの3’末端と第二のステムの5’末端の間を連結させることを意味し、当該連結させる配列は、タンパク質との相互作用を検出すべき配列であれば、任意の配列からなるRNAであってよく、例えば、ステムーループ構造を持つRNAのループ部分であり、５００塩基以下、４００塩基以下、３００塩基以下、２００塩基以下、１５０塩基以下、１００塩基以下、５０塩基以下のRNAが例示される。好ましいRNAは、任意のPre-miRNAに含有されるループ部分である。
【００２０】
本発明において、Pre-miRNAとは、miRNAとその相補鎖を含むヘアピンループ構造を取ることが可能な一本差のRNAである。本発明において、miRNAとは、mRNAからタンパク質への翻訳の阻害やmRNAの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する、細胞内に存在する短鎖（20-25塩基）のノンコーディングRNAである。このmiRNAは、Pri-miRNAとして転写され、核内にあるDroshaと呼ばれる酵素により一部が切断されPre-miRNAとなって核外に輸送された後、さらにDicerによって切断され、ステム構造が解けたのち一本鎖RNA（mature miRNA）として機能する。従って、本発明において、Pre-miRNAに含有されるループ部位には、Pri-miRNAに含有されるループ部位と区別されるものではない。Pre-miRNAは、データベースの情報（例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microRNA.org/）などにおいて、stem-loop配列として、その配列が入手できる。本発明において好ましいPre-miRNAは、ヒトまたはマウス由来の配列である。
【００２１】
本発明において、任意のPre-miRNAに含有されるループ部分とは、Pre-miRNAのうちmature miRNAとその相補鎖となる部分の一部を除く配列を有する一本鎖RNA部分を意味し、例えば、次の通り定義された方法によって抽出することができる。
（I）Pre-miRNAにmature miRNAが１つ含まれている場合
（1）mature miRNAがループの5’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの3’側から４塩基目を始点とし、当該始点の塩基と対合する塩基を終点とする（図１（a）下段参照のこと）。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、始点から3’側の次の塩基目に対合する塩基を終点とする。
（2）mature miRNAがループの3’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの5’側から４塩基目を終点とし、当該始点の塩基と対合する塩基を始点とする（図１（a）上段参照のこと）。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、終点から5’側の次の塩基に対合する塩基を始点とする。
（II）Pre-miRNAにmature miRNAが２以上含まれている場合
（1）ループ側からより離れたmature miRNAに着目し、当該mature miRNAループの5’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの3’側から４塩基目を始点とし、当該始点の塩基と対合する塩基を終点とする。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、始点から3’側の次の塩基目に対合する塩基を終点とする。
（2）ループ側からより離れたmature miRNAに着目し、当該mature miRNAがループの3’側の場合、Pre-miRNAに含有されるループ部分は、当該mature miRNAの5’側から４塩基目をループ部分の終点とし、当該始点の塩基と対合する塩基をループ部分の始点とする。このとき、ミスマッチにより対合する塩基がない場合は、終点から5’側の次の塩基に対合する塩基を始点とする。
【００２２】
本発明では、上述したRNAプローブをDNAバーコード配列を付加されたマイクロビーズまたはスライドガラス等の固定化用支持体とハイブリダイズさせる工程を含む、RNAマイクロアレイを製造する方法を提供する。本発明おいては、固定化用支持体としては、シリコンなどの半導体、ガラス、ダイヤモンドなどの無機物、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等の高分子物質を主成分とするフィルムなどが挙げられ、また基板の形状としては、スライドガラス、マイクロウェルプレート、マイクロビーズ、繊維型などが挙げられるが、それらに制限されない。
【００２３】
固定化用支持体にDNAバーコード配列を付加する方法としては、予めDNAバーコード配列を有する核酸にアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固定化用支持体にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、ＳＨ基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固定化用支持体と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固定化用支持体をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。DNAバーコード配列の調製法としては、フォトリソグラフィー法を用いて核酸プローブを基板（ガラス、シリコンなど）上で１ヌクレオチドずつ合成するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ方式と、マイクロスポッティング法、インクジェット法、バブルジェット（登録商標）法などを用いて、予め調製されたDNAバーコード配列を有する核酸を基板上にスポッティングするＳｔａｎｆｏｒｄ方式とが挙げられるが、３０ｍｅｒ以上のプローブを用いる場合にはＳｔａｎｆｏｒｄ方式、あるいは両者を組み合わせた手法を用いることが好ましい。DNAバーコード配列を付加された固定化用支持体は、受託業者に委託して作製することができる。
【００２４】
上述のように用意したDNAバーコード配列を付加された固定化用支持体とRNAプローブとをハイブリダイズすることによって、固定化用支持体とRNAプローブを特異的に結合させることができる。当業者は、ハイブリダイズ用の溶液の塩濃度、温度、プローブ濃度、反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、実施することができる。
【００２５】
本発明の方法を用いることで、１００以上のRNAプローブを同一の固定化用支持体（例えば、1インチ×3インチのガラススライド）にスポットすることが可能であり、例えば、５００以上、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、１００００以上など、DNAマイクロアレイと同様の密度でRNAプローブ有するRNAマイクロアレイを提供することができる。
【００２６】
本発明において、当該RNAプローブを有するRNAマイクロアレイに対して、溶媒中で任意のタンパク質を供することで、当該タンパク質に対して相互作用するRNAプローブを検出することができる。このとき用いる溶媒は、例えば、Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl2, 0.1% Tween-20を含有する水溶液が例示される。当該タンパク質は、検出を行うため、放射性同位体、ジゴキシゲニン (DIG) 、蛍光色素（例えば、FITC、PE、Cy3およびCy5）などで標識してもよく、RNAプローブに対して行った標識とは異なる標識を行うことが好ましい。RNAプローブはCy5で標識され、当該タンパク質はCy3で標識されることがより好ましい。本発明において相互作用とは、タンパク質とRNAプローブとが結合することを意味し、ここでの結合とは、２つの分子を機能的に接続する（これは、「物理的に結合された」と呼ばれる）ための当該分野で公知の任意の状態を指し、これには、非共有結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合および共有結合）、水素結合、静電結合ならびに高次構造結合（例えば、鍵−鍵穴結合）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、当該RNAマイクロアレイに対してタンパク質を供した後、同溶媒で洗浄しても結合している場合を相互作用すると言い換えることができる。
【００２７】
本発明において、タンパク質とRNAプローブの相互作用を検出する第一の方法は、以下の工程を含むことを特徴とする；
１）前記RNAプローブを含むRNAマイクロアレイと、前記タンパク質とを接触させる工程、
２）工程１におけるRNAプローブと前記タンパク質の相互作用を、前記タンパク質に対する標識物質に基づく測定手段により測定する工程、および
３）工程２で得られる測定結果に基づき、前記RNAマイクロアレイ上の前記タンパク質の量を計算する工程。
【００２８】
前記測定手段は、前記標識物質の存在を検出し、その存在量を測定できる機能を備える分析機器が使用される。前記標識物質が蛍光物質であれば光学的な検出装置を備えた機器が使用される。
【００２９】
前記「計算」は、予め検出に用いた前記タンパク質と相互作用しないことが確認されたRNAプローブに対する前記タンパク質の標識物質量を使用することにより当該RNAプローブにおけるタンパク質量を計算することである。
【００３０】
本発明では、前記の予め相互作用しないことが確認されたRNAプローブに対するタンパク質の標識物質量よりも高値であった場合、当該高値を示したRNAプローブに対してタンパク質が相互作用するとして検出することができる。
【００３１】
本発明において、タンパク質とRNAプローブの相互作用の検出において誤認識を防ぐため、（ii）第一のステム部分の配列、（iii）第一のステム部分とハイブリダイズし、二本鎖ステムを形成するために、第一のステム部分に対して相補的な、第二のステム部分の配列、および（iv）２つのステム部分を連結するPre-miRNAに含有されるループ部分の配列（（ii）、（iii）および（iv）を合わせて、タンパク質認識部位という）が同一であり、（i）DNAバーコード配列への相補鎖配列が異なる２種以上のRNAプローブを含むRNAマイクロアレイであることが好ましい。同一のタンパク質認識部位を有し、異なる（i）DNAバーコード配列への相補鎖配列を有する２種以上のRNAプローブ含むRNAマイクロアレイに対して対象タンパク質を供した場合、２０％以上、２５％以上、３３％以上、５０％以上、６６％以上、７５％以上、１００％の割合で当該同一のタンパク質認識部位を有するRNAプローブと対象タンパク質が相互作用したことが検出できたとき、当該タンパク質認識部位は対象タンパク質と相互作用すると言える。
【００３２】
本発明の方法を用いて行うことで、３５塩基以上のタンパク質認識部位を有するRNAプローブに対して同時に相互作用を検出することが可能であり、例えば、４０塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上のタンパク質認識部位を有するRNAプローブに対して実施し得る。
【００３３】
本発明では、DNAバーコード配列にタンパク質が相互作用することが確認されたため、上述の第一の方法では、RNAプローブのタンパク質認識部位のみに相互作用するタンパク質を特異的に検出するために、以下の第二の方法を用いることができる；
１）RNAプローブを含むRNAマイクロアレイと前記対象タンパク質を含む試料を接触させる工程、
２）RNAプローブを含まないDNAバーコード配列を含むDNAマイクロアレイと前記対象タンパク質を含む試料を接触させる工程、
３）工程１におけるRNAプローブと前記タンパク質の相互作用を、前記タンパク質に対する標識物質に基づく測定手段により測定する工程、
４）工程３で得られる測定結果に基づき、前記RNAマイクロアレイ上の前記タンパク質の量を計算する工程。
５）工程２におけるDNAバーコード配列と前記タンパク質の相互作用を、前記タンパク質に対する標識物質に基づく測定手段により測定する工程、
６）工程５で得られる測定結果に基づき、対応するDNAバーコード配列を抽出する工程、および
７）工程４の計算によって前記対象タンパク質と相互作用すると検出されたRNAプローブから工程６で抽出されたDNAバーコード配列に対応するRNAプローブを削除する工程。
【００３４】
すなわち、当該第二の方法は、以下の工程を含む方法である；
（１）RNAプローブを含むRNAマイクロアレイおよびRNAプローブをハイブリダイズしていないDNAバーコード配列を付加されたスライドと蛍光標識された対象タンパク質と接触させる工程、
（２）当該対象タンパク質と結合したRNAプローブおよびDNAバーコード配列を特定する工程、および
（３）工程（２）で特定されたDNAバーコード配列と対応する相補鎖を有するRNAプローブを工程（２）で特定されたRNAプローブから削除して得られたRNAプローブに含まれる配列を含むPre-miRNAを当該対象タンパク質と結合するPre-miRNAとして検出する工程。
【００３５】
本発明において、第二の方法を用いることによって、対象タンパク質がDNAバーコード配列に対して相互作用するノイズを消去し、RNAプローブと前記対象タンパク質が特異的に相互作用するRNAプローブを検出することを可能とする。
【００３６】
本発明の第一の方法および第二の方法において、検出においてマイクロアレイに供する対象タンパク質の濃度は、５ｎM、１０ｎM、２０ｎM、３０ｎM、４０ｎM、５０ｎM、６０ｎM、７０ｎM、８０ｎM、９０ｎM、１００ｎMで行うことができる。より好ましくは、４０ｎM以下である。
【００３７】
本発明において、タンパク質とRNAプローブの相互作用を検出する第三の方法は、以下の工程を含むことを特徴とする；
（１）前記RNAプローブおよび対象タンパク質を接触させる工程、
（２）工程（１）で得られた対象タンパク質をRNAプローブとの結合を保持したまま単離する工程、
（３）工程（２）で得られた対象タンパク質からRNAプローブを抽出する工程、
（４）工程（３）で得られたRNAプローブとDNAバーコード配列を付加されたスライドを接触させる工程、
（５）前記DNAバーコード配列を付加されたスライドとハイブリダイズしたRNAプローブを特定する工程、および
（６）工程（５）で特定されたRNAプローブに含まれる（iv）の配列を含むRNAを当該対象タンパク質と結合するRNAとして検出する工程。
【００３８】
本発明の第三の方法において、対象タンパク質は、工程（２）において、RNAプローブとの結合を保持したまま単離するために、レジン等の担体と結合させても良い。本発明において、担体は、磁性ビーズであっても良い。対象タンパク質と結合させるため、当該担体は、プロテイン A, G, または L、金属イオン（例えば、銅、ニッケル、亜鉛、コバルトのイオン）、ビオチンまたはグルタチオンと交差結合または、コーティングされていることが好ましい。対象タンパク質は、担体等と結合させるため、Hisタグまたは GSTタグを付しても良く、対象タンパク質に特異的な抗体を用いても良い。
【００３９】
本発明の第三の方法において用いる、RNAプローブは、１００μg以下の量にて行うことができる。より好ましくは、１μgである。
【００４０】
本発明の第三の方法の工程（５）には、RNAプローブの蛍光色素標識を検出し、当該蛍光色素が検出されたスライドの位置に対応するDNAバーコード配列を特定し、当該DNAバーコード配列を有するRNAプローブを検索することによってRNAプローブを特定することができる。
【００４１】
本発明の第三の方法において、検出においてマイクロアレイに供する対象タンパク質の濃度は、１００ｐM以下にて行うことができ、例えば、１ｐM、２ｐM、３ｐM、４ｐM、５ｐM、１０ｐM、２０ｐM、３０ｐM、４０ｐM、５０ｐM、６０ｐM、７０ｐM、８０ｐM、９０ｐM、１００ｐMの濃度が挙げられる。より好ましくは、２０ｐM以下である。
【００４２】
以下、本発明の代表的な実施態様について本願に添付される図面を参照して説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら具体的な態様に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
1. 鋳型DNAのPCR増幅
RNAプローブの鋳型DNA配列は、5’末端から順に、(i) Adjuster Sequence、(ii) CC + T7 promoter + G（24塩基）、(iii) Complementary sequence of 25mer DNA Barcode（25塩基）、(iv) G + Stem forward sequence（18塩基）、(v) Designed RNA coding Sequenceおよび(vi) Stem reverse Sequence（17塩基）を有するように設計した（図1(a)）。各配列は以下に示す。
(i) Adjuster Sequence
OLIGONUCLEOTIDE LIBRARY SYNTHESIS（OLS）（Agilent Technologies社）を用いて鋳型DNAの全長を180塩基にて合成するため、Adjuster Sequenceの塩基数は、96塩基からDesigned RNA coding Sequenceの塩基数を差し引いた長さとして設計した。配列は、5’-CAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATAGTTATTAATAGTAAT-3’（配列番号：１）の5’末端から必要な塩基数を用いた。
(ii) CC + T7 promoter + G（24塩基）
5’- CCGCGCTAATACGACTCACTATAG-3’（配列番号：２）
(iii) Complementary sequence of 25mer DNA Barcode（25塩基）
Xu, Q., Schlabach, M.R., Hannon, G.J. et al. (2009) PNAS 106, 2289-2294に開示されたされた240000種の25塩基長のDNA配列（bc25mer_1-240000）のうちbc25mer_1からbc25mer_6500までの相補鎖を用いた。
(iv) G + Stem forward sequence（18塩基）
5’- GGTGTACGAAGTTTCAGC-3’ （配列番号：３）
(v) Designed RNA coding Sequence
miRBase release 20（http://www.mirbase.org/）に開示されたヒト1872種類およびマウス1186種類のAccession番号に対応する配列（Pre-miRNA配列）からStem loop構造、及びmature miRNAの配列を取得し、Designed RNA coding Sequence（ループ部位）を以下のように定義し、抽出した。ここで、hsa-mir-3652（MI0022909）、hsa-mir-6753（MI0016052）、hsa-mir-6892（MI0022598）、mmu-mir-7060（MI0022739）の4つのPre-miRNAのループ部位は96 塩基よりも鎖長が長く、180塩基の鋳型DNA配列鎖長を超えてしまうため、 この4つのループはライブラリから除いた。従って、ヒト1869種類, マウス1185種類のループ部位よりライブラリを作製した。
(1) Pre-miRNAのループ部位は5’末端側から始まり、3’末端側で終わる。
(2) Designed RNA coding Sequenceの始点と終点は塩基対を形成しているか否かに関わらず、miRBaseにて予想されたStem loop二次構造図上で同じ列の塩基とする。
(3) Pre-miRNAに1つmature miRNA配列が含まれている場合は (図2(a))、mature miRNA（実線のBox）のループ側から4塩基目の列をループ部位（点線のBox）の始点、終点の位置とし、Pre-miRNAに2つのmature miRNA配列が含まれている場合は(図2(b))、mature miRNAのループ部位側がよりループ部位から離れている方の配列を選択し、当該選択したmature miRNAのループ部位側から4塩基目の列をループ部位（点線のBox）の始点、終点の位置とする。
(vi) Stem reverse sequence（17塩基）
5’- GCTGAAGCTTCGTGCAC-3’ （配列番号：４）
このように設計した鋳型DNA配列は、相補鎖を一本鎖DNAとしてAgilent  Technologies社にOLIGONUCLEOTIDE LIBRARY SYNTHESISを用いて合成するよう委託した（図1(b)）。この一本鎖DNAをテンプレートとして、Forward primer (5’-CCGCGCTAATACGACTCACTATAGG-3’（配列番号：５）)およびReverse primer (5’-GTGCACGAAGCTTCAGC-3’（配列番号：６）)を用いて、PCRにより鋳型DNA二重鎖 (Template dsDNA)を増幅した。【００４４】
なお、本発明において、RNAプローブの表記は、以下の規則に則り命名した；
RNP_xxxxx中のxxxxx は25mer barcode DNA番号を表記する。【００４５】
また、1869種のヒトPre-miRNAのループ部位は、以下の通り、同一のループ部位に対して、異なる３種または２種のComplementary sequence of 25mer DNA Barcodeを有するように作製した；
第一のヒトPre-miRNAループライブラリ：RNP_00018からRNP_00028およびRNP_00030- RNP_01887、
第二のヒトPre-miRNAループライブラリ：RNP_01888- RNP_03756、および
第三のヒトPre-miRNAループライブラリ：RNP_03757- RNP_05315。【００４６】
参考までに、RNP_00001からRNP_00029の配列を表１に例示する。【００４７】
【表１Ａ】
0006594776.tif 000002
【表１Ｂ】
0006594776.tif 000003
【表１Ｃ】
0006594776.tif 000004
【表１Ｄ】
0006594776.tif 000005
【表１Ｅ】
0006594776.tif 000006
【００４８】
2. 二重鎖DNAからのin vitro転写によるRNAプローブ合成
得られたTemplate dsDNAからin vitro転写系（MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit, Life Technologies）を用いて製造者のプロトコールに従ってRNAプローブを転写した（図1(c)）。【００４９】
3. RNAプローブのCy5蛍光ラベル
得られたRNAプローブの3’末端にT4 RNA ligaseを用いてpCp-Cy5を修飾した。【００５０】
4. マイクロアレイ上のDNA BarcodeとRNAプローブのハイブリダイゼーション
Xu, Q., Schlabach, M.R., Hannon, G.J. et al. (2009) PNAS 106, 2289-2294に開示されたされた240,000種の25塩基長のDNA配列（bc25mer_1-240000）のうちbc25mer_1からbc25mer_10667をスポットしたスライドをAgilent  Technologies社に作製委託した。このスライドへRNAプローブを加えてスライド製造者のプロトコール（8x15K, 8x60K Agilent Oligo microarray Protocol）に従って、ハイブリダイゼーションを行った。【００５１】
5. 蛍光ラベルされたタンパク質との結合 
Cy3蛍光標識されたNHS（N-Hydroxysuccinimide）エステルと目的タンパク質を反応させ、Cy3ラベルされた目的タンパク質を用意した。このタンパク質を適切なバッファーで希釈し、4で得たマイクロアレイスライドに添加・洗浄してRNAプローブに特異的に結合させた。【００５２】
6. マイクロアレイスライドの2色法スキャン（Cy3/Cy5） 
マイクロアレイスキャナーを用いてCy3及びCy5の蛍光強度を測定し、それぞれの蛍光強度からRNAタンパク質相互作用の有無、強度を概算した。
【実施例２】
【００５３】
L7AeまたはU1Aタンパク質とRNAプローブの相互作用の確認
1. 鋳型DNA配列の設計
古細菌のリボソームタンパク質L7Ae（AAB90466）と結合するKt配列および結合ミュータント配列dKt、ヒトU1Aタンパク質（NP_004587）に結合する2種類の配列U1AまたはU1A2およびそれぞれの結合ミュータント配列dU1AまたはdU1A2、実施例１の手法でmiRBaseから取得したhsa-Pre-let7 ファミリー（hsa-Pre-let7 a-1（miRBase Accession番号：MI0000060）、a-2（miRBase Accession番号：MI0000061）、a-3（miRBase Accession番号：MI0000062）、b（miRBase Accession番号：MI0000063）、c（miRBase Accession番号：MI0000064）、d（miRBase Accession番号：MI0000065）、e（miRBase Accession番号：MI0000066）、f-1（miRBase Accession番号：MI0000067）、f-2（miRBase Accession番号：MI0000068）、g（miRBase Accession番号：MI0000433）i（miRBase Accession番号：MI0000434））のループ配列ならびにle7ファミリー共通配列（consensus）をDesigned RNA coding Sequenceとした鋳型DNA配列を設計した（表２）。なお本実施例では、hsa-Pre-let7ファミリーとle7共通配列の鋳型DNA配列配列のみ全長130塩基となるようAdjuster Sequenceを加えた。【００５４】
【表２Ａ】
0006594776.tif 000007
【表２Ｂ】
0006594776.tif 000008
【００５５】
2. Template dsDNAのPCR増幅
RNAプローブ（PoP_00001_Kt）のTemplate ssDNA （配列は表１参照、Greinerによる受託合成）を鋳型として、PCR法を用いてTemplate dsDNAの増幅を行った。
PCRプライマーにはForward primerおよびReverse primerを用いた。50 μL 反応溶液の組成は1x KOD -Plus- Neo buffer (TOYOBO)、0.2 mM dNTPs、1.5 mM MgSO4、0.5 μM DNA primers、2 nM Template ssDNA、0.02 U/μL KOD -Plus- Neo polymerase (TOYOBO)とし、反応は初めに94℃  2分間インキュベートした後、98℃  10秒間、68℃  20秒間のインキュベートを15サイクルで行った。生成したPCR産物はPCR Purification Kit (QIAGEN)を用いて精製した。ただし溶出の際には超純水15 μLを用いた。その他のRNAプローブについても同様の操作を行った。また、複数種類のRNAプローブを合成する際には各Template ssDNAの総和が終濃度2nMとなるように混合してPCRを行った。【００５６】
3. Template dsDNAからのin vitro転写
in vitro転写系（MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit, Life Technologies）を用いてTemplate dsDNAからの転写反応を行った。10 μL反応溶液の組成は1x T7 Reaction Buffer（Life Technologies）、7.5 mM GTP Solution、7.5 mM ATP Solution、7.5 mM CTP Solution、7.5 mM UTP Solution、150 nM Template dsDNA、1x T7 Enzyme Mix（Life Technologies）として、37℃、4時間インキュベートした。その後、反応溶液にTURBO DNase（Life Technologies）1 μLを加えて混合し、37℃、30分間インキュベートした。生成した転写産物はRNeasy MinElute Cleanup Kit（QIAGEN）を用い、Kitプロトコルを改変して精製した。転写産物に超純水を加えて100 μLに調整し、Buffer RLTを350 μL（QIAGEN）加えて混合し、続いてエタノールを700 μL加えて混合した。混合物575 μL を2 mLコレクションチューブ（QIAGEN）にセットしたRNeasy MinElute Spin Column（QIAGEN）にアプライし、10,000 xg、15秒間遠心操作し、ろ液を棄てた。残りの混合物も同様にアプライし、遠心操作を繰り返した。続いて、Spin ColumnにBuffer RPE（QIAGEN） 500 μLを添加し、10,000 xg、15秒間遠心操作し、ろ液を棄てた。Spin Columnに80％エタノールを500 μL添加し、20,400 xg、2分間遠心操作し、ろ液を棄てた。このSpin Columnを新しいコレクションチューブにセットし、蓋を開けた状態で20,400 xg、5分間遠心操作した。Spin Columnを1.5 mLチューブにセットし、超純水20 μLを加えて20,400 xg、1分間遠心操作しRNAプローブを溶出した。RNA濃度は260 nmの吸光度をNanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）で計測して決定した。【００５７】
4. RNAプローブのCy5蛍光ラベル
転写合成したRNAプローブの3’末端にpCp-Cy5（Jena Bioscience）をT4 RNA ligase (cloned) 5 U/μL （Life Technologies）で修飾した。20 μL反応溶液の組成は1x T4 RNA Ligase Buffer（Life Technologies）、50 μM pCp-Cy5（Jena Bioscience）、6 μM RNAプローブ、0.5 U/μL T4 RNA Ligase（Life Technologies）とし、16℃、20時間インキュベートした。生成したCy5ラベルRNAプローブはRNeasy MinElute Cleanup Kit（QIAGEN）を用い、上記と同様の方法により精製した。ただし、溶出の際には超純水15 μLを加えて20,400 xg、1分間遠心する操作を2回繰り返し、RNAプローブを溶出した。RNA濃度は260 nmの吸光度を、ラベルされたCy5濃度は650 nmの吸光度を、それぞれNanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）で計測して決定した。この操作を用いることで、約90％のRNAプローブにCy5がラベル化された。【００５８】
5. タンパク質L7Ae、U1AのCy3ラベル
L7Ae、U1Aの大腸菌精製は、先の報告の通りに行った（L7Ae: Saito H, Fujita Y, Kashida S, et al. 2011. Nat. Commun. 2: 160.、U1A: Kashida S, Inoue T and Saito H. 2012. Nucleic Acids Res. 40: 9369-78.）。【００５９】
L7Ae、U1AをCy3 Mono-Reactive Dye, protein array grade（GE Healthcare）を用いてCy3ラベル反応を行った。まず、1.0 mg/mLのタンパク質溶液0.20mL をOscillatory Microdialysis System (8K MWCO) (COSMO Bio Ltd.)の透析カップに加え、0.1M Sodium-Carbonate Sodium-Bicarbonate (SCSB) buffer (pH 9.3)でバッファー交換した。Cy3 Mono-Reactive Dye（GE Healthcare）のチューブにジメチルスルホキシド30 μLを加えて溶解し、この色素溶液6 μLを直ちにタンパク質溶液に加えて、暗所で室温30分間インキュベートした。その際10分置きに上下振盪による撹拌を行った。また、この反応時間中に回収チューブ（Millipore）にセットしたAmicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters（Millipore）にTBST buffer (Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, 0.1% Tween-20)を0.5 mL加え、4℃  14,000 xg  15分間遠心して、ろ液を棄て、フィルタを平衡化した。反応後のタンパク質溶液を平衡化したフィルタに添加した。続いてTBSTを0.4 mLになるまで加えてマイクロピペットで混合した後に、4℃、14,000 xg、15分間遠心し、ろ液を棄てる操作を3回繰り返した。このフィルタを新しい回収チューブに上下逆向きにセットして4℃、1,000 xg、2分間遠心してタンパク質溶液を回収した。回収したタンパク質溶液に等量のグリセロールを加え、‐30℃で保存して以降の実験に使用した。ラベルされたCy3の濃度は552 nmの吸光度から決定し、タンパク質濃度はプロテインアッセイ（Bio-Rad）を用いてBradford法で決定した。【００６０】
6. ゲルシフトアッセイによるCy3-L7AeとCy5-RNAプローブの結合確認
DNA Barcode (bc25mer_00001)とCy5-RNAプローブ(PoP_00001)の結合、さらにこのDNA/RNA複合体とCy3-L7Aeとの結合をEMSA(Electro Mobility Shift Assay)で以下のように確認した。まず、bc25mer_00001とPoP_00001_Ktを混合し、アニーリングを行った。11 μL の反応溶液の組成は500 nM bc25mer _00001、500 nM PoP_00001_Kt、1x Annealing Buffer （50 mM HEPES-KOH(ph7.8)、100 mM KCl）とし、反応は98℃  2分間、55℃  1分間インキュベートした後、毎分1℃、30分間温度を低下させながらインキュベートした。次に、アニーリングしたDNA/RNA複合体とL7Aeを以下のように混合して結合させた。15 μL反応溶液の組成は0、100、200、500または1000 nM Cy3-L7Ae、50 nM DNA/RNA複合体、1x Annealing Bufferとして、氷上で30分間インキュベートした。この溶液に5x色素液（0.25%ブロモフェノールブルー、30％グリセロール）3.75 μLを加えて混合し、この混合液10 μLを非変性15％ポリアクリルアミド（1/30ビスアクリルアミド）ゲルに重層し、4℃、200Vで60分間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを室温で15分間、SYBR Green I及びIIで染色し、Typhoon FLA 7000（GE Healthcare）のSYBR Greenモード（600 pmt）、Cy5モード（900 pmt）でスキャンし、バンドを確認した。結果を図4に示す。その結果、DNA BarcodeとCy5-RNAプローブがDNA/RNA複合体を形成し、さらにL7Aeと複合体も結合することが示された。【００６１】
7. 25 mer DNA Barcodeをスポットしたカスタムアレイの設計
CGHカスタムアレイ8x15K (Agilent)に25 mer DNA Barcodeのスポットを配置してDNA Barcodeマイクロアレイをデザインした。bc25mer_00001からbc25mer_00500までのDNA Barcodeが結合するスポット、bc25mer_1からbc25mer_500は10スポットずつ配置し、bc25mer _501からbc25mer _10667までは1スポットずつ配置した。【００６２】
8. 12種類のRNAプローブとL7AeのRNPマイクロアレイ
DNA Barcodeマイクロアレイ上でCy5-RNAプローブ(PoP_00001および、PoP_000018-28)とCy3-L7AeのRNP相互作用が検出可能かを検証した。1.5 mLチューブに120 ng Cy5-RNAプローブPoP_00001_Kt、120 ng Cy5-RNAプローブPoP_00018-28及び超純水を混合して18 μLとし、10x Gene Expression Blocking Agent （Agilent）4.5μLと2x Hi-RPM Hybridization Buffer（Agilent）22.5 μLを加えて混合した。混合液を100℃、5分間インキュベートした後、氷上で 5分間インキュベートした。ハイブリチャンバー（Agilent）の下枠にガスケットスライド（Agilent）を載せ、ガスケットスライドの１つのウェル上に混合液45 μLを加えた後、DNA Barcodeマイクロアレイスライドを被せてハイブリチャンバーを組み立てた。ハイブリチャンバーを55℃のハイブリオーブンのローター（Agilent）にセットし、毎分20 回転で 20時間インキュベートした。オーブンから取り出したハイブリチャンバーを分解してマイクロアレイスライドを取り出し、Gene Expression Wash Buffer 1 （Agilent）内でガスケットと分離し、Gene Expression Wash Buffer 1 で室温5分間洗浄した。さらに Gene Expression Wash Buffer 2（Agilent）で37℃、5分間洗浄した。乾燥させたマイクロアレイスライドをマイクロアレイスキャナ（Agilent）の8x 15K, c scan, AglilentHD_miRNA, two color, XDR Hi and Lo (0.05)モードで スキャンし、目的のスポットにRNAプローブが結合していることをCy5シグナルで確認した。【００６３】
続いて、ハイブリチャンバー上でガスケットスライドに5 nM Cy3-L7Ae 70 μL（TBSMT buffer (Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl2, 0.1% Tween-20)で濃度調製）を加え、スキャンしたマイクロアレイスライドを載せて、ハイブリチャンバーを組み立て、室温で30分間インキュベートした。ハイブリチャンバーを分解してマイクロアレイスライドを取り出し、TBSMT buffer内でガスケットと分離し、TBSMT bufferで室温5分間洗浄した。さらにTBSM buffer  (Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, 5 mM MgCl2)で室温5分間洗浄した。乾燥させたマイクロアレイスライドを再度スキャンした。その結果、図5のように、ポジティブコントロールであるPoP_00001_KtのスポットでCy3シグナルを検出しただけでなく、PoP_00024_hsa-let-7eのスポットでPoP_00001_Kt より1.5倍程度強いCy3シグナルを検出した。他の10本のプローブのスポットではCy3シグナルは検出されなかった。【００６４】
9. ゲルシフトアッセイによるL7AeとPoP_00024プローブの結合確認
DNA Barcode (bc25mer_00001)とCy5-RNAプローブ(PoP_00001_Kt)の特異的な結合、さらにCy5-RNAプローブ(PoP_00001_Kt、PoP_00024_hsa-let-7e)とL7Aeとの結合をEMSAで以下のように確認した。まず、bc25mer_00001とPoP_00001_KtまたはPoP_00024_hsa-let-7eを混合し、アニーリングを行った。11 μL の反応溶液の組成は500 nM bc25      mer_00001、500 nM Cy5-RNAプローブ、1x Annealing Buffer （50 mM HEPES-KOH(ph7.8)、100 mM KCl）とし、反応は95℃  5分間、室温  10分間インキュベートした。次に、アニーリングしたDNA/RNA複合体とL7Aeを以下のように混合して結合させた。15 μL反応溶液の組成は0、100、200、500または1000 nM Cy3-L7Ae、50 nM DNA/RNA複合体、1x Annealing Bufferとして、氷上で1時間インキュベートした。この溶液に5x色素液（0.25%ブロモフェノールブルー、30％グリセロール）3.75 μLを加えて混合し、この混合液10 μLを非変性15％ポリアクリルアミド（1/30ビスアクリルアミド）ゲルに重層し、4℃、200Vで60分間電気泳動を行った。泳動後、ゲルを室温で15分間、SYBR Green I及びIIで染色し、Typhoon FLA 7000（GE Healthcare）のSYBR Greenモード（600 pmt）でスキャンし、バンドを確認した。結果を図6に示す。その結果、bc25mer_00001とPoP_00001_Ktは結合して複合体を作るが、PoP_00024_hsa-let-7eとは結合しないこと、 PoP_00001_Kt、PoP_00024_hsa-let-7eはL7Aeと結合するが、PoP_00024_hsa-let-7eはPoP_00001_Ktより10倍程度強く結合することが示された。以上より、hsa-let-7eの Pre-miRNAのループ配列がL7Aeと結合し、その親和性は既知のKtループよりも強いということが発見された。このことから、本申請技術のRNPマイクロアレイによって、特定のタンパク質に結合する新規のRNA配列を取得可能であることが示唆された。【００６５】
10. 18種類のRNAプローブとU1AのRNPマイクロアレイ
DNA Barcodeマイクロアレイ上でCy5-RNAプローブ(PoP_00001、00008、00010、00011、00014、00016および、PoP_000018-28)とCy3-U1AのRNP相互作用が検出可能かを検証した。【００６６】
1.5 mLチューブに120 ng Cy5-RNAプローブPoP_00001_Kt、120 ng Cy5-RNAプローブPoP_00001、00008、00010、00011、00014、00016、PoP_00018-28及び超純水を混合して18 μLとし、以降前記8.と同様の操作で目的のスポットにRNAプローブが結合していることをCy5シグナルで確認した。【００６７】
続いて、ハイブリチャンバー上でガスケットスライドに40 nM Cy3-U1A 70 μLを加え、RNAプローブの結合したマイクロアレイスライドを載せて、ハイブリチャンバーを組み立て、室温で30分間インキュベートした。ハイブリチャンバーを分解してマイクロアレイスライドを取り出し、TBSMT buffer内でガスケットと分離し、TBSMT bufferで室温5分間洗浄した。さらにTBSM bufferでリンスした。その後、乾燥させたマイクロアレイスライドをスキャンした。その結果、図7のように、U1A結合配列を持つPoP_00010_U1A2、PoP_00014_U1Aのスポットで他のスポットと比較して10倍以上強いCy3シグナルを検出した。以上より、RNPマイクロアレイによってU1Aと結合するRNA配列を検出可能であることが示唆された。
【実施例３】
【００６８】
実施例２の結果を踏まえ、6500種類のRNAプローブ(RNP_00001-06500)の鋳型DNAの相補鎖である、OLSで受託合成したTemplate ssDNAライブラリをもとに、ヒト、マウスのPre-miRNAループ配列とL7Aeの相互作用をRNPマイクロアレイで検出可能かを検証した。【００６９】
1. Template dsDNAのPCR増幅
OLSで受託合成したTemplate ssDNAライブラリを鋳型として、実施例2の2.と同様の操作でTemplate dsDNAのPCR増幅を行った。ただし、その際反応スケールは100 μLで行い、超純水15 μLを用いて2回溶出を行った。【００７０】
2. Template dsDNAからのin vitro転写
実施例2の2.と同様の操作でTemplate dsDNAからの転写反応を行った。ただし、その際反応スケールは20 μLで行い、超純水15 μLを用いて2回溶出を行った。【００７１】
3. RNAプローブのCy5蛍光ラベル
実施例2の3.と同様の操作で転写合成したRNAプローブの3’末端にpCp-Cy5を修飾した。ただし、その際反応スケールは100 μL x2で行った。【００７２】
4. 6500種類のRNAプローブとL7AeのRNPマイクロアレイ
DNA Barcodeマイクロアレイ上でCy5-RNAプローブ(RNP_00001-06500)とCy3-U1AのRNP相互作用が検出可能かを検証した。【００７３】
1.5 mLチューブにCy5-RNAプローブ(RNP_00001-06500) 5 μg及び超純水を混合して18 μLとし、以降は実施例2の8.と同様の操作で目的のスポットにRNAプローブが結合していることをCy5シグナルで確認した。また、コントロールとして240 ng Cy5-RNAプローブ(PoP_00001、00008、00010、00011、00014、00016および、PoP_000018-28)に関しても同様の操作を行った。実験はRNP_00001-06500及びコントロールともに2サンプルずつ行った。その結果、図8のようにRNP_00001-06500の2の15乗から20乗付近の強いCy5シグナルを検出した。また同様の操作を行った2サンプル間のCy5シグナル強度のばらつきは2倍以内に収まっていることが示された。【００７４】
続いて、ハイブリチャンバー上でガスケットスライドに5 nM Cy3-L7Ae 70 μLを各ウェルに加え、RNAプローブの結合したマイクロアレイスライドを載せて、ハイブリチャンバーを組み立て、室温で30分間インキュベートした。ハイブリチャンバーを分解してマイクロアレイスライドを取り出し、TBSMT buffer内でガスケットと分離し、TBSMT bufferで室温5分間洗浄した。さらにTBSM bufferで室温1分間洗浄した。その後、乾燥させたマイクロアレイスライドをスキャンした。結果のデータから、DNA Barcodeに直接結合するCy3-L7Aeのシグナルをノイズとして除去するため、以下のデータ操作を行った。コントロールサンプルのデータの、RNAプローブが結合せずBarcode DNAしかないスポット(18種類のRNAプローブが結合するスポット以外のスポット)のCy3シグナルをRNP_00001-06500サンプルのCy3シグナルを引いた値が0以上のスポット（図9の三角形の太枠内）のみを陽性のシグナルとして解析した。2サンプルのシグナルを平均した後にCy3のシグナルをスポットへのRNAプローブの結合量（Cy5のシグナル）で補正するため、
L7Aeの結合量（2log値）＝Cy3-Cy5+20
として、シグナルを補正した。さらに同じループを持つRNAプローブのCy3シグナルを平均化して、シグナルの高いRNA配列（RNAloop）を算出した（表３）。その結果、実施例２と同様にKt、hsa-let-7eの配列を含むRNA配列がL7Aeと相互作用することが確認された。【００７５】
【表３】
0006594776.tif 000009
【実施例４】
【００７６】
RNAとの結合を検出する対象となるタンパク質に対してエステル共有結合による蛍光標識せず検出する方法を検討した。Lin28Aを対象タンパク質として用いた場合の方法を例示する（図１０）。簡潔には、次の通りである。20 pmolのHis6タグを付したLin28A、上記の方法で得られた1 μg Cy5-RNAプローブ(RNP_00001-06500)および20 μL TALON Magnetic Beads（Clonetech）をProtein Binding buffer (20 mM Hepes pH7.8、80 mM KCl、20 mM NaCl、10% glycerol、2 mM DTTおよび0.1 μg/μL BSA)に溶解させ、4℃で30分間混合した。混合後、磁気を利用して、TALON Magnetic Beadsを容器内に保持し、溶液を除去した。当該TALON Magnetic BeadsをProtein Binding bufferを用いて洗浄後、200 μL Elution buffer（1% SDS、10 mM Tris-HClおよび2 mM EDTA）を加え95℃で3分間熱し、RNAを溶出させた。得られたRNA溶液へ等量のフェノールを加え、水層を抽出し、さらに、等量のクロロホルムを加え、水層を中抽出した。当該水層へ、6.6 μL 3M NaOAcおよび2 μL Ethachinmateを加え混合し、さらに500 μL Ethanolを加えた後、遠心分離によりRNAを単離した。回収されたRNAを純水に溶解し、18 μLとし、以降は実施例2の8.と同様の操作でDNA Barcodeマイクロアレイとハイブリダイズした。Cy5を指標として、マイクロアレイ上に存在するRNAプローブを検出し、Lin28Aと混合せずに同様の方法で検出されたRNAプローブの結果（陰性対照）と比較した（図１１）。なお、Cy5の蛍光強度（Cy5 Intensity）は、Cy5-RNAプローブとDNA Barcodeマイクロアレイとハイブリダイズして得られたCy5の蛍光強度（陽性対照）との比較値として算出した。Lin28Aと特異的に結合したヒトRNAプローブのうちCy5 Intensityが強いものから上位20位を表４に示す。ここで、Lin28Aと結合することが既知であるLet-7dが検出されたことから、対象タンパク質を蛍光標識することなくタンパク質とpull-down（共沈）させることによっても相互作用の検出できることが示された。【００７７】
本実施例で用いたRNAプローブのコピー数は、マイクロアレイにスポットされたDNA Barcodeのコピー数と比較してより少ないことから、蛍光強度は、Lin28Aと結合したRNAプローブのコピー数と比例している。従って、蛍光強度が高いほどLin28Aへの結合の高いRNAプローブであったと考えられる。【００７８】
【表４】
0006594776.tif 000010
【実施例５】
【００７９】
実施例４と同様の方法を用いて、U1Aタンパク質への結合するRNAプローブの検出を行った。簡潔には、次の通りである。20 pmolのHis6タグを付したU1A、上記の方法で得られた1 μg Cy5-RNAプローブ(RNP_00001-06500)および20 μL TALON Magnetic Beads（Clonetech）をProtein Binding buffer (20 mM Hepes pH7.8、80 mM KCl、20 mM NaCl、10% glycerol、2 mM DTTおよび0.1 μg/μL BSA)に溶解させ、4℃で30分間混合した。混合後、磁気を利用して、TALON Magnetic Beadsを容器内に保持し、溶液を除去した。当該TALON Magnetic BeadsをProtein Binding bufferを用いて洗浄後、200 μL Elution buffer（1% SDS、10 mM Tris-HClおよび2 mM EDTA）を加え95℃で3分間熱し、RNAを溶出させた。得られたRNA溶液へ等量のフェノールを加え、水層を抽出し、さらに、等量のクロロホルムを加え、水層を中抽出した。当該水層へ、6.6 μL 3M NaOAcおよび2 μL Ethachinmateを加え混合し、さらに500 μL Ethanolを加えた後、遠心分離によりRNAを単離した。回収されたRNAを純水に溶解し、18 μLとし、以降は実施例2の8.と同様の操作でDNA Barcodeマイクロアレイとハイブリダイズした。ただし、本実施例では、マイクロアレイスライドは、8x 60Kを使用した。Cy5を指標として、マイクロアレイ上に存在するRNAプローブを検出し、U1Aと混合せずに同様の方法で検出されたRNAプローブの結果（陰性対照）と比較した（図１２）。なお、Cy5の蛍光強度（Cy5 Intensity）は、Cy5-RNAプローブとDNA Barcodeマイクロアレイとハイブリダイズして得られたCy5の蛍光強度（陽性対照）との比較値として算出した。検出されたU1Aと特異的に結合するヒトRNAプローブのうちCy5の蛍光強度（Cy5 Intensity）が強いものから上位20位を表５に示す。ここで、U1Aと結合することが既知であるU1A2またはU1Aが検出されたことから、本方法によってLin28A以外のタンパク質と相互作用するRNA構造体を検出できることが示された。【００８０】
【表５】
0006594776.tif 000011
【図１】
0006594776.tif 000012
【図２】
0006594776.tif 000013
【図３】
0006594776.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006594776.tif 000023
【配列表】
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