(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの変異体であって、配列番号５３のアミノ酸配列を含む機能的第ＶＩＩＩ因子である、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの変異体。 
【請求項２】
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの変異体であって、配列番号５３のアミノ酸配列を含む機能的第ＶＩＩＩ因子であり、更にＲ３３６Ｉのアミノ酸置換を含む、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの変異体。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項記載の変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと医薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２のいずれか１項記載の変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項５】
請求項４記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項６】
該ベクターが発現ベクターである、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項４記載の単離された核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）請求項７記載の組換え宿主細胞を該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、（ｂ）該変異体を単離することを含む、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
出血障害の予防または治療のための、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該出血障害が慢性出血障害である、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該出血障害が急性出血エピソードである、請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１３年３月１５日付け出願の米国仮特許出願第６１／７８９，１１２号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００２】
開示の分野
ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子変異体およびそのような変異体をコードするポリヌクレオチド、そのような変異体を含み発現するベクターおよび宿主細胞、そのような変異体の入手方法、そのような変異体の使用方法、該変異体の組成物、ならびにそれらに関連した追加的な発明の特徴を本明細書において提供する。
【背景技術】
【０００３】
血液凝固は、最終的にフィブリン塊を生じさせる、種々の血液成分（または因子）との間の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般に、しばしば凝固「カスケード」と称されるものに関与する血液成分は、それ自体が活性化凝固因子であることが多いアクチベーターの作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質（プロ酵素またはチモーゲン）である。凝固カスケードに決定的に重要な１つのペプチドは第ＶＩＩＩ因子またはＦＶＩＩＩである。実際、最も一般的な遺伝性凝固障害である血友病Ａは第ＶＩＩＩ因子の欠乏または構造的欠陥により引き起こされる。第ＶＩＩＩ因子の生化学的性質は凝固のための迅速なオン／オフの切替を可能にする。それは、凝固カスケードの最後から２番目の酵素であるトロンビンによりＦＶＩＩＩａに活性化される不活性補因子として循環する。ＦＶＩＩＩａは、ＦＩＸａ、膜またはリン脂質（ＰＬ）表面およびＣａ＋２と共に短命酵素複合体（ＦＸａｓｅ）に加わって、ＦＸをＦＸａに変換する。ＦＸａｓｅ複合体における参加体としてのＦＶＩＩＩａの主な機能は、ＦＸａを著しく増幅することであり、ついでこれはトロンビン生成を可能にする。第ＶＩＩＩ因子は、２６個のエキソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２９：１１−２２（２００３）（参考文献１１および１６〜１８））からなる約１８６ｋｂの遺伝子によりコードされている。この遺伝子のｍＲＮＡの翻訳およびそれに続く１９アミノ酸のシグナル配列の除去は２３３２アミノ酸の成熟タンパク質を与える。該タンパク質は６つの主要ドメインからなり、これらはアミノ末端から順にＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１およびＣ２である。Ａ１およびＡ２ドメイン間、Ａ２およびＢドメイン間ならびにＢおよびＡ３ドメイン間に、活性化に関与している追加的な短い酸性領域であるそれぞれａ１、ａ２およびａＡ３が介在している。２３３２アミノ酸の一次翻訳産物は、無傷Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２ドメインおよび種々の長さのＢドメインを含有する不均一な重鎖と、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含有する均一な８０ｋＤの軽鎖とからなるヘテロ二量体へとプロセシングされる。Ｂドメインの不均一性は分泌中のタンパク質分解から生じる。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子から第ＶＩＩＩａ因子への活性化は一般にトロンビンによるプロ補因子のタンパク質分解を介して生じる。トロンビンは、第ＶＩＩＩ因子ペプチド鎖に沿ったトロンビン切断部位を定める或るアミノ酸領域を認識する。第ＶＩＩＩ因子は３つのトロンビン切断部位を有する。他のトロンビン基質の試験は、トロンビンに適合した種々の残基を明らかにしている。これらのトロンビン切断部位内のアミノ酸は或る程度変動しうるが、これらの切断部位内では或るアミノ酸が他のアミノ酸より遥かに頻繁に見られ、或るアミノ酸残基はトロンビンによる該ペプチドのより効率的な切断をもたらす（例えば、Ｎｅｗｅｌｌ−Ｃａｉｔｏら，“Ｐ３−Ｐ３’Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  Ｓｃｉｓｓｉｌｅ  Ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｒａｔｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆａｃｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：３４５１−５９（２０１２）；Ｇａｌｌｗｉｔｚら，“Ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ，”ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３１７５６（２０１２）を参照されたい）。第ＶＩＩＩ因子における３つのトロンビン切断部位の１つはａ１−Ａ２接合部またはその近傍に存在し、これは成熟野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子ペプチドのアミノ酸３７０−３７５位に存在する。
【０００５】
切断後、活性な第ＶＩＩＩａ因子は、Ａ１サブユニット、Ａ２サブユニットおよびＡ３Ｃ１Ｃ２サブユニットから構成されるヘテロ三量体である。このヘテロ三量体は、「ドメイン界面」と称されるそれらのサブユニットが互いに相互作用する領域における該サブユニット間の静電的相互作用および疎水性相互作用の両方により維持される。該ヘテロ三量体は少なくともＡ１−Ａ２およびＡ２−Ａ３ドメイン界面を含むことが公知である（例えば、米国特許第８，３３８，５７１号（２００８年７月２５日付け出願）（２０１２年１２月２５日付け発行）を参照されたい）。
【０００６】
ヒト第ＶＩＩＩ因子は約３００ｋＤの一本鎖分子として組換え的に産生されている。該前駆体産物はゴルジ装置において２００ｋＤ（重鎖）および８０ｋＤ（軽鎖）の２本のポリペプチド鎖へとプロセシングされ、それらの２本の鎖は金属イオンによって合体している（Ｋａｕｆｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３５２（１９８８）；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：２９７９（１９８６））。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ；９０ｋＤ  Ａ１−Ａ２重鎖＋８０ｋＤ  軽鎖）も血友病Ａに対する補充療法として有効であることが示されているため、ＦＶＩＩＩのＢドメインは不必要だと思われる。１つのよく知られたＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子配列（「ＢＤＤ−ＳＱ」または単に「ＢＤＤ」と称される）はＢドメインの１４アミノ酸を除く全ての欠失を含有する。
【０００７】
血友病Ａの治療は、現在、要求に応じた又は予防的治療としての第ＶＩＩＩ因子の静脈内（ｉｖ）投与を含む。第ＶＩＩＩ因子は、完全長タンパク質として３００ｋＤを超える大きなサイズを有するにもかかわらず、ヒトにおいて約１１時間の半減期を有するに過ぎない（Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎら，Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４１：１−１６（２００４））。したがって、第ＶＩＩＩ因子は、凝固障害の予防的治療のためには比較的頻繁に投与される必要がある。第ＶＩＩＩ因子は、典型的には、第ＶＩＩＩ因子の活性に基づく投与では、週２〜３回投与される。頻繁な静脈内注射がこのように必要とされることは患者のコンプライアンスに大きな障害となる。それほど頻繁な投与を要しない第ＶＩＩＩ因子製品を開発することができれば、患者にとってより好都合であろう。更に、必要な投与回数の減少は治療コストをも低減するであろう。また、これらの頻繁な投与の場合であっても、その短い半減期ゆえに、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受けている患者は、しばしば、血漿第ＶＩＩＩ因子活性レベルにおける大きな変動を示して、（最高レベルで）血栓症および（最低レベルで）出血のリスクを潜在的に被る。
【０００８】
また、代替的な非静脈内経路の投与、例えば皮下（ｓｃ）投与は治療の容易さを向上させ、かつ、血症第ＶＩＩＩ因子レベルをより一定レベルに維持することにより血栓症および出血の潜在的リスクを減少させうるであろう。皮下運搬の１つの課題は、投与された第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティを向上させることである。増強した活性を有する第ＶＩＩＩ因子ペプチドは、バイオアベイラビリティを向上させるのに有用である可能性があり、したがって、第ＶＩＩＩ因子の皮下運搬において有用でありうるであろう。そのような第ＶＩＩＩ因子ペプチドは、より高いその比活性ゆえに、該薬物の活性濃度がより高いため、投与に必要な体積の低減を可能にしうるであろう。注射体積の低減は患者の不快感を軽減しうるであろう。更に、体積の低減は商品のコストの削減にもつながるであろう。最後に、増強した活性の第ＶＩＩＩ因子分子はまた、投与が活性によるものではなく質量によるものである場合には、補因子活性の持続時間を延長させることにより、野生型第ＶＩＩＩ因子の場合を上回る追加的な防御をもたらしうるであろう。例えば、等しい質量の投与の場合、２倍の比活性増強を有する増強した活性のＦＶＩＩＩ変異体は０．５％のレベルで、野生型ＦＶＩＩＩにより１％レベルでもたらされる防御と同じ防御をもたらして、第ＶＩＩＩ因子の投与間隔を延長させるであろう。
【０００９】
現在の医学療法の１以上の欠点に対処するために多数の第ＶＩＩＩ因子変異体が製造されている。例えば、米国特許第８，３３８，５７１号（２００８年７月２５日付け出願；２０１２年１２月２５日付け発行）は、第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の両方の安定性の増強をもたらす１以上の突然変異を含む組換え第ＶＩＩＩ因子を記載している。同様に、米国特許公開第２０１２／０１９０６２３号（２０１１年１月２７日付け出願）は、不活性化に抵抗性である第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質、例えば、「ＡＰＣ切断部位Ａｒｇ３３６およびＩｌｅ５６２が突然変異している」突然変異タンパク質を記載している。米国特許公開第２０１１／０１２４５６５号（２００６年４月１０日付け出願）は、凝固因子、特にヒト第ＶＩＩＩ因子、および改善された安定性を有するそれらの誘導体、例えば、ＦＶＩＩＩのＡ１およびＡ２ドメイン間のトロンビン切断を妨げると報告されている修飾を有する第ＶＩＩＩ因子ペプチドをコードする修飾核酸配列に関するものである。他の研究は、例えば、ペプチドのペグ化を可能にする突然変異の導入ゆえに増加した循環半減期を有すると報告されている修飾第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（Ｍｅｉら，Ｂｌｏｏｄ  １１６：２７０−２７９（２０１０））、および活性ＦＶＩＩＩａヘテロ三量体のドメイン界面を構成するアミノ酸に対する突然変異ゆえに増強した安定性を有すると報告されている修飾第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７：４３８−４４４（２００９））を製造している。
【００１０】
前記理由により、改良された第ＶＩＩＩ因子変異体、例えば、増強した活性を有する変異体ならびに／または頻繁におよび／もしくは高い用量で投与される必要がない変異体が必要とされている。更に、そのようなタンパク質は一貫した様態で均一な産物として製造されることが望ましい。
【発明の概要】
【００１１】
簡潔な概要
１つの実施形態においては、本開示は、機能的第ＶＩＩＩ因子である第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの変異体に関するものであり、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはアミノ酸３７０−３７５位のトロンビン切断部位およびアミノ酸５５８−５６５位の活性化ループを含み、ここで、これらのアミノ酸位置番号は配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づくものであり、該変異体は該トロンビン切断部位内の１以上の残基におけるアミノ酸置換および該活性化ループ内の１以上の残基におけるアミノ酸置換を含む。
【００１２】
ある例においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのトロンビン切断部位内の置換はアミノ酸３７２位の置換を含まない。他の例においては、該トロンビン切断部位内の置換は３７０、３７１または３７４位の１以上における置換を含み、他の例においては、該トロンビン切断部位内の置換は３７０、３７１または３７４位の２以上における置換を含む。
【００１３】
更なる例においては、該活性化ループ内の置換は５５９、５６２および５６５位の１以上における置換を含み、他の例においては、該活性化ループ内の置換は５５９、５６２および５６５位の２以上における置換を含む。
【００１４】
他の例においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは更に、アミノ酸残基Ｅ２７２およびＤ５１９を含むＡ１−Ａ２ドメイン界面ならびにアミノ酸残基Ｅ６６５およびＥ１９８４を含むＡ２−Ａ３ドメイン界面を含み、ここで、これらのアミノ酸位置は配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づくものであり、該変異体は更に、Ａ１−Ａ２ドメイン界面のアミノ酸残基の１以上における置換ならびにＡ２−Ａ３ドメイン界面のアミノ酸残基の１以上における置換を含む。追加的な例においては、Ａ１−Ａ２ドメイン界面の置換は、Ｅ２７２Ａ、Ｅ２７２Ｖ、Ｄ５１９ＡおよびＤ５１９Ｖからなる群から選択される１以上の置換を含む。他の例においては、Ａ２−Ａ３ドメイン界面の置換は、Ｅ６６５Ａ、Ｅ６６５Ｖ、Ｅ１９８４ＡおよびＥ１９８４Ｖからなる群から選択される１以上の置換を含む。更に他の例においては、Ａ１−Ａ２ドメイン界面の置換はＤ５１９Ｖを含み、Ａ２−Ａ３ドメイン界面の置換はＥ６６５Ｖを含む。
【００１５】
特定の例においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは３７０、３７１および３７４位の１以上におけるアミノ酸置換ならびに５５９、５６２および５６５位の１以上におけるアミノ酸置換を含む。他の例においては、該変異体は３７０、３７１および３７４位の２以上におけるアミノ酸置換ならびに５５９、５６２および５６５位の２以上におけるアミノ酸置換を含む。更に他の例においては、該変異体は、Ｑ３７０Ｍ、Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２Ｗ、Ｒ５６２Ｆ、Ｒ５６２ＫおよびＱ５６５Ｅからなる群から選択される。追加的な例においては、該変異体は、（ｉ）Ｑ３７０ＭおよびＩ３７１Ｐ、ならびに（ｉｉ）Ｉ３７１ＰおよびＶ３７４Ｆからなる群から選択されるトロンビン切断部位内のアミノ酸置換を含む。他の例においては、該変異体は、（ｉ）Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｆ、（ｉｉ）Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｗ、（ｉｉｉ）Ｖ５５９ＬおよびＱ５６５Ｅ、（ｉｖ）Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅ、ならびに（ｖ）Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＦおよびＱ５６５Ｅからなる群から選択される活性化ループ内のアミノ酸置換を含む。
【００１６】
ある特定の例においては、該変異体はアミノ酸置換Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含む。他の特定の例においては、該変異体はアミノ酸置換Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２Ｗ、Ｑ５６５Ｅ、Ｄ５１９ＶおよびＥ６６５Ｖを含む。更に他の例においては、該変異体はアミノ酸３３６位におけるアミノ酸置換を更に含む。ある例においては、アミノ酸３３６位におけるアミノ酸置換はＲ３３６Ｉ置換を含む。
【００１７】
ある例においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、配列番号１、２または３の配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。他の例においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
ある例においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、未修飾第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して増加した比活性を有する。
【００１９】
追加的な実施形態においては、本開示は、本明細書に記載されている変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００２０】
もう１つの実施形態においては、本開示は、本明細書に記載されている変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。
【００２１】
もう１つの実施形態においては、本開示は、本明細書に記載されている変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターに関する。ある例においては、該ベクターは発現ベクターである。
【００２２】
更にもう１つの実施形態においては、本開示は、本明細書に記載されている単離された核酸またはベクターを含む組換え宿主に関する。
【００２３】
もう１つの実施形態においては、本開示は、本明細書に記載されている組換え宿主細胞を変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、該変異体を単離することを含む、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの製造方法に関する。
【００２４】
更にもう１つの実施形態においては、本開示は、本明細書に記載されている変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドまたは医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、出血障害の予防または治療方法に関する。ある例においては、該出血障害は慢性出血障害である。他の例においては、該出血障害は急性出血エピソードである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、野生型第ＶＩＩＩ因子に対する活性倍数として示された、種々の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび変異体のａＰＴＴ比活性を示す。記号は以下の意味を有する：「Ａ」は、該ポリペプチドがトロンビン切断部位内にＩ３７１ＰおよびＶ３７４Ｆのアミノ酸置換を有していたことを示す；「Ｂ」は、該ポリペプチドが活性化部位内にＶ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅのアミノ酸置換を有していたことを示す；「Ｃ」は、該ポリペプチドがＤ５１９ＶおよびＥ６６５Ｖのアミノ酸置換を有していたことを示す。全てのアミノ酸位置の表示は野生型（ｗｔ）ＦＶＩＩＩ（配列番号１）における位置番号に基づくものである。
【図２】図２は、発色性アッセイにより測定された場合の、野生型第ＶＩＩＩ因子に対する活性倍数として示された、種々の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび変異体の比活性を示す。記号は図１の場合と同じ意味を有する。
【図３】図３は、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）およびＶａｒ９７（アミノ酸置換Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを有するＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体）（配列番号５３）に関するトロンビン産生プロファイルを示す。
【図４】図４は、一定量のピークトロンビンを惹起するのに必要な種々の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび変異体の濃度を示すデータを示す。調べた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）（Ｄ５１９ＶおよびＥ６６５Ｖのアミノ酸置換を有する修飾ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ）およびＶａｒ９７（アミノ酸置換Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを有するＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体）（配列番号５３）である。
【図５】図５はＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）およびＶａｒ９７（追加的アミノ酸置換Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを有するＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体）（配列番号５３）に関する血餅形成速度の動力学的プロファイルを示す。血餅形成の最大速度を達成するのに必要な時間において、ＢＤＤおよびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖより約１０倍大きなＶａｒ９７の活性が明らかである。
【図６】図６はＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）およびＶａｒ９７（追加的アミノ酸置換Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを有するＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体）（配列番号５３）に関する結合アフィニティの結果を示す。
【図７】図７は、正常血漿、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿またはＦＶＩＩＩ変異体ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ、Ｖａｒ９７もしくはＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉの１つの５０ｍＵ／ｍＬ（５％）を含有するＦＶＩＩＩ欠乏血漿を使用した場合の血餅形成に関する濁度プロファイル（吸光度単位対時間）を示す。
【図８】図８は、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（灰色の円）またはＶａｒ９７（黒色の三角形）の、質量（左パネル）または単位（右パネル）により測定された種々の投与量の投与の後の血管損傷後のＨｅｍＡマウスの２４時間生存率（％）のプロットを示す。
【図９】図９は過剰なＦＩＸａの存在下（＋）または非存在下（−）のＦＸａｓｅ反応からの変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。調べたＦＶＩＩＩポリペプチドはＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（レーン２および３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（レーン４および５）、Ｖａｒ９７（レーン６および７）またはＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ（レーン８および９）であり、質量マーカーがレーン１に示されている。
【図１０】図１０は、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）、Ｖａｒ９７（配列番号５３）およびＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ（配列番号５５）に関するトロンビン産生プロファイルを示す。
【図１１】図１１は、一定量のピークトロンビンを惹起するのに必要な種々の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび変異体の濃度を示すデータを示す。調べた第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）、Ｖａｒ９７（配列番号５３）およびＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ（配列番号５５）である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
配列の簡潔な説明
配列番号１は野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド配列を含む。このポリペプチドは、一般に、本明細書においては「野生型第ＶＩＩＩ因子」、「ｗｔ−ＦＶＩＩＩ」または単に「第ＶＩＩＩ因子」もしくは「ＦＶＩＩＩ」と称される。
【００２７】
配列番号２は、配列番号１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
配列番号３は、Ｂドメイン内に欠失を有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩポリペプチド配列の修飾形態を含む。これはＢドメインのほぼ完全な欠失体であり、Ｂドメインの１４アミノ酸のみが残存している。このポリペプチドは、一般に、本明細書においては「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ」または「ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ」と称される。
【００２９】
配列番号４は、配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
配列番号５は、２つのアミノ酸置換：Ｄ５１９ＶおよびＥ６６５Ｖを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの修飾形態を含む。このポリペプチドは、一般に、本明細書においては「Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ第ＶＩＩＩ因子」または「Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩ」と称される。
【００３１】
配列番号６は、配列番号５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
配列番号７は、アミノ酸置換：Ｑ３７０ＭおよびＩ３７１Ｐを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００３３】
配列番号８は、配列番号７のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
配列番号９は、アミノ酸置換：Ｑ３７０ＭおよびＩ３７１Ｐを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００３５】
配列番号１０は、配列番号９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
配列番号１１は、追加的アミノ酸置換：Ｑ３７０ＭおよびＩ３７１Ｐを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００３７】
配列番号１２は、配列番号１１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
配列番号１３は、アミノ酸置換：Ｉ３７１ＰおよびＶ３７４Ｆを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００３９】
配列番号１４は、配列番号１３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
配列番号１５は、アミノ酸置換：Ｉ３７１ＰおよびＶ３７４Ｆを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００４１】
配列番号１６は、配列番号１５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
配列番号１７は、追加的アミノ酸置換：Ｉ３７１ＰおよびＶ３７４Ｆを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００４３】
配列番号１８は、配列番号１７のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
配列番号１９は、アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｆを含有する、配列番号１のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００４５】
配列番号２０は、配列番号１９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
配列番号２１は、アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｆを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００４７】
配列番号２２は、配列番号２１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
配列番号２３は、追加的アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｆを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００４９】
配列番号２４は、配列番号２３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
配列番号２５は、アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｗを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００５１】
配列番号２６は、配列番号２５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
配列番号２７は、アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｗを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００５３】
配列番号２８は、配列番号２７のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
配列番号２９は、追加的アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＲ５６２Ｗを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００５５】
配列番号３０は、配列番号２９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
配列番号３１は、アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００５７】
配列番号３２は、配列番号３１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
配列番号３３は、アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００５９】
配列番号３４は、配列番号３３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
配列番号３５は、追加的アミノ酸置換：Ｖ５５９ＬおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００６１】
配列番号３６は、配列番号３５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
配列番号３７は、アミノ酸置換：Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００６３】
配列番号３８は、配列番号３７のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
配列番号３９は、アミノ酸置換：Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００６５】
配列番号４０は、配列番号３９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６６】
配列番号４１は、追加的アミノ酸置換：Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００６７】
配列番号４２は、配列番号４１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
配列番号４３は、アミノ酸置換：Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＦおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００６９】
配列番号４４は、配列番号４３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
配列番号４５は、アミノ酸置換：Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＦおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００７１】
配列番号４６は、配列番号４５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
配列番号４７は、追加的アミノ酸置換：Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＦおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００７３】
配列番号４８は、配列番号４７のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
配列番号４９は、アミノ酸置換：Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００７５】
配列番号５０は、配列番号４９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７６】
配列番号５１は、アミノ酸置換：Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号３のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの変異体である。
【００７７】
配列番号５２は、配列番号５１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
配列番号５３は、追加的アミノ酸置換：Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００７９】
配列番号５４は、配列番号５３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８０】
配列番号５５は、追加的アミノ酸置換：Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２Ｗ、Ｑ５６５ＥおよびＲ３３６Ｉを含有する、配列番号５のＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩの変異体である。
【００８１】
配列番号５６は、配列番号５５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００８２】
詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本開示は、もちろん変動しうる特定の実施形態に限定されないと理解されるべきである。本明細書中で用いる用語は、専ら特定の実施形態を説明することを目的としたものであり、限定的であるとは意図されないとも理解されるべきである。特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、一般に、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で用いる命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける手法は、当技術分野でよく知られており一般に用いられているものである。核酸およびペプチドの合成のための標準的な技術が用いられる。本明細書中で用いる命名法および後記の実験手法は、当技術分野でよく知られており一般に用いられているものである。遺伝子工学のために用いられる手法はよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）において見出されうる。
【００８３】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形の用語は、内容と明らかに矛盾しない限り、例えば、複数形対象物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド」に対する言及は複数のポリペプチドをも含む。また、本明細書中で用いる「含む」なる語は、成分または工程の非網羅的な列挙を示すと意図され、したがって、与えられた組成物または方法が、挙げられている成分または工程を含み、具体的に挙げられていない追加的な成分または工程をも含みうることを示す。一例としては、「ポリペプチドを含む」組成物は追加的な成分またはポリペプチドをも含みうる。「含む」なる語は、挙げられている成分または工程「から実質的になる」および「からなる」実施形態を含むとも意図される。同様に、「から実質的になる」なる語は、挙げられている成分または工程「からなる」実施形態を含むとも意図される。
【００８４】
本明細書中に挙げられている数的範囲は、該範囲を定める数字（エンドポイントの数字）を含み、各整数または任意の非整数の分数を含むとも意図される。
【００８５】
個々の実施形態の説明および特許請求においては、以下の定義に従い以下の用語を用いる。
【００８６】
本明細書中で用いる「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ」は、Ｂドメインの少なくとも何らかの部分の欠失を含有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを意味する。本明細書に記載されている具体例においては、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤは、特に、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの１４アミノ酸を除く全ての欠失体を意味し（Ｌｉｎｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７（１９９５））、そのポリペプチド配列は配列番号３に記載されており、これは配列番号４のヌクレオチド配列によりコードされる。しかし、本明細書における具体例においてはこの特定のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ配列を使用したが、配列番号３と比較した場合の修飾（Ｂドメイン欠失における相違を含む）を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドも使用されうると理解されるべきである。例えば、Ｂドメインの１４アミノ酸より多い又は少ない残存アミノ酸を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドも、第ＶＩＩＩ因子凝血促進活性が保持されている場合には、幾つかの実施形態において有用でありうるであろう。
【００８７】
本明細書中で用いる「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」は、肝臓により合成され血流中へ放出される糖タンパク質である血液凝固因子を意味する。その未熟形態においては、ＦＶＩＩＩはシグナル配列を含有し、これは翻訳過程中にタンパク質分解切断される。その１９アミノ酸シグナル配列の除去の後、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはその成熟形態となり、それにおいては、分泌ＦＶＩＩＩ産物の最初のアミノ酸はアラニンである。第ＶＩＩＩ因子のこの成熟形態は本明細書中では「成熟第ＶＩＩＩ因子」と称される。成熟野生型ヒトＦＶＩＩＩは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するが、配列番号３および５に記載のもののような修飾形態に加えて、対立遺伝子変異体が考えられうる。
【００８８】
本明細書中で用いる「機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド」は、例えば血友病Ａにより特徴づけられるヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏症をインビボまたはインビトロで矯正しうるポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを示す。第ＶＩＩＩ因子は天然状態において複数の分解またはプロセシング形態を有する。これらは、本明細書に記載されているとおり、一本鎖タンパク質である前駆体からタンパク質分解により誘導される。機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはそのような一本鎖タンパク質を含み、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠乏症を矯正する生物活性を有するこれらの種々の分解産物を与える。対立遺伝子変異が存在する可能性がある。機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子の誘導体を与える全てのそのような対立遺伝子変異体、グリコシル化形態、修飾体および断片を含み、ただし、それらは第ＶＩＩＩ因子の機能的セグメントを含有し、必須の特徴的な第ＶＩＩＩ因子機能的活性が実質的に尚も損なわれていないことが要求される。必要な機能的活性を有する第ＶＩＩＩ因子の誘導体は、本明細書に記載されている直接的なインビトロ試験により、容易に特定されうる。更に、機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＩＸａ因子、カルシウムおよびリン脂質の存在下、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換を触媒し、血友病Ａ罹患個体に由来する血漿における凝固欠損を矯正しうる。本明細書におけるヒト第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列および機能的領域の配列の開示から、そのＤＮＡの制限酵素切断またはヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質のタンパク質分解もしくは他の分解により誘導されうる断片が当業者に明らかであろう。
【００８９】
本明細書中で用いる「トロンビン切断部位」は、トロンビンに対する標的切断部位である第ＶＩＩＩ因子ペプチド鎖の部分を意味する。ある実施形態においては、トロンビン切断部位は第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのａ１−Ａ２接合部またはその近傍に位置する。他の実施形態においては、トロンビン切断部位は成熟野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子ペプチド（配列番号１）のアミノ酸残基３７０−３７５に位置する。他の実施形態においては、トロンビン切断部位は、相同第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば対立遺伝子変異体または修飾ポリペプチドにおける相同部位でありうる。
【００９０】
本明細書中で用いる「活性化ループ」は、第ＩＸａ因子と相互作用する第ＶＩＩＩ因子ペプチド鎖のＡ２サブユニットの部分を意味する。ある実施形態においては、活性化ループは成熟野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子ペプチド（配列番号１）のアミノ酸残基５５８−５６５に位置する。他の実施形態においては、活性化ループは、相同第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、例えば対立遺伝子変異体または修飾ポリペプチドにおける相同部位でありうる。
【００９１】
本明細書において用いる「ドメイン界面」は、第ＶＩＩＩａ因子ヘテロ三量体のその他のサブユニットと相互作用する第ＶＩＩＩａ因子ヘテロ三量体のそれぞれのサブユニット上の領域または残基を意味する。したがって、「Ａ１−Ａ２ドメイン界面」は、その他のサブユニットにおける対応領域または残基と相互作用するＡ１およびＡ２サブユニットのそれぞれにおける領域または残基を意味する。同様に、「Ａ２−Ａ３ドメイン界面」は、その他のサブユニットにおける対応領域または残基と相互作用するＡ２およびＡ３サブユニットのそれぞれにおける領域または残基を意味する。ある例においては、Ａ１−Ａ２ドメイン界面は残基Ｅ２７２およびＤ５１９（配列番号１の野生型第ＶＩＩＩ因子配列に基づく）を含む。他の例においては、Ａ２−Ａ３ドメイン界面は残基Ｅ６６５およびＥ１９８４（配列番号１の野生型第ＶＩＩＩ因子配列に基づく）を含む。
【００９２】
本明細書中で用いる「第ＩＸ因子」または「ＦＩＸ」は凝固第ＩＸ因子を意味し、これはヒト凝固第ＩＸ因子または血漿トロンボプラスチン成分としても公知である。
【００９３】
本明細書中で用いる「第Ｘ因子」または「ＦＸ」は凝固第Ｘ因子を意味し、これはヒト凝固第Ｘ因子なる名称またはスチュアート−プロワー因子なるエポニムとしても公知である。
【００９４】
「薬物動態」または「ＰＫ」は、体内における薬物の吸収、分布、代謝および消失の特性を示すために本明細書において用いられる。薬物の薬物動態の改善は、治療用物質としてインビボにおいて薬物をより有効にする特性、特に体内におけるその有用な持続時間の改善を意味する。
【００９５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる語は一般に本明細書中で互換的に用いられ、それらは、アミド結合により互いに連結されたアミノ酸を単量体とする重合体を意味する。また、非天然アミノ酸、例えばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。遺伝子によりコードされないアミノ酸も、本明細書に開示されている技術で使用されうる。更に、反応性基、グリコシル化部位、重合体、治療用部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も使用されうる。本明細書中で使用されるアミノ酸の全てはＤまたはＬ異性体でありうる。Ｌ異性体が一般に好ましい。本明細書中で用いる「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」はグリコシル化形態および非グリコシル化形態の両方を意味する。
【００９６】
「アミノ酸」なる語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様態で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、および後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマートおよびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保有する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似した様態で機能する化合物を意味する。
【００９７】
「変異体」および「突然変異タンパク質」は本明細書中で互換的に用いられ、それらはそれぞれ、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対する実験誘発変化の結果として生じる遺伝的に操作されたポリペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。アミノ酸の表示においては、当技術分野でよく知られている標準的な１文字または３文字アミノ酸記号がアミノ酸の完全名称の代わりに用いられうる。また、１文字アミノ酸記号およびそれに続く数字が、出発配列における特定の位置における特定のアミノ酸を示すために用いられうる。例えば、「Ｖ３７４」はｗｔ−ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１）のアミノ酸３７４位のバリンを示すであろう。更に、置換アミノ酸の１文字記号が、施された特定のアミノ酸置換を示すために、位置番号の後に含まれうる。例えば、「Ｖ３７４Ｆ」は、３７４位のバリンがフェニルアラニン残基により置換されたことを示すであろう。本明細書中で用いる「置換」は１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されたことを意味し、明示的に特記されていない限り、欠失または付加を含まない。
【００９８】
特定の例の表示が代わりに具体的に示されていない限り、本明細書に開示されているアミノ酸位置は全て、当技術分野で通常に行われているとおり、配列番号１に記載されている成熟野生型第ＶＩＩＩ因子ペプチドのアミノ酸配列における対応位置に基づくものであることにも注目されるべきである。
【００９９】
本開示の変異体ポリペプチドはトロンビン切断部位および活性化ループの一方または両方における１以上のアミノ酸置換を含む。ある例においては、該変異体ポリペプチドは、１）配列番号１のアミノ酸３７０−３７５位により表されるトロンビン切断部位と、２）配列番号１のアミノ酸５５８−５６５位により表される活性化ループとのうちの一方または両方における１以上のアミノ酸置換を含む。残基３７０−３７５におけるトロンビン切断部位に関しては、切断は、典型的に、Ｒ３７２残基の直後で生じ、したがって、この残基はこの部位における適切な切断のために重要である。したがって、ある実施形態においては、該変異体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３７０−３７５位により表されるトロンビン切断部位における１以上のアミノ酸置換を含み、ここで、該置換は３７２位には存在しない。ある実施形態においては、該アミノ酸置換は（配列番号１のｗｔ−ＦＶＩＩＩ配列に基づく位置番号を有する）出発配列における以下の位置の１以上における置換でありうる：Ｑ３７０、Ｉ３７１、Ｓ３７３、Ｖ３７４、Ａ３７５、Ｓ５５８、Ｖ５５９、Ｄ５６０、Ｑ５６１、Ｒ５６２、Ｇ５６３、Ｎ５６４およびＱ５６５。ある他の実施形態においては、それらの位置の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個において置換が存在しうる。追加的な実施形態においては、該変異体は、トロンビン切断部位（３７０−３７５）および活性化ループ（５５８−５６５）のそれぞれにおいて少なくとも１つの置換を含みうる。ある例においては、該変異体はＱ３７０、Ｉ３７１、Ｓ３７３、Ｖ３７４およびＡ３７５の少なくとも１つの置換と、Ｓ５５８、Ｖ５５９、Ｄ５６０、Ｑ５６１、Ｒ５６２、Ｇ５６３、Ｎ５６４およびＱ５６５の少なくとも１つの置換とを含みうる。他の実施形態においては、該変異体は、トロンビン切断部位（３７０−３７５）または活性化ループ（５５８−５６５）のいずれかにおける２以上の置換、例えば２、３、４、５、６、７または８個の置換を含みうる。特定の例においては、該変異体はトロンビン切断部位（３７０−３７５）内の２つの置換と活性化ループ（５５８−５６５）内の２つの置換とを含む。他の例においては、該変異体はトロンビン切断部位（３７０−３７５）内の２つの置換と活性化ループ（５５８−５６５）内の３つの置換とを含む。特定の例においては、トロンビン切断部位内の置換はＱ３７０Ｍ、Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｑ３７０Ｍ／Ｉ３７１ＰまたはＩ３７１Ｐ／Ｖ３７４Ｆである。他の例においては、活性化ループ内の置換はＶ５５９Ｌ、Ｒ５６２Ｗ、Ｒ５６２Ｆ、Ｒ５６２Ｋ、Ｑ５６５Ｅ、Ｖ５５９Ｌ／Ｒ５６２Ｆ、Ｖ５５９Ｌ／Ｒ５６２Ｗ、Ｖ５５９Ｌ／Ｑ５６５Ｅ、Ｖ５５９Ｌ／Ｒ５６２Ｗ／Ｑ５６５ＥまたはＶ５５９Ｌ／Ｒ５６２Ｆ／Ｑ５６５Ｅである。
【０１００】
更なる例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは更に、Ａ１−Ａ２およびＡ２−Ａ３ドメイン界面のそれぞれにおけるアミノ酸残基に対する１以上の置換を含む。特定の例においては、Ａ１−Ａ２ドメイン界面内の置換は残基Ｅ２７２およびＤ５１９（配列番号１の野生型第ＶＩＩＩ因子配列に基づく）の一方または両方の置換を含む。ある実施形態においては、これらの置換はＥ２７２およびＤ５１９における荷電アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）残基の一方または両方を疎水性残基、特にアラニン、ロイシン、プロリン、メチオニン、グリシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンのような疎水性残基で置換する。ある例においては、Ａ１−Ａ２ドメイン界面内の１以上の置換は、Ｅ２７２Ａ、Ｅ２７２Ｖ、Ｄ５１９ＡおよびＤ５１９Ｖからなる群から選択される。追加的な例においては、Ａ２−Ａ３ドメイン界面内の置換は残基Ｅ６６５およびＥ１９８４（配列番号１の野生型第ＶＩＩＩ因子配列に基づく）の一方または両方の置換を含む。ある実施形態においては、これらの置換はＥ６６５およびＥ１９８４における荷電グルタミン酸（Ｅ）残基の一方または両方を疎水性残基、特にアラニン、ロイシン、プロリン、メチオニン、グリシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンのような疎水性残基で置換する。更に詳細な例においては、Ａ２−Ａ３ドメイン界面内の１以上の置換は、Ｅ６６５Ａ、Ｅ６６５Ｖ、Ｅ１９８４ＡおよびＥ１９８４Ｖからなる群から選択される。ある例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはＤ５１９Ａ／Ｅ６６５Ａ置換、Ｄ５１９Ａ／Ｅ６６５Ｖ置換、Ｄ５１９Ｖ／Ｅ６６５Ａ置換、またはＤ５１９Ｖ／Ｅ６６５Ｖ置換を含む。
【０１０１】
ある例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの製造は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発を含む。ヌクレオチド配列のそのような部位特異的突然変異は当技術分野で公知のいずれかの方法により施されることが可能であり、当業者であれば、目下の具体的な用途のために用いるべき適当な突然変異誘発技術を容易に決定することが可能であろう。ある例においては、商業的に入手可能な部位特異的突然変異誘発キット、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ部位特異的突然変異誘発キット番号Ｋ１６００−１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎＴａｙｌｏｒ部位特異的突然変異誘発系番号１２３９７０１４、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ＩＩインビトロ突然変異誘発系キット番号Ｑ６２１０またはＴａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＡ  ＰＣＲ突然変異誘発キット番号ＴＡＫ  ＲＲ０１６を使用して、突然変異誘発が達成される。
【０１０２】
ある実施形態においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、少なくとも１つの活性アッセイにおいて、出発第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して増強した活性を有する。第ＶＩＩＩ因子活性を試験するためのいずれかの適当なアッセイが本開示の変異体ポリペプチドで使用可能であり、そのようなアッセイは当技術分野でよく知られている。そのような活性アッセイには、ａＰＴＴ；ＦＸａｓｅ複合体の個々の成分から又はキットとして構築される、ＦＶＩＩＩに関する発色性または発蛍光性基質アッセイ；トロンビン産生アッセイまたは試験（ＴＧＡまたはＴＧＴ）、または較正自動トロンボグラフィー（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）；およびローテーショナル・トロンボエラストメトリー（ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ）（ＲＯＴＥＭ）またはローテーショナル・トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＧ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
ａＰＴＴは、所定のサンプル濁度または粘度を得るのに必要な時間（凝固時間またはＣＴ）として凝固を検出する、１段階の、またはそれほど一般的ではないが２段階のアッセイを意味する。ａＰＴＴは血漿ベースアッセイであるため、それは、血漿における潜在的な第ＶＩＩＩ因子活性および機能をアッセイするために使用されている。典型的な１段階ａＰＴＴにおいては、ＦＶＩＩＩを含有する血漿サンプルを負荷電表面または粒子およびＣａ２＋と共にインキュベートして、凝固を開始させる。１段階アッセイにおいては、ＦＸＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、トロンビンおよびフィブリン生成が１つの反応において生じる。２段階アッセイにおいては、ＦＸＩａ、ＦＶＩＩＩａおよびＦＸａ生成が第１段階で生じ、トロンビンおよびフィブリン生成は第２段階で生じる。ＦＶＩＩＩ特異的因子アッセイの場合と同様に、該アッセイをＦＶＩＩＩ定量に特異的にするために、１段階および２段階ａＰＴＴの修飾が可能でありうる。
【０１０４】
発色性基質アッセイ（クロモアッセイ）は、ＦＸａｓｅ複合体（ＦＩＸａ、ＰＬ、Ｃａ＋２およびＦＸ）の状況でのＦＶＩＩＩ機能を評価するように設計された２段階アッセイである。このアッセイにおいては、ＦＶＩＩＩａは完全に活性化され、ＦＩＸａおよびＰＬは過剰に存在し、これは、生理的に典型的には生じない状況である。このアッセイにおいては、ＦＶＩＩＩａを、精製された又は比較的精製されたＦＸａｓｅ複合体成分と組合せて、第１段階でＦＸａを産生させる。第２段階においては、生じたＦＸａのレベルを、ＦＸａにより切断された際に発色する基質により定量する。発色アッセイの変法は発蛍光性基質での発色性基質の置換を含み、蛍光発光が検出される（発蛍光アッセイ）。
【０１０５】
ＦＶＩＩＩ凝血促進機能のもう１つのアッセイであるＴＧＡは、ＦＶＩＩＩを含有する血漿を、リン脂質（ＰＬ）（４０：４０：２０，ｖ／ｖ／ｖのホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミン）の存在下、生理的開始因子、例えば組織因子（ＴＦ）またはＦＸＩａで活性化させて活性化血小板の膜表面を刺激することにより行われる。トロンビンに対する発色性基質およびＣａ２＋をサンプルに加えると、トロンビン産生（および凝固）が開始する。ＣＡＴにおいては、ついで、一定レベルのトロンビンを含有する並行サンプルにおける蛍光変化の速度をモニタリングすることにより、経時的な蛍光変化をトロンビン濃度に関連づける。トロンビン産生プロファイルにおける動力学的変化を示すパラメータは応答の開始前の時間（遅れ）および達成された最高トロンビン（ピーク）を含みうる。
【０１０６】
ＲＯＴＥＭ／ＲＯＴＥＧはＴＧＡに類似しているが、この場合、トロンビン産生ではなく凝固に伴う粘性の発生をモニタリングする。この場合もまた、Ｃａ２＋またはＴＦ−ＰＬ混合物により、ＦＶＩＩＩを含有する血漿において凝固を開始させる。粘性における動力学的変化を示すパラメータは凝血開始時間（ＣＴ）および粘度変化の速度（α角）を含みうる。
【０１０７】
ある例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの活性は１以上のアッセイにより試験されるであろう。これらのＦＶＩＩＩ変異体に対する作用メカニズムにおける変化ゆえに、そしてＦＶＩＩＩ機能の特異的態様を検出するアッセイの能力における相違ゆえに、あるアッセイのみが第ＶＩＩＩ因子活性における顕著な増強を検出することに注目されたい。したがって、ある例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは１つのアッセイにおいてはｗｔ−ＦＶＩＩＩと比較しうる活性を有しうるが、別のアッセイにおいては、増強した活性を有しうる。例えば、該変異体は、発色性アッセイにおいてはｗｔ−ＦＶＩＩＩの活性と比較しうる活性を有しうるが、ａＰＴＴアッセイまたはトロンビン産生アッセイを用いて試験された場合には、増強した活性を有しうる。これは、例えば、変異体が触媒活性の増強を示すがタンパク質分解にもより感受性である場合に生じうる。幾つかの変異体の場合、増強した活性に最も感受性であるアッセイは発色性アッセイではなく１段階ａＰＴＴおよびＴＧＡでありうる。凝固タンパク質のアッセイ性能におけるそのような矛盾は珍しいことではなく、特に、突然変異が、特異的機能に影響を及ぼすドメイン内に存在し、それ以外には存在しない場合に、それが言える（Ｌｅｏｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：２５６７（１９９２）；Ｓｔｏｎｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：６３９２（１９９１）；ＨｅｎｒｉｋｓｅｎおよびＭａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：２０７８（１９８９））。これらの結果は、これらの変異体が、活性化するのがより容易である、すなわち、ＦＶＩＩＩからＦＶＩＩＩａへの変換が加速されるという利点を有しうることを示唆している可能性があり、したがって、そのような利点はトロンビン産生の向上につながりうるであろう。
【０１０８】
ある例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは出発第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩの活性より高い活性を有する。これらの活性は、比較しうる条件下、ポリペプチド産物を使用して測定される（例えば、比較しうる条件下の同じタイプの細胞系における該変異体および出発ポリペプチドの組換え発現）。ある実施形態においては、該活性は、少なくとも１つのアッセイにおいて、出発第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩの活性と比較して少なくとも１．１倍増加する。他の実施形態においては、該活性は、少なくとも１つのアッセイにおいて、出発第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩの活性と比較して少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４５０倍、５００倍以上増加する。
【０１０９】
更に他の実施形態においては、該活性は、少なくとも１つのアッセイにおいて、出発第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩの活性と比較して約１．２〜１０倍、１．２〜１２倍、１．２〜１４倍、１．２〜１６倍、１．２〜１８倍、１．２〜２０倍、１．２〜３０倍、１．２〜４０倍、１．２〜５０倍、１．２〜６０倍、１．２〜７０倍、１．２〜８０倍、１．２〜９０倍、１．２〜１００倍、１．３〜１０倍、１．３〜１２倍、１．３〜１４倍、１．３〜１６倍、１．３〜１８倍、１．３〜２０倍、１．３〜３０倍、１．３〜４０倍、１．３〜５０倍、１．３〜６０倍、１．３〜７０倍、１．３〜８０倍、１．３〜９０倍、１．３〜１００倍、１．４〜１０倍、１．４〜１２倍、１．４〜１４倍、１．４〜１６倍、１．４〜１８倍、１．４〜２０倍、１．４〜３０倍、１．４〜４０倍、１．４〜５０倍、１．４〜６０倍、１．４〜７０倍、１．４〜８０倍、１．４〜９０倍、１．４〜１００倍、１．５〜１０倍、１．５〜１２倍、１．５〜１４倍、１．５〜１６倍、１．５〜１８倍、１．５〜２０倍、１．５〜３０倍、１．５〜４０倍、１．５〜５０倍、１．５〜６０倍、１．５〜７０倍、１．５〜８０倍、１．５〜９０倍、１．５〜１００倍、１．６〜１０倍、１．６〜１２倍、１．６〜１４倍、１．６〜１６倍、１．６〜１８倍、１．６〜２０倍、１．６〜３０倍、１．６〜４０倍、１．６〜５０倍、１．６〜６０倍、１．６〜７０倍、１．６〜８０倍、１．６〜９０倍、１．６〜１００倍、１．８〜１０倍、１．８〜１２倍、１．８〜１４倍、１．８〜１６倍、１．８〜１８倍、１．８〜２０倍、１．８〜３０倍、１．８〜４０倍、１．８〜５０倍、１．８〜６０倍、１．８〜７０倍、１．８〜８０倍、１．８〜９０倍、１．８〜１００倍、２〜１０倍、２〜１２倍、２〜１４倍、２〜１６倍、２〜１８倍、２〜２０倍、２〜３０倍、２〜４０倍、２〜５０倍、２〜６０倍、２〜７０倍、２２〜８０倍、２〜９０倍、２〜１００倍、４〜１０倍、４〜１２倍、４〜１４倍、４〜１６倍、４〜１８倍、４〜２０倍、４〜３０倍、４〜４０倍、４〜５０倍、４〜６０倍、４〜７０倍、４〜８０倍、４〜９０倍、４〜１００倍、５〜１０倍、５〜１２倍、５〜１４倍、５〜１６倍、５〜１８倍、５〜２０倍、５〜３０倍、５〜４０倍、５〜５０倍、５〜６０倍、５〜７０倍、５〜８０倍、５〜９０倍、５〜１００倍、６〜１２倍、６〜１４倍、６〜１６倍、６〜１８倍、６〜２０倍、６〜３０倍、６〜４０倍、６〜５０倍、６〜６０倍、６〜７０倍、６〜８０倍、６〜９０倍、６〜１００倍、８〜１６倍、８〜１８倍、８〜２０倍、８〜３０倍、８〜４０倍、８〜５０倍、８〜６０倍、８〜７０倍、８〜８０倍、８〜９０倍、８〜１００倍、１０〜２０倍、１０〜３０倍、１０〜４０倍、１０〜５０倍、１０〜６０倍、１０〜７０倍、１０〜８０倍、１０〜９０倍、１０〜１００倍、１２〜２０倍、１２〜３０倍、１２〜４０倍、１２〜５０倍、１２〜６０倍、１２〜７０倍、１２〜８０倍、１２〜９０倍、１２〜１００倍、１５〜３０倍、１５〜４０倍、１５〜５０倍、１５〜６０倍、５〜７０倍、１５〜８０倍、１５〜９０倍、１５〜１００倍、２０〜４０倍、２０〜５０倍、２０〜６０倍、２０〜７０倍、２０〜８０倍、２０〜９０倍、２０〜１００倍、３０〜４０倍、３０〜５０倍、３０〜６０倍、３０〜７０倍、３０〜８０倍、３０〜９０倍、３０〜１００倍、４０〜６０倍、４０〜７０倍、４０〜８０倍、４０〜９０倍、４０〜１００倍、５０〜８０倍、５０〜９０倍、５０〜１００倍、６０〜８０倍、６０〜９０倍、６０〜１００倍、７０〜１００倍、７０〜２００倍、９０〜１００倍、９０〜１２０倍、９０〜１４０倍、１００〜１５０倍、１００〜１６０倍、１００〜１８０倍、１００〜２００倍、１００〜２５０倍、１００〜３００倍、１００〜３５０倍、１００〜４００倍、１００〜５００倍、１２０〜１５０倍、１２０〜１６０倍、１２０〜１８０倍、１２０〜２００倍、１２０〜２５０倍、１２０〜３００倍、１２０〜３５０倍、１２０〜４００倍、１２０〜５００倍、１５０〜２００倍、１５０〜２５０倍、１５０〜３００倍、１５０〜３５０倍、１５０〜４００倍、１５０〜５００倍、２００〜３００倍、２００〜４００倍、２００〜５００倍、００〜４００倍、３００〜５００倍または４００〜５００倍増加する。
【０１１０】
本明細書に記載されている第ＶＩＩＩ因子変異体は、出発ポリペプチドとしていずれかの機能的第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを使用して設計されうる。ある実施形態においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである。他の実施形態においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはヒトｗｔ−ＦＶＩＩＩ（配列番号１）、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）またはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）である。該出発ポリぺプチドは、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列と比較した場合の欠失、挿入および／または付加を有しうる。非限定的な例として、該出発ポリペプチドは、Ａ２ドメインを更に安定化させる突然変異を有する第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質（例えば、ＷＯ  ９７／４０１４５を参照されたい）、発現の増強をもたらす第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質（例えば、Ｓｗａｒｏｏｐら，ＪＢＣ  ２７２：２４１２１−２４１２４（１９９７）を参照されたい）、野生型と比較して免疫原性を低減する第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質（例えば、Ｌｏｌｌａｒ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５−５０８（１９９９）を参照されたい）、異なって発現された重鎖および軽鎖から再構成された第ＶＩＩＩ因子（例えば、Ｏｈら，Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５−１００（１９９９）を参照されたい）、あるいはＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）および／またはＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）のような第ＶＩＩＩ因子の異化を招く受容体への低減した結合性を有する第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質（例えば、Ａｎａｎｙｅｖａら，ＴＣＭ  １１：２５１−２５７（２００１）を参照されたい）を含みうる。ある例においては、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは追加的アミノ酸置換、例えば、Ｒ３３６またはその近傍における置換、例えば、Ｒ３３６Ｉ置換をも含有しうる。また、有用な出発ポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子の機能性を尚も有するこれらの修飾形態、例えば、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ（配列番号１）、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）またはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）の配列に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドでありうる。更に、本開示の変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ（配列番号１）、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）またはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）の配列に対して少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％の同一性を有し、本明細書に記載のアミノ酸置換の１以上をも含有する、あるいはもう１つの実施形態においてはトロンビン切断部位と活性化ループとの両方における１以上のアミノ酸置換を含有するいずれかの変異体ポリペプチドを含む。もう１つの実施形態においては、本開示の変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ（配列番号１）、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号３）またはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩ（配列番号５）の配列に対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％を超える同一性を有し、本明細書に記載のアミノ酸置換の１以上をも含有する、あるいはもう１つの実施形態においてはトロンビン切断部位と活性化ループとの両方における１以上のアミノ酸置換を含有するいずれかの変異体ポリペプチドを含む。
【０１１１】
もう１つの実施形態においては、本開示は、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。１つの実施形態においては、該第ＶＩＩＩ因子変異体は、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ（配列番号２）、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号４）またはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩ（配列番号６）のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％の同一性を有するヌクレオチド配列であって、本明細書に記載のアミノ酸改変の１以上を含有する、あるいはもう１つの実施形態においてはトロンビン切断部位と活性化ループとの両方における１以上のアミノ酸置換を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によりコードされる。もう１つの実施形態においては、該第ＶＩＩＩ因子変異体は、ｗｔ−ＦＶＩＩＩ（配列番号２）、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（配列番号４）またはＤ５１９ＶＥ６６５Ｅ−ＦＶＩＩＩ（配列番号６）のヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％を超える同一性を有するヌクレオチド配列であって、本明細書に記載のアミノ酸改変の１以上を含有する、あるいはもう１つの実施形態においてはトロンビン切断部位と活性化ループとの両方における１以上のアミノ酸置換を含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１１２】
同一性（％）の値はアミノ酸または核酸配列領域の全体にわたって計算される。種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、種々の配列を比較するために当業者に利用可能である。少なくとも１つの実施形態においては、２つのアミノ酸配列間の同一性（％）は、遠縁関係のタンパク質にはＢＬＯＳＵＭ  ４５またはＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、あるいは近縁関係のタンパク質にはＢＬＯＳＵＭ  ６２またはＰＡＭ１６０スコアリングマトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ・オープニング・ペナルティ、および０．５、１、２、３、４、５または６のギャップ伸長ペナルティを使用して、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージ（Ｒｉｃｅら，“ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，”Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７６−２７７（２０００））におけるニードル（ｎｅｅｄｌｅ）プログラムに組込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））を使用して決定される。ＥＭＢＯＳＳパッケージのローカルインストールおよびウェブサービスに対するリンクはｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ．において見出されうる。ニードル・プログラムを使用して２つのアミノ酸配列をアライメントするために使用されるべきパラメータの非限定的な例としては、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、１０のギャップ・オープニング・ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータが挙げられる。更にもう１つの実施形態においては、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、ＥＤＮＡＦＵＬＬスコアリングマトリックスおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ・オープニング・ペナルティ、および０．５、１、２、３、４、５または６のギャップ伸長ペナルティを使用して、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージ（Ｒｉｃｅら，“ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，”Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７６−２７７（２０００））におけるニードル・プログラムを使用して決定される。ニードル・プログラムを使用して２つのアミノ酸配列をアライメントするために共に使用されるべきパラメータの非限定的な例としては、ＥＤＮＡＦＵＬＬスコアリングマトリックス、１０のギャップ・オープニング・ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータが挙げられる。該核酸およびタンパク質配列は更に、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を特定するために公的データベースに対する検索を行うための「問合せ（クエリー）配列」として使用されうる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０））のＢＬＡＳＴ系のプログラム（バージョン２．２）を使用して行われうる。本開示の核酸配列を問合せ配列として使用するＢＬＡＳＴは、本開示の核酸配列によりコードされる配列に相同なヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ）またはアミノ酸配列（ＢＬＡＳＴｘ）を得るためにデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｘまたはｔＢＬＡＳＴｘプログラムで行われうる。本開示の核酸配列によりコードされるタンパク質配列を問合せ配列として使用するＢＬＡＳＴは、本開示の配列に相同なアミノ酸配列（ＢＬＡＳＴｐ）または核酸配列（ｔＢＬＡＳＴｎ）を得るためにデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴｐまたはｔＢＬＡＳＴｎプログラムで行われうる。比較目的でギャップ化アライメントを得るためには、デフォルトパラメータを使用するギャップ化（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されているとおりに利用されうる。
【０１１３】
ある実施形態においては、本開示のポリヌクレオチドは前記ヌクレオチド配列から実質的になる、または前記ヌクレオチド配列を含む。したがって、それらは他のヌクレオチド配列をも含有しうる。ある実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームに加えて更に、コード遺伝子領域の３’および５’末端に非翻訳配列を含むことが可能であり、例えば、コード領域の５’末端の上流に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドもしくはそれ以上の配列を、および／またはコード遺伝子領域の３’末端の下流に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドもしくはそれ以上の配列を含みうる。更に、該ポリヌクレオチドは、検出可能なマーカーとして又は精製目的のための補助手段として役立ちうるいわゆる「タグ」を含むタンパク質をコードしうる。種々の目的のためのタグが当技術分野でよく知られており、例えば、ＦＬＡＧ−タグ、６−ヒスチジン−タグ、ＭＹＣ−タグなどを包含する。１つの実施形態においては、該ポリヌクレオチドは更に、該ヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む。
【０１１４】
ある実施形態においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列を適当なベクター内に挿入する。種々の目的に有用な多数のベクターが当技術分野でよく知られており、当業者であれば、それらの所望の用途のための適当なベクターを容易に選択しうるであろう。ある例においては、該ベクターはクローニングベクターまたは発現ベクターでありうる。他の例においては、該ベクターはプラスミド、ウイルスベクター、コスミドまたは人工染色体でありうる。適当なベクターの例には、Ｔａｔ／Ｔａｒ−ｏｒｉＰ発現ベクター、例えばｐＳＳ１８５（Ｃｈｏら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：２２９−２３２（２００３））およびｐＳＳ２０７（Ｍｅｉら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３４：１６５−１７８（２００６））、ならびにｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＩＮｅｏ、ｐＥＡＫ、ｐＣＥＰ４およびｐＵＣＯＥベクターが含まれる。ある例においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸は、適当なプロモーターに隣接して及び／又は適当なプロモーターの制御下に配置されうる。種々の目的に有用な多数のプロモーターが当技術分野でよく知られており、当業者であれば、それらの所望の用途のための適当なプロモーターを容易に選択しうるであろう。ある例においては、該プロモーターは構成プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターでありうる。適当なプロモーターの例には、ヒトまたはマウスＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー、ＥＩｆ１アルファプロモーター、ＭＰＳＶプロモーターおよびＳＲアルファプロモーターが含まれる。
【０１１５】
ある実施形態においては、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは細胞、組織または生物において組換え製造される。ある実施形態においては、そのような組換え製造は、該変異体ポリペプチドをコードする核酸分子またはそのような核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることにより達成される。形質転換およびトランスフェクションの多数の方法は当技術分野でよく知られており、当業者であれば、それらの所望の用途のための適当な方法を容易に選択しうるであろう。適当な形質転換方法の例には、リポソーム媒介トランスフェクション（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ＦｅｃｔｉｎＴＭ）、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションおよびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションが含まれる。
【０１１６】
そのような組換え製造はまた、いずれかの適当な宿主細胞、組織または生物を使用して達成されうる。適当な細胞、組織および生物が当技術分野でよく知られており、当業者であれば、所望の用途のための適当な宿主を容易に選択しうるであろう。幾つかの実施形態においては、宿主細胞は哺乳類である。適当な哺乳類細胞系としては、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系、例えばＢＨＫ２１、ＨＫＢ１１（Ｃｈｏら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．９：６３１（２００２））、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３；Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２（１９７７））、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２６８；ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２４９４）およびＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｒ７９００７）細胞が挙げられる。有用なＢＨＫ細胞系はｔｋ３１  ｔｓ１３  ＢＨＫ細胞系（ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：１１０６−１１１０（１９８２）（これを参照により本明細書に組み入れることとする））（以下、ＢＨＫ５７０細胞と称される）である。ＢＨＫ５７０細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  １０３１４として寄託されている。ｔｋ−  ｔｓ１３  ＢＨＫ細胞系もＡＴＣＣから受託番号ＣＲＬ  １６３２として入手可能である。また、Ｒａｔ  Ｈｅｐ  Ｉ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６００）、Ｒａｔ  Ｈｅｐ  ＩＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８０６５）、ＮＣＴＣ  １４６９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、ＣＨＯ  Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＩ６１）、ＤＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０（１９８０））およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｃｅｌｌ  ３３：４０５−４１２（１９８３））を含む幾つかの他の細胞系が本開示において使用されうる。
【０１１７】
もう１つの実施形態においては、本開示は第ＶＩＩＩ因子変異体の医薬製剤、および第ＶＩＩＩ因子変異体の治療的有効量と医薬上許容される賦形剤または担体とを含む医薬組成物に関する。医薬上許容される賦形剤または担体は、一般に、製剤の製剤化を補助するために又は製剤を安定化するために有効成分に加えられうる、有意な有害毒性作用を患者に引き起こさない物質を含む。多数の適当な賦形剤および担体が当技術分野でよく知られており、当業者であれば、個々の製剤または組成物に使用する適当な賦形剤または担体を容易に特定しうるであろう。適当な賦形剤または担体の例には、水、糖、例えばマルトースまたはスクロース；アルブミン；および塩が含まれる。適当な製剤の具体例には、米国特許第５，７６３，４０１号（１９９６年７月１２日付け出願；１９９８年６月９日付け発行）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている製剤が含まれる。
【０１１８】
１つの実施形態においては、該医薬製剤／組成物は非経口投与用、例えば静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）または筋肉内（ｉｍ）投与用であり、投与は単一ボーラス用量、断続的投与または連続的静脈内注入としてのものでありうる。局所製剤も有用である。１つの実施形態においては、該医薬製剤は、使用時に還元（再構成）される凍結乾燥製剤中に、本明細書に記載されている単離された第ＶＩＩＩ因子変異体を含み、あるいは本明細書に記載されている第ＶＩＩＩ因子変異体の組成物を含む。あるいは、該医薬製剤は、再構成（還元）を必要としない安定な液体既製製剤でありうる。該医薬製剤は、約２５  ＩＵ、５０  ＩＵ、７５  ＩＵ、１００  ＩＵ、１２５  ＩＵ、１５０  ＩＵ、１７５  ＩＵ、２００  ＩＵ、２５０  ＩＵ、３００  ＩＵ、３５０  ＩＵ、４００  ＩＵ、４５０  ＩＵ、５００  ＩＵ、５５０  ＩＵ、６００  ＩＵ、６５０  ＩＵ、７００  ＩＵ、７５０  ＩＵ、８００  ＩＵ、８５０  ＩＵ、９００  ＩＵ、９５０  ＩＵ、１０００  ＩＵ、１０５０  ＩＵ、１１００  ＩＵ、１１５０  ＩＵ、１２００  ＩＵ、１２５０  ＩＵ、１３００  ＩＵ、１３５０  ＩＵ、１４００  ＩＵ、１４５０  ＩＵ、１５００  ＩＵ、１５５０  ＩＵ、１６００  ＩＵ、１６５０  ＩＵ、１７００  ＩＵ、１７５０  ＩＵ、１８００  ＩＵ、１８５０  ＩＵ、１９００  ＩＵ、１９５０  ＩＵ、２０００  ＩＵ、２０５０  ＩＵ、２１００  ＩＵ、２１５０  ＩＵ、２２００  ＩＵ、２２５０  ＩＵ、２３００  ＩＵ、２３５０  ＩＵ、２４００  ＩＵ、２４５０  ＩＵ、２５００  ＩＵ、２５５０  ＩＵ、２６００  ＩＵ、２６５０  ＩＵ、２７００  ＩＵ、２７５０  ＩＵ、２８００  ＩＵ、２８５０  ＩＵ、２９００  ＩＵ、２９５０  ＩＵ、３０００  ＩＵ、３０５０  ＩＵ、３１００  ＩＵ、３１５０  ＩＵ、３２００  ＩＵ、３２５０  ＩＵ、３３００  ＩＵ、３３５０  ＩＵ、３４００  ＩＵ、３４５０  ＩＵ、３５００  ＩＵ、３５５０  ＩＵ、３６００  ＩＵ、３６５０  ＩＵ、３７００  ＩＵ、３７５０  ＩＵ、３８００  ＩＵ、３８５０  ＩＵ、３９００  ＩＵ、３９５０  ＩＵ、４０００  ＩＵ、４０５０  ＩＵ、４１００  ＩＵ、４１５０  ＩＵ、４２００  ＩＵ、４２５０  ＩＵ、４３００  ＩＵ、４３５０  ＩＵ、４４００  ＩＵ、４４５０  ＩＵ、４５００  ＩＵ、４５５０  ＩＵ、４６００  ＩＵ、４６５０  ＩＵ、４７００  ＩＵ、４７５０  ＩＵ、４８００  ＩＵ、４８５０  ＩＵ、４９００  ＩＵ、４９５０  ＩＵ、５０００  ＩＵ、５５００  ＩＵ、６０００  ＩＵ、６５００  ＩＵ、７０００  ＩＵ、７５００  ＩＵ、８０００  ＩＵ、８５００  ＩＵ、９０００  ＩＵ、９５００  ＩＵ、１００００  ＩＵ、１０５００  ＩＵ、１１０００  ＩＵ、１１５００  ＩＵ、１２０００  ＩＵ、１２５００  ＩＵ、１３０００  ＩＵ、１３５００  ＩＵ、１４０００  ＩＵ、１４５００  ＩＵもしくは１５０００  ＩＵの既製溶液のバイアルまたは凍結乾燥粉末の１回使用バイアル中で提供されることが可能であり、前記数字の２つにより特定される前記量のいずれかの範囲（例えば、２５〜７５  ＩＵ、１００〜２００  ＩＵなどの範囲）を含有するバイアルが本発明に含まれる。「ＩＵ」は国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔ）として当分野にお���ては理解されており、ＷＨＯ国際標準（ＷＨＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）により定義されている。非経口投与可能な組成物を製造するための実際の方法は当業者に公知か又は明らかとなり、例えば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）により発行されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ  ｅｄ．に、より詳細に記載されている。例えば外傷または手術の場合に得策でありうる局所適用は、噴霧、灌流、カテーテル、ステント、血管移植またはステント、軟膏剤または当技術分野で公知の他の製剤を使用して行われうる。ある例においては、局所投与は、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物で処理、注入、被覆または浸漬された外科用スポンジまたはコラーゲンマトリックスのような固体または半固体マトリックスによるものでありうる。そのようなマトリックスの製造方法は当技術分野でよく知られている（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １２：４４５（２００６））。ついで本開示の組成物は、公知技術を用いて、例えば、水性製剤をマトリックスに噴霧することにより、マトリックスに適用されるであろう。
【０１１９】
１つの実施形態においては、本開示は、変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含むキットに関する。ある例においては、該キットは、凍結乾燥変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを含有するバイアル、または該ポリペプチドを含有する凍結乾燥製剤を含有するバイアル、そしてまた、再構成のための希釈剤を含有する。他の例においては、該キットは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの局所製剤、例えば軟膏剤、噴霧剤または液体、および患者への投与の前に該局所製剤が適用されうるスポンジまたは他の医学的マトリックスのようなマトリックスを含有する。
【０１２０】
特定の凝固因子の欠乏により引き起こされる血友病Ａまたは別の凝血障害に罹患している患者への投与のための適切な投与量は、例えば、患者の体重、出血エピソードの重症度、因子欠乏症、および使用される個々の変異体の比活性に基づいて、当業者により容易に決定されうる。ある例においては、投与量は、非経口投与された場合、約５  ＩＵ／ｋｇ、１０  ＩＵ／ｋｇ、１５  ＩＵ／ｋｇ、２０  ＩＵ／ｋｇ、２５  ＩＵ／ｋｇ、３０  ＩＵ／ｋｇ、３５  ＩＵ／ｋｇ、４０  ＩＵ／ｋｇ、４５  ＩＵ／ｋｇ、５０  ＩＵ／ｋｇ、５５  ＩＵ／ｋｇ、６０  ＩＵ／ｋｇ、６５  ＩＵ／ｋｇ、７０  ＩＵ／ｋｇ、７５  ＩＵ／ｋｇ、８０  ＩＵ／ｋｇ、８５  ＩＵ／ｋｇ、９０  ＩＵ／ｋｇ、９５  ＩＵ／ｋｇ、１００  ＩＵ／ｋｇまたはそれ以上でありうる。投与量はまた、範囲内の各エンドポイントが前記投与量から選択される投与量の範囲（例えば、すなわち、５〜１５  ＩＵ／ｋｇ、１０〜２０  ＩＵ／ｋｇなど）内であってもよい。ある実施形態においては、血友病Ａを有する患者の場合、静脈内投与される投与量は手術前適応症に対しては約４０  ＩＵ／キログラムであり、軽度の出血に対しては１５〜２０  ＩＵ／キログラムであり、維持用量として８時間にわたって投与される場合には２０〜４０  ＩＵ／キログラムである。これらの投与量は、投与される変異体第ＶＩＩＩ因子製剤の薬物動態学的プロファイルに基づいて、必要な頻度で投与されうる。例えば、そのような製剤は予防用には１日２回、毎日、隔日、３日に１回、週３回、週２回または週１回、静脈内に投与されうる。投与頻度は、血友病Ａの状態の重症度、投与される該変異体の薬物動態、および活性増強により達成される作用の持続性に基づいて決定されるであろう。
【０１２１】
本発明における第ＶＩＩＩ因子変異体および組成物は血液凝固障害および血液凝固が有利となる障害の治療に有用であり、増強した凝血活性を有する第ＶＩＩＩ因子が必要とされる状況において特に有用である。したがって、本発明における第ＶＩＩＩ因子変異体および組成物は、凝血障害を有する患者における予防的治療に、および根底にある凝血欠損を伴う又は伴わない患者における急性出血エピソードの治療に有用である。ある実施形態においては、該変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、貫通性外傷；鈍的外傷；待機手術における出血；心臓手術における出血；脊髄手術における出血；整形外科手術；脳神経手術；癌手術；産後手術；月経過多；幹細胞移植における出血；肝移植における出血；消化管出血；肝硬変における激しい静脈瘤出血；肝硬変における非静脈瘤出血；びまん性肺胞出血；大動脈瘤；脳内出血；外傷性脳損傷；脳挫傷；ワルファリンの逆転；ヘパリンの逆転；抗凝固薬の逆転；抗血栓薬の逆転；第ＶＩＩＩ因子欠乏症；特定の型のフォン・ヴィレブランド病；遺伝性出血性毛細血管拡張症；種々の動静脈奇形；火傷；インヒビターでの血友病患者における予防；非肝硬変および肝硬変患者に対する部分的肝切除；後天性血友病；特発性血小板減少性紫斑病；血小板媒介止血の欠損（例えば、血小板数または応答の欠損）；グランツマン血小板無力症；血小板輸血に対して難治性のグランツマン血小板無力症；ベルナール・スーリエ症候群；およびデング出血熱により引き起こされる又はそれらに関連した出血を治療するために使用されうる。
【０１２２】
以下の実施例は、特許請求している実施形態を例示するために記載されており、それを限定するものではない。本明細書に記載されている実施例（具体例）および実施形態は例示を目的としたものであるに過ぎず、当業者は、本開示の精神または添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく改変されうる種々のパラメータを認識する、と理解されるべきである。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：トロンビン切断部位および活性化ループの突然変異誘発
トロンビン切断部位の突然変異誘発
トロンビン切断部位内の位置にアミノ酸置換を含有する種々のＦＶＩＩＩ変異体のための発現構築物を、クイックチェインジ部位特異的突然変異誘発キット（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｃａｔ．＃  ２００２５１）を使用して、そして出発ポリペプチドとしてＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを使用して、標準的な部位特異的突然変異誘発により作製した。該構築物を最初はｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおいて作製した。突然変異誘発後、変異体第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列を、適当な制限酵素を使用して該ｐｃＤＮＡ３．１から切り出し、ｐＳＳ２０７発現ベクター内に連結した。得られたプラスミドを９６ウェルベースフォーマットにおけるＨＥＫ２９３細胞内に一過性にトランスフェクトした。ＦＶＩＩＩ発現レベルを標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量した。
【０１２４】
活性化ループの突然変異誘発
アミノ酸５５８−６５位を個々にランダム化する遺伝子ライブラリーを、出発ポリペプチドとしてのＦＶＩＩＩ−ＢＤＤおよび前記の標準的な突然変異誘発技術を用いて作製した。８個のライブラリーのクローン性ＤＮＡ調製物をＨＥＫ２９３細胞内に一過性にトランスフェクトした。ＦＶＩＩＩ発現レベルを前記の標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量した。
【０１２５】
追加的突然変異の組込み
トロンビン切断部位および活性化ループ内に置換を施すことに加えて、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド鎖に沿った他の位置に或る置換を施して、そのような追加的突然変異の影響を調べた。一例においては、Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅ置換を有するＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸を含有するｐｃＤＮＡ３．１ベクターを前記のとおりに部位特異的突然変異誘発に更に付して、Ｒ３３６Ｉ置換を施した。ついで、得られた核酸を発現ベクターｐＳＳ２０７に移した。
【０１２６】
関心のある突然変異の組合せ
異なる変異体セットの作製の後、実質的に同一の方法を用いて、種々の順列で、関心のある突然変異を組合せ、特徴づけした。全体として、約２０００個のＦＶＩＩＩ変異体を産生し、特徴づけした。
【０１２７】
第ＶＩＩＩ因子活性のアッセイ
ＦＶＩＩＩ活性を発色性アッセイとａＰＴＴアッセイとの両方により測定した。精製されたタンパク質に関して、標準物質として０２−１２２（ＮＩＢＳＣ；Ｐｏｔｔｅｒｓ  Ｂａｒ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、Ｃｏａｔｅｓｔ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により発色活性を測定した。該発色アッセイの原理の詳細は前記に記載されている。精製されたタンパク質のａＰＴＴ活性を、標準物質としてのＦＶＩＩＩ−ＢＤＤおよびＡＰＴＴ−ＳＰキット（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、ＡＣＬ  ＴＯＰで測定した。１段階ａＰＴＴアッセイの原理の詳細は前記に記載されている。精製タンパク質の比活性を、Ａ２８０を用いて計算して、タンパク質濃度を決定した。
【０１２８】
結果
アミノ酸３７０−３７５におけるトロンビン切断部位内の位置にアミノ酸置換を有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの多数の変異体を製造し、精査した（表１を参照されたい）。好ましいトロンビン切断配列は、動力学的発蛍光基質アッセイを用いた場合に特定の線状ペプチド配列を他のものよりも切断するトロンビンの能力に基づくものであった（Ｂｉａｎｃｈｉｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２０５２７（２００２））。驚くべきことに、「最適」トロンビン切断部位を含有していると予め予想されていた１つの変異体が（Ｂｉａｎｃｈｉｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２０５２７（２００２））不良なａＰＴＴ活性を示した（表１における変異体「ａ」）。予想された「最適」コンセンサス配列に対する部分的対応を有する他の変異体（表１における変異体ｂおよびｃ）はａＰＴＴ活性の増強を示した。いかなる点においても理論により限定されることを望むものではないが、予想された「最適」トロンビン切断部位との矛盾は、部分的には、小さな線状ペプチド配列とのトロンビン相互作用から大きな三次元タンパク質とのトロンビンの相互作用を推定しうることに無理があったためかもしれない。それでも、「ｂ」および「ｃ」のａＰＴＴ活性の増強は、これらのＦＶＩＩＩ突然変異体が、ａＰＴＴ条件下（例えば、限られた活性化凝固因子の始動）、より効率的に活性化されることを示した。
【表１】
0006523244.tif 000002
【０１２９】
５５８−５６５位の活性化ループ内にアミノ酸置換を有する約１６００個の第ＶＩＩＩ因子変異体を製造し、特徴づけした。発色アッセイを用いて予備スクリーニングを行い、一方、ａＰＴＴアッセイは、増強した凝固促進活性を有する変異体を特定した。表２は、製造され特徴づけされた或る変異体のａＰＴＴ活性を一覧している。
【表２】
0006523244.tif 000003
【０１３０】
ついで、活性化ループ内の複数のアミノ酸置換の組合せの効果を調べた。表３は、選択された変異体の組合せの活性を一覧している。
【表３】
0006523244.tif 000004
【０１３１】
最後に、トロンビン切断部位と活性化ループとの両方における変異体の組合せを特徴づけした。得られた変異体の多くは発色アッセイによる評価では僅かな活性増強を示したに過ぎなかったが（図２）、ａＰＴＴアッセイにより特徴づけされた場合には相当な活性増強を示した（図１）。ＦＶＩＩＩは発色アッセイにおいては完全に前活性化されるが、ａＰＴＴアッセイにおいてはそうではないため、ａＰＴＴ活性の顕著な増強と対比される発色アッセイ活性の僅かな変化はこれらのＦＶＩＩＩ変異体の活性化の利点に合致しているであろう。
【０１３２】
実施例２：Ｖａｒ９７の更なる特徴づけ
出発ポリペプチドとしてＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩを用い、Ｉ３７１Ｐ、Ｖ３７４Ｆ、Ｖ５５９Ｌ、Ｒ５６２ＷおよびＱ５６５Ｅアミノ酸置換を有する、Ｖａｒ９７と称されるもう１つの特定の変異体を更に特徴づけした。選択された変異体を、まず、ｐＳＳ２０７発現ベクター内にクローニングし、ＨＫＢ１１細胞内にトランスフェクトして、１０Ｌのウェーブ・ファーメンター（ｗａｖｅ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）に播くために使用される細胞の安定発現プールを得た。精製されたＶａｒ９７タンパク質を得、後記のとおり、インビトロおよびインビボの両方において特徴づけした。
【０１３３】
初期研究において、精製Ｖａｒ９７タンパク質は、出発第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに対するその発色アッセイ活性と比較して有意に増強したａＰＴＴ活性を有することが判明した。これらの両方のアッセイに関する比活性の比は、変異体Ｖａｒ９７タンパク質に関する発色アッセイ活性に対するａＰＴＴ活性の度合がＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ活性の場合の約３０倍であることを示した（表４）。
【表４】
0006523244.tif 000005
【０１３４】
凝固におけるＶａｒ９７の効力の更なる評価を、開始因子として組織因子（ＴＦ）を使用するＴＧＡにより行った。製造業者（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ；Ａｓｎｉｅｒｅｓ  ｓｕｒ  Ｓｅｉｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により推奨されているとおりにＴＧＡを行った。簡潔に説明すると、ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖまたは変異体）を１ｐＭ  ＴＦ  ４μＭ  ＰＬ混合物と共にヒト血友病Ａ血漿中に加えた（最終濃度、前記のとおり）。反応を、トロンビン基質とＣａＣｌ２（Ｆｌｕ−Ｃａ）との混合物を加えることにより開始させ、６０分間モニタリングした。ここに報告されているＴＧＡの結果は３回の重複実験の平均を表している。低レベルのＴＦの使用ゆえに、ＴＧＡは生理的凝固をより厳密に反映している可能性がある。ＴＧＡによると、Ｖａｒ９７はＦＶＩＩＩ−ＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩタンパク質より、明らかに強力であり、それらの親分子と比較してトロンビン産生における非常に迅速な増加を誘発した（図３）。Ｖａｒ９７とその親であるＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩとの間のトロンビンプロファイルの比較は、増強したＦＸａ産生（より速い上昇速度およびより大きな度合のトロンビン産生）およびトロンビン活性化の容易さ（より短い遅れ）を向上させることにより、追加的な突然変異の寄与を示した。
【０１３５】
トロンビン応答を惹起するその増強した能力ゆえに、全体的なＶａｒ９７のトロンビンプロファイルはＦＶＩＩＩ−ＢＤＤおよびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩに定性的に非常に類似しており、ここで、ベースラインのトロンビンレベルに戻る速度は最高トロンビンレベルに関連づけられた（図３）。これは、Ｖａｒ９７が、血漿中のトロンビンレベルを調節するメカニズムを変化させなかったことを示唆している。これらの結果は、Ｖａｒ９７が、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩタンパク質のものを上回る追加的な血栓形成リスクまたは全身凝血リスクを課さないと考えられることを予測している。
【０１３６】
試験された他のＦＶＩＩＩ分子に対するＶａｒ９７効力の定量的比較は凝固促進アッセイ（ＴＧＡおよびａＰＴＴ）の結果の間の合致を示している。一定量の最高トロンビンを誘導するために要したＶａｒ９７の濃度の比較は、Ｖａｒ９７がその親であるＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩより〜１０倍強力であり、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤより〜１００倍強力であることを示した（図４）。ａＰＴＴによる類似評価は、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩと同じ凝固時間を誘導するために、〜１０倍低いＶａｒ９７を要するに過ぎないことを示した（図５）。
【０１３７】
Ｖａｒ９７変異体の、その生理的酵素複合体における機能を、ＦＸａｓｅ動力学的アッセイを用いて調べた。これらのＦＸａｓｅ動力学的アッセイは、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％  ＢＳＡおよび１０μＭ  ＰＬ（４０：４０：２０，ｖ／ｖ／ｖ  ＰＳ：ＰＣ：ＰＥ）中で行った。これらのＦＸａｓｅ動力学的アッセイにおいては、精製されたＦＶＩＩＩａタンパク質を２０ｎＭ  トロンビンとのインキュベーションにより産生させた。ＦＶＩＩＩレベルを１０ｐＭに一定に維持し、種々の濃度のＦＩＸａ（０〜１０ｎＭ）と反応させ、あるいはＦＩＸａレベルを１００ｐＭに一定に維持し、トロンビン活性化ＦＶＩＩＩａのレベルを変動させた（０〜１０ｎＭ）。ＦＸ（１５０ｎＭ）をいずれかのタイプの反応に加え、１分後、ＥＤＴＡの添加によりＦＸａｓｅ反応を停止させた。これらの反応において産生したＦＸａの量を、Ｓ−２７６５発色性基質を使用して測定した。ついでＦＸａの産生を、ＦＸａレベルを発色性基質切断の速度に関連づける標準曲線から外挿した。データを標準的なミカエリス−メンテン式に当てはめて、反応動力学速度定数を導き出した。ＦＸａ活性の生成がＦＩＸａ濃度によってどのように変動したかを示すために、このデータをプロットした。この分析の結果を表５および図６に示す。表５が示しているとおり、Ｖａｒ９７変異体は、ｗｔ−ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ−ＢＤＤポリペプチドと比較して上昇したＦＸ活性化速度を有する。また、図６は、Ｖａｒ９７変異体がＦＩＸａに対する結合アフィニティの増強を示すことを例示している。実際、Ｖａｒ９７は、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤポリペプチドと比較して少なくとも４倍大きな、ＦＩＸａに対する結合アフィニティを示す。
【表５】
0006523244.tif 000006
【０１３８】
経時的な凝血溶液の濁度を分析して、凝血動力学および生じる血餅の構造の両方を調べることが可能である。凝血中の濁度対時間のプロファイルにおける変化は、生理的レベルと比較して凝固因子の濃度を低下させることにより誘導されうること、そして更に、該濁度プロファイルにおけるそのような変化は血餅のフィブリン構造の変化と相関することが、既に示されている。例えば、ＷｅｉｓｅｌおよびＮａｇｓａｗａｍｉ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，６３：１１１−２８（１９９２）を参照されたい。正常血漿、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿、または５０ｍＵ／ｍＬの種々の第ＶＩＩＩ因子変異体を含有するＦＶＩＩＩ欠乏血漿を使用して、ＷｅｉｓｅｌおよびＮａｇｓａｗａｍｉにより記載されているとおりに濁度分析を行った。図７に示されているとおり、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿への５０ｍＵ／ｍＬのＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｖの導入は、正常血清とは異なる濁度プロファイル（吸光度単位［ＡＵ］対時間［秒］）を与え、これらの２つの変異体における濁度の上昇は、正常血清サンプルにおいて観察されたものほど迅速ではなかった。ＢＤＤおよびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖの凝血動力学が正常血清ほど迅速ではないことを示していることに加えて、これは、５０ｍＵ／ｍＬのＢＤＤまたはＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ変異体の存在が、正常凝血中に生じるものとは異なる血餅構造および構成をもたらしうることを示唆している。これとは対照的に、５０ｍＵ／ｍＬのＶａｒ９７  第ＶＩＩＩ因子変異体の導入は、正常血清サンプルのものに完全に類似した濁度プロファイルを示したが、このことは、正常血餅のものに酷似した凝血動力学および血餅構造を示している。
【０１３９】
Ｖａｒ９７変異体の更なる特徴づけとして、ＨｅｍＡマウスにおける血管損傷からの死亡を防ぐＢＤＤおよびＶａｒ９７の能力を比較するための研究を行った。ＨｅｍＡマウスに種々の濃度の種々のＦＶＩＩＩを投与し、２４時間後、記載されているとおりに（Ｍｅｉら，Ｂｌｏｏｄ（２０１０）１１６：２７０−２７９）、ＨｅｍＡマウスの尾静脈を横切開した。ＨｅｍＡマウスの生存を２４時間モニタリングし、ＦＶＩＩＩ変異体の効力を２４時間生存として評価した。ついで種々の投与量における生存率をプロットし（μｇ／ｋｇおよびＩＵ／ｋｇの両方）、５０％生存（ＥＤ５０）をもたらすのに要したＢＤＤおよびＶａｒ９７の投与量を該プロットから決定した（図８および表６）。これが示すとおり、５０％生存率はＶａｒ９７ではＢＤＤの場合より〜２ないし３倍低い用量で達成される。これは、Ｖａｒ９７の効力の増強およびＶａｒ９７によりもたらされた血餅構造の改善を示した本明細書に記載のその他の試験の結果と良く相関する。
【表６】
0006523244.tif 000007
【０１４０】
可変ＦＩＸａおよび一定ＦＶＩＩＩａでの動力学的ＦＸａｓｅの結果（非表示）は、タンパク質分解がＶａｒ９７のａＰＴＴと発色アッセイ活性との矛盾を説明しうることを示唆した。変異体第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの切断を調べるために、ＦＸａｓｅ反応における過剰なＦＩＸａの存在下のＦＶＩＩＩの物理的変化を可視化した。ＦＸａｓｅに存在するＦＩＸａによるＦＶＩＩＩａ切断の検出のために、試験されている第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを、ウシ血清アルブミンが存在しない標準的なＸａｓｅ反応バッファー中の０．１μｇ／ｍｌの最終濃度に調節した。ＦＶＩＩＩ溶液（２５μＬ）を５μｌの１２０ｎＭ  ＩＸａまたはバッファーに加えた。該反応物を３７℃で１時間インキュベートし、４×ｎｕｐａｇｅバッファーを加えて反応を停止させた。ついで該サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続くクーマシーブルー染色に付した（図９）。この分析は、Ｖａｒ９７第ＶＩＩＩ因子変異体が、ＢＤＤおよびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ変異体ＦＶＩＩＩの一方または両方と比較して増強した、ＦＩＸａによるタンパク質分解切断を示すことを示した。
【０１４１】
実施例３：Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉの特徴づけ
Ｖａｒ９７のタンパク質分解切断の増強を低減するために、Ｖａｒ９７ペプチド鎖内に追加的な置換Ｒ３３６Ｉを施した（Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ；配列番号５５）。これは活性化プロテインＣ（ａＰＣ）に対する公知切断部位内の置換である。図９のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルイメージにおいて認められうるとおり、ＦＩＸａ消化アッセイにおいて、Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉのタンパク質分解切断は、Ｖａｒ９７と比較して顕著に低減した。
【０１４２】
また、凝固変異体におけるＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ変異体の効力を、前記のとおり、開始因子として組織因子（ＴＦ）を使用するＴＧＡにより評価した。ＴＧＡによれば、Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉは、Ｖａｒ９７およびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖほどは強力でなかったものの、ＢＤＤよりは強力であった（図１０）。また、全体的なＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉトロンビンプロファイルは再び、ＢＤＤ、Ｄ５１９ＶＥ６６５ＶおよびＶａｒ９７に定量的に非常に類似しており、ここで、ベースラインのトロンビンレベルに戻る速度は最高トロンビンレベルに関連づけられた（図１０）。一定量の最高トロンビンを誘導するために要したＢＤＤ、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ、Ｖａｒ９７およびＶａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ第ＶＩＩＩ因子変異体の濃度の定量的比較は、Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉが、Ｄ５１９ＶＥ６６５Ｖ−ＦＶＩＩＩに類似した効力を有することを示した（図１１）。
【０１４３】
Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ変異体を更に特徴づけるために、前記のとおり、この変異体の濁度プロファイルをその他の変異体および正常血清対照と比較した。図７に示されているとおり、Ｖａｒ９７−Ｒ３３６Ｉ変異体の濁度プロファイルはＢＤＤおよびＤ５１９ＶＥ６６５Ｖ変異体のものに酷似しており、これは類似した凝血動力学および血餅構造を示している。
【０１４４】
Ｖａｒ９７を含む本明細書に記載されている変異体ポリペプチドは種々の臨床適応症に対する用途を有する。血友病Ａに対しては、迅速で増強したトロンビン応答プロファイルを有するそのような分子は静脈内または皮下投与経路で急性的または予防的に使用されうるであろう。これらの変異体はまた、血小板または凝固欠損から生じるものを含む他の出血障害を治療するために使用されうるであろう。血小板媒介止血における欠損の場合には、血小板数または応答の不全によるものであるかどうかにかかわらず、トロンビンを産生するこれらの変異体の能力の向上は、血小板活性を増強することにより、および有効な止血に必要な血小板血栓を保持するために、より多くのフィブリン「糊」を与えることにより、潜在的に補償しうるであろう。
【０１４５】
血友病および他の止血障害に加えて、これらの変異体がそのような迅速な応答を誘発しうることは、より急性的な状況、例えば外傷および手術における可能な有用性を示唆している。そのような状況においては、トロンビンレベルを調節するメカニズムに対する影響を最低限度に抑えたままこれらの変異体がトロンビン応答を支持することを可能にする迅速性およびロバスト性は利点となりうるであろう。それらの状況においては、これらの変異体は、噴霧剤の形態またはマトリックス（例えば、外科用スポンジまたはコラーゲン）に浸漬された形態で、静脈内、皮下および局所を含む種々の様態で投与されうるであろう。これらの変異体が有用性を有しうる他の適用には、甚だしい血管透過性、血小板機能の欠損および線維素溶解の増強が生命を脅かす内出血を引き起こしうる、デング出血熱のような出血性症候群の治療が含まれる。
【図１】
0006523244.tif 000008
【図２】
0006523244.tif 000009
【図３】
0006523244.tif 000010
【図４】
0006523244.tif 000011
【図５】
0006523244.tif 000012
【図６】
0006523244.tif 000013
【図７】
0006523244.tif 000014
【図８】
0006523244.tif 000015
【図９】
0006523244.tif 000016
【図１０】
0006523244.tif 000017
【図１１】
0006523244.tif 000018
【配列表】
0006523244000001.app