(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、以下の部位におけるアミノ酸のシステインによる置換を含み、
システインにより置換された前記部位を介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントがペイロードに結合され前記イムノコンジュゲートが形成される、イムノコンジュゲート：
前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の定常領域上の１５２位であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、部位。
【請求項２】
前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号１０の配列を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、以下の部位における２つ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、システインにより置換された部位を介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントがペイロードに結合され前記イムノコンジュゲートが形成されるイムノコンジュゲート：
重鎖の定常領域上の１５２及び３７５位であり、前記位置がＥＵシステムに基づいて番号付けされている、部位。
【請求項４】
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の３つ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、システインにより置換された部位を介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントがペイロードに結合され前記イムノコンジュゲートが形成され、
前記組み合わせが、
ａ．抗体重鎖の１５２、３７５及び３９２位、
ｂ．抗体重鎖の１５２、３３４及び３７５位、並びに
ｃ．抗体重鎖の１５２、３３４及び３９２位から選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、
イムノコンジュゲート。
【請求項５】
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の４つ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、
システインにより置換された部位を介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントがペイロードに結合され前記イムノコンジュゲートが形成され、前記組み合わせが、
ａ．重鎖の１５２、３３４、３７５及び３９２位、又は
ｂ．重鎖の１５２、３３３、３７５及び３９２位
における置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
【請求項６】
薬剤抗体比が、約４，約６又は約８である、請求項１から５のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
さらに、薬剤部分を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８】
薬剤部分が、前記システインの硫黄及び任意のリンカーを介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントに付着している、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
前記薬剤部分が、開裂性又は非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記硫黄に結合している、請求項８に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記イムノコンジュゲートが、チオール−マレイミド結合、−Ｓ−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−結合又はジスルフィド結合を含む、請求項８または９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
前記薬剤部分が、細胞傷害剤である、請求項７から１０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
前記薬剤部分が、タキサン、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、チューブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチン類及びメイタンシノイドからなる群から選択される、請求項１１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記抗体又は抗体フラグメントが、腫瘍に特有の細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項１６】
以下より選択される、その定常領域上における１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含む、修飾抗体又はその抗体フラグメント：
前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１５２位であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、位置。
【請求項１７】
以下より選択される、その定常領域上における１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含む、修飾抗体又はその抗体フラグメントであり、
前記置換が、
ａ．重鎖の１５２位、
ｂ．重鎖の１５２位および３７５位、
ｅ．重鎖の１５２位、３７５位および３９２位、
ｆ．重鎖の１５２位、３３４位および３７５位、
ｇ．重鎖の１５２位、３３４位および３９２位、
ｈ．重鎖の１５２位、３３４位、３７５位および３９２位、または
ｉ．重鎖の１５２位、３３３位、３７５位および３９２位
から選択される位置にあり、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、修飾抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の修飾抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
修飾抗体又は抗体フラグメントを製造する方法であって、
請求項１９に記載の宿主細胞を、前記抗体又は抗体フラグメントを発現させるのに適した条件下でインキュベートすること、及び、前記抗体又は抗体フラグメントを単離することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
種々の治療用途のための抗体が重要であるために、抗体を選択的に修飾して改善された特性又は更なる機能を導入するための堅牢な方法に対する必要性が存在する。本発明は、修飾抗体を調製するため、例えば、抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製に使用するために、抗体に部分を付着するための特定部位を提供する。これらの選択コンジュゲート部位は、抗体の定常領域上に位置するため、種々の抗体に有用である。
【背景技術】
【０００２】
抗体修飾法の有用性は周知であり、種々の「ペイロード」部分を付着させるために抗体をコンジュゲートする方法が多数開発されている。これらの方法の多くは、抗体上の特異的反応性アミノ酸残基、例えば、リジン及びシステインの自然発生に頼っており、同残基が、ペイロードを付着させるために使用され得る。しかしながら、天然アミノ酸に頼ることは、常に望ましいとは限らない。付着するペイロードの位置及び量が、それらの反応性アミノ酸の数及び位置により決定される、及びこのような残基の過剰又は不足により、抗体上へのペイロードの負荷を効率的に制御するのが困難となるためである。さらに、反応性アミノ酸の配置により、完全なコンジュゲート化を得ることが困難となり、コンジュゲート中に不均一な生成物がもたらされるおそれがある。例えば、薬学的活性成分の不均一性は、異種集団の患者に薬剤を投与する予測不可能性を高めるため、典型的には望ましくない。つまり、均一な生成物を投与することがはるかに好ましく、不均一な生成物の挙動を完全に特徴付け及び予測することははるかに困難である。例えば、操作されたシステイン残基を介した抗体への細胞傷害剤の部位特異的コンジュゲートは、改善された治療指数を示す均一なイムノコンジュゲートをもたらす（Junutula et al., (2008) Nat Biotechnol. 26(8):925-932（非特許文献１））。
【０００３】
抗体は、特定位置に特定の残基、例えば、システインが追加されるように操作されてきた。これらの残基が、コンジュゲートに使用され得る（Lyons et al., (1990) Protein Eng., 3:703-708（非特許文献２））が、特異的置換の有用性は、操作されたシステインが抗体のフォールディング及び適切な分子内ジスルフィド結合の酸化を妨害する可能性があるため、特定の抗体について変動し得る（Voynov et al., (2010) Bioconjug. Chem. 21(2):385-392（非特許文献３））
【０００４】
哺乳類細胞内で発現した抗体中の操作されたシステインは、その生合成中に、グルタチオン（ＧＳＨ）及び／又はシステインとのジスルフィド結合により修飾されるため（Chen et al. (2009) mAbs 1:6, 563-571（非特許文献４））、初期発現体としての抗体薬剤コンジュゲート生成物中のこの修飾された（１又は複数の）システインは、チオール反応性試薬に対して反応しない。前記操作された（１又は複数の）システインの活性化には、ＧＳＨ及び／又はシステイン付加物を還元し（同還元により、典型的には、抗体の全ての鎖内ジスルフィド結合の還元がもたらされる。）、続けて、コンジュゲート前に、天然の鎖内ジスルフィド結合を再酸化及び再形成する必要がある（Junutula et al., (2008) Nat. Biotechnol. 26(8):925-32）。システインが挿入されているいくつかの部位は、再酸化プロセスを妨害し、この結果として、望ましくない不均一なコンジュゲート生成物がもたらされる。したがって、チオール反応性試薬、例えば、マレイミド又はブロモ−、クロロ−若しくはヨード−アセトアミドの基とのコンジュゲート前に、導入されたシステインが再酸化プロセスを妨害しない、抗体上の部位を特定することが重要である。
【０００５】
システイン残基とブロモ−アセトアミド、ヨード−アセトアミド又はクロロ−アセトアミドとのコンジュゲートは、安定したチオエーテル結合の形成をもたらす（Alley et al., (2008) Bioconjug Chem. 19(3):759-65（非特許文献５））。しかしながら、その化学は、マレイミドコンジュゲート化学より効率的でない。このようなチオール−マレイミド結合を形成することは、ペイロード又はリンカーをシステインに付着させる時に使用する、一般的で高効率な方法であるため、マレイミド結合が使用され得る、抗体上のシステイン置換部位を特定する必要性が存在する。より重要なこととして、部位特異的にコンジュゲートしたイムノコンジュゲートは、改善された治療指数を示し得るため、抗体上へのペイロードのコンジュゲートを効率的に形成するのを可能にし、高い安定性を有するコンジュゲートを提供する、抗体中のシステイン置換用の特定の特権部位を特定する必要性が残っている。本発明は、コンジュゲート目的用の改善された抗体及びこのような改善された抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する、このような特権的システイン置換部位を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Junutula et al., (2008) Nat Biotechnol. 26(8):925-932
【非特許文献２】Lyons et al., (1990) Protein Eng., 3:703-708
【非特許文献３】Voynov et al., (2010) Bioconjug. Chem. 21(2):385-392
【非特許文献４】Chen et al. (2009) mAbs 1:6, 563-571
【非特許文献５】Alley et al., (2008) Bioconjug Chem. 19(3):759-65
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、化学部分（例えば、ペイロード／薬剤部分）の付着用のＣｙｓ残基を提供して良好な効率及び安定性を有するイムノコンジュゲートを形成するために、親抗体又は抗体フラグメント上の天然アミノ酸のシステイン（「Ｃｙｓ」）置換が行われ得る、抗体又は抗体フラグメントの定常領域中の特定部位を提供する。本発明は、さらに、１つ又はそれ以上のこれらの特定部位に１つ又はそれ以上のＣｙｓ残基を有する操作された抗体又は抗体フラグメント及びこのような操作された抗体又は抗体フラグメントから調製されたイムノコンジュゲートを提供する。
【０００８】
抗体の特定位置にＣｙｓを挿入するための方法は、当分野において公知であり、例えば、国際公開第２０１１／００５４８１号明細書を参照されたい。しかしながら、本発明は、親抗体又は抗体フラグメントの１つ又はそれ以上の天然アミノ酸をＣｙｓにより置換することが、１つ又はそれ以上の下記利益：効率的なイムノコンジュゲート化を促進する良好な反応性；Ｃｙｓ−マレイミドコンジュゲート化リンカーを使用した場合のペイロード損失が低下する傾向；望ましくないジスルフィド結合、例えば、抗体間の架橋の形成又は非天然分子内ジスルフィド結合の形成が低下する傾向；並びに、得られたＡＤＣの低い疎水性を提供する、抗体又は抗体フラグメントの定常領域中の特定部位を開示する。
【０００９】
親抗体又は抗体フラグメントの定常領域中の天然アミノ酸のＣｙｓ置換用の特定の特権部位は、効率的なコンジュゲート化を提供し、一方、望ましくない作用を最小化するために選択される。まず、親抗体又は抗体フラグメントの天然アミノ酸をＣｙｓにより１つ又はそれ以上の選択された位置において置換することにより、新たなシステインにおいて容易にコンジュゲート化する抗体又は抗体フラグメントを提供するように、修飾用の特定部位が選択される。前記特定位置は、システイン残基のスルフヒドリルを水性溶液中で求電子体に対して反応性にするのに十分なだけ表面アクセシブルであるように選択される。親抗体又は抗体フラグメントの天然アミノ酸のＣｙｓ置換に適した部位の特定は、結晶構造データに基づいて、前記天然アミノ酸の表面露出を分析することを必要とした。本願明細書に記載された部位は、十分にアクセシブルで、反応性であるため、それらは、天然由来のシステイン残基を修飾するために当分野において周知の化学により、イムノコンジュゲートを形成するために使用され得る。このため、置換Ｃｙｓ残基のコンジュゲート化は、従来法を使用する。
【００１０】
選択された修飾部位は、チオール−マレイミド部分がコンジュゲート化に使用される場合、コンジュゲート化のわずかな逆行の傾向を示す場合がある。前記チオール−マレイミドコンジュゲート化反応は、多くの場合、非常に選択的で、極めて効率的であり、ペイロードをタンパク質のシステイン残基のチオールに付着させるため、又は、タンパク質とペイロードとの間の結合における他の場所のリンカーとしてのいずれかで使用されてもよい。例えば、マレイミドは、タンパク質（例えば、抗体又は抗体フラグメント）に付着することができ、付着したチオールを有するペイロードは、マレイミドに付加されて、コンジュゲートを形成し得る。
【化１】
0006609477.tif 000002
したがって、このコンジュゲート化工程では、タンパク質（例えば、抗体又は抗体フラグメント）は、一重円又は二重円のいずれかであり得、それと異なる方が、ペイロードを表す。ここで、イムノコンジュゲートの安定性情報は、特に、マレイミド基との反応による置換システインのコンジュゲート化に関する。一部の実施形態では、チオールは、タンパク質（例えば、抗体又は抗体フラグメント）上のシステイン由来であり、この場合、前記二重円は、タンパク質を表し、前記一重円は、ペイロードを表す。
【００１１】
多くの場合、チオール−マレイミド反応は、コンジュゲートを調製するために使用されるが、以下に示したコンジュゲート化工程の逆行により、ペイロードの損失又はペイロードと他のチオール含有種との混合がもたらされ得る。
【化２】
0006609477.tif 000003
【００１２】
システイン置換用のいくつかの部位が、他のものより安定したマレイミドコンジュゲートを提供することが報告されている。これはおそらく、新たなシステイン周囲における抗体表面上の特定位置における局所化学環境が、スクシンイミド環の加水分解を促進し得、これにより、イムノコンジュゲート中のチオール−マレイミド結合の逆行を防ぐためである（Shen et al. (2012), Nat. Biotechnol. 30(2):184-9）。この基準に合致するための有益な部位の特定は、適切な表面露出を有する多数の天然アミノ酸に代えてＣｙｓを挿入し、チオール−マレイミド結合を含むイムノコンジュゲートを調製し、コンジュゲートの安定性が不安定化した部位周囲の局所環境により低下した部位を除去するために、イムノコンジュゲートの安定性を評価することを必要とした。このため、リンカー及びペイロードを置換Ｃｙｓ残基に付着させるために使用され得る化学は、前述のチオール−マレイミドコンジュゲートの逆行性に関連する安定性の問題に限定されない。数多くの方法が、システインにおけるコンジュゲートの形成、例えば、マレイミドコンジュゲート化のために使用され得る。最も一般的なコンジュゲート法の１つを使用し、抗体操作に有益なこれらの部位を作製する際に、本願明細書に記載されたシステイン置換用の部位は、抗体コンジュゲート生成物の安定性を向上させる。これは、修飾抗体が周知の非常に効率的なマレイミドコンジュゲート法と共に使用され得るためである。この基準に基づく部位の選択は、表２２及び実施例９に表されたデータにより示される。
【００１３】
選択された部位は、均一なコンジュゲートの形成を妨害するおそれのある、望ましくないジスルフィド形成を最小化するように配置され得る。操作されたシステインを含む抗体又は抗体フラグメントが哺乳類細胞中で産生された場合、Ｃｙｓ残基は、典型的には、遊離のＣｙｓアミノ酸又はグルタチオンに対するジスルフィドとして存在する（Chen et al., (2009) mAbs 16, 353-571）。チオール反応性基とのコンジュゲート化のためのＣｙｓ残基を遊離させるためには、全てのジスルフィド結合を開裂させて、抗体又は抗体フラグメントを還元する必要がある。ついで、前記抗体又は抗体フラグメントは、前記抗体又は抗体フラグメントを安定化する天然ジスルフィドの形成を容易にする条件下で再酸化される。再酸化の際に、前記抗体又は抗体フラグメント表面上に顕著に露出し過ぎたシステイン残基は、別の抗体又は抗体フラグメント上のＣｙｓとの反応により（「抗体間ジスルフィド」）又は望ましくない抗体内ジスルフィドを形成することによりジスルフィドを形成し得る。本願明細書に記載された特定部位に位置するシステイン残基は、効率的なコンジュゲート化に利用可能であるように適切にアクセシブルであるが、そうでない場合に、ｃｙｓ修飾抗体を発現時に典型的に必要とされる還元／再酸化工程中に生じる抗体間及び抗体内ジスルフィド結合の形成を、減少又は除去するのに十分なだけ遮断されるか、又は、適切に配置されることが見出されている。同様に、再酸化後に、いくつかの部位が、操作された新たなＣｙｓ残基のタンパク質内への配置のためと思われる不均一なコンジュゲート生成物を産生することが見出され、本願明細書で特定した特定部位がこのような不均一性を最小化する部位である。
【００１４】
タンパク質薬剤の疎水性を低下させることは、凝集及び循環からのクリアランスを低下させる場合があるため一般的に有益であると考えられるため、薬剤付着が好ましい場合、薬剤ペイロードを、それらが溶媒の相互作用及び付着から遮断された部位においてコンジュゲートさせることは、抗体の疎水性を向上させ得る。抗体あたり４、６又は８個の薬剤が付着している場合、又は特に、疎水性のペイロードが使用される場合、疎水性の変化を最小にする付着部位を選択することが、特に有益である場合がある。
【００１５】
本願明細書の実施例に記載されたこれら及び更なる方法を使用して、Ｃｙｓ取り込み用の部位を評価し、これにより、抗体又は抗体フラグメントを操作してコンジュゲート化、特にＡＤＣ調製用の部位としてＣｙｓを導入するためのＣｙｓ取り込み用の好ましい部位を選択した。抗体の天然アミノ酸をＣｙｓにより置換するための特定部位の選択に関する更なる詳細が、本願明細書に提供される。
【００１６】
システイン置換部位は、抗体又は抗体フラグメントの定常領域中に位置し、標準的な番号付け規則を使用して、本願明細書において特定される。ただし、抗体の部分又はフラグメントが、完全な全長抗体に代えて、多くの目的に使用され得ることは周知であり、抗体は、種々の方法において修飾されることができ、前記方法は、それらが定常領域の機能性に実質的に影響を及ぼさなくとも、定常領域中の部位の番号付けに影響を及ぼすことも周知である。例えば、抗体のループ領域へのＳ６タグ（短いペプチド）の挿入は、抗体の多くの部位の番号付けを変化させるにも関わらず、抗体の活性を保持させ得ることが示されている。したがって、本願明細書に記載された好ましいシステイン置換部位は、完全な抗体の番号付けに基づく標準的な番号付けシステムにより特定されるが、本発明は、抗体フラグメント中又は他の修飾（例えば、ペプチドタグ挿入）を含む抗体中の対応する部位を含む。このため、それらのフラグメント又は修飾抗体中の前記対応する部位は、フラグメント又は修飾抗体中のシステイン置換用に好ましい部位である。番号によるシステイン置換への言及は、全長抗体の関連部分の機能を保持する修飾抗体又は抗体フラグメント中の対応する部位を含む。
【００１７】
抗体フラグメント又は修飾抗体中の対応する部位は、前記抗体フラグメント又は修飾抗体のセグメントを全長抗体と整列させて、本発明の好ましいシステイン置換部位の１つと適合する、前記抗体フラグメント又は修飾抗体中の部位を特定することにより、容易に特定され得る。アライメントは、セグメントが全長抗体の正確な部分と適合するのを確保するのに十分長いセグメント、例えば、少なくとも２０個のアミノ酸残基又は少なくとも５０個の残基又は少なくとも１００個の残基又は少なくとも１５０個の残基のセグメントに基づく場合がある。アライメントは、抗体フラグメント又は修飾抗体内に操作されているため、アライメント、特に保存的置換に使用したセグメント中の操作された点変異による配列中の差異が許容される場合がある他の修飾を考慮してもよい。このため、例えば、Ｆｃドメインは、抗体から切除されることができ、番号付けの差異に関わらず、本願明細書に記載されたシステイン置換部位に対応するアミノ酸残基を含む。本発明のシステイン置換部位に対応するＦｃドメイン中の部位は、前記Ｆｃドメイン中のシステイン置換用の有益な部位であることも期待され、本発明の範囲内に含まれる。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、式（Ｉ）：
【化３】
0006609477.tif 000004
のイムノコンジュゲートを提供する。
【００１９】
式中、Ａｂは、本願明細書に記載された好ましいシステイン置換部位の１つに、少なくとも１つのシステイン残基を含む抗体又は抗体フラグメントを表し、ＬＵは、本願明細書に記載されたリンカーユニットであり、Ｘは、ペイロード又は薬剤部分であり、ｎは、１〜１６の整数である。
【００２０】
典型的には、式（Ｉ）の化合物において、ＬＵは、本願明細書に記載されたシステイン置換部位の１つにおいて、システインに付着しており、Ｘは、薬剤部分、例えば、抗ガン剤であり、Ａｂが抗体である場合、ｎは、２〜８であり、又は、Ａｂが抗体フラグメントである場合、ｎは、１〜８であり得る。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲートを提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、イムノコンジュゲートを提供する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含むイムノコンジュゲートであって、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲートを提供する。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、本願明細書に記載された位置において、１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含む、修飾抗体又はその抗体フラグメントを提供する。システイン置換用の部位は、抗体の定常領域中にあるため、各種の抗体に適用可能であり、前記部位は、安定的で、均一なコンジュゲートを提供するために選択される。前記修飾抗体又はフラグメントは、２つ又はそれ以上のシステイン置換を有することができ、これらの置換は、本願明細書に記載された他の抗体修飾及びコンジュゲート法との組み合わせで使用され得る。
【００２５】
一実施形態において、本発明は、上記で開示されたイムノコンジュゲートを含む医薬組成物及び前記イムノコンジュゲートを使用する方法を提供する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、本願明細書に記載された部位において、少なくとも１つのシステイン置換を有する、本願明細書に記載された修飾抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を提供する。本発明は、さらに、これらの核酸を含む宿主細胞、及び、前記核酸又は宿主細胞を使用して、本願明細書に記載された抗体又は抗体フラグメントを発現及び産生する方法を提供する。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、システインによる置換に適した抗体のアミノ酸を選択して、コンジュゲート用に良好な部位を提供する方法であって、
【００２８】
（１）適切な表面露出を有する前記抗体の定常領域中のアミノ酸を特定して、初期候補部位のセットを提供することと、
【００２９】
（２）各初期候補部位について、その部位における天然アミノ酸がシステインにより置換されている抗体を発現させることと、
【００３０】
（３）発現した各抗体について、発現したタンパク質が、還元及び再酸化後に実質的に均一であるかどうかを決定して、前記初期候補部位に遊離システインを有する機能的な抗体を提供することと、
【００３１】
（４）実質的に均一で、機能的な発現した各タンパク質について、前記初期候補部位におけるシステインをマレイミド部分とコンジュゲートさせて、チオール−マレイミド結合がその部位において安定であるかどうかを決定することと、
【００３２】
（５）前記発現した抗体が実質的に均一でなく、機能的でない初期候補部位、及び、前記チオール−マレイミド結合が不安定化されている初期候補部位を、前記初期候補部位のセットから除去して、システイン置換に有益な部位のセットを提供することとを含む、方法。
【００３３】
場合により、前記方法は、各有益なシステイン置換部位のコンジュゲートについての融解温度を測定し、システイン置換及びコンジュゲート化によって、前記融解温度が自然抗体の融解温度と５℃以上異なっている部位を前記セットから除去する工程をさらに含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、イムノコンジュゲートを製造する方法であって、リンカーユニット（ＬＵ）又はリンカーユニット−ペイロードの組み合わせ（−ＬＵ−Ｘ）を、抗体又は抗体フラグメント中のシステイン残基に付着させることを含み、前記システインが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５位、並びに、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択されるシステイン置換部位に位置し、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、方法を提供する。
【００３５】
本発明の他の態様及び実施形態は、本願明細書においてより詳細に記載される。
１．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３３４、３６０、３７５及び３９２位から選択される部位において、その定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
２．前記１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換が、１２１、１２４、１５２、２５８、３３４、３６０及び３９２位から選択される、実施形態１に記載のイムノコンジュゲート。
３．前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号４、５、１０、１７、１８、２９、３５、４２、４３、４８、５０、５４、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４及び２９５からなる群から選択される配列を含む、実施形態１又は２に記載のイムノコンジュゲート。
４．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択される部位において、その定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、イムノコンジュゲート。
５．前記１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換が、１４５又は１６５位から選択される、実施形態４に記載のイムノコンジュゲート。
６．前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号６１、６２、６９、７１、７５、７６及び７７からなる群から選択される配列を含む、実施形態４に記載のイムノコンジュゲート。
７．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択される部位において、その定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲート。
８．前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号９２、９４、９６、９７及び９８からなる群から選択される配列を含む、実施形態７に記載のイムノコンジュゲート。
９．前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択される部位において、その定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換をさらに含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、実施形態１、２又は３に記載のイムノコンジュゲート。
１０．前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換をさらに含み、前記軽鎖位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、実施形態１、２又は３に記載のイムノコンジュゲート。
１１．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、１５２及び３７５位又は３２７及び３７５位において、重鎖の定常領域上の２つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
１２．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、軽鎖の１０７位及び重鎖の３６０位を含むその定常領域上の２つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
１３．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１１７、１１９、１２１、１２４、１３９、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６９、１７１、１７４、１８９、２０５、２０７、２４６、２５８、２６９、２７４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９３、３２０、３２２、３２６、３３３、３３４、３３５、３３７、３４４、３５５、３６０、３７５、３８２、３９０、３９２、３９８、４００及び４２２位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
１４．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１０９、１１４、１２９、１４２、１４３、１４５、１５２、１５４、１５６、１５９、１６１、１６５、１６８、１６９、１７０、１８２、１８３、１９７、１９９及び２０３位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、イムノコンジュゲート。
１５．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖のその定常領域上の、１４３、１４５、１４７、１５６、１５９、１６３及び１６８位から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲート。
１６．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の２つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、抗体重鎖の３７５位及び抗体軽鎖の１６５位、又は、抗体重鎖の３３４位、抗体軽鎖の１６５位における置換を含み、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
１７．薬剤抗体比が、約４である、実施形態１１、１２及び１６のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
１８．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、その定常領域上の３つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
ａ．抗体重鎖の３７５及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位、
ｂ．抗体重鎖の３３４及び３７５位並びに抗体軽鎖の１６５位、並びに
ｃ．抗体重鎖の３３４及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位
から選択される置換を含み、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
１９．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の３つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
ａ．抗体重鎖の１５２、３７５及び３９２位、
ｂ．抗体重鎖の１５２、３３４及び３７５位、並びに
ｃ．抗体重鎖の１５２、３３４及び３９２位
から選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
２０．薬剤抗体比が、約６である、実施形態１８又は１９に記載のイムノコンジュゲート。
２１．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の４つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、抗体重鎖の３３４、３７５及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位、又は、抗体重鎖の３３３、３７５及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位における置換を含み、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
２２．修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の４つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、抗体重鎖の１５２、３３４、３７５及び３９２位、又は、抗体重鎖の１５２、３３３、３７５及び３９２位における置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
２３．薬剤抗体比が、約８である、実施形態２１又は２２に記載のイムノコンジュゲート。
２４．さらに、薬剤部分を含む、実施形態１から２３のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
２５．薬剤部分が、前記システインの硫黄及び任意のリンカーを介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントに付着している、実施形態２４に記載のイムノコンジュゲート。
２６．前記薬剤部分が、開裂性又は非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記硫黄に結合している、実施形態２５に記載のイムノコンジュゲート。
２７．前記薬剤部分が、非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記硫黄に結合している、実施形態２５に記載のイムノコンジュゲート。
２８．前記イムノコンジュゲートが、チオール−マレイミド結合を含む、実施形態２５に記載のイムノコンジュゲート。
２９．前記イムノコンジュゲートが、−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−結合又はジスルフィド結合を含む、実施形態２５に記載のイムノコンジュゲート。
３０．前記薬剤部分が、細胞傷害剤である、実施形態２５から２９のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
３１．前記薬剤部分が、タキサン、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、チューブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ及びメイタンシノイドからなる群から選択される、実施形態３０に記載のイムノコンジュゲート。
３２．前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１から３１のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
３３．前記抗体が、キメラ抗体である、実施形態１から３１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
３４．前記抗体が、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、実施形態３１に記載のイムノコンジュゲート。
３５．前記抗体が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、実施形態３１に記載のイムノコンジュゲート。
３６．前記抗体又は抗体フラグメントが、腫瘍に特有の細胞表面マーカーに特異的に結合する、実施形態１から３２のいずれかに記載のイムノコンジュゲート。
３７．実施形態１から３６のいずれかに記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
３８．修飾抗体又はその抗体フラグメントであって、
前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１１７、１１９、１２１、１２４、１３９、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６９、１７１、１７４、１８９、２０５、２０７、２４６、２５８、２６９、２７４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９３、３２０、３２２、３２６、３３３、３３４、３３５、３３７、３４４、３５５、３６０、３７５、３８２、３９０、３９２、３９８、４００及び４２２位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、修飾抗体又はその抗体フラグメント。
３９．修飾抗体又はその抗体フラグメントであって、
前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１０９、１１４、１２９、１４２、１４３、１４５、１５２、１５４、１５６、１５９、１６１、１６５、１６８、１６９、１７０、１８２、１８３、１９７、１９９及び２０３位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、修飾抗体又はその抗体フラグメント。
４０．修飾抗体又はその抗体フラグメントであって、
前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖のその定常領域上の、１４３、１４５、１４７、１５６、１５９、１６３、１６８位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、修飾抗体又はその抗体フラグメント。
４１．前記置換が、前記重鎖の１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５位から選択される少なくとも１つのシステインであり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、実施形態３８に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４２．前記置換が、２〜６個のシステインであり、前記システインが、重鎖の１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５から選択される位置にあり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、実施形態３９に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４３．前記置換が、少なくとも１つのシステインであり、軽鎖の１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択され、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、実施形態３９に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４４．前記置換が、２〜６個のシステインであり、前記システインが、軽鎖の１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択される位置にあり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、実施形態４０に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４５．前記置換が、軽鎖の１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択される少なくとも１つのシステインであり、、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、実施形態４０に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４６．前記置換が、２〜６個のシステインであり、前記システインが、軽鎖の１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択される位置にあり、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、実施形態４０に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４７．さらに、薬剤部分に付着し、前記薬剤部分が、前記システインの硫黄及び任意のリンカーを介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントに付着している、実施形態１１、１２、１４から２２、３８から４７のいずれかに記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４８．前記薬剤部分が、リンカーユニットを介して、前記システインの硫黄に付着している、実施形態４７に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
４９．少なくとも１つのＰｃｌ若しくは非天然アミノ酸置換若しくは酵素媒介性コンジュゲート用のペプチドタグ及び／又はそれらの組み合わせを更に含む、実施形態３８から４８のいずれかに記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
５０．実施形態３８から４９のいずれかに記載の修飾抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
５１．実施形態５０に記載の核酸を含む宿主細胞。
５２．修飾抗体又は抗体フラグメントを製造する方法であって、
実施形態４９に記載の宿主細胞を、前記抗体又は抗体フラグメントを発現させるのに適した条件下でインキュベートすること、及び、前記抗体又は抗体フラグメントを単離することを含む、方法。
５３．システインによる置換に適した抗体のアミノ酸を選択して、コンジュゲートに適した部位を提供する方法であって、
（１）適切な表面露出を有する前記抗体の定常領域中のアミノ酸を特定して、初期候補部位のセットを提供することと、
（２）各初期候補部位について、その部位における天然アミノ酸がシステインにより置換されている抗体を発現させることと、
（３）発現した各抗体について、発現したタンパク質が、還元及び再酸化後に実質的に均一であるかどうかを決定して、前記初期候補部位に遊離システインを有する機能的な抗体を提供すること、
（４）実質的に均一で、機能的な発現した各タンパク質について、前記初期候補部位におけるシステインをマレイミド部分とコンジュゲートさせて、チオール−マレイミド結合がその部位において不安定化されているかどうかを決定することと、
（５）前記発現した抗体が実質的に均一でなく、機能的でない初期候補部位、及び、前記チオール−マレイミド結合が不安定化されている初期候補部位を、前記初期候補部位のセットから除去して、システイン置換に有益な部位のセットを提供することとを含む、方法。
５４．各有益なシステイン置換部位のコンジュゲートについての融解温度を測定し、システイン置換及びコンジュゲート化によって、前記融解温度が親抗体の融解温度と５℃以上異なっている部位を前記セットから除去する工程をさらに含む、実施形態５３に記載の方法。 
５５．特定された置換部位の１つ又はそれ以上にシステインを含む抗体又は抗体フラグメントを産生することをさらに含む、実施形態５３又は５４に記載の方法。
５６．イムノコンジュゲートを製造する方法であって、
リンカーユニット（ＬＵ）又はリンカーユニット−ペイロードの組み合わせ（−ＬＵ−Ｘ）を、抗体又は抗体フラグメント中のシステイン残基に付着させることを含み、前記システインが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５位、並びに、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択されるシステイン置換部位に位置し、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、方法。
５７．前記イムノコンジュゲートが、式（Ｉ）：
【化４】
0006609477.tif 000005
で表されるものであり、
式中、Ａｂは、本願明細書に記載された好ましいシステイン置換部位の１つに、少なくとも１つのシステイン残基を含む抗体又は抗体フラグメントを表し、ＬＵは、本願明細書に記載されたリンカーユニットであり、Ｘは、ペイロード又は薬剤部分であり、ｎは、１〜１６の整数である、実施形態５６に記載の方法。
【００３６】
定義
「アミノ酸」という用語は、天然由来、合成及び非天然のアミノ酸、並びに、天然由来のアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を意味する。天然由来のアミノ酸は、遺伝情報によりコードされるタンパク新生アミノ酸であり、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン及びセレノシステイン、ピロリジン及びその類似体のピロリン−カルボキシ−リジンを含む。アミノ酸類似体は、天然由来のアミノ酸と同じ基礎的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合したα−炭素を有する化合物、例えば、シトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然由来のアミノ酸と同じ基礎的化学構造を保持している。
【００３７】
アミノ酸模倣物は、アミノ酸の全体的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然由来のアミノ酸に類似する様式で機能する化合物を意味する。本願明細書で使用する場合、「非天然のアミノ酸」という用語は、同じか異なるかどうかに関わらず、任意の生物由来の非修飾又は修飾遺伝子を使用しても、どのような生物においても生合成的に生成され得ないアミノ酸構造を表すことを意図する。さらに、このような「非天然のアミノ酸」は、典型的には、タンパク質内に取り込むための修飾されたｔＲＮＡ及び修飾されたｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）を必要とする。このｔＲＮＡ／ＲＳペアは、天然由来アミノ酸に対して非天然アミノ酸を優先的に取り込む。このような直交性のｔＲＮＡ／ＲＳペアは、Schultz et al.により開発された選択プロセス（例えば、Liu et al., (2010) Annu. Rev. Biochem. 79:413-444を参照のこと。）又は類似の手法により生成される。前記「非天然アミノ酸」という用語は、天然由来の２２番目のタンパク新生アミノ酸であるピロリジン（Ｐｙｌ）及びその脱メチル化類似体であるピロリジン−カルボキシ−リジン（Ｐｃｌ）を含まない。これは、タンパク質内への両残基の取り込みが、非修飾の天然由来のピロリジン−ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡ合成酵素ペアにより媒介され、Ｐｙｌ及びＰｃｌが、生合成的に生成されるためである（例えば、Ou et al., (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:10437-10442；Cellitti et al., (2011) Nat. Chem. Biol. 27;7(8):528-30を参照のこと。）。米国仮出願第６１／７６２３６号も参照のこと。同仮出願は、参照により組み込まれ、同仮出願には、Ｐｃｌにより置換され得る、抗体軽鎖及び重鎖中の部位特異的アミノ酸残基が記載されている。
【００３８】
本願明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、対応する抗原と、非共有的、可逆的及び特異的な様式で結合可能な、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを意味する。例えば、天然由来のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合により相互に結合している、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖（「抗体重鎖」とも言う）及び２つの軽（Ｌ）鎖（「抗体軽鎖」とも言う）を含む四量体である。各重鎖には、重鎖可変領域（本願明細書において、ＶＨと省略される）及び重鎖定常領域が含まれる。前記重鎖定常領域には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。各軽鎖には、軽鎖可変領域（本願明細書において、ＶＬと省略される）及び軽鎖定常領域が含まれる。前記軽鎖定常領域には、１つのドメイン、ＣＬが含まれる。前記ＶＨ及びＶＬの領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分され、その間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する。各ＶＨ及びＶＬには、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲが含まれ、下記順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ−末端からカルボキシ−末端に配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。前記抗体の定常領域は、宿主組織又は因子、例えば、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介する場合がある。
【００３９】
「抗体」という用語は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。前記抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のものであり得る。
【００４０】
軽鎖及び重鎖は両方とも、構造的及び機能的相同性の領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は、機能的に使用される。この認識において、軽鎖部分の可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖部分の可変ドメイン（ＶＨ）は両方とも、抗原認識及び特異性を決定することが理解される。逆に、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、重要な生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤性移動性、Ｆｃ受容体結合性、相補結合性等を付与する。慣例的に、前記定常領域ドメインの番号付けは、それらが、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠位側になる場合に大きくなる。Ｎ末端は、可変領域であり、Ｃ末端は、定常領域である。ＣＨ３及びＣＬドメインは、実際には、重鎖及び軽鎖それぞれのカルボキシ末端ドメインを含む。
【００４１】
本願明細書で使用する場合、「抗体フラグメント」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント又は抗体の非抗原結合フラグメント（例えば、Ｆｃ）のいずれかを意味する。本願明細書で使用する場合、前記「抗原結合フラグメント」という用語は、（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間的分布により）抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の１つ又はそれ以上の部分を意味する。結合フラグメントの例としては、限定されるものではないが、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；Ｆ（ａｂ）２フラグメント（ヒンジ領域においてジスルフィド結合により結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の１本の腕のＶＬ及びＶＨからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）；並びに、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又は抗体の他のエピトープ結合フラグメントがあげられる。
【００４２】
さらに、前記Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え法を使用して、前記ＶＬ及びＶＨ領域対が一価の分子を形成する１本のタンパク質鎖を構成するのを可能にする、合成リンカーにより結合され得る（一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として公知；例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988；及びHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883, 1988を参照のこと。）。このような一本鎖抗体も、前記「抗原結合フラグメント」という用語に包含されることを意図する。これらの抗原結合フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して得られる。前記フラグメントは、完全な抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。
【００４３】
抗原結合フラグメントは、単一のドメイン抗体、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（minibody）、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖにも包含され得る（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 1126-1136, 2005を参照のこと。）。抗原結合フラグメントは、ポリペプチド、例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）に基づく足場に移植され得る（例えば、米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照のこと。同特許には、フィブロネクチンポリペプチドのモノボディ（monobody）が記載されている。）。
【００４４】
抗原結合フラグメントは、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む一本鎖分子に包含され得る。前記セグメントは、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する（Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-1062, 1995；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００４５】
本願明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は、同じ遺伝的ソースから得られるポリペプチド、例えば、抗体及び抗体フラグメントを意味する。この用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００４６】
本願明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト由来の配列から得られる可変領域を有する抗体を含む。さらに、前記抗体が定常領域を含む場合、前記定常領域も、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系配列若しくはヒト生殖系配列の変異型、又は、例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000に記載されているように、ヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列を含む抗体から得られる。
【００４７】
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム若しくは部位特異的変異誘発により、又は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異により導かれる変異、又は、安定性若しくは製造を促進する保存的置換）を含んでもよい。
【００４８】
本願明細書で使用する場合、「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の反応性を保持しているが、ヒトにおける免疫原性がほとんどない抗体を意味する。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残り部分をそのヒトカウンターパートにより置き換えることにより達成され得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)；Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991)；Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)を参照のこと。
【００４９】
本願明細書で使用する場合、「認識する」という用語は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、そのエピトープが直線状であるか又は立体構造であるかに関わらず、そのエピトープを発見し、同エピトープと相互作用する（例えば、結合する）ことを意味する。前記「エピトープ」という用語は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントが特異的に結合する抗原上の部位を意味する。エピトープは、連続的なアミノ酸又は、タンパク質の三次フォールディングにより並べられた非連続的なアミノ酸の両方から形成され得る。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に対する暴露において保持される。一方、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理において失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的構造において、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的構造を決定する方法は、当分野における技術、例えば、ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴法（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと。）を含む。
【００５０】
本願明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、１つの抗原部位における抗体と抗原との間における相互作用の強度を意味する。各抗原部位において、抗体「腕」の可変領域は、弱い非共有力により、多くの部位において抗原と相互作用し、相互作用が強いほど親和性が高い。
【００５１】
「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する。ただし、１つの抗原に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００５２】
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列について、保存的に修飾された変異体は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同じ配列を意味する。遺伝情報の退縮のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全て、アミノ酸のアラニンをコードする。このため、アラニンがコドンにより特定される全ての位置において、前記コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、「サイレント変異」である。前記サイレント変異は、保存的に修飾された変異の１種である。ポリペプチドをコードする本願明細書における全ての核酸配列は、前記核酸の全ての可能性のあるサイレント変異も説明する。当業者は、核酸における各コドン（ＡＵＧ及びＴＧＧを除く、ＡＵＧは通常、メチオニンに対する唯一のコドンであり、ＴＧＧは通常、トリプトファンに対する唯一のコドンである。）が修飾されて、機能的に同一の分子を生じ得ることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された配列それぞれに黙示的に含まれる。
【００５３】
ポリペプチド配列について、「保存的に修飾された変異体」は、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失又は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当分野において周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を除外するものではなく、これらに追加されるものである。下記８つのグループ：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び、８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照のこと。）。一部の実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、前記アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさない、又は、同特性を有意に変更しない、アミノ酸修飾を意味するために使用される。
【００５４】
本願明細書で使用する場合、「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞又は生物（一般的には、真核生物の細胞、例えば、酵母細胞、ピキア細胞、糸状菌細胞、トリコデルマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞）において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、本来開始ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を完全に、又は、可能な限り高く維持するように操作される。前記開始ヌクレオチド配列は、「親」配列としても公知である。
【００５５】
２つ又はそれ以上の核酸配列又はポリペプチドの配列についての、「パーセント同一」又は「パーセント同一性」という用語は、２つ又はそれ以上の配列又はサブ配列が同じであることを意味する。比較ウインドウにわたって最大の一致を比較及び整列させるか、又は、下記配列比較アルゴリズムの１つを使用して、若しくは、手動のアライメント及び目視検査によって測定されたものとして領域を指定した場合に、２つの配列が、特定の割合の、同じ（すなわち、特定の領域にわたって、又は、特定しない場合には配列全体にわたって、６０％同一性、場合により、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一性の）アミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意に、前記同一性は、長さが少なくとも約３０個のヌクレオチド（又は１０個のアミノ酸）の領域にわたって、又はより好ましくは、長さが１００から５００個又は１０００個又はそれ以上のヌクレオチド（又は２０、５０、２００個又はそれ以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００５６】
配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列は、コンピュータに入力され、必要に応じて、配列座標が指定される。配列アルゴリズムのプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は、別のパラメータが指定され得る。ついで、前記配列比較アルゴリズムは、前記プログラムパラメータに基づいて、前記参照配列に対する前記試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００５７】
本願明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、２０から６００、一般的には、約５０から約２００、より一般的には、約１００から約１５０からなる群から選択される数の連続的な位置のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで、前記２つの配列が最適に整列された後に、ある配列が、同じ数の連続的な位置の参照配列に対して比較されてもよい。比較のための配列のアライメント方法は、当分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の局所的ホモロジーアルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は、手動アライメント及び目視検査（例えば、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, 2003を参照のこと。）により行われ得る。
【００５８】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０のアルゴリズムである。前記２つのアルゴリズムは、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；及び、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990それぞれに記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechology Information）から公開されている。このアルゴリズムは、まず、照会配列において長さＷのショートワードを特定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。前記特定は、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合、いくつかの正の値を有する閾値スコアＴに適合するか、又は、同スコアＴを満たすかのいずれかである。Ｔは、近接ワードスコア閾値（Altschul et al、上記）と呼ばれる。これらの最初の近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対の適合する残基についての報酬スコア；通常＞０）及びＮ（適合しない残基についてのペナルティスコア；通常＜０）を使用して算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスが、前記累積スコアを算出するために使用される。各方向における前記ワードヒットの伸長は、前記累積アライメントスコアが、その最大達成値からの量Ｘにより減少する；前記累積スコアが、１つ又はそれ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積によりゼロ以下になる；又は、いずれかの配列の端部に達した時点で停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ及びＸは、前記アライメントの感受性及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長及び１０の予測（Ｅ）並びに５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと。）アライメント（Ｂ）、１０の予測（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。
【００５９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間における類似性の統計学的分析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993を参照のこと。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。前記最小合計確率は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の適合が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における前記最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは、約０．００１未満である場合、参照配列に類似すると考えられる。
【００６０】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）を使用しても決定され得る。前記アルゴリズムは、ＰＡＭ１２０重量残基表（PAM120 weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に包含されている。さらに、前記２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）のアルゴリズムを使用して決定され得る。前記アルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）におけるＧＡＰプログラムに包含されている。前記ＧＡＰプログラムは、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、並びに、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み及び１、２、３、４、５又は６の長さ重みを使用する。
【００６１】
上記配列同一性の割合以外に、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して生じる抗体と、免疫学的に交差反応性であることである。このため、ポリペプチドは、典型的には、例えば、前記２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合に、第２のポリペプチドに対して実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、前記２つの分子又はその相補体が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下において互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同じプライマーが前記配列を増幅するために使用され得ることである。
【００６２】
本願明細書において、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態におけるそれらのポリマーを意味する。前記用語は、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基若しくは結合を含む核酸を包含する。前記核酸は、合成、天然由来及び非天然由来であり、参照核酸と類似する結合特性を有し、前記参照ヌクレオチドに類似する様式で代謝される。このような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）があげられる。
【００６３】
特に断らない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、そのサイレント変異体（例えば、変性コドン置換）及び相補配列並びに明確に示された配列も包含する。具体的には、以下に詳述されるように、変性コドン置換は、１つ又はそれ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することにより達成されてもよい（Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081；Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608；及びRossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98）。
【００６４】
核酸についての「操作可能に結合した」という用語は、２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を意味する。典型的には、前記用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を意味する。例えば、プロモータ配列又はエンハンサ配列は、それが、適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に操作可能に結合する。一般的には、転写される配列に操作可能に結合するプロモータ転写調節配列は、前記転写される配列に対して物理的に連続している。すなわち、それらは、シス作用性である。ただし、一部の転写調節配列、例えば、エンハンサは、物理的に連続している必要がないか、又は、それらにより転写が増大するコード配列に近接して配置される必要がない。
【００６５】
本願明細書において、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。前記用語は、天然由来のアミノ酸ポリマー及び非天然由来のアミノ酸ポリマーに適用する。特に断らない限り、特定のポリペプチド配列は、黙示的に、その保存的に修飾された変異体も包含する。
【００６６】
本願明細書で使用する場合、「イムノコンジュゲート」又は「抗体コンジュゲート」という用語は、抗体又はその抗体フラグメントと別の作用剤（例えば、化学療法剤、毒物、免疫療法剤、画像化プローブ、分光プローブ等）との結合を意味する。前記結合は、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有的相互作用によることができ、キレート化を含み得る。種々のリンカーは、その多くが当分野において公知であり、前記イムノコンジュゲートを形成するために使用され得る。さらに、前記イムノコンジュゲートは、前記イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現されてもよい融合タンパク質の形態で提供され得る。本願明細書で使用する場合、「融合タンパク質」は、本来別々のタンパク質についてコードされる、２つ又はそれ以上の遺伝子又は遺伝子フラグメント（例えば、ペプチド及びポリペプチド）の結合により形成されたタンパク質を意味する。融合タンパク質は、遺伝子若しくは遺伝子フラグメントのＮ−若しくはＣ−末端における結合により、又は、１つのパートナータンパク質の許容される領域内への遺伝子若しくは遺伝子フラグメントの挿入により形成されてもよい。前記融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質それぞれに由来する機能的特性を有する１つのタンパク質をもたらす。
【００６７】
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物（例えば、哺乳類及び非哺乳類）、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類を含む。言及した場合を除いて、「患者」又は「対象」という用語は、本願明細書において互換的に使用される。
【００６８】
本願明細書で使用する場合、「細胞毒」又は「細胞傷害剤」という用語は、細胞の成長及び増殖に有害であり、細胞又は悪性腫瘍を減少、阻害又は崩壊するために作用する場合がある、任意の作用剤を意味する。
【００６９】
本願明細書で使用する場合、「抗ガン剤」という用語は、細胞増殖性障害、例えば、ガンを処置するために使用され得る任意の作用剤を意味し、限定されるものではないが、細胞傷害剤、化学療法剤、放射線治療及び放射線治療剤、標的化抗ガン剤及び免疫療法剤があげられる。
【００７０】
「薬剤部分」又は「ペイロード」という用語は、互換的に使用され、本発明の抗体又は抗体フラグメントにコンジュゲートする化学部分を意味し、抗体又は抗体フラグメントに付着するのに有用な任意の部分を含み得る。例えば、薬剤部分又はペイロードは、抗ガン剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、麻酔剤であり得る。特定の実施形態では、薬剤部分は、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、プロテインＣＲＭ１の核外移行の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、プロテアソーム阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ副溝結合剤及びＤＨＦＲ阻害剤から選択される。適切な例としては、オーリスタチン、例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ；カリチアマイシン、例えば、ガンマ−カリチアマイシン；及び、メイタンシノイド、例えば、ＤＭ１及びＤＭ４があげられる。これらのそれぞれを、本発明の抗体及び方法と適合するリンカーに付着させるための方法は、当分野において公知であり、例えば、Singh et al., (2009) Therapeutic Antibodies:  Methods and Protocols, vol. 525, 445-457を参照のこと。さらに、ペイロードは、前記コンジュゲートを別の部分、表面等に結合させ得る、生物物理学的プローブ、蛍光体、スピン標識、赤外プローブ、親和性プローブ、キレート剤、分光プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体フラグメント、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、糖類若しくは多糖類、反応性官能基又は結合剤であり得る。
【００７１】
「薬剤抗体比」（「ＤＡＲ」とも言う）という用語は、前記イムノコンジュゲートの抗体に結合しているペイロード又は薬剤部分の数を意味する。例えば、薬剤抗体比が２であることは、イムノコンジュゲートのサンプル中の各抗体に、平均２個の薬剤部分が結合していることを意味する。薬剤抗体比が２のサンプル中には、薬剤部分と全く結合していないか又は１つの薬剤部分とのみ結合している個々のイムノコンジュゲートもあれば、個々の抗体上に、２、３、４個又はそれ以上の部分さえ有する同サンプル中のイムノコンジュゲートもある。しかし、前記サンプル中の平均は、２である。イムノコンジュゲートの薬剤抗体比を測定するための当分野において公知の種々の方法が存在する。
本発明の実施形態において、イムノコンジュゲートのサンプル中のＤＡＲは、「均一」であり得る。「均一なコンジュゲートサンプル」は、狭い分布のＤＡＲを有するサンプルである。例示となる実施形態として、均一なコンジュゲートサンプルにおいて、２のＤＡＲを有することは、そのサンプル中に、コンジュゲートしていない抗体、及び、約２のＤＡＲでコンジュゲートしている、３つ又はそれ以上の部分を有する一部の抗体を含み得る。「ほとんどのサンプル」は、２つの部分に結合しているサンプル中の抗体を、少なくとも７０％を超え、又は、少なくとも８０％を超え、又は、少なくとも９０％を超えて有することを意味する。
例示となる実施形態として、均一なコンジュゲートサンプルにおいて、４のＤＡＲを有することは、そのサンプル中に、約４のＤＡＲにおいてコンジュゲートしている４つ前後の部分を有する抗体を含み得る。「ほとんどのサンプル」は、４つの部分にコンジュゲートしているサンプル中の抗体を、少なくとも７０％を超え、又は、少なくとも８０％を超え、又は、少なくとも９０％を超えて有することを意味する。
例示となる実施形態として、均一なコンジュゲートサンプルにおいて、６のＤＡＲを有することは、そのサンプル中に、約６のＤＡＲにおいてコンジュゲートしている６つ前後の部分を有する抗体を含み得る。「ほとんどのサンプル」は、６つの部分にコンジュゲートしているサンプル中の抗体を、少なくとも７０％を超え、又は、少なくとも８０％を超え、又は、少なくとも９０％を超えて有することを意味する。
例示となる実施形態として、均一なコンジュゲートサンプルにおいて、８のＤＡＲを有することは、そのサンプル中に、約４のＤＡＲにおいてコンジュゲートしている８つ前後の部分を有するいくつかの抗体を有する抗体を含み得る。「ほとんどのサンプル」は、８つの部分にコンジュゲートしているサンプル中の抗体を、少なくとも７０％を超え、又は、少なくとも８０％を超え、又は、少なくとも９０％を超えて有することを意味する。
【００７２】
「約２の薬剤抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、前記薬剤抗体比が約１．６〜２．４部分／抗体、１．８〜２．３部分／抗体又は１．９〜２．１部分／抗体の範囲であり得るイムノコンジュゲートのサンプルを意味する。
【００７３】
「約４の薬剤抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、前記薬剤抗体比が約３．６〜４．４部分／抗体、３．８〜４．３部分／抗体又は３．９〜４．１部分／抗体の範囲であり得るイムノコンジュゲートのサンプルを意味する。
【００７４】
「約６の薬剤抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、前記薬剤抗体比が約５．６〜６．４部分／抗体、５．８〜６．３部分／抗体又は５．９〜６．１部分／抗体の範囲であり得るイムノコンジュゲートのサンプルを意味する。
「約８の薬剤抗体比」を有するイムノコンジュゲートは、前記薬剤抗体比が約７．６〜８４部分／抗体、７．８〜８．３部分／抗体又は７．９〜８．１部分／抗体の範囲であり得るイムノコンジュゲートのサンプルを意味する。
【００７５】
「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず新生細胞の成長及び増殖、並びに、全ての前ガン性及びガン性の細胞及び組織を意味する。
【００７６】
「抗腫瘍活性」という用語は、腫瘍細胞増殖の速度、生存率又は転移活性の低下を意味する。抗腫瘍活性を示すのを可能にする方法は、治療中に生じる異常な細胞の成長速度の低下又は腫瘍サイズの安定性若しくは低下を示すことである。このような活性は、承認されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを使用して評価され得る。前記モデルとしては、限定されるものではないが、異種移植片モデル、同種移植片モデル、ＭＭＴＶモデル及び抗腫瘍活性を研究するための当分野において公知の他の公知のモデルがあげられる。
【００７７】
「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍又はガンを意味する。本願明細書で使用する場合、前記「ガン」という用語は、調節解除され、無制御な細胞成長により特徴付けられる悪性腫瘍を含む。例示となるガンとしては、ガン腫、肉腫、白血病及びリンパ腫があげられる。
【００７８】
前記「ガン」という用語は、原発性悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位以外の対象の身体中の部位に、その細胞が移動していないもの）及び二次悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍部位とは異なる二次部位に腫瘍細胞の転移、移動を生じているもの）があげられる。
【００７９】
本願明細書で使用する場合、「光学異性体」又は「立体異性体」という用語は、本発明の所定の化合物について存在する場合があり、幾何異性体を含む、種々のステレオ異性体型のいずれかを意味する。置換基が炭素原子のキラル中心に付着する場合があることが理解される。前記「キラル」という用語は、その鏡像パートナーと重ね合わせることができない特性を有する分子を意味する。一方、「アキラル」という用語は、その鏡像パートナーとの重ね合わせができる分子を意味する。したがって、本発明は、前記化合物のエナンチオマー、ジアステレオマー又はラセミ体を含む。「エナンチオマー」は、互いの鏡像を重ね合わせることができない、一対の立体異性体である。一対のエナンチオマーの１：１の混合物は、「ラセミ」混合物である。前記用語は、必要に応じて、ラセミ混合物を指定するために使用される。「ジアステレオマー」は、少なくとも２つの不斉原子を有するが、互いに鏡像関係にない立体異性体である。絶対立体化学は、Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ  Ｒ−Ｓシステムに基づいて特定される。化合物が純粋なエナンチオマーである場合、各キラル炭素における立体化学は、Ｒ又はＳのいずれかにより特定されてもよい。絶対配置が未知である分離された化合物は、それらがナトリウムＤ線の波長における面偏光を回転させる方向（右旋又は左旋）に応じて、（＋）又は（−）で指定され得る。本願明細書に記載された特定の化合物は、１つ又はそれ以上の不斉中心又は軸を含むため、エナンチオマー、ジアステレオマー及び、絶対立体化学に関して、（Ｒ）−又は（Ｓ）−として定義される場合がある他の立体異性体を生じる場合がある。
【００８０】
開始材料及び手法の選択に応じて、前記化合物は、可能性のある異性体又はそれらの混合物の１つの形態において、例えば、純粋な光学異性体又は異性体混合物、例えば、不斉炭素原子の数に応じて、ラセミ体及びジアステレオ異性体混合物として存在し得る。本発明は、全てのこのような可能性のある異性体、例えば、ラセミ混合物、ジアステレオマー混合物及び光学的に純粋な形態を含むことを意味する。光学的に活性な（Ｒ）−及び（Ｓ）−異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を使用して調製されてもよいし、又は、従来技術を使用して分離されてもよい。前記化合物が二重結合を含む場合、置換基は、Ｅ又はＺ配置でもよい。前記化合物が二置換のシクロアルキルを含む場合、前記シクロアルキル置換基は、ｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−配置を有してもよい。全ての互変異体も含まれると意図する。
【００８１】
本願明細書で使用する場合、「塩」又は「複数の塩」という用語は、本発明の化合物の酸付加塩又は塩基付加塩を意味する。「塩」は特に、「薬学的に許容され得る塩」を含む。前記「薬学的に許容され得る塩」という用語は、本発明の化合物における生物学的有効性及び特性を保持する塩を意味し、典型的には、生物学的に又はその他の方法で望ましくないことはないものである。多くの場合に、本発明の化合物は、アミノ及び／若しくはカルボキシルの基又はそれに類似する基の存在により、酸及び／又は塩基塩を形成可能である。
【００８２】
薬学的に許容され得る酸付加塩は、無機酸及び有機酸、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、樟脳スルホン酸塩、塩化物／塩化水素塩、クロロテオフィリネート、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩及びトリフルオロ酢酸塩により形成され得る。
【００８３】
塩が得られる無機酸としては、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等があげられる。
【００８４】
塩が得られる有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸等があげられる。薬学的に許容され得る塩基付加塩は、無機及び有機の塩基により形成され得る。
【００８５】
塩が得られる無機塩基としては、例えば、アンモニウム塩及び周期表のＩ〜ＸＩＩ族の金属があげられる。特定の実施形態では、前記塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛及び銅から得られ、特に適した塩は、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウムの塩を含む。
【００８６】
塩が得られる有機塩基としては、例えば、一級、二級及び三級アミン、置換アミン（例えば、天然由来の置換アミン）、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂等があげられる。特定の有機アミンとしては、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リジン、メグルミン、ピペラジン及びトロメタミンを含む。
【００８７】
本発明の薬学的に許容され得る塩は、塩基性又は酸性部分から、従来の化学法により合成され得る。一般的には、このような塩は、遊離酸の形態のこれらの化合物と化学量論量の適切な塩基（例えば、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ又はＫの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）とを反応させることにより、又は、遊離塩基の形態のこれらの化合物と化学量論量の適切な酸とを反応させることにより調製され得る。このような反応は、典型的には、水若しくは有機溶媒又はその２つの混合物中で行われる。一般的には、実施可能な場合、非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール又はアセトニトリルを使用することが望ましい。更なる適切な塩の列記は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)；及び「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use」by Stahl and Wermath（Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002）に見出すことができる。
【００８８】
本願明細書に提供される任意の式は、無標識の形態及び同位体的に標識した形態の化合物を表すことも意図する。同位体的に標識した化合物は、１つ又はそれ以上の原子が選択した原子量又は質量数を有する原子により置き換えられていることを除いて、本願明細書に提供された式により表した構造を有する。本発明の化合物内に包含され得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素及び塩素の同位体、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、１２５Ｉのそれぞれがあげられる。本発明は、本願明細書において定義した種々の同位体的に標識した化合物、例えば、前記化合物内に放射性同位体、例えば、３Ｈ及び１４Ｃ、又は、非放射性同位体、例えば、２Ｈ及び１３Ｃが存在するものを含む。このような同位体的に標識した化合物は、代謝試験（１４Ｃによる）、反応速度論試験（例えば、２Ｈ又は３Ｈによる）、薬剤又は基質の組織分布アッセイを含む検出又は画像化技術、例えば、陽電子放出型コンピュータ断層撮影法（ＰＥＴ）又は単一光子放出型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）又は患者の放射線治療に有用である。特に、１８Ｆ又は標識化合物は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ試験に特に望ましい場合がある。式（Ｉ）の同位体的に標識した化合物は、通常、当業者に公知の従来技術により、又は、添付の実施例及び調製に記載されたものに類似するプロセスにより、先に使用した非標識試薬に代えて、適切な同位体的に標識した試薬を使用して調製され得る。
【００８９】
さらに、より重い同位体、特に重水素（すなわち、２Ｈ又はＤ）による置換により、より高い代謝安定性、例えば、増大したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期若しくは減少した用量要求又は治療指数の改善を生じる特定の治療的利益が達成されてもよい。この文脈における重水素は、式（Ｉ）の化合物の置換基と見なすことができると理解される。このようなより重い同位体（特に重水素）の濃度は、同位体濃縮因子により定義されてもよい。本願明細書で使用する場合、「同位体濃縮因子」という用語は、特定の同位体の同位体存在度と天然存在度との間の割合を意味する。本発明の化合物における置換基が言及される重水素である場合、このような化合物は、少なくとも３５００（各指定の重水素原子における５２．５％の重水素包含）、少なくとも４０００（６０％の重水素包含）、少なくとも４５００（６７．５％の重水素包含）、少なくとも５０００（７５％の重水素包含）、少なくとも５５００（８２．５％の重水素包含）、少なくとも６０００（９０％の重水素包含）、少なくとも６３３３．３（９５％の重水素包含）、少なくとも６４６６．７（９７％の重水素包含）、少なくとも６６００（９９％の重水素包含）又は少なくとも６６３３．３（９９．５％の重水素包含）の、各指定の重水素原子についての同位体濃縮因子を有する。
【００９０】
本願明細書で使用する場合、「薬学的許容され得るキャリア」という用語は、当業者に公知であるように（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329を参照のこと。）、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬剤安定化剤、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味料、着香料、染料等及びこれらの組み合わせを含む。任意の従来のキャリアが活性成分と不適合である場合を除いて、治療的組成物又は医薬組成物におけるその使用が考えられる。
【００９１】
本発明の化合物の「治療的に有効量」という用語は、対象の生物学的又は医学的応答、例えば、酵素又はタンパク質の活性の低下若しくは阻害を引き出す、又は、兆候を改善し、状態を緩和し、疾患の進行を遅くする若しくは遅延させる、又は、疾患を予防する、等をする量の本発明の化合物を意味する。非限定的な一実施形態において、前記「治療的に有効量」という用語は、対象に投与した場合、状態又は障害若しくは疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、予防及び／又は改善し、又は、標的の酵素又は受容体の活性を少なくとも部分的に阻害するのに有効な量の本発明の化合物を意味する。
【００９２】
本願明細書で使用する場合、「阻害する」、「阻害」又は「阻害すること」という用語は、所定の状態、兆候又は障害若しくは疾患の低下若しくは抑制、又は、生物学的活性若しくはプロセスのベースライン活性の顕著な低下を意味する。
【００９３】
本願明細書で使用する場合、任意の疾患又は障害を「処置する」、「処置すること」又は「処置」という用語は、一実施形態において、前記疾患又は障害を改善すること（すなわち、前記疾患又は少なくとも１つのその臨床的兆候の発症を遅くし、停止させ又は低下させること）を意味する。別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、患者により認識できない場合があるものを含む、少なくとも１つの肉体的パラメータを緩和又は改善することを意味する。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、前記疾患又は障害を、肉体的（例えば、認識できる兆候の安定化）、生理学的（例えば、肉体的パラメータの安定化）のいずれか又は両方で調節することを意味する。さらに別の実施形態では、「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、前記疾患又は障害の開始又は進行若しくは進展を予防又は遅延させることを意味する。
【００９４】
本願明細書で使用する場合、このような対象がこのような処置により、生物学的に、医学的に又は生活の質において利益を得る場合、対象は、処置を「必要とする」。
【００９５】
本願明細書で使用する場合、本発明について（特に特許請求の範囲において）使用する「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語及び類似する用語は、本願明細書において別段示すか、又は、文脈と明確に矛盾しない限り、単数又は複数の両方を含むものと解釈すべきである。
【００９６】
本願明細書で使用する場合、「チオール−マレイミド」という用語は、この一般式
【化５】
0006609477.tif 000006
を有する、チオールとマレイミドとの反応により形成された基を説明する。
式中、Ｙ及びＺは、チオール−マレイミド結合を介して結合している基であり、リンカーユニットであり得、抗体又はペイロードに付着していることができる。一部の例では、Ｙは、本発明に基づく操作された抗体であり、前記式に示した硫黄原子は、本願明細書に記載された置換部位の１つにおけるシステイン由来であり；一方、Ｚは、ペイロードに結合しているリンカーユニットを表す。
【００９７】
本願明細書で使用する場合、「リンカーユニット（ＬＵ）」は、２つの部分、例えば、抗体とペイロードとの間の共有的化学結合を意味する。各ＬＵには、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６として本願明細書に記載された１つ又はそれ以上の成分が含まれ得る。前記リンカーユニットは、前記結合している部分間の適切な間隔を提供し、又は、特定の物理化学的特性を提供するために選択され、又は、特定の条件下において前記リンカーユニットの開裂を可能にするように選択され得る。
【００９８】
本願明細書で使用する場合、「開裂性」は、共有結合により２つの部分を結合させるが、生理学的条件下において壊れて、その部分間の共有結合を切断する、リンカー又はリンカーユニット（ＬＵ）を意味する。開裂は、酵素的でもよいし、又は、非酵素的でもよいが、一般的には、抗体を分解することなく、抗体からペイロードを脱離させる。
【００９９】
本願明細書で使用する場合、「非開裂性」は、生理学的条件下における破壊に感受性でないリンカー又はリンカーユニット（ＬＵ）を意味する。前記リンカーは、生理学的に修飾される場合があるが、前記抗体が実質的に分解する、すなわち、前記抗体の分解がｉｎ  ｖｉｖｏにおける前記リンカーの開裂に先行するまで、前記抗体に結合しているペイロードを維持する。
本願明細書で使用する場合、「シクロオクチン」は、炭素−炭素三重結合（アセチレン）を含む８員環を意味する。前記環は、場合により、１つ又は２つのフェニル環と縮合しており、前記フェニル環は、１〜４個のＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＬ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ１、Ｏ−Ｌ１又は類似する基により置換されていてもよく、環員としてＮ、Ｏ又はＳを含んでよい。好ましい実施形態では、シクロオクチンは、Ｃ８炭化水素環、特に、前記三重結合を除いて飽和しており、Ｆ又はヒドロキシにより置換されていてもよく、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ又はＣ（Ｏ）Ｏを介して、リンカー又はＬＵに結合していてもよい、孤立環（isolated ring）であり得る。
【０１００】
本願明細書で使用する場合、「シクロオクテン」は、少なくとも１つの二重結合、特にｔｒａｎｓ−二重結合を含む８員環を意味する。前記環は、場合により、１つ又は２つのフェニル環と縮合しており、前記フェニル環は、１〜４個のＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロ、ヒドロキシル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＬ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｌ１、Ｏ−Ｌ１又は類似する基により置換されていてもよく、環員としてＮ、Ｏ又はＳを含んでよい。好ましい実施形態では、シクロオクテンは、前記ｔｒａｎｓ二重結合を除いて飽和しており、場合により、Ｆ又はヒドロキシにより置換されており、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ又はＣ（Ｏ）Ｏを介して、リンカー又はＬＵに結合していてもよい、孤立したＣ８炭化水素環であり得る。
【０１０１】
本願明細書に記載された全ての方法は、本願明細書において別段示すか、又は、文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本願明細書において提供されたいずれか及び全ての例示又は例示的言語（例えば、「例えば」）は、単に本発明をより良好に明らかにすることを意図し、本発明又は特許請求の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】ヒトＩｇＧ１重鎖（Ａ）及びカッパ軽鎖（Ｂ）中のアミノ酸残基の表面アクセシビリティプロット。Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒａｃｅｒ  ５．０を使用して、表面アクセシビリティを算出し、平方オングストローム［Å２］として表す。
【図１Ｂ】ヒトＩｇＧ１重鎖（Ａ）及びカッパ軽鎖（Ｂ）中のアミノ酸残基の表面アクセシビリティプロット。Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒａｃｅｒ  ５．０を使用して、表面アクセシビリティを算出し、平方オングストローム［Å２］として表す。
【図２】カッパ軽鎖を含むヒトＩｇＧ１の構造において選択した９２個のＴＡＧ変異の位置。ＴＡＧ変異用に選択した残基を、２つの重鎖の一方のみにおいて、及び、２つのカッパ軽鎖（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）の一方について、黒色で示す。ＰｙＭＯＬ、オープンソース分子モデリングパッケージ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．０．Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ＬＬＣ）を使用して、構造を示す。
【図３】トラスツズマブ及び抗体１４０９０における重鎖定常領域のアミノ酸配列アライメント。トラスツズマブ抗体及び抗体１４０９０中のＣｙｓに変異した残基に下線を引いている。重鎖中のアミノ酸残基を、Ｅｕナンバリングシステム（Edelman et al., 1969）により番号付けしている。
【図４】トラスツズマブ、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の定常領域のアミノ酸配列アライメント。
【図５】ヒトカッパ及びラムダ軽鎖の定常領域のアミノ酸配列アライメント。Ａ．トラスツズマブのカッパ軽鎖及び抗体１４０９０のラムダ軽鎖中のＣｙｓに変異した残基に下線を引いている。Ｂ．Ｃｙｓ変異用に選択した残基を、ヒトラムダ軽鎖（タンパク質構造データバンクエントリ  ３Ｇ６Ｄ．ｐｄｂ）のＰｙＭＯＬ構造モデルに示す。
【図６】非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるトラスツズマブＣｙｓ抗体の分析。
【図７】トラスツズマブＬＣ−Ｓ１５６Ｃ変異抗体（破線）及び野生型トラスツズマブ（実線）のサイズ排除クロマトグラフィー。
【図８】逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による、野生型トラスツズマブ（Ａ）及びトラスツズマブＬＣ−Ｅ１５８Ｃ変異抗体（Ｂ）の分析。
【図９】プロテインＡ精製後のトラスツズマブＬＣ−Ｒ１０８Ｃ変異抗体のＭＳ分析（インタクトＭＳ）。
【図１０】ＭＣ−ＭＭＡＦの構造。
【図１１Ａ】ＲＰ−ＨＰＬＣによる、トラスツズマブＣｙｓ抗体とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲート混合物の分析。前記コンジュゲート混合物のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、破線で示す。非修飾抗体のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、実線で示す。Ａ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＨＣ−３６０Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｓ１５６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｓ２７５Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１１Ｂ】ＲＰ−ＨＰＬＣによる、トラスツズマブＣｙｓ抗体とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲート混合物の分析。前記コンジュゲート混合物のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、破線で示す。非修飾抗体のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、実線で示す。Ａ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＨＣ−３６０Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｓ１５６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｓ２７５Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１１Ｃ】ＲＰ−ＨＰＬＣによる、トラスツズマブＣｙｓ抗体とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲート混合物の分析。前記コンジュゲート混合物のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、破線で示す。非修飾抗体のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、実線で示す。Ａ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＨＣ−３６０Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｓ１５６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｓ２７５Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１１Ｄ】ＲＰ−ＨＰＬＣによる、トラスツズマブＣｙｓ抗体とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲート混合物の分析。前記コンジュゲート混合物のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、破線で示す。非修飾抗体のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、実線で示す。Ａ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＨＣ−３６０Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｓ１５６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｓ２７５Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１２】ＲＰ−ＨＰＬＣによる、トラスツズマブＣｙｓ抗体とＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲート混合物の分析。前記コンジュゲート混合物のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、破線で示す。非修飾抗体のＲＰ−ＨＰＬＣトレースを、実線で示す。Ａ．ＨＣ−Ｓ１３４Ｃ−ＭＭＡＦ及びＢ．ＨＣ−Ｓ１３６Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１３】分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＡｎＳＥＣ）によるトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの分析。トラスツズマブＨＣ−Ｋ２９０Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ（短い破線）、トラスツズマブＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ（破線）及びトラスツズマブＬＣ−Ｌ１５４Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ（点線）を、非修飾の野生型トラスツズマブ（実線）と比較している。
【図１４】非修飾の野生型トラスツズマブ並びにトラスツズマブＨＣ−Ｔ３３５Ｃ−ＭＭＡＦ、トラスツズマブＨＣ−Ｓ３３７Ｃ−ＭＭＡＦ及びトラスツズマブＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの熱融解曲線。
【図１５】Ａ．ＨＣＣ１９５４、Ｂ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６及びＣ．ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン４０細胞による、トラスツズマブＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦについての細胞増殖アッセイ。
【図１６】ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞の増殖アッセイにおけるトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのＩＣ５０。
【図１７】Ａ．ＣＭＫ１１−５及びＢ．Ｊｕｒｋａｔ細胞による、抗体１４０９０  ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについての細胞増殖アッセイ。
【図１８Ａ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＬＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．野生型の非コンジュゲート化トラスツズマブ、Ｂ．ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｄ．ＬＣ−Ｌ１５４Ｃ−ＭＭＡＦ及びＥ．ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１８Ｂ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＬＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．野生型の非コンジュゲート化トラスツズマブ、Ｂ．ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｄ．ＬＣ−Ｌ１５４Ｃ−ＭＭＡＦ及びＥ．ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１８Ｃ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＬＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．野生型の非コンジュゲート化トラスツズマブ、Ｂ．ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｄ．ＬＣ−Ｌ１５４Ｃ−ＭＭＡＦ及びＥ．ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１８Ｄ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＬＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．野生型の非コンジュゲート化トラスツズマブ、Ｂ．ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｄ．ＬＣ−Ｌ１５４Ｃ−ＭＭＡＦ及びＥ．ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１８Ｅ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＬＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．野生型の非コンジュゲート化トラスツズマブ、Ｂ．ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＬＣ−Ｒ１０８Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｄ．ＬＣ−Ｌ１５４Ｃ−ＭＭＡＦ及びＥ．ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１９Ａ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＨＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＨＣ−Ｋ１２１Ｃ−ＭＭＡＤ、Ｂ．ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ２９２Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１９Ｂ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＨＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＨＣ−Ｋ１２１Ｃ−ＭＭＡＤ、Ｂ．ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ２９２Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１９Ｃ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＨＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＨＣ−Ｋ１２１Ｃ−ＭＭＡＤ、Ｂ．ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ２９２Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図１９Ｄ】有意な薬剤損失を示さないトラスツズマブＨＣ−Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＨＣ−Ｋ１２１Ｃ−ＭＭＡＤ、Ｂ．ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ２９２Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図２０Ａ】有意な薬剤損失を示すトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＬＣ−Ｔ１２９Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＬＣ−Ｅ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｋ２４６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ３４４Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図２０Ｂ】有意な薬剤損失を示すトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＬＣ−Ｔ１２９Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＬＣ−Ｅ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｋ２４６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ３４４Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図２０Ｃ】有意な薬剤損失を示すトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＬＣ−Ｔ１２９Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＬＣ−Ｅ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｋ２４６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ３４４Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図２０Ｄ】有意な薬剤損失を示すトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＬＣ−Ｔ１２９Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｂ．ＬＣ−Ｅ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ、Ｃ．ＨＣ−Ｋ２４６Ｃ−ＭＭＡＦ及びＤ．ＨＣ−Ｒ３４４Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図２１】ｉｎ  ｖｉｖｏにおける速いクリアランスを示す、２つのトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。Ａ．ＨＣ−Ｔ３３５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＢ．ＨＣ−Ｓ３３７Ｃ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ。
【図２２】ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６異種移植片マウスモデルにおける、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験。
【図２３Ａ】疎水性相互作用クロマトグラフィーにより測定した場合の、トラスツズマブＰｃｌ  ＭＭＡＦ  ＤＡＲ２  ＡＤＣの保持時間。ＡＢＡ−ＭＭＡＦは、示したＨＣ又はＬＣ残基を置換したＰｃｌ残基において付着している。Ａ）ＨＣをコンジュゲートさせたＡＤＣ。Ｂ）ＬＣをコンジュゲートさせたＡＤＣ。非コンジュゲート化野生型抗体の保持時間を示す（ＷＴ）。
【図２３Ｂ】疎水性相互作用クロマトグラフィーにより測定した場合の、トラスツズマブＰｃｌ  ＭＭＡＦ  ＤＡＲ２  ＡＤＣの保持時間。ＡＢＡ−ＭＭＡＦは、示したＨＣ又はＬＣ残基を置換したＰｃｌ残基において付着している。Ａ）ＨＣをコンジュゲートさせたＡＤＣ。Ｂ）ＬＣをコンジュゲートさせたＡＤＣ。非コンジュゲート化野生型抗体の保持時間を示す（ＷＴ）。
【図２４Ａ】カッパ軽鎖を含むヒトＩｇＧ１の構造において選択したペイロード部位の位置。選択した残基を、２つの重鎖の一方のみにおいて、及び、２つのカッパ軽鎖（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）の一方について黒色で示す。ＰｙＭＯＬ、オープンソース分子モデリングパッケージ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．０．Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ＬＬＣ）を使用して、構造の３つの回転を示す。
【図２４Ｂ】カッパ軽鎖を含むヒトＩｇＧ１の構造において選択したペイロード部位の位置。選択した残基を、２つの重鎖の一方のみにおいて、及び、２つのカッパ軽鎖（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）の一方について黒色で示す。ＰｙＭＯＬ、オープンソース分子モデリングパッケージ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．０．Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ＬＬＣ）を使用して、構造の３つの回転を示す。
【図２４Ｃ】カッパ軽鎖を含むヒトＩｇＧ１の構造において選択したペイロード部位の位置。選択した残基を、２つの重鎖の一方のみにおいて、及び、２つのカッパ軽鎖（１ＨＺＨ．ｐｄｂ）の一方について黒色で示す。ＰｙＭＯＬ、オープンソース分子モデリングパッケージ（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５．０．Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ．ＬＬＣ）を使用して、構造の３つの回転を示す。
【図２５Ａ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｂ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｃ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｄ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｅ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｆ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｇ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｈ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｉ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｊ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｋ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【図２５Ｌ】２、３又は４つのＣｙｓ変異を含む抗体により調製した、４、６及び８のＤＡＲを有する、トラスツズマブ及び抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験。ＤＡＲが４のトラスツズマブＡＤＣ：ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ａ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｂ）、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｃ）、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｄ）、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｅ）、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ−ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｅ１５２Ｃ−ＬＣ−Ｓ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｇ）；ＤＡＲが４の抗体１４０９０  ＡＤＣ：ＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ａ１４３Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｈ）、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｉ）及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｖ１５９Ｃ−ＭＭＡＦ（Ｊ）；Ｋ．ＤＡＲが６のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ；Ｌ．ＤＡＲが８のトラスツズマブＡＤＣ  ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｋ３６０Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃ−Ｓ３７５Ｃ−Ｋ３９２Ｃ−ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ−ＭＭＡＦ。抗体１４０９０は、マウス交差反応性であるため、マウス抗原に結合しないトラスツズマブＡＤＣより急速に排出される。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
本発明は、親抗体又は抗体フラグメントの特定位置における１つ又はそれ以上のアミノ酸を、システインアミノ酸（「Ｃｙｓ」）により置き換えることにより、抗体又は抗体フラグメントを部位特異的に標識する方法を提供する。これにより、操作された抗体又は抗体フラグメントは、種々の作用剤（例えば、細胞傷害剤）にコンジュゲート可能である。本発明は、本願明細書に記載された方法を使用することにより産生されたイムノコンジュゲートも提供する。
【０１０４】
システインが親抗体又は抗体フラグメント内に操作された場合、修飾抗体又は抗体フラグメントを、まず、ジスルフィド結合を介して操作された(１又は複数の)システイン部位に付着しているシステイン又はグルタチオン（ＧＳＨ）と共に発現培地から回収する（Chen et al., (2009) mAbs 16, 353-571）。ついで、前記付着しているシステイン又はＧＳＨを、還元工程において除去する。前記還元工程は、前記親抗体又は抗体フラグメントの全ての天然鎖間ジスルフィド結合も還元する。第２工程において、これらのジスルフィド結合を、コンジュゲート化が生じる前に再酸化する。本開示は、システインが特定部位に操作された場合、不正確なジスルフィド結合が形成される可能性があるために、前記再酸化工程は十分進行しないことを示す。したがって、本発明は、抗体重鎖定常領域及び抗体軽鎖定常領域のそれぞれに固有の部位セットを提供し、この場合、本願明細書に記載されたＣｙｓ置換により、前記再酸化工程において良好に作用し、また、安定した良好な挙動を示すイムノコンジュゲートも産生する、修飾抗体又は抗体フラグメントが生じる。
【０１０５】
本発明に基づく部位特異的抗体標識は、各種の化学的アクセシブル標識試薬、例えば、抗ガン剤、蛍光体、ペプチド、糖、界面活性剤、ポリエチレングリコール、免疫賦活剤、放射性画像化プローブ、プロドラッグ及び他の分子により達成され得る。
【０１０６】
したがって、本発明は、ガン治療及び他の適用並びに画像化試薬に使用するための、定義した薬剤対抗体比を有する均一なイムノコンジュゲートを調製する方法を提供する。本発明は、それにより調製したイムノコンジュゲート及びこれらのイムノコンジュゲートを含む医薬組成物も提供する。本発明の方法は、当分野において公知の他のコンジュゲート法と組み合わせて使用され得る。
【０１０７】
以下に列記した実施形態は、本発明の特定の態様及び変形例を表す。
【化６】
0006609477.tif 000007
式中、Ａｂは、本願明細書に記載された好ましいシステイン置換部位の１つにおいて、少なくとも１つのシステイン残基を含む抗体又は抗体フラグメントを表し；ＬＵは、本願明細書に記載されたリンカーユニットであり；Ｘは、ペイロード又は薬剤部分であり；ｎは、１〜１６の整数である。これらの実施形態では、ｎは、好ましくは、約２、約４、約６又は８である。ＬＵは、典型的には、式−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６−であり、式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−及び−Ｘ２−から独立して選択され；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化７】
0006609477.tif 000008
0006609477.tif 000009
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化８】
0006609477.tif 000010
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択される。
これらの実施形態の一部では、前記イムノコンジュゲートは、式
【化９】
0006609477.tif 000011
の基を含む。
【０１０８】
式中、硫黄原子は、修飾抗体又は抗体フラグメント中のシステイン側鎖の硫黄であり、本願明細書で特定した置換部位の１つに位置している。
【０１０９】
前述の実施形態にいずれかにおいて、配列中の部位の位置が全長抗体の修飾又は短縮化により変更されている場合であっても、前記システイン置換部位は、位置番号により特定された部位の１つに対応する位置であってよい。対応する部位は、抗体又はフラグメントと全長抗体とのアライメントにより容易に特定され得る。
【０１１０】
１．部位特異的システイン操作抗体
部位特異的標識
本発明の抗体（例えば、親抗体、場合により、１つ又はそれ以上の非天然由来のアミノ酸を含む）は、ラムダ軽鎖が、Kabat et al., (1991) Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242で説明されたＫａｂａｔナンバリングシステムに基づいて番号付けされているのを除いて、Edelman et al., (1969) Proc. Natl. Acad. USA 63:78-85で説明された、ＥＵナンバリングシステムに基づいて番号付けされている。ヒトＩｇＧ１定常領域が、本出願全体を通して代表例として使用される。ただし、本発明は、ヒトＩｇＧ１に限定されず、対応するアミノ酸位置が、配列アライメントにより容易に推定され得る。例えば、図４は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖定常領域の配列アライメントを示し、これにより、前記ＩｇＧ１定常領域中で特定したＣｙｓ操作部位は、図４に示したように、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４について容易に特定され得る。軽鎖定常領域についても、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４は同様である。以下の表１は、システインにより置き換えられ得る、抗体重鎖の定常領域中のアミノ酸位置を列記する。表２は、システインにより置き換えられ得る、抗体カッパ軽鎖の定常領域中のアミノ酸位置を列記する。表３は、システインにより置き換えられ得る、抗体ラムダ軽鎖の定常領域中のアミノ酸位置を列記する。
【表１】
0006609477.tif 000012
0006609477.tif 000013
【表２】
0006609477.tif 000014
【表３】
0006609477.tif 000015
【０１１１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体の定常領域の高い配列相同性のために、本発明の知見は、任意の特定の抗体又は抗体フラグメントに限定されない。
【０１１２】
一実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、表１で特定した位置から選択されるその重鎖定常領域上の１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のアミノ酸の置換を含む、イムノコンジュゲートを提供する。具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、重鎖の１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３３４、３６０、３７５及び３９２位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含む、イムノコンジュゲートを提供する。例えば、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の１２１及び１２４、１２１及び１５２、１２１及び１７１、１２１及び１７４、１２１及び２５８、１２１及び２９２、１２１及び３３３、１２１及び３３４、１２１及び３６０、１２１及び３７５、１２１及び３９２、１２４及び１５２、１２４及び１７１、１２４及び１７４、１２４及び２５８、１２４及び２９２、１２４及び３３３、１２４及び３３４、１２４及び３６０、１２４及び３７５、１２４及び３９２、１５２及び１７１、１５２及び１７４、１５２及び２５８、１５２及び２９２、１５２及び３３３、１５２及び３３４、１５２及び３６０、１５２及び３７５、１５２及び３９２、１７１及び１７４、１７１及び２５８、１７１及び２９２、１７１及び３３３、１７１及び３６０、１７１及び３７５、１７４及び２５８、１７４及び２９２、１７４及び３３３、１７４及び３３４、１７４及び３６０、１７４及び３７５、１７４及び３９２、２５８及び２９２、２５８及び３３３、２５８及び３３４、２５８及び３６０、２５８及び３７５、２５８及び３９２、２９２及び３３３、２９２及び３３４、２９２及び３６０、２９２及び３７５、２９２及び３９２、３３３及び３３４、３３３及び３６０、３３３及び３７５、３３３及び３９２；３３４及び３６０、３３４及び３７５、３３４及び３９２、３６０及び３７５、３６０及び３９２又は３７５及び３９２位から選択されるその定常領域上の２つのアミノ酸のシステインによる置換を含む。
別の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の１２１、１２４及び１５２；１２１、１２４及び１７１；１２１、１２４及び１７４；１２１、１２４及び２５８；１２１、１２４及び２９２；１２１、１２４及び３３３；１２１、１２４及び３３４；１２１、１２４及び３６０；１２１、１２４及び３７５；１２１、１２４及び３９２；１２１、１５２及び１７１；１２１、１５２及び１７４；１２１、１５２及び２５８；１２１、１５２及び２９２；１２１、１５２及び３３３；１２１、１５２及び３３４；１２１、１５２及び３６０；１２１、１５２及び３７５；１２１、１５２及び３９２；１２１、１７１及び１７４；１２１、１７１及び２５８；１２１、１７１及び２９２；１２１、１７１及び３３３；１２１、１７１及び３３４；１２１、１７１及び３６０；１２１、１７１及び３７５；１２１、１７１及び３９２；１２１、１７４及び２５８、１２１、１７４及び２９２；１２１、１７４及び３３３；１２１、１７４及び３３４；１２１、１７４及び３６０；１２１、１７４及び３７５；１２１、１７４及び３９２；１２１、２５８及び２９２；１２１、２５８及び３３３；１２１、２５８及び３３４；１２１、２５８及び３６０；１２１、２５８及び３７５；１２１、２５８及び３９２；１２１、２９２及び３３３；１２１、２９２及び３３４；１２１、２９２及び３６０；１２１、２９２及び３７５；１２１、２９２及び３９２；１２１、３３３及び３３４；１２１、３３３及び３６０；１２１、３３３及び３７５；１２１、３３３及び３９２；１２１、３３４及び３６０；１２１、３３４及び３７５；１２１、３３４及び３９２；１２１、３６０及び３７５；１２１、３６０及び３９２；１２１、３７５及び３９２；１２４、１５２及び１７１；１２４、１５２及び１７４；１２４、１５２及び２５８；１２４、１５２及び２９２；１２４、１５２及び３３３；１２４、１５２及び３３４；１２４、１５２及び３６０；１２４、１５２及び３７５；１２４、１５２及び３９２；１２４、１７１及び１７４；１２４、１７１及び２５８；１２４、１７１及び２９２；１２４、１７１及び３３３；１２４、１７１及び３３４；１２４、１７１及び３６０；１２４、１７１及び３７５；１２４、１７１及び３９２；１２４、１７４及び２５８；１２４、１７４及び２９２；１２４、１７４及び３３３；１２４、１７４及び３３４；１２４、１７４及び３６０；１２４、１７４及び３７５；１２４、１７４及び３９２；１２４、２５８及び２９２；１２４、２５８及び３３３；１２４、２５８及び３３４；１２４、２５８及び３６０；１２４、２５８及び３７５；１２４、２５８及び３９２；１２４、２９２及び３３３；１２４、２９２及び３３４；１２４、２９２及び３６０；１２４、２９２及び３７５；１２４、２９２及び３９２；１２４、３３３及び３６０；１２４、３３３及び３３４；１２４、３３３及び３７５；１２４、３３３及び３９２；１２４、３３４及び３６０；１２４、３３４及び３７５；１２４、３３４及び３９２；１２４、３６０及び３７５；１２４、３６０及び３９２；１２４、３７５及び３９２；１５２、１７１及び１７４；１５２、１７１及び２５８；１５２、１７１及び２９２；１５２、１７１及び３３３；１５２、１７１及び３３４；１５２、１７１及び３６０；１５２、１７１及び３７５；１５２、１７１及び３９２；１５２、１７４及び２５８；１５２、１７４及び２９２；１５２、１７４及び３３３；１５２、１７４及び３３４；１５２、１７４及び３６０；１５２、１７４及び３７５；１５２、１７４及び３９２；１５２、２５８及び２９２；１５２、２５８及び３３３；１５２、２５８及び３３４；１５２、２５８及び３６０；１５２、２５８及び３７５；１５２、２５８及び３９２；１５２、２９２及び３３３；１５２、２９２及び３３４；１５２、２９２及び３６０；１５２、２９２及び３７５；１５２、２９２及び３９２；１５２、３３３及び３３４；１５２、３３３及び３６０；１５２、３３３及び３７５；１５２、３３３及び３９２；１５２、３３４及び３６０；１５２、３３４及び３７５；１５２、３３４及び３９２；１５２、３６０及び３７５；１５２、３６０及び３９２；１５２、３７５及び３９２；１７１、１７４及び２５８；１７１、１７４及び２９２；１７１、１７４及び３３３；１７１、１７４及び３３４；１７１、１７４及び３６０；１７１、１７４及び３７５；１７１、１７４及び３９２；１７１、２５８及び２９２；１７１、２５８及び２９２；１７１、２５８及び３３３；１７１、２５８及び３３４；１７１、２５８及び３６０；１７１、２５８及び３７５；１７１、２５８及び３９２；１７１、２９２及び３３３；１７１、２９２及び３３４；１７１、２９２及び３６０；１７１、２９２及び３７５；１７１、２９２及び３９２；１７１、３３３及び３３４；１７１、３３３及び３６０；１７１、３３３及び３７５；１７１、３３３及び３９２；１７１、３３４及び３６０；１７１、３３４及び３９２；１７１、３６０及び３７５；１７１、３６０及び３９２；１７１、３７５及び３９２；１７４、２５８及び２９２；１７４、２５８及び３３３；１７４、２５８及び３３４；１７４、２５８及び３６０；１７４、２５８及び３７５；１７４、２５８及び３９２；１７４、２９２及び３３３；１７４、２９２及び３３４；１７４、２９２及び３６０；１７４、２９２及び３７５；１７４、２９２及び３９２；１７４、３３３及び３３４；１７４、３３３及び３６０；１７４、３３３及び３７５；１７４、３３３及び３９２；１７４、３３４及び３６０；１７４、３３４及び３７５；１７４、３３４及び３９２；１７４、３６０及び３７５；１７４、３６０及び３９２；１７４、３７５及び３９２；２５８、２９２及び３３３；２５８、２９２及び３３４；２５８、２９２及び３６０；２５８、２９２及び３７５；２５８、２９２及び３９２；２５８、３３３及び３６０；２５８、３３３及び３７５；２５８、３３３及び３９２；２５８、３３４及び３６０；２５８、３３４及び３７５；２５８、３３４及び３９２；２５８、３６０及び３７５；２５８、３６０及び３９２；２５８、３７５及び３９２；２９２、３３３及び３３４；２９２、３３３及び３６０；２９２、３３３及び３７５；２９２、３３３及び３９２；２９２、３３４及び３６０；２９２、３３４及び３７５；２９２、３３４及び３９２；２９２、３６０及び３７５；２９２、３６０及び３９２；２９２、３７５及び３９２；３３３、３３４及び３６０；３３３、３３４及び３７５；３３３、３３４及び３９２；３３３、３６０及び３７５、３３３、３６０及び３９２；３３３、３７５及び３９２；３３４、３６０及び３７５；３３４、３６０及び３９２；又は３６０、３７５及び３９２位から選択されるその定常領域上の３つのアミノ酸のシステインによる置換を含む。
【０１１３】
一実施形態において、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の１５２、３３３、３７５及び３９２又は１５２、３３４、３７５及び３９２位から選択されるその定常領域上の４つのアミノ酸のシステインによる置換を含む。
【０１１４】
具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号２、３、９、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２５、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３４、３６、３８、３９、４０、４３、４４、４５、４６、４７、５１、５３、５４、５６、５７又は６０を含む、イムノコンジュゲートを提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号６、７、８、１５、１９、２０、２２、２３、２４、２７、３６、３７、４１、４９、５２、５５、５８又は５９を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、表２で特定した位置から選択されるその軽鎖定常領域上の１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のアミノ酸の置換を含む、イムノコンジュゲートを提供する。具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、軽鎖の１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、イムノコンジュゲートを提供する。例えば、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、軽鎖の１０７及び１０８；１０７及び１４２；１０７及び１４５；１０７及び１５９；１０７及び１６１；１０７及び１６５；１０８及び１４２；１０８及び１４５；１０８及び１５９；１０８及び１６１；１０８及び１６５；１４２及び１４５；１４２及び１５９；１４２及び１６１；１４２及び１６５；１４５及び１５９；１４５及び１６１；１４５及び１６５；１５９及び１６１；１５９及び１６５；１６１及び１６５位から選択されるその定常領域上の２つのアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。別の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、軽鎖の１０７、１０８及び１４２；１０７、１０８及び１４５；１０７、１０８及び１５９；１０７、１０８及び１６１；１０７、１０８及び１６５；１０７、１４２及び１４５；１０７、１４２及び１５９；１０７、１４２及び１６１；１０７、１４２及び１６５；１０７、１４５及び１５９；１０７、１４５及び１６１；１０７、１４５及び１６５；１０７、１５９及び１６１；１０７、１５９及び１６５；１０７、１６１及び１６５；１０８、１４２及び１４５；１０８、１４２及び１５９；１０８、１４２及び１６１；１０８、１４２及び１６５；１０８、１４５及び１５９；１０８、１４５及び１６１；１０８、１４５及び１６５；１０８、１５９及び１６１；１０８、１５９及び１６５；１０８、１６１及び１６５；１４２、１４５及び１５９；１４２、１４５及び１６１；１４２、１４５及び１６５；１４２、１５９及び１６１；１４２、１５９及び１６５；１４２、１６１及び１６５；１４５、１５９及び１６１；１４５、１５９及び１６５；１４５、１６１及び１６５；又は１５９、１６１及び１６５位から選択されるその定常領域上の３つのアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖である。
【０１１６】
具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号６３、６５、６８、７０、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８６、８７又は８８を含む、イムノコンジュゲートを提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号６４、６６、６７、８４、８５又は８９、６３、６４、６５、６６、６７、６８、７０、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８又は８９を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、表３で特定した位置から選択されるその軽鎖定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換を含む、イムノコンジュゲートを提供する。具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、軽鎖の１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択されるその定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記軽鎖位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲートを提供する。例えば、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、軽鎖の１４３及び１４７；１４３及び１５９；１４３及び１６３；１４３及び１６８；１４７及び１５９；１４７及び１６３；１４７及び１６８；１５９及び１６３；１５９及び１６８；又は１６３及び１６８位から選択されるその定常領域上の２つのアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記軽鎖位置は、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である。別の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントは、軽鎖の１４３、１４７及び１５９；１４３、１４７及び１６３；１４３、１４７及び１６８；１４３、１５９及び１６３；１４３、１５９及び１６８；１４３、１６３及び１６８；１４７、１５９及び１６３；１４７、１５９及び１６８；１４７、１６３及び１６８；又は１５９、１６３及び１６８位から選択されるその定常領域上の３つのアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記軽鎖位置は、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である。
【０１１８】
一実施形態において、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号９２、９４、９６、９７又は９８を含む、イムノコンジュゲートを提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、配列番号９３又は９５を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
【０１１９】
一実施形態において、前記イムノコンジュゲートは、約２又は約４のＤＡＲを有し得る。一実施形態において、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、表１で特定した位置から選択されるその重鎖定常領域上の１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のアミノ酸のＣｙｓ置換、及び、表２又は３で特定した位置から選択されるその軽鎖定常領域上の１つ又はそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のアミノ酸のＣｙｓ置換を含む、イムノコンジュゲートを提供する。一実施形態では、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３３４、３６０、３７５及び３９２位から選択されるその重鎖定常領域中の１つ又はそれ以上のアミノ酸のＣｙｓ置換、並びに、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択されるその軽鎖定常領域中の１つ又はそれ以上のアミノ酸のＣｙｓ置換を含み、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、イムノコンジュゲートを提供する。一実施形態において、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１０８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４２位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１４５位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６１位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換を含んでもよい。一実施形態において、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の３７５位及び３９２位におけるＣｙｓ置換並びにヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換を含む。一実施形態において、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の３３４位及び３７５位におけるＣｙｓ置換並びにヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換を含んでもよい。別の例では、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の３３４位及び３９２位におけるＣｙｓ置換並びにヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換を含んでもよい。一実施形態において、それらの組み合わせのイムノコンジュゲートは、約４又は約６のＤＡＲを有し得る。
【０１２０】
一実施形態において、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の３３４位、３７５位及び３９２位におけるＣｙｓ置換並びにヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換を含んでもよい。一実施形態において、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の３３３位、３７５位及び３９２位におけるＣｙｓ置換並びにヒトカッパ軽鎖の１６５位におけるＣｙｓ置換を含んでもよい。一実施形態において、それらの組み合わせは、約４、６又は８のＤＡＲを有し得る。
【０１２１】
一実施形態において、本発明は、修飾抗体又はその抗体フラグメントと、薬剤部分とを含み、前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３３４、３６０、３７５及び３９２位から選択されるその重鎖定常領域中の１つ又はそれ以上のアミノ酸のＣｙｓ置換；及び１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択されるその軽鎖定常領域中の１つ又はそれ以上のアミノ酸のＣｙｓ置換を含み、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲートを提供する。例えば、本発明に基づく修飾抗体又は抗体フラグメントは、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１２４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１５２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７１位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の１７４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２５８位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の２９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３３位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３３４位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３６０位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３７５位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１４７位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１５９位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６３位におけるＣｙｓ置換；又は、重鎖の３９２位におけるＣｙｓ置換及びヒトラムダ軽鎖の１６８位におけるＣｙｓ置換を含んでもよい。
【０１２２】
本発明の一実施形態において、本願明細書に記載されたアミノ酸置換は、チオール基を含むシステインである。本発明の一部の態様では、チオール基は、化学的コンジュゲートに使用され、リンカーユニット（ＬＵ）及び／又は薬剤部分に付着する。一部の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、プロテインＣＲＭ１の核外移行の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ副溝結合剤及びＤＨＦＲ阻害剤からなる群から選択される薬剤部分を含む。一部の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、抗ガン剤である薬剤部分を含む。本発明の修飾抗体又は抗体フラグメントは、当分野において公知の任意の様式、例えば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、完全ヒト、二重特異的又は多重特異的な抗体又はその抗体フラグメントであり得る。
【０１２３】
本発明によると、修飾抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖（又はその抗体フラグメント）は、１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のシステイン置換を、その定常領域中に含んでもよい。一実施形態では、修飾抗体又は抗体フラグメントは、２、４、６、８個以上のシステイン置換を、その定常領域中に含む。一部の実施形態では、修飾抗体、抗体フラグメント又はそのイムノコンジュゲートは、２又は４個のＣｙｓ置換を含む。
【０１２４】
一実施形態では、親抗体（システイン置換を含まない抗体）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＡの抗体である。具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ１の抗体である。別の具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の抗体である。
【０１２５】
本発明は、表１で特定した位置から選択されるその重鎖定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換を含む、修飾抗体又はその抗体フラグメントも提供する。一部の実施形態では、本発明は、表２又は３で特定した位置から選択されるその軽鎖定常領域上の１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換を含む、修飾抗体又はその抗体フラグメントを提供する。
【０１２６】
特定の実施形態では、本願明細書に提供された修飾抗体又は抗体フラグメントは、本発明の方法を当分野において公知の他のコンジュゲート法との組み合わせで使用して標識される。公知の他のコンジュゲート法としては、限定されるものではないが、リジン、ヒスチジン、チロシン、ホルミル−グリシン、ピロリジン、ピロリン−カルボキシ−リジン、非天然アミノ酸及び酵素媒介性コンジュゲート用のタンパク質タグ（例えば、Ｓ６タグ）による化学選択コンジュゲートがあげられる。
【０１２７】
２．コンジュゲート化学
本願明細書に提供されたコンジュゲート化抗体又はその抗体フラグメントは、上述したように、部位特異的標識法により、抗体又はその抗体フラグメント内に組み込まれた、少なくとも１つのシステイン残基の翻訳後修飾により産生される。コンジュゲート化抗体又は抗体フラグメントは、タンパク質中に天然に存在するシステイン残基に対して所望のペイロードをコンジュゲートさせるための、当分野において公知の方法により、及び、天然タンパク質配列の別のアミノ酸に対して置換された更なるシステイン残基を含むように操作されたタンパク質に対するコンジュゲートのために記載された方法により、調製され得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、本願明細書に提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントは、組み込まれたシステイン（ｃｙｓ）が、以下のスキームＩａのように、マレイミド誘導体にコンジュゲートされる、公知の方法を使用してコンジュゲートされる。この種のコンジュゲート化を経る本発明の修飾抗体は、チオール−マレイミド結合を含む。
スキームＩａ．チオール−マレイミド付加物形成を介したコンジュゲート化
【化１０】
0006609477.tif 000016
式中、ＬＵは、リンカーユニット（ＬＵ）であり、Ｘは、ペイロード又は薬剤部分である。
【０１２９】
他の実施形態では、修飾抗体又は抗体フラグメント内に組み込まれたＣｙｓは、以下のスキームＩｂに示したように、α−ハロカルボニル化合物、例えば、クロロ−、ブロモ−又はヨード−アセトアミドとの反応によりコンジュゲートされる。ハロゲン以外の他の脱離基、例えば、トシレート、トリフラート及び他のアルキル又はアリールスルホネートが、脱離基Ｙとして使用され得ることが理解される。スキームＩｂは、Ｃｙｓのチオールとα−ハロアセトアミドとの反応を示すが、前記方法は、式Ｙ−ＣＨＲ−Ｃ（＝Ｏ）−の基による、組み込まれたＣｙｓの硫黄のアルキル化を含む。式中、Ｒは、Ｈ又はＣ１−４アルキルであり、Ｙは、脱離基（典型的には、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ、及び場合により、アルキルスルホネート又はアリールスルホネート）であり、アミドに限定されない。
スキームＩｂ．α−ハロカルボニル化合物との反応を介したコンジュゲート化
【化１１】
0006609477.tif 000017
【０１３０】
あるいは、修飾抗体又は抗体フラグメント内に組み込まれたＣｙｓは、以下のスキームＩｃに示したように、外部チオールと組み込まれたＣｙｓ残基の硫黄原子との間のジスルフィド結合の形成を誘導する条件下における、外部チオールとの反応によりコンジュゲートされ得る。これらの例では、Ｒは、Ｈであり得るが、Ｒ基の一方又は両方がアルキル基、例えば、メチルを表す化合物が、ジスルフィドの安定性を向上させることが見出されている。
スキームＩｃ．ジスルフィド形成を介したコンジュゲート化
【化１２】
0006609477.tif 000018
【０１３１】
例としてのみであるが、このような翻訳後修飾は、上記スキーム（Ｉａ）〜（Ｉｃ）に示され、これらにおいて、開始構造は、本願明細書で特定した特定部位の１つにおいて、抗体の軽鎖又は重鎖内に組み込まれたシステインを表す。これらのコンジュゲート法のそれぞれを行うための方法は、当分野において周知である。抗体は、その軽鎖若しくはその重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方において、これらの方法により修飾され得る。各軽鎖又は各重鎖が修飾されて１つの組み込まれたシステインを含む抗体は、概ね、２つのコンジュゲート部位を含む。これは、抗体が、典型的に２つの軽鎖及び２つの重鎖を含むためである。
【０１３２】
コンジュゲート化すると、本発明の修飾抗体は、典型的に１〜１２個、多くの場合２〜８個、及び好ましくは２、４又は６個の−ＬＵ−Ｘ（リンカーユニット−ペイロード）部分を含む。一部の実施形態では、抗体の軽鎖又は重鎖は修飾されて、Ｃｙｓ置換について本願明細書で特定した特定部位の２つにおいて、２つの新たなＣｙｓ残基を組み込む（あるいは、１つのＣｙｓが軽鎖に組み込まれ、１つのＣｙｓが重鎖に組み込まれる。）。これにより、四量体抗体は、最終的に、４つのコンジュゲート部位を含む。同様に、抗体は、軽鎖若しくは重鎖又はその組み合わせにおける本願明細書で特定した特定部位において、３つ又は４つのその天然アミノ酸のＣｙｓによる置換により修飾されて、四量体抗体中に６又は８個のコンジュゲート部位をもたらし得る。
【０１３３】
これらのコンジュゲートにおけるＸは、ペイロードを表し、ペイロードは、抗体に付着するのに有用な任意の化学部分であり得る。一部の実施形態では、Ｘは、細胞毒、抗ガン剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、免疫賦活剤及び麻酔剤又は任意の他の治療剤から選択される薬剤部分、又は、生物学的に活性な部分若しくは薬剤部分である。他の実施形態では、Ｘは、標識、例えば、生物物理的プローブ、蛍光体、親和性プローブ、分光プローブ、放射性プローブ、スピン標識、量子ドットである。他の実施形態では、Ｘは、抗体の物理化学的性質を修飾する化学部分、例えば、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、多糖類、リポソーム又はキレート剤である。他の実施形態では、Ｘは、機能性又は検出可能な生体分子、例えば、核酸、リボ核酸、タンパク質、ぺプチド（例えば、酵素若しくは受容体）、糖若しくは多糖類、抗体若しくは抗体フラグメントである。他の実施形態では、Ｘは、アンカー部分、例えば、ナノ粒子、ＰＬＧＡ粒子若しくは表面又は、別の部分にコンジュゲートを特異的に結合させるための任意の結合部分、例えば、ヒスチジンタグ、ポリ−Ｇ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等である。他の実施形態では、Ｘは、抗体コンジュゲートを別の化学部分、例えば、薬剤部分、標識、別の抗体、別の化学部分又は表面に付着させるために使用され得る反応性官能基である。
【０１３４】
リンカーユニット（ＬＵ）は、チオール反応性基（例えば、マレイミド、α−ハロカルボニル、ビニルカルボニル（例えば、アクリレート若しくはアクリルアミド）、ビニルスルホン、ビニルピリジン又はチオール）をペイロードに共有結合的に付着させる、任意の適切な化学部分であり得る。多くの適切なＬＵが、当分野において公知である。例えば、ＬＵには、１、２、３、４、５、６個又は６個より多くのリンカーが含まれることができ、本願明細書において、リンカーは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６と呼ばれる。特定の実施形態では、ＬＵは、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカー又はそれらの任意の組み合わせから選択されるリンカーを含む。ＬＵは、場合により、自己犠牲スペーサ（self-immolative spacer）を含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＬＵは、式−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−又は−Ｌ１−Ｌ−Ｌ３−Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６−の基である。ＬＵにおいて使用するための結合基Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、アルキレン基−（ＣＨ２）ｎ−（ｎは、１〜２０、典型的には１〜１０又は１〜６である。）、エチレングリコールユニット（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎ（ｎは、１〜２０、典型的には１〜１０又は１〜６である。）アミド−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−若しくは−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、エステル−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、２つの利用可能な付着点を有する環、例えば、二価のフェニル、Ｃ３−８シクロアルキル若しくはＣ４−８ヘテロシクリル基、アミノ酸−ＮＨ−ＣＨＲ＊−Ｃ＝Ｏ−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨＲ＊−ＮＨ−（Ｒ＊は、公知のアミノ酸（多くの場合、天然由来のアミノ酸の１つであるが、例えば、ノルバリン、ノルロイシン、ホモセリン、ホモシステイン、フェニルグリシン、シトルリン及び他の名称のα−アミノ酸も含む）の側鎖）、公知のアミノ酸のポリペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等）、チオール−マレイミド結合（マレイミドへの−ＳＨの付加に由来）、−Ｓ−ＣＲ２−及び他のチオールエーテル、例えば、−Ｓ−ＣＲ２−Ｃ（＝Ｏ）−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＲ２−Ｓ−（Ｒは、スキームＩｃについて上記で定義した通りである。）−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−及びジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）並びに、これらのいずれかと以下に記載される他のリンカー、例えば、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーとの組み合わせを含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＬＵが−Ｌ１−Ｌ−Ｌ３−Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６−である場合、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−及び−Ｘ２−から選択されることができ；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化１３】
0006609477.tif 000019
0006609477.tif 000020
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化１４】
0006609477.tif 000021
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択される。
【０１３７】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも１つは、安定性又は非開裂性リンカーである。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも１つは、開裂性リンカーであり、開裂性リンカーは、化学開裂性（ヒドラゾン、ジスルフィド）でもよいし、又は、酵素開裂性でもよい。一部の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、ペプチダーゼにより容易に開裂するものである。２つの公知のアミノ酸のジペプチドであるＶａｌ−Ｃｉｔリンカー（バリン−シトルリン）は、このようなリンカーの１つである。他の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、グルクロニダーゼの活性により誘導されるものである。
【化１５】
0006609477.tif 000022
は、このようなリンカーの例である。前記リンカーは、生理学的条件下において、グルクロニダーゼがグリコシド結合を開裂させると自然に分解する自己犠牲スペーサも含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、式ＩＩＡ又はＩＩＢの修飾システイン残基を含む。
【化１６】
0006609477.tif 000023
式中、−ＣＨ２−Ｓ−は、本願明細書に記載された、選択されたＣｙｓ置換部位の１つに組み込まれたＣｙｓの側鎖を表し、Ｌ２−Ｌ６及びＸは、本願明細書においてさらに記載される、結合基及びペイロードそれぞれを表す。ＩＩＡの一部の実施形態では、Ｌ２は、結合である。ＩＩＢの一部の実施形態では、Ｌ２は、ＮＨ又はＯである。ＩＩＡ及びＩＩＢ両方の一部の実施形態では、Ｌ３は、（ＣＨ２）１−１０及び（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−６から選択される。Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、本願明細書に記載されたものから選択される、更なる任意のリンカーである。特定の実施形態では、Ｌ６は、カルボニル（Ｃ＝Ｏ）又は自己犠牲スペーサを含むリンカーであり得る。
【０１３９】
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；及び、
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーである。
【０１４０】
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；及び、
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーである。
【０１４１】
ＬＵの一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも１つは、開裂性リンカーであり、ＬＵは、開裂性であると考えられる。同様に、ＬＵの一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも１つは、非開裂性リンカーである。これらの実施形態のうち、特定の実施形態では、ＬＵの各リンカーは非開裂性であり、ＬＵは、非開裂性であると考えられる。
【０１４２】
前述の実施形態のうち、ＬＵが−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−である一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４の少なくとも１つは、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−及び−Ｘ２−から選択されるリンカーであり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化１７】
0006609477.tif 000024
0006609477.tif 000025
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化１８】
0006609477.tif 000026
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択される。
【０１４３】
これらの実施形態では、ＬＵの他のリンカーは、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−、−Ｘ２−、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー及び自己犠牲スペーサを含むリンカーから独立して選択される。
【０１４４】
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化１９】
0006609477.tif 000027
0006609477.tif 000028
0006609477.tif 000029
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化２０】
0006609477.tif 000030
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；並びに、
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーである。
特定の実施形態では、Ｌ１はＣ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−であり、このため、ＬＵは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−である。
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化２１】
0006609477.tif 000031
0006609477.tif 000032
0006609477.tif 000033
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化２２】
0006609477.tif 000034
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；並びに、
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーである。
【０１４５】
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化２３】
0006609477.tif 000035
0006609477.tif 000036
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化２４】
0006609477.tif 000037
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー又は光開裂性リンカーであり；並びに、
Ｌ４は、結合、非酵素開裂性リンカー、非開裂性リンカー、酵素開裂性リンカー、光安定性リンカー、光開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーである。
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化２５】
0006609477.tif 000038
0006609477.tif 000039
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化２６】
0006609477.tif 000040
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され；
Ｌ２は、結合、非酵素開裂性リンカー又は非開裂性リンカーであり；
Ｌ３は、結合、非酵素開裂性リンカー又は非開裂性リンカーであり；
Ｌ４は、結合、酵素開裂性リンカー又は自己犠牲スペーサを含むリンカーである。
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ｌ２は、結合、−Ａ２−又は−Ａ２Ｘ２−であり；
Ｌ３は、結合、−Ａ３−又は−Ａ３Ｘ２−であり；
Ｌ４は、結合、−Ａ４、−Ａ４Ｘ２−、
【化２７】
0006609477.tif 000041
0006609477.tif 000042
であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
Ａ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＲ４−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、
【化２８】
0006609477.tif 000043
であり、
Ａ３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、
【化２９】
0006609477.tif 000044
であり：
Ａ４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍＣ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ４）２）ｎＯ）ｍ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ４）２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化３０】
0006609477.tif 000045
0006609477.tif 000046
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化３１】
0006609477.tif 000047
から独立して選択され；
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択される。
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ｌ２は、結合、−Ａ２−又は−Ａ２Ｘ２−であり；
Ｌ３は、結合、−Ａ３−又は−Ａ３Ｘ２−であり；
Ｌ４は、結合、−Ａ４、−Ａ４Ｘ２−、
【化３２】
0006609477.tif 000048
であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ａ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は
【化３３】
0006609477.tif 000049
であり；
Ａ３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は
【化３４】
0006609477.tif 000050
であり；
Ａ４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、
【化３５】
0006609477.tif 000051
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択される。
特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、
Ｌ１は、結合、−Ａ１−、−Ａ１Ｘ２−又は−Ｘ２−であり；
Ｌ２は、結合、−Ａ２−又は−Ａ２Ｘ２−であり；
Ｌ３は、結合、−Ａ３−又は−Ａ３Ｘ２−であり；
Ｌ４は、結合、−Ａ４、−Ａ４Ｘ２−、
【化３６】
0006609477.tif 000052
であり；
Ａ１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ａ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は
【化３７】
0006609477.tif 000053
であり；
Ａ３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−又は
【化３８】
0006609477.tif 000054
であり；
Ａ４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍ−、−（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍ（ＣＨ２）ｎ−又は、（Ｏ（ＣＨ２）ｎ）ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−であり；
各Ｘ２は、結合、Ｒ８、
【化３９】
0006609477.tif 000055
0006609477.tif 000056
0006609477.tif 000057
−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ４（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から独立して選択され；
各Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、公知のアミノ酸の側鎖、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ及び−ＯＨから独立して選択され、
各Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル又は１〜３個の−ＯＨ基により置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
各Ｒ６は、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルコキシ及び−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨにより置換されているＣ１−４アルキルから独立して選択され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、ピリミジン及びピリジンから独立して選択され；
Ｒ８は、
【化４０】
0006609477.tif 000058
から独立して選択され、
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−６ハロアルキルから独立して選択され；
各ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択され、並びに、
各ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８及び９から独立して選択される。
【０１４６】
一実施形態では、Ｌ１は、−（ＣＨ２）１−１０−Ｃ（＝Ｏ）−、例えば、−（ＣＨ２）５−Ｃ（＝Ｏ）−であり；Ｌ２、Ｌ３及びＬ４はそれぞれ、結合を表す。
【０１４７】
特定の実施形態では、ＬＵは、この式のｖａｌ−ｃｉｔリンカーを含み、式中、Ｘは、ペイロード、典型的には、薬剤部分、例えば、抗ガン活性を有するものを表す。
【化４１】
0006609477.tif 000059
Ｌ４−Ｌ５−Ｌ６が上記に示したｖａｌ−ｃｉｔリンカーである場合、Ｌ３は、好ましくは、−（ＣＨ２）２−６−Ｃ（＝Ｏ）−である。
【０１４８】
特定の実施形態では、Ｘ基は、メイスタノイド、例えば、ＤＭ１若しくはＤＭ４、又は、ドラスタチン類似体若しくは誘導体、例えば、ドラスタチン１０若しくは１５及びオーリスタチンＭＭＡＦ若しくはＭＭＡＥ、又は、カリチアマイシン、例えば、Ｎ−アセチル−γ−カリチアマイシン、又は、標識若しくは染料、例えば、ローダミン若しくはテトラメチルローダミンである。
【０１４９】
本願明細書で使用する場合、「リンカー」は、抗体又は抗体フラグメントをＸ基（ペイロード）に結合させて、イムノコンジュゲートを形成可能な任意の化学部分である。リンカーは、化合物又は抗体が活性なままである条件下において、開裂、例えば、酸誘導性開裂、光誘導性開裂、ペプチダーゼ誘導性開裂、エステラーゼ誘導性開裂及びジスルフィド結合開裂に感受性であり得る。あるいは、リンカーは、開裂に対して実質的に抵抗性であり得る。リンカーは、自己犠牲スペーサを含んでもよいし、又は、含まなくてもよい。
【０１５０】
本願明細書において、本願明細書に提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントにＸ１基をコンジュゲートさせるために使用される、非酵素開裂性リンカーの非限定的な例としては、酸不安定性リンカー、ジスルフィド部分を含むリンカー、トリアゾール部分を含むリンカー、ヒドラゾン部分を含むリンカー、チオエーテル部分を含むリンカー、ジアゾ部分を含むリンカー、オキシム部分を含むリンカー、アミド部分を含むリンカー及びアセトアミド部分を含むリンカーがあげられる。
【０１５１】
本願明細書において、本願明細書に提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントにＸ基をコンジュゲートさせるために使用される、酵素開裂性リンカーの非限定的な例としては、限定されるものではないが、プロテアーゼにより開裂されるリンカー、アミダーゼにより開裂されるリンカー及び  −グルクロニダーゼ又は別のグルコシダーゼにより開裂されるリンカーがあげられる。
【０１５２】
特定の実施形態では、このような酵素開裂性リンカーは、カテプシン、例えば、カテプシンＺ、カテプシンＢ、カテプシンＨ及びカテプシンＣにより開裂されるリンカーである。特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、カテプシンにより開裂されるジペプチド、例えば、カテプシンＺ、カテプシンＢ、カテプシンＨ又はカテプシンＣにより開裂されるジペプチドである。特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、カテプシンＢ開裂性ペプチドリンカーである。特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーは、カテプシンＢ開裂性ジペプチドリンカーである。特定の実施形態では、酵素開裂性ジペプチドリンカーは、バリン−シトルリン又はフェニルアラニン−リジンである。本願明細書において、本願明細書に提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントにＸ基をコンジュゲートさせるために使用される、酵素開裂性リンカーの他の非限定的な例としては、限定されるものではないが、  −グルクロニダーゼより開裂されるリンカー、例えば、
【化４２】
0006609477.tif 000060
があげられる。Ducry et al, Bioconjugate Chem, (2010) vol. 21(1), 5-13を参照のこと。
【０１５３】
「自己犠牲スペーサ」は、一方の末端において第１化学部分に共有結合しており、他方の末端において第２化学部分に共有結合していることにより、安定した３つの部分に分かれた分子を形成する、二官能性の化学部分である。リンカーは、スペーサから化学的又は酵素的に開裂性である、第３化学部分に結合している自己犠牲スペーサを含み得る。自己犠牲スペーサと第１化学部分又は第３化学部分との間の結合が開裂されると、自己犠牲スペーサは、急速かつ同時の分子内反応を経て、これにより、第２化学部分から分離する。これらの分子内反応は、一般的には、電子転位、例えば、１，４若しくは１，６若しくは１，８脱離反応又は環化を含み、非常に好ましい５又は６員環を形成する。本発明の特定の実施形態では、第１又は第３部分は、酵素開裂性基であり、この開裂は、酵素反応に起因する。一方、他の実施形態では、第１又は第３部分は、酸不安定性基であり、この開裂は、ｐＨの変化により生じる。本発明に適用した場合、第２部分は、本願明細書で定義した「ペイロード」基である。特定の実施形態では、自己犠牲スペーサからの第１又は第３部分の開裂は、タンパク質分解酵素による開裂に起因する。一方、他の実施形態では、これは、加水分解酵素による開裂に起因する。特定の実施形態では、自己犠牲スペーサからの第１又は第３部分の開裂は、カテプシン酵素又はグルクロニダーゼによる開裂に起因する。
【０１５４】
特定の実施形態では、酵素開裂性リンカーはペプチドリンカーであり、自己犠牲スペーサがその端部の一方においてペプチドリンカーに共有結合しており、その他端において薬剤部分に共有結合している。この３つの部分に分かれた分子は、酵素が存在しない状態で、安定しており、薬理学的に不活性であるが、スペーサ部分及びペプチド部分を共有結合している結合において、酵素により酵素開裂性である。ペプチド部分は、３つの部分に分かれた分子から開裂され、これが、スペーサ部分の自己犠牲特性を開始して、スペーサ部分を薬剤部分に共有結合させている結合の自然開裂をもたらし、よって、薬理学的に活性な形態での薬剤の放出を引き起こす。
【０１５５】
他の実施形態では、リンカーは、一端において直接又は間接のいずれかでペプチドに結合し、他端においてペイロードに結合する自己犠牲スペーサを含む。スペーサは、例えば、グルクロニダーゼによりスペーサから酵素的に開裂され得る第３部分に付着している。第３部分が開裂されると、スペーサは、ペイロードの放出を引き起こす方法で、分解又は転位する。この種の自己犠牲スペーサを有するリンカーの例は、このグルクロニダーゼ開裂性リンカーであり、この場合、グルクロニダーゼにより触媒されるアセタールの加水分解により、生理学的条件下において自然に分解する、フェノール性化合物が放出される。
【化４３】
0006609477.tif 000061
【０１５６】
本願明細書に提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントにＸ１基をコンジュゲートさせるのに場合により使用される、自己犠牲スペーサの非限定的な例としては、限定されるものではないが、ベンジルカルボニル部分、ベンジルエーテル部分、４−アミノブチレート部分、ヘミチオアミナール部分又はＮ−アシルヘミチオアミナール部分を含む部分があげられる。
【０１５７】
自己犠牲スペーサの他の例としては、限定されるものではないが、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基と電子的に類似する芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体及びオルト若しくはパラ−アミノベンジルアセタールがあげられる。特定の実施形態では、アミド結合の加水分解の際に環化される、本願明細書において使用される自己犠牲スペーサとしては、置換及び非置換の４−アミノ酪酸アミド及び２−アミノフェニルプロピオン酸アミドがあげられる。
【０１５８】
特定の実施形態では、自己犠牲スペーサは、
【化４４】
0006609477.tif 000062
であり、一方、他の実施形態では、自己犠牲スペーサは、
【化４５】
0006609477.tif 000063
であり、ｎは、１又は２である。他の実施形態では、自己犠牲スペーサは、
【化４６】
0006609477.tif 000064
であり、ｎは、１又は２である。他の実施形態では、自己犠牲スペーサは、
【化４７】
0006609477.tif 000065
であり、ｎは、１又は２である。他の実施形態では、自己犠牲スペーサは、
【化４８】
0006609477.tif 000066
であり、ｎは、１又は２である。他の実施形態では、自己犠牲スペーサは、
【化４９】
0006609477.tif 000067
であり、ｎは、１又は２である。
【０１５９】
スキーム（２ａ〜２ｃ）は、本願明細書に提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントの翻訳後修飾を説明する。リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−であり、Ｌ１は、各場合において、新たなＣｙｓと反応する基である。
スキーム２ａ．
【化５０】
0006609477.tif 000068
スキーム２ｂ．
【化５１】
0006609477.tif 000069
スキーム３ｃ
【化５２】
0006609477.tif 000070
スキーム２ａ〜２ｃのそれぞれにおいて、出発物質は、本願明細書に記載された修飾抗体又は修飾抗体フラグメント中の置換Ｃｙｓ残基であり、ここにおいて、破線による結合は、抗体又は抗体フラグメントの隣の残基への結合を示し；各Ｒは、Ｈ又はＣ１−４アルキル、典型的には、Ｈ又はメチルであり；Ｌ２、Ｌ３又はＬ４は、リンカーユニットＬＵの成分、例えば、上記のものであり；Ｘは、ペイロードであり；及び、本発明の置換基Ｃｙｓの硫黄にＬ２を結合させる基は、Ｌ１である。
【０１６０】
本発明の一部の実施形態では、Ｘは、適切な相補性官能基との相互作用により、コンジュゲート化抗体を別の化学部分に結合させるために使用され得る反応性官能基である。表４は、Ｘを含むコンジュゲートを別の化合物に結合させるために使用され得る相補性官能基と共に、Ｘにより表され得る反応性官能基の一部の例を示す。対応する相補性官能基に結合させるＸを使用するための方法は、当分野において周知である。アジドを使用する結合は、典型的には、「クリック」又は銅を含まないクリック化学を使用して行われる。ヒドラジン、アルコキシアミン又はアシルヒドラジンによる反応は、典型的には、カルボニル官能基の１つとのシッフ塩基の形成を経由して進行する。
【表４】
0006609477.tif 000071
これらの成分を使用して構成される結合の例示となる生成物を、表５に示す。表５において、Ｙ１は、本発明の抗体を表し、Ａ１は、抗体をペイロードＸａに結合させるリンカーユニット（ＬＵ）を表し、式ＩＩ−ａ中の−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４−は、Ｘａを介してコンジュゲートした抗体に結合される分子中に存在し得るリンカーユニットを表し、Ｘ１は、ペイロードを表す。ペイロードＸａは、反応性官能基であり、式ＩＩ−ａ上のＸｂは、対応する相補性官能基であり、式ＩＩ−ａ自体は、コンジュゲート化抗体に結合している分子を表す。表５の第３列目は、ＸａとＸｂとの反応の生成物を示す。
【表５】
0006609477.tif 000072
0006609477.tif 000073
0006609477.tif 000074
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0006609477.tif 000076
【０１６１】
特定の実施形態では、本願明細書で提供された修飾抗体又はその抗体フラグメントは、約１〜１６、例えば、１〜１２又は１、２、３、４、５、６、７若しくは８の「Ｘ基対抗体」（ペイロード対抗体）比でコンジュゲートする。この場合、前記修飾抗体又はその抗体フラグメントは、本願明細書に開示された特定部位に組み込まれた、１、２、３、４、５、６、７又は８個のシステイン残基を含む。例えば、４の「Ｘ基対抗体」比は、前記抗体の重鎖内に２つのＣｙｓ残基を組み込むことにより達成され得る。前記組込みにより、各重鎖から２つで、４つのコンジュゲート部位が含まれる。このような抗体のイムノコンジュゲートは、４つ以下のペイロード基を含む。前記４つ以下のペイロード基は、同じでも又は異なってもよく、好ましくは、全て同じである。別の例では、４の「Ｘ基対抗体」比は、前記重鎖内に１つのＣｙｓ残基を組み込み、抗体の軽鎖内に第２Ｃｙｓ残基を組み込むことにより達成され得る。前記組込みにより、前記２つの重鎖中に２つ及び前記２つの軽鎖中に２つで、４つのコンジュゲート部位がもたらされる。６、８又はそれ以上の比は、前記抗体の重鎖及び軽鎖中の本発明の３若しくは４つ又はそれ以上のシステイン置換の組み合わせにより達成され得る。抗体内に複数のシステイン基を置換することは、不適切なジスルフィド形成及び他の問題をもたらし得る。このため、４つより多くのペイロード基を１つの抗体分子上に負荷するために、本発明の方法は、代替的に、システインの硫黄の反応に頼らない、例えば、リジンのアシル化又はＳ６タグを介したコンジュゲート化又はＰｃｌ法と組み合わせられ得る。
【０１６２】
前記ペイロード対抗体比は、特定のコンジュゲート分子についての正確な値を有するが、その値は、典型的には、コンジュゲート化工程におけるある程度の不均一性のために、多くの場合、多くの分子を含むサンプルを説明するために使用される平均値であることが理解される。本願明細書において、イムノコンジュゲートのサンプルについての平均負荷は、薬剤対抗体比又はＤＡＲと呼ばれる。一部の実施形態では、前記ＤＡＲは、約１〜約１６であり、典型的には、約１、２、３、４、５、６、７又は８である。一部の実施形態では、サンプルの少なくとも５０重量％が、平均比±２を有する化合物であり、好ましくは、前記サンプルの少なくとも５０％が、前記平均比±１を含むコンジュゲートである。好ましい実施形態は、ＤＡＲが約２又は約８、例えば、約２、約４、約６又は約８であるイムノコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、「約ｎ」のＤＡＲは、ＤＡＲの測定値が、（式（Ｉ）において）ｎの１０％以内であることを意味する。
【０１６３】
３．Ｆｃ領域のフレームワークの更なる変異
本発明は、部位特異的標識化イムノコンジュゲートを提供する。本発明のイムノコンジュゲートは、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対する修飾を、例えば前記抗体の特性を改善するためにさらに含む、修飾抗体又はその抗体フラグメントを含んでもよい。典型的には、このようなフレームワークの修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１つ又はそれ以上のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、前記抗体が得られる生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含む場合がある。このような残基は、前記抗体のフレームワーク配列を抗体が得られる生殖細胞系配列に対して比較することにより特定され得る。前記フレームワーク領域配列をその生殖細胞系構成に戻すために、前記体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発により、前記生殖細胞系配列に復帰変異され得る。このような「復帰変異」した抗体も、本発明に包含されると意図する。
【０１６４】
別の種類のフレームワーク修飾は、前記フレームワーク領域内又はさらに１つ又はそれ以上のＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去することにより、前記抗体の潜在的な変異原性を低下させることを含む。このアプローチは、「非免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ）にさらに詳細に記載されている。
【０１６５】
前記フレームワーク又はＣＤＲ領域内になされる修飾に加えて、又は、同修飾に代えて、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含むために、典型的には、前記抗体の１つ又はそれ以上の機能的特性、例えば、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性及び／又は抗原依存性細胞傷害活性を変更するために操作されてもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾されてもよいし（例えば、１つ又はそれ以上の化学部分を前記抗体に付着させることができる。）、又は、そのグリコシル化を変更して前記抗体の１つ又はそれ以上の機能的特性を再び変更するために修飾されてもよい。これらの実施形態はそれぞれ、以下にさらに詳細に説明される。
【０１６６】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、前記ヒンジ領域のシステイン残基数が変更、例えば、増加又は減少するように修飾される。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号明細書（Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ）においてさらに説明される。前記ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にし、又は、前記抗体の安定性を向上若しくは低下させるために変更される。
【０１６７】
別の実施形態では、前記抗体のＦｃヒンジ領域は、前記抗体の生物学的半減期を減少させるために変異される。より具体的には、前記抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に対する障害性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌプロテインＡ（ＳｐＡ）結合性を有することになるよう、１つ又はそれ以上のアミノ酸変異が、ＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域内に導入される。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号明細書（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ）にさらに詳細に記載されている。
【０１６８】
さらに他の実施形態では、前記Ｆｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸残基を種々のアミノ酸残基により置き換えることにより変更されて、前記抗体のエフェクタ機能を変更する。例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸は、前記抗体がエフェクタリガンドに対する変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、種々のアミノ酸残基により置き換えられ得る。親和性が変更されるエフェクタリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８、２６０号明細書（両方ともＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ）に記載されている。
【０１６９】
別の実施形態では、前記抗体が、変化したＣｌｑ結合性及び／又は低下若しくは無効になった補体依存傷害性（ＣＤＣ）を有することになるように、アミノ酸残基から選択された１つ又はそれ以上のアミノ酸が、種々のアミノ酸残基により置き換えられ得る。このアプローチは、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ）に記載されている。
【０１７０】
別の実施形態では、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が変更されることにより、補体を固定する前記抗体の能力が変化する。このアプローチは、例えば、国際公開第９４／２９３５１号パンフレット（Ｂｏｄｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ）に記載されている。具体的な実施形態では、本発明の抗体又はその抗体フラグメントの１つ又はそれ以上のアミノ酸は、１つ又はそれ以上のアロタイプのアミノ酸残基、例えば、ＩｇＧ１サブクラス及びカッパアイソタイプについて図４に示したものにより置き換えられる。アロタイプのアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、Jefferis et al., MAbs. 1:332-338 (2009)に記載された、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３サブクラスにおける重鎖の定常領域並びに前記カッパアイソタイプにおける軽鎖の定常領域もあげられる。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、前記Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を向上させ、及び／又は、１つ又はそれ以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるために修飾される。このアプローチは、例えば、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されている。さらに、ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位は、マッピングされており、改善した結合性を有する変異体が記載されている（Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001を参照のこと。）。
【０１７２】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、グリコシル化していない抗体が調製され得る（すなわち、前記抗体は、グリコシル化を欠いている。）。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する前記抗体の親和性を増大させるために変更され得る。このような炭水化物の修飾は、例えば、前記抗体配列内の１つ又はそれ以上のグルコシル化部位を変異させることにより達成され得る。例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換は、１つ又はそれ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらすことにより、その部位におけるグリコシル化を除去するようになされ得る。このような非グルコシル化は、抗原に対する前記抗体の親和性を増大させ得る。このようなアプローチは、例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号明細書（Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ）に記載されている。
【０１７３】
さらに又はあるいは、変化した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加した二つに分かれたＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が調製され得る。このような変更したグルコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ活性を増大することが説明されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞中で前記抗体を発現させることにより達成され得る。変化したグリコシル化機構を有する細胞は、当分野において説明されており、本発明の組換え抗体を発現することにより、変化したグリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書（Ｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ）には、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載されている。前記遺伝子は、フコシル転移酵素をコードし、これにより、このような細胞株中で発現した抗体は、低フコシル化を示す。国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａ）には、フコースをＡｓｎ（２９７）−結合炭水化物に付着させる能力が低下し、その宿主細胞中で発現した抗体の低フコシル化ももたらす、ＣＨＯ細胞株の変異体、Ｌｅｃ１３細胞が記載されている（Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと。）。国際公開第９９／５４３４２号パンフレット（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ）には、糖タンパク質修飾グリコシル転位酵素（例えば、ベータ（１，４）−Ｎ  アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている。これにより、前記操作された細胞株中で発現した抗体が増加した２つに分かれるＧｌｃＮａｃ構造を示し、この構造により、前記抗体の増大したＡＤＣＣ活性がもたらされる（Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999も参照のこと。）。
【０１７４】
別の実施形態では、前記抗体は、生物学的半減期を増大するために修飾される。種々なアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号明細書（Ｗａｒｄ）に記載されているように、１つ又はそれ以上の下記変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ又はＴ２５６Ｆが導入され得る。あるいは、前記生物学的半減期を増大させるために、米国特許第５，８６９，０４６号及び同第６，１２１，０２２号明細書（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ）に記載されているように、前記抗体を、ＩｇＧにおけるＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含むよう、ＣＨ１又はＣＬ領域内で変更し得る。
【０１７５】
４．抗体コンジュゲート
本発明は、部位特異的標識方法、修飾抗体及びその抗体フラグメント並びにそれによって調製されたイムノコンジュゲートを提供する。本発明の方法を使用して、修飾抗体又はその抗体フラグメントは、標識、例えば、薬剤部分、例えば、抗ガン剤、自己免疫処置剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤若しくは麻酔剤又は画像化試薬、例えば、ＰＥＴ画像化用のキレート剤、又は、蛍光標識又はＭＲＩ造影試薬にコンジュゲートし得る。抗体又は抗体フラグメントは、本発明の方法と他のコンジュゲート法とを組み合わせて、複数の同一又は異なる標識部分を使用してもコンジュゲートし得る。
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴｏｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、オーリスタチン、ドラスタチン、メイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、プロテインＣＲＭ１の核外移行の阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ傷害剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡインターカレータ、ＤＮＡ副溝結合剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＲＮＡ合成阻害剤、キネシン阻害剤、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害剤及びＤＨＦＲ阻害剤から選択される薬剤部分を含む。
【０１７７】
さらに、本発明の修飾抗体又は抗体フラグメントは、所定の生物学的応答を修飾する薬剤部分にコンジュゲートしてもよい。薬剤部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるものではない。例えば、前記薬剤部分は、免疫モジュレータ、例えば、免疫賦活剤、小分子免疫賦活剤、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧオリゴマー、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープペプチド等でもよい。前記薬剤部分は、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ｃＤＮＡ等でもよい。あるいは、前記薬剤部分は、所望の生物学的活性を有する、タンパク質、ペプチド又はポリペプチドでもよい。このようなタンパク質は、例えば、毒物、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、コレラ毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベータ、サイトカイン、アポトーシス剤、抗血管新生剤又は生物学的応答修飾剤、例えば、リンホカイン等を含んでもよい。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の修飾抗体又は抗体フラグメントは、薬剤部分、例えば、細胞毒、薬剤（例えば、免疫抑制剤）又は放射性毒にコンジュゲートする。細胞毒の例としては、限定されるものではないが、タキサン（例えば、国際公開第０１／３８３１８号パンフレット及び国際特許出願第ＵＳ０３／０２６７５号を参照のこと。）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アントラサイクリン、チューブリシン（tubulysin）類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、メイタンシノイド及び、反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞傷害剤（例えば、Sasse et al., J. Antibiot. (Tokyo), 53, 879-85 (2000)、Suzawa et al., Bioorg. Med. Chem., 8, 2175-84 (2000)、Ichimura et al., J. Antibiot. (Tokyo), 44, 1045-53 (1991)、Francisco et al., Blood (2003)（印刷出版前に電子出版）、米国特許第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号及び同第６，４３６，９３１号明細書、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３号明細書、係属中の米国特許出願第１０／０２４，２９０号及び同第１０／１１６，０５３号並びに国際公開第０１／４９６９８号パンフレット）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、マイトキサントロン、マイトラマイシン、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド並びにピューロマイシン及びその類似体又はホモログがあげられる。治療剤は、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、除去剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メイファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含む（例えば、米国特許出願公開第２００９０３０４７２１号明細書（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を参照のこと。）。
【０１７９】
本発明の修飾抗体又は抗体フラグメントにコンジュゲートし得る治療的細胞毒の他の例としては、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、メイタンシン及びオーリスタチン並びにそれらの誘導体があげられる。カリチアマイシン抗体コンジュゲートの例は市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
【０１８０】
細胞毒の種類、治療剤を抗体にコンジュゲートさせるためのリンカー及び方法の更なる検討については、Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215；Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212；Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763；Pastan and Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091；Senter and Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照のこと。
【０１８１】
本発明に係る、修飾抗体又はその抗体フラグメントは、放射性同位体にコンジュゲートして、細胞傷害性放射性医薬品を生成することもできる。これは、放射性イムノコンジュゲートと呼ばれる。診断的又は治療的に使用するために抗体にコンジュゲートし得る放射性同位体の例としては、限定されるものではないが、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０及びルテニウム１７７があげられる。放射性イムノコンジュゲートを調製するための方法は、当分野において確立されている。放射性イムノコンジュゲートの例は市販されており、例えば、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）及びＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。類似する方法が、本発明の抗体を使用して、放射性イムノコンジュゲートを調製するために使用され得る。特定の実施形態では、マクロ環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に付着し得る、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子が、一般的に当分野において公知であり、Denardo et al., (1998) Clin. Cancer Res. 4(10):2483-90；Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；及びZimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
【０１８２】
本発明は、抗原に特異的に結合する修飾抗体又はその抗体フラグメントをさらに提供する。前記修飾抗体又はフラグメントは、異種タンパク質又はポリペプチド（又は、そのフラグメント、好ましくは、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）にコンジュゲート又は融合して、融合タンパク質を生成してもよい。特に、本発明は、本願明細書に記載された抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ、ＶＬドメイン又はＶＬＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
【０１８３】
一部の実施形態では、抗原結合特異性を有しない修飾抗体フラグメント、例えば、限定されるものではないが、本発明に基づいて操作されたシステイン残基を有する修飾Ｆｃドメインが、このような抗体フラグメント（例えば、操作されたＦｄ）と、異種タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとを含む融合タンパク質を生成させるために使用され得る。
【０１８４】
更なる融合タンパク質は、遺伝子−シャッフリング、モチーフ−シャッフリング、エキソン−シャッフリング及び／又はコドン−シャッフリング（正確には、「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術により生成されてもよい。ＤＮＡシャッフリングは、本発明の抗体又はそのフラグメント（例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体又はそのフラグメント）の活性を変化させるために使用されてもよい。一般的には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号及び同第５，８３７，４５８号明細書；Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76；及びLorenzo and Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313を参照のこと（これらの特許及び刊行物はそれぞれ、その全体が参照に組み込まれる。）。抗体若しくはそのフラグメント又はコードされた抗体若しくはそのフラグメントは、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は組換え前の他の方法に供されることにより変更されてもよい。抗原に特異的に結合する抗体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、１つ上の異種分子の１つ又はそれ以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメント等により組み換えられてもよい。
【０１８５】
さらに、本発明の修飾抗体又はその抗体フラグメントは、精製を容易にするマーカー配列、例えば、ペプチドにコンジュゲートし得る。好ましい実施形態では、前記マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）で提供されるタグである。中でも、それらの多くは市販されている。Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ（このタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson et al., (1984) Cell 37:767）。）及び「ＦＬＡＧ」タグ（A. Einhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455-465, 2001）があげられる。本発明に基づいて、抗体又は抗体フラグメントは、その有効性を向上させるために、腫瘍透過性ペプチドにもコンジュゲートし得る。
【０１８６】
他の実施形態では、本発明の修飾抗体又はその抗体フラグメントは、診断剤又は検出剤にコンジュゲートする。このようなイムノコンジュゲートは、臨床試験法、例えば、特定の治療法の有効性を判定することの一部として、疾患又は障害の開始、進行、進展及び／又は重症度をモニター又は予後判断するのに有用であり得る。このような診断及び検出は、前記抗体を検出物質に結合させることにより達成され得る。前記検出物質としては、限定されるものではないが、種々の酵素、例えば、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば、限定されるものではないが、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリン；発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルミノール；生体発光物質、例えば、限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエアクオリン；放射性物質、例えば、限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ及び１２１Ｉ，）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、６４Ｃｕ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｓｎ；並びに、種々の陽電子放出断層撮影法に使用する陽電子放出金属及び非放射性常磁性金属イオンがあげられる。
【０１８７】
本発明の修飾抗体又は抗体フラグメントは、固体支持体にも付着し得る。前記固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイ又は精製に特に有用である。このような固体支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンがあげられる。
【０１８８】
５．医薬組成物
イムノコンジュゲートを含む医薬組成物又は無菌の組成物を調製するために、本発明のイムノコンジュゲートは、薬学的に許容され得るキャリア又は賦形剤と混合される。前記組成物は、ガン（乳ガン、大腸ガン、肺ガン、多発性骨髄腫、卵巣ガン、肝臓ガン、胃ガン、膵臓ガン、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、鱗状細胞ガン腫、末梢神経鞘腫瘍（例えば、神経鞘腫）、頭頸部ガン、膀胱ガン、食道ガン、Ｂａｒｒｅｔｔｓ食道ガン、神経膠芽腫、軟組織の澄明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓ガン、メラノーマ、前立腺ガン、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、女性化乳房及び子宮内膜症）を処置又は予防するのに適した、１つ又はそれ以上の他の治療剤をさらに含み得る。
【０１８９】
治療剤及び診断剤の配合物は、生理学的に許容され得るキャリア、賦形剤又は安定化剤と混合することにより、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション又は懸濁液の形態に調製され得る（例えば、Hardman et al., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y., 2001；Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y., 2000；Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993；Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990；Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990；Weiner and Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 2000を参照のこと。）。
【０１９０】
治療用の投与計画の選択は、複数の要因、例えば、実体の血清又は組織代謝回転速度、兆候のレベル、前記実体の免疫原性及び生物学的マトリクス中での標的細胞のアクセシビリティにより決まる。特定の実施形態では、投与計画は、副作用の許容レベルと整合的に、患者に治療的に投与する量を最大化する。したがって、生物学的投与量は、１つには、特定の実体及び処置される状態の重症度により決まる。抗体、サイトカイン及び小分子の適切な用量を選択するガイダンスが利用可能である（例えば、Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK, 1996；Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1991；Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y., 1993；Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003；Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999；Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001；Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000；Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003；Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000を参照のこと。)。
【０１９１】
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼす、又は、処置に影響を及ぼすと予測される、当分野において公知又は予測されるパラメータ又は要因を使用して、医師によりなされる。一般的には、前記用量は、最適用量よりいくらか少ない量で開始し、その後、いかなる負の副作用に対しても所望又は最適な効果が達成されるまで、少しの増加量で増加させる。重要な診断的測定は、例えば、炎症の兆候の測定又は産生された炎症性サイトカインのレベルを含む。
【０１９２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物及び投与形態について、患者に対する毒性なしに、所望の治療応答を達成するのに有効な、前記活性成分量を得るように変化させてもよい。選択される用量レベルは、各種の薬理学的要因、例えば、使用する本発明の特定の組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、投与経路、投与のタイミング、使用した特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、使用した前記特定の組成物との組み合わせで使用する他の薬剤、化合物及び／若しくは材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康及び既往歴、及び医療分野において公知の同様の要因により決まる。
【０１９３】
本発明の抗体又はそのフラグメントを含む組成物は、連続的な注入により、又は、例えば、１日、１週間若しくは１週間あたり１〜７回の間隔での投与により提供され得る。投与は、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内で、又は、吸入により提供されてもよい。具体的な投与プロトコルは、著しく望ましくない副作用を避ける、最大用量又は投与頻度を含むものである。
【０１９４】
本発明のイムノコンジュゲートについて、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ  患者の体重でもよい。前記用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ又は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１０ｍｇ／ｋｇ  患者の体重でもよい。本発明の抗体又はそのフラグメントの用量を、患者の体重（キログラム（ｋｇ））に投与量（ｍｇ／ｋｇ）を掛けて算出してもよい。
【０１９５】
本発明のイムノコンジュゲートの投与は繰り返されてもよく、前記投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月又は少なくとも６ヶ月まで分割されてもよい。具体的な実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートの投与は、３週間毎に繰り返される。
【０１９６】
特定の患者に対する有効量は、処置される状態、前記患者の全体的な健康、投与の経路及び用量並びに副作用の重症度等の要因に応じて変化する場合がある（例えば、Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996；Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK, 2001を参照のこと。）。
【０１９７】
前記投与経路は、例えば、局所若しくは皮膚への塗布、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内の注射若しくは注入、又は、持続性放出システム若しくはインプラントによるものでもよい（例えば、Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983；Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981；Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982；Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034, 1980；米国特許第６，３５０，４６６号及び同第６，３１６，０２４号明細書を参照のこと。）。必要に応じて、前記組成物は、溶解剤及び、注射部位における疼痛を緩和する局所麻酔、例えば、リドカインも含み得る。さらに、肺内投与も、例えば、吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤との配合により使用され得る。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、及び同第４，８８０，０７８号明細書；並びに国際公開第９２／１９２４４号、同第９７／３２５７２号、同第９７／４４０１３号、同第９８／３１３４６号及び同第９９／６６９０３号パンフレットを参照のこと。各文献は、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１９８】
本発明の組成物は、１つ又はそれ以上の各種の当分野において公知の方法を使用して、１つ又はそれ以上の投与経路を介して投与されることもできる。当業者に理解されるように、投与の経路及び／又は形態は、望まれる結果に応じて変化する。本発明のイムノコンジュゲート用に選択した投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口の投与経路、例えば、注射若しくは注入があげられる。非経口投与は、通常注射による経腸及び局所投与以外の投与形態を表す場合があり、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄膜内、硬膜外並びに胸骨内の注射及び注入を含む。あるいは、本発明の組成物は、非経口経路でない経路、例えば、局所、表皮又は粘膜経路の投与、例えば、経鼻、経口、経膣、直腸、舌下又は局所を介して投与され得る。一実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、注入により投与される。別の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、皮下に投与される。
【０１９９】
本発明のイムノコンジュゲートが制御放出又は持続性放出システムで投与される場合、ポンプが、制御又は持続性放出を達成するために使用されてもよい（Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20, 1987；Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980；Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989を参照のこと。）。ポリマー材料が、本発明の治療剤の制御又は持続性放出を達成するために使用され得る（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., 1974；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984；Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1983を参照のこと；Levy et al., Science 228:190, 1985；During et al., Ann. Neurol. 25:351, 1989；Howard et al., J. Neurosurg. 7 1:105, 1989；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；同第５，９８９，４６３号；同第５，１２８，３２６号明細書；国際公開第９９／１５１５４号；及び同第９９／２０２５３号パンフレットも参照のこと。）。持続性放出配合物に使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステルがあげられる。一実施形態では、前記持続性放出配合物に使用されるポリマーは、不活性で、溶出性不純物を含まない、保存安定性で、無菌かつ生分解性である。制御又は持続性放出システムは、予防又は治療ターゲットに近接して置くことができるため、わずかな全身性用量しか必要としない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984を参照のこと。）。
【０２００】
制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによるレビューにおいて検討されている（Science 249 : 1527 - 1533, 1990）。当業者に公知の任意の技術が、１つ又はそれ以上の本発明のイムノコンジュゲートを含む持続性放出配合物を製造するために使用され得る。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号明細書、国際公開第９１／０５５４８号、同第９６／２０６９８号パンフレット、Ning et al., Radiotherapy & Oncology 39:179-189, 1996；Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, 1995；Cleek et al., Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 1997；及びLam et al., Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 1997を参照のこと。各文献は、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【０２０１】
本発明のイムノコンジュゲートが局所に投与される場合、それらは、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョンの形態又は当業者に周知の他の形態に配合され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照のこと。非噴霧性局所剤形について、局所用途に適合したキャリア又は１つ又はそれ以上の賦形剤を含み、一部の例では、水より高い絶対粘度を有する半固体又は固体状の粘着性物質が、典型的に使用される。適切な配合物としては、限定されるものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、軟膏等があげられ、必要に応じて、滅菌され、又は、種々の特性、例えば、浸透圧等に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩）と混合される。他の適切な局所剤形としては、噴霧性エアロゾル調製物があげられ、一部の例では、固体又は液体の不活性キャリアとの組み合わせでの活性成分が、加圧した揮発性物質（例えば、ガス状の噴射剤、例えば、Ｆｒｅｏｎ（商標））との混合物において、又は、スクイズボトルに封入される。必要に応じて、保湿剤又は湿潤剤も、医薬組成物及び剤形に添加され得る。このような更なる成分の例は、当分野において周知である。
【０２０２】
前記イムノコンジュゲートを含む組成物が鼻腔内に投与される場合、エアロゾル状、スプレー、ミスト又はドロップ状に配合され得る。特に、本発明に基づいて使用するための予防剤又は治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）を含む、加圧した充填物又は噴霧器からのエアロゾルスプレー状での提供において簡便に送達され得る。加圧したエアロゾルの場合、用量単位は、計測した量を送達するための弁を提供することにより決定されてもよい。吸入器又は注入器で使用するための（例えば、ゼラチンから構成された）カプセル及びカートリッジは、前記化合物と適切な粉末成分、例えば、ラクトース又はデンプンとの粉末混合物を含むように配合されてもよい。
【０２０３】
第２治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質又は放射線と共に投与又は処置するための方法は、当分野において公知である（例えば、Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.；Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.；Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照のこと。）。有効量の治療剤は、少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも３０％；少なくとも４０％又は少なくとも５０％まで、兆候を低下させ得る。
【０２０４】
更なる治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）が、本発明のイムノコンジュゲートとの組み合わせで投与されることができ、本発明のイムノコンジュゲートとは、５分未満空けて、３０分未満空けて、１時間空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、約１２時間〜１８時間空けて、１８時間〜２４時間空けて、２４時間〜３６時間空けて、３６時間〜４８時間空けて、４８時間〜５２時間空けて、５２時間〜６０時間空けて、６０時間〜７２時間空けて、７２時間〜８４時間空けて、８４時間〜９６時間空けて又は９６時間〜１２０時間空けて投与されてもよい。２つ以上の治療剤が、患者の同一外来時内に投与されてもよい。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適切な分布を確保するように配合され得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高い親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物が（必要に応じて）前記ＢＢＢを確実に通過するよう、それらは、例えば、リポソームに配合され得る。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；及び同第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。前記リポソームは、特定の細胞又は臓器に選択的に輸送されることで標的薬剤送達を向上させる、１つ又はそれ以上の部分を含む場合がある（例えば、Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照のこと。）。例示となる標的化部分としては、葉酸塩又はビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号明細書（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ））；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140；Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090を）があげられる。K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
【０２０６】
本発明は、本発明のイムノコンジュゲートを単独又は他の治療剤をとの組み合わせで含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するためのプロトコルを提供する。本発明の併用療法における治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）は、同時又は連続的に対象に投与され得る。本発明の併用療法における治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）は、周期的にも投与され得る。前記治療剤（例えば、作用剤）の１つに対する抵抗性の進行を低下させ、前記治療剤（例えば、作用剤）の１つの副作用を防ぐ若しくは低下させ、及び／又は、前記治療剤の有効性を改善するために、周期的治療剤は、第１治療剤（例えば、第１の予防剤又は治療剤）の一定期間にわたる投与、続けて、第２治療剤（例えば、第２の予防剤又は治療剤）の一定期間にわたる投与、及びこの連続的投与の繰り返し（すなわち周期）を含む。
【０２０７】
本発明の併用療法における治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）は、対象に同時に投与され得る。
【０２０８】
「同時に」という用語は、正確に同時に治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）を投与することに限定されるものではなく、むしろ、本発明の抗体が他の１つ又はそれ以上の治療剤と共に作用して、それらが他の方法で投与された場合より向上した利益を提供するよう、連続で及び一定の時間間隔で対象に投与されることを意味する。例えば、各治療剤は、同時又は、異なる時点で任意の順序で連続的に対象に投与されてもよい。ただし、同時に投与されない場合、それらは、所望の治療的又は予防的効果を提供するように、十分近いタイミングで投与されるべきである。各治療剤は、任意の適切な形態及び任意の適切な経路により、別々に対象に投与され得る。種々の実施形態では、前記治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）は、１５分未満、３０分未満、１時間未満空けて、約１時間空けて、約１〜約２時間空けて、約２時間〜約３時間空けて、約３時間〜約４時間空けて、約４時間〜約５時間空けて、約５時間〜約６時間空けて、約６時間〜約７時間空けて、約７時間〜約８時間空けて、約８時間〜約９時間空けて、約９時間〜約１０時間空けて、約１０時間〜約１１時間空けて、約１１時間〜約１２時間空けて、２４時間空けて、４８時間空けて、７２時間空けて又は１週間空けて、対象に投与される。別の実施形態では、２つ以上の治療剤（例えば、予防剤又は治療剤）が、患者の同一外来時内に投与される。
【０２０９】
前記併用療法の予防剤又は治療剤は、同じ医薬組成物において対象に投与され得る。あるいは、前記併用療法の予防剤又は治療剤は、別々の医薬組成物において対象に同時に投与され得る。前記予防剤又は治療剤は、同じ又は異なる投与経路により対象に投与されてもよい。
【０２１０】
本発明について詳細に記載してきたが、下記実施例及び特許請求の範囲によりさらに説明するものとする。これらは例示であり、更に限定することを意味しない。
【実施例】
【０２１１】
実施例１．ヒトＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖中のＣｙｓ変異用の表面アクセシブル部位の選択
Tsodikov et al,「A novel computer program for fast exact calculation of accessible and molecular surface areas and average surface curvature,」 J. Comput. Chem., 23, 600-609 (2002)に記載された、コンピュータプログラム  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒａｃｅｒ  ５．０を使用して、ｈＩｇＧ１／カッパ抗体（タンパク質データバンク構造エントリ  １ＨＺＨ．ｐｄｂ、表６、表７、図１）の結晶構造において、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖の定常領域中の表面露出残基を特定した。ｈＩｇＧ重鎖中の５９個の部位及びヒトカッパ軽鎖中の２９個の部位の８８個の残基をＣｙｓ置換用に選択した。この選択は、下記規準に基づいている：１）重鎖の定常領域におけるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及び軽鎖の定常領域中の残基を選択する；２）表面露出残基を選択するが、抗体間二量体形成を避けるため、全面的に露出された残基及びＣ−末端領域は避ける；３）極性又は荷電残基、例えば、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐに注目する；及び、４）ＦｃＲｎ結合ドメイン、プロテインＡ結合ドメイン及び重鎖ヒンジ領域中の残基を除外する。
【０２１２】
基準１）すなわち、抗体の定常領域中のＣｙｓ置換部位の選択は、多くの異なる抗体に対するコンジュゲート化部位の移行性を確保する。基準２）は、顕著に露出した残基のＣｙｓ置換に対する抗体間二量体形成の観察に基づいている（この基準に基づいて除外した残基を、表６に列記する。）。前記ＩｇＧの結晶構造に基づいて、Ｃｙｓ側鎖の推定の方向性を考慮した。Ｃｙｓ側鎖が別の抗体との相互作用から部分的に遮断され得るが、小分子ペイロードと未だに反応性である場合がある残基は、より大きな表面アクセシビリティを有するが、大きな巨大分子との相互作用、例えば、二量体形成を可能にする場合がある残基より好ましい。基準３）を、前記抗体の変異における不安定化作用を最小化するために、好ましい保存的変異に対して実行した。同様に、規準４）を、抗体に対する機能性変化、例えば、それぞれ、抗体の薬物動態特性に影響を及ぼす場合があるか、又は、精製ハンドルの欠損をもたらす場合がある、ＦｃＲｎ及びプロテインＡ結合性に対する影響を防止するために使用した。基準４に基づいて除外した残基を、表６に列記する。ｈＩｇＧ１／カッパの構造モデル中の８８個の選択した変異部位の位置は、前記選択した部位が表面アクセシブルであることを示す（図２）。
【表６】
0006609477.tif 000077
0006609477.tif 000078
0006609477.tif 000079
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【表７】
0006609477.tif 000086
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【０２１３】
実施例２．トラスツズマブＣｙｓ変異抗体の調製
トラスツズマブの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを化学的に合成し、ヒトＩｇＧ１及びヒトカッパ軽鎖の定常領域を含む２つの哺乳類発現ベクター、ｐＯＧ−ＨＣ及びｐＯＧ−ＬＣ内にクローニングして、２つの野生型構築物、ｐＯＧ−トラスツズマブＨＣ及びｐＯＧ−トラスツズマブＬＣそれぞれをもたらした。これらのベクター中では、哺乳類細胞中の抗体重鎖及び軽鎖構築物の発現が、ＣＭＶプロモータにより駆動される。前記ベクターは、哺乳類細胞からのその分泌を導く、２４個の合成アミノ酸シグナル配列：ＭＫＴＦＩＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＩＦＬＬＰＧＡＴＡ（配列番号９９）を、重鎖又は軽鎖のＮ−末端に含む。前記シグナル配列は、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞において、数百の哺乳類タンパク質のタンパク質分泌を方向付けるのに効果的であることが確認されている。オリゴヌクレオチド定方向変異誘発を、トラスツズマブ中でのＣｙｓ変異体構築物を調製するために使用した。実施例１に記載したヒトＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖の定常領域中で選択した８８個のＣｙｓ変異部位に対応する８８対の変異プライマー（表８）を化学合成した。センス及びアンチセンス変異プライマーペアを、ＰＣＲ増幅前に混合した。テンプレートとしてのｐＯＧ−トラスツズマブＨＣ及びｐＯＧ−トラスツズマブＬＣと共に、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用することにより、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後に、ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル上で確認し、ＤＰＮ  Ｉで処理し、続けて、ＤＨ５ａ細胞（Klock et al., (2009) Methods Mol Biol. 498:91-103）中で形質転換した。
【０２１４】
８８個のＣｙｓ変異体構築物の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。野生型トラスツズマブ重鎖の全長アミノ酸配列を、配列番号１として示し、軽鎖の全長アミノ酸配列を、配列番号９０として示す。５９個のトラスツズマブＨＣ  Ｃｙｓ変異体構築物における定常領域のコードしたタンパク質配列（配列番号２〜配列番号６０）及び２９個のトラスツズマブＬＣ  Ｃｙｓ変異体構築物における定常領域のコードしたタンパク質配列（配列番号６１〜配列番号８９）をそれぞれ、表９及び表１０に示す。ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖中のアミノ酸残基を、Ｅｕナンバリングシステム（Edelman et al, (1969) Proc Natl Acad Sci U S A, 63:78-85）により番号付けする。
【表８】
0006609477.tif 000088
0006609477.tif 000089
0006609477.tif 000090
0006609477.tif 000091
0006609477.tif 000092
【表９】
0006609477.tif 000093
0006609477.tif 000094
0006609477.tif 000095
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0006609477.tif 000100
0006609477.tif 000101
【表１０】
0006609477.tif 000102
0006609477.tif 000103
【０２１５】
実施例３．トラスツマブ重鎖及び軽鎖のＣｙｓ変異の種々の抗体への転移
トラスツズマブについて、薬剤ペイロード付着用の全てのＣｙｓ変異を、そのヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖の定常領域にあるように選択した。抗体の定常領域が一次配列及び構造において非常に保存されているため、トラスツズマブについての良好なペイロード付着部位として特定したＣｙｓ変異残基は、他の抗体における好ましい付着部位としても機能するであろう。他の抗体に対するこれらの包括的なコンジュゲート部位の転移性を説明するために、本発明者らは、抗体１４０９０内のＣｙｓ変異のセットをクローニングした。抗体１４０９０は、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトラムダ軽鎖を有する抗体であり、トラスツズマブとは異なる標的タンパク質に結合する。抗体１４０９０の可変領域をコードするＤＮＡを、７つの選択したｐＯＧトラスツズマブＣｙｓ変異体プラスミド構築物（表１１に列記した配列番号）内にクローニングして、実施例２に記載したプラスミド中のトラスツズマブ構築物の可変領域を置き換えた。その結果、抗体１４０９０及びトラスツズマブの対応する７つのＣｙｓ構築物中の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、同一である（図３）。この後の実施例は、これらの部位が容易にコンジュゲートし得ることを示す。逆に、種々のヒトＩｇＧアイソトープについての一次配列及び三次構造における高度の類似性のために（図４）、トラスツズマブのカッパ軽鎖上のＣｙｓ変異は、種々のアイソトープ重鎖を含むヒト抗体上の同等の軽鎖に容易に転移し得る。同様に、ＩｇＧ１の定常領域中で特定した部位は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に転位する場合がある。
【０２１６】
実施例４．ヒトラムダ軽鎖中でのシステイン変異
ヒトラムダ及びカッパ軽鎖は、アミノ酸配列類似性をほとんど有しない（図５Ａ）。トラスツズマブのカッパ軽鎖中の望ましい残基を参照して、前記ヒトラムダ軽鎖を含むＦａｂのタンパク質結晶構造モデル（タンパク質データバンク構造エントリ３Ｇ６Ｄ．ｐｄｂ）中の残基位置のおおよその類似性に基づいて、抗体１４０９０のラムダ軽鎖中の変異を選択した（図５Ａ及びＢ）。ＰＩＰＥクローニング戦略（Klock and Lesley, 2009）と組み合わせてオリゴヌクレオチド定方向変異誘発（Higuchi et al. 1988）を使用して、７つの更なるＣｙｓ変異体構築物を、抗体１４０９０−ラムダ軽鎖プラスミド中に生成した。前記ラムダ軽鎖中にＣｙｓ点変異を生成するために使用した変異プライマーを、表１２に列記する。抗体１４０９０の分泌も、２４個の合成アミノ酸シグナル配列：ＭＫＴＦＩＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＩＦＬＬＰＧＡＴＡ（配列番号９９）により方向付けられる。抗体１４０９０  Ｃｙｓ構築物の配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。ヒト野生型ラムダ軽鎖の定常領域についての配列を、配列番号９１として示す。前記軽鎖中の７つのＣｙｓ変異体構築物のコードしたタンパク質配列（配列番号９２〜配列番号９８）を、表１３に示す。この後の実施例は、これらのＣｙｓ変異体がＡＤＣペイロードと効率的にコンジュゲートすることを示す。これらの変異体は全てヒトラムダ軽鎖の定常領域にあるため、これらのコンジュゲート部位は、ラムダ軽鎖を有する他の抗体に容易に転移され得る。
【表１１】
0006609477.tif 000104
【表１２】
0006609477.tif 000105
【表１３】
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【０２１７】
実施例５．２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞中でのＣｙｓ変異抗体の発現及び精製
先に記載された一過性形質転換法(Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 (2001))を使用して、重鎖及び軽鎖のプラスミドを共形質転換することにより、トラスツズマブ抗体のＣｙｓ変異体を、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞中で発現させた。Ｑｉａｇｅｎプラスミド調製キットをメーカーのプロトコルに従って使用して、共形質転換に使用したＤＮＡプラスミドを調製した。２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃における５％ ＣＯ２下において、懸濁状態で培養した。形質転換の前日に、細胞を、新鮮な培地中に、０．７×１０６個／ｍｌに分割した。形質転換の当日に、細胞密度は、典型的には、１．５×１０６個／ｍｌに達した。ＰＥＩ法（Meissner et al., 2001）を使用して、１：１の比における重鎖及び軽鎖プラスミドの混合物により、前記細胞を形質転換した。前記形質転換した細胞を、さらに５日間培養した。培養物からの培地を、２０００×ｇで２０分間、前記培養物を遠心することにより収集し、０．２マイクロメートルのフィルタによりろ過した。プロテインＡ−セファロース（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、発現した抗体を、前記ろ過した培地から精製した。抗体ＩｇＧを、前記プロテインＡ−セファロース（商標）カラムから、溶出バッファー（ｐＨ３．０）により溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により直ちに中和し、続けて、ＰＢＳにバッファー交換した。
【０２１８】
一過性に形質転換した２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）中での８８個のＣｙｓトラスツズマブ変異抗体の発現レベルは、野生型トラスツズマブの発現レベルと同様であり、１８．６ｍｇ／Ｌ＋／−９．５ｍｇ／Ｌの平均収量を有した（表１４）。このことは、選択した部位における一点変異は、細胞分泌機構による発現した抗体の保持を顕著に変更させなかったことを示唆している。非還元性ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用する前記精製したトラスツズマブＣｙｓ変異抗体の分析は、前記Ｃｙｓ変異抗体が、操作されたシステインによりジスルフィド結合されたオリゴマーを形成しなかったことを示す（図６）。サイズ排除クロマトグラフィー（図７）は、全てのＣｙｓ変異トラスツズマブ抗体が単量体であるとの結論をさらに支持した。前記変異抗体のＨＰＬＣ逆相分析も、Ｃｙｓ変異抗体の大部分が、保持時間及び同質性に関して、野生型トラスツズマブと区別がつかないことを示唆している（図８）。非還元性脱グリコシル化全長トラスツズマブＬＣ−Ｒ１０８Ｃの質量分析法（インタクトＬＣ−ＭＳ）による分析は、前記抗体の大部分が、２つのシステインにより修飾されていたことを示した（図９及び表１５）。これらの観察は、トラスツズマブＣｙｓ変異抗体中の操作されたシステインのチオール基が、２９３  ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞中で発現された場合、システインにより修飾されること、及び、任意のチオール反応性試薬とのコンジュゲート前に前記修飾を還元試薬により除去する必要があることを示す、先の刊行物（Chen, et al., mAbs 1:6, 563-571, 2009）と一致する。
【０２１９】
記載したＰＥＩ法（Meissner et al., 2001）を使用して、ＨＣ及びＬＣプラスミドを共形質転換することにより、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞中で、抗体１４０９０の前記Ｃｙｓ変異体も発現させた。前記抗体１４０９０のＣｙｓ変異体の発現レベルは、野生型抗体１４０９０の発現レベルと同様である（表１６）。
【表１４】
0006609477.tif 000107
0006609477.tif 000108
【表１５】
0006609477.tif 000109
【表１６】
0006609477.tif 000110
【０２２０】
実施例６．Ｃｙｓ変異抗体の還元、再酸化及びＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲート
哺乳類細胞中で発現させた抗体中の操作されたＣｙｓは、その生合成中に付加物（ジスルフィド）、例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）及び／又はシステインにより修飾されるため（Chen et al. 2009）、最初に発現した生成物中の前記修飾されたＣｙｓは、チオール反応性試薬、例えば、マレイミド又はブロモ−若しくはヨード−アセトアミド基に対して反応性でない。前記操作されたシステインを発現後にコンジュゲートさせるために、前記グルタチオン又はシステインの付加物を、これらのジスルフィドを還元することにより、除去する必要があり、前記還元は、一般的に、発現したタンパク質中の全てのジスルフィドの還元を伴う。これは、まず、前記抗体を還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）に曝し、続けて、前記抗体の全ての天然ジスルフィド結合の再酸化が機能性抗体構造を復元及び／又は安定化するのを可能にする手法を行うことにより達成され得る。したがって、全ての天然ジスルフィド結合及び操作されたシステイン残基のシステイン又はＧＳＨ付加物間のジスルフィド結合を還元するために、新たに調製したＤＴＴを、トラスツズマブ及び抗体１４０９０の先に精製したＣｙｓ変異体に、２０ｍＭの最終濃度になるよう添加した。前記抗体をＤＴＴと３７℃で１時間インキュベートした後、混合物を、ＰＢＳに対して、４℃で３日間、毎日バッファー交換して透析し、ＤＴＴを除去し、天然ジスルフィド結合を再酸化した。代替法は、脱塩カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５により、還元試薬を除去するものである。前記タンパク質を完全に還元した後、１ｍＭ  酸化型アスコルビン酸塩（デヒドロ−アスコルビン酸）を、前記脱塩したサンプルに添加し、再酸化インキュベートを２０時間行う。両方法は、同様の結果を生じた。ただし、文献に先に記載された、ＣｕＳＯ４を使用する再酸化プロトコルに従った試みは、タンパク質の沈殿をもたらした。本願明細書における全ての実施例は、上記透析プロトコルを使用する。再酸化が鎖内ジスルフィドを復元する一方で、透析は、新たに導入したシステインに結合したシステイン及びグルタチオンを透析により分離させる。
【０２２１】
再酸化後に、前記抗体は、コンジュゲートの準備ができた状態となる。マレイミド−ＭＭＡＦ（ＭＣ−ＭＭＡＦ、抗体に対して１０当量、図１０）を、再酸化した抗体にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中で添加した。インキュベートを、１時間〜２４時間行った。コンジュゲート化プロセスを、逆相ＨＰＬＣによりモニターした。前記逆相ＨＰＬＣは、コンジュゲートした抗体をコンジュゲートしていない抗体から分離可能である。コンジュゲート反応混合物を、８０℃に加熱したＰＲＬＰ−Ｓ  ４０００Ａカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）において分析した。前記カラムの溶出を、０．１％ ＴＦＡを含む水における３０〜６０％アセトニトリルの直線勾配により、１．５ｍｌ／分の流速で行った。前記カラムからのタンパク質の溶出を、２８０ｎｍ、２５４ｎｍ及び２１５ｎｍでモニターした。代表的なコンジュゲート混合物の逆相ＨＰＬＣトレースを、図１１に示す。
【０２２２】
前記コンジュゲート混合物を逆相ＨＰＬＣにより分析した場合、多くのＣｙｓ部位が、均一な単独ピーク溶出プロファイル（図１１）により示唆されたように、均一なコンジュゲート生成物を生成した。一方、一部のＣｙｓ部位は、不均一なコンジュゲート生成物を生成した（図１２）。上記手法は、天然ジスルフィド結合の還元及び再酸化、並びに、前記操作されたシステイン残基のシステイン及びＧＳＨ付加物間の結合の還元を伴う。前記再酸化プロセス中に、前記操作されたシステイン残基は、適切な天然ジスルフィド結合の再形成を、ジスルフィドシャッフリングプロセスにより妨害する場合がある。これは、前記操作されたシステインと天然システイン残基との間、又は、不正確に適合した天然ジスルフィド結合間のいずれかにおいて、不適合ジスルフィド結合の形成をもたらすおそれがある。このような不適合ジスルフィド結合は、逆相ＨＰＬＣカラムにおける前記抗体の保持に影響を及ぼす場合がある。不適合プロセスは、所望の操作されたシステイン以外の不対のシステイン残基をもたらす場合もある。前記マレイミド−ＭＭＡＦの、前記抗体の種々の位置への付着は、様々に保持時間に影響を及ぼす（以下の均一にコンジュゲートしたＡＤＣについての論考を参照のこと）。さらに、不完全な再酸化は、前記操作されたシステイン残基との所望のコンジュゲートに加えて、マレイミド−ＭＭＡＦと反応する天然システイン残基を有する抗体を残す。前記天然ジスルフィド結合の適切かつ完全な形成を妨げる何らかのプロセスが、マレイミド−ＭＭＡＦに対するコンジュゲートの際、複雑なＨＰＬＣプロファイルをもたらす（図１１）。未精製反応混合物のＵＶ吸収により測定した均一なＡＤＣの収量は、Ｃｙｓ変異に応じて変動した（表１７）。上記還元／再酸化プロトコル及びコンジュゲート化手法を使用して、８８個のうち６５個のＣｙｓ変異トラスツズマブ抗体が、均一なコンジュゲート生成物をもたらし、これらの部位は、コンジュゲート化用のシステイン操作抗体を調製する場合になされるＣｙｓ置換に有益な部位である。
【０２２３】
これらの６５個のＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣを、種々のアッセイにおいて詳細に分析した。示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して熱安定性を測定した。分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＡｎＳＥＣ）を使用して凝集を測定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原依存性細胞殺傷能を、細胞生存率アッセイにより測定した。薬物動態挙動を、マウスにおいて測定した。これらのアッセイ及びそれぞれの結果を、以下により詳細に記載する。
【０２２４】
トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの凝集状態を評価するために、前記ＡＤＣを、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ＧＥ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、３．２／３０）において、ＰＢＳ中０．１ｍｌ／分の流速で分析した。６５個のＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ全てが単量体であった。ＡＤＣの大部分は、１０％未満のオリゴマーを含む（図１３、表１８）。このことは、選択した位置におけるトラスツズマブＣｙｓ変異体構築物へのＭＣ−ＭＭＡＦのコンジュゲートが、前記抗体の凝集を引き起こさなかったことを示す。
【表１７】
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【表１８】
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【０２２５】
実施例７．トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ熱安定性アッセイ
ＭＭＡＦペイロードのトラスツズマブへのコンジュゲートは、前記抗体を安定化又は不安定化させ、抗体の融解温度の変化をもたらす場合がある。前記融解温度を、環境感受性染料、例えば、ｓｙｐｒｏオレンジによりモニターされる温度誘導変性に基づく示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により測定することができる。ＡＤＣサンプルを、ＰＢＳ（６．７ｍＭ リン酸ナトリウム  ｐＨ７．２；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）における３８４ウェルプレートに、トリプリケートでアリコートした。各ウェルにおいて、８μｌの０．２５ｍｇ／ｍｌ 抗体を、２μｌの２５×ｓｙｐｒｏオレンジ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。プレートを密封し、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システムにおいて、３０〜８５℃の温度傾斜により、１℃あたり２０回の蛍光スキャンを記録して分析した。融解温度を、蛍光強度対時間曲線の一次導関数から決定した。
【０２２６】
野生型トラスツズマブの代表的な熱シフトアッセイにより、２つの融解転移（Ｔｍ）、６９．７℃のＴｍ１及び８１．２℃のＴｍ２それぞれが明らかになった（表１９）。トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣをタンパク質熱安定性アッセイに供した際に、ＭＣ−ＭＭＡＦの前記抗体へのコンジュゲートが、コンジュゲート部位に応じて、種々のＴｍ変化を導いたことが明らかになった（表１９）。ＭＣ−ＭＭＡＦが、ＣＨ１又はＣＨ３ドメインのいずれかにおけるＣｙｓ部位の大部分にコンジュゲートした時点で、得られたＡＤＣ、例えば、ＨＣ−Ｋ３５６Ｃ−ＭＭＡＦは、Ｔｍ１及びＴｍ２においてほとんど変化することなく、野生型抗Ｈｅｒのパターンと類似するパターンを示した。しかしながら、ＭＣ−ＭＭＡＦを、ＣＨ２ドメインに位置するＣｙｓ部位にコンジュゲートした場合、Ｔｍ１の低下は、ほとんどの部位について観察されたが、前記Ｔｍ２は、大部分が変化しないままであった。ほとんどのＣＨ２ドメインＣｙｓ−ＭＭＡＦコンジュゲートについて観察された前記Ｔｍ１の低下は、５℃〜２６℃の範囲であった。Ｔｍ１が最も大きく低下した２つのＡＤＣは、ＨＣ−Ｔ３３５Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｓ３３７Ｃ−ＭＭＡＦであり、Ｔｍ１はそれぞれ４２℃及び４５℃であった（図１４）。この結果は、ＭＣ−ＭＭＡＦのコンジュゲート位置が前記ＡＤＣの安定性に顕著な影響を及ぼし得ることを示す。
【表１９】
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【０２２７】
実施例８．Ｃｙｓ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞殺傷能を測定するための細胞増殖アッセイ
標的抗原を自然に発現する細胞又は標的抗原を発現するために操作された細胞株は、ＡＤＣの活性及び有効性をアッセイするために使用されることが多い。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるトラスツズマブＡＤＣの細胞殺傷能の評価のために、２つの操作された細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６及びクローン４０並びにＨＣＣ１９５４細胞を使用した（Clinchy B, Gazdar A, Rabinovsky R, Yefenof E, Gordon B, Vitetta ES. Breast Cancer Res Treat. (2000) 61:217-228）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞は、高コピー数（約５×１０５コピー／細胞）の組換えヒトＨｅｒ２を安定して発現する。一方、クローン４０は、低コピー数（約５×１０３コピー／細胞）のヒトＨｅｒ２を発現する。ＨＣＣ１９５４細胞は、高レベル（約５×１０５コピー／細胞）のヒトＨｅｒ２を表面において内在的に発現する。抗体１４０９０ＡＤＣの細胞殺傷能を決定するために、ＣＭＫ１１−５及びＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。ＣＭＫ１１−５細胞は、細胞表面において、抗体１４０９０に対する抗原を高レベルで発現するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞においては、検出可能な抗原発現は見られない。抗原依存性細胞傷害作用は、細胞表面に十分な抗原を発現する細胞のみを殺傷すべきであり、抗原を欠いている細胞を殺傷すべきでない。種々の濃度のＡＤＣと共に細胞をインキュベートした５日後に、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて前記細胞増殖アッセイを行った（Riss et al., (2004) Assay Drug Dev Technol. 2:51-62）。一部の試験では、前記細胞系アッセイは高スループットであり、自動システムで実施される（Melnick et al., (2006)Proc Natl Acad Sci U S A. 103:3153-3158）。
【０２２８】
トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６及びＨＣＣ１９５４を特異的に殺傷したが、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン４０細胞を殺傷しなかった（図１５）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞アッセイにおけるトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのＩＣ５０は、３０ｐＭ〜２００ｐＭの範囲である（表２０、図１６）。同様に、抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣは、細胞増殖アッセイにおいて、抗原依存性細胞殺傷を示した。前記抗体１４０９０  Ｃｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣは、抗原を発現しているＣＭＫ１１−５細胞を殺傷したが、抗原陰性のＪｕｒｋａｔ細胞を殺傷しなかった（図１７）。ＣＭＫ１１−５増殖アッセイにおける前記抗体１４０９０−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのＩＣ５０は、４００ｐＭ〜１ｎＭの範囲である（表２１）。
【表２０】
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【表２１】
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【０２２９】
実施例９．トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬物動態試験
長い血清半減期がＡＤＣの高いｉｎ  ｖｉｖｏ有効性にとって重要であることが実証されている（Hamblett, et al., 「Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate,」 Clin Cancer Res., 10:7063-7070 (2004)；Alley et al., Bioconjug Chem. 19:759-765 (2008)）。通常疎水性である薬剤ペイロードを抗体に付着させることは、抗体の特性に有意に影響を及ぼす可能性があり、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける前記ＡＤＣの速いクリアランス（Hamblett et al., 2004）及び乏しいｉｎ  ｖｉｖｏ有効性をもたらす場合がある。ＭＭＡＦ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるクリアランスに対する、種々のコンジュゲート化部位の影響を評価するために、腫瘍を有しないマウスにおける薬物動態試験を、６５個のトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣにより行った。マウス血漿中における、ＡＤＣを含有するＭＭＡＦを検出するために、抗ＭＭＡＦ抗体を生成した。２つの別々のアッセイにおけるシグナル生成用の、前記血漿からのトラスツズマブＩｇＧ分子並びに抗ヒトＩｇＧ（抗ｈＩｇＧ）抗体及び抗ＭＭＡＦ抗体を捕捉するために、ヒトＨＥＲ２の細胞外ドメインを使用して、ＡＤＣ検出用のＥＬＩＳＡアッセイを開発した。前記２つのＥＬＩＳＡアッセイは、以下でより詳細に検討したように、前記トラスツズマブ抗体及び「完全な」ＡＤＣそれぞれの血清濃度を測定する。
【０２３０】
群あたり３匹のマウスに、１ｍｇ／ｋｇの単回用量で、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣを投与した。１０個の血漿サンプルを、２週間の期間にわたって収集し、ヒトＨＥＲ２の細胞外ドメインを使用して、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ及びＭＭＡＦを欠いているトラスツズマブを含む全てのトラスツズマブＩｇＧ分子を捕捉するＥＬＩＳＡによりアッセイした。ついで、抗ＭＭＡＦ及び抗ｈＩｇＧ抗体を、２つの別々のアッセイにおける検出に使用した。前記抗ＭＭＡＦ抗体ＥＬＩＳＡは、トラスツズマブＭＭＡＦコンジュゲートの濃度のみを測定し、前記抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡは、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦコンジュゲート及びＭＭＡＦを欠いているトラスツズマブ抗体の両方を定量する。前記マウスに注射したのと同じ材料を使用して、各ＡＤＣについて別々に検量線を生成した。したがって、前記トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの薬剤負荷に対する変化がマウスへの注射後に起こらない場合、抗ＭＭＡＦ及び抗ｈＩｇＧについてのアッセイでは、同一の濃度値が得られるはずである。一部のＭＭＡＦペイロードを失ったトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについて、前記抗ＭＭＡＦ抗体によるＥＬＩＳＡアッセイは、抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡより低い濃度を測定する。したがって、２つの濃度値を比較することにより、マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏインキュベート中での、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣからの薬剤放出の測定が可能となる。
【０２３１】
抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより測定した場合、６５個のうちの６３個のＡＤＣが、非コンジュゲートの野生型トラスツズマブ抗体と同様の薬物動態プロファイルを示した（図１８、１９、２０）。このことは、これらの部位へのＭＣ−ＭＭＡＦペイロードのコンジュゲートが抗体のクリアランスに有意に影響を及ぼさなかったことを示す。２つの例外は、ＨＣ−Ｔ３３５Ｃ及びＨＣ−Ｓ３３７Ｃである。これら２つの部位へのＭＣ−ＭＭＡＦのコンジュゲートは、前記抗ＭＭＡＦ及び前記抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより測定した場合、前記ＡＤＣの急速なクリアランスをもたらす（図２１）。タンパク質熱シフトアッセイは、トラスツズマブＨＣ−Ｔ３３５Ｃ−ＭＭＡＦ及びトラスツズマブＨＣ−Ｓ３３７Ｃ−ＭＭＡＦについてのＴｍ１が野生型トラスツズマブ抗体の６９℃からそれぞれ４２℃及び４５℃に低下したことを示した（図１４）。前記２つの部位へのＭＣ−ＭＭＡＦのコンジュゲートは、前記ＡＤＣの熱安定性を劇的に低下させた（それぞれ、２７℃及び２４℃）。非コンジュゲート抗体と同様の薬物動態プロファイルを示す６３個のＡＤＣについて、Ｔｍ１の変化は、８℃より小さかった。このことは、速いクリアランスが前記ＡＤＣの低い熱安定性と関連する可能性があることを示唆している。
【０２３２】
種々のＣｙｓ部位における、前記ＭＭＡＦペイロードと前記抗体との間の結合の化学的安定性を決定するために、抗ＭＭＡＦ  ＥＬＩＳＡにより測定した場合のトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの濃度と、抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより測定した場合の全てのトラスツズマブ分子の濃度とを、各サンプルについて互いに比較した。測定の誤差範囲内で、多くのトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣが、２週間の期間にわたって、２つの濃度間で良好な重複を示した。このことは、ＭＣ−ＭＭＡＦとこれらの部位に導入されたシステインとの間の結合がこの期間にわたってマウスの循環中において安定していたことを示唆している（図１８、１９）。対照的に、一部のトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣは、前記抗ＭＭＡＦ値より高い抗ｈＩｇＧ値が示すように、著しい薬剤損失を示した（図２０）。一部のトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについて、前記ＡＤＣ濃度は、ｈＩｇＧ濃度の約５０％であった。これらの結果は、先に示唆されているように（Shen et al. Nat. Biotechnol. 2012, 30 (2):184-9）、種々の部位にコンジュゲートした薬剤ペイロードのチオール−マレイミド結合の安定性に顕著な差異が存在することを示唆している。良好な安定性を有する部位が、本願明細書に記載されたＡＤＣを調製するのに使用するための好ましい部位である。
【０２３３】
薬物動態試験において、血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、投与した薬剤の全クリアランス及び生物学的利用能を推定する重要なパラメータである。本発明者らの薬物動態試験では、各トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについて、２つのＡＵＣ値、ＡＵＣ−ＭＭＡＦ及びＡＵＣ−ｈＩｇＧを、前記抗ＭＭＡＦ及び前記抗ｈＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによる測定から別々に算出した。全てのトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについてのＡＵＣ−ｈＩｇＧに対するＡＵＣ−ＭＭＡＦの比は、０．４〜１．２で変動した（表２０）。図１８、１９及び２０は、観察されたＡＵＣ−ＭＭＡＦ／ＡＵＣ−ｈＩｇＧ比の全範囲にわたるＡＤＣについてのＰＫ曲線を含み、前記測定の変動性及び不確実性を示す。ＡＵＣ−ｈＩｇＧに対するＡＵＣ−ＭＭＡＦの比が１より大きいこと（表２０）は、２５％より大きい不確実性を示唆している。これは、薬剤損失が起こらない場合、前記比は、１付近のままのはずだからである。表２０に示したように、両ＥＬＩＳＡから測定可能なＡＵＣに関して、６３個のトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのうち、４０個のＡＤＣが、０．７より大きいＡＵＣ−ＭＭＡＦ／ＡＵＣ−ｈＩｇＧ比を示す。このことは、前記測定の精度範囲内において、ＭＭＡＦ薬剤損失が、マウスへの投与後にこれらにおいてほとんど観察されなかったことを示す。しかしながら、２３個のＡＤＣは、０．７より小さいＡＵＣ−ＭＭＡＦ／ＡＵＣ−ｈＩｇＧ比を示した。このことは、これらの２３個の部位におけるＭＭＡＦペイロードコンジュゲートの量が、前記マウスでのｉｎ  ｖｉｖｏインキュベート中に著しく減少したことを示唆している。
【０２３４】
種々のコンジュゲート部位におけるマレイミド結合の安定性における差異は、Ｃｙｓ操作ＡＤＣについて先に報告されている（Shen et al., (2012) Nat Biotechnol. 22;30(2):184-9を参照のこと）。向上した血清安定性を示す好ましい部位について、抗体環境は、マレイミドとシステインとの反応により形成されたスクシンイミド環の加水分解をおそらく触媒する。この加水分解型は元に戻ることができず、マレイミド薬剤を放出することができない。したがって、環加水分解を触媒する前記抗体環境の能力は、予測不能であり、特定の操作されたＣｙｓ部位の予期しない特性である。したがって、０．７より大きいＡＵＣ（ＭＭＡＦ）／ＡＵＣ（ｈＩｇＧ）比を有する表２２の部位は、この基準に基づくシステイン置換に特に適している。約０．９以上の比を有する部位は、適用する場合、本発明の目的に特に好ましいシステイン置換部位である。これらは、重鎖の３２２、３３４、１２１、２８８、１７１、１３９、３６０、１１７、３９２、３７５、２９２、３３３、１７４、２５８、３３７、４２２、３２０、３９０及び３３５の部位、並びに、軽鎖の１０７、２０３、１０８及び１１４の部位を含む。
【表２２】
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【０２３５】
実施例１０：２より大きい薬剤対抗体比を有する抗体薬剤コンジュゲートを産生するためのＣｙｓ部位の組み合わせ
リジン残基又は部分的に還元した天然ジスルフィド結合へのコンジュゲートにより産生した抗体コンジュゲートは、多くの場合、３〜４の薬剤対抗体比（ＤＡＲ）を特徴とする。Ｃｙｓ操作抗体は、より典型的には、２のＤＡＲを特徴とする。特定の適用について、より高いＤＡＲを有するＡＤＣを産生するのが望ましい場合がある。前記より高いＤＡＲは、原理的には、前記抗体中に複数のＣｙｓ変異を導入することにより達成され得る。Ｃｙｓ変異数が増加すると、このような変異が、ＡＤＣ調製中に要求される再酸化プロセスを妨害するおそれがあるため、不均一な生成物も増加する。この試験では、良好な再酸化挙動を有する、重鎖及び軽鎖の数多くの単一部位のＣｙｓ変異体を特定した。
【０２３６】
複数のコンジュゲート部位が２より大きいＤＡＲを有するＡＤＣを産生するために組み合わせられ得ることを実証するために、トラスツズマブ及び抗体１４０９０の軽鎖及び重鎖における、複数の好ましい単一部位のＣｙｓ構築物（表２３）を、実施例５に記載したのと同様に、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞において共発現させた。全て、重鎖上に１つのＣｙｓ変異及び軽鎖上に１つのＣｙｓ変異を含む精製した抗体を、実施例６に記載したのと同様に、還元し、再酸化し、ＭＣ−ＭＭＡＦとコンジュゲートする。逆相高圧液体クロマトグラフィーは、天然ジスルフィド結合の効率的な再酸化を示唆している、単一の明確な溶出ピークを示した。ＭＣ−ＭＭＡＦのコンジュゲート後の逆相高圧液体クロマトグラフィーも、ＤＡＲが４のＡＤＣ種についての単一の溶出ピークを主に示した。表２３における全てのＡＤＣのＤＡＲが、質量分析により４であることを確認した。産生収量は、一過性細胞培養物１Ｌあたり１６〜２４ｍｇで変動した。前記ＡＤＣは、分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した場合、主に単量体であった。８個のうち２つの抗体のみについて、少量の凝集体が検出された（表２３）。トラスツズマブ及び１４０９０ＡＤＣは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６及びＣＭＫ１１０５細胞の増殖アッセイそれぞれにおいて、抗原依存性細胞殺傷を示した（表２３）。
【表２３】
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【０２３７】
実施例１１．ＡＤＣの疎水性に基づくＣｙｓ部位の選択
２、４、６及び８のＤＡＲを有するＡＤＣを調製するためのＣｙｓ変異体及び変異体組み合わせの選択をさらに最適化するために、単一部位のトラスツズマブＣｙｓ及びＰｃｌ変異体（Ｐｃｌ  ＡＤＣの調製は、特許出願５５５７３に記載されている）により調製したＭＭＡＦ  ＡＤＣの特性を分析した。コンジュゲート部位のアクセシビリティ及び溶媒暴露を、ＩｇＧの結晶構造中において調べた。
【０２３８】
最も有益なデータの１つは、前記ペイロードが種々の部位に付着した場合、トラスツズマブＰｃｌ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣの疎水性がかなり変動したとの観察であった（図２３）。ＴＳＫゲル  フェニル−５ＰＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫゲル  フェニル−５ＰＷ、１３  ｍ、２１×１５０ｍｍ、ステンレス鋼、Ｃａｔ＃０７６５６；ランニングバッファーＡ：２０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）における１．５Ｍ 硫酸アンモニウム；バッファーＢ：２０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．４）における２０％  イソプロパノール；流速５ｍｌ／分；９０分にわたる２０％〜８０％ バッファーＢの直線勾配；２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によりモニター）を使用する、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、これらのＡＤＣの疎水性を測定した。驚くべきことに、ＤＡＲが２の種の保持時間は、ＡＤＣの中でもかなり変動したが、その差異は、ＡＢＡ−ＭＭＡＦ付着の部位のみであったことが観察された（図２３）。ＨＩＣは、疎水性に基づいて分子を分離する。ＤＡＲが２の全てのＡＤＣは、非コンジュゲート抗体の保持時間より長いＨＩＣ保持時間を有する（ＷＴ＝４５分、図２３）。このことは、疎水性の薬剤分子、例えば、ＡＢＡ−ＭＭＡＦが抗体に付着している場合に予測される。しかしながら、種々の部位にペイロードを付着することは、様々な程度にＡＤＣの疎水性を向上させる。
【０２３９】
前記驚くべき保持時間の大きな差異を、抗体の構造上の付着部位の位置の検査から説明し得る（図２４）。前記薬剤ペイロードが抗体の外側に露出した部位、例えば、ＨＣ−Ｋ２８８Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｎ２８６Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｖ４２２Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｌ３９８Ｐｃｌ及びＨＣ−Ｓ４１５Ｐｃｌに付着している場合、前記保持時間は、より長くなる。この場合、８７〜９４分の保持時間が、各ＡＤＣについて測定された（図２３）。逆に、内側部位、例えば、可変ドメインとＣＨ１ドメインとの間に形成される溝（例えば、ＨＣ−Ｐ１５３Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｅ１５２Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｐ１７１Ｐｃｌ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｐｃｌ、ＬＣ−Ｅ１６１Ｐｃｌ、ＬＣ−Ｅ１６５Ｐｃｌ、ＬＣ−Ｓ１５９Ｐｃｌ）又は、前記抗体のＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間の大きな開口（例えば、ＨＣ−Ｋ２４６Ｃ、ＨＣ−Ｓ３７５Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｔ３９３Ｐｃｌ、ＨＣ−Ｋ３３４Ｐｃｌ）に、前記ペイロードが付着している場合、ＨＩＣ保持時間は、４７〜５７分にのみ増大した。これは、前記ペイロードが、溶媒及び前記ＨＩＣカラムとの相互作用から部分的に遮断されたためである。他の部位について、例えば、比較的露出した部位、ＬＣ−Ｋ１０７Ｐｃｌ及びＨＣ−Ｋ３６０Ｐｃｌについては、７０及び８３分の中間の保持時間が測定された。
【０２４０】
タンパク質薬剤の疎水性を低下させることは、一般的に有益であると考えられる。これは、この低下により、凝集及び循環からのクリアランスが低下する場合があるためである。本発明者らは、図２３に表したＨＩＣデータにより、好ましいペイロード付着部位の選択が可能であることを提案する。溶媒との相互作用から遮断されており、薬剤付着の際に付着が抗体の疎水性を最小限に向上させる部位に薬剤ペイロードをコンジュゲートさせることは、コンジュゲート化学及びペイロードクラスとは無関係に、有益なはずである。疎水性の最小変化をもたらす付着部位を注意深く選択することは、抗体あたり４、６若しくは８個の薬剤が付着する場合、又は、特に疎水性ペイロードを使用する場合、特に有益である場合がある。
【０２４１】
低い疎水性を有するＡＤＣ用に選択したＣｙｓ部位
ＡＤＣの疎水性を最小化するために、前記抗体の種々のタンパク質ドメインの内部に向かう部位を選択した。選択は、適用可能な場合、ＤＡＲ＝２を有する既存のＡＤＣの抗体構造及び挙動の分析に基づいた（挙動＝ＨＩＣにおける保持時間及び／又はＳＥＣ樹脂と相互作用するコンジュゲートによるＡｎＳＥＣにおける遅延した保持時間）。表１及び表２で特定したＣｙｓ部位のうち、表２４に列記した部位が、上記基準を満たした。
【０２４２】
全てのＡＤＣを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分析した。露出した部位、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃ、ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ及びＨＣ−Ｒ２９２ＣにおいてコンジュゲートしたトラスツズマブＭＭＡＦ  ＡＤＣを、比較目的で使用した。結果を表２５に示す。前記トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ及び非コンジュゲートの野生型抗体を、ＴＳＫゲル  ブチル−ＮＰＲカラムにおいて、以下に記載するように分析した。比較のために、ＴＳＫゲル  フェニル−５ＰＷにおいてＰｃｌ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについて先に得たＨＩＣデータ（図２３）も列記する。異なる機器及びプロトコルにも関わらず、また、２つのリンカーの異なる幾何形状及び構造のためにある程度の変動性が予測されるものの、同じ位置にコンジュゲートしているが異なるコンジュゲート法によるＡＤＣについての保持時間比は、ほぼ一定のままである。前記ＨＩＣデータは、保持時間が実際には、付着化学及びリンカー構造とは無関係に、前記抗体の内部でどの程度ペイロードが遮断されているかの目安であることを示唆している。予測通り、種々の付着部位の相対ランキングは、Ｐｃｌ−ＭＭＡＦ及びＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについて大部分は同一のままである。
【０２４３】
表２４で選択した部位、ＨＣ−Ｅ３３３Ｃ、ＨＣ−Ｋ３９２Ｃ及びＨＣ−Ｋ３２６Ｃへの付着は、露出した部位のＡＤＣ、ＬＣ−Ｋ１０７Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｅ２５８Ｃ−ＭＭＡＦ、ＨＣ−Ｒ２９２Ｃ−ＭＭＡＦ及びＨＣ−Ｋ３６０Ｃ−ＭＭＡＦに類似するＨＩＣ保持時間を有するＭＭＡＦ  ＡＤＣをもたらす（表２８）。ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ、ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ、ＨＣ−Ｐ１７１Ｃ、ＬＣ−Ｒ１４２Ｃ、ＬＣ−Ｅ１６１Ｃ、ＨＣ−Ｌ１７４Ｃ及びＨＣ−Ｓ１２４Ｃの部位への付着は、得られたＡＤＣの保持時間を、非コンジュゲートの野生型抗体と比較して１５％未満まで増大させる。これらの部位は全て、前記ＣＨ１ドメイン上又は前記軽鎖（ＬＣ）上に位置し、ＨＩＣ保持時間データは、それらが好ましい付着部位であると示唆している。ＣＨ３ドメイン部位の中でも、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃは、コンジュゲートの際、疎水性の最も低い向上を示すため、それらが好ましい付着部位となる。
【表２４】
0006609477.tif 000124
【表２５】
0006609477.tif 000125
分析的ＨＩＣプロトコルの詳細
Ｄｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）に取り付けられた、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）ＴＳＫゲル  ブチル−ＮＰＲカラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ、２．５μｍ）を使用して、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣについての分析的ＨＩＣデータを収集した。前記方法は、バッファーＡ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、１．５Ｍ 硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）及びバッファーＢ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の二成分勾配からなった。約５０μｇの抗体（ＰＢＳ）を、等量の３Ｍ 硫酸アンモニウムと希釈することにより、サンプルを調製した。前記勾配は、１００％ Ａで５分保持、続けて、４０分にわたる２０〜１００％ Ｂの直線勾配、最後に、次の注射前の、最初の条件における１０分間の再平衡化からなった。分離を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によりモニターした。
【０２４４】
ＤＡＲが４、６及び８のＣｙｓ  ＡＤＣの調製及び特徴付け
Ｃｙｓ変異は、ＤＡＲが４、６及び８のＡＤＣの調製のために組み合わせ得る。一般的に、前記好ましい組み合わせは、４のＤＡＲを有するＡＤＣをもたらす２つのＣｙｓ変異の組み合わせである。ＤＡＲが４のＡＤＣを調製するための、重鎖（ＨＣ）Ｃｙｓ変異体と軽鎖（ＬＣ）Ｃｙｓ変異体との組み合わせを含む一部の例を、トラスツズマブ及び抗体１４０９０について、実施例１０に示す。更なるデータを、表２６に提供する。ＨＩＣデータ及び前記ＩｇＧ結晶構造中の付着部位の検査に基づいて、実施例２、５及び６に記載したプロトコルを使用して、更なるＣｙｓの組み合わせを調製した。選択した例のＭＭＡＦ  ＡＤＣについてのデータを、表２６に示す。さらに、選択した重鎖部位を組み合わせ、前記重鎖の二重Ｃｙｓ変異を、実施例２に列記したプロトコルに従ってクローニングした。２つのＨＣ  Ｃｙｓ変異を特徴とする抗体を調製し、実施例５及び６に記載したプロトコルに従ってコンジュゲートした。
【０２４５】
ＤＡＲが４のＡＤＣを調製するために、組み合わせは、表２４に列記した単一部位の変異を含む。単一部位の組み合わせは、低い疎水性を有するＡＤＣをもたらした（表２５）。一部の組み合わせでは、１つのＣｙｓ変異は、ＣＨ１ドメイン又は前記軽鎖に位置し、第２部位は、ＣＨ３ドメインに位置する。このような組み合わせの例は、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃと、ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ及びＨＣ−Ｓ３７５Ｃと、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ及びＨＣ−Ｋ３３４Ｃと、ＬＣ−Ｅ１６５Ｃ及びＨＣ−Ｋ３３４ＣとのＣｙｓ変異体の組み合わせを特徴とする抗体である。
【０２４６】
３つ又は４つのＣｙｓ変異を１つの抗体中で組み合わせた場合、６及び８のＤＡＲを有するＡＤＣも調製し得る。選択した重鎖の組み合わせを、ＤＡＲが４、６及び８のＡＤＣの調製用に組み合わせた。前記重鎖の二重及び三重Ｃｙｓ変異を、実施例２に列記したプロトコルに従ってクローニングした。２、３及び４つのＣｙｓ変異を特徴とする抗体を調製し、実施例５及び６に記載したプロトコルに従ってコンジュゲートした。ＤＡＲが４、ＤＡＲが６及びＤＡＲが８のＡＤＣの一部の例の特徴を、表２６にまとめる。これらのＡＤＣの一部は、図２５に示したように、驚くほど良好なＰＫ特性を有する。抗体１４０９０は、マウス交差反応性である。したがって、予測通り、抗体１４０９０  ＡＤＣは、いずれのマウス抗原にも結合していないトラスツズマブＡＤＣよりも急速に排出される。
【０２４７】
組み合わせは、表２４に列記した単一部位変異を３つ及び４つ有するものを含む。組み合わせは、低い疎水性を有するＡＤＣをもたらしたそれらの部位を含む（表２５）。組み合わせは、ＣＨ１ドメイン又は前記軽鎖（ＬＣ）に位置する１つのＣｙｓ変異を含む。場合により、更なる１〜３個の部位が、ＣＨ３ドメインにある。このような組み合わせの例は、ＨＣ−Ｅ１５２Ｃ又はＬＣ−Ｅ１６５Ｃと、ＨＣ−Ｓ３７５Ｃと、ＨＣ−Ｋ３３４Ｃ及び／又はＨＣ−Ｋ３９２ＣのＣｙｓ変異体の組み合わせを特徴とする抗体を含む。ＤＡＲが６及びＤＡＲが８のＡＤＣを調製するのに好ましい組み合わせを、それぞれ表２７及び２８に示す。
【０２４８】
わずかな例外を除いて、試験した全てのＣｙｓ部位におけるＭＭＡＦの付着は、ＤＡＲが２のＡＤＣの、高い熱安定性（実施例７、表１９）、低い凝集傾向（実施例６、表１８）及び良好な薬物動態特性（実施例９、表２２、図１８）を有するＡＤＣをもたらす。ＡＤＣの疎水性の差異は、比較的可溶性のペイロード、例えばＭＭＡＦを使用する場合、生物物理学的及び薬物動態的特性における大きな差異とならないことは明らかである。実際に、上記で示したように、露出した「疎水性」部位、例えば、ＨＣ−Ｋ３６０Ｃをより好ましい付着部位との組み合わせで使用しても、許容可能な薬物動態特性を有する、ＤＡＲが４、ＤＡＲが６及びＤＡＲが８のＭＭＡＦ  ＡＤＣを調製することができる。ただし、十分な挙動性を示さず、より疎水性のペイロードを使用する場合、疎水性の最小変化をもたらす付着部位を注意深く選択することが、良好な薬物動態特性を有する非凝集性のＡＤＣの調製を可能にするのに必須となる場合がある。このような疎水性ペイロードについて、疎水性の向上を低下させる部位の組み合わせを使用することが、抗体あたり４、６又は８個の薬剤を付着させる場合、有益である場合がある。
【表２６】
0006609477.tif 000126
【表２７】
0006609477.tif 000127
【表２８】
0006609477.tif 000128
【０２４９】
実施例１２．トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
ｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植片腫瘍モデルは、関連する十分特徴付けられたヒト原発性腫瘍又は腫瘍細胞株を、免疫不全ヌードマウスに移植することにより観察される生物学的活性をシミュレートする。抗ガン剤による腫瘍異種移植マウスの処置試験は、試験した試薬のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に関する有益な情報を提供している（Sausville and Burger, 2006）。ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞が抗原依存的な方法でトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣに感受性であったため（図１５）、前記細胞株をｉｎ  ｖｉｖｏモデルとして選択し、前記トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣを評価した。全ての動物試験を、実験動物の管理と使用に関する指標（NIH publication；National Academy Press, 8th edition, 2001）に基づいて行った。ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの皮下に移植した（Morton and Houghton, 2007）。腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に達した後に、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣを、３ｍｇ／ｋｇの単回投与でのＩＶ注射により、前記マウスに投与した。前記腫瘍の成長を、ＡＤＣ注射後に毎週測定した。各処置群には、９匹のマウスが含まれていた。３つのトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣによるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験の例を、図２２に示す。３ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣによるマウスの処置により、試験した３つのＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣ全てについて、腫瘍退縮が引き起こされた（図２２）。前記ＡＤＣ処置に関連する体重減少は観察されなかった。前記結果から、３ｍｇ／ｋｇでの単回投与処置により、トラスツズマブＣｙｓ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６腫瘍の退縮を効果的に引き起こしたことが確認された。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１２
１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３３４、３６０、３７
５及び３９２位から選択される部位において、その定常領域上の１つ以上のアミノ酸のシ
ステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、
イムノコンジュゲート。
［２］
前記１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換が、１２１、１２４、１５２、２５８
、３３４、３６０及び３９２位から選択される、請求項１に記載のイムノコンジュゲート
。
［３］
前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号４、５、１０、１７、１８、２９、３５、
４２、４３、４８、５０、５４、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４及び２９５か
らなる群から選択される配列を含む、請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲート。
［４］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０
７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択される部位において
、その定常領域上の１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｅ
Ｕシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、イムノ
コンジュゲート。
［５］
前記１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換が、１４５又は１６５位から選択され
る、請求項４に記載のイムノコンジュゲート。
［６］
前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号６１、６２、６９、７１、７５、７６及び
７７からなる群から選択される配列を含む、請求項４に記載のイムノコンジュゲート。
［７］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１４
３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択される部位において、その定常領域上
の１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステム
に基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲ
ート。
［８］
前記抗体又は抗体フラグメントが、配列番号９２、９４、９６、９７及び９８からなる
群から選択される配列を含む、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
［９］
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０
７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択される部位において
、その定常領域上の１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換をさらに含み、前記位置
が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、
請求項１、２又は３に記載のイムノコンジュゲート。
［１０］
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１４
３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択されるその定常領域上の１つ以上のア
ミノ酸のシステインによる置換をさらに含み、前記軽鎖位置が、Ｋａｂａｔシステムに基
づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、請求項１、２又は３に
記載のイムノコンジュゲート。
［１１］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、１５２及び３７５位又は３２７及び３７５位に
おいて、重鎖の定常領域上の２つ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを
含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート
。
［１２］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、軽鎖の１０７位及び重鎖の３６０位を含むその
定常領域上の２つ以上のアミノ酸のシステインによる置換の組み合わせを含み、前記軽鎖
が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノ
コンジュゲート。
［１３］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１１
７、１１９、１２１、１２４、１３９、１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６
９、１７１、１７４、１８９、２０５、２０７、２４６、２５８、２６９、２７４、２８
６、２８８、２９０、２９２、２９３、３２０、３２２、３２６、３３３、３３４、３３
５、３３７、３４４、３５５、３６０、３７５、３８２、３９０、３９２、３９８、４０
０及び４２２位から選択されるその定常領域上の１つ以上のアミノ酸のシステインによる
置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュ
ゲート。
［１４］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０
７、１０８、１０９、１１４、１２９、１４２、１４３、１４５、１５２、１５４、１５
６、１５９、１６１、１６５、１６８、１６９、１７０、１８２、１８３、１９７、１９
９及び２０３位から選択されるその定常領域上の１つ以上のアミノ酸のシステインによる
置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒ
トカッパ軽鎖である、イムノコンジュゲート。
［１５］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又は抗体フラグメントが、前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖のその定
常領域上の、１４３、１４５、１４７、１５６、１５９、１６３、１６８位から選択され
る１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステム
に基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、イムノコンジュゲ
ート。
［１６］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の２つ以上のアミノ酸のシ
ステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、抗体重鎖の３７５位及び抗
体軽鎖の１６５位、又は、抗体重鎖の３３４位、抗体軽鎖の１６５位における置換を含み
、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされてい
る、イムノコンジュゲート。
［１７］
薬剤抗体比が、約４である、請求項１１、１２及び１６のいずれか一項に記載のイムノ
コンジュゲート。
［１８］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の３つ以上のアミノ酸のシ
ステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
ａ．抗体重鎖の３７５及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位、
ｂ．抗体重鎖の３３４及び３７５位並びに抗体軽鎖の１６５位、並びに
ｃ．抗体重鎖の３３４及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位
から選択される置換を含み、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置が、ＥＵシステムに
基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
［１９］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の３つ以上のアミノ酸のシ
ステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
ａ．抗体重鎖の１５２、３７５及び３９２位、
ｂ．抗体重鎖の１５２、３３４及び３７５位、並びに
ｃ．抗体重鎖の１５２、３３４及び３９２位
から選択される置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、
イムノコンジュゲート。
［２０］
薬剤抗体比が、約６である、請求項１８又は１９に記載のイムノコンジュゲート。
［２１］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の４つ以上のアミノ酸のシ
ステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、抗体重鎖の３３４、３７５
及び３９２位並びに抗体軽鎖の１６５位、又は、抗体重鎖の３３３、３７５及び３９２位
並びに抗体軽鎖の１６５位における置換を含み、前記軽鎖が、カッパ鎖であり、前記位置
が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュゲート。
［２２］
修飾抗体又はその抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートであって、
前記修飾抗体又はその抗体フラグメントが、その定常領域上の４つ以上のアミノ酸のシ
ステインによる置換の組み合わせを含み、前記組み合わせが、抗体重鎖の１５２、３３４
、３７５及び３９２位、又は、抗体重鎖の１５２、３３３、３７５及び３９２位における
置換を含み、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、イムノコンジュ
ゲート。
［２３］
薬剤抗体比が、約８である、請求項２１又は２２に記載のイムノコンジュゲート。
［２４］
さらに、薬剤部分を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲ
ート。
［２５］
薬剤部分が、前記システインの硫黄及び任意のリンカーを介して、前記修飾抗体又は抗
体フラグメントに付着している、請求項２４に記載のイムノコンジュゲート。
［２６］
前記薬剤部分が、開裂性又は非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記硫黄
に結合している、請求項２５に記載のイムノコンジュゲート。
［２７］
前記薬剤部分が、非開裂性のリンカーを介して、前記システインの前記硫黄に結合して
いる、請求項２５に記載のイムノコンジュゲート。
［２８］
前記イムノコンジュゲートが、チオール−マレイミド結合を含む、請求項２５に記載の
イムノコンジュゲート。
［２９］
前記イムノコンジュゲートが、−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−結合又はジスルフィド結合
を含む、請求項２５に記載のイムノコンジュゲート。
［３０］
前記薬剤部分が、細胞傷害剤である、請求項２５から２９のいずれか一項に記載のイム
ノコンジュゲート。
［３１］
前記薬剤部分が、タキサン、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、
アントラサイクリン、チューブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチ
ンＥ、オーリスタチンＦ及びメイタンシノイドからなる群から選択される、請求項３０に
記載のイムノコンジュゲート。
［３２］
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から３１のいずれか一項に記載のイ
ムノコンジュゲート。
［３３］
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項１から３１のいずれか一項に記載のイムノコン
ジュゲート。
［３４］
前記抗体が、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項３１に記載のイムノコンジュ
ゲート。
［３５］
前記抗体が、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、請求項３１に記載のイムノコ
ンジュゲート。
［３６］
前記抗体又は抗体フラグメントが、腫瘍に特有の細胞表面マーカーに特異的に結合する
、請求項１から３２のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
［３７］
請求項１から３６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物。
［３８］
修飾抗体又はその抗体フラグメントであって、
前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１１７、１１９、１２１、１２４、１３９、
１５２、１５３、１５５、１５７、１６４、１６９、１７１、１７４、１８９、２０５、
２０７、２４６、２５８、２６９、２７４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９３、
３２０、３２２、３２６、３３３、３３４、３３５、３３７、３４４、３５５、３６０、
３７５、３８２、３９０、３９２、３９８、４００及び４２２位から選択されるその定常
領域上の１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステム
に基づいて番号付けされている、修飾抗体又はその抗体フラグメント。
［３９］
修飾抗体又はその抗体フラグメントであって、
前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１０９、１１４、１２９、
１４２、１４３、１４５、１５２、１５４、１５６、１５９、１６１、１６５、１６８、
１６９、１７０、１８２、１８３、１９７、１９９及び２０３位から選択されるその定常
領域上の１つ以上のアミノ酸のシステインによる置換を含み、前記位置が、ＥＵシステム
に基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、修飾抗体又はその
抗体フラグメント。
［４０］
修飾抗体又はその抗体フラグメントであって、
前記抗体又は抗体フラグメントの軽鎖のその定常領域上の、１４３、１４５、１４７、
１５６、１５９、１６３、１６８位から選択されるその定常領域上の１つ以上のアミノ酸
のシステインによる置換を含み、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けさ
れており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、修飾抗体又はその抗体フラグメント。
［４１］
前記置換が、前記重鎖の１２１、１２４、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、
３３３、３６０及び３７５位から選択される少なくとも１つのシステインであり、前記位
置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、請求項３８に記載の修飾抗体又は抗
体フラグメント。
［４２］
前記置換が、２〜６個のシステインであり、前記システインが、重鎖の１２１、１２４
、１５２、１７１、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５から選択される
位置にあり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付けされている、請求項３８に記
載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
［４３］
前記置換が、軽鎖の１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位か
ら選択される少なくとも１つのシステインであり、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて
番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、請求項３９に記載の修飾抗体
又は抗体フラグメント。
［４４］
前記置換が、２〜６個のシステインであり、前記システインが、軽鎖の１０７、１０８
、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位から選択される位置にあり、前記位置が
、ＥＵシステムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトカッパ軽鎖である、請
求項３９に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
［４５］
前記置換が、軽鎖の１４３、１４７、１５９、１６３及び１６８位から選択される少な
くとも１つのシステインであり、前記位置が、Ｋａｂａｔシステムに基づいて番号付けさ
れており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、請求項４０に記載の修飾抗体又は抗体フ
ラグメント。
［４６］
前記置換が、２〜６個のシステインであり、前記システインが、軽鎖の１４３、１４７
、１５９、１６３及び１６８位から選択される位置にあり、前記位置が、Ｋａｂａｔシス
テムに基づいて番号付けされており、前記軽鎖が、ヒトラムダ軽鎖である、請求項３８に
記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
［４７］
さらに、薬剤部分に付着し、前記薬剤部分が、前記システインの硫黄及び任意のリンカ
ーを介して、前記修飾抗体又は抗体フラグメントに付着している、請求項１１、１２、１
４から２２、３８から４７のいずれか一項に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
［４８］
前記薬剤部分が、リンカーユニットを介して、前記システインの硫黄に付着している、
請求項４７に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
［４９］
少なくとも１つのＰｃｌ若しくは非天然アミノ酸置換若しくは酵素媒介性コンジュゲー
ト化用のペプチドタグ及び／又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項３８から４８
のいずれか一項に記載の修飾抗体又は抗体フラグメント。
［５０］
請求項３８から４９のいずれか一項に記載の修飾抗体又は抗体フラグメントをコードす
る核酸。
［５１］
請求項５０に記載の核酸を含む宿主細胞。
［５２］
修飾抗体又は抗体フラグメントを製造する方法であって、
請求項４９に記載の宿主細胞を、前記抗体又は抗体フラグメントを発現させるのに適し
た条件下でインキュベートすること、及び、前記抗体又は抗体フラグメントを単離するこ
とを含む、方法。
［５３］
システインによる置換に適した抗体のアミノ酸を選択して、コンジュゲート化に適した
部位を提供する方法であって、
（１）適切な表面露出を有する前記抗体の定常領域中のアミノ酸を特定して、初期候補
部位のセットを提供することと、
（２）各初期候補部位について、その部位における天然アミノ酸がシステインにより置
換されている抗体を発現させることと、
（３）発現した各抗体について、発現したタンパク質が、還元及び再酸化後に実質的に
均一であるかどうかを決定して、前記初期候補部位に遊離システインを有する機能的な抗
体を提供することと、
（４）実質的に均一で、機能的な発現した各タンパク質について、前記初期候補部位に
おけるシステインをマレイミド部分とコンジュゲートさせて、チオール−マレイミド結合
がその部位において不安定化されているかどうかを決定することと、
（５）前記発現した抗体が実質的に均一でなく、機能的でない初期候補部位、及び、前
記チオール−マレイミド結合が不安定化されている初期候補部位を、前記初期候補部位の
セットから除去して、システイン置換に有益な部位のセットを提供することと、
を含む、方法。
［５４］
各有益なシステイン置換部位のコンジュゲートについての融解温度を測定し、システイ
ン置換及びコンジュゲート化によって前記融解温度が親抗体の融解温度と５℃以上異なっ
ている部位を前記セットから除去する工程をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
［５５］
特定された置換部位の１つ以上にシステインを含む抗体又は抗体フラグメントを製造す
ることをさらに含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
［５６］
イムノコンジュゲートを製造するための方法であって、
リンカーユニット（ＬＵ）又はリンカーユニット−ペイロードの組み合わせ（−ＬＵ−
Ｘ）を、抗体又は抗体フラグメント中のシステイン残基に付着させることを含み、前記シ
ステインが、前記抗体又は抗体フラグメントの重鎖の、１２１、１２４、１５２、１７１
、１７４、２５８、２９２、３３３、３６０及び３７５位、並びに、前記抗体又は抗体フ
ラグメントの軽鎖の、１０７、１０８、１４２、１４５、１５９、１６１及び１６５位か
ら選択されるシステイン置換部位に位置し、前記位置が、ＥＵシステムに基づいて番号付
けされている、方法。
［５７］
前記イムノコンジュゲートが、式（Ｉ）：
【化５３】
0006609477.tif 000129
で表されるものであり、
式中、Ａｂは、本願明細書に記載された好ましいシステイン置換部位の１つに、少なく
とも１つのシステイン残基を含む抗体又は抗体フラグメントを表し、
ＬＵは、本願明細書に記載されたリンカーユニットであり、
Ｘは、ペイロード又は薬剤部分であり、
ｎは、１〜１６の整数である、請求項５６に記載の方法。
【図１Ａ】
0006609477.tif 000130
【図１Ｂ】
0006609477.tif 000131
【図２】
0006609477.tif 000132
【図３】
0006609477.tif 000133
【図４】
0006609477.tif 000134
【図５】
0006609477.tif 000135
【図６】
0006609477.tif 000136
【図７】
0006609477.tif 000137
【図８】
0006609477.tif 000138
【図９】
0006609477.tif 000139
【図１０】
0006609477.tif 000140
【図１１Ａ】
0006609477.tif 000141
【図１１Ｂ】
0006609477.tif 000142
【図１１Ｃ】
0006609477.tif 000143
【図１１Ｄ】
0006609477.tif 000144
【図１２】
0006609477.tif 000145
【図１３】
0006609477.tif 000146
【図１４】
0006609477.tif 000147
【図１５】
0006609477.tif 000148
【図１６】
0006609477.tif 000149
【図１７】
0006609477.tif 000150
【図１８Ａ】
0006609477.tif 000151
【図１８Ｂ】
0006609477.tif 000152
【図１８Ｃ】
0006609477.tif 000153
【図１８Ｄ】
0006609477.tif 000154
【図１８Ｅ】
0006609477.tif 000155
【図１９Ａ】
0006609477.tif 000156
【図１９Ｂ】
0006609477.tif 000157
【図１９Ｃ】
0006609477.tif 000158
【図１９Ｄ】
0006609477.tif 000159
【図２０Ａ】
0006609477.tif 000160
【図２０Ｂ】
0006609477.tif 000161
【図２０Ｃ】
0006609477.tif 000162
【図２０Ｄ】
0006609477.tif 000163
【図２１】
0006609477.tif 000164
【図２２】
0006609477.tif 000165
【図２３Ａ】
0006609477.tif 000166
【図２３Ｂ】
0006609477.tif 000167
【図２４Ａ】
0006609477.tif 000168
【図２４Ｂ】
0006609477.tif 000169
【図２４Ｃ】
0006609477.tif 000170
【図２５Ａ】
0006609477.tif 000171
【図２５Ｂ】
0006609477.tif 000172
【図２５Ｃ】
0006609477.tif 000173
【図２５Ｄ】
0006609477.tif 000174
【図２５Ｅ】
0006609477.tif 000175
【図２５Ｆ】
0006609477.tif 000176
【図２５Ｇ】
0006609477.tif 000177
【図２５Ｈ】
0006609477.tif 000178
【図２５Ｉ】
0006609477.tif 000179
【図２５Ｊ】
0006609477.tif 000180
【図２５Ｋ】
0006609477.tif 000181
【図２５Ｌ】
0006609477.tif 000182
【配列表】
0006609477000001.app