(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の特性を有し、配列番号１〜１７の何れか一つに記載のアミノ酸配列を有する金属結合性ペプチド：
（ｉ）パラジウムへの結合能を有する；
（ｉｉ）ペプチド全体に占めるＲ及びＫの合計比率が少なくとも３０％である；
（ｉｉｉ）等電点が９．５〜１２．５である；及び
（ｉｖ）親疎水性指標が−０．８００〜−３．２００である、
からなる結合剤。
【請求項２】
蛋白質に請求項１に記載の結合剤を連結した、金属結合性蛋白質。
【請求項３】
蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に結合剤を連結した、請求項２記載の金属結合性蛋白質。
【請求項４】
蛋白質が抗体又は酵素である、請求項２又は３記載の金属結合性蛋白質。
【請求項５】
蛋白質が酸化還元酵素である、請求項２〜４の何れか１項に記載の金属結合性蛋白質。
【請求項６】
請求項２〜５の何れか１項に記載の金属結合性蛋白質を含む、測定試薬組成物。
【請求項７】
請求項２〜５の何れか１項に記載の金属結合性蛋白質を使用する、試料中の測定対象物の測定方法。
【請求項８】
測定対象物がグルコースである、請求項７記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属結合能を有する結合剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
電極の表面に抗体又は酵素等の蛋白質を固定化した電極が、バイオセンサやバイオ電池に使用されている。固定化には架橋剤を用いた方法等が知られているが、蛋白質の配向性を制御することが難しいという問題があった（特許文献１）。
【０００３】
配向性を制御する固定化方法も知られているが、電極構成基材が炭素基材に限定される、又は酵素が特定の構造を有する必要があり、汎用性が低いという問題があった（特許文献２又は３）。
【０００４】
一方、幾つかの金属結合性ペプチドが知られていた（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−６１５４号公報
【特許文献２】特開２００５−８３８７３号公報
【特許文献３】特許第５２１９２６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ”、（英国）、２００３年、第２巻、ｐ．５７７−５８５
【非特許文献２】“Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ”、（米国）、２００７年、第３巻、第３号、ｐ．２８９−２９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
電極への蛋白質の固定化において、配向性を制御できる固定化方法であって、かつ汎用性のある固定化方法が求められていた。本発明は、前記に鑑みてなされたものであり、金属結合能を有する結合剤及び該結合剤を連結した金属結合性蛋白質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、金属結合能を有するペプチドを見出した。更に、蛋白質に該ペプチドを連結することで、金属に蛋白質を結着できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］の態様に関する。
［１］以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の特性を有する金属結合性ペプチドからなる結合剤：
（ｉ）金及び白金族金属結合能を有する；
（ｉｉ）塩基性ペプチドである；
（ｉｉｉ）親水性ペプチドである；
（ｉｖ）配向性制御能を有する。
［２］ペプチド全体に占めるＲ及びＫの合計比率が少なくとも３０％である金属結合性ペプチドからなる、［１］記載の結合剤。
［３］６アミノ酸の金属結合性ペプチドからなる、［１］又は［２］記載の結合剤。
［４］以下の（ｖ）、（ｖｉ）及び（ｖｉｉ）の特性を有する、［１］〜［３］の何れかに記載の結合剤：
（ｖ）等電点が８．５〜１３．５である；
（ｖｉ）親疎水性指標が−０．２００〜−４．０００である；
（ｖｉｉ）４〜１４アミノ酸からなる。
［５］以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する、結合剤：
（ａ）以下の（１）〜（１７）の何れかに記載のアミノ酸配列；
（１）Ｋ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｖ及びＲからなるアミノ酸配列、
（２）Ｖ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｒ及びＫからなるアミノ酸配列、
（３）Ｓ、Ｒ、Ａ、Ａ、Ｋ及びＹからなるアミノ酸配列、
（４）Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｋ、Ｖ及びＶからなるアミノ酸配列、
（５）Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｇ、Ｒ及びＶからなるアミノ酸配列、
（６）Ｋ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ａ及びＭからなるアミノ酸配列、
（７）Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｇ、Ｖ及びＫからなるアミノ酸配列、
（８）Ｋ、Ｑ、Ｋ、Ｋ、Ｔ及びＴからなるアミノ酸配列、
（９）Ｒ、Ｔ、Ｒ、Ｎ、Ｒ及びＳからなるアミノ酸配列、
（１０）Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｇ、Ｒ及びＫからなるアミノ酸配列、
（１１）Ｋ、Ｇ、Ａ、Ｋ、Ｋ及びＶからなるアミノ酸配列、
（１２）Ｋ、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｋ及びＧからなるアミノ酸配列、
（１３）Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、Ｒ及びＧからなるアミノ酸配列、
（１４）Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｋ、Ｋ及びＫからなるアミノ酸配列、
（１５）Ｒ、Ｇ、Ｙ、Ｋ、Ｋ及びＧからなるアミノ酸配列、
（１６）Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｋ及びＡからなるアミノ酸配列、
（１７）Ｒ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｋ及びＧからなるアミノ酸配列
（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
［６］以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する、［５］に記載の結合剤：
（ｃ）配列番号１〜１７の何れかに記載のアミノ酸配列；
（ｄ）（ｃ）に記載のアミノ酸配列の逆配列；
（ｅ）（ｃ）又は（ｄ）に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
［７］Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｍ、Ｌ、Ｄ又はＥから選ばれるアミノ酸からなる、［１］〜［６］の何れかに記載の結合剤。
［８］蛋白質に［１］〜［７］の何れかに記載の結合剤を連結した、金属結合性蛋白質。
［９］蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に結合剤を連結した、［８］記載の金属結合性蛋白質。
［１０］蛋白質が抗体又は酵素である、［８］又は［９］記載の金属結合性蛋白質。
［１１］蛋白質が酸化還元酵素である、［８］〜［１０］の何れかに記載の金属結合性蛋白質。
［１２］［８］〜［１１］の何れかに記載の金属結合性蛋白質を含む、測定試薬組成物。
［１３］［８］〜［１１］の何れかに記載の金属結合性蛋白質を使用する、試料中の測定対象物の測定方法。
［１４］測定対象物がグルコースである、［１３］記載の測定方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、金属結合能を有するペプチドからなる結合剤が利用できるようになった。更に、抗体や酵素等の蛋白質に該結合剤を連結することで、金属結合性蛋白質を得ることができる。該蛋白質は、容易に金属へ結合するため、該蛋白質を簡便に電極へ固定化でき、かつ該蛋白質の配向性を持たせた固定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】金属結合性蛋白質固定化電極の模式図である。左から、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端、並びにＮ末端及びＣ末端に金属結合性ペプチドを連結した金属結合性蛋白質の固定化を表している。
【図２】金属結合性エステラーゼＥｓｔ−Ｎ１〜１７及びＥｓｔ−Ｃ１〜１７の模式図である。
【図３】金属結合性エステラーゼの結合能の評価結果である。
【図４】金属結合性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの配向性制御能評価結果である。
【図５】金属結合性グルコース脱水素酵素ＧＬＤ−Ｎ１、ＧＬＤ−Ｃ１’及びＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’の模式図である。
【図６】金属結合性グルコース脱水素酵素ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’の結合能の評価結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の結合剤は、以下の特性を有する金属結合性ペプチドからなる。
（ｉ）金及び白金族金属結合性ペプチドである。
（ｉｉ）塩基性ペプチドである。
（ｉｉｉ）親水性ペプチドである。
（ｉｖ）配向性制御能を有する。
【００１３】
本発明の結合剤は、好ましくは以下の特性を有する金属結合性ペプチドからなる。
（ｖ）等電点が８．５〜１３．５であり、好ましくは９．０〜１３．０であり、より好ましくは９．５〜１２．５である。
尚、該等電点は、ＥｘＰＡＳｙのＰｒｏｔＰａｒａｍ  ｔｏｏｌ（http://web.expasy.org/protparam/）で算出した理論上の等電点（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｐＩ）である。
（ｖｉ）親疎水性指標が−０．２００〜−４．０００であり、好ましくは−０．５００〜−３．５００であり、より好ましくは−０．８００〜−３．２００である。
尚、該親疎水性指標は、ＥｘＰＡＳｙのＰｒｏｔＰａｒａｍ  ｔｏｏｌ（http://web.expasy.org/protparam/）で算出した親疎水性指標（Ｇｒａｎｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ（ＧＲＡＶＹ））である。
（ｖｉｉ）４〜１４アミノ酸からなり、好ましくは５〜１３アミノ酸又は６〜１２アミノ酸からなり、より好ましくは多くとも１０アミノ酸、９アミノ酸、８アミノ酸又は７アミノ酸からなる結合剤である。更に好ましくは６アミノ酸からなる。
【００１４】
本発明の結合剤は、好ましくは（ｖｉｉｉ）ペプチド全体に占めるアルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）の合計比率が少なくとも２０％である金属結合性ペプチドである。より好ましくは、ペプチド全体に占めるＲとＫの合計比率が、少なくとも２５％、３０％、３５％又は４０％である。
【００１５】
本発明の結合剤は、好ましくは（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する。
（ａ）以下の（１）〜（１７）の何れかに記載のアミノ酸配列。
（１）Ｋ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｖ及びＲからなるアミノ酸配列。
（２）Ｖ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｒ及びＫからなるアミノ酸配列。
（３）Ｓ、Ｒ、Ａ、Ａ、Ｋ及びＹからなるアミノ酸配列。
（４）Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｋ、Ｖ及びＶからなるアミノ酸配列。
（５）Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｇ、Ｒ及びＶからなるアミノ酸配列。
（６）Ｋ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ａ及びＭからなるアミノ酸配列。
（７）Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｇ、Ｖ及びＫからなるアミノ酸配列。
（８）Ｋ、Ｑ、Ｋ、Ｋ、Ｔ及びＴからなるアミノ酸配列。
（９）Ｒ、Ｔ、Ｒ、Ｎ、Ｒ及びＳからなるアミノ酸配列。
（１０）Ｔ、Ｑ、Ｋ、Ｇ、Ｒ及びＫからなるアミノ酸配列。
（１１）Ｋ、Ｇ、Ａ、Ｋ、Ｋ及びＶからなるアミノ酸配列。
（１２）Ｋ、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｋ及びＧからなるアミノ酸配列。
（１３）Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｍ、Ｒ及びＧからなるアミノ酸配列。
（１４）Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｋ、Ｋ及びＫからなるアミノ酸配列。
（１５）Ｒ、Ｇ、Ｙ、Ｋ、Ｋ及びＧからなるアミノ酸配列。
（１６）Ｒ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｋ及びＡからなるアミノ酸配列。
（１７）Ｒ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｋ及びＧからなるアミノ酸配列。
（１）〜（１７）に記載のアミノ酸配列は、何れも構成するアミノ酸の順番は限定されない。より好ましくは、前記に記載の順番からなる配列であり又はその逆配列である。更に好ましくは（１）〜（１７）の何れかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する。好ましくは前記（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の少なくとも１の特性を有する。尚、（１）〜（１７）に記載のアミノ酸は、何れも１文字表記である。
（ｂ）上記（ａ）に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する。数個とは好ましくは３個、より好ましくは２個である。
【００１６】
本発明の結合剤は、好ましくは下記（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する。好ましくは前記（ｉ）から（ｖｉｉｉ）の少なくとも１の特性を有する。
（ｃ）配列番号１〜１７の何れかに記載のアミノ酸配列。
（ｄ）（ｃ）に記載のアミノ酸配列の逆配列。
（ｅ）（ｃ）又は（ｄ）に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。数個とは好ましくは３個、より好ましくは２個である。
【００１７】
本発明の結合剤は、好ましくは下記（ｆ）のアミノ酸配列を有するペプチドからなり、かつ金属への結合能を有する。
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のアミノ酸配列の内、二配列がタンデム結合したアミノ酸配列。タンデム結合する二配列の組み合わせは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に記載のアミノ酸配列であれば特に限定されず、同じ配列の組合せでも良い。
【００１８】
本発明の結合剤は、好ましくはＫ、Ｒ、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｍ、Ｌ、Ｄ又はＥから選ばれるアミノ酸からなる。好ましくはＣ、Ｈ、Ｐ、Ｗ、Ｉ又はＦから選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含まない。
【００１９】
本発明の結合剤は、前記配列を有する金属結合性ペプチドであれば特に限定されず、遺伝子組換えによって得られたペプチドでもよく、合成によって得られたペプチドでもよい。遺伝子組換えは、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を用いて、周知の方法で行えば良い。
【００２０】
本発明の結合剤は、金属結合能を有するペプチドであればよく、金属に化学的に結合できるペプチドであれば良い。該結合剤が結合できる金属は、金又は白金族金属が好ましい。例えば、白金族金属は白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム又はイリジウムが例示でき、パラジウムがより好ましい。本発明の結合剤は、該金属を導電物質とする電極に結合でき、測定に使用する酵素や抗体等を電極に固定化できる。
【００２１】
前記結合剤を蛋白質に連結することで、金属結合性蛋白質を製造できる。結合剤は、蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に連結するのが好ましい。尚、蛋白質のＮ末端に結合剤を連結する場合は、分泌シグナル配列を含まないマチュアな蛋白質のＮ末端に連結すると良い。更に、該蛋白質と該結合剤との間にリンカーペプチドがあっても良い。連結方法は、金属結合性蛋白質全体の全合成でも良く、遺伝子工学的手法でも良い。本発明の結合剤であれば、蛋白質へ連結しても蛋白質の構造に悪影響を与え難く、蛋白質の特性を保持できる。
【００２２】
例えば、遺伝子工学的手法は、金属結合性蛋白質をコードする塩基配列が挿入されたベクターを準備する。最終的に、発現用ベクターを用いて宿主となる微生物を形質転換し、形質転換体を得る。続いて、該形質転換体を培養し、得られた培養物から金属結合性蛋白質を得ることができる。
【００２３】
ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサートとして前記塩基配列を含む。形質転換体としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、真菌（酵母、アスペルギルス属などの子嚢菌、担子菌等）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。前記ベクターを、プラスミドのような状態で形質転換細胞内に維持しても良く、染色体中に組みこませて維持しても良い。更に、糖鎖の要、不要、分泌生産等、必要に応じて適宜宿主は選択することができる。尚、蛋白質のＮ末端側に結合剤を連結した金属結合性蛋白質を宿主に分泌生産させる場合は、結合剤の配列の前に分泌シグナル配列が存在するように塩基配列をデザインする。又は、ベクター側の分泌シグナル配列を使用しても良い。蛋白質のＣ末端側に結合剤を連結した金属結合性蛋白質を宿主に生産させる場合は、蛋白質遺伝子の終止コドンの前に結合剤をコードする遺伝子配列を挿入する。該蛋白質と該結合剤との間にリンカーペプチドを挿入する場合は、該リンカーペプチドをコードする塩基配列を各遺伝子の間に挿入しても良い。
【００２４】
前記結合剤を連結する蛋白質は、糖蛋白質でもよい。該蛋白質は酵素又は抗体が好ましく、前記結合剤をそれらに連結すると、金属結合性酵素又は金属結合性抗体が得られる。該蛋白質は加水分解酵素、転移酵素又は酸化還元酵素が例示でき、前記結合剤をそれらに連結すると、金属結合性加水分解酵素、金属結合性転移酵素又は金属結合性酸化還元酵素が得られる。例えば、加水分解酵素はエステラーゼ、転移酵素はｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼが例示できる。酸化還元酵素は、酸化酵素及び脱水素酵素を包含する。例えば、グルコース、乳酸、コレステロール又はアルコールをそれぞれ基質として、酸化反応を触媒する酵素が例示できる。グルコース酸化酵素、グルコース脱水素酵素、乳酸酸化酵素、乳酸脱水素酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、アルコール酸化酵素又はアルコール脱水素酵素が好ましい。
【００２５】
前記蛋白質は、公知の配列を有する蛋白質を使用しても良い。例えば、配列番号１８〜２２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を使用できる。配列番号１８〜２２記載のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、前記（ａ）〜（ｆ）の何れかに記載の結合剤の配列を連結して、金属結合性蛋白質を製造しても良い。配列番号１８〜２２記載のアミノ酸配列の何れかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の類似性を有するアミノ酸配列を使用しても良い。配列番号１８〜２１記載のアミノ酸配列の何れかで、１又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を使用しても良い。変異数は、好ましくは多くとも６０個、５５個、５０個、４０個、３０個、２０個、１５個、１０個、５個、３個又は２個である。それらのアミノ酸配列をコードする塩基配列を使用すると、前記遺伝子工学的手法で本発明の金属結合性蛋白質を製造できる。
【００２６】
本発明の金属結合性蛋白質を化学結合により電極に固定化することで、金属結合性蛋白質固定化電極を製造できる。本発明の金属結合性蛋白質は、結合剤部分を介して前記金属の導電物質を備える電極に容易に結合し、配向性持たせた固定化が可能である。該金属結合性蛋白質固定化電極の模式図を図１に示す。
【００２７】
本発明の金属結合性蛋白質を固定化した電極及び絶縁性基板を含むバイオセンサを製造できる。例えば、電気化学式バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着等の方法を利用して電極系を形成する工程、及び蛋白質を固定化する工程を含むことにより製造できる。電極は、対極及び作用極を備えることが好ましく、参照極を備えても良い。電流値、イオン、発色強度又は振動数変化等を検知する方式のバイオセンサを構築可能である。更に、メディエータ、緩衝剤又は安定化剤を含んでも良い。
【００２８】
メディエータは、ヘム等の蛋白質性電子メディエータや、フェリシアン化化合物、キノン系化合物、オスミウム系化合物、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物等を例示できる。緩衝剤は、目的の反応環境に調整できる緩衝剤であれば良い。安定化剤としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、分子識別素子と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等を例示できる。
【００２９】
本発明のバイオセンサを用いることによって、試料液中の測定対象物を測定する、測定方法を提供できる。試料液に該バイオセンサを接触させる工程を備えることで、試料液中の測定対象物を測定できる。固定化する蛋白質は、所望の測定対象物によって、適宜選択すれば良い。例えば、グルコースを測定する場合は、グルコース酸化酵素又はグルコース脱水素酵素を電極に固定化すれば、グルコース測定方法を提供できる。試料液は特に限定されないが、生体試料が例示でき、具体例として血液、涙、尿又は細胞間質液等が例示できる。血糖測定には、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする真核細胞由来のグルコース脱水素酵素が好ましい。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］
（金属結合性ペプチドの取得）
金属結合能を有する金属結合性ペプチドを取得する為に、ファージディスプレイ法により６アミノ酸配列からなるランダムペプチドライブラリーを構築し、バイオパニングを行った。詳細には、下記洗浄条件Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの条件で、サイクル（１）から（３）又は（４）を行った。最終的に、パラジウム（Ｐｄ）板に強固に結合するファージ１７種を取得し、ＤＮＡ配列解析を行った。解析したＤＮＡ配列から決定した、金属結合性ペプチド１７種（Ｐ１〜Ｐ１７）のアミノ酸配列を表１に示す。尚、各アミノ酸配列について、ＥｘＰＡＳｙのＰｒｏｔＰａｒａｍ  ｔｏｏｌ（http://web.expasy.org/protparam/）で理論上の等電点（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｐＩ）及び親疎水性指標（Ｇｒａｎｄ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ（ＧＲＡＶＹ））を算出し、表１に記載した。何れも塩基性ペプチドだった。尚、非特許文献１及び２に記載のＡｕ、Ｐｔ又はＰｄ結合性ペプチドについて表２にまとめた。
【００３１】
洗浄条件Ｉ
サイクル（１）：工程１→工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（２）：工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（３）：工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５
洗浄条件ＩＩ
サイクル（１）：工程１→工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（２）：工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（３）：工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（４）：工程２→工程３（ＦＢＳ×１回、ＰＢＳ×２回）→工程４→工程５
洗浄条件ＩＩＩ
サイクル（１）：工程１→工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（２）：工程２→工程３（１％ＳＤＳ×１回、ＰＢＳ×２回）→工程４→工程５→
サイクル（３）：工程２→工程３（ＰＢＳ×３回）→工程４→工程５→
サイクル（４）：工程２→工程３（ＦＢＳ×１回、ＰＢＳ×２回）→工程４→工程５
※ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＦＢＳ：ウシ胎児血清
【００３２】
工程１：ランダムペプチドを提示しているＴ７ファージ懸濁液を用意する。
工程２：Ｐｄ板を、Ｔ７ファージ懸濁液に、３７℃で１時間浸し、Ｐｄ板にＴ７ファージを結合させる。
工程３（洗浄工程）：Ｔ７ファージを結合させたＰｄ板を、各洗浄条件の緩衝液に、３７℃で５分間浸し、洗浄する。該洗浄を各洗浄条件の回数行う。
工程４：洗浄後のＰｄ板を、大腸菌ＢＬ２１株の培養液に浸し、Ｐｄ板上に残っているＴ７ファージを大腸菌ＢＬ２１に感染させ、増幅する。
工程５：タイターチェックにて、Ｔ７ファージの増幅を確認する。
【００３３】
【表１】
0006623406.tif 000002
【００３４】
【表２】
0006623406.tif 000003
【００３５】
［実施例２］
（金属結合性エステラーゼ）
（１）金属結合性エステラーゼの作製
配列番号１〜１７記載のアミノ酸配列を有する結合性ペプチドＰ１〜Ｐ１７を、配列番号１８に記載のエステラーゼ（Ｅｓｔ）のＮ末端又はＣ末端に各々連結した、３４種類の金属結合性Ｅｓｔを作製した。各金属結合性Ｅｓｔは、各々、Ｅｓｔ−Ｎ１、Ｅｓｔ−Ｎ２、Ｅｓｔ−Ｎ３、Ｅｓｔ−Ｎ４、Ｅｓｔ−Ｎ５、Ｅｓｔ−Ｎ６、Ｅｓｔ−Ｎ７、Ｅｓｔ−Ｎ８、Ｅｓｔ−Ｎ９、Ｅｓｔ−Ｎ１０、Ｅｓｔ−Ｎ１１、Ｅｓｔ−Ｎ１２、Ｅｓｔ−Ｎ１３、Ｅｓｔ−Ｎ１４、Ｅｓｔ−Ｎ１５、Ｅｓｔ−Ｎ１６、Ｅｓｔ−Ｎ１７、Ｅｓｔ−Ｃ１、Ｅｓｔ−Ｃ２、Ｅｓｔ−Ｃ３、Ｅｓｔ−Ｃ４、Ｅｓｔ−Ｃ５、Ｅｓｔ−Ｃ６、Ｅｓｔ−Ｃ７、Ｅｓｔ−Ｃ８、Ｅｓｔ−Ｃ９、Ｅｓｔ−Ｃ１０、Ｅｓｔ−Ｃ１１、Ｅｓｔ−Ｃ１２、Ｅｓｔ−Ｃ１３、Ｅｓｔ−Ｃ１４、Ｅｓｔ−Ｃ１５、Ｅｓｔ−Ｃ１６又はＥｓｔ−Ｃ１７とした。
【００３６】
金属結合性Ｅｓｔは何れも遺伝子工学的手法で製造した。ベクターには、配列番号１８に記載のＥｓｔを発現する遺伝子が挿入されたＨｉｓタグ融合発現ベクターを用いた。
【００３７】
Ｅｓｔ−Ｎ１が発現するように、ベクター内のＥｓｔ遺伝子の開始コドンの前に、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入し、Ｅｓｔ−Ｎ１遺伝子全長を含む発現ベクターｐＥｓｔ−Ｎ１を作製した。Ｅｓｔ−Ｎ２〜１７についても同様に、Ｅｓｔ−Ｎ２〜１７遺伝子全長を含む発現ベクターｐＥｓｔ−Ｎ２〜１７を各々作製した。
【００３８】
Ｅｓｔ−Ｃ１が発現するように、ベクター内のＥｓｔ遺伝子の終止コドンの前に、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入し、Ｅｓｔ−Ｃ１遺伝子全長を含む発現ベクターｐＥｓｔ−Ｃ１を作製した。Ｅｓｔ−Ｃ２〜１７についても同様に、Ｅｓｔ−Ｃ２〜１７遺伝子全長を含む発現ベクターｐＥｓｔ−Ｃ２〜１７を各々作製した。
【００３９】
前記各ベクターで大腸菌を各々形質転換し、Ｅｓｔ−Ｎ１〜１７又はＥｓｔ−Ｃ１〜１７産生組換え大腸菌計３４種を作製した。各組換え株をアンピシリンを含む液体培地で培養し、各々集菌した。集菌した各組換え大腸菌を超音波破砕し、Ｅｓｔ−Ｎ１〜１７又はＥｓｔ−Ｃ１〜１７を含む各無細胞抽出液（ＣＦＥ）を回収した。各ＣＦＥを熱処理した後、Ｈｉｓタグ融合蛋白質精製カラムで精製し、精製Ｅｓｔ−Ｎ１〜１７又は精製Ｅｓｔ−Ｃ１〜１７計３４サンプルを回収した。各精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、夾雑蛋白質が除去できていた。更に、何れの金属結合性Ｅｓｔも、金属結合性ペプチドを連結していないＥｓｔと同程度の活性を有していた。ＥｓｔのＮ末端及び／又はＣ末端に本発明の金属結合性ペプチドを連結しても、連結による不活性化はみられず、酵素活性を保持できることが分かった。各金属結合性Ｅｓｔの模式図を図２に示した。
【００４０】
（２）金属結合性エステラーゼの結合能評価
実施例２の（１）で得られた３４種類の各金属結合性Ｅｓｔについて、パラジウムへの結合能を評価した。２４穴プレートに、片面がパラジウムメッキされた１ｃｍ×１ｃｍのプラスチック板（Ｐｄ板）を、メッキ面を上にして、両面テープで固定した。該プレートに、１０μｇ／ｍｌＥｓｔ−Ｎ１溶液を、８００μＬ添加し、３７℃で１時間静置することで、Ｐｄ板上にＥｓｔ−Ｎ１を結合させた。次に、該Ｐｄ板を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに、３７℃で５分間浸す洗浄工程を３回行った。更に、ＰＢＳに３７℃で５分間浸し、未結合のＥｓｔ−Ｎ１を除去した。
【００４１】
該Ｐｄ板上のＥｓｔ活性を測定するため、該Ｐｄ板を、予め３７℃保温した４．９５ｍＬＰＢＳ入り５ｍＬ容チューブに移した。該チューブに、１００ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル酢酸を５０μＬ添加し、酵素反応を開始した。５分毎に１００μＬサンプリングして９６穴プレートに入れ、プレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。Ｅｓｔ−Ｎ２〜１７及びＥｓｔ−Ｃ〜１７についても前記と同様に測定した。尚、コントロールとして、金属結合性ペプチドを連結していないＥｓｔを用いて、前記と同様に測定した。結果を図３に示した。横軸に、金属結合性ペプチドＰ１〜Ｐ１７をＮ末端又はＣ末端に連結したものを、Ｐ１〜Ｐ１７で表し、前記コントロールをＣで表した。縦軸に、Ｐｄ板上のエステラーゼ残存活性について、コントロールを１として相対値で表した。
【００４２】
その結果、Ｅｓｔ−Ｎ１〜１７及びＥｓｔ−Ｃ１〜１７は、金属結合性ペプチドを連結していないＥｓｔと比較して、Ｐｄ板上のＥｓｔ残存活性が約１．５〜４．０倍だった。よって、金属結合性エステラーゼは、何れも、連結した金属結合性ペプチドによって、金属結合能が高まると共に、Ｐｄ板上に適正に結合可能になり、Ｐｄ板上で高い残存活性を呈することが可能になったと思われる。
【００４３】
［実施例３］
（金属結合性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ）
（１）金属結合性ｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼの作製
配列番号１、２、３、４、９又は１３記載のアミノ酸配列を有する金属結合性ペプチドＰ１、２、３、４、９又は１３を、配列番号１９に記載のｏ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ（ＯＡＳＳ）のＮ末端又はＣ末端に各々連結した、１２種類の金属結合性ＯＡＳＳを作製した。各金属結合性ＯＡＳＳは、各々、ＯＡＳＳ−Ｎ１、ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９、ＯＡＳＳ−Ｎ１３、ＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３とした。
【００４４】
金属結合性ＯＡＳＳは何れも遺伝子工学的手法で製造した。ベクターには、配列番号１９に記載のＯＡＳＳを発現する遺伝子が挿入されたＨｉｓタグ融合発現ベクターを用いた。
【００４５】
ＯＡＳＳ−Ｎ１が発現するように、ベクター内のＯＡＳＳ遺伝子の開始コドンの前に、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入し、ＯＡＳＳ−Ｎ１遺伝子全長を含む発現ベクターｐＯＡＳＳ−Ｎ１を作製した。ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９又はＯＡＳＳ−Ｎ１３についても同様に、発現ベクターｐＯＡＳＳ−Ｎ３、ｐＯＡＳＳ−Ｎ４、ｐＯＡＳＳ−Ｎ９又はｐＯＡＳＳ−Ｎ１３を各々作製した。
【００４６】
ＯＡＳＳ−Ｃ１が発現するように、ベクター内のＯＡＳＳ遺伝子の終止コドンの前に、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入し、ＯＡＳＳ−Ｃ１遺伝子全長を含む発現ベクターｐＯＡＳＳ−Ｃ１を作製した。ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３についても同様に、発現ベクターｐＯＡＳＳ−Ｃ２、ｐＯＡＳＳ−Ｃ３、ｐＯＡＳＳ−Ｃ４、ｐＯＡＳＳ−Ｃ９又はｐＯＡＳＳ−Ｃ１３を各々作製した。
【００４７】
前記各ベクターで大腸菌を各々形質転換し、ＯＡＳＳ−Ｎ１、ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９、ＯＡＳＳ−Ｎ１３、ＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３産生組換え大腸菌計１２種を作製した。各組換え株をアンピシリンを含む液体培地で培養し、各々集菌した。集菌した各組換え大腸菌を超音波破砕し、ＯＡＳＳ−Ｎ１、ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９、ＯＡＳＳ−Ｎ１３、ＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３を含む各無細胞抽出液（ＣＦＥ）を回収した。その後、Ｈｉｓタグ融合蛋白質精製カラムで精製し、精製したＯＡＳＳ−Ｎ１、ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９、ＯＡＳＳ−Ｎ１３、ＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９又はＯＡＳＳ−Ｃ１３計１２サンプルを回収した。各精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、夾雑蛋白質が除去できていた。
【００４８】
尚、非特許文献１記載のパラジウム結合性ペプチド：ＳＰＨＰＧＰＹをＯＡＳＳのＮ末端又はＣ末端に連結した金属結合性ＯＡＳＳも前記と同様に作成し、コントロールとした。
【００４９】
（２）金属結合性ｏ-アセチルセリンスルフヒドリラーゼの配向性制御能評価
実施例３の（１）で得られた１２種類の各金属結合性ＯＡＳＳについて、ＮＡＰｉＣＯＳシステム（日本電波工業社製）を用いて配向性制御能を評価した。最初に、ＱＣＭセンサ（日本電波工業社製）について、水晶振動子の金電極表面をパラジウム蒸着処理することで、パラジウム成膜処理ＱＣＭセンサを作製した。該センサのパラジウム上に、１００μｇ／ｍＬ  ＯＡＳＳ−Ｎ１溶液を添加し、室温にて１時間静置することで、パラジウム表面にＯＡＳＳ−Ｎ１を結合させた。次に、該センサを、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、未結合のＯＡＳＳ−Ｎ１を除去し、ＯＡＳＳ−Ｎ１固定化センサチップを作製した。該センサをＮＡＰｉＣＯＳシステムにセットし、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ溶液でブロッキング処理した。１０μｇ／ｍＬのセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）溶液を流し、次に１００μｇ／ｍＬのＳＡＴ溶液を流して、該センサ上のＯＡＳＳ−Ｎ１と相互作用させ、各々の振動数変化を測定した。ＯＡＳＳ−Ｎ２、ＯＡＳＳ−Ｎ３、ＯＡＳＳ−Ｎ４、ＯＡＳＳ−Ｎ９、ＯＡＳＳ−Ｎ１３、ＯＡＳＳ−Ｃ１、ＯＡＳＳ−Ｃ２、ＯＡＳＳ−Ｃ３、ＯＡＳＳ−Ｃ４、ＯＡＳＳ−Ｃ９、ＯＡＳＳ−Ｃ１３又はコントロールについても同様の操作を行い、振動数変化を測定した。結果を図４に示した。図４では、金属結合性ペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ９又はＰ１３をＮ末端又はＣ末端に連結したものを、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ９又はＰ１３で表し、前記コントロールをＰＣで表した。尚、点線が、Ｎ末端側に金属結合性ペプチドを連結した金属結合性ＯＡＳＳの振動数変化を表しており、実線が、Ｃ末端側に金属結合性ペプチドを連結した金属結合性ＯＡＳＳの振動数変化を表している。
【００５０】
蛋白質のＮ末端側に金属結合性ペプチドを連結すると、Ｎ末端側で金属に結合し、一方、Ｃ末端側に金属結合性ペプチドを連結すると、Ｃ末端側で金属に結合する。ＯＡＳＳはＣ末端付近に活性部位があるため、理論上、Ｃ末端側で金属に結合すると、ＳＡＴが作用し難いため測定値が小さく、Ｎ末端側で金属に結合すると、活性部位にＳＡＴが作用し易いため測定値が大きくなると考えられる。よって、ＯＡＳＳ−Ｎ１とＯＡＳＳ−Ｃ１の前記測定値を比べて、ＯＡＳＳ−Ｎ１の方が振動数変化が大きければ、金属結合性ペプチドにより配向性制御がなされていると判断できる。
【００５１】
図４より、ＯＡＳＳ−Ｎ１とＯＡＳＳ−Ｃ１（Ｐ１）、ＯＡＳＳ−Ｎ２とＯＡＳＳ−Ｃ２（Ｐ２）、ＯＡＳＳ−Ｎ３とＯＡＳＳ−Ｃ３（Ｐ３）、ＯＡＳＳ−Ｎ４とＯＡＳＳ−Ｃ４（Ｐ４）、ＯＡＳＳ−Ｎ９とＯＡＳＳ−Ｃ９（Ｐ９）又はＯＡＳＳ−Ｎ１３とＯＡＳＳ−Ｃ１３（Ｐ１３）は、全てＮ末端に金属結合性ペプチドを連結した方が振動数変化が大きかった。一方、コントロール（ＰＣ）は、Ｎ末端側とＣ末端側とに各々金属結合性ペプチドを連結したものとで差がみられなかった。すなわち、コントロールでは配向性制御がほとんどなされておらず、本発明の金属結合性ペプチドでは配向性制御がなされていることが明らかとなった。
【００５２】
［実施例４］
（金属結合性グルコース脱水素酵素）
（１）金属結合性グルコース脱水素酵素の作製
配列番号１記載のアミノ酸配列又はその逆配列を有する結合性ペプチドを連結した、３種類の金属結合性グルコース脱水素酵素を作製した。１つ目はグルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）のＮ末端に配列番号１記載のアミノ酸配列を有する結合性ペプチドを連結したＧＬＤ−Ｎ１である。２つ目はＧＬＤのＣ末端に配列番号１記載のアミノ酸配列の逆配列を有する結合性ペプチドを連結したＧＬＤ−Ｃ１’である。３つ目はＧＬＤのＮ末端に配列番号１記載のアミノ酸配列を有する結合性ペプチドを、及びＣ末端に配列番号１記載のアミノ酸配列の逆配列を有する結合性ペプチドを連結したＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’である。ＧＬＤ−Ｎ１、ＧＬＤ−Ｃ１’及びＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’は何れも遺伝子工学的手法で製造した。ベクターには、配列番号２０に記載のＧＬＤを発現する遺伝子が挿入された発現ベクターを用いた。該ベクターは、ＷＯ２００６／１０１２３９号パンフレットの実施例４に記載されたベクターのシグナル配列遺伝子部分をＭＬＦＳＬＡＦＬＳＡＬＳＬＡＴＡＳＰＡＧＲＡをコードする遺伝子に置換したベクターである。
【００５３】
ＧＬＤ−Ｎ１が発現するように、前記ベクター内のシグナル遺伝子配列の後に、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入し、ＧＬＤ−Ｎ１遺伝子全長を含む発現ベクターｐＧＬＤ−Ｎ１を作製した。
【００５４】
ＧＬＤ−Ｃ１’が発現するように、前記ベクター内のＧＬＤ遺伝子の終止コドンの前に、配列番号１記載のアミノ酸配列の逆配列をコードする塩基配列を挿入し、ＧＬＤ−Ｃ１’遺伝子全長を含む発現ベクターｐＧＬＤ−Ｃ１’を作製した。
【００５５】
ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’が発現するように、前記ｐＧＬＤ−Ｎ１内のＧＬＤ遺伝子の終止コドンの前に、配列番号１記載のアミノ酸配列の逆配列をコードする塩基配列を挿入し、ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’遺伝子全長を含む発現ベクターｐＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’を作製した。
【００５６】
ＷＯ２００６／１０１２３９号パンフレットの実施例４に記載の方法で、前記各ベクターでアスペルギルス・オリゼＮＳ４株を各々形質転換し、ＧＬＤ−Ｎ１、ＧＬＤ−Ｃ１’又はＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’産生組換えアスペルギルス・オリゼ３種を作製した。各組換え株を液体培地で培養し、各々培養上清を回収した。各培養上清について、陰イオン交換カラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、単一バンドのＧＬＤ−Ｎ１、ＧＬＤ−Ｃ１’又はＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’を確認できた。更に、何れの金属結合性ＧＬＤも、金属結合性ペプチドを連結していないＧＬＤと同程度の活性を有していた。ＧＬＤのＮ末端及び／又はＣ末端に本発明の金属結合性ペプチドを連結しても、連結による不活性化はみられず、酵素活性を保持できることが分かった。各金属結合性ＧＬＤの模式図を図５に示した。
【００５７】
（２）金属結合性グルコース脱水素酵素の評価
実施例４の（１）で得られたＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’について、パラジウムへの結合能を評価した。１２穴プレートに、片面がパラジウムメッキされた１ｃｍ×１ｃｍのプラスチック板（Ｐｄ板）を、メッキ面を上にして、両面テープで固定した。該プレートに、７μｇ／ｍｌＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’溶液を１ｍＬ添加し、３７℃で１時間静置することで、Ｐｄ板上にＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’を結合させた。次に、該Ｐｄ板を、５ｍＬの０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに、室温で５分間浸す洗浄工程を３回行った。更に、ＰＢＳに室温で５分間浸し、未結合のＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’を除去した。
【００５８】
該Ｐｄ板上のＧＬＤ活性を測定するため、該Ｐｄ板を、１２穴プレートに移した。該１２穴プレートに、予め２５℃保温したＧＬＤ活性測定試薬を添加することで酵素反応を開始した。経時的にサンプリングして、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４、モレキュラーデバイス社製）で６００ｎｍにおける吸光度を測定した。尚、グルコース脱水素酵素活性測定試薬は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水０．６１ｍＬ、３ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール０．１４ｍＬ及び３ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２０ｍＬの混合液である。尚、コントロールとして、金属結合性ペプチドを連結していないグルコース脱水素酵素を用いて、前記と同様に測定した。何れも２回測定し、平均値を算出した。結果を図６に示した。縦軸に、Ｐｄ板上のＧＬＤ残存活性について、コントロールの平均値を１として相対値で表した。
【００５９】
その結果、平均値で比較すると、ＧＬＤ−Ｎ１Ｃ１’は、金属結合性ペプチドを連結していないＧＬＤと比較して、Ｐｄ板上のＧＬＤ残存活性が約３．８倍だった。よって、金属結合性グルコース脱水素酵素は、連結した金属結合性ペプチドによって、金属結合能が高まると共に、Ｐｄ板上に適正に結合可能になり、Ｐｄ板上で高い残存活性を呈することが可能になったと思われる。
【符号の説明】
【００６０】
１・・・蛋白質、２・・・金属結合性ペプチド、３・・・電極、４・・・金属結合性蛋白質
【図１】
0006623406.tif 000004
【図２】
0006623406.tif 000005
【図３】
0006623406.tif 000006
【図４】
0006623406.tif 000007
【図５】
0006623406.tif 000008
【図６】
0006623406.tif 000009
【配列表】
0006623406000001.app