(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩の化合物であって、
【化１】
0006609634.tif 000028
式中、Ｘが、
（１）
【化２】
0006609634.tif 000029
（ここで、ｎおよびｍがそれぞれ、独立して、１〜６の整数を表す）と、
（２）
【化３】
0006609634.tif 000030
（ここで、ｐおよびｑがそれぞれ、独立して、１〜６の整数を表す）と、
（３）
【化４】
0006609634.tif 000031
（ここで、ｔが、１〜６の整数を表す）と
から選択される二価基を表し、これらの官能基は、それらの末端窒素または酸素原子を介して式（Ｉ）の前記化合物のイミン官能基に、および、それらの末端炭素原子を介して式（Ｉ）の前記化合物のヒドロキシビスホスホン酸官能基に結合される化合物。
【請求項２】
ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｔがそれぞれ、独立して、１〜４の整数を表すことを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、以下の化合物
【化５】
0006609634.tif 000032
【化６】
0006609634.tif 000033
【化７】
0006609634.tif 000034
およびその薬学的に許容できる塩から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
医薬品として使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
骨腫瘍の治療に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記骨腫瘍が、骨肉腫、軟骨肉腫、巨細胞腫またはユーイング肉腫のような原発性骨腫瘍と、骨転移と、多発性骨髄腫とから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
【請求項８】
医薬品として使用するための、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
骨腫瘍の治療に使用するための、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記骨腫瘍が、骨肉腫、軟骨肉腫、巨細胞腫またはユーイング肉腫のような原発性骨腫瘍と、骨転移と、多発性骨髄腫とから選択されることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物を調製するための方法であって、
（ａ）ドキソルビシンまたはその塩を、以下の式（Ａ）
【化８】
0006609634.tif 000035
（式中、Ｘが、請求項１に定義されるとおりである）の化合物またはその塩と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップと、
（ｂ）任意に、前のステップ（ａ）で得られた式（Ｉ）の前記化合物を塩化して、その薬学的に許容できる塩を得るステップと
を含む方法。
【請求項１２】
Ｘが官能基（１）を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物を調製するための方法であって、
（ｉ）以下の式（Ｂ）
【化９】
0006609634.tif 000036
の化合物またはその塩と、以下の式（Ｃ）
【化１０】
0006609634.tif 000037
（式中、ｎおよびｍが、請求項１に定義されるとおりである）の化合物またはその塩と、
ドキソルビシンまたはその塩とのカップリング反応のステップ、であって、
前記カップリング反応が、式（Ｂ）の前記化合物またはその塩と、式（Ｃ）の前記化合物またはその塩と、ドキソルビシンまたはその塩との存在下で、１工程で、あるいは式（Ｂ）の前記化合物またはその塩を、ドキソルビシンまたはその塩とまずカップリングしてから、式（Ｃ）の前記化合物またはその塩との前記カップリングを行うことによるか、または式（Ｂ）の前記化合物またはその塩を、式（Ｃ）の前記化合物またはその塩とまずカップリングしてから、ドキソルビシンまたはその塩との前記カップリングを行うことによる２工程で行い、Ｘが官能基（１）を表す、式（Ｉ）の化合物を得るステップと、
（ｉｉ）任意に、前のステップ（ｉ）で得られた式（Ｉ）の前記化合物を塩化して、その薬学的に許容できる塩を得るステップと
を含む方法。
【請求項１３】
以下の式（Ａ）または（Ｂ）
【化１１】
0006609634.tif 000038
【化１２】
0006609634.tif 000039
（式中、Ｘが、請求項１に定義されるとおりである）若しくはその塩の化合物。
【請求項１４】
前記化合物が、以下の化合物
【化１３】
0006609634.tif 000040
【化１４】
0006609634.tif 000041
【化１５】
0006609634.tif 000042
およびその塩から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、骨腫瘍の治療における、特に、医薬品としての使用のための、骨組織を標的とするドキソルビシンの水溶性ヒドロキシビスホスホン酸誘導体と；それを合成するための方法と；このような誘導体を含む医薬組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、ヒドロキシアパタイト結晶、細胞外基質および特殊化した細胞（骨芽細胞および破骨細胞）から構成される常に再構築される結合組織である。骨付加（ｂｏｎｅ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）および骨吸収の現象の間の均衡の乱れは、腫瘍に由来し得る（骨肉腫のような原発性腫瘍または骨転移のような二次性腫瘍による）溶骨性または骨凝縮性病変を引き起こす。骨肉腫は、骨膜付加（ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）、皮質の破壊および軟組織の浸潤を伴う非常に侵攻性の高い骨腫瘍である。骨肉腫は、一般に、若年層（年齢中央値１８歳）で発症し、小児癌の５％を占める。これらの腫瘍は、骨溶解と腫瘍増殖との間の悪循環を確立する特殊性を有する。これらの腫瘍の現在の治療は、術前化学療法、続いて腫瘍の外科的切除、次に術後化学療法からなり、５年患者生存率は６０〜７０％であるが、肺転移が検出された場合、わずか３０％である。これらの比較的低い生存率に直面して、骨肉腫の新規な治療法の開発が必要なようである。
【０００３】
ヒドロキシビスホスホン（ＨＢＰ）酸誘導体は、骨組織に対するそれらの非常に高い親和性および骨吸収を阻害するそれらの特性で知られている分子である（Ｍｏｒｉｃｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２０１０，１６（２７），２９８１）。ドキソルビシンは、骨腫瘍の治療に使用される必需品の１つである。しかしながら、ドキソルビシンの毒性は、その使用を大きく制限する。ＨＢＰと化学的に結合するドキソルビシンへの関心には、２つの側面がある。ベクター化（ｖｅｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）により、血中濃度を低下させながら（ひいてはその毒性を低下させながら）、骨部位におけるドキソルビシンの抗腫瘍活性を標的とすること（ひいてはより効果的に腫瘍を治療すること）が可能になるはずである。同時に、ＨＢＰベクター（ｖｅｃｔｏｒ）は、その再吸収阻害効果によって腫瘍骨溶解の治療を改善し得る。
【化１】
0006609634.tif 000002
【０００４】
国際公開第２０１２／１３０９１１号には、イミン結合を介して、ＨＢＰ官能基を有するベクター上で、ドキソルビシンを含む活性成分とベクターを化学的に組み合わせるこの手法が特に記載されている。しかしながら、ＨＢＰベクターに結合されたドキソルビシン部分（修飾されているか否かにかかわらず）を含む国際公開第２０１２／１３０９１１号に記載される生成物は、有機添加剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＰＥＧ、グリセリン、グルコース）または無機添加剤（例えば、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム）を用いても、水に、および有機溶媒（例えば、エタノールまたはジメチルスルホキシド）に不溶性（またはその修飾形態で非常に難溶性）であることが分かっており、それにより、この生成物を医薬品として使用するのが難しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、医薬品として使用することを可能にするために水溶性であり得るＨＢＰベクターに結合される新規なドキソルビシン誘導体を開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、以下の一般式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩のドキソルビシンのヒドロキシビスホスホン酸誘導体であって、
【化２】
0006609634.tif 000003
式中、Ｘが、
（１）
【化３】
0006609634.tif 000004
（ここで、ｎおよびｍがそれぞれ、独立して、１〜６、特に、１〜４の整数を表す）と、
（２）
【化４】
0006609634.tif 000005
（ここで、ｐおよびｑがそれぞれ、独立して、１〜６、特に、１〜４の整数を表す）と、
（３）
【化５】
0006609634.tif 000006
（ここで、ｔが、１〜６、特に、１〜４の整数を表す）と
から選択される二価基を表し、これらの官能基は、それらの末端窒素または酸素原子を介して式（Ｉ）の化合物のイミン官能基に、および、それらの末端炭素原子を介して式（Ｉ）の化合物のヒドロキシビスホスホン酸官能基に結合されるドキソルビシンのヒドロキシビスホスホン酸誘導体に関する。
【０００７】
ここで、本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、骨組織を標的とするヒドロキシビスホスホン酸ベクターによってドキソルビシン（抗腫瘍薬）のベクター化を可能にする。ドキソルビシンが結合される方法およびベクターの性質は、特に、それらの臨床用途を容易にするために化合物の水への高い溶解度を確保するように適合される。
【０００８】
本発明において、「薬学的に許容できる」とは、一般に安全で、非毒性で、生物学的にも他の形でも望ましくないことはなく、動物ならびにヒトの医薬品用途に許容できる医薬組成物の調製に有用であることを意味する。
【０００９】
化合物の「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物の所望の薬理学的活性を有する、本明細書において定義される薬学的に許容できる塩を意味する。
【００１０】
薬学的に許容できる塩としては、特に、以下のものが挙げられる。
（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような薬学的に許容できる無機酸とともに形成されるか；または酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシナフトエ酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、２−ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、サリチル酸、コハク酸、ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリメチル酢酸、トリフルオロ酢酸などのような薬学的に許容できる有機酸とともに形成される薬学的に許容できる酸付加塩、および
（２）親化合物中に存在する酸プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン（例えば、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ若しくはＣｓ）、アルカリ土類金属イオン（例えば、Ｃａ、Ｍｇ）またはアルミニウムイオンで置換される場合；あるいはジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエタノールアミン、トロメタミンなどのような薬学的に許容できる有機塩基と；または水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウムなどのような薬学的に許容できる無機塩基と配位される場合に形成される薬学的に許容できる塩基付加塩。
【００１１】
ここで、ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｔがそれぞれ、独立して、１、２、３、４、５または６に等しい整数、特に、１、２、３または４に等しい整数を表す。
【００１２】
本発明の特定の実施形態によれば、ｎ＝３、ｍ＝２、ｐ＝３、ｑ＝２およびｔ＝１である。ここで、有利には、Ｘが、
【化６】
0006609634.tif 000007
【化７】
0006609634.tif 000008
及び
【化８】
0006609634.tif 000009
から選択される官能基を表し、これらの基は、それらの末端窒素または酸素原子を介して式（Ｉ）の化合物のイミン官能基に、および、それらの末端炭素原子を介して式（Ｉ）の化合物のヒドロキシビスホスホン酸官能基に結合される。
【００１３】
本発明の特定の実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物は、以下の実験項に記載される化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）およびその薬学的に許容できる塩から選択される。
【００１４】
本発明は、特に骨組織を標的とする医薬品として使用するための、上記の式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩の化合物にも関する。
【００１５】
本発明は、より特定的には骨組織を標的とする医薬組成物を製造するための、上記の式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩の化合物の使用にも関する。
【００１６】
特に、本発明に係る式（Ｉ）の化合物は、骨腫瘍を治療するのに使用され得る。
【００１７】
本発明は、骨腫瘍を治療するための方法であって、それを必要とする人に、有効量の上記の式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩の化合物を投与する工程を含む方法にも関する。
【００１８】
骨腫瘍は、特に、骨肉腫、軟骨肉腫、巨細胞腫またはユーイング肉腫のような原発性骨腫瘍；骨転移；または多発性骨髄腫であり得る。
【００１９】
本発明は、上記の式（Ｉ）またはその薬学的に許容できる塩の少なくとも１つの化合物と、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物にも関する。
【００２０】
この組成物は、特に、非経口経路（例えば、皮下、静脈内、皮内または筋肉内）によって、すなわち、好ましくは、注射用溶液の形態で、およびヒトを含む哺乳動物に向けて、その投与を可能にするように製剤化され得る。
【００２１】
注射される溶液は、薬学的に許容できる分散剤および／または湿潤剤を含有する、水性懸濁液、等張食塩水溶液または滅菌注射用溶液の形態であり得る。
【００２２】
投与計画は、治療および該当する疾患に応じて変化する。活性成分としての本発明の化合物は、特に、１日当たり０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇの用量で使用され、１日１回単回投与されるか、または１日を通して数回投与で、例えば等しい用量で１日に２回投与され得る。これらの範囲を超える用量を使用することが必要であることがあり、このことは、当業者に明らかであろう。
【００２３】
本発明は、目的として、特に上に定義される骨腫瘍の治療に使用するための、上に定義される医薬組成物も有する。
【００２４】
本発明は、本発明に係る式（Ｉ）の化合物を調製するための方法にも関する。
【００２５】
第１の方法は、
（ａ）ドキソルビシンまたはその塩を、以下の式（Ａ）
【化９】
0006609634.tif 000010
（式中、Ｘが、上に定義されるとおりである）の化合物またはその塩と反応させて、本発明に係る式（Ｉ）の化合物を得るステップと、
（ｂ）任意に、前のステップ（ａ）で得られた式（Ｉ）の前記化合物を塩化して、その薬学的に許容できる塩を得るステップと
を含む。
【００２６】
＜ステップ（ａ）＞
ドキソルビシンは、特に、その塩酸塩の形態で使用され得る。
【００２７】
式（Ａ）の化合物は、以下の実験項に記載されるとおりに調製され得る。
【００２８】
ドキソルビシンまたはその塩と、式（Ａ）の化合物またはその塩との間のカップリングは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、水およびそれらの混合物から選択される溶媒中で、特に、水／ＴＨＦ混合物中で行われ得る。このカップリングは、０〜８０℃の温度、特に、室温で行われ得る。
【００２９】
「室温」とは、本発明の文脈において、１５〜４０℃、好ましくは、２０〜３０℃、特に、約２５℃の温度を意味する。
【００３０】
＜ステップ（ｂ）＞
式（Ｉ）の化合物の塩化（ｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、式（Ｉ）の化合物と、薬学的に許容できる酸または塩基との反応によって行われ得る。
【００３１】
Ｘが官能基（１）を表す、式（Ｉ）の化合物を調製するための第２の方法は、
（ｉ）以下の式（Ｂ）
【化１０】
0006609634.tif 000011
の化合物またはその塩と、以下の式（Ｃ）
【化１１】
0006609634.tif 000012
（式中、ｎおよびｍが、上に定義されるとおりである）の化合物またはその塩と、
ドキソルビシンまたはその塩とのカップリング反応のステップであって、
カップリング反応が、式（Ｂ）の化合物またはその塩と、式（Ｃ）の化合物またはその塩と、ドキソルビシンまたはその塩との存在下で、１工程で、あるいは式（Ｂ）の化合物またはその塩を、ドキソルビシンまたはその塩とまずカップリングしてから、式（Ｃ）の化合物またはその塩とのカップリングを行うことによるか、または式（Ｂ）の化合物またはその塩を、式（Ｃ）の化合物またはその塩とまずカップリングしてから、ドキソルビシンまたはその塩との前記カップリングを行うことによる２工程で行い、Ｘが官能基（１）を表す、本発明に係る式（Ｉ）の化合物を得るステップと、
（ｉｉ）任意に、前のステップ（ｉ）で得られた式（Ｉ）の化合物を塩化して、その薬学的に許容できる塩を得るステップと
を含む。
【００３２】
＜ステップ（ｉ）＞
ドキソルビシンは、特に、その塩酸塩の形態で使用され得る。
【００３３】
式（Ｂ）の化合物は、チオカルボヒドラジド（化合物２）と、エチレンジアミン四酢酸二無水物（化合物１）との反応によって、以下の実験項に記載されるとおりに調製され得る。
【００３４】
式（Ｃ）の化合物は、国際公開第２０１２／１３０９１１号に記載されているように調製され得る。式（Ｃ）の化合物は、特に、二ナトリウム塩の形態で使用され得る。
【００３５】
第１の変形例によれば、式（Ｂ）および（Ｃ）の化合物およびドキソルビシンまたはその塩は、全て一緒に反応されて、Ｘが官能基（１）を表す、本発明に係る式（Ｉ）の化合物が得られる（１工程カップリング反応）。
【００３６】
第２の変形例（２工程カップリング反応）によれば、式（Ｂ）の化合物またはその塩は、第１のステップにおいて、ドキソルビシンまたはその塩と反応されて、以下の式（Ｄ）
【化１２】
0006609634.tif 000013
の中間化合物が得られる。次に、式（Ｄ）のこの化合物は、第２のステップにおいて、式（Ｃ）の化合物またはその塩と反応されて、Ｘが官能基（１）を表す、本発明に係る式（Ｉ）の化合物が得られる。
【００３７】
第３の変形例（２工程カップリング反応）によれば、式（Ｂ）の化合物またはその塩は、第１のステップにおいて、式（Ｃ）の化合物またはその塩と反応されて、以下の式（Ｅ）
【化１３】
0006609634.tif 000014
（式中、ｎおよびｍが、上に定義されるとおりである）の中間化合物が得られる。次に、式（Ｅ）のこの化合物は、第２のステップにおいて、ドキソルビシンまたはその塩と反応されて、Ｘが官能基（１）を表す、本発明に係る式（Ｉ）の化合物が得られる。
【００３８】
３つの変形例における上記のカップリング反応は、特に、トリフルオロ酢酸の存在下で、酸性媒体中で行われ得る。テトラヒドロフラン、メタノール、ジメチルスルホキシド、水およびそれらの混合物から選択される溶媒、特に、ＴＨＦ／水混合物が使用され得る。このカップリングは、室温で行われ得る。
【００３９】
「室温」とは、本発明の文脈において、１５〜４０℃、好ましくは、２０〜３０℃、特に、約２５℃の温度を意味する。
【００４０】
＜ステップ（ｉｉ）＞
式（Ｉ）の化合物の塩化は、式（Ｉ）の化合物と、薬学的に許容できる酸または塩基との反応によって行われ得る。
【００４１】
上記の方法の１つによって得られる化合物は、例えば抽出、溶媒蒸発または沈殿およびろ過のような、当業者に周知の方法によって、反応媒体から分離され得る。
【００４２】
さらに、化合物は、化合物が結晶質である場合には再結晶化または沈殿、カラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲルにおける、シリカは、特に、Ｃ１８またはＣ８カラム上などで疎水性にさせるように、任意に修飾される）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような、当業者に周知の技術によって、必要に応じて精製され得る。
【００４３】
本発明は、目的として、上に定義される式（Ａ）または（Ｂ）若しくは上に定義される薬学的に許容できる塩のようなその塩の化合物も有する。
【００４４】
この化合物は、特に、以下の実験項に記載される化合物４、７、１３および上に定義される薬学的に許容できる塩のようなその塩から選択され得る。
【００４５】
このような化合物は、特に、上に定義される式（Ｉ）の化合物を調製するための、合成中間体として有用である。
【００４６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】対照（ＣＴ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、ドキソルビシン、ベクター５、およびドキソルビシン＋ベクター５群のマウスで発生されるＨＯＳ腫瘍の平均腫瘍容積（ｍｍ３）の経時的な変化を表す。
【図２】各対照（ＣＴ）、化合物（ＩＩ）および化合物（ＩＩＩ）群の１０匹のマウスの腫瘍のある足の２７日目のＸ線写真を表す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４８】
使用される略語:
ＤＭＳＯ：  ジメチルスルホキシド
ＤＰＢＳ：  ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＤＴＡ：  エチレンジアミン四酢酸
ＥＳ：  エレクトロスプレー
ＨＰＬＣ：  高速液体クロマトグラフィー
ＭＳ：  質量分析計
ｙｌｄ：  収率
ＮＭＲ：  核磁気共鳴
ｓａｔ：  飽和
ＲＴ：  室温
ＴＦＡ：  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：  テトラヒドロフラン
ＴＲＩＳ：  ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール
【００４９】
（１．本発明に係る化合物の合成）
＜化合物（ＩＩ）＞：
【化１４】
0006609634.tif 000015
＜ステップ１＞：
【化１５】
0006609634.tif 000016
化合物１（３ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）を、８０℃で、ＤＭＳＯ（１５ｍｌ）中で可溶化し、次に、８０℃でＤＭＳＯ（３０ｍｌ）中の化合物２（５ｇ、４７．２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。得られた透明の溶液を、室温で３時間撹拌する。反応混合物を、メタノール（１２０ｍｌ）と水（１２０ｍｌ）との混合物で希釈する。得られた透明の溶液に、メタノール（６００ｍｌ）を撹拌しながら加えた後、ジエチルエーテル（１５０ｍｌ）を加え、撹拌を室温で５分間続ける。得られた沈殿物をろ過し、メタノールで洗浄し、次に、１５分間にわたって室温で、１５０ｍｌの水中で完全に可溶化する。得られた溶液に、メタノール（６００ｍｌ）を加えた後、ジエチルエーテル（１５０ｍｌ）を加え、撹拌を室温で５分間続ける。得られた沈殿物をろ過し、メタノール、続いてジエチルエーテルで洗浄し、次に、室温で、減圧下で乾燥させる。化合物４（３．２ｇ、収率＝５８％）が得られる。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：３．８７（２Ｈ、ｓ）、３．７０（２Ｈ、ｓ）、３．２４（２Ｈ、ｓ）。
【００５０】
＜ステップ２＞：
【化１６】
0006609634.tif 000017
化合物５の合成は、国際公開第２０１２／１３０９１１号に記載されている。アルゴン下で、２４ｍｌのＴＨＦ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（２０：２０：１）混合物中の化合物４（１０６０ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液を、２４ｍｌのＴＨＦ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（２０：２０：１）混合物中の化合物３（９１８ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）および５（１０２８ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液に一度に加える。得られた暗赤色の溶液を、光から保護しながら室温で１６時間撹拌する。次に、Ｅｔ２Ｏ／ＭｅＯＨ（５：１）混合物（３６０ｍｌ）を、撹拌を維持しながらこの溶液に加え、得られた赤色の沈殿物懸濁液を室温で５分間撹拌する。沈殿物をろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、次に、減圧下で乾燥させる。得られた赤色の粉末を、１０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３：Ｈ２Ｏ（１：１）混合物中で可溶化し、得られた溶液を、Ｃ１８カラム中に導入し、次に、［６００ｍｌの３％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋２ｍｌの２０％のＮＨ３／Ｈ２Ｏ］から［６００ｍｌの５０％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋２ｍｌの２０％のＮＨ３／Ｈ２Ｏ］の勾配で溶離する。約４５０ｍｌの溶離剤から出発して、約１５０ｍｌの溶離剤中で最終生成物が残る。最終生成物を含有する画分を、約１０ｍｌの溶液が残るまで減圧下で蒸発させ、次に、それを、ＭｅＯＨ（４０ｍｌ）、続いてＥｔ２Ｏ（２００ｍｌ）で希釈する。得られた混合物を、赤色の沈殿物が形成されるまで撹拌し、それを室温で５分間撹拌し、次に、ろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、室温で、減圧下で乾燥させる。化合物（ＩＩ）（５２６ｍｇ、収率＝２３％）が得られる。
【００５１】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（１％のＴＦＡ−Ｄ／ＤＭＳＯ−Ｄ６、４００ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：１４．０７（１Ｈ、ｓ）、１３．３６（１Ｈ、ｓ）、１１．９７（１Ｈ、ｓ）、１１．２４（１Ｈ、ｓ）、１０．５３（１Ｈ、ｓ）、１０．４８（１Ｈ、ｓ）、１０．３０（１Ｈ、ｓ）、９．８０（１Ｈ、ｓ）、８．０５（１Ｈ、ｓ）、７．９５（２Ｈ、ｓ）、７．８４（２Ｈ、ｍ）、７．６８（１Ｈ、ｄｄ）、７．４６（１Ｈ、ｓ）、７．４０（１Ｈ、ｄ）、７．３３（１Ｈ、ｔ）、７．０２（１Ｈ、ｄ）、５．３０（１Ｈ、ｓ）、４．９９（１Ｈ、ｓ）、４．６１（１Ｈ、ｔ）、４．５−３．７（１２Ｈ、ｍ）、３．６−２．８５（１４Ｈ、ｍ）、３．０１（１Ｈ、ｄ）、２．８１（３Ｈ、ｓ）、２．２７（４Ｈ、ｍ）、２．１３（２Ｈ、ｍ）、１．８５（１Ｈ、ｔ）、１．６５（１Ｈ、ｄ）、１．１８（３Ｈ、ｄ）。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル（１％のＴＦＡ−Ｄ／ＤＭＳＯ−Ｄ６、１６２ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：１８．２３。質量スペクトル（ＥＳ−）（ｍ／ｚ）：[Ｍ−Ｈ]‐  １３８６。ＨＰＬＣ分析による純度（Ｃ１８、Ｈ２Ｏ／ＥＤＴＡ／ＮＨ３−ＭｅＣＮ）：９７％。
【００５２】
＜化合物（ＩＩＩ）＞：
【化１７】
0006609634.tif 000018
＜ステップ１＞：
【化１８】
0006609634.tif 000019
撹拌しながら、化合物５（１ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を、９５℃で水（４０ｍｌ）中の化合物２（１ｇ、９．４ｍｍｏｌ）の溶液に加える。得られた透明の溶液に、ＴＦＡ（０．８ｍｌ）を加え、混合物を同じ温度で３０分間撹拌する。次に、混合物を室温に置き、ＮａＢＨ３ＣＮ（０．６ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を加え、次に、撹拌を室温で２４時間続ける。反応混合物を、［６００ｍｌの３％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ］から［６００ｍｌの５０％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ］の勾配で溶離されるＣ１８カラムに導入する。過剰な化合物２が、約１５０ｍｌの溶離剤の後に溶離され、最終生成物７が、約２００ｍｌの溶離剤の体積中で、約４００ｍｌの溶離剤の後に溶離される。画分を、約１０ｍｌの溶液が残るまで減圧下で蒸発させ、次に、それを、撹拌によって、ＭｅＯＨ（２００ｍｌ）、続いてＥｔ２Ｏ（３００ｍｌ）で希釈する。得られた沈殿物をろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、室温で、減圧下で乾燥させる。化合物７（７８０ｍｇ、収率＝７１％）が得られる。
【００５３】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：７．２６（１Ｈ、ｔ）、６．９７（２Ｈ、ｍ）、６．８９（１Ｈ、ｄｄ）、４．１０（２Ｈ、ｔ）、３．８９（２Ｈ、ｓ）、３．６０−３．１０（４Ｈ、ｓ）、２．８２（３Ｈ、ｓ）、２．３１（２Ｈ、ｍ）、２．１９（２Ｈ、ｍ）。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、１６２ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：１６．８７。質量スペクトル（ＥＳ−）（ｍ／ｚ）：[Ｍ−Ｈ]‐  ５００。
【００５４】
＜ステップ２＞：
【化１９】
0006609634.tif 000020
化合物７（２５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と３（２９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）との混合物を、８０℃で、６ｍｌのＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１）混合物中で可溶化し、この温度で３分間撹拌し、次に、減圧下で蒸発乾固させる。得られた乾燥された混合物を、８０℃で５分間にわたって減圧下に置き、栓付きの丸底フラスコを、冷水で室温に急冷する。得られた固体を、飽和ＮａＨＣＯ３（４ｍｌ）と、水（４ｍｌ）と、ＴＨＦ（８ｍｌ）との混合物中で、３０〜４０℃で撹拌しながら可溶化する。得られた非常に濃い透明の溶液を水（５０ｍｌ）で希釈し、Ｃ１８カラムに導入する。カラムを、６００ｍｌの３％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏから６００ｍｌのＭｅＯＨの勾配で溶離する。化合物（ＩＩＩ）が、約２００ｍｌの溶離剤の体積中で、約４００ｍｌの溶離剤の後に溶離される。画分を、約１０ｍｌの溶液が残るまで減圧下で蒸発させ、それを、撹拌によって、ＭｅＯＨ（１００ｍｌ）、続いてＥｔ２Ｏ（３００ｍｌ）で希釈する。形成された赤色の沈殿物をろ過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、室温で、減圧下で乾燥させる。化合物（ＩＩＩ）（１６０ｍｇ、収率＝３２％）が得られる。
【００５５】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ／ＴＨＦ−Ｄ８＝３／１、４００ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：８．０３（２Ｈ、ｍ）、７．８１（１Ｈ、ｄ）、７．４０（１Ｈ、ｔ）、７．２１（１Ｈ、ｓ）、７．０７（１Ｈ、ｄ）、５．４０（１Ｈ、ｓ）、５．１７（１Ｈ、ｔ）、４．４２−３．９９（１１Ｈ、ｍ）、３．８０−３．３５（６Ｈ、ｍ）、３．１４−３．９５（４Ｈ、ｍ）、２．７３−２．３５（７Ｈ、ｍ）、２．２２（１Ｈ、ｔ）、２．０２（１Ｈ、ｍ）、１．４７（１Ｈ、ｍ）、１．４４（３Ｈ、ｄ）。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ／ＴＨＦ−Ｄ８＝３／１、１６２ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：１４．６２。質量スペクトル（ＥＳ−）（ｍ／ｚ）：[Ｍ−Ｈ]‐  １０２５。ＨＰＬＣ分析による純度（Ｃ１８、Ｈ２Ｏ／ＥＤＴＡ／ＮＨ３−ＭｅＣＮ）：９８％。
【００５６】
＜化合物（ＩＶ）＞：
【化２０】
0006609634.tif 000021
＜ステップ１＞：
【化２１】
0006609634.tif 000022
ＴＨＦ（２ｍｌ）中の市販の製品８（３００ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の透明の溶液に、トリエチルアミン（２１８μｌ、１．５７ｍｍｏｌ）を加え、均一混合物を０℃に冷却する。この温度で、ＴＨＦ（６００μｌ）中の製品１０（１９０ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）の溶液を、徐々に加え、反応混合物を０℃で１５分間撹拌する。アルゴン下で透明の溶液を収集するために、沈殿物を迅速にろ過する。この溶液に、化合物１１（１．４ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）を加え、得られた透明の混合物を室温で１時間撹拌する。メタノール（３ｍｌ）を加え、１０分間撹拌した後、混合物を、３６℃で、減圧下で濃縮乾固する。得られた残渣に、ＴＦＡ（２ｍｌ）を加え、形成された白色の沈殿物を室温で１時間撹拌し、次に、揮発性物質を、３６℃で、蒸発乾固させる。得られた油を、メタノール、続いてエーテルで処理し、形成された白色の沈殿物をろ過し、エーテルで洗浄し、乾燥させる。化合物１３が得られる（２０５ｍｇ、収率＝５５％）。
【００５７】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：４．４９（２Ｈ、ｔ）。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、１６２ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：１４．１８。
【００５８】
＜ステップ２＞：
【化２２】
0006609634.tif 000023
アルゴン下で、３ｍｌのＴＨＦ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ（２０：２０：１）混合物中の化合物３（２７０ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）および１３（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の溶液を、光から保護しながら、室温で１６時間撹拌する。２０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３：Ｈ２Ｏ（１：１）混合物を加え、得られた溶液を、Ｃ１８カラム中に導入し、次に、［６００ｍｌの３％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋２ｍｌの２０％のＮＨ３／Ｈ２Ｏ］から［６００ｍｌの５０％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＋２ｍｌの２０％のＮＨ３／Ｈ２Ｏ］の勾配で溶離する。約２１０ｍｌの溶離剤から出発して、約１５０ｍｌの溶離剤中で最終生成物が残る。最終生成物を含有する画分を、約５ｍｌの溶液が残るまで減圧下で蒸発させ、次に、それを、メタノール（４０ｍｌ）、次にジエチルエーテル（２００ｍｌ）で希釈する。得られた混合物を、赤色の沈殿物が形成されるまで撹拌し、それを室温で５分間撹拌し、次に、ろ過し、ジエチルエーテルで洗浄し、室温で、減圧下で乾燥させる。化合物（ＩＶ）（１６０ｍｇ、収率＝４７％）が得られる。
【００５９】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：７．６６（１Ｈ、ｔ）、７．３８（２Ｈ、ｍ）、５．４８（１Ｈ、ｓ）、４．８４（１Ｈ、ｓ）、４．６２（２Ｈ、ｍ）、４．４０（２Ｈ、ｓ）、４．２９（１Ｈ、ｍ）、３．９０（３Ｈ、ｓ）、３．８７（１Ｈ、ｓ）、３．７３（１Ｈ、ｔ）、２．９０（１Ｈ、ｄ）、２．５７（１Ｈ、ｄ）、２．３５（１Ｈ、ｄ）、２．１５−１．９２（３Ｈ、ｍ）、１．３３（３Ｈ、ｄ）。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、１６２ＭＨｚ）δ、ｐｐｍ：１５．１９（１Ｐ、ｄ）、１５．０８（１Ｐ、ｄ）。質量スペクトル（ＥＳ＋）（ｍ／ｚ）：[Ｍ−Ｈ]‐  ８０７。ＨＰＬＣ分析による純度（Ｃ１８、Ｈ２Ｏ／ＥＤＴＡ／ＮＨ３−ＭｅＣＮ）：９９％。
【００６０】
（２．生成物（ａ）および（ｂ）と比較した化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の溶解度）
国際公開第２０１２／１３０９１１号には、修飾されたドキソルビシン部分とＨＢＰ型ベクターとの間のカップリングから誘導される以下の誘導体（ｂ）が記載されている。この化合物（ｂ）は、水に不溶性であり、ＴＲＩＳが追加された水に難溶性であり、それにより、このような化合物を使用するのが難しい。国際公開第２０１２／１３０９１１号にあるのと同じＨＢＰベクターを用いることによって、ドキソルビシンとこのベクター５とのカップリングから誘導される生成物（ａ）も、水、有機添加剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＰＥＧ、グリセリン、グルコース、ＴＲＩＳ）または無機添加剤（炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム）を含む水、および有機溶媒（エタノール若しくはジメチルスルホキシドまたは水とそれらとの混合物）に不溶性であり、それにより、この生成物を使用するのが難しい。
【化２３】
0006609634.tif 000024
【化２４】
0006609634.tif 000025
【００６１】
本発明に係る生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の溶解度が、分子（ａ）および（ｂ）の溶解度と比べて大幅に改善され（以下の表を参照）、このことは、医薬品としてのこのような化合物の使用を容易にする。
【００６２】
【表１】
0006609634.tif 000026
【００６３】
（３．生物学的試験）
＜材料および方法＞：
本発明に係る化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の抗腫瘍活性を、免疫抑制マウスへのヒト腫瘍株ＨＯＳ（ヒト骨肉腫、ＡＴＣＣ）の前脛骨（ｐａｒａｔｉｂｉａｌ）注入によって誘発される溶骨性骨肉腫の同所性異種移植マウスモデルにおいて評価した。本発明に係る分子の活性を、単独でまたは組み合わせてそれらを構成する２つの主要サブユニット（ドキソルビシンおよびベクター５）の活性と比較した。群当たり１０匹の動物における治療を、腫瘍誘発の翌日に開始し、５週間にわたって週に１〜２回腹腔内に投与した。腫瘍容積を、ノギスを用いて週に２回測定し、Ｘ線写真評価を、週に１回行った。ｍｍ３で表される腫瘍容積を、以下の式：Ｖ＝（Ｌ×ｌ２）／２（ｍｍで表されるＬおよびｌはそれぞれ、腫瘍の長い方の長さおよび短い方の長さに対応する）にしたがって計算する。
【００６４】
ここで、以下の治療群を、１０匹のマウスに対してそれぞれ試験した。
【００６５】
【表２】
0006609634.tif 000027
【００６６】
＜結果＞：
（毒性）  １２ｍｇ／ｋｇ（２０μｍｏｌ／ｋｇ）の用量で投与されると、ドキソルビシンは、動物の非常に早い体重減少（１０％を超える体重減少では、２週間の治療後の動物の安楽死が求められる）および心臓毒性の原因となる。モル当量の用量で使用される化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は、毒性のこれらの兆候を誘発しない。より効果的に腫瘍を治療するために、二官能性分子を、抗癌剤単独より高い用量で使用することもできる（典型的なドキソルビシン治療用量は、２ｍｇ／ｋｇ（３．７μｍｏｌ／ｋｇ）であることが分かっている）。ここで、使用可能な最大用量を決定するための試験は、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）が、ドキソルビシン単独より１３倍多い用量で静脈内または腹腔内に使用された場合、マウスの同様の体重減少を示した。
【００６７】
（抗腫瘍特性）（図１および２を参照）  化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、対照群、およびベクター５および／またはドキソルビシンで治療された群と比べて、測定される骨外性腫瘍のサイズを著しく減少させる。しかしながら、様々な群の腫瘍容積の比較は、２７日まで可能である。この日の後、対照、ドキソルビシンおよびベクター５群の動物は、過度に大きい腫瘍容積のため、安楽死させる必要があった。さらに、３２日目に、ドキソルビシン＋ベクター５群の全ての動物が、容積が１５００ｍｍ３を超える腫瘍を有する一方、化合物（ＩＩ）群からのわずか１匹のマウスが、この閾値を超える。
【００６８】
（腫瘍成長に関連する骨病変の予防）  化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）は、対照、ドキソルビシン、ベクター５、およびドキソルビシン＋ベクター５群と比較して、骨幹端骨折、皮質の完全性の変化、および新たな異所性骨形成を減少させる。２７日目に、対照群の動物の９０％が、腫瘍成長の生じる場所である脛骨骨幹端の骨折を有するが、これらの骨折は、化合物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で治療されたマウスのいずれにも検出されない。ドキソルビシン群で観察される病変は、対照群のものと同等である（皮質表面および骨幹端骨折における著しい骨溶解）。ベクター５（ベクター５、およびドキソルビシン＋ベクター５群）は、骨幹端骨折を部分的に減少させるが、残念ながら、大きい溶骨性病変が、皮質表面において観察された。一方、本発明に係る化合物は、この骨肉腫モデルにおいて、腫瘍成長に関連する骨溶解を著しく防ぐ。
【図１】
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【図２】
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