(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場とを含む収容器において、前記捕捉体と被反応物質とを結合させる反応方法であって、
前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、
前記収容部内に前記被反応物質を含む液体を提供して、前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、
を有し、
前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われ、
前記ブロッキング処理をする工程と前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程との間には、前記収容部を洗浄する工程は行われない、
反応方法。
【請求項２】
前記ブロッキング処理をする工程における、前記収容部内の液体の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であり、
前記反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における、前記収容部の断面積は、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下である、
請求項１に記載の反応方法。
【請求項３】
前記ブロッキング液における前記ブロッキング剤の濃度は、５質量％以上かつ８質量％以下である、
請求項１または請求項２に記載の反応方法。
【請求項４】
液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出方法であって、
前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、
前記収容部内に前記検体を提供して、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、
前記被検出物質と前記捕捉体とが結合している状態で、前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように前記金属膜に光を照射して、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する工程と、
を有し、
前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われ、
前記ブロッキング処理をする工程と前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程との間には、前記収容部を洗浄する工程は行われない、
検出方法。
【請求項５】
前記ブロッキング処理をする工程における、前記収容部内の液体の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であり、
前記反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における、前記収容部の断面積は、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下である、
請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記ブロッキング液における前記ブロッキング剤の濃度は、５質量％以上かつ８質量％以下である、
請求項４または請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出装置であって、
前記検出チップを保持するためのホルダーと、
前記ホルダーに前記検出チップが保持された状態で、前記収容部内に液体を提供する送液部と、
前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記金属膜に光を照射する光照射部と、
前記光照射部が前記金属膜に光を照射したときに、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する光検出部と、
を有し、
前記送液部は、
前記収容部内にブロッキング剤を含むブロッキング液を提供するとともに、前記収容部内において前記ブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、
前記検体を前記収容部内に提供して前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、
を行い、
前記送液部は、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程を、前記ブロッキング処理をする工程の次に行い、
前記ブロッキング処理をする工程と前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程との間には、前記収容部を洗浄する工程は行われない、
検出装置。
【請求項８】
前記送液部が移動させる前記収容部内の液体の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であり、
前記反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における前記収容部の断面積は、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下である、
請求項７に記載の検出装置。
【請求項９】
前記ブロッキング液における前記ブロッキング剤の濃度は、５質量％以上かつ８質量％以下である、
請求項７または請求項８に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕捉体が固定されている反応場を含む収容器を用いた反応方法、ならびに前記収容器を用いて被検出物質を検出するための検出方法および検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、検体中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療することが可能となる。このため、検体中の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる方法が求められている。【０００３】
近年、微量の被検出物質を分析するために、マイクロ総合分析システム（μ−ＴＡＳ）が使用されている。マイクロ総合分析システムは、少量の試薬や試料を用いて、短時間で分析できるという利点を有している。マイクロ総合分析システムの一例として、微細な流路を有するマイクロ流路チップを利用したマイクロ流路システムがある。マイクロ流路チップの流路内には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定された反応場が配置されている。この反応場では、流路内に提供された検体に含まれる被検出物質を捕捉体に結合させる抗原抗体反応（以下、「一次反応」ともいう）などが行われる。このマイクロ流路システムでは、捕捉体に捕捉された被検出物質を検出している。【０００４】
しかし、被検出物質は、非特異的に流路の内面にも付着しうる。反応場外において流路の内面に付着した被検出物質は、検出されない。このため、信頼性のある検出結果を得られないという問題があった。そこで、被検出物質が、非特異的に流路の内面に付着することを防ぐための手段として、流路の内面にブロッキング処理を施すことが提案されている（例えば、特許文献１参照）。【０００５】
特許文献１に記載のマイクロ総合分析システムでは、ブロッキング処理は、一次反応と別工程として行われる。具体的には、流路の内面へのブロッキング処理の後に、流路内からブロッキング液を除去し、さらに流路内の洗浄が行われる。この後、流路内に被検出物質を含む検体が導入されて、反応場で一次反応が行われる。これにより、特許文献１に記載のマイクロ総合分析システムでは、非特異的に流路の内面に被検出物質が付着することを防いでいる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２９２４７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ブロッキング処理後に流路内の洗浄を行う場合、工程数が増えるため検出時間が長くなってしまう。また、洗浄によってブロッキング剤が流路の内面から剥がれてしまい、ブロッキング処理の効果が低下してしまうおそれもある。すなわち、特許文献１に記載のマイクロ総合分析システムは、検出時間の短縮化および検出精度の向上の観点から、改善の余地がある。【０００８】
本発明の第１の目的は、流路（収容部）の内面へのブロッキング処理の効果を低下させることなく、捕捉体と被反応物質（被検出物質）とを結合させることができる反応方法を提供することである。また、本発明の第２の目的は、この反応方法を利用することにより流路（収容部）の内面へのブロッキング処理の効果を低下させることなく、被検出物質を短時間かつ高精度で検出することができる検出方法および検出装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る反応方法は、液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場とを含む収容器において、前記捕捉体と被反応物質とを結合させる反応方法であって、前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、前記収容部内に前記被反応物質を含む液体を提供して、前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、を有し、前記被反応物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われるか、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われる。【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出方法は、液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出方法であって、前記収容部内においてブロッキング剤を含むブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、前記収容部内に前記検体を提供して、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、前記被検出物質と前記捕捉体とが結合している状態で、前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように前記金属膜に光を照射して、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する工程と、を有し、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程は、前記ブロッキング処理をする工程の次に行われるか、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行われる。【００１１】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出装置は、液体を収容するための収容部と、前記収容部に露出し、かつ捕捉体が固定されている反応場を含む金属膜とを有する検出チップを用いて、表面プラズモン共鳴を利用することにより、検体中の被検出物質の存在または量を検出するための検出装置であって、前記検出チップを保持するためのホルダーと、前記ホルダーに前記検出チップが保持された状態で、前記収容部内に液体を提供する送液部と、前記金属膜において表面プラズモン共鳴が発生するように、前記ホルダーに保持された前記検出チップの前記金属膜に光を照射する光照射部と、前記光照射部が前記金属膜に光を照射したときに、前記金属膜の前記収容部側の面の近傍から放出される蛍光の光量、または前記金属膜で反射された光の光量を検出する光検出部と、を有し、前記送液部は、前記収容部内にブロッキング剤を含むブロッキング液を提供するとともに、前記収容部内において前記ブロッキング液を移動させて、前記収容部内をブロッキング処理する工程と、前記検体を前記収容部内に提供して前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程と、を行い、前記送液部は、前記被検出物質を前記捕捉体に捕捉させる工程を、前記ブロッキング処理をする工程の次、または前記ブロッキング処理をする工程と同時に行う。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る反応方法によれば、流路（収容部）の内面へのブロッキング処理の効果を低下させることなく、捕捉体と被反応物質（被検出物質）とを短時間で効率的に結合させることができる。したがって、本発明に係る検出方法および検出装置によれば、被検出物質の存在または量を短時間かつ高精度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）の構成を示す模式図である。
【図２】図２は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の第１の動作手順を示すフローチャートである。
【図３】図３は、図１に示されるＳＰＦＳ装置の第２の動作手順を示すフローチャートである。
【図４】図４Ａは、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合の、ブロッキング液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフであり、図４Ｂは、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合の、混合液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合の、ブロッキング液の移動の有無およびブロッキング剤の濃度と、被検出物質の量を示すシグナル値との関係を示すグラフであり、図５Ｂは、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合の、ブロッキング剤の濃度と被検出物質の量を示すシグナル値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。ここでは、本発明に係る検出装置の代表例として、検体（被反応物質を含む液体）中の被検出物質（被反応物質）の量を検出する表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用する分析装置（ＳＰＦＳ装置）について説明する。
【００１５】
（ＳＰＦＳ装置および検出チップの構成）
図１は、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部（光照射部）１１０、反射光検出部１２０、蛍光検出部１３０、送液部１４０、搬送部１５０および制御部１６０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１５０のチップホルダー１５２に検出チップ１０（収容器）を装着した状態で使用される。そこで、検出チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００１６】
検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２上に形成された金属膜３０と、金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。また、後述のとおり、検出チップ１０（収容器）は、流路４１（収容部）と、流路４１に露出した反応場とを含む。反応場では、被検出物質（被反応物質）の捕捉体による捕捉や、被検出物質の蛍光物質による標識などが行われる。通常、検出チップ１０は、分析のたびに交換される。検出チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないようなより小型の構造物、またはより大型の構造物であってもよい。
【００１７】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射部１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面で反射されて反射光βとなる。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射されて反射光βとなる。出射面２３は、反射光βをプリズム２０の外部に出射させる。
【００１８】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
【００１９】
入射面２１は、励起光αが励起光照射部１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光βの光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）δの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００２０】
なお、検出チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被検出物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００２１】
プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４〜１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２２】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。
【００２３】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２４】
また、特に図示しないが、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）には、被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。捕捉体を固定化することで、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。本実施の形態では、金属膜３０上の所定の領域（反応場）に、捕捉体が均一に固定化されている。捕捉体の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。本実施の形態では、捕捉体は、被検出物質に特異的に結合する抗体またはその断片である。また、乾燥による変性を防止する観点から、通常、捕捉体は、未使用時において保護層により保存される。
【００２５】
流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。流路蓋４０の裏面には、流路溝が形成されており、流路蓋４０は、金属膜３０（およびプリズム２０）と共に、液体を収容するための収容部を形成する。本実施の形態では、収容部は、液体が流れる流路４１である。流路４１の断面積の大きさにより流路４１内の液体の移動速度が調節されうる。後述する反応場上の液体の流れ方向に対して垂直な断面における流路４１の断面積は、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ２以上かつ１００ｍｍ２以下であることが好ましい。流路４１内で液体をより高速で移動させる観点からは、０．０１ｍｍ２以上かつ１０ｍｍ２以下であることがより好ましく、０．０１ｍｍ２以上かつ１ｍｍ２以下であることがさらに好ましい。また、反応場は、流路４１（収容部）に露出するように配置されている。液体の例には、被検出物質を含む検体（例えば、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液など）や、ブロッキング剤を含むブロッキング液、蛍光物質で標識された捕捉体を含む標識液、基準液、洗浄液などが含まれる。金属膜３０に固定化されている捕捉体は、流路４１内に露出している。流路４１の両端は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口とそれぞれ接続されている。流路４１内へ液体が提供されると、液体は捕捉体に接触する。
【００２６】
流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、樹脂が含まれる。蛍光γおよびプラズモン散乱光δを外部に取り出す部分が蛍光γおよびプラズモン散乱光δに対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００２７】
なお、検出チップ１０は、流路蓋４０の代わりに、貫通孔を有する枠体と、枠体に積層される天板とを有していてもよい。この場合、流路４１（収容部）は、金属膜３０が形成されたプリズム２０に対して、枠体および天板をこの順で積層することで形成される。金属膜３０の表面は、流路４１の底面となる。枠体の貫通孔の内面は、流路４１の側面となる。天板の一方の面（内側の面）は、流路４１の天面となる。
【００２８】
図１に示されるように、励起光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、金属膜３０に全反射角度（ＳＰＲが生じる角度）で入射する。このように金属膜３０に対して励起光αをＳＰＲが生じる角度で照射することで、金属膜３０上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被検出物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光γが金属膜３０の流路４１（収容部）側の面の近傍から放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光γの光量を測定することで、被検出物質の存在または量を検出する。
【００２９】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射部１１０、反射光検出部１２０、蛍光検出部１３０、送液部１４０、搬送部１５０および制御部１６０を有する。
【００３０】
励起光照射部１１０は、チップホルダー１５２に保持された検出チップ１０に励起光αを照射する。蛍光γまたはプラズモン散乱光δの測定時には、励起光照射部１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００３１】
光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００３２】
光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００３３】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００３４】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００３５】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００３６】
角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
【００３７】
たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００３８】
前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光δの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光γを測定することが可能となる。検出チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、流路４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、流路４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
【００３９】
光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４０】
反射光検出部１２０は、共鳴角の測定などを行うために、検出チップ１０への励起光αの照射によって生じた反射光βの光量を測定する。反射光検出部１２０は、受光センサー１２１、角度調整機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。
【００４１】
受光センサー１２１は、反射光βが入射する位置に配置され、反射光βの光量を測定する。受光センサー１２１の種類は、特に限定されない。たとえば、受光センサー１２１は、フォトダイオード（ＰＤ）である。
【００４２】
角度調整機構１２２は、金属膜３０に対する励起光αの入射角に応じて、受光センサー１２１の位置（角度）を調整する。角度調整機構１２２は、反射光βが受光センサー１２１に入射するように、受光センサー１２１とチップホルダー１５２とを相対的に回転させる。
【００４３】
センサー制御部１２３は、受光センサー１２１の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２１の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２１の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４４】
蛍光検出部１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光γを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出部１３０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光δも検出する。蛍光検出部１３０は、受光ユニット１３１、位置切替機構１３２およびセンサー制御部１３３を含む。
【００４５】
受光ユニット１３１は、検出チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１３１は、第１レンズ１３４、光学フィルター１３５、第２レンズ１３６および受光センサー１３７を含む。
【００４６】
第１レンズ１３４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３４で集光された光を受光センサー１３７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１３５は、両レンズの間に配置されている。
【００４７】
光学フィルター１３５は、蛍光成分のみを受光センサー１３７に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光δ）を除去する。光学フィルター１３５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１３５は、例えば、所定の光成分（所定の波長成分の光）を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
【００４８】
受光センサー１３７は、蛍光γおよびプラズモン散乱光δを検出する。受光センサー１３７は、微量の被検出物質からの微弱な蛍光γを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１３７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００４９】
位置切替機構１３２は、光学フィルター１３５の位置を、受光ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１３７が蛍光γを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路上に配置し、受光センサー１３７がプラズモン散乱光δを検出する時には、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路外に配置する。
【００５０】
センサー制御部１３３は、受光センサー１３７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１３３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５１】
送液部１４０は、チップホルダー１５２に保持された検出チップ１０の流路４１内に、検体やブロッキング剤を含むブロッキング液、標識液、基準液、洗浄液などを供給する。送液部１４０は、液体チップ１４１、シリンジポンプ１４２および送液ポンプ駆動機構１４３を含む。
【００５２】
液体チップ１４１は、検体やブロッキング液、標識液、基準液、洗浄液などの液体を収容する容器である。液体チップ１４１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
【００５３】
シリンジポンプ１４２は、シリンジ１４４と、シリンジ１４４内を往復動作可能なプランジャー１４５とによって構成される。プランジャー１４５の往復運動によって、液体の吸引および吐出が定量的に行われる。シリンジ１４４が交換可能であると、シリンジ１４４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１４４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１４４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１４４を交換せずに使用することが可能となる。
【００５４】
送液ポンプ駆動機構１４３は、プランジャー１４５の駆動装置、およびシリンジポンプ１４２の移動装置を含む。シリンジポンプ１４２の駆動装置は、プランジャー１４５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１４２の送液量や送液速度を管理できるため、検出チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１４２を、シリンジ１４４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１４２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００５５】
送液部１４０は、液体チップ１４１より各種液体を吸引し、検出チップ１０の流路４１内に供給する。このとき、プランジャー１４５を動かすことで、検出チップ１０中の流路４１内を液体が往復し、流路４１内の液体が撹拌される。これにより、液体の濃度分布の均一化や、流路４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、検出チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１４４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、検出チップ１０およびシリンジ１４４が構成されていることが好ましい。
【００５６】
流路４１内の液体は、再びシリンジポンプ１４２で吸引され、液体チップ１４１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、各種液体による反応、洗浄などを実施し、流路４１内の反応場に、蛍光物質で標識された被検出物質を配置することができる。
【００５７】
搬送部１５０は、検出チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射部１１０が検出チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する反射光β、蛍光γまたはプラズモン散乱光δを反射光検出部１２０または蛍光検出部１３０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液部１４０が検出チップ１０の流路４１内に液体を供給するか、または検出チップ１０の流路４１内の液体を除去する位置である。搬送部１５０は、搬送ステージ１５１およびチップホルダー１５２を含む。チップホルダー１５２は、搬送ステージ１５１に固定されており、検出チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１５２の形状は、検出チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１５２には、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１５１は、チップホルダー１５２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１５１も、励起光α、反射光β、蛍光γおよびプラズモン散乱光δの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１５１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００５８】
制御部１６０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、角度調整機構１２２、センサー制御部１２３、位置切替機構１３２、センサー制御部１３３、送液ポンプ駆動機構１４３および搬送ステージ１５１を制御する。制御部１６０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５９】
（ＳＰＦＳ装置の検出動作）
次に、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００の検出動作（本発明の実施の形態に係る検出方法）について説明する。ＳＰＦＳ装置１００は、例えば次に説明する２つの検出動作のいずれかに従って動作することができる。以下、それぞれの検出動作について図を用いて説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の第１の動作手順を示すフローチャートである。
【００６０】
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５２に検出チップ１０を設置する。
【００６１】
次いで、捕捉体の保護層を除去するとともに、流路４１の内面をブロッキング処理する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１のブロッキング液を、検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、ブロッキング液によって捕捉体の保護層が除去されるとともに、ブロッキング液が流路４１内を移動し、流路４１の内面をブロッキング処理する。このとき、流路４１内におけるブロッキング剤の濃度分布をより均一化してブロッキング処理を促進させるために、ブロッキング液を流路４１内において移動させる。ブロッキング液を移動させる方法は、特に限定されない。ブロッキング液を移動させる方法の例には、シリンジで吸引と吐出とを交互に繰り返すことや、超音波やマイクロウェーブなどの照射などが含まれる。また、ブロッキング液の流量（移動量）は、特に限定されない。ブロッキング処理（工程Ｓ２０）と１次反応（工程Ｓ３０）とを別々に行う場合、流路４１内の液体（ブロッキング液）の流量は、１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下であることが好ましい。これにより、流路４１内におけるブロッキング剤の濃度分布を均一化してブロッキング処理を促進し、ブロッキング処理に要する時間を短縮化することができる。さらに、ブロッキング液におけるブロッキング剤の濃度は、５〜８質量％程度であることが好ましい。ブロッキング処理を促進する観点からは、ブロッキング剤の濃度は、高いほうが好ましいが、ブロッキング剤の濃度が高すぎるとブロッキング液の粘度が高くなり、ブロッキング液の移動が阻害される。一方、ブロッキング剤の濃度が低すぎると、ブロッキング処理が適切に行われない。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内のブロッキング液を除去する。
【００６２】
ブロッキング液に含まれるブロッキング剤の種類は、流路４１の内面への被検出物質の非特異的結合を抑制することができれば特に限定されない。ブロッキング剤の種類の例には、アルブミンやカゼイン、スキムミルク、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物；リン脂質やエチレンジアミン、アセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらのブロッキング剤は、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００６３】
ブロッキング処理（工程Ｓ２０）の次に、被検出物質を捕捉体に捕捉させる（１次反応；工程Ｓ３０）。ここで、「ブロッキング処理の次に」とは、ブロッキング処理の後に他の工程（例えば洗浄工程や長期間に亘る保管工程など）を含まないことを意味する。具体的には、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１内の検体を流路４１内に提供する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上の捕捉体に被検出物質が捕捉される。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の検体を除去し、少なくとも１回は洗浄液（例えば、リン酸緩衝液）を用いて、流路４１内を洗浄する。
【００６４】
次いで、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ４０）。ここで「光学ブランク値」とは、後述する蛍光γの測定（工程Ｓ６０）において検出チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を検出位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射部１１０および蛍光検出部１３０を操作して、捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に、表面プラズモン共鳴が発生するように入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値（光学ブランク値）を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切替機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。測定された光学ブランク値は、制御部１６０に記録される。
【００６５】
次いで、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ５０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、蛍光物質で標識された捕捉体を含む液体（標識液）を検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、抗原抗体反応によって、金属膜３０上に捕捉されている被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の標識液を除去し、流路４１内を洗浄液で洗浄する。
【００６６】
次いで、金属膜３０の流路４１（収容部）側の面の近傍から放出される蛍光γの光量を測定して、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を得る（工程Ｓ６０）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を検出位置に移動させる。この後、制御部１６０は、励起光照射部１１０および蛍光検出部１３０を操作して、被検出物質および捕捉体が結合し、かつ金属膜３０上に検体が存在しない状態で、プリズム２０側から捕捉体が固定されている領域に対応した金属膜３０の裏面に入射面２１を介して励起光αを照射するとともに、受光センサー１３７の出力値を記録する。このとき、制御部１６０は、角度調整機構１１２を操作して、励起光αの入射角を増強角に設定する。また、制御部１６０は、位置切替機構１３２を制御して、光学フィルター１３５を受光ユニット１３１の光路内に配置する。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する。シグナル値は、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算される。以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または量を検出することができる。
【００６７】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の第２の検出動作について説明する。図３は、ＳＰＦＳ装置１００の第２の動作手順を示すフローチャートである。
【００６８】
まず、前述した動作手順と同様に、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１５２に検出チップ１０を設置して検出の準備をする（工程Ｓ１０’）。
【００６９】
次いで、捕捉体の保護層を除去するとともに、流路４１内のブロッキング処理と一次反応とを同時に行う（工程Ｓ２０’）。具体的には、制御部１６０は、搬送ステージ１５１を操作して、検出チップ１０を送液位置に移動させる。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、液体チップ１４１のブロッキング液と、被検出物質を含む検体との混合液を検出チップ１０の流路４１内に提供する。流路４１内では、ブロッキング液および検体の混合液が流路４１内を移動し、捕捉体の保護層が除去されるとともに、流路４１内の内面にブロッキング処理を施す。また、抗原抗体反応によって、金属膜３０上の捕捉体に被検出物質が捕捉される。本動作手順でも、ブロッキング処理を促進させるために、第１の動作手順と同様の方法で流路４１内の液体（ブロッキング液および検体の混合液）を移動させる。また、流路４１内の液体（ブロッキング液および検体の混合液）の流量は、特に限定されず、第１の動作手順での流量と同様である。一方、流路４１内の液体（ブロッキング液および検体の混合液）におけるブロッキング剤の濃度は、例えば、２〜３質量％程度であることが好ましい。ブロッキング処理と一次反応とを同時に行う場合、流路４１内を移動する液体は、ブロッキング剤の他にも被検出物質などの各種タンパク質を含む。そのため、ブロッキング処理と一次反応とを別々に行う場合（ブロッキング剤の濃度は、５〜８質量％）と比較して、液体の粘度が高くなり、液体を適切に移動させることが難しくなるおそれがあるため、流路４１内の液体に含まれるブロッキング剤の濃度を下げることが好ましい。この後、制御部１６０は、送液ポンプ駆動機構１４３を操作して、流路４１内の液体を除去し、少なくとも１回は洗浄液（例えば、リン酸緩衝液）を用いて、流路４１内を洗浄する。
【００７０】
次いで、前述した動作手順と同様に、光学ブランク値を測定し（工程Ｓ３０’）、２次反応を行った後に（工程Ｓ４０’）、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を得る（工程Ｓ５０’）。制御部１６０は、検出値から光学ブランク値を引き、検体中の被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出し、必要に応じて、被検出物質の量や濃度などに換算する。以上の手順により、検体中の被検出物質の存在または量を検出することができる。
【００７１】
（効果）
本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、ブロッキング液を流路４１内において移動させることで、ブロッキング剤の濃度分布を均一化することができる。この結果、ブロッキング処理が促進され、短時間でブロッキング処理を施すことができる。また、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００では、ブロッキング液を移動させるため、ブロッキング液の粘度にかかわらず、適切に、かつ短時間でブロッキング処理を施すことができる。
【００７２】
従来、ブロッキング処理を促進させる観点から、ブロッキング液のｐＨの調整などが行われてきた。しかしながら、ブロッキング液のｐＨと、検体のｐＨとが異なる場合、検体中の被検出物質およびブロッキング剤が変性するおそれがあった。このため、ブロッキング処理の後に、流路４１内からブロッキング液を除去するために、流路４１内を洗浄する必要があった。しかしながら、前述したとおり、ブロッキング剤が洗浄液により剥がれ落ちることによって、ブロッキング処理の効果が低下するおそれがあるため、従来の検出方法では、被検出物質を高精度で検出することができないおそれがあった。また、洗浄工程などの他の工程を行うことにより被検出物質の検出までの工程が増え、検出に要する時間が長くなっていた。
【００７３】
これに対して、本実施の形態では、ブロッキング液を移動させることにより、ブロッキング処理の促進を図っている。このため、ブロッキング液のｐＨを調整する必要がない。また、本実施の形態では、ブロッキング処理と一次反応との間に流路４１内の洗浄などの他の工程を含む必要がないため、他の工程によりブロッキング剤が剥がれ落ちるおそれがない。したがって、本実施の形態に係るＳＰＦＳ装置１００は、ブロッキング処理の効果を低下させることなく、被検出物質の存在または量を短時間で、かつ高精度で検出することができる。
【００７４】
なお、上記実施の形態では、プリズム２０と金属膜３０の界面において励起光を全反射させることで、励起光と表面プラズモンとを結合させる検出方法および検出装置について説明した。しかし、本発明に係る検出方法および検出装置は、回折格子を利用して励起光と表面プラズモンとを結合させてもよい。この場合、ＳＰＦＳ装置１００では、金属膜３０は、プリズム２０上に配置されていなくてもよく、代わりに回折格子を含んでいてもよい。
【００７５】
また、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用する検出方法および検出装置について説明したが、本発明に係る検出方法および検出装置は、ＳＰＦＳを利用する検出方法および検出装置に限定されない。たとえば、本発明に係る検出方法および検出装置は、ＳＰＲ法を利用する検出方法および検出装置であってもよい。この場合、ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光γの光量を測定せずに、シグナル値として反射光βの光量を測定することで被検出物質の存在または量を検出する。したがって、光学ブランク値の測定（工程Ｓ４０、工程Ｓ３０’）および２次反応（工程Ｓ５０、工程Ｓ４０’）は不要である。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。【００７７】
［実施例１］
実施例１では、ブロッキング処理においてブロッキング液を移動させることの効果を調べた。【００７８】
１．ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合
（１）検出チップの準備
金属膜上の反応場（捕捉体として抗トロポニン抗体が固定されている領域）が保護層で保護されている検出チップを準備した。反応場上における流路の断面積は、０．４６ｍｍ２である。準備した検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。【００７９】
（２）ブロッキング液の調製
ブロッキング剤（ＢＳＡ；牛血清アルブミン）を終濃度が５質量％となるように酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング液を調製した。【００８０】
（３）ブロッキング処理
送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング液（１００μＬ）を３５秒間、所定の流量（１〜３３００μＬ／分）で、検出チップの流路内において往復送液を行って、ブロッキング処理をした。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内のブロッキング液を除去した。【００８１】
（４）一次反応
ブロッキング処理の次に、送液部のシリンジポンプを用いて、リン酸緩衝液とトロポニン（被検出物質）を含む血漿（検体）とを体積比が２対１になるように混合した血漿の希釈液（１００μＬ）を４分、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、一次反応を行った。【００８２】
（５）ブロッキング処理の効果の確認
一次反応の後、波長６３５ｎｍの光をプリズム側から金属膜に照射した。次いで、金属膜からの反射光を検出し、反射率を測定した。あらかじめ作成しておいた反射率およびブロッキング率の検量線と、測定した反射率とに基づいてブロッキング率を算出した。検量線を作成する際、ブロッキング処理の時間を長くするか、またはブロッキング剤の濃度を高くしていき、反射率の変化が見られなくなったときのブロッキング率を１００％とした。【００８３】
２．ブロッキング処理および一次反応を同時に行う場合
（１）検出チップの準備
上記１.（１）と同様に、準備した検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。【００８４】
（２）ブロッキング液および検体の混合液の調製
ブロッキング剤（ＢＳＡ）を酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング液を調製した。調製したブロッキング液および血漿を体積比が２対１となるように混合して、ブロッキング液および血漿の混合液を調製した。混合液中のブロッキング剤の終濃度は２質量％である。【００８５】
（３）ブロッキング処理および一次反応
送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング液および血漿の混合液（１００μＬ）を１分２８秒間、所定の流量（１〜３３００μＬ／分）で、流路内において往復送液を行って、ブロッキング処理および一次反応を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の混合液を除去した。【００８６】
（４）ブロッキング処理の効果の確認
流路の内面をブロッキング処理した後、上記１.（５）と同様の手順でブロッキング率を算出した。【００８７】
３．結果
図４Ａは、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合の、ブロッキング液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフである。図４Ｂは、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合の、混合液の流量とブロッキング率との関係を示すグラフである。図４Ａおよび図４Ｂにおいて、横軸は、流路内の液体（ブロッキング液または混合液）の流量（μＬ／分）を示し、縦軸は、ブロッキング率（％）を示す。【００８８】
図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、ブロッキング処理の次に一次反応を行った場合、およびブロッキング処理と一次反応とを同時に行った場合のいずれの場合においても、流路内の液体（ブロッキング液または混合液）の流量が大きいほど、ブロッキング率が高くなった。特に、いずれの場合も、流路内の液体の流量が１６００μＬ／分以上のとき、ブロッキング率が９０％以上となった。この結果から、流路内の液体を移動させることによって、流路内のブロッキング処理を短時間で行えることがわかる。また、流路内の液体の流量を１６００μＬ／分以上かつ３３００μＬ／分以下とすることで、ブロッキング率を９０％以上にできることもわかる。【００８９】
［実施例２］
実施例２では、ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合における、ブロッキング液の移動の有無およびブロッキング剤の濃度と、ブロッキング処理に要する時間との関係を調べた。【００９０】
（１）ブロッキング液の調製
ブロッキング剤（ＢＳＡ）を終濃度が０質量％、１質量％、２質量％、５質量％または８質量％となるように酢酸緩衝液に加えて、５種類のブロッキング液を調製した。【００９１】
（２）検出チップの準備
実施例１と同様に、金属膜上の反応場（捕捉体として抗トロポニン抗体が固定されている領域）が保護層で保護されている検出チップを複数作製した。反応場上における流路の断面積は、０．４６ｍｍ２である。一部の検出チップについては、作製直後にブロッキング剤を１質量％含むブロッキング液（１００μＬ）を流路内に提供し、検出チップを所定の時間静置して、ブロッキング処理をした。その後、流路内からブロッキング液を除去し、常温常圧下で１日以上保存した。【００９２】
（３）ブロッキング処理
作製直後にブロッキング処理をしていない検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング剤を０質量％、２質量％、５質量％または８質量％含むブロッキング液（１００μＬ）を所定の時間、所定の流量で、流路内において往復送液（撹拌）を行って、ブロッキング処理をした。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内のブロッキング液を除去した。【００９３】
（４）一次反応
ブロッキング処理の次に、リン酸緩衝液とトロポニン（被検出物質）を含む血漿（検体）を体積比が２対１になるように混合した血漿の希釈液（１００μＬ）を４分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って一次反応を行った。また、作製直後にブロッキング処理をした検出チップについても、検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーにそれぞれ設置した後、同様の手順で一次反応を行った。【００９４】
（５）ブロッキング時間の決定
一次反応の後、実施例１と同様の手順で流路の内面のブロッキング率を算出した。各ブロッキング処理の条件ごとに、ブロッキング率が９０％以上となるときの処理時間の下限値（以下、「ブロッキング時間」ともいう）を決定した。【００９５】
ブロッキング処理の条件と、ブロッキング時間との関係を表１に示す。条件Ａ、Ｃ〜Ｅでは、一次反応の直前にブロッキング処理を行っている。条件Ｂは、検出チップの作製直後にブロッキング処理を行っている。【００９６】
【表１】
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【００９７】
表１に示されるように、ブロッキング液を移動させなかった場合（条件Ｂ）のブロッキング時間は、５時間であった。一方、ブロッキング液を移動させた場合（条件Ｃ〜Ｅ）のブロッキング時間は、ブロッキング液を移動させなかった場合（条件Ｂ）と比較して顕著に短くなっていた。この結果から、ブロッキング液を移動させることによって、ブロッキング時間を大幅に短縮できることがわかる。また、ブロッキング剤の濃度が高いほど、ブロッキング時間を短縮できることもわかる。【００９８】
［実施例３］
実施例３では、ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合における、ブロッキング液の移動の有無およびブロッキング剤の濃度と、シグナル値との関係を調べた。比較例として、ブロッキング処理と一次反応との間に他の工程を含む場合についても調べた。【００９９】
（１）検出チップの準備
作製直後のブロッキング処理において、３０分間静置したこと以外は、実施例２と同様の手順により、作製直後にブロッキング処理をした検出チップと、作製直後にブロッキング処理をしていない検出チップを準備した。これらの検出チップを、常温常圧下で１日以上保存した。【０１００】
（２）ブロッキング処理
作製直後にブロッキング処理をしていない検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。実施例２と同様の手順で、送液部のシリンジポンプを用いて、ブロッキング剤を０質量％、２質量％、５質量％または８質量％含むブロッキング液（１００μＬ）を１５秒間、３３００μＬ／分の流量で流路内において往復送液を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内のブロッキング液を除去した。【０１０１】
ブロッキング処理の条件を表２に示す。条件Ｆ、Ｈ〜Ｊでは、一次反応の直前にブロッキング処理を行っている。条件Ｇは、検出チップの作製直後にブロッキング処理を行っている。【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
（３）一次反応
ブロッキング処理の次に、送液部のシリンジポンプを用いて、リン酸緩衝液および血漿（検体）を体積比が２対１になるように混合した血漿の希釈液（１００μＬ）を、４分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、一次反応を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の希釈液を除去した。また、作製直後にブロッキング処理をした検出チップについても、検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーにそれぞれ設置した後、同様の手順で一次反応を行った。【０１０４】
本実験では、検体として、被検出物質（トロポニン）を含む血漿、またはトロポニンを含まない血漿のそれぞれについて送液を行った。以下、被検出物質を含む検体を用いた場合の一次反応を「ポジティブ反応」、被検出物質を含まない検体を用いた場合の一次反応を「ネガティブ反応」ともいう。【０１０５】
（４）光学ブランク値の測定
一次反応の後、流路内にリン酸緩衝液を導入して、流路内を洗浄した。その後、波長６３５ｎｍの光をプリズム側から金属膜に照射した。金属膜の流路側の面の近傍から放出される光を検出し、光学ブランク値を得た。【０１０６】
（５）二次反応
その後、送液部のシリンジポンプを用いて、蛍光色素で標識された抗トロポニン抗体を含む溶液（１００μＬ）を、１分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行って、二次反応を行った。なお、ポジティブ反応およびネガティブ反応いずれを行った場合も、二次反応を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の溶液を除去した。【０１０７】
（６）被検出物質の量を示すシグナル値の測定
光学ブランク値の測定と同様に、流路内を洗浄した後に、金属膜の流路側の面の近傍から放出される蛍光を検出した。検出値から光学ブランク値を引いて、被検出物質の量を示すシグナル値を得た。測定結果を図５Ａに示す。【０１０８】
図５Ａは、条件Ｆ〜Ｊにおける被検出物質の量を示すシグナル値を示すグラフである。図５Ａにおいて、黒色の棒は、ネガティブ反応を行った場合の結果を示し、白色の棒は、ポジティブ反応を行った場合の結果を示している。縦軸は、条件Ｇにおけるシグナル値を基準（１００）としたときのシグナル値（相対値）を示している。ポジティブ反応を行った場合のシグナル値は、主に、被検出物質を標識している蛍光色素から放出される蛍光に由来する。一方、ネガティブ反応では、蛍光色素が特異的に結合しうる被検出物質が存在しないため、シグナル値は、流路内に非特異的に結合した蛍光色素やその他の自家蛍光に由来する。すなわち、ポジティブ反応を行った場合のシグナル値は、被検出物質の量を示し、ネガティブ反応を行った場合のシグナル値は、ノイズの量を示す。【０１０９】
図５Ａにおいて、条件Ｇ〜Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、作製直後にブロッキング処理を行った検出チップ（条件Ｇ）のシグナル値（ノイズ）は、一次反応の直前にブロッキング処理を行った検出チップ（条件Ｈ〜Ｊ）のシグナル値（ノイズ）よりも高かった。この結果から、ブロッキング処理を行った後に検出チップを長期間保管することによって、ブロッキング処理の効果が低下してしまうことがわかる。このことから、ＳＮ比を向上させる観点からは、ブロッキング処理と一次反応との間に他の工程を含まず、一次反応の直前にブロッキング処理を行うことが好ましいことがわかる。【０１１０】
また、図５Ａにおいて、条件Ｆおよび条件Ｈ〜Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング剤の濃度が高いほど、シグナル値（ノイズ）が低下していた。特に、条件Ｆおよび条件Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、シグナル値（ノイズ）は、３０％程度低減していた。また、条件Ｇおよび条件Ｊのネガティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング液を移動させることで、シグナル値（ノイズ）が２０％程度低減していた。これらの結果から、ブロッキング液を移動させ、かつブロッキング剤の濃度が高いほど、ブロッキング処理の効果は高くなり、被検出物質の流路の内面への非特異的結合を抑制できることがわかる。【０１１１】
一方、条件Ｆ〜Ｊのポジティブ反応の結果を比較してみると、シグナル値は、ブロッキング剤の濃度が高くなっても低下していなかった。このことから、ブロッキング処理の次に一次反応を行う場合、ブロッキング剤の濃度は、捕捉体に捕捉される被検出物質の量に影響を与えないことがわかる。【０１１２】
以上の結果から、ブロッキング液を移動させるとともに、ブロッキング剤の濃度を高くすることによって、被検出物質の検出に要する時間（ブロッキング処理に要する時間を含む）を短縮化しつつ、ＳＮ比を向上させて被検出物質の量を高精度で検出できることがわかる。【０１１３】
［実施例４］
実施例４では、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行う場合におけるブロッキング剤の濃度と、シグナル値との関係を調べた。【０１１４】
（１）検出チップの準備
実施例１と同様に、金属膜上の反応場（捕捉体として抗トロポニン抗体が固定されている領域）が保護層で保護されている検出チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。なお、反応場上における流路の断面積は、０．４６ｍｍ２である。【０１１５】
（２）ブロッキング液および検体の混合液の調製
ブロッキング剤（ＢＳＡ）を酢酸緩衝液に加えて、ブロッキング液を調製した。調製したブロッキング液および血漿（検体）を体積比が２対１となるように混合して、６種類の濃度のブロッキング液および血漿の混合液を調製した。混合液中のブロッキング剤の終濃度は、それぞれ０質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％または５質量％である。このとき、検体として被検出物質（トロポニン）を含む血漿、またはトロポニンを含まない血漿を用いて、１２種類の混合液をそれぞれ調製した。【０１１６】
（３）ブロッキング処理および一次反応
送液部のシリンジポンプを用いて、混合液（１００μＬ）を、４分間、３３００μＬ／分の流量で、流路内において往復送液を行った。次いで、送液部のシリンジポンプを用いて、流路内の混合液を除去した。【０１１７】
（４）被検出物質の量を示すシグナル値の測定
実施例２と同様の手順で光学ブランク値の測定および二次反応を行い、被検出物質の量を示すシグナル値を得た。測定結果を図５Ｂに示す。【０１１８】
図５Ｂにおいても、黒色の棒は、ネガティブ反応を行った場合の結果を示し、白色の棒は、ポジティブ反応を行った場合の結果を示している。横軸は、ブロッキング剤の濃度（質量％）を示している。縦軸は、ブロッキング剤の濃度が０質量％のとき（ブロッキング剤を含まないとき）のシグナルを基準（１００）としたときのシグナル値（相対値）を示している。【０１１９】
ネガティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング剤の濃度が０質量％のときのシグナル値（ノイズ）が最も高く、ブロッキング剤の濃度が高いほど、シグナル値（ノイズ）が低下する傾向にあった。この結果から、ブロッキング剤の濃度が高いほど、ブロッキング処理の効果が高くなり、流路内の非特異的結合を抑制できることがわかる。【０１２０】
一方、ポジティブ反応の結果を比較してみると、ブロッキング剤の濃度が３質量％より高くなると、ブロッキング剤の濃度が高いほど、シグナル値が低下していた。この結果は、ブロッキング剤の濃度が３質量％より高くなると、捕捉体と結合した被検出物質の量が減少することを示唆している。これは、ブロッキング剤の濃度が３質量％より高くなると、混合液の粘度が増大し、被検出物質の移動が抑制されるため、一次反応が阻害される傾向にあると考えられる。【０１２１】
以上の結果から、ブロッキング処理と一次反応とを同時に行う場合は、一次反応が阻害されることを防止するために、混合液中のブロッキング剤の濃度を３質量％以下にすることが好ましいことがわかる。【０１２２】
本出願は、２０１４年８月２５日出願の特願２０１４−１７０４３８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明に係る反応方法を用いた被検出物質の検出方法および検出装置は、被検出物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【０１２４】
１０  検出チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０  流路蓋
４１  流路
１００  ＳＰＦＳ装置
１１０  励起光照射部
１１１  光源ユニット
１１２  角度調整機構
１１３  光源制御部
１２０  反射光検出部
１２１  受光センサー
１２２  角度調整機構
１２３  センサー制御部
１３０  蛍光検出部
１３１  受光ユニット
１３２  位置切替機構
１３３  センサー制御部
１３４  第１レンズ
１３５  光学フィルター
１３６  第２レンズ
１３７  受光センサー
１４０  送液部
１４１  液体チップ
１４２  シリンジポンプ
１４３  送液ポンプ駆動機構
１４４  シリンジ
１４５  プランジャー
１５０  搬送部
１５１  搬送ステージ
１５２  チップホルダー
１６０  制御部
α  励起光
β  反射光
γ  蛍光
δ  プラズモン散乱光
【図１】
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【図２】
0006520950.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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