(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体を有する細胞外ループ１（ＥＣ１）に連結された、配列番号１３で示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体を有するヒト成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）のＮ末端（ここで、Ｎ末側からＣ末側の方向に、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端−ＥＣ１である）、または
ｉｉ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体を有する細胞外ループ１（ＥＣ１）および配列番号１７で示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体を有する細胞外ループ２（ＥＣ２）に連結された、配列番号１３で示されるアミノ酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体を有するＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端（ここで、Ｎ末側からＣ末側の方向に、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端−ＥＣ１−ＥＣ２である）と
ｂ）前記ａ）のＣ末側に連結された、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）である融合パートナー
とを含んでなる可溶性融合分子。
【請求項２】
前記ａ）が、ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端、細胞外ループ１および細胞外ループ２を含むか、またはからなる、請求項１に記載の可溶性融合分子。
【請求項３】
ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端が配列番号１２で示される核酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体によりコードされ、ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ループ１が配列番号１４で示される核酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体によりコードされ、および／または、ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ループ２が配列番号１６で示される核酸配列または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体によりコードされる、請求項１または２に記載の可溶性融合分子。
【請求項４】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ２のＦｃ領域である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性融合分子。
【請求項５】
ａ）とｂ）の間にペプチドリンカーをさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性融合分子。
【請求項６】
配列番号１１または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体で示されるか、あるいは、配列番号１０または少なくとも９５％の配列同一性を有するその変異体で示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の可溶性融合分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の可溶性融合分子をコードする核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の可溶性融合分子、前記可溶性融合分子をコードする核酸分子または前記核酸分子を発現する宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
前記可溶性融合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
動物における脂肪過多を軽減することに用いるための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
動物において体重増加を軽減することに用いるための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
動物において肥満または肥満関連病態を治療することに用いるための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記肥満関連病態が２型糖尿病、心血管疾患または癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が食道、乳房、子宮内膜、結腸直腸および膵臓の癌である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記肥満関連病態が高コレステロール、高トリグリセリド、高血圧性代謝症候群または多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善することに用いるための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記動物が２型糖尿病を有する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記動物がヒトである、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、脂肪過多の軽減ならびに肥満および肥満関連病態の治療または予防に有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪過多は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）、心血管疾患、および癌を含む多くの慢性疾患のリスク因子である(Wang, McPherson et al. 2011)。研究によれば、少しの体重減少であっても心血管リスク因子にプラスの影響を持ち(Blackburn 1995; Pi-Sunyer 1996)、Ｔ２ＤＭおよび糖尿病関連合併症の両方の発症リスクの軽減に関連することが示されている(Bosello, Armellini et al. 1997)。
【０００３】
カロリーの制限および運動の増加から行動変化までを目的とするライフスタイルへの介入は、現在、体重管理の第一選択アプローチとして推奨されている。しかしながら、これらの戦略だけでは、持続的（６〜１２か月）体重減少のための薬理学的介入に比べて成功度が低い(Gray, Cooper et al. 2012)。残念なことに、肥満治療に承認されているほとんどの薬物はそれらの副作用のために回収されて使用できなくなっている(Gray, Cooper et al. 2012)。最近、肥満治療のための消化管ホルモンのターゲティングが注目を集めている(Neary and Batterham 2009)。実際に、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）を注射すると、ヒトにおいて脳の摂食領域に作用することによって食欲を抑えることができる(De Silva, Salem et al. 2011)。他の有望な候補は、胃由来ペプチドホルモン、グレリンである。グレリンレベルは、エネルギー消耗状態の際に循環中で極大となり、視床下部の弓状核内の食欲刺激ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）およびアグーチ遺伝子関連ペプチド（ＡｇＲＰ）ニューロンの活性化をもたらす(Nakazato, Murakami et al. 2001)。この作用は、成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）に対するグレリンの結合を介して起こる(Kamegai, Tamura et al. 2000)。食欲に加え、グレリンは、脂肪細胞の分化および脂肪組織におけるカロリー貯蔵の優先性を促進する(Tschop, Smiley et al. 2000; Rodriguez, Gomez-Ambrosi et al. 2009)。
【０００４】
グレリンペプチドはプログレリンに由来し、プログレリンは、タンパク質分解切断を受けてアシル化グレリン（ＡＧ）(Zhu, Cao et al. 2006)、非アシル化グレリン（ＵＡＧ）(Zhu, Cao et al. 2006)およびオベスタチン（ベスタチン）(Zhang, Ren et al. 2005)を産生する前駆体ペプチドである。しかしながら、イン・ビトロ（in vitro）研究では、ＵＡＧ(Kojima, Hosoda et al. 1999)およびオベスタチン（ベスタチン）(Zhang, Ren et al. 2005)は、ＧＨＳ−Ｒ１ａと結合することができないことが示されている。ＧＨＳ−Ｒ１ａは、Ｇタンパク質共役受容体であり(Howard, Feighner et al. 1996)、唯一知られている内因性リガンドＡＧの結合を介して活性化される(Kojima, Hosoda et al. 1999)。最近の研究では、ＡＧは、疎水性ポケットを形成する第２の細胞外ループ（ＥＣ２）でＧＨＳ−Ｒ１ａと結合し、結合の際にグレリンの親油性アシル化側鎖を安定化させることが示唆された(Pedretti, Villa et al. 2006)。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、Ｎ末端および細胞外結合ループ１および２（ＧＨＳＲ／Ｆｃ）を含むＧＨＳ−Ｒ１ａ融合構築物のイン・ビボ（in vivo）発現がＡＧの減少を引き起こしたが、興味深いことにＵＡＧレベルは減少させず、高脂肪食により誘発される体重増加からマウスを保護し、脂肪遺伝子発現プロファイルの変化ならびにグルコースクリアランスおよびインスリン感受性の改善を伴っていたことを示した。これらの所見は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ融合構築物が肥満および肥満関連病態の治療に臨床用途が見出せることを示唆する。
【０００６】
よって、一態様において、本開示は、ａ）成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）のｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも１つと、ｂ）前記に連結された融合パートナー（融合相手）とを含んでなる可溶性融合分子を提供する。
【０００７】
一実施形態では、前記可溶性融合分子は、融合パートナーに連結された、ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも２つを含んでなる。別の実施形態では、前記可溶性融合分子は、融合パートナーに連結された、ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２を含んでなる。さらなる実施形態では、前記可溶性融合分子は、融合パートナーに連結された、ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２からなる。
【０００８】
一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端領域は、配列番号４もしくは１３もしくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有し；細胞外ループ１は、配列番号６もしくは１５もしくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有し；および／または細胞外ループ２は配列番号８もしくは１７もしくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有する。
【０００９】
別の実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端領域は、配列番号３もしくは１２もしくはその変異体で示される核酸配列によりコードされ；細胞外ループ１は、配列番号５もしくは１４もしくはその変異体で示される核酸配列によりコードされ；および／または細胞外ループ２は、配列番号７もしくは１６もしくはその変異体で示される核酸配列によりコードされる。
【００１０】
一実施形態では、前記融合パートナーは、安定化タンパク質またはポリマーなどの安定化分子である。一実施形態では、安定化タンパク質は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）またはアルブミンタンパク質である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域、場合により、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。別の実施形態では、安定化ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
【００１１】
本開示の可溶性融合分子は直接結合させることもできるし、または２つ以上の細胞外ＧＨＳ−Ｒ１ａドメインの間および／または１または複数のＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインと融合パートナーの間にペプチドリンカーを含んでなることもできる。
【００１２】
一実施形態では、前記可溶性融合分子は、配列番号２もしくは１１またはその変異体で示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号１もしくは１０またはその変異体で示される核酸配列によりコードされる。
【００１３】
本明細書ではまた、本開示の可溶性融合分子をコードする核酸分子が提供され、ここでは、ａ）およびｂ）は、場合によりペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である。
【００１４】
別の実施形態では、本開示は、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端ドメインをコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号３または１２で示される核酸配列を含んでなるか、配列番号４または１３で示されるアミノ酸配列をコードする。別の実施形態では、本開示は、ＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ループ１をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号５もしくは１４またはその変異体で示される核酸配列を含んでなるか、配列番号６もしくは１５またはその変異体で示されるアミノ酸配列をコードする。さらに本明細書では、ＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ループ２をコードする単離された核酸分子が提供される。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号７もしくは１６またはその変異体で示される核酸配列を含んでなるか、配列番号８もしくは１７またはその変異体で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１５】
また、本開示の核酸分子を含んでなる宿主細胞も提供される。
【００１６】
さらにまた、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインと担体、場合により、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物、場合により、医薬組成物も提供される。一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、Ｎ末端領域、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択される。別の実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、細胞外ループ１および／または２である。
【００１７】
別の態様では、本開示は、動物において脂肪過多を軽減する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物において脂肪過多を軽減するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物において脂肪過多を軽減するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物において脂肪過多を軽減する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、Ｎ末端領域、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択される。別の実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、細胞外ループ２である。
【００１８】
一実施形態では、本開示は、動物において体重増加を軽減する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物において体重増加を軽減するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物において体重増加を軽減するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物において体重増加を軽減する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、Ｎ末端領域、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択される。別の実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、細胞外ループ２である。
【００１９】
別の実施形態では、本開示は、動物において肥満または肥満関連病態を治療する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物において肥満または肥満関連病態を治療するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物において肥満または肥満関連病態を治療するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物において肥満または肥満関連病態を治療する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、Ｎ末端領域、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択される。別の実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、細胞外ループ２である。
【００２０】
一実施形態では、肥満関連病態は、２型糖尿病、心血管疾患または癌である。中でも、肥満に最も関連のある癌のタイプは、食道、乳房、子宮内膜、結腸直腸および膵臓である。よって、一実施形態では、前記癌は、食道、乳房、子宮内膜、結腸直腸および膵臓の癌である。別の実施形態では、肥満関連病態は、高コレステロール、高トリグリセリド、高血圧性代謝症候群（高血糖、高血圧、高トリグリセリドおよび高コレステロールの組合せ）または多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）である。
【００２１】
さらなる実施形態では、本開示は、動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、Ｎ末端領域、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択される。別の実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインは、細胞外ループ２である。
【００２２】
前記動物は、任意の動物、場合により、ヒトであり得る。一実施形態では、前記動物は２型糖尿病を有する。
【００２３】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明および具体例は本開示の実施形態を示すが、本詳細な説明から当業者には本開示の趣旨および範囲の中で様々な変更および改変が明らかであるので、単に例として示されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本開示を以下、図面に関して説明する。
【図１】図１は、ＧＨＳＲ関連構築物のバリデーションを示す。全長（ＷＴ）および細胞外ドメイン（ＧＨＳＲ／Ｆｃ）構築物の図示（Ａ）。ドメインは、Ｎ末端（Ｎｔ）、細胞外ドメイン１および２（ＥＣ１、ＥＣ２）およびマウス免疫グロブリンＩｇＧ１定常領域（Ｆｃ）として示される。ウエスタンブロットは、ＧＨＳＲ／Ｆｃに基づく構築物でトランスフェクトされたＬ６細胞（Ｂ）およびＣＨＯ（Ｃ）細胞由来の細胞溶解液（Ｌ）および培養培地（Ｍ）の免疫ブロットのための抗Ｍｙｃタグ抗体を用いて行った。抗マウスＩｇＧ−Ｆｃｓを用いた蛍光免疫細胞化学法を、ＷＴおよびＧＨＳＲ／ＦｃプラスミドでされたＬ６筋肉細胞で行った（Ｄ、図ではトランスフェクト細胞は灰色に見える）。
【図２】図２は、体重増加および代謝パラメーターに対するＧＨＳＲ／Ｆｃの効果を示す。マウスに示されたプラスミドの筋肉内注射を３回施し、最初の遺伝子導入後２日目に高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた。摂食過程の体重をモニタリングした（Ａ）。
【図３】図３は、試験の終了時に腓腹筋組織溶解液（Ａ）および血漿（Ｂ）の免疫ブロットのための抗Ｍｙｃタグ抗体を用いて行ったウエスタンブロットを示す。全（ＡＧおよびＵＡＧ）、アシル特異的（ＡＧ）（Ｃ）およびＩＧＦ−１（Ｄ）の循環レベルを試験の終了時にアッセイした。データは平均±ＳＥＭである、＊Ｐ＜０．０５。
【図４】図４は、脂肪組織に対するＧＨＳＲ／Ｆｃの効果を示す。試験後に、屠殺したＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスおよび対照マウス由来の腹腔脂肪体を観察した（Ａ）。ＧＨＳＲ／Ｆｃマウスおよび対照マウスにおいて示された貯蔵所の脂肪体量（Ｂ）および腓腹筋量（Ｃ）を定量した（Ｂ）。レプチン、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）、ＰＰＡＲγ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のｍＲＮＡ転写産物レベルを、標準曲線法を用いた、１８ＳリボソームＲＮＡと比較するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｄ）。データは平均±ＳＥＭである、＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜．００１（ｎ＝５）。
【図５】図５は、腹腔内グルコース負荷試験およびインスリン負荷試験を示す。グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）は、ＨＦＤ摂食前および代謝ケージアッセイ前のいずれかに行った（Ａ）。グルコース負荷試験の曲線下面積（ＡＵＣ）をＧＨＳＲ／Ｆｃマウスと対照マウスの間で比較した（Ｂ）。インスリン負荷試験（ＩＴＴ）はマウス屠殺の前日に行い（Ｃ）、（ＡＵＣ）を示す（Ｄ）。データは平均±ＳＥである、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜．０００１（ｎ＝５）。
【発明の具体的説明】
【００２５】
本発明者らは、グレリン受容体のリガンド結合ドメインを含むデコイタンパク質のＧＨＳ−Ｒ１ａ融合構築物を開発した。ＧＨＳＲ／Ｆｃプラスミドの筋肉内注射は、アシル化グレリンの循環レベルを低下させた。高脂肪食（ＨＦＤ）を投与した際、処置マウスは対照に比べて体重増加の低下を示し、これは腹膜内の脂肪蓄積の減少に関連しており、除脂肪量には関連してない。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、処置動物の脂肪組織におけるＰＰＡＲγおよびホルモン感受性リパーゼ転写産物レベルの上昇を示し、これは脂肪利用の優先性を示す。腹腔内グルコース耐性およびインスリン負荷試験は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置動物におけるグルコースクリアランスおよびインスリン感受性の改善を示した。従って、ＧＨＳＲに基づく融合タンパク質のイン・ビボ発現は、食餌誘発性の体重増加を防ぎ、脂肪遺伝子発現を変化させ、グルコース耐性を改善する。
【００２６】
本発明者らは、細胞外結合ループ１および２を含むＧＨＳ−Ｒ１ａ融合構築物（ＧＨＳＲ／Ｆｃ）のイン・ビボ発現がアシル化グレリン（ＡＧ）の減少を引き起こしたが、興味深いことに非アシル化グレリン（ＵＡＧ）レベルは減少させず、高脂肪食により誘発される体重増加からマウスを保護し、脂肪遺伝子発現プロファイルの変化ならびにグルコースクリアランスおよびインスリン感受性の改善を伴っていたことを示した。これらの所見は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ融合構築物が肥満および肥満関連病態の治療に臨床用途が見出せることを示唆する。
【００２７】
よって、一態様において、本開示は、ａ）成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）のｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも１つと、ｂ）前記に連結された融合パートナーとを含んでなる可溶性融合分子を提供する。
【００２８】
用語「成長ホルモン分泌促進因子受容体」または「ＧＨＳ−Ｒ１ａ」は、任意の種または供給源、場合によりヒトまたはマウスなどの哺乳動物に由来する全長成長ホルモン分泌促進因子受容体、ならびにそのアイソフォームおよび同族体を意味する。このような受容体は、図１Ａのように適切に折り畳まれた際に、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、３つの細胞外ループ（ＥＣ１、ＥＣ２およびＥＣ３）および膜貫通ドメインを含む、細胞外および細胞内の両ドメインを有する。ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａのヌクレオチド配列は配列番号１８で示され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９２８４７としてのヒトＧＨＳ−Ｒ１ａタンパク質をコードする。ネズミＧＨＳ−Ｒ１ａのヌクレオチド配列は配列番号９で示され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９９Ｐ５０としてのネズミＧＨＳ−Ｒ１ａタンパク質をコードする。
【００２９】
用語「ＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ドメイン」は、受容体の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを欠き、限定されるものではないが、Ｎ末端ドメイン、細胞外ループ１および細胞外ループ２を含む、ＧＨＳ−Ｒ１ａ受容体のドメインを意味する。
【００３０】
用語「Ｎ末端」は、本明細書で使用する場合、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端細胞外領域をコードするアミノ酸配列に相当する単離されたペプチドを意味する。一実施形態では、Ｎ末端ドメインは、膜貫通ドメインアミノ酸配列の前の細胞外ドメインの最後のアミノ酸に及ぶ。
【００３１】
用語「細胞外ループ」は、本明細書で使用する場合、ＧＨＳ−Ｒ１ａの、細胞膜の細胞外側にループを形成する部分の配列を含んでなる単離されたタンパク質を意味する。ＧＨＳ−Ｒ１ａは、ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａの１０２〜１２７のアミノ酸、またマウスＧＨＳ−Ｒ１ａの１０１〜１２６のアミノ酸の、細胞外ループ１と呼ばれる第１の細胞外ループと、ヒトＧＨＳ−Ｒ１ａの１８２〜２０７のアミノ酸、またマウスＧＨＳ−Ｒ１ａの１８１〜２０６のアミノ酸の、細胞外ループ２と呼ばれる第２の細胞外ループを有する。
【００３２】
一実施形態では、前記融合分子は、融合パートナーに連結された、ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも２つを含んでなる。別の実施形態では、前記融合分子は、融合パートナーに連結された、ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２を含んでなる。さらなる実施形態では、前記融合分子は、融合パートナーに連結された、ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２からなる。
【００３３】
一実施形態では、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端領域は、配列番号４もしくは１３もしくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号３もしくは１２もしくはその変異体で示される核酸配列によりコードされ；細胞外ループ１は、配列番号６もしくは１５もしくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号５もしくは１４もしくはその変異体で示される核酸配列によりコードされ；および／または細胞外ループ２は配列番号８もしくは１７もしくはその変異体で示されるアミノ酸配列を有するか、配列番号７もしくは１６もしくはその変異体で示される核酸配列によりコードされる。
【００３４】
用語「融合分子」は、ＧＨＳ−Ｒ１ａの１または複数の細胞外ドメインに由来するペプチド配列と融合パートナーとの連結を意味し、共有結合または非共有結合を介した直接的結合または間接的結合であり得る。融合パートナーは、ＧＨＳ−Ｒ１ａ由来のペプチド配列のＮ末端またはＣ末端のいずれと結合されてもよい。
【００３５】
用語「可溶性融合分子」は、本明細書で使用する場合、いずれの膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインも欠き、細胞内でヌクレオチド配列から発現された際に分泌型タンパク質となる融合分子を意味する。
【００３６】
一実施形態では、融合パートナーは、安定化タンパク質またはポリマーなどの安定化分子である。
【００３７】
用語「安定化分子」は、本明細書で使用する場合、１または複数の細胞外ドメインと連結された場合に、そのような分子を伴わない１または複数の細胞外ドメインに比べて半減期の延長および／または免疫原性の低減をもたらす分子を意味する。
【００３８】
一実施形態では、安定化タンパク質は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）またはアルブミンタンパク質である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、場合により、マウスＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。別の実施形態では、安定化ポリマーは、ポリエチレングリコールなどである。
【００３９】
別の実施形態では、可溶性融合分子は、配列番号２もしくは１１またはその変異体で示されるアミノ酸配列を含んでなるか、配列番号１もしくは１０またはその変異体で示される核酸配列によりコードされる。
【００４０】
本開示の可溶性融合分子のドメインまたは領域は直接連結することもできるし、または各領域間にリンカー、場合により、ペプチドリンカーを含んでなることもできる。ペプチドリンカーは、連結された個々の領域の機能に干渉しない限りどんなサイズでもよい。一実施形態では、ペプチドリンカーは、約１〜約１５アミノ酸、より具体的には約１〜約１０アミノ酸、最も具体的には約１〜約６アミノ酸の長さである。可溶性融合分子が融合ペプチドだけから構成される場合には、それは連続する配列の一部であってよく、従って、少なくとも１つの細胞外ドメインおよび安定化タンパク質の両方をコードするコード配列から単一のポリペプチドとして翻訳され得る。
【００４１】
他の実施形態において、当業者ならば、融合分子がイン・ビトロで、例えば化学架橋剤と用いて少なくとも２つのタンパク質領域を連結することによっても形成可能であることが認識できるであろう。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、核酸分子によりコードされるアミノ酸残基の配列を意味する。本出願の文脈の範囲内で、本開示のポリペプチドは、一実施形態では、一次タンパク質の種々の構造形態を含み得る。例えば、本開示のポリペプチドは、酸性塩もしくは塩基性塩の形態または中性形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾されてもよい。
【００４３】
本開示のタンパク質およびポリペプチドはまた、例えばアシル化グレリンを低下させる能力など、本開示のタンパク質またはポリペプチドと実質的に同じ機能を有する、本明細書に記載のタンパク質およびポリペプチドの末端切断型、類似体および同族体も含み得る。
【００４４】
本明細書に記載のタンパク質の類似体としては、限定されるものではないが、１以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含むアミノ酸配列を含み得る。アミノ酸置換は、保存性のものであっても非保存性のものであってもよい。保存的アミノ酸置換は、本開示のタンパク質の１以上のアミノ酸を、類似の電荷、サイズ、および／または疎水性のアミノ酸で置換することを含む。保存的置換だけが行われる場合には、得られる類似体は機能的に等価となるはずである。非保存的置換は、アミノ酸配列の１以上のアミノ酸を異なる電荷、サイズ、および／または疎水性を有する１以上のアミノ酸で置換することを含む。
【００４５】
保存的置換は、例えば、米国特許第５，２６４，５５８号のような特許文献に記載されている。従って、非極性脂肪族中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、プロリン、バリンおよびイソロイシン間の交換は可能であると予想される。同様に、極性脂肪族中性アミノ酸であるセリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミン間の置換もおそらく行うことができる。荷電塩基性アミノ酸であるリシンおよびアルギニン間での置換が可能であるのと同様に、荷電酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸間の置換もおそらく行うことができる。フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンを含む芳香族アミノ酸間の置換もおそらく可能である。他の置換も十分可能であると思われる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「その変異体」は、対象とするヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する配列を意味する。
【００４７】
用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを意味する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するためには、最適な比較を行うためにそれらの配列をアラインする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められていれば、それらの分子はその位置において同一である。２配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共通に持つ同一の位置の関数である（すなわち、同一性％＝同一重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２配列は同じ長さである。２配列間の同一性パーセントの決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて行うこともできる。２配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの任意の限定されない例として、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268のアルゴリズムを、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877のように修正したものがある。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセット、例えば、本開示の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、スコア＝１００、ワードレングス＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーター、例えば、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、スコア−５０、ワードレングス＝３を用いて行うことができる。比較目的でギャップを含むアラインメントを得るためには、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようなギャップＢＬＡＳＴを使用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて反復検索を行い、分子間の遠縁を検出することもできる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト参照）。配列比較に使用される数学的アルゴリズムのもう１つの任意の限定されない例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合には、ＰＡＭ１２０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップ・レングス・ペナルティー１２、およびギャップ・ペナルティー４を使用することができる。２配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたは許容せずに、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際には、一般に、正確なマッチだけを計数する。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「そのフラグメント」は、対象とするヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の３、５、１０、１５、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００または３０００までの連続する残基を含んでなる核酸配列またはアミノ酸配列を意味する。
【００４９】
本開示の文脈の範囲内で、本開示のタンパク質は、生物活性を保持する一次タンパク質の種々の構造形態を含み得る。例えば、本開示のタンパク質は、酸性塩もしくは塩基性塩の形態または中性形態であり得る。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって修飾されてもよい。
【００５０】
上記に示される変異を作出する例示的方法は、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に開示されている。
【００５１】
本明細書ではまた、本開示の可溶性融合分子をコードする核酸分子も提供され、前記分子は場合により、融合分子の種々のドメインを連結するペプチドリンカーを含んでなる。
【００５２】
別の実施形態では、本開示は、ＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端ドメインをコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号３または１２で示される核酸配列を含んでなるか、配列番号４または１３で示されるアミノ酸配列をコードする。別の実施形態では、本開示は、ＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ループ１をコードする単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号５もしくは１４またはその変異体で示される核酸配列を含んでなるか、配列番号６もしくは１５またはその変異体で示されるアミノ酸配列をコードする。さらに本明細書では、ＧＨＳ−Ｒ１ａの細胞外ループ２をコードする単離された核酸分子が提供される。一実施形態では、単離された核酸は、配列番号７もしくは１６またはその変異体で示される核酸配列を含んでなるか、配列番号８もしくは１７またはその変異体で示されるアミノ酸配列をコードする。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「核酸分子」は、天然の塩基、糖および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を意味する。この用語は、非天然モノマーまたはその一部を含んでなる修飾または置換配列も含む。本開示の核酸配列はオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然の塩基を含み得る。これらの配列はまた修飾塩基も含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシル；およびキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００５４】
用語「単離された核酸配列」は、本明細書で使用する場合、細胞材料もしくは組換えＤＮＡ技術によって産生された場合には培養培地、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸を意味する。単離された核酸はまた、核酸が由来する核酸に天然に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に位置する配列）も実質的に含まない。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意図し、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列を含む。
【００５５】
本開示はまた、上述のＣＤＲ配列および可変領域配列の変異体をコードする単離された核酸配列を提供する。
【００５６】
変異体核酸配列は、少なくとも中等度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示される核酸配列とハイブリダイズするか、または本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【００５７】
用語「ハイブリダイズする配列」は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示される核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を意味する。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適当な「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は当業者に公知であるか、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。用語「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用する場合、溶液中で２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズ部分は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の１つに対して少なくとも５０％の長さである。これに関して、核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性はＴｍによって決定され、Ｔｍは、ナトリウム含有バッファーでは、ナトリウムイオン濃度、標識核酸のＧ／Ｃ含量、核酸プローブの長さ（ｌ）、および温度の関数である（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）。従って、ハイブリッドの安定性を決める洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度と温度である。既知の核酸分子と類似の(同一ではない)分子を同定するためには、１％のミスマッチがＴｍに約１℃の低下をもたらすと想定され、例えば、９５％を超える同一性を有する核酸分子を探す場合には、最終洗浄は５℃引き下げる。これらの考慮に基づけば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ（上の式に基づく）−５℃にて、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションと、その後の６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄と定義されよう。
【００５８】
類似体を作製するための核酸修飾の一例は、その配列の天然塩基（すなわち、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミジン）の１つを、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、シュードウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の８−置換グアニン、他のアザおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、またはグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンなどの修飾塩基で置換することである。
【００５９】
修飾のもう１つの例は、リン酸骨格に修飾リンまたは酸素ヘテロ原子を、核酸分子中に短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子または複素環式糖間結合を含めることである。例えば、核酸配列は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、およびホスホロジチオエートを含み得る。
【００６０】
本開示の核酸分子の類似体のさらなる例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格が、ペプチド中に見られるものと類似のポリアミド骨格で置換された、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である(P.E. Nielsen, et al Science 1991, 254, 1497)。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性があること、ならびにイン・ビボおよびイン・ビトロで長い寿命を持つことが示されている。ＰＮＡはまた、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖の間に電荷の反発が無いために相補的ＤＮＡ配列とより強く結合する。他の核酸類似体は、ポリマー主鎖、環状骨格、または非環状骨格を含むヌクレオチドを含み得る。例えば、ヌクレオチドは、モルホリノ骨格構造（米国特許第５，０３４，５０６号）を持ち得る。これらの類似体はまた、リポーター基、核酸配列の薬物動態または薬力学的特性を改善するための基などの基を含んでもよい。
【００６１】
当業者ならば、本開示のタンパク質が、限定されるものではないが組換え法の使用を含むいくつかの方法で作製できることを認識するであろう。
【００６２】
よって、本明細書で開示される核酸分子は、それらのタンパク質の良好な発現を保証する適当な発現ベクターに、既知の方法で組み込むことができる。可能性のある発現ベクターとしては、限定されるものではないが、そのベクターが使用する宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。発現ベクターは、「宿主細胞の形質転換に好適」であり、これは、発現ベクターが本出願の核酸分子と、その核酸分子に作動可能に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される調節配列とを含むことを意味する。作動可能に連結されるとは、核酸が、その核酸の発現を可能とする様式で調節配列に連結されることを意味するものとする。
【００６３】
従って、本開示は、本明細書に開示される核酸分子と、挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列とを含む、組換え発現ベクターを企図する。
【００６４】
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む様々な供給源に由来してよい（例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている調節配列を参照）。適当な調節配列の選択は、以下に述べるように選択される宿主細胞によって異なり、当業者ならば容易に達成することができる。このような調節配列の例としては、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボゾーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が含まれる。加えて、選択される宿主細胞および使用されるベクターに応じて、複製起点、付加的ＤＮＡ制限部位、エンハンサー、および転写の誘導性を付与する配列などの他の配列を発現ベクターに組み込んでもよい。
【００６５】
本開示の組換え発現ベクターはまた、本出願の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子も含んでよい。選択マーカー遺伝子の例は、ある種の薬剤に対する耐性を付与するＧ４１８およびハイグロマイシンなどのタンパク質、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくはその一部、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分、場合により、ＩｇＧをコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどの選択マーカータンパク質の濃度の変化によってモニタリングされる。選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換体細胞はＧ４１８で選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残り、一方で他の細胞は死滅する。これにより、本出願の組換え発現ベクターの発現を可視化およびアッセイすること、特に、発現および表現型に対する突然変異の影響を決定することが可能となる。
【００６６】
組換え発現ベクターはまた、組換えタンパク質の発現の増強；組換えタンパク質の溶解度の上昇；およびアフィニティー精製においてリガンドとして働くことで標的組換えタンパク質の精製の補助を提供する融合部分をコードする遺伝子も含み得る。例えば、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離できるように、タンパク質分解切断部位を標的組換えタンパク質に付加してもよい。典型的な融合発現ベクターとしては、組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合するｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭａｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ベヴァリー、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ピスカタウェー、ＮＪ）が含まれる。
【００６７】
組換え発現ベクターは、形質転換宿主細胞を作出するため宿主細胞に組み込むことができる。用語「で形質転換された」、「でトランスフェクトされた」、「形質転換」および「トランスフェクション」は、当技術分野で公知の可能性のある多くの技術の１つによる細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含するものとする。用語「形質転換された宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、本発明の組換え発現ベクターで形質転換されたグリコシル化能を有する細胞も含むものとする。原核細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウムを介した形質転換によって、核酸で形質転換することができる。例えば、核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションなどの従来の技術によって哺乳動物細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)および他の実験室テキストに見出すことができる。
【００６８】
好適な宿主細胞には、多様な真核生物の宿主細胞および原核細胞が含まれる。例えば、本開示のタンパク質は、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させることができる。他の好適な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)に見出すことができる。加えて、本開示のタンパク質は、大腸菌(Escherichia coli)などの原核細でも発現させることができる(Zhang et al., Science 303(5656): 371-3 (2004))。加えて、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)などのシュードモナスに基づく発現系も使用可能である（米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０１８６６６６号、Schneider, Jane C et al.）。
【００６９】
よって、本明細書ではまた、本開示の核酸分子を含んでなる宿主細胞も提供される。
【００７０】
さらにまた、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子または本開示の宿主細胞と薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物も提供される。
【００７１】
可溶性融合分子は、場合により、必要とする哺乳動物において脂肪過多を軽減するための有効量で存在してよい。
【００７２】
用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、所望の結果を達成するために十分な量を意味し、従って、成分およびその所望の結果によって異なる。しかしながら、所望の効果が既知となれば、有効量の決定は当業者の技能の範囲内である。
【００７３】
好適な薬学的に許容可能な担体としては、医薬組成物の生物活性の有効性に干渉せず、本質的に化学的に不活性で無毒の材料を含む。好適なビヒクルは、(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000)に記載されている。好適な医薬担体の例としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ−（１（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが含まれる。このような組成物は、治療上有効な量の薬剤を、患者への直接投与のための形態を提供するのに好適な量の担体とともに含有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、組成物はヒトなどの対象に投与するために処方される。特定の実施形態では、組成物は、静脈投与または経口投与用に処方される。場合により、組成物は、皮膚、皮内(intradermal)、胃内、皮内(intracutan)、血管内、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、腟内、口内、経皮(percutaneous)、皮下、舌下、局所的または経皮投与(transdermal administration)を含む吸入投与、直腸投与または非経口投与用に処方される。
【００７５】
別の態様では、本開示は、動物において脂肪過多を軽減する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物において脂肪過多を軽減するための本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物において脂肪過多を軽減するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物において脂肪過多を軽減する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。
【００７６】
「脂肪過多を軽減する」という句は、本明細書で使用する場合、同じまたは類似の食餌を与えた対照に比べて、処置対象における脂肪組織量の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％またはそれを超える減少を意味する。
【００７７】
一実施形態では、本開示は、動物において体重増加を軽減する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物において体重増加を軽減するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物において体重増加を軽減するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物において体重増加を軽減する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。
【００７８】
「体重増加を軽減する」という句は、本明細書で使用する場合、同じまたは類似の食餌を与えた対照に比べて、処置対象における脂肪組織量の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％またはそれを超える減少を意味する。
【００７９】
別の実施形態では、本開示は、動物において肥満または肥満関連病態を治療する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物において肥満または肥満関連病態を治療するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、必要とする動物において肥満または肥満関連病態を治療するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物において肥満または肥満関連病態を治療する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。
【００８０】
用語「肥満」は、本明細書で使用する場合、体脂肪が蓄積した対象における病態を意味し、限定されるものではないが、一般に２５を超える体格指数を有すると定義される前肥満、および一般に３０を超える体格指数を有すると定義される肥満(obesity)（または肥満(obese)とも呼ばれる）を含む。
【００８１】
「肥満を治療する」という句は、類似のまたは同じ食餌計画を与えた非処置対象に比べて、体重の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％またはそれを超える減少、または対象の除脂肪量に対する脂肪量の比率の５％、１０％、１５％、２０％またはそれを超える減少を含む。
【００８２】
用語「治療する」または「治療」は、本明細書で使用する場合、当技術分野で十分に理解されているように、臨床結果を含め、有益または所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益または所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能であれ検出不能であれ、１以上の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の低減、病状の安定化（すなわち、悪化抑制）、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、疾患の再発の低減、および緩解（部分的であれ全面的であれ）を含み得る。「治療する」または「治療」はまた、治療を受けない場合の期待生存期間に比べての、生存期間の延長も意味し得る。「治療する」または「治療」はまた、本明細書で使用する場合、予防的処置も含む。治療方法は、対象に治療上有効な量の活性薬剤を投与することを含んでなり、場合により単回投与からなるか、あるいはまた一連の適用を含んでなる。治療期間の長さは、その病態の重篤度、患者の齢、有効成分または薬剤の濃度、本明細書に記載の組成物の活性、および／またはそれらの組合せなどの様々な因子によって決まる。また、治療または予防に使用される薬剤の有効用量は、特定の治療または予防計画のコースにわたって増減可能であることも認識される。用量の変更は、当技術分野で公知の標準的な診断アッセイにより得られ、明らかとなり得る。場合によっては、慢性投与が必要となることがある。例えば、これらの組成物は、患者の治療に十分な量および期間で対象に投与される。
【００８３】
一実施形態では、肥満関連病態は、２型糖尿病、心血管疾患または癌である。一実施形態では、癌は、食道、乳房、子宮内膜、結腸直腸または膵臓の癌である。
【００８４】
別の実施形態では、肥満関連病態は、高コレステロール、高トリグリセリド、高血圧性代謝症候群（高血糖、高血圧、高トリグリセリドおよび高コレステロールの組合せ）または多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）である。
【００８５】
さらなる実施形態では、本開示は、動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善する方法であって、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を提供する。また、必要とする動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらに、グルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善するための薬剤の製造における、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインの使用も提供される。さらにまた、必要とする動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善する上で使用するための、本開示の可溶性融合分子、本開示の核酸分子、本開示の宿主細胞、本開示の医薬組成物、または成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）の細胞外ドメインも提供される。
【００８６】
「グルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善する」という句は、本明細書で使用する場合、体内のインスリン分泌およびインスリン作用の増進の結果としての血糖値の低下を含む代謝状態の改善を意味する。これはまた、筋肉、脂肪および肝臓などのインスリン応答組織におけるグルコースの取り込みまたは利用の増進によっても例示される。
【００８７】
用語「対象」または「動物」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物を含む動物界の総てのメンバーを含み、好適にはヒトを意味する。一実施形態では、動物は２型糖尿病を有する。
【００８８】
用語「本明細書に開示されるタンパク質を投与する」とは、タンパク質の投与と、動物への、またはイン・ビトロもしくはイン・ビボにおける細胞への、そのタンパク質をコードする核酸配列の投与の両方を含む。用語「投与する」とはまた、抗体またはその抗体フラグメントを発現する細胞の投与も含む。
【００８９】
用語「細胞」は、単細胞ならびに複数のまたは集団の細胞を含む。細胞に投与するとは、イン・ビトロ（またはｅｘ  ｖｉｖｏ）ならびにイン・ビボにおいて投与することを含む。
【００９０】
本開示の活性薬剤または組成物は単独で使用してもよいし、脂肪過多または体重増加の軽減に、例えば、対象における肥満または肥満関連病態の治療に有用な他の既知の薬剤と併用してもよい。他の薬剤と併用する場合、本開示の組成物または活性薬剤がそれらの薬剤と同時に投与されることが一実施形態となる。本明細書で使用する場合、対象に対する２つの物質の「同時投与」は、それらが個体内で両方とも同時に生物学的に活性となるように、その２つの物質のそれぞれを提供することを意味する。投与の厳密な詳細は、その２つの物質の互いの存在下での薬物動態学に依存し、その２つの物質を互いに数時間以内に投与すること、またはさらには、薬物動態学が好適な場合には、一方の物質を他方の物質の投与の２４時間以内に投与することを含み得る。好適な投与計画の設計は、当業者にとっては慣例である。特定の実施形態では、２つの物質は、実質的に同時に、すなわち、互いに数分以内に、または両方の物質を含有する単一の組成物で投与される。本開示の組成物または活性薬剤および他の１または複数の薬剤が非同時的様式で対象に投与されることが本開示のさらなる実施形態となる。
【００９１】
本開示の組成物または活性薬剤の用量は、組成物の薬力学的特性、投与様式、レシピエントの齢、健康状態および体重、症状の性質および程度、治療の頻度およびあれば、併用治療のタイプ、ならびに処置される対象における組成物のクリアランス速度などの多くの因子によって異なり得る。当業者ならば、例えば、上記の因子に基づいて適当な用量を決定することができる。本開示の組成物は、臨床奏効に応じ、必要であれば調節できる好適な用量でまず投与することができ、単回の一日用量で投与してもよいし、または総一日用量を２回、３回または４回の一日用量に分割してもよい。
【００９２】
本発明は以下の通りである。
［１］ａ）成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）のｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも１つと
ｂ）前記に連結された融合パートナー
とを含んでなる可溶性融合分子。
［２］ａ）ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも２つを含んでなる、上記［１］に記載の可溶性融合分子。
［３］ａ）ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２を含んでなる、上記［１］に記載の可溶性融合分子。
［４］ａ）ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２からなる、上記［１］に記載の可溶性融合分子。
［５］前記Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号４もしくは１３またはその変異体で示されるか、あるいは、配列番号３もしくは１２またはその変異体で示される核酸配列によりコードされる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の可溶性融合分子。
［６］前記細胞外ループ１のアミノ酸配列が配列番号６もしくは１５またはその変異体で示されるか、あるいは、配列番号５もしくは１４またはその変異体で示される核酸配列によりコードされる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の可溶性融合分子。
［７］前記細胞外ループ２のアミノ酸配列が配列番号８もしくは１７またはその変異体で示されるか、あるいは、配列番号７もしくは１６またはその変異体で示される核酸配列によりコードされる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の可溶性融合分子。
［８］前記融合パートナーが免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の可溶性融合分子。
［９］前記Ｆｃ領域がＩｇＧ２またはＩｇＧ４である、上記［８］に記載の可溶性融合分子。
［１０］ａ）とｂ）の間にペプチドリンカーをさらに含んでなる、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の可溶性融合分子。
［１１］配列番号２もしくは１１またはその変異体で示されるか、あるいは、配列番号１もしくは１０またはその変異体で示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる、上記［１］に記載の可溶性融合分子。
［１２］前記融合パートナーがタンパク質である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
［１３］上記［１２］に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
［１４］上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の可溶性融合分子、上記［１２］に記載の核酸分子または上記［１３］に記載の宿主細胞と薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
［１５］ＧＨＳ−Ｒ１ａのｉ）Ｎ末端、ｉｉ）細胞外ループ１およびｉｉｉ）細胞外ループ２のうち少なくとも１つと薬学的に許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
［１６］動物における脂肪過多を軽減する方法であって、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の可溶性融合分子、上記［１２］に記載の核酸分子、上記［１３］に記載の宿主細胞、上記［１４］もしくは［１５］に記載の医薬組成物、またはＮ末端、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択されるＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、方法。
［１７］動物において体重増加を軽減する方法であって、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の可溶性融合分子、上記［１２］に記載の核酸分子、上記［１３］に記載の宿主細胞、上記［１４］もしくは［１５］に記載の医薬組成物、またはＮ末端、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択されるＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、方法。
［１８］動物において肥満または肥満関連病態を治療する方法であって、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の可溶性融合分子、上記［１２］に記載の核酸分子、上記［１３］に記載の宿主細胞、上記［１４］もしくは［１５］に記載の医薬組成物、またはＮ末端、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択されるＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、方法。
［１９］前記肥満関連病態が２型糖尿病、心血管疾患または癌である、上記［１８］に記載の方法。
［２０］前記癌が食道、乳房、子宮内膜、結腸直腸および膵臓の癌である、上記［１９］に記載の方法。
［２１］前記肥満関連病態が高コレステロール、高トリグリセリド、高血圧性代謝症候群または多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）である、上記［１８］に記載の方法。
［２２］動物においてグルコース耐性および／またはインスリン感受性を改善する方法であって、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の可溶性融合分子、上記［１２］に記載の核酸分子、上記［１３］に記載の宿主細胞、上記［１４］もしくは［１５］に記載の医薬組成物、またはＮ末端、細胞外ループ１および／もしくは細胞外ループ２またはそれらの組合せから選択されるＧＨＳ−Ｒ１ａ細胞外ドメインを、それを必要とする動物に投与することを含んでなる、方法。
［２３］前記動物が２型糖尿病を有する、上記［１６］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記動物がヒトである、上記［１６］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］ＧＨＳ−Ｒ１ａの前記細胞外ドメインが細胞外ループ２および／または細胞外ループ１を含んでなる、上記［１６］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］ＧＨＳ−Ｒ１ａの前記細胞外ドメインが細胞外ループ２からなる、上記［１６］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
上記の開示は一般に、本出願を記載する。より完全な理解は、以下の具体例を参照して得ることができる。これらの例は単に例示を目的に記載され、本開示の範囲を限定することを意図しない。状況が示唆する、または好都合とするならば、形態の変更および等価の置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は記述的意味で意図され、限定を目的とするものではない。
以下の限定されない例は、本開示の例示である。
【実施例】
【００９３】
循環グレリンを枯渇させると、カロリー摂取を抑え、脂肪エネルギーの利用を促進する能力が保持される。従って、ＧＨＳ−Ｒ１ａのリガンド結合ドメインコードする哺乳動物発現プラスミドベクターを構築し、具体的には、Ｎ末端（Ｎｔ）、および／または第１、第２の細胞外ドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２）をマウスＩｇＧ定常領域（Ｆｃ）と融合させ、ＧＨＳＲ／Ｆｃを形成した（図１Ａ）。これらの融合タンパク質のイン・ビボ発現は、プラスミドの筋肉内注射とその後のマウス腓腹筋内でのエレクトロポレーションによって達成された。これらの融合構築物は受容体の膜貫通ドメインに相当する配列モチーフを欠き、分泌可能なＧＨＳＲ／Ｆｃの産生を可能とする。
【００９４】
結果
ＧＨＳＲ構築物のバリデーション
融合タンパク質の発現および分泌をまず、Ｌ６ラット骨格筋細胞株へのプラスミドベクター（図１Ａ）の一時的トランスフェクションによりイン・ビトロ条件下で調べた。トランスフェクション後４８時間目に培地および細胞を別個に採取し、抽出したタンパク質を、抗Ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロット解析に付した。示されるように、融合構築物（ＧＨＳＲ／Ｆｃとして示されるＮｔ−、Ｎｔ−ＥＣ１、およびＮｔ−ＥＣ１−ＥＣ２）の発現は細胞溶解液および培養培地の両方に一貫して検出されたが、膜貫通ドメインを含むＷＴ／Ｆｃは細胞溶解液にのみ見られた（４５ｋＤ）（図１Ｂ）。同様の結果が、これらの融合構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養培地または細胞溶解液でも得られた（図１Ｃ）。抗ＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いた免疫細胞化学試験では、Ｎｔ−ＥＣ１−ＥＣ２（ＧＨＳＲ／Ｆｃ）、Ｎｔ／Ｆｃ、ＥＣ１／Ｆｃ、およびＷＴ／ＦｃがトランスフェクトされたＬ６細胞において検出され（図１Ｄ）、これらの融合タンパク質がイン・ビトロの哺乳動物発現系で産生可能であることが示唆される。
【００９５】
マウスにおけるＧＨＳＲ／Ｆｃのイン・ビボ発現の効果
エネルギー摂取および体重増加に対するＧＨＳＲ遺伝子療法の影響を調べるために、高脂肪食（ＨＦＤ）を与えた、ＧＨＳＲに基づく構築物を注射したマウスおよび対照マウス（Ｆｃエンプティーベクターを注射）において摂食量および体重を測定した。ＧＨＳＲ／Ｆｃ構築物で処置したマウスは、対照動物に比べて有意に低い体重増加を示した（図２Ａ）。体重の違いは注射後３０日目に始まり（２１．０±０．１９５ｇ対、対照の２３．８±０．４３３ｇ、ｐ＜０．０５）、１回目の注射後５３日目の試験の終了時まで続いた（２３．５±１．３６ｇ対、対照の２９．６±０．４３４ｇ、ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。Ｎｔ／Ｆｃ、Ｎｔ−ＥＣ１／Ｆｃ、またはＷＴ／Ｆｃ注射を受けたマウスは総て、体重増加のある程度の低下を示したが、これは統計的有意性に達しなかった。Ｎ末端ならびに細胞外ループ１および細胞外ループ２の両方を有するＧＨＳＲ／Ｆｃが残りの分析の焦点となった。
【００９６】
グレリンは強力な食欲増進作用を有することが従前に示されたことから、毎日の食物および水の摂取量を調べた。図２Ｂで示されるように、対照マウスとおよびＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスの間の摂食量に違いは無かった。しかしながら、ＧＨＳＲ／Ｆｃによる処置は水の摂取と尿を増やした。
【００９７】
ＧＨＳＲ／Ｆｃのイン・ビボ発現は、ウエスタンブロット解析により様々であった。示されるように、全腓腹筋溶解液のウエスタンブロットでは、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスのそれぞれにおいてＧＨＳＲ／Ｆｃ融合タンパク質に相当する５５ｋＤａのバンドが検出された（図３Ａ）。さらに、血漿のウエスタンブロット解析は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスにおいては５５ｋＤａのバンドの存在を示したが、ビヒクル注射対照マウスでは示さなかった（図３Ｂ）。この処置の中和作用を確認するために、ＡＧおよび全グレリン（主として、ＵＡＧ）のレベルを循環中で測定した。図３Ｃに示されるように、ＧＨＳＲ／Ｆｃの発現は全グレリンのレベルを変更することはなかったが（図２Ｄ  １４０．９±３０．２ｐｇ／ｍｌ対、対照の１４０．８±３７．９４ｐｇ／ｍｌ）、ＡＧのレベルを有意に引き下げた（図２Ｄ、１．４１±０．１６０ｐｇ／ｍｌ対、対照の２．２５±０．２４０ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）。最後に、ＡＧレベルの低下が成長ホルモン経路に影響を及ぼしたかどうかを検討するために、ＧＨ依存性インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の血漿レベルを調べた。ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスと対照マウスの間のＩＧＦ−１レベルに違いは見られなかった（図３Ｄ）。
【００９８】
脂肪組織に対するＧＨＳＲ／Ｆｃの効果
処置動物における体重増加の減少の源泉を決定するために、脂肪体および除脂肪組織（腓腹筋およびヒラメ筋）を調べた。視覚的に、処置マウスの腹膜に見られる白色脂肪組織（ＷＡＴ）の量は、対照よりも少なかった（図４Ａ）。この違いを種々の脂肪体の秤量によって定量した。腹膜後（０．４７６±０．１２対、対照の０．９４８±０．１１９ｇ、ｐ＜０．００１）、腎周囲（０．４４±０．１９ｇ対、対照の０．７３４±０．０１１ｇ、ｐ＜０．０５）および鼠径脂肪体（０．３９６±０．０６７ｇ対、対照の０．７２２±０．５６ｇ、ｐ＜０．０５）を含むいくつかの脂肪貯蔵所は処置マウスの方が有意に小さかった（図４Ｂ）。除脂肪量は、匹敵する腓腹筋重で決定したところ、処置のより影響を受けなかった（０．１３１±０．０１６ｇ対、対照の０．１０９±０．０１１ｇ）（図４Ｃ）。
【００９９】
カロリー消費の減少がＷＡＴの減少の原因ではなかったことから、いくつかの代謝遺伝子に関してＷＡＴ  ｍＲＮＡ発現の変化を調べた。定量的ＲＴ−ＰＣＲを用い、内臓ＷＡＴをアディポカインレプチン（脂肪細胞の同化作用に応答してシグナルを伝達するホルモン）、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ；トリグリセリドの脂肪酸への分解を触媒する酵素）およびＰＰＡＲγ（脂肪生成を促進する核受容体）ｍＲＮＡに関して調べた。処置動物は、ＷＡＴに低レベルのレプチン遺伝子発現を示したが（対照の０．１０±０．１４倍、ｐ＜０．０５）、ＨＳＬ  ｍＲＮＡ（対照の１．７６±０．０７倍、ｐ＜０．０５）およびＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ（対照の３．９１±０．３７８倍、ｐ＜０．０５）の発現は上昇していた（図４Ｄ）。加えて、肥満において上昇していることが知られる脂肪由来炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルをＷＡＴにおいて調べた。インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は両方とも、対照に比べてＧＨＳＲ／Ｆｃでは減少していた（ＩＬ−１では対照の２．９±１．６％、ＴＮＦαでは対照の１５±７％、ｐ＜０．０５）。
【０１００】
グルコース代謝に対するグレリン中和の効果
グレリンは、グルコースホメオスタシスに影響を及ぼすことが知られている(Broglio, Arvat et al. 2001)。グルコース代謝に対するＧＨＳＲ／Ｆｃ処置の効果を決定するために、試験の前と終了時に対照マウスおよび処置マウスで、腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）およびインスリン負荷試験（ＩＴＴ）を行った。処置マウスは、グルコース注射後１０分（１４．５±１．５２ｍｍｏｌ／Ｌ対、対照の１８．９±１．４８ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐ＜０．０１）および２０分（１０．１±０．９６８ｍｍｏｌ／Ｌ対、対照の１４．２±０．９８９ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐ＜０．０５）で有意に低い血糖を伴い、グルコース耐性の改善を示した（図５Ｂ）。ＩＰＧＴＴにおける曲線下面積も、処置マウスでは有意に低下していた（５１６±３２．２対、対照の６６８±２２．１、ｐ＜０．０５）（図  ５Ｃ）。ＩＴＴでは、グルコース曲線下面積は処置動物で低く（１８０±１９．１対、対照の２３０±２０．３、ｐ＜０．０５）、インスリン感受性の上昇を示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。これらの結果は、循環ＡＧの低下が高脂肪食のマウスにおいてインスリン感受性およびグルコース耐性を改善することを示唆する。
【０１０１】
考察
本研究では、マウスにおいて循環ＡＧの「デコイレセプター」としてのＧＨＳＲ１ａ基づく融合タンパク質を投与するためにイン・ビボ遺伝子導入法を用いた。融合構築物は、循環中の複合体の安定性および半減期を改善するために、ＩｇＧ  Ｆｃと融合した、グレリンのアシル化部分と相互作用するＧＨＳＲ１ａの細胞外ドメインを組み込むように設計された(Soltani, Kumar et al. 2007)。まず、イン・ビトロにおける構築物の発現および分泌を、Ｌ６筋肉細胞株およびＣＨＯ細胞株でのプラスミドトランスフェクションによって確認した。予想されたように、全長ＷＴ／Ｆｃは、それを原形質膜に保持すると考えられる疎水性の膜貫通ドメインを持っているので、培養培地には検出されなかった。さらに、ＧＨＳＲ／Ｆｃプラスミドを注射した動物からの筋肉および血漿の両方において発現を確認した。この処置がグレリンレベルの変化をもたらしたことを確認するために、全（ＡＧ＋ＵＡＧ）レベルおよびアシル化（ＡＧ）レベルの両方を循環中で測定した。全グレリンレベルには有意な違いはなかったが、処置動物にはＡＧの有意な低下が見られた。全グレリンアッセイで見られるＡＧの違い（循環中の全グレリンの５％）は検出不能であると思われた(Kojima, Hosoda et al. 1999; Ariyasu, Takaya et al. 2001)。全グレリンアッセイに違いが無いことは、ＡＧだけに結合するＧＨＳＲ／Ｆｃの特異性を確実なものとする。
【０１０２】
エネルギー恒常性に対するグレリン中和の影響を、動物にＨＦＤを与えることによって調べた。ＨＦＤ摂取３日後に、ＧＨＳＲ／Ｆｃで処置した動物は、エンプティーベクターで処置した高脂肪食マウスに比べて有意に低い体重増加を示した。このＧＨＳＲ／Ｆｃ群における体重増加の低下は、遺伝子導入後７４日目の試験の終了時まで維持され、最終的な体重増加の低下は２０％を超えた。ＧＨＳＲ／Ｆｃマウスにおけるこれらの体重増加の低下および循環ＡＧの低下の所見は、グレリンの免疫中和の効果を調べる従前の研究と一致している(Zorrilla, Iwasaki et al. 2006)。
【０１０３】
また、ＧＨＳＲ１ａのＮ末端領域（Ｎｔ／Ｆｃ）またはＮ末端および第１の細胞外ループ（Ｎｔ−ＥＣ１／Ｆｃ）をコードする構築物も設計した。これらの構築物は、若干の減量効果(weight sparing effect)を示すものの、ＧＨＳＲ／Ｆｃに比べてあまり大きいとは言えない効果に過ぎなかった。ＧＨＳＲ／Ｆｃは、ＧＨＳＲ１ａの３つの細胞外ドメイン（Ｎｔ、ＥＣ１およびＥＣ２）の総てを組み込んだ１つの構築物であった。特定の理論に縛られることを望むものではないが、これらの細胞外ループはＧＨＳ−Ｒ１ａに対するＡＧの結合部位であると思われるので(Pedretti, Villa et al. 2006)、可能性として重要なのは、両方のループドメイン（ＥＣ１およびＥＣ２）を組み込むことであったと考えられる。
【０１０４】
体重増加の違いにも関わらず、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置群と対照群の間には試験中、摂取された食物に違いは見られなかった。興味深いことに、ＧＨＳＲ／Ｆｃマウスは、水消費および尿生産の増加を示した。食欲に対するグレリンの作用は、視床下部の弓状核内のニューロンのＧＨＳＲ１ａとの結合を介して起こる(Cowley, Smith et al. 2003)。末梢のグレリン投与は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して食欲を刺激することが示されているが(Banks, Tschop et al. 2002)、弓状核内にはグレリン産生ニューロンの集団も存在する(Kageyama, Kitamura et al. 2008)。本研究では、ＧＨＳＲ／Ｆｃタンパク質の大きさのために、それがＢＢＢを通過して視床下部のグレリンを中和できるとは考えにくい。従って、特定の理論に縛られることを望むものではないが、本戦略は末梢グレリンおよびその作用をターゲティングするだけであり得ると考えられる。本研究と一致して、グレリンの免疫中和研究でも、摂食量に対する効果は示されなかった(Zorrilla, Iwasaki et al. 2006)。さらに、グレリンおよびＧＨＳＲ１ａ胚性ノックアウトマウスの両方を検討した研究でも、摂食行動に対する効果は無く、むしろ、高脂肪食を投与した場合に、それらのエネルギー基質として脂肪を利用する可能性が高かった(Wortley, Anderson et al. 2004; Zigman, Nakano et al. 2005)。これらの従前の所見と一致して、本研究でも主として腹膜内の脂肪体の減少が見られた。
【０１０５】
ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスにおいて摂食量が変化しなかったことを考えれば、脂肪量の減少は、脂肪組織代謝に影響を及ぼしたＡＧの低下の結果である可能性がある。実際に、最近の研究では、グレリンが脂肪細胞に直接作用して脂肪分解を妨げることが示された(Davie, Kotokorpi et al. 2009)。脂肪組織に対する循環グレリンレベルの低下の効果を決定するために、ＷＡＴ中の脂肪代謝遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定した。驚くことではないが、脂肪蓄積および脂肪細胞分化の際に産生されるレプチン(Houseknecht, Baile et al. 1998)は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置動物では低かった。特に注目されるのは、トリグリセリドから脂肪酸への異化作用における重要な酵素であるＨＳＬ(Yeaman 2004)が処置動物では上昇していることが分かったことである。このリパーゼ発現の増強はエネルギー基質としての脂肪酸の動員の増加を示し、このことは、処置動物がＨＦＤ摂取中に脂肪過多から保護されたという所見を裏付ける。この所見はまた、それらのエネルギー基質としての脂肪の優先的使用を示唆したグレリンＫＯマウスでの従前の間接熱量測定研究と良好な一致を見た(Wortley, Anderson et al. 2004)。
【０１０６】
また、ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡレベルも処置動物において上昇していることが分かった。この核受容体の活性化は一般に脂肪組織の分化および増殖をもたらすが、いくつかの証拠が、ＰＰＡＲγの増加は内臓の貯蔵所から離れて脂肪を分配する可能性があることを示唆する(Laplante, Sell et al. 2003)。実際に、本研究は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスにおいて、脂肪体重量の最も有意な減少は内臓蓄積におけるものであったことを示す。これらの所見は、低用量のグレリン投与が、マウスにおける摂食に影響を及ぼさずに脂肪体重量の増加および脂肪細胞の遺伝子発現の変化を引き起こすことを示した他の研究によって裏付けられる(Tsubone, Masaki et al. 2005)。これらのことを考え合わせると、本データは、ＧＨＳＲ−１ａ／Ｆｃ処置による循環ＡＧの減少は脂肪貯蔵の減少および脂肪細胞の遺伝子発現の変化をもたらすことを示唆する。
【０１０７】
ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置によるＡＧ減少は、ＨＦＤ摂食マウスのグルコース耐性およびインスリン感受性を有意に改善した。これらの所見は、グレリンが膵臓からのインスリン放出の阻害を介してグルコース恒常性を増進することを示唆するいくつかの研究と一致する(Dezaki, Sone et al. 2006; Dezaki, Sone et al. 2008)。循環インスリンレベルに違いは見られなかったことから、グルコースクリアランスの改善は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置動物における肝臓のグルコース生産の低下の結果である可能性がある。このことは少なくとも１つには、グレリンが肝細胞のグルコース産生を促進することを実証した従前の研究(Gauna, Delhanty et al. 2005)によって裏付けられる。さらに、グルコース耐性の改善は、ＧＨＳＲ／Ｆｃ−マウスにおける内臓脂肪過多の軽減に対する二次的効果であり得る。脂肪過多の増大は、炎症を起こした脂肪貯蔵所から放出された炎症性因子により引き起こされるインスリン抵抗性をもたらし得ることが知られている(Oliver, McGillicuddy et al. 2010)。
【０１０８】
炎症誘発性サイトカインの、あり得る関与を決定するために、ＩＬ−１およびＴＮＦαの両方のｍＲＮＡ発現を内臓脂肪組織において調べた。これらの遺伝子は両方とも、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置動物では有意に低いレベルで発現しており、このことは、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置マウスにおけるインスリン感受性の改善が、一部には、これらのマウスにおける炎症誘発性サイトカインの減少によって与えられる得ることを示唆する。従って、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置により例示される循環グレリンの中和を含む戦略は、体重増加を防ぎ、グルコース耐性を改善し、これにより、Ｔ２ＤＭに対して有益な両方を提供し得る。
【０１０９】
本発明者らは、ＧＨＳＲ／Ｆｃ処置が他の代謝ホルモンに何らかの影響を持つかどうかを検討した。検討したホルモン（ＧＬＰ−１、インスリン、ＰＹＹ、膵臓ポリペプチドおよびグルコースインスリン分泌刺激ペプチド）に、ＧＨＳＲ／Ｆｃの発現によって有意に変化を受けるものは無かった（データ示さず）。グレリンは既知のＧＨ分泌促進因子であり(Kojima, Hosoda et al. 1999)、ＧＨはグルコース代謝およびインスリン感受性に効果を有する(Moller and Jorgensen 2009)ので、ＧＨに対するグレリン枯渇の効果を検討した。ＧＨは一日中、脈動的に変化するので、循環ＩＧＦ−１を測定することによってより安定なＧＨレベルの測定が得られる。興味深いことに、循環ＩＧＦ−１レベルはグレリンの中和によって変化を受けず、体重の減少およびグルコースパラメーターの改善の原因ではなかったと思われる。この効果の欠如は、ＨＦＤのＧＨＳＲ１ａ  ＫＯマウスではＧＨレベルが変化しないことを示す従前の報告と一致している(Zigman, Nakano et al. 2005)。
【０１１０】
要約すると、循環中の活性グレリンを中和するため、従ってＨＦＤにより誘発される体重増加を軽減するために安定なＧＨＳＲ１ａに基づく融合タンパク質を用いる新規な戦略が開発された。融合構築物の中でも、ＧＨＳＲ１ａのＮｔ、ＥＣ１、およびＥＣ２ドメインを含むＧＨＳＲ／Ｆｃは、ＨＦＤを与えたマウスにおいて、体重増加の軽減、インスリン抵抗性の改善、およびグルコース耐性の改善に最も効果的であった。特に有益なことに、このアプローチは、食欲、より詳しくは、除脂肪量に影響を及ぼすことなく体重および脂肪過多を軽減した。この処置はまた、脂肪の異化作用の増大および炎症誘発性サイトカイン遺伝子の低下により例示される脂肪の遺伝子発現を変化させたが、このことは、マウスにおける脂肪の貯蔵よりもむしろ利用へのシフトを示唆する。これは、インスリン感受性の改善およびグルコースクリアランスの改善により例示される二次的で有益な有益転帰をもたらす。よって、ＧＨＳＲ／Ｆｃ融合タンパク質は、肥満およびＴ２ＤＭの治療および管理について臨床適用できる。
【０１１１】
方法
構築物の設計
総てのグレリン受容体構築物は、マウス成長ホルモン分泌促進因子受容体配列（遺伝子ＩＤ：２０８１８８）に基づいて設計した。ＧＨＳＲ領域およびマウスＩｇＧ  Ｆｃフラグメントは、ＰＣＲ増幅により作製した。Ｎ末端領域の増幅に用いたプライマーは、（６ｍＮｔＦ）GCG GGG TAC CAT GTG GAA CGC GAC GCC A（配列番号１９）および（６ｍＮｔＲ）GCG AGT ACT CGC GGG GAA CAG TGG CAG CAG TTC（配列番号２０）、第１の細胞外ループ（６ｍＥＣ１Ｆ）GCG AAG CTT TTC CAG TTT GTC AGC GAG AGC TGC ACC TAC GCC CCC AGC GAG ACC GTC ACC TGC（配列番号２１）および（６ｍＥＣ１Ｒ）CGA AGC TTG CAG AGC AGG TCG CCG AAG TTC CAG GGC CGA TAC TGC CAG AGG CGC GCG GGG AAC AGT GGC AGC AGT TC（配列番号２２）、第２の細胞外ループ（６ｍＥＣ２Ｆ）GCG ACG GAT CCC CGG GAC ACC AAC GAG TGC CGC GCC ACC GAG TTC GCT GTG CGC TCT CCC AGC GAG ACC GTC ACC TGC AAC（配列番号２３）および（６ｍＥＣ２Ｒ）GCGGGGATCCGTG CCG TTC TCG TGC TCC ACG CCC ACC AGC ACG GCG TAG GTG CAG CTC TCG CTG AC（配列番号２４）、およびマウスＩｇＧ  Ｆｃフラグメント（ｍＩｇＧＦ）GCG AGT ACT TGG CCC AGC GAG ACC GTC ACC TGC AAC（配列番号２５）および（ｍＩｇＧＲ）GCG CTC GAG CAG GGA AGA AGT CTG TTA TCA TGC A（配列番号２６）であった。各細胞外ドメインＧＨＳＲ  ＰＣＲ産物はＫｐｎＩおよびＳｃａＩで切断し、マウスＩｇＧ  ＦｃフラグメントはＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断した。これをｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＯＮ  カナダ）のＫｐｎ１およびＸｈｏＩ部位に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【０１１２】
同様のクローニング戦略を、マウスまたはヒトＧＨＳ−Ｒ１ａのＮ末端、細胞外ループ１および／または細胞外ループ２を含んでなる融合分子を作出するために使用することができる。
【０１１３】
融合構築物のイン・ビトロ発現
ＧＨＳＲ構築物の発現および分泌を確立するために、ラット骨格筋細胞株Ｌ６およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞を、設計したプラスミドでトランスフェクトした。４０μｇの細胞抽出液および培地を標準的な方法を用いて採取し、１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで泳動させた。試験の終了後、腓腹筋を採取し、処置マウスから抽出し、イン・ビボ発現を調べた。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、４℃で１：３０００の抗Ｍｙｃ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、その後、室温で１：５０００の二次ウサギ抗マウスＨＲＰを用いてプロービングした。
【０１１４】
免疫蛍光顕微鏡
トランスフェクトされたＧＨＳＲタンパク質の局在および発現を決定するために、細胞株を、トランスフェクトされたタンパク質のＦ鎖のみを検出する抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体で免疫染色した。Ｌ６細胞をカバーガラス上で増殖させ、室温で１時間、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。次に、それらをＰＢＳで３回洗浄した後、５％正常ウマ血清中で１５分間ブロッキングした。細胞をブロッキング溶液中、室温（ＲＴ）で２時間、一次ビオチン化抗マウスＦｃとともにインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ブロッキング溶液中、暗所、室温で４５分間、アビジンコンジュゲートＣｙ３で処理した。スライドグラスにカバーガラスをかけ、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ＩＩ顕微鏡で観察した。
【０１１５】
マウスにおけるＧＨＳＲ／Ｆｃのイン・ビボ発現
Ｃ５７／Ｂｌ６マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ．、ＵＳＡ）から購入した。マウスを制御された光（１２時間明／１２時間暗）および温度条件下で飼育し、食物（通常の齧歯類餌、または示されている場合には高脂肪食）および水は自由に摂らせた。手順は総て、カナダ動物管理協会(Canadian Council on Animal Care)のガイドラインに従って行い、セント・マイケルズ病院動物管理委員会によって承認されたものである。
【０１１６】
ＧＨＳＲ／Ｆｃのイン・ビボ発現は、従前に記載されているように(Soltani, Kumar et al. 2007)、筋肉内プラスミド注射とその後のエレクトロポレーションによって達成した。簡単に述べれば、総量５０μｇのプラスミドＤＮＡを８週齢雄Ｃ５７／Ｂｌ６マウスの腓腹筋の筋肉内に注射し（片足２５μｇ）、キャピラリー電極（ＢＴＸ、ＭＡ）を用い、次のように筋肉に電流を流した：２００Ｖ／ｃｍにて１秒間隔で８パルス（パルス長２０ｍｓ）。電流の流れを良くするために伝導性ゲル（アクアソニック１００）を用いた。プラスミド注射およびエレクトロポレーションは、試験コースの最初の３週間に週に１回行った。
【０１１７】
摂食量および体重の測定：
高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔｓ、ノース・ブランズウィック、ＮＪ、ＵＳＡ、ｋＣａｌの６０％を脂肪として含有）は１回目のＤＮＡ注射の日に開始し、５４日後の試験の終了時まで続けた。摂食量は、各ケージの餌かごを３日毎に秤量することによって測定した。各群の動物を３日毎に個々に秤量した。
【０１１８】
グルコースおよびインスリン負荷試験：
腹腔内（ｉｐ）グルコースおよびインスリン負荷試験を、５４日の高脂肪食の後に行った。動物を試験前に一晩（１２時間）絶食させた。ＩＰＧＴＴでは、１．５ｍｇ／マウス体重ｋｇのグルコースの単回ボーラスをｉｐ投与した。ＩＴＴでは、０．７５Ｕ／ｋｇのインスリンの単回ボーラスをｉｐ注射した。尾の先端を局所麻酔剤（ＥＭＬＡ、ＯＮ  カナダ）で処理し、注射後０、１０、２０、３０、および６０分の時点で尾静脈から血液サンプルを採取した。血液サンプル（４〜５μｌ）を、Ｂａｙｅｒ  Ａｃｅｎｓｉａ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬグルコメーター（Ｂａｙｅｒ、ＯＮ  カナダ）を用いるグルコースオキシダーゼ法によって分析した。
【０１１９】
脂肪組織の回収
脂肪組織重量の死後分析は、脂肪体を両側採取してすぐに秤量することによって行った。腹膜脂肪組織は、後のＲＮＡ抽出のために液体窒素中で急送冷凍した。
【０１２０】
リアルタイムＰＣＲ
内臓白色脂肪組織を試験の終了時に採取した。全ＲＮＡは、トリゾール（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ  ＵＳＡ）抽出フェノールクロロホルム沈降法を製造者のプロトコールに従って用いて抽出した。サンプルをＤＮアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、標準法下でランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡを作製した。リアルタイムＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ  ＵＳＡ）にて、レプチンプライマー（フォワード：CCAAAACCCTCATCAAGACC（配列番号２７）、リバーズ：TGTCTCCACCACCGAAACTC（配列番号２８））、ホルモン感受性リパーゼ（フォワード：TGTCTCCACCACCGAAACTC（配列番号２９）、リバースTCTCCAGTTGAACCAAGCAGGTCA（配列番号３０））、ＰＰＡＲγ（フォワード：GGAAAGACAACGGACAAATCAC（配列番号３１）、リバース：ATCCTTGGCCCTCTGAGATG（配列番号３２））、ＩＬ−１（フォワード：TGTCTGAAGCAGCTATGGCAA（配列番号３３）、リバース：TGCTGCGAGATTTGAAGCTG（配列番号３４））およびＴＮＦα（フォワード：TGATCGGTCCCCAAAGGGAT（配列番号３５）、リバース：TTGCTACGACGTGGGCTAC（配列番号３６））を用いて行った。データはＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸマネージャーソフトウエアを用いて解析し、相対的発現を、正規化遺伝子として１８Ｓを用いる標準曲線法を用いて決定した。
【０１２１】
ホルモンアッセイ
試験の終了時に、食物を自由に摂らせたマウスから、ＥＤＴＡ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ＰＱ）を含有する毛細管に血液を採取した。エネルギー代謝の調節に関与するホルモンの血漿レベルを、活性ＧＬＰ−１、インスリン、ＰＹＹ、膵臓ポリペプチド、およびＧＩＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＭｉｌｌｉｐｌｅｘホルモンアッセイパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）を用いて分析した。アシル化グレリンおよびＩＧＦ−１血漿レベルを酵素結合免疫アッセイ（それぞれＣａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＯＮおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）によって分析し、全グレリンレベルを、ラジオイムノアッセイ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＣＡ）を用いて測定した。
【０１２２】
統計分析
体重増加の相対的変化を、各群と対照群を比較するためにボンフェローニ事後検定を用いる２元配置ＡＮＯＶＡを用いて経時的に分析した。各群を分析するＭｕｌｔｉｐｌｅｘホルモンアッセイを一元配置ＡＮＯＶＡで比較した。ＩＰＧＴＴおよびＩＴＴ中の各時点は２元配置ＡＮＯＶＡを用いて調べた。対照群とＧＨＳＲ／Ｆｃ群の間の他の比較は総て、スチューデントのｔ検定を用いて分析した。
【０１２３】
本開示は、現在のところ例であると考えられるものを参照して記載されているが、本開示は開示されている例に限定されるものではないと理解されるべきである。それとは反対に、本開示は添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる種々の改変および等価な構成を包含することが意図される。
【０１２４】
総ての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許および特許出願が引用することによりその全内容が本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示される場合と同程度に、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【０１２５】
【表１】
0006609480.tif 000002
0006609480.tif 000003
0006609480.tif 000004
【０１２６】
参照文献
0006609480.tif 000005
0006609480.tif 000006
【図１】
0006609480.tif 000007
【図２】
0006609480.tif 000008
【図３】
0006609480.tif 000009
【図４】
0006609480.tif 000010
【図５】
0006609480.tif 000011
【配列表】
0006609480000001.app