(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源（１１０）と、
第１ポート、第２ポート、及び第３ポートを有する光学カップラー（１３０）であって、該光学カップラー内で、光信号が実質的に、前記第１ポートから前記第２ポートにのみ、及び前記第２ポートから前記第３ポートにのみ伝播し、該光学カップラーが前記第１ポートで前記光源に接続される、光学カップラーと、
前記光学カップラーの前記第２ポートから出力された光をダイクロニックミラー（１７０）と顕微鏡対物レンズ（１６０）とを通って試料（１９５）上に案内するための光学コリメーター（１５０）であって、前記試料（１９５）が調整可能な顕微鏡ステージ（１９８）によって支持された培養基上に載置される、光学コリメーターと、
軸に沿った複数の焦点において前記光を合焦させるための走査手段（２７０）と、
前記軸に沿った前記複数の焦点における前記培養基からの反射を含む前記光信号を、強度信号に変換するためのフォトダイオード検出器（２４０）であって、前記光信号が、前記顕微鏡対物レンズ（１６０）によって捉えられ、前記ダイクロニックミラー（１７０）と前記光学コリメーター（１５０）とを通って前記光学カップラー（１３０）の前記第２ポートに入り、前記第３ポートから出るように、該フォトダイオード検出器（２４０）に送られる、フォトダイオード検出器と、
信号テンプレートを格納するための記憶装置（２３０）と、
前記強度信号を前記信号テンプレートと相互相関させることによって前記強度信号内のピークを検知するためのマイクロプロセッサ（１８０）であって、該マイクロプロセッサ（１８０）は、前記強度信号内の検出された前記ピークの位置と、合焦状態にあり、所望の合焦位置に対応するピークを含む参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージ（１９８）の位置を移動させるためのコマンドを生成する、マイクロプロセッサと、
を備えるオートフォーカス装置。
【請求項２】
前記マイクロプロセッサは前記強度信号における前記ピークを連続して検知し、前記強度信号内の前記検出された前記ピークの位置と前記参照信号内の前記ピークの位置との間の差に基づき、所望の光学焦点を維持するために、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるためのコマンドを生成する請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記走査手段は、電気的焦点レンズと、該電気的焦点レンズの焦点を調整するためのコントローラーとを備える請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記走査手段は、異なる伝送遅れを有する複数の長さのファイバーを備える請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記走査手段は、複数のレーザーと、異なる焦点のための前記複数のレーザーのそれぞれに対応する対応固定コリメーターとを備える請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記走査手段は、ピエゾコリメーターを備える請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記光学カップラーは、ファイバー光学サーキュレーターを備える請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記光学カップラーは、光学アイソレーターを備える請求項１に記載の装置。
【請求項９】
光学カップラーを、第１ポートで光源の光信号出力に、第２ポートで光学コリメーターに、第３ポートでフォトダイオード検出器に、前記光学カップラー内で、光信号が実質的に、前記第１ポートから前記第２ポートにのみ、及び前記第２ポートから前記第３ポートにのみ伝播するように、接続することと、
前記光学コリメーターによって、前記光学カップラーの前記第２ポートからの光線をダイクロニックミラーと顕微鏡対物レンズとを通って、調整可能な顕微鏡ステージによって支持された培養基上に載置された試料に案内することと、
軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることと、
前記顕微鏡対物レンズによって、前記軸に沿った前記複数の焦点における前記培養基からの前記光線の反射を含む反射した前記光信号を捉えるとともに、前記光学コリメーターを通って、前記光学カップラーの前記第２ポートに入り、前記第３ポートから出るように前記フォトダイオード検出器に送ることと、
前記反射した光信号を前記フォトダイオード検出器によって強度信号に変換することと、
前記強度信号を格納された信号テンプレートと相関させることによって前記強度信号内のピークを検知することと、
前記強度信号内の検出された前記ピークの位置と、合焦状態にあり、所望の合焦位置に対応するピークを含む参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるためのコマンドを生成することと、
を含むオートフォーカス装置を自動的に走査する方法。
【請求項１０】
さらに、前記強度信号内のピークを連続して検知するとともに、前記強度信号内の検出されたピークの位置と前記参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、所望の光学焦点を維持するために、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるコマンドを生成することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、調整可能なレンズを電気的に制御することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、発振されたレーザーと異なる伝送遅れを有する複数の長さのファイバーとを用いることを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、異なる焦点のための前記複数のレーザーのそれぞれに対応する対応固定コリメーター用いることを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、ピエゾコリメーターを制御することを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記光学カップラーは、ファイバー光学サーキュレーターを備える請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記光学カップラーは、光学アイソレーターを備える請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本米国特許出願は、２０１３年８月２２日に出願された米国仮出願第６１／８６８，８８１号の利益を主張するものであり、また本出願は、２０１３年７月３日に出願された米国出願第１３/９３４，７２７号の一部継続出願であって、２０１０年１０月１６日に出願された米国出願第２/９０６，０８６号の分割出願であって、２００９年１０月１６日に出願された米国仮出願第６１／２５２，２６３号の利益を主張するものであり、各々の開示は参照により本開示に含まれる。
【０００２】
本発明は、広く顕微鏡装置に係り、さらに特に適正な焦点を得るためにステージを自動的に調整する技術に関する。
【背景技術】
【０００３】
すべての光学システムでそうであるように、顕微鏡は拡大時に被写界深度が浅くなる点と、撮像（対物）レンズのＮＡ（開口数）が増加することに悩まされている。顕微鏡を利用する際、利用者は対物レンズに対して試料を動かすことで試料の適正に合焦させる責任がある。顕微鏡による検査が自動化され、利用者が個々の画像を見るのにもはや巻き込まれないような時にはオートフォーカスさせる方法が求められる。従来技術において、前方レンズと容器（例えば、スライド、ウェルプレート等）の底との間の距離を測定することでオートフォーカスを達成した技術が説明されている。そのような技術は、第１表面での光線の反射とその反射の測定に基づいている。しかしながら、そのような技術の欠点は、試料が載っている容器が、多くの樹脂がそうであるように均一でない厚さを有していたりすると、その結果としての画像が培養基の誤差分だけ合焦状態から外れる得ることである。
【０００４】
細胞の画像化は、ガラスあるいは樹脂製の培養基の底部上での細胞の成長に依存する。細胞はその表面に沿って成長し、それらを培養基に貼り付かせてしまうようなタンパク質を分泌する。細胞の成長を維持させるために、細胞を養うための高栄養の液状媒質が添加され、適正な生理学上の状態が維持される。このシナリオにおいて、樹脂の表面は水溶液で覆われ、それは細胞の位置を探知するために用いることができる。樹脂と液体との間の屈折率は、低ノイズ、高感度の反射光の構成を用いることで設定することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施例において、オートフォーカス顕微鏡装置が提供されている。この装置は、光源と、第１ポート、第２ポート、及び第３ポートを有する光学カップラーであって、該光学カップラー内で、光信号が実質的に、前記第１ポートから前記第２ポートにのみ 、及び前記第２ポートから前記第３ポートにのみ伝播し、該光学カップラーが前記第１ポートで前記光源に接続される、光学カップラーと、前記光学カップラーの前記第２ポートから出力された光をダイクロニックミラーと顕微鏡対物レンズとを通って試料上に案内するための光学コリメーターであって、前記試料が調整可能な顕微鏡ステージによって支持された培養基上に載置される、光学コリメーターと、軸に沿った複数の焦点において前記光を合焦させるための走査手段と、前記軸に沿った前記複数の焦点における前記培養基からの反射を含む前記光信号を、強度信号に変換するためのフォトダイオード検出器であって、前記光信号が、前記顕微鏡対物レンズによって捉えられ、前記ダイクロニックミラーと前記光学コリメーターとを通って前記光学カップラーの前記第２ポートに入り、前記第３ポートから出るように、該フォトダイオード検出器に送られる、フォトダイオード検出器と、信号テンプレートを格納するための記憶装置と、前記強度信号を前記信号テンプレートと相互相関させることによって前記強度信号内のピークを検知するためのマイクロプロセッサであって、該マイクロプロセッサは、前記強度信号内の検出されたピークの位置と参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるためのコマンドを生成する、マイクロプロセッサと、を含む。
【０００６】
他の実施例において、顕微鏡装置を走査するための方法が提供される。この方法は、光学カップラーを、第１ポートで光源の光信号出力に、第２ポートで光学コリメーターに、第３ポートでフォトダイオード検出器に、前記光学カップラー内で、光信号が実質的に、前記第１ポートから前記第２ポートにのみ、及び前記第２ポートから前記第３ポートにのみ伝播するように、接続することと、前記光コリメーターによって、前記光学カップラーの前記第２ポートからの光線をダイクロニックミラーと顕微鏡対物レンズとを通って、調整可能な顕微鏡ステージによって支持された培養基上に載置された試料に案内することと、軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることと、前記顕微鏡対物レンズによって、前記軸に沿った複数の焦点における前記培養基からの反射を含む反射した前記光信号を捉えるとともに、光学コリメーターを通って、前記光学カップラーの前記第２ポートに入り、前記第３ポートから出るように前記フォトダイオード検出器に送ることと、前記強度信号を格納された信号テンプレートと相関させることによって前記強度信号内のピークを検知することと、前記強度信号内の検出された前記ピークの位置と参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるためのコマンドを生成することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】複数の表面境界からの反射に対しての予想される信号レベルの図である。
【図２】一実施例によるオートフォーカス装置の図である。
【図３】一実施例による反射ピークを捉える相互相関図である。
【図４】一実施例によるオートフォーカス装置の図である。
【図５】一実施例によるオートフォーカス装置の図である。
【図６】一実施例によるオートフォーカス装置の図である。
【図７】一実施例によるオートフォーカス装置の図である。
【図８】一実施例によるオートフォーカス装置の図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、本発明を実行するための現在考えられる最良の態様である。この記載は、限定的なものとしてではなく、添付図面を参照することにより具体的目的を提示することのみを目的とした本発明の一例を提供し、本発明の有益な点および構成を当業者に教えるものである。様々な図面の視点では、同様の符号は、同様の部品を示す。すべてのファイバー光学システムが空間伝送の等価物に置き換えることができることに注目すべきである。
【０００９】
顕微鏡では、検査されるべき試料対象はスライド上に置かれ、スリップカバーで覆われている。顕微鏡の対物レンズは、拡大された対象の合焦状態の視野が得られるように調整される。第１の屈折率を有する第１の媒質中を伝搬する光が第２の屈折率を有する第２の媒質に入る際、２つの媒質の間の境界において反射が生じる。境界において反射する光の量と透過する光の量とは２つの媒質の屈折率に依存する。顕微鏡では、例えば、空気−ガラス、ガラス−水、水−ガラス、及びガラス−空気等の、一般に複数の異なる境界が存在し、このため、これらの境界に対応する異なる反射強度レベルが存在する。図１は、光がこれらの境界位置で合焦したときの幾つかの境界における反射強度レベルの一例を示している。軸（一般概念を失うことなく、以下ｚ軸として参照される）に沿ったこれら幾つかの点において反射強度を走査することでｚ軸反射プロファイルを得ることができる。ｚ軸反射プロファイルにおいて、幾つかの強度ピークが幾つかの媒質境界に対応する。従って、ｚ軸反射プロファイルを用いることで、顕微鏡の対物レンズを、所望の光学焦点に対して最も相関する強度レベルピークの位置に調整することができる。
【００１０】
図２は実施例に従って実行されるオートフォーカス装置２００の典型的な図を示している。本発明の一実施例において、光源１１０の波長は、１３１０ｎｍである。他の値も考えられる。光学カップラー１３０は、第１ポート（１）、第２ポート（２）、及び第３ポート（３）から構成されている。光は光学カップラー１３０内を伝播し、第２ポート（２）で出力され、光信号はコリメーター１５０において光線にコリメートされる。光信号は、光学カップラー１３０内を、実質的に第１ポート（１）から第２ポート（２）にのみ、及び第３ポート（３）に伝播することができることに注目すべきである。一実施例において、光学カップラーの指向性は少なくとも５５ｄＢである。
【００１１】
光線、予め設定された波長より高い波長のみを反射し、低いものは透過するように設計された、ダイクロイックミラー１７０から反射する。典型的な実施例において、予め設定された波長は１３００ｎｍである。光線は顕微鏡の対物レンズ１６０を通して伝播し、調整可能な顕微鏡ステージ１９８上に載置された試料１９５で合焦する。光は試料１９５が載置された樹脂製またはガラス製の培養基から反射し、対物レンズ１６０によって捉えられ、さらにコリメーター１５０によってファイバー内に送り戻される。もし試料１９５がガラス製または樹脂製の培養基に収容されていない場合には、反射光は試料１９５自身から返すことができる。
【００１２】
コリメーター１５０からの光信号は第２ポート（２）において光学カップラー１３０内に入力され、また第３ポート（３）において出力され、このように光はカップラー１３０を通して実質的に一方向にのみ伝播する。光学カップラー１３０からの出力はフォトダイオード検出器２４０内に送られる。フォトダイオード検出器２４０は光信号を電圧信号出力または強度信号出力に変換する。
【００１３】
一実施例において、ｚ−走査コントローラー２７０は反射した光信号の走査データを得るために、光がｚ軸に沿った幾つかの焦点で合焦するように電気的焦点レンズ２２０を調整する。
【００１４】
一実施例において、マイクロプロセッサ１８０は、種々の処理モジュール、例えば、アナログ強度レベル信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター１８１、デジタル化された走査データを保持するｚ−走査バッファー１８２、データを補間する補間器、補間データを２３０内に格納されたテンプレートと相互相関させるための相互相関器１８４、相互相関結果を利用して一又は複数のピークを検出するピーク検出器１８５、合焦状態のｚ−参照信号に関する変動を決定するためのコンパレーター１８６、変動を計算するための積分器１８７、及びピエゾステージ１９０を駆動するために変動値をコマンド信号に変換するＤ／Ａコンバーター１８８を含む。これらのモジュールは１又は複数のマイクロプロセッサ内で、ハードウエア及び／またはソフトウエアコンポーネントの組み合わせによって実行することができる。あるいは、これらの１又は複数のモジュールが、自身のマイクロプロセッサを有することができる。マイクロプロセッサ１８０は、ｚ軸走査プロファイルを生成するために強度レベル信号を処理し、ｚ軸走査プロファイル内の１又は複数のピークを検知するために記憶装置２３０内に格納されたテンプレートと相互相関させる。テンプレートとの相互相関関係の利用は迅速で正確なピークの検知を可能にする。図３は、ノイズが存在する状況にもかかわらず、ピーク中心を正確に見つけるために、ｚ軸プロファイルのテンプレートとの相互関係の利用を示している。
【００１５】
特定のピークが一旦検知されると、ピークの位置は合焦状態にある参照信号２５０において対応するピークと比較される。合焦状態にあるｚ−参照信号は、利用者によって選択され、あるいはシステムによって自動的に決定された所望の合焦位置に対応するピークを含む。さらにピークの位置は、ピーク回りの特定の位置に移動させるためのｚ−参照信号において対応するピークと比較されることができる。加えて、手動合焦制御装置２６０は利用者が所望の合焦位置を選択および／または調整するように使うことができる。
【００１６】
たとえば、試料の位置が経時的に変化する場合には、システムが試料の焦点を外してしまうことも想定される。システムがわずかな距離だけ焦点がずれている場合、得られたｚ軸走査プロファイルは、あらかじめ得られている合焦状態のｚ軸走査プロファイルに対してわずかな距離だけ変動するであろう。このように、システムはｚ軸走査プロファイルにおいて変動した距離だけ調整可能なステージを変動させることで合焦状態を回復させることができる。
【００１７】
本発明の一実施例において、システムはトラッキング装置として実現することができる。本発明の原理を用いることにより、トラッキング装置は、強度レベル信号における特定のピークをトラッキングすることと、強度レベル信号を格納されたプロファイルと相関させることによってｚ−位置を連続的に調整することで、装置と試料との間の特定の距離を保持することができる。試料１９５の位置が変化すると、フォトダイオード検出器２４０の受光した反射光信号が変化する。その結果、マイクロプロセッサ１８０はフォトダイオード検出器２４０で得られた強度レベル信号の変化を検知し、さらに強度レベル信号を格納されたプロファイルと相関させることによって、強度レベル信号におけるピークの位置の変化を検知する。マイクロプロセッサ１８０は、変動を補償するために対応した動作コマンドを生成し、これにより対物レンズ１６０と試料１９５との間で同一距離を保持する。
【００１８】
ｚ軸反射プロファイルを得るために、光は走査手段によって、ｚ軸に沿った幾つかの点において合焦する。ｚ軸の強度プロファイルの走査は、いくつかの高速走査技術によって達成されることが考えられる。共焦点顕微鏡において、空間ピンホールは焦点の合っていない光を取り除く。従って、空間ピンホールの連続した変更と調整とにより幾つかの焦平面での走査が達成され得る。
【００１９】
図４は、電気的焦点レンズ４１０が、ｚ軸に沿った幾つかの点の走査に用いられ、それらの幾つかの点における反射の強度レベルが記録される実施例を示している。一般に、ｚ軸走査を完了するための時間は、たとえば光源の強度の変化の経過時間や、試料の移動の経過時間に比べて比較的短い。
【００２０】
図５は、光学カップラーの出力が２経路に分岐した実施例を示している。ファイバー長Ｌ１とＬ２（５１１〜５１２）に対する離れた伝送遅れが２個の固定焦点のそれぞれにおける反射強度の時間分割多重計測を生成する。２個の焦点は焦平面のそれぞれの側において１個の点を含む。これらの２個の離れた時間点を跨ぐように計測された光学強度は反射強度プロファイルにマッピングされる。
【００２１】
図６は、光学カップラーの出力が４経路に分岐した実施例を示している。ファイバー長Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，及びＬ４（６１１〜６１４）に対する離れた伝送遅れが４個の固定焦点のそれぞれにおける反射強度の時間分割多重計測を生成する。４個の焦点は焦平面のそれぞれの側において２個の点を含む。これらの４個の離れた時間点を跨ぐように計測された光学強度は反射強度プロファイルにマッピングされる。光学カップラーとフォトダイオード検出器は簡単化のために描かれていない。
【００２２】
図７は、３個のレーザー７１１〜７１３が、順に発振されｚ軸プロファイル走査を得るためのフォトダイオード検出器と同期されるような実施例を示している。異なった焦点のためにそれぞれ選択された３個の固定コリメーター７２１〜７２３は、３個のレーザーにそれぞれ接続されている。３個の「人工」の焦点は、３個の異なるファイバーコリメーターの各々からのものであり、焦平面に関して対称な各点において合焦するように選択される。光学カップラーとフォトダイオード検出器は簡単化のために描かれていない。
【００２３】
図８は、ピエゾ制御コリメーター８１０がファイバーの端面を動かすことでｚ軸プロファイルを走査するために使用されるような実施例を示している。ピエゾ制御コリメーターは、様々なファイバーコリメーター位置を生成し、その結果、焦平面に関して対称な幾つかの点において合焦する。光学カップラーとフォトダイオード検出器は簡単化のために描かれていない。
【００２４】
本発明を、いくつかの実施形態に関して相当詳しく入念に説明してきたが、そのような詳細や実施形態または特定の実施形態によって限定されるものではないが、添付された請求項に関し、従来技術に照らしてそのような請求項の最も広く考えられる解釈を提供し、よって本発明の趣旨とする範囲を効果的に含むものと解釈される。さらに、前述したことは、発明者が想定した実現可能な実施形態に関して本発明を述べたものであるが、現時点では想定していない本発明の実体的でない変更もまたこれと同等物とみなすことができる。
【００２５】
（付記）
（付記１）
光源（１１０）と、
第１ポート、第２ポート、及び第３ポートを有する光学カップラー（１３０）であって、該光学カップラー内で、光信号が実質的に、前記第１ポートから前記第２ポートにのみ、及び前記第２ポートから前記第３ポートにのみ伝播し、該光学カップラーが前記第１ポートで前記光源に接続される、光学カップラーと、
前記光学カップラーの前記第２ポートから出力された光をダイクロニックミラー（１７０）と顕微鏡対物レンズ（１６０）とを通って試料（１９５）上に案内するための光学コリメーター（１５０）であって、前記試料（１９５）が調整可能な顕微鏡ステージ（１９８）によって支持された培養基上に載置される、光学コリメーターと、
軸に沿った複数の焦点において前記光を合焦させるための走査手段（２７０）と、
前記軸に沿った前記複数の焦点における前記培養基からの反射を含む前記光信号を、強度信号に変換するためのフォトダイオード検出器（２４０）であって、前記光信号が、前記顕微鏡対物レンズ（１６０）によって捉えられ、前記ダイクロニックミラー（１７０）と前記光学コリメーター（１５０）とを通って前記光学カップラー（１３０）の前記第２ポートに入り、前記第３ポートから出るように、該フォトダイオード検出器（２４０）に送られる、フォトダイオード検出器と、
信号テンプレートを格納するための記憶装置（２３０）と、
前記強度信号を前記信号テンプレートと相互相関させることによって前記強度信号内のピークを検知するためのマイクロプロセッサ（１８０）であって、該マイクロプロセッサ（１８０）は、前記強度信号内の検出されたピークの位置と参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージ（１９８）の位置を移動させるためのコマンドを生成する、マイクロプロセッサと、
を備えるオートフォーカス装置。
【００２６】
（付記２）
前記マイクロプロセッサは前記強度信号における前記ピークを連続して検知し、前記強度信号内の前記検出された前記ピークの位置と前記参照信号内の前記ピークの位置との間の差に基づき、所望の光学焦点を維持するために、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるためのコマンドを生成する付記１に記載の装置。
【００２７】
（付記３）
前記走査手段は、電気的焦点レンズと、該電気的焦点レンズの焦点を調整するためのコントローラーとを備える付記１に記載の装置。
【００２８】
（付記４）
前記走査手段は、異なる伝送遅れを有する複数の長さのファイバーを備える付記１に記載の装置。
【００２９】
（付記５）
前記走査手段は、複数のレーザーと、異なる焦点のための前記複数のレーザーのそれぞれに対応する対応固定コリメーターとを備える付記１に記載の装置。
【００３０】
（付記６）
前記走査手段は、ピエゾコリメーター備える付記１に記載の装置。
【００３１】
（付記７）
前記光学カップラーは、ファイバー光学サーキュレーター備える付記１に記載の装置。
【００３２】
（付記８）
前記光学カップラーは、光学アイソレーター備える付記１に記載の装置。
【００３３】
（付記９）
光学カップラーを、第１ポートで光源の光信号出力に、第２ポートで光学コリメーターに、第３ポートでフォトダイオード検出器に、前記光学カップラー内で、光信号が実質的に、前記第１ポートから前記第２ポートにのみ、及び前記第２ポートから前記第３ポートにのみ伝播するように、接続することと、
前記光コリメーターによって、前記光学カップラーの前記第２ポートからの光線をダイクロニックミラーと顕微鏡対物レンズとを通って、調整可能な顕微鏡ステージによって支持された培養基上に載置された試料に案内することと、
軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることと、
前記顕微鏡対物レンズによって、前記軸に沿った複数の焦点における前記培養基からの反射を含む反射した前記光信号を捉えるとともに、光学コリメーターを通って、前記光学カップラーの前記第２ポートに入り、前記第３ポートから出るように前記フォトダイオード検出器に送ることと、
前記反射した光信号を前記フォトダイオード検出器によって強度信号に変換することと、
前記強度信号を格納された信号テンプレートと相関させることによって前記強度信号内のピークを検知することと、
前記強度信号内の検出された前記ピークの位置と参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるためのコマンドを生成することと、
を含むオートフォーカス装置を自動的に走査する方法。
【００３４】
（付記１０）
さらに、前記強度信号内のピークを連続して検知するとともに、前記強度信号内の検出されたピークの位置と前記参照信号内のピークの位置との間の差に基づき、所望の光学焦点を維持するために、前記軸に沿って調整可能な前記顕微鏡ステージの位置を移動させるコマンドを生成することを含む付記９に記載の方法。
【００３５】
（付記１１）
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、調整可能なレンズを電気的に制御することを含む付記９に記載の方法。
【００３６】
（付記１２）
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、発振されたレーザーと異なる伝送遅れを有する複数の長さのファイバーとを用いることを含む付記９に記載の方法。
【００３７】
（付記１３）
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、異なる焦点のための前記複数のレーザーのそれぞれに対応する対応固定コリメーター用いることを含む付記９に記載の方法。
【００３８】
（付記１４）
前記軸に沿った複数の焦点において前記光線を合焦させることは、ピエゾコリメーターを制御することを含む付記９に記載の方法。
【００３９】
（付記１５）
前記光学カップラーは、ファイバー光学サーキュレーター備える付記９に記載の方法。
【００４０】
（付記１６）
前記光学カップラーは、光学アイソレーター備える付記９に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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