(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞レベルでの遺伝子発現をサイレンシングする方法であって、
（ｉ）染色体接触に関与するＤＮＡの領域において部位特異的な二本鎖切断を誘発することにより、細胞内の少なくとも１つの染色体接触を撹乱するステップと、
（ｉｉ）少なくとも１つの二本鎖切断部位を検出するステップと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性に対する少なくとも１つの撹乱の効果を検出するステップと
を含み、
前記撹乱の効果が、対象遺伝子の転写活性の抑制であり、前記部位特異的な二本鎖切断は、対象遺伝子、或いは、対象遺伝子のエンハンサー又はプロモーターに含まれない、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性が、
（ｉ）ＤＮＡの領域に結合したときに少なくとも１つの染色体接触を妨害する、二本鎖切断の修復プロセスに関わるタンパク質の動員、
（ｉｉ）染色体接触に関与する遺伝子ループの能力低下を引き起こす、二本鎖切断を含有するＤＮＡの領域の移動性の増強、及び
（ｉｉｉ）染色体接触の抑制を引き起こす、遺伝子ループの構造的完全性の喪失
からなる群から選択される機構により抑制され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの染色体接触が、遺伝子間接触、遺伝子内接触、又は両方であり得る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
撹乱されたＤＮＡの領域が、（ｉ）染色体内又は染色体間の接触に関与するＤＮＡループ内の部位、並びに（ｉｉ）ループ構造を決定するＤＮＡループ内の制御部位からなる群から選択される遺伝子又は制御エレメントを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの染色体接触が、染色体間、染色体内、又は両方に位置するＤＮＡの間にある、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
二本鎖切断が、部位特異的ヌクレアーゼにより誘発される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＢＵＤ１ヌクレアーゼ、及びＣｒｉｓｐＲヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
部位特異的ヌクレアーゼが、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクターを用いた細胞のトランスフェクションにより細胞に送達され、部位特異的ヌクレアーゼが細胞内で内因的に発現され、又は部位特異的ヌクレアーゼが外因的に発現され、その結果細胞に送達される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
二本鎖切断が、細胞の修復プロセスに関わるタンパク質の免疫蛍光染色により、又は細胞の修復プロセスに関わる、蛍光標識を発現する組換えタンパク質の場所を検出することにより検出される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
対象遺伝子の転写活性に対する二本鎖切断の効果が、ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、生ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫金標識、分子ビーコン、及びＭＳ２タギングからなる群から選択される方法を用いて検出される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞内の少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を決定する単一細胞アッセイキットであって、
（ｉ）細胞内の染色体接触に関わるＤＮＡの少なくとも１つの領域内に二本鎖切断を誘発する少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼであって、前記部位特異的な二本鎖切断は、対象遺伝子、或いは、対象遺伝子のエンハンサー又はプロモーターに含まれない、前記部位特異的ヌクレアーゼと、
（ｉｉ）二本鎖切断部位を検出するための免疫蛍光プローブ又は蛍光標識を発現する組換えタンパク質と、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの対象遺伝子の転写により生成した少なくとも１つの標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする能力がある少なくとも１つの蛍光オリゴヌクレオチドプローブと
を含み、標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズした少なくとも１つの蛍光オリゴヌクレオチドプローブの蛍光の有無及び蛍光の相対強度が、少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を示す、単一細胞アッセイキット。
【請求項１３】
少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性が、
（ｉ）ＤＮＡに結合したときに染色体接触を妨害する、二本鎖切断の修復プロセスに関与するタンパク質の動員、
（ｉｉ）染色体接触に関与するＤＮＡループの能力低下を引き起こす、二本鎖切断を含有するＤＮＡの領域の移動性の増強、及び
（ｉｉｉ）染色体接触の抑制を引き起こす、ＤＮＡループの構造的完全性の喪失
からなる群から選択される機構により抑制され得る、請求項１２に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項１４】
染色体接触が、遺伝子間接触、遺伝子内接触、又は遺伝子間及び遺伝子内接触の両方であり得る、請求項１２又は１３に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項１５】
二本鎖切断が、染色体接触に関与するＤＮＡを撹乱し、その結果、少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性を撹乱する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項１６】
撹乱されたＤＮＡの領域が、（ｉ）染色体内又は染色体間の接触に関与するＤＮＡループ内の部位、及び（ｉｉ）ループ構造を決定するＤＮＡループ内の制御部位からなる群から選択される遺伝子又は制御エレメントを含む、請求項１５に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項１７】
部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＢＵＤ１ヌクレアーゼ、及びＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項１８】
部位特異的ヌクレアーゼが、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクターを用いた細胞のトランスフェクションにより細胞に送達され、部位特異的ヌクレアーゼが細胞内で内因的に発現され、又は部位特異的ヌクレアーゼが外因的に発現され、その結果細胞に送達される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項１９】
免疫蛍光プローブが、細胞内の二本鎖切断の細胞修復プロセスに関わる少なくとも１つのタンパク質と結合する抗体である、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項２０】
細胞内のハイブリダイズした蛍光オリゴヌクレオチドプローブの場所が、標的ｍＲＮＡ配列に対応する遺伝子発現に関する染色体の場所を示し、ハイブリダイズした免疫蛍光プローブの場所が、二本鎖切断の場所を示す、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項２１】
細胞内のハイブリダイズした蛍光オリゴヌクレオチドプローブの場所が、
回折限界型画像化技法、サブ回折限界画像分解能、及び三次元画像化法からなる群から選択される技法により観測可能であり、
標的ｍＲＮＡ配列についての遺伝子発現の染色体上の場所、及びハイブリダイズした免疫蛍光プローブの回折限界又はサブ回折による場所の検出が、二本鎖切断の場所を示す、
請求項１２から２０のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【請求項２２】
細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項１２から２１のいずれか一項に記載の単一細胞アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内の対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を決定する単一細胞アッセイ、及び染色体接触に関与する遺伝子制御エレメントを撹乱することにより、細胞内遺伝子発現をサイレンシングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子制御は、シグナル伝達カスケードより開始して核内転写を引き起こす。遺伝子発現は、本質的に確率論的であり、転写は、遺伝子が不活性状態から活性状態に切り替わると爆発的に生ずる。遺伝子発現を解読し、またそれを生物学的ノイズや確率性と関連付け、同時に細胞間の変動を説明する試みがなされてきた。
【０００３】
高度に保存性の内因性真核細胞ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路は、遺伝子発現をサイレンシングするのに用いられる標準アプローチである。このアプローチは、小型の外因性干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のトランスフェクション及び母集団レベルでの遺伝子発現変化に関する解析を含む。したがって、ｓｉＲＮＡ−アプローチは、細胞間変動を明らかにすることはできない。非特異的な効果は、ｓｉＲＮＡを遺伝子ノックダウンツールとして使用する際の別の重要な課題を提起する。
【０００４】
真核細胞核は非常に密集している、逆に言えば、高度に組織された環境である。その主要な構成成分であるＤＮＡは、多数回折り畳まれ、空間内で百万回を超えて折り畳まれることにより、その一次元の長さを過剰に短縮する。この密な圧縮により、ループ化したクロマチン領域は、相互作用する又は「キス」することができる。
【０００５】
ＤＮＡが相互作用する部位を同定することにより、母集団に基づく染色体立体構造捕捉法（３Ｃ）及び派生的技法（４Ｃ、５Ｃ、ＨｉＣ、ＣｈＩＡ−ＰＥＴ）は、グローバルインタラクトームの特徴付けを可能にする（Ｄｅｋｋｅｒら、２００２年、Ｆｕｌｌｗｏｏｄら、２００９年）。Ｈｉ−Ｃデータの解析から、クロマチンは、サイズが数百Ｋｂ〜約３Ｍｂの範囲のトポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）と呼ばれるより小さな染色体相互作用性ドメインに分割されることが明らかにされている（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎら、２００９年）。ＤＮＡトポロジーに制約を加えることにより、ＴＡＤ構造は、特異的なループ媒介型相互作用が生じ、したがってこの作用が転写活性において直接的な役割を演ずる確率を高める可能性がある。
【０００６】
ゲノムをサブ染色体ドメイン又はＴＡＤに細分化すると、染色体組織の高度に保存された特徴が現れる（Ｄｉｘｏｎら、２０１２年）。これは、各細胞は、母集団全体にわたり、その染色体に関して一般的に類似した配置を有することを示唆する。逆説的に言えば、従来型のｉｎ  ｓｉｔｕ試験では、遺伝子型が同一の細胞であっても、その母集団全体において不均一度が大きいことが判明している（Ｌｉら、２０１２年）。Ｃ−技法は多くの核の集合体についての報告であり、単一細胞レベルでのＴＡＤ構造の動的性質、及びその結果生じた何らかの転写に対する効果は、当該データでは不明瞭である。明らかに、単一細胞レベルで染色体相互作用を調べることが、グローバルインタラクトーム試験の解釈にとって不可欠である。
【０００７】
ＴＡＤの特長として、ドメイン内クロマチン接触に富んでいることが挙げられる。互いに類似したゲノム距離を有するにもかかわらず、単一ドメイン内の遺伝子座は、異なるドメイン内の遺伝子座よりも核空間内で接近していることから、ＦＩＳＨの結果は、ドメイン間の空間的な相違及びドメイン内における接触の配置を確認する。したがって、ＴＡＤは、ロングレンジクロマチン接触の原理を支配する、層状の構造的制御を提供し得る。
【０００８】
ＴＡＤ内、及び／又はＴＡＤ間の界面において、染色体接触は、相互作用性ＤＮＡエレメントの転写活性と強い相関関係を有する（Ｌｉら、２０１２）。最近、本発明者らは、相互作用性遺伝子の転写に対するループ媒介型接触の役割を直接取り扱う、新規の単一細胞顕微鏡方式のアッセイを開発した。このアッセイを用いて、本発明者らは、染色体接触は、同時制御された遺伝子の転写を支援する際に、中心的役割を演ずることを実証した。
【０００９】
本明細書に記載する本発明は、染色体接触に関与する遺伝子制御エレメントを個別に標的とすることにより（切断することにより）、遺伝子発現をサイレンシングするこのような単一細胞アッセイに関する。主要な制御エレメントとして、（Ｉ）エンハンサー、（ＩＩ）多重遺伝子複合体内の染色体内又は染色体間の接触に関与するクロマチンループ内の部位、及び（ＩＩＩ）ループ構造を決定するクロマチンループ内の制御部位が挙げられる。
【００１０】
ロングレンジ染色体接触により、同時制御された遺伝子の転写が同時に生じ、多重遺伝子複合体が形成される。かかる接触及び転写は、転写因子及び構造クロマチンタンパク質のノックアウト試験で失われる。しかし、このようなアプローチからは、多重遺伝子複合体内の同時転写にとって、染色体接触が必要であることは判明しない。同時転写に対するループ媒介型の接触の役割を個々に調べるために、本発明者らは、十分に特徴付けがなされた多重遺伝子複合体内の遺伝子ループを開裂及び破断させる、ＴＡＬＥＮを用いた新規戦略を考案した。ＲＮＡ  ＦＩＳＨ及び免疫蛍光顕微鏡検査法を用いて、この破断をモニタリングすることにより、接触部位を撹乱すると、その他の相互作用性遺伝子の転写に直接影響を及ぼすことが明らかになった。思いもよらず、この同時転写に対する効果は階層的であり、多重遺伝子複合体の上位及び下位のメンバーが、染色体内及び染色体間の両方の接触に関与している。この観察所見より、多重遺伝子複合体内における同時制御された遺伝子の転写に対する、このような染色体接触の影響は、前例のないレベルであることが判明する。転写は、近位及び遠位のクロマチンループ化相互作用に満ちており、その形成は、核構造及び遺伝子活性の基本的な組織化原理を代表する（Ｔａｎ−Ｗｏｎｇら、２０１２年）。ループ媒介型染色体接触は、母集団に基づく「染色体立体構造捕捉」（３Ｃ）技術を用いて、ゲノム規模のスケールで通常同定される（Ｄｅｋｋｅｒら、２００２年；Ｆｕｌｌｗｏｏｄら、２００９年；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎら、２００９年；Ｌｉら、２０１２年）。３Ｃに基づくデータの解析から、グローバルなクロマチン相互作用では、不均一性が大きいことが判る（Ｆｕｌｌｗｏｏｄら、２００９年；Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年；Ｌｉら、２０１２年）。したがって、３Ｃに基づく技術により同定された相互作用性ＤＮＡエレメントは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを用いて、単一細胞レベルで検証される（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）。このような高感度アッセイは、ＤＮＡ又は発生期ｍＲＮＡを標的とすることができ、また一部の母集団において、ＦＩＳＨフォーカス間の同時局在を明らかにした（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。これは、母集団に含まれる細胞のサブセットは、特定の染色体相互作用に富んでいる可能性があることを示唆する。染色体は大型であり、核容積全体を移動するその能力は限定されている。したがって、各細胞が分裂した後のトポロジー的配置が、染色体同士の近接性をシャッフルし、その３Ｄ配置が１Ｄ空間内で変化するものと推測することは合理的である。これは、母集団に含まれるすべての細胞が、その染色体について固有の空間的配置を保持できるようにする可能性がある。
【００１１】
エンハンサー−プロモーター相互作用は、クロマチンループ化を利用し、転写を開始する際に動的変化を引き起こす（Ｄｅｎｇら、２０１２年）。この例は、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）とβ−グロビン遺伝子のプロモーターとの間で、十分に立証されたモデルである。組織特異的な方式で、ＬＣＲは、β−グロビン遺伝子のプロモーターと物理的に接触し、そして転写を開始することが明らかにされている（Ｄｅｎｇら、２０１２年）。このようなＬＣＲ媒介型染色体相互作用は、母集団全体にわたり、β−グロビン遺伝子転写レベルに変動をもたらす、又は多様な遺伝子発現を引き起こすことが明らかにされている（Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年）。それ以外の同様の細胞母集団では、おそらくは染色体相互作用を通じて、「ジャックポット（ｊａｃｋｐｏｔ）」のような細胞は、より高レベルのβ−グロビン転写を示す（Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年）。したがって、染色体相互作用の特定のセット（及び結果として生じた、ＬＣＲ媒介型相互作用に依存し得る遺伝子発現）は、母集団全体にわたり細胞間で異なる。このような不均一性は、グローバルインタラクトーム及び遺伝子ループ試験において単一細胞解析が絶対要件であることを明らかにする。
【００１２】
また、ループ化は、遠位遺伝子も近接させ、複数のＲＮＡポリメラーゼの単一フォーカスにおいて、「多重遺伝子複合体」内の染色体接触を可能にする（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年；Ｌｉら、２０１２年）。非常に多くの試験により、ループ媒介型接触の形成が、遺伝子発現変化と同時に起きることが実証されている（Ｆｕｌｌｗｏｏｄら、２００９年）。確かに、多重遺伝子複合体内の染色体接触は、転写活性の９５％超と関連するので、後生動物細胞内転写における主要手段と思われる（Ｌｉら、２０１２年）。エンハンサー−プロモーター相互作用と同様の方式で、多重遺伝子複合体における特異的クロマチン相互作用が、母集団に含まれる細胞のサブセットにおいて検出される（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。ペア化エンドタグによるゲノム規模のクロマチン相互作用解析（ＣｈＩＡ−ＰＥＴ）は、ＧＲＥＢ１遺伝子座及び３つのその他の遺伝子を含む多重遺伝子複合体を明らかにした（Ｌｉら、２０１２年）。４つの相互作用性遺伝子のうち、ＧＲＥＢ１転写のみが、エストロゲン受容体−α（ＥＲα）により活性化される（Ｌｉら、２０１２年）。興味深いことに、この多重遺伝子複合体は、母集団に含まれるすべての細胞においてアセンブルするわけではないという事実にもかかわらず、ＥＲαを標的とするｓｉＲＮＡｓは、４つの相互作用性遺伝子すべてを破綻させた（Ｌｉら、２０１２年）。したがって、このような染色体接触は、一部の母集団においてのみ生じ得るものの、かかる接触は、遺伝子制御において重要な役割を演ずるのは明らかである。更に、このデータは、相乗的転写モデルを裏付け、この場合、染色体接触は、相互作用性遺伝子の転写に影響を及ぼす。これは、転写制御に関するトポロジーフレームワークは、多重遺伝子複合体内の染色体ループ化による物理的接触であることを暗示する。
【００１３】
現在のｓｉＲＮＡ及び３Ｃに基づく実験的なアプローチは、すべての相互作用性遺伝子が、同一の転写因子により活性化される多重遺伝子複合体に適用することができない。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、かかる多重遺伝子複合体の形成を誘発することが明らかにされており、この場合、すべての相互作用性遺伝子は、ＮＦ−κＢにより活性化される（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）。ＴＮＦα刺激後１０分経過して、同一の染色体上に位置する遺伝子のプロモーター（ＳＡＭＤ４ＡとＴＮＦＡＩＰ）及び異なる染色体上に位置する遺伝子のプロモーター（ＳＬＣ６Ａ５）は、会合してＮＦ−κＢ−依存性多重遺伝子複合体を形成する（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。３Ｃにより同定されたおよその相互作用部位を標的とするＲＮＡ  ＦＩＳＨアッセイは、このＮＦ−κＢ−制御型多重遺伝子複合体形成と相互作用性遺伝子の同時転写との間の関連性を示唆する（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。しかし、３Ｃ及びＦＩＳＨアプローチのいずれも、これらの相互作用性遺伝子の同時転写に関して、染色体接触の必要性を明らかにすることはできない。したがって、相乗的制御モデルを正確に調べるためには、遺伝子ループ内の単一部位について、多重遺伝子複合体のその他メンバーの転写状態をモニタリングしながら、個々に撹乱することが必要となる。重要なこととして、多様な遺伝子発現に起因して（Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年）、これは、単一細胞アプローチを用いることで、唯一実現可能である。
【００１４】
本発明において、本発明者らは、十分に特徴付けがなされたＮＦ−κＢ−制御型多重遺伝子複合体内の染色体接触に関与することが立証されている遺伝子ループ内の部位を個々に撹乱するために、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を用いた単一細胞戦略を考案する（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。この戦略は、多重遺伝子複合体内の転写を同時制御するためにループ媒介型接触が必要であるという長年の疑問に対し対処可能とした。ＲＮＡ  ＦＩＳＨ及び免疫蛍光検査法（ＩＦ）を用いて、ＮＦ−κＢ制御型多重遺伝子複合体内のその他の相互作用性遺伝子の転写活性と同時に、破綻したループの部位を画像化した。この独自の単一細胞透視法により、ＮＦ−κＢ−制御型遺伝子間のループ媒介型の接触を撹乱すると、相互作用性遺伝子の転写状態が変化することが判明した。更に、この同時転写に対する効果は階層的であり、多重遺伝子複合体の上位及び下位のメンバーが、４８ｍｂｐにわたる距離で染色体内の接触に関与する他、染色体間相互作用にも関与する。更に、破綻した遺伝子ループを復元すると、染色体接触及び相互作用性遺伝子の転写の両方が、配列に依存しない様式で再構築された。ＴＮＦα誘発型多重遺伝子複合体内の予期せぬ階層構成は、このような染色体接触が、多重遺伝子複合体内の同時制御された遺伝子の転写に対して、前例のないレベルの影響を及ぼすことを明らかにする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄｅｋｋｅｒら、２００２年
【非特許文献２】Ｆｕｌｌｗｏｏｄら、２００９年
【非特許文献３】Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎら、２００９年
【非特許文献４】Ｄｉｘｏｎら、２０１２年
【非特許文献５】Ｌｉら、２０１２年
【非特許文献６】Ｔａｎ−Ｗｏｎｇら、２０１２年
【非特許文献７】Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年
【非特許文献８】Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年
【非特許文献９】Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年
【非特許文献１０】Ｄｅｎｇら、２０１２年
【非特許文献１１】Ｌｉら、２０１１年
【非特許文献１２】Ｄｏｙｌｅら、２０１２年
【非特許文献１３】Ｓａｎｊａｎａら、２０１２年
【非特許文献１４】Ｋｅｏｇｈら、２００５年
【非特許文献１５】Ｂｉｅｎｋｏら、２０１２年
【非特許文献１６】Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０年
【非特許文献１７】Ｂｏｃｈら、２００９年
【非特許文献１８】Ｓｈａｎｂｈａｇら、２０１０年
【非特許文献１９】Ｃｉｓｓｅら、２０１３年
【非特許文献２０】Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、遺伝子発現をサイレンシングする方法、及び遺伝子サイレンシングに対する染色体接触の効果を決定するアッセイに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の態様では、単一細胞レベルで遺伝子発現をサイレンシングする方法が提供される。本方法は、細胞内の少なくとも１つの染色体接触を撹乱する又はそれに干渉するステップを含む。染色体接触ポイントとして、クロマチン及び／又はＤＮＡの任意の領域を挙げることができる。本方法は、染色体接触の撹乱部位を検出するステップを更に含む；及び対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の撹乱の効果を検出するステップも更に含む。対象遺伝子は、単一遺伝子及び／又は多重遺伝子複合体を含み得るものと認識される。
【００１８】
１つの実施形態では、染色体接触は、クロマチン又はＤＮＡ内において部位特異的な二本鎖切断を誘発することにより撹乱される。
【００１９】
別の実施形態では、対象遺伝子の転写活性は、二本鎖切断部位に、修復プロセスに関わるタンパク質を動員することにより抑制又は阻止され得るが、同タンパク質は、二本鎖切断部位においてクロマチン又はＤＮＡに結合した際に、染色体接触を妨害する。あるいは、対象遺伝子の転写活性は、二本鎖切断を含有するクロマチン又はＤＮＡの領域の移動性を増強することにより抑制又は阻止され得るが、この場合、遺伝子ループが染色体接触に関与する能力の低下を引き起こす。更なる代替案では、対象遺伝子の転写活性は、遺伝子ループの構造的完全性の喪失を通じて抑制又は阻止され得るが、この場合、染色体接触の抑制を引き起こす。
【００２０】
本発明のなおも別の実施形態では、染色体接触は、遺伝子間接触、遺伝子内接触、又は遺伝子間及び遺伝子内接触の両方であり得る。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、撹乱又は干渉されたクロマチン又はＤＮＡの領域は、エンハンサー及び／又はプロモーター、染色体内若しくは染色体間の接触に関与するクロマチン若しくはＤＮＡループ内の部位、又はループ構造を決定するクロマチン若しくはＤＮＡループ内の制御部位からなる群から選択される遺伝子又は制御エレメントを含み得る。染色体接触は、染色体間、染色体内、又は染色体間及び染色体間の両方に位置するクロマチン及び／又はＤＮＡ間であり得ると認識される。
【００２２】
本発明のなおも別の実施形態では、二本鎖切断は、部位特異的ヌクレアーゼにより誘発され得る。部位特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＢＵＤ１ヌクレアーゼ、及びＣｒｉｓｐＲヌクレアーゼからなる群から選択され得る。部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクターを用いた、細胞のトランスフェクションにより細胞に送達され得るが、この場合、部位特異的ヌクレアーゼは細胞内で内因的に発現されるものと認識される。あるいは、部位特異的ヌクレアーゼは外因的に発現され得るが、その結果、外因的に発現された部位特異的ヌクレアーゼが細胞に送達可能である。
【００２３】
本発明のなおも別の実施形態では、二本鎖切断は、細胞内の細胞修復プロセスに関わるタンパク質の免疫蛍光染色により、又は細胞内の細胞修復プロセスに関わる、蛍光標識を発現する組換えタンパク質の場所を検出することにより検出される。
【００２４】
本発明の更なる実施形態では、対象遺伝子の転写活性に対する二本鎖切断の効果は、ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、生ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫金標識、分子ビーコン、及びＭＳ２タギングからなる群から選択される方法を用いて検出される。
【００２５】
本発明のなおも別の実施形態では、細胞は真核細胞又は原核細胞である。
【００２６】
本発明の第２の態様は、細胞内の少なくとも１つの対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を決定する単一細胞アッセイを提供する。１つの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼが、細胞内の染色体接触に関与するクロマチン又はＤＮＡの領域において、二本鎖切断を誘発する又は引き起こすのに用いられる。したがって、免疫蛍光プローブ又は蛍光標識を発現する組換えタンパク質が、二本鎖切断部位を検出するのに用いられ、少なくとも１つの対象遺伝子の転写により生成した標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズする能力がある１つ又は複数の蛍光オリゴヌクレオチドプローブが、標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズした蛍光オリゴヌクレオチドプローブの蛍光及び蛍光の相対的強度をモニタリングすることにより、対象遺伝子の転写の有無を検出するのに用いられる。蛍光及び蛍光の相対的強度は、対象遺伝子の転写活性に対する染色体接触の効果を示す。
【００２７】
本発明の本態様の１つの実施形態では、対象遺伝子の転写活性は、二本鎖切断部位に対する修復プロセスに関わるタンパク質を動員することにより抑制又は阻止され得るが、同タンパク質は、二本鎖切断部位においてクロマチン又はＤＮＡに結合した際に、染色体接触を妨害する。あるいは、対象遺伝子の転写活性は、二本鎖切断を含有するクロマチン又はＤＮＡの領域の移動性を増強することにより抑制又は阻止され得るが、この場合、遺伝子ループが染色体接触に関与する能力の低下を引き起こす。更なる代替案では、対象遺伝子の転写活性は、遺伝子ループの構造的完全性の喪失を通じて抑制又は阻止され得るが、この場合、染色体接触の抑制を引き起こす。
【００２８】
別の実施形態では、染色体接触は、遺伝子間接触、遺伝子内接触、又は遺伝子間及び遺伝子内接触の両方であり得る。
【００２９】
更なる実施形態では、二本鎖切断は、染色体接触に関与するクロマチン又はＤＮＡを撹乱し又はそれに干渉し、その結果対象遺伝子の転写活性を撹乱し又はそれに干渉する。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、撹乱又は干渉されたクロマチン又はＤＮＡの領域は、エンハンサー及び／若しくはプロモーター、染色体内若しくは染色体間の接触に関与するクロマチン若しくはＤＮＡループ内の部位、又はループ構造を決定するクロマチン若しくはＤＮＡループ内の制御部位からなる群から選択される遺伝子又は制御エレメントを含み得る。
【００３１】
本発明のなおも別の実施形態では、二本鎖切断は、部位特異的ヌクレアーゼにより誘発され得る。部位特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＢＵＤ１ヌクレアーゼ、及びＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼからなる群から選択され得る。部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクターを用いた、細胞のトランスフェクションにより細胞に送達され得る、及びこの場合、部位特異的ヌクレアーゼは細胞内で内因的に発現されるものと当業者は認識する。あるいは、部位特異的ヌクレアーゼは外因的に発現され得るが、その結果、外因的に発現された部位特異的ヌクレアーゼが細胞に送達可能である。
【００３２】
本発明のなおも別の実施形態では、免疫蛍光プローブは、細胞内二本鎖切断の細胞修復プロセスに関わる少なくとも１つのタンパク質と結合する抗体であり得る。
【００３３】
別の実施形態では、細胞内のハイブリダイズした蛍光オリゴヌクレオチドプローブの場所は、回折限界型画像化技法、サブ回折限界画像分解能、及び三次元画像化法等のその他の画像化技法からなる群から選択される技法により観測可能であり、この場合、標的ｍＲＮＡ配列についての遺伝子発現の染色体上の場所、及びハイブリダイズした免疫蛍光プローブの回折限界又はサブ回折による場所の検出は、二本鎖切断場所を示す。
【００３４】
なおも別の実施形態では、細胞は、真核細胞又は原核細胞である。
【００３５】
本発明の非限定的な実施形態を、事例目的に限定して下記の図を参照しながら次に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】エンハンサー−プロモーター相互作用の図である。エンハンサー−プロモーター相互作用では、転写の動的変化の契機となるように、ループ化を利用する。この例は、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）とβ−グロビン遺伝子のプロモーターとの間で十分に立証されているモデルである。このようなＬＣＲ媒介型染色体相互作用は、母集団全体にわたりβ−グロビン遺伝子転写物レベル又は多様な遺伝子発現に変化をもたらすことが明らかにされている（Ｎｏｏｒｄｍｅｅｒら、（２０１１年））。したがって、エンハンサー−プロモーター相互作用を阻止すれば、遺伝子発現に有意な影響を与える。今日までに、遺伝子の発現をサイレンシングするためにエンハンサーエレメントを個別に撹乱するアッセイは存在しない。
【図２】多重遺伝子複合体内の染色体内又は染色体間の接触に関する図である。ループ化は、遠位遺伝子を近接させ、多重遺伝子複合体内での染色体接触を可能にする。エンハンサー−プロモーター相互作用と同様の方式で、多重遺伝子複合体内の特異的クロマチン相互作用は、母集団内の細胞のサブセット内で検出される（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。多重遺伝子複合体内で、ループ媒介型遺伝子間接触が生ずると、相互作用性遺伝子の転写状態に影響を及ぼす。したがって、ループ媒介型接触を阻止すれば、多重遺伝子複合体における相互作用性遺伝子の遺伝子発現に有意な影響を及ぼす。今日までに、発現をサイレンシングするために、多重遺伝子複合体内で相互作用性遺伝子を個別に乱すアッセイは存在しない。
【図３】ループ構造を決定する制御部位の図である。クロマチンをループ状に構成する多くの異なる制御エレメントが同定されており、これにより遺伝子発現が変化する。このような構造クロマチンタンパク質のノックアウト試験から、その転写調整における役割が判明する。しかし、遺伝子発現における、必然的に生じるグローバルな変化により、かかる試験の解釈は複雑化している。クロマチンのリモデリングや構造タンパク質がその標的部位に結合するのを阻止すれば、関連遺伝子の遺伝子発現に有意な影響を与える。今日までに、クロマチン構造タンパク質が結合する部位を個別に撹乱し、また単一細胞レベルにおいて関連遺伝子発現をモニタリングするアッセイは存在しない。
【図４】多重遺伝子複合体内の同時制御遺伝子の転写応答は非対称性であることを示す図である。同一染色体上に位置する遺伝子のプロモーター（ＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ）、及び異なる染色体上に位置する遺伝子のプロモーター（ＳＬＣ６Ａ５）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（オレンジ色）により会合して、ＮＦ−κＢ−依存性多重遺伝子複合体を形成する。ＢＭＰ４及びＲＣＯＲ１は、ＴＮＦαに対して非反応性であり、ＳＡＭＤ４Ａ（青色）、ＴＮＦＡＩＰ２（緑色）、又はＳＬＣ６Ａ５（赤色）とは相互作用せず、したがって本試験では対照として機能する。
【図５】多重遺伝子複合体内の同時制御遺伝子の転写応答は非対称性であることを示す図である。多重遺伝子複合体内の染色体接触は同時転写と関連する。染色体接触に関わるこれらの遺伝子の領域を標的とする、スペクトル的に異なるＲＮＡ  ＦＩＳＨイントロンプローブは、フォーカスを重ね合わせることにより可視化され、発生期イントロンＲＮＡの同時局在を明らかにする。両側フィッシャーの正確確率検定；＊＊＊Ｐ＝４．５Ｅ−４、ｎ：対立遺伝子数。
【図６】ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ媒介型のＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の同時転写は、ＴＡＤ内で生じ得ることを示す図である。ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及び／又はＳＬＣ６Ａ５  ＲＮＡ  ＦＩＳＨのフォーカスを重ね合わせると、活性で不安定形態のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ（セリン５でリン酸化されている）と一様に同時局在している。バー：１０μｍ。
【図７】ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ媒介型のＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の同時転写は、ＴＡＤ内で生じ得ることを示す図である。ＨＵＶＥＣは、ＴＮＦα処理前後の両方において、２つの空間的に異なるＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスを常に示す。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図８】ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ媒介型のＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の同時転写は、ＴＡＤ内で生じ得ることを示す図である。ＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスを重ね合わせ、これを解析すると、ＴＮＦαで刺激されない、及びＴＮＦαで処理されたＨＵＶＥＣ母集団の両方において、同時局在化したフォーカスが明らかとなった。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図９】多重遺伝子複合体内の同時制御遺伝子の転写応答は非対称性であることを示す図である。ＴＮＦαに対する応答は、二倍体ＨＵＶＥＣ内では非対称性である。細胞の母集団に含まれる各遺伝子の対立遺伝子発現を示す。ＳＡＭＤ４Ａも転写されるとＴＮＦＡＩＰ２転写が主として生じ（約８６％）、またＳＡＭＤ４ＡのときはＳＬＣ６Ａ５転写が主に生じ（約９２％）、又はＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２の両方が転写されるときにも生ずる（約６２％）。Ｎ：細胞数（Ｎ＝１６６）、ｎ：対立遺伝子数（ｎ＝３３２）。
【図１０】多重遺伝子複合体内の同時制御遺伝子の転写応答は非対称性であることを示す図である。（Ｃ）のデータは、全母集団（Ｔ／Ｐ）内のＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の複合した対立遺伝子転写状態を示すために再プロットした。ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及び／又はＳＬＣ６Ａ５を同時発現する細胞に関する同時局在頻度も示す。ｎ：対立遺伝子数、バー：５μｍ。図６、７、及び８も参照。
【図１１】遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断を可視化した図である。ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮは、ＴＮＦα刺激後１０分経過して、染色体接触に関わるイントロン１内の領域を標的とする。ＴＡＬＥリピートドメインには、反復可変性二残基（repeat variable diresidue）（ＲＶＤ）の同定を示す目的で色をつけている；各ＲＶＤは、下記のコードにより、同族の標的化ＤＮＡ塩基と関連付けられている；ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＮ＝Ｇ／Ａ、ＮＧ＝Ｔ。
【図１２】ＨＵＶＥＣにおける二本鎖切断検出に関する図である。間接的な免疫蛍光検査法を、ヒストン変異体、Ｈ２Ａ．ＸのＳｅｒ１３９のリン酸化に特異的な抗体を用いて実施した。Ｈ２Ａ．Ｘにより標識されたＤＳＢを、Ａｔｔｏ４８８に結合したロバ抗ウサギ抗体により検出した。ＤＳＢ−誘導物質であるエトポシド、１００μＭで１時間処理したＨＵＶＥＣにおいて、顕著な核染色が明らかであった。細胞は、ＤＡＰＩで対比染色した。バー：５μｍ。
【図１３】遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断を可視化した図である。単一細胞レベルでのＴＡＬＥＮトランスフェクション検出の成功例である。Ｈ２Ａ．Ｘ  ｐＳｅｒ１３９の個々の部位が、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣの約６０％において明らかであった。トランスフェクションに成功した細胞では、より多くの部分が、二重対立遺伝子ＤＳＢよりも単一対立遺伝子ＤＳＢを示した。
【図１４】ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ活性のタイムコースの図である。Ｈ２Ａ．Ｘ  ｐＳｅｒ１３９一次抗体により標識されたＤＳＢを、Ａｔｔｏ４８８に結合したロバ抗ウサギ二次抗体により検出した。ＳＡＭＤ４Ａ  ｐｃＤＮＡ  ＴＡＬＥＮでトランスフェクトされたＨＵＶＥＣの約４０％において、Ｈ２Ａ．Ｘ  ｐＳｅｒ１３９の部位が区別されたことから証明されるように、ヌクレアーゼ活性（トランスフェクション有効性の指標）が、６時間後に最初に明らかとなった。この時点では、大部分の細胞は、Ｈ２Ａ．Ｘフォーカスを示さず、細胞から明らかなように、低レベルのアポトーシス性細胞が複数（３つ以上）の切断を示した。トランスフェクションから２４時間後、約６０％の細胞がＤＳＢを示し、アポトーシス性細胞のレベルは若干高かった（約５％）。トランスフェクション後、４８時間経過して、約７０％の細胞がＤＳＢを示し、またアポトーシス性細胞のレベルは、約１２％に増加した。すべての時点において、トランスフェクトされた細胞では、より多くの部分が、二重対立遺伝子ＤＳＢよりも単一対立遺伝子ＤＳＢを示した（約３：１の比）。
【図１５】遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断を可視化した図である。Ｈ２Ａ．Ｘ免疫蛍光検査法は、破断したＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの部位を正確に標識する。ＳＡＭＤ４Ａ  ＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスは、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢと一様に同時局在化する。
【図１６】遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断を可視化した図である。サーベイヤーヌクレアーゼを示すゲルは、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮの対に起因する。ＮＴ、トランスフェクトされない対照；ＧＦＰ、ＧＦＰトランスフェクト後の細胞；Ｌ、左側ＴＡＬＥＮのみのＳＡＭＤ４Ａ；Ｒ、右側ＴＡＬＥＮのみのＳＡＭＤ４Ａ；Ｌ＋Ｒ、ｐｃＤＮＡ左側及び右側ＴＡＬＥＮによりトランスフェクトされた細胞。赤色矢印：２４６ｂｐ、青色矢印：１１４ｂｐ。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。図１２、１４、２１、３２、及び４１も参照。
【図１７】ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＡＭＤ４Ａ  ＲＮＡ及びタンパク質の発現を抑制することを示す図である。ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮ誘発性ＤＳＢは、ＤＳＢまでの転写に変化をもたらさない。ＤＳＢの５’側を転写した発生期イントロンＳＡＭＤ４Ａ  ＲＮＡ（プローブセットｉにより検出される）が、Ｈ２Ａ．Ｘ染色により証明されるように、ＤＳＢを示すＨＵＶＥＣの４２％において明白であった。ｎ：対立遺伝子数（ｎ＝１９４）、ＮＳ：有意差無し。
【図１８】ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＡＭＤ４Ａ  ＲＮＡ及びタンパク質の発現を抑制することを示す図である。ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮは、ＤＳＢ下流の転写を抑制する。ＤＳＢの３’側を転写した発生期のイントロンＳＡＭＤ４Ａ  ＲＮＡ（プローブセットｉｉにより検出される）は認められなかった。ｎ：対立遺伝子数（ｎ＝８４）、両側フィッシャーの正確確率検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１９】ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＡＭＤ４Ａ  ＲＮＡ及びタンパク質の発現を抑制することを示す図である。ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの破断は、タンパク質の発現を抑制するのに十分である。ＴＮＦαは、ＴＮＦα刺激後１６時間でＳＡＭＤ４Ａタンパク質の発現を誘発する。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出される、二重対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞は、タンパク質の発現について有意な低下を示したが、一方、単一対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞は、なおもＳＡＭＤ４Ａタンパク質を発現する。Ｒ．Ｆ．Ｕ．：相対蛍光単位、平均値±ＳＤ、＊Ｐ＜０．０１、両側独立スチューデントのｔ検定、細胞はＤＡＰＩにより対比染色した、バー：５μｍ。
【図２０】多重遺伝子複合体における単一遺伝子ループ及び関連する染色体接触のＴＡＬＥＮ媒介型破断は、同一複合体を占有するその他の遺伝子の転写状態を変化させることを示す図である。非ＴＮＦα応答性遺伝子のＢＭＰ４内で誘発されたＤＳＢは、正常なＴＮＦα応答と比較して、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、又はＳＬＣ６Ａ５の転写を変化させなかった（図９）。
【図２１】ＴＡＬＥＮ有効性の検出に関する図である。サーベイヤーヌクレアーゼを示すゲルは、ＢＭＰ４  ＴＡＬＥＮの対に起因する。ＮＴ、トランスフェクトされない細胞に由来する対照；ＧＦＰ、ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞；Ｌ、左側ＴＡＬＥＮのみのＢＭＰ４；Ｒ、右側ＴＡＬＥＮのみのＢＭＰ４；Ｌ＋Ｒ、左側及び右側ＴＡＬＥＮのＢＭＰ４  ｐｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞。ＭＷ、Ｏ’ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １ｋｐ＋ＤＮＡラダー。
【図２２】多重遺伝子複合体における単一遺伝子ループ及び関連する染色体接触のＴＡＬＥＮ媒介型破断は、同一複合体を占有するその他の遺伝子の転写状態を変化させることを示す図である。ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの破断は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写並びに同時局在を抑制する。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出されるＳＡＭＤ４Ａループの破断は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写を利用して、ＲＮＡ  ＦＩＳＨにより同時にモニタリングした。
【図２３】単一対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞と二重対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞における表現型の比較に関する図である。ＳＡＭＤ４Ａの単一対立遺伝子を標的とした細胞では、対応する対立遺伝子において、実質的にＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５のすべての転写が喪失し、多重遺伝子の転写はインタクトな対立遺伝子に限定された。ＳＡＭＤ４Ａ対立遺伝子の両方を標的とした場合、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５に由来するほとんどの転写が、両方の対立遺伝子において喪失した。単一及び二重対立遺伝子ＤＳＢを示す両細胞において、ＴＮＦＡＩＰ２／ＳＬＣ６Ａ５の同時局在頻度が有意に低下した。両側フィッシャーの正確確率検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ：ＤＳＢ数。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図２４】ＴＡＬＥＮ誘発型二重対立遺伝子ＤＳＢは、ＮＦ−ｋＢ多重遺伝子複合体のその他のメンバーにおけるタンパク質発現を抑制することを示す図である。ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの破断は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５のタンパク質発現を抑制するのに十分である。Ｈ２Ａ．Ｘを検出するためにＡｔｔｏ４８８に結合したロバ抗ウサギ抗体を用いて、またＴＮＦＡＩＰ２又はＳＬＣ６Ａ５を検出するためにＡｔｔｏ５６５に結合したロバ抗ヤギ二次抗体を用いて、二重間接免疫蛍光法を実施した。二重ＳＡＭＤ４Ａ誘発型ＤＳＢを示す細胞はＨ２Ａ．Ｘにより検出され、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５のタンパク質の発現において顕著な低下を示した。
【図２５】ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮは、ＲＣＯＲ１の転写状態に影響を及ぼすことを示す図である。ＲＣＯＲ１は、ＧＡＰＤＨに匹敵する転写活性を有する遺伝子であり、ＴＮＦＡＩＰ２の５’側約４００ｋｂに位置するが、これはＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮの影響を受けない。ＲＣＯＲ１の２つのフォーカスが、視野内の各細胞において明白である。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：１０μｍ。
【図２６】多重遺伝子複合体内の単一遺伝子ループ及び関連する染色体接触のＴＡＬＥＮ媒介型破断は、同一複合体を占有するその他の遺伝子の転写状態を変化させることを示す図である。ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループの破断は、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子発現に影響を及ぼさないが、ＳＬＣ６Ａ５の転写及びＳＡＭＤ４Ａ／ＳＬＣ６Ａ５の同時局在を変化させる。
【図２７】ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＴＮＦＡＩＰ２の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮは、ＴＮＦα刺激後１０分で、染色体接触に関わるイントロン２内の推定領域を標的とする。１８個の完全モノマーリピートを含み、また２０ｂｐの標的領域を標的とするように、左側及び右側ＴＡＬＥＮを設計し、この場合、最初と最後のスペースは、Ｎ末端のＴ及び０．５リピートをそれぞれ規定する。
【図２８】ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＴＮＦＡＩＰ２の遺伝子発現を抑制することを示す図である。トランスフェクションして２４時間後、約６０％の細胞がＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢを示し、また細胞から明らかなように、低レベルのアポトーシス性細胞が複数（３つ以上）の切断を示した。トランスフェクトされた細胞のより多くの部分が、二重対立遺伝子ＤＳＢではなく、単一対立遺伝子ＤＳＢを示した。
【図２９】ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＴＮＦＡＩＰ２の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮは、ＤＳＢ下流の転写を抑制する。ＴＮＦＡＩＰ２の最初の約１．５ｋｂｐについて転写が可能となるように、二重トランスフェクトされたＨＵＶＥＣを、ＴＮＦαで１０分間刺激した。ＤＳＢ（Ｈ２Ａ．Ｘ−Ａｔｔｏ４８８）の下流で転写された発生期のイントロンＴＮＦＡＩＰ２  ＲＮＡ（Ａｔｔｏ５６５）は認められなかった。両側フィッシャーの正確確率検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図３０】ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＴＮＦＡＩＰ２の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＴＮＦαは、刺激後の１６時間でＴＮＦＡＩＰ２タンパク質の発現を誘発する。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図３１】ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＴＮＦＡＩＰ２の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループの破断は、タンパク質の発現を抑制するのに十分である。ＴＮＦＡＩＰ２及びＨ２Ａ．Ｘ（ＤＳＢ）の二重間接免疫蛍光法を、Ａｔｔｏ４８８に結合したロバ抗ウサギ抗体及びＡｔｔｏ５６５に結合したロバ抗ヤギを用いてそれぞれ実施した。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出されるＤＳＢは、タンパク質の発現において顕著な低下を示した。Ｒ．Ｆ．Ｕ．：相対蛍光単位、平均値±ＳＤ、＊＊Ｐ＜０．０１、両側独立スチューデントｔ検定、細胞はＤＡＰＩにより対比染色した、バー：５μｍ。
【図３２】ＴＡＬＥＮ有効性の検出に関する図である。サーベイヤーヌクレアーゼを示すゲルは、ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮの対に起因する。ＮＴ、トランスフェクトされない細胞に由来する対照；ＧＦＰ、ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞；Ｌ、左側ＴＡＬＥＮのみのＴＮＦＡＩＰ２；Ｒ、右側ＴＡＬＥＮのみのＴＮＦＡＩＰ２；Ｌ＋Ｒ、左側及び右側ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮのｐｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞。
【図３３】単一対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞と二重対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞における表現型を比較した図である。単一対立遺伝子ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢを示す細胞では、ＳＡＭＤ４Ａの転写は影響を受けないままであったが、一方、ＳＬＣ６Ａ５の転写は、インタクトなＴＮＦＡＩＰ２対立遺伝子に限定された。ＳＬＣ６Ａ５の転写は、二重対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞ではほとんど認められなかったが、一方、ＳＡＭＤ４Ａの転写は影響を受けないままであった。単一及び二重対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞の両方で、ＳＡＭＤ４Ａ／ＳＬＣ６Ａ５の同時局在頻度は低下した。両側フィッシャーの正確確率検定；＊Ｐ＜０．０５、細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図３４】ＴＡＬＥＮ誘発型二重対立遺伝子ＤＳＢは、ＮＦ−ｋＢ多重遺伝子複合体のその他のメンバーにおけるタンパク質発現を抑制することを示す図である。ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループの破断は、ＳＬＣ６Ａ５を抑制するのに十分であるが、ＳＡＭＤ４Ａタンパク質の発現では不十分である。ＳＡＭＤ４Ａ又はＳＬＣ６Ａ５及びＤＳＢの二重間接免疫蛍光法を、Ａｔｔｏ４８８と結合したロバ抗ウサギ抗体、及びＡｔｔｏ５６５と結合したロバ抗ヤギ抗体を用いてそれぞれ実施した。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出される、二重ＴＮＦＡＩＰ２誘発型ＤＳＢを示す細胞は、ＳＬＣ６Ａ５のタンパク質発現において低下を示したが、一方、ＳＡＭＤ４Ａのタンパク質発現は、影響を受けないと思われた。
【図３５】多重遺伝子複合体内の単一遺伝子ループ及び関連する染色体接触のＴＡＬＥＮ媒介型破断は、同一複合体を占有するその他の遺伝子の転写状態を変化させることを示す図である。ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループの破断は、ＳＡＭＤ４Ａ／ＴＮＦＡＩＰ２の転写又は同時局在を変化させない。両側フィッシャーの正確確率検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ：ＤＳＢ数。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。図２３、２４、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３６、３７、３８、３９、４０、４２、及び    も参照。
【図３６】ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＬＣ６Ａ５遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＳＬＣ６Ａ５  ＴＡＬＥＮは、ＴＮＦα刺激後１０分で染色体接触に関わるイントロン１の推定領域を標的とする。１８個の完全モノマーリピートを含み、また２０ｂｐの標的領域を標的とするように、左側及び右側ＴＡＬＥＮを設計したが、この場合、最初と最後のスペースは、Ｎ末端のＴ及び０．５リピートをそれぞれ規定する。
【図３７】ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＬＣ６Ａ５遺伝子発現を抑制することを示す図である。トランスフェクションから２４時間後、約６０％の細胞が、ＳＬＣ６Ａ５  ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢを示し、また細胞から明らかなように、低レベルのアポトーシス性細胞が複数（３つ以上）の切断を示した。ＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮと一致して、トランスフェクトされた細胞のより多くの部分が、二重対立遺伝子ＤＳＢではなく、単一対立遺伝子ＤＳＢを示した。
【図３８】ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＬＣ６Ａ５の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＳＬＣ６Ａ５  ＴＡＬＥＮは、ＤＳＢ下流の転写を抑制する。ＳＬＣ６Ａ５の最初の約１．５ｋｂｐについて転写が可能となるように、二重トランスフェクトされたＨＵＶＥＣを、ＴＮＦαで１０分間刺激した。ＤＳＢ（Ｈ２Ａ．Ｘ−Ａｔｔｏ４８８）の下流で転写された発生期のイントロンＳＬＣ６Ａ５（Ａｔｔｏ６４７Ｎ）ＲＮＡは認められなかった。両側フィッシャーの正確確率検定；＊＊＊Ｐ＜０．００１。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図３９】ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＬＣ６Ａ５の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＴＮＦαは、刺激後１６時間でＳＬＣ６Ａ５のタンパク質発現を誘発する。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図４０】ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、ＳＬＣ６Ａ５の遺伝子発現を抑制することを示す図である。ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループの破断は、タンパク質の発現を抑制するのに十分である。ＳＬＣ６Ａ５及びＨ２Ａ．Ｘ（ＤＳＢ）の二重間接免疫蛍光法を、Ａｔｔｏ４８８に結合したロバ抗ウサギ抗体及びＡｔｔｏ５６５に結合したロバ抗ヤギ抗体を用いてそれぞれ実施した。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出されるＤＳＢは、タンパク質発現の有意な低下を示した。Ｒ．Ｆ．Ｕ．：相対蛍光単位、平均値±ＳＤ、＊＊Ｐ＜０．０１、両側独立スチューデントｔ検定、細胞はＤＡＰＩにより対比染色した、バー：５μｍ。
【図４１】ＴＡＬＥＮ有効性の検出に関する図である。サーベイヤーヌクレアーゼを示すゲルは、ＳＬＣ６Ａ５  ＴＡＬＥＮの対に起因する。ＮＴ、トランスフェクトされない細胞に由来する対照；ＧＦＰ、ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞；Ｌ、左側ＴＡＬＥＮのみのＳＬＣ６Ａ５；Ｒ、右側ＴＡＬＥＮのみのＳＬＣ６Ａ５；Ｌ＋Ｒ、左側及び右側ＴＡＬＥＮのＳＬＣ６Ａ５  ｐｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞。
【図４２】単一対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞と二重対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞における表現型を比較した図である。ＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２の転写並びに同時局在は、単一対立遺伝子又は二重対立遺伝子ＳＬＣ６Ａ５  ＴＡＬＥＮ媒介型ＤＳＢの両方を内包する細胞では影響を受けなかった。ｎ：ＤＳＢ数。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図４３】ＴＡＬＥＮ誘発型二重対立遺伝子ＤＳＢは、ＮＦ−ｋＢ多重遺伝子複合体のその他のメンバーのタンパク質発現を抑制することを示す図である。ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループを破断しても、ＳＡＭＤ４Ａ又はＴＮＦＡＩＰ２のタンパク質の発現に変化はない。ＳＡＭＤ４Ａ又はＴＮＦＡＩＰ２及びＤＳＢの二重間接免疫蛍光法を、Ａｔｔｏ４８８に結合したロバ抗ウサギ抗体及びＡｔｔｏ５６５に結合したロバ抗ヤギ抗体を用いてそれぞれ実施した。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出される二重ＳＬＣ６Ａ５誘発型ＤＳＢを示す細胞は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５のタンパク質発現において、変化をまったく示さなかった。Ｒ．Ｆ．Ｕ．：相対蛍光単位、平均値±ＳＤ、マンホイットニーのＵ検定、＊Ｐ＜０．０５、細胞はＤＡＰＩにより対比染色した、バー：５μｍ。
【図４４】ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループ修復の成功例を示す図である。修復戦略の図形表現。修復構築物は、ＩＲＥＳ及びｅＧＦＰから構成され、スプライス部位と隣接する。
【図４５】ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループ修復の成功例を示す図である。ＴＮＦα誘発型のＳＡＭＤ４Ａ活性化は、ｅＧＦＰの発現を誘発する。ｅＧＦＰシグナルが、ｐＤＴベクターとＰＣＲ産物で７２時間二重トランスフェクトし、ＴＮＦαで２４時間刺激したＨＵＶＥＣの約１％に認められた。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。ｎ：細胞数。バー：５μｍ。図４６及び４７も参照。
【図４６】ＩＲＥＳ−ＧＦＰ構築物によるＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループ修復の成功例を示す図である。ＨＵＶＥＣを、ＣＭＶ−ｅＧＦＰ構築物でトランスフェクトした。ｅＧＦＰ陽性又は「緑色」細胞は、大多数のＲＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスと一致した。
【図４７】ＩＲＥＳ−ＧＦＰ構築物によるＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループ修復の成功例を示す図である。ＳＡＭＤ４Ａプロモーターは、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを構成的には発現しない。ｅＧＦＰシグナルが、ｐＤＴベクターとＰＣＲ産物で７２時間二重トランスフェクトし、ＴＮＦαで２４時間刺激したＨＵＶＥＣの約１％に認められた。ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ転写物を提示する細胞の約９０％が、「緑色」細胞として可視化されなかった。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：１０μｍ。
【図４８】破断したＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループを修復することにより、多重遺伝子複合体内の遺伝子転写が回復することを示す図である。ＨＵＶＥＣを２０分間ＴＮＦαで刺激し、ＳＡＭＤ４Ａの最初の約１．５ｋｂｐ並びにＩＲＥＳ−ｅＧＦＰの転写を反復した。トランスフェクトされた細胞の約１０％で、顕著なｅＧＦＰフォーカスが明らかであり、これらのフォーカスはＳＡＭＤ４Ａ  ｍＲＮＡと重複した。ｎ：細胞数（ｎ＝１１８）、バー：５μｍ。
【図４９】破断したＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループを修復することにより、多重遺伝子複合体内の遺伝子転写が回復することを示す図である。ｅＧＦＰ／ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５、並びに模擬的にトランスフェクトした細胞の間で、同時局在頻度に有意差はなかった。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。Ｎ：細胞数（Ｎ＝４４８）、ｎ：ｅＧＦＰフォーカスの数（ｎ＝４５）、ＮＳ：有意差無し、バー：５μｍ。
【図５０】多重遺伝子複合体内の同時制御遺伝子間の階層的転写について、その仮想的モデルを示す図である。ＴＡＤは、遺伝子を、ロングレンジの染色体相互作用に対して許容性の核内のコンパートメントに閉じ込める。ＴＮＦαにより誘発されると、ＮＦ−ｋＢ応答性遺伝子が、染色体相互作用に関与する。これらの遺伝子のうちの２つが同一の染色体上に、但しほぼ５０Ｍｂｐ隔たって存在し、そして別の遺伝子が異なる染色体上に存在するので、これらの相互作用はＴＡＤ内でほぼ間違いなく生ずる。ＴＮＦα刺激後１０分で行う単一細胞解析から、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写応答は非対称性であることが明らかである（図９）。対立遺伝子解析から、下記の４分類が最も広く認められることが判明した；（ａ）いずれの遺伝子においても転写は生じない、（ｂ）ＳＡＭＤ４Ａのみ発現する、（ｃ）ＳＡＭＤ４Ａ、ＳＬＣ６Ａ５、及びＴＮＦＡＩＰ２が複合して発現する、及び（ｄ）ＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２が複合して発現する。これらの相互作用の頻度は低いにもかかわらず（図１０）、染色体接触に関与する遺伝子ループ内の部位を破断することにより、このＴＮＦα誘発型多重遺伝子複合体における階層構成が明らかにされた。
【図５１】ＩＬ８エンハンサーの破断が、ＣＸＣ炎症促進性遺伝子の転写を抑制することを示す図である。（Ａ）ＩＬ−８エンハンサーは、染色体のループ化によりＩＬ８近傍に位置することとなる。（Ｂ）ＩＬ８プロモーター内でのＤＳＢ誘発は、ＩＬ８発現並びにエンハンサー内で転写される非コーディングＲＮＡの発現を抑制する。両側フィッシャーの正確確率検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ：ＤＳＢの数。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図５２】多重遺伝子複合体における単一遺伝子ループ及び関連する染色体接触のＴＡＬＥＮ媒介型破断は、同一複合体を占有するその他の遺伝子の転写状態を変化させることを示す図である。（Ａ）非ＴＮＦα応答性遺伝子、ＢＭＰ４内で誘発されたＤＳＢは、正常なＴＮＦα応答と比較して、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、又はＳＬＣ６Ａ５の転写を変化させなかった。（Ｂ）ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの破断は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写及び同時局在を抑制する。Ｈ２Ａ．Ｘにより検出されるＳＡＭＤ４Ａループの破断は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写を利用して、ＲＮＡ  ＦＩＳＨにより同時にモニタリングした。（Ｃ）ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子ループが破断すると、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子発現には影響しないが、ＳＬＣ６Ａ５の転写及びＳＡＭＤ４Ａ／ＳＬＣ６Ａ５の同時局在に変化が生ずる。（Ｄ）ＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループが破断しても、ＳＡＭＤ４Ａ／ＴＮＦＡＩＰ２の転写又は同時局在に変化はない。両側フィッシャーの正確確率検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ：ＤＳＢの数。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【図５３】ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子の３’側のＣＴＣＦ部位を破断させると、ＴＮＦＡＩＰ２の転写が抑制されることを示す図である。（Ａ）ＴＮＦＡＩＰ２遺伝子の３’側に位置するコンセンサスＣＴＣＦ部位にＤＳＢが誘発されるように、ＣＲＩＳＰＲを設計した。（Ｂ）３’ＣＴＣＦ部位の破断を、Ｈ２Ａ．Ｘにより検出し、ＴＮＦＡＩＰ２の転写を利用して、ＲＮＡ  ＦＩＳＨにより同時にモニタリングした。両側フィッシャーの正確確率検定；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ：ＤＳＢの数。細胞はＤＡＰＩにより対比染色した。バー：５μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明を、以下、添付図面を参照しながらより完全に記載するが、但し本発明の実施形態のすべてではなく、その一部を示す。
【００３８】
記載するような本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものでなく、また修正形態及びその他の実施形態も、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。
【００３９】
本明細書では、特定の用語が採用されるが、一般的かつ記述的意味合いで用いられるに過ぎず、制限するためではない。本明細書全体を通じて、及び後続する特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈から別途明確に示唆されない限り、複数形態も含まれる。
【００４０】
本明細書で用いられる用語法及び表現法は説明目的であり、制限とみなすべきでない。用語「を含む（comprising）」、「を含有する（containing）」、「を有する（having）」 及び「を含む（including）」、及び本明細書で用いられるその変形形態の使用には、それ以降に列挙されている事項及びその等価物並びに追加事項が含まれるように意図されている。
【００４１】
用語「核酸」又は「核酸分子」は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）の両方、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含む。核酸は、二本鎖であっても、また一本鎖であってもよい。核酸が一本鎖の場合、核酸は、センス鎖であっても、またアンチセンス鎖であってもよい。核酸分子は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドからなる任意の鎖であり得、天然又は非天然のヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体又は誘導体を含む。「ＲＮＡ」とは、２つ以上の共有結合した、天然の又は修飾されたリボヌクレオチドからなる配列を意味する。用語「ＤＮＡ」とは、２つ以上の共有結合した、天然の又は修飾されたデオキシリボヌクレオチドからなる配列を意味する。
【００４２】
用語「クロマチン」とは、細胞ゲノムを構成する核タンパク質構造を意味する。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡと、ヒストン及び非ヒストン染色体タンパク質とを含むタンパク質を含む。大部分の真核細胞クロマチンは、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４のヒストン各２個を含む八量体と会合した約１５０塩基対のＤＮＡ；及びヌクレオソームコア間に延在するリンカーＤＮＡを含む。本開示の目的に照らせば、用語「クロマチン」とは、原核性及び真核性の両方を含む、すべての種類の細胞核タンパク質を含むように意図されている。
【００４３】
用語「対象遺伝子」とは、転写ユニットを含み、また転写され、そしてタンパク質に翻訳され得るヌクレオチド配列を含む核酸配列を意味する。本発明の方法及び／又はアッセイを用いれば、細胞内で染色体接触を撹乱した結果、対象遺伝子の発現を中断又はサイレンシングし得る。
【００４４】
染色体接触は、細胞内のクロマチン又はＤＮＡの領域に干渉することにより撹乱可能であり、その結果、対象遺伝子の転写活性抑制を引き起こす。細胞内のクロマチン又はＤＮＡにおける二本鎖切断部位に対してＤＮＡ修復に関わるタンパク質を動員すると、その結果、転写活性は、抑制、停止、阻止され、又は減少し得る。このようなタンパク質を動員した結果、染色体接触は阻止され得る。あるいは、染色体接触は細胞の転写機構に干渉するタンパク質により撹乱され得るが、それはタンパク質が染色体接触部位に「駐留する」、したがって染色体接触を滞らせる又はタンパク質駐留部位において転写機構のアセンブリを妨害することに起因し、かかるタンパク質の非限定的な事例として不活性化Ｃａｓ９タンパク質が挙げられ、クロマチン又はＤＮＡに結合した際に、染色体接触を妨害する。一般的に、ＤＮＡ内に二本鎖切断を導入することにより染色体接触は破綻する又は阻止される。
【００４５】
染色体接触は、二本鎖切断近傍のクロマチン又はＤＮＡ領域の移動性が増強された結果、破綻し得る。クロマチン又はＤＮＡ領域の移動性が高まると、遺伝子ループが染色体接触に関与する能力の低下を引き起こし、その結果対象遺伝子の転写活性は悪影響を受ける。
【００４６】
染色体接触は、二本鎖ＤＮＡ切断に起因する遺伝子ループの構造的完全性の喪失により、更に影響を受ける可能性があり、かかる喪失は、染色体接触を阻止することとなり、したがって転写活性が破綻する。
【００４７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、又は「ポリペプチド」は、天然又は非天然のアミノ酸又はアミノ酸類似体を含む２つ以上のアミノ酸からなる任意の鎖を意味し、翻訳後修飾の有無（例えば、グリコシル化又はリン酸化）を問わない。
【００４８】
用語「組換え」とは、あるものが組み換えられたことを意味する。核酸構築物を参照して用いられる際には、当該用語は、分子生物学的技法により共に結び付けられ又は生成される核酸配列を含む分子を意味する。用語「組換え」は、タンパク質又はポリペプチドを参照して用いられる際には、分子生物学的技法により生み出された組換え核酸構築物から発現するタンパク質又はポリペプチド分子を意味する。組換え核酸構築物は、あるヌクレオチド配列を含み得るが、そのようなヌクレオチド配列は、本来ライゲートしない核酸配列、又は本来とは異なる場所でライゲートする核酸配列にライゲートしている、又はライゲートするように操作されている。したがって、組換え核酸構築物とは、核酸分子が遺伝子工学を用いて操作されていることを示す。組換え核酸構築物は、形質転換により宿主細胞に導入され得る。かかる組換え核酸構築物は、同一の宿主細胞種に由来する、又は異なる宿主細胞種に由来する配列を含み得る。
【００４９】
本発明は、染色体接触に関与する遺伝子制御エレメントを個別に標的とすることにより（切断により）遺伝子の発現をサイレンシングする単一細胞アッセイに関する。本アッセイで用いられる細胞は、真核細胞又は原核細胞から選択され得るものと認識される。また、真核細胞は、二倍体、又は倍数体の細胞系、二倍体又は倍数体の発癌性細胞、初代細胞、幹細胞、多能性幹細胞から選択される細胞、又は組織サンプル、又は任意のその他の真核細胞を非限定的に含み得るものと更に認識される。
【００５０】
本発明の方法で用いられる蛍光部分は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒファミリーの色素、ＦＡＭ、ＴＥＴ又はＣＡＬ  ＦｌｕｏｒＧｏｌｄ  ５４０、ＨＥＸ又はＪＯＥ、ＶＩＣＢ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０Ａ；Ｃｙ３Ｃ又はＮＥＤＢ、Ｑｕａｓａｒ  ５７０Ａ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６Ｄ；ＴＭＲ又はＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０Ａ；ＲＯＸ又はＬＣ  Ｒｅｄ  ６１０Ｅ、ＣＡＬ  ＦＬｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０Ａ；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  又は  ＬＣ  Ｒｅｄ  ６１０Ｅ、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０Ａ；  ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０Ｅ又はＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５Ａ；Ｃｙ５Ｃ又はＬＣ  Ｒｅｄ  ６７０Ｅ、Ｑｕａｓａｒ  ６７０Ａ、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５Ｄ；ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５Ｅ又はＣｙ５．５Ｃ又は５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、フルオレセイン、アントラニルアミド、クマリン、及びテルビウムキレートからなる群から選択される蛍光体を含み得るものと、当業者は認識する。
【００５１】
主要な制御エレメントとして、（Ｉ）エンハンサー、（ＩＩ）多重遺伝子複合体内の染色体内又は染色体間接触に関与するクロマチンループ内の部位、及び（ＩＩＩ）ループ構造を決定するクロマチンループ内の制御部位が挙げられる。異なる種類の制御エレメントのそれぞれについて以下に展開する。
【００５２】
エンハンサー−プロモーター相互作用（図１）
エンハンサーは、特異的遺伝子プロモーターの活性を制御するＤＮＡエレメントである。エンハンサーは、これが制御する遺伝子とは、長い遺伝的距離を置いて分離し得る。エンハンサーは、クロマチンループ化により標的遺伝子近傍に移動する。ゲノム規模のクロマチンインタラクトーム試験により、エンハンサー−プロモーター相互作用は浸透性であり、また長い遺伝的距離にわたる場合でもシスで、又は異なる染色体にまたがりトランスで生じ得ることが明らかになっている。
【００５３】
エンハンサー−プロモーター相互作用は、細胞特異的遺伝子発現を実現させる主要な手段である。エンハンサーは、転写因子、クロマチンリモデラー、及び転写共役因子に関する結合部位を含む。多数の制御タンパク質結合部位（転写因子、クロマチンリモデラー、活性化補助因子）を有するエンハンサーは、「スーパーエンハンサー」と呼ばれる。
【００５４】
スーパーエンハンサーは、結合部位の数が少ないエンハンサーよりも、因子濃度の小さい変化に対して高い感受性を有することが明らかにされている。スーパーエンハンサー制御型遺伝子は、同一のＴＡＤを有して配置する遺伝子を同定することにより同定され得る。スーパーエンハンサー制御型遺伝子は、胚性幹細胞の同一性において重要な役割を有することが明らかにされている。スーパーエンハンサー制御型遺伝子は、典型的なエンハンサーにより制御される遺伝子よりも高度に発現することが明らかにされている。
【００５５】
最近の目覚ましい観察所見として新規クラスの非コーディングＲＮＡの転写が挙げられ、これにはケモカイン遺伝子座を含むゲノム全体にわたるエンハンサー遺伝子座に起因するエンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）、活性化ＲＮＡ、及び長尺非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が含まれる。ｅＲＮＡは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに富むが、一方ｌｎｃＲＮＡは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ３６ｍｅ３クロマチンマークを有する。プロモーター、コヒーシン、及びメディエータータンパク質複合体との相互作用を通じて、ｅＲＮＡは、クロマチンループ化を制御しているとの提案がなされている。
【００５６】
最近の試験は、単一細胞間におけるＴＡＤの内部構造変化を確認するために、予測的なポリマーモデリングと、後続する細胞内のＣＴＣＦ／コヒーシン等の構造的ＤＮＡ制御エレメントの画像化及び欠損を組み合わせて用いてきた。これらの試験は、ＴＡＤ内の変動性の構造的環境、及び転写活性と関連し得る単一細胞間のＴＡＤコンフィギュレーションにおける極端な不均一性を明らかにした。ＤＮＡ制御エレメントは、すべての細胞で同一であるが、ｅＲＮＡ活性は、高度に組織特異的である。ｅＲＮＡは、機能的に未検出のままであるが、ＴＡＤ構造を形成する上で重要な役割を演ずるものと推測されている。
【００５７】
エンハンサー−プロモーター相互作用の十分に特徴付けがなされた例として、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）とβ−グロビン遺伝子のプロモーターとの間の十分に立証されたモデルが挙げられる。このようなＬＣＲ媒介型染色体相互作用は、母集団全体にわたり、β−グロビン遺伝子転写物レベル変化、又は多様な遺伝子発現を引き起こすことが明らかにされている（Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年）。このエンハンサー−プロモーターループを形成することができない細胞では、ＬＣＲ−β−グロビン相互作用を媒介すると考えられている転写因子Ｌｄｂ１をβ−グロビンプロモーターにしっかりと繋留することにより、ＬＣＲ−β−グロビンループ形成が転写活性化の根底にあることが明らかになった（Ｄｅｎｇら、２０１２年）。したがって、エンハンサー−プロモーター相互作用を阻止すると、遺伝子発現に有意な影響を与える。今日までに、エンハンサーエレメントを個別に撹乱して遺伝子発現をサイレンシングするアッセイは存在しない。
【００５８】
ループ構造を決定するクロマチンループ内の制御部位（図２）
配列特異的ＤＮＡ−結合タンパク質のＣＴＣＦは、遺伝子と隣接する頻度が高いコンセンサス部位（ＣＳ）と結合する。ＣＳ部位では、多重タンパク質のコヒーシン「リング様」複合体（Ｓｍｃ１−Ｓｍｃ３ヘテロ二量体、Ｒａｄ２１、及びＳｃｃ３／ＳＡ１／ＳＡ２を含む）は、Ｎｉｐｂｌによりクロマチン上にロードされる。メディエーター複合体（３０個を超えるタンパク質から構成される多重タンパク質複合体）も、ループトポロジーを安定化し、また転写開始及び伸長を制御するために、ＣＴＣＦ及び／又はコヒーシンが占有するクロマチンに動員することができる。
【００５９】
３次元ゲノムを形作る構築タンパク質を同定する試験では、ＣＣＴＣ−結合因子（ＣＴＣＦ）、メディエーター、及びコヒーシンは、ゲノム全体にわたり、広汎で特異的な役割を有することが明らかにされた。エンハンサー−プロモーター相互作用における上記役割と整合して、メディエーター及びコヒーシンは、ショートレンジの細胞型が異なる相互作用を特異的に架橋することが判明した。一方、ロングレンジの相互作用では、ＣＴＣＦ及びコヒーシンが架橋することが判明した。ＴＡＤの境界部は、ＣＴＣＦ及びコヒーシン複合体に関する結合部位に富んでおり、ドメインの完全性及びループ媒介型の転写を維持する上で、これが重要であることを示唆している。Ｘ−染色体不活性化センターにおいて、Ｘｉｓｔ及びＴｓｉｘ  ＴＡＤ間の境界に広がる欠損を含有する細胞を対象とした実験では、境界の喪失により、隣接するＴＡＤの部分的な融合及び新規で異所性の接触形成が引き起こされ、ロングレンジの転写誤制御の原因となることが直接的に実証された（Ｄｉｘｏｎら、２０１２年）。更に、ＣＴＣＦ及びコヒーシンが枯渇すると、これらの因子はドメインの組織化及び転写制御に対して差動的に寄与することが判明した。特に、コヒーシンが破断すると、ＴＡＤはインタクトなままであっても、局所的なクロマチン相互作用が低下するが、一方、ＣＴＣＦが枯渇すると、局所的ドメイン内相互作用の低下の他、ドメイン間相互作用の増加も引き起こす。いずれの場合にも、異なるクラスの遺伝子が誤制御され、各因子は、クロマチンの組織化及び遺伝子制御において顕著な能力を有することが示唆される。
【００６０】
これらの構造クロマチンタンパク質（メディエーター、コヒーシン、ＣＴＣＦ）のノックアウト試験から、転写を制御する際の、それらの役割が明らかとなる。しかし、遺伝子発現における、必然的に生じるグローバルな変化により、かかる試験の解釈は複雑化している。クロマチンのリモデリングや構造タンパク質がその標的部位に結合するのを阻止すれば、関連遺伝子の遺伝子発現に有意な影響を与える。今日までに、クロマチン構造タンパク質が結合する部位を個別に撹乱し、また単一細胞レベルにおいて関連遺伝子発現をモニタリングするアッセイは存在しない。
【００６１】
多重遺伝子複合体内の染色体内又は染色体間接触（図３）
ＴＡＤ内又はＴＡＤ間の界面では、染色体のループ化は、同時制御された遺伝子を近傍に移動させて染色体接触を可能にし得る。このような相互作用は、多重遺伝子複合体又は転写因子と呼ばれてきた活性高リン酸化ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩの個々のフォーカスにおいて生ずるとの提案がなされている。
【００６２】
染色体内又は染色体間の接触に関与する、クロマチン又はＤＮＡループ内の部位は、イントロン、エクソン、及び３’非翻訳領域を含む、但しこれらに限定されない、コーディング領域及び非コーディング領域の両方を含み得る。
【００６３】
非常に多くの試験から、同時制御された遺伝子間のループ媒介型接触は、相互作用性遺伝子の転写に生じる変化と同時に生ずることが実証された（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年、Ｌｉら、２０１２年）。多重遺伝子複合体内のプロモーター媒介型染色体接触に関わる遺伝子の９５％超が、転写活性と関連する。したがって、多重遺伝子複合体内の同時制御された遺伝子間の染色体接触は、転写制御の重要な構成要素と思われる。
【００６４】
本発明者らは、相互作用性遺伝子を転写する際のループ媒介型接触の役割について、直接対処する新規の単一細胞顕微鏡検査式アッセイを開発した。このアッセイを用いて、本発明者らは、同時制御された遺伝子の転写を支援する際に、染色体接触が中心的役割を演ずることを実証した。したがって、ループ媒介型接触を阻止すると、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の遺伝子発現に有意な影響を与える。これは、今日までに最初に記載されたアッセイであり、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子を個別に撹乱して発現をサイレンシングすることが可能である。
【００６５】
本発明は、染色体接触に関与するクロマチン制御エレメントを個別に撹乱することにより、細胞プロセスの試験を増強する手段を提供する。
【００６６】
本発明は、クロマチン制御エレメントを個別に撹乱する手段を提供し、トランスレーショナル医療に応用可能な転写抑制を実現する。例えば、正しい細胞型及び場所にヌクレアーゼを正確に送達することによって。又はヌクレアーゼを用いて患者細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで操作し、次に患者細胞を対象としてすでに実施済みのヌクレアーゼ修飾物を用いて、これを患者に同系細胞移植することによる。
【００６７】
撹乱は、制御部位内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発するように設計された、部位特異的ヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼを含む）、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系（クラスター化した一定間隔出現型短尺回文式リピート、ＢＵＤヌクレアーゼ）により誘発される（Ｌｉら、２０１１年）。
【００６８】
一般的には、これらの部位特異的ヌクレアーゼは、「カットアンドペースト」実験で用いられるが、これにより、細胞独自の修復反応、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、又は相同組換え（ＨＲ）が、ＤＳＢの修復に利用される。これは、染色体接触の破綻を目的とした、このような部位特異的ヌクレアーゼの使用に関する最初の記載である。
【００６９】
リプレッサードメインに結合した、触媒として不活性化なＣａｓ９を使用することにより、ＣＲＩＳＰＲｉ系は、母集団レベルで遺伝子発現をサイレンシングする効果的な手段として用いられてきた。しかし、ＣＲＩＳＰＲｉアプローチは、細胞間の変動を明らかにすることはできない。更に、このアプローチは、転写レベルでの発現をサイレンシングするに過ぎず、制御エレメント間の染色体相互作用を撹乱することができない。
【００７０】
本発明者らの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的ＤＮＡ配列にタンパク質を動員するためのモジュラー及び柔軟性を有するＤＮＡ結合プラットフォームとして利用可能であることを立証し、真核細胞において遺伝子発現を精密に制御するための一般的なツールとしてのＣＲＩＳＰＲｉの能力を明らかにする。部位特異的ヌクレアーゼは、トランスフェクション（マイクロポレーション、エレクトロポレーション、脂質トランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクションを含む）により生細胞内に送達され、また内因的に発現する。
【００７１】
本アッセイで用いられる細胞は、初代幹細胞系統及び誘導多能性幹細胞系統を含む、但しこれらに限定されない任意の種類の真核細胞を含む。
【００７２】
ＤＳＢ、又は破断部位は、ＤＳＢ修復プロセスの因子を免疫蛍光染色することにより、単一細胞レベルで検出される。
【００７３】
ＤＳＢにより引き起こされた破断がなし得る機能として、下記のうちの１つが挙げられる：（Ｉ）修復プロセスに関わるその他の多くのタンパク質は、ＤＳＢ部位に動員される。したがって、１つの可能性として、遺伝子又は遺伝エレメント間の染色体接触は依然として生じ得るが、修復複合体による「架橋」の対象となることが挙げられ得る。これにより、Ｐｏｌ  ＩＩをその他の相互作用性遺伝子に「送達する」遺伝子ループの能力が滞る可能性がある。（ＩＩ）ＤＳＢの誘発は、損傷を受けたクロマチンの移動性を増強することが明らかにされている。したがって、移動量が増加することにより、破断した遺伝子ループがその他の遺伝子座と相互作用することができる確率は有意に低下する。（ＩＩＩ）あるいは、ＤＳＢ及び関連する修復因子がどのように遺伝子のトポロジーに影響を及ぼすか、その様式は未知である。したがって、ＤＳＢは、遺伝子ループの不安定化又は崩壊により、ループ媒介型接触を阻止し得る。
【００７４】
ＤＳＢ修復プロセスの因子を免疫蛍光染色することにより、ＤＳＢの検出と並行して、（ｉ）対象遺伝子、又は（ｉｉ）多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写活性が、イントロン単一分子ＲＮＡ蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ｓｍＦＩＳＨ）を用いて検出される。イントロンは一般的に切除され、また同時転写的に分解を受けるので、イントロンＦＩＳＨフォーカスは、転写開始部位に該当する（ＴＳＳ）。
【００７５】
下記の実施例は、制限するものではなく、説明目的で提供される。
【実施例１】
【００７６】
細胞培養
プールされたドナー（Ｌｏｎｚａ社）に由来する初期継代ＨＵＶＥＣを、サプリメント（Ｌｏｎｚａ社）を含む血管内皮基礎培地−２（ＥＧＭ−２）内で約８０％のコンフルエンスまで増殖させ、ＥＧＭ−２＋０．５％ＦＢＳ中で血清を欠乏させ（１８時間）、そしてＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）で最長３０分間処理した。トランスフェクション前に、細胞を、抗生物質を含まないＥＧＭ−２中で増殖させた。
【００７７】
ＴＡＬＥＮの設計
Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより開発されたソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｌｅｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）を、ＴＡＬＥＮ候補結合部位を同定するのに用いた（Ｄｏｙｌｅら、２０１２年）。２０ｂｐの配列を標的とする、左側及び右側ＴＡＬＥＮを、１８個の完全モノマーリピートを含むように設計したが、この場合、最初と最後の塩基は、Ｎ末端チミン及び０．５リピートによりそれぞれ規定される。ＦｏｋＩ二量化を促進するために、左側及び右側ＴＡＬＥＮ標的部位を、１６〜１９ｂｐのスペーサーを用いて選択した。ｐＤＴ  ＴＡＬＥＮベクターでは、ＳＡＭＤ４Ａの左側及び右側のアームをｐＢＩ＿ＣＭＶ１双方向プロモーターベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローン化した。左側ＴＡＬＥＮを、ｐＢＩ＿ＣＭＶ１のＭＣＳ１（Ｍｌｕ及びＨｉｎｄＩＩＩ）にクローン化し、また右側ＴＡＬＥを、ｐＢＩ＿ＣＭＶ１のＭＣＳ２（ＥｃｏＲＩ及びＢｇ／ＩＩ）にクローン化した。
【００７８】
ＴＡＬＥＮ結合部位及びスペーサー領域
ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮ認識配列（ｐｃＤＮＡ及びｐＤＴベクターの両方）は：左側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＴＣＣ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＡＧＣ  ＴＧ−３’（配列番号：１）、及び右側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＧＣＡ  ＴＡ−３’（配列番号：２）であり、１６ｂｐのスペーサーを含む。ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮ認識配列は：左側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣ−３’（配列番号：３）、及び右側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＡ−３’（配列番号：４）であり、１６ｂｐのスペーサーを含む。ＳＬＣ６Ａ５  ＴＡＬＥＮ認識配列は：左側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＡ−３’（配列番号：５）、及び右側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＣＡ−３’（配列番号：６）であり、１７ｂｐのスペーサーを含む。ＢＭＰ４  ＴＡＬＥＮ認識配列は：左側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＣＣ  ＧＧ−３’（配列番号：７）、及び右側ＴＡＬＥＮ  ５’−ＣＡＡ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＡＧ−３’（配列番号：８）であり、１９ｂｐのスペーサーを含む。
【００７９】
ＴＡＬＥＮの合成
ＴＡＬＥＮを、Ｓａｎｊａｎａら、２０１２年によるプロトコールを用いて生成した。要するに、適するアダプターを付加するために、特異的プライマーを用いて４つのプラスミドそれぞれに由来するモノマーを増幅した（各プラスミドは１つのＲＶＤに対応する；ＮＩ＝Ａ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＧ＝Ｔ、及びＮＮ＝Ａ／Ｇ）。次に、ＰＣＲにより生成したモノマーをゲル抽出により精製し、そしてモノマーライブラリを作成するためにＤＮＡ濃度を標準化した。最初のゴールデンゲート反応ステップでは、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＢＩを用いてモノマーを同時消化し、そしてライゲートして環状化六量体を生成させた。非六量体をエキソヌクレアーゼ処理により除去した。次に、六量体をＰＣＲにより増幅し、ゲル精製し、そしてサンプル間のＤＮＡ濃度を、Ｑｕｂｉｔ高感度ＤＮＡ定量キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて標準化した。第２のゴールデンゲートステップでは、ＢｓａＩを用いて六量体を同時消化し、そして適するＴＡＬＥＮクローニング骨格にライゲートして（０．５リピートの標的となる４つの異なる塩基の１つに対応する）、最終ＴＡＬＥＮ発現構築物を生成させた。ＴＡＬＥＮクローンの成否を確認するために、コロニーＰＣＲを大腸菌形質転換体に用いた。次に、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、製造業者の説明書に従い、ＨＵＶＥＣを各ＴＡＬＥＮと共にマイクロポレーションした。ヌクレアーゼ活性を、サーベイヤーアッセイ、及びＨ２Ａ．Ｘ免疫蛍光検査法により評価されるＤＮＡ  ＦＩＳＨと二本鎖切断との一貫した同時局在により評価した（Ｋｅｏｇｈら、２００５年）。
【００８０】
サーベイヤーアッセイ
トランスフェクトされた細胞のゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ社）を用いて抽出した。ヒトＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、ＳＬＣ６Ａ５、又はＢＭＰ４内のヌクレアーゼ標的部位を含むゲノム領域をＰＣＲ増幅し、そしてアンプリコンをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）で洗浄した。ＳＡＭＤ４Ａの場合、プライマーは、５’−ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＧＡ  ＧＣ−３’（配列番号：９）、及び５’−ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＡＣ−３’（配列番号：１０）であった。ＴＮＦＡＩＰ２の場合、プライマーは、５’−ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡ−３’（配列番号：１１）、及び５’−ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＡＣ−３’（配列番号：１２）であった。ＳＬＣ６Ａ５の場合、プライマーは、５’−ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＣＣ−３’（配列番号：１３）、及び５’−ＣＴＴ  ＴＡＧ  ＧＡＧ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＡＣ−３’（配列番号：１４）であった。ＢＭＰ４の場合、プライマーは、５’−ＣＴＡ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＧＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号：１５）、及び５’−ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡ−３’（配列番号：１６）であった。次に、ＤＮＡフラグメントを、ミスマッチ感受性Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）で消化した。Ｔ７Ｅ１アッセイの場合、ＤＮＡを９５℃で５分間変性し、室温までゆっくりと冷却してヘテロ二本鎖ＤＮＡの形成を可能にし、５ＵのＴ７Ｅ１により、３７℃で１時間処理し、次に１．２％アガロースゲル電気泳動により分析した。
【００８１】
ＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブ
ＲＮＡ  ＦＩＳＨを、Ｒａｊら、２００８年によるプロトコールに基づき、下記の遺伝子を標的とする４８  ２０−ｍｅｒプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社）を用いて実施した：ＳＡＭＤ４Ａ（プローブセットｉ＝イントロン１に約１．５ｋｂｐ、プローブセットｉｉ＝イントロン１に約３４ｋｂｐ、ＴＮＦＡＩＰ２（イントロン２）、ＳＬＣ６Ａ５（イントロン１）、ＲＣＯＲ１（イントロン１）、及びｅＧＦＰを標的とする３２  ２０−ｍｅｒプローブ（表１）。各２０−ｍｅｒは、３’−アミノ−修飾因子Ｃ６−ｄＴを露出する。アミノ基は、その後下記のＮＨＳ−エステル色素に結合させた：ＡＴＴＯ−４８８、ＡＴＴＯ−５６５、ＡＴＴＯ−６４７Ｎ（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ）、又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。要するに、オリゴヌクレオチドプローブを、エタノール沈殿処理し、そして０．１Ｍテトラホウ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社）中で再懸濁した。約０．３ｍｇのＮＨＳ−エステル色素（ＡＴＴＯ−ＴＥＣ）を、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ社）に溶解した。色素溶液を、プローブ溶液に添加し、そして３７℃にて、遮光、オーバーナイトでインキュベーションした。コンジュゲーション反応の後、プローブをオーバーナイトでエタノール沈殿処理し、そして０．１Ｍトリエチルアンモニウム（ＴＥＡ、Ｓｉｇｍａ社）中で再懸濁した。色素結合したプローブに富むように、Ｃ１８カラムにて、逆相ＨＰＬＣにより、結合させたプローブを分離及び精製した。
【００８２】
【表１】
0006535333.tif 000002
【００８３】
0006535333.tif 000003
【００８４】
0006535333.tif 000004
【００８５】
0006535333.tif 000005
【００８６】
免疫−ＲＮＡ  ＲＮＡ  ＦＩＳＨ
実験毎に、カバーガラス上の初期継代ＨＵＶＥＣを約８０％コンフルエンスまで増殖させ、ＴＮＦαで処理し、３．７％ホルムアルデヒド内で室温にて１０分間固定化し、次にＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、氷冷９０％メタノール中で１０分間、透過性化処理し、次にＰＢＳで２回洗浄し、そしてオービタルシェーカー上、ブロッキングバッファー（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）中で３０分間、室温にてインキュベーションした。次に、細胞を、１°抗体溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳで稀釈）中で１時間インキュベーションした。二本鎖切断を、ウサギポリクロナール抗ホスホ−ヒストンＨ２Ａ／Ｘ（Ｓｅｒ１３９）（Ｓｉｇｍａ社）で検出した。ヤギポリクロナール抗ＳＡＭＤ４Ａ  Ｃ−１５（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）、マウスモノクロナール抗ＴＮＦＡＩＰ２  Ｆ−６（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）、及びヤギポリクロナール抗−ＳＬＣ６Ａ５／ＧＬＹＴ２  Ｎ−２０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）を、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５タンパク質をそれぞれ検出するのに用いた。次に、Ａｔｔｏ−４８８又はＡｔｔｏ−５６５に結合した二次抗体と共に１時間インキュベーションした後、カバーガラスを洗浄バッファー（０．０５％ツイーン−２０／ＰＢＳ）で５回洗浄した。次に、洗浄バッファー（０．０５％ツイーン−２０／ＰＢＳ）でカバーガラスを５回洗浄し、そして３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間、室温にて事後固定化し、その後７０％エタノール中、オーバーナイトにて更に透過化処理した。ＲＮＡ  ＦＩＳＨ検出の場合、カバーガラスをＰＢＳで２回洗浄し、そして洗浄バッファー（１０％ホルムアミド、２×ＳＣＣ−１×ＳＣＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）中で５分間インキュベーションした。次に、細胞を、加湿チャンバー内、３７℃、オーバーナイトにて、単一分子ＦＩＳＨプローブ、５０ｎｇと混合したＨｙｂバッファー（１０％デキストラン硫酸塩、１μｇ／μｌ大腸菌ｔＲＮＡ、２ｍＭバナジルリボヌクレオシド複合体、０．０２％ＲＮＡｓｅを含まないＢＳＡ、１０％ホルムアミド）、５０μｌ中でハイブリダイズした。次に、カバーガラスを、洗浄バッファー（１０％ホルムアミド、２×ＳＣＣ）中で３回（オービタルシェーカー上で各３０分間）洗浄した。次に、細胞を平衡バッファー（０．４％グルコース、２×ＳＣＣ）中で５分間インキュベーションし、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で対比染色した。カバーガラスをｇｌｏｘバッファー（３．７μｇ／μｌのグルコースオキシダーゼ、１Ｕカタラーゼ）中にマウントし、そして画像化した。
【００８７】
画像の取得及び処理
細胞を１００×のＮ．Ａ．１．４９  Ｎｉｋｏｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ＴＩＲＦ油浸対物レンズを用いて、特別に構成されたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ  Ｅｃｌｉｐｓｅ広視野ＴＩＲＦ顕微鏡上で画像化した。−８０℃に冷却したＡｎｄｏｒ  ｉＸｉｏｎ８９７  ＥＭＣＣＤカメラを用いて、照明に水銀ランプを採用し、蛍光チャンネル毎に、低カメラゲインにふさわしいフィルターセットを通して画像化を実施した。μｍａｎａｇｅｒオープンソース顕微鏡マネジメントソフトウェア（ＮＩＨ及びＵＣＳＦ、米国）を用いて顕微鏡を制御した。ＤＡＰＩについて、露出時間２０ｍｓを用いた。その他の色素の場合、露出時間は２００〜５００ｍｓの範囲であった。軸平面内の２〜１０μｍの範囲において、サンプルを通過し、多重焦点面上で取得された一連の画像として、各視野を撮影した。０.２μｍピエゾステップサイズを、これらのｚ−スタックについて用いた。画像撮影する前に、Ｆｏｃａｌ  Ｃｈｅｃｋ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）のアライメントにより色収差を検証した。シグナル強度を、Ｆｉｊｉを用いて測定した。表示画像のコントラストは、１６ビットグレースケールに当て嵌めて調整した。同一カバーガラス上の異なる視野間の比較をしやすくするために、ＩＤＶ数値を、蛍光ビーズ強度と比較して標準化した。
【００８８】
ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブ
ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブを、２つの方法のうちの１つを用いて構築した。第１の方法では、ＢＡＣクローンＲＰ１１−２９９Ｄ５（ＳＡＭＤ４Ａ）、ＲＰ１１−１１０２Ｄ６（ＴＮＦＡＩＰ２）、及びＲＰ１１−２０７Ａ１５（ＳＬＣ６Ａ５）（Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）からプローブを構築した。ＦＩＳＨ  Ｔａｇ  ＤＮＡ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用い、これらのクローンをニックトランスレーションしてアミノアリル−ｄＵＴＰを組み込み、その後、アミン修飾ＤＮＡの色素標識を行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、５５５、又は６４７色素を組み込んだ。あるいは、「高精細」ＦＩＳＨプローブを構築するのに、ＰＣＲに基づくプロトコールに従った（Ｂｉｅｎｋｏら、２０１２年）。ｖａｎ  Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ  ＦＩＳＨプローブデータベースから得られた２０組のＰＣＲプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから各遺伝子座を増幅した（表２；ｗｗｗ．ｈｄｆｉｓｈ．ｅｕ）。増幅したＤＮＡをプール、精製し、そしてＦＩＳＨＢｒｉｇｈｔ核酸標識キット（Ｋｒｅａｔｅｃｈ社）を用いて、蛍光色素（ＦＩＳＨＢｒｉｇｈｔ  ４９５、５５０、又は６４７）で標識した。
【００８９】
【表２】
0006535333.tif 000006
【００９０】
0006535333.tif 000007
【００９１】
0006535333.tif 000008
【００９２】
免疫−ＤＮＡ  ＦＩＳＨ
免疫蛍光検査法を上記の通り実施し、また３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで２０分間、室温にて細胞を事後固定化した。ＤＮＡ  ＦＩＳＨハイブリダイゼーションを、以下の通り実施した。細胞を、ＰＢＳ中で２回、各５分間洗浄し、そして０．５％トリトンＸ−１００中で１０分間透過化処理した。２×ＳＣＣに溶解した１０ＵのＲＮＡｓｅＡにより、３７℃にて、１時間細胞を処理した。次に、細胞を２×ＳＳＣで２回洗浄し、そして７０％、８５％、及び１００％エタノール中で各２分間脱水した。空気乾燥後、７０％ホルムアミド、２×ＳＣＣ中で、３分間、７３℃にて細胞を変性し、そして氷冷した７０％、８５％、及び１００％エタノール中で各２分間脱水した。次に、加湿チャンバー内で、７２℃にて５分間新たに変性し、氷上で冷却したＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブ、３０ｎｇと混合したＨｙｂバッファー（１０％デキストラン硫酸、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ）、１０μｌ中、オーバーナイト、３７℃にて細胞をハイブリダイズした。次に、カバーガラスを以下の３つの洗浄バッファーそれぞれで３回洗浄した（オービタルシェーカー上で各５分間）−１）５０％ホルムアミド、２×ＳＣＣ、２）１×ＳＳＣ、及び３）４×ＳＳＣ、０．０１％ツイーン２０。細胞をＤＡＰＩで対比染色し、ｇｌｏｘバッファー（３．７μｇ／μｌのグルコースオキシダーゼ、１Ｕカタラーゼ）中にマウントし、そして画像化した。
【００９３】
修復構築物
修復構築物ｐＣＲ−ＳＡＭＤ４Ａ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰは、それぞれ５６４ｂｐ及び５６３ｂｐからなるＳＡＭＤ４Ａの５’側イントロン１、及びＳＡＭＤ４Ａの３’側イントロン１の２つのセグメントを含み、同セグメントは、ＳＡＭＤ４Ａイントロン１  ＴＡＬＥＮ切断部位のいずれかの側の領域と相同である。セグメントＳＡＭＤ４Ａの５’側イントロン１は、３’スプライスアクセプター部位、及び哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＷＩ、米国）で用いられる修飾型キメライントロンに由来する５２ｂｐの３’イントロン配列を含む。同様に、セグメントＳＡＭＤ４Ａの３’側イントロン１は、５’スプライスドナー部位、及び哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＷＩ、米国）で用いられる修飾型キメライントロンに由来する５２ｂｐの５’イントロン配列を含む。得られた人工的なエクソンはＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを含み、修復（相同組換え）及びスプライシングの後に、ＳＡＭＤ４Ａプロモーターの独立したｉｎ  ｓｉｔｕ  ＧＦＰ発現を可能にする。５６４ｂｐの５’側ＳＡＭＤ４Ａフラグメントを増幅するのに用いられるプライマーは、以下の通りである：ＳＡＭＤ４Ａの５’側イントロンＦ：５’−ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号：１７）；ＳＡＭＤ４Ａの５’側イントロンＲ：５’−ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＴＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＴＴＴ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＧＴＧ−３’（配列番号：１８）（太字（下線部最初の２文字ＣＴ）＝スプライスアクセプター部位；下線部＝ｐＣＩ−ｎｅｏに由来する修飾されたキメライントロン［Ｐｒｏｍｅｇａ社］からのイントロン伸長）。５６３ｂｐの３’側ＳＡＭＤ４Ａフラグメントを増幅するのに用いられるプライマーは以下の通りである：ＳＡＭＤ４Ａの３’側イントロンＦ：５’−ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＡＧＴ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  Ｇ−３’（配列番号：１９）（太字（下線部最初の２文字ＧＴ）＝スプライスドナー部位；下線部＝ｐＣＩ−ｎｅｏ［Ｐｒｏｍｅｇａ社］に由来する修飾されたキメライントロンからのイントロン伸長）；ＳＡＭＤ４Ａの３’側イントロンＲ：５’−ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  Ｇ−３’（配列番号：２０）。両方のアンプリコンをＮｈｅＩ（ＮＥＢ）で消化し、そしてライゲートした。完全長ライゲート後産物を、プライマー、ＳＡＭＤ４Ａの５’側イントロンＦ及びＳＡＭＤ４Ａの３’側イントロンＲを用いてＰＣＲにより選択し、そしてＴＡベクターｐＣＲ．２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化して、ｐＣＲ−ＳＡＭＤ４Ａ−５／３を生成した。（ＨＣＶ）ＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列をｐＨＩＶ７−ＩＲＥＳ−ＧＦＰから増幅し（Ｊｏｈｎ  Ｒｏｓｓｉから贈与）、そしてｐＣＲ−ＳＡＭＤ４Ａ−５／３のＮｈｅＩ部位にクローン化して、ｐＣＲ−ＳＡＭＤ４Ａ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを生成した。増幅で用いたプライマーは以下を含む：ＩＲＥＳ  Ｆ：５’−ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＣＣＧ−３’（配列番号：２１）、及びＧＦＰ  Ｒ：５’−ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  Ｃ−３’（配列番号ＮＯ：２２）。２０及び１８ｂｐの相同アームを内包する二本鎖ＰＣＲ産物を生成するために、下記のプライマーを用いた：５’−ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号：２３）、及び５’−ＴＡＡ  ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＧ−３’（配列番号：２４）。ＰＣＲ産物を、トランスフェクション前に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。
【００９４】
多重遺伝子複合体における同時制御された遺伝子の転写応答は非対称性である
ＴＮＦαは、初期継代のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、幅広く異なる多重遺伝子複合体の形成を系統的に誘発することにより、急速かつ同期的に転写応答を形作ることが明らかにされている（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）。ＴＮＦα誘発型多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子は、ＮＦ−κＢにより活性化される（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５遺伝子は、ＮＦ−κＢ依存性多重遺伝子複合体内で連携しているが（図４）、同複合体は、３Ｃ、４Ｃ（３Ｃ  ｃａｐｔｕｒｅ−ｏｎ−ｃｈｉｐ）により、マイクロアレイ及びＦＩＳＨを駆使して幅広く特徴付けられており、したがって染色体接触が同時転写において単一細胞レベルで演ずる役割を調べるのに理想的なモデルである（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年；Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）。血清を枯渇させることにより、ＨＵＶＥＣを細胞周期のＧ０相において捕捉した。重要なこととして、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の転写は、ＴＮＦα刺激後１０分間で急速に誘発される（図５；Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。１０分におけるそれらの発現と同時に、本発明者ら独自のデータ（データは示さない）を含む３Ｃ前のデータ（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）は、このような遺伝子間の染色体接触が、ＴＳＳの下流約１．５ｋｂｐの部位において生ずることを示唆する（図５）。このような接触の形成が、同時転写と関連するか調べる目的で、本発明者らは、このような接触がＴＮＦα処理後１０分で生ずるイントロン部位を標的とするＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブを設計した（図５）。このイントロンは一般的にスプライスされ、また同時転写的に分解されるので、このようなプローブは、転写開始部位（ＴＳＳ）を標識する。一連の遺伝子特異的ＲＮＡ  ＦＩＳＨイントロンプローブそれぞれを、スペクトル的に異なる蛍光体に結合させた。３つのＮＦ−κＢ制御型遺伝子についてＲＮＡ  ＦＩＳＨを同時に実施することにより、本発明者らは、細胞母集団全体にわたり、このような相互作用の頻度を調査することができた。過去の試験成績（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年、Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）と一致して、ＲＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスの重なりに関する解析により、同時局在化したフォーカスは、全母集団に含まれるすべての対立遺伝子の一部（約５％）にしか認められないことが判明した（図５）。転写された遺伝子間の染色体相互作用は、活性なＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩの個々のフォーカス、並びに核スペックルにおいて生ずることが明らかとなった。ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及び／又はＳＬＣ６Ａ５  ＲＮＡ  ＦＩＳＨのフォーカスを重ね合わせると、活性な、不安定形態のＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ（セリン５でリン酸化されている）と一様に同時局在している（図６）。全体として、これらのデータから、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩフォーカスにおけるこのような遺伝子の同時転写は、ＨＵＶＥＣ母集団のごく一部で生ずるに過ぎない可能性があることが示唆される。初代細胞内の染色体は、核内で異なるテリトリーを占める。ＨＵＶＥＣは初代細胞なので、これは、ＴＮＦα処理前後のいずれにおいても、２つの空間的に異なるＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスを常に示す（図７）。テリトリー内では、染色体はトポロジー関連ドメイン（ＴＡＤ）に更に分割される。この区分化の結果、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子は、かなり小さなゲノム的に近接した部位内に閉じ込められ得る。これら３つの同時制御された遺伝子についてＤＮＡ  ＦＩＳＨを同時に実施することにより、本発明者らは、これら３つの遺伝子のＤＮＡが、ＴＮＦαによる活性化前に近接した状態にあるか調査することができた。興味深いことに、ＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスを重ね合わせ、これを解析すると、ＴＮＦαで刺激されない、及びＴＮＦαで処理されたＨＵＶＥＣ母集団の両方において、フォーカスの近接が明らかになった（図８）。このデータから、ＨＵＶＥＣ母集団の一部分においては、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５遺伝子のＤＮＡは、ＴＮＦα誘発前はＴＡＤ内に閉じ込められ得ることが示唆される。
【００９５】
ＴＡＤにおける染色体相互作用の富化、及びより高レベルの転写を通じて、「ジャックポット」細胞は、遺伝子発現において、変動的又は確率論的効果に寄与し得る（Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年）。このようなＮＦ−κＢ制御型遺伝子は、ＴＮＦαに対して確率論的に反応するので（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）、本発明者らは、３つの遺伝子の単一対立遺伝子発現及び二対立遺伝子発現について評価した。３３の考え得る表現型のうち９つの表現型が大部分の母集団（約８４％）において認められた（図９）。フォーカスを示さない細胞（約２９％）を例外とし、このカテゴリーに含まれるすべての細胞は、単一又は二重のＳＡＭＤ４Ａフォーカスを示した。３つの遺伝子それぞれの個々の発現に関して、すべての細胞が同様にＴＮＦαに対して応答するわけではなく、ＳＡＭＤ４Ａを発現する対立遺伝子は約半分、ＴＮＦＡＩＰ２を発現する部分はより少なく、またＳＬＣ６Ａ５を発現するものは約１／５であった（図９）。染色体接触は、これら３つの遺伝子間で生ずるので（図５；Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）、これらの遺伝子のＴＮＦαに対する非対称性の転写応答は、このような多重遺伝子複合体のアセンブリにおける階層的制御を示唆する。この仮説を裏付けるように、ＴＮＦＡＩＰ２の転写は、ＳＡＭＤ４Ａも転写される際に主として生じ（約８６％）、またＳＬＣ６Ａ５の転写は、ＳＡＭＤ４Ａ（約９２％）、又はＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２の両方が転写される際に主に生ずる（約６２％）（図９）。
【００９６】
ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５は、常に同時発現するわけではないので（図９）、本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及び／又はＳＬＣ６Ａ５を同時発現する細胞と比較して同時局在頻度も提示した（図１０）。３遺伝子間の対立遺伝子の同時発現解析により、ＳＡＭＤ４Ａ、及びＴＮＦＡＩＰ２の同時発現、並びに３遺伝子の三重発現が、母集団全体を通じて最も広く認められることが判明した（それぞれ約１２％及び約１４％）（図１０）。対応する対立遺伝子においてＴＮＦＡＩＰ２発現が存在しない場合には、ＳＬＣ６Ａ５はほとんど発現しない（約４％）（図１０）。更に、ＳＡＭＤ４Ａ転写が存在しない場合のＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の同時転写は極めて稀であった（約１％）（図１０）。これは、ＳＡＭＤ４Ａの転写状態とＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写活性化との間の関連性について更なるエビデンスを提供する。同時発現した対立遺伝子に関して、ＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２は、同時発現した対立遺伝子の約２６％（全母集団（Ｔ／Ｐ）の３％）において同時局在し、一方ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５は、同時発現したすべての対立遺伝子の約４０％において同時局在した（Ｔ／Ｐの５％）（図１０）。全体として、これらのデータから、これら遺伝子間では階層様式の制御が示唆され、この場合、染色体接触は同時転写的活性化に有利に働く。
【００９７】
ＴＡＬＥＮ媒介型遺伝子ループ破断の可視化
染色体接触に依存する階層的制御は、ＧＲＥＢ１多重遺伝子複合体において判明した（Ｌｉら、２０１２年）。ｑＰＣＲ解析から、ＥＲαを標的とするｓｉＲＮＡは、ＧＲＥＢ１転写を破綻させただけでなく、相互作用性メンバーの転写を２〜４分の１以下に低下させるのに十分であることが明らかにされた。これら３遺伝子はＮＦ−κＢにより転写的に活性化されるので、ｓｉＲＮＡアプローチは、ＴＮＦα誘発型の多重遺伝子複合体に適用できない（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。このような目的で、本発明者らは、染色体接触部位において個々の遺伝子ループを個別に破断できるようにする単一細胞アッセイを開発した（図５）。並行して、同一の多重遺伝子複合体における同時転写について、個々の単一遺伝子ループの役割を解読するために、本発明者らは、多重遺伝子複合体内のその他の遺伝子の転写活性を、高感度ＲＮＡ  ＦＩＳＨを用いて可視化した（図５）。本発明者らは、ザントモナス種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）のＴＡＬエフェクターに由来する直交型及び強化型の、十分に立証されたゲノム編集ツールである、ＴＡＬＥＮに基づく独自の顕微鏡検査式アッセイを構築した（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０年、Ｌｉら、２０１１年）。ＴＡＬＥ構造内では、セントラルリピートドメインが、高度に特異的なＤＮＡ認識を媒介する（Ｂｏｃｈら、２００９年；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０年）。このドメインをＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合させると、ＴＡＬＥＮが部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発できるようになる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０年、Ｌｉら、２０１１年）。この試験で用いられるＴＡＬＥＮは、ＴＮＦα処理後１０分で生ずる染色体接触の推定部位においてＤＳＢを誘発するので（図１１）、本発明者らは、ループ媒介型の接触が同時転写に必要とされるのであれば、ＤＳＢは、これら遺伝子間の染色体接触を破綻させるように働くはずである、と推論した。ＴＡＬＥＮが遺伝子ループ破綻に成功したか確認するために、本発明者らは、ヒストン変異体Ｈ２Ａ．Ｘを用いて、ＤＳＢの誘発について染色を行った（図１２及び１３）。ＤＮＡ破断後数分以内に、Ｓｅｒ１３９において迅速にリン酸化すると、このような修飾は、ＤＮＡ修復プロセスの全体を通じて持続する。本発明者らのＴＡＬＥＮシステム、及びその単一遺伝子ループを破断させる能力、及び同時に生ずる多重遺伝子複合体のアセンブリについて、最初に試験するために、本発明者らは、多重遺伝子複合体ＳＡＭＤ４Ａ中で最長遺伝子の遺伝子ループを破断することが可能であった本発明者らのＴＡＬＥＮベクターを、高効率マイクロポレーションにより、ＨＵＶＥＣに導入した。ＴＡＬＥＮ活性のタイムコースを（またトランスフェクション有効性の指標も）、慎重に設定するために、本発明者らはＤＳＢのＨ２Ａ．Ｘ染色を用いたが、但しヌクレアーゼ活性は約６時間後に初めて明白となり、約４８時間まで持続したことに留意されたい（図１４）。本発明者らは、２４時間後にヌクレアーゼ活性をアッセイする方法を選択するが、それはこの時点では高レベルのＤＳＢが存在し、また細胞毒性レベルも低いためである。トランスフェクション後２４時間で、個々のＨ２Ａ．Ｘリン酸化部位は、細胞の約６０％において明白であったが、これらの細胞のより多くの割合が単一対立遺伝子ＤＳＢを示し、二重対立遺伝子ＤＳＢを示した細胞はより少なかった（図１３）。ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮの特異性が高いことは、ＤＮＡ  ＦＩＳＨにより可視化されるＳＡＭＤ４Ａ  ＤＮＡとＤＳＢとの一貫した同時局在により実証された（図１５）。ＴＡＬＥＮ切断の有効性は、「サーベイヤーアッセイ」の結果により更に裏付けられた（図１６、２１、３２、及び４２）。したがって、本発明者らは、単一細胞レベルで、その本来の環境において、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの破断について一義的にアッセイすることができた。
【００９８】
ＲＮＡ及びタンパク質の発現を抑制する遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断
ＴＮＦαにより刺激を与えると、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩはＳＡＭＤ４Ａプロモーターと関係するようになり、遺伝子下流に伝播する転写の波を引き起こす契機となる。アレイ解析法を駆使するＲＮＡ  ＦＩＳＨでは、転写サイクルには約８５分かかることが判明した（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。したがって、ＴＳＳの下流約１．５ｋｂｐが転写されたＲＮＡは、ＴＮＦα刺激後１０分以内（プローブセットｉ、図１７）、及びイントロン１への約３４ｋｂｐは、３０分後に現れる（プローブセットｉｉ、図１８）。重要なこととして、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮにより誘発されたＤＳＢは、異なるセットのイントロンＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブが結合するこれら２つの領域の間の部位において生ずる。ＨＵＶＥＣを、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮで２４時間二重トランスフェクトし、そしてＴＮＦαに１０分間曝露した。この反復性のＳＡＭＤ４Ａ転写活性は、ＳＡＭＤ４Ａの最初の約１．５ｋｂについて転写を可能にする。ＴＮＦα刺激後１０分で生ずるイントロンＲＮＡ転写をモニタリングするＲＮＡ  ＦＩＳＨを用いることにより、ＳＡＭＤ４Ａ転写は重複部又はＤＳＢ近傍において高頻度に検出された（約４２％）（図１７）。したがって、これらのデータから、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループを破綻させたにもかかわらず、ＤＳＢは、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩがＳＡＭＤ４Ａプロモーターにアクセスし、転写開始及びＤＳＢまでの伸長を可能にする能力に影響を及ぼすようには見えないことが示唆される。１０分の時点で転写されたＳＡＭＤ４ＡイントロンＲＮＡ転写物の半減期は、３〜６分である。したがって、１０分の時点でＴＳＳの下流において転写されたＲＮＡ転写物は、３０分経過時点までに分解された。異なる実験では、ＳＡＭＤ４Ａの最初の約３４ｋｂｐについて転写が可能となるように、二重トランスフェクトされたＨＵＶＥＣをＴＮＦαで３０分間刺激した（図１８）。特に、ＳＡＭＤ４Ａのイントロン領域の転写は、ＤＳＢより先では明白ではなかったので、ＴＡＬＥＮ誘発型の撹乱は、この領域におけるＳＡＭＤ４Ａの転写を抑制することができる（図１８）。
【００９９】
ＤＮＡが損傷すると、ＤＳＢより遠位におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩの占有状態が変化し、転写阻害を引き起こすことが公表されている（Ｓｈａｎｂｈａｇら、２０１０年）。この効果には、ＡＴＭキナーゼ活性が媒介し、ＤＳＢより先のＰｏｌ  ＩＩ依存性の伸長を抑制する。重要なこととして、Ｐｏｌ  ＩＩのＡＴＭ媒介型局所的阻害が、ＤＳＢに対してシスで生ずる（Ｓｈａｎｂｈａｇら、２０１０年）。したがって、本試験では、ＤＳＢより遠位において生ずるＰｏｌ  ＩＩの局所的阻害は、単一対立遺伝子ＤＳＢを示す細胞内のインタクトな対立遺伝子に影響を及ぼさないはずである。トランスフェクトされない細胞を対象としたＩＦにより、ＴＮＦαによる誘発は、多重遺伝子複合体メンバーの強力な転写だけでなく、タンパク質の発現量の増加も引き起こすことが判明した（図１９）。転写を抑制するＴＡＬＥＮの能力と整合して、ＩＦにより検出される二重対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞内で生ずるＳＡＭＤ４Ａタンパク質の発現に有意な低下が認められたが、一方、単一対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞は、おそらくはインタクトな対立遺伝子に由来するＳＡＭＤ４Ａタンパク質をなおも発現し得る（図１９）。全体として、この強力なアッセイは、ＴＡＬＥＮ活性の動力学、標的対象遺伝子の転写状態、及び単一細胞分解能での関連するタンパク質濃度について前例のない展望をもたらした。重要なこととして、ＳＡＭＤ４Ａ  ＲＮＡ（図１８）及びタンパク質の発現（図１９）において破綻が認められたが、そのような破綻は、Ｈ２Ａ．Ｘ染色が生じた、意図するようなＴＡＬＥＮ活性部位でＤＳＢが生ずることの確認となることから、本アッセイの裏付けとなった。
【０１００】
遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断は、相互作用性メンバーの発現を抑制する
本発明のＴＡＬＥＮアッセイが、染色体接触に関与する部位において、ＳＡＭＤ４Ａを個別に破断可能であったことに満足して、本発明者らは重要な修正を加えてこれまでの実験を繰り返した：本発明者らは、破断したＳＡＭＤ４Ａの領域と共に、染色体内及び染色体間において関与する２つのその他の相互作用性遺伝子の転写を視覚化するために、ＲＮＡ  ＦＩＳＨを用いた。ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの破断、並びにこの多重遺伝子複合体の追加メンバーに関する転写を同時にモニタリングすることにより、本発明者らは、複合体の２つのその他のメンバーの転写状態に対する破断したＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの効果を個別に調べることができた。
【０１０１】
初めに、ＤＳＢが、細胞周期停止を誘発し、これによりグローバルな転写を変化させる能力を有する可能性を排除するために、本発明者らは、１４番染色体上、ＳＡＭＤ４Ａの５’側約６００ｋｂに位置する非ＴＮＦα反応性遺伝子ＢＭＰ４を破壊するＴＡＬＥＮを設計した（図２０）。本発明者らは、正常なＴＮＦα誘発型転写応答と比較して、多重遺伝子複合体の３つのメンバーのいずれについても、その転写に変化を認めなかった（図９）。したがって、ＳＡＭＤ４Ａの５’側にＤＳＢを誘発しても、多重遺伝子複合体を構成するメンバーの転写に対して、何ら効果を有さない。
【０１０２】
次に、本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａのクロマチンループを、その最初のイントロンにおいて撹乱し、その効果をモニタリングした。本発明者らは、ＳＡＭＤ４ＡのＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢにおいて、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写の有意な低下を認めた（図２２）。ＳＡＭＤ４Ａの単一対立遺伝子を標的とした細胞では、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の実質的にすべての転写が、ＲＮＡ  ＦＩＳＨにより評価されたように、対応する対立遺伝子又はＤＳＢにおいて失われ、多重遺伝子の転写は、インタクトな対立遺伝子に限定された（図２３）。重要なこととして、ＳＡＭＤ４Ａタンパク質は、単一対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞になおも認められるので（図１８）、この観察所見から、ＳＡＭＤ４Ａタンパク質は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写に必要である可能性は排除される。
【０１０３】
最初に、図２０、２２、２６、及び３５で認められた転写応答に対する考え得る説明として、ＳＡＭＤ４Ａタンパク質は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の発現に必要とされることを挙げることができよう。しかし、マイクロアレイ解析により、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子を転写するのにＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩは約８５分間かかることが実証される。認められたような、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢによるＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の発現低下は、ＴＮＦα刺激後１０分において認められる（図２２及び２６）。転写又は染色体接触は、刺激を受けないＨＵＶＥＣ内のこのような同時制御された遺伝子の間では認められない（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。したがって、これらの効果は、ＳＡＭＤ４Ａ転写物全体又はそのタンパク質は、１０分の時点ではいずれも存在しないので、その転写物全体又はタンパク質に起因するとは言えない。ＨＵＶＥＣは、定義された染色体テリトリーを有する初代細胞であり、したがって２つの空間的に異なるＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスを常に示す（図７）。単一対立遺伝子ＤＳＢ及び二重対立遺伝子ＤＳＢを内包する細胞間の比較（図１９）では、多重遺伝子複合体のアセンブリにおけるタンパク質の発現の影響について、特有の展望を提供する。単一対立遺伝子切断（１つの対立遺伝子におけるＳＡＭＤ４Ａ転写の破綻）を示す細胞では、以下の現象が認められる；ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢ近傍のＳＡＭＤ４Ａと相互作用する２つのその他の遺伝子の転写減少（図２３）、及びインタクトな対立遺伝子におそらく由来するＳＡＭＤ４Ａタンパク質の翻訳（図１９）。ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写の減少は、ＳＡＭＤ４Ａについて二重対立遺伝子ＤＢＳを内包する細胞でも認められた（図２３）。二重対立遺伝子ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮ誘発型ＤＳＢを示す細胞でも、タンパク質の発現量は低下した（図１９）。全体として、これらのデータは、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子のタンパク質産物は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の発現には不要であることを明確に示している。現在のところ、その他の生化学的技法は、同様の見識をもたらさない。ＳＡＭＤ４Ａの対立遺伝子の両方が標的とされる細胞では、単一対立遺伝子ＤＳＢにおいて転写の減少が認められたが、これを裏付けるように、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５に由来する実質的にすべての転写が両対立遺伝子で喪失した（図２３、３３、及び４２）。更に、ＳＡＭＤ４Ａ対立遺伝子の両方を標的とするのに成功した細胞では、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５のタンパク質濃度も、ＩＦにより評価されたように、顕著に低下した（図２４、３４、及び４３）。したがって、ＧＲＥＢ１（Ｌｉら、２０１２年）に類似した様式で、ＳＡＭＤ４Ａは、同一の多重遺伝子複合体内のその他の同時制御型及び相互作用性遺伝子についても、その転写に影響を及ぼすと思われる。
【０１０４】
本発明者らは、ＴＮＦＡＩＰ２の転写喪失は１４番染色体上のＳＡＭＤ４ＡとＴＮＦＡＩＰ２の間に位置する遺伝子の転写を抑制するＤＳＢに起因するか調べる努力を行った。ＲＣＯＲ１は、ＴＮＦＡＩＰ２の５’側４００ｋｂに位置する遺伝子であり、ＧＡＰＤＨに匹敵する転写活性を示す（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）。本発明者らは、ＲＣＯＲ１の転写をモニタリングしながら、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループのＴＡＬＥＮ媒介型破断を繰り返した（図２５）。転写は、ＲＣＯＲ１遺伝子座では影響を受けないままであった（図２５）。この観察所見は、ＳＡＭＤ４Ａのループ媒介型染色体接触は、多重遺伝子複合体のその他のメンバーの転写に特異的に影響を及ぼすが、複合体外の遺伝子には影響を及ぼさないという仮説と一致する。これは、多重遺伝子複合体内の２つの遺伝子間に散在した同一の染色体上の遺伝子まで拡張される。
【０１０５】
多重遺伝子複合体内のすべての遺伝子は、ＮＦ−κＢ転写因子の制約を受けたので、本発明者らは、多重遺伝子複合体内のその他の遺伝子ループの存在が、同時転写に等しく必要とされるか調べる努力を行った（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。本発明者らは、遺伝子ループが、同時転写に等しく必要とされるならば、その他の遺伝子ループのいずれかが破断すれば、ＳＡＭＤ４Ａについて認められた効果と類似した効果を有するものと仮定した。あるいは、遺伝子ループ間の非対称的関連性は、１つの遺伝子ループの破断は、複合体内のその他の遺伝子の転写状態に対して影響を有さない可能性があることを示唆する。これら２つの仮説を区別するために、本発明者らは、ＴＮＦＡＩＰ２（図２７、２８、２９、３０、及び３１）及びＳＬＣ６Ａ５（図３６、３７、３８、３９、及び４０）を標的とするＴＡＬＥＮを設計した。これらのＴＡＬＥＮに関する部位は、染色体接触がこれらの遺伝子間で生ずる場所を示す３Ｃ（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）により同定された。本発明者らの初期のアッセイと同一のアプローチを用いて、ＳＡＭＤ４Ａ及びＳＬＣ６Ａ５の転写をモニタリングしながら、ＴＡＬＥＮをＴＮＦＡＩＰ２に送達した。ＴＮＦＡＩＰ２  ＴＡＬＥＮは、染色体接触の部位を標的とするが（ＴＳＳの下流約１．５ｋｂｐ）、一方、本発明者らのＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブはこの部位の下流領域を調べた（図２７）。注目すべきことに、本発明者らは、ＴＮＦＡＩＰ２ループが破断しても、ＳＡＭＤ４Ａ転写に有意な影響は有さないが、ＴＮＦＡＩＰ２（図２９）及びＳＬＣ６Ａ５の両方の転写はなおも減少したこと（図２６）を認めた。転写喪失が一方又は両方の標的対象対立遺伝子で認められた（図３３）。本発明者らが、１１番染色体上のＳＬＣ６Ａ５遺伝子ループを標的とするＴＡＬＥＮを用いて実験を繰り返したとき（図３６）、階層的効果はより顕著であり、転写はＳＡＭＤ４Ａ及びＴＮＦＡＩＰ２の両方において影響を受けなかった（図３５及び図４２）。しかし、標的化に成功したすべてのＳＬＣ６Ａ５の単一及び二重対立遺伝子において、転写は喪失した（図３８）。この結果は、ループ媒介型染色体接触が必要とされることから、染色体接触部位が破綻すれば、遺伝子ループが重要な転写機構にアクセスする能力が奪われるという仮説を裏付ける。この特有の単一細胞の展望から、ＴＮＦα誘発型多重遺伝子複合体内のほとんど予期されない階層構成が明らかとなり、染色体接触は、転写を支援し、階層を決定する際に中心的役割を演ずるという第１の直接的なエビデンスを提供する。
【０１０６】
破断したＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループは、瑕疵なく修復され得る
遺伝子ループトポロジー及び染色体接触の完全性が、同時転写にとって不可欠であるならば、染色体接触を復元すれば、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写が修復されると、本発明者らは仮定した。ＤＳＢは、２つの高度に保存された機構によりほとんどの細胞で一般的に修復される：迅速であるが間違いを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、又はより低速であるが、極めて正確な相同性指向型修復（ＨＤＲ）。エクソンｅＧＦＰ配列をＳＡＭＤ４Ａのイントロン１に挿入することにより、ＨＤＲを利用してＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの完全性を修復するために、本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａ  ＴＡＬＥＮの標的部位に及ぶように設計された修復構築物を作製した（図４４）。本発明者らは、修復構築物の同時転写スプライシング及び独立した翻訳を促進するために、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）、並びにＩＲＥＳ−ｅＧＦＰに隣接するスプライス部位を含めた（図４４）。修復されたら、ＳＡＭＤ４Ａの活性化を通じて、ＴＮＦαによる刺激はＳＡＭＤ４Ａ／ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ転写を誘発することができる。本発明者らは、ＴＮＦα処理に関するタイムコースを設定するために、ｅＧＦＰ陽性細胞の同定を利用した。ＨＤＲは稀なため、またＩＲＥＳ−ｅＧＦＰは、内因性のＳＡＭＤ４Ａプロモーターの制御下にあるので、本発明者らは修復の効率を高める努力を行った。ＤＳＢ誘発プロセス全体を通じて、左側及び右側の両方について等モル量のＴＡＬＥＮが同一細胞内で合成されることを保証するために、本発明者らは、ＴＡＬＥＮの両標的化アームを単一の双方向プロモータープラスミドと合体させることができる新規の双方向ＴＡＬＥＮシステムを構築した（ｐＤＴ；図４５）。ｅＧＦＰシグナルが欠損していることから立証されるように、ｐＤＴ及び修復プラスミドで二重トランスフェクトしたＨＵＶＥＣでは、トランスフェクトされた細胞内の修復効率は不十分であることが実証された（データは示さない）。修復構築物を改変するために、本発明者らは、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ配列を関連する隣接スプライス部位と共に増幅し、また短尺の５’側２０ｂｐ及び３’側１８ｂｐの相同伸長をＳＡＭＤ４Ａ  ＤＳＢのいずれかの側に含めて、効率的なＨＤＲを誘発した（図４５）。特に、ｅＧＦＰタンパク質シグナルが、ｐＤＴプラスミド及びＰＣＲ産物で７２時間二重トランスフェクトし、ＴＮＦαで２４時間刺激したＨＵＶＥＣの約１％に認められた（図４５）。しかし、ＨＤＲが奏功した後に限り生じ得るｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ転写物は、母集団に含まれる細胞の約１０％に認められた（図４６及び４７）。特に、ｅＧＦＰ陽性又は「緑色」細胞は、多数のＲＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスと一致した（図４６及び４７）。ＳＡＭＤ４Ａプロモーターは、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを恒常的に発現しないので、母集団に含まれるごく少数の細胞が十分量のＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを転写して、「緑色」細胞の検出を可能にするというのは合理的である。したがって、ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡの検出は、奏功性のＨＤＲを同定するより高感度のアプローチであり、また修復された遺伝子ループの影響を調べるのに用いられた。
【０１０７】
ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの復元は、相互作用性メンバーの転写を配列に依存しない様式で修復する
修復実験は十分に機能的であったことに満足して、本発明者らは、接触の再構築が、相互作用性遺伝子の転写を修復するのに十分であったか調査する努力を行った。本発明者らは、ＨＵＶＥＣをＴＮＦαで２０分間刺激し、ＳＡＭＤ４Ａ及びＩＲＥＳｅＧＦＰの最初の約１．５ｋｂｐの転写を繰り返した。本発明者らは、ｅＧＦＰのＲＮＡに結合するＲＮＡ  ＦＩＳＨプローブを用いてｅＧＦＰの転写を検出し（図４６及び４７）、またｅＧＦＰ転写位置を多重遺伝子複合体のメンバーと関連付けた。顕著なｅＧＦＰフォーカスが、トランスフェクトされた細胞の約１０％で明白であり、またこれらのフォーカスは、ＳＡＭＤ４ＡイントロンｍＲＮＡと重複した（図４８）。本発明者らがＨＤＲ媒介型修復に成功した事例では、正常なＴＮＦα誘発型転写応答と比較して、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５のいずれかの転写について何ら変化を認めなかった（図４９）。更に、修復された細胞及び模擬的なトランスフェクト細胞において、ｅＧＦＰ／ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の間の同時局在頻度に有意差は認められなかった（図４９）。この結果から、インタクトなＳＡＭＤ４Ａループを配列に依存しない様式で再構築すれば、このような多重遺伝子複合体内の染色体接触並びにＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写が修復されることが示唆される。
【実施例２】
【０１０８】
ＩＬ８エンハンサーを破断すると、ＩＬ８発現が抑制される
最近、Ｈｉ−Ｃ試験により、炎症促進性ケモカインＣＣ  Ｃｈｒ．１７（ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１１）、及びＣＸＣ  Ｃｈｒ．４（ＩＬ８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ２）は、ＴＡＤに組織化され、また染色体接触に関与することが明らかにされた。
【０１０９】
ｓｍＦＩＳＨのイントロンを用いて、本発明者らは、ＣＸＣケモカインはＴＮＦ誘発後に限り誘発されることを示すことができた。更に、同時発現したＣＸＣ遺伝子のｓｍＦＩＳＨフォーカスは、常に同時局在する。
【０１１０】
ＣＣ及びＣＸＣ  ＴＡＤのＨｉ−Ｃ及びＣｈＩＡ−ＰＥＴデータ両方について、より深いバイオインフォマティクス解析を行って、転写エンハンサーの大クラスターを同定した。ＣＸＣ  ＴＡＤの５’末端において、本発明者らは約８０ｋｂにわたり延在し、また炎症促進性遺伝子と広範な染色体接触を形成する「スーパーエンハンサー」推定領域を同定した（未公開データ）。一般的に、かかる領域は、数十ｋｂにわたりクロマチン制御因子により密に占有されている。したがって、この領域は、ｅＲＮＡクロマチンマーク、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７Ａｃに非常に富んでいる。最近公表された「ｅＲＮＡエンサイクロペディア」を用いて、本発明者らは、組織及び細胞特異的な方式でこの領域から転写された、いくつかのｅＲＮＡを同定した。ｓｍＦＩＳＨを用いて、本発明者らは、異なる初代細胞型において、これらｅＲＮＡの一部を検出することができたが、また異なる発現パターンも認めた（未公開データ）。
【０１１１】
メディエーター複合体との相互作用を通じて、ｅＲＮＡは、クロマチン組織の設計者であり、したがっておそらくはＴＡＤであるとの提案がなされている。本発明者らは、メディエーター１２（Ｍｅｄ１２）が枯渇すると、すべてのＣＸＣサイトカインの発現が抑制されることを見出した。本発明者らは、接触に関与するようにＣｈＩＡ−ＰＥＴによって確立されたスーパーエンハンサー領域内の様々な部位においてＤＳＢを誘発するために、ＴＡＬＥＮを設計した。１つの事例では、ＤＳＢは、ｅＲＮＡの部位で誘発された。ＤＳＢ又は破断部位は、ＤＳＢ修復プロセスの因子、Ｈ２Ａ．Ｘ  ｐＳｅｒ１３９の免疫蛍光染色により検出された。ＤＳＢの検出に並行して、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写活性を、イントロンＲＮＡ  ＦＩＳＨを用いて決定した。本発明者らは、ＣＸＣ  ＴＡＤ内のスーパーエンハンサーを撹乱することにより、すべての炎症促進性ＣＸＣ遺伝子がサイレンシングされることを認めた（ＩＬ８、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１、及びＣＸＣＬ３）。
【実施例３】
【０１１２】
多重遺伝子複合体内の染色体内又は染色体間の接触を破綻させると、相互作用性遺伝子の転写が抑制される（図５２を参照）
主要な炎症促進性サイトカインであるＴＮＦαは、ＮＦ−κＢ依存性多重遺伝子複合体内の同時制御された遺伝子の協調的なアセンブリを誘発する刺激剤である（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１２年）。１４番染色体上の約２２１Ｋｂの遺伝子、ＳＡＭＤ４Ａは、主要なヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において、ＴＮＦαにより急速にスイッチオンとなる。４Ｃ解析より、ＴＮＦα刺激前には、ＳＡＭＤ４Ａは、その他の遺伝子とほとんど相互作用しないことが明白である。
【０１１３】
ＴＮＦαによる活性化後、ＳＡＭＤ４Ａは、複数の同時制御された遺伝子と相互作用して、多重遺伝子複合体を形成する。同一染色体上に位置するが、約５０Ｍｂ下流の遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ２、及び１１番染色体上のＳＬＣ６Ａ５は、ＳＡＭＤ４Ａの２つの十分に特徴付けがなされた相互作用性パートナーである。３つすべての遺伝子は、同一の転写因子により活性化されるので、ｓｉＲＮＡアプローチは、ＳＡＭＤ４Ａ／ＴＮＦＡＩＰ２／ＳＬＣ６Ａ５多重遺伝子複合体におけるループ媒介型動力学を調べるのに利用することはできない。これは、転写制御因子のグローバルアブレーションがなくても、遺伝子ループトポロジーを個別に変化させることができる機能的アッセイを開発する必要性を露見させる。
【０１１４】
本発明者らは、ＴＡＬＥＮを用いて、十分に特徴付けがなされたＮＦ−κＢ制御型多重遺伝子複合体内の染色体接触に関与するように構築された遺伝子ループ内の部位を個別に撹乱した（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。
【０１１５】
ＴＡＬＥＮ単一細胞アッセイを用いて、本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループを撹乱しても、ＤＳＢの５’側の転写は変化しないことを認めた。しかし、その他の試験と一致して、本発明者らは、ＳＡＭＤ４ＡのＤＳＢについて、３’側の転写のサイレンシングを認めた。興味深いことに、遺伝子の遠位側の位置を占めるにもかかわらず、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写も有意に減少した（図５２（Ｉ））。更に、同時転写に対する効果は、階層的であり、ＴＮＦＡＩＰ２の破断は、ＳＬＣ６Ａ５の発現を変化させるが、ＳＡＭＤ４Ａに対して影響は有さず（図５２（ＩＩ））、一方、ＳＬＣ６Ａ５を撹乱しても、ＳＡＭＤ４Ａ又はＴＮＦＡＩＰ２の転写に影響は及ぼさない（図５２（ＩＩＩ））。これは、これら３遺伝子間において階層的なアセンブリが存在し、これによりＴＮＦＡＩＰ２は、ＳＡＭＤ４Ａに由来するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩを「収集する」が、次にこれらの遺伝子は、ＳＬＣ６Ａ５を多重遺伝子複合体に動員することができることを示唆する。
【実施例４】
【０１１６】
ＴＮＦＡＩＰ２に隣接するＣＴＣＦ部位を撹乱すると転写が抑制される
ＣＴＣＦは、遺伝子と隣接する頻度が高いコンセンサス部位と結合する。ＴＮＦＡＩＰ２は、１４番染色体上の約１１Ｋｂの遺伝子であり、これにＣＴＣＦコンセンサス結合部位が隣接する。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲを用いて、ＣＴＣＦコンセンサス結合部位内の部位を個別に撹乱した（図５３）。本発明者らは、ＤＳＢで３’ＣＴＣＦ結合部位を撹乱すると、ＴＮＦＡＩＰ２の発現がサイレンシングされることを認めた。
【０１１７】
考察
ここで、本発明者らは、染色体接触に関与する遺伝子ループ内の部位を破綻させると、多重遺伝子複合体内の相互作用性遺伝子の転写に有意な影響を及ぼすことを明らかにする。本発明者らは、クロマチンループ内で個別に撹乱できるようにする新規の単一細胞戦略を実行することにより、このレベルの遺伝子制御を明らかにした。この制御に関する最初のエビデンスは、ＴＮＦα誘発に対するこれら３遺伝子の階層的転写応答に関する本発明者らの単一細胞に基づく観察所見であった（図９）。非対称性の転写応答が明確であるにも関わらず、ＲＮＡ  ＦＩＳＨフォーカスの同時局在は、母集団のサブセットにのみ認められた（図５）。染色体接触と多重遺伝子複合の相互作用性メンバーにおける同時転写との間の機能的関連性が不透明のままである。しかし、ループ媒介型接触が、確かに同時転写の前提条件であるならば、ＲＮＡ  ＦＩＳＨの同時局在データは、母集団内の特定の細胞のみが、その染色体について正しい空間的配置を有し、かかる制御を可能にし得ることを示唆する（図５）。かかる多様な遺伝子発現は、哺乳動物染色体テリトリー内の高度に保存されたコンパートメントであるＴＡＤで生ずることが示唆される（Ｄｉｘｏｎら、２０１２年）。本発明者らは、ＴＡＤは、ロングレンジの相互作用を可能にするエリアに、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５の遺伝子を閉じ込めることにより、これらの強固な遺伝子の制御を保証し得ると推測する（図５０）。確かに、刺激を受けないＨＵＶＥＣにおけるＤＮＡの解析により、遺伝子の遠位側の位置を占めるにもかかわらず、一部のＨＵＶＥＣ母集団においては、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５のＤＮＡは、ＴＮＦαによる誘発前では近接していることが判明した（図８）。これらの「ジャックポット」細胞における染色体相互作用の富化は、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＮＦＡＩＰ２、及びＳＬＣ６Ａ５遺伝子の階層的発現に寄与する可能性がある。しかし、現在の生化学的技法及び画像化技術は、これら遺伝子間のループ媒介型同時転写は、このような「ジャックポット」細胞においてのみ生じ得るか、あるいは、もっと時間が経てば、これらの染色体相互作用は、母集団全体にわたりほとんどの細胞で生じ得るのか、それを調べるための時間的及び空間的な分解能を欠いている。
【０１１８】
染色体の転位は、染色体構造の自然な乱れであり、これは染色体テリトリー内のＤＮＡの空間的配置を変化させる。興味深いことに、染色体構造におけるこのような個々の乱れは、切断点近傍に位置する遺伝子に影響を及ぼすだけでなく、シス及びトランスでの遺伝子発現を変化させるのにも十分である。したがって、染色体のリポジショニング及びＤＮＡの異なるＴＡＤへの再配置を通じて、転位は染色体内及び染色体間相互作用を破綻させることにより、転写を変化させ得る。本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループの撹乱は、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の転写状態に対して直接的な作用を有することを明らかにすることができた（図２２）。更に、転写応答に対応して（図９）、同時転写に対する効果は階層的であり、ＴＮＦＡＩＰ２を撹乱するとＳＬＣ６Ａ５発現を変化させるが、ＳＡＭＤ４Ａに対する影響は全く有さない（図２６）。更に、ＳＬＣ６Ａ５を撹乱してもＳＡＭＤ４Ａ又はＴＮＦＡＩＰ２の転写のいずれにも影響を及ぼさない（図３５）。この観察所見は以下の疑問を提起する：転写に必要なすべての因子が存在したら、なぜこれらの相互作用性遺伝子の転写が生じないのか？考え得る説明として、多数の修復タンパク質をＤＳＢに動員すると、これらの遺伝子ループ間の正常なクロマチン接触に対する妨害として作用することが挙げられる。あるいは、相互作用性遺伝子間の接触は、なおも存在し得るが、修復機構により「架橋される」。この「架橋」は遺伝子ループ間の接触を維持するが、転写活性が生ずるにはなおも不適切である。留意すべき重要な点として、３Ｃ接触が存在しないにもかかわらず、これら３遺伝子座のＤＮＡは、未刺激のＨＵＶＥＣでは近接していると思われることが挙げられる（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１０年）。したがって、遺伝子ループの破断が、少なくとも回折限界型同時局在化ＤＮＡ  ＦＩＳＨフォーカス法により測定されるその他の相互作用性遺伝子間の接触を抑制することを確定的に示すのは非常に困難である。ＤＮＡ修復機構が、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩの他方の相互作用性遺伝子への進入を妨げていることが、別の考え得る説明として挙げられよう。しかし、これら３遺伝子間の転写では、一方向性の喪失が認められたが（図２０、２２、２６、及び３５）、そのような喪失はこの可能性を排除する。したがって、これらを総じて考慮すると、ほぼ間違いない結論として、ＤＳＢが、相互作用性遺伝子間の染色体接触を破綻させるように働いていることが挙げられる。修復実験から、配列に依存しない様式でインタクトなＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループに復元すれば、ＴＮＦＡＩＰ２及びＳＬＣ６Ａ５の同時転写、並びに同時局在を修復するのに十分であることが明らかである（図４９）。したがって、本発明者らは、染色体相互作用を破綻させることにより、トポロジーフレームワーク（遺伝子ループ及びＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩから構成される）はアセンブルすることができず、したがって転写を破綻させると推測する。全体として、これらのデータは、インタクトなクロマチンはループ媒介型同時転写の要件であるという強固なエビデンスを提供する。
【０１１９】
一方向エンハンサー−プロモーター相互作用は、タンパク質複合体をプロモーターに運ぶことにより、転写を増強するものと提案されている（Ｄｅｎｇら、２０１２年）。類似の方法で、染色体間相互作用を通じて、ＮＦ−ＫＢは、誘導性遺伝子のプロモーターに送達されることが明らかにされている。同様に、本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａは、ループ媒介型接触を通じて転写を「組織化」するＮＦ−κＢ多重遺伝子複合体の主要メンバーであるものと提案する。生細胞を対象とした最近公表されたデータから、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩは移動性であり、またクラスタリングは転写伸長に先行し、そして転写開始と関連することが判明している（Ｃｉｓｓｅら、２０１３年）。したがって、本発明者らは、ＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループは、スキャフォールドとして機能するトポロジープラットフォームを提供し、当該スキャフォールド上では、多くのＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ分子のフォーカスがクラスター化し、多重遺伝子複合体の下位メンバーの転写に関与し得るものと推測する。ＴＮＦＡＩＰ２又はＳＬＣ６Ａ５が染色体接触に関与できない場合、そのＰｏｌ  ＩＩのフォーカスにアクセスする能力は限定的である。相互作用性メンバー間の厳密な階層的関連性により、主要な遺伝子ループとの動的染色体接触が形成されるハンドオフ又は「コレクター」プロセスが更に示唆される（図５０）。これは、染色体接触を経たＴＮＦＡＩＰ２がインタクトなＳＡＭＤ４Ａ遺伝子ループからそのＰｏｌ  ＩＩを、次にインタクトなＴＮＦＡＩＰ２ループからＳＬＣ６Ａ５を「収集」する機構により生じ得る。したがって、これらのデータは、現在定義されているような仮想「転写因子工場」に対して反対も肯定もしないが、かかる工場は固定した構造ではなく、動的にアセンブルし得ることを示唆する。最近の試験より、プロモーター内の配列は、このようなＮＦｋＢ制御型遺伝子間の同時局在を促進し得ることが判明した（Ｐａｐａｎｔｏｎｉｓら、２０１３年）。したがって、代替的モデルは、３遺伝子に関する一般的な転写因子について異なる閾値の蓄積を促進するプロモーター内に配列特異的要素を含むと考えられよう。したがって、ＳＡＭＤ４Ａにより、十分な活性を有する核のサブコンパートメントが構築された場合にのみ、ＴＮＦＡＩＰ２、次にＳＬＣ６Ａ５が活性化され得る。
【０１２０】
本発明者らの観察所見は、三次元転写制御がどのように生ずるか、その一般的枠組みを一新させる。これらの染色体相互作用は稀であり、また確率論的であるものの（Ｎｏｏｒｄｅｒｍｅｅｒら、２０１１年）、本発明者らが行った単一細胞の観察は、多重遺伝子複合体に関与する遺伝子間の染色体接触は、相互作用性遺伝子の同時転写に有意な影響を与えることを強く示唆する。同時転写された遺伝子のかかるロングレンジ相互作用は、遺伝子ループ間の階層的な関連性を用いて、核空間内で転写を組織するように働く。主要メンバーの遺伝子ループが存在しなければ、多重遺伝子複合体の下位のメンバーは、ロングレンジ染色体接触に関与することができず、また転写に参加することもできない。最後に、ループ化は、多重遺伝子複合体内の遺伝子間の確率論的染色体接触を可能にすることから、本試験は、遺伝子ループ化は転写活性の基本的な要件であることを示すこれまでの研究に対する裏付けとなるエビデンスを提供する（Ｔａｎ−Ｗｏｎｇら、２０１２年）。重要なこととして、多重遺伝子複合体内のかかるクロマチンループ化（Ｌｉら、２０１２年）は、類似した階層的制御により支配されていると考えられる。ノックアウト、遺伝子欠損、染色体転位、又は転写因子のサイレンシングを通じて多重遺伝子複合体のメンバーを撹乱すると、これらはいずれもループ媒介型接触を破綻させるが、所与の多重遺伝子複合体のその他のメンバーにおいて、その転写の意図しない結果を不本意にも引き起こすおそれがある。
参考文献
【０１２１】
【表３】
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【図１】
0006535333.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006535333.tif 000014
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006535333.tif 000019
【図１１】
0006535333.tif 000020
【図１２】
0006535333.tif 000021
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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