(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンベロープ上に融合タンパク質を提示する、組換えバキュロウイルスであって、前記融合タンパク質が、
（ｉ）異種抗原；及び
（ｉｉ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域であって、少なくとも１００のアミノ酸残基長を有し、且つ前記ＧＰ６４タンパク質の中央塩基性領域内に位置する配列番号：２又は３のアミノ酸配列から成るＢ１２Ｄ５結合エピトープを欠く、バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域
を含み、
前記異種抗原が、前記組換えバキュロウイルスの前記エンベロープ上に提示される前記融合タンパク質のＮ末端に位置する、
組換えバキュロウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えバキュロウイルスであって、そのゲノムが、融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記融合タンパク質が、
（ａ）シグナルペプチド；
（ｂ）前記異種抗原；及び
（ｃ）前記バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質の前記Ｃ末端領域
を含み、
前記異種抗原が、前記シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
組換えバキュロウイルス。
【請求項３】
融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含むベクターであって、前記融合タンパク質が、
（ａ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置するシグナルペプチド；
（ｂ）異種抗原；及び
（ｃ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域であって、少なくとも１００のアミノ酸残基長を有し、且つ前記ＧＰ６４タンパク質の中央塩基性領域内に位置する配列番号：２又は３のアミノ酸配列から成るＢ１２Ｄ５結合エピトープを欠く、バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域
を含み、
前記異種抗原が、前記シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
ベクター。
【請求項４】
組換えバキュロウイルスである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
エンベロープ上に融合タンパク質を提示する、組換えバキュロウイルスであって、前記融合タンパク質が、
（ｉ）異種抗原；及び
（ｉｉ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域であって、少なくとも１００のアミノ酸残基長を有し、且つ配列番号：４のアミノ酸配列から成る前記ＧＰ６４タンパク質の中央塩基性領域内に位置するＢ１２Ｄ５結合エピトープを欠く、バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域
を含み、
前記異種抗原が、前記組換えバキュロウイルスの前記エンベロープ上に提示される前記融合タンパク質のＮ末端に位置する、
組換えバキュロウイルス。
【請求項６】
融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含むベクターであって、前記融合タンパク質が、
（ａ）前記融合タンパク質のＮ末端に位置するシグナルペプチド；
（ｂ）異種抗原；及び
（ｃ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域であって、少なくとも１００のアミノ酸残基長を有し、且つ配列番号：４のアミノ酸配列から成る前記ＧＰ６４タンパク質の中央塩基性領域内に位置するＢ１２Ｄ５結合エピトープを欠く、バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域
を含み、
前記異種抗原が、前記シグナルペプチドのＣ末端に位置する、
ベクター。
【請求項７】
前記ＧＰ６４タンパク質の前記Ｃ末端領域が、配列番号：１の３２７〜５１２のアミノ酸を含む、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項８】
前記ＧＰ６４タンパク質の前記Ｃ末端領域のＮ末端が、配列番号：１の２９２〜３２８のアミノ酸残基に位置する、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項９】
前記シグナルペプチドが、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１０】
請求項１に記載の組換えバキュロウイルスで形質導入された昆虫細胞。
【請求項１１】
前記抗原が、病原体タンパク質、がん細胞タンパク質、及び免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換えバキュロウイルスであって、
（ｉ）前記病原体が、ヒトパピローマウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス−１、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ブタサーコウイルス２、ブタコレラウイルス、口蹄疫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、ブタ水疱病ウイルス、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、感染性気管支炎、及び感染性嚢胞疾患ウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであり；
（ｉｉ）前記がんが、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がん、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つであり；
（ｉｉｉ）前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＴＬＡ−４からなる群より選択される少なくとも１つである、
組換えバキュロウイルス。
【請求項１３】
前記抗原が、ブタコレラウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ２、ブタ流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質、プログラム細胞死タンパク質１、及び腫瘍関連抗原からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１４】
前記抗原が、病原体タンパク質、がん細胞タンパク質、及び免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項３に記載のベクター。
【請求項１５】
抗原特異的免疫原性応答を、それを必要とする被験体において誘発することでの治療のための、医薬品の製造における、請求項３に記載のベクター又は請求項１に記載の組換えバキュロウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は一般に、組換えバキュロウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
バキュロウイルスは昆虫に感染し、ヒトには非病原性である。しかし、幅広い範囲のほ乳類及び鳥類細胞に形質導入することができる。バイオセーフティ、大きいクローニング能力、形質導入された細胞における低い細胞毒性及び非複製性、並びに操作及び生産の容易さのおかげで、バキュロウイルスは、抗ウイルス治療、がん治療、再生医療及びワクチンなどの、幅広い用途のための遺伝子送達ベクターとして、爆発的な人気を得ている。
【０００３】
米国特許第７，５２７，９６７号は、組換えバキュロウイルスであって、バキュロウイルスの表面上に融合異種ポリペプチドを提示しており、異種タンパク質又はウイルスに対する抗体又は免疫応答を、それを必要とする被験体において、生成する際に使用するための、組換えバキュロウイルスを開示する。その中の融合異種ポリペプチドは、異種抗原をバキュロウイルスＧＰ６４タンパク質の２２７〜５２９のカルボキシル末端アミノ酸と融合することによって作製される（図２Ｃ）。その中の構成は、Ｂ１２Ｄ５結合部位を含むＧＰ６４の細胞外ドメインのかなりの部分を含む。それが免疫化において使用されると、ＧＰ６４の細胞外ドメインは、免疫応答を誘発し、役に立たない抗ＧＰ６４  Ｂ１２Ｄ５抗体などの意図しない抗体を産生する可能性がある（Ｚｈｏｕら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００６；  ３５２（２）：  ４２７−４３７）。ＧＰ６４  Ｂ１２Ｄ５抗体は、目的の外来抗原ではなく、バキュロウイルス自体に対する中和抗体である。加えて、バキュロウイルスはブタに対してわずかに免疫原性である。
【０００４】
台湾特許第Ｉ３６８６５６号は、ＧＰ６４由来のシグナルペプチド、膜貫通ドメイン及び細胞質導入ドメインを使用して抗原を提示する方法を開示している。その中の構成は、膜貫通ドメイン及び細胞質導入ドメインのみを含み、ＧＰ６４の細胞外ドメインを含まない（図２Ｄ）。これは、外来抗原の発現が少なく、不活性化試薬に感受性である（Ｐｒｅｍａｎａｎｄら  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１３；  ８（２）：  ｅ５５５３６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それ故に、不活性化試薬に感受性でなく、免疫原性が向上したバキュロウイルスベクターに特に関連する、これまでに取り組まれていなかった上述の欠点及び不備に取り組む必要性が、本技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の概要
一つの態様において、本発明は、融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含むベクターに関するものであり、融合タンパク質が、（ａ）融合タンパク質のＮ末端に位置するシグナルペプチド；（ｂ）異種抗原；及び（ｃ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域であって、少なくとも１００のアミノ酸残基長を有し、且つＧＰ６４タンパク質の中央塩基性領域内に位置するＢ１２Ｄ５結合エピトープを欠く、バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域を含み、異種抗原が、シグナルペプチドとＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域との間に位置する。
【０００７】
本発明の一つの実施形態において、本発明のベクターが組換えバキュロウイルスである。
【０００８】
別の態様において、本発明は、エンベロープ上に融合タンパク質を提示する、組換えバキュロウイルスに関するものであり、融合タンパク質が、（ｉ）異種抗原；及び（ｉｉ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域であって、少なくとも１００のアミノ酸残基長を有し、且つＧＰ６４タンパク質の中央塩基性領域内に位置するＢ１２Ｄ５結合エピトープを欠く、バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域を含む。
【０００９】
本発明の一つの実施形態において、組換えバキュロウイルスのゲノムが、融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、融合タンパク質が、（ａ）シグナルペプチド；（ｂ）異種抗原；及び（ｃ）バキュロウイルスエンベロープＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域を含み、抗原が、シグナルペプチドとＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域との間に位置する。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、導入遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結される。
【００１１】
本発明の別の実施形態において、プロモーターがポリヘドリンである。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、ＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域が、１８６〜２２０のアミノ酸長を有する。
【００１３】
本発明の別の実施形態において、ＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域が、配列番号：２、３、又は４のアミノ酸配列を欠く。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、ＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域が、配列番号：１の２９３〜５１２のアミノ酸を含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、ＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域が、配列番号：１の３２７〜５１２のアミノ酸を含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、ＧＰ６４タンパク質のＣ末端領域が、配列番号：１の２９２〜３２８のアミノ酸残基のＮ末端を有する。
【００１７】
本発明の別の実施形態において、シグナルペプチドが、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のベクター又は組換えバキュロウイルスで形質導入された昆虫細胞又は細胞に関する。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、抗原が、病原体タンパク質、がん細胞タンパク質、及び免疫チェックポイントタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００２０】
病原体は、ヒトパピローマウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス−１、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ブタサーコウイルス２、ブタコレラウイルス、口蹄疫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、ブタ水疱病ウイルス、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、感染性気管支炎、感染性嚢胞疾患ウイルスからなる群より選択される少なくとも１つであってよい。がんは、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がん、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つであってよい。免疫チェックポイントは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＴＬＡ−４からなる群より選択される少なくとも１つであってよい。
【００２１】
本発明の別の実施形態において、抗原が、ブタコレラウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ２、ブタ流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質、プログラム細胞死タンパク質１、及び腫瘍関連抗原からなる群より選択される少なくとも１つである。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、抗原特異的免疫原性応答を、それを必要とする被験体において誘発するための方法に関するものであり、この方法は、治療的に有効量の本発明のベクター又は組換えバキュロウイルスを被験体に投与するステップを含む。本発明はまた、抗原特異的免疫原性応答を、それを必要とする被験体において誘発するための、医薬品の製造における、本発明に係るベクター又は組換えバキュロウイルスの使用に関する。代わりに、本発明は、抗原特異的免疫原性応答を、それを必要とする被験体において誘発する際に使用するための、本発明に係るベクター又は組換えバキュロウイルスに関する。
【００２３】
これらの態様及び他の態様は、以下の図面と併せて、以下の好ましい実施形態の説明から明らかとなるであろう。しかし、その変更及び改変が、本開示の新規の概念の精神及び範囲から逸脱することなく、好んで用いられる可能性がある。
【００２４】
添付の図面は、本発明の１又は複数の実施形態を、本発明の原理を説明するのに役立つ説明の記載とともに示している。可能な限り、一実施形態の同じ又は類似の要素を指すために、図面全体で同じ参照番号が使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の１つの実施形態に係るバキュロウイルスベクタープラットフォーム設計を示す略図である。
【００２６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ｇＢａｃ表面提示プラットフォームによって、外来抗原又は外来遺伝子を、ウイルスエンベロープ上に固定することができるだけでなく、昆虫細胞の膜画分中に発現させることもできる、ということを示す略図である。長方形はウイルスを表す。
【００２７】
【図２Ａ】図２Ａは、完全長ＧＰ６４タンパク質を示す略図である。ＧＰ６４  ｍｉｎｉｍｕｍ（ＧＰ６４３２７−４８２）、ＧＰ６４膜貫通ドメイン（ＴＭ）（ＧＰ６４４８３−５０５）；細胞質導入ドメイン（ＣＴＤ）（ＧＰ６４５０６−５１２）。
【００２８】
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の１つの実施形態に係るバキュロウイルスベクターを示す略図である。ＳＰ：シグナルペプチド；ＴＭ：膜貫通ドメイン、ＣＴＤ：細胞質導入ドメイン。
【００２９】
【図２Ｃ】図２Ｃは、アメリカ合衆国特許第７５２７９６７号に開示されるバキュロウイルスベクター設計を示す略図である。
【００３０】
【図２Ｄ】図２Ｄは、台湾特許第Ｉ３６８６５６号に開示されるバキュロウイルスベクター設計を示す略図である。
【００３１】
【図３】図３は、ワクチン接種後に、マウスにおいてバキュロウイルスベクターにより誘導された免疫応答（左のパネル）、及びマウスにおけるＥ２−ｇＢａｃサブユニットワクチンの中和血清（ＳＮ）力価測定（右のパネル）を示すグラフである。示される各ＥＬＩＳＡ値は、５匹のマウスからの平均値である。ｇＢａｃ群とＢａｃ群との間の差は、統計的に有意である（Ｐ≦０．０５）。使用したバキュロウイルスの株は、ＡｃＮＰＶであった。用語「ＳＮ」は、中和血清を表す。用語「Ｅ２−ｇＢａｃ」は、図２Ｂのベクター設計に係る「バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃ」を表す。用語「Ｅ２−ｇＢａｃ（不活性化）」は、バキュロウイルスが免疫化に使用される前に不活性化されたことを意味する。用語「Ｅ２−Ｂａｃ」は、図２Ｄのベクター設計に係る「バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−Ｂａｃ」を表す。
【００３２】
【図４】図４は、ワクチン接種後に、ブタにおいてバキュロウイルスベクターにより誘導された免疫応答を示すグラフである。示される各ＥＬＩＳＡ値は、３匹のブタからの平均値である。ｇＢａｃ群とｇｐ６４群との間の差は、統計的に有意である（Ｐ≦０．０５）。用語「Ｅ２−ｇｐ６４」は、図２Ｃのベクター設計に係る「バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇｐ６４」を表す。
【００３３】
【図５】図５は、バキュロウイルスベクターＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃによるワクチン接種後の、３匹の特定病原体除去（ＳＰＦ）ブタ中の、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗体価を示すグラフである。この３匹のＳＰＦブタを、それぞれ番号７３、７４及び７５とラベルした。用語「ＩＦＡ」は、免疫蛍光抗体を表す。この結果は、ワクチン接種されたブタ由来の血清が、ＰＥＤウイルスによって認識されることができたことを示した。
【００３４】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、Ｓｆ９細胞サンプルから、ＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃの抗原Ｅ２（図６Ａ）及びＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃの抗原Ｓ１（図６Ｂ）が検出されたことを示す、ウエスタンブロットの写真である。
【００３５】
【図６Ｃ−６Ｄ】図６Ｃ−６Ｄは、サンプル中のｈＰＤ−１−ｇＢａｃの抗原が、抗ｇｐ６４  ｍＡｂ（左のパネル）及びヒトＰＤ−１抗体（右のパネル）によってそれぞれ認識及び検出されたことを示す、ウエスタンブロットの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の実施例においてより具体的に説明されている。これらの実施例は、単なる例示であることが意図される。なぜなら、実施例における多数の改変及び変更が当業者には明らかであるためである。本発明の様々な実施形態をここで詳細に説明する。図面を参照すると、図面全体において、類似の番号は、類似の構成要素を示す。この詳細な説明において、及び以下に続く特許請求の範囲全体において使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形の参照を含む。また、この詳細な説明において、及び以下に続く特許請求の範囲全体において使用されるように、「ｉｎ」の意味は、文脈上他に明確に指示されない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。さらに、読者の便宜のために、タイトル又はサブタイトルが明細書中で使用され得る。このことは、本発明の範囲に影響を与えるものではない。加えて、この明細書において使用されるいくつかの用語が、以下により具体的に定義される。
【００３７】
＜定義＞
【００３８】
この明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、及び各用語が使用される特定の文脈において、本技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明を説明するために使用されるある特定の用語が、以下で、又は本明細書の他の場所で論じられて、本発明の詳細な説明を読む実務者に追加のガイダンスを提供する。便宜上、ある特定の用語が、例えばイタリック及び／又は引用符を使用してハイライトされ得る。ハイライトの使用は、用語の範囲及び意味に影響を与えない。用語の範囲及び意味は、それがハイライトされているか否かにかかわらず、同じ文脈において同じである。同じものを複数の方法で言うことができることが理解されるだろう。従って、本明細書で論じられる用語のうち任意の１又は複数について、別の言葉及び同義語を使用してよく、また、用語が本明細書において詳細に述べられる又は論じられるかどうかには特別な意味はない。ある特定の用語についての同義語が提供される。１又は複数の同義語の使用は、他の同義語の使用を除外するものではない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む、この明細書のどこかでの例の使用は、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲及び意味又は任意の例示される用語の範囲及び意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、この明細書で与えられる様々な実施形態に限定されない。
【００３９】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が統制する。
【００４０】
ベクターは、遺伝子材料を標的細胞に移入するために使用される、乗り物である。ウイルスベクターは、外来遺伝子材料を細胞内に送達するように改変されたウイルスである。
【００４１】
用語「遺伝子導入（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」、「形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）」、又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ウイルスベクターを介して別の細胞内に外来ＤＮＡが導入されるプロセスである。
【００４２】
シグナル配列又はシグナルペプチド（時折、シグナル配列、標的シグナル、局在化シグナル、局在化配列、移行ペプチド、リーダー配列又はリーダーペプチドと呼ばれる）は、分泌経路に行くことになる新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する、短鎖（５−３０アミノ酸長）ペプチドである。これらのタンパク質には、ある特定のオルガネラ（小胞体、ゴルジ体又はエンドソーム）の内側に存在するか、細胞から分泌されるか、又はほとんどの細胞膜に挿入されるタンパク質が含まれる。
【００４３】
用語「Ｂ１２Ｄ５」は、ｇｐ６４に対するモノクローナル抗体を指す。Ｂ１２Ｄ５は、ｇｐ６４の２７７−２８７にあるＫＫＲＰＰＴＷＲＨＮＶ（配列番号：３）、又はＧＰ６４の残基２７１〜２９２（配列番号：４）の中央領域内に位置するＨＲＶＫＫＲＰＰＴＷ（配列番号：２）の結合エピトープを有する。Ｚｈｏｕら（２００６）Ｓｕｐｒａ；Ｗｕら（２０１２）「Ａ  ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｐ６４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  Ｎｏｔ  ｔｏ  Ｓｆ９  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．  ８６  （１）  ４８４−４９１を参照されたい。
【００４４】
プログラム細胞死タンパク質１は、ＰＤ−１及びＣＤ２７９（表面抗原分類２７９）としても知られており、ヒトにおいてＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面レセプターであり、Ｔ細胞及びプロＢ細胞上で発現される。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と結合する。免疫チェックポイントとして機能するＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を防止することによって免疫システムをダウンレギュレートする際に、重要な役割を果たし、これは次に自己免疫を低減し自己寛容を促進する。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節の抗原特異的Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進し、同時に、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを低減するという二重のメカニズムによって達成される。ＰＤ−１をブロックする新規のクラスの薬物、ＰＤ−１阻害剤は、免疫システムを活性化して腫瘍を攻撃し、それ故にいくつかのタイプのがんを治療するのに使用されて様々に成功を収めている。
【００４５】
抗原は、病原体によって引き起こされる疾患の原因となる、又は病原体が感染した宿主において免疫学的応答を誘導することができる、病原性タンパク質、ポリペプチド又はペプチドであり得、又は腫瘍細胞で特異的に発現されるポリペプチドである腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。抗原は、病原体又はがん細胞から選択してよく、この病原体又はがん細胞としては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、インフルエンザウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタ水疱病ウイルス（ＳＶＤＶ）、ポックスウイルス、ロタウイルス、マイコプラズマ肺炎、ヘルペスウイルス、感染性気管支炎、又は感染性嚢胞疾患ウイルス、非小細胞肺がん、乳がん、メラノーマ、リンパ腫、結腸がん、肝細胞がん及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質（Ｅ７）、ＨＣＶコアタンパク質（ＨＣＶ  ｃｏｒｅ）、ＨＢＶ  Ｘタンパク質（ＨＢｘ）を、ワクチン開発のための抗原として選択した。抗原は、１又は複数の病原性タンパク質から選択される２以上の抗原の融合物に由来する融合抗原であってよい。例えば、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ６及びＯＲＦ５断片の融合抗原、又はＰＲＲＳＶ病原体及びＰＣＶ２病原体由来の抗原の融合物。
【００４６】
代わりに、抗原は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、及びＣＴＬＡ−４、などの阻害性免疫チェックポイントタンパク質であってよい。
【００４７】
用語「免疫チェックポイントタンパク質」及び「免疫チェックポイント」は交換可能である。免疫チェックポイントは、免疫システムの機能に影響を及ぼす。免疫チェックポイントは、刺激性又は阻害性である可能性がある。腫瘍は、これらのチェックポイントを使用して、免疫システムの攻撃からその身を守ることができる。チェックポイント療法は、阻害性チェックポイントをブロックし、免疫システム機能を回復することができる。調査中の１つのリガンド−レセプター相互作用は、膜貫通プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤＣＤ１、ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても知られる）と、そのリガンド、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）との間の相互作用である。細胞表面上のＰＤ−Ｌ１は、免疫細胞表面上のＰＤ１に結合し、免疫細胞活性を阻害する。ＰＤ−Ｌ１の機能の中には、Ｔ細胞活性に対する重要な調節性の役割がある。細胞表面上のＰＤ−Ｌ１の（がん媒介性）アップレギュレーションが、Ｔ細胞を阻害する可能性があると思われ、このＴ細胞は、このように阻害しなければ攻撃する可能性がある。ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に結合し、それ故に相互作用をブロックする抗体は、Ｔ細胞が腫瘍を攻撃するのを可能にし得る。イピリムマブは、ＦＤＡによって承認された最初のチェックポイント抗体である。これは、阻害性免疫チェックポイントＣＴＬＡ−４をブロックする。
【００４８】
用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、有効量の融合タンパク質を、それを必要とする被験体（この被験体は、がん又は感染を有するか、又はそのような疾患の症状又は素因を有する）に、疾患、その症状、又はその素因を治癒、軽減、緩和、矯正、改善、又は防止する目的で、投与することを指す。このような被験体は、任意の適切な診断方法の結果に基づいて、医療従事者によって同定されることができる。
【００４９】
用語「有効量」は、治療される被験体に治療的効果を与えるために必要とされる活性化合物の量を指す。当業者によって認識されるように、投与の経路、添加剤の使用、及び他の治療との併用の可能性に応じて、有効投与量は変化するだろう。
【実施例】
【００５０】
本発明の範囲を限定しようとするものではないが、本発明の実施形態に係る例示的な器具、装置、方法及びそれらに関連する結果を以下に示す。実施例において、タイトル又はサブタイトルが、読者の便宜のために使用される可能性があり、これは、決して本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。さらに、ある特定の理論が、本明細書において提案及び開示される。しかしながら、それらの理論が正しくても間違っていても、いかなる特定の理論又は行動のスキームにも関係なく、本発明が本発明にしたがって実施される限り、それらの理論は決して、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
例１
ベクターの構築及び組換えバキュロウイルス、ウイルス様粒子、及びタンパク質の生成
【００５２】
図１ＡはｇＢａｃプラットフォームを示す。外来遺伝子（例えば、最適化されたブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）Ｅ２又はブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイク遺伝子）は、ＰＣＲ合成によって得られ、次いでＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）クローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、制限酵素部位（例えば、ＳａｃＩ／ＮｏｔＩ）により、ｇＢａｃベクターにクローニングすることができる。ｇＢａｃベクターは、バキュロウイルス移入ベクターｐＢＡＣＰＡＫ８（商標）（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受託番号Ｕ０２４４６）に由来する。図１ＡのｇＢａｃ表面提示プラットフォームを使用して、外来抗原又は外来遺伝子を、ウイルスエンベロープ上に固定することができ、また、昆虫細胞の膜画分中に発現させることができる（図１Ｂ）。
【００５３】
図２Ａは完全長ＧＰ６４を示す。バキュロウイルスＧＰ６４エンベロープ融合タンパク質（ＧＰ６４  ＥＦＰ）は、一部の（全てではない）バキュロウイルスにおける主要なエンベロープ融合糖タンパク質である。これは、感染細胞及び出芽ビリオンの両方の表面上に、ホモ三量体として見出される。バキュロウイルスはエンドサイトーシスによってその宿主細胞に入り、次いでウイルスエンベロープとエンドソーム膜との低ｐＨ誘導型融合が起こり、これによりウイルスの細胞質への侵入が可能になる。この膜融合は、そしてまた感染細胞からのビリオンの効率的な出芽は、ＧＰ６４に依存する。
【００５４】
図２Ｂ−Ｄは、３種類のベクター、ｇＢａｃ（又はＲｅｂｅｒ−ｇＢａｃ）、抗原−ｇｐ６４（又は「ｇｐ６４」と短縮され、ＵＳ  ７５２７９６７に開示される）、及び抗原−Ｂａｃ（又は「Ｂａｃ」と短縮され、ＴＷ  Ｉ３６８６５６に開示される）の比較を示す。ｇＢａｃベクターは、シグナルペプチド（ＳＰ）及びＧＰ６４のアミノ酸３２７〜５１３のＣ末端領域を使用して構築された。ｇｐ６４ベクターは、ＳＰ及びＧＰ６４のアミノ酸２２７〜５１３のＣ末端領域を使用して構築された。Ｂａｃベクターは、昆虫シグナルペプチド（ＳＰ）、ＧＰ６４のＴＭ（膜貫通ドメイン）及びＣＴＤ（細胞質導入ドメイン）を含み、ＧＰ６４細胞外ドメインアミノ酸を含まない。「ＳＰ」の前にある三角形のシンボルは、ポリヘドリンプロモーターを表し、これは挿入遺伝子の開始コドンの−１部位に位置する。
【００５５】
フォワードプライマー及びリバースプライマー5'-GAGCTCATGGTAAGC-3'（配列番号：１９）及び5'-AGGCAGAATGCG-3'（配列番号：２０）をそれぞれ使用するＰＣＲによって、ＳＰをコードするＤＮＡ断片を生成及び増幅した。フォワードプライマー及びリバースプライマー5'-GCGTGTCTGCTCA-3'（配列番号：２１）及び5'-TTAATATTGTCTA-3'（配列番号：２２）をそれぞれ使用するＰＣＲによって、（ＧＰ６４のアミノ酸３２７〜アミノ酸５１３をコードする）ｇｐ６４遺伝子のＣ末端部分を生成及び増幅した。フォワードプライマー及びリバースプライマー5'-ATCAACAAGCTAA-3'（配列番号：２３）及び5'-TTAATATTGTCTA-3'（配列番号：２４）をそれぞれ使用するＰＣＲによって、（ＧＰ６４のアミノ酸２２７〜アミノ酸５１３をコードする）ｇｐ６４遺伝子のＣ末端部分を生成及び増幅した。上記の外来遺伝子をそれぞれ、ｐＢＡＣＰＡＫ８（商標）移入ベクターにクローニングした。
【００５６】
図２Ｂ（又は図１Ａ）のｇＢａｃプラットフォームを使用して、我々は、２種類のバキュロウイルスベクター：バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃ及びバキュロウイルスベクターＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃ（図２Ｂの設計）を生成した。前者はブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）エンベロープ糖タンパク質Ｅ２をコードする遺伝子を形質導入し、後者はブタ流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質をコードする遺伝子を形質導入する。
【００５７】
並列比較のために、我々はまた、図２Ｃ及び２Ｄのベクターを使用して、抗原ＣＳＦＶ  Ｅ２をコードする外来遺伝子を形質導入するための、２種類の別々のバキュロウイルスベクター：バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇｐ６４（図２Ｃの設計）、及びバキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−Ｂａｃ（図２Ｄの設計）を生成した。
【００５８】
ｇＢａｃ、ｇｐ６４、及びＢａｃベクター（それぞれ、図２Ｂ−Ｄの設計）中の融合遺伝子を配列決定して、それらの同一性を確認した。組換えＧＰ６４遺伝子を含み、移入ベクター骨格を含まない組換えバキュロウイルスを、相同性組換えによって生成した。この構築及び組換えのための方法は、本技術分野において周知である。これらの組換えウイルスを使用して、抗原を調製した。改変されたＧＰ６４遺伝子を、ＰＣＲによって、多角体プロモーター下のバキュロウイルス移入ベクターに挿入して、ｇＢａｃベクターを形成した。ｇＢａｃベクターは２つの相同性組換え部位を有するため、ｇＢａｃプラスミド及び野生型バキュロウイルスの同時導入の際に、野生型バキュロウイルスの元の多角体座がｇＢａｃ配列によって置き換えられる。
【００５９】
例２
タンパク質発現及び抗原の精製
【００６０】
組換えバキュロウイルスの増殖及び感染のために、Ｓｆ９細胞を使用した。バキュロウイルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ−９細胞系統で増殖させ、無血清培地中で２６℃で育てた。組換えバキュロウイルスを、５−１０のＭＯＩでＳｆ−９細胞を感染させることによって産生し、感染の３日後に採取した。バキュロウイルスを大きいスケールで産生するために、バイオリアクターにおいて細胞を培養し感染させてよい。感染細胞の培養上清からバキュロウイルス画分を単離した。適切なタンパク質カットオフ膜及び０．４５μｍ滅菌膜を使用して、接線流ろ過（ＴＦＦ）によって、バキュロウイルス粒子を回収した。
【００６１】
抗原の産生を試験するために、部分的に精製されたバキュロウイルス又は感染細胞溶解物を、８−１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ニトロセルロース膜に転写した。一次抗体であるマウス抗ｇｐ６４  ｍＡｂ（商業的に入手可能であり、１：５，０００希釈で使用される）によって、外来抗原を検出した。二次抗体は、アルカリホスファターゼがコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウスｍＡｂ（１：５，０００希釈）であった。タンパク質のバンドは、ＥＣＬ  ＰＬＵＳ（商標）ウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって可視化した。バキュロウイルス表面提示システムにおいて、外来抗原は最初に昆虫細胞膜上に発現することができ、次いで出芽バキュロウイルスが、細胞膜の一部を取り込んで、そのエンベロープを形成する。その結果、バキュロウイルス提示抗原を、感染細胞溶解物（膜画分）及びウイルス表面から採取することができる。
【００６２】
例３
組換えウイルスによる抗原の発現
【００６３】
ｇＢａｃワクチンで免疫化する前に、融合タンパク質ＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃ又はＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃがバキュロウイルスエンベロープ上に首尾よく提示されたかどうかを確認するために、遠心分離及びＴＦＦによって組換えバキュロウイルスを回収した。様々な異なる濃度のｐ．ｆ．ｕ／μｌで、ＰＢＳ中に、組換えバキュロウイルスを再懸濁した。バキュロウイルス粒子への組換えタンパク質の組み込みを、抗ｇｐ６４  ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するウエスタンブロッティングによって分析した。約８０ｋＤａの分子量で融合タンパク質ＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃを検出した。そして、１３０ｋＤａの分子量で融合タンパク質ＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃを検出した。
【００６４】
例４
ワクチン調製及び免疫化
【００６５】
ワクチン調製のために、抗原を提示する組換えバキュロウイルスを、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）アジュバント（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ２０６  ＶＧ、ＳＥＰＰＩＣ．）と混合した。国立実験動物センター、台湾、Ｒ．Ｏ．Ｃ．から購入した、４週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを、１グループあたり５匹のマウスで、４つのグループに分けた。１０７ｐ．ｆ．ｕ．の組換えバキュロウイルスを含む溶液２００μｌを用いて、０日目及び１４日目の２回、マウスを皮下で免疫化した（図３）。ＣＳＦＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２を含む、Ｅ２−ｇＢａｃ、Ｅ２−ｇｐ６４、及びＥ２−Ｂａｃ（図２Ｂ−Ｄ）のウイルスを不活性化し、ワクチンとして処方した。ネガティブコントロールとして、マウスに野生型バキュロウイルス（１０７ｐ．ｆ．ｕ．）又はＰＢＳを注射した。６週目に、尾静脈から血液サンプルを回収した。バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を使用して、バキュロウイルスを不活性化した。これは、０．１Ｍの２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）を、０．２ＮのＮａＯＨ中に、３７℃で１時間溶解することによって調製した。バキュロウイルスを不活性化するために、ウイルス培地に４ｍＭのＢＥＩを添加し、ウイルスを１６時間３７℃でインキュベートした。不活性化後、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）を、最終ＢＥＩ濃度の１０倍の最終濃度で培地に添加し、不活性化を停止した。
【００６６】
例５
組換えウイルスによって産生された抗原の免疫原性
【００６７】
免疫化の後、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）抗体を検出するために、ＩＤＥＸＸ  ＣＳＦＶ  Ａｂ試験キット（ＩＤＥＸＸ）を使用して、抗ＣＳＦＶ  Ｅ２抗体の存在について、マウスの血清を分析した。血清中のＣＳＦＶ  Ｅ２特異的抗体の程度を計算し、ブロッキングのパーセンテージが４０％を超える場合を陽性とした（図３）。この結果は、バキュロウイルスベクターが融合タンパク質ＣＳＦＶ  Ｅ２−Ｂａｃを提示したことを示す。図３は、バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃが、バキュロウイルスが不活性化されたか否かに関わらず、マウスにおいて、バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−Ｂａｃよりもはるかに高い抗ＣＳＦＶ  Ｅ２抗体価を誘導したことを示す。
【００６８】
我々はまた、ブタにおける免疫原性応答の誘導における、３種類のバキュロウイルスベクターの効果を比較した。３匹のＳＰＦ（特定病原体除去）ブタを、１０８ｐｆｕの組換えバキュロウイルスベクターＥ２−ｇＢａｃ、Ｅ２−ｇｐ６４、Ｅ２−Ｂａｃ、及びＰＢＳそれぞれで、筋肉内経路を介して２回（６週齢及び９週齢）免疫化した。免疫化の後、ＩＤＥＸＸ  ＣＳＦＶ  Ａｂ試験キット（ＩＤＥＸＸ）を使用して、ＣＳＦＶ  Ｅ２抗体の存在について、子ブタの血清を分析した。血清中のＣＳＦＶ  Ｅ２特異的中和抗体の程度を計算し、ブロッキングのパーセンテージが４３％を超えた場合を陽性且つ効率的であるとした。
【００６９】
図４に示されるように、Ｅ２−ｇＢａｃで免疫化されたブタは、ＣＳＦＶチャレンジを乗り切ることができた。これは、有能な中和抗体がブタにおいて誘導されたことを示す（ＳＮ力価≧１６、ＩＤＥＸＸブロッキング率≧４３％）。このことは、ｇＢａｃプラットフォームがワクチンプラットフォームであることを証明する。図４は、バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃが、ブタにおいて、バキュロウイルスベクターＣＳＦＶ  Ｅ２−Ｂａｃ及びＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇｐ６４よりもはるかに高い抗ＣＳＦＶ  Ｅ２抗体価を誘導したことを示す。この結果は、本発明のｇＢａｃ表面提示プラットフォームが、従来技術のバキュロウイルスベクターよりも強い免疫性を誘導することができることを示す。
【００７０】
我々はまた、ワクチン接種用途のために、ブタ流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質（ＰＥＤＶ  Ｓ１）を細胞に形質導入するためのバキュロウイルスベクターを生成した。我々は、免疫原性応答の誘導におけるその効果を試験した。簡単に言うと、３匹の９週齢のＳＰＦブタ（それぞれ、番号７３、７４及び７５とラベルした）を、１０８ｐｆｕの組換えバキュロウイルスベクターＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃ又はＰＢＳで、筋肉内経路を介して、２回、それぞれ免疫化した。免疫化の後、ＰＥＤウイルスのＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗ＰＥＤＶ抗体の存在について、（ワクチン接種後１〜４週間の）ブタの血清を分析した。図５は、バキュロウイルスベクターＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃが、この３匹のブタ全てにおいて、ブタ流行性下痢ウイルスに対する抗体価を誘導したことを示す。
【００７１】
図６Ａ−６Ｂは、ウエスタンブロットの写真であり、Ｓｆ９細胞サンプルから、抗原であるＣＳＦＶ  Ｅ２−ｇＢａｃ（図６Ａ）のＥ２及びＰＥＤＶ  Ｓ１−ｇＢａｃ（図６Ｂ）のＳ１が検出されたことを示す。細胞溶解物及び回収されたウイルスを、様々な異なる細胞数及びウイルス力価でロードした。我々はまた、バキュロウイルスベクターヒトプログラム細胞死タンパク質１（ｈＰＤ−１ｇＢａｃ）−ｇＢａｃ（ｈＰＤ−１ｇＢａｃ）を構築した。抗原の産生を試験するために、組換えバキュロウイルス又は感染細胞溶解物を、８−１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、ニトロセルロース膜に転写した。一次抗体であるマウス抗ｇｐ６４  ｍＡｂ（図６Ｃ）及び抗ＰＤＣＤ−１抗体（図６Ｄ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）によって、外来抗原を検出した。タンパク質のバンドは、ＥＣＬ  ＰＬＵＳ（商標）ウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって可視化した。図６Ｄは、バキュロウイルスがヒトＰＤ−１抗原をエンベロープ上に提示したこと、及び提示されたＰＤ−１抗原が市販の抗ＰＤＣＤ−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）によって認識されることができたことを示す。
【００７２】
要約すると、本発明のベクターは不活性化試薬に感受性でなく（図３）、より高い免疫原性を示す（図４）。表１は、ペプチド配列及び配列番号を示す。
【００７３】
【表１−１】
0006535133.tif 000002
【００７４】
【表１−２】
0006535133.tif 000003
【００７５】
【表１−３】
0006535133.tif 000004
【００７６】
【表１−４】
0006535133.tif 000005
【００７７】
【表１−５】
0006535133.tif 000006
【００７８】
*完全長GP64:GP64シグナルペプチド(SP)(GP641-20)は、下線が引かれイタリックで示されている。GP64 minimum(GP64327-482)は、下線が引かれており、イタリックではない。GP64膜貫通ドメイン(TM)(GP64483-505)は太字でのみ示されている。GP64細胞質導入ドメイン(CTD)(GP64506-512)はイタリックでのみ示されている。
【００７９】
E2-gBacタンパク質(SP-E2-GP64 mini-TM/CTD):GP64シグナルペプチド(SP)(GP641-20)は、下線が引かれイタリックで示されている。GP64 minimum(GP64327-482)は、下線が引かれており、イタリックではない。GP64膜貫通ドメイン(TM)(GP64483-505)は太字でのみ示されている。GP64細胞質導入ドメイン(CTD)(GP64506-512)はイタリックでのみ示されている。
【００８０】
S1-gBacタンパク質(SP-S1-GP64 mini-TM/CTD):GP64シグナルペプチド(SP)(GP641-20)は、下線が引かれイタリックで示されている。GP64 minimum(GP64327-482)は、下線が引かれており、イタリックではない。GP64膜貫通ドメイン(TM)(GP64483-505)は太字でのみ示されている。GP64細胞質導入ドメイン(CTD)(GP64506-512)はイタリックでのみ示されている。
【００８１】
hPD1-gBacタンパク質(SP-hPD1-GP64 mini-TM/CTD):GP64シグナルペプチド(SP)(GP641-20)は、下線が引かれイタリックで示されている。GP64 minimum(GP64327-482)は、下線が引かれており、イタリックではない。GP64膜貫通ドメイン(TM)(GP64483-505)は太字でのみ示されている。GP64細胞質導入ドメイン(CTD)(GP64506-512)はイタリックでのみ示されている。
【００８２】
本発明の実施形態を図示し説明してきたが、当業者であれば様々な改変及び改良を行うことができる。本発明は、図示された特定の形態に限定されないこと、及び本発明の精神及び範囲から逸脱しない全ての改変が、添付の特許請求の範囲に規定される範囲内にあることが意図される。企図される特定の用途に適するように様々な改変をして、本発明及び様々な実施形態を当業者が利用することができるように、本発明の原理及びその実際の適用を説明する目的で、実施形態及び実施例は選択及び記載された。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、別の実施形態が、本発明に関する分野の当業者には明らかになるであろう。したがって、本発明の範囲は、前述の説明及びそこに記載された例示的な実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００８３】
特許、特許出願及び様々な刊行物を含み得る、いくつかの参考文献が、本発明の説明において引用され、論じられている。そのような参考文献の引用及び／又は議論は、単に本発明の説明を明確にするために提供されたものであり、そのような参照が本明細書に記載された発明の「先行技術」であることを認めるものではない。本明細書で引用され論じられたすべての参考文献は、各参考文献が参照により個別に組み込まれているのと同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
0006535133.tif 000007
【図１Ｂ】
0006535133.tif 000008
【図２Ａ】
0006535133.tif 000009
【図２Ｂ】
0006535133.tif 000010
【図２Ｃ】
0006535133.tif 000011
【図２Ｄ】
0006535133.tif 000012
【図３】
0006535133.tif 000013
【図４】
0006535133.tif 000014
【図５】
0006535133.tif 000015
【図６Ａ−６Ｂ】
0006535133.tif 000016
【図６Ｃ−６Ｄ】
0006535133.tif 000017
【配列表】
0006535133000001.app