(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部を備え、
該情報処理部では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、
該粒子比率が、予め設定された閾値を超える場合には前記最大蛍光強度集団の蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
前記粒子比率が、前記閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなして蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
認識された前記強度中心を基準として、前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する、情報処理装置。
【請求項２】
前記サンプルは、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含む請求項１記載の情報処理装置。
【請求項３】
前記サンプルは、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含む請求項２記載の情報処理装置。
【請求項４】
前記サンプルは、少なくとも２種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含む請求項１記載の情報処理装置。
【請求項５】
前記閾値は、前記サンプル内の前記蛍光色素が有する前記蛍光強度の種類に基づき決定される請求項１から４のいずれか一項に記載の情報処理装置。
【請求項６】
前記情報処理部は、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識する請求項１から５のいずれか一項に記載の情報処理装置。
【請求項７】
前記クラスタリングは、ｋ平均法を用いて実施される請求項６記載の情報処理装置。
【請求項８】
前記情報処理部は、前記強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去する請求項１から７のいずれか一項に記載の情報処理装置。
【請求項９】
前記情報処理部は、前記中央絶対偏差の一定数倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去する請求項８記載の情報処理装置。
【請求項１０】
前記蛍光検出部の感度に関する情報は、蛍光強度と粒子数による直線度及び／又は蛍光検出感度である請求項１から９のいずれか一項に記載の情報処理装置。
【請求項１１】
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルに光を照射する光照射部と、
前記サンプルからの蛍光信号を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記検出部の感度に関
する情報を算出する情報処理部と、
を備え、
該情報処理部では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、
該粒子比率が、予め設定された閾値を超える場合には前記最大蛍光強度集団の蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
前記粒子比率が、前記閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなして蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
認識された前記強度中心を基準として、前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する、情報処理システム。
【請求項１２】
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理工程を行い、
該情報処理工程では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、
該粒子比率が、予め設定された閾値を超える場合には前記最大蛍光強度集団の蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
前記粒子比率が、前記閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなして蛍光強度範囲の強度中心を算出し、
認識された前記強度中心を基準として、前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する、情報処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、蛍光標識サンプルから得られる蛍光情報の処理を行う情報処理装置に関する。より詳しくは、蛍光標識サンプルから得られる蛍光情報に基づいて、蛍光検出の感度に関する情報を得る情報処理装置、情報処理システム及び情報処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分析手法の発展に伴い、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子を個々に測定したり、測定した微小粒子を解析し、分取したりする手法が開発されつつある。
【０００３】
このような微小粒子の解析又は分取の手法の代表的な一例として、フローサイトメトリーと呼ばれる分析手法の技術改良が急速に進んでいる。フローサイトメトリーとは、解析の対象となる微小粒子を流体中に整列させた状態で流し込み、該微小粒子にレーザー光等を照射することにより、各微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで微小粒子の解析、分取を行う分析手法である。
【０００４】
フローサイトメトリーなどに代表される微小粒子の解析では、分析対象となる微小粒子にレーザーなどの光を照射し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光を検出する光学的手法が多く用いられている。そして、検出された光学的情報をもとに、解析用コンピューターとソフトウェアでヒストグラムを抽出し、解析が行われる。
【０００５】
微小粒子の光学的解析においては、実際に被検対象となる微小粒子の光学的測定の前に、その精度等の検証や装置の動作確認・標準化等のために、クオリティーコントロール（ＱＣ：Quality Control）を行う場合がある。このクオリティーコントロールにおいては、通常、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数のビーズ（３ピークビーズ、６ピークビーズ、８ピークビーズ等）等が用いられている。
【０００６】
複数の蛍光色素間で測定を行う際に、蛍光補正を行う技術として、例えば、特許文献１には、フローサイトメーターによって得られた蛍光標識被験細胞の二次元相関図から当該蛍光標識被験細胞に関する蛍光集団の重心値を算出し、重心値に該当する蛍光標識被験細胞の蛍光値と所定の行列式を用いて蛍光値の補正計算を行うようなプログラムを開発することにより、複数の蛍光色素間や、複数のレーザー光を用いて蛍光の測定を行う際にも蛍光補正が可能であり、また、被験細胞の測定処理が終了した後でも試料の再調製を行うことなく蛍光補正を実施することが可能な技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−８３８９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微小粒子の光学的解析におけるクオリティーコントロールにおいて、複数のピークを有するビーズを使用する場合、複数ピークの自動認識が必要である。複数ピークの自動認識に誤認が生じると、クオリティーコントロールを正確に行うことができず、装置の標準化等にも過誤が生じる可能性がある。
【０００９】
そこで、本技術では、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号を自動認識する際に、その精度を高める技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、前記の目的を解決するために鋭意研究を行った結果、サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識することで、自動認識の精度向上に成功し、本技術を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本技術では、まず、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部を備える情報処理装置を提供する。
本技術で使用可能な前記サンプルとしては、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることができ、更に、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることもできる。
また、本技術で使用可能な前記サンプルとしては、少なくとも2種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含むサンプルを用いることも可能である。
前記情報処理部では、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出することもできる。
前記情報処理部では、前記最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなすこともできる。この際、前記閾値は、前記サンプル内の前記蛍光色素が有する前記蛍光強度の種類に基づき決定することもできる。
前記情報処理部では、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識することもできる。この場合、前記クラスタリングは、ｋ平均法を用いて実施することができる。
前記情報処理部では、前記強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去することもできる。この際、前記情報処理部は、前記中央絶対偏差の一定数倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去することもできる。
本技術に係る情報処理装置で算出可能な前記蛍光検出部の感度に関する情報としては、蛍光強度と粒子数による直線度及び／又は蛍光検出感度が挙げられる。
【００１２】
本技術では、次に、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルに光を照射する光照射部と、
前記サンプルからの蛍光信号を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部と、
を備える情報処理システムを提供する。
【００１３】
本技術では、更に、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理工程を行う情報処理方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本技術によれば、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号を自動認識する際に、その精度を向上させることができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本技術に係る情報処理装置1を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。
【図２】８ピークビーズから取得した蛍光強度について、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識した結果の一例を示す図面代用グラフである。
【図３】図１１に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、最大蛍光強度集団の誤認防止方法（閾値は６％に設定）を用いて、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識した結果を示す図面代用グラフである。
【図４】図１２に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識して、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識した結果を示す図面代用グラフである。
【図５】中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去する方法の一例を示す図面代用グラフである。
【図６】図１３に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、中央絶対偏差の７．４１３倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去した上で、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識した結果示す図面代用グラフである。
【図７】本技術に係る情報処理システム１０を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。
【図８】第１実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。
【図９】第２実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。
【図１０】第３実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。
【図１１】８ピークビーズから取得した蛍光強度について、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認された例を示す図面代用グラフである。
【図１２】８ピークビーズから取得した蛍光強度について、最大ピークを２つの集団として誤認した例を示す図面代用グラフである。
【図１３】８ピークビーズから取得した蛍光強度について、キャリーオーバーとビーズの最大ピークとが１つの集団として誤認された例を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．情報処理装置１
（１）情報処理部１１
２．情報処理システム１０
（１）情報処理部１１
（２）光照射部１２
（３）蛍光検出部１３
（４）分取部１４
３．情報処理方法
【００１７】
＜１．情報処理装置１＞
本技術に係る情報処理装置１は、微小粒子の光学的解析を行う際に用いることが可能な情報処理装置であって、少なくとも情報処理部１１を備える。本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能な微小粒子の光学的解析を行う装置の一例としては、フローサイトメーターが挙げられる。図１は、本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。
【００１８】
本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能なフローサイトメーターでは、フローセル（流路Ｐ）中で一列に整列させた微小粒子から得られる光学的情報を検出することにより、微小粒子の解析や分取を行うことができる。
【００１９】
流路Ｐは、フローサイトメーターに予め備えていてもよいが、市販の流路Ｐや流路Ｐが設けられた使い捨てのチップなどをフローサイトメーターに設置して解析又は分取を行うことも可能である。
【００２０】
流路Ｐの形態も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、図１に示すような２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成した流路Ｐに限らず、後述する図７に示すように、従来のフローサイトメーターで用いられているような流路Ｐも、フローサイトメーターに用いることができる。
【００２１】
また、前記流路Ｐの流路幅、流路深さ、流路断面形状も、層流を形成し得る形態であれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、フローサイトメーターに用いることが可能である。特に、流路幅１０μｍ以上１ｍｍ以下程度のマイクロ流路は、本技術に係る情報処理装置１を用いることが可能なフローサイトメーターにより好適に用いることができる。
【００２２】
（１）情報処理部１１
情報処理部１１では、蛍光検出部の感度に関する情報（以下、「感度情報」ともいう）の算出が行われる。感度情報の算出は、以下の手順で行われる。
【００２３】
［蛍光強度の取得］
まず、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得する。蛍光信号は、例えば、後述するフローサイトメーターの蛍光検出部において検出された光学的情報を、電気的信号（電圧パルス）に変換し、変換された電気的信号をアナログ−デジタル変換したものを用いることができる。
【００２４】
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルとしては、例えば、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることができ、更に、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含むサンプルを用いることもできる。より具体的には、例えば、３ピークビーズ、６ピークビーズ、８ピークビーズ等の複数のピークを有するビーズ等が挙げられる。
【００２５】
また、本技術で使用可能な前記サンプルとしては、少なくとも2種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含むサンプルを用いることも可能である。本技術で使用可能な蛍光色素としては、例えば、Cascade Blue、Pacific Blue、Fluorescein isothiocyanate(FITC)、Phycoerythrin(PE)、Propidium iodide(PI)、Texas red(TR)、Peridininchlorophyll protein(PerCP)、Allophycocyanin(APC)、4’,6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)、 Cy3、Cy5、Cy7等を、１種又は２種以上自由に組み合わせて用いることができる。
【００２６】
［強度範囲の認識］
次に、サンプルの蛍光強度割合に基づいて、取得した複数の蛍光強度にそれぞれに対する強度範囲を認識する。例えば、８ピークビーズを用いてフローサイトメーターのクオリティーコントロールを行う場合、８ピークのそれぞれの集団の強度範囲を認識する。８ピークビーズから取得した蛍光強度について、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識した結果の一例を図２に示す。図２の横軸は蛍光強度を、縦軸は粒子数を表す（以下同様）。
【００２７】
より具体的には、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定することができる。
【００２８】
前記クラスタリングは、例えば、ｋ平均法（k-means）等を用いて実施することができる。
【００２９】
強度範囲の認識が、図２のように正常に認識されれば、後述する感度情報の算出を精度よく行うことができるが、強度範囲の認識が正常に認識されないと、感度情報の算出にも誤算が生じ、装置の動作確認や標準化が適切に行えないという問題がある。例えば、サンプル中に８ピークビーズ以外に、前測定サンプルがキャリーオーバーとして残っていたり、異物の混入等があると、これらを１つのピークとして認識してしまう場合がある。例えば、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認された例を図１１に示す。また、１つの集団を２つ以上の集団として認識してしまう場合もある。例えば、最大ピークを２つの集団として誤認した例を図１２に示す。更に、キャリーオーバーとビーズのピークとを、１つのピークとして認識してしまう場合もある。例えば、キャリーオーバーとビーズの最大ピークとを１つの集団として誤認された例を図１３に示す。これらの誤認を防止する方法の例を以下に示す。なお、本技術において、下記の誤認防止方法（ａ）〜（ｃ）は、１種又は２種以上の自由に組み合わせて用いることができる。また、誤認防止方法（ａ）〜（ｃ）を２種以上組み合わせる場合は、その順番も自由に設定することができる。
【００３０】
（ａ）最大蛍光強度集団の誤認防止方法
図１１に示すように、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認されるのを防止するために、最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなす方法が挙げられる。
【００３１】
例えば、８ピークビーズの場合、１つの蛍光強度集団の粒子比率は、理論上、１００／８＝１２．５％である。ここで、クラスタリングにより最大蛍光強度集団として認識された粒子のサンプル全体に対する比率が、１２．５％を大きく下回る場合には、その集団は、キャリーオーバーである可能性が高い。そこで、予め、粒子比率の閾値を設定しておき、最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率が閾値以下の場合には、その集団は排除した上で、二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなす。そして、この最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出することで、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認されるのを防止することができる。
【００３２】
図１１に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、この最大蛍光強度集団の誤認防止方法（前記閾値は６％に設定）を用いて、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識し直した結果を図３に示す。
【００３３】
なお、前記閾値については、用いられる蛍光強度の種類に基づき設定することができる。例えば、８ピークビーズの場合の閾値としては、６％以下に設定するのが好ましい。また、６ピークビーズの場合の閾値としては、８％以下に設定するのが好ましい。更に、３ピークビーズの場合の閾値としては、１６％以下に設定するのが好ましい。
【００３４】
（ｂ）１つの集団を２つ以上の集団として誤認するのを防止する方法
それぞれの集団の強度範囲は、例えば、１つの集団の強度中心を算出し、これを基準として、サンプルの蛍光強度割合に基づき、他の集団の強度中心を算出することができる。例えば、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出することができる。
【００３５】
より具体的には、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識することができる。例えば、８ピークビーズの場合、それぞれの集団の蛍光強度割合は予め決まっているため、最大ピークの強度中心が定まれば、最大ピーク以外の強度中心は、前記割合から算出することができる。
【００３６】
このように、１つの集団の強度中心を算出し、これを基準として、サンプルの蛍光強度割合に基づき、他の集団の強度中心を算出することで、１つの集団を２つ以上の集団として誤認するのを防止することができる。
【００３７】
図１２に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識して、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識し直した結果を図４に示す。
【００３８】
（ｃ）キャリーオーバーと別ピークを１つのピークとして誤認するのを防止する方法
ピークが近いと、同一のピークとして誤認される場合がある。これを防止するために、中央絶対偏差（ＭＡＤ：median absolute deviation）を導入することができる。中央絶対偏差を用いることで、極端な値を排除することができる。より具体的には、強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去することで、キャリーオーバーと別ピークを１つのピークとして誤認するのを防止することができる。
【００３９】
例えば、図５に示すように、得られた蛍光強度について、評価軸、リファレンス軸で中央値（Median）と中央絶対偏差を求め下記の数式（１）を用いて楕円を作成する（図５Ｂ参照）。この楕円を逸脱した蛍光強度については、集団から除去する。このように、中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去することで、キャリーオーバーと別ピークを１つのピークとして誤認するのを防止することができる。
【００４０】
【数１】
0006623551.tif 000002
【００４１】
中央絶対偏差の何倍（数式中「ａ」）を範囲に設定するかについては、本技術の効果を損なわない範囲で自由に設定することができるが、例えば、中央絶対偏差の７．４１３倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去することができる。因みに、この７．４１３において、標準偏差σと中央絶対偏差MADの一般的な関係式σ≒1.4826×MADを用い、5σをばらつきの範囲と考え、求めた。
【００４２】
図１３に示す８ピークビーズから取得した蛍光強度について、中央絶対偏差の７．４１３倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去した上で、８ピークそれぞれの集団の強度範囲を認識し直した結果を図６に示す。
【００４３】
［感度情報の算出］
前記で認識された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲に基づいて、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する。本技術に係る情報処理装置１で算出可能な前記蛍光検出部の感度に関する情報としては、蛍光強度と粒子数による直線度（Linearity）や蛍光検出感度（ＭＥＳＦ：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes）が挙げられる。以下、８ピークビーズを用いた場合の各感度情報の算出方法の一例を説明する。
【００４４】
（ａ）定義
Dim1：最小ピーク
Dim2：下から2番目のピーク
Dim3：下から3番目のピーク
・
・
・
Dim8：最大ピーク
MFI : mean fluorescence intensity（平均蛍光シグナル強度の最高値と最低値を1及び0に換算した値）
ME2〜ME8 : Dim2〜Dim8のリファレンスMESF値
MESF：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes（一粒子当りの蛍光分子数）
【００４５】
Dim1〜Dim8の平均値：MFI1〜MFI8
MFI1〜MFI8のLog値：LogMFI1〜LogMFI8
Dim1〜Dim8のリファレンス値：ME1〜ME8
ME2〜ME8のLog値：LogME2〜LogME8
Dim1の計算されたMESF値：MESF
【００４６】
（ｂ）直線度（Linearity）
LogMFI2〜LogMFI8とLogME2〜LogME8を用いてR2（決定係数）を求め、直線度（Linearity）とする。直線度は、１００％に近いほど良い。
【００４７】
（ｃ）蛍光検出感度（ＭＥＳＦ：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes）
〔１〕LogMFI2〜LogMFI8とLogME2〜LogME8を用いて回帰直線を求め、その直線の傾きをa、切片をbとする。
〔２〕下記数式（２）を用いて、蛍光検出感度（ＭＥＳＦ）を求める。
【００４８】
【数２】
0006623551.tif 000003
【００４９】
蛍光検出感度（ＭＥＳＦ）は、Dim1のリファレンス値（通常は０）に近いほど良い。
【００５０】
＜２．情報処理システム１０＞
本技術に係る情報処理システム１０は、微小粒子の光学的解析を行う際に用いることが可能な情報処理システムであって、少なくとも情報処理部１１、光照射部１２、蛍光検出部１３を備える。また、必要に応じて、分取部１４等を備えることも可能である。本技術に係る情報処理システム１０を用いることが可能な微小粒子の光学的解析を行う装置の一例としては、フローサイトメーターが挙げられる。図７は、本技術に係る情報処理システム１０を用いることが可能なフローサイトメーターの一例を模式的に示す模式概念図である。
【００５１】
（１）情報処理部１１
情報処理部１１では、後述する蛍光検出部によって取得された蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記検出部の感度に関する情報を算出する。詳細は、前述した情報処理装置１の情報処理部１１と同一のため、ここでは説明を割愛する。
【００５２】
（２）光照射部１２
光照射部１２では、異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルへの光の照射が行われる。光照射部１２から照射される光の種類は特に限定されないが、粒子から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ等を挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー、半導体レーザー、または、半導体レーザーと波長変換光学素子を組み合わせた固体レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
【００５３】
（３）蛍光検出部１３
蛍光検出部１３では、サンプルからの蛍光信号の検出が行われる。本技術に用いることができる蛍光検出部１３は、サンプルからの蛍光信号の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器、などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
【００５４】
また、本技術に係る情報処理システム１０における蛍光検出部１３の設置箇所は、サンプルからの蛍光信号の検出ができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば図１及び図７に示すように、流路Ｐを挟んで光照射部１２と逆側に配置することが好ましい。蛍光検出部１３を、流路Ｐを挟んで光照射部１２と逆側に配置することで、光照射部１２や蛍光検出部１３をより自由な構成で配置させることができるからである。また例えば、蛍光は照射光の入射方向とは異なる方向にも放射されるため、流路Ｐを基準に光照射部１２と同じ側や９０度側面の側に蛍光検出部１３を配置してもかまわない。
【００５５】
（４）分取部１４
分取部１４では、前記蛍光検出部１３により検出された蛍光信号、又は、前記情報処理部１１で解析された粒子の解析結果に基づいて、粒子の分取が行われる。例えば、分取部１４では、光学的情報から解析された粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、流路Ｐの下流において、粒子の分取を行うことができる。
【００５６】
より具体的には、図７に示すように、例えば、所定の振動数で振動する振動素子１４１ａなどを用いて、流路Ｐの全体若しくは一部に振動を加えることで、流路Ｐの吐出口から液滴を発生させる。なお、この場合、用いる振動素子１４１ａは特に限定されず、公知のものを自由に選択して用いることができる。一例としては、ピエゾ振動素子などを挙げることができる。また、流路Ｐへの送液量、吐出口の径、振動素子の振動数などを調整することにより、液滴の大きさを調整し、試料を一定量ずつ含む液滴を発生させることができる。
【００５７】
次に、発生した液滴に、解析された粒子の大きさ、形態、内部構造等の解析結果に基づいて、プラスまたはマイナスの電荷を荷電する（図７中符号１４１ｂ参照）。そして、荷電された液滴は、電圧が印加された対向電極１４１ｃによって、その進路が所望の方向へ変更され、分取される。
【００５８】
＜３．情報処理方法＞
本技術に係る情報処理方法は、微小粒子の光学的解析を行う際に用いることが可能な情報処理方法であって、少なくとも情報処理工程を行う方法である。情報処理工程で行う具体的な情報処理方法は、前述した情報処理装置１の情報処理部１１が行う方法と同一である。以下、本技術に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れの一例について、図８〜１０を参照しながら説明する。なお、図８〜１０は、８ピークビーズを用いた場合である。
【００５９】
［第１実施形態］
図８は、第１実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。
【００６０】
（１）１次初期センター値の設定（Ｓ１）
まず、１次初期センター値を８点決める。各１次初期センター値は、任意の値に設定することができるが、例えば、レンジを８等分した点に設定することができる。
【００６１】
（２）クラスタリング（Ｓ２）
前記で設定した１次初期センター値各々について、クラスタリングを繰り返し行う。クラスタリングの方法としては、例えば、ｋ平均法（k-means）等を用いて実施することができる。
【００６２】
（３）クラスタリング回数及び結果の判定（Ｓ３）
クラスタリングを繰り返し、その回数が１００回に到達した場合、又は、クラスタリングの結果が前回と変化がない場合には、次の工程へと移行する。クラスタリングの結果が前回と変化しており、かつ、その回数が１００回に満たない場合には、再度、クラスタリングを繰り返す。なお、本実施形態では回数の基準を１００回としているが、クラスタリングの回数の上限については、目的に応じて自由に設定することができる。
【００６３】
（４）最大蛍光強度集団（最大ピーク）粒子比率の算出（Ｓ４）
次に、クラスタリングの結果、最大蛍光強度集団（最大ピーク）と認識された集団の粒子比率の算出を行う。算出した粒子比率が閾値以下の場合、下記Ｓ５へ移行する。算出した粒子比率が閾値を超える場合、下記Ｓ５をとばして、下記Ｓ６へ移行する。
【００６４】
（５）最大蛍光強度集団（最大ピーク）の変更（Ｓ５）
前記で算出した最大蛍光強度集団（最大ピーク）の粒子比率が閾値以下の場合、キャリーオーバーが最大ピークとして誤認されている可能性が高いため、最大から２番目を最大蛍光強度集団（最大ピーク）としてみなす。
【００６５】
（６）２次初期センター値の設定（Ｓ６）
Ｓ３又はＳ５で認識された最大蛍光強度集団（最大ピーク）と、リファレンス値を基に、他の７点の２次初期センター値を設定する。
【００６６】
（７）クラスタリング（Ｓ７）
前記で設定した２次初期センター値各々について、再度、クラスタリングを繰り返し行う。クラスタリングの方法としては、前記Ｓ２と同様に、例えば、ｋ平均法（k-means）等を用いて実施することができる。
【００６７】
（８）クラスタリング回数及び結果の判定（Ｓ８）
クラスタリングを繰り返し、その回数が１００回に到達した場合、又は、クラスタリングの結果が前回と変化がない場合には、次の工程へと移行する。クラスタリングの結果が前回と変化しており、かつ、その回数が１００回に満たない場合には、再度、クラスタリングを繰り返す。なお、本実施形態では回数の基準を１００回としているが、クラスタリングの回数の上限については、前記Ｓ３と同様に、目的に応じて自由に設定することができる。
【００６８】
（９）特異な蛍光強度を除去（Ｓ９）
それぞれのピークにおいて、評価軸（Ｘ軸）、リファレンス軸（Ｙ軸）で中央値（Median）と中央絶対偏差（ＭＡＤ：median absolute deviation）を求め、前記数式（１）を用いて楕円を作成する（図５Ｂ参照）。この楕円を逸脱した蛍光強度については、集団から除去する。
【００６９】
（１０）各集団の強度範囲を認識（Ｓ１０）
前記Ｓ９において、特異な蛍光強度を除去した上で、各集団の強度範囲を認識する。
【００７０】
（１１）感度情報の算出（Ｓ１１）
Ｓ１〜Ｓ１０までの工程を経て認識された各集団の強度範囲に基づいて、蛍光検出部の感度に関する情報（直線度（Linearity）や蛍光検出感度（ＭＥＳＦ：Molecules of Equivalent Soluble Fluorochromes）等）を算出する。
【００７１】
［第２実施形態］
図９は、第２実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。第２実施形態は、２回目のクラスタリング（Ｓ７・Ｓ８）後に、特異な蛍光強度を除去する工程（Ｓ９）を行わない例である。各工程の詳細は、前記第１実施形態と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００７２】
例えば、Ｓ５工程を行うことで、最大蛍光強度集団（最大ピーク）が正確に認識されており、特異な蛍光強度が最大ピークより高い部分にしか存在しない場合等には、Ｓ９工程を行わなくても、強度範囲について精度の高い認識が可能である。
【００７３】
なお、図示しないが、特異な蛍光強度を除去する工程（Ｓ９）は、１回目のクラスタリング（Ｓ２・Ｓ３）後に行い、初期段階で特異な蛍光強度を除去しておくことも可能である。
【００７４】
［第３実施形態］
図１０は、第３実施形態に係る情報処理方法を用いた情報処理の流れを示すフローチャートである。第３実施形態は、１回目のクラスタリング（Ｓ２・Ｓ３）後に、最大蛍光強度集団（最大ピーク）粒子比率の算出（Ｓ４）と最大蛍光強度集団（最大ピーク）の変更（Ｓ５）を行わない例である。各工程の詳細は、前記第１実施形態と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００７５】
例えば、前測定がなくキャリーオーバーが存在しないと考えられる場合や、キャリーオーバーが存在したとしても、キャリーオーバーから得られる蛍光強度が、最大ピークより高い領域にないと考えられる場合には、最大蛍光強度集団（最大ピーク）の誤認の発生確率は低いと考えられる。このような場合には、最大蛍光強度集団（最大ピーク）粒子比率の算出（Ｓ４）と最大蛍光強度集団（最大ピーク）の変更（Ｓ５）を行わなくても、強度範囲について精度の高い認識が可能である。
【００７６】
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部を備える情報処理装置。
（２）
前記サンプルは、少なくとも３種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含む（１）記載の情報処理装置。
（３）
前記サンプルは、少なくとも６種類以上の異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子を含む（２）記載の情報処理装置。
（４）
前記サンプルは、少なくとも2種類以上の異なる蛍光色素で標識された粒子を含む（１）から（３）のいずれかに記載の情報処理装置。
（５）
前記情報処理部は、複数の蛍光強度のうち最大の強度を有する最大蛍光強度集団の強度中心と前記サンプルの蛍光強度割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度集団の強度中心を算出する（１）から（４）のいずれかに記載の情報処理装置。
（６）
前記情報処理部は、前記最大蛍光強度集団のサンプル全体に対する粒子比率を算出し、閾値以下の場合には二番目に強度の高い蛍光強度集団を最大蛍光強度集団とみなす（５）記載の情報処理装置。
（７）
前記閾値は、前記サンプル内の前記蛍光色素が有する前記蛍光強度の種類に基づき決定される（６）記載の情報処理装置。
（８）
前記情報処理部は、検出された複数の蛍光強度に基づき前記複数の蛍光強度集団に対する第一の中心強度を算出し、前記第一の中心強度に基づきクラスタリングを繰り返し行うことで前記複数の蛍光強度に対する集団を特定し、前記複数の集団のうち最大の強度を有する最大蛍光強度と前記粒子の割合に基づき前記最大蛍光強度集団以外の蛍光強度範囲を認識する（５）から（７）のいずれかに記載の情報処理装置。
（９）
前記クラスタリングは、ｋ平均法を用いて実施される（８）記載の情報処理装置。
（１０）
前記情報処理部は、前記強度範囲それぞれに対して中心強度値及び中心粒子数を算出し、中心強度値及び中心粒子数より中央絶対偏差を求め、前記中央絶対偏差に基づき特異な蛍光強度を除去する（５）から（９）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１１）
前記情報処理部は、前記中央絶対偏差の一定数倍を範囲とし、該範囲に含まれない特異な蛍光強度を除去する（１０）記載の情報処理装置。
（１２）
前記蛍光検出部の感度に関する情報は、蛍光強度と粒子数による直線度及び／又は蛍光検出感度である（１）から（１１）のいずれかに記載の情報処理装置。
（１３）
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルに光を照射する光照射部と、
前記サンプルからの蛍光信号を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、前記検出部の感度に関する情報を算出する情報処理部と、
を備える情報処理システム。
（１４）
異なる蛍光強度を有する蛍光色素で標識された複数の粒子からなるサンプルからの蛍光信号に基づき複数の蛍光強度を取得し、前記サンプルの蛍光強度割合に基づいて検出された複数の蛍光強度それぞれに対する強度範囲を認識し、蛍光検出部の感度に関する情報を算出する情報処理工程を行う情報処理方法。
【符号の説明】
【００７７】
１  情報処理装置
１１  情報処理部
１０  情報処理システム
１２  光照射部
１３  蛍光検出部
１４  分取部
【図１】
0006623551.tif 000004
【図２】
0006623551.tif 000005
【図３】
0006623551.tif 000006
【図４】
0006623551.tif 000007
【図５】
0006623551.tif 000008
【図６】
0006623551.tif 000009
【図７】
0006623551.tif 000010
【図８】
0006623551.tif 000011
【図９】
0006623551.tif 000012
【図１０】
0006623551.tif 000013
【図１１】
0006623551.tif 000014
【図１２】
0006623551.tif 000015
【図１３】
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