(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
無菌かつ注射することができる組成物であって、500 000〜10 000 000ダルトンの範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量と、前記組成物の総重量に対して0.01〜5重量％の少なくとも有効量の、麻酔薬としてのメピバカイン塩酸塩とを含む、上記組成物。
【請求項２】
ヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸、非架橋ヒアルロン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に従う組成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸と非架橋ヒアルロン酸との混合物である、請求項１又は２に従う組成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量が、前記組成物の総重量に対して0.1〜5重量％のヒアルロン酸を含む、請求項１〜３のいずれか一つに従う組成物。
【請求項５】
ヒアルロン酸は、架橋されているとき、0.1〜20％の変性度を有する、請求項１〜４のいずれか一つに従う組成物。
【請求項６】
前記組成物はさらに、少なくともリドカインまたはその塩を含む、請求項１〜５のいずれか一つに従う組成物。
【請求項７】
前記組成物はさらに、少なくとも平衡塩溶液を含む、請求項１〜６のいずれか一つに従う組成物。
【請求項８】
前記平衡塩溶液が、リン酸塩緩衝液である、請求項１〜７のいずれか一つに従う組成物。
【請求項９】
前記組成物はさらに、アルファリポ酸；N-アセチル-L-システイン；還元グルタチオン；L-アルギニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン一水和物、グリシン、L-バリン、L-スレオニン、L-プロリンを包含するアミノ酸；ピリドキシン塩酸塩；脱水酢酸亜鉛；硫酸銅五水和物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項１〜８のいずれか一つに従う組成物。
【請求項１０】
（i）皮膚の表面外観、ii）加齢および/または外部の要因による皮膚の徴候、（iii）皮膚の損なわれた表面外観、（iv）皮膚の損なわれた粘弾性又は生体力学的特性を予防および/または処置するための、および/または（v）皮膚の体積欠陥の長期間持続する充填をするための請求項１〜９のいずれか一つに従う組成物。
【請求項１１】
歯肉の組織および輪郭、および骨組織における欠陥および欠損の部位を処置するための請求項１〜９のいずれか一つに従う組成物。
【請求項１２】
前記組成物が第１の組成物であり、メピバカイン塩酸塩の代わりにリドカインを含む以外は前記第１の組成物と同じ組成を有する無菌かつ注射することができる第２の組成物よりも低い、滅菌されていない形態と滅菌された形態との間の弾性係数G'の損失を示す、請求項１〜１１のいずれか一つに従う組成物。
【請求項１３】
無菌かつ注射することができる組成物の調製方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法：a）500 000〜10 000 000ダルトンの範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量の少なくとも1つのゲルを用意すること、ここで前記ヒアルロン酸は、架橋ヒアルロン酸の形、非架橋ヒアルロン酸の形またはそれらの混合物から選択される；b）前記ゲルへ、前記組成物の総重量に対して0.01〜5重量％の少なくとも有効量の、麻酔薬としてのメピバカイン塩酸塩を添加すること；そしてc）工程b）で得られた混合物を滅菌すること。
【請求項１４】
前記工程c）は、120〜140℃の範囲の温度で行われる、請求項１３に従う方法。
【請求項１５】
工程a)の架橋ヒアルロン酸は、無架橋ヒアルロン酸と、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）、1,4-ビス（2,3-エポキシプロポキシ）ブタン、1,4- ビスグリシジルオキシブタン、1,2-ビス（2,3-エポキシプロポキシ）エチレン、1-（2,3-エポキシプロピル）-2,3-エポキシシクロヘキサン、内在性ポリアミン、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの架橋剤の有効量との架橋から、前もって得られる、請求項１３又は１４に従う方法。
【請求項１６】
500 000〜10 000 000ダルトンの範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量を含む無菌かつ注射することができる第１の組成物において、滅菌することによって生ずる該組成物の弾性係数G'の損失を制限するためにメピバカイン又はその塩を用いる方法であって、前記第１の組成物は、メピバカイン又はその塩の代わりにリドカインを含む以外は前記第１の組成物と同じ組成を有する無菌かつ注射することができる第２の組成物よりも低い、滅菌されていない形態と滅菌された形態との間の弾性係数G'の損失を示す、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸またはその塩を含有する、無菌かつ注射可能な組成物、特に歯周組織を含む軟組織の増大および/または修復のための、および特に皮膚等のケラチン物質の欠損および欠陥の処置のための、軟組織充填組成物の分野に関する。本発明はそれに関連する方法にも導かれる。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の欠損、例えば傷痕または皺を修復するために、または皮膚、特に顔の皮膚の外観を改善する目的で対象の組織を増大するために、有用な組成物を開発する為の努力がなされてきた。そのような欠損等を修復するために使用される主な方法は、上記効果または望まれる増大に近い、皮膚の真皮層に充填組成物を注射することを含む。
【０００３】
ヒアルロン酸は細胞外マトリックス (ECM) の主な成分である。それは、主に皮膚中に多く見出される。それは、関節軟骨マトリックスの主な生理学的成分でもあり、特に関節液中に豊富である。
【０００４】
従って、酸または塩の形のヒアルロン酸は、生体組織工学への応用、および特に真皮組織または歯肉組織のような他の軟組織の増大のために、注射できる充填材料として多く使用される生体材料である。
【０００５】
ヒアルロン酸は、D-グルクロン酸およびN-アセチル-D-グルコサミンの反復単位から構成される直鎖の非硫酸化グリコサミノグリカンである(Tammi R., Agren UM., Tuhkanen AL., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry 29 (2): 1.-81, 1994)。
【０００６】
皮膚中では, ヒアルロン酸は、主に真皮線維芽細胞および表皮ケラチノサイトにより合成される(Tammi R., 上述)。負に荷電しているその残基を通して、 ヒアルロン酸は、皮膚の柔軟性を保つ水ポンプとして働く。
【０００７】
さらに、ECMは、組織のために構造的および調節的役割を伴う動的構造物である。ECMは、コラーゲンおよびエラスチン、およびまた基本物質(主に水、ミネラル、およびプロテオグリカン）から構成される。このマトリックスは、皮膚に、その膨張性および堅固な機械的特性、弾力性、および緊張を与える。
【０００８】
皮膚について、年齢とともに、ヒアルロン酸の量、およびその重合度が減少し、接続組織の中に保持される水の量の減少を招くことが知られている。
【０００９】
一方、 ECM成分は、マトリックスメタプロテアーゼすなわちＭＭＰと呼ばれるエンドペプチダーゼタイプの酵素により主に分解される。
【００１０】
最終的に、細胞防護の減少は、損傷、および酸化ストレスのような外部ストレスにより誘発される損傷および障害を増加させる。
【００１１】
皮膚は、欠損の出現およびケラチン物質、特に皮膚のシミを導く加齢プロセスに従う。
【００１２】
皺充填剤の分野において、主にヒアルロン酸から成るゲル（化学的架橋が生ずる場合）は、ライド（ride）により掘られたくぼみを埋めるために、経皮的に注射される。架橋は、真皮内の生成物の持続性を増大させる。ヒアルロン酸に基づくようなゲルは、必要に応じて架橋され、皮膚の皺の吸引の結果、充填剤の機械的効果により皺の減少を許す。
【００１３】
しかしながら、このようなゲルの注射は、しばしば患者の痛みの感覚を生成することが知られており、この感覚はさらに、ゲルが高粘性および／または高弾性であるほど悪化する。
【００１４】
今日では、この技術的な問題を克服するために、ヒアルロン酸に基づく主な充填剤は、患者の快適性を確保するために局所麻酔薬とともに利用される。この局所麻酔薬は、約0.3％の用量のリドカインだけである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかし、リドカインは、その血管拡張特性について、患者の身体によるあまりに急速な吸収および、時には明白な審美的な理由のために可能な限り回避されるべき血腫の発生頻度の悪化を示すという、不都合を呈することがあるかも知れないことが知られている。上記の問題点を克服するための解決策は、血管収縮薬、特にエピネフリンと共にリドカインを用いることであり得る(J. ndod. 2013 May; 39(5):597-9)。しかし、エピネフリンのような血管収縮剤の存在は、常に患者に対して不活性というわけではなくて、アレルギーを起こすかもしれない防腐剤の添加を、要求するかもしれない。
【００１６】
したがって、化学的に架橋を生じる場合、注射時に患者の痛みの感覚という上記の技術的課題を克服し、かつ何らかのアレルギーの問題、または血腫の発生頻度の悪化も含まない、主にヒアルロン酸から成るゲルを開発する必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第一の局面に従い、本発明は、
（a）ヒアルロン酸またはその塩の少なくとも有効量;および
（b）麻酔薬としてのメピバカインまたはその塩の少なくとも有効量を、
必要とする患者への注射により投与することを少なくとも含む方法に関する：
ここで、前記メピバカインはヒアルロン酸の前または同時に投与される。
【００１８】
具体的な局面に従い、本発明の方法は、軟組織の増大が意図されている。
【００１９】
標的組織は皮膚だけでなく、歯肉組織でもあり得る。
【００２０】
より特別には、本発明の方法は、（i）皮膚の表面外観の予防および/または処置のために、効率的に使用することができる。
【００２１】
このように、本発明の方法は、有利には、（ii）加齢および/または外部の要因、例えばストレス、大気汚染、タバコ、または紫外線（UV)への長期の暴露による皮膚の徴候、（iii）皮膚の損なわれた表面外観、（iv）皮膚の損なわれた粘弾性又は生体力学的特性を予防および/または治療するための、および/ または（v）皮膚の体積欠陥の長期間持続する充填をするため使用することができ得る。
【００２２】
さらに、本発明の方法は、また、有利には、インプラント、クラウン、ブリッジを含むがこれらに限定されない補綴のフィットおよび機能の増大のために、歯肉の組織および輪郭、および骨組織における欠陥および欠損の部位（例えば歯の欠損、加齢、歯周病および不調、歯周外傷、および歯のインプラントの後で生じる）を処置するために使用され得る。
【００２３】
他の実施形態に従い、本発明の方法はまた、軟骨再生のために有用である。
【００２４】
他の実施形態に従い、本発明の方法は、関節炎の処置として使用することができる。
【００２５】
最後に、ヒアルロン酸は、眼内に位置する天然の流体に似た、高粘度の透明な液体である。従って、それは既に、手術中に眼の流体量を維持するために提案されている。このように、本発明の方法はまた、白内障摘出術、眼内レンズ（IOL）挿入と取り外し、角膜手術、緑内障手術、外傷外科手術、眼の整形手術や筋肉の手術を含むほとんどの眼科の眼内手術に有用である。 
【００２６】
第二の局面に従い、本発明は、無菌および注射することができる組成物、より特別には有効量の少なくともヒアルロン酸またはその塩を含み、および有効量の麻酔薬としての少なくともメピバカインまたはその塩を含む、軟組織充填剤組成物に関する。
また、本発明は、無菌かつ注射することができる組成物であって、ヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量と、前記組成物の総重量に対して0.01〜5重量％の少なくとも有効量の、麻酔薬としてのメピバカイン塩酸塩とを含む、上記組成物に関する。
【００２７】
最後に、もう一つの局面に従い、本発明は、無菌および注射することができる組成物、より特別には軟組織充填剤組成物を調製する方法であって、少なくとも以下のステップを含む方法に関する：
a）ヒアルロン酸またはその塩の少なくとも一つのゲルを用意することであって、前記ヒアルロン酸が、架橋ヒアルロン酸の形、非架橋ヒアルロン酸の形、またはそれらの混合物から選択されること;
b)前記ヒアルロン酸のゲルへ、少なくともメピバカインまたはその塩を麻酔薬として添加すること;そして
c）工程b）で得られた混合物を滅菌すること。
また、本発明は、無菌および注射することができる組成物、より特別には軟組織充填剤組成物、を調製する方法であって、少なくとも以下の工程を含む方法に関する：
a）ヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量の少なくとも1つのゲルを用意すること、ここで前記ヒアルロン酸は、架橋ヒアルロン酸の形、非架橋ヒアルロン酸の形またはそれらの混合物から選択される；
b）前記ゲルへ、前記組成物の総重量に対して0.01〜5重量％の少なくとも有効量の、麻酔薬としてのメピバカイン塩酸塩を添加すること；そして
c）工程b）で得られた混合物を滅菌すること。
さらに本発明は、ヒアルロン酸又はその塩の少なくとも有効量を含む無菌かつ注射することができる第１の組成物において、滅菌することによって生ずる該組成物のG'の損失を制限するためにメピバカイン又はその塩を用いる方法であって、前記第１の組成物は、メピバカイン又はその塩の代わりにリドカインを含む以外は前記第１の組成物と同じ組成を有する無菌かつ注射することができる第２の組成物よりも低い、滅菌されていない形態と滅菌された形態との間のG'の損失を示す、上記方法に関する。
【発明を実施する為の形態】
【００２８】
第一の局面に従い、本発明は、
（a）ヒアルロン酸またはその塩の少なくとも有効量;および
（b）麻酔薬としてのメピバカインまたはその塩の少なくとも有効量を、
必要とする患者への注射により投与することを少なくとも含む方法：
ここで前記メピバカインはヒアルロン酸の前または同時に投与される。
【００２９】
本発明者らは、特にヒアルロン酸とリドカインの施与を考慮する皮膚の表面外観の予防および/または処置のために、また(i)歯肉組織および輪郭および骨組織中の部位の欠陥および欠損の部位の処置のために、（ii）眼科の眼内手術のために、（iii）軟骨の再生のために、および（iv）関節炎の処置においても、本発明に従う方法が、現在の方法に対し実行可能な代替案を構成することができることを実際に発見した。
【００３０】
第一に、リドカインとは対照的に、メピバカインはリドカインよりも顕著な血管拡張特性を示さない。 
【００３１】
さらに、リドカインがpKa7.9を有するのに対し、メピバカインは7.6のpKaを持っている。したがって、メピバカインはリドカインよりも低いpKaを持っており、それは脂質障壁を通る拡散性を向上させるより良い脂溶性を示す。そのため、実際にそのメピバカインがリドカインよりも、より急速に吸収されることができる事実によって、メピバカインは、それゆえに注射時に、痛みの感覚をより良く防ぐのに適切である。 
【００３２】
しかし、とりわけ、本発明者らは、予想外にも、本発明に従う充填剤組成物すなわち麻酔薬としてメピバカインを含む組成物が、ヒアルロン酸のゲルの安定性に重大な影響を与えることなく滅菌されることができることを観察した。
【００３３】
ヒアルロン酸ゲルが特別には、それらの滅菌のために必要とされるような熱処理に敏感であり、この低安定性は、麻酔薬のようなさらなる物質の存在によって増加されうることが確かに知られている。意外なことに、この望ましくない現象は、以下の実施例1及び2に示すように、リドカインに比較して、メピバカインで有意に低下される。さらに、本発明者らは、本発明に従う組成物が、本明細書で実施例3に示すように、時間的安定性の面で要求を満たすことを示した。
【００３４】
本発明者らに従うと、ヒアルロン酸を含む軟組織充填剤組成物の内で、上記有利な効果の出現は、知られていなかった。
【００３５】
好ましくは、ヒアルロン酸またはその塩は、メピバカインまたはその塩と同時に投与される。
【００３６】
好ましくは、注射による投与は、経上皮および/または経真皮および/または皮下注射である。しかし、それはまた歯肉、関節、眼内流路によっても投与することができる。
ヒアルロン酸
【化１】
0006543625.tif 000002
【００３７】
上記のように、ヒアルロン酸（ヒアルロナンまたはヒアルロネートとも呼ばれる）は、D-グルクロン酸とN-アセチル-D-グルコサミンの繰り返し単位から構成される直鎖の非硫酸化グリコサミノグリカンである(Tammi R., Agren UM., Tuhkanen AL., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry 29 (2): 1. -81, 1994)。
【００３８】
皮膚では、ヒアルロン酸は主に、真皮線維芽細胞および上皮ケラチノサイトによって合成される（Tammi R.は、上記に引用）。負の電荷を帯びるその残基を介し、ヒアルロン酸は、皮膚の弾力性を維持するための水ポンプとして働く。
【００３９】
上記のように、本発明は、ヒアルロン酸そのものだけでなく、その塩の実施も考慮する。
【００４０】
したがって、本発明に従うヒアルロン酸は、より特別には、生理学的に許容される塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銀塩およびそれらの混合物、好ましくはナトリウム塩から選択された塩であってもよい。
【００４１】
好ましくは、本発明に従うヒアルロン酸は、高い平均分子量、好ましくは50000から10000000ダルトン、好ましくは500000から4000000ダルトンの範囲を持っている。
【００４２】
一つの特別に好ましいヒアルロン酸の塩は、ヒアルロン酸ナトリウム（NaHA）である。
【００４３】
上述したように、ヒアルロン酸は、有効量で注射によって投与される。
【００４４】
ヒアルロン酸の「有効量」は、所望の技術効果を得るために、特に皮膚の表面外観に目に見える効果を持つのに適切な量である。特に、ヒアルロン酸の有効量は、皮膚の体積欠損の良好な充填、特に皺の充填のための、ヒアルロン酸の適切な量である。
【００４５】
ヒアルロン酸量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。
【００４６】
有利には、本発明に従う方法中のヒアルロン酸またはその塩は、溶液中に存在する。
【００４７】
この点では、ヒアルロン酸の有効量は、ヒアルロン酸またはその塩を含む前記溶液の総重量に対して0.1〜5重量％、好ましくは1〜3重量％の範囲であってもよい。
【００４８】
特別な実施形態に従い、ヒアルロン酸は、非架橋型で存在することができる。
【００４９】
本発明の目的ために、語「非架橋」または「無架橋」は、本発明の文脈の中で、架橋されていないかまたはわずかに架橋されているヒアルロン酸のゲルを意味すると理解され、すなわち1ヘルツの動的なレオロジー条件で測定された位相シフト角δが、1 Paより上のストレスにさらされた時、40°よりも大きいゲルを意味する。
【００５０】
別の特別な実施形態に従い、ヒアルロン酸は架橋型で存在することができる。
【００５１】
他の特別な実施形態に従い、ヒアルロン酸は、架橋型とおよび無架橋型で存在することができる。
【００５２】
これに関し、「架橋ヒアルロン酸/無架橋ヒアルロン酸」の重量比は、好ましくは1より大きい。
【００５３】
特別な実施形態に従い、ヒアルロン酸を含んでいて、投与されることが意図されている溶液は以下を含んでいてもよい： 
- 50％〜99重量％、より好ましくは70％〜95重量％の、架橋ゲルの形で存在するヒアルロン酸、
-1％〜50重量％、好ましくは5％〜30重量％の遊離の形で存在するヒアルロン酸、またはそれらの生理学的に許容される塩、
ここで、架橋ヒアルロン酸ゲル重量と遊離のヒアルロン酸重量の比が、1：1〜1：0.02である。
【００５４】
ヒアルロン酸が架橋されているとき、前記架橋ヒアルロン酸は、好ましくは0.1〜20％、好ましくは0.4〜10％の範囲の変性度を持つ。 
【００５５】
本発明の意味において、「変性度」とは、ヒアルロン酸に結合された架橋剤のモル数と、前記架橋ヒアルロン酸ゲルを形成するヒアルロン酸のモル数の比を意味する。この値は、架橋ゲルの1D1HのNMR分析により測定することができる。
【００５６】
「ヒアルロン酸のモル数」とは、ヒアルロン酸の二糖単位の繰り返しモル数を意味し、ここで二糖単位は、交互するβ-1,4およびβ-1,3グリコシド結合によって互いに結合されたD-グルクロン酸およびD-N-アセチルグルコサミンから構成されている。
【００５７】
本明細書において後に開示されるように、この変性度は顕著に理解されるであろう。
【００５８】
このように、ヒアルロン酸の変性度の特徴付けは、NMR（400メガヘルツ（1H）で動作する分光計Bruker Avance1）によるスペクトル分析法によって行われる。
【００５９】
0006543625.tif 000003
0006543625.tif 000004
架橋剤
【００６０】
語「架橋剤」は、ヒアルロン酸の様々な鎖の間に架橋を誘導することができる任意の化合物を意味すると理解される。
【００６１】
この架橋剤の選択は、明らかに当業者の能力の範囲内にある。
【００６２】
本発明に従う架橋剤は二官能性又は多官能性エポキシ架橋剤から選択されるだけでなく、例えばヘキサメチレンジアミン（HMDA）、または内在性ポリアミンのようなポリアミンでもよい。
【００６３】
本発明の意味の範囲内の語「内在性ポリアミン」とは、生物、特にヒトの生体中に天然に存在するポリアミンを意味する。内在性ポリアミンの代表として、真核動物において言及されるもの、特に、たとえばプトレシン（すなわち1,4-ジアミノブタン）、スペルミジン（すなわち1,8-ジアミノ-5- アサオクタン）およびスペルミン（1,12- ジアミノ-5,9- ジアザドデカン）、好ましくはスペルミンを挙げることができる。
【００６４】
より特別には、本発明に従う架橋剤は、好ましくは1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）、1,4-ビス（2,3-エポキシプロポキシ）ブタン、1,4- ビスグリシジルオキシブタン、1,2-ビス（2,3-エポキシプロポキシ）エチレンおよび1-（2,3-エポキシプロピル）-2,3-エポキシシクロヘキサン、内在性ポリアミン、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。
【００６５】
好ましくは、本発明にしたがう架橋剤は、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）である。
【００６６】
架橋剤がポリアミンであり、より特別には内在性ポリアミンである、特別な実施形態において、ヒアルロン酸とのカップリング反応は、少なくとも1つの活性化剤の存在下で行うことができ、少なくとも一つの付加的なカップリングが伴う場合がある。
【００６７】
この点で、活性化剤は、水溶性カルボジイミド、例えば1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）、1-エチル-3-（3-25トリメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ETC）、1-シクロヘキシル-3-（2-モルホリノエチル）カルボジイミド（CMC）およびそれらの塩、およびその混合物から選択することができ、好ましくはEDCで表される。
【００６８】
カップリング付加物について、それが存在する場合、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアゾール（HOOBt）、1-ヒドロキシ-7-7アザベンゾトリアゾール（HAt）、及びN-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホNHS）およびそれらの混合物から選択することができ、好ましくはHOBtで表される。
【００６９】
架橋剤は有効量で供給される。
【００７０】
架橋剤の「有効量」は、適度なヒアルロン酸架橋を得るために適切な量である。 
【００７１】
架橋剤の量の調整は、当業者の能力の範囲内である。 
【００７２】
有利には、架橋剤の有効量は、ヒアルロン酸またはその塩の総重量に対し、0.05〜15重量％の範囲とすることができる。 
【００７３】
有利には、ヒアルロン酸が架橋されているときに、およびときに架橋剤がBDDEであるときに、nBDDE / nヒアルロン酸のモル比は0.01〜0.50、好ましくは0.04〜0.25の範囲であり得る。
麻酔薬
【００７４】
本発明に従う麻酔薬は、注射中および/またはそれに続いて患者が経験する痛感を軽減または除去するために、特別な優位性を持っている。
【００７５】
さらに、本発明に従う麻酔薬は、本発明に従う組成物中で使用される他の化合物、特にアルロン酸との不適合性のリスクを高めない化合物の中から選択される。
【００７６】
上記のように、本発明に従い、麻酔薬は、メピバカイン、またはその塩である。
【００７７】
メピバカインは、式（I）のアミノアミド族の局所麻酔薬である：
【化２】
0006543625.tif 000005
【００７８】
メピバカインは、カルボカイン（商標）の名称でクック・ウェイト社により公知のように販売されている。
【００７９】
メピバカインは、良好な安定性を有する分子である。その主な分解生成物は、2,6-ジメチルアニリンである。メピバカインは、キラル中心（不斉炭素）を有する分子である。従って、RおよびS鏡像異性体が存在する。以下の実施例では、それは、メピバカインの二つの形のラセミ混合物であると考えられる。
【００８０】
好ましくは、メピバカインは、塩の状態であり、より特別には、メピバカインの塩はメピバカイン塩酸塩である。
【００８１】
上記のように、メピバカインまたはその塩は、その有効量で注射によって投与される。
【００８２】
メピバカインまたはその塩の「有効量」は、注射の間および/またはそれに続いて患者によって経験する痛感を効果的に低減または排除するための適切な量である。
【００８３】
メピバカインまたはその塩の量の調整は、当業者の能力の範囲内にある。 
【００８４】
有利には、本発明に従う方法においてメピバカインまたはその塩は、溶液中に存在する。
【００８５】
この点で、メピバカインまたはその塩の有効量は、前記メピバカインまたはその塩を含む溶液の重量に対して、0.05〜3重量％の範囲であってもよい。
【００８６】
メピバカインに関連する場合、メピバカインとは異なる少なくとも一つの追加の麻酔薬またはその塩の投与を該投与は含みうる。
【００８７】
このさらなる麻酔薬は、特別には、アンブカイン、アモラノン、アミロカイン、ベノキシネート、ベンゾカイン、ベトキシカイン、ビフェナミン、ブピバカイン、ブタカイン、ブタンベン、ブタニリカイン、ブテタミン、ブトキシカイン、カルチカイン、クロロプロカイン、コカエチレン、コカイン、シクロメチカイン、ジブカイン、ジメチソキン、ジメトカイン、ジペロドン、ジシクロニン、エクゴニジン、エクゴニン、塩化エチル、エチドカイン、ベータオイカイン、ユープロシン、フェナルコミン、ホルモカイン、ヘキシルカイン、ヒドロキシテトラカイン、イソブチルパラアミノ安息香酸、ロイシノカインメシレート、レボキサドロール、リドカイン、メプリルカイン、メタブトキシカイン、塩化メチル、ミルテカイン、ナエパイン、オクタカイン、オルトカイン、オキセサゼイン、パレトキシカイン、フェナカイン、フェノール、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモキシン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロパラカイン、プロピポカイン、プロポキシカイン、シュードコカイン、ピロカイン、ロピバカイン、サリチルアルコール、テトラカイン、トリカイン、トリメカイン、ゾラミン、またはそれらの塩、及びそれらの混合物から選択されても良い。
【００８８】
好ましくは、この追加の麻酔薬はリドカインであるか、またはその塩である。
【００８９】
第一の実施形態に従い、追加の酔麻薬は、ヒアルロン酸およびメピバカインまたはその塩の前に単独で投与される。 
【００９０】
第二の実施形態に従い、追加の麻酔薬は、ヒアルロン酸またはその塩の前に、メピバカインまたはその塩と一緒に投与される。 
【００９１】
第三の実施形態に従い、追加の麻酔薬は、メピバカインまたはその塩およびヒアルロン酸またはその塩と一緒に投与される。 
【００９２】
両方の麻酔薬が同じ組成物に含有される特定の実施形態では、それらは「メピバカイン/リドカイン」比1：1、好ましくは比1:0.1でその中に存在することができる。
平衡塩溶液
【００９３】
特別な実施形態に従い、本発明に従う方法は、（c）少なくとも平衡塩溶液を前記ヒアルロン酸および/またはメピバカインと、好ましくメピバカインと同時に、前記患者に注射によって投与する工程を少なくともさらに含むことができる。
【００９４】
この平衡塩溶液の使用は、注射の痛みをさらに減らすことができる点で特に興味深い(see Farley J.S. et al., Regional Anesthesia A., 1994, Vol. 19: 48) 。
【００９５】
好ましくは、前記平衡塩溶液は、リン酸塩緩衝液であり、より特別にはリン酸塩緩衝液、および特別にはKH2PO4/K2HPO4塩緩衝液である。
【００９６】
特別な実施形態に従い、前記平衡塩溶液は、アルファリポ酸、N-アセチル-L-システイン、還元グルタチオン;アミノ酸,例えば、L-アルギニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン一水和物、グリシン、L-バリン、L-スレオニン、L-プロリン;ピリドキシン塩酸塩; 脱水亜鉛アセテート；硫酸銅五水和物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことができる。
本発明に従う組成物
【００９７】
上記のように、本発明は、また、少なくともヒアルロン酸またはその塩の有効量を含み、および有効量の少なくともメピバカインまたはその塩を麻酔薬として含む、無菌および注射できる組成物、特別には、柔軟充填剤組成物に関する。
【００９８】
本発明の意味での「無菌」とは、例えば上記のように、特に皮膚中にまたは皮膚を通しての投与経路の為の安全性の要求を、本発明に従う組成物中の、考慮される化合物に保証できる環境を意味しており、本発明に従う組成物が、宿主生物における望ましくない副反応を開始させることができる何らかの汚染物質を欠いていることが不可欠である。
【００９９】
ヒアルロン酸、架橋剤、および麻酔薬は、例えば上記である。
【０１００】
ヒアルロン酸について、本発明に従う組成物は、組成物の総重量に対してヒアルロン酸0.1〜5重量％を含んでよく、好ましくは1〜3重量％含んでよい。
【０１０１】
特別な実施形態に従い、上記のように、ヒアルロン酸は、架橋された形および無架橋の形で存在してもよい。
【０１０２】
この点で、「架橋ヒアルロン酸/無架橋ヒアルロン酸」比は、好ましくは1より大きい。
【０１０３】
より特別には、本発明に従う組成物は、以下を含むことができる：
-架橋ゲルの形で存在するヒアルロン酸の50重量％〜99重量％、より好ましくは70重量％〜95重量％、
-無架橋形で存在するヒアルロン酸が1重量％〜50重量％、好ましくは5重量％〜30重量％、
ここで架橋ヒアルロン酸ゲルと無架橋ヒアルロン酸との重量の比が、1：1〜1：0.02である。
【０１０４】
麻酔薬について、本発明に従う組成物は、前記組成物の総重量に基づいて、重量%で0.01％〜5％、好ましくは0.05%〜3％の麻酔薬を含んでも良い。
【０１０５】
注射することができる特性によって、本発明に従う組成物は、生理学的に許容される媒体を必ず含む。
【０１０６】
「生理学的に許容される媒体」は、毒性がなく、本発明で考慮されるような組成物の、注射および/または適用に適合性のある媒体を意味する。
【０１０７】
該組成物は、生理学的に許容される溶媒または溶媒の混合物を含むことができる。
【０１０８】
該組成物は、生理学的に許容される水性媒体を含むことができる。
【０１０９】
本発明に適した水性媒体としては、例えば水が挙げられ得る。
【０１１０】
本発明に従う組成物を調製するのに適した等張剤としては、糖および塩化ナトリウムが言及されることができる。
【０１１１】
特別な実施形態に従い、本発明に従う組成物は、少なくとも例えば上述の平衡塩溶液をさらに含んでいてもよい。
【０１１２】
特別な実施形態に従い、本発明に従う組成物は、さらにアルファリポ酸; N-アセチル-L-システイン；還元グルタチオン；アミノ酸、例えば、L-アルギニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リシン一水和物、グリシン、L-バリン、L-スレオニン、L-プロリン；ピリドキシン塩酸塩;脱水亜鉛アセテート;硫酸銅五水和物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも一つの化合物を含むことができる。
【０１１３】
本発明に従う組成物は、上記化合物に加えて、軟組織充填剤組成物の分野での使用に適合する追加の少なくとも一つの化合物を含むことができる。
【０１１４】
この点で、本発明に従う組成物中で使用されることができる追加の化合物は、銅塩、アルファリポ酸、システインのアセチル化誘導体、またはそれらの混合物から選択することができる。
【０１１５】
これらの追加の化合物の量は、当該化合物の性質、所望の効果、および本発明に従う組成物の目的による。
【０１１６】
これらのパラメータは、当技術の一般的なスキルに属している。
【０１１７】
少なくとも一つの銅塩をさらに含む組成物は、好ましくは前記組成物の総重量に基づいて0.1〜50ppmの範囲の量の銅塩を含むことができる。
【０１１８】
少なくとも一つのアルファリポ酸をさらに含む組成物は、好ましくは該組成物の総重量に基づいて、前記アルファリポ酸を0.5〜10000 ppm、好ましくは5〜100 ppmの範囲の量で含む。
【０１１９】
少なくとも一つのシステインのアセチル化誘導体をさらに含む組成物は、好ましくは前記システインのアセチル化誘導体を、組成物の総重量に基づいて、0.5〜10000 ppmの範囲の量で含む。
【０１２０】
本発明で使用することができる他の追加の化合物の中で、酸化防止剤、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、核酸、補酵素、副腎の誘導体、及びそれらの混合物が、挙げられ得る、ここで追加の化合物は、上に示したものとは異なる。
【０１２１】
酸化防止剤としては、グルタチオン、エラグ酸、スペルミン、レスベラトロール、レチノール、L-カルニチン、ポリオール、ポリフェノール、フラボノール、テアフラビン、カテキン、カフェイン、ユビキノール、ユビキノン、およびそれらの混合物が挙げられ得る。
【０１２２】
アミノ酸として、アルギニン、イソロイシン、ロイシン、リシン、グリシン、バリン、トレオニン、プロリン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびそれらの混合物が挙げられ得る。
【０１２３】
ビタミン類及びその誘導体としては、ビタミンE、A、C、B、特にビタミンB6、B8、B4、B5、B9、B7、B12、およびより良くはピリドキシンを挙げることができる。
【０１２４】
ミネラルとしては、特別には、亜鉛塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、ナトリウム塩、およびそれらの混合物の言及がなされ得る。
【０１２５】
核酸としては、特別には、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、シチジン、およびそれらの混合物の誘導体が挙げられ得る。
【０１２６】
補酵素としては、コエンザイムQ10、CoA、NAD、NADP、およびそれらの混合物が挙げられ得る。
【０１２７】
アドレナリン誘導体としては、ノルアドレナリン、アドレナリンが挙げられ得る。
【０１２８】
加えて、本発明従う組成物は、さらに、当技術分野で通常使用される任意の添加剤、例えば、生理学的濃度での、一および/または二水和のリン酸２水素ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含むことができる。
【０１２９】
コースの追加の活性剤および/または添加剤の量はもちろん、当該化合物の性質、所望の効果、および組成物に従う目的による。
【０１３０】
特別な実施形態に従い、本発明に従う組成物は、約１Hzで測定した場合、約5 Pa・s〜約450 Pa・sの複素粘度η*を有していてもよい。 
【０１３１】
特別な実施形態に従い、架橋ヒアルロン酸から成る本発明に従う組成物は、200と2000 Pa・sの間、好ましくは1000と1800Pa・sの間の粘度を有していてもよい。
【０１３２】
本発明に従う組成物の粘弾性特性は、コーン/プレート立体配置（1°の円錐角/直径35mmプレート）を持つレオメーター（特にHaake  RS6000）を用いて測定され得る。ひずみスキャンが行われ、弾性係数G '( Pa単位)及び位相シフト角δ（°）が5 Paでの応力について測定される。
無菌および注射することができる、本発明に従う組成物を調製するための方法 
【０１３３】
上記のように、本発明はまた、無菌および注射することができる組成物を調製する方法、より特別には軟組織充填剤組成物の少なくとも以下の工程を含む方法に関する：
a）ヒアルロン酸又はその塩の少なくとも1つのゲルを用意すること、ここで前記ヒアルロン酸は、架橋ヒアルロン酸の形、非架橋ヒアルロン酸の形またはそれらの混合物から選択される；
b) 前記ゲルへ少なくともメピバカインまたはその塩を麻酔薬として添加すること；および
c）工程b）で得られた混合物を滅菌すること。
【０１３４】
好ましい実施形態に従い、メピバカインまたはその塩は、その注射することができる形のヒアルロン酸に添加される。 
【０１３５】
言い換えれば、工程a）で考慮されるヒアルロン酸のゲルは、特に上記応用分野において、既にヒアルロン酸の、架橋剤残渣が存在する場合の濃度、および注射することができる使用に適合する生理学的および/またはpH条件を示す。 
【０１３６】
このようにして、例えば上記に定義されているように、付加的な精製工程を課すことによってヒアルロン酸とメピバカインとの混合物中のヒアルロン酸の安定性に影響を与えるリスクは、大幅に減少される。 
【０１３７】
該混合物は、有利には唯一の滅菌工程を経る。この工程は、好ましくは、すでに送達デバイス、本明細書中で後に定義されるように通常は注射器中にパッケージングされた混合物について使用される。
【０１３８】
有利には、滅菌工程は、加熱手段によって行われ得る。
【０１３９】
有利には、滅菌は120から140℃の範囲の温度で行われる。 
【０１４０】
特別には、滅菌工程は、をオートクレーブ（湿熱）T°C≧121°Cで実行することができ、F0>15（滅菌値）を得る。
【０１４１】
この点に関して、上記のように、本発明に従う組成物は、特別には、この滅菌工程に対する非常に興味深い高い耐性を示すことにおいて有利である。 
【０１４２】
実際に、実施例1及び2に示すように、本発明に従う組成物について滅菌することによって生ずるG’の損失は、メピバカインの代わりのリドカインを含む組成物についてよりも小さい。
【０１４３】
特別な実施形態に従い、本発明に従うヒアルロン酸ゲルを調製するための方法は、例えば上記のメピバカインまたはその塩とは別の、追加の麻酔薬またはその塩、好ましくはリドカインまたはその塩を添加することから成る工程d）を含み、前記工程d）は、工程b）の前、同時、および/または後に行われる。
【０１４４】
工程a) において考慮されるゲルが、架橋ヒアルロン酸の形を含む場合、この架橋型のものは非架橋型ヒアルロン酸から事前に取得することができる。
【０１４５】
上記のように、網状組織は、少なくとも１の架橋剤を用いて、従来の方法によって実行され得る。 
【０１４６】
架橋剤と架橋すべきヒアルロン酸とを含む水性混合物は、有利には架橋を行う前に均質化される。
【０１４７】
この操作の目的は、より特別には水性の媒体中のヒアルロン酸またはその塩が水和され、完全に均質化され、したがって期待されるようにヒアルロン酸のゲルの特性を最適化するのに役立つためである。均質化のこの工程は、ヒアルロン酸が高い分子量を持っていとき、より重要である。なぜならそのような化合物の水和は、凝集体の出現が一般的に観察されるところのその中に高粘度溶液の形成をもたらす傾向があるためである。 
【０１４８】
この操作の目的は、また、後の均質な架橋反応を確実にするように、架橋剤を混合物内に完全に均質化することを意図している。
【０１４９】
均質化は、得られた溶液が、凝集体がなく、均一に着色され、均一な粘度を有する場合に良好であると考えられる。均質化は、有利にはヒアルロン酸鎖の分解を防ぐために、穏やかな操作条件下で行われ得る。 
【０１５０】
この均質化工程の持続時間は、ヒアルロン酸またはその塩の性質、特別には、分子量、およびその濃度、水性の媒体内の操作条件、および使用される均質化デバイス、一般的にはソフトな機械的撹拌が可能なデバイスに依存する。 
【０１５１】
好ましくは、均質化工程は200分間未満の時間をかけて、好ましくは150分間未満、または15〜100分間でさえ行われてもよい。
【０１５２】
架橋反応の目的は、ヒアルロン酸鎖間にブリッジを作成して粘性溶液から緻密な固体三次元網目構造を得ることである。
【０１５３】
架橋反応を刺激するために採用される特別な条件は、ヒアルロン酸の分子量、水性媒体、および架橋剤の性質に依存し得る。一般的に、この網状組織は、無架橋ヒアルロン酸、および少なくとも一つの上記架橋剤を含む混合物をトリガー因子、または刺激剤に接触させることによって、例えば、加熱やUV暴露により、あるいは前記混合物を触媒型の材料と接触させることでさえ、達成することができる。
【０１５４】
そのようなトリガー因子の選択は、当業者の一般的な知識の範囲内に収まる。
【０１５５】
本発明の文脈で、このトリガー因子は、有利には「無架橋ヒアルロン酸/水性媒体/架橋剤」混合物に課せられた温度の上昇によって表される。
【０１５６】
架橋反応のために特に適切な温度は、35〜60℃、好ましくは45〜55℃の間であり、より好ましくは48℃〜52℃の間である。
【０１５７】
架橋の程度はまた、架橋時間、「無架橋ヒアルロン酸/水性媒体/架橋剤」混合物に課せられた温度に依存する。時間が長いほど、架橋の程度は上がるであろうが、ヒアルロン酸を分解する危険を冒すことなく、最適を行き過ぎるべきではない。
【０１５８】
このように、35℃〜60℃の範囲の温度で、架橋反応は、30〜300分間、好ましくは100〜200分間、より良好には150〜190分間の範囲の時間をかけて行ってもよい。 
【０１５９】
好ましくは、架橋条件は、形成された架橋ヒアルロン酸のゲルが、粘稠な、粘弾性のゲル、あるいは固体ゲルでさえあるような架橋度が得られるように、調整される。
【０１６０】
架橋反応を停止することは、架橋を停止させるために好都合な条件に、さもなければ、さまざまなヒアルロン酸鎖の間の結合の形成を停止させることが可能な条件に、架橋ゲル、または架橋中にそれを含む容器を、暴露させることを要求する。
【０１６１】
たとえば、架橋プロセスを刺激するために適用される熱的条件に関しては、架橋は以下により停止されてもよい：
- 単純に恒温槽から容器を取り出して、室温に戻るまで、それを冷却することにより、
-好ましくは室温より下の温度で、前記容器内の温度が室温に近くなるまで、冷水浴に容器を配置することにより、 あるいは
-前記容器からゲルを取り出すことによってさえ。 
【０１６２】
特定の実施形態によれば、例えばWO 2010/131175に特に記載されているように、均質化および架橋は、手で触って少なくとも手で変形され得る、変形可能なポーチ内に好ましくは作られた、変形可能な壁によって少なくとも部分的に区切られた密閉空洞内で、行うことができる。
【０１６３】
架橋工程の最後に得られたゲルは、特に、その高いヒアルロン酸濃度及び/又は架橋剤残渣の存在の可能性、さもなければ上記に考慮されている応用分野での使用に適合する生理学的および/またはpH条件の故に、一般的に直接注射されることができない。
【０１６４】
さらに、いくつかのゲルは、特に患者にそのまま注射するには、剛性が高すぎるかもしれない。したがって、当業者に知られているいくつかの追加の工程は、注射可能な水性ゲルを得るために行うことができる。より具体的には、このゲルを中和し、膨張させるステップは、それにインプラントの性質を与えるために必要とされる。続いて、pHが真皮のｐHにされながら、ヒアルロン酸網の鎖は、延伸および水和される。
【０１６５】
ゲルを保護し再高密度化する工程は、当業者のノウハウに従って、さらにインプラントの品質を向上させるために行うことができる。ゲルは、注射された媒体と同等量の塩の存在により生理学的に処方されなければならない。
【０１６６】
さらに高い純度のために、追加の精製工程が行われ得る。
【０１６７】
有利には、メピバカインまたはその塩と、場合により、追加の麻酔薬とは、上記定義のように、滅菌工程の直前に、注射可能な形のヒアルロン酸の調製のプロトコールの最後に添加される。
【０１６８】
特定の実施形態にしたがい、メピバカインおよび必要に応じて追加の麻酔薬を添加されたヒドロゲルは、制御された雰囲気条件下で注射器に充填するために使用されてもよく、前記注射器はその後、滅菌工程、例えば上記定義のように、好ましくは加熱滅菌工程を経る可能性がある。
組成物の投与
【０１６９】
本発明に従う組成物は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて注射することができる。
【０１７０】
特別には、本発明の組成物は、表皮内及び/又は真皮内及び/又は皮下投与に適した注射装置によって投与することができる。
【０１７１】
本発明の組成物はまた、歯肉、関節および/または眼の領域に適した注射装置によって投与することができる。
【０１７２】
本発明の組成物が表皮内及び/又は真皮内及び/又は皮下投与に適した注射装置によって投与される場合、注射装置は、注射器、マイクロ注射器のセット、レーザ装置、油圧装置、注射銃、無針注射装置、マイクロニードルによる回転から選択することができる。
【０１７３】
好ましくは、注射装置は、注射器またはマイクロ注射器のセットから選択することができる。
【０１７４】
代替の実施形態では、注射装置は、メソセラピーの技術に適合されることができる。
【０１７５】
メソセラピーは、表皮内および/または真皮内および/または皮下注用活性物質による治療法である。
【０１７６】
本発明に従う表皮内および/または真皮内および/または皮下の投与は、表皮領域、真皮表皮および/または真皮に本発明の組成物を注入することである。
【０１７７】
注射装置は、例えば、皮下注射針またはカニューレのような任意の従来の注射を含むことができる。
【０１７８】
本発明に従う針またはカニューレは、18と34 Gの間の範囲、好ましくは25G〜32Gの間の直径、および4〜70 mm、好ましくは4〜25 mmミリメートルの長さを有することができる。
【０１７９】
針またはカニューレは、好ましくは使い捨てである。
【０１８０】
有利なことに、針またはカニューレは、該注射可能な組成物を針またはカニューレを通して送達することが可能な注射器または他のデバイスと関連付けられる。一実施形態に従い、カテーテルは、針/カニューレと注射器との間に挿入されてもよい。
【０１８１】
既知の方法によって、注射器は、施行者によって手動で、または銃などの注射器ホルダーによって操作することができる。
【０１８２】
特許請求の範囲を含む明細書全体にわたって、語「含む」は、具体的に別記されない場合は、「少なくとも一つを含む」と同義と理解されるべきである。 
【０１８３】
「...と...の間で」および「...から...に至るまで」の表現は、具体的に別記がない限り、境界を包含することを意味すると理解すべきである。
実施例:
【０１８４】
以下の実施例および図面は、本発明の非限定的な例示として提示される。
材料と方法:
【０１８５】
以後本明細書中に組成物の粘弾性特性の測定値について定義されたプロトコールは、以下の実施例に適用される。
【０１８６】
組成物の粘弾性特性は、コーン/プレート形状（1°の円錐角/直径35mmのプレート）を有するレオメーター（Haake製RS6000）を用いて測定される。ひずみスキャンが行われ、弾性係数G '（PA単位）及び位相シフト角δ（°）が5 Paの応力について測定される。
実施例1：本発明に従う組成物の調製、非架橋ヒアルロン酸の使用、および滅菌に対する安定性の分析についてのプロトコール
【０１８７】
3gのヒアルロン酸（1.5MDa）及び197gのリン酸塩緩衝液（FR 2 979 539で定義されている）が混合される。
【０１８８】
調製のプロトコールは、次のとおりである:
1.気密容器（ナルゲン瓶）中、室温20時間以上での「ヒアルロン酸+リン酸塩緩衝塩液」混合物の三次元均質化；
2.得られた無架橋ゲルの2つの均等画分への分割（以下、画分A1とA2と呼ばれる，下記の表中において、分画A1、A2ともいう）；
3. 画分A1について、1％NaOH溶液0.4重量％、およびメピバカイン溶液（リン酸塩緩衝塩液媒体中30重量％）1重量％の、ゲルへの添加、または
4.画分A2について、1％NaOH溶液の0.4重量％、およびリドカイン溶液（リン酸塩緩衝塩液媒体中30重量％）1重量％の、ゲルへの添加；および
5.均質化、注射用に注射器1mLに包装、およびオートクレーブ処理（F0> 15）。
結果:
【０１８９】
以下の表は、得られた水性ゲルの弾性係数G'（Pa）および押出力F（N）の値を与える。
【０１９０】
F= 5 HzでのG’の滅菌中のロスは次のように計算される:
(103.3 − 45.0)/103.3 = 56.4 (en %)
【表２−１】
0006543625.tif 000006
【表２−２】
0006543625.tif 000007
【０１９１】
上記の観点から、したがって、非架橋ヒアルロン酸を含む組成物の滅菌工程への安定性は、リドカインよりもメピバカインを用いると少なくとも同等である事が判る。
【０１９２】
結果は、メピバカインを用いると有意に良好である。
実施例2：本発明に従う組成物の調製、架橋および無架橋ヒアルロン酸の使用、および滅菌に対するその安定性についての分析のプロトコル
【０１９３】
ヒアルロン酸（4MDa）8g、1％水酸化ナトリウム（NaOH）58.7g、およびブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）0.6gが使用される。架橋反応は、52℃で3時間インキュベートすることによって誘発される。
【０１９４】
調製のプロトコールは、次のとおりである:
1.完全に均一の粘性溶液を得るように、気密性かつ変形可能な容器（特許出願WO 2010/131175中に考慮されるようなポーチ）中の「ヒアルロン酸+ 1％NaOH」混合物の、室温約1時間30分間での均質化;
2.架橋剤（BDDE）の容器への添加と室温約20分間での新たな均質化；
3. 架橋工程を開始するために、「ヒアルロン酸/1％水酸化ナトリウム、/ BDDE」の粘性溶液を含有する容器の52℃3時間でのインキュベート；
4. リン酸緩衝塩液中での、得られた固体（架橋ヒアルロン酸の溶液）の中和、膨潤化および均質化（FR 2 979539に定義される）、および中性付近のpHで、ヒアルロン酸中11ミリグラム/グラムのヒドロゲルを得るために、HA 4MDa4gと補充のリン酸緩衝塩液668グラムを含有する無架橋ゲルの添加；
5.48時間の透析による精製、およびその後の、該精製されたゲルのタンク中での均質化での収集；
6. ゲル全体（230μm）のふるい分け;
7集められたゲルの 2画分（画分B1とB2，下記の表中において分画B1、B2ともいう）への分割;
8.メピバカイン溶液（リン酸塩緩衝塩液媒体中30重量％）1重量％及び1％NaOH溶液0.4重量％をゲルへ添加（=画分B1）；
9. リドカイン溶液（リン酸塩緩衝塩液媒体中30重量％）1重量％及び1％NaOH溶液0.4重量％をゲルへ添加（=画分B2）；
10. 均質化、注射のための注射器1mL内に包装、そして滅菌。
結果:
【０１９５】
以下の表は、得られた水性ゲルの弾性係数G’（Pa）および押出力F（N）の値を与える。
【表３】
0006543625.tif 000008
【表４−１】
0006543625.tif 000009
【表４−２】
0006543625.tif 000010
【０１９６】
実施例１に表示されているように、滅菌中のロスが計算される。
【０１９７】
上記の観点から、したがって、架橋ヒアルロン酸と非架橋ヒアルロン酸を含む組成物の滅菌工程への安定性は、リドカインよりもメピバカインを用いると少なくとも同等である。
【０１９８】
結果は、メピバカインであっても良好である。
実施例3：本発明に従う組成物の調製、架橋および無架橋ヒアルロン酸の使用、および経時的安定性についての分析のプロトコル
【０１９９】
ヒアルロン酸（1.5MDa）10g、1％水酸化ナトリウム73g、およびブタンジオールジグリシジルエーテル（BDDE）0.9gが混合される。その後、架橋反応は、52℃で3時間インキュベートすることによって誘発される。
【０２００】
調製手順は次のとおりである；
1. 完全に均一な粘性溶液を得るために、気密性で変形可能な容器（ポケット）中、「ヒアルロン酸+1％水酸化ナトリウム」混合物を、約1時間30分間室温で均質化すること。
2. 容器への架橋剤（BDDE）の添加と室温約20分間でのさらなる均質化；
3. 架橋工程を開始するために、「ヒアルロン酸/1％水酸化ナトリウム、/ BDDE」の粘性溶液を含有する容器の52℃3時間でのインキュベート； 
4.中性付近のpHでヒアルロン酸25ミリグラム/グラムの水性ゲルを得るために、無架橋ヒアルロン酸（1.5MDa）を2g含有するリン酸塩緩衝塩液中での得られた固体（架橋ヒアルロン酸の溶液）の中和、膨潤化、および均質化； 
5.透析(48時間)による精製、およびその後の脱気容器中で精製されたゲルの収集/均質化； 
6. メピバカイン溶液（リン酸緩衝塩液媒体中30重量％）1重量％及び1％NaOH溶液0.4重量％をゲル中に添加;
7. 均質化、脱気、注射用に注射器1mL中に包装、および滅菌（F0>15）。
結果:
【０２０１】
以下の表は、位相シフト角δ（°）と押出力の値を与える。
【表５】
0006543625.tif 000011
【０２０２】
ゲルの製造日19ヶ月後に得られた結果は、最初に得られたものと同等であり、従って、ゲルの安定性を示す。