(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子の大規模分離のための方法であって、
- 分離される前記分子への親和性を有する磁性粒子（Ｐ）を提供するステップと、
- 前記磁性粒子（Ｐ）と、前記分子を含む溶液とを混合するステップと、
- 前記混合物を、流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置と接触させるステップと、
- 少なくとも１種の前記磁性素子を除去し、そして前記分子を担持する前記磁性粒子（Ｐ）を収集するステップと、
- 前記分子を前記磁性粒子（Ｐ）から分離するステップと、
- 前記分子の濃縮画分を得るステップと、  
- 前記磁性粒子（Ｐ）を再循環させるステップと
を含む方法であって、
前記磁性粒子（Ｐ）は、外側表面と、孔と、前記孔によって規定されるつながった内側表面とを有する粒子（Ｐｐ）を含み、前記粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーと、前記外側及び内側表面上の官能基と、前記粒子（Ｐｐ）の内側及び外側表面に共有結合した磁性粒子（Ｍｐ）とを含み、
全磁性粒子の少なくとも９５重量％の最小直径は、前記粒子（Ｐｐ）の孔の少なくとも９５％の平均直径よりも大きい、
方法。
【請求項２】
前記磁性粒子（Ｐ）が、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、アクリレート、デキストラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記磁性粒子（Ｐ）が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、アミド、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される少なくとも１種を含む官能基を担持する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記磁性粒子（Ｐ）が、ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される官能基を担持する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記磁性粒子（Ｐ）が、ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を担持する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記官能基が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
磁性粒子（Ｐ）に導入される分子相互作用に適合する分子を用いて親和性が達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
分子相互作用に適合する前記分子が、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記磁性粒子（Ｐ）が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記磁気分離装置が流路又は容器を含み、前記磁性素子が前記流路又は前記容器の外側表面に塗布される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記磁気分離装置は容器を含み、そして中空体が前記容器の混合物に導入され、前記中空形状は、前記混合物と接触する外側表面と、磁性素子が除去可能に挿入される内部体積とを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記磁気分離装置が流路を含み、そして磁性素子が流路の外側に塗布される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
分子を含む溶液から前記分子の濃縮画分を製造する方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項の方法を実施することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、一般的に、分子への高い許容量及び／又は親和性を有する磁性フィルター及び磁性粒子が主な構成要素である、分子及び細胞の分離のための新規な方法、装置及びシステムに関する。この方法並びに対応する装置及びシステムは、化学的及び生化学的合成、並びに種々の精製ステップにおけるような、１種以上の反応物、例えば触媒又は酵素が、固体メディアに結合する化学的及び生化学的方法に有用である。
【０００２】
前記方法、装置及びシステムは、例えば、限定されるものではないが、残留薬物、重金属又は飲料水からの他の不必要な汚染物質の除去、並びに化学的及び生化学的合成、製造及び回収における中間生成物及び最終生成物の濃縮のような、所望の又は不必要な成分の除去及び／又は濃縮に適用可能でもある。
【背景技術】
【０００３】
低又は高分子量化合物、生体分子及び細胞の分離技術は、限定されるものではないが、例えば、食品工学及び浄水を含む、生物薬剤学及び生物工学などの多くの技術的用途において極めて重要である。非常に多数のクロマトグラフィーメディア並びにクロマトグラフ装置及びシステムが利用できる。例えば、バイオ親和性に基づくクロマトグラフ法が、５０年を超えて使用されている。１つの重要なバイオ親和性システムは、固定化されたプロテインＡであり、それにより、免疫グロブリンは、相互作用し、生体分子特異的相互作用を示すであろう。これは、非常に効率的な方法で、モノクローナル抗体を単離することを可能にする。
【０００４】
現在最も頻繁に使用されている分離技術は、分離メディアがシリンダーに充填され、そして対象分子の分離を可能にするクロマトグラフィーシステムに接続している、クロマトグラフ技術である。この技術によるいくつかの不利な点の１つは、プロセス時間である。分離そのものに相当な時間がかかるだけでなく、クロマトグラフィーシステムを準備することも、時間の消費である。濾過、遠心及び清澄方法のような余分なステップは、分離される材料がカラムに適用できる前に、しばしば必須である。器具及び装置は、高価であり、準備するために時間がかかる。更に、システムを扱うこと、及び結果を評価することを可能にするために、専門的知識及び経験が必要である。
【０００５】
代替方法は、存在し、磁性粒子の使用はそれらの１つである。
【０００６】
米国特許出願第６，６２３，６５５は、金属キレート化合物の調製方法を開示する。
【０００７】
Ｚｈａｏ  ａｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２００９，９，２９８１−２９８６は、細胞を対象とした区画、及び磁性ナノ粒子の区画を用いた粒子を製造するための技術を記載している。
【０００８】
米国特許出願番号第４，４３８，１７９は、ポリマー粒子表面に結合する磁性粒子を有するポリマー粒子を記載している。磁性材料は、イオン性又は金属キレートもしくは錯体の形成が可能な官能基を含む結合ポリマーの層に結合する。あるいは、磁性材料はポリエチレングリコール及び／又はポリプロピレングリコールによって結合する。
【０００９】
国際公開ＷＯ２０１２／０１５８９１は、粒子表面においてより小さい無機粒子を有する多孔性であってもよい粒子を開示する。粒子は、プリンタのトナー粒子として提供される。
【００１０】
英国特許１５７７９３０は、多孔性ポリマーマトリックスに埋め込まれる吸着粒子及び磁性粒子を開示する。マトリックスの多孔性は、分子のみをマトリックスの裂け目に浸透する特定の分子量にすることである、その結果、生成物は溶液から溶かされた物質を選択的に吸着する。化合物材料、特に真珠の形状の化合物材料は、特に不必要な風味を種々の食品から分離する、又はビタミンのような有用な材料を種々の生成物から回収するため、食品業界に特に有用である。特定の用途は、苦いイソフムロンの濃縮イースト抽出物からの除去；及びリボフラビンのホエーからの回収が挙げられる。選択的に吸着された物質を含む粒子は、それらの磁気特性により、媒体から容易に分離されるため、このタイプの先行技術吸着材料で遭遇する分離問題を克服する。吸着粒子は、例えば、炭素、Ａｌ２Ｏ３、シリカゲル、活性ケイ酸マグネシウム、粘土などであってもよい。磁性粒子は、例えば、磁鉄鉱、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライトなどであってもよい。多孔性マトリックスは、例えば、ＰＶＣ、ポリアクリルアミド（任意選択的に、エピクロルヒドリンで架橋される）フェノール樹脂、ＨＣＨＯで架橋されるナイロン−６，６などであってもよい。
【００１１】
米国特許第８，５１８，２６５は磁性粒子、並びに磁性粒子の表面において提供される疎水基及び親水基を含む官能性粉末に関連し、疎水基の数（Ｍ）及び親水基の数（Ｎ）が、０．２〜０．８であるＭ／Ｎの条件を満たす。独立請求項には、粉体が、磁力を用いて水から不純物を吸着するために、不純物を含有する水中で官能性粉末を分散させる工程を含む水処理方法（例えば、産業的な廃水のような廃水処理）が含まれる。
【００１２】
大部分の商業的に入手可能な磁性粒子は、主に少量の分子を単離することに有用な、限られた許容量を有する固体粒子である。大規模単離において、許容量は、商業的関心を持つには不十分すぎるであろう。しかし、大きな内側表面積を有する多孔性磁性粒子（粒子１ｍｌにつき５ｍ２、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、及びＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｂｙ  Ｊ．Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  及び  Ｌ．Ｒｙｄ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｃｅｒｓ  Ｉｎｃ．１９８９、４０ページ参照）は、従来のクロマトグラフ技術に対する代替物の開発を可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記を考慮すると、それはまだ大規模利用でクロマトグラフ技術を利用する問題が残り、そして、大規模利用においては、クロマトグラフ粒子を扱うための方法、装置及びユニット操作の改善と同様に、粒子の改善が必要である。
【００１４】
磁性フィルターが、高い許容量の磁性粒子と組み合わされ、開発及び最適化される分子及び細胞のほぼ自動分離方法をもたらす、新規な方法、装置及びシステムが、本願明細書において記載される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本願明細書において述べられる一般的な概念及び実施形態の目的は、先行技術の少なくともいくつかの不利な点を軽減すること、及び分子の分離のために改良された新規な方法を提供することであり、好ましくは磁性粒子の使用に基づく大規模な方法、そして最も好ましくは、磁性粒子の使用に基づく大規模な連続的又は半継続的な方法である。
【００１６】
第１の態様は、粒子、好ましくは分離される前記分子への親和性を有する磁性多孔性粒子、を提供するステップと；前記磁性多孔性粒子と前記分子を含む溶液とを混合するステップと；前記分子を、流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置と接触させるステップと；少なくとも１種の前記磁性素子を除去し、そして前記分子を担持する前記磁性多孔性粒子を収集するステップと；前記分子を前記磁性多孔性粒子から分離するステップと；前記分子の濃縮画分を得て、前記磁性多孔性粒子を再循環させるステップとを含む、分子の大量分離のための方法である。
【００１７】
粒子は、商業的に入手可能な粒子から選択される。ただし、必要な磁気特性及び十分な比表面積を有する、又は好ましくは本願明細書において開示されるように製造される磁性粒子である。
【００１８】
前記第１態様のある実施形態によると、磁性粒子、好ましくは、多孔性磁性粒子は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、アクリルレート及びそれらの誘導体からなる群から選択される材料を含む。
【００１９】
前記第１の態様の他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、磁性粒子、好ましくは、多孔性磁性粒子は、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、アミド、アミノエチル、ジエチルアミノエチル 、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される少なくとも１種を含む官能基を担持する。それらがＦｅ及びＮｉ等の磁性イオンの粒子に対する結合を容易にするので、これらの官能基は磁性粒子の製造に適する。これらの官能基は、例えばイオン交換のような、分離に対して異なる方法で有用であることができる。
【００２０】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、官能基は、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む。
【００２１】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、官能基は、ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される基を含む。これらの官能基は、例えば疎水的相互作用、及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を含む用途に有用である。
【００２２】
更なる別の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、官能基はＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及びその誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む。これらの基は、例えば疎水性分離と混在モード分離を含む用途に有用である。
【００２３】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、分子相互作用に適合する前記分子が、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。これらの基は、例えば、バイオ親和性に基づく分離を含む用途に有用である。
【００２４】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、磁性多孔性粒子はポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む。
【００２５】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、磁気分離装置は流路又は容器を含み、前記磁性素子が前記流路又は前記容器の外側表面に塗布される。
【００２６】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、前記磁気分離装置は容器を含み、中空体が前記容器の混合物に導入され、前記中空形は、前記混合物と接触する外側表面と、磁性素子が除去可能に挿入される内部体積とを有する。
【００２７】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、前記磁気分離装置が流路を含み、前記磁性素子が流路の外側に塗布される。
【００２８】
第２の態様は、分子の大規模分離のためのシステムであって、磁性粒子、好ましくは分離される前記分子への親和性を有する多孔性磁性粒子を貯蔵するための貯蔵タンク、；前記磁性粒子と前記分子を含む溶液とを混合するための反応器；流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置；及び前記磁性粒子と前記分子を含む溶液との混合物を輸送するためのポンプとを少なくとも含む、システムである。
【００２９】
第２の態様のある実施形態によると、システムは洗浄タンクを更に含む。
【００３０】
他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、システムは光学濃度監視のための光学濃度センサーを更に含む。
【００３１】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、システムは不活性ガスを用いてシステムに加圧するためのガス注入口を更に含む。
【００３２】
方法及び／又はシステムの２つの態様のうちのいずれかのある実施形態によると、磁性粒子、好ましくは、多孔性磁性粒子は、外側表面と、孔と、前記孔によって規定されるつながった内側表面とを有し、前記粒子は、少なくとも１種のポリマーと、前記外側及び内側表面上の官能基と、前記粒子の内側表面及び／又は外側表面に共有結合した磁性粒子とを含む。
【００３３】
更なる実施形態において、磁性粒子、望ましくは、多孔性磁性粒子は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、アクリレート、デキストラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される材料を含む。
【００３４】
他の実施形態において、磁性多孔性粒子は、共有結合磁性粒子なしで、多孔性粒子の密度よりも高い密度を有する。
【００３５】
他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）において、磁性多孔性粒子の外側表面及び／又は内側表面の官能基は、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、アミド、アミノエチル、ジエチルアミノエチル 、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される。
【００３６】
他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）において、粒子、望ましくは磁性多孔性粒子の外側表面及び／又は内側表面の官能基は、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む。
【００３７】
他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）において、多孔性磁性粒子の表面の官能基は、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む。
【００３８】
他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）において、分子相互作用に適合された分子は、粒子、好ましくは磁性多孔性粒子、に導入される。
【００３９】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）において、分子相互作用に適合された分子は、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００４０】
他の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）において、多孔性磁性粒子はポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む。
【００４１】
更なる実施形態（上記実施形態と自由に組み合わせ可能）によると、粒子、好ましくは、磁性多孔性粒子は分離メディアである。
【００４２】
本明細書に記載の態様及び実施形態による粒子は、既知の磁性粒子と比較して増加した結合許容量を有する。影響を受けず、かつ分離される成分との吸着及び結合反応に利用可能である、多孔性粒子の内側体積の大部分を残しながら粒子を形成することにより、結合許容量は、維持される、及び／又はむしろ改善される。
【００４３】
更に他の利点は、方法が極めて少ないステップで実行できることである。方法は、先行技術による方法と比較すると、実施がより容易である。更なる特徴及び利点は、詳細な説明及び実施例で証明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
態様及び実施形態は、以下の図を参照して説明及び実施例により詳細に記載する。図中の磁性多孔性粒子は、一般の多孔性磁性粒子を例示するものであり、説明及び実施例に示す磁性多孔性粒子の例に限定されない。
【００４５】
【図１】図１は、多孔性非磁性粒子（Ｐｐ）と、その表面に分布し、それに共有結合的に結合する複数磁性粒子（Ｍｐ）とを含む粒子（Ｐ）の断面図を示す。
【００４６】
【図２】図２は、磁性粒子（Ｍｐ）を有する非磁性多孔性粒子（Ｐｐ）を含む類似の粒子（Ｐ）であって、多孔性粒子における孔の直径に関係するそれらの大きさに応じて、前記粒子の中に大なり小なりの程度で侵入した磁性粒子は、内側表面及び外側表面に接し、そこに共有結合している、粒子（Ｐ）の断面図を示す。
【００４７】
【図３】図３は、エポキシド活性されたアガロースと、１０μｍ、５μｍ及び２μｍのサイズを有するＭｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｍ  ＮＨ２粒子との反応の結果として得られる、表面に結合したより小さい磁性粒子を有する多孔性粒子としてのアガロースビーズの光学顕微鏡画像を示す。
【００４８】
【図４】図４は、エポキシド活性されたアガロースと２μｍのＭｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｍ  ＮＨ２粒子（ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）との反応の結果として得られる磁性アガロス粒子の光学顕微鏡画像を示す。
【００４９】
【図５】図５は、以下の成分：細胞培養タンク／再循環タンク（１）、格納式磁石（８）を有する磁性フィルターユニット（２）、排出バルブ（３）、洗浄及び溶出のためのタンク（４）、回収及び任意選択的に新しい磁性粒子のための容器（５）、光学濃度センサー又は視界穴（６）、ポンプ（７）（例えば蠕動ポンプ）、フィルター（９）（例えば溶出液の最終精製のための０．２２μｍフィルター）、無酸素環境を維持するための、例えばＮ２のようなガス注入口（１０）、磁性フィルターユニットをすすぐためのすすぎ水の注入口（１１）、溶出液を排出するためのバルブ（１２）、細胞培養タンク（１３）、及び細胞除去のためのフィルター（１４）を含む方法スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
種々の態様及び実施形態を詳細に説明する前に、この記載は本明細書に記載の特定の化合物、構成、方法ステップ、基質及び材料に限定されず、そのような化合物、構成、方法ステップ、基質、材料は変わり得る。本明細書で使用されている専門用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定する意図はなく、当該実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物のみによって限定されることを理解すべきである。
【００５１】
本願明細書及び添付の請求項にて用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、前後関係で明確に指示しない限り、複数の参照物を含むことに留意する必要がある。
【００５２】
また、用語「約」は、該当する場合、数値の±１０％、及び最も好ましくは±５％の偏差を示すために使用される。
【００５３】
特に定義のない場合、本願明細書において使用されるいかなる用語を含む科学的専門用語は、本開示に関連する当業者により一般に理解される意味を有することを意図する。
【００５４】
特に大規模用途において、発明者は広範囲な研究を実施して、多孔性磁性粒子は生体分子の分離のための方法で使用することができることを見出した。固定化した分子及び／又は細胞を伴う粒子は、１以上の外部の磁石を使用して、容易に分離される。磁性粒子が粒子に付加的な密度を与えるにつれて、分離は遠心によって、又は、重力を使用する静的固定によって補助するができる。密度に基づく分離は、予備分離ステップとして及び／又は磁気分離の一部として使うことができる。
【００５５】
発明者は異なる磁性粒子を試験し、すべてが本願明細書において開示される分離方法及びシステムに適さないことを見出した。多くの商業的に入手可能な粒子は、磁気特性が弱すぎるため、本方法及びステムに有用ではない。現在、最適であると考えられる粒子は、本願明細書において概説される方法を用いて発明者により製造される粒子である。この方法は同時係属出願の対象でもある。そして、これは２０１３年９月９日に出願したＳＥ１３５１０３８−３の優先権を主張する。
【００５６】
磁性粒子の例としては、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのＭａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ磁性ビーズが挙げられる。他の実施例はＢｉｏｖｉｓｉｏｎ、ｉｎｃの磁性ビーズである。更に他の例は、（現在の方法及びシステムで非常に適切であると見出した）Ｔｕｒｂｏｂｅａｄｓ  ＬＬＣ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＣＨのＴｕｒｂｏＢｅａｄｓ（登録商標）製品範囲であり、生物医学グレード版及び化学グレード版の両方において利用可能である。これらすべてのビーズは異なる特性及び異なる官能性おいて利用可能である。
【００５７】
適切な磁性粒子は、３つの群に大まかに分類できる：
- 固体磁性微粒子。これらは低い磁力、及び低い許容量をしばしば有する。これらは、本願明細書において開示される方法及びシステムへの使用に今のところあまり適さない。例として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）及びＭｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｍ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙの磁性ポリスチレン粒子）が挙げられる。
- 多孔性磁性粒子。これらは、良好な磁気特性及び高い許容量を有する。これらは、本願明細書において開示される方法及びシステムへの使用に適する。例として、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｉｎｃの粒子、及び本明細書及び同時係属出願で概説されるように製造される粒子。
- 固体磁性粒子。例えばＣｏｂａｌｔ粒子（Ｔｕｒｂｏｂｅａｄｓ  ＬＬＣ、Ｚｕｒｉｃｈ、ＣＨからのＴｕｒｂｏＢｅａｄｓ（登録商標）製品範囲）及び類似品であり、高い磁力を有する。
【００５８】
ある実施形態によると、多孔性粒子は基本的に球形であるが、他の形状も包含され、磁性多孔性粒子はいかなる特定の形状に限定されない。すべての形状は、本願明細書において示される実施形態の範囲内に含有される。磁性粒子も同様とする。
【００５９】
好ましくは、全磁性粒子の少なくとも９５重量％の最小直径は、多孔性粒子の孔の少なくとも９５％の平均直径よりも大きい。ある実施形態によると、磁性粒子の最小平均直径は、２０ｎｍよりも大きい。
【００６０】
ある実施形態によると、本方法及びシステムで使用される磁性多孔性粒子は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、アクリルレート及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む。
【００６１】
好ましくは、磁性粒子は、磁性金属、磁性金属合金及び磁性酸化物又はそれらの組合せから選択される少なくとも１種の磁性材料を含む。非限定的な例として、鉄、ニッケル、コバルト、ガドリニウム、ネオジム及びサマリウム、並びにそれらの酸化物及びそれらの合金が挙げられる。
【００６２】
好ましくは、磁性粒子は非磁性粒子の密度よりも高い密度を有する。したがって、磁性粒子は、粒子全体の密度を増加するために使用することができる。これは、重力又は遠心分離は、分離ステップの一部として、例えば磁気分離の前又は後のステップとして、使用される際に、有用である。
【００６３】
前記第１の態様（上記と自由に組み合わせ可能）の他の実施形態によると、磁性粒子（好ましくは多孔性磁性粒子）は、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、アミド、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される少なくとも１種を含む官能基を担持する。これらの官能基は、粒子に対する、例えばＦｅ及びＮｉ等の磁性イオンの結合を促進するため、磁性粒子の製造に適する。これらの官能基は、例えばイオン交換等の分離のための異なる方法に有用でもあり得る。
【００６４】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、官能基はジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む。
【００６５】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、官能基は、ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される基を含む。これらの官能基は、例えば疎水的相互作用及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を含む用途に有用である。
【００６６】
更なる別の実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、官能基はＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及び誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を含む。これらの基は、例えば疎水性分離と混在モード分離を含む用途に有用である。
【００６７】
更なる実施形態（上記と自由に組み合わせ可能）によると、分子相互作用に適合する前記分子が、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。これらの基は、例えば、バイオ親和性に基づく分離を含む適用に有用である。
【００６８】
重要なことに、官能基は、多孔性粒子に結合し、一緒になって十分な表面を有する磁性粒子を生成する磁性固体粒子上に存在してもよく、又は多孔性磁性粒子上に存在してもよく、多孔性非磁性粒子上に存在してもよい。なお、これらはそれらに結合する磁性粒子を順々に担持するものである。
【００６９】
ある実施形態において、前記磁性粒子は、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む。
【００７０】
ある実施形態において、多孔性粒子は、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、デキストラン、アクリレート、及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種を含む。
【００７１】
磁性粒子は少なくとも１種の磁性材料を含むものであり、例えば、これらに限定しないが、磁性金属、磁性金属合金、及び磁性酸化物又はそれらの組合せが挙げられる。ある実施形態において、磁性粒子は、非磁性多孔性粒子の密度よりも高い密度を有する。密度は、ＩＳＯ  １１８３−１：２０１２に従って測定される。
【００７２】
ある実施形態において、前記磁性多孔性粒子の少なくとも１種及び前記少なくとも１種の磁性粒子は、分子相互作用に適合する分子を含む。相互作用に適合する分子は、手段、例えば、限定されるものではないが、結合を形成することによって他の分子と相互作用する能力を有する分子である。
【００７３】
ある実施形態において、前記多孔性粒子の少なくとも１種及び／又は前記少なくとも１種の磁性粒子は、検出に適合する分子を含む。
【００７４】
ある実施形態において、検出に適合する分子は、有機分子、核酸、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、複合糖質、レクチン、及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である。検出に適合する分子は、いかなる手段によっても検出することが可能な分子である。例として、少なくとも１種の特定の波長の光を放射する分子が挙げられる。
【００７５】
ある実施形態において、前記磁性粒子が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む。磁性粒子（Ｍｐ）の材料の例としては、これらに限定されるわけではないが、鉄、コバルト及びそれらの酸化物の、磁性金属、磁性金属合金、及び磁性酸化物が挙げられる。
【００７６】
磁性粒子が用いられる場合、分離は両方の磁場によって、又は、密度の違いを用いて実施することができる。ある実施形態において、磁場に基づく分離及び／又は密度の差に基づく分離を用いることができるように、磁性粒子は磁性を有し、高密度を有する。密度に基づく分離は、遠心及び／又は重力への暴露を含む。より高密度な粒子が沈殿するように、重力への暴露は、単純に試料を置くだけでよい。
【００７７】
本願明細書において開示される方法及びシステムは、多くの利点を有する。それは、従来のクロマトグラフ装置を補う又は完全に取って代わることができ、そして、より丈夫であり、容易に操作される連続又は半継続的システムを提供する。処理量は本明細書で記載されたように著しく増加し、システム溶液の最小の前処理なし又はありで、従来のクロマトグラフ装置よりも非常に高い流動速度で、操作可能である。本明細書で開示される方法及びシステムも、中断するような傾向も少なく、メンテナンスの必要も少なく、例えば、圧縮クロマトグラフィーカラムの問題、メディアの流路の形成、フィルターの詰まりなどを回避することができる。
【００７８】
一般に、方法とシステムの実施は、方法ステップと、ユニット操作の数を減らすことを可能にし、そして、より低コストの及びより短い時間で、より大きいバッチを処理することを可能にする。磁気分離装置の大きさを増加させることにより、又は、並列でいくつかの磁気分離装置を用いることにより、方法は、より容易にスケールアップされる。経時的なシステム、磁性粒子の再循環を設計することも可能である。
方法とシステムは、使用をモノクローナル抗体の捕獲への使用に制限することなく、プラットフォームとして用いることができる。他の適切な使用は、疎水的相互作用、イオン交換又は親和性クロマトグラフィーを含む方法である。方法及びシステムは、非破壊的であり、大量の生体分子及び生細でさえ扱うことに適切なものである。更に、本明細書で開示されるシステムは、清浄が容易であり、方法で必要とされる無菌性を必要とする処理又は無菌の環境にさえ適切である。これは、特に製薬、生化学及び微生物学的な用途に適切にする。
【実施例】
【００７９】
例１  処理による流動−磁気分離を用いたＩｇＧの単離
より大きい試料容積（例えば約１〜１００００Ｌ）から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を単離することが、磁性粒子、及び流動システム組立物に備えられた磁気分離装置の利用により実行される。組立物は、ＩｇＧが製造され、そしてＩｇＧへの親和性を有する磁性粒子が、製造されたＩｇＧを捕獲するために加えられるところである発酵槽を備え、その後、磁性粒子を洗浄、溶出及び再生するための種々の容器が続いている。磁気分離装置は、例えば、ＩｇＧを担持する磁性粒子が捕獲され、及び大量の細胞培養メディアから濃縮されるところである磁性フィルターである。本願明細書において開示される磁気分離装置は、１〜１０００Ｌ／分の流動速度で、細胞培養メディア及び粒子を処理することができ、それは短い時間で大量の細胞培養メディアを扱うことを可能にする。
【００８０】
磁気分離装置は例えば、フィルター装置からの磁石の除去、又は磁石の自動的な退避により、容易に停止可能であり、したがってＩｇＧを担持する捕獲した粒子の放出を可能にする。そしてこれらを次の容器又は器で更に、例えば洗浄及び溶出され、磁性粒子からＩｇＧの放出等の処理を行う。そして、粒子と自由なＩｇＧとの混合物を、磁性粒子を再び捕獲するところである活性磁気分離装置に再循環することにより、ＩｇＧ分子は、磁性粒子から分離される。したがって、ＩｇＧ分子を磁気分離装置に通過させ、更なる処理のために分離容器に収集する。そして、磁性粒子は、発酵槽からＩｇＧ含有細胞培養メディアの新しいバッジに再循環できる。
【００８１】
例えば流動システム組立物に含まれる上記の磁気分離システムのような、ある実施形態による分離システムの例を、図５で概略的に示す。
【００８２】
例２  流動システム組立物での磁性粒子の大規模分離
約２００ｍｌの固定化した磁性粒子を、流動システム組立物に備わる磁気分離装置を利用し、３５分以内で、３Ｌ／分の流動速度で１０ＬのＰＢＳ溶液から分離し、濃縮した。
【００８３】
流動システム組立物に備わる磁気分離装置は、商業的装置（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．，のＡｕｔｏＭａｇ  Ｃｏｍｐａｃｔ（ＡＭＣ）、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、ＵＫ）に基づく磁気分離装置を備えていた。ＡＭＣオリジナル磁性フィルターをハウジングの底（図５の項目３のドレイン弁に対応する）における２つの追加の出口により変更した。これは、装置の単純化された排水を可能にし、前記方法により回収及び再循環された磁性粒子の効果的な回収及び濃縮を結果的にもたらすものであった。
【００８４】
１０Ｌの細胞培養／供給タンク１、廃棄物容器、及び磁性粒子を回収するための５Ｌ容器を、図５で示すように接続した。なお、必要な追加の管、弁、及びコネクタを含んでいた。この実験的な組立物において、ポンプ７は蠕動ポンプであり、少なくとも３Ｌ／分の流動許容量で操作した。
【００８５】
磁性粒子：２００ｍｌの固定化した磁性粒子を、上記のように製造した。方法は、当然ながら、例えば十分な磁力を呈し、捕獲される分子に対して必要な親和性を有する商業的に入手可能な粒子等の他の粒子に適用可能である。
【００８６】
実験で用いられるような方法は、以下のステップ：磁性粒子の捕獲、捕獲した磁性粒子の洗浄、並びに磁性粒子の放出及び回収、を含んでいた。これらのステップは更に下記する。
【００８７】
磁気分離システムの準備／清浄：磁気分離装置及び流動システム組立物における捕獲の磁性粒子の捕獲の前に、装置を、脱イオン水を用いてシステムを空にする前に、水１０Ｌを加え、１５分間、流動速度３Ｌ／分で再循環することにより、清浄した。
【００８８】
磁性粒子の捕獲：磁性粒子をＰＢＳ溶液１０Ｌで懸濁し、そして１０Ｌの細胞培養／供給タンク（図５の符号１）へ移した。磁性粒子の溶液を、活性化された磁石（図５の中の符号２）を有する磁気分離装置により、３Ｌ／分の流動速度で再循環した。３５分の再循環後、溶液はきれいになり、供給タンクから黒い磁性粒子が消失したことにより、視覚的に認められた。したがって磁性粒子を、磁気分離装置の磁石上で完全に捕獲した。そして磁性粒子のないきれいな溶液を、磁気分離装置から廃棄物容器へ排出した。この廃棄物溶液１０Ｌを、磁性粒子の損失について点検した。溶液は、磁性粒子が溶液から保持されてあったガラスフィルター漏斗を通過した。固定化した磁性粒子約１００μｌを、廃棄物溶液から単離することが可能であった。これは最初に追加した磁性粒子の０．０５％に対応する。
【００８９】
捕獲された磁性粒子の洗浄：そしてＰＢＳ溶液５Ｌを、細胞培養／供給タンクに加え、磁気分離装置を通して廃棄物容器の出口に流した。流動速度は、３Ｌ／分であった。磁気分離装置の磁石を、依然として活性化させ、装置の中で粒子を保持した。
【００９０】
磁性粒子の放出と回収：そして磁気分離装置（図５の符号２）を容積約２ＬのＰＢＳ溶液で充填した。これに続いて、磁気分離装置の磁石を非活性化し、フィルター（図５の符号８）から退避させ、それにより粒子を放出した。そして磁性粒子は、フィルターの底に堆積させた。
【００９１】
そして磁気分離装置から磁性粒子を回収するために、磁気分離装置ハウジング（図５の符号３）の底のドレイン弁を開放した。回収した磁性粒子を、ＰＢＳ溶液２Ｌと共に容器に収集した。
【００９２】
収集した画分を点検し、収集した磁性粒子の量を測定した。磁性粒子の９８％である非常に高い部分であった。
【００９３】
例３  プロテインＡに対する免疫グロブリンの結合と溶出
磁性粒子は、流動システム組立物に備えられる磁気分離装置を用いて、大規模細胞培養実験において試験した。適切な１０００グラム又は１０〜１０００リットルの細胞培養において、細胞培養から細胞を除去ために、特定の濾過は実行しない。細胞培養バッチの処理後、粒子はシステムから除去でき、代わりに、磁性粒子は静菌性溶液のシステムに保存できる。
【００９４】
流動システム組立物に含まれる磁気分離装置を、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液１０リットルを用いて、徹底的に清浄した。溶液をシステム内で循環し、溶液をすべての管、弁及び構成要素と接触させた。接続時間は、フィルターを効率的に清潔及び衛生化するために約３０分かかった。
【００９５】
すべての配管と蠕動ポンプを含む流動システム組立物の磁気分離装置を、脱イオン化発熱物質遊離水を用いてすすいだ後、ＰＢＳ緩衝水（リン酸緩衝食塩水）ですすいだ。
【００９６】
そして清浄した磁気分離装置を、細胞培養タンクに無菌的に接続した。磁性素子８を磁気分離装置から最初に退避し、磁力を排除し、そして磁性粒子が装置を通過することを可能にした。
【００９７】
内容物とバッチの抗体の濃度を、ＧＰＣ−ＨＰＬＣ又はＥＬＩＳＡにより決定した。そして磁気分離装置に加えるための、対応する細胞培養容積を、ＧＰＣ−ＨＰＬＣ又はＥＬＩＳＡの結果に基づいて算出した。
【００９８】
そして、抗菌性溶液に保存され、そしてＰＢＳ緩衝液で平衡にされた、清潔なプロテインＡ磁性粒子（固定化した粒子３０ｍｇ／ｍＬの結合を許容する粒子の量を目標とする）を、細胞培養タンク／再循環タンクに加え、磁気分離装置により細胞培養を再循環、ルーピングし、そして細胞培養／再循環タンクへ戻しながら、懸濁液の中で保持した。ルーピングを、約３０分間継続し、細胞培養から抗体の完全な抽出、及び抗体の磁性粒子への完全な吸着を達成した。
【００９９】
次に磁石を活性化し、磁性粒子を磁気分離装置の磁石へ付着させることを始めた。それらに吸着された抗体を有する磁性粒子を、細胞培養から除去した。
【０１００】
ルーピングは、溶液がきれいになるまで、すなわち吸着したタンパク質を含むすべての粒子を捕獲するまで、継続する。細胞培養溶液の清浄は、透明ガラス及び外径５００〜６００ｎｍのセンサー（図５の符号６）により観察できる。光学濃度測定は、方法を自動化することを可能にする。光学濃度監視センサー及びシステムは、商業的な提供者、例えばＤＡＳＧＩＰ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ及びＰｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ、から入手可能である。
【０１０１】
次にドレイン弁（符号３）を介して磁気分離装置から溶液を排出し、システム（ＰＢＳ）にすすぎ緩衝液（廃棄物に対して容積１０リットル）を通過させ、廃棄物、出口廃棄物となる。これは、効率的に細胞培養ブロス及び細胞を、磁気分離装置から除去するために行った。
【０１０２】
次に磁石を退避させ、粒子の再懸濁を可能にした。これはＰＢＳ緩衝液を磁気分離装置に通過させ、洗浄タンクへ再循環させることにより達成される。ＰＢＳを、容積約１０リットルの洗浄タンクから加えた。再循環、ルーピングを１５分間継続し、不純物（Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、エンドトキシンなど）を放出させ、プロテインＡリガンドを介して非特異的に磁性粒子に結合した。そして、磁石を活性化し、粒子がＯＤセンサーにより溶液中で観察できなくなるまで、循環を維持する。そして溶液をシステムから排出する。このステップを２回更に繰り返す。
【０１０３】
そして、溶出緩衝液（クエン酸６０ｍＭ  ｐＨ３、又は１００ｍＭ  アミノ酸緩衝液ｐＨ３）を、洗浄タンク（図５の符号４）から加える際、磁石を活性化するように保つ。バッファの容積は約２リットルである。再循環を、洗浄タンク（符号４）を介して始め、ポンプ（符号７）を通し、洗浄タンク（符号４）に戻し、磁石が非活性化、退避させる。循環を約１５〜２０分間継続し、磁性粒子から抗体を効率的に溶出し、放出する。
【０１０４】
次に、磁石を活性化し、溶出した抗体を含む溶液から粒子の除去を可能にする。目視観測に基づいて溶液がきれいな際、又はＯＤセンサーを使用して決定されるように、再循環、ルーピングを中断する。
【０１０５】
そして磁気分離装置を、ガス注入弁（図５の符号１０）を通して、窒素（Ｎ２）ガス（圧力０．５〜１バール）を用いて加圧する。他のすべての弁を、この時点で閉じる。抗体を含む溶出液を、濾過弁（符号１２）を開き、外部０．２２ミクロンフィルター（符号９）を通して、適切で清潔な外部器に送り、抗体含有溶液から粒子及び微生物を効率的に除去する。
【０１０６】
３つのそれ以前のステップを合計約３０〜４５分実行する際に、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ 7）を、１〜１０の割合で溶出液に加え、溶液のｐＨを中和する。低いｐＨを伴う保持時間は、潜在的ウイルス性不活性化ステップとして機能する。これは、哺乳動物細胞を使用する際、抗体精製方法で必要とされる最初のウイルス性不活性化ステップとして機能する。
【０１０７】
再利用のための磁性粒子の回収と清浄：磁性粒子を、フィルターの磁石に付着するように保ち、そしてクエン酸６０ｍＭ（ｐＨ３）からなるＣＩＰ緩衝液の約１０リットルを、洗浄タンクから再循環し、約１５分間再循環して磁気分離装置で洗浄タンクへ戻し、そしてフィルター、廃棄物出口から排出する。
【０１０８】
次に、０．５ＭのＮａＣｌ及び１％のＴｗｅｅｎで補充されているＰＢＳ緩衝液１０リットルを、ステップ１のように、フィルターを通して１５分間再循環し、ループし、そしてシステムから排出する。
【０１０９】
ステップ２を繰り返すが、磁石を１５分間退避し、粒子を懸濁液に戻す。そして、視覚的に観察されるように又は外径センサー信号に基づき、粒子を溶液から除去するように、磁石を活性化する。そして溶液をシステムから排出する。
【０１１０】
そして、エチル又はプロピルアルコールの１０％のｖ／ｖからなる静菌溶液（容積約１０リットル）を洗浄タンクに加え、その一方で、粒子を懸濁液に再び戻すために、ステップ１−２のようにループした磁力を除去する。約１５分後、磁石を再び活性化させ、そして清澄な溶液を排出する。
【０１１１】
それから、追加の静菌溶液（容積２リットル）をフィルターに加え、そして磁石を不活性化する。放出された粒子は、フィルターの円錐体の底へ沈み込む。窒素（０．５−１バール）の低圧を、フィルター上に適用する。ドレイン弁をゆっくり開け、フィルターを、貯蔵器に注いで空にする。粒子を、静菌２０％エタノール溶液に２〜８℃で、更なる使用までの間保存する。
【０１１２】
代わりに、磁性粒子を、フィルターの静菌溶液で、更なる使用までの間保存する。磁性粒子を再利用する際、磁性粒子は、例えばＬＡＬ試験（ｌｉｍｕｌｏｕｓ変形細胞溶解物試験、種々の商業的提供者から入手可能、例えばＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．，ＣＨ）を使用し、可能性のある微生物汚染の制御、及びエンドトキシンの欠如を経るだろう。
【０１１３】
例４  プロテインＡに対する免疫グロブリンの結合及び溶出
大規模細胞培養からの磁性粒子を、磁気分離装置、約１０００グラムの製品又は１０〜１０００リットルの細胞培養に対応するバッチで処理し、その後細胞培養から細胞を除去するために濾過を実施する。
【０１１４】
濾過した細胞培養を、細胞培養タンク（図５の符号１３に対応する）から細胞培養／再循環タンク（符号１）に、０．２２マイクロメートルのフィルター（符号１４）を介して加える。例３で記載のように、他のすべてのステップを実行する。
【０１１５】
前述の発明の理解の明確化を目的とするために図と例を挙げることにより詳細に記載したが、特定の改変と修正が添付の請求の範囲の精神又は範囲を逸脱しない範囲で可能なことは、この発明の教示の観点から、当業者にとって容易に明らかである。
以下に本発明を示す。
［請求項１］
分子の大規模分離のための方法であって、
- 分離される前記分子への親和性を有する磁性粒子を提供するステップと、
- 前記磁性粒子と、前記分子を含む溶液とを混合するステップと、
- 前記混合物を、流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置と接触させるステップと、
- 少なくとも１種の前記磁性素子を除去し、そして前記分子を担持する前記磁性粒子を収集するステップと、
- 前記分子を前記磁性粒子から分離するステップと、
- 前記分子の濃縮画分を得るステップと、  
- 前記磁性粒子を再循環させるステップと
を含む方法。
［請求項２］
前記磁性粒子が、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、アクリレート、デキストラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
前記磁性粒子が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、アミド、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される少なくとも１種を含む官能基を担持する、請求項１又は２に記載の方法。
［請求項４］
前記磁性粒子が、ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される官能基を担持する、請求項１又は２に記載の方法。
［請求項５］
前記磁性粒子が、ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を担持する、請求項１又は２に記載の方法。
［請求項６］
前記官能基が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む、請求項１又は２に記載の方法。
［請求項７］
磁性粒子に導入される分子相互作用に適合する分子を用いて親和性が達成される、請求項１に記載の方法。
［請求項８］
分子相互作用に適合する前記分子が、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の方法。
［請求項９］
前記磁性粒子が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
前記磁気分離装置が流路又は容器を含み、前記磁性素子が前記流路又は前記容器の外側表面に塗布される、請求項１に記載の方法。
［請求項１１］
前記磁気分離装置は容器を含み、そして中空体が前記容器の混合物に導入され、前記中空形状は、前記混合物と接触する外側表面と、磁性素子が除去可能に挿入される内部体積とを有する、請求項１に記載の方法。
［請求項１２］
前記磁気分離装置が流路を含み、そして磁性素子が流路の外側に塗布される、請求項１に記載の方法。
［請求項１３］
分子の大規模分離のためのシステムであって、少なくとも
- 分離される前記分子に親和性を有する磁性粒子を貯蔵するための貯蔵タンクと、
- 前記磁性粒子と前記分子を含む溶液とを混合するための反応器と、
- 流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置と、
- 磁性粒子と前記分子を含む溶液との混合物を輸送するためのポンプと
を含む、システム。
［請求項１４］
洗浄タンクを更に含む、請求項１１に記載のシステム。
［請求項１５］
光学濃度監視のための光学濃度センサーを更に含む、請求項１１に記載のシステム。
［請求項１６］
不活性ガスを用いてシステムに加圧するためのガス注入口を更に含む、請求項１１に記載のシステム。
上記記載と重複するが、本発明を以下に示す。
＜発明１＞
分子の大規模分離のための方法であって、
- 分離される前記分子への親和性を有する磁性粒子（Ｐ）を提供するステップと、
- 前記磁性粒子（Ｐ）と、前記分子を含む溶液とを混合するステップと、
- 前記混合物を、流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置と接触させるステップと、
- 少なくとも１種の前記磁性素子を除去し、そして前記分子を担持する前記磁性粒子（Ｐ）を収集するステップと、
- 前記分子を前記磁性粒子（Ｐ）から分離するステップと、
- 前記分子の濃縮画分を得るステップと、  
- 前記磁性粒子（Ｐ）を再循環させるステップと
を含む方法であって、
前記磁性粒子（Ｐ）は、外側表面と、孔と、前記孔によって規定されるつながった内側表面とを有する粒子（Ｐｐ）を含み、前記粒子（Ｐｐ）は少なくとも１種のポリマーと、前記外側及び内側表面上の官能基と、前記粒子（Ｐｐ）の内側及び外側表面に共有結合した磁性粒子（Ｍｐ）とを含み、
全磁性粒子の少なくとも９５重量％の最小直径は、前記粒子（Ｐｐ）の孔の少なくとも９５％の平均直径よりも大きい、
方法。
＜発明２＞
前記磁性粒子（Ｐ）が、アガロース、シリカ、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、アクリレート、デキストラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される材料を含む、発明１に記載の方法。
＜発明３＞
前記磁性粒子（Ｐ）が、−ＳＨ、−Ｓ−Ｓ−ピリジン、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＨＯ、−ＯＨ、フェノール、無水物、エポキシ、Ｓ−Ａｕ、アミド、アミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、カルボキシメチル、ホスホ及びスルホプロピルからなる群から選択される少なくとも１種を含む官能基を担持する、発明１又は２に記載の方法。
＜発明４＞
前記磁性粒子（Ｐ）が、ＩＤＡ（イミノジアセテート）及びその誘導体、ＴＥＤ（トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン）及びその誘導体、ＣＭ−Ａｓｐ（カルボキシメチル化アスパラギン酸）及びその誘導体、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）及びその誘導体、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）及びその誘導体、ＤＰＡ（ジピコリルアミン）及びその誘導体、Ｃ６−Ｓゲル（ヘキシルスルフィド基）及びその誘導体、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート）及びその誘導体からなる群から選択される官能基を担持する、発明１又は２に記載の方法。
＜発明５＞
前記磁性粒子（Ｐ）が、ＣｎＨｍ（１≦ｎ≦２０  ４≦ｍ≦４２）、フェノール及びその誘導体、チオフェノール及びその誘導体、メルカプトピリジン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の基を担持する、発明１又は２に記載の方法。
＜発明６＞
前記官能基が、ジビニルスルホン、ベンゾキノン、イミダゾール、過ヨウ素酸塩、トリクロロ−Ｓ−トリアジン、トシレート、ジアゾニウム、イソ尿素塩、カルボジイミド、ヒドラジン、エピクロロヒドリン、グルタルアルデヒド、臭化シアン、ビスエポキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、シラン及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の化合物との反応結果である少なくとも１種の基を含む、発明１又は２に記載の方法。
＜発明７＞
磁性粒子（Ｐ）に導入される分子相互作用に適合する分子を用いて親和性が達成される、発明１に記載の方法。
＜発明８＞
分子相互作用に適合する前記分子が、有機分子、タンパク質、抗原、酵素、酵素阻害剤、共同因子、ホルモン、毒素、ビタミン、複合糖質、核酸、レクチン及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１種である、発明５に記載の方法。
＜発明９＞
前記磁性粒子（Ｐ）が、ポリマーマトリックスに埋め込まれる少なくとも１種の磁性材料の粒子を含み、前記ポリマーマトリックスが前記官能基を含む、発明１〜６のいずれか一に記載の方法。
＜発明１０＞
前記磁気分離装置が流路又は容器を含み、前記磁性素子が前記流路又は前記容器の外側表面に塗布される、発明１に記載の方法。
＜発明１１＞
前記磁気分離装置は容器を含み、そして中空体が前記容器の混合物に導入され、前記中空形状は、前記混合物と接触する外側表面と、磁性素子が除去可能に挿入される内部体積とを有する、発明１に記載の方法。
＜発明１２＞
前記磁気分離装置が流路を含み、そして磁性素子が流路の外側に塗布される、発明１に記載の方法。
＜発明１３＞
分子を含む溶液から前記分子の濃縮画分を製造する方法であって、発明１〜１２のいずれか一の方法を実施することを含む、方法。
＜発明１４＞
分子の大規模分離のためのシステムであって、少なくとも
- 分離される前記分子に親和性を有する磁性粒子（Ｐ）を貯蔵するための貯蔵タンクと、
- 前記磁性粒子（Ｐ）と前記分子を含む溶液とを混合するための反応器と、
- 流路及び少なくとも１種の磁性素子を含む磁気分離装置と、
- 磁性粒子（Ｐ）と前記分子を含む溶液との混合物を輸送するためのポンプと
を含む、システム。
＜発明１５＞
光学濃度監視のための光学濃度センサーを更に含む、発明１２に記載のシステム。
＜発明１６＞
不活性ガスを用いてシステムに加圧するためのガス注入口を更に含む、発明１２に記載のシステム。
＜発明１７＞
分子を含む溶液から前記分子の濃縮画分を製造する方法であって、発明１４〜１６のいずれか一のシステムを利用することを含む、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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