(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３０＋リンパ腫を治療する方法において使用するための、
（ｉ）ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体と、
（ｉｉ）拮抗性の抗ＰＤ‐１抗体、との組み合わせ物。
【請求項２】
前記組み合わせ物は、ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａ単独に対する特異性を有する前記多機能抗体の先天性免疫応答と比較して前記先天性免疫応答を増加させるための方法において使用される請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
増加した前記先天性免疫応答は、腫瘍内への先天性細胞の増加した腫瘍内細胞浸潤である請求項２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞の腫瘍内浸潤が増加させられる請求項３に記載の組み合わせ物。
【請求項５】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の前記腫瘍内浸潤がさらに増加させられる請求項４に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫である請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
前記多機能抗体は、抗ＣＤ３０結合ドメインを含み、前記抗ＣＤ３０結合ドメインは、配列番号２に規定した重鎖可変ドメインおよび配列番号３に規定した軽鎖可変ドメインを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
前記多機能抗体は、抗ＣＤ１６Ａ結合ドメインを含み、前記抗ＣＤ１６Ａ結合ドメインは、配列番号４に規定した重鎖可変ドメインおよび配列番号５に規定した軽鎖可変ドメインを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項９】
前記多機能抗体は、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディである請求項１〜８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
前記二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、配列番号１に規定したアミノ酸配列を有する請求項９に記載の組み合わせ物。
【請求項１１】
抗ＣＤ１３７抗体および抗ＣＴＬＡ‐４抗体からなる抗体の群から選択される免疫チェックポイント分子を調節する別の作用物質を含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１２】
ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する前記多機能抗体、抗ＣＤ１３７抗体および前記抗ＰＤ‐１抗体を含む請求項１１に記載の組み合わせ物。
【請求項１３】
前記多機能抗体は、前記抗ＰＤ‐１抗体の前に投与される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍、特にホジキンリンパ腫（ＨＬ）の治療のための、（ｉ）腫瘍細胞上のＣＤ３０に対する特異性を有し、さらにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＣＤ１６、特にＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体と（ｉｉ）ＰＤ−１アンタゴニスト、例えば抗ＰＤ−１抗体との組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ細胞は、先天性免疫を媒介して構成的に活性化されるので、癌免疫療法のための候補物質である。二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））は、ＣＤ１６Ａを介してＮＫ細胞に結合し、癌特異的標的であるＣＤ３０、例えば、ＣＤ３０＋ホジキン・リード・スタンバーク（Ｈｏｄｇｋｉｎ  Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ：ＨＲＳ）リンパ腫細胞に対する第二結合ドメインを有する。そのようなタンデムダイアボディは、該ＮＫ細胞を動員してＣＤ３０＋腫瘍細胞へリダイレクトし、両方の標的に高親和性で結合して架橋を確立するので、それによりＮＫ細胞が活性化されて腫瘍細胞を殺滅するようにリダイレクトされる。この二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディについては、天然抗体およびＦｃ増強抗体に比較して高い細胞傷害能が報告されている（Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ．２０１４；６（３）：７２７−７３８（非特許文献１）を参照されたい）。当該ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、ホジキンリンパ腫患者において良好に耐容されて活性である（Ｒｏｔｈｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０２４−４０３１（非特許文献２）を参照されたい）。これらの前途有望な結果にもかかわらず、腫瘍を標的とするこのＮＫ細胞誘導免疫療法については、いっそうの改善が望ましい。
【０００３】
免疫チェックポイント分子は、細胞表面タンパク質、例えば、免疫応答の共刺激性もしくは共阻害性経路を調節する受容体である。免疫チェックポイント分子の例は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死１（ＰＤ−１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）もしくはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＫ細胞上の免疫共刺激性分子およびＴＮＦ受容体ファミリーの共刺激性受容体、例えばＣＤ１３７である。
【０００４】
ＰＤ−１（ＰＤＣＤ１もしくはＣＤ２７９）受容体は、共阻害性経路を媒介する。さらにＰＤ−１はＰＤ−Ｌ１に結合して、受容体−リガンドのライゲーション後に共阻害性シグナリングを誘導する。ＰＤ−１経路は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を制限するチェックポイントである（Ｋｅｉｒ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；２６：６７７−７０４（非特許文献３））。該細胞表面上でＰＤ−１リガンドを発現させ、ＰＤ−１＋免疫エフェクター細胞に係合することによって、腫瘍は、免疫応答を回避するために該ＰＤ−１経路を吸収することができる（Ｗｅｂｅｒ  Ｊ，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；３７：４３０−９（非特許文献４）、Ａｎｓｅｌｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５；３７２：３１１−３１９（非特許文献５））。Ｔ細胞応答の該抑制的調節に関係しているＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の該相互作用を遮断するＰＤ−１アンタゴニストは、様々な癌において研究されてきており、ＰＤ−１遮断薬と適応免疫を調節するためのＣＴＬＡ−４遮断薬との組み合わせが提案されてきた（Ｄｏｌａｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ  Ｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．２０１４；２１：２３１−２３７（非特許文献６））。該抗ＰＤ−１抗体であるペンブロリズマブは、応答率によって決定される、ホジキンリンパ腫を有する患者における単施設単剤療法臨床試験において初期臨床有効性を実証した。これらの腫瘍タイプならびに多数の他の進行性充実性腫瘍適応および血液学的悪性腫瘍において、現在臨床試験が進行中である。
【０００５】
さらに、ＮＫ細胞上の該共刺激性分子ＣＤ１３７に結合する抗ＣＤ１３７抗体は、ＮＫ細胞の機能を増強するためにリツキシマブもしくはレナリドミドなどの他のモノクローナル抗体と組み合わせて使用されてきた（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０１３：２４７−２５３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ．２０１４；６（３）：７２７−７３８
【非特許文献２】Ｒｏｔｈｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０２４−４０３１
【非特許文献３】Ｋｅｉｒ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；２６：６７７−７０４
【非特許文献４】Ｗｅｂｅｒ  Ｊ，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０；３７：４３０−９
【非特許文献５】Ａｎｓｅｌｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．２０１５；３７２：３１１−３１９
【非特許文献６】Ｄｏｌａｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ  Ｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．２０１４；２１：２３１−２３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
腫瘍を標的とするこのＮＫ細胞誘導免疫療法については、いっそうの改善が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、腫瘍、特にホジキンリンパ腫（ＨＬ）を治療する方法に使用するための、ＣＤ３０およびＣＤ１６、特にＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体とＰＤ−１アンタゴニスト、特に抗ＰＤ−１抗体との組み合わせが提供される。この組み合わせは、ＮＫ細胞誘導および腫瘍標的多機能抗体と免疫調節因子との組み合わせがＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージおよび樹状細胞に関係する統合免疫応答を介して相乗作用的な抗腫瘍効果を有するので、腫瘍細胞殺滅の増強を生じさせる。そこで、当該併用治療によって、すべての免疫サブポプレーションが活性化され、腫瘍に浸潤するように誘導される。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ二重特異性抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせは、先天性免疫細胞、特にＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞の強化された腫瘍浸潤による初期先天性免疫応答を強化する。自己患者材料、すなわち患者由来異種移植片（ＰＤＸ）および同一ドナー由来の血液由来免疫細胞（ＰＢＭＣ）を使用したホジキンリンパ腫の前臨床動物試験では、樹立された腫瘍が、抗ＰＤＩ抗体を調節する薬剤単独および併用の両方で組み合わせた二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体を用いて治療された。単剤治療はコントロール治療群（無関係ＩｇＧ）と比較した場合に、大多数の分子について腫瘍増殖の有意な減少を証明したが、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６多機能抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせは、増強された抗腫瘍有効性を証明した。ＩｇＧ治療と比較して、ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせで治療された動物では、腫瘍内のＮＫ細胞集団が増加した。治療２日間後（第３０日目）という早期に、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ単剤療法は、腫瘍内でＮＫ細胞およびマクロファージ両方の浸潤を誘導した。この効果は、経時的に強化され、両方の免疫細胞集団は、実験の終了時（第５８日目）に向かって腫瘍の強力な二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ媒介性浸潤を証明した。二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディが免疫調節性抗体抗ＰＤ−１と組み合わされると、先天性免疫への効果は、最初は二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ単独によって駆動されたが、抗ＰＤ−１治療は実験の終了時にはより顕著な先天性細胞浸潤を生じさせた。さらに、ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体だけで治療された動物においてはＴ細胞の少量の増加が見られたが、ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体が免疫チェックポイント分子を調節する物質と組み合わせて治療された動物において検出された細胞傷害性Ｔ細胞は増加した。
【０００９】
抗ＰＤ−１を用いる単剤療法はＴ細胞浸潤をある程度まで誘導するが、抗ＰＤ−１と組み合わせたＣＤ３０／ＣＤ１６抗体は、腫瘍内のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の浸潤を強化した。Ｔ細胞および樹状細胞は、ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体または抗ＰＤ−１のいずれかの単剤療法に比較してＣＤ３０／ＣＤ１６抗体と抗ＰＤ−１との組み合わせによって有意に誘導された（図８Ｂ）。ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体と抗ＰＤ−１との組み合わせは、有益にも投与後短期間で（第３０日目および第４０日目）、該腫瘍内への樹状細胞の浸潤を誘導した。ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体と抗ＰＤ−１との該組み合わせは、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞などのすべての免疫サブポプレーションの腫瘍浸潤をＣＤ３０／ＣＤ１６抗体および抗ＰＤ−１のそれぞれによる単剤療法と比較して有意に増加させた（図８Ｂ）。
【００１０】
このため、（ｉ）ＣＤ３０に対する特異性を有し、ＣＤ１６、特にＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体と（ｉｉ）抗ＰＤ−１抗体との該組み合わせは、腫瘍細胞の殺滅を相乗作用的に増加させ、有意に増加した腫瘍退縮を生じさせる。注目すべき腫瘍退縮は、すべての免疫サブポプレーション、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞ならびに炎症性サイトカイン、例えば特にＩＦＮγの該腫瘍内増加の協調作用、すなわち統合作用によって、ＮＫ細胞誘導多機能抗体および該免疫チェックポイント分子を調節する作用物質の複合活性を通して達成される。本明細書に提供した併用療法は、ＮＫ細胞誘導および腫瘍標的抗体により先天性免疫応答を誘導する有効性を、該ＰＤ−１経路を遮断することによって適応的免疫応答を刺激するために公知である抗ＰＤ−１抗体によって増強できることを初めて証明するものである。
【００１１】
ＣＤ３０およびＣＤ１６、特にＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体とＰＤ−１アンタゴニスト、特にＰＤ−１抗体との組み合わせは、腫瘍、特にホジキンリンパ腫（ＨＬ）を治療する方法において、先天性免疫応答をＣＤ３０およびＣＤ１６Ａ単独に対する特異性を有する多機能抗体の先天性免疫応答に比較して増加させるために使用される。特に、当該先天性免疫応答は、先天性細胞、特にマクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞の腫瘍内への細胞浸潤によって増加させられる。さらに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の当該腫瘍内浸潤が増加させられる。
【００１２】
「先天性免疫応答」は、先天性免疫系（または非特異的免疫系もしくは生まれつきの免疫系）の一つ以上の先天性白血球の該活性化を意味する。当該先天性免疫応答の活性化白血球は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージおよび樹状細胞を含む。当該先天性免疫系は、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞のようなリンパ球を含む適応的免疫系（もしくは特異的免疫系）とは異なる。
【００１３】
「組み合わせ」は、一つの腫瘍、すなわち単一疾患の治療のために二種以上の薬剤を使用する併用療法、複合療法もしくは多剤療法を意味する。本発明では、「組み合わせ」は、一つの腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫の治療のために、ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体、例えば、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディとＰＤ−１アンタゴニスト、例えば抗ＰＤ−１抗体とを投与する該工程を含む併用療法に対して使用される。そこで、当該二重特異性ＣＤ３０／Ｄ１６Ａタンデムダイアボディおよび当該抗ＰＤ−１抗体が組み合わせて投与される。これとは対照的に、「単剤療法」は、単一医薬品単独、例えば、二重特異性ＣＤ３０／Ｄ１６Ａタンデムダイアボディまたは抗ＰＤ−１抗体のいずれかの投与を含む療法を意味する。
【００１４】
当該組み合わせは、腫瘍のＮＫ細胞をベースとする免疫療法に使用するための多機能抗体を含む。本明細書で使用する用語「多機能」は、抗体が二つ以上の異なる生物学的機能を示すことを意味する。例えば、該異なる生物学的機能とは、異なる抗原に対する異なる特異性である。所定の例では、多機能抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性、三重特異性などである。そのような多重特異性、例えば二重特異性の結合タンパク質には、例えば、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭの二重特異性モノクローナル抗体ならびに例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ、タンデム一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）２、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ（商標））、ダイアボディおよびタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）ならびにフレキシボディを含む抗体フラグメントもしくは抗体誘導体が含まれる。本明細書で使用する用語「抗体」は、モノクローナル抗体ならびに抗体結合ドメインを含む抗体フラグメントおよび抗体誘導体を意味する。様々な抗体フォーマットは、天然抗体として類似の抗体結合特異性を有するが、結合ドメインの数もしくはＦｃ領域の欠如に起因して有効性およびエフェクター機能が異なる抗体フラグメントおよび抗体誘導体から生成することができる。二重特異性抗体についての抗体フォーマットの例は、Ｓｐｉｅｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  Ｏｃｔ；６７（２  Ｐｔ  Ａ）：９５−１０６およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ  ２０１５  Ｊｕｌ；２０（７）：８３８−４７に記載されている。
【００１５】
所定の実施形態では、当該多機能抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））である。タンデムダイアボディは、単一ポリペプチド内の二つ以上の異なるＦｖ結合ドメイン由来の重鎖および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）の四つの可変ドメインを連結させることによって構築される。ドメインは、ポリペプチドの二つの分子がヘッドトゥテイル（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）法で整列した場合に、対応するＶＨとＶＬが対合できるように配置される。ドメイン間の短い（アミノ酸１２個以下）リンカーは、Ｆｖの分子内対合を防止する。タンデムダイアボディの抗体フォーマットおよびその製造については、Ｗｅｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２０１５，ｖｏｌ．２０：２７−３２，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９；５６２：１７７−９３またはＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２０７：３２３−３３に記載されている。
【００１６】
所定の実施形態では、最初に、当該多機能抗体、例えば二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディが投与され、続いて免疫調節分子である作用物質、すなわち抗ＰＤ−１抗体が投与される。そこで、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａおよび抗ＰＤ−１抗体は、連続的に、典型的には所定の時間をかけて投与することができる。当該多機能抗体および当該抗ＰＤ−１抗体の投与は、様々な方法で、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、局所もしくは皮内投与によって実施できる。一部の実施形態では、投与経路は療法の種類および医薬組成物中に含有される化合物の種類に依存する。投薬計画は、主治医および他の臨床学的因子によって決定されるであろう。任意の患者一人のための用量は、当該患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間および経路、療法の種類、全身健康状態および同時に投与される他の薬物を含む多数の因子に依存する。「有効量」は、そのような病状の低減もしくは寛解をもたらす、該疾患の経過および該重症度に影響を及ぼすために十分である該有効成分の量を意味する。腫瘍を治療するために有用な「有効量」は、公知の方法を使用して決定することができる。そこで、本発明は、ＣＤ３０＋腫瘍、例えばホジキンリンパ腫に罹患している被験者に有効量の多機能抗体と抗ＰＤ−１（ＰＤ−１抗体）との組み合わせを投与する該工程を含み、このとき当該多機能抗体がＣＤ３０およびＣＤ１６に対する特異性を有する、例えばＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ抗体である治療方法、すなわち併用療法を含む。
【００１７】
多機能抗体を使用して腫瘍へＮＫ細胞を抗体媒介性動員するこの免疫療法的アプローチは、腫瘍、例えばホジキンリンパ腫の該治療のために使用することができる。このため、本発明は、腫瘍、例えばホジキンリンパ腫または未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を治療するための併用療法において使用するためのＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに対する特異性を有する多機能抗体、例えば二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと抗ＰＤ−１抗体との組み合わせを提供する。
【００１８】
所定の実施形態では、当該多機能抗体は、ＣＤ１６アイソフォームであるＣＤ１６Ａに排他的に結合することによりＮＫ細胞を動員する。抗ＣＤ１６Ａ結合ドメインの例およびそれらの生成については、国際公開第２００６／１２５６６８号に記載されている。所定の実施形態では、当該抗ＣＤ１６Ａ結合ドメインは、配列番号４に規定した重鎖可変ドメインのＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに配列番号５に規定した軽鎖可変ドメインのＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでいる。特定の実施形態では、該抗ＣＤ１６Ａ結合ドメインは、配列番号４に規定した重鎖可変ドメインおよび配列番号５に規定した軽鎖可変ドメインを含んでいる。
【００１９】
本発明による多機能抗体のために好適なＣＤ３０抗体結合ドメインの例は、Ａｒｎｄｔ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９４：２５６２−８；Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２００４；１２：８４７−６０およびＲｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ．２０１４；６（３）：７２７−７３８に開示されている。所定の実施形態では、当該抗ＣＤ３０結合ドメインは、改変抗ＣＤ３０  ＩｇＧ  ＨＲＳ−３であり（Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、配列番号２に規定した重鎖可変ドメインのＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに配列番号３に規定した軽鎖可変ドメインのＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んでいる。特定の実施形態では、抗ＣＤ３０は、改変抗ＣＤ３０  ＩｇＧ  ＨＲＳ−３のＦｖ結合ドメインを有しており（Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、配列番号２に規定した重鎖可変ドメインおよび配列番号３に規定した軽鎖可変ドメインを含んでいる。
【００２０】
本発明の所定の実施形態では、当該多機能抗体は、二本の非共有的に関連しているポリペプチド鎖のホモダイマーである二重特異性四価タンデムダイアボディＣＤ３０／ＣＤ１６Ａであり、このとき、タンデムダイアボディポリペプチド鎖のそれぞれは、配列番号１に規定したアミノ酸配列を有する。実施例１は、アイソフォームＣＤ１６Ａに排他的に結合することによりＮＫ細胞を特異的に動員する該ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディについて記載する。タンデムダイアボディは、各抗原に対して二つの結合部位を有するが、Ｆｃドメインを有していない。実施例１のＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、約１０４ｋＤａの分子量を有し、細菌中もしくは哺乳動物細胞中、例えばＣＨＯ中で産生できる。このタンデムダイアボディは、ホジキンリンパ腫細胞上のＣＤ３０を特異的に標的とし、ＣＤ１６Ａに結合することにより、ＮＫ細胞を動員しＮＫ細胞を活性化する。このタンデムダイアボディの構築および産生については、Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ．２０１４；６（３）：７２７−７３８に記載されており、このＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの有効性については、Ｒｏｔｈｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０２４−４０３１に報告されている。
【００２１】
所定の実施形態では、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１抗体もしくはＰＤ−Ｌ１抗体である。ＰＤ−１抗体（抗ＰＤ−１もしくは抗ＰＤ−１抗体）の例としては、ニボルマブ、ペンブロリズマブ（ＭＫ３４７５、Ｋｅｙｔｒｕｄａ）が挙げられ、ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ１抗体）の例は、ピジリズマブである。
【００２２】
多機能ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体、例えば、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ抗体と抗ＰＤ−１抗体との組み合わせは、例えば、ホジキンリンパ腫もしくは未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）などのＣＤ３０＋腫瘍を治療するために使用できる。
【００２３】
所定の実施形態では、最初にＣＤ３０／ＣＤ１６抗体、例えばＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ、例えば二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディが投与され、続いて抗ＰＤ−１抗体が投与される。例えば、抗ＰＤ−１抗体は、当該ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体、例えば二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの投与の１０〜７２時間後、例えば１日後に投与される。
【００２４】
所定の実施形態では、当該組み合わせ、すなわち併用療法は、また別の免疫チェックポイント分子を調節するためのまた別の作用物質、例えば共阻害性経路を遮断するアンタゴニスト抗体または各免疫チェックポイント分子への結合を介して共刺激性経路を誘導するアゴニスト抗体の該投与を含む。そのような抗体は、さらにチェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）もしくはチェックポイントアゴニスト（ＣＰＡ）としても知られており、これまでに記載され、臨床的に試験されてきた。
【００２５】
当該組み合わせ、すなわち併用療法のための別の免疫チェックポイント分子の例は、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ１３７である。
【００２６】
ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞応答を阻害するシグナルを誘導する。当該組み合わせのためのＣＴＬＡ−４抗体の例は、イピリムマブおよびトレメリムマブである。
【００２７】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）もしくはＴＮＦ受容体スーパーファミリー９（ＴＮＦＲＳＦ９）は、免疫細胞の活性化の該調節に関与している腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであるＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する共刺激性受容体である。ＣＤ１３７の機能的役割は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を強化することである。Ｔ細胞応答を強化するＣＤ１３７アゴニスト抗体の例は、ウレルマブである。
【００２８】
所定の実施形態では、本発明による組み合わせ、すなわち併用療法は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＣＤ１３７抗体からなる群から選択される抗体をさらに含む。
【００２９】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＤ１３７抗体の両方の抗体が、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６抗体と組み合わせて投与される。したがって、この所定の実施形態では、当該組み合わせ、すなわち併用療法は、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ４を投与する該工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】クロム遊離アッセイを示す図である。溶解率は、培地単独（抗体なし）または単一抗体（ａＣＤ１３７、ａＰＤｌ、ａＣＴＬＡ４）もしくは複数抗体（ａＣＤ１３７およびａＰＤｌ）（このとき「ａ」は「ａｎｔｉ（抗）」の略語である）中において、予め活性化した精製ＮＫ細胞の培養後に、５１Ｃｒ標識リンパ腫細胞を用いて可変性エフェクター：標的細胞（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）比で決定した。
【図２】クロム遊離アッセイを示す図である。溶解率は、培地単独（抗体なし）または単一抗体（ａＣＤ１３７、ａＰＤｌ、ａＣＴＬＡ４）もしくは複数抗体（ａＣＤ１３７およびａＰＤｌ）（このとき「ａ」は「ａｎｔｉ（抗）」の略語である）中において、予め活性化した精製ＮＫ細胞の培養後に、５１Ｃｒ標識リンパ腫細胞を用いて可変性エフェクター：標的細胞（ＫＡＲＰＡＳ−２９９）比で決定し、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは濃度１ｐＭで使用した。
【図３】インビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。ＡＦＭ１３は、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指す。
【図４】インビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。ＡＦＭ１３は、該ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指す。
【図５】インビンボＰＤＸモデルを示す図である。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ処置マウスではリンパ球が増加した。
【図６Ａ】第３０日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。（Ａ）腫瘍サイズ。ＩｇＧは無関係のコントロールＩｇＧ抗体を指し、ＡＦＭ１３はＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指し、ＡＦＭ２２は無関係のコントロールタンデムダイアボディ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＣＤ１６Ａ）を指し、抗ＰＤ−１はペンブロリズマブを指す。（Ｂ）腫瘍内リンパ球集団。
【図６Ｂ】第３０日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。（Ａ）腫瘍サイズ。ＩｇＧは無関係のコントロールＩｇＧ抗体を指し、ＡＦＭ１３はＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指し、ＡＦＭ２２は無関係のコントロールタンデムダイアボディ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＣＤ１６Ａ）を指し、抗ＰＤ−１はペンブロリズマブを指す。（Ｂ）腫瘍内リンパ球集団。
【図７Ａ】第４４日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。（Ａ）腫瘍サイズ。ＩｇＧは無関係のコントロールＩｇＧ抗体を指し、ＡＦＭ１３はＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指し、ＡＦＭ２２は無関係のコントロールタンデムダイアボディ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＣＤ１６Ａ）を指し、抗ＰＤ−１はペンブロリズマブを指す。（Ｂ）腫瘍内リンパ球集団。
【図７Ｂ】第４４日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。（Ａ）腫瘍サイズ。ＩｇＧは無関係のコントロールＩｇＧ抗体を指し、ＡＦＭ１３はＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指し、ＡＦＭ２２は無関係のコントロールタンデムダイアボディ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＣＤ１６Ａ）を指し、抗ＰＤ−１はペンブロリズマブを指す。（Ｂ）腫瘍内リンパ球集団。
【図８Ａ】第５８日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。（Ａ）腫瘍サイズ。ＩｇＧは無関係のコントロールＩｇＧ抗体を指し、ＡＦＭ１３はＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指し、ＡＦＭ２２は無関係のコントロールタンデムダイアボディ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＣＤ１６Ａ）を指し、抗ＰＤ−１はペンブロリズマブを指す。（Ｂ）腫瘍内リンパ球集団。
【図８Ｂ】第５８日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの結果を示す図である。（Ａ）腫瘍サイズ。ＩｇＧは無関係のコントロールＩｇＧ抗体を指し、ＡＦＭ１３はＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを指し、ＡＦＭ２２は無関係のコントロールタンデムダイアボディ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＣＤ１６Ａ）を指し、抗ＰＤ−１はペンブロリズマブを指す。（Ｂ）腫瘍内リンパ球集団。
【図９】第５８日目の４例のインビンボＰＤＸモデルの腫瘍内サイトカインプロファイルを示す図である。
【図１０Ａ】腫瘍内ヒト白血球プロファイルを示す図である。Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウスへ第０日目にＨＬ患者由来の腫瘍片を植え付け、第２８日目にｉ．ｐ．（腹腔内）注射によって自己患者由来ＰＢＭＣを用いて再構成した。抗体治療は、第２８日に５ｍｇ／ｋｇのＡＦＭ１３もしくはコントロールタンデムダイアボディＡＦＭ２２もしくはＩｇＧのｉ．ｐ．注射で開始し、さらに１日後からの週１回の計３サイクルにわたる抗ＰＤ−１の注射を実施した。第３０日目（Ａ、Ｃ）および第５８日目（Ｂ、Ｄ）にマウスを犠死させ、腫瘍浸潤性ＣＤ３−／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１６３＋マクロファージ（Ａ、Ｂ）もしくはＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤｌｌｃ＋／ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋樹状細胞（Ｃ、Ｄ）を定量した。
【図１０Ｂ】腫瘍内ヒト白血球プロファイルを示す図である。Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウスへ第０日目にＨＬ患者由来の腫瘍片を植え付け、第２８日目にｉ．ｐ．（腹腔内）注射によって自己患者由来ＰＢＭＣを用いて再構成した。抗体治療は、第２８日に５ｍｇ／ｋｇのＡＦＭ１３もしくはコントロールタンデムダイアボディＡＦＭ２２もしくはＩｇＧのｉ．ｐ．注射で開始し、さらに１日後からの週１回の計３サイクルにわたる抗ＰＤ−１の注射を実施した。第３０日目（Ａ、Ｃ）および第５８日目（Ｂ、Ｄ）にマウスを犠死させ、腫瘍浸潤性ＣＤ３−／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１６３＋マクロファージ（Ａ、Ｂ）もしくはＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤｌｌｃ＋／ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋樹状細胞（Ｃ、Ｄ）を定量した。
【図１０Ｃ】腫瘍内ヒト白血球プロファイルを示す図である。Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウスへ第０日目にＨＬ患者由来の腫瘍片を植え付け、第２８日目にｉ．ｐ．（腹腔内）注射によって自己患者由来ＰＢＭＣを用いて再構成した。抗体治療は、第２８日に５ｍｇ／ｋｇのＡＦＭ１３もしくはコントロールタンデムダイアボディＡＦＭ２２もしくはＩｇＧのｉ．ｐ．注射で開始し、さらに１日後からの週１回の計３サイクルにわたる抗ＰＤ−１の注射を実施した。第３０日目（Ａ、Ｃ）および第５８日目（Ｂ、Ｄ）にマウスを犠死させ、腫瘍浸潤性ＣＤ３−／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１６３＋マクロファージ（Ａ、Ｂ）もしくはＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤｌｌｃ＋／ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋樹状細胞（Ｃ、Ｄ）を定量した。
【図１０Ｄ】腫瘍内ヒト白血球プロファイルを示す図である。Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウスへ第０日目にＨＬ患者由来の腫瘍片を植え付け、第２８日目にｉ．ｐ．（腹腔内）注射によって自己患者由来ＰＢＭＣを用いて再構成した。抗体治療は、第２８日に５ｍｇ／ｋｇのＡＦＭ１３もしくはコントロールタンデムダイアボディＡＦＭ２２もしくはＩｇＧのｉ．ｐ．注射で開始し、さらに１日後からの週１回の計３サイクルにわたる抗ＰＤ−１の注射を実施した。第３０日目（Ａ、Ｃ）および第５８日目（Ｂ、Ｄ）にマウスを犠死させ、腫瘍浸潤性ＣＤ３−／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびＣＤ１１ｂ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１６３＋マクロファージ（Ａ、Ｂ）もしくはＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤｌｌｃ＋／ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋樹状細胞（Ｃ、Ｄ）を定量した。
【実施例】
【００３１】
ＣＤ１３７共刺激性および／または遮断性ＰＤ−１は、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディによるＮＫ細胞媒介性標的細胞溶解を増強する
方法：
有効性は、ヒトＰＢＭＣ、濃縮ＮＫおよびＣＤ３０＋標的細胞ならびに細胞系を用いてインビトロで、およびＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＤ１３７抗体を用いて患者由来異種移植片インビボモデルで評価した。
【００３２】
ＣＤ３０＋リンパ腫細胞系に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を評価するために、クロム（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ）遊離試験を次のように実施した：ＰＢＭＣは、１：１の比率で抗ＣＤ３０（１０μｇ／ｍＬ）および照射（５，０００ラッド）ＣＤ３０＋リンパ腫腫瘍細胞と共に２４時間培養した。２４時間後、ＮＫ細胞は、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＮＫ細胞単離ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する負磁気細胞ソーティングによってこれらの培養から単離した。ＮＫ細胞をクロム遊離アッセイの前に純度について評価した（フローサイトメトリーによって９０％超の純度であると定義された）。標的細胞は、２時間にわたり細胞１×１０６個につき１５０μＣｉの５１Ｃｒで標識した。溶解率は、培地単独中または単一抗体もしくは複数抗体中で、予め活性化した精製ＮＫ細胞の培養４時間後に、５１Ｃｒ標識リンパ腫細胞を用いて可変性エフェクター：標的細胞比で決定した。
【００３３】
Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス（ｎ〜１００）におけるＣＤ３０＋リンパ腫（ホジキン病を含む）であると新規に診断された患者の外科標本由来の異種移植腫瘍片（８×８ｍｍ）について移植を観察し、類似サイズ（０．５ｃｍ２）の移植を備える８０匹までのマウスを第２８日目に８群までに無作為割り付けした。自己ＰＢＭＣを第２８日目に腹腔内注入した（２×１０６ＰＢＭＣ／マウス）。療法は第２８日目に開始し、週１回、計３回の腹腔内注射を継続し、全投与量は１５ｍｇ／ｋｇとなった。併用療法については、抗ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ（ＡＦＭ１３；Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ．２０１４；６（３）：７２７−７３８）を第２８日に投与し、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、抗ＣＤ１３７（ウレルマブ）もしくは抗ＰＤ１（ペンブロリズマブ）を第２９日目に投与した。腫瘍サイズは、第５６日目に群間で比較した。免疫表現型検査のためには第５８日目に全マウスを犠死させたが、元の腫瘍サイズ（およそ３．５ｃｍ２）の７００％への増殖のために１群につき一回は安楽死を必要とした。
【００３４】
腫瘍浸潤性ヒトリンパ球、骨髄細胞および腫瘍内サイトカインは、第３０、４４および５８日目に、すなわち治療開始２、１６および３０日後に評価した。該下記のバイオマーカーを決定した。ＮＫ細胞浸潤は、ＣＤ３−およびＣＤ５６＋として決定した。Ｔ細胞浸潤は、ＣＤ２５＋およびＣＤ４＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋、ＣＤ３＋およびＣＤ８＋として決定した。ＮＫ細胞サブセットは、ＣＤ５６ｄｉｍ、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ６９として決定した；マクロファージは、ＣＤ１１ｂ、ＨＬ−ＤＲおよびＣＤ１６３として決定した。樹状細胞は、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０およびＣＤ８６によって決定した（図６Ｂ、７Ｂおよび８Ｂ）。
【００３５】
ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、Ｒｅｕｓｃｈ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ．２０１４；６（３）：７２７−７３８に記載された抗体ＡＦＭ１３である。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、ハイブリドーマＨＲＳ−３の抗ＣＤ３０ドメインを含み、その構造および細菌中の発現は、国際公開第２００６／１２５６６８号の実施例１９に開示されている。
【００３６】
結果：
ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、他のＣＤ３０＋抗体フォーマットに比較して標的およびエフェクター細胞に対するより高い効力および有効性を証明した（ＥＣ５０＝１５ｐＭ）。これらの好都合な特性は、ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディがＣＤ３０＋腫瘍細胞および濃縮ＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に極めて優れた細胞傷害性を生じさせた（図２）。準最適濃度（１ｐＭ）でＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを用いる単剤治療は、濃縮ＮＫ細胞を使用して４０％までのＣＤ３０＋リンパ腫細胞のエフェクター対標的細胞依存性溶解を誘導した。免疫調節抗体単独は、実質的により低い溶解（＜２５％）を媒介した（図１）。しかし、抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＤ１３７のＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディへの該添加は、特異的溶解率を７０％まで強度に増強したが、他方、抗ＣＴＬＡ−４のＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディへの該添加は有益な作用を全く示さなかった。有効性の最も印象的な増加は、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディが抗ＰＤ−１および抗ＣＤ１３７の組み合わせと一緒に適用された場合に観察された（図２）。インビボでは、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと免疫調節抗体との組み合わせの相乗作用は、試験した各免疫調節抗体を用いて観察され、抗ＰＤｌ（９／１０例の腫瘍における退縮）、抗ＣＴＬＡ−４（３／１０例）および抗ＣＤ１３７ｍＡｂ（３／１０例）を用いると増強され、調節性Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＴｈ１サイトカインの存在によって影響を受けた（図３および４）。
【００３７】
ＩｇＧ治療と比較して、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１およびＣＤ１３７との組み合わせで治療された動物では、該腫瘍内の該ＮＫ細胞集団が増加したことが確認された。さらに、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディのみ、または抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１および抗ＣＤ１３７単独を用いて治療された動物においてＴ細胞の増加は見られなかったが、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１および抗ＣＤ１３７とを組み合わせて治療された動物で検出された該細胞傷害性Ｔ細胞は増加した（図５）。
【００３８】
これらの所見は、二重抗体療法がＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと免疫調節抗体が顕著な腫瘍退縮を達成する有効性を強化することを裏付けている。
【００３９】
免疫調節抗体と組み合わせた場合のＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの該強化された抗腫瘍活性は、極めて多数の腫瘍浸潤性ＮＫ細胞およびＴ細胞ならびに前炎症性サイトカインの遊離増加と関連していた。コントロールＩｇＧもしくは無関係のＣＤ１６Ａ動員タンデムダイアボディを用いた治療は、非特異的免疫細胞活性化を誘導しなかったので、これはＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディによるＮＫ細胞活性化が厳密に標的依存性であることを支持している。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと免疫調節性抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ１３７および抗ＰＤ−１抗体との組み合わせは、ＮＫ細胞の該抗腫瘍活性を強化しただけではなく、さらに該腫瘍内のＴ細胞浸潤およびサイトカイン遊離も刺激したので、これは先天性免疫と適応免疫とのクロストークを支持している。
【００４０】
上記と同一ＰＤＸモデルおよび抗ＰＤ−１（ペンブロリズマブ）を用いたまた別の実験では、腫瘍サイズ、腫瘍浸潤性ヒトリンパ球、骨髄細胞および腫瘍内サイトカインを第３０、４４および５８日目に、すなわち治療開始２、１６および３０日後に評価した。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを用いた単剤療法は抗ＰＤ−１を用いた単剤療法より再現性がありより効力が高く、両剤を組み合わせた場合には相乗作用が観察された。第５８日目の腫瘍の分析は、腫瘍増殖阻害（図８Ａ）と腫瘍浸潤性ＮＫ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞（図８Ｂ）および腫瘍内サイトカイン、例えばＩＦＮγ（図９）のレベルとの強力な相関を明らかにした。Ｔ細胞浸潤しか誘導しなかった抗ＰＤ−１単剤療法とは対照的に、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを用いた単剤療法は、該腫瘍内のＮＫ細胞およびＴ細胞の浸潤を誘導することができたが、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと抗ＰＤ−１との該組み合わせはＮＫ細胞およびＴ細胞両方の浸潤をいっそう強化した。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、抗ＰＤ−１よりもマクロファージの強力な浸潤を生じさせ、この浸潤はさらに両剤の該組み合わせによって増加したので（図８Ｂ）、このため先天性免疫と適応免疫との間のクロストークをいっそう支持している。さらに、第３０日目（図６Ｂ）と第４４日目（図７Ｂ）の早期の時点での腫瘍分析は、初期免疫応答がＮＫ細胞の浸潤および活性化ならびにマクロファージの浸潤を特徴とすることを証明したが、他方Ｔ細胞および活性化樹状細胞による適応免疫応答は第５８日目の方がより顕著であった（図８Ｂ）。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディと抗ＰＤ−１との組み合わせは、全免疫サブポプレーションの浸潤および活性化を強化する（図８Ｂ）。治療２日間後（第３０日目）という早期に、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ単剤療法は、腫瘍内でＮＫ細胞およびマクロファージ両方の浸潤を誘導した。この効果は、経時的に強化され、両方の免疫細胞集団は、実験の終了時（第５８日目）に向けて腫瘍の強力なタンデムダイアボディ媒介性浸潤を証明した。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディが免疫調節性抗体である抗ＰＤ−１と組み合わされると、先天性免疫への該効果は、最初はタンデムダイアボディ単独によって駆動されたが、実験の終了時には抗ＰＤ−１治療がより顕著な先天性細胞浸潤を生じさせた（図１０）。
【００４１】
要約すると、これらのデータは、ホジキンリンパ腫ＰＤＸモデルにおいてＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディを抗ＰＤ−１チェックポイント遮断薬と組み合わせた場合に、腫瘍浸潤性リンパ球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび樹状細胞）によって媒介される強力な抗腫瘍効果を証明している。したがって、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディによって誘導される初期抗腫瘍応答は、例えばＮＫ細胞およびマクロファージなどの先天性免疫細胞の動員および活性化によって駆動され、それらの活性化が先天性免疫と、例えば効率的な腫瘍増殖制御と相関するＣＤ４およびＣＤ８＋Ｔ細胞などの適応免疫との間のクロストークを生じさせる。これらの観察所見は、さらに例えばＩＦＮγもしくはＴＮＦαなどの腫瘍内サイトカインの遊離とも相関している。
【００４２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006609784.tif 000009
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【配列表】
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