(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
太陽光の照射によって減少する皮膚細胞内の抗菌性ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＭＰｓ）の発現量およびＳ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の、対象物質による変化を測定するステップを含む太陽光遮断機能測定方法であって、
前記方法は、前記変化を測定するステップの前に、
前記対象物質を太陽光透過性物質に塗布するステップと、
単離された皮膚細胞を前記太陽光透過性物質の下部に位置させた後、前記太陽光透過性物質の上部に太陽光を照射するステップとをさらに含み、
前記太陽光は、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）であり、
前記抗菌性ペプチドは、ＨＢＤ（Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ）‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ（Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）‐３７、ソライアシン（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）およびリボ核酸加水分解酵素（ＲＮａｓｅ）７のうち一つ以上である、
太陽光遮断機能測定方法。
【請求項２】
前記変化を測定した結果、対象物質によって皮膚細胞内抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の減少が抑制されれば、太陽光遮断機能があるものと判定する太陽光遮断機能性物質スクリーニングステップをさらに含む、請求項１に記載の太陽光遮断機能測定方法。
【請求項３】
前記変化を測定した結果、対象物質によって前記抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の減少が抑制される程度が大きいほど、太陽光遮断機能が高いものと判定する太陽光遮断効能評価ステップをさらに含む、請求項１に記載の太陽光遮断機能測定方法。
【請求項４】
前記太陽光透過性物質は、石英板（Ｑｕａｒｔｚ  Ｐｌａｔｅ）または帯域透過フィルタ（Ｂａｎｄ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）である、請求項１に記載の太陽光遮断機能測定方法。
【請求項５】
前記単離された皮膚細胞は、角質分化形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびメラニン形成細胞（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）のうち一つ以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の太陽光遮断機能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載された内容は、皮膚細胞における特定の遺伝子の発現変化を通じて太陽光遮断機能を測定する方法、具体的に、太陽光遮断機能性物質をスクリーニングする方法または太陽光遮断効能を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽光（太陽エネルギー）は、光の波長が長い方から順にラジオ波、超短波、赤外線、可視光線、紫外線、Ｘ線、およびγ線などからなっている。そして、太陽光の皮膚に対する否定的な影響が知られていく中で、こうした太陽光から皮膚を保護するための多くの製品が開発されている。
【０００３】
しかし、上述したように、太陽光には多様な波長の電磁波が存在するにもかかわらず、現在、大部分の太陽光遮断効能は、紫外線をどれだけ効果的に遮断することができるかどうかによってのみ判断されている。これにより、太陽光遮断製品の効能評価も、紫外線遮断の程度を評価する指標である、「ＳＰＦ（ｓｕｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）」と呼ばれるＵＶＢ領域（２９０〜３２０ｎｍ）が誘導する紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ）および「ＰＡ（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＶＡ）」と呼ばれるＵＶＡ領域（３２０〜４００ｎｍ）が誘導する黒化（Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｄａｒｋｅｎｉｎｇ）現象を、実験者が肉眼で観察する方法を通じてのみ行われている。すなわち、実際のところ太陽光において紫外線が占める比重は非常に少なく、また、太陽光には他の波長領域の電磁波がより多くの比重を占めているにもかかわらず、前記ＳＰＦとＰＡを通じた紫外線遮断効能以外に、他の波長を有する大部分の太陽光の遮断効能を確認することができないという問題がある。
【０００４】
実際に市販されている大部分の太陽光遮断製品の場合、前記のようなＳＰＦとＰＡで表示される紫外線遮断指数のみに焦点を当てて開発されてきており、その結果、可視光に対する太陽光遮断またはこれを利用する技術の開発は不十分であるという実情である。
【０００５】
また、前記のような太陽光遮断製品は、可視光線の中で最も皮膚の損傷を多く誘導する４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト領域を含む可視光に対する太陽光遮断機能が非常に不十分であるにもかかわらず、現在、前記ブルー／バイオレットライトの遮断効能を評価することのできるいかなる遮断指標も設定されていないため、これを確認することができないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許公報第１０‐０１５１６３５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一側面は、太陽光、具体的に、ブルー／バイオレットライトの遮断機能を測定して、太陽光遮断機能物質をスクリーニングすることができる方法、または太陽光遮断効能を評価することができる太陽光遮断効能評価方法を提供することである。また、本発明の他の一側面は、前記方法によりブルー／バイオレットライトを遮断することができる組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記の目的を達成するために、  本発明の一具現例は、太陽光の照射によって減少する皮膚細胞内の抗菌性ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＭＰｓ）の発現量およびＳ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の、対象物質による変化を測定するステップを含む、太陽光遮断機能測定方法を提供する。
【０００９】
また、本発明の一具現例は、前記変化を測定した結果、対象物質によって皮膚細胞内抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の減少が抑制されれば、太陽光遮断機能があるものと判定する太陽光遮断機能性物質スクリーニングステップをさらに含む、太陽光遮断機能測定方法を提供する。
【００１０】
また、本発明の他の一具現例は、前記変化を測定した結果、対象物質によって前記抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の減少が抑制される程度が大きいほど、太陽光遮断機能が高いものと判定する太陽光遮断効能評価ステップをさらに含む、太陽光遮断機能測定方法を提供する。
【００１１】
また、本発明の一具現例は、太陽光のうち４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）による皮膚細胞内抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち一つ以上の減少を抑制させる物質を有効成分として含む、太陽光遮断用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明による測定方法は、太陽光が皮膚に照射されると、皮膚細胞内抗菌性ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＭＰｓ）の発現量およびＳ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量が減少するようになることを明らかにし、これを対象物質の太陽光遮断機能を測定するためのパラメータとして利用することにより、肉眼評価を通じて紫外線遮断の程度を評価していた既存の方法とは異なり、正確かつ客観的に太陽光遮断の程度を測定および判断することができる。本発明による測定方法は、紫外線遮断指数のみを提供していた既存の太陽光遮断効能評価方法とは異なり、可視光線のうち最も皮膚の損傷を多く誘導する４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライトの遮断の有無まで判別することができ、より細分化された太陽光遮断効能評価結果を提供することができ、これを利用して太陽光遮断の程度を指数化することが可能である。
【００１３】
また、本発明は、前記のような方法で太陽光遮断機能があるものと判断された物質を有効成分として含むことにより、既存の紫外線遮断用組成物と差別化されて４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライトまで遮断することができる用途の組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐１の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図１ｂ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐２の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図１ｃ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐３の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図１ｄ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＬＬ‐３７の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図１ｅ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＰｓｏｒｉａｓｉｎの遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図１ｆ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＤｅｒｍｃｉｄｉｎの遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図１ｇ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＲＮａｓｅ７の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）の、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）を比較したグラフを示したものである。
【図２ａ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐１の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ）の、ＵＶ（紫外線）照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（ＵＶ）、ならびに照射強度による変化を比較したグラフを示したものである。
【図２ｂ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐２の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ）の、ＵＶ（紫外線）照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（ＵＶ）、ならびに照射強度による変化を比較したグラフを示したものである。
【図２ｃ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐３の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ）の、ＵＶ（紫外線）照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（ＵＶ）、ならびに照射強度による変化を比較したグラフを示したものである。
【図２ｄ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＰｓｏｒｉａｓｉｎの遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ）の、ＵＶ（紫外線）照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（ＵＶ）、ならびに照射強度による変化を比較したグラフを示したものである。
【図２ｅ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＤｅｒｍｃｉｄｉｎの遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ）の、ＵＶ（紫外線）照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（ＵＶ）、ならびに照射強度による変化を比較したグラフを示したものである。
【図２ｆ】本発明の一具現例として使用される抗菌性ペプチドであるＲＮａｓｅ７の遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ）の、ＵＶ（紫外線）照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（ＵＶ）、ならびに照射強度による変化を比較したグラフを示したものである。
【図３ａ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、ＨＢＤ‐１の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図３ｂ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、ＨＢＤ‐２の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図３ｃ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、ＨＢＤ‐３の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図３ｄ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、ＬＬ‐３７の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図３ｅ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎの遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図３ｆ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ（図３ｆ）の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図３ｇ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を処理した場合の、ＲＮａｓｅ７の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ａ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、ＨＢＤ‐１の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ｂ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、ＨＢＤ‐２の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ｃ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、ＨＢＤ‐３の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ｄ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、ＬＬ‐３７の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ｅ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎの遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ｆ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎの遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図４ｇ】ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理し、これとともに酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯと活性酸素種スカベンジャー（ＲＯＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＮＡＣをそれぞれ処理したときの、ＲＮａｓｅ７の遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（−）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較したグラフを示したものである。
【図５】ヒト正常角質皮膚細胞にブルー／バイオレットライトを照射した場合の、Ｓ‐ニトロシル化されたタンパク質（ＳＮＯ‐ｐｒｏｔｉｅｎｓ）生成量の変化を比較した結果（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの様子）を示したものである。
【図６】ヒト正常角質皮膚細胞に紫外線を照射した場合の、Ｓ‐ニトロシル化されたタンパク質（ＳＮＯ‐ｐｒｏｔｉｅｎｓ）生成量の変化を比較した結果（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの様子）を示したものである。
【図７ａ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＨＢＤ‐１の発現量を比較したグラフを示したものである。
【図７ｂ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＨＢＤ‐２の発現量を比較したグラフを示したものである。
【図７ｃ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＨＢＤ‐３の発現量を比較したグラフを示したものである。
【図７ｄ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＬＬ‐３７の発現量を比較したグラフを示したものである。
【図７ｅ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＰｓｏｒｉａｓｉｎの各発現量を比較したグラフを示したものである。
【図７ｆ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＤｅｒｍｃｉｄｉｎの発現量を比較したグラフを示したものである。
【図７ｇ】ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）の、実施例１〜３のＲＮａｓｅ７の発現量を比較したグラフを示したものである。
【図８】ブルー／バイオレットライトを照射した場合の、実施例１および３のＳ‐ニトロシル化されたタンパク質（ＳＮＯ‐ｐｒｏｔｉｅｎｓ）生成量の変化を比較した結果（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの様子）を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「太陽光（ｓｕｎｌｉｇｈｔ）」とは、紫外線だけでなく、ラジオ波、超短波、赤外線、可視光線、Ｘ線およびγ線など、太陽光のすべての波長を含む最広義の概念である。また、本明細書において「皮膚細胞」とは、動物の体表を覆う組織の細胞を意味するものであって、顔または体などの体表を覆う組織だけでなく、頭皮や毛髪に存在する細胞を含む最広義の概念である。
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明の一具現例は、太陽光の照射によって減少する皮膚細胞内の抗菌性ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＭＰｓ）の発現量およびＳ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の、対象物質による変化を測定するステップを含む、太陽光遮断機能測定方法を提供する。
【００１８】
また、本発明の一具現例は、前記変化を測定した結果、対象物質により皮膚細胞内抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の減少が抑制されれば、太陽光遮断機能があるものと判定する太陽光遮断機能性物質スクリーニングステップをさらに含む、太陽光遮断機能測定方法を提供する。
【００１９】
また、本発明の他の一具現例は、前記変化を測定した結果、対象物質により前記抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の減少が抑制される程度が大きいほど、太陽光遮断機能が高いものと判定する太陽光遮断効能評価ステップをさらに含む、太陽光遮断機能測定方法を提供する。
【００２０】
一具現例による本発明の太陽光遮断機能測定方法において照射される前記太陽光は、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を含む。また、前記太陽光は、２９０〜４００ｎｍの波長の紫外線をさらに含んでよい。
【００２１】
一具現例によると、前記太陽光、具体的に、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライトは、前記抗菌性ペプチド（ＡＭＰｓ）の発現量を減少させる。また、前記ブルー／バイオレットライトは、各種サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）およびそれと関連する遺伝子、タンパク質としてＲＡＮＴＥＳ（Ｈｕｍａｎ  ＣＣＬ５）、ＣＣＬ  ２（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｌｉｇａｎｄ  ２）、ＩＬ‐６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐６）、ＩＬ‐８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐８）、ＴＮＦ‐α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ‐α）、ＣＯＸ‐２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ‐２）などの発現量を減少させ得る。
【００２２】
具体的に、前記抗菌性ペプチドは、小さな分子量を持つタンパク質であって、バクテリア、ウイルスおよびカビといった病原菌による感染を予防する抗菌活性を有する。前記抗菌性ペプチドは、血管新生、創傷治癒および化学走性を誘導するものと報告されており、正電荷を帯び、親水性および疎水性部位を同時に持っている構造的な特徴がある。一具現例として、前記抗菌性ペプチド（ＡＭＰｓ）は、ＨＢＤ‐１（Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ‐１，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＰ＿００５２０９、ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＰ＿００５０２９．１  ＧＩ：４８８５１８１）、ＨＢＤ‐２（Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ‐２，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＰ＿００４９３３、ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＰ＿００４９３３．１  ＧＩ：４８２６６９２）、ＨＢＤ‐３（Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ‐３，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＡＧ０２２３７，ＶＥＲＳＩＯＮ  ＡＡＧ０２２３７．１  ＧＩ：４９９３１６２７）、ＬＬ‐３７（Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ‐３７，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＰ＿００４３３６，ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＰ＿００４３３６．３  ＧＩ：３４８０４１３１４）ソライアシン（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＡＡ６０２１０，ＶＥＲＳＩＯＮ  ＡＡＡ６０２１０．１  ＧＩ：１９０６６８）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＰ＿４４４５１３，ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＰ＿４４４５１３．１  ＧＩ：１６７５１９２１）とリボ核酸加水分解酵素７（ＲＮａｓｅ  ７，ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＣＡＣ８４４５８，ＶＥＲＳＩＯＮ  ＣＡＣ８４４５８．１  ＧＩ：４０６４３２３５）のうち一つ以上を含んでよい。
【００２３】
一具現例による本発明の太陽光遮断機能測定方法に使用される前記ＨＢＤ（Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ）‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ（Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）‐３７、ソライアシン（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）、リボ核酸加水分解酵素（ＲＮａｓｅ）７は、先天免疫因子として皮膚、消化器、呼吸器、眼球結膜に存在し、グラム陽／陰性細菌や真菌、ウイルスを殺したり、成長を抑制したりする。これらは、角質形成細胞以外に、皮膚の汗腺や皮脂腺の分泌物に存在し、汗や皮脂を通じて皮膚表面に分泌され、沈着して抗菌バリアの形成に寄与する。また、前記抗菌性ペプチドは、紫外線照射時には、ブルー／バイオレットライト照射時とは反対に、発現量が増加する特性を持っている。前記紫外線に対する抗菌性ペプチドの発現特性は、Ｇｌａｓｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．ＵＶ‐Ｂ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｍａｙ；１２３（５）：１１１７‐２３．に記載されており、前記文献は、その全体が本明細書に参考として統合される。
【００２４】
Ｓ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質は、紫外線照射時に発現量が増加するが、本発明の他の一具現例よると、前記太陽光、具体的に、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライトは、前記Ｓ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量を減少させる。具体的に、生体内の多くの機能と関連付けられている窒素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）は、活性システイン残基と反応してタンパク質のＳ‐ニトロシル化を生成することができ、タンパク質のリン酸化過程のように、タンパク質のＳ‐ニトロシル化は、タンパク質活性等の細胞信号伝達を調節することができる。そして、前記ブルー／バイオレットライトは、生体内で正常的にニトロシル化、すなわち、前記のようにＳ‐ニトロシル化されているタンパク質から窒素酸化物（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ）を切り離す脱ニトロシル化（Ｄｅ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を誘導することができる。そして、ブルー／バイオレットライトによって前記のようにＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量が減少すると、抗菌性ペプチド（ＡＭＰｓ）も減少し得る。
【００２５】
前記抗菌性ペプチドの遺伝子またはＳ‐ニトロシル化のタンパク質の発現水準は、たとえば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、ノーザンブロット（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ）分析、酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ‐ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、サンドイッチ測定法、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）、免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｅｂｌｏｔ）、免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、ビオチン‐スイッチアッセイ（Ｂｉｏｔｉｎ‐ｓｗｉｔｃｈ  ａｓｓａｙ）、およびこれらの組み合わせからなる群より選択された方法によって測定されてよい。
【００２６】
また、一具現例として、本発明による方法は、前記変化を測定するステップの前に、対象物質を太陽光透過性物質に塗布するステップ、および皮膚細胞を前記太陽光透過性物質の下部に位置させた後、太陽光透過性物質の上部に太陽光を照射するステップをさらに含んでよい。
【００２７】
前記太陽光透過性物質は、太陽光、すなわち、前記紫外線またはブルー／バイオレットライトを透過させるとともに、測定対象物質の塗布が可能な物性を持つものであればすべて使用が可能であり、たとえば、石英板（Ｑｕａｒｔｚ  Ｐｌａｔｅ）または目標とする光線領域のみ透過させる帯域透過フィルタ（Ｂａｎｄ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）などを使用してよいが、これらに限定されない。このとき、前記対象物質は、太陽光遮断効能を評価するための物質として、人間の皮膚に適用する物質であれば、化粧品、薬品、繊維などのように、これを含む製品や剤形に限定されず、すべて含む。
【００２８】
一具現例による本発明の太陽光遮断機能測定方法において使用される前記皮膚細胞は、ヒトまたは動物由来の皮膚細胞をすべて使用してよく、たとえば、角質分化形成細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびメルケル細胞（Ｍｅｒｋｅｌ  ｃｅｌｌ）といったメラニン形成細胞（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）のうち一つ以上を使用してよいが、これらに限定されない。
【００２９】
前記のように、皮膚細胞内抗菌性ペプチドの発現量および／またはＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量が減少する場合、皮膚の免疫力が低下して、各種の皮膚トラブル、疾病などが発生するだけでなく、これにより、皮膚保湿能が低下して老化が促進されるため、皮膚の美容にも好ましくない。しかし、本発明の太陽光遮断機能測定方法によれば、ブルー／バイオレットライトを遮断することができる太陽光遮断機能性物質をスクリーニングし、これを開発することにより、前記のようなブルー／バイオレットライトによって誘導される皮膚の否定的な効果を防止することができる。本発明によれば、ブルー／バイオレットライトを遮断する効能の程度を客観的に評価することができるので、これを指数化することも可能である。さらに、前記のような本発明によるスクリーニングおよび効能評価方法を使用して、ブルー／バイオレットライトの遮断に有用な物質を発掘し、これを皮膚に適用する場合、抗菌性ペプチドの減少が遮断されるので、自然免疫の減少も遮断されて免疫力を増加させることができるだろう。
【００３０】
また、本発明の他の一具現例は、ブルー／バイオレットライトによる抗菌性ペプチド量の減少を防止するために、太陽光のうち４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライトを遮断する有効成分、具体的に、ブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）による皮膚細胞内抗菌性ペプチドの発現量およびＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量のうち１つ以上の変化を抑制させる物質を有効成分として含む太陽光遮断用組成物を提供することができる。具体的に、前記抗菌性ペプチドは、ＨＢＤ（Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ‐ｄｅｆｅｎｓｉｎ）‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ（Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）‐３７、ソライアシン（Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、ダームシジン（Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ）およびリボ核酸加水分解酵素（ＲＮａｓｅ）７のうち一つ以上を例として挙げることができる。前記組成物の有効成分は、上述された本発明の具現例による太陽光遮断機能測定方法により太陽光遮断機能が測定された対象物質であってよい。前記有効成分は、たとえば、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）およびチノソーブのうち１種以上を含んでよく、この他、サンスクリーン製品に含まれる太陽光を遮断する成分であれば、制限なく使用してよい。
【００３１】
以下、試験例、実施例および比較例を挙げつつ、本発明の構成および効果についてより具体的に説明する。しかし、これらの試験例、実施例および比較例は、本発明の理解を助けるために例示の目的にのみ提供されたものであるだけで、本発明の範疇および範囲が下記の試験例、実施例および比較例により制限されるものではない。
【００３２】
［試験例１］
本発明の一具現例として、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を皮膚細胞に照射した時の、抗菌性ペプチドの発現量の変化を測定する実験を、下記のとおり実施した。
【００３３】
まず、本発明において使用されるヒト正常角質皮膚細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）は、常用的に確保されて勧奨される方法で、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液は、ロンザ社のマニュアルに従って培養した。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブリットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）２ｍｌ、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）０．５ｍｌ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）０．５ｍｌ、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）０．５ｍｌ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．５ｍｌ、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．５ｍｌ、および硫酸ゲンタマイシン＋アンホテリシン‐Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００）０．５ｍｌを添加して使用した。
【００３４】
その次に、前記ヒト正常角質皮膚細胞が培養された培地に、４００〜５００ｎｍのブルー／バイオレットライト（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射した後、ヒト正常角質皮膚細胞の培養液を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、その後トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞内のＲＮＡを分離した。
【００３５】
分離されたＲＮＡを、キアジェン社のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｔ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）でもう一度精製した後、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用して前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ：ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて定量的に分析した。
【００３６】
ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の各発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(登録商標)  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して、ブルー／バイオレットライトが誘導する皮膚の遺伝子変化をリアルタイムＰＣＲで評価し、その結果を図１ａ〜図１ｇに示した。このとき、各遺伝子増幅のために使用したプライマーは、下記表１のとおりである。
【００３７】
【表１】
0006594992.tif 000002
【００３８】
その結果、図１ａ〜図１ｇに示されたところのように、先天免疫遺伝子、すなわち抗菌性ペプチドであるＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ、Ｄｅｒｍｃｉｄｉｎ、ＲＮａｓｅ７のすべてについて、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）よりも照射後（Ｂｌｕｅ）において各遺伝子発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｌｅｖｅｌ）が減少することが分かる。これは、ブルー／バイオレットライトの代わりに紫外線（１０，３０ｍＪ）を照射したことを除き、前記実験と同一の条件および方法で実施した実験の結果、紫外線照射時には、生体内のＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ、ＤｅｒｍｃｉｄｉｎおよびＲＮａｓｅ７の発現量が照射強度の増加に伴って増加したことと対比される結果である（図２ａ〜図２ｆを参照）。これは、同じ太陽光であっても、その波長に応じて皮膚に対する作用が異なり、前記のような抗菌性ペプチドを、ブルー／バイオレットライト遮断機能を測定し、その有効性を評価するための指標として使用することができることを意味する。
【００３９】
［試験例２］
本発明の一具現例として、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を皮膚細胞に照射した時の、抗菌性ペプチドの発現量の変化を測定する実験を、下記のとおり実施した。
【００４０】
まず、本発明において使用されるヒト正常角質皮膚細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）は、常用的に確保されて勧奨される方法で、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液は、ロンザ社のマニュアルに従って培養した。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブリットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）２ｍｌ、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）０．５ｍｌ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）０．５ｍｌ、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）０．５ｍｌ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．５ｍｌ、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．５ｍｌ、および硫酸ゲンタマイシン＋アンホテリシン‐Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００）０．５ｍｌを添加して使用した。
【００４１】
その次に、前記ヒト正常角質皮膚細胞が培養された培地に、４００〜５００ｎｍのブルー／バイオレットライト（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射した後、ヒト正常角質皮膚細胞の培養液を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、その後トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞内のＲＮＡを分離した。
【００４２】
このとき、前記ブルー／バイオレットライト（１０Ｊ／ｃｍ２）の照射前と後でウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するために、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃとフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ，ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を処理した。
【００４３】
その次に、分離されたＲＮＡを、キアジェン社のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｔ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）でもう一度精製した後、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用して前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ：ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて定量的に分析した。
【００４４】
ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の各発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(登録商標)  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して、ブルー／バイオレットライトが誘導する皮膚の遺伝子変化をリアルタイムＰＣＲで評価し、その結果を図３ａ〜図３ｇに示した。このとき、各遺伝子増幅のために使用したプライマーは、前記表１のとおりである。
【００４５】
図３ａ〜図３ｇは、ヒト正常角質皮膚細胞にウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するためにＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃとフラジェリンを処理した場合の、ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の各遺伝子発現量の変化を、ブルー／バイオレットライト照射前（ｃｏｎｔ．）と照射後（Ｂｌｕｅ）で比較した結果を示したものである。図３に示されたところのように、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃとフラジェリンによって抗菌性ペプチドである前記ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７が増加した場合、ブルー／バイオレットライトの照射により前記各遺伝子の発現量が減少することを確認することができる。このような増減は、統計的に有意であり、統計情報は、両側スチューデントｔ検定により検証し、ｐ値が０．０５以下であるとき有意な差があると表示した。これは、前記のような抗菌性ペプチドを、ブルー／バイオレットライト遮断機能を測定し、その有効性を評価するための指標として使用できることを意味する。
【００４６】
［試験例３］
本発明の一具現例として、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を皮膚細胞に照射した時の、抗菌性ペプチドの発現量の変化を測定する実験を、下記のとおり実施した。
【００４７】
まず、本発明において使用されるヒト正常角質皮膚細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）は、常用的に確保されて勧奨される方法で、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液は、ロンザ社のマニュアルに従って培養した。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブリットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）２ｍｌ、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）０．５ｍｌ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）０．５ｍｌ、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）０．５ｍｌ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．５ｍｌ、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．５ｍｌ、および硫酸ゲンタマイシン＋アンホテリシン‐Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００）０．５ｍｌを添加して使用した。
【００４８】
その次に、前記ヒト正常角質皮膚細胞が培養された培地に、４００〜５００ｎｍのブルー／バイオレットライト（１０Ｊ／ｃｍ２）を照射した後、ヒト正常角質皮膚細胞の培養液を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、その後トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞内のＲＮＡを分離した。
【００４９】
このとき、前記ブルー／バイオレットライト（１０Ｊ／ｃｍ２）の照射前と後でウイルス、バクテリアの感染状況を誘導するために、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃを処理した。これに加え、酸化窒素スカベンジャー（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）であるＰＴＩＯ（２‐（４‐Ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）‐４，４，５，５‐ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｅ‐１‐ｏｘｙｌ‐３‐ｏｘｉｄｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｔ）と、活性酸素種スカベンジャーであるＮＡＣ（Ｎ‐Ａｃｅｔｙｌ‐Ｌ‐ｃｙｓｔｅｉｎｅ）をそれぞれ処理した（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）。
【００５０】
その次に、分離されたＲＮＡを、キアジェン社のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｔ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）でもう一度精製した後、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用して前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ：ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて定量的に分析した。
【００５１】
ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の各発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(登録商標)  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して、ブルー／バイオレットライトが誘導する皮膚の遺伝子変化をリアルタイムＰＣＲで評価し、その結果を図４ａ〜図４ｇに示した。このとき、各遺伝子増幅のために使用したプライマーは、前記表１のとおりである。
【００５２】
その結果、図４ａ〜図４ｇに示されたところのように、前記ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の発現量がＰｏｌｙ  Ｉ：Ｃによって増加した場合に、ブルー／バイオレットライト照射によって減少されることを、処理した２種類のスカベンジャーのうち酸化窒素スカベンジャーであるＰＴＩＯを処理した群では、ブルー／バイオレットライトの照射にもかかわらず抗菌性ペプチド（ＡＭＰｓ）の発現量が減少しなかった。これは、ブルー／バイオレットライトがＳ‐ニトロシル化の生成および抗菌性ペプチド（ＡＭＰｓ）の発現調節に関与することを意味する。
【００５３】
［試験例４］
本発明の一具現例として、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を皮膚細胞に照射した時の、Ｓ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量の変化を測定する実験を、下記のとおり実施した。
【００５４】
まず、本発明において使用されるヒト正常角質皮膚細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）は、常用的に確保されて勧奨される方法で、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液は、ロンザ社のマニュアルに従って培養した。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブリットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）２ｍｌ、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）０．５ｍｌ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）０．５ｍｌ、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）０．５ｍｌ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．５ｍｌ、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．５ｍｌ、および硫酸ゲンタマイシン＋アンホテリシン‐Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００）０．５ｍｌを添加して使用した。
【００５５】
前記培養細胞に、４００〜５００ｎｍのブルー／バイオレットライトをそれぞれ１０、３０、６０Ｊｃｍ２で照射した後、ヒト正常角質皮膚細胞の培養液を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、タンパク質のＳ‐ニトロシル化を検出するためのビオチン‐スイッチアッセイ（Ｂｉｏｔｉｎ‐ｓｗｉｔｃｈ  ａｓｓａｙ）を遂行した。具体的に、前記洗浄された細胞を、ＨＥＮＴＳ溶液（ＨＥＰＥＳ，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＥＤＴＡ）で１０分間溶解させて上澄液のみを取り出した。タンパク質の定量後、ＨＥＮ（ＨＥＰＥＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＥＤＴＡ）溶液を利用して、６００ｕｇ／２００ｕｌに合わせた。Ｓ‐ニトロシル化されていないシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）の反応を防ぐために、ＭＭＴＳ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＭになるように追加した後、５０℃で１５分間反応させた。アセトンによるタンパク質沈殿後、１ｍＭのＨＰＤＰ‐ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれている５０ｍＭのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）ＨＥＮＳ溶液（ＨＥＰＥＳ，ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＥＤＴＡ）に溶かして３７℃で１時間反応させることにより、Ｓ‐ニトロシル化されたシステインにビオチンを結合させた。アセトンによるタンパク質沈殿後、ＨＥＮＳ溶液に溶かし、補正のための投入（ｉｎｐｕｔ）を５％減らしておいた後、アビジン‐アガロースビーズ（ａｖｉｄｉｎ‐ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄ，Ｐｉｅｒｃｅ）をそれぞれ２０μｌずつ加えて、４℃で１２時間反応させた。ビーズをｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ溶液（ＨＥＰＥＳ，ＥＤＴＡ，ＮａＣｌ，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）で５回洗浄した後、サンプルバッファ（ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、沸騰させた後、投入（ｉｎｐｕｔ）とともにＳＤＳ‐ＰＡＧＥを遂行する。その後、銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じて、ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで確認し、これを図５に示した。
【００５６】
その結果、図５に示されたところのように、ブルー／バイオレットライトを照射していない対照群（ｃｏｎｔ）と比較した場合、ブルー／バイオレットライトの照射強度が増加するほど、生体内のＳ‐ニトロシル化されたタンパク質（ＳＮＯ‐ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が減少することを確認することができる。
【００５７】
これは、ブルー／バイオレットライトの代わりに紫外線（２０ｍＪ）を照射したことを除き、前記実験と同一の条件および方法で実施した実験の結果、紫外線照射時には、生体内のＳ‐ニトロシル化されたタンパク質（ＳＮＯ‐ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が増加したことと対比される結果である（図６参照）。これは、同じ太陽光であっても、その波長に応じて皮膚に対する作用が異なり、前記のようなＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量を、ブルー／バイオレットライト遮断機能を測定し、その有効性を評価するための指標として使用できることを意味する。
【００５８】
［試験例５］
本発明の一具現例により測定対象物質の皮膚細胞に対する太陽光遮断機能を測定するのに先立ち、対象物質の紫外線およびブルー／バイオレットライト透過の程度を、下記のとおり測定した。
【００５９】
本実験に先立ち、対象物質として実施例１〜３の太陽光遮断剤形を、下記組成で通常的な方法に従って製造した（単位：質量％）。
【００６０】
【表２】
0006594992.tif 000003
【００６１】
その次に、前記実施例１〜３の各ＳＰＦおよびＰＡの臨床指数、ならびにブルー／バイオレットライトの透過率をそれぞれ測定し、その結果を下記表３にそれぞれ示した。このとき、ブルー／バイオレットライトの透過率は、実施例１〜３の太陽光遮断剤形を、それぞれ帯域透過フィルタ上に２ｍｇ／ｃｍ２の量で塗布した後、ブルー／バイオレットライト領域を含む光源を照射し、透過されるブルー／バイオレットライト波長領域（４００〜５００ｎｍ）を分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）であるＳＰＦ‐２９０Ｓ紫外線遮断剤分析システム（Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）で測定した。紫外線によるＳＰＦ（皮膚紅斑）およびＰＡ（皮膚黒化）確認実験は、紫外線遮断剤実験法および食品医薬品安全処（ＫＦＤＡ）の方法どおりに実施した。
【００６２】
【表３】
0006594992.tif 000004
【００６３】
前記表３の結果から、実施例１〜３の太陽光遮断剤形は、紫外線に対してほぼ同一のＳＰＦおよびＰＡを示したのに対し、ブルー／バイオレットライトの透過率においては大きな差を有することが分かる。これは、同一の紫外線遮断効能を有する太陽光遮断製品の間でも、可視光線のうち４００〜５００ｎｍの波長領域を有するブルー／バイオレットライトの遮断効能は、それぞれ異なり得るため、紫外線防止指数が、すなわち太陽光の全体的な遮断機能の保有または遮断効能の程度を包括的に意味し得るものではないことを意味する。
【００６４】
［試験例６］
本発明の一具現例として、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を皮膚細胞に照射した時の、太陽光遮断機能を有する物質による抗菌性ペプチドの発現量の変化を測定する実験を、下記のとおり実施した。
【００６５】
まず、本発明において使用されるヒト正常角質皮膚細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）は、常用的に確保されて勧奨される方法で、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液は、ロンザ社のマニュアルに従って培養した。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブリットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）２ｍｌ、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）０．５ｍｌ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）０．５ｍｌ、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）０．５ｍｌ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．５ｍｌ、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．５ｍｌ、および硫酸ゲンタマイシン＋アンホテリシン‐Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏtｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００）０．５ｍｌを添加して使用した。
【００６６】
その次に、前記試験例５で使用した実施例１〜３の太陽光遮断剤形を帯域透過フィルタ上に２ｍｇ／ｃｍ２塗布した後、その下部にヒト正常角質皮膚細胞を位置させてから、太陽光遮断剤形が塗布された部位の上側から４００〜５００ｎｍのブルー／バイオレットライトを０，３０Ｊ／ｃｍ２の強さでそれぞれ照射した。
【００６７】
その次に、ヒト正常角質皮膚細胞の培養液を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、その後トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、細胞内のＲＮＡを分離した。
【００６８】
分離されたＲＮＡを、キアジェン社のＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｔ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）でもう一度精製した後、Ａｇｉｌｅｎｔ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）を確認した。インビトロジェン社の逆転写キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を利用して前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ‐ＲＴ‐ＰＣＲ：ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ‐ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて定量的に分析した。
【００６９】
ＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の各発現パターンの変化を、アプライドバイオシステム社のタックマン遺伝子発現システム（ＴａｑＭａｎ(登録商標)  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して、ブルー／バイオレットライトが誘導する皮膚の遺伝子変化をリアルタイムＰＣＲで評価し、その結果を図７ａ〜図７ｇに示した。このとき、各遺伝子増幅のために使用したプライマーは、前記表１のとおりである。
【００７０】
その結果、図７ａ〜図７ｇに示されたところのように、ブルー／バイオレットライトを照射した場合（Ｂｌｕｅ）、実施例１〜３のＨＢＤ‐１、ＨＢＤ‐２、ＨＢＤ‐３、ＬＬ‐３７、ソライアシン、ダームシジン、ＲＮａｓｅ７の各発現量が減少したが、実施例１〜３のブルー／バイオレットライト遮断効能に応じて、その減少の程度にそれぞれ差があった。これは、前記のような抗菌性ペプチドの発現量を、ブルー／バイオレットライト遮断効能を評価するための指標として使用することができることを意味する。
【００７１】
［試験例７］
本発明の一具現例として、４００〜５００ｎｍの波長のブルー／バイオレットライト（Ｂｌｕｅ／Ｖｉｏｌｅｔ  ｌｉｇｈｔ）を皮膚細胞に照射した時の、太陽光遮断機能を有する物質によるＳ‐ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質の生成量の変化を測定する実験を、下記のとおり実施した。
【００７２】
まず、本発明において使用されるヒト正常角質皮膚細胞（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌｓ）は、常用的に確保されて勧奨される方法で、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）所在）から購入して継代培養した後、ＣＯ２培養器（ＣＯ２  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞培養液は、ロンザ社のマニュアルに従って培養した。５００ｍｌのＫＢＭ‐２（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＣＣ‐３１０３）培地に、ＫＧＭ‐２ブリットキット（Ｂｕｌｌｅｔ  ｋｉｔ：ＢＰＥ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｔ）２ｍｌ、ｈＥＧＦ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）０．５ｍｌ、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）０．５ｍｌ、ヒドロコルチゾン（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）０．５ｍｌ、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）０．５ｍｌ、エピネフリン（Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）０．５ｍｌ、および硫酸ゲンタマイシン＋アンホテリシン‐Ｂ（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｆｌａｔｅ＋Ａｍｐｈｏtｅｒｉｃｉｎ‐Ｂ：ＧＡ‐１０００）０．５ｍｌを添加して使用した。
【００７３】
その次に、前記試験例４で使用した実施例１および３の太陽光遮断剤形を帯域透過フィルタ上に２ｍｇ／ｃｍ２塗布した後、その下部にヒト正常角質皮膚細胞を位置させてから、太陽光遮断剤形が塗布された部位の上側から４００〜５００ｎｍのブルー／バイオレットライトを３０Ｊ／ｃｍ２の強さでそれぞれ照射した。
【００７４】
その次に、ヒト正常角質皮膚細胞の培養液を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）で細胞を洗浄した後、タンパク質のＳ‐ニトロシル化を検出するためのビオチン‐スイッチアッセイ（Ｂｉｏｔｉｎ‐ｓｗｉｔｃｈ  ａｓｓａｙ）を遂行した。具体的に、前記洗浄された細胞を、ＨＥＮＴＳ溶液（ＨＥＰＥＳ，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＥＤＴＡ）で１０分間溶解させて上澄液のみを取り出した。タンパク質の定量後、ＨＥＮ（ＨＥＰＥＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＥＤＴＡ）溶液を利用して、６００μｇ／２００μｌに合わせた。Ｓ‐ニトロシル化されていないシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎ）の反応を防ぐために、ＭＭＴＳ（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＭになるように追加した後、５０℃で１５分間反応させた。アセトンによるタンパク質沈殿後、１ｍＭのＨＰＤＰ‐ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれている５０ｍＭのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）ＨＥＮＳ溶液（ＨＥＰＥＳ，ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＥＤＴＡ）に溶かして３７℃で１時間反応させることにより、Ｓ‐ニトロシル化されたシステインにビオチンを結合させた。アセトンによるタンパク質沈殿後、ＨＥＮＳ溶液に溶かし、補正のための投入（ｉｎｐｕｔ）を５％減らしておいた後、アビジン‐アガロースビーズ（ａｖｉｄｉｎ‐ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄ，Ｐｉｅｒｃｅ）をそれぞれ２０μｌずつ加えて、４℃で１２時間反応させた。ビーズをｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ溶液（ＨＥＰＥＳ，ＥＤＴＡ，ＮａＣｌ，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）で５回洗浄した後、サンプルバッファ（ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、沸騰させた後、投入（ｉｎｐｕｔ）とともにＳＤＳ‐ＰＡＧＥを遂行する。その後、銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じて、ニトロシル化（Ｓ‐Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ）されたタンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで確認し、これを図８に示した。
【００７５】
その結果、図８に示されたところのように、ブルー／バイオレットライトを照射していない対照群（ｃｏｎｔ）と比較した場合、実施例１および３の太陽光遮断効能の差により、生体内のＳ‐ニトロシル化されたタンパク質（ＳＮＯ‐ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の生成量も差が示されることが分かる。これは、前記のようなＳ‐ニトロシル化されたタンパク質の生成量を、ブルー／バイオレットライト遮断効能を評価するための指標として使用することができることを意味する。
【図１ａ】
0006594992.tif 000005
【図１ｂ】
0006594992.tif 000006
【図１ｃ】
0006594992.tif 000007
【図１ｄ】
0006594992.tif 000008
【図１ｅ】
0006594992.tif 000009
【図１ｆ】
0006594992.tif 000010
【図１ｇ】
0006594992.tif 000011
【図２ａ】
0006594992.tif 000012
【図２ｂ】
0006594992.tif 000013
【図２ｃ】
0006594992.tif 000014
【図２ｄ】
0006594992.tif 000015
【図２ｅ】
0006594992.tif 000016
【図２ｆ】
0006594992.tif 000017
【図３ａ】
0006594992.tif 000018
【図３ｂ】
0006594992.tif 000019
【図３ｃ】
0006594992.tif 000020
【図３ｄ】
0006594992.tif 000021
【図３ｅ】
0006594992.tif 000022
【図３ｆ】
0006594992.tif 000023
【図３ｇ】
0006594992.tif 000024
【図４ａ】
0006594992.tif 000025
【図４ｂ】
0006594992.tif 000026
【図４ｃ】
0006594992.tif 000027
【図４ｄ】
0006594992.tif 000028
【図４ｅ】
0006594992.tif 000029
【図４ｆ】
0006594992.tif 000030
【図４ｇ】
0006594992.tif 000031
【図５】
0006594992.tif 000032
【図６】
0006594992.tif 000033
【図７ａ】
0006594992.tif 000034
【図７ｂ】
0006594992.tif 000035
【図７ｃ】
0006594992.tif 000036
【図７ｄ】
0006594992.tif 000037
【図７ｅ】
0006594992.tif 000038
【図７ｆ】
0006594992.tif 000039
【図７ｇ】
0006594992.tif 000040
【図８】
0006594992.tif 000041