(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−Ｐｒｏの配列を有するジペプチドを有効成分とする、老化した線維芽細胞のための線維芽細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は線維芽細胞増殖促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは線維芽細胞から細胞外に分泌されるタンパク質である。コラーゲンは、生体における種々の結合組織に、力学的な強度を与えるのに役立っており、腱の主成分はコラーゲン繊維がきちんとすきまなく配列したもので非常に強い力に耐える。また、皮膚においては、真皮の乾燥重量のうち約７０％をコラーゲンが占めているといわれ、皮膚の弾力性や柔軟性を維持するのに重要な役割を果たしている。また、コラーゲンが、それに接する細胞に対して、増殖、分化シグナルを与えるための情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。
近年、皮膚の弾力性や、シワの改善を目的としてコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を経口摂取することが行われており、「美容ドリンク」や「美肌飲料」などの名称でコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を含む飲料が市販されている。これらの飲料は、１回当たりコラーゲン換算で１０００〜１００００ｍｇを摂取することが効果的であるといわれている。
経口摂取したコラーゲンやコラーゲンペプチドがどのような作用機作で皮膚の弾力性やシワの改善に働くのか、詳細な機構は明らかになっていない。
【０００３】
特許文献１には、コラーゲンをコラゲナーゼで酵素分解した際に得られるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するトリペプチド（コラーゲントリペプチド）が生体コラーゲン合成促進作用を有し、これを含むコラーゲンの加水分解物をコラーゲン合成促進剤として利用する技術が記載されている。
特許文献２には、前記のコラーゲントリペプチドとフラボノイドの一種であるシリマリンとリンゴ抽出物が、コラーゲンと線維芽細胞からなるコラーゲンゲルを収縮させ、シワ改善に用いることができることが記載されている。
特許文献３には、コラーゲンを経口摂取した直後に血液中に出現する複数のトリペプチド又はジペプチドを合成して、これらのペプチドが培養マウス線維芽細胞対してコラーゲン合成を促進することを確認して、その結果に基づき、皮膚コラーゲン産生促進剤として利用することを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３８０２７２１号公報
【特許文献２】特許第５５７２４０６号公報
【特許文献３】特許第４９９５１５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、コラーゲンをコラゲナーゼで加水分解したときに出現する多数のトリペプチドやジペプチドについて研究している。その過程で、従来あまり注目されていない構造のジペプチドが特異的に線維芽細胞を増殖させることを見出し、本発明を完成するにいたった。
本発明は新たな線維芽細胞増殖促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、次の構成からなる。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｒｏの配列を有するジペプチドを有効成分とする、老化した線維芽細胞のための線維芽細胞増殖促進剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、あらたな線維芽細胞増殖促進剤が提供される。本発明の線維芽細胞増殖促進剤を皮膚外用剤として用いることで、皮膚のシワを改善することができる。とくに老化により増殖能力が低下した線維芽細胞の細胞増殖能を回復させる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】老化したヒト皮膚線維芽細胞と若い細胞の増殖能を比較した試験結果である。
【図２】コラーゲンをコラゲナーゼで加水分解した加水分解物中に存在する４種の合成ジペプチドの線維芽細胞増殖能を試験した結果を示すグラフである。
【図３】試験に用いたペプチドを構成するアミノ酸を単独添加した場合の細胞増殖能に及ぼす効果を試験した結果を示すグラフである。
【図４】試験に用いたペプチドを構成するアミノ酸を２種混合して添加した場合の細胞増殖能に及ぼす効果を試験した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に係る線維芽細胞増殖促進効果を有するジペプチドは、グリシンにプロリンがアミド結合したジペプチドであって、簡易的な表記ではＨ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨの構造を有する。本発明においては、Ｎ末端を先頭に記載し、Ｃ末端を後に記載する。すなわちＧｌｙ−Ｐｒｏ又はＧｌｙＰｒｏで表わす。またプロリンのカルボキシル基は、ナトリウムなどの金属塩となっていても良い。
【００１０】
本発明に使用するＧｌｙ−Ｐｒｏは蛋白質加水分解法、化学合成法、酵素法、発酵法の何れかの方法によって製造することができる。特に製造方法を限定するものではない。
【００１１】
本発明に係る線維芽細胞増殖促進剤、皮膚外用剤、シワ改善剤を製造するには、上記の方法で製造したジペプチド又は市販されている当該ジペプチドをそのまま、あるいは当該ジペプチドを含む組成物を原料として用いることができる。製剤化に当たっては、常法に従って公知の医薬用、あるいは化粧料用に用いられている無毒性担体と組み合わせて製剤化すればよい。
【００１２】
本発明に係る関わる線維芽細胞増殖促進剤、皮膚外用剤、シワ改善剤は、種々の剤型での投与が可能であり、例えば、経口投与剤としては錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、非経口投与剤としては、注射剤のほか、坐剤、噴霧剤、経皮吸収剤、外用剤、化粧用剤等の形態を挙げることができる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。
【００１３】
本発明に係る線維芽細胞増殖促進剤、皮膚外用剤、シワ改善剤において、Ｇｌｙ−Ｐｒｏの投与量は、患者の年齢、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択・決定されるが、例えば、１日あたり０．１〜１００００ｍｇ／ｋｇ体重程度とされ、１日１〜数回に分けて投与してもよい。
また、当該ジペプチドは、生体生成又は構成成分であり、すでに長年の使用経験があるコラーゲンの酵素分解物や、これを含む食品中にも含有される成分であることから安全性が高いと考えられる。
【実施例】
【００１４】
以下に、試験例、処方例を示して本発明を具体的に説明する。
＜各種ジペプチド、アミノ酸の細胞増殖試験＞
（１）試験方法
・使用細胞
細胞株；正常ヒト皮膚線維芽細胞 (ＮＨＤＦ)（クラボウ社から購入した）
【００１５】
・試験サンプル
市販の次のジペプチドとアミノ酸を試験サンプルとした。
ペプチド
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ (和光純薬工業)、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ (Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ)、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ(和光純薬工業)、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ(和光純薬工業)。
各ペプチドも、上に述べたとおりＮ末端を先に表記している。
【００１６】
アミノ酸
Ｌ−グリシン(Ｇｌｙ：和光純薬工業)、Ｌ−プロリン(Ｐｒｏ：和光純薬工業)、Ｌ−ヒドロキシプロリン(Ｈｙｐ：和光純薬工業)
【００１７】
１）細胞培養
細胞は３７ ℃、５％二酸化炭素、９５％空気の雰囲気下にて培養を行った。培地は不活性化したウシ胎児血清(ＦＢＳ) (Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)１０％、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ(Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ)１％を添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ, ｌｉｑｕｉｄ (ＤＭＥＭ) (Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を用いた。通常培養には１００ｍｍディッシュに細胞を播種し８０〜９０％コンフルエント時に０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ (Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ)にて剥離し継代を行った。また、老化した細胞は繰り返し３０回の継代を行い、作成した。
【００１８】
２）サンプル調整
各サンプルはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ (Ｄ−ＰＢＳ) (Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ) に溶解した。ＤＭＥＭにおける溶媒含有量は１％とした。
【００１９】
３）細胞の形態観察
形態観察は倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いて行った。
【００２０】
４）細胞数の測定
６ｗｅｌｌプレートに細胞を４×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｍＬ濃度に調整したＤＭＥＭ ２ｍＬを播種し、３日間培養した細胞数の測定を行った。細胞は上清を取り除き０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを添加し、３７℃で１分間インキュベートし細胞を剥離した後にＤＭＥＭを１ｍＬ添加して回収した。回収した細胞は室温で１２００ｒｐｍで、３分間遠心し上清を取り除いた。再度ＤＭＥＭにて縣濁した細胞溶液をコールターカウンター(ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ)を用いて細胞数の測定を行った。
【００２１】
５）細胞増殖作用の測定
９６ｗｅｌｌプレートに老化細胞を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ/ｍＬ濃度に細胞を分散したＤＭＥＭ１００μＬを播種した。１日間前培養の後、サンプルを添加して３日間培養行った。培養が終了した細胞は上清を取り除きＤ−ＰＢＳで洗浄の後、Ｄ−ＰＢＳに５ｍｇ/ｍＬに溶解した３−[４,５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ] −２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ(ＭＴＴ) (和光純薬工業)を２０分の１量添加したＤＭＥＭ１００μＬを添加し４時間インキュベートした。ＭＴＴを混合培地を除去した後、２−プロパノール (和光純薬工業) １００μＬを各ｗｅｌｌに添加しマイクロプレートシェーカーにて３０分撹拌してホルマザンを溶解し、５７０ｎｍと６３０ｎｍの吸光度を測定した。細胞生存率はｃｏｎｔｒｏｌの吸光度(Ａ５７０−Ａ６３０)を１００％とし、サンプル添加時の吸光度 (Ａ５７０−Ａ６３０)から百分率を算出した。
【００２２】
（２）結果
１）老化による細胞の変化
若い細胞と老化細胞を同数播種し、経時的に細胞数を計測した結果、老化細胞において有意な増殖細胞量の低下がみられた。図１に示すとおり播種後１日目で増殖能に顕著な差が生じた。すなわち、老化に伴う皮膚の弾力性の低下やシワの発生には、この細胞増殖能の低下が影響する。
【００２３】
２）ジペプチドによる老化した線維芽細胞の増殖能の変化
各ジペプチドの線維芽細胞に対する増殖促進作用を確認した結果を図２に示す。Ｇｌｙ−Ｐｒｏは、１ｍｇ/ｍＬ添加により統計的に有意な細胞増殖能の亢進がみられた。Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐは、濃度の増加に伴って増殖が確認されたが、統計的な有意差は認められなかった。Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、濃度の上昇に伴って減少する傾向が認められた。
また、ペプチドを構成するアミノ酸を単独で添加した場合の細胞の増殖に及ぼす効果を確認した結果を図３、図４に示す。アミノ酸をそれぞれ単独添加、およびペプチドを構成するアミノ酸の２種の組み合わせで添加した場合も細胞増殖能の亢進は示さなかった。
以上の試験結果から、Ｇｌｙ−Ｐｒｏの配列を有するペプチドのみが、老化した線維芽細胞に作用して増殖を促進することがわかった。したがって、老化に伴って発生した皮膚のシワに作用し、皮膚基底部の線維芽細胞を増殖させ、シワ改善作用を示すことが予想される。
【００２４】
以下にＧｌｙ−Ｐｒｏを配合した、線維芽細胞増殖剤・シワ改善剤の処方例を示す。
［処方例１］クリーム
下記の処方（単位は質量％）により、外用クリームを製造した。
（１）  ステアリルアルコール                                        ６．０
（２）  ステアリン酸                                                ２．０
（３）  水添ラノリン                                                ４．０
（４）  スクワラン                                                  ９．０
（５）  オクチルドデカノール                                      １０．０
（６）  ＰＯＥ（２５）セチルアルコールエーテル                      ３．０
（７）  モノステアリン酸グリセリン                                  ２．０
（８）  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ                                              ０．１
（９）  防腐剤                                                        適量
（１０）香料                                                          適量
（１１）１，３ブチレングリコール                                    ６．０
（１２）ＰＥＧ１５００                                              ４．０
（１３）精製水                                                        残余
〔製法〕上記成分（１）〜（１０）を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（１１）〜（１３）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、撹拌しながら４０℃まで冷却し、さらに３０℃まで撹拌冷却して外用クリームを得た。
【００２５】
［処方例２］錠剤
下記の処方（単位は質量％）により、錠剤を製造した。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｒｏ                                                 ２．０
（２）乳糖                                                         ８３．０
（３）コーンスターチ                                               １４．０
（４）グアーガム                                                     １．０
【００２６】
［処方例３］外用乳液
下記の処方（単位は質量％）により、乳液を製造した。
（１）  ジプロピレングリコール                                       ９．０００
（２）  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ                                               １．０００
（３） （ヒドロキシエチルアクリル酸／アクリルジメチルタウリンＮａ）コポリマー                                                                        ０．１８８
（４）  スクワラン                                                   ０．１２７
（５）  ポリソルベート６０                                           ０．０２８
（６）  ラウロイルグルタミン酸ジ（フィトステリル／オクチルドデシル） １．０００
（７）  グリセリン                                                   ５．０００
（８）  ジメチコン                                                   ３．０００
（９）  精製水                                                     ７４．７４２
（１０）カルボマー                                                   ０．２００
（１１）ベタイン                                                     ２．０００
（１２）エタノール                                                   ３．０００
（１３）水酸化カリウム                                               ０．０６５
（１４）精製水                                                       ０．６５０
〔製法〕上記成分（１）に（２）を加え８０℃に加熱溶解する。成分（３）〜（８）を加え、８０℃に加熱溶解し油相とする。成分（９）〜（１１）を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、撹拌しながら３０℃まで冷却する。成分（１２）および（１３）を（１４）に撹拌溶解したものを加え、撹拌冷却して外用乳液を得た。
【図１】
0006517546.tif 000002
【図２】
0006517546.tif 000003
【図３】
0006517546.tif 000004
【図４】
0006517546.tif 000005