(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素付加赤血球を有効成分として含む、横紋筋融解症治療剤。
【請求項２】
横紋筋融解症誘発急性腎障害の治療剤である、請求項１に記載の横紋筋融解症治療剤。
【請求項３】
クラッシュ・シンドローム治療剤である、請求項１又は２に記載の横紋筋融解症治療剤。
【請求項４】
静脈内に投与される、請求項１から３の何れか一項に記載の横紋筋融解症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、横紋筋融解症により誘発される急性腎傷害などの治療に有用である新規な横紋筋融解症に関する。
【背景技術】
【０００２】
横紋筋融解症は、横紋筋が融解し、筋細胞内の成分が血中に流出する症状または病態を指し、重篤化すると急性腎傷害 (AKI) を合併し死に至る。横紋筋融解症誘発AKIは、第2次世界大戦当時、BywatersとBeallにより提唱された病態であり（非特許文献１） 、米国でのAKI患者のうち8-15%を占める（非特許文献２）。また、潜在的なものも含めると発症率は13-50%まで上昇するという報告もある（非特許文献３及び４）。本病態の発症原因としては、脱水、薬物副作用、解糖系遺伝子欠損などによる非外傷的要因と、事故や負傷などによる外傷的要因があるが、このうちの約50%を外傷的要因が占める（非特許文献５及び６）。横紋筋融解症AKIに対する治療は対症療法であり、水分・血液補充のための輸液や尿のアルカリ化のための重炭酸の投与、あるいは血液透析が行われるものの（非特許文献７）、未だ有効な治療薬は存在しない。また、横紋筋融解症では、病態が重篤化すると貧血が生じるため、赤血球 (RBC) 輸血が施行される。特に、外傷性出血を伴う場合は、輸血の施行頻度が高くなる。
【０００３】
また、広義的には、クラッシュ・シンドロームも外傷性横紋筋融解症AKIに含まれる。クラッシュ・シンドロームは、災害時などで生じる倒壊物の下敷きになることで、四肢が長時間圧迫を受け、救助などの圧迫解除によって急速に現れる骨格筋の損傷と、これによって引き起こされる全身症状を呈する疾患群である（非特許文献８）。過去に大地震や家屋の倒壊事故などの災害時で多くの犠牲者を出している。さらに、圧迫という機会があれば、昏睡患者（非特許文献９）や、術中患者の長時間臥床（非特許文献１０）、ギプス固定（非特許文献１１）など、臨床現場でも生じることがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Bywaters EG, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function, 1941 J Am Soc Nephrol. 1998;9(2):322-332
【非特許文献２】Moore KP, Holt SG, Patel RP, et al. A causative role for redox cycling of myoglobin and its inhibition by alkalinization in the pathogenesis and treatment of rhabdomyolysis-induced renal failure. J Biol Chem. 1998;273(48):31731-31737
【非特許文献３】Rocuts F,Ma Y,Zhang X,ey al. Carbon monoxide suppresses membrane expression of TLR4 via myeloid differentiation factor-2 in beta TC3 cells. J Immunol. 2010;185(4):2134-2139
【非特許文献４】Melli G,Chaudhry V,Cornblath DR. Rhabdomyolysis: An evaluation of 475 hospitalized patients. Medicine. 2005;84(6):376-385
【非特許文献５】Fernandez WG,Hung O,Bruno GR,et al. Factors predictive of acute renal failure and need for hemodyalysis ED patients with rhabdomyolysis. Am J Emerg Med. 2005;23(1):1-7
【非特許文献６】Allison RC,Bedsole DL. The other medical causes of rhabdomyolysis. Am J Med Sci. 2003;326(2):79-88
【非特許文献７】Sever MS,Erek E,Vanholder R,et al. Serum potassium in the crush syndrome victims of the Marmara disaster. Clin Nephrol. 2003;59(5):326-333
【非特許文献８】Smith J,Greaves I. Crush injury and crush syndrome: a review. J Trauma. 2003;54(5):S226-S230
【非特許文献９】Show AD, Sjolin SU, McQueen MM. Crush syndrome following unconsciousness: need for urgent orthopaedic referral. BMJ. 1994;309(6958): 857-859
【非特許文献１０】Godbaut B, Burchard KW, Slothman GJ, et al. Crush syndrome with death following pneumatic antishock garment application. J Trauma. 1984;24(12):1052-1056
【非特許文献１１】Rhaukhverger AB, Koshkalda VG. Development of the protracted compression syndrome after shoulder dislocation and application of an immobilizing bandage. Sud Med Ekspert 1977;20(4):56
【非特許文献１２】Murata I, Nozaki R, Ooi K, et al. Nitrite reduce ischemia/reperfusion-induced muscle damage and improves survival rates in rat crush injury model. J Trauma. 2011;72(6):1453-1463
【非特許文献１３】Murata I, Ooi K, Sakai H, et al. Characterization of systematic and histologic injury after crush syndrome and intervals of reperfusion in a small animals. J Trauma Acute Care Surg. 2012;70(6):1548-1554
【非特許文献１４】Izuishi K, Wakabayashi H, Maeba T, et al. Lidocaine-metabolizing activity after warm ischemia and reperfusion of the rat liver in vivo. World J Surg. 2000;24(1):49-53
【非特許文献１５】KaruzinaII, Archakov AI. The oxidative inactivation of cytochrome P450 in monooxygenase reactionas. Free Radic Biol Med. 1994;16(1):73-97
【非特許文献１６】Wilson DR, Thiel G, Arce ML, et al. Glycerol induced hemoglobinuric acute renal failure in the rat. 3. Micropuncture study of the effects of mannitol and isotonic saline on individual nephron function. Nephron. 1967;4(6): 337-355
【非特許文献１７】Baliga R, Ueda N, Walker PD, et al. Oxidant mechanism in toxic acute renal failure. Am J Kidney Dis. 1997;29(3):465-477
【非特許文献１８】Boutaud O,Moore KP,Reeder BJ,et al. Acetaminopheninhibits hemoprotein-catalyzed lipid peroxidation and attenuatesrhabdomyolysis-induced renal failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(6): 2699-2704
【非特許文献１９】Ogaki S, Taguchi K, Watanabe H, et al. Carbon monoxide-bound red blood cells protect red blood cell transfusion-induced hepatic cytochrome P450 impairment in hemorrhagic-shock rats. Drug Metab Dispos. 2013;41(1):141-8.
【非特許文献２０】Ogaki S, Taguchi K, Watanabe H, et al. Carbon monoxide-bound red blood cell resuscitation ameliorates hepatic injury induced by massive hemorrhage and red blood cell resuscitation via hepatic cytochrome P450 protection in hemorrhagic shock rats. J Pharm Sci. 2014;103(7):2199-206.
【非特許文献２１】Billings FT,Ball SK,Roberts LJ,et al. Postoperative acute kidney injury is associated with hemoglobinemia an enhancement oxidative stress response. Free Radic Biol Med. 2011;50(11):1480-1487
【非特許文献２２】Pinheiro CH,Vitzel KF,Curi R. Effect of N-acetylcisteine on markers of skeletal injury after fatiguing contractile activity. Scand J Med Sci Sports. 2012;22(1): 24-33
【非特許文献２３】Jastrow KM, Gonzalez EA,McGuire MF,et al. Early cytokine production risk stratifies trauma patients for multiple organ failure. J Am Coll Surg. 2009;209(3):320-331
【非特許文献２４】Yassin MM,Harkin DW,Barros D'Sa AA,et al. Lower limb ischemia-reperfusion injury triggers a systematic inflammatory response and multiple organ dysfunction. World J Surg. 2002;26(1):115-121
【非特許文献２５】Sonoi H,Matsumoto N,Ogura H,et al. The effect of antithrombin on pulmonary endothelial damage induced crush injury. Shock. 2009;32(6):593-600
【非特許文献２６】Gonzalez D. Crush syndrome. Crit Care Med. 2009;33(1):S34-S41
【非特許文献２７】Omura T, Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. J Biol Chem. 1964;239(7):2370-2378
【非特許文献２８】Sakai H, Masada Y, Horinouchi H, Yamamoto M, Ikeda E, Takeoka S, Kobayashi K, Tsuchida E,. Hemoglobin-vesicles suspended in recombinant human serum albumin for resuscitation from hemorrhagic shock in anesthetized rats. Crit Care Med. 2009;31(2):192-200
【非特許文献２９】Taguchi K, Maruyama T, Iwao Y, et al. Pharmacokinetics of single and repeated injection of hemoglobin-vesicles on hemorrhagic shock rat model. J Control Release. 2009;136(3):232-239
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
クラッシュ・シンドロームは、圧迫時よりも圧迫解除時において、症状が急変する。すなわち、障害を受けた筋肉から、細胞内容物のカリウム (K) やミオグロビン (Mb)、さらには傷害によって惹起される炎症性サイトカインなどのメディエーターが全身循環に放出され、それに伴い不整脈や低循環性ショックが引き起こされる結果、病院搬送までの主たる死因リスクとなる。また、Mbによる急性腎不全に伴い、カリウムの腎排泄が阻害されることも不整脈による死亡リスクを高める要因である。つまり、クラッシュ・シンドロームは、横紋筋融解症と類似のメカニズムで死亡に至る病態である。
【０００６】
これまでの横紋筋融解症急性腎障害に対する治療は対症療法であり、水分・血液補充のための輸液や尿のアルカリ化のための重炭酸の投与、あるいは血液透析が行われるものの、未だ有効な治療薬は存在せず、医療現場、さらには災害現場で簡便に施行可能な治療薬の開発が切望されている。
【０００７】
本発明は、横紋筋融解症により誘発される急性腎傷害 (AKI)などの治療に有用である新規な横紋筋融解症治療剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために、横紋筋融解症誘発AKIに対する一酸化炭素付加赤血球 (CO-RBC) の有用性を、次の3つの病態モデル、（１）脱水/グリセロール誘発の横紋筋融解症併発AKIラット (非外傷性モデル)、（２）出血性ショックを併発させた外傷性横紋筋融解症AKIモデルラット、及び（３）Murataら（非特許文献１２及び１３） により確立されたゴムバンド圧迫によるクラッシュ・シンドロームモデル、を用いて検討した。その結果、一酸化炭素付加赤血球 (CO-RBC)が、横紋筋融解症誘発AKIに対して治療効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  一酸化炭素付加赤血球を有効成分として含む、横紋筋融解症治療剤。
（２）  横紋筋融解症誘発急性腎障害の治療剤である、（１）に記載の横紋筋融解症治療剤。
（３）  クラッシュ・シンドローム治療剤である、（１）又は（２）に記載の横紋筋融解症治療剤。
（４）  静脈内に投与される、（１）から（３）の何れか一に記載の横紋筋融解症治療剤。
【発明の効果】
【００１０】
現在の横紋筋融解症急性腎障害に対する治療は対症療法であり、理想的な治療法は、迅速な血液透析であるが、繁雑な装置や専門の技師が必要であり、医療現場や災害現場では現実的に困難である。本発明で使用する一酸化炭素付加赤血球は上市されている濃厚赤血球液中に一酸化炭素を暴露処置するだけで簡便にかつ迅速に作製可能であり、実用性は非常に高い。また、横紋筋融解症では、病態が重篤化すると貧血が生じるため、赤血球輸血が施行される頻度は非常に高く、一酸化炭素付加赤血球は横紋筋融解症急性腎障害に対する治療だけでなく、貧血や外傷性出血に対する輸血の役割も併用できる。本発明の一酸化炭素付加赤血球を、非外傷性または外傷性横紋筋融解症患者さらには家屋の倒壊により下敷きになった人々 (クラッシュ・シンドローム予備群) に投与することによって、急性腎障害の発症を抑制し、生存率の向上や予後を改善する新規の横紋筋融解症急性腎障害治療薬となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射) ６時間後又は２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、A) 血漿ミオグロビン(Mb), B) 腎臓ミオグロビン、 C) 血漿クレアチニンホスホルキナーゼ(CPK)の量の変化を示す。各カラムは、平均± SD (n=3-5)を示す。** p<0.01 vs. 対照ラット群
【図２】図２は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、A) 血漿遊離ヘム, B) 腎臓遊離ヘムの量の変化を示す。各カラムは、平均± SD (n=5-6)を示す。** p<0.01 vs. 対照ラット群
【図３】図３は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、A) 全腎臓CYP, B) 全肝臓CYPの含有量を示す。各カラムは、平均± SD (n=5)を示す。** p<0.01 vs. 対照ラット群
【図４】図４は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、(A) 血液尿素窒素(BUN), (B) 血清クレアチニン(SCr), (C) クレアチニンクリアランス(CCr) 及び D) 尿の N-アセチル-β-D-グルコサミニダーゼ(NAG) 活性の量を示す。各カラムは、平均± SD(n=5-6)を示す。** p<0.01 vs. 対照ラット群
【図５】図５は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、(A)代表的な腎臓の観察試験、（B) PAS染色腎臓切片の代表的な顕微鏡写真を示す。拡大率、Bでは×200
【図６】図６は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットからの代表的な尿の観察試験を示す。
【図７】図７は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、尿のミオグロビン(Mb)及びヘモグロビン(Hb)の濃度を示す。各カラムは、平均± SD(n=5-6)を示す。* p<0.05, ** p<0.01 vs. 対照ラット群
【図８】図８は、対照ラット及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)ラットにおける、(A) 赤血球(RBC) 及び (B) ヘマトクリット (Hct)の量の変化を示す。各カラムは、平均± SD(n=5-6)を示す。*: p<0.05, vs. 対照   #: p<0.05 vs. 生理食塩水
【図９】図９は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)２４時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラットにおける、血漿のA) マロンジアルデヒド(MDA), B) ヒドロペルオキシドの量の変化を示し、グリセロール注射の２４時間後における、対照（白丸）及び生理食塩水（点線丸）、赤血球（RBC）（黒丸）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）（灰色丸）で処理したラットにおける、血漿遊離ヘム及びMDAとの関係を示す。各カラムは、平均± SD(n=5-6)を示す。* p<0.05, ** p<0.01 vs. 対照ラット群
【図１０】図１０は、対照ラット群 (グリセロール未処置) 及び横紋筋融解誘発 (グリセロール筋肉内注射)６時間後における、生理食塩水、赤血球（RBC）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）で処理したラット腎臓におけるミオグロビン酸化体の吸収スペクトルを示す。データは、同様の結果を有する各群３匹のラットの代表を示す。
【図１１】図１１は、生理食塩水（点線丸）、赤血球（RBC）（黒丸）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）（灰色丸）により処理した、グリセロール注射で誘発した横紋筋融解症ラットの生存率を示す。生存率は、Kaplan-Meier生存曲線及びlog-rank試験を用いて比較した。**: p<0.01 vs. 生理食塩水で処理したラット(n=10).
【図１２】図１２は、生理食塩水（点線丸）、赤血球（RBC）（黒丸）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）（灰色丸）により処理した、出血性ショック併発グリセロール誘発横紋筋融解症モデルラットの生存率を示す。生存率は、Kaplan-Meier生存曲線及びlog-rank試験を用いて比較した。***: p<0.001 vs. 生理食塩水で処理したラット(n=10).
【図１３】図１３は、生理食塩水（点線丸）、赤血球（RBC）（黒丸）又は一酸化炭素赤血球（CO-RBC）（灰色丸）により処理した、クラッシュシンドロームモデルラットの生存率を示す。生存率は、Kaplan-Meier生存曲線及びlog-rank試験を用いて比較した。***: p<0.001 vs. 生理食塩水で処理したラット(n=10).
【図１４】図１４は、グリセロールによる横紋筋融解症誘発ＡＫＩの進行を示す。
【図１５】図１５は、一酸化炭素付加赤血球（CO-RBC）処理による非外傷性の横紋筋融解症誘発急性腎障害の抑制メカニズムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
横紋筋融解症が重篤化するとAKIを併発し、致死率が急激に上昇する。そのため、横紋筋融解症AKIの適切なマネージメントが求められているものの、現時点では、輸液や血液透析による対症療法のみが施行されており、有効な治療薬の開発が望まれている。これまでの報告をまとめると、横紋筋融解症AKIの病態発症や進行には、筋肉中のMbや腎臓中のCYP（チトクロームP450）から遊離したヘムが重要な役割を果たしている。このことより、Mb誘発の酸化ストレス障害を抑制する抗酸化剤、腎CYP保護剤、あるいはヘム捕獲剤が横紋筋融解症AKIに対する有効な治療薬の候補として考えられる。これまでに我々は、一酸化炭素付加赤血球（CO-RBC）が、遊離ヘムによる肝障害や肝チトクロームP450 (CYP) に対して優れた保護効果を示すことを見出しており（非特許文献１９及び２０）、CO-RBCが横紋筋融解症AKIにも治療効果を発揮することが期待される。そこで、横紋筋融解症の3つのタイプの病態ラットとして、非外傷性横紋筋融解症AKI、外傷性横紋筋融解症AKI、及びクラッシュ・シンドロームを作成し、これらに対するCO-RBCの有用性について検討した。
【００１３】
グリセロール誘発の非外傷性横紋筋融解症AKIモデルでは、以下の病態進展機序が考えられる。まず、グリセロール処置により横紋筋が障害され、筋肉内のMbやCPKが血中に流出して血漿や腎臓に蓄積する。中でも、Mbやそのヘム分子が酸化ストレスを誘導し、腎障害を引き起こすと同時に、腎臓のCYPが破壊され、ヘム分子が遊離する。これらが相まって、腎臓中の遊離ヘム濃度が急上昇し、更に腎機能を悪化させる結果、血漿中からMbの排泄が低下し、より血中や腎臓中に蓄積するようになるという一連の病態進行における悪循環が形成され、AKIが誘発される、というモデルである (図１４)。
【００１４】
この非外傷性横紋筋融解症AKIモデルラットに対し、生理食塩水、RBCまたはCO-RBCをグリセロール処置の3時間後に投与し、その効果をグリセロール処置24時間後に評価したところ、RBC投与では、1) 筋タンパク質 (CPK、Mb) の血中への放出 (図１)、2) 腎機能低下 (図４)、3) 尿細管障害 (核の脱落) (図５)、4) 代謝性アシドーシス・高カリウム血症 (表１)、5) 血尿・タンパク尿 (表２)、6) 尿中Mb・Hbの増加 (図７) といった横紋筋融解症AKIに特有の臨床所見が改善されなかった。また、それを反映して、生理食塩水、RBC投与群では、病態モデルラットがそれぞれ80%及び60%死亡した (図１１)。一方、CO-RBC投与では、上述した臨床所見の変化を抑制し、生存率を改善した (100%生存)。
【００１５】
また、本疾患における酸化ストレスの誘発物質としては、遊離ヘムに加えてMbが関与していると考えている。その理由として、Mbは、遊離ヘムに比べてオキシダントとしての活性は少ないものの、内部ヘム鉄が2価から3価、さらに4価鉄の状態に移行すると、より高い酸化力を獲得するため、障害作用が強化される（非特許文献１６及び２１）。実際、グリセロール処置1時間後において、Mbが血中だけでなく腎蔵中へ蓄積していたこと、また、グリセロール処置6時間後において、腎蔵内にMb酸化体の増加が観察されたことからも (図１０)、Mb酸化体が強力なプロオキシダントとして、腎CYPの分解をはじめとする腎障害に関与していることが推察される。また、CO-RBC投与群では、グリセロール処置6時間後におけるMbの上昇を抑制しなかったものの (図１)、Mb酸化体への形成促進を抑制したことから、COは病態早期に放出されるMbの量を抑制するのではなく、その質であるオキシダント度を抑制している可能性が考えられる。
【００１６】
さらに、CO-RBC投与が病態初期に上昇しているMbやCPKに影響せず、逆に病態が形成されたグリセロール処置後24時間で減少させていたことから、CO-RBCの後投与は、病態発症を引き起こす初期の障害を抑制したのではなく、上述したヘムタンパク質あるいは遊離ヘムを介した酸化ストレス反応を軽減することで、二次的に筋障害を抑制した可能性が強く示唆された。事実、骨格筋細胞が脂質過酸化により障害されることからも（非特許文献２２）、CO-RBCによる間接的な筋保護効果が支持される。これらの知見をふまえ、現時点で想定される非外傷性横紋筋融解症誘発AKIの病態進行過程の概要とCO-RBCの作用点を図１５に示す。
【００１７】
さらに、先程の非外傷性モデルよりも致死的な出血性ショックを併発した外傷性横紋筋融解症AKI及びクラッシュ・シンドロームモデルラットに対しても、RBC投与は有効性を示さなかったのに対し、CO-RBCは優れた救命効果を発揮した (生存率100%) (図１２、図１３)。
【００１８】
外傷性横紋筋融解症AKIあるいはクラッシュ・シンドロームに対するCO-RBCの作用機序の詳細は不明であるが、筋肉細胞の障害が生じた以降の過程は、非外傷性モデルと類似していることから、COによる全身性虚血再灌流障害の抑制やヘムタンパク質の安定化、さらに遊離ヘムに対する臓器保護効果が大きく寄与しているのではないかと推察される。また、横紋筋融解症AKIやクラッシュ・シンドロームは、全身性炎症反応症候群に伴う多臓器不全を引き起こし、重篤な病態を呈するため（非特許文献２３及び２４）、対症療法であっても、救出後早期からの治療が重要であるとされている（非特許文献２５及び２６）。理想的には、現場での迅速な血液透析療法であるが、現状では不可能である。その代わり、静脈内投与可能なCO-RBCの単回投与で救命効果が発揮されれば、災害現場でも使用できるため、幅広い活用が期待される。以上の結果から、CO-RBCは、未だ有効な治療薬が開発されていない多彩な横紋筋融解症AKI (非外傷性、外傷性横紋筋融解症及びクラッシュ・シンドローム) に対して、有効な治療薬であることが示された。
【００１９】
本発明の横紋筋融解症治療剤は、一酸化炭素付加赤血球を有効成分として含む。
本発明で用いる赤血球は、哺乳動物赤血球であり、好ましくはヒト赤血球である。免疫適合性とするために治療を受ける患者自身から得てもよく、ボランティアからの献血を用いてもよく、上市されている濃厚赤血球液でもよい。
【００２０】
本発明で用いる赤血球は、一酸化炭素が付加した赤血球である。一酸化炭素が付加した赤血球は、赤血球液中に一酸化炭素を暴露処置することにより製造することができる。具体的には、洗浄RBC(Hb濃度: 10 g/dL)にCOを緩やかに5分バブリングし、CO-RBCを作製する。なお、RBCへのCOの付加をカルボニルHb量により評価したところ、COバブリング時間5分において、HbCO含量は90%まで達する。
【００２１】
一酸化炭素付加赤血球は、横紋筋融解症の治療に用いる医薬組成物として使用することができる。
横紋筋融解症は、外因性（クラッシュシンドローム）、過度の筋の活動、筋肉の虚血、代謝疾患、薬物、中毒、感染症、遺伝疾患、熱射病などの原因による筋細胞含有物の血漿への放出を伴う骨格筋障害の結果起きる疾患であり、急性再発性横紋筋融解症、労作性横紋筋融解症、家族性発作性横紋筋融解症および特発性発作性横紋筋融解症などが含まれる。横紋筋融解症の臨床症状としては、四肢の脱力、しびれ、筋肉痛、筋力低下、硬直、腫脹、赤褐色尿などが挙げられる。検査所見では、血中のミオグロビン（Ｍｂ）、クレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アルドラーゼなどの筋逸脱酵素群の急激な上昇が認められ、筋変性が認められる。
【００２２】
本発明における横紋筋融解症の治療としては、横紋筋融解症誘発急性腎障害の治療、またはクラッシュ・シンドロームの治療などが包含されるが、特にこれらに限定されるものではない。 これらの疾病は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
【００２３】
本発明の治療剤の投与方法は、注射や点滴により静脈又は動脈に投与することが好ましく、静脈に投与することがさらに好ましい。
本発明の治療剤は、注射や点滴に適した医薬組成物の形態で提供することができる。
大量投与する際には、膠漆浸透圧を維持するためにアルブミン等の血漿増量剤を添加することが望ましい。
【００２４】
本発明の横紋筋融解症治療剤の投与量は、患者の年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、投与量の具体例としては、１日１回あたりヘモグロビン２０ｇ／ｄｌの濃厚パックで２００〜８００ｍＬ程度であり、１回又は複数回投与される。複数回投与の場合は、１日あたり３〜４回に分けてもよい。
【００２５】
本発明によればさらに、横紋筋融解症の治療において使用するための、一酸化炭素付加赤血球が提供される。好ましくは、横紋筋融解症誘発急性腎障害の治療において使用するための、一酸化炭素付加赤血球、並びにクラッシュ・シンドロームの治療において使用するための、一酸化炭素付加赤血球が提供される。上記の一酸化炭素付加赤血球は、好ましくは静脈内に投与される。
【００２６】
本発明によればさらに、一酸化炭素付加赤血球の治療有効量を、横紋筋融解症患者に投与することを含む、横紋筋融解症の治療方法が提供される。
上記の横紋筋融解症の治療方法においては、好ましくは、横紋筋融解症誘発急性腎障害を治療することができ、またはクラッシュ・シンドロームを治療することができる。
一酸化炭素付加赤血球の治療有効量は、好ましくは、静脈内に投与することができる。
本発明によればさらに、横紋筋融解症の製造のための一酸化炭素付加赤血球の使用が提供される。
【００２７】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
[実験の方法]
（１）横紋筋融解症モデルラットの作成
モデル作製前24時間、ラットに絶水処置を施した後、エーテル麻酔下、ラットに8 mL/kg の用量で50%グリセロール／生理食塩水を両側の下腿部筋肉内に投与した。グリセロール投与3時間後に生理食塩水、RBC（赤血球）又はCO-RBC（一酸化炭素付加赤血球）を静脈内投与 (1,400 mg Hb/kg、22.4 mL/kg)した。
【００２９】
RBC（赤血球）としては、ラットより血液を回収し、遠心処理 (1,200 rpm、15 min、4°C) により血漿を取り除いた。生理食塩水で洗浄及び遠心処理 (1,200 rpm、15 min、4°C) を3回行い、洗浄RBCを作製した。Hb濃度はヘモグロビンBテストワコー (和光純薬工業) により測定し、生理食塩水で10 g/dL の濃度に希釈した。
CO-RBC（一酸化炭素付加赤血球）としては、洗浄RBCにCOを緩やかに5分バブリングし、CO-RBCを作製した。
【００３０】
（２）腎機能、筋障害、酸化ストレスパラメータの測定
グリセロール投与前、投与後1、3、6、12、24時間に採血し、全血中の血球パラメータ (RBC、 Hct) を血球測定器 (Sysmec社) で測定した。また、得られた血液を遠心 (3,000 rpm、 10 min、4°C) 後、上清を測定サンプルとして、BUN、SCr、Mb、CPK、遊離ヘム及びMDAを各々の測定キット (BUN・SCr：和光純薬工業、Mb：Life Diagnostics社、CPK・遊離ヘム・MDA：Cayman Chemical社) を用いて添付のプロトコールに準じて測定した。
【００３１】
（３）パラフィン切片の作製
グリセロール投与24時間後、左腎を摘出し、4%パラホルムアルデヒドにより固定化を行い (4°C、overnight)、その後、パラフィンに包埋した。パラフィン固定した腎よりパラフィン切片 (2.5 μm) を作製した。
【００３２】
（４）PAS染色
作製したパラフィン切片を脱パラフィンし、1%過ヨード酸液に10分間浸透した。流水水洗後、ヘマトキシリンで核を染め、顕微鏡 (BZ-8000、Keyence社) にて画像を取得した。
【００３３】
（５）尿中パラメータの測定
グリセロール投与後に24時間蓄尿し、得られた尿中のNAG活性を測定キット (塩野義製薬) を用いて添付のプロトコールに準じて測定した。また、グリセロール投与前後24時間蓄尿して得られた尿についての尿所見について、尿潜血・タンパク・尿pHを試験紙 (プレテスト5bII、和光純薬工業) にてスコア化して評価した。尿潜血については、Hb及びMb濃度0, 0.06, 0.15, 0.75 mg/dLを各々スコア0-4と判定した。尿タンパクについてはタンパク濃度(-), 30, 100, 300, 1000 mg/dLを各々スコア0-5と判定した。
【００３４】
（６）血中生化学パラメータの測定
グリセロール投与前、投与後6、24時間に採血し、採血した血液中におけるpH、BE、乳酸、K及びNa値をi-STAT 300F (扶桑薬品工業) を用いて測定した。
【００３５】
（７）肝及び腎ミクロソーム中総CYP量の測定
肝及び腎ミクロソーム中の総CYP量はOmuraらの報告（非特許文献２７） に基づき、吸収差スペクトル法を用いて算出した。肝臓または腎臓100 mgあたり1 mLのlysis bufferを添加し、ホモジナイザーで作製したホモジネートを10,000 g、4°C、30分間遠心し、その上清を採取した。さらに、上清を105,000 g、4°C、60分間超遠心した。沈殿物 (ミクロソーム画分) を10%グリセロール含有0.1Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7.4) に溶解し、これらをミクロソーム試料溶液とし、これに還元剤としてハイドロスルファイトナトリウム1mgを加え、得られた溶液にCOを1分間バブリングした。分光光度計にて450 nm付近の吸光度と490 nmの吸光度の差から分子吸光係数91 cm-1mM-1を用いて、総CYP量 (nmol/mg protein) を算出した。
【００３６】
（８）腎組織中Mb酸化体の検出
Mooreらの方法に基づき（非特許文献２） 、10 μmに切り出したラット腎組織片に10 μM DTPAを含むリン酸緩衝液 (pH7.4) を添加し、ホモジナイザー (Power Gen 125、Fisher Scientific社) を用いてホモジナイズを行い、遠心分離 (6,000 rpm、10 min、4°C) して得られた上清について、350-700 nmの吸光度を測定した。
【００３７】
（９）出血性ショック併発グリセロール誘発横紋筋融解症モデルラットの作製
モデル作製前24時間、ラットに絶水処置を施した後、エーテル麻酔下、ラットに8 mL/kg の用量で50%グリセロール／生理食塩水を両側の下腿部筋肉内に投与した。その１時間後に左大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブ (PE-50) により脱血を行い、全血液量の40%の血液 (22.4 mL/kg) （非特許文献２８）を脱血し、出血性ショックを誘発した（非特許文献２９）。最終脱血終了10分経過後をに各投与液を投与した。
【００３８】
（１０）クラッシュ・シンドロームモデルラットの作成
クラッシュ・シンドロームモデルは既法（非特許文献１２及び１３）に従い、2.0 kg荷重下でステンレスパイプに巻き付けたラバーバンドをラット両後肢に適用し、5時間圧迫後、ラバーバンドを解除してモデルとした。
【００３９】
[結果]
（１）非外傷性横紋筋融解症AKIラットに対するCO-RBCの治療効果
（１−１）筋タンパク質の逸脱に及ぼす影響
横紋筋融解症の特徴的な臨床所見の一つである、血漿及び腎組織中Mbと血漿中クレアチニンホスホキナーゼ (CPK) 濃度に及ぼすCO-RBCの影響を検討した。具体的には、グリセロール処置3時間後に、生理食塩水 (生理食塩水)、RBCまたはCO-RBCを投与し、グリセロール処置後6及び24時間の時点で、血漿及び腎組織中Mb、血漿中CPK濃度を測定し比較した。その結果、生理食塩水及びRBC投与群では、血漿及び腎組織中Mbと血漿中CPK濃度が対照群 (グリセロール未処理群) と比較して有意に高かった (図１)。一方、CO-RBC投与の場合、グリセロール処置6時間後の時点では、上述したパラメータに対する改善効果が認められなかったものの、24時間後にはそれらの上昇を有意に抑制していた。このことから、CO-RBCは病態誘発初期の筋障害を軽減したというよりも、むしろ、それ以降の病態進行過程で惹起される腎及び筋障害を抑制したものと思われた。
【００４０】
（１−２）遊離ヘム及びCYP 濃度に及ぼす影響
グリセロール処置24時間後における血漿及び腎組織中の遊離ヘム濃度を測定した。対照群と比較して、生理食塩水及びRBC投与群では、血漿中及び腎組織中の遊離ヘム濃度が有意に増加していた (図２Ａ、Ｂ)。一方、CO-RBC投与群では、この上昇が抑制されていた。
【００４１】
図３には、グリセロール処置24時間後における、腎及び肝組織中の総CYP量を示す。図に示すように、腎臓におけるCYP総量は、対照群と比較して、生理食塩水及びRBC投与群で有意に減少した。他方、CO-RBC投与群では、その低下が抑制されていた (図３Ａ)。腎臓とは対照的に、肝臓の総CYP量はいずれの群でも変化していなかった (図３Ｂ)。このことは、横紋筋融解症AKIに誘起されるCYPの分解が、主に腎臓で生じていることを意味している。これらの結果から、生理食塩水及びRBC投与群で観察された腎臓中の遊離ヘム濃度の上昇には、腎CYPの分解が大きく寄与しており、CO-RBCはそれを阻害することで、腎蔵中の遊離ヘム濃度の上昇を抑制していることが推察された。
【００４２】
（１−３）血液生化学的パラメータに及ぼす影響
筋細胞の障害時には、様々な内容物が血中へ放出されるため、血管内外のイオンバランスの平衡が崩れ、高カリウム血症、代謝性アシドーシスを呈するようになる。そこで、グリセロール処置前、処置後6、24時間に、全血中の乳酸、K、ナトリウム (Na) 値及びアシドーシスの指標となる血液pH、BE を測定した。その結果、生理食塩水及びRBC投与群では、血液pH、塩基過剰 (BE)の低下及び血中乳酸値の有意な上昇が認められ、代謝性アシドーシスを呈していることが確認できた (表１)。また、高K血症も生じていた。他方、CO-RBC投与群では、アシドーシス及び高K血症が軽減化していた。
【００４３】
【表１】
0006523842.tif 000002
【００４４】
（１−４）腎機能及び腎組織学的変化に及ぼす影響
横紋筋融解症AKIに対するCO-RBCの腎保護効果を、腎機能パラメータの観点から評価した。具体的には、グリセロール処置3時間後に、生理食塩水、RBCまたはCO-RBCを投与し、グリセロール投与24時間後の腎障害パラメータ (尿素窒素 (BUN), 血清クレアチニン (SCr)) を測定した。また、グリセロール投与後24時間まで蓄尿し、クレアチニンクリアランス (CCr) を算出した。加えて、近位尿細管からの逸脱酵素であり、尿細管障害に伴い早期に尿中に出現するためAKIの指標として用いられる尿中N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) 活性も測定した。その結果、生理食塩水投与群は、対照群と比較して、BUN、SCr及び尿中NAG活性の有意な上昇と、CCrの有意な減少が観察された (図４)。類似した結果がRBC投与群でも認められた。対照的に、CO-RBC投与群では、腎機能の低下が有意に抑制されていた。このことから、RBC投与は、横紋筋融解症AKIによる腎機能低下を改善しないものの、CO-RBC投与は腎機能低下を抑制することが示された。このことから、本病態の改善におけるCOの有用性が見出された。
【００４５】
また、ヒトにおける横紋筋融解症では、筋由来Mbの腎組織への沈着により、臨床所見として著しい尿細管障害が認められる （非特許文献１４〜１６）。そこで、生理食塩水、RBC、CO-RBC投与群における腎臓及び腎組織切片像を形態学的及び組織学的に評価した。図５Ａには腎臓の画像を示す。対照群の深紅色で表面がなめらかな腎臓とは異なり、生理食塩水及びRBC投与群では、変色や萎縮が観察され、臓器表面に凹凸が認められた。他方、CO-RBC投与群では、そのような外観上の変化が軽減化し、対照と類似した形態を保持していた。そこで次に、各群の腎切片を作成し、periodic acid schiff (PAS) 染色により組織学的観察を行った。その結果、生理食塩水及びRBC投与群では、尿細管の核の脱落が認められた (図５Ｂ)。一方、CO-RBC投与群では、そのような顕著な尿細管変性は認めらず、組織学的にも対照群と類似していた。これらの組織学的変化は、図４で示した腎機能パラメータの変動とよく対応していた。
【００４６】
（１−５）尿所見に及ぼす影響
横紋筋融解症の確定診断基準の一つに尿所見がある。具体的には、Mbやヘモグロビン (Hb) などのタンパクが尿中に排泄されるため、尿潜血が観察され、褐色尿を呈し、尿pHが酸性化する。そこでまず、生理食塩水、RBC、CO-RBC投与群についてグリセロール処置後の24時間の蓄尿を行った。図６に示すように、生理食塩水及びRBC投与群では褐色尿が認められた。一方、CO-RBC投与群では、着色の程度が低かった。次に、尿潜血、尿中pH、タンパク尿を解析したところ、生理食塩水及びRBC投与群において、尿潜血と尿タンパクの陽性反応が、また尿pHの低下が観察された。一方、CO-RBC投与群では、それら尿所見の変動が抑制されていた (表２)。さらに、尿潜血の内容を精査すべく、蓄尿 (24時間) 中に存在するMbまたはHb濃度を測定した。その結果、Mbは、生理食塩水及びRBC投与群で顕著に増加した (図７)。一方、CO-RBC投与群ではそれらの1/3程度の蓄積しか認められなかった。Hbについては、対照群で検出できなかったが、他の3群では同程度の蓄積が認められた。ただし、MbとHbの蓄積量を比較すると、ヒトと同様、いずれの群でもMb優位であった。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
（１−６）溶血に及ぼす影響
横紋筋融解症では、血中の酸化ストレスが増加する結果、赤血球の脂質過酸化が亢進し、溶血症状を呈するようになる。また、重症化すると貧血となるため、RBC輸血が施行されるようになる。そこで、CO-RBCの溶血に対する影響を検討すべく、グリセロール処置後から24時間の間、経時的にRBC数及びヘマトクリット値 (Hct)を測定した。その結果、対照群と比較して、生理食塩水投与群では、グリセロール処置3時間後よりRBC数及びHct値が低下した (図８Ａ、Ｂ)。一方、RBCまたはCO-RBC投与群では、投与3時間後 (グリセロール投与6時間後) から貧血症状の改善を認めた。
【００４９】
（１−７）血漿及び腎臓中の酸化ストレスに及ぼす影響
遊離ヘム誘発の酸化ストレスに及ぼすCO-RBCの影響について検討した。ここでは、グリセロール処置24時間後に、脂質過酸化物である血漿中マロンジアルデヒド (MDA) 及び酸化障害により蓄積する血漿中ヒドロペルオキシド (酸化代謝物) 濃度を測定した。図９Ａ及びＢで示すように、対照群と比較して、生理食塩水及びRBC投与群では、血漿中MDA及びヒドロペルオキシド濃度の有意な上昇が観察された。これに対し、CO-RBC投与群では、それらの上昇が抑制されていた。また、遊離ヘム濃度とMDAの関係を調べたところ、両者の間に正の相関傾向が認められた (図９Ｃ)。
【００５０】
筋肉中のMbが血中に漏出し、腎組織に沈着すると、分子内ヘム鉄が2価から3価に酸化され、Mb酸化体を生成する（非特許文献１７及び１８）。この酸化体はより強力な酸化物質として、更なる酸化ストレスを惹起するため、病態との関連性が注目されている。Mb酸化体は、410 nm付近に吸収極大を有しているため、これを指標として、各群における腎組織中のMb酸化体の有無を測定した。図１０には、生理食塩水、RBC、CO-RBC投与群の腎ホモジネートにおける吸収スペクトルを示す。生理食塩水投与群では、対照と比較して410 nm付近の吸光度が上昇し、Mb酸化体の蓄積が認められた。類似したスペクトル変化が、RBC投与群でも観察された。一方、CO-RBC投与群ではその上昇が抑制され、対照群と同じ様なスペクトル特性を示していた。以上の結果より、CO-RBCは、横紋筋融解症AKIモデルラットでの遊離ヘム及びMb酸化体の蓄積を阻害するため、腎組織での酸化ストレスの亢進を抑制することが示された。
【００５１】
（１−８）生存率に及ぼす影響
横紋筋融解症AKIに対するCO-RBCの救命効果を検討した。グリセロール誘発の横紋筋融解症AKIモデルラットに対して、グリセロール処置3時間後に、生理食塩水、RBCまたはCO-RBCを後投与し、その後の生存率を経日的に評価した。その結果、生理食塩水、RBC処置群では、観察2日目から死亡が確認され、5日目では、生理食塩水処置群で80% (8/10)、RBC処置群で60% (6/10) が死亡した (図１１)。一方、CO-RBC処置群では、観察期間中の死亡例は認められなかった (0/10)。この結果より、CO-RBCは、非外傷性横紋筋融解症AKIラットに対して優れた救命効果を有していることが判明した。
【００５２】
（２）外傷性横紋筋融解症AKIラットの生存率に及ぼす影響
横紋筋融解症の多くを占める外傷性横紋筋融解症に対するCO-RBCの治療効果を検討した。出血を伴う外傷性横紋筋融解症AKIを考慮して、グリセロール処置1時間後に、40%脱血を行い、同時に 生理食塩水、RBC、CO-RBCによる蘇生を行って、生存率を経時的に評価した。その結果、生理食塩水投与群では、出血性ショック併発4時間後で死亡が観察され、9時間内に全てのラットの死亡が確認された (0/10) (図１２)。また、RBC投与群でも、出血性ショック併発4時間後より死亡が確認され、24時間後での生存率は10%であった (1/10)。対照的に、CO-RBC投与群では、全例が生存していた (10/10)。このことから、CO-RBCの後投与は、外傷性横紋筋融解症AKIに対しても優れた治療効果を発揮することが明らかとなった。
【００５３】
（３）クラッシュ・シンドロームモデルラットの生存率に及ぼす影響
横紋筋融解症に対し、CO-RBCが優れた救命効果を発揮したことから、クラッシュ・シンドロームに対しても、治療効果を発揮するのではないかと期待して、その有用性を生存率により評価した。既法（非特許文献１２及び１３）に従い、2.0 kg荷重下でステンレスパイプに巻き付けたゴムバンドをラット両後肢に装着し、5時間圧迫することでクラッシュ・シンドロームモデルを作成した。圧迫によりラットの両後肢は紫色に変色し、筋障害が外観上から示唆された。ゴムバンド装着5時間後、圧迫を解除し、その1時間後に、生理食塩水、RBCまたはCO-RBCを投与し、その後の生存率をモニタリングした。その結果、生理食塩水投与群では、圧迫解除後3時間より死亡が観察され、9時間内に全例が死亡した (10/10) (図１３)。また、RBC投与群でも、圧迫解除後6時間より死亡例が出現し、18時間内に全例が死亡した (10/10)。対照的に、CO-RBC投与群では、全例が生存した (0/10)。これらの結果から、CO-RBCは、クラッシュ・シンドロームに対しても治療効果を発揮することが判明した。
【図１】
0006523842.tif 000004
【図２】
0006523842.tif 000005
【図３】
0006523842.tif 000006
【図４】
0006523842.tif 000007
【図５】
0006523842.tif 000008
【図６】
0006523842.tif 000009
【図７】
0006523842.tif 000010
【図８】
0006523842.tif 000011
【図９】
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【図１０】
0006523842.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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