(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー結合部位、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、及びＲＮＡパッケージング配列を含むレトロウイルスベクターであって、前記ＲＮＡパッケージング配列が前記ＬＴＲの３’側に位置し、前記ＲＮＡパッケージング配列の３’側に位置するＬＴＲがなく、かつ前記プライマー結合部位で開始された逆転写は、ＲＮＡパッケージング配列を標的細胞中のベクターＤＮＡ中に逆転写しない、レトロウイルスベクター。
【請求項２】
前記ＬＴＲが、自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】
前記ベクターが、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの２つのＬＴＲを含み、前記ＲＮＡパッケージング配列が、前記３’ＬＴＲの３’側に位置する、請求項１又は２に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項４】
前記２つのＬＴＲが両方とも自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項３に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項５】
前記プライマー結合部位が、５’プライマー結合部位であり、前記ベクターが、３’プライマー結合部位を更に含む、請求項１又は２に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項６】
前記ＲＮＡパッケージング配列が、ＲＮＡパッケージングシグナル（Ψ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項７】
前記ＲＮＡパッケージング配列が、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）も含む、請求項６に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項８】
前記ベクターが、標的細胞中へ導入するための外来性ヌクレオチド配列を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項９】
前記ベクターが、３’ポリプリントラクト（３’ＰＰＴ）を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１０】
前記ベクターが、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、転写後制御エレメント（ＰＲＥ）を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１２】
前記ベクターが、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、前記ベクターゲノムの転写を駆動するためのプロモーターを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１４】
前記プライマー結合部位が、前記ベクターゲノムの転写を駆動するプロモーターの転写開始部位上に正確に配置されている、請求項１３に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１５】
前記ベクターが、前記ベクターの５’末端の近くに位置する主要スプライスドナー（ＭＳＤ）部位を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが、５’から３’方向に以下の構成要素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクター：
（ａ）５’−プロモーター−ＰＢＳ−発現可能な導入遺伝子−ＬＴＲ−ＰＢＳ−ＲＮＡパッケージング配列−３’；又は
（ｂ）５’−プロモーター−ＬＴＲ−ＰＢＳ−発現可能な導入遺伝子−ＬＴＲ−ＲＮＡパッケージング配列−３’。
【請求項１７】
前記ベクターが、５’から３’方向に以下の構成要素を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクター：
（ａ）５’−プロモーター−ＰＢＳ−ＭＳＤ（省略可能）−ｃＰＰＴ（省略可能）−発現可能な導入遺伝子−ＷＰＲＥ（省略可能）−ＰＰＴ−ＬＴＲ−ＰＢＳ−ＭＳＤ（省略可能）−ＲＮＡパッケージング配列−ポリＡシグナル（省略可能）−３’；又は
（ｂ）５’−プロモーター−ＬＴＲ−ＰＢＳ−ＭＳＤ（省略可能）−ｃＰＰＴ（省略可能）−発現可能な導入遺伝子−ＷＰＲＥ（省略可能）−ＰＰＴ−ＬＴＲ−ＭＳＤ（省略可能）−ＲＮＡパッケージング配列−ポリＡシグナル（省略可能）−３’。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクターを含むビリオン。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１９に記載のビリオンを含む医薬組成物。
【請求項２１】
遺伝子治療等の治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１９に記載のビリオン。
【請求項２２】
遺伝子治療において対象への導入遺伝子の導入に使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１９に記載のビリオン。
【請求項２３】
インビトロ及び／又はエクスビボで標的細胞に遺伝子を導入する方法であって、有効量
の請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１９に記載のビリオンを前記標的細胞に投与することを含み、前記ベクター又はビリオンが、発現可能な導入遺伝子を含む、方法。
【請求項２４】
対象（ヒトを除く）中の標的細胞に遺伝子を導入する方法であって、有効量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１９に記載のビリオンを前記対象に投与することを含み、前記ベクター又はビリオンが、発現可能な導入遺伝子を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２３に記載の方法によって作製された細胞。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法によって作製されたトランスジェニック動物（ヒトを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シスエレメントが３’ＬＴＲの下流に位置するレトロウイルスベクターに関する。したがって、これらのエレメントは、ビリオンへとパッケージングされ得るようにウイルスＲＮＡゲノム中に存在するが、逆転写されるゲノム領域の外側にあり、そのため、標的細胞中のベクターＤＮＡ中には存在しない。これにより、標的細胞中にトランスファーベクターシスエレメントが残留することに関連する不利益が低減される。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスベクターは、哺乳動物遺伝子導入のために開発された最も早いウイルスベクターの１つである。複数のレトロウイルス種、特にアルファレトロウイルス（非特許文献１）、ガンマレトロウイルス（非特許文献２）、レンチウイルスヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）（非特許文献３）、非ヒトレンチウイルス（非特許文献４）、及びスプーマウイルス（非特許文献５）がベクターへと開発された。
【０００３】
レトロウイルスからレトロウイルスベクターへの変化における最も重要な構造変化は、ビリオン産生のためのプロデューサー細胞中でトランスに必要なウイルスタンパク質コード配列からの、遺伝子導入される核酸上でシスに必要なウイルス非コード配列の分離である。この分離により、ウイルスタンパク質が標的細胞中で産生されないので、１回のみ感染できるベクターが得られる。
【０００４】
ＲＲＬ又はＣＣＬ（非特許文献３）等の標準的な第３世代ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターでは、ビリオン産生中、プロデューサー細胞中に以下の４つのプラスミドをコトランスフェクションする必要がある（図１）：必須シスエレメント及び導入遺伝子発現カセットを含むトランスファーベクター、ＨＩＶ−１ポリタンパク質Ｇａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌを発現するパッケージングプラスミド、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質発現のためのプラスミド、並びにウイルスエンベロープタンパク質発現のためのプラスミド。レンチウイルスベクターは、他のエンベロープされたウイルスから、エンベロープタンパク質がプロデューサー細胞中で共発現された場合、それらを取り込むことができ、この現象はシュードタイピングとして知られる。最も一般的に使用されるエンベロープタンパク質は水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）であり、レンチウイルスベクタービリオンに安定性及び広い指向性を付与する（非特許文献６）。
【０００５】
トランスファーベクター中に含まれる必須シスエレメントには、ＨＩＶ−１の長い末端反復配列（Long terminal repeat）（ＬＴＲ）、ＲＮＡパッケージングシグナル（Ψ）、及び好ましくはＲｅｖ応答配列（Rev responsible element）（ＲＲＥ）が含まれる。Ｌ
ＴＲは、ベクターゲノムの転写、逆転写、及び組込みに必要な配列を含む。自己不活型（ＳＩＮ）トランスファーベクター中では、そのプロモーター及びエンハンサー活性を除くためにウイルス３’Ｕ３領域のほとんど全てが除去されている（非特許文献３）。逆転写のメカニズムは、両方のプロウイルスＵ３がＲＮＡゲノムの３’ＬＴＲに由来するようになっており、そのため、このベクターの感染により生じたプロウイルスはＬＴＲによって駆動される転写を欠いており、標的細胞中でその全ゲノムを効率的に転写できない。ＲＮＡパッケージングシグナルは、ｇａｇコード配列の開始部の中にまで延びていると考えられるが、ｇａｇ開始コドンの下流に点変異が導入されてこの配列の大部分の翻訳を防いでいる。Ｒｅｖタンパク質は、プロデューサー細胞中のＲＲＥと相互作用して転写産物を安定化し、核からのＲＮＡの搬出を促進し、ビリオンへのＲＮＡパッケージングを増強する（非特許文献７；８）。必須ではないがよく用いられるシスエレメントとしては、非分裂細胞の形質導入を促進するＨＩＶ−１由来セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（
非特許文献９）並びにポリアデニル化の効率を向上させることによりウイルス力価及び導入遺伝子発現を向上させるウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）（非特許文献１０）が含まれる。
【０００６】
標準的な第３世代レンチウイルスベクター中では、これらのシスエレメントが標的細胞中で導入遺伝子発現カセットと共に逆転写され、その結果、２３６ｂｐのＨＩＶ−１  ＤＮＡをそれぞれが含む２つのＳＩＮ  ＬＴＲ、４９０ｂｐのＨＩＶ−１  ＤＮＡを含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）からＧａｇの領域、８５８ｂｐのＨＩＶ−１  ＤＮＡを含むＲＲＥ、及び６９ｂｐのＨＩＶ−１  ＤＮＡを含むＮｅｆからポリプリントラクト（ＰＰＴ）の領域が組み込まれたプロウイルスが生じ、全長１８８９ｂｐのＨＩＶ−１  ＤＮＡが標的細胞に導入される。これらのウイルスシスエレメントは、導入遺伝子発現カセットに共有結合しており、形質導入後も標的細胞中に残留する。組込み型のレンチウイルスベクターが使用される場合、それらは標的細胞染色体に不可逆的に組み込まれる。
【０００７】
標的細胞中のトランスファーベクターシスエレメント残留の結果
標的細胞中でのＨＩＶ−１由来シスエレメントの長期残留は、細胞培養物又はモデル動物への導入された遺伝子の生物学的影響の研究、トランスジェニック動物株及び安定細胞系の作製、並びにヒト疾患を処置するための治療遺伝子の導入におけるレンチウイルスベクターの実際的応用に対して、複数の実験的に観察される及び理論的にあり得る問題を生じさせる。
【０００８】
第１に、トランスファーベクターシスエレメントは、宿主細胞遺伝子とスプライスして異常な融合転写産物を作ることができる活性スプライスアクセプター部位を含む（非特許文献１１〜１３）。遺伝子治療臨床試験において、この種のイベントが観察され、患者の成長促進性ＨＭＧＡ２遺伝子のコピーと組込み型レンチウイルスプロウイルスとの間でのスプライシングによってＨＭＧＡ２転写の調節解除及び形質導入された細胞の大規模なクローン増殖が生じた（非特許文献１４）。
【０００９】
第２に、ＲＮＡパッケージングに必要なシスエレメントの残留は、ウイルスタンパク質を発現する細胞中での自己不活型レンチウイルスベクターゲノムの再可動化を可能にする（非特許文献１５）。ＨＩＶ感染患者で使用された場合、これにより、再可動化されたレンチウイルスベクタープロウイルス及び野生型ＨＩＶ−１ゲノムとの組換えが生じ得る。
【００１０】
第３に、レンチウイルスシスエレメントは、ＤＮＡメチル化を受け易い非転写ＣｐＧリッチＤＮＡを含み、宿主細胞中でのサイレンシングを介して、導入された導入遺伝子の発現低下の一因となり得る（非特許文献１６）。
【００１１】
第４に、エピソームＤＮＡベクター内の巨大な非転写領域が、インビボでの導入遺伝子サイレンシングに関連付けられている（非特許文献１７）。したがって、エピソーム組込み欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）内の非転写領域のサイズを小さくすることにより、これらのベクターの適用における長期発現が向上し得る。
【００１２】
第５に、逆転写産物のサイズを小さくすると、レンチウイルスベクターの導入遺伝子運搬能が大きくなり得る。ＲＮＡパッケージング（非特許文献１８）、細胞内ｄＮＴＰ濃度が低い細胞型中での逆転写（非特許文献１９）、及び染色体への組込み等のレンチウイルスのライフサイクルの複数の段階がベクターゲノムサイズにとって制限的であり得る。
【００１３】
標的細胞プロウイルス内のシスエレメントの最小化
標的細胞プロウイルス内に残り続けるウイルスシスエレメントを最小化する目的に向かって複数のアプローチが取られてきた。
【００１４】
第１に、複数の著者らが、残るシスエレメントを除去又は不活性化するためのシンプルな欠失及び点変異の影響を調べてきた。Ｃｕｉらは、Ｇａｇの上流に配置されたＨＩＶ−１主要スプライスドナー（ＭＳＤ）への点変異並びにＨＩＶ−１シスＤＮＡの５５０ｂｐ（又はプロウイルス中の両方のＬＴＲを考慮する場合７８６ｂｐ）を含むトランスファーベクターを生じるＧａｇ及びＲＲＥエレメントの更なる漸増的欠失を報告している（非特許文献２０）。２９３Ｔプロデューサー細胞中では、これらの変化は、スプライシングされないトランスファーベクターＲＮＡの発現を大きく減少させたが、ＴＥ６７１細胞中では、細胞型特異的スプライシングパターンのため、この影響はさほど顕著でなく、得られた力価の低下は２分の１だけであった。このシステムは、おそらく力価の低下と一般的でないプロデューサー細胞系の組合せのため、当該技術分野で広く採用されていない。Ｋｏｔｓｏｐｏｕｌｏｕらは、パッケージングプラスミドのコドン最適化及びトランスファーベクターからのＲＲＥの欠失によりＲｅｖ非依存的レンチウイルスベクターを作製する試みを報告しており、力価は５分の１に低下した（非特許文献２１）。その後、トランスファーベクターＲＮＡのビリオンへの効率的パッケージングにＲｅｖ／ＲＲＥシステムが必要であることが報告されている（非特許文献８）。Ｋｏｌｄｅｊらは、ＰＰＴ上流のＮｅｆコード配列の量の最小化を報告している（非特許文献２２）。ＰＰＴのすぐ上流の５チミジン塩基までの配列全体が不要なようである。
【００１５】
標的細胞プロウイルス内のシスエレメントを最小化するための第２のアプローチは、これらのエレメントがウイルスＲＮＡゲノム中に存在するが、その後、逆転写又は組込み中に欠失されるベクターをデザインすることである。
【００１６】
Ｄｅｌｖｉｋｓらは、ＲＮＡパッケージングシグナルに単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）の７０１ｂｐリピートが隣接したガンマレトロウイルスベクターを報告している（非特許文献２３）。標的細胞中での逆転写中、１つのリピートから別のリピートへの逆転写酵素による鋳型転換により、ＲＮＡパッケージングシグナルの欠失が生じた。鋳型転換は逆転写酵素に必須の活性ではないので、この欠失の効率はクローンの９１％であったと報告された。このシスエレメントを欠失させる戦略には、それ自体は欠失されない新たなシスエレメント（この場合には、ＨＳＶ−ＴＫ）を導入する必要があるという欠点がある。このベクターから派生した特許及び特許出願には米国特許第５７４１４８６号、同第５７１４３５３号、及び国際公開第９５／０３２２９８号が含まれる。Ｓｒｉｎｉｖａｓａｋｕｍａｒは、ＲＲＥにハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の反復コピーを隣接させたレンチウイルスベクターで同様な戦略を用いて、クローンの８４％でＲＲＥを欠失させた（非特許文献２４）。
【００１７】
Ｔｏｒｎｅ−Ｃｅｌｅｒらは、レトロウイルスインテグラーゼが内部ａｔｔ部位を切断する能力を用いて、組込みの３’末端プロセシング段階でウイルスインテグラーゼ酵素により組込み前複合体から５’ＬＴＲ及びＲＮＡパッケージングシグナルが切断除去されるアルファレトロウイルスベクターを作製した（非特許文献２５）。この報告では、クローンの６１％が予想された欠失を有していたが、内部ａｔｔ部位のプロセシングは異種プロウイルス生成物を生成するようであり、力価は、より従来のアルファレトロウイルスベクターで予想される力価の１０2〜１０3分の１であった（非特許文献２６）。
【００１８】
レンチウイルスシスエレメントを最小化するための第３のアプローチは、形質導入後に標的細胞プロウイルスからそれらを除去することである。Ｌｕｃｈｅらは、標的細胞中でトランスにＣｒｅリコンビナーゼが与えられた時に切り出すことができるようにＲＮＡパッケージングシグナルにｌｏｘＰ部位が隣接したレンチウイルスベクターを報告している（非特許文献２７）。形質導入された２９３Ｔ細胞では、形質導入細胞の１２〜２０％で切出しに成功した。Ｆａｎｇらは、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現カセットを組み込んだ自己
最小化レンチウイルスベクターを報告しており、これは標的細胞の形質導入後にＲＮＡパッケージングシグナル、ＲＲＥ、及びそれ自身を切り出した（非特許文献２８）。Ｃｒｅ発現の減少によって測定される切出しの成功は標的細胞の９２％で起こった。これらの戦略は両方とも、標的細胞中でのＣｒｅリコンビナーゼの発現及び機能の成功に頼っており、このような戦略が近い将来に患者での使用の規制承認を受ける可能性はほとんどない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Suerth JD, Maetzig T, Galla M, Baum C, Schambach A. Journal of Virology 2010 Jul 1;84(13):6626-35.
【非特許文献２】Hildinger M, Abel KL, Ostertag W, Baum C. Journal of Virology 1999 May 1;73(5):4083-9.
【非特許文献３】Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, et al. Journal of Virology 1998 Dec 1;72(12):9873-80.
【非特許文献４】Jarraya B+, Boulet S, Scott Ralph G, Jan C, Bonvento G, Azzouz M, et al. Science Translational Medicine 2009 Oct 14;1(2):2ra4.
【非特許文献５】Heinkelein M, Dressler M, Jirmy G, Rammling M, Imrich H, Thurow J, et al. Journal of Virology 2002 Apr 15;76(8):3774-83.
【非特許文献６】Burns JC, Friedmann T, Driever W, Burrascano M, Yee JK. Proceedings of the National Academy of Sciences 1993 Sep 1;90(17):8033-7.
【非特許文献７】Malim MH, Hauber J, Le SY, Maizel JV, Cullen BR. Nature 1989 Mar 16;338(6212):254-7.
【非特許文献８】Cockrell A, van Praag H, Santistevan N, Ma H, Kafri T. Retrovirology 2011;8(1):51.
【非特許文献９】Sirven A, Pflumio F, Zennou V, Titeux M, Vainchenker W, Coulombel L, et al. Blood 2000 Dec 15;96(13):4103-10.
【非特許文献１０】Higashimoto T, Urbinati F, Perumbeti A, Jiang G, Zarzuela A, Chang LJ, et al. Gene Ther 2007 Jun 28;14(17):1298-304.
【非特許文献１１】Cesana D, Sgualdino J, Rudilosso L, Merella S, Naldini L, Montini E. J Clin Invest 2012 May 1;122(5):1667-76.
【非特許文献１２】Moiani A, Paleari Y, Sartori D, Mezzadra R, Miccio A, Cattoglio C, et al. J Clin Invest 2012 May 1;122(5):1653-66.
【非特許文献１３】Almarza D, Bussadori G, Navarro M, Mavilio F, Larcher F, Murillas R. Gene Ther 2011 Jul;18(7):674-81.
【非特許文献１４】Cavazzana-Calvo M, Payen E, Negre O, Wang G, Hehir K, Fusil F, et al. Nature 2010 Sep 16;467(7313):318-22.
【非特許文献１５】Hanawa H, Persons DA, Nienhuis AW. Journal of Virology 2005 Jul 1;79(13):8410-21.
【非特許文献１６】He J, Yang Q, Chang LJ. Journal of Virology 2005 Nov 1;79(21):13497-508.
【非特許文献１７】Lu J, Zhang F, Xu S, Fire AZ, Kay MA. Mol Ther 2012 Nov;20(11):2111-9.
【非特許文献１８】Kumar M, Keller B, Makalou N, Sutton RE. Hum Gene Ther 2001 Oct 10;12(15):1893-905.
【非特許文献１９】Descours B, Cribier A, Chable-Bessia C, Ayinde D, Rice G, Crow Y, et al. Retrovirology 2012 Oct 23;9:87. doi: 10.1186/1742-4690-9-87.:87-9.
【非特許文献２０】Cui Y, Iwakuma T, Chang LJ. Contributions of Viral Splice Sites and cis-Regulatory Elements to Lentivirus Vector Function. Journal of Virology 1999 Jul 1;73(7):6171-6.
【非特許文献２１】Kotsopoulou E, Kim VN, Kingsman AJ, Kingsman SM, Mitrophanous KA. Journal of Virology 2000 May 15;74(10):4839-52.
【非特許文献２２】Koldej R, Anson D. BMC Biotechnology 2009;9(1):86.
【非特許文献２３】Delviks KA, Pathak VK. Journal of Virology 1999 Oct 1;73(10):7923-32.
【非特許文献２４】Srinivasakumar N. Peer J 2013 Jun 4;1:e84. doi: 10.7717/peerj.84. Print;%2013.:e84.
【非特許文献２５】Torne-Celer C, Moreau K, Faure C, Verdier G, Ronfort C. Intervirology 2008;51(6):447-52.
【非特許文献２６】Torne-Celer C, Moreau K, Faure C, Verdier G+, Ronfort C. Arch Virol 2008;153(12):2233-43.
【非特許文献２７】Luche RM, Enssle J, Kiem HP. Sci Rep 2012 Jun 1;2.
【非特許文献２８】Fang Y, Gong X, Xu M, Zeng F, Zhang J. J Gene Med 2013 Feb 1;15(2):102-12.
【非特許文献２９】Voronin YA, Pathak VK. Journal of Virology 2004 May 15;78(10):5402-13.
【非特許文献３０】Aki T, Yanagisawa S, Akanuma H. Journal of Biochemistry 1997 Aug 1;122(2):271-8.
【非特許文献３１】Fuller M, Anson DS. Hum Gene Ther 2001 Nov;%20;12(17):2081-93.
【非特許文献３２】Carswell S, Alwine JC. Molecular and Cellular Biology 1989 Oct 1;9(10):4248-58.
【非特許文献３３】Isomura H, Stinski MF, Kudoh A, Nakayama S, Murata T, Sato Y, et al. Journal of Virology 2008 Jan 15;82(2):849-58.
【非特許文献３４】Perkins KJ, Lusic M, Mitar I, Giacca M, Proudfoot NJ. Molecular Cell 2008 Jan 18;29(1):56-68.
【非特許文献３５】Ashe MP, Pearson LH, Proudfoot NJ. EMBO J 1997 Sep 15;16(18):5752-63.
【非特許文献３６】Furger A, Binnie JMO, Lee BA, Proudfoot NJ. Genes & Development 2002 Nov 1;16(21):2792-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明者らは、標的細胞中のトランスファーベクターシスエレメント残留に関連する不利益を低減するために別の方法で標的細胞プロウイルス内のシスエレメントを最小化しようとした。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
既存のレンチウイルスベクターでは、ＲＮＡパッケージングシグナル及びＲＲＥ等のシスエレメントが２つのウイルスＬＴＲの間に位置しており、そのため、逆転写されるゲノム領域内にある。本発明のベクターでは、これらのシスエレメントが３’ＬＴＲの下流に位置する。したがって、これらのエレメントは、ビリオンへとパッケージングされ得るようにウイルスＲＮＡゲノム中に存在するが、逆転写されるゲノム領域の外側にあり、そのため、標的細胞中のベクターＤＮＡ中には存在しない。
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様では、プライマー結合部位、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、及びＲＮＡパッケージング配列を含むレトロウイルスベクターであって、プライマー結合部位で開始された逆転写が標的細胞中でのベクターＤＮＡへのＲＮＡパッケージング配列の逆転写につながらないようにＲＮＡパッケージング配列がＬＴＲの３’に位置するレトロウイルスベクターが提供される。言い換えると、ベクターの逆転写により、標的
細胞中で生成する逆転写産物からＲＮＡパッケージング配列が除去される。このベクター中では、ＲＮＡパッケージング配列の３’に位置するＬＴＲはない。
【００２３】
このレトロウイルスベクターは、遺伝情報を真核細胞に導入できる任意の好適なレトロウイルスに基づき得る。例えば、レトロウイルスベクターは、アルファレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はスプーマレトロウイルスベクターであり得る。このようなベクターは、遺伝子治療処置及び他の遺伝子導入用途で広く用いられてきた。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。場合によっては、レトロウイルスベクターはＨＩＶ−１に基づいてもよい。
【００２４】
ベクターはプライマー結合部位（ＰＢＳ）を含む。これは、逆転写プロセス中のマイナス鎖合成の開始を担うｔＲＮＡプライマーに結合する部位である。プライマー結合部位は、ＬＴＲの５’又は３’のいずれかに位置し得る。好ましくは、このプライマー結合部位はベクターの５’末端の方に位置する。好ましくは、プライマー結合部位はＬＴＲの５’側に位置する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ベクターは第２のプライマー結合部位を含む。好ましくは、これは長い末端反復配列（ＬＴＲ）の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、これら２つのプライマー結合部位は、５’プライマー結合部位及び３’プライマー結合部位と呼ばれる。いくつかの実施形態では、第２のプライマー結合部位は、ＬＴＲの３’側の隣に位置する。好ましくは、ＲＮＡパッケージング配列が第２のプライマー結合部位の３’に位置するように、第２のプライマー結合部位はＬＴＲとＲＮＡパッケージング配列の間に位置する。
【００２６】
プライマー結合部位は、逆転写プロセス中のマイナス鎖合成の開始を担うｔＲＮＡプライマーに結合する。プライマー結合部位は更に、逆転写プロセス中のプラス鎖転移のための相同性を提供する。
【００２７】
ベクターは長い末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。好ましくは、これはベクターの３’末端の方に位置する（但し、ＲＮＡパッケージング配列等のいくつかの構成要素がベクターの更に３’末端の方に配置されてもよい）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲと呼ばれる２つの長い末端反復配列を含む。５’ＬＴＲは、ベクターの５’末端の方に位置する（但し、更に５’末端側に構成要素があってもよい）。２つのＬＴＲが存在する場合、プライマー結合部位は好ましくは５’ＬＴＲの３’側（しかし、３’ＬＴＲの５’側）に位置する。プライマー結合部位は、５’ＬＴＲの３’側の隣に位置し得る。
【００２９】
レトロウイルスＬＴＲは通常、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域のセグメントに分けられる。しかし、特定のＬＴＲでは、これらの領域の一部が欠失していることがある。「長い末端反復配列」又は「ＬＴＲ」という用語は、ＬＴＲの全てのそのようなバリエーションをカバーすることが意図される。ＬＴＲは、ベクターＲＮＡに基づいて標的細胞中でベクターＤＮＡが産生されるように、逆転写プロセスに関与する。ＬＴＲは、転写エンハンサー、プロモーター、転写開始シグナル、及び／又はポリアデニル化シグナル等の遺伝子発現に必要な複数のシグナルを含み得る。
【００３０】
ＬＴＲは自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲであり得る。ベクター中、安全性を向上させるために、ＬＴＲは好ましくは、Ｕ３領域中のヌクレオチドが欠失した自己不活型ＬＴＲである。これは、ＴＡＴＡボックス及び転写因子の結合部位を含み得る。欠失は標的細胞中で
の逆転写後に５’ＬＴＲに移り、プロウイルス中でのＬＴＲの転写が不活性化される。
【００３１】
ベクターが２つのＬＴＲを含む場合、両方がＳＩＮ  ＬＴＲであってもよい。５’ＬＴＲのＵ３領域はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター等のプロモーターで置換されてもよい。これにより、Ｔａｔ非依存的転写となるが、依然として高レベルの発現が維持される。前述したように、３’ＬＴＲはＵ３領域からヌクレオチドが欠失している。ＳＩＮ  ＬＴＲは当業者に周知である（例えば、Retroviruses. Edited by Coffin JM, Hughes SH, and Varmus HE.  Cold Spring Harbor (NY):
Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1997参照）。
【００３２】
好ましくは、ベクターが１つのＬＴＲを含む場合、ベクターは２つのＰＢＳを含む。１つのＰＢＳはベクターの５’末端の方に位置し（５’ＰＢＳ）、ベクターゲノムの転写を駆動するプロモーターのための転写開始部位に正確に接して位置し得る。１つのＰＢＳはベクターの３’末端の方、ＬＴＲの３’に位置する（３’ＰＢＳ）。３’ＰＢＳは、逆転写プロセス中、マイナス鎖合成の開始部位として働く。５’ＰＢＳは、逆転写プロセス中のプラス鎖転移のための相同性を提供する。
【００３３】
好ましくは、ベクターが２つのＬＴＲ（５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ）を含む場合、ベクターは１つのＰＢＳを含む。ＰＢＳはベクターの５’末端の方に位置し（５’ＰＢＳ）、５’ＬＴＲの３’に位置する。ＰＢＳは、マイナス鎖合成の開始部位として働き、逆転写プロセス中のプラス鎖転移のための相同性を提供する。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明は、５’プライマー結合部位；３’ＬＴＲ；ＲＮＡパッケージング配列；及び３’プライマー結合部位又は５’ＬＴＲのいずれかを含み、ＲＮＡパッケージング配列が、標的細胞中でベクターＤＮＡへとＲＮＡパッケージング配列が逆転写されないように３’ＬＴＲの３’に位置する、レトロウイルスベクターを提供する。
【００３５】
ベクターは、標的細胞中でベクターＤＮＡへとＲＮＡパッケージング配列が逆転写されないようにＬＴＲの３’に位置するＲＮＡパッケージング配列を含む。ベクターが２つのＬＴＲを含む実施形態では、ＲＮＡパッケージング配列は、標的細胞中でベクターＤＮＡへとＲＮＡパッケージング配列が逆転写されないように、３’ＬＴＲの３’（すなわち、両方のＬＴＲの３’）に位置する。ＲＮＡパッケージング配列は、プロデューサー細胞によってウイルス粒子が構築される際に、レトロウイルスＲＮＡゲノムをウイルス粒子へとパッケージングする必須のプロセスに必要である。ＲＮＡパッケージング配列は、新生ウイルス粒子内のウイルスタンパク質に結合できる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡパッケージング配列はＲＮＡパッケージングシグナル（Ψ）を含む。ＨＩＶ−１中では、ｇａｇ遺伝子の一部がＲＮＡパッケージングに関与することが見出されている。ＲＮＡパッケージング配列はＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を含んでもよい。ＲＮＡパッケージング配列及びこれを構成する構成要素は当業者に周知である（例えば、Retroviruses. Edited by Coffin JM, Hughes SH, and Varmus HE.  Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1997参照）。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、標的細胞中へ導入するための外来性ヌクレオチド配列を更に含む。この外来性ヌクレオチド配列は、標的細胞中に挿入したいと望まれ得る任意の配列であり得る。例えば、外来性ヌクレオチド配列は、発現可能な導入遺伝子、ＲＮＡ干渉カセット、又は、例えば異なる細胞の系統をマーキングするための、分子バーコードであり得る。外来性ヌクレオチド配列は、ＰＢＳ（２つのＰＢＳがある場合、５’ＰＢＳ）とＬＴＲ（２つのＬＴＲがある場合、３’ＬＴＲ）との間に位置すべきである。
【００３７】
いくつかの実施形態では、外来性ヌクレオチド配列は発現可能な導入遺伝子である。こ
の導入遺伝子は、非レトロウイルス遺伝子であり、標的細胞中での発現が望まれる任意の遺伝子であり得る。発現可能な導入遺伝子は、ＰＢＳ（２つのＰＢＳがある場合、５’ＰＢＳ）とＬＴＲ（２つのＬＴＲがある場合、３’ＬＴＲ）との間に位置すべきである。導入遺伝子は、ペプチド又はタンパク質をコードし得、あるいは非コードＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はペプチド又はタンパク質をコードする。好ましくは、ペプチド又はタンパク質は遺伝子治療に有用であるべきである。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はプロモーター（例えば、ＰＧＫ又はＧＡＰＤＨプロモーター）の制御下にある。
【００３８】
導入遺伝子の発現は、細胞の正常な成長を助け得るか、対象の健康を維持し得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対象中に存在しない又は対象中で低発現のペプチド又はタンパク質をコードする。あるいは、導入遺伝子は、医学的状態を防止又は寛解するのに役立つペプチド又はタンパク質をコードし得る。ペプチド又はタンパク質は、癌、アテローム性動脈硬化症、鎌状赤血球貧血、感染症、代謝障害、神経疾患、及びサラセミア等の疾患の処置に有用なものであり得る。そのようなペプチド及びタンパク質の例として、ヘモグロビン、造血因子、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、共通ガンマ鎖、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）、ＧＰ９１ｐｈｏｘ、及びＡＢＣＤ１が挙げられる。もう１つの例は、癌及び特に腫瘍の処置に使用できる分子である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。腫瘍抑制因子ｐ５３及び網膜芽細胞腫（ＲＢ）も考えられる。種々のサイトカイン、例えばマスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、及びインターロイキン１〜１１も本発明が想定するタンパク質である。ｐ−糖タンパク質をコードする多剤耐性遺伝子（ｍｄＲ）も導入遺伝子として考えられる。ペプチド又はタンパク質は真核生物における抗生物質耐性の選択マーカーであってもよい。その他の種類の選択マーカー、例えばＡＰＲＴ欠損細胞におけるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、蛍光タンパク質又はホタルルシフェラーゼ遺伝子も含まれる。ペプチド又はタンパク質は、付加的な又は変化した酵素活性を宿主に提供するタンパク質、例えば反応性移植の「自殺療法（suicide therapy）
」のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼタンパク質、又は毒素、例えば癌の処置のためのジフテリア毒素タンパク質であってもよい。これらのタンパク質をコードする導入遺伝子は、ルーチンなクローニング法（Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY）、目的の遺伝子を含むベクターからの切出し、又は公開配列情報に基づく化学的若しくは酵素的合成等の種々の方法のいずれかによって提供され得る。多くの場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡは市販されている。別の実施形態では、導入遺伝子は、細胞の実験操作を可能にするタンパク質、例えば毒素又は蛍光若しくは薬物選択マーカーをコードする。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、導入遺伝子は、非コードＲＮＡ分子へと転写されることができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、細胞内で遺伝子の発現レベルを変化させることができる非コードＲＮＡをコードしてもよく、あるいは酵素活性を有するリボ核タンパク質複合体の構成要素である。そのような非コードＲＮＡの例として、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（piwi-interacting RNA）（ｐｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、目的のｍＲＮＡ又はＤＮＡにハイブリダイズするのに充分相補的な非コードＲＮＡをコードし得る。そのようなＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡであり、過剰生成される分子、欠損がある分子、若しくはその他何らかの望ましくない分子の発現の防止若しくは制限に又は遺伝子機能の研究に有用である。本発明のベクターは、導入遺伝子として、標的配列に対して充分相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする配列を含み得、アンチセンスＲＮＡが標的配列に結
合するようになっている。例えば、標的配列は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの一部であり得、その結果、アンチセンスＲＮＡはポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合してその翻訳を防止する。別の実施形態では、標的配列は、転写に必須な遺伝子のセグメントであり、その結果、アンチセンスＲＮＡがセグメント（例えば、プロモーター又はコード領域）に結合して転写を防止又は制限する。したがって、アンチセンスＲＮＡは、その標的ｍＲＮＡの翻訳又はその標的ＤＮＡの転写を防止するのに充分な長さ及び相補性のものでなければならない。当業者であれば、アンチセンス分子が標的に結合でき、それによって翻訳又は転写を阻害できるように、標的配列に充分相補的なアンチセンス分子を決定できる。導入遺伝子配列は、例えば化学的又は酵素的合成によって、あるいは商業的な供給元から提供され得る。
【００４０】
ベクターは、ベクターの形質導入及び発現に役立つ更なるエレメントを含み得る。これらのエレメントは通常、ＰＢＳ（２つのＰＢＳがある場合、５’ＰＢＳ）とＬＴＲ（２つのＬＴＲがある場合、３’ＬＴＲ）の間に位置する。
【００４１】
例えば、ベクターは、３’ポリプリントラクト（３’ＰＰＴ）を更に含み得る。これは、ＲＮＡ中に存在する時にレトロウイルス逆転写酵素のＲＮＡｓｅＨ活性に抵抗性の部位である。好ましくは、これはＬＴＲ（２つある場合、３’ＬＴＲ）の５’に位置する。ＰＰＴは、ＬＴＲ（２つある場合、３’ＬＴＲ）の５’側の隣に位置し得る。
【００４２】
ベクターは、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）を更に含み得る。ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）等の転写後制御エレメント（ＰＲＥ）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）及び転写後制御エレメント（ＰＲＥ）を更に含む。
【００４３】
ベクターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期又は後期ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル等のポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを更に含み得る。好ましくは、ポリＡシグナルはＲＮＡパッケージング配列の３’に位置する。好ましくは、ベクターは、ＳＶ４０後期ポリＡシグナルを更に含む。好ましくは、これは、ベクターの３’末端でＲＮＡパッケージング配列等の他の構成要素の後ろに位置する。
【００４４】
ベクターは好ましくはベクターゲノムの転写を駆動するためのプロモーターを含む。これは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、又はＨＩＶ−１  Ｕ３プロモーターを含む任意の好適なプロモーターであってよい。このプロモーターは好ましくはベクターの５’末端に配置されている。
【００４５】
好ましくは、ベクターのプライマー結合部位は、ベクターゲノムの転写を駆動するプロモーターのための転写開始部位に正確に接して配置されている。２つのＰＢＳがある場合、５’ＰＢＳは、好ましくは、ベクターゲノムの転写を駆動するプロモーターのための転写開始部位に正確に接して配置されている。
【００４６】
好ましくは、レトロウイルス主要スプライスドナー（ＭＳＤ）部位が、プロモーターに近接してベクターの５’末端近くに位置する。このＭＳＤは、ＰＢＳ（２つある場合、５’ＰＢＳ）の３’に位置し得る。これはベクターの力価レベルを上昇させることが見出されている。
【００４７】
ベクターが１つのＬＴＲ及び２つのＰＢＳを含む一実施形態では、ベクターは５’から３’方向に以下の構成要素を含む：
５’−プロモーター−ＰＢＳ−発現可能な導入遺伝子−ＬＴＲ−ＰＢＳ−ＲＮＡパッケー
ジング配列−３’。
【００４８】
ベクターが２つのＬＴＲ及び１つのＰＢＳを含む一実施形態では、ベクターは５’から３’方向に以下の構成要素を含む：
５’−プロモーター−ＬＴＲ−ＰＢＳ−発現可能な導入遺伝子−ＬＴＲ−ＲＮＡパッケージング配列−３’。
【００４９】
ベクターが１つのＬＴＲ及び２つのＰＢＳを含む一実施形態では、ベクターは５’から３’方向に以下の構成要素を含む：
５’−プロモーター−ＰＢＳ−ＭＳＤ（省略可能）−ｃＰＰＴ（省略可能）−発現可能な導入遺伝子−ＷＰＲＥ（省略可能）−ＰＰＴ−ＬＴＲ−ＰＢＳ−ＭＳＤ（省略可能）−ＲＮＡパッケージング配列−ポリＡシグナル（省略可能）−３’。
【００５０】
ベクターが２つのＬＴＲ及び１つのＰＢＳを含む一実施形態では、ベクターは５’から３’方向に以下の構成要素を含む：
５’−プロモーター−ＬＴＲ−ＰＢＳ−ＭＳＤ（省略可能）−ｃＰＰＴ（省略可能）−発現可能な導入遺伝子−ＷＰＲＥ（省略可能）−ＰＰＴ−ＬＴＲ−ＭＳＤ（省略可能）−ＲＮＡパッケージング配列−ポリＡシグナル（省略可能）−３’。
【００５１】
別の実施形態では、上記ベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、ベクターが導入され得る任意の好適な真核細胞であり得る。
【００５２】
本発明のレトロウイルスベクターをコードするプラスミドは、当業者に公知の標準的な方法によって好適な宿主細胞（又はパッケージング細胞）にトランスフェクトされる。本明細書において、好適なパッケージング細胞とは、レトロウイルスベクターから転写されたＲＮＡのパッケージング及びベクターウイルス粒子又はビリオンの放出を許すのに充分なヘルパーウイルスを含む細胞として定義される。通常、トランス作用性ウイルス配列をコードするが、パッケージングに必要なシス作用性配列を欠いた、付加的プラスミドがコトランスフェクトされる。これらは、発現されたウイルス骨格ＲＮＡのパッケージング及び産生のために必要な構造タンパク質及び酵素タンパク質を供給する。そのようなパッケージング細胞は当業者に公知且つ入手可能であり、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞が含まれる。
【００５３】
トランスフェクト細胞から産生された組換えレトロウイルスは標準的な方法で回収される。ビリオンの形態の回収されたレトロウイルスは、標準的な技術によって許容標的細胞の形質導入に用いられる。本明細書において、標的細胞とは、本発明のレトロウイルスベクターによって産生されたウイルスによる感染を許容する任意の細胞として定義される。標的細胞はインビボ又はエクスビボであり得る。代表的な標的細胞としては、例えば、骨髄幹細胞、肝細胞、筋細胞、腫瘍細胞、ニューロン、網膜、及び気道上皮細胞が含まれる。標的細胞中で形成されるプロウイルスはその後、導入遺伝子を発現できる。プロウイルスはＲＮＡパッケージング配列を含まないので、存在する如何なる内因性ヘルパータンパク質も、プロウイルスからの感染性ウイルスの産生の引き金を引くことができない。
【００５４】
更なる実施形態では、上記ベクターを含むビリオンが提供される。
【００５５】
更に、上記ベクター又はビリオンを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、１又は複数の薬学的に許容される補形剤を更に含み得る。
【００５６】
更に、治療、特に遺伝子治療で使用するためのベクター又はビリオンが提供される。
【００５７】
遺伝子治療において対象への導入遺伝子の導入に使用するためのベクター又はビリオンも提供される。
【００５８】
本発明は、標的細胞に遺伝子を導入する方法であって、標的細胞に有効量のベクター又はビリオンを投与することを含む方法を提供する。この方法は、目的の遺伝子を発現する細胞系を作成するために用いることができる。例えば、遺伝子は、細胞系が生物学的治療薬（biotherapeutic）、例えば治療的タンパク質又は抗体、を産生するように生物学的治療薬をコードし得る。
【００５９】
本発明は更に、上記方法によって作製された細胞を提供する。
【００６０】
更に、対象中の標的細胞に遺伝子を導入する方法であって、対象に有効量のベクター又はビリオンを投与することを含む方法を提供する。
【００６１】
対象はヒト又は動物であり得る。対象がヒトである場合、遺伝子は、対象中で遺伝子が発現されるように、遺伝子治療の一部として対象に導入され得る。対象が動物である場合、遺伝子が発現されるトランスジェニック動物を作製するために上記方法を用いることができる。
【００６２】
本発明は更に、上記方法によって作製されたトランスジェニック動物を提供する。
【００６３】
添付の図面を参照して、単なる例としてここで本発明を具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＨＩＶ−１ゲノム及びそれに由来するＲＲＬ／ＣＣＬ第３世代レンチウイルスベクターシステムの模式図である。Ｕ３、３’特異領域（unique in 3' region）；Ｒ、反復領域；Ｕ５、５’特異領域（unique in 5' region）；ＰＢＳ、プライマー結合部位；Ψ、ＲＮＡパッケージングシグナル；ＰＰＴ、ポリプリントラクト；ＬＴＲ、長い末端反復配列；ＲＳＶ、ラウス肉腫ウイルスＵ３プロモーター；ＣＭＶ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター；Δｇａｇ、切断ｇａｇ配列；ｆｓ、フレームシフト変異；ＲＲＥ、Ｒｅｖ応答配列；ｃＰＰＴ、セントラルポリプリントラクト；ｗＰＲＥ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント；ΔＵ３、自己不活型Ｕ３領域；ｐＡ、ポリアデニル化シグナル；ＶＳＶ−Ｇ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質。
【図２】本発明において開発されたベクタープラスミドの模式図及びＲＮＡゲノムの３’末端のパッケージング配列（Ｇａｇ＋ＲＲＥ）が逆転写されないことを示すＬＴＲ１ベクターの逆転写の模式図である。ＳＩＮ  ＬＴＲ、自己不活型ＬＴＲ；ＳＶ４０ｐＡ、サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル；ＧＡＰＤＨ、ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター；ｅＧＦＰ、高感度緑色蛍光タンパク質。
【図３】全ての配列が逆転写されることを示す第３世代レンチウイルスベクター逆転写の詳細模式図である。ＰＧＫ、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター。
【図４】逆転写産物からのＰＢＳ−Ψ−ＲＲＥ  ＲＮＡ配列の除去を示すＬＴＲ１逆転写の詳細模式図である。
【図５−１】本発明に記載のベクタープラスミドのマップである。ＳＶ４０ＥｐＡ、サルウイルス４０初期ポリアデニル化シグナル；ＳＶ４０ＬｐＡ、サルウイルス４０後期ポリアデニル化シグナル；ＤＩＳ、ＨＩＶ−１二量体化シグナル；ｐＡ-、ＡＡＴＡＡＡからＡＡＣＡＡＡへの変異ポリアデニル化シグナル。ＡｍｐＲ、アンピシリン耐性遺伝子；ｏｒｉ、細菌複製起点。
【図５−２】本発明に記載のベクタープラスミドのマップである。ＳＶ４０ＥｐＡ、サルウイルス４０初期ポリアデニル化シグナル；ＳＶ４０ＬｐＡ、サルウイルス４０後期ポリアデニル化シグナル；ＤＩＳ、ＨＩＶ−１二量体化シグナル；ｐＡ-、ＡＡＴＡＡＡからＡＡＣＡＡＡへの変異ポリアデニル化シグナル。ＡｍｐＲ、アンピシリン耐性遺伝子；ｏｒｉ、細菌複製起点。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
概要
ＨＩＶ−１のＲＮＡパッケージングシグナル（Ψ）及びＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）等のレンチウイルストランスファーベクターシスエレメントは、プロデューサー細胞中でのビリオンへのウイルスＲＮＡゲノムパッケージングに必須である。標準的なレンチウイルスベクターでは、これらのシスエレメントは、導入遺伝子発現カセットと一緒にＤＮＡに逆転写され、形質導入後も標的細胞中に残り続ける。この存続により、レンチウイルスベクターの遺伝子治療利用に対する複数の公知の潜在的問題が生じる。シスエレメント内のスプライス部位が近くの宿主遺伝子とスプライシングして異常な融合転写産物を生じさせることが示されている。ＲＮＡパッケージング配列内のＣｐＧ島は、一部の標的細胞中でＤＮＡメチル化を受け、これは導入遺伝子のサイレンシングの一因となる可能性がある。ＲＮＡパッケージング配列は更に、レンチウイルスタンパク質を発現する細胞中でレンチウイルスベクターゲノムの再可動化を可能にし、これはＨＩＶ陽性患者において問題となり得る。逆転写産物内の巨大なパッケージング配列により、収容できる導入遺伝子カセットのサイズが小さくなり得る。
【００６６】
標準的なレンチウイルスベクターでは、必須シスエレメントが２つのウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）の間に位置し、そのため、逆転写されるベクター領域内にある。本発明者らは、ＲＮＡパッケージングシグナル及びＲＲＥが３’ＬＴＲの下流に位置し、そのためビリオンのパッケージング中にＲＮＡゲノム中に存在するが、標的細胞中でＤＮＡへと逆転写されるゲノム領域の外側にある、新規なトランスファーベクターを開発した。これらのベクターは、高い力価で作製することができ（２９３ＴのｅＧＦＰフローサイトメトリーで２．６×１０8ＴＵ／ｍｌ、並行調製物ｐＣＣＬは１．３×１０9ＴＵ／ｍｌ）、ｅＧＦＰ発現は形質導入の１４日後まで維持される。標的細胞プロウイルスから残存するウイルスＤＮＡの大部分を除去するためのこのコンフィグレーションの使用はＨＩＶ−１及び他のレトロウイルスに基づく次世代の遺伝子治療ベクターの特徴となり得ることが示唆される。
【００６７】
イントロダクション
既存のレンチウイルスベクターでは、ＲＮＡパッケージングシグナル及びＲＲＥ等のシスエレメントが２つのウイルスＬＴＲの間に位置し、したがって、逆転写されるゲノム領域内にある。本発明のＬＴＲ１ベクターでは、シスエレメントは３’ＬＴＲの下流に位置する（図２）。したがって、これらのエレメントは、ビリオンへとパッケージングされるようにウイルスＲＮＡゲノム中に存在するが、逆転写されるゲノム領域の外側にあり、そのため標的細胞中のベクター中に存在しない。「ＬＴＲ１」という名称は、従来のレンチウイルスベクター中に２個のＬＴＲが存在するのに対してこれらのベクターがトランスファーベクタープラスミド中にＬＴＲを１個だけ含むことから選択された。
【００６８】
本発明の背景にあるメカニズムを理解するために、ＲＲＬ又はＣＣＬ等の第３世代レンチウイルスベクターにより使用されるレトロウイルス逆転写の古典的モデルを用いて概要を述べることが有用である（図３）。これらのベクター中では（それより前の世代のものと同様に）、逆転写の基質は標的細胞中に位置するウイルスＲＮＡゲノムである。ＰＢＳに結合した宿主由来ｔＲＮＡ分子は、ウイルス逆転写酵素によるマイナス鎖ＤＮＡ合成の開始のためのプライマーとして働く。開始されると、マイナス鎖合成は５’Ｒ領域の末端まで進行する。マイナス鎖が合成されるに従って、生じたＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖ハイブリッドのＲＮＡ鎖を逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性が分解する。５’Ｒ領域の末端に到達すると、マイナス鎖ＤＮＡのＲ領域とＲＮＡゲノムの３’末端との間の相同性によるマイナ
ス鎖転移が起こる。この領域からマイナス鎖合成が続けられる。ＲＮａｓｅＨ分解が続くが、Ｕ３領域のすぐ上流にあるＲＮＡゲノム内の短いＰＰＴは分解されない。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成開始のためのプライマーとして働く。プラス鎖合成はｔＲＮＡプライマー中へと続き、最初の１８ｂｐの後、ｔＲＮＡ中の次の位置に逆転写酵素が鋳型として用いることができない修飾ＲＮＡヌクレオチドが存在するため、停止する。その後、各ＤＮＡ鎖上の相補的ＰＢＳ配列間の相同性により、プラス鎖転移が起こり、全長二本鎖ＤＮＡプロウイルスが作成されるまで両方のＤＮＡ鎖の合成が続く。
【００６９】
本発明のＬＴＲ１ベクターは、逆転写に異なるメカニズムを用いる（図４）。このベクター中では、ｔＲＮＡプライマーは、ＲＮＡゲノムの３’末端の方に近いＰＢＳに結合すると予想される。５’ＰＢＳに結合したｔＲＮＡ分子は、この位置の上流に鋳型がないため、マイナス鎖合成を開始できない。３’ＰＢＳでマイナス鎖合成が開始した後、これは、マイナス鎖転移工程が起こることなく５’ＰＢＳの末端まで進む。先ほどと同様にプラス鎖合成がＰＰＴで開始し、相補的ＰＢＳ配列間の相同性によりプラス鎖転移が起こった後、二本鎖ＤＮＡプロウイルスが合成される。ＲＮＡパッケージングシグナル及びＲＲＥを含むＲＮＡゲノムの３’末端は、マイナス及びプラス鎖のどちらとも相同性を有さず、そのため逆転写の準備が整わないため、逆転写されないと予想される。その代わり、逆転写複合体から離れ、最終的に標的細胞ＲＮａｓｅによって分解されると予想される。
【００７０】
新規なコンフィグレーションのＬＴＲ１ゲノムは、ビリオンへとパッケージングされ、標的細胞中で逆転写されることが複数の報告によって確認されている。第１に、ＨＩＶ−１のＲＮＡパッケージングシグナル及びＲＲＥは異種ＲＮＡ分子の中心近くに再配置された時にビリオンへと効率的にパッケージングされる能力を維持していることが示されている（非特許文献８）。第２に、適切な局所的ＨＩＶ二次構造が隣接したＰＢＳはレンチウイルスベクターゲノムの中心に再配置された時にマイナス鎖合成を効率的に開始させる能力を維持していることが示されている（非特許文献２９）。
【００７１】
標的細胞プロウイルスからＲＮＡパッケージングシグナル及びＲＲＥ等のシスエレメントを除去するためにこの新規な逆転写メカニズムを用いるレンチウイルスベクターの実用的開発が本明細書に記載されている。
【実施例】
【００７２】
１．材料及び方法
１．１．プラスミド
本発明に記載のコンストラクトの親プラスミドは、ＨＩＶ−１構成要素、ＰＧＫプロモーター、ｅＧＦＰ  ｃＤＮＡ、及びｗＰＲＥ用のｐＲＲＬ．ＳＩＮ及びｐＣＣＬ．ＳＩＮレンチウイルストランスファーベクタープラスミド（非特許文献３）、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル用のｐＣＩプラスミド（プロメガ社）であり、ＧＡＰＤＨプロモーターの遺伝子合成（ライフテクノロジーズ社）は、（非特許文献３０）に記載のプライマー配列間のカリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）のｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ
ｂｕｉｌｄ  ｈｇ１９に基づいた。全てのプラスミドの配列を付録に示す。プラスミドｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４及びｐＭＤＧ２はスイス連邦工科大学ローザンヌ校のＤｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏによって作製及び配布された。
【００７３】
１．２．レンチウイルスベクターの作製
Ｔ１７５フラスコ中の１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補った２０ｍｌダルベッコ変法イーグル培地（完全ＤＭＥＭ）に１．２×１０7ＨＥＫ２
９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞をトランスフェクションの前日に播種して、＞９０％のコンフルエンスに到達させた。各フラスコについて、５０μｇのベクタープラスミド、３２．５μｇのパッケージングプラスミドｐＣＭＶ−ｄＲ８．７４、及び１７．５μｇの水疱性口内
炎ウイルスエンベローブプラスミドｐＭＤＧ２を５ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（ギブコ社）に加え、０．２２μｍのフィルターで濾過した。１μｌの１０ｍＭ  ＰＥＩ（シグマ  アルドリッチ社、４０８７２−７）を５ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍに加え、０．２２μｍのフィルターで濾過した。２つの混合物を混ぜ、２０分間複合体を形成させた。この複合体を、２９３Ｔ細胞を含むＴ１７５フラスコに加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベート
した。複合体を取り、２０ｍｌの完全ＤＭＥＭで置換した。２４時間後、培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後、培地を取り、０．２２μｍのフィルターで濾過し、５０，０００ｇで２時間遠心分離した。ウイルスペレットを１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍに再懸濁し、アリコートを−８０℃で保存した。
【００７４】
１．３．フローサイトメトリーによるレンチウイルスベクターの力価測定
形質導入の前日に、２４ウェルプレートの各ウェル中の２５０μｌの完全ＤＭＥＭに１０5の２９３Ｔ細胞を播種した。形質導入のために、Ｏｐｔｉｍｅｍの５０μｌのアリコ
ート中にウイルスの５倍希釈系列を作製した。希釈ウイルスの各アリコートを１個のウェル中の培地に加えた。形質導入の１４日後にフローサイトメトリーにより導入遺伝子発現を測定した。形質導入細胞の５〜１５％が目的の導入遺伝子を発現したウェルを選択し、このウェル中の形質導入された細胞の数を、それらの形質導入に用いたウイルスの体積で割ることにより、発現力価を計算した。
【００７５】
１．４．プラスミドレスキュー
簡潔に述べると、アンピシリン耐性遺伝子及び細菌のプラスミド複製起点を含むＬＴＲ１．２０／ＡｍｐＲ−ｏｒｉを用いて高いＭＯＩでＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞への形質導入を行い、１週間培養した後、細胞ペレットを回収した。市販のキット（キアゲン社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、Ｎａｎｏｄｒｏｐで定量化した。プロウイルス内のどの配列も標的としないが、ヒトゲノム内に百万塩基対当たり約２７９．３部位の頻度で存在するＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼで１０μｇのｇＤＮＡを消化した。その後、消化されたｇＤＮＡをカラム精製した後、放出されたレンチウイルス骨格断片をライゲーションにより環状化し、その後、エレクトロコンピテントな大腸菌を形質転換した。配列分析のための調製において、個々の細菌コロニーを選択して生育した。これらは、ＡｍｐＲ及びｏｒｉを含むベクター骨格の再環状化コピーを受け取った場合にのみ成長する。ＲＲＥ領域（最終的なプロウイルスから脱落しているべき）、細菌複製起点、及びアンピシリン耐性遺伝子を標的とするプライマーを用いて、回収したＤＮＡをシークエンシングした。
【００７６】
２．結果
２．１．ゲノムＲＮＡ転写カセットの最適化
感染性レンチウイルスビリオンの産生には、ウイルスゲノムＲＮＡとウイルスＧａｇ、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、及びエンベロープタンパク質のコアセンブリ（co-assembly）が必要で
ある。コドン最適化Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現プラスミドの過去の報告では、これらのタンパク質の細胞内発現は向上したが、高い力価は得られなかった（非特許文献２１；３１）。ウイルスＲＮＡゲノムの発現は一般的に多くのベクター調製プロトコールにおいてウイルス力価の制限因子であると考えられる。したがって、ＬＴＲ１ベクターで得ることができる力価を最大化するために、ウイルスＲＮＡゲノムの転写を駆動するために用いられるエレメントを最適化するための実験を行った。
【００７７】
効率的ポリアデニル化が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）転写産物のより高い定常レベルと関連付けられており、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルはＳＶ４０初期ポリＡシグナルより強いポリアデニル化シグナルとして働くことが示されている（非特許文献３２）。そこで、本発明者らは２つのＬＴＲ１コンフィグレーションを作製した：ＬＴＲ１．０／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ（ＬＴＲ１．０／ＰＥＷ）は、親ＲＲＬ骨格中に存在するＳＶ４０初期ポリＡシグナルを利用し、一
方、ＬＴＲ１．５／ＰＥＷは、ｐＣＩに由来するＳＶ４０後期ポリＡシグナルを利用する（図５）。これら２つのコンストラクト及び従来のＲＲＬ／ＰＥＷコンストラクトを用いて並行してレンチウイルスベクターを作製し、フローサイトメトリーにより２９３Ｔ細胞での力価を測定した。ベクターの力価は、ＬＴＲ１．０  ＰＥＷが２．３×１０4形質転
換単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）、ＬＴＲ１．５  ＰＥＷが４．５×１０4ＴＵ／ｍｌ、ＲＲ
Ｌ  ＰＥＷが６．９×１０7ＴＵ／ｍｌと計算された。ＳＶ４０後期ポリＡシグナルの方
が、力価が高かったので、以降の全てのＬＴＲ１コンストラクトでこのエレメントを用いた。形質導入の１４日後及び分裂細胞の少なくとも４回継代後のｅＧＦＰ発現の継続は、ＬＴＲ１ベクターがインテグラーゼ媒介染色体組込みを受ける能力を有することを示唆している。
【００７８】
強力なプロモーターを用いることで、高い定常レベルのＰｏｌ  ＩＩ転写産物も達成できるので、親ＲＲＬ骨格に由来するラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターをＣＣＬプラスミドに由来するヒトサイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ）プロモーターで置換したコンストラクトを作製した。ＣＭＶプロモーターとＬＴＲ１の５’ＰＢＳのアラインメントを最適化するために、ＰＢＳがＣＭＶプロモーターの報告されている転写開始部位（非特許文献３３）に正確に接して配置されているか（ＬＴＲ１．７．６７２／ＰＥＷ）、１ｂｐ上流に配置されているか（ＬＴＲ１．７．６７１／ＰＥＷ）、又は１ｂｐ下流に配置された（ＬＴＲ１．７．６７３／ＰＥＷ）、３つのコンストラクトを作製した。これらのコンストラクトから並行してレンチウイルスベクターＬＴＲ１．５／ＰＥＷ及びＲＲＬ／ＰＥＷを作製し、フローサイトメトリーにより２９３Ｔ細胞での測定を決定した。ＣＭＶプロモーターによるＲＳＶプロモーターの置換により、ＬＴＲ１ベクターの力価は２５倍上昇した（ＬＴＲ１．５  ＰＥＷ、２．３×１０4ＴＵ／ｍｌ；ＬＴＲ１．７．６７１
ＰＥＷ、５．６×１０5ＴＵ／ｍｌ；ＬＴＲ１．７．６７２  ＰＥＷ、５．４×１０5ＴＵ／ｍｌ；ＬＴＲ１．７．６７３  ＰＥＷ、４．７×１０5ＴＵ／ｍｌ；ＲＲＬ  ＰＥＷ
、５．８×１０7ＴＵ／ｍｌ）。ＬＴＲ１．７．６７１  ＣＭＶのコンフィグレーション
で最も高い力価が得られたので、このプロモーター及びアラインメントをその後のＬＴＲ１コンストラクト中で用いた。
【００７９】
２．２．ＬＴＲ１トランスファーベクターＲＮＡの翻訳の影響
レンチウイルスＲＮＡゲノムは、ＰｏｌＩＩによる転写中に５’の７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ）キャップを獲得しているので、プロデューサー細胞リボソームにより翻訳される能力を有している。哺乳動物細胞における翻訳開始のスキャニングモデルにおいて、リボソームは、５’キャップにローティングされ、翻訳を開始できる５’最末端ＡＴＧコドンに到達するまで５’から３’方向にスキャンする。ＲＲＬ及びＣＣＬのＲＮＡゲノム中、５’最末端ＡＴＧは切断されたＧａｇエレメントの最初に現れ、それに２１コドンのオープンリーディングフレームが続く。ＬＴＲ１ベクターコンフィグレーションでは、５’最末端ＡＴＧは導入遺伝子発現カセット内の、おそらく内部プロモーター内にある、潜在的ＡＴＧに見られる。
【００８０】
例えば、ＬＴＲ１．７．６７１  ＰＥＷベクターでは、５’最末端ＡＴＧはＰＧＫプロモーターの中央近くにあり、終止コドンが介在せずに下流のｅＧＦＰコード配列とインフレ−ムになっている。ＬＴＲ１．７．６７１  ＰＥＷはベクター力価がＲＲＬ  ＰＥＷベクターの約１０2分の１であったので、この潜在的翻訳産物はプロデューサー細胞中での
ビリオンの産生に干渉する可能性があるという仮説を立てた。
【００８１】
この仮説を試験するために、ＡＴＧコドン全体を欠いたヒトＧＡＰＤＨプロモーターでＰＧＫプロモーターを置換した。ＬＴＲ１．７．６７１  ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ｗＰＲＥ（ＬＴＲ１．７．６７１  ＧＥＷ）中、５’最末端ＡＴＧはｅＧＦＰオープンリーディングフレームの開始部にあるので、全長ベクターＲＮＡの翻訳はｅＧＦＰのみを産生する
はずである。ＲＲＬ  ＰＥＷ、ＲＲＬ  ＧＥＷ、ＬＴＲ１．７．６７１  ＰＥＷ、及びＬＴＲ１．７．６７１  ＧＥＷからレンチウイルスベクターを作製し、フローサイトメトリーにより２９３Ｔ細胞での力価を測定した。得られた力価は、ＲＲＬ  ＰＥＷ、６．４×１０7ＴＵ／ｍｌ；ＲＲＬ  ＧＥＷ、１．６×１０8ＴＵ／ｍｌ；ＬＴＲ１．７．６７１  ＰＥＷ、７．１×１０5ＴＵ／ｍｌ、及びＬＴＲ１．７．６７１  ＧＥＷ、７．６×１０5ＴＵ／ｍｌであった。潜在的翻訳開始は、このＬＴＲ１ベクター調製物における制限因子ではないようであるが、ＧＡＰＤＨプロモーターがＰＧＫプロモーターより強力なプロモーターであるので形質導入成功のより良いレポーターであることを平均蛍光強度は示しているので、これをその後のコンストラクトに用いた。
【００８２】
２．３．内部ＬＴＲ内での切断及びポリアデニル化の防止
ＬＴＲ１ベクターコンフィグレーションの中間点の近くに位置するＳＩＮ  ＬＴＲはＨＩＶ−１ポリアデニル化シグナルを含む。ＨＩＶ−１  ＬＴＲをベクターの中間点に再配置した過去の報告は効率的な全長転写を報告しているが（非特許文献８）、ＬＴＲ１ベクターのＳＩＮ  ＬＴＲ内のポリアデニル化が全長ＲＮＡゲノムの産生を妨げている可能性、したがって、観察された第３世代レンチウイルスのコンフィグレーションと比べた力価の低下を引き起こしている可能性を調べることに決定した。
【００８３】
ＬＴＲポリＡシグナルでの切断及びポリアデニル化を防止するために、コンストラクトＬＴＲ１．１１．０  ＧＥＷ中で、切断・ポリアデニル化特異的因子（ＣＰＳＦ）に結合するＡＡＴＡＡＡモチーフをＡＡＣＡＡＡに変異させた。この変異はＨＩＶ−１ポリＡシグナルでの切断及びポリアデニル化を消失させることが以前に報告されている（非特許文献３４）。標的細胞中でのレポーター遺伝子発現には機能的ポリＡシグナルが必要なので、５’Ｒから主要スプライスドナー（ＭＳＤ）ステムループの領域までをカバーするＨＩＶ−１ゲノムの断片をこのコンストラクトの５’末端に導入し、３’ＰＢＳを欠失させた。このベクターは、第３世代レンチウイルスベクターと同じように、５’ＰＢＳでマイナス鎖合成を開始して、マイナス鎖転移及びその後の逆転写段階を経ると予想され、その結果、３’変異ポリＡシグナルが機能的５’ポリＡシグナルで置換される。コンストラクトＬＴＲ１．１１．１  ＧＥＷは、機能的ＡＡＴＡＡＡモチーフを保持していること以外はＬＴＲ１．１１．０と同じである。
【００８４】
ＬＴＲ１．１１．０  ＧＥＷ及びＬＴＲ１．１１．１  ＧＥＷから作製したレンチウイルスベクターの力価は、ＣＣＬ  ＧＥＷ並行対照の力価１．３×１０9ＴＵ／ｍｌと比べ
て、それぞれ２．５×１０8ＴＵ／ｍｌ及び１．７×１０8ＴＵ／ｍｌであった。これは、中間点ポリＡシグナルがＬＴＲ１コンフィグレーション中で効率的に使用されないことを示唆している。従来のレンチウイルスベクター中の５’ポリＡシグナルでそうであるように（非特許文献３５）、ＬＴＲの下流に位置するＭＳＤがこの部位でのポリアデニル化をブロックできる可能性がある。
【００８５】
２．４．マイナス鎖転移及び５’主要スプライスドナーの影響
ＬＴＲ１．１１コンフィグレーションで観察された力価の大幅な改善は２つの可能性を示唆した。第１に、５’ＰＢＳでのマイナス鎖合成の開始及び／又はマイナス鎖転移が逆転写の効率を向上させるのかも知れない。第２に、ベクターの５’末端のＭＳＤの存在がＲＮＡゲノム転写の効率を向上させるのかも知れない。これらの仮説を試験するために、ＲＮＡの５’末端が１８ｂｐのＰＢＳだけの代わりにＰＢＳとＭＳＤステムループとの間の全ＨＩＶ−１ゲノムを含むこと以外はＬＴＲ１．７．６７１と同様なコンストラクトＬＴＲ１．１３．０  ＧＥＷを作製した。このコンストラクトでは、マイナス鎖ＤＮＡ合成の開始がベクターの中間点で起こると予想される。コンストラクトＬＴＲ１．１３．１  ＧＥＷは、５’ＰＢＳとＭＳＤステムループとの間の配列が欠失されていること以外はＬＴＲ１．１３．０  ＧＥＷと同じである。
【００８６】
ＬＴＲ１．１３．０  ＧＥＷ、ＬＴＲ１．１３．１  ＧＥＷ、及びＬＴＲ１．７．６７１  ＧＥＷからレンチウイルスベクターを作製し、フローサイトメトリーにより力価を測定した。これらのコンストラクトの力価は、ＣＣＬ  ＧＥＷ並行対照の力価１．３×１０9ＴＵ／ｍｌと比べて、それぞれ２．６×１０8ＴＵ／ｍｌ、９．２×１０7ＴＵ／ｍｌ、
及び３．２×１０7ＴＵ／ｍｌであった。これらの結果は、逆転写からマイナス鎖転移を
排除してもウイルス力価に悪影響がないこと及びＬＴＲ１．１１コンフィグレーションで観察された力価の大幅な上昇が５’ＰＢＳとＭＳＤステムループとの間の全配列の存在によるものであったことを示唆している。プロモーターに近いスプライス部位が哺乳動物遺伝子の転写を活性化することが以前に報告されており（非特許文献３６）、レンチウイルスベクター中の主要スプライスドナーを変異させるという過去の試みはベクターの力価を低下させた（非特許文献２０；２１）。したがって、ベクターＲＮＡゲノムの５’末端に近いスプライシング因子の存在は、従来の及びＬＴＲ１のコンフィグレーションの両方でより高い力価のレンチウイルスベクターの生成に必要なようである。
【００８７】
ＨＩＶ配列を減らしながらＬＴＲ−１ベクター中のＭＳＤの転写活性化作用を真似るために、ｐＣＩ発現プラスミドに由来するキメライントロンをＰＢＳとｃＰＰＴとの間に挿入することでＭＳＤを置換して、ｐＬＴＲ１．２０／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥを作製した。野生型５’ＬＴＲはＬＴＲ−１から除去されているので、ＨＩＶ  ＭＳＤはもはやこのベクター中でサブゲノムＲＮＡの産生を制御する機能を果たしておらず、交換できる。ｐＣＩ由来の強力な異種イントロンの利用には、隣接するスプライスエンハンサーが必要でないことを考慮すると、ＭＳＤを含めることにはない利点があり、これは更に、プロデューサー細胞中でのウイルスＲＮＡからのその除去を容易化するスプライスアクセプターを含む。
【００８８】
ｐＬＴＲ１．２０／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥベクター中へのｐＣＩキメライントロンの付加により、ＦＡＣＳによる計算で力価が３倍向上した。
【００８９】
２．５  ｐＬＴＲ１．７．６７１／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥプロウイルスの全長ＰＣＲ及びシークエンシング
ｐＬＴＲ１．７．６７１／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥベクターから逆転写されたプロウイルスＤＮＡの構造を示すために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染多重度１０で形質導入した。形質導入の１週間後にゲノムＤＮＡを抽出した。以下に示すオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより全長プロウイルスを増幅して２．１ｋｂのアンプリコンを得、これを、１％アガロースゲルを用いて分離した後、抽出し、ＴＡクローニング（ライフテクノロジーズ社）した後、シークエンシングした。
Ｕ５フォワード：５’ＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣ３’（配列番号１）
Ｕ３リバース：５’ＣＧＴＴＧＧＧＡＧＴＧＡＡＴＴＡＧＣＣＣＴＴＣＣ３’（配列番号２）
【００９０】
プロウイルスを調べた時、配列分析により、プロウイルスが逆転写後に正しい５’及び３’ＬＴＲを含んでいることが示され、ｇａｇ−ＲＲＥ領域が除去された予想される配列が示された。
【００９１】
２．６  「プラスミドレスキュー」による組み込まれたＬＴＲ−１プロウイルス配列の検査
ＬＴＲ−１プロウイルスの配列を厳密に調べるため及び欠失させたＨＩＶ−１パッケージング配列が存在しないことを確認するために、アンピシリン耐性マーカー及び細菌複製起点がｐＬＴＲ１．２０プラスミド骨格から除去されてＬＴＲ間の遺伝子導入領域内に挿
入された技術を用いた。これにより、ｐＬＴＲ１．２０／Ａｍｐ１Ｒ−ＯｒｉプロウイルスＤＮＡを形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から切り出し、再環状化し、ＬＴＲ間のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）及び細菌複製起点（ｏｒｉ）を含むベクターゲノムの取込み後に複製及びコロニー形成する大腸菌細菌に形質転換することが可能になる。細菌中でのプロウイルス配列の増殖は、逆転写された配列の詳細な研究を可能にする。細菌中でレスキューされたプロウイルスＤＮＡのシークエンシングは、ＬＴＲを通って、ＢＬＡＳＴサーチにより同定された宿主細胞染色体ＤＮＡ内の領域中へと読まれた。プロウイルスの内部配列により、逆転写のメカニズムは図４に示されているような予想される構造を確かに生じさせていることが確認された。ＲＲＥエレメントはシークエンスできなかったことから、予想通り、これは組み込まれたプロウイルスには存在していないことが示唆された。
【００９２】
２．７．ｐＬＴＲ１．２０／ＳＦＦＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥのインビボ機能
インビボでのＬＴＲ−１ベクターの機能を実証するために、１日齢の新生仔ＣＤ−１マウスに４．５×１０5ベクター粒子のＬＴＲ１．２０／ＳＦＦＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥを
静脈内注射した。ベクター投与の１週間後にマウスを屠殺し、肝臓を解剖し、注射された動物の肝臓中、目で見えて明らかになったＧＦＰ陽性細胞をイメージングし、ＬＴＲ−１がインビボで細胞に遺伝子導入できることが示された。
【００９３】
３．考察
哺乳動物遺伝子導入用のレトロウイルスベクターとして複数の異なるレトロウイルスが開発されてきた（非特許文献１〜５）。レトロウイルスのベクター化中に起こる最も大きな変化は、標的細胞中に導入される核酸上に存在したままでなくてはならないシスエレメント及び感染性粒子の産生を可能にするためにプロデューサー細胞に与えられるだけでよいトランスエレメントへのウイルス構成要素の分離である。レトロウイルスシスエレメントの例としては、ビリオンへとパッケージングされるために導入遺伝子発現カセットに共有結合したままでなくてはならないＨＩＶ−１  ＲＮＡパッケージングシグナル（Ψ）及びＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）が含まれ、一方、トランスエレメントとしては、Ｇａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質並びにウイルスエンベロープ糖タンパク質のコード配列が含まれる。
【００９４】
他のレトロウイルスベクター同様、ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクター内のシスエレメントはウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）の間に位置し、そのため、逆転写され、標的細胞内で導入遺伝子発現カセットに付随したままである。標的細胞プロウイルス内にこれらのシスエレメントが存在することで、レンチウイルスベクターの実際的応用、特に遺伝子治療にとって、複数の実験的に観察される及び理論的にあり得る問題が生じる。シスエレメントは、細胞増殖の調節に関わる宿主遺伝子とのスプライシング及びその調節解除が可能なスプライス部位（非特許文献１４）、ＤＮＡメチル化を受けることができるＣｐＧ島（非特許文献１６）、エピソームＤＮＡ分子の転写サイレンシングに関連する巨大非翻訳領域（非特許文献１７）、及びベクターの再可動化を媒介できるＲＮＡパッケージングシグナル（非特許文献１５）を含む。レンチウイルスシスエレメントは更に、逆転写産物の最大２ｋｂを占めるので、これらのベクターを用いて導入可能な導入遺伝子発現カセットのサイズが小さくなり得る。
【００９５】
本明細書では、標的細胞に導入されるＤＮＡからＨＩＶ−１由来シスエレメントを除去するアプローチが記載されている。新規なＬＴＲ１コンフィグレーションでは、シスエレメントは３’ＬＴＲの下流に位置している。したがって、これらのエレメントは、ビリオンへとパッケージングされ得るようにウイルスＲＮＡゲノム中に存在するが、逆転写されるゲノム領域の外側にあるため、標的細胞中のベクターＤＮＡ中には存在しない。
【００９６】
調べた第１のコンフィグレーションでは、ＲＳＶプロモーター及びＳＶ４０初期ポリＡ
シグナルカセットによりＬＴＲ１  ＲＮＡゲノムの転写が駆動された。このコンフィグレーションでは、機能的ベクターの力価は従来のＲＲＬベクターの３０００分の１となった。ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを用いた改変カセットにより、従来のＲＲＬベクターの約１００分の１まで力価が有意に改善された。
【００９７】
ＨＩＶ−１由来５’リーダー配列を再配置することにより、新規なコンフィグレーションでは、導入遺伝子カセット内から始まる異常な翻訳産物の可能性が示唆された。異常な翻訳がこれらのコンストラクトで得られるベクター力価を下げていることが示唆された。本発明者らは、ＡＴＧコドンを欠いたＧＡＰＤＨプロモーターで潜在的開始コドンを含むＰＧＫプロモーターを置換することにより、この可能性に取り組んだ。力価の差は観察されなかった。
【００９８】
ベクター力価の別の潜在的問題は、ベクターの中間点近くに位置するＬＴＲ内に機能的ポリアデニル化シグナルが存在することである。この部位での転写の終結が、ビリオンへとパッケージング可能な全長トランスファーベクターＲＮＡの産生を妨げ得る。ＨＩＶ−１ポリＡシグナルでの切断及びポリアデニル化を消失させることが以前に示されている点変異をＡＡＴＡＡＡ六量体に導入したが、力価の上昇は観察されなかった。本発明者らは、ＬＴＲ１コンフィグレーション中のＬＴＲの下流に位置するＨＩＶ−１主要スプライスドナー（ＭＳＤ）が、野生型ＨＩＶ−１及び従来のレンチウイルスベクターでそうするように（非特許文献３５）、この部位での切断及びポリアデニル化をブロックできるという仮説を立てた。
【００９９】
その後、本発明者らは、ＬＴＲ１ゲノムＲＮＡの５’末端にＰＢＳとＭＳＤステムループとの間の配列を再度導入し、ＣＣＬ系コンストラクトの５倍以内までの力価の有意な上昇を観察した。ベクターゲノムＲＮＡの５’末端近くのスプライシング因子の存在は、従来の及びＬＴＲ１のコンフィグレーションの両方において高い力価のレンチウイルスベクターを作る助けとなるようであるが、必須ではない（非特許文献２０；２１）。
【０１００】
本明細書に記載のＬＴＲ１ベクターコンフィグレーションは、第３世代ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターが現在使用されている応用において、全ての第３世代ＨＩＶ−１系レンチウイルスベクターに取って変わり得る。更に、逆転写のメカニズムはレトロウイルス間で高度に保存されているので、ＬＴＲ１コンフィグレーションは、ＨＩＶ−１以外のレトロウイルスに基づくベクターにも応用可能である。
【０１０１】
付録
コンストラクト配列
コンストラクトは以下の配列番号に従う配列を有する。各コンストラクトの実際の配列は添付の配列表に記載されている。これらのコンストラクトの構成は図５にも示されている。
（ａ）ｐＲＲＬ／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号３
（ｂ）ｐＲＲＬ／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号４
（ｃ）ｐＣＣＬ／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号５
（ｄ）ｐＬＴＲ１．０／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号６
（ｅ）ｐＬＴＲ１．５／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号７
（ｆ）ｐＬＴＲ１．７．６７１／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号８
（ｇ）ｐＬＴＲ１．７．６７２／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号９
（ｈ）ｐＬＴＲ１．７．６７３／ＰＧＫ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号１０
（ｉ）ｐＬＴＲ１．７．６７１／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号１１
（ｊ）ｐＬＴＲ１．１１．０／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ｗＰＲＥ−配列番号１２
（ｋ）ｐＬＴＲ１．１１．１／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号１３
（ｌ）ｐＬＴＲ１．１３．０／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号１４
（ｍ）ｐＬＴＲ１．１３．１／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号１５
（ｎ）ｐＬＴＲ１．２０／ＧＡＰＤＨ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−配列番号１６
【図１】
0006525986.tif 000002
【図２】
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【図３】
0006525986.tif 000004
【図４】
0006525986.tif 000005
【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
0006525986000001.app