(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において不安の特徴を減少させる方法において使用するための、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１の一つに対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性化光応答性ポリペプチド、または該光応答性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む医薬組成物であって、該特徴が、呼吸数、リスク回避、または嫌悪であり、該方法が、
(a)  前背側分界条床核（BNST）ニューロンに対する扁桃体基底外側部（BLA）錐体ニューロン入力を、
(i)  該活性化光応答性ポリペプチドを、該BNSTニューロンにおいて発現させること；および
(ii)  該前背側BNSTニューロンを活性化波長の光へ曝露すること
によって活性化する工程であって、それによりBLA錐体ニューロンが活性化され、該活性化がリスク回避を減少させ、かつ呼吸数を減少させる、工程；または
(b)  外側視床下部への前背側BNSTニューロンの投射を、
(i)  該活性化光応答性ポリペプチドを、該前背側BNSTニューロン投射において発現させること；および
(ii)  該前背側BNSTニューロン投射を活性化波長の光へ曝露すること
によって活性化する工程であって、該活性化がリスク回避を減少させ、かつ呼吸数に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない、工程；または
(c)  傍小脳脚核への前背側BNSTニューロンの投射を、
(i)  該活性化光応答性ポリペプチドを、該前背側BNSTニューロン投射において発現させること；および
(ii)  該前背側BNSTニューロン投射を活性化波長の光へ曝露すること
によって活性化する工程であって、それにより該前背側BNSTニューロン投射が活性化され、該活性化が呼吸数を減少させ、かつリスク回避行動に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない、工程
を含む、組成物。
【請求項２】
前記方法が、腹側被蓋野への前背側ＢＮＳＴニューロンの投射を活性化する工程をさらに含み、該活性化が、正常化された行動をもたらす、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記方法が、前背側ＢＮＳＴニューロンに対するＢＬＡ錐体ニューロン入力を、
(i)  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１の一つに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性化光応答性ポリペプチドを、該BNSTニューロンにおいて発現させること；および
(ii)  該前背側BNSTニューロンを活性化波長の光へ曝露すること
によって活性化する工程であって、それによりBLA錐体ニューロンが活性化され、該活性化がリスク回避を減少させ、かつ呼吸数を減少させる、工程
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記方法が、外側視床下部への前背側ＢＮＳＴニューロンの投射を、
(i)  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１の一つに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性化光応答性ポリペプチドを、該前背側BNSTニューロン投射において発現させること；および
(ii)  該前背側BNSTニューロン投射を活性化波長の光へ曝露すること
によって活性化する工程であって、該活性化がリスク回避を減少させ、かつ呼吸数に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない、工程
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記方法が、傍小脳脚核への前背側ＢＮＳＴニューロンの投射を、
(i)  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５〜１１の一つに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む活性化光応答性ポリペプチドを、該前背側BNSTニューロン投射において発現させること；および
(ii)  該前背側BNSTニューロン投射を活性化波長の光へ曝露すること
によって活性化する工程であって、それにより該前背側BNSTニューロン投射が活性化され、該活性化が呼吸数を減少させ、かつリスク回避行動に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない、工程
を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヌクレオチド配列が、ニューロン特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ニューロン特異的プロモーターが、EF1αプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、CAGプロモーター、シナプシンIプロモーター、ヒトシヌクレイン1プロモーター、ヒトThy1プロモーター、またはカルシウム／カルモデュリン依存キナーゼIIアルファ（CAMKIIα）プロモーターである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
行動障害の処置のための候補薬剤を特定する方法であって、該方法は
(a)  行動の齧歯類モデルに対して試験薬剤を投与する工程；ならびに 
(b)  行動障害の行動的および／または生理学的特徴の一つまたは複数における、該試験薬剤の効果を、高架式十字迷路（ＥＰＭ）、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、およびリアルタイム場所嗜好（ＲＴＰＰ）試験を用いて決定する工程
を含み、行動障害の行動的および／または生理学的特徴を改善する試験薬剤が、行動障害の処置のための候補薬剤である、方法であって、
該齧歯類が、前背側BNSTニューロンへの扁桃体基底外側部（BLA）錐体ニューロン入力において発現する抑制性光応答性ポリペプチドを含み、該抑制性光応答性ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、４、１２、１４、または１５の一つに対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および活性化波長の光への該BLA錐体ニューロンの曝露が、該齧歯類において不安を誘発し、かつ呼吸数を増加させる、方法。
【請求項９】
前記齧歯類が、前背側BNSTニューロンへの扁桃体基底外側部（BLA）錐体ニューロン入力において発現する抑制性光応答性ポリペプチドを含み、該抑制性光応答性ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、４、１２、１４、または１５の一つに対して少なくとも95％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および活性化波長の光への該BLA錐体ニューロンの曝露が、該齧歯類において不安を誘発し、かつ呼吸数を増加させる、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、米国特許仮出願第６１／７８９，９６１号（２０１３年３月１５日出願）及び第６１／８０８，９６５号（２０１３年４月５日出願）の優先権を主張するものであり、これらの出願を全体として参照により本明細書中に援用する。テキストファイルとして提供される配列表を参照により本明細書中に援用する。
【０００２】
テキストファイルとして提供された配列表の参照による援用
配列表は、２０１４年３月６日に作成された５１ＫＢのテキストファイル「ＳＴＡＮ−１０１７ＷＯ  ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書とともに提供される。このテキストファイルの内容をその全体として参照により本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００３】
序論
動物は、生存及び生殖の可能性を高めるために異なる行動状態間での迅速な切り替えが必要である環境条件に遭遇する。そのような状態は、神経系出力の異なった様式によって調整される一群の変化からなり、多様な特徴からこの行動状態の集まりを理解することは、重要な関心事項である。十分に研究された例は、怯えている状態であり、扁桃は、異なる標的を介して恐怖発露の様々な側面を調節すると考えられている。しかしながら、特定の発散する投射が行動状態を組み立てるための異なった特徴を漸増する原因となるかどうかを調べることは未だ不可能である。
【０００４】
「光遺伝学（ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」とは、遺伝学的方法と光学的方法との組み合わせのことをいい、機能しているインタクトな生物系と歩調を合わせるのに必要な時間精度（ミリ秒時間スケール）で、自由運動中の哺乳動物及び他の動物においてさえも生体組織の標的細胞内の特定の事象を制御するために使用される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示は、行動状態の特徴を調整する方法を提供する。本方法は、分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の活動を抑制または活性化する工程を含む。
【０００６】
本開示は、行動障害の特徴を調整する方法を特徴とし、この方法は、分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の活動を抑制または活性化する工程を含み、前記特徴は行動的特徴または生理学的特徴である。いくつかの例では、行動状態は、不安である。いくつかの例では、特徴は、呼吸数、リスク回避、または嫌悪である。いくつかの例では、調整は、ＢＮＳＴニューロンを抑制することを含み、前記抑制は不安緩解である。いくつかの例では、調整は、ＢＮＳＴの楕円核を抑制することを含み、前記抑制は、不安緩解であり、かつ呼吸数を減らす。いくつかの例では、調整は、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）錐体ニューロンを活性化することによる、ＢＮＳＴニューロンに対するＢＬＡ入力の活性化を含み、前記活性化はリスク回避を減らして、呼吸数を減らす。いくつかの例では、調整は、外側視床下部への前背側ＢＮＳＴニューロン投射の刺激を含み、前記活性化はリスク回避を減らし、呼吸数に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない。いくつかの例では、調整は、傍小脳脚核への前背側ＢＮＳＴニューロン投射の活性化を含み、前記活性化は呼吸数を減らし、リスク回避行動に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない。いくつかの例では、調整は腹側被蓋野への前背側ＢＮＳＴニューロン投射の活性化を含み、前記活性化は正常化された行動をもたらす。いくつかの例では、調整は、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力における、興奮性光応答性タンパク質または抑制性光応答性タンパク質の発現、及び、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の、光応答性タンパク質が応答する波長の光への暴露を含む。いくつかの例では、光応答性タンパク質は、図２８Ａ〜Ｄに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本開示は、行動障害の非ヒト動物モデルを特徴とし、ここで、光応答性タンパク質が、分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンからのもしくはＢＮＳＴニューロンへのニューロン出力において、発現され、さらに、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンからのもしくはＢＮＳＴニューロンへのニューロン出力を光に暴露することが、行動障害の行動的及び／または生理学的特徴を誘導する。いくつかの例では、光応答性タンパク質は、図２８Ａ〜Ｄに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、興奮性光応答性タンパク質は、ＢＮＳＴ細胞体で発現し、光応答性タンパク質が応答する波長の光にＢＮＳＴニューロンを暴露することは、不安の増加をもたらす。いくつかの例で興奮性光応答性タンパク質は、ＣｈＲ２ポリペプチドに対して少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、興奮性光応答性タンパク質は、ＢＮＳＴの楕円核で発現し、光応答性タンパク質が応答する波長の光にＢＮＳＴニューロンを暴露することは、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。いくつかの例では、興奮性光応答性タンパク質は、ＣｈＲ２ポリペプチドに対して少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、抑制性光応答性タンパク質は、前背中側ＢＮＳＴ（ａｄＢＮＳＴ）ニューロンへの扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）錐体ニューロン入力で発現し、ａｄＢＮＳＴへのＢＬＡ錐体ニューロン入力を光応答性タンパク質が応答する波長の光に暴露することは、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。いくつかの例では、抑制性光応答性タンパク質は、ＮｐＨＲポリペプチドに対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本開示は、行動障害の行動的または生理学的特徴を改善する候補薬剤を特定する方法を提供する。この方法は、（ａ）請求項１２の非ヒト動物に対して試験薬剤を投与する工程、（ｂ）光応答性オプシンポリペプチドが光によって活性化される場合に、前記非ヒト動物によって表される前記行動障害の行動的または生理学的特徴に対する試験薬剤の効果を決定する工程、を含み、ここで行動的または生理学的特徴を改善する試験薬剤は、行動障害の行動的または生理学的特徴を改善する候補薬剤と考えられる。いくつかの例では、非ヒト動物モデルは、ＢＮＳＴ細胞体において興奮性光応答性ポリペプチドを発現し、光応答性タンパク質が応答する波長の光にＢＮＳＴニューロンを暴露することが不安の増加をもたらす。ここで、試験薬剤は不安に対するその効果について評価される。いくつかの例では、非ヒト動物モデルは、ＢＮＳＴの楕円核で発現される興奮性光応答性タンパク質を発現し、光応答性タンパク質が応答する波長の光にＢＮＳＴニューロンを暴露することが不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。ここで、試験薬剤は不安及び／または呼吸数に対するその効果について評価される。いくつかの例では、非ヒト動物モデルは発現し、ここで、抑制性光応答性タンパク質が前背中側ＢＮＳＴ（ａｄＢＮＳＴ）ニューロンへの扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）錐体ニューロン入力で発現され、光応答性タンパク質が応答する波長の光にａｄＢＮＳＴへのＢＬＡ錐体ニューロン入力を暴露することが不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。ここで、試験薬剤は不安及び／または呼吸数に対するその効果について評価される。
[本発明1001]
行動障害の特徴を調整する方法であって、
分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の活動を抑制または活性化する工程を含み、該特徴が、行動的特徴または生理学的特徴である、前記方法。
[本発明1002]
行動状態が、不安である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記特徴が、呼吸数、リスク回避、または嫌悪である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記調整が、ＢＮＳＴニューロンの抑制を含み、該抑制が不安緩解である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記調整が、ＢＮＳＴの楕円核の抑制を含み、該抑制が、不安緩解であり、かつ呼吸数を減少させる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記調整が、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）錐体ニューロンを活性化することによる、ＢＮＳＴニューロンに対するＢＬＡ入力の活性化を含み、該活性化がリスク回避を減少させかつ呼吸数を減少させる、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記調整が、外側視床下部への前背側ＢＮＳＴニューロンの投射の刺激を含み、該刺激が、リスク回避を減少させ、かつ呼吸数に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記調整が、傍小脳脚核への前背側ＢＮＳＴニューロンの投射の活性化を含み、該活性化が、呼吸数を減少させ、かつリスク回避行動に対しては実質的に何ら作用を及ぼさない、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記調整が、腹側被蓋野への前背側ＢＮＳＴニューロンの投射の活性化を含み、該活性化が、正常化された行動をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記調整が、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力における、興奮性光応答性タンパク質または抑制性光応答性タンパク質の発現、及び、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の、該光応答性タンパク質が応答する波長の光への暴露を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
光応答性タンパク質が、図28Ａ〜Ｄに示したアミノ酸配列に対して少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1010の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＢＮＳＴを標的にする光ファイバ及びカニューレガイドの配置を示す。
【図２】図２は、ａｄＢＮＳＴを標的にする光ファイバ及びステレオトロードアレイの配置を示す。
【図３】図３は、ｏｖＢＮＳＴ及びＬＨを標的にする光ファイバの配置を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｈは、背側ＢＮＳＴ内の機能的異質性を示す。
【図５】図５Ａ〜Ｊは、歩行運動に対する様々な操作の効果を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｆは、不安パラダイムにおけるＢＮＳＴの機能的異質性を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｆは、不安関連行動に対するＢＮＳＴ細胞体の光遺伝学的刺激の効果を示す。
【図８】図８は、不安環境下における呼吸数増加を示す。
【図９】図９Ａ〜Ｄは、不安関連行動に対するｏｖＢＮＳＴの光遺伝学的刺激の効果を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｐは、異なるａｄＢＮＳＴ出力が不安緩解に関連した異なる特徴を調整することを示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｈは、ＰＢまたはＶＴＡではなくＬＨへのａｄＢＮＳＴ投射の刺激が、不安緩解性であることを示す。
【図１２】図１２は、ＥＰＭに供した最初の５分間において、ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射の光遺伝学的刺激がＥＰＭにおける不安関連行動に与えた効果を示す。
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、大脳前交連（ａｃａ）におけるＢＬＡ線維の刺激が不安関連行動に影響を及ぼさないことを示しているデータを示す。
【図１４】図１４Ａ〜Ｄは、ＬＨへ投射しているａｄＢＮＳＴニューロンがＢＬＡ軸索末端により神経支配されていることを示す。
【図１５】図１５は、ＢＮＳＴ−ＰＢ投射を刺激することによって、不安を惹起する環境における呼吸数増加が減衰されることを示しているデータを示す。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、ａｄＢＮＳＴニューロンの部分集団がＬＨ、ＰＢ、及びＶＴＡに投射していることを示すデータを示す。
【図１７】図１７Ａ〜Ｉは、ａｄＢＮＳＴ求心路のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気生理学的評価を示す。
【図１８】図１８Ａ及び図１８Ｂは、ステレオトロードを介した単一ユニットの分離を示す。
【図１９−１】図１９Ａ〜Ｌは、ａｄＢＮＳＴにおけるフィードフォワード抑制性及び興奮性の回路のエビデンスを示す。
【図１９−２】図１９−１の続きの図である。
【図２０−１】図２０Ａ〜Ｉは、反回性興奮がＢＮＳＴ下流投射の協調的漸増を可能にし得ることを示しているデータを示す。
【図２０−２】図２０−１の続きの図である。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、ｏｖＢＮＳＴへ弱く投射しているａｄＢＮＳＴを示す。
【図２２−１】図２２Ａ〜Ｇは、安全位置と不安惹起位置とを区別するために、ＢＮＳＴニューロンが部分的にＢＬＡ入力に頼っていることを示しているデータを示す。
【図２２−２】図２２−１の続きの図である。
【図２３】図２３Ａ〜Ｄは、不安パラダイムの安全コンパートメントにおいて、ａｄＢＮＳＴマルチユニット活動がより高いことを示しているデータを示す。
【図２４】図２４Ａ及び２４Ｂは、ａｄＢＮＳＴ単一ユニットによるクローズドアームとオープンアームとの識別を測定するためのＥＰＭスコアの計算を示す。
【図２５】図２５Ａ〜Ｄは、ＥＰＭでの安全位置と嫌悪位置とを区分するために、ａｄＢＮＳＴマルチユニット活動がＢＬＡ入力に依存していることを示しているデータを示す。
【図２６】図２６Ａ〜Ｃは、ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射を抑制することが、クローズドアームでの発火頻度及びＥＰＭスコアに与える効果を示す。
【図２７】図２７は、ＢＮＳＴ回路の可能な機能的組織化を模式的に示す。
【図２８Ａ】様々な光応答性タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図２８Ｂ】様々な光応答性タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図２８Ｃ】様々な光応答性タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図２８Ｄ】様々な光応答性タンパク質のアミノ酸配列を提供する。
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、図８及び図１５に示したデータの記録方式を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
「個体」は、哺乳動物（ヒトを含む）であり得る。哺乳動物は、限定されるものではないが、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類、ウサギ、ならびに齧歯動物（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。一態様において、個体はヒトである。別の態様において、個体はヒト以外の哺乳動物である。
【００１１】
天然タンパク質配列のアミノ酸置換は、「保存的」または「非保存的」であってもよく、そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされたものであってよく、またはそうでなくてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる（すなわち、塩基性側鎖を持っているアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸と置き換える）ものである。「非保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸と置き換える）ものである。標準的な２０種類のアミノ酸「アルファベット」は、それらの側鎖の化学的特性に基づいて、複数の化学ファミリーに分けられる。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族基を有する側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００１２】
本明細書で用いられるように、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効用量」または「有効量」は、有益または所望の結果を生ずるのに十分な量である。予防的使用に関しては、有益または所望の結果として、疾患（例えば疾患の生化学的、組織学的、及び／または行動的症状、該疾患の発症の過程で現れる、その合併症及び中間病理学的表現型など）のリスクが除去もしくは減らされること、重症度が少なくなること、または発症が遅くなることなどの結果が挙げられる。治療的な使用に関しては、有益または所望の結果として、疾患から生ずる１または複数の症状を減少させること、疾患を患っている個体の生活の質を上昇させること、疾患を処置するのに必要な他の薬物の容量を減少させること、ターゲッティングを介するなどの別の医療の効果を高めること、病勢悪化を遅らせること、及び／または生存を延ばすこと、などの臨床結果が含まれる。有効量は、１回または複数回の投与によって、投与され得る。この発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、予防的または治療的な処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床的状況で理解されるように、ある薬物、化合物、または医薬組成物の有効用量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物を併用して達成される場合または達成されない場合がある。したがって、「有効用量」は、１または複数の治療薬を投与する状況のもとで考慮され得、かつ、１または複数の薬剤と併用して所望の結果が達成可能または達成される場合、単一の薬剤が有効量で与えられると考えられ得る。
【００１３】
本明細書中で使用されるように、「処置（「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」または「ｔｒｅａｔｉｎｇ」）」は、臨床結果を含む有益または所望の結果を得るためのアプローチである。この発明の目的に関して、有益または所望の臨床結果として、限定されるものではないが、以下のものの１または複数が挙げられる。すなわち、疾患から生じている症状を軽減すること、疾患を患っている個体の生活の質を上昇させること、疾患を処置するのに必要な他の薬物の用量を減少させること、病勢悪化を遅らせること、及び／または個体の生存を延長すること、である。
【００１４】
本発明をさらに説明する前に、説明される特定の実施形態に本発明が限定されるものでなく、変化し得ることも理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
【００１５】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の（別途指示しない限り下限の位の１０分の１までの）各介在値、及び、その定められた範囲内の任意の他の定められた値または介在値が、本発明に包含されると理解されるべきである。これらのより小さい範囲の上限及び下限は独立に、より小さい範囲に含まれてもよく、かつまた本発明にも包含され、定められた範囲内の任意の具体的に除外された限界に従う。定められた範囲が限界の一方または両方を含む場合、限界に含まれるもののいずれかまたは両方を排除する範囲もまた、本発明に包含される。
【００１６】
別途定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと類似または同等のいかなる方法及び材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書中に言及されるすべての刊行物は、刊行物に引用されたものと関連して方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書中に援用される。
【００１７】
本明細書中及び添付の特許請求の範囲中で用いられるように、単数形である「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別段のはっきりした指示がない限り、複数の対象を含むことに、留意しなければならない。したがって、例えば、「光活性化ポリペプチド」への言及は複数のそのような光活性化ポリペプチドを含み、「不安障害」への言及は当技術分野で既知の１または複数の不安障害とその等価物とを含む。さらに留意すべきことには、添付の特許請求の範囲は任意選択の構成要素のいずれも排除して起草され得る。このように、この記述は、添付の特許請求の範囲の構成要素の説明に関連して、「単独」、「のみ」、などのような排他的用語の使用のためまたは「負の」限定の使用のための先行詞としての役割を担うことが意図されている。
【００１８】
本発明のいくつかの特徴は、明確にするために別々の実施形態との関連で説明されるが、これらの特徴もまた、単一の実施形態の中に組み合わせて提供されてもよいことが、理解される。これとは反対に、本発明の様々な特徴は、簡略化を目的として、単一の実施形態に関連して説明されるが、これらの特徴を、別々に、または任意の適切なサブコンビネーションで、提供されてもよい。本発明に係る実施形態のすべての組み合わせは、具体的には、本発明に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々に、かつ明確に開示されているかのように、本明細書中に開示されている。さらに、種々の実施形態とその構成要素のすべてのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々に、かつ明確に開示されているかのように、本明細書中に開示されている。
【００１９】
本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前の開示に関してのみ提供される。本明細書中には、先行発明によってそのような刊行物に先行する権利が本発明にはないことを自認するようなものは、何もないと解釈されるべきである。さらに、提供される刊行物の日付は、個々に確認される必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合もある。
【００２０】
詳細な説明
本発明は、行動状態の特徴を調整する方法を提供する。この方法は概して、分界条床核（ＢＮＳＴ）ニューロン、ＢＮＳＴ亜核、あるいはＢＮＳＴニューロンへのまたはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の活動を抑制または活性化する工程を含む。いくつかの例では、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力を抑制または活性化する工程は、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力において光応答性ポリペプチドを発現させること、ニューロン、亜核、またはニューロン出力を光に暴露することを伴う。
【００２１】
行動状態または行動障害の特徴には、生理学的特徴と行動的特徴が含まれる。生理学的特徴には、恐れ、不安、及びその他が含まれ得る。生理学的特徴には、呼吸数（例えば、呼吸数の増加）、心拍数（例えば、心拍数の増加）、食欲（例えば、食欲不振）、及びその他が含まれ得る。行動状態及び障害は、当技術分野では周知であり、例えば、鬱病、不安障害、ならびに他の行動障害及び状態を含む。
【００２２】
いくつかの例では、光応答性ポリペプチドがＢＮＳＴ細胞体で発現する。その他の例では、光応答性ポリペプチドがＢＮＳＴ投射で発現する。
【００２３】
いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドがＢＮＳＴニューロンで発現し、抑制性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対するニューロンの暴露が病理学的行動状態の１または複数の特徴の減少をもたらす。例えば、いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドがＢＮＳＴニューロンで発現し、抑制性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対するニューロンの暴露が、不安の減少、リスク回避の減少などの１または複数をもたらす。
【００２４】
いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドがＢＮＳＴ楕円核（ｏｖＢＮＳＴ）で発現し、抑制性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対するニューロンの暴露が病理学的行動状態の１または複数の特徴の減少をもたらす。例えば、いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドがｏｖＢＮＳＴで発現し、抑制性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対するニューロンの暴露が、不安の減少、リスク回避の減少、及び呼吸数の減少の１または複数をもたらす。
【００２５】
いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドが前背中側（ａｄ）ＢＮＳＴ（ａｄＢＮＳＴ）への扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）錐体ニューロン入力で発現し、興奮性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対してａｄＢＮＳＴへのＢＬＡ錐体ニューロン入力を暴露させることが病理学的行動状態の１または複数の特徴の減少をもたらす。例えば、いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドがａｄＢＮＳＴへのＢＬＡ錐体ニューロン入力で発現し、興奮性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対してａｄＢＮＳＴへのＢＬＡ錐体ニューロン入力を暴露させることが、不安の減少、リスク回避の減少、及び呼吸数の減少の１または複数をもたらす。
【００２６】
いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドが外側視床下部（ＬＨ）へのａｄＢＮＳＴニューロン投射で発現し、興奮性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対してＬＨへのａｄＢＮＳＴニューロン投射を暴露することが、リスク回避の減少などの病理学的行動状態の負の行動的特徴の１または複数の減少をもたらす。
【００２７】
いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドが傍小脳脚核（ＰＢ）核へのａｄＢＮＳＴニューロン出力で発現し、興奮性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対してＰＢへのａｄＢＮＳＴニューロン出力を暴露することが、呼吸数の減少などの病理学的行動状態の生理学的特徴の１または複数の減少をもたらす。
【００２８】
いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドが腹側被蓋野（ＶＴＡ）へのａｄＢＮＳＴニューロン出力で発現され、興奮性光応答性ポリペプチドが応答する波長帯の光に対してＶＴＡへのａｄＢＮＳＴニューロン投射を暴露することが、病理学的行動状態の行動的特徴の１または複数の改善をもたらす。
【００２９】
光応答性オプシンタンパク質
本明細書中に提供するものは、不安という特徴に関係するニューロンを選択的に過分極または脱分極する、光遺伝学に基づいた方法であり、不安障害に罹患した個体の不安特徴を効果的に調整するべく光応答性オプシンタンパク質が用いられる。光遺伝学は、遺伝学的方法と光学的方法との組み合わせのことをいい、自由運動中の哺乳動物及びさらには他の動物内において、機能しているインタクトな生物系と歩調を合わせるのに必要な時間的精度（ミリ秒の時間尺度）で、生体組織内の標的細胞における特定の事象を制御するために、使用される。光遺伝学は、標的ニューロン細胞の細胞膜に対して高速光応答性チャネルまたはポンプタンパク質を導入することを必要とし、これらは特定の標的化機構の使用を介して細胞型解像度（ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を維持しながらニューロン膜電位を時間的に精度高く操作することを可能にする。光に応答して神経細胞膜過分極または脱分極を促進させるべく用いられ得る任意の微生物オプシンを使用することも可能である。
【００３０】
例えば、光応答性クロライドポンプのハロロドプシンファミリー（例えば、ＮｐＨＲ、ＮｐＨＲ２．０、ＮｐＨＲ３．０、ＮｐＨＲ３．１）とＧｔＲ３プロトンポンプとを用いて、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。別の例として、ｅＡｒｃｈ（プロトンポンプ）を用いて、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。別の例として、ＡｒｃｈＴオプシンタンパク質またはＭａｃオプシンタンパク質を用いて、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。
【００３１】
さらに、光応答性カチオンチャネルタンパク質のチャネルロドプシンファミリー（例えば、ＣｈＲ２、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１）のメンバーを用いて、光刺激に応答して、神経細胞膜脱分極または脱分極誘発性シナプス枯渇を促進することができる。
【００３２】
細胞内輸送強化アミノ酸モチーフ
本開示は、哺乳動物細胞の細胞膜への輸送を強化する１または複数のアミノ酸配列モチーフの付加によって、細胞内で発現される光応答性オプシンタンパク質の修飾を提供する。進化的により単純な生物に由来する成分を有する光応答性オプシンタンパク質は、哺乳動物細胞によって発現または許容されない場合もあり、あるいは、哺乳動物細胞内において高レベルで発現された場合に、正常でない細胞内局在性を示す場合もある。それ故、いくつかの実施形態では、細胞内で発現される光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル、膜輸送シグナル、及び／またはＮ末端ゴルジ搬出シグナルからなる群から選択される１または複数のアミノ酸配列モチーフと融合され得る。哺乳動物の細胞膜への光応答性タンパク質の輸送を高める１または複数のアミノ酸配列モチーフは、光応答性タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ及びＣ末端の両方に融合され得る。任意で、光応答性タンパク質と１または複数のアミノ酸配列モチーフとがリンカーによって分離されてもよい。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、細胞膜へのタンパク質の輸送を高める輸送シグナル（ｔｓ）の付加によって、修飾され得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000002
を含み得る。
【００３３】
使用に適した輸送配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えば、
0006594854.tif 000003
）などのアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００３４】
輸送配列の長さは、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば、約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸であり得る。
【００３５】
使用に適したシグナル配列は、以下のうちの１つなどのアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド（例えば、
0006594854.tif 000004
）
２）ニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド（例えば、
0006594854.tif 000005
）；
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えば、
0006594854.tif 000006
）；及び
４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えば、
0006594854.tif 000007
）。
【００３６】
シグナル配列の長さは、約１０アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば約１０アミノ酸〜約２０アミノ酸、約２０アミノ酸〜約３０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸〜約５０アミノ酸であり得る。
【００３７】
本開示の修飾オプシンでの使用に適している小胞体（ＥＲ）搬出配列は、例えば、ＶＸＸＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）（ここでＸは任意のアミノ酸）（例えば、ＶＫＥＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；ＶＬＧＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）；その他）；
0006594854.tif 000008
（ここでＸは任意のアミノ酸）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；及びその他を含む。ＥＲ搬出配列の長さは、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸、例えば約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸であり得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、タンパク質中のシグナルペプチド配列は、欠失され得るか、または異なるタンパク質からのシグナルペプチドで置換され得る。
【００３９】
抑制性光応答性オプシンタンパク質
いくつかの実施形態では、行動特徴を調整する本方法は、抑制性光応答性オプシンタンパク質の使用を伴う。抑制性光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、１２、１３、１４、及び１５（図２８）の１つに対して配列類似性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性）を有するポリペプチドを含む。
【００４０】
光応答性クロライドポンプ
本明細書中に提供される方法のいくつかの態様では、光応答性クロライドポンプのハロロドプシンファミリーの１または複数のメンバーは、ＢＮＳＴ内、例えばｏｖＢＮＳＴ内などのＢＮＳＴ小領域内のニューロンの細胞膜上で発現される。
【００４１】
いくつかの態様において、上記ニューロンの細胞膜上で発現する前記１または複数の光応答性クロライドポンプタンパク質は、ナトロノモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ）に由来する。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、赤色光と同様に琥珀色光に応答することができ、光応答性クロライドポンプタンパク質が琥珀色光または赤色光によって照射されたときに、ニューロン内の過分極電流を媒介し得る。光応答性クロライドポンプを活性化し得る光の波長は、約５８０ｎｍと約６３０ｎｍとの間であり得る。いくつかの実施形態では、光は、約５８９ｎｍの波長であり得る。または、光は、約６３０ｎｍよりも大きい（例えば、約７４０ｎｍよりも低い）波長を有することができる。別の実施形態では、光は、約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光の連続パルスに暴露された場合、少なくとも約９０分間にわたって、神経膜を過分極にし得る。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、光応答性クロライドポンプタンパク質は、光感受性を増加もしくは減少させるため、特定の光波長に対する感受性を増加もしくは減少させるため、及び／または光応答性タンパク質の能力を増加もしくは減少させて細胞の細胞膜の分極状態を調節するために天然のアミノ酸配列に導入される、置換、欠失、及び／または挿入を含み得る。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、１または複数の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質は、１または複数の非保存的アミノ酸置換を含む。天然のアミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含む光応答性タンパク質は、光に応答してニューロン細胞の細胞膜を過分極する能力を適切に保持する。
【００４２】
さらに、他の態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）搬出シグナルとを含む。ＥＲ搬出シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合され得るか、または、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合され得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、リンカーによってコアアミノ酸配列に連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸のいずれかの長さを含み得る。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を、さらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を含み得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。別の実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を含み得、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含み得る。
【００４３】
本開示の修飾オプシンでの使用に適している小胞体（ＥＲ）搬出配列は、例えば、ＶＸＸＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）（ここでＸは任意のアミノ酸）（例えば、ＶＫＥＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；ＶＬＧＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）；その他）；
0006594854.tif 000009
；ＦＸＹＥＮＥ（ここでＸは任意のアミノ酸）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）；及びその他を含む。ＥＲ搬出配列の長さは、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸、例えば約５アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１５アミノ酸〜約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約２５アミノ酸であり得る。
【００４４】
他の態様では、本明細書中に記載された光応答性クロライドポンプタンパク質は、細胞膜上で発現される光応答性タンパク質を含み得る。ここで、タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するコアアミノ酸配列と、輸送シグナル（例えば、細胞膜への光応答性クロライドポンプタンパク質の輸送を高め得る）を含む。輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されてもよく、または、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸のいずれかの長さを含み得るリンカーによって、コアアミノ酸配列に連結され得る。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を、さらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来し得る。他の実施形態では、輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000010
を含み得る。
【００４５】
いくつかの態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するコアアミノ酸配列と、ＥＲ搬出シグナル、シグナルペプチド、及び膜輸送シグナルからなる群から選択される哺乳動物の細胞膜への輸送を高める少なくとも１つの（例えば、１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフとを含み得る。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナルとＣ末端輸送シグナルとは、リンカーによって連結され得る。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸のいずれかの長さを含み得る。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質を、さらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。別の実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000011
を含み得る。別の実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４６】
さらに、他の態様では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するコアアミノ酸配列を含み得る。ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端シグナルペプチドは、欠失または置換されている。いくつかの実施形態では、他のシグナルペプチド（例えば、他のオプシン由来のシグナルペプチド）が用いられる。光応答性タンパク質は、本明細書中に記載されたＥＲ搬出シグナル及び／または膜輸送シグナルをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、光応答性クロライドポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＮｐＨＲオプシンタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、小胞体（ＥＲ）搬出シグナル及び／または膜輸送シグナルをさらに含む。例えば、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）搬出シグナルとを、さらに含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列は、リンカーを介して、ＥＲ搬出シグナルと連結される。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。いくつかの実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。別の実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の実施形態では、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態では膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000012
を含む。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーによって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列に連結される。いくつかの実施形態では、膜輸送シグナルは、リンカーを介して、ER搬出シグナルに連結される。リンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸のいずれかの長さを含む。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本明細書に記載された光応答性クロライドイオンポンプタンパク質、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む光応答性タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドも本明細書中に提供される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸をコードする配列を含む。ポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、限定されるものではないが、本明細書中に記載されたウイルスベクター）内にあってもよい。ポリヌクレオチドは、光応答性クロライドイオンポンプタンパク質の発現に用いられてもよい。
【００４９】
光応答性クロライドポンプタンパク質に関連したさらなる開示は、各々の開示の全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号及び第２０１０／０１４５４１８号と国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号とに見出され得る。
【００５０】
光応答性プロトンポンプ
本明細書中に提供された方法のいくつかの態様において、１または複数の光応答性プロトンポンプは、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の細胞膜上で、発現される。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、青色光に応答することができ、グィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）に由来し得る。ここで、プロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光で照射されたときに、細胞内の過分極電流を媒介する能力を持ち得る。光は、約４５０ｎｍと約４９５ｎｍとの間の波長を有し得るか、または、約４９０ｎｍの波長を有し得る。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸を含み得る。光応答性プロトンポンプタンパク質は、光感受性を増加もしくは減少させるため、特定の光波長に対する感受性を増加もしくは減少させるため、及び／または光応答性プロトンポンプタンパク質が細胞の細胞膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させるために天然のアミノ酸配列に導入される、置換、欠失、及び／または挿入をさらに含み得る。さらに、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１または複数の保存的アミノ酸置換及び／または１または複数の非保存的アミノ酸置換を含み得る。天然のアミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の細胞膜を過分極する能力を適切に保持する。
【００５１】
本明細書中に開示された方法の他の態様では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルからなる群から選択される哺乳動物の細胞膜への輸送を高める少なくとも１つの（例えば、１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフとを含み得る。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ搬出シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナルとＣ末端輸送シグナルとがリンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸のいずれかの長さを含み得る。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。
【００５２】
本明細書に記載された光応答性プロトンポンプタンパク質、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドも本明細書中に提供される。本明細書中に記載されたタンパク質、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（例えば本明細書中に記載されたウイルスベクター）も提供される。ポリヌクレオチドは、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力において光応答性タンパク質を発現させるために、使用されてもよい。
【００５３】
光応答性プロトンポンプタンパク質に関連したさらなる開示は、その開示の全体が参照により本明細書に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、緑色光または黄色光に応答することができ、ハロルブルム・ソドメンス（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ）に由来し得、プロトンポンプタンパク質は、細胞が緑色または黄色光で照射されたときに、細胞内の過分極電流を媒介する能力を持ち得る。光は、約５６０ｎｍと約５７０ｎｍとの間の波長を有し得るか、または、約５６６ｎｍの波長を有し得る。別の実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。光応答性プロトンポンプタンパク質は、光感受性を増加もしくは減少させるため、特定の光波長に対する感受性を増加もしくは減少させるため、及び／または光応答性プロトンポンプタンパク質が細胞の細胞膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させるために天然のアミノ酸配列に導入される、置換、欠失、及び／または挿入をさらに含み得る。さらに、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１または複数の保存的アミノ酸置換及び／または１または複数の非保存的アミノ酸置換を含み得る。天然のアミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してニューロン細胞の細胞膜を過分極する能力を適切に保持する。
【００５５】
本明細書中に開示された方法の他の態様では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するコアアミノ酸配列と、ＥＲ搬出シグナル、シグナルペプチド、及び膜輸送シグナルからなる群から選択される哺乳動物細胞の細胞膜への輸送を高める少なくとも１つの（例えば、１、２、３、またはそれ以上の）アミノ酸配列モチーフとを含み得る。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端ＥＲ搬出シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドとＣ末端輸送シグナルとを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナル、及びＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端ＥＲ搬出シグナルとＣ末端輸送シグナルとがリンカーによって連結されている。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸のいずれかの長さを含み得る。リンカーは、蛍光タンパク質、例えば、限定されるものではないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン色蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＥＲ搬出シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。いくつかの実施形態では、輸送シグナルは、ＥＲ搬出シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。
【００５６】
本明細書に記載された光応答性プロトンポンプタンパク質、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドも本明細書中に提供される。本明細書中に記載されたタンパク質、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（例えば本明細書中に記載されたウイルスベクター）も提供される。ポリヌクレオチドは、神経細胞（例えばＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力）において光応答性タンパク質を発現させるために、使用されてもよい。
【００５７】
興奮性光応答性オプシンタンパク質
いくつかの実施形態では、行動特徴を調整する本方法は、興奮性光応答性オプシンタンパク質の使用を伴う。興奮性光応答性オプシンタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、９、１０、及び１１（図２８）の１つに対して配列類似性（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性）を有するポリペプチドを含む。
【００５８】
光応答性カチオンチャネルタンパク質
本明細書中に提供された方法のいくつかの態様において、１または複数の光応答性カチオンチャネルは、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の細胞膜上に発現され得る。
【００５９】
いくつかの態様では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）に由来し得、カチオンチャネルタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持ち得る。別の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（ＣｈＲ２）に示す配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。コナミドリムシ由来の光応答性カチオンチャネルタンパク質を活性化するのに用いられる光は、約４６０ｎｍと約４９５ｎｍとの間の波長を有し得るか、または、約４８０ｎｍの波長を有し得る。さらに、光の強度は、少なくとも約１００Ｈｚであり得る。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光によるコナミドリムシ由来の光応答性カチオンチャネルの活性化は、光応答性カチオンチャネルを発現しているニューロンの脱分極誘発性シナプス枯渇を生じ得る。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、光感受性を増加もしくは減少させるため、特定の光波長に対する感受性を増加もしくは減少させるため、及び／または光応答性プロトンポンプタンパク質が細胞の細胞膜の分極状態を調節する能力を増加もしくは減少させるために天然のアミノ酸配列に導入される、置換、欠失、及び／または挿入をさらに含み得る。さらに、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、１または複数の保存的アミノ酸置換及び／または１または複数の非保存的アミノ酸置換を含み得る。天然のアミノ酸配列に導入された置換、欠失、及び／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答してＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の細胞膜を脱分極する能力を適切に保持する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換とＥ１２３Ｔ置換とを含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換とＥ１２３Ａ置換とを含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、及びＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、及びＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換とＥ１２３Ｔ置換とを含む。いくつかの実施形態では、光応答性カチオンチャネルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換とＥ１２３Ａ置換とを含む。
【００６１】
光応答性カチオンチャネルタンパク質に関連するさらなる開示は、各々の開示の全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００５４３１９号と国際特許出願ＷＯ２００９／１３１８３７及びＷＯ２００７／０２４３９１に見出され得る。
【００６２】
階段関数（ｓｔｅｐ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）オプシンと安定化階段関数オプシン
他の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、タンパク質のレチナール結合ポケット全体にわたる主な位置に特定のアミノ酸置換を有し得る、階段関数オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化階段関数オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸残基Ｃ１２８に変異を有し得る。他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５にＣ１２８Ａ変異を有する。他の実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５にＣ１２８Ｓ変異を有する。別の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５にＣ１２８Ｔ変異を有する。いくつかの実施形態では、ＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸残基Ｄ１５６に変異を有し得る。他の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸残基Ｃ１２８及びＤ１５６の両方に変異を有し得る。一実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に変異Ｃ１２８Ｓ及びＤ１５６Ａを有し得る。別の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５にＣ１２８Ｔ変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＦＯタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５にＣ１２８Ｔ変異とＤ１５６Ａ変異とを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に提供されたＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持ち得る。他の実施形態では、光は、約４４５ｎｍの波長を有し得る。さらに、光の強度は、少なくとも約１００Ｈｚであり得る。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光によるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現しているニューロンの脱分極誘発性シナプス枯渇を生じ得る。いくつかの実施形態では、開示された階段関数オプシン及び安定化階段関数オプシンタンパク質の各々は、光に応答してニューロン細胞の膜を脱分極するのに使用するための特定の性質及び特徴を有し得る。
【００６５】
ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関連したさらなる開示は、各々の開示の全体が参照により本明細書に援用される国際特許出願第ＷＯ２０１０／０５６９７０号と米国仮特許出願第６１／４１０，７０４号及び第６１／５１１，９０５号に見出され得る。
【００６６】
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネル
他の実施形態では、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）のＶＣｈＲ１タンパク質とコナミドリムシのＣｈＲ１タンパク質とに由来するＣ１Ｖ１キメラタンパク質であり得る。ここで、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１及び第２の膜貫通ヘリックスにより置き換えられた第１及び第２の膜貫通ヘリックスを少なくとも有するＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み；光応答性であり；細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持つ。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、キメラ光応答性タンパク質の第２の膜貫通ヘリックスと第３の膜貫通ヘリックスとの間に位置した細胞内ループドメイン内に置換をさらに含み、その細胞内ループドメインの少なくとも一部分がＣｈＲ１からの対応する部分によって置き換わる。別の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５まで及ぶＣｈＲ１からの対応する部分によって置き換えられ得る。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、キメラ光応答性タンパク質の第３の膜貫通ヘリックス内に置換をさらに含み得る。ここで、第３の膜貫通ヘリックスの少なくとも一部分は、ＣｈＲ１の対応する配列によって置き換わる。さらに別の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部分は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３まで及ぶＣｈＲ１からの対応する部分で置き換えられ得る。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では，Ｃ１Ｖ１タンパク質は、細胞が緑色光によって照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介し得る。他の実施形態では、光の波長は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍまでの間であり得る。いくつかの実施形態では、光の波長は約５４２ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、紫色光によって照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介することができない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長の光によって細胞が照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持たない。さらに、光の強度は、約１００Ｈｚである。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質を発現しているニューロンの脱分極誘発性シナプス枯渇を生じ得る。いくつかの実施形態では、開示されたＣ１Ｖ１キメラタンパク質は、光に応答してＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の膜を脱分極するのに使用するための特定の性質及び特徴を有し得る。
【００６８】
Ｃ１Ｖ１キメラ突然変異体
いくつかの態様では、本開示は、置換されたまたは変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ここで、変異ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光活性化可能な性質を保持してはいるが、いくつかの特定の態様では変化した特性も有する場合がある。例えば、本明細書中に記載された変異光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞の細胞膜上の両方での発現レベルの上昇；異なる波長の光、特に赤色光に曝されたときの応答性の変化；ならびに／または、結果としてキメラＣ１Ｖ１ポリペプチドに、低い脱感作、速い非活性化、他の光応答性カチオンチャネルとの最小限交差活性化のための低い紫色光活性化、及び／もしくは動物細胞内における強い発現という特性をもたらす、形質の組み合わせを示す。
【００６９】
したがって、本明細書中に提供されるのは、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部位のレチナール結合ポケットの全体にわたる主な位置に特定のアミノ酸置換を有し得るＣ１Ｖ１キメラ光応答性オプシンタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸残基Ｅ１２２に変異を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸残基Ｅ１６２に変異を有し得る。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸残基Ｅ１６２とＥ１２２とに変異を有し得る。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、開示された変異Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の各々は、光に応答してＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の膜を脱分極するのに使用するための特定の性質及び特徴を有し得る。
【００７０】
いくつかの態様では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持つ。いくつかの実施形態では、光は緑色光であり得る。いくつかの他の実施形態では、光の波長は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍまでの間であり得る。いくつかの実施形態では、光の波長は、約５４６ｎｍであり得る。他の実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラタンパク質は、細胞が赤色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持つ。いくつかの実施形態では、赤色光の波長は、約６３０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長の光によって細胞が照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介しない。さらに、光の強度は、少なくとも約１００Ｈｚであり得る。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス枯渇を生じ得る。いくつかの実施形態では、開示されたＣ１Ｖ１−Ｅ１２２変異キメラタンパク質は、光に応答してＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の膜を脱分極するのに使用するための特定の性質及び特徴を有し得る。
【００７１】
他の態様では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持つ。いくつかの実施形態では、光は緑色光であり得る。他の実施形態では、光の波長は、約５３５ｎｍと約５４０ｎｍとの間であり得る。いくつかの実施形態では、光の波長は、約５４２ｎｍであり得る。他の実施形態では、光は約５３０ｎｍの波長を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長の光によって細胞が照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介しない。さらに、光の強度は、少なくとも約１００Ｈｚであり得る。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス枯渇を生じ得る。いくつかの実施形態では、開示されたＣ１Ｖ１−Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、光に応答してＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の膜を脱分極するのに使用するための特定の性質及び特徴を有し得る。
【００７２】
さらに他の態様では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、細胞が光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介する能力を持つ。いくつかの実施形態では、光は緑色光であり得る。他の実施形態では、光の波長は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍまでの間であり得る。いくつかの実施形態では、光の波長は、約５４６ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、細胞が紫色光で照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、約４０５ｎｍの波長の光によって細胞が照射されたときに、細胞内の脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態では、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、紫色光に曝したときに、Ｅ１２２／Ｅ１６２における変異を欠いているＣ１Ｖ１キメラタンパク質と比べて、または、他の光応答性カチオンチャネルタンパク質と比べて、より低い活性化を示し得る。さらに、光の強度は、少なくとも約１００Ｈｚであり得る。いくつかの実施形態では、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス枯渇を生じ得る。いくつかの実施形態では、開示されたＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２変異キメラタンパク質は、光に応答してＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力の膜を脱分極するのに使用するための特定の性質及び特徴を有し得る。
【００７３】
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネルとその突然変異体に関連したさらなる開示は、各々の開示の全体が参照により本明細書に援用される、米国仮特許出願第６１／４１０，７３６号、第６１／４１０，７４４号、及び第６１／５１１，９１２号に見出され得る。
【００７４】
ポリヌクレオチド
本開示は、本明細書中に記載された光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、上記核酸を含むベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の光応答性タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結している。プロモーターは、当技術分野において周知である。宿主細胞で機能するいずれのプロモーターも本開示の光応答性オプシンタンパク質及び／またはその任意の変異体の発現に使用され得る。一実施形態では、光応答性オプシンタンパク質の発現を駆動するのに用いられるプロモーターは、特定のニューロンに対して特異的であるプロモーターであり得る。特定の動物細胞内の光応答性オプシンタンパク質またはその変異体の発現を駆動するのに有用である開始制御領域またはプロモーターは、多数あり、当業者によく知られている。実質的には、これらの核酸を駆動することができる任意のプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態では、光応答性タンパク質の発現を駆動するのに用いられるプロモーターは、Ｔｈｙ１プロモーターであり得る（例えば、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ他、２０１０，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  １６（１０）：１１６１−１１６６を参照）。他の実施形態では、光応答性タンパク質の発現を駆動するのに用いられるプロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンＩプロモーター（例えば、ヒトシナプシンＩプロモーター）、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、カルシウム／カルモデュリン依存キナーゼＩＩアルファ（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーター、または、哺乳動物のニューロン内での光応答性オプシンタンパク質の発現を駆動することができる他のプロモーターであり得る。
【００７５】
本明細書中では、本明細書に記載された光応答性タンパク質またはその任意の変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも提供される。本開示に基づいて投与され得るベクターは、ベクターのポリヌクレオチドから転写されたときに、標的動物細胞の細胞膜上の光応答性オプシンタンパク質の集積をもたらすＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターも含む。使用可能なベクターとして、限定されるものではないが、レンチウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。レンチウイルスとして、限定されるものではないが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、及びＥＩＡＶが挙げられる。レンチウイルスは、限定されるものではないが、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルス、及びエボラなどを含む他のウイルスのエンベロープタンパク質で偽型化されている場合もある。そのようなベクターは、当技術分野における標準的な方法を用いて調製可能である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、安定かつ部位特異的な方法で、それが感染した細胞のゲノムに組み込まれ得る、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の成長、形態、または分化に対して何ら影響を誘発することなく、広範囲な細胞に感染することができ、ヒトの病態に関与しないようである。ＡＡＶゲノムはクローニングされ、配列決定され、さらに特徴づけられている。これは、約４７００塩基を包含し、ウイルスのための複製起点として機能する各端部に、約１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が含まれる。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成機能をもたらす２つの重要な領域に分けられる。すなわち、ウイルス複製及びウイルス遺伝子の発現に関わるｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左側部分と、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの右側部分と、である。
【００７７】
ＡＡＶベクターは、当技術分野の標準的な方法を用いて調製可能である。アデノ随伴ウイルスのいずれの血清型も適合性がある（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ、ｐｐ．１６５〜１７４、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」  Ｊ．  Ｒ．  Ｐａｔｔｉｓｏｎ編（１９８８）；Ｒｏｓｅ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：１，  １９７４；  Ｐ．  Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ  「Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ」  Ｉｎ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ  （ＪＲ  Ｋｅｒｒ，  ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．  ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，  ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，  ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，  Ｅｄｓ．）  ｐ５〜１４，  Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ  （２００６）；及びＤＥ  Ｂｏｗｌｅｓ，  ＪＥ  Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，  ＲＪ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  「Ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ」  （ＪＲ  Ｋｅｒｒ，  ＳＦ  Ｃｏｔｍｏｒｅ．  ＭＥ  Ｂｌｏｏｍ，  ＲＭ  Ｌｉｎｄｅｎ，  ＣＲ  Ｐａｒｒｉｓｈ，編）  ｐ１５〜２３，  Ｈｕｄｄｅｒ  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ  （２００６）を参照のこと。これらの各々の開示をそれら全体として参照により本明細書中に援用する）。ベクターを精製する方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号、及び第６，９９５，００６号と、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｔｉｔｅｒ  Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」と題されたＷＯ／１９９９／０１１７６４とに見出すことが可能であり、これらの開示をそれらの全体として参照により本明細書中に援用する。バキュロウイルス系でＡＡＶベクターを調製する方法は、例えば、ＷＯ２００８／０２４９９８に記載されている。ＡＡＶベクターは自己相補的または一本鎖であり得る。例えば、ハイブリッドベクターの調製は、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示をその全体として参照により本明細書中に援用する。インビトロ及びインビボで遺伝子の移入にＡＡＶに由来するベクターを使用することについては、記載されている（例えば、国際特許出願第９１／１８０８８号及びＷＯ９３／０９２３９、米国特許第４，７９７，３６８号、第６，５９６，５３５号、及び第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号、これらのすべてをそれらの全体として参照により本明細書中に援用する）。これらの刊行物は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子が欠失されて目的の遺伝子によって置換されている様々なＡＡＶ由来コンストラクトと、目的の遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏ（培養細胞内へ）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（直接、生物へ）導入するためのこれらコンストラクトの使用とを記載している。本開示に係る複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接した目的の核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染した細胞株へ、同時に導入することによって調製され得る。次に、作られたＡＡＶ組換え体は、標準的な技術で精製される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本開示の方法に用いられるベクターは、ウイルス粒子（例えば、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、及びＡＡＶ１６などのＡＡＶウイルス粒子）の中にキャプシド化される。したがって、本開示は、本明細書中に記載されたベクターのいずれかを含む組換えウイルス粒子（それは組換えポリヌクレオチドを含むことから、組換え体）を含む。そのような粒子を生産する方法は、当技術分野で知られ、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されており、その開示をその全体として参照により本明細書中に援用する。
【００７９】
光応答性オプシンタンパク質の送達
いくつかの態様では、本明細書中に開示された光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、針、カテーテル、または関連装置により、当技術分野で知られている定位固定注入（例えば、Ｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：３４２４３４２９、１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ他、ＰＮＡＳ、９７：３４２８〜３４３２、２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９〜２２３、１９９３；及びＡｌｉｓｋｙ＆Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１１：２３１５〜２３２９、２０００を参照、なお、これらの各々の内容をそれらの全体として参照により本明細書中に援用する）などの神経外科的技術、あるいは、蛍光透視法を用いて、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力へ、直接送達され得る。
【００８０】
目的のニューロンへ光応答性オプシンタンパク質を送達するために他の方法を用いることもでき、例えば、限定されるものではないが、イオン性脂質またはポリマーによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、光によるトランスフェクション、刺通によるトランスフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、または遺伝子銃を介するものが挙げられる。
【００８１】
光源及び電源
本開示のいくつかの態様では、本明細書中に開示された光応答性オプシンタンパク質は、光応答性オプシンタンパク質を発現するニューロンの周囲または近傍に置かれる埋め込み可能な光源（例えば光カフ）または埋め込み可能な電極によって、活性化され得る。ニューロンの電気的刺激に使用されるためにニューロンの周囲または近傍に外科的に配置される電極カフ及び電極は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，６０２，６２４号、第７，１４２，９２５号、及び第６，６００，９５６号と、米国特許出願公開第２００８／０１７２１１６号及び第２０１０／００９４３７２号を参照、なお、各々の開示の全体を参照により本明細書に援用する）。本発明の光源（例えば、光カフ）または電極は、当技術分野で知られている任意の有用な組成物または複数の組成物の混合物（例えばプラチナまたはステンレス鋼）から構成され得るもので、本明細書中に開示された光応答性オプシンタンパク質の刺激にとって有用な任意の構成であってもよい。光源は、光ファイバ光源であり得る。
【００８２】
電極または埋め込み可能な光源（例えば光カフ）は、光応答性タンパク質を発現するニューロンの周囲または近傍に配置され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、埋め込み可能な光源（例えば光カフ）は、光応答性タンパク質を発現するニューロンを含む領域を完全には囲まず、むしろ、Ｕ字形を有し得る。別の実施形態では、埋め込み可能な光源は、埋め込み可能な光源（例えば光カフ）を、光が照射されるべきニューロン領域へ誘導するために使用することができるアタッチメントアームを有し得る。このアタッチメントアームは、光源の埋め込みの後に取り出すことができ、または、目的のニューロンの近傍の光源の位置を固定するべく所定の位置に留置され得る。
【００８４】
埋め込み可能な光源（例えば光カフ）は、内側本体部を含むことができ、この内側本体部は、電源に構成される光を生じるための少なくとも１つの手段を有する。いくつかの実施形態では、電源は、光発生手段に電力を供給するための内部バッテリーであり得る。別の実施形態では、埋め込み可能な光源は、光発生手段に電力を供給する外部源からの無線送信電磁エネルギーを受信するための外部アンテナを含み得る。無線送信電磁エネルギーは、埋め込み可能な光源（例えば光カフ）の光発生手段へ電力を供給するべく外部源から送信され得る、電波、マイクロ波、または任意の他の電磁エネルギー源であり得る。一実施形態では、光発生手段は、当技術分野で知られている半導体または他のプロセスを用いて作られた集積回路によって、制御される。
【００８５】
いくつかの態様では、光手段は、発光ダイオード（ＬＥＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥＤは、青色及び／または緑色の光を生じ得る。他の実施形態では、ＬＥＤは、琥珀色及び／または黄色の光を生じ得る。いくつかの実施形態では、埋め込み可能な光源（例えば光カフ）の内側本体部に、いくつかの微小ＬＥＤが埋め込まれている。他の実施形態では、光発生手段は、ソリッドステートレーザーダイオード、または光を発生させることが可能な任意の他の手段である。光発生手段は、光源（例えば、光カフ）近傍の神経の細胞膜上で発現される光応答性オプシンタンパク質を活性化させるのに十分な強度を有する光を生成し得る。いくつかの実施形態では、光発生手段は、約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２のいずれかの、これらの間の値も含まれる強度を有する光を生じる。他の実施形態では、光発生手段は、少なくとも約１００Ｈｚの強度の光を発生する。
【００８６】
いくつかの態様において、光発生手段は外部コントローラによって外部から活性化されることができる。外部コントローラは、送信コイルに設けられ得る電力発生装置を含み得る。外部コントローラのいくつかの実施形態では、電力発生装置に、それに電力を供給するために、バッテリーが接続され得る。スイッチは、電力発生装置に接続され得、個体が手動で電力発生装置を起動または動作停止することを可能にする。いくつかの実施形態では、スイッチが起動されると、電力発生装置は、外部コントローラ上の送信コイルと埋め込み可能な光源（例えば、光カフ）の外部アンテナとの間の電磁カップリングを介して、光源上の光発生手段に対して電力を供給し得る。送信コイルは、光学発生手段へ電力を供給するため、および１または複数の制御シグナルを埋め込み可能な光源に送信するために、埋め込み可能な光源の外部アンテナと、その近傍にある場合に、電磁カップリングを確立することができる。いくつかの実施形態では、外部コントローラの送信コイルと埋め込み可能な光源（例えば光カフ）の外部アンテナとの間の電磁カップリングは、高周波磁気インダクタンスカップリングであり得る。高周波磁気インダクタンスカップリングが使用される場合、電波の動作周波数を約１ＭＨｚと約２０ＭＨｚとの間にすることができ、これらの間の値も含まれる（例えば、約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚ、または約２０ＭＨｚ）。しかしながら、他のカップリング技術を用いてもよく、例えば、光受信機、赤外線、または生物医学遠隔測定システムである（例えば、Ｋｉｏｕｒｔｉ、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｗｏｒｌｄ、Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６、（８）：Ｓｐｒｉｎｇ、２０１０）。
【００８７】
行動の非ヒト動物モデル
本開示は、行動障害の非ヒト動物モデルを提供する。ここで、上記の光応答性タンパク質は、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンへのもしくはＢＮＳＴニューロンからのニューロン出力において発現され、ＢＮＳＴニューロン、ＢＮＳＴ亜核、またはＢＮＳＴニューロンからのもしくはＢＮＳＴニューロンへのニューロン出力の光への暴露が、行動障害の行動的及び／または生理学的特徴を誘発する。適当な非ヒト動物として、齧歯類（例えば、ラット、マウス）が挙げられる。いくつかの例では、非ヒト動物モデルは、ラットである。いくつかの例では、非ヒト動物モデルは、マウスである。いくつかの例では、非ヒト動物モデルは、非ヒト霊長類である。
【００８８】
例えば、興奮性光応答性タンパク質（例えば、上記したような、ＣｈＲ２及び他の興奮性光応答性タンパク質）は、ＢＮＳＴ細胞体で発現され得る。また、光応答性タンパク質が応答する波長の光に対するＢＮＳＴニューロンの暴露は、不安の増加をもたらす。別の例として、興奮性光応答性タンパク質は、ｏｖＢＮＳＴで発現され得る。また、光応答性タンパク質が応答する波長の光に対するＢＮＳＴニューロンの暴露は、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。
【００８９】
例えば、いくつかの実施形態では、本非ヒト動物モデルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、９、１０、及び１１の１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む興奮性光応答性ポリペプチドを含む。ここで、このポリペプチドはＢＮＳＴ細胞体で発現され、また、光応答性タンパク質が応答する波長の光に対するＢＮＳＴニューロンの暴露は、不安の増加をもたらす。いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナルと膜輸送シグナルとの両方を含む。例えば、いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000013
を含む。いくつかの例では、ＥＲ搬出シグナルは、配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。
【００９０】
例えば、いくつかの実施形態では、本非ヒト動物モデルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、９、１０、及び１１の１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む興奮性光応答性ポリペプチドを含む。ここで、このポリペプチドは、ｏｖＢＮＳＴニューロンで発現され、また、光応答性タンパク質が応答する波長の光に対するｏｖＢＮＳＴニューロンの暴露は、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナルと膜輸送シグナルとの両方を含む。例えば、いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000014
を含む。いくつかの例では、ＥＲ搬出シグナルは、配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。
【００９１】
例えば、いくつかの実施形態では、本非ヒト動物モデルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、１２、１３、１４、及び１５の１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抑制性光応答性ポリペプチドを含む。ここで、このポリペプチドは、ａｄＢＮＳＴニューロンに対するＢＬＡ錐体ニューロン入力で発現され、また、光応答性タンパク質が応答する波長に対するＢＬＡ錐体ニューロン入力の暴露は、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナルと膜輸送シグナルとの両方を含む。例えば、いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の例では、抑制性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000015
を含む。いくつかの例では、ＥＲ搬出シグナルは、配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。
【００９２】
別の例として、抑制性光応答性タンパク質（例えば、上記したような、ＮｐＨＲ及びその他の抑制性光応答性タンパク質）は、ａｄＢＮＳＴに対するＢＬＡ錐体ニューロン入力で発現され得る。また、ａｄＢＮＳＴへのＢＬＡ錐体ニューロン入力を光応答性タンパク質が応答する波長の光に暴露することは、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。
【００９３】
光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、発現ベクター）は、任意の簡便な手段によって、非ヒト動物（例えば、ラットもしくはマウスなどの齧歯類、または非ヒト霊長類）に導入され得る。例えば、光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、発現ベクター）をＢＬＡ、ＢＮＳＴ、ＬＨ、ＰＢ、またはＶＴＡに定位注入することができる。
【００９４】
適当な発現ベクターとして、限定されるものではないが、レンチウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。レンチウイルスとして、限定されるものではないが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、及びＥＩＡＶが挙げられる。レンチウイルスは、限定されるものではないが、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルス、及びエボラなどを含む他のウイルスのエンベロープタンパク質により偽型化されている場合がある。そのようなベクターは、当技術分野において標準的な方法を使用して調製されてもよい。適当な発現ベクターは、上述されており、また以下の実施例に記載されている。
【００９５】
行動障害の本非ヒト動物モデルは、行動障害の１または複数の行動的及び／または生理学的特徴を改善する薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【００９６】
スクリーニング方法
本開示は、行動障害の１または複数の行動的及び／または生理学的特徴を調整する薬剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。
【００９７】
本スクリーニング方法は、（ａ）本開示の非ヒト動物モデルに試験薬剤を投与する工程、及び（ｂ）光応答性オプシンポリペプチドが光によって活性化されるときに非ヒト動物によって示される行動障害の行動的または生理学的特徴に対する試験薬剤の効果を決定する工程を、概ね伴う。行動的または生理学的特徴を改善する試験薬剤は、行動障害の行動的または生理学的特徴を改善するための候補薬剤と考えられる。
【００９８】
例えば、本非ヒト動物モデルが示す行動障害の行動的または生理学的特徴を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または２５％よりも大きく（例えば、２５％〜５０％；５０％〜７５％；その他）改善する試験薬剤は、行動障害の行動的または生理学的特徴を改善（処置）する候補薬剤と考えられ得る。本方法を用いて同定された試験薬剤は、様々な行動障害及び他の負の心理的及び生理学的状態のいずれかを処置するための候補薬剤と考えられる。
【００９９】
いくつかの例では、試験薬剤は、呼吸数に対するその効果について評価される。他の例では、試験薬剤は、不安に対する効果について評価される。
【０１００】
本非ヒト動物モデルで発現される光応答性タンパク質は、埋め込み可能な光源によって活性化され得る。ここで、適当な光源は、上述及び実施例のものである。抑制性または興奮性オプシンタンパク質を活性化させるのに適当な波長は、上記されている。
【０１０１】
本非ヒト動物モデルにより示される行動障害の行動的または生理学的特徴を試験薬剤が処置（例えば、改善）するかどうかについて、任意の適当な方法、例えば実施例に記載されているものを用いて、決定することができる。例えば、高架式十字迷路（ＥＰＭ）、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、及びリアルタイム場所嗜好（ＲＴＰＰ）試験を用いることができる。呼吸数は、実施例に記載の方法を含む、任意の便利な方法を用いて測定することができる。
【０１０２】
例えば、いくつかの実施形態では、本スクリーニング方法は、（ａ）本非ヒト動物モデルに対して試薬薬剤を投与する工程を含む。ここで、非ヒト動物モデルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、９、１０、及び１１の１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む興奮性光応答性ポリペプチドを含み、ここで、このポリペプチドはＢＮＳＴ細胞体で発現され、また、光応答性タンパク質が応答する波長の光に対するＢＮＳＴニューロンの暴露は、不安の増加をもたらす。いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナルと膜輸送シグナルとの両方を含む。さらに、この方法は、（ｂ）光応答性タンパク質が光によって活性化された場合の不安に対する試験薬剤の効果を決定する工程を含む。いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000016
を含む。いくつかの例では、ＥＲ搬出シグナルは、配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。
【０１０３】
別の例として、いくつかの実施形態では、本スクリーニング方法は、（ａ）本非ヒト動物モデルに対して試薬薬剤を投与する工程を含む。非ヒト動物モデルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、６、７、８、９、１０、及び１１の１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む興奮性光応答性ポリペプチドを含む。ここで、このポリペプチドは、ｏｖＢＮＳＴニューロンで発現され、また、光応答性タンパク質が応答する波長の光に対するｏｖＢＮＳＴニューロンの暴露は、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。さらに、この方法は、（ｂ）光応答性タンパク質が光によって活性化された場合に不安及び／または呼吸数に対する試験薬剤の効果を決定する工程を含む。いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナルと膜輸送シグナルとの両方を含む。例えば、いくつかの例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の例では、興奮性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000017
を含む。いくつかの例では、ＥＲ搬出シグナルは、配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。
【０１０４】
別の例として、いくつかの実施形態では、本スクリーニング方法は、（ａ）本非ヒト動物モデルに対して試薬薬剤を投与する工程を含む。ここで、非ヒト動物モデルは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、１２、１３、１４、及び１５の１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抑制性光応答性ポリペプチドを含む。ここで、このポリペプチドは、ａｄＢＮＳＴニューロンに対するＢＬＡ錐体ニューロン入力で発現され、また、光応答性タンパク質が応答する波長に対するＢＬＡ錐体ニューロン入力の暴露は、不安の増加と呼吸数の増加をもたらす。さらに、この方法は、（ｂ）光応答性タンパク質が光によって活性化された場合に不安及び／または呼吸数に対する試験薬剤の効果を決定する工程を含む。いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドは、ＥＲ搬出シグナルと膜輸送シグナルとの両方を含む。例えば、いくつかの例では、抑制性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナル、及び膜輸送シグナルを含む。他の例では、抑制性光応答性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、膜輸送シグナル、及びＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの例では、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列
0006594854.tif 000018
を含む。いくつかの例では、ＥＲ搬出シグナルは、配列ＦＣＹＥＮＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）を含む。
【０１０５】
本非ヒト動物モデルで分析され得る症状として、例えば、逃避関連行動減少、不安、及びストレスが挙げられる。抑うつ及び／または不安及び／またはストレスの試験として、強制水泳試験（ＦＳＴ）（例えば、Ｐｏｒｓｏｌｔ他（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ２６６：７３０；及びＰｅｔｉｔ−Ｄｅｍｏｕｌｉｅｒｅ他（２００５）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１７７：２４５を参照）、尾懸垂試験（例えば、Ｃｒｙａｎ他（２００５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．２９：５７１；及びＬｉ他（２００１）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：１０２８を参照）；条件付け場所嫌悪（例えば、Ｂｅｃｈｔｈｏｌｔ−Ｇｏｍｐｆ他（２０１０）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５：２０４９を参照）；目新しいものに対する食欲不振試験（Ｄｕｌａｗａ他（２００５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．２９：７７１を参照）；社会的敗北ストレス試験（例えば、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ他（２００１）ＰｈｙｓｉｏｌＢｅｈａｖ．７３：２６１−２７１；及びＫｕｄｒｙａｖｔｓｅｖａ他（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．３８：３１５を参照）；ショ糖嗜好試験（例えば、ＫｕｒｒｅＮｉｅｌｓｅｎ他（２０００）ＢｅｈａｖｉｏｕｒａｌＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ１０７：２１−３３を参照）；オープンフィールド試験（例えば、Ｈｏｌｍｅｓ（２００１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．２５：２６１−２７３を参照）；高架式十字迷路試験（例えば、Ｈｏｌｍｅｓ（２００１）上掲）；及びその他が挙げられる。そのような試験はいずれも本スクリーニング方法に用いることができる。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、「決定する」という用語は、定量的及び定性的測定の両方のことを指し、そのようなものとして、「決定する」という用語は、「アッセイする」、「測定する」などと互換的に本明細書中で使用される。
【０１０７】
用語「候補薬剤」、「試験薬剤」、「薬剤」、「物質」、及び「化合物」は、互換的に本明細書中で使用される。候補薬剤は、多数の化学物質の種類、典型的には合成、半合成、または天然の無機もしくは有機分子を包含する。候補薬剤として、合成または天然の化合物の大きなライブラリに見出されるものが挙げられる。例えば、合成化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、ＣｏｍＧｅｎｅｘ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、及びＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）から市販されている。希少な化学物質ライブラリがＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）から入手可能であり、使用することもできる。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態にある天然化合物のライブラリは、Ｐａｎ  Ｌａｂｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）から入手可能であり、または容易に生産可能である。
【０１０８】
候補薬剤は、分子量が５０ダルトンよりも大きくて約２，５００ダルトンよりも小さい、小さな有機または無機化合物であり得る。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用（例えば、水素結合）に必要な官能基を含むことができ、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含んでよく、さらに、これら化学官能基のうちの少なくとも2つを含んでもよい。候補薬剤は、１または複数の上記官能基と置換された環式炭素または複素環式の構造、及び／あるいは、芳香族または多環芳香族構造を含んでもよい。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、及びそれらの誘導体、構造類似体、または組み合わせを含む生体分子の中から見つけられる。
【０１０９】
本開示のアッセイは、対照群を含み、適切な対照群として、活性化する光に曝されたが試験薬剤の投与を受けていない本非ヒト動物モデルが挙げられる。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本発明を使用する方法の完全な開示及び説明が提供者に提供されるように、記載されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図してもしなくても、それらは実験が以下に行われたすべてのまたは唯一の実験であることを示すことを意図している。使用される数（例えば量、体温、その他）に関して精度を確実にするための努力がなされたが、いくつかの実験誤差及び偏差は考慮されなければならない。特に明記されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。標準的な略語を用いる場合もある。例えば、ｂｐ、塩基対、ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロ塩基；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内；ｉ．ｐ．、腹腔内；ｓ．ｃ．、皮下；及びその他。
【０１１１】
実施例１
材料及び方法
方法の概要
ウイルス媒介遺伝子発現。ＡＡＶ５ウイルスをＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，  ＮＣ，  ＵＳＡ）によってパッケージングした。ＡＡＶコンストラクトのマップは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇ．で入手可能である。０．５ｐｌのウイルスストックをＢＬＡ、ＢＮＳＴ、ＬＨ、ＰＢ、またはＶＴＡに定位注入した。
【０１１２】
不安アッセイ及び呼吸数測定。ウイルスを注入され、かつカニューレまたは光ファイバを埋め込まれたマウスを、高架式十字迷路（ＥＰＭ）、オープンフィールド試験（ＯＦＴ）、及びリアルタイム場所嗜好（ＲＴＰＰ）試験で、続いて試験した。ＥＰＭ試験セッションは１５分長であり、５分間の光オフ／オン／オフのエポックからなるものとした。ＯＦＴは２０分長であり、５分間の光オフ／オン／オフ／オンのエポックからなるものとした。ＲＴＰＰ試験では、対象は、２つのチェンバーを自由に探索し、それぞれ光遺伝学的刺激をオンまたはオフにされたチェンバーの１つに入ったり、またはそこから出たりした。行動的データを自動的に収集し、ＢＩＯＢＳＥＲＶＥソフトウェアで分析した。覚醒行動中のマウスの呼吸数をパルスオキシメータで３分間測定した。黄色光を恒常的な照明として送達し、一方で青色光を一連の１０Ｈｚ、５ｍｓのパルスとして送達した。
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ生理学。１本の光ファイバを囲む８本のステレオトロードを含むカスタムメードのマイクロドライブをＢＮＳＴに埋め込み、覚醒行動中の動物においてＢＮＳＴニューロンの光送達及び記録を可能にした。さらに、分析の詳細とＥＰＭスコアの計算とを以下に提供する。
【０１１４】
ｅｘ  ｖｉｖｏ電気生理学。急性切片を切片パッチクランプ記録用に準備した。ホールセル記録は、ＢＮＳＴニューロンから実施し、１０Ｈｚの青色光パルスを顕微鏡対物レンズ経由で冠状切断上に送達した。
【０１１５】
統計。図中のすべてのグラフと数値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。統計分析に関する詳細を以下に示す。
【０１１６】
対象
オスＣ５７ＢＬ／６マウス、実験時６〜８週齢を逆転１２時間明／暗サイクルで収容した。餌及び水は、自由に与えた。ドーパミン受容体Ｄ１ａ（Ｄｒｄｉａ）−Ｃｒｅトランスジェニックマウス（樹立系統：ＥＹ２６６）をＧＥＮＳＡＴから入手した。行動実験に使用したすべてのマウスは、ベースライン行動の変動性を減らすために一匹ずつ収容した。例外としてｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ細胞体マウス及びＣｈＲ２：ＢＮＳＴ細胞体マウスはグループ収容して、ベースライン不安レベルを下げた。さらに、グループ収容された低不安ベースラインの動物においてＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射の刺激が不安を緩解することを示すべく、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスのコホート（図１０ｄ及び図１２に示すデータ作成に使用）をグループ収容した。すべての実験プロトコールは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受け、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのガイドラインに従った。
【０１１７】
ウイルス生産
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ５コートタンパク質で血清型が決定されて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ＮＣ、ＵＳＡ）によりパッケージングされた。ウイルス力価は以下であった。
ＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩａ：：ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰについて４ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ＣａＭＫＩｌａ：：ｅＹＦＰについて３ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩａ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰについて４ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰについて４ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｅＹＦＰについて４ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰについて４ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ＥＦ１ａ：：ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰについて２ｘ１０１２粒子／ｍｌ
ＡＡＶ５：ＥＦ１ａ：：ＤＩＯ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰについて２ｘ１０１２粒子／ｍｌ
【０１１８】
これらのコンストラクトのマップは、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇ．で入手可能である。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ＨＳＶ株１７＋からＲ．Ｎ．によって誘導されて、複製不能であった。ｉｎ  ｖｉｖｏでの持続的な発現を可能にするこのＨＳＶアンプリコンウイルスの機能力価は３×１０８感染単位（ＩＵ）／ｍｌだった。狂犬病ウイルス（ＲＶ）については、以前に記述されている２。狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）をｅＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏと置換して、ｅＧＦＰ（ＲＶ：ｅＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ（ＲＶ：ｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現するウイルスを生成した。
【０１１９】
定位ウイルス注入及びガイドカニューレ／光ファイバカニューレ埋め込み
すべての外科的処置を無菌的に行った。マウスを１．５〜３．０％イソフルランで麻酔し、加熱パッド上に静置させながら、脳定位固定装置（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ、ＵＳＡ）内に置いた。薬物注射の実験に使用したマウスについては、小開頭術を行い、ガイドカニューレ（２２ゲージＣ３１３Ｇ／ＳＰＣ  ＧＵＩＤＥ３８１７２；ＰｌａｓｔｉｃｓＯｎｅ、Ｒｏａｎｏｋｅ、ＶＡ、ＵＳＡ）を、ＢＮＳＴ（ＡＰ＋０．２ｍｍ、ＭＬ１．０ｍｍ、ＤＶ−３．９ｍｍ）上の片側に配置した。すべての座標は、ｍｍ３のプレグマを基準にする。接着用セメント（Ｃ＆Ｂ  ｍｅｔａｂｏｎｄ；Ｐａｒｋｅｌｌ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を最初に塗布し、歯科用セメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を加えてカニューレを頭蓋骨に固定した。組織接着剤（Ｖｅｔｂｏｎｄ；Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して切開を閉じた。ダミーキャップ（Ｃ３１３ＤＣ／１／ＳＰＣ  ＤＵＭＭＹ．０１４／．３６ＭＭ；ＰｌａｓｔｉｃｓＯｎｅ）を挿入して、カニューレガイドに障害物がないように保った。
【０１２０】
行動の光遺伝学的操作で使われるすべてのマウスについて、１部位あたり０．５μｌのウイルスを注入した。ＣｈＲ２マウスに片側ウイルス注入と光ファイバカニューレ埋め込み（０．２２ＮＡ、直径２００μｍ；Ｄｏｒｉｃ  Ｌｅｎｓｅｓ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）を施し、一方、すべてのｅＮｐＨＲ３．０マウスに対しては、片側性機能喪失が他の半球によって補償される可能性があることから、両側に注入して埋め込みを施した。薬物注入、ウイルス注入、及びカニューレ埋め込みを含むすべての片側操作は、半球全体で釣り合うようにした。ＢＮＳＴ細胞体の光遺伝学的操作については、小開頭術後、ＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰまたはＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを、１０ｐｌシリンジ及び３３ゲージの傾斜金属針（Ｎａｎｏｆｉｌ、ＷＰＩ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ、ＵＳＡ）を前方にその傾斜面を向けて用いて、背側ＢＮＳＴの中心（ＡＰ＋０．２ｍｍ、ＭＬ±１．０ｍｍ、ＤＶ−４．３ｍｍ）に注入した。ｈＳｙｎ（ヒトシナプシン）は、ＢＮＳＴのすべてのニューロンで導入遺伝子の発現を可能にする汎神経細胞プロモーターである４。シリンジポンプ（ＵＭＰ３；ＷＰＩ）により注入を行い、コントローラ（Ｍｉｃｒｏ４；ＷＰＩ）によって速度を０．１μｌ／分に設定した。注入後、針をゆっくりと１００μｍ持ち上げ、続いて、針に沿って液体が上方向に流れるのを防ぐためにゆっくりと引き抜く前に、さらに５分間その場に置いた。対照群に対して、ＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｅＹＦＰを注入した。次に、２本の光ファイバカニューレを両側ＢＮＳＴ（ＡＰ＋０．２ｍｍ、ＭＬ１．０ｍｍ、ＤＶ−４．０ｍｍ）上に置き、上記したように頭蓋骨に固定した。暖かいケージの中でマウスを麻酔から回復させ、電気生理学的実験を、注射後、４〜６週間（すべての細胞体操作について）または８〜１２週間（すべての終末操作について）のウィンドウ内で実施し、オプシン発現を可能にした。
【０１２１】
ＬＨ、ＰＢ、またはＶＴＡにおけるＢＮＳＴ終末の光遺伝学的刺激に関しては、すべての手順が同じであり、その際、異なる点は、ＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰをＢＮＳＴに送達したこと、及び光ファイバカニューレをＬＨ（ＡＰ−１．０ｍｍ、ＭＬ１．３ｍｍ、ＤＶ−５．０ｍｍ）、ＰＢ（ＡＰ−５．２ｍｍ、ＭＬ１．５ｍｍ、ＤＶ−３．２ｍｍ）またはＶＴＡ（ＡＰ−３．４ｍｍ、ＭＬ０．３ｍｍ、ＤＶ−３．９ｍｍ）の上方に置いたことである。ＢＮＳＴにおけるＢＬＡ終末の光遺伝学的操作については、ＡＡＶ：ＣａＭＫＩＩａ：：ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ、ＡＡＶ：ＣａＭＫＩｌａ：：ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰまたは（対照に対して）ＡＡＶ：ＣａＭＫＩｌａ：：ｅＹＦＰをＢＬＡ（ＡＰ−１．６ｍｍ、ＭＬ±３．１ｍｍ、ＤＶ−４．９ｍｍ）に送達し、光ファイバカニューレをＢＮＳＴの上部に置いた。ＣａＭＫＩｌａがＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンのマーカーであることから５、ＣａＭＫＩｌａプロモーターの使用はＢＬＡ錐体ニューロンに有利な導入遺伝子発現を可能にする。大脳前交連のＢＬＡを刺激するために、ＡＡＶ：ＣａＭＫＩＩａ：：ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰをＢＬＡに注入し、光ファイバカニューレを大脳前交連の右上方（ＡＰ＋０．１４ｍｍ、ＭＬ１．５ｍｍ、ＤＶ−４．４ｍｍ）に埋め込んだ。ｏｖＢＮＳＴの光遺伝学的抑制については、Ｄｒｄ１ａＣｒｅマウスに対して、ＢＮＳＴの上部にＡＡＶ：ＥＦ１ａ：：Ｄ１０−ｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰの注入を行い、光ファイバカニューレをＢＮＳＴの上部に置いた。
【０１２２】
ｏｖＢＮＳＴに投射している領域を探るために、０．３μｌのＲＶ：ｅＧＦＰをｏｖＢＮＳＴ（ＡＰ＋０．２ｍｍ、ＭＬ１．０ｍｍ、ＤＶ−４．１ｍｍ）に注入した。狂犬病ウイルスの二重注入については、ＬＨ（ＡＰ−１．５ｍｍ、ＭＬ１．０ｍｍ、ＤＶ−５．６ｍｍ）、ＰＢ（ＡＰ−５．２ｍｍ、ＭＬ１．０ｍｍ、ＤＶ−３．８ｍｍ）、またはＶＴＡ（ＡＰ−３．５ｍｍ、ＭＬ０．３５ｍｍ、ＤＶ−４．５ｍｍ）に対して、ＲＶ：ｅＧＦＰを０．５μｌ、ＲＶ：ｔｄＴｏｍａｔｏを０．５μｌ、または、二種類のウイルスの混合物を０．５μｌ、注入した。
【０１２３】
薬物送達
ＢＮＳＴへグルタメート受容体アゴニストを注入するために、１０ｍＭの２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（ＮＢＱＸ；Ｔｏｃｒｉｓ、Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ  ＭＯ、ＵＳＡ）と５０ｍＭの２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（Ｄ−ＡＰＶ；Ｔｏｃｒｉｓ）とからなるグルタメートアンタゴニスト溶液を、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解した。不安アッセイの３０分前に、０．３μｌのグルタメートアンタゴニスト溶液を、光送達用の光ファイバカニューレを導入するために使用される同一のガイドカニューレに挿入された内部注入針（２８ゲージＣ３１３Ｉ／ＳＰＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ３８７９９；ＰｌａｓｔｉｃｓＯｎｅ）を介して、ＢＮＳＴに注入した。内部注入針を１０μｌ  ハミルトンシリンジ（Ｎａｎｏｆｉｌ；ＷＰＩ）に接続した。流速（０．１μｌ／分）をシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）で調整した。内部注入針は、カニューレガイドを超えて約５００μｍ突き出すことで、カニューレガイドの先端部の潜在的血液凝固を突き通って背側ＢＮＳＴの中心に達するようにした。注入の終了２分後に注入針を取り出し、ガイドカニューレからの流出を避けるようにした。
【０１２４】
光送達
ｅＮｐＨＲ３．０を使用するすべての光遺伝学的抑制実験については、５ｍＷ（光ファイバの先端で１５９ｍＷ／ｍｍ２）の黄色光を、５９３．５ｎｍＤＰＳＳレーザー（ＭＧＬＦ５９３．５；ＯＥＭ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ、ＵＳＡ）で発生させ、埋め込まれた光ファイバカニューレに連結用プラスチックスリーブを用いて取り付けられた２本の光ファイバパッチコード（０．２２ＮＡ、直径２００μｍ；Ｄｏｒｉｃ  Ｌｅｎｓｅｓ）により両側から、マウスに送達した。ＣｈＲ２を使用するすべての光遺伝学的刺激実験については、３〜５ｍＷの青色光（光ファイバの先端で９５〜１５９ｍＷ／ｍｍ２）を４７３ｎｍＤＰＳＳレーザー（ＭＢＬ−１１１４７３；ＯＥＭ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で発生させ、片側から送達させた。すべてのｅＮｐＨＲ３．０マウスに対して黄色光を送達するために一定の黄色レーザーを用いた。一方、パルス発生装置（Ｍａｓｔｅｒ−８；ＡＭＰＩ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）を用いて青色レーザー出力を制御し、５ミリ秒の光パルス列を１０Ｈｚ（ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡマウスを除くすべてのＣｈＲ２マウスについて）または２０Ｈｚ（ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡについて）で送達した。
【０１２５】
行動アッセイ
実験者との接触により誘発されるストレスを減らすため、すべてのマウスを行動アッセイの前に３日間、１日あたり５分間、手で触れた。セッション開始前に、１〜５分間、ホームケージで、光ファイバ及びパッチコードを接続するために手で触れてから回復させた。高架式十字迷路をプラスチック製とし、中心プラットホーム（５×５×５ｃｍ）から十字の形状に９０度で延びる、２本の灰色オープンアーム（３０×５ｃｍ）と２本の灰色クローズドアーム（３０×５×３０ｃｍ）とからなるものとした。同一タイプのアームは、互いに向き合った。迷路を床から３０ｃｍ上方に配置した。マウスを個々に中心に置き、頭をクローズドアームに向けさせた。高架式十字迷路試験は１５分間のセッションからなり、これは、３つの５分エポックに分けられる：順番に（オフ／オン／オフエポック）、刺激前光オフエポックと、光オンエポックと、刺激後光オフエポック。オープンフィールドチェンバー（５０×５０ｃｍ）は、プラスチック製であり、中心フィールド（中心、２５×２５ｃｍ）と外側フィールド（周囲）とに分けられた。試験開始時に、個々のマウスをフィールドの周囲に置いた。オープンフィールド試験は、４つの５分エポック（オフ／オン／オフ／オンエポック）がある２０分のセッションからなった。エポックは、非光刺激時期と光刺激時期とが交互になり、ベースライン光オフエポックから開始された。すべての分析と光オフ及びオンの条件のみが表示されたプロットとに関して、両方のオフエポックをプールし、両方のオンエポックをプールした。リアルタイム場所嗜好試験をカスタムメードの黒色プラスチック領域（５０×５０×２５ｃｍ）で実施した。この領域は、見分けのつかない１５分用の２つのチェンバーからなる。一方のチェンバーを光刺激と対にした。対になったチェンバーの選択は、マウス全体で釣り合うようにした。セッション開始時、動物は、非刺激チェンバーに置かれ、対になったチェンバーに入るたびに開始される光刺激を受けた。明るいコンパートメントと暗いコンパートメントとからなるカスタムメードの灰色プラスチックアリーナ（５０×２５ｃｍ）で、１５分間、明暗ボックス試験を実施した。実験の始めは、マウスを暗いコンパートメントに置いた。すべての行動アッセイについて、ビデオトラッキングソフトウェア（Ｖｉｅｗｅｒ２；ＢＩＯＢＳＥＲＶＥ、Ｓｔ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、位置及び速度を自動的にトラッキングした。
【０１２６】
呼吸数及び心拍数の測定
呼吸数及び心拍数の測定は、ＭｏｕｓｅＯｘ  Ｐｌｕｓソフトウェアを備えるコンピュータに接続されたパルスオキシメータ（ＭｏｕｓｅＯｘ  Ｐｌｕｓ；Ｓｔａｒｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｐａｒｋ、ＰＡ、ＵＳＡ）で行った。覚醒マウスからの記録には、カラーセンサーを用いた。マウスの頸部の周りを剃り、カラーセンサー（Ｓｔａｒｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌｌｉｓｏｎ  Ｐａｒｋ、ＰＡ、ＵＳＡ）に一晩、順化させた。さらに、測定の前の３日間、マウスを、実験者が手で触れることに慣らした。すべての記録は、特に明記しない限り、ケージの上部で行われた。マウスがケージで順化するのに５分間を設け、ベースライン測定として３分間記録し、次の３分間で光送達を行った。１．７秒ごとに１０回測定の移動平均として呼吸数を得た。鼓動５回の移動平均として心拍数を記録した。記録は、しばしば、シグナル消失または動きのアーチファクトにより中断した。したがって、すべてのパラメータをリアルタイムで注意深くモニターし、不十分なサンプリングのために生理学的に非現実的な値が観察された場合には記録を破棄した（例えば、呼吸数が＜１００ｂｒｐｍまたは心拍数が＜６００ｂｐｍ）。記録の質を確実にするために、１匹のマウスあたり少なくとも２回の記録を行い、平均値を求めた。また、時間の３０％を上回って心拍数及び呼吸速度のモニタリングに失敗した記録を破棄した。図９及び１５に示すデータを除いて、上記のプロトコールによってすべての呼吸数データを得た。これらの図面で使用される手順を以下に詳述する。
【０１２７】
ホームケージとオープンフィールドとの間で呼吸数を比較するために、これらの２つの環境において、同一マウスで呼吸速度を測定した。マウスは、ホームケージまたはオープンフィールドで３分間記録され、新しくてきれいなケージで回復のための５分間が与えられ、次にもう一方の環境で３分間、記録された。マウスを各々の環境に置いた直後に、記録を開始した。記録の順序の影響を打ち消すために、マウスの半分で、記録を最初にホームケージで行い、続いてオープンフィールドで行った（以下の図で、Ａ群）。残り半分については、記録の順番を交換した（Ｂ群）。２通りの記録の間、各々のマウスを新しくてきれいなケージで回復させた。図８に示すデータは、図２９Ａに示すスキームに従って記録された。
【０１２８】
オープンフィールドから得た呼吸数をホームケージから得た呼吸数で割り、その結果として得られた値をＣｈＲ２群とｅＹＦＰ群との間で比較した。したがって、ホームケージの呼吸数を、Ａ群及びＢ群両方、すべてのマウスのベースラインとして用いた。マウスを手で触れること及び環境間で搬送することは、ホームケージでの記録の前及びオープンフィールドでの記録の前の両方で、行われた。したがって、手で触れることそれ自体は、環境間での呼吸数の違いの根拠となるものではなかった（さらに、手で触れることとクリッピングされたカラーセンサーを付けての移動との両方に動物が慣れるように、すべての動物を記録前の３日間、徹底的に手で触れた）。手で触れることと環境間での移送が、観察された効果の原因ではないことをさらに実証するために、オープンフィールドのＡ群の呼吸数をホームケージのＢ群と比較した。マウスの両方の群が記録前に等しく手で触れられ／搬送されたが、オープンフィールドに置かれたマウスは、ホームケージのものと比較して、統計的に有意なより高い呼吸数を示した（オープンフィールドの場合、２３３．１±１２．８ｂｒｐｍ、ｎ＝３；ホームケージの場合、１７０．３±７．４ｂｒｐｍ、ｎ＝４；ｐ＜０．０５）。このことにより、呼吸数の増加はオープンフィールドに起因するものであり、先行する搬送及び手で触れることに起因するものではないことが示された。図１５に示す実験では、マウスがオープンフィールドに置かれたときに光を送達した。図１５に示されたデータを得るために使用されるプロトコールは、図２９Ｂで示されるスキームに示されるように、青色光がオープンフィールドの探査中に送達された点が異なるが、図８で用いたものと同一であった。
【０１２９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ電気生理学的記録
光遺伝学と組み合わせた切片生理学のために、３〜４週齢オス野生型マウスのＢＬＡにＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩａ：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを注射した。または、オスＤｒｄ１ａ−ＣｒｅマウスのｏｖＢＮＳＴにＡＡＶ−ＥＦ１ａ：：ＤＩＯ−ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰを注射した。１ヶ月後、氷冷ショ糖切除溶液（１１ｍＭ  Ｄ−グルコース、２３４ｍＭショ糖、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）を経心的に灌流し、ビブラトーム（ＶＴ１０００Ｓ；Ｌｅｉｃａ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて同一溶液中でスライスすることによって、３００μｍ冠状急性切片を得た。切片を、３２℃、１時間で、酸素添加人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；１２３ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１１ｍＭグルコース）に回収した。すべての電気生理学的記録を、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングし、かつ３２℃で加熱しながらａＣＳＦの恒常的な灌流のもと、実施した。ニューロンの視覚化は、４０ｘ水浸対物レンズと電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（ＲｅｔｉｇａＥｘｉ  ＦＡＳＴ；  Ｑｌｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｒｒｅｙ、Ｃａｎａｄａ）とを用い、ＤＩＣ光学素子とｅＹＦＰを視覚化するためのフィルターセットとを備えた直立型顕微鏡（ＤＭＬＦＳＡ；Ｌｅｉｃａ）により、行った。ＢＬＡを含む切片を用いてＢＬＡでのＣｈＲ２の発現を確認し、ＢＬＡに制限されたＣｈＲ２発現を有するマウス由来の切片のみ、用いた。ホールセル記録をａｄＢＮＳＴニューロンから、カリウムベースの内部溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ  Ｎａ３−ＧＴＰ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、及び１４０ｍＭグルコン酸カリウム）またはセシウムベースの内部溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  Ｍｇ−ＡＴＰ、０．３ｍＭ  Ｎａ３−ＧＴＰ、２ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＣｓＣｌ、４ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＱＸ３１４、及び１３０ｍＭセシウムグルコネート）で満たされたパッチ電極（３〜６ＭΩ）を用いて、得た（さらに詳しくは後述）。ほとんどの電圧クランプ実験及びすべての電流クランプ実験をカリウムベースの内部溶液で実施し、一部の電圧クランプ実験をセシウムベースの内部溶液で行って、空間クランプを改善した。直列抵抗は、概して１０〜２０ＭΩであった。
【０１３０】
青色光送達については、光を３００Ｗ幅広帯域波長キセノンランプ光源（ＤＧ−４、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から発し、４７０±２０ｎｍの帯域フィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）でフィルタリングし、追加のニュートラル濃度フィルター（ＴｈｏｒＬａｂｓ；Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を通し、顕微鏡の蛍光ポートにカップリングさせた。すべての実験について、５〜１５ｍＷ／ｍｍ２の光を４０×０．８ＮＡ対物レンズを通して、切片に送達した。パルス入力シグナルを、ｐＣｌａｍｐ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）から発生させ、ＢＮＣを介してＤＧ−４に送達した。
【０１３１】
電圧クランプ記録を、ＥＰＳＣを分離するための−７０ｍＶと、ＩＰＳＣを分離するための０ｍＶとの両方で、実施した。光誘発ＥＰＳＣ及びＩＰＳＣを、グルタメート受容体アンタゴニストの浴適用によって無効にした（１０μＭ  ＮＢＱＸ及び５０μＭ  ＡＰＶ；ｎ＝４；図１９ｅ）。１００μＭのピクロトキシン（１０μＭ；ｎ＝４；図１９ｆ）の浴適用を介して、各々のＩＰＳＣを確認した。本発明者らは、細胞が約−６０ｍＶで静止状態になる場合に電流クランプ記録を実施した。電流を２ｋＨｚでフィルタリングし、５０ｋＨｚでデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて記録した。
【０１３２】
ＢＬＡ軸索線維を刺激する実験について、パッチクランプ記録をａｄＢＮＳＴから得た。ＤＩＣ光学部品で見られるｏｖＢＮＳＴとａｄＢＮＳＴとの間の明確な解剖学的境界線がないにもかかわらず、本発明者らは、ｏｖＢＮＳＴがＢＬＡからの投射を受け取らないことから、ｅＹＦＰ発現線維が存在した領域で、記録を行った（図４ｆ及び１０ａ）。これと一致して、ＢＮＳＴの背側領域の推定上のｏｖＢＮＳＴニューロンは、何ら光誘発応答を示さなかった。ＬＨに投射するａｄＢＮＳＴニューロンから記録する実験について、ＨＳＶ：ＥＦ１ａ：：ＧＦＰを、切片生理学実験の３〜４日前に、ＬＨ（ＡＰ−１．５ｍｍ、ＭＬ１．２ｍｍ、ＤＶ−６．０ｍｍ）に注入して、ＬＨに投射するａｄＢＮＳＴニューロンを標識した。個々の細胞でのＧＦＰ発現を視覚的に確認した後に、ＧＥＰ発現ＢＮＳＴニューロンで、パッチクランプ記録を実行した。
【０１３３】
マイクロドライブ構築及び埋め込み
１本の光ファイバカニューレ（０．２２ＮＡ、直径２００μｍ；Ｄｏｒｉｃ  Ｌｅｎｓｅｓ）の周りに８本のステレオトロードを含むカスタムマイクロドライブを、テフロンプラットホーム（Ａｄｈｉｋａｒｉ他、２０１１７から改良）に取り付けたインタフェースボード（ＥＩＢ−１６；Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ；Ｂｏｚｅｍａｎ、ＭＴ、ＵＳＡ）をベースにして構築した。ステレオトロードは、２５ｍＭホルムバール被覆タングステンマイクロ導線（Ｍ１６５２６０；Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｗｉｒｅ；Ｇｒｏｖｅｒ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）から構成され、インタフェースボードに取り付けられたカニューレに固定した。光ファイバカニューレをインタフェースボードに取り付け、マイクロ導線が光ファイバの先端を超えて約０．５ｍｍ突出するようにして、マイクロ導線に接着させた。プラットホーム全体を３本の微小機械ネジ（ＳＨＣＸ−０８０−６；Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ；Ｍｉｒａｍａｒ、ＦＬ、ＵＳＡ）でテフロンカフに固定し、ネジをカフにねじ込むことでプラットホームを前進させることを可能にした。埋め込みのために、追加のネジを頭蓋骨の前部または後部に埋め込み、それぞれ接地及び物理的支持体としての役割を持たせた。ＢＮＳＴにマイクロドライブを注意深く設置した後、テフロンカフを頭蓋骨に接着（Ｇｒｉｐ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｃｅｍｅｎｔ；Ｄｅｎｔｓｐｌｙ、Ｙｏｒｋ、ＰＡ、ＵＳＡ）させ、接地ネジをインタフェースボードに接続させた。
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ単一ユニット記録
動物を少なくとも１週間回復させ、次に８５％の体重まで食事制限した。食事制限の間、動物をホームケージのヘッドステージに繋げることによって記録のセットアップと手で触れることに慣らした。より多く不安惹起する領域（オープンアーム）と安全領域（クローズドアーム）との境界が明確に定義されていることから、ＯＦＴではなくＥＰＭを、ｉｎ  ｖｉｖｏ記録用に選択した。さらに、一般的に、マウスはＥＰＭ全体を探査するが、ＯＦＴの中心の領域のほとんどを訪問しない。このことは、ＥＰＭの各群での発火頻度推定精度を増加させる。不安の独自のアッセイとして、明暗ボックス試験を１５分間の明るいコンパートメントと暗いコンパートメントとからなるカスタムメードの灰色プラスチックアリーナ（５０×２５ｃｍ）で実行した。実験の始めに、マウスを暗いコンパートメントに置いた。
【０１３５】
少なくとも４本の十分に分離された単一ユニットがＢＮＳＴで記録可能になるまで、ステレオトロードを前進させた。ＣｈＲ２またはｅＮｐＨＲ３．０発現ＢＬＡ線維のそれぞれの活性化または抑制が、記録された領域での活動を増減させた。このことは、記録がａｄＢＮＳＴで行われたことを示している、なぜなら光送達がＢＬＡ線維を欠いたｏｖＢＮＳＴでの活動を変化させることは、予想されないからである。また、電極の先端に印を付ける電気的障害のみがａｄＢＮＳＴで観察された（図２）。細線ケーブルに取り付けられた単一のゲインヘッドステージ前置増幅器（ＨＳ−１６；Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ；Ｂｏｚｅｍａｎ、ＭＴ、ＵＳＡ）を介して、記録を得た。４０μＶを超えるスパイクを帯域フィルター（６００〜６，０００Ｈｚ）でフィルタリングし、３２ｋＨｚで記録した。スパイクデータをＣｈｅｅｔａｈデータ収集ソフトウェア（Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ）で獲得した。動物の位置を、ヘッドステージに取り付けられた２つの発光ダイオードのオーバーヘッドビデオトラッキング（３０Ｈｚ）で得た。
【０１３６】
単一ユニットスパイクソーティング及び分析
カスタム書き込みソフトウェアを用いて分析するために、データをＭａｔｌａｂにインポートした。スパイクのクラスタリングをオフラインで、ＳｐｉｋｅＳｏｒｔ  ３Ｄ（Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ）を用いて実施した。ＣｈＲ２発現ＢＬＡ終末の刺激に対するａｄＢＮＳＴ単一ユニットのｉｎ  ｖｉｖｏ応答を分類するために、本発明者らは５ｍｓ青色光パルスの４００プレゼンテーション全体の応答を記録した。レーザーパルス開始時を中心とした１００ｍｓエポックで発火頻度を分析した（−５０〜５０ｍｓ、０ｍｓでパルス発生）。ｚスコア発火頻度がベースライン（−５０〜０ｍｓ）とパルス後（０〜３５ｍｓ）との間で有意な差があった場合、ユニットをパルスに対して「応答性」と分類した。「応答性ユニット」の中でも、ｚスコア平均発火頻度がパルス後でより高い場合、ユニットは「有意に興奮した」と分類した。そうでなければ、ユニットは抑制されたと分類した。興奮したユニットは、さらに、「一過性応答のみ」を示すユニット（０〜１０ｍｓの発火頻度がベースラインよりも有意に高く、１０〜３５ｍｓの頻度がベースラインと有意な違いはない）または「一過性及び持続的な応答」を示すユニット（開始後の０〜３５ｍｓの頻度がベースラインの頻度よりも有意に高い）に分けられた。持続性のマルチユニットを、ベースライン（−３０〜０秒）と比較して３０〜４０秒での有意に高い発火頻度（ｚスコアとして測定）と定義した。応答をレーザーパルスと比較するためにウィルコクソン順位和検定を用いた。
【０１３７】
ＥＰＭスコア計算
迷路のすべてのアームを探求したマウスからのデータのみを使用した。ＥＰＭスコアを計算して、単一ユニットが迷路のオープンアーム構造とクローズドアーム構造とを一貫して区別し得る範囲を定量化した。ＥＰＭスコアは以下の式により計算した。
スコア＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）、式中、
Ａ＝０．２５×（｜ＦＬ−ＦＵ｜＋｜ＦＬ−ＦＤ｜＋｜ＦＲ−ＦＵ｜＋｜ＦＲ−ＦＤ｜）及び
Ｂ＝０．５×（｜ＦＬ−ＦＲ｜＋｜ＦＵ−ＦＤ｜）。
【０１３８】
ＦＬ、ＦＲ、ＦＵ、及びＦＰは、それぞれ、左、右、上、及び下アームの平均発火頻度からの％差である。「Ａ」は、異なる種類のアーム間の正規化された発火頻度の平均差であり、一方「Ｂ」は同一種類のアームの平均差である。本発明者らは「平均発火頻度からの％変化」として各位置での頻度を用いたが、「平均発火頻度からの増加倍率」を用いることもできる。なぜなら、この選択は最終ＥＰＭスコアに影響しないからである。作業に関連した発火パターンを有する細胞は、同一種類のアームで類似の発火頻度（結果として小さいＢをもたらす）と異なる種類のアーム間での頻度の大きな差（結果としてＡの大きな値をもたらす）とを有する。重要なことに、正のスコアは、両クローズドアームで選択的に発火する細胞に対して、また両オープンアームで選択的に発火する細胞に対して、割り当てられると考えられる。１．０という最大スコアは、同一種類のアーム全体で発火頻度の差がないことを示す（Ｂ＝０）。一方では、ゼロのスコアは、迷路のすべてのアームで同一発火頻度を有する細胞に割り当てられると考えられる。最後に、負のスコアは、発火頻度が同一種類のアーム全体よりも異なる種類のアーム全体によりいっそう類似していることを示す（例えば、１つのクローズドアーム及び１つのオープンアームのみで選択的に高い発火頻度を有する細胞）。
【０１３９】
光オフエポック中のＥＰＭスコアを計算するべく、１０オフエポック中の所定の単一ユニットからのすべてのスパイクをまとめてプールした。各々のエポックは６０秒である（図２２ｅを参照）。オフエポックの全秒数（６０秒／エポック×１０エポック＝６００秒）で割られたオフエポックの全スパイク数は、オフエポックの平均発火頻度を生じた。各々のアームの発火頻度を、この平均オフ発火頻度からの％変化として計算した。上記の式に示すように、これらの発火頻度を、オフＥＰＭスコアの計算に用いた。
【０１４０】
同様に、光オンエポック中のＥＰＭスコアを計算するために、オンエポックで生じた所定の単一ユニットからのスパイクすべてをまとめてプールし、平均オン発火頻度を計算した。なお、オフエポック内のスパイク活動が、オンエポックの特定のアームにおける平均発火頻度または発火頻度の計算に影響を及ぼさないことに留意すること。表１及び２に示すスキームは、未加工データから光オン及びオフエポック中のＥＰＭスコアをどのように計算するか、段階を追って示している。
【０１４１】
（表１）
0006594854.tif 000019
スパイクの合計数＝４０＋３０＋２０９＋２１５＋３０
スパイクの合計数＝５２４
秒の合計数＝７０＋７６＋１９１＋２１７＋４６
秒の合計数＝６００
平均頻度＝５２４／６００＝０．８７Ｈｚ
ＥＰＭスコア＝（Ａ-Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）、式中
Ａ＝０．２５×（｜ＦＬ-ＦＵ｜＋｜ＦＬ-ＦＤ｜＋｜ＦＲ-ＦＵ｜＋｜ＦＲ-ＦＤ｜）及び
Ｂ＝０．５×（｜ＦＬ-ＦＲ｜）＋｜ＦＵ-ＦＤ｜）
Ａ＝６４及びＢ＝１６
ＥＰＭスコア（光オフ）＝０．６０
【０１４２】
（表２）
0006594854.tif 000020
スパイクの合計数＝３７３
秒の合計数＝６００
平均頻度＝３７３／６００＝０．６２
ＥＰＭスコア＝（Ａ-Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）、式中
Ａ＝０．２５×（｜ＦＬ-ＦＵ｜＋｜ＦＬ-ＦＤ｜＋｜ＦＲ-ＦＵ｜＋｜ＦＲ-ＦＤ｜）及び
Ｂ＝０．５×（｜ＦＬ-ＦＲ｜）＋｜ＦＵ-ＦＤ｜）
Ａ＝３５及びＢ＝１６
ＥＰＭスコア（光オン）＝０．３７
【０１４３】
シミュレートされたデータによるＥＰＭスコアの計算
実験的に観察されたＥＰＭスコアの母集団が偶然に予想されるよりも有意に異なっていたかを計算するために、スコアの分布シミュレーションを生成した。ｎ個のスパイクを持つ各々のユニットについて、ｎ個のランダムに選択されたタイムスタンプのＥＰＭスコアを５００回計算することで、シミュレートされたスコアを５００個生成した。これは、５００×３８のシミュレートされたＥＰＭスコアによる分布を生成した。これらの１９０００個のシミュレートされたＥＰＭスコアの中で、１２７３０個（６７％）の値が負であった。正のシミュレートされたスコアの母集団（３３％）は、クローズ及びオープンアームを好む細胞にほぼ完全に等しく分かれた（それぞれ、３１２９及び３１４１個の値）。ウィルコクソン順位和検定を使用して、すべての細胞の実験的に観察されたＥＰＭスコアの母集団の有意性を、スコアのシミュレートされた分布との比較により計算した。
【０１４４】
組織学的な確認及び共焦点顕微鏡法
マウスを、氷冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で深く麻酔させるとともに経心的に灌流した。脳を一晩４％ＰＦＡ溶液で固定し、続いて３０％ショ糖含有ＰＢＳで平衡化させた。脳をショ糖溶液に沈めた後、４０μｍ厚の冠状切片を凍結ミクロトーム上で切り取った。スライス後、ガイドカニューレ、光ファイバ、及びステレオトロードアレイの配置が容易に視覚化された（図１〜３）。切片を、さらに処理するまで、４℃で凍結防止溶液（グリセロール、エチレングリコール、及びＰＢＳの５：６：９混合液）中に保存した。浮動性の断片をＰＢＳで洗い、１：５０，０００ＤＡＰＩ溶液中で２５分間、インキュベートし、再びＰＢＳで洗い、ＰVＤ−ＤＡＢＣＯとともに顕微鏡スライドに載せた。共焦点像は、２０Ｘ／０．７０ＮＡまたは４０Ｘ／１．２５ＮＡ油浸対物レンズを用いるＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５走査型レーザー顕微鏡で得られた。像の分析は、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＬＡＳ  ＡＦ  ソフトウェアを用いて行った。
【０１４５】
カルシウムイメージング及び分析
ＢＮＳＴを含む冠状脳切片を若いマウスから調製し（ｎ＝４  切片、Ｐ８〜Ｐ１０、厚さ３００μｍ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  Ｂａｐｔａ−１ＡＭ（ＯＧＢ）で染色した。簡潔に言えば、切片を氷冷ａＣＳＦ（１１０ｍＭ塩化コリン、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３．１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中、ビブラトーム上で切り取り、直ちに、室温で１時間の回収用ａＣＳＦ溶液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、３ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）に移した。次に、切片を、２．５ｍｌの回収用ＡＣＳＦを含む３２℃のインキュベーションチェンバーに移した。１０μｌのＯＧＢ溶液（９μｌのＤＭＳＯに溶解した５０μｇＯＧＢと１μｌの２０％プルロン酸含有ＤＭＳＯ）を直接、切片に適用した。ＯＧＢ溶液中で２０〜２５分間インキュベーションした後、切片を、室温の実験用ａＣＳＦ（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、３ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）に移した。１時間後、イメージングセッションが開始された。像は、落射蛍光顕微鏡及びＣＣＤカメラを用いて獲得した（５０ｍｓ積分時間、−４Ｈｚで１回の試験あたり約４００フレーム）。刺激試験では、０．２ｍｓ電流パルスを、ａｄＢＮＳＴに配置され、かつ顕微鏡の視野内にある双極電極に印加した。一組の刺激条件について、電流パルスの振幅は、１０μＡずつ、増加または減少のいずれかの順序で、１０μＡと５０μＡとの間を試験間で変動した。次に、１００μＭのＡＰＶを灌流槽に添加し、刺激実験を繰り返した。次に、１０μＭのＮＢＱＸをこの槽に添加し（一方でＡＰＶの濃度を保ちながら）、刺激を再び繰り返した。ＯＧＢ蛍光ムービーの分析のために、半自動化された手順を使用して、関心領域（ＲＯＩ）を各々の細胞の周りと神経網の周りとに描いた。各ＲＯＩ内の画素をフレームごとに平均し、時系列を細胞ごとに生成した。蛍光団の光脱色を修正するために、双指数関数を各細胞のベースライン時系列（刺激の前の）に近似させ、細胞の最小限の蛍光値への減衰を仮定し、さらに、近似曲線を細胞の時系列から減算した。神経網のスケーリングされた時系列を各セルの時系列から差し引いて、全体的な事象を取り出した（スケーリングは、神経網の時系列と細胞の時系列との間の最小二乗差によって決定された）。ベースラインを超える蛍光の変化を、試験ごとに各細胞について計算した（ＡＦ／Ｆ＝（Ｆ１―Ｆ）／Ｆ、式中、Ｆｉは瞬間的な蛍光であり、Ｆはベースラインの間の平均蛍光である）。Ｚスコアを、ベースラインの標準偏差と平均値とに基づいて、各時系列について計算した（刺激に対して、−４０〜０秒）。ニューロンの統計的に有意な活動を、何らかの変調と定義した。この変調は、電気刺激の後、少なくとも５秒間生じ（なぜなら、神経網応答が約５秒、減衰してベースラインに戻った）、３．４３（ｐ＜０．０５；ボンフェローニ補正）のｚスコアを超えた。
【０１４６】
統計
すべての統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて実施した。ＥＰＭ及びＯＦＴデータについて、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを用い、続いてボンフェローニ補正ポストホック検定を行った。メインテキストのＰ値は、オプシン処理とエポックとの間の相互作用のｐ値を示し、図中の星印（＊）は所定のエポックでのポストホック検定のｐ値を示す。単一の変数の二標本比較（実験群及び対照群の呼吸数の％変化またはＥＰＳＣ及びＩＰＳＣの開始潜時など）について、ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を用いた。すべての試験は両側で、アルファ水準が０．０５であった。スピアマン相関をピアソン相関の代わりに用いた。なぜなら、スピアマンの相関がノンパラメトリックであり、外れ値に対して感受性が低く、さらに、２つの変数の間の単調な関係を検出可能であるからである。標準誤差の平均（ｓ．ｅ．ｍ．）をグラフにプロットして、母集団の平均を推定する精度を示した。
【０１４７】
ＹＦＰ
コンストラクト中のＹＦＰのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
0006594854.tif 000021
【０１４８】
結果
解剖学的研究、行動研究、及び神経画像処理研究から得られたエビデンスは、ＢＮＳＴを、病理学的不安及び適応不安に関連付けた。例えば、背側ＢＮＳＴ（以下、ＢＮＳＴと呼ぶ）の損傷は、不安様行動を減少させることが報告された。この知見をさらに調べるために、本発明者らは、高架式十字迷路（ＥＰＭ）試験前に、グルタメート受容体アンタゴニストをＢＮＳＴに注入した（図４ａ；図１〜３の組織構造）。この介入は、オープンアーム探索を増加させ（ｐ＜０．０１、統計的分析を参照のこと；図４ａ）、歩行運動を変更させることはなかった（図５；マウスが生来の嫌悪を示すそのようなオープンスペース探索の増加は、不安様行動の減少を示すと考えられる）。次に、本発明者らは、抑制性ハロロドプシンｅＮｐＨＲ３．０と、ＢＮＳＴへの黄色光の送達とを用いて、ＢＮＳＴを光遺伝学的に抑制した（ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体；図４ｂ）。ＥＰＭ及びＯＦＴのオープンスペースでの探索の増加が観察され（図４ｂ；図６ａ及び６ｂ）、不安緩解を示した。これとは逆に、興奮性チャネルロドプシンＣｈＲ２によるＢＮＳＴ細胞体の刺激は、両アッセイで不安による行動測定値を増加させた（ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ細胞体；図７）。この操作が不安の生理学的徴候に変化を与えたかどうかを調べるために、本発明者らは呼吸数をモニタリングしながらＢＮＳＴ細胞体を刺激した。換気亢進は、ヒト及び齧歯類において不安の増加に連関している（図８）。また、ＢＮＳＴは呼吸中枢に投射することが知られている。実際、呼吸数の増加が観察された（図７ｄ）。同時に、これらの結果は、ＢＮＳＴの活動が不安様状態を引き起こすことを示唆しており、以前の研究の大部分と整合性がある。
【０１４９】
図１。（左側）ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ細胞体マウス及びｅＹＦＰ対照用の光ファイバ先端の片側配置を示す（それぞれシアン色及び灰色）。ガイドカニューレ先端配置を赤色で示す。すべての片側外科手術を半球に対して釣り合うようにした。（右側）ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体マウス及び対照群用の光ファイバ先端の両側配置を示す（それぞれオレンジ色及び黒色）。数字は、ブレグマからの前後の座標を示す。
【０１５０】
図２。（左側）ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウス及びｅＹＦＰ対照用の光ファイバ先端の片側配置を示す（それぞれシアン色及び灰色）。ｉｎ  ｖｉｖｏ記録用のステレオトロードアレイの先端を赤色で示す。すべての片側外科手術を半球に対して釣り合うようにした。（右側）ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウス及び対照群用の光ファイバ先端の両側配置を示す（それぞれ黄色及び黒色）。数字は、ブレグマからの前後の座標を示す。
【０１５１】
図３。（左側）ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨマウス及びｅＹＦＰ対照用の光ファイバ先端の片側配置を示す（それぞれ青色及び灰色）。すべての片側外科手術を半球に対して釣り合うようにした。（右側）ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴマウス及び対照群用の光ファイバ先端の両側配置を示す（それぞれ黄色及び黒色の記号）。数字は、ブレグマからの前後の座標を示す。
【０１５２】
図４ａ〜ｈ。背側ＢＮＳＴ内の機能的異質性。（ａ）薬物注入用のカニューレ；ＮＢＱＸ＋Ｄ−ＡＰＶは、ＥＰＭのオープンアーム滞在時間を増加させた（各々、ｎ＝５）。（ｂ）ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体マウスは、ＢＮＳＴより上方に光ファイバを両側に埋め込まれた。光は、ＥＰＭのオープンアーム滞在時間を増加させた（ｎ＝８  ｅＮｐＨＲ３．０、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）。（ｃ）ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴマウスは、両側光を受けた。ｏｖＢＮＳＴに制限された発現は、Ｄ１Ｒ−ＣｒｅマウスにおいてＣｒｅ依存的ｅＮｐＨＲ３．０−ＡＡＶによって得られた。（ｄ）ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴマウスのｏｖＢＮＳＴへの光送達は、ＥＰＭのオープンアーム滞在時間を増加させた（ｎ＝７  ｅＮｐＨＲ３．０、ｎ＝８  ｅＹＦＰ）。また、（ｅ）呼吸数を減少させた（ｎ＝７  ｅＮｐＨＲ３．０、ｎ＝８  ｅＹＦＰ）。（ｆ）ＢＬＡでｅＮｐＨＲ３．０を発現しているｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスは、ａｄＢＮＳＴでＢＬＡ線維の両側照明を受けた。（ｇ）ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスでの光は、オープンアーム滞在時間を減少させた（ｎ＝１１  ｅＮｐＨＲ３．０、ｎ＝１５  ｅＹＦＰ）。また、（ｈ）呼吸数を増加させた（ｎ＝８  ｅＮｐＨＲ３．０、ｎ＝８  ｅＹＦＰ）。スケール：２００ｐｍ。示される平均±ｓ．ｅ．ｍ．；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１。
【０１５３】
統計。図４ａ。群ごとにｎ＝５。ｐ＜０．０１。ウィルコクソン順位和検定。図４ｂ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ細胞体群についてｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，２８＝１０．７４、ｐ＜０．００１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。図４ｄ。ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ｏｖＢＮＳＴ群についてｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，２６＝１４．６６、ｐ＜０．０００１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図４ｅ。ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ｏｖＢＮＳＴ群について、ｎ＝８。ｐ＜０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図４ｇ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１１。ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１５。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，４８＝５．５８、ｐ＜０．０１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図４ｈ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝８。ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝８。ｐ＜０．０１。ウィルコクソン順位和検定。
【０１５４】
図５ａ〜ｊ。歩行運動は、実行された操作のいずれによっても変化しなかった。（ａ）ＮＢＱＸ及びＡＰＶをＢＮＳＴに局所注入すること（実験群についてｎ＝５、対照群についてｎ＝５；ｐ＞０．０５）、（ｂ）ＢＮＳＴ細胞体を抑制すること（実験群についてｎ＝１０；対照群についてｎ＝１１；ｐ＞０．０５）、（ｃ）ＢＮＳＴ細胞体を刺激すること（実験群についてｎ＝６；対照群についてｎ＝６；ｐ＞０．０５）、（ｄ）ｏｖＢＮＳＴを抑制すること（実験群についてｎ＝８；対照群についてｎ＝８；ｐ＞０．０５）、（ｅ）ｏｖＢＮＳＴを刺激すること（実験群についてｎ＝７；対照群についてｎ＝７；ｐ＞０．０５）、（ｆ）ａｄＢＮＳＴのＢＬＡ線維を抑制すること（実験群についてｎ＝１１；対照群についてｎ＝１１；ｐ＞０．０５）、（ｇ）ａｄＢＮＳＴのＢＬＡ線維を刺激すること（実験群についてｎ＝８；対照群についてｎ＝８；ｐ＞０．０５）、（ｈ）ＬＨのａｄＢＮＳＴ線維を刺激すること（実験群についてｎ＝１１；対照群についてｎ＝８；ｐ＞０．０５）、（ｉ）ＰＢのＢＮＳＴ線維を刺激すること（実験群についてｎ＝８、対照群についてｎ＝７；ｐ＞０．０５）、または、（ａ）ＶＴＡのａｄＢＮＳＴ線維を刺激すること（実験群についてｎ＝８，対照群についてｎ＝７；ｐ＞０．０５）は、平均移動速度に対して検出可能な効果を示さなかった。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１５５】
図６ａ〜ｆ。不安パラダイムにおけるＢＮＳＴの機能的異質性。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体マウスでの黄色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ａ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｂ）とを増加させた。ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴマウスでの黄色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ｃ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｄ）とを増加させた。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスでの黄色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ｅ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｆ）とを減少させた。値は、平均±ｓ．ｅ．ｎｎである。＊、＊＊、及び＊＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０５、０．０１、及び０．００１を示す。この図のデータは、図４で示されるものと同じコホートからの、さらなる行動結果を示す。
【０１５６】
図６統計。図６ａ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体群についてｎ＝１０、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ細胞体群についてｎ＝１１。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった。（挿入図）二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ１，１３＝８．３４、ｐ＜０．０５。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。図６ｂ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＮＳＴ細胞体群についてｎ＝１０、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ細胞体群についてｎ＝１１。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，２６＝４．７０、ｐ＜０．０５。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。図６ｃ。ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ｏｖＢＮＳＴ群について、ｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ３，４２＝７．９３、ｐ＜０．００１。（挿入図）二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ１，１４＝３１．０３，ｐ＜０．０５。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。図６ｄ。ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ｏｖＢＮＳＴ群について、ｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，２６＝６．６７、ｐ＜０．０１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図６ｅ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１３、ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴについてｎ＝１５。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ３，７８＝４．３５、ｐ＜０．０１．（挿入図）二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ１，２６＝１２．５６、ｐ＜０．０１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。図６ｆ。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１３、ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴについてｎ＝１５。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群ｘ光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，４８＝６．２４、ｐ＜０．０１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．００１、ポストホックボンフェローニｔ検定。
【０１５７】
図７ａ〜ｆ。ＢＮＳＴ細胞体の光遺伝学的刺激は、不安関連行動を増加させる。（ａ）６〜８週齢マウスは、ＢＮＳＴに、０．５μｌのＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ（ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ細胞体；ｎ＝６）またはＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ細胞体；ｎ＝６）の片側注入を受け、ＢＮＳＴの真上に光ファイバが埋め込まれた。行動アッセイを、注入の４週間後に実行した。共焦点像は、ＢＮＳＴ細胞体でのＣｈＲ２−ｅＹＦＰの発現を示す（４０Ｘ対物レンズ、３Ｘ光学ズーム、単一平面）。（ｂ）マウスに、５分間の光オフ／オン／オフのエポックからなる１５分間セッションにわたって、高架迷路を走らせた。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ細胞体群でのオンエポック（５ｍｓパルス幅、１０Ｈｚ）中の青色光刺激送達は、ｅＹＦＰ対照と比べて、オープンアーム滞在時間及びオープンアーム進入確率（挿入図）を減少させた（Ｆ２，１８＝５．０４、ｐ＜０．０５；挿入：Ｆ２，１８＝３．９４、ｐ＜０．０５）。（ｃ）１週間後、マウスに、５分間の光オフ／オン／オフ／オンのエポックからなる２０分間セッションにわたって、オープンフィールドを走らせた。青色光刺激は、ｅＹＦＰと比較して光オンエポックの間、ＯＦＴでの中心滞在時間を減少させた（左、Ｆ３，３０＝３．８９、ｐ＜０．０５；右、Ｆ１，１０＝１６．０２、ｐ＜０．０１）。（ｄ）一週間後、呼吸数を、６分間、同一マウスから測定し、光刺激を最後の３分間与えた。光刺激によって、呼吸数が増加した（ｐ＜０．０５、ウィルコクソン符号順位検定）。（ｅ〜ｆ）（ａ）との比較のために、ａｄＢＮＳＴにおいてＣｈＲ２−ｅＹＦＰを発現しているＢＬＡ線維の高解像度像（ｅ）とＬＨにおいてＣｈＲ２−ｅＹＦＰを発現しているａｄＢＮＳＴ線維の高解像度像（ｆ）とを示す。統計的分析のために、特に明記しない限り、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを用いた。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊及び＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０５及び＜０．０１を示す。
【０１５８】
図８。不安環境下における呼吸数増加。１２〜１６週齢未処置マウス（ｎ＝７）を３日間、手で触れ、呼吸数測定のために用いられるカラークリップに順化させた。呼吸数はまず、ホームケージまたはオープンフィールドで３分間記録した。マウスを新しいきれいなケージで５分間休ませ、次にもう一方の環境で３分間、記録した。記録の順序は、動物全体で釣り合うようにした。ホームケージで測定した値と比べて、不安を惹起する環境であるオープンフィールド装置に動物を置くことで呼吸数が有意に増加したことに、注意すべきである（ｐ＜０．０５、ウィルコクソン符号順位検定０＞＊、ｐ＜０．０５。
【０１５９】
しかしながら、これらの結果は、複数の小領域を含むＢＮＳＴの完全な像を提供するものではないと考えられる。ＢＮＳＴ楕円核（ｏｖＢＮＳＴ）を、ｏｖＢＮＳＴに制限されたＣｒｅ発現を示すＣｒｅ依存的ｅＮｐＨＲ３．０ウイルスをドーパミン受容体ｌａ：：Ｃｒｅ（Ｄｒｄｌａ：：Ｃｒｅ）マウスのＢＮＳＴに導入することによって、標的化した（ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴ；図４ｃ）。ｅＮｐＨＲ３．０：ｏｖＢＮＳＴマウスでの黄色光送達は、ＥＰＭオープンアーム（ｐ＜０．０００１；図４ｄ）及びＯＦＴ中心（ｐ＜０．００１；図６ｃ）の回避を減少させた。同じ操作により、呼吸数も減少した（ｐ＜０．０５；図４ｅ）。これとは逆に、ＣｈＲ２によるｏｖＢＮＳＴの刺激は、不安の行動的測定及び生理学的測定の両方を増加させた（ＣｈＲ２：ｏｖＢＮＳＴ；図９）。これらの結果は、ｏｖＢＮＳＴの不安惹起の役割を示唆しており、ＢＮＳＴ全体を調整することによって得られる結果と（図４ａ〜ｃ）を調整することによって得られる結果と整合した。
【０１６０】
本発明者らは、扁桃体基底外側部（ＢＬＡ）が不安に関係する領域でありＢＮＳＴに投射することから、ＢＮＳＴへのＢＬＡ入力の機能を次に調べた。ＢＬＡ錐体ニューロンでｅＮｐＨＲ３．０−ｅＹＦＰを発現するマウスは、ｏｖＢＮＳＴを囲んでいるＢＮＳＴの領域に投射しているｅＹＦＰ＋線維を示し、これを前背中側ＢＮＳＴまたはａｄＢＮＳＴと呼ぶ（ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ；図４ｆ）。驚くべきことに、ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射を抑制することは、ＥＰＭオープンアーム（ｐ＜０．０１；図４ｇ）及びＯＦＴ中心（ｐ＜０．０１；図６ｅ）の回避を増加させ、さらに呼吸数も増加させた（ｐ＜０．０１；図４ｈ）。逆に、ＣｈＲ２によるＢＬＡの刺激（ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ；図１０ａ）は、行動不安測定（図１０ｂ、図１１ａ、１１ｂ、及び１２）及び呼吸数（ｐ＜０．０５；図１０ｃ）の両方を減少させた。以下に確認されるように、ＢＬＡ投射は興奮性であると考えられることから、ｏｖＢＮＳＴ活動の不安惹起の性質と対照的に、これらのデータは、ａｄＢＮＳＴ漸増が不安を緩解することを示している。重要なことに、これらの効果は、大脳前交連で、ＢＬＡ線維の興奮に起因していなかった（図１３）。さらなる試験として、不安緩解の臨床的に関連した特徴が正の主観的値であり得ると考え、本発明者らは、ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射を刺激することが、正の条件的誘発性を引き出すことができるかどうかを検討した（リアルタイム場所嗜好タスク；ＲＴＰＰを使用、方法を参照）が、本発明者らは引き出された場所嗜好を観察できなかった（図１０ｄ）。
【０１６１】
本発明者らは、ａｄＢＮＳＴ活動がオープンスペースの回避と呼吸数とを減少させることを発見し、どのａｄＢＮＳＴ出力がこれらの異なる効果を媒介する可能性があるかについて、次に調査した。外側視床下部（ＬＨ）に対するａｄＢＮＳＴ投射は、ＬＨがａｄＢＮＳＴから投射を受けるがｏｖＢＮＳＴからは受けず（図１４ａ）、かつ正常ＥＰＭ行動に必要とされることから、不安の行動的発露の減少を媒介する候補であった。この仮説と一致して、本発明者らは、ＬＨに投射するａｄＢＮＳＴニューロンがＢＬＡ入力を受け取ること（図１４ｂ〜ｄ）、及びａｄＢＮＳＴ−ＬＨ投射の刺激によりＥＰＭ（ｐ＜０．０１；図１０ｆ）とＯＦＴ（ｐ＜０．０５；図１１ｃ）との両方でオープンスペースの回避を減少させることを見出した。しかし、呼吸数（図１０ｇ）またはＲＴＰＰ（図１０ｈ）に対しては何ら効果が見られなかった。このことは、ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ経路が選択的に不安緩解の行動的特徴を調整するが、生理学的または要求的特徴は調整しないことが示唆される。
【０１６２】
本発明者らは、傍小脳脚核（ＰＢ）に対するａｄＢＮＳＴ出力は、ＰＢが呼吸を調整する２，１７２６ことから、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスで見られる呼吸数の減少（図１０ｃ）を媒介することができる、と仮定した。実際、ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢマウス（図１０ｉ）において、青色光が呼吸数を減少させた（ｐ＜０．０５；図１０ｋ）。さらに、ａｄＢＮＳＴ−ＰＢ投射を刺激することは、不安環境下における呼吸数増加を減衰させたが（図１５）、ＥＰＭまたはＲＴＰＰにおける行動を変化させなかった（図１０ｊ及び１０ｌ）。ａｄＢＮＳＴ及びｏｖＢＮＳＴの両方がＰＢに投射するが、ｏｖＢＮＳＴ活動は呼吸数を増加させるので、ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢマウスの呼吸数減少はａｄＢＮＳＴ−ＰＢ線維により引き起こされたと思われる（図４ｅ、図９）。最後に、本発明者らは、腹側被蓋野（ＶＴＡ）に対するａｄＢＮＳＴ出力を調べた。驚くべきことに、ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡマウス（図１０ｍ）は、刺激されたチェンバーでのＲＴＰＰを示し（ｐ＜０．００１；図１０ｐ）、不安関連リスク回避（図１０ｎ）または呼吸数（図１０ｏ）に影響はみられなかった。異なるａｄＢＮＳＴ投射の相補的役割を示しているこれらのデータは、ａｄＢＮＳＴニューロンの複数の集団が、不安緩解の異なる特徴を調整する異なる下流構造（ＬＨ、ＰＢ及びＶＴＡ；図１６）に投射するモデルを支持する。
【０１６３】
図９ａ〜ｄ。ｏｖＢＮＳＴの光遺伝学的刺激は、不安関連行動を増加させる。図９（ａ）６〜８週齢Ｄｒｄ１ａ−Ｃｒｅマウスは、ｏｖＢＮＳＴに、０．５μｌのＡＡＶ５：ＥＦ１α：：ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ（ＣｈＲ２：ｏｖＢＮＳＴ；ｎ＝７）またはＡＡＶ５：ＥＦ：：ＤＩＯ−ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ：ｏｖＢＮＳＴ；ｎ＝７）の片側注入を受け、ｏｖＢＮＳＴの真上に光ファイバが埋め込まれた。行動アッセイを、注入の４週間後に実行した。（ｂ）マウスに、５分間の光オフ／オン／オフのエポック３回からなる１５分間セッションにわたって、高架式十字迷路を走らせた。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ細胞体群でのオンエポック（５ｍｓパルス幅、１０Ｈｚ）中の青色光刺激送達は、ｅＹＦＰ対照と比べて、オープンアーム滞在時間及びオープンアーム進入確率（挿入図）を減少させた（Ｆ２，２４＝６．２０８、ｐ＜０．０５；挿入：Ｆ２，２４＝４．０７８、ｐ＜０．０５）。（ｃ）１週間後、マウスに、５分間の光オフ／オン／オフ／オンのエポックからなる２０分間セッションにわたって、オープンフィールドを走らせた。青色光刺激は、ｅＹＦＰと比較して光オンエポックの間、ＯＦＴでの中心滞在時間を減少させた（左、Ｆ３、３６＝２．３１１、ｐ＝０．９２７；右、Ｆ１、１２＝６．２０６、ｐ＜０．０５）。（ｄ）１週間後、呼吸数を、６分間、同一マウスから測定し、光刺激を最後の３分間与えた。光刺激は、呼吸数（ｐ＜０．００１、ウィルコクソン符号順位検定）を増加させた。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊、＊＊、及び＊＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０５、０．０１、及び０．００１を示す。
【０１６４】
図１０ａ〜ｐ。異なったａｄＢＮＳＴ出力は、不安緩解に関連した異なる特徴を調整する。（ａ〜ｄ）ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスをＢＬＡで形質導入し、片側性光ファイバをａｄＢＮＳＴマウスのＢＬＡ線維の上方に埋め込んだ。（ａ）ａｄＢＮＳＴに対する光は、ＥＰＭのオープンアーム滞在時間を増加させ（ｎ＝１１  ＣｈＲ２、ｎ＝１２  ｅＹＦＰ）（ｂ）呼吸数を減少させたが（ｎ＝７  ＣｈＲ２、ｎ＝８  ｅＹＦＰ）（ｃ）、場所嗜好を引き出さなかった（ｎ＝８  ＣｈＲ２、ｎ＝６  ｅＹＦＰ）（ｄ）。（ｅ〜ｈ）ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨマウスをＢＮＳＴで形質導入し、片側性光ファイバをＬＨの上方に埋め込んだ（ｅ）。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨマウスでは、光は、ＥＰＭでのオープンアーム滞在時間を増加させたが（ｎ＝１１  ＣｈＲ２、ｎ＝８  ｅＹＦＰ）（ｆ）、呼吸数（ｎ＝９  ＣｈＲ２、ｎ＝１０  ｅＹＦＰ）（ｇ）または場所嗜好（ｎ＝７  ＣｈＲ２、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）（ｈ）に影響を及ぼさなかった。（ｉ〜ｌ）ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢマウスをＢＮＳＴで形質導入し、片側性光ファイバをＰＢに埋め込んだ（ｉ）。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢマウスの光は、ＥＰＭに影響しないが（ｎ＝７  ＣｈＲ２、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）（ｊ）、呼吸数を減少させた（ｎ＝８  ＣｈＲ２、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）（ｋ）。場所嗜好には何ら効果は見られなかった（ｎ＝７  ＣｈＲ２、ｎ＝５  ｅＹＦＰ）（ｌ）。（ｍ〜ｐ）ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡマウスをＢＮＳＴで形質導入し、片側性光ファイバをＶＴＡの真上に埋め込んだ（ｍ）。光は、ＥＰＭ（ｎ＝７  ＣｈＲ２、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）（ｎ）または呼吸数（ｎ＝８  ＣｈＲ２、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）（ｏ）に影響を及ぼさなかったが、ロバストな場所嗜好を誘導した（ｎ＝８  ＣｈＲ２、ｎ＝７  ｅＹＦＰ）（ｐ）。スケール：２００ｐｍ。平均±ｓ．ｅ．ｍ．；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；'＝ｐ＜０．００１。
【０１６５】
統計。図１０ｂ。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１１、ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１２。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，４２＝５．５８、ｐ＜０．０１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図１０ｃ。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝８。ｐ＜０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｄ。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝６。ｐ＞０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｆ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝１１、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，３４＝８．５１、ｐ＝０．００１０。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．００１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図１０ｇ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝９。ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝１０。ｐ＞０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｈ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝７。ｐ＞０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｊ。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。図１０ｋ。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７。ｐ＜０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｌ。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝５。ｐ＞０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｍ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝７。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。図１０ｏ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝７。Ｐ＞０．０５。ウィルコクソン順位和検定。図１０ｐ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝７。Ｐ＜０．００１。ウィルコクソン順位和検定。
【０１６６】
図１１。ＰＢまたはＶＴＡではなくＬＤＨへのａｄＢＮＳＴ投射の刺激は、不安を緩解する。
【０１６７】
ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスでの青色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ａ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｂ）とを増加させた。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨマウスでの青色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ｃ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｄ）とを増加させた。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢマウスでの青色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ｅ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｆ）とを増加させた。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡマウスでの青色光は、ＯＦＴでの中心滞在時間（ｇ）とＥＰＭでのオープンアーム進入確率（ｈ）とに効果を示さなかった。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊、＊＊、及び＊＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０５、０．０１、及び０．００１を示す。以下に統計的分析。この図面のデータは、図１０に示される同一コホートからの、さらなる行動結果である。
【０１６８】
統計。図１１ａ。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１１、ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１１。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ３，６０＝２．８９、ｐ＜０．０５。２つの群は、第１の光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。（挿入図）二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ１，２０＝９．７２、ｐ＜０．０１。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０５、ポストホックボンフェローニｔ検定。図１１ｂ。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１１、ｅＹＦＰ：ＢＬＡａｄＢＮＳＴ群についてｎ＝１１。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，４２＝４．２１、ｐ＜０．０５。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．０１、ポストホックボンフェローニｔ検定．図１１ｃ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝１１、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴＬＨ群についてｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった。（挿入図）しかし、光オフ及び光オンエポックを平均化させた場合、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ１，１７＝５．５９、ｐ＜０．０５。２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．００１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図１１ｄ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＬＨ群についてｎ＝１１、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴＬＨ群についてｎ＝８。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出した：Ｆ２，３４＝４．４１、ｐ＜０．０５．２つの群は、光オンエポックで有意差を示した：ｐ＜０．００１、ポストホックボンフェローニｔ検定。図１１ｅ。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。（挿入図）二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。図１１ｆ。ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢ群についてｎ＝７、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。図１１ｇ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝７。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。（挿入図）二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。図１１ｈ。ＣｈＲ２：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝８、ｅＹＦＰ：ａｄＢＮＳＴ−ＶＴＡ群についてｎ＝７。二元配置反復測定ＡＮＯＶＡは、群×光エポックの有意な相互作用を検出しなかった：ｐ＞０．０５。
【０１６９】
図１２。ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射の光遺伝学的刺激は、ＥＰＭに供した最初の５分間において、ＥＰＭにおける不安関連行動を減少させる。ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴの光遺伝学的刺激がより一般的に用いられる５分高架式十字迷路試験で不安様行動を減少させることを示すために、群飼育ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスの別のコホートを作成した。６〜８週齢マウスは、ＢＬＡに、０．５μｌのＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ（ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ；ｎ＝８）またはＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ；ｎ＝６）の片側注入を受け、ＢＮＳＴの真上に光ファイバが埋め込まれた。行動アッセイを、注入の８週間後に実行した。マウスに、５分間の光オン／オフのエポックからなる１０分間セッションにわたって、高架式十字迷路を走らせた。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ群でのオンエポック（５ｍｓパルス幅、１０Ｈｚ）中の青色光刺激送達は、ｅＹＦＰ対照と比べて、オープンアーム滞在時間を減少させた（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ、Ｆ１，１２＝８．３４７、ｐ＜０．０５；ポストホックボンフェローニｔ検定、光オンエポックでｐ＜０．０５）。不安緩解効果が最初の５分間（オンエポック）に存在することに注目。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１７０】
図１３。大脳前交連（ａｃａ）でＢＬＡ線維を刺激することは、不安関連行動に影響を及ぼさない。（ａ）６〜８週齢マウスは、ＢＬＡに、０．５μｌのＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ（ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｃａ；ｎ＝５）またはＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ：ＢＬＡ−ａｃａ；ｎ＝５）の片側注入を受け、ＢＮＳＴの真上に光ファイバが埋め込まれた。行動実験を注入の８週間後に実施した。共焦点像は、大脳前交連を通過しているＢＬＡ線維におけるＣｈＲ２−ｅＹＦＰのロバスト発現を示す。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｃａ群（ｎ＝５）での青色光刺激（５ｍｓパルス幅、１０Ｈｚ）は、光オンエポックの間、高架式十字迷路試験（５分間オフ／オン／オフエポックに分かれた１５分間セッション）でのオープンアーム滞在時間及びオープンアーム進入確率（ｂ）、中心滞在時間（ｃ）、及びオープンフィールド試験（５分間オフ／オン／オフ／オンエポックからなる２０分セッション）での歩行運動（ｄ）に影響しなかった。すべて、ｐ＞０．０５、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１７１】
図１４。ＬＨに投射するａｄＢＮＳＴニューロンは、ＢＬＡ軸索末端によって神経支配される。（ａ）３匹の６週齢マウスのＬＨに、ＥＦ１αプロモーターのもとでＧＦＰをコードする、逆行性増殖ウイルスである単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（ＨＳＶ：ＥＦ１α：：ＧＦＰ）を０．５μｌ注入した。注入の５日後にマウスを灌流し、ＢＮＳＴを含む４０μｍの冠状切片を共焦点顕微鏡法用に調製した。ＧＦＰ陽性の逆行性標識ニューロンを、すべてのマウスにおいて、ｏｖＢＮＳＴではなく、ａｂＢＮＳＴのみで、観察した。典型的な共焦点像は、１２μｍの切片のｚｍａｘ投射を示す。スケールバー、２００μｍ。（ｂ）３匹の６週齢マウスに対して、ＬＨに０．５μｌのＨＳＶ：ＥＦ１α：：ＧＦＰを注入し、ＢＬＡに０．５μｌのＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを注入した。注入の３〜５日後に、ＢＮＳＴを含む急性切片を切片パッチクランプ記録用に調製した。（ｃ）ａｄＢＮＳＴにおけるＧＦＰ発現ニューロンを、ＢＮＳＴのＢＬＡ終末を光刺激している間に記録した。ＧＦＰ（＋）ａｄＢＮＳＴニューロン（Ｖｍ＝約−６０ｍＶ）から得た典型的な電流クランプトレースを下部に示す。（ｄ）電流クランプモードでほとんどのニューロンが静止電位で興奮した（８／９本のニューロン）。驚くべきことに、個々の標識ニューロンが光誘発応答を示した（ｎ＝９本のａｄＢＮＳＴニューロン）。
【０１７２】
図１５。不安を惹起する環境での呼吸数の増加は、ＢＮＳＴ−ＰＢ投射を刺激することによって減衰させられる。１０週齢マウスは、ＢＮＳＴに、０．５μｌのＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰ（ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢ；ｎ＝７）またはＡＡＶ５：ｈＳｙｎ：：ｅＹＦＰ（ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢ；ｎ＝５）の片側注入を受け、ＰＢの真上に光ファイバが埋め込まれた。実験は、注入の１６週間後に開始した。マウスを３日間、手で触れ、呼吸数測定のために用いられるカラークリップに順化させた。呼吸数はまず、ホームケージまたはオープンフィールドで３分間記録した。マウスを５分間、新しくきれいなケージで休ませ、その後、もう一方の環境で３分間、記録した。青色レーザー刺激（５ｍｓパルス幅、１０Ｈｚ）をオープンフィールドに送達した。記録環境の順序は、動物全体で釣り合うようにした。ｅＹＦＰ：ＢＮＳＴ−ＰＢマウスでの光刺激と対になったオープンフィールドに動物を配置することによって、ホームケージで測定した値と比べて、呼吸数が有意に増加した。この増加は、ＣｈＲ２：ＢＮＳＴ−ＰＢマウスで有意に減衰し（ｐ＜０．０１、ウィルコクソン順位和検定）、ＢＮＳＴ−ＰＢ投射を刺激することが不安惹起刺激によって誘発された呼吸数の増加を減少させるのに十分であることを示した。
【０１７３】
図１６。ＬＨ、ＰＢ、及びＶＴＡに投射するａｄＢＮＳＴニューロンの部分集団。（ａ〜ｂ）ＬＨ、ＰＢ、及びＶＴＡに投射するＢＮＳＴニューロンの部分集団の間の重なりの程度を検討するために、ｅＧＦＰ（ＲＶ：ｅＧＦＰ）及びｔｄＴｏｍａｔｏ（ＲＶ：ｔｄＴｏｍａｔｏ）をコードしている狂犬病ウイルス０．５μｌを６週齢マウスの示された領域に注入した。注入の４日後にマウスを灌流し、４０μｍの冠状切片を共焦点顕微鏡法用に調製した。（ａ）％標識ａｄＢＮＳＴニューロンの概要プロット。ＲＶ−ｅＧＦＰ及びＲＶ−ｔｄＴｏｍａｔｏウイルスの混合物をＶＴＡに注入することで、手綱（Ｈｂ）において８．３％二重標識ニューロンを生じた。しかし、ＲＶ：ｅＧＦＰ及びＲＶ：ｔｄＴｏｍａｔｏをＬＨ、ＰＢ、またはＶＴＡのいずれか２つに注入することで同時標識されたＢＮＳＴニューロンは、非常に少なかった（ＰＢ／ＬＨは１．７％、ＶＴＡ／ＬＨは０．５％、ＶＴＡ／ＰＢは０．０％）。すべての群は、陽性対照ＶＴＡ−ＶＴＡ群よりも同時標識された細胞の割合が有意に小さいことを示した（Ｐ＜０．０００１）。このことは、ＬＨ、ＰＢ、及びＶＴＡに投射するａｄＢＮＳＴニューロンの部分集団が完全に重複していることを示唆している。数字は、細胞数を示す。（ｂ）示された領域での蛍光体発現を示している典型的な像（緑色：ｅＧＦＰ、赤色：ｔｄＴｏｍａｔｏ、黄色：二重標識）。（１）単一平面；（２〜４）２０μｍ切片のｚ最大投射。スケールバー、１００μｍ。これらの同じ狂犬病ウイルス調製物によってニューロンが２度感染し得ることを示している別の正の対照が、Ｌａｍｍｅｌ等のＮａｔｕｒｅ，  ２０１２  Ｎｏｖ  ８；４９１（７４２３）：２１２〜７（２０１２）に見出されることに留意されたい。以下に統計的分析。
【０１７４】
図１６。統計：カイ２乗検定は、（１）（２）（Ｘ２（１，ｎ＝３４７）＝１９．１３２，ｐ＜０．０００１），（１）−（３）（Ｘ２（１，ｎ＝３７６）＝２９．５６７，ｐ＜０．０００１）と（１）（４）（Ｘ２（１，ｎ＝２１５）＝１７．２８７，ｐ＜０．０００１）との間に、有意差を検出した。
【０１７５】
本発明者らは、ａｄＢＮＳＴの内因性マイクロ回路を次に調査した。ＢＬＡとａｄＢＮＳＴとの間の連結度を検討するために、ＢＬＡでＣｈＲ２を発現するマウスに対して、光ファイバを囲んでいる複数のステレオトロードを含むマイクロドライブをａｄＢＮＳＴに移植し（図１７ａ、図１８）、覚醒動物における同時興奮及び記録を可能にした。予想されるように、グルタミン酸作動性ＢＬＡ終末の興奮はａｄＢＮＳＴ単一ユニット（図１７ｂ及び１７ｃ）のスパイキングを増加させた。急性切片からの対応するホールセルパッチ記録は、電圧クランプ（方法；図１９）において誘発ＥＰＳＣ及びＩＰＳＣの両方を示しているａｄＢＮＳＴニューロンの８４％が電流クランプ（図１７ｄ〜ｆ）におけるＢＬＡ入力刺激に応答して正味の興奮を示したことを、示した。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気生理学は、ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射の刺激が、局所ａｄＢＮＳＴ反回性興奮によって高められ得るａｄＢＮＳＴ活動を増加させることを示すのと一致していた（図１９及び２０）。本発明者らはまた、ｏｖＢＮＳＴ入力を光学的に刺激しながらａｄＢＮＳＴニューロンから記録することによって、ａｄＢＮＳＴへの局所入力を特徴づけした（図１７ｇ）。興味深いことに、ニューロンの７９％が正味の抑制を示し（図１７ｈ及び１７ｉ）、これは、ｏｖＢＮＳＴニューロンがほとんどＧＡＢＡ作動性であるという事実と一貫する。対照的に、逆行性追跡実験は、ａｄＢＮＳＴがｏｖＢＮＳＴにごく弱くしか投射しないこと（図２１）を示した。同時に、これらのデータは、ｏｖＢＮＳＴとａｄＢＮＳＴが不安の調整において正反対の役割を示すという結論を支持する。
【０１７６】
図１７ａ〜ｉ。ａｄＢＮＳＴ求心路のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ電気生理学的評価。（ａ〜ｆ）ａｄＢＮＳＴに対するＢＬＡ求心路の評価。（ａ）ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスのａｄＢＮＳＴに８本のステレオトロードと１本の光ファイバとを含むマイクロドライブを、ａｄＢＮＳＴニューロンの同時光遺伝学的刺激／記録を行うべく、埋め込んだ。（ｂ）５ｍｓ光パルス（上側）と、２０ｓの１０Ｈｚ光パルス列（下側）とに対する典型的な応答を示す、行動中のマウス内のａｄＢＮＳＴ単一ユニットの典型的なＰＳＴＨ。興奮は、最も一般的に観察された（ｎ＝５５）。（ｄ）ＣｈＲ２は、ＢＬＡで発現した。急性切片をＢＮＳＴから調製し、ＢＮＳＴニューロンを電流クランプで記録する一方、光学的にＢＬＡ求心路を刺激した。（ｅ）興奮（上側）と抑制（下側）とを示す、ａｄＢＮＳＴニューロン（Ｖｍ＝−−６０ｍＶ）からの典型的なトレース。（ｆ）ＥＰＳＣ及びＩＰＳＣの両方を示すａｄＢＮＳＴニューロンの中でも、ほとんどが静止電位で興奮した（ｎ＝１６／１９  ニューロン；電圧クランプについては図１９を参照）。（ｇ〜ｉ）ｏｖＢＮＳＴからａｄＢＮＳＴへの電気生理学的に評価された機能的接続性（図２１）は、逆方向において最小限の接続性を示す。（ｇ）ＣｈＲ２は、Ｄｒｄ１ａ−Ｃｒｅ系マウスを用いてｏｖＢＮＳＴで発現された。ｏｖＢＮＳＴ線維を刺激しながらａｄＢＮＳＴニューロンを記録した。（ｈ）興奮（上側）及び抑制（下側）の応答を示すａｄＢＮＳＴニューロン（Ｖｍ＝−−６０ｍＶ）からの典型的な電流クランプトレース。（ｉ）ＥＰＳＣとＩＰＳＣとを示したａｄＢＮＳＴニューロンの中で、ほとんどが静止電圧で抑制された（ｎ＝１１／１４  ニューロン）。平均±ｓ．ｅ．ｍ．；統計。図３ｃ。ｎ＝５５  ａｄＢＮＳＴ単一ユニット。図３ｆ。ｎ＝１９  ａｄＢＮＳＴニューロン。図１７ｌ。ｎ＝１４  ａｄＢＮＳＴニューロン。
【０１７７】
図１８。ステレオトロードを介した単一ユニットの分離。マウスに、８本のタングステンステレオトロードを含むマイクロドライブを埋め込んだ。（ａ）同一ステレオトロードによって同時に記録された２つのａｄＢＮＳＴ単一ユニットからのスパイクの例。（ｂ）電極２上のピークに対する電極１上のピークの散布図。十分に分離されたクラスターからのこれら２つの単一ユニットのスパイク。ＳｐｉｋｅＳｏｒｔ３Ｄソフトウェア（Ｎｅｕｒａｌｙｎｘ）を用いて、オフラインでスパイクをソートした。
【０１７８】
図１９。ａｄＢＮＳＴのフィードフォワード抑制性及び興奮性の回路のエビデンス。ＢＬＡとＢＮＳＴとの連結度を検討するために、（ａ）８匹の４週齢マウスのＢＬＡに０．５μｌのＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを注入した。注入の４週間後に、ＢＮＳＴ及びＢＬＡ軸索線維を含む急性切片を切片パッチクランプ記録用に調製した。関連した電流クランプ及びｉｎ  ｖｉｖｏ記録実験については図３を参照。（ｂ）ａｄＢＮＳＴニューロンからの典型的な電圧クランプトレースを０ｍＶ（上側）と−７０ｍＶ（下側）とに保持し、１０Ｈｚ、５ｍｓ青色光パルスに応答したＩＰＳＣとＥＰＳＣとが示された。（ｃ）ほとんどの光応答性ニューロンは、ＥＰＳＣ及びＩＰＳＣの両方を示した（ｎ＝４８  ａｄＢＮＳＴニューロン）。これらのＩＰＳＣは、おそらく単シナプス性ではなく、局所的ａｄＢＮＳＴニューロンによって間接的に駆動される。理由は以下である：（１）本発明者らは、光遺伝学的に興奮性投射を刺激した、（２）ＥＰＳＣの潜時がＩＰＳＣよりも短かった（ｐ＜０．００１；以下の（ｄ）を参照）、ならびに、（３）興奮性グルタメート受容体アンタゴニストであるＮＢＱＸ（２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン）及びＡＰＶ（（２Ｒ）−アミノ−５−ホスホノペンタノエート）の浴適用がＥＰＳＣ及びＩＰＳＣの両方を阻害し、一方、ＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるピクロトキシンの浴適用がＩＰＳＣのみを阻害した（以下の（ｅ，ｆ）を参照）。（ｄ）ＥＰＳＣの開始潜時は、ＩＰＳＣよりも短かった（ＥＰＳＣについてｎ＝１４、ＩＰＳＣについてｎ＝１６、ｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定）。（ｅ）１０μＭ  ＮＢＱＸ及び５０μＭ  ＡＰＶの浴適用は、ＩＰＳＣ及びＥＰＳＣの両方を無効にした（ｎ＝４）（上側）。一方、（ｆ）１００μＭピクロトキシンはＩＰＳＣを阻害したがＥＰＳＣを阻害しなかった（ｎ＝４）（下側）。ａｄＢＮＳＴニューロンからの典型的な電圧クランプトレースを−７０ｍＶに保持したところ、５ｍｓ青色光パルスに応答した単一のピーク（ｇ）または二重のピーク（ｈ）が示された。（ｉ）ＥＰＳＣを示したａｄＢＮＳＴニューロンで観察された応答の概要（ｎ＝３１）。４匹の６週齢マウスのＢＬＡに０．５μｌのＡＡＶ５：ＣａＭＫＩＩα：：ＣｈＲ２−ｅＹＦＰを注入し、ａｄＢＮＳＴニューロンの同時光遺伝学的刺激／記録を行うべく、８本のステレオトロード及び１本の光ファイバを含む駆動可能なマイクロドライブをａｄＢＮＳＴに植え込んだ。ａｄＢＮＳＴ単一ユニット記録の典型的なＰＳＴＨは、５ｍｓレーザーパルスにロックされた活動時間の増加（ｊ）またはレーザーパルスの終了後でさえも活動が持続されていること（ｋ）を示した。（ｌ）青色光に対する興奮性応答を示したａｄＢＮＳＴ単一ユニットの概要（ｎ＝２０）。図３の結果とともに、これらのデータは、ａｄＢＮＳＴニューロンが直接的な興奮性入力と間接的な阻害性入力との両方をＢＬＡから受け取るが、ほとんどの一般的な正味の応答は興奮である。
【０１７９】
図２０。反回性興奮は、ＢＮＳＴ下流投射の協調的漸増を可能にし得る。（ａ〜ｃ）図３ａ〜ｃと同じ実験。ａｄＢＮＳＴに光ファイバ／ステレオトロードのアレイが埋め込まれたＣｈＲ２：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスは、３０秒間にわたり１０Ｈｚ光パルス列（５ｍｓパルス幅）を受けた（下側）。ａｄＢＮＳＴ投射ニューロンの別個の集団の漸増は、ａｄＢＮＳＴにおける反回性興奮を伴うことができ、これはｉｎ  ｖｉｖｏマルチユニット記録でのそれらの知見と整合した。すなわち、ＢＬＡ線維刺激後の記録の２８％で、持続性の活動が見られた。レーザーパルス列にロックされた活動時間の増加を示すａｄＢＮＳＴマルチユニット記録の典型的なＰＳＴＨが示される。（ａ）ではなく（ｂ）での例は、レーザー刺激の後でさえも持続性の活動を示す。（ｃ）ａｄＢＮＳＴマルチユニット記録の概要（ｎ＝１０３）。（ｄ）減少したＢＮＳＴ切片での持続性活動について試験するために、本発明者らはＣａ２＋イメージングを実行し、１回の短時間０．２ｍｓ刺激後にａｄＢＮＳＴ切片での持続活動が検出された。ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎＢＡＰＴＡ−１（ＯＧＢ−１）注入ａｄＢＮＳＴニューロン（画像）を電気刺激の電流レベルの変化に応じてモニターした。（ｅ）電極から１００μｍ上のニューロンの遅発性活性化を含む、０．２ｍｓ電気刺激により誘導された持続性活動を示す細胞の典型的なトレース。色分けされた細胞の各々の位置を（ｄ）に示す。縦線は、電気刺激の時間を示す。（ｆ）電気刺激の大きさを上げることで、活性化した細胞の割合が増加し、１００μＭ  ＡＰＶ単独または１０μＭ  ＮＢＱＸと１００μＭ  ＡＰＶいずれかの浴適用の後では、４０％を上回って減少した。（ヒストグラムビンサイズ：２３４ｍｓ＝１フレーム）。（ｇ）ニューロンの活性化の持続時間は、持続性の活動の漸増を示している電気刺激の大きさを増加させることによって高められた。興味深いことに、活性化ニューロンの割合がＮＢＱＸとＡＰＶの適用後に減少する一方で、活性化ニューロンの活性化の持続時間は対照条件（５０μＡ）と類似しており、ＡＰＶ及びＮＢＱＸ条件での興奮性伝達の減少が持続性の活動を完全には妨げなかったことを示唆した。（ｈ）電極先端からの細胞の距離に対して、５０μＡ刺激によって誘発される活動の開始の散布図。異なる刺激強度に関する回帰線を示し、距離を超えた活動開始の伝播が示されている（３０、４０、及び５０μＡ刺激条件について、Ｐ＜０．００１）。（ｉ）電気刺激後の活性化細胞の平均ΔＦ／Ｆ。電気刺激によって活性化された、後刺激期間（％ΔＦ／Ｆ）にわたって平均化された細胞の活動は、刺激強度が増すにつれて増加する傾向を示す。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。＊及び＊＊＊は、それぞれ、ｐ＜０．０５及び＜０．００１を示す。統計的分析を以下に示す。
【０１８０】
（表３）図２０の統計。図２０ｆ〜ｉ。各々の条件のｎを以下の表に挙げる。
0006594854.tif 000022
【０１８１】
図２０ｆ。カイ２乗検定は、０μＡ〜５０μＡ（Ｘ２（１，ｎ＝２２０）＝４９．２６、ｐ＜０．０００１）、５０μＡ−ＡＰＶ（Ｘ２（１，ｎ＝２７７）＝３７．３１、ｐ＜０．０００１）、及び５０μＡ−ＮＢＱＸ＋ＡＰＶ（Ｘ２（１，ｎ＝２７９）＝４１．３２、ｐ＜０．０００１）の間に有意差を検出した。図２０ｇ。一方向ＡＮＯＶＡは、刺激条件の有意な主効果を検出した。すなわち、Ｆ７，７９２＝８．５１２、ｐ＜０．００１。Ｔｕｋｅｙのポストホックテストは、０μＡ〜５０μＡ（ｐ＝０．００１）、１０μＡ〜３０μＡ（ｐ＝０．０１９）、１０μＡ〜４０μＡ（ｐ＝０．００１）、１０μＡ〜５０μＡ（ｐ＜０．００１）、１０μＡ−ＡＰＶ（ｐ＝０．００１）、１０μＡ−ＮＢＱＸ＋ＡＰＶ（ｐ＝０．００３）、２０μＡ〜５０μＡ（ｐ＜０．００１）、及び３０μＡ〜５０μＡ（ｐ＝０．０２２）の間に、有意差があることを明らかにした。図２０ｈ。ｎ＝１３７  ａｄＢＮＳＴニューロン。スピアマンのρ及びｐの値：
【０１８２】
（表４）
0006594854.tif 000023
【０１８３】
図２０ｉ。一方向ＡＮＯＶＡ検出は、刺激条件の有意な主効果を検出した。すなわち、Ｆ７，７９２＝２．２２２、ｐ＝０．０３１。Ｔｕｋｅｙのポストホックテストは、条件間の有意差を検出できなかった。
【０１８４】
図２１。ａｄＢＮＳＴは、ｏｖＢＮＳＴに対して弱く投射する。（ａ）ｏｖＢＮＳＴとａｄＢＮＳＴとの間の連結度を検討するために、糖タンパク質をエンハンスト緑色蛍光タンパク質で置換した狂犬病ウイルス（ＲＶ−ｅＧＦＰ）をｏｖＢＮＳＴに注入した。（ｂ）局所ｏｖＢＮＳＴニューロンでのｅＧＦＰ発現を示す典型的な蛍光像。ａｄＢＮＳＴでのｅＧＦＰ発現ニューロンの欠乏に注目されたい。これは、ａｄＢＮＳＴからｏｖＢＮＳＴへの投射が弱いことを示している。（ｃ）扁桃体のＣｅＡでのｅＧＦＰ発現が制限されていることを示す蛍光像。ＣｅＡがｏｖＢＮＳＴ及びａｄＢＮＳＴに投射する一方で、ＢＬＡはｏｖＢＮＳＴに投射せずにａｄＢＮＳＴにのみ投射することから、この結果は、ｏｖＢＮＳＴへのＲＶ−ｅＧＦＰ注入がａｄＢＮＳＴまで広がらなかったことを示す。すべてのスケールバーは、２００μｍである。すべての像は、２０μｍ切片のｚ最大投射である。
【０１８５】
次に、本発明者らは、自由運動マウスのａｄＢＮＳＴニューロンの本来の発火頻度が環境的安全性の態様をコードしていたかどうかを、探索中のａｄＢＮＳＴにおけるステレオトロードアレイによる記録活動によって、検討した（図２２ａ及び２２ｂ）。実際、２つのパラダイム（ＥＰＭのクローズドアームと明暗試験ボックスの暗いコンパートメント、図２３）でのより安全な位置で、より大きなａｄＢＮＳＴマルチユニット活動が観察された。ＥＰＭでクローズドアームとオープンアームとの間で異なるａｄＢＮＳＴ単一ユニットの範囲を定量化するために、本発明者らはＥＰＭスコアを定義した（方法；図２４を参照）、ここでは、正のスコアは、発火頻度が同一種類のアーム（例えば、一対のクローズドアーム）間では類似しているが、オープンアームとクローズドアームとの間では異なることを示している（例えば、図２２ｃ）。この測定基準は、光オン及び光オフエポックの両方で各々の単一ユニットについての特定のＥＰＭパフォーマンス関連活動の計算を可能とした。照射なしでは、複数のａｄＢＮＳＴ単一ユニットからなるサブセットがＥＰＭのクローズドアームで優先的に発火し、一方、他のユニットは優先性を示さなかった（図２２ｃ）。実際、正のＥＰＭスコアを有する全てのａｄＢＮＳＴ単一ユニット（ユニットの６６％）は、オープンアームよりもクローズドアームでより高い発火頻度を有した。一方、シミュレーションでは、環境条件に対する依存性がないとすれば、細胞のうち３３％しか正のＥＰＭスコアを有さず、それらはクローズドアームを好むユニットとオープンアームを好むユニットとに等しく分かれると、予想される（方法）。
【０１８６】
本発明者らは、次に、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスのａｄＢＮＳＴにステレオトロードと光ファイバとを埋め込み（図２２ａ）、記録とａｄＢＮＳＴへの黄色光送達とを同時に行うことを可能にした。これらのマウスにおける照射は、ａｄＢＮＳＴでのマルチユニット活動を減らした（図２２ｄ；図２５）。最後に、本発明者らは、ＢＬＡ求心路の抑制の存在または非存在下での各単一ユニットのＥＰＭスコアの計算を可能にするため、１分間の光オフエポック及び光オンエポックを交互にしながら（図２２ｅ）、２０分間にわたるＥＰＭ試験中、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスのａｄＢＮＳＴ単一ユニットから記録した。ａｄＢＮＳＴにおける不安関連の特徴が表出することはＢＬＡ入力に依存すると示唆されることから、本発明者らは、ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射の光遺伝学的抑制が単一ユニットＥＰＭスコアを減少させたことを観察した（ｐ＜０．０１；図２２ｆ及び２２ｇ）。また、ＥＰＭスコアの減少は、照射エポック中に発火頻度が低下した細胞ではより高かった（図２６）。これらのデータは、ａｄＢＮＳＴにおけるＥＰＭ環境の生来の不安関連エンコーディングが部分的にＢＬＡ入力に依存することを示しており；この同じ操作（ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴを抑制する）が、オープンアームへの移行を阻止した全体的な不安の増加を引き起こすことに整合した様式で、不安様のＥＰＭ行動を増加させたことに留意されたい（図４ｇ）。
【０１８７】
ここで、本発明者らは、不安行動状態の構築及び変調におけるＢＮＳＴ回路要素の役割をマッピングした。本発明者らは、ｏｖＢＮＳＴ及びａｄＢＮＳＴが不安関連行動をそれぞれ増加及び減少させることを示した。ｏｖＢＮＳＴは、ａｄＢＮＳＴを抑制することによって（概要図としての図２７を参照）、または、扁桃体中心核などの構造に対して直接投射することを介して、不安を促進することができた。次に、本発明者らは、異なったａｄＢＮＳＴ投射が、不安緩解に関連した行動状態の異なる特徴、すなわち、ａｄＢＮＳＴからＰＢ、ＶＴＡ、及びＬＨへの投射によってそれぞれが媒介される、呼吸数減少、正の条件付け誘発性、およびリスク回避行動減少を調整するという、知見を得た。この機構は、発達及び経験を超える状態自体のモジュール式適合化を容易にすることが可能であり、原則として、発散する投射の強さを調整することによって、異なる特徴を個別に調整し、その一方で行動状態の上流での協調を保つと思われる。さらなる研究は、協調が最終的にどのようにして起こるかとともに、これらの経路の機能的分化が生ずる回路機構を決定するために必要とされる。ａｄＢＮＳＴ投射ニューロンの別個の集団の協調的漸増は、反回性興奮を含むことができた（図１９及び２０）。実際、ＢＬＡ線維刺激終了後の記録の２８％で持続性の活動が見られたので、ｉｎ  ｖｉｖｏでのマルチユニット記録は、ａｄＢＮＳＴでの反回性興奮の存在を支持している（図２０ａ〜ｃ）。また、急性ＢＮＳＴ切片でのＣａ２＋イメージングにより、１回の短い刺激の後のａｄＢＮＳＴでの持続的活動が明らかになった（図２０ｄ〜ｉ）。
【０１８８】
図２２ａ〜ｇ。ＢＮＳＴニューロンは、安全位置と不安惹起位置とを識別するために部分的にＢＬＡ入力に依存する。（ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏ記録構成の概略。（ｂ）ＥＰＭからトレースされる典型的な行動トラック。すべてのＥＰＭ図面に関して、水平／垂直アームはそれぞれクローズド／オープンアームを表す。（ｃ）上側、２つの典型的なａｄＢＮＳＴ単一ユニットの空間発火頻度マップ。一方のユニットは、クローズドアームでより高い活動を示したが（左側）、他方のユニットは嗜好を示さなかった（右側）。正規化された平均発火頻度は、空間位置のピクセルごとに色分けされている。下側、例示ユニットの各アームの正規化された頻度（平均発火頻度からの％変化）。これらの頻度は、ＥＰＭスコアの計算に用いられる（方法及び図２４）。ＥＰＭスコアが高ければ、クローズドアームとオープンアームとの間の差がより大きいことを示している。ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射を抑制する光は、ａｄＢＮＳＴでのマルチユニット活動を適度に抑制した。（ｅ）１分間の光オフエポック及び光オンエポックを交互にして、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスに２０分間、ＥＰＭ内を走らせた。（ｆ）左側、光オフ及び光オン条件でのＥＰＭスコアの散布図。右側、ほとんど（ｎ＝２８／３８）のユニットのＥＰＭスコアを減少させる黄色光に応答して１つの単一ユニット（散布図の赤色の点）のＥＰＭスコアにおける変化を示す、空間発火マップ。（ｇ）単一ユニット（ｎ＝３８）全体の概要データ：−ａｄＢＮＳＴ投射の抑制によるＥＰＭスコアの平均変化。とりわけ、ＥＰＭスコアは、光オンボックスにおいても、ランダムにシミュレートされたスパイクから生ずるＥＰＭスコアよりも有意に高かった（ｐ＜０．０１）。このことは、たとえ光オンであっても、光オフの場合よりもロバスト性が落ちるにも関わらず、ＢＮＳＴユニットはクローズドアームとオープンアームとを区別することができたことを示す。平均±ｓ．ｅ．ｍ．；＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＊＝ｐ＜０．００１。統計。図２２ｆ。ｎ＝３８  ａｄＢＮＳＴ単一ユニット。Ｓｐｅａｒｍａｎのρ値＝０．５７、ｐ＜０．０００１。図２２ｇ。ｎ＝３８  ａｄＢＮＳＴ単一ユニット。光オンエポックのＥＰＭスコアは、光オフエポックのＥＰＭスコアより小さかった：ｐ＜０．０５、ウィルコクソン順位和検定。ジッタスパイクから発生するＥＰＭスコアは、光オンエポック及び光オフエポックでのＥＰＭスコアよりも小さかった。両方ともｐ＜０．００１、ウィルコクソン順位和検定。
【０１８９】
図２３。ａｄＢＮＳＴマルチユニット活動は、不安パラダイムの安全コンパートメントにおいて、より高い。マウスのａｄＢＮＳＴに、ａｄＢＮＳＴマルチユニット活動を可能にするべく、８本のステレオトロードを含むマイクロドライブを埋め込んだ。マウスに、ＥＰＭ（ａ〜ｂ）と明暗ボックス（ｃ〜ｄ）とを走らせた。（ａ）各々のアームからの空間発火頻度マップ（左側）及び正規化された発火頻度（平均頻度との％差）を、１５分間にわたってＥＰＭを探索したマウスのａｄＢＮＳＴにおける典型的なマルチユニット記録について、示した。左側：より暖かい色は、より高い発火頻度に対応する。（ｂ）すべてのマルチユニット記録についてクローズドアーム及びオープンアームでの頻度を示している散布図（４匹のマウスからｎ＝３２  マルチユニット記録）。頻度は、クローズドアームで有意に高かった（ｐ＜１０−５、ウィルコクソン符号順位検定）。留意すべきことは、すべてのマウスのすべてのチャネルからのａｄＢＮＳＴマルチユニット活動は、クローズドアームでより高かったことである。データを、未加工の発火頻度の自然対数変換として、Ｈｚでプロットすることで、視覚化をより容易にした。（ｃ）１５分間にわたって明暗テストの探索を行ったマウスのａｄＢＮＳＴでの典型的なマルチユニット記録の空間的発火頻度マップ。留意すべきことは、明暗テストボックスの暗いコンパートメントで、活動がより高かったことである。左側チェンバーの上側コーナーでの投射は、壁の１つに反射するＬＥＤをトラッキングする位置に起因した。より暖かい色は、より高い発火頻度を表す。（ｄ）明るいコンパートメントからの増加倍率としてプロットされた、暗いコンパートメントでのマルチユニット発火頻度のヒストグラム。留意すべきことは、この分散の平均が１よりも有意に高いことである（平均＝１．１６、ｐ＜０．００５、ウィルコクソン符号順位検定）。
【０１９０】
図２４。ａｄＢＮＳＴ単一ユニットによるクローズドアームとオープンアームとの識別を測定するための、ＥＰＭスコアの計算。同一マウス由来の典型的な２つの単一ユニットを、１５分間ＥＰＭ探索セッションの間に、同時に記録した。（ａ）左側パネル：ＥＰＭにおいてマウスが取る経路を示す行動トラック。中央パネル：クローズドアームとオープンアームとを識別した単一ユニットの空間発火頻度マップ（より高い頻度を暖かい色で示す）。このユニットは、クローズドアームでより活動的であった。右側パネル：ＥＰＭの各下位位置の正規化された発火頻度を示す棒グラフ（平均頻度からの％変化としてプロット）。留意すべきことは、このユニットが両方のクローズドアームでより発火したことである。図の下にある式に従って計算されたこのユニットのＥＰＭスコアは、その空間発火頻度マップの上方に表示されている。ＦＬ、ＦＲ、ＦＵ、ＦＤ、及びＦＣは、それぞれ、ＥＰＭの左アーム、右アーム、上アーム、下アーム、及び中心の正規化された発火頻度（平均頻度からの％変化）を示す。（ｂ）（ａ）と同様であるが、同一のセッションで記録された単一ユニットがＥＰＭにおいてタスク関連活動を示さなかったという点で、異なる。留意すべきことは、異なるアームでは該ユニットは異なる発火をしたにもかかわらず、該ユニットは、一貫して、クローズドアームをオープンアームと区別しなかったので、結果として低いＥＰＭスコアをもたらした（方法を参照）。対照的に、高ＥＰＭスコアは、ユニットが同一種類のアームでは類似の発火頻度を有し、異なる種類のアームでは異なる発火頻度を有することを示している。（ａ）のユニットは、同一種類のアームでは類似の発火頻度を有するが、クローズドアームとオープンアームの頻度とは、互いにかなり異なる。
【０１９１】
図２５。ａｄＢＮＳＴマルチユニット活動は、ＥＰＭ上で安全位置と嫌悪位置とを識別するためのＢＬＡ入力に依存する。（ａ）ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスにおける黄色光オフ及びオンエポックの間のマルチユニット発火頻度の散布図。（ｂ）１分間のレーザーオフエポック及びレーザーオンエポック（図４と同一実験）を交互にして、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスに２０分間、ＥＰＭを走らせた。ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射の抑制は、マルチユニット記録のＥＰＭスコアを減少させた（ｎ＝３２  記録、Ｐ＜０．０５ウィルコクソン符号順位検定）。このことは、単一ユニットデータの場合と一致した。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。（ｃ）ＥＰＭスコア変化の分散を示す散布図。記録のうち２５／３２例は、オフエポックと比較して、光オンエポックでＥＰＭスコアがより小さいことを示した。ＥＰＭスコアは、光オフエポックで有意に高かった（ｐ＜０．０１、ウィルコクソン符号順位検定）。（ｄ）正のＥＰＭスコアを有するマルチユニット記録の数もまた、黄色光で減少した（ｐ＜０．０５、フィッシャーの正確確率検定）。
【０１９２】
図２６。ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射を抑制することにより、クローズドアームの発火頻度とＥＰＭスコアとを減少させる。１分間のレーザーオフエポック及びレーザーオンエポック（図４と同一実験）を交互にして、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴマウスに２０分間、ＥＰＭを走らせた。（ａ）ＢＬＡ−ａｄＢＮＳＴ投射を抑制することは、ａｄＢＮＳＴ単一ユニットの発火頻度を減少させる傾向があった。しかし、この効果は、すべてのニューロンを一緒にプールした場合には統計学的有意に達しなかった（ｐ＜０．６８、ウィルコクソンの検定、マウス４匹からのｎ＝３８  単一ユニット）。（ｂ）しかし、光オンエポックの間に発火頻度の有意な減少を示したａｄＢＮＳＴ単一ユニット（３８単一ユニットのうちｎ＝２０）は、クローズドアームで頻度の有意な減少を示したが（ｐ＜０．０５、ウィルコクソン符号順位検定）、オープンアームでは示さなかった（ｐ＜０．３４、ウィルコクソン符号順位検定）。光誘発性の発火減少の有意性については、各単一ユニットについて、１０回の１分間の光オフエポック及び１０回の１分間の光オンエポック全体の頻度と比較することで、調べた。（ｃ）ＥＰＭスコアの減少は、光オンの間の発火頻度の有意な減少を伴って、ａｄＢＮＳＴ単一ユニットで高かった。（すべての細胞についてｎ＝３８、光オンにおいて発火の減少を伴う細胞についてｎ＝２０、ｐ＜０．０５、ウィルコクソン符号順位検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。
【０１９３】
図２７。概要図。ＢＮＳＴ回路の可能性がある機能的組織を例示する模式図。ｏｖＢＮＳＴはａｄＢＮＳＴを抑制するが、ａｄＢＮＳＴは弱い投射だけをｏｖＢＮＳＴに送る。ａｄＢＮＳＴは、ＬＨ、ＰＢ、及びＶＴＡに投射する。これらの投射の各々は、不安発露の別個の態様を減少させる。これらの部分集団の協調的漸増は、ａｄＢＮＳＴの反復性回路によって実現可能である。ＢＬＡ入力は、特定の状況下ではＶＴＡへではなくＬＨ及びＰＢへのＢＮＳＴ出力ニューロンを漸増する。ｏｖＢＮＳＴは、ａｄＢＮＳＴを抑制することによって、あるいは、扁桃体中心核（ＣｅＡ）、無名質（ＳＩ）、ＰＢ、または中脳網様体（ｍＲＴ）などの下流構造に個別に影響を及ぼすことによって、不安を増加させるために作用する可能性がある。赤色及び青色の矢印は、それぞれ興奮性及び抑制性の投射を示す。紫色の矢印は、未知の神経伝達物質アイデンティティによる投射を示す。実線は、本研究で直接対象とされ、かつ調査される投射を示し、破線はデータによって存在することが示唆される投射を示す。
【０１９４】
本発明は、その特定の実施形態を参照して説明したが、それは様々な変更を行うことができ、等価物が本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく置換されていてもよいことは、当業者によって理解されるべきである。加えて、本発明の目的、精神、及び範囲に対して、個々の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程または複数の工程を適応させるべく、多くの変更がなされてもよい。すべてのそのような変更は、本明細書に添付される特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９】
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【配列表】
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