(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から得た試料中の１つ以上の関心がある遺伝子（標的遺伝子）のメチル化を定量するインビトロの方法であって、以下のａ）〜ｈ）を含み、
ここで、基準遺伝子は、関心がある標的遺伝子の５´末端及び３´末端と同じ５´末端及び３´末端ヌクレオチド配列を有し、基準遺伝子の５´末端オリゴヌクレオチド配列と３´末端オリゴヌクレオチド配列との間に介在するオリゴヌクレオチド配列が標的遺伝子内の標的領域と同じ数の塩基を有し、前記介在するオリゴヌクレオチド配列が標的遺伝子の標的領域と相同性がないＤＮＡを含む
ことを特徴とする方法。
ａ）検出される関心がある各標的遺伝子に特異的な基準遺伝子の複数のコピーを、前記被検体から得たＤＮＡを含む前記試料に添加する
ｂ）前記試料中のＤＮＡを単離及び加工する
ｃ）メチル化特異的ＰＣＲのために、前記（ａ）中のＤＮＡを準備する
ｄ）１対以上のメチル化非依存的な外部ＰＣＲプライマーであって、プライマーの各対が、検出される標的遺伝子のうちのただ１つ、及び前記標的遺伝子に特異的な基準遺伝子に選択的にハイブリダイズするプライマーを用いて、第一の増幅産物を得るのに十分な条件下のＰＣＲにより、前記（ｂ）中のＤＮＡを増幅する
ｅ）前記（ｄ）で得られた前記第一の増幅産物を希釈した試料を得る
ｆ）前記（ｅ）に
関心がある各標的遺伝子に特異的でメチル化依存的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
関心がある標的遺伝子に対する基準遺伝子に特異的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
関心がある各標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ、及び
関心がある標的遺伝子用の各基準遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ
を添加する
ｇ）関心があるメチル化された標的遺伝子のコピー数及び関心がある前記標的遺伝子に対する基準遺伝子のコピー数の定量を提供する第二の増幅産物を得るのに十分な条件下の定量的リアルタイムＰＣＲによって、前記（ｆ）中のＤＮＡを増幅する
ｈ）１つ以上の関心がある標的遺伝子のメチル化を定量する
【請求項２】
定量化を用いて、下記式により関心がある遺伝子のメチル化量を計算する、請求項１に記載の方法。
（関心があるメチル化標的遺伝子のコピー数）／（関心があるメチル化標的遺伝子のコピー数＋関心がある前記標的遺伝子用の基準遺伝子のコピー数）×１００
【請求項３】
定量化を用いて、下記式により関心があるメチル化標的遺伝子のコピー数の割合を計算する、請求項１に記載の方法。
（関心があるメチル化標的遺伝子のコピー数）／（関心がある標的遺伝子用の基準遺伝子のコピー数）×１００
【請求項４】
１つ以上の光学的に検出可能に標識された前記ＤＮＡプローブが、消光部位を伴う又は伴わない、蛍光部位を含む分子指標、又は消光部位を伴う又は伴わない、蛍光部位を含むオリゴヌクレオチドプローブである、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記被検体が哺乳類である、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記被検体がヒトである、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
関心がある前記標的遺伝子が、ＡＫＲ１Ｂ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＭＡＬ、ＲＡＳＧＲＦ２、ＲＡＳＳＦＩＡ、ＴＭ６ＳＦ１、ＴＭＥＦＦ２、ＴＷＩＳＴ１、ＡＬＸ１、ＤＡＢ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＧＡＳ７Ｃ、ＧＳＴＰ１、ＨＩＮ１、ＨＩＣ１及びＲＡＲＢ２からなる群より選択される、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマー及び前記プローブが、配列表番号１−１１、１３−２３、２５−３５、３７−４７、４９−５９、６１−７１、７３−８３、８５−９５、９７−１０７、１０９−１１９、１２１−１３１、１３３−１４３、１４５−１５５、１５７−１６７、１６９−１７９、１８１−１９１、１９３−２０３、２０５−２１５、２１７−２２７、２２９−２３９からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被検体中の異常なＤＮＡのメチル化を定量するインビトロの方法であって、以下のａ）〜ｇ）を含み、
ここで、基準遺伝子は、関心がある標的遺伝子の５´末端及び３´末端と同じ５´末端及び３´末端ヌクレオチド配列を有し、基準遺伝子の５´末端オリゴヌクレオチド配列と３´末端オリゴヌクレオチド配列との間に介在するオリゴヌクレオチド配列が標的遺伝子内の標的領域と同じ数の塩基を有し、前記介在するオリゴヌクレオチド配列が標的遺伝子の標的領域と相同性がないＤＮＡを含む
ことを特徴とする方法。
ａ）検出される関心がある各標的遺伝子に特異的な基準遺伝子の複数のコピーを、被検体から得たＤＮＡを含む試料に添加する
ｂ）前記ａ）の試料中のＤＮＡを単離及び加工して、メチル化特異的ＰＣＲのためにＤＮＡを準備する
ｃ）１対以上のメチル化非依存的な外部ＰＣＲプライマーであって、プライマーの各対が、検出される関心がある標的遺伝子のうちのただ一つ、及び前記標的遺伝子に特異的な基準遺伝子に選択的にハイブリダイズすることができるプライマーを用いて、第一の増幅産物を得るのに十分な条件下のＰＣＲにより、前記（ｂ）中のＤＮＡを増幅する
ｄ）前記（ｃ）で得られた前記第一の増幅産物を希釈した試料を得る
ｅ）前記（ｄ）に
関心がある標的遺伝子に特異的でメチル化依存的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
関心がある前記標的遺伝子用の基準遺伝子に特異的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
関心がある標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ、及び
関心がある標的遺伝子用の基準遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ
を添加する
ｆ）関心があるメチル化された標的遺伝子のコピー数、及び関心がある前記標的遺伝子用の基準遺伝子のコピー数の定量を提供する第二の増幅産物を得るのに十分な条件下の定量的リアルタイムＰＣＲによって、前記（ｅ）中のＤＮＡを増幅し、対照と比較した試料から得られた関心がある１つ以上の標的遺伝子のメチル化コピーの量の増加が疾病の危険性及び／又は存在の増加を示す
ｇ）１つ以上の関心がある標的遺伝子のメチル化を定量する
【請求項１０】
前記疾病が癌であり、対照と比較した試料から得られた関心がある１つ以上の遺伝子のメチル化コピー数の前記増加が、被検体の組織内の発癌の変化、癌の変化、前癌の変化、又は異形成の変化を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検者から得た前記試料が、血液、血清及び血漿からなる群より選択される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下のａ）並びにｂ）を含む、ＤＮＡ試料中の複数のＤＮＡ配列のメチル化状態を検出し、
ここで、基準遺伝子は、関心がある標的遺伝子の５´末端及び３´末端と同じ５´末端及び３´末端ヌクレオチド配列を有し、基準遺伝子の５´末端オリゴヌクレオチド配列と３´末端オリゴヌクレオチド配列との間に介在するオリゴヌクレオチド配列が標的遺伝子内の標的領域と同じ数の塩基を有し、前記介在するオリゴヌクレオチド配列が標的遺伝子の標的領域と相同性がないＤＮＡを含む
キット。
ａ）検出される関心がある各標的遺伝子に特異的な基準遺伝子の複数のコピーと、
１つ以上の検出される関心がある１つ以上の各標的遺伝子に対して選択的にハイブリダイズすることができ、且つ第一の単位複製配列を含む第一の増幅産物が得られる条件下で関心がある標的遺伝子用の各基準遺伝子に選択的にハイブリダイズすることができる、メチル化非依存的な１対以上の外部ＰＣＲプライマー、及び
ｂ）関心がある標的遺伝子に特異的で、メチル化依存的な１対以上の内部ＰＣＲプライマーと、
関心がある前記標的遺伝子用の基準遺伝子に特異的な１対以上の内部ＰＣＲプライマーと、
関心がある標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブと、
関心がある標的遺伝子用の基準遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ
【請求項１３】
前記ＤＮＡ配列が、ＡＫＲ１Ｂ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＭＡＬ、ＲＡＳＧＲＦ２、ＲＡＳＳＦＩＡ、ＴＭ６ＳＦ１、ＴＭＥＦＦ２、ＴＷＩＳＴ１、ＡＬＸ１、ＤＡＢ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＧＡＳ７Ｃ、ＧＳＴＰ１、ＨＩＮ１、ＨＩＣ１及びＲＡＲＢ２のプロモーターから選択される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
配列番号１−１１、１３−２３、２５−３５、３７−４７、４９−５９、６１−７１、７３−８３、８５−９５、９７−１０７、１０９−１１９、１２１−１３１、１３３−１４３、１４５−１５５、１５７−１６７、１６９−１７９、１８１−１９１、１９３−２０３、２０５−２１５、２１７−２２７、２２９−２３９からなる群より選ばれる１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２又は１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
この出願は、２０１２年５月２２日付け出願の米国仮特許出願第６１／６５０，０８３号の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に完全に援用される。
【０００２】
［電子的に提出された資料の参照援用］
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体を援用する。２０１３年５月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１２０１４−０２＿ＳＬ．ｔｘｔと題され、サイズは５８，４１６バイトである。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子プロモーターや、遺伝子内部のある領域の高メチル化を含むエピジェネチックな変化は、腫瘍進行の一貫した初期現象であることは、現在では明白である。そのような変化は、腫瘍抑制遺伝子発現の転写サイレンシング、及び遺伝子突然変異の割合の増加により、腫瘍の進行に関連していると考えられる。ＤＮＡのメチル化は、そのＤＮＡ配列を変えないため、可逆的である。しかしながら、細胞から細胞へと遺伝する。そのため、メチル化遺伝子は、癌の早期発見、危機分析、治療に対する応答の予測及び監視、再発の早期検出などのバイオマーカーとしても役に立つであろう。
【０００４】
腫瘍ＤＮＡは、さまざまな体液中に検出され、これらの体液は診断材料として用いることができる可能性がある。これらの体液中の腫瘍ＤＮＡの評価には、特異的かつ感度のよい方法が必要となる。ＰＣＲをベースとしたメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）と呼ばれる方法は、ゲノムＤＮＡの１０００種の非メチル化コピー中の、１つのメチル化ゲノムＤＮＡのコピーを検出することが知られている。定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）は、試料の取扱いを最小限にしつつも、数時間で、関心がある遺伝子の転写量、又はＤＮＡ量を高い感度で定量することができる。関心がある遺伝子のｃＤＮＡ又はゲノムのコピーは、光学的に検出可能なポリヌクレオチドプローブを用いて、蓄積したＰＣＲ産物を検出することで定量化される。定量的ＭＳＰ（Ｑ−ＭＳＰ）は、メチル化特異的プライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲにより、遺伝子プロモーターのメチル化量を高い感度で検出することができる。
【０００５】
定量的多重ＭＳＰ法は、ネステッドＭＳＰアッセイ又は多重ＭＳＰアッセイにおいて、いくつかの遺伝子を同時に増幅し、定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭ−ＭＳＰ）が開発できるように改良されてきた。ＱＭ−ＭＳＰ法は、一つ以上の、光学的に区別して検出可能なプローブを用いて、遺伝子の１００，０００種の非メチル化コピーの中から、目的のメチル化遺伝子の１〜１０個のコピーを検出できるようにアッセイの特異性及び感度を向上させたリアルタイムＰＣＲに基づいている。
【０００６】
本発明者らは、メチル化マーカーのパネルは、全種の乳癌の１００％、ＤＣＩＳの９５％、及び管溶出液中の細胞内及び自然の乳頭分泌内の癌を検出できることを見出した。しかし、血清／血漿からメチル化ＤＮＡを再現よく検出することは、非常に困難であった。一つのマーカー又はマーカーのパネルを使用して、血清／血漿中の乳癌を検出した例が、過去１５年間に多数報告されている。しかし、この方法においては、これらの事前の発見に続いて臨床の検証がされた例はなく、いまだに解決されていない、技術的問題があることを示唆している。すなわち、
１）第一に、血清中を流れるメチル化腫瘍ＤＮＡの量は、正常細胞から発せられた非メチル化全ＤＮＡ（適合する遺伝子特異的ＤＮＡ、又はアクチンなどの参照ＤＮＡのいずれか）のごく一部に過ぎない。体液中には、希少な標的のメチル化ＤＮＡと、相対的に多量の非メチル化又は参照ＤＮＡとの間の不均衡がある。これにより、量の多い種によるメチル化シグナルのマスクキングのため、アッセイの頑強性が失われる。
２）正常な非メチル化ＤＮＡが発生する程度は、毎日、そして様々な臨床状態（例えば、外科手術、感染など）によって変動する。参照ＤＮＡが変動すれば、関心がある標的遺伝子のメチル化％の判断は不正確となる。
３）入手可能な最も感度がよいアッセイは、ネステッドＰＣＲ（複合又は非複合）を利用して、二回目の定量ＰＣＲを行う前に、関心がある領域の外側の外部プライマーを用いて、標的ＤＮＡ及び参照ＤＮＡの単位複製配列（アンプリコン）を事前増幅する。しかし、事前増幅ＰＣＲ反応において、標的及び参照ＤＮＡ領域を同じ効率で、理想としては参照ＤＮＡに対する標的ＤＮＡの開始割合を正確に維持するために同じ組み合わせの外部プライマーを用いて、共増幅する必要があるという技術的制限がある。非同一な遺伝子間では、プライマーハイブリダイゼーション効率が異なるため、ネステッドＰＣＲにおいて、アクチン又は他の遺伝子は、関心がある遺伝子に対する参照として正確に機能することができない。このように、標的ＤＮＡ及び参照ＤＮＡに対するＤＮＡ特異的プライマーのハイブリダイゼーション効率の相対的な変化により、参照遺伝子に対する標的遺伝子の割合は、事前増幅のサイクルごとに変化する。
４）既存の血清ＭＳＰ法は、通常、一回の一遺伝子の評価に対し、１０−２０ｎｇのゲノムＤＮＡを必要とする。癌患者の血清中の全ＤＮＡ量は低いため（中央値６５．４ｎｇ／ｍｌ；範囲６．３−２６８．６ｎｇ／ｍｌ；Holdenrieder et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1 137: 162-170（2008））、数種の遺伝子のアッセイには、かなりの量の血清が必要となる。このため、既存の臨床研究から得られた保存血清はごくわずかな量しか利用できないため、繰り返しの試験は問題があり、臨床的な検証も困難となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの問題を解決するため、本発明者らは、「ｃＭｅｔｈＤＮＡ」と呼ばれる新規な定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ法を開発した。この方法は、上記で挙げた全ての問題を克服している。すなわち、
１）全ての遺伝子マーカーに対して、参照ＤＮＡとして機能する、組み換え技術で作成した遺伝子特異的基準（基準遺伝子、ＳＴＤｇｅｎｅ）を開発した。標的ＤＮＡ（標的遺伝子、ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）のマスキングを避けるため、血清３００μｌに対して、わずか５０コピー（１５０ｐｇのゲノム等価性）が用いられる。
２）非メチル化又は無関係のＤＮＡは、評価しない。従って、非メチル化ＤＮＡの変動は、標的遺伝子のメチル化の定量に影響しない。
３）各基準遺伝子ＤＮＡは、関心があるメチル化標的遺伝子と相同な５´末端及び３´末端（末端当たり〜２０−２２塩基）を持ち、末端間のヌクレオチド数が同じになるように設計されている。そのため、事前増幅ＰＣＲ（一周り目）では、標的遺伝子及び基準遺伝子のＤＮＡはともに、標的遺伝子のメチル化状態に依存しない、ただ一つの外部プライマーセットによって共増幅する。
４）３００μｌの血清（中央値６５．４ｎｇ／ｍｌ；範囲６．３−２６８．６ｎｇ／ｍｌ；Holdenrieder et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1 137: 162-170 (2008)）から単離した入力ゲノムＤＮＡを（最小でわずか１．９ｎｇ）用いて、１２種又はそれ以上の標的遺伝子ＤＮＡ（及びそれに対応するそれぞれの基準遺伝子ＤＮＡ）の一億の単位複製配列の合成促進する事前増幅工程において、多重ＰＣＲは行われる。まとめると、蓄積された及び個々の標的遺伝子のメチル化は、マーカーパネルでは蓄積メチル化指数（ＣＭＩ）として、個々の遺伝子ではメチル化指数（ＭＩ）として表示される。ＣＭＩは、パネルの個々の遺伝子のＭＩの合計値を決定することにより計算される。ＭＩ＝標的遺伝子のコピー数／標的遺伝子及び基準遺伝子のコピー数×１００
【０００８】
一つ以上の態様によれば、本発明者らは、選択された標的遺伝子のパネルを用いた、全ゲノムメチル化アレイ分析を通して見出された、第４ステージの患者の血清（癌患者５７、正常者（健常者）５５）のトレーニングセット及びテストセットにおいて、９０％超の感度及び９６％超の特異性で、メチル化標的遺伝子ＤＮＡを検出する、ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイを開発した。３つの異なる群、すなわち、血清、再発性の転移性乳癌、検視で採取した試料の第４ステージからの同一患者由来の原発腫瘍、遠位への転移、及び同一患者の間において、ＤＮＡのメチル化パターンの顕著な一致が見られた。これは、核となるメチル化の痕跡が、長い年月保持されることを示唆している。メチル化量は、化学療法処置後の処置に対する反応と相関があると考えられた。２９人の患者の試験的な研究において、ｃＭｅｔｈＤＮＡは、治療に対する反応を監視ができることが示された。と同時に、以下の例におけるデータによれば、本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡ法が、
１）血中に放たれた腫瘍ＤＮＡを検出できること
２）原発腫瘍と転移性の病変の特有のメチル化変化を反映すること
３）化学療法の介在後の処置に対する反応を評価できる可能性があること
を示している。
【０００９】
本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡ法は、ＱＭ−ＭＳＰ法（米国特許第８，０６２，８４９号、参照によりその全体を本明細書に援用する）の新規な改良であり、低い濃度（３００μｌ血清中５０コピー）で、血清又は血漿などの溶液内の腫瘍ＤＮＡ（又は他の循環ＤＮＡ）を定量的に検出することを特に意図している。ＰＣＲ法に基づく他の方法と比較して独特に、少数のコピーの合成ポリヌクレオチド基準（基準遺伝子、ＳＴＤｇｅｎｅ）を、一定量の患者血清に添加する。標準の方法では、複数の関心がある遺伝子（ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）用の基準カクテルを、血清試料に添加する。一度全ＤＮＡが精製され加工されれば、ＰＣＲ（事前増幅、多重工程）が行われる。そして、標的遺伝子のメチル化状態に依存しない条件で、同じ外部プライマーセットを用いて、基準遺伝子と標的遺伝子とが共増幅される。ネステッドＰＣＲの第二の工程において、第一のＰＣＲ反応の希釈液中の単位複製配列を用いてリアルタイムＰＣＲが行われ、２色リアルタイムＰＣＲによって、１又は２ウェル内のそれぞれの遺伝子が定量される。メチル化標的遺伝子、及び関連する基準遺伝子に特異的な内部プライマーセットを用いた完全な定量によって、ＰＣＲ産物が計算される。遺伝子パネルの蓄積メチル化指数（ＣＭＩ）と同様に、それぞれの遺伝子のメチル化指数（ＭＩ）は、コピー数に基づいて決定される。
【００１０】
ある態様によれば、本発明は、以下のａ）〜ｇ）を含む、被検体から得た試料中の１つ以上の関心がある遺伝子のメチル化を定量する方法を提供する。
ａ）検出される関心がある各標的遺伝子に特異的な基準遺伝子の複数のコピーを、上記被検体から得たＤＮＡを含む上記試料に添加する
ｂ）前記試料中のＤＮＡを単離及び加工する
ｃ）メチル化特異的ＰＣＲのために、上記（ａ）中のＤＮＡを準備する
ｄ）１対以上のメチル化非依存的な外部ＰＣＲプライマーであって、プライマーの各対が、検出される標的遺伝子のうちのただ１つ、及び前記標的遺伝子に特異的な基準遺伝子に選択的にハイブリダイズするプライマーを用いて、第一の増幅産物を得るのに十分な条件下のＰＣＲにより、上記（ｂ）中のＤＮＡを増幅する
ｅ）上記（ｄ）で得られた上記第一の増幅産物を希釈した試料を得る
ｆ）上記（ｅ）に
各標的遺伝子に特異的でメチル化依存的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
関心がある遺伝子に対する各基準遺伝子に特異的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
各標的遺伝子の標的配列に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ、及び
各基準遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ
を添加する
ｇ）メチル化された各標的遺伝子のコピー数と各基準遺伝子のコピー数との定量を提供する第二の増幅産物を得るのに十分な条件下の定量的リアルタイムＰＣＲによって、上記（ｆ）中のＤＮＡを増幅する
【００１１】
他の態様によれば、本発明は、以下のａ）〜ｆ）を含む、被検体から得た試料中の異常なＤＮＡメチル化に関連する疾病の発生を診断する方法を提供する。
ａ）検出される関心がある各標的遺伝子用の基準遺伝子の複数のコピーを、被検体から得たＤＮＡを含む上記試料に添加する
ｂ）上記ａ）の試料中のＤＮＡを単離及び加工して、メチル化特異的ＰＣＲのためにＤＮＡを準備する
ｃ）１対以上のメチル化非依存的な外部ＰＣＲプライマーであって、プライマーの各対が、検出される関心がある標的遺伝子のうちのただ一つ、及び前記標的遺伝子に特異的な基準遺伝子に選択的にハイブリダイズすることができるプライマーを用いて、第一の増幅産物を得るのに十分な条件下のＰＣＲにより、上記（ｂ）中のＤＮＡを増幅する
ｄ）上記（ｃ）で得られた上記第一の増幅産物を希釈した試料を得る
ｅ）上記（ｄ）に
各標的遺伝子に特異的で、メチル化依存的な１対の内部ＰＣＲプライマー、
前記標的遺伝子用の各基準遺伝子に特異的な１対の内部ＰＣＲプライマー
関心がある標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ、及び
関心がある遺伝子に対する各基準遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブ
を添加する
ｆ）メチル化された標的遺伝子のコピー数、及び関心がある標的遺伝子用の基準遺伝子のコピー数の定量を提供する第二の増幅産物を得るのに十分な条件下の定量的リアルタイムＰＣＲによって、上記（ｅ）中のＤＮＡを増幅し、対照と比較した被検体から得られた１つ以上の標的遺伝子のメチル化コピーの量の増加が疾病の危険性及び／又は存在の増加を示す
ｂ）疾病の危険性及び／又は存在の増加があると被検体を診断する
【００１２】
他の態様によれば、本発明は、内在する関心がある標的遺伝子の５´末端及び３´末端のヌクレオチド配列と同じ５´末端及び３´末端ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、５´末端オリゴヌクレオチド配列と３´末端オリゴヌクレオチド配列との間に介在するオリゴヌクレオチド配列が、原核生物、非哺乳類、無関係の哺乳類のＤＮＡ配列を含み、基準遺伝子の全体の長さ（塩基対の数）が、関心がある標的遺伝子の単位複製配列の長さと大体同じである、ＲＴ−ＰＣＲで使用する基準遺伝子を提供する。
【００１３】
他の態様によれば、ＤＮＡ試料中の複数の標的遺伝子のＤＮＡ配列のメチル化状態を検出する１つ以上のキットを提供する。本発明のキットは、検出される関心がある各標的遺伝子に特異的な基準遺伝子の複数のコピーと、１つ以上の検出される各標的遺伝子に選択的にハイブリダイズすることができ、且つ第一の単位複製配列を含む第一の増幅産物が得られる条件下で各基準遺伝子に選択的にハイブリダイズすることができる、メチル化非依存的な１対以上の外部ＰＣＲプライマーと、関心がある各標的遺伝子に特異的で、メチル化依存的な１対以上の内部ＰＣＲプライマーと、関心がある各標的遺伝子用のＳＰＳに特異的な１対以上の内部ＰＣＲプライマーと、関心がある標的遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブと、関心がある遺伝子用の基準遺伝子に特異的にハイブリダイズする光学的に検出可能に標識された１つ以上のＤＮＡプローブと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、乳癌におけるゲノム全体の血清ＤＮＡメチル化アレイを示す。乳癌患者及び正常者対照の個人から得た血清試料は、インフィニウムヒューマンメチレーション２７ビードチップを用いて調べられた。  １Ａ）教師なし２次元階層的クラスター分析は、個々の患者の試料（Ｘ軸）及び個々の試料において技術的再現性がよいように選択されたプローブ（Ｙ軸）で行われた（プローブ検出のｐ値＜０．００００１；２６７８９／２７５７８アレイプローブ）。癌又は正常者によって、２つの異なる集団に分離して示し、アレイにおける遺伝子メチル化プロフィールの違いを示している。  １Ｂ）癌特異的なアレイプローブの教師選択の基準一覧。  １Ｃ）１７２種の各癌特異的プローブの平均メチル化量（四角）は、血清の散布図（左図）及び、組織の散布図（右図）に示している。正常者（Ｘ軸）及び癌患者（Ｙ軸）の集合である。実線は、個々のＣｐＧ座プローブの群（ＡＶＥ＿ｂｅｔａ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）間の平均メチル化量の±１．５倍の差の領域を示している。
【図２】図２は、本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡ法の一態様の模式図である。  ２Ａ）第一のＰＣＲ反応（工程１）を多重に行い、遺伝子に対して１対のプライマー（順方向プライマー及び逆方向プライマー）を用いて、１０種の独自の遺伝子を共増幅する。それぞれの独自のプライマー対は、関心がある遺伝子（標的遺伝子）と、ＤＮＡ精製前に患者の血清に添加されたクローン化遺伝子特異的な基準（基準遺伝子）の５０コピーとを増幅する。第二のＰＣＲ（工程２）において、それぞれの独自の標的遺伝子及び基準遺伝子の遺伝子組み合わせの単位複製配列は、同じウェル内で、リアルタイムＰＣＲによって、遺伝子特異的なプライマーの組（順方向プライマー及び逆方向プライマー）と加水分解性のプローブ（二色、標的遺伝子又は基準遺伝子を認識する）とを用いて、分析される。  ２Ｂ）バイオマーカーパネルの検証。５２種の血清からなるトレーニングセットを、ｃＭｅｔｈＤＮＡによって、検査した。  ２Ｃ）上記２Ｂ中のデータの箱髭図は、正常者のコントロールに対して、癌患者血清は蓄積メチル化の中央値が優位に高いことを示している（ｐ＜０．０００１）。
【図３】図３は、アッセイ検証の工程を示す。  ３Ａ）０−３２００コピーのメチル化ゲノムＭＤＡ−ＭＢ−４５３ＤＮＡを添加した正常血清試料を用いて、６回反復して行ったｃＭｅｔｈＤＮＡの再現性。箱髭図は、ＣＭＩ（Ｙ軸）、各サンプルの複製数（Ｘ軸）の中央値及び範囲を示している。統計学的優位性（マンホイットニー検定）及びｐ値を示し、表中に各試験における変数の詳細と％率とを示している（ＣＶ、度数分布の規格化された測定）。  ３Ｂ）ｃＭｅｔｈＤＮＡとＱＭ−ＭＳＰとの比較。ｃＭｅｔｈＤＮＡは、複数試験において、各コピー数における蓄積されたメチル化量が優位に高かった（ｐ値＝０．００２２〜０．００５）。  ３Ｃ）各々１２名の転移性の乳癌患者の各血清試料から得た多重化血清ＤＮＡの一部から、ＱＭ−ＭＳＰ法とｃＭｅｔｈＤＮＡ法とを直接互いに比較した。ｑＰＣＲの参照として遺伝子特異的な基準を用いることにより、ＱＭ−ＮＳＰ法と比較して、ｃＭｅｔｈＤＮＡでは、優位に高いＲＡＳＳＦ１Ａのメチル化値を出した。参照として遺伝子特異的非メチル化ＤＮＡを用いた（ｐ＝０．０２３３、対応のあるｔ検定）。  ３Ｄ）同じ研究室内の二人の研究者により、１３名の患者の血清試料で、ユーザー間の再現性を評価した。１０の遺伝子パネルでユーザーの成績を評価し、検者内誤差は高い再現性を示した（０．９９、９５％信頼区間０．９６−１．００）。
【図４】図４は、ｃＭｅｔｈＤＮＡによる転移性の乳癌ＤＮＡの検出を示す。転移が再発したステージ４の患者から得た血清試料をトレーニングセット及びテストセット（Ｘ軸；Ｊ０４２５／Ｊ０２１４とＪ０５２４の試験。それぞれ図４Ａ−４Ｂ）として割り当てた。正常な女性から得た血清試料は、ランダムに各セットに割り当てた。ｃＭｅｔｈＤＮＡは各セット行った。実験の閾値（ＣＭＩ＝７ユニット；Ｙ軸）は、トレーニングセットを用いて、受信者動作特性によって定めた。ＣＭＩ（Ｙ軸；バーの高さにより示される）は、全体のパネルについて計算した。  ４Ｃ）データの統計的解析を示した。  ４Ｄ）パネル内の、各マーカーのメチル化頻度（メチル化はＭＩ＞１ユニットと定義した）。
【図５】図５は、処置に対する反応の監視を示す。  ５Ａ）ｃＭｅｔｈＤＮＡは、再発性病変の再発時（Ｐｒｅ）、及び治療の８-２１日後（Ｐｏｓｔ）、反応の臨床評価の６−１０週前、の乳癌患者（ｎ＝２８）から得た血清試料を用いて行った。各患者のＣＭＩに従ってデータをプロットし、８−１２週後にＲＥＣＩＳＴ基準に従って、進行性の疾病か否かを判定した  ５Ｂ）ＣＭＩの％変化で、同じデータをプロットした。  ５Ｃ）（ａ−ｄ）：治療の過程での、異なる時間における、ｃＭｅｔｈＤＮＡで評価した、患者（ＳＴ＃）の血清のＣＭＩの代表的なプロット。ａ−ｂ：２８日サイクルの化学療法。ｃ−ｄ：２１日サイクルの化学療法。Ｃ：処置の回数。ＰＤ（症状の進行）、ＳＤ（症状の安定）：病状の進行、症状の安定を評価するイメージ、及びＲＥＣＩＳＴ基準。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の方法では、わずか一種の遺伝子に対して以前は用いられていた試料の量から多くの遺伝子を共増幅でき、遺伝子のパネルについて、組み合わされたメチル化の評価をできる、改変された２工程の定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭ−ＮＳＰ）手法を用いる。本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡ法は、多重高感度ＱＭ−ＭＳＰに、基準遺伝子配列、基準遺伝子プライマー及び基準遺伝子プローブを添加することで増加させた定量化信号対雑音比を組み合わせている。これらの新規なｃＭｅｔｈＤＮＡ法は、高メチル化を癌の型などの疾病や生物学的な状態と関連させた複数の遺伝子のパネルにが、検査される被験体の試料に由来する限定的な量のＤＮＡから共増幅されることを可能とする。ｃＭｅｔｈＤＮＡは、背景技術に記載したような、検査の頑強さの欠如から生ずる、他の血清ＭＳＰ法の既知の限界を克服する。
【００１６】
本発明の方法は、ヒト又はヒト以外の哺乳類、植物、及び昆虫などに由来するがこれらに限定されないゲノムＤＮＡの高メチル化領域の数百種の遺伝子の評価にも広く適用される。例えばヒトなどの哺乳類において、試料は、例えば、検査される被験体から得られる血液、血清、血漿、管溶出液、乳頭吸引液、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び又は羊水から選択される１種以上を含む体液に由来していてもよい。哺乳類において、遺伝子の異常メチル化と関連する、検出又は監視できる状態としては、例えば、あらゆる種類の癌腫や肉腫が挙げられがこれらに限定されず、１種以上の特定の種類の癌、例えば、乳癌、大腸、食道、膵臓癌などの消化器系又は胃腸系管の癌、肝臓がん、皮膚癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病などの造血器腫瘍、腎臓がん、肺癌、気管支癌、筋腫瘍、骨癌、膀胱がん、又は星状細胞腫、退形成星こう腫、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、及び神経芽細胞腫などの脳癌、及びこれらの転移が挙げられる。本発明の方法は、例えば、ヒト、ペット（例えば、犬、猫、フェレットなど）、家畜（食肉用と乳製品用）、及び競走馬などを含むあらゆる哺乳類被検体のＤＮＡの検査に使用することができる。
【００１７】
昆虫や植物などの、他の多細胞生物の液体から得た試料もまた、本発明の方法を用いて遺伝子メチル化状態を評価できる場合がある。例えば、遺伝子のメチル化状態は、被検体における、遺伝の指標やエピジェネチックな状態の適応性の指標として役立つ場合がある。このように、遺伝子のメチル化は、組織において、異なる特性を獲得することと関連している。
【００１８】
本発明の方法は、定量的多重メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭ−ＭＳＰ）の原理と、関心がある標的遺伝子に特異的に作製された基準遺伝子の添加とを組み合わせている。ここに記載の試験によれば、ＱＭ−ＭＳＰの感度が１：１００，０００であり、手法の組み合わせ（ｃＭｅｔｈＤＮＡ）により、わずか５０コピーまでのメチル化ＤＮＡを検出できることを示している。この成果は、感度が１：１０，０００であるＱ−ＭＳＰ、及び感度が１：１０００である従来のＭＳＰと比べて有利である。さらに、一方又は他方のＤＮＡが１０５倍以上過剰で構成される混合物においてさえ、標的遺伝子プライマーと基準遺伝子プライマーとが交差反応性を示さず、反応は特異的である。
【００１９】
ｃＭｅｔｈＤＮＡ用のプライマー及びプローブの設計。本発明の方法の実施にあたり、一回目の（事前増幅）ＰＣＲにおいて、標的遺伝子のメチル化の状態に依存せずに、標的遺伝子に対するそれぞれの基準遺伝子と共に、１種の関心がある標的遺伝子（ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）にハイブリダイズする一組の外部プライマー対を用い、二回目のＰＣＲ（リアルタイムＭＳＰ）において、基準遺伝子にハイブリダイズする内部プライマー／プローブの、標的遺伝子基準に特異的な（すなわち、ＳＴＤｇｅｎｅ）の組と共に、標的遺伝子にハイブリダイズするメチル化状態に特異的な一組の内部プライマー／プローブを用いることにより、ｃＭｅｔｈＤＮＡを実施するようにＱＭ−ＭＳＰ法を構成した。このように、関心がある各標的遺伝子は、１対の外部プライマーと、２組の内部プライマー／プローブを有しており、それぞれの内部セットは、関心がある標的遺伝子領域、又は関心がある各標的遺伝子に一致する基準遺伝子を検出し、定量するように特異的に設計されている（図２Ａ）。
【００２０】
いわゆる多重ＰＣＲにおいては、複数の遺伝子特異的外部プライマーの組み合わせを用いて、複数の標的遺伝子ＤＮＡを共増幅する。本発明の方法で用いられる、一回の反応における複数の外部プライマー対は、各対が本発明で用いる検査される標的遺伝子、及びその標的遺伝子の各基準遺伝子のパネルの１つに選択的にハイブリダイズし、標的遺伝子とその各基準遺伝子の混合物を共増幅できる。外部プライマー対は、ＤＮＡ増幅がＤＮＡ配列のメチル化状態に依存しないように設計される。従って、外部プライマーの結合部位の内部のメチル化標的遺伝子及び基準遺伝子のＤＮＡ配列は、その標的遺伝子に特異的な一対の外部プライマーによって、任意の所定の遺伝子に対して、共増幅する（そして、後に、内部プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによって定量化される）。例えば、本発明の方法で使用される、下記の表１、及び添付する配列表に挙げるプライマー配列は、原発乳癌と関連する標的遺伝子である。
表１：ｃＭｅｔｈＤＮＡ法の一態様におけるプライマー配列
【００２１】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【００２２】
関心があるメチル化標的遺伝子ＤＮＡ配列の定量的リアルタイムＰＣＲ用、及び関心がある内在性の標的遺伝子に対するそれぞれの基準遺伝子（２周り目のｃＭｅｔｈＤＮＡ）用の内部ＰＣＲプライマーは、メチル化状態（すなわち、ＣｐＧアイランドの増幅領域内にメチル化ＣｐＧ残基があるか否か）を検出する本発明の方法を用いて、検査される標的遺伝子ＤＮＡ配列のパネル中の１つ以上のメンバーに対して、一周り目のＰＣＲで得られた単位複製配列に選択的にハイブリダイズするように設計されている。本発明のアッセイで用いられるＤＮＡ配列の開始パネルのそれぞれのメンバーに対して、それぞれのメチル化特異的内部プライマー対とそれぞれの基準遺伝子特異的な内部プライマー対とを用いて、独立したｃＭｅｔｈＤＮＡの二周り目反応を行うことにより、一周り目のＰＣＲで得られた単位複製配列を増幅する。ｃＭｅｔｈＤＮＡ法の二周り目は、一周り目に合成された標的遺伝子及び基準遺伝子の領域から得られる単位複製配列を定量する。二周り目のリアルタイムＰＣＲにおいて、標的遺伝子とそれぞれの基準遺伝子は、独立して個々のウェルでアッセイすることもできるし、内部プライマー／プローブセットが同じウェル内に存在し、２つを異なって検出可能なラベル（例えば、全く異なる蛍光ラベル及び消光剤（例えば、６ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡとＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ）がそれぞれのプローブに用いられるなど）であれば、１つのウェルで同時にアッセイすることもできる。
【００２３】
当業者には、本発明の方法を用いて、メチル化及び非メチル化ＤＮＡを定量できると理解されるであろう。しかし、様々な要因によって、患者の非メチル化ＤＮＡの量は、日々変動し、したがって、変動する参照点とメチル化ＤＮＡ量を比較することは適切とは言えないことに注意することが重要である。
【００２４】
ここで、「基準遺伝子」との用語は、キャリアＤＮＡ配列中内に、組み換え技術によって組み込まれ、関心がある内在性の標的遺伝子（ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）と釣り合うオリゴヌクレオチドを意味する。基準遺伝子の５´末端及び３´末端におけるヌクレオチド（順方向外部プライマー及び逆方向外部プライマーにハイブリダイズする約２０−２２ｂｐ）は、関心がある内在性のゲノムＤＮＡ（ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）と配列が同じである。そして、基準遺伝子オリゴヌクレオチド内の５´領域と３´領域の間に介在する塩基数は、標的遺伝子内の標的領域と本質的に同じである。ある態様においては、ヒトＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションを避けるため、５´末端と３´末端の間に介在する塩基は、標準として、λファージＤＮＡで構成される。ある態様においては、基準間（例えば、一周り目の多重反応中）のクロスハイブリダイゼーションを避けるため、各基準遺伝子の型は、独特なλファージＤＮＡ配列をもつ。１つ以上の他の態様によれば、介在する塩基は、関心がある遺伝子領域と相同性がない無関係のＤＮＡを含む。これらの特徴の組み合わせにより、一対の外部の順方向及び逆方向プライマーを用いた多重反応、及び二周り目の特異的プライマー／プローブを用いたリアルタイムＰＣＲによる単位増幅配列の後の定量において、標的遺伝子と基準遺伝子とを共増幅させることができる。
【００２５】
一周り目の多重ＰＣＲにおいて、標的遺伝子と基準遺伝子の増幅したＤＮＡのコピー数には直接的な関係がある。なぜなら、標的遺伝子が存在する場合、外部順方向プライマー及び外部逆方向プライマーは、それぞれ、標的と基準遺伝子（標的遺伝子と同一の５´及び３´末端を持つようにクローン化されている）に対してハイブリダイズする機会が均等にあるためである。このように、各標的遺伝子に対して、ｃＭｅｔｈＤＮＡセットは、以下を含む。
１）順方向及び逆方向の外部プライマー
２）標的遺伝子のメチル化特異的な順方向及び逆方向の内部プライマー
３）基準遺伝子特異的な順方向及び逆方向の内部プライマー
４）個々に異なる色を有する２）および３）に対応するプローブ（例えば、６ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ及びＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ、又は他の組み合わせ）
【００２６】
二周り目のｃＭｅｔｈＤＮＡにおいて、一種の遺伝子又は基準が増幅された場合、その事象は区別可能な蛍光ラベルプローブによって検出され、信号強度はＰＣＲの各周で２倍となる（効率１００％）。本発明の二周り目のｃＭｅｔｈＤＮＡで用いられるプローブは、それぞれの内部プライマー対の結合領域間にある単位複製配列の部分に選択的にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＰＣＲに適するポリヌクレオチドプローブとしては、蛍光部分と消光部分とを有する、分子指標やタックマンプローブ（登録商標）のような、複ラベルのオリゴヌクレオチドプローブが挙げられるが、これらに限定されない。分子指標において、蛍光は、プローブのハイブリダイズにより発せられ、このハイブリダイズは、複ラベルのオリゴヌクレオチドのステムループ構造の崩壊により消光部分を蛍光部分に近接する部位から外す。アンプリフロア（登録商標）やトリスター（登録商標）試薬や方法などの分子指標が市販されている（ストラタジーン、インビトロジェン）。タックマンプローブ（登録商標）において、蛍光は、増幅サイクルの間のタックＤＮＡポリメラーゼによるプローブの進行性の崩壊により、消光部分を蛍光部分から外すことで、進行的に発せられる。一度増幅が起こると、プローブは、タックＤＮＡポリメラーゼの５´−３´エキソヌクレアーゼ活性によって崩壊し、例えば配列検出器内に統合されたレーザーを用いて、蛍光は検出される。従って、蛍光強度は、増幅した産物の量に比例する。本発明に用いられる蛍光色素の例としては、６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、Ｃａｌ  ＦＬＵＯＲ  Ｇｏｌｄ、Ｃａｌ  ＦＬＵＯＲ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｃａｌ  ＦＬＵＯＲ  Ｒｅｄ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｑｕａｓａｒ５７０、Ｑｕａｓａｒ６７０、ＲＯＸ、テキサスレッドが挙げられる。本発明の方法に用いることができる消光剤としては、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ＴＡＭＲＡが挙げられる。
【００２７】
ある態様において、プローブから発せられる蛍光は、直線的に増幅する反応中に検出し測定されるので、増幅産物のコピー数の検出に用いることができる。
【００２８】
ある態様において、完全な定量の実行を可能とする高効率な評価を促進するので、７５−１５０塩基対の範囲の単位複製配列は、一般的に内部ＰＣＲ分析に有利である。特異的な遺伝子に対する基準遺伝子及びメチル化標的遺伝子の単位複製配列のコピー数の定量は、背景技術で記載したような、ＤＮＡ入力を見積もるために、同じ遺伝子又はアクチンの参照非メチル化（Ｕ）ＤＮＡとして用いる必要性に対する改良である。それぞれの基準遺伝子は、特異的な標的遺伝子（一周り目のｃＭｅｔｈＤＮＡの多重ＰＣＲに由来する）における関心領域と同じ構造的特徴（同じ単位複製配列長、５´及び３´末端の同じ配列）を持つように設計される。
【００２９】
可能であればいつでも、標的遺伝子の関心がある領域に対するプライマー及びプローブは、Ｇ／Ｃ量が２０−８０％の領域内で選択される。Ｇ／Ｃ量がこれを越える領域は、加熱サイクルにおいて変性が起こらず、反応が効果的に進まない場合がある。さらに、Ｇ／Ｃが多い配列は、反応効率の低下を招く、非特異的な相互作用を起こしやすい。この理由から、Ｇ塩基が４つ以上連続する配列を含むプライマー及びプローブ配列は、一般的に避けられる。Ａ／Ｔが多い配列は、推奨される融解温度（ＴＭ）を得るために、長いプライマー及びプローブ配列が必要となる。これは定量試験においてまれにしかおきない問題である。しかし、４０塩基対に近いタックマン（登録商標）プローブでは、消光の効率が低下し、合成効率の低下がみられる。
【００３０】
原発乳癌に関連する標的遺伝子のメチル化状態を決定するための、外部プライマー対、内部プライマー対、及び遺伝子特異的なプローブの例や、それぞれの基準遺伝子を表１に示す。
【００３１】
本発明の方法で用いられる標的遺伝子（ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）の例としては、ＡＫＲ１Ｂ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＭＡＬ、ＲＡＳＧＲＦ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＭ６ＳＦ１、ＴＭＥＦＦ２、ＴＷＩＳＴ１、ＡＬＸ１、ＤＡＢ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＧＡＳ７Ｃ、ＧＳＴＰ１、ＨＩＮ１、ＨＩＣ１、ＲＡＲＢ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ここで例示されるタックマン（登録商標）プローブは、５´末端の蛍光レポーター色素（例えば６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ、発光λｍａｘ＝５１８ｎｍ））と３´末端の消光剤色素（例えば６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ、発光λｍａｘ＝５８２ｎｍ））との双方を含む。消光剤は、二つの色素が互いに近い時に、レポーター蛍光を消す。これは、未変化のプローブにおいて起こる。他のレポーター色素としては、ＶＩＣ（登録商標）やＴＥＴ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、６−ＦＡＭと組み合わせて用いて、定量的リアルタイムＰＣＲによって遺伝子を共増幅するができる。消光部分と組み合わせて構成された、又は消光部分がない他のレポーターを用いてもよい。
【００３３】
本発明の方法によれば、ごくわずかな量のＤＮＡを用いて、複数の遺伝子のメチル化状態を評価することができる。個々の遺伝子メチル化マーカーによる値に比べ、複数の遺伝子間の高メチル化の蓄積値は、体液試料中の正常又は良性の腫瘍と、悪性の腫瘍とをよく区別する。本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡ法を用いることにより、正常／異常のＤＮＡ配列の高メチル化の範囲を、より大きな臨床規模に変換可能な方法で、客観的に定義できる（図４）。本発明の方法は、良性状態における累積高メチル化の解析に用いたり、ＤＮＡ高メチル化と関連する様々な癌やその転移のような状態の予測因子として用いたりすることもできる。本発明の方法は、子癇前症、子癇、ウィルス性疾患（例えば、ヘルペスウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス）、神経変性、精神系疾患などの、癌とは関連しない症状も予測できる場合がある。
【００３４】
ある態様によれば、プライマー伸長反応は直線的な増幅反応であり、プライマー伸長反応は、多数のサイクルにわたって行われ、直線的な増幅産物が生成され検出される。
【００３５】
本発明の方法の感度のため、第一の増幅産物は、任意に、約１：５〜約１：１０５に希釈される。そして、任意に、第一の増幅産物の一部を用いて、ここに記載されるように、さらにｃＭｅｔｈＤＮＡが行われる。
【００３６】
リアルタイムＰＣＲにおいて、本発明の方法で用いられるように、第一の増幅産物の一又はそれ以上の分割量（通常は希釈液）は、第一の増幅サンプル内の１つ以上の単位複製配列に選択的にハイブリダイズし、内部増幅プライマー対の第二のプライマー及び蛍光プローブの存在下で、第二の増幅産物ができるような条件下で、内部増幅プライマー対の第一のプライマーを少なくとも用いて増幅される。同時に、少なくとも１つ以上の関心がある標的遺伝子用の基準遺伝子に特異的な内部プライマー対は、基準遺伝子に特異的な第二の蛍光プローブの存在下で、基準遺伝子に選択的にハイブリダイズできる。第二の増幅産物からの蛍光の検出は、第二の増幅産物の産生のリアルタイムな検出、及びメチル化標的遺伝子及び関連する基準遺伝子の量の計算を提供する。
【００３７】
本明細書中で使用される増幅「プライマー対」は、順方向プライマーと逆方向プライマーと一般に称されるものを必要とし、よく知られた決まった手法を用い、本明細書に記載されるように、そこから増幅産物が産生されるように選択されることに留意すべきである。
【００３８】
本明細書で使用される「増幅産物が産生する条件」又は「直線的に増幅産物が産生する条件」とは、増幅反応がおこる試料が、増幅反応をおこすのに必要な成分を含んでいることを言う。そのような条件の例は実施例１に挙げられ、例えば、適切な緩衝能、ｐＨ、塩濃度、特にポリメラーゼに必要であれば金属イオン濃度、鋳型核酸分子にプライマー又はプライマー組み合わせが選択的にハイブリダイズできる適切な温度、ポリメラーゼが失活せず、プライマーの溶解、プライマーの伸長、ステムループ構造などの二次構造を有する鋳型からの増幅産物が起こる温度サイクル、などが挙げられる。そのような条件、及びそのような条件をを選択する方法は、ありきたりであり、当業で公知である（例えば、Innis et al, "PCR Strategies" (Academic Press 1995); Ausubel et al, "Short Protocols in Molecular Biology" 4th Edition (John Wiley and Sons, 1999); "A novel method for real time quantitative RT-PCR" Gibson U.E. et al. Genome Res (1996) 6:995-1001; "Real time quantitative PCR" Heid C.A. et al. Genome Res (1996) 6:986- 994参照）。
【００３９】
ここで用いられる「核酸」は、「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」「核酸分子」を含み、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味する。かかるポリマーは、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよく、また、合成物であってもよいし、天然源からの入手物（例えば単離及び又は精製物）であってもよく、天然、非天然、変性オリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、未変性のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステル結合の代わりに、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオネート結合などの天然、非天然、変性のオリゴヌクレオチド結合を含んでいてもよい。一般的には、核酸は、挿入、欠如、転位、及び／又は置換がないことが好ましい。しかし、いくつかの例においては、１つ以上の挿入、欠如、転位、及び／又は置換を含む核酸が適する場合がある。
【００４０】
ある態様において、本発明の核酸は組み換え体である。ここで、「組み換え体」とは、（ｉ）生細胞中で複製できる核酸分子に、天然又は合成核酸部分を組み込むことによって、生細胞外で調製された分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載される分子の複製により得られる分子をいう。ここでの目的のためには、複製は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の複製であってもよいし生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の複製であってもよい。
【００４１】
本発明のある態様において、プライマーとして使用される核酸は、当業で公知の手法を用いて、化学的な合成、及び／又は酵素による核酸連結反応により調製できる（例えば、Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) and Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY (1994)を参照）。例えば、核酸は、天然のヌクレオチドや、分子の生物学的な安定性を向上させたり、ハイブリダイゼーション時の二本鎖の物理的安定性を向上させたりするように設計された様々な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート由来物、アクリジン置換ヌクレオチドなど）を用いて化学的に合成できる。核酸の産生に用いられる修飾ヌクレオチドとしては、例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケウオシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキリプロピル）ウラシル、２，６−ジアミノプリン、が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の１つ以上の核酸は、マクロモレキュラーリソーシズ（コロラド州フォートコリンズ）、シンテゲン（テキサス州ヒューストン）などの会社から購入してもよい。
【００４２】
本明細書で用いる「単離され及び精製され」との用語は、例えば、抗体や他の手法を用いて細胞や他の混入物を除いた天然のタンパク質や組み換え宿主細胞培養の精製産物などの、他のタンパク質又はポリペプチドと本質的に関連しないタンパク質を意味する。
【００４３】
本明細書で用いる「生物学的な活性」との用語は、天然分子の構造的、制御的、又は生化学的な機能を有する酵素やタンパク質を意味する。
【００４４】
本明細書で用いる「被検体」との用語は、あらゆる哺乳類をいう。哺乳類は、マウスやハムスターなどのネズミ目、ウサギなどのウサギ目、が挙げられるが、これらに限定されない。また、哺乳類としては、ネコ科（ネコ）、イヌ科（イヌ）を含む食肉目、ウシ科（ウシ）、ブタ科（ブタ）を含むウシ目、ウマ科（ウマ）を含むウマ目がより好ましい。哺乳類しては、サル目、セボイド目、シモイド目（サル）を、又は霊長目（ヒト及び猿人類）などが挙げられる。哺乳類としては、特に、ヒトが好ましい。
【００４５】
当業者には、本発明の方法を、任意の疾病や生物学的状態であって、被験体において遺伝子のメチル化が関連している疾病や生物学的状態の診断、予後、監視処置に用いることができることが理解されるであろう。ある態様において、疾病は癌である。
【００４６】
本発明のある態様によれば、ここで提供される方法を用いて行われる癌の診断のタイプは特に限定されないことが理解されよう。ここでの目的のためには、癌は、どのような癌であってもよい。ここで、「癌」とは、リンパ器官や血流に乗って体内の他の場所に広がるかもしれない、異常で制御できない細胞分裂によって起こる悪性の増殖又は腫瘍を意味する。
【００４７】
癌は、転移性の癌又は非転移性の（例えば局所的な）癌であってもよく、浸潤性の癌又は上皮内癌であってもよい。ここで、「転移性の癌」とは、癌細胞が転移する癌（例えば、癌細胞の転移によって特徴付けられる癌など）をいう。転移とは、ここで記載されるように、局所的な転位であってもよいし、遠位の転移であってもよい。
【００４８】
ここで、「処置する」及び「予防する」は、これらに由来する用語と同様に、必ずしも１００％又は完全な処置又は予防を示すものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益や治療効果があると認識する、様々な程度の処置と予防を含む。この点において、本発明の方法は、哺乳類における癌の処置や予防を含む、任意のレベルにおける任意の程度の診断、病期分類、スクリーニング、又は他の患者管理を提供することができる。さらに、本発明によって提供される処置や予防には、処置や予防が行われた癌などの疾病の、一つ以上の状態又は症状に対する処置や予防を含むことができる。また、「予防」には、疾病の発生、その症状又は状態を遅らせることを含むことができる。
【００４９】
「相補」又は「相補的な」は、ヌクレオチド間又は核酸分子のヌクレオチド類似物間のワトソンクリック塩基対（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ、Ｃ−Ｇ）又はフーグスティーン塩基対をいう。
【００５０】
本明細書で用いる「選択的なハイブリダイゼーション」又は「選択的にハイブリダイズする」は、核酸配列が、選択されたヌクレオチド配列に関連し、無関係なヌクレオチド配列には関連しないような、中程度又は高度に厳密な条件のもとでのハイブリダイゼーションをいう。一般的に、選択されたヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドであり、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、特には約２０ヌクレオチド又はそれ以上の長さである。選択的なハイブリダイゼーションの条件を経験的に決定することができる。あるいは、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのＧＣ：ＡＴ含有量の割合、ハイブリダイズする配列、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さ、および、もしあれば、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする配列間の不適正塩基対の数に基づいて推定することができる（例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)を参照）。
【００５１】
本明細書で用いる「比較可能な正常ＤＮＡ試料」とは、例えば植物や昆虫などの、メチル化状態を試験する複数のゲノムＤＮＡが、比較の目的で、同種、家族などの正常組織から得た同じ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列のパネルと一致することをいう。例えば、正常試料と比較して、試験試料中のメチル化量の顕著な累積的増加又は減少は（例えば、比較可能な明らかな正常試料にみられる蓄積と比べて、試験ＤＮＡパネルにおける腫瘍マーカーの蓄積された頻度など）、分析された状態の存在の信頼できる指標である。
【００５２】
二つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関する文脈における「同一の」又は「一致」は、特定の領域にわたって同じである残基を特定の割合で有する配列をいう場合がある。割合は、適切に二つの配列を並べ、特定の領域において二つの配列を比較し、同一残基が両配列で存在する位置の数を求めて一致位置の数を出し、特定の領域における全位置の数で一致位置の数を除し、商に１００をかけて一致する配列の割合（パーセント）を出すことで計算することができる。二つの配列の長さが異なり、又は、アライメントが、一つ以上のずれた末端を生じて、比較する特定の領域で一つの配列しかない場合は、その一つの配列の残基は上記計算の分母には加えるが、上記計算の分子には加えない。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合は、チアミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等とみなしてもよい。一致は、手作業で確認してもよいし、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０などの、コンピューターの配列演出法を用いて確認してもよい。
【００５３】
本明細書で用いる「プローブ」とは、一つ以上の化学的結合（通常は、相補的な塩基対形成（通常は水素結合形成））を通して、相補的な配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドをいう場合がある。プローブは、ハイブリダイゼーション条件の厳密さに依存して、プローブ配列と完全な相補性を欠いている標的配列を結合する場合がある。標的配列と、一つの上記記載の基準核酸との間でのハイブリダイゼーションを妨げるような、不適正塩基対の数がある場合がある。しかし、変異の数があまりに多くて、厳密なハイブリダイゼーション条件においてさえ、ハイブリダイゼーションは起こらない場合は、その配列は相補的な標的配列ではない。プローブは、一本鎖又は部分的に一本鎖、及び部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖は、標的配列の構造、組成、特性によって決められる。プローブは、ストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチンなどによって、直接的又は間接的に標識されていてもよい。
【００５４】
本明細書で用いる「光学的に検出可能なＤＮＡプローブ」とは、消光部位を伴って又は伴わないで、蛍光部位又は他の検出可能な標識を含む、分子指標又はオリゴヌクレオチドプローブとして働くオリゴヌクレオチドプローブをいう。
【００５５】
本明細書で用いる「実質的に相補」とは、第一の配列が、第二の配列の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上のヌクレオチドの領域において、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％相補的に一致すること、又は厳密なハイブリダイゼーション条件において二つの配列がハイブリダイズすることをいう場合がある。
【００５６】
本明細書で用いる「実質的に同一」とは、第一の配列と第二の配列とが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域において、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％一致すること、又は核酸に関しては第一の配列が第二の配列の相補体と実質的に相補することをいう。
【００５７】
本発明の他の態様において、「生体試料」又は「生体液」とは、現に又は以前は、生存する（していた）患者又は哺乳類から得られる物質を非限定的に含むと理解される。そのような物質としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ液、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞、皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、液体は血液又は血清である。
【００５８】
ある態様において、本発明の方法は、原発乳癌を例として用いて説明される。乳癌において、試料は、管溶出液、乳頭吸引液のような組織源等の、ＤＮＡ量が限定的な、例えば、わずか約５０〜約１００個の細胞、及び、コア生検のホルマリン固定されたパラフィン包埋切片のような、それよりも大きな試料から収集することができる。最大の入力ＤＮＡ量は、約６００ｎｇである。試料中のＤＮＡが限定的である遺伝子である場合、又は過剰な感度が要求される場合に、本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡの方法を用いて、ＡＫＲ１Ｂ１、ＡＲＨＧＥＦ７、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＨＯＸＢ４、ＭＡＬ、ＲＡＳＧＲＦ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＭ６ＳＦ１、ＴＭＥＦＦ２、ＴＷＩＳＴ１、ＡＬＸ１、ＤＡＢ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＧＡＳ７Ｃ、ＧＳＴＰ１、ＨＩＮ１、ＨＩＣｌ、ＲＡＲＢ２内の高メチル化ＣｐＧアイランドの量及び発生が、被験者の原発乳癌の進行の検出を目的として、共増幅される。試料内のこれらの遺伝子領域の蓄積されたメチル化の評価により、高度に選択的で特異的な原発乳癌の検出、及び正常組織に対する腫瘍内のプロモーターの高メチル化の全体的な指標が得られる。本発明の方法は、管溶出液又は乳頭吸引液から得られたような、極度に限定されたＤＮＡ量を含む試料を評価できるように設計されている。その過程において、原発乳癌の遺伝子高メチル化の程度が測定され、本方法は容易に臨床試験に適用可能である。この技術を胸部組織に関して説明しているが、この技術を用いて、広い範囲の組織における遺伝子（例えば、遺伝子プロモーター）の高メチル化を評価することもできる。
【００５９】
ｃＭｅｔｈＤＮＡは、個々のマイクロチューブ、９６ウェルプレート、３８４プレート、又はさらに大きなプレート内で行うことができ、デジタルＰＣＲのような、より大きな設計用にフォーマットされる場合は、高い処理能力のために用いることができる。ｃＭｅｔｈＤＮＡ技術は、新鮮な又は凍結した、管溶出液、血漿、血液、血清、乳頭吸引液、脳脊髄液、微量の針穿刺吸引液に適用できる。ＤＮＡ試料の他の源としては、気管支洗浄、頬側口腔洗浄、前立腺液、尿を含むが、これらに限定されないｃＭｅｔｈＤＮＡ監視にも適している。癌と関係がなく、本発明のモニタリングに適している症状としては、子癇前症、及び子癇が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
単一の遺伝子のメチル化状態の解析よりも情報価値のあることとして、蓄積した複数の遺伝子プロモーターの高メチル化の研究は正常組織と悪性組織の間に存在する顕著な違いを示した（図２−４）。
【００６１】
本発明は、遺伝子メチル化のスクリーニング又は治療応用のためのキットも提供する。スクリーニングへの応用において、上記キットは、以下（アッセイ試薬、バッファー、及び各標的遺伝子など）のうちの何れか又は全てが含まれていてもよい。ｃＭｅｔｈＤＮＡは以下の１)〜４を含む。
１）順方向及び逆方向の外部プライマー
２）標的遺伝子メチル化状態に特異的な、順方向及び逆方向の内部プライマー
３）基準遺伝子に特異的な、順方向及び逆方向の内部プライマー
４）それぞれ異なる色（例えば、６ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ、ＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ、あるいは他の組み合わせ）を有する、＃２及び＃３に対応するプローブ、又は同種の他のもの。
【００６２】
さらに、上記キットは、本発明の方法の実施のための指示（すなわち、プロトコール）を含む指示書を備えていてもよい。指示書には、一般に、記載又は印刷された材料が含まれるが、材料はそれらに限定されない。それらの指示を格納し、指示を使用者に伝えることができる任意のメディアが、本発明では考慮されている。そのようなメディアとしては、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学メディア（例えば、ＣＤＲＯＭ）、そして同種のものが含まれるが、これらに限定されない。メディアには、そのような指示書を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれる。
【実施例】
【００６３】
アッセイの開発のための患者及び血液採取。全血は、正常対照者と、再発と診断された時点の転移乳癌の女性から、ジョンホプキンス大学（メリーランド州ボルチモア）で採取した。全ての試料は、治験審査委員会から適切な承認を得て採取した。
【００６４】
メチル化アレイ用の無細胞血清ＤＮＡの加工方法。全血は、ＳＳＴバキュテナーチューブ（ベクトンディッキンソンダイアグノスティック、ニュージャージー州フランクリンレイクス、＃３６７９８８）内に採取し、製造者の指示に従い、２時間以内に、凝固及び分離をした。血清（６ｍｌ）は、継続して回転させながら、４８℃で夜通し、１％ＳＤＳ、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．５）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、及び１２０μｌの２％ｗ／ｖプロテインエースＫ（ロシュアプライドサイエンス、インディアナ州インディアナポリス）を含む１２ｍｌのバッファーと消化された。その後、一日当たり１２０μｌの２％ｗ／ｖプロテインエースＫを３回添加し、合計７２時間消化した。試料は１０分間遠心し、上清を等量の温かい（５０℃）フェノールクロロホルム飽和トリスバッファー（ｐＨ８．０）内に抽出した。フェーズロックヘビーゲル（５プライム、メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて、水層を単離した。ＤＮＡは、グリコーゲンとＮａＣｌ存在下でエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、１ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に再懸濁した。製造者の指示に従い、ＥＺ ＤＮＡ メチレーションキット（ザイモリサーチ、米国カリフォルニア州オレンジ）を用いて、重亜硫酸ナトリウム置換を行った。溶出したＤＮＡは、ＪＨＵ ＤＮＡマイクロアレイコア内で、イルミナインフィニウムヒューマンメチレーション２７ビードチップ（イルミナ社、カリフォルニア州サンディエゴ；ＷＧ−３１１−１２０２）で処理した。ゲノムスタジオソフトウェア（イルミナ社）で、アレイの結果を解析した。製造メーカに従って、０〜１（低い〜高い）の範囲のβ値（％メチル化と同様）として、メチル化量を定義した。Ｄｉｆｆスコアは、ベンジャミン−ホッホバーグ補正後偽陽性の検出のために計算された（ｐ＝０．０５）。Ｄｉｆｆスコアは、ｐ値の変換であり、参照群と比較群における平均値間の違いに基づく、ｐ値の方向性を与える。式は以下である。
Ｄｉｆｆスコア＝１０×ｓｇｎ（μｃｏｎｄ−μｒｅｆ）×ｌｏｇ１０ｐ；ｐ値が０．０５では、Ｄｉｆｆスコア＝±１３；ｐ値が０．０１では、Ｄｉｆｆスコア±２２；ｐ値が０．００１では、Ｄｉｆｆスコア＝±３３；ｐ＝１０´（Ｄｉｆｆスコア×ｓｇｎ（μｃｏｎｄ−μｒｅｆ）／１０）。
【００６５】
メチル化アレイ解析。転位乳がん患者又は正常者の女性から得た６ｍｌの血清を、指示どおりに、プロテインエースＫで消化し、ＤＮＡを抽出し、重亜硫酸処理した（ＥＺ ＤＮＡ メチレーションキット、ザイモリサーチ、カリフォルニア州オレンジ）。重亜硫酸置換されたＤＮＡは、イルミナインフィニウムヒューマンメチレーション２７ビードチップ（イルミナ社、カリフォルニア州サンディエゴ；ＷＧ−３１１−１２０２）で処理した。メチル化は、０〜１（低い〜高い）の範囲のβ値として測定した。メチル化差異分析は、ゲノムスタジオ（イルミナ）を用いて行った、データは、ジーンエクスプレッションオムニバス（ＧＥＯ）レポジトリに供託した。
【００６６】
無細胞の循環ＤＮＡの精製。外部遺伝子に特異的な基準（関心がある遺伝子あたり５０コピーの標的遺伝子。この例では１２種の関心がある遺伝子を用いた）及びキャリアＤＮＡ／ＲＮＡ（サケ精子１μｇ及びｔＲＮＡ３μｇ）をそれぞれの血清試料（３００μｌ）に添加し、無細胞ＤＮＡを抽出した。３つの血清ＤＮＡ精製キットを評価した：ＱｉａＡｍｐ  ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ （ＭＥ；キアゲン、カリフォルニア州ヴァレンシア）、ＱｉａＡｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ（米国；キアゲン）、及びＱｕｉｃｋ−ｇＤＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ（ＺＲ；ザイモリサーチ、カリフォルニア州オレンジ）。抽出したＤＮＡは、製造者のプロトコールに従い、二亜硫酸ナトリウムで修飾し、カラム精製し、１５μｌの水に溶出した。
【００６７】
ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイ用の血清ＤＮＡの加工。ｃＭｅｔｈＤＮＡを修飾したが製造者のプロトコールに従い、血清はＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（キアゲンカタログ＃５７７０４）を用いて精製した。それぞれの新たなキット用に、プロテアーゼ（プロテアーゼバイアルに対して１．４ｍｌＡＶＥ、混合液、一定分割、−２０℃保存）、及びキャリアＲＮＡ（キャリアＲＮＡ３１０μｇ中に３１０μｌＡＶＥ、溶解液、１μｇ／ｍｌの分割量を−２０℃保存、５．６μｇ／試料で使用）を準備した。遠心を含むすべての工程は、室温で行った。溶出工程のため、ＡＶＥバッファーは室温に平衡化した。インキュベーターオーブンは５６℃に予熱した。キャリアＲＮＡは希釈した（ＡＬバッファー２９４μｌ及びＡＶＥバッファーに溶解したキャリアＲＮＡ５．６μｌの試料ごとに）。その後、以下のプロトコールに従った：約３７μｌのキアゲンプロテアーゼ（ＡＶＥバッファー中に調製し、−２０℃に凍結保存した）を２ｍｌのエッペンチューブに移し、約３００μｌの血清を添加し、混合した。その後、５．６μｇのキャリアＲＮＡ（５．６μｌ）を含むＡＬバッファー約３００μｌを添加し、混合した。使用の直前に、凍結保存された基準遺伝子カクテルを溶解し、約２μｌの基準遺伝子ストック１０３／μｌと１９８μｌの希釈バッファー（１ｘＭＳＰバッファー、５０μｇ／ｍｌｔＲＮＡ、５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）を混合した。その後、約５μｌの希釈した基準遺伝子カクテルを、血清希釈液に添加した。この１２種の基準遺伝子の例において、最終血清混合液中には、それぞれの基準遺伝子が計５０コピーあった。その後、これを混合し、事前に温めたラック内で５６℃１５分間恒温放置し、その後、簡単に遠心した。約３７５μｌの無水エタノールを添加し、振動ボルテックスによって１５秒間混合した。その溶解物を、エタノールと、室温（２５℃を超えない）で５分間恒温放置し、その後簡単に遠心した。すべての溶解物をＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ ｃｏｌｕｍｕｎに移し、８０００ｒｐｍで約１分間遠心し、それからフィルターを捨てて新たな回収チューブに移した。カラムは５００μｌのＡＷ１バッファーで洗浄し、１分間８０００ｒｐｍで遠心した。そして、新たな回収チューブに移した。カラムはＡＷ２バッファー５００μｌで洗浄し、８０００ｒｐｍ約１分間遠心し、新たな回収チューブに移した。カラムは５００μｌの無水エタノールで洗浄し、８０００ｒｐｍで１分間遠心し、新たな回収チューブに移した。空のカラムは、フルスピード（１３０００ｒｐｍ）で約３分間遠心し、新たな回収チューブに移した。約２２μｌのＡＶＥバッファーをメンブレンの中央に直接添加し、室温で約５分間恒温放置し、フルスピードで１分間遠心し、それを繰り返し、貯蔵した。内容物は、二亜硫酸ナトリウムで処理するために５００μｌエッペンチューブに移し、氷上においた。
【００６８】
血清ＤＮＡの二亜硫酸ナトリウムで媒介した保存。約７．５μｌのＭ希釈バッファー（ザイモリサーチ）をＤＮＡ試料（５０μｌ以下の量）に添加し、４２℃で２０−３０分間恒温放置し、短時間遠心した。ＣＴ保存試薬（サンプルごとに、水７１．４μｌ、Ｍ希釈バッファー１７．６μｌ、ＣＴ粒状保存試薬（ザイモリサーチ）５４ｍｇ）の調製後、約７５０μｌ脱イオン蒸留水と１８５μｌのＭ希釈バッファーを５６７ｍｇのＣＴ試薬が入った茶色の１．７ｍｌバイアルに添加する。この量は、１１種の血清ＤＮＡ試料に十分な量である。この溶液を、暗中、室温で１０分間回転させて溶解した。約９７．５μｌのＣＴ保存試薬を完全に試料と混合させ、最終量約１５０μｌで簡単にボルテックスした。ＤＮＡ溶液はＰＣＲ機中で、９５℃３０秒、５０℃１時間の１６サイクルの加熱サイクルでインキュベートした。溶液は、４℃におき、簡単に遠心した。ＤＮＡはザイモスピンカラム（ＩＣ）を用いて、回収チューブ内で、６００μｌのＭ結合バッファー（ザイモリサーチ）で精製し、１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、新たなチューブに移し、Ｍ洗浄バッファー（ザイモリサーチ）で洗浄し、そして１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心した。２００μｌのＭ脱スルホン化バッファー（ザイモリサーチ）をカラムに添加し、混合液を室温で３０分間置き、１３０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、これを繰り返した。カラムは新たな回収チューブに移し、７０℃の水１５μｌをカラムに添加し、室温で５−１０分静置し、続いて遠心でＤＮＡを回収した。試料は氷上に置き、それから全試料を用いて多重ＰＣＲを行った。
【００６９】
ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイ。ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイのプライマー／プローブはアレイ解析によって同定されたメチル化遺伝子座に対して非常に近い（１００塩基対）ところから設計された。ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイのプライマー（２種）及びプローブ（１種）は、望むプライマー／プローブの融解温度、及び領域内におけるＣＧジヌクレオチドの割合によって、共に、約９−１１ＣｐＧジヌクレオチド（７〜１２の範囲内）を含む。Ｃ残基自体（約８、６〜１０の範囲内）は、二亜硫酸ナトリウムに変換されたＤＮＡのみに対する、選択的なハイブリダイズを保証する。ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイセットは以下の１）〜５）を含む。
１）関心がある標的遺伝子（ＴＡＲＧＥＴｇｅｎｅ）の各内在性ＤＮＡ及び内部のλファージ配列（各標準型に対して特有）と、同一の５´末端及び３´末端を有する関心がある遺伝子と同じ大きさの遺伝子に特異的な参照ＤＮＡ（基準ＤＮＡ、ＳＴＤｇｅｎｅ）のセット
２）メチル化ＤＮＡに依存せずに、標的遺伝子のＤＮＡ及び基準遺伝子のＤＮＡの両方にハイブリダイズできる１対の外部プライマー（順方向及び逆方向）
３）順方向及び逆方向の、関心がある標的遺伝子に対する１対のメチル化遺伝子特異的内部プライマー
４）順方向及び逆方向の、１対の基準遺伝子の内部プライマー
５）標的遺伝子ＤＮＡ及び基準遺伝子ＤＮＡにそれぞれハイブリダイズでき、区別可能な色（例えば、６ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ又はＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ）をもつプローブ
【００７０】
２回の連続するＰＣＲ反応を行った。ｃＭｅｔｈＤＮＡＰＣＲ反応＃１（多重反応）：多重反応において、ＤＮＡは、関心があるメチル化領域の側面の配列に特異的な外部プライマーを用いて増幅される。この例において、５０μｌ反応当たり１２種の遺伝子までが、１５０ｐｇ（５０コピーのゲノムＤＮＡ）以上のＤＮＡ鋳型から共増幅される。５０コピーの基準ＤＮＡを含む３００μｌの血清から得られたＤＮＡは、二亜硫酸塩で変換された後に、加工される。
【００７１】
最後の５０μｌ反応は、以下の条件で行った。１６．６ｍＭ  ＮＨ４ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（それぞれ；Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、メアチェン  ニュージャージー州）、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１％ＤＭＳＯ、２ｎｇ／μｌ  各プライマー、１０Ｕ／５０μｌ  プラチナタックポリメラーゼ（インビトロジェン）。サーマルサイクラーの設定は９５℃５分であり、続いて、９５℃３０秒、５６℃４５秒、及び７２℃４５秒の２６サイクル、その後７２℃７分間の最終伸長反応とした。ＰＣＲの終了後、反応混合液は、定量的リアルタイムＰＣＲを行う前に、１×複合希釈バッファー（１×ＭＳＰバッファー、５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（インビトロジェン）、５０μｇ／ｍｌｔＲＮＡ（ロッシュアプライドサイエンス、インディアナ州インディアナポリス）を含む）２００μｌを添加して１：５に希釈した。反応混合液は、−２０℃で凍結保存した。
表２：ＰＣＲ反応＃１の反応条件
【００７２】
【表２】
0006543569.tif 000012
【００７３】
ｃＭｅｔｈＤＮＡＰＣＲ反応＃２（リアルタイム反応）：リアルタイムＰＣＲ反応では、完全な定量法により、２色リアルタイムＰＣＲによって、反応＃１で得た単位複製配列を定量した。各標的遺伝子及びそれに対応する参照基準遺伝子は、同じウェル内で、独立して評価される。各反応において対照を用いて、標的又は参照に対する特異的なハイブリダイゼーションと、何らかの混入がないことを担保した。ｃＭｅｔｈＤＮＡにおいて、メチル化指数（ＭＩ）は、各遺伝子について、以下の式を用いて計算した。
遺伝子メチル化指数＝メチル化遺伝子コピー数／総コピー数（メチル化遺伝子と基準遺伝子の和）×１００
蓄積メチル化指数（ＣＭＩ）は、全ての遺伝子のメチル化指数（ＭＩ）の和として計算した。
【００７４】
リアルタイムＰＣＲ反応は、２０μｌの以下の組成内で行った。１６．６ｍＭ  ＮＨ４ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．８、６．７ｍＭ  ＭｇＣ１２、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１％  ＤＭＳＯ、３００ｎＭ  ＲＯＸ  （インビトロジェン／ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ネブラスカ州）、２００μＭ  ｄＮＴＰ  （Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ  （ロッシュアプライドサイエンス、インディアナ州インディアナポリス）、１．０Ｕ  ＲＡＭＰタックポリメラーゼ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；＃ＣＢ４０８０−９）、８００ｍＭ  順方向及び逆方向の各プライマー（ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州フォスターシティ）、２００ｎＭ  各加水分解プローブ（６ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ又はＶＩＣ／ＴＡＭＲＡ標識、アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ）。
【００７５】
各試料又は各多重反応において、コントロール４μｌを、最終的に１：５００又は１：５００００に希釈して試験を行った。希釈は、１×ＭＳＰバッファー（１６．６ｍＭ  ＮＨ４ＳＯ４、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．８、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  βメルカプトエタノール、０．１％  ＤＭＳＯ、５０μｇ／ｍｌ  サケ精子、５０μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ）で行った。
【００７６】
各遺伝子の基準カーブを作成するため、等コピー数の標的遺伝子及び基準遺伝子を含むストックの分割液を準備した（リアルタイムＰＣＲにおいて増幅点の重ね合わせによって決定した）。各分析において、曲線用ＤＮＡは、サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）内で、連続的に１：１０ずつ７回希釈し、それから使用後に捨てた。４μｌは、２重ウエル内でリアルタイムに分析した。曲線用ＤＮＡのストックを調製するため、多重ＰＣＲ反応プロトコールを用いて、標的遺伝子と基準遺伝子の鋳型を、各遺伝子について、独立に増幅した。増幅には、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ（細胞株ＤＮＡのＳｓｓＩ処理によって広くメチル化されたＤＮＡ又は基準を含むプラスミドＤＮＡ）、４ｎｇの順方向及び逆方向のプライマーを用いた。これらのストックは−８０℃で保存し、そしていつまでも安定である。
【００７７】
多重単位複製配列の完全な定量は、製造者の指示に従い、幾つかの改良を加えて、ＡＢＩ７５００ソフトを用いて行った。自動基準線設定を使用する間、全ての試料（標的遺伝子又は基準遺伝子（例えば、通常は０．０２〜０．０４間のΔＲｎ））について、同様の設定で、手動で閾値を設定し、基準曲線連続希釈液を、最も濃縮した点が２００００００００コピー／ウェルで始まるコピー数に割り当てた。試料の値は、標的及び参照ＤＮＡのカーブから推定され、基準遺伝子曲線の範囲内に入る試料値のみを採用した。各遺伝子のメチル化指数（ＭＩ）は、上記のように計算した。
【００７８】
標的遺伝子及び基準遺伝子のＤＮＡ曲線の理想的な重ね合わせが得られない場合、及び平均ΔＣｔが１．０サイクル未満である場合は、曲線を採用し、コピー数を、以下の方法による後計算で求めた。
１）曲線の全ての点（７ｌｏｇ）の平均ΔＣｔに基づき、倍の差異（Δ１サイクルが２倍）を計算する。
２）最も濃縮した試料の値をこの差異で割る。例：ΔＣｔ基準遺伝子−標的遺伝子＝１．５サイクルであれば、２１．５＝２．８２８、２００，０００，０００コピー／２．８２８倍＝７０７０００００コピー。１ウェルあたりの割り当てた基準遺伝子＝７０，７００，０００コピー、割り当てた標的遺伝子＝２００，０００，０００コピー／ウェル。
表３：ＰＣＲ反応＃２の反応条件
【００７９】
【表３】
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【００８０】
アプライドバイオシステムズ（ＡＢＩ）のＡＢＩ  Ｆａｓｔ  ７５００リアルタイムＰＣＲシステムと、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェルプレート（＃４３４６９０６）を用いた。通常は、基準曲線試料は、Ａ列のウェル１〜１２及びＢ列のウェル１〜２に配置した。また、Ｂ列ウェル３は、多重反応から得られたＮＴＣ（鋳型なしのコントロール）、ウェル４はリアルタイム反応混合液のＮＴＣ、ウェル５は多重反応からの基準ＤＮＡカクテル（標的遺伝子を含まない）、ウェル６は広くメチル化されたゲノムＤＮＡ（参照の基準ＤＮＡを含まない）とした。残ったウェルは、試料によって満たされた。
【００８１】
統計解析。メチル化アレイ解析は、ゲノムスタジオソフトウェア（イルミナ社）を用いて行った。プローブ検出のｐ値は、用いて計算した。
【００８２】
ゲノムスタジオ。Ｄｉｆｆスコアは、偽陽性の検出のためのベンジャミン−ホッホバーグ補正後に、ゲノムスタジオによって計算した。ｃＭｅｔｈＤＮＡデータ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて行った。箱髭図は、マンホイットニー検定によって解析した。受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線解析を用いて、トレーニングセットで感度と選択性を最大化した試験の閾値を決めた。ウィルコクソンの符号順位検定を用いて、処置前及び処置後のメチル化レベルの意義を解析した。
【００８３】
（実施例１）
近年、原発乳癌のゲノムの広いメチル化アレイ及び二亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列により、遺伝子発現プロファイリングによって確認された「固有のサブタイプ」から新たなサブグループが同定された（Breast Cancer Res. 2007;9:R20; Pathobiology. 2008;75: 149-52; Anal Cell Pathol (Amst). 2010;33: 133-41; Cancer EpidemiolBiomarkers Prev. 2007; 16: 1812-21; J Epidemiol. 2012;22:384-94）。乳癌患者の循環ＤＮＡのメチル化プロファイルを包括的に解析する第一の工程として、メチル化アレイ解析は、６名の再発転位乳癌血清、５名の正常血清、２０名の一般的な白血病（それぞれ５名分の４プール）の検出セットで、インフィニウムヒューマンメチレーション２７ビードチップ（イルミナ社）を用いて行った（表１）。２６７５９プローブ（アレイの９７％、プローブ検出のｐ値＜０．０００１）を用いて行われた教師なし階層的クラスター分析により、メチル化ゲノムの独特のプロファイルの存在を示す、癌血清と正常血清の二つの群に分けられることが分かった（図１Ａ）。癌特異的なメチル化の変化が頻発する遺伝子座を同定するため、図１Ｂに概略した図に従って、癌血清を正常血清と比較した。プローブは以下の条件１）〜４）で選択した。
１）全ての試料の中で最も再現性のある成績（癌血清と正常血清；プローブ検出ｐ値＜０．００００１；９７％、２６７５９／２７５７８プローブ）
２）正常な対照に対して、癌血清内のメチル化が２倍以上（９０２／２６７５９プローブ）
３）正常な対照組織（ｎ＝２１）、以前の研究のデータ（１１）、白血病ＤＮＡ（ｎ＝４のプール）に対して、乳癌組織（ｎ＝８９）におけるメチル化が１．５倍以上（２３２／９０２プローブ）
４）それぞれの正常血清試料（ｎ＝５）及びそれぞれの一般的な乳癌組織試料（ｎ＝１５）においてメチル化が低い（≦０．１５β値メチル化）（１７２プローブ）
そして、最後に乳癌の全てのメチル化のサブタイプの中で選択性を最適化して、我々のデータベース中の、３０％かそれより多い乳癌においてメチル化をしているマーカー部に位置する、１３の遺伝子プロモーターを選択した。１７２の癌特異的なＣｐＧプローブを、教師なし階層的クラスター分析の対象とした。これによって、正常血清及び白血病ＤＮＡと癌とを識別した（データを示さず）。図１Ｃ（左側）の散布図は、癌血清に対する正常血清における１７２プローブのβメチル化値の平均を示す。また、図１Ｃ（右側）は、正常な胸部に対する癌組織のものである。ピンク色の点は、表１に示した検証のために選択された１３遺伝子の位置を示す。散布図において、±１．５倍量は赤線示され、中心線は同一のメチル化量を示す。
【００８４】
選ばれた１３プローブのうち７プローブは、われわれが以前再発マーカーの候補として挙げたものと同一であった（ＡＫＲ１Ｂ１、ＡＬＸ1、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＯＸＢ４、ＲＡＳＧＲＦ２、ＴＭ６ＳＦ１）。これらのプローブは、乳癌において結果が乏しいが、これらのマーカーが転位過程に対する生物学的な意味を提供するという可能性が高いことを示した。アレイに用いるために、その後、患者（ｎ＝５）及び正常血清（ｎ＝６）のＤＮＡ試料において、１３プローブのメチル化β値及び頻度が、それぞれ検証された（データは示さず）。これらのプローブは、正常者と比べて、転位患者の血清において頻度を変えて他と異なるように高メチル化され、パネルは乳癌のメチル化マーカーパネルを提供していた可能性が高かった。
【００８５】
（実施例２）
循環腫瘍ＤＮＡにおけるマーカー検出頻度。この例において、正常血清と比べた癌血清における高メチル化した１４の遺伝子の試験を行った。１４遺伝子は、以前の経験に基づく、アレイ解析と同じ１３の新たな遺伝子（ＨＯＸＢ４  ｍｉＲＮＡ、ＲＡＳＧＲＦ２、ＡＲＨＧＥＦ７、ＡＫＲ１Ｂ１、ＴＭＥＦＦ２、ＴＭ６ＳＦ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＧＰＸ７、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ、ＡＬＸｌ、ＤＡＢｌ、ＤＡＢＩＰ２、及びＧＡＳ７）及びＲＡＳＳＦ１Ａである。１４遺伝子のメチル化頻度は、ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイを用いたアレイに用いられた患者及び正常者の血清ＤＮＡ試料を用いて検証された。遺伝子パネルは、パネルから高いバックグラウンド又は低い頻度の遺伝子を除くことで、精錬した（図２Ｂ）。特に、７ユニット（対照の正常血清において「正常」の閾値として設定した値）を超えるメチル化量を示したＡＬＸ１、ＤＡＢＩＰ２、ＤＡＢ１を除き、癌血清におけるメチル化頻度が低いこと（２０％未満）に基づいてＧＡＳ７を除いた。次に、残った１０の遺伝子パネルを、試料のトレーニングセットで評価した（ｎ＝５２、表Ｓ５）。図２Ｃに示すように、統計的な評価により、蓄積メチル化量は転位乳癌の患者において一貫して高いこと、及び癌ではない女性において無視できることが示された（それぞれのＣＭＩの中央値が１１７．３と０．０４、ｐ＜０．０００１、マンホイットニー検定）。
【００８６】
（実施例３）
ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイの技術的な評価、解析直線性、感度。一連の実験を行い、アッセイの直線性及び感度を立証した。３種の異なる血清ＤＮＡ抽出法（ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ、キアゲン；ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ、キアゲン；Ｑｕｉｃｋ−ｇＤＮＡ  Ｐｒｅｐ  Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の試験により、最小限の循環ＤＮＡを単離する最適な方法が確立された。一人の正常人ドナーから得た血清の原版混合物（アッセイあたり３００μｌ血清）に、生理学的な範囲のＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞株から抽出した完全メチル化ＤＮＡ（０、５０、２００、８００、３２００コピー）を加えた。各複製（５−６複製）における変動の係数を、各方法で計算した（図３Ａ）。添加ゲノムＤＮＡが最も少ない５０コピーにおいて、３つの方法何れにおいても最も低いレベルが検出された。そして、正常血清においては、メチル化ＤＮＡは無視できる量であった。しかし、３つのキットのテストにおいて（図３Ａ）、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ法が、アッセイ間の変動係数が最も小さく、最も高い再現性を示した（５０、２００、８００、３２００コピーのメチル化ＤＮＡにおいて、それぞれ、ＣＶ＝２９％、１２％、４．６％、２．５％）。そして、全ての添加ＤＮＡの量で、６回の各アッセイで全ての遺伝子が増幅した。本分野において既知のＤＮＡ抽出方法を、本発明の方法に用いることができることは当業者に理解されるであろう。
【００８７】
（実施例４）
アッセイ間試験。ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイは、我々の研究室で発見したＱＭ−ＭＳＰ法の改良であり、我々の研究室や他人によって、広く用いられる。ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイでは、内部の参照対照として役立つように血清中に基準を添加するのに対し、ＱＭ−ＭＳＰは、内部参照として、自由に循環している各遺伝子の非メチル化ＤＮＡを用いる。ｃＭｅｔｈＤＮＡとＱＭ−ＭＳＰの比較における癌検出の感度の改良を立証するため、添加されたＤＮＡ５０〜３２００コピーに由来する複合反応液の一定分量を、二つの方法によって、同時に試験した（図４Ｂ）。蓄積メチル化量は、添加された全てのメチル化ＤＮＡにおいて、優位にｃＭｅｔｈＤＮＡが高かった（５０コピー、ｐ＝０．００４７；２００コピー、ｐ＝０．００４８；８００コピー、ｐ＝０．００５；３２００コピー、ｐ＝０．００２２、マンホイットニー検定）。患者の試料においてこれらの知見を確認するため、再発した転位乳癌患者から得た血清を、高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａについて、ｃＭｅｔｈＤＮＡ及びＱＭ−ＭＳＰ法によって同時に試験した。高メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａのシグナル強度及び検出頻度は共に、ＱＭ−ＭＳＰに比べて、ｃＭｅｔｈＤＮＡの方が高かった（ｐ＝０．０２３３、対応のあるｔ検定、図４Ｃ）。
【００８８】
（実施例５）
評価者間の再現性。個々の試験者によって独立して精製され、分析された癌患者血清（ｎ＝１３）の検査後に、２人の試験者により得られたｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイ値を比較した。級内相関係数（０．９９；９５％信頼区間０．９６−１．００）を用いて評価された評価者間の再現性は、試験者間の高い再現性を示した（図４Ｄ）。
【００８９】
（実施例６）
転位乳癌患者血清内のメチル化ＤＮＡの検出−アッセイの特異性。転位乳癌患者用の、最適なアッセイの選択性及び特異性の基準を設定することを目的として、正常血清内のメチル化閾値を設定するため、転位乳癌患者（ｎ＝２４）と癌ではない女性（ｎ＝２８、平均年齢）から構成される血清の５２サンプルのトレーニングセットを用いた。受信者操作特性（ＲＯＣ）解析により、患者のトレーニングセットで、最大の感度及び特異性が得られる閾値が６．９ユニットと確認した。アッセイの特異性は、９６．４％（９５％信頼区間＝８１．７−９９．９％）、アッセイの感度は９１．７％（９５％信頼区間＝７３．０−９９．０％）、ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）＝０．９５０（９５％信頼区間＝０．８７３−１．０２３；ｐ＜０．０００１）、分類精度は９４％（４９／５２）、尤度比＝２５．７であった（図５）。これらの試料において、任意の一つの遺伝子に対して、メチル化の平均頻度が高かった（４２％、８−７８％の範囲、図５）。マーカー遺伝子パネルのメチル化の年齢依存的な変化は、正常女性（ｎ＝５５）中の循環ＤＮＡ中では、見られなかった。独立ｔ検定を用いて、正常女性を最も若い４分位数と、最も年長の４分位数とを比較し、そして不等分散（ｐ＝０．６４３）、又は４つのグループすべて間の一元配置分散法により、校正した。
【００９０】
次に、再発した転位乳癌患者血清（ｎ＝３３）、及び正常者の血清（ｎ＝２７）の独立したテストセットを、トレーニングセットで定めたパラメータ（例えば閾値など）を用いて、評価した。閾値を７ユニットに固定した後、アッセイの特異性は１００％（９５％信頼区間＝８７．２−１００％）、アッセイの選択性は９０．９％（９５％信頼区間＝７５．７−９８．１％、ｐ＜０．０００１）、ＲＯＣ曲線下の面積（ＡＵＣ）＝０．９９４（９５％信頼区間＝０．９８４−１．０１％；ｐ＜０．０００１）、分類精度は９５％（５７／６０）、尤度比＝２４．６であった（図５）。トレーニングセットと同様に、それぞれの遺伝子のメチル化平均頻度は高かった（３８．３％、１８−６７％の範囲）；最もメチル化が発生した遺伝子はＲＡＳＳＦ１Ａであった。このように、本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイは、血清内で発見された新たなマーカーを用いて、メチル化アレイで示された２７ＫＣｐＧサイトの検査によって、精度の高いレベルで（９０％を超える）転位乳癌患者における血清内の異常高メチル化を検出した。
【００９１】
（実施例７）
処置への応答を監視するｃＭｅｔｈＤＮＡの利用。これまでの研究では、新たな化学療法方式に対する応答の監視だけでなく、疾病の長期経過の予測においても、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）アッセイの臨床における重要性が明らかにされてきた。同様に、循環腫瘍抗原、腫瘍特異的なＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質を検出する、血漿や血清に基づくアッセイが行われてきた（J Natl Cancer Inst Monogr. 2011;2011(43):75-8）。ｃＭｅｔｈＤＮＡによって評価される我々のメチル化遺伝子マーカーパネルのＣＭＩの変化が化学療法の応答を反映するか否かを判定するため、再発した転位乳癌の患者の血清で、試験的な研究が行われた。患者（ｎ＝２９）を、処置前及び処置後６-１２週に段階分けした。血液は、事前及び治療中に時々に採取した。２９名の患者全員において、治療開始前、及び新たな化学療法開始後３週間に採取した血清を、ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイで試験した。
【００９２】
治療のｄ１およびｄ８−１２の２点で採取した、試験した５８の血清において評価を行った。その結果、安定している疾患、又は治療反応があった患者（ｐ＝０．００１）の血清ＤＮＡメチル化量が、統計的に有意に減少していたが、症状が進行した患者（ｐ＝０．７２８；ウィルコクソンの符号順位検定）には減少は見られなかった。ＲＯＣを使用して最適な選択性と特異性を選び、−０．４６％のカットオフが、非進行患者と進行患者とを、８９％の選択性及び９１％の特異性で識別した（ＡＵＣ＝０．９４５、９５％信頼区間０．８７５−１．０２５、尤度比１．７３）。少ない試料セットだが、データは、本発明のｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイが、治療スケジュールの初期の段階で、治療に反応する変化を明らかにできる能力を有することを示している。これらの知見に基づき、治療中のメチル化量の変化が腫瘍の重量を反映しているか否かを判定する試験的な研究を行った。ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイは１６名の患者の集団から得た血清により行った。これらの血清は、治療の様々な段階中に、３又はそれ以上の時点で採取され（合計７６血清）から利用可能であった。
【００９３】
（実施例８）
メチル化のパターンは、原発腫瘍と転移腫瘍とで維持される。検視（死後４時間以内）で採取した現発腫瘍と遠位の転移腫瘍から得たＤＮＡと用いた以前の研究では、原発部位と遠位転移部位との腫瘍のメチル化プロファイルが似ていることを見出した。そして、以下の仮説がたてた。
１）多重遺伝子のメチル化パターンは、同様に血清にも反映している。
２）多重遺伝子のメチル化パターンは、イメージング及び／又は臨床検査による発見の前に、転移の再発を予測することに役立つかもしれない。
この仮説の第一の見解を検証するため、ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイを用いて、原発癌及び遠位転位癌のセット、及び１０名の患者の死直後に採取した血清のセットを評価した。患者は３３〜７９歳であり、乳癌と診断された後２〜１１年生存した。同じ患者の試料のメチル化遺伝子間で、顕著な一致が見られた（データは示さず）。統計的に、血清と組織間で高いレベルの一致が見られた。血清／組織組み合わせの５０％は、９以上のマーカーで一致し、６以下の一致はなかった。血清試料と組織試料間で観察された一致は、組織と組織の比較でも同様であった。評価された遺伝子の全体頻度に基づき、予測される一致の中央値は７（範囲３〜９）、帰無分布は約７０％の一致割合を示した。これらの知見を強化するため、同様の解析を、原発腫瘍組織及び再発診断時に採取された血液を用いて行った。組織及び血液は、トレーニングセットの１０名の患者、及びステージ４の乳癌患者群１８名の、生体組織検査に利用された、血液、原発腫瘍及び遠位の転移腫瘍組織から得た。ここで再度、ｃＭｅｔｈＤＮＡアッセイによって、顕著な一致が、１０遺伝子パネルのメチル化パターンで見られた（データは示さず）。さらに、この解析では、ステージ４の乳癌患者において、メチル化循環ＤＮＡが、１８／２５（７２％）の患者で検出できた。この試験は、同じ患者の遠位の転移及び血清中で主なメチル化パターンが維持されるという仮説を証明している。また、データは、本発明の方法を用いた、診断での各患者の原発腫瘍の包括的なメチローム解析が、独特のバーコード、又は患者の癌の目印を付与できるであろうことを示唆している。これは、同じ患者で発生した他の癌からも、バーコードや目印となるであろう。
【００９４】
ここで引用した、文献、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって援用されるように個々に及び具体的に記載され、そして完全にここに記載されているのと同じ程度に、参照によってここに援用される。
【００９５】
本発明を記載する文章中（特に、以下の特許請求の範囲の文章中）の、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」の用語及び同様の指示語は、別段に示さない限り、又は明確に文書中で否定されない限り、単数と複数の両方を含むように解釈されるべきである。「備える」「有する」「含む」「含有する」の用語は、別段の言及がない限り、オープンエンドの用語（例えば、含むがこれに限定されない意味）として解釈される。本明細書中での値の範囲の記載は、別段に示さない限り、範囲中に含まれるそれぞれ別個の値を個々に参照する簡略的な方法として用いることを意図しており、それぞれの個々の値は、この中に個々に記載されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、別段に示さない限り、又は明確に文章中で否定されない限り、あらゆる適当な順序で実施することができる。本明細書で用いる、任意の及び全ての例示又は例示の言語（例えば「等」）は、別段の言及がない限り、単に発明をよく説明するために用いることを意図しており、発明の範囲の限定を意図するものではない。明細書中のいかなる言語も、言及されていない要素を、発明の実施に不可欠なものとして解釈をしてはならない。
【００９６】
本発明の好ましい態様は、ここに記載されており、発明者が知る本発明の実施におけるベストモードを含んでいる。好ましい態様の変更は、前記記載を読んだ当業者にとっては明らかであろう。本発明者は、当業者が、そのような変更を適当なものとして採用することを予測している。さらに本発明者は、ここに具体的に記載されたこと以外で本発明が実施されることも意図している。従って、本発明は、準拠法で許容されるようにここに付加される、特許請求の範囲の主題の全ての改良及び同等物を含む。さらに、明細書に別段に示さない限り、又は明確に文章中で否定されない限り、あらゆる変更をした上記記載の要素のいかなる組み合わせも本発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【配列表】
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