(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）間葉幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階と、
（ｂ）前記間葉幹細胞を無血清培地で培養する段階と、
（ｃ）培養１２０時間経過後、幹細胞培養液を収得する段階と、
を含む羊水由来間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法であって、
前記間葉幹細胞は、−８０℃の超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ（登録商標名）溶液で保管したものであり、
前記タンパク質は、ＡＲ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ＧＨ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＳＣＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−５、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−ｂ、ＭＩＰ−ｄ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲＩＩを含む生産方法。
【請求項２】
前記タンパク質は、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ−４、ｂ−ＮＧＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＧＤＦ−１５、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−Ｉ、インスリン、ＭＣＳＦＲ、ＮＧＦＲ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＰＧ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ、ＭＩＧ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＮＦα及びＴＮＦβを追加して含むことを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
前記段階（ｃ）は、１２０時間間隔で、１回ないし３回、幹細胞培養液を収得することを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項４】
前記生産方法は、分泌タンパク質の総濃度が、ＢＣＡ測定法で、３０μｇ／ｍｌないし７０μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載の生産方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のうちいずれか１項に記載の生産方法で生産されたタンパク質を含む間葉幹細胞培養液。
【請求項６】
前記培養液は、コラーゲンを、１０ないし１５重量％で含むことを特徴とする請求項５に記載の間葉幹細胞培養液。
【請求項７】
前記培養液は、線維芽細胞のコラーゲン生成を促進させることを特徴とする請求項５に記載の間葉幹細胞培養液。
【請求項８】
請求項５に記載の間葉幹細胞培養液を含む、皮膚再生用またはしわ改善用の化粧料組成物。
【請求項９】
請求項５に記載の間葉幹細胞培養液を含む皮膚再生用薬学組成物。
【請求項１０】
請求項５に記載の間葉幹細胞培養液を含む、脱毛防止用または発毛促進用の化粧料組成物。
【請求項１１】
請求項５に記載の間葉幹細胞培養液を含む、脱毛治療用または発毛促進用の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多様な成長因子及びサイトカインを含む間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法、前記生産方法で生産されたタンパク質を多量含む間葉幹細胞培養液、前記培養液を含む皮膚再生、しわ改善、脱毛防止、脱毛治療、並びに発毛促進用化粧料組成物及び皮膚再生用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療剤（cell therapy product）は、細胞と組織との機能を復元させるために、生きている自家（autologous）細胞、同種（allogeneic）細胞または異種（xenogeneic）細胞を体外で増殖させたり選別したりするか、その他の方法により、細胞の生物学的特性を変化させるような一連の行為（最小限以上の操作：more-than-minimal manipulation）を介して、治療、診断及び予防の目的に使用する医薬品と定義される。幹細胞治療剤は、細胞治療剤のうち、特に、幹細胞を含むものを意味し、神経疾患、心疾患、肺疾患、肝疾患、癌のように、損失された細胞の回復及び再生が必須でありながらも、自然治癒が困難な疾患に対して活発に開発が進められている。
【０００３】
幹細胞は、多分化性を有しており、特定細胞に分化されるので、細胞治療剤として潜在力が大きいが、今のところでは、体内移植後、生存率が高くなく、免疫拒絶反応を起こし、実際臨床適用で、広範囲に安定して成功した例を探し難い。
【０００４】
そのために、幹細胞治療剤に対する代案として、前記幹細胞の培養液（conditioned media）が注目を集めている。幹細胞培養液とは、細胞を培養した後、得られた細胞を含まない培地として、細胞成長に必須なさまざまな成分（例えば、サイトカイン、成長因子など）が含まれている。幹細胞培養液は、細胞の成長を促進させるために使用されたり、特定成分を分離し出したりするために使用されており、それ以外にも、幹細胞培養液自体で、さまざまな疾患の治療に応用されている。例えば、ヒト間葉幹細胞培養液の肝細胞の死滅抑制、及び肝細胞再生を増大させる効能を利用し、急性の肝疾患治療に適用することができると報告され、ヒト羊水由来間葉幹細胞の培養液は、細胞再生及び傷治癒に有効な成長因子とタンパク質とを含んでおり、これを傷部位に塗布した場合、傷治癒を促進させると報告された。また、脂肪に由来する間葉幹細胞が、血管及び細胞の再生に関与する遺伝子、並びに成長因子を分泌すると報告され、ヒト胚芽幹細胞から分化された肝細胞類似細胞と、該細胞から分泌されたタンパク質を、肝損傷マウスにそれぞれ適用した場合、いずれも肝損傷を回復させると報告された。
【０００５】
しかし、前記研究に使用された培地は、動物由来成分である牛血清、安全性が落ちる緩衝溶液、及び指示薬成分が含まれており、臨床に直接適用し難いという短所がある。また、従来の一般的な細胞培養法の場合、培地から分泌される成分（例えば、成長因子など）の濃度が低く、臨床適用時、患部に幹細胞培養液を多量使用しなければならない問題があり、また濃度を高めるために、濃縮などの操作を行えば、生産コストが顕著に上昇し、経済性が落ちるという問題がある。
【０００６】
かような問題を克服するための多様な試みがなされてきたが、今のところ、満足すべき結果は報告されていない。例えば、ＶＥＧＦなどの特定成長因子の含量を高める目的で、低酸素条件において培養を実施した報告があったが、収得量には限界があった。また、牛血清を排除させるために、無血清培地を使用する場合、幹細胞の幹細胞性（stemness）の維持が困難であり、結局、幹細胞培養液の生理活性が落ち、前記培養液を１回しか得られないというような問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、前述のような問題を解決すべく、幹細胞培養液において、以前の培養方法では、発現されないか、あるいは非常に少量しか発現されないと知られた多様な成長因子及びタンパク質を量産することができる間葉幹細胞培養方法を開発した。さらに、前記培養方法は、特定成長因子を含むタンパク質含量を高めるために、細胞自体に人為的な操作を加える代わりに、無血清培養段階での多様な培養条件を変化させ、成長因子を含む有用タンパク質量産のための最適培養条件を確立したことにより、それを介して生産された間葉幹細胞培養液は、皮膚再生、しわ改善、脱毛防止、脱毛治療及び発毛促進の用途として、人体適用に非常に有用であると期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、多様な成長因子及びサイトカインを含む間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法、前記生産方法で生産されたタンパク質を多量含む間葉幹細胞培養液、前記培養液を含む皮膚再生、しわ改善、脱毛防止、脱毛治療用または発毛促進用の化粧料組成物、及び皮膚再生用薬学組成物を提供することである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法は、既存の方法に比べ、間葉幹細胞から分泌されるタンパク質の種類及び量を著しく増加させ、特に、前記方法によって製造された間葉幹細胞培養液は、多種のサイトカイン及び成長因子を多量含んでおり、皮膚の主要構成成分であるコラーゲンを多量含んでおり、コラーゲン生成促進効果にもすぐれるので、皮膚再生、しわ改善、脱毛防止、脱毛治療及び発毛促進に優秀な効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】幹細胞分泌タンパク質量産のための最適の細胞接種密度条件を確認したグラフである。
【図２】無血清培養時間（１２時間間隔）によるタンパク質生産量を比較したグラフである。
【図３】間葉幹細胞の冷凍保管条件による細胞生存率を比較したグラフである。
【図４】細胞凍結溶液種類による幹細胞の分泌タンパク質を比較したグラフである。
【図５】最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液のタンパク質総量を比較したグラフである。
【図６】最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液の抗体アレイ（antibody array）のスキャンイメージである。
【図７】最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液のコラーゲン合成効能を確認したグラフである。
【図８】最適無血清培養条件及び保管条件で収得された幹細胞培養液の傷治癒効能を比較した図面である。
【図９】毛髪生長抑制モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長促進効果を確認したものであり、試験０日目マウスの被毛状態を示す。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１０】毛髪生長抑制モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長促進効果を確認したものであり、試験４日目マウスの被毛状態を示す。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２はプラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１１】毛髪生長抑制モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長促進効果を確認したものであり、試験８日目マウスの被毛状態を示す。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１２】毛髪生長抑制モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長点数をグラフで示したグラフである。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１３】毛髪生長抑制モデルにおいて、間葉幹細胞培養液を処理したマウスの組織病理学的毛嚢比較写真である。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１４】毛髪生長抑制モデルにおいて、間葉幹細胞培養液を処理したマウスの毛嚢数を比較したグラフである。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１５】生長期毛髪モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長促進効果を確認したものであり、試験１３日目マウスの被毛状態を示す。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１６】生長期毛髪モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長促進効果を確認したものであり、試験１５日目マウスの被毛状態を示す。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１７】生長期毛髪モデルにおいて、間葉幹細胞培養液の毛髪生長点数をグラフで示したものである。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１８】生長期毛髪モデルにおいて、間葉幹細胞培養液を処理したマウスの組織病理学的毛嚢比較写真である。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図１９】生長期毛髪モデルにおいて、間葉幹細胞培養液を処理したマウスの毛嚢数を比較したグラフである。Ｇ１は、蒸溜水対照群、Ｇ２は、プラシーボ対照群、Ｇ３は、試験物質、及びＧ４は、陽性対照群（５％ミノキシジル）を処理したものである。
【図２０】脂肪由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件を検証したグラフである。
【図２１】骨髄由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件を検証したグラフである。
【図２２】臍帯血由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件を検証したグラフである。
【図２３】羊膜由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件を検証したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、１つの様態として、（ａ）間葉幹細胞を、１８，０００ないし２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階と、（ｂ）前記間葉幹細胞を無血清培地で培養する段階と、（ｃ）培養１１４ないし１２６時間経過後、幹細胞培養液を収得する段階と、を含む間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法であって、前記間葉幹細胞は、−９０ないし−７０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液で保管したものであり、前記タンパク質は、ＡＲ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ＧＨ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＳＣＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−５、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−ｂ、ＭＩＰ−ｄ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲＩＩを含む、間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法を提供する。
【００１２】
本発明者らは、幹細胞培養液から、サイトカイン、成長因子など有用なタンパク質を量産するために、幹細胞培養方法を最適化し、前記最適化された幹細胞培養方法から収得された幹細胞培養液は、有用なタンパク質を大量含んでおり、特に、コラーゲンを高レベルで含んでおり、線維芽細胞においてコラーゲン合成を向上させ、優秀な傷治癒（wound healing）能を示すということを確認した。
【００１３】
以下、間葉幹細胞由来タンパク質量産方法の各段階をついて詳細に説明する。
【００１４】
段階（ａ）は、間葉幹細胞を適切な数に分注して接種する段階であって、特に、１８，０００ないし２２，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する段階である。
【００１５】
本発明において用語「幹細胞（stem cell）」とは、適する環境及び刺激を介して、各種細胞に分化することができる能力を備えており、自家増殖能を備えている細胞をいう。
【００１６】
本発明において使用される幹細胞は、分化能及び自家増殖能を備えたものであるならば、その種類が制限されるものではないが、望ましくは、間葉幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cell）でもあり、さらに望ましくは、ヒト脂肪、ヒト臍帯血、ヒト骨髄、ヒト羊水またはヒト羊膜に由来する間葉幹細胞でもある。最も望ましくは、羊水由来間葉幹細胞でもある。
【００１７】
本発明において用語「間葉幹細胞（ＭＳＣ）」とは、軟骨、骨、脂肪、骨髄間質、筋肉、神経などを作るのに援助になる細胞であり、成人では、一般的に骨髄に留まっているが、臍帯血、末梢血液、脂肪、羊水のようなその他組織にも存在し、それらから収得することができる間葉幹細胞を意味し、その由来に、特別に制限されるものではない。
【００１８】
該間葉幹細胞は、生体内において、周辺微細環境（stem cell niche）によって、細胞の分裂、分化または移動など行動様相が異なる。さらに具体的には、該間葉幹細胞は、周辺微細環境から来る刺激によって、遺伝子発現様相が異なり、それにより、分泌タンパク質の種類、及びタンパクの質量も異なる。かような周辺微細環境は、細胞周辺の物理的環境、すなわち、細胞が存在する組織の特性、細胞の位置、付着状態などを含むだけではなく、化学的環境、すなわち、外部のサイトカインまたは成長因子などを含む。
【００１９】
かような傾向は、生体外幹細胞培養でも類似して示されるが、それにより、幹細胞を培養する条件を異ならせることにより、幹細胞から分泌されるタンパク質の種類及び量が異なる。
【００２０】
幹細胞の生体外培養は、保管された幹細胞、初代培養細胞または継代培養細胞を培養容器に分注して接種する過程を含むが、このとき、接種する細胞の密度が、幹細胞分泌タンパク質の種類及び量を異ならせる。それは、直接的または間接的になされる細胞・細胞相互作用（cell-cell interaction）によって、幹細胞の遺伝子発現様相が異なるからである。
【００２１】
本発明において接種される細胞の密度は、１８，０００ないし２２，０００細胞／ｃｍ２密度でもあり、望ましくは、１９，０００ないし２０，０００細胞／ｃｍ２密度でもあり、さらに望ましくは、２０，０００細胞／ｃｍ２密度でもある。
【００２２】
本発明の具体的な一実施例においては、間葉幹細胞を５，０００ないし２５，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種し、分泌タンパク質の濃度を確認した結果、２０，０００細胞／ｃｍ２の密度において、最も高い濃度のタンパク質を発現することを確認した（図１）。特に、２５，０００細胞／ｃｍ２の場合、むしろ細胞数がさらに多いにもかかわらず、タンパク質濃度がさらに落ちるということを確認することができた。従って、間葉幹細胞由来タンパク質を量産するための最適の細胞密度は、約２０，０００細胞／ｃｍ２であるということが分かった。
【００２３】
次に、段階（ｂ）は、間葉幹細胞を無血清培地で培養する段階である。
【００２４】
本発明において用語「培地（culture media）」とは、インビトロ（in vitro）上で、幹細胞の成長及び生存を支持することができるようにする培地であり、幹細胞培養に適切な当分野で使用される一般的な培地をいずれも含む。細胞の種類によって、培地及び培養条件を選択することができる。培養に使用される培地は、望ましくは、細胞培養最小培地（ＣＣＭＭ：cell culture minimum medium）であり、一般的に、炭素源、窒素源及び微量元素成分を含む。かような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）、ＭＥＭ（minimal essential medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α−ＭＥＭ（α−minimal essential medium）、ＧＭＥＭ（Glasgow’s Minimal essential Medium）及びＩＭＥＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）などがあるが、それらに制限されるものではない。また、前記培地は、ペニシリン（penicillin）、ストレプトマイシン（streptomycin）またはゲンタマイシン（gentamicin）などの抗生物質を含んでもよい。
【００２５】
特に、本発明において、前記培地は、無血清培地（serum-free media）であることを特徴とする。血清（serum）は、一般的に、生体外で細胞を培養する場合、培養培地に必須に添加される。血清が添加されていない場合、細胞周期がＧ０期に留まる細胞周期抑制（cell cycle arrest）が起こり、かような状態が持続する場合、細胞老化（senescence）が進んだり、細胞死滅（apoptosis）が起きたりもする。一方、血清が添加される場合、細胞が持続的に増殖することができる。
【００２６】
ヒト血清を大量に得ることは現実的に困難があるので、生体外培養においては、主に牛胎児（fetal bovine）、馬（horse）、ロバ（donkey）などの動物血清を使用する。血清には、多様なサイトカイン及び成長因子が含まれており、細胞増殖を可能にするが、今のところ、血清成分が完全に明らかにはされてはいない。従って、動物由来血清は、免疫反応を誘発したり、特定疾病の発病原因になったりもする危険性を孕んでおり、血清を含んだ培地で培養された細胞または細胞培養液の、人間への適用に対して、副作用の可能性が続けて指摘されており、臨床を進めるにおいても、困難がある。
【００２７】
そのために、本発明においては、人体に適用される場合、安全な細胞培養液を収得するために、間葉幹細胞を無血清培地で培養する段階を含み、間葉幹細胞由来タンパク質を量産する方法を開発した。
【００２８】
段階（ｃ）は、前記間葉幹細胞を無血清培地で培養し、１１４ないし１２６時間経過後、幹細胞培養液を収得する段階である。
【００２９】
前述のように、幹細胞は、培養過程において、外部の刺激によって分泌されるタンパク質の種類及び量が異なり、かような外部刺激に影響を及ぼす因子には、培養時間も含まれる。すなわち、経時的に幹細胞から分泌されるタンパク質の種類及び量が異なり、培養液内に存在するタンパク質の含量も、異なるので、本発明者らは、幹細胞の培養時間による培養液内のタンパク質生産量を比較し、間葉幹細胞を培養してタンパク質を量産するための最適時間条件を確立した。
【００３０】
本発明において、幹細胞培養液を収得するために、幹細胞を培養する時間は、１１４ないし１２６時間でもあり、望ましくは、１１７ないし１２３時間でもあり、さらに望ましくは、１２０時間でもある。
【００３１】
本発明の具体的な一実施例においては、間葉幹細胞を無血清培地で７２ないし１４４時間培養し、それぞれの時間条件で、タンパク質生産量を比較した（図２）。その結果、間葉幹細胞を約１２０時間培養した培養液において、タンパク質生産量が最大になるということを確認することができた。
【００３２】
前記培養液を収得する段階においては、培養容器から、間葉幹細胞で生産されたタンパク質を含む培養液を集める過程を経て、前記収得段階は、１回培養液を収得した後、細胞を緩衝液で洗浄し、さらに新たな培地に交替させた後、１１４ないし１２６時間経過後、幹細胞培養液を追加して収得することができる。かような幹細胞培養液収得過程は、数回反復され、望ましくは、１回ないし３回反復されるが、それらに制限されるものではない。
【００３３】
本発明の具体的な一実施例においては、本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法によって製造された幹細胞培養液を順次に３回収得し、培養液のタンパク質濃度を確認した結果、収得回数が増加するほど、培養液内のタンパク質濃度は、少しずつ低下する現象を示したが、既存方法によって培養された間葉幹細胞培養液に比べては、顕著に多量のタンパク質を含むということを確認した（図５）。従って、かような収得過程は、間葉幹細胞を培養する過程において、数回反復されてもよいということが分かる。
【００３４】
前記間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法は、間葉幹細胞を、−９０ないし−７０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液で保管することを特徴とする。
【００３５】
生体外で細胞を培養する場合、初代培養を介して培養した細胞を、すぐに利用する場合ではなければ、細胞を保管する過程が必須的である。該幹細胞は、自家増殖が可能であり、無限に増殖することができる細胞であるが、生体外培養は、人為的に作られた環境において、癌細胞及び胚芽幹細胞を含むいくつかの細胞を除けば、長期培養時、細胞が老化したり細胞死滅が起きたりし、間葉幹細胞の場合にも、継代培養の限界がある。また、細胞培養には、多くのコスト及び人力が必要であるので、必要時に細胞を培養するように、細胞培養過程には、細胞を保管する過程が非常に重要である。
【００３６】
細胞は、一般的に、凍結保存液に細胞を混合し、超低温状態で保管するが、凍結保存液は、細胞が凍結されたとき、結晶化によって、細胞膜が破壊されることを防止する役割を行う。また、細胞を凍結させる温度が、重要であるが、ＬＮ２（liquid nitrogen）タンクで、−１９６℃で保管するか、あるいはそれより温度が高い超低温冷凍庫において保管することができる。
【００３７】
本発明の具体的な一実施例においては、間葉幹細胞を保管する段階において、凍結保存液の種類による幹細胞分泌タンパク質の生産性を確認した。まず、対照群（１０％ ＤＭＳＯ、２０％ ＦＢＳ及び７０％ ｃＤＭＥＭ）、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ、ＣＲＹＯ−ＲＯＳ、STEM−CELL BANKER及びCell Freezerで凍結保存された細胞の生存性を確認したが、凍結保存液による細胞生存性には、差がなかった（図３）。ただし、前記細胞を培養した培養液のタンパク質濃度を確認した結果、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液を凍結保存液として使用したとき、タンパク質濃度が最も高く示されるということを確認することにより、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液で細胞を保管することが、幹細胞でタンパク質を量産することができる最適条件であるということが分かった（図４）。
【００３８】
本発明の具体的な他の一実施例においては、最適化された培養条件、または従来の培養条件で生産されたヒト羊水由来間葉幹細胞培養液に存在するタンパク質濃度を確認した結果、最適化された培養条件において、タンパク質濃度が著しく上昇したということを確認し（図５）、かような結果は、羊水由来間葉幹細胞だけではなく、脂肪（図２０）、骨髄（図２１）、臍帯血（図２２）及び羊膜（図２３）に由来する間葉幹細胞の培養液においても、類似して示された。従って、本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法は、間葉幹細胞の由来組織に関係なく適用可能であり、前記方法を利用して、間葉幹細胞において有用な成長因子及びサイトカインを含む多様なタンパク質を大量に生産することができる。
【００３９】
本発明においては、間葉幹細胞を培養し、成長因子を含んだタンパク質を量産することを目的とする。前記タンパク質は、既存に間葉幹細胞から分泌されると知られたタンパク質の量を増加させることでもあり、既存に分泌すると知られていなかったが、前記方法によって、新たに分泌するものでもある。
【００４０】
具体的には、本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法によって生産されたタンパク質は、ＡＲ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−７、ＧＨ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＳＣＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−５、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−ｂ、ＭＩＰ−ｄ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲＩＩを含む。
【００４１】
また、本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法を介して、生産された幹細胞培養液は、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ−４、ｂ−ＮＧＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＧＤＦ−１５、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＧＦ−Ｉ、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＭＣＳＦＲ、ＮＧＦＲ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＯＰＧ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＩＧＦ、ＳＣＦＲ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＭＣＰ−１、ＭＣＳＦ、ＭＩＧ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＮＦα及びＴＮＦβを追加して含むものでもある。
【００４２】
本発明において用語「ＦＧＦ−７（fibroblast growth factor ７）」は、ＦＧＦファミリに属しながら、胚芽発達、細胞増殖、細胞分化調節に重要に作用する。正常な組織形成に必要であり、角質形成細胞（keratinocytes）の成長因子と作用し、正常な上皮細胞（epithelialcells）増殖に係わる主な因子である。また、上皮形成、傷の再上皮化、毛髪発達、肺器官形成に重要に関与すると知られている。
【００４３】
本発明において用語「ＩＧＦＢＰ−１（insulin-like growth factor-binding protein １）」は、インシュリン類似成長因子結合タンパク質であり、ＩＧＦの半減期を延長させ、細胞培養において、ＩＧＦの成長促進効果を阻害または刺激する作用を行う。また、細胞の移動（migration）を促進すると知られている。
【００４４】
本発明において用語「ＩＧＦＢＰ−３（insulin-like growth factor-binding protein ３）」は、インシュリン類似成長因子結合タンパク質であり、ＩＧＦＡＬＳ（insulin-like growth factor acid-labile subunit）と結合体を形成し、血漿を循環し、ＩＧＦの半減期を延長させ、細胞培養時、成長促進効果を刺激する作用を行う。前立腺癌などの進行中、タンパク質レベルが低下する。
【００４５】
本発明において用語「ＭＣＳＦ−Ｒ（macrophage colony-stimulating factor receptor）」は、ＭＣＳＦの受容体であり、前記ＭＣＳＦは、造血幹細胞（hematopoietic stem cell）が、大食細胞、または他の関連細胞に分化することに影響を及ぼし、真核細胞において、ウイルス感染に対応して生産され、胎盤発達と関連がある。
【００４６】
本発明において用語「ＮＴ−４（neurotrophin−４）」は、神経栄養因子であり、ＴｒｋＢ受容体チロシンキナーゼを受容体にして信号伝達を行い、末梢感覚交感神経の生存に必要な因子であると知られている。
【００４７】
本発明において用語「ＴＧＦ−β１（transforming growth factor−β１）」は、多くの他の成長因子を、陽性的及び陰性的に調節し、多くの細胞タイプに対して、細胞の増殖、分化、及びさまざまな機能を調節する複合機能を持つタンパク質である。骨母細胞の骨形成などを刺激することにより、骨再形成に対して重要な役割を行い、傷治癒に重要な役割を行う。また、免疫系調節に重要であり、ほとんどの免疫細胞がＴＧＦ−β１が分泌すると知られている。
【００４８】
本発明において用語「ｂＦＧＦ（fibroblast growth factor ２）」は、細胞の生存、細胞分裂、新生血管形成（angiogenesis）、細胞分化及び細胞移住の調節に重要な役割を担当し、傷治癒（wound healing）に重要な役割を担当する。
【００４９】
本発明において用語「ＥＧＦ−Ｒ（epidermal growth factor receptor）」は、上皮細胞成長因子受容体であり、チロシンキナーゼである。
【００５０】
本発明において用語「ＦＧＦ−４（fibroblast growth factor ４）」は、ＦＧＦファミリに属しながら、胚芽発達、細胞増殖、細胞分化調節に重要に作用する。発達タンパク質、成長因子、ミトーゲンとして作用し、胚発達（embryonic development）の間、正常な手足、及び心臓弁膜の発達に必要なタンパク質である。
【００５１】
本発明において用語「ＧＤＦ−１５（growth/differentiation factor１５）」は、ＴＧＦスーパーファミリに属し、ＴＧＦ−ＰＬ、ＭＩＣ−１、ＰＤＦ、ＰＬＡＢ、ＰＴＧＦＢとも知られている。損傷された組織において、そして疾病過程の間、炎症性及び細胞死滅経路を調節する役割を行う。
【００５２】
本発明において用語「ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）」は、肝細胞増殖因子であり、さまざまな種類の間葉細胞から分泌される。細胞増殖促進活性、細胞運動性促進活性、上皮形態形成誘導活性などがあり、神経栄養因子及び血管新生因子として作用する。また、発生過程において、上皮・間葉相互作用の媒介体として、肝臓、腎臓、肺などの内臓器官、胎盤、骨格系の形成に関与し、成体においては、肝臓、腎臓、肺、消化管の再生を促進する器官再生因子としての機能を行うことにより、臓器疾患治療剤として期待されている物質である。
【００５３】
本発明において用語「ＩＧＦＢＰ−４（insulin-like growth factor-binding protein ４）」は、ＩＧＦと結合し、糖化及び非糖化の形態で血漿内を循環し、ＩＧＦの半減期を延長させ、細胞培養において、ＩＧＦの成長促進効果を阻害または刺激する作用を行う。生体内及び生体外において、多くの癌細胞を阻害し、癌細胞に対して細胞死滅因子として作用することにより、前立腺癌、大腸癌などの癌の増殖を減少させると知られている。
【００５４】
本発明において用語「ＩＧＦＢＰ−６（insulin-like growth factor-binding protein ６）」は、タンパク質の細胞表面受容体とＩＧＦとが相互作用を行って結合し、ＩＧＦの半減期を延長させ、細胞培養において、ＩＧＦの成長促進効果を阻害または刺激する作用を行う。
【００５５】
本発明において用語「ＮＴ−３（neurotrophin−３）」は、神経栄養因子であり、脳及び末梢組織において、特に存在し、神経発生（neurogenesis）を促進及び調節するのに寄与するタンパク質である。また、内臓感覚神経細胞及び固有受容性感覚神経細胞の生存を増進させる。毛髪周期のうち退行期において、ＦＧＦ５、ＴＧＦ−１などと共に発現される特徴を有すると知られている。
【００５６】
本発明において用語「ＯＰＧ（tumor necrosis factor receptor superfamily member １１Ｂ）」は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ：osteoprotegerin）及びオステオクラストジェネシス抑制因子（ＯＣＩＦ）としても知られている。骨破壊（骨組織吸収（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ））に対して相殺機能を行う。生体外において、破骨細胞（osteoclasts）活性を阻害し、破骨細胞の細胞死滅を促進する。骨恒常性は、ＴＮＳＦ１１とＴＮＦＲＳＦ１１Ｂとの局所比率による。また、動脈石灰化（arterialcal cification）を予防すると知られている。
【００５７】
本発明において用語「ＰＤＧＦ−ＡＡ（platelet-derived growth factor subunit Ａ）」は、胎児発達、細胞増殖、細胞マイグレーション、生存、走化性などの調節に重要な役割を担当する成長因子である。間葉起源の細胞に対して、マイトジェンとして作用し、傷治癒に重要な役割を行うと知られている。
【００５８】
本発明において用語「ＰＩＧＦ（placenta growth factor）」は、胎盤増殖因子であり、新生血管生成、内皮細胞成長、増殖及びマイグレーションの刺激及び活性化に作用する成長因子として作用する。
【００５９】
本発明において用語「ＶＥＧＦ（vascular endothelialgrowth factorＡ）」は、発達タンパク質、成長因子、ミトーゲンであり、新生血管生成、血管生成、内皮細胞成長を活性化させるのに作用すると知られている。また、内皮細胞増殖を誘導し、細胞マイグレーションを促進し、細胞死滅を阻害し、血管透過性を増進させる役割を担当する。
【００６０】
本発明において用語「Ｇ−ＣＳＦ（granulocyte-colony stimulating factor）」は、顆粒球集落刺激因子受容体として骨を構成し、血液循環を円滑にさせる役割を行う。また、白血球生成を促進し、組織を分化させ、炎症性サイトカイン調節信号であるＪＡＫを調節し、それ以外の他のサイトカイン（ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ）物質の活性を促進させると知られている。
【００６１】
本発明において用語「ＩＣＡＭ−１（intercellular adhesion molecule １）」は、細胞間付着分子であり、炎症細胞の付着及び移動に関与する炎症タンパク質の一種である。血管内側細胞の構造的変化を誘導し、免疫システム細胞を変換させる。
【００６２】
本発明において用語「ＩＬ−６（interleukin ６）」は、beta細胞の抗体生産細胞への最終分化を誘導し、筋肉細胞の役割を行って骨髄細胞を形成する。感染を防ぎ、バクテリアに耐えると知られている。
【００６３】
本発明において用語「ＩＬ−１１（interleukin １１）」は、骨髄の線維芽細胞であり、生物活性が多様であり、血質細胞主の増殖、Ｂリンパ球の分化、造血肝細胞の増殖及び分化、巨核球の増殖及び成熟、造血系に係わる作用、骨格、神経系にも影響を及ぼす。
【００６４】
本発明において用語「ＭＣＰ−１（monocyte chemoattractant protein−１）は、ＣＣケモカインであり、単核球、リンパ球、好塩球などを選択的に誘導し、ＩＬ−１ａ ＴＮＦ−ａ低密度脂タンパク質（ＬＤＬ）などに反応し、基質細胞、絲球体の内皮、細尿管上皮細胞、毛細血管の内皮細胞、及び平滑筋細胞などで生産されている。かような単核球／多核球の浸潤が炎症性腎疾患の病態生理に重要な役割を行っていると知られている。
【００６５】
本発明において用語「ＭＩＰ−１ａ（macrophage inflammatory protein １ alpha）」は、大食細胞炎症性タンパク質アルファ１であり、ＣＣケモカインまたはベータサブファミリの一員である。ＭＩＰ−１アルファ単核球、Ｔ細胞、Ｂ細胞など多様な細胞に対する化学誘引物質として作用すると知られている。
【００６６】
本発明において用語「ＴＩＭＰ−１（ＴＩＭＰ metallopeptidase inhibitor １）は、ＴＩＭＰの構成遺伝要素であり、構成タンパク質である。ＭＭＰの抑制剤役割を行い、細胞死滅を防ぐ機能を行うと知られている。
【００６７】
本発明において用語「ＴＩＭＰ−２（ＴＩＭＰ metallopeptidase inhibitor ２）は、ＴＩＭＰの構成遺伝要素であり、ＭＩＴＦによって、メラノサイト細胞を調節すると知られている。
【００６８】
本発明において用語「ＴＮＦＲＩ（tumor necrosis factor-and ＴＮＦ receptor Ｉ）は、腫瘍懐死因子伝達物質であり、大食細胞によって体内で生成されるタンパク質である。ＴＮＦ関連サイトカインは、自家免疫疾病に係わっており、特に、Ｔ細胞を刺激させると知られている。
【００６９】
前記タンパク質は、いずれも従来の間葉幹細胞培養方法では、分泌されないか、あるいは極めて少量分泌されるものであったが、本発明において最適化した培養方法を介して、新たに分泌するか、あるいは分泌量が増加するということを確認した（表３及び表４）。
【００７０】
本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法を介して、前記タンパク質を、既存の培養方法で分泌する量よりも、さらに多量を生産することができる。かように、多種の有用な成長因子及びサイトカインを含むタンパク質を量産することにより、所望の標的タンパク質を生産、精製して収得するのに非常に効果的であり、さらには、皮膚再生及びしわ改善用の組成物に利用されてもよい。
【００７１】
前記生産方法を介して、得られた分泌タンパク質の総濃度は、それに制限されるものではないが、ＢＣＡ測定法で、３０μｇ／ｍｌないし７０μｇ／ｍｌでもある。
【００７２】
本発明は、他の１つの様態として、前記間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法で生産されたタンパク質を含む間葉幹細胞培養液を提供する。
【００７３】
該間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法、及びそこから製造された間葉幹細胞培養液は、前述の通りである。
【００７４】
前記幹細胞培養液は、コラーゲンを、全体培養液の５ないし２０重量％で含むものでもあり、望ましくは、１０ないし１５重量％で含むものでもあるが、それらに制限されるものではない。
【００７５】
また、前記幹細胞培養液は、線維芽細胞のコラーゲン生成を促進させるものでもある。
【００７６】
本発明の具体的な一実施例においては、本発明の幹細胞培養液内に含有されたコラーゲン含量を絶対定量し、既存方法で生産された幹細胞培養液と比較した結果、総検出されたタンパク質の１２．４重量％がコラーゲンとして検出され、既存方法に比べ、２倍以上のコラーゲン含量を有するということを確認した（表６）。
【００７７】
本発明の他の具体的な一実施例においては、本発明の幹細胞培養液をヒト線維芽細胞に処理した結果、線維芽細胞のコラーゲン合成能を向上させるということを確認し（図７）、それは、機能性告示原料であるアデノシンと比較し、１３倍以上の著しい効果を示すものである。
【００７８】
本発明は、さらに他の１つの様態として、前記間葉幹細胞培養液を含む皮膚再生用またはしわ改善用の化粧料組成物を提供する。
【００７９】
前記間葉幹細胞培養液については、前述の通りである。
【００８０】
本発明において使用される用語「皮膚再生」は、皮膚の外部原因及び内部原因による損傷に対して、皮膚組織の回復過程を意味する。前記外部原因による損傷は、紫外線、外部汚染物質、創傷、外傷などを挙げることができ、前記内部的原因による損傷は、ストレスなどを挙げることができる。
【００８１】
本発明において使用される用語「しわ改善」は、皮膚のしわ及び弾力を維持または強化させることを意味する。
【００８２】
本発明の具体的な一実施例においては、前記間葉幹細胞培養液において、皮膚再生能及びしわ改善能を評価することができる傷治癒試験（wound healing assay）を介して、既存方法で培養して得られた間葉幹細胞培養液に比べ、著しい効果を確認した（図８）。それは、前述のように、本発明の間葉幹細胞培養液が、傷治癒に効果的なタンパク質を大量に含んでいるためであり、それにより、本発明の間葉幹細胞培養液を含む組成物が、皮膚再生及びしわ改善の用途に活用されるということが分かる。
【００８３】
本発明においては、前述の間葉幹細胞培養液は、前述の効果を示すことができる適切な量で含まれる。
【００８４】
また、本発明による化粧料組成物は、前記間葉幹細胞培養液以外にも、必要によっては、本発明の効果を低下させない範囲内において、皮膚外用剤に、一般的に使用する各種成分、例えば、水溶性成分、粉末成分、油分、界面活性剤、補湿剤、粘度調節剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色素などを配合して構成されてもよい。
【００８５】
本発明による化粧料組成物の剤形は、任意に選択することができ、有効成分である間葉幹細胞培養液と共に、水、生理食塩水、グリセロール、油分、界面活性剤、補湿剤、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤及び香料のような既公知の化粧料用賦形剤が混合され、ローション剤（lotiones）、液剤、乳剤、エマルジョン剤、懸濁液剤（懸濁剤）、錠剤及びカプセル剤（capsules）の形態をなす化粧料組成物が形成される。前記化粧料組成物を使用し、柔軟化粧水、ミルクローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、クレンジングフォーム、クレンシングウォーター、パックまたはボディーオイルなどの基礎化粧料、及びファウンデーション、リップスティック、マスカラーまたはメーキャップベースなどの色調化粧料を製造することができ、また洗顔剤及び入浴剤を製造することができる。
【００８６】
かような化粧料組成物の間葉幹細胞培養液が、皮膚に吸収及び固定されることを促進するように、化粧料用賦形剤内にグリセリン１〜７重量％が含まれ、間葉幹細胞培養液含有化粧料組成物が構成されてもよいが、それに制限されるものではない。
【００８７】
また、化粧料組成物に抗酸化機能を提供するように、化粧料用賦形剤内にサンフラワーオイル（sunflower oil）が含まれてもよいが、それに制限されるものではない。
本発明は、さらに他の１つの様態として、前記間葉幹細胞培養液を含む皮膚再生用薬学組成物を提供する。
【００８８】
前記間葉幹細胞培養液については、前述の通りである。
【００８９】
本発明の組成物は、傷治癒試験を介して、既存の方法によって培養された間葉幹細胞培養液より優秀な傷治癒効能があるので（図８）、皮膚再生用薬学組成物として使用されてもよい。
【００９０】
本発明において使用される皮膚再生用薬学組成物の処理量は、薬学的に有効な量でなければならない。本発明において使用される用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率であり、疾患治療に十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体種類及び重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素、及びその他医学分野に周知の要素によって決定される。有効量は、当業者に認識されているように、処理の経路、賦形剤の使用、及び他の薬剤と共に使用することができる可能性によって変わる。
【００９１】
本発明の皮膚再生用薬学組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速であって、持続されたり遅延されたりする放出を提供するように、当業界に周知の方法を使用して、薬学的剤形に製造される。
【００９２】
従って、本発明の薬学的組成物は、一般的な方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形や、外用剤及びパッチ形態に剤形化して使用され、組成物の製造に一般的に使用する適切な担体、賦形剤または希釈剤を追加して含んでもよい。前記担体は、非自然担体（non-naturally occurring carrier）を含んでもよい。
【００９３】
例えば、本発明の薬学組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を有することができる。製剤化する場合には、一般的に使用する充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調剤される。
【００９４】
本発明は、さらに他の１つの様態として、前記間葉幹細胞培養液を含む脱毛防止用または発毛促進用の化粧料組成物を提供する。
【００９５】
本発明は、さらに他の１つの様態として、前記間葉幹細胞培養液を含む脱毛治療用または発毛促進用の薬学組成物を提供する。
【００９６】
前記間葉幹細胞培養液、化粧料組成物及び薬学組成物は、前述の通りである。
【００９７】
本発明において使用される用語「脱毛防止」は、脱毛現象を予防して抑制することを意味し、「脱毛治療」は、脱毛症状を改善させたり緩和させたりすることを意味する。本発明において、前記脱毛とは、頭皮から毛髪が脱落する現象、または毛髪が薄くなったり細くなったりする状態を意味し、その発生の直間接的な原因を問わず、当業界において脱毛として分類される全ての症状を含む意味として使用される。例えば、前記脱毛は、血液循環不良、ホルモンによる皮脂過剰分泌、過酸化物または細菌などによる頭皮機能低下、老化、遺伝的要因、ストレス、それらの複合的な作用などによる脱毛症状をいずれも含んでもよい。
【００９８】
本発明において使用される用語「発毛」は、新たな毛髪生成の促進だけではなく、既存毛髪が健康に育つようにすることを含み、当業界で利用される他の用語「養毛」促進または「育毛」促進の意味を含む広義の概念である。
【００９９】
人間及び動物の毛髪は、生長期、退行期及び休止期によって構成された毛髪周期を繰り返す。本発明の具体的な実施例においては、マウスを利用した動物試験を介して、毛髪の生長期から退行期への転換を遅延させる効果（退行期抑制効果または生長期延長効果）と、休止期から生長期への転換を促進させる効果（生長期誘導効果）とを確認することにより、本発明の幹細胞培養液の脱毛防止、脱毛治療及び発毛促進の効力を評価した。ヒト毛髪は、個々人の毛髪の毛髪周期が異なるが、マウスの場合、初期には、全ての毛髪が同一毛髪周期にあり、また人為的な方法により、毛髪周期を同一に合わせることができ、毛髪周期変化を見る実験に有用である。
【０１００】
また、本発明の実施例で使用したＣ５７ＢＬ／６マウスは、色素を作るメラニン細胞が、表皮には存在せずに毛嚢にのみ存在するために、毛嚢のメラニン色素の量によって、色が決定される特性を有している。毛嚢でのメラニン色素合成は、生長期にしかなされないために、生長期には、皮膚色が黒色になり、メラニン色素合成がなされない退行期及び休止期には、色がピンク色になる。かような特性を利用して、皮膚組織検査を行わなくとも、色を介した毛髪周期を確認することができるという長所がある。また、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、生後４ないし７週齢になれば、ほとんどの毛がいずれも休止期になり、色は、ピンク色になる。また、休止期状態の毛髪を同時に抜いて除去すれば、全ての毛髪を同時に生長期に転換させることができる。
【０１０１】
本発明の具体的な一実施例においては、退行期抑制効果を評価するために、休止期状態のＣ５７ＢＬ／６マウスの毛を除去して生長期を誘導した後、デキサメタゾン（dexamethasone）のような退行期誘導薬物で試験物質を処理しながら、毛髪生長レベル及び毛嚢の数を観察し、退行期抑制程度を評価した。その結果、図９ないし図１４のように、間葉幹細胞培養液処理群が、脱毛防止効果及び発毛促進効果があると示された。
【０１０２】
また、本発明の具体的な他の一実施例においては、生長期誘導効果を評価するために、休止期状態であるＣ５７ＢＬ／６マウスの背中毛を刈った後、試験物質を処理しながら、毛髪生長レベル及び毛嚢の数を観察し、生長期誘導程度を評価した。その結果、図１５ないし図１９の結果比較から分かるように、間葉幹細胞培養液処理群が、発毛促進効果があるということが分かった。
【０１０３】
以上のように、本発明は、動物モデルを介して、本発明の間葉幹細胞培養液が、脱毛防止、脱毛治療及び発毛促進にいずれも寄与するということを究明した。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例を介して、本発明についてさらに詳細に説明する。それら実施例は、ただ本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものであると解釈されるものではない。
【０１０５】
実施例１．細胞接種密度別最適条件確認
最適細胞接種密度条件を探すために、多様な細胞接種密度別に収得された幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量をＢＣＡ測定法で調査した。培養容器に、それぞれ５，０００細胞／ｃｍ２密度、１０，０００細胞／ｃｍ２密度、１５，０００細胞／ｃｍ２密度、２０，０００細胞／ｃｍ２密度、２５，０００細胞／ｃｍ２密度で、ヒト羊水由来間葉幹細胞（human amniotic fluid derived cell、ANGIOCRINE、ｃａｔ．＃ｈＡｍｎｉｏ−０１）を接種した後、１２０時間無血清培養して得られた幹細胞培養液に対して、総タンパク質含量を測定した。具体的な培養条件及び培養過程は、次の通りである。
【０１０６】
まず、冷凍された間葉幹細胞１ｘ１０６個を解凍し、Ｔ７５フラスコに接種した。このときの培地は、１０％牛胎児血清（fetal bovine serum、Gibco、Austria origin）、及び１００μｇ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン（Gibco）とを含むＤＭＥＭ（low glucose、Welgene）を使用した。その後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで３日間培養し、フラスコに７０ないし９０％ほど細胞が増殖すれば、１：３比率で、２回あるいは３回継代培養を実施し、十分な細胞を確保した。各継代培養は、フラスコに、７０％を超えないほどにし、継代培養期間は、３ないし５日ほど必要となった。前記継代培養後、培養容器表面に付着した細胞を除いた全ての培地を除去し、Ｄ−ＰＢＳで２回あるいは３回洗浄した。２ｍｌトリプシン−ＥＤＴＡを入れ、細胞を培養容器表面から取り除き、１５ｍｌチューブに前記細胞を移した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、全ての培地成分を除去した。新たなフラスコに、無血清培地であるＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加し、細胞密度を、１０，０００ないし２５，０００細胞／ｃｍ２に接種した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで培養した。１２０時間後、培養液を収去した。
【０１０７】
前記過程で収去した培養液は、ＢＣＡ定量法を利用して、タンパク質濃度を定量した。具体的な実験過程は、次の通りである。
【０１０８】
まず、７ｍｌの培養液からタンパク質を抽出した。１Ｘ ＰＢＳ（GIBCO、ＮＹ、米国）を２０ｍｌまで充填した後、２０ｍｌ Vivaspin３Ｋフィルタ（ＧＥ Healthcare、Chalfont Ｓｔ．Giles、英国）を利用して、４℃で４，０００ｒｐｍで３０分間４回遠心分離し、試料を濃縮させた。濃縮過程は、１Ｘ ＰＢＳを続けて入れながら進めた。１ｍｌほどまで濃縮されれば、５００μｌ Vivaspin３Ｋフィルタ（ＧＥ Healthcare、Chalfont Ｓｔ．Giles、英国）を利用して、４℃で１４，０００ｒｐｍで３０分間４回遠心分離し、３００μｌまで濃縮させた。
【０１０９】
次に、ＢＣＡ定量キット（Thermo Fisher Scientific Ｉｎｃ、Rockford、ＩＬ、米国）を利用して、タンパク質定量準備を行った。まず、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（bovine serumal bumin）アンプルを希釈し、下記表１の標準サンプルを作った。
【０１１０】
【表１】
0006609034.tif 000002
【０１１１】
次に、作動試薬を準備した。ＢＣＡ試薬Ａ，Ｂを、常温で５０：１で混ぜた。次に、９６ウェルプレートに、標準サンプルと、前述の得られた幹細胞培養液濃縮物とを２５μｌずつローディングした後、作動試薬を２００μｌずつローディングした。前記過程は、３回反復して遂行した。サンプルがローディングされた９６ウェルプレートを、Multiskan ＦＣ（Thermo Fisher ScientificＩｎｃ、Rockford、ＩＬ、米国）に入れた後、３７℃で３０分間インキュベーションした。３０分後、常温に冷やした後、５６２ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１２】
その結果、細胞接種密度によって、それぞれ２２．７７４μｇ／ｍｌ、３１．８３１μｇ／ｍｌ、４１．３２７μｇ／ｍｌ、５１．９３３μｇ／ｍｌ及び４９．７１１μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を確認することができた。２０，０００細胞／ｃｍ２の細胞接種密度において、タンパク質濃度が最大であると確認され、２５，０００細胞／ｃｍ２接種密度においては、かえって２０，０００細胞／ｃｍ２接種密度においてより、総タンパク質含量が減少する結果を確認した。結果として、無血清培養段階において、幹細胞から分泌されるタンパク質の高度生産のための最適幹細胞接種密度は、２０，０００細胞／ｃｍ２であるということを確認することができた（図１）。
【０１１３】
実施例２．培養時間によるタンパク質生産量比較
培養容器に、ヒト羊水由来幹細胞を接種した後、培養液を収去するまでの無血清培養時間による幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量をＢＣＡ測定法でもって調査した。培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種し、無血清培養後、７２時間から１４４時間まで、毎１２時間間隔で得られた幹細胞培養液に対して、タンパク質濃度を測定した。細胞の種類、培養方法及びタンパク質濃度測定方法は、前記実施例１と同一に遂行し、無血清培養時間を異ならせた。
【０１１４】
その結果、無血清培養時間が、７２時間目から、８４時間、９６時間、１０８時間及び１２０時間のときに得られた幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量は、それぞれ２６．９３４μｇ／ｍｌ、２８．６４７μｇ／ｍｌ、３７．６７４μｇ／ｍｌ、３８．４００μｇ／ｍｌ、４４．５２０μｇ／ｍｌと増加するということを確認することができた。しかし、無血清培養時間が１２０時間が過ぎ、１３２時間及び１４４時間のときに得られた幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量は、それぞれ４１．１６６μｇ／ｍｌ及び３９．６１０μｇ／ｍｌと、むしろ１２０時間に得られた幹細胞培養液より減少するということを確認した（図２）。
【０１１５】
前記結果に照らし、無血清培養時間が約１２０時間のとき、幹細胞から分泌される総タンパク質の含量が最大になるということを確認することができた。
【０１１６】
実施例３．間葉幹細胞の凍結保管条件による細胞生存率比較
間葉幹細胞を凍結保管する条件、具体的には、凍結保存液種類による幹細胞の生存率を比較し、最適保管条件を確立した。一般的に、間葉幹細胞を凍結保管するためには、１０％ ＤＭＳＯ、２０％ ＦＢＳ及び７０％ ｃＤＭＥＭの培地を混合した細胞保管培地（cell banking media）１ｍｌを、凍結保管用バイアルに、幹細胞１ｘ１０６個と共に入れ、−１９６℃液体窒素タンクに保管するが、それと共に、間葉幹細胞の保管及び細胞生存率、並びに保管された幹細胞を解凍し、無血清培養を介して得られた幹細胞分泌タンパク質の生産性をさらに向上させる多様な凍結保存液を比較した。同一継代のヒト羊水由来間葉幹細胞１ｘ１０６個、及び多様な凍結保存液１ｍｌと共に凍結保管用バイアルに入れ、−８０℃超低温冷蔵庫に２週間保管した後で解凍し、細胞生存率を測定して比較し、使用された凍結保存液は、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ（Revive Organtech、Ｃａｔ．＃１０００３）、ＣＲＹＯ−ＲＯＳ（Revive Organtech、Ｃａｔ．＃１０００２）、STEM−CELL BANKER（Zenoaq、Ｃａｔ．＃ＢＬＣ−３）及びCell Freezer（Genenmed、Ｃａｔ．＃ＧＥＮ−１０００−０５０）の４種を使用した。具体的な実験方法は、次の通りである。
【０１１７】
まず、冷凍保管された細胞チューブを取り出し、３７℃恒温水槽に入れ、約２分間続けて振りながら溶かした。冷凍された細胞が約９０％ほど溶ければ、１０ｍｌ成長培地を入れておいた１５ｍｌチューブに移した。次に、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、細胞ペレットに１０ｍｌ成長培地を添加した。次に、９６ウェルプレートに、細胞溶液２０μｌを入れ、０．４％トリパンブルー２０μｌを入れた後、ピペッティングして良好に混合した。次に、血球計算板（hemocytometer）に覆いガラスを覆い、両側隙間に混合液を、１０μｌずつ入れた。次に、顕微鏡の倍率を４０倍に合わせ、細胞数を測定した。このとき、青色に染色された死んだ細胞をまず数え、染色されていない生きている細胞を数えた。メモリ付け４区域を数え、メモリ付け１マスの生きている細胞数平均を出した。次の公式によって、全ての生きている細胞数を計算した。
【０１１８】
［数１］
生きている細胞＝メモリ付け１マスの生きている細胞数ｘ２ｘ１０４ｘ細胞溶液体積
【０１１９】
次に、次の公式によって、細胞生存率（cell viability）を計算した。
［数２］
細胞生存率＝生きている細胞数／（生きている細胞数＋死んだ細胞水）ｘ１００
【０１２０】
その結果、既存に知られた冷凍保管方法（対照群；１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭ）で、液体窒素タンクに２週間保管してから解凍させた間葉幹細胞は、平均８４．４１％の細胞生存率を示すということを確認し、細胞凍結保存液であるＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ、ＣＲＹＯ−ＲＯＳ、STEM−CELL BANKER及びCell Freezerと共に、−８０℃で２週間保管してから解凍させた間葉幹細胞は、それぞれ平均９２．２５％、８９．１５％、９１．９２％及び８６．５５％の細胞生存率を示すということを確認したが、Cell Freezerを除いた残り３種の細胞保存液は、既存に知られた凍結保管方法に比べ、優秀な細胞生存率を示した（図３）。
【０１２１】
実施例４．細胞凍結保存液による間葉幹細胞の分泌タンパク質含量比較
前記実施例３で使用した多様な細胞凍結保存液に冷凍保管されてから解凍した人体羊水由来間葉幹細胞を、前記実施例１及び実施例２を介して確立した無血清培養条件、すなわち、培養容器に２０，０００細胞／ｃｍ２密度で細胞を接種した後、無血清培養後、１２０時間目に収去した幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量を、ＢＣＡ測定法でもって調査して比較した。
【０１２２】
既存の冷凍保管方法（対照群；１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭ）によって２週間液体窒素タンクで保管された幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、１２０時間の無血清培養後、収去した幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量は、３７．７５４μｇ／ｍｌであり、細胞凍結保存液であるＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ、ＣＲＹＯ−ＲＯＳ、STEM−CELL BANKER及びCell Freezerと共に、−８０℃で２週間保管してから解凍させた間葉幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、１２０時間の無血清培養後、収去した幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量は、それぞれ５１．０３０μｇ／ｍｌ、４６．２２９μｇ／ｍｌ、３３．８０３μｇ／ｍｌ及び２０．４７７μｇ／ｍｌであり、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液で保管した幹細胞において、最も多くのタンパク質が分泌されるということを確認した（図４）。
【０１２３】
前記結果に照らし、既存の液体窒素タンクで保管した間葉幹細胞に比べ、多様なＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液で保管した幹細胞の細胞生存率及びタンパク質生産量が最も優秀であり、ＣＹＲＯ−ＧＯＬＤを利用して、−８０℃で幹細胞を保管する方法が、幹細胞分泌タンパク質の含量を最も増加させることができる最適保管方法であるということを確認することができた。
【０１２４】
実施例５．最適培養条件で収得された幹細胞培養液収得回数の比較
次に、既存に知られた無血清培養条件及び凍結保管条件で収得された幹細胞培養液と、本発明を介して確立された最適無血清培養条件及び凍結保管条件で収得された幹細胞培養液との内に存在する総タンパク質含量を、ＢＣＡ測定法でもって調査して比較した。前記培養液は、１２０時間間隔で総３回収得した。既存培養液は、−１９６℃液体窒素タンクで、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭの混合培地と共に、保管された間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目、２１６時間目にそれぞれ収去した幹細胞培養液を意味し、新規培養液は、−８０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液と共に、保管された間葉幹細胞を、培養容器に２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目、３６０時間目にそれぞれ収去した幹細胞培養液を意味する。
【０１２５】
その結果、既存の冷凍保管方法（−１９６℃、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭ）で保管された間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目、２１６時間目に得られた幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量は、それぞれ４．１８７μｇ／ｍｌ、４．５２μｇ／ｍｌ及び２．６８６μｇ／ｍｌであり、３回にわたって生産された総タンパク質含量は、平均３．６μｇ／ｍｌレベルと測定された。
【０１２６】
一方、新たに確立された冷凍保管方法（−８０℃、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ）で保管された間葉幹細胞を同一培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目、３６０時間目に得られた幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量は、４４．５２μｇ／ｍｌ、３５．６９μｇ／ｍｌ及び２８．７４μｇ／ｍｌと、平均３６．３μｇ／ｍｌであり、タンパク質含量が顕著に増加したということを確認することができた（図５）。
【０１２７】
前記結果に照らし、本発明を介して確立された最適細胞保管及び無血清培養条件を介して収得されたヒト羊水由来間葉幹細胞分泌タンパク質の含量が１０倍以上向上したということを確認することができた。
【０１２８】
実施例６．最適培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液内に含有された成長因子の抗体アレイ（antibody array）を介した定量比較
前記実施例１ないし実施例５を介して確立された間葉幹細胞の培養及び保管条件で生産されたタンパク質の種類を定性分析した。
【０１２９】
Fullmoon BioSystems社のSignaling Explorer Antibody Array（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＥＴ１００）で、総１３５７種のタンパク質に対して、２回反復して定性分析を行った。具体的な試験方法は、次の通りである。
【０１３０】
まず、タンパク質試料５０μｇに、標識緩衝液（labelling buffer）を利用して、総７５μｌに合わせた後、ビオチン／ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−dimethylformamide）溶液でビオチン標識を進めた。前記標識されたタンパク質は、スライドにプローブでもって付着された抗体と結合する。
【０１３１】
次に、スライドとタンパク質との結合を防ぐためにブロッキングを行い、カップリング試薬と塊になることを防ぐために、粉乳でカップリング混合液を作った後、ブロッキング過程を経た抗体マイクロアレイスライドにカップリングを進めた。前記過程を介して、プローブである抗体に標識されたタンパク質が結合される。
【０１３２】
次に、前記結合過程を経たタンパク質は、蛍光を利用して検出し、それをスキャナで読取り、蛍光程度を数値化した。スキャニングされたタンパク質アレイデータは、データ分析過程を経て、それぞれのタンパク質の発現程度を数値化した。
【０１３３】
ＧｅｎｅＰｉｘ ４００Ｂ（Agilent）スキャナ及びＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ ６．０（Agilent）Image Analysisを介してスキャニングし、全体スポットに対する標準化は、Genowiz ４．０（Ocimum Biosolutions、インド）ソフトウェアを介して行った。
図６はスキャニングされた抗体アレイデータの写真を示し、分析結果を下記表２に示した。
【０１３４】
【表２Ａ】
0006609034.tif 000003
【表２Ｂ】
0006609034.tif 000004
【表２Ｃ】
0006609034.tif 000005
【表２Ｄ】
0006609034.tif 000006
【表２Ｅ】
0006609034.tif 000007
【表２Ｆ】
0006609034.tif 000008
【表２Ｇ】
0006609034.tif 000009
【表２Ｈ】
0006609034.tif 000010
【表２Ｉ】
0006609034.tif 000011
【表２Ｊ】
0006609034.tif 000012
【表２Ｋ】
0006609034.tif 000013
【表２Ｌ】
0006609034.tif 000014
【表２Ｍ】
0006609034.tif 000015
【表２Ｎ】
0006609034.tif 000016
【表２Ｏ】
0006609034.tif 000017
【表２Ｐ】
0006609034.tif 000018
【表２Ｑ】
0006609034.tif 000019
【表２Ｒ】
0006609034.tif 000020
【表２Ｓ】
0006609034.tif 000021
【表２Ｔ】
0006609034.tif 000022
【表２Ｕ】
0006609034.tif 000023
【表２Ｖ】
0006609034.tif 000024
【表２Ｗ】
0006609034.tif 000025
【表２Ｘ】
0006609034.tif 000026
【表２Ｙ】
0006609034.tif 000027
【表２Ｚ】
0006609034.tif 000028
【表２ＡＡ】
0006609034.tif 000029
【表２ＡＢ】
0006609034.tif 000030
【表２ＡＣ】
0006609034.tif 000031
【表２ＡＤ】
0006609034.tif 000032
【表２ＡＥ】
0006609034.tif 000033
【表２ＡＦ】
0006609034.tif 000034
【表２ＡＧ】
0006609034.tif 000035
【表２ＡＨ】
0006609034.tif 000036
【表２ＡＩ】
0006609034.tif 000037
【表２ＡＪ】
0006609034.tif 000038
【表２ＡＫ】
0006609034.tif 000039
【表２ＡＬ】
0006609034.tif 000040
【０１３５】
前記表に示されたように、本発明の間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法を介して、従来間葉幹細胞で生産されないか、あるいは微量しか生産されないと知られていた多様な成長因子及びサイトカインを含むタンパク質が量産されたということを確認した。
【０１３６】
実施例７．最適培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液内に含有された成長因子の成長因子アレイ（growth factor array）を介した定量比較
前記実施例１ないし実施例５を介して確立された間葉幹細胞培養及び保管条件で生産されたタンパク質を定量分析した。
【０１３７】
具体的には、既存に知られた無血清培養条件及び冷凍保管条件で収得されたヒト羊水由来幹細胞培養液と、本発明を介して確立された最適無血清培養条件及び冷凍保管条件で収得されたヒト羊水由来幹細胞培養液との内に存在する成長因子の含量を、マイクロアレイ定量法でもって調査して比較した。
【０１３８】
既存培養液は、−１９６℃液体窒素タンクで、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭの混合培地と共に保管された間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、−８０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液と共に保管された間葉幹細胞を培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
【０１３９】
また、前記マイクロアレイは、Raybiotech Quantibody Human Growth Factor Array １（Ｃａｔ．＃ＱＡＨ−ＧＦ−１）を利用した。具体的な実験方法は、次の通りである。
【０１４０】
まず、Quantibody Human Cytokine Antibody Array Ｑ１０００（Ray Biotech、Ｉｎｃ．）からスライドガラスを取り出し、室温で乾燥させた。次に、７種類の濃度で、サイトカイン標準溶液希釈液を製造した。次に、スライド各ウェルに、サイトカイン標準溶液または試液を添加し、室温で１ないし２時間置いた後、添加された溶液を除去し、水洗い溶液で５回水洗いした。次に、各ウェルに、抗体複合溶液を８０μｌずつ添加し、１ないし２時間培養した。培養後、水洗い溶液で２回水洗いした後、水洗い溶液を完全に除去した。次に、シアニン蛍光染料が結合されたストレプトアビジン８０μｌを各ウェルに添加し、アルミニウム箔を覆い、光を遮断するか、あるいは暗所下で１時間培養した。培養後、添加された溶液を除去し、水洗い溶液で５回水洗いした後、各ウェルから水洗い溶液を完全に除去した。
【０１４１】
最後に、マイクロアレイレーザスキャナを利用して、前記標本を分析し、標準溶液検出量を比較し、試料のサイトカイン含有量を計算した。
【０１４２】
その結果、総５６個の比較対象成長因子内において、既存の冷凍保管方法（−１９６℃、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭ）で保管されたヒト羊水由来間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目、２１６時間目に得られた幹細胞培養液を混合した培養液内では、検出されていない成長因子のうち２３個の成長因子が、新たに確立された冷凍保管方法（−８０℃、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ）で保管された同一培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目、３６０時間目に得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在しているということを確認した。また、総５６個の比較対象成長因子のうち残り３３個成長因子については、最小５１％ないし最大２７６，４００％まで成長因子の含量が増加するということを確認した（表３）。
【０１４３】
【表３Ａ】
0006609034.tif 000041
【表３Ｂ】
0006609034.tif 000042
【０１４４】
次に、既存に知られた無血清培養条件及び冷凍保管条件で収得された脂肪由来間葉幹細胞培養液と、本発明を介して確立された最適無血清培養条件及び冷凍保管条件で収得された脂肪由来間葉幹細胞培養液との内に存在する成長因子の含量を、マイクロアレイ定量法でもって調査して比較した。測定試料は、既存培養液は、−１９６℃液体窒素タンクで、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭの混合培地と共に保管された脂肪由来間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、−８０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液と共に保管された脂肪由来間葉幹細胞を培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。また、マイクロアレイは、Raybiotech Quantibody Human Growth Factor Array １（Ｃａｔ．＃ＱＡＨ−ＧＦ−１）を利用した。実験方法は、前記ヒト羊水由来間葉幹細胞で遂行した方法と同一である。
【０１４５】
その結果、総１８個の比較対象成長因子において、既存の冷凍保管方法（−１９６℃、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭ）で保管された脂肪由来間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目、２１６時間目に得られた幹細胞培養液を混合した中では検出されていない成長因子のうち６個の成長因子が、新たに確立された冷凍保管方法（−８０℃、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ）で保管された脂肪由来間葉幹細胞を同一培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目に得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在するということを確認した。また、総１８個の比較対象成長因子のうち残り１２個成長因子については、最小１３３％ないし最大８,８３３％まで成長因子の含量が増加するということを確認した（表４）。
【０１４６】
【表４】
0006609034.tif 000043
【０１４７】
結論として、本発明において確立した間葉幹細胞由来タンパク質の量産方法は、既存の方法に比べ、間葉幹細胞から分泌されるタンパク質の含量を増加させるか、あるいは新規したタンパク質を分泌させる効果があるということを確認した。
【０１４８】
実施例８．最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液内に含有されたコラーゲン含量絶対定量
コラーゲンは、皮膚再生及びしわ改善において、重要な役割を行うと周知されているので、既存に知られた無血清培養及び保管条件で収得された間葉幹細胞培養液と、本発明を介して確立された最適無血清培養及び保管条件で収得された間葉幹細胞培養液との内に含有されたコラーゲン含量を、絶対定量方法でもって調査して比較した。
【０１４９】
既存培養液は、−１９６℃液体窒素タンクで、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭの混合培地と共に保管された間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、−８０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液と共に保管された間葉幹細胞を培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
具体的な実験方法は、次の通りである。
【０１５０】
ＢＣＡ定量法を利用して、検液のタンパク質を定量し、そのうち１００μｇを取り、凍結乾燥を実施した。乾燥された試料を、６Ｍウレア２５μｇに添加して溶かした後、９０℃で２０分間反応を進めた。１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸、４％ドデシル硫酸ナトリウム、及び６Ｍウレア緩衝溶液に溶解された０．２Ｍ重炭酸アンモニウム溶液２５μｌを入れ、３７℃で３０分間反応させた後、アシルアミド／ビスアシルアミド（４０％ｖ／ｖ２９：１）を利用して、試料にゲルを固めた。試料が含まれたゲルに対して、１ｍｌ蒸溜水を添加し、１日反復して交替させつつ残余洗浄を実施した。５０％アセトニトリル、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを順に１ｍｌ添加し、それぞれ１日反復して交替させつつ残余洗浄を実施した。
【０１５１】
次に、乾燥した試料を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．３、１００μｌ）に溶かし、１Ｍジチオトレイトール５μｌを添加して良好に混合した後、５５℃で３０分間反応を進めた。
【０１５２】
次に、二硫化結合還元反応を終えた試料に、１Ｍヨードアセトアミド５μｌを添加した後、常温で遮光した状態で、３０分間カルバミドメチル化反応を進め、完全に乾燥させた。
【０１５３】
次に、乾燥された試料を、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液１００μｌに良好に混合した後、トリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）２μｌを添加した後、約１８時間３７℃で反応を進めた。次に、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液２００μｌ、０．１％（ｖ／ｖ）トリフロオロ酢酸２００μｌ、アセトニトリルに溶解された０．１％トリフロオロ酢酸１００μｌ、及びアセトニトリル溶液１００μｌでそれぞれ１時間ずつ抽出した。抽出した試料を冷凍させ、完全に乾燥させた後、８０℃で３０分間反応させ、重炭酸アンモニウムの分解を進めた。
【０１５４】
次に、前記試料を取り、Oasis ＳＰＥ（Waters社）のカラムに入れ、真空を利用して、脱塩を実施して完全に乾燥させた。
【０１５５】
次に、標準タンパク質ペプチドを、０．１％ギ酸１ｍｌ（４００ｎＭ）に溶解させ、標準タンパク質ペプチド溶液を準備した。次に、トリプシン加水分解を行った試料に、２μｌの前記標準タンパク質ペプチドタンパク質溶液を添加した後（最終濃図１０ｎＭ）、０．１％ギ酸９８μｌを追加して添加し、最終１００μｌになるように準備し、質量分析を実施した。このときの条件は、下記の通りである。
【０１５６】
＜ＮＡＮＯ ＵＰＬＣ運用条件＞
−カラム：
・nanoAcquity ＢＥＨ３００ Ｃ１８、１．７μｍｘ１５０ｍｍ
・温度：４０℃
−移動相：
・移動相Ａ：０．１％ｖ／ｖギ酸
・移動相Ｂ：０．１％ｖ／ｖギ酸、アセトニトリル
【表５】
0006609034.tif 000044
・流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
・注入量：３μｌ
【０１５７】
＜質量分析運用条件＞
−装備：Synapt Ｇ２−ＳｉＨＤＭＳ（Waters、英国）
−source：NanoLockSpray Ｅｘａｃｔ Ｍａｓｓ ionization source Positive
−質量分析設定条件
・毛細管（ｋＶ）：３．０
・電圧（Ｖ）：３０
・温度（℃）：１２０
・スキャン時間（ｓｅｃ）：０．５
【０１５８】
前記質量分析を介して得られた結果は、ProteinLynx Global Server（ＰＬＧＳ）Ｖｅｒ．３．０を利用して、タンパク質同定及び絶対定量を実施した。タンパク質同定は、International Protein IndexのHuman Database（Ｖｅｒ．３．８７）を利用して実施し、絶対定量は、標準ＢＳＡ（SwissProt Ｐ２７６９）の質量値情報を基に行った。
それぞれ総３０μｇのタンパク質試料について定量した結果、本発明の最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液は、既存培養液対比で、約２３０％コラーゲン含量が上昇したということを確認した（表６）。
【０１５９】
【表６】
0006609034.tif 000045
【０１６０】
実施例９．最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液のコラーゲン合成効能比較
ヒト線維芽細胞（ＣＣＤ−９８ｓｋ、human fibroblast cell）を使用して、本発明を介して確立された最適無血清培養及び保管条件で収得された間葉幹細胞培養液の細胞内コラーゲン生成試験を行った。細胞内コラーゲン生成試験のための検液濃度を設定するために、検液濃度設定予備試験を行った結果、検液濃度０ないし０．５％において、細胞毒性が誘発されないと確認され、そのうち最大濃度である０．５％（タンパク質定量値基準）を、細胞内コラーゲン生成試験のための検液濃度として設定して行い、陽性対照物質は、しわ改善機能性告示原料であるアデノシン（adenosine）の告示含量である０．０４％を使用した。
【０１６１】
細胞内コラーゲン生成試験を行った結果、陽性対照群（０．０４％アデノシン）と比較した結果、アデノシンに比べ、１３倍以上コラーゲン生成を促進させる結果を確認した（図７）。
【０１６２】
従って、本発明の間葉幹細胞培養液は、コラーゲンを多量に含んでいるだけではなく、線維芽細胞のコラーゲン生成を誘導する効能があるので、皮膚再生及びしわ改善に効果があるということが分かる。
【０１６３】
実施例１０．最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液の傷治癒（woundhealing）効能比較
既存に知られた無血清培養及び保管条件で収得された間葉幹細胞培養液と、本発明を介して確立された最適無血清培養及び保管条件で収得された間葉幹細胞培養液との傷治癒効能を調査して比較した。
【０１６４】
既存培養液は、−１９６℃液体窒素タンクで、１０％ ＤＭＳＯ＋２０％ ＦＢＳ＋７０％ ｃＤＭＥＭの混合培地と共に保管された間葉幹細胞を培養容器に、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目に収去して混合した幹細胞培養液を意味し、新規培養液は、−８０℃超低温冷凍庫において、ＣＲＹＯ−ＧＯＬＤ溶液と共に保管された間葉幹細胞を培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
【０１６５】
ヒト線維芽細胞を培養容器に７．５ｘ１０５個ずつ接種した後、マイクロチップを利用して傷つけた後、写真撮影を介して、傷の間隔を測定した直後、既存培養液と新規培養液とをそれぞれ３ｍｌずつ処理し、１２時間後再び写真撮影を行い、傷間隔を測った。
その結果、本発明の最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液は、既存培養液対比で、約７９％上昇した傷治癒効果を示した（図８）。
【０１６６】
実施例１１．最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液の毛髪生長抑制モデルにおける生長促進効能比較
Ｃ５７ＢＬ／６miceを使用して、本発明の間葉幹細胞培養液の発毛効力を調べるための比較試験を行った。
【０１６７】
試験動物を除毛させた後、除毛剤を処理し、休止期から生長期に誘導した後、さらに被毛の生長を抑制するために、除毛後８日から、０．１％デキサメタゾン（dexamethasone）を５日間反復経皮投与して生長を抑制した。次に、本発明の間葉幹細胞培養液が３％含有された試験物質の生長促進効力を比較するために、それぞれＧ１（蒸溜水対照群）、Ｇ２（プラシーボ対照群）、Ｇ３（試験物質）及びＧ４（陽性対照群：ミノキシジル５％）を８日間反復経皮投与し、生長促進効力を試験物質と比較した。
【０１６８】
育毛に対する肉眼的観察結果（表７、及び図９ないし図１２）、試験物質投与４日目から被毛が灰色に変化が始まり、投与８日目、発毛程度を判定した結果、Ｇ１：１．７０点、Ｇ２：１．４５点、Ｇ３：３．５０点、Ｇ４：２．６８点と観察された。結論として、試験物質投与群が、対照群及びプラシーボ対照群に比べ、統計学的に有意に増加したということを確認した（ｐ＜０．０１）。
【０１６９】
【表７】
0006609034.tif 000046
Ｇ１：蒸溜水対照群、Ｇ２：プラシーボ対照群、Ｇ３：試験物質、Ｇ４：陽性対照群（５％ミノキシジル）
点数：０〜１９％（０）、２０〜３９％（１）、４０〜５９％（２）、６０〜７９％（３）、８０〜１００％（４）
＊＊：significantdifference compared with vehicle control group value、ｐ＜０．０１
＃＃：significant difference compared with placebo group value、ｐ＜０．０１
【０１７０】
また、組織病理学的検査を介して毛嚢数を測定した結果（表８、図１３及び図１４）、Ｇ１：５４．３７個、Ｇ２：５３．９７個、Ｇ３：１０５．５３個、Ｇ４：６６．３７個と判定され、やはり試験物質投与群が、対照群及びプラシーボ対照群に比べ、統計学的に有意に増加したということが分かった（ｐ＜０．０１）。
【０１７１】
【表８】
0006609034.tif 000047
Ｇ１：蒸溜水対照群、Ｇ２：プラシーボ対照群、Ｇ３：試験物質、Ｇ４：陽性対照群（５％ミノキシジル）
＊＊：significant difference compared with vehicle control group value、ｐ＜０．０１
＃＃：significant difference compared with placebo group value、ｐ＜０．０１
【０１７２】
前記結果に照らし、本試験条件で、生長期毛髪Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルに、０．１％デキサメタゾンを５日間投与し、生長抑制の誘導と同時に、本発明を介して確立されたヒト間葉幹細胞培養液が含有された試験物質を８日間反復経皮投与した結果、陽性対照群であるミノキシジルよりも、毛髪の生長促進に顕著にすぐれる効果があるということを確認することができた。
【０１７３】
実施例１２．最適無血清培養及び保管条件で収得された幹細胞培養液の生長期毛髪モデルでの生長促進効能比較
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、本発明の間葉幹細胞培養液の養毛効力を調べるための比較試験を行った。
【０１７４】
試験動物の被毛を、休止期から生長期に誘導して除毛した後、本発明の間葉幹細胞培養液が３％含有された試験物質の生長促進効力を比べるために、それぞれＧ１（蒸溜水対照群）、Ｇ２（プラシーボ対照群）、Ｇ３（試験物質）及びＧ４（陽性対照群−ミノキシジル５％）を、１４日間反復経皮投与し、生長促進効力を試験物質と比較した。
育毛に対する肉眼的観察結果（表９、表１０、及び図１５ないし図１７）、１３日目発毛程度は、Ｇ１：１．４７点、Ｇ２：１．３３点、Ｇ３：２．５３点、Ｇ４：３．２７点に判定され、１５日目発毛程度は、Ｇ１：３．０５点、Ｇ２：２．８０点、Ｇ３：３．６０点、Ｇ４：３．７８点と判定され、１３日目及び１５日目の試験物質投与群が、対照群及びプラシーボ対照群に比べ、統計学的に有意に増加したということを確認した（ｐ＜０．０１）。
【０１７５】
【表９】
0006609034.tif 000048
Ｇ１：蒸溜水対照群、Ｇ２：プラシーボ対照群、Ｇ３：試験物質、Ｇ４：陽性対照群（５％ミノキシジル）
点数：０〜１９％（０）、２０〜３９％（１）、４０〜５９％（２）、６０〜７９％（３）、８０〜１００％（４）
＊＊：significant difference compared with vehicle control group value、ｐ＜０．０１
＃＃：significant difference compared with placebo group value、ｐ＜０．０１
【０１７６】
【表１０】
0006609034.tif 000049
Ｇ１：蒸溜水対照群、Ｇ２：プラシーボ対照群、Ｇ３：試験物質、Ｇ４：陽性対照群（５％ミノキシジル）
点数：０〜１９％（０）、２０〜３９％（１）、４０〜５９％（２）、６０〜７９％（３）、８０〜１００％（４）
＊＊：significant difference compared with vehicle control group value、ｐ＜０．０１
＃＃：significant difference compared with placebo group value、ｐ＜０．０１
【０１７７】
また、組織病理学的検査を介して毛嚢数を測定した結果（表１１、図１８及び図１９）、Ｇ１：８７．８０個、Ｇ２：１０３．５７個、Ｇ３：１３０．６３個、Ｇ４：１０４．７０個と判定され、やはり試験物質投与群が、対照群及びプラシーボ対照群に比べ、統計学的に有意に増加したということを確認した（ｐ＜０．０１）。
【０１７８】
【表１１】
0006609034.tif 000050
Ｇ１：蒸溜水対照群、Ｇ２：プラシーボ対照群、Ｇ３：試験物質、Ｇ４：陽性対照群（５％ミノキシジル）
＊＊：significant difference compared with vehicle control group value、ｐ＜０．０１
＃＃：significant difference compared with placebo group value、ｐ＜０．０１
【０１７９】
前記結果に照らし、本試験条件で、生長期毛髪Ｃ５７ＢＬ／６マウスモデルに、本発明を介して確立されたヒト間葉幹細胞培養液が含有された試験物質を、１４日間反復経皮投与した結果、皮膚の生長促進に優秀な効果があるということを確認することができた。
【０１８０】
実施例１３．脂肪由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件の検証
本発明の最適無血清培養条件が、他の組織由来の間葉幹細胞にも、適用可能であるか否かということを確認するために、ヒト脂肪由来間葉幹細胞（STEMPRO Human Adipose-Derived Stem Cells、INVITROGEN、Ｃａｔ．＃Ｒ７７８８−１１０）を、実施例５と同一方式で、２つの無血清培養条件でそれぞれ培養して収得された幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量を、ＢＣＡ測定法でもって調査して比較した。
【０１８１】
既存培養液は、培養容器に脂肪由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
【０１８２】
その結果、培養容器にヒト脂肪由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、１２．４６μｇ／ｍｌであり、同一培養容器にヒト脂肪由来間葉幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、１８．２７μｇ／ｍｌと、５０％以上向上したタンパク質含量を確認することができた（図２０）。
【０１８３】
前記結果に照らし、本発明を介して確立されたヒト間葉幹細胞分泌タンパク質の含量を極大化することができる最適無血清培養条件は、ヒト羊水由来間葉幹細胞だけではなく、ヒト脂肪由来間葉幹細胞についても、適用が可能であるということを確認することができた。
【０１８４】
実施例１４．骨髄由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件の検証
本発明の最適無血清培養条件が、他の組織由来の間葉幹細胞にも、適用可能であるか否かということを確認するために、ヒト骨髄由来間葉幹細胞（Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell、SCIENCELL、Ｃａｔ．＃７５００）を、実施例５と同一方式で、２つの無血清培養条件でそれぞれ培養して収得された幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量を、ＢＣＡ測定法でもって調査して比較した。
【０１８５】
既存培養液は、培養容器に骨髄由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目に収去した幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ収去した幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
【０１８６】
その結果、培養容器にヒト骨髄由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、２８．１６μｇ／ｍｌであり、同一培養容器にヒト骨髄由来間葉幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目に得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、３８．７８μｇ／ｍｌと、３７％以上向上したタンパク質含量を確認することができた（図２１）。
【０１８７】
前記結果に照らし、本発明を介して確立されたヒト間葉幹細胞分泌タンパク質の含量を極大化することができる最適無血清培養条件は、ヒト羊水由来間葉幹細胞だけではなく、ヒト骨髄由来間葉幹細胞についても、適用が可能であるということを確認することができた。
【０１８８】
実施例１５．臍帯血由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件の検証
本発明の最適無血清培養条件が、他の組織由来の間葉幹細胞にも適用可能であるか否かということを確認するために、ヒト臍帯血由来間葉幹細胞（Human Umblical Mesenchymal Stem Cell、SCIENCELL、Ｃａｔ．＃７５３０）を、実施例５と同一方式で、２つの無血清培養条件でそれぞれ培養して収得された幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量を、ＢＣＡ測定法でもって調査して比較した。
【０１８９】
既存培養液は、培養容器に臍帯血由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ収去した幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ収去した幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
【０１９０】
その結果、培養容器にヒト臍帯血由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、２０．０５６μｇ／ｍｌであり、同一培養容器にヒト臍帯血由来間葉幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目に得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、３８．９９１μｇ／ｍｌと、９４％以上向上したタンパク質含量を確認することができた（図２２）。
【０１９１】
前記結果に照らし、本発明を介して確立されたヒト間葉幹細胞分泌タンパク質の含量を極大化することができる最適無血清培養条件は、ヒト羊水由来間葉幹細胞だけではなく、ヒト臍帯血由来間葉幹細胞についても、適用が可能であるということを確認することができた。
【０１９２】
実施例１６．羊膜由来間葉幹細胞培養液での最適無血清培養条件の検証
本発明の最適無血清培養条件が、他の組織由来の間葉幹細胞にも適用可能であるか否かということを確認するために、ヒト羊膜由来間葉幹細胞（Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell、SCIENCELL、Ｃａｔ．＃７５０１）を、実施例５と同一方式で、２つの無血清培養条件でそれぞれ培養して収得された幹細胞培養液内に存在する総タンパク質含量を、ＢＣＡ測定法でもって調査して比較した。
【０１９３】
既存培養液は、培養容器に羊膜由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目に収去した幹細胞培養液を混合した培養液を意味し、新規培養液は、培養容器に、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した後、無血清培養し、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ収去した幹細胞培養液を混合した培養液を意味する。
【０１９４】
その結果、培養容器にヒト羊膜由来間葉幹細胞を、１０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、７２時間目、１４４時間目及び２１６時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、２７．２６９μｇ／ｍｌであり、同一培養容器にヒト羊膜由来間葉幹細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ２密度で接種した無血清培養条件で、１２０時間目、２４０時間目及び３６０時間目にそれぞれ得られた幹細胞培養液を混合した培養液内に存在する総タンパク質含量は、４８．３７９μｇ／ｍｌと、７７％以上向上したタンパク質含量を確認することができた（図２３）。
前記結果に照らし、本発明を介して確立されたヒト間葉幹細胞分泌タンパク質の含量を極大化することができる最適無血清培養条件は、ヒト羊水由来間葉幹細胞だけではなく、ヒト羊膜由来間葉幹細胞についても、適用が可能であるということを確認することができた。
【０１９５】
前記結果を総合すれば、本発明において確立された最適無血清培養条件は、間葉幹細胞由来タンパク質を量産する方法として、羊水由来間葉幹細胞だけではなく、脂肪由来、骨髄由来、臍帯血由来及び羊膜由来の間葉幹細胞についても、適用が可能であるので、間葉幹細胞であるならば、由来に関係なく適用され、それを介して得られた間葉幹細胞培養液は、多様な成長因子とサイトカインとを多量に含むので、皮膚再生用及びしわ改善用の組成物として利用することができる。
【０１９６】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明が、その技術的思想や必須特徴を変更せずとも、他の具体的な形態で実施されるということを理解することができるであろう。それと関連し、以上で記述した実施例は、全ての面において、例示的なものであって、限定的なものではないということが理解されなければならない。本発明の範囲は、前述の詳細な説明よりは、特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出される全ての変更、または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものであると解釈されなければならない。
【図１】
0006609034.tif 000051
【図２】
0006609034.tif 000052
【図３】
0006609034.tif 000053
【図４】
0006609034.tif 000054
【図５】
0006609034.tif 000055
【図６】
0006609034.tif 000056
【図７】
0006609034.tif 000057
【図８】
0006609034.tif 000058
【図９】
0006609034.tif 000059
【図１０】
0006609034.tif 000060
【図１１】
0006609034.tif 000061
【図１２】
0006609034.tif 000062
【図１３】
0006609034.tif 000063
【図１４】
0006609034.tif 000064
【図１５】
0006609034.tif 000065
【図１６】
0006609034.tif 000066
【図１７】
0006609034.tif 000067
【図１８】
0006609034.tif 000068
【図１９】
0006609034.tif 000069
【図２０】
0006609034.tif 000070
【図２１】
0006609034.tif 000071
【図２２】
0006609034.tif 000072
【図２３】
0006609034.tif 000073