(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）分離された細胞にプロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物とミトコンドリアの分裂を調節することができると予想される候補化合物を処理する候補化合物処理段階であって、前記ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物が、下記化学式（１）のプロトパナキサジオール（ＰＰＤ）または下記化学式（２）のコンパウンド−Ｋ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ−Ｋ、Ｃ−Ｋ）である、候補化合物処理段階；
【化１】
0006535107.tif 000004
【化２】
0006535107.tif 000005
（ｂ）前記候補化合物を処理した細胞内ミトコンドリアの分裂水準を測定する段階；及び
（ｃ）前記候補化合物を処理しない陰性対照群と比較して、前記ミトコンドリアの分裂水準を促進または抑制する候補化合物を選別する段階を含む、ミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記分離された細胞が、インスリン分泌細胞またはがん細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物を含む、ミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング用組成物であって、前記ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物が、プロトパナキサジオール（ＰＰＤ）またはコンパウンド−Ｋ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ−Ｋ、Ｃ−Ｋ）である、組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物を含む、ミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング方法に関し、より具体的には、本発明は、プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物が処理された細胞を用いて、ミトコンドリア分裂調節剤をスクリーニングする方法、前記ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を含むミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング用組成物及び前記組成物を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアはほとんどの真核細胞に存在する細胞性小器官である。ミトコンドリアの主な機能の一つは、酸化性リン酸化であり、前記過程を介してブドウ糖または脂肪酸のような燃料物質の代謝から由来するエネルギーがＡＴＰに転換され、これは多様なエネルギー要求生合成及び他の代謝性活性を推進させるために使用される。
【０００３】
構造的に、ミトコンドリアは外膜（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）と内膜（ｉｎｎｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）で構成されており、絶え間なく動いて（ｍｏｖｅ）、融合（ｆｕｓｉｏｎ）して、分裂（ｆｉｓｓｉｏｎ）するダイナミックな細胞小器官である。ミトコンドリアは互いに連結された管状ネットワーク（ｔｕｂｕｌａｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ）を形成しており、ミトコンドリア結合−分裂機作（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｆｕｓｉｏｎ−ｆｉｓｓｉｏｎ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によりその形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）と数が精巧に調節されている。ミトコンドリア結合に関与するタンパク質としては、ミトフシン１（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ  １；Ｍｆｎ１）、ミトフシン２（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ  ２；Ｍｆｎ２）、Ｏｐａ１などが知られており、ミトコンドリア分裂に関与するタンパク質としては、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１などが知られている。
【０００４】
一方、１９９０年代以後からミトコンドリアを構成する主要成分が細胞死滅に重要な役割をすることが明らかになって、細胞死滅において非常に重要な位置を占めることになった。細胞死滅が誘導されると、様々な細胞死滅調節タンパク質、小胞体（ＥＲ）、細胞質に存在するカルシウムイオン及びこれと関連したタンパク質がミトコンドリアに移動して、ミトコンドリア形態タンパク質（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ｓｈａｐｉｎｇ  ｐｒｏｔｅ）によりミトコンドリアの分裂及び断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）が誘発される。断片化されたミトコンドリアは、膜電位が喪失されて外膜が損傷され、これにより外膜の透過性が増加されるが、このような外膜の透過性が増加されることにより、前記外膜を通じてミトコンドリア内の色々なタンパク質（例えば、シトクロム−Ｃなど）が細胞質に放出されることと同時に、ミトコンドリア核が凝集されてミトコンドリアＤＮＡが切断され、ミトコンドリアの機能が中断されて、これにより細胞が死滅する。このようなミトコンドリア媒介性細胞死滅機作は、様々な細胞で広範囲で観察されており、特に、パーキンソン病、遺伝性視神経症のような様々な退行性神経疾患の発症の原因になると知られている。
【０００５】
ここで、ミトコンドリアの損傷により誘発される疾患を予防または治療することを目的に、前記ミトコンドリアの損傷を抑制することができる製剤を開発しようとする研究が活発に進行されている。例えば、特許文献１には、ミトコンドリアのヒドロキシラジカルによる損傷を効果的に抑制するジヒドロキシベンズアルデヒド化合物が開示されており、特許文献２にはミトコンドリア損傷を誘導するストレスの調節において重要な役割を行うＮ−末端が除去されたユビキチンＣ−末端加水分解酵素Ｌ１を有効成分として含むパーキンソン病予防及び治療用組成物が開始されている。このように、ミトコンドリア損傷を調節する製剤が開発されているが、これら製剤開発は比較的ゆっくりと進行されていて、その理由は、前記製剤がミトコンドリア損傷に与える効果を確認するためには多くの費用と時間がかかるからである。もし、多様なミトコンドリア損傷調節剤を効果的に発掘することができる方法が開発されれば、ミトコンドリアの損傷による疾患を治療できる製剤をより効果的に開発しうると予想されている。
【０００６】
このような背景の下、本発明者らはミトコンドリアの損傷を調節することができる製剤を効果的に発掘しうる方法を開発しようと鋭意努力した結果、分離された細胞でミトコンドリアの分裂を促進させることができるＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を用いる場合、ミトコンドリア損傷抑制剤を効果的に発掘しうることを確認し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国公開特許第２００２−００４２０２０号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２０１４−００００７３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの目的は、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物が処理された細胞を用いて、ミトコンドリア分裂調節剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を含むミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記組成物を含むミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニングキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、多様なミトコンドリアの損傷を調節することができる製剤を効果的に発掘しうる方法を開発しようと、様々な研究を実行していたところ、ミトコンドリアの分裂現象に注目するようになった。通常、ミトコンドリアは融合と分裂を繰り返して、その活性を調節することになるが、融合されたミトコンドリアは、ＡＴＰ生成のようなミトコンドリアの主な機能を行うことができ、分裂されたミトコンドリアは、ミトコンドリアの数を増殖させてミトコンドリアの全体的な活性を向上させる。また、ミトコンドリアの分裂はミトコンドリアの損傷による分節化時にも発生するため、ミトコンドリアの分裂はミトコンドリアを活性化させることも、損傷させることもできる重要な役割を行うことが知られている。したがって、前記ミトコンドリアの分裂を調節することができる製剤を開発すれば、これを使用してミトコンドリアの損傷に起因する疾患をより効果的に治療することができる。
【００１１】
このように、ミトコンドリアの分裂を調節する製剤を開発するためには、ミトコンドリアを人為的に分裂状態に維持させなければならないので、本発明者らは、ミトコンドリアの分裂を誘導することができる製剤を開発しようと様々な研究を行っていたところ、プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物がミトコンドリアの融合に関与するタンパク質（例えば、Ｍｆｎ２など）の発現を減少させ、ミトコンドリアの分裂に関与するタンパク質（例えば、ＯＰＡ−３など）の発現を増加させることを確認した。
【００１２】
したがって、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を処理した細胞にミトコンドリアの分裂を調節すると予想される候補物質を処理し、これからミトコンドリアの分裂有無を確認する場合、ミトコンドリア分裂調節剤を効果的にスクリーニングすることができることも確認しており、このようにＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を使用してミトコンドリア分裂調節剤をスクリーニングする方法は、従来に公知されず、本発明者によって最初に開発された。
【００１３】
前述した目的を達成するために、本発明は一つの様態として、分離された細胞にプロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物とミトコンドリアの分裂を調節することができると予想される候補物質を処理し、前記細胞からミトコンドリアの分裂水準を測定する段階を含む、ミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング方法を提供する。
【００１４】
具体的に、本発明のミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング方法は、（ａ）分離された細胞にＰＰＤ類ジンセノサイド化合物とミトコンドリアの分裂を調節することができると予想される候補化合物とを処理する候補化合物の処理段階；（ｂ）前記候補化合物を処理した細胞内ミトコンドリアの分裂水準を測定する段階；及び（ｃ）前記候補化合物を処理しない陰性対照群と比較して、前記ミトコンドリアの分裂水準を促進または抑制する候補化合物を選別する段階を含む。
【００１５】
この際、前記分離された細胞は、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物によってミトコンドリア分裂を誘導することができる限り、特に限定されないが、一例として、インスリン分泌細胞、がん細胞などになってもよく、前記ミトコンドリアの分裂水準の測定は、分裂されたミトコンドリアの水準を顕微鏡などで観察したり、ミトコンドリアの融合に関与するタンパク質（例えば、Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２、ＯＰＡ１など）の発現水準を測定したり、またはミトコンドリアの分裂に関与するタンパク質（例えば、Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１、ＯＰＡ−３など）の発現水準を測定して行ってもよい。例えば、候補物質が処理された細胞で分裂したミトコンドリアの水準が増加されると、前記候補物質をミトコンドリアの分裂を促進する調節剤として選別することができ、候補物質が処理された細胞で分裂されたミトコンドリアの水準が減少されると、前記候補物質をミトコンドリアの分裂を抑制する調節剤として選別することができ、候補物質が処理された細胞でミトコンドリアの融合に関与するタンパク質の発現水準が低下すると、前記候補物質をミトコンドリアの分裂を促進する調節剤として選別することができ、候補物質が処理された細胞でミトコンドリアの融合に関与するタンパク質の発現水準が増加すると、前記候補物質をミトコンドリアの分裂を抑制する調節剤として選別することができ、候補物質が処理された細胞でミトコンドリアの分裂に関与するタンパク質の発現水準が増加すると、前記候補物質をミトコンドリアの分裂を促進する調節剤として選別することができ、候補物質が処理された細胞でミトコンドリアの分裂に関与するタンパク質の発現水準が低下すると、前記候補物質をミトコンドリアの分裂を抑制する調節剤として選別することができる。
【００１６】
このような、ミトコンドリアの分裂を測定する方法は前述した方法以外にも当業界に公知となったすべての方法を使用することができ、当業者が必要に応じて、前記公知となった方法を選択的に使用しうることは自明である。
【００１７】
本発明で提供するミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング方法を通じて発掘されたミトコンドリア分裂調節剤は、ミトコンドリアの分裂水準を促進させたり、または抑制することができるため、ミトコンドリアの分裂により誘発されるミトコンドリア損傷による疾患を改善または治療することに使用されうる。この時、前記ミトコンドリア損傷による疾患は、特にこれに制限されないが、代謝性疾患（糖尿病など）、退行性脳疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病など）、肝機能異常、筋肉病症、自己免疫疾患（関節リウマチなど）などが挙げられる。
【００１８】
本発明の用語、「プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物」とは、前記ＰＰＤと同様の化学的構造を有するジンセノサイド化合物を意味する。
【００１９】
本発明において、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物は、細胞内ミトコンドリアを損傷させて、ミトコンドリア媒介性抗がん活性を示す抗がん剤の抗がん活性を補助する役割を行う化合物であると解釈されることができるが、一例として、下記化学式（１）のＰＰＤ、下記化学式（２）のＣ−Ｋなどであってもよい。前記ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物は、高麗人参、紅参などから抽出されたものを使用してもよく、化学的に合成したものを使用してもよい。
【００２０】
本発明の用語、「プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）」とは、Ｃ３０Ｈ５２Ｏ３の化学式で表され、約４６０Ｄａの分子量を有し、高麗人参から分離された下記化学式（１）の構造を有する化合物を意味する。
【００２１】
本発明において、前記ＰＰＤはミトコンドリア分裂を促進させて、ミトコンドリアの分裂を調節することができる製剤をスクリーニングする方法に使用されることができ、前記ミトコンドリア分裂を促進させるために使用されうる濃度はそれ自体で細胞毒性を示さず、ミトコンドリアの分裂を促進することができる限り、特にこれに制限されないが、一例として、１０μｇ／ｍｌ以下の処理濃度になってもよく、他の例として、０．１〜１０μｇ／ｍｌの処理濃度になってもよく、また他の例として、５〜１０μｇ／ｍｌの処理濃度になってもよい。
【００２２】
【化１】
0006535107.tif 000002
本発明の用語、「コンパウンド―Ｋ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ−Ｋ，Ｃ−Ｋ）」とは、高麗人参自体には存在しないが、高麗人参または紅参に存在するジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄなどのサポニンがビフィズス菌のような腸内微生物または土壌微生物の作用によって、体内で吸収可能な形態に変換された形態のジンセノサイド化合物であって、Ｃ３６Ｈ６２Ｏ８の化学式で表示され、約６２２Ｄａの分子量を有し、下記化学式（２）の構造を有する化合物を意味する。
【００２３】
本発明において、前記Ｃ−Ｋはミトコンドリア分裂を促進させ、ミトコンドリアの分裂を調節することができる製剤をスクリーニングする方法に使用されうるが、前記ミトコンドリア分裂を促進させるために使用される濃度はそれ自体で細胞毒性を示さず、ミトコンドリアの分裂を促進させることができる限り、特にこれに制限されないが、一例として、１０μｇ／ｍｌ以下の処理濃度になってもよく、他の例として、０．１〜１０μｇ／ｍｌの処理濃度になってもよく、また他の例として、５〜１０μｇ／ｍｌの処理濃度になってもよい。
【００２４】
【化２】
0006535107.tif 000003
本発明の一実施例によると、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物は、乳がん細胞に対して濃度依存的な抗がん活性を示すことができるが（図１）、抗がん活性を示さない容量で処理する場合、一部化合物（Ｃ−ＫまたはＰＰＤ）が乳がん細胞のミトコンドリアの融合に関与するタンパク質の発現を抑制させ、ミトコンドリア分裂に関与するタンパク質の発現を促進させること（図５ａ及び５ｂ）を確認した。
【００２５】
従って、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物に属するＰＰＤまたはＣ−Ｋは、ミトコンドリアの分裂を促進させ、ミトコンドリアの分裂を調節することができる製剤をスクリーニングする方法に使用されうることが分かった。
【００２６】
本発明は他の様態として、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を含むミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング用組成物及び前記組成物を含むミトコンドリア分裂調節剤スクリーニングキットを提供する。
【００２７】
前記組成物及びキットに含まれたＰＰＤ類ジンセノサイド化合物は、細胞内ミトコンドリアの分裂を促進させることができるため、前記組成物及びキットはミトコンドリア分裂調節剤をスクリーニングするために使用されうる。
【００２８】
特に、前記キットは、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物だけでなく、候補物質がミトコンドリア分裂を調節することができるかどうかを確認する方法に適した一種類またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置が含まれてもよい。例えばは、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物によってミトコンドリア分裂が促進される細胞、前記細胞の培養に使用される容器、前記細胞の培養に使用される培地、ミトコンドリアの融合または分裂に関与するタンパク質の発現水準の測定に使用される適切な緩衝液、ミトコンドリアの融合または分裂に関与するタンパク質の発現水準の測定に使用される蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなど）などをさらに含んでもよい。
【００２９】
具体的な一例として、本発明のミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング用キットは、ミトコンドリアの融合または分裂に関与するタンパク質の発現水準を測定するウェスタンブロット分析を実行するために必要な必須要素を含むキットであってもよい。即ち、前記キットは、細胞破砕用緩衝液、１次抗体、２次抗体、２次抗体検出用製剤、ウェスタンブロット分析に必要な緩衝液、テストチューブまたは別の適切なコンテナなどを含んでもよい。
【００３０】
他の一例として、本発明のミトコンドリア分裂調節剤のスクリーニング用キットは、ＲＴ−ＰＣＲを行ってミトコンドリアの融合または分裂に関与するタンパク質の発現水準を測定するために必要な必須要素を含むキットであってもよい。即ち、前記キットは、前記ミトコンドリアの融合または分裂に関与するタンパク質のＤＮＡに対する特異的なそれぞれのプライマー対、テストチューブまたは別の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含んでもよい。また、定量対照区として使用される遺伝子に特異的なプライマー対を含んでもよい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のミトコンドリア分裂調節剤をスクリーニングする方法を使用すると、ミトコンドリアの分裂を調節してミトコンドリア関連疾患を予防、改善または治療することができる製剤を効果的に発掘しうるため、ミトコンドリア関連疾患の治療剤の開発に広く活用される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】多様な濃度（０、５、１０、２０、５０、１００または２００μｇ／ｍｌ）のＰＰＤ類ジンセノサイド化合物（Ｆ２、Ｒｈ２、Ｃ−ＫまたはＰＰＤ）が乳がん細胞株であるＭＣＦ−７細胞の生存率に及ぼす効果を比較した結果を示したグラフである。
【図２ａ】ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物ががん細胞の抗がん活性に及ぼす効果を比較した結果を示したグラフである。
【図２ｂ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤと多様な濃度のドキソルビシンが同時処理された乳がん細胞の生存率を比較した結果を示したグラフであって、（●）は陰性対照群を示し、（■）は陽性対照群を示し、（▲）はＣ−Ｋが処理された実験群を示し、（▼）はＰＰＤが処理された実験群を示す。
【図３ａ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理した乳がん細胞において、細胞死滅関連タンパク質の発現水準を比較した結果を示すウェスタンブロット分析写真である。
【図３ｂ】ＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理した乳がん細胞において、処理時間による細胞死滅関連タンパク質の発現水準を比較した結果を示すウェスタンブロット分析写真である。
【図３ｃ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとの同時処理による抗がん効果に対するＰＡＲＰまたはカスパーゼ−９活性抑制剤の効果を比較した結果を示すグラフである。
【図４ａ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとの同時処理によるミトコンドリアから放出されたシトクロム−Ｃの水準変化を示す免疫蛍光染色写真である。
【図４ｂ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとの同時処理時間によるミトコンドリアからシトクロム−Ｃが放出された細胞数を示すグラフである。
【図５ａ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤが処理されたＭＣＦ−７細胞に含まれたミトコンドリアを蛍光染色した結果を示す写真である。
【図５ｂ】Ｃ−ＫまたはＰＰＤが処理されたＭＣＦ−７細胞で発現されるミトコンドリア分裂に関与するタンパク質（Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１またはＯＰＡ−３）と、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２またはＯＰＡ１）の発現水準を示すウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【図６ａ】ミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１またはＭｆｎ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡによる前記タンパク質の発現抑制を確認した結果を示すウェスタンブロット分析写真である。
【図６ｂ】ミトコンドリア分裂が誘発された細胞に対するドキソルビシンとタモキシフェンの抗がん活性を比較した結果を示すグラフである。
【図７】本発明で提供する抗がん補助剤とミトコンドリア媒介性抗がん活性を示す抗がん剤の抗がん活性機作を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１：プロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）の細胞毒性
がん細胞に対してプロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ、ＰＰＤ）類ジンセノサイド化合物が細胞毒性を示すかどうかを確認しようとした。
【００３５】
まず、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７細胞を１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地に接種して、３７℃及び５％ＣＯ２条件で培養し、培養されたＭＣＦ−７が飽和すると３〜５日間隔で継代培養した。
【００３６】
次に、前記培養されたＭＣＦ−７細胞に多様な濃度（０、５、１０、２０、５０、１００または２００μｇ／ｍｌ）のＰＰＤ類ジンセノサイド化合物（Ｆ２、Ｒｈ２、Ｃ−ＫまたはＰＰＤ）を２４時間処理し、前記細胞を対象にＷＳＴ−１分析を実行することにより、これら細胞の生存率を測定した（図１）。この時、ＷＳＴ−１分析は前記各細胞を１０％ＥＺ−Ｃｙｔｏｘを含む培地に接種して、３７℃で１．５時間反応させた後、生存細胞により生成される水溶性ホルマザン染料の水準を吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、これを分析することにより、細胞生存率を算出する方式で行った。
【００３７】
図１は多様な濃度（０、５、１０、２０、５０、１００または２００μｇ／ｍｌ）のＰＰＤ類ジンセノサイド化合物（Ｆ２、Ｒｈ２、Ｃ−ＫまたはＰＰＤ）が乳がん細胞株であるＭＣＦ−７細胞の生存率に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフである。図１に示したように、前記ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物は濃度依存的に乳がん細胞に対する抗がん活性を示すことを確認した。各化合物別に差はあるが、大体２０μｇ／ｍｌ以上の濃度で処理する場合、抗がん活性を示し始めており、２００μｇ／ｍｌ以上の濃度で処理する場合はほとんどの乳がん細胞をすべて死滅させる効果を示すことを確認した。反面、１０μｇ／ｍｌ以下の濃度で処理する場合、抗がん活性を全く示してないことを確認した。特に、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物中、Ｃ−ＫまたはＰＰＤが相対的に優秀な抗がん活性を示すことを確認した。
【００３８】
従って、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物は濃度依存的に乳がん細胞に対する抗がん活性を示すことが分かった。
実施例２：ドキソルビシンの抗がん活性に及ぼすＰＰＤの影響
ミトコンドリア媒介性抗がん活性を示すと知られている抗がん剤の一種であるドキソルビシンの抗がん活性に及ぼすＰＰＤ類ジンセノサイド化合物の効果を研究した。
【００３９】
実施例２−１：ドキソルビシンに対する感受性に及ぼす効果
ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７細胞、前記実施例１で優秀な抗がん活性を示すと確認されたＣ−ＫまたはＰＰＤ、ホルモン受容体の拮抗剤として作用してホルモン媒介性がんの成長を阻害する抗がん活性を示すタモキシフェン、及びミトコンドリア媒介性抗がん活性を示すと知られている抗がん剤の一種であるドキソルビシンを使用して、抗がん剤に対するがん細胞の感受性に及ぼすＰＰＤ類ジンセノサイド化合物の効果を確認しようとした。
【００４０】
具体的に、ＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＰＰＤ類ジンセノサイド化合物（Ｆ２、Ｒｈ２、Ｃ−ＫまたはＰＰＤ）を加えて１２時間培養した後、２０μＭのタモキシフェンまたは５μｇ／ｍｌのドキソルビシンを処理して２４時間培養し、培養が終了した後、ＷＳＴ−１分析を通じてＭＣＦ−７細胞の生存率を比較した（図２ａ）。
【００４１】
図２ａはＰＰＤ類ジンセノサイド化合物ががん細胞の抗がん活性に及ぼす効果を比較した結果を示したグラフである。図２ａで示したように、実施例１を通じて抗がん活性を全く示さない濃度のＰＰＤ類ジンセノサイド化合物を乳がん細胞に処理して、ここに抗がん剤を処理した結果、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物の中で、Ｃ−ＫまたはＰＰＤがドキソルビシンによる抗がん活性を向上させることを確認した。反面、タモキシフェンを処理した場合には、あらゆるＰＰＤ類ジンセノサイド化合物もタモキシフェンの抗がん活性を向上させなかったことを確認した。
【００４２】
これにより、前記Ｃ−ＫまたはＰＰＤがドキソルビシンの処理濃度に影響を及ぼすかどうかを確認するため、１０μｇ／ｍｌのＰＰＤ類ジンセノサイド化合物（Ｃ−ＫまたはＰＰＤ）を加え、１２時間培養した後、多様な濃度（０、０．１、０．５、１、２、５、１０、５０μｇ／ｍｌ）のドキソルビシンを処理して２４時間培養し、培養が終了した後、ＷＳＴ−１分析を通じてＭＣＦ−７細胞の生存率とこれから算出されたＬＣ５０値を比較した（図２ｂ）。この時、陰性対照群としてはジンセノサイドを処理しない実験群を使用し、陽性対照群としてはドキソルビシンに対して特別な効果を示さないことが確認されたＰＰＤ類ジンセノサイド化合物であるＦ２を処理した実験群を使用した。
【００４３】
図２ｂは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤと多様な濃度のドキソルビシンが同時処理された乳がん細胞の生存率を比較した結果を示すグラフであって、（●）は陰性対照群を示し、（■）は陽性対照群を示し、（▲）はＣ−Ｋが処理された実験群を示し、（▼）はＰＰＤが処理された実験群を示す。図２ｂで示したように、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理する場合、ドキソルビシン単独で処理した場合よりも抗がん活性が増加されることを確認した。特に、ＬＣ５０値を比較すると、ドキソルビシンを単独で処理するか（陰性対照群）、またはＦ２とドキソルビシンとを同時に処理した場合（陽性対照群）には約１０μｇ／ｍｌを示した反面、Ｃ−Ｋとドキソルビシンとを同時に処理した場合には２μｇ／ｍｌを示し、ＰＰＤとドキソルビシンとを同時に処理した場合には１．５μｇ／ｍｌを示して、Ｃ−ＫまたはＰＰＤがドキソルビシンの抗がん活性を向上させる効果を示すことが分かった。
【００４４】
実施例２−２：細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）関連タンパク質の発現水準に及ぼす効果
ＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤを含む培地を加えて１２時間培養した後、１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤと０または５μｇ／ｍｌのドキソルビシンとを含む培地に交替して２４時間培養した。培養が終了された細胞を破砕して、これを対象にリン酸化ＪＮＫに対する抗体、ＰＡＲＰに対する抗体、切断されたＰＡＲＰに対する抗体、カスパーゼ−９に対する抗体または切断されたカスパーゼ−９に対する抗体を使用したウェスタンブロット分析を行った（図３ａ）。この時、陰性対照群としてはジンセノサイドを処理しない実験群を使用し、陽性対照群としてはドキソルビシンに対して特別な効果を示さないことが確認されたＰＰＤ類ジンセノサイド化合物であるＦ２を処理した実験群を使用した。
【００４５】
図３ａは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理した乳がん細胞で、細胞死滅関連タンパク質の発現水準を比較した結果を示すウェスタンブロット分析写真である。図３ａで示したように、ドキソルビシンが処理されたすべての細胞でリン酸化ＪＮＫ、切断されたＰＡＲＰ及び切断されたカスパーゼ−９の水準が増加された。また、前記増加されたリン酸化ＪＮＫ、切断されたＰＡＲＰ及び切断されたカスパーゼ−９の中でリン酸化ＪＮＫ及び切断されたＰＡＲＰの水準はＣ−ＫまたはＰＰＤの処理により影響を受けなかったが、切断されたカスパーゼ−９はＣ−ＫまたはＰＰＤが処理された場合に有意に増加し、特に、ＰＰＤが処理された場合に著しく増加したことを確認した。
【００４６】
これにより、ＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＰＰＤを含む培地を加えて１２時間培養した後、１０μｇ／ｍｌのＰＰＤと５μｇ／ｍｌのドキソルビシンとを含む培地に交替して０、０．５、１、２、４または６時間培養した。前記培養された細胞を利用して同様にウェスタンブロット分析を行った（図３ｂ）。この時、比較群としてはＰＰＤとドキソルビシンを含む培地の代わりに、ドキソルビシンを単独で含む培地で培養された細胞を使用した。
【００４７】
図３ｂはＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理した乳がん細胞で、処理時間による細胞死滅関連タンパク質の発現水準を比較した結果を示すウェスタンブロット分析写真である。図３ｂで示したように、ＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理した乳がん細胞では、ドキソルビシンを単独処理した乳がん細胞よりも切断されたＰＡＲＰ及び切断されたカスパーゼ−９が早く形成されることを確認した。
【００４８】
前記結果から、ドキソルビシンの抗がん活性にＰＡＲＰ及びカスパーゼ−９が影響を及ぼすことが分かったため、前記ＰＡＲＰ及びカスパーゼ−９の活性を抑制する場合、ドキソルビシンの抗がん活性が抑制されるかどうかを確認しようとした。
【００４９】
具体的に、カスパーゼ−９の抑制剤であるＺ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫまたはＰＡＲＰの抑制剤である３−ＡＢを前処理したＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤを含む培地を加えて１２時間培養した後、１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤと０または５μｇ／ｍｌのドキソルビシンとを含む培地に交替して２４時間培養した。前記培養された細胞を利用して同様のウェスタンブロット分析を行った（図３ｃ）。この時、陰性対照群としてはジンセノサイドを処理しない実験群を使用し、陽性対照群としてはドキソルビシンに対して特別な効果を示さないことが確認されたＰＰＤ類ジンセノサイド化合物であるＦ２を処理した実験群を使用した。
【００５０】
図３ｃは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとの同時処理による抗がん効果に対するＰＡＲＰまたはカスパーゼ−９活性抑制剤の効果を比較した結果を示すグラフである。図３ｃで示したように、すべての対照群及び実験群でＰＡＲＰまたはカスパーゼ−９活性抑制剤を処理した場合、ドキソルビシンの抗がん効果が抑制されることを確認した。ただ、ＰＡＲＰ活性抑制剤を処理した場合には、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとを同時処理した場合に、抗がん活性がやや回復されたが、これはＰＡＲＰの上流に存在するカスパーゼ−９の活性によるものと分析された。
【００５１】
実施例３：ミトコンドリアに及ぼすＰＰＤの効果
前記実施例２の結果から、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物に属するＣ−ＫまたはＰＰＤがミトコンドリア媒介性抗がん活性を示すと知られている抗がん剤の一種であるドキソルビシンの抗がん活性を促進されることを確認したため、前記Ｃ−ＫまたはＰＰＤがミトコンドリアに影響を及ぼすかどうかを確認しようとした。
【００５２】
実施例３−１：ミトコンドリアで誘発されるシトクロム−Ｃの放出に及ぼす効果
ＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤを含む培地を加えて２４時間培養した後、５μｇ／ｍｌのドキソルビシンを含む培地に交替して０または４時間培養した。培養が終了した細胞に４％パラホルムアルデヒドを加えて固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００溶液を加えて穿孔した後、シトクロム−Ｃに対する抗体を使用して３０分間免疫染色した。染色が終了した後、前記細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光ラベルされた２次抗体を３０分間加えて反応させて、ＰＢＳで洗浄した後、共焦点顕微鏡で撮影し、発色された蛍光水準を測定した（図４ａ）。この時、陰性対照群としてはジンセノサイドを処理しない実験群を使用し、陽性対照群としてはドキソルビシンに対して特別な効果を示さないことが確認されたＰＰＤ類ジンセノサイド化合物であるＦ２を処理した実験群を使用した。
【００５３】
図４ａは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとの同時処理によるミトコンドリアから放出されたシトクロム−Ｃの水準変化を示す免疫蛍港染色写真である。図４ａで示したように、ドキソルビシンを処理した場合には、ドキソルビシンを処理しない場合に比べてシトクロム−Ｃの放出水準が増加し、ドキソルビシンを処理しても単独でドキソルビシンを処理した場合よりは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンを共に処理した場合にシトクロム−Ｃの放出水準が増加したことを確認した。
【００５４】
これにより、ドキソルビシンの処理時間によってシトクロム−Ｃの放出水準が変化するかどうかを確認しようとした。即ち、ＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤを含む培地を加えて２４時間培養した後、５μｇ／ｍｌのドキソルビシンを含む培地に交替して０、０．５、１、２、４または６時間培養された細胞を使用することを除いては、前述した同様の方法を行い、免疫蛍光染色を実行して、ミトコンドリアで細胞質内に放出されたシトクロム−Ｃが放出された細胞の数を測定した（図４ｂ）。この時、対照群としてはジンセノサイドを処理しない実験群を使用した。
【００５５】
図４ｂは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤとドキソルビシンとの同時処理時間によるミトコンドリアからシトクロム−Ｃが放出された細胞数を示すグラフである。図４ｂで示したように、６時間が経過した後、ドキソルビシンを単独で処理した対照群では、全体細胞の７％でシトクロム−Ｃが放出されたが、Ｃ−Ｋとドキソルビシンとを処理した実験群では全体細胞の２０％でシトクロム−Ｃが放出され、ＰＰＤとドキソルビシンとを処理した実験群では全体細胞の４３％でシトクロム−Ｃが放出されたことを確認した。
【００５６】
従って、Ｃ−ＫまたはＰＰＤはドキソルビシンによりミトコンドリアでシトクロム−Ｃの放出を促進する効果を示すことが分かった。
実施例３−２：ミトコンドリアの損傷誘導に及ぼす効果
前記実施例３−１の結果からＣ−ＫまたはＰＰＤがドキソルビシンによりミトコンドリアでシトクロム−Ｃの放出を促進させることを確認したため、前記Ｃ−ＫまたはＰＰＤがミトコンドリアを損傷させることができるかどうかを確認しようとした。
【００５７】
即ち、ＭＣＦ−７細胞に１０μｇ／ｍｌのＣ−ＫまたはＰＰＤを含む培地を加えて２４時間培養した。培養が終了した細胞に４％パラホルムアルデヒドを加えて固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００溶液を加えて穿孔した後、Ｔｏｍ−２０を使用してミトコンドリアを染色した。染色が終了した後、前記細胞をＰＢＳで洗浄し、共焦点顕微鏡で撮影し、発色された蛍光水準を測定した（図５ａ）。この時、陰性対照群としてはジンセノサイドを処理しない実験群を使用し、陽性対照群としてはＰＰＤ類ジンセノサイド化合物であるＦ２を処理した実験群を使用した。
【００５８】
図５ａは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤが処理されたＭＣＦ−７細胞に含まれたミトコンドリアを蛍光染色した結果を示す写真である。図５ａで示したように、陰性対照群のミトコンドリアに比べて、陽性対照群のミトコンドリアは特別な変化を示さなかったが、Ｃ−ＫまたはＰＰＤが処理されたＭＣＦ−７細胞に含まれたミトコンドリアは損傷されることを確認した。
【００５９】
これにより、前記培養された各細胞を対象にウェスタンブロット分析を行い、ミトコンドリア分裂に関与するタンパク質（Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１またはＯＰＡ−３）と、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２またはＯＰＡ１）の発現水準を比較した（図５ｂ）。
【００６０】
図５ｂは、Ｃ−ＫまたはＰＰＤが処理されたＭＣＦ−７細胞で発現されるミトコンドリア分裂に関与するタンパク質（Ｄｒｐ１、Ｆｉｓ１またはＯＰＡ−３）と、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１、Ｍｆｎ２またはＯＰＡ１）の発現水準を示すウェスタンブロット分析結果を示す写真である。図５ｂで示したように、Ｃ−ＫまたはＰＰＤが処理されたＭＣＦ−７細胞では、ミトコンドリア分裂に関与するタンパク質であうＯＰＡ−３の発現水準が増加する反面、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質であるＭｆｎ２の発現水準が減少されることを確認した。
【００６１】
前記実施例３−１及び３−２の結果を総合すると、Ｃ−ＫまたはＰＰＤはミトコンドリアの損傷を誘発することができるため、前記Ｃ−ＫまたはＰＰＤをドキソルビシンと共に処理した場合には、前記Ｃ−ＫまたはＰＰＤがドキソルビシンの処理によりミトコンドリアから放出されるシトクロム−Ｃの放出水準を増加させ、ドキソルビシンの抗がん活性を向上させることが分かった。
【００６２】
実施例４：ミトコンドリアの分裂とドキソルビシンの抗がん活性の関連性分析
前記実施例３−２の結果からＣ−ＫまたはＰＰＤはミトコンドリアの損傷を誘発させることを確認したので、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１またはＭｆｎ２）の発現を抑制させて、ミトコンドリアの分裂を誘発し、これにドキソルビシンを処理してミトコンドリアの分裂とドキソルビシンの抗がん活性の関連性を分析しようとした。
【００６３】
具体的に、Ｍｆｎ１及びＭｆｎ２を標的とするｓｉＲＮＡを合成し、陰性対照群としてランダムｓｉＲＮＡを合成した。
対照群：５’−ＣＣＵＡＣＧＣＣＡＡＵＵＵＣＧＵ−３’−ｄＴｄＴ（配列番号１）
Ｍｆｎ１：５’−ＧＵＧＵＡＧＡＵＵＣＵＧＧＵＡＡＵＧＡ−３’−ｄＴｄＴ（配列番号２）
Ｍｆｎ２：５’−ＣＧＡＵＧＣＡＡＣＵＣＵＡＵＣＧＵＣＡ−３’−ｄＴｄＴ（配列番号３）
前記合成された各ｓｉＲＮＡをＭＣＦ−７細胞に導入し、１２時間培養して、前記細胞をｓｉＲＮＡが含まれない正常培地で４８時間再び培養した後、これらの細胞で発現されるミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１またはＭｆｎ２）の発現水準をウエスタンブロット分析によって確認した（図６ａ）。
【００６４】
図６ａは、ミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１またはＭｆｎ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡによる、前記タンパク質の発現抑制を確認した結果を示すウェスタンブロット分析写真である。図６ａで示したように、前記ｓｉＲＮＡの導入によってミトコンドリア融合に関与するタンパク質（Ｍｆｎ１またはＭｆｎ２）の発現が抑制されることを確認した。
【００６５】
一方、前記合成された各ｓｉＲＮＡをＭＣＦ−７細胞に導入して１２時間培養し、前記細胞をｓｉＲＮＡが含まれない正常培地で４８時間再び培養した後、５μＭのドキソルビシンまたは２０μＭのタモキシフェンを処理して２４時間培養した。培養が終了した後、ＷＳＴ−１分析を通じてＭＣＦ−７細胞の生存率を比較した（図６ｂ）。この時、対照群としてはドキソルビシンまたはタモキシフェンを処理せず培養した細胞を使用した。
【００６６】
図６ｂは、ミトコンドリア分裂が誘発された細胞に対するドキソルビシンとタモキシフェンの抗がん活性を比較した結果を示すグラフである。図６ｂで示したように、ドキソルビシンまたはタモキシフェンが処理されない細胞ではミトコンドリア分裂が誘導された後にも生存率が減少しなかったが、ここにドキソルビシンまたはタモキシフェンを処理した場合には抗がん活性を示し、特に、タモキシフェンに比べてドキソルビシンを処理した場合に、著しく高い水準の抗がん活性を示したことを確認した。また、ミトコンドリア分裂が誘導された場合、Ｍｆｎ１の発現が抑制された場合より、Ｍｆｎ２の発現が抑制された場合にドキソルビシンの抗がん活性がさらに増加することを確認した。しかし、タモキシフェンが処理された場合には、各ｓｉＲＮＡの処理による抗がん活性に差がないことを確認した。
【００６７】
前記実施例１〜４の結果を総合すると、図７で示したように、ＰＰＤ類ジンセノサイド化合物に属するＣ−ＫまたはＰＰＤはミトコンドリア融合タンパク質に属するＭｆｎ２の発現を抑制させ、ミトコンドリアの分裂を促進し、その結果によりミトコンドリアが損傷されることになり、このような状態でミトコンドリア媒介性抗がん活性を示す抗がん剤（ドキソルビシン）をがん細胞に処理すると、損傷されたミトコンドリアの外膜をさらに損傷させ、ミトコンドリアから細胞質へとシトクロム−Ｃがもっと多く放出されて、このように放出されたシトクロム−Ｃは、アポトソームを通じた細胞死滅を誘導することになって、結果的にはがん細胞を死滅させることになる。
【００６８】
従って、Ｃ−ＫまたはＰＰＤはミトコンドリア媒介性抗がん活性を示す抗がん剤を複合的に使用する場合、前記抗がん剤の投与量を減少させてより安全な抗がん治療を行うことができることが分かった。
【図１】
0006535107.tif 000006
【図２ａ】
0006535107.tif 000007
【図２ｂ】
0006535107.tif 000008
【図３ａ】
0006535107.tif 000009
【図３ｂ】
0006535107.tif 000010
【図３ｃ】
0006535107.tif 000011
【図４ａ】
0006535107.tif 000012
【図４ｂ】
0006535107.tif 000013
【図５ａ】
0006535107.tif 000014
【図５ｂ】
0006535107.tif 000015
【図６ａ】
0006535107.tif 000016
【図６ｂ】
0006535107.tif 000017
【図７】
0006535107.tif 000018
【配列表】
0006535107000001.app