(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）を粉末化し、この粉末からアルコール溶液による加熱抽出を行うことにより得られる抽出物を含む血栓予防治療剤。
【請求項２】
前記アルコール溶液による加熱抽出を行うことにより得られる抽出物には、下式（１）で示されるプテロスチルベンが含まれていることを特徴とする請求項１記載の血栓予防治療剤。
【化１】
0006523634.tif 000009
【請求項３】
（１）植物インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）を粉末化する工程と、（２）（１）により得られた粉末からアルコール溶液による抽出物を抽出する工程とにより得られる抽出物を含む血栓予防治療剤の製造方法。
【請求項４】
前記アルコール溶液による抽出物を抽出する工程により得られる抽出物には下式（１）で示されるプテロスチルベンが含まれていることを特徴とする請求項３記載の血栓予防治療剤の製造方法。
【化３】
0006523634.tif 000010
【請求項５】
前記アルコール溶液に含まれるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項３または４に記載の血栓予防治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓予防治療剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、血管内の血液が何らかの原因で塊を形成し、主に血管壁が傷害されることにより起こり、血栓による疾患として血栓性静脈炎、静脈血栓塞栓症（エコノミークラス症候群）、動脈血栓塞栓症、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）等が知られている。これまで血栓を治療するための薬剤が開発されており、血栓治療剤に使用される有効成分の１つとして、スチルベン誘導体が知られている。
【０００３】
特許文献１には、スチルベン誘導体であり抗血栓作用を有するレスベラトロールを、ブドウ果実、果皮、種子、新芽又は茎の１つあるいは複数からなる素材から水とエタノールとの混合溶媒を用いて抽出する方法が記載されている。
【０００４】
しかしながら、レスベラトロールは体内への吸収率・滞留率が低く、血中滞留時間が短い。このため、近年レスベラトロールよりも体内への吸収率・滞留率が高く、血中滞留時間を長くすることで血栓予防をより有効とする治療剤が求められている。そこで本発明者らは植物インドキノキから抽出される成分を血栓予防治療剤として使用できることを発見し本発明に至ったのである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−４１２９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）の全木からアルコール抽出によって得られた抽出成分を用いることで従来よりも更に治療効果の高い血栓予防治療剤とその製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る発明は、植物インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）を粉末化し、この粉末からアルコール溶液による加熱抽出を行うことにより得られる抽出物を含む血栓予防治療剤に関する。
【０００８】
請求項２に係る発明は、前記アルコール溶液による加熱抽出を行うことにより得られる抽出物には、下式（１）で示されるプテロスチルベンが含まれていることを特徴とする請求項１記載の血栓予防治療剤に関する。
【０００９】
【化１】
0006523634.tif 000002
【００１３】
請求項３に係る発明は、（１）植物インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）を粉末化する工程と、（２）（１）により得られた粉末からアルコール溶液による抽出物を抽出する工程とにより得られる抽出物を含む血栓予防治療剤の製造方法に関する。
請求項４に係る発明は、前記アルコール溶液による抽出物を抽出する工程により得られる抽出物には下式（１）で示されるプテロスチルベンが含まれていることを特徴とする請求項３記載の血栓予防治療剤の製造方法に関する。
【化２】
0006523634.tif 000003
請求項５に係る発明は、前記アルコール溶液に含まれるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項３または４に記載の血栓予防治療剤の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１及び３に係る発明によれば、工程（１）〜（２）を経て植物インドキノキから血栓予防治療剤として有効な抽出物を得ることができる。更にこの抽出物は、血液中の粘性を低下させ血栓の発生を抑制することができることから、血栓性疾患の治療に有効な血栓予防治療剤を提供することができる。
【００１５】
請求項２及び４に係る発明によれば、アルコール溶液による加熱抽出を行うことにより得られる抽出物にはプテロスチルベンが含まれていることから、血栓性疾患の治療により有効な血栓予防治療剤を提供することができる。
【００１６】
請求項５に係る発明によれば、アルコール溶液として、メタノール、エタノール、プロパノールを使用することにより、インドキノキから血栓治療剤に有効な成分を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施例における高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）によるアルコール溶液を用いて抽出された抽出物（粉末）の成分を示す図である。
【図２】本実施例における高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による酢酸エチルに可溶する抽出物の成分を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る血栓予防治療剤は以下の工程を経て得られる。
（１）植物インドキノキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍ）を粉末化する工程
（２）（１）により得られた粉末からアルコール溶液により抽出物を抽出する工程
（３）（２）により得られた抽出粉末から酢酸エチルに可溶する抽出物を抽出する工程
【００１９】
本発明に係る血栓予防治療剤の製造方法について詳細に説明する。
先ず、工程（１）について説明する。
植物インドキノキを破砕機等により粉末化する。
インドキノキは、マメ科シタン属に属するＰｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｍａｒｓｕｐｉｕｍであり、インド南部からスリランカに分布する常緑樹である。このとき、粉末化するにあたって、インドキノキの幹（心材、辺材、樹皮）、枝、葉、花、根を含む全木を使用してもよいし、インドキノキの幹、枝、葉、花、根の何れか又はその組み合わせを使用してもよい。また、粉末化により得られる粉末の粒径については特に限定されない。
【００２０】
工程（２）について説明する。
粉末化したインドキノキの粉末から水とアルコールからなる混合溶媒（アルコール溶液）を用いて、アルコール溶液に可溶する成分を得る。このとき使用されるアルコールとして、メタノール、エタノール、プロパノール等が好適に利用される。更にアルコール溶液に含まれるアルコールの含有量は３０〜１００％であることが好ましい。また、アルコール含有量が３０％より少ないとプテロスチルベンが抽出され難くいため好ましくない。この操作にアルコール溶液を用いることで、インドキノキに含まれる血栓性疾患の治療に有効な成分を抽出することができる。更に、この抽出操作に使用する粉末化したインドキノキ及びアルコール溶液の質量比は、１：５〜２０であることが好ましい。
【００２１】
アルコール溶液に可溶する成分を含む溶液を濃縮し、濃縮液を得る。この操作により、水よりも低沸点成分であるアルコールに溶解しているインドキノキの成分の濃度を高めることができる。この操作の濃縮温度は４０〜６０℃であることが好ましい。この理由は成分の分解を防ぐためである。また、濃縮後の抽出液には粉末等の固体が含まれている虞があるため、濾過により取り除くことが好ましい。
【００２２】
工程（３）について説明する。
工程（２）により得られた濃縮液を減圧乾燥器等による減圧乾燥により、抽出粉末（固体の抽出物）が得られる。このとき、減圧乾燥に使用される装置については特に限定されない。
【００２３】
得られた抽出粉末に、水及び酢酸エチルを加えて、この抽出粉末から酢酸エチルに可溶する成分を抽出する。この後、シリカゲルを用いたカラムクロマトにより目的抽出物を得る。この抽出物は、下式（１）に示されるプテロスチルベンを主成分として含んでいる（図１、２参照、下記［００４０］において詳細に説明する）。
【００２４】
【化３】
0006523634.tif 000004
【００２５】
工程（３）において、酢酸エチルを複数回に分けて加え、水中に含まれている酢酸エチルに可溶する成分（目的抽出物）を抽出してもよい。
【００２６】
上記した方法により、得られた抽出物は、血液中の粘性を低下させ血栓の発生を抑制することができることから、血栓性疾患の治療に有効な血栓予防治療剤とすることができる。
【実施例】
【００２７】
本発明に係る血栓予防治療剤及びその製造方法に関する実施例を示すことにより、本発明の効果をより明確なものとする。但し、本発明はこの実施例に何ら限定されるものでない。
【００２８】
＜血栓治療剤の作製＞
インドキノキの全木（幹、枝、葉、花、根を含む）５０ｇを粉砕器を用いて粉末化した。蒸留装置（熱源（ガスバーナー）、蒸留用フラスコ、ト字管、温度計、冷却器、冷却水、蒸留液を溜めるフラスコ）の蒸留用フラスコに、得られた粉末を５０ｇと５０％エタノール溶液５００ｍｌ加えて、温度を９０℃とし、インドキノキから５０％エタノール溶液に可溶する成分を得て、エバポレ−タ−により液を濃縮した。これをエタノール抽出物とする。減圧蒸留により濃縮した抽出液は減圧乾燥（４０℃）し、抽出粉末を得た。
分液漏斗に抽出粉末を５００ｍｇ、水を５０ｍｌ、そして酢酸エチルを４０ｍｌ加え、酢酸エチルに可溶するする成分を抽出した。このとき、酢酸エチルは４０ｍｌずつ３回に分けて加えた（全量１２０ｍｌ）。この後、減圧濃縮により、酢酸エチル抽出物（血栓予防治療剤）を得た。このとき、分液漏斗に加えた水を水抽出物とした。
【００２９】
＜成分分析＞
本実施例における抽出粉末、及び酢酸エチル抽出物の成分は液体クロマトグラフにより分析を行った。
本実施例で用いた液体クロマトグラフ測定装置及び条件を以下に示す。
測定機器：ＨＰＬＣシステム  （株）島津製作所製高速液体クロマトグラフ  
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ相はリン酸０．１％を含む３０％メタノール溶液、Ｂ相はメタノールとした。
Ａ／Ｂ＝（１００／０）→Ａ／Ｂ＝（０／１００）となるように３０分送液。
送液速度：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ（２９０ｎｍ）
結果を図１及び２に示す。
【００３０】
＜エンドトキシン（ＬＰＳ）誘発ＤＩＣ病態ラットを用いた血液レオロジー改善作用試験＞
各サンプル共に１週間予備飼育した雄性ラット（８週齢、各群７匹）を使用した。
（対照）
本試験における対照とは、健康な雄性ラットである。このラットに０．２％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ・Ｎａ）を１日１回、連日７日間経口投与した。７日目投与後にペントバルビダール麻酔下にて腹部大静脈から採血した。
（担体対照）
本試験における担体対照は、ＬＰＳ誘発ＤＩＣ病態にさせ、血栓予防に有効である成分を投与しない。雄性ラットに０．２％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ・Ｎａ）を１日１回、連日７日間経口投与した。７日目の被検体投与１時間後にＬＰＳをペントバルビダール（睡眠薬）で軽度な麻酔下投与した。ＬＰＳの投与から４時間後にペントバルビダール麻酔下にて腹部大静脈から採血した。
（陽性対照）
本試験における陽性対照は、血栓予防に有効であることが知られている薬剤を投与する。雄性ラットに、陽性対照薬としてヘパリンを７日目のＬＰＳ投与の１時間前に投与した。ＬＰＳの投与から４時間後にペントバルビダール麻酔下にて腹部大静脈から採血した。
【００３１】
（実施例１）
酢酸エチル抽出物を５０［ｍｇ／ｋｇ］に調製した被検体を１日１回７日間、連日経口投与した。７日目の被検体投与１時間後にＬＰＳをペントバルビダール（睡眠薬）で軽度な麻酔下投与した。ＬＰＳの投与から４時間後にペントバルビダール麻酔下にて腹部大静脈から採血した。
（実施例２）
酢酸エチル抽出物を２００［ｍｇ／ｋｇ］に調製した被検体を使用した以外は実施例１と同じである。
（実施例３）
酢酸エチル抽出物を５００［ｍｇ／ｋｇ］に調製した被検体を使用した以外は実施例１と同じである。
【００３２】
採血した血液について、血液中の血小板数、白血球数、赤血球数、血清中のフィブリノーゲン量、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）量について生化学的検査を実施した。
全血通過時間は、実施例、対照、担体対照、陽性対照の各サンプルのラットから採血したそれぞれの血液を用い、マイクロチャネルアレイＢｌｏｏｄｙ  ６−５（幅４．５μｍ、長さ３０μｍ、深さ４．５μｍ、８７３６本並列）を装填した血液流動性測定装置（ＭＣ−ＦＡＮ：日立製作所製）を用いて測定した。
実施例、対照、担体対照、陽性対照の各サンプルのラットから採血したそれぞれの血液９容量に対して、３．８％クエン酸ナトリウム溶液１容量を混合したもの５０μＬをＭＣ−ＦＡＮに付し、２０ｃｍ水柱圧下で５０μＬの全血通過時間を測定した。全血通過時間の測定値は、直前に測定された生理食塩水１００μＬの通過時間を用いて、以下の式により生理食塩水の通過時間が１２．０秒の場合に換算して示した。
全血通過時間＝血液通過時間（ｓ）×１２．０（ｓ）／生理食塩水通過時間（ｓ）
結果を表１、２に示す。
【００３３】
＜血小板凝集抑制試験＞
（ＰＲＰ懸濁液の調製）
雄性ウサギ（１４週齢）の心臓から血液９容量に対して３．８％クエン酸ナトリウム溶液１容量の割合で採血した後、シリコンチューブに入れ、遠心分離（１７０ｇ、１０分間、２５℃）し、上層の多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。得られたＰＲＰは別のシリコンチューブに入れた後、キャップをして室温にて保存した。さらに、下層を遠心分離（１５２０×ｇ、１５分間、２５℃）し、その上層の乏血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。血小板数が２．５−３．５×１０５個／μＬになるようにＰＲＰをＰＰＰで希釈し、ＰＲＰ  懸濁液とした。ＰＰＰを透過度１００％、ＰＲＰ懸濁液を透過度０％の標準値に設定した。
【００３４】
（被検液の調製）
陽性対照
本試験において陽性対照には、凝集抑制の効果がある薬剤を使用した。陽性対照薬にはインドメタシンを用い、インドメタシンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、１Ｍ  ＨＣｌ溶液でｐＨ  ７．４に調整した緩衝液）でＤＭＳＯの濃度が０．５％となるように溶解させたものを使用した。
【００３５】
陰性対照
本試験における陰性対照には、凝集抑制に有効である成分を投与せず、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒでＤＭＳＯの濃度が０．５％となるように溶解させたものを使用した。
【００３６】
実施例
インドキノキの粉末からエタノール溶液に可溶した成分からなる抽出物（エタノール抽出物）、酢酸エチルに可溶する成分からなる抽出物（酢酸エチル抽出物）、及び水に可溶する成分からなる抽出物（水抽出物）夫々をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させた後、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、１  Ｍ  ＨＣｌ溶液でｐＨ  ７．４に調整した緩衝液）でＤＭＳＯの濃度が０．５％となるように溶解させたものを使用した。
【００３７】
比較例
従来、凝集抑制効果のあるものとして知られているプテロスチルベン、レスベラトロールについても同様の試験を行った。プテロスチルベン、レスベラトロールをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でＤＭＳＯの濃度が０．５％となるように溶解させたものを使用した。
【００３８】
（凝集抑制試験）
調製したＰＲＰをアグリゴメーター（ＰＲＰ３１３Ｍ、ＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）専用のキュベットに２００μＬずつ分注し、３７℃、１０００ｒｐｍで３分間攪拌した後、被検液はマイクロシリンジを用いて１１  μＬ添加した。さらに３７℃、１０００ｒｐｍで３分間保温撹拌した後、凝集剤としてコラーゲン（１００μｇ／ｍＬ、希釈液に溶解）をマイクロシリンジで１１μＬ添加した。血小板凝集によって生じるＰＲＰ懸濁液の透過度の変化は、凝集剤添加後１０分間、アグリゴメーターを用いて記録した。血小板凝集率（％）は凝集剤添加後１０分間における最大透過度の増加量として評価した。透過度はＰＲＰ懸濁液を０％、ＰＰＰを１００％に設定した。被検体の血小板凝集率は対照群の最大透過度に対する被検体の最大透過度の減少割合とした。
結果を表３、４に示す。
【００３９】
【表１】
0006523634.tif 000005
【００４０】
【表２】
0006523634.tif 000006
【００４１】
【表３】
0006523634.tif 000007
【００４２】
【表４】
0006523634.tif 000008
【００４３】
＜血栓予防治療剤の調製結果＞
図１及び２において、縦軸はピーク強度、横軸はリテンションタイムを示している。このとき、リテンションタイム２８．１４［ｍｉｎ］に示されるピークは、プテロスチルベンのピークである。
図１に示すように、エタノール溶液を抽出液として使用することで、インドキノキの粉末からプテロスチルベンを主成分とする抽出物を抽出することができた。また、図２に示すように、図１よりもプテロスチルベンを示すピークが高くなっていることから、抽出粉末から、エタノール蒸留により得られた抽出物を酢酸エチルで更に分画することで、目的抽出物を選択的に得ることができた。
【００４４】
＜血液レオロジー改善作用試験結果＞
表１の実施例に示されるように、目的抽出物の投与量が多くなる毎に、全血通過時間が短縮されていることが分かる。この結果から、インドキノキからアルコール溶液を用いて抽出した酢酸エチル抽出物（目的抽出物）は、血液の粘性を低下させる働きがあることが分かった。
【００４５】
＜血小板凝集抑制試験結果＞
表３に示すように、エタノール溶液から抽出した抽出物（エタノール抽出物）、及び酢酸エチルに可溶する成分から得られた抽出物（酢酸エチル抽出物）は血小板が凝集する割合が低いことが分かる。
レスベラトールとプテロスチルベンは血小板の凝集率を下げる効果があることが知られている。表４に示すように、プテロスチルベン単独でも効果はあるが、インドキノキから抽出された酢酸エチル抽出物（目的抽出物）の方が効果に優れている。これは、インドキノキから抽出される抽出物に凝集率を下げる効果のある成分がプテロスチルベン以外にも含まれているためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明に係る血栓予防治療剤及びその製造方法により、インドキノキを抽出することにより得られる抽出物は、血栓性疾患における血栓予防治療剤について好適に利用される。
【図１】
0006523634.tif 000011
【図２】
0006523634.tif 000012