(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補分子がヘパドナウイルスの共有結合閉環状（ｃｃｃ）ＤＮＡを阻害する能力を査定するための方法であって、
（ａ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を、その候補分子と接触させる；
核酸分子は１以上のタグをコードする配列を含み、その配列はヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造中へ挿入されている；
１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子は、ＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入されている；
核酸分子は、１以上のタグをコードする配列の５’側に、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含み、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列はＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５４に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成することができる；
（ｂ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを査定する；
および
（ｃ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルが対照と比較して低下した場合に候補分子を選択する；
工程を含む方法。
【請求項２】
ヘパドナウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であり、ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が１つのタグのみを含む；またはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が２以上のタグを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
タグが、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ（１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグなど）、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグ
からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＨＡタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される；
Ｈｉｓタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される；
１×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される；
３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される；
ｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される；
Ｖ５タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される；
および／または
Ｃ９タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される；
あるいは
ＨＡタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される；
Ｈｉｓタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される；
１×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される；
３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示される；
ｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される；
Ｖ５タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される；
および／または
Ｃ９タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示される；
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
核酸分子が、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示すＢ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質の核酸配列である；または
ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示すＢ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のアミノ酸配列である；
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１以上のタグをコードする核酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノム、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４のいずれか１つに示すＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＢＶゲノムがＨＢＶ遺伝子亜型ａｙｗのゲノムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示すＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に示す配列からなる；またはヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示すポリペプチドをコードする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示す核酸配列を含む；または
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む；
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
タグ付きＨＢｅＡｇをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示され；またはタグ付きＨＢｅＡｇのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法；
あるいは
タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示され；またはタグ付きＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）がさらに、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を下記のことが可能な条件で培養する工程（ａａ）を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法：
（ｉ）ヘパドナウイルスのプレゲノム（ｐｇ）ＲＮＡの合成；
（ｉｉ）合成されたｐｇＲＮＡからマイナス鎖ＤＮＡへの逆転写；
（ｉｉｉ）第２のプラス鎖ＤＮＡの合成；それによりマイナス鎖ＤＮＡとプラス鎖ＤＮＡが二本鎖弛緩型閉環状ＤＮＡを形成する；
（ｉｖ）弛緩型閉環状二本鎖ＤＮＡからｃｃｃＤＮＡの形成；
（ｖ）所望により、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする条件の回復；
（ｖｉ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードするｍＲＮＡの転写；
（ｖｉｉ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳；
その際、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする条件の回復は開始コドンの回復である。
【請求項１６】
工程（ｂ）によるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原レベルの査定が、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＩＡまたはＡｌｐｈａＬＩＳＡにより行なわれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）によるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原レベルの査定が、ヘパドナウイルスｅ抗原を特異的に認識する抗体および１以上のタグを特異的に認識する１以上の抗体の使用を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子：
ここで、
核酸分子は１以上のタグをコードする配列を含み、その配列はヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造中へ挿入されている；
１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子は、ＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入されている；
核酸分子は、１以上のタグをコードする配列の５’側に、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含み、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列はＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５４に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、National Institute of Health（米国国立予防衛生研究所）により与えられる Contract No. R01AI094474 の下に政府支援でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、抗ヘパドナウイルス物質をスクリーニングするための方法および使用に関する；それらの物質は、本発明に記載する細胞系において主に共有結合閉環状(covalently closed circular)（ｃｃｃ）ＤＮＡ依存性であってｃｃｃＤＮＡに対するサロゲートマーカーとして使用できるＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の阻害剤であり、ヘパドナウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｃｃｃＤＮＡを阻害する能力についてスクリーニングされる。本方法および使用は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原、たとえばＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）をコードする核酸配列を含む細胞を利用する。さらに、本発明はタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列およびそれによりコードされるタンパク質を提供する。これらのスクリーニング方法に使用するためのキットも提供される。
【背景技術】
【０００３】
慢性Ｂ型肝炎は、現在、世界的に３５０００万人、米国で少なくとも１２０万人が罹患している重大な公衆衛生上の負担である。これらの患者は肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、および他の重篤な臨床続発症の高リスクをもつ(1, 2, 12, 14)。毎年、世界中で約１００万人がＨＢＶ関連の肝疾患で死亡する。したがって慢性ＨＢＶ感染症を治癒させ、それの悲惨な結果を阻止することが、世界的な健康上の優先事項である。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス(Hepadnaviridae)科に属する非細胞変性(noncytopathic)、肝指向性ＤＮＡウイルスである。ヘパドナウイルスはエンベロープ保有二本鎖ウイルスの科であり、ヒトおよび動物において肝臓感染症を引き起こす可能性がある。ヘパドナウイルスは類似のゲノム編成を共有する。それらは部分二本鎖閉環状ＤＮＡの小さなゲノムをもつ。そのゲノムは２つのＤＮＡ鎖からなり、一方はマイナスセンス配向をもち、他方の鎖はプラスセンス配向をもつ。複製は、プレゲノムＲＮＡと呼ばれるＲＮＡ中間体の逆転写を伴なう(15, 19)。３つの主オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がコードされ、このウイルスは５つの既知ｍＲＮＡをもつ(18, 19)。
【０００５】
感染すると、ウイルスゲノムの弛緩型閉環状(relaxed circular)（ｒｃ）ＤＮＡが細胞核内へ輸送され、エピソーム共有結合閉環状（ｃｃｃ）ＤＮＡに変換され、それがすべてのウイルスｍＲＮＡの転写鋳型として使われる；特に、ＨＢｅＡｇの前駆体であるプレコア(precore)タンパク質をコードする３．５〜３．６ｋｂのプレコアｍＲＮＡ；コアタンパク質およびウイルスポリメラーゼをコードする３．５ｋｂのプレゲノム(pregenomic)（ｐｇ）ＲＮＡ；ウイルスのエンベロープタンパク質（ラージ（Ｌ）、ミドル（Ｍ）、およびスモール（Ｓ）抗原）をコードする２．４ｋｂ／２．１ｋｂの表面ｍＲＮＡ；ならびにＸタンパク質をコードする０．７ｋｂのＸ  ｍＲＮＡ(18, 19)。ＨＢｅＡｇはプレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびＣ末端アルギニンリッチ配列を除去する２つのタンパク質分解事象により生成する(Wang (1991) J Virol 65(9), 5080 (10, 21)。転写および核外輸送(nuclear exportation)の後、細胞質ウイルスｐｇＲＮＡがＨＢＶポリメラーゼおよびキャプシドタンパク質と共に組み立てられてヌクレオキャプシドを形成し、その内部でポリメラーゼ触媒作用による逆転写によりマイナス鎖ＤＮＡが生成し、それがその後、プラス鎖ＤＮＡにコピーされて後代ｒｃＤＮＡゲノムを形成する。新たに合成された成熟ヌクレオキャプシドはウイルスエンベロープタンパク質でパッケージされてビリオン粒子として放出されるか、あるいは核内へ送り戻されて細胞内ｃｃｃＤＮＡ増幅経路によりｃｃｃＤＮＡリザバーを増幅する(19)。したがって、慢性Ｂ型肝炎の分子基盤は感染した肝細胞の核におけるウイルスｃｃｃＤＮＡの存続である。
【０００６】
慢性Ｂ型肝炎の決定的な治癒法はない。ＨＢＶ治療のために現在承認されている薬物は、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）および５種類のヌクレオシ（チ）ドアナログ（ラミブジン(lamivudine)、アデホビル(adefovir)、エンテカビル(entecavir)、テルビブジン(telbivudine)およびテノホビル(tenofovir)）である。Xu (2010) J Virol (84) 9332-9340には、マウスインターフェロンによるマウス肝細胞の処理が開示されている。ＩＦＮ−αは小グループの患者において４８週間の標準治療後に持続的ウイルス応答を達成するにすぎず、かつ著しい有害作用を伴なう(9)。５種類のヌクレオシ（チ）ドアナログ（ＮＡ）はすべてウイルスポリメラーゼ阻害剤として作用するが、ＨＢＶ感染症を治癒させるのは稀であり(6)、かつ耐性の出現はそれらの長期有効性を著しく制限する(16, 24)。現在の治療法の主な限界は既存のｃｃｃＤＮＡプールを排除できないこと、および／または痕跡レベルの野生型ウイルスもしくは薬物耐性ウイルスからのｃｃｃＤＮＡ形成を阻止できないことであるのは、現在十分に認識されている。よって、ｃｃｃＤＮＡの形成および維持を直接ターゲティングする新規療法剤の開発に対して緊急のアンメットニーズがある。
【０００７】
Cai (2013) Methods in Mol Biol 1030 (151-161)は、細胞培養物からｃｃｃ（共有結合閉環状）ＤＮＡを検出するためのサザンブロットアッセイを開示している。それでもなお、現在まで、有効な in vitro ＨＢＶ感染モデルが無く、ハイスループット−ないしミッドスループットフォーマットでｃｃｃＤＮＡを測定するための実用的方法が得られていないため、抗ｃｃｃＤＮＡ剤のスクリーニング法は限定されている。その代わりに、ＨｅｐＧ２．２．１５およびＨｅｐＡＤ３８細胞により代表されるように安定トランスフェクションしたＨＢＶ細胞培養物において、ＨＢＶゲノムを構成的または条件的に複製する細胞内増幅経路によりｃｃｃＤＮＡ形成を達成できる(7, 11, 20)。
【０００８】
しかし、サザンブロットハイブリダイゼーションまたはリアルタイムＰＣＲアッセイのいずれかによるＨＢＶ細胞系からの直接ｃｃｃＤＮＡ検出は、それぞれ感度および特異性の問題のためスクリーニングに適さないであろう。他方で、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞においては大部分のウイルス生成物がｃｃｃＤＮＡの関与と区別できない組み込まれたウイルストランスジーンに由来するので、ｃｃｃＤＮＡに対する適切なサロゲートマーカーが無い。ＨｅｐＡＤ３８細胞においては分泌されたＨＢｅＡｇの産生が主にｃｃｃＤＮＡに依存し、ｃｃｃＤＮＡに対するサロゲートマーカーとして作動する可能性があると以前に報告された(11, 23)。最近、Caiらは、ｃｃｃＤＮＡのみに依存するＨｅｐＤＥ１９と命名されたＨＢｅＡｇ産生細胞系のアップグレード型(7)をｃｃｃＤＮＡ阻害剤のスクリーニングのために９６ウェルフォーマットアッセイに適用して、ｃｃｃＤＮＡ形成を阻害する２つの小分子化合物を同定した(3)。よってそのような研究は、ｃｃｃＤＮＡ生合成を化学分子によって直接ターゲティングでき、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤をハイスループットスクリーニングキャンペーンから同定できるであろうという堅実な“概念実証(proof-of-concept)”立証を提供した。しかし、既存のＨｅｐＤＥ１９アッセイ系がもつある欠点が、大規模ライブラリーのスクリーニングを実現性のないものにしている。たとえば、ＨＢｅＡｇに現在用いられている伝統的ＥＬＩＳＡアッセイは多数の操作を必要とし、アミノ酸配列相同性のためウイルス  コアタンパク質との一定範囲の交差反応を示し、大規模フォーマットの細胞ベースアッセイには適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Arzumanyan, A., H. M. Reis, and M. A. Feitelson. 2013. Pathogenic mechanisms in HBV- and HCV-associated hepatocellular carcinoma. Nature reviews. Cancer 13:123-135.
【非特許文献２】Block, T. M., H. Guo, and J. T. Guo. 2007. Molecular virology of hepatitis B virus for clinicians. Clin Liver Dis 11:685-706, vii.
【非特許文献３】Liang, T. J. 2009. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology 49:S13-21.
【非特許文献４】McMahon, B. J. 2014. Chronic hepatitis B virus infection. The Medical clinics of North America 98:39-54.
【非特許文献５】Nassal, M. 2008. Hepatitis B viruses: reverse transcription a different way. Virus Res 134:235-249.
【非特許文献６】Seeger, C., and W. S. Mason. 2000. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev 64:51-68.
【非特許文献７】Quasdorff, M., and U. Protzer. 2010. Control of hepatitis B virus at the level of transcription. J Viral Hepat 17:527-536.
【非特許文献８】Wang, J., A. S. Lee, and J. H. Ou. 1991. Proteolytic conversion of hepatitis B virus e antigen precursor to end product occurs in a postendoplasmic reticulum compartment. J Virol 65:5080-5083.
【非特許文献９】Hoofnagle, J. H., E. Doo, T. J. Liang, R. Fleischer, and A. S. Lok. 2007. Management of hepatitis B: summary of a clinical research workshop. Hepatology 45:1056-1075.
【非特許文献１０】Xu (2010) J Virol (84) 9332-9340
【非特許文献１１】Gish, R. G., A. S. Lok, T. T. Chang, R. A. de Man, A. Gadano, J. Sollano, K. H. Han, Y. C. Chao, S. D. Lee, M. Harris, J. Yang, R. Colonno, and H. Brett-Smith. 2007. Entecavir therapy for up to 96 weeks in patients with HBeAg-positive chronic hepatitis B. Gastroenterology 133:1437-1444.
【非特許文献１２】Pawlotsky, J. M., G. Dusheiko, A. Hatzakis, D. Lau, G. Lau, T. J. Liang, S. Locarnini, P. Martin, D. D. Richman, and F. Zoulim. 2008. Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and practice: recommendations for a standardized approach. Gastroenterology 134:405-415.
【非特許文献１３】Zoulim, F., and S. Locarnini. 2009. Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues. Gastroenterology 137:1593-1608 e1591-1592
【非特許文献１４】Cai, D., H. Nie, R. Yan, J. T. Guo, T. M. Block, and H. Guo. 2013. A southern blot assay for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA from cell cultures. Methods Mol Biol 1030:151-161.
【非特許文献１５】Guo, H., D. Jiang, T. Zhou, A. Cuconati, T. M. Block, and J. T. Guo. 2007. Characterization of the intracellular deproteinized relaxed circular DNA of hepatitis B virus: an intermediate of covalently closed circular DNA formation. J Virol 81:12472-12484.
【非特許文献１６】Ladner, S. K., M. J. Otto, C. S. Barker, K. Zaifert, G. H. Wang, J. T. Guo, C. Seeger, and R. W. King. 1997. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob Agents Chemother 41:1715-1720.
【非特許文献１７】Sells, M. A., M. Chen, and G. Acs. 1987. Production of hepatitis B virus particles in hepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1005-1009.
【非特許文献１８】Zhou, T., H. Guo, J. T. Guo, A. Cuconati, A. Mehta, and T. M. Block. 2006. Hepatitis B virus e antigen production is dependent upon covalently closed circular (ccc) DNA in HepAD38 cell cultures and may serve as a cccDNA surrogate in antiviral screening assays. Antiviral Res 72:116-124.
【非特許文献１９】Cai, D., C. Mills, W. Yu, R. Yan, C. E. Aldrich, J. R. Saputelli, W. S. Mason, X. Xu, J. T. Guo, T. M. Block, A. Cuconati, and H. Guo. 2012. Identification of disubstituted sulfonamide compounds as specific inhibitors of hepatitis B virus covalently closed circular DNA formation. Antimicrob Agents Chemother 56:4277-4288.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、本発明の基礎となる技術的課題は、ヘパドナウイルスｃｃｃＤＮＡの阻害剤を信頼性をもってスクリーニングするための手段および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この技術的課題は、特許請求の範囲に明記する態様を提供することにより解決される。
したがって、本発明は、候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃ（共有結合閉環状）ＤＮＡを阻害する能力を査定するための方法であって、
（ａ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を、その候補分子と接触させる；
（ｂ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを査定する；および
（ｃ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルが対照と比較して低下した場合に候補分子を選択する；
工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＨＢＶプレコアＯＲＦ中へのＨＡタグ配列の挿入を示す。
【図２】図２は、ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの発現および分泌を示す。
【図３】図３は、ＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ細胞系におけるＨＡ−ＨＢｅＡｇの分泌を示す。
【図４】図４は、一過性トランスフェクションした細胞におけるＨＡ組換えＨＢＶゲノムの複製を示す。
【図５】図５は、ＨｅｐＢＨＡｅ安定細胞系におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ依存性のＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ発現の合理的設計の模式図を示す。
【図６】図６は、ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞におけるウイルスＤＮＡ複製、ｃｃｃＤＮＡ蓄積、およびＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ産生の動態を示す。
【図７】図７は、ＨＡ組換えＨＢＶ  ＤＮＡ複製を支持する他の誘導性ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系を示す。
【図８】図８は、ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系におけるｃｃｃＤＮＡの確実性を示す。
【図９】図９は、ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系におけるＨＡ−ＨＢｅＡｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出を示す。
【図１０】図１０は、ＨＢＶ複製阻害剤（３ＴＣ）がＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞におけるＨＡ−ＨＢｅＡｇ発現をブロックすることを示す。
【図１１】図１１は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤がＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞においてＨＡ−ＨＢｅＡｇレベルを低下させたことを示す。
【図１２】図１２は、他のＨｅｐＢＨＡｅ細胞クローンにおけるウイルスＲＮＡ転写、ＤＮＡ複製およびｃｃｃＤＮＡ蓄積の動態を示す。
【図１３】図１３は、他のＨｅｐＢＨＡｅ細胞クローンにおけるＨＡ−ＨＢｅＡｇのｃｃｃＤＮＡ依存性発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本方法は一般に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）と類似の遺伝子編成および複製様式を共有する他の哺乳類および鳥類のヘパドナウイルス、たとえば代表的なウッドチャック肝炎ウイルス(woodchuck hepatitis virus)（ＷＨＶ）およびアヒルＢ型肝炎ウイルス(duck Ｂ型肝炎ウイルス)（ＤＨＢＶ）に適用できる。したがって、Ｂ型肝炎ウイルスに関して本明細書に提示する説明および実験は他のヘパドナウイルスに同様に適用される。しかし、本明細書に提示する教示は、好ましい態様において、“Ｂ型肝炎ウイルス”／ＨＢＶに関係する。用語“ヘパドナウイルス”、“Ｂ型肝炎ウイルス”、“アヒルＢ型肝炎ウイルス”、“ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）”は当技術分野で周知であり、本明細書中でそれに従って用いられる。略号“ＨＢＶ”、“ＤＨＢＶ”または“ＷＨＶ”は、本明細書中でそれぞれ完全用語“Ｂ型肝炎ウイルス”、“アヒルＢ型肝炎ウイルス”および“ウッドチャック肝炎ウイルス”と互換性をもって用いられる。
【００１４】
本発明において好ましいヘパドナウイルスは、好ましくはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス科に属する非細胞変性、肝指向性ＤＮＡウイルスであり、すなわちＨＢＶはヘパドナウイルスである。ＨＢＶゲノムの代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に示す。
【００１５】
本発明において好ましいヘパドナウイルスｅ抗原はＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である。用語“Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原”と“ＨＢｅＡｇ”は、本明細書中で互換性をもって用いられる。ＨＢｅＡｇの代表的な核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および１８に示す。本明細書中で用いる“ヘパドナウイルスｅ抗原”（および同様に“Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原”）は、主にタンパク質／ポリペプチド、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列をもつタンパク質／ポリペプチドを表わす。
【００１６】
ＨＢｅＡｇは、感染に際して下記に従って産生できる：感染すると、ＨＢＶウイルスゲノム弛緩型閉環状（ｒｃ）ＤＮＡが細胞核内へ輸送され、エピソームｃｃｃＤＮＡに変換され、これが、ＨＢｅＡｇの前駆体であるプレコアタンパク質をコードする３．５〜３．６ｋｂプレコアｍＲＮＡを含めたすべてのウイルスｍＲＮＡの転写鋳型として使われる。用語“ｃｃｃ  ＤＮＡ”と“共有結合閉環状ＤＮＡ”は、本明細書中で互換性をもって用いられる。
【００１７】
ＨＢＶプレコアタンパク質の代表的な核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１７に示す。ＨＢＶプレコアタンパク質は、Ｎ末端１９アミノ酸のシグナルペプチド、１０アミノ酸のリンカー、中心アミノ酸区間(central amino acid  stretch)、およびＣ末端３４アミノ酸のアルギニンリッチドメインをもつ。
【００１８】
ＨＢＶコアタンパク質の代表的な核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４に示す。コアタンパク質は、プレコアタンパク質のＣ末端アルギニンリッチ配列を含むという点ではプレコアタンパク質（参照：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）に対応する；しかし、コアタンパク質はプレコアタンパク質のＮ末端のシグナルペプチドおよび１０アミノ酸のリンカー配列を含まない。
【００１９】
ＨＢｅＡｇは、プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびＣ末端アルギニンリッチ配列を除去する２つのタンパク質分解事象により作製される(Wang (1991) J Virol 65(9), 5080 (21)。よって、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）はプレコアタンパク質のＮ末端１０アミノ酸リンカーペプチドを含むという点ではプレコアタンパク質（参照：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）に対応する；しかし、ＨＢｅＡｇはプレコアタンパク質のＣ末端アルギニンリッチ配列を含まない。
【００２０】
慢性Ｂ型肝炎の分子基盤は、感染した肝細胞の核内にウイルスｃｃｃＤＮＡが存続することである。
用語“共有結合閉環状ＤＮＡ”と“ｃｃｃＤＮＡ”は、本明細書中で互換性をもって用いられる。用語“共有結合閉環状ＤＮＡ”／“ｃｃｃＤＮＡ”は当技術分野で周知であり、本明細書中でそれに従って用いられる。一般に、本明細書中で用いる“共有結合閉環状ＤＮＡ”／“ｃｃｃＤＮＡ”は、ヘパドナウイルスｍＲＮＡの基準エピソーム転写鋳型として使われるＤＮＡを表わす。
【００２１】
Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、ＨＢＶヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡ（これは慢性ヘパドナウイルス感染を反映する）について認められたサロゲートマーカーである。それでもなお、ＨＢｅＡｇを用いる既知の細胞ベースのアッセイは、ウイルス  コアタンパク質との交差反応などの欠点を伴なう。
【００２２】
ｃｃｃＤＮＡレポーター検出の特異性および感度を改善するために、タグ（たとえば、Ｎ末端に組み込んだヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグ）を備えた組換えＨＢｅＡｇのｃｃｃＤＮＡ依存性産生を支持する細胞系を本発明において樹立した。さらに、（ＨＡ−）タグ付きＨＢｅＡｇを検出するための化学発光ＥＬＩＳＡ（ＣＬＩＡ）およびＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを開発した。このアッセイ系は、ハイスループットスクリーニングフォーマットおよび全自動化に適合できる。
【００２３】
本発明において提供される方法は、確立しているタグ（たとえば、ＨＡタグ、またはＨＡタグの代わりとしてもしくはそれに加えて使用できるＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグもしくはＣ９タグ）を利用する。これらのタグは、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の精製および検出に使用できる。タグに特異的に結合する抗体の使用により（たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイ、たとえば化学発光ＥＬＩＳＡ（ＣＬＩＡ）およびＡｌｐｈａＬＩＳＡによる）、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを信頼性をもって迅速に査定でき、コアタンパク質との交差反応を避けることができる。
【００２４】
本発明において提供する方法は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を用いる。その核酸分子は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質、またはヘパドナウイルスゲノムすらコードする配列を含み、ヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡ形成を反映し、可能にすることができる。当技術分野において、ＨＢＶゲノムはオーバーラップしたＯＲＦおよび多重のシスエレメント(cis element)を示す著しくコンパクトな遺伝子編成をもつことが知られている。したがって、遺伝子の挿入／欠失または配列置換はウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼす可能性がきわめて大きいと思われていた(13, 22). (Liu, et al, J Virol. 2004; 78(2):642-9.) (Wang, et al. PLoS One. 2013  2; 8(4):e60306)。従来の研究は、ＨＢＶ配列、たとえば大部分の場合ｐｏｌ／エンベロープコーディング領域をＧＦＰにより置き換えて組換えＨＢＶゲノムを作製したが、ウイルスの複製およびビリオンのアセンブリーを支持するためにウイルスタンパク質のトランス−コンプレメント(trans-complement)が必要であった(17) (Protzer, et al, PNAS (1999), 96: 10818-23.)。さらに、このレポートされた組換えＨＢＶゲノムは、許容できる細胞を感染させるために用いた場合、１ラウンドのｃｃｃＤＮＡ合成を行なうことができるにすぎず、不完全なウイルスＤＮＡ複製のためｃｃｃＤＮＡの細胞内増幅はブロックされる。
【００２５】
ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡの５’側ステム−ループ構造（イプシロン）はウイルス複製に必須のシスエレメントである。それはｐｇＲＮＡパッケージングシグナルおよびＤＮＡプライミング部位として作動する。イプシロンはプレコアＯＲＦの５’側部分とオーバーラップし、キャプシド（コア）タンパク質ＯＲＦの開始コドンを含む。イプシロン構造の統合性を変化させることなく、ＨＢＶゲノムによりコードされるプレコアＯＲＦのＮ末端シグナルペプチド配列の下流にタグをコードする核酸配列を挿入するために、本発明においては３アミノ酸のリンカー配列（ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＣ）を（ＨＡ−）タグの５’末端に導入して、ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロンのボトムにある右アームの元のウイルス配列（ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＡＴＣ）を置き換えた。それにより、ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロンの塩基対合が保持され、ＯＲＦの開始コドンはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロンの下流へ移動した。さらに、コア開始コドンの基準コザックモチーフ(Kozak motif)を維持するために、元のＧＧＣ配列はＨＡタグ配列とコアＡＵＧの間に配置された（図１）。図１はＨＢＶゲノムのイプシロン構造をコードする部分を示し、そこにタグをコードする核酸配列が本発明に従って挿入される。
【００２６】
本発明において前記の修飾がＨＢＶ  ｐｇＲＮＡ依存性のコア発現およびｐｇＲＮＡのキャプシド被包(encapsidation)に及ぼす影響は最小であると考えられる；コアタンパク質の転写開始部位はｐｇＲＮＡ鋳型においてさらに３９ヌクレオチド下流に移動したけれども、イプシロンおよびコア発現カセットは保存されたからである。実際に、この組換えＨＢＶゲノムは野生型に近いレベルのウイルスＤＮＡ複製を支持し、ｃｃｃＤＮＡ分子にプレコアＯＲＦを再構成した際にＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの産生に成功した。
【００２７】
タグをコードするオリゴの挿入はウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼさなかったので、本発明において提供する方法は、ｃｃｃＤＮＡの産生を可能にし、結果的にサロゲートマーカーである“タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原”の量を決定することにより物質／候補分子がｃｃｃＤＮＡ形成を阻害する能力を査定できる。本発明において提供する手段および方法は、主に、ヘパドナウイルスに関連する慢性疾患、たとえば（慢性）肝炎、特に慢性Ｂ型肝炎感染症の療法に使用できる候補分子をスクリーニングおよび同定するために有用である。
【００２８】
ヘパドナウイルス（たとえばＨＢＶ）プレコアＯＲＦをコードする核酸配列へのタグ（たとえばＨＡタグ）の挿入により、改善された抗原検出特異性に有用なヘパドナウイルス（たとえばＨＢＶ）ｃｃｃＤＮＡ依存性のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＢｅＡｇ）産生が得られる。本発明を支持するものとして、（ＨＡ）タグ挿入はプレコアタンパク質の発現、ならびにそれに続く翻訳後プロセシング（Ｎ末端シグナルペプチド開裂およびＣ末端ドメイン開裂）および成熟ＨＢｅＡｇ分泌に影響を及ぼさないことが本発明において確認された（図２）。より重要なことに、ヘパドナウイルス（たとえばＨＢＶ）ゲノムにおけるそのような修飾は、細胞内増幅経路によるｃｃｃＤＮＡ形成の前提条件であるウイルスｐｇＲＮＡのキャプシド被包および逆転写を妨げないことが本発明において示された（図４、６〜８、１２）。
【００２９】
本発明は、薬理作用物質をヘパドナウイルスに対するそれらの活性についてスクリーニングおよび査定することに関する。特に、本発明は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ依存性エピトープ（たとえば、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ）タグ付きＨＢＶｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の誘導発現のための組換えＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムおよび新規細胞系の設計および構築を記載する。培養液中へ分泌されたタグ付きＨＢｅＡｇを、たとえば化学発光エンザイムイムノアッセイ（ＣＬＩＡ）および／またはＡｌｐｈａＬＩＳＡにより定量測定できる。本発明は、化合物を抗ヘパドナウイルス活性、特にｃｃｃＤＮＡの形成、維持および／またはそれの転写活性を阻害する活性についてスクリーニングするのに有効な、細胞ベースのＨＢＶレポーター系を提供する。
【００３０】
本発明を図１０によりさらに説明する。そこには、３ＴＣ処理がＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞においてＨＡ−ＨＢｅＡｇシグナルを消滅させることを示した；ただし、これは３ＴＣがウイルスＤＮＡ複製をブロックし、よってｃｃｃＤＮＡが合成されない、極端な条件であった。さらに、原理の証拠として、２種類のｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤（ＣＣＣ−０９７５およびＣＣＣ−０３４６）をＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞において試験した。両化合物とも用量依存性でＨＡ−ＨＢｅＡｇレベルを低下させた；図１１を参照。
【００３１】
たとえば、限定ではない下記の抗ヘパドナウイルスアッセイを本発明に従って実施できる：
１  ．ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系を用いる、ｃｃｃＤＮＡの安定性および／または転写活性を調節する化合物／候補分子のスクリーニング；
本発明によれば、in vitro アッセイ法を用いて、化合物／候補分子が核におけるｃｃｃＤＮＡ安定性または転写活性を調節する効力をスクリーニング／評価できる。それらの化合物／候補分子はそれにより培養上清中のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）のレベルを変化させる。このアッセイを実施するために、細胞をまずテトラサイクリンの存在下で培養プレートに播種することができ、細胞が周密状態に達した後、培地を無テトラサイクリン培地と交換してヘパドナウイルス（たとえばＨＢＶ）のＤＮＡ複製およびｃｃｃＤＮＡ形成を誘導する；それには普通は６〜８日かかる。その後、テトラサイクリンを再び添加して、組み込まれたＨＢＶゲノムからの de novo ウイルスＤＮＡ複製を遮断し、それと共に３ＴＣ（または他のＨＢＶポリメラーゼ阻害剤）を添加してｃｃｃＤＮＡの細胞内増幅経路をブロックすることができる。同時に、被験化合物を一定期間、培地に添加しておくことができる。培地を次いでタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）のＥＬＩＳＡ測定に使用できる。その化合物を含有しないウェルからの培地を対照として使用できる。培地中のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）レベルを低下させる有効化合物は、ｃｃｃＤＮＡターンオーバーを促進する活性またはｃｃｃＤＮＡ転写を抑制する活性をもつ可能性がある。“有効または効果的に”という句は、本明細書中で、化合物が特定の試験濃度で本発明の細胞ベースのアッセイ系でタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）の産生を阻止し、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減するのに十分であることを示すために使用できる。ｑＰＣＲまたはハイブリダイゼーションによるｃｃｃＤＮＡおよびプレコアｍＲＮＡの定常状態レベルの直接測定を用いて、被験化合物／候補化合物／候補分子がそれぞれｃｃｃＤＮＡの安定性または転写を低減するかどうかを識別できる。
【００３２】
２．  HｅｐＢＨＡｅ細胞系を用いたヘパドナウイルス（たとえばＨＢＶ）ｃｃｃＤＮＡ形成を阻害する化合物／候補分子のスクリーニング；
本発明の他の観点によれば、in vitro アッセイ法を用いてｃｃｃＤＮＡ形成を抑制する化合物／候補分子を評価することができる。簡単に述べると、細胞を培養ウェルに播種し、細胞単層が周密状態になった日にテトラサイクリンを除くことができる。同時に、被験化合物を添加し、処理の終了時（約６日目）に培地中のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）をＥＬＩＳＡにより測定することができる。タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）の低減を生じる化合物はいずれも、それがｃｃｃＤＮＡの形成を効果的にブロックする可能性があることを示す。この in vitro アッセイ法を拡張した観点として、このアッセイにおけるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）の低減はその化合物がヘパドナウイルス（たとえばＨＢＶ）  ＤＮＡ複製を阻害する効力をもつことの指標となる可能性もあることを明記する価値がある。そのような可能性は、サザンブロットおよび／またはｑＰＣＲによりウイルス  コアＤＮＡを直接測定することによって調べることができる。上記アッセイから現れる“ヒット”には、ｃｃｃＤＮＡの安定性および／または転写に影響を及ぼす化合物が含まれる可能性もある。誘導期間中に、初期に形成されたｃｃｃＤＮＡの安定性および／または転写活性を化合物の試験によりターゲティングすることができる。
【００３３】
３．  ＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ細胞系はカウンタースクリーニング系として作動する；
理論的に、前記アッセイからの化合物“ヒット”は、ＨＡタグ付きプレコアタンパク質の翻訳もしくは翻訳後プロセシング、またはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡ−ＨＢｅＡｇ）分泌を直接阻害する可能性がある。そのような非ｃｃｃＤＮＡ阻害剤を除外するために、トランスジーンを鋳型として使ってタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ）を産生するＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ細胞において、“ヒット”をカウンタースクリーニングすることができる。他方で、ＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ細胞はＨＢｅＡｇ阻害剤をスクリーニングするために用いることもできる。
【００３４】
用語“共有結合閉環状ＤＮＡを阻害する”およびそれの文法的バージョンは、共有結合閉環状ＤＮＡの安定性の阻害（すなわち、共有結合閉環状ＤＮＡの安定性の低減）、共有結合閉環状ＤＮＡの転写活性の阻害（すなわち、共有結合閉環状ＤＮＡを転写鋳型として使うヘパドナウイルスｍＲＮＡの転写の低減）、または共有結合閉環状ＤＮＡの形成の阻害（すなわち、ｃｃｃＤＮＡの形成が無いか、またはより少ない）を表わすことができる。
【００３５】
“共有結合閉環状ＤＮＡを阻害する”という用語のこれらの代表的な説明および定義は相互排他的ではない。たとえば、共有結合閉環状ＤＮＡの形成の阻害は、共有結合閉環状ＤＮＡを転写鋳型として使うヘパドナウイルスｍＲＮＡの転写の低減（すなわち、共有結合閉環状ＤＮＡの転写活性の阻害）をもたらし／その低減と関連する可能性がある。共有結合閉環状ＤＮＡの安定性の阻害は、共有結合閉環状ＤＮＡを転写鋳型として使うヘパドナウイルスｍＲＮＡの転写の低減をもたらし／その低減と関連する可能性がある。
【００３６】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原は、本発明においてヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡのそのような阻害のいずれに対してもサロゲートマーカーとして使用できる。
前記によれば、本発明において提供する方法は、候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの形成を阻害する能力を査定するためのものであってもよい（査定するために使用できる）。これに関しては、ｃｃｃＤＮＡが形成される前に細胞を候補分子と接触させることができる。
【００３７】
本発明において提供する方法は、候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの安定性（たとえば、ｃｃｃＤＮＡの量または数）を低減する能力を査定するためのものであってもよい（査定するために使用できる）。この場合は、ｃｃｃＤＮＡが形成された後に細胞を候補分子と接触させることができる。
【００３８】
本発明において提供する方法は、候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの転写（活性）を低減する能力を査定するためのものであってもよい（査定するために使用できる）。この場合は、ｃｃｃＤＮＡが形成された後に細胞を候補分子と接触させることができる。
【００３９】
そのレベルを本発明に従って査定すべきタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原は、１以上のタグを含むことができる。本発明において示すように、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の信頼できる査定は１つのタグのみの使用により、たとえばそのタグに特異的に結合する抗体の使用により達成できる。したがって、本発明においてタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が１つのタグのみを含むことが想定され、かつ好ましい。
【００４０】
以下は、本発明に使用する１以上のタグに関する。
本明細書中で用いる用語“タグ”は、マーカーとして有用であるいずれかの化学構造体を表わす。主に、用語“タグ”は“タンパク質タグ”を表わす。用語“タグ”および“タンパク質タグ”は当技術分野で知られている；参照：特にFritze CE, Anderson TR. “Epitope tagging: general method for tracking recombinant proteins”. Methods Enzymol. 2000; 327: 3-16; Brizzard B, Chubet R. Epitope tagging of recombinant proteins. Curr Protoc Neurosci. 2001 May; Chapter 5: Unit 5.8; および／またはTerpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60(5):523-33。
【００４１】
一般に、本発明に使用するタグはヘパドナウイルスｅ抗原に融合させるタンパク質タグである。たとえば、タグをコードする核酸をヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸に、タグとヘパドナウイルスｅ抗原の両方を含む融合タンパク質が発現するように融合させることができる。タグ（単数または複数）を、ヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’末端に融合させる、ヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の内部に挿入する、および／またはヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の３’末端に融合させることができる。よって、得られる融合タンパク質は、タグ（単数または複数）をＮ末端、内部（すなわち、ヘパドナウイルスｅ抗原内に／内部エピトープとして）、および／またはＣ末端に含むことができる。本発明において示すように、内部エピトープタグはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルの信頼できる査定のために使用でき、したがって好ましい。
【００４２】
多様なタグが当技術分野で知られており、本発明に従って使用できる。通常は、本発明に使用するタグは約１〜３ｋＤａ、好ましくは約１ｋＤａの低い分子量をもつ。代表的な、限定ではない低分子量タグは、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグまたはＣ９タグである。ＨＡタグの使用が本発明において好ましい。本発明に使用するタグは１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグであってもよい。
【００４３】
低い分子量はタグの長さ、すなわちタグを構成するアミノ酸残基の数に反映される。たとえば、Ｈｉｓタグ（６アミノ酸）、ＨＡタグ（９アミノ酸）、ＦＬＡＧタグ（８アミノ酸）、または３×ＦＬＡＧタグ（２２アミノ酸）を本発明に使用できる。これらの代表的タグは野生型レベルに近いＨＢＶ  ＤＮＡ複製を支持し、したがって本発明を実施するために有用である。
【００４４】
したがって、本発明に使用するタグは６〜２２アミノ酸、たとえば６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、２１アミノ酸、または２２アミノ酸からなることができる。
【００４５】
本発明に使用するタグをコードする代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＨＡタグをコードする核酸配列；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すＨｉｓタグをコードする核酸配列；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すＶ５タグをコードする核酸配列；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すＣ９タグをコードする核酸配列である。本発明には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によりコードされるかまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアミノ酸配列からなるＨＡタグの使用が好ましい。
【００４６】
本発明に使用するＦｌａｇタグをコードする代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す１×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示す３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列である。
【００４７】
本発明に使用するタグの代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すＨＡタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すＨｉｓタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示すｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すＶ５タグのアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すＣ９タグのアミノ酸配列である。
【００４８】
本発明に使用するタグの代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示す１×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示す３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列である。
【００４９】
主にエピトープタグ、たとえばヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグの使用が本発明において想定される。エピトープタグは、高親和性抗体を多様な種において信頼性をもって産生できるという理由で選択される短いペプチド配列である。これらのタグはしばしばウイルス遺伝子に由来し、これはそれらの高い免疫反応性を説明する。これらのタグは、ウェスタンブロット法、免疫蛍光法、免疫組織化学、イムノアフィニティークロマトグラフィーおよび免疫沈降実験に特に有用である。それらは抗体精製にも使用できる。そのようなエピトープタグは、これらのタグに特異的に結合する既知の市販抗体を本発明に従って使用できるので特に有用である。
【００５０】
アフィニティータグは、アフィニティー法を用いてそれらの粗製生物源から精製できるようにタンパク質に付加される。これらにはキチン結合タンパク質(chitin binding protein)（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質(maltose binding protein)（ＭＢＰ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase)（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（Ｈｉｓ）タグは広く用いられるタグである；それは金属マトリックスに結合する。
【００５１】
クロマトグラフィータグはタンパク質のクロマトグラフィー特性を変化させて特定の分離法における異なる分解能を付与するために用いられる。しばしば、これらはポリアニオン性アミノ酸、たとえばＦＬＡＧタグからなる。
【００５２】
本質的に、いかなるタグも本発明に使用できる。本発明に使用する核酸分子に含まれるタグをコードする核酸は、ヘパドナウイルスのＤＮＡ複製、ｃｃｃＤＮＡ形成、ならびにタグ付きヘパドナウイルス抗原ｅのｃｃｃＤＮＡ依存性産生および分泌を支持することができなければならない。この能力は、本発明において提供するアッセイ、たとえば実験に提示するアッセイを用いて容易に確証できる。たとえば、ＨＡタグ挿入は安定細胞系においてｃｃｃＤＮＡから野生型レベルのＨＢＶ  ＤＮＡ複製およびＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ産生をもたらすことが本発明において証明された。これらの能力は他のタグについて容易に確認および試験することができる。たとえば、ＨｉｓタグおよびＦｌａｇタグの挿入は実際に一過性トランスフェクションアッセイにおいてウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼさない。
【００５３】
本発明の要旨から逸脱することなくさらなるタグを使用できる。
たとえば、レポータータンパク質、たとえばルシフェラーゼ（たとえば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、ガウシア(Gaussia)（海生カイアシ類）ルシフェラーゼなど)、緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein)（ＧＦＰ）などを本発明においてタグとして使用できる。これらのレポータータンパク質は、たとえば目視検査、蛍光測定などによるタグ付きヘパドナウイルスのレベルの査定を容易にする。蛍光タグはタンパク質について目視読出しを得るために用いられる。ＧＦＰおよびそれのバリアントは最も一般的に用いられる蛍光タグである。
【００５４】
本発明のスクリーニング法に使用できる代表的なレポータータンパク質は、特にルシフェラーゼ、（緑色／赤色）蛍光タンパク質およびそのバリアント、ＥＧＦＰ(enhanced green fluorescent protein、増強緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ(red fluorescent protein、赤色蛍光タンパク質、たとえばＤｓＲｅｄまたはＤｓＲｅｄ２）、ＣＦＰ(cyan fluorescent protein、シアン蛍光タンパク質）、ＢＦＰ(blue green fluorescent protein、緑青色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ(yellow fluorescent protein、黄色蛍光タンパク質)、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである。
【００５５】
ルシフェラーゼは周知のレポーターである；たとえば、Jeffrey (1987) Mol. Cell. Biol. 7(2), 725-737を参照。当業者は、対応するデータベースおよび標準テキストブック／概説から本発明に関して用いるさらなるルシフェラーゼの核酸配列およびアミノ酸配列を容易に演繹できる。
【００５６】
レポータータンパク質は、検出可能な信号の信号強度の変化を誘導することにより、ｃｃｃＤＮを阻害する候補分子の検出／査定を可能にすることができる。その検出可能な信号は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）信号、蛍光偏光（ＦＰ）信号、またはシンチレーション近接（ＳＰ）信号であってもよい。検出可能な信号を前記に規定したレポータータンパク質と関連づけることができる。たとえば、ＧＦＰはオワンクラゲ(Aequorea victoria)から得ることができる(US 5,491,084)。オワンクラゲのＧＦＰをコードするプラスミドは、ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．８７４５１から入手できる。このＧＦＰの他の変異型、特にｐＲＳＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ／ＤｓＲｅｄ、ＤＳＲｅｄ２、およびＥＹＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ（これらに限定されない）を含むものが、とりわけＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州パロアルト）から販売されている。
【００５７】
ヘパドナウイルスｅ抗原がレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ、ＧＦＰなど）に融合したものをコードする核酸配列を含む核酸分子を含む培養細胞／組織を、レポーター遺伝子の転写の証拠について、培地中の被験化合物／候補分子の濃度の関数としてモニターすることができる。被験化合物の濃度の関数としてのレポーター遺伝子の転写レベルの変動は、被験化合物／候補分子がｃｃｃＤＮＡを阻害する能力の指標となる。
【００５８】
レポータータンパク質は、通常は前記の低分子量タグ、たとえばエピトープタグより大きい。より小さな（エピトープ）タグ（たとえばＨＡタグ）をコードする核酸配列と比較してより長い挿入配列、たとえばルシフェラーゼをコードする核酸配列のため、組換えプレゲノムＲＮＡからの下流のウイルス  コアおよびｐｏｌの発現が低減する可能性があり、したがってウイルス複製を回復するためにコア／ｐｏｌのトランスコンプレメント(transcomplement)が必要な場合がある。特にこの観点の本発明に従って、たとえばヘパドナウイルス  コアタンパク質およびヘパドナウイルスポリメラーゼ（コア／ｐｏｌ）を構成性発現する細胞（単数または複数）／細胞系（単数または複数）を使用できる。
【００５９】
２以上のタグを含むタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の使用が本発明において想定される。２以上のタグの使用は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のよりいっそう信頼できる、よって有利な、査定を可能にすることができる。たとえば、２以上のタグが異なるタグである（たとえば、１つのタグはＨＡタグであり、第２タグはＨｉｓタグである）場合、両方のタグに特異的に結合する抗体を使用できる。したがってそのようなアッセイは、たとえばＥＬＩＳＡ検出のために２種類のエピトープ抗体を用いてアッセイ特異性をさらに高めることができる。
【００６０】
２２アミノ酸の３×ＦＬＡＧタグ挿入は効果的なＨＢＶ複製を支持することが本発明において見出された。したがって、たとえばＨＡ−リンカー−ＦＬＡＧのようなタンデムキメラエピトープタグの使用も本発明に採用できると考えられる。
【００６１】
前記によれば、２以上のタグ（たとえば、２以上の異なるタグ）を用いる場合、１つのタグは６〜２２個のアミノ酸からなることができる。特に本発明においては、本発明に用いるタグの全長（すなわち、２以上のタグのアミノ酸残基の和）は約２２個の最大アミノ酸を超えないことが想定される；前記にレポータータンパク質（たとえばルシフェラーゼ）に関して記載したように、組換えプレゲノムＲＮＡからの下流のウイルス  コアおよびｐｏｌの発現が低減する可能性があるからである。たとえば２以上のタグの全長が約２２アミノ酸を超える場合にそのような下流のウイルス  コアおよびｐｏｌの発現低減が起きるならば、ウイルス複製を回復するためにコア／ｐｏｌのトランスコンプレメントが必要になる可能性がある。特にこれに関して、たとえばヘパドナウイルス  コアタンパク質およびヘパドナウイルスポリメラーゼ（コア／ｐｏｌ）を構成性発現する細胞（単数または複数）／細胞系（単数または複数）を本発明に従って使用できる。
【００６２】
１つのタグのみをコードする核酸と同様に、２以上のタグをコードする核酸を、ヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’末端に融合させる、ヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の内部に挿入する、および／またはヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の３’末端に融合させることができる。タグをリンカーにより分離することができる：２以上のタグを用いる場合はタグ−リンカータグ、３つのタグを用いる場合はタグ−リンカータグ−リンカータグ、など。
【００６３】
よって、生成する融合タンパク質は２以上のタグをＮ末端、内部（すなわち、ヘパドナウイルスｅ抗原内部に／内部エピトープとして）、および／またはＣ末端に含むことができる。本発明において示すように、内部エピトープタグはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを信頼性をもって査定するために使用でき、したがって好ましい。たとえばＮ末端の１つのタグ、およびたとえば第２の内部タグ、および／またはＣ末端の第３タグをもつ状態で生成する融合タンパク質の使用が本発明において想定される。本発明の要旨から逸脱しないさらなる組合わせが自明であり、包含される。
【００６４】
２以上のタグは、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグのうち２以上であってもよい。Ｆｌａｇタグは１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグであってもよい。
【００６５】
以下に、本発明に従って用いる核酸分子を詳細に記載する。
核酸分子は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質、たとえばＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示し、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す。
【００６６】
核酸分子は、前記に定義および説明した１以上のタグをコードする核酸配列を含むことができる。１以上のタグをコードする配列は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。
【００６７】
Ｂ型肝炎ウイルスに関して、Ｎ末端シグナルペプチドおよびリンカーは、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すプレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸を構成する。したがって、１以上のタグをコードする核酸配列は、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。言い換えると、１以上のタグをコードする核酸配列は、ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸（ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示される）の５’末端から８７核酸残基を構成する核酸の３’側下流にある（挿入する）ことができる。タンパク質レベルでは、１以上のタグをＢ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質（プレコアタンパク質のアミノ酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される）の位置２９に相当するアミノ酸残基のＣ末端に挿入することができる。
【００６８】
ＨＢｅＡｇに関して、リンカーは、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示すＨＢｅＡｇのＮ末端１０アミノ酸を構成する。ＨＢｅＡｇに関して、１以上のタグをコードする核酸配列は、ＨＢｅＡｇのＮ末端１０アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。言い換えると、１以上のタグをコードする核酸配列は、ＨＢＶ  ＨＢｅＡｇをコードする核酸（ＨＢＶ  ＨＢｅＡｇをコードする核酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される）の５’末端からの３０核酸残基を構成する核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。タンパク質レベルでは、１以上のタグをＨＢｅＡｇ（ＨＢｅＡｇのアミノ酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される）の位置１０に相当するアミノ酸残基のＣ末端に挿入することができる。
【００６９】
より厳密には、１以上のタグをコードする配列は、ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列（ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示される）の位置８７と８８に相当するヌクレオチド間にある（挿入する）ことができる。これらの位置は、ヘパドナウイルスのｐｇＲＮＡのイプシロン構造において、またはヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロンにおいて、リンカーのコーディング配列とヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンとの境界を定める。ＨＢＶに関して、位置８７はリンカーをコードする配列の最後の３’側ヌクレオチドであり、位置８８はコアタンパク質をコードする配列の最初のヌクレオチドである。タンパク質レベルでは、１以上のタグをＢ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質（プレコアタンパク質のアミノ酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される）の位置２９と３０に相当するアミノ酸残基間に挿入することができる。
【００７０】
同様に、１以上のタグをコードする核酸配列は、ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列（ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される）の位置３０と３１に相当するヌクレオチド間にある（挿入する）ことができる。タンパク質レベルでは、１以上のタグをＨＢｅＡｇ（ＨＢｅＡｇのアミノ酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される）の位置１０と１１に相当するアミノ酸残基間に挿入することができる。
【００７１】
１以上のタグをコードする核酸配列は、ヘパドナウイルス  コアタンパク質、たとえばＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列の５’側上流にある（挿入する）ことができる。ＨＢＶコアタンパク質をコードする代表的な核酸をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示す。ＨＢＶコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示す。
【００７２】
１以上のタグをコードする核酸配列の前記に規定した挿入部位は、ヘパドナウイルスゲノム中のヌクレオチドの位置により規定することもできる。ＨＢＶゲノムに関して、１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子を、前記に従ってＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入することができる。これらの位置は、たとえばGalibert, F., et al (1979), Nature 281:646-650に記載される命名法に従って決定できる。本明細書中で用いるヌクレオチド（位置）“Ｃ１９０２”および“Ａ１９０３”がそれぞれプレコア領域コーディング配列の最後のヌクレオチドおよびコアＡＵＧの最初のヌクレオチドを表わすことは明らかである。それらは異なるＨＢＶ遺伝子型（Ａ〜Ｈ）配列（同様に本明細書中に提示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７〜３４に示される）間で保存されている。したがって、本発明に使用する代表的な、限定ではないＨＢＶゲノムの核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に示される。それでもなお、ある稀な（臨床）分離株からの配列において、ヌクレオチド“Ｃ”またはそれらの位置が異なる場合がある（ただし、コアＡＵＧ中の“Ａ”はそうではない）。そのような配列も本発明に含まれる。
【００７３】
本発明によれば、１以上のタグをコードする核酸配列を、ＨＢＶゲノム以外のヘパドナウイルスゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入することができる。ヘパドナウイルスゲノム中のこれらに相当する位置（すなわち、ヘパドナウイルスゲノムにおいてＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当する位置）は容易に決定できる。言い換えると、１以上のタグをコードする核酸配列を、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造またはヘパドナウイルスゲノム（好ましくはＨＢＶゲノム）によりコードされるイプシロン構造と、ヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンとの間に挿入することができる。
【００７４】
たとえば、核酸分子がヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含む場合、１以上のタグをコードする配列は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列は容易に決定できる。この配列は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンで開始し（よって、それを含む）、ヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンの前で終了する（すなわち、コアタンパク質のコーデング配列は除外される）。タンパク質レベルでは、１以上のタグをリンカー（Ｎ末端シグナルペプチドに続くリンカー）のＣ末端の最後のアミノ酸に相当するアミノ酸残基のＣ末端に挿入することができる。
【００７５】
したがって、１以上のタグをコードする核酸配列は、ヘパドナウイルスｅ抗原のＮ末端アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。これらのＮ末端アミノ酸はヘパドナウイルス  プレコアタンパク質において“リンカー”を構成する。タンパク質レベルでは、１以上のタグをリンカーの最後のＣ末端アミノ酸残基のＣ末端に挿入することができる。
【００７６】
より厳密には、１以上のタグをコードする核酸配列は、ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列（ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示される）の位置８７と８８に相当するヌクレオチド間にある（挿入する）ことができる。タンパク質レベルでは、１以上のタグを、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質（プレコアタンパク質のアミノ酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示される）の位置２９と３０に相当するアミノ酸残基間に挿入することができる。これらの位置は、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造において、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロンにおいて、リンカーのコーディング配列とヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンとの境界を定める。ＨＢＶに関して、位置８７はリンカーを構成する配列の最後の３’側ヌクレオチドであり、位置８８はコアタンパク質をコードする配列の最初のヌクレオチドである。ヘパドナウイルスＨＢＶプレコアタンパク質中のこれらに相当する位置（すなわち、ヘパドナウイルスゲノムにおいてＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列の位置８７および８８に相当する位置）は容易に決定できる。
【００７７】
同様に、１以上のタグをコードする核酸配列は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列とヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸配列との間にある（挿入する）ことができる。
【００７８】
たとえば、その核酸配列は、ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列（ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される）の位置３０と３１に相当するヌクレオチド間にある（挿入する）ことができる。タンパク質レベルでは、１以上のタグをＨＢｅＡｇ（ＨＢｅＡｇのアミノ酸は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される）の位置１０と１１に相当するアミノ酸残基間に挿入することができる。これらの位置は、プレコアタンパク質のＮ末端ヘパドナウイルスリンカーのコーディング配列（またはヘパドナウイルスｅ抗原のＮ末端ヘパドナウイルスリンカーのコーディング配列）とヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンとの境界を定める。ＨＢＶに関して、位置３０は、ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列中のリンカーをコードする配列の最後の３’側ヌクレオチドである。位置３１は、コアタンパク質をコードする核酸配列の最初のヌクレオチドである。ヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列中の相当する位置（すなわち、ヘパドナウイルスｅ抗原においてＨＢｅＡｇをコードする核酸配列の位置３０および３１に相当する位置）は容易に決定できる。
【００７９】
１以上のタグをコードする核酸配列は、ヘパドナウイルス  コアタンパク質、好ましくはＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列の５’側上流にある（挿入する）ことができる。ＨＢＶコアタンパク質をコードする代表的な核酸をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示す。ＨＢＶコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示す。言い換えると、１以上のタグをコードする核酸配列は、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造、またはヘパドナウイルスゲノム（好ましくはＨＢＶゲノム）によりコードされるイプシロン構造と、ヘパドナウイルス  コアタンパク質、好ましくはＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦ開始コドンとの間に挿入することができる。
【００８０】
前記に述べたように、本発明において使用／提供する核酸分子は、１以上のタグをコードする配列を含むことができ、その配列はヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造中へ、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造中へ挿入される。ＨＢＶゲノムによりコードされる代表的なイプシロン構造を図１に示す。ＨＢＶに関して、ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造は位置Ｔ１８４９において開始し（かつそれを含む）、ＨＢＶゲノムの位置Ａ１９０９において終了する（かつそれを含む）。ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示す。
【００８１】
前記に述べたように、１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子を、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の、下側ステム(lower stem)に挿入することができる。ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の代表的な下側ステムを図１に示す。たとえば、１以上のタグをコードする核酸配列は、ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列（ＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５に示される）の位置８７と８８に相当するヌクレオチド間に、またはＨＢｅＡｇをコードする核酸配列（ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される）の位置３０と３１に相当するヌクレオチド間に、またはＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入することができる。これらの位置はすべて、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の下側ステム内に、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステム内にある。
【００８２】
本発明において、核酸分子は、１以上のタグをコードする配列の５’側に、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の下側ステム、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含むことが想定され、かつ好ましい。Ｂ型肝炎ウイルス／タグ付きＢ型肝炎ウイルスｅ抗原に関して本明細書に記載および提示する実験および教示は、ヘパドナウイルス／タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原に全般的に適用できると考えられる。ＨＢＶに用いる挿入配列に対する唯一の修飾は、それぞれ具体的なヘパドナウイルス、好ましくはＨＢＶについて、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロンの塩基対合を維持するための、（エピトープ）タグをコードする核酸配列の５’側フランキング配列の修飾に関係する可能性がある。本発明の教示に基づいて、当業者は、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造との塩基対合を維持するために、タグをコードする核酸配列の５’側の核酸配列を容易に設計および調製することができる。特に、アヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）に関しては、それのコアＯＲＦの開始コドンはイプシロンの下流にあるので、よってＤＨＢＶについてはイプシロンの塩基対合を維持するために（エピトープ）タグをコードする核酸配列の５’側フランキング配列を導入する必要すらない。
【００８３】
図１に示すように、ＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２とＡ１９０３に相当するヌクレオチド間に核酸配列を導入し、その核酸配列は９ヌクレオチドの５’側フランキング領域（すなわち、１以上のタグをコードする核酸配列の５’側）を含み、それはヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの、たとえばＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ｔ１８５５に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成した。
【００８４】
本発明において規定する１以上のタグをコードする核酸配列および／または前記に従って挿入する核酸配列がさらに、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造との塩基対、特にヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる核酸配列を含むことは、本発明の重要な好ましい観点である。イプシロン構造との塩基対を形成できる核酸配列の使用により、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造を保存することを目的とする。イプシロン構造は、複製、ｃｃｃＤＮＡの産生、および（タグ付き）ヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＨＢＶｅ抗原の発現／産生のために重要であると考えられる。
【００８５】
好ましくは、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列は、好ましくはＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ  １８５４に相当する、または所望により位置Ｔ１８４９〜Ｔ１８５５に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成できる。一般に、ｐｇＲＮＡにおける塩基対の形成は適合リボヌクレオチド、たとえばＡ−Ｕ、Ｇ−Ｃ、およびゆらぎ塩基対Ｇ−Ｕの間で起きる。イプシロン構造が維持されていれば、本発明において使用／提供する核酸分子における複製、ｃｃｃＤＮＡの産生、および／または（タグ付き）ヘパドナウイルスｅ抗原の発現／産生は妨げられない。
【００８６】
イプシロン構造の左アームはヘパドナウイルスｅ抗原（たとえばＨＢｅＡｇ）のシグナルペプチドをコードする核酸配列の一部であり、よって変化しない状態に保持されているはずであることを留意すべきである。イプシロンの右アームにおける前記に従って設計された挿入配列は下側ステムの塩基対合を変化させるべきではない。図１に例示した挿入配列において、唯一のヌクレオチド変化はＡ１９０３Ｇに関するものであった（すなわち、ＨＢＶゲノムの位置１９０３においてＡがＧにより置き換えられた）。位置１９０３における点変異は、コアＯＲＦをヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロンの外へ移動させて、イプシロン構造の維持およびコアＡＵＧ前へのタグの挿入を可能にする。コアタンパク質はプレコアＯＲＦの開始コドンの後に転写されるゲノムＲＮＡから翻訳されるので、タグはコアタンパク質に組み込まれないであろう。
【００８７】
ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造（の下側ステム）との塩基対を形成できるエピトープタグの５’側フランキング配列は、最大３、６または９個のヌクレオチド、一般に９個のヌクレオチドからなる。
【００８８】
ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる代表的な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に示す配列からなる。ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる代表的な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４０に示すポリペプチドをコードする。
【００８９】
本発明において使用／提供する核酸分子は、１以上のタグをコードする配列の３’側に、さらにリンカーをコードする核酸配列を含むことができる。リンカーは１以上のアミノ酸残基からなることができる。好ましくは、リンカーは１つのアミノ酸残基のみ、たとえばグリシン残基からなる。
【００９０】
たとえば、リンカーをコードする核酸配列は配列ＧＧＣからなる；あるいは、その核酸配列はグリシン残基をコードする。ＧＧＣはコアＯＲＦのＡＵＧの前にある元の３個のヌクレオチドからコピーされ、それはＡＵＧと一緒に最適な翻訳開始のための典型的なコザックモチーフを組み立てる。よって、使用／挿入できるリンカーは、好ましくはコア開始コドンの基準コザックモチーフを保持するように適切に選択される。
【００９１】
たとえば、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４１に示す核酸配列を含むことができる。たとえば、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４１に示す代表的な核酸配列は、イプシロン構造（の下側ステム）との塩基対を形成できる核酸配列（ＧＴＧＧＡＣＡＴＣ；特に、ヌクレオチドＧＴＧＧＡＣＡＴはＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ｔ１８５５に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成する）、ＨＡタグをコードする核酸配列、およびリンカーとしてのグリシン残基をコードする核酸配列（後者の核酸配列は主にコア開始コドンの基準コザックモチーフを保持するために有用である）からなる。
【００９２】
本発明においては、１以上のタグをヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）内へインフレーム融合させることを想定する。同様に、本発明においては、１以上のタグをコードする核酸配列（イプシロン構造（の下側ステム）との塩基対を形成できる潜在的な５’側フランキング核酸配列を含み、および／またはコア開始コドンの基準コザックモチーフを保持するかもしくはリンカーをコードする潜在的な３’側核酸配列を含むもの）を、ヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）をコードする核酸配列にインフレーム融合させることを想定する。
【００９３】
本発明において使用および提供する核酸分子は、ヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムを含むことができる。たとえば、ＨＢＶゲノムはＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨのゲノムである。本発明に使用するＨＢＶゲノムの代表的な、限定ではない核酸配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に示す。ＨＢＶゲノムはＨＢＶ遺伝子型Ｄのゲノム、特にＨＢＶ遺伝子亜型ａｙｗのゲノム（たとえば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示すＨＢＶゲノム）であってもよい。
【００９４】
本発明によれば、(タグ付き)ヘパドナウイルスｅ抗原の（実質的な）発現／産生が可能な核酸分子、たとえばヘパドナウイルスゲノムのみを使用すべきである。たとえば、ヘパドナウイルスｅ抗原の実質的な発現／産生が可能ではない、ある臨床ＨＢＶバリアントが知られている。ある臨床ＨＢＶバリアントにおいて、ＨＢｅＡｇ陰性は、基本コアプロモーター(basal core promoter)（ＢＣＰ）二重変異（遺伝子型ＤにおけるＡ１７６４Ｔ／Ｇ１７６６Ａ）またはプレコア(precore)（ｐＣ）変異（遺伝子型ＤにおけるＧ１８９８Ａ）によるものである。ＢＣＰ変異はプレコアｍＲＮＡ転写のダウンレギュレーションによってＨＢｅＡｇを低減させるが、ｐＣ変異は未成熟終止コドンを導入してプレコア翻訳を失速させる。そのようなヘパドナウイルスバリアントは、本発明において提供する方法に対する適性がより低い。
【００９５】
本発明の好ましい態様において、タグ付きＨＢｅＡｇはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。タグ付きＨＢｅＡｇをコードする対応する核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す。これらの配列は本発明に関して特に有用であるが、好ましい態様の例にすぎない。
【００９６】
ＨＡタグ付きプレコアタンパク質、すなわちタグ付きＨＢｅＡｇの前駆体をコードする核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す。この核酸配列はタグ付きＨＢｅＡｇの前駆体をコードするので、タグ付きＨＢｅＡｇをコードする核酸配列とみなすことができる。対応するアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示す。
【００９７】
以下は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の調製についてのより詳細な記載、および候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡを阻害する能力の査定におけるその使用に関する。
【００９８】
本発明において使用／提供する核酸は、プレゲノム（ｐｇ）ヘパドナウイルスＲＮＡ、特にプレゲノム（ｐｇ）ＨＢＶ  ＲＮＡに転写可能である。
本発明においては、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を阻止するようにその核酸を設計することができると想定される。たとえば、その核酸はタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流に開始コドンＡＴＧを含まない。ＨＢＶに関して、プレコアタンパク質をコードする核酸の開始コドンを欠失または変異させることができる。たとえば、そのような開始コドン（欠失／変異させるべきもの）は、ＨＢＶゲノムの位置１８１６（を含む）〜位置１８１８（を含む）のヌクレオチドに相当するものであってもよい；たとえば図１を参照。
【００９９】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を避けることは、アッセイの開始時にその産生／発現を避けるために有利である可能性がある。本発明の目的は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をｃｃｃＤＮＡに対するサロゲートマーカーとして使用することである。タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が常に産生されていれば、それの発現／産生は必ずしもｃｃｃＤＮＡの産生と相関しない。図５に示すように、開始コドンをアッセイの後の段階で、ｃｃｃＤＮＡが形成された時点／後に回復させことができ、それによりタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の発現／産生（すなわち、そのレベル）はヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの産生／レベルを真に反映する。よって、候補分子がｃｃｃＤＮＡを阻害する能力のよりいっそう信頼できる査定を得るために、たとえばそれをコードする対応する核酸配列の開始コドンを除去／変異させることによりアッセイの開始時にはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の産生／発現を阻害し、そしてタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の産生／発現を後に可能にすることが、ヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの産生／レベルを反映させるために有利である。
【０１００】
たとえば、前記に定義および記載したタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流にある開始コドンＡＴＧを、核酸ＴＧで置き換えることができる。したがって、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を阻止するために、本発明において使用および提供される核酸分子を、たとえば点変異により修飾することができる。
【０１０１】
工程（ａ）はさらに、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を下記のことが可能な条件で培養する工程（ａａ）を含むことができる：
（ｉ）ヘパドナウイルスのプレゲノム（ｐｇ）ＲＮＡの合成；
（ｉｉ）合成されたｐｇＲＮＡからマイナス鎖ＤＮＡへの逆転写；
（ｉｉｉ）第２のプラス鎖ＤＮＡの合成；それによりマイナス鎖ＤＮＡとプラス鎖ＤＮＡが二本鎖弛緩型閉環状ＤＮＡを形成する；
（ｉｖ）弛緩型閉環状二本鎖ＤＮＡからｃｃｃＤＮＡの形成；
（ｖ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする条件の回復；
（ｖｉ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードするｍＲＮＡの転写；
（ｖｉｉ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳。
【０１０２】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする条件の回復は、前記に定義および説明したように開始コドンの回復に関係するものまたは回復であってもよい。
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ベクター、特に発現ベクターに含まれていてもよい。
【０１０３】
ベクターは、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示す配列を含むことができる。
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）をコードする核酸配列を含む核酸分子を、誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。本発明に使用する代表的な、限定ではない誘導性プロモーター（単数または複数）は、テトラサイクリン誘導性プロモーター（単数または複数）、ドキシクリン誘導性プロモーター（単数または複数）、抗生物質誘導性プロモーター（単数または複数）、銅誘導性プロモーター（単数または複数）、アルコール誘導性プロモーター（単数または複数）、ステロイド誘導性プロモーター（単数または複数）、または除草剤誘導性プロモーター（単数または複数）である。本発明に用いたテトラサイクリン誘導性プロモーター（たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されている）は、ｔｅｔ−ｏｆｆ様式で作動する。ｔｅｔ−ｏｎ様式で作動するテトラサイクリン誘導性プロモーターも本発明に使用できると考えられる。ｔｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆ系は、たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから、プラスミドまたはウイルス（レトロ−、アデノ）いずれかのバックボーンのものを入手できる。前記のテトラサイクリン／ドキシクリン誘導性プロモーターのほか、他の化合物のうちたとえば抗生物質、銅、アルコール、ステロイドまたは除草剤に応答する他の誘導性プロモーターも適している。たとえば、誘導性プロモーターはＣＭＶプロモーターである。誘導性プロモーターはｔｅｔ−ＥＦ−１  アルファプロモーターであってもよい。
【０１０４】
さらに、１以上の終止コドンを１以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入でき、たとえば１以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質は１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質である。１以上のヘパドナウイルス（ＨＢＶ）エンベロープタンパク質は、１以上のラージ表面タンパク質(large surface protein)（Ｌ）、ミドル表面タンパク質(middle surface protein)（Ｍ）およびスモール表面タンパク質(small surface protein)（Ｓ）であってもよい。１態様において、ＨＢＶエンベロープタンパク質はスモール表面タンパク質（Ｓ）である。１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質の代表的なコーディング領域を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（Ｌ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７（Ｍ）および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｓ）に示す。ＨＢＶにおいて、エンベロープタンパク質の発現を阻止するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｓ）のヌクレオチド２１７〜２２２（ＴＴＧＴＴＧ）を、たとえばＴＡＧＴＡＧに変異させることができる。
【０１０５】
候補分子は、ｃｃｃＤＮＡのサロゲートマーカーであるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（発現）レベルが対照と比較して低下すれば、ヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡを阻害できると決定される。
【０１０６】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の査定（発現）レベルをタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（発現）レベルの対照、たとえば標準または基準値と比較することを理解すべきである。対照（標準／基準値）は、候補分子と接触させていない、本発明において規定する細胞、組織または非ヒト動物において査定することができる。あるいは、対照（標準／基準値）は、本発明において規定する細胞、組織または非ヒト動物において、前記の接触工程の前に査定することができる。候補分子（単数または複数）と接触させた際のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（発現）レベルの低下を、ルーティンに用いられる基準化合物（単数または複数）、たとえばｃｃｃＤＮＡを阻害できないことが分かっている化合物により誘導されたタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（発現）レベルの低下と比較することもできる。当業者は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（発現）レベルが低下したかどうかを容易に決定／査定できる立場にある。
【０１０７】
逆に、かつ本発明の要旨から逸脱することなく、陽性対照、たとえばｃｃｃＤＮＡを阻害できることが分かっている化合物のような基準化合物（単数または複数）を使用できる。ｃｃｃＤＮＡのサロゲートマーカーであるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（発現）レベルがそのような（陽性）対照と比較して同等であるかまたは増大すらしていれば、候補分子はヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡを阻害できると判定される。
【０１０８】
本発明によれば、特に本明細書に記載するスクリーニング法または同定法において、候補分子と接触させる細胞、組織または非ヒト動物は、本発明において規定するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む。
【０１０９】
たとえば、その細胞、組織または非ヒト動物は、本発明において規定するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原を発現することができる。本明細書に説明するように、候補分子がｃｃｃＤＮＡを阻害／拮抗する能力は、したがってタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列のそのような遺伝子生成物の発現レベル、特にタンパク質発現レベルを測定することにより検出できる。（対照（標準または基準値）と比較して）低い（より低い）（タンパク質）発現レベルは、その候補分子が阻害剤／アンタゴニストとして作用する能力の指標となる。
【０１１０】
転写／発現レベルの低下のため、翻訳された遺伝子生成物のレベル（すなわち、タンパク質レベル）も低下するであろう。前記のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原タンパク質の（タンパク質）レベルは、一般にタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原タンパク質と関連する検出可能な信号の信号強度と相関する。代表的なタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原タンパク質は、前記のレポーター（たとえば、ルシフェラーゼ、（緑色／赤色）蛍光タンパク質およびそのバリアント、ＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）など）を含むことができる。
【０１１１】
したがって、細胞／組織／非ヒト動物を候補分子と接触させた際のレポーター信号の低減は、その候補分子が実際にｃｃｃＤＮＡ阻害剤／アンタゴニストであり、よってｃｃｃＤＮＡを阻害できることの指標となるであろう。前記に規定したタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを低下させる候補分子を被検候補分子から選択し、その際、好ましくはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを強く低下させる（たとえば、レポーター信号の低下に反映される）分子を選択する。
【０１１２】
本発明（特に、本明細書に開示するスクリーニング／同定法）に関して、細胞抽出物（たとえば、本明細書に記載および定義するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞抽出物）を接触させることもできると想定される。たとえば、これらの細胞抽出物は、本発明に使用する、特に候補分子と接触させる（トランスジェニック／遺伝子工学操作）細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）および／または非ヒト動物（単数または複数）から得ることができる。
【０１１３】
そのような細胞抽出物の使用は、それにより候補分子の活性を in vitro で査定できるので、特に有利である。そのような（細胞）抽出物を利用する査定／スクリーニング法は、たとえば候補分子のプレスクリーニングに使用でき、そのようなプレスクリーニングにおいて選択された分子に、次いでたとえば本明細書に開示する細胞ベースの方法で、特に（トランスジェニック）細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）および／または非ヒト動物（単数または複数）を候補分子と接触させる方法で、後続スクリーニングを施すことができる。これに関しては、したがって候補分子が前記および後記の in vitro プレ−スクリーニング法において選択されていることが好ましい。
【０１１４】
よって、本明細書中で用いる用語“細胞”は、(トランスジェニック／遺伝子工学操作）細胞（単数または複数）、（トランスジェニック／遺伝子工学操作）組織（単数または複数）および／または非ヒト（トランスジェニック／遺伝子工学操作）動物（単数または複数）を包含し、それに由来する細胞抽出物をも包含する。
【０１１５】
ハイスループットスクリーニングにおいてはルーティンに多数（しばしば数千の候補分子）が同時にスクリーニングされることを理解すべきである。したがって、(第１)スクリーニングにおいて、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを低下させる候補分子をスクリーニングする。
【０１１６】
本発明のスクリーニング法の工程（ａ）、すなわち“接触工程”は、候補分子または複数の候補分子（すなわち、種々の異なる候補分子）を含有する（生体）試料または組成物を、分析すべき細胞（タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞（単数または複数）／組織（単数または複数）／非ヒト動物）に添加することによっても達成できる。
【０１１７】
一般に、候補分子（単数または複数）、または候補分子（単数または複数）を含む／含有する組成物を、たとえばタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む（トランスフェクションした）細胞、組織または非ヒト動物に添加することができる。本明細書において定義および開示するように、用語“タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む”は、レポーターの使用を意味する。プロモーターおよび／またはエンハンサー領域を含むレポーター構築体も本発明に使用できる。
【０１１８】
本発明において、特にスクリーニング／同定法に関して使用または提供する細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）および／または非ヒト動物を、本明細書に開示するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子で安定または一過性トランスフェクションすることができる。
【０１１９】
ｃｃｃＤＮＡを阻害できる（タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルの低下に反映される）化合物／分子は、本明細書に開示する医薬設定において薬剤として有益であり、医療目的で、特にヘパドナウイルスに関連する疾患、特にヘパドナウイルスに関連する慢性疾患、たとえば慢性肝炎、特に慢性Ｂ型肝炎の処置に用いられると予想される。
【０１２０】
ヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの特異的な“アンタゴニスト”または“阻害剤”として機能できる候補分子／化合物は、低分子結合分子、たとえば低分子（有機）化合物であってもよい。
【０１２１】
薬物探索に関して、用語“低分子”は当技術分野で知られており、２，５００ダルトン未満、好ましくは１，０００ダルトン未満、より好ましくは５０〜３５０ダルトンの分子量をもつ医薬化合物に関する。（低分子）結合分子には、天然化合物および合成化合物が含まれる。本発明に関して、用語“化合物”（または、同様に“分子”）は、単一の物質または複数の物質を含む。それらの化合物／分子は、たとえば試料、たとえば植物、動物または微生物からの細胞抽出物に含まれる可能性がある。さらに、その（それらの）化合物は当技術分野で既知であるけれどもヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡに（負の）影響を及ぼす可能性があることはこれまで知られていなかった可能性がある。複数の化合物をたとえば試料に in vitro で添加するか、培地に添加するか、あるいは細胞に注入することができる。
【０１２２】
候補薬剤は、タンパク質との構造相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含むこともでき、一般に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能基を含むことができる。候補薬剤はしばしば、１以上の上記官能基で置換された炭素環式もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。
【０１２３】
代表的な候補薬剤のクラスには、複素環式化合物、ペプチド、糖類、ステロイドなどを含めることができる。それらの化合物は、有効性、安定性、医薬適合性などを高めるために修飾することができる。ある薬剤の構造同定を用いて他の薬剤を同定、作製またはスクリーニングすることができる。たとえば、ペプチド薬剤を同定する場合、それらの安定性を高めるためにそれらを多様な方法で修飾することができる；たとえば、非天然アミノ酸、たとえばＤ−アミノ酸、特にＤ−アラニンの使用、アミノ末端またはカルボキシル末端の官能化、たとえばアミノ基についてはアシル化またはアルキル化、カルボキシル基についてはエステル化またはアミド化などによる。他の安定化方法は、たとえばリポソーム内への封入などを含むことができる。
【０１２４】
前記のように、候補薬剤は、アミノ酸、脂肪酸、プリン類、ピリミジン類、核酸、およびその誘導体、構造類似体または組合わせを含めた、他の生体分子中にも見出すことができる。候補薬剤は合成化合物または天然化合物のライブラリーを含めた多様な供給源から得られる。たとえば、多様な有機化合物および生体分子をランダム合成および指向性合成するための多数の手段を利用でき、それにはランダムなオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形の天然化合物のライブラリーを入手でき、または容易に調製できる。さらに、天然の、または合成により製造したライブラリーおよび化合物は、一般の化学的、物理的および生化学的手段で容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーの作製に使用できる。既知の薬理作用剤に指向性またはランダムな化学修飾、たとえばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などを施して、構造類似体を製造することができる。
【０１２５】
本発明においては、特にペプチド、タンパク質、核酸（ｃＤＮＡ発現ライブラリーを含む）、低分子有機化合物、リガンド、ＰＮＡなどを含む化合物／分子も、ｃｃｃＤＮＡを阻害する能力について査定できると想定される。それらの化合物は機能性誘導体または類似体であってもよい。
【０１２６】
化学的誘導体および類似体を製造するための方法は当業者に周知であり、たとえばBeilstein, “Handbook of Organic Chemistry”, Springer Edition New York、または“Organic Synthesis”, Wiley, New Yorkに記載されている。さらに、、本発明に従ってそれらの誘導体および類似体をｃｃｃＤＮＡに対するそれらの作用、すなわちそれらの拮抗作用について試験することができる。
【０１２７】
さらに、ｃｃｃＤＮＡの適切なアンタゴニストもしくは阻害剤のペプチドミメティックおよび／またはコンピューター支援による設計を採用できる。たとえばタンパク質およびペプチドのコンピューター支援による設計に適したコンピューターシステムは、当技術分野で、たとえばBerry (1994) Biochem. Soc. Trans. 22:1033-1036; Wodak (1987) , Ann. N. Y. Acad. Sci. 501:1-13; Pabo (1986) , Biochemistry 25:5987-5991に記載されている。たとえば既知の化合物、物質または分子の最適化のために、上記のコンピューター解析から得られる結果を本発明方法と組み合わせて使用できる。適切な化合物は、連続化学修飾によりペプチドミメティック  コンビナトリアルライブラリーを合成し、得られた化合物をたとえば本明細書に記載する方法により試験することによっても同定できる。ペプチドミメティックコンビナトリアルライブラリーの作製および使用のための方法は、先行技術において、たとえばOstresh (1996) Methods in Enzymology 267:220-234 and Dorner (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:709-715に記載されている。さらに、ｃｃｃＤＮＡのアンタゴニストの三次元構造および／または結晶学的構造を、ｃｃｃＤＮＡの（ペプチドミメティック）アンタゴニストの設計のために使用できる(Rose (1996) Biochemistry 35:12933-12944; Rutenber (1996) Bioorg. Med. Chem. 4:1545-1558)。
【０１２８】
ｃｃｃＤＮＡを阻害できる候補分子の同定／査定は、とりわけ、適切な宿主にタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子をトランスフェクションし、その宿主を候補分子（単数または複数）と接触させることにより実施できる。
【０１２９】
本発明に使用する細胞（単数または複数）／宿主（単数または複数）は、好ましくは真核細胞（単数または複数）、特に肝細胞由来の真核細胞（単数または複数）である。真核細胞（単数または複数）は、好ましくは肝癌細胞（単数または複数）または肝細胞（単数または複数）である。真核細胞（単数または複数）は肝癌細胞（単数または複数）または肝細胞（単数または複数）に由来するものであってもよい。本発明に使用する好ましい細胞は、真核細胞ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＃ＨＢ−８０６５）である。ＨｅｐＧ２細胞は機能性ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの形成および転写を支持することが知られている。他の細胞、たとえば肝細胞由来の細胞（たとえばＨｕｈ７）の使用も本発明において想定される。非−肝細胞（単数または複数）／宿主（単数または複数）も、それらがヘパドナウイルスｃｃｃＤＮＡ形成（または、より広義にはヘパドナウイルスＤＮＡ複製）を支持する限り、本発明に従って使用できる。たとえば、そのような非−肝細胞（単数または複数）／宿主（単数または複数）を、ウイルスプレゲノムＲＮＡが細胞に導入されるかあるいはＤＮＡ鋳型から外因性プロモーター転写されればヘパドナウイルスｃｃｃＤＮＡ形成（またはヘパドナウイルスＤＮＡ複製）を支持するように、修飾することができる。そのような非−肝細胞に肝特異的転写因子がトランスコンプレメントされれば、ｃｃｃＤＮＡ転写が作動できる。本発明の核酸分子またはそれを含むベクターを、それらの細胞（単数または複数）のゲノム中に安定に組み込むことができる。
【０１３０】
本発明に従って使用する核酸分子（すなわち、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子）またはそれを含むベクターは、好ましくは（本質的に）ＤＮＡからなる。
【０１３１】
“細胞”に関して前記に挙げた説明は、これらの細胞を含むかまたはそれらに由来する組織／非ヒト動物にも適用され、それらを包含する。本発明に使用する細胞は、試料、たとえば生体試料、医学的試料または病理学的試料中に含まれる可能性がある。たとえば、細胞、組織または細胞培養物を含む流体の使用が想定される。そのような流体は体液または排泄物であってもよく、培養試料であってもよい。体液には血液、血清、血漿、尿、唾液、滑液、髄液、脳脊髄液、涙液、糞便などを含めることができるが、これらに限定されない。
【０１３２】
同様に、候補分子（単数または複数）は（生体）試料または組成物中に含まれる可能性がある。（複数の）候補分子に、しばしば第１スクリーニングを施す。第１スクリーニングで陽性と判定された試料／組成物に、先の所見を確証しかつ最も有効な阻害剤／アンタゴニストを選択するために、後続スクリーニングを施すことができる。多数ラウンドのスクリーニングおよび選択に際して、本発明において定義および開示するようにｃｃｃＤＮＡを阻害し／それに拮抗する顕著な能力を示す候補分子を選択できる。たとえば、多数の候補分子を含有するバッチ（すなわち、組成物／試料）を再スクリーニングし、阻害活性が無いかまたは不十分な候補分子を含むバッチは再試験せずに廃棄する。
【０１３３】
たとえば、多数の異なる候補分子を含む（生体）試料または組成物を試験して１つの（生体）試料または組成物が陽性と判定されれば、第２スクリーニングにおいて、好ましくは精製後に、その（生体）試料または組成物の個々の分子（単数または複数）をスクリーニングすることもできる。第１スクリーニングの（生体）試料または組成物のサブグループを後続スクリーニング（単数または複数）でスクリーニングすることもできる。前ラウンドのスクリーニングで試験したそれらの候補分子のサブグループを含む組成物のスクリーニングは、よって有望な可能性があるｃｃｃＤＮＡ阻害剤（単数または複数）に絞り込むであろう。これは、特に多数の分子をスクリーニングする場合に、スクリーニングプロセスを容易にし、かつ促進することができる。したがって、それぞれすべての個々の候補分子を第１（および後続）スクリーニング（単数または複数）でスクリーニングする（それももちろん可能である）のと比較して、スクリーニングラウンドの回数が低減する。よって、候補分子の複雑さおよび数に応じて、スクリーニングすべき（生体）試料または組成物が限られた数、好ましくは１つだけの物質（スクリーニングした分子がタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを低下させる能力を示すもの）を含むようになるまで、本明細書に記載するスクリーニング法の工程を数回実施することができる。
【０１３４】
本発明においては、たとえば蛍光を、単一細胞レベルまたは組織の単一細胞レベルで、たとえば細胞下レベルで解像できる光学測定法の使用が想定される。これらの手法は、蛍光、たとえば共焦点顕微鏡測定、デジタルイメージ記録、たとえばＣＣＤカメラ、および適切な画像解析ソフトウェアを伴なうことができる。たとえば、工程（ｂ）は、対照実験を実施することによる標準応答の測定後に行なわれる。たとえば、第１スクリーニングにおいて、候補分子を接触させずに、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原を含む細胞、組織または非ヒト動物においてタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを決定する。第２スクリーニングにおいて、候補分子を接触させた後、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを測定／査定する。レベルの差は、試験した候補分子が実際にｃｃｃＤＮＡのアンタゴニスト／阻害剤であるかどうかの指標となる。
【０１３５】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルは、遺伝子生成物のレベル（特に、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のタンパク質レベル）を、本明細書に記載する方法のいずれか、特にタンパク質の測定／検出／査定法により測定することによって定量できる。
【０１３６】
たとえば、免疫凝集、免疫沈降（たとえば、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫固定）、ウェスタンブロット法（たとえば、(in situ)免疫組織化学、(in situ)免疫細胞化学、アフィニティークロマトグラフィー、エンザイムイムノアッセイ）などを利用して、タンパク質レベルで発現を測定できる。溶液中の精製ポリペプチドの量は、物理的方法、たとえば測光法により測定できる。混合物中の特定のポリペプチドを定量する方法は、たとえば抗体の特異的結合に依存する。抗体の特異性を利用する特異的な検出法および定量法は、たとえば免疫組織化学(in situ)を含む。たとえば、細胞、組織または非ヒト動物におけるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原タンパク質レベルの濃度／量は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定できる。
【０１３７】
本発明においては、工程（ｂ）に従ったタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルの査定をＥＬＩＳＡ、ＣＬＩＡまたはＡｌｐｈａＬＩＳＡにより実施できることを想定する。
本発明において提供する方法は、確立されたタグ（たとえば、ＨＡタグ、またはＨＡタグの代わりにもしくはそれに加えて使用できるＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグもしくはＣ９タグ）の使用を利用する。これらのタグは、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の精製および検出に使用できる。タグに特異的に結合する抗体の使用（たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイ、たとえば化学発光ＥＬＩＳＡ（ＣＬＩＡ）およびＡｌｐｈａＬＩＳＡ）により、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを信頼性をもって迅速に査定することができ、かつコアタンパク質との交差反応が避けられる。
【０１３８】
本発明において提供する方法の工程（ｂ）に従ったタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルの査定は、ヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原を特異的に認識する抗体（限定ではないが、たとえば抗ＨＢｅ：クローン２９，ロット２０１１０３０５，Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１以上のタグを特異的に認識する１以上の抗体（限定ではないが、たとえば抗ＨＡ：カタログ＃  Ａ０１２４４−１００，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の使用を含むことができる。
【０１３９】
下記の抗体はＢ型肝炎ウイルスｅ抗原を特異的に認識し、本発明に従って使用できる：
Imai, et al. Demonstration of two distinct antigenic determinants on hepatitis B e antigen by monoclonal antibodies. J Immunol. 1982 Jan; 128(1):69-72.
Ferns and Tedder. Monoclonal antibodies to hepatitis B antigen (HBeAg) derived from hepatitis B core antigen (HBcAg): their use in characterization and detection of HBeAg. J Gen Virol. 1984 May; 65 ( Pt 5):899-908.
Mondelli et al. Differential distribution of hepatitis B core and E antigens in hepatocytes: analysis by monoclonal antibodies. Hepatology. 1986 6(2):199-204.
Stuckmann and Mushahwar. Re-examination and further characterization of a monoclonal antibody to hepatitis B e antigen (抗HBe). J Virol Methods. 1986 Jul;13(4):351-62.
Korec et al. Monoclonal antibodies against hepatitis B e antigen: production, characterization, and use for diagnosis. J Virol Methods. 1990 May; 28(2):165-9.
Usuda et al. A monoclonal antibody against a hepatitis B e antigen epitope borne by six amino acids encoded by the precore region. J Virol Methods. 1997 Nov; 68(2):207-15.
Sogut et al. Monoclonal antibodies specific for hepatitis B e antigen and hepatitis B core antigen. Hybridoma (Larchmt). 2011 Oct; 30(5):475-9.
あるいは、ウェスタンブロット分析または免疫組織化学的染色を実施することができる。ウェスタンブロット法は、電気泳動によるタンパク質混合物の分離と抗体による特異的検出を組み合わせたものである。電気泳動は多次元、たとえば２Ｄ電気泳動であってもよい。通常、ポリペプチドは、２Ｄ電気泳動で一方の次元に沿ったそれらの見掛け分子量により、および他方の方向に沿ったそれらの等電点により分離される。
【０１４０】
当業者は、好ましくは検出信号の強度と、たとえば決定すべきポリペプチド／タンパク質の量との相関性、好ましくは直線的相関性を利用して、ポリペプチド／タンパク質、特に本明細書に記載する遺伝子生成物の量を決定できる。したがって、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のタンパク質レベルに基づいて定量できる。当業者は、試料中のタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原タンパク質発現生成物のレベルの量／濃度を決定する際に用いる標準法を承知しており、あるいは対応する方法を標準的テキストブック(たとえば、Sambrook, 2001)から演繹できる。
【０１４１】
候補分子（単数または複数）は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（または対応するレポーター信号の）レベルが強く低下し、好ましくはきわめて低いかまたは検出不可能であれば、選択される。たとえば、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（または対応するレポーター信号の）レベルが、（対照）標準値と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、より好ましくは少なくとも９０％低下する可能性がある。
【０１４２】
細胞または組織をトランスフェクションするための方法は当技術分野で知られている。したがって、細胞または組織をトランスフェクションしてそのレポーター構築体を発現させるためにリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションを使用できる(参照：Sambrook (2001), 前記引用文中)。さらに、そのレポーター構築体を発現する核酸分子を標的細胞へ送達するためにリポソームに再構築することができる。さらなる別法として、遺伝子工学操作したウイルスベクターを用いて特定のレポーター構築体を発現するように細胞をトランスダクションすることができる。
【０１４３】
他の態様において、ｃｃｃＤＮＡ阻害を検出するためのそのレポーター構築体を含む非ヒト動物は、トランスジェニック非ヒト動物である。記載するスクリーニングアッセイに用いる非ヒト生物は、線虫(C. elegans)、酵母、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、モルモット、ラットおよびマウスからなる群から選択できる。そのようなトランスジェニック動物の作製は当業者がなしうる範囲のものである。対応する手法は、とりわけ“Current Protocols in Neuroscience” (2001), John Wiley&Sons, Chapter 3.16に記載されている。
【０１４４】
したがって、本発明は、本明細書に開示するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子をＥＳ細胞または生殖細胞に導入する工程を含む、非ヒト−トランスジェニック動物の作製方法に関するものでもある。本明細書において提供および記載する非ヒト−トランスジェニック動物は、前記のスクリーニング法および薬理学的試験に特に有用である。本明細書に記載する非ヒト−トランスジェニック動物は、ヘパドナウイルスに関連する疾患の処置のためのｃｃｃＤＮＡアンタゴニスト／阻害剤をトラッキング、選択および／または単離する薬物スクリーニングアッセイならびに科学的および医学的研究に使用できる。
【０１４５】
本発明、特にスクリーニング／同定法に関して使用するトランスジェニック／遺伝子工学操作した細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）、および／または非ヒト動物は、本明細書に記載および定義するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む。
【０１４６】
本発明は、ヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの阻害剤であると思われる化合物をスクリーニングおよび／または確証するための、細胞、組織または非ヒト動物の使用に関する。
本明細書中で用いる用語“トランスジェニック非ヒト動物”、“トランスジェニック細胞”または“トランスジェニック組織”は、対応する野生型の動物、組織または細胞のものとは異なる遺伝子材料を含む、ヒトではない非ヒト動物、組織または細胞を表わす。これに関して用語“遺伝子材料”は、いずれかの種類の核酸分子またはその類似体、たとえば本発明において規定する核酸分子またはその類似体であってもよい。用語“異なる”は、野生型の動物または動物細胞のゲノムと比較して追加されたまたはより少ない遺伝子材料を意味する。トランスジェニック細胞／動物を作製するために用いる種々の発現系の概説は、たとえば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, Bitter et al (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) および Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffithset al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)を参照されたい。
【０１４７】
本発明は、前記に規定した核酸分子、すなわちタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。前記に挙げた説明および定義を、必要な変更を加えてここに適用する。ヘパドナウイルスｅ抗原は、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である。
【０１４８】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原は１つのタグのみを含むことができる。そのタグは、６〜２２個のアミノ酸からなることができる。一般的な、本発明において好ましい（エピトープ）タグは、８、９、１０または１１個のアミノ酸からなる。６×Ｈｉｓは本発明に使用できる最小エピトープタグである。６アミノ酸未満の挿入配列が隣接ＨＢｅＡｇアミノ酸と一緒に新たなエピトープに組み立てられる可能性があり、したがってそのような挿入もタグ付きヘパドナウイルスを生じる。タグは、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグまたはＣ９タグであってもよい。Ｆｌａｇタグは１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグであってもよい。
【０１４９】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原は２以上のタグを含むことができる。２以上のタグは好ましくは異なるタグである。それらの２以上のタグの全長は、約１２アミノ酸から約３１アミノ酸までであってもよい。たとえば、２以上のタグの全長は１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１アミノ酸であってもよい。２以上のタグは２以上のヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグであってもよい。Ｆｌａｇタグは１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグであってもよい。
【０１５０】
タグ（単数または複数）をコードする代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＨＡタグをコードする核酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すＨｉｓタグをコードする核酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すＶ５タグをコードする核酸配列、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すＣ９タグをコードする核酸配列である。
【０１５１】
Ｆｌａｇタグをコードする代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す１×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示す３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列である。
【０１５２】
タグ（単数または複数）の代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すＨＡタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すＨｉｓタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示すｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すＶ５タグのアミノ酸配列、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すＣ９タグのアミノ酸配列である。
【０１５３】
Ｆｌａｇタグの代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示す１×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示す３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列である。
【０１５４】
ＨＢｅＡｇをコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示す。ＨＢｅＡｇの代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示す。
核酸分子は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す。ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す。
【０１５５】
核酸分子は１以上のタグをコードする核酸配列を含むことができ、その配列はヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入される）。
【０１５６】
１以上のタグをコードする核酸配列は、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある（挿入する）ことができる。
核酸分子はヘパドナウイルスゲノムを含むことができる。好ましくは、ヘパドナウイルスゲノムはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムである。ＨＢＶゲノムはＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨのゲノムであってもよい。ＨＢＶゲノムはＨＢＶ遺伝子型Ｄのゲノムであってもよい。好ましくは、ＨＢＶゲノムはＨＢＶ遺伝子型Ｄ、遺伝子亜型ａｙｗのゲノムである。
【０１５７】
１以上のタグをコードする核酸は、ヘパドナウイルス  コアタンパク質、好ましくはＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸の５’側上流にある（挿入する）ことができる。ＨＢＶコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示す。コアタンパク質はＨＢＶコアタンパク質であってもよい。ＨＢＶコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示す。
【０１５８】
１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子を、本発明において規定するように、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造に挿入することができる。ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示す。１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子を、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムに挿入することができる。
【０１５９】
１以上のタグをコードする配列を含む核酸分子を、ＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２とＡ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入することができる。
核酸分子は、１以上のタグをコードする配列の５’側に、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含むことができる。ヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶの（または、それによりコードされる）イプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列は、主に、好ましくはＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５４、または所望により位置Ｔ１８４９〜Ｔ１８５５に相当する位置のヌクレオチドとの塩基対を形成できる。ヘパドナウイルスゲノムのイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列は、（最大）９個のヌクレオチドからなることができる。
【０１６０】
ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる代表的な配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に示す。ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる代表的な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４０に示すポリペプチドをコードする。
【０１６１】
核酸分子は、１以上のタグをコードする配列の３’側に、リンカーをコードする配列を含む。リンカーは１以上のアミノ酸残基からなることができる。好ましくは、リンカーは１個のアミノ酸残基のみ、たとえばグリシン残基からなる。リンカーをコードする配列は、配列ＧＧＣからなることができる。リンカーをコードする配列は、グリシン残基をコードすることができる。このコーディング配列は、コア開始コドンの基準コザックモチーフを保持するのに有用であり、そのように適切に選択することができる。
【０１６２】
核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４１に示す核酸配列を含む、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含むことができる。タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。
【０１６３】
１以上のタグを、好ましくはヘパドナウイルスｅ抗原内に（または、ヘパドナウイルスｅプレコアタンパク質内へ）、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）内に（または、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質内へ）、インフレーム融合させる。
【０１６４】
タグ付きＨＢｅＡｇをコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す。タグ付きＨＢｅＡｇの好ましいアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示す。
タグ付きＢ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す。タグ付きＢ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示す。
【０１６５】
ＨＢＶゲノムの代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４に示す。
核酸はプレゲノム（ｐｇ）ヘパドナウイルスＲＮＡに転写可能である。ヘパドナウイルスＲＮＡは、好ましくはＨＢＶ  ＲＮＡである。
【０１６６】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ベクター、たとえば発現ベクター中に含まれていてもよい。好ましくは、ヘパドナウイルスｅ抗原はＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である。
【０１６７】
核酸は一般にタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の翻訳を可能にする。核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に示す配列を含むベクター中に含まれていてもよい。
【０１６８】
特定の態様において、核酸はタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を阻止するように設計される。たとえば、その核酸は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流に開始コドンＡＴＧを含まない。たとえば、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流にある開始コドンＡＴＧを、核酸ＴＧにより置き換えることができる。核酸を、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を阻止するために点変異により修飾できる。そのベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示す配列を含むことができる。
【０１６９】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）をコードする核酸配列を含む核酸分子を、誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。
【０１７０】
誘導性プロモーターは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ドキシクリン誘導性プロモーター、抗生物質誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、または除草剤誘導性プロモーターであってもよい。
【０１７１】
誘導性プロモーターは、好ましくはＣＭＶプロモーターであってもよい。誘導性プロモーターはｔｅｔ−ＥＦ−１  アルファプロモーターであってもよい。
１以上の終止コドンを、１以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質、好ましくは１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入することができる。
【０１７２】
１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質は、１以上のＬ、Ｍおよび／またはＳであってもよい。ＨＢＶエンベロープタンパク質はＳであってもよい。
１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質の代表的なコーディング領域（または、それをコードする代表的な核酸配列）を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（Ｌ）、３７（Ｍ）または３８（Ｓ）に示す。エンベロープタンパク質の発現を阻止するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｓ）のＨＢＶヌクレオチド２１７〜２２２（ＴＴＧＴＴＧ）をＴＡＧＴＡＧに変異させることができる。
【０１７３】
本発明は、前記において定義および提供する核酸分子によりコードされるタンパク質に関する。
そのタンパク質は、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはタグ付きＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を含む。
【０１７４】
Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原は１つのタグのみを含む。
【０１７５】
タグは、６〜２２個のアミノ酸からなることができる。タグは、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグまたはＣ９タグであってもよい。Ｆｌａｇタグは１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグであってもよい。
【０１７６】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原は２以上のタグを含むことができる。好ましくは、２以上のタグは異なるタグである。２以上のタグの全長は、約１４アミノ酸から約３１アミノ酸まででる。２以上のタグは、２以上のヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグであってもよい。Ｆｌａｇタグは１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグであってもよい。
【０１７７】
タグをコードする代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すＨＡタグをコードする核酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すＨｉｓタグをコードする核酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すＶ５タグをコードする核酸配列、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示すＣ９タグをコードする核酸配列である。
【０１７８】
Ｆｌａｇタグをコードする代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す１×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示す３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列である。
【０１７９】
タグの代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すＨＡタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示すＨｉｓタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示すｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示すＶ５タグのアミノ酸配列、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示すＣ９タグのアミノ酸配列である。
【０１８０】
タグの代表的なアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示す１×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示す３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列である。
【０１８１】
タンパク質は、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質を含むことができる。ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示す。ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示す。
【０１８２】
タンパク質は１以上のタグのアミノ酸配列を含むことができ、その配列はヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のシグナルペプチドおよびリンカーのアミノ酸配列のＣ末端にある。タンパク質は、１以上のタグのアミノ酸配列を、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸のアミノ酸配列のＣ末端に含むことができる。
【０１８３】
タンパク質は１以上のタグのアミノ酸配列を含むことができ、その配列はヘパドナウイルス  コアタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端、好ましくはＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にある。ＨＢＶコアタンパク質をコードする代表的な核酸をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示す。ＨＢＶコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示す。
【０１８４】
１以上のタグのアミノ酸配列を、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造によりコードされるアミノ酸配列に、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造のアミノ酸配列に挿入することができる。ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示す。１以上のタグのアミノ酸配列を、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムによりコードされるアミノ酸配列内へ、好ましくはヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムによりコードされるアミノ酸配列内へ、挿入することができる。
【０１８５】
１以上のタグのアミノ酸配列を、ＨＢＶプレコアタンパク質、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すものの位置Ｇ２９と位置Ｍ３０に相当するアミノ酸残基間に挿入することができる。
【０１８６】
タンパク質はさらに、１以上のタグのアミノ酸配列のＮ末端に、（最大）３アミノ酸のアミノ酸配列を含むことができ、最大３アミノ酸のそのアミノ酸配列は、ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる核酸配列によりコードされる。ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる核酸配列は、主に、好ましくはＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５５、または所望により位置Ｔ１８４９〜Ｔ１８５５に相当する位置のヌクレオチドとの塩基対を形成できる。ヘパドナウイルスｐｇＲＮＡ、好ましくはＨＢＶ  ｐｇＲＮＡのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる代表的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に示す配列からなる。（最大）３アミノ酸の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４０に示す。
【０１８７】
タンパク質はさらに、１以上のタグのアミノ酸配列のＣ末端に、リンカーを含む。リンカーは１以上のアミノ酸残基からなることができる。好ましくは、リンカーは１個のアミノ酸残基のみ、たとえばグリシン残基からなる。
【０１８８】
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４１に示す核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４２に示すアミノ酸配列を含むことができる。
【０１８９】
１以上のタグを、好ましくはヘパドナウイルスｅ抗原、好ましくはＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）内に、インフレーム融合させる。
タグ付きＨＢｅＡｇをコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示す。好ましくは、タグ付きＨＢｅＡｇはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示すアミノ酸配列をもつ。
【０１９０】
タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示す。タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示す。
【０１９１】
本発明は、本発明において規定および提供する核酸分子を含む宿主細胞、および／または本発明において規定および提供するタンパク質を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は真核細胞であってもよい。真核細胞は肝細胞由来のものであってもよい。真核細胞は肝癌細胞であってもよく、あるいは肝癌細胞由来のものであってもよい。好ましい態様において、真核細胞はＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＃ＨＢ−８０６５）である。
【０１９２】
本発明は、本発明において規定するタンパク質の製造方法に関するものであり、その方法は本発明において規定する宿主をタンパク質の発現が可能な条件下で培養し、産生されたタンパク質を培養物から回収することを含む。
【０１９３】
本発明は、本発明の方法に使用するためのキットに関する。同様に、本発明は、ヘパドナウイルスの共有結合閉環状ＤＮＡを阻害できると思われる候補分子をスクリーニングするための、キットの使用に関する。候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡを阻害する能力を査定するための方法に関して前記に提示した説明を、必要な変更を加えてここに適用する。
【０１９４】
キットは、本発明において規定するヘパドナウイルス抗原ｅを特異的に認識する抗体、および１以上のタグを特異的に認識する１以上の抗体を含むことができる。
本発明または本発明方法および使用の（に関して調製される）キットは、さらに指示マニュアル（単数または複数）を含むか、または備えていることができる。たとえば、その指示マニュアル（単数または複数）は、本発明に従って候補分子がｃｃｃＤＮＡを阻害する能力を査定する（方法）および／またはタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを査定する方法について当業者をガイドすることができる。特に、その指示マニュアル（単数または複数）は本発明において提供する方法または使用の採用または適用に対するガイダンスを含むことができる。
【０１９５】
本発明の（に関して調製される）キットは、さらに、本発明の方法および使用を実施するのに適した／必要な、物質／化学薬品および／または用品を含むことができる。たとえば、そのような物質／化学薬品および／または用品は、本発明において規定するタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の（タンパク質（発現））レベルを特異的に決定するのに必要な化合物を安定化および／または貯蔵するための溶剤、希釈剤および／または緩衝液である。
【０１９６】
本発明は、ヘパドナウイルスの共有結合閉環状ＤＮＡを阻害できると思われる候補分子のスクリーニングのための、本発明において規定および提供する核酸分子、本発明において規定および提供するタンパク質、および／または本発明において規定および提供する宿主細胞の使用に関する。候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡを阻害する能力を査定するための方法に関して前記に提示した説明を、必要な変更を加えてここに適用する。
【０１９７】
本明細書中で用いる用語“含む(comprising)”および“含めた(including)”またはその文法上の変形は、記載された特色、整数、工程または成分を明示しているけれども、さらに他の１以上の特色、整数、工程、成分またはそのグループの追加を排除しないと解釈すべきである。この用語は用語“からなる(consisting of)”および“本質的に・・・からなる”を包含する。よって、用語“含む”/“含めた”/”有する(having)”は、いずれかのさらなる成分（または同様に特色、整数、工程など）が存在する可能性があることを意味する。
【０１９８】
用語“からなる(consisting of)”は、さらなる成分（または同様に特色、整数、工程など）が存在し得ないことを意味する。
用語“本質的に・・・からなる(consisting essentially of)”またはその文法上の変形は、本明細書中で用いる場合、記載された特色、整数、工程または成分を明示しているけれども、さらに他の１以上の特色、整数、工程、成分またはそのグループの追加を排除しないと解釈すべきである；ただし、追加の特色、整数、工程、成分またはそのグループが特許請求の範囲に定める組成物、デバイスまたは方法の基本的な新規特徴を実質上変更しない場合のみである。
【０１９９】
用語“本質的に・・・からなる”は、特定のさらなる成分（または同様に特色、整数、工程など）、すなわち組成物、デバイスまたは方法の本質的特徴に実質上影響を及ぼさないものが存在する可能性があることを意味する。言い換えると、用語“本質的に・・・からなる”（本明細書中で用語“実質的に含む(comprising substantially)”と互換性をもって使用できる）は、必須成分（または同様に特色、整数、工程など）に加えて他の成分が組成物、デバイスまたは方法に存在することを許容する；ただし、他の成分の存在によりデバイスまたは方法の本質的特徴が実質上影響を受けない限りにおいてである。
【０２００】
用語“方法”は、与えられたタスクを達成するための様式、手段、手法および手順を表わし、化学、生化学および生物物理学の技術の専門家に既知の様式、手段、手法および手順またはそれらから容易に開発される様式、手段、手法および手順を含むが、それらに限定されない。
【０２０１】
本明細書中で用いる用語“単離された”は、それの in-vivo 存在位置から分離された組成物を表わす。好ましくは、本発明の単離された組成物または化合物は、それの in-vivo 存在位置に存在する他の物質（たとえば、他のタンパク質または他の化合物）を実質的に含まない（すなわち、精製または半精製された組成物または化合物）。
【０２０２】
本明細書中で用いる用語“約”は±１０％を表わす。
本発明を限定ではない下記の図面および例を参照することによってさらに記載する。
別に指示しない限り、組換え遺伝子技術の確立された方法、たとえばSambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001))に記載されたものを用いる。
【０２０３】
以下の例は本発明を説明する：
図面は下記のものを示す：
図１．  ＨＢＶプレコアＯＲＦ中へのＨＡタグ配列の挿入；
ＨＢＶプレコアタンパク質のＯＲＦ（遺伝子型Ｄ，亜型ａｙｗ，ヌクレオチド１８１６−２４５４）を描いてある；５’側部分（ヌクレオチド１８１６−１９４１）をヌクレオチド配列で示す。プレコアＯＲＦのヌクレオチド１９４１と終止コドンの間の配列は省略してある。プレコアＯＲＦの開始コドン、ダイレクトリピート配列１(direct repeat sequence 1)（ＤＲ１）、およびコアＯＲＦのインフレーム開始コドンは四角で囲んである。プラスミドｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅにおいては、５’末端プレコアＯＲＦの開始コドンが変異している（ＡＴＧからＴＧに）。基準ｐｇＲＮＡ転写開始部位（ヌクレオチド１８２０）を矢印でマークしてある。ＨＢＶヌクレオチド位置はGalibert命名法に従っている(5)。ＨＢＶ  ｐｇＲＮＡにおいて後続のＤＮＡ複製に際して必須のシス−エレメントとして作動する重要なステム−ループ構造（イプシロン，ε）を、推定内部構造（下側ステム、バルジ、上側ステム、ループ）で示す。インフレーム融合ＨＡタグ配列をプレコアＯＲＦ内へイプシロンの塩基対合を変化させることなく配置するために、ＨＡタグ含有ＤＮＡ配列（ｇｔｇｇａｃａｔｃＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴｇｇｃ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）をコアＯＲＦの開始コドンに隣接した上流位置にインフレーム挿入する（参照：挿入ボックス）。この配列修飾の結果、ＨＡタグ＋リンカー配列がプレコアタンパク質内へインフレーム融合し、イプシロンの下流にコアタンパク質の無傷ＯＲＦが保持される。
【０２０４】
図２．  ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの発現および分泌；
（Ａ）野生型およびＨＡタグ付きプレコアの細胞内発現。ＨｅｐＧ２細胞にプラスミドｐｃＨＢｅまたはｐｃＨＡ−ＨＢｅをトランスフェクションし、５日後、全細胞溶解物に抗ＨＢｃ抗体（上パネル）および抗ＨＡ抗体（中パネル）を用いるウェスタンブロット分析を施した。β−アクチンを装填対照として用いた。野生型プレコアおよびＨＡタグ付きプレコア（ＨＡ−プレコア）をラベルする。
【０２０５】
（Ｂ）培養液中のＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの検出。ＨｅｐＧ２細胞を偽トランスフェクションし、あるいはプラスミドｐｃＨＢｅまたはｐｃＨＡ−ＨＢｅでトランスフェクションし、指示した時点で上清試料を採集し、トランスフェクション後、５日目に細胞を回収した。上清試料に抗ＨＡ抗体を用いる免疫沈降（ＩＰ）を施し、ＨＡに対する抗体を用いるウェスタンブロットによりＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ（ＨＡ−ＨＢｅＡｇ）を検出した。抗体の軽鎖（ＬＣ）を指標とする。ＨＡ−プレコアの細胞内発現がＨＡウェスタンブロットにより解明された。
【０２０６】
図３．  ＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ細胞系におけるＨＡ−ＨＢｅＡｇの分泌；
樹立したＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ安定発現細胞系、具体的にはＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ４およびＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ４７細胞を、コラーゲンコートした１２ウェルプレートに周密状態で播種した。細胞を播種した日を０日目と設定し、隔日に培地を補充した。指示した時点で上清試料を採集し、材料および方法に記載するようにＡｌｐｈａＬＩＳＡ分析によりＨＡ−ＨＢｅＡｇを検出した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ信号（相対光単位）（Ｙ軸）を時点（Ｘ軸）に対応してヒストグラムにプロットした。
【０２０７】
図４．  一過性トランスフェクションした細胞におけるＨＡ組換えＨＢＶゲノムの複製；
ＨｅｐＧ２細胞にｐＴＲＥＨＢＶＤＥＳまたはｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅおよびプラスミドｐＴｅｔ−ｏｆｆをトランスフェクションした。トランスフェクションの５日後に細胞を回収し、ウイルスベースのＨＢＶ  ＲＮＡ、コアタンパク質、キャプシド被包されたｐｇＲＮＡの産生、およびウイルスＤＮＡ複製を、それぞれノーザンブロット、ウェスタンブロットおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。ｐｇＲＮＡ：プレゲノムＲＮＡ；ｓＲＮＡ：表面ＲＮＡ；ＲＣ：弛緩型閉環状ＤＮＡ；ＳＳ：一本鎖ＤＮＡ。
図５．  ＨｅｐＢＨＡｅ安定細胞系におけるＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ依存性ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ発現の合理的設計の模式図；
ｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅおよびｐＴｅｔ−ｏｆｆを安定トランスフェクションした細胞において、トランスジーンは１．１オーバーレングス(overlength)のＨＢＶゲノムをｔｅｔ−ＣＭＶプロモーターの制御下に含む。プレコアの開始コドン（ＡＴＧ）をＨＢＶ  ＤＮＡの５’末端で変異させ、３’側冗長配列(redundancy)にある第２のものは変化させなかった。材料および方法に記載するように、ＨＡタグを含むフラグメント（灰色で示す）をプレコアＯＲＦに挿入した。このトランスジーンは、ウイルスエンベロープタンパク質発現を阻止するために、スモール表面（Ｓ）  ＯＲＦ中に２つのタンデム終止コドンをも含む。（Ｂ）テトラサイクリンを除くと、ｐｇＲＮＡが転写され、コアおよびポリメラーゼが産生されて、ｐｇＲＮＡパッケージング、および（Ｃ）ｐｇＲＮＡからｒｃＤＮＡへの逆転写が起きる。ＤＮＡ修復メカニズムは、（Ｄ）ｒｃＤＮＡを、（Ｅ）ＨＡ−ｐｒｅコアＯＲＦが再生された環状ｃｃｃＤＮＡ鋳型に変換して、ＨＡ−プレコアｍＲＮＡ、および（Ｆ）de novo ウイルス複製のためのｐｇＲＮＡを生成する。（Ｇ）ＨＡ−プレコアｍＲＮＡからのＨＡ−プレコア翻訳、およびＥＬＩＳＡにより検出できる分泌型ＨＡ−ＨＢｅＡｇへのプロセシング。ｐｒｅＣ、Ｃ、ｐｏｌ、Ｌ、Ｍ、ＳおよびＸは、それぞれプレコア、コア、ポリメラーゼ、ラージ、ミディアムおよびスモール表面抗原、ならびにＸタンパク質のためのＯＲＦ開始コドンを表わす。ＤＲはダイレクトリピート配列を表わす。ＣＴＤはＣ末端ドメインを表わす。
【０２０８】
図６．  ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞におけるウイルスＤＮＡ複製、ｃｃｃＤＮＡ蓄積、およびＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ産生の動態；
ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞をテトラサイクリンの存在下で６ウェル−プレートに播種した。細胞単層が周密状態になった時点で、テトラサイクリンを培地から除き、培地を隔日に交換した。指示した時点で細胞および上清試料を回収した。細胞内コアＤＮＡ（上パネル）およびｃｃｃＤＮＡ（下パネル）を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。ＤＰ−ｒｃは脱タンパク質(deproteinized)（無タンパク質）ＲＣ  ＤＮＡを表わす。分泌されたＨＡタグ付きＨＢｅＡｇを前記に従ってＨＡ  ＩＰ−ウェスタンブロットにより検出した。
【０２０９】
図７．  ＨＡ組換えＨＢＶ  ＤＮＡ複製を支持する他の誘導性ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系；
ＨｅｐＤＥＳ１９細胞、および種々のクローン番号をもつ新たに樹立したＨｅｐＢＨＡｅ細胞を同一密度で６ウェル−プレートにテトラサイクリンの存在下に播種した。細胞が周密状態に達した時点で、１セットの細胞をテトラサイクリンの存在下で培養し、他の１セットの細胞をテトラサイクリンの非存在下で培養した。６日後に細胞を回収し、ウイルス  コアＤＮＡをサザンブロットにより分析した。
【０２１０】
図８．  ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系におけるｃｃｃＤＮＡの確実性；
ＨｅｐＤＥＳ１９細胞および指示したＨｅｐＢＨＡｅ細胞において産生されたｃｃｃＤＮＡを、Ｈｉｒｔ抽出法により抽出し、ゲル電気泳動およびサザンブロットハイブリダイゼーションを施した（レーン１、５、８、１１、１４）。ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの確実性をさらに確認するために、Ｈｉｒｔ  ＤＮＡ試料をゲル装填前に８５℃に５分間加熱した；これはＤＰ−ｒｃＤＮＡをＳＳ  ＤＮＡに変性させ、一方でｃｃｃＤＮＡは変性せずにそれの電気泳動移動性が変化しないまま保持される条件である（レーン２、６、９、１２、１５）。熱変性ＤＮＡ試料をさらにＥｃｏＲＩで消化した；この条件で、ｃｃｃＤＮＡは線状化してゲノム長の二本鎖ＤＮＡになる（レーン３、７、１０、１３、１６）。
【０２１１】
図９．  ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系におけるＨＡ−ＨＢｅＡｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出；
ＨｅｐＢＨＡｅ細胞をテトラサイクリンの存在下でプレートに播種した。細胞が周密状態になった時点でテトラサイクリンを培地から除き、培地を隔日に交換した。上清試料を指示した時点で回収し、ＨＡ−ＨＢｅＡｇ検出のためにＡｌｐｈａＬＩＳＡを施した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ読出し（相対光単位，ＲＬＵ）をカウント毎秒（ＣＰＳ）として表わした。
【０２１２】
図１０．  ＨＢＶ複製阻害剤（３ＴＣ）はＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞におけるＨＡ−ＨＢｅＡｇ発現をブロックする；
ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞を６ウェル−プレートにおいてテトラサイクリンの存在下で周密状態になるまで培養した。１セットの細胞を継続してテトラサイクリンの存在下に維持した。第２セットの細胞を次いで無テトラサイクリン培地に切り換えた。第３セットの細胞を次いで１０μＭの３ＴＣを含有する無テトラサイクリン培地で培養した。培地を隔日に補充し、指示した時点で回収した上清試料にＨＡタグ付きＨＢｅＡｇについての化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）を施した。
【０２１３】
図１１．  ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤はＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞においてＨＡ−ＨＢｅＡｇレベルを低下させた；
細胞を９６ウェル−プレートに播種し、細胞が周密状態になった時点で、ウイルス複製を誘導するためにテトラサイクリンを培地から除いた。同時に、細胞を非処理のままとし、または指示した濃度の化合物で処理した；処理グループおよび非処理グループにおいてＤＭＳＯ濃度を０．５％に正規化した。４日毎に処理を繰り返した。処理後１２日目に、培養液にＨＡ−ＨＢｅＡｇ  ＣＬＩＡを施し、読出しを対照に対するパーセント（平均±ＳＤ）としてプロットした。
【０２１４】
図１２．  他のＨｅｐＢＨＡｅ細胞クローンにおけるウイルスＲＮＡ転写、ＤＮＡ複製およびｃｃｃＤＮＡ蓄積の動態；
指示したＨｅｐＢＨＡｅ細胞をテトラサイクリンの存在下で６ウェル−プレートに播種した。細胞単層が周密状態になった時点で、テトラサイクリンを培地から除き、培地を隔日に交換した。細胞を指示した時点で回収した。総ウイルスＲＮＡ（上パネル）、細胞質コアＤＮＡ（中パネル）を抽出し、それぞれノーザンブロットおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。抽出したｃｃｃＤＮＡを８５℃で５分間、熱変性させ、次いでＥｃｏＲ  Ｉにより線状化し、続いてサザンブロット分析を行なった（下パネル）。
【０２１５】
図１３．  他のＨｅｐＢＨＡｅ細胞クローンにおけるＨＡ−ＨＢｅＡｇのｃｃｃＤＮＡ依存性発現；
選択したＨｅｐＢＨＡｅ細胞を９６ウェル−プレートにおいてテトラサイクリンの存在下で周密状態まで培養した。１セットの細胞を継続してテトラサイクリンの存在下に維持した。第２セットの細胞を次いで無テトラサイクリン培地に切り換えた。第３セットの細胞を次いで１０μＭの３ＴＣを含有する無テトラサイクリン培地で培養した。培地を隔日に補充し、処理後９日目に回収した上清試料にＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ検出のための化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）を施した。
【実施例】
【０２１６】
実施例により本発明を説明する。
実施例１：Ｂ型肝炎ウイルス共有結合閉環状ＤＮＡ依存性エピトープタグ付きｅ抗原を誘導発現する培養細胞系、および抗ウイルス物質をスクリーニングするためのその使用
材料および方法
プラスミド
ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）融合プレコアオープンリーディングフレームの開始コドンをノックアウトしたものを収容したテトラサイクリン誘導性ＨＢＶ複製ベクターを構築するために、ＣＭＶ−ＩＥプロモーターのＴＡＴＡボックスモチーフおよび下流のＨＢＶフラグメント（遺伝子型Ｄ，亜型ａｙｗ，ヌクレオチド１８０５−２３３５）を含み、プレコアＯＲＦのヌクレオチド１８１６（Ａ）を欠失し、ＨＡタグ配列が挿入されたＤＮＡフラグメントを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．により化学合成した。このＤＮＡフラグメント内には、５’末端にＳａｃＩ制限酵素部位が存在し、３’末端に基準ＢｓｐＥＩ制限部位が存在する。ベクターｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅは、この合成ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＴＲＥＨＢＶＤＥＳのＳａｃＩ／ＢｓｐＥＩ制限部位に挿入することにより構築された。ｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅの完全配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３５に示す。
【０２１７】
ＨＡ融合プレコア発現ベクターを作製するために、ＨＡ配列を挿入したＨＢＶヌクレオチド１８１６−２３３５を含むＰＣＲフラグメントを、ｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅから、プライマー
５’−ＡＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’および
５’−ＡＣＡＧＴＡＧＴＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＡＧＧＧＧ−３’
を用いて増幅した。ＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩおよびＢｓｐＥＩで制限消化し、プレコア発現ベクター（ｐｃＨＢｅ）の同じ制限部位に挿入して、プラスミドｐｃＨＡ−ＨＢｅを得た。ｐｃＨＡ−ＨＢｅの完全配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３９に示す。
【０２１８】
細胞培養
ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＨＢ−８０６５（商標））、すなわちＨＢＶ複製を支持する肝芽腫細胞系を、ＡＴＣＣから入手した。ＨＢＶ  ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡを誘導発現するＨｅｐＧ２由来ＨｅｐＤＥＳ１９細胞系が以前に記載されている(7)。１０％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−Ｆ１２培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中に細胞系を維持した。
【０２１９】
ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系を樹立するために、ＨｅｐＧ２細胞に、テトラサイクリン応答性転写アクチベーターを発現するプラスミドｐＴｅｔ−ｏｆｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびプラスミドｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅをトランスフェクションした；その際、修飾されたＨＢＶ  ｐｇＲＮＡの転写はテトラサイクリン応答エレメントを含むＣＭＶ−ＩＥプロモーターにより制御される。トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞を、１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下に５００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択した。Ｇ４１８耐性クローンを採取し、増殖させて細胞系にした。細胞を無テトラサイクリン培地で培養することによりＨＢＶ複製を誘導し、ウイルスＤＮＡ複製中間体のレベルをサザンブロットハイブリダイゼーションにより決定した。高レベルのＨＢＶ複製を伴なう細胞系を選択し、異なるクローン番号をもつＨｅｐＢＨＡｅとして表示した。
【０２２０】
ＨｅｐＧ２細胞にｐｃＨＡ−ＨＢｅプラスミドをトランスフェクションすることによりＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ安定発現細胞系ＨｅｐＨＡ−ＨＢｅを作製し、コロニーを５００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択し、抗ＨＡウェスタンブロット分析により陽性コロニーを同定した。
【０２２１】
ＨｅｐＢＨＡｅおよびＨｅｐＨＡ−ＨＢｅの安定細胞系をＨｅｐＧ２と同じ方法で、ただし５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加して培養した。ＨｅｐＢＨＡｅ細胞については、維持に際してＨＢＶ  ｐｇＲＮＡの転写を抑制するために１μｇ／ｍｌのテトラサイクリンをルーティンに添加した。
【０２２２】
細胞トランスフェクション
細胞（約１．０×１０６）を、コラーゲンコートした３５ｍｍ径の皿において、抗生物質を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に播種した。一夜のインキュベーション後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って用いて各ウェルに合計４μｇのプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞または上清の試料を指示した時点で回収した。
【０２２３】
ウイルス核酸分析
総細胞ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で製造業者のプロトコルに従って抽出した。キャプシド被包されたウイルスｐｇＲＮＡを下記に従って精製した；１２ウェルプレートの１ウェルからの細胞を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ−４０および５０ｍＭのＮａＣｌを含有する細胞溶解緩衝液２５０μｌ中、３７℃で１０分間溶解し、遠心により核を除去した。試料を６Ｕのミクロコッカスヌクレアーゼおよび１５μｌの１００ｍＭ  ＣａＣｌ２と共にインキュベートし、３７℃で１５分間インキュベートして遊離核酸を消化した。キャプシド被包されたウイルスｐｇＲＮＡを、７５０μｌのＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により製造業者のプロトコルに従って抽出した。ＲＮＡ試料を、２．２Ｍのホルムアルデヒドを含有する１．５％アガロースゲルにより電気泳動し、２０×ＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）中でＨｙｂｏｎｄ−ＸＬ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に写し取った。
【０２２４】
細胞質ウイルス  コアＤＮＡを下記に従って抽出した；３５ｍｍ径の１つの皿からの細胞を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０および２％のスクロースを含有する細胞溶解緩衝液０．５ｍｌにより３７℃で１０分間溶解した。細胞屑および核を遠心により除去し、上清を３μｌの１Ｍ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２および５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。ヌクレオキャプシド沈殿のために、上清を次いで１５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、および１３０μｌの、１．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する３５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００と混合した。氷上で１時間インキュベートした後、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間の遠心によりウイルスヌクレオキャプシドをペレット化し、続いて０．５ｍｇ／ｍｌのプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液４００μｌ中、３７℃で１時間、消化した。消化混合物をフェノールで抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。各プレートからのコアＤＮＡ試料の三分の一を電気泳動により１．２％アガロースゲル中へ分離させた。次いで、０．２ＮのＨＣｌを含有する緩衝液中での脱プリン、０．５ＭのＮａＯＨおよび１．５ＭのＮａＣｌを含有する溶液中での変性、ならびに１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１．５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中での中和をゲルに施した。ＤＮＡを次いで２０×ＳＳＣ緩衝液中でＨｙｂｏｎｄ−ＸＬ膜上へブロットした。
【０２２５】
無タンパク質ウイルスＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡおよび無タンパク質ｒｃＤＮＡ）の抽出を、改変Ｈｉｒｔ抽出法により実施した(4, 8)。簡単に述べると、３５ｍｍ径の１つの皿からの細胞を３ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＤＴＡ、および０．７％  ＳＤＳ中で溶解した。室温で３０分間のインキュベーション後、溶解物を１５−ｍｌチューブへ移し、この工程に続いて０．８ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、４℃で一夜インキュベートした。溶解物を次いで１０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間の遠心によって澄明にし、フェノールで２回、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回、抽出した。ＤＮＡをエタノール中において室温で一夜沈殿させ、ＴＥ緩衝液に溶解した。この無タンパク質ＤＮＡ試料の三分の一を次いで１．２％アガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−ＸＬ膜に写し取った。
【０２２６】
ＨＢＶ  ＲＮＡおよびＤＮＡの検出のために、［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）標識したプラス鎖またはマイナス鎖特異的全長ＨＢＶリボプローブで膜を標識した。５ｍｌのＥＫＯＮＯハイブリダイゼーション緩衝液（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）中において、６５℃で１時間のプレハイブリダイゼーションおよび６５℃で一夜のハイブリダイゼーションによりハイブリダイゼーションを実施し、続いて０．１×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中、６５℃で１時間、洗浄した。膜をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒスクリーンに露光し、ハイブリダイゼーション信号をＴｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ−７０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により検出した。
【０２２７】
ウェスタンブロット分析
３５ｍｍ皿内の細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解した。合計５０μｌの細胞溶解物をＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に写し取った。膜をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅブロッキング緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でブロックし、ＨＢｃＡｇ（アミノ酸１７０−１８３）、ＨＡタグ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，クローンＭ２）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する抗体で調べた。結合した抗体をＩＲＤｙｅ二次抗体により解明した。イムノブロット信号をＬｉ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステムで視覚化および定量した。
【０２２８】
免疫沈降
３５ｍｍ径の１つの皿からの細胞を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０、２％のスクロース、および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｇ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する細胞溶解緩衝液０．５ｍｌで溶解した。遠心して細胞屑を除去した後、澄明な細胞溶解物を５０μｌのＥｚｖｉｅｗ  Ｒｅｄ  抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に４℃で一夜、穏やかに回転させながらインキュベートした。３５ｍｍ径の１つの皿からの培地試料（合計１ｍｌ）のうち０．５ｍｌに、そのまま免疫沈降を施した。ビーズをＴＢＳ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］）で４℃において３回洗浄した。ペレット化したビーズをＬａｅｍｍｌｉ緩衝液でタンパク質試料調製した。免疫沈降したＨＡタグ付きタンパク質を、ＨＡタグに対する抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いるウェスタンブロットにより検出した。
【０２２９】
ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの検出のためのＥＬＩＳＡ
ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの化学発光エンザイムイムノアッセイ（ＣＬＩＡ）検出のために、高感度のストレプトアビジンコートしたプレート（黒色，カタログ＃：１５５２５，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）により３回洗浄し、次いで５０μｌの抗ＨＡ−ビオチン（カタログ＃：Ａ００２０３，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌ）と共に室温で３０分間インキュベートし、続いて２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。洗浄緩衝液を除去した後、５０μｌの培養上清試料をＥＬＩＳＡウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートし、続いて２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで５０μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートした抗ＨＢｅ抗体（ＨＢｅＡｇ  ＣＬＩＡキットから，カタログ＃：ＣＬ０３１２−２，Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。２００μｌのＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＣＬＩＡキットからの基質ＡおよびＢをそれぞれ２５μｌ添加し、プレートを穏やかに１０秒間、振とうした。プレートをルミノメーターで読み取った。
【０２３０】
ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇのＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出のために、抗ＨＡ−ビオチン（カタログ＃：Ａ００２０３，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を１×アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％  ＢＳＡ，ｐＨ７．４）に希釈して２μｇ／ｍｌにし、５μｌをＰｒｏｘｉプレート−３８４  ＨＳ（カタログ＃：６００８２７９，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の各ウェル中へ分注した。５μｌの培養液試料を次いでウェルに添加し、穏やかに混合し、続いて室温で３０分間インキュベートした。その後、５μｌの０．２μｇ／ｍｌ  抗ＨＢｅ（クローン２９，ロット２０１１０３０５，Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を添加し、穏やかに混合し、続いて室温で３０分間インキュベートした。次いで、アッセイ溶液を５μｌの希釈した抗−マウスＩｇＧ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（カタログ＃：ＡＬ１０５Ｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（１２５μｇ／ｍｌ）と混合し、室温で３０分間インキュベートし、続いて５μｌのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズ（カタログ＃：６７６０００２Ｓ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（１２５μｇ／ｍｌ）と共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。
【０２３１】
結果
本発明において、それぞれトランスジーンおよびＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡからＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ（ＨＡ−ＨＢｅＡｇ）を発現させるための２タイプの新規細胞系、ならびに組換えＨＢｅＡｇを化学発光イムノアッセイおよびＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより検出するための方法を提供する。これらの細胞系およびアッセイ法は、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベルを低減する化合物および／またはｃｃｃＤＮＡ転写を抑制する化合物のハイスループットスクリーニングに適切である。
【０２３２】
小型でコンパクトなＨＢＶ  ＤＮＡゲノムサイズおよびオーバーラップしたゲノム構成により、トランスフェクションした細胞におけるウイルスＤＮＡ複製および後続のｃｃｃＤＮＡ形成に影響を及ぼすことなくレポーター遺伝子を挿入するのが制限される。
【０２３３】
プレコア／ＨＢｅＡｇをＨｅｐＤＥ１９細胞において工学操作してｃｃｃＤＮＡ依存性様式にすることはできる(3)。当技術分野において、ＨＢＶゲノムはオーバーラップしたＯＲＦおよび多重のシスエレメントを示すきわめてコンパクトな遺伝子編成をもつことが知られている。したがって、遺伝子の挿入／欠失または配列置換はウイルスＤＮＡ複製に影響を及ぼす可能性がきわめて大きいであろうと考えられていた。以前の研究は、ＨＢＶ配列、たとえば大部分の場合はエンベロープコーディング領域をＧＦＰにより置き換えて組換えＨＢＶゲノムを作製したが、ウイルス複製およびビリオンアセンブリーを支持するためにウイルスタンパク質のトランス−コンプレメントが必要であった(Protzer, et al, PNAS (1999), 96: 10818-23.)。さらに、それらのレポートされた組換えＨＢＶゲノムは、許容される細胞にインフェクションするのに用いた場合に第１ラウンドのｃｃｃＤＮＡ合成を行なうことができるにすぎず、ｃｃｃＤＮＡの細胞内増幅はウイルスＤＮＡ複製の欠陥のためブロックされる。
【０２３４】
上記の先行技術の知見にもかかわらず、本発明においては、プレコアオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にインフレーム融合した短い外因性エピトープタグがＨＢＶゲノムによって耐容されてｃｃｃＤＮＡ鋳型から発現でき、よってタグ特異的抗体とＨＢｅＡｇ抗体の対がＥＬＩＳＡ検出の特異性を著しく改善するであろうと企画および推論した。
【０２３５】
ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）融合したプレコアオープンリーディングフレームを含むテトラサイクリン誘導性ＨＢＶ複製ベクターを構築するために、ＨＡタグを含むＤＮＡ配列（ｇｔｇｇａｃａｔｃＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴｇｇｃ；ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ．：４１）をＨＢＶ発現ベクターｐＴＲＥＨＢＶＤＥＳ内のコアＯＲＦの開始コドンに隣接したインフレーム上流位置に挿入した；その際、ＨＢＶ  ｐｇＲＮＡ発現はテトラサイクリン（ｔｅｔ）調節されたＣＭＶ−ＩＥプロモーターによりＴｅｔ−ｏｆｆ様式で支配される。ＨＡタグ（大文字）のフランキング配列（小文字）は、ＨＢＶゲノムのステム−ループ構造（イプシロン，ε）の塩基対合およびコアＯＲＦ開始コドンのコザックモチーフを保持するように設計された（図１）。得られた組換えプラスミドをｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅと表記した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）。ＨＡタグ挿入のほかに、プラスミドｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅはプレコアＯＲＦの５’末端開始コドンに点欠失（ＡＴＧをＴＧに）を含み、それによりプラスミド鋳型中におけるＨＢＶゲノムからのプレコアの発現が阻止される。さらに、ＨＢＶ感染性粒子の産生をブロックするために、スモール（Ｓ）エンベロープタンパク質のアミノ末端のコーディング領域に２つのタンデム終止コドンを導入した（２１７ＴＴＧＴＴＧ２２２を２１７ＴＡＧＴＡＧ２２２に；変異に下線を施した）。
【０２３６】
エピトープタグ付きＨＢＶプレコアタンパク質の発現およびＨＢｅＡｇ分泌の実現性を試験するために、ＨＡタグ含有ＤＮＡ配列をプレコア発現プラスミドｐｃＨＢｅ中の前記と同じウイルスＤＮＡ部分に挿入し、構築体をｐｃＨＡ−ＨＢｅと表示した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）。ｐｃＨＡ−ＨＢｅをＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションすることにより、ＨＡタグ付きプレコアタンパク質の細胞内発現およびＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの細胞外蓄積が生じ（図２）、よってプレコアタンパク質へのＨＡタグの挿入はプレコア発現、翻訳後プロセシング、およびＨＢｅＡｇ分泌に影響を及ぼさないことが確認された。材料および方法のセクションに記載したように、ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ（ＨＡ−ＨＢｅＡｇ）を検出するための化学発光ＥＬＩＳＡおよびＡｌｐｈａＬＩＳＡも確立された。
【０２３７】
前記に従って、ＨｅｐＧ２細胞にｐｃＨＡ−ＨＢｅを安定トランスフェクションすることにより、ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇを継続発現する細胞系を樹立した。高レベルのＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ発現を伴なう２クローンをＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより選択し、それぞれＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ４およびＨｅｐＨＡ−ＨＢｅ４７と表示した（図３）。
【０２３８】
組換えＨＢＶプラスミドｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅは、ｐＴＲＥＨＢＶＤＥＳが一過性トランスフェクションアッセイにおいて行なったものに匹敵するレベルでＨＢＶ  ＤＮＡを複製することができ（図４）、これはＨＡタグ挿入がＨＢＶゲノム複製により耐容されたことを示唆する。次いで、ｐＴＲＥＨＢＶ−ＨＡｅをｐＴＥＴ−ｏｆｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共にＨｅｐＧ２細胞中へ安定に共トランスフェクションして、テトラサイクリン誘導性ＨＢＶ細胞系を作製した。理論的に、そのような細胞系においては、プレコアＯＲＦ開始コドンのサイレンスのため誘導に際してプレコアタンパク質およびそれの派生物ＨＢｅＡｇはトランスジーンから産生しないであろう。転写されたｐｇＲＮＡはウイルス  コアタンパク質およびポリメラーゼを発現し、逆転写を開始してｒｃＤＮＡを生成し、細胞内増幅経路を介してｃｃｃＤＮＡ形成をもたらすであろう。ｐｇＲＮＡの３’側冗長配列にある不完全プレコアＯＲＦの開始コドンがウイルスＤＮＡ配列中へコピーされ、ＨＡタグ付きプレコアの無傷ＯＲＦがｒｃＤＮＡからｃｃｃＤＮＡへの変換に際して再構築されるであろう。よって、ＨＡ−プレコアｍＲＮＡはｃｃｃＤＮＡのみから転写されて、分泌されたＨＡタグ付きＨＢｅＡｇは核内ｃｃｃＤＮＡに対するサロゲートマーカーとなることができる（図５）。
【０２３９】
高レベルのＨＢＶ  ＤＮＡ複製をテトラサイクリン依存性様式で支持する５つの細胞系（ＨｅｐＢＨＡｅ１、ＨｅｐＢＨＡｅ１３、ＨｅｐＢＨＡｅ３４、ＨｅｐＢＨＡｅ４５、ＨｅｐＢＨＡｅ８２）を得た（図６および７）。
【０２４０】
代表的な系統ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞において、テトラサイクリン除去した際に複製可能ＤＮＡ中間体およびｃｃｃＤＮＡを含むウイルス生成物の合成および蓄積の時間依存性動態がみられた。ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞の培養液中に、テトラサイクリン除去後６日目にＨＡタグ付きＨＢｅＡｇもウェスタンブロットにより検出され、この抗原レベルはその後徐々に増大した。Ａタグ付きＨＢｅＡｇ（ＨＡ−ＨＢｅＡｇ）のレベルはウイルス  コアＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡの細胞内レベルに比例していた（図６）。ＨｅｐＢＨＡｅ細胞系から産生されたｃｃｃＤＮＡの確実性は熱変性およびさらなる制限酵素消化により確認された（図８）。よって、プレコアにＨＡタグを挿入した組換えＨＢＶのＤＮＡ複製およびｃｃｃＤＮＡ形成を支持する誘導性細胞系が樹立された。
【０２４１】
培養ＨｅｐＢＨＡｅ細胞からの上清試料についてのＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより、１６日間タイムコース試験でＨＡタグ付きＨＢｅＡｇのレベル増大が立証された（図９）。ＨｅｐＨＢＡｅ１３細胞をさらなる確証のために選択した。細胞を３つの条件下で培養した：１）トランスジーン発現を抑制するためにテトラサイクリンの存在下で；２）ウイルスＤＮＡ複製を誘導するためにテトラサイクリンの非存在下で；３）ウイルスＤＮＡ複製および後続のｃｃＤＮＡ形成をブロックするために、テトラサイクリンの非存在下で、ただし３ＴＣ処理を伴なって。化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）は、ｃｃｃＤＮＡ確立および遺伝子発現の結果として培地におけるＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ信号がテトラサイクリン除去後６日目に出現し、その後次第に増大したことを示した。予想したように、テトラサイクリンの存在下または３ＴＣ処理（ｔｅｔ−）下ではいずれの時点でも培養液中にＨＡ−ＨＢｅＡｇは検出されなかった（図１０）。さらに、これまでに同定された２種類のｃｃｃＤＮＡ形成阻害剤、具体的にはＣＣＣ−０９７５およびＣＣＣ−０３４６(3)が、ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞からのＨＡ−ＨＢｅＡｇ産生の用量依存性阻害を示した（図１１）。したがって、ＨｅｐＢＨＡｅ１３細胞におけるＨＡタグ付きＨＢｅＡｇの産生はｃｃｃＤＮＡ依存性である。
【０２４２】
さらに、ＨｅｐＢＨＡｅ１、ＨｅｐＢＨＡｅ４５およびＨｅｐＢＨＡｅ８２を含めた他のＨｅｐＢＨＡｅ細胞系が、テトラサイクリン除去した際にＨＢＶ  ｍＲＮＡ、細胞質コアＤＮＡ、および核ｃｃｃＤＮＡの時間依存性蓄積を示した（図１２）。図１３に示すように、これら他の３種類のＨｅｐＢＨＡｅ細胞系においてｃｃｃＤＮＡ依存性ＨＡタグ付きＨＢｅＡｇ産生が確証された。
【０２４３】
まとめると、本発明においてＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡ依存性でＨＡタグ付きＨＢｅＡｇを発現する新規な誘導性細胞系が樹立され、それは本明細書に記載するＨＡ−ＨＢｅＡｇ検出法による抗ウイルス化合物スクリーニングにおいてＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡに対するサロゲートマーカーとして使用できる。
【０２４４】
本発明は下記のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について述べる：
本明細書に提示する配列はＮＣＢＩデータベースにおいて入手でき、世界規模ウェブからncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=geneで検索できる；これらの配列はアノーテーションおよび修飾した配列にも関係する。本発明は本発明において提供する簡潔な配列の相同配列およびバリアントを使用する手法および方法をも提供する。好ましくは、そのような“バリアント”は遺伝子バリアントである。
【０２４５】
【化１−１】
0006543338.tif 000002
【０２４６】
【化１−２】
0006543338.tif 000003
【０２４７】
【化１−３】
0006543338.tif 000004
【０２４８】
【化１−４】
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【０２４９】
【化１−５】
0006543338.tif 000006
【０２５０】
【化１−６】
0006543338.tif 000007
【０２５１】
【化１−７】
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【０２５２】
【化１−８】
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【０２５３】
【化１−９】
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【０２５４】
【化１−１０】
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【０２５５】
【化１−１１】
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【０２５６】
【化１−１２】
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【０２５７】
【化１−１３】
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【０２５８】
【化１−１４】
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【０２５９】
【化１−１５】
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【０２６０】
【化１−１６】
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【０２６１】
【化１−１７】
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【０２６２】
【化１−１８】
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【０２６３】
【化１−１９】
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【０２６４】
【化１−２０】
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【０２６５】
【化１−２１】
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【０２６６】
【化１−２２】
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【０２６７】
【化１−２３】
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【０２６８】
【化１−２４】
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【０２６９】
【化１−２５】
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【０２７０】
【化１−２６】
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【０２７１】
【化１−２７】
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【０２７２】
【化１−２８】
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【０２７３】
【化１−２９】
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【０２７４】
【化１−３０】
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【０２７５】
【化１−３１】
0006543338.tif 000032
【０２７６】
【化１−３２】
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【０２７７】
【化１−３３】
0006543338.tif 000034
【０２７８】
本明細書に引用したすべての参考文献を全体として援用する。以上に本発明を十分に記載したので、本発明またはそのいずれかの態様の精神または範囲に影響を及ぼすことなく広い均等範囲の条件、パラメーターなどで本発明を実施できることは当業者に理解されるであろう。
【０２７９】
前記に従って、また特許請求の範囲に定めるように、本発明は特に下記の項目に関する：
１．  候補分子がヘパドナウイルスの共有結合閉環状（ｃｃｃ）ＤＮＡを阻害する能力を査定するための方法であって、
（ａ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を、その候補分子と接触させる；
（ｂ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルを査定する；および
（ｃ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のレベルが対照と比較して低下した場合に候補分子を選択する；
工程を含む方法。
【０２８０】
２．  ヘパドナウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であり、ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目１の方法。
３．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が１つのタグのみを含む、項目１または２の方法。
【０２８１】
４．  タグが６〜２２個のアミノ酸を含む、項目３の方法。
５．  タグが、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグからなる群から選択される、項目３または４の方法。
【０２８２】
６．  Ｆｌａｇタグが１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグである、項目５の方法。
７．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が２以上のタグを含む、項目１または２の方法。
【０２８３】
８．  ２以上のタグが異なるタグである、項目７の方法。
９．  タグが６〜２２個のアミノ酸を含む、項目７または８の方法。
１０．  ２以上のタグが２以上のヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグである、項目７〜９のいずれか１項の方法。
【０２８４】
１１．  Ｆｌａｇタグが１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグである、項目１０の方法。
１２．  ＨＡタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される；
Ｈｉｓタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される；
ｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される；
Ｖ５タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される；
および／または
Ｃ９タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される；
項目５または１０の方法。
【０２８５】
１３．  １×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される；または３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される；項目６または１１の方法。
【０２８６】
１４．  ＨＡタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される；
Ｈｉｓタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される；
ｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される；
Ｖ５タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される；
および／または
Ｃ９タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示される；
項目５または１０の方法。
【０２８７】
１５．  １×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される；または３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示される；項目６または１１の方法。
【０２８８】
１６．  ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される、項目２〜１５のいずれか１項の方法。
１７．  ＨＢｅＡｇのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される、項目２〜１５のいずれか１項の方法。
【０２８９】
１８．  核酸分子が、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含む、項目１〜１７のいずれか１項の方法。
１９．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される、項目１８の方法。
【０２９０】
２０．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される、項目１８の方法。
２１．  核酸分子が１以上のタグをコードする核酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列の３’側下流にある、項目１〜１７のいずれか１項の方法。
【０２９１】
２２．  １以上のタグをコードする核酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある、項目２１の方法。
２３．  核酸分子がヘパドナウイルスゲノムを含む、項目１〜２２のいずれか１項の方法。
【０２９２】
２４．  ヘパドナウイルスゲノムがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムである、項目２３の方法。
２５．  ＨＢＶゲノムがＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨのゲノムである、項目２４の方法。
【０２９３】
２６．  ＨＢＶゲノムがＨＢＶ遺伝子型Ｄのゲノムである、項目２４の方法。
２７．  ＨＢＶ遺伝子型ＤのゲノムがＨＢＶ遺伝子亜型ａｙｗのゲノムである、項目２６の方法。
【０２９４】
２８．  １以上のタグをコードする核酸が、ヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸の５’側上流にある、項目１〜２７のいずれか１項の方法。
２９．  ヘパドナウイルス  コアタンパク質がＨＢＶコアタンパク質である、項目２８の方法。
【０２９５】
３０．  ＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示される、項目２９の方法。
３１．  ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示される、項目２９の方法。
【０２９６】
３２．  １以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造中へ挿入されている、項目１〜３１のいずれか１項の方法。
【０２９７】
３３．  ヘパドナウイルスゲノムがＨＢＶゲノムである、項目３２の方法。
３４．  ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示される、項目３３の方法。
【０２９８】
３５．  １以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムに挿入されている、項目１〜３４のいずれか１項の方法。
【０２９９】
３６．  ヘパドナウイルスゲノムがＨＢＶゲノムである、項目３５の方法。
３７．  １以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入されている、項目１〜３６のいずれか１項の方法。
【０３００】
３８．  核酸分子が、１以上のタグをコードする配列の５’側に、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含む、項目１〜３７のいずれか１項の方法。
【０３０１】
３９．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列が、ＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５４に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成できる、項目３８の方法。
【０３０２】
４０．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列が、最大９個のヌクレオチドからなる、項目３８または３９の方法。
【０３０３】
４１．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に示す配列からなる；またはヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示すポリペプチドをコードする、項目４０の方法。
【０３０４】
４２．  核酸分子が、１以上のタグをコードする配列の３’側に、リンカーをコードする配列を含む、項目１〜４１のいずれか１項の方法。
４３．  リンカーが１以上のアミノ酸残基からなる、項目４２の方法。
【０３０５】
４４．  リンカーが１個のアミノ酸残基のみからなる、項目４２の方法。
４５．  アミノ酸がグリシン残基である、項目４４の方法。
４６．  リンカーをコードする配列が配列ＧＧＣからなる；またはその配列がグリシン残基をコードする、項目４２〜４４のいずれか１項の方法。
【０３０６】
４７．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示す核酸配列を含む；または
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む；
項目１〜４６のいずれか１項の方法。
【０３０７】
４８．  １以上のタグがヘパドナウイルスｅ抗原にインフレーム融合している、項目１〜４７のいずれか１項の方法。
４９．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目４８の方法。
【０３０８】
５０．  タグ付きＨＢｅＡｇをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示される、項目２〜４９のいずれか１項の方法。
５１．  タグ付きＨＢｅＡｇのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される、項目２〜５０のいずれか１項の方法。
【０３０９】
５２．  タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示される、項目２〜５１のいずれか１項の方法。
５３．  タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される、項目２〜５２のいずれか１項の方法。
【０３１０】
５４．  ＨＢＶゲノムの核酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４のいずれかに示される、項目２４〜５３のいずれか１項の方法。
【０３１１】
５５．  核酸がプレゲノム（ｐｇ）ヘパドナウイルスＲＮＡ、特にプレゲノム（ｐｇ）ＨＢＶ  ＲＮＡに転写可能である、項目２３〜５４のいずれか１項の方法。
５６．  核酸がタグ付きＨＢＶプレコアタンパク質の翻訳を阻止する、項目１〜５５のいずれか１項の方法。
【０３１２】
５７．  核酸が、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流に開始コドンＡＴＧを含まない、項目５６の方法。
５８．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流にある開始コドンＡＴＧが、核酸ＴＧで置き換えられている、項目５６または５７の方法。
【０３１３】
５９．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を阻止するために、核酸が点変異により修飾されている、項目５６〜５８のいずれか１項の方法。
６０．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ベクター中に含まれている、項目１〜５９のいずれか１項の方法。
【０３１４】
６１．  ベクターがＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示す配列を含む、項目６０の方法。
６２．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、誘導性プロモーターの制御下にある、項目１〜６１のいずれか１項の方法。
【０３１５】
６３．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目５６〜６２のいずれか１項の方法。
６４．  誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ドキシクリン誘導性プロモーター、抗生物質誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、または除草剤誘導性プロモーターである、項目６２または６３の方法。
【０３１６】
６５．  誘導性プロモーターがＣＭＶプロモーターまたはｔｅｔ−ＥＦ−１  アルファプロモーターである、項目６２〜６４のいずれか１項の方法。
６６．  １以上の終止コドンを１以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入する、項目２３〜６５のいずれか１項の方法。
【０３１７】
６７．  １以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質が１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質である、項目６６の方法。
６８．  １以上のＨＢＶエンベロープタンパク質が、１以上のラージ表面タンパク質（Ｌ）、ミドル表面タンパク質（Ｍ）およびスモール表面タンパク質（Ｓ）である、項目６７の方法。
【０３１８】
６９．  ＨＢＶエンベロープタンパク質がスモール表面タンパク質（Ｓ）である、項目６７の方法。
７０．  １以上のＨＢＶエンベロープタンパク質のコーディング領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（Ｌ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７（Ｍ）および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｓ）に示される、項目６７〜６９のいずれか１項の方法。
【０３１９】
７１．  エンベロープタンパク質の発現を阻止するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｓ）のＨＢＶヌクレオチド２１７〜２２２（ＴＴＧＴＴＧ）をＴＡＧＴＡＧに変異させる、項目７０の方法。
【０３２０】
７２．  細胞が真核細胞である、項目１〜７１のいずれか１項の方法。
７３．  真核細胞が肝細胞由来のものである、項目７２の方法。
７４．  真核細胞が肝癌細胞であるか、または肝癌細胞由来のものである、項目７２または７３の方法。
【０３２１】
７５．  真核細胞がＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＃ＨＢ−８０６５）である、項目７２〜７４のいずれか１項の方法。
７６．  核酸分子またはそれを含むベクターが細胞のゲノム中に安定に組み込まれた、項目１〜７５のいずれか１項の方法。
【０３２２】
７７．  工程（ａ）がさらに、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を下記のことが可能な条件で培養する工程（ａａ）を含む、項目１〜７６のいずれか１項の方法：
（ｉ）ヘパドナウイルスのプレゲノム（ｐｇ）ＲＮＡの合成；
（ｉｉ）合成されたｐｇＲＮＡからマイナス鎖ＤＮＡへの逆転写；
（ｉｉｉ）第２のプラス鎖ＤＮＡの合成；それによりマイナス鎖ＤＮＡとプラス鎖ＤＮＡが二本鎖弛緩型閉環状ＤＮＡを形成する；
（ｉｖ）弛緩型閉環状二本鎖ＤＮＡからｃｃｃＤＮＡの形成；
（ｖ）所望により、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする条件の回復；
（ｖｉ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードするｍＲＮＡの転写；
（ｖｉｉ）タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳。
【０３２３】
７８．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする条件の回復は、開始コドンの回復である、項目７７の方法。
７９．  候補分子がヘパドナウイルスの共有結合閉環状（ｃｃｃ）ＤＮＡを阻害する能力を査定するための方法である、項目１〜７８のいずれか１項の方法。
【０３２４】
８０．  ｃｃｃＤＮＡが形成される前に細胞を候補分子と接触させる、項目７９の方法。
８１．  候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの量または数を低減する能力を査定するための方法である、項目１〜７８のいずれか１項の方法。
【０３２５】
８２．  候補分子がヘパドナウイルスのｃｃｃＤＮＡの転写を低減する能力を査定するための方法である、項目１〜７８のいずれか１項の方法。
８３．  ｃｃｃＤＮＡが形成された後に細胞を候補分子と接触させる、項目８１または８２の方法。
【０３２６】
８４．  工程（ｂ）によるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原レベルの査定が、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＩＡまたはＡｌｐｈａＬＩＳＡにより行なわれる、項目１〜８３のいずれか１項の方法。
【０３２７】
８５．  工程（ｂ）によるタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原レベルの査定が、ヘパドナウイルスｅ抗原を特異的に認識する抗体および１以上のタグを特異的に認識する１以上の抗体の使用を含む、項目１〜８４のいずれか１項の方法。
【０３２８】
８６．  ヘパドナウイルスがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であり、ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目７７〜８５のいずれか１項の方法。
【０３２９】
８７．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子。
８８．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目８７の核酸分子。
【０３３０】
８９．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が１つのタグのみを含む、項目８７または８８の核酸分子。
９０．  タグが６〜２２個のアミノ酸を含む、項目８９の核酸分子。
【０３３１】
９１．  タグがヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグからなる群から選択される、項目８９または９０の核酸分子。
【０３３２】
９２．  Ｆｌａｇタグが１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグである、項目９１の核酸分子。
９３．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が２以上のタグを含む、項目８７または８８の核酸分子。
【０３３３】
９４．  ２以上のタグが異なるタグである、項目９３の核酸分子。
９５．  ２以上のタグの全長が１４アミノ酸から３１アミノ酸までの長さである、項目９３または９４の核酸分子。
【０３３４】
９６．  ２以上のタグが２以上のヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグである、項目９３〜９５のいずれか１項の核酸分子。
【０３３５】
９７．  Ｆｌａｇタグが１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグである、項目９６の核酸分子。
９８．  ＨＡタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される；
Ｈｉｓタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される；
ｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される；
Ｖ５タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される；
および／または
Ｃ９タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される；
項目９１または９６の核酸分子。
【０３３６】
９９．  １×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される；または
３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される；
項目９２または９７の核酸分子。
【０３３７】
１００．  ＨＡタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される；
Ｈｉｓタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される；
ｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される；
Ｖ５タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される；
および／または
Ｃ９タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示される；
項目９１または９６の核酸分子。
【０３３８】
１０１．  １×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される；または
３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示される；
項目９２または９７の核酸分子。
【０３３９】
１０２．  ＨＢｅＡｇをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６に示される、項目８８〜１０１のいずれか１項の核酸分子。
１０３．  ＨＢｅＡｇのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８に示される、項目８８〜１０１のいずれか１項の核酸分子。
【０３４０】
１０４．  核酸分子が、ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含む、項目８７〜１０３のいずれか１項の核酸分子。
１０５．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される、項目１０４の核酸分子。
【０３４１】
１０６．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される、項目１０４の核酸分子。
１０７．  核酸分子が１以上のタグをコードする核酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列（“プレコア”領域）の３’側下流にある、項目８７〜１０６のいずれか１項の核酸分子。
【０３４２】
１０８．  １以上のタグをコードする核酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸をコードする核酸配列の３’側下流にある、項目１０７の核酸分子。
【０３４３】
１０９．  核酸分子がヘパドナウイルスゲノムを含む、項目８７〜１０８のいずれか１項の核酸分子。
１１０．  ヘパドナウイルスゲノムがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムである、項目１０９の核酸分子。
【０３４４】
１１１．  ＨＢＶゲノムがＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨのゲノムである、項目１１０の核酸分子。
１１２．  ＨＢＶゲノムがＨＢＶ遺伝子型Ｄのゲノムである、項目１１０の核酸分子。
【０３４５】
１１３．  ＨＢＶ遺伝子型ＤのゲノムがＨＢＶ遺伝子亜型ａｙｗのゲノムである、項目１１２の核酸分子。
１１４．  １以上のタグをコードする核酸が、ヘパドナウイルス  コアタンパク質をコードする核酸の５’側上流にある、項目８７〜１１３のいずれか１項の核酸分子。
【０３４６】
１１５．  核酸配列がＨＢＶコアタンパク質をコードする、項目１１４の核酸分子。
１１６．  ＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示される、項目１１５の核酸分子。
【０３４７】
１１７．  コアタンパクがＨＢＶコアタンパク質である、項目１１４の核酸分子。
１１８．  ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示される、項目１１６の核酸分子。
【０３４８】
１１９．  １以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造中へ挿入されている、項目８７〜１１８のいずれか１項の核酸分子。
【０３４９】
１２０．  ヘパドナウイルスゲノムがＨＢＶゲノムである、項目１１９の核酸分子。
１２１．  ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示される、項目１２０の核酸分子。
【０３５０】
１２２．  １以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムに挿入されている、項目８７〜１２１のいずれか１項の核酸分子。
【０３５１】
１２３．  ヘパドナウイルスゲノムがＨＢＶゲノムである、項目１２２の核酸分子。
１２４．  １以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ＨＢＶゲノムの位置Ｃ１９０２と位置Ａ１９０３に相当するヌクレオチド間に挿入されている、項目８７〜１２３のいずれか１項の核酸分子。
【０３５２】
１２５．  核酸分子が、１以上のタグをコードする配列の５’側に、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含む、項目８７〜１２４のいずれか１項の核酸分子。
【０３５３】
１２６．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列が、ＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５４に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成できる、項目１２５の核酸分子。
【０３５４】
１２７．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列が、最大９個のヌクレオチドからなる、項目１２５または１２６の核酸分子。
【０３５５】
１２８．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に示す配列からなる；またはヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０に示すポリペプチドをコードする、項目１２７の核酸分子。
【０３５６】
１２９．  核酸分子が、１以上のタグをコードする配列の３’側に、リンカーをコードする配列を含む、項目８７〜１２８のいずれか１項の核酸分子。
１３０．  リンカーが１以上のアミノ酸残基からなる、項目１２９の核酸分子。
【０３５７】
１３１．  リンカーが１個のアミノ酸残基のみからなる、項目１２９の核酸分子。
１３２．  アミノ酸がグリシン残基である、項目１３１の核酸分子。
１３３．  リンカーをコードする配列が配列ＧＧＣからなる；またはその配列がグリシン残基をコードする、項目１２９〜１３１のいずれか１項の核酸分子。
【０３５８】
１３４．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１に示す核酸配列を含む；または
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む；
項目８７〜１３３のいずれか１項の核酸分子。
【０３５９】
１３５．  １以上のタグがヘパドナウイルスｅ抗原にインフレーム融合している、項目８７〜１３４のいずれか１項の核酸分子。
１３６．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目１３５の核酸分子。
【０３６０】
１３７．  タグ付きＨＢｅＡｇをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示される、項目８８〜１３６のいずれか１項の核酸分子。
１３８．  タグ付きＨＢｅＡｇのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される、項目８８〜１３７のいずれか１項の核酸分子。
【０３６１】
１３９．  タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示される、項目８８〜１３８のいずれか１項の核酸分子。
１４０．  タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される、項目８８〜１３９のいずれか１項の核酸分子。
【０３６２】
１４１．  ＨＢＶゲノムの核酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４のいずれかに示される、項目１１０〜１４０のいずれか１項の核酸分子。
【０３６３】
１４２．  核酸がプレゲノム（ｐｇ）ヘパドナウイルスＲＮＡに転写可能である、項目１０９〜１４１のいずれか１項の核酸分子。
１４３．  ヘパドナウイルスＲＮＡがＨＢＶ  ＲＮＡである、項目１４２の核酸分子。
【０３６４】
１４４．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ベクター中に含まれている、項目８７〜１４３のいずれか１項の核酸分子。
１４５．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目１４４の核酸分子。
【０３６５】
１４６．  核酸がタグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を可能にする、項目８７〜１４５のいずれか１項の核酸分子。
１４７．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目１４６の核酸分子。
【０３６６】
１４８．  核酸が、ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示す配列を含むベクター中に含まれている、項目１４７の核酸分子。
１４９．  核酸がタグ付きＨＢＶプレコアタンパク質の翻訳を阻止する、項目８７〜１４８のいずれか１項の核酸分子。
【０３６７】
１５０．  核酸が、タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流に開始コドンＡＴＧを含まない、項目１４９の核酸分子。
１５１．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸の５’側上流にある開始コドンＡＴＧが、核酸ＴＧで置き換えられている、項目１４７または１５０の核酸分子。
【０３６８】
１５２．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原の翻訳を阻止するために、核酸が点変異により修飾されている、項目１４７〜１５１のいずれか１項の核酸分子。
１５３．  ベクターがＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示す配列を含む、項目１４４、１４５および１４９〜１５２のいずれか１項の核酸分子。
【０３６９】
１５４．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、誘導性プロモーターの制御下にある、項目８７〜１５３のいずれか１項の核酸分子。
１５５．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目１４９〜１５４のいずれか１項の核酸分子。
【０３７０】
１５６．  誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ドキシクリン誘導性プロモーター、抗生物質誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、または除草剤誘導性プロモーターである、項目１５４または１５５の核酸分子。
【０３７１】
１５７．  誘導性プロモーターがＣＭＶプロモーターまたはｔｅｔ−ＥＦ−１  アルファプロモーターである、項目１５４〜１５６のいずれか１項の核酸分子。
１５８．  １以上の終止コドンを１以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入する、項目１１０〜１５７のいずれか１項の核酸分子。
【０３７２】
１５９．  １以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質が１以上のＨＢＶエンベロープタンパク質である、項目１５８の核酸分子。
１６０．  １以上のヘＨＢＶエンベロープタンパク質が、１以上のＬ、Ｍおよび／またはＳである、項目１５９の核酸分子。
【０３７３】
１６１．  ＨＢＶエンベロープタンパク質がＳである、項目１５９の核酸分子。
１６２．  １以上のＨＢＶエンベロープタンパク質のコーディング領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（Ｌ）、３７（Ｍ）または３８（Ｓ）に示される、項目１５９〜１６１のいずれか１項の核酸分子。
【０３７４】
１６３．  エンベロープタンパク質の発現を阻止するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（Ｓ）のＨＢＶヌクレオチド２１７〜２２２（ＴＴＧＴＴＧ）をＴＡＧＴＡＧに変異させる、項目１６２の核酸分子。
【０３７５】
１６４．  項目８７〜１６３のいずれか１項の核酸分子によりコードされるタンパク質。
１６５．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原を含むタンパク質。
【０３７６】
１６６．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目１６５のタンパク質。
１６７．  Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に示すアミノ酸配列を含む、項目１６６のタンパク質。
【０３７７】
１６８．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が１つのタグのみを含む、項目１６５〜１６７のいずれか１項のタンパク質。
１６９．  タグが６〜２２個のアミノ酸を含む、項目１６８のタンパク質。
【０３７８】
１７０．  タグがヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグからなる群から選択される、項目１６５〜１６９のいずれか１項のタンパク質。
【０３７９】
１７１．  Ｆｌａｇタグが１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグである、項目１７０のタンパク質。
１７２．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原が２以上のタグを含む、項目１６５〜１６７のいずれか１項のタンパク質。
【０３８０】
１７３．  ２以上のタグが異なるタグである、項目１７２のタンパク質。
１７４．  ２以上のタグの全長が１４アミノ酸から３１アミノ酸までの長さである、項目１７２または１７３のタンパク質。
【０３８１】
１７５．  ２以上のタグが２以上のヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｖ５タグおよび／またはＣ９タグである、項目１７２〜１７４のいずれか１項のタンパク質。
【０３８２】
１７６．  Ｆｌａｇタグが１×Ｆｌａｇタグまたは３×Ｆｌａｇタグである、項目１７５のタンパク質。
１７７．  ＨＡタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される；
Ｈｉｓタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される；
ｃ−ｍｙｃタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される；
Ｖ５タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される；
および／または
Ｃ９タグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される；
項目１７０または１７５のタンパク質。
【０３８３】
１７８．  １×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される；または
３×Ｆｌａｇタグをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される；
項目１７１または１７６のタンパク質。
【０３８４】
１７９．  ＨＡタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される；
Ｈｉｓタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示される；
ｃ−ｍｙｃタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される；
Ｖ５タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に示される；
および／または
Ｃ９タグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に示される；
項目１７０または１７５のタンパク質。
【０３８５】
１８０．  １×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示される；または
３×Ｆｌａｇタグのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４に示される；
項目１７１または１７６のタンパク質。
【０３８６】
１８１．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質を含む、項目１６５〜１８０のいずれか１項のタンパク質。
１８２．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される、項目１８１のタンパク質。
【０３８７】
１８３．  ヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される、項目１８１のタンパク質。
１８４．  タンパク質が１以上のタグのアミノ酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルス  プレコアタンパク質のシグナルペプチドおよびリンカーの配列のアミノ酸配列のＣ末端にある、項目１６５〜１８３のいずれか１項のタンパク質。
【０３８８】
１８５．  １以上のタグのアミノ酸配列を含むタンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス  プレコアタンパク質のＮ末端２９アミノ酸のアミノ酸配列のＣ末端にある、項目１８４のタンパク質。
【０３８９】
１８６．  タンパク質が１以上のタグのアミノ酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルスのコアタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にある、項目１６５〜１８３のいずれか１項のタンパク質。
【０３９０】
１８７．  ヘパドナウイルスのコアタンパク質がＨＢＶコアタンパク質である、項目１８６のタンパク質。
１８８．  ＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示される、項目１８７のタンパク質。
【０３９１】
１８９．  ＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に示される、項目１８７のタンパク質。
１９０．  １以上のタグのアミノ酸配列が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造によりコードされるアミノ酸配列中へ挿入されている、項目１６５〜１８９のいずれか１項のタンパク質。
【０３９２】
１９１．  ヘパドナウイルスゲノムがＨＢＶゲノムである、項目１９０のタンパク質。
１９２．  ＨＢＶゲノムによりコードされるイプシロン構造の核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５に示される、項目１９１のタンパク質。
【０３９３】
１９３．  １以上のタグのアミノ酸配列が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムによりコードされるアミノ酸配列中へ挿入されている、項目１６５〜１９２のいずれか１項のタンパク質。
【０３９４】
１９４．  ヘパドナウイルスゲノムがＨＢＶゲノムである、項目１９３のタンパク質。
１９５．  １以上のタグのアミノ酸配列が、ＨＢＶプレコアタンパク質（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７に示すもの）の位置Ｇ２９と位置Ｍ３０に相当するアミノ酸残基間に挿入されている、項目１６５〜１９４のいずれか１項のタンパク質。
【０３９５】
１９６．  さらに、１以上のタグのアミノ酸配列のＮ末端に、最大３アミノ酸のアミノ酸配列を含み、最大３アミノ酸のそのアミノ酸配列は、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる核酸配列によりコードされる、項目１６５〜１９５のいずれか１項のタンパク質。
【０３９６】
１９７．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる核酸配列が、ＨＢＶゲノムの位置Ｔ１８４９〜Ａ１８５４に相当する位置のヌクレオチドとの塩基対を形成できる、項目１９６のタンパク質。
【０３９７】
１９８．  ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる核酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６に示す配列からなる、項目１９８のタンパク質。
【０３９８】
１９９．  最大３アミノ酸のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４０に示される、項目１９６〜１９８のいずれか１項のタンパク質。
２００．  さらに、１以上のタグのアミノ酸配列のＣ末端にリンカーを含む、項目１６５〜１９９のいずれか１項のタンパク質。
【０３９９】
２０１．  リンカーが１以上のアミノ酸残基からなる、項目２００のタンパク質。
２０２．  リンカーが１個のアミノ酸残基のみからなる、項目２０１のタンパク質。
２０３．  アミノ酸がグリシン残基である、項目２０２のタンパク質。
【０４００】
２０４．  タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４１に示す核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む；
タグ付きヘパドナウイルスｅ抗原のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４２に示すアミノ酸配列を含む；または
項目１〜４６のいずれか１項のタンパク質。
【０４０１】
２０５．  １以上のタグがヘパドナウイルスｅ抗原内にインフレーム融合している、項目１６５〜２０４のいずれか１項のタンパク質。
２０６．  ヘパドナウイルスｅ抗原がＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）である、項目２０５のタンパク質。
【０４０２】
２０７．  タグ付きＨＢｅＡｇをコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示される、項目１６６〜２０６のいずれか１項のタンパク質。
２０８．  タグ付きＨＢｅＡｇのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される、項目１６６〜２０７のいずれか１項のタンパク質。
【０４０３】
２０９．  タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質をコードする核酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に示される、項目１６６〜２０８のいずれか１項のタンパク質。
２１０．  タグ付きＨＢＶプレコアタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される、項目１６６〜２０９のいずれか１項のタンパク質。
【０４０４】
２１１．  項目８７〜１６３のいずれか１項の核酸分子または項目１６４〜２１０のいずれか１項のタンパク質を含む、宿主細胞。
２１２．  細胞が真核細胞である、項目２１１の宿主細胞。
【０４０５】
２１３．  真核細胞が肝細胞由来のものである、項目２１２の宿主細胞。
２１４．  真核細胞が肝癌細胞であるか、または肝癌細胞由来のものである、項目２１２または２１３の宿主細胞。
【０４０６】
２１５．  真核細胞がＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＃ＨＢ−８０６５）である、項目２１２〜２１４のいずれか１項の宿主細胞。
２１６．  項目１６４〜２１０のいずれか１項に定めるタンパク質の製造方法であって、項目２１０〜２１５のいずれか１項の宿主細胞を、そのタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、産生されたタンパク質を培養物から回収することを含む方法。
【０４０７】
２１７．  項目１〜８６のいずれか１項の方法に使用するためのキット。
２１８．  項目１６５〜１６７のいずれか１項に定めるヘパドナウイルスｅ抗原を特異的に認識する抗体、および項目１６８〜１８０のいずれか１項に定める１以上のタグを特異的に認識する１以上の抗体を含むキット。
【０４０８】
２１９．  ヘパドナウイルスの共有結合閉環状ＤＮＡを阻害できると思われる候補分子をスクリーニングするための、項目８７〜１６３のいずれか１項の核酸分子、項目１６４〜２１０のいずれか１項のタンパク質、および／または項目２１１〜２１５のいずれか１項の宿主細胞の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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