(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幾何学的ハイドロフォーカシング用に構成された粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像する方法であって、前記血液試料に包含される粒子が１つの試料液粘度を有し、前記方法が：
前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、フローセルの流路に前記血液試料を注入する工程であって、前記試料フロー流は流路サイズの縮小部を流れ、撮像軸を横切る、工程と、
撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程であって、前記画像キャプチャデバイスは、視野を有し、前記撮像目標は、前記画像キャプチャデバイスの前記視野内に前記フローセルに対する固定位置を有する、工程と、
粒子の特性評価及び計数に適した、粒子の合焦画像を前記試料フロー流内で前記画像キャプチャデバイスを用いて取得する工程であって、前記画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて前記試料フロー流に焦点を合わせる、工程と、を含む、方法。
【請求項２】
シース液を前記フローセルの前記流路に沿って流す工程を更に含み、前記粒子分析システムが粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング用に構成され、前記シース液が所定の粘度差範囲の粘度差で試料液粘度と異なるシース液粘度を有し、前記シース液と血液試料との間の前記粘度差と、前記流路サイズの縮小部との組み合わせは、前記撮像軸において前記試料フロー流にハイドロフォーカシングするのに有効であり、同時に、前記シース液中の増粘剤は、前記試料フロー流中の細胞が前記試料フロー流から前記シース液へと延出するときに、前記試料フロー流中の前記細胞の生存能を維持し、前記試料フロー流中の前記細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幾何学的ハイドロフォーカシング用に構成された粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像する方法であって、前記血液試料に包含される粒子が１つの試料液粘度を有し、前記方法が：
前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、フローセルの流路に前記血液試料を注入する工程であって、前記試料フロー流は流路サイズの縮小部を流れ、撮像軸を横切る、工程と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程と、
粒子の特性評価及び計数に適した、粒子の合焦画像を前記試料フロー流内で前記画像キャプチャデバイスを用いて取得する工程であって、前記画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて前記試料フロー流に焦点を合わせる、工程と、を含み、
前記撮像目標が、前記試料フロー流と前記画像キャプチャデバイスとの間に配置された観察窓の上に位置付けされる、方法。
【請求項４】
前記撮像目標が、照明窓と観察窓との間に位置付けされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記合焦画像を取得することが、前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の距離を前記変位距離を用いて調節する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節する工程が、前記画像キャプチャデバイスの構成要素を移動させる工程を含み、前記構成要素がズームレンズと前記画像キャプチャデバイスを含むアセンブリとからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節する工程が、前記フローセルの移動を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節する工程が、少なくとも前記画像キャプチャデバイスの光学素子及び前記フローセルを移動させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
幾何学的ハイドロフォーカシング用に構成された粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像する方法であって、前記血液試料に包含される粒子が１つの試料液粘度を有し、前記方法が：
前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、フローセルの流路に前記血液試料を注入する工程であって、前記試料フロー流は流路サイズの縮小部を流れ、撮像軸を横切る、工程と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程と、
粒子の特性評価及び計数に適した、粒子の合焦画像を前記試料フロー流内で前記画像キャプチャデバイスを用いて取得する工程であって、前記画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて前記試料フロー流に焦点を合わせる、工程と、を含み、
前記変位距離が、前記撮像目標と前記試料フロー流との間の前記撮像軸に沿った距離である、方法。
【請求項１０】
幾何学的ハイドロフォーカシング用に構成された粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像する方法であって、前記血液試料に包含される粒子が１つの試料液粘度を有し、前記方法が：
前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、フローセルの流路に前記血液試料を注入する工程であって、前記試料フロー流は流路サイズの縮小部を流れ、撮像軸を横切る、工程と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程と、
前記試料フロー流内で前記画像キャプチャデバイスを用いて、粒子の特性評価及び計数に適した、粒子の合焦画像を取得する工程であって、前記画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて前記試料フロー流に焦点を合わせる、工程と、
自動合焦する工程と
を含み、当該自動合焦する工程が、
試験液試料をシース液に注入して、前記フローセル内に試験試料フロー流を形成する工程と、
前記画像キャプチャデバイスを用いて前記撮像目標の第１の合焦画像を得る工程であって、前記撮像目標及び前記画像キャプチャデバイスが第１の焦点距離を画定する、工程と、
前記画像キャプチャデバイスを用いて前記試験試料フロー流の第２の合焦画像を得る工程であって、前記試験試料フロー流及び前記画像キャプチャデバイスが第２の焦点距離を画定する、工程と、
前記第１の焦点距離と前記第２の焦点距離との間の差を計算することによって、前記変位距離を得る工程と、を含む、方法。
【請求項１１】
自動合焦再開始信号を検出する工程と、
前記自動合焦再開始信号に応答して前記自動合焦する工程と前記合焦画像を取得する工程とを繰返す工程と、を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記自動合焦再開始信号が、温度変化、焦点品質の低下、経過時間、又はユーザーの入力からなる群から選択されるメンバーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記撮像目標が、前記画像キャプチャデバイスの前記撮像軸を前記試料フロー流に対して位置決めする際に使用するための目盛を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記撮像目標が、前記撮像軸に対して位置合わせされた絞りを含み、その結果前記粒子の前記合焦画像は前記絞りによって画定される開口内に配置され、前記絞りの１つ以上の辺縁部分が自動合焦中に撮像される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記画像キャプチャデバイスが、前記フローセルと前記画像キャプチャデバイスとの間の回転調節を実施することによって前記試料フロー流に合焦する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
血液試料中の粒子を撮像するために幾何学的ハイドロフォーカシングを実施する粒子分析システムであって、
注入管を有する流路と、撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通したシース液投入部と、
前記注入管と流体連通した血液投入部であって、前記血液投入部が、前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、前記フローセル内の前記シース液に前記血液試料を注入するように構成されている、血液投入部と、
視野を有する画像キャプチャデバイスと、
前記画像キャプチャデバイスの合焦状態を前記フローセルに対して設定するように構成された合焦機構と、
前記画像キャプチャデバイスの前記視野内に前記フローセルに対する固定位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び前記試料フロー流が前記撮像軸に沿った変位距離を画定する、撮像目標と、
粒子の特性評価及び計数に好適な前記画像キャプチャデバイスの前記合焦状態を、前記変位距離を用いて設定するプロセッサと、を含む、システム。
【請求項１７】
前記血液試料中の粒子は、試料液粘度を有し、前記粒子分析システムが、粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング用に構成されており、前記シース液が、前記試料液粘度から所定の粘度差範囲の粘度差だけ異なるシース液粘度を有し、前記シース液と血液試料との間の前記粘度差と、前記流路サイズの縮小部との組み合わせは、前記撮像軸において前記試料フロー流にハイドロフォーカシングするのに有効であり、同時に、前記シース液中の増粘剤は、前記試料フロー流中の細胞が前記試料フロー流から前記シース液へと延出するときに、前記試料フロー流中の前記細胞の生存能を維持し、前記試料フロー流中の前記細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記合焦機構が、前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の距離を調節するように構成された駆動モーターを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
血液試料中の粒子を撮像するために幾何学的ハイドロフォーカシングを実施する粒子分析システムであって、
注入管を有する流路と、撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通したシース液投入部と、
前記注入管と流体連通した血液投入部であって、前記血液投入部が、前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、前記フローセル内の前記シース液に前記血液試料を注入するように構成されている、血液投入部と、
画像キャプチャデバイスと、
前記画像キャプチャデバイスの合焦状態を前記フローセルに対して設定するように構成された合焦機構と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び前記試料フロー流が前記撮像軸に沿った変位距離を画定する、撮像目標と、
粒子の特性評価及び計数に好適な前記画像キャプチャデバイスの前記合焦状態を、前記変位距離を用いて設定するプロセッサと、を含み、
前記撮像目標が、前記試料フロー流と前記画像キャプチャデバイスとの間に配置された観察窓の上に位置付けされる、システム。
【請求項２０】
前記撮像目標が、照明窓と観察窓との間に位置付けされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記システムが、前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の距離を前記変位距離を用いて調節することによって、前記粒子の合焦画像を得るように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２２】
前記システムが、前記画像キャプチャデバイスの構成要素を移動させることによって前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節するように構成されており、前記構成要素がズームレンズ、前記画像キャプチャデバイスのミラー、及び前記画像キャプチャデバイスを含むアセンブリからなる群から選択されるメンバーを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記システムが、前記フローセルを移動させることによって前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節するように構成される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記システムが、少なくとも前記画像キャプチャデバイスの光学素子及び前記フローセルを移動させることによって前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節するように構成される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
血液試料中の粒子を撮像するために幾何学的ハイドロフォーカシングを実施する粒子分析システムであって、
注入管を有する流路と、撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通したシース液投入部と、
前記注入管と流体連通した血液投入部であって、前記血液投入部が、前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、前記フローセル内の前記シース液に前記血液試料を注入するように構成されている、血液投入部と、
画像キャプチャデバイスと、
前記画像キャプチャデバイスの合焦状態を前記フローセルに対して設定するように構成された合焦機構と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び前記試料フロー流が前記撮像軸に沿った変位距離を画定する、撮像目標と、
粒子の特性評価及び計数に好適な前記画像キャプチャデバイスの前記合焦状態を、前記変位距離を用いて設定するプロセッサと、を含み、
前記変位距離が、前記撮像目標と前記試料フロー流との間の前記撮像軸に沿った距離である、システム。
【請求項２６】
血液試料中の粒子を撮像するために幾何学的ハイドロフォーカシングを実施する粒子分析システムであって、
注入管を有する流路と、撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通したシース液投入部と、
前記注入管と流体連通した血液投入部であって、前記血液投入部が、前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、前記フローセル内の前記シース液に前記血液試料を注入するように構成されている、血液投入部と、
画像キャプチャデバイスと、
前記画像キャプチャデバイスの合焦状態を前記フローセルに対して設定するように構成された合焦機構と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び前記試料フロー流が前記撮像軸に沿った変位距離を画定する、撮像目標と、
粒子の特性評価及び計数に好適な前記画像キャプチャデバイスの前記合焦状態を、前記変位距離を用いて設定するプロセッサと、を含み、
前記システムが、試験流体試料を前記シース液に注入して試験試料フロー流を前記フローセル内に形成する工程と、前記画像キャプチャデバイスを使用して前記撮像目標の第１の合焦画像を得る工程であって、前記撮像目標及び前記画像キャプチャデバイスが第１の焦点距離を画定する工程と、前記画像キャプチャデバイスを使用して前記試験試料フロー流の第２の合焦画像を得る工程であって、前記試験試料フロー流及び前記画像キャプチャデバイスが第２点距離を画定する工程と、前記第１の焦点距離と前記第２の焦点距離との間の差を計算することによって前記変位距離を得る工程と、を包含する、自動合焦する工程を実施するように構成される、システム。
【請求項２７】
血液試料中の粒子を撮像するために幾何学的ハイドロフォーカシングを実施する粒子分析システムであって、
注入管を有する流路と、撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通したシース液投入部と、
前記注入管と流体連通した血液投入部であって、前記血液投入部が、前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅を有する試料フロー流を形成するように流れるように、前記フローセル内の前記シース液に前記血液試料を注入するように構成されている、血液投入部と、
画像キャプチャデバイスと、
前記画像キャプチャデバイスの合焦状態を前記フローセルに対して設定するように構成された合焦機構と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び前記試料フロー流が前記撮像軸に沿った変位距離を画定する、撮像目標と、
粒子の特性評価及び計数に好適な前記画像キャプチャデバイスの前記合焦状態を、前記変位距離を用いて設定するプロセッサと、を含み、
前記システムが、自動合焦再開始信号を検出し、前記自動合焦再開始信号に応答して自動合焦及び画像取得工程を繰り返すように構成される、システム。
【請求項２８】
前記自動合焦再開始信号が、温度変化、焦点品質の低下、経過時間、又はユーザー入力からなる群から選択されるメンバーを含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記撮像目標が、前記画像キャプチャデバイスの前記撮像軸を前記試料フロー流に対して位置付ける際に使用するための目盛を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記撮像目標が、前記撮像軸に対して位置合わせされた絞りを含み、その結果前記粒子の前記合焦画像は前記絞りによって画定される開口内に配置され、前記絞りの１つ以上の辺縁部分が自動合焦中に撮像される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３１】
前記システムが、前記フローセルと前記画像キャプチャデバイスとの間の回転調節を実施することによって前記画像キャプチャデバイスの焦点を前記試料フロー流に合わせるように構成される、請求項１６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容を参照により本願に援用する２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願番号第６１／７９９，１５２号の非仮出願であり、当該仮出願に対する優先権の利益を主張する。本出願は、全て２０１４年３月１７日に出願された、米国特許出願第１４／２１５，８３４号、同第１４／２１６，５３３号、同第１４／２１６，３３９号、同第１４／２１６，８１１号及び同第１４／２１７，０３４号；並びに国際特許出願（シース液、フローセル、ダイナミックレンジ、造影剤、血液学）にも関する。上記の出願のそれぞれの内容は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、試料中の血液細胞等の粒子を識別及び定量するための全自動又は部分自動デバイスを用いた、流体試料中の粒子の撮像を包含する、粒子分析のための装置、システム、組成物、及び方法の分野に関する。本開示は、被検者から得た試料中の粒子の分析に有用な粒子及び／又は細胞内オルガネラ位置合わせ液（ＰＩＯＡＬ）、ＰＩＯＡＬの製造方法、及びＰＩＯＡＬを使用して粒子を検出及び分析する方法にも関する。画像に基づく生体液試料分析の実施に有用な組成物、システム、デバイス及び方法も開示される。本開示の組成物、システム、デバイス、及び方法は、赤血球、網状赤血球、有核赤血球、血小板のような生体液中の粒子の検出、計数及び特性評価、並びに画像及びモルホロジーに基づく白血球の分画計数、分類、小分類、特性評価及び／又は分析にも有用である。
【０００３】
血球分析は、患者の健康状態の概要を得るために最も一般的に実施される医学的検査の１つである。血液試料は、患者の身体から採取し、凝固を防止するための抗凝血剤を入れた試験管内に保存することができる。全血試料は通常、赤血球（エリスロサイト）、白血球（ロイコサイト）及び血小板（トロンボサイト）を包含する主要３クラスの血球を含む。各クラスは、更に構成要素のサブクラスに分けることができる。例えば、白血球（ＷＢＣ）の主な５つの種類又はサブクラスは、異なる形状及び機能を有する。白血球は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を包含し得る。赤血球の種類にもサブクラスが存在する。試料中の粒子の外観は、病理学的状態、細胞成熟及びその他の要因によって異なる場合がある。赤血球のサブクラスとしては、網赤血球及び有核赤血球が挙げられる。
【０００４】
赤血球、白血球又は血小板の濃度を推定する血球計数は、手作業により又は自動分器を用いて実施できる。血球計数を手作業により実施する場合、１滴の血液を薄い塗抹としてスライドグラスに塗布する。伝統的に、スライドグラス上の乾燥染色塗抹の手作業による検査は、５種類の白血球の数又は相対量の測定に使用されてきた。細胞又は細胞構造の染色には、組織染料及び染色剤が使用されてきた。例えば、ライト染色は、光学顕微鏡検査用に血液塗抹を染色するために使用されてきた組織染色である。全血算（ＣＢＣ）は、自動化分析機を使用して得ることができ、そのうちの１つは、血液試料中の異なる粒子又は細胞の数を、粒子又は細胞が感知領域内を細管に沿って通る際のインピーダンス又は動的光散乱に基づいて計数する。自動ＣＢＣは、ＲＢＣ、ＷＢＣ及び血小板（ＰＬＴ）等の、別々に計数することができる異なる種類の細胞を区別する計器又は方法を用いることができる。例えば、最小粒径又は体積を必要とする計数法を使用して、大きい細胞のみを計数する場合がある。血液中の異常な細胞のような特定の細胞は、正しく計数又は識別されない場合がある。互いに付着した小さな細胞は、誤って大きな細胞として計数される場合がある。誤計数が疑われる場合、計器による結果を手作業により見直しして細胞を確認及び識別する必要がある場合がある。
【０００５】
自動血球計数技術には、フローサイトメトリーを伴うことができる。フローサイトメトリーは、細い流路を提供する工程、並びに個々の血球の通過を感知及び計数する工程を伴う。フローサイトメトリー法は、血液試料中の細胞のような流体中に懸濁した粒子の検出、及び血液試料中のそれぞれの種類の粒子の濃度、又は粒子体積を推定するための、粒子の種類、寸法、及び体積分布に関する分析に使用されてきた。流体中に懸濁した粒子の分析に適した方法の例としては、沈降、顕微鏡による特性評価、インピーダンスに基づく計数、及び動的光散乱が挙げられる。これらのツールは、試験誤差を生じることがある。他方、粒子の種類及び濃度の正確な特性評価は、医療診断のような用途できわめて重要となり得る。
【０００６】
画像に基づく計数法では、顕微鏡の対物レンズにデジタルカメラを連結させて用い、調製試料に観察領域を通過させて、ピクセルデータ画像をキャプチャする。このピクセル画像データを、データ処理技術を用いて分析し、更にモニタに表示することができる。
【０００７】
フローセルを用いた自動診断システムの態様は、米国特許第６，８２５，９２６号（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）並びに米国特許第６，１８４，９７８号；同第６，４２４，４１５号；及び同第６，５９０，６４６号（全てＫａｓｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されており、これらは参照により、本明細書に全体が記載されているかのように本明細書に援用される。
【０００８】
動的光散乱又はインピーダンスを用いた自動化システムは、全血算（ＣＢＣ）：全白血球数（ＷＢＣ）、赤血球の全細胞容積（ＲＢＣ分布）、ヘモグロビンＨＧＢ（血中ヘモグロビン量）；平均血球容積（ＭＣＶ）（赤血球の平均容積）；ＭＰＶ（平均ＰＬＴ容積）；ヘマトクリット（ＨＣＴ）；ＭＣＨ（ＨＧＢ／ＲＢＣ）（赤血球１個当たりの平均ヘモグロビン量）；及びＭＣＨＣ（ＨＧＢ／ＨＣＴ）（赤血球１個当たりの平均ヘモグロビン濃度）を得るために使用されてきた。自動化又は部分自動化プロセスは、５種の白血球の分画計数及び血液試料の分析を容易にするために使用されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような現在既知の粒子分析システム及び方法は、関連する医用診断技術と共に、医師、臨床医、及び患者に現実的に利益を提供することができるものの、なお更なる改善が望まれている。本発明の実施形態は、これらの未解決のニーズの少なくともいくつかに対する解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の実施形態は、血液検査システム及び方法によって血液試料中に存在する粒子の高品質画像を作製できるようにする特定の合焦技術を包含する。このような高品質画像は、高倍率及び高開口数の対物レンズを有する光学システムの使用を可能にする細胞の正確な区分に有用な、高レベルの識別を達成するための基礎を提供する。典型的な光学的位置合わせ又は合焦技術は、高解像度で、粒子を運ぶ流体試料の薄いリボンに対応する短い被写界深度を有する画像の作製を容易にする。
【００１１】
場合によっては、血液検査システムは、定期的に合焦をやり直して、局所温度及びその他の因子の変化に合わせた調節を行う。例えば、本明細書に記載の自動合焦技術は、血液分析器に生じ、撮像対物レンズとフローセルとの間の距離を変化させて撮像結果に悪影響を及ぼす（例えば、焦点外れの画像を生成するなど）、熱膨張又はその他の因子を補正することができる。本発明の実施形態は、フォーカス液若しくは溶液、又はユーザーによるその他の介入を必要とすることなく、画像システムの自動合焦を伴う血液検査機器のための自動合焦システム及び方法も包含する。例えば、代表的な自動合焦技術は、画像に現れる被写体そのもののコントラストを最大化することによる技術を用いるよりも、むしろフローセルに対して固定した目標に対し初期焦点を得ることを伴い得る。
【００１２】
本発明の特定の実施形態は、フローセル内の流れの位置が温度変動に応答して変化しないという観察に少なくとも部分的に基づいており、フローセル内のどこかにある目標への合焦及びその後の固定オフセットを使用した試料流への良好な焦点の達成を伴ってもよい。このようなアプローチは、フローセルを通って流れるフォーカス溶液を使用せずに実施することができ、自動的に、ユーザーに全く意識させずに実施できる。
【００１３】
いくつかの実施形態によると、本開示は、液体に懸濁した粒子を含む試料の撮像のための光学分析器に関し、この装置は、試料供給源及びＰＩＯＡＬ供給源に連結されたフローセルを包含し、その際フローセルは内部流路を画定し、フローセルはＰＩＯＡＬで包囲されたリボン状試料流のフローをフローセルの視域に通すように構成されている。高光学解像度撮像デバイスに付随する対物レンズは、リボン状試料流と交差する光軸上に配置される。対物レンズとフローセルとの間の相対距離は、フォトセンサアレイ上のデジタル画像を解像及び収集するため、制御装置と連結したモーター駆動部の作動によって変動可能である。自動合焦パターン又は撮像目標は、フローセルに対して固定位置で提供され、自動合焦パターンは調製されたリボン状試料流の平面から所定の距離に位置付けされている。光源は、リボン状試料流及び自動合焦パターンを照明する。少なくとも１つのデジタルプロセッサが、モーター駆動部を操作するために連結された制御装置に付随する。このプロセッサは、デジタル画像を解析するようにも構成される。プロセッサは、合焦画像を作製するための自動合焦パターンの焦点位置を決定し、その後対物レンズ及びフローセルを焦点位置から所定距離（例えば、ある変位距離）にわたって相対的に変位させて、高光学解像度撮像デバイスの焦点をリボン状試料流に合わせる。
【００１４】
一態様において、本発明の実施形態は、粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像する方法を包含する。粒子分析システムは、幾何学的ハイドロフォーカシング用に構成できる。場合によっては、システムは、粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング用に構成できる。場合によっては、粒子は、ある試料液粘度を有する血液試料に包含され得る。代表的な方法は、シース液を粒子分析システムのフローセルの流路に沿って流す工程を包含できる。場合によっては、シース液は、所定の粘度差範囲内の粘度差で試料液粘度と異なるシース液粘度を有することができる。方法は、血液試料が試料フロー流内を、フロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入する工程も包含することができ、試料フロー流は流路サイズの縮小部を通って流れ、撮像軸を横切る。更に、方法は、フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程を包含できる。更に、方法は、フロー流内の粒子の特性評価及び計数に適した粒子の合焦画像を、画像キャプチャデバイスを用いて取得する工程を包含でき、この画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて試料フロー流に焦点を合わせる。いくつかの実施形態によると、シース液と血液試料との間の粘度差と、流路サイズの縮小部との組み合わせは、撮像軸において試料フロー流にハイドロフォーカシングするのに有効であり、同時に、シース液中の増粘剤は、細胞が試料フロー流からシース液流へと延出するときに、試料フロー流中の細胞の生存能を維持し、細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す。場合によっては、試料フロー流は、撮像軸において、約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の厚さを有する。場合によっては、流路は、撮像軸において約１５０μｍの厚さを有する。場合によっては、撮像目標は、試料フロー流と画像キャプチャデバイスとの間に配置された観察窓の上に置かれる。場合によっては、撮像目標は、照明窓の上に置かれ、試料フロー流は照明窓と画像キャプチャデバイスとの間に配置される。場合によっては、変位距離はゼロである。場合によっては、撮像目標は、照明窓と観察窓との間に置かれる。場合によっては、取得工程において、画像キャプチャデバイスは、画像キャプチャデバイスの焦点距離を変位距離に基づいて調節することによって、試料フロー流に焦点を合わせる。
【００１５】
いくつかの実施形態によると、合焦画像を取得する方法は、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を変位距離を用いて調節する工程を包含する。場合によっては、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節する工程は、画像キャプチャデバイスの構成要素を移動させる工程を包含する。画像キャプチャデバイスの構成要素は、ズームレンズ、画像キャプチャデバイスのミラー、又は画像キャプチャデバイスを含むアセンブリであり得る。場合によっては、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節する工程は、フローセルを移動させる工程を包含する。場合によっては、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節する工程は、少なくとも画像キャプチャデバイスの光学素子及びフローセルを移動させる工程を包含する。場合によっては、変位距離は、撮像目標と試料フロー流との間の撮像軸に沿った距離である。場合によっては、変位距離は、画像キャプチャデバイスと目標との間の第１焦点距離と、画像キャプチャデバイスと試料フロー流との間の第２焦点距離との距離差である。場合によっては、方法は、試験流体試料をシース液に注入して試験試料フロー流をフローセル内に形成する工程と、画像キャプチャデバイスを使用して撮像目標の第１の合焦画像を得て、その結果合焦した撮像目標及び画像キャプチャデバイスが第１焦点距離を画定する工程と、画像キャプチャデバイスを使用して試験試料フロー流の第２の合焦画像を得て、その結果焦点合焦した試験試料フロー流及び画像キャプチャデバイスが第２点距離を画定する工程と、第１焦点距離と第２焦点距離との間の差を計算することによって変位距離を得る工程とを伴う、自動合焦工程を包含する。場合によっては、試験流体試料は同じ血液試料であり、試験試料フロー流は試料フロー流と同じである。場合によっては、自動合焦工程は、画像キャプチャデバイスに関連する焦点面を確立し、この焦点面は、画像キャプチャデバイスに対して定位置である。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、試料液温度、シース液温度、フローセル温度、又は画像キャプチャデバイス温度のような温度を用いて試料フロー流に焦点を合わせる。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、撮像部位におけるフローセル温度、撮像部位の上流位置におけるフローセル温度、及び撮像部位の下流位置におけるフローセル温度を用いて、試料フロー流に焦点を合わせることができる。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、試料液温度変化率、シース液温度変化率、フローセル温度変化率、又は画像キャプチャデバイス温度変化率のような、温度変化率を用いて、試料フロー流に焦点を合わせることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態によると、方法は、自動合焦再開始信号を検出する工程、並びにその自動合焦再開信号に応答して自動合焦及び画像取得工程を繰り返す工程を包含してもよい。場合によっては、自動合焦再開始信号は、温度の変化、焦点品質の低下、経過時間、又はユーザーの入力を包含するか又はこれらに基づく。場合によっては、画像キャプチャデバイスの焦点を試料フロー流に合わせる工程は、画像キャプチャデバイスの温度と無関係に実施される。場合によっては、撮像目標は、画像キャプチャデバイスの撮像軸を試料フロー流に対して位置付ける際に使用するための目盛を包含する。場合によっては、撮像目標は、撮像軸に対して位置合わせされた絞り（ｉｒｉｓ）を包含し、その結果撮像した粒子は絞りによって画定される開口内に配置され、絞りの１つ以上の辺縁部分が自動合焦中に撮像される。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、撮像軸を中心とした画像キャプチャデバイスの軸回転、撮像軸に沿って伸長する軸を中心とした撮像デバイスの視野内でのフローセルの軸回転、流路に沿って伸長する軸を中心とした画像キャプチャデバイスの先端回転、流路に沿って流路内を伸長する軸を中心としたフローセルの先端回転、流路及び撮像軸を横切る軸を中心とした画像キャプチャデバイスの傾斜回転、及び／又は流路及び撮像軸を横切る軸を中心とした画像キャプチャデバイスの視野内でのフローセルの傾斜回転を実施することによって、試料フロー流に焦点を合わせる。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、フローセルの回転を実施することによって試料フロー流に焦点を合わせ、この回転は、画像キャプチャデバイスの視野を中心とする。場合によっては、画像キャプチャデバイスの自動合焦は、複数の焦点位置から最適な焦点位置を決定する工程を包含する。
【００１７】
別の態様では、本発明の実施形態は、血液試料中の粒子を撮像する方法を包含する。代表的な方法は、シース液をフローセルの流路に沿って流す工程、及び血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入する工程を包含することができる。フローセルは、関連温度を有することができる。方法は、フローセルに関連する温度が第１温度にある間に、画像キャプチャデバイスの焦点を、撮像軸に沿ってフロー流に合わせて第１合焦状態とする工程と、第１合焦状態においてフロー流内の粒子の第１サブセットの第１合焦画像を画像キャプチャデバイスで取得する工程も包含できる。方法は、フローセルに関連する温度が第１温度から第２温度に変化したことを判断する工程と、この温度変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係に応じて、画像キャプチャデバイスの焦点を第１合焦状態から第２合焦状態へ自動的に調節する工程とを更に包含できる。更に、方法は、第２合焦状態においてフロー流内の粒子の第２サブセットの第２合焦画像を画像キャプチャデバイスで取得する工程も包含できる。場合によっては、画像キャプチャデバイスの焦点を調節する工程は、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を、温度変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係を用いて調節する工程を伴う。場合によっては、画像キャプチャデバイスの焦点を調節する工程は、画像キャプチャデバイスの焦点距離を、温度変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係を用いて調節する工程を伴う。場合によっては、画像キャプチャデバイスの焦点を調節する工程は、撮像軸を中心とした画像キャプチャデバイスの軸回転、撮像軸に沿って伸長する軸を中心とした撮像デバイスの視野内でのフローセルの軸回転、流路に沿って伸長する軸を中心とした画像キャプチャデバイスの先端回転、流路に沿って流路内を伸長する軸を中心としたフローセルの先端回転、流路及び撮像軸を横切る軸を中心とした画像キャプチャデバイスの傾斜回転、及び／又は流路及び撮像軸を横切る軸を中心とした画像キャプチャデバイスの視野内でのフローセルの傾斜回転の実施を伴う。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、フローセルの回転を実施することによって試料フロー流に焦点を合わせ、この回転は、画像キャプチャデバイスの視野を中心とする。
【００１８】
別の態様では、本発明の実施形態は、血液試料中の粒子を撮像するために、幾何的ハイドロフォーカシング、又は場合によっては粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシングを実行する、粒子分析システムを包含する。代表的なシステムは、注入管を有する流路と撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルを包含できる。フローセルの流路は、流路サイズの縮小部を有することができる。システムは、流路と流体連通したシース液投入部も包含できる。更に、システムは、注入管と流体連通した血液投入部を包含できる。血液投入部は、血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入するように構成できる。場合によっては、シース液は、血液試料の粘度よりも高い粘度を有することができる。更に、システムは、画像キャプチャデバイスと、フローセルに対して画像キャプチャデバイスの合焦状態を設定するように構成された合焦機構と、フローセルに対して固定位置を有する撮像目標と、を包含することができる。場合によっては、撮像目標及び試料フロー流は、撮像軸に沿った変位距離を画定できる。更に、システムは、プロセッサと、粒子の特性評価及び計数に好適な、変位距離を用いて合焦機構を作動して画像キャプチャデバイスの合焦状態を設定するためにそのプロセッサで実行される機械読み取り可能なコードを具現化する有形媒体を有する合焦モジュールと、を包含できる。場合によっては、シース液と血液試料との間の粘度差と、流路サイズの縮小部との組み合わせは、撮像軸において試料フロー流にハイドロフォーカシングするのに有効であり、同時に、シース液中の増粘剤は、細胞が試料フロー流からシース液流へと延出するときに、試料フロー流中の細胞の生存能を維持し、細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す。場合によっては、合焦機構は、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節するように構成された駆動モーターを包含できる。場合によっては、撮像目標は、試料フロー流と画像キャプチャデバイスとの間に配置された観察窓の上に置かれる。場合によっては、撮像目標は、照明窓の上に置かれ、試料フロー流は照明窓と画像キャプチャデバイスとの間に配置される。場合によっては、システムは、画像キャプチャデバイスの焦点距離を変位距離に基づいて調節することによって、画像キャプチャデバイスの焦点を試料フロー流に合わせる工程を包含する取得工程を実施するように構成される。場合によっては、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を変位距離を用いて調節することによって、合焦画像を得るための取得工程を実施するように構成される。場合によっては、システムは、フローセルを移動させることによって画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節するように構成される。場合によっては、システムは、試験流体試料をシース液に注入してフローセル内に試験試料フロー流を形成する工程と、画像キャプチャデバイスを使用して撮像目標の第１の合焦画像を得て、その結果合焦した撮像目標及び画像キャプチャデバイスが第１焦点距離を画定する工程と、画像キャプチャデバイスを使用して試験試料フロー流の第２の合焦画像を得て、その結果合焦した試験試料フロー流及び画像キャプチャデバイスが第２点距離を画定する工程と、第１焦点距離と第２焦点距離との間の差を計算することによって変位距離を得る工程とを包含する、自動合焦工程を実施するように構成される。場合によっては、システムは、試料液温度、シース液温度、フローセル温度、又は画像キャプチャデバイス温度のような温度を用いて、画像キャプチャデバイスの焦点を試料フロー流に合わせるように構成される。場合によっては、システムは、自動合焦再開始信号を検出し、その自動合焦再開始信号に応答して自動合焦及び画像取得工程を繰り返すように構成される。
【００１９】
別の態様では、本発明の実施形態は、血液試料中の粒子を撮像するシステムを包含する。代表的なシステムは、注入管を有する流路と撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセル、流路と流体連通するシース液投入部、及び注入管と流体連通する血液投入部を包含できる。血液投入部は、血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入するように構成できる。システムは、画像キャプチャデバイス、フローセルに対して画像キャプチャデバイスの合焦状態を設定するように構成された合焦機構、フローセルと熱的に連結した温度センサ、プロセッサ、及び合焦モジュールも包含することができる。合焦モジュールは、粒子の特性評価及び計数点に好適な、温度センサが感知した温度変化及び温度と所望の焦点との間の既知の関係に応じて、合焦機構を作動して画像キャプチャデバイスの合焦状態を設定するためにプロセッサで実行される機械読み取り可能なコードを具現化する有形媒体を包含できる。場合によっては、合焦機構は、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節するように構成された駆動モーターを包含する。
【００２０】
別の態様では、本発明の実施形態は、血液試料中の細胞を分析する方法を包含する。代表的な方法は、シース液をフローセルの流路に沿って流す工程、及び血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入する工程を包含することができる。試料フロー流は、撮像軸に沿って、フローセルの撮像窓から、第１の距離分オフセットできる。方法は、フローセルに固定された撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスを自動合焦する工程も包含できる。撮像目標は、撮像軸に沿って撮像窓から第２の距離に位置付けることができる。更に、方法は、細胞の特性評価及び計数に好適な、フロー流内の細胞の合焦画像を、画像キャプチャデバイスで取得する工程を包含できる。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、自動合焦工程及び第１距離と第２距離との間の既知の関係を用いて試料フロー流に焦点を合わせることができる。
【００２１】
別の態様では、本発明の実施形態は、血液試料中の細胞を分析するシステムを包含する。代表的なシステムは、注入管を有する流路と撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルを包含できる。システムは、流路と流体連通したシース液投入部、及び注入管と流体連通した血液投入部も包含できる。血液投入部は、血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入するように構成できる。試料フロー流は、撮像軸に沿って、フローセルの撮像窓から第１距離分オフセットできる。システムは、撮像軸に沿って配向可能な画像キャプチャデバイスも包含できる。画像キャプチャデバイスは、合焦機構を包含できる。更に、システムは、フローセルに固定された撮像目標を包含できる。撮像目標は、撮像軸に沿って撮像窓表面から第２の距離に位置付けることができる。更に、システムは、合焦機構に連結したプロセッサを包含できる。プロセッサは、画像キャプチャデバイスの焦点を撮像目標に合わせることによって、及び第１距離と第２距離との間の既知の関係を用いることによって、細胞の特性評価及び計数に十分な、フロー流内の粒子の合焦画像を取得するように構成できる。
【００２２】
更に別の態様では、本発明の実施形態は、血液試料中の細胞を分析するシステムを包含する。代表的なシステムは、注入管を有する流路と撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルを包含できる。更に、システムは、流路と流体連通したシース液投入部と、注入管と流体連通した血液試料投入部とを包含できる。試料液投入部は、血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入するための構成にできる。更に、システムは、撮像軸に沿って配向可能な画像キャプチャデバイスを包含することができ、この画像キャプチャデバイスは合焦機構を包含できる。システムは、フローセルと熱的に連結した温度センサと、温度センサ及び合焦機構に連結したプロセッサとを包含することもできる。場合によっては、プロセッサは、温度変化及び温度と所望の焦点との間の既知の関係に応じて、細胞の特性評価及び計数を行うために十分に、画像キャプチャデバイスの焦点を調節するように構成される。
【００２３】
いくつかの実施形態によると、光学分析器は、試料供給源及びシース液供給源に連結したフローセルを包含できる。フローセルは、内部流路を画定することができ、シース液で包囲された試料流を、フローセルの視域に通すように構成することができる。分析器は、リボン状試料流と交差する光軸上に対物レンズを有する高光学解像度撮像デバイスを包含することもでき、対物レンズとフローセルとの間の相対距離は、フォトセンサアレイ上のデジタル画像を解像及び収集するために、モーター駆動部の作動によって変動可能なものとすることができる。分析器は、フローセルに対して固定位置を有する自動合焦パターンも包含することができ、この自動合焦パターンは、リボン状試料流の平面から変位距離に置かれている。変位距離は、所定であり得る。分析器は、リボン状試料流及び自動合焦パターンを照明するように構成された光源も包含できる。更に、分析器は、モーター駆動部を作動するため及びデジタル画像を解析するために連結された少なくとも１つのデジタルプロセッサを包含できる。プロセッサは、自動合焦パターンの焦点位置を決定し、高光学解像度撮像デバイス及びフローセルを焦点位置から変位距離にわたって相対的に移動させるように構成することができ、これによって高光学解像度撮像デバイスの焦点がリボン状試料流に合うようになる。いくつかの実施形態によると、自動合焦パターンは限られたサイズの形状を包含し、変位距離は、リボン状試料流に焦点を合わせたときにその形状がデジタル画像中で実質的に不可視となるのに十分である。場合によっては、光軸は、リボン状試料流に実質的に垂直である。
【００２４】
別の態様では、本発明の実施形態は、試料分析用の光学分析器を合焦する方法を包含する。代表的な方法は、高光学解像度撮像デバイスの焦点を、フローセルに対して固定された自動合焦パターンに合わせる工程を包含することができ、この自動合焦パターンは、リボン状試料流から所定の変位距離に置かれ、高光学解像度撮像デバイスはリボン状試料流と交差する光軸上に対物レンズを有し、高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の相対距離はモーター駆動部の作動によって変動可能であり、高光学解像度撮像デバイスはフォトセンサアレイ上のデジタル画像を解像及び収集するように構成される。更に、方法は、モーター駆動部を変位距離にわたって駆動し、高光学解像度撮像デバイスの焦点をリボン状試料流に合わせる工程を包含できる。
【００２５】
別の態様では、本発明の実施形態は、試料中の粒子を撮像する方法を包含する。代表的な方法は、液体に懸濁した粒子を含む試料のための光学分析器を提供する工程と、光学分析器内に高粘度又は低粘度の層状セクションを有する流れを確立する工程と、を包含できる。分析器は、試料供給源及び試料粘度よりも高い粘度を有するＰＩＯＡＬの供給源に連結したフローセルを包含できる。フローセルは、内部流路を画定することができ、ＰＩＯＡＬで包囲された試料のフローを、フローセルの視域に通すように構成することができる。分析器は、リボン状試料流と交差する光軸上に対物レンズを有する高光学解像度撮像デバイスも包含することができ、高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の相対距離は、フォトセンサアレイ上のデジタル画像を解像及び収集するため、モーター駆動部の作動によって変動可能である。分析器は、フローセルに対して固定位置を有する自動合焦パターン（この自動合焦パターンは、リボン状試料流の平面から所定の変位距離に置かれる）と、リボン状試料流及び自動合焦パターンを照明するように構成された光源と、モーター駆動部を作動しデジタル画像を解析するように連結された少なくとも１つのデジタルプロセッサとを包含することもでき、ここでプロセッサは、自動合焦パターンの焦点位置を決定し、高光学解像度撮像デバイス及びフローセルを合焦位置から変位距離にわたって相対的に移動させるように構成され、それによって高光学解像度撮像デバイスの焦点がリボン状試料流に合うようになる。場合によっては、分析器は、試料供給源及びＰＩＯＡＬ供給源に連結したフローセル（このフローセルは内部流路を画定し、ＰＩＯＡＬで包囲された試料流をフローセルの視域内に向けるように構成される）と、リボン状試料流と交差する光軸上に対物レンズを有する、フォトセンサアレイ上のデジタル画像を解像及び収集するための高光学解像度撮像デバイス（この対物レンズとフローセルとの間の相対距離はモーター駆動部の作動によって変動可能である）と、フローセルに対して固定位置を有する自動合焦パターン（自動合焦パターンはリボン状試料流の平面から所定の変位距離に置かれる）、リボン状試料流及び自動合焦パターンを照明するように構成された光源と、モーター駆動部を作動させデジタル画像を解析するように連結された少なくとも１つのデジタルプロセッサ（このプロセッサは、自動合焦パターンの焦点位置を決定し、高光学解像度撮像デバイス及びフローセルを合焦位置から変位距離にわたって相対的に移動させるように構成され、それによって高光学解像度撮像デバイスの焦点がリボン状試料流に合うようになる）とを包含することができる。
【００２６】
場合によっては、本明細書に記載のシステム及び方法によって得られる画像は、デジタル画像であることができる。場合によっては、画像は顕微鏡画像であることができる。場合によっては、画像は、手作業により又は自動で観察できる。
【００２７】
上記したもの及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態を参照し、付随の図と共に考慮されることにより、明らかとなり、より理解されるだろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
幾何学的ハイドロフォーカシング用に構成された粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像する方法であって、前記血液試料に包含される粒子が１つの試料液粘度を有し、前記方法が：
前記血液試料がフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で試料フロー流内を流れるように、フローセルの流路に前記血液試料を注入する工程であって、前記試料フロー流は流路サイズの縮小部を流れ、撮像軸を横切る、工程と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程と、
粒子の特性評価及び計数に適した、粒子の合焦画像を前記フロー流内で前記画像キャプチャデバイスを用いて取得する工程であって、前記画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて前記試料フロー流に焦点を合わせる、工程と、を含む、方法。
（項目２）
シース液を前記フローセルの前記流路に沿って流す工程を更に含み、前記粒子分析システムが粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング用に構成され、前記シース液が所定の粘度差範囲の粘度差で試料液粘度と異なるシース液粘度を有し、前記シース液と血液試料との間の前記粘度差と、前記流路サイズの縮小部との組み合わせは、前記撮像軸において前記試料フロー流にハイドロフォーカシングするのに有効であり、同時に、前記シース液中の増粘剤は、前記細胞が前記試料フロー流から前記シース液流へと延出するときに、前記試料フロー流中の細胞の生存能を維持し、前記細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記撮像目標が、前記試料フロー流と前記画像キャプチャデバイスとの間に配置された観察窓の上に位置付けされる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記撮像目標が、照明窓と観察窓との間に位置付けされる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記合焦画像を取得することが、前記画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を前記変位距離を用いて調節する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節する工程が、前記画像キャプチャデバイスの構成要素を移動させる工程を含み、前記構成要素がズームレンズと前記画像キャプチャデバイスを含むアセンブリとからなる群から選択されるメンバーを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節する工程が、前記フローセルの移動を含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節する工程が、少なくとも前記画像キャプチャデバイスの光学素子及び前記フローセルを移動させる工程を含む、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記変位距離が、前記撮像目標と前記試料フロー流との間の前記撮像軸に沿った距離である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
自動合焦の工程を更に含み、当該自動合焦工程が、
試験液試料を前記シース液に注入して、前記フローセル内に試験試料フロー流を形成する工程と、
前記画像キャプチャデバイスを用いて前記撮像目標の第１の合焦画像を得る工程であって、前記合焦撮像目標及び前記画像キャプチャデバイスが第１の焦点距離を画定する、工程と、
前記画像キャプチャデバイスを用いて前記試験試料フロー流の第２の合焦画像を得る工程であって、前記合焦試験試料フロー流及び前記画像キャプチャデバイスが第２の焦点距離を画定する、工程と、
前記第１焦点距離と前記第２焦点距離との間の差を計算することによって、前記変位距離を得る工程と、を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
自動合焦再開始信号を検出する工程と、
前記自動合焦再開始信号に応答して前記自動合焦する工程と前記画像取得工程とを繰返す工程と、を更に含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記自動合焦再開始信号が、温度変化、焦点品質の低下、経過時間、又はユーザーの入力からなる群から選択されるメンバーを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記撮像目標が、前記画像キャプチャデバイスの前記撮像軸を前記試料フロー流に対して位置決めする際に使用するための目盛を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記撮像目標が、前記撮像軸に対して位置合わせされた絞りを含み、その結果前記撮像した粒子は前記絞りによって画定される開口内に配置され、前記絞りの１つ以上の辺縁部分が自動合焦中に撮像される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記画像キャプチャデバイスが、前記フローセルと前記画像キャプチャデバイスとの間の回転調節を実施することによって前記試料フロー流に合焦する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
血液試料中の粒子を撮像するために幾何学的ハイドロフォーカシングを実施する粒子分析システムであって、
注入管を有する流路と、撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記流路と流体連通したシース液投入部と、
前記注入管と流体連通した血液投入部であって、前記血液投入部が、前記血液試料が前記試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、前記フローセル内の前記シース液流に前記血液試料を注入するように構成されている、血液投入部と、
画像キャプチャデバイスと、
前記画像キャプチャデバイスの合焦状態を前記フローセルに対して設定するように構成された合焦機構と、
前記フローセルに対して固定位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び前記試料フロー流が前記撮像軸に沿った変位距離を画定する、撮像目標と、
粒子の特性評価及び計数に好適な前記画像キャプチャデバイスの前記合焦状態を、前記変位距離を用いて設定するプロセッサと、を含む、システム。
（項目１７）
前記粒子分析システムが、粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング用に構成されており、前記シース液が、前記試料液粘度から所定の粘度差範囲の粘度差だけ異なるシース液粘度を有し、前記シース液と血液試料との間の前記粘度差と、前記流路サイズの縮小部との組み合わせは、前記撮像軸において前記試料フロー流にハイドロフォーカシングするのに有効であり、同時に、前記シース液中の増粘剤は、前記細胞が前記試料フロー流から前記シース液流へと延出するときに、前記試料フロー流中の細胞の生存能を維持し、前記細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
前記合焦機構が、前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の距離を調節するように構成された駆動モーターを含む、項目１６に記載のシステム。
（項目１９）
前記撮像目標が、前記試料フロー流と前記画像キャプチャデバイスとの間に配置された観察窓の上に位置付けされる、項目１６に記載のシステム。
（項目２０）
前記撮像目標が、照明窓と観察窓との間に位置付けされる、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記システムが、前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の距離を前記変位距離を用いて調節することによって、前記合焦画像を得るように構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目２２）
前記システムが、前記画像キャプチャデバイスの構成要素を移動させることによって前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節するように構成されており、前記構成要素がズームレンズ、前記画像キャプチャデバイスのミラー、及び前記画像キャプチャデバイスを含むアセンブリからなる群から選択されるメンバーを含む、項目２１に記載のシステム。
（項目２３）
前記システムが、前記フローセルを移動させることによって前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節するように構成される、項目２１に記載のシステム。
（項目２４）
前記システムが、少なくとも前記画像キャプチャデバイスの光学素子及び前記フローセルを移動させることによって前記画像キャプチャデバイスと前記フローセルとの間の前記距離を調節するように構成される、項目２１に記載のシステム。
（項目２５）
前記変位距離が、前記撮像目標と前記試料フロー流との間の前記撮像軸に沿った距離である、項目１６に記載のシステム。
（項目２６）
前記システムが、試験流体試料を前記シース液に注入して試験試料フロー流を前記フローセル内に形成する工程と、前記画像キャプチャデバイスを使用して前記撮像目標の第１の合焦画像を得る工程であって、前記合焦撮像目標及び前記画像キャプチャデバイスが第１焦点距離を画定する工程と、前記画像キャプチャデバイスを使用して前記試験試料フロー流の第２の合焦画像を得る工程であって、前記合焦試験試料フロー流及び前記画像キャプチャデバイスが第２点距離を画定する工程と、前記第１焦点距離と前記第２焦点距離との間の差を計算することによって前記変位距離を得る工程と、を包含する、自動合焦工程を実施するように構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目２７）
前記システムが、自動合焦再開始信号を検出し、前記自動合焦再開始信号に応答して自動合焦及び画像取得工程を繰り返すように構成される、項目１６に記載のシステム。
（項目２８）
前記自動合焦再開始信号が、温度変化、焦点品質の低下、経過時間、又はユーザー入力からなる群から選択されるメンバーを含む、項目２７に記載のシステム。
（項目２９）
前記撮像目標が、前記画像キャプチャデバイスの前記撮像軸を前記試料フロー流に対して位置付ける際に使用するための目盛を含む、項目１６に記載のシステム。
（項目３０）
前記撮像目標が、前記撮像軸に対して位置合わせされた絞りを含み、その結果前記撮像した粒子は前記絞りによって画定される開口内に配置され、前記絞りの１つ以上の辺縁部分が自動合焦中に撮像される、項目１６に記載のシステム。
（項目３１）
前記システムが、前記フローセルと前記画像キャプチャデバイスとの間の回転調節を実施することによって前記画像キャプチャデバイスの焦点を前記試料フロー流に合わせるように構成される、項目１６に記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】デジタル画像処理を用いた試料の画像解析のための代表的なフローセル、自動合焦システム及び高光学解像度撮像デバイスの動作態様を示す、部分的に断面で、正確な縮尺ではない、模式図。
【図１Ａ】本発明の実施形態による光学ベンチ構成の態様を示す模式図。
【図１Ｂ】本発明の実施形態による光学ベンチ構成の態様を示す模式図。
【図１Ｃ】本発明の実施形態による血液分析器のブロック図。
【図１Ｄ】本発明の実施形態による方法の流れ図。
【図１Ｅ】本発明の実施形態による代表的なモジュールシステムの態様を示す模式図。
【図２】代表的実施形態によるフローセルの透視図。
【図３】図２に示すフローセルの線３−３に沿った長手方向中央断面図。
【図３Ａ】本発明の実施形態によるフローセルの別の断面図。
【図３Ｂ】本発明の実施形態によるフローセルの別の断面図。
【図４】本発明の実施形態による撮像システムの態様を示す図。
【図４Ａ】本発明の実施形態によるフローセルの態様を示す図。
【図４Ｂ】本発明の実施形態によるフローセルの態様を示す図。
【図４Ａ−１】本発明の実施形態によるカニューレ出口及び画像キャプチャ部位におけるフローセル内のシース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）エンベロープの断面図及び試料液流の寸法を示す図。
【図４Ａ−２】本発明の実施形態によるカニューレ出口及び画像キャプチャ部位におけるフローセル内のシース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）エンベロープの断面図及び試料液流の寸法を示す図。
【図４Ｋ】本発明の実施形態によるフローセルの画像キャプチャ部位を通って流れる試料流を示す図。
【図４Ｋ−１】本発明の実施形態による目標撮像部位を示す図。
【図４Ｋ−２】本発明の実施形態による目標撮像部位を示す図。
【図４Ｋ−３】本発明の実施形態による試料フロー流内の粒子位置合わせの態様を示す図。
【図４Ｌ】本発明の実施形態によるフローセルの画像キャプチャ部位を通って流れる試料流を示す図。
【図４Ｌ−１】本発明の実施形態によるフローセルの流路内の流体フロー流の速度プロファイルの態様を示す図。
【図４Ｍ】本発明の実施形態による代表的な細胞内粒子位置合わせの特徴を示す図。
【図４Ｎ】本発明の実施形態による代表的な細胞内粒子位置合わせの特徴を示す図。
【図５】本発明の実施形態による合焦技術の態様を示す図。
【図６】本発明の実施形態による合焦技術の態様を示す図。
【図７】本発明の実施形態によるフロー流歪み速度の態様を示す図。
【図８】本発明の実施形態によるフロー流歪み速度の態様を示す図。
【図９Ａ】本発明の実施形態による代表的な自動合焦目標の態様を示す図。
【図９Ｂ】本発明の実施形態によるキャプチャ画像を示す図。
【図１０】本発明の実施形態による代表的な自動合焦目標を示す図。
【図１１】本発明の実施形態による代表的な自動合焦目標を示す図。
【図１２Ａ】本発明の実施形態による代表的な自動合焦目標を示す図。
【図１２Ｂ】本発明の実施形態による自動合焦目標の中央部の拡大図を示す図。
【図１３Ａ】本発明の実施形態によるフローセル温度センサの図を示す図。
【図１３Ｂ】本発明の実施形態によるフローセル温度センサの図を示す図。
【図１３Ｃ】本発明の実施形態によるフローセル温度センサの図を示す図。
【図１４Ａ】本発明の実施形態による合焦システム及び方法の態様を例示する側面断面図。
【図１４Ｂ】本発明の実施形態による合焦システム及び方法の態様を例示する側面断面図。
【図１４Ｃ】本発明の実施形態による合焦システム及び方法の態様を例示するフローセルの側面断面図。
【図１４Ｄ】本発明の実施形態による合焦システム及び方法の態様を例示する側面断面図。
【図１５】本発明の実施形態による自動合焦パターン及び合焦技術の態様を示す図。
【図１６Ａ】本発明の実施形態による合焦システム及び方法の態様を示す図。
【図１６Ｂ】本発明の実施形態による合焦システム及び方法の態様を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、粒子を含有する試料を分析するための装置、システム、組成物、及び方法に関する。一実施形態では、本発明は、分析器を備える自動粒子撮像システムに関し、この分析器は、例えば光学分析器であってもよい。いくつかの実施形態では、光学分析器は、画像の自動分析を容易にするためのプロセッサを更に備えてもよい。
【００３０】
代表的な粒子は、本明細書に開示されるような生体液試料中の任意の有形成分を包含することができ、例として、球形及び非球形粒子が挙げられる。ＰＩＯＡＬは、流れ方向に実質的に平行な平面内で非球形粒子を位置合わせし、その結果画像が最適化される。ＰＩＯＡＬは、球形細胞が、流れ方向に実質的に平行に細胞内構造、オルガネラ又は葉（ｌｏｂｅｓ）の位置決め、再位置決め及び／又は位置決め改良を行うのを助ける。いくつかの実施形態では、血小板、網赤血球、有核赤血球、及び白血球（好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、及び芽球、前骨髄球、骨髄球、又は後骨髄球等の未熟白血球を包含する）が粒子として計数及び分析される。
【００３１】
ＰＩＯＡＬは、フローセルに導入でき、撮像領域を通って、その後排出部に向けて試料を運ぶ。試料液の流れは、かなりの幅を有する流路を確立するために扁平状の開口部を有するカニューレを通して注入することができる。例えば、ＰＩＯＡＬは、試料液よりも相対的に高い粘度、好適な密度を有することができ、試料注入点における流量は、試料液が扁平化されて薄いリボン状になるような流量である。試料液のリボンはＰＩＯＡＬと共に運ばれ、リボン状試料流を観察するために高光学解像度撮像デバイス及び光源が配置された観察ポートの前を通る。
【００３２】
リボン状試料流はＰＩＯＡＬと共に運ばれ、リボン状試料流を観察するために高光学解像度撮像デバイス及び光源（例えば、紫外、可視、又は赤外）が配置された観察ポートの前を通る。高光学解像度撮像デバイス及び光源は、血球等の粒子の逆光画像を得るために、フローセルの反対側に置くことができる。高光学解像度撮像デバイスは、フローセル内の観察ポートを通して試料のピクセルデータ画像をキャプチャする。例えば、高光学解像度撮像デバイスは、試料流速と合致した反復速度で画像をキャプチャすることで、ほぼギャップ又はオーバーラップを生じずにリボン状試料流の断面が撮像される。
【００３３】
本発明の実施形態は、フローセルを通って流れるリボン状試料流の画像を収集するためのシステムの設計及び操作において実行されるいくつかの独自の構造的及び機能的特徴を提供する。代表的な実施形態は、血球のような様々な粒子の異なる特徴を明らかにするための十分な明瞭性及び解像度を有し、粒子及び／又は細胞の種類を互いに区別できる、十分に焦点の合った粒子の画像を得るように構成される。
【００３４】
リボン状試料流に焦点を合わせるために、高光学解像度撮像デバイスとリボン状試料流との間の距離を、リボン状試料流が高光学解像度撮像デバイスから光軸に沿って所望の距離（例えば、合焦距離）にあるように設定できる。
【００３５】
合焦距離は、フォトセンサアレイ上の画像を解像するために使用される高光学解像度撮像デバイスのレンズの性質であり、即ち、レンズ素子の材料、形状及び寸法並びにその構成及び光軸に沿った配置によって定義される。撮像される試料領域の寸法、及び試料の被写界深度は、レンズ構成によって決定される。
【００３６】
開口調節及びズーム調節は可能であるが、単純化のため、本開示の特定の実施例では、リボン状試料流中の粒子への高光学解像度撮像デバイスの合焦は、単に、高光学解像度撮像デバイスとフローセル内のリボン状試料流とを、正しい距離、即ち、リボン状試料流中の粒子のフォトセンサアレイ（例えば、電荷結合デバイスアレイ）上に合焦画像を解像する距離に、相対的に位置決めすることが必要である。高光学解像度撮像デバイスは、表示及び／又は処理及び／又は伝達用に静止画像又はビデオ画像を記録又は送信するカメラも包含してもよい。
【００３７】
一態様において、フローセルの対称性並びに試料液及びＰＩＯＡＬの注入方法は、ＰＩＯＡＬ中のリボン状試料流に対してフローセル内での再現性のある位置を提供する。しかし、フローセルと高光学解像度撮像デバイスとの相対的位置は変わる可能性があり、高光学解像度撮像デバイスとリボン状試料流との間の最適距離を維持し、それによって高品質な合焦画像を提供するためには、時々位置調整する必要がある。
【００３８】
本発明の実施形態は、リボン状試料流と高光学解像度撮像デバイスとの間の距離を非常に正確に設定することによって試料の確実な合焦画像を提供するために自動合焦デバイス／装置を組み込んだ、血液及び／又はその他の生体液用の自動光学分析器システム及び方法を包含する。一態様において、本明細書に開示される自動合焦システムの実施形態は、リボン状試料流と高光学解像度撮像デバイスとの間の距離を非常に正確に設定すること及び試料の確実に合焦した画像をキャプチャすることができる。いくつかの実施形態では、良好な合焦結果を達成する距離を確立するためにアルゴリズムを使用する。
【００３９】
ＰＩＯＡＬ流に包囲されたリボン状試料流に安定で再現性の高い位置を提供するフローセルを、高光学解像度撮像デバイスとリボン状試料流との間の最適距離を維持し、それにより高品質の合焦画像を提供する高光学解像度撮像デバイス及び自動合焦デバイス／装置と組み合わせて使用することが目的である。
【００４０】
そのような装置及び方法を、本明細書に開示し、特許請求する。対称フローセルが提供され、これはフローセル内で再現性のあるリボン状試料流位置を生じることが見出されている。合焦は、リボン状試料流に対する焦点を維持するために、高光学解像度画像デバイスのリボン状試料流に対する厳密に正しい相対位置を設定することを伴う。
【００４１】
有利には、フローセル及び／又は高光学解像度画像デバイスは、自動合焦プロセスにおいて、高コントラストパターン又は類似の焦点目標、好ましくは辺縁のような鮮鋭なコントラストを有する平面目標、のような自動合焦パターンを用いて互いに相対的に移動することができ、この自動合焦パターンはフローセルに対する位置が固定され、試料自体の代わりに合焦目標として使用される。リボン状試料流は、高光学解像度撮像デバイスの光軸に平行な線に沿って自動合焦パターンから固定距離にある薄いリボンである。自動合焦パターンとリボン状試料流位置との間の変位距離は一定距離であり、最初に決定されて、自動合焦手順にプログラムされる。その後の代表的な技術は、自動合焦パターンに自動合焦する工程と、その後高光学解像度画像デバイス及び／又はフローセルを互いに対して既知で一定の所定距離だけ変位する工程であり、その際に、高光学解像度画像デバイスとリボン状試料流の位置との間の距離は、リボン状試料流の高品質合焦画像を提供する最適距離である。例えば、最初、自動合焦アルゴリズムは、高光学解像度撮像デバイスの位置の焦点を、リボン状試料流から固定位置に置かれた自動合焦パターンに合わせる。自動合焦パターンに焦点を合わせた状態で、プロセッサは、モーター駆動部を固定距離にわたって作動し、それによってリボン状試料流を高光学解像度撮像デバイスの焦点に合わせる。
【００４２】
代表的な高光学解像度画像デバイスは、対物レンズ及び付随するピクセル画像センサを備え、粒子の視覚的特徴を解像するために十分な細部を提供するのに十分な倍率及び解像度で粒子を示す画像をキャプチャすることができる。特定の実施形態では、倍率は少なくとも２倍よりも高く（したがって、取り込んだ画像１枚につき２倍の画像面積を提供する）、それによって従来の尿分析器と比較して、各粒子についてのより詳細な情報が得られる。
【００４３】
ＰＩＯＡＬ流路は、リボン状試料流の上下を等量のＰＩＯＡＬが流れるように、対称的に配置することができ、これによって、リボン状試料流が、高光学解像度撮像デバイスの光軸に平行な線に沿って自動合焦パターンから固定距離にある薄いリボンとして伸展及び位置づけされる。一実施形態では、自動合焦パターンは後方照明の光源から光が入射する開口部の周囲に不透明な境界を含み、自動合焦パターンの距離を自動焦点制御によってすぐにかつ明確に自動追尾する。続いて、高光学解像度撮像デバイスをフローセルに対して所定の一定の変位距離にわたって変位させることによって、リボン状試料流に焦点が合わせられる。更なる自動合焦が想定できるが、試料の画像内容物に直接自動合焦する必要はない。
【００４４】
自動合焦の構成は、焦点品質の１つ以上の尺度をある範囲の距離にわたって評価し、最適距離を探すプロセッサからの制御信号に応答して、フローセル及び高光学解像度撮像デバイスの光軸方向の相対的位置を調節するモーター駆動部を包含する。例えば、プロセッサは、コントラストの尺度を評価し、自動合焦のためにモーター駆動部を作動させてもよい。通常動作において、プロセッサはモーター駆動部を作動させて、目標に自動合焦した後、高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の距離を、記録された目標からの変位によって調節し、リボン状試料流に焦点を合わせる。デバイスが同じ方法でリボン状試料流を動かし続け、かつ熱膨張又は類似の交絡因子が生じない限り、リボン状試料流の画像は焦点が合った状態を保つであろう。
【００４５】
予備設定又はキャリブレーション工程を用いて、目標とフローセル内のリボン状試料流との間の変位距離を測定及び記録することができる。正確な変位距離は、異なるフローセルではわずかに異なる場合があるが、目標と試験リボン状試料流とに数回交互に自動合焦し、その平均結果をフローセルに関連する定数として記録する等の予備試験によって確立される。
【００４６】
したがって、調製した血液試料又は別の種類の試料等の、撮像される試料は、フローセル内の視域を通る画定された流路に沿って方向付けされる。ＰＩＯＡＬ流路は、好ましくは対称であり、試料は、試料を包囲するＰＩＯＡＬ流の中央に注入される。試料及びＰＩＯＡＬのようなシース材料の流量並びに粘度及び密度特性は、フローセルの輪郭と共に、リボン状試料流を、再現性のある位置で視域内を一貫して流れる扁平なリボンへと成形する。
【００４７】
試料は、高光学解像度撮像デバイスのカメラコンポーネントによって撮像でき、収集されたデジタル画像は、本明細書に記載の自動合焦プロセスを包含する少なくとも部分的に自動化された画像解析方法によって解析される。
【００４８】
１つの目的は、本明細書に記載の血液試料中の血液細胞並びにその他の生体試料のような粒子を区別、分類、小分類及び／又は計数することであり、これは特定の条件に関するものであってもよい。一態様において、本開示の粒子造影剤組成物は、本明細書に記載の分析器のような光学分析器と組み合わせて、流れ中の細胞の驚くほど高品質の合焦画像を提供することができる。細胞は自動的にキャプチャされ、処理されてもよい。
【００４９】
画像は、自動化された撮像に基づく白血球分画計数、並びに被検者が健康であるか若しくは何等かの疾患、状態、異常及び／又は感染を有するかの判断、診断、予後、予測、及び／又は診断の支援をする際に有用な、及び／又は被検者が処置に反応するか、反応しないかを判断又は監視するための、形態学的異常の自動識別を可能にする。血液試料中の細胞分類及び／又は小分類の計数は、本開示において、分析される流体の種類の非限定例として使用される。
【００５０】
一態様において、本発明の組成物と共に使用する画像解析器は、リボン状試料流と光学システムの高光学解像度撮像デバイスとの間の距離を非常に正確に設定することによって、試料の確実な合焦画像をキャプチャすることができる。いくつかの実施形態では、光学分析器を、本発明の組成物、及び良好な合焦結果を達成できる前記距離を確立するためのアルゴリズムと組み合わせて使用することができる。試料は、観察ポートを通して見ることができるようにフローセル内で配置及び照明される。個々の細胞又は粒子は、キャプチャされたピクセルデータ画像内で、細胞の分類及び小分類を互いに区別するために既知のパラメータで比較及び対比される属性を明らかにするのに十分な特徴的細部がはっきりと見える。
【００５１】
フローセルを、粒子認識のための最適な品質及び細部の画像を提供する、本明細書に記載の代表的な粒子造影剤組成物、並びに代表的なＰＩＯＡＬと組み合わせて使用することが目的である。更に、ＰＩＯＡＬ及び装置は、ＰＩＯＡＬ流に包囲されたリボン状試料流に安定で再現性の高い位置を提供する。これは、高光学解像度撮像デバイス、及び、高光学解像度撮像デバイスのリボン状試料流までの最適距離を維持する自動合焦デバイス／装置と組み合わせて、高品質の合焦画像を提供する。
【００５２】
特定の実施形態において、分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連する分類誤差を補正するための追加情報を提供し、更に粒子の異なる分類及び／若しくは小分類の正確な粒子数若しくは濃度、並びに、試料中の粒子の各分類、若しくは各小分類の構成要素を測定するように構成することができる。
【００５３】
本開示によると、光学分析器を含むシステムは、液体に懸濁した粒子を含む試料の画像を得るために提供される。システムは、例えば、白血球分画計数、分類及び小分類並びに分析等の、赤血球、網赤血球、有核赤血球、血小板、及び白血球の検出及び定量など、生体液中の粒子の特性評価を実施する際に有用となり得る。他の流体由来の血球の特性評価のような、他の類似用途も考えられる。
【００５４】
血液試料中の血球の識別は、本発明の主題が特に適する代表的な用途である。試料は自動技術によって調製され、リボン状試料流が視野を横切る間に周期的に撮像される薄いリボン状試料流として高光学解像度撮像デバイスに提示される。粒子（例えば、血球）の画像は、完全に自動的に、又は限られた人的補助を用いて、細胞又は粒子を同定及び計数するピクセル画像データプログラム処理技術を用いて、互いに区別、分類、及び計数される。粒子の特徴が異常又は決定的だった場合に、保管され利用可能にされ得る細胞画像に加え、出力データは、記録された試料画像内で区別される細胞又は粒子の特定の分類及び／又は小分類の出現の計数を包含する。
【００５５】
各画像に見出される各種の粒子の数は、更に処理することができ、例えば、それぞれの区別される各分類及び／又は小分類の細胞についての試料全体における正確で統計的に有意な比を蓄積するために使用できる。光学的識別に使用する試料は、希釈することができるが、各分類及び／又は小分類の細胞の割合は、特に複数の画像が処理された後に、希釈試料において表される。
【００５６】
本明細書に開示される装置及び方法は、試料中の細胞を光学的な差異に基づいて識別及び定量する際に有用である。試料は、生物学的試料、例えば、血液、血清、骨髄、洗浄液、体腔液、滲出液、脳脊髄液、胸膜液、腹水、及び羊水が挙げられるがこれらに限定されない、白血球を含む体液試料とすることができる。いくつかの実施形態では、試料は固形組織試料、例えば、細胞懸濁液を生成するように処理された生検試料であることができる。試料は、糞便試料の処理から得られる懸濁液であってもよい。試料は、細胞培養試料のような、粒子を含む実験室又は製造ライン試料であってもよい。試料という用語は、患者若しくは実験室から得た試料、又はその任意の画分、部分若しくはアリコートを指すために使用されてもよい。試料は、いくつかの工程で、希釈、部分への分割、又は染色することができる。
【００５７】
一態様において、本開示のシステム、組成物及び方法は、フロー中の細胞の驚くべき高品質画像を提供する。一態様において、光学分析器は、本開示の方法で使用して、自動化された撮像に基づく白血球分画計数を提供することができる。特定の実施形態では、本開示の方法は、視覚的区別、例えば、被検者が健康であるか若しくは何等かの疾患、状態、異常及び／又は感染を有するか否か、及び／又は処置に反応するか、反応しないかの判断、診断、予後、予測、及び／又は診断の支援をするための、形態学的特徴及び／又は異常の自動同定に関する。いくつかの実施形態では、システムは、粒子計数器を更に含んでもよい。用途としては、血液試料のような流体試料中の細胞の分類及び／又は小分類、並びに計数が挙げられる。追加の種類の粒子及び／又は他の流体試料中の粒子の計数のためのその他の類似使用も想到される。本発明のシステム、組成物、及び方法は、任意の好適な自動化粒子認識アルゴリズムを用いた実時間分類及び小分類並びに画像観察に使用できる。各試料のキャプチャ画像は、保管して、後日閲覧することができる。
【００５８】
別の態様では、本発明の装置、組成物、及び方法は、現在の自動分析機を使用した場合の手動レビューと比較して、手動レビュー率を低減する、驚くほど正確な画像に基づく細胞の分類及び小分類並びにフラッギングを提供する。本発明のシステム、組成物、及び方法は、手動レビューの割合を低減し、手動レビューを機器上で実施することを可能にする。更に、本開示のシステム、組成物、及び方法は、自動分析中に手動レビューを要求するものとしてフラッギングされる試料のパーセンテージも低減する。
【００５９】
本開示は更に、全血算（ＣＢＣ）及び画像に基づく拡張白血球分画計数及び画像に基づく拡張血小板計数を得て、血小板計数の有効検出範囲を拡大するために、ＣＢＣ計数器を光学分析器のような分析器と組み合わせるためのシステム、方法及び組成物に関する。
【００６０】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、粒子（例えば、血球）を含有する試料を分析するための装置及び方法を提供する。本開示によると、光学分析器は、液体に懸濁した粒子を含む試料の画像を得るために提供される。いくつかの実施形態では、光学分析器はフローセル及び自動合焦構成要素を含み、この分析器で、対象とする粒子を含有する液体試料が観察ポートを有するフローセル内に流され、対物レンズに連結したカメラがこの観察ポートを通して粒子のデジタル画像をキャプチャする。フローセルは、本明細書に記載されているように、希釈及び／若しくは処理された血液試料又はその他の体液試料のような試料液体の供給源、並びに透明シース液又は粒子及び／若しくは細胞内オルガネラ位置合わせ液（ＰＩＯＡＬ）の供給源に連結される。
【００６１】
一実施形態では、装置は、分析器、及びプロセッサだけでなく、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器も含む。分析器及びプロセッサは、粒子計数器に関連する計数、分類、及び小分類の誤差を補正するための追加情報を提供し、更に試料中の粒子の異なる分類及び／又は小分類の正確な粒子数又は濃度を測定するように構成される。
【００６２】
本開示は、画像に基づく試料分析の実施において粒子及び／又は細胞内オルガネラの位置合わせに有用な方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、全血算（ＣＢＣ）並びに、白血球、赤血球及び／又は血小板のような細胞の種類（例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、網赤血球、有核赤血球、芽球、前骨髄球、骨髄球、又は後骨髄球）を同定及び計数できる画像に基づく拡大白血球（ＷＢＣ）分画を実施する能力、及びＷＢＣの数及びモルホロジー、赤血球（ＲＢＣ）の数及びモルホロジー、並びに血小板（ＰＬＴ）の数及びモルホロジーに関する画像に基づく情報を提供する能力を有する計数及び撮像を組み合わせたシステムのための方法及び組成物に関する。
【００６３】
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の粒子の画像に基づく分析に使用できるＰＩＯＡＬに関する。血液試料中の細胞分類及び／又は小分類の計数は、本開示において、分析される試料の種類の非限定例として使用される。いくつかの実施形態では、試料中に存在する細胞は、白血球、赤血球及び／又は血小板だけでなく、細菌又は真菌細胞も包含し得る。いくつかの実施形態では、組織又は吸引液から得た粒子懸濁液を分析することもできる。
【００６４】
血液試料中の血球の識別は、本発明の主題が特に適する代表的な用途である。試料は自動技術によって調製され、試料流が視野を横切る間に周期的に撮像されるリボン状試料流として高光学解像度撮像デバイスに提示される。粒子（例えば、血球）の画像は、完全に自動的に、又は限られた人的補助を用いて、細胞又は粒子を同定及び計数するピクセル画像データプログラム処理技術を用いて、互いに区別、分類、小分類及び／又は計数される。特徴が異常又は決定的なものだった場合に、保管及び利用可能な細胞画像に加え、出力データは、記録された試料画像内で区別される細胞又は粒子の特定の分類及び／又は小分類の出現の計数を包含する。各画像に見出される異なる粒子の数は、更に処理することができ、例えば、区別される各分類及び／又は小分類の細胞の試料全体における正確で統計的に有意な割合、又はその機能を蓄積するために使用できる。光学的識別に使用される試料は、高度に希釈することもできるが、各分類及び／又は小分類の細胞の割合は、特に多数の画像が処理された後では、希釈試料についての分布で表される。
【００６５】
いくつかの態様において、試料は、自動化された方法で表示、撮像及び分析される。血液試料の場合、試料は水又は生理食塩水で実質的に希釈されてもよく、これは、未希釈又はあまり希釈されていない試料でいくつかの細胞が他の細胞によって隠される度合を低減する。細胞は、いくつかの細胞の外観のコントラストを増強する作用剤、例えば細胞膜を透過性にする透過剤、並びに顆粒及び核のような特徴的な構造に付着して特徴的な構造を明らかにする組織染色を用いて、処理することができる。いくつかの実施形態において、網赤血球、有核赤血球、及び血小板を包含する粒子の計数及び特性評価のため、並びに白血球の分画、特性評価及び分析のために、試料のアリコートを染色することが望ましい場合がある。他の実施形態では、赤血球を含有する試料は、フローセルへの導入及び撮像の前に希釈してもよい。
【００６６】
試料希釈、透過化及び組織染色のための試料調製装置及び方法の詳細は、一般的に、１つ以上のプログラム可能な制御装置によって操作される精密ポンプ及びバルブを用いて達成され、本開示の中心ではない。例は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された、プログラム可能な制御に関する特許、例えば米国特許第７，３１９，９０７号に見出すことができる。同様に、特定の細胞分類及び／又は小分類を、相対的なサイズ及び色のような属性によって区別する技術は、白血球に関して、米国特許第５，４３６，９７８号に見出すことができる。上記特許の開示を、参照により本明細書に援用する。
【００６７】
細胞のような粒子を分類及び／又は小分類する能力、速度及び効率を促進するためには、データ処理システムによる自動分析用に血球の明瞭で高品質な画像を提供することが有利である。本開示によると、調製された試料流は、フローセルの向かい合う壁の間に安定な位置を有する薄いリボン状に配置される。試料流の位置決め及び薄いリボン状への扁平化は、粘度が試料液と異なり、対称的なフローチャンネルを通って流される、フローセルに導入されたＰＩＯＡＬの層間流によって達成されてもよい。
【００６８】
ＰＩＯＡＬは好適な粘度及び密度を有し、フローセルへの導入点における試料の流量は、試料液が薄いリボン状に扁平化されるような流量である。リボン状の試料流は、ＰＩＯＡＬと共に運ばれ、リボン状試料流の観察を可能にするように対物レンズ及び光源が配置された観察ポートの前を通る。試料液は、ＰＩＯＡＬの流路が対称的に細くなる点で導入される、例えば、注入される。結果として、試料液流は、扁平化及び伸展されて薄いリボン状になる。本開示のＰＩＯＡＬは、本開示の任意の光学分析器に、シース液として使用されてもよい。一実施形態では、ＰＩＯＡＬを、フローセルの末端に導入し、試料液に沿って排出部へ向けて運ぶことができる。
【００６９】
視域内のリボン状試料の寸法は、ＰＩＯＡＬ流路の幾何学的薄化並びにリボン状試料流の薄化及び伸展をもたらす試料液とＰＩＯＡＬの線速度の差によって影響を受ける。試料とＰＩＯＡＬの初期線速度の差は、０．５：１〜５：１の範囲であってもよい。ＰＩＯＡＬ流路断面は、その深さを約１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、又は２００：１の比率で縮小することによって薄化されてもよい。一実施形態では、幾何学的薄化は４０：１である。一実施形態では、幾何学的薄化は３０：１である。考慮に入れる要素は、フローセルを通る通過時間、所望の試料処理速度、粒径と同程度のリボン状試料流厚の達成、粒子及びオルガネラの位置合わせ達成、粒子内容物の合焦の達成、作動限度内での圧力、流れ、及び粘度の調整、リボン状試料流の厚さの最適化、所望の線速度の獲得、製造可能性の考慮、及び必要な試料及びＰＩＯＡＬの体積である。
【００７０】
カニューレの長さ及び容積並びに断面の扁平化を、試料フローの不安定期間を短縮するように選択して、処理量を増大させることもできる。いくつかの実施形態では、流れの不安定期間は、約３、２．７５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５、１．２５秒未満、又は約１秒未満とすることができる。カニューレ容積が小さくなると、試料処理の間にカニューレを清掃するために必要な時間及び希釈剤の量も低減され得る。いくつかの実施形態では、フローセルを通る通過時間は、１、２、３、又は４秒、又はそれらの時間の任意の２つの間の範囲である。いくつかの実施形態では、通過時間は、４、３又は２秒未満であってもよい。
【００７１】
試料液及びＰＩＯＡＬの粘度及び流量並びにフローセルの輪郭は、ＰＩＯＡＬ流が試料流を扁平化及び伸展し、信頼できる位置で一貫して視域を通して平坦なリボン状とするように構成される。試料液流は、約２〜３μｍの流体フロー厚さまで圧縮されてもよい。数種類の血球は、流の厚さよりも大きい直径を有する。フローの方向に平行な方向の剪断力（Ｓｈｅｅｒ  ｆｏｒｃｅｓ）は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、撮像条件下での粒子の画像投影の増大をもたらし、及び／又は粒子内構造、例えば、細胞内構造、オルガネラ、又は葉（ｌｏｂｅｓ）の、流れ方向に実質的に平行とする、位置決め、再位置決め、及び／又は位置決め改良が行われる。高光学解像度撮像デバイスの被写界深度は最大で７μｍ、例えば、１〜４μｍである。
【００７２】
リボン状試料流が一緒に運ばれるＰＩＯＡＬのフロー断面は、それを通して対物レンズが向けられる観察ポートの前の視域全体で一定である。対物レンズは、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの対物コンポーネントであってもよい。リボン状試料流は、フローセル内の既知で再現性のある位置で視域を横切る経路を辿り、例えば、フローセルの２つの壁から既知の再現性のある距離で、下流に排出される。
【００７３】
試料中の粒子由来の光学的情報は、リボン状試料流が観察ポートの前の視域を通って運ばれるときに、分析器の検出部によって検出され、それによって試料に含有される粒子／細胞由来のデータを生成する。この分析器の使用は、試料に含有される細胞及び／又は粒子のキャプチャ、処理、分類及び小分類並びに計数を可能にする。ＰＩＯＡＬ液は、粘度調節剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、抗菌剤、イオン強度調節剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤の追加によって調製できる。本開示の分析器の代表的な機能的構成要素及び／又は機能としては、例えば、画像解析からデータを取得及び／又は処理する能力、試料染色処理、画像処理、及び／又は粒子画像同定、計数及び／又は分類及び小分類が挙げられる。
【００７４】
一実施形態において、本開示は、好適量の増粘剤をＰＩＯＡＬに添加することで、フローセル内の粒子／細胞位置合わせが大幅に改良され、合焦される細胞、若しくは細胞成分の割合の向上、及び流れ中の細胞及び／又は粒子の画像品質の向上が得られるという、驚くべき、予想外の発見に基づく。増粘剤の添加は赤血球等の細胞への剪断力を増大し、これは流れ方向に実質的に平行な平面内での細胞の位置合わせを改良し、その結果、画像最適化が得られる。画像最適化は、細胞内構造、オルガネラ又は葉（ｌｏｂｅｓ）のような粒子内構造を流れ方向と実質的に平行に位置決め、再位置決め、及び／又は位置決め改良することによっても得られる。増粘剤は、細胞の位置合わせの失敗、一般的に、限定するものではないが、フロー流よりも直径が小さい細胞の位置合わせの失敗も低減する。
【００７５】
フロー流よりも直径が小さい細胞、例えば、赤血球の位置合わせは、例えば、ＰＩＯＡＬの粘度増大によって、又は流速比の増大によって得ることもできる。この結果、流れ方向に平行な赤血球の位置合わせが得られる。いくつかの実施形態では、赤血球の位置合わせの失敗の低減及び／又は赤血球の位置合わせの向上は、ＰＩＯＡＬの粘度を増加させることによって達成される。
【００７６】
リボン状試料流の厚さは、試料液及びＰＩＯＡＬの相対的な粘度及び流量によって影響され得る。例えば精密容積ポンプを含む、試料供給源及び／又はＰＩＯＡＬの供給源は、試料及び／又はＰＩＯＡＬを、リボン状試料流の寸法を最適化するための制御可能な流量で提供するように、即ち、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとして提供するように、構成できる。
【００７７】
リボン状試料流が一緒に運ばれるＰＩＯＡＬのフロー断面は、それを通して高光学解像度撮像デバイスが向けられる観察ポートの前の視域全体で一定である。リボン状試料流は、フローセルの前方及び後方のいずれかの壁からも既知で再現性のある距離で視域を横切る経路を辿り、その下流に排出される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び／又は方法のいずれかで得られる画像は、デジタル画像であってもよい。いくつかの実施形態では、得られる画像は顕微鏡画像である。特定の実施形態では、画像は手動で得られてもよい。他の実施形態では、画像取得の手順の少なくとも一部は自動化される。いくつかの実施形態では、画像は、フローセル、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスを含み、任意選択的に自動合焦機能を有する光学分析器を用いて得られる場合がある。
【００７９】
一実施形態では、画像は、細胞の細胞質、細胞核及び／又は核成分に関する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞の顆粒成分及び／又はその他の形態学的特徴に関する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞の細胞質、核及び／又は顆粒成分に関する情報を提供する。顆粒及び／又は核の画像及び／又は特徴は、独立して又は互いと組み合わせてのいずれでも、細胞分類及び小分類の決定要因である。
【００８０】
本発明の方法の一態様において、粒子造影剤組成物と接触及び／又は撮像される細胞は有核赤血球である。更に別の態様において、本発明の方法は、ａ）赤血球の一部を撮像する工程と、ｂ）撮像した赤血球の形態を判定する工程と、を含む、画像に基づく赤血球分類及び小分類を実施する方法に関する。本発明で使用するとき、赤血球（ＲＢＣ）は、例えば、正常若しくは異常赤血球、網赤血球、有核赤血球、及び／又はマラリア感染細胞を包含し得る。いくつかの実施形態では、撮像は、粒子計数器、光学分析器及びプロセッサを備える装置のような、本開示の装置を用いて実施される。
【００８１】
本明細書で使用するとき、代表的な全血算（ＣＢＣ）は、患者の血液試料中の粒子及び／又は細胞に関する情報を提供する医師又はその他の医療専門家によって一般的に要求されるテストパネルを包含し得る。血流内を循環する代表的な細胞は、一般的に、例えば、限定するものではないが、白血球（例えば、ロイコサイト）、赤血球（例えば、エリスロサイト）、及び血小板（例えば、トロンボサイト）を含む３種類に分けることができる。
【００８２】
本明細書で使用するとき、異常に高い又は低い数は、状態、障害、及び／又は症状の存在を示す。このように、ＣＢＣは、患者の全体的な健康状態の概要を提供できることから、医学で一般的に実施される血液検査の１つである。したがって、ＣＢＣは、一年に１回の健康診断で通常実施される。
【００８３】
本明細書で使用するとき、一般的に瀉血専門医が被検者から血液試料を採取し、この血液は一般的に、凝固を阻止する抗凝血剤（例えば、ＥＤＴＡ、場合によりクエン酸塩）を通常含有する試験管内に引き込まれる。続いて、試料を検査室に輸送する。場合により、試料は、自動計数器で直ちに処理するため、パスツールピペットを用いて指の刺し傷から得られる。一実施形態では、粒子画像は、粒子がシース液又はＰＩＯＡＬに包囲されている間に取得される。特定の実施形態において、血液試料は、患者血液の試料を用いて調製したスライドで、顕微鏡下で観察されてもよい（血液塗抹標本、又は末梢血液塗抹）。特定の実施形態において、全血算は、自動分析器によって実施される。
【００８４】
本明細書で使用するとき、一般的に、血液分析器は、細い管を通してごく少量の検体を吸引することができる。センサは、この管を通過する細胞の数及び／又は個数を検出することができ、細胞の種類を同定することができる。代表的なセンサは、光（例えば、可視、紫外又は赤外）及び／又は電気インピーダンスの検出器を包含してもよい。代表的な検出パラメータとしては、サイズ、体積、及び／又は細胞特徴が挙げられる。特定の実施形態において、約２００ｎｍ〜約１００００ｎｍの範囲の波長スペクトルの可視光及び非可視光を検出できる。特定の実施形態において、センサは、約３８０ｎｍ〜約７６０ｎｍの間の波長を検出できる。
【００８５】
本明細書で使用するとき、血球計数のデータ／パラメータとしては、例えば、全赤血球；ヘモグロビン−血液中のヘモグロビンの量；ヘマトクリット又は血中赤血球容積（ＰＣＶ）；平均赤血球容積（ＭＣＶ）−赤血球の平均容積（貧血は、この値が期待される正常範囲よりも上か下かに基づいて、小球性又は大球性に区分される）。ＭＣＶに影響するその他の状態としては、サラセミア、網赤血球増加症及びアルコール中毒が挙げられる）；平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）−赤血球１個当たりのヘモグロビンの平均量（ピコグラム）；平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）−細胞中のヘモグロビンの平均濃度；赤血球分布幅（ＲＤＷ）−赤血球母集団の細胞容積のばらつき；全白血球；好中性顆粒球（細菌感染を示す場合があり、典型的には、急性ウイルス感染時に増加する）が挙げられる。分葉核の外観から、好中球は時として「ｓｅｇ」と呼ばれる。成熟度の低い好中球の核は分葉化されていないが、帯状又は細長い形状を有する。成熟度の低い好中球−骨髄から血流中に直近に放出された好中球−は「ｂａｎｄ」として知られる。血球計数のその他のデータ／パラメータとしては、例えば、リンパ球（例えば、腺熱のようないくつかのウイルス感染、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）では増加し、ＨＩＶ感染症によって減少する）；単球（細菌感染、結核、マラリア、ロッキー山脈紅斑熱、単球性白血病、慢性潰瘍性大腸炎及び限局性腸炎で増加し得る；好酸球顆粒球（例えば、寄生虫感染症、喘息、又はアレルギー反応で増加）；好塩基球顆粒球（例えば、白血病又はリンパ腫のような骨髄関連の状態で増加）も挙げられる。
【００８６】
本明細書で使用するとき、血球計数のデータ／パラメータとしては、例えば、血小板数、血液中のそのサイズ及びサイズ範囲に関する情報；平均血小板容積（ＭＰＶ）−血小板の平均サイズの測定値を含む、血小板に関連するデータも含むことができる。
【００８７】
本発明の方法の別の態様において、粒子造影剤組成物と接触され及び／又は撮像される細胞は、マラリア感染細胞、異型リンパ球のような異常細胞である。本発明のいくつかの態様において、細胞は、状態、疾患、感染症及び／又は症候群の同定、予測、診断、予後、又は診断の支援に使用できる異常細胞である。
【００８８】
本発明の方法の別の態様において、細胞は血小板である。
【００８９】
他に明示しない限り、本開示における「粒子」への言及は、流体中に分散された任意の分離した又は形成された物体を包含すると理解される。本明細書で使用するとき、「粒子」は、生体液中の全ての（例えば、画像及び／又は他の測定可能なパラメータによって）測定可能及び検出可能な成分を包含できる。粒子は、任意の材料、任意の形状及び任意のサイズである。特定の実施形態において、粒子は細胞を含むことができる。粒子の例としては、限定するものではないが、血球、胎児細胞、上皮、幹細胞、腫瘍細胞を含む細胞、若しくは細菌、寄生生物、又は上記のいずれかの断片又は生体液中の他の断片が挙げられる。血球は、任意の血球であってもよく、生体液中に潜在的に存在する任意の正常又は異常な、成熟又は未成熟の細胞、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）及びその他の細胞を包含する。要素は未成熟又は異常細胞も包含する。未成熟ＷＢＣは、後骨髄球、骨髄球、前骨髄細胞及び芽球を包含し得る。成熟赤血球に加え、赤血球は、有核赤血球（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を包含し得る。血小板は、「巨大」血小板及び血小板凝集塊を包含し得る。血球及び有形成分については、本開示の別の場所で更に記載する。
【００９０】
代表的な粒子は、生体液試料中の有形成分を包含することができ、例として、球形及び非球形粒子が挙げられる。特定の実施形態において、粒子は非球形成分を含むことができる。非球形成分の画像投影は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面で最大化することができる。特定の実施形態において、非球形粒子は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面内で位置合わせされる（流れ方向と実質的に平行な平面内で位置合わせされる）。いくつかの実施形態では、血小板、網赤血球、有核赤血球、及び白血球（好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、並びに芽球、前骨髄球、骨髄球、又は後骨髄球等の未熟白血球を包含する）が粒子として計数及び分析される。
【００９１】
本明細書で使用するとき、検出可能及び測定可能な粒子パラメータは、例えば、サイズ、形状、対称性、輪郭及び／又はその他の特徴の視覚的及び／又は非画像ベースの指標を包含できる。
【００９２】
試料は、単離及び／又は調製された生物学的試料であってよく、例としては、体液試料、血液、血清、脳脊髄液、胸膜液、腹水、唾液、精液、涙、汗、乳汁、羊水、洗浄液、骨髄穿刺液（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｓｐｉｒａｔｅ）、滲出液、滲出物、又は被検者から得たその他の試料（例えば、細胞懸濁液を作製するために処理した生検試料、又は粒子を含む検査室若しくは製造ライン試料）が挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は固形組織試料、例えば、細胞懸濁液を生成するように処理された生検試料であることができる。試料は、糞便試料の処理から得られる懸濁液であってもよい。試料は、細胞培養試料のような、粒子を含む検査室、化学、工業又は製造ライン試料であってもよい。試料という用語は、患者若しくは検査室から得た試料、又はその任意の画分、部分若しくはアリコートを指すために使用されてもよい。試料は、いくつかの過程で、希釈、分割、又は造影剤処理することができる。
【００９３】
本発明に開示する方法は、広範な生物から得た試料に使用でき、その例としては、哺乳類、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、サル）、ウマ、ウシ又はその他の家畜、イヌ、ネコ又はその他のペットとして飼育される哺乳類、ラット、マウス、又はその他の実験動物；鳥類、例えば、ニワトリ；爬虫類、例えば、ワニ；魚類、例えば、サケ及び／又はその他の養殖種；並びに両生類が挙げられる。
【００９４】
試料は、任意の従来方法、例えば、排泄、摘出、採取、吸引、又は生検によって得ることができる。試料は、健康と考えられる被検者から得ることができ、例えば、通常の健康診断の一環として採取された試料であってよい。試料は、障害を有するか、障害のリスクがあるか、又は障害が疑われる被検者から得ることもできる。障害は、疾患、遺伝的異常、感染症、外傷又は未知の原因の結果であり得る。あるいは又は加えて、本発明の方法は、障害の治療過程で被検者のモニタリングに有用となり得る。処置及び／又は治療に対して非反応性の徴候がある場合、臨床医は代替薬又は補助薬を選択できる。被検者の状態及び特定の障害がある場合にはその障害に応じて、試料を、１日に、１週に、１月に、又は１年に１回（又は２回、３回等）採取することができる。
【００９５】
粒子は試料に応じて異なり得る。粒子は、生体細胞、例えば、血球、胎児細胞、幹細胞、腫瘍細胞又はそれらの断片であることができる。いくつかの実施形態では、粒子は感染因子、例えば、ウイルス又は細菌であることができる。
【００９６】
本開示において「血球」は、生体液中に潜在的に存在する任意の正常又は異常な、成熟又は未成熟な細胞、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）及びその他の細胞を包含すると理解されるであろう。一般的に、正常な赤血球、血小板、及び白血球は、それぞれ６〜８μｍ、２〜３μｍ、及び８〜１５μｍの範囲の粒径を有する。正常な赤血球、血小板及び白血球は、正常な患者から得た全血試料中に、それぞれおよそ３．９〜５．７×１０１２個／Ｌ、１．４〜４．５×１０１１個／Ｌ、３．５〜１１×１０９個／Ｌの範囲で存在する。Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．Ｂａｉｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２００７，３４〜３６を参照のこと。
【００９７】
「有形成分」は、生体液試料中に存在する非流体成分を包含すると理解されるであろう。有形成分としては、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及び血小板（ＰＬＴ）を含む、科学的区分又は物理的機能に基づく血球のクラス、白血球凝集塊、成熟リンパ球、及び単球、好中球、好酸球、好塩基球等の未成熟白血球を包含する白血球の小区分、が挙げられる。本明細書で使用される「有形成分」は、微生物、細菌、真菌、寄生生物、若しくはこれらの断片、又はその他の細胞断片のような粒子も包含する。ＷＢＣの主要メンバーとしては、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球が挙げられるがこれらに限定されない。メンバーは未成熟又は異常細胞も包含する。例えば、未成熟ＷＢＣは、後骨髄球、骨髄球、前骨髄細胞を包含し得る。成熟した赤血球に加え、赤血球は、有核赤血球（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を包含し得る。ＰＬＴは、通常のＰＬＴ及びそのサイズがＷＢＣのサイズに近い「巨大」ＰＬＴを包含し得る。本開示で言及する粒子の分類及び／又は小分類の「メンバー」は、粒子の分類及び／又は小分類内の個々の粒子を包含すると理解される。
【００９８】
他に明示しない限り、本開示で言及する粒子の「分類」は、サイズ、形状、テクスチャー、又は色のような、測定、検出又は誘導される少なくとも１つの検出基準を用いて検出される粒子群を包含すると理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本開示の装置で計数される粒子の少なくとも１つの分類及び／又は小分類のメンバーは、同じ種類の有形成分であろう。
【００９９】
そのような粒子は、「チャンネル」で検出される。本開示で言及する「チャンネル」は、信号源に連結され、少なくとも１つのチャンネル検出基準に適合する粒子の検出の増減と共に変動する出力を提供する検出器を備える粒子計数器の部分を包含すると理解される。例えば、チャンネル検出基準は、粒子のサイズ又は体積に基づくことができる。いくつかの実施形態では、粒子計数器内のチャンネルの数は１つである。他のいくつかの実施形態では、粒子計数器内のチャンネルの数は２つ以上である。
【０１００】
粒子計数器の１つのチャンネルで検出される粒子の分類及び／又は小分類は、粒子の異なるクラス又はサブクラス、及び２つ以上のサブクラスの粒子群を含んでもよい。本開示で言及する粒子の「分類」は、サイズ、形状、テクスチャー、又は色のような、測定、検出又は誘導される基準に相当する粒子群を包含すると理解されるであろう。いくつかの実施形態では、本開示の装置で計数される粒子の少なくとも１つの分類及び／又は小分類のメンバーは、同じ種類の有形成分であろう。
【０１０１】
本明細書で使用するとき、高光学解像度撮像デバイスという用語は、形態学的特徴及び／又は変化を区別するのに十分な光学的な差異を有する粒子画像を得ることができるデバイスを包含できる。代表的な高光学解像度撮像デバイスとしては、例えば、０．４６μｍなどの、例えば、０．４〜０．５μｍを含む、１μｍ以下の光学解像度を有するデバイスが挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用するとき、粒子造影剤組成物は、被検者から得た試料中の粒子を分析するために、光学分析器内で粒子及び／又は細胞内オルガネラ位置合わせ液（ＰＩＯＡＬ）と組み合わせて使用するように適応できる。代表的なＰＩＯＡＬは、例えば、被検者から得た試料中の異なる種類の粒子を自動認識する方法において、有用である。
【０１０３】
別の態様では、細胞は、画像を得るときにＰＩＯＡＬに包囲されていてもよい。好適な代表的な細胞内オルガネラ位置合わせ液は、本明細書に記載される。
【０１０４】
本明細書で使用するとき、「位置合わせ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）」は、部分的に、球形及び／又は非球形粒子の位置合わせによって特性評価することができる。例えば、非球形粒子のような粒子は、流れ方向と実質的に平行な平面内で位置合わせしてもよい。特定の実施形態において、非球形粒子の位置合わせは、撮像条件下での高光学解像度撮像デバイスの焦点面内の非球形粒子の画像投影を増大する粒子配向によって特性評価される。球形粒子のような粒子は、粒子及び細胞の合焦されている粒子内容物の量を増大する場合があり、これは粒子分類及び小分類のための光学的な差異を生成するのに有効である。球形粒子のような粒子の粒子内構造は、流れ方向と実質的に平行に位置決め、再位置決め及び／又は位置決め改良されてもよい。例えば、細胞内構造、オルガネラ又は葉（ｌｏｂｅｓ）は、流れ方向と実質的に平行に位置決め、再位置決め、及び／又は位置決め改良されてもよい。
【０１０５】
本開示で言及する粒子の「クラス」は、科学的区分に基づく粒子の群を包含すると理解される。例えば、全血試料中には、赤血球、白血球及び血小板を包含する主要３クラスの血球が存在する。
【０１０６】
本開示で言及する粒子の「メンバー」は、粒子の１つの分類及び／又は小分類の粒子を包含すると理解される。例えば、血球の各分類は、更に小分類又はメンバーに分けることができる。白血球の主要メンバーとしては、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球が挙げられるがこれらに限定されない。メンバーには、未成熟又は異常細胞も包含される。例えば、未成熟白血球は、後骨髄球、骨髄球、及び前骨髄球を包含し得る。赤血球のメンバーは、成熟赤血球に加え、有核赤血球（ＮＲＢＣ）及び網赤血球を包含し得る。血小板は、通常の血小板及びそのサイズが白血球のサイズに近い「巨大」血小板を包含し得る。
【０１０７】
「未成熟細胞」への言及は、特定の発達段階、例えば骨髄内の段階又は骨髄から放出されて間もないが成熟細胞に完全に発達する前の段階の細胞を包含すると理解されるであろう。
【０１０８】
「異常細胞」への言及は、異常な形態学的特徴を有する細胞、又は特定の疾患若しくは状態に関連する細胞、又は場合によっては特定の疾患又は状態に関連する異常性を包含すると理解されるであろう。特定の疾患の例としては、限定するものではないが、赤血球増加症、多血症、貧血、赤芽球減少症、白血球増加症、白血球減少症、リンパ球増加症、リンパ球減少症、顆粒球増加症、顆粒球減少症若しくは無顆粒球、好中球増加症、好中球減少症、好酸球増加症、好酸球減少症、好塩基球増加症、好塩基球減少症、血小板増加症、血小板減少症、及び汎血球減少症が挙げられる。細胞の１クラスは、血流中で増加又は減少することがある。いくつかの条件において、通常の白血球よりもはるかに大きい異常細胞が、血液試料中に低濃度で存在する。サイズ、形状、色、及び／又は細胞内構造の変動は、特定の疾患又は状態に関連する場合がある。
【０１０９】
本開示で言及する粒子の「計数」又は「粒子計数」は、粒子計数器の１つのチャンネルから得られる粒子の数を包含すると理解されるであろう。本開示で言及する、粒子のクラス又はメンバーの「濃度」は、単位体積当たり（例えば、１リットル当たり）、又は既知の体積の試料当たりの粒子の数を意味すると理解されるであろう。例えば、粒子計数器は、粒子の分類に関して計数若しくは濃度又はその他の計数に基づく関数を提供し得るが、光学分析器は、粒子の各分類又は小分類に関して、計数、濃度、割合又はその他の濃度に基づくパラメータを提供し得る。
【０１１０】
本開示で言及する「割合」は、粒子の２つの分類／小分類、クラス又はメンバーの任意の定量的及び／又は比例的割合を包含すると理解されるであろう。このような割合の例としては、限定するものではないが、濃度、重量、及び／又は粒子の数による割合が挙げられる。典型的には、割合は、ある分類、クラス又はメンバーの数の、別のそのような分類、クラス又はメンバーの数に対する数的比率に関する。いくつかの実施形態では、加重計数又は加重及び／若しくは比例的割合を用いた判定も行われる。
【０１１１】
血液学−粒子分析システム
ここで図を参照すると、図１は、試料フロー流３２中の微視的粒子をデジタル画像処理を用いて撮像する構成において、試料液を高光学解像度撮像デバイス２４の視域２３を通して運ぶ代表的なフローセル２２を概略的に示す。フローセル２２は、粒子造影剤組成物との接触及び加熱等の処理をされた試料液の供給源２５と連結されている。フローセル２２は、粒子及び／又は細胞内オルガネラ位置合わせ液（ＰＩＯＡＬ）（試料液の粘度よりも高い粘度を有する透明なグリセロール溶液など）の１つ以上の供給源２７とも連結している。
【０１１２】
試料液は、ＰＩＯＡＬフローが実質的に確立されリボン状試料流の上下（又は対向する位置）で安定で対称なＰＩＯＡＬの層流が得られる地点で、試料供給管２９の先端２８で扁平化された開口部を通してフローセル２２の内部に注入される。試料及びＰＩＯＡＬの流れは、ＰＩＯＡＬを、注入された試料液と共に、実質的に狭窄する流路に沿って移動させる精密定量ポンプによって供給されてもよい。ＰＩＯＡＬは、流路が狭窄するゾーン２１において試料液を包囲及び圧縮する。したがって、ゾーン２１における流路厚の減少は、試料流３２への幾何学的合焦に寄与し得る。試料液リボン３２は、ＰＩＯＡＬに包囲されて狭窄ゾーン２１の下流へ一緒に運ばれ、高光学解像度撮像デバイス２４の前を通過するか、又はその視域２３を通して、例えば、ＣＣＤ  ４８を用いて該デバイスで画像が収集される。プロセッサ１８は、ＣＣＤ  ４８からピクセルデータを入力として受信することができる。試料液のリボンはＰＩＯＡＬと一緒に排出部３３へと流れる。
【０１１３】
ここで示すように、狭窄ゾーン２１は、近位厚さＰＴを有する近位流路部分２１ａと遠位厚さＤＴを有する遠位流路部分２１ｂとを有することができ、遠位厚さＤＴは近位厚さＰＴよりも小さい。したがって、試料液は、近位部分２１ａに対して遠位であって遠位部分２１ｂに対して近位である位置で、試料管２９の先端２８を通して注入することができる。したがって、試料液は、ＰＩＯＡＬ流がゾーン２１によって圧縮されるときにＰＩＯＡＬエンベロープに入ることができ、その際試料液注入管は、試料液がシース液流へ注入される時に通る遠位出口を有し、この遠位出口はフローセルの流路サイズの縮小部によって制限される。
【０１１４】
対物レンズ４６を有するデジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン状試料流３２と交差する光軸に沿って方向付けされる。対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離は、フォトセンサアレイ上の合焦デジタル画像を解像及び収集するため、モーター駆動部５４の作動によって変動可能である。
【０１１５】
本開示は、リボン状試料流３２に焦点を合わせるための高光学解像度撮像デバイス２４の正しい作動位置を自動的に達成するための技術を提供する。フローセル構造２２は、リボン状試料流３２が、ＰＩＯＡＬの層間の薄いリボン状で、フローセル２２の視域２３を通過する試料液の流路を画定するフローセル内に固定された信頼できる位置を有するように構成できる。特定のフローセルの実施形態において、ＰＩＯＡＬのための流路の断面は、オリフィスで長方形の内腔を有する管２９のような扁平化オリフィス、又はカニューレを通して試料が挿入される点で対称的に狭窄する。狭窄する流路（例えば、断面積で２０：１の比、又は２０：１〜７０：１の比で幾何学的に狭窄する）は、ＰＩＯＡＬと試料液の粘度の差、及び任意選択的にＰＩＯＡＬと試料のフローとの線速度の差と共に働いて、試料断面を約２０：１〜７０：１の比で圧縮する。いくつかの実施形態では、断面厚さの比は４０：１であってもよい。
【０１１６】
一態様において、フローセル２２の対称性及び試料液及びＰＩＯＡＬの注入方法は、ＰＩＯＡＬの２層間のリボン状試料流３２にフローセル２２内で再現性のある位置を提供する。結果として、試料及びＰＩＯＡＬの固有線速度のようなプロセス変動によって、リボン状試料流がフロー中のその位置から変位することは起こりにくい。フローセル２２の構造に対して、リボン状試料流３２の位置は安定で再現性がある。
【０１１７】
ただし、フローセル２２と光学システムの高光学解像度撮像デバイス２４との相対的位置は、変化する可能性があり、高光学解像度撮像デバイス２４とリボン状試料流３２との間の最適又は所望距離を維持し、これによりリボン状試料流３２内の包囲された粒子の高品質合焦画像を提供するために、時々位置調節を行うことが有益となる場合がある。いくつかの実施形態によると、包囲された粒子の合焦画像を得るための高光学解像度撮像デバイス２４とリボン状試料流３２との間の最適又は所望距離が存在し得る。光学素子は、最初に、自動合焦又はその他の技術によってフローセル２２に対して的確に位置決めされ、高光学解像度撮像デバイス２４を、フローセル２２に対して固定位置にある自動合焦目標４４から最適又は所望の距離に位置付けることができる。自動合焦目標４４とリボン状試料流３２との間の変位距離は、例えば、初期校正工程の結果、正確にわかる。自動合焦目標４４に自動合焦した後、フローセル２２及び／又は高光学解像度撮像デバイス２４は、自動合焦目標４４とリボン状試料流３２との間の既知の変位距離にわたって変位される。結果として、高光学解像度撮像デバイス４４の対物レンズの焦点は、包囲された粒子を含有するリボン状試料流３２に正確に合わせられる。
【０１１８】
代表的な本発明の実施形態は、焦点又は撮像目標４４への自動合焦を伴い、この撮像目標は高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイス２４の光軸に沿った既知の位置を画定する高コントラスト図である。目標４４は、リボン状試料流３２の位置に対して既知の変位距離を有することができる。コントラスト測定アルゴリズムを、目標の特徴に特異的に用いることができる。一実施形態では、高光学解像度撮像デバイス２４の位置は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの光軸に平行な線に沿って変動することができ、コントラスト図の辺縁と交差することが既知である画像中のピクセルの線に沿って生じるピクセル輝度値の間で、１つ以上の最大振幅差が見出される深度又は距離を見出すことができる。場合によっては、自動合焦パターンは、光軸に平行な線に沿って変動せず、これは、記録された変位を提供するように高光学解像度撮像デバイス２４の位置を調節するためのモーター制御の作動が沿う線でもある。
【０１１９】
この方法では、異なる画像間で変動する可能性がある、コントラストに関してそれほど高度に規定されていない、又はある範囲の位置のどこかに位置する可能性がある画像内容物の外観に、参照用の距離を決定する根拠として、必ずしも自動合焦又は依拠する必要はない。自動合焦目標４４上の最適又は所望の焦点の位置が見出された後、高光学解像度撮像デバイス対物レンズ２４及びフローセル２２の相対的位置を記録された変位距離で変位させて、リボン状試料流３２中の粒子の最適又は所望の焦点位置を提供することができる。
【０１２０】
いくつかの実施形態によると、高光学解像度撮像デバイス２４は、照明開口部（窓）４３を通って適用される光源４２によって背面照明されたときにリボン状試料流３２の画像を解像することができる。図１に示す実施形態において、照明開口部４３の外周が自動合焦目標４４を形成する。ただし、目的は、リボン状試料流３２に正確に合焦した画像を、高光学解像度撮像デバイス光学素子４６を通して、集積電荷結合デバイスなどの感光性素子のアレイ上で収集することである。
【０１２１】
高光学解像度撮像デバイス２４及びその光学素子４６は、距離５０で合焦したリボン状試料流３２中の粒子の画像を解像するように構成され、この距離は、光学システムの寸法、レンズの形状、及びその材料の屈折率の結果であり得る。場合によっては、高光学解像度撮像デバイス２４とリボン状試料流３２との間の最適又は所望距離は変化しない。別の場合には、フローセル２２と高光学解像度撮像デバイス及びその光学素子４６との間の距離は変化し得る。高光学解像度撮像デバイス２４及び／又はフローセル２２を、互いに対して近づけて又は離して移動させると（例えば、撮像デバイス２４とフローセル２２との間の距離５１を調節することによって）、距離５０の末端におけるフローセルに対する合焦点の位置が移動する。
【０１２２】
本発明の実施形態によると、焦点目標４４は、リボン状試料流３２からある距離で配置することができ、この場合、照明光源４２からの光のための開口部４３の辺縁において、フローセル２２に直接固定されている。焦点目標４４は、リボン状試料流３２から一定の変位距離５２にある。多くの場合、フローセル中のリボン状試料流３２の位置が一定であることから、変位距離５２は一定である。
【０１２３】
代表的な自動合焦手順は、高光学解像度撮像デバイス２４とフローセル２２の相対的位置を、適切な焦点距離に到達するようにモーター５４を用いて調節し、それによって高光学解像度撮像デバイス２４の焦点を自動合焦目標４４に合わせる工程を伴う。この例において、自動合焦目標４４は、フローセル内のリボン状試料流３２の背後にある。続いて、自動合焦手順で、フォトセンサ上で解像された画像が自動合焦目標４４の的確な合焦画像であることが確立されるまで、高光学解像度撮像デバイス２４をフローセル２２に接近又は離隔する方向に移動させる。モーター５４を作動させて、高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の相対的位置を変位させて、即ち高光学解像度撮像デバイス２４をフローセル２２から離すよう、厳密には変位距離５２のスパン分、移動させることによって、高光学解像度撮像デバイスの焦点をリボン状試料流３２に合わせる。この代表的な実施形態において、撮像デバイス２４は、モーター５４によって焦点位置まで動かされることが示されている。他の実施形態において、フローセル２２が動かされるか、又はフローセル２２及び撮像デバイス２４の両方が、同様の手段によって動かされて、合焦画像が得られる。
【０１２４】
これらの移動の方向は、当然、目標４４が後方の照明窓４３ではなく前方の観察窓に配置されている場合には反対になる。その場合、変位距離は、リボン状試料流３２と前方観察ポートにおける目標４４（非表示）との間の全長となる。
【０１２５】
変位距離５２は、高光学解像度撮像デバイス２４の光軸に沿ったリボン状試料流３２と自動合焦目標４４との間の距離に等しく、出荷時校正工程で設定されるかユーザーによって設定できる。一般的に、変位距離５２は、いったん設定されると変化しない。熱膨張変化及び振動は、高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の精密な位置が互いに対して変化する原因となり、その結果自動合焦プロセスの再開始が必要になる場合がある。ただし、目標４４への自動合焦は、フローセル２２に対して固定され、それ故リボン状試料流３２に対して固定された位置基準を提供する。同様に、変位距離は一定である。したがって、目標４４に自動合焦し、高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２を変位距離の全長だけ変位させることによって、高光学解像度撮像デバイスの焦点がリボン状試料流３２に合わせられる結果となる。
【０１２６】
いくつかの実施形態によると、合焦目標は、照明開口部４３の周囲に印刷又は貼付された高コントラストの円として提供される。別の合焦目標の構成については、本明細書の他の場所で論じる。正方形又は長方形の画像を目標４４に焦点を合わせて収集すると、照明の中心周囲に高コントラストの枠が現れる。開口部の内縁で画像に最も高いコントラストが得られる位置を探すことで、高光学解像度撮像デバイスの焦点が目標４４の作動位置に自動的に合わせられる。いくつかの実施形態によると、用語「作動距離」は対物レンズとその焦点面との間の距離を指すことができ、用語「作動位置」は、撮像デバイスの焦点面を指すことができる。画像のコントラストの測度が最も高くなるのは、最も明るい白色と最も暗い黒色の測定ピクセルが、内縁を通る線に沿って互いに隣接する場所である。このコントラスト最高測度を使用して、撮像デバイスの焦点面が目標４４に対して所望の位置にあるか否かを評価することができる。その他の自動合焦技術も使用することができ、例えば、辺縁検出法、画像分割、並びに隣接する画素間の振幅差の積分及び差分和の最高値を求める等である。１つの技術では、目標４４のいずれかの側の作動位置を包含する３つの距離で差分和を計算し、得られた値を特性曲線と合致させる。その際最適距離は曲線のピーク値となる。関係して、代表的な自動合焦技術は、異なる位置のフローセル目標の画像を収集して、その画像を解析して、目標の画像が最も鮮鋭なときに最大となる指標を用いて最良の焦点位置を見つけることを含むことができる。第１工程では、自動合焦技術は、２．５μｍ間隔で収集した画像の組から予備的な最良位置を見出すよう操作できる（粗動）。自動合焦技術は、その位置から０．５μｍ間隔で第２の画像の組を収集し、目標に対する最終的な最良焦点位置を計算することができる（微動）。
【０１２７】
場合によっては、焦点目標（自動合焦パターン）は、試料が現れる視界の領域の辺縁に存在し得る。図１５に示すように、焦点目標は、視野に存在するコントラストをなす図形によって画定することもできる。典型的には、自動合焦目標はフローセル上に置かれるか、フローセルに対して固定位置に強固に取付けられる。自動合焦目標の画像のコントラストの最大化に応答して検出器によって制御される位置決めモーターの力で、装置は、リボン状試料流ではなく目標上に自動合焦する。続いて、フローセル及び／又は高光学解像度撮像デバイスを、自動合焦目標とリボン状試料流との間の距離であることが既知の変位距離分だけ、互いに対して変位することによって、高光学解像度撮像デバイスの作動位置又は焦点面が自動合焦目標からリボン状試料流へ変位される。結果として、リボン状試料流は、収集したデジタル画像に焦点が合った状態で現れる。
【０１２８】
赤血球及び白血球の分類及び／又は小分類のような粒子の種類をデータ処理技術によって区別するためには、１つの分類又は小分類を他のものと区別する外観を明らかにする十分な解像度及び明瞭性を有する微視的ピクセル画像を記録することが有利である。記載のように自動合焦技術を容易にすることが、本発明の目的である。
【０１２９】
実際の実施形態において、装置は、図１Ａに示し、図１Ｂに拡大するような光学ベンチ設備を基本とし、ジンバル式又はフローセルキャリア５５に取り付けされたフローセル２２に向けられ、高光学解像度撮像デバイス２４によって得られる画像内のフローセル２２の内容物に背面照明する照明光源４２を有する。キャリア５５は、高光学解像度撮像デバイス２４に向けて正確な前後移動が可能となるようにモーター駆動部に取り付けられる。キャリア５５は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの光学的観察軸に対してフローセルを精密に位置合わせすることも可能にし、その結果、リボン状試料流が撮像されるゾーン内の観察軸に垂直な平面内、即ち、図１に示す照明開口部４３と観察ポート５７との間を、リボン状試料流が流れる。焦点目標４４は、キャリア５５の調節を補助して、例えば、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの光軸に垂直なリボン状試料流の平面を確立することができる。
【０１３０】
したがって、キャリア５５は、例えば画像キャプチャデバイス２４又は画像キャプチャデバイス対物レンズに対する、フローセル２２の位置及び方向の非常に精密な線形及び角度調節を提供する。ここに示すように、キャリア５５は画像キャプチャデバイスに対するキャリア及びフローセルの角度調節を容易にするため、２つのピボット点５５ａ、５５ｂを包含する。角度調節ピボット点５５ａ、５５ｂは同一平面内に位置し、（例えば、画像キャプチャサイトにおいて）フローセルチャンネルに中心を合わせられる。これにより、フローセル位置の直線移動を生じさせずとも角度調節することが可能である。キャリア５５は、ピボット点５５ａの軸若しくはピボット点５５ｂの軸、又は両方の軸を中心にして回転できる。このような回転は、プロセッサ及びフローセル移動制御機構、例えば、図４に示すプロセッサ４４０及びフローセル制御機構４４２によって制御できる。
【０１３１】
図１Ｂの参照に戻ると、画像キャプチャデバイス２４及びキャリア５５（フローセル２２を伴う）のいずれか又は両方を、様々な軸（例えば、Ｘ、Ｙ、Ｚ）に沿って三次元で回転できることがわかる。したがって、画像キャプチャデバイスの焦点を調節するための代表的な技術は、画像キャプチャデバイス２４の撮像軸を中心とした軸回転を、例えば、軸Ｘを中心にしてデバイス２４を回転することによって、実施する工程を包含できる。焦点調節は、フローセル２２及び／又はキャリア５５を撮像軸から延伸する軸（例えば、軸Ｘ）を中心に、かつ撮像デバイスの視野内で、軸回転することによっても達成できる。場合によっては、焦点調節は、画像キャプチャデバイスの先端回転（例えば、Ｙ軸を中心とした回転）を包含してもよい。場合によっては、焦点調節は、フローセルの先端回転（例えば、Ｙ軸を中心とした回転、又はピボット点５５ａを中心とした回転）を包含してもよい。図示の通り、ピボット点５５ａはフローセルの流路に沿って該流路内に延伸するＹ軸に対応する。場合によっては、焦点調節は、画像キャプチャデバイスのチルト回転（例えば、Ｚ軸を中心とした回転）を包含できる。場合によっては、焦点調節は、フローセルのチルト回転（例えば、Ｚ軸を中心とした回転、又はピボット点５５ｂを中心とした回転）を包含してもよい。本明細書に図示するように、ピボット点５５ｂは、流路及び撮像軸を横切るＺ軸に対応する。場合によっては、画像キャプチャデバイスは、回転の中心を画像キャプチャデバイスの視野内に置いて、フローセルの回転（例えば、Ｘ軸を中心とする）を実施することによって試料フロー流に焦点を合わせることができる。本明細書に記載の三次元回転調節は、分析器システムの１つ以上の構成要素の位置的ずれを考慮に入れるように実施することができる。場合によっては、三次元回転調節は、分析器システムの１つ以上の構成要素の温度変動を考慮に入れるように実施することができる。場合によっては、分析器システムの調節は、撮像デバイス２４を軸Ｘに沿って並進する工程を包含してもよい。場合によっては、分析器システムの調節は、キャリア５５又はフローセル２２を軸Ｘに沿って並進する工程を包含してもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態によると、液体中に懸濁した粒子を含有する試料の画像を取得するための光学分析器は、図１に示すように、試料供給源２５及びＰＩＯＡＬ材料の供給源２７に連結したフローセル２２を包含する。図３の断面図からわかるように、フローセル２２は、流れ方向（図３では右から左、図１では下から上）に対称に狭窄する内部流路を画定する。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬで包囲された試料のフロー３２を、フローセルの視域、即ち観察ポート５７の後方を通るように方向付けするように構成される。
【０１３３】
再度図１を参照すると、対物レンズ４６を有するデジタル高光学解像度撮像デバイスは、リボン状試料流３２と交差する光軸に沿って方向付けされる。対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離は、フォトセンサアレイ上の合焦デジタル画像を解像及び収集するため、モーター駆動部５４の作動によって変動可能である。
【０１３４】
自動合焦パターン４４は、フローセル２２に対して固定位置を有し、この自動合焦パターンは、リボン状試料流３２の平面からある変位位置５２に位置付けされる。表示の実施形態において、自動合焦パターン（目標４４）は、高光学解像度撮像デバイス２４によって収集された画像内で見える位置でフローセル２２に直接取り付けられている。別の実施形態において、目標は、一体化するようにフローセル本体に直接取り付けられない場合、フローセル２２及びリボン状試料流３２に対する定位置に強固に固定された部品上に保持することができる。
【０１３５】
光源４２は、定常光源であることも、高光学解像度撮像デバイスフォトセンサの作動時に閃光するストロボであることもでき、リボン状試料流３２を照明し、更に目標４４のコントラストに寄与するように構成される。図示した実施形態において、照明は背面からの照明である。
【０１３６】
図１Ｃは、代表的な血液分析器の更なる態様を示すブロック図を与える。ここに示すように、分析器１００ｃは、モーター駆動部５４を作動させ、目標自動合焦パターン４４に対して異なる焦点位置で収集されたフォトセンサアレイからのデジタル画像を解析するように連結した少なくとも１つのデジタルプロセッサ１８を包含する。プロセッサ１８は、自動合焦パターン４４の焦点位置を決定するように、即ち、目標自動合焦パターン４４に自動合焦し、それによって高光学解像度撮像デバイス２４と自動合焦パターン４４との間の最適距離を確立するように、構成される。これは、第１の距離で画像のコントラストのレベルを評価するためのアルゴリズムを適用する工程のような画像処理工程によって実施でき、このアルゴリズムは、自動合焦パターン４４の画像全体又は少なくとも辺縁に適用できる。プロセッサは、モーター５４を別の位置に移動し、その位置又は辺縁におけるコントラストを評価し、２回以上の反復の後、自動合焦パターン４４上の焦点の精度を最大にする（又はその位置に移動したときに焦点の精度が最適になる）最適距離を決定する。プロセッサは、自動合焦目標自動合焦パターン４４とリボン状試料流との間の固定間隔を信頼し、その後プロセッサ１８はモーター５４を制御して、高光学解像度撮像デバイス２４をリボン状試料流３２に合焦するための正しい距離に移動する。より具体的には、プロセッサはモーターを作動させ、高光学解像度撮像デバイスとリボン状試料流３２との間の距離を、リボン状試料流が目標自動合焦パターン４４から変位している距離である変位距離５２（例えば、図１に示す）だけ変位させる。この方法で、高光学解像度撮像デバイスをリボン状試料流に合焦する。
【０１３７】
モーター５４は、光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスによって撮像された際立った特徴（特に血球の外観）よりもやや小さい精度のギア付ステッピングモーターを含むことができる。高光学解像度撮像デバイス２４の位置が、光学対物レンズの位置をリボン状試料流の幅内に位置付けるように調節されたならば、リボン状試料流中の細胞／粒子の視像が合焦される。自動合焦パターン４４は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像キャプチャデバイスの視野の辺縁に位置付けることができ、そのため観察を妨害しない。
【０１３８】
更に、高光学解像度撮像デバイスが変位距離にわたって移動され、自動合焦パターンの焦点が外れた場合、焦点に現れる特徴は、自動合焦パターンではなく、血球である。図１５の実施形態では、例えば、自動合焦パターンは視野内の図形によって規定される。図形は、限られたサイズの比較的薄い個別の形状であり、したがって、変位距離を移動した後、その形状は、リボン状試料流に合焦したときにデジタル画像中に実質的に見えなくなる。代表的な変位距離は、例えば、血液学（血球）撮像用途向けの寸法のフローセルで５０〜１００μｍであってよい。いくつかの実施形態では、自動合焦の機能は、高光学解像度撮像デバイスを最適焦点距離の１μｍ以内に維持する。
【０１３９】
フローセルの内部輪郭並びにＰＩＯＡＬ及び試料の流量は、試料がリボン状の流れに成形されるように調節できる。流れは、リボン状試料流に包囲された粒子とほぼ同じ薄さにすることができ、又は更に薄くすることができる。白血球は、例えば、約１０μｍの直径を有し得る。厚さが１０μｍ未満のリボン状試料流を提供することによって、リボン状試料流がシース液、即ちＰＩＯＡＬによって伸展されたときに、細胞が方向付けられ得る。驚くべきことに、より高い粘度などの、リボン状試料流と異なる粘度のＰＩＯＡＬ層内で、狭窄する流路に沿ってリボン状試料流を伸展すると、有利には、流れ方向と実質的に平行な平面内に非球形粒子を位置合わせさせ、細胞に力を加え、細胞の細胞内構造の合焦内容物が改善される傾向がある。高光学解像度撮像デバイス２４の光軸は、リボン状試料流の平面に実質的に垂直（直角）である。撮像点におけるリボン状試料流の線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であってよい。いくつかの実施形態では、リボン状試料流の線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒である。
【０１４０】
リボン状試料流の厚さは、試料液及びＰＩＯＡＬの相対的な粘度及び流量によって影響され得る。図１の参照に戻ると、例えば精密容積型ポンプを含む、試料供給源２５及び／又はＰＩＯＡＬの供給源２７は、試料及び／又はＰＩＯＡＬを、リボン状試料流３２の寸法を最適化するための制御可能な流量で提供するように、即ち、高光学解像度撮像デバイス２４の視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとして提供するように構成できる。
【０１４１】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬの供給源２７は、所定の粘度でＰＩＯＡＬを提供するように構成される。この粘度は、試料の粘度と異なってもよく、試料の粘度よりも高くなり得る。ＰＩＯＡＬの粘度及び密度、試料材料の粘度、ＰＩＯＡＬの流量及び試料材料の流量は、リボン状試料流を自動合焦パターンから変位距離に、そして、例えば有利なリボン状試料流厚さなどの所定の寸法特性を有するように、維持するように調整される。
【０１４２】
一実施形態において、ＰＩＯＡＬは試料よりも高い線速度及び試料よりも高い粘度を有し、それによって試料を扁平なリボン状に伸展する。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬ粘度は、最大１０センチポアズになり得る。
【０１４３】
図１Ｃに示す実施形態では、フォトセンサアレイから得たピクセルデジタル画像の分析に使用したものと同じデジタルプロセッサ１８を、自動合焦モーター５４の制御にも使用する。しかしながら、一般的には、高光学解像度撮像デバイス２４は、画像のキャプチャの都度自動合焦しない。自動合焦プロセスは、定期的（一日の開始時又はシフトの開始時）に、又は例えば適切なセンサによって温度若しくは他のプロセス変化が検出されたとき、又は画像解析で再合焦が必要である可能性が検出されたときに、実施できる。場合によっては、自動化した自動合焦プロセスは、約１０秒の時間内で実施されてもよい。場合によっては、自動合焦手順は、試料のラック（例えば、１ラックにつき１０点の試料）を処理する前に実施できる。他の実施形態では、１つのプロセッサで血液学的画像解析を実施し、固定された目標４４への自動合焦の工程を扱うように構成された、任意選択的に自身のフォトセンサアレイに関連付けられた別のプロセッサを有することも可能である。
【０１４４】
デジタルプロセッサ１８は、プログラムされた時間で、又はプログラムされた条件で、又はユーザーの必要に応じて、自動合焦するように構成することができ、画像に基づく粒子の分類及び小分類を実施するようにも構成される。代表的な粒子としては、細胞、白血球、赤血球等が挙げられる。
【０１４５】
一実施形態では、図１又は図１Ｃのデジタルプロセッサ１８は、自動合焦再開始信号を検出するように構成される。自動合焦再開始信号は、温度変化の検出、ピクセル画像日付（ｐｉｘｅｌ  ｉｍａｇｅ  ｄａｔｅ）のパラメータによって識別される焦点品質の低下、経過時間、又はユーザー入力によってトリガされ得る。有利には、図１に示す変位距離５２の再校正のために測定する意味で、再校正を行う必要はない。任意選択的に、品質管理のため及び／又は焦点維持のために、特定の頻度／間隔で自動焦点を再校正するようにプログラムすることができる。
【０１４６】
変位距離５２は、フローセルごとにわずかに変動するが、所与のフローセルについては一定を保つ。画像解析器にフローセルを装備する設定プロセスとして、変位距離は最初に推定され、その後自動合焦及び撮像の態様を実行する校正工程の間に、フローセルの正確な変位距離が決定され、定数として、プロセッサ１８のプログラミングに入力される。
【０１４７】
したがって、図１Ｄのフローチャート形式に示すように、更に図１及び／又は図１Ｃの血液分析器を参照して、本開示の方法及び装置に従って実施されるプロセスは、１回の又は稀な校正を伴う。校正は、工程１１０ｄに示すように、コントラスト目標４４への合焦、リボン状試料流３２への合焦、及び２箇所間の光軸に沿った変位の記録を包含する。変位は定数として記録できる。したがって、工程１２０ｄに示すように、モーター５４を制御し、フォトセンサアレイからの画像データを分析することによって、プロセッサ１８は目標４４に自動合焦し、高光学解像度撮像デバイス２４及び／又はフローセル２２を記録された変位距離だけ互いに対して変位する。続いて、リボン状試料流３２が合焦され、その画像を、一定の間隔で、特に、観察ポート５７で視域を通過するリボン状試料流の部分の実質的に重ならない隣接する視像を収集するのに十分な間隔で、収集（工程１３０ｄに示すように）及び処理（工程１４０ｄに示すように）することができる。自己監視（工程１５０ｄに示すように）でデータ異常又は熱膨張の違いによって高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の相対的位置を変化させた可能性のある温度変化が明らかになった場合、自動合焦（１６０ｄに示すように）が開始され、その後通常作動が再開始される。したがって、自動合焦プロセスは、自動合焦再開始信号を検出する工程、並びにその自動合焦再開始信号に応答して自動合焦及び画像取得工程を繰り返す工程を包含してもよい。いくつかの実施形態では、自動合焦再開始信号は、温度の変化、焦点品質の低下、経過時間、又はユーザーの入力を包含するか又はこれらに基づくことができる。
【０１４８】
リボン状試料流の線速度は、フォトセンサアレイの画像露出時間におけるデジタル画像のモーションブラーを防止するのに十分なだけ制限できる。光源は、任意選択的に、閃光して高入射振幅を短時間当てるストロボ光であることができる。自動合焦パターン４４及び画像は同じ視野にあることから、光源は、リボン状試料流と自動合焦パターンとを同時に照明するように構成される。しかしながら、他の実施形態において、撮像の視野と自動焦点の視野は異なっていてもよく、例えば、別々に照明及び／又は撮像することが可能である。
【０１４９】
本発明の主題である開発は、方法及び装置の態様を有する。光学分析器を合焦する方法は、高光学解像度撮像デバイス２４（これはデジタル高光学解像度撮像デバイスでもデジタル画像キャプチャデバイスでもよい）の焦点を、フローセル２２に対して固定された自動合焦パターン４４に合わせる工程を含み、その際自動合焦パターン４４は、リボン状試料流３２から変位距離５２の位置に置かれる。デジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン状試料流３２と交差する光軸を有する対物レンズを有する。対物レンズとフローセル２２との間の相対距離は、モーター駆動部５４の作動によって変動するのに対し、高光学解像度撮像デバイスと最適焦点との間の光軸方向の距離は既知である。デジタル高光学解像度撮像デバイスは、デジタル画像をフォトセンサアレイ上で解像及び収集するように構成される。モーター駆動部は、自動合焦プロセスで自動合焦パターンに合焦するように作動される。モーター駆動部は、続いて、変位距離にわたって作動され、それによって高光学解像度撮像デバイスをリボン状試料流に合焦する。
【０１５０】
目標への自動合焦及び変位距離による変位を使用して、リボン状試料流に合焦するための適切な距離を得ることができる。ただし、有利には、自動合焦は、画像キャプチャの都度に必要とされるものではなく又は反復されない。しかしながら、自動合焦は、特定条件で開始される。自動合焦再開始信号を検出又は発生することができ、これは、自動合焦パターンの再合焦の工程、モーター駆動部を変位距離にわたって作動する工程、及び高光学解像度撮像デバイスをリボン状試料流に再合焦する工程につながる。自動合焦再開始信号は、例えば温度変化の検出、焦点品質の低下、経過時間、その他のプロセスパラメータ又はユーザーの入力によって発生し得る。
【０１５１】
図１Ｅは、代表的なモジュールシステムの簡略ブロック図であり、モジュールシステム１００ｅの個々のシステム要素が、別々に、又はより一体的にどのように実装され得るかを大まかに示している。本発明の実施形態によると、モジュールシステム１００ｅは、血液試料液中の粒子を撮像するための粒子分析システムの一部であるか、又はそれと連結していてもよい。モジュールシステム１００ｅは、本明細書の別の場所に記載のように、合焦及び撮像技術に関するデータ若しくは命令の生成、合焦及び撮像技術に関する入力の受信、並びに／又は合焦及び撮像技術に関する情報若しくはデータの処理に十分に好適である。ある場合には、モジュールシステム１００ｅは、１つ以上のプロセッサ１０４ｅ、ユーザーインターフェース入力デバイスなどの１つ以上の入力デバイス１０６ｅ、及び／又はユーザーインターフェース出力デバイスなどの１つ以上の出力デバイス１０８ｅを包含する、バスサブシステム１０２ｅを介して電気的に接続されるハードウェア要素を含む。ある場合には、システム１００ｅは、ネットワークインターフェース１１０ｅ、並びに／又は、撮像システム１４２ｅからの信号受信及び／若しくは撮像システム１４２ｅへの信号送信が可能な、撮像システムインターフェース１４０ｅを備える。ある場合には、システム１００ｅは、ソフトウェア要素、例えばここでは、メモリ１１４ｅのワーキングメモリ１１２ｅ内に現在位置するように示されるもの、オペレーティングシステム１１６ｅ、及び／又はその他コード１１８ｅ、例えば、本明細書に開示される手法の１つ以上の態様を実行するように構成されるプログラムを備える。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、モジュールシステム１００ｅは、本明細書に開示される様々な手法の機能をもたらす、基本プログラム及びデータ構造を記憶できる、記憶サブシステム１２０ｅを備えてよい。例えば、本明細書に記載されるような方法の態様の機能を実行するソフトウェアモジュールが、記憶サブシステム１２０ｅに記憶されてよい。これらのソフトウェアモジュールは、１つ以上のプロセッサ１０４ｅによって実行されてよい。分散型環境では、ソフトウェアモジュールは、複数のコンピュータシステムに記憶され、複数のコンピュータシステムのプロセッサによって実行されてよい。記憶サブシステム１２０ｅは、メモリサブシステム１２２ｅと、ファイル記憶サブシステム１２８ｅと、を備えてよい。メモリサブシステム１２２ｅは、プログラム実行中に命令及びデータを記憶するメインのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１２６ｅ、及び固定命令を記憶する読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）１２４ｅなどの、多くのメモリを備えてよい。ファイル記憶サブシステム１２８ｅは、プログラム及びデータファイルに対する固定（不揮発性）記憶装置をもたらすことができ、任意に、試料、患者、治療、評価、又はその他データを組み入れることができる有形記憶媒体を備えてよい。ファイル記憶サブシステム１２８ｅは、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ並びに関連リムーバブルメディア、コンパクトデジタル読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ドライブ、光学式ドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ  ＲＷ、固体リムーバブルメモリ、その他リムーバブルメディアカートリッジ又はディスク、及びその他同種のものを備えてよい。当該ドライブの１つ以上は、遠隔位置でモジュールシステム１００ｅに結合された他のサイトの他の接続コンピュータ上に配置されてもよい。いくつかの例において、システムは、１つ以上のプロセッサによって実行されたときに、１つ以上のプロセッサに本明細書に開示する技術又は方法の任意の態様を実施させることができる、１つ以上の一連の命令を記憶するコンピュータ読取り可能記憶媒体又は他の有形記憶媒体を含んでもよい。本明細書に開示される手法の機能を実行する１つ以上のモジュールは、ファイル記憶サブシステム１２８ｅによって記憶されてよい。いくつかの実施形態では、ソフトウェア又はコードは、モジュールシステム１００ｅが通信ネットワーク１３０ｅと通信できるようにするプロトコルを提供する。任意選択で、このような通信には、ダイヤルアップ又はインターネット接続通信を含んでよい。
【０１５３】
システム１００ｅは、本発明の方法の様々な態様を実施するように構成できると理解される。例えば、プロセッサ構成要素又はモジュール１０４ｅは、センサ入力デバイス若しくはモジュール１３２ｅから、ユーザーインターフェース入力デバイス若しくはモジュール１０６ｅから、並びに／又は撮像システム１４２ｅから、任意選択的に画像システムインターフェース１４０ｅ並びに／又はネットワークインターフェース１１０ｅ及び通信ネットワーク１３０ｅを介して、温度パラメータ信号及び／又はフローセル作動パラメータを受信するように構成された、マイクロプロセッサ制御モジュールであり得る。いくつかの例において、センサ入力デバイス（単数又は複数）は、血液試料の画像を得るために装備された粒子分析システムを包含するか又はその一部であってもよい。いくつかの例において、ユーザーインターフェース入力デバイス（単数又は複数）１０６ｅ及び／又はネットワークインターフェース１１０ｅは、画像パラメータを得るために装備された粒子分析システムによって発生される画像パラメータ信号を受信するように構成されてもよい。いくつかの例において、撮像システム１４２ｅは、血液試料に関連する画像パラメータを得るために装備された粒子分析システムを包含するか又はその一部であってもよい。
【０１５４】
プロセッサ要素つまりモジュール１０４ｅは、粒子分析パラメータ信号又は画像パラメータ信号を、任意選択的に本明細書に開示される手法のいずれかによって処理して、センサ出力デバイス又はモジュール１３６ｅ、ユーザーインターフェース出力デバイス又はモジュール１０８ｅ、ネットワークインターフェースデバイス又はモジュール１１０ｅに、撮像システムインターフェース１４０ｅ、又はこれらの任意の組み合わせ、に送信するように構成することもできる。本発明の実施形態による装置又はモジュールのそれぞれは、プロセッサ若しくはハードウェアモジュール、又はこれらの任意の組み合わせによって処理される、コンピュータ読み取り可能な媒体上の１つ以上のソフトウェアモジュールを備えてよい。任意の様々な一般的プラットフォーム、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃＩｎｔｏｓｈ、及びＵｎｉｘ（登録商標）を、任意の様々な一般的なプログラミング言語と共に用いて、本発明の実施形態を実行してよい。
【０１５５】
ユーザーインターフェース入力デバイス１０６ｅは、例えば、タッチパッド、キーボード、マウスのようなポインティングデバイス、トラックボール、グラフィックスタブレット、スキャナ、ジョイスティック、画面に組み込まれたタッチスクリーン、音声認識システムのような音声入力デバイス、マイク、及び他の型の入力デバイスを含んでもよい。ユーザー入力デバイス１０６ｅは、有形記憶媒体から、又は通信ネットワーク１３０ｅからコンピュータで実行可能なコードをダウンロードしてもよく、このコードは、本明細書に開示される方法又は態様のいずれかを具現化する。端末ソフトウェアは時々アップデートされ、必要に応じて端末にダウンロードできることが理解されるであろう。概して、用語「入力デバイス」は、情報をモジュールシステム１００ｅに入力するための、様々な通常の及び固有のデバイス及び手段を含むことを意図する。
【０１５６】
ユーザーインターフェース出力デバイス１０６ｅは、例えば、表示サブシステム、プリンタ、ファックス機、又は音声出力デバイスのような非視覚表示を含んでもよい。ディスプレイサブシステムは、陰極管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのフラットパネルデバイス、投射デバイスなどであってよい。ディスプレイサブシステムは、音声出力デバイスを介するものなど非視覚的表示を提供してもよい。概して、用語「出力デバイス」の使用は、モジュールシステム６００からユーザーに情報を出力するための、様々な通常の及び固有のデバイス及び手段を含むことを意図する。
【０１５７】
バスサブシステム１０２ｅは、モジュールシステム１００ｅの様々な構成要素及びサブシステムに意図又は所望に応じて互いに通信させるための機構を提供する。モジュールシステム１００ｅの様々なサブシステム及び構成要素は、物理的に同じ位置にいる必要はないが、分散型ネットワーク内の様々な位置に分散されてよい。バスサブシステム１０２ｅは、模式的に単一バスとして示されるが、バスサブシステムの別の実施形態では、複数のバスを利用してもよい。
【０１５８】
ネットワークインターフェース１１０ｅは、外部ネットワーク１３０ｅ又は他のデバイスへのインターフェースを提供できる。外部通信ネットワーク１３０ｅは、必要に応じて、又は要求に応じて他と通信できるように構成されてよい。したがって、モジュールシステム１００ｅから電子パケットを受信し、必要に応じて、又は要求に応じてモジュールシステム１００ｅに任意の情報を送り返すことができる。本明細書に図示するように、通信ネットワーク１３０ｅ及び／又は撮像システムインターフェース１４２ｅは、血液試料に対応する画像又は画像パラメータを得るために装備された撮像システム１４２ｅに情報を送信するか、又はそこから情報を受信してもよい。
【０１５９】
システム内にこのようなインフラストラクチャ通信リンクを提供することに加え、通信ネットワークシステム１３０ｅは、インターネットなどの別のネットワークへの接続を提供することもでき、有線、無線、モデム、及び／又は別の種類のインターフェース通信を含んでよい。
【０１６０】
特定の要件に従って大幅に変更され得ることが、当業者には明らかであろう。例えば、カスタマイズされたハードウェアも使用され、及び／又は、特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（アプレット等の高移植性ソフトウェアを含む）、若しくは両方で実装され得る。更に、ネットワーク入力／出力デバイスなどの他のコンピュータデバイスへの接続が利用できる。モジュール端末システム１００ｅ自体は、コンピュータ端末、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、ネットワークコンピュータ、又は任意のその他データ処理システムなどの、様々な種類のものであってよい。コンピュータ及びネットワークの変化し続ける性質により、図１Ｅに記載するモジュールシステム１００ｅの説明は、本発明の１つ以上の実施形態を例示する目的の具体例にすぎない。図１Ｅに記載するモジュールシステム１００ｅよりも、多くの又は少ない構成要素を有する、モジュールシステムの多くの他の構成が可能である。モジュールシステム１００ｅの任意のモジュール若しくは構成要素、又はかかるモジュール若しくは構成要素の任意の組み合わせは、本明細書に開示する粒子分析及び／又は撮像システムの実施形態の任意のものと結合、又は統合することができ、又は別の方法で接続するように構成できる。関連して、上記任意のハードウェア及びソフトウェア構成要素は、別の場所で使用される別の医学的評価、又は治療システムと一体化され、又はインターフェースで接続されるように構成されてよい。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、モジュールシステム１００ｅは、入力モジュールにおいて、血液試料の１つ以上の画像パラメータを受信するように構成できる。画像パラメータデータは、評価モジュールに送信されて、画像データの分析に基づいて診断又はその他の結果を予測又は判断できる。画像又は診断データは、出力モジュールを介して、システムのユーザーに対して出力できる。場合によっては、モジュールシステム１００ｅは、血液試料の診断結果を、例えば診断モジュールを使用することによって、決定できる。診断情報は、出力モジュールを介して、システムのユーザーに対して出力できる。任意選択的に、診断の特定の態様は出力デバイスによって決定することができ、診断システム又は診断システムのサブデバイスに送信され得る。血液試料又は試料を採取した患者に関する種々のデータのいずれか、例えば、年齢、体重、性別、治療歴、病歴等を、モジュールシステムに入力することができる。治療レジメン又は診断的評価のパラメータは、かかるデータに基づいて決定してよい。
【０１６２】
関連して、いくつかの例において、システムは、画像データを入力として受信するように構成されたプロセッサを含む。任意選択的に、プロセッサ、記憶媒体、又はその両方を、血液学的機器又は粒子分析機器に組み込んでもよい。いくつかの例において、血液学的機器は、画像データ又は他の情報をプロセッサへの入力のために生成してもよい。ある場合には、プロセッサ、記憶媒体、又は両方は、コンピュータ内に組み込まれてよく、コンピュータは血液学的機器と通信してよい。ある場合には、プロセッサ、記憶媒体、又は両方は、コンピュータ内に組み込まれてよく、コンピュータはネットワークを介して血液学的機器とリモート通信してよい。
【０１６３】
フローセル
フローセル２２の具体的な実施形態を更に図２及び図３に示す。ここに示すように、フローセル２２は、試料供給源２５及びＰＩＯＡＬ材料の供給源２７とも連結できる。試料液は、カニューレ２９を介して、例えばカニューレ２９の先端出口３１を通って、フローセル２２に注入される。典型的には、ＰＩＯＡＬシース液は、供給源２７から視域２３の方向にフローセル内の湾曲チャンネル部分４１を通って流れるときに層流状態ではない。しかし、フローセル２２は、試料液がシース液流に導入される先端出口３１をＰＩＯＡＬシース液が流れるときに、ＰＩＯＡＬシース液が層状であるか若しくは層状になるように、又はフラットな速度プロファイルを示すように、構成できる。試料液及びＰＩＯＡＬは、全体的に矢印Ａで示される方向にフローセル２２に沿って流れ、その後、排出部３３を介してフローセル２２の外へと流れる。フローセル２２は、流れ方向Ａで対称的に狭窄する（例えば、遷移ゾーン２１において）内部流路２０を画定する。流路の対称性は、不安定な状況に左右されず中心に配置された試料流の流れに寄与する。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬで包囲された試料のフロー３２を、フローセルの視域２３、即ち観察ポート５７の後方を通るように方向付けするように構成される。自動合焦パターン４４は観察ポート５７に関連付けられている。フローセル２２は、顕微鏡対物レンズ（非表示）を受け入れ又は受け取る円形又は陥凹した座部５８も有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態によると、自動合焦パターン４４は、フローセル２２に対して固定位置を有することができ、その位置はリボン状試料流３２の平面からある変位距離にある。本明細書に表示の実施形態において、自動合焦パターン（目標４４）は、高光学解像度撮像デバイス（非表示）によって観察ポート５７を通じて収集された画像に見える位置でフローセル２２に直接取り付けられている。フローセル２２は第１若しくは上方の部分若しくは層２２ａ、及び第２若しくは下方の部分若しくは層２２ｂで構成され得る。ここに示すように、ガラス又は透明な窓ガラス（ｐａｎｅ）６０は、第１部分２２ａに取り付けられるか第１部分と一体となっている。窓ガラス６０は、フローセル内の試料流路の少なくとも一部を画定できる。光源４２からの光は、フロー流３２内を流れる試料粒子を照明するように自動合焦パターン４４の開口又は通路を通って進むことができる。
【０１６５】
場合によっては、窓ガラス６０の厚さは、約１５０μｍ〜約１７０μｍの範囲内の値を有することができる。上記のように、窓ガラス６０は、流路又はシース（例えば、ＰＩＯＡＬ）チャンネルを画定するかその一部を形成することができる。薄い窓ガラス６０を使用することによって、顕微鏡対物レンズを試料液のリボンのすぐ近くに置くことができ、したがって、流路に沿って流れる粒子の高倍率画像を得ることができる。
【０１６６】
図３Ａはフローセルの実施形態の態様を示し、図中、撮像軸３５５と遠位遷移ゾーン部分３１６との間の距離は約８．２４ｍｍである。遠位遷移ゾーン部分３１６とカニューレ出口３３１との間の距離は約１２．５４ｍｍである。カニューレ出口３３１とシース液入口３０１との間の距離は約１２．７ｍｍである。カニューレ出口３３１と近位遷移ゾーン部分３１８との間の距離は約０．７３ｍｍである。図３Ｂは、図３Ａの実施形態と比較して、カニューレ出口が遷移ゾーンに対してより遠位の位置に移動したフローセル実施形態の態様を示す。ここに示すように、カニューレ遠位端は、フローセルの狭窄遷移ゾーン内へと進み、撮像軸３５５と遠位遷移ゾーン部分３１６との間の距離は約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内にある。場合によっては、撮像軸３５５と遠位遷移ゾーン部分３１６との間の距離は約２１ｍｍである。
【０１６７】
図１の参照に戻ると、フローセル内部輪郭（例えば、遷移ゾーン２１における）並びにＰＩＯＡＬ及び試料の流量は、試料がリボン状の流れ３２に成形されるように調節できる。流れは、リボン状試料流に包囲された粒子とほぼ同じ薄さか、又は更に薄いことも可能である。白血球は、例えば、約１０μｍの直径を有する。厚さが１０μｍ未満のリボン状試料流を提供することによって、リボン状試料流がシース液、即ちＰＩＯＡＬによって伸展されたときに、細胞が配向され得る。驚くべきことに、より高い粘度などの、リボン状試料流と異なる粘度のＰＩＯＡＬ層内で、狭窄する流路に沿ってリボン状試料流を伸展すると、有利には、流れ方向と実質的に平行な平面内に非球形粒子を位置合わせさせ、細胞に力を加え、細胞の細胞内構造の合焦内容物が改善される傾向がある。高光学解像度撮像デバイス２４の光軸は、リボン状試料流の平面に実質的に垂直（直角）である。撮像点におけるリボン状試料流の線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であってよい。いくつかの実施形態では、リボン状試料流の線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒である。
【０１６８】
リボン状試料流の厚さは、試料液及びＰＩＯＡＬの相対的な粘度及び流量によって影響され得る。例えば精密容積ポンプを含む試料供給源２５及び／又はＰＩＯＡＬの供給源２７は、試料及び／又はＰＩＯＡＬを、リボン状試料流３２の寸法を最適化するために制御可能な流量で提供するように、即ち、高光学解像度撮像デバイス２４の視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとして提供するように、構成できる。
【０１６９】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬの供給源２７は、所定の粘度でＰＩＯＡＬを提供するように構成される。この粘度は、試料の粘度と異なっていてもよく、試料の粘度よりも高くすることもできる。ＰＩＯＡＬの粘度及び密度、試料材料の粘度、ＰＩＯＡＬの流量及び試料材料の流量は、リボン状試料流を、自動合焦パターンから変位距離で、所定の寸法特性、例えば有利なリボン状試料流厚さで維持するように調整される。
【０１７０】
実用的実施形態では、ＰＩＯＡＬは試料よりも高い線速度及び試料よりも高い粘度を有し、それによって試料を扁平なリボン状に伸張する。ＰＩＯＡＬ粘度は、最大１０センチポアズになり得る。
【０１７１】
図２及び３も参照すると、フローセルの内部流路はリボン状試料流をＰＩＯＡＬ内に注入する点の下流で狭窄し、例えば、７μｍまでのリボン状試料流の厚さを生じ、及び／又は内部流路は５００〜３，０００μｍのリボン状試料流幅を生じる。代表的な実施形態において、図１に示すように、フローセルの内部流路は、試料流をＰＩＯＡＬ内へ注入する点の上流で狭窄遷移ゾーンを開始する。
【０１７２】
別の実施形態において、内部流路は厚さ２〜４μｍのリボン状試料流を生じ、及び／又は内部流路は幅２０００μｍのリボン状試料流を生じる。これらの寸法は、血液学的に特に有用である。この場合の流れの厚さは、弛緩状態（ｒｅｌａｘｅｄ  ｓｔａｔｅ）の赤血球等のいくつかの粒子の直径よりも小さい。したがって、これらの粒子は、広い方が撮像軸と面するように再配向されるようになり、これは際立った特徴を明らかにする効果がある。
【０１７３】
リボン状試料流の線速度は、フォトセンサアレイの画像露出時間におけるデジタル画像のモーションブラーを防止するのに十分に制限できる。光源は、任意選択的に、閃光して高入射振幅を短時間当てるストロボ光であることができる。自動合焦パターン４４及び画像は同じ視野にあることから、光源は、リボン状試料流と自動合焦パターンとを同時に照明するように構成される。しかしながら、他の実施形態において、撮像の視野と自動焦点の視野は異なっていてもよく、例えば、別々に照明及び／又は撮像することが可能である。
【０１７４】
本発明の主題である開発は、方法及び装置の態様を有する。光学分析器を合焦する方法は、高光学解像度撮像デバイス２４（これはデジタル高光学解像度撮像デバイスでもデジタル画像キャプチャデバイスでもよい）の焦点を、フローセル２２に対して固定された自動合焦パターン４４に合わせる工程を含み、その際自動合焦パターン４４は、リボン状試料流３２から変位距離５２に位置付けされる。デジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン状試料流３２と交差する光軸を有する対物レンズを有する。対物レンズとフローセル２２との間の相対距離は、モーター駆動部５４の作動によって変動するのに対し、高光学解像度撮像デバイスと最適焦点との間の光軸方向の距離は既知である。デジタル高光学解像度撮像デバイスは、デジタル画像をフォトセンサアレイ上で解像及び収集するように構成される。モーター駆動部は、自動合焦プロセスで自動合焦パターンに合焦するように作動される。モーター駆動部は、続いて、変位距離にわたって作動され、それによって高光学解像度撮像デバイスをリボン状試料流に合焦する。
【０１７５】
本方法は、リボン状試料流をリボン状に成形する工程を更に包含できる。このリボンの形は、高光学解像度撮像デバイスの光軸がリボン状試料流に実質的に垂直となるように、即ち、リボン状流の平面と直角となるように存在する。
【０１７６】
図４は、血液試料中の粒子を撮像するためのシステム４００の態様を示す。ここに示すように、システム４００は、試料液注入システム４１０、フローセル４２０、及び画像キャプチャデバイス４３０、及びプロセッサ４４０を包含する。フローセル４２０は、シース液のフローを、任意選択的に試料液と組み合わせて送出する流路４２２を提供する。いくつかの実施形態によると、試料液注入システム４１０は、カニューレ又は管４１２を包含するか、これらと連結されている。試料液注入システム４１０は、流路４２２と流体連通することができ、試料液の流れ４２８を提供するように、試料液４２４をカニューレ４１２の遠位出口４１３を通じて、フローセル４２０内のシース液流４２６に注入するように動作することができる。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、試料液注入システム４１０がシース液流４２６に試料液４２４を注入するように構成されたコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を包含するか、又はそれと連動してもよい。ここに示すように、シース液４２６は、シース液注入システム４５０によってフローセル４２０に導入できる。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、シース液注入システム４５０がフローセル４２０にシース液４２６を注入するように構成されたコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を包含するか、又はそれと連動してもよい。
【０１７７】
試料液流４２８は、注入管４１２に隣接して第１の厚さＴ１を有する。フローセルの流路４２２は、試料液流４２８の厚さが初期厚さＴ１から画像キャプチャ部位４３２に隣接する第２の厚さＴ２に減少するような流路サイズの縮小部を有する。画像キャプチャデバイス４３０は、フローセル４２０の画像キャプチャ部位４３２において第１の試料液から第１の複数の粒子を撮像するように、画像キャプチャ部位４３２と位置合わせされる。
【０１７８】
プロセッサ４４０は、試料液注入器システム４１０、画像キャプチャデバイス４３０、及び任意選択的にシース液注入システム４５０と連結される。プロセッサ４４０は、シース液流４２６への第１の試料液の注入を終了し、シース液４２６への第２の試料液の注入を開始し、試料液の過渡が開始されるように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、試料液注入システム４１０が第２試料液をシース液流４２６に注入し、試料液の過渡が開始されるように構成されたコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を包含するか、該記憶媒体と連動してもよい。
【０１７９】
更に、プロセッサ４４０は、試料液の過渡後及び第１の複数の粒子の撮像から４秒以内に、フローセル４２０の画像キャプチャ部位４３２において第２の試料液から第２の複数の粒子の画像キャプチャを開始するように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、試料液の過渡後及び第１の複数の粒子の撮像から４秒以内に、フローセル４２０の画像キャプチャ部位４３２において第２の試料液から第２の複数の粒子の画像キャプチャを開始するように構成されたコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を包含するか、該記憶媒体と連動してもよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、フローセル移動制御機構４４２が、フローセル４２０の位置を、例えば、画像キャプチャデバイス４３０に対して調節するように構成された記憶媒体を包含するか、該記憶媒体と連動してもよい。いくつかの実施形態では、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、画像キャプチャデバイス移動制御機構４４４が、画像キャプチャデバイス４３０の位置を、例えば、フローセル４２０に対して調節するように構成された記憶媒体を包含するか、該記憶媒体と連動してもよい。移動制御機構４４２、４４４は、モーター、ジンバル、及びその他のフローセル及び画像キャプチャデバイスのそれぞれの移動を促進及びもたらす機械的機能を包含してもよい。場合によっては、フローセル制御機構４４２及び／又は画像キャプチャデバイス制御機構４４４はフローセルに対する画像キャプチャデバイスの電動化及び自動化合焦を提供する高精度ステッパーモーター制御を包含してもよい。図１に示すように、プロセッサは画像キャプチャデバイス２４の移動を制御できる。同様に、図１Ｂに示すように、プロセッサはフローセルキャリア５５の移動を制御できる。
【０１８１】
したがって、本発明の実施形態は、粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシングを実行する、血液試料中の粒子を撮像するための粒子分析システムを包含する。代表的なシステムは、注入管を有する流路と撮像軸がその中を通る撮像窓とを有するフローセルを包含できる。フローセルの流路は、流路サイズの縮小部を有することができる。更に、分析器システムは、流路と流体連通したシース液投入部、及び注入管と流体連通した血液投入部を包含できる。血液投入部は、血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きいフロー流幅で流れるように、フローセル内のシース液流に血液試料を注入するように構成できる。シース液は、血液試料の粘度よりも大きい粘度を有することができる。更に、分析器システムは、画像キャプチャデバイスと、フローセルに対して画像キャプチャデバイスの合焦状態を設定する合焦機構とを包含できる。更に、システムは、フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を包含することができ、撮像目標及び試料フロー流は撮像軸に沿った変位距離を画定する。システムはまた、プロセッサと、変位距離を用いて粒子の特性評価及び計数をするのに好適である、画像キャプチャデバイスの合焦状態を設定するよう、合焦機構を作動させるために、プロセッサで実行される機械読み取り可能なコードを具現化する有形媒体を有する合焦モジュールと、を包含できる。シース液と血液試料の粘度差は、流路サイズの縮小部と組み合わせて、血液試料中の細胞の生存能を維持しながら撮像軸において第１及び第２試料液にハイドロフォーカシングするために有効となり得る。場合によっては、合焦機構は、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節するように構成された駆動モーターを包含できる。
【０１８２】
場合によっては、分析器システム４００は、図４に示すように、フローセル４２０と熱的に連結した温度又は熱センサ４４８を包含してもよい。合焦モジュールは、プロセッサに動作的に関連付けられてもよく、温度センサによって検知された温度変化、及び温度と所望の焦点との間の既知の関係に応じて、粒子の特性評価及び計数に適した画像キャプチャデバイスの合焦状態又は焦平面を設定するべく合焦機構（例えばフローセル制御機構４４２又は画像キャプチャデバイス制御機構４４４）を操作するためにプロセッサ上で実行される機械読み取り可能なコードを組み込んだ有形媒体を含むことができる。
【０１８３】
図４Ａに示したフローセルの実施形態に示すように、流路サイズの縮小部（例えば、遷移ゾーン４１９ａにおいて）は、流路４２２ａの対向する壁４２１ａ、４２３ａによって画定できる。対向する壁４２１ａ、４２３ａは、流路４２２ａに沿って半径方向に内側に曲がることができ、試料液の流れ４２８ａを二等分する水平面４５１ａに関して概ね対称である。平面４５１ａは、試料流４２８ａがカニューレ又は試料注入管４１２ａの遠位部分４２７ａから出る場所で、試料流が第１の厚さＴ１を有するところで試料流４２８ａを二等分することができる。同様に、平面４５１ａは、試料流４２８ａは画像キャプチャ部位４３２ａを通過する場所で、試料流が第２の厚さＴ２を有するところで試料流４２８ａを二等分することができる。いくつかの実施形態によると、第１の厚さＴ１は約１５０μｍの値を有し、第２の厚さＴ２は約２μｍの値を有する。このような場合、試料リボン流の圧縮比は７５：１である。いくつかの実施形態によると、第１の厚さＴ１は約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有し、第２の厚さＴ２は約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の値を有する。試料流の流体がフローセルを通って流れると、リボンは、加速され伸展されるにつれて薄くなる。フローセルの２つの特徴が、試料液リボンの薄化に寄与し得る。第１に、シース液エンベロープと試料液リボンとの間の速度差が、リボンの厚さの低減に作用し得る。第２に、遷移ゾーンの先細の形状は、リボンの厚さの低減に作用し得る。
【０１８４】
典型的には、第１の厚さＴ１は、試料粒子のサイズよりもはるかに大きく、したがって粒子は試料リボン流内に完全に収容される。しかしながら、第２の厚さＴ２は特定の試料粒子のサイズよりも小さくてもよく、したがってこれらの粒子は試料液から出て、周囲のシース液の中へ延出してもよい。図４Ａに示すように、試料リボン流は、カニューレを出て画像キャプチャ部位へ向けて移動する際に、概ね同じ平面に沿って流れることができる。
【０１８５】
フローセルは、遠位カニューレ部分４２７ａと画像キャプチャ部位４３２ａとの間の分離距離４３０ａも提供できる。いくつかの実施形態によると、試料液注入管４１２ａの遠位部分４２７ａは、画像キャプチャ部位４３２ａから軸方向分離距離４３０ａに位置決めすることができ、そこで軸方向分離距離４３２ａは約２１ｍｍの値を有する。場合によっては、軸方向分離距離４３０ａは、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。
【０１８６】
カニューレ出口と画像キャプチャ部位と間の軸方向分離距離４３０ａは、流体が出口から画像キャプチャ部位へと横切る際の試料液の遷移時間に影響し得る。例えば、比較的短い軸方向分離距離４３０ａは、より短い遷移時間に寄与し、比較的長い軸方向分離距離４３０ａは、より長い遷移時間に寄与し得る。
【０１８７】
流路遷移ゾーン４１９ａに対する、又は流路遷移ゾーン４１９ａの近位部分４１５ａに対する、カニューレ遠位部分４２７ａにおける出口の位置も、流体が出口から画像キャプチャ部位へと移動する際の試料液の遷移時間を推論することができる。例えば、シース液は、近位部分４１５ａにおいて比較的低速を有し、近位部分４１５ａと遠位部分４１６ａとの間の場所では比較的高速を有してもよい。したがって、遠位部分４２７ａにおけるカニューレ出口が近位部分４１５ａに位置付けされている場合、移動距離が長いからだけでなく、カニューレ遠位口を出た後の試料液の初期速度が低速（シース液速度が低速であるため）であることからも、試料液が画像キャプチャ部位に到達するのに、より長い時間を要するであろう。言い換えれば、試料液がフローセルの厚い部分（例えば、近位部分４１５ａの近く）に存在する時間が長いほど、試料が画像キャプチャ部位に到達するまでに要する時間が長くなる。逆に、遠位部分４２７ａにおいてカニューレ出口が近位部分４１５ａに対して遠位（例えば、図４Ａに示すように、近位部分４１５ａと遠位部分４１６ａとの間の中央位置）に位置決めされている場合、移動距離が短いからだけでなく、カニューレ遠位口を出た後の試料液の初期速度が高速（シース液速度が高速であるため）であることからも、試料液が画像キャプチャ部位に到達するのに、より短い時間を要するであろう。本明細書の他の場所で論じるように、シース液は、遷移ゾーン４１９ａを通って流れる際に、ゾーン４１９ａの断面積が狭窄することにより加速される。
【０１８８】
いくつかの実施形態によると、遷移時間が短くなると、画像キャプチャ部位での画像収集により多くの時間を利用できる。例えば、カニューレ先端から撮像領域までの遷移時間の時間が短くなるにつれて、特定の時間により多くの試料を処理することが可能になり、関連して、特定の時間により多くの画像を得ることが可能になる（例えば、１分当たりの画像数）。
【０１８９】
カニューレ遠位部分４２７ａの出口を画像キャプチャ部位４３２ａにより近くに位置決めすることに伴う利点はあるが、出口とキャプチャ部位との間に特定の距離を維持することも望ましい。例えば、図３に示すように撮像デバイスの光学対物レンズ又は前方レンズはフローセル２２の座部５８に位置決めすることができる。カニューレの出口３１が座部５８に近すぎる場合、試料液は、シース液内に注入された後に、画像キャプチャ部位において所望の撮像特性を提供するために十分に安定化されない場合がある。同様に、先細の領域が画像キャプチャデバイス対物レンズを受容する座部５８の位置決めを邪魔しないように、先細の遷移領域２１を視域２３からある距離に維持することが望ましい場合がある。
【０１９０】
引き続き図４Ａを参照すると、試料液注入管４１２ａの下流端部４２７ａは、流路遷移ゾーン４１９ａの近位部分４１５ａの遠位に位置決めすることができる。関連して、試料液注入管４１２ａの下流端部４２７ａは、流路遷移ゾーン４１９ａの遠位部分４１６ａの近位に位置決めすることができる。したがって、いくつかの実施形態によると、試料液を、遷移ゾーン４１９ａ内の位置で、注入カニューレ４１２ａからフローセル内に注入することができる。
【０１９１】
いくつかの実施形態によると、流路サイズ（例えば、流路遷移ゾーン４１９ａにおける）の縮小の対称性は、血液試料中の粒子の位置合わせの失敗を制限する機能がある。例えば、そのような対称性は、血液試料中の赤血球撮像配向の位置合わせの失敗を約２０％未満に制限する効果がある。
【０１９２】
いくつかの実施形態によると、本明細書に開示される方法は、血球数分析中のフラッギング率を試料の３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％又は５％未満にするのに有効である。
【０１９３】
いくつかの実施形態によると、画像キャプチャ部位４３２ａは、約１５０μｍ×１５０μｍ〜４００μｍ×４００μｍの視野４３３ａを有する。場合によっては、画像キャプチャ部位４３２ａは約２７５μｍ×２７５μｍの視野４３３ａを有する。場合によっては、視野は、長さ×幅で定義できる。表面積として表す場合、２７５μｍ×２７５μｍの視野は、７５，６２５μｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態によると、視野は、撮像デバイス対物レンズ及びその倍率によって決定できる。場合によっては、視野は、収集光学素子（例えば、対物レンズ、チューブレンズ、及びカメラ）によって撮像された部分（領域）の範囲に対応し得る。場合によっては、視野は、画像キャプチャ部位における透明な領域の観察ポートよりもはるかに小さい。
【０１９４】
図４Ａ−１及び４Ａ−２は、試料流がカニューレ出口から画像キャプチャ部位まで移動する際の試料流に対するハイドロフォーカシングの効果を示す。図４Ａ−１に示すように、試料流は約１５０μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有することができる。更に、ＰＩＯＡＬシース流は、約６０００μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有することができる。ハイドロフォーカシングの後で、図４Ａ−２に示すように、試料流は約２μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有することができる。更に、ＰＩＯＡＬシース流は、約１５０μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有することができる。一実施形態では、カニューレ出口におけるＰＩＯＡＬシース流の断面積は、画像キャプチャ部位付近の断面積の４０倍の大きさである。
【０１９５】
いくつかの実施形態によると、画像キャプチャ部位におけるフローセルチャンネルの断面を測定することは有用となり得る。これは、図４Ａ−２に示すように、高さＨ（Ｐ）約１５０μｍ及び幅Ｗ（Ｐ）約４０００μｍのＰＩＯＡＬシース流に対応し得る。フローセルを流れる試料とシース液との組み合わせの流れの画像キャプチャ部位における体積流量を測定することも有用となり得る。断面積及び流量が既知の場合、試料とシース液との組み合わせの流れの画像キャプチャ部位における速度を測定することが可能である。
【０１９６】
いくつかの実施形態によると、フローセルを流れる試料とシース液のフローは、平行板断面モデルで近似できる。関連して、試料液流（例えば、図４Ａ−２に示す）の中心の流量は、試料とシース液との組み合わせの流れの平均流量の約１．５倍である。
【０１９７】
いくつかの実施形態によると、カニューレ出口における試料フローの断面積（例えば、図４Ａ−１のＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））は、撮像部位における試料フロー（例えば、図４Ａ−２のＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））の断面積の４０倍である。撮像領域におけるシース液の体積流量は約４５μＬ／秒となり得る。撮像領域における試料液の体積流量は約０．２３２μＬ／秒となり得る。場合によっては、撮像部位におけるシース流と試料流との組み合わせの断面積は６００，０００μｍ２である。場合によっては、撮像部位における平均フロー流速度は７５ｍｍ／秒である。
【０１９８】
この流量又は速度は、鮮明で焦点の合った細胞画像が得られる速度として決定できる。代表的な流量及び速度は、特定の試料フロー流リボン形状又は特性を撮像部位において達成することが観察された２つの試料の流量に基づいて発見された。例えば、約７５ｍｍ／秒（又は２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内）の流量では、細胞は、連続画像に細胞の重複が存在するほど低速で流れず、ゴースト効果（ぼけた画像）が生じるほど高速で流れない。関連して、過度に高い流量を避けることによって、より多くの試薬及び試料を節約することができる。いくつかの実施形態によると、最適又は所望の線速度は、体積フロー（ポンプ速度）又はカニューレの形状のいずれかを変えることによって達成できる。
【０１９９】
画像キャプチャゾーンを通る試料流の速度は、フローセル機能に対する画像キャプチャデバイスの性能にも関係し得る。例えば、試料流の流速が速すぎる場合、試料に含有される粒子の鮮明な画像を得ることが困難な場合がある（例えば、画像キャプチャデバイスのシャッター速度が低速すぎて、ぼけた画像を生じる）。同様に、試料流の流れが低速すぎる場合、画像キャプチャデバイスは同じ粒子の連続画像を得る場合がある（例えば、２回の画像キャプチャで同じ粒子がキャプチャフレーム内に残る）。いくつかの実施形態では、試料リボンの速度は、画像キャプチャ速度に対して調節することができ（例えば、様々なフローセル作動パラメータのいずれかを調節することによって）、その結果、フレームキャプチャ間のフローが最小限となり、高い割合の試料が撮像される。
【０２００】
いくつかの実施形態によると、粒子分析システム及び関連構成要素は、シース液及び流体試料がフローセルを通って流れる際に、シース液は４５μＬ／秒のシース液体積流量で流れることができ、流体試料は、０．２３２μＬ／秒（又は０．２〜０．３５μＬ／秒の範囲内）の流体試料体積流量で流れることができる。場合によっては、シース液流量の試料液流量に対する比は約２００である。場合によっては、シース液流量の試料液流量に対する比は約７０〜２００の範囲内の値を有する。場合によっては、シース液流量の試料液流量に対する比は約１９３である。場合によっては、シース液流量の試料液流量に対する比は約７０である。場合によっては、シース液体積のフローセル内を流れる流体試料体積に対する比は、２５：１〜２５０：１の範囲内とすることができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態によると、シース液及び流体試料がフローセル４２０を通って流れる際に、シース液は撮像領域より前では７５ｍｍ／秒のシース液速度で流れることができ、流体試料は撮像領域より前では１３０ｍｍ／秒の流体試料速度で流れることができるようにシステム及び関連構成要素を構成することができる。場合によっては、シース液体積のフローセル内を流れる流体試料体積に対する比は、１００：１〜２００：１の範囲内とすることができる。
【０２０２】
場合によっては、フローセルは、約５０：１の最小圧縮比率及び約１２５：１の最大圧縮比率を有することができる。場合によっては、最小圧縮比率は約３０：１又は２０：１であることができる。この圧縮比は、図４Ａ−１と図４Ａ−２を比較したときの、フロー流厚さの比Ｈ（Ｓ）：Ｈ（Ｓ）を指す。この圧縮比は、幾何学的圧縮（例えば、図４Ａ−１と図４Ａ−２を比較したときのシース液厚さの比Ｈ（Ｐ）：Ｈ（Ｐ）、これは図４Ａに示すフローセルの狭窄する先細の遷移ゾーン４１９ａの寸法にも概ね相当する）と、流体力学的圧縮（例えば、速度差にも相当する）との組み合わせによって影響を受ける可能性がある。いくつかの実施形態によると、幾何学的圧縮比は約４０：１である。
【０２０３】
遷移ゾーンに対応する流路サイズの縮小部は、近位厚さ若しくは高さを有する近位流路部分、並びに近位厚さ若しくは高さよりも小さい遠位厚さ若しくは高さを有する遠位流路部分によって画定することができる。例えば、図４Ｂの部分図に示すように、流路の遷移ゾーン４１９ｂは、近位部分４１５ｂと遠位部分４１６ｂとの間の長さＬを有することができ、ここで近位部分４１５ｂは近位高さ４１７ｂを有し、遠位部分４１６ｂは遠位高さ４１８ｂを有する。本明細書の他の場所に記載するように、遷移ゾーンの形状又は輪郭は、曲線又は平滑であることができ、例えばＳ曲線又は正接曲線の形状で提供され得る。いくつかの実施形態によると、近位高さ４１７ｂは、約６０００μｍの値を有する。場合によっては、近位高さ４１７ｂは、約３０００μｍ〜約８０００μｍの範囲内の値を有する。いくつかの実施形態によると、遠位高さ４１８ｂは約１５０μｍの値を有する。場合によっては、遠位高さ４１８ｂは、約５０μｍ〜約４００μｍの範囲内の値を有する。
【０２０４】
遷移ゾーン４１９ａの幾何形状は、第１流路境界４０３ｂと流路を二等分する水平面４５１ｂとの間の第１の角度α１、及び第２流路境界４０４ｂと流路を二等分する水平面４５１ｂとの間の第２の角度α２を提供できる。場合によっては、角度α１は約４５度であり、角度α２は約４５度である。場合によっては、角度α１は約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。場合によっては、角度α２は約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの実施形態によると、角度α１及びα２は同じ値を有する。角度α１及びα２は、試料液が、近位部分４１５ｂから遠位部分４１６ｂに移動するときに、層流を維持するか又は試料流の乱流を最小限に抑えるように選択することができ、それが次に水平面４５１ｂに沿った試料内の粒子の位置合わせを強化できる。上で図４Ａを参照して述べたように、遷移ゾーンの遠位及び近位の境界若しくは部分は、折れ曲がる代わりに、曲線又は平滑であってもよい。
【０２０５】
図４Ｋに示すように、フローセル４２０ｋの画像キャプチャ部位４３２ｋを通って流れる試料流リボンＲは、約２μｍの厚さＴを有することができる。場合によっては、試料流リボンの厚さＴは最大で約３μｍであることができる。典型的には、試料流厚さよりも小さい細胞又は粒子は、リボン内に含有される。代表的な赤血球（ＲＢＣ）は、両凹の円板として存在することができ、約６．２μｍ〜約８．２μｍの直径Ｄを有することができる。更に、代表的な赤血球は、約２μｍ〜約２．５μｍの最大厚さＴ１及び約０．８μｍ〜約１μｍの最小厚さＴ２を有することができる。場合によっては、赤血球は最大で約３μｍの厚さを有することができる。代表的なヒト血小板は多様なサイズであることができ、約２μｍの厚さ又は直径を有することもできる。ここで一定の縮尺で示していないが、フローセルは、画像キャプチャ部位において約１５０μｍの値を有する流路厚さＨを画定できる。場合によっては、流路厚さＦは５０μｍ〜４００μｍの値を有する。この流路厚さＦは、図４Ｂに示す遠位部分４６１ｂの遠位高さ４１８ｂにも相当し得る。
【０２０６】
図４Ｋに示すように、試料液流の厚さＴの粒子（赤血球）の厚さに対する比は約１：１である。いくつかの実施形態によると、画像キャプチャ部位における試料液流の厚さＴの粒子の１つのサイズに対する比は、０．２５〜２５の範囲内である。場合によっては、厚さＴは、約０．５μｍ〜約５μｍの範囲内の値を有することができる。シース液と試料液との間の粘度差は、フローセル内のリボン状試料流の所望の位置決めを達成するように選択できる。
【０２０７】
本明細書の他の場所、並びに同時係属米国特許出願公開第＿＿＿＿号に記載のように、試料リボンＲの流体とシース液との間の粘度差は、試料流中の粒子、例えば、赤血球を、流れ方向に沿って位置合わせ又は配向させるように機能できる。そのようにして位置合わせされたとき、図４Ｋに示すように、血球の主表面はカメラの方に向いているので、撮像デバイス又はカメラは赤血球が丸く見えるように赤血球の画像を得ることができる。この方法で、赤血球は、流れに対して低い抵抗を示す位置合わせをとる。したがって、シース液及び試料液の相対的粘度特性は、カメラの方を向く赤血球の割合又は数の増大に貢献し、それ故粒子分析システムの評価能力を高める。
【０２０８】
いくつかの実施形態によると、シース液の粘度特性は、血液試料中の粒子の位置合わせの失敗を制限するように機能する。例えば、粘度差は、血液試料中の赤血球の撮像配向の位置合わせの失敗を約１０％未満に制限する効果がある。即ち、試料中の１００個の赤血球のうち９０個以上の赤血球を、その主表面が撮像デバイスの方を向くように位置合わせできる。対称狭窄遷移ゾーンは、２０％という値を提供できる。いくつかの実施形態によると、シース液は、水の屈折率（即ち、ｎ＝１．３３３０）とほぼ同じ屈折率を有する。場合によっては、シース液は約８９％の含水量を有する。粘度差の結果として観察される位置合わせ効果に加え、位置合わせ効果は、左右対称に先細の遷移ゾーンの結果としても観察される。場合によっては、左右対称の（即ち、対称な）先細の遷移ゾーンは、非対称の先細の遷移ゾーン設計と比較して、粒子の位置合わせ効果が２倍であることが観察される。
【０２０９】
赤血球の効率的位置合わせは、診断の改善に貢献し得る。場合によっては、撮像赤血球の形状を使用して、試料を得た患者が特定の生理学的状態又は疾患を有するか否かを判断できる。例えば、鎌状赤血球症の患者は、異常な形状（即ち、鎌の形）を有する血球を示す。したがって、位置合わせされた赤血球の高品質画像を得ることによって、正確な診断を確実にすることが可能である。赤血球の形状のその他の変異、例えば薄い辺縁領域と大きく扁平な中央領域とを有し、その結果自転車のタイヤの外形を有するように見える赤血球を、この即時位置合わせ技術を用いて効果的に撮像できる。同様に、小さい中央部分と厚い辺縁領域とを有し、その結果トラックのタイヤの外形を有するように見える赤血球を、診断目的で撮像できる。本明細書に開示される改良された撮像技術は、ヘモグロビン含有量、鉄含有量等の他の赤血球特性の評価にも有用である。
【０２１０】
特定の理論に束縛されるものではないが、シース液の粘度と試料液の粘度との間の粘度差は、修正放物線状のプロファイルを生じると考えられ、その際プロファイルは全体的に放物線状であり、加速が増大されたフロー中央領域に相当する中央の隆起を有し、この中央隆起は試料粒子又は粒子内オルガネラの位置合わせに貢献する。いくつかの実施形態によると、シースと試料リボンとの間の速度差及び粘度差は、オルガネラ又は細胞内粒子の位置合わせを増大する剪断力を生じる。シース液の放物線状のプロファイルの代表的な態様は、同時係属米国特許出願公開第＿＿＿＿＿＿＿＿号に記載され、その内容を参照により本明細書に援用する。
【０２１１】
白血球は、一般的に赤血球及び血小板よりも大きい。例えば、代表的な好中球及び好酸球は、約１０μｍ〜約１２μｍの直径を有することができる。代表的な好塩基球は、約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有することができる。代表的なリンパ球（小）は、約７μｍ〜約８μｍの直径を有することができ、代表的なリンパ球（大）は約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有することができる。代表的な単球は、約１２μｍ〜約２０μｍの直径を有することができる。フローセルを通過する際のシース液と流体試料リボンとの間の相互作用を含む粒子分析システムの構成は、図４Ｌに示すように、画像キャプチャ部位４３２ｌを通過する際に白血球を圧縮するように機能できる。したがって、例えば、白血球（ＷＢＣ）の中心部分を試料液リボンＲ内に位置決めすることができ、白血球の辺縁部分をシース液内に位置決めすることができる。したがって、白血球がリボンによってフローセルを通って輸送される際に、白血球の側面はシース液中に延出し得る。上で図４Ｋに関して論じた試料流リボンＲの厚さＴ、及び流路の厚さＦの数値又は範囲は、同様に図４Ｌに当てはまる。
【０２１２】
いくつかの実施形態によると、シース液と試料液との間の粘度差は、白血球等の細胞内に存在するオルガネラ又はその他の細胞内特徴を位置合わせさせるように機能し得る。特定の理論に束縛されるものではないが、シース液と試料液との間の粘度差に関連付けられる剪断力は、細胞内特徴を位置合わせするように白血球に作用し得ると考えられる。場合によっては、シース液と試料液との間の速度差に伴う剪断力は、そのような位置合わせに貢献し得る。これらの位置合わせ効果は、粒子と試料液リボンとの間のサイズ差による影響も受ける場合がある。例えば、粒子の一部が試料液リボンから周囲のシース液内へと延出する場合、粘度差に伴う剪断力は、細胞内特徴の位置合わせに明白な影響を有し得る。
【０２１３】
図４Ｌに示すように、白血球のような細胞の一部は、シース液内へと延出し得る。本発明の実施形態は、細胞がシース液に曝露されたときに、細胞を溶解又は細断しない、又はその他の方法で外部細胞膜の完全性を損なわない、シース液組成物を包含する。シース液中の増粘剤は、細胞膜又は壁が試料液リボンとシース液エンベロープとの間の界面を横切るか又はさもなければ試料液流から出てシース液流内へ延出する際に、細胞の構造（例えば、形状）及び内容物（例えば、核）が無傷のまま残るように、試料液中の細胞の生存能を維持するように機能することができる。
【０２１４】
しばしば、細胞又は粒子が試料液リボン内をフローセルに沿って流れる際に細胞又は粒子に作用する圧縮力が存在する。したがって、細胞は、狭窄遷移ゾーンの結果として圧縮状態にあるか又は圧縮力を受けた状態でありながら、シース液と接触するようになる。シース液の増粘剤は、圧縮された細胞が薄い試料液リボンから現れて、粘稠なシース液に曝露されたときに、少なくとも細胞が画像キャプチャ部位に達するまで、細断又は破壊されないように保護するように機能できる。したがって、シース液の増粘剤組成物は、細胞保護剤として機能することができ、同時に粒子又は粒子内容物の位置合わせも向上する。
【０２１５】
図４Ｋ及び４Ｌを参照すると、場合によっては細胞又は粒子の一部は薄い試料液リボンＲから出て周囲のシース液内へと延出し得る。同時係属米国特許出願公開第＿＿＿＿号に記載のように、シース液は、シース液が細胞又は粒子を破壊又は溶解するのを抑止又は防止する細胞保護剤を含有してもよい。例えば、シース液は、細胞がシース液の化学環境に曝露されたときに細胞壁の構造的完全性を保持する細胞保護剤を含有してもよい。同様に、細胞保護剤は、細胞がフローセルの幾何形状、並びに試料液とシース液との間の速度及び／又は粘度差によって生じる剪断力、を受けたときに、細胞壁の構造的完全性を保持するように機能する場合もある。関連して、保護剤は、試料液とシース液との間の速度差から生じる力から細胞又は粒子を保護することができる。この方法で、細胞は、画像キャプチャ部位に到達したときにその生存性を保持する。
【０２１６】
剪断力は、試料液リボンとシース液エンベロープとの間の界面で大きくなり得る。いくつかの実施形態によると、フローセル流路内のフローは、放物線状の流れプロファイルで特性評価される。いくつかの実施形態によると、十分に大きいサイズの粒子は、そのような粒子が単一の流体相（即ち、シース液エンベロープ内、あるいは代替的に試料液リボン内のいずれか）に完全に包含されている場合でも、いくらかの量の剪断力を受けるであろう。
【０２１７】
場合によっては、シース液の速度は、試料液の速度と異なっていてもよい。例えば、シース液は８０ｍｍ／秒で移動し、試料液は６０ｍｍ／秒で移動してもよい。したがって、場合によっては、試料液は周囲のエンベロープのシース液速度よりも遅い試料液速度で遠位カニューレ口を出る。したがって、シース液は試料液をカニューレの流路に沿って引っ張るように機能することができ、それにより試料液を加速し、試料液リボンの厚さを低減する。試料液リボンは、全体の体積及び質量を維持することから、高速で移動するほど薄くなる。いくつかの実施形態によると、シース液及び試料液のいずれも、画像キャプチャ部位において約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する。
【０２１８】
典型的には、試料液の速度は、試料液がカニューレ出口から画像キャプチャ部位まで移動するにつれて増大する。場合によっては、画像キャプチャ部位における試料液の速度は、カニューレ遠位部分でカニューレ口を出る試料液の速度の４０倍である。いくつかの実施形態によると、試料リボンの断面積の低下は、速度の増大に対して線形である。いくつかの実施形態によると、カニューレ出口におけるシース速度が試料リボン速度よりも高速である場合、撮像領域における最終的な試料リボン速度も増大する。
【０２１９】
シース液は、試料液リボンに対して、及び試料液リボン内の粒子に対して有意な剪断力を加えるように機能することができる。いくつかの力は流れ方向に平行であり、粒子は、流れ方向に垂直な力にも遭遇し得る。しばしば、シース液及び試料液が画像キャプチャ部位又はゾーンに近づく際、シース及び試料液は同一又はほぼ同一の速度で移動する。したがって、シース及び試料液が画像キャプチャ部位を通過する際のシースと試料液との間の境界若しくは界面は、遠位カニューレ出口又は先細の遷移ゾーンにおける境界若しくは界面と比較して、低い剪断力を示す場合がある。例えば、先細の遷移ゾーンにおいて、シース液エンベロープと試料液リボンとの間の境界又は界面は過渡的であることができ、その結果最初は低速で厚い試料リボンが、より高速で薄くなり、試料液中の粒子はより一層位置合わせされるようになる。言い換えれば、剪断力は、先細の遷移ゾーンで顕著であってもよく、画像キャプチャ部位に向かって消失することができる。画像キャプチャ部位における剪断力は、放物線状のプロファイルで表され、先細遷移ゾーンにおける剪断力よりもはるかに小さくなり得る。したがって、細胞又は粒子は、遷移ゾーンを通過するときにより高い剪断力を受け、画像キャプチャ部位を通過するときにより低い剪断力を受け得る。いくつかの実施形態によると、シースと試料液との間の粘度差は、赤血球を位置合わせさせ、それによって焦点を合わせることができる。いくつかの実施形態によると、シースと試料液との間の粘度差は、白血球オルガネラを位置合わせさせ、それによって焦点を合わせることができる。関連して、流れの幾何学的狭窄及びシースと試料液との間の速度差の結果、位置合わせされ合焦される細胞及びオルガネラ構成要素について、改良された撮像結果を得ることができる。
【０２２０】
本明細書の他の場所に記載のように、更に図４Ｋ及び４Ｌを参照して、シース液及び試料液Ｒが流路サイズの縮小部又はフローセルの遷移ゾーンを通って、撮像部位４３２ｋ又は４３２ｌに向って流れる際、シース液粘度と試料液粘度との間の粘度差に関連するシース液と試料液Ｒとの間の相互作用によって生じる粘度ハイドロフォーカシング作用は、流路サイズの縮小部又は遷移ゾーンに関連するシース液と試料液Ｒとの間の相互作用によって生じる幾何学的ハイドロフォーカシング作用と共に、撮像部位４３２ｋ又は４３２ｌにおいて複数の粒子の少なくともいくつかで、目標撮像状態を提供する。
【０２２１】
場合によっては、目標撮像状態は、撮像部位における焦点面Ｆに対する目標配向である。例えば、図４Ｋ−１に示すように、粒子（ＲＢＣ）が、焦点面Ｆからある距離で変位することができる。場合によっては、目標配向は、撮像部位４３２ｋ−１における焦点面Ｆに対する目標粒子配向を伴う。粒子は、血球、例えば、赤血球、白血球、又は血小板であることができる。ここに示すように、撮像部位４３２ｋ−１における流路は、焦点面Ｆと実質的に平行又は共面であるＰ面を画定することができる。場合によっては、粒子の一部は、焦点面Ｆに沿って位置決めされてもよく、更に粒子の中央部分は他の方法で焦点面Ｆからオフセットしていてもよい。場合によっては、目標配向は、撮像部位４３２ｋ−１における焦点面Ｆに対する目標位置を伴う。例えば、目標位置は、粒子の少なくとも一部が焦点面Ｆに沿って配されるような粒子の位置決めを伴ってもよい。場合によっては、目標位置は、粒子と焦点面Ｆとの間の距離が特定の閾値を超えないような粒子の位置決めを伴ってもよい。場合によっては、目標位置は、撮像部位４３２ｋ−１における焦点面Ｆに対する目標粒子位置を伴う。場合によっては、目標位置は、焦点面Ｆから距離Ｄ又はそれ未満の位置であり、ここで距離Ｄは位置公差に相当する。シース液と試料液との間の粘度差は、フローセル内でのリボン試料流の所望の位置決めを達成するように選択できる（例えば、流路面Ｐ及び／又は焦点面Ｆに対する）。場合によっては、粘度差は、位置公差Ｄ以下の目標粒子位置を達成するように選択できる。
【０２２２】
場合によっては、焦点面Ｆは、図４Ｋ−２に示すような厚さ又は被写界深度を有し、粒子（ＲＢＣ）は焦点面厚さに対する目標撮像状態を有する。例えば、粒子の目標位置は焦点面Ｆ内であるか又は少なくとも部分的に焦点面Ｆ内であることができる。場合によっては、高光学解像度撮像デバイス又はカメラは、約７μｍの被写界深度又は焦点面厚さを有することができる。場合によっては、被写界深度又は焦点面厚さは約２μｍ〜約１０μｍの範囲の値を有する。場合によっては、カメラの被写界深度は、画像キャプチャ部位における試料リボン厚さとほぼ同じか等しい。
【０２２３】
場合によっては、目標配向は、撮像部位における焦点面Ｆに対する目標位置合わせを伴うことができる。例えば、目標位置合わせは、粒子によって画定される面が、図４Ｋ−３に示される通りの画像キャプチャ部位４３２ｋ−３における焦点面Ｆに対して一定の角度αを超えないように、焦点面Ｆに対して位置合わせされることを指示することができる。場合によっては、目標撮像状態は、試料中の位置合わせを失敗した粒子の数又は割合の制限を伴うことができる。例えば、シース液と試料液Ｒとの間の粘度差は、血液試料中の赤血球撮像配向の位置合わせの失敗を約１０％未満に制限するのに有効となり得る。即ち、試料中の１００個の赤血球のうち９０個以上の赤血球を、その主表面が（図４Ｋ−１及び４Ｋ−２に図示するように）撮像デバイスの方を向くように又は９０個以上の赤血球の位置合わせが流れ方向に実質的に平行な平面から２０度以内となる（例えば、赤血球の位置合わせ角度αが２０度以下となる）ように、位置合わせできる。本明細書の他の場所で論じるように、場合によっては、ＲＢＣのような非球形粒子の少なくとも９２％を、流れ方向に実質的に平行な平面内で位置合わせできる。場合によっては、ＲＢＣのような非球形粒子の少なくとも７５％〜９５％を実質的に位置合わせすること、即ち、流れ方向に実質的に平行な平面から２０度以内で位置合わせすること（例えば、位置合わせ角度αは２０度以下）ができる。いくつかの実施形態によると、特定の粒子（例えば、赤血球及び／又は血小板）の９０％以上を、撮像デバイスの撮像軸を横断して配向することができる。
【０２２４】
場合によっては、本発明の実施形態は、本明細書に記載のように血液検査システムに使用するための組成物、例えば、シース液又は粒子及び細胞内オルガネラ位置合わせ液（ＰＩＯＡＬ）を包含する。このようなシース液又はＰＩＯＡＬは、粘度と幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング光学分析器での使用に好適である。ＰＩＯＡＬは、所与の粘度の血液試料液の流れを、光学分析器の狭窄するフローセル遷移ゾーンを通るように方向付け又は容易にするよう機能できる。ＰＩＯＡＬは、試料の粘度よりも高い粘度を有する流体を包含できる。粘度差に関連するＰＩＯＡＬ流体と試料液との間の相互作用によって生じる粘度ハイドロフォーカシング効果は、狭窄するフローセル遷移ゾーンに関連するＰＩＯＡＬ流体と試料液との間の相互作用によって生じる幾何学的ハイドロフォーカシング効果と組み合わせて、血液試料中の細胞の生存能を維持しながら光学分析器の撮像部位において複数の粒子の少なくともいくつかに目標撮像状態を提供するのに有効となり得る。
【０２２５】
図４Ｍは、葉（ｌｏｂｅｓ）４１０ｍのような内部オルガネラを有する代表的な好中球４００ｍ（白血球の一種）を示す。試料液とシース液との間の粘度差の結果、図４Ｎに示すように、内部オルガネラは細胞内で位置合わせできる。したがって、細胞内オルガネラは、オルガネラが互いに重なることなく、画像キャプチャデバイス４３０ｍで有効に撮像することができる。即ち、画像キャプチャデバイスの撮像軸又は光軸から見たときに、図４Ｍに示すように葉（ｌｏｂｅｓ）が互いに積み重なるのではなく、図４Ｎに示すように葉（ｌｏｂｅｓ）が位置合わせされて隣り合う。したがって、キャプチャされた画像において、葉（ｌｏｂｅｓ）をより有効に視覚化できる。この内部オルガネラの位置合わせは、試料とシース液との間の粘度差の驚くべき、かつ予想外の結果である。したがって、細胞位置合わせ及び合焦に対応する改良された撮像結果は、粘度差、流体力学的フロー、及び幾何学的圧縮の特徴を用いて達成される。
【０２２６】
本明細書の他の場所に記載のように、更に図４Ｍ及び４Ｎを参照して、シース液及び試料液Ｒがフローセルの流路サイズの縮小部又は遷移ゾーンを通って、画像キャプチャデバイス４３０ｍ又は４３０ｎの撮像部位に向って流れる際、シース液粘度と試料液粘度との間の粘度差に関連するシース液と試料液Ｒとの間の相互作用によって生じる粘度ハイドロフォーカシング作用は、流路サイズの縮小部又は遷移ゾーンに関連するシース液と試料液Ｒとの間の相互作用によって生じる幾何学的ハイドロフォーカシング効果と共に、撮像部位において、複数の粒子の少なくともいくつかで目標撮像状態を提供する。いくつかの実施形態によると、目標撮像状態は撮像状態の分布に相当する。
【０２２７】
場合によっては、目標撮像状態は、撮像部位における焦点面に対する目標粒子内構造配向（例えば、位置合わせ及び／又は位置）を伴い得る。例えば、図４Ｎに示すように、内部構造４１０ｍ（例えば、細胞内構造、オルガネラ、葉等）は、焦点面Ｆに対して配向できる。場合によっては、目標位置合わせは、図４Ｋ−３に示す粒子位置合わせ関係に類似した、撮像部位における焦点面Ｆに対する目標粒子内構造位置合わせを伴う。場合によっては、目標位置は、図４Ｋ−１に示す粒子位置関係に類似した、撮像部位における焦点面に対する目標粒子内構造位置を伴う。場合によっては、粒子内構造の目標配向は、焦点面に対する目標位置合わせ及び焦点面に対する目標位置の両方を包含できる。場合によっては、目標撮像状態は、撮像部位における目標変形を伴い得る。例えば、図４Ｎに示すように、粒子４００ｍは、図４Ｍに示す粒子形状と比較して、圧縮された形状を有する。したがって、フローセルの作用は、粒子形状に横方向への圧縮効果を生じ得ることがわかる。関連して、粒子内特徴は、粒子自体の形状が圧縮されたときに、位置的又は方向的に配向する（例えば、焦点面Ｆ及び／又はリボンフロー面に対して位置合わせする）ことができる。いくつかの実施形態によると、シースと試料液との間の速度差は、フロー流内に摩擦を生じることができ、シースと試料液との間の粘度差は、その流体力学的摩擦を増幅できる。
【０２２８】
種々の血液学又は血液粒子分析技術の任意のものを、フローセルを通って流れる試料液の画像を用いて実施できる。しばしば、画像解析は、特定の細胞又は粒子パラメータの決定、又は特定の細胞若しくは粒子の特徴の測定、検出、又は評価を伴うことができる。例えば、画像解析は、細胞又は粒子のサイズ、細胞核の特徴、細胞質の特徴、細胞内オルガネラの特徴等を評価する工程を伴うことができる。関連して、分析技術は、白血球（ＷＢＣ）分画を含む、特定の計数又は分類方法又は診断試験を包含できる。場合によっては、フローセルを用いて得た画像は、ＷＢＣ５分画試験を支援できる。場合によっては、フローセルを用いて得た画像は、ＷＢＣ９分画試験を支援できる。関連して、図４を参照すると、プロセッサ４４０は、プロセッサで実行したときに、システム４００が画像キャプチャデバイスから得た画像に基づいて異なる種類の細胞を区別するように構成されたコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を包含するか、該記憶媒体と連動することができる。例えば、診断又は試験技術を用いて、様々な細胞（例えば、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球）を区別することができる。
【０２２９】
方法
図５は、本発明の実施形態による、血液試料中の粒子を撮像するための代表的な方法５００の態様を示す。方法５００は、工程５１０に示すように、フローセルの流路に血液試料を注入する工程を包含できる。この方法は、工程５２０に示すように、フローセルに対して固定位置を有する撮像目標を撮像することによって画像キャプチャデバイスの焦点を合わせる工程を包含できる。更に、この方法は、工程５３０に示すように、粒子の合焦画像を取得する工程を包含してもよい。合焦画像は、画像キャプチャデバイスを用いたフロー流内での粒子の特性評価及び計数に好適となり得、この画像キャプチャデバイスは、変位距離を用いて試料フロー流に合焦する。
【０２３０】
図６は、血液試料中の粒子を撮像するための代表的方法の態様を示す。ここに示すように、方法６００は、工程６１０に示すように、フローセルの流路に沿ってシース液を流す工程と、工程６２０に示すように、流体試料が試料フロー流内を流れるように、フローセル内のシース液流に流体試料を注入する工程と、工程６３０に示すように、フローセルに関連する温度が第１温度にある時に、画像キャプチャデバイスの焦点をフロー流に合わせて第１合焦状態にする工程と、工程６４０に示すように、第１焦点工程において、フロー流内の粒子の第１のサブセットの第１の合焦画像を画像キャプチャデバイスで取得する工程と、工程６５０に示すように、フローセルに関連する温度が第１温度から第２温度に変化したことを判断する工程と、工程６６０に示すように、温度の変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係に応じて画像キャプチャデバイスを第１合焦状態から第２合焦状態に自動的に調節する工程と、工程６７０に示すように、第２焦点工程において、フロー流内の粒子の第２のサブセットの第２の合焦画像を画像キャプチャデバイスで取得する工程と、を包含することができる。
【０２３１】
剪断歪み速度
図７及び８は、本発明の実施形態によるフローセル内の特定のフロー条件についての剪断歪み速度の値の態様を示す。上記の図のそれぞれにおいて、３０％グリセロールシース液を使用する。場合によっては、粘度は、２．４５×１０−３の値を有することができる。剪断応力値は、粘度値に歪み速度の値を乗じることで得られる積と等しくなり得る。図７に関して、試料は０．３μＬ／秒の流量を有することができ、シース液は２１μＬ／秒の流量を有することができる。図８に関して、試料は１μＬ／秒の流量を有することができ、シース液は７０μＬ／秒の流量を有することができる。これらの図のそれぞれにおいて、フローは中央（Ｃ）に向って低い歪み値を示し、辺縁（Ｐ）に向って高い歪み値を示すことがわかる。このような歪み値は、いくつかの実施形態では、非対称なフローセル構成に対応し得る。
【０２３２】
図７に示すように、いくつかの実施形態によると、フロー流の中央（Ｃ）部分の方の低い歪み速度は約５００（１／秒）以下の値を有することができ、フロー流の辺縁（Ｐ）の方の高い歪み速度は、約３０００（１／秒）以上の値を有することができる。図８に示すように、いくつかの実施形態によると、フロー流の中央（Ｃ）部分の方の低い歪み速度は約１０００（１／秒）以下の値を有することができ、フロー流の辺縁（Ｐ）の方の高い歪み速度は、約９０００（１／秒）以上の値を有することができる。
【０２３３】
したがって、より低い試料及びシース液の速度は（例えば、図７）より低い歪み速度に対応し、より高い試料及びシース液の速度（例えば、図８）はより高い歪み速度に対応する。本発明の実施形態は、様々な粘度値、様々な歪み速度値、及び／又は様々な剪断応力値に対応する試料及び／又はシース液の使用を包含することを理解されたい。
【０２３４】
自動合焦目標
図１の参照に戻ると、粒子撮像システムは、フローセル２２に対して固定された自動合焦パターン又は撮像目標４４を包含することができる。自動合焦目標４４は、フローセルを通って流れる血液粒子の合焦画像の達成に使用できる。
【０２３５】
図９Ａは、本発明の実施形態による代表的な自動合焦目標９００を示す。ここに示すように、目標９００は、不透明な環状帯又は絞り９１０と透明な中心又は開口９２０とを包含する。作動中、撮像デバイスは帯９１０に焦点を合わせ、開口を通して画像をキャプチャする。本明細書の他の場所で論じるように、画像キャプチャプロセスは、最初の帯９１０への合焦（又は自動合焦）工程と、その後の開口９２０を通じて画像を取得する前に画像キャプチャデバイスと試料液流との間の距離を調節する工程を伴うことができる。したがって、帯９１０は、画像キャプチャデバイスの自動合焦システムが検出及び合焦できる目標を呈することができ、目標の特定の部分（例えば、辺縁又はセグメント）を画像に含むことができる。場合によっては、目標は中央開口を有するクロム円板として提供できる。代表的な目標は、約０．５ｍｍの直径を有する中央ピンホールを有し、フローセルに接着又は固定される。中央ピンホール又は開口９２０のサイズは、図９Ｂに示すように、不透明な環状帯９１０の４つの辺縁部分９３０のみがキャプチャ画像９４０に見えるように選択できる。したがって、環状帯９１０は、細胞画像のキャプチャを邪魔しない（例えば、光は、試料粒子を照明するように開口９２０を通過することができ、視野は環状帯によって実質的に妨げられない）。この方法で、帯９１０は、画像の角のみに現れる。
【０２３６】
図１０は、本発明の実施形態による代表的な自動合焦又は撮像目標１０００の態様を示す。目標１０００は、帯若しくは境界１０１０及び中央開口１０２０を包含する。帯又は絞り１０１０は不透明であることができ、開口１０２０は透明であることができる。図１１は、本発明の実施形態による別の代表的な自動合焦目標１１００を示す。目標１１００は、帯若しくは境界１１１０及び中央開口１１２０を包含する。帯又は絞り１１１０は不透明であることができ、開口１１２０は透明であることができる。いくつかの実施形態によると、自動合焦目標１１００は、上下に黒色の５０ピクセルを有する画像を提供する。場合によっては、自動合焦目標１１００は、約６５．３μｍのフローセル焦点オフセット（ＦＣＦＯ）を提供する。
【０２３７】
図１２Ａは、本発明の実施形態による代表的な自動合焦目標１２００を示す。目標１２００はレターボックス設計として呈示され、第１又は上方境界１２１０と第２又は下方境界１２２０とを包含する。目標１２００は、第１境界と第２境界との間に開口又は透明流路１２３０も包含する。いくつかの実施形態によると、目標は約４ｍｍの直径を有し、レターボックスの高さは２６５μｍである。場合によっては、上下の境界は、半円として存在することができ、酸化クロム等のような溶着金属又はその他の不透明材料で作製できる。
【０２３８】
図１２Ｂは、自動合焦目標１２００の中央部の拡大図を示す。ここに示すように、第１の境界１２１０は、中央をゼロ値とするマイナス／プラスの数値目盛を包含する。第２の境界１２２０は、同様の目盛を包含する。場合によっては、目盛の増分は１００μｍである。いくつかの実施形態によると、目盛を使用して、撮像デバイス又はカメラの視野の中心が試料流上に来るようにフローセルを位置決めすることが容易になり得る。ここに示すように、試料流１２４０は第１及び第２の境界の目盛に垂直な方向に流れる。合焦プロトコルの一部として、画像キャプチャデバイスは、境界１２１０、１２２０上に存在する数字若しくはその他の文字又は撮像可能対象に焦点を合わせるように機能できる。
【０２３９】
本発明の実施形態は、粒子分析システムの使用に関連する熱ドリフトに対処する技術を包含し、そうでなければそのような熱的作用が撮像デバイスで得た画像の品質を損なう可能性がある。図１３Ａは、熱センサ１３７０、反射体１３８０、及び自動合焦目標１３４４を有するフローセル１３２０の部分的側面図を示す。粒子分析システムの作動中、熱的作用により、試料流がゆっくりとドリフトして撮像デバイスの焦点から外れる場合がある。例えば、熱的作用は、ランプから生じる放射熱によるフローセルの熱膨張によって引き起こされ得る。更に、熱的作用は、伝導及び放射加熱によるフローセル及び光学ベンチアセンブリ（ＯＢＡ：ｏｐｔｉｃａｌ  ｂｅｎｃｈ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）の熱膨張によって引き起こされ得る。いくつかの実施形態では、ＯＢＡの特定の構成要素が膨張し、これが焦点誤差に寄与する場合がある。例えば、このような構成要素としては、カメラ２４を保持する金属板、フローセルを保持するか若しくはフローセルに接続する金属板、又はフローセル及びカメラ２４を一緒に保持する金属板が挙げられる。図１３Ｂは、熱センサ１３７０及び自動合焦目標１３４４を有するフローセル１３２０の部分的斜視図を示す。更に、図１３Ｃは、熱センサ１３７０、反射体１３８０、及び自動合焦目標１３４４を有するフローセル１３２０の別の斜視図を示す。
【０２４０】
図１３Ｂは、熱センサ１３７０及び自動合焦又は撮像目標１３４４を有するフローセル１３２０の部分的斜視図を示す。本発明のいくつかの実施形態によると、画像キャプチャデバイスは、分析器に関連付けられた熱センサによって感知された温度を用いて試料フロー流に焦点を合わせることができる。例えば、温度は、試料液温度、シース液温度、フローセル温度、又は画像キャプチャデバイス温度に相当し得る。場合によっては、温度は、フローセルの撮像部位における温度である。場合によっては、温度は、撮像部位の下流位置における温度である。場合によっては、温度は、撮像部位の上流位置における温度である。本発明のいくつかの実施形態によると、画像キャプチャデバイスは、分析器に関連する温度の変化率を用いて試料フロー流に合焦することができる。例えば、温度変化率は、試料液温度変化率、シース液温度変化率、フローセル温度変化率、又は画像キャプチャデバイス温度変化率に相当する。
【０２４１】
図１３Ｃは、熱センサ１３７０、反射体１３８０、及び自動合焦又は撮像目標１３４４を有するフローセル１３２０の別の斜視図を示す。反射体１３８０は、フローセル１３２０に吸収される熱の量を低減又は制限するように機能できる。例えば、反射体１３８０は、図１３Ａに示すように、フラッシュランプ１３４２によって放射される熱を遮ることができる。したがって、反射体１３８０は、ランプの熱影響を最小限に抑えることができる。反射体１３４２は、ランプによって生じる。グレア及び光散乱を低減し、その結果、画像品質の改善をもたらす。熱センサ１３７０は、流体フローチャンネルの近くで画像キャプチャ部位に隣接して配置され、その結果正確な温度読取値を得ることができる。温度センサからの情報を使用して、画像キャプチャデバイスの焦点を試料液リボン流に合わせることができる。本明細書に開示する例示的な自動合焦技術は、分析器の特定の要素内で発生する温度変動に基づくことができる。
【０２４２】
いくつかの実施形態によると、血液試料の粒子を撮像する方法は、シース液をフローセルの流路に沿って流す工程と、血液試料が試料フロー流内をフロー流厚さよりも大きなフロー流幅で流れるように血液試料をフローセル内のシース液流に注入する工程とを包含してもよく、その結果フローセルは関連する温度を有する。更に、方法は、フローセルに関連する温度が第１温度にある間に画像キャプチャデバイスの焦点を、撮像軸に沿ってフロー流に合わせて第１合焦状態にする工程と、第１合焦状態においてフロー流内の粒子の第１サブセットの第１合焦画像を画像キャプチャデバイスで取得する工程を包含してもよい。更に、方法は、フローセルに関連する温度が第１温度から第２温度に変化したことを判断する工程と、この温度変化、及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係に応じて、画像キャプチャデバイスの焦点を第１合焦状態から第２合焦状態へ自動的に調節する工程とを包含してもよい。更にまた、方法は、フロー流内の粒子の第２サブセットの第２合焦画像を第２合焦状態における画像キャプチャデバイスで取得する工程も包含してもよい。
【０２４３】
場合によっては、画像キャプチャデバイスの焦点を調節する方法は、温度変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係を用いて、画像キャプチャデバイスとフローセルとの間の距離を調節する工程を包含する。場合によっては、画像キャプチャデバイスの焦点を調節する方法は、温度変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係を用いて、画像キャプチャデバイスの焦点距離を調節する工程を包含する。
【０２４４】
合焦画像
図１４Ａ及び１４Ｂは、本発明の実施形態による撮像システム及び方法の態様を例示する側面断面図を提供する。図１４Ａを参照すると、血液分析器のような粒子分析システム１４００ａは、例えば、同時係属米国特許出願第＿＿＿＿＿号に記載されているようなフローセル及び粘性シース液技術を用いて、粘度及び幾何学を組み合わせたハイドロフォーカシング用に構成することができ、この出願の内容を参照により本明細書に援用する。粒子分析システムを用いて血液試料中の粒子を撮像するための代表的な方法は、粒子分析システムのフローセル１４３０ａの流路１４２０ａに沿ってシース液１４１０ａを流す工程を包含できる。流路１４２０ａは、少なくとも部分的に、フローセルの対向するフローセル壁１４２２ａ、１４２４ａによって画定される。シース液１４１０ａは、血液試料の粘度と異なる粘度を有することができる。撮像方法は、更に、血液試料が試料フロー流１４４０ａ内を流れるよう、フローセル１４３０ａ内のシース液流１４１０ａに血液試料を注入する工程を包含できる。試料フロー流１４４０ａは、フロー流厚さよりも大きなフロー流幅を有することができる。試料フロー流１４４０ａはまた、流路サイズの縮小部を通過し、撮像軸１４５０ａを横切ることができる。図１４Ａにおいて、フローの方向は、左から右である。
【０２４５】
更に、撮像方法は、フローセル１４３０ａに対して固定した位置を有する撮像目標１４７０ａを撮像することによって画像キャプチャデバイス１４６０ａの焦点を合わせる工程を包含できる。例えば、ここに図示するように、撮像目標１４７０ａは、フローセルの照明窓１４８０ａに対して固定された位置を有することができる。場合によっては、撮像目標１４７０ａは、窓１４８０ａ内に埋め込むか窓上に固定することができる。方法は、試料液の粒子（例えば、粒子１４９０ａ、少なくとも部分的にフロー流１４４０ａに配置される）の合焦画像を画像キャプチャデバイス１４６０ａで取得する工程も包含できる。合焦画像は、粒子の特性評価及び計数に好適である。
【０２４６】
画像キャプチャデバイス１４６０ａは、変位距離を用いて試料フロー流１４４０ａに合焦することができる。例えば、変位距離は、試料フロー流１４４０ａと撮像目標１４７０ａとの間の距離Ｄに対応し得る。シース液１４１０ａと血液試料との間の粘度差は、流路サイズの縮小部と組み合わせて、血液試料中の細胞の生存能を維持しながら撮像軸１４５０ａにおいて試料フロー流１４４０ａ中の試料液にハイドロフォーカシングするのに有効である。例えば、粘度差に関連するシース液１４１０ａと試料液流１４４０ａとの間の相互作用によって生じる粘度ハイドロフォーカシング効果は、流路サイズの縮小部に伴うシース液１４１０ａと試料液流１４４０ａとの間の相互作用によって生じる幾何学的ハイドロフォーカシング効果と組み合わせて、撮像軸１４５０ａにおいて流体試料粒子の少なくともいくつかに目標撮像状態を提供するのに有効であり、同時に、シース液１４１０ａ中の増粘剤は、細胞が試料液流１４４０ａからシース液流１４１０ａ内へと延出するときに、試料液流１４４０ａ中の細胞の生存能を維持し、細胞の構造及び内容物を無傷のまま残す。
【０２４７】
画像キャプチャデバイス１４６０ａは、変位距離を用いて試料フロー流１４４０ａに焦点を合わせることから、画像キャプチャデバイス１４６０ａは、試料フロー流１４４０ａ内の粒子又は細胞の画像を撮像軸１４５０ａにおいて、又は撮像軸１４５０ａに関連する画像キャプチャ部位において、得ることができる。場合によっては、粒子を、照明光源又はランプ１４２６ａで照明することができる。試料フロー流１４４０ａの画像は、粒子が撮像軸１４５０ａに近づくとき、粒子が撮像軸１４５０ａを横切るとき、及び／又は粒子が撮像軸１４５０ａから流れ去るときに得ることができる。
【０２４８】
図１４Ｂは、撮像目標１４７０ｂはフローセル１４３０ｂの観察窓１４８２ｂに対して固定した位置を有する、代替フローセル構成の態様を示す。例えば、撮像目標１４７０ｂは、窓１４８２ｂに埋め込むか窓上に固定することができる。ここに示すように、撮像方法は、フローセル１４３０ｂに対して固定した位置を有する撮像目標１４７０ｂを撮像することによって画像キャプチャデバイス１４６０ｂの焦点を合わせる工程を包含できる。更に、画像キャプチャデバイス１４６０ｂは、変位距離を用いて試料フロー流１４４０ｂに焦点を合わせることができる。例えば、変位距離は、試料フロー流１４４０ｂと撮像目標１４７０ｂとの間の距離Ｄに対応し得る。
【０２４９】
図１４Ｃは、自動合焦又は撮像目標の様々な代替位置を例示する、フローセル１４３０ｃの断面端面図を示す。例えば、撮像目標１４７２ｃは、フローセル１４３０ｃの観察窓１４８２ｃに配置できる。任意選択的に、撮像目標１４７４ｃは、フローセル１４３０ｃの照明窓１４８０ｃに配置できる。更に任意選択的に、撮像目標１４７６ｃは、側方のフローセルの壁（例えば、１４３２ｃ及び／又は１４３４ｃ）に配置できる。画像キャプチャデバイス１４６０ｃは、変位距離を用いて、シース液１４１０ｃに包囲された試料フロー流１４４０ｃに焦点を合わせることができる。いくつかの実施形態では、変位距離は、試料フロー流１４４０ｃ（又はフロー流１４４０ｃによって画定される中央面１４４１ｃ）と観察窓撮像目標１４７２ｃとの間の撮像軸１４５０ｃに沿った距離Ｄ１に対応するか距離Ｄ１によって画定され得る。いくつかの実施形態では、変位距離は、試料フロー流１４４０ａ（又は中央面１４４１ｃ）と照明窓撮像目標１４７６ｃとの間の撮像軸に沿った距離Ｄ２に対応するか距離Ｄ２によって画定され得る。いくつかの実施形態では、変位距離は、試料フロー流１４４０ａ（又は中央面１４４１ｃ）とフローセル側壁撮像目標１４７４ｃとの間の撮像軸に沿った距離Ｄ３に対応するか距離Ｄ３によって画定され得る。場合によっては、距離Ｄ３はゼロよりも大きい値を有する。場合によっては、距離Ｄ３はゼロの値を有する。即ち、試料フロー流１４４０ａ（又は中央面１４４１ｃ）は撮像目標１４７４ｃと共面である。場合によっては、距離Ｄ１、距離Ｄ２、又は距離Ｄ３に基づいて計算されない変位距離を定義することができる。例えば、変位距離は、フローセル又は血液分析器製造業者によって提供される所定の数又は値であってもよい。
【０２５０】
いくつかの実施形態によると、試料フロー流１４４０ｃは、撮像軸において約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の厚さＴ１を有する。場合によっては、流路又はシース液１４１０ｃは、撮像軸において約１５０μｍの厚さＴ２を有する。ここに示すように、撮像目標１４７２ｃは、試料フロー流１４４０ｃと画像キャプチャデバイス１４６０ｃとの間に配置された観察窓１４８２ｃ上に配置できる。場合によっては、撮像目標（例えば、１４７４ｃ）は、照明窓１４８０ｃと観察窓１４８２ｃとの間に配置できる。本明細書の他の場所で論じるように、合焦画像を取得する方法は、画像キャプチャデバイス１４６０ｃとフローセル１４３０ｃとの間の距離を変位距離を用いて調節する工程を包含できる。場合によっては、本明細書の他の場所で論じるように、合焦画像を取得する方法は、画像キャプチャデバイス１４６０ｃの焦点距離を変位距離を用いて調節する工程を包含できる。場合によっては、合焦画像を取得する方法は、画像キャプチャデバイス１４６０ｃとフローセル１４３０ｃとの間の距離を調節する工程を包含でき、この距離調節の方法は、フローセル１４３０ｃを、例えば、画像キャプチャデバイス１４６０ｃにより近い位置に、又は画像キャプチャデバイス１４６０ｃからより離れた位置に、移動させる工程を包含する。
【０２５１】
図１４Ｄに示すように、画像キャプチャデバイス１４６０ｄの第１焦点距離は、画像キャプチャデバイス１４６０ｄと撮像目標１４７０ｄとの間の距離Ｄ１（例えば、撮像軸１４５０ｄに沿った）に対応することができ、画像キャプチャデバイス１４６０ｄの第２焦点距離は、画像キャプチャデバイス１４６０ｄと試料フロー流１４４０ｄ（又は試料フロー流によって画定される中央面）との間の距離Ｄ２（例えば、撮像軸１４５０ｄに沿った）に対応することができる。場合によっては、撮像目標を、例えば、図１４Ｃに示すようなフローセル内の別の位置に配置してもよい。いくつかの実施形態によると、変位距離は、第１焦点距離（又は距離Ｄ１）と第２焦点距離（又は距離Ｄ２）との間の距離差に対応し得る。画像キャプチャデバイス１４６０ｄは、この変位距離（例えば、Ｄ１とＤ２との間の差）を用いて試料フロー流１４４０ｄに焦点を合わせることができる。
【０２５２】
図１５は、自動合焦パターン（又は撮像目標）の実施形態を示す立面図であり、自動合焦パターンは、例えば、照明開口又は窓上、観察口又は窓上、又は別のフローセル位置に配置できる。高光学解像度撮像デバイスの距離又は位置がリボン状試料流に対して移動したときに、目標がかすむ可能性がある。図９〜１２Ｂに示すように、撮像又は焦点目標（自動合焦パターン）は、試料が現れる視界の領域の辺縁に存在し得る。図１５の参照に戻ると、視野に存在するコントラストをなす図形によっても焦点目標を画定できることがわかる。
【０２５３】
撮像デバイスが自動合焦パターン（目標）（図１５のパネルＢ）に合焦しているとき、デバイスによって撮像される図形は輪郭がはっきりとし、本明細書に記載のように自動合焦のために、即ち、矢じりとして示す線のような図形が、図形と交差する線に沿って位置する隣接ピクセル間で振幅の最高コントラストを作り出すときの、目標と撮像デバイスとの間の距離を探すために使用することが可能である。パネルＢに示す焦点構成は、図１６Ａに示す類似の焦点構成に対応する。図１６Ａに示すように、画像キャプチャデバイスの焦点面は自動合焦目標と整列しており、したがって画像キャプチャデバイスは自動合焦目標の鮮鋭な画像を得る位置にある。
【０２５４】
図１５を参照すると、例えば、対物レンズの作動距離又は対物レンズとその焦点面との間の距離を調節することによって、作動位置（例えば、撮像デバイスの焦点面）が自動合焦パターンから離れた場合（図１５で自動焦点パタ−ンの左と右に表示されたパネルＡ及びＣに表示）、焦点目標の図形の焦点が外れ、高光学解像度撮像デバイスがリボン状試料流に焦点を合わせた位置において、焦点目標の図形はもはやまったく識別できない。（図１５のパネルＤ参照）。パネルＤに示す焦点構成は、図１６Ｂに示す類似の焦点構成に対応し得る。図１６Ｂに示すように、画像キャプチャデバイスの焦点面は試料液流と整列しており、したがって画像キャプチャデバイスは試料フロー流中の粒子の鮮鋭な画像を得る位置にある。図１６Ａの焦点面は、図１６Ｂの焦点面と、距離Ｄだけ離れている。図１６Ｂに示すように、画像キャプチャデバイスを距離Ｄ移動させることによって、焦点面も距離Ｄ移動させることができ、したがって焦点面を自動合焦目標から試料フロー流へ移動させることができる。場合によっては、画像キャプチャデバイスをフローセルに対して固定位置に保ちながら、画像キャプチャデバイスの焦点距離を内部調節することによって、焦点面を自動合焦目標から試料フロー流へ移動することができる。場合によっては、フローセルに対する画像キャプチャデバイスの位置の調節と組み合わせて、画像キャプチャデバイスの焦点距離の内部調節することによって、焦点面を自動合焦目標から試料フロー流へ移動することができる。自動焦点図形は、視界内の、フローセルに対して固定された任意の位置で提供でき、例えば、照明開口部又は窓上、又は高光学解像度撮像デバイスが方向付けされる観察ポート又は窓の前若しくは後、又は目標を撮像すべき位置に保持するためにフォトセルに取り付けされた取付具で提供できる。
【０２５５】
いくつかの実施形態によると、高光学解像度撮像デバイスが変位距離にわたって移動され、自動合焦パターンの焦点が外れた場合、合焦して現れる形状は、自動合焦パターンではなく、血球である。図１５の実施形態では、自動合焦パターンは視野の図形によって規定される。図形は、限られたサイズの比較的薄い個別の形状であり、したがって、変位距離を移動した後、その形状は、リボン状試料流に合焦したときにデジタル画像中に実質的に見えなくなる。代表的な変位距離は、例えば、血液学（血球）撮像用途向けの寸法のフローセルで５０〜１００μｍであってよい。いくつかの実施形態では、自動合焦の特徴は、最適焦点距離の１μｍ以内に高光学解像度撮像デバイスを維持する。
【０２５６】
したがって、図１５に記載の特徴は、変位距離を決定するための代表的な技術を提供する。例えば、変位距離を決定する方法は、フローセル内の試験試料フロー流を形成するために試験流体試料をシース液内へ注入する工程と、画像キャプチャデバイスを用いて撮像目標の第１の合焦画像を得る工程とを伴う自動合焦方法を含んでもよい。第１合焦画像は、図１５のパネルＢに相当し、ここで合焦撮像目標及び画像キャプチャデバイスは第１の焦点距離を画定する。ここに示すように、画像キャプチャデバイスの焦点面又は作動距離／位置が、撮像目標において位置決めされる。自動合焦方法は、試験試料フロー流の第２の合焦画像を、画像キャプチャデバイスを用いて得る工程も包含できる。第２の合焦画像は、図１５のパネルＤに対応でき、ここで合焦試験試料フロー流及び合焦画像キャプチャデバイスは第２の焦点距離を画定する。ここに示すように、画像キャプチャデバイスの焦点面又は作動距離／位置は、撮像目標において位置決めされる。自動合焦方法は、更に、第１焦点距離と第２焦点距離との間の差を計算することによって、変位距離を得る工程も包含してもよい。場合によっては、試験流体試料は血液試料と同じであり、試験試料フロー流は試料フロー流と同じである。場合によっては、自動合焦方法は、画像キャプチャデバイスに関連する焦点面を確立し、この焦点面は、画像キャプチャデバイスに対して静止を保つ。場合によっては、画像キャプチャデバイスの自動合焦の方法は、複数の焦点位置から最適な焦点位置を決定する工程を包含する。
【０２５７】
いくつかの実施形態によると、画像キャプチャデバイスは、温度データを使用することなく、試料フロー流に焦点を合わせることができる。例えば、画像キャプチャデバイスの焦点を試料フロー流に合わせる方法は、画像キャプチャデバイスの温度と無関係に実施できる。場合によっては、撮像目標は、画像キャプチャデバイスを試料フロー流に対して位置決めする際に使用するための目盛（例えば、図１２Ｂに示すような）を包含できる。場合によっては、撮像目標は、撮像軸に対して位置合わせされた絞りを包含することができ、その結果撮像した粒子は絞りによって画定される開口内に配置され、絞りの１つ以上の辺縁部分が自動合焦中に撮像される。
【０２５８】
代表的な実施形態において、自動合焦技術は、フローセルを試料流の最適焦点位置から±１μｍの範囲内に位置決めすることができる。場合によっては、実施形態は別個の合焦液体若しくは溶液又は任意のいかなるユーザーの介入も必要とすることなく、撮像システムを自動的に合焦することができる自動合焦技術を包含する。代表的な自動合焦技術は、撮像デバイス対物レンズとフローセルとの間の距離の変動を引き起こし得るドリフト又は熱膨張のような、合焦性能が最適以下となる機械的原因の理由に対処することもできる。場合によっては、フローセル内の試料フローの位置は、非常に安定で温度に依存しないことが観察された。したがって、代表的な撮像技術は、フローセル中の撮像目標に焦点を合わせる工程と、固定オフセットを使用して試料流への最適な焦点を達成する工程とを伴うことができる。
【０２５９】
いくつかの実施形態によると、撮像システムで使用される顕微鏡対物レンズは０．７５の開口数を有し、その結果、理論的被写界深度（ＤｏＦ）は±０．５μｍとなる。特定の実験的試験において、良好な画像品質は、最適焦点から±１．２５μｍで得られることが観察された。特定の実用的又は実験的被写界深度は、理論的被写界深度とは異なり得ることも観察された。例えば、特定の実験的試験において、被写界深度は約２．５〜３μｍであることが観察された。特定の実験研究に基づき、フローセルを±１．２５μｍに位置決める自動合焦性能により、良好な画像品質が確実に得られると判断した。いくつかの実施形態では、自動合焦システムは、フローセルを試料流の最適焦点位置から±１μｍの範囲内に位置決めするように動作することができる。特定の実験的試験において、本明細書に開示する自動合焦技術は、フローセル中の目標を、０．３μｍ未満の標準偏差で繰返し位置付けできることが観察された。場合によっては、試験的自動合焦システムの作動で、卓越した再現性が実証され（標準偏差≦０．２３μｍ）、試料流の焦点位置を、±１μｍの位置公差内の最適計量位置から＜０．６μｍ以内に決定することができた。様々な温度条件で実施した追加の自動合焦試験作動では、卓越した位置決め性能（例えば、最適焦点位置の要求される±１μｍの公差内でのフローセル位置決め）も示した。自動化分析器システムにおけるこの精度は、本明細書の他の場所に開示するように、標準実験室条件に相当する作動温度範囲にわたって、薄いリボンフロー流内を流れる血液試料から粒子の高品質画像を一貫して確実に得るのに十分に適する。
【０２６０】
本明細書に記載される計算、つまり演算はそれぞれ、ハードウェア、ソフトウェア、及び／又はファームウェアを有するコンピュータ又はその他プロセッサを用いて実行されてよい。様々な方法工程はモジュールによって実行されてよく、モジュールは、本明細書に記載される方法工程を実行するために配置される、任意の広範なデジタル及び／又はアナログデータ処理ハードウェア及び／又はソフトウェアを備えてよい。データ処理ハードウェアを任意に備えるモジュールは、これらに伴って適当な機械プログラミングコードを有することによって、これらの工程のうち１つ以上を実行するのに適しており、２つ以上の工程（又は２つ以上の工程の部分）に対するモジュールは、任意の広範な統合処理及び／又は分散処理アーキテクチャにおいて、単一のプロセッサボードに組み込まれている、又は、異なるプロセッサボードに分かれている。これらの方法及びシステムは、多くの場合、上記方法工程を実行するための命令を伴う、機械読み取り可能なコードを組み込む有形媒体を利用するだろう。好適な有形媒体は、メモリ（揮発性メモリ及び／又は不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープなどへの磁気記録、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなどといった光学式メモリ、又は任意のその他デジタル若しくはアナログ記憶媒体）などを含んでよい。
【０２６１】
本開示で論じた全ての特許、特許公開、特許出願、雑誌論文、書籍、技術文献などは、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６２】
図に描写する又は上述する構成要素の異なる配置が、示していない又は記載していない構成要素及び工程と同様に可能である。同様に、一部の特徴及びサブコンビネーションは有用なものであり、他の特徴及びサブコンビネーションに関係なく使用できる。本発明の実施形態は、限定目的ではなく例示目的で説明しており、本発明の読者には、別の実施形態が明らかになるであろう。特定の場合では、方法工程又は操作が異なる順序で実施、つまり実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると見なされる。したがって、本発明は、上記の、又は図に示した実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び変更がなされてよい。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｋ−１】
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【図４Ｋ−２】
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【図４Ｋ−３】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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