(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん転移を予防または治療するための、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、がん転移抑制活性を有する単離されたペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記がんは、転移がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記転移がんは、すい臓がん、結腸がん、大腸がん、結腸腺がん、直腸腺がん、乳がん、皮膚がん、肺がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、多発性骨髄腫、甲状腺がん、前立腺がん、腺がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、小腸がん、紡錘細胞腫瘍、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）および女性生殖系の悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物は、少なくとも１つの追加の抗がん治療と組み合わされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの追加のがん治療は、血管新生阻害剤、細胞毒性薬、化学療法剤、ホルモン療法、放射線治療および免疫療法からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、局所、関節内、結膜下、経口、鼻腔内および眼球内からなる群から選択される経路で投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
がん細胞の運動性を低下させるための、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、がん細胞の運動性を低下させる活性を有する単離されたペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
転移能を有するがんを有すると診断されたがん患者に投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
がん患者における血管新生を予防または阻害するための、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、血管新生を予防または阻害する活性を有する単離されたペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
がん患者における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを低下させるための、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを低下させる活性を有する単離されたペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
前記単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド。
【請求項１６】
配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に転移がん治療に関する。
【０００２】
先行技術
今回開示する主題の背景として関連があると考えられる参照文献は、以下に列挙される：
［１］Ｆｉｏｒｉｏ Ｐｌａ, Ａ.およびＧｋｉｋａ, Ｄ.  ２０１３年、生理学４（記事３１１）のフロンティア（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ）：１〜１２
［２］Ｂｅｎｏｉｓｔ, Ｓ.ら  ２００６年  Ｊ. Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２４（２４)：３９３９〜３９４５
［３］ＷＯ２００６／０４６２３９
［４］ＷＯ２００７／１２２６２２
［５］ＷＯ２００７／０９１２４０
［６］ＷＯ２００８／０７５３４９
［７］Ｄｉａｚ, Ｖ. Ｍ.ら  ２００４年ＧＵＴ５３：９９３〜１０００
［８］Ｋｕｍａｒ, Ｓ.ら、２００２年  Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ. ２７０ (４６)：２７９０５〜２７９１３
［９］Ｇｉｌｌｉｂｅｒｔ−Ｄｕｐｌａｎｔｉｅｒ, Ｊ.ら  ２０１２年Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３１：３５１６〜３５２４。
【０００３】
本明細書中の上記参照文献の承認は、これらがここに開示される主題の特許性に何らかの関連性を有することを意味するとして推定されるべきではない。
【０００４】
背景
世界保健機関によると、７６０万人が世界中で２００８年にがんで死亡した。がんは、体の何れかの部分に影響を与え得る大きなグループの疾患に関連する一般的な用語であることがよく知られている。がんの一つの決定的な特徴は、それらの通常の境界を越えて成長する異常細胞の急速な生成であり、それは次に体の隣接部分に侵入し、転移として呼ばれる方法で、他の臓器に拡散することができる。
【０００５】
転移は、がんにおける主な死亡原因であり、２つの重要なプロセスに依存する：周辺組織へ侵入するがん細胞の細胞遊走と、その後の血液／リンパ管および腫瘍血管系への脈管内侵入（１）であり、これは、血流へのアクセスを与える。がん転移は、身体でのがんの拡散をもたらし、時には、原発がんを治療するために選択されたアプローチとは異なる治療アプローチを必要とする、複雑な多段階プロセスとして知られている。
【０００６】
例えば、最も一般的ながんの一つである大腸がんにおいて、約５０％の大腸がん患者は、それらの疾患の経過中に、いくつかの時点で、肝転移を発症する（２）。それらの肝転移の外科的切除の候補である患者は、生存期間の延長または治癒さえ期待することができる。残念ながら、１０％〜２５％の患者だけが、肝臓切除術の候補であり、切除不能な転移を有する患者では、化学療法が選択される治療である。
【０００７】
がんの治療に対する完全な応答は、通常、イメージングでの標的病変の消失として定義される。しかしながら、Ｂｅｎｏｉｓｔ, Ｓ.ら（２）によって報告されるように、２５％を超える症例で、肉眼で見える残存疾患が、イメージングに基づいて消失したと考えられた肝転移の部位で外科的診査の間に発見された。また、手術で明らかな疾患が認められない患者において、顕微鏡的腫瘍が、８０％の患者において、最初の肝転移の部位からの切除標本で観察された。最後に、これ以上の腫瘍が観察されない患者において、および完全な応答の部位が所定の場所に残された患者において、１年後にその場での再発が症例の７４％で観察された。
【０００８】
これらのデータは、イメージングで見られる完全な応答は、化学療法の有効性を評価するのに有用な基準であり得るが、ほとんどの場合、がんの治癒を意味するものではないことを示す。また、転移がんの特定のタイプは、慢性疾患として処置され、それによって患者の生命を延長するが、多くのタイプの転移がんは依然として不治であると考えられる。
【０００９】
ヒト胸腺に固有のｃＤＮＡによってコードされる「Ｔ１０１」と呼ばれるペプチドが同定されている。このペプチドは、とりわけ、免疫系の刺激剤としてのその役割を介してがんの治療に関連付けられている（ＷＯ２００６/０４６２３９、３）。ＷＯ２００６／０４６２３９は、Ｔ１０１は、免疫系を刺激することができ、腫瘍の大きさを低減することが可能であることを示し、そのペプチドが、がん細胞の増殖に影響を与えることを示唆している。Ｔ１０１を使用することによるがんの治療はまた、ＷＯ２００７／１２２６２２（４）で示唆され、それは、とりわけ、様々なタイプの腫瘍の発生に対するＴ１０１の効果を示している。ペプチドＴ１０１はまた、免疫学的疾患の治療に関連するＷ２００７／０９１２４０（５）、及びＴ１／ＳＴ２受容体を有する細胞を含む疾患を治療または予防することに関連するＷＯ２００８／０９１２４０（６）に記載されている。
【００１０】
概要
その態様の１つによって、本発明は、がん転移を予防または治療する方法で使用するための、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
そのさらなる態様によって、本発明は、がん細胞の運動性を低下させる方法、がん患者における血管新生を予防または阻害する方法、またはがん患者における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを低下させる方法において使用するための、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
その態様のさらに別の１つによって、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の治療有効量を含む医薬組成物を、それを必要とするがん患者に投与することを含む、がん転移を予防または治療する方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、がん細胞の運動性を低下させ、がん患者において血管新生を予防または阻害し、またはがん患者の血清中でＶＥＧＦのレベルを低下させる方法であって、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の治療有効量を含む医薬組成物を、転移能を有するがんを有すると診断されたがん患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本明細書中で定義される単離されたペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む。
他の実施形態において、本発明の単離されたペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００１５】
さらなる実施形態において、本明細書中で定義される単離されたペプチドは、配列番号３の修飾アミノ酸配列であって、配列番号３のアミノ酸配列を有する非修飾ペプチドと比較して、修飾ペプチドの生物学的特性に重大な影響を与えることなく、１つ以上のアミノ酸残基が、保存的置換によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、本明細書中で定義される単離されたペプチドは、配列番号３の修飾アミノ酸配列であって、１つ以上のアミノ酸残基が、対応するＤ−アミノ酸残基によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む。
【００１７】
さらなる特定の実施形態において、本発明に係る単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
またさらなる実施形態において、本明細書中で定義される単離されたペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００１８】
上記および他の実施形態において、本発明は、転移がんであるがんに関する。
いくつかの実施形態において、転移がんは、すい臓がん、結腸がん、大腸がん、結腸腺がん、直腸腺がん、乳がん、皮膚がん、肺がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、多発性骨髄腫、甲状腺がん、前立腺がん、腺がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、小腸がん、紡錘細胞腫瘍、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）および女性生殖系の悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、少なくとも１つの追加の抗がん治療と共に投与するために適合される。いくつかの実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法はさらに、前記がん患者に少なくとも１つの追加の抗がん治療を投与することを含む。
【００２０】
他の実施形態において、本明細書中で定義されるような少なくとも１つの追加の抗がん治療は、血管新生阻害剤、細胞毒性薬、化学療法剤、ホルモン療法、放射線治療および免疫療法からなる群から選択される。
【００２１】
さらに他の実施の形態において、本発明による使用および方法のための医薬組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、局所、関節内、結膜下、経口、鼻腔内および眼球内からなる群から選択される経路により投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本明細書中に開示される主題をよく理解し、それが実際に実施される得る方法を例示するために、ここで添付図面を参照しながら、非限定的な例のみの方法によって、実施形態を説明する。
【００２３】
【図１】図１は、ＢｒｄＵ取り込みアッセイで分析されたヒト腺がん膵臓がん細胞増殖に対するＮｅｒｏｆｅペプチド（１〜５０μｇ／ｍＬ）の効果を説明するグラフ（上の線）である。下側の棒グラフは、細胞培地に組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）を分泌するヒト腺がん膵臓がん細胞の能力に対するＮｅｒｏｆｅペプチド（１〜５０μｇ／ｍＬ）の効果を示す。略語：ＴＰＡ、組織プラスミノーゲン活性化因子；ＢｒｄＵ、ブロモデオキシウリジン；細胞株１、細胞株２、細胞株３、ヒト腺がん膵臓がん細胞。
【００２４】
【図２】図２は、ＢｒｄＵ取り込みアッセイで分析されたヒト腺がん膵臓がん細胞増殖に対するＮｅｒｏｆｅペプチド（１〜５０μｇ／ｍＬ）の効果を説明するグラフ（上の線）である。下側の棒グラフは、ヒト腺がん膵臓がん細胞のｓＳＴ２の分泌に対するＮｅｒｏｆｅペプチド（１〜５０μｇ／ｍＬ）の効果を示す。略語：ｓＳＴ２、可溶性ＳＴ２；ＢｒｄＵ、ブロモデオキシウリジン；細胞株１、細胞株２、細胞株３、ヒト腺がん膵臓がん細胞。
【００２５】
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、細胞遊走アッセイの開始時（図３Ａおよび図３Ｂ）およびその遊走アッセイが開始された後の２７時間（図３Ｃおよび図３Ｄ）に撮影したヒト腺がん膵臓がん細胞の顕微鏡写真である。細胞は、２５μｇ／ｍＬのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下で（図３Ｂおよび図３Ｄ）またはペプチドなしで（図３Ａおよび図３Ｃ）、アッセイを開始する前の４８時間インキュベートされた。
【００２６】
【図４】図４は、細胞遊走アッセイを開始する前に２５μｇ／ｍＬのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下で４８時間インキュベートされたヒト腺がん膵臓がん細胞を使用して実施された細胞遊走アッセイにおける無細胞領域の割合を示す棒グラフである。２つの独立したアッセイ（Ｔ１およびＴ２）が実施された。４つの独立したアッセイで使用された対照細胞は、ＣＯＮ１、ＣＯＮ１、ＣＯＮ３およびＣＯＮ４によって示される。無細胞領域の割合は、実験が開始された後の１時間で得られた無細胞領域によって、実験が開始された２７時間後に得られた無細胞領域を割ることによって、計算された。
【００２７】
【図５】図５は、示された時点で６ｍｇ／ｍ２（０．１６ｍｇ／ｋｇ体重、破線）または１２ｍｇ／ｍ２（０．３２ｍｇ／ｋｇ体重、実線）でペプチドＮｅｒｏｆｅを投与された患者における血清ＶＥＧＦレベルを説明するグラフである。略語：ｐｔ００２、ｐｔ００４、ｐｔ００７、ｐｔ０１１、結腸がんを有する患者；ｐｔ００５、大腸がんを有する患者；ｐｔ０．０６、紡錘細胞腫瘍を有する患者。
【００２８】
【図６】図６は、示された時点で２４ｍｇ／ｍ２（０．６４ｍｇ／ｋｇ体重、破線）または４８ｍｇ／ｍ２（１．２８ｍｇ／ｋｇ体重、実線）でペプチドＮｅｒｏｆｅを投与された患者における血清ＶＥＧＦレベルを説明するグラフである。略語：ｐｔ０１２、膵臓がんを有する患者；ｐｔ０．０１３、小腸がんを有する患者；ｐｔ０１５、非小細胞肺がんを有する患者；ｐｔ０１６、肝臓がんを有する患者；ｐｔ０１７、結腸腺がんを有する患者；ｐｔ０．０１９、直腸腺がんを有する患者。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
実施形態の詳細な説明
本発明は、Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒg Ｌｙｓのアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸残基の全てが、それらのＤの立体配置であるペプチドが、本明細書中で「Ｎｅｒｏｆｅ」と呼ばれ、がん転移に関連するとして知られているタンパク質（すなわち、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）および可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２））のがん細胞による分泌を低下したという観察に基づく。このペプチドは、直接、インビトロでがん細胞の遊走を阻害することが実証された。また、そのペプチドは、がん患者における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の血清レベルを低下させることが示された。
【００３０】
Ｎｅｒｏｆｅペプチドに曝露された際のがん細胞によるＴＰＡおよびｓＳＴ２の分泌の低下、インビトロでのがん細胞の遊走能に対するペプチドの直接的効果、およびがん患者で観察されるＶＥＧＦの血清レベルに対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果に基づいて、本発明は、がん転移の阻害におけるＮｅｒｏｆｅペプチドの方法および使用を提供する。
【００３１】
したがって、その態様の１つにおいて、本発明は、がん転移を予防または治療するための、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本明細書中で定義される用語「ペプチド」は、アミノ酸残基の分子鎖を意味し、それは、必要な場合、例えば、マンノシル化、グルコシル化、アミド化（例えばＣ末端アミド）、カルボキシル化またはリン酸化によって、そのアミノ酸残基の各１つにおいて修飾されることができる。ペプチドは、遺伝子工学的方法、宿主細胞中での発現、または任意の他の適切な手段によって、合成により得ることができる。ペプチドを生成するための方法は、当分野で周知である。
【００３３】
用語「単離された」は、それらの自然環境から取り出され、単離され、または分離された、アミノ酸配列またはペプチドなどの分子を意味する。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「アミノ酸」は、天然に発生するおよび合成のアミノ酸残基、ならびに天然に発生するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体(analogs)およびアミノ酸擬似体(mimetics)を意味する。天然に発生するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。
【００３５】
用語アミノ酸はまた、Ｄ−アミノ酸を含み、それは、炭素αでのキラリティーが反転されたＬ−アミノ酸の鏡像体である。Ｄ−アミノ酸は、プロテアーゼが媒介する分解に対して高い耐性があり、低免疫原性応答を有する。
【００３６】
用語「アミノ酸配列」または「ペプチド配列」はまた、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基が、ペプチドおよびタンパク質における鎖中に存在する順序をいう。その配列は、一般的に、遊離アミノ基を含むＮ末端から遊離カルボキシル基を含むＣ末端へと報告される。
【００３７】
以下に例示するように、本明細書中で「Ｎｅｒｏｆｅ」と呼ばれるペプチドは、Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓの配列を有し、そのアミノ酸残基の全てがそれらのＤの立体配置であり（配列番号４によって示される）、ＴＰＡおよびｓＳＴ２の分泌を低下させ、がん細胞の遊走を直接阻害することが示され、がん転移の阻害におけるその可能性を示唆した。
【００３８】
Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓのアミノ酸配列を有し、そのアミノ酸残基の全てが、Ｌアミノ酸残基であるペプチド（配列番号３によって本明細書中に示される）は、ＷＯ２００３／０４６２３９（３）に記載された「完全Ｔ１０１ペプチド」と呼ばれるペプチドのＣ末端断片である。
【００３９】
完全Ｔ１０１ペプチドは、配列番号１によって本明細書中に示される８４個の長さのアミノ酸配列である。そのＮ末端の３３個のアミノ酸シグナルペプチドの欠失は、配列番号２によって本明細書中に示されるペプチド断片をもたらし、「Ｔ１０１ペプチド」と呼ばれる。Ｔ１０１ペプチドは、５１個のアミノ酸長である。配列番号１および配列番号２、並びに配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を以下の表１に詳述する。
【００４０】
【表１】
0006609556.tif 000002
【００４１】
本発明による単離されたペプチドは、本明細書中で「完全１０１ペプチド」と呼ばれるペプチドの少なくとも連続するＣ末端断片を含み、例えば、これに限定されないが、完全Ｔ１０１ペプチドのＣ末端の１４個のアミノ酸残基である配列番号３により示されるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、本発明による単離されたペプチドは、完全Ｔ１０１ペプチド（配列番号１により示される）のＣ末端からの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３または８４個のアミノ酸残基を含む完全Ｔ１０１ペプチドの連続するＣ末端断片を含む。
【００４３】
具体的には、本発明による用語「単離されたペプチド」は、配列番号３によって示されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチド、またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体に関する。いくつかの実施形態において、本発明による単離されたペプチドは、以下に定義される完全Ｔ１０１ペプチド（配列番号１を有する）またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体である。他の実施形態において、本発明による単離されたペプチドは、Ｎ末端の３３個のアミノ酸を欠く胸腺ペプチドＴ１０１（配列番号２を有する）またはその単離ペプチドの任意の機能的断片および誘導体である。
【００４４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」によって、本発明による単離されたペプチドは、配列番号３または配列番号４によって示されるペプチドを含むことを意味するが、配列番号３または配列番号４によって示されるペプチドのＮ末端またはＣ末端に追加のアミノ酸残基を含んでもよく、例えば、限定されないが、本発明による単離されたペプチドは、以下に詳説するように、配列番号１および配列番号２によって示される配列を含んでもよい。
【００４５】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、配列番号３により示されるようなアミノ酸配列Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓを含む単離されたペプチド、またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体に関する。
【００４６】
他の実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体である。
【００４７】
さらなる実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるか、またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体である。
【００４８】
さらに別の実施の形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００４９】
本明細書中で定義されるような単離されたペプチドの誘導体および修飾ペプチドはまた、本発明によって包含される。用語「修飾された」、「誘導体」または「単離されたペプチドの誘導体」は、配列全体において、１以上のアミノ酸が異なる、すなわち欠失、置換（例えば、保存的置換による別のアミノ酸での少なくとも１つのアミノ酸の置換）、逆位または追加を有するペプチドを含むことを意味する。この用語はまた、配列全体において、それぞれのＤアミノ酸残基による少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を包含する。
【００５０】
例えば、ペプチドＮｅｒｏｆｅ（配列番号４によって示される）は、配列番号３のアミノ酸配列において、全てのアミノ酸残基が、それらの対応するＤアミノ酸によって置換されているアミノ酸配列を有する。
【００５１】
アミノ酸「置換」は、類似する構造的および／または化学的特性、すなわち、保存的アミノ酸置換を有する別のアミノ酸で１つのアミノ酸を置換する結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいてすることができる。例えば、以下の８つのグループのそれぞれは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【００５２】
本明細書中で定義されるようなペプチドの断片はまた、本発明に含まれる。用語「断片」は、本発明によるペプチドからの少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失によって得られる、本発明による単離されたペプチドよりも短い少なくとも１つアミノ酸である任意のペプチドを意味する。
【００５３】
具体的には、完全Ｔ１０１ペプチド（配列番号１により示される）を含む本発明による単離されたペプチドの断片は、完全Ｔ１０１ペプチドのＣ末端からの少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３個または８４個のアミノ残基の断片であり得る。
【００５４】
本発明によって含まれる単離されたペプチドの特定の修飾ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の修飾アミノ酸配列であって、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を有する非修飾ペプチドと比較して、修飾ペプチドの生物学的特性に重大な影響を与えることなく、１つ以上のアミノ酸残基が保存的置換によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む単離されたペプチドである。
【００５５】
いくつかの実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の修飾アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の対応する配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に１００％の同一性を有する。
【００５６】
本発明によるペプチド誘導体はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列含む任意の融合タンパク質またはコンジュゲート、ならびに追加の薬剤（例えば、安定化剤、血管新生阻害剤、細胞毒性薬等）にその残基の少なくとも１つを介して結合されている本明細書中で定義される任意の単離されたペプチドを含む。
【００５７】
修飾された断片もまた、本発明により意図される。例えば、修飾された断片は、完全Ｔ１０１ペプチドのＣ末端からの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個または少なくとも８０個のアミノ酸残基の連続配列を含むペプチドであり、これはその完全Ｔ１０１ペプチドに含まれる少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個または少なくとも８０個の対応する配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも１００％の同一性の程度を有するものであり得る。
【００５８】
これらのペプチド断片または誘導体は、元のペプチドの生物学的活性を変化させてはならないことを理解されたい。用語「機能的な」または「非修飾ペプチドと比較した際、修飾ペプチドの生物学的特性に重大な影響を与えることなく」は、修飾ペプチドは、非修飾ペプチドの生物学的活性に定性的に類似する生物学的活性を維持することを示すことを意味する。
【００５９】
本発明の単離されたペプチドに言及する場合、用語「生物学的特性」は、がん細胞の遊走の阻害、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の分泌レベルの低下、がん細胞における可溶性ＳＴ２の分泌レベルの低下およびＶＥＧＦの分泌レベルの低下を包含する。
【００６０】
ペプチドが非修飾ペプチドの生物学的特性に定性的に類似するその生物学的特性を維持するかどうかを決定するために、例えば、修飾ペプチドが並行してアッセイされる対応する非修飾ペプチドと比較されるインビトロ、インビボまたは臨床試験；または修飾ペプチドが、それが別々に実施される実験から知られるようにして、非修飾ペプチドの生物学的効果に類似する生物学的効果を有するかどうかを試験するためにアッセイされる実験など、１つ以上のアッセイを実施することができる。そのような実験は、例えば、以下の実施例で記載される方法で実施できる。
【００６１】
いくつかの特定の実施形態において、本発明は、機能的断片、誘導体または修飾ペプチドであって、本発明の非修飾の単離されたペプチドのアミノ酸配列、つまり、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列の１つと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％と同一であるアミノ酸配列を有する機能的断片、誘導体または修飾ペプチドに関連する。
【００６２】
他の実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドが配列番号３または配列番号４の修飾アミノ酸配列であって、それぞれ配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有する非修飾ペプチドと比較して、修飾ペプチドの生物学的特性に重大な影響を与えることなく、１つ以上のアミノ酸残基が保存的置換によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む。
【００６３】
さらなる実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドは、配列番号３または配列番号４の修飾アミノ酸配列であって、それぞれ配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有する非修飾ペプチドと比較して修飾ペプチドの生物学的特性に重大な影響を与えることなく、１つ以上のアミノ酸残基が保存的置換によって置換されており、それぞれ配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有する非修飾ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％と同一である修飾アミノ酸配列を含む。
【００６４】
またさらなる実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドは、配列番号３の修飾アミノ酸配列であって、１つ以上のアミノ酸残基が、対応するＤ−アミノ酸残基によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む。
【００６５】
またさらなる実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
またさらなる実施形態において、本発明による使用のための医薬組成物は、単離されたペプチドは配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００６７】
以下に例示するように、本明細書中で「Ｎｅｒｏｆｅ」と呼ばれるペプチドは、膵臓がん細胞および乳がん細胞において細胞の運動性または遊走性を直接阻害することが示された。体内でそれらの元の場所から異なる場所に移動するがん細胞の能力は、がん転移における基本的なステップの１つである。
【００６８】
本明細書中で定義される用語「がん転移」は、体内でそれが最初に発生した場所から別の場所または部位にがんが拡散または遊走するプロセスを意味する。用語がん転移はまた、転移がん細胞の元の位置と異なる場所で転移がん細胞によって形成される腫瘍に関する。転移がん細胞によって形成される腫瘍はまた転移性腫瘍と呼ばれる。
【００６９】
がん細胞転移は通常、以下のステップを含む：近隣の正常組織へのがん細胞の局所浸潤；脈管内への侵入、それによりがん細胞は、近くのリンパ管または血管の壁を通って侵入および移動する；身体の他の部分へのリンパ系および血流を介するがん細胞の循環；停止および溢出、それによって、がん細胞は離れた場所で小さい血管に停止し、次いで毛細血管の壁に侵入し、周辺組織に移行する（溢出）；微小転移として知られる小さな腫瘍を形成する離れた場所でのがん細胞の増殖；および血管新生、血液供給を得るための微小転移による新血管の成長の刺激。がん転移の最も一般的な部位は、骨、肝臓、肺および脳である。
【００７０】
本発明は、転移または二次成長を形成しうる任意のがん疾患を含む。
【００７１】
がんのタイプが最終的に転移に発展するだろうことを予測することは、熟練した医師（例えば、腫瘍学を専門とする医師）よって実施され得る。がんの転移の可能性の予測は、とりわけ、大きさ、深さ、およびリンパ節が含まれるか否かを含む、がんの全体的なステージに基づく。他の指標は、腫瘍悪性度並びに遺伝子およびタンパク質試験でありうる。
【００７２】
がん転移の同定または診断は、例えば、転移がんの徴候でありうる骨の痛み、持続性の咳、および頭痛などの症状の出現を追跡することによって、熟練した医師によって実施され得る。また、転移がんは、血液検査、イメージング（例えば、Ｘ線、陽電子放出断層撮影およびコンピュータ断層撮影（ＰＥＴ／ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、骨スキャン、ＭＲＩおよびＣＴ）などのルーチンのスキャン並びに通常、疑念のある診断を確認するために行われる生検で検出され得る。
【００７３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、「転移がん」として分類されるがん、すなわち、転移能を有するとして当該分野で知られている任意のがんのタイプに関する。
【００７４】
したがって、上記および他の実施形態において、本発明に包含されるがんは、転移がんである。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書中で定義される転移がんは、すい臓がん、結腸がん、大腸がん、結腸腺がん、直腸腺がん、乳がん、皮膚がん、肺がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、多発性骨髄腫、甲状腺がん、前立腺がん、腺がん、頭頸部がん、消化管がん、胃がん、小腸がん、紡錘細胞腫瘍、肝細胞がん（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）および女性生殖系の悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００７６】
添付の実施例で示されるように、ＶＥＧＦの血清レベルは、がん患者が２４ｍｇ／ｍ２または４８ｍｇ／ｍ２（体表面積単位で与えられ、それぞれ、約０．６４または約１．２８ｍｇ／ｋｇ体重に変換する）の用量で、ペプチドＮｅｒｏｆｅを投与された場合、約３０〜４０％低下した。ＶＥＧＦの血清レベルの低下は、特に小腸および直腸腺がんを有するがん患者で顕著であった。
【００７７】
当技術分野で知られるように、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管新生を刺激する細胞によって生産されるシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦの正常な機能は、胚発生の間の新しい血管、損傷後の新しい血管、運動後の筋肉、およびブロックされた血管をバイパスする新しい血管を作成することである。ＶＥＧＦの過剰発現は、疾患に関与し得ることが知られている。固形がんは、適切な血液供給なしに限られた大きさを超えて成長することができないので、ＶＧＥＦを発現することができるがんは、成長し、転移することができる。
【００７８】
ペプチドＮｅｒｏｆｅをがん患者に投与する結果として、ＶＥＧＦの血清レベルで観察される低下は、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの明らかな抗血管新生効果である。
したがって、その態様の別の１つによって、本発明は、がん患者における血管新生の予防または阻害の方法に使用するための本明細書中で定義される単離されたペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００７９】
１つの特定の実施形態において、血管新生は、腫瘍関連血管新生である。別の特定の実施形態において、血管新生は、ＶＥＧＦに関連する。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明は、血管新生を予防または阻害する方法で使用するための、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００８１】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、血管新生を予防または阻害する方法で使用するための、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００８２】
当技術分野で知られるように、用語「血管新生」は、新しい血管が形成されるプロセスを意味し、これは、創傷修復、再生、局所貧血に対する応答、関節炎、乾癬、網膜症、固形腫瘍の増殖および転移性腫瘍の拡散を含む様々な生理学的ならびに病理学的プロセスに関与する。血管新生は、促進および阻害因子の両方の複雑なバランスに依存する高度に制御されたプロセスである。
【００８３】
用語「血管新生を予防または阻害」は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約１００％の血管新生の任意の制限、遅延、減少、低下または縮小を意味する。
【００８４】
血管新生を予防または阻害という用語はまた、任意の新しい血管形成の予防または阻害を意味し、これに限定されないが、脈管形成（中胚葉前駆細胞からの内皮細胞のデノボ形成）の阻害を含む。
【００８５】
血管新生について本明細書中で定義されるような単離されたペプチドの効果が、任意の当技術分野で公知の方法、例えば、血管新生に関連する生理学的マーカー（例えば、血管内皮増殖因子）を画像化またはモニターすることによって、モニターすることができる。
【００８６】
当技術分野で知られ、上記したように、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞遊走、管形成および増殖を含む血管新生促進特性を刺激する分裂促進因子である。病的状態での血管新生の主要な刺激としてＶＥＧＦが認識されると、これが、ＶＥＧＦ活性をブロックする様々な試みにつながった。
【００８７】
理論に拘束されることを望むものではないが、図６に示されるような、がん患者へのペプチドＮｅｒｏｆｅの投与の結果として、ＶＥＧＦの血清レベルで観察された低下は、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの抗血管新生効果を示す。
【００８８】
したがって、その態様のまた別の１つにおいて、本発明は、がん患者でＶＥＧＦのレベルを低下させる方法で使用するための、本明細書中に定義されるような単離されたペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００８９】
本明細書中で定義される単離されたペプチドを投与されたがん患者のＶＥＧＦレベルを測定することは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、本明細書中で定義される単離されたペプチドを用いて治療の開始前および治療期間およびその後の様々な時点で患者から生物学的サンプル（例えば、血液）を得ることにより実施することができる。
【００９０】
ＶＥＧＦのレベルの低下は、本明細書中で定義される単離されたペプチドを用いる治療の開始後のがん患者から得られた生物学的サンプル中のＶＥＧＦの血清レベルが、治療が開始される前のがん患者から得られた生物学的サンプル中のＶＥＧＦ血清レベルより低い場合に観察される。
【００９１】
本明細書中で定義される単離されたペプチドを投与されたがん患者の血液中のＶＧＥＦの血清レベルの任意の低下は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＶＥＧＦの血清レベルの低下は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約１００％であり得る。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦのレベルを低下させる方法で使用するための、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００９３】
特定の実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦのレベルを低下させる方法で使用するための、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００９４】
さらなる実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦの過剰発現を伴う転移がんに関連する。例えば、本明細書中で定義される転移がんは、限定されないが、膵臓がん、小腸がん、直腸腺がん、結腸がん、大腸がん、紡錘細胞腫瘍、非小細胞肺がん、肝臓がんおよび直腸腺がんであり得る。
【００９５】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、膵臓がん、乳がん、小腸がんまたは直腸腺がんである転移がんに関する。
【００９６】
当分野で公知のように、本明細書中で定義される用語「膵臓がん」は、膵臓（胃の後ろに位置する線器官）を構成する細胞の制御されない増殖を意味する。これらのがん細胞は、体の他の部分に侵入または拡散する能力を有する。多くの異なるタイプの膵臓がんがあるが、膵臓腺がんは、約８５％の症例を占める。
【００９７】
本明細書中で定義され、当技術分野で公知の用語「乳がん」は、乳房の組織で形成されるがんを意味する。乳がんの最も一般的なタイプは、乳管の裏層で始まる、腺管がんである。乳がんの別のタイプは、乳房の小葉（乳腺）で始まる小葉がんである。浸潤性乳がんは、乳管または小葉で始まる場所から周辺正常組織へと拡散した乳がんである。
【００９８】
当技術分野で知られているように、用語「小腸がん」は、悪性がん細胞が小腸の組織で形成された稀な疾患である。
【００９９】
用語「直腸腺がん」は、がん細胞が直腸の組織で形成される疾患に関する。腺がんは、結腸直腸がんの大多数（９８％）を含み、よりまれな直腸がんは、リンパ腫（１．３％）、カルチノイド（０．４％）、および肉腫（０．３％）を含む。
【０１００】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、膵臓がんまたは乳がんの転移を予防または治療する方法で使用するための、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０１】
またさらなる特定の実施形態において、本発明は、膵臓がんの転移を予防または治療する方法で使用するための、配列番号４のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０２】
本発明に従って使用するための方法および医薬組成物の意図された使用は、それを必要とする対象でがん転移を予防または治療することである。
【０１０３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従って使用するための方法および医薬組成物は、がんを有すると診断された患者でがん転移の形成を防止することが意図される。そのような場合において、本発明の医薬組成物は、それ自体で、または癌と診断された個人に投与される主な治療に加えて「予防」または補助（adjuvant）プランとして投与するために、他の抗がん剤と組み合わせて投与されてもよい。主な治療は、例えば、手術および／または化学療法であり得る。
【０１０４】
用語「補助療法」は、一次的な、主要なまたは最初の治療に加えて与えられる治療を意味する。現在知られているがん患者に投与される補助療法のいくつかの非限定的な例は、がんの種類に応じて、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線治療またはそれらの組み合わせである。補助療法は、さらなる転移のリスクをより低下させるために設計されるが、再発に対する保証はない。
【０１０５】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬組成物が少なくとも１つの追加の抗がん治療とともに投与するために適合される。
【０１０６】
すなわち、その態様の１つにおいて、本発明は、がん転移の発症を予防するために、任意に、一次的な、主要なまたは最初の治療と組み合わせて、がんと診断された対象（がん患者）の治療で使用するための方法および医薬組成物を提供する。
【０１０７】
本発明による医薬組成物の投与は、少なくとも１つの追加の抗がん治療の投与の前、同時、または後に行うことができる。
【０１０８】
本明細書中で定義される用語「少なくとも１つの追加の抗がん治療」は、当技術分野で公知の任意の抗がん治療を意味し、例えば、限定するものではないが、抗血管新生剤、細胞毒性薬、化学療法剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤および細胞毒性抗生物質）、ホルモン療法（例えば、乳がんの治療のためのタモキシフェン）、放射線治療および免疫療法（例えば、細胞に基づく治療、抗体治療またはサイトカイン治療）である。
【０１０９】
本明細書で定義される用語「抗血管形成剤」は、新しい血管（血管新生）の成長を阻害する物質を意味する。血管新生を阻害する薬剤のいくつかの非限定的な例は、ほんの数例を挙げれば、血管新生促進因子の生産を減少させる薬剤およびＶＧＥＦ経路の阻害剤である。ＶＥＧＦ経路の阻害剤は、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤およびＶＧＥＦに結合し、それがＶＥＧＦ受容体に結合するのを阻害するベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（アバスチン）などの、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲに対する抗体であり得る。
【０１１０】
したがって、上記および他の実施形態において、前記少なくとも１つの追加のがん治療は、抗血管新生剤、細胞毒性薬、化学療法剤、ホルモン療法、放射線治療および免疫療法からなる群から選択される。
【０１１１】
本明細書中で定義される用語「予防する」は、がんと診断された（任意に転移がんとして診断されることがある）個体におけるがん転移の形成の何らかの制限、遅延、低減、減少、妨害、阻害、妨げまたは抑制を意味する。
【０１１２】
本明細書中で定義される用語「予防する」は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、8０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％の、がんと診断された個体における転移がんの形成の制限、遅延、低減、減少、妨害、阻害、妨げまたは抑制を意味する。
【０１１３】
本発明はまた、がん転移を治療する方法で使用するための本明細書中で定義される医薬組成物を提供する。換言すれば、本発明による方法はまた、「がん転移の治療」に有用であり、それは、がん転移ががん患者で診断された後の転移がん細胞の継続的なまたはさらなる拡散の防止として本明細書中で定義される。
【０１１４】
したがって、本明細書中で定義される用語「がん患者」または「それを必要とするがん患者」は、がん、とりわけ転移がんを有すると診断された温血動物、特に、ヒトを意味する。用語「治療する」、「治療」またはそれらの形態は、患者の疾患または病気を予防、阻害、停止または軽減することを意味する。
【０１１５】
がん転移の形成の妨害、阻害、妨げまたは抑制のレベルは、当該分野で知られているように、本発明の単離されたペプチドの存在下で適切なアッセイを実施することによって、実験的に評価できる。がん転移の形成の妨害、阻害、妨げまたは抑制のレベルの臨床評価は、例えば、上記のように、熟練した医師によって実施することができる。
【０１１６】
本発明による医薬組成物または使用のため医薬組成物は、医薬品の臨床試験の実施の基準に従って、例えば、非経口、静脈内、腹腔内または筋肉内注射によって全身的に投与および投薬することができる。別の例において、医薬組成物は、例えば、静脈内、皮下、経皮、局所、筋肉内、関節内、結膜下、または粘膜、例えば、口腔、鼻腔内、または眼内投与を含む任意の適切なルートによって部位に導入することができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本発明による投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、局所、関節内、結膜内、口腔、鼻腔内および眼内からなる群によって選択される経路による。
【０１１８】
以下に例示されるように、ペプチド「Ｎｅｒｏｆｅ」が膵臓がん細胞における細胞の運動性を直接阻害することが示された。
【０１１９】
したがって、その態様の別の１つにおいて、本発明は、がん細胞の運動性を低下させる方法で使用するための、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、本明細書中で定義される医薬組成物は、転移能を有するがんと診断されたがん患者におけるがん細胞の移動性を低下させる方法に使用するためのものである。
【０１２１】
用語「がん細胞の運動性を低下させる」は、それらが存在する場所から移動するがん細胞の能力の部分的または完全な阻害、減弱または減少を意味する。がん細胞遊走は、当該分野の任意の公知の方法により、例えば、以下に例示される細胞遊走アッセイにより、モニターされ得る。
【０１２２】
本明細書中で定義される用語「組成物」または「医薬組成物」は、一般的に、本発明による単離されたペプチドである活性物質およびその浸透圧を調整する薬剤である緩衝剤の少なくとも１つ、および任意に、当技術分野で公知の少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または添加剤を含む。
【０１２３】
本発明による医薬組成物は、製薬業界で周知の従来技術に従って調製され得る。そのような技術は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または添加剤と活性成分に関連性をもたらす工程を含む。
【０１２４】
例えば、本明細書中で使用される用語「薬学的に許容可能な担体」は、当技術分野で周知の任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤を含む。各担体は、他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で、薬学的および生理学的に許容可能であるべきである。
【０１２５】
薬学的に許容可能な担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。
【０１２６】
捕捉または追加の活性成分、例えば追加の抗がん剤を、本発明の医薬組成物に組み込むこともできる。
【０１２７】
上記で具体的に言及した成分に加えて、処方はまた、問題の処方のタイプに関して当技術分野で一般的な他の薬剤を含んでもよいと理解されるべきであり、例えば、経口投与に適切な成分は、香味剤を含んでもよい。
【０１２８】
したがって、上記または他の態様において、本発明による医薬組成物および使用するための医薬組成物はさらに、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または添加剤を含む。
【０１２９】
その態様の別の１つによって、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたぺプチドの任意の機能的断片または誘導体の治療有効量を含む医薬組成物を、それを必要とするがん患者に投与することを含む、がん転移を予防または治療する方法を提供する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、本明細書中で定義される前記単離されたペプチドが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体である。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、前記単離されたペプチドが、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるか、またはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体である。
【０１３２】
さらなる実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、前記単離されたペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０１３３】
またさらなる実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、単離されたペプチドが、配列番号３または配列番号４の修飾アミノ酸配列であって、それぞれ配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を有する非修飾ペプチドと比較した際に修飾ペプチドの生物学的特性に重大な影響を与えることなく、１つ以上のアミノ酸残基が保存的置換によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む。
【０１３４】
またさらなる実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、単離されたペプチドが、配列番号３の修飾アミノ酸配列であって、１つ以上のアミノ酸残基が対応するＤ−アミノ酸残基によって置換されている修飾アミノ酸配列を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、単離されたペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号４のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドの治療有効量を含む医薬組成物を、それを必要とするがん患者に投与することを含むがん転移を予防または治療する方法を提供する。
【０１３７】
他の実施形態において、本発明によるがん転移を予防または治療する方法は、さらに、本明細書中で定義される少なくとも１つの追加の抗がん治療をがん患者に投与することを含む方法である。
【０１３８】
本発明はさらに、がん細胞の運動性を低下させる方法であって、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の治療有効量を含む医薬組成物を、転移能を有するがんを有すると診断されたがん患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１３９】
その態様の別の１つにおいて、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の治療有効量を含む医薬組成物を、それを必要とするがん患者に投与することを含む、がん患者における血管新生を予防または阻害する方法を提供する。
【０１４０】
その態様のまた別の１つにより、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の治療有効量を含む医薬組成物をがん患者に投与することを含む、それを必要とするがん患者の血清中のＶＥＧＦのレベルを低下させる方法を提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本発明による、それを必要ながん患者の、がん細胞の運動性を低下させる方法、血管新生を予防または阻害する方法、または血清中のＶＥＧＦレベルを低下させる方法は、医薬組成物が、配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドの治療有効量を含む。
【０１４２】
他の実施形態において、本発明による、それを必要ながん患者の、がん細胞の運動性を低下させる方法、血管新生を予防または阻害する方法、または血清中のＶＥＧＦレベルを低下させる方法は、医薬組成物が、配列番号４のアミノ酸配列からなる単離されたペプチドの治療有効量を含む。
【０１４３】
本明細書中で定義される目的のために本発明により単離されたペプチドの「治療有効量」（単数または複数）は、がん転移を治療、予防、阻害、停止または軽減するために当分野で知られている考慮によって決定される。
【０１４４】
本発明に従って、それを含む単離されたペプチドまたは医薬組成物は、治療有効量で複数用量を単回でそれを必要とする患者に投与されてもよい。
【０１４５】
本明細書中で定義されるのと同じものを含む単離されたペプチドまたは医薬組成物の投与計画および投与スケジュールは、当該分野で公知の考慮事項に基づいて、例えば、限定されないが、以下の表３にまとめられる臨床アッセイに従い、当業者によって決定されてもよい。
【０１４６】
本明細書中で定義される治療の方法および使用するための医薬組成物は、がん転移の進行を阻害、妨害またはスローダウンすることが意図される。本明細書中で定義される単離されたペプチドの治療効果（または本明細書中で定義される治療に対するがん患者の応答性）をモニタリングすることは、熟練した医師によって定期的に実施することができ、例えば上記したように、当分野で知られているような、例えばすべての腫瘍の評価およびそれらの大きさおよび転移の追跡のよって、またはがん患者におけるがん転移の徴候を追跡することによって実施できる。
【０１４７】
例えば、本明細書中で定義される使用のための医薬組成物を投与することを含む治療に対するがん患者の反応性を決定することは、がん転移の以下の特定のマーカーによって実施することができ、例えば、これに限定されないが、本明細書中で定義されるような方法および使用のための医薬組成物によって治療される前に、及び治療後に通常の方法で（例えば、１週間に１回、２週間ごとに１回、１月に１回）がん患者から得られた細胞を含む生物学的サンプルからの、分泌された可溶性ＳＴ２、ＴＰＡまたはＶＥＧＦのレベルの少なくとも１つによって実施することができる。
【０１４８】
用語「生物学的サンプル」は、その最も広い意味で使用される。生物学的サンプルは、（ヒトを含む）動物から得ることができ、液体（例えば、血液）、固体および組織を含む。
【０１４９】
その態様のまた別の１つにおいて、本発明は、がん転移を予防または治療するための医薬組成物の調製において本明細書中で定義される単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の使用を提供する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要とするがん患者に投与することを含むがん転移を予防または治療するための医薬組成物の調製において、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の使用を提供する。
【０１５１】
本発明はさらに、がん細胞の運動性を低下させるための医薬組成物の調製において、本明細書中で定義される単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の使用を提供する。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、がん細胞の運動性を低下させるための医薬組成物の調製において、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドまたはその単離されたペプチドの任意の機能的断片または誘導体の使用を提供する。
【０１５３】
本明細書中で使用される用語「約」は、整数値、および適用可能な場合、更に非整数値を含む、連続する範囲を構成する偏差範囲に言及される値よりも１％、より具体的には５％、より具体的に１０％、より具体的に１５％まで、ある場合において２０％まで高くまたは低く逸脱してもよい。
【０１５４】
開示され、記載され、本発明は、方法ステップおよび組成物のような本明細書中で開示される特定の実施例、方法ステップ、および組成物に限定されるものではなく、組成物は多少変化してもよいことを理解すべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ制限されるので、本明細書中で使用される用語は、特定の態様のみを記載する目的のために使用され、限定する意味ではないことを理解されるべきである。
【０１５５】
この明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数の言及を含むことを留意しなければならない。
【０１５６】
以下の本明細書および実施例およびその後に続く特許請求の範囲を通して、文脈が特に要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変化は、言及された整数若しくはステップ又は整数またはステップのグループを含むが、他の整数若しくはステップ又は他の整数またはステップのグループを排除しないことを暗示するものとして理解されるべきである。
【０１５７】
以下の実施例は、本発明の態様を実施で本発明者らによって使用される技術の代表例である。これらの技術は、本発明の実施のための好ましい態様の例であり、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および意図される範囲から離れることなく、多数の修正がされることができることを認識するだろうと認められるべきである。
【０１５８】
さらに詳述することなく、当業者は、前述の記載を使用して、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の好ましい特定の態様は、単に例示的であると理解されるべきであり、任意の方法で特許請求される発明を限定するものではない。
【０１５９】
当該分野で公知であり、本明細書中で具体的に記載されない標準的な分子生物学プロトコルは、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１年に従う。
【０１６０】
実験手順
細胞培養（細胞継代）
細胞（ヒト腺がん膵臓がん細胞およびヒト乳がん細胞）をフラスコで７０〜８０％の密度に達するまで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーター中で増殖した。７０〜８０％の密度に達すると、細胞を次のように処理した：培地を捨て、フラスコをトリプシンＥＤＴＡ（５ｍｌ、生物学的産業カタログ番号０３−０５２−１Ｂ）で洗浄した。次に５ｍｌトリプシンＥＤＴＡの追加の量を細胞に添加し、その細胞をほとんどの細胞がフラスコから分離されるまで、３７℃、５％ＣＯ２で数分間（５〜１０分）インキュベーター中に置いた。細胞の分離を高めるためにフラスコを叩くのを避けることを勧める。フラスコをＮｕｎｃ（カタログ番号１７８９０５）から購入した。
【０１６１】
次にＲＰＭＩ培地（１０ｍＬ）をトリプシン処理された細胞に添加した。その培地をＲＰＭＩ １６４０（Ｌ−グルタミンおよび２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｒｅｎｉｕｍカタログ番号５２４００）を５０ｍＬのＦＢＳ（生物学的産業カタログ番号０４−１２１−１Ａ）、５ｍＬのピルビン酸ナトリウム（生物学的産業カタログ番号０３−０４２−１Ｂ）、５ｍＬのＰｅｎ-Ｓｔｒｅｐ（生物学的産業カタログ番号０３−０３１−１Ｂ）および５ｍＬの非必須アミノ酸（生物学的産業カタログ番号０３−３４０−１Ｂ）で捕捉することによって調製した。次に培地およびトリプシン処理された細胞を２つのフラスコに分け、各フラスコを追加の１５ｍＬの新鮮な培地で補充した。７０〜８０％の細胞密度に到達するまで、細胞を２〜３日間増殖させた。次いで、上記手順を繰り返した。
【０１６２】
ペプチドの調製
アミノ酸残基の全てがＤ構造であり、Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ（または配列番号４で示される単一文字コードでＷＷＴＦＦＬＰＳＴＬＷＥＲＫ）のアミノ酸配列を有する１４個のアミノ酸残基のペプチド（それは本明細書中で「Ｎｅｒｏｆｅ」とも呼ばれる）は、次のように調製され、使用された：そのペプチドは、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理の基準（ＧＭＰ）条件下でＮｏｖｅｔｉｄｅによって合成され、粉末に凍結乾燥された。１０ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅ溶液が得えられるようにＮｅｒｏｆｅ粉末をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、次いで、さらに溶媒で希釈して、最終細胞懸濁液で合計２％のＤＭＳＯの濃度を超えないようにしながら、所望のアッセイ濃度の２倍の濃度を得た。実験で使用される最終Ｎｅｒｏｆｅ濃度は、１、１０、２５および５０μｇ／ｍｌであった。ＤＭＳＯの同様の量が、Ｎｅｒｏｆｅの存在下でインキュベートされなかった対照細胞に添加された。
【０１６３】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイ
ヒト腺がん膵臓がん細胞およびヒト乳がん細胞をフラスコで７０〜８０％の密度に到達するまで増殖させ、上記のようなトリプシンＥＤＴＡを使用してフラスコから分離した（細胞培養のための上記手順がトリプシン処理された細胞に１０ｍｌの培地を添加するステップまで使用された）。次に培地とトリプシンで懸濁された細胞は、５０ｍｌのコニカルチューブに移され、３００ｇ（１０分、４℃）で遠心分離した。次に上清を捨て、細胞ペレットを新しい培地（上記のように調製された２ｍＬの培地）で再懸濁した。
【０１６４】
次に細胞を流動化し、追加の３ｍｌの培地を細胞が５ｍｌの培地の全用量中に再懸濁されるように細胞懸濁液に添加した。次に細胞を計数し、２０，０００細胞／ｍｌ培地の濃度に希釈した。次に細胞を、各ウェルが２０００細胞を含むように、ウェル当たり１００μｌ細胞懸濁液を置く９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号１６７００８）に置いた。次に細胞を３７℃でインキュベーターで一晩インキュベートした。
【０１６５】
濃縮されたＮｅｒｏｆｅペプチドを１００μｌの全容量中に懸濁し、１、１０、２５および５０μｇ／ｍｌの最終濃度で、９６ウェルプレートでアッセイされた細胞に添加した。対照（バックグラウンド）アッセイをペプチドの非存在下で実施し、つまり、１００μｌ培地を対照細胞に加えた。
【０１６６】
細胞を２４または４８時間、３７℃でＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下でインキュベートした。次にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号２７５２、培地中で１：５００に希釈される）のウェル当たり２０μｌを細胞が収集される２４時間前に、ウェルに添加した。すなわち、ＢｒｄＵを、ペプチドと共にインキュベーションする際すぐに、または細胞が４８時間インキュベートされた実験においてインキュベーションの最初の２４時間のいずれかに添加した。ＢｒｄＵキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｔｄ）を製造者のプロトコルに従って使用した。
【０１６７】
組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のヒトＥＬＩＳＡアッセイ
ヒト腺がん膵臓がん細胞をフラスコで７０〜８０％の密度に到達するまで増殖させ、上記のようなトリプシンＥＤＴＡを使用してフラスコから分離した。次に培地およびトリプシン中に懸濁された細胞を遠心分離し、（上記、ＢｒｄＵ取り込みアッセイのために記載されるような）２ｍｌの新鮮な培地で再懸濁した。
【０１６８】
次に細胞を流動化し、３ｍｌの培地を細胞が５ｍｌ培地の全容量中に再懸濁されるように細胞懸濁液に添加した。細胞を計数し、５０，０００細胞／ｍｌ培地の濃度に希釈した。次に、各ウェルが１００，０００細胞を含むようにウェル当たり２ｍｌの細胞培養液を入れることによって、細胞を６ウェルプレート（Ｎｕｎｃカタログ番号１４０６７５）の各ウェルに置いた。次に細胞を一晩、３７℃で、インキュベーター中でインキュベートした。
【０１６９】
上清を捨て、２．５％ＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ培地によって置換した。次に、１、１０、２５および５０μｇ／ｍｌの最終濃度でのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下、細胞を３７℃で２４時間または４８時間、インキュベートした。上清を細胞の遠心分離（３００ｇで５分、４℃）によって回収し、−２０℃で保存した。
【０１７０】
次に、ＴＰＡ  ＥＬＩＳＡアッセイを次の通り実施した：上清を解凍し、氷の上に保持し、次にキット（ｘ１Ｎ、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ１０８９１４）で供給されたＴＰＡ希釈液で１：１５に希釈した。手順は、製造業者のプロトコルに従って継続され、ＥＬＩＳＡプレートを４５０／５９０の光学密度（Ｏ．Ｄ．）で読み取った。
【０１７１】
可溶性ＳＴ２（ｓＳＴ２）ＥＬＩＳＡアッセイ
ヒト腺がん膵臓がん細胞およびヒト乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をフラスコで７０〜８０％の細胞密度に到達するまで増殖し、上記のようなトリプシンＥＤＴＡを使用してフラスコから分離した。次に培地およびトリプシン中に懸濁された細胞を遠心分離し、（上記、ＢｒｄＵ組み込みアッセイとして記載されるような）２ｍｌの新鮮な培地で再懸濁した。
【０１７２】
次に細胞を流動化し、３ｍｌの培地を細胞が５ｍｌの培地の全容量中に再懸濁されるように細胞懸濁液に添加した。次に細胞を計数し、５０，０００細胞／ｍｌ培地の濃度に希釈した。プレートごとに２ｍｌで細胞を各ウェルが１００，０００細胞を含むように６ウェルプレートの各ウェルに置いた。細胞を一晩、３７℃でインキュベーター中でインキュベートした。
【０１７３】
上清を捨て、２．５％ＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩによって置換された。次に１、１０、２５および５０μｇ／ｍｌの最終濃度でのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下、細胞を３７℃で２４時間または４８時、インキュベートした。上清を細胞の遠心分離（５分、３００ｇ、４℃）によって回収し、−２０℃で保存した。
【０１７４】
次に、ｓＳＴ２  ＥＬＩＳＡアッセイを次のとおり実施した：最初に、ＰＢＳ（生物学的産業、０２−０２３−５Ａ）でｓＳＴ２ペプチド（Ｇｅｎｍｅｄ、プロジェクトＩＤ３５６２２ Ｂフォーム、配列：ＨＴＶＲＬＳＲＫＮＰＳＫＥＣＦ）を連続希釈することによって、ｓＳＴ２ペプチドについての較正曲線を１０，０００ｐｇ／ｍｌ〜１５６ｐｇ／ｍｌで調製した。次に、上清サンプルを解凍し、氷上に維持した（濃縮されたサンプルをＰＢＳで希釈した）。サンプル充填を、Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ、４４２４０４）で、各サンプルおよび標準について１００μｌを2重で充填することによって実施した。
【０１７５】
次に、液体を除去し、３００μｌのＰＢＳ中０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、０７７７−１Ｌ）でマルチピペットまたは自動洗浄機を使用して、３回プレートを洗浄することによって、サンプルを洗浄した。ＰＢＳで５％のＢＳＡ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１６００６９）で希釈し、各ウェルに３００μｌのこのブロッキング緩衝液を充填することによりサンプルをブロックした。ブロッキングステップは、振盪しながら１時間のインキュベーションを含んだ。次に、サンプルを上記のように洗浄した。
【０１７６】
ｓＳＴ２の検出は、希釈剤（０．０５％ＴＥ−２０、ＰＢＳ中で０．１％ＢＳＡ）で希釈された抗ｓＳＴ２アフィニティー精製抗体（Ｇｅｎｍｅｄ、プロジェクトＩＤ３５６２２ Ｂフォーム）１：１００によって実施され、１００μｌの検出抗体が各ウェルに充填された。次にサンプルを振盪しながら（３５０ＲＰＭ）、室温で１．５時間インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、希釈された（希釈剤中１：５００）ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（細胞シグナリング、７０７４）を各ウェル（１００μｌ）に充填し、サンプルをさらに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。次にサンプルを上記のように洗浄し、各ウェルに１００μｌの３,３’,５,５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、ＥＳ００１−５００ＭＬ）を添加し、青色発色をまって、最終的に１００μｌ ２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、５５５２５４０）を加えることによって染色した。プレートの吸光度をマイクロプレートリーダーで４５０／５９０のＯ．Ｄ．で実施した。
【０１７７】
ヒトがん細胞の細胞遊走アッセイ
ヒト腺がん膵臓がん細胞をフラスコで７０〜８０％の細胞密度に到達するまで増殖し、上記のようなトリプシンＥＤＴＡを使用してフラスコから分離した。次に培地およびトリプシン中に懸濁された細胞を１０分間、３００ｇ（４℃）で遠心分離し、（上記ＢｒｄＵ組み込みアッセイとして記載されるような）２ｍｌの新鮮な培地で再懸濁した。
【０１７８】
次に細胞を流動化し、３ｍｌの培地を細胞が５ｍｌの培地の体積で懸濁されたように添加し、続いて計数し、１５０，０００または３００，０００細胞／ｍｌ培地の濃度に希釈した。
【０１７９】
また、５０ｍｌのＦＢＳ（生物学的産業カタログ番号０４−１２１−１Ａ）、５ｍｌのＨｅｐｅｓ １Ｍ（生物学的産業カタログ番号０３−０２５−１Ｃ）、０．５ｍｌのアンホテリシンＢ ２５００μｇ／ｍｌ（生物学的産業カタログ番号０３−０２９−１）および５ｍｌのゲンタマイシン硫酸塩５０ｍｇ／ｍｌ（生物学的産業カタログ番号０３−０３５−１）で補われたＥａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ、生物学的産業カタログ番号０１−０５５−１Ａ）のＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾培地を細胞培養および再懸濁のために使用し、その細胞を１００，０００細胞／ｍｌ培地の最終濃度に再懸濁した。
【０１８０】
半径９６ウェル細胞遊走アッセイプレート（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ.カタログ番号ＣＢＡ−１２６）を製造業者のプロトコルに従って調製し、各ウェルが１０，０００、１５，０００または３０，０００細胞を含むように各ウェルに１００μｌ細胞液を充填した。細胞を一晩、インキュベーター（３７℃）でインキュベートした。次に、上清を廃棄し、２．５％ＦＢＳを含む１００μｌのＲＰＭＩによって置換した。次に、細胞を、全容量で１００μｌの培地に懸濁されたＮｅｒｏｆｅペプチド（１および１０μｌの最終濃度）によって処理し、その結果各ウェルは２００μｌの全容量を含んだ。次に、細胞を３７℃で２４時間、インキュベーター中でインキュベートした。
【０１８１】
また、上清を捨て、２．５％ＦＢＳ、要求された処置、すなわち対照（Ｎｅｒｏｆｅ無し）、１、１０、２５および５０μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅを含む２００μｌのＤＭＥＭより置換した。次に細胞をインキュベーター中で、３７℃で４８時、インキュベートした。
【０１８２】
細胞が７０〜８０％の密度に到達したら、上清を捨て、製造業者のプロトコルで記載されるように、細胞の付着に影響を与えることなく、ゲルをウェルの中心から除去した。次に細胞のない領域を、ゼロ時（すなわち、ゲルが除去された直後）および次に２時間ごとに倒立共焦点顕微鏡（×４０倍）を使用して撮影した。アッセイは、製造業者のプロトコルに従って細胞を染色することによって終了した。
【０１８３】
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを用いて各時点での細胞が存在しない面積を計算し、細胞がそのような非存在領域内に進んでいたペースを決定した。全ての実験を二度実施した。
【０１８４】
実施例１  ヒト膵臓がん細胞における組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）のレベルでのＮｅｒｏｆｅペプチドの効果
膵臓がん細胞中の組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の過剰発現は、浸潤およびインビトロでの増殖および腫瘍の成長およびインビボでの血管新生を促進することが報告されている（７）。
【０１８５】
インビトロで膵臓がん細胞によるＴＰＡ分泌に対する（配列番号４で示されるような）Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓの全Ｄアミノ酸配列を有するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果を調べた。図１（下側の棒グラフ）は、上記のように、２４時間、１〜５０μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下でインキュベートされ、次にＥＬＩＳＡアッセイによってＴＰＡのレベルについて評価したヒト腺がん膵臓がん細胞を示す。
【０１８６】
図１（下側の棒グラフ）で示すように、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの存在下では、該ペプチドと一緒にインキュベートされなかった対照細胞と比較して、より低いレベルのＴＰＡの分泌が、試験細胞（本明細書中ではまた、「細胞株１」、「細胞株２」および「細胞株３」とも呼ばれる）で検出された。
【０１８７】
上に示したように、膵臓がん細胞中のＴＰＡの過剰発現は、細胞浸潤を促進する。結果的に、ＴＰＡレベルの低下は、がん細胞の浸潤または転移能に影響を与えることができ、したがって、ペプチドの存在下、ＴＰＡレベルの実証された低下は、ペプチドが細胞の運動性を低下させることに効果的であり得ることを示す。
【０１８８】
実施例２  ヒト膵臓がん細胞における可溶性ＳＴ２のレベルに対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果
Ｔ１／ＳＴ２受容体（また、インターロイキン１受容体様１と呼ばれる）は、Ｔｏｌｌ様受容体スーパーファミリーのメンバーである。可溶性および膜結合Ｔ１／ＳＴ２受容体の両方は、インビボで造血組織で主に発現される（８）。ＳＴ２（ｓＳＴ２）の可溶性フォームのノックダウンは、様々な細胞株でＥｒｂＢ２誘導性細胞の運動性を低下させることが報告されている（９）。
【０１８９】
図２（下側の棒グラフ）で示されるように、１〜５０μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下、ｓＳＴ２の低いレベルが、ペプチドでインキュベートされなかった細胞中で試験されたｓＳＴ２のレベルと比較して、試験された細胞（ヒト腺がん膵臓がん細胞）の全てにおいて、検出された。Ｎｅｒｏｆｅペプチドの観察された効果は、用量依存的であった。ｓＳＴ２は、細胞の運動性と関連しているので、ペプチドの存在下でｓＳＴ２レベルの実証された低下は、ペプチドが細胞の運動性または浸潤を低下させるのに有効であり得ることを示す。
【０１９０】
ｓＳＴ２のレベルで約８０％の低下は、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの存在下、類似するアッセイ条件下で、ヒト乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）で実証された（データは示されず）。
【０１９１】
実施例３  ヒト腺がん膵臓がん細胞増殖に対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果
胸腺ペプチドのＣ末端の５１個のアミノ酸残基からなるペプチド（上記、表１で示される「Ｔ１０１ペプチド」と呼ばれる）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有し、発明者らによって、成人Ｂａｌｂ／Ｃマウスモデルで腫瘍の大きさ有意に減少させることが以前に実証された（３）。
【０１９２】
また、Ｎｅｒｏｆｅペプチドは、Ｔ１０１ペプチドの修飾されたペプチド断片であり、（配列番号４によって示される）全てのＤアミノ酸残基のようにそのＣ末端の１４個のアミノ酸残基からなり、造血起源の様々ながん細胞で細胞増殖を阻害することが以前に示された。「細胞増殖での抑制効果」は、ペプチドの非存在下で実施された対照アッセイと比較してペプチドの存在下で細胞増殖の少なくとも４０％阻害として、本明細書中で定義される。
【０１９３】
驚くべきことに、発明者らは、Ｎｅｒｏｆｅペプチドが、図１および図２の上のパネルに示すように、ヒト腺がん膵臓がん細胞増殖でのわずかな効果のみを有することが発見されたことを示す。
【０１９４】
ヒト腺がん膵臓がん細胞の増殖は、上記のように、ＤＮＡを合成している細胞の量を評価するために、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を使用して、アッセイされた。図１よび図２に示すように（上側の線）、１、１０、２５および５０μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下でインキュベートされたヒト膵臓がん細胞は、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの非存在下で実施された対照アッセイと比較して、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの存在下でのそれらのＢｒｄＵ取り込み能力でわずかな減少（２６％まで阻害）のみを実証した。また、相関関係は、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの濃度と阻害の程度との間で見られなかった。
【０１９５】
実施例４  ヒト腺がん膵臓がん細胞における細胞遊走に対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果
細胞遊走に対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果は、製造業者のプロトコルに従って、半径細胞遊走アッセイ（Ｒａｄｉｕｓ Ｃｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）を使用して、直接アッセイされた。つまり、細胞を半径９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ.カタログ番号ＣＢＡ−１２６）のウェルに播種し、生物適合性ハイドロゲルスポットを設置したウェルの中心部を除いてどこにでも付着させた。細胞が単層を形成した後、アッセイは、細胞遊走が起こる得る間隙を残して、除去溶液でゲルを徐々に溶解することによって開始された。
【０１９６】
以下の表２に示されるように、細胞をＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下、８時間（１０μｇ／ｍｌの最終濃度で）、インキュベートした場合、ウェルの中心への細胞の遊走は、（Ｎｅｒｏｆｅペプチドでインキュベートされなかった）対照細胞と比較して、細胞株１に対して３０％および細胞株２に対して８２％低減された。細胞株「１」と細胞株「２」は、両方、腺がん膵臓がん細胞である。
【０１９７】
これらの結果は、癌細胞の転移可能性でのＮｅｒｏｆｅペプチドの効果についての直接的な証拠である。
【０１９８】
【表２】
0006609556.tif 000003
【０１９９】
ヒト腺がん膵臓がん細胞の転移能力に対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果はさらに、異なるアッセイ条件、すなわち、アッセイ開始前の４８時間の期間、０、１０、２５および５０μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下で、細胞をインキュベーションに付すことによって、アッセイされた。
【０２００】
２５μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅペプチドの存在下、ヒト腺がん膵臓がん細胞をインキュベートすることによって実施されたアッセイの結果を図３に示す。遊走アッセイ開始の２７時間後に得られた図３Ｃを、遊走アッセイ開始の１時間後に得られた図３Ａと比較して明らかなように、Ｎｅｒｏｆｅペプチドによって処理されなかった対照がん細胞は、プレートの中心に遊走した。
【０２０１】
対照的に、図３Ｄを図３Ｂと比較することによって示されるように、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの存在下でインキュベートされた細胞の転移は、実質的に阻害された。
【０２０２】
この阻害効果はまた、図４でグラフで示され、２５μｇ／ｍｌのＮｅｒｏｆｅペプチド（Ｔ１およびＴ２）の存在下、遊走アッセイの開始前の４８時間の間インキュベートされたヒト腺がん膵臓がん細胞で実施された２つの独立した遊走アッセイで得られた結果および対照細胞（ＣＯＮ１、ＣＯＮ２、ＣＯＮ３およびＣＯＮ４）で実施された４つの独立したアッセイで得られた結果を示す。
【０２０３】
図４にグラフで示されるように、Ｎｅｒｏｆｅペプチドに先に曝露された細胞で実施された細胞遊走アッセイの無細胞領域は、遊離アッセイの間、実質的に維持され、これらの細胞の遊走が大幅に阻害されたことを示唆する。
【０２０４】
がん細胞転移のＮｅｒｏｆｅｎの直接的な阻害効果とともに、Ｎｅｒｏｆｅペプチドの存在下で分泌されたＴＰＡおよびｓＳＴ２のレベルの観察された低下は、がん転移の阻害でこのペプチドの特定の治療可能性を示唆する。
【０２０５】
理論に束縛されることなく、Ｎｅｒｏｆｅペプチドのこれらの観察された効果は、図１および図２において例示されたように、Ｎｅｒｏｆｅが細胞増殖に対してわずかな阻害効果しか有しないことが示されたので、必ずしも細胞増殖機構に関連付けられない。
【０２０６】
実施例５  がん患者における血管内皮増殖因子の血清レベルに対するＮｅｒｏｆｅペプチドの効果
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成および血管新生を刺激する細胞によって生産されるシグナルタンパク質である。上記で示されたように、ＶＥＧＦを発現するがんは、成長し、転移することができる。
【０２０７】
したがって、ＶＥＧＦの血清レベルに従う臨床研究がペプチドＮｅｒｏｆｅを投与されたがん患者で実施された。以下の表３でまとめられるように、その研究に参加する患者は、様々ながんのタイプ、すなわち、結腸、大腸、紡錘細胞腫瘍、膵臓、小腸、非小細胞肺がん、肝臓がん、結腸腺がんおよび直腸腺がんと診断された。
【０２０８】
患者には、コホート１、コホート２、コホート３およびコホート４のうちの少なくとも１つが含まれ、それぞれ、示された時点で、ペプチドＮｅｒｏｆｅの６、１２、２４または２４ｍｇ／ｍ２（約０．１６、０．３２、０．６４または１．２８ｍｇ／ｋｇ体重）の用量を受けた。
【０２０９】
ＶＥＧＦの血清レベルは、ヒトＶＥＧＦに対するＥｌｉｓａキット（Ｒ＆Ｄシステム）を使用してこれらの患者のために得られた血液サンプルで測定され、その結果が図５（コホート１およびコホート２の患者について）および図６（コホート３およびコホート４の患者について）に提示される。
【０２１０】
図５に示されるように、コホート１およびコホート２において、参加するがん患者についてＶＧＥＦの血清レベルの増加があった。しかしながら、図６で示されるように、ＶＥＧＦの血清レベルは、がん患者でＮｅｒｏｆｅに対する明らかな抗血管新生効果を示す、コホート３およびコホート４の患者の血清で３０〜４０％で低下した。
【０２１１】
この観察された効果は、小腸および直腸腺がんを有するがん患者、すなわち、それぞれ患者１３および１９について特に顕著であった。
【０２１２】
【表３】
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【０２１３】
転移および腫瘍細胞転移は血管を介して起こるので、ＶＥＧＦのレベルを低下させると、血管は透過性がより低くなり、転移が阻害されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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