(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、前記試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定する微生物の検査方法であって、
プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットと、前記抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるプラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌の有無を判定する
ことを特徴とする微生物の検査方法。
【請求項２】
プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第一の増幅産物に相補的に結合する配列番号１２に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第一の増幅産物を接触させ、
前記第一のプローブと相補的に結合した前記第一の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項１記載の微生物の検査方法。
【請求項３】
ピシウム属菌のＤＮＡと前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第二の増幅産物に相補的に結合する配列番号１３または１４に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第二の増幅産物を接触させ、
前記第二のプローブと相補的に結合した前記第二の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項１または２記載の微生物の検査方法。
【請求項４】
フィトフトラ属菌のＤＮＡと前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第三の増幅産物に相補的に結合する配列番号１５または１６に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第三の増幅産物を接触させ、
前記第三のプローブと相補的に結合した前記第三の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物の検査方法。
【請求項５】
プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのＤＮＡと前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第四の増幅産物に相補的に結合する配列番号１７に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第四のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第四の増幅産物を接触させ、
前記第四のプローブと相補的に結合した前記第四の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物の検査方法。
【請求項６】
プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットと、前記抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるプラズモディオフォラ属菌の有無を判定する
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物の検査方法。
【請求項７】
プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと前記第二のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第五の増幅産物に相補的に結合する配列番号１８に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第五の増幅産物を接触させ、
前記第五のプローブと相補的に結合した前記第五の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項６記載の微生物の検査方法。
【請求項８】
ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号７または８に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットと、前記抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるピシウム属菌の有無を判定する
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物の検査方法。
【請求項９】
ピシウム属菌のＤＮＡと前記第三のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第六の増幅産物に相補的に結合する配列番号１９に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第六の増幅産物を接触させ、
前記第六のプローブと相補的に結合した前記第六の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項８記載の微生物の検査方法。
【請求項１０】
ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットと、前記抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるピシウム属菌またはフィトフトラ属菌の有無を判定する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微生物の検査方法。
【請求項１１】
ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡと前記第四のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第七の増幅産物に相補的に結合する配列番号２０または２１に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブを固定化したマイクロアレイに、前記第七の増幅産物を接触させ、
前記第七のプローブと相補的に結合した前記第七の増幅産物の標識を検出する
ことを特徴とする請求項１０記載の微生物の検査方法。
【請求項１２】
植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、前記試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定するために用いる微生物の検査キットであって、
プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを含む
ことを特徴とする微生物の検査キット。
【請求項１３】
プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項１２記載の微生物の検査キット。
【請求項１４】
ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号７または８に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項１２または１３記載の微生物の検査キット。
【請求項１５】
ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットをさらに含む
ことを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の微生物の検査キット。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかに記載の微生物の検査キットによって得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定する微生物検査用マイクロアレイであって、
プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子について、配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第一の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１２に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブと、
ピシウム属菌のＤＮＡと、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子について、前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第二の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１３または１４に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブと、
フィトフトラ属菌のＤＮＡと、フィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子について、前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第三の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１５または１６に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブと、
を固定化したことを特徴とする微生物検査用マイクロアレイ。
【請求項１７】
プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのＤＮＡと、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのＤＮＡについて、前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第四の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１７に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第四のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項１６に記載の微生物検査用マイクロアレイ。
【請求項１８】
プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域について、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第五の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１８に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項１６または１７に記載の微生物検査用マイクロアレイ。
【請求項１９】
ピシウム属菌のＤＮＡと、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域について、配列番号７または８に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第六の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１９に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれかに記載の微生物検査用マイクロアレイ。
【請求項２０】
ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡと、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域について、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第七の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号２０または２１に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブをさらに固定化した
ことを特徴とする請求項１６〜１９のいずれかに記載の微生物検査用マイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の種類等を遺伝子配列にもとづき特定する遺伝子検査技術に関し、特に土壌伝染性病害に係る病原菌を検出するための微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品検査や環境検査等において、食品や環境に存在するカビや食中毒菌などの微生物の種類を特定するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などの核酸増幅法を用いて、標的とする遺伝子におけるＤＮＡを増幅し、その増幅産物を検出して、微生物の種類を判定することが行われている。
一方、植物組織または土壌や水に存在する土壌伝染性病害に係る病原菌には、食品検査や環境検査等における検出対象菌とは界が異なるものが存在し、これらの検出対象菌のプライマーを用いてＰＣＲを行っても、土壌伝染性病害菌のＤＮＡを増幅させることは、困難であった。
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−２３４３９９号公報
【特許文献２】特許第５５２２８２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ここで、本発明者らは、土壌伝染性病原菌の中でも特に、ハクサイなどに根こぶ病を発症させるプラズモディオフォラ属菌と、ウリ科野菜などに苗立枯病等を発症させるピシウム属菌と、ジャガイモなどに疫病を発症させるフィトフトラ属菌を検出対象菌として選択した。
そして、本発明者らは、鋭意研究し、これらの検出対象菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を標的領域として好適に増幅させることができるプライマーセットと、ｒＤＮＡ遺伝子（リボソームＲＮＡ遺伝子）ＩＴＳ領域を標的領域として好適に増幅させることができるプライマーセットを開発すると共に、それぞれの増副産物を特定可能なプローブ（ＤＮＡチップ基板上の１本鎖オリゴＤＮＡ）を備えたマイクロアレイを開発し、これらの病原菌を特異的に検出することに成功した。
【０００５】
ここで、特許文献１にはピシウム属菌を簡便、迅速かつ高感度で検出または同定するためのオリゴヌクレオチドが開示されている。また、特許文献２にはフィトフトラ属菌を検出可能なイチゴ重要病害の病原菌検出方法および検出用プライマーが開示されている。
しかしながら、これらの技術では、プラズモディオフォラ属菌を検出することはできなかった。また、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌をより好適にそれぞれ特異的に同時に検出可能にすることが望ましい。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌を好適に検出することの可能な微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明の微生物の検査方法は、植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、前記試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定する微生物の検査方法であって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットと、前記抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、前記試料におけるプラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌の有無を判定する方法としてある。
【０００８】
また、本発明の微生物の検査キットは、植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、前記試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定するために用いる微生物の検査キットであって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを含む構成としてある。
【０００９】
さらに、本発明の微生物検査用マイクロアレイは、前述の微生物の検査キットによって得られた増幅産物に基づき前記試料における微生物の有無を判定する微生物検査用マイクロアレイであって、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子について、配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第一の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１２に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブと、ピシウム属菌のＤＮＡと、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子について、前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第二の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１３または１４に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブと、フィトフトラ属菌のＤＮＡと、フィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子について、前記第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより得られる第三の増幅産物とに、相補的に結合する配列番号１５または１６に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブと、を固定化した構成としてある。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌の有無を同時に判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイで用いられるプライマーの塩基配列を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイで用いられるβ-チューブリン遺伝子を標的とするプローブの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を検出した結果（試験例１）を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を検出した結果（試験例２）を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を検出した結果（試験例３）を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出した結果（試験例４）を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出した結果（試験例５）を示す図である。
【図８】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイで用いられるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とするプローブの塩基配列を示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌を検出した結果（試験例６）を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイを用いて、プラズモディオフォラ属菌と、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌とを同時に検出した結果（試験例７）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態に係る微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイについて、詳細に説明する。
本実施形態の微生物の検査方法は、植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき試料における微生物の有無を判定する微生物の検査方法であって、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットと、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、試料におけるプラズモディオフォラ属菌の有無を判定することを特徴とする。
【００１３】
また、本実施形態の微生物の検査方法は、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第一の増幅産物に相補的に結合する配列番号１２に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブを固定化したマイクロアレイに、第一の増幅産物を接触させ、第一のプローブと相補的に結合した第一の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
プラズモディオフォラ属菌は、土壌伝染性病原菌であり、ハクサイ、キャベツ類等のアブラナ科野菜などに寄生して、根こぶ病を引き起こす。生きた植物細胞だけに寄生して病気を起こす絶対寄生菌である。
本明細書において、塩基配列は、全て５’末端から３’末端方向に把握するものとする。
【００１４】
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、このようなプラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を好適に増幅させることが可能となっている。
また、上記の第一のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
【００１５】
また、本実施形態の微生物の検査方法は、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的として、第一のプライマーセットと、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、試料におけるプラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌の有無を同時に判定することを特徴とする。
【００１６】
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌のＤＮＡと第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第二の増幅産物に相補的に結合する配列番号１３または１４に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブを固定化したマイクロアレイに、第二の増幅産物を接触させ、第二のプローブと相補的に結合した第二の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
ピシウム属菌は、多犯性の土壌伝染性病原菌であり、ウリ科野菜やナス科野菜などをはじめ多くの野菜類に対して、苗立枯病や腐敗病等を起こす。
【００１７】
さらに、本実施形態の微生物の検査方法は、フィトフトラ属菌のＤＮＡと第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第三の増幅産物に相補的に結合する配列番号１５または１６に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブを固定化したマイクロアレイに、第三の増幅産物を接触させ、第三のプローブと相補的に結合した第三の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
フィトフトラ属菌は、土壌中や植物体内で生息する病原菌であり、１９世紀の中頃にヨーロッパにおいてジャガイモ飢饉を引き起こしたフィトフトラ・インフェスタンスが有名である。
【００１８】
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、このようなピシウム属菌とフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を好適に増幅させることが可能となっている。
また、上記の第二のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能であり、上記の第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
【００１９】
また、本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第一のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を好適に増幅させ、第一のプローブ、第二のプローブ、及び第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、これらの微生物をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００２０】
さらに、本実施形態の微生物の検査方法は、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのＤＮＡと第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第四の増幅産物に相補的に結合する配列番号１７に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第四のプローブを固定化したマイクロアレイに、第四の増幅産物を接触させ、第四のプローブと相補的に結合した第四の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第四のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及び例えばアスペルギルス・バージカラーなどのその他の微生物を検出することが可能となっている。
なお、その他の微生物はアスペルギルス・バージカラーに限定されず、上記の第四のプローブを固定化したマイクロアレイを、真菌共通用として利用しても良い。
【００２１】
またさらに、本実施形態の微生物の検査方法は、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットと、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、試料におけるプラズモディオフォラ属菌の有無を判定することを特徴とする。
また、本実施形態の微生物の検査方法は、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと第二のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第五の増幅産物に相補的に結合する配列番号１８に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブを固定化したマイクロアレイに、第五の増幅産物を接触させ、第五のプローブと相補的に結合した第五の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
【００２２】
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第二のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、上記の第五のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
【００２３】
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号７または８に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットと、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、試料におけるピシウム属菌の有無を判定することを特徴とする。
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌のＤＮＡと第三のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第六の増幅産物に相補的に結合する配列番号１９に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブを固定化したマイクロアレイに、第六の増幅産物を接触させ、第六のプローブと相補的に結合した第六の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
【００２４】
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第三のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、上記の第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
【００２５】
また、本実施形態の微生物の検査方法によれば、第二のプライマーセットと第三のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌とピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させ、第五のプローブと第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌とピシウム属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００２６】
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットと、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき、試料におけるピシウム属菌またはフィトフトラ属菌の有無を判定することを特徴とする。
また、本実施形態の微生物の検査方法は、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡと第四のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第七の増幅産物に相補的に結合する配列番号２０または２１に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブを固定化したマイクロアレイに、第七の増幅産物を接触させ、第七のプローブと相補的に結合した第七の増幅産物の標識を検出することを特徴とする。
【００２７】
本実施形態の微生物の検査方法によれば、上記の第四のプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、上記の第七のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌を検出することが可能となっている。
【００２８】
ここで、本実施形態の微生物の検査方法において、プライマーセットとして、β-チューブリン遺伝子を標的とする第一のプライマーセットを用いることなく、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とするプライマーセットを用いる場合、第三のプライマーセット（配列番号７，８，１０）と、第四のプライマーセット（配列番号８，１１）を組み合わせて用い、かつ第六のプローブ（配列番号１９＋相補配列）と第七のプローブ（配列番号２０，２１＋相補配列）を固定化したマイクロアレイを用いることで、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌の検出について、以下のように判定することができる。
まず、第六のプローブと第七のプローブの両方について増幅産物の標識が検出された場合、ピシウム属菌が存在し、フィトフトラ属菌の存否は、不明であることが分かる。また、第六のプローブについて増幅産物の標識が検出されず、第七のプローブについて増幅産物の標識が検出された場合、ピシウム属菌が存在せず、フィトフトラ属菌が存在することが分かる。また、第六のプローブと第７のプローブの両方について増幅産物の標識が検出されない場合、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌のいずれも存在しないことが分かる。
【００２９】
なお、本実施形態の微生物の検査方法において、上述の通り、プライマーセットとして、β-チューブリン遺伝子を標的とする第一のプライマーセットを用いる場合、第一のプローブ（配列番号１２＋相補配列）、第二のプローブ（配列番号１３，１４＋相補配列）、及び第三のプローブ（配列番号１５，１６＋相補配列）を固定化したマイクロアレイを用いることで、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００３０】
本実施形態の微生物の検査キットは、植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき試料における微生物の有無を判定するために用いる微生物の検査キットであって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを含むことを特徴とする。
【００３１】
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を好適に増幅させることが可能となっている。
【００３２】
また、本実施形態の微生物の検査キットは、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを含むことを特徴とする。
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査キットによれば、上記各プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子と、プラズモディオフォラ属のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ好適に同時に増幅させることが可能となっている。
【００３３】
また、本実施形態の微生物の検査キットは、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号７または８に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを含むことを特徴とする。
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査キットによれば、上記各プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子と、プラズモディオフォラ属、及びピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ好適に同時に増幅させることが可能となっている。
【００３４】
また、本実施形態の微生物の検査キットは、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを含むことを特徴とする。
本実施形態の微生物の検査キットによれば、このようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を好適に増幅させることが可能となっている。
また、本実施形態の微生物の検査キットによれば、上記各プライマーセットを用いてＰＣＲを行うことによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子と、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ好適に同時に増幅させることが可能となっている。
【００３５】
本実施形態の微生物の検査方法、及び微生物の検査キットを用いるにあたり、試料からＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。
まず、微生物のコロニーを採取して、液体窒素などによりコロニーを凍結し、コロニーに含まれる微生物の細胞を破砕する。次に、得られた微生物の細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl  trimethyl  ammonium  bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。また、土壌中から直接カビのＤＮＡを抽出することもできる。この場合も、ＤＮＡの抽出は、直接溶菌法（Direct  Lysis  Method）による方法や土壌ＤＮＡ抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【００３６】
次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法として、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００３７】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP））、プライマーセット、核酸合成酵素（ＥＸ  Ｔａｑ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
【００３８】
本実施形態の微生物の検査方法、及び微生物の検査キットを用いるにあたり、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、各微生物の標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃  １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃  １０分
【００３９】
また、本実施形態及び実施例において、プライマー及びプローブは、それぞれの塩基配列そのものに限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１または数個の塩基が欠損、置換または付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
【００４０】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、それぞれの塩基配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、それぞれの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００４１】
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにおいて用いるプライマー及びプローブは、いずれも１６〜４０ｍｅｒ（塩基）程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成することができる。
【００４２】
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、植物組織または土壌、水、もしくはその他の環境中から試料を採取し、試料に含まれる微生物群からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物に基づき試料における微生物の有無を判定する微生物検査用マイクロアレイであって、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号１〜３に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号４，５に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるリバースプライマーとからなる第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第一の増幅産物に相補的に結合する配列番号１２に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第一のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第一のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
【００４３】
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、ピシウム属菌のＤＮＡと、第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第二の増幅産物に相補的に結合する配列番号１３または１４に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第二のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第二のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、第一のプローブと第二のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌とピシウム属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００４４】
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、フィトフトラ属菌のＤＮＡと、第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第三の増幅産物に相補的に結合する配列番号１５または１６に示す塩基配列の少なくともいずれかからなる第三のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、フィトフトラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、第一のプローブ、第二のプローブ、及び第三のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００４５】
さらに、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及びその他の微生物の少なくともいずれかのＤＮＡと、第一のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第四の増幅産物に相補的に結合する配列番号１７に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第四のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第四のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、フィトフトラ属菌、及び例えばアスペルギルス・バージカラーなどのその他の微生物を検出することが可能となっている。
【００４６】
またさらに、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡと、プラズモディオフォラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第二のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第五の増幅産物に相補的に結合する配列番号１８に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第五のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第五のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌を特異的に検出することが可能となっている。
【００４７】
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、ピシウム属菌のＤＮＡと、ピシウム属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号７または８に示す塩基配列の少なくともいずれかからなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第三のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第六の増幅産物に相補的に結合する配列番号１９に示す塩基配列及びこの相補配列の少なくともいずれかからなる第六のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌を特異的に検出することが可能となっている。
また、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、第五のプローブと第六のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、プラズモディオフォラ属菌とピシウム属菌をそれぞれ特異的に同時に検出することが可能となっている。
【００４８】
さらに、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡと、ピシウム属菌またはフィトフトラ属菌のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲによる増幅の標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなる第四のプライマーセットを用いてＰＣＲにより得られた第七の増幅産物に相補的に結合する配列番号２０または２１に示す塩基配列及びこれらの相補配列の少なくともいずれかからなる第七のプローブを固定化したことを特徴とする。
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイによれば、上記の第七のプローブを固定化したマイクロアレイを用いることによって、ピシウム属菌とフィトフトラ属菌を検出することが可能となっている。
【００４９】
本実施形態の微生物検査用マイクロアレイは、検出対象の微生物を検出するための上記プローブの少なくとも１つを固定化したものであれば、特に限定されるものではなく、例えばスポット型ＤＮＡマイクロアレイ、合成型ＤＮＡマイクロアレイなどを用いることができる。
例えば、本実施形態の微生物検査用マイクロアレイとして貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【００５０】
次に、増幅産物を本実施形態の微生物検査用マイクロアレイに滴下し、この微生物検査用マイクロアレイに固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の微生物を特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比値（Signal  to  Noise  ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【００５１】
以上説明した通り、本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイによれば、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌を好適に検出することが可能になる。
【実施例】
【００５２】
（試験１）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するための試験を行った。
【００５３】
具体的には、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・アファニデルマタム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ウルティマム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
そして、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００５４】
絶対寄生菌であるプラズモディオフォラ・ブラシカエは、京都府立大学  植物病理学研究室から譲り受けたものを使用した。ピシウム属菌とフィトフトラ属菌は、ＮＢＲＣ（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター  ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。後述する試験も含めて、該センターから入手した菌株は以下の通りである。
ピシウム・アファニデルマタム（Pythium  aphanidermatum）  NBRC7030
ピシウム・ウルティマム（Pythium  ultimum）  NBRC100125
ピシウム・ジンジベリス（Pythium  zingiberis）  NBRC30818
フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）  NBRC9174
【００５５】
ＰＣＲ反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社島津製作所製）を用いて、以下の組成のものを使用した。各プライマーは、オペロンテクノロジー株式会社により合成したものを使用した。
・Ampdirect(G/Crich)  4.0μl
・Ampdirect(addition-4)  4.0μl
・dNTP  Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)  1.0μl
・Cy-5  dCTP  0.2μl
・EX  Taq  Hot  Start  DNA  polymerase  (5U/μl)  0.2μl
・フォワードプライマー(10μM)  1.0μl
・リバースプライマー  (10μM)  1.0μl
・試料のＤＮＡ  (100pg/μl)  1.0μl
・水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【００５６】
ＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（Ｒ）  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  タカラバイオ株式会社製）により、実施形態で説明したものと同一の次の条件で行った。
（a）９５℃  １０分
（b）９５℃  ３０秒
（c）５６℃  ３０秒
（d）７２℃  ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃  １０分
【００５７】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記マイクロアレイに滴下した。このマイクロアレイを４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をマイクロアレイから洗い流した。
そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ），東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、上記マイクロアレイに固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図３に示す。
【００５８】
図３において、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１２と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・アファニデルマタムとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１３と１７、配列番号１５と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００５９】
同様に、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物が、配列番号１２と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１３と１７、配列番号１５と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００６０】
（試験２）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するためのさらに試験を行った。
【００６１】
具体的には、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・アファニデルマタム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
そして、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００６２】
ＰＣＲ反応液、及びＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様の組成及び同一の条件で行った。
そして、試験１と同様にＰＣＲ増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を取得した。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４において、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１２と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・アファニデルマタムとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１４と１７、配列番号１６と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００６４】
同様に、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物が、配列番号１２と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ジンジベリスとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１４と１７、配列番号１６と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００６５】
（試験３）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するためのさらに試験を行った。
【００６６】
具体的には、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら４種類の微生物のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
そして、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００６７】
ＰＣＲ反応液、及びＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様の組成及び同一の条件で行った。
そして、試験１と同様にＰＣＲ増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を取得した。その結果を図５に示す。
【００６８】
図５において、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１２と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ジンジベリスとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１４と１７、配列番号１６と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００６９】
同様に、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物が、配列番号１２と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ジンジベリスとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１４と１７、配列番号１６と１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
さらに、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００７０】
（試験４）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出できるかを検証するための試験を行った。
【００７１】
具体的には、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・アファニデルマタム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ウルティマム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
そして、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、及び配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００７２】
ＰＣＲ反応液、及びＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様の組成及び同一の条件で行った。ただし、ＰＣＲ反応液は、試料のＤＮＡとして、菌毎に1.0μl、合計4.0μlを含めたものを使用した。
そして、試験１と同様にＰＣＲ増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を取得した。その結果を図６に示す。
【００７３】
図６において、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・アファニデルマタム、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１２、１３，１５に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
【００７４】
同様に、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ウルティマム、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１２、１３，１５に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
【００７５】
（試験５）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、β-チューブリン遺伝子を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出できるかを検証するための試験をさらに行った。
【００７６】
具体的には、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・アファニデルマタム、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、フィトフトラ・インフェスタンス、及びアスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
【００７７】
さらに、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら４種類のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
また、β-チューブリン遺伝子を標的とする配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら４種類の微生物のＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
【００７８】
そして、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００７９】
ＰＣＲ反応液、及びＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様の組成及び同一の条件で行った。ただし、ＰＣＲ反応液は、試料のＤＮＡとして、菌毎に1.0μl、合計4.0μlを含めたものを使用した。
そして、試験１と同様にＰＣＲ増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を取得した。その結果を図７に示す。
【００８０】
図７において、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・アファニデルマタム、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１２、１４，１６に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
【００８１】
同様に、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１２、１４，１６に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号２に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
【００８２】
さらに、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１２、１４，１６に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
【００８３】
同様に、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ジンジベリス、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１２、１４，１６に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号５に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、アスペルギルス・バージカラーのＤＮＡにおけるβ-チューブリン遺伝子をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１７に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出された可能性があることが示されている。
【００８４】
（試験６）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等をそれぞれ単独で検出できるかを検証するための試験を行った。
【００８５】
具体的には、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、ピシウム・ウルティマム、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
また、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら３種類の微生物のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
【００８６】
さらに、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら３種類の微生物のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
また、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、これら３種類の微生物のＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をそれぞれ個別にＰＣＲにより増幅した。
【００８７】
そして、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００８８】
ＰＣＲ反応液、及びＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様の組成及び同一の条件で行った。
そして、試験１と同様にＰＣＲ増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を取得した。その結果を図９に示す。
【００８９】
図９において、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１８に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１９に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
また、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物も、配列番号１９に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００９０】
さらに、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットを用いて、ピシウム・ウルティマムとフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物が、配列番号２０と２１に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００９１】
（試験７）
本実施形態の微生物の検査方法、微生物の検査キット、及び微生物検査用マイクロアレイにより、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とするプライマーセット及びプローブを用いて、プラズモディオフォラ属菌、ピシウム属菌、及びフィトフトラ属菌等を同時に検出できるかを検証するための試験を行った。
【００９２】
具体的には、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットとを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、及びピシウム・ウルティマムのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
【００９３】
また、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットとを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、及びピシウム・ウルティマムのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
【００９４】
さらに、ｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を標的とする、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットとを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、及びフィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域を一つのＰＣＲ反応液を用いて、ＰＣＲにより同時に増幅した。
そして、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に示す塩基配列からなるプローブがそれぞれ固定化されたマイクロアレイに、上記のＰＣＲによる増幅産物を滴下して、増幅産物の蛍光標識を検出した。
【００９５】
ＰＣＲ反応液、及びＰＣＲ法による遺伝子の増幅は、試験１と同様の組成及び同一の条件で行った。ただし、ＰＣＲ反応液は、試料のＤＮＡとして、菌毎に1.0μl、合計2.0μlを含めたものを使用した。
そして、試験１と同様にＰＣＲ増幅産物とプローブのハイブリダイズを行って、標識検出装置により各プローブにおける蛍光強度を測定し、Ｓ／Ｎ比値を取得した。その結果を図１０に示す。
【００９６】
図１０において、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットとを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエ、及びピシウム・ウルティマムのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、それぞれ配列番号１８，１９に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００９７】
また、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットとを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１８に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されると共に、ピシウム・ウルティマムのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号２０，２１に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００９８】
さらに、配列番号６に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号８に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１１に示す塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットとを用いて、プラズモディオフォラ・ブラシカエのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号１８に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されると共に、フィトフトラ・インフェスタンスのＤＮＡにおけるｒＤＮＡ遺伝子ＩＴＳ領域をＰＣＲにより増幅して得られた増幅産物は、配列番号２０，２１に示す塩基配列からなるプローブに結合して、標識が検出されたことが示されている。
【００９９】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、上記各プライマーセットをＰＣＲ反応液において単独で用いてもよく、複数のプライマーセットを全ての組合せで一つのＰＣＲ反応液で同時に用いてもよい。また、微生物検査用マイクロアレイにおいて、上記各プローブは、全ての組合せでそれぞれ単独でまたは複数で用いるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明は、植物組織や土壌検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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