(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプルにおけるコピー数多型（CNV）を測定する方法であって、
デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の枯渇により増幅を制限するように、１以上のdNTPの低減した濃度における同じ反応系で少なくとも前記核酸サンプルの目的領域及び参照領域を同時に増幅することにより、少なくとも前記２つの領域の初期の比率を維持しつつ、反応をプラトーまで行う工程、
前記増幅する工程において生成した増幅産物の融解曲線を測定する工程、及び
参照の核酸の参照曲線と前記融解曲線を比較する工程であって、２つの曲線間の差異がコピー数多型の存在を示す工程
を含む、方法。
【請求項２】
(a)前記反応のプラトー前の増幅サイクルの総数を制限すること、又は
(b)増幅の間に存在するポリメラーゼ量を制限して少なくとも前記２つの領域の増幅を減少させること、
の１以上の工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅開始前の１以上のdNTPの濃度が、200μMである標準PCRプロトコル濃度の５０％以下に制限される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２つの曲線間の比率を計算する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
融解曲線を測定する工程が、温度に対する蛍光データを取得する工程を含み、前記融解曲線のデータが負の微分プロットとしてプロットされ、前記増幅した領域を融解ピークとして表示する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光が飽和色素若しくは不飽和色素により生じる、又は標識プローブにより生じる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
全ての参照ピークが同じ温度になるように、サンプル間の参照ピークの位置を標準化する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記データの標準化が、相乗平均を用いて蛍光強度を調整することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸サンプルが胎児のDNAを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記胎児のＤＮＡが母体血清由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸サンプルが癌であると疑われる組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
患者におけるヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染に対する感受性を測定する方法であって、
前記増幅した領域の１つがサンプル間で同じコピー数を有する参照領域であり、少なくとも１つの他の領域がサンプル間でコピー数が変化し得る目的領域であり、前記目的領域が、前記患者のケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド3-様1（CCL3L1）遺伝子の一部を含む請求項１に記載の方法を使用することを含む、方法。
【請求項１３】
ウイルス感染の程度を測定する方法であって、前記核酸サンプルがウイルスに感染した組織を含む請求項１に記載の方法を使用することを含む、方法。
【請求項１４】
核酸サンプルにおける目的領域の相対的発現レベルを測定する方法であって、
増幅の間に存在する１以上のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の濃度を制限して前記目的領域の増幅を減少させ、増幅がプラトーに達する際の参照の核酸に対する前記目的領域の比率を維持することにより、該増幅を制限しつつ、各サンプルにおいて前記目的領域と参照の核酸を増幅する工程、
各サンプルにおいて、前記目的領域の融解曲線と前記参照の核酸の融解曲線を測定する工程、
各サンプルにおいて、前記目的領域の融解曲線を該目的領域の融解ピークに変換し、且つ前記参照の核酸の融解曲線を該参照の核酸の融解ピークに変換する工程
サンプル全体で前記参照のピークの蛍光強度を標準化する工程、及び
サンプル間で前記目的領域の融解ピークを比較する工程であって、ピークの差異がサンプル間での相対的発現量の差異を示す工程
を含む、方法。
【請求項１５】
増幅開始前の前記dNTPの濃度が、200μMである標準PCRプロトコル濃度の５０％以下に制限される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸サンプルがメッセンジャーリボ核酸(mRNA)を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅する工程の前に前記mRNAを逆転写する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標準化された曲線の対象ピークを位置付けることにより相対コピー数を定量し、最小二乗フィッティングを行い、前記ピークの高さ又は面積の比率を計算することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
対象核酸及び参照の核酸を含む複数のサンプルにおいて、該対象核酸の対立遺伝子の特異的増幅を行うことにより対立遺伝子の割合を測定する方法であって、
各サンプルにおける対立遺伝子及び参照の核酸を増幅する工程、
前記増幅する工程において生成した各増幅産物の融解曲線を測定する工程、
前記複数のサンプル全体で各参照の増幅産物における融解曲線を標準化する工程、及び
各サンプルにおける前記対象の増幅産物の融解曲線を比較し、各サンプルにおいて前記対立遺伝子の割合を決定する工程を含み、
ここで、各サンプルが、
プライマー対の一つが前記対立遺伝子のみを増幅するように構成され、プライマー対が前記遺伝子の増幅産物を生成するように構成され、該増幅産物はTmを有する、前記対立遺伝子を増幅するためのプライマー対、
前記参照の核酸の増幅産物のTmが、前記対立遺伝子の増幅産物のTmとは異なる、前記参照の核酸の増幅産物を生成するように構成された第２のプライマー対、
ポリメラーゼ、及び
増幅を開始する前の１以上のdNTPが、200μMである標準ＰＣＲプロトコル濃度の５０％以下に制限されている、dNTPをさらに含む、方法。
【請求項２０】
前記対象核酸の第２の対立遺伝子を増幅する工程であって、該第２の対立遺伝子のためのプライマー対の１つが該第２の対立遺伝子のみを増幅するように構成され、該プライマー対が前記第２の対立遺伝子の増幅産物を生成するように構成され、該第２の対立遺伝子の増幅産物がTmを有し、該第２の対立遺伝子の増幅産物のTmが前記対立遺伝子の増幅産物のTmと異なる、工程、及び
前記第２の対立遺伝子の増幅産物の融解曲線を測定する工程
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の対立遺伝子が前記対立遺伝子と同時に前記サンプル中で増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対立遺伝子及び前記第２の対立遺伝子の融解曲線を比較する工程をさらに含み、ここで、２つの曲線の差異が前記対象核酸の対立遺伝子の割合の差異を示す、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に関する。より具体的には、本発明は、PCRを制限し、融解解析を行う方法及びそうした方法及び解析の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸(DNA)コピー数多型(CNV)は、所定の遺伝性疾患、ゲノム再配列、及び癌に関連している。
【０００３】
臨床試験室で通常用いられるCNV検査のための標準的方法は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)である(非特許文献１及び２、[13,14])。FISHの解像度は約100キロベース(kb)であるが、より短いセグメントを含むCNVをこの方法で検出するのは難しい。ヒトゲノム配列の完了後のこの１０年間で、より短いCNVを分解できるいくつかの分子検出技術が正常な個体の中に存在する、著しい程度の構造変化を明らかにしてきた（非特許文献３、[13]）。
【０００４】
この１０年間において開発された最も評判の良い技術としては、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）アレイ、一塩基多型（SNP）アレイ、リアルタイム定量的PCR（定量PCR）、多重ライゲーション依存プローブ増幅、及び超並列シーケンシングが挙げられる。アレイベースの技術（CGHアレイ及びSNPアレイ）は、ヒトのゲノムワイド多型の構造的特徴の広範囲で高解像度のスキャンに効果的である（非特許文献４〜７、[16-19]）。高密度対象アレイの解像度は、数個の塩基対まで達した。近年、CNV検出のための次世代のシークエンシングが用いられている（非特許文献８及び９、[20,21]）。上記方法は時間がかかり、費用のかかる設備及び試薬が必要とされる。
【０００５】
リアルタイムqPCRは、閾値交差サイクル数(ΔΔCq)の変化からCNVを計算するのに用いることができる（非特許文献１０及び１１[22,23]）。このアプローチは迅速であり、高価な機器を必要としない。ヒトゲノムにおいて一般的に確認されるコピー数多型の比率は１０：１以上、又は小さくても４：３程度であり得る。トリソミー(例えば、ダウン症)に関わる３：２の比率は、特に一般的である。理論的には、qPCRは２：１のCNV及びトリソミーまで検出するのに用いられるが、信頼性の高い結果のためには実務上で相当の注意が必要とされ、qPCRにより、より小さい比率を区別するのは非常に難しい。qPCRは一般的に遺伝子発現のために用いられるが、コピー数計測のためには、qPCRは臨床現場ではあまり用いられていない。
【０００６】
MLPAは、遺伝子における多くの欠損及び重複（典型的には、エクソンの欠損及び重複）を検出できるので、臨床試験室における遺伝性疾患に関連するCNVを検出するのに広く用いられている（非特許文献１２及び１３[24,25]）。しかしながら、MLPAは時間がかかり、長く、カスタマイズされたオリゴヌクレオチドプローブを必要とする。これらのすべてのアプローチは、リアルタイムPCRを除いて、完了するのに少なくとも１日かかる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Visakorpi T, Hyytinen E, Kallioniemi A, Isola J, Kallioniemi OP (1994) Sensitive detection of chromosome copy number aberrations in prostate cancer by fluorescence in situ hybridization. Am J Pathol 145: 624-630.
【非特許文献２】Wang F, Fu S, Shao Q, Zhou YB, Zhang X, et al. (2013) High EGFR copy number predicts benefits from tyrosine kinase inhibitor treatment for non-small cell lung cancer patients with wild-type EGFR. J Transl Med 11: 90.
【非特許文献３】International Human Genome Sequencing C (2004) Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931-945.
【非特許文献４】Sharp AJ, Locke DP, McGrath SD, Cheng Z, Bailey JA, et al. (2005) Segmental duplications and copy-number variation in the human genome. Am J Hum Genet 77: 78-88.
【非特許文献５】Urban AE, Korbel JO, Selzer R, Richmond T, Hacker A, et al. (2006) High-resolution mapping of DNA copy alterations in human chromosome 22 using high-density tiling oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 4534-4539
【非特許文献６】Komura D, Shen F, Ishikawa S, Fitch KR, Chen W, et al. (2006) Genome-wide detection of human copy number variations using high-density DNA oligonucleotide arrays. Genome Res 16: 1575-1584
【非特許文献７】Lai WR, Johnson MD, Kucherlapati R, Park PJ (2005) Comparative analysis of algorithms for identifying amplifications and deletions in array CGH data. Bioinformatics 21: 3763-3770.
【非特許文献８】Xi R, Hadjipanayis AG, Luquette LJ, Kim TM, Lee E, et al. (2011) Copy number variation detection in whole-genome sequencing data using the Bayesian information criterion. Proc Natl Acad Sci U S A 108: E1128-1136.
【非特許文献９】Sepulveda N, Campino SG, Assefa SA, Sutherland CJ, Pain A, et al. (2013) A Poisson hierarchical modelling approach to detecting copy number variation in sequence coverage data. BMC Genomics 14: 128.
【非特許文献１０】D'Haene B, Vandesompele J, Hellemans J (2010) Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods 50: 262-270.
【非特許文献１１】Ingham DJ, Beer S, Money S, Hansen G (2001) Quantitative real-time PCR assay for determining transgene copy number in transformed plants. Biotechniques 31: 132-134, 136-140.
【非特許文献１２】Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch A, Zschocke J (2005) MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics 6: 29-35
【非特許文献１３】Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, et al. (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res 30: e57
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
迅速で、CNVを測定し、遺伝子発現を測定する代わりの方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書は、PCRを制限し、融解解析を行う方法を開示する。これらの方法は、遺伝子コピー数多型(CNV)の測定、関連する遺伝子の発現レベルの測定等の種々の目的のために用いることができる。
【００１０】
例えば、ある実施形態において、本方法は、増幅を制限しつつ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて遺伝子サンプルの目的の領域（又は場所、遺伝子座）の増幅を含む。この方法は、任意の得られた増幅産物（アンプリコン）の融解曲線を測定し、次いでこの融解曲線を参照の融解曲線と比較することをさらに含んでもよく、ここで、これらの２つの曲線の間の差異は、遺伝子サンプルの目的の領域におけるコピー数多型の存在を示す。
【００１１】
別の例において、ある実施形態において、本発明は、増幅を制限しつつ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、遺伝子サンプルの目的の領域を増幅すること及び参照を増幅することを含む。本発明は、この目的の領域の融解曲線及び参照の融解曲線を測定し、次いで、この目的の領域の融解ピークを参照の融解ピークと比較することをさらに含んでもよく、ここで、これらの２つのピークの差異は、相対的なコピー数又は発現レベルの差を示す。
【００１２】
PCR融解温度データを解析する方法も開示される。この方法は、遺伝子サンプル及び参照にPCRを行うことを含む。この方法は、LightScanner等を用いて、融解温度に対する生の（未加工の、原）蛍光データを得ることをさらに含む。この方法は、融解温度に対する生の蛍光データからバックグラウンドノイズを除くことを含んでもよい。この方法は、すべての融解温度データを標準化した後、続いて参照の蛍光ピークの高さを標準化して遺伝子サンプルピークにおける差を明らかにすることを含んでもよい。
【００１３】
こうした方法を行うためのキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)濃度を用いる二重増幅を例示する図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａで例示した二重増幅の融解曲線を例示する図である。
【図２−１】図２Ａは、２１サイクルで停止したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物を例示する図である。図２Ｂは、２４サイクルで停止したPCR増幅産物を例示する図である。図２Ｃは、２７サイクルで停止したPCR増幅産物を例示する図である。
【図２−２】図２Ｄは、３０サイクルで停止したPCR増幅産物を例示する図である。図２Ｅは、３３サイクルで停止したPCR増幅産物を例示する図である。
【図３−１】図３Ａは、標準dNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図３Ｂは、100μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図３Ｃは、50μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図３Ｄは、25μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。
【図３−２】図３Ｅは、12.5μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図３Ｆは、6.25μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図３Ｇは、3.125μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図３Ｈは、1.56μMのdNTP濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。
【図４】図４Ａは、１０倍異なる濃度の出発サンプルでのPCR増幅産物を例示する図である。図４Ｂは、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、図１Ａの増幅産物の融解曲線を例示する図である。
【図５】図５Ａは、標準ポリメラーゼ濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図５Ｂは、0.2U/μLのポリメラーゼ濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図５Ｃは、0.1U/μLのポリメラーゼ濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。図５Ｄは、0.05U/μLのポリメラーゼ濃度でのPCRの融解曲線を例示する図である。
【図６】図６Ａは、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、トリソミー１３サンプルの盲検試験の概要を例示する図である。図６Ｂは、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いて解析した、トリソミー１８サンプルの盲検試験の概要を例示する図である。図６Ｃは、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いて解析した、トリソミー２１サンプルの盲検試験の概要を例示する図である。
【図７】図７は、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いて解析した、性染色体の盲検試験の概要を例示する図である。
【図８】図８は、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、ヘテロ接合体欠失の解析を例示する図である。
【図９】図９は、非飽和色素及び本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、コピー数多型の解析を例示する図である。
【図１０】図１０は、本明細書の実施例の多くの場合に用いられるプライマーを列挙している。塩基対のサイズ及びTmは、得られた増幅産物を示している。
【図１１】図１１は、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、癌サンプルのコピー数多型の解析を例示する図である。
【図１２】図１２は、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、サンプルの定量化の結果を例示する図である。
【図１３】図１３は、本明細書に開示した方法の２つの実施形態により測定された相対的遺伝子発現の、通常の定量ＰＣＲに対する相関を例示する図である。
【図１４】図１４は、本明細書に開示した方法の一実施形態を用いる、相対的遺伝子発現の解析を例示する図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、異なるdNTP濃度を用いて、104コピーのヒトゲノムDNAと共に増幅されたプラスミドＤＮＡの一連の希釈系列(1011〜101)を例示する図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、２ｘの希釈系列(220〜29)を示し、214コピーのヒトゲノムDNAと混合されたこと以外は、図１５Ａと同様のものを示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、コピー数比率に対する相対ピーク高さのプロットを示す図であり、ここで、CXCL9増幅産物は1011〜101コピーで提供され、参照遺伝子としての104コピーのマウスのベータアクチンcDNAと共に増幅された。25μMのdNTPを各反応で用いた。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、qPCR法により測定されたコピー数と、相対ピーク高さにより測定されたコピー数の間の相関を例示する図である。qPCR法においてマウスのcDNAベータアクチン参照遺伝子及び対象遺伝子をqPCRにより別々に増幅する。ベータアクチン及びCXCL9のCqを用いて、CXCL9のコピー数を計算した。融解ピークによるCXCL9のコピー数は図１６Ａの式に従って計算する。
【図１７Ａ】図１７Ａは、SMA1遺伝子のコピー数を測定するための単一の対立遺伝子の増幅を示している。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、SMA2遺伝子のコピー数を測定するための単一の対立遺伝子の増幅を示している以外は、図１７Ａと同様のものを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
コピー数多型(CNV)は、遺伝子変異の通常のタイプである。ヒトゲノムのうち、約１３％の遺伝子がコピー数において変異を有している[1]。CNVは、人の疾患及び集団の多様性に関連している。CNVは、ゲノムの構造的再配列、例えば欠損及び重複により引き起こされ得る。多くの遺伝子疾患は、デオキシリボ核酸(DNA)配列の大きなセグメントの損失又は増幅により引き起こされ得る。例えば、嚢胞性線維症の１〜３％のケースは、嚢胞性線維症膜貫通調節因子(CFTR)遺伝子における多数の欠損による減少したコピー数により引き起こされる[2,3]。同様に、乳癌の同様の割合のケースは、乳癌1型感受性遺伝子(BRCAI)及び乳癌2型感受性遺伝子(BRCAII)における多数の欠損により引き起こされる[4-6]。別の例において、染色体全体のCNV、例えばトリソミー13、トリソミー18、及びトリソミー21が生じる。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染に対する感受性は、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3-様1(CCL3L1)遺伝子のコピー数の増加に関連している[7,8]。例えば、上皮成長因子受容体(EGFR)遺伝子のより多いコピー数は、結腸癌及び非小細胞肺癌に関連している[9-12]。
【００１６】
遺伝子のCNVを測定する方法が本明細書に開示される。ある実施形態において、本方法は、目的の領域の増幅を制限しつつ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて遺伝子サンプルの目的の領域を増幅することを含む。この方法は、任意の得られたアンプリコン（増幅産物）の融解曲線を測定し、次いでこの融解曲線を参照の融解曲線と比較することをさらに含んでもよく、ここで、これら２つの曲線の間の差異は、コピー数多型の存在を示す。
【００１７】
特定の細胞、組織、及び／又は生物における遺伝子の発現レベルの測定は、いくつもの理由のために重要であろう。遺伝子の相対的な発現レベルを測定する方法が、本明細書に開示される。この方法は、増幅を制限しつつ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、遺伝子サンプルの目的の領域を増幅すること及び参照を増幅することを含む。この方法は、この目的の領域の融解曲線及び参照の融解曲線を測定し、次いで、この目的の領域の融解ピークを参照の融解ピークと比較することをさらに含んでもよく、ここで、これらの２つのピークの差異は、相対的な発現レベルの差を示す。
【００１８】
目的の領域の増幅の制限は、(a) 目的の領域の増幅のプラトー（停滞期）の前の全PCRサイクル数を制限すること、(b) PCR中に存在するデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)の量を十分に制限して、目的の領域の増幅を減少させること、又は(c) PCR中に存在するポリメラーゼの量を十分に制限して、目的の領域の増幅を減少させることの１つ以上を含んでもよい。
【００１９】
オプション(a)において、PCRサイクルは、増幅の間に発生するバックグラウンドノイズから、目的の増幅された領域が区別可能であるサイクル程度まで制限されてよく、このサイクルを本明細書で「定量化サイクル」又は「Cq」と示す。ある実施形態において、PCRサイクルは、Cqのプラス又はマイナス３サイクル以内まで制限され得る。ある実施形態において、PCRサイクルは、Cqのプラス又はマイナス２サイクル以内まで制限され得る。ある実施形態において、PCRサイクルは、Cqのプラス又はマイナス１サイクル以内まで制限され得る。CqであるPCRサイクルは、初期の鋳型のコピー数に依存し得る。この方法では、CNVを測定する前にサンプルにおけるCqを測定することが必要となる場合がある。
【００２０】
オプション(b)において、ＰＣＲ開始前のdNTPの濃度は、約30%の標準PCRプロトコル濃度から約1%の標準PCRプロトコル濃度まで制限することができ、例えば、約25％、約12.5％、約6.25％、約3.125％、及び約1.56%の標準PCRプロトコル濃度に制限できる。例えば、通常の標準PCRプロトコル濃度である、PCR開始前の約200マイクロモーラー(μM)のdNTPの濃度を一般的に使用するPCRプロトコルにおいて、dNTPの濃度は約50 μMから約3.1 μMまで、例えば約25 μM、約12.5 μM、及び6.25 μMに制限できる。本明細書の実施例において４種すべてのdNTPを制限しているが、例えばGC含有量に応じて、１、２、又は３種のdNTPを制限することもできる。オプション(c)において、PCR開始前のポリメラーゼの濃度は、約50%の標準PCRプロトコル濃度から約20%の標準PCRプロトコル濃度まで制限することができ、例えば、約25％の標準PCRプロトコル濃度に制限できる。例えば、約0.04 U/μLのポリメラーゼ濃度を一般的に使用するPCRプロトコルにおいて、ポリメラーゼの濃度は約0.02 U/μL又は約0.01 U/μLであり得る。
【００２１】
遺伝子のCNVを測定する方法は、コピー数の違いの割合及び／又は参照に対する遺伝子サンプルのコピー数の比率を計算することをさらに含み得る。この遺伝子の相対的な発現レベルを測定する方法は、発現レベルの違いの割合及び／又は比率を計算することをさらに含むことができる。
【００２２】
遺伝子のCNVを測定する方法において、遺伝子サンプルは、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)等の拡散を含み得る。遺伝子の相対的な発現レベルを測定する方法において、遺伝子サンプルはメッセンジャーリボ核酸(mRNA)を含み得る。サンプルがmRNA等のRNAを含む場合、この方法は増幅工程の前に遺伝子サンプルの逆転写を行うことを含み得る。
【００２３】
本方法のある実施形態において、PCRはエンドポイントPCRを含む。例えば、エンドポイントPCRは、遺伝子のCNV又は相対的な発現レべルの相対的又は絶対的な測定に用いることができる。
【００２４】
本方法のある実施形態において、PCRはリアルタイムPCRを含む。
【００２５】
遺伝子のCNVを測定する方法は、目的の領域と同じ反応混合物中で参照を増幅させることを含んでもよい。この参照は、遺伝子サンプルの目的の領域の野生型対立遺伝子を含み得る。この参照は、未知の増幅効率を有していてもよい。参照のためのプライマーは、目的の領域のためのプライマーと異なっていてもよいし、同じであってもよい。参照のためのプライマー及び目的の領域のためのプライマーの濃度は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【００２６】
発現レベルを測定する方法において、参照は、目的の領域の遺伝子の同じ細胞又は組織で発現するハウスキーピング遺伝子を含んでもよい。この参照は、未知の増幅効率を有していてもよい。参照のためのプライマーは、目的の領域のためのプライマーと異なっていてもよい。参照のためのプライマー及び目的の領域のためのプライマーの濃度は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【００２７】
本方法のある実施形態において、遺伝子サンプルの目的の領域及び参照の増幅産物は、最小限の一塩基多型(SNP)を有する領域及び他の配列変異体（バリアント）から選択され得る。ヘテロ接合変異体又はSNPが目的の領域又は参照の増幅産物に存在する場合、対応する融解ピークはより小さく広くなるか、又は２つのピークを示し、検出精度を低下させ得る。同じ理由により、目的の領域及び参照の断片は、参照のピークに対して標準化するのにより容易である単一の融解ドメインを呈するように選択され得る。参照ピークにおける２つの融解ドメインは、理解するのにそれほど難しくないが、目的の領域の断片が２以上の融解ドメインを有する場合、シグナルはピーク間で分割される場合があり、相対的な発現レベル又はコピー数多型の測定がより難しくなる場合がある。ある実施形態において、増幅産物は、目的の領域及び参照の断片のそれぞれが１つの融解ドメインを有するように設計され得る。
【００２８】
本方法のある実施形態において、マルチプレックスPCRの間、アニーリング及び増幅効率が、種々のプライマーにおいて異なり得る。これは、反応が進行するにつれて、参照の増幅産物に対する目的の領域の増幅産物の比率に影響を与える場合があり、結果における不確実性の原因になり得る。アニーリング時間の増大は、効率性を均等化するのに用いられ得る。アニーリング時間は、不特定の生成物の増幅を避けるような時間に十分に制限され得る。
【００２９】
本方法のある実施形態において、本方法は融解温度に対するハイブリダイゼーション蛍光データを取得することを含み得る。
【００３０】
ある実施形態において、蛍光は、当業者に公知である、飽和dsDNA結合色素、例えばLCGreen、LCGreen+、Syto9、EvaGreen、及びResoLight Dye、並びに他の飽和色素により発生し、これらの多くは米国特許第7,456,281号に列挙されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。蛍光は、当該技術分野に公知である、不飽和dsDNA結合色素によっても発生し得る。最も一般的に使用される不飽和dsDNA結合色素は、SYBRグリーン(SYBRGreen) Iであり、一方、他の一般的に使用される不飽和dsDNA結合色素は、米国特許第7,582,429号の表１に列挙されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。ホモ接合遺伝子型において、飽和dsDNA結合色素の使用が望ましいであろうことが理解され、こうした色素は正確さの点で有利である。ヘテロ接合遺伝子型において、ヘテロ接合遺伝子型が低温ピーク又は発生するミスマッチ（不一致）からのショルダーを生じ得るため、不飽和色素が好ましく、不飽和色素の再配分はそうした低温ピーク又はショルダーを最小化し得る。しかしながら、色素の具体的な選択は、行われる実際のアッセイに応じて変化し得る。ある実施形態において、蛍光は標識化プローブ、例えば分子ビーコン、ハイブリダイゼーションプローブ、TaqManプローブ、スコーピオンプローブ、LNA（ロックド核酸）プローブ、及びサイクリングプローブにより発生し得る。
【００３１】
ある実施形態において、1つの対立遺伝子のみを増幅することが望ましい。ARMS PCR（又は、特定の対立遺伝子のPCR増幅(PASA)）において、プライマーの一つは、プライマーの3’-末端に位置する単一のヌクレオチド残基において異なる鋳型と区別できるように設計される。この3’-末端とマッチする配列のみが効率的に伸長する。そのため、ARMSプライマーは、非相補的な対立遺伝子からの単一塩基程の少ない程度で、別の対立遺伝子の増幅に対する不応性を残しながら、マルチ対立遺伝子システムの特定の因子を増幅するように設計され得る。単一の対立遺伝子を増幅する他の方法は公知であり、本明細書において考慮される。
【００３２】
PCRは本明細書の実施例において用いられる増幅方法であるが、サイクル、ポリメラーゼ若しくは他の適切な酵素の量、又はｄNＴP若しくはNTPsの量を制限することにより増幅停滞期を制限する任意の増幅方法が適当であり得ることが理解される。こうした適当な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)；鎖置換増幅（SDA）；核酸配列ベース増幅（NASBA）；カスケードローリングサークル増幅（RCA）；DNAのループ媒介等温増幅（LAMP）；核酸の等温およびキメラプライマー開始増幅（ICAN）；ターゲットベースのヘリカーゼ依存性増幅（HDA）；転写媒介増幅（TMA）等が挙げられる。そのため、用語「PCR」が用いられる場合、他の代わりの増幅方法を含むことが理解されるべきである。
【００３３】
融解温度に対して取得された蛍光データに対して、高分解能融解分析が行われ得る。高分解能融解分析は、温度及び蛍光強度の両方に関するデータを標準化することを場合により含み得る。目的の領域の融解曲線と参照の核酸の参照曲線との比較は、融解ピークの標準化及びピーク高さ又は目的の領域における融解曲線の領域の差異の観察を含み得る。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,582,429号を参照されたい。しかしながら、負の微分がピーク高さを測定する場合に用いられるので、標準化は必要ない場合がある。
【００３４】
CNVを測定する本方法のある実施形態において、相対的なコピー数が定量される。他の実施形態において、絶対量が定量される。絶対的定量のために、遺伝子サンプル濃度は標準化され得る。また、絶対的定量のために、参照は遺伝子サンプルと一緒に増幅されないようにすることができ、また、参照は検量曲線を含み得る。
【００３５】
本方法のある実施形態において、同じ遺伝子サンプルの複数の目的領域は、同じPCRで増幅され得る。こうした実施形態において、目的の各領域のプライマーは、互いに異なってもよく、優先的には同じ又は同様のプライマーTmを有する。しかしながら、増幅産物Tmは、例えば、４〜１０℃の差で互いに区別された方がよい。生成物の融解温度を４℃よりも近くすること（例えば、１〜２℃）もできるが、ピークは重複し始め、各生成物に対して正確なピーク高さ又は面積を特定するのがより難しくなり得る。複数のガウス曲線を重複するピークに適用して高さ又は面積をより正確に推定できるが、融解ピークを分離できるならば、こうした問題をさけるためにより簡単である。参照及び対象のコピー数が、例えば１０：１で大きく異なり、Tmが近い場合に特に問題となる。複数のガウス曲線の適用はより小さいピークの存在を明らかにし得るが、同定されるべき微分融解プロットにおけるピークではない場合さえあり得る。
【００３６】
遺伝子のCNVを測定する本方法は、PCR反応において、単純にdNTP、DNAポリメラーゼ、サイクル数（又は組み合わせ）を制限することによるDNA融解分析を用いてCNVを検出できる。この方法は、コピー数多型を定量するのに用いられる現在の最先端の方法よりもずっと簡単（単純）で、より速く、そしてより経済的であり、及び／又は、より正確であり得る。さらに、鋳型を調整する必要も、特別なオリゴヌクレオチドを修正又は設計する必要もなくてよい。本開示の方法は、一体化した融解（機器）を有する任意のPCRプラットホーム又は別々の融解機器（例えばLightScanner）を伴うPCRプラットホームを用いて行われ得る。いくつかの実施形態において、リアルタイムPCRは必要ではないが、しかし用いてもよい。本発明の方法を実施するには、PCRの後でわずか５〜１０分が必要とされ得る。CNVに関連する多くの深刻な状況を考慮すると、CNVを検出し、定量するためのこうした技術の改善は、非常に有益であり得る。本方法は、全ゲノム方法（CNVアレイ、SNPアレイ、又は次世代シーケンシング）によりコピー数多型を仮に検出した後に、コピー数多型の存在を確認するのに用いられてもよい。
【００３７】
胎児における先天異常を検出する方法も開示される。この方法は、上述した遺伝子のCNVを検出する方法の１つを用いることを含み、また、胎児のDNAを含む遺伝子サンプルを使用することを含む。ある実施形態において、胎児のDNAは母体血清から得られ得る。
【００３８】
遺伝性疾患を検出する方法も開示される。この方法は、上述した遺伝子のCNVを検出する方法の１つを用いることを含む。
【００３９】
癌の種類を測定する方法も開示される。この方法は、上述した遺伝子のCNVを検出する方法の１つを用いることを含み、また、癌であると疑われる組織に由来する遺伝子サンプルを用いることを含む。例えば、特定のCNVの存在に応じて、結腸癌及び／又は肺癌を同定することができる。
【００４０】
患者におけるヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染に対する感受性を測定する方法も開示される。この方法は、上述した遺伝子のCNVを検出する方法の１つを用いることを含み、ここで、遺伝子サンプルの目的の領域は、患者のケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3-様1(CCL3L1)遺伝子の一部を含む。
【００４１】
ウイルス感染の程度を測定する方法も開示される。この方法は、上述した遺伝子のCNVを検出する方法の１つを用いることを含み、また、ウイルスに感染した組織からの遺伝子サンプルを使用することを含む。この方法は、参照としてアーマードウイルス（armored virus）を用いることをさらに含んでもよい。
【００４２】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の融解温度データを解析する方法も開示される。この方法は、少なくとも一つの遺伝子座及び参照遺伝子に対してPCRを行うことを含む。この方法は、融解温度に対する生の蛍光データを取得することをさらに含む。この方法は、融解温度に対する生の蛍光データからバックグラウンドノイズを除くことをさらに含む。この方法は、残った融解温度データを標準化し、次いで参照蛍光ピークを標準化して、遺伝子座ピークのピーク高さ又は面積を比較することをさらに含む。
【００４３】
バックグラウンドノイズの除去は、指数的バックグラウンド減算を行うことを含んでもよいが、バックグラウンドノイズを除去する他の方法も考慮される。
【００４４】
残った融解温度データの場合によるシフト又はオーバーレイは、曲線間の最小二乗分離を最小化するために得られる曲線のそれぞれのシフトを含んでもよい。このシフトは特定の間隔にわたって各曲線の平均温度を測定し、その各平均値とすべての曲線の中央値の平均との差異により各曲線をシフトすることを含み得る。特定の間隔は、ピーク強度の約５％〜約１５％の蛍光強度に相当する温度データであり得る。特定の間隔は、高温領域であって、指数関数的に減少するハイブリダイゼーションからの移行状態である低ハイブリダイゼーション領域、例えば、温度融解に対する蛍光データの負の微分プロットの右手側の最も「足首型」領域等であり得る。
【００４５】
他の実施形態において、参照ピークは、比較される遺伝子座のピーク又は面積蛍光の強度の標準化用として作用するだけではなく、増幅プレートの位置又はバッファの相違によるサンプル間のわずかな温度の相違を修正する内部対照（コントロール）としても作用し得る。その結果、参照ピークは、比較のためのより正確な曲線を得るために、２つの機能を有する：蛍光強度の標準化及び温度調整。
【００４６】
ある実施形態において、残った融解温度データの標準化は、カーブ間の最小二乗分離以外の標準を用いてもよく、例えば、最大又は平均絶対値、二乗平均平方根、微分係数、
、及び／又はL^p値（pは無限大、1、及び2）が挙げられる。選択した標準は、中央、下方、又は上方の蛍光強度又は温度範囲の周辺で測量されてもよい。さらに、各標準は、フィッティング（近似、補正）されたデータに対してよりも個々のデータに対して適用され得る。標準化は、目的の領域及び参照ピークの公知の保存された特徴の分離を最小化するように選択することができ、ここで、分離は標準又は距離関数の特性を満足する任意の数学的量により定義される。
【００４７】
ある実施形態において、残った融解温度データの標準化は、１又は２の内部コントロールを遺伝子サンプルとともに増幅することを含み得る。内部コントロールのための実際及び予想されるピーク温度の間の相違は、目的の領域のピーク温度を見積もることであり得る。
【００４８】
本方法は、参照の蛍光強度ピークの標準化の前に標準化温度データの負の微分を計算して遺伝子サンプルのピークを比較することをさらに含んでもよい。
【００４９】
他の実施形態において、本方法は、レーベンバーグ・マーカート法を用いて、非線形最小二乗フィットを指数関数Ce^{rt}に行うことにより、バックグラウンドノイズを除去することを含んでもよい。フィッティングしたウィンドウ（枠）内のポイントの（平均）温度の関数としての指数関数的減衰因子「r」は、融解曲線の負の微分の代わりに用いられ得る。バックグラウンドノイズを除去するシステム及び方法は、２００６年９月２０日に出願された「MELTING CURVE ANALYSIS WITH EXPONENTIAL BACKGROUND SUBTRACTION」というタイトルのPCT公報WO2007/035806、及び２０１０年５月１４日に出願された「SYSTEMS AND METHODS FOR AUTOMATED MELTING CURVE ANALYSIS」というタイトルのPCT公報WO2010/132813に記載されており、これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
本方法は、標準化された蛍光ピークに対する偏っていない階層型クラスタリング（不偏階層型クラスタリング）を行うことをさらに含んでもよい。当該技術分野で公知の不偏階層型クラスタリング、例えば参照文献27に記載されたものを用いることができる。
【００５１】
本方法は、最小二乗フィッティングを行い、ピークの比率を計算して、標準化した蛍光ピークの対象ピークを位置づけることにより相対コピー数を定量することをさらに含んでもよい。追加的に又は代わりに、曲線面積の比率を用いてもよい。同様に、本方法は相対的な発現レベルを定量するのに用いることができる。
【実施例】
【００５２】
変化させた特定のパラメータに応じて、増幅を制限する、異なるサイクル数、dNTP、及びポリメラーゼのコピー数比率の定量化の分解能に対する効果を試験する研究結果を、最初に示す。次いで、盲検化試験、１０倍のサンプル容量の変化を用いる試験、高次のマルチプレックス（higher multiplex）、ヘテロ接合体欠失の検出、及びSYBRグリーン実験を次に示す。これらは前の試験から得られた方法及びパラメータを使用することに基づいていた。遺伝子の相対的な発現レベルを測定する本明細書に記載した方法の使用を例示する試験を最後に示す。
【００５３】
染色体Ｘの１、２、３、及び４コピーを有する遺伝子サンプルは、CNV検出方法の研究において有用な鋳型を提供した。１及び２コピーの間の相違の割合は５０％であり、２及び３の間は３３％であり、３及び４の間は２５％である。以下の実施例において、ヒト細胞株のゲノムDNAサンプルをCoriell Institute for Medical Researchから購入した。サンプルNA11472は、染色体Ｘの標準的な１つのコピーを有する男性のＤＮＡである。サンプルNA18800は、染色体Ｘの標準的な２つのコピーを有する女性のＤＮＡである。サンプルNA03623は、染色体Ｘの３つのコピーを含む。サンプルNA11226は、染色体Ｘの４つのコピーを含む。サンプルNA18668は、CFTRのエクソン２及びエクソン３においてヘテロ接合体欠失を有する。５０のゲノムＤＮＡサンプル（トリソミー１３、１８、２１及び野生型のいずれかを示す）、及び別の５０サンプル（モノソミー、三倍体性症候群、及び野生型を示す）は、ARUPラボラトリーズから頂いた。ゲノムＤＮＡを、5プライムDNA抽出試薬を用いて余剰の洗浄した絨毛、胎児の体細胞組織、又は脱落膜から直接抽出した(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)。すべてのＤＮＡサンプルのコピー数多型を、Affymetrix SNP 6.0マイクロアレイにより検出した[26]。
【００５４】
以下の実施例において、uMelソフトウェア(https://dna.utah.edu/umelt/umelt.html)を用いて、コピー数多型(CNV)及び参照の増幅産物の融解曲線及び融解温度（Ｔｍ）を見積もった。目的（対象）の領域の増幅産物及び参照の増幅産物の間のTmの差異は、２〜１０℃の間を示した。ヒトゲノムデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov and http://genome.ucsc.edu）を検索して目的及び参照の配列がヒトゲノム中で固有に表れることを確認し、配列変異の可能性は非常に低かったことを確認した。
【００５５】
以下の実施例において、参照及び目的の断片を以下のとおりに選択した。
【００５６】
第７染色体の嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)のエクソン７の断片を染色体13、18、21、X、及びYのCNV検出の参照として選択した。第７染色体のCFTRのエクソン６の断片を染色体Ｘ単独のCNVの参照として選択した。シトクロムb-245ベータ(CYBB)のエクソン10の断片も染色体ＸのCNVの参照として用いた。性決定領域Y(SRY)の断片を染色体ＹのCNVのために用いた。MIM 104895（NCBI遺伝子バンク番号）の断片を第１３染色体のCNVを検出するのに用いた。チューブリンポリグルタミラーゼ複合体サブユニット２(Tubulin PolyGlutamylase complex Subunit 2)のエクソン４の断片を第１８染色体のCNV解析に用いた。マイクロサテライトマーカーD21S11の近くの断片を第２１染色体と共に用いた。第２１染色体のホルムイミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ(FTCD)のエクソン６の断片をCFTRのエクソン２及びエクソン３欠失のための参照として用いた。参照及び目的のプライマー配列を図１０に示す。
【００５７】
以下の実施例において、２又は３の増幅産物を含むマルチプレックスＰＣＲに続く高分解能の融解解析を用いて、CNV又は相対的な遺伝子発現を検出した。以下の実施例において、一つの成分は常に参照であり、１つ又は２つの対象を伴う。以下で他の言及がない限り、PCR試薬は、 64 ngの抗Taq抗体(eEnzyme)、2 mMのMg++、50 mmol/L (mM) Tris (pH 8.3)、1×LCGreen（登録商標）Plus (BioFire Diagnostics)、及び0.5 μmの各プライマーをとともに、0.04U/μL KlenTaq1（登録商標）(Ab Petides)を含んでいた。5ng〜200ngの異なる濃度のゲノムＤＮＡ及び異なる濃度のdNTPを、定量化のためのアッセイを比較、最適化するのに用いた。PCRを10 μLの容量で行った。
【００５８】
PCRの終了後、高分解能融解を行い、参照と対象の融解ピーク比率を定量した。二重ＰＣＲ（Duplex（デュプレックス）PCR）を用いて、トリソミー１３、１８、及び２１を検出した。トリプレックスPCR(Triplex PCR)を用いて、染色体Ｘ及びＹのCNVを、これらの対応するCNV融解ピークを参照のピークと比較することにより同時に検出した。トリプレックスPCRを用いて、CFTRエクソン２及び３におけるヘテロ接合体欠失を検出した。
【００５９】
LightCycler 480(Roche)でPCRを行った。９５℃で２分間の最初の変性に続いて、各サイクルは、プラトー（停滞期）までの９５℃で１０秒の変性、６５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で１０秒の伸長を含んでいた。上述した各高分解能の融解収集を、ランプ速度0.04°C/sで、65°Cから95°Cまで15回のデータ取得(acquisition)/°Cで行った。プライマーTmよりも１〜２℃高い温度でのアニーリングを用いた。高いアニーリング温度は、非特異的な増幅の可能性を低減する。長いアニーリング時間は、プライマーアニーリング効率の類似性を向上させ、結果がより正確になり、より短い増幅産物が優先的に増幅されない。しかしながら、この増幅プロトコルは例示だけであり、他の増幅プロトコルも使用され得る。
【００６０】
以下の実施例において、いくつかの変形が生の高分解能の融解（蛍光対温度）データに対して適用され、コピー数比率及び相対遺伝子発現を正確に同定し、定量した。最初のステップにおいて、指数的バックグラウンド減算を用いて、ハイブリダイゼーション対温度曲線を抽出した[27]。第２のステップにおいて、温度ドメインの各シフトを得られた各曲線に適用し、サンプルと無関係に保存された特性である低ハイブリダイゼーション区間（[pL,pH]=[.05,.15]）の曲線間の最小二乗分離を最小化した。シフトは、この間隔の間の各曲線の平均温度を検出することにより得られ、その後各曲線を、その各平均値と全曲線の中央値の平均との差分だけシフトする。曲線の温度平均値（平均温度）を、ハイブリダイゼーションが[.05,.15]の間隔の間であるその曲線の点(tj,pj)を抽出し、これらの独立変数及び従属変数を反転して温度を従属変数(pj,,tj)にすることにより求めた。これらの点を、 T(p)=ap2+bp+cの形式のn=2のサビツキー・ゴーレイ又は単にSG2フィッティングとして公知である、最小二乗多項式を用いてフィッティングした[28]。シフトに用いた温度平均値は、間隔[pL,pH]にわたるT(p)の一体の平均値：[a(pH 3- pL 3)/3+b(pH 2- pL 2)/2+c(pH - pL)]/( pH - pL)であった。第３のステップにおいて、シフトした曲線の負の微分を、スライドする枠（ウィンドウ）[T,T+W]におけるシフトした曲線の形式p(T)=aT2+bT+cのSG2フィッティングを行うことにより計算した。各ウィンドウにおける点の平均値<T>でのフィッティングの負の微分を評価することにより、負の微分曲線の点を得た：(<T>, -p’(<T>)=-(2a<T>+b))。第４のステップにおいて、これらの閾値画分の最大値より上の各曲線の参照ピークの一部を抜き出し、再度形式p(T)=aT2+bT+cのSG2フィッティングを計算した。頂点の振幅p(-b/(2a))を計算し、その後、すべてのピークの振幅の平均値に対する参照ピークの振幅の比率の分、各曲線をスケーリングした。
【００６１】
代わりに、上記の第２のステップで記載した曲線オーバーレイ又は温度シフトに代えて、上述したp(T)=aT2+bT+cの一次微分を０に設定(2aT+ b = 0; T = -b/2a)することによる参照ピークの最大温度の測定により、最終段階で各曲線に対する温度調整がなされる。結果として、各曲線は、すべての曲線の主な最大値Ｔに対して水平にシフトする。
【００６２】
例示的に、温度スケールが対応する参照ピークの位置が一致するように調整される場合、これはシグナルピークの相対分離を保つように追加的になされる。そのため、調整される温度の自然な選択は、加算又は相加平均である。これは、同じ合計得るために、いくつかの異なる数字の代わりにそれ自体により加算され得る単一の数字として定義される。例えば、2、5、及び11の加算平均は、2+5+11=18=6+6+6であるため、6である。これは、しばしば平均値と示される。そのため、a_1、a_2、…、a_nと示されるn個の数の加算平均は、1/n (a_1+ a_2 + … + a_n)である。
【００６３】
色素のシグナルスケールが、（例えば、バックグラウンド除去の後に）対応する参照ピークの高さが一致するように調整される場合、これはシグナルピークの相対高さを保つように乗法的にされ得る。そのため、調整されるシグナル（負の微分）ピーク高さの自然な選択は、乗法又は相乗平均である。これは、同じ積を得るために、いくつかの異なる数字の代わりにそれ自体により乗算され得る単一の数字として定義される。例えば、3*8*9=216=6*6*6であるため、3、8、及び9の乗法平均は6である。そのため、a_1、a_2、…、a_nで示されるn個の数の乗法平均は(a_1* a_2 * … * a_n)^(1/n)であり、ここで、括弧内の1/nの累乗は積のn平方根を意味する。
【００６４】
ゼロシグナル（微分）ピークの意義を順守することが望ましく、これはハブリダイズしたＤＮＡとの一定の色素の相互作用からの一定の絶対的な信号と対応する。これは、加法的な調整よりもむしろ乗法的な調整を必要とする。絶対０℃の温度を順守するために、同じことが温度に対しても要求されるのかという疑問が生じ得る。しかしながら、試験の温度スケールにおいて、温度誤差のための適切なモデルは、プレートにおける異なる位置で取得した試験温度における差異、又は１つのランから次のランまでの特定の単一の試験機器における変化による一様なシフトである。
【００６５】
そのため、本明細書で用いるように、融解曲線は、生の（加工されていない）若しくはバックグラウンドを除くことにより調整した、平均の蛍光対温度であるか、又は、シフト若しくは調整を伴う、微分ピーク、又はそれらの組み合わせであり得る。こうした融解データの処理は、アプリケーションに応じて変化することが理解される。
【００６６】
サンプルを、不偏階層型クラスタリングを再スケール化した対象ピークに対して行うことによって、コピー数多型の種類に分類した。相対コピー数を、p(T)=aT2+bT+cの形式の１以上のSG2フィッティングを行い、頂点振幅p(-b/(2a))の比率を計算して、再スケール化した曲線の対象ピークを位置づけることにより定量した。相対遺伝子発現を同様に計算した。
【００６７】
実施例１−サイクル数変更試験
【００６８】
標準的なPCR（スタンダードPCR）を比較の基準を確立するために行った。KlenTaq1(0.04U/μL)及びdNTP(各200μM)の標準PCR濃度を用いて、35サイクル後にPCRはプラトーに達し、平均Cqは24サイクル直前（23.8）であった。Cq前及び後の異なるサイクルでPCRを停止し、融解を行いピークを比較した。18サイクルでPCRを停止した場合、増幅産物の融解ピークは確認されなかった（データ図示せず）。21サイクルでPCRを停止した場合（Cq前）、染色体Ｘの４つの異なるコピーが区別されたが、CNV及び参照のPCR融解ピークは非常に小さかった（図2A）。24サイクルでPCRを停止した場合（Cq）、染色体Ｘの４つの異なるコピーが良好に区別され、融解ピークシグナルは強く、参照に対するCNVの比率は、ゲノム鋳型のものと同じであった(図2B)。27サイクルでPCRを停止した場合（Cq後）、より多くのプライマーが消費され、３コピー及び４コピーのＸ染色体は互いに辛うじて区別可能であった（図２Ｃ）。そのため、ＣＮＶ検出の感度は33%まで低下した（３：２の場合）。３０又は３３サイクルでPCRを停止した場合（プラトーのほぼ前又は後）やはりより多くのプライマーが消費され、Ｘ染色体の４種の異なるコピー数すべてが区別できなかった。（図２Ｄ及び２Ｅ）。３０及び３３サイクルにより、参照及びCNVの増幅産物比は、初期のゲノム鋳型比率よりもむしろプライマーの比率を反映していると言える。
【００６９】
サイクル数を制限する場合、融解によりCNVを検出するためのPCRを制限するために、Cqサイクルが最も効果的であることが示された。この方法によりCNVを区別する能力の感度は、少なくとも25%である（4:3の場合）。
【００７０】
鋳型濃度が異なる場合、Cqは相違し、CqからのCNV比率検出を潜在的に不正確にし得る。このアプローチを用いて、反応を、固定されたサイクル数ではなく、それら自体のCqまで進行させるべきであり、また、初期の濃度の変化はそのサイクルを反応Cqの前又は後に位置させ、ピークからのCNV比率測定の正確性を低下させ得る。
【００７１】
この実施例１の試験から、CqでPCRを停止する場合、CNV検出のために融解ピークは十分に強く、CNVの参照に対する融解ピーク比はゲノムにおけるものと同じであり、プライマーは初期鋳型に対する比率で用いられた。このアプローチは、PCRがプラトーまで達した場合、機能しないと考えられる。例示的なPCR反応において、プライマー及び鋳型に加えて、試薬はMg++、Tris、BSA、Taqポリメラーゼ及びdNTPを含み得る。dNTP及びTaqポリメラーゼ濃度の制限（それぞれ、実施例２及び４）は、PCRがそのプラトーまで達した場合に、CNV比率を区別可能な程度で増幅産物を制限した。
【００７２】
実施例2 - dNTPの変更試験
【００７３】
図３Ａから確認できるように、標準の200μMのdNTP濃度で、PCRがプラトーまで達する場合、染色体Ｘの４種の異なるコピーサンプルの融解ピークは区別できない。
【００７４】
dNTP濃度を100μMまで減少させる場合、１及び２のコピーサンプルのピークはわずかに区別可能である。この濃度では、50%CNV(2:1)の比率は辛うじて区別可能であったが、33%及び25%CNVは区別不可能であった。100μMのdNTP濃度において（図3B）、３５サイクルでプライマー伸長が制限され始めることが理解される。
【００７５】
dNTP濃度をさらに50μM及び25μMまで減少させる場合（それぞれ、図３Ｃ及び３Ｄ）、１、２、及び３のコピーサンプルのピークは互いに区別可能であり、Cq（２７サイクル、図２Ｃ）後の数サイクルで標準ＰＣＲを停止させることにより得られた分解能と同等であり、33%の異なるCNVの比率が区別可能であった。
【００７６】
dNTP濃度を12.5μM、6.25μM、及び3.125μMまで減少させる場合、１、２、３、及び４コピーを有する染色体Ｘのサンプルに対応する融解ピークを明確に区別でき、Cq（サイクル２４）で停止させたスタンダードPCRに相当し、25%のCNVの差異(4:3)の比率を良好に区別した。3.125μMのdNTP濃度において(図３Ｇ)、dNTPが12.5μM(図3E)又は6.25μM(図3F)だった場合ほど融解ピークシグナルは強くなかったが、Ｘ染色体の１、２、３、及び４コピーの融解ピークをより良好に分離する。dNTP濃度が12.5μMから3.12μMまで減少するにつれて（図３Ｇ）、dNTP濃度が低ければ低いほど、CNV溶融ピークのより良好に分離される。6.25μMでのdNTPがゲノムにおけるCNVを検出するのに最良であると確認された。
【００７７】
dNTPをさらに1.56μMまで減少させた場合（図３Ｈ）、より短い参照の増幅産物のピークのみが確認されたが、染色体ＸのCNV断片は確認されなかった。
【００７８】
標準のdNTP濃度(200 μM)のPCRで、より前のPCRのサイクルで、より高いTm(又はより長い増幅産物の)融解ピークは、より高い振幅融解ピークを有し、より低いTm(又はより短い増幅産物の)融解ピークはより低い振幅融解ピークを有する。どちらの融解ピークも同じサイクルで最初に現れる。これは、どちらの断片の増幅効率が同じであることを示唆している。dNTP濃度が減少するにつれて、より高いTmピークの相対増幅は減少し、より低いTmピークの相対増幅は増加する。dNTP濃度が1.56μMに達する場合、より低いTmの断片が増幅されたが、より高いTmの断片はまったく増幅されない（図３Ｈ）。これは、dNTP濃度が減少するにつれて、より長い増幅産物において増幅効率がより迅速に減少することを示している。
【００７９】
図１Ａは、異なるdNTP濃度で、第７染色体のCFTRのエクソン6の断片及びCYBBのエクソン１０の断片の二重増幅を例証している。図１Ｂは図１Ａにおいて例示された二重増幅の融解曲線を例示している。
【００８０】
dNTP濃度を200μMから0.78μMに減少させた場合、PCRのCqが３サイクル後に生じる（図１Ａ）。dNTP濃度が減少するにつれて、より長い増幅産物の融解ピークの相対振幅が減少し、一方、より短い増幅産物の融解ピークの振幅は増加する(図１Ｂ)。
【００８１】
dNTP濃度制御によるCNV検出は、PCRサイクル数制御によって得られるものよりもより良好な結果を与える。理論に縛られることなく、これはおそらくdNTP濃度を減少させることによるCNV検出が、対象及び参照生成物の比率をPCRがプラトーに達する場合であっても同じ程度に維持するためであると考えられる。dNTPを制限するため、たとえPCRがプラトーに達するとしても、CNV及び参照の比率は初期の鋳型濃度に関係なく維持される。各プライマーがその増幅産物のみに影響を与えるので、プライマー濃度を制限する場合、上記比率は必ずしも維持されない。
【００８２】
実施例３−鋳型濃度の変更
次いで、6.25uMのMg++を用いる、ゲノムＤＮＡ鋳型の１０倍異なる濃度（５ngと５０ng）を比較する。図４Ａは、５及び５０ngのＤＮＡ鋳型のCqが異なることを示している。しかしながら、一度すべてのサンプルがPCRプラトーに達するとCNVの参照に対する融解ピークの比率は、初期の１０倍の鋳型濃度の相違に影響されない（図４Ｂ）。dNTP濃度制御によるCNV検出は、結果を一貫性のあるものとするための鋳型濃度の調整を必要としない。
【００８３】
実施例４−ポリメラーゼの変更
【００８４】
Taqポリメラーゼを、たとえ標準のdNTP濃度(200μM)を使用する場合であっても、PCRの間にCNV比率を一定に維持しながらPCRを制限するのに用いることもできる。標準的なKlenTaq1ポリメラーゼ濃度(0.04U/μL)を用いて、染色体Ｘの４つの異なるコピー数に対応する融解ピークは、一般的に分離不可能である（図５Ａ）。0.02U/μLのKlenTaq1では、２及び３コピーの染色体Ｘを有するサンプルに対応する融解ピークが分離されたが、この分離は小さかった（図５Ｂ）。0.01U/μLのKlenTaq1では１及び２コピーのサンプルに対応する融解ピークが良好に分離された。２、３、及び４コピーのサンプルの融解ピークは分離されたが、十分ではなかった（図５Ｃ）。0.005U/μLのKlenTaq1ポリメラーゼにおいて、より短い増幅産物のみが増幅された（図５Ｄ）。0.005U/μLのKlenTaq1ポリメラーゼ未満でも、増幅した断片は十分に検出されない。
【００８５】
実施例５−盲検試験１：トリソミー１３、１８、及び２１
【００８６】
トリソミー１３、１８、及び２１は人において最も一般的である。野生型の参照に対するCNV比率は１（２：２）であり、トリソミーの参照に対するCNVの比率は1.5(3:2)、又は最も高い（トリソミー）ピークとより小さい参照ピークの間の33%の相違である。6.25μMのdNTP濃度を用いる二重ＰＣＲをトリソミー１３、１８、及び２１の盲目試験のために用いた。上述した、10ng/μL〜200ng/μLの初期濃度でトリソミー１３、１８、及び２１並びに野生型サンプルを含む50のサンプルを増幅させた。すべてのトリソミー及び野生型サンプルは、ＰＣＲプラトーまでそれらのコピー数比率を維持した。トリソミー及び野生型は、CNV融解ピークの振幅の調査により容易に区別可能であり、また、不偏階層型クラスタリングにより体系的に且つ自動的に区別可能である。サンプルのうちの９つは、トリソミー１３であると同定され（図６Ａ）、８つはトリソミー１８であると同定され（図６Ｂ）、１３個はトリソミー２１であると同定され（図６Ｃ）、３０個は野生型であると同定された。２：２のコピー比率の野生型及び３：２のコピー比率のトリソミーサンプルの融解ピークは明確に区別可能であった。CNV測定は、前に確立した遺伝子型と完全に相関した。この盲目試験の感度及び自動分類に従う特異性は、どちらも１００％であった。
【００８７】
鋳型濃度を調整しないで、リアルタイムPCRのΔΔCqを計算することによるCNVを検出する標準的な方法を用いて同じサンプルを解析した[22]。この方法を用いても、野生型からトリソミーを区別することはできなかった。2:2のゲノムコピー数の比において、ΔΔCqは０である。野生型及びトリソミーは3:2の比率を示すが、このΔΔCqは１未満であり、これは確実に検出するのが難しい。
【００８８】
実施例６−盲目試験２、染色体X及びYのコピー数
【００８９】
正常の男性の第７染色体：染色体Ｘ：染色体Ｙのコピー数の比は2：1：1であり、その正常の女性の比は2：2：0であり、染色体細胞株NA03623においては、2：3：0である。第７染色体コピーの１つに対して標準化して、第７染色体：染色体Ｘ：染色体Ｙの比は、正常の男性で1：0.5：0.5であり、正常の女性で1：1：0であり、3コピーの染色体細胞株NA03623では1：1.5：0（図７の表２）である。表１は、図７に示されるサンプルの染色体コピー数を示している。
【００９０】
上述した三倍体性染色体異常及び野生型を含む５０のサンプルを、6.25μMのdNTP以外標準的なPCR混合物を使用するトリプレックスＰＣＲを用いる、性染色体CNV盲検試験のために用いた。野生型の男性及び女性のサンプルを、染色体Ｘ及びＹのコピー数の比率により容易に区別できた（図７）。２２のサンプルが正常の女性と同じ比率を示した。これらは、野生型か、染色体Ｘの３コピーを有する３倍体のいずれかであり得る。６サンプルが、染色体Ｙを含まない、第７染色体の２コピー及び染色体Ｘの１コピーを示し、８サンプルが正常の男性と同じ比率を示し、１１サンプルが染色体Ｘの２コピー及び染色体Ｙの１コピーを有する３倍体であった（図７）。そのアレイ解析が染色体Ｘの１コピーと染色体Ｙのコピーを示さなかった２つのサンプルを除いて、すべてのサンプルのＣＮＶ比が正しく分類された。これらの２つのサンプルは、マイクロアレイを用いて再解析され、分析された遺伝子座で野生型であることが分った。
【００９１】
実施例7−ヘテロ接合体欠失の検出
【００９２】
約１〜３％の遺伝性疾患がヘテロ接合体の大きな欠失に関連する。これらの欠失は、１又は複数のエクソン又は遺伝子全体を含み得る。この試験において、細胞株NA18668におけるCFTRのエクソン２及びエクソン３のヘテロ接合体欠失を検体として用いた。トリプレックスＰＣＲを用いて、CFTRのエクソン２及びエクソン３の欠失を同時に検出した。CNV検出のためのCFTRのエクソン２及びエクソン３の短い増幅産物を選択し、予期しないバリアント、例えば、試験における増幅産物に影響を与え得るSNPの可能性を最小限にした。これらの試験において、対象増幅産物のCFTRのエクソン２(Tm 73°C)及びエクソン３(Tm 77°C)のTm値を第２１染色体での参照増幅産物のTm(Tm 83°C)よりも低かった。野生型とのコピー数比率の比較から、細胞株NA18668はCFTRのエクソン２及びエクソン３において明らかにヘテロ接合体欠失を有している（図８）。この試験はまた、コピー数多型を検出するための参照及び対象増幅産物の設計において、Tmの相対的なオーダー（順番）は任意であり、アッセイの効率に影響を与えないであろうということを確認した。
【００９３】
実施例8−SYBRグリーン試験
【００９４】
CNV検出のためのLCGreen Plusの代わりにSYBRグリーンを用いた。１、２、及び３コピー数のサンプルが、 12.5μM（図示せず）及び6.25μM（図９）のdNTP濃度でこれらの融解ピークから区別できた。
【００９５】
実施例9−EGFR試験
【００９６】
EGFRコピー数変化は、肺癌の発病及び肺癌の標的療法のための重要なマーカーであり得る。ARUPラボラトリーズは、８人の匿名の患者由来の、ホルマリン固定及びパラフィン包埋肺腫瘍から抽出したDNAを提供した。各サンプル中のDNA量は測定されていなかった。CFTRのエクソン７を参照DNA対象として用い、EGFRのDNAのレベルを見積もった(エクソン20からの増幅産物)。２重PCR反応物(10μL)は、0.5μMのフォワード及びリバースプライマー、6.25μMのdNTP、0.4UのKlenTaq1（登録商標）(Ab Peptides)、64ngの抗Taq抗体(eEnzyme)、2mMのMg、50mMのTris(pH 8.3)、500μg/mlのウシ血清アルブミン、1xのLCGreen（登録商標）Plus(BioFire Diagnostics)、及び1μLの腫瘍DNA又は25ngの野生型DNAを含んでいた。PCRをLightCycler 480(Roche)で行い、９５℃で２分間の変性に続いて、９５℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、及び７２℃で１０秒間の４０サイクルを行った。各高分解能の融解収集をランプ速度0.04°C/sで、65°Cから95°Cまで15回のデータ取得(acquisitions)/°Cで行った。実施例１〜８と同じ方法を用いてデータを解析した。図１１は、CFTRのエクソン７、８つの非小細胞肺癌(NSCLC)サンプルを用いるEGFR、及び１つの野生型の参照の2重PCRの増幅産物を示している。NSCLCの１つ(#02)のEGFRは、野生型と同じコピー数を有していた（２コピー）。その他は、EGFRコピーの増加を示し、EGFRのコピー数は野生型よりも多かった（１細胞当たり２コピー超）。
【００９７】
実施例１０−定量化
【００９８】
PCRの間にdNTP濃度を制限する方法は、定量のために使用できる。CFTR遺伝子、エクソン27を参照として用いた。プライマー配列を図１０に示す。定量化対象として、種々に希釈したプラスミドを用いた。10^6コピー〜7.8x10^3コピー（１２８倍）の一連の２倍希釈のプラスミドを調製した。6.25μMのdNTP濃度を用いるマルチプレックスPCRを用いた。図１２に示しているとおり、すべての鋳型濃度は区別可能であった。
【００９９】
実施例11−2ステップPCRを用いる相対的遺伝子発現
【０１００】
図１３は、1)制限されたdNTPを用いるマルチプレックスPCR（面積又はピーク高さ）及び本明細書に示した融解データを解析する方法、並びに2)従来の定量PCR(ΔCq)により測定した相対遺伝子発現の相関を示している。マウスOasl2遺伝子の発現を、ボレリアブルグドルフェリ（Borelia Burgdorferi）及びポリI/C（ポリイノシン−ポリシチジル酸）の種々の組み合わせを用いて処理したいくつかのマウス細胞株において測定した。ベータアクチン及びOasl2のプライマー配列及びPCR増幅産物サイズを図１０に示す。マウス細胞株B6、CBCb1、C3H、C3H/HeN、IFNARO/BL6、及びIFNARO/C3Hを用いる試験を３回行った。Mouse RiboPure(登録商標)-Blood RNA単離キットを用いてmRNAを抽出し、このRNAをSuperScript（登録商標）II (Life Technologies)を用いて逆転写した。相対Oasl2遺伝子発現を２つの方法で測定した。第１の方法において、qPCRを行い、20〜50ngのcDNAを増幅した後でベータアクチンとOasl2の間のΔCqを測定した。第２の方法において、制限されたdNTPのマルチプレックスPCR（参照としてベータアクチンを用いる）においてcDNAを用い、続いて融解を行った。このPCR試薬及びプロトコルは、実施例９のものと同じであった。Oasl2の融解ピーク高さ及び面積を測定し、ベータアクチンの対照に対して標準化した。
【０１０１】
qPCRによるΔCqと、融解ピーク高さ又はピーク面積のいずれかを用いる制限されたdNTPを用いるマルチプレックスPCRとの間の相関は高い(R2= 0.9788及びR2=0.9678)。制限したdNTPを用いると、ΔCqと比べて３回の試験の間の標準偏差がより小さく、２つの反応物に比べて、１つのみのPCR反応のみが必要とされる。
【０１０２】
実施例12−１ステップの逆転写PCRを用いる相対遺伝子発現
【０１０３】
図１４は、４つのマウスＲＮＡサンプルに対して、6.25μMの濃度に制限されたdNTPを用いる2重の１ステップ逆転写PCRの微分融解曲線を示している。ベータアクチンを参照遺伝子に用い、また、Oasl2を対象とした。３つのマウス細胞株(B6、B34、及びCg)をマウスの血液に由来するボレリアブルグドルフェリRNAに対して暴露し、３つの細胞株をMouse RiboPure（登録商標）−Blood RNA単離キット(Life Technologies)を用いて抽出した。１ステップRT-PCRを、20μLの50μM dNTP、3mMのMgCl2、500μg/mlのウシ血清アルブミン、0.5XのLCGreen（登録商標）Plus(BioFire Diagnostics)、0.5μMの各プライマー、0.4UのKlenTaq1（登録商標）(Ab Petides)、64ngの抗Taq抗体(eEnzyme)、0.6Uのトランスクリプター逆転写酵素(Roche)及び50〜200ngの精製RNA中で行った。RT-PCRをLightCycler 480(Roche)を用いて、以下のとおりに行った：42°Cで15分間の逆転写、95℃で15秒間の初期変性、次いで、９５℃に１０秒間及び６５℃に３０秒間の４０サイクル。PCRに続いてすぐに、融解曲線を作成し、上述したとおりに解析した。比較のために、SuperScript（登録商標）II逆転写キットを用いて得られたcDNAを用いて行ったqPCRによりΔCqを得た。ΔCq及び融解ピーク高さは良好に相関した。４種のマウスサンプルにおいて、ベータアクチンと比較して、異なるOasl2遺伝子発現を反映して、Oasl2のピーク高さは異なっている。
【０１０４】
マウス血液及び細胞B6のOasl2遺伝子発現のレベルは、ΔCq及び融解ピーク高さにおいて同一であり、一方、細胞B34及びCgにおいてはより少ないOasI2を発現した（図１４）。この１ステップPCRを、200μMの標準dNTP濃度を用いる最初の工程としての逆転写のためのランダムヘキサマーを使用し、続いて6.25μMのdNTP濃度を用いる第２工程としてのqPCRによる、ベータアクチン及びOasl2の２ステップPCRにより得られた結果とも比較した。これらの技術の間の結果は良好に相関した。
【０１０５】
実施例13−希釈系列のための標準曲線
【０１０６】
図１５Ａは、異なる濃度のdNTPを用いて、104コピーのヒトゲノムＤＮＡとともに増幅された、1011〜101コピーを伴うプラスミドＤＮＡを用いる希釈系列から作成した標準曲線を示している。ヒト及びプラスミドＤＮＡ濃度の間の比率を、ヒト及びプラスミドＤＮＡの間の相対ピーク高さに対してプロットした。すべてのdNTP濃度が0.1〜1000の比率のいくらかの分離を示したが、コピー数の間の最も良好な分離は6.25μMのdNTPを用いて確認された。この範囲をさらに調べるために、同じプラスミドの２倍の希釈系列を220〜29で用い、214コピーのヒトゲノムＤＮＡと混合した。図１５Ｂから確認されるとおり、6.25μMのdNTPは略直線的な関係を示し、3.13μM及び12.5μMは同様の結果を示し、標準曲線が多量のコピー数に対して用いられ得ることを示す。
【０１０７】
図１６Ａは、コピー数比率に対する相対ピーク高さのプロットであり、ここで、CXCL9増幅産物は1011〜101コピーで提供され、参照遺伝子としての104コピーマウスのベータアクチンcDNAとともに増幅された。25μMのdNTPを各反応で用いた。コピー数とピーク高さとの間に良好な相関が確認できる。そのため、この開示の方法は、相対コピー数又は実際のコピー数のいずれかを測定するのに用いられ得ることが理解できる。図１６Ｂは、qPCR法により測定されたコピー数と、本開示の方法により測定されたコピー数との間の直線的相関を示している。qPCR法において、CXCL9対象遺伝子はマウスの参照遺伝子と分離して増幅された。ピーク高さ法において、対象のCXCL9は、104コピーのマウスのベータアクチンcDNA参照遺伝子と共に、25μMのdNTPを用いて増幅された。0.1〜100,000のコピー数で、良好な相関が確認され、この相対ピーク高さ測定が広いダイナミックレンジを有していることを示している。
【０１０８】
実施例14−コピー数多型測定を用いる単一対立遺伝子増幅
【０１０９】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、一般的な劣性遺伝病である。大部分の場合は遺伝子SMN1のホモ接合性欠失に起因する。非常に近い関連遺伝子、SMN2は、エクソン７における１塩基のみがSMN1と異なる(c.840C>T)。SMN1及びSMN2の両方に共通のプライマーを用いる増幅が、SMAのSMN1ホモ接合性欠失特性を確立するのに用いられてきた[30]。さらに、SMN1とSMN2の様々な割合は、ヘテロ二重鎖の複雑なパターンをもたらし、これは遺伝子型を特徴付ける各遺伝子のコピー数に適合され得る。正常の個体において、SMN1のコピー数は１〜４に変化し、SMN2のコピー数は０〜６に変化し得る。しかしながら、この方法の１つの不利な点は、一定の比率を区別できないことである。例えば、1：1、2：2、及び3：3のSMN1：SMN2コピーは、すべて同じ比率（１：１）を与え、同じ融解曲線を与える。
【０１１０】
SNM1及びSMN2の絶対的及び相対的コピー数を得るために、１つの共通プライマーと、３’−末端がc.840C又はc.840Tに適合する２つのARMS対立遺伝子特異的プライマーを用いて、対立遺伝子特異的PCRを行った。２つの反応を各サンプルに対して行う。各反応は、同じ参照遺伝子を用いて多重化され、低いdNTP濃度が、プライマー制限が達成される前の早期のプラトーをもたらす。例えば各対立遺伝子において異なる非-ARMSプライマーを用いることにより、同じ反応中で測定して、各対立遺伝子において異なる融解ピークを得ることが可能であることが理解されるが、この実施例において、参照遺伝子に対するSNM1のコピー数比及び参照遺伝子に対するSNM2のコピー数比が別々の反応において測定される。これらはSNM1及びSMN2の絶対及び相対コピー数を同時に確立する。この実施例の対立遺伝子特異的PCRにおいて、dNTP濃度をそれぞれ6.25mMまで低下させ、プライマー濃度はそれぞれ0.5uMであった。
【０１１１】
CFTRの参照遺伝子のためのプライマー配列は、
CFTRエクソン6F：TTGTGATTACCTCAGAAATGATTGA (配列番号1)、及び、
CFTRエクソン6R：CATTGCTTCTTCCCAGCAGT (配列番号2)であり、78.5°Cで融解する50bpの増幅産物を生成した。
【０１１２】
SNM1及びSMN2は、同じフォワードプライマー：
SMAF：TTCCTTTATTTTCCTTACAGGGTTT (配列番号27)、並びに2つのARMS対立遺伝子特異的プライマー：
SMA1R：CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCTG (配列番号28)、及び
SMA2R：CCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTCTA (配列番号29)を用いて増幅され、SMN1において74.5°Cで融解し、SNM2において73.7°Cで融解する48bpの生成物を生成した。
【０１１３】
増幅をLC480リアルタイムPCR機器(Roche)で行い、初期変性を95℃で２分間、続いて2.2°C/sのランプ速度で、95℃で10秒間及び65℃で20秒間を３２サイクル行った。融解ランプを、６０℃〜９０℃において１℃あたり10回のデータ取得(acquisition)で行った(ランプ速度：0.06°C/s)。結果を図１７Ａに示し、これは、多くのサンプルがSMN1の２コピーを有することを示している。図１７Ｂは、０、１、２、及び３コピーのSMN2を含むサンプルを示している。
【０１１４】
PCRプラトーのdNTP制限と組み合わせた対立遺伝子特異的ＰＣＲは、遺伝子型と対立遺伝子の割合の推定において多くの用途を有している。例えば、患者に由来する逆転写したC型肝炎又はHIVのcDNAのサンプルに対して、同様の対立遺伝子特異的PCRを行って、種々の治療の予後に影響を与える遺伝子型又は変異の割合を測定できる。治療からの逃避は、医薬品で治療される患者の共通の問題であり、対立遺伝子特異的PCR及びdNTP制限により正確に測定できる耐性クローンの拡大により証拠づけられる。
【０１１５】
本明細書に開示した任意の方法に必要とされる材料はキットとして提供され得ることが理解され、このキットは、
ポリメラーゼ又は増幅方法に適した他の酵素、
例えばスタンダードＰＣＲプロトコル濃度よりも低い量の、dNTP、例えば50μM以下、25μM、12.5μM、6.25 μM、若しくは3.125μM等、又はこの間の任意の濃度のdNTP
対象核酸の遺伝子座を増幅するように構成されたプライマー、
参照の核酸を増幅するように構成されたプライマー、こうしたプライマーは、対象核酸の遺伝子座を増幅するように構成されたプライマーと同じか又は異なるチューブ中に提供され得る、及び、
増幅を行い、対象核酸のCNVを測定するためのプロトコル
のいずれか又は全てを含む。
【０１１６】
さらなる詳細な説明をしないでも、本発明の技術分野に属する当業者は、上記した明細書を用いて本開示を最大限の範囲まで利用することができるはずである。本明細書に開示した実施例及び実施形態は、単なる例示的且つ模範的なものであり、いかなる方法でも本開示の範囲を制限するものではないと解される。本開示の基本原則から逸脱しない限り、上述した実施形態に対して変更がなされ得ることは当該技術分野の通常の知識を有し、本開示の利益を有するものにとって、明らかであろう。
【０１１７】
参照文献
以下の各参照文献の内容が、その全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
【表１】
0006609551.tif 000002
0006609551.tif 000003
【図１Ａ】
0006609551.tif 000004
【図１Ｂ】
0006609551.tif 000005
【図２Ａ】
0006609551.tif 000006
【図２Ｂ】
0006609551.tif 000007
【図２Ｃ】
0006609551.tif 000008
【図２Ｄ】
0006609551.tif 000009
【図２Ｅ】
0006609551.tif 000010
【図３Ａ】
0006609551.tif 000011
【図３Ｂ】
0006609551.tif 000012
【図３Ｃ】
0006609551.tif 000013
【図３Ｄ】
0006609551.tif 000014
【図３Ｅ】
0006609551.tif 000015
【図３Ｆ】
0006609551.tif 000016
【図３Ｇ】
0006609551.tif 000017
【図３Ｈ】
0006609551.tif 000018
【図４】
0006609551.tif 000019
【図５Ａ】
0006609551.tif 000020
【図５Ｂ】
0006609551.tif 000021
【図５Ｃ】
0006609551.tif 000022
【図５Ｄ】
0006609551.tif 000023
【図６Ａ】
0006609551.tif 000024
【図６Ｂ】
0006609551.tif 000025
【図６Ｃ】
0006609551.tif 000026
【図７】
0006609551.tif 000027
【図８】
0006609551.tif 000028
【図９】
0006609551.tif 000029
【図１０】
0006609551.tif 000030
【図１１】
0006609551.tif 000031
【図１２】
0006609551.tif 000032
【図１３】
0006609551.tif 000033
【図１４】
0006609551.tif 000034
【図１５Ａ】
0006609551.tif 000035
【図１５Ｂ】
0006609551.tif 000036
【図１６Ａ】
0006609551.tif 000037
【図１６Ｂ】
0006609551.tif 000038
【図１７Ａ】
0006609551.tif 000039
【図１７Ｂ】
0006609551.tif 000040
【配列表】
0006609551000001.app