(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための連続方法であって、
（ａ）基質フィードおよび前記基質フィードを希釈するための溶媒を同時に添加して、反応器中で反応混合物を形成させ；前記基質に前記反応混合物中で反応産物を形成させる段階；
（ｂ）反応器の出口から、反応産物および溶媒を含む反応混合物を排出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で排出された反応混合物全体を濾過膜に導く段階であって、濾過膜が、溶媒に対し透過性であり、反応産物に対し不透過性であるように提供される、段階；
（ｄ）段階（ａ）における前記基質フィードの希釈のために、濾過膜を透過した溶媒を再利用する段階；および
（ｅ）反応産物を含む、前記濾過膜からの未透過物を、前記反応器以外のリザーバに導く段階、
を含み、
段階（ｃ）が、段階（ｂ）で排出された反応混合物を濾過ループフィードタンクに導き；反応混合物を前記濾過ループフィードタンクの出口から排出し；反応混合物を前記濾過膜に導くことを含み；
段階（ｅ）が前記濾過膜からの未透過物を前記濾過ループフィードタンクに戻すことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記反応が、環化反応、重合反応、基質阻害を示す酵素反応、生成物阻害を示す酵素反応、基質または共反応物の沈殿を示す反応、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質フィードおよび前記溶媒が前記反応器内で混合される別々の流れとして前記反応器に進入して、段階（ｄ）が濾過膜を透過した溶媒を前記反応器に連続的に戻すことを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質フィードおよび前記溶媒が混合容器内で混合されることで、前記混合容器から前記反応器に連続的に排出される希釈された基質フィードが形成され、段階（ｄ）が濾過膜を透過した溶媒を前記混合容器に連続的に戻すことを含む、請求項１または２に記載の
方法。
【請求項５】
段階（ａ）で加えられる溶媒の体積が段階（ａ）で加えられる基質フィードの体積の少なくとも５倍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）が、前記基質フィードおよび溶媒と、触媒および前記基質と反応する共反応物から選択される一つまたは複数の追加成分とを混合することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記基質フィードが基質フィードタンクから連続的に排出され、前記一つまたは複数の追加成分が前記基質フィードタンク以外の一つまたは複数のフィードタンクから連続的に排出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記濾過膜の除去率が、前記共反応物、前記触媒、および一つまたは複数の副生成物から選択される一つまたは複数の成分に対して１０％未満である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
段階（ａ）で加えられる溶媒の少なくとも９５％が濾過膜の透過側からの溶媒である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記濾過膜が少なくとも９０％の反応産物除去率を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記濾過膜が少なくとも９５％の基質除去率を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記濾過膜がナノ濾過膜、精密濾過膜、限外濾過膜、逆浸透濾過膜、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための系であって、
（ｉ）以下を含む反応器（３）：
第一、第二、および第三の入口（７、８、９）；並びに
反応器出口（１３）；
（ｉｉ）前記第一入口（７）を介して前記反応器（３）に連結された第一フィードタンク（１）；
（ｉｉｉ）前記第二入口（８）を介して前記反応器（３）に連結された第二フィードタンク（２）；
（ｉｖ）以下を含む濾過ループフィードタンク（４）：
前記反応器出口（１３）を介して前記反応器（３）に連結された第一濾過ループフィードタンク入口（１０）；
第二濾過ループフィードタンク入口（１１）；および
濾過ループフィードタンク出口（１４）；
並びに、
（ｖ）濾過膜（５）であって、前記濾過ループフィードタンク出口（１４）から溶液を受け取るように構成され、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する段階であって、前記第三入口（９）を介して前記反応器（３）に透過物を戻すように、および、前記第二濾過ループフィードタンク入口（１１）を介して前記濾過ループフィードタンク（４）に未透過物を戻すようにさらに構成された、濾過膜、
を含む、前記系。
【請求項１４】
溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための系であって、
（ｉ）以下を含む反応器（３）：
第一および第二の入口（７、８）；並びに
反応器出口（１３）；
（ｉｉ）入口（１２）を有し、前記第一入口（７）を介して前記反応器（３）に連結された、混合容器（６）；
（ｉｉｉ）前記混合容器（６）に連結された第一フィードタンク（１）；
（ｉｖ）前記第二入口（８）を介して前記反応器（３）に連結された第二フィードタンク（２）；
（ｖ）以下を含む濾過ループフィードタンク（４）：
前記反応器出口（１３）を介して前記反応器（３）に連結された第一濾過ループフィードタンク入口（１０）；
第二濾過ループフィードタンク入口（１１）；および
濾過ループフィードタンク出口（１４）；
並びに、
（ｖｉ）濾過膜（５）であって、前記濾過ループフィードタンク出口（１４）から溶液を受け取るように構成され、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する段階であって、前記入口（１２）を介して前記混合容器（６）に透過物を戻すように、および、前記第二濾過ループフィードタンク入口（１１）を介して前記濾過ループフィードタンク（４）に未透過物を戻すようにさらに構成された、濾過膜、
を含む、前記系。
【請求項１５】
反応器（３）が混合手段を備える、請求項１３または１４に記載の系。
【請求項１６】
膜流束の関数として、反応混合物が濾過ループフィードタンクから排出される速度および基質添加速度を調整するための手段をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環化反応、重合反応、基質阻害を示す酵素反応、または基質もしくは反応物の沈殿を示す反応等の、少なくとも１つの理由により希釈形態の基質の反応を必要とする化学反応を実行するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
製造業ではしばしば、典型的には望まれない副生成物の形成をもたらし得る副反応を避けるために、ある反応を、基質のうちの一つまたは複数を低濃度および／または高希釈にして実行しなければならないという問題に直面する。
【０００３】
高希釈でしばしば実行される反応の例としては、医薬品有効成分の製造のための分子内大環状化反応等の環化反応が挙げられる。そのような反応において、高い基質濃度は、分子内反応ではなく、分子間反応の形成を好む場合があるが、これは、反応媒体中での基質の重合または他の望まれない副反応の発生をもたし、それにより、所望の生成物への収率および生成物純度を減少させる可能性がある。
【０００４】
同様の望まれない分子間副反応が、ある特定の種類の重合反応において、例えば環状ポリマーの合成において、観察されている。基質阻害を伴う酵素反応は、基質を高希釈にして実行されることが好ましい別の種類の反応の例示である。実際に、そのような反応では、高い基質濃度は酵素の触媒活性低下をもたらす場合がある。低濃度の基質を好むさらに他の種類の反応としては、高い基質濃度が反応混合物中の一つまたは複数の成分の望まれない沈殿をもたらす反応が挙げられる。
【０００５】
従って、ある特定の反応は、望まれない副生成物の形成を最小限にするために、基質を高希釈して実行されることが好ましい。具体的にバッチ式反応では、バッチ式反応は、十分に低い基質濃度の維持を可能にするために、頻繁に使用される溶媒希釈率が１００〜１０００Ｌ／ｍｏｌの基質にまで高まるように、大量の溶媒の使用を必要とする。言い換えれば、少量の最終産物の生成のために、しばしば、大量の溶媒の使用および大きな反応器容積の使用が必要となり、それにより、反応器の単位容積当たりの得られる反応産物収率が小さくなる。
【０００６】
いくつかの反応において、反応に必要とされる溶媒の総量は、基質が徐々に反応器に加えられ、生成物が実行の最後まで反応器内に残る、いわゆる「流加（fed-batch）」方法
の使用によって減少し得る。しかし、そのような方法は、所望の反応産物が反応器内で安定である場合にのみ有効となる。しかし、反応が可逆的であることも珍しくなく、それにより、望まれない副生成物の形成に繋がり得る過剰に高い基質濃度がもたらされる。
【０００７】
ＵＳ２００４０２１１７２９では、フィルター膜を用いて洗浄流からオリゴマーおよび／または酸触媒を回収するための方法および系が開示されており、そこで生成物流が沈殿槽を介して取り除かれる。前記方法の好ましい運転はバッチ運転であり、連続運転の場合、未透過物の回収は行われない。さらに、前記反応は希釈条件下で実行されない。
【０００８】
ＷＯ８８／０５４４４では、重合反応がバッチ反応として実行され、生成物流が膜ユニットに負荷され、濾過後に得られた透過物の反応器への再循環を伴う、合成水溶性ポリマーの分離のための方法および系が開示されている。
【０００９】
これらのことから、基質のうちの一つまたは複数を低濃度に維持することを必要とする
反応の実行に適した、より具体的には、反応産物が反応器内で安定でない反応に同様に適した、方法および系が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、バッチ処理と比較して、同量の反応産物に対し必要とされる溶媒が有意により少ない、希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、適用された反応条件下で反応産物が不安定である反応を実行するのに適した方法を提供することである。
【００１１】
より具体的には、本明細書において、溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための連続方法が提供され、前記方法は以下の段階を含む：
（ａ）基質フィードおよび前記基質フィードを希釈するための溶媒を（同時に）添加して、反応器中で反応混合物を形成させ；前記基質に前記反応混合物中で反応産物を形成させる段階；
（ｂ）反応器の出口から、反応産物および溶媒を含む反応混合物を排出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で排出された反応混合物を濾過膜に導く段階であって、濾過膜が、溶媒に対し透過性であり、反応産物に対し不透過性であるように提供される、段階；
（ｄ）段階（ａ）における前記基質フィードの希釈のために、濾過膜を透過した溶媒を再利用する段階；および
（ｅ）反応産物を含む、前記濾過膜からの未透過物を、前記反応器以外のリザーバに導く段階。
【００１２】
特定の実施形態では、前記反応は、環化反応、重合反応、基質阻害を示す酵素反応、生成物阻害を示す酵素反応、基質または共反応物の沈殿を示す反応、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１３】
ある実施形態では、基質フィードおよび溶媒は、前記反応器内で混合される別々の流れとして前記反応器に（連続的に）進入し、段階（ｄ）は、濾過膜を透過した溶媒を前記反応器に連続的に戻すことを含む。
【００１４】
特定の実施形態では、前記基質フィードおよび前記溶媒が混合容器内で混合されることで、前記混合容器から前記反応器に連続的に排出される希釈された基質フィードが形成され、段階（ｄ）は濾過膜を透過した溶媒を前記混合容器に連続的に戻すことを含む。
【００１５】
ある実施形態では、段階（ａ）は、前記基質フィードおよび溶媒と、触媒および前記基質と反応する共反応物から選択される一つまたは複数の追加成分とを混合することをさらに含む。さらなる実施形態では、基質フィードは、基質フィードタンクから連続的に排出され、前記一つまたは複数の追加成分は、前記基質フィードタンク以外の一つまたは複数のフィードタンクから連続的に排出される。ある実施形態では、前記濾過膜の除去率は、前記共反応物、前記触媒、および一つまたは複数の副生成物から選択される一つまたは複数の成分に対して１０％未満である。
【００１６】
特定の実施形態では、段階（ｃ）は、段階（ｂ）で排出された反応混合物を濾過ループフィードタンクに導き；反応混合物を前記濾過ループフィードタンクの出口から排出し；反応混合物を前記濾過膜に導くことを含み；段階（ｅ）は、前記濾過膜からの未透過物を前記濾過ループフィードタンクに戻すことを含む。
【００１７】
ある実施形態では、段階（ａ）で加えられる溶媒の体積は、段階（ａ）で加えられる基質フィードの体積の少なくとも５倍である。
【００１８】
特定の実施形態では、段階（ａ）で加えられる溶媒の少なくとも９５％は濾過膜の透過側からの溶媒である。
【００１９】
ある実施形態では、前記濾過膜は少なくとも９０％の反応産物除去率を有する。
【００２０】
特定の実施形態では、前記濾過膜は少なくとも９５％の基質除去率を有する。
【００２１】
ある実施形態では、前記濾過膜は、ナノ濾過膜、精密濾過膜、限外濾過膜、逆浸透濾過膜、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２２】
特定の実施形態では、濾過ループおよび反応器の内部の温度は異なり得る。より具体的には、濾過ループフィードタンクおよび反応器の内部の温度は異なり得る。最も具体的には、濾過ループフィードタンク内の温度は反応器内の温度未満であり得る。
【００２３】
さらに、本明細書において、溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための系が提供され、前記系は以下を含む：
（ｉ）以下を含む反応器（３）：
第一、第二、および第三の入口（７、８、９）；並びに
反応器出口（１３）；
（ｉｉ）前記第一入口（７）を介して前記反応器（３）に連結された第一フィードタンク（１）；
（ｉｉｉ）所望による、前記第二入口（８）を介して前記反応器（３）に連結された第二フィードタンク（２）；
（ｉｖ）以下を含む濾過ループフィードタンク（４）：
前記反応器出口（１３）を介して前記反応器（３）に連結された第一濾過ループフィードタンク入口（１０）；
第二濾過ループフィードタンク入口（１１）；および
濾過ループフィードタンク出口（１４）；
並びに、
（ｖ）濾過膜（５）であって、前記濾過ループフィードタンク出口（１４）から溶液を受け取るように構成され、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する段階であって、前記第三入口（９）を介して前記反応器（３）に透過物を戻すように、および、前記第二濾過ループフィードタンク入口（１１）を介して前記濾過ループフィードタンク（４）に未透過物を戻すようにさらに構成された、濾過膜。
【００２４】
特定の実施形態では、前記反応器（３）は連続的に撹拌される反応器である。
【００２５】
さらに、本明細書において、溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための系が提供され、前記系は以下を含む：
（ｉ）以下を含む反応器（３）：
第一および第二の入口（７、８）；並びに
反応器出口（１３）；
（ｉｉ）入口（１２）を有し、前記第一入口（７）を介して前記反応器（３）に連結された、混合容器（６）；
（ｉｉｉ）前記混合容器（６）に連結された第一フィードタンク（１）；
（ｉｖ）所望による、前記第二入口（８）を介して前記反応器（３）に連結された第二フィードタンク（２）；
（ｖ）以下を含む濾過ループフィードタンク（４）：
前記反応器出口（１３）を介して前記反応器（３）に連結された第一濾過ループフィードタンク入口（１０）；
第二濾過ループフィードタンク入口（１１）；および
濾過ループフィードタンク出口（１４）；
並びに、
（ｖｉ）濾過膜（５）であって、前記濾過ループフィードタンク出口（１４）から溶液を受け取るように構成され、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する段階であって、前記入口（１２）を介して前記混合容器（６）に透過物を戻すように、および、前記第二濾過ループフィードタンク入口（１１）を介して前記濾過ループフィードタンク（４）に未透過物を戻すようにさらに構成された、濾過膜。
【００２６】
特定の実施形態では、前記反応器（３）は連続的に撹拌される反応器である。
【００２７】
本発明者らは、本明細書に記載の方法および系が、はるかに低いプロセス・マス・インテンシティ（Process Mass Intensity）（ＰＭＩ）を与えつつ、高希釈におけるバッチ処理と比較して、類似のまたは増加した反応産物収率および／または生成物純度を得ることを可能にすることを発見した。従って、本方法は、より高い持続可能性に向けた化学工業の試みにおいて、化学工業を支援し得る。本明細書に記載される概念の上記および他の特徴、特色および利点は、本発明の原理を一例として説明する、以下の発明を実施するための形態から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本明細書に記載される方法および機器の特定の実施形態の図面の以下の説明は、事実上単なる例示に過ぎず、本教義、それらの適用または用途の限定を意図していない。図面の全体を通じて、一致した符号は類似または一致した部分および特色を示す。
【図１】基質フィードタンク（１）、触媒フィードタンク（２）、反応器（３）、濾過ループフィードタンク（４）、および濾過膜（５）を含む、本明細書に記載される方法の特定の実施形態の構成の略図。
【図２】基質フィードタンク（１）、混合容器（６）、触媒フィードタンク（２）、反応器（３）、濾過ループフィードタンク（４）、および濾過膜（５）を含む、本明細書に記載される方法の特定の実施形態の構成の略図。
【図３】非環式ペプチド（１７）の２つの官能基ＲおよびＲ１の内部反応による環式ペプチド（１８）の形成を含む、ペプチド環化の説明。
【００２９】
図面において、以下の番号付けが使用される：１−基質フィードタンク；２−触媒フィードタンク；３−反応器；４−濾過ループフィードタンク；５−濾過膜；６−混合容器；７−第一反応器入口、８−第二反応器入口、９−第三反応器入口、１０−第一濾過ループフィードタンク入口、１１−第二濾過ループフィードタンク入口、１２−混合容器入口；１３−反応器出口；１４−濾過ループフィードタンク出口；１５−未透過側；１６−透過側；１７−非環式ペプチド；１８−環式ペプチド。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
理解の指針として機能し得るが、本明細書および特許請求の範囲で使用されるいかなる引用符号も、その範囲を限定すると解釈されるものではない。
【００３１】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって特に明示されない限り、単数の指示対象および複数の指示対象の両方が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（comprises）」お
よび「〜から構成される（comprised of）」は、「〜を包含する（including）」、「を
包含する（includes）」または「〜を含有する（containing）」、「〜を含有する（contains）」と同義であり、包括的または開放型であり、追加の非記載の部材、要素または方
法段階を排除しない。用語「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（comprises）」お
よび「〜から構成される（comprised of）」は、記載された成分、要素または方法段階を言及している場合、前記の記載された成分、要素または方法段階「から成る（consist of）」実施形態も包含する。
【００３３】
さらに、明細書および特許請求の範囲における第一、第二、第三等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、明記されない限りは必ずしも連続したまたは経時的な順番を記述するためのものではない。そのように使用された用語が適切な状況下では可換であること、および、本明細書に記載の実施形態が本明細書に記載または例示された順序とは異なる順序で施行可能であることを理解されたい。
【００３４】
本明細書で使用される値は、パラメータ、含量、持続時間等の測定可能な値に関しての場合、特定の値の、および特定の値からの、＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を、そのような変動が本明細書において企図される技術的効果のうちの一つまたは複数を保証するのに適切である限り、包含することが意図される。本明細書で使用される各々の値がそれ自体明確に、且つ好ましいものとして、開示されていることを理解されたい。典型的には、用語「約」がこの文脈においては読まれるべきである。
【００３５】
端点による数値範囲の列挙は、各々の範囲に含まれる全ての数および端数、並びに記載された端点を包含する。本明細書において引用された全ての文書は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【００３６】
別途定義がない限り、専門用語および科学用語を含む、本明細書に記載の概念の開示において使用される全ての用語は、当業者が一般に理解する通りの意味を有する。さらなる指針により、本明細書において使用される用語の定義が、本開示の教義をより深く理解するために含まれる。本明細書で使用される用語または定義は、単に、本明細書において提供される教義の理解の助けのためにのみ提供される。
【００３７】
本発明との関連において、用語「膜」および「濾過膜」は同義的に使用される。
【００３８】
本明細書で使用される用語「定容量ダイアフィルトレーション（constant volume diafiltration）」は、濾液が膜を透過するのと同じ速度（体積／時間の単位）で新たな液体が
未透過側の膜に加えられる、濾過膜を通過させる連続濾過方法を指す。
【００３９】
本明細書で使用される用語「環化反応」は、少なくとも１つの環が形成される化学反応を指す。環は、分子の１つの部分が同一分子の別の部分と化学的に縮合することにより形成され得、その場合、前記反応は分子内環化反応である。環は、また、第一分子の第一部分が第二分子の第一部分と化学的に連結または縮合した後、第二分子の第二部分が第一分子の第二部分と連結または縮合することによっても形成され得、その場合、前記反応は分子間環化反応である。また、そのような分子間環化反応では、１つの単環を形成する３つ以上の分子が存在し得る。
【００４０】
本明細書の全体にわたる、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態と関連して記載された特定の特色、構造、または特徴が、本明細書において企図される少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書の全体にわたる、様々な場所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を言及しているわけではないが、言及している場合もある。さらに、本開示から当業者には明らかであろうが、一つまたは複数の実施形態において、特定の特色、構造または特徴があらゆる適切な様式で組み合わせることができる。
さらに、当業者には理解されることであろうが、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、いくつかの特色を含み、他の実施形態に含まれる他の特色は含まないが、異なる実施形態の特色の組合せも本明細書においては企図されており、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲では、特許請求された実施形態のいかなる特色も、あらゆる組合せで使用され得る。
【００４１】
本明細書において、溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための方法が提供される。希釈された基質の使用の実施がしばしば必要とされる化学反応の例としては、限定はされないが、環化反応、重合反応、基質阻害を示す酵素反応、生成物阻害を示す酵素反応、基質および／または共反応物の沈殿を示す反応、並びにこれらの組合せが挙げられる。これら全ての反応において、本方法は、必要とされる（高い）希釈においての反応の実施を可能にし、少ない溶媒使用と組み合わせた高収率をもたらす。
【００４２】
本明細書において提供される方法は、前記方法が反応産物および溶媒を含む反応混合物を濾過膜に導くことを含み、それにより、濾過膜が、溶媒に対し透過性であり、反応産物に対し不透過性であるよう提供されることを特徴とする。本方法は、濾過膜を透過した溶媒を再利用すること、および、未透過物を前記濾過膜から反応器以外のリザーバへ導くことを含む。
【００４３】
より具体的には、本明細書に記載の方法は、典型的には、以下の段階を含む：
（ａ）基質フィードおよび基質フィードを希釈するための溶媒を反応器に添加し；基質を反応させて反応産物を形成させる段階；
（ｂ）反応器の出口から、反応産物および溶媒を含む反応混合物を排出する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で排出された反応混合物を濾過膜に導く段階であって、濾過膜が、溶媒に対し透過性であり、反応産物に対し不透過性であるように提供される、段階；
（ｄ）段階（ａ）におけるさらなる基質フィードの希釈のために、濾過膜を透過した溶媒を再利用する段階；および
（ｅ）未透過物を、前記濾過膜から反応器以外のリザーバに導く段階。
【００４４】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法は連続方法である。これらの実施形態では、反応器への基質の添加および段階（ｂ）〜（ｅ）は、段階（ａ）における基質の反応と同時に行われる。より具体的には、本方法は、上記のような、反応器への基質の連続的な添加、反応器からの反応混合物の連続的な排出、反応混合物の連続的な濾過、および溶媒の連続的な再利用を含み得る。連続的な添加、排出、濾過、および溶媒再利用は、一定（中断されない）またはパルス性であり得る。前記段階は同時に行われることが好ましい。これは、本明細書の以下においてさらに説明される。
【００４５】
本明細書に記載される方法において、基質は少なくとも１つの目的反応産物に変換される。以下、用語「反応産物」は一つまたは複数の目的反応産物を指し得る。本明細書に記載される方法の好ましい実施形態では、基質は有機化合物である。一実施形態において、有機基質の分子はいくつかの炭素および水素原子を含有し、さらに、酸素、窒素、硫黄等の通常「ヘテロ原子」と呼ばれる他の原子が存在していてもよい。有機化合物はイオン性部分を有していてもよく、例えば塩として存在していてもよい。特定の実施形態では、基質は環化反応を受ける。従って、反応産物は環状分子であり得る。ある実施形態では、基質は重合反応を受け得る。従って、反応産物は重合体であり得る。
【００４６】
基質は典型的には、分子内および／または分子間の経路で反応することが可能な化合物である。分子内化学反応は、環化反応等の、特定の分子とそれ自身との反応である。分子間反応は、ある分子と別の分子との反応である。分子間反応はホモ性の分子間反応であってもよく、それにより、２つの分子は同一の化学物質となる。また、分子間反応はヘテロ性
の分子間反応であってもよく、それにより、２つの分子は異なる種類または化学物質となる。特定の実施形態では、基質は、経路の１つ（且つ、１つのみ）が所望の反応産物をもたらす、いくつかの異なる競合経路を介して反応することが可能であり得る。本発明との関連において、所望の経路は、基質が高希釈である条件での反応の実施に好まれ得る。
【００４７】
本明細書に記載される方法において、基質は基質フィードとして供給され、基質フィードは典型的には基質フィードタンク内に貯蔵される。従って、特定の実施形態では、基質は基質フィードタンク（１）から反応器（３）に供給される。基質フィードは、基質のみから成っていてもよいが、典型的には、基質を含む液体として、より具体的には溶媒または溶媒混合物中の基質溶液として、供給される。基質フィード中の基質の濃度は、典型的には、反応の間、所望の基質濃度よりも有意により高い。従って、本明細書に記載の方法は、基質フィードを溶媒で希釈することを含む（後述）。反応器内の基質濃度が反応前に基質フィードに加えられる溶媒の量によって決定されることから、基質フィードタンク内の基質の正確な濃度は本方法にとっては重要ではない。ある実施形態では、基質フィード中の基質の濃度は０．０１Ｍ〜１０Ｍ、より具体的には０．０２〜５Ｍ、０．０４Ｍ〜２．０Ｍである。ある実施形態では、基質フィードは、不純物等の、追加の非溶媒化合物を含み得る。基質は、基質フィード中の非溶媒化合物の少なくとも５０ｗｔ％、６０ｗｔ％、７０ｗｔ％、８０ｗｔ％、８５ｗｔ％、９０ｗｔ％または９５ｗｔ％を構成する、基質フィード中に存在する主要な非溶媒化合物であることが好ましい。
【００４８】
本明細書に記載される方法では、基質フィードおよび基質フィードを希釈するための一つまたは複数の溶媒が反応器に加えられることで、反応混合物が形成される。次に、基質が反応を起こすことにより、基質による反応産物の形成が生じる。典型的に、反応器内の初期反応混合物は、一つまたは複数の溶媒を含有するが、基質を含有しない。基質フィードが反応器に加えられるにつれて、基質濃度は最初増加し、その後、基質が反応し、反応混合物が反応器から取り除かれるために、安定化する（後述）。
【００４９】
基質フィードに加えられる溶媒は、基質フィードタンク内に貯蔵される基質フィード中に既に存在するあらゆる溶媒と同じであっても異なっていてもよい。例えば、基質フィード用の溶媒は、基質の高い溶解性および／または安定性を与えるように選択され得るが、他方では、基質を希釈するための溶媒は反応産物の安定性の機能において選択され得る。
【００５０】
反応器に加えられる基質フィードおよび追加溶媒の相対体積は、典型的には、基質フィード中の基質濃度、および反応混合物中の所望の基質濃度に依存する。本方法は、典型的には、基質の５倍希釈を少なくとも含み、少なくとも１０倍希釈を含むことが好ましい。ある実施形態では、段階（ａ）で加えられる溶媒の体積は、段階（ａ）で加えられる基質フィードの体積の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍である。
【００５１】
上記の通り、本明細書に記載される方法は連続方法であることが好ましい。そのような方法において、基質フィードおよび溶媒は、一定の（中断されない）流れとして、またはパルス性の流れとして、反応器に連続的に加えられる。基質フィードおよび溶媒は、典型的には、反応器に同時に加えられる。これにより、方法の全体を通じて、反応器内に安定な基質濃度を得ることが容易となる。
【００５２】
本方法は特定の溶媒に限定されない。方法で使用される溶媒の選択は、方法で使用される基質の種類および濾過膜の種類等の要素に依存し得る。本発明との使用に適した溶媒の例としては、水、芳香族化合物、アルカン、ケトン、グリコール、塩素化溶剤、エステル、エーテル、アミン、ニトリル、アルデヒド、フェノール、アミド、カルボン酸、アルコール、フランおよび双極性非プロトン性溶媒、並びに前記溶媒の２つ以上の混合物、並びに前記溶媒の１つまたは複数と水との混合物が挙げられる。
【００５３】
特定の実施形態では、基質フィードおよび基質フィードを希釈するための溶媒は、同一の反応器入口（７）を介して、単一の流れとして反応器（３）に同時に進入し得る。そのような実施形態では、典型的には、基質フィードおよび溶媒が専用の混合容器（６）内で混合されて、希釈された基質フィードが形成され、次にそれが混合容器から反応器（３）に連続的に移される。これらの実施形態による方法の実施に適した機構の非限定例が図２に示される。他の実施形態では、基質フィードおよび基質フィードを希釈するための溶媒は、２つの別々の流れとして、より具体的には反応器（３）の２つの別々の入口（７、９）を介して、反応器に（同時に）進入し得る。従って、そのような実施形態では、基質フィードおよび溶媒は反応器内部で混合される。これらの実施形態による方法の実施に適した機構の非限定例が図１に示される。反応器内での基質フィードおよび溶媒の混合は、上記のような専用の混合容器（６）の必要性を排除する。一方で、専用の混合容器内での混合と比較して、反応器内の混合を制御することがより難しくなり得る。
【００５４】
好ましい実施形態では、前記方法は、反応器（３）内に存在する基質の量が反応を通じて消費されるにつれて補充されるように、混合容器（６）を介していてもよい、基質フィードタンク（１）から反応器（３）への新たな基質の継続的供給と共に運用される。このようにして、反応器内の基質の濃度は安定に保たれる。基質が消費される速度は方法の間モニターされてもよく、あるいは、以前の測定に基づいて推定されてもよい。
【００５５】
溶媒による基質フィードの希釈以後、基質は、基質が反応を起こし得る条件に暴露されることとなり得る。より具体的には、希釈された基質および所望による他の反応成分が反応器内に進入すると、基質は反応を起こして所望の反応産物を形成する。従って、反応器内の条件はそのような反応を可能にするように選択される。これは、反応によって異なり得る、反応器内の適切な反応温度および／または圧力を与えることを含み得る。
【００５６】
ある反応では、基質および一つまたは複数の溶媒に加えて、反応器に他の成分を導入することが必要とされ得る。例えば、反応が一つもしくは複数の触媒の存在を必要とする場合があり、および／または、基質が共反応物、すなわち基質以外の反応物、と反応することが必要とされる場合がある。
【００５７】
ある実施形態では、一つまたは複数の追加成分が、基質フィードタンク（１）内の基質フィード中に供給済みであり得る。しかし、場合によっては、基質／共反応物混合物は、単一のフィードタンク内での貯蔵に十分に安定でない場合がある。従って、好ましい実施形態では、追加成分は基質フィード中に存在しない。
【００５８】
特定の実施形態では、一つまたは複数の追加成分は反応器内に最初に供給され得る。例えば、方法の初めに、反応器は開始溶媒および一つまたは複数の触媒を供給され得る。そのような実施形態では、濾過膜は、好ましくは、反応産物に対する高い除去率（例えば、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％）を有するが、溶媒および触媒に対して、所望により未反応基質に対しても、低い除去率（例えば、高くて１０％、好ましくは高くて５％）を有する。これにより、溶媒、触媒、および所望により未反応基質が、方法を継続させるために反応器に戻ることが可能となる。濾過ループフィードタンクおよび濾過ループの残部（濾過膜等）は、反応混合物の成分のさらなる反応を阻止する条件において、例えば、反応器から排出された反応混合物の成分のさらなる反応を阻止するのに十分に低い温度で、作動されることが好ましい。従って、濾過ループは、反応器内の温度よりも低い温度において作動されることが好ましい。このようにして、反応は実質的に反応器内でのみ起こる。
【００５９】
さらにまたはあるいは、一つまたは複数の追加成分が、基質フィードタンク（１）以外
の一つまたは複数のフィードタンク（２）内に供給され得る。従って、基質フィードは基質フィードタンク（１）から（連続的に）排出され、一方、一つまたは複数の追加成分は基質フィードタンク以外の一つまたは複数のフィードタンクから（連続的に）排出される。方法が２つ以上の追加成分の使用を含む場合、それらは別々のフィードタンク内に供給され得、あるいは、追加成分の混合物が十分に安定である場合、同一のフィードタンク内に供給され得る。
【００６０】
従って、本方法のある実施形態では、段階（ａ）は、基質フィードおよび溶媒を、触媒および基質と反応する反応物から選択される一つまたは複数の追加成分と混合することをさらに含み得る。
【００６１】
ある実施形態では、基質フィード、基質フィードを希釈するための溶媒、および一つまたは複数の追加成分は、反応器内で混合される別々の流れとして反応器（３）に進入し得る。前記別々の流れは、典型的には、別々の入口（７、８、９）を介して反応器に進入する。しかし、ある特定の成分は反応器に進入する前に互いに混合され得ることが考えられる。
【００６２】
特定の実施形態では、一つまたは複数の追加成分は、専用の混合容器内で基質フィードおよび溶媒と混合され得る。ある実施形態では、これは、基質フィードと基質フィードを希釈するための溶媒とを混合するために使用されるものと同じ混合容器（６）であり得る。しかし、ある反応においては、さらなる成分の追加前に基質を希釈することが好ましい場合がある。そのような実施形態では、基質フィードおよび基質フィードを希釈するための溶媒が専用の混合容器（６）内で最初に混合されて、希釈された基質フィードが形成され、それが次に反応器（３）または別の専用の混合容器内で追加成分と混合される。ある実施形態では、専用の混合容器は一つまたは複数の追加成分のそれぞれに対して用意され得る。
【００６３】
本方法において、反応混合物は反応器（３）の出口（１３）から連続的に排出される。上記のように基質は反応を起こして反応産物を形成するため、排出された反応混合物は反応産物および溶媒を含む。
【００６４】
ある実施形態では、排出された反応混合物は、未反応基質、未反応共反応物、触媒、および副生成物（すなわち、所望の反応産物以外の基質の最終形態）等の、他の成分も含み得る。典型的には、反応条件および方法パラメータはこれらの成分の存在が最小となるように選択される。
【００６５】
例えば、未反応基質および所望による共反応物の量は、反応混合物が反応器から排出される速度（体積／時間の単位）を調節することにより最小化され得る。より遅い排出速度は、基質および所望による共反応物が反応器内でのより長い滞留時間を有することで、より高い割合の基質の反応が可能となることを意味する。さらに、未反応基質または共反応物の割合は、基質および共反応物を化学量論量で反応器に供給することによって低下し得る。
【００６６】
上記の通り、本明細書に記載される方法は連続方法であることが好ましい。そのような方法において、反応混合物は、一定の（中断されない）流れとして、またはパルス性の流れとして、反応器から連続的に排出される。典型的には、反応混合物が反応器から排出される速度は、基質フィードおよび溶媒が反応器に加えられる速度と一致し、それにより、反応混合物の体積および組成が安定化される。
【００６７】
ある実施形態では、反応器から排出される反応混合物は、望まれない副生成物の形成を
もたらし得る、少量の未反応基質および／または共反応物を含み得る。さらにまたはあるいは、反応産物は、排出された反応混合物中で乏しい安定性しか有さない場合があり、さらに反応して望まれない副生成物を形成する傾向を有する場合がある。そのような望まれない副生成物の形成は、反応混合物を冷却することによって阻止され得る。従って、特定の実施形態では、反応器から反応混合物を排出する段階（ｂ）は、反応器から排出された反応混合物を冷却することをさらに含み得る。従って、ある実施形態では、濾過ループフィードタンク（および、典型的には、濾過膜等の濾過ループの他の構成要素）内の温度は、反応内の温度と異なり得る。より具体的には、濾過ループフィードタンク内の温度は反応内の温度未満であり得る。特定の実施形態では、濾過ループフィードタンク内の温度は、反応内の温度よりも少なくとも５℃、少なくとも１０℃、または少なくとも２０℃低い場合がある。
【００６８】
本方法のさらなる段階（ｃ）において、反応器から排出された反応混合物は濾過膜に導かれ、それにより、濾過膜は、溶媒に対し透過性となり、反応産物に対し不透過性となるように提供される。従って、濾過膜は、反応産物から溶媒を分離または単離することが可能である。当該技術分野において公知であり、図１および図２に示されるように、典型的な濾過膜（５）は透過側（１６）および未透過側（１５）を有する。
【００６９】
溶媒回収のための濾過膜の使用は、蒸留、蒸発および結晶化等の従来の溶媒回収技術よりもエネルギー消費量が少ない。さらに、これらの従来技術はしばしば、本明細書に記載の連続的な反応、反応産物（例えば、高温の使用により）、および／または使用される反応条件に適合しない。現在、濾過膜は主に反応後の反応産物の精製に使用されているが、本方法はインサイチュでの溶媒回復を含む。
【００７０】
本方法で使用される濾過膜は反応産物に対し不透過性である。本明細書で使用される場合、濾過膜は、その成分に対する膜除去率が８０％〜１００％である場合、すなわち、成分の８０％〜１００％が濾過後に未透過物中に存在したままである場合、組成の特定の成分に対し「不透過性」と見なされる。しかし、最良の結果のためには、反応産物除去率は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％であることが好ましい。
【００７１】
反応産物、基質、触媒、共反応物、および副生成物等の反応混合物中に存在し得る種々の成分に対する膜の除去率は、同じであっても異なっていてもよい。より具体的には、特定の実施形態では、濾過膜は、未反応基質、触媒、未反応共反応物、および／または副生成物等の反応器から排出される反応混合物中に含有され得る一つまたは複数の他の成分から溶媒を分離または単離することがさらに可能であるように選択され得る。従って、ある実施形態では、濾過膜は、基質、反応で使用される一つまたは複数の触媒、一つまたは複数の共反応物、および／または副生成物から選択される一つまたは複数の成分に対して不透過性であり得る。特定の実施形態では、濾過膜は、反応産物に対して、且つ一つまたは複数の副生成物に対して不透過性であり得る。しかし、ある実施形態においては、濾過膜が反応産物以外の一つまたは複数の成分に対して透過性であり得ると考えられる。ある実施形態では、濾過膜の除去率は、基質、触媒（使用される場合）、および共反応物から選択される一つまたは複数の成分に対して１０％未満である。このようにして、未反応基質、触媒、および／または未反応共反応物は反応器に戻され（上記のように混合容器（６）を介してもよい）、そこで反応を起こして所望の反応産物を形成し得る。
【００７２】
従って、濾過膜は基質に対しては透過性であっても不透過性であってもよい。好ましい実施形態では、濾過膜は基質に対して不透過性である。より具体的には、濾過膜は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の基質除去率を有し得る。この
ようにして、透過物が基質を本質的に含有しないことを保証でき、これにより、反応器（３）内および／または混合容器（６）内の基質濃度を一定に維持することが容易となる。
【００７３】
しかし、前記方法は、典型的には、段階（ｂ）で反応器から排出される反応混合物が未反応基質をほとんど含有しないように実行される。そのような条件下では、濾過膜が基質に対して透過性であっても、濾過膜の透過物は基質を本質的に含有しない。
【００７４】
本方法では、反応器から排出される反応混合物は直接的または間接的に濾過膜に導かれ得る。
【００７５】
特定の実施形態では、反応混合物は、間接的に、例えば図１および図２に示されるように、濾過膜に導かれる。より具体的には、反応器出口（１３）を介して反応器（３）から排出される反応混合物は、まず濾過ループフィードタンク（４）に導かれ、そのタンクの内容物と混合され得る。そのような実施形態では、濾過ループフィードタンクからの内容物（反応混合物を含む）は、濾過ループフィードタンク出口（１４）を介して濾過ループフィードタンク（４）から排出され、濾過膜（５）に導かれる。
【００７６】
濾過ループフィードタンクは、反応開始時の溶媒の初期貯蔵に使用され得る。従って、濾過ループフィードタンクは、反応を開始させるための、および反応の連続性を保証するための、緩衝液を供給する。さらにまたはあるいは、濾過ループフィードタンクは、反応産物の蓄積に使用され得る（後述）。
【００７７】
典型的には、反応混合物は、上記のように直接的にであれ間接的にであれ濾過膜に導かれる前には、他のいかなる濾過も受けない。従って、反応器から排出される反応混合物が溶媒および反応産物以外の成分を含む場合、これらの成分も濾過膜に導かれる。このような他の成分は、副生成物、未反応基質、未反応共反応物、および触媒から選択される一つまたは複数の成分を含み得る。従って、特定の実施形態では、反応器から排出される反応混合物は、上記のように直接的にであれ間接的にであれ、その全体が前記濾過膜に移される。好ましい実施形態では、本方法は単一の濾過膜の使用を含み、すなわち、反応混合物または濾過膜の透過物は第二の濾過膜に導かれない。しかし、これは、方法終了後の反応産物のさらなる精製を排除するものではない。
【００７８】
典型的に、濾過はダイアフィルトレーション方式で作動される。ダイアフィルトレーションは、少なくとも２つの化合物、すなわち溶媒および反応産物、を含有する供給液を膜と接触させ圧力をかけて、前記液体（の一部分）に強制的に膜を通過させる、液体濾過法を含む。本方法では、濾過膜は、反応産物に対しては高い除去率を、溶媒に対しては低い除去率を有する。濾過の間、一定の供給体積で作動可能であるように、あらたな供給が膜の供給側に補充されて、膜を透過する液体が補われる。濾過膜はさらに、クロスフロー濾過方式で作動し得る。そのような方式では、膜を透過する液体は膜と平行して供給されるが、これは、膜と平行した供給によって、膜表面における十分な程度の乱流が保証されるためである。しかし、ある実施形態では、濾過膜は、膜を透過する液体が膜と垂直方向に供給される全量濾過方式で作動され得ると考えられる。
【００７９】
濾過膜は種々様々な材料で作られていてよく、異なるカットオフ値を有する種々様々な濾過膜を使用してよい。カットオフまたはカットオフ値とは、その９０％が膜によって除去される分子の分子量を意味する。濾過膜は、膜により除去されることが意図される、溶媒、基質、または他の反応成分の性質を考慮して、当業者によって選択される。
【００８０】
含まれる反応、基質、反応物および溶媒の性質に応じて、膜は、２ｋＤＡ〜５００ｋＤａの範囲の典型的なカットオフを有する限外濾過膜、または、酵素反応もしくは重合反応
の場合により適切である可能性がある、５００ｋＤａ超の分子量に対する典型的なカットオフを有する精密濾過膜であり得る。より小さな分子を含む反応（例えば大環状化反応）においては、膜は、２００Ｄａ〜２ｋＤａの範囲の典型的なカットオフ値を有するナノ濾過膜、または、さらには２００Ｄａ未満の典型的なカットオフを有する逆浸透膜である可能性がより高い。
【００８１】
濾過膜は、典型的には、膜除去率、カットオフおよび透過流束が方法によって、並びに方法に含まれる基質、溶媒および反応産物によって課せられる要求を満たすように選択される。濾過膜は、暴露される混合物中に含有される成分との反応の最小のリスク、および暴露される混合物中の成分の分解の最小のリスクを示すように、並びに、膜を通過する流動および膜の除去特性を変化させ得ることから、膨張の最小のリスクを示すように、選択されることが好ましい。それにより、膜は、選択された反応溶媒と接触した状態で数ヶ月〜数年の安定性を示すように選択されることが好ましい。
【００８２】
本発明のデバイスにおける濾過膜としての使用に適した材料としては、高分子材料またはセラミック材料が挙げられる。好ましい材料としては、精密濾過膜、限外濾過膜、ナノ濾過膜または逆浸透膜の作製に適した高分子材料、例えば、限定はされないが、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリアミドイミド（ＰＡＩ）、セルロースアセテート（ＣＡ）、ポリアニリン（ＰＡｎ）、ポリベンゾイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、並びにこれらの組合せおよび混合物が挙げられる。
【００８３】
ある実施形態では、濾過膜は、（薄い）選択的に透過性の上層を備えた担体を含み得る。前記上層は、以下から選択されるがこれらに限定はされない、一つまたは複数の高分子から形成または構成され得る：（修飾）ポリシロキサン系エラストマー、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）系エラストマー、エチレン−プロピレン−ジエン（ＥＰＤＭ）系エラストマー、ポリノルボルネン系エラストマー、ポリオクテナマー系エラストマー、ポリウレタン（ＰＵ）系エラストマー、ブタジエンおよびニトリルブタジエンゴム系エラストマー、天然ゴムおよびブチルゴム系エラストマー、ポリクロロプレン（Ｎｅｏｐｒｅｎｅ）系エラストマー、エピクロロヒドリンエラストマー、ポリアクリレートエラストマー、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）系エラストマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリアミド、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡＸ）、ポリ（１−トリメチルシリル−１−プロピン）（ＰＴＭＳＰ）並びに他のポリアセチレン、ポリアミド、ポリアニリン、ポリピロール、並びにこれらの組合せおよび混合物。
【００８４】
高分子膜を製造するための技術は当該技術分野において公知であり、例えば、転相、焼結、延伸、トラックエッチング、テンプレートリーチング、界面重合、溶液流延、浸漬塗布、スピン塗布および溶射塗布が挙げられる。膜は架橋結合されていてもよく、あるいは、反応溶媒中の膜の安定性を向上させるように処理されていてもよい。
【００８５】
適切な膜材料の他の具体例としては、例えば焼結、リーチング、熱水またはゾル・ゲル処理等の当業者に公知のあらゆる技術を用いて作製された、無機材料、例えば、炭化ケイ素、酸化ケイ素、酸化ジルコニウム、酸化チタン、ゼオライト、およびこれらの組合せまたは混合物から作製されたものが挙げられる。
【００８６】
本発明で使用される膜は、粉末固体の形態の分散した有機粒子または無機粒子を有する高分子膜（混合型マトリックス膜）も含み得る。粉末固体は通常、高分子膜の２０ｗｔ％
以下の含量で存在し、分子ふるいカーボン粒子、ゼオライト、並びに二酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化亜鉛および二酸化ケイ素等の金属酸化物が挙げられる。酸化セリウム、酸化ジルコニウム、および酸化マグネシウムの混合物等の混合金属酸化物も使用され得る。マトリックス粒子は、１．０ミクロン未満、より好ましくは０．１ミクロン未満、最も好ましくは０．０１ミクロン未満の数平均直径を有することが好ましい。これらの混合型マトリックス膜は、焼結、延伸、トラックエッチング、テンプレートリーチング、界面重合または転相を含む、当該技術分野において公知のあらゆる技術によって作製され得る。膜内の高分子は架橋結合されていてもよく、あるいは、膜は、反応溶媒中の膜の安定性を向上させるように処理されていてもよい。
【００８７】
本発明において使用される膜は、例えば、シラン化、ホスホン酸グラフティングまたはグリニャールグラフティング等の、当業者に公知のあらゆるグラフティング技術を用いて作製される、外表面上に、または完全な細孔表面上にグラフトされたセラミック（または無機）膜も含み得る。あるいは、膜は、例えば、当業者に公知の、適合した金属酸化物前駆物質から開始するゾル・ゲル法を用いて作製される、複合型有機−無機材料を含み得る。
【００８８】
上記の通り、本明細書に記載される方法は連続方法であることが好ましい。そのような方法において、反応混合物（または濾過ループフィードタンク内容物）は、一定の（中断されない）流れとして、またはパルス性の流れとして、濾過膜を横切って連続的に導かれる。典型的には、反応混合物（または濾過ループフィードタンクの内容物）からの溶媒が膜を透過する速度は、反応混合物が反応器から排出される速度、および基質フィードおよび溶媒が反応器に加えられる速度と一致する。好ましい実施形態では、これらの流れの速度は５％を超えて異ならず、好ましくは１％を超えて異ならない。
【００８９】
上記のように、濾過膜は、反応産物および反応混合物中に含有される所望による他の成分から、溶媒を分離または単離する。より具体的には、濾過膜の透過物は溶媒（の大部分）を含み、一方、未透過物は反応産物（の大部分）を含む。本方法において、透過側からの濾過膜を透過した溶媒は、上記のような段階（ａ）におけるさらなる基質フィードの希釈のために（連続的に）再利用される。これにより、溶媒の消費および浪費の最小化が可能となる。好ましい実施形態では、段階（ａ）で加えられる溶媒の少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、は濾過膜の透過側からの溶媒である。
【００９０】
より具体的には、本方法の段階（ｄ）において、濾過膜を透過した溶媒は、段階（ａ）におけるさらなる基質フィードの希釈のために再利用される。より具体的には、これは、濾過膜の透過側からの溶媒が反応器の入口に（直接的または間接的に）導かれることを意味する。
【００９１】
基質が専用の混合容器（６）内で溶媒と混合される実施形態では、段階（ｄ）は、濾過膜を透過した溶媒を混合容器（６）に（連続的に）戻すことを含む。反応器（３）に戻された溶媒は、段階（ｂ）において反応器から排出される反応混合物を補充し、反応器（３）内での企図される基質希釈の達成を支援する。
【００９２】
同様に、基質が反応器（３）内で溶媒と混合される実施形態では、段階（ｄ）は、濾過膜を透過した溶媒を反応器（３）に（連続的に）戻すことを含む。混合容器（６）に戻された溶媒は、混合容器から反応器（３）に排出される反応混合物を補充し、混合容器（６）内での企図される基質希釈の達成を支援する。
【００９３】
上記の通り、本明細書に記載される方法は連続方法であることが好ましい。そのような方法において、透過した溶媒は、連続的に再利用され、一定の（中断されない）流れとし
て、またはパルス性の流れとして、反応器（３）または混合容器（６）に戻される。溶媒が反応器または混合容器に戻される速度は、典型的には、基質フィードが反応器または混合容器に加えられる速度、反応混合物が反応器から排出される速度、および反応混合物が濾過膜を透過する速度と一致する。
【００９４】
上記のように、濾過膜（５）は、溶媒からの反応産物の分離を可能にし、透過物は溶媒（の大部分）を含有し、未透過物は反応産物（の大部分）を含む。本明細書に記載される方法において、未透過物（反応産物および所望により副生成物等の他の成分を含む）は、反応器（３）に戻されずに、反応器以外のリザーバ内に蓄積される。このようにして、反応産物がさらに反応することで、望まれない副生成物を形成しないことを、確実にすることができる。従って、本方法では、濾過膜からの未透過物は、反応器以外のリザーバに導かれる。
【００９５】
濾過ループフィードタンクの使用を含む実施形態では、濾過ループフィードタンクは、反応産物が蓄積されるリザーバとして機能し得る。従って、ある実施形態では、本方法の段階（ｅ）は、濾過膜からの未透過物を濾過ループフィードタンクに戻すことを含み得る。従って、濾過ループフィードタンクは、溶媒用のリザーバを提供し得るだけでなく、反応産物を蓄積するためのリザーバも提供し得る。これにより、比較的単純な機構を用いての本方法の実施が可能となる。
【００９６】
濾過ループフィードタンク内の反応産物の蓄積は、必要な場合の反応産物の追加処理をさらに促進し得る。このような処理は、純粋溶媒で反応産物を洗浄して不純物を除去し、前記産物がさらなる精製段階に適した溶媒中に与えられるように溶媒交換を行うこと、を含み得る。
【００９７】
本明細書に記載の方法は、基質フィードが枯渇するとすぐに、またはより一般的には、特定量の基質フィード、触媒、および／または共反応物が消費されるとすぐに、終了し得る。その時点から、新たな基質フィードの追加は停止され得るが、反応混合物排出、濾過、および溶媒再利用のループは、反応を完了させることにより、および、可能な限り多くの反応産物を収集することにより、方法収率を増加させるために、しばらく継続され得る。
【００９８】
本方法は、反応する基質に対する高度希釈下での、化学反応の実行を可能にする。しかし、典型的に反応産物が高度に希釈された形態で得られる対応するバッチ処理と異なり、本方法で得られる反応産物は濃縮された形態であり、これは、反応産物の精製および／またはさらなる使用を有意に促進する。従って、方法の終了時に、反応産物は、古典的な単離および／もしくは精製手順を受けるか、または、その後に行われ得る合成段階の制約に応じて、その後の反応で直接使用され得る。特定の実施形態では、本方法は、上記のようにリザーバ内に蓄積された反応産物を精製する段階（ｆ）を含み得る。典型的には、段階（ｆ）は、他の段階（ａ）〜（ｅ）とは同時に実行されず、これらの段階の終了後に実行される。反応産物の精製は、典型的には、副生成物、基質、共反応物、および／または触媒等の一つまたは複数の不純物から反応産物を分離することを含む。精製は、濾過、蒸留、液液抽出、または当該技術分野において公知の他の分離技術を含み得る。
【００９９】
さらに、本明細書において、溶媒を含む希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための系が提供される。そのような系の例が図１および図２に示される。より具体的には、前記系は、本明細書に記載の方法の実行に適しており、基質フィードをそれ自体としてまたは溶剤溶液中で含有するためのフィードタンク（１）を含む。フィードタンク（１）は、第一入口（７）を介して反応器（３）に（図１）、または、第一入口（７）を介して反応器（３）に連結された混合容器（６）に（図２）、連結されていてもよい。本
明細書で使用される用語「連結された」は、一方の構成要素から他方へ溶液が流れることを可能にする、系の２つの構成要素間の連結を指す。反応が起こる反応器（３）はさらに、その出口（１３）を介して、濾過ループフィードタンク（４）に、その入口（１０）を介して連結される。濾過ループフィードタンク（４）はさらに、出口（１４）を介して、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する本明細書に記載の濾過膜に連結される。未透過物は、濾過ループフィードタンク（４）にその入口（１１）を介して戻され、一方、濾液（溶媒）は、反応器（３）に、または混合容器（６）に、入口（９、１２）を介して戻される。前記系は、触媒および／または共反応物を含有するための反応器（３）および／または混合容器（６）に連結されたさらなるフィードタンク（２）を含んでいてもよい。
【０１００】
本明細書において企図される系において、用語「反応器」は、基質が反応を起こして反応産物を形成する容器を記述するために使用される。特定の実施形態では、これは、反応器が、そのような反応を可能にするように、反応器内の圧力および／または温度等の条件を測定、モニターおよび／または管理（調節）するように構成されていることを意味する。
【０１０１】
ある実施形態では、前記系は以下を含み得る：
（ｉ）以下を含む反応器（３）：
少なくとも１つの第一および第二（７、８、９のうちの２つ以上）；並びに
反応器出口（１３）；
（ｉｉ）前記第一入口（７）を介して前記反応器（３）に連結された第一フィードタンク（１）；
（ｉｉｉ）所望による、前記第二入口（８）を介して前記反応器（３）に連結された第二フィードタンク（２）；
（ｉｖ）以下を含む濾過ループフィードタンク（４）：
前記反応器出口（１３）を介して前記反応器（３）に連結された第一濾過ループフィードタンク入口（１０）；
第二濾過ループフィードタンク入口（１１）；および
濾過ループフィードタンク出口（１４）；
並びに、
（ｖ）前記濾過ループフィードタンク出口（１４）から溶液を受け取るように構成され、未透過側および透過側を有することにより、前記第三入口（９）を介して前記反応器（３）に透過物を戻すように、および、前記第二濾過ループフィードタンク入口（１１）を介して前記濾過ループフィードタンク（４）に未透過物を戻すようにさらに構成された、濾過膜（５）。
【０１０２】
特定の実施形態では、前記系は２つのフィードタンクを含み、それにより、反応器は、第一入口（７）を介して第一フィードタンクに、および、第二入口（８）を介して第二フィードタンクにに連結されている。特定の実施形態では、前記系は、濾過膜（５）の透過側（１６）に連結された第三入口（９）を含む。
【０１０３】
ある実施形態では、前記系は、基質フィードが反応器（３）に進入する前に基質フィードを溶媒で希釈することを可能にする、混合容器（６）を含み得る。そのような実施形態では、前記系は以下を含み得る：
（ｉ）以下を含む反応器（３）：
少なくとも１つの第一および第二の入口（７、８）；並びに
反応器出口（１３）；
（ｉｉ）入口（１２）を有し、前記第一入口（７）を介して前記反応器（３）に連結された、混合容器（６）；
（ｉｉｉ）前記混合容器（６）に連結された第一フィードタンク（１）；
（ｉｖ）所望による、前記第二入口（８）を介して前記反応器（３）に連結された第二フィードタンク（２）；
（ｖ）以下を含む濾過ループフィードタンク（４）：
前記反応器出口（１３）を介して前記反応器（３）に連結された第一濾過ループフィードタンク入口（１０）；
第二濾過ループフィードタンク入口（１１）；および
濾過ループフィードタンク出口（１４）；
並びに、
（ｖｉ）前記濾過ループフィードタンク出口（１４）から溶液を受け取るように構成され、未透過側および透過側を有することにより、前記入口（１２）を介して前記混合容器（６）に透過物を戻すように、および、前記第二濾過ループフィードタンク入口（１１）を介して前記濾過ループフィードタンク（４）に未透過物を戻すようにさらに構成された、濾過膜（５）。
【０１０４】
特定の実施形態では、前記系は２つのフィードタンクを含み、それにより、反応器は、第一入口（７）を介して第一フィードタンクに、および、第二入口（８）を介して第二フィードタンクにに連結されている。特定の実施形態では、反応器は、フィードタンクに連結された１つのみの第一および第二の入口を含む。特定の実施形態では、前記系は、フィードタンクに連結された第一および第二の入口が確実に同時に開放されるように構成される。特定の実施形態では、前記系は、少なくとも３つの入り口を含み、そのうちの１つ（９）は濾過膜（５）の透過側（１６）に連結される。
【０１０５】
ある実施形態では、前記系は、膜流束の関数として、反応混合物が反応器（３）または濾過ループフィードタンク（４）から放出される速度および基質添加速度を調整するための手段を含み得る。濾過系は反応器または濾過ループフィードタンクからの定容量ダイアフィルトレーションによって遂行されるため、反応混合物が反応器（３）または濾過ループフィードタンク（４）から放出される速度は膜流束によって決定される。従って、膜流束は、反応混合物が反応器から取り除かれる速度を決定し、従って、反応の発生要求速度も決定する。膜流束の変動は、例えば、膜および濾過のパラメータ（膜表面積、圧力等）を変化させることにより達成され得る。
【０１０６】
本発明の系における使用に適した反応器の例は、事実上大きく異なっている場合があり、例えば、従来のバッチ式反応器、および連続撹拌反応器、フロー反応器またはマイクロ反応器が挙げられる。反応器は、典型的には、反応器に含有される反応混合物の十分な均一性を保証するための混合手段を備えている。混合手段はさらに、基質フィードを溶媒と混合するためにも使用され得る。また、混合容器および濾過ループフィードタンクは、典型的には、適切な混合手段を備えている。
【０１０７】
前記系の種々の構成要素間の液体流動を実現するため、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、および逆浸透において従来的に適用されているように、圧力が駆動力として使用され得る。典型的には、これは、当該技術分野で公知のように、ポンプを用いて獲得される。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、特許請求された方法および適用の説明を目的として提供するものであり、本発明の範囲を限定することは決して意図しておらず、そのように解釈されるべきでもない。
【０１０９】
ペプチド環化
本明細書に記載の方法は、ペプチド環化を含む種々の反応を実行するのに使用すること
ができる。非環式ペプチド基質（１７）の２つの官能基ＲおよびＲ１の間の内部反応を介した一般的なペプチド環化反応による、環式ペプチド反応産物（１８）の形成が、図３に示される。
【０１１０】
環化反応は、図１に示される機構を用いて実行した。方法開始時における機構の各部分内の成分の概要を表１に示す。
【０１１１】
基質フィード溶液（非環式ペプチド（１７）の濃縮溶液）は基質フィードタンク（１）に供給される。適切な溶媒中の試薬溶液または触媒溶液は別のフィードタンク（２）に供給される。基質フィード溶液および試薬溶液または触媒溶液は、それぞれ第一（７）および第二（８）反応器入口を介して反応器（３）に連続的且つ同時に加えられる。反応器（３）はまず、溶媒または溶媒混合物を含んで、非環式ペプチドを含む希釈反応混合物を形成させる。反応が進むにつれて、反応産物（１８）を含む反応混合物が反応器出口（１３）を介して反応器（３）から連続的に取り除かれ、濾過ループフィードタンク入口（１０）を介して濾過ループフィードタンク（４）に進入する。濾過ループフィードタンク（４）は最初、溶媒または溶媒混合物を含むのみである。濾過ループフィードタンク（４）内に含有された溶液は、反応器（３）内の溶液をダイアフィルトレーション溶液として使用する、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する濾過膜（５）を通過する定容量ダイアフィルトレーションに連続的にかけられる。未透過物（環式ペプチド産物（１８）を含む）は濾過ループフィードタンク（４）に戻され、一方、透過物（溶媒）は第三反応器入口（９）を介して反応器（３）に戻される。反応器（３）内の基質の一定の希釈が得られるように、反応器（３）への透過物添加速度は基質フィード添加と一致する。
【０１１２】
実際には、最初の２００ｍＬの透過物の膜流束の測定で十分である。測定された流束に基づいて、基質フィードおよび試薬／触媒（ヨウ素）溶液が加えられる速度を決定することができる。
【０１１３】
適切な膜が濾過膜として使用される。使用したセラミック膜を通じた非環式ペプチド出発物質（１７）および環式ペプチド産物（１８）の除去率は、共に、約９５％以上であることが分かった。この高い除去率は、反応が進行するにつれて、濾過ループフィードタンク（４）内の環式ペプチド産物の蓄積をもたらす。
【０１１４】
この方法を用いた結果を表２にまとめる。本明細書に記載の方法（エントリー５〜１０）によって得られる環式ペプチド収率および非環式ペプチド変換（超高性能液体クロマトグラフィー‐ＵＰＬＣを介して決定される）は、対応するバッチ式反応（エントリー１）から得られた値に匹敵することが分かった。
【０１１５】
【表１】
0006517350.tif 000002
【０１１６】
【表２】
0006517350.tif 000003
【０１１７】
本発明の目的は、バッチ処理と比較して、同量の反応産物に対し必要とされる溶媒が有意により少ない、希釈された反応混合物中の基質の化学反応を実行するための方法を提供することである。これの適切な計量はプロセス質量強度（ＰＭＩ）である（Jimenez-Gonzalez C et al., Org. Process Res. Dev. 2011, 15, 912を参照）が、それは、ＰＭＩが
反応中の全ての投入材料を考慮に入れており、ACS・グリーン・ケミストリー・インステ
ィテュート・ファーマシューティカル・ラウンド・テーブルによって推奨されているためである。ＰＭＩは、方法または方法段階で得られた反応産物の質量に対する方法または方法段階中の全質量（試薬、溶媒等）の割合と定義される。
【０１１８】
各実験について得られたＰＭＩが表２に含まれる。エントリー１（バッチ処理）をエントリー５〜９（本明細書に記載の連続方法を介した反応）と比較した場合、本明細書に記載される方法が対応するバッチ処理よりもかなり少ない溶媒しか必要としないことは明らかである。
【０１１９】
エントリー５は、最適化されていない方法の結果を示している。前記方法は約６３％の溶媒添加減少を可能にするが、非環式ペプチドの変換および環式ペプチドの収率は、バッチ式反応との直接比較において、減少している（表２のエントリー１）。収率および変換の減少は、反応混合物がいったん撹拌器／反応器から取り除かれると、さらなる反応がほぼまたは全く起こらないという事実に起因し得る。従って、反応混合物が反応器から排出される前に環式ペプチドへの環化が完了されない場合、最適以下の収率が得られる。
【０１２０】
濾過系は反応器からの定容量ダイアフィルトレーションによって遂行されるため、反応混合物が反応器から排出される速度は膜流束によって決定される。従って、膜流束は、反応混合物が反応器から取り除かれる速度を決定し、従って、反応の発生要求速度も決定する。膜流束の変動は、膜パラメータ（表面積、圧力等）を変化させることにより達成され得る。基質（１７）の十分な変換を伴って、反応混合物を反応器から取り除くことができる速度は反応速度によって決定され、反応速度は反応パラメータの変化により影響を受け得る。
【０１２１】
本実験では、使用した試薬のモル当量を２（表２のエントリー５で使用）から３（表２のエントリー６〜９で使用）に増加させることにより、環化の速度は増加した。変換を強制的に完了させるためのさらなる手段としては、成功した場合もあれば失敗した場合もあるが、非環式ペプチドの添加を開始する前にいくつかの試薬を撹拌器／反応タンクに添加すること（表２のエントリー７）、および、このタンクを通常の温度より５℃高温まで温めること（表２のエントリー８）が挙げられる。完全な変換は最終的に、非環式ペプチドの添加と同時に、３当量のヨウ素を触媒として反応器に添加することにより達成された。さらに、断続的な触媒添加と比較して、円滑で連続的な触媒添加によってより良好な結果が得られることが分かった。
【０１２２】
１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンの調製
１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンは式（Ｉ）で表される。
【０１２３】
【化１】
0006517350.tif 000004
【０１２４】
１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンは、高度希釈条件下での非環式ノナペプチド（１−９）ＮＨ２ＤＤＡＶＰ（ＮＨ２−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ２）の環化により調製することができる。環化反応はスルフィド架橋の形成を含む酸化的方法である。１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンの合成のための従来のバッチ処理の一例は、米国特許第５，６７４，８５０号に記載されている。前記米国特許に記載されるバッチ処理は、反応産物の量に対して、大量の溶媒（水および酢酸）を必要とする。
【０１２５】
本発明者らは、本明細書に記載される方法の特定の実施形態により、１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンを調製した。基質として、システイン硫黄部分にアセトアミドメチル（Ａｃｍ）保護基を有する（１−９）ＮＨ２ＤＤＡＶＰを使用した。前記基質はエタノール中のヨウ素の溶液で処理され、それにより、システインが脱保護され、ジスルフィド架橋が酸化的に形成される。
【０１２６】
前記反応は、図１に示される機構を用いて実行される。方法開始時における機構の各部分内の成分の概要を表３に示す。基質フィード溶液（約１８ｍＭの酢酸溶液または２２．５ｇ／Ｌ（１−９）ＮＨ２ＤＤＡＶＰ）が基質フィードタンク（１）に供給される。エタノール中のヨウ素溶液（約２００ｍＭまたは２５ｇ／Ｌのヨウ素濃度）が別のフィードタンク（２）に供給される。基質フィード溶液およびヨウ素溶液は、それぞれ第一（７）および第二（８）反応器入口を介して反応器（３）に連続的且つ同時に加えられる。反応器（３）はまず、水−酢酸混合物を含んで、１ｇ／Ｌ（１−９）ＮＨ２ＤＤＡＶＰを含む希釈反応混合物を形成させる。反応器（３）内の温度は約２６℃である。反応が進むにつれて、反応混合物が反応器出口（１３）を介して反応器（３）から連続的に取り除かれ、濾過ループフィードタンク入口（１０）を介して濾過ループフィードタンク（４）に進入する。濾過ループフィードタンク（４）は最初、水を含有するのみである。濾過ループフィードタンク（４）内に含有された溶液は、反応器（３）内の溶液をダイアフィルトレーション溶液として使用する、未透過側（１５）および透過側（１６）を有する濾過膜（５）を通過する定容量ダイアフィルトレーションに連続的にかけられる。未透過物（１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンを含む）は濾過ループフィードタンク（４）に戻され、一方、透過物（溶媒）は第三反応器入口（９）を介して反応器（３）に戻される。反応器（３）内の基質の一定の希釈が得られるように、反応器（３）への透過物添加速度は基質フィード添加と一致する。
【０１２７】
実際には、最初の２００ｍＬの透過物の膜流束の測定で十分である。測定された流束に基づいて、基質フィードおよびヨウ素溶液が加えられる速度を決定することができる。
【０１２８】
約４５０Ｄａの分画分子量を有する５０ｃｍ単一チューブ０．９ｎｍ  ＴｉＯ２セラミック膜（イノポア社（ドイツ）から市販）が、濾過膜として使用される。使用したセラミック膜を通じた直鎖ペプチド出発物質および環式ペプチド産物の除去率は、共に、約９７．５であることが分かった。この高い除去率は、反応が進行するにつれて、濾過ループフィードタンク（４）内の生成物１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンの蓄積をもたらす。
【０１２９】
膜透過性は、膜を用いて実行された全ての実験において０．６ｌｍ−２ｈｒ−１ｂａｒ−１であった。反応が完了した後、ダイアフィルトレーション方法を継続して、確実に、全ての反応成分を濾過ループに移した。より具体的には、ダイアフィルトレーション方法を、４ダイアフィルトレーション体積が膜を通過するまで、作動させた。ダイアフィルトレーション方法のより短期の継続も、良好な結果を与えるであろうと予想される。完全な方法のための時間の減少は、膜表面積を増加させて、時間当たりに生じる透過物の体積および試薬添加速度を同時に増加させることにより、達成することができる。
【０１３０】
この方法（実験１）を用いた結果を表４にまとめる。１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニン収率および（１−９）ＮＨ２ＤＤＡＶＰ変換（超高性能液体クロマトグラフィー−ＵＰＬＣによって決定される）が、対応するバッチ式反応（実験２）から得られた値に匹敵することが分かった。
【０１３１】
【表３】
0006517350.tif 000005
【０１３２】
【表４】
0006517350.tif 000006
【０１３３】
しかしながら、各実験について得られたＰＭＩ（表２）によって示されるように、本明細書に記載される方法は、対応するバッチ処理よりもかなり少ない溶媒しか必要としない。実際に、本方法のＰＭＩがバッチ処理のＰＭＩよりかなり低く、７０％超の溶媒使用の減少を可能にすることは明らかである。なお、前記反応は、フィードタンク（２）内のヨウ素に加えて、いくらかのヨウ素を反応開始時に反応器（３）に与えることによっても、さらに最適化することができた（収率および変換を向上させることができた）（表２、実験３を参照）。
【０１３４】
従って、本明細書に記載される方法は、得られる生成物の同様の収率および純度をもたらす、従来のバッチ処理と同様の基質濃度を用いた反応の実行が可能である。しかしながら、溶媒が連続的に再利用されることから、反応器（３）の体積および必要とされる溶媒の総量を有意に減少させることができる。
【図１】
0006517350.tif 000007
【図２】
0006517350.tif 000008
【図３】
0006517350.tif 000009