(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの志賀毒素Ｂサブユニットタンパク質がペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質を有効成分とする大腸菌性下痢症防除剤であって、前記大腸菌性下痢症が、易熱性エンテロトキシン（LT）と耐熱性エンテロトキシン（ST）のどちらか一方、または両方を産生し、Stx2e毒素を産生しない腸管毒素原性大腸菌の感染によって引き起こされる大腸菌性下痢症であり、前記ペプチドリンカーが配列番号２で表されるアミノ酸配列または配列番号２と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドである、前記大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項２】
前記腸管毒素原性大腸菌は少なくともLTを産生する、請求項１に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項３】
前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を含む組み換えベクターで形質転換され、前記ハイブリッドタンパク質を発現した形質転換体として投与される、請求項１または２に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項４】
形質転換体が栄養繁殖性植物である、請求項３に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項５】
栄養繁殖性植物がイチゴである、請求項４に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項６】
非ヒト動物用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項７】
非ヒト動物がブタ、ウシまたはニワトリである、請求項６に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項８】
非ヒト動物が哺乳期〜120日齢のブタまたは母豚である、請求項７に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
【請求項９】
少なくとも２つの志賀毒素Ｂサブユニットタンパク質がペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質または当該ハイブリッドタンパク質を含む形質転換体を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の大腸菌性下痢症を防除する方法であって、前記大腸菌性下痢症が、易熱性エンテロトキシン（LT）と耐熱性エンテロトキシン（ST）のどちらか一方、または両方を産生し、Stx2e毒素を産生しない腸管毒素原性大腸菌の感染によって引き起こされる大腸菌性下痢症であり、前記ペプチドリンカーが配列番号２で表されるアミノ酸配列または配列番号２と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドである、前記方法。
【請求項１０】
前記腸管毒素原性大腸菌は少なくともLTを産生する、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、志賀毒素を有効成分とする大腸菌性下痢症防除剤に関する。本発明はまた、志賀毒素防除剤を高生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌性下痢の多くは腸管毒素原性大腸菌により引き起こされるが、その主要な原因毒素は、易熱性毒素（LT）または耐熱性毒素（ST）であり、毒素原性大腸菌（enterotoxigenic Escherichia coli）が産生するタンパク質性内毒素である。これらの細菌毒素による疾患を予防する方法としては、ワクチンを、注射もしくは経鼻スプレーにより投与したり、経口的に投与したりする方法が知られている。
大腸菌性下痢には、新生期下痢（早発性下痢）と離乳後下痢がある。予防には抗生物質の投与とワクチンの投与がある。新生期下痢の予防には母豚免疫用不活化ワクチンが開発されている。哺乳豚は母豚を介して、ワクチン抗体を乳汁から受動的に獲得できる。国内の市販ワクチンでは、精製したF4、F5、F6線毛等の定着因子またはこれらの定着因子を発現する大腸菌の不活化菌体が免疫原として使用されている。これらの定着因子の他に、LTの細胞レセプターへの結合を阻止する目的でLTのBサブユニットも配合されたワクチンがある。【０００３】
一方、離乳後下痢においては、新生豚体内での免疫グロブリンGの半減期は平均13.8日と報告されており、初乳を介した母豚から獲得した免疫グロブリンGの量では感染防御は期待できない。また、線毛を発現する生菌ワクチンや、線毛を成分にしたサブユニットワクチンの開発が試みられているが、実用化には至っていない。さらに近年、LTやST毒素に加え、Stx2e毒素も産生する大腸菌の出現が知られており、複合的な予防が必要になっている。【０００４】
特許文献１では、志賀毒素のＢサブユニットがブタ浮腫病に対してワクチン効果を有することが記載されている。特許文献２では、植物における遺伝子組換えハイブリッドタンパク質を高生産することを目的として、志賀毒素ワクチンおよびコレラ毒素を各々２〜３個連結すると、ハイブリッドタンパク質の蓄積量が向上することが記載されている。特許文献３では、易熱性毒素及びコレラ毒素を発現するように形質転換された植物を経口投与して免疫化することが記載されている。
非特許文献１では、マウスを使った実験で易熱性毒素のＢサブユニットが大腸菌性下痢症の予防に期待できる知見が得られている。非特許文献２では、Ｂサブユニットを含む易熱性ホロ毒素がブタ大腸菌性下痢症に対してワクチン効果を有することが記載されている。非特許文献３では、志賀毒素のＢサブユニットを連結したハイブリッドタンパク質がレタスにおいて高発現されることが記載されている。
しかしながら、ブタ浮腫病と大腸菌性下痢症は防疫の観点では異なる対策が取られることが一般的であり、上記先行技術文献のいずれにおいても、志賀毒素が大腸菌性下痢症に対して防除効果を有することは記載されていない。また、特許文献１，２及び非特許文献３では、志賀毒素をレタスやタバコに導入し、ハイブリッドタンパク質を生産できることが記載されているが、イチゴなどの栄養繁殖性植物でハイブリッドタンパク質を高生産できることは記載されていない。なお、志賀毒素タンパク質は、タバコで高発現できたとしても、防除剤等の開発にはタンパク質精製等が伴うため、応用面では不適であるという問題、そして、タバコなどの種子繁殖性植物の場合、獲得した組換え系統の世代を跨いだ維持が難しい等の問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第0793717号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vaccine 19 (2001) 2742-2748
【非特許文献２】Vet Microbiol. 2013 Mar 23;162(2-4):731-9
【非特許文献３】Matsui et al., 2011, Transgenic Res., 20;735-48
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、大腸菌性下痢症、より詳細には、離乳後下痢を予防することを課題とする。また、本発明は、十分な量の志賀毒素タンパク質を生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、志賀毒素のＢサブユニットが、大腸菌性下痢症、特に離乳後下痢の防除剤（ワクチン効果、免疫賦活効果、または治療効果）として有効であること、そして、LT毒素及びST毒素などの複数毒素を保有する大腸菌の感染予防に有効であることを見出した。
本発明者らは、このようにして本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）志賀毒素を有効成分とする大腸菌性下痢症防除剤。
（２）志賀毒素がＢサブユニットである、（１）に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（３）少なくとも２つの志賀毒素タンパク質がペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質を有効成分とする、（１）または（２）に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（４）志賀毒素をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を含む組み換えベクターで形質転換され、志賀毒素を発現した形質転換体として投与される、（１）〜（３）のいずれかに記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（５）形質転換体が栄養繁殖性植物である、（４）に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（６）栄養繁殖性植物がイチゴである、（５）に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（７）非ヒト動物用である、（１）〜（６）のいずれかに記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（８）非ヒト動物がブタ、ウシまたはニワトリである、（７）に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（９）非ヒト動物が哺乳期〜120日齢のブタまたは母豚である、（８）に記載の大腸菌性下痢症防除剤。
（１０）志賀毒素をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を含む組み換えベクターで栄養繁殖性植物を形質転換することを特徴とする、大腸菌性下痢症防除剤の製造方法。
（１１）志賀毒素または志賀毒素を含む形質転換体を非ヒト動物に投与することを特徴とする、非ヒト動物の大腸菌性下痢症を防除する方法。
（１２）志賀毒素タンパク質のＢサブユニットを有効成分とする動物の肥育向上剤。
（１３）動物の大腸菌性下痢症の防除に用いるための志賀毒素。
（１４）動物用大腸菌性下痢症防除剤の製造のための志賀毒素の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の防除剤は、予防剤（ワクチンや免疫賦活剤）や治療剤として機能するため、離乳後下痢などの大腸菌性下痢症を予防または治療することができ、結果として、ブタの肥育向上に有効である。また、本発明の防除剤により、複数毒素を保有する大腸菌の感染を予防することができる。さらに、本発明の防除剤は、大腸菌性下痢症の症状を抑制できるという治療効果を有する。
本発明の形質転換体は、栄養繁殖性の植物の形質転換体であるため、獲得した組換え系統のクローン増殖が容易であり、同一系統の維持も容易であるため、遺伝的に均一な苗の大量生産が必要な実用化場面において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】志賀毒素のＢサブユニットをアグロバクテリウムＴｉプラスミドに導入した、改良型2a プラスミド構築物を示す。
【図２】抗生物質耐性を有する形質転換イチゴ株のPCR解析を示す（電気泳動写真）。
【図３】形質転換イチゴ株におけるStx2eBタンパク質の発現解析を示す（電気泳動写真）。
【図４】毒素原性大腸菌攻撃後の体重推移を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、志賀毒素を有効成分とする。
志賀毒素（Ｓｔｘ）は、１型（Ｓｔｘ１）及び２型（Ｓｔｘ２）に分けられる。Ｓｔｘ１は、ａ〜ｄのサブクラスに、Ｓｔｘ２はａ〜ｇのサブクラスにそれぞれ分類される。浮腫病菌が産生する型はＳｔｘ２ｅである。志賀毒素タンパク質は、毒性本体である１つのＡサブユニットと腸管粘膜への侵入へ関与する５つのＢサブユニットからなる。
Ｓｔｘ２ｅは、志賀毒素の他にベロ毒素とも呼ばれ、毒性本体であるＡサブユニット１分子と腸管粘膜への侵入に働くＢサブユニット５分子からなるホロ毒素で、真核細胞のリボソームに作用して、タンパク質合成を阻害する働きを持つ。腸管出血性大腸菌や赤痢菌の感染時に見られる出血性の下痢や、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、急性脳症などのさまざまな病態の直接の原因となる病原因子である。
Ｓｔｘ２ｅはブタ浮腫病毒素としても知られており、そのＡサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＡ）は配列番号４のアミノ酸配列で表され、Ｂサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）は配列番号６のアミノ酸配列で表される。
【００１３】
Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、ブタなどの動物に投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、それぞれ、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Ｓｔｘ２ｅＡにおいて、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり、Ｓｔｘ２ｅＢにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Ｓｔｘ２ｅＡ及びＳｔｘ２ｅＢは、それぞれ、配列番号４又は配列番号６で表されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつブタなどの動物に投与して免疫応答を引き起こすことができるものであってもよい。
なお、本発明で使用されるＳｔｘ２ｅは、ＡサブユニットまたはＢサブユニットのいずれでもよいが、Ｂサブユニットが好ましい。
【００１４】
本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、上記のような志賀毒素を有効成分とすることにより、大腸菌性下痢症に対して効果を発揮する。大腸菌性下痢症とは、易熱性エンテロトキシン（LT）と耐熱性エンテロトキシン（ST）のどちらか一方、または両方を産生する腸管毒素原性大腸菌の感染によって引き起こされる。急性の症例では急激に脱水し数日以内の経過で死亡する。回復しても肺炎などに罹患しやすく、発育不良となることが多く大きな経済損失を被る。
易熱性エンテロトキシン（LT）は、易熱性毒素と呼ばれる。コレラ毒素とほとんど同じタンパク質で、毒性本体であるAサブユニット１分子とBサブユニット５分子からなるホロ毒素である。分子量は86,000である。粘膜上皮細胞のアデニル酸シクラーゼを活性化し、cAMPレベルを上昇させることにより、膜のイオン輸送系に影響を与え、水分の流出を招き、下痢を起こすと考えられている。この毒素を産生する大腸菌を毒素原性大腸菌（ETEC）と呼ぶ。
耐熱性エンテロトキシン（ST）は、分子量2,000のペプチドからなる耐熱性毒素である。粘膜上皮細胞のグアニル酸シクラーゼを活性化し、cGMPレベルを上昇させることにより、膜のイオン輸送系に影響を与え、水分の流出を招き、下痢を誘発する。この毒を産生する大腸菌を毒素原性大腸菌（ETEC）と呼ぶ。
本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、驚くべきことに、LT毒素及びST毒素などの複数毒素を保有する大腸菌の感染予防に有効である。
本発明の防除剤は、ヒト及び動物の大腸菌性下痢症の症状を抑制できるという治療効果を有する。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、少なくとも２つの志賀毒素タンパク質のＢサブユニットがペプチドリンカーを介してタンデムに連結されたハイブリッドタンパク質である。
なお、本願明細書中において、志賀毒素またはハイブリッドタンパク質を有効成分とする大腸菌性下痢症防除剤及び肥育向上剤、志賀毒素またはハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物、志賀毒素またはハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含むベクターで形質転換された植物等を総称して、大腸菌性下痢症防除剤ということがある。なお、本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、上記志賀毒素またはハイブリッドタンパク質を含む限り、ワクチンまたは免疫賦活剤などの医薬及び飼料のいずれの形態であってもよい。本発明において、防除とは、予防及び治療のいずれも含むものである。
【００１６】
本発明で用いるペプチドリンカーのアミノ酸の個数は、好ましくは１２〜２５個、さらに好ましくは１２〜２２個である。また、本発明で用いるペプチドリンカーにおいて、好ましくは、プロリンの含有率が２０〜２７％、より好ましくは、２０〜２５％である。
ペプチドリンカーにおいて、プロリンは、好ましくは２つ置き、又は３つ置きに配置される。但し、この場合でも、ペプチドの末端においては、プロリン以外のアミノ酸が、５つ以内、好ましくは４つ以内の範囲で連続していてもよい。このような好ましいペプチドリンカーは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
本発明において、ペプチドリンカーは、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＰＧ１２）である。この配列と９０％以上、好ましくは９５％以上同一性を有するペプチドリンカーでもよい。
【００１７】
本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、２つ以上のＢサブユニットが、前記ペプチドを介してタンデムに連結されていることが好ましい。本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、２つのＢサブユニットが、ＰＧ１２（配列番号２）を介してタンデムに連結されていることがより好ましい。本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、Ａサブユニットを含んでいてもよいが、Ａサブユニットを含む場合には、Ａサブユニットは無毒化されていることが好ましい。
また、本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、さらにそのＣ末端に前記ペプチドリンカーが付加されていることが好ましい。特に、本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、そのＣ末端にＰＧ１２が付加されていることが好ましい。
本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するハイブリッドタンパク質は、２つのＳｔｘ２ｅＢが、ＰＧ１２を介してタンデムに連結され、そのＣ末端にはＰＧ１２がさらに付加されている。
前記ＰＧ１２などのペプチドを、前記志賀毒素タンパク質を連結するためのリンカーとして使用することにより、前記志賀毒素タンパク質の植物細胞への蓄積レベルが増大する。
【００１８】
本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、好ましくは、そのアミノ末端に、植物由来の分泌シグナルペプチド及び／又は葉緑体移行シグナルペプチドが付加されている。ここで、「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドが、前記ペプチドを介して連結した２つ以上の前記志賀毒素タンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、分泌シグナルペプチドは、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-glucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドが挙げられる。タバコのβ−ＤグルカンエキソヒドロラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号９で表される。
好ましい葉緑体移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット及び国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
【００１９】
さらに、本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドが付加されていてもよい。ここで、「付加」とは、シグナルペプチドが、前記ハイブリッドタンパク質のカルボキシル末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。本明細書において、アミノ末端に分泌シグナルペプチドが付加され、かつカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドが付加されたハイブリッドタンパク質を、小胞体型（ER）のハイブリッドタンパク質ともいい、該小胞体型のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を、小胞体型のＤＮＡ構築物ともいう。小胞体型のハイブリッドタンパク質は、真核生物で効率良く蓄積する報告例が多数ある。
本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、そのカルボキシル末端に、好ましくは、小胞体残留シグナルペプチドが付加されている。好ましい小胞体残留シグナルペプチドは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット及び国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されているが、ＨＤＥＬ配列（配列番号１１）を利用することができる。
他の好ましい液胞移行シグナルペプチドは、例えば、国際公開ＷＯ２００９／００４８４２号パンフレット及び国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
【００２０】
本発明で用いるハイブリッドタンパク質は、化学的に合成することもできるし、遺伝子工学的に生産することもできる。遺伝子工学的に生産する方法については、後述する。
【００２１】
本発明で用いるＤＮＡ構築物は、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。
すなわち、本発明で用いるＤＮＡ構築物は、２つ以上の志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡが、前記ペプチドをコードするＤＮＡを介してタンデムに連結されているＤＮＡを含む。前記ペプチドリンカーをコードするＤＮＡは、例えば配列番号１（ＰＧ１２）で表される。志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡとして、例えばＳｔｘ２ｅＡをコードするＤＮＡ（配列番号３）、Ｓｔｘ２ｅＢをコードするＤＮＡ（配列番号５）が挙げられる。前記ペプチドをコードするＤＮＡと志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡは、終止コドンを除いて読み枠を合わせて連結される。
【００２２】
志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号３、５の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。具体的には、各志賀毒素を生産する細菌より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択する。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。
本発明で用いるハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号７で表される。
【００２３】
ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、ハイブリッドタンパク質の翻訳量が増大するように、ハイブリッドタンパク質を構成するアミノ酸を示すコドンが適宜改変されていることも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００２４】
また、ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×ＳＳＣ（３３０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、４２℃が挙げられ、好ましくは０．１×ＳＳＣ（３３０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、６０℃が挙げられる。
【００２５】
本発明で用いるＤＮＡ構築物において、好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、エンハンサーに発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、前記ＤＮＡ構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記ハイブリッドタンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのＤＮＡが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。
エンハンサーとしては、Ｋｏｚａｋ配列や植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域が挙げられる。特に好ましくは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域に発現可能に連結されている。
【００２６】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ＡＴＧ、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域（NtADH5'UTR）（配列番号１２）を用いることができ、翻訳開始点上流３塩基を改変したNtADH5'UTR領域（NtADHmod 5'UTR）（配列番号１３）を用いることでさらに高翻訳が期待できる。
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域を得る方法は、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１３３８８２号パンフレットに記載されている。
【００２７】
また、配列番号１３の塩基配列で表されるようなNtADHmod 5'UTRは、翻訳量増大機能を保持している限り、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記NtADHmod 5'UTRと好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。
【００２８】
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞でのアッセイ等により確認することができる。
【００２９】
本発明で用いるＤＮＡ構築物は、例えば、配列番号１４で表される塩基配列を有する。
配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ構築物は、NtADHmod 5'UTRに、２つのＳｔｘ２ｅＢタンパク質を、ＰＧ１２を介してタンデムに連結し、アミノ末端に分泌シグナルペプチドを、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチドを付加したハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ構築物である。
このようなＤＮＡ構築物は、好ましくは、Matsui et al., 2011, Transgenic Res., 20;735-48の図４に記載の2BHプラスミドである。
【００３０】
本発明で用いるＤＮＡ構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及び志賀毒素タンパク質をコードするＤＮＡ、小胞体残留シグナルペプチドをコードするＤＮＡなどの各ＤＮＡを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することで構築することができる。
【００３１】
本発明で用いる組換えベクターは、前記ＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする。本発明で用いる組換えベクターは、前記ハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513）又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等を用いることもできる。ウイルスＤＮＡとしては、例えばpTB2(Donson et al., 1991)等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）
【００３２】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAターミネーター等が好ましく用いられる。
【００３３】
本発明で用いる組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、前記ＤＮＡ構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。
【００３４】
本発明で用いる形質転換体は、前記組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもアキノノゲシ属（Lactuca）などのキク科（Asteraceae）、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。本発明においては、バラ科に属する植物の細胞、中でもオランダイチゴ属 (Fragaria)の細胞が好ましく用いられる。好ましくはオランダイチゴ (Fragaria ×ananassa)を用いることができる。品種としては、とよのか、女峰、サマーベリー、エッチエス−１３８などが挙げられる。
宿主細胞としてイチゴ細胞を用いる場合は、ベクターは、前記カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を有する組換えベクター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。
【００３５】
本発明で用いる形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明のベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
【００３６】
本発明で用いるベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発明の形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより、前記志賀毒素タンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記志賀毒素タンパク質を十分な量で蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。
【００３７】
アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)は植物の傷口で感染させるもので、腫瘍誘発性のTi(tumor-inducing)プラスミドと呼ばれる大きな染色体外因子を運搬する。多くの研究所において、数年に亘る鋭意研究の後、アグロバクテリウム系の開発により、様々な植物組織を型通りに形質転換することが可能となった。この技術により転換された代表的な組織として、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、ナタネ、ジャガイモ、ポプラ、及びダイズなどがある。
様々な種の植物について、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)で形質転換された組織から植物を再生することが実証されている。この植物として、ヒマワリ、トマト、シロツメクサ、アブラナ、コットン、タバコ、ジャガイモ、トウモロコシ、イネ、その他多数の野菜作物を挙げることができる。
本発明においては、アグロバクテリウムＴｉベクターにより上記イチゴおよびジャガイモなどの栄養繁殖性植物を形質転換することが好ましい。本発明において、志賀毒素タンパク質は、イチゴの場合、好ましくは、イチゴ植物体の葉及び果実を含む植物体全体において十分な量で産生される。ジャガイモの場合、好ましくは、ジャガイモ植物体の葉、茎、及び塊茎を含む植物体全体において十分な量で産生される。
【００３８】
本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、前記形質転換体を含んでいてもよい。本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、Ｓｔｘ２ｅタンパク質を含む前記形質転換体の全部を含んでいても、一部を含んでいてもよい。また、形質転換体をそのまま用いることもでき、乾燥、粉砕するなどして用いることもできる。また、本発明の大腸菌性下痢症防除剤には、Ｓｔｘ２ｅタンパク質の免疫原性を高めるアジュバントを配合することもできる。一般的には、安全性を考慮して水酸化アルミニウムなどがアジュバントとして用いられる。一方、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のＢサブユニットは、それ自体がアジュバント活性を示すため、前記ＤＮＡ構築物がＢサブユニットをコードするＤＮＡを含む場合には、さらにアジュバントを配合しなくても、高い免疫原性が得られる。
【００３９】
本発明の大腸菌性下痢症の防除方法は、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体を動物に投与することを特徴とする。本発明の大腸菌性下痢症の防除対象としては、ヒト、ブタ、ウシ、またはニワトリなどが挙げられるが、ブタに投与することが好ましい。
大腸菌性下痢症防除剤による免疫は、ブタに投与する場合、哺乳期〜１２０日齢のブタに、好ましくは、哺乳期〜９０日齢のブタに対して行うことが好ましい。また繁殖期前後の母豚に対して行うことが好ましい。免疫の方法としては、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体を母豚に投与して、母豚が産生した抗体を、乳汁により子豚に与える方法、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体を哺乳期〜１２０日齢のブタに、好ましくは、哺乳期〜９０日齢の子豚に投与し、子豚を直接免疫する方法等が挙げられる。
本発明の大腸菌性下痢症防除剤をブタに投与する方法としては、ブタの飼料に、前記ＤＮＡ構築物で形質転換された植物体またはその乾燥物もしくは粉砕物を混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。この場合の投与量は、Ｓｔｘ２ｅタンパク質の質量として、１日当たり好ましくは１．５ｍｇ以上、さらに好ましくは３．０ｍｇ以上である。本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、４〜７日おきに、合計２〜３回投与する方法が挙げられる。
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１．Stx2eB発現ベクターの構築
Stx2eB発現ベクターは、Matsui et al., 2011, Transgenic Res., 20;735-48のMaterials and methodsに従って作成した。
具体的には、C末端にPG12スペーサー（配列番号１）およびHAタグ、HDEL配列を融合したStx2eB(1×2eB)を作製し、さらにStx2eBをPG12スペーサーを介してタンデムに連結した2×2eBとした。これを安定形質転換体作製用バイナリーベクターpRI909に組み込んだ（配列番号１４）。このようなベクターは、Matsui et al., 2011, Transgenic Res., 20;735-48の図４に記載される2BHプラスミドである。
このようにして作成したバイナリーベクターを図１に示す。【００４１】
実施例２．イチゴへの遺伝子導入試験
Stx2e発現プラスミド（図１）を直接導入法にてアグロバクテリウム（系統EHA105およびLB4404)に導入した。得られたカナマイシン（Km）耐性株（導入プラスミド確認済み）を用いてイチゴ（品種名：エッチエス−１３８）の形質転換試験を行った。Km添加培地を用いてカルス誘導と再分化を行い、抗生物質（Km）耐性個体を選抜した。
どちらのアグロバクテリウム系統の試験からも100個体以上の抗生物質耐性個体を得ることができた。生育の早い株より、順次、導入したStx2eB遺伝子の確認および当該タンパク質の発現解析を行った。
抗生物質耐性株18個体よりゲノムDNAを抽出し、PCR解析を行った。プライマー組み合わせは、図2に記載のpRI M3FW（配列番号１５）とpRI RV（配列番号１６）（増幅予定断片長約1.9kbp）、pro35SF（配列番号１７）とpRI RV（配列番号１６）（増幅予定断片長約1kbp）の2つの組み合わせで行い、17個体で目的遺伝子の導入が確認された。なお、どちらの組み合わせにおいても、非特異バンドは確認されなかった。【００４２】
実施例３．形質転換イチゴの発現解析
図２に示すPCR解析結果より、得られた再分化個体には、ほとんどの株で目的遺伝子が挿入されていることが推定された。従って、全系統における目的タンパク質の発現解析を行った。
約200〜300mg新鮮重のイチゴ培養株より葉をサンプリングし、タンパク質抽出を行うまで-80℃で保存した。上記試料に、5倍量のバッファー（0.2M Tris-Cl (pH=8.0)、0.1M NaCl、0.01M EDTA、0.014M 2ME、0.001M PMSF、0.05% Tween20）を加え、乳鉢にて液体窒素とともに磨砕し、可溶性タンパク質の抽出を行った。可溶性タンパク質試料に等量のLaemmli Sample buffer（5% 2-Mercaptoethanol含有）を添加し、加熱処理した後、アクリルアミドゲル泳動に供した（ゲル濃度：15％、Wako）。電気泳動にて展開したゲルのタンパク質をPVDF膜に転写し、ウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット解析の一次抗体は、1000倍希釈したハイブリドーマ培養上清Rat 37C mAb、P-12を、二次抗体には、12000倍希釈したAnti-Rat IgG(whole molecule)-Peroxidase, antibody produced in rabbit (SIGMA A5795)を用いた。抗体反応はCan Get Signal solution（TOYOBO）を、検出反応はECL plus Western Blotting Detection System（GE Healthcare）をそれぞれ使用し、化学発光検出はVersaDoc Model5000（BioRad）で実施した。
図３にその結果の一部を示す。供試した150系統中99系統で目的タンパク質の発現が確認された。【００４３】
実施例４．水耕栽培と果実採取
目的タンパク質の発現が確認された系統を順化し閉鎖型植物工場内で水耕栽培した。葉かき、養液交換等の栽培管理を行い、開花を確認して、果実採取を行った。【００４４】
実施例５．ブタ投与サンプルの調製
投与サンプルには果実を用いた。まず、果実に含まれるStx2eBを定量した。タンパク質の抽出はTCA-acetone法（Shultz等、2005）に従い行った。2 mlマイクロチューブにイチゴ果実凍結乾燥粉末約10 mg、直径5 mmステンレスビーズをおよび-20℃に冷やした約0.7 ml TCA-acetone（10% トリクロロ酢酸、90% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加し、本チューブを液体窒素で冷却しておいたTissueLyser Adapter Set 2×24（Qiagen）に設置しTissueLyser II（Qiagen）で20回/秒、3分間往復振とうすることによりサンプルを混合した。-20℃で1時間静置後、16,000×g、4℃、30分間遠心操作を行い、上清を除去し、タンパク質を含む沈殿を得た。さらに夾雑物を除去するために、約0.7 ml acetone/BME（100% アセトン、0.07% 2-メルカプトエタノール）を添加し、上記同様に混合し、16,000×g、4℃、10分間遠心操作を行い、上清を除去した。本夾雑物除去操作はさらに2回行った。沈殿は減圧乾燥後、1.1 ml 抽出Iバッファー [20 mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Tris）-HCl、pH 7.9、0.5 M 塩化ナトリウム、5 mM イミダゾール、6 M 尿素] に懸濁し、16,000×g、4℃、10分間遠心操作を行い、上清を回収、タンパク質溶液を得た。
当該タンパク質溶液を同量のSDS-PAGE用サンプルバッファー(Ez Apply、ATTO製)と混合し、沸騰水中で10分間加温することにより変性させた。変性させたタンパク質は適宜希釈し、Criterionセル（電気泳動槽、BIO-RAD）、Ez Run (電気泳動バッファー、ATTO製)を入れおよびCriterion TGX-ゲル（BIO-RAD)を用い、200 V定電圧で40分間電気泳動（SDS-PAGE）を行った。電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック(BIO-RAD)を用い、トランスブロットTurbo (BIO-RAD)でブロッティングを行った。
転写後のメンブレンはブロッキング溶液(TBS系, pH7.2、ナカライテスク)に浸し、室温で1時間振とうまたは4°Cで16時間静置しブロッキング処理した。ブロッキングしたメンブレンはTBS-T (137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4)中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。2×Stx2eBタンパク質のウェスタン解析による検出には、一次抗体としてTBS-Tで1,000倍希釈したラット抗Stx2eBモノクローナル抗体Rat 37C mAb、P-12を使用した。当該一次抗体液中にメンブレンを浸し、室温で2時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。二次抗体にはTBS-Tで10,000倍希釈したAnti-Rabbit IgG, AP-linked Antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY)を使用した。本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振とうすることにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振とうを3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液(0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5) 中にメンブレンを浸し、室温で7分間振とうすることにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。発色したメンブレンはスキャナー（PM-A900、エプソン）により画像化し、画像解析ソフト（CS Analyzer ver. 3.0、アトー）を用い、2×Stx2eBタンパク質の定量を行った。
上述の定量結果をもとに、一頭一回当たりのStx2eB投与量が1.5mgとなるよう、イチゴ果実を量りとり、ミキサーミルで破砕し液状化したのち、凍結乾燥により粉末化したものを投与サンプルとした。【００４５】
実施例６．毒素原性大腸菌のブタチャレンジ試験
(a)菌種
ブタ由来易熱性毒素（LT）、耐熱性毒素（ST）産生Escherichia Coli (ETEC) No.4242-1 （（株）食環境衛生研究所より入手）（野外圃場死亡豚由来）を供試した。性状は以下の通り。
溶血性：+
線毛タイプ： F18, -；K88, +
毒素：Stx2e, -; ST, +; LT, +
（b）攻撃菌の調製（用時調製）
上記No.4242-1菌株をＴＳブロス培地で３７℃で対数増殖期になるまで培養した。培養後、遠心分離を行い、沈澱物として集菌した。菌体は2×109CFU/頭となるよう、アルカリ性ハンクス緩衝液で調製した。
（c）被験物質及び攻撃菌の投与
養豚場で飼育されている健康な母豚１頭に由来する離乳期子豚を６頭選抜した。２４日齢で屋内飼育室に移動し、表１に示すように３頭ずつ２群に分け、各群を柵で囲われたスペース（ペン）で隔離飼育した。第１群の子豚には、２８日齢および３１日齢で、表１に示す所定量（１回当たり）の被験物質を飼料に混合し、自発的経口投与を行った。第２群の子豚には、有効成分を含まないイチゴ粉末を被験物質と同量、同様の方法で投与した。各群の子豚は、それぞれ１日後に、２９日齢と３２日齢の２回攻撃菌を強制経口投与した。攻撃菌の投与は、胃カテーテルを用い強制経口投与を行った。飼料は、子豚人工乳後期用標準飼料（日本配合飼料株式会社製）を用い、飼料及び水は自由摂取させた。なお、飼育期間中、体重を記録した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
０日目（２回目の攻撃菌強制投与日）から１４日目まで、毎日、臨床観察を行った。観察は、病性鑑定マニュアルに記載の大腸菌性下痢症の臨床症状として知られている、被毛粗雑、糞便性状の項目について行い、以下の基準に基づいて、臨床症状スコアをつけた。
被毛粗雑（0：なし、1：あり）
糞便性状（0：正常、1：軟便、2：泥状便、3：水様・粘血便）
また、剖検時の病変有無（腹水貯留）についても調べた。
腹水貯留（0：正常、1：軽度、2：重度）
また、５日目、１０日目、１４日目に体重を測定した。【００４８】
（ｄ）試験結果
臨床観察
各項目について得た合計臨床症状スコアと剖検時病変スコアを表２に示す。観察全期間中（０〜１４日目）において、被験物質を投与した第１群において、大腸菌性下痢症の症状を抑制できることが明らかになった。【００４９】
【表２】
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【００５０】
被験物質非投与第２群の子豚においては、１０日目から被毛粗雑が観察され、１４日目には全頭で観察された。これに対し、被験物質を投与した第１群の子豚においては、全く観察されなかった。被験物質非投与第２群の子豚１頭で１３日目から軟便が観察された。被験物質を投与した第１群では全頭で糞便性状に異常は認められなかった。【００５１】
体重推移
全期間における体重推移を図４に示す。
攻撃後５日目において、第１群の平均体重は9.0kgであった。第２群では7.5kgであった。群間の体重差は統計学的にも有意差ありと判断できた。この傾向は、１０日目、１４日目も継続して観察された。
また、剖検時の所見として、被験物質非投与群（第２群）の２頭で顕著な腹水の貯留が認められた。被験物質投与群（第１群）では全頭腹水の貯留は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の大腸菌性下痢症防除剤は、畜産の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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