(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３２、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１４及び配列番号２９からなる群より選択される１以上のアミノ酸配列を含む、ＭＵＣ１ポリペプチド又はそのフラグメントであって、該ポリペプチド又はそのフラグメントがそれに含まれる前記アミノ酸配列の各々に特異的なＴ細胞を活性化し得、
但し、以下のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチド：
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Ala Thr Thr Ala Pro Lys Pro Ala Thr Val Val Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Ala His Gly Val Thr Ser Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Ala Pro Val Tyr Leu Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Glu Ser Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Val Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Leu Phe Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser His His His His His His
及び
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Thr Ser Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Ala Pro Val Tyr Leu Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Ser Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Val Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Leu Phe Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Ala Ser Ala Asn Leu His His His His His His 
を除く、ＭＵＣ１ポリペプチド又はそのフラグメント。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドであって、該ペプチドがそれに含まれる前記アミノ酸配列の各々に特異的なＴ細胞を活性化し得、
但し、以下のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチド：
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Ala Thr Thr Ala Pro Lys Pro Ala Thr Val Val Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Ala His Gly Val Thr Ser Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Ala Pro Val Tyr Leu Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Glu Ser Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Val Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Leu Phe Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser His His His His His His
及び
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Thr Ser Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Leu Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Tyr Leu Asp Thr Arg Pro Ala Pro Val Tyr Leu Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Ser Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Tyr Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Val Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Leu Phe Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Ala Ser Ala Asn Leu His His His His His His
を除く、ペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、完全長ＭＵＣ１アミノ酸配列又はそのフラグメントを含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９及び配列番号３２の１以上を更に含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
ベクターが、プラスミド、酵母、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、及びシンドビスウイルスからなる群より選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ベクターが、オルソポックス、アビポックス、カプリポックス、及びスイポックスウイルスからなる群より選択されるポックスウイルスである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
ポックスウイルスが、ワクシニア、鶏痘、及びカナリア痘ウイルスからなる群より選択される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の１つ以上のペプチド又はポリペプチド、（ｉｉ）請求項５に記載の１つ以上の核酸、又は（ｉｉｉ）請求項６〜９のいずれか一項に記載の１つ以上のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１１】
細胞がヒト細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
細胞が、抗原提示細胞又は腫瘍細胞である、請求項１０又は１１に記載の細胞。
【請求項１３】
（ａ）（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の１つ以上のペプチド又はポリペプチド、（ｉｉ）請求項５に記載の１つ以上の核酸、（ｉｉｉ）請求項６〜９のいずれか一項に記載の１つ以上のベクター、又は（ｉｖ）請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞
、及び
（ｂ）医薬上許容される担体
を含む組成物。
【請求項１４】
さらに免疫賦活／制御分子を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
免疫賦活／制御分子が、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７０、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＯＸ−４０Ｌ、４１ＢＢＬ、抗ＣＴＬＡ−４、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
免疫賦活／制御分子が、（ｉ）キトサンと複合化した、ＩＬ−１２をコードするプラスミド、及び（ｉｉ）キトサンと混合した組換えＩＬ−１２からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、シクロフォスファミド、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
１つ以上のアジュバントをさらに含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
１つ以上のアジュバントが、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミニウムシリカ、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、ＱＳ２１、ＭＰＬ−Ａ、ＲＩＢＩＤＥＴＯＸＴＭ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をさらに含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
リポソームをさらに含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド又はポリペプチドを含むリポソーム。
【請求項２３】
請求項２２に記載のリポソーム及び医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項２４】
対象において免疫応答を増強するための、請求項１３〜２１及び２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制するための、請求項１３〜２１及び２３のいずれか一項に記載の組成物で刺激されたリンパ球を含む組成物。
【請求項２６】
対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制するための、請求項１３〜２１及び２３のいずれか一項に記載の組成物で処理された樹状細胞を含む組成物。
【請求項２７】
対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制するための、養子移入されるＴ細胞を産生する方法であって、請求項１３〜２１及び２３のいずれか一項に記載の組成物でｉｎ ｖｉｔｒｏにてＴ細胞を刺激する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１２年１月３日出願の米国仮特許出願第６１／５８２，７２３号（参照により組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
電子出願された物件の参照による組み込み
本願明細書と同時提出され、かつ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、本明細書中、参照によりその全体が組み込まれる：２０１３年１月２日付ファイル名「７１１７８８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、７，３６７バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
【背景技術】
【０００３】
ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）は、小さなＣ末端サブユニット（ＭＵＣ１−Ｃ）に共有結合する大きなＮ末端サブユニット（ＭＵＣ１−Ｎ）のヘテロ二量体から構成されるＩ型膜糖タンパク質である。ＭＵＣ１−Ｎは、完全に細胞外であり、高度にグリコシル化されており、２０アミノ酸の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）ドメインからほとんど全てが構成される。ＭＵＣ１−Ｃは短い細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質テール又はドメイン（ＭＵＣ１−ＣＤ）からなる。
【０００４】
ＭＵＣ１は、通常、上皮細胞の頂端表面上、及び造血細胞や活性化Ｔ細胞などの非上皮細胞の小さなサブセット中に発現する。健康な上皮におけるその主な機能は、潤滑、並びに化学薬品及び微生物因子に対する物理的バリアを提供することである。他の細胞タイプにおける、その生理的役割は明確ではない。
【０００５】
多くのヒト癌腫（卵巣、胸、膵臓、大腸及び前立腺など）及び血液系腫瘍（多発性骨髄腫及びいくつかのＢ細胞非ホジキンリンパ腫など）は、ＭＵＣ１を異常に過剰発現するということが証明されている。正常な組織におけるそのクラスター化した発現と対照的に、ＭＵＣ１は腫瘍細胞の全表面に均一に分散する。さらに、ＭＵＣ１は、一般的に腫瘍においてグリコシル化が不十分であり、タンパク質コアの新規かつ潜在的な抗原エピトープを免疫システムにさらしている。ＭＵＣ１の発現及び分泌は、予後不良及び高転移能とも関連している。
【０００６】
ＭＵＣ１は腫瘍関連抗原であるため、ＭＵＣ１を治療用の癌ワクチンのターゲット候補として利用する多くの計画が、癌ワクチンに対するターゲット候補としてのＭＵＣ１の利用に対して最近の２０年の間評価されている。臨床試験では、タンパク質、ペプチド、アジュバント、担体、ｅｘ ｖｉｖｏで培養された樹状細胞（ＤＣｓ）、可溶化液、樹状細胞融合、リポソーム、ポックスウイルス、アデノウイルス、酵母、及び樹状細胞をターゲットとするＣ型レクチンが試験されている。
【０００７】
免疫療法に対するターゲットとしてＭＵＣ１を使用するほとんどの臨床試験は、長期完全寛解に達することができなかった、進行した転移性疾患を有する被験者を登録する。この結果における１つの要因は、これらの臨床試験の大多数は、ＭＵＣ１に対する体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を高めるために、ＶＮＴＲドメインに焦点をあてていることだといえる。腫瘍進行の間に血液中に流される、ＶＮＴＲドメインを含むＮ末端サブユニットの相当量は、表面上にＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答の欠如を部分的に説明できる。
【０００８】
ＭＵＣ１−Ｃは、ＭＵＣ１のＣ末端サブユニットである。ＭＵＣ１の切断後、大きな細胞外サブユニットにも関わらず、ＭＵＣ１−Ｃは、シングルパス（２８アミノ酸）膜貫通ドメイン（ＴＤ）によって、細胞膜に固定されたままである。ＭＵＣ１ではなく、ＭＵＣ１−Ｃが、おそらくＮ末端サブユニットの切断により、いくつかの種々の腫瘍細胞株及び癌標本でタンパク質の優勢な形態であることが明らかになっている。さらに、Ｎ末端サブユニットが１又は２点でクラスター化され、健康な上皮におけるＭＵＣ１の正常な挙動を想起させるのに対して、ＭＵＣ１−Ｃは、腫瘍細胞の表面全体にわたって均一に分布する。重要なことに、いくつかの組織標本では、ＭＵＣ１−Ｃの存在に対してポジティブに染色されるが、Ｎ末端サブユニットに対してはネガティブとなり得ることが実証されている。
【０００９】
最近の数年間において、癌遺伝子としてのＭＵＣ１−Ｃの役割に関する証拠が急速に蓄積されている。ＭＵＣ１−ＣＤの７２アミノ酸残基は、いくつかのミトコンドリア、細胞質、細胞膜、及び核成分との相互作用を伴う、細胞内シグナリング機能の注目に値する範囲と関連する。ＭＵＣ１−ＣＤは、ζ鎖関連７０−ｋＤプロテインキナーゼ（ＺＡＰ−７０）、プロテインキナーゼＣのδアイソフォーム（ＰＫＣδ）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）、並びにチロシンキナーゼｃ−Ｓｒｃ及びＬｃｋなどのいくつかのキナーゼに対するターゲットである。ＭＵＣ１−ＣＤのリン酸化は、線維芽細胞増殖因子レセプター３、血小板由来増殖因子レセプター、及びＥｒｂＢファミリーのメンバーを含むいくつかの細胞表面増殖因子レセプターの活性化に反応して起こるのかもしれない。リン酸化に加え、ＭＵＣ１−ＣＤは、β−カテニン、エストロゲンレセプター−α、及びヒートショックプロテインなどのいくつかのタンパク質及びレセプターと直接結合できる。ＭＵＣ１−Ｃトランスフェクションは、増殖率の増加、足場非依存性の細胞増殖、及び化学療法剤に対する耐性など、予め全長のＭＵＣ１タンパク質に起因する形質転換の誘導及び発癌活性を起こすのに十分である。ｃ−Ｓｒｃにより活性化されたＭＵＣ１−Ｃシグナリングは、癌細胞の運動性、浸潤、転移を刺激するＥ−カドヘリン接着結合及びインテグリン接着斑の両方の崩壊に関わっており、上皮間葉転移におけるＭＵＣ１−Ｃの潜在的役割を示唆する。特異的細胞内ＭＵＣ１ペプチドが、癌の進行を抑制できるということも証明されている。最後に、ＭＵＣ１−Ｃはヒト多能性幹細胞の増殖を媒介し、その発現は、未分化細胞を同定及び単離するためのマーカーとして利用できるということが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＭＵＣ１−Ｃの新たな特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ及びエンハンサーアゴニストペプチドの同定が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９、及び配列番号３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドを提供する。本発明は、２０以下のアミノ酸残基を有し、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２６、又は配列番号３０を含む、単離されたペプチドも提供する。
【００１２】
他の側面において、本発明は、ペプチドをコードする核酸と、核酸を含むベクターと、ペプチド、核酸又はベクターを含む細胞と、それらの組成物とを提供する。
【００１３】
本発明は、宿主においてＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答の増強方法であって、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物の治療上有効量を宿主に投与する工程を含み、該宿主の免疫応答が増強される方法も提供する。
【００１４】
本発明はさらに、対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制する方法であって、（ａ）対象からリンパ球を得る（単離する）工程、（ｂ）宿主に対し、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該リンパ球を刺激して、ｅｘ ｖｉｖｏにて細胞傷害性Ｔリンパ球を産生する工程、及び（ｃ）該細胞傷害性Ｔリンパ球を対象へ投与する工程を含み、該対象においてＭＵＣ１を発現する癌が抑制される方法を提供する。
【００１５】
本発明は、対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制する方法であって、（ａ）対象から樹状細胞を得る（単離する）工程、（ｂ）ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて処理する工程、及び（ｃ）処理した樹状細胞を対象へ投与する工程を含み、該対象においてＭＵＣ１を発現する癌が抑制される方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、対象においてＭＵＣ１を発現する癌の抑制であって、（ａ）癌に罹患した対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を得る工程、（ｂ）該ＰＢＭＣｓから樹状細胞を単離する工程、（ｃ）ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて処理する工程、（ｄ）処理した樹状細胞で該ＰＢＭＣｓをｅｘ ｖｉｖｏにて活性化する工程、及び（ｅ）活性化したＰＢＭＣｓを対象へ投与する工程を含み、該対象においてＭＵＣ１を発現する癌が抑制される、癌の抑制を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、対象においてＭＵＣ１を発現する癌の抑制であって、（ａ）癌に罹患した対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を得る工程、（ｂ）該ＰＢＭＣｓから樹状細胞を単離する工程、（ｃ）ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて処理する工程、（ｄ）処理した樹状細胞で該ＰＢＭＣｓをｅｘ ｖｉｖｏにて活性化する工程、（ｅ）活性化したＰＢＭＣｓからＴリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで単離する工程、及び（ｆ）単離したＴリンパ球を対象へ投与する工程を含み、該対象においてＭＵＣ１を発現する癌が抑制される、癌の抑制を提供する。
【００１８】
本発明は、対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制するために、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物でｉｎ ｖｉｔｒｏにて刺激された、養子移入されるＴ細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、ネイティブペプチド及びアゴニストペプチドに特異的なＴ細胞株によるＩＦＮ−γの産生を示すグラフである。ＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）はＹ軸に示され、（Ａ）Ｐ１１７２又はＰ１１７２（１Ｙ）；（Ｂ）Ｐ１１７７又はＰ１１７７（１０Ｖ）；並びに（Ｃ）Ｐ１２４０及びＰ１２４０（１Ｙ）のそれぞれのペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）はＸ軸に示されている。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｃは、ネイティブペプチド及びアゴニストペプチドに特異的なＴ細胞株によるＩＦＮ−γの産生を示すグラフである。ＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）はＹ軸に示され、（Ａ）Ｐ１１７２又はＰ１１７２（１Ｙ）；（Ｂ）Ｐ１１７７又はＰ１１７７（１０Ｖ）；並びに（Ｃ）Ｐ１２４０及びＰ１２４０（１Ｙ）のそれぞれのペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）はＸ軸に示されている。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、ネイティブペプチド及びアゴニストペプチドに特異的なＴ細胞株によるＩＦＮ−γの産生を示すグラフである。ＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）はＹ軸に示され、（Ａ）Ｐ１１７２又はＰ１１７２（１Ｙ）；（Ｂ）Ｐ１１７７又はＰ１１７７（１０Ｖ）；並びに（Ｃ）Ｐ１２４０及びＰ１２４０（１Ｙ）のそれぞれのペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）はＸ軸に示されている。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、Ｔ細胞株Ｔ−Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ（Ａ）及びＴ−Ｐ４８３−２Ｌ３Ｆ（Ｂ）を用いた、ＨＬＡ−Ａ３＋，ＭＵＣ１＋ターゲット細胞のペプチド特異的なＴ細胞株溶解を示すグラフである。それぞれの図において、溶解（％）はＹ軸上、及びＸ軸上には（ａ）Ｔ細胞株のみ、（ｂ）Ｔ細胞株＋Ｋ５６２−Ａ３、及び（ｃ）Ｔ細胞株＋Ｋ５６２−Ａ３＋対応するＡ３ペプチドである。
【図３】図３は、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体（それぞれＶＮＴＲ−１、ＶＮＴＲ−２、ＶＮＴＲ−３、ＶＮＴＲ−４及びＶＮＴＲ−５ペプチド）の安定性を示すグラフである。残存する複合体の割合はＹ軸上、及び時間は時（ｈｏｕｒｓ）としてＸ軸上に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、癌のワクチン予防又は治療において利用可能である、ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ムチン１（ＭＵＣ１）由来のヒト細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ及びそのアナログを含むペプチドを提供する。特に、本発明は、ＭＵＣ１−Ｃ由来ヒトＣＴＬエピトープ及びそのアナログを含むペプチドを提供する。
【００２１】
第一の実施形態において、本発明のペプチドは、ＸＬＡＩＶＹＬＩＡＬ（配列番号３）のアミノ酸配列（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはアラニン又はチロシンである）を含むか、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる。配列番号３のＸがアラニンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１の１１７２〜１１８１位のＣＴＬエピトープ（配列番号１）に一致する。配列番号３のＸがチロシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号２）に一致する。
【００２２】
第二の実施形態において、本発明のペプチドは、ＹＬＩＡＬＡＶＣＱＸ（配列番号６）のアミノ酸配列（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはシステイン又はバリンである）を含むか、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる。配列番号６のＸがシステインの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１の１１７７〜１１８６位のＣＴＬエピトープ（配列番号４）に一致する。配列番号６のＸがバリンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号５）に一致する。
【００２３】
第三の実施形態において、本発明のペプチドは、ＸＬＳＹＴＮＰＡＶ（配列番号９）のアミノ酸配列（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはセリン又はチロシンである）を含むか、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる。配列番号９のＸがセリンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１の１２４０〜１２４８位のＣＴＬエピトープ（配列番号７）に一致する。配列番号９のＸがチロシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号８）に一致する。
【００２４】
第四の実施形態において、本発明のペプチドは、ＡＬＸ１ＩＶＹＬＩＡＸ２（配列番号１１）（式中、Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、Ｘ１はアラニン又はフェニルアラニンであり、Ｘ２はロイシン又はリシンである）を含む。配列番号１１のＸ１がアラニンであり、かつ配列番号１１のＸ２がロイシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１の１１７２〜１１８１位のＣＴＬエピトープ（配列番号１）に一致する。配列番号１１のＸ１がフェニルアラニンであり、かつ配列番号１１のＸ２がリシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号１０）に一致する。
【００２５】
第五の実施形態において、本発明のペプチドは、ＳＸ１Ｘ２ＲＳＰＹＥＫ（配列番号１５）（式中、Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、Ｘ１はトレオニン又はロイシンであり、Ｘ２はアスパラギン酸、チロシン又はフェニルアラニンである）を含む。配列番号１５のＸ１がトレオニンであり、かつ配列番号１５のＸ２がアスパラギン酸の場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１の１２２３〜１２３１位のＣＴＬエピトープ（配列番号１２）に一致する。配列番号１５のＸ１がロイシンであり、かつ配列番号１５のＸ２がチロシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号１３）に一致する。配列番号１５のＸ１がロイシンであり、かつ配列番号１５のＸ２がフェニルアラニンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号１４）に一致する。
【００２６】
第六の実施形態において、本発明のペプチドは、Ｘ１Ｘ２ＡＰＰＡＨＸ３Ｖ（配列番号２６）（式中、Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、Ｘ１はセリン又はチロシンであり、Ｘ２はトレオニン又はリシンであり、かつＸ３はアスパラギン又はグリシンである）を含む。配列番号２６のＸ１、Ｘ２及びＸ３が、それぞれセリン、トレオニン及びアスパラギンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１の可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）領域のＣＴＬエピトープ（配列番号２７）に一致する。配列番号２６のＸ１、Ｘ２及びＸ３が、それぞれセリン、トレオニン及びグリシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のＶＮＴＲ領域のＣＴＬエピトープ（配列番号２８）に一致する。配列番号２６のＸ１、Ｘ２及びＸ３が、それぞれチロシン、リシン及びグリシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のＶＮＴＲ領域のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号２９）に一致する。
【００２７】
第七の実施形態において、本発明のペプチドは、Ｘ１Ｘ２ＤＴＲＰＡＰＸ３（配列番号３０）（式中、Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、Ｘ１はアラニン又はチロシンであり、Ｘ２はプロリン又はロイシンであり、かつＸ３はグリシン又はバリンである）を含む。配列番号３０のＸ１、Ｘ２及びＸ３が、それぞれアラニン、プロリン及びグリシンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のＶＮＴＲ領域のＣＴＬエピトープ（配列番号３１）に一致する。配列番号３０のＸ１、Ｘ２及びＸ３が、それぞれチロシン、ロイシン及びバリンの場合、該ペプチドは、ＭＵＣ１のＶＮＴＲ領域のエンハンサーアゴニストエピトープ（配列番号３２）に一致する。
【００２８】
本発明のペプチドは、配列番号１〜１５及び２６〜３２のアミノ酸配列の１つ、並びに１つ以上の隣接残基を含むことができる。隣接残基は、ペプチドの免疫応答（例、ＣＴＬ活性）を誘導する能力を阻害しないように選択されるべきである。そのような残基の選択のための指針は、ＭＵＣ１自身と関連する配列によって提供される。例えば、ペプチドを使用するために、ＭＵＣ１タンパク質（好ましくはヒトＭＵＣ１）の対応する位置の残基と同一である、又は類似する特性を持つ残基を選択できる。
【００２９】
ペプチドがネイティブＭＵＣ１配列に存在するＣＴＬエピトープ（例、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１２、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号３１）を含む場合、ペプチドは望ましくは、２０以下（例、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下又は１０以下）のアミノ酸残基を有する。一実施形態において、追加のアミノ酸残基は、存在する場合には、ＭＵＣ１（例、ＭＵＣ１−Ｎ、ＭＵＣ１−Ｃ又はＶＮＴＲ領域）由来である。この点において、本発明のペプチドは、ＭＵＣ１（例、ＭＵＣ１−Ｎ、ＭＵＣ１−Ｃ又はＶＮＴＲ領域）タンパク質の２０以下の連続するアミノ酸を含む、ＭＵＣ１（例、ＭＵＣ１−Ｎ、ＭＵＣ１−Ｃ又はＶＮＴＲ領域）タンパク質のフラグメントであり得、ここで、該ペプチドは配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１２、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号３１のアミノ酸配列を含む。ＭＵＣ１タンパク質の追加のアミノ酸残基は、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１２、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号３１のアミノ酸配列のいずれかの末端又は両端に位置し得る。
【００３０】
特に、本発明のペプチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１２、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号３１のアミノ酸配列のＣ末端に、１１以下（例、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、１以下、又は０）のアミノ酸残基を含み得、かつ／又は配列番号１、配列番号４、配列番号７、配列番号１２、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号３１のアミノ酸配列のＮ末端に、１１以下（例、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、１以下、又は０）のアミノ酸残基を含み得、ここで、本発明のペプチドは合計で２０以下のアミノ酸残基を有する。
【００３１】
ペプチドが、ＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（例、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９又は配列番号３２）を含む場合、ペプチドは任意の適切な長さであり得る。一実施形態において、ペプチドは２０以下（例、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下又は１０以下）のアミノ酸残基を有する。追加のアミノ酸残基は、存在する場合には、好ましくはＭＵＣ１（例、ＭＵＣ１−Ｃ）タンパク質由来、又は本明細書に記載のＭＵＣ１の配列に基づく。追加のアミノ酸残基は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９又は配列番号３２のアミノ酸配列のいずれかの末端又は両端に位置し得る。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、１つ以上の対応するアミノ酸残基が、１つ以上のＭＵＣ１のエンハンサーアゴニストエピトープ（例、配列番号２、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２９又は配列番号３２）で置き換えられている、ＭＵＣ１アミノ酸配列又はそのフラグメントを含むポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、１１７２位のアラニンがチロシンで置き換えられている（配列番号２のエンハンサーアゴニストエピトープに相当）、完全長のＭＵＣ１アミノ酸配列又はそのフラグメントを含み得る。
【００３３】
ペプチドは、任意の方法、例えば、ペプチドを合成することにより、又は細胞内で適切なアミノ酸配列をコードする核酸を発現させ、細胞よりペプチドを回収することなどによって、調製され得る。そのような方法の組み合わせも利用できる。ペプチドのｄｅ ｎｏｖｏ合成方法及び組み換え的にペプチドを製造する方法は当分野で公知である（例、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００５；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２００１；ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４参照）。
【００３４】
本発明は、ペプチドをコードする核酸も提供する。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡを含むことができ、一本鎖又は二本鎖であり得る。さらに、核酸は、ヌクレオチドアナログ又は誘導体（例、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチドなど）を含むことができる。核酸はペプチドを単独で、又は融合タンパク質の一部としてコードできる。ペプチドをコードする核酸は、核酸と、細胞への核酸のデリバリー及び／又は細胞での核酸の発現を可能にする要素とを含む構築物の一部として提供され得る。そのような要素としては、例えば、発現ベクター、プロモーター、並びに転写及び／又は翻訳配列が挙げられる。適したベクター、プロモーター、転写／翻訳配列、及び他の要素、並びにかかる核酸及び構築物の調製方法は、当分野で公知である（例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記参照；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。
【００３５】
本発明はさらに、核酸を含むベクターを提供する。適したベクターの例として、プラスミド（例、ＤＮＡプラスミド）、酵母（例、サッカロマイセス）、及びウイルスベクター、例えば、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｒｖｉｒｕｓ）、及びシンドビスウイルスなどが挙げられる。ベクターがプラスミド（例、ＤＮＡプラスミド）の場合、該プラスミドはキトサンと複合化され得る。好ましくは、ベクターは、オルソポックス、アビポックス、鶏痘、ラクーンポックス、家兎痘、カプリポックス（例、羊痘）、レポリポックス、及びスイポックス（例、豚痘）からなる群から選択されるポックスウイルスである。アビポックスウイルスの好ましい例として、鶏痘、鳩痘、及びカナリア痘、例えばＡＬＶＡＣが挙げられる。オルソポックスウイルスの好ましい例として、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、Ｗｙｅｔｈ、ＮＹＶＡＣ、ＴＲＯＹＶＡＣ、Ｄｒｙ−Ｖａｘ、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びそれらの誘導体が挙げられる。例えば、Ｗｙｅｔｈ株の誘導体はこれに限定されないが、機能的Ｋ１Ｌ遺伝子を欠いた誘導体を含む。
【００３６】
ベクターが宿主（例、ヒト）への投与のためである場合、ベクター（例、ポックスウイルス）は好ましくはターゲット細胞において低い複製効率を有する（例、細胞あたり約１子孫以下、又は、より好ましくは、細胞あたり０．１子孫以下）。複製効率は、ターゲット細胞の感染後のウイルス力価の決定によって、容易に経験的に決定され得る。
【００３７】
ペプチドをコードする核酸に加えて、ベクターは、１つ以上の免疫賦活／制御分子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン、又は免疫応答を増強し得る他の分子（例、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの追加の腫瘍関連抗原、又はＣＥＡ−６Ｄなどのそれらの改変体）をコードする遺伝子も含むことができる。ペプチドをコードする核酸及び任意の他の外来性遺伝子は、好ましくは、結果として生じる組換えウイルスのウイルス生存率に影響を及ぼさない、ベクター（例、ポックスウイルス）の部位又は領域（挿入領域）に挿入される。そのような領域は、組換えウイルスのウイルス生存率に重大な影響を及ぼすことなく、組換えの構成を許容する領域に対して、ウイルスＤＮＡのセグメントを試験することにより、容易に同定され得る。
【００３８】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、容易に利用でき、多くのウイルスに存在する挿入領域である。特に、ＴＫ遺伝子は、全ての検査されたポックスウイルスゲノムにおいて見つけられている。さらなる適した挿入部位は、国際特許出願公開公報ＷＯ ２００５／０４８９５７に記載されている。例えば、鶏痘において、挿入領域はＢａｍＨＩ Ｊ フラグメント、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、ＢａｍＨＩフラグメント、ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、長い特有な配列（ＬＵＳ）挿入部位（例、ＦＰＶ００６／ＦＰＶ００７及びＦＰＶ２５４／ＦＰＶ２５５）、ＦＰ１４挿入部位（ＦＰＶ０６０／ＦＰＶ０６１）、及び４３Ｋ挿入部位（ＦＰＶ１０７／ＦＰＶ１０８）を含むが、これに限定されない。ワクシニアにおいて、挿入部位は４４／４５、４９／５０、及び１２４／１２５を含むが、これに限定されない。
【００３９】
ベクターが、ペプチドをコードする核酸、及び／又は他の外来性遺伝子（例、１つ以上の免疫賦活／制御分子をコードするもの）を含む組換え鶏痘ウイルスの場合、ペプチドをコードする核酸は、１つの領域（例、ＦＰ１４領域）に挿入されることができ、外来性遺伝子は他の領域（例、ＢａｍＨＩＪ 領域）に挿入され得る。
【００４０】
本発明のベクターは、適したプロモーター及び制御エレメント、例えば転写制御エレメント又はエンハンサーなどを含み得る。ベクターがポックスウイルスベクターの場合、ポックスウイルスプロモーターを利用でき、これにはワクシニア７．５Ｋプロモーター、ワクシニア３０Ｋプロモーター、ワクシニア４０Ｋプロモーター、ワクシニアＩ３プロモーター、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーター、７．５プロモーター、ＨＨプロモーター、１１Ｋプロモーター、及びＰｉプロモーターが含まれるが、これに限定されない。プロモーターは、典型的には構成的プロモーターであるものの、誘導性プロモーターも本発明のベクターにおいて利用され得る。そのような誘導可能なシステムは、遺伝子発現の制御を可能にする。
【００４１】
ペプチド、ペプチドをコードする核酸、又はベクターを含む細胞も、本明細書において提供される。適した細胞は、原核細胞並びに真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母、真菌、及びバクテリア（大腸菌など）を含む。細胞は、研究又はペプチドの産生のために役立つようにｉｎ ｖｉｔｒｏでもよく、又はｉｎ ｖｉｖｏでも可能である。細胞は、ペプチドパルスされた抗原提示細胞でもあり得る。適した抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂリンパ球、単球、マクロファージなどを含むが、これに限定されない。
【００４２】
一実施形態において、細胞は樹状細胞である。異なる成熟段階の樹状細胞は、細胞表面の発現マーカーに基づいて単離され得る。例えば、成熟樹状細胞は、提示のために新しいタンパク質を捉えることはほとんどできないが、増殖及び分化のために休止Ｔ細胞を刺激することはより上手くできる。従って、成熟樹状細胞は重要となり得る。成熟樹状細胞は、形態学におけるそれらの変化及び種々のマーカーの存在によって、同定され得る。そのようなマーカーは、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＣＤ１１及びＭＨＣクラスＩＩなどの細胞表面マーカーを含むが、これに限定されない。あるいは、成熟は炎症性サイトカインの産生の観察又は測定によって、同定され得る。
【００４３】
樹状細胞は、典型的な細胞蛍光法、並びに細胞選別技術及び装置、例えば蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）などを使用して、集められ、解析され得る。成熟段階が異なる樹状細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体は、商業的に利用可能である。
【００４４】
ペプチド、核酸、ベクター又は細胞は単離され得る。用語「単離された」は、本明細書において使用される場合、生物学的環境（例、細胞、組織、培養培地、体液など）から取り除かれた又は任意の程度に純度を上げられた（例、合成培地から単離された）、組成物若しくは化合物を包含する。単離された組成物及び化合物は、従って、合成され又は天然で産生され得る。
【００４５】
ペプチド、核酸、ベクター又は細胞は、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞と、担体（例、医薬上又は生理学的に許容される担体）とを含む組成物（例、医薬組成物）として製剤化され得る。さらに、ペプチド、核酸、ベクター、細胞又は本発明の組成物は、本明細書に記載の方法において、単独で又は医薬製剤の一部として利用され得る。
【００４６】
組成物（例、医薬組成物）は、２以上のペプチド、核酸、ベクター、若しくは細胞又は本発明の組成物を含むことができる。あるいは、又はさらに、組成物は１つ以上の他の医薬活性剤又は薬品を含むことができる。医薬組成物の利用に適してよい、そのような他の医薬活性剤又は薬品の例として、抗癌剤（例、化学療法剤）、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、シクロフォスファミド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適した抗癌剤は、限定されないが、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、葉酸拮抗薬、プリン拮抗薬、ピリミジン代謝拮抗物質、紡錘体阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アポトーシス誘導剤、血管新生抑制剤、ポドフィロトキシン、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチン、インターフェロン、アスパラギナーゼ、タモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、メゲストロール、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イリノテカン、タキソール、ゲルダナマイシン（例、１７−ＡＡＧ）、及び当分野で公知の種々の抗癌ペプチド並びに抗体を含む。
【００４７】
担体は、慣習的に使用されるもののいずれでもあり得、溶解度、及び活性化合物との反応性の欠如など、生理化学的な考慮点によって、及び投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載の医薬上許容される担体、例えば、賦形剤、アジュバント、医薬品添加物、及び希釈剤は、当業者に周知であり、容易に公衆に利用可能である。医薬上許容される担体は、活性剤に対し化学的に不活性であるもの、及び使用条件下、有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００４８】
担体の選択は、特定のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又は本発明のそれらの組成物、及び使用される他の活性剤又は医薬品、並びにペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部は決定されるだろう。
【００４９】
組成物は、さらに又は代わりに、１つ以上の免疫賦活／制御分子を含むことができる。任意の適した免疫賦活／制御分子を使用でき、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７０、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＯＸ−４０Ｌ、４１ＢＢＬ、抗ＣＴＬＡ−４、及びそれらの組み合わせなどが使用できる。好ましくは、組成物は、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３（ＴＲＩＣＯＭともいう）の組み合わせを含む。１つ以上の免疫賦活／制御分子は、１つ以上の免疫賦活／制御分子をコードする核酸を含むベクター（例、ポックスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクター）の形で投与され得る。例えば、１つ以上の免疫賦活／制御分子（例、ＩＬ−１２）は、キトサンあり又はなしでＤＮＡプラスミドの形で投与され得る。あるいは、１つ以上の免疫賦活／制御分子は、キトサンと混合したタンパク質（例、組換えＩＬ−１２）など、タンパク質（例、組換えタンパク質）として投与され得る。
【００５０】
本発明の一実施形態において、組成物は、本発明のペプチドをコードする核酸を含む第一の組換えベクター、並びにＢ７．１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３をコードする核酸を含む第二の組換えベクターを含む。他の実施形態において、本発明のペプチドをコードする核酸、並びにＢ７．１、ＩＣＡＭ−１、及びＬＦＡ−３をコードする核酸は、同じ組換えベクターにある。第一及び／又は第二のベクターは、他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体（例、ＣＥＡ−６Ｄ）、又はそれらのエピトープをさらに含むことができる。
【００５１】
本発明は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物、及び任意で、免疫賦活／制御分子、例えばＢ７−１、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３などで樹状細胞を形質導入する方法を提供する。本発明の一局面において、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物で宿主に形質導入された樹状細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の活性化などの免疫応答を起こす。
【００５２】
本発明は、ＭＵＣ１腫瘍にかかった又はかかりやすい患者の治療方法、及び／又は、ＭＵＣ１を発現する癌に対する免疫応答の増強方法、及び／又は、ＭＵＣ１を発現する癌の抑制方法を提供する。第一の実施形態において、本発明の方法は、１つ以上のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の治療上有効量を対象へ投与する工程を含む。本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、ＭＵＣ１を発現する癌の進行を妨げるために、特に他の個体よりもそのような癌になるリスクの高い個体において、又はＭＵＣ１を発現する癌に苦しめられている患者を治療するために使用され得る。本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意のステージにあるＭＵＣ１を発現する癌の対象を治療するために使用され得る。
【００５３】
第二の実施形態において、本発明の方法は、対象から樹状細胞を得る（単離により）工程、治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１つ以上で該樹状細胞を処理する工程、及び処理した樹状細胞を対象へ投与する工程を含む。
【００５４】
第三の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）対象から抹消血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を得る（単離する）工程、（ｂ）該ＰＢＭＣｓから樹状細胞を単離する工程、（ｃ）治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１つ以上で該樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて処理する工程、（ｄ）処理した樹状細胞で該ＰＢＭＣｓをｅｘ ｖｉｖｏにて活性化する工程、及び（ｅ）活性化したＰＢＭＣｓを対象へ投与する工程を含む。
【００５５】
第四の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）対象からＰＢＭＣｓを得る（単離する）工程、（ｂ）該ＰＢＭＣｓから樹状細胞を単離する工程、（ｃ）治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１つ以上で該樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて処理する工程、（ｄ）処理した樹状細胞で該ＰＢＭＣｓをｅｘ ｖｉｖｏにて活性化する工程、及び（ｅ）活性化したＰＢＭＣｓを対象へ投与する工程を含む。
【００５６】
第五の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）対象からＰＢＭＣｓを得る（単離する）工程、（ｂ）該ＰＢＭＣｓから樹状細胞を単離する工程、（ｃ）治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１つ以上で該樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて処理する工程、（ｄ）処理した樹状細胞で該ＰＢＭＣｓをｅｘ ｖｉｖｏにて活性化する工程、（ｅ）活性化したＰＢＭＣｓからＴリンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで単離する工程、及び（ｅ）単離したＴリンパ球を対象へ投与する工程を含む、該対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制する方法を含む。
【００５７】
本発明は、対象においてＭＵＣ１を発現する癌を抑制するために、治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の１つ以上でｉｎ ｖｉｔｒｏにて刺激された、養子移入されるＴ細胞の使用も提供する。
【００５８】
ＭＵＣ１を発現する癌は、ＭＵＣ１を発現する任意の癌であり得、これにはヒト癌腫（例えば卵巣、胸、膵臓、結腸直腸、肺、甲状腺、胃、頭頸部及び前立腺）並びに血液系腫瘍（多発性骨髄腫及びいくつかのＢ細胞非ホジキンリンパ腫）が含まれるが、これに限定されない。
【００５９】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意の方法によって宿主へ投与され得る。例えば、ペプチド、核酸、又は本明細書に記載の、核酸のデリバリー及び発現を可能にする構築物の一部としての核酸を含む組成物と細胞を接触させることによってなど、種々の技術のいずれかによって、ペプチド又はペプチドをコードする核酸（例、ベクターとして）は細胞（例、宿主における）内に導入され得る。細胞内で核酸を導入及び発現するための具体的なプロトコルは、当分野で公知である（参照、例、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），上記参照；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。
【００６０】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、及び組成物を宿主（対象）に投与するのに適した方法は、当分野で公知である。宿主（対象）は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター又はモルモットなどの齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、霊長類又はヒト）などの任意の適した宿主であり得る。
【００６１】
例えば、ペプチド、核酸又はベクター（例、組換えポックスウイルス）は、ｅｘ ｖｉｖｏで腫瘍細胞をペプチド、核酸、若しくはベクターにさらすことにより、又はペプチド、核酸、若しくはベクターを宿主へ注入することにより、宿主へ投与され得る。ペプチド、核酸、ベクター（例、組換えポックスウイルス）又はベクターの組み合わせ、細胞、及び組成物は、癌病変又は腫瘍への直接注入により、又は局所適用（例、医薬上許容される担体とともに）により、直接投与（例、局所投与）され得る。
【００６２】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、リポソーム内への取り込み（例、米国特許第５，６４３，５９９号、５，４６４，６３０号、５，０５９，４２１号、及び４，８８５，１７２号に記載）、サイトカインとともに、生物学的応答修飾物質（例、インターフェロン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ））とともに、又は免疫応答を増強することが公知の、当分野の他の試薬とともに投与され得る。
【００６３】
適したアジュバントの例として、ミョウバン、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、アルミニウムシリカ（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓｉｌｉｃａ）、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント、ＱＳ２１、ＭＬＰ−Ａ、及びＲＩＢＩ ＤＥＴＯＸＴＭが挙げられる。
【００６４】
本発明での使用に対して特に好ましいアジュバントは、サイトカインＧＭ−ＣＳＦである。ＧＭ−ＣＳＦは、樹状細胞による抗原プロセシング及び提示を増強するため、効果的なワクチンアジュバントとして示されている。実験研究及び臨床試験によって、組換えＧＭ−ＣＳＦは、種々の免疫原を対象とした宿主免疫を増強できるということが示唆されている。
【００６５】
ＧＭ−ＣＳＦは、ウイルスベクター（例、ポックスウイルスベクター）を用いて、又は医薬製剤において単離されたタンパク質として、投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦはペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の最初の投与前、投与中又は投与後に、宿主へ投与され、宿主の抗原特異的免疫応答を増強できる。例えば、組換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物でのワクチン接種の各日に宿主へ投与され、次の各３日間（すなわち合計４日間）投与され得る。任意の適した用量のＧＭ−ＣＳＦも使用できる。例えば、１日当たり５０〜５００μｇ（例、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、及びそれらの範囲）の組換えＧＭ−ＣＳＦを投与できる。ＧＭ−ＣＳＦは、任意の適切な方法（例、皮下投与）により投与でき、好ましくは、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物での宿主のワクチン接種部位又はその近くに投与される。
【００６６】
一実施形態において、本発明のペプチドは、ヘルパーペプチド又は大きな担体分子に結合させて、ペプチドの免疫原性を増強できる。これらの分子は、インフルエンザペプチド、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドＣＤ４エピトープ、シュードモナス体外毒素Ａ、ポリＬリジン、脂質尾部、小胞体（ＥＲ）シグナル配列などを含むが、これに限定されない。
【００６７】
本発明のペプチドは、当分野で認められた方法を用いて、免疫グロブリン分子と結合され得る。該免疫グロブリン分子は、腫瘍細胞に存在するが通常の細胞には存在しない又はごく少量しか存在しない表面レセプターに特異的であり得る。該免疫グロブリンは、特定の組織（例、胸、卵巣、結腸又は前立腺組織）に特異的であり得る。そのようなペプチド−免疫グロブリン結合体は、特定の組織及び／又は細胞へのペプチドのターゲッティングを許容する。
【００６８】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、ＭＵＣ１特異的免疫応答、好ましくは細胞性免疫応答を生じるのに効果的な量で、宿主（例、ヒトなどの哺乳動物）へ投与される。免疫原としてのペプチド、核酸、ベクター又は細胞の有効性は、当分野で公知のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏパラメーターによって決定されてもよい。これらのパラメーターは、抗原特異的な細胞毒性試験、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１エピトープを発現する腫瘍の退縮、ＭＵＣ１又はＭＵＣ１エピトープを発現する癌細胞の抑制、サイトカインの産生などを含むが、これに限定されない。
【００６９】
任意の適した用量のペプチド、核酸、ベクター、細胞又はそれらの組成物は、宿主に投与され得る。適切な用量は、宿主の年齢、体重、身長、性別、全身状態、既往歴、疾患進行、及び全身腫瘍組織量などの因子に応じて変化し、臨床医によって決定され得る。例えば、ペプチドは、ワクチン接種あたり約０．０５ｍｇから約１０ｍｇまで（例、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、及びそれらの範囲）の用量で宿主（例、ヒトなどの哺乳動物）に投与されることが可能であり、好ましくはワクチン接種あたり約０．１ｍｇから約５ｍｇである。種々の用量（例、１、２、３、４、５、６又はそれ以上）が、提供（例、数週間又は数か月にわたって）され得る。一実施形態において、用量は３か月の間毎月提供される。
【００７０】
ベクターがウイルスベクターの場合、適した用量は、約１×１０５から約１×１０１２（例、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、及びそれらの範囲）プラーク形成単位（ｐｆｕｓ）を含むことができるものの、より低用量又はより高用量を宿主に投与できる。例えば、約２×１０８ｐｆｕｓを投与（例、約０．５ｍＬ量で投与）できる。
【００７１】
本発明の細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）は、注入あたり、約１×１０５細胞と２×１０１１細胞との間（例、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、及びそれらの範囲）の用量で宿主に投与され得る。細胞は、例えば、１〜３（例、２）回の注入により投与され得る。細胞の投与に加え、宿主は、インターロイキン２（ＩＬ−２）などの生物学的応答修飾物質を投与され得る。投与される細胞が細胞傷害性Ｔ細胞の場合、ｉｎ ｖｉｖｏのＴ細胞の数をさらに増やすように細胞傷害性Ｔ細胞に刺激を与えるために、細胞傷害性Ｔ細胞の投与後、ペプチド、核酸、ベクター、又はそれらの組成物が投与され得る。
【００７２】
投与される細胞が樹状細胞の場合、対象に投与される樹状細胞の量は、対象の状態によって変化し、実務者により全ての適切な要因を考慮して決められるべきである。好ましくは、約１×１０６から約１×１０１２（例、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、又は約１×１０１１であって、本明細書に記載の細胞数の、いずれかの範囲を含む）の樹状細胞がヒト成人に利用される。これらの量は、対象の年齢、体重、大きさ、体調、性別、治療されるべき腫瘍の種類、投与経路、治療は局所又は全身かどうか、及び他の要因によって変わる。当業者は、対象の特殊な状況及びニーズに合わせるために、適した投与量及び投与スケジュールを容易に導き出せるべきである。
【００７３】
本発明は、有効量の本発明のペプチド、核酸、ベクター又は細胞を単独で、又は１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又はアジュバントと組み合わせて、又はリポソーム製剤で、リンパ球を刺激することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、ペプチド特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を産生する方法を提供する。リンパ球は、例えば、末梢血、腫瘍組織、リンパ節、及び胸膜液又は腹水液のような滲出液など、任意の適したソース由来のリンパ球であり得る。
【００７４】
ＭＵＣ１ペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＭＵＣ１に対して免疫反応性である。好ましくは、細胞傷害性Ｔリンパ球は、腫瘍細胞及び癌の発生を抑制し、ＭＵＣ１又はそのエピトープを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制するか、又は該細胞を死滅させる。細胞傷害性Ｔリンパ球は、抗原特異的であることに加えて、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり得る。一実施形態において、細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ａ２拘束性である。他の実施形態において、細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ａ３拘束性である。細胞傷害性Ｔリンパ球は、好ましくはＣＤ８＋表現型を有する。
【００７５】
一実施形態において、リンパ球は宿主から取り出され、ｅｘ ｖｉｖｏでペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物により刺激され、細胞傷害性Ｔリンパ球を産生する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、癌に対する免疫応答を増強するために宿主に投与でき、それにより癌を抑制する。従って、本発明は、宿主の癌を抑制する方法であって、（ａ）リンパ球を得る工程（例、宿主より）、（ｂ）ペプチド、核酸、ベクター、細胞又はそれらの組成物で該リンパ球を刺激して、細胞傷害性Ｔリンパ球を産生する工程、及び（ｃ）該細胞傷害性Ｔリンパ球を宿主へ投与する工程を含み、癌が抑制される方法を提供する。
【００７６】
他の実施形態において、宿主内のリンパ球は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物が宿主へ投与されることにより刺激され、細胞傷害性Ｔリンパ球を産生し、かかる細胞傷害性Ｔリンパ球は癌への免疫応答を増強し、それによって癌を抑制する。
【００７７】
本発明はプライム及びブーストのプロトコルを含む。特に、プロトコルは、本発明のペプチドと、任意選択で１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする１つ以上の組換ベクターを含む組成物での最初の「プライム」と、それに続いて、本発明のペプチド、又は本発明のペプチドと、任意選択で１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする１つ以上のポックスウイルスベクターを含む組成物での１回、又は好ましくは複数回の「ブースト」を含む。
【００７８】
最初のプライミングワクチン接種は、１つ以上のベクターを含み得る。一実施形態において、単一のベクター（例、ポックスウイルスベクター）は、本発明のペプチド並びに１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープのデリバリーに利用される。他の実施形態において、２つ以上のベクター（例、ポックスウイルスベクター）は、プライミングワクチン接種を含み、これは一回の注射で同時に投与される。
【００７９】
ブースティングワクチン接種も、１つ以上のベクター（例、ポックスウイルスベクター）を含み得る。一実施形態において、単一のベクターは、本発明のペプチド並びに１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープ（ブースティングワクチン接種のため）のデリバリーに利用される。他の実施形態において、２つ以上のベクターは、ブースティングワクチン接種を含み、これは一回の注射で同時に投与され得る。
【００８０】
異なるベクター（例、ポックスウイルスベクター）は、異なる時間間隔での接種のために、異なるセットの治療用分子を運ぶベクターを用いた、異種のプライム／ブーストプロトコルを提供するために使用できる。例えば、１つの異種のプライム／ブースト組み合わせにおいて、第一のオルソポックスベクター組成物をプライムに使用し、第二のアビポックスベクター組成物をブーストに使用する。
【００８１】
ベクター（例、ポックスウイルスベクター）の投与スケジュールは典型的に、ブースティングベクターの頻回投与を伴う。ブースティングベクターは、任意の適した期間（例、２〜４週間毎）で１〜３回（例、１、２又は３回）、任意の適した期間の間（例、６〜１２週間で合計少なくとも５から１５回ブースティングワクチン接種）投与され得る。例えば、プライマリーワクチン接種は、組換えワクシニア又はＭＶＡベクターを含み、それに続いて、複数回のブースターワクチン接種では、アビポックスベクター用いる。特定の実施形態において、宿主は、プライミングベクターで一回ワクチン接種を受けた後、２週間毎に６ブーストのブースティングベクター、その後４週間毎にブースティングベクター、そして疾病進行に応じた期間、ブースティングベクターを続ける。
【００８２】
本発明はさらに、医薬上許容される担体中、少なくとも第一の組換えベクター（例、ポックスウイルスベクター）であって、そのゲノム又はその一部に本発明のペプチドをコードする核酸が組み込まれているものを有するキットを提供する。第一の組換えベクター（例、ポックスウイルスベクター）は、１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする１つ以上の核酸も含むことができる。第一の組換えベクターに加え、キットは、医薬上許容される担体中、１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする１つ以上の核酸を含む第二の組換えベクターを有し得る。キットはさらに、容器、注射針、及びキットの使用方法についての説明書を提供する。他の実施形態において、キットはさらに、ＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバント及び／又はキット構成物品とともに市販されているアジュバントを使用するための説明書を提供する。
【００８３】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、及び腫瘍内を含む（これに限定されない）様々なルートによって、宿主に投与され得る。複数回投与される場合、宿主の１つ以上の部位に投与され得る。
【００８４】
ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の投与は、「予防的」又は「治療的」であり得る。予防的に提供される場合、宿主の免疫システムが、宿主が発症しやすい腫瘍と戦うことを可能にするために、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は腫瘍形成に先立って提供される。例えば、遺伝性癌感受性を有する宿主は、そのような予防免疫接種で治療されることが好ましい患者群である。ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の予防的な投与は、ＭＵＣ１を発現する癌を予防し、改善し、又は遅らせる。治療的に提供される場合、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、ＭＵＣ１を発現する癌の診断時又は診断後に提供される。
【００８５】
宿主がすでにＭＵＣ１を発現する癌又は転移性癌と診断されている場合、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、化学療法又は放射線などの他の治療的処置と併せて投与され得る。
【００８６】
好ましい実施形態において、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を宿主へ投与すると、結果として、本発明のペプチド並びに任意選択で１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープ（同時投与されたもの）を発現する宿主細胞がもたらされる。本発明のペプチド（すなわち、ＭＵＣ１抗原）は、感染した宿主細胞の細胞表面に発現し得る。１つ以上の免疫賦活／制御分子及び／又は他の腫瘍関連抗原（例、ＣＥＡ）、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープは、細胞表面に発現することが可能であり、又は宿主細胞によって活発に分泌されてもよい。ＭＵＣ１抗原及び免疫賦活／制御分子の両方が発現すると、特定のＴ細胞に必要なＭＨＣ拘束性ペプチドと、該Ｔ細胞に適切なシグナルが提供されて、抗原認識、並びに抗原特異的Ｔ細胞の増殖又はクローン性増殖に役立つ。総合的な結果は、免疫システムのアップレギュレーションである。好ましくは、免疫反応のアップレギュレーションは、癌（例、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、甲状腺癌、胃癌、頭頸部癌又は前立腺癌）細胞の増殖を抑制する又は死滅させることができる、抗原特異的ヘルパーＴリンパ球及び／又は細胞傷害性Ｔリンパ球の増加である。
【００８７】
本発明の方法について、医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。非経口、皮下、静脈内、筋肉内、及び腹腔内投与のための以下の製剤が代表的であるが、これに制限されない。当業者ならば、本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞又は組成物のこれらの投与ルートが公知であり、２つ以上のルートを用いて特定の合成物を投与することができるものの、特定のルートが他のルートと比べてより即効性があり、より効果的な反応を提供できるということを理解するだろう。
【００８８】
注射製剤は、本発明に基づいて好まれるこれら製剤のうちの１つである。注射用組成物として効果的な医薬担体の要件は、当業者に周知である（例、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８−２５０（１９８２），ａｎｄ ＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４Ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２−６３０（１９８６）参照）。
【００８９】
非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張とする溶質を含むことができる水性及び非水性の等張滅菌注射液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、医薬担体中、生理学的に許容される希釈剤中で投与でき、これは例えば滅菌液体又は液体の混合物などであって、水、生理食塩水、デキストロース水溶液及び関連する糖溶液、エタノール、イソプロパノール、若しくはヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなどのグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００などのエーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、石鹸若しくは洗剤などの医薬上許容される界面活性化剤の添加を有する若しくは有さないアセチル化脂肪酸グリセリド、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、又は乳化剤及び他の医薬アジュバントを含む。
【００９０】
非経口製剤で利用できる油は、石油系、動物性、植物性、及び合成油を含む。油の具体例として、ピーナッツ、大豆、胡麻、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン及び鉱物の油が挙げられる。非経口製剤での利用に適した脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、脂肪酸エステルの適切な例である。
【００９１】
非経口製剤での利用に適した石鹸は、脂肪アルカリ金属（ｆａｔｔｙ ａｌｋａｌｉ ｍｅｔａｌ）、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩を含み、並びに適した洗剤は、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライドなどの陽イオン性洗剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリル、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセライドスルフェート、並びにスルホサクシネートなどの陰イオン性洗剤、（ｃ）例えば、脂肪アミンオキシド（ｆａｔｔｙ ａｍｉｎｅ ｏｘｉｄｅｓ）、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）などの非イオン性洗剤、（ｄ）例えば、アルキル−ｂ−アミノプロピオネート、及び２−アルキル−イミダゾリン四級アンモニウム塩などの両性洗剤、並びに（ｅ）それらの混合物を含む。
【００９２】
防腐剤及び緩衝液を使用してもよい。注射部位の炎症を最小限にする又は排除するために、そのような組成物は、約１２から約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。そのような製剤における界面活性剤の量は、一般的に約５重量％から約１５重量％の範囲である。適した界面活性剤としては、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びエチレンオキサイドの疎水性塩基との高分子量付加物（プロピレンオキサイドのプロピレングリコールとの縮合により形成される）を含む。
【００９３】
非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数用量密閉容器に入れて供給することができ、かつ、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存でき、これは、使用直前に、注射のために滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要する。即席注射用液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【００９４】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然ながら、その範囲を制限するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９５】
実施例１
以下の材料及び方法は、実施例２〜５で議論する実験のために使用した。
【００９６】
細胞培養
ＭＣＦ−７ヒト乳腺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＵＣ１＋）、ＣＦ−ＰＡＣ−１ヒト膵臓腺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＵＣ１＋）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２４メラノーマ細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＵＣ１−）、及びＡＳＰＣ−１ヒト膵臓腺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２−／ＭＵＣ１＋）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、及び０．０１μｇ／ｍＬヒト組換えインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ完全培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で維持した。全ての培養は、マイコプラズマフリーだった。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（Ｓｔｏｒｋｕｓｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：１６５７−１６５９（１９８７））を発現するＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２／Ａ＊０２０１）（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：３４０７−３４１９（１９９３））は、Ｃ．Ｂｒｉｔｔｅｎ（Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ，Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、１０％の熱失活させたウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬＧ４１８を補充したＲＰＭＩ−１６４０完全培地で培養した。１７４ＣＥＭ−Ｔ２細胞株（Ｔ２）トランスポート欠失変異株（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８：７２５−７３６ （１９８８））は、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）により提供された。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞及びＴ２細胞は、マイコプラズマフリーであり、それぞれ、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地及びイスコフ改変ダルベッコ完全培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で維持した。
【００９７】
ペプチド
ＭＵＣ１−Ｃのアミノ酸配列は、ペプチド／ＭＨＣ複合体の予測される解離半減期により潜在的なＭＨＣ結合ペプチドを位置づける、アメリカ国立衛生研究所のバイオインフォマティクス及び分子解析部門（ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ）（Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：１６３−１７５（１９９４））のコンピューターアルゴリズムを使用して、ＨＬＡ−Ａ２結合についてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）は、７つの９−ｍｅｒペプチド又は１０−ｍｅｒペプチド及びそれらのアナログをＭＵＣ１−Ｃから合成した。ペプチドの純度は＞９０％だった。
【００９８】
フローサイトメトリー解析
単色のフローサイトメトリー解析は、Ｇｕａｄａｇｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０：６２４８−６２５５（１９９０）で以前に述べられている。簡単には、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋フリーの冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を３回洗浄し、その後、抗ＨＬＡ−Ａ２，２８（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ，ＣＡ）、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、及び抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体を用いて４℃で１時間染色した。マウスＩｇＧ２ａ，ｋ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をアイソタイプコントロールとして用いた。次いで、細胞をＣａ２＋及びＭｇ２＋フリーの冷ＰＢＳで３回洗浄後、同じ緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてすぐに分析した。結果は、１０，０００個の生細胞から集めたデータから得られ、陽性細胞のパーセント及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表した。ＭＦＩ値は対数スケールで集め、蛍光ドットプロットで全細胞の平均を測定することにより決定された蛍光レベルを表すのに使用した。
【００９９】
２色のフローサイトメトリー解析の手順は、以下を除いて単色の解析と同様である。樹状細胞は、以下の抗体組み合わせ：抗ＭＨＣクラスＩＩＦＩＴＣ／抗ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ；抗クラスＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８０フィコエリトリン（ＰＥ）；抗クラスＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８３ＰＥ；抗クラスＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ８６ＰＥ；抗クラスＩ ＦＩＴＣ／抗クラスＩＩ ＰＥ；抗クラスＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ５８ＰＥ；抗クラスＩ ＦＩＴＣ／抗ＣＤ５４ＰＥを用いて分析した。マウスＩｇＧ１，ｋ ＦＩＴＣ、マウスＩｇＧ１，ｋ ＰＥ、及びマウスＩｇＧ２ａ，ｋ ＦＩＴＣをアイソタイプコントロールとして用いた。＞９６％のＤＣがＣＤ１１ｃ＋及びＭＨＣクラスＩＩ＋であった。ＭＨＣクラスＩＩに対する抗体は、Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）から購入し、他の抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【０１００】
ペプチドのＨＬＡ−Ａ２への結合
Ｐ１１７２、Ｐ１１７７、Ｐ１２４０及びそれらのアナログのＨＬＡ−Ａ２分子への結合は、フローサイトメトリーによって実証されるように（Ｎｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１２１５−１２１９（１９９３））、Ｔ２Ａ２細胞でのＨＬＡ−Ａ２発現のアップレギュレーションによって評価した。
【０１０１】
ＰＢＭＣｓ由来のＤＣｓの培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、ＰＡＮＶＡＣ−ＶＦ臨床試験に登録されたＨＬＡ−Ａ２＋の患者のヘパリン処理済血液から得た。リンパ球分離媒体グラジエント（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を用いて、製造者の指示に従ってＰＢＭＣｓを分離した（Ｂｏｙｕｍ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．，９７：５１−７６（１９６８））。ＤＣｓは、Ｓａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８（１９９４）に記載されるように、ＰＢＭＣｓから調製した。
【０１０２】
Ｔ細胞株の産生
Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９９０（１９９５）により述べられているプロトコルの修正により、ＭＵＣ１−Ｃ特異的ＣＴＬｓを産生した。Ｐ１１７２、Ｐ１１７２（１Ｙ）、Ｐ１１７７、及びＰ１１７７（１０Ｖ）特異的Ｔ細胞株は、ＭＵＣ１−ＣＥＡベースのワクチンを接種した２人の結腸癌患者から産生した。Ｐ１２４０及びＰ１２４０（１Ｙ）特異的Ｔ細胞株は、ＭＵＣ１−ＣＥＡベースのワクチンを接種した卵巣癌患者及び乳癌患者から産生した。前述のとおり生成したＣＤ４０Ｌ又は酵母成熟自己ＤＣｓを、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）として使用した。ワクチン接種後７０日目に得たＰＢＭＣｓをＡＰＣｓに添加し、１２．５μｇ／ｍＬの対応するペプチドで、エフェクター：ＡＰＣが１０：１の比率でパルスした。３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）サイクルのために、自己ＤＣｓをＡＰＣｓとして使用した。３回目のＩＶＳサイクル後、放射線照射（２３，０００ｒａｄｓ）された自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を、ＡＰＣｓとして使用した。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞での再刺激のために、１２．５μｇ／ｍＬの濃度でペプチドを用いて、自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を、エフェクター：ＡＰＣが１：３の比率でパルスした。５％ＣＯ２を含む加湿大気中で、培養物を３日間、３７℃でインキュベートした。その後、培養物に７日間、２０Ｕ／ｍＬの濃度の組換えヒトＩＬ−２を補充し；ＩＬ−２を含む培地を３日毎に補給した。ペプチドとの３日間のインキュベーション及び７日間のＩＬ−２補充は、１回のＩＶＳサイクルを構成した。
【０１０３】
テトラマー染色
ストレプトアビジン−ＰＥ標識Ｐ１１７２（１Ｙ）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー、ＰＥ標識Ｐ１１７７（１０Ｖ）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー、ＰＥ標識Ｐ１２４０／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー、及びＰＥ標識Ｐ１２４０（１Ｙ）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマーは、Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）により調製された。ＰＥ標識ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号２５）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマーは、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から入手し、ネガティブコントロールとして使用した。１μＬのテトラマー及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０分間、室温で暗所にてＰＢＭＣｓ（１×１０６）を染色し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して解析した。結果は、１００，０００個の細胞から集めたデータから得た。
【０１０４】
細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞を、５０μＣｉの１１１Ｉｎで標識したオキシキノリン（Ｍｅｄｉ−Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）で、室温にて１５分間標識した。１００μＬのＲＰＭＩ−１６４０完全培地中のターゲット細胞（３×１０３）を、平底アッセイプレートの各９６ウェルに添加した。１０％のプールされたヒトＡＢ血清を補充した１００μＬのＲＰＭＩ−１６４０完全培地にエフェクター細胞を懸濁し、ターゲット細胞に添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、４又は１６時間インキュベートした。ハーベスターフレームズ（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｓ）（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用いてガンマ線計数するために、上清を回収した。測定を３回行い、標準偏差を算出した。特異的溶解は以下の計算式により算出した（全ての値はｃｐｍで表示）。
【０１０５】
【化１】
0006523685.tif 000002
【０１０６】
１００μＬのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を添加したウェルから、自然遊離を決定した。ターゲットを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理後、全遊離放射活性を得た。
【０１０７】
サイトカインの検出
種々のペプチド濃度のＩＬ−２を含まない培地中、ペプチドパルスした自己ＤＣｓ又は自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞により２４時間刺激されたＴ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）によりＩＦＮ−γの分泌についてスクリーニングした。結果はｐｇ／ｍＬで表した。
【０１０８】
統計解析
対応のある両側スチューデントｔ検定及びＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を使用して、統計学的有意性を算出した。
【０１０９】
実施例２
本実施例は、ＭＵＣ１−ＣサブユニットのＣＴＬエピトープ及びそのアナログの決定を実証する。
【０１１０】
ＭＵＣ１−Ｃサブユニットの第一のアミノ酸配列（ＭＵＣ１配列の残基１０９８から１２５４に対応）を、ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドのコンセンサスモチーフについて解析した。２つの１０−ｍｅｒペプチド（Ｐ１１７２及びＰ１１７７と称する）及び１つの９−ｍｅｒペプチド（Ｐ１２４０と称する）を同定し、合成した（表１参照）。ネイティブエピトープＰ１１７２、Ｐ１１７７、及びＰ１２４０の３つのアナログ（それぞれＰ１１７２（１Ｙ）、Ｐ１１７７（１０Ｖ）、及びＰ１２４０（１Ｙ））を、１位及び１０位のアミノ酸残基の単一アミノ酸置換により作製した。各アナログは、対応するネイティブエピトープよりもＨＬＡ−Ａ２分子に対する高い予測親和性を有した。
【０１１１】
ＨＬＡ−Ａ２分子に対して高い親和性を有するペプチド（ＮＧＥＰＰ７０３）（Ｃｅｒｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５９：６３−７１（２０１０））及び特異的なＨＬＡ−Ａ３ペプチド（ＣＡＰ−７）を、それぞれ、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしてアッセイで使用した。
【０１１２】
【表１】
0006523685.tif 000003
【０１１３】
Ｐ１１７７、Ｐ１１７２、及びＰ１２４０は、ＨＬＡ−Ａ２分子に対し、ネガティブコントロールと比較してより高い親和性を示した。アナログペプチドＰ１１７７（１０Ｖ）及びＰ１２４０（１Ｙ）は、ＨＬＡ−Ａ２分子に対し、対応するネイティブペプチドＰ１１７７及びＰ１２４０と比較してより高い親和性を示した。
【０１１４】
アナログ及びネイティブペプチドのペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体の安定性は、ＨＬＡ−Ａ２分子の残存する複合体のパーセンテージを異なる時点（０、２、４、６、８、及び１０時間）で決定することにより解析した。アナログペプチドＰ１１７７（１０Ｖ）は、ネイティブペプチドＰ１１７７よりも、クラスＩ分子に対してより結合活性が高いことを各時点で実証した。Ｐ１１７２（１Ｙ）及びＰ１１７２、並びにＰ１２４０（１Ｙ）及びＰ１２４０の間では、解離半減期に関して違いは認められなかった。
【０１１５】
実施例３
本実施例は、ＭＵＣ１−ＣサブユニットのＣＴＬエピトープ及びそのアナログのさらなる特徴を実証する。
【０１１６】
Ｐ１１７２、Ｐ１１７７、Ｐ１２４０、及びそれらの対応するアナログの免疫原性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的ＣＴＬｓを産生する能力を評価することによりさらに調べた。組換えワクシニア−ＣＥＡ−ＭＵＣ１−ＴＲＩＣＯＭ及び組換え鶏痘−ＣＥＡ−ＭＵＣ１−ＴＲＩＣＯＭでワクチン接種された、結腸癌患者（患者１）由来及び乳癌患者（患者２）由来のＰＢＭＣｓを用いて、これらのＭＵＣ１−Ｃネイティブ及びアゴニストペプチドに対して特異的ＣＤ８＋細胞株を樹立した。Ｐ１１７２、Ｐ１１７２（１Ｙ）、Ｐ１１７７、及びＰ１１７７（１０Ｖ）を用いて患者１から産生されたＴ細胞株は、それぞれ、Ｔ−１−Ｐ１１７２、Ｔ−１−１１７２（１Ｙ）、Ｔ−１−Ｐ１１７７、及びＴ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）とした。Ｐ１２４０及びＰ１２４０（１Ｙ）を使用して患者２から産生したＴ細胞株は、それぞれ、Ｔ−２−Ｐ１２４０及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）とした。
【０１１７】
これらのＴ細胞株の特異性を評価するために、対応するペプチドでパルスされ放射線照射された自己Ｂ細胞を用いて、ＩＦＮ−γリリースアッセイを行った。対応するペプチドでパルスされ放射線照射された自己Ｂ細胞を用いて、ＡＰＣ：Ｔ細胞が２：１の比率でＴ細胞を刺激した。Ｔ細胞は５×１０５／ｍＬの濃度で使用した。２４時間の培養上清を集め、ＩＦＮ−γの分泌を調べた。Ｔ−１−Ｐ１１７２（１Ｙ）、Ｔ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）、及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）細胞株は、対応するネイティブペプチドを用いて産生されたＴ細胞株と比較して、より高レベルのＩＦＮ−γを産生した（表２）。
【０１１８】
【表２】
0006523685.tif 000004
【０１１９】
次いで、アゴニストペプチド特異的Ｔ細胞を活性化するネイティブペプチド及びアゴニストペプチドの能力を比較するために、種々の濃度で試験を行った。各ペプチド濃度において、アゴニストペプチドＰ１１７２（１Ｙ）、Ｐ１１７７（１０Ｖ）、及びＰ１２４０（１Ｙ）でＡＰＣｓをパルスすると、ネイティブペプチドＰ１１７２、Ｐ１１７７、及びＰ１２４０と比較して、アゴニストペプチド特異的Ｔ細胞株による、最大レベルのＩＦＮ−γ産生が導かれた（図１Ａ〜１Ｃ参照）。
【０１２０】
次いで、上述と同じ臨床試験より他の結腸癌患者（患者３）のＰＢＭＣｓから、Ｐ１１７７及びＰ１１７７（１０Ｖ）を使用して更なるＴ細胞株を樹立し、それぞれＴ−３−Ｐ１１７７及びＴ−３−Ｐ１１７７（１０Ｖ）とした。Ｔ−３−Ｐ１１７７（１０Ｖ）はＴ−３−Ｐ１１７７よりも高レベルのＩＦＮ−γを産生した（＞１，０００ｐｇ／ｍＬ対４５６ｐｇ／ｍＬ）。
【０１２１】
実施例４
本実施例は、癌患者のＭＵＣ１ ＣＴＬエピトープ及びエンハンサーアナログペプチドの免疫原性を実証する。
【０１２２】
Ｔ細胞株Ｔ−１−Ｐ１１７２、Ｔ−１−１１７２（１Ｙ）、Ｔ−１−Ｐ１１７７、Ｔ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）、Ｔ−２−Ｐ１２４０、及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）におけるＭＵＣ１−Ｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、Ｐ１１７２（１Ｙ）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー、Ｐ１１７７（１０Ｖ）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー、Ｐ１２４０（１Ｙ）／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１テトラマー、及び抗ＣＤ８抗体を使用して調べた。アゴニストエピトープ特異的Ｔ細胞株Ｔ−１−Ｐ１１７２（１Ｙ）、Ｔ−３−Ｐ１１７７（１０Ｖ）、及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）では、対応するネイティブペプチドを使用して産生したＴ細胞株と比較して、高頻度のＭＵＣ１−Ｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が産生された（それぞれ、６．３８％対１．５３％、６．１８％対３．５３％、及び６．６％対１．６％）。
【０１２３】
次いで、これらのＴ細胞株を、ＭＵＣ１＋／ＨＬＡ−Ａ２＋乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）及びＭＵＣ１＋／ＨＬＡ−Ａ２＋膵臓癌細胞株（ＣＦ−ＰＡＣ−１）に対する細胞傷害性活性について試験した。ＭＵＣ１−／ＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２４）及びＭＵＣ１＋／ＨＬＡ−Ａ２−膵臓癌細胞株（ＡＳＰＣ−１）をネガティブコントロールとして使用した。これらの腫瘍細胞株のＨＬＡ−Ａ２及びＭＵＣ１−Ｃの発現を、フローサイトメトリーで評価した（表３参照）。
【０１２４】
【表３】
0006523685.tif 000005
【０１２５】
ＭＵＣ１−Ｃエピトープ特異的Ｔ細胞株を用いて、１６時間の１１１Ｉｎリリースアッセイを行った。ＭＣＦ−７細胞は、アゴニストエピトープ特異的Ｔ細胞株により、対応するネイティブエピトープに特異的なＴ細胞株よりも著しく溶解された。予想通り、ＳＫ−ＭＥＬ−２４細胞に対する溶解は観察されなかった（表４参照）。
【０１２６】
【表４】
0006523685.tif 000006
【０１２７】
実施例５
本実施例は、本発明のペプチドを用いて産生したＴ細胞株のＣＴＬ細胞溶解の特異性及びＨＬＡ−Ａ２拘束性を実証する。
【０１２８】
Ｔ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）細胞は、該細胞株が高レベルのＩＦＮ−γ、高パーセンテージのテトラマー＋Ｔ細胞、及び殺腫瘍細胞の増大を生じたため、選択した。
【０１２９】
ＣＴＬ細胞溶解の特異性及びＨＬＡ−Ａ２拘束性を確認するため、Ｔ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）細胞を、ターゲットとしたＣＦ−ＰＡＣ−１細胞とともにコールドターゲット阻害アッセイで使用した。１１１Ｉｎで標識したＣＦ−ＰＡＣ−１細胞及び非標識のＫ５６２／Ａ２．１細胞を、１：１０で使用した。Ｋ５６２／Ａ２．１細胞を、ペプチド（２５μｇ／ｍＬ）あり又はなしで２時間インキュベートした。
【０１３０】
Ｐ１１７７（１０Ｖ）及びＰ１２４０（１Ｙ）ペプチドパルスされた非標識のＫ５６２／Ａ２．１細胞の添加は、エフェクター：ターゲット比が２５：１で、Ｔ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）細胞のＣＦ−ＰＡＣ−１コントロールに対するＣＴＬ活性を、それぞれ２１．１％から４．０％溶解及び１３．５％から１．７％溶解まで減少させた（表５）。
【０１３１】
【表５】
0006523685.tif 000007
【０１３２】
抗体ブロッキング試験を実施して、溶解がＨＬＡ−Ａ２拘束性であるかどうかを決定した。１６時間の１１１Ｉｎリリースアッセイにおいて、いずれの抗体も含まないか、ＵＰＣ−１０（１０μｇ／ｍＬ）を含むか、又は抗ＨＬＡ−Ａ２（１０μｇ／ｍＬ）を含む、培地でＣＦ−ＰＡＣ−１細胞を１時間インキュベートした。ＣＦ−ＰＡＣ−１細胞に対するＴ−１−Ｐ１１７７（１０Ｖ）及びＴ−２−Ｐ１２４０（１Ｙ）のＣＴＬ活性は、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体では溶解が抑制されたがコントロール抗体ＵＰＣ−１０では抑制されなかったことから示されるように、ＨＬＡ−Ａ２拘束性であることが示された（表６）。
【０１３３】
【表６】
0006523685.tif 000008
【０１３４】
これらの結果は、アゴニストエピトープを用いて産生されたＭＵＣ１−Ｃ特異的Ｔ細胞が、抗原特異的及びＨＬＡ−Ａ２拘束性の様式で、ネイティブＭＵＣ−１を内在的に発現する腫瘍細胞を溶解することを示した。
【０１３５】
実施例６
以下の材料及び方法は、実施例７〜９において議論する実験のために使用した。
【０１３６】
患者
前述のＣＥＡベース及びＭＵＣ１ベースウイルスワクチン（ＰＡＮＶＡＣ−Ｖ／Ｆ）（Ｇｕｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１４：３０６０−３０６９（２００８））の臨床試験で登録された卵巣癌患者の抹消血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を使用した。ＰＡＮＶＡＣは、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、及び３つの共刺激分子（Ｂ７．１、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、及びリンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３））を発現する、組換えワクシニア（Ｖ）及び鶏痘（Ｆ）ベクターからなる。プライムとしてワクシニア、ブースト注射として鶏痘を用いて、最初の月は隔週で、それ以降は月１回与えた。
【０１３７】
ＨＬＡ−Ａ３＋の健康なドナー由来のＰＢＭＣｓを、記載される参照集団として使用した。アメリカ国立衛生研究所臨床センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）の治験審査委員会は手順を承認し、インフォームド コンセントはヘルシンキ宣言に従って得られた。
【０１３８】
細胞培養
ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＨＬＡ−Ａ３＋及びＭＵＣ１＋）、及び膵臓癌細胞株ＣＦＰＡＣ１（ＨＬＡ−Ａ３＋及びＭＵＣ１＋）並びにＡＳＰＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３＋及びＭＵＣ１−）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入した。全ての細胞培養物は、マイコプラズマフリーであり、完全培地（１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２ｍＭＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で維持した。Ｃ１ＲＡ３及びＫ５６２−Ａ３細胞：Ｃ１Ｒ（Ｄｒ．ＷＥＢｉｄｄｉｓｏｎ（ＮＩＮＤＳ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から親切な贈与）及びＫ５６２（ＡＴＣＣ）は、ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｒｉｃｋ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）によって、ＨＬＡ−Ａ３を発現するためにＨＬＡ−Ａ３ベクターでトランスフェクトされた。０．２ｍｇ／ｍｌのＧ−４１８（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ完全培地で、それらを維持した。
【０１３９】
ペプチド
ＭＵＣ１−Ｃのアミノ酸配列は、ペプチド／ＭＨＣ複合体の予測される解離半減期により潜在的なＭＨＣ結合ペプチドを位置づけるためにＰａｒｋｅｒらによって開発されたコンピューターアルゴリズム（Ｐａｒｋｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：１６３−１７５（１９９４））を使用して、ＨＬＡ−Ａ３結合ペプチドについてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）が、結合親和性を増大させるために、アミノ酸置換したＭＵＣ１−Ｃ由来の、７つの９−ｍｅｒ又は１０−ｍｅｒペプチドアナログを合成した。ペプチドの純度は＞９０％だった。
【０１４０】
ＰＢＭＣｓ由来樹状細胞の培養
患者から末梢血を集め、密度勾配遠心法によりＰＢＭＣｓを単離した（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＶＡ）。樹状細胞（ＤＣｓ）は、以前に記載された手順（Ｙｏｋｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２１：５９５−６０５（２００７））の変更を使用して産生した。１００ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で、樹状細胞を増殖させた。５日間培養後、１μｇ／ｍｌＣＤ４０Ｌ及び１μｇ／ｍｌエンハンサー（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）の２４時間添加によりＤＣｓを成熟させた。次いで、それらを、ＰＢＭＣｓの最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ１）のためにすぐに使用するか、又は今後の使用のために分割して凍結した。
【０１４１】
Ｔ細胞株の産生
Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９９０（１９９５）により述べられているプロトコルの改訂版を使用し、ＭＵＣ１−Ｃ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を産生した。放射線照射された自己ＤＣｓを、１２．５μｇ／ｍｌのペプチドで２時間パルスし、次いで、ＰＢＭＣｓを１０：１の比率で添加した。３日後、ヒトＩＬ−２（２０Ｃｅｔｕｓ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加えた。細胞を７日毎に、再刺激した。３回目のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）後、抗原提示細胞として自己エプスタイン―バーウイルス形質転換Ｂ細胞を使用して、３：１の比率で細胞を再刺激した。
【０１４２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）は、以前に記載されたように（Ｙｏｋｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，上記参照）行った。簡単には、ヤギ抗ヒト二次ＦＩＴＣ結合抗体とともにＧＡＰ−Ａ３抗体をＨＬＡ−Ａ３に使用し、ＤＦ３抗体を細胞外ＭＵＣ−１に使用した。ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥＣｙ７、ＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ及びＣＸＣＲ３−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で４０分間、４℃で染色することにより、Ｔ細胞株に対して４色ＦＡＣＳ解析を実施した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）により１×１０５細胞を得て、ＦｌｏｗＪｏ９．０．１ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用してデータを解析した。適切なアイソタイプコントロールを使用し、死細胞は解析から除いた。
【０１４３】
テトラマー染色
ＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）により、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＨＬＡ−Ａ３−Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＨＬＡ−Ａ３−Ｐ４８３−２Ｌ３Ｆテトラマーを調製し、ＰＥで標識したＭＨＣクラスＩヒトネガティブテトラマー（ＫｉｔＮｏ Ｔ０１０４４）をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ（Ｓｙｋｅｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ネガティブテトラマーは、特異性は知られておらず、及びどのＨＬＡ対立遺伝子のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞にも結合しない。テトラマーを１：１００で希釈して使用し、細胞を４５分、４℃で染色した。ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）により１×１０５細胞を得て、ＦｌｏｗＪｏ９．０．１ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用してデータを解析した。
【０１４４】
細胞傷害性アッセイ及びコールドターゲット阻害アッセイ
Ｔ細胞により媒介される死滅を決定するために、１６時間の１１１Ｉｎリリースアッセイを使用した（Ｔｓａｎｇｅｔ ａｌ．，上記参照）。３７℃で２０分間、２×１０６ターゲット細胞を６０μＣｉの１１１Ｉｎオキサイド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡ）で標識し、９６ウェルの丸底培養プレート中、３０００細胞／ウェルで使用した。Ｔ細胞を異なる比率で添加した。全てのアッセイは、１０％ウシ胎児血清、グルタミン、及び抗生物質（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で置き換えたＲＰＭＩ培地中で実施された。培地のみでターゲット細胞をインキュベートすることによって自然遊離を決定し、２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でインキュベートすることによって完全溶解を決定した。計算式を用いて溶解を算出した（全ての値はｃｐｍで表示）：
【０１４５】
【化２】
0006523685.tif 000009
【０１４６】
コールドターゲット阻害アッセイは、Ｋ５６２−Ａ３細胞又はペプチドパルスされたＫ５６２−Ａ３細胞を１：１０の比率でウェルに添加することによって実施した（Ｙｏｋｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。
【０１４７】
サイトカインの検出
２．２×１０６Ｔ細胞、及びペプチドＰ４３２−３Ｆ１０Ｋ又はＰ４８３−２Ｌ３Ｆでパルスされた５．５×１０６自己Ｂ細胞を２４時間、ウェルあたり５ｍＬの培地でインキュベートした。サイトカインの検出のために、上清をＭｕｌｔｉ−ａｒｒａｙテクノロジー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇａｉｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で解析した。
【０１４８】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＨＬＡ−Ａ３＋患者におけるＣＤ８免疫応答の測定は、Ａｒｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４９：５１７−５２９（２０００）により述べられている手順の変更を用いて、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって行った。ＡＰＣとしてＫ５６２−Ａ３細胞を使用して、アッセイを実施した。ＥＬＩＳＰＯＴは、ペプチドによる刺激に応じてＩＦＮγを放出するＴ細胞の頻度を測定する。Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ、Ｐ４８３−２Ｌ３Ｆ、ペプチドなし、又はＨＩＶｇａｇペプチド（配列番号２５：ネガティブコントロール）を使用した。ワクチン接種前又は接種後に各患者のＰＢＭＣｓを比較した。陽性反応は、ＩＦＮγ分泌細胞において≧２倍増加として得点された。スポットは、イムノスポットカウンター（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ，Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を使用して解析した。
【０１４９】
統計解析
統計的評価のため、２群間でノンパラメトリックマン−ホイットニー検定を使用した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。＜０．０５のＰ値を有意とみなした。
【０１５０】
実施例７
本実施例は、ＭＵＣ１−ＣサブユニットのＣＴＬエピトープ及びそれらのアナログの決定を実証する。
【０１５１】
ＭＵＣ１−Ｃアミノ酸配列は、免疫療法に使用できる可能性があるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定するために、ＨＬＡ−Ａ３結合ペプチドについてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。ネイティブエピトープの予測される結合は低いので、Ｔ細胞レセプターに対するより高い結合が予測される７つの新しいペプチドを調製した（表７参照）。
【０１５２】
【表７】
0006523685.tif 000010
【０１５３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生能力について、これらのペプチドを調べた。ＰＢＭＣｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激によりＣＴＬを産生し、次いで、ターゲットとしてのペプチドパルスされたＣ１ＲＡ３細胞とともに、細胞傷害性アッセイに使用した。Ｔ−４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＴ−４８３−２Ｌ３Ｆ（それぞれ、Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＰ４８３−２Ｌ３Ｆに対応）と称する、２つのペプチドで産生された細胞株は、高い細胞傷害性活性を実証し、これらのペプチドを以降の実験に使用した。
【０１５４】
ペプチドＰ４３２−３Ｆ１０Ｋ及びペプチドＰ４８３−２Ｌ３Ｆで産生されたＴ細胞株におけるＭＵＣ１−Ｃ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を決定するために、ＨＬＡ−Ａ３−Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋテトラマー及びＨＬＡ−Ａ３−Ｐ４８３−２Ｌ３Ｆテトラマー解析を使用した。６回のＩＶＳサイクル後、２０％及び１６％のＴ細胞が、それぞれＰ４３２−３Ｆ１０Ｋテトラマー及びＰ４８３−２Ｌ３Ｆテトラマーに結合した。０．０１％及び０．０４％の細胞は、ネガティブテトラマーに結合した。
【０１５５】
サイトカイン産生を誘導するＭＵＣ１−Ｃペプチドの能力を試験するために、実施例６に記述したＰＡＮＶＡＣ卵巣癌臨床試験の２人の患者由来のＰ４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＰ４８３−２Ｌ３Ｆ特異的Ｔ細胞株（１．１×１０６Ｔ細胞／ｍＬ）を、Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ又はＰ４８３−２Ｌ３Ｆで２４時間パルスした自己Ｂ細胞と、２４時間インキュベートした。刺激した細胞及び刺激していない細胞の上清のサイトカインレベルを評価した。表８に示すように、刺激後にいくつかのＩ型サイトカインが増加した。
【０１５６】
【表８】
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【０１５７】
実施例８
本実施例は、本発明のペプチドの癌細胞を抑制する能力を実証する。
【０１５８】
４回又は６回のＩＶＳ後、２人の癌患者由来のペプチド特異的Ｔ細胞株を、細胞傷害性アッセイに使用した。ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３、及び膵臓癌細胞株ＡＳＰＣ−１を、ＦＡＣＳ解析のために、ＨＬＡ−Ａ３及びＭＵＣ１に対する抗体で染色した。ＳＫＯＶはＨＬＡ−Ａ３（９９％）及びＭＵＣ１（９４％）を発現したのに対し、ＡＳＰＣ−１はＭＵＣ１陽性（７１％）であったが、ＨＬＡ−Ａ３を発現しなかった。
【０１５９】
癌細胞株を放射性インジウム（１１１Ｉｎ）とインキュベートし、特異的Ｔ−４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＴ−４８３−２Ｌ３ＦＴ細胞株とともに細胞傷害性アッセイに使用した。Ｔ細胞は、ＭＵＣ１及びＨＬＡ−Ａ３の両方を発現する腫瘍細胞を特異的に殺したが、ＭＵＣ１を発現するがＨＬＡ−Ａ３は発現していない細胞は殺さなかった。
【０１６０】
さらに、ターゲットとして膵臓癌細胞株ＣＦ−ＰＡＣ−１（ＨＬＡ−Ａ３＋及びＭＵＣ１＋）を、コールドターゲットとしてペプチドパルスＫ５６２−Ａ３細胞を用いて、コールドターゲット阻害アッセイを実施した。これらの細胞は効率的にペプチドを提示し、１：１０の比率で添加された場合に、腫瘍細胞の溶解をブロックするが、ペプチドにさらされていないＫ５６２−Ａ３細胞は、同じ濃度で添加された場合、腫瘍溶解に影響を及ぼさなかった（図２Ａ、２Ｂ参照）。Ｔ細胞：ターゲット細胞の比率は２５：１であった。
【０１６１】
実施例９
本実施例は、癌患者における本発明のペプチドの免疫原性を実証する。
【０１６２】
臨床ワクチン試験の３人の患者のＰＢＭＣｓを、ペプチドＰ４３２−３Ｆ１０Ｋ又はペプチドＰ４８３−２Ｌ３Ｆにさらした自己樹状細胞で、２回のＩＶＳサイクルで刺激し、最後の刺激から１週間後、細胞をＣＤ８−ＦＩＴＣ（２０μＬ）と、Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ／Ｐ４８３−２Ｌ３Ｆ−テトラマーＰＥ（１μＬ）又はネガティブテトラマーＰＣ（１μＬ）のいずれかとで４５分間染色後、ＦＡＣＳ解析に供した。
【０１６３】
表９及び表１０に示すように、２０〜６０％の細胞が、２回の刺激後にテトラマーと結合した。表９及び表１０の結果は、全てのＣＤ８＋Ｔ細胞からのテトラマー陽性細胞の頻度で表す。
【０１６４】
【表９】
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【０１６５】
【表１０】
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【０１６６】
臨床ワクチン試験に登録した癌患者のＰＢＭＣｓにおいて、Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＰ４８３−２Ｌ３Ｆペプチドに反応するＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を評価するため、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。Ｐ４３２−３Ｆ１０Ｋ及びＰ４８３−２Ｌ３Ｆペプチドを、２５μｇ／ｍＬの濃度でＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用して、特異的Ｔ細胞の前駆体頻度を決定した。ペプチドパルスしたＫ５６２−Ａ３細胞をＡＰＣとして、エフェクター：ＡＰＣを１：２の比率で使用した。ＨＩＶペプチド及びペプチドなしをコントロールとして使用した。
【０１６７】
表１１に示すように、１１人の患者のうち５人が、ワクチン接種前及び接種後３か月のＰＢＭＣｓにおいて、ペプチドＰ４３２−３Ｆ１０Ｋによる刺激で特異的なＩＦＮγ産生を示した。いずれの患者もＰ４８３−２Ｌ３Ｆペプチドに対して特異的な反応を示さず、患者ＩはＰＢＭＣｓが少なすぎたため評価できなかった。
【０１６８】
【表１１】
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【０１６９】
実施例１０
以下の材料及び方法は、実施例１１及び１２において議論する実験のために使用した。
【０１７０】
ペプチドのＨＬＡ−Ａ２への結合
ｐＶＮＴＲ１、ｐＶＮＴＲ２、ｐＶＮＴＲ４及びそれらのアナログ（ｐＶＮＴＲ３及びｐＶＮＴＲ５）のＨＬＡ−Ａ２分子への結合を、フローサイトメトリーによって実証されるように、Ｔ２Ａ２細胞でのＨＬＡ−Ａ２発現のアップレギュレーションによって評価した（Ｎｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１２１５−１２１９（１９９３））。
【０１７１】
Ｔ細胞株の産生
Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８７：９８２−９９０（１９９５）により述べられたプロトコルを修正して、ＭＵＣ１−Ｃ特異的ＣＴＬｓを産生した。ｐＶＮＴＲ３、ｐＶＮＴＲ５特異的Ｔ細胞株を、ＰＳＡベースワクチンでワクチン接種した前立腺患者から産生した。先に記載するように作製したＣＤ４０Ｌ又は酵母成熟自己ＤＣｓを抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）として使用した。ワクチン接種後９４日目に得たＰＢＭＣｓをＡＰＣｓに添加し、エフェクター：ＡＰＣを１０：１の比率で、１２．５μｇ／ｍＬの対応するペプチドでパルスした。自己ＤＣｓをＡＰＣｓとして、３回のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）サイクルに使用した。放射線照射（２３，０００ｒａｄｓ）された自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をＡＰＣｓとして、３回のＩＶＳサイクル後に使用した。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞での再刺激のために、１２．５μｇ／ｍＬの濃度のペプチドを使用して、自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をエフェクター：ＡＰＣが１：３の比率でパルスした。５％ＣＯ２を含む加湿大気中で、培養物を３日間、３７℃でインキュベートした。次いで、培養物に、２０Ｕ／ｍＬの濃度で組換えヒトＩＬ−２を７日間補充した；ＩＬ−２を含む培地を３日毎に補充した。ペプチドとの３日間のインキュベーション及び７日間のＩＬ−２補充は、１回のＩＶＳサイクルを構成した。
【０１７２】
細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞を、５０μＣｉの１１１Ｉｎで標識したオキシキノリン（Ｍｅｄｉ−Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＩＬ）で１５分間、室温で標識した。ＲＰＭＩ−１６４０完全培地１００μＬ中のターゲット細胞（３×１０３）を、平底アッセイプレートの各９６ウェルに添加した。１０％のプールされたヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０完全培地１００μＬにエフェクター細胞を懸濁し、ターゲット細胞に添加した。次いで、５％ＣＯ２中、３７℃で４又は１６時間、プレートをインキュベートした。ガンマ線計数のために、ハーベスターフレームズ（ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｓ）（Ｓｋａｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を使用して上清を回収した。測定は３回行い、標準偏差を算出した。特異的溶解は以下の計算式により算出した（全ての値はｃｐｍで表示）。
【０１７３】
【化３】
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【０１７４】
１００μＬのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を添加したウェルから自然遊離を決定した。ターゲットを２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理後、全遊離放射活性を得た。
【０１７５】
細胞培養
ＭＣＦ−７ヒト乳腺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＵＣ１＋）、ＣＦ−ＰＡＣ−１ヒト膵臓腺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＵＣ１＋）、ＳＫ−Ｍｅｌ−２４メラノーマ細胞株（ＨＬＡ−Ａ２＋／ＭＵＣ１−）、及びＡＳＰＣ−１ヒト膵臓腺癌細胞株（ＨＬＡ−Ａ２−／ＭＵＣ１＋）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、及び０．０１μｇ／ｍＬヒト組換えインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ完全培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で維持した。全ての培養物はマイコプラズマフリーだった。
【０１７６】
実施例１１
本実施例は、ＭＵＣ１ ＶＮＴＲ領域のＣＴＬエピトープ及びそれらのアナログの決定を実証する。
【０１７７】
ＭＵＣ１ ＶＮＴＲアミノ酸配列は、免疫療法に使用できる可能性があるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを同定するために、ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドについてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。３つの９−ｍｅｒペプチド（ＶＮＴＲ−１、ＶＮＴＲ−２、及びＶＮＴＲ−４と称する）を同定し、合成した（表１２参照）。
【０１７８】
ネイティブエピトープＶＮＴＲ−２及びＶＮＴＲ−４の２つのアナログ（それぞれＶＮＴＲ−３及びＶＮＴＲ−５）は、１、２、及び９位のアミノ酸残基のアミノ酸置換により産生した（表１２参照）。各アナログは、対応するネイティブエピトープよりもＨＬＡ−Ａ２分子に対する高い予測親和性を有した。
【０１７９】
ＨＬＡ−Ａ２分子に対して高い親和性を有するペプチド（ＮＧＥＰＰ７０３）（Ｃｅｒｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５９：６３−７１（２０１０））及び特異的なＨＬＡ−Ａ３ペプチド（ＣＡＰ−７）を、それぞれ、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしてアッセイで使用した。
【０１８０】
【表１２】
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【０１８１】
ＶＮＴＲ−１、ＶＮＴＲ−２、及びＶＮＴＲ−４は、ＨＬＡ−Ａ２分子に対し、ネガティブコントロールと比較してより高い親和性を示した。アナログペプチドＶＮＴＲ−３及びＶＮＴＲ−５は、ＨＬＡ−Ａ２分子に対し、それぞれ対応するネイティブペプチドＶＮＴＲ−２及びＶＮＴＲ−４と比較してより高い親和性を示した。
【０１８２】
アナログ及びネイティブペプチドのペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体の安定性は、ＨＬＡ−Ａ２分子の残存する複合体のパーセンテージを異なる時点（０、２、４、６、８、及び１０時間）で決定することにより解析した。アナログペプチドＶＮＴＲ−３及びＶＮＴＲ−５は、それぞれのネイティブペプチドＶＮＴＲ−２及びＶＮＴＲ−４よりも、クラスＩ分子に対してより高い結合活性を各時点で実証した（図３参照）。
【０１８３】
実施例１２
本実施例は、癌患者におけるＭＵＣ１ ＶＮＴＲエンハンサーアナログペプチドの免疫原性を実証する。
【０１８４】
ＰＢＭＣｓのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激によるＣＴＬｓの産生能力について、ＶＮＴＲ−３及びＶＮＴＲ−５ペプチドを調べた。次いで、得られたＴ細胞株（それぞれＴ−ＶＮＴＲ−３及びＴ−ＶＮＴＲ−５）を、ＭＵＣ１＋／ＨＬＡ−Ａ２＋乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）及びＭＵＣ１＋／ＨＬＡ−Ａ２＋／Ａ３＋膵臓癌細胞株（ＣＦ−ＰＡＣ−１）に対する細胞傷害性活性について試験した。ＭＵＣ１−／ＨＬＡ−Ａ２＋メラノーマ細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ）及びＭＵＣ１＋／ＨＬＡ−Ａ２−膵臓癌細胞株（ＡＳＰＣ−１）をネガティブコントロールとして使用した。
【０１８５】
ＭＵＣ１ ＶＮＴＲエピトープ特異的Ｔ細胞株を使用して、１１１Ｉｎリリースアッセイを行った。予想通り、ＡＳＰＣ−１（ＨＬＡ−Ａ２−）及びＳＫ−ＭＥＬ（ＭＵＣ１−）細胞に対する溶解は観察されなかった（表１３参照）。
【０１８６】
【表１３】
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【０１８７】
Ｔ−ＶＮＴＲ−３（ＶＮＴＲ−３アゴニストペプチド特異的Ｔ細胞株）及びＴ−ＶＮＴＲ−５（ＶＮＴＲ−５アゴニストペプチド特異的Ｔ細胞株）を１×１０５細胞／ｍＬの濃度で別々に培養した。ＡＰＣ：Ｔ細胞の比率は３：１だった。アゴニスト又はネイティブペプチドを種々の濃度で使用した（表１４及び１５参照）。２４時間後に上清を集め、ＩＦＮ−γの量を決定した。アゴニストペプチドで刺激したＶＮＴＲ−３及びＶＮＴＲ−５特異的Ｔ細胞株は、ネイティブペプチドでの刺激と比較して高レベルのＩＦＮ−γを産生した（表１４及び１５参照）。
【０１８８】
【表１４】
0006523685.tif 000018
【０１８９】
【表１５】
0006523685.tif 000019
【０１９０】
ＣＴＬ細胞溶解の特異性及びＨＬＡ−Ａ２拘束性を確認するため、Ｔ−ＶＮＴＲ−３及びＴ−ＶＮＴＲ−５細胞を、膵臓癌細胞株ＣＦ−ＰＡＣ−１（ＨＬＡ−Ａ２＋／Ａ３＋及びＭＵＣ１＋）とともにコールドターゲット阻害アッセイで使用した。ＣＦ−ＰＡＣ−１細胞、及びＶＮＴＲアゴニストペプチドでパルスされた又はパルスされていない自己Ｂ細胞を、ターゲットとして使用した。
【０１９１】
表１６のデータにより実証されるように、対応するＶＮＴＲアゴニストペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞は、腫瘍細胞の溶解をブロックするが、ペプチドにさらされていない自己Ｂ細胞は、腫瘍溶解に影響を及ぼさなかった。
【０１９２】
【表１６】
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【０１９３】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度、及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１９４】
本発明の説明に関して（特に以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例文又は例示的語句（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をより明瞭にすることのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のどの語句も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０１９５】
発明者が知る、発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載される主題の全ての変更形態及び同等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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