(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体を含み、
前記ピロロキノリンキノン及び前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、下記一般式（２）、若しくは（３）で表される化合物又はその塩である、平均寿命延長剤。
【化１】
0006609261.tif 000012
（上記一般式（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数１〜１０の置換基を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）。
【請求項２】
前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、ピロロキノリンキノンナトリウム塩を含む、請求項１に記載の平均寿命延長剤。
【請求項３】
前記ピロロキノリンキノンナトリウム塩が、粉末Ｘ線回折におけるＣｕ Ｋα放射線測定で、２θ ９．１±０．２°、１０．３±０．２°、１３．８±０．２°、２４．０±０．２°を示す結晶を含む、請求項２に記載の平均寿命延長剤。
【請求項４】
平均寿命延長剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用であって、
前記ピロロキノリンキノン及び前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、下記一般式（２）、若しくは（３）で表される化合物又はその塩である、使用。
【化２】
0006609261.tif 000013
（上記一般式（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数１〜１０の置換基を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）。
【請求項５】
デュアルオキシダーゼの活性化により被対象者又は動物の平均寿命を延長する平均寿命延長剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用であって、
前記ピロロキノリンキノン及び前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、下記一般式（２）、若しくは（３）で表される化合物又はその塩である、使用。
【化３】
0006609261.tif 000014
（上記一般式（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数１〜１０の置換基を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な寿命延長剤、該寿命延長剤を用いた寿命延長方法、新規なデュアルオキシダーゼ活性化剤、デュアルオキシダーゼの活性化方法、寿命延長剤の製造、及びデュアルオキシダーゼ活性化剤の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
寿命を延長する試みは多く行われてきたが、科学的に寿命を延ばすことが可能であるとされるようになったのは最近である。【０００３】
これまでに生物種を問わず、寿命の延長を引き起こす方法として、カロリー制限が知られている。カロリー制限により、酵母、輪形動物、グッピー、クモ、ショウジョウバエ、ハムスター、ラット、マウスを含む広範囲の異なる生物において、平均寿命及び／又は最大寿命が拡大する。ここで「カロリー制限」とは、糖質、脂質、又はタンパク質に由来する総カロリーを、自由に食餌を与えた対照動物のカロリーの２５％〜６０％低いレベルまで制限することをいう。【０００４】
また、カロリー制限により、寿命の拡大の他に、加齢関連疾患の発症も同様に遅れ、それによってより長期間より健康な生活が得られる。例えば、哺乳動物において、カロリー制限は腎疾患、自己免疫疾患、及び糖尿病を遅らせることが知られている。【０００５】
さらに、カロリー制限は、パーキンソン病及びアルツハイマー病のマウスモデルにおける加齢関連ニューロン喪失をも低減させる。また、哺乳動物における癌のリスクを低下、紫外線に対する暴露後、皮膚及び他の組織におけるＤＮＡの修復を増強することが示されている。【０００６】
カロリー制限が、単細胞生物から非常に複雑な生物（霊長類を含む）までの広範囲の生物に対して作用するということは、寿命を拡大させるプロセスが種を超えて保存されているという観点から重要である。齧歯類において、寿命の拡大は５０％に達しうるが、生物がとる必要があるカロリーは通常消費するより少なくとも２５％少ないことから、この寿命は空腹や活動制限のようなかなりの犠牲を払って得られる。（特許文献１）【０００７】
そのほかの方法として遺伝子操作によって寿命を延ばすことも可能である。しかし、遺伝子操作は十分に安全なものとは考えられない上、簡単に適用するわけにはいかない。【０００８】
このような欠点を克服する方法として、寿命を延長させる物質が見出されてきた。例えば、レスベラトロールはぶどうの果皮に含まれるポリフェノールで高脂肪食を食べさせたマウスには効果的であることが知られている。このときにはサーチュイン遺伝子を活性化するといわれている。【０００９】
また、糖尿病治療薬であるメトホルミンも寿命を延ばす効果がある。これはＡＭＰ−活性化蛋白質キナーゼを増加させていると考えられている。また、免疫抑制作用のあるラパマイシンは寿命を延ばす効果がある。しかし、これらの薬剤は価格が高く投与による副作用も懸念される。したがって安価で副作用がない物質が求められている。（非特許文献１，２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−１００３２３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ｎａｔｕｒｅ，２００９，  ４６０，  ｐ３９２−３９５
【非特許文献２】ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，  ２００３，  ＤＯＩ１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ３１９２
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５  ，１１７，  ｐ３２７８−３２７９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」ともいう。）は、下記構造式で表される化合物であり、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。なお、ピロロキノリンキノンはアミノ酸と反応してイミダゾリルキノンを作ることが知られており（非特許文献３）、安定性にややかける面がある。
【化１】
0006609261.tif 000002
【００１３】
現在までに明らかにされているPQQの持つ多様な生理活性作用は細胞、組織レベルの効果が中心であり、動物個体の寿命延長に効果があることは知られていない。また、ＮＡＤＰＨオキシダーゼであるデュアルオキシダーゼを活性化することも知られていない。さらに、ＮＡＤＰＨオキシダーゼであるデュアルオキシダーゼの活性化が、一般的には活性酸素量を向上させると考えられるにもかかわらず、寿命延長に効果があることも知られていない。【００１４】
本発明は、上記ＰＱＱを用いて、新規な寿命延長剤、該寿命延長剤を用いた寿命延長方法、新規なデュアルオキシダーゼ活性化剤、デュアルオキシダーゼの活性化方法、寿命延長剤の製造、及びデュアルオキシダーゼ活性化剤の製造を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＰＱＱが生体に与える影響、特に、生体の寿命に与える影響について鋭意検討した。一般的に、活性酸素が生じると、生体は酸化ストレスを受け、老化・短寿命化につながると考えられている。活性酸素（ＲＯＳ）を生産し得るタンパク質としては、ＮＡＤＰＨオキシダーゼであるデュアルオキシダーゼ等が知られている。活性酸素が老化を促進するという従来の知見によると、デュアルオキシダーゼの活性化は、老化・短寿命化を引き起こすものと考えられる。しかしながら、本発明者らがモデル生物である線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを用いて検討した結果、ＰＱＱが、寿命延長をもたらし、その寿命延長はデュアルオキシダーゼ（Ｂｌｉ−３）の活性化に起因することが見出された。すなわち、ＰＱＱが、線虫個体内でデュアルオキシダーゼ（Ｂｌｉ−３）を活性化し長寿誘導性ＲＯＳを産生することが刺激となり、生体防御系が強化され寿命延長に結実するという知見が得られた。本発明は、当該知見によりなされたものである。【００１６】
すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕
ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体を含む、寿命延長剤。
〔２〕
前記ピロロキノリンキノン及び前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、下記一般式（１）、（２）、若しくは（３）で表される化合物又はその塩である、〔１〕に記載の寿命延長剤。
【化２】
0006609261.tif 000003
（上記一般式（１）、（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数１〜１０の置換基を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）
〔３〕
前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、ピロロキノリンキノンナトリウム塩を含む、〔１〕又は〔２〕に記載の寿命延長剤。
〔４〕
前記ピロロキノリンキノンナトリウム塩が、粉末Ｘ線回折におけるＣｕ  Ｋα放射線測定で、２θ  ９．１±０．２°、１０．３±０．２°、１３．８±０．２°、２４．０±０．２°を示す結晶を含む、〔３〕に記載の寿命延長剤。
〔５〕
〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の寿命延長剤を使用する、寿命延長方法。
〔６〕
被検対象者又は動物に対し、前記寿命延長剤を投与することにより、前記被検対象者又は前記動物の寿命を延長する、〔５〕に記載の寿命延長方法。
〔７〕
被検対象者又は動物に対し、前記寿命延長剤を投与することにより、デュアルオキシダーゼを活性化し、前記被検対象者又は前記動物の寿命を延長する、〔５〕又は〔６〕に記載の寿命延長方法。
〔８〕
ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体を含む、デュアルオキシダーゼ活性化剤。
〔９〕
前記ピロロキノリンキノン及び前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、下記一般式（１）、（２）、若しくは（３）で表される化合物又はその塩である、〔８〕に記載のデュアルオキシダーゼ活性化剤。
【化３】
0006609261.tif 000004
（上記一般式（１）、（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数１〜１０の置換基を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）
〔１０〕
前記ピロロキノリンキノンの誘導体が、ピロロキノリンキノンナトリウム塩を含む、〔８〕又は〔９〕に記載のデュアルオキシダーゼ活性化剤。
〔１１〕
前記ピロロキノリンキノンナトリウム塩が、粉末Ｘ線回折におけるＣｕ  Ｋα放射線測定で、２θ  ９．１±０．２°、１０．３±０．２°、１３．８±０．２°、２４．０±０．２°を示す結晶を含む、〔９〕に記載のデュアルオキシダーゼ活性化剤。
〔１２〕
〔８〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載のデュアルオキシダーゼ活性化剤を使用する、デュアルオキシダーゼの活性化方法。
〔１３〕
寿命延長剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用。
〔１４〕
デュアルオキシダーゼの活性化により被対象者又は動物の寿命を延長する寿命延長剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用。
〔１５〕
デュアルオキシダーゼ活性化剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、新規な寿命延長剤、該寿命延長剤を用いた寿命延長方法、新規なデュアルオキシダーゼ活性化剤、デュアルオキシダーゼの活性化方法、寿命延長剤の製造、及びデュアルオキシダーゼ活性化剤の製造を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１〜４、比較例１における寿命試験の結果を示すグラフである。
【図２】実施例１〜４、比較例１における寿命試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例５、比較例２における寿命試験の結果を示すグラフである。
【図４】比較例３〜４における寿命試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００２０】
〔寿命延長剤〕
本実施形態の寿命延長剤は、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体を含む。本実施形態の寿命延長剤によれば、寿命延長が可能になり、老化に伴う疾患を防止することが可能となり、強力な薬理作用を有して副作用の危険性が高いものを使用しなくとも、有効な寿命延長効果を得ることができる。
【００２１】
本明細書において、「寿命延長」とは、本発明の物質の摂取により誘引される寿命延長をいう。
【００２２】
〔デュアルオキシダーゼ活性化剤〕
また、本実施形態のデュアルオキシダーゼ活性化剤は、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体を含む。
【００２３】
本発明者らの知見によると、デュアルオキシダーゼが活性化された後、p38 mitogen-activated protein kinase（ｐ３８ＭＡＰＫ）カスケードを経由して、線虫のＮｒｆ２に相当するＳＫＮ−１が活性化されることが分かった。
【００２４】
Ｎｒｆ２は、哺乳類に存在する塩基性ロイシンジッパー（ｂａｓｉｃ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）モチーフを有する転写因子の１つであり、幅広い臓器に発現し、通常、Ｋｅａｐ１タンパク質と結合して細胞質に存在するが、親電子物質や酸化ストレスの刺激によって核内へ移行し、小Ｍａｆタンパク質とヘテロ二量体を形成して解毒や抗酸化に関連する遺伝子群の発現を誘導する。この転写活性化で、Ｎｒｆ２の複合体は標的遺伝子群のプロモーター領域に共通して存在する抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）に結合する。これまでに、Ｎｒｆ２欠損マウスの解析などから、Ｎｒｆ２の活性化は、発がん、肝障害、肺障害、炎症などの抑制に寄与していることが示唆されている。Ｎｒｆ２は、種を越えて、その構造・機能が保存されており、モデル生物である線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてはＳＫＮ−１がＮｒｆ２に相当する。
【００２５】
ストレス応答性転写因子Ｎｒｆ２の転写のターゲットとなる遺伝子群としては、例えば、ＧＣＬＭ、ＧＣＬＣ、ＧＳＲ、ＧＳＴＡ１、ＧＰＸ１、ＧＰＸ４、ＨＭＯＸ１、ＮＱＯ１、ＳＲＸＮ１、ＳＱＳＴＭ１、ＳＯＤ１、ＵＧＴ１Ａ６、ＮＯＳ２、ＮＯＳ３及びＰＴＧＳ２が挙げられる。
【００２６】
ＧＣＬＭ及びＧＣＬＣ：グルタミン酸システインリガーゼはγ−グルタミルシステインシンテターゼとしても公知であり、グルタチオン（ＧＳＨ）合成の第１の律速酵素である。この酵素は２つのサブユニット（重い触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）及び軽い調節サブユニット（ＧＣＬＭ））からなる。ショウジョウバエでのＧＣＬＣ又はＧＣＬＭの過剰発現は、酸素消費の速度に影響を及ぼすことなく、寿命を延長させる。
【００２７】
ＧＳＲ：クラスＩピリジンヌクレオチド−ジスルフィドオキシドレダクターゼファミリーのメンバーであるグルタチオンレダクターゼ（ＧＳＲ）をコードする。これは細胞性抗酸化物質防御で中心的な酵素であり、酸化したグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）をスルフヒドリル形のＧＳＨに還元する。
【００２８】
ＧＳＴＡ１：αクラスグルタチオンＳトランスフェラーゼ（alpha class glutathione S-tranferase）をコードし、それは発がん物質、治療薬、環境毒素及び酸化的ストレスの生成物を含めた求電子化合物の、ＧＳＨとのコンジュゲーションによる解毒において機能する。肝臓でビリルビン及び特定の抗がん薬を代謝することに加えて、αクラスグルタチオンＳトランスフェラーゼはグルタチオンペルオキシダーゼ活性を示し、それによって反応性酸素種及び過酸化生成物から細胞を保護する。
【００２９】
ＧＰＸ１：電子供与体としてＧＳＨを利用して、傷害性反応性酸素種である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及び合成有機過酸化物の除去を担う内在性の抗酸化物質酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼをコードする。
【００３０】
ＧＰＸ４：ＧＰＸ１と同じ活性を有するが、代謝性毒物である脂肪酸ヒドロペルオキシド及びコレステロールヒドロペルオキシドを除去するさらなる能力を有する、内在性の抗酸化物質酵素であるリン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼをコードする。
【００３１】
ＳＯＤ１：反応性スーパーオキシドラジカル（Ｏ２−）の触媒除去に関与する内在性の抗酸化物質酵素である銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＣｕＺｎＳＯＤ１）の可溶性形をコードする。
【００３２】
ＨＭＯＸ１：ヘム分解の第１の及び律速性の酵素の誘導可能なアイソフォームであるヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）をコードする。ＨＯ−１は、強力な抗酸化物質機能及び抗炎症機能も有する。ＨＯ−１の誘導は、酸化的ストレスの細胞傷害性及びアポトーシス細胞死から保護する。
【００３３】
ＮＱＯ１：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）ファミリーのメンバーであり、細胞質の２電子レダクターゼをコードする。このタンパク質の発現変化は多くの腫瘍で観察されており、アルツハイマー病（ＡＤ）とも関連している。
【００３４】
ＳＲＸＮ１：肺での酸化的損傷に対する保護にＮｒｆ２によって転写制御を受ける重要な分子である。Ｎｒｆ２活性化に関与するシグナル伝達を、マウス個体で遺伝子ノックアウトあるいは培養細胞系でＲＮＡｉにより低下させた場合、ＳＲＮＸ１の発現を減少させる。ＳＲＸＮ１の５’−プロモーター隣接領域に対するコンピューター分析は、高度に保存される複数の抗酸化物質応答エレメント（ＡＲＥ）を同定した。レポーター及びクロマチン免疫沈降アッセイは、−２２８位のＡＲＥ１がＮｒｆ２による転写応答のために重要なことを実証した。ＲＮＡｉによるＳＲＸＮ１発現の減弱はＨ２Ｏ２に対する毒感受性を高くし、一方、ＳＲＸＮ１の過剰発現はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨ２Ｏ２媒介細胞死から保護した。
【００３５】
ＵＧＴ１Ａ６：小さな親油性分子、例えばステロイド、ビリルビン、ホルモン及び薬物を水溶性の排泄可能な代謝産物に転換するグルクロン酸化経路の酵素であるＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼをコードする。この遺伝子によってコードされる酵素は、フェノール性及び平面性の化合物に活性がある。
【００３６】
ＮＯＳ２：一酸化窒素は、神経伝達ならびに抗微生物活性及び抗腫瘍活性を含むいくつかの過程で生物学的媒介物質として作用する反応性フリーラジカルである。この遺伝子は、肝臓で高度に発現される誘導可能な一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）をコードする。
【００３７】
ＮＯＳ３：血管拡張のために必要な一酸化窒素の生産を担う内皮由来のＮＯＳ（ｅＮＯＳ）をコードする；炎症状態及び加齢で異常調節される。
【００３８】
ＰＴＧＳ２：プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ（ＰＴＧＳ）はシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）としても公知であり、プロスタグランジン生合成での鍵となる酵素であり、ジオキシゲナーゼ及びペルオキシダーゼの両方として作用する。ＰＴＧＳには２つのアイソザイム（構成的ＰＴＧＳ１及び誘導可能なＰＴＧＳ２）があり、それらは発現の調節及び組織分布が異なる。ＰＴＧＳ２は炎症及びマイトジェネシスに関与するプロスタノイド生合成を担うことが、示唆されている。
【００３９】
Ｎｒｆ２によって転写制御を受ける分子群の中でも、ＧＣＬＭ、ＧＣＬＣ、ＮＯＳ３による生理応答が顕著で態様として望ましい。
【００４０】
本明細書において、「活性化」とは、特定の因子を上方調節することをさす。また、「上方調節」とは、例えば、あるシグナル又は作用因子に応答して、１つ又は複数の遺伝子、及びその結果としてのそれらの遺伝子によってコードされるタンパク質（複数可）の発現または活性が、増加することを指す。
【００４１】
〔ピロロキノリンキノン及びその誘導体〕
以下、寿命延長剤、及び、デュアルオキシダーゼ活性化剤において用いられ得るピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体について詳細に説明する。ピロロキノリンキノン及びその誘導体としては、特に限定されないが、例えば、下記一般式（１）、（２）、若しくは（３）で表される化合物又はその塩が挙げられる。
【化４】
0006609261.tif 000005
（上記一般式（１）、（２）、及び（３）中、Ｒは、各々独立して、水素原子又は炭素原子数１〜１０の置換基を示し、Ｒ’は、炭素原子数１〜１０の置換基を示す。）
【００４２】
Ｒで示される炭素原子数１〜１０の置換基としては、特に限定されないが、例えば、アルキル、アリルが挙げられる。この中でも、合成の観点から、アルキルが好ましい。なお、Ｒで示される炭素原子数１〜１０の置換基は、炭素原子のほか、酸素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子、リン原子を含んでもよい。
【００４３】
〔一般式（１）で表される化合物又はその塩〕
上記一般式（１）中、Ｒが全て水素原子である化合物は、酸化型ピロロキノリンキノンという。該酸化型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
【００４４】
上記一般式（１）中、１つ以上のＲが水素原子であることが好ましい。１以上のＲが水素原子である化合物は、溶液中において塩をつくり、イオン性になるためにトリカルボン酸の形態よりも水溶性が向上する傾向にある。
【００４５】
上記一般式（１）で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、酸化型ピロロキノリンキノン；酸化型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジカリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリカリウムのような酸化型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００４６】
このなかでも、入手しやすさの観点から、酸化型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノンジナトリウム、酸化型ピロロキノリンキノントリナトリウムのような酸化型ピロロキノリンキノンナトリウム塩が好ましい。
【００４７】
〔一般式（２）で表される化合物又はその塩〕
上記一般式（２）で表される化合物又はその塩は、ピロロキノリンキノンの誘導体である。Ｒ’で示される炭素原子数１〜１０の置換基としては、特に限定されないが、例えば、アセチル基、エトキシ基、ケトアルキル基、ヒドロキシアルキル基が挙げられる。この中でも、安定性の観点から、アセチル基、ケトアルキル基が好ましい。なお、Ｒ’で示される炭素原子数１〜１０の置換基は、炭素原子以外に酸素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子、リン原子を含んでもよい。
【００４８】
一般式（２）で表される化合物の塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
【００４９】
上記一般式（２）で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、Ｒ’がアセチル基又はエトキシ基である、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジナトリウム塩、トリカルボン酸トリナトリウム塩、トリカルボン酸ジカリウム塩、トリカルボン酸トリカリウム塩が挙げられる。
【００５０】
このなかでも、下記一般式（４）で表されるピロロキノリンキノンの誘導体又はその塩（以下、「アセトン付加体」ともいう。）が好ましい。このような化合物であれば、アミノ酸等が存在する環境下においても変質しにくい傾向にある。
【化５】
0006609261.tif 000006
【００５１】
〔一般式（３）で表される化合物又はその塩〕
上記一般式（３）中、Ｒが全て水素原子である化合物は、酸価型ピロロキノリンキノンが還元されてできた還元型ピロロキノリンキノンという。還元型ピロロキノリンキノンの塩としては、特に限定されないが、例えば、トリカルボン酸、トリカルボン酸ジ塩、トリカルボン酸モノ塩、トリカルボン酸トリ塩が挙げられる。塩としては、特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、ストロンチウム塩、バリウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩のようなカチオン性化合物との塩が挙げられる。
【００５２】
上記一般式（３）中、１つ以上のＲが水素原子であることが好ましい。一般式（３）中１以上のＲが水素原子である化合物は、溶液中において塩をつくり、イオン性になるためにトリカルボン酸の形態よりも水溶性が向上する傾向にある。
【００５３】
上記一般式（３）で表される化合物又はその塩としては、特に限定されないが、例えば、還元型ピロロキノリンキノン；還元型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノントリナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジカリウム、還元型ピロロキノリンキノントリカリウムのような還元型ピロロキノリンキノンのアルカリ金属塩が挙げられる。
【００５４】
このなかでも、製造しやすさの観点から、還元型ピロロキノリンキノンモノナトリウム、還元型ピロロキノリンキノンジナトリウム、還元型ピロロキノリンキノントリナトリウムのような還元型ピロロキノリンキノンジナトリウムが好ましい。
【００５５】
上記一般式（１）で表される化合物は、キノンを２つ有しているためにアミノ酸と反応しやすく、アミノ酸との反応によって複素環形成が生じイミダゾロキノンになることが知られている。一方で、上記一般式（２）又は（３）で表される化合物は、キノンが１つ又は０であるため、アミノ酸と反応しにくい傾向にある。そのため、温度が高い状態でアミノ酸と混合した場合においても、ピロロキノリンキノン及び該その誘導体が減少しにくく、安定性がより高い傾向にある。アミノ酸は、培地、食品、医薬品などに多く含まれるため、ピロロキノリンキノン及び該その誘導体はアミノ酸と反応しにくいほうが好ましい。また、アミノ酸と反応しにくい上記一般式（２）又は（３）で表される化合物を用いることにより、寿命延長効果がより向上する傾向にある。
【００５６】
また、一般式（２）で表される化合物の有するフェノール性水酸基は、空気中の酸素によって酸化され、キノンになりやすい。そのため、一般式（１）、（２）、及び（３）で表される化合物のなかでも、寿命延長効果の観点から一般式（２）で表される化合物がより好ましく、一般式（４）で表される化合物がさらに好ましい。
【００５７】
〔粉末Ｘ線回折〕
上記一般式（１）で表されるピロロキノリンキノンナトリウム塩は、粉末Ｘ線回折におけるＣｕ−Ｋα放射線測定で２θ  ９．１±０．２°、１０．３±０．２°、１３．８±０．２°、２４．０±０．２°を示す結晶であることが好ましい。このようなピロロキノリンキノンナトリウム塩を用いることにより、安定性がより向上する傾向にある。このような結晶は、例えば再表２０１１／００７６３３に記載の方法により得ることができる。なお、「ピロロキノリンキノンナトリウム塩」とは、ピロロキノリンキノンモノナトリウム塩、ピロロキノリンキノンジナトリウム塩、及びピロロキノリンキノントリナトリウム塩を意味する。
【００５８】
〔ピロロキノリンキノン及びその誘導体の製造方法〕
ピロロキノリンキノンの製造方法としては、特に限定されないが、例えば、有機化学的に合成する方法又は発酵法が挙げられる。このなかで発酵法とは、例えば、メタノール資化性を有し、かつロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを使用して培養することによりＰＱＱを製造する方法である。
【００５９】
ピロロキノリンキノンの誘導体、具体的にはピロロキノリンキノンのエステル体等又はピロロキノリンキノンの塩は、このようにして得られたピロロキノリンキノンを出発物質として、常法に従って合成することができる。ピロロキノリンキノン及びその誘導体は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法、又は溶媒抽出法等の通常の方法により、反応液中から分離、精製することができる。また、それらの同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、質量分析等の各種手段が用いられる。
【００６０】
〔用途：ＰＱＱの使用〕
本実施形態は、寿命延長剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用、デュアルオキシダーゼの活性化により被対象者又は動物の寿命を延長する寿命延長剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用、デュアルオキシダーゼ活性化剤の製造のための、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体の使用を含む。
【００６１】
寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤は、ヒト用又は動物用の、食品、機能性食品、医薬品又は医薬部外品として使用することができる。ここでいう機能性食品とは、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保険食品等、健康の維持あるいは食事にかわり栄養補給の目的で摂取する食品を意味する。具体的な形態としてはカプセル剤、タブレット、チュアブル、錠剤、ドリンク剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
医薬品用途としては、寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤は、経口投与、注射、皮膚吸収等の方法で使用することができる。経口投与の場合、寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤はハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤の形で他の物質と混合して用いることができる。また、寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤は、その高い水溶性を利用して、飲料、点滴液、注射液として使用することもできる。さらに、寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤は乳化物と混合し、化粧用クリーム、ケーキに配合すること、または、米、麦の粉と混合も容易でそれを利用した食品に使用することができる。
【００６３】
寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤を線虫に対して使用する場合は、培地中に混合する方法が挙げられる。具体的にはアミノ酸を多く含むペプトン、コレステロール、無機イオンを含む培地に、寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤を溶かし、その状態で生育するえさの大腸菌を介して、線虫に、寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤を、経口吸収、もしくは培地からの経皮吸収させることができる。培地中に混合する量としては、好ましくは１〜１００ｍＭであり、より好ましくは１〜２０ｍＭであり、更に好ましくは１〜１５ｍＭであり、より好ましくは１〜５ｍＭである。
【００６４】
寿命延長剤又はデュアルオキシダーゼ活性化剤を動物に対して使用する場合、その投与量は、対象動物により変化する。対象動物が人である場合には、その投与量は、適用疾患、患者の年齢、性別又は体重、症状の重篤度、投与経路など、様々な要因により変化する。対象動物が人である場合においては、典型的には、体重約６０ｋｇの成人に対し、１日当たり０．２５〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜２５０ｍｇ、より好ましくは１０〜１００ｍｇの寿命延長剤又はＮｒｆ２活性化剤が投与される。寿命延長剤又はＮｒｆ２活性化剤は１日１回又は複数回投与することができる。
【００６５】
〔寿命延長方法〕
本実施形態の寿命延長方法は、上記寿命延長剤を使用し、好ましくは上記一般式（１）、（２）、及び（３）で表される化合物又はその塩を使用する。本発明で寿命延長効果は、真核生物に有効であり、好ましくは動物である。
【００６６】
本実施形態の寿命延長方法によれば、寿命を延長させることができ、さらに、生物を加齢関連疾患から保護することができる。また、生物における寿命を延長させて、加齢関連疾患に関連した合併症の発症及び多くを遅らせることが可能となる。
【００６７】
具体的な方法としては、特に限定されないが、例えば、上記寿命延長剤を動物又は患者に対して上記〔用途〕で記載したような方法により、治療又は処置を目的として投与する方法が挙げられる。すなわち、被検対象者又は動物に対し、前記寿命延長剤を投与することにより、前記被検対象者又は前記動物の寿命を延長する方法、より具体的には、被検対象者又は動物に対し、前記寿命延長剤を投与することにより、デュアルオキシダーゼを活性化し、前記被検対象者又は前記動物の寿命を延長する方法が挙げられる。
【００６８】
なお、本明細書で「動物」又は「患者」とは、鳥類、魚類、哺乳類などの脊椎動物、昆虫、線虫などの無脊椎動物に使用可能である。なお、本実施形態の寿命延長方法が治療方法に当たる場合には、対象動物からヒトを除く。
【００６９】
本明細書で「治療」又は「処置」とは、以下のものが挙げられるが特に制限されない。
（ａ）哺乳動物において病態が生じることを予防するステップ、具体的にはそのような哺乳動物が病態を罹患しやすいが、罹患しているとまだ診断されていない場合；
（ｂ）病態を抑制するステップ、例えばその進行を止めるステップ；及び／又は
（ｃ）病態を軽減するステップ、例えば病態の退行を所望の終点に至るまで生じさせるステップ、を含む哺乳動物における病態の処置を含む。治療は、疾患の症状の回復（例えば疼痛又は不快感の緩和）も含み、そのような回復は、疾患に直接効果を与える又は与えない場合がある（例えば原因、伝染、発現など）。
【００７０】
〔デュアルオキシダーゼ活性化方法〕
本実施形態のデュアルオキシダーゼ活性化方法は、ピロロキノリンキノン及び／又は該ピロロキノリンキノンの誘導体（デュアルオキシダーゼ活性化剤）を使用し、好ましくは、上記一般式（１）、（２）、及び（３）で表される化合物又はその塩を使用する。
【００７１】
具体的な方法としては、特に限定されないが、例えば、上記デュアルオキシダーゼ活性化剤を動物に対して上記〔用途〕で記載したような方法により使用（投与）する方法が挙げられる。
【００７２】
加齢の過程が生物体のレベルで現れ得る１つの様式としては、細胞性損傷の増加をもたらす、酸化的ストレス及び求電子性傷害へ応答する能力の変化である。加齢によるこの変化は、組織を構成し、器官系でそれらの機能に寄与する様々な細胞のレベルで生じる。細胞の活性、構造及び独自性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、遺伝子発現によって調節される、特異的なタンパク質に由来する。そのため、細胞の構造及び機能における年齢に関連した変化は、遺伝子発現の変化に根本が見出されるともいえる。
【００７３】
このようにデュアルオキシダーゼ活性化方法は、寿命延長効果と共に加齢による疾患の抑制に有効である。より具体的には、加齢が危険因子として考えられる疾患全般に有効である。このような疾患としては、特に限定されないが、例えば、アルツハイマー、パーキンソン病、心筋梗塞、糖尿病等である。
【００７４】
また、デュアルオキシダーゼ活性化方法は、デュアルオキシダーゼの発現及び／又は機能、Ｎｒｆ２の発現及び／又は機能に関連する、疾患又は障害を、予防又は治療するために使用される。ここで疾患又は障害とは、デュアルオキシダーゼの変異体又は正常なデュアルオキシダーゼの、又は、Ｎｒｆ２の変異体又は正常なＮｒｆ２の、異常な発現及び／又は機能に関連するものを含む。特に、Ｎｒｆ２は、成体または細胞の酸化還元状態に応答する転写因子で、酸化ストレスに対する防御を構成する一連の抗酸化性遺伝子及び細胞保護的酵素を上方制御する。Ｎｒｆ２を調節することは、酸化ストレスに関連する疾患又は障害の治療において重要である。
【００７５】
本実施形態の対象とする疾患及び障害としては、特に限定されないが、例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、肝臓の疾患又は障害、胃腸の疾患又は障害、糖尿病、自己免疫、免疫に関連する疾患又は障害、免疫不全（例えば、ＡＩＤＳ）、神経性の疾患又は障害、神経変性の疾患又は障害、酸化ストレスに関連する疾患又は障害又は状態、眼疾患（例えば、加齢黄斑変性症、白内障、光網膜症、未熟児網膜症など）、皮膚疾患、喘息、動脈硬化症、慢性の炎症性の疾患又は状態（例えば、血管炎、肺気管支炎、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、膵炎、皮膚炎、食道炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、結膜炎など）、神経の修復及び麻痺、神経内分泌分化、炎症性疾患、筋肉の疾患又は障害、感染性生物に関連する疾患又は障害、老人斑、脳アミロイド血管症、アテローム性動脈硬化症、神経膠芽腫、アミロイド沈着、神経原線維変化、認知症、絨毛癌、星状細胞腫、アミロイドーシス、高脂血症、悪性形質転換、動脈硬化巣、アテローム硬化性閉塞、転移、心筋梗塞、肺線維症、壊死、ショック、メラノーマ、結腸直腸癌、遺伝子感受性、乾癬、異常な細胞増殖に関連する疾患又は障害（例えば、癌、乾癬など）、癌（例えば、前立腺癌、肺癌、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、白血病など）、炎症、神経膠腫、癌腫、神経病理、腫瘍、血管疾患、細胞傷害、脳腫瘍、高コレステロール血症、脂肪肉腫、冠動脈心疾患、冠動脈疾患、糸球体腎炎、静脈血栓症、甲状腺機能不全、及び病的過程を含む。
【００７６】
本明細書において使用される用語「癌」は、任意の悪性腫瘍、詳細には肺、腎臓又は甲状腺において生じる悪性腫瘍を意味する。癌は、「腫瘍」又は癌の悪性細胞を含む組織として現れる。腫瘍の例は、これだけに限らないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫などの肉腫及び癌腫を含む。本明細書において使用される「癌」、「新生物」及び「腫瘍」は、互換的に使用され、単数形又は複数形のいずれかで、宿主生物体に対して病的になる悪性変換を受けている細胞を意味する。原発癌細胞（すなわち、悪性変換部位の近くから得られた細胞）は、よく確立された技法、具体的には組織学的検査によって、非癌細胞と容易に区別されうる。本明細書において使用される癌細胞の定義は、原発癌細胞だけでなく、癌細胞祖先由来の任意の細胞も含む。これは転移した癌細胞、ならびに癌細胞由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物及び細胞株を含む。通常固形腫瘍として現れる種類の癌に言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、ＣＡＴスキャン、核磁気共鳴画像法、Ｘ線、超音波又は触診などの手順によって腫瘍量に基づいて検出することができる腫瘍、及び／又は患者から得られた試料中に１種又は複数種の癌特異的抗原が発現することにより検出可能な腫瘍である。
【００７７】
「神経性の疾患又は障害」は、任意の神経系及び／又は視覚系の疾患又は障害を意味する。「神経性の疾患又は障害」は、中枢神経系（脳、脳幹及び小脳）、末梢神経系（脳神経を含む）及び自律神経系（その一部は中枢神経系及び末梢神経系の両方に位置する）に関わる疾患又は障害を含む。神経性の疾患又は障害は、これだけに限らないが、後天性てんかん性失語症；急性播種性脳脊髄炎；副腎白質ジストロフィー；加齢黄斑変性症；脳梁欠損症；失認症；アイカルディ症候群；アレキサンダー病；アルパース病；交代性片麻痺；アルツハイマー病；血管性認知症；筋萎縮性側索硬化症；無脳症；アンジェルマン症候群；血管腫症；無酸素症；失語症；失行症；くも膜嚢胞；くも膜炎；アーノルド・キアリ奇形；動静脈奇形；アスペルガー症候群；毛細血管拡張性運動失調症；注意欠陥多動性障害；自閉症；自律神経障害；背痛；バッテン病；ベーチェット病；ベル麻痺；良性本態性眼瞼痙攣；良性病巣；筋萎縮症；良性頭蓋内圧亢進；ビンスワンガー病；眼瞼痙攣；ブロッホ・ズルツベルガー症候群；腕神経叢損傷；脳膿瘍；脳損傷；脳腫瘍（多形神経膠芽腫を含む）；脊椎腫瘍；ブラウン・セカール症候群；カナバン病；手根管症候群；灼熱痛；中枢性疼痛症候群；橋中心髄鞘崩壊症；頭部の障害；脳動脈瘤；脳動脈硬化症；大脳萎縮症；脳性巨人症；脳性麻痺；シャルコー・マリー・トゥース病；化学療法誘発性のニューロパチー及び神経因性疼痛；キアリ奇形；舞踏病；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー；慢性疼痛；慢性局所疼痛症候群；コフィン・ローリー症候群；遷延性植物状態を含めた昏睡；先天性顔面両側麻痺；大脳皮質基底核変性症；頭蓋動脈炎；頭蓋骨早期癒合症；クロイツフェルト・ヤコブ病；累積外傷性障害；クッシング症候群；巨細胞封入体病；サイトメガロウイルス感染症；ダンシングアイズ・ダンシングフィート症候群(dancing eyes-dancing feet syndrome)；ダンディ・ウォーカー症候群；ドーソン病(Dawson disease)；ド・モルシア症候群(De Morsier's syndrome)；デジェリン・クルンプケ麻痺(Dejerine-Klumke palsy)；認知症；皮膚筋炎；糖尿病性神経障害；びまん性硬化症；自律神経障害；書字障害；失読症；ジストニア；早期乳児てんかん性脳症；エンプティセラ症候群；脳炎；脳ヘルニア；脳三叉神経領域血管腫症；てんかん；エルブ麻痺；本態性振戦症；ファブリー病；ファール症候群；失神；家族性痙性麻痺；熱性痙攣；フィッシャー症候群；フリードライヒ失調症；前頭側頭型認知症及び他の「タウオパチー」；ゴーシェ病；ゲルストマン症候群；巨細胞性動脈炎；巨細胞封入体病；グロボイド細胞白質ジストロフィー；ギラン・バレー症候群；HTLV-１関連脊髄症；ハラーホルデン・スパッツ症候群；頭部損傷；頭痛；片側顔面痙攣；遺伝性痙性対麻痺；多発神経炎型遺伝性運動失調症；耳帯状疱疹；帯状疱疹；平山症候群(Hirayama syndrome)；HIV関連認知症及びHIV関連ニューロパチー(AIDSの神経症状も)；全前脳症；ハンチントン病及び他のポリグルタミン反復疾患；水無脳症；水頭症；副腎皮質ホルモン過剰症；低酸素症；免疫介在性脳脊髄炎；封入体筋炎；色素失調症；乳児フィタン酸蓄積症；乳児レフスム病；点頭てんかん；炎症性ミオパチー；頭蓋内嚢胞；頭蓋内圧亢進；ジュベール症候群；カーンズ・���イヤー症候群；ケネディ病；キンズボーン症候群(Kinsboume syndrome)；クリッペル・ファイル症候群；クラッベ病；クーゲルベルク・ヴェランダー病；クールー病；ラフォラ病；ランバート・イートン症候群；ランドウ・クレフナー症候群；延髄外側(ワレンベルグ)症候群；学習障害；リー病；レンノックス・ガストー症候群；レッシュ・ナイハン症候群；白質ジストロフィー；レビー小体型認知症；脳回欠損；閉じ込め症候群；ルー・ゲーリック病(すなわち、運動ニューロン疾患又は筋萎縮性側索硬化症)；腰部椎間板症；ライム病-神経性後遺症；マシャド・ジョセフ病；巨大脳髄症；巨脳症；メルカーソン・ローゼンタール症候群；メニエール病；髄膜炎；メンケス病；異染性白質ジストロフィー；小頭症；片頭痛；ミラー・フィッシャー症候群；小発作；ミトコンドリア筋症；メビウス症候群；単肢筋萎縮症；運動ニューロン疾患；もやもや病；ムコ多糖症；多発脳梗塞性認知症；多巣性運動ニューロパチー；多発性硬化症及び他の脱髄性疾患；体位性低血圧を伴う多系統萎縮症；筋ジストロフィー；重症筋無力症；ミエリン分解性びまん性硬化症(myelinoclastic diffuse sclerosis)；乳児ミオクローヌス性脳症；ミオクローヌス；ミオパチー；先天性筋緊張症；ナルコレプシー；神経線維腫症；神経遮断薬悪性症候群；AIDSの神経症状；ループスの神経性後遺症；神経性筋強直症；ニューロンセロイド脂褐素症；ニューロン遊走障害；ニーマン・ピック病；オサリバン・マクラウド症候群(O'Sullivan-McLeod syndrome)；後頭神経痛；潜在性脊椎癒合不全の続発；大田原症候群；オリーブ橋小脳萎縮症；眼球クローヌス・ミオクローヌス；視神経炎；起立性低血圧症；オーバーユース症候群；感覚異常症；神経変性の疾患又は障害(パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、認知症、多発性硬化症及び神経細胞死に関連する他の疾患又は障害)；先天性パラミオトニア；腫瘍随伴疾患；発作；パリー・ロンベルク症候群；ペリツェウス・メルツバッヘル病；周期性四肢麻痺；末梢性ニューロパチー；有痛性ニューロパチー及び神経因性疼痛；遷延性植物状態；広汎性発達障害；光くしゃみ反射；フィタン酸蓄積症；ピック病；はさまれた神経(pinched nerve)；下垂体腫瘍；多発性筋炎；孔脳症；ポリオ後症候群；ヘルペス後神経痛；麻疹後脳脊髄炎；体位性低血圧症；プラダー・ウィリー症候群；原発性側索硬化症；プリオン病；進行性顔面片側萎縮症；進行性多巣性白質脳症；進行性硬化性ポリオジストロフィー(progressive sclerosing poliodystrophy)；進行性核上性麻痺；偽脳腫瘍；ラムゼイ・ハント症候群(I型及びII型)；ラスムッセン脳炎；反射性交感神経性ジストロフィー症候群；レフサム病；反復運動障害(repetitive motion disorder)；反復ストレス傷害；レストレスレッグス症候群；レトロウイルス関連脊髄症(retrovirus-associated myelopathy)；レット症候群；ライ症候群；舞踏病；サンドホフ病；シルダー病；裂脳症；中隔視神経異形成症；揺さぶられっ子症候群；帯状ヘルペス；シャイ・ドレーガー症候群；シェーグレン症候群；睡眠時無呼吸；ソトス症候群；痙縮；二分脊椎症；脊髄損傷；脊髄腫瘍；脊髄性筋萎縮症；全身硬直症候群；脳卒中；スタージ・ウェーバー症候群；亜急性硬化性全脳炎；皮質下動脈硬化性脳症；シド���ム舞踏病；失神；脊髄空洞症；遅発性ジスキネジア；テイ・サックス病；側頭動脈炎；脊髄係留症候群；トムゼン病；胸郭出口症候群；有痛性チック；トッド麻痺；トゥレット症候群；一過性脳虚血発作；伝達性海綿状脳症；横断性脊髄炎；外傷性脳損傷；振戦；三叉神経痛；熱帯性痙性不全対麻痺症；結節性硬化症；血管性認知症(多発脳梗塞性認知症)；側頭動脈炎を含めた脈管炎；フォンヒッペル・リンダウ病；ワレンベルグ症候群；ウェルドニッヒ・ホフマン病；ウエスト症候群；むち打ち症；ウィリアムズ症候群；ウィルソン病；ならびにツェルウェガー症候群を含む。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。【００７９】
本実施例で用いるＰＱＱジナトリウム塩としては、三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱを使用した。なお、その他の化合物については、特に断りがない限り、和光純薬製の試薬を用いた。【００８０】
〔粉末Ｘ線回折におけるＣｕ  Ｋα放射線測定〕
ＰＱＱジナトリウム塩の粉末Ｘ線回折におけるＣｕ  Ｋα放射線測定を以下に示す条件で測定した。その結果、２θ  ９．１°、１０．３°、１３．８°、２４．０°を示す結晶であった。
（測定条件）
装置            ：株式会社リガク製ＲＩＮＴ２０００
Ｘ線            ：Ｃｕ／管電圧４０ｋＶ／管電流１００ｍＡ
入射スリット    ：２／３°
散乱スリット    ：２／３°
受光スリット    ：０．３ｍｍ
スキャンスピード：４．０００°／ｍｉｎ
サンプリング幅  ：０．０２【００８１】
〔紫外可視（ＵＶ）スペクトル分析〕
紫外可視スペクトルは、ＵＶスペクトルメーター島津製ＵＶ１８００を用いて測定した。【００８２】
〔ＰＱＱ分析〕
ＰＱＱナトリウム塩の分析は以下の分析条件で行った。ＰＱＱ濃度、及び純度を、高速液体クロマトグラフィーにより以下に示す条件で測定した。
（測定条件）
装置    ：  島津製作所、高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ−２０１０
カラム  ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、１５０ｘ４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．
測定温度：４０℃
検出    ：２５９ｎｍにおける吸光度
溶離液  ：３０ｍＭ  酢酸／７０ｍＭ  酢酸アンモニウム  （ｐＨ５．１）
溶出速度：１．５ｍＬ／ｍｉｎ【００８３】
次に、同じ溶液に含まれるＮａ濃度はホリバ製ナトリウム電極で測定した。【００８４】
また、上記の溶液中に含まれるＰＱＱとＮａの濃度から、ＰＱＱナトリウム塩に含まれるＰＱＱとＮａの物質量比を求めた。この物質量比が２．０±０．２であればＰＱＱジナトリウム塩であり、３．０±０．２であればＰＱＱトリナトリウム塩であると判断した。【００８５】
〔製造例１：還元型ピロロキノリンキノン〕
ＰＱＱジナトリウム塩（三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ）５ｇと水１Ｌとを混合し、得られた水溶液を７０℃に加温した。この水溶液に対し、アスコルビン酸５０ｇと水０．２Ｌとを含む混合液を混合した。得られた水溶液を７０℃で３日反応させた後、２Ｎ塩酸を１０ｍＬ加え２時間反応させた。その後、室温に戻し、水溶液中に析出した固体をろ過し、２Ｎ塩酸、エタノールで洗った。得られた固体を減圧乾燥して、下記一般式（４）で表される還元型ピロロキノリンキノン固体３．６ｇを得た。
【化６】
0006609261.tif 000007
【００８６】
〔製造例２：ピロロキノリンキノンのアセトン付加体〕
ＰＱＱジナトリウム塩（三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ）１１．２ｇと水１Ｌとを混合し、水酸化ナトリウムを加え、ｐＨ９の水溶液を得た。得られた水溶液に、アセトン２００ｇ加えると、水溶液は２０分には赤から薄い黄色に変色した。変色後の水溶液に塩酸を加え、ｐＨを２．５とした。この水溶液から溶媒を留去して全体の重量が４００ｇになるまで濃縮した。濃縮した水溶液中に析出した黄色い固体を減圧乾燥して、下記一般式（５）で表されるピロロキノリンキノンのアセトン付加体の個体８．０１ｇを得た。
【化７】
0006609261.tif 000008
【００８７】
〔製造例３：イミダゾロキノン〕
ＰＱＱジナトリウム塩（三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ）１００ｇとグリシン２００ｇと水０．５Ｌとを混合し、ｐＨ４．８の水溶液を得た。得られた水溶液を３０分攪拌したところ、泡が出て水溶液は固まった。得られた混合物を７０℃に加熱して、３日反応させた。その後、混合物に１０質量％ＮａＣｌ水を１０００ｇ加え、固体を濾過した。濾過で得られた固体に２５質量％ＮａＯＨ水１２０ｇと水３０ｇとを混合し、ｐＨ１０．８の水溶液を得た。得られた水溶液を７０℃に加温して一晩放置後、析出した固体を濾過し、２−プロパノールで洗い、さらにエタノール４００ｍＬで洗った。得られた固体と水５００ｍＬとＮａＯＨ４１．５ｇとを混合し、ｐＨ１０．３の水溶液を得た。得られた水溶液を、７０℃で一晩静置した。その後、水溶液を氷で冷やし、析出した固体を濾過し、２−プロパノールで洗浄した。得られた固体を７０℃で減圧乾燥して、６５．８ｇの固体を得た。得られた固体をＬＣ，Ｎａイオン分析により分析し、下記一般式（６）で表されるイミダゾロキノン（以下、ＩＰＱと記すことがある）のトリナトリウム塩であることが確認された。
【化８】
0006609261.tif 000009
【００８８】
〔実施例１〜４、比較例１：ピロロキノリンキノンジナトリウム塩〕
〔寿命試験〕
〔線虫用培地の作製〕
ピロロキノリンキノンジナトリウムを水と水酸化ナトリウムとを混合し、ｐＨ６の試験サンプル濃縮液１を得た。【００８９】
試験サンプル濃縮液１は、ピロロキノリンキノンジナトリウム塩の含有量が３０ｍＭになるように調整した。また、試験サンプル濃縮液１は、オートクレーブ滅菌により使用した。【００９０】
フラスコ中に、ＮａＣｌ７．２ｇ、Ａｇａｒ４８ｇ、Ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ（ＢＤ社製）６ｇを２．４Ｌからサンプル濃縮液添加分を除いた水を加え、１２０℃で２０分以上オートクレーブにかけ、その後、フラスコの表面温度が４５℃程度になるまで冷やした。このフラスコに、１Ｍのリン酸カリウム溶液６０ｍＬ、１ＭのＣａＣｌ２溶液２．４ｍＬ、１ＭのＭｇＳＯ４溶液２．４ｍＬ、７５０ｍｇ／１５０ｍＬのコレステロール溶液２．４ｍＬ、３０ｍＭの試験サンプル濃縮液１を所定量加えて、培地溶液を得た。なお、試験サンプル濃縮液１の添加量は、培地溶液中のピロロキノリンキノンジナトリウム塩の濃度が０ｍＭ（比較例１）、０．１ｍＭ（実施例１）、１．０ｍＭ（実施例２）、３．０ｍＭ（実施例３）、及び５．０ｍＭ（実施例４）となるように調整した。フラスコの表面温度が４０−４１℃に達するまでさらに冷却し、培地溶液を１４ｍＬずつ、直径６ｃｍポリスチレン製シャーレに加え、室温に冷やし、異なる濃度のピロロキノリンキノンジナトリウム塩を含む培地を有するシャーレを作製した。【００９１】
一方で、ＬＢ培地（Luria-Bertani broth）で培養した大腸菌液に、上記作製したシャーレの培地とピロロキノリンキノンジナトリウム塩の濃度が同濃度になるよう試験サンプル濃縮液１を添加した。得られた大腸菌液１００μＬをシャーレの中心に約２ｃｍ直径の円を描くようにまいた。このシャーレを常温で保存し、作製２〜４日後に下記線虫試験に使用した。【００９２】
〔線虫試験〕
（シンクロナイズ（年齢の調整））
実験開始時の線虫個体の年齢を同期させるため、産卵させたあと親虫を取り除き、孵化させて一定時間の期間一様に育てた個体を使用した。具体的には、シャーレに５匹ずつ、ａｄｕｌｔ（抱卵している個体）を選んで移し、２０℃で２時間放置（産卵期間）し、親虫を取り除いた。その後、２０℃で７２時間放置し、１シャーレあたり１０〜２０匹となったところで寿命試験を開始した。１シャーレあたり１０〜２０匹という低密度で飼育することで、エサの不足や排泄物の蓄積に由来する影響を減少させた。【００９３】
また、各種突然変異体を用いた実験に関しては、発生速度が野生株に比べ遅いものが多いため、生殖器官の発達の度合いでステージを判断し、成虫に達した個体を寿命アッセイに用いた。【００９４】
（寿命アッセイ（寿命測定））
シャーレ内の個体を毎日新しいシャーレに移し替えた。スコアシートに日付、生存数、死亡数、行方不明数などの情報を記録した。保管時はシャーレにパラフィルムをまいた。自発的な行動がみられず、振動刺激や接触刺激を与えても全く反応がみられなかった場合を死亡と判断した。また、線虫がシャーレ外へ逃走したり、壁面で乾燥したり、培地の隙間から潜り込んだりするなどの理由で行方不明になることがしばしば起こるため、行方不明数を記録し、データからは除外した。また、ある種の変異体において頻出する自分の子供が体内で羽化して死亡する個体をＢＡＧ、脱腸などにより個体が死亡する個体を破裂と記録し、テータからは除外した。培地中のピロロキノリンキノンジナトリウム塩の濃度を変えて測定した結果を図１及び２に示す。【００９５】
図１及び２に示されるように、ピロロキノリンキノンジナトリウム塩の濃度が高いほど平均寿命は延びる傾向が見られる。なお、図１及び２の縦軸は、線虫の生存率を示し、横軸は成体に達したあとの育成日数（寿命）を示し、グラフの足は標準偏差を示す。また、図１及び２中のＮは、試験時の線虫の個数を示す。以下図３及び４においても同様とする。【００９６】
〔実施例５、比較例２：アセトン付加体〕
製造例２で作製したアセトン付加体と、同重量の炭酸水素ナトリウムと、滅菌水とを混合し、試験サンプル濃縮液２を得た。試験サンプル濃縮液２は、アセトン付加体の含有量が３０ｍＭになるように調整した。【００９７】
試験サンプル濃縮液２の添加量を、培地溶液中のアセトン付加体の濃度が０ｍＭ（比較例２）、及び５．０ｍＭ（実施例５）となるように調整したこと以外は、実施例１と同様の操作により、異なる濃度のアセトン付加体を含む培地を有するシャーレを作製した。その後、実施例１と同様に寿命試験を行った。その結果を図３に示す。【００９８】
図３に示されるように、アセトン付加体を含むことにより平均寿命は延びる傾向が見られる。【００９９】
〔比較例３〜４：ＩＰＱトリナトリウム塩〕
製造例３で作製したＩＰＱトリナトリウム塩と水とを混合し、試験サンプル濃縮液３を得た。試験サンプル濃縮液３は、ＩＰＱトリナトリウム塩の含有量が３０ｍＭになるように調整した。また、試験サンプル濃縮液３は、オートクレーブ滅菌により使用した。【０１００】
試験サンプル濃縮液３の添加量を、培地溶液中のＩＰＱトリナトリウム塩の濃度が０ｍＭ（比較例３）、及び５．０ｍＭ（比較例４）となるように調整したこと以外は、実施例１と同様の操作により、異なる濃度のＩＰＱトリナトリウム塩を含む培地を有するシャーレを作製した。その後、実施例１と同様に寿命試験を行った。その結果を図４に示す。なお、図４には、実施例４のデータも併記している。【０１０１】
〔実施例６〜７、比較例５：試験物質の安定性〕
寿命試験に使用したシャーレ中の還元型ピロロキノリンキノン、ピロロキノリンキノンのアセトン付加体、及びＩＰＱトリナトリウム塩の安定性を液体クロマトグラフィー分析（ＬＣ分析）によって評価した。その結果を表１に示す。なお、液体クロマトグラフィー分析は、上記したものに従って行うことができる。【０１０２】
〔実施例８：還元型ＰＱＱの安定性〕
還元型ＰＱＱを滅菌水に加え、３０ｍＭの分散液を作製した。これを前記の評価用組成において５ｍＭになるように添加してシャーレを作製した。３０度で３日保存試験を行い、ＬＣ分析、およびＵＶスペクトル分析を行った。還元型は中性条件ではＰＱＱに変化する。そのため、ＬＣ分析によりＰＱＱを検出し、それをジメチルスルホキシドで溶解しＵＶスペクトルを測定することで還元状態を確認できる。このようにして寒天培地中の還元型ＰＱＱの状態を確認した結果、全ＰＱＱのうち８６％が還元状態を維持していた。【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
また、実施例１−５で使用したシャーレにある大腸菌コロニーを取り出し、培地分析同様の操作で抽出、分析を行った。試験に使用した大腸菌からも試験物質は主要成分として検出された。【０１０５】
実施例１で製造したＰＱＱはペプトン中のアミノ酸と反応してＩＰＱになってしまう。しかし、比較例１で示すようにＩＰＱには寿命延長効果は小さく、ＰＱＱが活性成分であることがわかる。また、アセトン付加体にすることで生成しやすいＩＰＱは見られなくなり、安定性が向上していることがわかった。【０１０６】
〔実施例９〜１８、比較例６〜１５：変異体使用した寿命試験〕
線虫の変異体を使用することでＰＱＱがどのように働いているかを知ることができる。実施例４で調製したＰＱＱ５ｍＭを含む培地を用いて、シャーレを複数作製した。作製したシャーレを用いて、表２に示す各変異体で上記実施例１と同様に寿命延長試験を行った。その結果を以下の表２にまとめる。相対的な効果としてＰＱＱを添加しない場合を１００として示す。なお、表２は成体に成長したのちの、５ｍＭＰＱＱにおける寿命延長を示す。
【表２】
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【０１０７】
実施例１４および実施例１７ではｂｌｉ−３遺伝子の機能低下株ではＰＱＱによる寿命延長効果は見られなかった。これに対し、実施例１５のｂｌｉ−３遺伝子欠損株にｂｌｉ−３遺伝子を導入した株に関しては、ＰＱＱを添加することによって寿命が延長され、ＰＱＱにより寿命延長が生じない表現型がレスキューされた。この結果はｂｌｉ−３遺伝子が長寿実現に利く遺伝子であることを示している。つまり、ＰＱＱはデュアルオキシデースを活性化しているといえる。なお、線虫のｂｌｉ−３遺伝子は、哺乳類のＤＵＯＸ１遺伝子とＤＵＯＸ２遺伝子に相当する。【０１０８】
このように線虫の変異体を使用することでＰＱＱがどのように働いているかを知ることができる。ｂｌｉ−３変異体、ｎｓｙ−１変異体、ｐｍｋ−３変異体、及びＮｒｆ２のホモログをコードする ｓｋｎ−１遺伝子変異体では寿命延長効果が強く抑制され、これらの遺伝子群が寿命延長に必須である事がわかる。ｂｌｉ−３（ｅ７６７）およびｂｌｉ−３（ｉｍ１０）は、Ｄｕａｌ  ｏｘｉｄａｓｅの活性が低下した変異体であり、ＯＢ２６５  ｂｌｉ−３（ｅ７６７）；ｉｍＥｘ１４４［ｂｌｉ−３ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｌｏｎｅ］はｂｌｉ−３変異体（ｅ７６７）にＤｕａｌ  ｏｘｉｄａｓｅ遺伝子を導入して活性を取り戻した株である。なお、これらの株は、森部らがＰＬＯＳ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＤＯＩ：  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００２９５７において報告している株を使用した。また、ｎｓｙ−１（ｋｙ４００）、ｐｍｋ−３（ｏｋ１６９）変異体は、それぞれＡＳＫ−１／ＭＡＰＫＫＫ、ｐ３８／ＭＡＰＫの活性を低下させた株である。【０１０９】
これらの結果より、ＰＱＱは、上流のｂｌｉ−３にコードされるデュアルオキシダーゼを活性化させる。その後、活性化されたデュアルオキシダーゼから産出されたＲＯＳは、ｐ３８  ＭＡＰＫカスケードの活性化を経て、ＳＫＮ−１／ＮＲＦ−２を活性化させる。ＰＱＱにより活性化されたデュアルオキシダーゼは、結果として、生体防御応答を強化し、寿命延長に寄与していることがわかる。一般に活性酸素（ＲＯＳ）は、寿命を短縮させる働きがあると認識されている。そのため、生体の老化防止には、抗酸化剤が有効であると考えられている。しかしながら、ＰＱＱは、抗酸化剤としてではなく、驚くべきことに、活性酸素生産酵素の働きを高めることにより寿命を延長させる。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の寿命延長剤及びデュアルオキシダーゼ活性化剤は、食品、飼料、医薬品などの用途において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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