(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃドメインに融合したアぺリンペプチドを含む、ポリペプチドであって、前記アぺリンペプチドのＮ末端は、前記ＦｃドメインのＣ末端に、任意選択的にペプチドリンカーを介して、融合され、
前記アぺリンペプチドは、アぺリン４２〜７７（アぺリン−３６）、アぺリン６１〜７７（アぺリン−１７）、アぺリン６３〜７７（アぺリン−１５）、アぺリン６４〜７７（アぺリン−１４）、アぺリン６５〜７７（アぺリン−１３）、アぺリン６６〜７７（アぺリン−１２）、アぺリン６７〜７７（アぺリン−１１）、アぺリン６８〜７７（アぺリン−１０）、アぺリン７３〜７７（アぺリン−５）、アぺリン６１〜７６（アぺリン−Ｋ１６Ｐ）、アぺリン６１〜７５（アぺリン−Ｋ１５Ｍ）、アぺリン６１〜７４（アぺリン−Ｋ１４Ｐ）、アぺリン−Ｆ１３Ａ、アぺリン６５〜７６、アぺリン６５〜７５、アぺリン６６〜７６、アぺリン６７〜７６、アぺリン６６〜７５、アぺリン６７〜７５、［Ｐｙｒ1］アぺリン−１３、配列番号３８（アペリン−１３＋５Ｇ）、配列番号４２（アペリン−１３＋Ｒ）、配列番号４３（アペリン−１３＋Ｓ）、および配列番号４４（アペリン−１３＋Ｈ）からなる群から選択される、前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記アぺリンペプチドは、アぺリン４２〜７７（アぺリン−３６）、アぺリン６１〜７７（アぺリン−１７）、アぺリン６３〜７７（アぺリン−１５）、アぺリン６４〜７７（アぺリン−１４）、アぺリン６５〜７７（アぺリン−１３）、アぺリン６６〜７７（アぺリン−１２）、アぺリン６７〜７７（アぺリン−１１）、アぺリン６８〜７７（アぺリン−１０）、アぺリン７３〜７７（アぺリン−５）、［Ｐｙｒ1］アぺリン−１３、配列番号３８（アペリン−１３＋５Ｇ）、配列番号４２（アペリン−１３＋Ｒ）、配列番号４３（アペリン−１３＋Ｓ）、および配列番号４４（アペリン−１３＋Ｈ）からなる群から選択される、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アぺリンペプチドは、アぺリン−１３である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記アぺリンペプチドは、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４からなる
群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記アぺリンペプチドは、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介して、前記Ｆｃドメインに融合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン；ならびにＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｆｃドメインは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、または配列番号２２を含むＩｇＧヒンジドメインを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、二量体を形成することができる単量体融合ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２を含む前記アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
アぺリンペプチドに対して血清安定性が増強されており、そして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＰＬＮＲ活性化アッセイで測定した場合、１ｎＭ未満のＥＣ５０を示す、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、ベクターであって、
任意選択的に、前記核酸分子は、宿主細胞における発現に適した発現制御配列に作動可能に連結されている、前記ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載のベクターを含む、細胞であって、
任意選択的に、前記細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される、前記細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された融合ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ．宿主細胞を、前記融合ポリペプチドをコードする核酸分子でトランスフェクトすることであって、前記核酸分子は、前記アぺリンペプチドのＮ末端でヒトＩｇＧのＦｃドメインがアぺリンペプチドに連結された前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に融合された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、および、
ｂ．前記宿主細胞において（ａ）の核酸分子を発現させることによって前記融合タンパ
ク質を作製することを含む、前記方法。
【請求項１７】
それを必要とする対象のアぺリンに関連する疾患または状態の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
前記疾患または状態は、心血管疾患、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流障害、肺高血圧症、糖尿病、肥満、癌、転移性疾患、体液ホメオスタシス、のぼせ症、病的血管新生、網膜症、線維症、およびＨＩＶ感染からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８６，１７２号の利益を主張し、また米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１３年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／９０６，５６７号の利益を主張するものであり、これらの出願は各々、参照によりそれらの全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ファイル８０５０ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（４３，４２０バイト）として２０１４年３月１３日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表を、参照により組み込む。
【０００３】
本発明は、アぺリンペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した、ヒト免疫グロブリンＦｃドメイン等の多量体形成成分を用いて操作した融合タンパク質に関する。本発明の組換えタンパク質およびその組成物は、心血管疾患、虚血再灌流障害、糖尿病を治療する際に、また他のアぺリン関連療法において有用である。
【背景技術】
【０００４】
プレプロアペリンは、ヒトＣＮＳおよび末梢組織、例えば、肺、心臓、および乳腺において発現される７７アミノ酸からなるタンパク質である。様々なサイズのアぺリンペプチドのＣ末端断片を含むペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体であるＡＰＪ受容体を活性化することが示された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。多くの研究によって、アぺリンペプチドおよび類似体が、ＡＰＪ受容体（ＡＰＬＮＲとしても知られる）とのそれらの相互作用を通して、内皮依存性血管拡張（非特許文献５）、陽性変力作用（非特許文献６；非特許文献７）、ならびに心筋領域の虚血および再灌流（非特許文献８）等の心臓血管作用を伝達することが示唆されている。特に、アぺリン−１３は、心臓収縮力を増加させることによって心不全のための治療を提供することができる強力な変力物質である（非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００５】
ヒト患者における心室組織の術前および術後の転写プロファイリングにより、ＡＰＬＮＲが最も著しく上方制御された遺伝子であることが明らかになった（非特許文献１１）。マウスにおけるアぺリン（アぺリン−／−）およびＡＰＪ（ＡＰＪ−／−）ノックアウト試験は、内因性アぺリン−ＡＰＪ経路の欠損が、運動等の心循環系ストレスに応答する能力の低下につながることを示唆している（非特許文献１２）。
【０００６】
またアぺリンは、インスリンの調節ならびに糖尿病および肥満に関連する障害の機構においても報告されている。肥満のマウスモデルにおいて、アぺリンは、脂肪細胞から放出され、インスリンによって直接的に上方制御される（非特許文献１３）。アぺリンノックアウトマウスは、インスリン感受性の低下を証明した（非特許文献１４）。
【０００７】
合成アぺリンペプチドがＨＩＶ−１のＣＤ４−ＡＰＬＮＲ発現細胞への侵入を阻害したことから、ＡＰＬＮＲ調節剤もＨＩＶの治療に有用性が認められている（非特許文献１５）。さらに、ＡＰＬＮＲ阻害剤（すなわち、病的血管新生を阻止することができる）は、腫瘍増殖または網膜における血管新生を阻害する際に有用であり得る（非特許文献１６；非特許文献１７）。また、アぺリン−１３、アぺリン−１７、およびアぺリン−３６が、神経細胞の生存を促進するようにシグナル経路を介して作用する、アぺリンによる神経保
護も見られる（非特許文献１８）。
【０００８】
ＡＰＬＮＲ結合剤は、他のアぺリン関連性疾患の中でも、心血管疾患、ならびに癌、および糖尿病を改善する上で有用である。アぺリンは、循環から急速に除去され、８分以下という短い血漿半減期を有するため（非特許文献１９）、現在、アぺリンは、治療結果をもたらすために連続的に投与される。
【０００９】
治療薬として改善されたアぺリン結合剤、特に、ＡＰＬＮＲ結合活性を維持しながら、延長された半減期を有するものが、当該技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａｂａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４５２：２５−３５
【非特許文献２】Ｈｏｓｏｙａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，ＪＢＣ，２７５（２８）：２１０６１−６７
【非特許文献３】Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７４：３４−４１
【非特許文献４】Ｍｅｄｈｕｒｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ８４：１１６２−１１７２
【非特許文献５】Ｔａｔｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ９９：８７−９２
【非特許文献６】Ｓｚｏｋｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９１：４３４−４４０
【非特許文献７】Ｍａｇｕｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ５４：５９８−６０４、印刷前のｅｐｕｂ、２００９年７月１３日
【非特許文献８】Ｐｉｓａｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ａｐｅｌｉｎ−１２  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ”、印刷前のｅｐｕｂ
【非特許文献９】Ｄａｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５５３（１−３）：２２２−２２８
【非特許文献１０】Ｍａｑｕｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．５４：５９８−６０４
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８：１４３２−３９
【非特許文献１２】Ｃｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９７：Ｈ１９０４−１９１３
【非特許文献１３】Ｂｏｕｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １４６：１７６４−７１
【非特許文献１４】Ｙｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９８：Ｅ５９−Ｅ６７
【非特許文献１５】Ｃａｙａｂｙａｂ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１９７２−１１９７６
【非特許文献１６】Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ，Ｔ．，２００８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ；２８；１６８７−１６８８
【非特許文献１７】Ｒａｙａｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６（３）：３６７−７２
【非特許文献１８】Ｃｈｅｎｇ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３７（１）：１７１−３
【非特許文献１９】Ｊａｐｐ，ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｊ  ｏｆ  Ａｍｅｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇ，５２（１１）：９０８−１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生物学的に活性なアぺリンペプチドを送達するように操作された、Ｆｃドメインに融合したアぺリン等のアぺリン融合タンパク質を提供する。具体的には、アぺリン融合タンパク質は、ＡＰＬＮＲ活性を維持しながら、野生型アぺリンペプチドと比較して改善された薬物動態特性を有する。
【００１２】
本発明の一態様は、多量体形成成分に融合したアぺリンペプチドを含むポリペプチドを提供する。一実施形態において、多量体形成成分は、少なくとも１つのシステイン残基を含有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、多量体形成成分は、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、コイルドコイルモチーフ、または免疫グロブリン由来ドメインを含有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、多量体形成成分は、Ｆｃドメインを含有するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
関連する態様において、本発明は、Ｆｃドメイン、Ｆｃドメインの断片、またはＦｃドメインの変異体に融合したアぺリンペプチドを含むポリペプチドを提供する。いくつかの場合において、ポリペプチドは、タンパク質または多量体複合体等の高次構造の一部であってもよい。いくつかの実施形態において、アぺリンペプチドは、１つ以上のペプチドリンカーを介してＦｃドメイン、またはその断片に融合される。他の実施形態において、アぺリンペプチドは、前記ＦｃドメインのＣ末端に融合されるか、またはアぺリンペプチドは、前記ＦｃドメインのＮ末端、もしくはその断片に融合される。
【００１４】
一実施形態において、本明細書に記載のアぺリン融合タンパク質のいずれかのＦｃドメインは、免疫グロブリンＣＨ２ドメインまたは免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ１  ＣＨ２およびＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ４  ＣＨ２およびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインからなる群から選択される。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧヒンジドメインを含む。さらに他の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、および配列番号２２からなる群から選択されるＩｇＧヒンジドメインを含む。
【００１５】
別の実施形態において、ポリペプチドは、二量体を形成することができる単量体融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、第２のポリペプチドと少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。
【００１６】
別の関連する態様において、本発明は、アぺリンペプチド成分、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメイン、および少なくとも１つのリンカー成分を含むアぺリン受容体（ＡＰＮＬＲ）結合分子を提供する。いくつかの実施形態において、アぺリン受容体（ＡＰＮＬＲ）結合分子はＡＰＬＮＲアゴニストであり、他の場合において、アぺリン受容体（ＡＰＮＬＲ）結合分子はＡＰＬＮＲアンタゴニストである。
【００１７】
本発明の別の態様において、少なくとも約１時間、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０時間、またはそれ以上のｉｎ  ｖｉｖｏ血漿または血清半減期を有するアぺリン融合ポリペプチドまたはアぺリン受容体結合分子が提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明のアぺリン融合ポリペプチドまたは受容体結合分子は、アぺリン４２〜７７（アぺリン−３６）、アぺリン６１〜７７（アぺリン−１７）、アぺリン６３〜７７（アぺリン−１５）、アぺリン６４〜７７（アぺリン−１４）、アぺリン６５〜７７（アぺリン−１３）、アぺリン６６〜７７（アぺリン−１２）、アぺリン６７〜７７（アぺリン−１１）、アぺリン６８〜７７（アぺリン−１０）、アぺリン７３〜７７（アぺリン−５）、アぺリン６１〜７６（アぺリン−Ｋ１６Ｐ）、アぺリン６１〜７５（アぺリン−Ｋ１５Ｍ）、アぺリン６１〜７４（アぺリン−Ｋ１４Ｐ）、アぺリン−Ｆ１３Ａ、アぺリン６５〜７６、アぺリン６５〜７５、アぺリン６６〜７６、アぺリン６７〜７６、アぺリン６６〜７５、アぺリン６７〜７５、および［Ｐｙｒ１］アぺリン−１３からなる群から選択されるアぺリンペプチドを含む。
【００１９】
特定の実施形態において、アぺリン融合ポリペプチドまたはアぺリン受容体結合分子は、血清安定性タンパク質である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４を含むアミノ酸配列に対して、９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様において、ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４を含むアミノ酸配列を有する。さらに他の態様において、ポリペプチドは、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、組換えポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、Ｎ’−Ｐ１ｍ−Ｘ１ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｐ２−Ａ１−Ｃ’を含み；Ｎ’は、ポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’は、ポリペプチドのＣ末端であり；Ｐ１は、ペプチドリンカーであり；Ｘ１は、ＩｇＧヒンジドメインを含み；Ｘ２は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインを含み；Ｘ３は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含み、Ｐ２は、ペプチドリンカーであり；Ａ１は、ヒトアぺリンペプチド、またはその断片もしくは誘導体を含むアミノ酸配列であり；ｍ＝０または１であり、ｎ＝０または１である。
【００２１】
特定の態様において、本発明は、組換えポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、Ｎ’−Ａ１−Ｐ２−Ｘ１ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ’を含み：Ｎ’は、ポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’は、ポリペプチドのＣ末端であり；Ａ１は、ヒトアぺリンペプチド、またはその断片もしくは誘導体を含むアミノ酸配列であり；Ｐ２は、ペプチドリンカーであり；Ｘ１は、ＩｇＧヒンジドメインを含み；Ｘ２は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインを含み；Ｘ３は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含み；ｎ＝０または１である。
【００２２】
第２の態様において、本発明は、本発明の任意のアぺリン融合ポリペプチドまたはアぺリン受容体結合分子をコードする核酸分子を提供する。一実施形態において、核酸分子は、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される配列を有する。他の実施形態において、核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００２３】
第３の態様において、本発明のアぺリン融合ポリペプチドまたはアぺリン受容体結合分子をコードする核酸分子を含むベクターおよび細胞を提供する。一実施形態において、ベクターは、シグナルペプチド配列に連結された核酸分子をコードする。
【００２４】
本発明はまた、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むアぺリン融合タンパク質をコードするベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質の上流に配置されたシグナルペプチドのＣ末端に融合されたペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含むアぺリン融合タンパク質をコードするベクターを提供する。
【００２５】
第４の態様において、本発明は、ＡＰＬＮＲを発現する細胞を、試験分子と同じ試験条件下で本発明のアぺリン融合タンパク質と接触させて、試験分子がＡＰＬＮＲアゴニストであるかまたはＡＰＬＮＲアンタゴニストであるかを決定する、試験分子のＡＰＬＮＲ活性を決定するためのプロセスを提供する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、ＡＰＬＮ受容体（ＡＰＬＮＲ）の活性化を決定するためのプロセスであって、（ａ）ＡＰＬＮＲの活性化を可能にする条件下で、ＡＰＬＮＲを発現する細胞を試験分子と接触させることと、（ｂ）ＡＰＬＮＲ活性を測定することと、（ｃ）ステップ（ａ）と同じ条件下で、ＡＰＬＮＲを発現する細胞を本発明のアぺリン融合タンパク質と別個に接触させることと、（ｄ）ステップ（ｂ）と同じ様式で、ステップ（ｃ）において細胞のＡＰＬＮＲ活性を測定することと、を含み、ステップ（ｄ）におけるＡＰＬＮＲ活性の測定値と比較したステップ（ｂ）におけるＡＰＬＮＲ活性の測定値が、試験分子がＡＰＬＮＲを活性化することを決定する、プロセスを提供する。
【００２７】
本発明の別の態様は、アぺリンを含む融合タンパク質を作製する方法であって、（ａ）宿主細胞を、融合タンパク質をコードする核酸分子でトランスフェクトすることとであって、核酸分子は、ｉ）アぺリンペプチドのＮ末端で、前記アぺリンペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結されたヒトＩｇＧのＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列、またはｉｉ）前記ＦｃドメインのＮ末端で、ヒトＩｇＧのＦｃドメインをコードするヌクレオチド配列に連結されたアぺリンペプチドをコードするヌクレオチド配列のいずれかに融合された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、トランスフェクトすることと、（ｂ）宿主細胞において（ａ）の核酸分子を発現させることによって融合タンパク質を作製することと、を含む、方法を提供する。本発明は、本発明の融合タンパク質を細胞培養培地に分泌する宿主細胞を提供する。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする対象における、アぺリンに関連する疾患または状態の治療のための方法であって、対象に治療有効量の本発明のアぺリン融合タンパク質を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、心血管疾患、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流障害、肺高血圧症、糖尿病、肥満、癌、転移性疾患、体液ホメオスタシス、病的血管新生、網膜症、線維症、およびＨＩＶ感染からなる群から選択される疾患または状態を治療するための方法であって、対象に治療有効量の本発明のアぺリン融合タンパク質を投与することを含む方法も提供する。
【００２９】
本発明はさらに、本発明のアぺリン融合ポリペプチドまたはアぺリン受容体結合分子を含む組成物およびキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、少なくとも１つの本発明のアぺリン融合タンパク質またはポリペプチドを充填した１つ以上の容器を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】配列番号２のアミノ酸配列等の、ｈＦｃ−アぺリン融合タンパク質の成分を示す。配列番号２の配列は、（Ｎ末端からＣ末端へ）ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（下線）、Ｇ４Ｓ反復ペプチドリンカー（イタリック体）、およびアぺリン−１３（二重下線）からなる。
【図１Ｂ】ホモ二量体の形態で分泌されたＦｃ−アぺリン融合タンパク質およびその成分を表す。
【図２Ａ】配列番号４のアミノ酸配列等の、アぺリン−ｈＦｃ融合タンパク質の成分を示す。配列番号４の配列は、（Ｎ末端からＣ末端へ）アぺリン−１３（二重下線）、Ｇ４Ｓ反復ペプチドリンカー（イタリック体）、およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（下線）からなる。
【図２Ｂ】ホモ二量体の形態で分泌されたアぺリン−Ｆｃ融合タンパク質およびその成分を表す。
【図３Ａ】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のアぺリンＦｃ融合タンパク質およびタンパク質ラダー対照の泳動を示す。レーン１＝タンパク質マーカー測定値（３１および３８ｋＤ）；レーン２＝ｈＦｃ−アぺリン−１３（配列番号２）；レーン３＝アぺリン１３−ｈＦｃタンパク質（配列番号４）；レーン４＝ｈＦｃのみ。
【図３Ｂ】抗アぺリン抗体を用いたウエスタンブロットにおける、１０ｎｇまたは１００ｎｇのいずれかの単離されたｈＦｃ−アぺリン１３またはアぺリン１３−ｈＦｃタンパク質の反応性を示す。
【図４】以下のリガンドの各々の用量反応曲線および半最大濃度（ＥＣ５０）を表す：ＡＰＪ（ＡＰＮＬＲ）発現細胞においてフォルスコリンによって誘発されるｃＡＭＰ反応を測定することによるＣＲＥ−ｌｕｃアッセイにおける、アぺリン−１３（−●−）、ｈＦｃ−アぺリン１３（−■−）、またはアぺリン１３−ｈＦｃ（−◆−）。
【図５】以下のリガンドの各々の用量反応曲線および半最大濃度（ＥＣ５０）を表す：β−アレスチンアッセイにおけるアぺリン−１３（−●−）、ｈＦｃ−アぺリン１３（−■−）、アぺリン１３−ｈＦｃ（−▲−）、またはｈＦｃのみ（−▼−）。
【図６】ｈＦｃ（−▲−）と比較して正規化したｈＦｃ−アぺリン１３（−●−）またはアぺリン１３−ｈＦｃ（−■−）のｐ−ＥＲＫアッセイの用量反応曲線および半最大濃度（ＥＣ５０）を表す：両方のリガンドによるＡＰＮＬＲ発現細胞の活性化を示している。ｘ
【図７Ａ】皮下投与を行ったＣ５７／Ｂｌ６マウスの血清中の２．８ｍｇ／ｋｇアぺリン１３−ｈＦｃ（−■−）の安定性を示す：ｈＦｃ単独のレベル（−●−）と比較して、最大４８時間、約１０μｇ／ｍＬのレベルに達していた。
【図７Ｂ】皮下投与を行ったＣ５７／Ｂｌ６マウスの血清中の５ｍｇ／ｋｇ  ｈＦｃ−アぺリン１３（−●−）の安定性を示す：２４時間で３μｇ／ｍＬに達し、徐々に減少して約１４日目に１μｇ／ｍＬとなった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
記載される特定の方法、および実験条件は変化し得るため、本発明は、そのような方法および条件に限定されるものではないことを理解されたい。また、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書に記載される種類の１つ以上の方法および／もしくはステップ、ならびに／または、本開示を読めば当業者に明らかとなるものを含む。
【００３３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等のいずれの方法および材料が本発明の実施において使用されてもよいが、特定の方法および材料を次に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
融合タンパク質
「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、１対の軽（Ｌ）鎖および１対の重（Ｈ）鎖の２対のポリペプチド鎖からなる構造的に関連した糖タンパク質のクラスを指し、これら４つは、全てジスルフィド結合によって相互接続され得る。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域（ＣＨまたはＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＣＨ１およびＣＨ２ドメインは、ヒンジによって連結される。Ｆｃ部分は、少なくともＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
【００３５】
典型的には、免疫グロブリンのアミノ酸残基の番号付けは、ＩＭＧＴのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に従うか、または、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）におけるように、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステム（「ＥＵナンバリング」もしくは「ＥＵインデックス」とも称される）によるものである。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「多量体形成成分」は、同じかまたは類似する構造または構成の第２の多量体形成成分と会合する能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成成分は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成成分の非限定的な例は、免疫グロブリンのＦｃ部分、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群の任意のアロタイプから選択されるＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施形態において、多量体形成成分は、Ｆｃ断片、または少なくとも１つのシステイン残基を含有する１〜約５００アミノ酸長のアミノ酸配列である。他の実施形態において、多量体形成成分は、システイン残基、または短いシステインを含有するペプチドである。他の多量体形成ドメインは、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むかまたはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドを含む。
【００３７】
「Ｆｃ」という用語は、典型的には、Ｆｃ受容体、例えば、ＦｃγＲ、すなわち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、またはＦｃＲｎ、すなわち新生児型Ｆｃ受容体と結合した、少なくともＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域の一部を指す。ＣＨ２およびＣＨ３領域が、欠失、置換、および／もしくは挿入、またはいずれのＦｃ受容体とも結合できなくする他の修飾を含有する場合、ＣＨ２およびＣＨ３領域は、その典型的な生物学的機能という観点から非機能的であると見なされる。
【００３８】
「融合タンパク質」および特に「アぺリン融合タンパク質」という句は、本明細書に記載の多量体形成成分を含有するように操作されたアぺリンに由来する組換えポリペプチドおよびタンパク質を含む。
【００３９】
「Ｆｃ融合タンパク質」および特に「アぺリン−Ｆｃ」または「Ｆｃ−アぺリン」融合タンパク質という句は、本明細書に記載のＦｃ断片を含有するように操作されたアぺリンに由来する組換えポリペプチドおよびタンパク質を含む。例えば、「アぺリンＦｃ融合タンパク質」は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずにＩｇのＦｃドメインのアミノ酸配列に融合されたアぺリンペプチドまたは類似体のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を含む。融合タンパク質に使用されるペプチドの例は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ  ２０（３）：１５０−１６０を参照のこと）。Ｆｃ融合タンパク質はまた、当該技術分野においてイムノアドヘシンとも称される。
【００４０】
本明細書において使用される「融合する」という句は、典型的には、２つの遺伝子が１つの連続したポリペプチドをコードするように、１つの遺伝子を第２の遺伝子とインフレームで発現ベクターにクローニングすることによって作製されるキメラ遺伝子の発現によって形成されるポリペプチドを意味する（しかし、これに限定されない）。組換え技術によって作製されることに加えて、ポリペプチドの一部は、化学反応によって、または特製ポリペプチドを作製するための当該技術分野で既知の他の手段によって、互いに「融合する」ことができる。
【００４１】
「タンパク質」という用語は、四次構造、三次構造、および少なくとも１つのポリペプチドからなる他の高分子複合体を含むことを意味する。「タンパク質」という用語は、ポリペプチドを含む。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」は、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間でペプチド結合によって一緒に結合されたアミノ酸の単一の直鎖状ポリマー鎖である。「タンパク質」という用語はまた、７回膜貫通ドメインタンパク質等の大きなポリペプチドを説明するために使用されてもよい。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、免疫グロブリンドメインに由来するアミノ酸配列を含む。指定されたタンパク質またはポリペプチドに「由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンのクラスまたはサブクラス、（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を指す。
【００４４】
本明細書において使用される「重鎖」または「免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖」という句は、任意の生物からのＩｇ重鎖定常領域配列を含み、別途指定されない限り、重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインは、別途指定されない限り、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。重鎖可変ドメインの断片は、ＣＤＲ、またはＣＤＲとＦＲの両方を含む。典型的な重鎖定常領域（ＣＨ）は、可変領域に続いて、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。例えば、抗原結合タンパク質中の、重鎖の機能的断片は、抗原を特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲のＫＤを有する抗原を認識する）ことができ、細胞中で発現させることおよび細胞から分泌させることができ、かつ、少なくとも１つのＣＤＲを含む、断片を含む。
【００４５】
膜に結合したヒトＦｃγ受容体（ｈＦｃγＲ）を利用して同時分泌されたタンパク質を捕捉するフローサイトメトリーに基づく自己分泌トラップ（ＦＡＳＴＲ）法は、抗体またはＦｃ融合タンパク質を発現または分泌する高発現クローンを迅速に単離するために使用することができる。（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０１３７４１６  Ａ１号を参照のこと）。そのような高発現クローンは、本明細書に記載のＦｃ融合タンパク質を含むタンパク質を発現する細胞を単離するために利用することができる。ＦＡＳＴＲを利用して、本発明の任意の組換えポリペプチドまたはＦｃ融合タンパク質を発現する細胞を直接スクリーニングおよび単離することができる。
【００４６】
本明細書において使用される「ヒンジ」という用語は、免疫グロブリンのＣＨ１のＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に接続する連続したアミノ酸酸基の領域を含むことが意図される。ＣＨ２エクソンによってコードされるＣＨ２ドメインのＮ末端のいくつかのアミノ酸もまた、「下部ヒンジ」の一部であると見なされる。いかなる理論に拘束されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸は、異なるヒンジエクソンによってコードされる１２〜１５個の連続するアミノ酸と、ＣＨ２ドメインのいくつかのＮ末端アミノ酸（ＣＨ２エクソンによってコードされる）とを含むものとして特徴付けられている（Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６（２）：８５−９０）。それに対して、ＩｇＧ３は、４つのセグメントからなるヒンジ領域を含む：ＩｇＧ１のヒンジ領域に類似する１つの上部セグメント、およびＩｇＧ３に固有のアミノ酸リピートと同一である３つのセグメント。
【００４７】
ヒトＩｇＧ等のＩｇドメインに由来するアミノ酸残基は、「ＥＵナンバリング」または「ＥＵインデックス」とも称されるＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  ｅｄ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１による。ＩＭＧＴ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｈａｒｔ、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌに従って更新。作成日：２００１年５月１７日、最終更新日：２０１３年１月１０日）によって本明細書において同定される。
【００４８】
例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジアミノ酸に関するＥＵナンバリング、および対応するＩＭＧＴ固有の番号変換、ならびＫａｂａｔの番号変換（上記Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１，ａｎｄ  ＩＭＧＴ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｈａｒｔによる）を表１に列挙する。
【００４９】
【表１】
0006525951.tif 000002
【００５０】
【表２】
0006525951.tif 000003
【００５１】
一実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメイン、または任意のＦｃドメイン断片、または任意のＦｃドメイン変異体を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｉｇ  ＣＨ２およびＩｇ  ＣＨ３ドメイン、またはその断片もしくは変異体を含む。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｉｇヒンジドメインまたはその断片もしくは変異体、Ｉｇ  ＣＨ２ドメインまたはその断片もしくは変異体、およびＩｇ  ＣＨ３ドメインまたはその断片もしくは変異体を含む。さらに他の実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｉｇ  ＣＨ１ドメインまたはその断片もしくは変異体、Ｉｇヒンジドメインまたはその断片もしくは変異体、Ｉｇ  ＣＨ２ドメインまたはその断片もしくは変異体、およびＩｇ  ＣＨ３ドメインまたはその断片もしくは変異体を含む。
【００５２】
本明細書において使用される「キメラ」という用語は、異なる起源の部分からなることを意味する。「キメラポリペプチド」を包含する「キメラタンパク質」という句は、天然では通常連結されていない第２のアミノ酸ポリペプチドに連結された第１のアミノ酸ポリペプチドを含む。アミノ酸配列は、通常、別個のポリペプチドとして、または同じポリペプチドもしくはタンパク質上に異なる配置で存在してもよく、融合ポリペプチドにおいて新しい配置で集合させられる。
【００５３】
Ｆｃドメインは、１つより多くの免疫グロブリンアイソタイプ由来のＦｃ入配列を組み合わせたキメラであってもよい。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４  ＣＨ２領域由来のＣＨ２配列の一部または全部、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４由来のＣＨ３配列の一部または全部を含むことができる。キメラＦｃドメインは、キメラヒンジ領域も含有することができる。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」と組み合わせて、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」を含んでもよい。キメラＦｃドメインは、改変されたＦｃ受容体結合を有することができ、それがＦｃエフェクター機能に影響を与える。
【００５４】
特定の治療法のために、所望のＦｃ融合タンパク質の薬物動態特性に影響を与えることなく、正常なＦｃエフェクター機能の全てを活性化するように、いくつかを活性化するように、またはまったく活性化しないように、Ｆｃドメインを操作することができる。したがって、改変されたＦｃ受容体結合を有する操作されたＦｃドメインは、副作用が少ない可能性がある。よって、一実施形態において、タンパク質は、キメラＦｃドメインまたは別様に修飾されたＦｃドメインを含む。キメラＦｃドメインの例については、２０１３年２月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５９，５７８号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００５５】
本発明はまた、変異Ｆｃドメイン配列を含むアぺリンＦｃ融合タンパク質も提供する。そのような「変異」ＦｃドメインおよびＦｃドメイン断片は、野生型配列と比較して１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、本質的に所望されるように機能し、例えば、本明細書に記載されるように、ＡＰＬＮＲ活性を示し、融合タンパク質の半減期を延長する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。他の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン、またはＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインからなる群から選択される断片を含むキメラＦｃドメインであり、断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来する。いくつかの実施形態において、キメラＦｃドメインは、配列番号１５、配列番号１９、および配列番号２３からなる群から選択されるＣＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラＦｃドメインは、配列番号１６、配列番号２０、および配列番号２４からなる群から選択されるＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、キメラＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。したがって、そのようなＦｃドメインの変異体および断片もまた、本発明の一部である。
【００５７】
一実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒンジドメインを含む。一実施形態において、ヒンジドメインは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、または配列番号２２を含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、キメラヒンジドメインを含む。別の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号１４、配列番号１８、および配列番号２２からなる群から選択されるヒンジ断片を含むキメラヒンジドメインを含む。
【００５８】
本発明の特定の実施形態において、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体へのタンパク質結合を増強するかまたは減少させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含むＦｃ融合タンパク質が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に突然変異を含むＦｃ融合タンパク質を含み、突然変異（複数可）は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０のエンドソームにおいて）ＦｃドメインのＦｃＲｎへの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与した時に抗体の血清半減期を増加させる場合がある。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例として、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）の修飾；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）の修飾；または２５０位および／もしくは４２８位の修飾；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位の修飾が挙げられる。一実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【００５９】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される突然変異の１つ以上の対または群を含むＦｃドメインを含むＦｃ融合タンパク質を含む。上記Ｆｃドメインの突然変異、および本明細書に開示される融合タンパク質内の他の突然変異の考えられる全ての組み合わせが、本発明の範囲内で企図される。
【００６０】
Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインに対する修飾は、分解に対する耐性等の高い安定性を付与し得る。融合タンパク質は、タンパク質切断に対するそれらの耐性、または金属イオンに関連する切断に対する耐性を改善するために、通常の分子生物学的技術および合成化学を使用して修飾することができる。そのようなポリペプチドの類似体は、１つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換、または天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然には存在しない合成アミノ酸との置換によって作製される、置換変異体を含む。
【００６１】
一実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質は、本明細書に記載されるようにＦｃドメインに融合されたアぺリンペプチドを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質は、ＡＰＬＮＲ受容体を活性化し、Ｆｃドメインに融合されていないアぺリンペプチドの半減期よりも長い半減期（８分を超える半減期等）を有する。
【００６３】
アぺリンリガンドおよびアぺリン受容体
アぺリンは、７７アミノ酸のプレプロペプチドとして内在的に産生され、いくつかのより短い生物学的に活性な断片またはアぺリンペプチドを生じるように切断される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質は、本明細書に記載されるようなアぺリンペプチドを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、アぺリンペプチドは、プレプロアペリンポリペプチド（配列番号５）の断片または誘導体を含む。
【００６６】
「アぺリンペプチド」は、当該技術分野で既知の特異的なアぺリン断片および誘導体、例えば、アミノ酸６〜７７、４０〜７７、４２〜７７、４３〜７７、４７〜７７、５９〜７７、６１〜７７、６３〜７７、６４〜７７、６５〜７７、６６〜７７、６７〜７７、７３〜７７、１〜２５、６〜２５、４２〜６４、６１〜６４、６１〜７４、６１〜７５、６１〜７６、６５〜７６、６５〜７５、６６〜７６、６７〜７６、６６〜７５、６７〜７５、４２〜５８、４２〜５７、４２〜５６、４２〜５５、４２〜５４、４２〜５３を含むアぺリンペプチド、またはプレプロアペリンポリペプチド（配列番号５）のピログルタミル化アぺリン６５〜７７（［Ｐｙｒ１］アぺリン−１３）を含む。例えば、２００２年１２月１０日に発行された米国特許第６４９２３２４号、およびＥｌ  Ｍｅｓｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９０：１２９０−１３０１（両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一実施形態において、アぺリンペプチドは、配列番号５のアミノ酸６５〜７６、６５〜７５、６１〜７７、６３〜７７、６４〜７７、６５〜７７、６６〜７７、６７〜７７、６６〜７６、６７〜７６、６６〜７５、６７〜７５、または４２〜７７を含む。
【００６７】
アぺリンペプチド、例えば、Ｃ末端の欠失を有するペプチドの断片は、それらの細胞活性を保持することが本明細書において証明されている（Ｅｌ  Ｍｅｓｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９０：１２９０−１３０１も参照のこと）。１つ以上のさらなるＣ末端アミノ酸を有するアぺリンペプチドおよび融合物等の特定のアぺリンペプチド誘導体は、それらの細胞活性を保持することが本明細書において示される。そのため、本明細書に記載されるアぺリンペプチドの断片および誘導体は、本発明に含まれる。アぺリンペプチドの他の断片および誘導体は、組換え技術を用いて当業者によって作製されてもよい。
【００６８】
他の実施形態において、アぺリンペプチドは、アぺリン４０〜７７（アぺリン−３８）、アぺリン４２〜７７（アぺリン−３６）、アぺリン４３〜７７（アぺリン−３５）、アぺリン４７〜７７（アぺリン−３１）、アぺリン５９〜７７（アぺリン−１９）、アぺリン６１〜７７（アぺリン−１７）、アぺリン６３〜７７（アぺリン−１５）、アぺリン６４〜７７（アぺリン−１４）、アぺリン６５〜７７（アぺリン−１３）、アぺリン６６〜７７（アぺリン−１２、またはＡ１２）、アぺリン６７〜７７（アぺリン−１１）、アぺリン６８〜７７（アぺリン−１０）、アぺリン７３〜７７（アぺリン−５）、アぺリン６１〜７６（アぺリン−Ｋ１６Ｐ）、アぺリン６１〜７５（アぺリン−Ｋ１５Ｍ）、アぺリン６１〜７４（アぺリン−Ｋ１４Ｐ）、および［Ｐｙｒ１］アぺリン−１３からなる群から選択される。
【００６９】
さらに他の実施形態において、アぺリンペプチドは、アぺリン６１〜７７（アぺリン−１７；配列番号７）、アぺリン６５〜７７（アぺリン−１３；配列番号６）、アぺリン−Ｆ１３Ａ（配列番号２９）、アぺリン６６〜７７（アぺリン−１２、またはＡ１２、配列番号３２）、アぺリン６７〜７７（アぺリン−１１；配列番号３３）、アぺリン６５〜７６（配列番号３０）、アぺリン６５〜７５配列番号３１）、アぺリン６７〜７７（配列番号６）、アぺリン６６〜７６（配列番号３４）、アぺリン６７〜７６（配列番号３５）、アぺリン６６〜７５（配列番号３６）、アぺリン６７〜７５（配列番号３７）、および［Ｐｙｒ１］アぺリン−１３からなる群から選択される。
【００７０】
いくつかの実施形態において、アぺリンペプチドは、分解を最小限に抑え、血清安定性を増強するように修飾される。特定の実施形態において、修飾アぺリンペプチドは、配列番号３８（アぺリン−１３＋５Ｇ）、配列番号４２（アぺリン−１３＋Ｒ）、配列番号４３（アぺリン−１３＋Ｓ）、および配列番号４４（アぺリン−１３＋Ｈ）からなる群から選択される。
【００７１】
一実施形態において、アぺリンペプチドは、アぺリン−３６（配列番号８）、アぺリン−１７（配列番号７）、アぺリン−１３（配列番号６）、および［Ｐｙｒ１］アぺリン−１３からなる群から選択される。別の実施形態において、アぺリンペプチドは、アぺリン−１３（配列番号６）、またはその断片を含む。
【００７２】
アぺリンは、循環から急速に除去され、８分以下という短い血漿半減期を有する（Ｊａｐｐ，ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｊ  ｏｆ  Ａｍｅｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇ，５２（１１）：９０８−１３）。本発明のアぺリン融合タンパク質は、アぺリンペプチドと比較して長い半減期を有する。
【００７３】
非標準的アミノ酸または修飾アミノ酸を含むように修飾されたアぺリンの類似体が、本明細書に含まれる。非天然の、または天然であるがコードされていないアミノ酸を含有するそのようなペプチドは、１つ以上のコドンが、標準的アミノ酸の１つではないアミノ酸をコードするように割り当てられた人工的に修飾された遺伝コードによって合成することができる。例えば、遺伝コードは２０個の標準的アミノ酸をコードするが、天然では、特定の状況下において、さらなる３つのタンパク新生アミノ酸、セレノシステイン、ピロールリジン、およびＮ−ホルミルメチオニンが生じる：（Ａｍｂｒｏｇｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：２９−３５；Ｂoｃｋ，Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１，ＴＩＢＳ，１６（１２）：４６３−４６７；およびＴｈeｏｂａｌｄ−Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８７（９−１０）：８１３−８１７）。カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシグルタミン酸塩）、ヒドロキシプロリン、およびハイプシン等の翻訳後修飾アミノ酸も含まれる。他の非標準的アミノ酸は、限定されないが、シトルリン、４−ベンゾイルフェニルアラニン、アミノ安息香酸、アミノヘキサン酸、Ｎα−メチルアルギニン、α−アミノ−ｎ−酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、ｔ−ロイシン、α−アミノ−ｎ−ヘプタン酸、ピペコリン酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、アロスレオニン、ホモアラニン、ホモアルギニン、ホモアスパラギン、ホモアスパラギン酸、ホモシステイン、ホモグルタミン酸、ホモグルタミン、ホモイソロイシン、ホモロイシン、ホモメチオニン、ホモフェニルアラニン、ホモセリン、ホモチロシン、ホモバリン、イソニペコチン酸、β−アラニン、β−アミノ−ｎ−酪酸、β−アミノイソ酪酸、γ−アミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、イソバリン、サルコシン、ナフチルアラニン、ニペコチン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−プロピルグリシン、Ｎ−イソプロピルグリシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−エチルアラニン、Ｎ−メチルβ−アラニン、Ｎ−エチルβ−アラニン、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、ペニシラミン、ピログルタミン酸、サルコシン、ｔ−ブチルグリシン、テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、イソセリン、およびα−ヒドロキシ−γ−アミノ酪酸を含む。遺伝コードを拡張するための様々な形式が当該技術分野で既知であり、本発明の実施に利用されてもよい。（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ，Ｗ．，２００６，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１３（１０）：１０１１−１２を参照のこと）
【００７４】
そのような非標準的アミノ酸または翻訳後修飾を組み込んだアぺリン類似体は、既知の方法によって合成することができる。例示的なアぺリン類似体は、Ｎα−メチルアルギニン−アぺリン−Ａ１２類似体、［Ｎｌｅ７５，Ｔｙｒ］アぺリン−３６，［Ｇｌｐ６５Ｎｌｅ７５，Ｔｙｒ７７］アぺリン−１３，（Ｐｙｒ１）［Ｍｅｔ（Ｏ）１１］−アぺリン−１３，（Ｐｙｒ１）−アぺリン−１３、［ｄ−Ａｌａ１２］−Ａ１２、およびＮ−α−アセチル−ノナ−Ｄ−アルギニンアミドアセテートを含む。
【００７５】
切断、例えば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）による切断に対して耐性であるように修飾されたアぺリン融合タンパク質のアぺリン成分の類似体も、本発明に含まれる。そのようなアぺリン類似体は、虚血に対する心筋の反応のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、非修飾アぺリンリガンドと比較して著しい有効性の増加を示している（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｕｌｙ  １，２０１３，Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２：ｅ０００２４９）。
【００７６】
そのような切断から保護されたアぺリン融合タンパク質は、置換変異体、すなわち、タンパク質内の１つ以上の切断部位における１つのアミノ酸と別のアミノ酸との交換によって作製された変異体を含むように修飾されたアぺリンペプチドを含む。そのようなアミノ酸置換は、タンパク質の他の機能または特性を喪失することなく、高い安定性を付与するために想定される。切断から保護された他のアぺリン融合タンパク質は、末端アミノまたはアセチル基を含むように修飾されたアぺリンペプチドを含む。いくつかの実施形態において、切断から保護されたアぺリン融合タンパク質は、タンパク新生アミノ酸、非標準的アミノ酸、または翻訳後修飾アミノ酸を含む。さらに他の切断から保護されたまたは切断に対して耐性であるアぺリン融合タンパク質は、１つ以上のさらなるＮ末端アミノ酸を含む修飾アぺリンペプチドを含む。そのような修飾アぺリンペプチドは、ペプチドがＡＰＬＮＲを活性化する能力を変化させないことが望ましい。ＡＰＬＮＲを活性化する本発明の例示的な修飾アぺリンペプチドおよび融合タンパク質は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４を含む。
【００７７】
アぺリンは、前述のように、ＡＰＬＮＲ、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンドであることが知られている。本明細書において使用される「リガンド」という用語は、受容体等の別の分子に結合する分子を意味する。Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合することができるリガンド分子は、イオン、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、二重特異性抗体、抗体断片、タンパク質、および有機大分子からなる群から選択される。リガンドは、それが結合する受容体を通して付与する活性の状態に応じて、例えば、アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、競合的アンタゴニスト、正のアロステリック調節因子、または負のアロステリック調節因子として、さらに特徴付けられてもよい。例えば、ＧＰＣＲに結合するアゴニストの場合、そのようなＧＰＣＲを不活性状態に維持する他の分子の相互作用が妨害される。
【００７８】
本明細書において使用される「アゴニスト」という用語は、ＡＰＬＮＲ受容体等の受容体と相互作用（直接的または間接的に結合）してそれを活性化し、内因性リガンドと結合した場合等に、その受容体に特徴的な生理学的または薬理学的応答を開始させる部分を含む。例えば、ＧＰＣＲと結合すると、部分は、細胞内応答を活性化するか、ＧＴＰの細胞膜への結合を増強するか、または受容体を内在化させることができる。そのようなアゴニスト部分は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、または小分子であってもよい。
【００７９】
本明細書において使用される「アンタゴニスト」という用語は、アゴニストと同じ部位（例えば、内因性リガンド）で受容体に競合的に結合するが、受容体の活性形態によって開始される細胞内応答を活性化せず、それによってアゴニストまたは部分アゴニストによる細胞内応答を阻害する部分を意味することが意図される。いくつかの場合において、アンタゴニストは、アゴニストまたは部分アゴニストの非存在下ではベースライン細胞内応答を低下させない。アンタゴニストは、必ずしも競合的結合阻害剤として機能する必要はないが、アゴニストを隔離することによって、または下流効果を間接的に調節することによって作用し得る。
【００８０】
７回膜貫通ドメイン受容体であるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、典型的には、アルファ（α）、ベータ（β）、およびガンマ（γ）サブユニットからなるヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介してそれらの細胞シグナルを伝達する一方で、αサブユニットは、ＧＴＰ／ＧＤＰの結合部位を含有し、βγ二量体は、不活性状態でαサブユニットに結合する。Ｇタンパク質は、細胞膜の細胞質側で自然に発生する。細胞外リガンドの結合は、受容体タンパク質において立体構造変化を引き起こし、それによってグアニン−ヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）と接触することができ、したがってＧＴＰとＧＤＰとの交換を促進する。交換時には、βγ二量体がαサブユニットから解離する。活性化されたαサブユニットとβγ二量体の両方が、細胞内エフェクタータンパク質に影響を及ぼし得る。
【００８１】
一般的に、ＧＰＣＲは、特定のＧαタンパク質サブユニットファミリーを活性化し、それによって特定のシグナル伝達経路の活性化または不活性化を引き起こす。アぺリン受容体（ＡＰＬＮＲ）は、ＧＰＣＲである。
【００８２】
リガンドまたは結合分子と相互作用するト、アぺリン受容体（ＡＰＬＮＲ）は、１）阻害性Ｇタンパク質サブユニットＧαｉ／ｏ、２）ＰＫＣを介したＥＲＫの活性化、または３）ＧＰＣＲの内在化によって開始されるシグナル伝達を含むいくつかの細胞内シグナル伝達カスケードのうちの１つ以上を引き起こす。換言すると、ＡＰＬＮＲの活性状態における薬理学的および／または生理学的応答は、Ｇαｉサブユニットの下流作用（例えば、アデニリルシクラーゼを阻害する）、リン酸化ＥＲＫ、または内在化ＡＰＬＮＲによって決定される。他の細胞内エフェクターが、活性化ＡＰＬＮＲによって結合されてもよいことを理解されたい。
【００８３】
最初はＡＰＪ受容体と名付けられた（Ｏ’Ｄｏｗｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ  １３６（１−２）：３５５−３６０）アぺリン受容体（ＡＰＬＮＲ）は、３８０のアミノ酸からなる７回膜貫通ドメインのオーファン受容体としてヒトゲノムＤＮＡから単離された。（参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５１５２を参照のこと。）ウシの胃の組織抽出物から、０．１〜１００ｎＭの範囲でＡＰＬＮＲ（ＡＰＪ）を発現するＣＨＯ細胞において酸性化速度を促進するアぺリンペプチドが明らかとなり、アぺリンは、ＡＰＬＮＲ（ＡＰＪ）の内因性リガンドであることが示された（Ｔａｔｅｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２５１：４７１−４７６）。
【００８４】
アぺリンとＡＰＬＮＲとの間の相互作用、ひいてはアぺリン融合タンパク質とＡＰＬＮＲとの間の相互作用は、関連技術分野の当業者に既知である多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、試験管またはプレート内）、ｅｘ  ｖｉｖｏ（例えば、生きた動物由来の細胞培養物中）、およびｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、生きた動物における）バイオアッセイによって測定することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアゴニストは、アぺリン−３６、アぺリン−１９、アぺリン−１７、アぺリン−１３、アぺリン−１２、Ｎα−メチルアルギニン−アぺリン−Ａ１２類似体、［Ｎｌｅ７５、Ｔｙｒ］アぺリン−３６、［Ｇｌｐ６５Ｎｌｅ７５，Ｔｙｒ７７］アぺリン−１３、（Ｐｙｒ１）［Ｍｅｔ（Ｏ）１１］−アぺリン−１３、および（Ｐｙｒ１）−アぺリン−１３からなる群から選択される。
【００８６】
一実施形態において、アぺリン融合ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１、ならびにその断片または誘導体からなる群から選択されるＡＰＬＮＲアゴニストである。
【００８７】
受容体のアンタゴニストは、ＡＰＬＮＲの降圧作用を妨げることが分かっている。アぺリン−１３のＣ末端のフェニルアラニン（Ｆ）をアラニン（Ａ）に変更することによって作製されるアぺリンペプチド誘導体（アぺリン−１３（Ｆ１３Ａ）；配列番号２９）は、Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．２００５（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １４６（１）：２３１−２３６）によって機能的アンタゴニストとして記載されている。ＡＰＬＮＲアンタゴニストＦ１３Ａはまた、肝硬変動物において循環機能および腎機能を改善することも報告されており、アンタゴニストが、肝臓の線維症等の病原性疾患において上方制御されたアぺリン系の過滑動影響を媒介した可能性が示唆される（Ｐｒｉｎｃｉｐｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４８（４）：１１９３−１２０１）。いくつかの実施形態において、ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、アぺリン−１３（Ｆ１３Ａ）（配列番号２９）、［ｄ−Ａｌａ１２］−Ａ１２、シクロ（１−６）ＣＲＰＲＬＣ−ＫＨ−シクロ（９−１４）ＣＲＰＲＬＣ、およびＮ−α−アセチル−ノナ−Ｄ−アルギニンアミドアセテート（ＡＬＸ４０−４Ｃ；ＣＡＳ登録番号１５３１２７−４９−２）からなる群から選択される。
【００８８】
別の実施形態において、アぺリン融合タンパク質またはポリペプチドは、ＡＰＬＮＲ結合分子を含む。他の実施形態において、アぺリン融合タンパク質またはポリペプチドは、ＡＰＬＮＲアゴニストを含む。いくつかの実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、ＡＰＬＮＲアンタゴニストを含む。
【００８９】
受容体アッセイ
受容体スクリーニングアッセイは、本発明のアぺリン融合タンパク質だけではなく、ＡＰＬＮＲのアゴニストおよびアンタゴニストを含むいずれの試験化合物も供することができることを理解されたい。ＡＰＬＮＲの活性化または不活性化を決定するための多くの受容体スクリーニングアッセイが当該技術分野で周知であり、以下の例は、本発明者が彼らの発明であると見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。
【００９０】
ＧＰＣＲによって媒介されるグアニンヌクレオチド交換は、対象となるＧＰＣＲを発現する細胞から調製した細胞膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を測定することによって監視する。Ｇｉ／ｏは、ほとんどの細胞において最も豊富なＧタンパク質であり、他のＧタンパク質よりも迅速なＧＤＰ−ＧＴＰ交換速度を有するため、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、一般的にＧｉ／ｏ共役型受容体に有用である（Ｍｉｌｌｉｇａｎ  Ｇ．，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ，２００３，２４：８７−９０）。市販のＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＳＰＡＴＭ）キットは、所望の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合αサブユニットの測定を可能にする（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）。
【００９１】
Ｇｉ／ｏ共役型受容体の活性化は、アデニリルシクラーゼ活性の低下をもたらし、その結果、ＧαサブユニットＧｉまたはＧｏを介して細胞においてｃＡＭＰの阻害をもたらす。阻害シグナルを最大化するために、典型的にはフォルスコリン（アデニリルシクラーゼの直接的なアクチベーター）を用いて、アッセイにおいてアデニリルシクラーゼ、ひいてはｃＡＭＰを刺激し、それによって阻害シグナルをより容易に検出可能にする。Ｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＳＰＡ（商標）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｆｌａｓｈ−Ｐｌａｔｅ（商標）ｃＡＭＰアッセイ、ならびに蛍光または発光に基づく同種アッセイ（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（商標）（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＦＬＩＰＲ（登録商標）（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））が、細胞内ｃＡＭＰの蓄積を測定するために利用可能である。
【００９２】
ＡＰＬＮＲのようなｃＡＭＰレベルを調節するＧＰＣＲの作用は、ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）による細胞内のルシフェラーゼ転写と関連している可能性がある。ＣＲＥ−ルシフェラーゼ構築物（ＣＲＥ応答性ルシフェラーゼ）は、ＣＲＥ転写応答要素（ＴＲＥ）のプロモーターおよびタンデムリピートの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする。受容体の活性化に続いて、化学発光検出試薬の添加後、細胞内で発現されるルシフェラーゼの量によって細胞中のｃＡＭＰの蓄積が測定される。ＡＰＬＮＲおよび他のＧｉ共役型受容体の場合、ｃＡＭＰを誘導するためにフォルスコリンが添加され、ＣＲＥ活性（化学発光）の低下がＧＰＣＲの活性化を示唆する。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）等の種々の市販のキットが利用可能である。
【００９３】
いくつかの場合、アゴニストの受容体への結合は、Ｇタンパク質媒介性シグナル伝達を引き起こすことなく、またはＧタンパク質媒介性シグナル伝達を緩徐にすることなく、アレスチン媒介性シグナル伝達を開始することができる。ベータ−アレスチン（β−アレスチン）と細胞表面のＧＰＣＲとの相互作用は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を受容体と脱共役させ、他の細胞シグナル伝達カスケードを引き起こすことができる。β−アレスチンは、エンドサイトーシスおよびＥＲＫ経路の活性化を引き起こすことが知られている。ある例示的アッセイにおいて、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕ）に融合したＧＰＣＲと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したβ−アレスチンとの相互作用を調べるために、生物発光共鳴エネルギー転移またはＢＲＥＴが用いられた。この例では、ＢＲＥＴは、組換え発現ＧＰＣＲ−Ｒｌｕとβ−アレスチン−ＧＦＰとがルシフェラーゼ基質セレンテラジン添加後に近接した際のそれらの間のエネルギー伝達に基づいており、全細胞におけるこれらのタンパク質−タンパク質間相互作用のリアルタイムでの評価の測定が可能である。
【００９４】
β−アレスチンと活性化ＧＰＣＲとの相互作用を検出することによりＧＰＣＲの活性化を直接測定するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＧＰＣＲアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）等の他のアッセイも開発されている。端的に述べると、ＧＰＣＲを、小さな酵素断片ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）とインフレームで融合し、β−アレスチンの融合タンパク質およびβガラクトシダーゼの欠失変異体（すなわち、β−ｇａｌ、酵素アクセプター、またはＥＡ）を安定に発現する細胞において共発現させる。ＧＰＣＲの活性化は、β−アレスチンのＰｒｏＬｉｎｋタグ付きＧＰＣＲへの結合を刺激し、２つの酵素断片の相補性が活性なβ−ｇａｌ酵素の形成をもたらす。酵素活性の増加（すなわち、ＧＰＣＲの活性化）は、化学発光検出試薬を使用して測定することができる。
【００９５】
β−アレスチン分子は、ＡＰＬＮＲ等のＧＰＣＲの活性化後にＧＰＣＲの内在化（すなわち、エンドサイトーシス）を調節することが示されている。アゴニストによるＧＰＣＲの活性化は、受容体の立体構造変化、リン酸化、およびβ−アレスチンまたは他の経路の活性化を引き起こし、細胞表面からの受容体の隔離を媒介する。隔離機構は、脱感作（すなわち、受容体が内在化後に分解する）または再感作（すなわち、受容体が細胞表面に再利用される）の手段であり得る。概説については、例えば、Ｃｌａｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６：６１−７９を参照のこと。
【００９６】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、受容体の内在化を妨げ得る。ＡＰＬＮＲアゴニストは、ＡＰＬＮＲの内在化および／または再感作を誘導することができる（Ｌｅｅ，ＤＫ，ｅｔ  ａｌ．２０１０，ＢＢＲＣ，３９５：１８５−１８９）。いくつかの実施形態において、内在化アッセイによって測定されるように、ＡＰＬＮＲアゴニストは、ＡＰＬＮＲの再感作を示すかまたは誘導する。他の実施形態において、内在化アッセイによって測定されるように、ＡＰＬＮＲアゴニストは、ＡＰＬＮＲの細胞表面受容体のコピーの増加を示すかまたは誘導する。任意の内在化アッセイにおいて受容体内在化の程度（増加等）を測定することは、非内在化測定値（すなわち、以前にアゴニストに曝露されていない細胞）とアッセイにおいてアゴニストによって得られた測定値との間の差を決定することによって行われる。
【００９７】
アぺリン受容体の隔離、ひいてはアぺリン受容体のコピーは、当該技術分野で周知の多くの方法によって測定することができる。ＡＰＬＮＲアゴニストによる刺激は、特定の細胞の表面上で受容体コピーの増加または減少を引き起こし得る。例えば、ＡＰＬＮＲの内在化を誘導するアぺリン受容体アゴニストは、血圧に影響を及ぼし得る。受容体内在化アッセイは、例えば、蛍光標識もしくは放射標識リガンド、または免疫標識（蛍光タグ付き抗受容体抗体）の後に、顕微鏡およびデジタル画像技術を用いて日常的に行われる（例えば、Ｅｌ  Ｍｅｓｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，９０：１２９０−１３０１；およびＥｖａｎｓ，Ｎ．，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２４：１２．６．１−１２．６．２２を参照のこと）。
【００９８】
ＡＰＬＮＲ受容体を発現する細胞からの細胞可溶化物中でリン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）を測定して、ＡＰＬＮＲの活性化を決定することができる。内因性の細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ１およびＥＲＫ２）は、保存されたセリン／スレオニンタンパク質キナーゼのファミリーに属し、様々な刺激に関連する細胞シグナル伝達事象に関与する。ＥＲＫタンパク質のキナーゼ活性は、ＥＲＫ１のスレオニン２０２／チロシン２０４、およびＥＲＫ２のスレオニン１８５／チロシン１８７において二重リン酸化によって調節される。ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、この経路においてＥＲＫ１／２に関与する主要な上流キナーゼである。他のキナーゼおよび転写因子を含む、ＥＲＫ１／２の多くの下流標的が同定されている。１つの例において、ｐ−ＥＲＫ１／２アッセイは、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法を用いて、組換えまたは内因性受容体を発現する細胞培養物の細胞可溶化物においてＥＲＫ１の特異的リン酸化を測定する。別の例において、ｐ−ＥＲＫ１／２アッセイは、ＥＲＫ１中のリン酸化Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４またはＥＲＫ２中のｐｈｏｓ−Ｔｈｒ１８５／Ｔｙｒ１８７を認識する一次（非結合）抗体、および一次抗体を認識する結合型二次抗体を使用する一方で、結合型二次ｍＡｂは、外因的に添加された基質と反応する結合体等の検出方法を提供する。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＳｕｒｅＦｉｒｅ（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ＥＬＩＳＡＯｎｅ（ＴＧＲ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）等）等の種々の市販のキットが利用可能である。
【００９９】
本明細書において使用される場合、リガンドの受容体（例えば、ＧＰＣＲ）への結合、または抗体の抗原への結合等の文脈における「結合」という用語は、受容体−リガンド間の相互作用、または抗体−抗原間の相互作用等の最低でも２つの物体または分子構造の間の相互作用または会合を指す。したがって、「受容体結合分子」は、受容体と結合する、すなわち、相互作用するタンパク質等のリガンドまたは他の部分を指す。
【０１００】
例えば、リガンド（例えば、アぺリン融合タンパク質）と受容体（例えば、ＡＰＬＮＲまたはＡＰＬＮＲのリガンド結合断片）との間の結合親和性は、典型的には、約１０−８Ｍ未満等、約１０−９Ｍ未満等の約１０−７Ｍ未満のＫＤ値に相当する。結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器を使用した表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）等のいくつかの方法のうちのいずれか１つ以上によって決定することができる。したがって、リガンドは、非特異的リガンド（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合の親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低いＫＤ値に相当する親和性で受容体に結合する。
【０１０１】
本明細書において使用される「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定のリガンド−受容体間の相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤと結合親和性との間には逆の関係が存在するため、ＫＤ値が低いほど親和性がより高くなる。したがって、「より低い親和性」という用語は、相互作用を形成するためのより低い能力と、したがってより高いＫＤ値とに関連する。
【０１０２】
本明細書において使用される「ｋｄ」という用語（秒−１または１／ｓ）は、特定のリガンド−受容体間の相互作用の解離速度定数を指す。前記値はまた、ｋｏｆｆ値とも称される。
【０１０３】
本明細書において使用される「ｋａ」という用語（Ｍ−１×秒−１または１／Ｍ）は、特定のリガンド−受容体間の相互作用の会合速度定数を指す。
【０１０４】
本明細書において使用される「ＫＡ」という用語（Ｍ−１または１／Ｍ）は、特定のリガンド−受容体間の相互作用の会合平衡定数、または抗体−抗原間の相互作用の会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋａをｋｄで除すことによって得られる。
【０１０５】
本明細書において使用される「ＥＣ５０」または「ＥＣ５０」という用語は、半最大有効濃度を指し、指定の曝露時間後に、ベースラインと最大値との中間の応答、例えば細胞応答を誘導するリガンドの濃度を含む。ＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察されるリガンドの濃度を本質的に意味する。よって、細胞のシグナル伝達に関して、ＥＣ５０値、すなわち、半最大有効濃度の値が減少すると、活性の増加が観察される（より大きな応答をもたらすためにより少ないリガンドが必要である）。
【０１０６】
一実施形態において、結合の減少は、標的受容体または受容体を発現する細胞への半最大結合を可能にするＥＣ５０タンパク質濃度の増加を指す。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、活性の低下は、標的受容体または受容体を発現する細胞の半最大活性化を可能にするＥＣ５０タンパク質濃度の増加を指す。
【０１０８】
本明細書において使用される「ＩＣ５０」または「ＩＣ５０」という用語は、細胞応答の半最大阻害濃度を指す。換言すると、生物学的または生化学的機能の阻害における特定の部分（例えば、タンパク質、化合物、または分子）の有効性の尺度であり、アッセイによって、所与の生物学的プロセスを阻害するために必要とされるそのような部分の量が定量化される。よって、細胞のシグナル伝達に関して、ＩＣ５０、または半最大阻害濃度の値が減少すると、より高い阻害活性が観察される。
【０１０９】
一実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、ＡＰＬＮＲの活性化を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満、または約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＥＣ５０を有するＡＰＬＮＲのアゴニストである。一実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、アぺリンペプチドのＮ末端に連結されたＦｃドメインを含み、約１ｎＭ未満、または約５００ρＭ未満のＥＣ５０を示す。
【０１１０】
本発明のアぺリン融合タンパク質
融合タンパク質を作製する方法は、当該技術分野で既知である。そのような１つの方法において、ＤＮＡ発現ベクターが１つの連続した融合ポリペプチドを発現するように、Ｆｃをコードする核酸配列にインフレームで連結されたアぺリンをコードする核酸配列を含有するようにＤＮＡ発現ベクターが操作される。アぺリンペプチドは、Ｆｃ含有ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に連結されてもよい。本発明のアぺリン融合タンパク質は、アぺリンペプチド単独よりも安定であることが予測される。血清安定性タンパク質は、分解に対する耐性を付与するか、または循環からのクリアランスの低下を有するタンパク質を含む。例示的な本発明の血清安定性アぺリン融合タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１を含む。
【０１１１】
融合タンパク質を構築する文脈において、「インフレームで結合」という句は、成分の完全な翻訳、使用、または操作が可能であり、したがって破壊されないように、それらが一緒に連結されることを意味する。例えば、少なくとも２つのポリペプチドを含む融合タンパク質は、ポリペプチドの間にリンカーまたはスペーサー配列を有してもまたは有しなくてもよく、したがって、ポリペプチドは、各ポリペプチドと１つの連続したポリペプチドとしてインフレームで結合され、その操作性を維持する。融合タンパク質中で一緒に連結または融合された２つ以上のポリペプチドは、典型的には２つ以上の独立した源に由来し、したがって、融合タンパク質は、天然では通常連結された状態では見られない２つ以上の連結されたポリペプチドを含む。さらに、そのような融合タンパク質をコードするＤＮＡは、そのようなポリペプチドをコードする転写ｍＲＮＡ分子の作動可能なインフレーム（例えば、トリプレットコドン）翻訳を維持するリンカー配列を含有してもよい。
【０１１２】
ＤＮＡ発現ベクター構築物の文脈等において、「作動可能に連結された」という句は、制御配列、例えば、プロモーターまたはオペレーターが、コード配列によってコードされるポリペプチドの産生を誘導するように、コード配列に対する位置に適切に配置されることを意味する。
【０１１３】
「シグナルペプチド」または「シグナルペプチド配列」という用語は、細胞の細胞膜（原核生物では細胞膜、真核生物では小胞体膜）を横切ってまたはその中にポリペプチドを誘導する、新しく合成された分泌ポリペプチドまたは膜ポリペプチドのＮ末端に通常存在するペプチド配列として本明細書において定義される。それは、通常、酵素切断によって後に除去される。いくつかの実施形態において、前記シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞の分泌経路内に誘導することが可能であり得る。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、マウスＲＯＲ１の１−２９からのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＡ７５４８０（配列番号１０））を含む。他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号９に示されるシグナルペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の相同性を有する。さらに他の実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号９に示されるシグナルペプチドの核酸配列と、少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の相同性を有するヌクレオチドによってコードされる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質の成分またはペプチドは、リンカー（または「スペーサー」）ペプチドによって分離される。そのようなペプチドリンカーは、当該技術分野で周知であり（例えば、ポリグリシン）、典型的には融合タンパク質の成分の一方または両方の適切なフォールディングを可能にする。リンカーは、融合タンパク質の成分の柔軟な接合領域を提供し、分子の２つの端部が独立して動くことを可能にし、２つの部分の各々の適切な機能を保持する上で重要な役割を果たし得る。したがって、接合領域は、場合によっては、２つの部分を組み合わせるリンカー、および２つの部分の各々がその生物学的構造を形成することを可能にし、かつ他の部分に干渉しないスペーサーの両方として作用する。さらに、接合領域は、対象の免疫系によって異物として認識されない、換言すると免疫原性であると見なされない、エピトープを形成する。リンカーの選択も、融合分子の結合活性に影響を及ぼし得る。（Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ，１９８８，ＰＮＡＳ，８５：１６：５８７９−８３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｂａｔｅｓ，１９９８，ＰＮＡＳ  ９５（１１）：５９２９−３４；Ａｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．２００１，ＰＥＤＳ，１４（８）：５２９−３２；およびＣｈｅｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６５：１３５７−１３６９を参照のこと。）一実施形態において、アぺリンペプチドは、１つ以上のペプチドリンカーを介して、Ｆｃ含有ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端、またはその断片に接続される。
【０１１５】
リンカー鎖の長さは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸残基であってもよいが、典型的には５〜２５の残基である。リンカーの例として、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（３Ｇｌｙ）、４Ｇｌｙ、５Ｇｌｙ、６Ｇｌｙ、７Ｇｌｙ、８Ｇｌｙ、または９Ｇｌｙ等のポリグリシンリンカーが挙げられる。リンカーの例として、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、および（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝１〜１０）等のＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーが挙げられる。（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎおよび（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎは、それぞれ、（Ｇ４Ｓ）ｎおよび（Ｓ４Ｇ）ｎとしても知られる。
【０１１６】
そのような本発明の一実施形態において、アぺリンペプチドは、１つ以上のＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＦｃ含有ポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端、またはその断片に接続される。
【０１１７】
一実施形態において、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３、または（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４である。一実施形態において、ペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号１１）を含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、１つ以上のペプチドリンカーまたはスペーサーを介してＦｃ融合ポリペプチドのＮ末端に接続される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、発現ベクターにおいてＦｃ融合タンパク質の上流でコードされ、スペーサーは、シグナルペプチドとＦｃ融合タンパク質のＮ末端との間で、インフレームでエンコードされる。別の実施形態において、ペプチドリンカーまたはスペーサーは、ＲＳＴＧＳＰＧＳＧ（配列番号１２）を含む。
【０１１９】
修飾アぺリン融合ポリペプチド
他の実施形態において、本発明のいずれのＦｃ融合タンパク質の配列が、Ｎ連結グリコシル化のためのいずれのアクセプター部位も含まないように修飾されてもよい。さらに他の実施形態において、本発明のいずれのＦｃ融合タンパク質の配列が、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強するかまたは減少させるように修飾されてもよい。他の実施形態において、本発明のいずれのＦｃ融合タンパク質の配列が、切断または分解に耐性であるように修飾されてもよい。そのため、アぺリン−Ｆｃ融合タンパク質のアぺリンペプチドに対する１つ以上のＣ末端アミノ酸の付加は、分解に対する耐性等の高い安定性を付与し得る。１つの理論に拘束されるものではないが、付加的なＣ末端アミノ酸は、ペプチドまたは融合タンパク質内の切断部位に対する感受性を排除し得る。安定性は、循環からのクリアランス（すなわち、腎排泄または腎クリアランス）の低下または減速に起因して付与され得る。アぺリンペプチドに対するそのような修飾は、それらがＡＰＬＮＲを活性化させる能力を変化させない。例示的な修飾アぺリンペプチドは、表３および４に含まれ、例えば、配列番号３８、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４である。本発明の例示的なアぺリン融合タンパク質は、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１を含む。
【０１２０】
一般的に、本明細書に記載のＦｃ融合タンパク質を含むタンパク質は、任意の好適な数のそのような修飾アミノ酸の包含（上述の非標準的アミノ酸を含む）および／または共役置換基との会合によって修飾されてもよい。この文脈における適合性は、一般的に、Ｆｃ融合タンパク質の関連する選択性および／または特異性、例えば、ＡＰＬＮＲへの結合を少なくとも実質的に保持する能力によって決定される。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、ゲラニル−ゲラニル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸、または有機誘導体化剤に結合したアミノ酸等から選択されてもよい。１つ以上の修飾アミノ酸の包含は、例えば、ポリペプチドの血清半減期をさらに増加させる、ポリペプチドの抗原性を低下させる、またはポリペプチドの保存安定性を増加させる上で、有利であり得る。アミノ酸（複数可）は、例えば、組換え産生の間に同時翻訳的にもしくは翻訳後に修飾されるか（例えば、哺乳動物細胞における発現の間のＮ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフにおけるＮ連結グリコシル化）、または合成手段によって修飾される。修飾アミノ酸の非限定的な例として、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル−ゲラニル化）アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、脂肪アシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸等が挙げられる。アミノ酸の修飾において当業者を導くための適切な参考資料は、文献を通して豊富である。例示的なプロトコルは、Ｗａｌｋｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｏｎ  ＣＤ−Ｒｏｍ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに見出される。
【０１２１】
また、本発明のＦｃ融合タンパク質を含むタンパク質は、例えば、それらの循環半減期をさらに増加させるために、ポリマーに共有結合させることによって化学的に修飾してもよい。例示的なポリマーおよびそれらをペプチドに付着させるための方法は、例えば、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、および同第４，６０９，５４６号に示される。実例となるさらなるポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、約１，０００〜約４０，０００、例えば約２，０００〜約２０，０００、例えば、約３，０００〜１２，０００ｇ／ｍｏｌの分子量のＰＥＧ）を含む。例えば、ラットにおいて長期の変力効果を有するポリペプチドであるＰＥＧ−アぺリン−３６について記載する国際公開第ＷＯ２０１２／１２５４０８号を参照のこと。
【０１２２】
一実施形態において、１つ以上の放射標識アミノ酸を含むＦｃ融合タンパク質を含むタンパク質が提供される。診断と治療の両方の目的で放射標識抗体が用いられてもよい。別の実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質を含むタンパク質を、治療薬または検出可能なマーカーである分子に結合させてもよい。一実施形態において、治療薬は、放射性同位元素等の細胞傷害剤である。ポリペプチド用の放射性同位元素の例として、限定されないが、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、および１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、および２２５Ａｃが挙げられる。放射標識アミノ酸および関連するペプチド誘導体を調製するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））のＪｕｎｇｈａｎｓら、および米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０（米国特許ＲＥ３５，５００）号、同第５，６４８，４７１号、および同第５，６９７，９０２を参照のこと。例えば、放射性同位元素は、クロラミンＴによって結合されてもよい。さらなる実施形態において、検出可能なマーカーは、放射標識、酵素、発色段、または蛍光標識であってもよい。
【０１２３】
発現系
本発明は、ポリペプチド、例えば、本発明のアぺリンＦｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターを提供する。そのような発現ベクターは、本発明のポリペプチドの組換え産生のために使用されてもよい。
【０１２４】
本発明の文脈における発現ベクターは、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（好適な発現制御要素のセットを含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってもよい。そのようなベクターの例として、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、およびウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、線状発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １２，３５５−５９（１９９７）に記載されるような）、小型核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号および／もしくは国際公開第ＷＯ００／７００８７号に記載されるような）、またはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、もしくはｐＵＣ１１８／１１９等のプラスミドベクターを含む、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に含まれる。そのような核酸ベクターおよびその使用法は、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号および同第５，９７３，９７２号を参照のこと）。
【０１２５】
別の実施形態において、ベクターは、記載される核酸分子を含む発現ベクターを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含み、核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結されている。
【０１２６】
一実施形態において、ベクターは、細菌細胞における本発明のポリペプチドの発現に適している。そのようなベクターの例として、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５５０３−５５０９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等の発現ベクターが挙げられる。
【０１２７】
発現ベクターは、同様にまたは代替として、酵母系における発現に適したベクターであってもよい。酵母系における発現に適したいずれのベクターが用いられてもよい。好適なベクターは、例えば、酵母α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨ等の構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを含む（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＧｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５３，５１６−５４４に概説される）。
【０１２８】
他の実施形態において、発現ベクターは、バキュロウイルス感染昆虫細胞における発現に適している。（Ｋｏｓｔ，Ｔ；ａｎｄ  Ｃｏｎｄｒｅａｙ，ＪＰ，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（５）：４２８-３３。）
【０１２９】
核酸分子が哺乳動物宿主細胞における発現に適した発現制御配列に作動可能に連結された、本発明の核酸分子を含むベクターが提供される。
【０１３０】
発現制御配列は、種々の細胞系において対象となる遺伝子の転写、およびその後のタンパク質の発現を制御および駆動するように操作される。プラスミドは、対象となる発現可能な遺伝子を、例えば、プロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター等の望ましい要素を含む発現制御配列（すなわち、発現カセット）と組み合わせる。本発明の発現ベクターにおいて、Ｆｃ融合タンパク質または抗体をコードする核酸分子は、いずれの好適なプロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター、リプレッサータンパク質、ポリＡ終結配列、および他の発現を促進する要素を含んでもよいか、またはそれらと結合してもよい。
【０１３１】
本明細書において使用される「プロモーター」は、それが作動可能に連結された、すなわち、適切なシグナルが存在する場合にＦｃ融合タンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列の転写を許容するような様式で連結されたＤＮＡ配列の転写を誘導するのに十分なＤＮＡ配列を示す。Ｆｃ融合タンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、当該技術分野で既知のいずれのプロモーターまたはエンハンサー要素の制御下に置かれてもよい。そのような要素の例として、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター／エンハンサー、またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ−ＭＩＥ）プロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター）が挙げられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＣＭＶ−ＭＩＥ、ＲＳＶ、ＳＬ３−３、ＭＭＴＶ、Ｕｂｉ、ＵｂＣ、およびＨＩＶ  ＬＴＲからなる群から選択されるプロモーターを含む。
【０１３３】
本発明の核酸分子はまた、有効なポリ（Ａ）終結配列、大腸菌中のプラスミド産物のための複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または都合のよいクローニング部位（例えば、ポリリンカー）に作動可能に連結されてもよい。核酸はまた、ＣＭＶ  ＩＥ等の構成的プロモーターとは対照的に、調節可能な誘導性プロモーター（誘導性、抑制可能、発生的に制御される）を含んでもよい（当業者は、そのような用語が特定の条件下における遺伝子発現の程度の記述子であることを理解するであろう）。
【０１３４】
選択可能なマーカーは、当該技術分野で周知の要素である。選択的条件下では、適切な選択可能なマーカーを発現する細胞のみが生存することができる。一般的に、選択可能なマーカー遺伝子は、タンパク質、通常は、細胞培養において種々の抗生物質に耐性を付与する酵素を発現する。他の選択的条件において、蛍光タンパク質マーカーを発現する細胞が可視化され、したがって選択可能である。実施形態は、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）（ベータ−ラクタム抗生物質耐性またはアンピシリン耐性遺伝子またはａｍｐＲ）、ｂｌｓ（ブラストサイジン耐性アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ｂｓｄ（ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼ耐性遺伝子）、ｂｓｒ（ブラストサイジン−Ｓ耐性遺伝子）、Ｓｈ  ｂｌｅ（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、ｔｅｔＭ（テトラサイクリン耐性遺伝子またはｔｅｔＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ）（ネオマイシン耐性遺伝子またはｎｅｏＲ）、ｋａｎＲ（カナマイシン耐性遺伝子）、およびｐａｃ（ピューロマイシン耐性遺伝子）を含む。
【０１３５】
特定の実施形態において、ベクターは、ｂｌａ、ｂｌｓ、ＢＳＤ、ｂｓｒ、Ｓｈ  ｂｌｅ、ｈｐｔ、ｔｅｔＲ、ｔｅｔＭ、ｎｐｔ、ｋａｎＲ、およびｐａｃからなる群から選択される１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。他の実施形態において、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、高感度シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする１つ以上の選択的なマーカー遺伝子を含む。
【０１３６】
本発明の目的のために、真核細胞における遺伝子発現は、オペレーターによって制御される強力なプロモーターを使用して厳密に調節されてもよく、同様にオペレーターは、組換え「調節融合タンパク質」（ＲＦＰ）であってもよい調節タンパク質によって調節される。ＲＦＰは、転写ブロッキングドメインと、その活性を調節するリガンド結合ドメインから本質的になる。そのような発現系の例は、米国特許出願公開第２００９０１６２９０１Ａ１号に記載され、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
本明細書において使用される「オペレーター」は、ＲＦＰのオペレーターへの結合によって遺伝子が調節され得、その結果、対象となる遺伝子、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドの転写を妨げるかまたは可能にするような様式で遺伝子の中またはその近傍に導入されるＤＮＡ配列を意味する。原核細胞およびバクテリオファージにおいて、多くのオペレーターが十分に特徴付けられている（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｄ．，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｄ．Ｖｏｌ  ２  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．１９９６）。これらは、限定されないが、大腸菌のＬｅｘＡ遺伝子のオペレーター―領域（ＬｅｘＡペプチドに結合する）、ならびにラクト―スおよびトリプトファンオペレーター（大腸菌のＬａｃＩおよびｔｒｐＲ遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質に結合する）を含む。これらは、λＰＲおよびファージＰ２２  ａｎｔ／ｍｎｔ遺伝子からのバクテリオファージオペレーター（λｃＩおよびＰ２２  ａｒｃによってコードされるリプレッサータンパク質に結合する）も含む。いくつかの実施形態において、ＲＦＰの転写ブロッキングドメインがＮｏｔＩ等の制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者は、プロモーターによって転写を制御することができるように、オペレーターが、プロモーターに隣接して位置するかまたは３’に位置しなければならないことを認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９７２，６５０号は、ｔｅｔＯ配列がＴＡＴＡボックスから特定の距離内にあることを明確に述べている。特定の実施形態において、オペレーターは、好ましくは、プロモーターのすぐ下流に配置される。他の実施形態において、オペレーターは、プロモーターから１０塩基対以内に配置される。
【０１３８】
特定の実施形態において、オペレーターは、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）、ＮｏｔＩ認識配列（これには馴染みがない：ＮｏｔＩは制限酵素として知っている）、ＬｅｘＡオペレーター、ラクトースオペレーター、トリプトファンオペレーター、およびＡｒｃオペレーター（ＡＯ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リプレッサータンパク質は、ＴｅｔＲ、ＬｅｘＡ、ＬａｃＩ、ＴｒｐＲ、Ａｒｃ、ＬａｍｂｄａＣ１、およびＧＡＬ４からなる群から選択される。他の実施形態において、転写ブロッキングドメインは、真核生物リプレッサータンパク質、例えば、ＧＡＬ４由来のリプレッサードメインに由来する。細菌オペレーターは、哺乳動物および他の宿主細胞系において用いることができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０１６２９０１Ａ１号を参照のこと）。
【０１３９】
例示的な細胞発現系において、細胞は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するように操作され、対象となるタンパク質は、その活性がＴｅｔＲによって調節されるプロモーターの制御下に置かれる。２つのタンデムＴｅｔＲオペレーター（ｔｅｔＯ）は、ベクター中のＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置される。そのようなベクターにおいてＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターによって誘導される対象となるタンパク質をコードする遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたはいくつかの他の好適なインデューサー（例えば、ドキシサイクリン）の非存在下においてＴｅｔＲによってブロックされ得る。インデューサーの存在下では、ＴｅｔＲタンパク質はｔｅｔＯに結合することができず、そのため、対象となるタンパク質の転写、次いで翻訳（発現）が起こる。（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４３５，５５３号を参照のこと。）
【０１４０】
別の例示的な細胞発現系は、ＴｅｔＲ−ＥＲＬＢＤＴ２融合タンパク質等の調節融合タンパク質を含み、融合タンパク質の転写ブロッキングドメインはＴｅｔＲであり、リガンド結合ドメインは、Ｔ２変異を含むエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ）である（ＥＲＬＢＤＴ２；Ｆｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７）。ｔｅｔＯ配列が、強力なＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターの下流かつ近位に配置される場合、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ｔｅｔＯプロモーターからの対象となるヌクレオチド配列の転写は、タモキシフェンの存在下でブロックされ、タモキシフェンの除去によってブロック解除される。別の例において、１５アミノ酸リンカーによって接続された２つのＡｒｃタンパク質と、ＥＲＬＢＤＴ２（上記参照）とからなる単鎖二量体からなる融合タンパク質である融合タンパク質Ａｒｃ２−ＥＲＬＢＤＴ２の使用は、Ａｒｃオペレーター（ＡＯ）、より具体的には、ＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター／エンハンサーのすぐ下流の２つのタンデムａｒｃオペレーターに関与する。細胞株は、Ａｒｃ２−ＥＲＬＢＤＴ２によって調節することができ、対象となるタンパク質を発現する細胞は、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡｒｃＯ２プロモーターによって駆動され、タモキシフェンの除去により誘導可能である。（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０１６２９０１Ａ１号を参照のこと。）
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、ＣＭＶ−ＭＩＥ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ−ＭＩＥ／ＡＯ２ハイブリッドプロモーターを含む。
【０１４２】
本発明のベクターはまた、対象となる遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みを促進するためにＣｒｅ−ｌｏｘ組換えツールを用いることもできる。Ｃｒｅ−ｌｏｘストラテジーは、少なくとも２つの構成要素を必要とする：１）２つのｌｏｘＰ部位間の組換えを触媒する酵素、Ｃｒｅリコンビナーゼ；および２）ｌｏｘＰ部位（例えば、組換えが起こる８ｂｐのコア配列からなる特異的な３４塩基対（ｂｐ）配列、および２つの隣接する１３ｂｐの逆リピート）または変異ｌｏｘ部位。（例えば、Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＰＮＡＳ  ９２：１６０−４；Ｎａｇｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２６：９９−１０９；Ａｒａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０（１９）：ｅ１０３；および米国特許出願公開第２０１００２９１６２６Ａ１号（これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。）別の組換えストラテジーにおいて、酵母由来のＦＬＰリコンビナーゼが、コンセンサス配列ＦＲＴとともに用いられてもよい（例えば、Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｓ．Ｍ．，１９９６，ＰＮＡＳ  ９３（１２）：６１９１−６１９６も参照のこと）。
【０１４３】
別の態様において、遺伝子（すなわち、本発明の組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）は、発現カセットの発現増強配列内に挿入され、任意選択的にプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターに連結された遺伝子は、第１のリコンビナーゼ認識部位によって５’に隣接され、また第２のリコンビナーゼ認識部位によって３’に隣接される。そのようなリコンビナーゼ認識部位は、発現系の宿主細胞においてＣｒｅによって媒介される組換えを可能にする。いくつかの場合において、第２のプロモーター連結遺伝子は、第１の遺伝子の下流（３’）にあり、第２のリコンビナーゼ認識部位によって３’に隣接される。さらに他の場合において、第２のプロモーター連結遺伝子は、第２のリコンビナーゼ部位によって５’に隣接され、第３のリコンビナーゼ認識部位によって３’に隣接される。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位、ｌｏｘ５１１部位、ｌｏｘ２２７２部位、およびＦＲＴ部位から選択される。他の実施形態において、リコンビナーゼ認識部位は異なる。さらなる実施形態において、宿主細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現することができる遺伝子を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、ベクターは、小胞体（ＥＲ）内でのタンパク質フォールディングに関与する遺伝子の発現の制御によってタンパク質産生／タンパク質分泌を増強することができる、Ｘボックス結合タンパク質１（ｍＸＢＰ１）遺伝子をさらに含む。（例えば、Ｒｏｎ  Ｄ，ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｐ．，２００７，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：５１９-５２９を参照のこと。）
【０１４５】
「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現させることに適したあらゆる細胞を含む。細胞は、原核生物および真核生物の細胞（単細胞もしくは多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、桿菌種、ストレプトマイセス菌種等の菌株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、．出芽酵母、分裂酵母、ピキア酵母、メタノール酵母等）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ等）、非ヒト動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマ等の細胞融合物を含む。特定の実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。他の実施形態において、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、腫瘍細胞、および上記細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含む（例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞））。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態において、細胞は、ＣＨＯ  Ｋ１細胞である。
【０１４７】
例えば、一実施形態において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列を含む細胞ゲノム内に安定に組み込まれた核酸を含む宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の組換えポリペプチドの発現をコードする配列を含む、非組込み型（すなわち、エピソームの）の核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、または線状発現要素を含む細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを含むプラスミドで宿主細胞を安定にトランスフェクトすることによって生成される細胞株を提供する。
【０１４８】
さらなる態様において、本発明は、本発明のＦｃ融合タンパク質を生成するための方法に関し、前記方法は、ａ）本明細書において前述したように本発明の宿主細胞を培養するステップと、ｂ）培養培地からＦｃ融合タンパク質（上記参照）を精製するステップとを含む。
【０１４９】
本発明の治療的および診断的使用
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載されるアぺリン融合ポリペプチドまたはタンパク質を含む組成物に関する。
【０１５０】
組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されるような従来の技術に従って、試行錯誤実験を用いて、薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに既知のアジュバントおよび賦形剤を用いて製剤化することができる。
【０１５１】
薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の既知のアジュバントおよび賦形剤は、選択される本発明のアぺリン融合またはアぺリンＦｃ融合タンパク質および選択される投与様式に適しているべきである。原薬の適切な安定性、特定の患者、組成物、および投与様式に応じた所望の治療反応を達成するために効果的な活性成分の量を得るために、本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与レベルを変化させてもよい。選択される投与レベルは、様々な薬物動態的因子に依存する。
【０１５２】
薬学的組成物は、いずれの好適な経路および様式で投与されてもよい。本発明のアぺリン融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する好適な経路は当該技術分野で周知であり、当業者によって選択され得る（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，ＡＬ，ａｎｄ  Ｍｓｒｎｙ，ＲＪ，２００６，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ，５８（５−６）：６８６−７０６）。
【０１５３】
アぺリン融合タンパク質は、変力剤、特に陽性変力剤等の、心血管疾患の管理のために投与される薬剤である。特定の理論に拘束されるものではないが、陽性変力剤は、心筋の収縮力を増加させ、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症等の状態において心血管機能を支持するために使用される。（Ｄａｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５５３（１−３）：２２２−２２８；Ｍａｑｕｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００９；５４：５９８−６０４；およびＢｅｒｒｙ，Ｍ．，．ｅｔ  ａｌ．，２００４Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：ＩＩ１８７−ＩＩ１９３を参照のこと。）アぺリンによって誘発される血管拡張は、虚血再灌流障害において保護的であり得る。アぺリンペプチドによる血管新生の促進およびより大きな非漏出性血管の誘発は、虚血からの機能回復に寄与し得る。（Ｅｙｒｉｅｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １０３：４３２−４４０；Ｋｉｄｏｙａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｌｏｏｄ  １１５：３１６６−３１７４。）．
【０１５４】
アぺリン受容体アゴニストは、心拍出量を増加させるため、心血管機能を改善するため、心機能を安定化するため、心機能の低下を制限するため、または心臓もしくは他の組織の虚血もしくは損傷領域において新しい血管の成長を促進するために投与される、血管新生促進剤であると見なされる。このように、本発明のアぺリン受容体アゴニストは、血管新生を促進し、したがって虚血を治療するため、虚血器官および組織に血流を回復するため、例えば、四肢虚血、末梢虚血、腎虚血、眼虚血、脳虚血、または任意の虚血性疾患を治療するために有用である。
【０１５５】
本発明のアぺリン融合タンパク質は、血流を増加させるため、または心臓の収縮力を増加させるため、例えば、虚血および心不全を治療または軽減するために投与される薬剤である。
【０１５６】
アぺリン融合タンパク質は、虚血および再灌流障害を治療または軽減するために、例えば、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を制限するためもしくは心組織の壊死の発症を遅らせるため、または予防的処置を提供するため、例えば、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害から心臓を保護するため、心機能を改善するため、もしくは心筋梗塞の発症を制限するために投与される薬剤である。
【０１５７】
アぺリン融合タンパク質は、糖尿病および肥満に関連する代謝状態の管理のために投与される薬剤である。アぺリンは、肥満のインスリン抵抗性マウスにおいて耐糖能を改善し、筋組織によるグルコース利用を促進する（Ｄｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ８：４３７-４４５）。アぺリンＫＯマウスは、インスリン感受性が低下している（Ｙｕｅ  ａｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９８：Ｅ５９−Ｅ６７）。そのため、アぺリン融合タンパク質は、インスリン抵抗性糖尿病において耐糖能を改善するために投与される薬剤である。
【０１５８】
筋肉内アぺリンｍＲＮＡレベルの変化は、全身のインスリン感受性の改善とも相関している（Ｂｅｓｓｅ−Ｐａｔｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ａｕｇ  ２７，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ（Ｌｏｎｄ）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｊｏ．２０１３．１５８，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。筋肉組織におけるそのような代謝の改善、およびアぺリンによって誘発される血管拡張に起因して、アゴニストのアぺリン融合タンパク質は、筋肉の成長および耐久性を刺激するためにも投与することができる。
【０１５９】
一次ＨＩＶ−１分離株も、ＡＰＬＮＲをコレセプターとして使用することができ、合成アぺリンペプチドがＨＩＶ−１のＣＤ４−ＡＰＬＮＲ発現細胞への侵入を阻害することが示されている（Ｃａｙａｂｙａｂ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１１９７２−１１９７６）。アぺリン融合タンパク質は、ＨＩＶ感染を治療するために投与される。
【０１６０】
また、アぺリンペプチドがシグナル経路を介して神経細胞の生存を促進するように作用する、アぺリンによる神経保護も見られる（Ｃｈｅｎｇ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３７（１）：１７１−３）。アぺリン融合タンパク質は、神経細胞の生存を促進または延長するために投与される。
【０１６１】
アぺリン受容体アゴニストはまた、紅潮抑制薬としても記載されている。（２０１２年１０月４日に公開された国際公開第ＷＯ２０１２／１３３８２５号を参照のこと。）本発明のアぺリン融合タンパク質は、対象においてのぼせ症を治療、改善、または抑制するためにも投与され得る。
【０１６２】
アぺリンペプチドは、脂肪組織の拡大を通して肥満を促進し得る。アぺリンは、低酸素によって誘発され、拡大する脂肪組織の低酸素内部において血管新生を促進する。（Ｋｕｎｄｕｚｏｖａ  Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２２：４１４６-４１５３。）しかしながら、いくつかのアぺリン融合タンパク質は、体重減少を促進するためまたは肥満を治療するために、組織特異的な様式でこの機構の阻害薬として作用するＡＰＬＮＲのアンタゴニストである。したがって、アぺリン融合タンパク質は、肥満を治療するためおよび体重減少を促進するために投与される遮断薬である。
【０１６３】
網膜における腫瘍増殖または新血管新生の促進に関与する病的血管新生は、アぺリンまたはＡＰＬＮＲアンタゴニストに応答性であり得る。（Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ，Ｔ．，２００８，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，２８：１６８７−１６８８；Ｒａｙａｌａｍ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ６（３）：３６７−７２。）そのため、アぺリン融合タンパク質は、腫瘍増殖もしくは転移を遅らせるため、または癌および転移性疾患を治療するために投与される阻害薬である。アぺリン融合タンパク質は、網膜症を治療するためにも投与される。
【０１６４】
ＡＰＬＮＲアンタゴニストは、病原性疾患によって引き起こされる過剰活性アぺリンシステムの効果を軽減することによって、繊維組織等において血管新生を減少させ、機能を改善することもできる（Ｐｒｉｎｃｉｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｒｅｉｃｈｅｎｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＪＰＥＴ  ３４０（３）：６２９−６３７）。いかなる理論に拘束されるものではないが、アぺリンシステムをブロックすることにより、肝硬変のような病的状態等における修復または反応プロセスにおいて、器官または組織内での過剰な線維結合組織の形成を遅らせることができる。そのため、アぺリン融合タンパク質は、線維症の進行を遅らせるもしくは予防するため、または線維症を治療するために投与される阻害薬として使用されてもよい。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本発明のＦｃ融合タンパク質は、疾患または状態の治療のための方法であって、疾患または状態を治療するのに十分なアぺリン融合タンパク質の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１６６】
一実施形態において、アぺリンに関連する疾患または状態の治療を必要とする対象における、アぺリンに関連する疾患または状態の治療のための方法であって、対象に治療有効量のアぺリン融合タンパク質を投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、Ｆｃドメイン、またはその断片に融合されたアぺリンペプチドを含むポリペプチドを含む。
【０１６８】
疾患または状態は、心血管疾患、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流障害、肺高血圧症、糖尿病、肥満、癌、転移性疾患、体液ホメオスタシス、病的血管新生、網膜症、およびＨＩＶ感染からなる群から選択される。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、心血管疾患、急性非代償性心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、心筋症、虚血、虚血／再灌流障害、肺高血圧症、糖尿病、のぼせ症、体液ホメオスタシス、およびＨＩＶ感染からなる群から選択される疾患または状態を治療するのに有用なＡＰＬＮＲアゴニストである。別の実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、神経細胞の生存を促進するＡＰＬＮＲアゴニストである。別の実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、インスリンに対する抵抗性を低下させるＡＰＬＮＲアゴニストである。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、肥満、癌、転移性疾患、網膜症、線維症、および病的血管新生からなる群から選択される疾患または状態を治療するのに有用なＡＰＬＮＲアンタゴニストである。一実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、体重減少を促進するＡＰＬＮＲアンタゴニストである。一実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、病的血管新生または新血管新生を減少させるＡＰＬＮＲアンタゴニストである。他の実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、腫瘍増殖を減少させるかまたは阻害するＡＰＬＮＲアンタゴニストである。
【０１７１】
本明細書において使用される場合、Ｆｃ融合タンパク質の「治療有効量」とは、前記タンパク質の投与を含む治療的介入において、所与の疾患およびその合併症の臨床症状を改善、軽減、または一部停止させるのに十分な量を意味する。これを達成するための適当な量は、「治療有効量」として定義される。それぞれの目的のための有効量は、疾患または損傷の重症度、ならびに対象の体重および全身状態に依存する。
【０１７２】
本発明の文脈において、「治療」および「治療する」という用語は、疾患または障害等の状態を制圧することを目的とした患者の管理および介護を意味する。この用語は、症状および／もしくは合併症を軽減するため、疾患、障害、もしくは状態の進行を遅れさせるため、および／または疾患、障害、もしくは状態を改善もしくは排除するため、ならびに状態を予防するため（予防は、疾患進行を阻止することを目的とした患者の管理および介護として理解されたく、症状もしくは合併症の発症を予防するための活性成分の投与を含む）の活性成分（Ｆｃ融合タンパク質）の投与等、患者が苦しんでいる所与の状態のためのあらゆる治療を含むことが意図される。それにもかかわらず、予防的、対症的、および治療的（治癒的）処置が、本発明の各態様である。治療を受ける対象は、哺乳動物、具体的にはヒトである。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、治療は、維持療法、再発予防、または疾患もしくは状態の安定化である。
【０１７４】
本発明は、１つ以上のさらなる治療活性成分と組み合わせて、本明細書に記載されるアぺリン融合タンパク質のうちのいずれかを含む組成物および治療製剤と、そのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法とを含む。
【０１７５】
そのようなさらなる治療活性成分は、ＶＥＧＦ阻害薬、血圧の薬、カルシウムチャネル遮断薬、ジギタリス、抗不整脈薬、ＡＣＥ阻害剤、抗凝固剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、血管拡張剤等を含む。
【０１７６】
本発明のアぺリン融合タンパク質は、ＦｃドメインまたはＦｃドメインの断片を有しないアぺリンペプチドと比較して、循環血清半減期および安定性等の改善された薬物動態特性を有する薬剤を提供する。一実施形態において、アぺリン融合タンパク質の注射後血清レベルは、約１時間超、または約２時間超、または約３時間超、または約４時間超、または約５時間超、または約１０時間超、または約２４時間超の間、増加または上昇する。他の実施形態において、アぺリン融合タンパク質は、約１０分超、または約１時間超、または約２、３、４、５、６、７、８、９時間超、または約１０時間超、または約２４時間超の血清または血漿半減期を有する。
【０１７７】
標識された本発明のアぺリン融合タンパク質は、疾患または障害を検出、診断、または監視するために、診断目的で使用することができる。本発明は、（ａ）標的ＡＰＬＮＲに免疫特異的に結合する１つ以上のアぺリン融合タンパク質を使用して、対象の細胞または組織サンプル中のアぺリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の存在をアッセイすることと、（ｂ）ＡＰＬＮＲのレベルを、対照レベル、例えば正常組織サンプル中のレベルと比較することとを含む、疾患または障害の検出または診断を提供し、ＡＰＬＮＲの対照レベルと比較したＡＰＬＮＲのアッセイレベルにおける増加は、疾患もしくは障害を示すか、または疾患もしくは障害の重症度を示す。
【０１７８】
本発明のアぺリン融合タンパク質は、当該技術分野で周知の免疫組織化学法を使用して生物試料中のＡＰＬＮＲレベルをアッセイするために使用することができる。ＡＰＬＮＲタンパク質を検出するために有用な他のアぺリンに基づく方法は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ）等の免疫測定法を含む。好適なアぺリン融合タンパク質標識が、そのようなキットおよび方法に使用されてもよく、当該技術分野で既知の標識は、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼ等の酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ，１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）等の放射性同位元素標識；ならびにルミノールおよびルシフェラーゼ等の発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識を含む。
【０１７９】
標識されたアぺリン融合タンパク質の存在は、診断目的のためにｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。一実施形態において、診断は、ａ）対象に有効量の標識されたアぺリン融合タンパク質を投与することと；ｂ）標識されたアぺリン融合タンパク質をＡＰＬＮＲが検出され得る部位で濃縮させ、かつ未結合の標識されたアぺリン融合タンパク質をバックグラウンドレベルまで除去することができるように、ある時間間隔待つことと；ｃ）バックグラウンドレベルを決定することと；ｄ）バックグラウンドレベルを超える標識されたアぺリン融合タンパク質の検出は、対象が増加したＡＰＬＮＲタンパク質を有すること、または疾患もしくは障害を有することを意味するか、あるいは増加したＡＰＬＮＲレベルが疾患もしくは障害の重症度を示すように、対象において標識されたアぺリン融合タンパク質を検出することとを含む。そのような実施形態によれば、アぺリン融合タンパク質は、当業者に既知の特定の画像システムを使用して、検出に適した画像部分を用いて標識される。バックグラウンドレベルは、検出された標識アぺリン融合タンパク質の量を、特定の画像システムのために以前に決定した標準値と比較することを含む、当該技術分野で既知の種々の方法によって検出することができる。本発明の診断方法に使用され得る方法およびシステムは、限定されないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、全身スキャン、例えば、ポジトロン断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波
検査等を含む。
【０１８０】
本発明はまた、少なくとも１つの活性な本発明の融合タンパク質を充填した１つ以上の容器を含むパックまたはキット（例えば、薬学的なパックまたはキット）を提供する。本発明のキットは、例えば、診断を含む任意の適用可能な方法において使用されてもよい。任意選択的に、そのような容器（複数可）は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって既定された形式の通知を伴ってもよく、その通知は、（ａ）製造、使用、または販売の機関によるヒトへの投与のための承認、（ｂ）使用上の指示、（ｃ）製造の承認と使用上の指示の両方を反映する。
【０１８１】
Ｅｘ  ｖｉｖｏおよびＩｎ  ｖｉｖｏアッセイ
本発明のアぺリンＦｃ融合タンパク質は、血清半減期を延長する一方で、ＡＰＬＮＲに関連する実質的な活性を維持する。ＡＰＬＮＲシグナル伝達は、アぺリンＦｃ融合タンパク質と、アぺリンの既知の治療効果および生物学的効果との間に関連性を提供する。したがって、アぺリンＦｃ融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでＡＰＬＮＲ活性に及ぼす影響のいずれの証明も、患者または動物におけるアぺリンＦｃ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的または医学的効果の妥当な証拠を提供する。他の研究においても、アぺリン／ＡＰＬＮＲが、心筋虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害に対する内因性保護システムであり、アぺリン／ＡＰＬＮＲ活性化の抗アポトーシス効果、特にｐＥＲＫが、そのような障害から保護することが証明されている（Ｚｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３０（６）：１１４４−５２，ｅｐｕｂ  Ｆｅｂ  ２４，２００９）。
【０１８２】
内因性アぺリンペプチド、アぺリン類似体、および修飾アぺリンペプチドを含むＡＰＬＮＲのアゴニストは、多くのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて治療活性を示している（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１２５４０８号におけるＰＥＧ−アぺリン−３６、およびＩｔｕｒｒｉｏｚ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．２０１０，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２４（５）：１５０６−１７．Ｅｐｕｂ  Ｄｅｃ  ２９，２００９における非ペプチド性アぺリンアゴニスト）。
【０１８３】
ＡＰＬＮＲのアゴニズムは、心拍数および心臓収縮力の増加をもたらすことが証明されている（Ａｓｈｌｅｙ，ＥＡ，ｅｔ．ａｌ．２００５，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．６５（１）：７３−８２）。さらに、アぺリンペプチドは、心筋細胞の電気生理学を変化させることが証明されている。全細胞パッチクランプ技術は、アぺリン投与の前および後に、単離されたウサギ左心房（ＬＡ）筋細胞における活動電位（ＡＰ）およびイオン電流を調べるために使用された（例えば、Ｆａｒｋａｓｆａｌｖｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３５７（４）：８８９−９５．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｐｒ  １２；およびＣｈｅｎｇ，ＣＣ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．４３（１）：３４−４０．Ｅｐｕｂ  Ｏｃｔ  ２８，２０１２（両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。アぺリンのアゴニズムによって誘発される等方性も、ランゲンドルフまたはワーキングハートシステムを使用してマウスまたはラットから単離した心臓においてＥＣＧパラメータを測定することによって評価することができる。そのような電気生理学的およびｉｎ  ｖｉｖｏ技術、例えば、マイクロ超音波または心エコー法等は、本発明のポリペプチドの治療作用を評価するために使用される。
【０１８４】
アぺリンＦｃ融合ポリペプチドの保護効果は、ランゲンドルフシステムにおいて単離されたラットまたはマウスの心臓における心筋虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害または低酸素／再酸素化（Ｈ／Ｒ）の後に評価することができる（例えば、Ｚｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３０（６）：１１４４−５２，ｅｐｕｂ  Ｆｅｂ  ２４，２００９；Ｐｉｓａｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｋａｒｄｉｏｌｏｇｉｉａ，５０（１０）：４４−９；およびＰｉｓａｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ａｐｅｌｉｎ−１２  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ”、印刷前のｅｐｕｂを参照のこと）。
【０１８５】
一過性のＬＡＤ結紮も、再灌流の前にアぺリンアゴニストを投与して行うことができる。（Ｐｉｓａｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｂｕｌｌ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１５２（１）：７９−８２；Ｌｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，３０３（５）：Ｈ６０５−１８，Ｅｐｕｂ  Ｊｕｎ  ２９，２０１２；およびＴａｏ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，３０１（４）：Ｈ１４７１−８６，Ｅｐｕｂ  Ｊｕｌ  ２９，２０１１を参照のこと）。心外傷の後、マイクロ超音波パラメータを用いて、改善、および梗塞サイズの評価に関して心機能を測定することができる。
【０１８６】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製および使用の方法を当業者に説明するために提供されるものであって、本発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、濃度、温度等）に関して正確を期すための努力がなされてはいるが、ある程度の実験誤差および変動は考慮されるべきである。
【０１８７】
実施例
実施例１−発現構築物のクローニング
合成遺伝子断片を使用して、アぺリン−１３を有するＮ末端およびＣ末端のｈＦｃ融合物を作製した。得られた融合物、ｈＦｃ−アぺリン１３（配列番号１）およびアぺリン１３−ｈＦｃ（配列番号３）をコードするＤＮＡを、標準的な分子クローニング技術を使用してＣＭＶプロモーターの下流の発現ベクターに挿入した。ＣＨＯ安定細胞株を作製し、融合タンパク質の生成に使用し、次いで、それをアフィニティー法によって精製した。Ｎ末端ｈＦｃ−アぺリン１３およびＣ末端アぺリン１３−ｈＦｃ融合タンパク質は、それらの予測質量と一致してＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動する。（図３Ａを参照のこと。）抗アぺリン抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５９４６９番）を用いて行ったウエスタンブロット分析を使用して、ｈＦｃ−アぺリン１３およびアぺリン１３−ｈＦｃ上にアぺリンの存在を確認した。（図３Ｂを参照のこと。）
【０１８８】
実施例２−ｃＡＭＰレポーターアッセイにおけるアぺリンＦｃ融合タンパク質の効力および有効性
ｈＡＰＬＮＲの活性化を検出するために開発されたバイオアッセイを使用して、非修飾アぺリンペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、Ｈ−４５６８．０００１番）および本発明のアぺリン１３融合タンパク質による細胞内ｃＡＭＰレベルの調節を評価した。ルシフェラーゼレポーター［ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ，４Ｘ）−ルシフェラーゼ］とともに、全長ヒトｈＡＰＬＮＲ（受入番号ＮＰ＿００５１５２．１のアミノ酸１〜３８０）を安定に発現するようにＨＥＫ２９３細胞株をトランスフェクトした。得られた細胞株ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲを、１０％  ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含有するＤＭＥＭ中に維持した。バイオアッセイのために、０．１％  ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンを補充した８０μＬのＯＰＴＩＭＥＭ中の９６ウェルアッセイプレートに、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞を２０，０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で１６時間インキュベートした。翌朝、ｈＡＰＬＮＲの活性化を介してフォルスコリンによって誘発されたｃＡＭＰの生成を測定するために、非修飾アぺリンペプチドおよびアぺリン１３融合タンパク質を段階稀釈し（１：３）、次いで、アッセイ緩衝液（５μＭの最終フォルスコリン濃度）中でフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ、Ｆ６８８６番）と混合し、細胞に加えた。５％ＣＯ２中、３７℃で５時間のインキュベーション後、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、Ｏｎｅ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６０５１番）の添加後に発光を測定した。Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、非線形回帰により、データを４パラメータのロジスティック方程式に適合させた。
【０１８９】
ｈＦｃ−アぺリン１３融合タンパク質は、フォルスコリンで刺激したＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞からのｃＡＭＰ放出の阻害を１７４ρＭのＥＣ５０値で促進し、アぺリン１３−ｈＦｃは、２２．１ｎＭのＥＣ５０値で活性化した。このアッセイにおいて、アぺリン−１３は、３６．５ρＭのＥＣ５０値で活性化した。（図４を参照のこと。）
【０１９０】
実施例３−β−アレスチンアッセイにおけるＦｃ融合タンパク質の効力および有効性
ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームは、関連リガンドを用いた処理に応じたβ−アレスチンのＧＰＣＲへの動員に基づいている。このアッセイ形式では、β−アレスチンがβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）のＮ末端欠失変異体に融合されて細胞内で安定に発現される一方で、ＧＰＣＲがより小さな（４２アミノ酸）、弱い競合性β−ｇａｌ断片に融合される。このアッセイにおけるＧＰＣＲのリガンド刺激は、β−アレスチンのＧＰＣＲへの動員をもたらし、２つのβ−ｇａｌ断片の相補性を強制し、基質を検出可能なシグナルに変換する機能的酵素の形成をもたらす（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【０１９１】
アッセイのために、ＣＨＯ−Ｋ１／ｈＡＰＬＮＲ  ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ細胞をウェル当たり１０，０００細胞でアッセイ培地（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；９３−０２５０Ｅ２番）に播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で４８時間インキュベートした。次いで、非修飾アぺリン−１３ペプチドまたはアぺリン−１３融合タンパク質のいずれかの１：１０の段階稀釈により細胞を処理した。３７℃で１．５時間のインキュベーション後、製造者の仕様に従って検出試薬を加え、室温で１時間インキュベートした後、Ｖｉｃｔｏｒ機器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を測定した。
【０１９２】
ｈＦｃ−アぺリン１３、アぺリン−１３、およびアぺリン１３−ｈＦｃタンパク質は、それぞれ、９９２ρＭ、１７．６ρＭ、および４４．２ｎＭ（挿入値）のＥＣ５０値で、ＣＨＯ−Ｋ１／ｈＡＰＬＮＲ  ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ細胞を用量依存様式で活性化した（図５）。
【０１９３】
実施例４−ｐＥＲＫアッセイにおけるＦｃ融合タンパク質の効力および有効性
本発明のアぺリン−１３融合タンパク質がＡＰＬＮＲシグナル伝達経路に与える影響を測定するために、アッセイを使用してＡＰＬＮＲ発現細胞株由来のリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）および全ＥＲＫの量を定量化した。ドキシサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーターの制御下で全長ヒトＡＰＬＮＲ（ｈＡＰＬＮＲ；受入番号ＮＰ＿００５１５２．１のアミノ酸１〜３８０）を安定に発現するように、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株をトランスフェクトした。得られた細胞株ＣＨＯ／ｈＡＰＬＮＲを、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、および２５０ｕｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地中に維持した。
【０１９４】
アッセイのために、ＣＨＯ／ｈＡＰＬＮＲ細胞を、１０％ＦＢＳ，Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する２００μＬのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２中の９６ウェルアッセイプレートに１０，０００細胞／ウェルで播種し、５％  ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、ＡＰＬＮＲの発現を誘発してｐＥＲＫアッセイ用に細胞を調製するために、細胞を２５０μｌの１ｘ  ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；２００１２−０４３番）で１回洗浄し、次いで、０．１％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍＬドキシサイクリンを含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２中で２４時間、血清飢餓処理を行った。アッセイ当日、１％  ＢＳＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを補充したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２中で、非修飾アぺリンペプチドまたは融合タンパク質のいずれかの１：１０の段階稀釈により細胞を処理し、５％ＣＯ２中、３７℃で１５分間処理した。インキュベーション終了時に、細胞を２００μＬのＰＢＳで洗浄し、その後、１００ｕＬのＥＬＩＳＡｏｎｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＧＲ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ；ＥＢＦ００１番）で溶解させた。次いで、製造者の仕様に従って（ＴＧＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＫＴ００１番）、リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ１／２）および全ＥＲＫレベルについて抽出物を分析した。次いで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して蛍光シグナルを測定した。測定された全ＥＲＫに対する測定されたｐＥＲＫ１／２の比率を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してその結果を分析した。
【０１９５】
このｐＥＲＫアッセイでは、ｈＦｃ−アぺリン１３およびアぺリン１３−ｈＦｃが、それぞれ、２１６ｐＭおよび３３ｎＭのＥＣ５０値で、ＣＨＯ／ｈＡＰＬＮＲ細胞におけるｐＥＲＫ１／２対全ＥＲＫ１／２の比率を用量依存様式で増加させた（図６）。
【０１９６】
実施例６−Ｆｃ融合物の血清安定性を評価するための薬物動態試験
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（群当たりｎ＝３）にｈＦｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）またはアぺリン１３−ｈＦｃ（２．８ｍｇ／ｋｇ）を皮下（ｓ．ｃ．）投与し（図７Ａ）、１、４、２４、および４８時間目に血漿を採取した。別個の実験において、Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（群当たりｎ＝３）に５ｍｇ／ｋｇでｈＦｃ−Ａｐｅｉｎ１３をｓ．ｃ．投与し、０、１、２、４、５、６、２４時間、および２、３、７、１４、２１日目に血清を採取した（図７Ｂ）。
【０１９７】
投与したタンパク質の血清／血漿レベルを評価するために、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬの濃度の１００μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＬａｂ；１０９−００５−０９８）で、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１８時間４℃でコーティングした。その後、３００μＬ／ウェルの１Ｘ牛乳希釈液／ブロッキング溶液（ＫＰＬ；１００１０８番）を用いて、室温（ＲＴ）で１時間プレートをブロックした。希釈液１００μＬ中のｈＦｃ（ｆｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｕｒｖｅ）および血清試料の希釈物を、次いでプレートに加えた。ＲＴで２時間インキュベートした後、次いでウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕＬａｂ；１０９−０３５−０９８番）をＲＴで７分間プレートに加えることにより、プレートに結合したヒトＦｃを検出した。ＴＭＢ溶液（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；１５２３４６番）を用いて７分間試料を発色させて比色反応を引き起こし、次いで、１００μＬ／ウェルの２．０Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ；Ｈ３８１−０５番）で中和させた後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを使用してデータを分析し、血清中の試料の濃度を決定した。
【０１９８】
アぺリン１３−ｈＦｃの血清レベルは、約４時間で最大の１０μｇ／ｍＬ（３８０ｎＭ）に達し、ｈＦｃに匹敵するレベルに４８時間留まった（図７Ａ）。ｈＦｃ−アぺリン１３の血清レベルは、２４時間で最大の３μｇ／ｍＬ（１００ｎＭ）に達し、徐々に減少して１４日目に１μｇ／ｍＬ（３８ｎＭ）となった（図７Ｂ）。
【０１９９】
実施例７−ＣＲＥアッセイにおけるアぺリンペプチドの効力および有効性
上の実施例２から６に見られるように、そのＮ末端にＦｃが繋ぎ止められたアぺリン−１３（ｈＦｃ−アぺリン１３）は、そのＣ末端にＦｃが繋ぎ止められたアぺリン−１３（アぺリン−ｈＦｃ）よりも良好な効力を示す。１つ以上のアミノ酸（複数可）がＮ末端またはＣ末端から欠失しているかまたはそこに付加されたアぺリン−１３ペプチド等の修飾アぺリン−１３ペプチドを、ＡＰＬＮＲの活性化に関連するそれらの相対的な効力について調べた。
【０２００】
実施例２の方法に従って、ｈＡＰＬＮＲの活性化を検出するために開発されたバイオアッセイを使用して、非修飾アぺリン−１３ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、Ｈ−４５６８．０００１番）および本発明の修飾アぺリンペプチドによるｃＡＭＰレベルの調節を評価した（上記参照）。Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用してその結果を分析した。
【０２０１】
表３に示すようｊに、アぺリン−１３は、なおも完全に有効性を保持しながらＮ末端とＣ末端の両方からのアミノ酸欠失に耐えることができ、アぺリン−１３と比較して異なる程度の効力の減少を示す。さらに、アぺリン−１３は、そのＣ末端への５つのグリシン残基等のアミノ酸残基の付加に耐えることができ、なおも完全に有効性を保持するが、アぺリン−１３と比較すると効力が低い。Ｆｃ−アぺリン融合タンパク質の同様の変形例は、それらの有効性を維持することが想定される。
【０２０２】
【表３】
0006525951.tif 000004
【０２０３】
実施例８−修飾アぺリン融合タンパク質のＣＲＥアッセイにおける効力および有効性
ｈＦｃに融合された配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４等の修飾されたアぺリンペプチドを有することを除いて、実施例１と同様に、種々のアぺリン−Ｆｃ融合タンパク質を作製した。そのようなｈＦｃ−アぺリン１３融合タンパク質は、アぺリンペプチド成分のＣ末端にさらなるＣ末端アミノ酸を有する。実施例２および実施例７の方法と同様にＣＲＥバイオアッセイを使用して、各ペプチドのＮ末端に繋がれたｈＦｃを有する修飾アぺリン−１３ペプチド（ｈＦｃ−アぺリン１３＋）と比較して、アぺリン−１３ペプチドによるｃＡＭＰレベルの調節を評価した（上記参照）。Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用してその結果を分析した。
【０２０４】
表４に示すように、修飾アぺリン融合タンパク質（アぺリンペプチド成分のＮ末端にＦｃを、そしてＣ末端にはさらなるアミノ酸を有する）は、非修飾アぺリン−１３と同様の活性をＡＰＬＮＲに示す。Ｃ末端にさらなるアルギニンを有するｈＦｃ−アぺリン１３融合タンパク質は、６０ρＭのＥＣ５０値でＨＥＫ２９３／ＣＲＥ−ｌｕｃ／ｈＡＰＬＮＲ細胞を活性化した。Ｃ末端にさらなるセリンを有するｈＦｃ−アぺリン１３融合タンパク質、およびＣ末端にさらなるヒスチジンを有するｈＦｃ−アぺリン１３融合タンパク質は、それぞれ、９６ρＭおよび２０３ρＭのＥＣ５０値で各々ＡＰＬＮＲを活性化した。このアッセイにおいて、アぺリン−１３は、５６ρＭのＥＣ５０値で活性化した。
【０２０５】
【表４】
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【０２０６】
実施例９−アぺリンＦｃ融合物の心血管評価
麻酔下のマウスおよびラットにおける心電図検査によって、本発明のアぺリンＦｃ融合タンパク質の影響、特に、ＲＲ間隔（心拍数の指標）、およびイオンチャネル活性の指標としてのＱＴ間隔に与える影響を評価した。 
【０２０７】
本発明のアぺリンＦｃ融合タンパク質について、ＡＰＬＮＲアゴニストが血圧、心拍数および活動に与える影響をマウスおよびラットにおける無線遠隔測定により評価した。この方法は、継続的なデータ監視によって大動脈血圧、心拍数および活動を測定するための、頸動脈内への圧力変換器の実装を含む。
【０２０８】
ＡＰＬＮＲアゴニストによる心臓収縮力の変化をｉｎ  ｖｉｖｏで決定することによって、心機能も評価される。１つの方法は、マウスまたはラットにおけるマイクロ超音波、または心電図検査（ＥＣＧ）の使用である。アぺリンＦｃ融合タンパク質がマウスまたはラットに適用されると、左心室の拡張末期容積および収縮末期容積（ＥＤＶおよびＥＳＶ）の測定を用いて左心室の心機能における変化が監視される。マイクロ超音波走査の記録画像から心拍出量（ＣＯ）、駆出率（ＥＦ）、一回拍出量（ＳＶ）、短縮率（ＦＳ）を計算するために、心室の直径および心拍数等の他のパラメータも記録される。
【０２０９】
ＡＰＮＬＲアゴニストによって誘発されるか、またはアンタゴニストによってブロックされるかのいずれかである等の方性も、ランゲンドルフまたはワーキングハートシステムを使用してマウスまたはラットから単離した心臓において、ＥＣＧによって左心室圧力、およびｄＰ／ｄＴ（経時的な圧力の変化）、心拍数、ならびに心臓の伝導性を測定することによって評価される。 
【０２１０】
心筋虚血／再灌流：アぺリンＦｃ融合ポリペプチドの影響は、ランゲンドルフシステムにおけるように、単離されたラットまたはマウスの心臓において心筋虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害または低酸素／再酸素化（Ｈ／Ｒ）の後に評価することができる（例えば、Ｚｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，３０（６）：１１４４−５２，ｅｐｕｂ  Ｆｅｂ  ２４，２００９を参照のこと）。一過性のＬＡＤ結紮は、再灌流の前にアぺリンＦｃ融合ポリペプチドを投与して行われる。（例えば、Ｐｉｓａｒｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｂｕｌｌ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１５２（１）：７９−８２を参照のこと。）マイクロ超音波による心機能の測定（本明細書において上述）を適用して、これに関する改善を決定する。標準的な組織学的技術により梗塞サイズを評価する。
【０２１１】
前収縮させた大動脈輪の弛緩は、次のように評価する：マウスまたはラットからの胸部大動脈のＥｘ  ｖｉｖｏ調製物をチタンワイヤで力変換器に懸架する。血管収縮薬（フェニレフリン、ノルエピネフリン、またはノルアドレナリン、エンドセリンもしくはアンジオテンシンＩＩ等）を用いて輪を前収縮させる。直径の増加および力変換器によって測定される力の減少は、血管弛緩を誘発する能力を示唆する。（Ｉｔｕｒｒｉｏｚ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．２０１０，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２４（５）：１５０６−１７，Ｅｐｕｂ  Ｄｅｃ  ２９，２００９；およびｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｍｙｏｇｒａｐｈ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ｉｎ  Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ７４（３）：３８８−３９５も参照のこと。）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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