(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スチルベノイド化合物を抽出するための方法であって、スチルベノイド化合物を多く含む薬用材料を原料として使用すること、フラッシュ抽出器で抽出すること、濾過すること、濾液を合わせること、及び濃縮乾固することを含み、ここで、スチルベノイド化合物を多く含む薬用材料が、Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiaoであり、溶媒が、メタノール、エタノール又はアセトンであり、抽出することが１〜３回実施され、抽出することが１回につき５〜１０分間実施され、そして溶媒の温度が２０℃〜４０℃である方法。
【請求項２】
溶媒に対する薬用材料の重量：体積比が１：１０〜１：１５である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬化学の分野に属する。特に、本発明は、スチルベノイド化合物を抽出するための方法、より特定すると、ルバーブ（rhubarb）からスチルベノイド化合物を抽出するためのフラッシュ抽出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルバーブは、中国の伝統薬用材料の１つであり、タデ科（Polygonaceae）のRheum由来の様々な多年生植物を表す一般用語である。ルバーブは、地下茎及びその根と共に医薬用途に利用可能であり、そして、厳寒の性質及び味覚を有し、脾臓、胃、大腸、肝臓及び手厥陰心包経（pericardium meridian）に活力を与える。ルバーブは、血液の冷却及び止血、熱の放出及び毒素の分解、血液循環の促進及び鬱血の除去、利尿を介する水気の除去及び黄疸の除去、便通をつけることによる便秘の緩和等において効能を発揮する。約６０種のRheum由来の植物があり、これらはアジアの温帯及び亜熱帯の高く寒い山岳部に分布している。中国には、３９種と２つの変種があり、これらは中国北西部、南西部及び北部に主に分布しており、北東部ではより少ない。チベット医学では、ルバーブは、その便通効果に応じて３つの等級：上級、中級及び下級に分類される。上級は、ルバーブと称され、中級は、ヤ−ルバーブ（ya-rhubarb）と称され、そして、下級は、小−ルバーブ（small-rhubarb）と称される。近年の研究を通して、スチルベノイド化合物がRheum由来のSect. Rheum植物中の特徴的な成分であることが見いだされている。
【０００３】
ジフェニルエチレン化合物とも称されるスチルベノイド化合物は、タデ科のRheumに広範に存在する有効成分である。研究を通して、スチルベノイド化合物が、抗老化、老年性認知症を予防及び処置すること、学習及び記憶を改善すること、脳保護及び神経保護、血液脂質を調節すること、抗アテローム性動脈硬化、抗血栓、フリーラジカルを捕捉するための抗酸化、神経系を保護すること、抗腫瘍、コレステロールを低下させること、肝臓保護、血管拡張及び保護、皮膚保護、抗鬱、心臓及び心筋保護、糖尿病に対する効果、発毛を促進すること、骨を強化すること等において、ある役割を果たすことが見いだされている。上記の中でも、抗血栓、皮膚保護、抗鬱、心臓及び心筋保護、糖尿病に対する効果、発毛を促進すること、骨を強化すること等の活性が近年新たに報告されている。それゆえ、ルバーブ中のスチルベノイド化合物を開拓及び使用することは、非常に良好な社会的かつ経済的な恩恵をもたらす。結果として、ルバーブからスチルベノイド化合物を抽出するための迅速、簡便及び安価な方法を見いだすことは、ルバーブの開拓にとって極めて重要になっている。
【０００４】
フラッシュ抽出は、近年開発された新規な抽出法である。フラッシュ抽出は、材料がフラッシュ抽出器内で好適な溶媒により適切な粒径へと迅速に破壊される組織破壊抽出の原理に基づいているが、同時に、抽出の目的を達成するために、フラッシュ抽出において高速撹拌、超音波振動、減圧下での透析濾過及び他の機能がさらに存在する。１回の抽出は、一般に、フラッシュ抽出では数秒から数分で完了することができるので、その抽出速度は、伝統的な方法の百倍を超える。しかしながら、先行技術において用いられるフラッシュ抽出法は、抽出速度を改善することしかできず、有効成分の含量に対してほとんど効果をもたらさない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
先行技術において存在する上記欠点を克服するために、本発明の目的は、抽出速度を改善して抽出サイクルを短縮するだけでなく、スチルベノイド化合物の純度を高めることもできる、スチルベノイド化合物を抽出するためのフラッシュ抽出法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的を達成するために、以下の技術的解決法が用いられる：
【０００７】
以下を含む、スチルベノイド化合物を抽出するための方法：スチルベノイド化合物を多く含む薬用材料を原料として使用すること、フラッシュ抽出器内で抽出すること、濾過すること、濾液を合わせること、及び濃縮乾固すること。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のある実施態様において、スチルベノイド化合物を抽出するための方法は、以下を含む：スチルベノイド化合物を多く含む薬用材料を原料として使用すること、薬用材料を粉砕した後に溶媒を加えること、フラッシュ抽出器内で１〜４回（１回につき５〜２０分間）抽出すること、濾過すること、濾液を合わせること、及び濃縮乾固すること。
【０００９】
本発明のある好ましい実施態様において、溶媒に対する薬用材料の重量：体積比（g/ml単位）は、１：１０〜１：１５である。
【００１０】
本発明のある実施態様において、本発明に係るスチルベノイド化合物を抽出するための方法において、スチルベノイド化合物を多く含む薬用材料は、Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao、Rheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao、Rheum australe D. Don及びRheum likiangense Sam.の１つ又は２超の混合物である。
【００１１】
本発明のある実施態様において、本発明に係るスチルベノイド化合物を抽出するための方法において、溶媒は、水、メタノール、エタノール、アセトン又は任意の比率のそれらの混合溶媒である。
【００１２】
本発明のある好ましい実施態様において、本発明に係るスチルベノイド化合物を抽出するための方法において、溶媒は、メタノール、エタノール又はアセトンである。
【００１３】
本発明のある実施態様において、本発明に係るスチルベノイド化合物を抽出するための方法において、溶媒は、２０℃〜４０℃の温度を有する。
【００１４】
本発明のある実施態様において、本発明に係るスチルベノイド化合物を抽出するための方法において、抽出することは、１〜３回実施される。
【００１５】
本発明のある実施態様において、抽出することは、１、２又は３回実施される。
【００１６】
本発明のある好ましい実施態様において、本発明に係るスチルベノイド化合物を抽出するための方法において、抽出することは、１回につき５〜１０分間実施される。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、上記フラッシュ抽出法に従って調製されたスチルベノイド化合物を多く含む抽出物がさらに提供される。
【００１８】
本発明の技術的解決法は、少なくとも以下の利点の１つを有する：
【００１９】
本発明のフラッシュ抽出法は、簡単な操作、高い抽出速度、短い抽出サイクル、加熱及び冷却に必要なエネルギー消費の節約、並びに生産コストの低下において有利である。一方で、本発明の電撃的な（blitzkrieg）抽出法を使用することによって、スチルベノイド化合物が伝統的な方法よりもはるかに高い純度で得られる。これは、後続の精製を容易にし、かつ、スチルベノイド化合物の大規模な工業生産に好適であり、高い応用価値及び開発展望を示す。
【００２０】
実施態様の詳細な説明
本明細書以下で、本発明の実施態様における技術的解決法が、本発明の実施例と併せて明確かつ完全に記載されよう。記載される実施例が全てではなく本発明の一部にすぎないことは明らかである。本発明の実施例に基づいて、創造的な作業なしに当業者によって得られた全ての他の例は、本発明の範囲内にある。
【実施例】
【００２１】
実施例１：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料中のスチルベノイド化合物の抽出
材料：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料（Lhasa, Tibetから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００２２】
フラッシュ抽出：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で３回（１回につき５分間）抽出し、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約８．９ｇのRheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao抽出物を得た。
【００２３】
エタノール還流下での抽出：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき１時間）の還流下での抽出のためにエタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約９．２ｇのRheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao抽出物を得た。
【００２４】
超音波抽出：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき３０分間）の超音波抽出のためにエタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約８．８ｇのRheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao抽出物を得た。
【００２５】
実施例２：Rheum likiangense Sam.薬用材料中のスチルベノイド化合物の抽出
材料：Rheum likiangense Sam.薬用材料（Diqing, Yunnanから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００２６】
フラッシュ抽出：Rheum likiangense Sam.薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で３回（１回につき５分間）抽出し、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．５ｇのRheum likiangense Sam.抽出物を得た。
【００２７】
エタノール還流下での抽出：Rheum likiangense Sam.薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき１時間）の還流下での抽出のためにエタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約８．４ｇのRheum likiangense Sam.抽出物を得た。
【００２８】
超音波抽出：Rheum likiangense Sam.薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき３０分間）の超音波抽出のためにエタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．８ｇのRheum likiangense Sam.抽出物を得た。
【００２９】
実施例３：Rheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao薬用材料中のスチルベノイド化合物の抽出
材料：Rheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao薬用材料（Minhe, Qinghaiから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００３０】
フラッシュ抽出：Rheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノールを１５倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で３回（１回につき５分間）抽出し、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約６．９ｇのRheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao抽出物を得た。
【００３１】
エタノール還流下での抽出：Rheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき１時間）の還流下での抽出のためにエタノールを１５倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．６ｇのRheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao抽出物を得た。
【００３２】
超音波抽出：Rheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき３０分間）の超音波抽出のためにエタノールを１５倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．４ｇのRheum hotaoense C. Y. Cheng et Kao抽出物を得た。
【００３３】
実施例４：Rheum australe D. Don薬用材料中のスチルベノイド化合物の抽出
材料：Rheum australe D. Don薬用材料（Lhasa, Tibetから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００３４】
フラッシュ抽出：Rheum australe D. Don薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で３回（１回につき１０分間）抽出し、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．３ｇのRheum australe D. Don抽出物を得た。
【００３５】
エタノール還流下での抽出：Rheum australe D. Don薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき１時間）の還流下での抽出のためにエタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．７ｇのRheum australe D. Don抽出物を得た。
【００３６】
超音波抽出：Rheum australe D. Don薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、３回（１回につき３０分間）の超音波抽出のためにエタノールを１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加え、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固して、約７．２ｇのRheum australe D. Don抽出物を得た。
【００３７】
実施例５：スチルベノイド化合物抽出物の測定
装置及び試薬：Shimadzu UV-2450 UV分光光度計、Sartorius CP225D化学天秤、２，３，５，４’−テトラヒドロキシルジフェニルエチレン−２−Ｏ−β−Ｄグルコシド対照（National Institutes for the Control of Food and Pharmaceuticals, No.110844-201310）。
【００３８】
１．極大波長：全てのスチルベノイド化合物は、ジフェニルエチレン骨格構造を有し、そして、極大波長は、ジフェニルエチレングリコシドの測定法を参照して３０６nmとして選択される。
【００３９】
２．対照溶液の調製：適量の２，３，５，４’−テトラヒドロキシルジフェニルエチレン−２−Ｏ−β−Ｄグルコシド対照を正確に計量し、適量の９５％エタノールを加えることによって溶解して、対照溶液として濃度０．０５mg/mlの溶液を調製した。
【００４０】
３．試験溶液の調製：実施例１〜４の各々からの薬用材料抽出物約０．１ｇを取り、正確に計量し、そして、プラグ付きフラスコに入れた。９５％エタノール１００mLを正確に加え、計量した。溶液を３０分間超音波処理し（出力：２５０Ｗ；周波数：３５kHz）、放冷し、再度計量して、損失重量を９５％エタノールで補填し、振盪し、そして濾過した。試験溶液として、その後の濾液５mlを２５mlのメスフラスコに正確に取り、溶解させて、９５％エタノールで一定体積に調整した。
【００４１】
４．直線相関の調査：２，３，５，４’−テトラヒドロキシルジフェニルエチレン−２−Ｏ−β−Ｄグルコシド対照を取り、９５％エタノールを加えて、後で使用するために濃度０．１mg/mlの標準ストック溶液を調製した。０．５ml、１ml、２ml、５ml及び７mlのストック溶液を取り、１０mlのメスフラスコにそれぞれ入れ、そして、溶解させ、９５％エタノールで一定体積に調整して、０．００５mg/ml、０．０１mg/ml、０．０２mg/ml、０．０５mg/ml及び０．０７mg/mlの希釈溶液を調製した。ジフェニルエチレングリコシドストック溶液及び異なる濃度の希釈溶液を取り、吸光度についてそれぞれアッセイした。横座標としてジフェニルエチレングリコシドの濃度（mg/ml）及び縦座標として平均吸光度を用いて線形回帰を計算して、線形方程式：Ｙ＝６．９３３６Ｘ−０．００２８、ｒ＝０．９９９２（ｎ＝６）を得た。
【００４２】
５．安定性試験：同じ標準溶液を正確に取り、調製後０時間、０．５時間、１時間、２時間及び３時間の吸光度についてそれぞれアッセイし、それに基づいて相対標準偏差を計算した。結果は、ＲＳＤ＝３．６８％（ｎ＝５）を示し、このことは、試験溶液が３時間以内で安定かつ信頼性が高いことを示している。
【００４３】
６．繰り返し性試験：同じ試験溶液を、吸光度について７回連続的にアッセイし、相対標準偏差を計算した。結果は、ＲＳＤ＝０．９３％を示し、このことは、良好な計測繰り返し性を示している。
【００４４】
７．再現性試験：同じ薬用材料抽出物を取り、６つの部分を同時に計量した。抽出処理を試験溶液の調製法に従って平行して実施し、そして、スチルベノイド化合物の含量を測定した。結果は、ＲＳＤ＝２．６２％を示し、このことは、上記抽出法の良好な再現性を示している。
【００４５】
８．各試料中のスチルベノイド化合物の純度の測定：実施例１〜４の各々で調製した抽出物０．１ｇを正確に計量し、試験溶液の調製法に従って試験溶液をそれぞれ調製した。スチルベノイド化合物の純度を測定した。データ結果は表１に見られる。
【００４６】
【表１】
0006523457.tif 000002
【００４７】
表１の結果から見られるように、４つのRheum薬用材料を同じ溶媒条件下で異なる抽出法を使用して抽出したところ、フラッシュ抽出及び還流下での抽出によるスチルベノイド化合物の純度はより高い。加熱の間に生成したエネルギー消費、溶媒濃縮等を全体の考慮に入れると、同じ抽出率の場合に、フラッシュ抽出が顕著な利点を示すことを見いだすことができる。
【００４８】
実施例６：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料を抽出するための溶媒の選択
材料：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料（Lhasa, Tibetから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００４９】
Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル及び水をそれぞれ１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で３回（１回につき５分間）抽出し、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固した。適量の抽出物を取り、スチルベノイド化合物の純度について実施例５の方法に従ってそれぞれアッセイした。結果は表２に見られる。
【００５０】
【表２】
0006523457.tif 000003
【００５１】
表２の結果から見られるように、異なる溶媒抽出条件下では、メタノール、エタノール又はアセトンによるスチルベノイド化合物の抽出率がより高く、一方で、水又は酢酸エチルによる抽出率はより低い。
【００５２】
実施例７：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の抽出回数の選択
材料：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料（Lhasa, Tibetから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００５３】
Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノールをそれぞれ１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で１、２、３、４及び５回（１回につき５分間）抽出し、それぞれ濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固した。適量の抽出物を取り、スチルベノイド化合物の純度について実施例５の方法に従ってそれぞれアッセイした。結果は表３に見られる。
【００５４】
【表３】
0006523457.tif 000004
【００５５】
表３の結果から見られるように、異なる抽出回数下では、４回以上抽出されたスチルベノイド化合物の抽出率は、１〜３回の抽出下の場合と大きく異なることはない。さらに、抽出は１〜３回の抽出下でほとんど完了している。
【００５６】
実施例８：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の抽出期間の選択
材料：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料（Lhasa, Tibetから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００５７】
Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料の粗粉末１００ｇを取り、エタノールをそれぞれ１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で３回（それぞれ１回につき１分間、５分間、１０分間、１５分間及び２０分間）抽出し、濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固した。適量の抽出物を取り、スチルベノイド化合物の純度について実施例５の方法に従ってそれぞれアッセイした。結果は表４に見られる。
【００５８】
【表４】
0006523457.tif 000005
【００５９】
表４の結果から見られるように、異なる抽出期間下で抽出されたスチルベノイド化合物について、抽出されたスチルベノイド化合物の総量は、５分間及び１０分間でより高く、１分間ではより低い。
【００６０】
実施例９：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料を抽出するための溶媒温度の選択
材料：Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料（Lhasa, Tibetから購入）を、不純物を除去することによって処理し、そして、浄化し、粗粉末へと粉砕した。
【００６１】
Rheum lhasaense A. J. Li et P. K. Hsiao薬用材料由来の粗粉末１００ｇを取り、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃又は７０℃の温度のエタノールをそれぞれ１０倍体積（W/V、g/ml単位）で加えた。粗粉末をフラッシュ抽出器内で２回（１回につき１５分間）抽出し、そして濾過した。濾液を合わせ、濃縮乾固した。適量の抽出物を取り、スチルベノイド化合物の純度について実施例５の方法に従ってそれぞれアッセイした。結果は表５に見られる。
【００６２】
【表５】
0006523457.tif 000006
【００６３】
表５の結果から見られるように、抽出が同じ条件下で実施される場合に、２０℃〜４０℃の溶媒温度でより高い純度のスチルベノイド化合物を得ることができるが、その純度は５０℃超の温度では低下する。これは、おそらく、各成分の溶解度の増加及び溶媒温度が上昇した後の様々な不純物の取り込みの増加によるものである。