(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）の（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔであるサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩及び溶媒和物を有効成分とする肺線維症治療剤。
【化１】
0006517206.tif 000019
【請求項２】
（１ａ）抽出：丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物を水で抽出して、濾液を濃縮して水抽出エキスとし、続いてアルコールで沈殿させ、上清を濃縮させてアルコール沈殿エキスとするステップ、
（１ｂ）分離：前記ステップ（１ａ）で得られたアルコール沈殿エキスを水で希釈し、多孔質吸収性樹脂に通して、酸性水溶液で洗浄して不純物を除去し、続いてエタノールで溶出させ、エタノール溶出液を濃縮してエキスとするステップ、
或いは、前記ステップ（１ａ）及び（１ｂ）の代わりに使用する
（１）合成：サルビアノール酸Ｂを水溶液に溶解して、加熱反応させるステップ、及び
（２）精製：ステップ（１）で得られた反応液のｐＨを酸性に調整したもの、或いは前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを高圧分取液体クロマトグラフで精製し、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出又は勾配溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液を収集し、濃縮して前記サルビアノール酸Ｔを得るステップを含む、請求項１に記載の肺線維症治療剤の調製方法。
【請求項３】
（１ａ）抽出：丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物を水で抽出して、濾液を濃縮して水抽出エキスとし、続いてアルコールで沈殿させ、上清を濃縮させてアルコール沈殿エキスとするステップ、
（１ｂ）分離：前記ステップ（１ａ）で得られたアルコール沈殿エキスを水で希釈し、多孔質吸収性樹脂に通して、酸性水溶液で洗浄して不純物を除去し、続いてエタノールで溶出させ、エタノール溶出液を濃縮してエキスとするステップ、
或いは、前記ステップ（１ａ）及び（１ｂ）の代わりに使用する
（１）合成：サルビアノール酸Ｂを水溶液に溶解して、加熱反応させるステップ、及び
（２）精製：ステップ（１）で得られた反応液のｐＨを酸性に調整したもの、或いは前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを高圧分取液体クロマトグラフで精製し、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液を組み合わせ、濃縮して前記サルビアノール酸Ｔを得るステップ、及び
（３）光学異性体の調製：前記ステップ（２）で得られたサルビアノール酸Ｔに対し、分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは逆相キラルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出又は勾配溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液をそれぞれ収集し、凍結乾燥させて、前記（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得るステップを含む、請求項１に記載の肺線維症治療剤の調製方法。
【請求項４】
前記ステップ（１ａ）において、前記丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物は、飲片、粉砕顆粒又は粉末であり、前記他の生薬は、丹参と適合するサンシチニンジン、オウギ又は両方の組み合わせである、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項５】
前記ステップ（１ａ）において、前記水で抽出するステップでは、前記生薬の容積の４〜８倍の水を添加し、１．５〜４ｈ煎じて、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．１０〜１．３０（８０℃）の水抽出エキスとする、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項６】
前記ステップ（１ａ）において、前記水で抽出するステップでは、前記生薬の容積の６倍の水を添加し、３ｈ煎じて、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．２２（８０℃）の水抽出エキスとする、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ（１ａ）において、前記水で抽出するステップは、アルカリ水溶液によって行われ、前記アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、重炭酸カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液の少なくとも１種である、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項８】
前記アルカリ水溶液が、０．３％〜０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液である、請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
前記ステップ（１ａ）において、前記アルコールで沈殿させるステップでは、前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、エタノール含有量が５０％〜７０％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまでアルコールで沈殿を行い、８〜３６ｈ静置し、上清を採取し、減圧下でエタノールを回収し、濃縮して相対密度が１．２５〜１．５（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１０】
前記ステップ（１ａ）において、前記アルコールで沈殿させるステップでは、前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、エタノール含有量が６０％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまでアルコールで沈殿を行い、２４ｈ静置し、上清を採取し、減圧下でエタノールを回収し、濃縮して相対密度が１．３２（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１１】
前記ステップ（１ｂ）において、前記多孔質吸収性樹脂は無極性又は微極性多孔質吸収性樹脂である、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１２】
前記ステップ（１ｂ）において、前記ステップ（１ａ）で使用される生薬と前記多孔質吸収性樹脂との重量比が（５：１）〜（１：１）である、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１３】
前記ステップ（１ａ）で使用される生薬と前記多孔質吸収性樹脂との重量比が３：１である、請求項１２に記載の調製方法。
【請求項１４】
前記ステップ（１ｂ）において、前記酸性水溶液は、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液および酢酸水溶液の任意の１種又はそれらの組み合わせから選ばれ、溶液のｐＨを１．０〜５．０に調整し、溶出液がほぼ無色になるまで該酸性溶液で洗浄する、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１５】
前記酸性水溶液が塩酸水溶液であり、溶液のｐＨを３．０に調整する、請求項１４に記載の調製方法。
【請求項１６】
前記ステップ（１ｂ）において、カラムの容積の４〜１０倍量である５０％〜９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、続いて溶出液を濃縮してアルコール臭がないエキスとする、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１７】
カラムの容積の５倍量である９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄する、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
前記ステップ（１）において、前記反応の原料はサルビアノール酸Ｂまたはその塩である、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項１９】
前記ステップ（１）において、前記サルビアノール酸Ｂと前記水溶液との質量比が１：０．１〜１：１０００００、反応温度が１０〜１５０℃、反応時間が１０ｍｉｎ〜２４ｈである、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項２０】
前記ステップ（１）において、前記サルビアノール酸Ｂと前記水溶液との質量比が１：２００、反応温度が９０℃、反応時間が１ｈである、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項２１】
前記ステップ（１）において、前記水溶液が、酸性水溶液、中性水溶液又はアルカリ水溶液である、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項２２】
前記ステップ（１）において、前記水溶液がアルカリ水溶液であり、前記アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、重炭酸カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、及び水酸化カリウム水溶液から選ばれる少なくとも１種である、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項２３】
前記アルカリ水溶液が、０．０５％〜０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液である、請求項８に記載の調製方法。
【請求項２４】
前記ステップ（２）において、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液および酢酸水溶液の任意の１種又はそれらの組み合わせを使用し、前記反応液のｐＨを１．０〜６．０に調整する、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項２５】
前記塩酸水溶液を使用して、前記反応液のｐＨを３．０に調整する、請求項２４に記載の調製方法。
【請求項２６】
前記ステップ（２）において、前記高圧分取液体クロマトグラフは動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフで、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムであり、前記ステップ（１）で得られ、ｐＨを調整した反応液又は前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを移動相に溶解し、前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（１０：９０：１）〜（９０：１０：１）であり、溶出液は前記移動相の容積比を用いて配合し、溶出は均一濃度溶出又は勾配溶出であり、流速は３００ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２１．２〜２４．０ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまで濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る、請求項２又は３に記載の調製方法。
【請求項２７】
前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（１０：９０：１）〜（５０：５０：１）である、請求項２６に記載の調製方法。
【請求項２８】
前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１である、請求項２６に記載の調製方法。
【請求項２９】
前記溶出は、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１の移動相を使用して均一濃度溶出を行う、請求項２６に記載の調製方法。
【請求項３０】
前記ステップ（３）において、分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは逆相キラルカラムであり、ステップ（２）で得られたサルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相に溶解し、前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（９０：１０：１）〜（１０：９０：１）であり、溶出液は前記移動相の容積比を用いて配合し、溶出は均一濃度溶出又は勾配溶出であり、流速は２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が１９．５〜２１．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、保持時間が２３．９〜２５．３ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分をそれぞれ収集し、まず、低温で濃縮した後に凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る、請求項３に記載の調製方法。
【請求項３１】
前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１である、請求項３０に記載の調製方法。
【請求項３２】
前記溶出は、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１の移動相を使用して均一濃度溶出を行う、請求項３０に記載の調製方法。
【請求項３３】
前記低温が１０〜４０℃である、請求項３０に記載の調製方法。
【請求項３４】
前記低温が３０℃である、請求項３０に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野に関する。具体的には、新規サルビアノール酸化合物、その調製方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
丹参は、シソ科アキギリ属の植物の根部であって、苦味があり、少し冷気を帯び、心臓及び肝臓のチャネルに作用して、うっ血を除去することによって疼痛を止め、血流を活性化させ、心を清浄にすることによって不穏状態を軽減する機能を有する。現在の薬理学的研究は、丹参が冠動脈を拡張させ、微小循環を改善させて、心臓を保護する効果を有し、血小板凝集を抑制及び除去し、無酸素耐性の身体能力、並びに抗肝炎、抗腫瘍及び抗ウイルス等の活性を高めることが可能であることを示している。２００１年に、中国医学科学院協和医科大学の薬物研究所は、丹参及びその同属の植物の水溶性活性成分の、サルビアノール酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、リトスペルミン酸、ロスマリン酸及びイソサルビアノール酸Ｃ等（Ｌｉ  Ｌｉａｎｎｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１年，第３０巻第７号）を含む計１３種のフェノール酸化合物を報告し、かつその１３種のフェノール酸化合物の薬理学的作用について報告した。２００２年に、Ｒｅｎａ  Ｋａｓｉｍｕ  ｅｔ  ａｌ．は、サルビアノール酸Ｋの化学構造について報告した（Ｒｅｎａ  Ｋａｓｉｍｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｘｉｎｊｉａｎｇ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００２年，第２５巻第３号）。外国でも丹参の水溶性活性成分に関して研究を行ってきた。１９９９年に、アメリカ・ジョージ・ワシントン大学は、「サルビアノール酸系の１３個の化学構造の抗ＨＩＶインテグラーゼ及び他のウイルス」に関して米国特許を出願して権利を取得したことは、丹参が、多大な潜在性を持ち、かつ開発する価値のある薬用植物資源であることを示す。
【０００３】
本発明に記載のサルビアノール酸Ｔは、大量のスクリーニングの研究過程において見出された丹参中の新規化合物であり、さらに、該構造に関する化合物及び薬理学的効果はいまだに報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、化学式（Ｉ）のサルビアノール酸化合物Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その溶媒和物及び加水分解可能なエステルを提供することを目的とする。
【化１】
0006517206.tif 000002
【０００５】
本発明は、サルビアノール酸Ｔの調整方法を提供することをもう１つの目的とする。
【０００６】
本発明は、サルビアノール酸Ｔを含有する医薬組成物、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤を提供することをさらなる目的とする。
【０００７】
本発明は、サルビアノール酸Ｔの急性心筋梗塞、急性心筋虚血を治療する薬物の調製における応用を提供することをまた他の目的とする。
【０００８】
本発明は、サルビアノール酸Ｔの肺線維症を治療する薬物の調製における応用を提供することをまた他の目的とする。
【０００９】
本発明は、サルビアノール酸Ｔの抗酸化剤の調製における応用を提供することをまた他の目的とする。
【００１０】
本発明は、サルビアノール酸Ｔが急性心筋梗塞、急性心筋虚血、又は肺線維症の治療に使用されることをまた他の目的とする。
【００１１】
本発明は、サルビアノール酸Ｔが老化防止に使用されることをまた他の目的とする。
【００１２】
本発明は、サルビアノール酸Ｔが抗酸化作用として使用されることをまた他の目的とする。
【００１３】
具体的には、本発明は、下記（１）〜（３７）項の発明に関する。
【００１４】
［１］化学式（Ｉ）のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物及び加水分解可能なエステル。
【化１】
0006517206.tif 000003
【００１５】
［２］（１ａ）抽出：丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物を水で抽出して、濾液を濃縮して水抽出エキスとし、続いてアルコールで沈殿させ、上清を濃縮させてアルコール沈殿エキスとするステップ、
（１ｂ）分離：前記ステップの前記（１ａ）で得られたアルコール沈殿エキスを水で希釈し、多孔質吸収性樹脂に通して、酸性水溶液で洗浄して不純物を除去し、続いてエタノールで溶出させ、エタノール溶出液を濃縮してエキスとするステップ、
或いは、前記ステップ（１ａ）及び（１ｂ）の代わりに使用する
（１）合成：サルビアノール酸Ｂを水溶液に溶解して、加熱反応させるステップ、及び
（２）精製：ステップ（１）で得られた反応液のｐＨを酸性に調整したもの、或いは前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを高圧分取液体クロマトグラフで精製し、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムであり、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出又は勾配溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液を収集し、濃縮させて前記サルビアノール酸Ｔを得るステップを含む、［１］に記載のサルビアノール酸Ｔの調製方法。
【００１６】
［３］（１ａ）抽出：丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物を水で抽出して、濾液を濃縮して水抽出エキスとし、続いてアルコールで沈殿させ、上清を濃縮してアルコール沈殿エキスとするステップ、
（１ｂ）分離：前記ステップの前記（１ａ）で得られたアルコール沈殿エキスを水で希釈し、多孔質吸収性樹脂に通し、酸性水溶液で洗浄して不純物を除去し、続いてエタノールで溶出させ、エタノール溶出液を濃縮してエキスとするステップ、
或いは、前記ステップ（１ａ）及び（１ｂ）の代わりに使用する
（１）合成：サルビアノール酸Ｂを水溶液に溶解して、加熱反応させるステップ、及び
（２）精製：ステップ（１）で得られた反応液のｐＨを酸性に調整したもの、或いは前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを高圧分取液体クロマトグラフで精製し、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液を組み合わせ、濃縮して前記サルビアノール酸Ｔを得るステップ、及び
（３）光学異性体の調製：前記ステップ（２）で得られたサルビアノール酸Ｔに対し、分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは逆相キラルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出又は勾配溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液をそれぞれ収集し、凍結乾燥させて前記、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得るステップを含む、［１］に記載のサルビアノール酸Ｔの光学異性体の調製方法。
【００１７】
［４］前記ステップ（１ａ）において、前記丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物は、飲片（注：生薬を修治したもの）、粉砕顆粒又は粉末であり、前記他の生薬は、丹参と適合するサンシチニンジン、オウギ又は両方の組み合わせである、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００１８】
［５］前記ステップ（１ａ）において、前記水で抽出するステップでは、前記生薬の容積の４〜８倍の水を添加し、１．５〜４ｈ煎じて、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．１０〜１．３０（８０℃）の水抽出エキスとする、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００１９】
［６］前記ステップ（１ａ）において、前記水で抽出するステップでは、前記生薬の容積の６倍の水を添加し、３ｈ煎じて、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．２２（８０℃）の水抽出エキスとする、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００２０】
［７］前記ステップ（１ａ）において、前記水で抽出するステップは、アルカリ水溶液によって行われ、前記アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、重炭酸カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液の少なくとも１種である、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００２１】
［８］前記アルカリ水溶液が、０．３％〜０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液である、［７］に記載の調製方法。
【００２２】
［９］前記ステップ（１ａ）において、前記アルコールで沈殿させるステップでは、前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、エタノール含有量が５０％〜７０％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまでアルコールで沈殿を行い、８〜３６ｈ静置し、上清を採取し、減圧下でエタノールを回収し、濃縮して相対密度が１．２５〜１．５（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００２３】
［１０］前記ステップ（１ａ）において、前記アルコールで沈殿させるステップでは、前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、エタノール含有量が６０％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまでアルコールで沈殿を行い、２４ｈ静置し、上清を採取し、減圧下でエタノールを回収し、濃縮して相対密度が１．３２（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００２４】
［１１］前記ステップ（１ｂ）において、前記多孔質吸収性樹脂は無極性又は微極性多孔質吸収性樹脂である、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００２５】
［１２］前記無極性又は微極性多孔質吸収性樹脂は、ＡＢ−８型、ＨＰＤ４５０型、Ｄ１０１型、又はＸ５型多孔質吸収性樹脂である、［１１］に記載の調製方法。
【００２６】
［１３］前記無極性又は微極性多孔質吸収性樹脂は、ＡＢ−８型である、［１２］に記載の調製方法。
【００２７】
［１４］前記ステップ（１ｂ）において、前記ステップ（１ａ）で使用される生薬と前記多孔質吸収性樹脂との重量比が（５：１）〜（１：１）である、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００２８】
［１５］前記ステップ（１ａ）で使用される生薬と前記多孔質吸収性樹脂との重量比が３：１である、［１４］に記載の調製方法。
【００２９】
［１６］前記ステップ（１ｂ）において、前記酸性水溶液は、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液および酢酸水溶液の任意の１種又はそれらの組み合わせから選ばれ、溶液のｐＨを１．０〜５．０に調整し、溶出液がほぼ無色になるまで該酸性溶液で洗浄する、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３０】
［１７］前記酸性水溶液が塩酸水溶液であり、溶液のｐＨを３．０に調整する、［１６］に記載の調製方法。
【００３１】
［１８］前記ステップ（１ｂ）において、カラムの容積の４〜１０倍量である５０％〜９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、続いて溶出液を濃縮してアルコール臭がないエキスとする、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３２】
［１９］カラムの容積の５倍量である９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄する、［１８］に記載の調製方法。
【００３３】
［２０］前記ステップ（１）において、前記反応の原料はサルビアノール酸Ｂまたはその塩である、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３４】
［２１］前記ステップ（１）において、前記サルビアノール酸Ｂと前記水溶液との質量比が１：０．１〜１：１０００００、反応温度が１０〜１５０℃、反応時間が１０ｍｉｎ〜２４ｈである、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３５】
［２２］前記ステップ（１）において、前記サルビアノール酸Ｂと前記水溶液との質量比が１：２００、反応温度が９０℃、反応時間が１ｈである、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３６】
［２３］前記ステップ（１）において、前記水溶液が、酸性水溶液、中性水溶液又はアルカリ水溶液である、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３７】
［２４］前記ステップ（１）において、前記水溶液がアルカリ水溶液であり、前記アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、重炭酸カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、及び水酸化カリウム水溶液から選ばれる少なくとも１種である、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００３８】
［２５］前記アルカリ水溶液が、０．０５％〜０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液である、［８］に記載の調製方法。
【００３９】
［２６］前記ステップ（２）において、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液および酢酸水溶液の任意の１種又はそれらの組み合わせを使用し、前記反応液のｐＨを１．０〜６．０に調整する、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００４０】
［２７］前記塩酸水溶液を使用して、前記反応液のｐＨを３．０に調整する、［２６］に記載の調製方法。
【００４１】
［２８］前記ステップ（２）において、前記高圧分取液体クロマトグラフは動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフで、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムであり、前記ステップ（１）で得られ、ｐＨを調整した反応液又は前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを移動相を用いて溶解し、前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（１０：９０：１）〜（９０：１０：１）であり、溶出液は前記移動相の容積比を用いて配合し、溶出は均一濃度溶出又は勾配溶出であり、流速は３００ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２１．２〜２４．０ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまで濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る、［２］又は［３］に記載の調製方法。
【００４２】
［２９］前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（１０：９０：１）〜（５０：５０：１）である、［２８］に記載の調製方法。
【００４３】
［３０］前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１である、［２８］に記載の調製方法。
【００４４】
［３１］前記溶出は、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１の移動相を使用して均一濃度溶出を行う、［２８］に記載の調製方法。
【００４５】
［３２］前記ステップ（３）において、分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは逆相キラルカラムであり、ステップ（２）で得られたサルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相に溶解し、前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（９０：１０：１）〜（１０：９０：１）であり、溶出液は前記移動相の容積比を用いて配合し、溶出は均一濃度溶出又は勾配溶出であり、流速は２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が１９．５〜２１．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、保持時間が２３．９〜２５．３ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分をそれぞれ収集し、まず、低温で濃縮した後に凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る、［３］に記載の調製方法。
【００４６】
［３３］前記移動相はアセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１である、［３２］に記載の調製方法。
【００４７】
［３４］前記溶出は、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１の移動相を使用して均一濃度溶出を行う、［３２］に記載の調製方法。
【００４８】
［３５］前記低温が１０〜４０℃である、［３２］に記載の調製方法。
【００４９】
［３６］前記低温が３０℃である、［３２］に記載の調製方法。
【００５０】
［３７］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルを含有する医薬組成物。
【００５１】
［３８］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルを含有する抗酸化剤。
【００５２】
［３９］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルを含有するフリーラジカル捕捉剤。
【００５３】
［４０］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの急性心筋梗塞、急性心筋虚血を治療する薬物の調製への使用。
【００５４】
［４１］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの肺線維症を治療する薬物の調製への使用。
【００５５】
［４２］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの抗酸化剤の調製への使用。
【００５６】
［４３］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの急性心筋梗塞、急性心筋虚血、又は肺線維症の治療における使用。
【００５７】
［４４］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの老化防止における使用。
【００５８】
［４５］［１］に記載のサルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの抗酸化作用における使用。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
図１は、サルビアノール酸Ｔの高分解能マススペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図２は、サルビアノール酸Ｔの１Ｈ−ＮＭＲ図（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）で、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図３は、サルビアノール酸Ｔの１３Ｃ−ＮＭＲ図（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）で、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図４は、サルビアノール酸ＴのＤＥＰＴスペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図５は、サルビアノール酸ＴのＣＯＳＹスペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図６は、サルビアノール酸ＴのＲＯＥＳＹスペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図７は、サルビアノール酸ＴのＨＳＱＣスペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図８は、サルビアノール酸ＴのＨＭＢＣスペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図９は、サルビアノール酸ＴのＣＤスペクトルで、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図１０は、サルビアノール酸ＴのＣＤスペクトルとＥＣＤ算出スペクトルとの対照で、Ａ：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、Ｂ：（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔである。
図１１は、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔが冠動脈結紮による急性心筋梗塞を防ぐ作用の研究での、各実験群の心臓スライス画像である。
図１２は、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔが、ＴＧＦ−β１に誘導されるＬ９２９細胞の増殖に対する抑制作用である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明は、化学式（Ｉ）のサルビアノール酸化合物Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物及び加水分解可能なエステルを提供することを目的とする。
【化１】
0006517206.tif 000004
【００６１】
本発明によるフェノール酸新規化合物は、化合物の物理化学的特性、高分解能質量分析法（ＱＦＴ−ＥＳＩ）、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＤＥＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、ＨＭＱＣ、及びＣＤ等のスペクトル（図１−図１０）で同定して、その構造を確認した。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴スペクトル）は、分子中に、酸素に結合されたメチンプロトンの１個のシグナルδ４．９３（１Ｈ，ｄｄ，８．０，４．５Ｈｚ）、芳香族プロトンの１１個のシグナルδ６．８５（１Ｈ，ｄ，８．５Ｈｚ）、δ７．３１（１Ｈ，ｄ，８．５Ｈｚ）、δ７．４１（１Ｈ，ｄ，１５．５Ｈｚ）、δ６．２７（１Ｈ，ｄ，１５．５Ｈｚ）、δ６．６２（１Ｈ，ｓ）、δ６．６３（１Ｈ，ｄ，８．０Ｈｚ）、δ６．４７（１Ｈ，ｄ，８．０Ｈｚ）、δ６．４４（１Ｈ，ｄ，２．０Ｈｚ）、δ６．５５（１Ｈ，ｄ，８．５Ｈｚ）、δ６．４３（１Ｈ，ｄｄ，８．５，２．０Ｈｚ）、δ７．６９（１Ｈ，ｓ）、脂肪族プロトンの２個のシグナルδ２．８９（２Ｈ，ｄｄｄ，１４．０，８．０，４．５Ｈｚ）を有することを示す。
【００６３】
１３Ｃ−ＮＭＲ（炭素−１３核磁気共鳴スペクトル）は、１個の脂肪族炭素シグナルδ３６．０、酸素に結合されたメテニル炭素の１個のシグナルδ７２．８、カルボニル炭素の３個のシグナルδ１６６．０、δ１７０．６、δ１６８．４、及び二重結合炭素の２２個のシグナルδ１２３．７、δ１２６．４、δ１４２．９、δ１４７．７、δ１１５．０、δ１１８．４、δ１４３．７、δ１１３．９、δ１２７．１、δ１１６．５、δ１４３．９、δ１４４．８、δ１１５．５、δ１２０．０、δ１２６．０、δ１１７．３、δ１４４．８、δ１４７．２、δ１１５．３、δ１２２．９、δ１４１．１、δ１２３．４である２７個の炭素シグナルを示す。
【００６４】
本発明による化合物の２種の異性体は、旋光度がそれぞれ−１５７．５°、１９６．６°である。Ｃ−８’絶対立体配置をＳ／Ｒ立体配置とした化合物についてそれぞれ分子構造の最適化を行い、続いてＴＤ−ＳＣＦを有するＢＰＶ８６方法を採用し、６−３１＋＋Ｇ（２ｄ，ｐ）基底系で算出し、その算出結果を読み取って本発明の化合物ＣＤスペクトルと対照し、最終的な結果において、２種の立体配置の化合物の算出結果と本発明の化合物の実験ＣＤスペクトルとが概ね合致し、本発明の化合物の２種の異性体のＣ−８’の絶対立体配置がそれぞれＳ立体配置とＲ立体配置であることが推定される（図１０参照）。本発明の化合物の主なＨＭＢＣは以下に関する。
【化２】
0006517206.tif 000005
【００６５】
本発明の化合物は、１つの新規サルビアノール酸化合物で、本明細書では、サルビアノール酸Ｔと名称を定義した。
【００６６】
抽出調製のプロセスにおいて、本発明の化合物は立体配置及び立体配座の変化が起こる可能性があるため、スペクトルデータにおいて変化が起こる可能性がある。しかしながら、立体配置変化及び立体配座変化により生じる各種異性体は、いずれも本発明の保護範囲内にある。
【００６７】
本分野の通常の専門知識及び従来技術によれば、本発明のサルビアノール酸Ｔは、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和物の形態で使用することもできる。本発明によるサルビアノール酸Ｔの薬学的に許容可能な塩は、従来の、薬学的に許容可能な無機塩基又は有機塩基から生成される塩を含み、前記塩は、従来の塩形成方法により調製されてなる。塩の好適な実施例は、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛等の塩、又はＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、プロカイン及びベルベリンと生成される塩を含む。本発明の第２形態を説明する前に、下記に提出されるサルビアノール酸Ｔには、式（Ｉ）で表わされるサルビアノール酸Ｔ、並びにその薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物及び加水分解可能なエステルが含まれている。
【００６８】
本発明のサルビアノール酸Ｔは、医薬組成物の形態で投与されることに適する。これら組成物は、通常の形態で１種類又は複数種類の生理学的に許容可能なキャリア或いは賦形剤と混合して使用することができる。可能であれば、治療する際、本発明のサルビアノール酸Ｔを、原薬として投与し、好ましくは直接活性成分を医薬製剤とする。他の成分との適合性及び患者に対する安全性の観点から、キャリアは薬学的に許容可能でなくてはならない。
【００６９】
したがって、本発明は、本発明のサルビアノール酸Ｔ及び１種類又は複数種類の薬学的に許容可能なキャリアを含み、並びに他の治療及び／又は予防性成分を含有するか又は含有しない、本発明のサルビアノール酸Ｔの医薬製剤をさらに提供する。これらの製剤は、経口的に、非経口的に（皮下、例えば注射又はリザーバ型錠剤、皮内、クモ膜下腔内、筋内、例えばリザーバ型、及び静脈内を含む）、直腸的に、及び局所的に（例えば、舌下）投与するのに適するが、最も望ましい投与経路は、患者の疾患による。該製剤は単位製剤であってもよく、また、薬学分野で既知の任意の方法により調製することができる。全ての方法は、本発明のサルビアノール酸Ｔを、１種類又は複数種類の補助成分を構成するキャリアと組み合わせる工程を含む。一般的に言えば、該製剤の調製過程は以下の通りである。本発明のサルビアノール酸Ｔを液体キャリア、又は微細粉砕した固体キャリア、又は両方の組み合わせを均一かつ密に組み合わせ、続いて、必要に応じて、生成物を所望の製剤に形成させる。
【００７０】
通常、標準的な薬学的技術を使用して、本発明のサルビアノール酸Ｔ及び医薬キャリアを本発明の医薬組成物に調製することができ、この方法には、混合、造粒及び加圧成型が含まれる。当業者に既知のように、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤の特徴及び形態は、混合される活性成分の量、投与経路及び他の既知の要素による。
【００７１】
本明細書では、使用された医薬キャリアは、医薬組成物とともに投与することができる各種の有機又は無機キャリアであり、例えば、固体製剤に使用される賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤及びコーティング剤であり、着色剤及び甘味剤のような医薬添加物を使用しても良い。前記医薬キャリアは、糖アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール；アミノ酸、例えば塩酸システイン、メチオニン、グリシン；ビタミンＣ、二ナトリウムＥＤＴＡ、ＥＤＴＡカルシウムナトリウム、無機塩、例えば一価アルカリ金属の炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩又はその水溶液；塩化ナトリウム、塩化カリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、ステアリン酸塩、例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム；無機酸、例えば塩酸、酢酸、硫酸、リン酸；有機酸塩、例えば乳酸ナトリウム；オリゴ糖、グリカン、セルロース及びその誘導体、例えばマルトース、グルコース、フルクトース、デキストラン、スクロース、ラクトース、シクロデキストリン（例えばβ−シクロデキストリン）、デンプン；ケイ素誘導体；アルギン酸塩；ゼラチン；ポリビニルピロリドン；グリセロール；寒天；界面活性剤、例えばツイーン８０；ポリエチレングリコール；リン脂質材料；カオリン；タルク粉末等から選ばれる。
【００７２】
その医薬製剤の形態は、任意の薬学的に許容可能な製剤の形状であってもよく、これらの製剤の形状には、錠剤、例えば糖衣錠、フィルムコート錠、腸溶錠；カプセル、例えば、硬質カプセル、軟質カプセル；経口溶液；バッカル錠；顆粒；沸騰水中に溶解した後に摂取する顆粒；丸剤；散剤；ペースト；ペレット；懸濁液；粉末；溶液剤；注射剤；坐剤；ペースト、例えば、軟膏及び硬膏；クリーム；スプレー剤；滴剤及びパッチを含む。本発明の製剤では、好ましくは、経口剤形、例えばカプセル、錠剤、経口溶液、顆粒、丸剤、散剤、ペレット及びペースト等、並びに注射剤、例えば粉末注射剤、注射液、輸液等である。本発明の最も好ましい製剤は、錠剤である。
【００７３】
経口投薬の製剤は、一般的に使用される賦形剤、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤加圧成型剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、調味剤及び湿潤剤を含有することができ、必要に応じて、錠剤はコーティングすることができる。
【００７４】
賦形剤の好ましい例として、ラクトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、例えばα−デンプン、デキストリン、結晶性セルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、アミロペクチン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム又はケイ酸アルミニウムマグネシウム等を含む。
【００７５】
潤滑剤の好ましい例として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク粉末及びシリカゲル等を含む。
【００７６】
結合剤の好ましい例として、α−デンプン、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、アミロペクチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ピロリドン等を含む。
【００７７】
崩壊剤の好ましい例として、ラクトース、糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、アミノアルキルナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を含む。
【００７８】
コーティング剤の好ましい例として、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等を含む。
【００７９】
着色剤の好ましい例として、水溶性食用タートラジン色素（食用色素は、例えば食用赤色Ｎｏ．２号及びＮｏ．３、食用黄色Ｎｏ．４及びＮｏ．５号、食用青色Ｎｏ．１号及びＮｏ．２である）、水不溶性レーキ顔料（例えば、上述の水溶性食用タートラジン色素のアンモニウム塩）及び天然色素（例えば、β−カロテン、クロロフィル及びベンガラ）等を含む。
【００８０】
甘味剤の好ましい例として、サッカリンナトリウム、グリシルレチン酸、アスパルテーム及びステビオシド等を含む。
【００８１】
錠剤の調製方法は、一般的に、本発明のサルビアノール酸Ｔを１種又は複数種の薬学的に許容可能な補助剤と加圧成型するか又は成形する。
【００８２】
本発明のサルビアノール酸Ｔは、経口液体製剤、例えば、水溶性又は油溶性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ等にも調製される。本発明のサルビアノール酸Ｔは、乾燥製品であってもよく、使用前に水又は他の好適なキャリアと再混合する。このような液体製剤は、通常の添加剤を含有することができ、懸濁化剤、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は硬化食用脂；乳化剤、例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン又はアラビアゴム；非水性キャリア（食用油を含んでも良い）、例えば、扁桃油、分留ヤシ油、バター性エステル、プロピレングリコール又はエタノール；並びに防腐剤、例えば、メチルパラベン、プロピルエステル及びソルビン酸を含有することができる。
【００８３】
非経口的に投与される製剤は、水性及び非水性の滅菌注射剤を含み、ここで、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び等張剤等、及び水性及び非水性の滅菌懸濁液を含有することができ、懸濁化剤及び増粘剤を含有することができる。製剤は、単回用量又は複数回用量容器内、例えば密封アンプル及びバイアルで保存することができ、かつ凍結乾燥（凍結乾燥）の条件下で保管することができ、ただ使用前に滅菌液体キャリア、例えば注射用の水を注入すればよい。
【００８４】
直腸投与するために用いられる製剤は、従来の坐剤基剤、例えばココアバター、ステアリン酸又は他のグリセリド若しくはエチレングリコールを含有する坐剤であってもよい。
【００８５】
口腔に局所的、例えば頬又は舌下に投与するために用いられる製剤はトローチを含み、ここで、風味付けされた基剤中に活性成分が含まれ、該基剤は、例えばスクロース及びアラビアゴムであり、さらに香錠剤を含み、ここで、基剤中に活性成分が含まれ、該基剤は、ゼラチン及びグリセロール、又はスクロース及びアラビアゴムであっても良い。
【００８６】
本発明のサルビアノール酸Ｔは、リザーバ型製剤に配合することもできる。このような持続放出製剤は、移植（例えば皮下又は筋内）又は筋内注射により投与することができる。したがって、本発明のサルビアノール酸Ｔは、好適なポリマー或いは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョン）又はイオン交換樹脂と配合する、或いは難溶性誘導体、例えば難溶性塩に配合調製することができる。
【００８７】
本分野の通常の専門知識及び従来技術によれば、本発明に関連した治療は、予防並びに既定の疾患又は症状の治療を含む。また、本発明のサルビアノール酸Ｔの治療に必要な量は、治療する疾患の特性及び患者個人の条件による、又は医師の助言に従う。一般的には、成人に関する治療上有効な量は、通常０．０２〜５０００ｍｇ／日の範囲内であり、好ましくは１〜１５００ｍｇ／日である。有効な量は、単回投与量又は複数回用量であってもよく、適切な間隔で、例えば１日２回、３回、４回又はそれ以上投与する。本発明による製剤は、活性成分を０．１〜９９ｗｔ％含有してもよく、錠剤及びカプセルは、活性成分を３０〜９５ｗｔ％含有することが好ましく、液体製剤は、活性成分を３〜５０ｗｔ％含有することが好ましい。
【００８８】
第２形態において、本発明はサルビアノール酸Ｔの調製方法に関し、前記方法は、
（１ａ）抽出：丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物を水で抽出して、濾液を濃縮して水抽出エキスとし、続いてアルコールで沈殿させ、該上清を濃縮してアルコール沈殿エキスとするステップ、
（１ｂ）分離：ステップ（１ａ）で得られたアルコール沈殿エキスを水で希釈し、多孔質吸収性樹脂に通して、酸性水溶液で洗浄して不純物を除去し、続いてエタノールで溶出させ、エタノール溶出液を濃縮してエキスとするステップ、或いは、前記ステップ（１ａ）及び（１ｂ）の代わりに使用する
（１）合成：サルビアノール酸Ｂを水溶液に溶解して、加熱反応させるステップ、及び
（２）精製：ステップ（１）で得られた反応液のｐＨを酸性に調整したもの或いは前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを高圧分取液体クロマトグラフで精製し、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸で、均一濃度溶出又は勾配溶出で、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液を収集し、濃縮して前記サルビアノール酸Ｔを得るステップを含む。
【００８９】
さらに、本発明はサルビアノール酸Ｔの光学異性体の調製方法に関し、ここで、前記方法は、
（１ａ）抽出：丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物を水で抽出して、濾液を濃縮して水抽出エキスとし、続いてアルコールで沈殿させ、該上清を濃縮してアルコール沈殿エキスとするステップ、
（１ｂ）分離：ステップ（１ａ）で得られたアルコール沈殿エキスを水で希釈した後、多孔質吸収性樹脂に通して、酸性水溶液で洗浄して不純物を除去し、続いてエタノールで溶出させ、エタノール溶出液を濃縮してエキスとするステップ、
或いは、前記ステップ（１ａ）及び（１ｂ）の代わりに使用する
（１）合成：サルビアノール酸Ｂを水溶液に溶解して、加熱反応させるステップ、及び
（２）精製：ステップ（１）で得られた反応液のｐＨを酸性に調整したもの、或いは前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを高圧分取液体クロマトグラフで精製し、カラム充填材はＣ１８逆相シリカゲルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸であり、均一濃度溶出又は勾配溶出を行い、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液を収集し、濃縮して前記サルビアノール酸Ｔを得るステップ、及び
（３）光学異性体の調製：前記ステップ（２）で得られたサルビアノール酸Ｔに対し、分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは逆相キラルカラムで、溶出液はアセトニトリル−水−ギ酸で、均一濃度溶出又は勾配溶出で、検出波長は２８０ｎｍであり、溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを含有する溶出液をそれぞれ収集し、凍結乾燥させて前記、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得るステップを含む。
【００９０】
前記ステップ（１ａ）において、丹参生薬又は丹参生薬及び他の生薬の混合物は、飲片、粉砕顆粒又は粉末であってもよく、好ましくは飲片であり、前記他の生薬は、当業者に既知の、丹参と適合する生薬であってもよく、好ましくは、サンシチニンジン、オウギ又は両方の組み合わせである。
【００９１】
前記ステップ（１ａ）において、前記水抽出ステップでは、生薬の容積の４〜８倍の水を添加し、１．５〜４ｈ煎じ、好ましくは、生薬の容積の６倍の水を添加し、３ｈ煎じ、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．１０〜１．３０（８０℃）の水抽出エキスとし、好ましくは、相対密度が１．２２（８０℃）の水抽出エキスとする。抽出効果を高め、かつフェノール酸物質を早く溶出するために、前記水抽出ステップでは、好ましくは、アルカリ水溶液によって行われ、前記アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、重炭酸カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液の少なくとも１種が好ましく、０．３％〜０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００９２】
前記ステップ（１ａ）において、前記アルコール沈殿ステップでは、前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、エタノール含有量が５０％〜７０％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまで、好ましくは６０％（ｖ／ｖ）になるまでアルコールで沈殿を行い、８〜３６ｈ静置し、好ましくは２４ｈ静置し、上清を採取し、減圧下でエタノールを回収し、濃縮して相対密度が１．２５〜１．５（６０℃）、好ましくは１．３２（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする。
【００９３】
前記ステップ（１ｂ）において、前記多孔質吸収性樹脂は無極性又は微極性多孔質吸収性樹脂であり、ＡＢ−８型、ＨＰＤ４５０型、Ｄ１０１型、又はＸ５型多孔質吸収性樹脂から選ばれてもよく、好ましくは、ＡＢ−８型であり、前記ステップ（１）で使用される生薬と前記多孔質吸収性樹脂との重量比が（５：１）〜（１：１）、好ましくは３：１であり、前記酸性水溶液は、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液および酢酸水溶液の任意の１種又はそれらの組み合わせから選ばれ、好ましくは、塩酸水溶液であり、溶液のｐＨを１．０〜５．０、好ましくは３．０に調整し、溶出液がほぼ無色になるまで該酸性溶液で洗浄する、続いて、カラムの容積の４〜１０倍量である５０％〜９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、好ましくは、カラムの容積の５倍量である９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、溶出液を濃縮してアルコール臭がないエキスとする。
【００９４】
前記ステップ（１）において、前記反応原料はサルビアノール酸Ｂまたはその塩である。
【００９５】
前記ステップ（１）において、前記サルビアノール酸Ｂと前記水溶液との質量比が１：０．１〜１：１０００００であってもよく、好ましくは、１：２００であり、反応温度が１０〜１５０℃であってもよく、好ましくは、９０℃であり、反応時間が１０ｍｉｎ〜２４ｈであってもよく、好ましくは１ｈである。
【００９６】
前記ステップ（１）において、前記水溶液は、酸性水溶液、中性水溶液又はアルカリ水溶液であってもよく、好ましくは、アルカリ水溶液であり、前記アルカリ水溶液は、重炭酸ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、重炭酸カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液の任意の１種から選ばれ、さらに好ましくは、前記アルカリ水溶液が、０．０５％〜０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液である。
【００９７】
前記ステップ（２）において、前記反応液のｐＨの調整は、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液および酢酸水溶液の任意の１種又はそれらの任意の組み合わせを使用して、前記反応液のｐＨを１．０〜６．０に調整することができ、好ましくは、塩酸水溶液を使用して、前記反応液のｐＨを３．０に調整する。
【００９８】
前記ステップ（２）において、前記高圧分取液体クロマトグラフは動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフ、例えば、フランス  ＮＯＶＡＳＥＰＬＣ８０−６００を使用してもよく、カラム充填材は、Ｃ１８逆相シリカゲルカラム（１０μｍ、ＹＭＣ社）が好ましく、前記ステップ（１ｂ）で得られたエキスを移動相に溶解し（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（１０：９０：１）〜（９０：１０：１））、好ましくは、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（１０：９０：１）〜（５０：５０：１）、より好ましくは、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１であり、溶出液は前記移動相の容積比を用いて配合し、溶出は均一濃度溶出又は勾配溶出を選択することができ、好ましくは、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１で均一濃度溶出を行い、流速は３００ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２１．２〜２４．０ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまで濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る。
【００９９】
前記ステップ（３）において、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４００分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−ＲＨ逆相キラルカラム（２５０×２０ｍｍ、５μｍ）であり、ステップ（２）で得られたサルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相に溶解し（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝（９０：１０：１）〜（１０：９０：１））、好ましくは、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１であり、溶出液は前記移動相の容積比を用いて配合し、溶出は均一濃度溶出又は勾配溶出を選択することができ、好ましくは、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１で均一濃度溶出を行い、流速は２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が１９．５〜２１．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、２３．９〜２５．３ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分をそれぞれ収集し、まず、低温（１０〜４０℃、好ましくは３０℃）で濃縮した後に凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る。
【０１００】
本発明の薬効実験結果から、本発明のサルビアノール酸Ｔは、抗急性心筋梗塞の活性、抗急性心筋虚血の活性を有し、比較的良好なフリーラジカル捕捉力及び還元力を有し、また、肺線維症を治療する活性も有することを示す。
【０１０１】
従って、本発明は、さらに以下の内容に関する。
【０１０２】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルを含有する抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤。
【０１０３】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの、急性心筋梗塞、急性心筋虚血を治療する薬物の調製における応用。
【０１０４】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの、肺線維症を治療する薬物の調製における応用。
【０１０５】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルの、抗酸化剤の調製における応用。
【０１０６】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルは、急性心筋梗塞、急性心筋虚血、又は肺線維症の治療に使用される。
【０１０７】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルが、老化防止に使用される。
【０１０８】
サルビアノール酸Ｔ、その薬学的に許容可能な塩、その光学異性体、溶媒和物又は加水分解可能なエステルが、抗酸化作用として使用される。
【０１０９】
実施例
以下は、調製例及び試験例を参照し、本発明の技術方案をさらに詳細に説明する。本発明の保護範囲はこれらの調製例及び試験例によって限定されるものではない。
【０１１０】
調製例１  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの調製
【０１１１】
丹参飲片を取って、生薬煎じ器に置き、丹参飲片の質量の６倍量である０．３％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液を添加し、２．５ｈ煎じて、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．２２（８０℃）の水抽出エキスとする。
【０１１２】
前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、エタノール含有量が６０％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまでアルコールで沈殿を行い、２４ｈ静置し、上清を採取し、減圧下で濃縮して相対密度が１．３２（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする。
【０１１３】
前記アルコール沈殿エキスを水で溶解し、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂に通して、溶出液がほぼ無色になるまでｐＨ＝３．０の塩酸水溶液で洗浄し、続いて、カラムの容積の５倍量である９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、溶出液を濃縮してアルコール臭がないエキスとする。
【０１１４】
前のステップで得られたエキスを移動相に溶解し（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１）、フランス  ＮＯＶＡＳＥＰ  ＬＣ８０−６００の動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフを使用して精製し、カラム充填材は、Ｃ１８逆相シリカゲルカラム（１０μｍ、ＹＭＣ社）であり、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１で均一濃度溶出を行い、流速は３００ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２１．２〜２４．０ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまでロータリーエバポレーターにより濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る。
【０１１５】
前記サルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１）に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４００分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−ＲＨ逆相キラルカラム（２５０×２０ｍｍ、５μｍ）であり、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１で均一濃度溶出を行い、流速は２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が１９．５〜２１．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、２３．９〜２５．３ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分を収集し、まず、ロータリーエバポレーターにより３０℃で溶出液を濃縮した後、凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る。
【０１１６】
高分解能質量分析法によって、擬分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］−（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔｍ／ｚ＝５３７．１０３３、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔｍ／ｚ＝５３７．１０３２を示す。
【０１１７】
（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの核磁気共鳴スペクトルデータを下記表に示す。
【０１１８】
【表１】
0006517206.tif 000006
【０１１９】
【表２】
0006517206.tif 000007
【０１２０】
調製例２  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの調製
【０１２１】
丹参とサンシチニンジン飲片を取って、生薬煎じ器に置き、丹参とサンシチニンジン飲片の容積の４倍量である０．４５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウム水溶液を添加し、２ｈ煎じて、濾過し、濾液を濃縮して相対密度が１．２５（８０℃）の水抽出エキスとする。
【０１２２】
前記水抽出エキスに９５％（ｖ／ｖ）のエタノールを添加し、６５％（ｖ／ｖ）（２５℃）になるまでアルコールで沈殿を行い、１２ｈ静置し、上清を採取し、減圧下で濃縮して相対密度が１．２８（６０℃）のアルコール沈殿エキスとする。
【０１２３】
前記アルコール沈殿エキスを水で溶解し、ＡＢ−８多孔質吸収性樹脂に通して、ほぼ無色になるまでｐＨ＝２．５の塩酸水溶液で洗浄し、続いて、カラムの容積の４倍量である９５％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、溶出液を濃縮してアルコール臭がないエキスとする。
【０１２４】
前のステップで得られたエキスを移動相に溶解し（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１）、フランス  ＮＯＶＡＳＥＰ  ＬＣ８０−６００の動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフを使用して精製し、カラム充填材は、Ｃ１８逆相シリカゲルカラム（１０μｍ、ＹＭＣ社）であり、かつ０ｍｉｎ〜６０ｍｉｎ、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）が１５：８５：１から２０：８０：１に線形に変化する条件で線形勾配溶出を行い、流速は２５０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２９．５〜３２．１ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまでロータリーエバポレーターにより濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る。
【０１２５】
前記サルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１）に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４００分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−ＲＨ逆相キラルカラム（２５０×２０ｍｍ、５μｍ）であり、かつ０ｍｉｎ〜４５ｍｉｎ、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）が１７：８３：１から２２：７８：１に線形に変化する条件で線形勾配溶出を行い、流速は２０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が２５．２〜２７．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、３２．４〜３４．２ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分を収集し、まず、ロータリーエバポレーターにより３０℃で溶出液を濃縮した後、凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る。
【０１２６】
高分解能質量分析法によって、擬分子イオンピーク［Ｍ−Ｈ］−（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔｍ／ｚ＝５３７．１０３５、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔｍ／ｚ＝５３７．１０３４を示す。
【０１２７】
（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの核磁気共鳴スペクトルデータを下記表に示す。
【０１２８】
【表３】
0006517206.tif 000008
【０１２９】
【表４】
0006517206.tif 000009
【０１３０】
調製例３  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ、及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの調製
【０１３１】
サルビアノール酸Ｂを取って、２００倍量（質量比）である０．３％重炭酸ナトリウムに溶解し、丸底フラスコに置いて９０℃で１ｈ還流する。
【０１３２】
反応終了後、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液でｐＨを３．０に調整し、続いて移動相に溶解し（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１）、フランス  ＮＯＶＡＳＥＰＬＣ８０−６００の動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフを使用して精製し、カラム充填材は、Ｃ１８逆相シリカゲルカラム（１０μｍ、ＹＭＣ社）であり、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１で均一濃度溶出を行い、流速は３００ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２１．２〜２４．０ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまでロータリーエバポレーターにより濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る。
【０１３３】
前記サルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１）に溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４００分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−ＲＨ逆相キラルカラム（２５０×２０ｍｍ、５μｍ）であり、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１で均一濃度溶出を行い、流速は２５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が１９．５〜２１．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、２３．９〜２５．３ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分を収集し、まず、ロータリーエバポレーターにより３０℃で溶出液を濃縮した後、凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る。
【０１３４】
調製例４  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの調製
【０１３５】
サルビアノール酸Ｂマグネシウム塩を取って、３００倍量（質量比）である０．０５％重炭酸ナトリウムに溶解し、丸底フラスコに置いて９０℃で２ｈ還流する。
【０１３６】
反応終了後、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液でｐＨを３．０に調整し、続いて移動相に溶解し（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１５：８５：１）、フランス  ＮＯＶＡＳＥＰ  ＬＣ８０−６００の動的軸方向高圧分取液体クロマトグラフを使用して精製し、カラム充填材は、Ｃ１８逆相シリカゲルカラム（１０μｍ、ＹＭＣ社）であり、かつ０ｍｉｎ〜６０ｍｉｎ、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）が１５：８５：１から２０：８０：１に線形に変化する条件で線形勾配溶出を行い、流速は２５０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタして、保持時間が２９．５〜３２．１ｍｉｎの成分を収集し、乾固するまでロータリーエバポレーターにより濃縮して、サルビアノール酸Ｔのサンプルを得る。
【０１３７】
前記サルビアノール酸Ｔのサンプルを移動相（アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）＝１７：８３：１）で溶解し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ４００分取液体クロマトグラフを用いて光学異性体の分離を行い、カラムは、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ（登録商標）ＯＤ−ＲＨ逆相キラルカラム（２５０×２０ｍｍ、５μｍ）であり、かつ０ｍｉｎ〜４５ｍｉｎ、アセトニトリル：水：ギ酸（容積比）が１７：８３：１から２２：７８：１に線形に変化する条件で線形勾配溶出を行い、流速は２０ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２８０ｎｍである。溶出過程を高速液体クロマトグラフィーによりモニタし、保持時間が２５．２〜２７．１ｍｉｎの（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ成分、３２．４〜３４．２ｍｉｎの（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ成分を収集し、まず、ロータリーエバポレーターにより３０℃で溶出液を濃縮した後、凍結乾燥させて、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを純品で得る。
【０１３８】
製剤調製例１  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ、及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの錠剤の調製
処方：
サルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ
１００ｇ
微結晶性セルロース                              ５０ｇ
ラクトース                                      ３０ｇ
デンプン                                        ５５ｇ
デンプングリコール酸ナトリウム                  １０ｇ
５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ無水エタノール溶液            適量
ステアリン酸マグネシウム                          ５ｇ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１３９】
１０００錠に調製する。
【０１４０】
プロセス
１．造粒
サルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ及び処方中の他の補助剤を、それぞれ１００メッシュの篩に通して篩過し、処方量に従ってサルビアノール酸Ｔと微結晶性セルロース、デンプン及びデンプングリコール酸ナトリウムを取って、同等に漸増する方法を用いることによって十分に混合し、適量の５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ無水エタノール溶液を使用して、軟質材料を製造して、１４メッシュの篩を用いて造粒して、５０〜６０℃で１ｈ乾燥させ、処方量に従ってステアリン酸マグネシウムを添加して、１４メッシュの篩で顆粒を篩過する。
【０１４１】
２．錠剤の加圧成型
前記顆粒を、パンチプレス機で加圧成型する。
【０１４２】
製剤例２  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔのカプセルの調製
処方：
サルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ
１００ｇ
デンプン                                        ２００ｇ
デンプングリコール酸ナトリウム                    １５ｇ
５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ無水エタノール溶液              適量
ステアリン酸マグネシウム                            ５ｇ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１４３】
１０００粒に調製する。
【０１４４】
プロセス
１．造粒
サルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ及び処方中の他の補助剤を、それぞれ１００メッシュの篩に通して篩過し、処方量に従ってサルビアノール酸Ｔ、デンプン及びデンプングリコール酸ナトリウムを取って、同等に漸増する方法を用いることによって十分に混合し、適量の５％（ｗ／ｖ）ＰＶＰ無水エタノール溶液を使用して、軟質材料を製造して、１４メッシュの篩を用いて造粒して、５０℃〜６０℃で１ｈ乾燥させ、処方量に従ってステアリン酸マグネシウムを添加して、１４メッシュの篩で顆粒を篩過する。
【０１４５】
２．封入
前記顆粒をカプセルに装入する。
【０１４６】
製剤例３  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ、及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの注射剤の調製
【０１４７】
処方：
サルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ
１００ｇ
マンニトール                                        １００ｇ
注射用の水                                        ２５００ｍＬまで
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１４８】
１０００本に調製する。
【０１４９】
プロセス：
処方量に従ってサルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを取って、注射用の水１０００ｍＬを添加して溶解させ、均一に攪拌させる。また、処方量に従ってマンニトールを取って、注射用の水５００ｍＬを添加して溶解させ、前記溶液に添加して、均一に攪拌し、０．５ｇの活性炭で３０ｍｉｎ保温攪拌して濾過し、濾液のｐＨを４．５〜５．０に調整し、注射用の水を２５００ｍＬまで添加して、滅菌濾過し、別個に包入して得られる。
【０１５０】
製剤例４  サルビアノール酸Ｔ、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ、及び（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの凍結乾燥粉末の調製
【０１５１】
処方：
サルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ
１００ｇ
マンニトール                                        １００ｇ
注射用の水                                        ２０００ｍＬ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【０１５２】
１０００本に調製する。
【０１５３】
プロセス：
処方量に従ってサルビアノール酸Ｔ又は（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ又は（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ及びマンニトールを取って、注射用の水１５００ｍＬを添加して攪拌溶解し、０．５ｇの活性炭を添加して２０ｍｉｎ攪拌脱色し、０．４５μｍのフィルターフィルムによって炭素を除去し、水を２０００ｍＬまで補充し、滅菌濾過して、別個に装入し、凍結乾燥させて得られる。
【０１５４】
薬力学的試験例１  （Ｓ）−サルビアノール酸Ｔが冠動脈結紮による急性心筋梗塞を防ぐ作用
【０１５５】
実験材料
【０１５６】
１．被験物及び試薬
（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ、バッチ番号：１２０３０１、Ｔａｓｌｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｃａｄｅｍｙにより提供される。
アスピリン腸溶錠：仕様：１００ｍｇ／錠、Ｂａｙｅｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、パッチ番号：ＢＪ０７１６０。
０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム注射剤：仕様：５００ｍＬ、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｘｉａｏｙｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、パッチ番号：２０１２０５１２０５。
抱水クロラール：ＡＲ、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、パッチ番号：２０１００１１１。
２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、パッチ番号：Ｆ２００４０３０８。
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）測定キット、パッチ番号：２０１２０９１７；乳酸（ＬＤ）測定キット、パッチ番号：２０１２０９１９；マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）測定キット、パッチ番号：２０１２０９１９；スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）測定キット、パッチ番号：２０１２０９１８；クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）測定キット、パッチ番号：２０１２０９２２；ＡＴＰ酵素測定キット、パッチ番号：２０１２０９２１。いずれも  Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより提供される。
【０１５７】
２．主な装置
ＨＸ−３００呼吸器：  Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｔａｉｍｅｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．。
ＥＣＧ−６５１１心電図機：Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．。
ＨＨ−２デジタルサーモスタットの湯せん：Ｇｕｏｈｕａ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ａｐｐｌｉａｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．。
ＢＳ  ２２４ｓ電子天びん：Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＆  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．。
ＢＳ  １１０ｓ電子天びん：Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＆  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．。
【０１５８】
３．実験動物
ＳＤラット、体重２１０〜２３０ｇ、雄、Ｓｕｚｈｏｕ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐａｒｋ  Ａｉｅｒｍａｉｔｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、実験動物生産の品質合格証明書番号：ＳＣＸＫ（Ｓｕ）２００９−０００１。
【０１５９】
実験方法及び結果
【０１６０】
１．用量の設計
（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔの凍結乾燥粉末の投与用量：２０ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重。アスピリン：３０ｍｇ／ｋｇ体重。
【０１６１】
２．実験方法
クリーングレードの雄ＳＤラットを、体重に従って、偽手術群（蒸留水）、モデル群（蒸留水）、アスピリン群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ低用量群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群に無作為に１０匹ずつの群に分けた。各群のラットに毎日１回胃内投与し、１０日間連続して投与した。投与容積は１ｍＬ／１００ｇ体重である。最終投与の１ｈ後に、抱水クロラール３００ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔注射して麻酔し、仰臥位に固定し、順にヨードチンキ、アルコールで手術切開部位を消毒した後、第３肋と第４肋との間で開胸すると共に、人工呼吸を行い、心臓を露出し、医用無損傷縫合５／０で左冠動脈前下行枝を結紮し、迅速に閉胸して通常の消毒を行い、手術の操作過程は３０ｓもかからず、手術後に１〜２ｍｉｎ人工呼吸し続け、ペニシリン２０万単位を筋肉内注射（ｉ．ｍ．）して感染を予防する。手術開始の５ｍｉｎ前、結紮後０ｓ、１ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１ｈ、４ｈにそれぞれ標準ＩＩ誘導心電図を記録し、心電図Ｊ点の変化を観察する。
【０１６２】
試験終了直後、心臓を取り出して、生理的食塩水で血液を洗い流し、心房及び心臓底部の血管を除去し、心室の重量を測り、冠状溝に沿って心室を平均に５枚に切って１％（ｗ／ｖ）ＴＴＣ溶液内に入れ、３７℃の恒温水浴で５ｍｉｎ染色し、取り出した後、まずデジタル写真を撮り、その後、未染色部分（即ち、梗塞部分）を分離して、心室重量全体に占める百分率（心筋梗塞の百分率）を測って算出し、虚血モデル群と共に群間のｔ検定を行う。梗塞百分率を算出する方程式は以下の通りである。
【０１６３】
梗塞の百分率（％）＝（白い領域の重量／心室重量）×１００％
【０１６４】
２０００ｒｐｍで血液を２５ｍｉｎ遠心分離した後、血清を分離し、キットに記載の方法に基づいて、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、クレアチンキナーゼアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、ＡＴＰ酵素の含有量又は活性を測定する。結果を表５、表６、表７及び図１１に示す。
【０１６５】
表５に示されるように、各群のラットの冠動脈結紮手術後の心電図Ｊ点が手術前より著しく高く（Ｐ＜０．０１）、モデル作成に成功したことを説明する。モデル群に比べて、手術の５ｍｉｎ後、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群はＪ点の上昇を著しく抑制するごとができ（Ｐ＜０．０５）、手術の１５ｍｉｎ後、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群はＪ点の上昇を著しく抑制するごとができ（Ｐ＜０．０５）、手術の１ｈ及び４ｈ後、アスピリン群、及び（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群のいずれもＪ点の上昇を著しく抑制するごとができる（Ｐ＜０．０５）。
【０１６６】
表６に示されるように、モデル群と各薬物投与群の心筋梗塞率はいずれも偽手術群より著しく高く（Ｐ＜０．０１）、モデル作成に成功したことを示す。モデル群に比べて、アスピリン群、及び（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群はいずれも心筋梗塞率を著しく低下させることができる（Ｐ＜０．０５）。
【０１６７】
【表５】
0006517206.tif 000010
【０１６８】
【表６】
0006517206.tif 000011
【０１６９】
【表７】
0006517206.tif 000012
【０１７０】
表７に示されるように、モデル群中の血清ＭＤＡ、ＬＤ、ＣＫ、ＣＫ−ＭＢのレベルが偽手術群より著しく高く（Ｐ＜０．０１）、ＳＯＤ、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性が偽手術群より著しく低く（Ｐ＜０．０１）、モデル作成に成功したことを示す。モデル群に比べて、アスピリン群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ低用量群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群は、心筋虚血があるラットの血清ＭＤＡ及びＬＤの含有量を著しく低下させることができる（Ｐ＜０．０５）。アスピリン群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群は、心筋虚血があるラットの血清ＳＯＤの活性を著しく上昇させることができる（それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。アスピリン群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ低用量群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群は、心筋虚血があるラットの血清ＣＫの活性を著しく低下させることができる（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。アスピリン群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群は、ＣＫ−ＭＢの活性を著しく低下させることができる（Ｐ＜０．０１）。アスピリン群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ低用量群、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群は、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの活性を著しく上昇させることができる（Ｐ＜０．０５）。
【０１７１】
図１１から分かるように、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群とアスピリン群は、同じレベルの、冠動脈結紮による急性心筋梗塞を防ぐ作用を有する。さらなる実験から、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔに類似し、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ高用量群とアスピリン群も、同じレベルの、冠動脈結紮による急性心筋梗塞を防ぐ作用を有することを示す。
【０１７２】
薬力学的試験例２  （Ｒ）−サルビアノール酸Ｔがラットの実験的急性心筋梗塞に対する保護作用の研究
【０１７３】
実験材料
【０１７４】
１．被験物及び試薬
ピツイトリン（Ｐｉｔ）注射剤は、Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｘｉｎｂａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により製造され、バッチ番号は：０８１００４である。生理食塩水は、Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｔｉａｎ’ａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により製造され、仕様：５００ｍＬ／瓶、バッチ番号は２０１００９２３１である。（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、純度９５％以上、Ｔａｓｌｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｃａｄｅｍｙにより提供される。
【０１７５】
２．主な装置：ＭｅｄＬａｂ  ８チャネル生理学的記録計：Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｍｅｄｅａｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．。
【０１７６】
３．実験動物：ＳＤラット、体重２２０〜２５０ｇ、半分が雄で、半分が雌であり、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により提供され、合格証明書：ＳＣＸＫ（Ｊｉｎｇ）２００７−０００１である。室温が２０℃〜２５℃、照射時間が１２ｈであり、ラット専用餌（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋｅａｏｘｉｅｌｉ  Ｄｉｅｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により製造）を食べさせ、水道水が与えられる動物飼育室中で飼育した。
【０１７７】
実験方法
【０１７８】
１．用量の設計：（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの凍結乾燥粉末の投与用量：高用量群は１０．０ｍｇ／ｋｇ体重、低用量群は５．０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１７９】
２．群分け：
【０１８０】
２．１  動物のスクリーニング：正式の実験の前に、それぞれラットに尾側静脈を介してピツイトリン（Ｐｉｔ）（１Ｕ／ｋｇ）を注射し、正常及び注射の５ｍｉｎ後の心電図を記録して、Ｊ点の上昇及びＴ波異常を観察して、注射前に異常心電図が見られたもの又はＰｉｔに対して非感受性であるものは除外した。
【０１８１】
２．２  動物のグループ分け：選ばれたラットを、それぞれ（１）モデル対照群、（２）（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの凍結乾燥粉末低用量群、及び（３）（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの凍結乾燥粉末高用量群の３群に無作為に分けた。
【０１８２】
３．実験方法：ＳＤラット、体重２２０〜２５０ｇ、半分が雄で、半分が雌であり、各群には１０匹がある。モデル対照群中のラットは、等量の生理食塩水を毎日胃内投与し、薬物投与群は、異なるサンプルの水性懸濁液を毎日胃内投与し、全てのものに、７日間連続して投与した。最終投与の４０ｍｉｎ後に、ラットを麻酔し、デバイスに接続して、ＩＩ誘導正常心電図を記録する。ピツイトリン（Ｐｉｔ）を、尾側静脈を介して１Ｕ／ｋｇ体重で一定速度でラットに注射し、注射時間を１０ｓ程度に制御し、投与した０ｓ後、１５ｓ後、３０ｓ後、４５ｓ後、１ｍｉｎ後、５ｍｉｎ後、１０ｍｉｎ後の心電図の変化を記録して、各群のＰｉｔの注射前と注射後との間の差、並びに薬物投与群とモデル対照群との差を比較して、Ｊ点及びＴ波の変化を分析する。その結果のデータをｔ検定により統計解析する。
【０１８３】
実験結果
１．Ｊ点に対する影響
表８の結果で示されるように、本実験の条件下で、ピツイトリンにより引き起こされる急性心筋虚血において、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの高用量群は、１５ｓ、３０ｓ及び４５ｓで、ＥＣＧのＪ点の上昇度はモデル対照群より小さく、かつその差は統計学的有意性を有している（Ｐ＜０．０５）。
【０１８４】
【表８】
0006517206.tif 000013
【０１８５】
表９の結果で示されるように、本実験の条件下で、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの高用量群は、１５ｓ、３０ｓで、ＥＣＧのＴ波の上昇度はモデル群より小さく、かつその差は統計学的有意性を有している（Ｐ＜０．０５）。
【０１８６】
【表９】
0006517206.tif 000014
【０１８７】
実験結果
（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの高用量群は、１５ｓ、３０ｓで、ＥＣＧのＪ点及びＴ波の上昇度はモデル対照群より小さく、かつその差は統計学的有意性を有している（Ｐ＜０．０５）。その結果で示されるように、本実験の条件下で、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ（１０．０ｍｇ／ｋｇ）が抗急性心筋虚血の作用を有する。さらなる試験から、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔに類似し、（Ｓ）−サルビアノール酸も、類似の抗急性心筋虚血の作用を有することを示す。
【０１８８】
薬力学的試験例３  （Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔのフリーラジカル捕捉反応
【０１８９】
フリーラジカルは、直接的又は間接的な強酸化作用を有し、身体能力の生理学的プロセス及び病理学的プロセスに広く関与する。過剰量の身体能力のフリーラジカルが存在するとき、酸化作用により身体能力に損傷を引き起こす。サルビアノール酸化合物がフェノール性ヒドロキシル基の供与体であり、抗酸化活性に対する構造基盤を有する。本薬効実験では、１，１−ジフェニル−２−ピクリル−ヒドラジル（１，１ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌ−ｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ）フリーラジカル捕捉反応モデルを使用して、（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔのフリーラジカルに対する除去効果を観察する。
【０１９０】
１．試薬及び装置
（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、純度９５％以上、Ｔａｓｌｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｃａｄｅｍｙにより提供される。ビタミンＣ及びＤＰＰＨは、いずれもＳｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から購入した。紫外線分光光度計ＭＶ−１８００は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入した。
【０１９１】
２．実験方法
総反応容積は２ｍＬであり、異なる濃度でのサンプル溶液中の８０％メタノール溶液を１ｍＬ取って、１００μＭのＤＰＰＨメタノール溶液に添加して、均一に混合した後、暗所で２５℃で２０ｍｉｎ反応させ、反応液の吸光度を５１７ｎｍで測定した。実験では、ビタミンＣを陽性対照とみなした。フリーラジカル捕捉率を下記方程式に従って算出した：
フリーラジカル捕捉率（％）＝［（１−Ａサンプル／Ａ対照）／Ａ対照］×１００％
ここで、Ａサンプルは、試験サンプルの吸光度を意味し、Ａ対照は、未試験サンプルの吸光度を意味する。
【０１９２】
３．実験結果
（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔのフリーラジカル捕捉率は、ビタミンＣのフリーラジカル捕捉率よりもはるかに高いが、２種類の異性体のフリーラジカル捕捉率は顕著な差はない（Ｐ＜０．０５）。
【０１９３】
【表１０】
0006517206.tif 000015
【０１９４】
薬力学的試験例４  （Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの還元力の測定
薬物の還元力の大きさは、或る程度では、その予防的抗酸化機能の強さに関する。本発明は、（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの還元力に関して研究が行われた。
【０１９５】
１．試薬及び装置
（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、純度９５％以上、Ｔａｓｌｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｃａｄｅｍｙにより提供される。分析上純粋なフェリシアン化カリウムは、Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｎｏ．１  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒｙから購入した。分析上純粋なトリクロロ酢酸は、Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入した。分析上純粋な塩化第二鉄は、Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｆｅｎｇｃｈｕａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入した。ビタミンＣは、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から購入した。紫外線分光光度計ＭＶ−１８００は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入した。冷却遠心機：Ｚ３２３Ｋは、ドイツ  ＨＥＭＭＬＥから購入した。
【０１９６】
２．実験方法
異なる濃度の（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを含有する２００ｍＭ  ｐＨ６．８のリン酸緩衝液を０．５ｍＬ、１．０％（ｗ／ｖ）フェリシアン化カリウム溶液を０．２ｍＬ取って、５０℃の水浴で２０ｍｉｎ置いた後に氷浴で冷却し、１０％トリクロロ酢酸溶液を０．５ｍＬ添加して、１０００ｇ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心し、上清１．０ｍｌを採取して、蒸留水を１．０ｍＬ及び０．１％（ｗ／ｖ）のＦｅＣｌ３溶液を０．２ｍＬ添加して、１０ｍｉｎ静置した後、吸光度を７００ｎｍで測定すると共に、ブランク実験を実行した。ビタミンＣは、強力な還元物質であり、この研究において陽性対照とする。サンプルの還元力は、試験サンプルの吸光度から、ブランク対照群の吸光度を差し引くことと同じであり、吸光度が高いほど、還元力が強力である。
【０１９７】
３．実験結果
（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの還元力は、いずれもビタミンＣの還元力よりもはるかに強力であった。両方の還元力は顕著な差はない（Ｐ＜０．０５）。
【０１９８】
【表１１】
0006517206.tif 000016
【０１９９】
薬力学的試験例５  （Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの抗マウス肺線維症の実験
【０２００】
肺線維症は、肺が損傷された後によく見られる反応及び合併症であり、その主な病理変化はびまん性肺胞炎、肺線維芽細胞集塊の形成、並びに細胞外マトリックスの修復が繰り返され及び過度に積層されることである。肺線維症は、最終的な結果が呼吸機能を永久に失うことになるのが一般的であり、現在、まだ効果的な予防治療方法がない。ブレオマイシンで誘導されたマウスの肺線維症は、ヒト肺線維症の研究によく使用されるモデルであり、このモデルにおいて、ブレオマイシンが直接及び間接に生じた酸素フリーラジカルは肺線維症を促す原理の１つである。
【０２０１】
１．試薬及び装置
（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、純度９５％以上、Ｔａｓｌｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｃａｄｅｍｙにより提供される。スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）キットは、いずれも  Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。ブレオマイシンは、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０２０２】
２．動物
Ｋｕｎｍｉｎｇマウスは、全て雌で、体重２２〜２５ｇで、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により提供され、温度が２３±２℃、相対湿度が６５％〜７５％、光照射周期が１２ｈ：１２ｈである環境下で飼育した。
【０２０３】
３．実験方法
４０匹のマウスを、（１）鼻腔内に生理的食塩水を滴下し、生理食塩水を胃内投与する正常対照群、（２）鼻腔内にブレオマイシンを滴下し、生理食塩水を胃内投与するモデル対照群、（３）鼻腔内にブレオマイシンを滴下し、（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ溶液を胃内投与する（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔ群（１６ｍｇ／ｋｇ）（４）鼻腔内にブレオマイシンを滴下し、（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ溶液を胃内投与する（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ群（１６ｍｇ／ｋｇ）の４群に無作為に分けた。各群にマウスが１０匹ある。
実験１日目に、抱水クロラールを使用してマウスを麻酔し、マウスに一度にブレオマイシン５０μｇ／匹を鼻腔内に滴下して肺線維症モデルを作成した。実験２日目に、２つの治療群に、（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔを胃内投与し、モデル群と正常群に、毎日１回、３週間連続して等量の生理食塩水を胃内投与した。実験２１日目に、眼窩静脈から採血して血清を分離してＴＧＦ−β１を検出するために用いられ、マウスを殺して肺を取り出し、再蒸留水を用いてホモジナイズし（肺と再蒸留水の割合が１：５（ｗ／ｖ））て組織ホモジネートとし、遠心後、組織ＭＤＡ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）の検定に用いられる。
統計方法：結果をいずれもｘ±ｓで示し、ＳＰＳＳ１１０  統計解析ソフトを採用して群間の一元配置分散分析を行ない、２つずつ比較して２つ群の独立なサンプルでｔ検定を行なった。
【０２０４】
４．実験結果
ブレオマイシンで誘導されたマウスの肺線維症に対する影響：正常のマウスに比べて、ブレオマイシンで誘導されたマウスの肺線維症組織中のＴＧＦ−β１の上昇が９．９６倍であり、ＭＤＡの上昇が１．８３倍であり、抗酸化酵素ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴが約１．５倍低下し、血清ＴＧＦ−β１も４．４４倍上がり、モデル作成に成功した。（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔのいずれも、ブレオマイシンで誘導されたマウス血清ＴＧＦ−β１が上がることを抑制することができ（表１２）、ブレオマイシンで誘導されたマウスの肺臓のＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴが低下することを防ぎ（表１３）、かつ肺臓のＭＤＡ及びＴＧＦ−β１の含有量を低下させる（表１２）。
【０２０５】
【表１２】
0006517206.tif 000017
【０２０６】
【表１３】
0006517206.tif 000018
【０２０７】
薬力学的試験例６  （Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸ＴのＴＧＦ−βで誘導された線維芽細胞に対する抑制作用
【０２０８】
ＴＧＦ−βで誘導された線維芽細胞の過度の増殖と線維芽細胞の活性化後、筋線維芽細胞への分化は、肺線維症の形成過程において重要な役割を果たし、ＴＧＦ−βのシグナル伝達を抑制すると、肺線維芽細胞の増殖及び活性化を防ぐことができ、肺線維症を予防治療する重要な方法の１つである。
【０２０９】
１．試薬及び装置
（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔ、純度９５％以上、Ｔａｓｌｙ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ａｃａｄｅｍｙにより提供される。ＤＭＥＭ培養基、ＭＴＴ、改組ＴＧＦ−β１は、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から購入した。ペニシリンとストレプトマイシンは、Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．により製造される。ウシ胎仔血清は、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｓｉｊｉｑｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの製品である。コラーゲン検出キットは、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｉｎｃ．の製品である。ラミニン（ＬＮ）Ｒｉａキットは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｅｉｆａｎｇ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。
ＥＬ−８００Ｘ  プレートリーダーは、ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｃ．から購入した。ＣＯ２インキュベーターは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｉｎｃ．から購入した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０２１０】
２．細胞株
Ｌ９２９細胞は、Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入した。
【０２１１】
３．実験方法
Ｌ９２９細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培養液を使用して細胞数５×１０７／Ｌに調整して９６穴プレートに接種し、２４ｈ培養する。２μｇ／Ｌを含むＴＧＦ−β１及び異なる濃度の（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの同一の培養基を補充する。１つ毎に６つの複数の穴を作り、（Ｓ）／（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔの最終濃度を０、１、３、１０、２０、４０、８０、１５０μｍｏｌ／Ｌとする。７２ｈ培養した後、培養基を除去し、ＭＴＴ法に基づいて細胞の活性を測定する。
【０２１２】
４．実験結果
（Ｓ）−サルビアノール酸Ｔと（Ｒ）−サルビアノール酸Ｔが、ＴＧＦ−β１で誘導されたＬ９２９細胞の増殖に対して抑制作用を発揮し（図１２）、（Ｓ）−サルビアノール酸ＴのＩＣ５０が２６．１μｍｏｌ／Ｌ、（Ｒ）−サルビアノール酸ＴのＩＣ５０が２６．９μｍｏｌ／Ｌであり、両方は顕著な差はない。
【０２１３】
本発明の薬効実験結果から、本発明のサルビアノール酸Ｔは、抗急性心筋梗塞の活性、抗急性心筋虚血の活性を有し、比較的良好なフリーラジカル捕捉力及び還元力を有し、また、肺線維症を治療する活性も有することを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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