(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１の化合物：
【化１】
0006609308.tif 000017
・・・一般式１
に示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物又はエナンチオマー。
（式中、Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル又はＮＨ２（Ｒ２Ｒ３）Ｃ−であり、Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。）
【請求項２】
以下の群から選ばれる１種の化合物又はその薬学的に許容される塩又は溶媒和物。
【化２】
0006609308.tif 000018
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
薬剤として使用するための、請求項１又は２に記載の化合物、又は請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
過剰増殖疾患を治療又は予防するための、請求項１又は２に記載の化合物、又は請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
キナーゼシグナル伝達を調節するための、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項７】
腫瘍形成を治療するための、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項８】
肺がん、乳がん、脳がん、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫から選ばれる癌疾患を治療するための、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項９】
腫瘍形成を治療するための、１つ又は複数の抗癌剤と組み合わせた請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本発明は２０１４年８月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／０７０，２５０号の利益を主張するものであり、その全ての内容は援用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、キナーゼ阻害剤、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、前駆薬、代謝物、及びその調製方法、並びに癌等のキナーゼ媒介疾患及び病態を治療するためのこれらの化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロテインキナーゼは標的タンパク質基質のリン酸化を触媒する酵素の大規模ファミリーである。リン酸化は、通常、ホスフェート基をＡＴＰからタンパク質基質に移行させる反応である。ホスフェート基をタンパク質基質に結合させる一般的な地点には、例えば、チロシン残基、セリン残基、又はトレオニン残基が含まれる。プロテインキナーゼファミリーのキナーゼの例は、限定ではないが、Ａｂｌ１（ｖ−Ａｂｌ  Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス癌遺伝子相同体１）、Ａｋｔ、Ａｌｋ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ１、Ｂｌｋ、Ｂｒｋ、Ｂｔｋ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｍｓ、ＣＤＫ１〜１０、ｂ−Ｒａｆ、ｃ−Ｒａｆ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＫ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｅｒｋ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲ５、Ｆｌｔ−１、Ｆｐｓ、Ｆｒｋ、Ｊａｋ、ＫＤＲ、ＭＥＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＩＫ、ＰＫＣ、ＰＹＫ２、Ｒｏｓ、Ｔｉｅ、Ｔｉｅ２、及びＺａｐ７０を含む。プロテインキナーゼは、多数の細胞プロセスで活性があるため、重要な治療標的として注目されている。
【０００４】
ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）は、アミノ末端シグナルペプチドを有する細胞外ドメイン、インスリン受容体基質−１の結合部位を内包する膜近傍セグメントを有する細胞内ドメイン、及びカルボキシ末端キナーゼドメインで構成される１６２０個アミノ酸の膜貫通型タンパク質である。ＡＬＫは、インスリン受容体チロシンキナーゼのメンバーである。棘皮動物微小管結合タンパク質様４（ＥＭＬ４）は、微小管及び微小管結合タンパク質の形成に関与する１２０ＫＤａの細胞質タンパク質である。ＥＭＬ４−ＡＬＫは、ＥＭＬ４のエキソン１〜１３をＡＬＫのエキソン２０〜２９に連結する染色体２の短腕の逆位から生じる新規の融合遺伝子である。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体の存在は、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）患者のおよそ３〜１３％で特定されている。
【０００５】
そのため、プロテインキナーゼ阻害剤として用いられる低分子を特定する試みがなされている。例えば、アミノテロアリール化合物ジアリール尿素（特許文献１）が、ＡＬＫ／ｃ−ＭＥＴ阻害剤として記載されている。
【０００６】
上皮成長因子（ＥＧＦ）は広く分布している成長因子であり、癌においてがん細胞増殖を刺激し、アポトーシスを阻害し、侵襲と転移を活性化し、血管新生を刺激することができる（非特許文献１及び非特許文献２）。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ）は、４種の関連受容体ファミリーの１つに属する、膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である。ヒト上皮癌の大部分は、成長因子とこのファミリーの受容体の機能的活性化により標記される（非特許文献３）ことで、ＥＧＦとＥＧＦＲは癌治療の天然の標的である。ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）チロシンキナーゼファミリーは、４種の構造的に関連した細胞受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４から構成される。
【０００７】
従って、ＡＬＫ、ＲＯＳ１又はＥＧＦＲキナーゼ活性等のプロテインキナーゼを一緒に阻害することができる化合物は、癌等のヒト疾患を治療するために使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７６４１２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｉｔｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：５０５，  ２００６
【非特許文献２】Ｈｙｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ５：３４１，  ２００５
【非特許文献３】Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５８：１１６０，２００８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、式１の化合物、
【化１】
0006609308.tif 000002
・・・式１
又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、又は前駆薬、又はエナンチオマー、又は代謝物を提供する。
（式中、Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル又はＮＨ２（Ｒ２Ｒ３）Ｃ−であり、Ｒ２とＲ３は、独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。）
【００１１】
本発明は、上述の式１の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、哺乳動物被験体に治療上有効量の上述の式１の化合物のいずれかを投与することを含む、キナーゼ媒介疾患の治療又は予防のための方法をさらに提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の幾つかの実施形態では、本発明は、式１の化合物：
【化２】
0006609308.tif 000003
・・・式１
又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はエナンチオマー、又は前駆薬、又は代謝物を提供する。
（式中、Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル又はＮＨ２（Ｒ２Ｒ３）Ｃ−であり、Ｒ２とＲ３は、独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。）
【００１４】
ある実施形態では、限定されないが、以下のものから選ばれる化合物：
【化３】
0006609308.tif 000004
等、又はそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、又は前駆薬、又は代謝物を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明の化合物は代謝物の形である。他の実施形態では、本発明の化合物は前駆薬の形である。幾つかの実施形態では、本発明の化合物はエナンチオマーである。他の実施形態では、本発明の化合物はジアステレオマーである。別の実施形態では、本発明の化合物における重水素濃縮は、少なくとも約１％である。
【００１６】
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、前記組成物は、プロテインキナーゼにより調節される疾患の治療用である。ある実施形態では、前記組成物は、過剰増殖疾患及び／又は血管新生障害の予防又は治療用である。他の実施形態では、医薬組成物は、経口、非経口又は静脉内投与に好適である。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本発明は、哺乳動物被験体に、本明細書に記載の本発明の化合物のいずれかを治療上有効量で投与することを含む、キナーゼシグナル伝達を調節する方法を提供する。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、本明細書において、ＡＬＫ、ＲＯＳ１及び／又はＥＧＦＲ（融合体及び／又は変異体キナーゼを全て含む）媒介疾患を治療又は予防するための方法であって、哺乳動物被験体に本明細書に記載の本発明の化合物のいずれかを治療上有効量で投与することを含む方法を提供する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、本発明は、腫瘍形成を治療する方法を提供する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、肺がん、乳がん、脳がん、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫、及びびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない癌疾患の治療用の方法を提供する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本発明は、本発明の化合物と１つ又は複数の腫瘍形成の治療用の抗癌剤との組合せを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、過剰増殖疾患を治療又は予防するための方法を提供する。
【００２３】
以下の定義は、本明細書に記載の本発明の理解を支援するはずである。
【００２４】
用語「アルキル」は、炭素−炭素単結合のみを含み、置換されていなくともよく、又は随意に１つ又は複数の官能基で置換されていてもよい、直鎖、分岐、環式の炭化水素基を含むことが意図される。アルキルの好ましい鎖長は１つ〜６つの炭素原子である。Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、Ｃ１（メチル）、Ｃ２（エチル）、Ｃ３（ｎ−プロピル、ｉ−プロピル）、Ｃ４（例えば、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル）、Ｃ５（例えば、ｎ−ペンチル）、及びＣ６アルキルを含むことが意図される。アルキルは、置換されていてもよく又は置換されていなくともよい。例示的な置換アルキルには、これらに限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アミノメチル、アミノエチル、ヒドロキシメチル、メトキシメチル、２−フルオロエチル、及び２−メトキシエチル等が含まれる。
【００２５】
本発明の化合物に関して使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、被験体に投与するのに安全な化合物の形態を指す。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）等の所管当局又は規制当局により、経口摂取又は任意の他の投与経路による哺乳動物使用が承認されている、本発明の化合物の遊離塩基、塩形態、溶媒和物、水和物、前駆薬、又は誘導体形態は、薬学的に許容される。
【００２６】
語句「有効な量」は、代替療法に典型的に伴う有害副作用を回避しつつ、各薬剤単独での治療よりも、障害重症度及び発生頻度が改善するという目標を達成することになる各薬剤の量を定量化することが意図される。１つの実施形態では、有効量は、単一の剤形又は複数の剤形で投与される。
【００２７】
本発明の出発物質は、公知であるか、又は市販されているか、又は当技術分野で公知の方法で若しくはその類似方法で合成することができる。多数の出発物質は、公知のプロセスにより調製することができ、特に、実施例に記載のプロセスを使用して調製することができる。出発物質を合成する際、ある場合、官能基は、必要に応じて好適な保護基で保護される。保護基、それらの導入、及び除去は、以下に説明される。
【００２８】
所望の手順により式１の化合物を合成する場合、幾つかの実施形態でのステップは、本明細書に記載の手順を含む化合物の調製に好適な順序で、又は本明細書に記載のステップの代替的順序で実施される。１つの実施形態では、必要に応じて、その前又はその後に追加の保護／脱保護ステップがある。幾つかの実施形態では、中間体は、単離されるか又はそのままで使用され、精製されるか又は精製されない。本明細書に記載の阻害化合物の合成に有用な合成化学変換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｒ．  Ｌａｒｏｃｋ、「有機変換総論」（ＶＣＨ出版社（１９８９））；Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ、「有機合成における保護基」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（１９９９）、第３版；Ｌ．  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ、「有機合成のＦｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ試薬」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（１９９４）；Ａ．  Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．  Ｐｏｚｈａｒｓｋｉ、「複素環化学ハンドブック」、第２版（２００１）；Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、「ペプチド合成の実践」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、ベルリン  ハイデルベルク（１９８４年）；Ｊ．  Ｓｅｙｄｅｎ−Ｐｅｎｎｅ、「有機合成におけるアルミノハイドライドおよびボロハイドライドによる還元」、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、（１９９７）及びＬ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅから編集された「有機合成試薬百科事典」、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（１９９５）に記載のものが含まれる。
【００２９】
幾つかの実施形態では、本発明の化合物も、複数の互変異性型で表される。本発明は、本明細書に記載の化合物の互変異性型の全てを明確に含む。
【００３０】
また、１つの実施形態では、前記化合物は、ｃｉｓ−又はｔｒａｎｓ−又はＥ−又はＺ−二重結合異性体で存在する。そのような化合物の前記異性体の形は全て明確に本発明の保護範囲に含まれる。
【００３１】
適応症
本発明は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１とＥＧＦＲを含むがそれらに限定されない、１つ又は複数のシグナル伝達経路を調節することができる化合物を提供する。
【００３２】
用語「調節する」とは、前記化合物が存在しない時のその正常な活性と比較して、前記経路（又はその成分）の機能的な活性が変更されたことを意味する。この効果は、増加、アゴナイズ、増大、増強、促進、刺激、低下、阻止、阻害、低減、縮小、アンタゴナイズ等を含む、調節のあらゆる品質又は程度を含む。
【００３３】
また、本発明の化合物は、これらに限定されないが、以下のものを含む下記プロセスの１つ又は複数を調節することができる。例えば、細胞成長（例えば、分化、細胞生存、及び／又は増殖を含む）、腫瘍細胞成長（例えば、分化、細胞生存、及び／又は増殖を含む）、腫瘍退縮、血管内皮細胞成長（例えば、分化、細胞生存、及び／又は増殖を含む）、血管新生（血管増殖）、リンパ脈管新生（リンパ管増殖）、及び／又は血球新生（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞発生、樹状細胞発生等）。
【００３４】
任意の理論又は作用機序により拘束されることは望まないが、本発明の化合物は、キナーゼ活性を調節する能力を有することが見出された。しかしながら、本発明の方法は、いかなる特定の機序又は化合物が治療効果を達成する様式にも限定されない。語句「キナーゼ活性」とは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からのガンマ−ホスファートを、タンパク質基質のアミノ酸残基（例えば、セリン、トレオニン、又はチロシン）に移転させる触媒活性を意味する。化合物は、キナーゼ活性を調節することができる。例えば、キナーゼのＡＴＰ結合ポケットをＡＴＰと直接的に競合することにより、その活性に影響を及ぼす酵素構造の立体構造変化をもたらすことにより（例えば、生物学的に活性な三次元構造を破壊することにより）、不活性立体構造のキナーゼに結合して固定すること等により、キナーゼ活性を調節することができる。
【００３５】
制剤及び使用方法
本発明の化合物及び／又は組成物で癌を治療するための投与される化合物の量及び投与計画は、被験体の年齢、体重、性別、及び医学的状態、疾患のタイプ、その疾患の重症度、投与の径路及び頻度、並びに使用される具体的化合物を含む、様々な要因に依存する。従って、投与計画は、幅広く変動する場合があるが、標準的方法を使用して日常的に決定することができる。以下の１日用量が適切である可能性があり、本明細書で開示された使用方法全てに有用なはずである。すなわち、約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、有利的には約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より有利的には約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、更により有利的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇである。１日用量は、１日当たり１〜４回量で投与してもよい。
【００３６】
記載されている方法では、本発明の化合物を単独で投与することが可能な場合があるが、投与される化合物は、通常、医薬組成物における活性成分として存在するだろう。従って、本発明の別の実施形態では、本発明は、本発明の化合物と、本明細書に記載されているような希釈剤、賦形剤、アジュバント等を含む薬学的に許容される担体（本明細書では「担体」物質と総称される）及び必要に応じて他の活性成分との組み合わせを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、有効量の本発明の化合物又は有効用量の本発明の化合物を含んでいてもよい。本発明の化合物の有効用量は、当該化合物の有効量未満の量、当該化合物の有効量と同量、又は当該化合物の有効量を超える量を含み、例えば、錠剤及びカプセル等の、２単位またはそれ以上の用量が、有効量の化合物を投与するのに必要である医薬組成物、又はその代わりに粉末、液体等の、有効量の化合物が組成物の一部を投与することにより投与される多用量医薬組成物である。
【００３７】
投与経路
好適な投与経路には、これらに限定されないが、経口投与、静脈内投与、直腸内投与、エアゾル投与、非経口投与、点眼投与、肺内投与、径粘膜投与、経皮投与、膣内投与、経耳投与、経鼻投与、及び局所投与が含まれる。加えて、例示に過ぎないが、非経口送達には、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、髄内注射、並びに髄腔内注射、直接心室内注射、腹腔内注射、リンパ管内注射、及び鼻腔内注射が含まれる。
【００３８】
本発明の化合物は、経口投与してもよい。経口投与は、えん下を含み、したがって化合物は胃腸管に進入してもよく、又は化合物が口から直接的に血流に進入することによる頬側投与若しくは舌下投与を使用してもよい。経口投与に好適な製剤には、以下のものが含まれる。すなわち、錠剤等の固形製剤、微粒子、液体、又は粉末を含有するカプセル剤、トローチ剤（液体充填を含む）、咀嚼剤、多粒子及びナノ粒子、ゲル剤、固溶剤、リポソーム、薄膜（粘膜付着を含む）、オブル（ｏｖｕｌｅ）、スプレー剤、及び液剤が含まれる。
【００３９】
また、本発明の化合物は、例えばＬｉａｎｇとＣｈｅｎがＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ、１１（６）、９８１−９８６（２００１）に記載のもの等の迅速溶解剤形、迅速崩壊剤形で使用してもよく、その開示全体は、援用により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
非経口投与用の製剤は、即時放出及び／又は放出調節するように製剤化してもよい。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、プログラム放出が含まれる。したがって、本発明の化合物は、活性化合物の放出調節を提供する埋込み徐放性製剤としての固形、半固形、又はチキソトローフ液体として製剤化してもよい。そのような製剤の例には、薬物コーティングステント及びＰＧＬＡミクロスフェアが含まれる。
【００４１】
組み合わせ
本発明の化合物は、唯一の活性医薬品として投薬又は投与することができるが、１つ又は複数の本発明の化合物と組み合わせて又は他の薬剤と共に使用することもできる。組み合わせて投与される場合、治療剤は、様々な時点で同時又は逐次投与される別々の組成物として製剤化してもよく、又は治療剤は、単一組成物として投与してもよい。
【００４２】
合成
当業者は、式１の化合物を、以下のスキームに記載の手順により合成した。置換基は、更なる記述がある場合を除いて、上記の式１で定義した通りである。下述の合成方法は、例示に過ぎず、本発明の化合物は、当業者から理解される代替経路により合成することもできる。
【００４３】
本発明の化合物の合成を、以下のスキーム１に記載した。
【００４４】
文献に公知の出発原料である化合物Ａ（ＰＦ−０６４６３９２２）と化合物Ｂで式１に記載される化合物を合成した。化合物Ａと化合物Ｂは溶媒、例えば、ジクロロメタンにおいてアルカリ、例えばピリジンとの反応で式１の化合物を生成した。
【００４５】
スキーム１
【化４】
0006609308.tif 000005
【００４６】
スキーム２に記載される方法で化合物６を合成した。化合物１のアシル化で化合物２が得られ、それを化合物３及びｎ−プロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）とカップリングし化合物４を生成した。パラジウム触媒の条件における分子内環化反応させ、化合物５を得た。Ｆｍｏｃ基の脱保護で化合物６の合成につながる（スキーム２）。
【００４７】
スキーム２
【化５】
0006609308.tif 000006
【００４８】
或いは、スキーム３に記載される方法で化合物６を合成した。化合物７のアシル化で化合物８を得た。Ｂｏｃ基の脱保護で化合物９が得られ、それは分子内アミド形成を経て化合物５を生成した。化合物５のＦｍｏｃ基の脱保護で化合物６の合成につながる（スキーム３）。
【００４９】
スキーム３
【化６】
0006609308.tif 000007
【００５０】
プロトンＮＭＲスペクトル
別様の指定がない限り、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは全て、Ｖａｒｉａ社製Ｍｅｒｃｕｒｙ３００、４００、５００ＭＨｚ機器又はＢｒｕｋｅｒ社製４００及び５００ＭＨｚ機器で実施した。このように特徴付けられる場合、観察されたプロトンは全て、表示されている適切な溶媒におけるテトラメチルシラン（ＴＭＳ）又は他の内部標準値からのダウンフィールド百万分率（ｐｐｍ）として報告されている。
【００５１】
略号
ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味する。
ＤＣＭは、ジクロロメタンを意味する。
ＤＩＰＥＡは、ジイソプロピルエチルアミンを意味する。
ＤＣＣは、ジシクロヘキシルカルボジイミドを意味する。
ＴＨＦは、テトラヒドロフランを意味する。
ＥＡは、酢酸エチルを意味する。
ｍ−ＣＰＢＡは、メタクロロ過安息香酸を意味する。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨは、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グリシンを意味する。
ＢＯＰは、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリ−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイトを意味する。
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２は、［１、１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウムを意味する。
Ｔ３Ｐは、ｎ−プロピルホスホン酸無水物を意味する。
Ｅｔ３Ｎは、トリエチルアミンを意味する。
Ｆｍｏｃは、フルオレニルメトキシカルボキシを意味する。
ｃａｔａＣＸｉｕｍは、ジ（１−アダマンチル）−ｎ−ブチルホスフィンを意味する。
Ｐｄ（ＯＡｃ）２は、酢酸パラジウムを意味する。
ＣＹＰは、チトクロムＰ４５０を意味する。
ＥＧＦＲは、上皮成長因子受容体を意味する。
ＥＲＢＢ４は、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−４を意味する。
【００５２】
（実施例１）
（１０Ｒ）−７−アセタミド−１２−フルオロ−２，１０，１６−トリメチル−１５−オキソ−１０，１５，１６，１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８，４−（メテノ）ピラゾロ［４，３−ｈ］［２，５，１１］−ベンゾキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリル（化合物１０）の合成。
【化７】
0006609308.tif 000008
【００５３】
０℃で（１０Ｒ）−７−アミノ−１２−フルオロ−２，１０，１６−トリメチル−１５−オキソ−１０，１５，１６，１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８，４−（メテノ）ピラゾロ［４，３−ｈ］［２，５，１１］−ベンゾキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリル（５０ｍｇ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液にピリジン（１８９．６ｍｇ、１０．０当量）を仕込み、０．５時間攪拌した後で分割して塩化アセチル（１５０．４ｍｇ、８．０当量）を仕込んだ。反応は０℃で４時間攪拌し、ＴＬＣは反応完了を示した。反応において水（２０ｍＬ）を仕込み、ＥＡ（２×１０ｍＬ）で水層を抽出した。有機層を一つに合わせ、塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。調製用ＴＬＣ板により粗生成物を精製し、化合物１０の白い固体（１５ｍｇ）が得らた。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）：  ８．１３  ｐｐｍ、  （ｄ、  Ｊ＝１．６  Ｈｚ、  １Ｈ）、  ８．０４  （ｓ、  １Ｈ）、  ７．３１  （ｄｄ、  Ｊ１＝２．８  Ｈｚ、  Ｊ２＝９．６  Ｈｚ、  １Ｈ）、  ７．２５  （ｍ、  １Ｈ）、  ７．０６  （ｍ、  ２Ｈ）、  ５．７９  （ｍ、  １Ｈ）、  ４．１３  （ｓ、  ３Ｈ）、  ３．１６  （ｓ、  ３Ｈ）、  ２．５９  （ｓ、  ３Ｈ）、  １．８３  （ｄ、  Ｊ＝６．０  Ｈｚ、  ３Ｈ）．ＭＳ  ｍ／ｚ  ４４９  ［Ｍ＋１］．
【００５４】
（実施例２）
（１０Ｒ）−７−（２−アミノアセチル）アミノ−１２−フルオロ−２，１０，１６−トリメチル−１５−オキソ−１０，１５，１６，１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８，４−（メテノ）ピラゾロ［４,３−ｈ］［２，５，１１］−ベンゾキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリル（化合物６）の合成。
【化８】
0006609308.tif 000009
【００５５】
Ｆｍｏｃ−グリシン（７６３．４ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ、２０．０当量）をＳＯＣｌ２（１６．０ｍＬ）に仕込み、回流まで混合物を２時間加熱した。真空蒸発し、白い固体を得た。当該固体をＤＣＭ（８．０ｍＬ）に溶解させ、二つの部分に分けて（１０Ｒ）−７−アミノ−１２−フルオロ−２，１０，１６−トリメチル−１５−オキソ−１０，１５，１６，１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８，４−（メテノ）ピラゾロ［４,３−ｈ］［２，５，１１］−ベンゾキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリル（化合物Ａ、５０．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．０当量）のピリジン溶液を仕込んだ。反応混合物を室温にて１６時間攪拌した。その後水（２０ｍＬ）を仕込んだ。ＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で水層を抽出し、有機層を一つに合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し濃縮した。調製用ＴＬＣ板により粗生成物を精製し、化合物５（３０ｍｇ）を得た。
０℃で化合物５（３０．０ｍｇ）のＤＣＭ（２．０ｍＬ）溶液にピペリジン（０．１ｍＬ）を仕込んだ。反応は室温にて５時間攪拌し、ＴＬＣは反応完了を示した。反応混合物を濃縮しｎ−ヘキサン（２×５ｍＬ）で洗浄し、粗生成物を得た。その後粗生成物をシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲルをＤＣＭ中の１％  Ｅｔ３Ｎで予洗した）によりＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１００：１）で精製し、化合物６（１２．３ｍｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ、  ＣＤＣｌ３）：  ８．２３  ｐｐｍ．（ｓ、  １Ｈ）、  ７．３１  （ｍ、  １Ｈ）、  ７．２５  （ｍ、  １Ｈ）、  ７．１４  （ｄ、  Ｊ＝２．０  Ｈｚ、  １Ｈ）、  ７．０４  （ｍ、  ２Ｈ）、  ５．８０  （ｍ、  １Ｈ）、  ４．４６（ｍ、  ２Ｈ）、  ４．１２（ｓ、  ３Ｈ）、  ３．７８（ｓ、  ２Ｈ）、  ３．１７  （ｓ、  ３Ｈ）、  １．８５  （ｄ、  Ｊ＝６．０  Ｈｚ、  ３Ｈ）．ＭＳ  ｍ／ｚ：  ４６４  ［Ｍ＋１］．
【００５６】
生物学的アッセイ
前述のように、本発明で定義された化合物は、抗増殖活性を有する。こうした特性は、例えば、以下に記載の手順の１つ又は複数を使用して評価することができる。
【００５７】
キナーゼを阻害する試験化合物の能力を決定するインビトロアッセイ
キナーゼ標識Ｔ７ファージ株を、ＢＬ２１株由来の大腸菌宿主で調製した。大腸菌を対数増殖期まで増殖させ、Ｔ７ファージに感染させ、溶解するまで３２℃で振とうしてインキュベートした。溶解産物を遠心分離及びろ過して細胞残屑を除去した。残りのキナーゼは、ＨＥＫ−２９３細胞で産生した後、ｑＰＣＲ検出のためにＤＮＡで標識した。ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを、ビオチン化低分子リガンドにより３０分間室温で処理して、キナーゼアッセイ用の親和性樹脂を生成した。未結合リガンドを除去し、非特異的結合を低減させるために、リガンド付ビーズを、過剰量ビオチンでブロッキングし、ブロッキング緩衝液（ＳｅａＢｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄した。キナーゼ、リガンド付親和性ビーズ、及び試験化合物を１×結合緩衝液（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ  ＤＴＴ）に混合することにより、結合反応を構築した。反応は全て、ポリスチレン製９６ウエルプレートでの最終容積０．１３５ｍｌ中で実施した。アッセイプレートを、室温で１時間振とうさせてインキュベートし、親和性ビーズを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。その後、ビーズを、溶出緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μＭ非ビオチン化親和性リガンド）に再懸濁し、３０分間室温で振とうさせてインキュベートした。溶出液中のキナーゼ濃度を、ｑＰＣＲで測定した。
【００５８】
下記の表１には、本発明の代表的化合物及びキナーゼアッセイにおけるそれらの阻害活性が列挙されている。
【００５９】
キナーゼ阻害
【表１】
0006609308.tif 000010
化合物６は変異体ＥＧＦＲ（Ｌ７４７−Ｅ７４９ｄｅｌ、Ａ７５０Ｐ）の有効な阻害剤（４２０ｎＭ）である。
【００６０】
細胞増殖アッセイにより異なる癌細胞系、例えばＨＣＣ８２７及びＮＣＩ−Ｈ６９に対する代表的数の化合物を解析した。
細胞増殖アッセイ
１．１００μｌ培地（５％ＦＢＳ含有）における１ウエル当たり５×１０３個の細胞を、９６ウエルプレートに播種した。
２．２４時間後、種々の濃度の化合物を有する１００μｌの新しい培地（ＦＢＳを含まない）を各ウエルに添加した。
３．細胞を化合物で７２時間処理した後、２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウエルに添加した後、アッセイプレートを３７℃で４時間インキュベートした。
４．アッセイプレートを８００ｇで１０分間遠心分離した。培地を吸引し、１５０μｌのＤＭＳＯを各ウエルに添加した。プレートを１０分間穏やかに振とうした。
５．５７０ｎｍの吸光度をプレートリーダで測定した。
６．ＩＲ％＝（ＷＣ−ＷＴ）／ＷＣ＊１００％
下記の表２には、本発明の代表的化合物及び細胞アッセイにおけるそれの活性が列挙されている。
【００６１】
細胞増殖アッセイ
【表２】
0006609308.tif 000011
【００６２】
ＣＹＰ阻害を測定するために、ヒト肝ミクロソームにおけるＰ４５０  ３Ａ４アッセイにおいて代表的数の化合物をテストした。
【００６３】
−８０℃でヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）を貯蔵した。研究する前に、微粒体を冷水浴で解凍した直後に氷に載せた。試験化合物及びＰ４５０  ３Ａ４特異的阻害剤ケトコナゾールをＤＭＳＯに溶かし、１０ｍＭの貯蔵溶液を得た。貯蔵溶液を５０％アセトニトリルで希釈し、濃度が１．５ｍＭの希釈標準溶液を得た。希釈標準溶液を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液でさらに希釈し、濃度が１５０、５０、１５、５、１．５、０．５、０．１５、及び０．０５μＭの一連の希釈標準溶液を得た。２複製分のインキュベート混合物が、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（総体積０．１ｍＬ）に貯蔵されるヒト肝ミクロソーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）、３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＣＹＰ  ３Ａ４プローブ基質テストステロン（５０μＭ）、特異的阻害剤又は試験化合物（３０、１０、３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．０１μＭ）に含有される。陰性対照は特異的阻害剤又は試験化合物の代わりに、０．１Ｍリン酸塩緩衝液を含む。ＤＭＳＯとアセトニトリルの最終濃度は０．１％に等しいか、又はそれよりも小さかった。混合物を３７℃で１０分間プレインキュベートした。その後、反応を起こすために、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを添加する。３７℃で１０分間プレインキュベートした後、内部標準物質を含む３００μＬのアセトニトリルを添加することで反応を終了させる。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより対応する生成物の形成を検出する。
【００６４】
ＬＣＭＳ法：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステムにカップリングされたＡＰＩ  ４０００  Ｑｔｒａｐシステムを用いた。質量分析計にはターボイオンスプレー（ＥＳＩ）インターフェイス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、  Ｃｏｎｃｏｒｄ、  Ｏｎｔａｒｉｏ、  Ｃａｎａｄａ）が装備されている。Ａｎａｌｙｓｔ  １．５ソフトウェアパッケージ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを制御し、及びデータ取得と処理のために用いられた。Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ  ＩＤ、１．７μｍ）でクロマトグラフ分離を行った。カラムの温度が環境温度（２５℃）に保持された。移動相Ａは０．１％蟻酸（ｖ／ｖ）が補充されている純水である。移動相Ｂは０．１％蟻酸（ｖ／ｖ）が補充されているアセトニトリルである。流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎに保持された。
【００６５】
サンプル調製：内部標準物質を含む３倍体積の冷たいメタノール／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）混合物を添加することで反応をクエンチした。混合物は４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。１００μＬの上澄み液と２００μＬのＨ２Ｏを混合させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のために、最終溶液を注射した。
【００６６】
データ解析：残りの酵素活性を表すために、生成物（６β−ヒドロキシテストステロン）と内部標準物質のピーク面積比率が各反応の関連陰性対照の割合としてプロットされる。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアでグラフ図の酵素活性の阻害剤濃度に対する非線形回帰を介して試験化合物のＩＣ  ５０値を確定する。薬物相互作用（ＤＤＩ）の潜在リスクを評価する一般基準は以下の通りである。
ＩＣ５０＞１０μＭ  ＣＹＰ阻害が低い。
３μＭ＜ＩＣ５０＜１０μＭ  ＣＹＰ阻害が中程度である。
ＩＣ５０＜３μＭ  ＣＹＰ阻害が高い。
【００６７】
下記の表３には、本発明の代表的化合物及びチトクロムＰ４５０  ３Ａ４アッセイにおけるそれらの活性が列挙されている。
【００６８】
ＣＹＰ  ３Ａ４阻害
【表３】
0006609308.tif 000012
【００６９】
化合物ＰＦ−０６４６３９２２は、中度のチトクロムＰ４５０  ３Ａ４阻害を示し、化合物６及び１０は、低いチトクロムＰ４５０  ３Ａ４阻害を示したことからは、それらはよりよい安全性を有することが明らかである。
【００７０】
代謝速度を測定するために、ラット全血において代表的数の化合物をテストした。
【００７１】
貯蔵溶液の調製：１００％ＤＭＳＯに試験化合物の貯蔵溶液を提供した。各種の化合物の貯蔵溶液をアセトニトリル：ＰＢＳ緩衝液（２：８）の混合物で５００μＭに希釈した後で、終濃度が１．０μＭとなるようにラット血液（ｐＨ７．４）に希釈した。
【００７２】
インキュベート：２複製分で１．０μＭの試験化合物を３７℃で血液にインキュベートした。０ｈ、０．２５ｈ、０．５ｈ、１ｈと２ｈに５０μＬサンプルのアリコートを収集した。
【００７３】
サンプル調製：内部標準物質を含む冷たいアセトニトリル１５０μＬを添加することで、各時点（０、０．２５、０．５、１、２時間）に反応を終了させた。プレートを遠心分離させた（４０００ｒｐｍ、１５分間）。１００μＬの上澄み液を各ウェルに２００μＬ  Ｈ２Ｏと０．１％蟻酸（ｖ／ｖ）を含有するドータプレートに転移させた。ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりサンプルを解析した。
【００７４】
データ解析：試験化合物と内部標準物質のピーク面積比率が各反応の関連ゼロ時点対照の割合（残り％）としてプロットされる。代謝速度（ｋ）は残りの対数割合とインキュベート時間からの線形回帰の傾きである。Ｔ１／２が−０．６９３／ｋとして計算される。
【００７５】
下記の表４には、本発明の代表的化合物及びラット全血におけるそれらの代謝速度（ｋ）が列挙されている。
【００７６】
ラット全血における代謝速度
【表４】
0006609308.tif 000013
【００７７】
化合物６は、ＰＦ−０６４６３９２２と化合物１０に比較してはるかに大きいＫ値を有することが発見された。より速い代謝は、被験体における化合物の毒性をはるかに少なくすることを可能にする。
【００７８】
溶解度の測定
レファレンス標準溶液の調製：２ｍｇの化合物Ａ又は化合物６をそれぞれ１００ｍＬ容積フラスコに仕込んだ。化合物はアセトニトリルで１００ｍＬに希釈された。
【００７９】
サンプル溶液の調製：２ｍｇの化合物Ａ又は化合物６をそれぞれ２ｍＬ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（ＥＰ）に添加した後で１ｍＬ  ｐＨ７．０又は１０．０の緩衝溶液（２０ｍｍ）を仕込んだ。溶液を２分間振とうし、２５℃で３０分間放置した。３０分間静置した後、ＥＰの底部に沈殿が形成した。溶液を０．２μｍメンブレンフィルタでろ過した後、水で５０倍希釈した。
【００８０】
同じ体積の標準溶液とサンプル溶液を、クロマトカラムがＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＣＬＣ−ＯＤＳ  Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×６．０ｍｍ、５μｍ）であるＨＰＬＣに注入した。移動相はアセトニトリルと２％トリクロロメタン−２０ｍｍ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ＝７．０）から構成され、流速は１ｍＬ／分間（４０：６０）であった。検出波長は２６４ｎｍであった。計算：サンプル溶解度＝標準物濃度×サンプル面積×５０／標準物面積。化合物６はｐＨ＝１０．０の場合、化合物Ａと同様の溶解度を有したが、ｐＨ＝７．０の場合、化合物Ａよりもはるかに高い溶解度を有した。
【００８１】
本発明の化合物の溶解度
【表５】
0006609308.tif 000014
【００８２】
（付記）
（付記１）
一般式１の化合物：
【化９】
0006609308.tif 000015
・・・一般式１
に示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物又はエナンチオマー。
（式中、Ｒ１は、Ｃ１〜６アルキル又はＮＨ２（Ｒ２Ｒ３）Ｃ−であり、Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立してＨ又はＣ１〜６アルキルである。）
【００８３】
（付記２）
以下の群から選ばれる１種の化合物又はその薬学的に許容される塩又は溶媒和物。
【化１０】
0006609308.tif 000016
【００８４】
（付記３）
付記１又は２に記載の化合物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【００８５】
（付記４）
薬剤として使用するための、付記１又は２に記載の化合物、又は付記３に記載の医薬組成物。
【００８６】
（付記５）
過剰増殖疾患を治療又は予防するための、付記１又は２に記載の化合物、又は付記３に記載の医薬組成物の使用。
【００８７】
（付記６）
キナーゼシグナル伝達を調節するための、付記１又は２に記載の化合物の使用。
【００８８】
（付記７）
ＡＬＫ、ＲＯＳ１及び／又はＥＧＦＲキナーゼ媒介疾患を治療又は予防するための、付記１又は２に記載の化合物の使用。
【００８９】
（付記８）
腫瘍形成を治療するための、付記１又は２に記載の化合物の使用。
【００９０】
（付記９）
肺がん、乳がん、脳がん、慢性リンパ性白血病、マントル細胞リンパ腫又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫から選ばれる癌疾患を治療するための、付記１又は２に記載の化合物の使用。
【００９１】
（付記１０）
腫瘍形成を治療するための、１つ又は複数の抗癌剤と組み合わせた付記１〜３のいずれか１つに記載の化合物の使用。