(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド。
【請求項２】
前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子より低い血清有病率を示し、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項３】
前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子より低い程度にヒト血清によって中和され、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたは前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子が、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項４】
精製されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２に示される核酸配列によってコードされる、請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチド。
【請求項６】
配列番号２に示される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子。
【請求項１０】
導入遺伝子をさらに含む、請求項９に記載の精製されたウイルス粒子。
【請求項１１】
導入遺伝子を用いて遺伝子移入および／またはワクチン接種するための組成物であって、
前記組成物は請求項１０に記載のウイルス粒子を含み、前記ウイルス粒子がＡＡＶ２ウイルス粒子より低い血清有病率を示す、組成物。
【請求項１２】
前記ウイルス粒子が、ＡＡＶ８ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルス粒子が、ＡＡＶ２ウイルス粒子より低い程度にヒト血清によって中和され、前記ＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶ８ウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のＡＡＶキャプシドポリペプチドに作動可能に連結した標的抗原を含むワクチンであって、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドがＡＡＶ２キャプシドポリペプチドより低い血清有病率を示す、ワクチン。
【請求項１５】
前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドより低い程度にヒト血清によって中和され、前記ＡＡＶキャプシドポリペプチドが、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される、請求項１４に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療ベクターに対する中和または毒性免疫応答を逃れ回避することは、全ての遺伝子移入ベクタータイプを用いる場合に大きな課題である。これまでの遺伝子移入は、ヒトおよび動物内を循環するウイルスに基づくベクター、例えば、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いることで最も効率的に達成される。しかしながら、対象がウイルスに自然に感染している場合は、そのウイルスに基づくベクターによるその後の治療は、細胞性および体液性免疫応答に起因して、安全リスクの増加と遺伝子移入効率の低下をもたらす。キャプシド抗原は、主に、ウイルス粒子に対する先天性免疫および／または適応免疫の原因となるが、しかしながら、ウイルス遺伝子によりコードされたポリペプチドもまた免疫原性であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、祖先ウイルス配列またはその一部を予測および合成する方法を記載し、さらに、このような祖先ウイルス配列を含有するウイルス粒子を記載する。本明細書に記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された；したがって、本開示は、予測された祖先ＡＡＶ配列、およびこのような祖先ＡＡＶ配列を含有するＡＡＶウイルス粒子を記載する。本開示はまた、同時代の（contemporary）配列を含有するウイルス粒子と比較して低減した、祖先配列を含有するウイルス粒子によって示された血清有病率を記載する。
【０００４】
一態様において、本開示は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド、例えば、合成および／または人工のＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む。いくつかの実施において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子より低い血清有病率を示し、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子より低い程度にヒト血清によって中和され、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは精製されている。本明細書において提供されるＡＡＶキャプシドポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群から選択される核酸配列によってコードされ得る。
【０００５】
一態様において、本開示は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８からなる群から選択される核酸配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子、例えば、合成および／または人工の核酸分子を提供する。また、このような核酸を含むベクター、およびこのようなベクターを含む宿主細胞が提供される。
【０００６】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリペプチドを含む精製されたウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は導入遺伝子を含む。
【０００７】
他の態様において、本開示は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、９７、９８、９９または１００％）の配列同一性を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチド、例えば、合成および／または人工のＡＡＶキャプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子より低い血清有病率を示し、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子より低い程度にヒト血清によって中和され、ＡＡＶキャプシドポリペプチドまたはＡＡＶキャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子は、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは精製されている。
【０００８】
別の態様において、本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリペプチドは、本明細書に記載される核酸配列によってコードされ得る。一つの実施において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子を提供し、ここで、核酸分子は、本明細書に示される核酸配列と少なくとも９５％（例えば、９７、９８、９９または１００％）の配列同一性を有する。本開示はまた、このような核酸分子を含むベクターを提供し、宿主細胞はこのようなベクターを含む。
【０００９】
一態様において、本開示は、本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリペプチドの少なくとも１つを含むウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は導入遺伝子を含む。
【００１０】
特定の態様において、本開示は、遺伝子移入またはワクチン接種を必要とする対象に、本明細書に記載されるウイルス粒子を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、ＡＡＶ２ウイルス粒子より低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、ＡＡＶ８ウイルス粒子とほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、ＡＡＶ２ウイルス粒子より低い程度にヒト血清によって中和され、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ８ウイルス粒子と同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。
【００１１】
一態様において、本開示は、ワクチン接種を必要とする対象に、本明細書に記載されるＡＡＶキャプシドポリペプチドに作動可能に連結した標的抗原を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドとほぼ同じまたはより低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドより低い程度にヒト血清によって中和され、ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドと同程度またはより低い程度にヒト血清によって中和される。
【００１２】
別の態様において、本開示は、祖先ウイルスまたはその一部の配列を予測するインシリコの方法を提供する。このような方法は、典型的には、複数の同時代のウイルスまたはその一部由来のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を用意すること；多重配列アラインメント（ＭＳＡ）アルゴリズムを用いて配列を整列させること；進化をモデリングして複数の同時代のウイルスまたはその一部の予測される祖先系統発生を得ること；予測される祖先系統発生の系統発生学的な節で、配列のそれぞれの位置での特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を概算すること；およびそれぞれの位置で概算された確率に基づいて、祖先ウイルスまたはその一部の配列を予測することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、１つもしくは複数または全てのステップはコンピュータプロセッサを用いて行われる。いくつかの実施形態において、ＭＳＡアルゴリズムは、系統発生学的情報を用いて、アラインメントにおけるギャップが欠失または挿入の結果であるかどうかを予測する。いくつかの実施形態において、ＭＳＡアルゴリズムは確率的アラインメントキット（ＰＲＡＮＫ）である。いくつかの実施形態において、進化をモデリングするために使用されるモデルは赤池（Aikake）情報量規準（ＡＩＣ）を用いて選択される。いくつかの実施形態において、予測される祖先系統発生は、ガンマ分布モデル（「＋Ｇ」）とπｉの頻度計算（「＋Ｆ」）を伴うＪＴＴモデルを用いて得られる。いくつかの実施形態において、進化ステップのモデリングはＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆモデルを用いて行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、予測される配列に基づいて、祖先ウイルスまたはその一部を合成することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、祖先ウイルスまたはその一部を祖先ウイルス粒子にアセンブルすることを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本方法はまた、（ａ）複製；（ｂ）遺伝子移入特性；（ｃ）受容体結合；または（ｄ）血清有病率の少なくとも１つについて祖先ウイルス粒子をスクリーニングすることを含む。いくつかの実施形態において、祖先ウイルス粒子は、複数の同時代のウイルスまたはその一部の少なくとも１つからアセンブルされるウイルス粒子より低い血清有病率を示す。いくつかの実施形態において、祖先ウイルス粒子は、複数の同時代のウイルスまたはその一部の少なくとも１つからアセンブルされるウイルス粒子より低い程度にヒト血清によって中和される。いくつかの実施形態において、複数の同時代のウイルスまたはその一部は、アデノウイルス（ＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスおよび泡沫状ウイルスからなる群から選択されるファミリーに属する。
【００１５】
このように、本開示は、同時代のウイルスまたは一部と比較して、現在のヒト集団において既存の免疫に対する感受性の低減を示す祖先ウイルスまたはその一部を提供する。一般的に、現在のヒト集団における祖先ウイルスまたはその一部によって示される既存の免疫に対する感受性の低減は、中和抗体に対する感受性の低減として反映される。
【００１６】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、対象とする方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、対象とする方法および組成物の実施または試験に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。さらに、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、全体として参照により組み込まれる。
【００１７】
特許または出願ファイルは、カラーで作製された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、要求および必要とされる手数料の支払いにより特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、祖先の／同時代のウイルス感染と祖先の／同時代の宿主免疫応答の間の関係を示す概略図である。
【図２】図２Ａから２Ｄは、祖先の再構築手順の一例を示す一連の概略図である。示されたデータは、完全なデータセットから抜粋されたものであり、残基５６４〜５８４（ＡＡＶ２−ＶＰ１の番号付け）を表す。
【図３】図３Ａから３Ｃは共に、本明細書に記載される方法を用いて産生されたＡＡＶの同時代の配列の系統樹を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは共に、祖先ＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドのアラインメントを示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは共に、機能的な祖先ＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドおよび同時代のＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドのアラインメントを示す。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは共に、機能的な祖先ＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドおよび同時代のＡＡＶ  ＶＰ１ポリペプチドのアラインメントを示す。
【図６】図６は、祖先ＡＡＶ  ＶＰ１配列が転写され、同時代のＡＡＶ  ＶＰ１配列と同様に選択的にスプライスされることを実証する電気泳動ゲルである。
【図７】図７は、祖先ＡＡＶベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図８】図８は、Ａｎｃ８０ライブラリーとＡｎｃ８０Ｌ６５間の配列比較（対角線から上は％、下はａａの相違数）を示すグラフである。
【図９】図９Ａ−Ｄは、Ａｎｃ８０Ｌ６５が高力価の粒子をアセンブルし、得ることができることを実証する実験結果の画像である。パネルＡは、Ａｎｃ８０Ｌ６５がＡＡＶ２に相当するベクター収率を生じさせることができることを示す；パネルＢは、Ａｎｃ８０Ｌ６５を含むウイルス粒子のＴＥＭ画像である；パネルＣは、Ａｎｃ８０Ｌ６５を含むウイルス粒子が、変性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基づいて、ＡＡＶキャップＶＰ１、２および３タンパク質を産生し得ることを示す；パネルＤは、ＡＡＶキャプシド抗体、Ｂ１を用いたＡｎｃ８０Ｌ６５のウェスタンブロットを示す。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは、Ａｎｃ８０Ｌ６５が、読み出し（パネルＡ）またはルシフェラーゼ（パネルＢ）対ＡＡＶ２および／もしくはＡＡＶ８対照として、ＧＦＰを用いてインビトロでＨＥＫ２９３細胞上で細胞を感染させることができ、さらに、核のＬａｃＺ導入遺伝子をコードするＡＡＶのＩＶ注射後（上段の行、パネルＣ：肝臓）、ＧＦＰをコードするＡＡＶの直接的なＩＭ注射後（中段の行、パネルＣ：筋肉）およびＧＦＰをコードするＡＡＶによる網膜下注射後（下段の行、パネルＣ：網膜）効率的に肝臓を標的化することを実証する実験結果の画像である。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ａ）、および代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ｂ）を示すＭＡＦＦＴを用いて生成する配列同一性マトリックスである。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ａ）、および代表的な現存のＡＡＶのアミノ酸配列と整列させた祖先ベクターのＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列（図１１Ｂ）を示すＭＡＦＦＴを用いて生成する配列同一性マトリックスである。
【図１２】図１２は、ＡＡＶベクターが小規模（６ウェルディッシュ）で三連で生成されたことを実証するグラフである。粗ウイルスは、それぞれのベクターの絶対的な生成を決定するために定量ＰＣＲによって評価された。
【図１３】図１３は、ＡＡＶ８の力価に対して平均され、比較されたそれぞれのベクターの力価を示す表である。
【図１４】図１４は、それぞれのベクターの１．９Ｅ３  ＧＣ／細胞がＨＥＫ２９３細胞に添加された実験結果を示す写真である（Ａｎｃ１２６を除く。この場合、２．５Ｅ２−３．１Ｅ２  ＧＣ／細胞のＭＯＩが達成された。）。６０時間後、感染力を蛍光顕微鏡を用いて評価した。
【図１５】図１５は、図１４と同じ細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現についてアッセイした実験結果を示すグラフである。図１４のように、Ａｎｃ１２６は、他のベクターで制御された力価でなかったが、むしろ２．５Ｅ２−３．１Ｅ２  ＧＳ／細胞のＭＯＩの範囲であった。
【図１６】図１６は、ＡＡＶ８の発光に対して平均され、比較された、それぞれのベクターによって形質導入された細胞の発光を示す表である。
【図１７】図１７は、本明細書に記載される祖先ＡＡＶベクターの相対的な生成と感染力を決定するためのインビトロ実験の概要を提供するチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
実験目的または治療目的のための遺伝子移入は、遺伝情報を標的細胞に往復させるためのベクターまたはベクターシステムを利用する。ベクターまたはベクターシステムは、遺伝子移入反応の効率、特異性、宿主応答、薬理学および寿命の主要な決定要因であると考えられる。現在、遺伝子移入を達成するための最も効率的かつ効果的な方法は、複製欠損がなされているウイルスに基づくベクターまたはベクターシステムの使用を介するものである。
【００２０】
しかしながら、血清有病率の研究は、世界的なヒト集団のかなりの割合が、現在、遺伝子移入に使用されている大多数のウイルスに（例えば、自然感染によって）予め曝露され、したがって、既存の免疫を保有していることを示す。これらの予め曝露された個体中のウイルスベクターに対する抗体を中和することは、遺伝子移入の程度を時には有意に制限し、またはウイルスを標的から離れるように変えることが知られている。例えば、Calcedo et al. （2009, J. Infect. Dis., 199:381-90）、およびBoutin et al. （2010, Human Gene Ther., 21:704-12）を参照されたい。このように、本開示は、祖先ウイルスまたはその一部が、同時代のウイルスまたはその一部よりも、現在のヒト集団において既存の免疫に対する感受性の低減（例えば、中和抗体に対する感受性の低減）を示すという認識に基づく。
【００２１】
図１は、祖先および同時代のウイルス感染と祖先および同時代の宿主免疫応答の間の関係を示す概略図である。図１は、祖先ＡＡＶが、どのようにして同時代の既存の免疫に不応性であり得るかを示す。同時代の、現存のウイルス（Ｖｃ）は、免疫回避のメカニズムを介して、主に宿主免疫の進化的圧力下で祖先種（Ｖａｎｃ）から進化してきたことが推定される。これらの種ＶａｎｃおよびＶｃの各々は、Ｂ細胞免疫およびＴ細胞免疫（それぞれＩａｎｃおよびＩｃ）を含む適応免疫を誘導する能力を有する。同時代のウイルスによって誘導される免疫は、現存のウイルスよりもエピトープ組成の点で実質的に異なる可能性がある祖先ウイルス種と必ずしも交差反応しないことが仮定され、本明細書において確認された。
【００２２】
本開示は、祖先ウイルスまたはその一部の配列を予測する方法を提供する。本明細書に記載の方法を用いて予測される祖先ウイルス配列の１つまたは複数が生成され、ウイルス粒子にアセンブルすることができる。本明細書において実証されるように、予測される祖先ウイルス配列からアセンブルされるウイルス粒子は、現在の同時代のウイルス粒子よりも少ない、時として有意に低い血清有病率を示し得る。したがって、本明細書に開示されている祖先ウイルス配列は、遺伝子移入のためのベクターまたはベクターシステムにおける使用に適している。
【００２３】
祖先ウイルス配列を予測および合成する方法
祖先ウイルス配列を予測するために、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を最初に複数の同時代のウイルスまたはその一部から集める。本明細書に記載される方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド配列を用いて例示されが、同じ方法は、ＡＡＶ由来の他の配列（例えば、ゲノム全体、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）に適用され、または任意の他のウイルスまたはその一部に適用され得る。ＡＡＶ以外のウイルスとしては、限定されないが、アデノウイルス（ＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、泡沫状ウイルス、または既存する免疫が問題であると考えられる任意の他のウイルスが挙げられる。
【００２４】
わずか２つの同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができるが、しかしながら、同時代のウイルスまたはその一部の大多数の配列は、できるだけ多くの現在の配列多様性の状況を含むように所望されるが、さらに、大多数の配列が記載され、使用されるアルゴリズムの予測能力を増加させ得るためであることが理解される。例えば、１０個以上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、５０個以上の同時代のウイルスもしくはその一部由来の配列を用いることができ、または１００個以上の同時代のウイルスまたはその一部由来の配列を用いることができる。
【００２５】
このような配列は、例えば、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＥＭＢＬ、国際塩基配列データベースコラボレーション（ＩＮＳＤＣ）または欧州ヌクレオチドアーカイブを含む任意の数の公共のデータベースから取得することができる。追加的にまたは代替的に、このような配列は、特定の生物に特異的なデータベース（例えば、ＨＩＶデータベース）から取得することができる。同時代の配列は、ゲノム全体に対応し得、またはゲノムの一部のみ、例えば、限定されないが、ウイルスキャプシド、複製タンパク質またはＩＴＲ配列の１つまたは複数の構成成分をコードする配列を使用することができる。
【００２６】
次に、同時代の配列は、複数の配列アラインメント（ＭＳＡ）アルゴリズムを用いて整列される。図２（ａ）は複数配列のアラインメントを示す概略図である。ＭＳＡアルゴリズムは当技術分野において周知であり、一般的に、異なるサイズのデータセットと異なる入力（例えば、核酸またはタンパク質）に適用され、および特定の方法（例えば、動的プログラミング、プログレッシブ、ヒューリスティック）で配列を整列するように設計され、アラインメントにおける異なるスコアリングスキーム（例えば、マトリックスベースまたは整合性ベース、例えば、最小エントロピー、対の合計、類似性マトリックス、ギャップスコア）を適用する。周知のＭＳＡアルゴリズムとしては、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson et al., 1994, Nuc. Acids Res., 22:4673-90）、Ｋａｌｉｇｎ（Lassmann et al., 2006, Nuc. Acids Res., 34:W596-99）、ＭＡＦＦＴ（Katoh et al., 2005, Nuc. Acids Res., 33:511-8）、ＭＵＳＣＬＥ（Edgar, 2004, BMC Bioinform., 5:113）およびＴ−Ｃｏｆｆｅｅ（Notredame et al., 2000, J. Mol. Biol., 302:205-17）が挙げられる。
【００２７】
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法において使用するためのＭＳＡアルゴリズムを選択する場合の主な特徴の１つは、アルゴリズムがアラインメント中のギャップを処理する方法である。配列アラインメント中のギャップは、ギャップの大きさに依存するまたは独立であるペナルティ値を割り当てることができる。本方法において、本明細書に記載される方法において使用されるＭＳＡアルゴリズムは、ギャップのバイアスされた非系統発生学的処理とは対照的に、例えば、挿入および／または欠失に起因して、アラインメント中のギャップが欠失または挿入の結果であるかどうかを予測するために系統発生学的情報を適用することが好ましい。アラインメント中のギャップを処理する適切な方法および進化分析は、Loytynoja and Goldman, 2008, Science, 320:1632-5に記載され、本明細書に記載される方法における使用に適した方法でアラインメント中のギャップを適用する市販のアルゴリズムは、確率的アラインメントキット（ＰＲＡＮＫ；Goldman Group Software；Loytynoja and Goldman, 2005, PNAS USA, 102:10557-62）であり、ＰＲＡＮＫアルゴリズムのバリエーションである。
【００２８】
次に、進化モデルは、予測された祖先系統発生を得るために、得られたアラインメントに適用される（図２（ｂ）参照）。当技術分野において利用可能な多数の進化モデルが存在し、その各々は、アミノ酸について代替率のわずかに異なるマトリックスを適用する。限定されないが、進化のモデルを適用するためのアルゴリズムとしては、Ｄａｙｈｏｆｆモデル（例えば、ＰＡＭ１２０，ＰＡＭ１６０，ＰＡＭ２５０；Dayhoff et al., 1978, In Atlas of Protein Sequence and Structure (ed. Dayhoff), pp. 345-52, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C.）、ＪＴＴモデル（Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）、ＷＡＧモデル（Whelan and Goldman, 2001, Mol. Biol. Evol., 18:691-9）、およびＢｌｏｓｕｍモデル（例えば、Ｂｌｏｓｕｍ４５、Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｂｌｏｓｕｍ８０；Henikoff and Henikoff, 1992, PNAS USA, 89:10915-9）が挙げられる。
【００２９】
さらに、構造と機能が進化モデルに課す制約はそれ自体、例えば、いくつかの位置は不変であること（「＋Ｉ」；Reeves, 1992, J. Mol. Evol., 35:17-31）、いくつかの位置は異なる速度の変化を受けること（「＋Ｇ」；Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401）、および／またはヌクレオチドもしくはアミノ酸の平衡頻度がアラインメントと同じであること（「＋Ｆ」；Cao et al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27）を考慮することによってモデリングされ得る。
【００３０】
進化の１つまたは複数のモデルの適応度は、赤池情報量規準（ＡＩＣ；Akaike, 1973, In Second International Symposium on Information Theory, Petrov and Csaki, eds., pp 267-81, Budapest, Akademiai Kiado）、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ；Schwarz, 1978, Ann. Statist. 6:461-4）、またはそれらのバリエーションもしくは組合せを用いて評価することができる。さらに、ＡＩＣ、ＢＩＣまたはそれらのバリエーションもしくは組合せは、進化モデルにおける１つまたは複数のパラメータ（例えば、上記で検討した制約）を含むという相対的な重要性を評価するために使用され得る。
【００３１】
以下の実施例の項で説明されるように、ＰｒｏＴｅｓｔ３（Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5）は、最小ＡＩＣに基づいて、ＪＴＴ＋Ｇ＋ＦアルゴリズムがＡＡＶ進化のために最も適したモデルであったということを決定するために用いることができる。ＪＴＴ＋Ｇ＋Ｆアルゴリズムはまた、ＡＡＶキャプシドポリペプチド以外の祖先ウイルス配列を予測するために用いられてもよいことが当業者に理解されるであろうが、しかしながら、また、データセットと適応度スコアに応じて、進化の異なるモデルがより適切であり得ることが当業者に理解されるであろう。
【００３２】
進化のモデルが選択され、その適応度が決定されると、ウイルス配列またはその一部の系統樹を構築することができる。系統樹を構築することは、当技術分野において公知であり、典型的には、最大尤度法を採用し、例えば、ＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704)）、ＭＯＬＰＨＹ（Adachi and Hasegawa, 1996, ed. Tokyo Institute of Statistical Mathematics）、ＢｉｏＮＪ（Gascuel, 1997, Mol. Biol. Evol., 14:685-95）、またはＰＨＹＬＩＰ（Felsenstein, 1973, Systematic Biology, 22:240-9）によって実施されるものが挙げられる。当業者は、コンピュータ計算の複雑さと適応度の有益部分とのバランスがアミノ酸置換のモデルにおいて望ましいことを理解するであろう。
【００３３】
所望により、系統樹を有意性について評価することができる。多数の統計的方法が、モデルの有意性を評価するために利用可能であり、日常的に使用され、限定されないが、ブートストラップ、ジャックナイフ、交差検定、並べ替え検定またはそれらの組合せもしくはバリエーションが挙げられる。有意性はまた、例えば、おおよその尤度比検定（ａＬＲＴ；Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を用いて評価され得る。
【００３４】
系統発生のいずれかの系統発生的な節（例えば、内部系統発生の節）において、配列は、配列の各位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を概算することによって再構築することができまる（図２（ｃ））。系統発生的な節は、予測された祖先の系統樹内の中間進化の分岐点を指す。本明細書で使用するとき、「進化の確率」とは、考慮されないモデル、例えば、コドン使用における進化シフトとは対照的に、進化モデルに基づいて、特定の位置に特定のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する確率を指す。特定の位置で特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の進化の確率を考慮する例示的なモデルは、例えば、限定されないが、最大尤度法による系統発生学的分析（ＰＡＭＬ；Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6）または節約法を用いる系統発生学的分析（ＰＡＵＰ；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃ．，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ）を含む任意の数の最大尤度法を用いて概算され得る。
【００３５】
各位置での特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の概算された進化の確率に基づいて、祖先ウイルスまたはその一部の予測される配列はアセンブルされ、完全または部分的に合成の核酸またはポリペプチド配列を形成することができる。所望により、任意の残基が節に沿って所定の節で所定の状態にあった尤度を計算することができ、特定の閾値下に計算された事後確率を有する配列に沿った任意の位置を同定することができる（図２（ｄ））。このようにして、特定の閾値未満の確率を有するそれらの位置でバリエーションを含み得る祖先足場配列を生成することができる。
【００３６】
本明細書に記載の方法を用いて予測される祖先配列が核酸配列である場合、配列は、アミノ酸配列に効率的に翻訳され得るように最適化されたコドンであり得る。様々な生物のコドン使用頻度表は当技術分野において公知である。しかしながら、場合により、コドン使用頻度表は、祖先足場配列に対する相同性（例えば、少なくとも９０％の配列同一性）を有する１つまたは複数の同時代の配列に基づいて設計することができ、本明細書に記載される祖先配列は哺乳動物（例えば、ヒト）コドン使用頻度に向けて最適されたコドンであり得る。
【００３７】
祖先ウイルス配列を予測するための、本明細書に概説されているいずれかまたは全てのステップは、プロセッサまたはマイクロプロセッサを使用したコンピュータ（例えば、インシリコ）上で実行またはシミュレートすることができる。
【００３８】
祖先アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）足場配列
本明細書に記載される方法は、（下記の実施例において詳細に説明される）同時代のキャプシド配列を用いてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に適用された。ＡＡＶは、治療用遺伝子移入ベクターおよび遺伝子ワクチンビヒクルとして考えられるが、ヒト集団において高い血清有病率を示す。本明細書に記載される方法を用いて、系統樹は、同時代のＡＡＶ配列によりアセンブルされ（図３Ａ−３Ｃを参照）、予測された祖先足場配列は、指定された系統発生学的な節で得られた（表１）。本明細書で使用されるとき、祖先足場配列は、本明細書に記載される方法を用いて（例えば、進化可能性と進化モデリングを用いて）構築され、自然界に存在していたことが知られていない配列を意味する。本明細書で使用するとき、祖先足場配列は、典型的には、特定の位置でのヌクレオチドまたはアミノ酸残基の頻度を用いて構築されるコンセンサス配列とは異なる。
【００３９】
【表１】
0006552511.tif 000002
【００４０】
Ａｎｃ８０ポリペプチドの足場配列を配列番号１に示し、これは、配列番号２に示されるＡｎｃ８０核酸の足場配列によってコードされる。Ａｎｃ８０の足場配列は、２つの残基のいずれかが推定された１１位を含有する。したがって、Ａｎｃ８０足場配列は、２０４８（２１１）個の異なる配列を表す。
【００４１】
ウイルスまたはその一部の祖先配列を予測するための本明細書に記載される方法の有効性を実証するために、ＡＡＶ  Ａｎｃ８０節での２０４８個の予測された祖先配列のライブラリーを作製し、本明細書に記載されるように、同時代のキャプシドポリペプチドでアセンブルされたウイルス粒子と比較して、低い血清有病率、いくつかの例では有意に低い血清有病率を示す生存するウイルス粒子を形成することが実証された。
【００４２】
祖先ウイルス粒子を作製する方法
ウイルスまたはその一部の予測された祖先配列を取得した後、実際の核酸分子および／またはポリペプチド（単数または複数）を生成し、例えば、合成することができる。例えばインシリコで得られた配列に基づいて、人工的な核酸分子またはポリペプチドを生成する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、化学合成または組換えクローニングを含む。核酸分子またはポリペプチドを生成するためのさらなる方法は、当技術分野において公知であり、以下により詳細に検討される。
【００４３】
祖先ポリペプチドが生成されると、または祖先核酸分子が生成され、祖先ポリペプチドを生成するように発現されると、祖先ポリペプチドは、例えば、パッケージング宿主細胞を用いて、祖先ウイルス粒子にアセンブルされ得る。ウイルス粒子の構成成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列）は、本明細書に記載される１つまたは複数のベクターを使用してパッケージング宿主細胞に、一過性または安定に導入することができる。ウイルス粒子の構成成分の１つまたは複数は、本明細書に記載される予測された祖先配列に基づくことができ、一方、残りの構成成分は同時代の配列に基づくことができる。いくつかの例において、ウイルス粒子全体は、予測された祖先配列に基づくことができる。
【００４４】
このような祖先ウイルス粒子は、通常の方法を用いて精製することができる。本明細書で使用するとき、「精製された」ウイルス粒子とは、作製された混合物中の構成成分、例えば、限定されないが、ウイルス構成成分（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列）、パッケージング宿主細胞および部分的にまたは不完全にアセンブルされたウイルス粒子から取り除かれるウイルス成分を意味する。
【００４５】
アセンブルされると、祖先ウイルス粒子は、例えば、複製する能力；遺伝子移入特性；受容体結合能；および／または集団（例えば、ヒト集団）における血清有病率についてスクリーニングすることができる。ウイルス粒子が複製し得るかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、ある量のウイルス粒子で宿主細胞を感染させ、ウイルス粒子が経時的に数が増加するかどうかを決定することを含む。また、ウイルス粒子が遺伝子移入を行うことができるかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、導入遺伝子（例えば、以下でより詳細に検討されるレポーター遺伝子などの検出可能な導入遺伝子）を含有するウイルス粒子で宿主細胞を感染させることを含む。ウイルスの感染およびクリアランス後、宿主細胞は導入遺伝子の存在または非存在について評価され得る。ウイルス粒子がその受容体に結合するかどうかの決定は当技術分野において通常行われ、このような方法はインビトロまたはインビボで行うことができる。
【００４６】
ウイルス粒子の血清有病率の決定は当技術分野において通常行われ、典型的には、個体の特定の集団からの試料（例えば、血液試料）中の１つまたは複数の抗体の有病率を決定するためのイムノアッセイの使用を含む。血清有病率は、血清反応陽性である（すなわち、特定の病原体または免疫原に曝露されている）集団中の対象の割合を意味することが当技術分野において理解され、調べられた集団における個体の総数によって割った、特定の病原体または免疫原に対する抗体を産生する集団における対象の数として計算される。イムノアッセイは、当技術分野において周知であり、限定されないが、イムノブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。本明細書に示されるように、祖先ウイルス粒子は、同時代のウイルス粒子（すなわち、同時代のウイルス配列またはその一部を用いてアセンブルされたウイルス粒子）よりも低い血清有病率を示す。単に一例として、Xu et al. （2007, Am. J. Obstet. Gynecol., 196:43.e1-6）；Paul et al. （1994, J. Infect. Dis., 169:801-6）；Sauerbrei et al. （2011, Eurosurv., 16(44):3）；およびSakhria et al. （2013, PLoS Negl. Trop. Dis., 7:e2429）を参照されたい。それぞれは、所定の集団における特定の抗体についての血清有病率を決定した。
【００４７】
本明細書に記載されるように、祖先ウイルス粒子は、ヒトの免疫系、例えば、患者の免疫系によって、同時代のウイルス粒子よりも低い程度に中和される。血清試料中の抗体を中和する程度を決定するためにいくつかの方法が利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を含まない対照試料と比較して５０％以上の感染を中和する抗体濃度を含有する力価を測定する。また、Fisher et al. （1997, Nature Med., 3:306-12）およびManning et al. （1998, Human Gene Ther., 9:477-85）を参照されたい。
【００４８】
本明細書において例示される祖先ＡＡＶキャプシドポリペプチドに関して、血清有病率および／または中和の程度は、例えば、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドもしくはＡＡＶ８キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子、またはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドもしくはＡＡＶ２キャプシドポリペプチドを含むウイルス粒子と比較することができる。一般的に、ＡＡＶ８キャプシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、低いと考えられるヒト集団において、血清有病率および結果として得られる中和を示し、一方、ＡＡＶ２キャプシドポリペプチドまたはウイルス粒子は、高いと考えられるヒト集団において、血清有病率および結果として中和を示すことが当技術分野において理解される。明らかに、特定の血清有病率は、調べられる集団と使用される免疫学的方法に依存するが、ＡＡＶ８は約２２％から最大約３８％の血清有病率を示し、一方、ＡＡＶ２は約４３．５％から最大約７２％の血清有病率を示す。例えば、Boutin et al. 2010, “Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against AAV types 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors,” Hum. Gene Ther., 21:704-12を参照されたい。さらに、Calcebo et al. 2009, J. Infect. Dis., 199:381-90を参照されたい。
【００４９】
予測されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）祖先核酸配列およびポリペプチド配列
Ａｎｃ８０節の予測される祖先キャプシドポリペプチドをコードするライブラリーからの多数の異なるクローンを配列決定し、代表的なＡＡＶの予測されるキャプシドポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１９（Ａｎｃ８０Ｌ２７）；配列番号２０（Ａｎｃ８０Ｌ５９）；配列番号２１（Ａｎｃ８０Ｌ６０）；配列番号２２（Ａｎｃ８０Ｌ６２）；配列番号２３（Ａｎｃ８０Ｌ６５）；配列番号２４（Ａｎｃ８０Ｌ３３）；配列番号２５（Ａｎｃ８０Ｌ３６）；および配列番号２６（Ａｎｃ８０Ｌ４４）に示す。当業者は、それぞれのアミノ酸配列をコードする核酸配列が容易に決定され得ることを理解する。
【００５０】
配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に示される配列を有する予測される祖先キャプシドポリペプチドに加えて、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６に示される配列を有する予測される祖先キャプシドポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有するポリペプチドが提供される。同様に、祖先キャプシドポリペプチドをコードする核酸分子と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性）を有する（すなわち、少なくとも９５％の配列同一性を有する）核酸分子が提供される。
【００５１】
配列同一性パーセントの計算において、２つの配列が整列され、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一の合致数が決定される。同一の合致数は、整列された領域の長さ（すなわち、整列されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）によって割られ、パーセント配列同一性の値に到達させるために１００を乗じる。整列された領域の長さは、最も短い配列の全長サイズまでの１つまたは両方の配列の一部であり得ることが理解される。また、単一の配列は、１を超える他の配列と整列させることができ、したがって、それぞれの整列された領域に対する、異なる配列同一性パーセントの値を有することができることが理解される。
【００５２】
配列同一性パーセントを決定するための２つ以上の配列のアラインメントは、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴ（基礎局所的アラインメント検索ツール）プログラムに組み込まれた、Altschul et al. （1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402）によって記載されるアルゴリズムを用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴ検索は、Altschul et al.のアルゴリズムを用いて整列された、配列（核酸またはアミノ酸）と任意の他の配列またはその一部の間の配列同一性パーセントを決定するために行うことができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を整列させ、核酸配列間の同一性を比較するために使用されるプログラムであり、一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を整列させ、アミノ酸配列間の同一性を比較するために使用されるプログラムである。配列と別の配列の間の同一性パーセントを計算するためのＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを一般的に使用する。
【００５３】
代表的なアラインメントを図４Ａと４Ｂおよび図５Ａと５Ｂに示す。図４Ａと４Ｂは、祖先ＡＡＶ  ＶＰ１キャプシドポリペプチドのアラインメントを示し、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２４）、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（配列番号２６）、Ａｎｃ８０Ｌ５９（配列番号２０）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）およびＡｎｃ８０Ｌ６２（配列番号２２）と指定される。図４Ａと４Ｂに示されるアラインメントは、１１部位のそれぞれで予測されたバリエーションと、クローニングのアーティファクトであり得る、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）の６０９Ｅ位での１つの非同義突然変異を確認する。図５Ａと５Ｂは、祖先ＡＡＶ  ＶＰ１キャプシドポリペプチド（Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３）、Ａｎｃ８０Ｌ２７（配列番号１９）、Ａｎｃ８０Ｌ３３（配列番号２４）、Ａｎｃ８０Ｌ３６（配列番号２５）、Ａｎｃ８０Ｌ６０（配列番号２１）、Ａｎｃ８０Ｌ６２（配列番号２２）、Ａｎｃ８０Ｌ４４（Ｓ配列番号２６）およびＡｎｃ８０Ｌ５９（配列番号２０））と同時代のＡＡＶ  ＶＰ１キャプシドポリペプチド（ＡＡＶ８（配列番号２７）、ＡＡＶ９（配列番号２８）、ＡＡＶ６（配列番号２９）、ＡＡＶ１（配列番号３０）、ＡＡＶ２（配列番号３１）、ＡＡＶ３（配列番号３２）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号３３）およびＡＡＶ７（配列番号３４））の間のアラインメントを示す。図５Ａと５Ｂにおけるアラインメントは、祖先ＡＡＶ配列が、同時代のＡＡＶ配列と約８５％〜９１％の配列同一性を有することを示す。
【００５４】
また、ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクターが提供される。発現ベクターを含むベクターは市販され、または組換え技術によって生成することができる。核酸分子を含有するベクターは、このような核酸分子に作動可能に連結した、発現のための１つまたは複数のエレメントを有することができ、さらに、選択可能なマーカーをコードする核酸分子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、および／またはポリペプチド（例えば、６ｘＨｉｓタグ）の精製に使用され得る核酸分子を含むことができる。発現のためのエレメントには、核酸コード配列に指向し、その発現を制御する核酸配列を含む。発現エレメントの一例はプロモーター配列である。また、発現エレメントは、１つまたは複数のイントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または核酸分子の発現を調節する誘導可能なエレメントを含むことができる。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物またはウイルス起源であってもよく、ベクターは、異なる起源からの発現エレメントの組合せを含有することができる。本明細書で使用するとき、作動可能に連結したとは、発現のためのエレメントが、コード配列に指向し、またはその発現を調節するような方法で、コード配列に対してベクターに配置されることを意味する。
【００５５】
核酸分子、例えば、ベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター）中の核酸分子は、宿主細胞に導入され得る。「宿主細胞」なる用語は、核酸分子が導入された特定の細胞（単数または複数）を意味するだけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代もまた意味する。多数の適切な宿主細胞は当業者に公知である；宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）であり得る。代表的な宿主細胞としては、限定されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するＡ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、ならびに初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞が挙げられる。宿主細胞に核酸分子を導入する方法は当技術分野において公知であり、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入（例えば、形質導入）が含まれる。
【００５６】
ポリペプチドに関して、「精製された」とは、自然にそれに付随する細胞構成成分から分離または精製されたポリペプチド（すなわち、ペプチドまたはポリペプチド）を意味する。典型的には、ポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％）である場合に「精製された」と考えられ、ポリペプチドと自然に会合される天然に存在する分子を含まない。化学的に合成されるポリペプチドは、本質的に、自然にそれに付随する構成成分から分離されるため、合成ポリペプチドは「精製された」と考えられるが、さらに、ポリペプチドを合成するために使用される構成成分（例えば、アミノ酸残基）から取り除くことができる。核酸分子に関して、「単離された」とは、通常、ゲノム中で関連付けられる他の核酸分子から分離された核酸分子を意味する。さらに、単離された核酸分子は、組換えまたは合成の核酸分子などの遺伝子操作された核酸分子を含むことができる。
【００５７】
ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲルろ過および／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法により天然供給源（例えば、生物学的試料）から取得（例えば、精製）され得る。精製されたポリペプチドはまた、例えば、発現ベクターに核酸分子を発現させることによって、または化学合成によって得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて測定することができる。同様に、核酸分子は、通常行われる方法、例えば、限定されないが、組換え核酸技術（例えば、制限酵素消化およびライゲーション）またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995参照）を用いて取得（例えば、単離）され得る。さらに、単離された核酸分子は、化学的に合成することができる。
【００５８】
祖先ウイルスまたはその一部を使用する方法
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部、特に、同時代のウイルスまたはその一部と比較して低減した血清有病率を示すものは、多数の研究および／または治療用途において使用することができる。例えば、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、ヒトまたは動物の医療において、遺伝子治療（例えば、遺伝子移入のためのベクターもしくはベクターシステムにおいて）またはワクチン接種（例えば、抗原提示用）のために使用することができる。より具体的には、本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、遺伝子付加、遺伝子増加、ポリペプチド製剤の遺伝子送達、遺伝子ワクチン接種、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子治療、ＲＮＡｉ送達、ｃＤＮＡ送達、ｍＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡ送達、ｍｉＲＮＡスポンジング、遺伝子免疫、光遺伝学的遺伝子治療、遺伝子組換え、ＤＮＡワクチン接種またはＤＮＡ免疫のために使用することができる。
【００５９】
宿主細胞は、インビトロで（例えば、培養下で増殖中に）またはインビボで（例えば、対象において）祖先ウイルスまたはその一部により形質導入あるいは感染され得る。インビトロで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染され得る宿主細胞は本明細書に記載される；インビボで祖先ウイルスまたはその一部により形質導入または感染され得る宿主細胞としては、限定されないが、脳、肝臓、筋肉、肺、眼（例えば、網膜、網膜色素上皮）、腎臓、心臓、生殖腺（例えば、精巣、子宮、卵巣）、皮膚、鼻腔、消化器系、膵臓、膵島細胞、神経細胞、リンパ球、耳（例えば、内耳）、毛包および／または腺（例えば、甲状腺）が挙げられる。
【００６０】
本明細書に記載される祖先ウイルスまたはその一部は、（他のウイルス配列とシスまたはトランスである）導入遺伝子を含むように修飾することができる。導入遺伝子は、例えば、レポーター遺伝子（例えば、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光ポリペプチド（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼ、または赤血球凝集素もしくはＭｙｃなどの抗原タグドメインを含む融合ポリペプチド）または治療遺伝子（例えば、ホルモンもしくはそれらの受容体、増殖因子またはその受容体、分化因子またはその受容体、免疫系調節因子（例えば、サイトカインおよびインターロイキン）またはその受容体、酵素、ＲＮＡ（例えば、阻害性ＲＮＡもしくは触媒ＲＮＡ）または標的抗原（例えば、発癌性抗原、自己免疫抗原）をコードする遺伝子）であり得る。
【００６１】
特定の導入遺伝子は、少なくとも部分的に、治療される特定の疾患または欠損症に依存する。単に一例として、遺伝子移入または遺伝子治療は、血友病、網膜色素変性症、嚢胞性線維症、レーバー先天性黒内障、リソソーム貯蔵障害、先天性代謝異常（例えば、フェニルケトン尿症などのアミノ酸代謝の先天性異常、プロピオン酸血症などの有機酸代謝の先天性異常、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症（ＭＣＡＤ）などの脂肪酸代謝の先天異常）、癌、色覚異常、コーンロッドジストロフィー、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性症）、リポポリペプチドリパーゼ欠損症、家族性高コレステロール血症、脊髄性筋萎縮症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満症、炎症性腸疾患、糖尿病、うっ血性心不全、高コレステロール血症、難聴、冠状動脈性心臓病、家族性腎アミロイドーシス、マルファン症候群、致死性家族性不眠症、クロイツフェルトヤコブ病、鎌状赤血球病、ハンチントン病、前頭側頭葉変性症、アッシャー症候群、乳糖不耐症、脂質蓄積障害（例えば、ニーマンピック病、Ｃ型）、バッテン病、先天性脈絡膜欠如、ＩＩ型糖原病（ポンペ病）、毛細血管拡張性運動失調症（ルイバー症候群）、先天性甲状腺機能低下症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）および／または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療に適用することができる。
【００６２】
また、導入遺伝子は、対象（例えば、ヒト、動物（例えば、コンパニオンアニマル、家畜、絶滅寸前の動物）の免疫に有用である免疫原であり得る。例えば、免疫原は、生物（例えば、病原生物）またはその免疫原性部分もしくはその構成成分（例えば、毒素ポリペプチドまたはその副生成物）から得ることができる。一例として、免疫原性ポリペプチドを得ることができる病原生物としては、ウイルス（例えば、ピコルナウイルス、エンテロウイルス、オルトミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス）、原核生物（例えば、肺炎球菌（Pneumococci）、ブドウ球菌（Staphylococci）、リステリア菌（Listeria）、シュードモナス属（Pseudomonas））および真核生物（例えば、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア症、線虫）が挙げられる。本明細書に記載される方法およびこのような方法によって製造される組成物は、任意の特定の導入遺伝子によって限定されるものではないことが理解される。
【００６３】
通常、生理学的に適合した担体中に懸濁される祖先ウイルスまたはその一部を対象（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に投与することができる。適切な担体としては、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いて製剤化されてもよい生理食塩水、ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチンおよび水が含まれる。祖先ウイルスまたはその一部は、細胞に形質導入または感染させ、過度の副作用なしに治療上の利益を提供するために、遺伝子移入および発現の十分なレベルを与えるのに十分な量で投与される。従来のおよび医薬として許容される投与経路としては、限定されないが、例えば、肝臓もしくは肺などの臓器への直接送達、経口、鼻腔内、気管内、吸入による、静脈内、筋肉内、眼内、皮下、皮内、経粘膜、または他の投与経路によるものが挙げられる。所望により、投与経路を組み合わせることができる。
【００６４】
対象に投与される祖先ウイルスまたはその一部の用量は、主に、治療される状態、ならびに対象の年齢、体重および健康などの因子に依存する。例えば、ヒト対象に投与される祖先ウイルスまたはその一部の治療的有効量は、一般的に、祖先ウイルスの約１×１０１〜１×１０１２のゲノムコピー（ＧＣ）（例えば、約１×１０３〜１×１０９ＧＣ）の濃度を含有する約０．１ｍｌ〜約１０ｍｌの溶液の範囲にある。導入遺伝子の導入および／または発現は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質アッセイによって、投与後の種々の時点でモニターすることができる。いくつかの例において、導入遺伝子の発現レベルは、投薬の頻度および／または量を決定するためにモニターすることができる。また、治療目的のために記載されたものと類似する投薬計画を免疫化のために利用することができる。
【００６５】
また、本明細書に記載される方法は、ウイルスまたはその一部の１つまたは複数の免疫原性ドメインを修飾または除去するように、前方進化をモデリングするために使用することができる。
【００６６】
本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組換えＤＮＡ技術を採用してもよい。このような技術は、文献に十分に説明されている。本発明は、特許請求の範囲に記載される、対象とする方法および組成物の範囲を限定するものではない以下の実施例においてさらに説明される。
実施例
【実施例１】
【００６７】
祖先配列のコンピュータ計算による予測
ＡＡＶキャプシドの７５個の異なるアミノ酸配列のセットは、ＧｅｎＢａｎｋなどの多数の公共データベースから取得され、配列は、ＰＲＡＮＫ−ＭＳＡアルゴリズム、バージョン１２１００２を用いて整列され、オプションは「−Ｆ」である。
【００６８】
ＰｒｏｔＴｅｓｔ３（例えば、Darriba et al., 2011, Bioinformatics, 27(8):1164-5；ワールドワイドウェブ上のdarwin.uvigo.es/software/prottest3で利用可能である）は、様々な条件下（例えば、ＰｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、「＋Ｉ」、「＋Ｆ」、「＋Ｇ」およびそれらの組合せ）でポリペプチド進化の様々なモデル（例えば、ＰｒｏＴｅｓｔ３に含まれるもの、すなわち、ＪＴＴ、ＬＧ、ＷＡＧ、ＶＴ、ＣｐＲｅｖ、ＲｔＲｅｖ、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＤＣＭｕｔ、ＦＬＵ、Ｂｌｏｓｕｍ６２、ＶＴ、ＨＩＶｂ、ＭｔＡｒｔ、ＭｔＭａｍ）を評価するために使用された。＋Ｇおよび＋Ｆ（Yang, 1993, Mol. Biol. Evol., 10:1396-1401; およびCaoet al., 1994, J. Mol. Evol., 39:519-27）を用いたＪＴＴモデル（Jones et al., 1992, Comp. Appl. Biosci., 8:275-82）は、ＰｒｏＴｅｓｔ３において実行されるその赤池情報量規準（ＡＩＣ；Hirotugu, 1974, IEEE Transactions on Automatic Control, 19:716-23）に基づいて選択された。
【００６９】
ＡＡＶ進化の系統発生をＰｈｙＭＬ（Guindon and Gascuel, 2003, Systematic Biology, 52:696-704）を用いて構築した。図３を参照されたい。系統樹は、ＪＴＴ＋Ｆ置換モデルを用いて作成され、４つの離散置換カテゴリと概算ガンマ形状パラメータを有した。得られた系統樹は、最近隣交換（Nearest Neighbor Interchange）（ＮＮＩ）とサブツリー枝刈りおよび再移植（Subtree Pruning and Re-Grafting）（ＳＰＲ）を介して改善され、「ＳＨ様」バリアントを用いて、ブートストラップと近似尤度比テスト（ａＬＲＴ；Anisimova and Gascuel, 2006, Systematic Biology, 55:539-52）を介して有意性について評価された。
【００７０】
次に、上記で構築された系統樹は、系統発生内部の全ての節でＡＡＶキャプシドの祖先状態を概算するために使用された。祖先キャプシド配列は、Ｌａｚａｒｕｓ（ｓｆ．ｎｅｔのＳｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ）に含まれる最大尤度の系統発生学的分析（ＰＡＭＬ）ソフトウェア（Yang, 1997, Comp. Applic. BioSci., 13:555-6；ワールドワイドウェブ上のabacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.htmlで利用可能である）を介した最大尤度原理を用いて再構築された。より具体的には、Ｌａｚａｒｕｓ／ＰＡＭＬ再構築は、４ガンマ分布カテゴリを用いたＪＴＴ＋Ｆ置換モデルによるアミノ酸再構築を生成するように設定された。ＡＡＶ５を外集団として使用した。最後に、「Ｉ」オプションは、ＰＡＭＬ再構築がなされた後、インデルを配置するために追加された（すなわち、フィッチアルゴリズムを用いた最大節約を介して二値コード化され、配置された）。
【００７１】
再構築が最大尤度法で行われたため、任意の残基を所定の節で所定の位置にあった尤度を計算することができる。これを行うために、追加のスクリプトは、特定の閾値下に計算された事後確率を有する配列に沿った全ての位置を同定するために記述された。０．３の閾値が選択され、これは、０．３を超える計算された事後確率を有する任意のアミノ酸がライブラリーの合成に含まれたことを意味する。これらの残基は、ライブラリー中の目的とするバリアントであるように選択された。
【００７２】
配列を確定するために、追加の有用性は、コドンを選択するようにコード化されなければならなかった。スクリプトは、別のＡＡＶ配列（ＡＮＣ８０足場配列と約９２％の配列同一性を有するＡＡＶＲｈ１０）と同様のコドンを導き出し、コドン置換マトリックスに基づく配列の不一致があった場合にコドンを置換するための新規なアルゴリズムを適用するように記述された。新規なアルゴリズムを以下に示す：
前提：アミノ酸配列、Ｐｔ、対応するヌクレオチド配列を有する、Ｎｔ、この場合、ＮｔはＰｔをコードする；およびタンパク質配列、Ｐｉ、この場合、ＰｉはＰｔに強い相同性を示す。
スコアリングのためのＢｌｏｓｕｍ６２表を用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈによりＰｉとＰｔを整列させる。Ｎｔからの対応するコドンを用いて、タンパク質アラインメントに踏み込むことによって、新しいヌクレオチド配列、Ｎｉを生成する。
この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸はＰｉに正確に合致し、
コドン−ＰＡＭマトリックス（Schneider et al., 2005, BMC Bioinform., 6:134）からの「最良スコアリング」コドン、この場合、置換が存在する、
ギャップ、この場合、Ｐｔにおけるアミノ酸に対して整列されたＰｉにギャップが存在する、および
Ｎｔ（所定のアミノ酸をコードする）において最も頻繁に生じるヌクレオチド、この場合、Ｐｔにおけるギャップに対して整列されるＰｉにアミノ酸が存在する。
【００７３】
さらに、２つの単一ヌクレオチド変化は、野生型ＡＡＶにおけるＡＡＶキャプシド遺伝子内のフレームのうちコードされているアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の転写を除去するために行われた。ＡＡＰ（同時代または祖先）のコーディングは、この再構築の一部ではなかったので、ＡＡＰの発現はｃａｐ配列中に同義突然変異を作製することによって除去され、ＡＡＰ配列はウイルス生成中にトランスで提供された。
【実施例２】
【００７４】
祖先ＡＡＶ  ＶＰ１配列の発現
実験は、予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列がウイルスベクターを作製するために使用され得るかどうかを決定するために行われた。
【００７５】
多数の予測された祖先ＡＡＶキャプシド配列をクローニングした。祖先キャプシドのライブラリーは、一過性トランスフェクションにおいてウイルス粒子の形成を可能にするようにｒｅｐ−ｃａｐ発現プラスミドに移された。適切な発現レベルならびにＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のスプライシングを維持するために、ライブラリーｃａｐ遺伝子は、ｒｅｐコード配列におけるｃａｐの５’に位置したＨｉｎｄＩＩＩと、ｃａｐ終止コドンとポリアデニル化シグナルの間で遺伝子操作されたＳｐｅＩとを切断することによってクローニングされた。結果として、より従来の「ＲＥＰ／ＣＡＰ」構築物に祖先キャプシドをクローニングするために、継代プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｅＩで消化し、ゲル精製し、同様に消化されたｒｅｐ／ｃａｐプラスミドにライゲーションした。
【００７６】
発現されたポリペプチドを１０％ＳＤＳゲル上で分離した。図６に示されるように、キャプシドポリペプチドは適切に発現され、多数の祖先ＡＡＶ配列（Ａｎｃ８０Ｌ４４、Ａｎｃ８０Ｌ２７およびＡｎｃ８０Ｌ６５）ならびに同時代のＡＡＶ配列のＡＡＶ２／８からＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にスプライシングされた。
【実施例３】
【００７７】
ウイルス力価
ＡＡＶは、ウイルス粒子アセンブリに必要とされる全てのエレメントをコードするプラスミドの一過性共トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞中で産生された。簡単には、ＨＥＫ２９３細胞を９０％コンフルエントになるまで増殖させ、（ａ）ＡＡＶ２  ＩＴＲによって挟まれたルシフェラーゼ導入遺伝子（ＣＭＶプロモーターによって発現される）をコードするウイルスゲノムプラスミド、（ｂ）ＡＡＶ２  ｒｅｐと本明細書に開示されている合成されたキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶパッケージングプラスミド、（ｃ）キャプシドを発現するＡＡＶ２−ＡＡＰ、および（ｄ）ＡＡＶパッケージングとアセンブルに必要とされるアデノウイルスヘルパー遺伝子を用いてトランスフェクトした。細胞を３７℃にて２日間インキュベートし、細胞および培地を採取し、回収した。
【００７８】
細胞−培地懸濁液を３回連続した凍結融解サイクルによって溶解した。次に、溶解物を遠心分離によって清澄化し、徹底的なＤＮＡ消化を行う条件下で酵素、ここではＢｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を用いて処置し、ウイルス粒子の外側に存在する任意のＤＮＡを消化した。ＡＡＶ調製物は、対照ＤＮＡテンプレート、この場合は、ベクターゲノムと比べて、同一のＴａｑＭａｎ（商標）プライマーとプローブ結合配列を含む線状化プラスミドの線形測定範囲に含まれるように希釈された。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲは、選択したウイルスベクターゲノムにアニーリングするプライマーとプローブを用いて行われた。以下の表２に示すように、ミリリットル（ｍｌ）あたりのゲノムコピー（ＧＣ）におけるＴａｑＭａｎ（商標）測定に基づいて力価を計算した。
【００７９】
【表２】
0006552511.tif 000003
【００８０】
祖先的に再構築されたＡＡＶキャプシド粒子による小規模ベクター生成結果は、ＡＡＶ２に類似したが、ＡＡＶ８に対して低減した収量を実証し、これらの両方は同時代のＡＡＶに基づくベクター調製物である。
【実施例４】
【００８１】
インビトロのウイルス形質導入
インビトロのウイルス形質導入は、細胞を感染させる、予測された祖先ＡＡＶ配列を含有するウイルスの能力を評価するために行われた。
【００８２】
配列のＡｎｃ８０ライブラリーを使用したハイスループットベクター生成後、ＨＥＫ２９３細胞をそれぞれのウイルスベクターで形質導入した。Ａｎｃ８０配列に加えて、それぞれのウイルスベクターはルシフェラーゼ導入遺伝子を含有した。ルシフェラーゼは、形質導入細胞または細胞溶解物にルシフェリン基質を添加後、９６ウェルプレートリーダーで生物発光を定量することによって測定された。定量化後、４つの連結された９６ウェルプレートにおけるルシフェラーゼ発現のヒートマップを作製した（各プレートにおいて対照の列を除く）。ハイスループットベクター生成のプロセスに関連した、大多数の挿入、欠失および遷移に起因して、多数のベクターは非機能的であった。本明細書の目的のために、このアッセイにおいて機能的である（すなわち、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、導入遺伝子を発現することができる）ウイルスだけをさらに評価した。
【００８３】
ＨＥＫ２９３細胞は、２つの同時代のＡＡＶベクター（ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／８）と３つの予測された祖先ＡＡＶベクター（Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５）を用いて、細胞あたり１×１０４ゲノムコピー（ＧＣ）の等しい感染の多重度（ＭＯＩ）で形質導入された。各ベクターは、ルシフェラーゼをコードする導入遺伝子またはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子のいずれかを含有した。細胞は、６０時間後、ＡＭＧ  ＥｖｏｓＦｌ光学顕微鏡のＧＦＰチャネルを用いて撮像された。図７は、インビトロで形質導入後のルシフェラーゼ発現を示す。祖先ＡＡＶウイルスの各々は、ＨＥＫ２９３細胞の効率的な形質導入を実証した。
【実施例５】
【００８４】
インビボでのレチナール形質導入
レチナール形質導入は、祖先ＡＡＶベクターがインビボでマウス網膜細胞を標的とすることができるかどうかを決定するために行われた。
【００８５】
マウスの目は、２×１０８個のゲノムコピー（ＧＣ）の３種の異なる祖先ＡＡＶ（Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５）と同時代のＡＡＶ（ＡＡＶ２／８）で形質導入され、それらの全てはｅＧＦＰをコードする導入遺伝子を含んでいた。形質導入のために、各ＡＡＶベクターは、注射装置を用いたベクターボーラスの送達を介して、光受容体と網膜色素上皮層の間に空間を生成することにより網膜下に外科的に送達された。ベクターボーラスが網膜下空間に残存し、サブ網膜下の剥離が経時的に解決された。ＧＦＰ発現は、Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ（商標）を用いた瞳孔拡張後、動物の網膜の眼底撮影により非侵襲的にモニターされた。示された網膜の全ては、網膜への祖先ＡＡＶの、様々な程度の成功した標的化を実証した。
【００８６】
また、網膜組織学を行い、形質導入された細胞型を同定するために蛍光顕微鏡下で可視化した。組織学は、上述したＡｎｃ８０Ｌ６５祖先ＡＡＶベクターで形質導入されたマウス網膜上で行われた。Ａｎｃ８０Ｌ６５を媒介したｅＧＦＰ発現は、外核層（ＯＮＬ）、内部セグメント（ＩＳ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）において明らかであり、祖先Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターがマウス光受容体と網膜色素上皮細胞を標的とすることを示した。
【実施例６】
【００８７】
中和抗体アッセイ
中和抗体アッセイは、祖先ＡＡＶウイルスが、同時代のＡＡＶウイルスよりも抗体中和に対してより抵抗性であるか否かを評価するために行われた。中和抗体アッセイは、抗体の不存在下における対照と比較して、５０％以上の感染を中和する抗体濃度（または実験試料が抗体濃度を含有する力価）を測定する。
【００８８】
血清試料またはＩＶＩＧ原液（２００ｍｇ／ｍｌ）を連続して２倍希釈し、希釈していない試料および希釈した試料は、１０４のＭＯＩで約３０分間３７℃にて、祖先ＡＡＶウイルス、Ａｎｃ８０Ｌ６５、および同時代のＡＡＶウイルス、ＡＡＶ２／８と同時にインキュベートされた。各ウイルスはルシフェラーゼ導入遺伝子を含んだ。次に、混合ベクターおよび抗体試料をＨＥＫ２９３細胞に形質導入した。これらの実験について、使用された抗体試料は、静注用イムノグロブリン（ＩＶＩＧ）、１０００を超える血液ドナーの血漿から抽出され、プールされたＩｇＧ（例えば、Ｇａｍｍａｇａｒｄ（商標）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）またはＧａｍｎｅｘ（商標）（Ｇｒｉｆｏｌｓ；Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）として市販されている）であった。形質導入の開始から４８時間後、細胞は、ルシフェラーゼを検出するために生物発光によりアッセイされた。中和抗体力価は、５０％以上の中和（試料の形質導入／試料の不存在下での対照ウイルスの形質導入）が到達した試料の希釈を同定することによって決定された。
【実施例７】
【００８９】
Ａｎｃ８０の特徴付け
本明細書に記載される方法に基づいて、最も可能の高いＡｎｃ８０配列（事後確率によって決定される）が得られ、Ａｎｃ８０Ｌ１（配列番号３５はＡｎｃ８０Ｌ１キャプシドの核酸配列を示し、配列番号３６はＡｎｃ８０Ｌ１  ＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を示す）と指定された。Ａｎｃ８０確率ライブラリーは、営利企業によって、本明細書に記載される配列を用いて合成され、発現ベクターにサブクローニングされた。
【００９０】
Ａｎｃ８０ライブラリーは、組合せアッセイにおいてベクター収率および感染力についてクローン的に評価された。このスクリーニングのうち、Ａｎｃ８０Ｌ６５（配列番号２３）、およびいくつかの他の変異体をさらに特徴付けた。
【００９１】
Ａｎｃ８０ライブラリーとＡｎｃ８０Ｌ６５を配列の相違の観点から比較した（図８；対角線から上は％、下はアミノ酸の相違数）。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、Ａｎｃ８０Ｌ６５に最も近い公的に利用可能な配列はｒｈ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＯ８８２０１．１）である。
【００９２】
図９は、Ａｎｃ８０Ｌ６５はＡＡＶ２に相当するベクター収率を生成したこと（パネルＡ）、透過型顕微鏡検査（ＴＥＭ）下でウイルス粒子を生成したこと（パネルＢ）、変性条件下でのＳＤＳ  ｐａｇｅに基づくＡＡＶ  ｃａｐとＶＰ１、２および３タンパク質を生化学的に生成したこと（パネルＣ）、およびＡＡＶキャプシド抗体、Ｂ１を用いたウェスタンブロット（パネルＤ）を示す。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載される。
【００９３】
簡単には、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ｅＧＦＰで構成されるレポーター構築物を含有する小規模において生成され、ＣＭＶプロモーター下のホタルルシフェラーゼは小規模において生成された。次に、ウイルスのこれらの小規模製剤の力価は、定量ＰＣＲを介して得られた。これらの実験に基づいて、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ４４およびＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターは、ＡＡＶ２に匹敵するウイルスレベルを生成することが見出された（図９Ａ）。
【００９４】
Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシドタンパク質が、適切な大きさおよび立体構造の完全なウイルス様粒子にアセンブルされていることを確認するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて顕微鏡写真を得た。Ａｎｃ８０−Ｌ０６５の大規模の精製された調製物は、ポリビニルホルマール（Ｆｏｒｍｖａｒ（登録商標））被覆した銅グリッドに装填し、次に、酢酸ウラニルで染色した。顕微鏡写真は、２０〜２５ｎｍの直径を有する無傷な六角形の粒子を示した（図９Ｂ）。
【００９５】
合成祖先キャプシド遺伝子が正常に処理（すなわち、スプライスおよび発現）されたかどうかを決定するために、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターの大規模で精製された調製物を変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填した（１Ｅ１０  ＧＣ／ウェル）。ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を表すバンドは、明らかに、各ベクター調製物に存在した（図９Ｃ）。ＡＡＶキャプシド抗体Ｂ１を用いたウェスタンブロットにより、さらに、これらのバンドが予測されたタンパク質を表すことを確認した（図９Ｄ）。
【００９６】
さらに、図１０は、Ａｎｃ８０Ｌ６５が、読み出し（パネルＡ）またはルシフェラーゼ（パネルＢ）対ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ８対照として、ＧＦＰを用いて、ＭＯＩ  １０Ｅ４  ＧＣ／細胞でＨＥＫ２９３細胞においてインビトロで哺乳動物組織および細胞を感染させたことを示す。また、Ａｎｃ８０Ｌ６５は、核のＬａｃＺ導入遺伝子をコードする指示されたＡＡＶのＩＶ注射後（上段の行、パネルＣ）、ＧＦＰをコードする指示されたＡＡＶの直接的な筋肉内（ＩＭ）注射後（中段の行、パネルＣ）、およびＧＦＰをコードする指示されたＡＡＶによる網膜下注射後（下段の行、パネルＣ）に肝臓の標的に効果的であった。これらの実験は、以下の段落でより詳細に記載される。
【００９７】
祖先ビリオンの感染度の相対的尺度を得るために、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰ配列とホタルルシフェラーゼ配列を含む二シストロン性の受容体構築物を含有するＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ４４、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ２７、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２２、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２３、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２４およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ１２５を生成した。次に、ＨＥＫ２９３細胞でコンフルエントした９６ウェルプレートは、１Ｅ４  ＧＣ／細胞のＭＯＩ（上記したｑＰＣＲにより取得された力価）で各ベクターによる形質導入に供された。４８時間後、蛍光顕微鏡検査により、形質導入された細胞中のＧＲＰの存在を確認した（図１０Ａ）。次に、細胞をルシフェラーゼの存在についてアッセイし（図１０Ｂ）、これは、Ａｎｃ８０由来のベクターで形質導入された細胞におけるルシフェラーゼの発現が、ＡＡＶ８（低レベルの形質導入）とＡＡＶ２（高レベルの形質導入）の間にあることを決定した。
【００９８】
インビボという事情において遺伝子移入の相対的効率を評価するために、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５の精製された高力価の調製物を得た。３．９Ｅ１０  ＧＣの各ベクターは、ＴＢＧプロモーターの制御下で核のＬａｃＺをコードする導入遺伝子を封入し、一般的な麻酔後にＩＰ注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（条件あたり３匹）に注射された。注射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を回収した。肝臓は、標準的な組織学的技術により切片にされ、β−ガラクトシダーゼについて染色された。次に、切片を顕微鏡で画像化し、代表的な画像を図１０Ｃの上段の行に示す。
【００９９】
続いて、ｐＣＡＳＩプロモーターの制御下でｅＧＦＰおよびｈＡ１ＡＴをコードする二シストロン性の導入遺伝子を含有する同じ血清型のベクターを得た。マウス骨格筋を形質導入するＡｎｃ８０Ｌ６５の能力を評価するために、１Ｅ１０ＧＣの各ベクターは、一般的な麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（条件あたり５匹のマウス）の骨格筋に注射された。注射から２８日後、マウスを屠殺し、組織を凍結切片し、ｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微鏡を用いて評価した（青色はＤＡＰＩであり、緑色のｅＧＦＰである）。代表的な画像を図１０Ｃの中段の行に示す。これらの実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが筋肉内注射によりマウスの骨格筋を形質導入することができたことを実証した。
【０１００】
今回、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰ導入遺伝子のみをコードする構築物をキャプシド形成する、同じ血清型のベクターを取得した。２Ｅ９粒子は、一般的な麻酔後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに網膜下注射された。注射から２８日後、マウスを屠殺し、眼を回収し、凍結切片し、およびｅＧＦＰの存在を蛍光共焦点顕微鏡を用いて評価した（青色はＤＡＰＩであり、緑色はｅＧＦＰである）。代表的な画像を図１０Ｃの下段の行に示す。これらの実験は、Ａｎｃ８０Ｌ６５ベクターが、ＡＡＶ８ベクターに匹敵するレベルでマウス網膜に形質導入することができることを実証する。
【０１０１】
簡単には、ＣＭＶプロモーターの制御下でｅＧＦＰとホタルルシフェラーゼを含むバイシストロニック導入遺伝子をキャプシド形成するＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／ｒｈ３２．３３およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５ウイルスベクターの精製された高力価調製物を得た。次に、これらのベクターは、ＩＶＩＧの２倍連続希釈物（１０ｍｇ、５ｍｇ、２．５ｍｇなど）とともにインキュベートされ、またはＩＶＩＧなし（条件あたり１Ｅ９  ＧＣ）でインキュベートされた。インキュベーション後、ベクターを用いて、ウェルあたり１Ｅ４のＭＯＩ（ウェルあたり１希釈）でＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。
【実施例８】
【０１０２】
追加の祖先ＡＡＶキャプシドの産生
次に、最も可能性の高い祖先ＡＡＶキャプシド配列（事後確率により決定される）は、民間の研究所（Ｇｅｎ９）を介して合成され、線形ｄｓＤＮＡとして提供された。続いて、これらのアミノ酸配列は、それらが異なる程度を確認するために、現存のＡＡＶの配列と比較された（図１１）。各々の祖先ＶＰ１タンパク質は、３．６％〜９．３％で選択された代表的な現存のＡＡＶのものと相違し（図１１Ａ）、一方、祖先ＶＰ３タンパク質は４．２〜９．４％で相違する（図１１Ｂ）。これらのキャプシドは、それぞれ、制限酵素消化（ＨｉｎｄＩＩＩ＆ＳｐｅＩ）およびＴ４ライゲーションを介してＡＡＶ産生プラスミド（ｐＡＡベクター２／空）にサブクローニングされた。これらのクローンを制限消化およびサンガー配列決定により確認し、その後、プラスミドＤＮＡの中規模調製物を生成した。
【０１０３】
次に、これらのプラスミドの各々を、ｅＧＦＰとホタルルシフェラーゼの両方をコードするレポーター遺伝子を含有するＡＡＶベクターを生成させるために使用した。前述のように、これらのベクターを小規模で三連で生成した。その後、ウイルスの粗調製物を定量ＰＣＲを介して力価測定し、ＡＡＶ８と比較して２．７１％〜１８３．１％のウイルス粒子を生成することを見出した（図１２および１３）。続いて、これらの力価を用いて、相対感染力を評価するために力価制御実験を設定した。Ａｎｃ１２６は、その産生が有意に低下したため、力価制御されなかった。その結果、Ａｎｃ１２６の感染力に関するデータは、この実験における他のウイルスの感染力と正確に比較することができない。他のベクターを用いて、１．９Ｅ３  ＧＣ／細胞の感染の多重度（ＭＯＩ）でＨＥＫ２９３細胞を形質導入した。
【０１０４】
形質導入から６０時間後、細胞は、蛍光顕微鏡検査によりＧＦＰ発現について評価された。ｅＧＦＰ陽性細胞は、陰性対照を除き、各条件下で検出された（図１４）。これは、予測され、合成されおよびクローン化された祖先配列の各々が、生存可能な感染性ウイルス粒子を生成することができることを示す。感染力の相対的レベルという概念を得るために、ルシフェラーゼアッセイがまた、同じ細胞について行われた。結果は、祖先ベクターの各々が、ＡＡＶ８と比較して２８．３％〜８５０．８％でＨＥＫ２９３細胞に形質導入することが可能であることを示す（図１５および図１６）。力価制御されなかったため、Ａｎｃ１２６は相対的な形質導入の分析から除外されたことに留意されたい。
【０１０５】
まとめると、８つの新規な祖先ＡＡＶキャプシド遺伝子が、合成され、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２および前述のＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターと一緒に機能的ウイルスベクターの生成に用いられた。生成および感染力をインビトロで評価し、それらの知見の概要を図１７に示す。
【実施例９】
【０１０６】
ベクター免疫予防
ベクター免疫予防において、遺伝子治療用ビヒクル（ＡＡＶなど）は、感染性物質に対する広範に中和する抗体をコードする導入遺伝子を送達するために使用される。例えば、Balazs et al. （2013, Nat. Biotechnol., 31:647-52）； Limberis et al.（2013, Sci. Transl. Med., 5:187ra72）； Balazs et al.（2012, Nature, 481:81-4）； およびDeal et al.（2014, PNAS USA, 111:12528-32）を参照されたい。この治療の１つの利点は、宿主がそれら自体の細胞に抗体を産生することであり、これは、単一の投与が病因物質に対する保護の寿命を付与する可能性を有することを意味する。
【実施例１０】
【０１０７】
ドラッグデリバリービヒクル
ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）およびＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）は共に、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に対して同じヒト化マウスモノクローナル抗体に基づく抗血管形成剤である。ベバシズマブは全長抗体であり、ラニビズマブは断片（Ｆａｂ）であるが、それらは共に、ＶＥＧＦを拮抗することによって、同じメカニズムを介して滲出型加齢黄斑変性症を治療するように作用する。例えば、Mao et al.（2011, Hum. Gene Ther., 22:1525-35）； Xie et al.（2014, Gynecol. Oncol., doi: 10.1016/j.ygyno.2014.07.105）； およびWatanabe et al.（2010, Gene Ther., 17:1042-51）を参照されたい。これらの両分子はタンパク質であるため、それらはＤＮＡにコードされ、導入遺伝子を含有するベクターを用いて形質導入された細胞において産生され、ＡＡＶベクターにパッケージングされるのに十分小さい。
【０１０８】
他の態様
対象の方法および組成物は、多数の異なる態様と併せて本明細書に記載されるが、様々な態様の前述の記載は、説明することを意図しており、対象の方法および組成物の範囲を限定しないことを理解するべきである。他の態様、利点および修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１０９】
開示された方法および組成物に使用できるか、それと組み合わせて使用できるか、その調製に使用できるか、またはその生成物である方法および組成物が開示される。これらの物質および他の物質は、本明細書に開示され、これらの方法および組成物の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示されていると理解される。すなわち、様々な個々のおよび集合的な組合せならびにこれらの組成物の並べ替えについての具体的な言及は明示的に記載されていない場合もあるが、それぞれは本明細書において具体的に意図され、記載される。例えば、対象の特定の組成物または特定の方法が開示され、検討され、多数の組成物または方法が検討される場合、組成物および方法のそれぞれおよび全ての組合せおよび並び替えは、具体的な記載に反しない限り、具体的に意図される。同様に、これらのあらゆるサブセットまたは組合せもまた、特に意図され、開示される。
【０１１０】
付録Ａ
配列番号１：Ａｎｃ８０ポリペプチド
【０１１１】
【化１】
0006552511.tif 000004
【０１１２】
配列番号２：Ａｎｃ８０  ＤＮＡ
【０１１３】
【化２】
0006552511.tif 000005
【０１１４】
配列番号３：Ａｎｃ８１  ポリペプチド
【０１１５】
【化３】
0006552511.tif 000006
【０１１６】
配列番号４：Ａｎｃ８１  ＤＮＡ
【０１１７】
【化４】
0006552511.tif 000007
【０１１８】
配列番号５：Ａｎｃ８２ポリペプチド
【０１１９】
【化５】
0006552511.tif 000008
【０１２０】
配列番号６：Ａｎｃ８２  ＤＮＡ
【０１２１】
【化６】
0006552511.tif 000009
【０１２２】
配列番号７：Ａｎｃ８３ポリペプチド
【０１２３】
【化７】
0006552511.tif 000010
【０１２４】
配列番号８：Ａｎｃ８３  ＤＮＡ
【０１２５】
【化８】
0006552511.tif 000011
【０１２６】
配列番号９：Ａｎｃ８４ポリペプチド
【０１２７】
【化９】
0006552511.tif 000012
【０１２８】
配列番号１０：Ａｎｃ８４  ＤＮＡ
【０１２９】
【化１０】
0006552511.tif 000013
【０１３０】
配列番号１１：Ａｎｃ９４ポリペプチド
【０１３１】
【化１１】
0006552511.tif 000014
【０１３２】
配列番号１２：Ａｎｃ９４  ＤＮＡ
【０１３３】
【化１２】
0006552511.tif 000015
【０１３４】
配列番号１３：Ａｎｃ１１３ポリペプチド
【０１３５】
【化１３】
0006552511.tif 000016
【０１３６】
配列番号１４：Ａｎｃ１１３  ＤＮＡ
【０１３７】
【化１４】
0006552511.tif 000017
【０１３８】
配列番号１５：Ａｎｃ１２６ポリペプチド
【０１３９】
【化１５】
0006552511.tif 000018
【０１４０】
配列番号１６：Ａｎｃ１２６  ＤＮＡ
【０１４１】
【化１６】
0006552511.tif 000019
【０１４２】
配列番号１７：Ａｎｃ１２７ポリペプチド
【０１４３】
【化１７】
0006552511.tif 000020
【０１４４】
配列番号１８：Ａｎｃ１２７  ＤＮＡ
【０１４５】
【化１８】
0006552511.tif 000021
【０１４６】
配列番号１９：Ｌ００２７ポリペプチド
【０１４７】
【化１９】
0006552511.tif 000022
【０１４８】
配列番号２０：Ｌ００５９ポリペプチド
【０１４９】
【化２０】
0006552511.tif 000023
【０１５０】
配列番号２１：Ｌ００６０ポリペプチド
【０１５１】
【化２１】
0006552511.tif 000024
【０１５２】
配列番号２２：Ｌ００６２ポリペプチド
【０１５３】
【化２２】
0006552511.tif 000025
【０１５４】
配列番号２３：Ｌ００６５ポリペプチド
【０１５５】
【化２３】
0006552511.tif 000026
【０１５６】
配列番号２４：Ｌ００３３ポリペプチド
【０１５７】
【化２４】
0006552511.tif 000027
【０１５８】
配列番号２５：Ｌ００３６ポリペプチド
【０１５９】
【化２５】
0006552511.tif 000028
【０１６０】
配列番号２６：Ｌ００４４ポリペプチド
【０１６１】
【化２６】
0006552511.tif 000029
【０１６２】
配列番号２７：ＡＡＶ８  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６３】
配列番号２８：ＡＡＶ９  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６４】
配列番号２９：ＡＡＶ６  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６５】
配列番号３０：ＡＡＶ１  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６６】
配列番号３１：ＡＡＶ２  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６７】
配列番号３２：ＡＡＶ３  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６８】
配列番号３３：ＡＡＶ３Ｂ  ＶＰ１ポリペプチド
【０１６９】
配列番号３４：ＡＡＶ７  ＶＰ１ポリペプチド
【図１】
0006552511.tif 000030
【図２】
0006552511.tif 000031
【図３】
0006552511.tif 000032
【図４】
0006552511.tif 000033
【図５Ａ】
0006552511.tif 000034
【図５Ｂ】
0006552511.tif 000035
【図６】
0006552511.tif 000036
【図７】
0006552511.tif 000037
【図８】
0006552511.tif 000038
【図９】
0006552511.tif 000039
【図１０】
0006552511.tif 000040
【図１１Ａ】
0006552511.tif 000041
【図１１Ｂ】
0006552511.tif 000042
【図１２】
0006552511.tif 000043
【図１３】
0006552511.tif 000044
【図１４】
0006552511.tif 000045
【図１５】
0006552511.tif 000046
【図１６】
0006552511.tif 000047
【図１７】
0006552511.tif 000048
【配列表】
0006552511000001.app