(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、
該検出光学系の光軸に交差する平面に沿う複数方向から平面状の励起光を前記標本に入射可能なシート照明部と、
前記平面内における前記標本の観察領域に応じて、前記標本の内部における前記励起光の減衰量が最少になる１以上の入射方向から前記励起光が入射されるように前記シート照明部の前記入射方向を切り替える制御部とを備える顕微鏡。
【請求項２】
前記検出光学系により取得された前記蛍光画像を処理する画像処理部を備え、
前記制御部が、同一の前記観察領域に対する前記励起光の減衰量が最少となる前記平面内の複数の前記入射方向から前記標本に前記励起光が入射されるように、前記シート照明部を制御し、
前記画像処理部が、前記励起光の減衰量が最少となる前記複数の入射方向からの前記励起光が入射されることによって前記検出光学系により取得される前記同一の観察領域の前記蛍光画像を合成する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記制御部が、前記観察領域と前記標本の内部における励起光の減衰量が最少になる前記入射方向とを対応付けた撮影条件マップを有し、該撮影条件マップに基づいて前記シート照明部を制御する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部が、前記観察領域に応じて、前記励起光の強度、前記蛍光の露光時間および蛍光信号の増幅の少なくとも１つを制御する請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項５】
標本に対する励起光の入射方向を該標本を通過する同一の平面に沿う異なる複数の方向の内のいずれかの方向に切り替える切替ステップと、
該切替ステップにより切り替えられた方向から前記平面に沿って平面状の励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、
該入射ステップによって前記励起光が入射されたときに、前記標本において発生する蛍光を前記平面に交差する検出方向において検出して蛍光画像を取得する検出ステップとを含み、
前記切替ステップが、前記平面内における前記標本の観察領域に応じて、前記複数の方向の中で前記標本の内部における前記励起光の減衰量が最少になる前記方向に切り替える顕微鏡画像取得方法。
【請求項６】
前記検出ステップにより取得された前記蛍光画像を処理する画像処理ステップを含み、
前記切替ステップが、前記標本に対する前記励起光の入射方向を同一の前記観察領域に対する前記励起光の減衰量が最少となる複数の前記方向に切り替え、
前記画像処理ステップが、前記励起光の減衰量が最少となる前記複数の方向からの前記励起光が入射されることによって前記検出ステップにより取得される前記同一の観察領域の前記蛍光画像を合成する請求項５に記載の顕微鏡画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の光軸に対して直交する平面に沿って、標本を挟んで対向する２方向から異なる波長の平面状の励起光を標本に入射させて、励起光ごとに標本において発せられる蛍光に基づいて得られる蛍光画像を合成するシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
落射照明方式あるいは透過照明方式においては、共焦点光学系により１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査させることにより、光軸方向のボケ像の少ない２次元的な画像を取得するが、シート照明方式によれば、シート照明の検出光軸方向の厚さは、検出光学系の焦点深度に等しいか、または焦点深度より小さくなるように照明され、かつ広い範囲にわたってシートの厚さがほぼ一定とみなせるために、焦点深度以下の広い範囲が励起され、他の部分は励起されないために画像の取得に要する時間を短縮することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１２０６２９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、標本内部の光透過率の影響により標本に入射された励起光は標本内で減衰し、その減衰量は入射深度に応じて変化する。ここで、入射深度とは、励起光が標本に入射してから標本の中の観察領域に到達するまでの光路長である。そのため、各入射方向における励起光の入射深度が異なることにより入射方向ごとに励起光の減衰量が大きく相違すると、励起光ごとに標本において発せられる蛍光の強度も相違するため、これらの蛍光に基づいて取得される蛍光画像を合成した場合にムラが発生してしまうという問題がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、シート照明方式により、励起光の量の減衰の影響を抑制してムラがない鮮明な画像を取得することができる顕微鏡および顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、該検出光学系の光軸に交差する平面に沿う複数方向から平面状の励起光を前記標本に入射可能なシート照明部と、前記平面内における前記標本の観察領域に応じて、前記標本の内部における前記励起光の減衰量が最少になる１以上の入射方向から前記励起光が入射されるように前記シート照明部の前記入射方向を切り替える制御部とを備える顕微鏡を提供する。
【０００８】
本発明によれば、シート照明部により検出光学系の光軸に交差する平面に沿って平面状の励起光が標本に入射されるので、その入射平面に検出光学系の光軸方向の焦点面を一致させることにより、焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を検出光学系によって１度に検出することができる。また、シート照明部において、標本に入射させる励起光の入射方向をその入射平面に沿う他の方向に切り替えることで、励起光の入射平面内における標本の観察領域に応じて励起光の入射深度を変更することができる。
【０００９】
この場合において、励起光の入射平面内における標本の観察領域に応じて、制御部によりシート照明部が制御されて、励起光の入射方向が複数方向の中で標本の内部における励起光の減衰量が最少になる方向に切り替えられることで、励起光の入射平面内における標本の観察領域に関わらず、十分な光量の励起光を照射させて十分な強度の蛍光を発生させることができる。したがって、シート照明方式により、励起光の量の減衰の影響を抑制してムラがない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記検出光学系により取得された前記蛍光画像を処理する画像処理部を備え、前記制御部が、同一の前記観察領域に対する前記励起光の減衰量が最少となる前記平面内の複数の前記入射方向から前記標本に前記励起光が入射されるように、前記シート照明部を制御し、前記画像処理部が、前記励起光の減衰量が最少となる前記複数の入射方向からの前記励起光が入射されることによって前記検出光学系により取得される前記同一の観察領域の前記蛍光画像を合成することとしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、標本の同一の観察領域に対して複数の入射方向から励起光を入射させることにより、１つの入射方向からだけでは減衰によって十分な量の励起光を照射できない場合であっても、同一の観察領域において入射方向の数だけ蛍光を発生させることができる。
【００１２】
この場合において、標本の内部における励起光の減衰量が最少かつ略同一となる複数の入射方向からの励起光により得られる同一の観察領域の蛍光画像を合成することで、ムラがなく十分に明るい蛍光画像を生成することができる。
【００１３】
上記発明においては、前記制御部が、前記観察領域と前記標本の内部における励起光の減衰量が最少になる前記入射方向とを対応付けた撮影条件マップを有し、該撮影条件マップに基づいて前記シート照明部を制御することとしてもよい。
このように構成することで、標本の観察領域に応じて、撮影条件マップに基づき迅速かつ適切な入射方向から励起光を入射させることができる。
【００１４】
上記発明においては、前記制御部が、前記観察領域に応じて、前記励起光の強度、前記蛍光の露光時間および蛍光信号の増幅の少なくとも１つを制御することとしてもよい。
このように構成することで、観察領域ごとに、蛍光画像の明るさを所望の明るさに調整することができる。
【００１５】
本発明は、標本に対する励起光の入射方向を該標本を通過する同一の平面に沿う異なる複数の方向の内のいずれかの方向に切り替える切替ステップと、該切替ステップにより切り替えられた方向から前記平面に沿って平面状の励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、該入射ステップによって前記励起光が入射されたときに、前記標本において発生する蛍光を前記平面に交差する検出方向において検出して蛍光画像を取得する検出ステップとを含み、前記切替ステップが、前記平面内における前記標本の観察領域に応じて、前記複数の方向の中で前記標本の内部における前記励起光の減衰量が最少になる前記方向に切り替える顕微鏡画像取得方法を提供する。
【００１６】
本発明によれば、切替ステップにより切り替えられた方向から、入射ステップにより平面状の励起光が標本を通過する平面に沿って標本に入射され、その入射平面において発生した蛍光が、検出ステップにより励起光の入射平面に交差する検出方向に検出されて蛍光画像が取得される。
【００１７】
この場合において、標本に励起光を入射させる方向が、切替ステップにより、励起光の入射平面内における標本の観察領域に応じて、標本の内部での励起光の減衰量が最少になる方向に切り替えられることで、励起光の入射平面内における標本の観察領域に関わらず、十分な光量の励起光を照射させて十分な強度の蛍光を発生させることができる。したがって、シート照明方式により、励起光の量の減衰の影響を抑制してムラがない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１８】
上記発明においては、前記検出ステップにより取得された前記蛍光画像を処理する画像処理ステップを含み、前記切替ステップが、前記標本に対する前記励起光の入射方向を同一の前記観察領域に対する前記励起光の減衰量が最少となる複数の前記方向に切り替え、前記画像処理ステップが、前記励起光の減衰量が最少となる前記複数の方向からの前記励起光が入射されることによって前記検出ステップにより取得される前記同一の観察領域の前記蛍光画像を合成することとしてもよい。
【００１９】
このように構成することで、標本の同一の観察領域に対して複数の方向から励起光が入射されることにより、１つの方向からだけでは減衰によって十分な量の励起光を照射できない場合であっても、同一の観察領域において方向の数だけ蛍光を発生させることができる。この場合において、画像処理ステップにより、標本の内部における励起光の減衰量が最少かつ略同一となる複数の方向からの励起光により得られる同一の観察領域の蛍光画像を合成することで、ムラがなく十分に明るい蛍光画像を生成することができる。
【００２０】
また、本発明の参考例としての発明は、標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、該検出光学系の光軸に交差する平面に沿う少なくとも一方向から平面状の励起光を前記標本に入射可能なシート照明部と、前記平面内における前記標本の観察領域に応じて、前記標本の内部における前記励起光の強度、蛍光検出の露光時間、蛍光信号の増幅の制御をする制御部とを備える顕微鏡を提供する。
【００２１】
このような構成にすることで、複数のシート照明部を備えることが無くとも、励起光の照明強度や検出の露光時間を変化させることにより、励起光の量の減衰の影響を抑制してムラがない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、シート照明方式により、励起光の量の減衰の影響を受けずにムラがない鮮明な画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡を示す概略構成図である。
【図２】（ａ）は図１の顕微鏡の照明装置からの励起光を標本に対して一方向から入射させる場合をそれぞれ示す側面図であり、（ｂ）は図１の顕微鏡の照明装置からの励起光を標本に対して他方向から入射させる場合を示す側面図である。
【図３】図１の制御装置が有する撮影条件マップの一例を示す図である。
【図４】（ａ）は標本の観察領域Ａを観察する場合の励起光の入射方向の一例を示す図であり、（ｂ）は標本の観察領域Ｃを観察する場合の励起光の入射方向の一例を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る顕微鏡画像取得方法を説明するフローチャートである。
【図６】本発明の参考例としての発明の実施形態に係る顕微鏡の照明装置を示す概略構成図である。
【図７】図６の制御装置が有する撮影条件マップの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体３と、顕微鏡本体３に接続される照明装置（シート照明部）５と、照明装置５および顕微鏡本体３を制御する制御装置７とを備えている。制御装置７には、ユーザに指示を入力させるマウスやキーボード等の入力装置９と、顕微鏡本体３により取得された画像等を表示するモニタ１１とが接続されている。
【００２５】
顕微鏡本体３は、標本Ｓを載置するステージ１３と、ステージ１３に載置された標本Ｓにおいて発せられる蛍光を検出する検出光学系１５とを備えている。
検出光学系１５は、ステージ１３の載置面に対して垂直な方向において標本Ｓに対向して配置される対物レンズ１７と、対物レンズ１７により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ１９と、結像レンズ１９により結像された蛍光を撮影する撮像素子２１とを備えている。図中、符号２３は、蛍光に含まれる励起光を除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。
【００２６】
照明装置５は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、略平行光からなる励起光を射出する励起光源２５と、励起光源２５から射出された励起光を２つの光路に分岐するハーフミラー２７と、分岐された２つの光路を経由した励起光を標本Ｓを挟んで対向する２方向から略平面状の励起光として標本Ｓを通過する平面に沿って入射させる２つのシリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂとを備えている。
【００２７】
シリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂは、光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有するシート状に集光させるようになっている。各シリンドリカルレンズ２９Ａ，２９Ｂにより集光される励起光の２つの光軸Ｐは、検出光学系１５の光軸Ｑに直交する方向に沿って同一平面上に延びるように配置されている。図中、符号３１は光路を形成するミラーであり、符号３３は２つの光路に設けられ、択一的に開閉されるシャッタである。
【００２８】
制御装置７は、図１に示すように、照明装置５を制御する照明制御部（制御部）３５と、顕微鏡本体３を制御する顕微鏡制御部（制御部）３７と、撮像素子２１により取得された画像信号（蛍光信号）を処理する画像処理部３９とを備えている。
【００２９】
この制御装置７は、コンピュータにより構成され、画像処理部３９、顕微鏡制御部３７および照明制御部３５の動作、例えば、画像の生成、入力装置９からの指示入力の処理、各種電動部（例えば、ステージ１３、レンズ切替器またはズーム機構、フィルタホイール１９、シャッタ３３など。）やモニタ１１の表示の制御、各種パラメータの記憶などがこのコンピュータの演算処理装置とメモリにより実行されるようになっている。
【００３０】
メモリには、画像処理プログラム、顕微鏡制御プログラムおよび照明制御プログラム等が記憶されており、演算処理装置は、メモリに記憶されているこれらのプログラムに従って、画像処理部３９、顕微鏡制御部３７および照明制御部３５の動作を実行させるようになっている。また、メモリには、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域と標本Ｓの内部における励起光の減衰量が最少になる入射方向とが対応付けられた図３に示すような撮影条件マップが記憶されている。
【００３１】
照明制御部３５および顕微鏡制御部３７は、コンピュータからの制御信号に基づいて各種電動部を駆動する制御基板を備えている。
照明制御部３５は、シャッタ３３を開閉することにより、図４（ａ）に示されるように、標本Ｓに対して一方向（図４（ａ）の紙面に対して標本Ｓの左側）から励起光を入射させる光路（以下、左側光路Ｌという。）と、図４（ｂ）に示されるように、標本Ｓに対して他方向（図４（ｂ）の紙面に対して標本Ｓの右側）から励起光を入射させる光路（以下、右側光路Ｒという。）とを切り替えて、蛍光画像の取得を行うようになっている。
【００３２】
ここで、標本Ｓ内部の光透過率の影響により、標本Ｓに入射された励起光は標本Ｓの内で減衰し、その減衰量は入射深度に応じて変化する。照明制御部３５は、メモリに記憶されている撮影条件マップに基づき、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域に応じて、標本Ｓの内部における励起光の減衰量が最少になる入射方向から励起光が入射されるように、シャッタ３３の開閉を切り替えるようになっている。
【００３３】
例えば、照明制御部３５は、左側光路Ｌから励起光を入射させた方が観察領域までの標本Ｓ内の距離が短い場合、すなわち、左側光路Ｌからの方が標本Ｓ内での励起光の減衰量が小さい場合は、シャッタ３３により左側光路Ｌを開放して右側光路Ｒを閉鎖するようになっている。また、例えば、照明制御部３５は、右側光路Ｒから励起光を入射させた方が観察領域までの標本Ｓ内の距離が短い場合、すなわち、右側光路Ｒからの方が標本Ｓ内での励起光の減衰量が小さい場合は、シャッタ３３により右側光路Ｒを開放して左側光路Ｌを閉鎖するようになっている。
【００３４】
また、照明制御部３５は、左側光路Ｌからも右側光路Ｒからも観察領域までの標本Ｓ内の距離が同程度の場合、すなわち、左側光路Ｌからも右側光路Ｒからも標本Ｓ内での励起光の減衰量が略同一となる場合は、両方の入射方向から励起光が択一的に切り替えられて順次標本Ｓに入射されるように、シャッタ３３により左側光路Ｌと右側光路Ｒとを交互に開閉するようになっている。
【００３５】
また、照明制御部３５は、撮影条件マップに基づき、標本Ｓの観察領域に対して、一方の入射方向からのみ励起光を入射させる場合は、例えば、励起光源２５から射出させる励起光のパワーを５０％に設定し、両方の入射光路から励起光を入射させる場合は、例えば、励起光源２５から射出させる励起光のパワーを７０％に設定するようになっている。
【００３６】
顕微鏡制御部３７は、入力装置９からの入力によってステージ１３を作動させて標本Ｓを移動させ、対物レンズ１７や結像レンズ１９を交換あるいは倍率調節し、フィルタホイール２３を作動させてフィルタを交換する等の顕微鏡本体３の制御を行うようになっている。
【００３７】
また、顕微鏡制御部３７は、メモリに記憶されている撮影条件マップに基づき、標本Ｓの観察領域に対して、一方の入射方向からのみ励起光が入射される場合は、例えば、検出光学系１５の露光時間を１００ｍｓｅｃに設定し、両方の入射光路から励起光が入射される場合は、例えば、検出光学系１５の露光時間を１５０ｍｓｅｃに設定するようになっている。
【００３８】
画像処理部３９は、撮像素子２１から送られてくる画像信号を処理してモニタ１１に表示させるようになっている。また、画像処理部３９は、合成画像を生成することができるようになっている。具体的には、画像処理部３９は、撮影条件マップに基づき、同一の観察領域に対して、照明装置５の両方の光路から励起光が入射される場合は、左側光路Ｌから励起光が入射されたときに撮像素子２１により取得される蛍光画像と、右側光路Ｒから励起光が入射されたときに撮像素子２１により取得される蛍光画像とを合成して合成画像を生成するようになっている。観察領域に対して、一方の光路からのみ励起光が入射される場合は、画像処理部３９による画像合成処理は実施されない。
【００３９】
次に、本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図５のフローチャートに示されるように、照明装置５において標本Ｓに対する励起光の入射方向を標本Ｓを通過する同一の入射平面に沿ういずれかの方向に切り替える切替ステップＳ１と、切替ステップＳ１により切り替えられた方向から入射平面に沿ってシート状の励起光を標本Ｓに入射させる入射ステップＳ２と、入射ステップＳ２によって励起光が入射されたときに、標本Ｓにおいて発生する蛍光を検出光学系１５により検出して蛍光画像を取得する検出ステップＳ３と、検出ステップＳ３により取得された蛍光画像を画像処理部３９において処理する画像処理ステップＳ４とを含んでいる。
【００４０】
このように構成された顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法により標本Ｓを観察する場合は、入力装置９により、ユーザが標本Ｓの観察領域を指定する。観察領域が指定されると、顕微鏡制御部３７によりステージ１３が移動させられて、指定された観察領域に観察範囲が合わせられる。そして、照明制御部３５および顕微鏡制御部３７により、メモリに記憶されている撮影条件マップに基づいて、励起光のパワー、シャッタ３３の開閉、および検出光学系１５の露光時間等が制御される。
【００４１】
例えば、図４（ａ）に示すように、観察領域Ａが指定された場合は、顕微鏡制御部３７により観察領域Ａに観察範囲が合わせられる。そして、照明制御部３５により励起光源２５において励起光のパワーが５０％に設定されるともに、顕微鏡制御部３７により検出光学系１５の露光時間が１００ｍｓｅｃに設定される。また、照明制御部３５により、シャッタ３３が開閉されて、図２（ａ）に示すように、照明装置５の左側光路Ｌが開放されて右側光路Ｒが閉鎖される（切替ステップＳ１）。
【００４２】
この状態で励起光源２５から射出されてハーフミラー２７を透過した励起光は、そのままシリンドリカルレンズ２９Ａによりシート状に集光され、図４（ａ）に示すように、左側光路Ｌから標本Ｓに入射される（入射ステップＳ２）。ハーフミラー２７により反射された励起光は、シャッタ３３により遮断される。左側光路Ｌから標本Ｓに入射されたシート状の励起光が観察領域Ａに照射されることにより、励起光の入射平面に沿って標本Ｓ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。
【００４３】
標本Ｓにおいて発生した蛍光の内、検出光学系１５の光軸に沿う方向に放射された蛍光は、対物レンズ１７により集光されてフィルタホイール２３のバリアフィルタを通過した後、結像レンズ１９により結像されて撮像素子２１により撮影される（検出ステップＳ３）。撮影条件マップに示されるように、観察領域Ａの観察では画像合成処理は実施されないので（画像処理ステップＳ４）、撮像素子２１により取得された観察領域Ａの蛍光画像は画像処理部３９によりそのままモニタ１１に表示される。
【００４４】
次に、観察領域Ｂが指定された場合は、ステージ１３が移動させられて観察領域Ｂに観察視野が合わせられる。そして、照明制御部３５により励起光源２５においてレーザ光のパワーが７０％に設定されるとともに、顕微鏡制御部３７により検出光学系１５の露光時間が１５０ｍｓｅｃに設定される。また、照明制御部３５により、シャッタ３３が時間間隔を空けて交互に開閉される（切替ステップＳ１）。
【００４５】
例えば、図２（ａ）に示すように、最初に照明装置５の左側光路Ｌが開放されて右側光路Ｒが閉鎖された場合は、励起光源２５から射出されてハーフミラー２７を透過したレーザ光が、観察領域Ａの場合と同様に、シリンドリカルレンズ２９Ａによりシート状に集光されて左側光路Ｌから標本Ｓに入射されて観察領域Ｂに照射される（入射ステップＳ２）。左側光路Ｌからのシート状の励起光が照射されることにより観察領域Ｂにおいて発生した蛍光は、観察領域Ａの場合と同様に、対物レンズ１７により集光されて撮像素子２１により撮影される（検出ステップＳ３）。
【００４６】
次いで、照明制御部３５により、シャッタ３３の開閉が切り替えられ、図２（ｂ）に示すように、照明装置５の左側光路Ｌが閉鎖されて右側光路Ｒが開放される（切替ステップＳ１）。そして、励起光源２５から射出されてハーフミラー２７により反射されたレーザ光が、ミラー３３を介してシリンドリカルレンズ２９Ｂによりシート状に集光され、右側光路Ｒから標本Ｓに入射されて観察領域Ｂに照射される（入射ステップＳ２）。右側光路Ｒからのシート状の励起光が照射されることにより観察領域Ｂにおいて発生した蛍光は、左側光路Ｌの場合と同様にして、対物レンズ１７により集光されて撮像素子２１により撮影される（検出ステップＳ３）。
【００４７】
撮影条件マップに示されるように、観察領域Ｂの観察では画像合成処理が実施されるので（画像処理ステップＳ４）、画像処理部３９により、左側光路Ｌからの励起光が入射されたときに撮像素子２１により取得された蛍光画像と、右側光路Ｒからの励起光が入射させたときに撮像素子２１により取得された蛍光画像とが合成されて合成画像が生成され（ステップＳ５）、モニタ１１に表示される。
【００４８】
次に、図４（ｂ）に示すように、標本Ｓの観察領域Ｃが指定された場合は、顕微鏡制御部３７により観察領域Ｃに観察範囲が合わせられる。そして、照明制御部３５により、励起光源２５においてレーザ光のパワーが５０％に設定されるとともに、検出光学系１５の露光時間が１００ｍｓｅｃに設定される。また、照明制御部３５により、シャッタ３３が開閉されて、図２（ｂ）に示すように、照明装置５の左側光路Ｌが閉鎖されて右側光路Ｒが開放される（切替ステップＳ１）。
【００４９】
この状態で励起光源２５から射出されたハーフミラー２７により反射された励起光は、ミラー３３を介してシリンドリカルレンズ２９Ｂによりシート状に集光され、図４（ｂ）に示すように、右側光路Ｒから標本Ｓに入射されて観察領域Ｃに照射される（入射ステップＳ２）。ハーフミラー２７を透過した励起光は、シャッタ３３により遮断される。
【００５０】
右側光路Ｒからのシート状の励起光が照射されることにより観察領域Ｃにおいて発生した蛍光は、観察領域Ａ，Ｂの場合と同様に、対物レンズ１７により集光されて撮像素子２１により撮影される。撮影条件マップに示されるように、観察領域Ｃの観察では画像合成処理は実施されないので（画像処理ステップＳ４）、撮像素子２１により取得された観察領域Ｃの蛍光画像は画像処理部３９によりそのままモニタ１１に表示される。
【００５１】
次に、観察領域Ａ，Ｂ，Ｃと同様に、観察領域Ｄ，Ｅ，Ｆが指定された場合は、顕微鏡制御部３７により、指定された観察領域Ｄ，Ｅ，Ｆに観察範囲が合わせられる。観察領域観察領域Ｄ，Ｅ，Ｆは観察領域Ａ，Ｂ，Ｃと励起光の減衰量が変わらないので、撮影条件マップに基づき、観察領域Ａ，Ｂ，Ｃの場合と同様に、照明装置５の光路が切り替えられて、標本Ｓにシート状の励起光が入射される。
【００５２】
例えば、観察領域Ｄを観察する場合は、照明制御部３５により照明装置５の左側光路Ｌが開放されて右側光路Ｒが閉鎖され、左側光路Ｌからのシート状の励起光が標本Ｓに入射されて観察領域Ｄの蛍光画像が取得される。また、観察領域Ｅを観察する場合は、照明制御部３５により照明装置５の左側光路Ｌと右側光路Ｒとが交互に開放されて両方の光路から順次励起光が標本Ｓに入射されて、それぞれの観察領域Ｅの蛍光画像が合成される。また、観察領域Ｆを観察する場合は、照明制御部３５により照明装置５の右側光路Ｒが開放されて右側光路Ｌが閉鎖され、右側光路Ｒからのシート状の励起光が標本Ｓに入射されて、観察領域Ｆの画像が取得される。
【００５３】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域に応じて、照明制御部３５により照明装置５が制御されて、励起光の入射方向が標本Ｓの内部における励起光の減衰量が最少になる方向に切り替えられることで、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域に関わらず、十分な光量の励起光を照射させて十分な強度の蛍光を発生させることができる。したがって、シート照明方式により、励起光の量の減衰の影響を抑制してムラがない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００５４】
また、左側光路Ｌと右側光路Ｒの標本Ｓの内部における励起光の減衰量が略同一となる観察領域については、両方の光路から励起光を入射させることにより、１つの入射方向からだけでは減衰によって十分な量の励起光を照射できない場合であっても、入射方向の数だけ蛍光を発生させることができる。そして、両方の入射方向からの励起光により得られる同一の観察領域の蛍光画像を合成することで、ムラがなく十分に明るい蛍光画像を生成することができる。また、照明制御部３５が、撮影条件マップに基づいて照明装置５を制御することで、標本Ｓの観察領域に応じて、撮影条件マップに基づき迅速かつ適切な入射方向から励起光を入射させることができる。
【００５５】
本実施形態においては、２つの入射方向を例示して説明したが、３つ以上の入射方向から励起光を入射させることとしてもよい。この場合、照明制御部３５が、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域に応じて、標本Ｓの内部における励起光の減衰量が最少になる１以上の入射方向から励起光が入射されるように照明装置５を制御することとすればよい。また、励起光の減衰量が最少かつ略同一となる入射方向が複数ある場合は、照明制御部３５が、それら複数の入射方向から標本Ｓに励起光が入射されるように、照明装置５を制御することとすればよい。
【００５６】
また、本実施例では、励起光の切り替えを２つのシャッタ３３で行っているが、シャッタ３３をなくし、ハーフミラー２７を通常のミラーとして、これを光路から出し入れするようにしてもよい。こうすることで、励起光源２５の光量をどちらか一方の光路のみに使うことができる。
【００５７】
〔参考実施形態〕
本発明の参考例としての発明の実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、第１実施形態の図１の照明装置５に代えて、図６に示すように１つの方向の照明光学系からなる照明装置４１を備える点が第１実施形態と異なっている。
本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る顕微鏡１および画像取得方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００５８】
照明装置４１は、図６に示されるように、略平行光からなる励起光を射出する励起光源２５と、励起光源２５から射出された励起光を略平面状の励起光として標本Ｓを通過する平面に沿って入射させるシリンドリカルレンズ２９とを備えている。
【００５９】
シリンドリカルレンズ２９は、光軸Ｐに直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光をその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有するシート状に集光させるようになっている。シリンドリカルレンズ２９により集光される励起光の光軸Ｐは、検出光学系１５の光軸Ｑに直交する方向に沿って同一平面上に延びるように配置されている。
顕微鏡１の構成は第１実施形態と同じである。
【００６０】
制御装置７のメモリには、図７に示すような撮影条件マップが記憶されている。この撮影条件マップは、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域ごとに、標本Ｓ内の入射深度に応じた励起光の減衰量に関わらず各観察領域の蛍光画像の明るさが略一定になるように、励起光のパワーおよび検出光学系１５の露光時間が対応付けられている。例えば、図７に示す例では、観察領域の入射深度が深くなるほど、励起光のパワーを強くしたり検出光学系１５の露光時間を長くしたりするようになっている。
【００６１】
このように構成された顕微鏡の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法により標本Ｓを観察する場合は、第１実施形態と同じくユーザにより標本Ｓの観察領域が指定されると、顕微鏡制御部３７によりステージ１３が移動させられて、指定された観察領域に観察範囲が合わせられる。そして、照明制御部３５および顕微鏡制御部３７により、メモリに記憶されている図７のような撮影条件マップに基づいて、励起光のパワー、および検出光学系１５の露光時間等が制御される。
【００６２】
例えば、図４（ａ）に示すように、観察領域Ａが指定された場合は、顕微鏡制御部３７により観察領域Ａに観察範囲が合わせられる。そして、照明制御部３５により励起光源２５において励起光のパワーが５０％に設定されるともに、顕微鏡制御部３７により検出光学系１５の露光時間が１００ｍｓｅｃに設定される。
【００６３】
この状態で励起光源６０１から射出された励起光は、そのままシリンドリカルレンズ６０２によりシート状に集光され、図４（ａ）に示される観察領域Ａを照明する。励起光の入射平面に沿って標本Ｓ内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。標本Ｓにおいて発生した蛍光の検出は第１実施形態と同じである。
【００６４】
次に、観察領域Ｂが指定された場合は、ステージ１３が移動させられて観察領域Ｂに観察視野が合わせられる。そして、照明制御部３５により励起光源２５においてレーザ光のパワーが１００％に設定されるとともに、顕微鏡制御部３７により検出光学系１５の露光時間が１００ｍｓｅｃに設定される。
【００６５】
次に、観察領域Ｃが指定された場合は、ステージ１３が移動させられて観察領域Ｃに観察視野が合わせられる。そして、照明制御部３５により励起光源２５においてレーザ光のパワーが１００％に設定されるとともに、顕微鏡制御部３７により検出光学系１５の露光時間が２００ｍｓｅｃに設定される。
次に、観察領域Ｄ，Ｅ，Ｆが指定された場合は、照明パワーと露光時間はそれぞれＡ，Ｂ，Ｃと同様に設定される。
【００６６】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、励起光の入射平面内における標本Ｓの観察領域に応じて、照明制御部３５により照明装置４１が制御されて、励起光のパワーと検出の露光時間が制御されることにより、複数の光の励起光学系が無くとも、ムラがない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００６７】
本実施形態は、所望の１つの領域（例えば図４のＡ〜Ｆのうちの１つ）の画像を取得する場合に適用してもよく、隣接する複数領域（例えば図４のＡ〜Ｆの全て）の画像を取得して１枚の広視野合成画像を作成する場合に適用してもよい。
また、本実施形態においては、励起光のパワーと検出光学系１５の露光時間を制御することとしたが、標本Ｓ内の入射深度に応じた励起光の減衰量に関わらず各観察領域の蛍光画像の明るさが一定になればよく、例えば、標本Ｓの観察領域ごとに、蛍光画像の明るさが一定になるように、励起光のパワー、検出光学系１５の露光時間および蛍光信号の増幅の少なくとも１つを制御することとすればよい。蛍光信号の増幅の制御としては、光検出器（撮像素子２１）の検出感度や検出信号処理回路のゲインの制御、生成された画像の明るさ補正等を行うこととすればよい。
【００６８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本実施形態においては、撮影条件マップに基づき、顕微鏡制御部３７により検出光学系１５の露光時間を制御することとしたが、これに代えて、顕微鏡制御部３７により、観察領域ごとに蛍光信号を増幅するゲインを制御して、蛍光画像の明るさを所望の明るさに調整することとしてもよい。
【符号の説明】
【００６９】
１    顕微鏡
５，４１    照明装置（シート照明部）
１５    検出光学系
３５    照明制御部（制御部）
３７    顕微鏡制御部（制御部）
３９    画像処理部
Ｓ１    切替ステップ
Ｓ２    入射ステップ
Ｓ３    検出ステップ
Ｓ４    画像処理ステップ
【図１】
0006552881.tif 000002
【図２】
0006552881.tif 000003
【図３】
0006552881.tif 000004
【図４】
0006552881.tif 000005
【図５】
0006552881.tif 000006
【図６】
0006552881.tif 000007
【図７】
0006552881.tif 000008