(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面（１０２、２０２）を有する基板（１００、２００、３００、４００）を含む埋め込み可能なデバイスであって、
生物学的細胞または組織と直接接触するために使用される前記基板の表面の第１の部分（１１０、２１０、３１０、４１０）は、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含み、
ここで、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値であり、前記第１の部分は前記基板に対する細胞接着を促進し、その上に細胞増殖を方向付け、更に前記デバイスの半導体要素を画定することを特徴とするデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のデバイスであって、
ｘは０．０１〜０．８８の範囲内の値であることを特徴とするデバイス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のデバイスであって、
前記第１の部分は、前記基板の表面を一体的にカバーすることを特徴とするデバイス。
【請求項４】
請求項１または２に記載のデバイスであって、
前記基板の表面（２０２）は、前記第１の部分（２１０、３１０、４１０）とは異なる第２の部分（２２０、３２０、４２０）を更に含み、前記第２の部分（２２０、３２０、４２０）は、前記細胞への細胞接着を阻害し、前記第２の部分は、窒化インジウム（ＩｎＮ）を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項５】
請求項４に記載のデバイスであって、
前記第１の部分（２１０）および前記第２の部分（２２０）が、前記基板（２００）の表面（２０２）を一体的にカバーすることを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のデバイスであって、
前記基板は窒化インジウム（ＩｎＮ）を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のデバイスであって、
前記第１の部分は、前記基板の表面上に薄層として設けられ、および／または前記第１の部分とは異なる第２の部分を更に含み、前記第２の部分は前記基板の表面上に薄層として設けられていることを特徴とするデバイス。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項に記載のデバイスであって、
前記第１の部分は、前記基板の表面上に厚い層として設けられ、および／または前記第１の部分とは異なる第２の部分を更に含み、前記第２の部分は前記基板の表面上に厚い層として設けられていることを特徴とするデバイス。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のデバイスであって、
前記第１の部分は、前記基板の表面上のパターンを画定し、前記パターンに沿って細胞接着が増強されることを特徴とするデバイス。
【請求項１０】
請求項９に記載のデバイスであって、
前記パターンは少なくとも１本の線を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のデバイスであって、
前記パターンは、少なくとも１つの線に沿って配列された、窒化インジウム（ＩｎＮ）を含む一連のピラーによって画定されることを特徴とするデバイス。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のデバイスであって、
接触した細胞／組織を、刺激および／またはモニタリングするための少なくとも１つの電極を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１３】
表面を有する基板を含む埋め込み可能なデバイスを製造する方法であって、
前記表面の部分の上にＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含む層を形成するステップを含み、
前記部分は、生物学的細胞または組織と直接接触するために使用されたとき、前記部分上で細胞の接着および増殖を選択的に促進されるように適合され、
ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記基板上にＩｎＮの第１の層を形成するステップと、
前記第１の層を形成するステップの後に、前記第１の層の上にＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの第２の層を選択的に形成するステップであって、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である、該ステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、
基板上にＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの第１の層を形成するステップであって、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である、該ステップと、
前記第１の層を形成するステップの後に、前記第１の層の上にＩｎＮの第２の層を形成するステップと、
前記第２の層を形成するステップの後に、前記第２の層の複数の部分を選択的に除去して、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの前記第１の層を露出させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記第２の層は、前記第１の層をカバーすることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法であって、
ＩｎＮの前記第２の層は、エッチングによって選択的に除去されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載の方法であって、
ＩｎＮの前記第２の層は、イオンビームミリングによって選択的に除去されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、埋め込み可能な材料およびデバイスの分野に関する。本発明は、特に細胞増殖および接着が選択的に増強された基板を有する埋め込み可能なデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生物学的組織および細胞の活性をプロービングおよび／または回復させるために、いくつかの材料およびデバイスが研究および提案されてきている。そのような研究の目標は、例えば、ヒト神経細胞を後シナプス細胞と再接続することができる材料またはデバイスを提供して、失われた神経細胞機能を埋め込まれたデバイスによって修復または改善できるようにすることである。一例として、１９９０年代初頭に実施された最初の成功した神経機能代替−蝸牛（人工内耳）インプラントは、電極アレイを使用して電気インパルスで蝸牛の聴神経を刺激する神経インタフェースデバイスである。末梢神経の電気刺激は、痛みの治療、運動機能の回復、てんかんの治療のために臨床医から多くの関心を集めてきている。更に、ニューロエンジニアリング研究コミュニティは、中枢神経系（ＣＮＳ）のための様々な神経インタフェースデバイスを研究してきた。そのようなデバイスは、脳の深部刺激を伴う適切な電荷送達を介して、気分障害、てんかんまたはパーキンソン病で生じる症状を調節するように設計されている。脳信号の記録は、脳−コンピュータインタフェース、ＢＣＩを制御するために使用されている（非特許文献１参照）。神経自家移植片（非特許文献２）は、大きな神経ギャップ、すなわち２０ｍｍより長いギャップを横断する末梢神経再生の現在の臨床標準である。合成神経誘導チャネルは、細胞のシグナル伝達および誘導された増殖を可能にする適切な物質の欠如について現在知られてない。
【０００３】
埋め込み可能なデバイスおよび神経インタフェースには、いくつかの具体的な課題がある。すなわち、
−インプラント周囲の炎症反応やグリオーシス（神経膠症）を軽減すること（これら炎症反応やグリオーシス（神経膠症）は、デバイスへ／デバイスから伝達される信号の信号対雑音比を低下させるか、慢性的な記録障害につながるため）（非特許文献３参照）、
−神経細胞密度の高い脳の部分への信号の収集およびそこからの信号の収集を可能にする神経インタフェースの空間分解能を改善すること、および
−正確な領域を選択的に刺激して、ＣＮＳからの特定の応答を誘発すること、
である。
【０００４】
以下の説明および本明細書全体を通して、生体適合性という用語は、体内において望ましくない局所的または全身的な影響を引き起こすことなく、移植されたすなわち埋め込まれた環境において所望の機能を果たし、有益な細胞応答および組織応答を維持するという埋め込まれたデバイスおよびその構成要素の能力を指すために使用される。
【０００５】
更に、埋め込まれたデバイスまたは材料のバイオファウリングとは、デバイスまたは材料上での組織の制御されない成長を指す。
【０００６】
いくつかの材料が生体内バイオインプラント用途のために試験されているが、ポリマーはその可塑性および生体適合性から現時点での選択材料である。脳−機械インタフェース（ＢＭＩ）において、ポリマーは、主に半導体材料のカプセル化マトリックスとして使用される。ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）、ＰＥＤＯＴ、ポリアニリンまたはポリチオフェン等のいくつかのポリマーは導電性を有することが知られている。導電性ポリマーの使用により、埋め込まれた材料の生体適合性を高め、周囲の細胞との相互作用を可能にすることができる。しかしながら、導電性ポリマーは、バイオファウリングまたは脳の常在免疫細胞における物質の取り込みによって引き起こされるインピーダンスの変化に対して過敏なままである（非特許文献３参照）。
【０００７】
ポリマーに見られるような可塑性は重要ではあるが、神経細胞などの細胞を誘導し、プロービングする能力を有する基板を設計するためには、最小限の剛性が必要である。
【０００８】
脳−機械インタフェースに関連する用途では、神経細胞のシナプス接続を人工の基板上で成長させることができるインタフェースが必要とされている。成長は調節され、定められた場所に正確に向けられなければならない。従来のナノテクノロジー処理工程を用いて、半導体チップの表面上に設計パターンに従って細胞成長を制御するチャネル、ウェルまたはピラーを形成することが検討されてきている（非特許文献５）。このような技術は、電子チップの表面上のトランスデューサ部位上の架橋を有する神経細胞のカスタムネットワークのために特に適している。標準的なＳｉ（シリコン）ベースのチップは、この目的のために広く研究されてきたが、化学的安定性の欠如のために生体内でのそれらの使用が制限される。従って、Ｓｉベースのデバイスを使用するためには、塩基性または酸性条件下での急速なシリコン酸化を避けるために、特定のパッケージ技術を必要とする。いくつかの酵素がシリコンまたはその酸化物と反応することが知られている。実際に、ＳｉＯ２の加水分解は、通常、低濃度ではまだ知られていないケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）４）の放出をもたらす。高濃度では、Ｓｉ（ＯＨ）４はアルミニウム含有化合物と相互作用し、神経変性に寄与すると考えられている。Ｓｉベースのバイオセンサは、脳インプラントに使用すると炎症を誘発することが示されている。半導体材料では、炭化ケイ素であるＳｉＣは優れた化学的安定性と興味深い生体適合性を有することが知られている（非特許文献６）。その結晶相に応じて、ＳｉＣのバンドギャップは２．３ｅＶから３．２ｅＶまで変化する。しかし、その格子欠陥許容度が低いために、その電子特性を微調整することは困難である。Ｓｉプローブの断面積が小さいほど、大きな電極よりもアストログリア応答が遅いことが示されている。しかし、グリオーシス炎症反応は数週間後に全ての設計で同様であった（非特許文献７）。その顕著な化学的安定性のために、窒化ガリウム（ＧａＮ）は、埋め込み可能型またはバイオレコーディングデバイスの開発のための良い候補として特定されている（非特許文献８）。ＧａＮは、ペプチド結合を可能にするように官能化することができる。特定のペプチドは、生体接着を促進するために、または組織炎症の危険性を減少させるために使用することができる（非特許文献９）。
【０００９】
いくつかの第３ＩＩＩ−Ｖ化合物は、調整可能な光電子特性を有する新しい半導体材料を設計する道を開いている。残念ながら、それらのなかには、当技術分野において生体適合性であると記載されているものは殆どない。ＡｌＧａＮは、非特許文献１０において生体適合性であると記載されていたが、Ａｌ／Ｇａの比が小さく、この材料の適用範囲が制限されていた。
【００１０】
Ｋｉｍら（非特許文献１１）には、その生体接着特性を検討することなくＩｎＧａＮ層を形成することを記載している。
【００１１】
特許文献１（国際公開第２００９／０６５１７１号）は、蝸牛インプラントのための電極アレイと、生体適合性材料としてのシリコーンの使用を開示している。
【００１２】
特許文献２（米国特許出願公開第２０１１／０２８２４２１号明細書）は、ナノダイヤモンド粒子の層が神経細胞成長面として使用される神経細胞成長のためのデバイスを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６５１７１号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０２８２４２１号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Santhanam G, Ryu SI, Yu BM, Afshar A, Shenoy KV, Nature 442:195-98 (2006)
【非特許文献２】Bellamkonda, R. V. Biomaterials 2006, 27 (19), 3515-3518
【非特許文献３】Turner JN, Shain W, Szarowski DH, Andersen M, Martins S, et al., Exp. Neurol. 156:33-49 (1999)
【非特許文献４】Bellamkonda, R. V.; Pai, S. B.; Renaud, P. MRS Bulletin 2012, 37 (06), 557-561
【非特許文献５】Grill, W. M.; Norman, S. E.; Bellamkonda, R. V. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2009, 11 (1), 1-24
【非特許文献６】Li, X. D.; Wang, X. N.; Bondokov, R.; Morris, J.; An, Y. H. H.; Sudarshan, T. S. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials 2005, 72B (2), 353-361 .
【非特許文献７】Szarowski DH, Andersen MD, Retterer S, Spence AJ, Isaacson M, Brain Res. 983:23-35 (2003)
【非特許文献８】Ito, T.; Forman, S. M.; Cao, C; Li, F.; Eddy, C. R.; Mastro, M. A.; Holm, R. T.; Henry, R. L; Hohn, K. L; Edgar, J. H. Langmuir 2008, 24 (13), 6630-6635
【非特許文献９】He, W.; McConnell, G. G.; Schneider, T. G.; Bellamkonda, R. G. Adv. Mater. 2007, 19 (21), 3529-3533
【非特許文献１０】Biocompatibility of semiconducting AIGaN/GaN material with living cells, Podolska, A. et al. Sensors and Actuators B 169 (2012) 401-406
【非特許文献１１】Kim et al. "Formation of V-shaped pits in InGaN/GaN multiquantum wells and bulk InGaN films", Applied Physics Letters, Volum 73, Number 12, 1998, 1634-1636
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の目的は、細胞増殖を制御しながら選択的に細胞接着を増強または促進し、先行技術の欠点の少なくともいくつかを克服する埋め込み可能なデバイスを提供することである。本発明の更なる目的は、そのようなデバイスの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、埋め込み可能なデバイスが提供される。このデバイスは、表面を有する基板を備える。前記表面の第１の部分は、生物学的細胞または組織と直接接触するために使用される。前記表面の第１の部分は、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含み、ここで、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である。前記表面の第１の部分は、前記基板への細胞接着を促進し、前記基板上の細胞増殖を方向付け、更にデバイスの半導体要素を画定する。
【００１７】
前記基板は、第１のタイプの部分を含むいくつかの表面を有することができる。
【００１８】
好ましくは、ｘは、０．００１〜０．８８の範囲内の値、または０．０１〜０．８８の範囲内の値であり得る。
【００１９】
前記第１の部分は、好ましくは、前記基板の表面を一体的にカバーする。前記第１の部分は、前記表面上で連続的であっても非連続的であってもよい。
【００２０】
前記基板の表面は、前記第１の部分とは異なる第２の部分を更に含んでもよく、前記第２の部分は、前記細胞への細胞接着を阻害し、前記第２の部分は、窒化インジウム（ＩｎＮ）を含む。
【００２１】
前記第１の部分および前記第２の部分が、好ましくは前記基板の表面を一体的にカバーすることができる。
【００２２】
好ましくは、前記基板は窒化インジウム（ＩｎＮ）を含み得る。
【００２３】
第１の部分および／または第２の部分は、好ましくは、基板の表面上に薄層として設けられてもよい。
【００２４】
更に、第１の部分および／または第２の部分は、好ましくは、基板の表面上に厚い層として設けられてもよい。
【００２５】
更により好ましくは、前記第１の部分は、前記基板の表面上のパターンを画定し、前記パターンに沿って細胞接着が増強される。前記パターンは、線を含むことができる。前記パターンは、略平坦な領域または円形の形状を有することができる。あるいは、前記パターンは、例えばピラーまたは任意の繰り返し構造を含む３次元パターンであってもよい。
【００２６】
前記パターンは、好ましくは少なくとも１つの線に沿って配列された、窒化インジウム（ＩｎＮ）を含む一連のピラーによって画定されてもよい。
【００２７】
前記デバイスは、好ましくは、接触した細胞／組織を、刺激および／またはモニタリングするための少なくとも１つの電極を含むことができる。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、埋め込み可能なデバイスの基板の表面の部分上で細胞の接着および増殖を選択的に促進する方法が提供される。前記部分は、生物学的細胞または組織と直接接触するために使用される。前記方法は、前記部分の上にＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含む層を形成するステップを含み、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である。
【００２９】
好ましくは、前記基板上にＩｎＮの第１の層を形成するステップと、
前記第１の層を形成するステップの後に、前記第１の層の上にＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの第２の層を選択的に形成するステップであって、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である、該ステップとを含み得る。
【００３０】
前記方法は、基板上にＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの第１の層を形成するステップであって、ｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である、該ステップと、前記第１の層を形成するステップの後に、前記第１の層の上にＩｎＮの第２の層を形成するステップと、前記第２の層を形成するステップの後に、前記第２の層の複数の部分を選択的に除去して、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの前記第１の層を露出させるステップとを更に含み得る。
【００３１】
前記第２の層は、好ましくは前記第１の層をカバーすることができる。
【００３２】
好ましくは、ＩｎＮの前記第２の層は、エッチングによって選択的に除去される。
【００３３】
代替的には、ＩｎＮの前記第２の層は、イオンビームミリングによって選択的に除去される。
【００３４】
窒化インジウム（ＩｎＮ）は、その表面上の細胞増殖を阻害する非毒性生体適合性材料であることが分かっている。本発明者らは、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを得るために少量のガリウム（Ｇａ）を結晶内に添加することにより、得られた材料が生体適合性でかつ細胞接着性の基板として使用できることを示した。
インジウムが豊富なＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎは、インプラントによって接触された細胞から／細胞へ直接的に情報を記録および／または送信するのに特に適した光応答性の埋め込み可能な基板の設計を可能とし、電気的または光学的刺激によって細胞の制御された増殖を促進することもできる。Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎは、調整可能なバンドギャップを有する半導体材料である。従って、本発明を用いると、基板上に複数の電界効果トランジスタを設けることが可能となり、その感度はＩｎＮに添加されるＧａの量によって調整することができる。
【００３５】
Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ表面パターンを含むようにＩｎＮ基板をパターニングすることによって、細胞増殖を明確に定められた２次元または３次元パターンに沿って正確に方向付けすることができる。具体的には、本発明により、所定のパターンに沿った神経細胞成長および神経細胞モニタリング、または基板上の所定の経路に沿った神経細胞ネットワークの調整された成長が可能となる。
【００３６】
本発明による基板を使用することにより、小さい神経回路の形成および可塑性を研究するためのツールを試験管内で設計することができる。更に、生体内用途の例として、本発明による人工基板上に成長した神経細胞のシナプス結合を制御し、定められた位置に正確に方向付けすることができる脳−機械インタフェースに基板を使用することができる。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態を、下記の図面を参照して説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄよりなり、それぞれＧａＮ、ＩｎＮ、またはＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ上部層を有するサンプルの構造を概略的に示す図である。
【図２ａ】細胞株ＭＣＦ１０Ａについて図１のサンプルを用いて得られた細胞生存率の結果を示す図である。
【図２ｂ】ＨＳ−５について図１のサンプルを用いて得られた細胞生存率の結果を示す図である。
【図３ａ】図１のサンプルを用いて得られた細胞接着結果を示す図であり、ＧａＮサンプル上の異なる細胞株の接着を示す。
【図３ｂ】図１のサンプルを用いて得られた細胞接着結果を示す図であり、ＩｎＮサンプル上の異なる細胞株の接着を示す。
【図３ｃ】図１のサンプルを用いて得られた細胞接着結果を示す図であり、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎサンプル上の異なる細胞株の接着を示す。
【図４】異なる基板上で増殖させたＨＥＫ細胞の形態を示す図である。
【図５】本発明の好ましい実施形態による埋め込み可能なデバイスの基板を概略的に示す図である。
【図６】本発明の好ましい実施形態による埋め込み可能なデバイスの基板を概略的に示す図である。
【図７ａ】更なるＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ官能化の方法を概略的に示す図である。
【図７ｂ】更なるＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ官能化の方法を概略的に示す図である。
【図８】図８ａ、図８ｂ、および図８Ｃよりなり、図８ａは本発明の好ましい実施形態による埋め込み可能なデバイスの基板の概略上面図、図８ｂおよび図８ｃは概略側面図である。
【図９】本発明の好ましい実施形態による基板を有する埋め込み可能なデバイス上のヒト神経細胞の方向付けられた成長を示す図である。
【図１０】本発明のデバイスを用いた実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、好ましい実施形態および図面に基づいて本発明を更に詳細に説明する。初めに、提示された結果を得るために使用される材料および方法について説明する。特に断らない限り、特定の実施形態に提示される技術的特徴は、他の実施形態の特徴と組み合わせることが可能であることを理解されたい。
【００４０】
［材料および方法］
Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ材料を含む最上層、すなわち細胞接触層を含むデバイスの存在下での細胞の挙動をシミュレートするために、化学気相成長法（ＣＶＤ）を用いてサファイアまたはシリコン基板上に異なる構造を合成した。構造は図１ａ〜図１ｄに示されており、図１ａはＧａＮからなる細胞接触層を示し、図１ｂはＩｎＮからなる細胞接触層を示す。図１ｃは、１２．５％のＧａが存在するＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎからなる細胞接触層を示す。最後に図１ｄは、２５％のＧａが存在するＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎからなる細胞接触層を示す。最上層は約２００ｎｍの厚さを有する。図示の中間層は、それぞれの最上層からの電気信号の伝達を最適化するべく選択されたものである。それらの存在は、上層の生体接着および毒性に関する結果に影響しない。窒化ガリウム上の細胞接着および増殖は従来より公知である。それぞれの最上層の存在下での細胞の生体接着および毒性を評価するために、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＸＴＴ（商標）試験および生体接着試験が行われてきた。
【００４１】
報告された結果を得るために使用された実験手順を、以下に記載する。
【００４２】
接着顕微鏡法を実施するために、要素を、１ウェル当たり２５ｍｍ２要素で２４ウェルプレートに入れた。ダルベッコ変法イーグル培地中のそれぞれ５'０００および１０'０００の細胞と、ＤＭＥＭ−１％ウマ血清中とともに、神経成長因子１００ｎｇ／ｍｌを含有する５００μｌのＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）−ＰＣ１２懸濁液を加えて、７２時間インキュベートした。
【００４３】
Ｗｅｓｔｂｕｒｇ  Ｅｖｏｓ（商標）顕微鏡で画像化する前に、上清を吸引し、フェノールレッドを含まない新鮮なＤＭＥＭ培地と交換した。要素の画像化は、フェノールレッドを含まない新鮮なＤＭＥＭ培地中のＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０（商標）を用いる共焦点顕微鏡法実験か、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のＺｅｉｓｓ（商標）顕微鏡を使用する反射モードの光学顕微鏡法によって行った。
【００４４】
Ｐｆｉｚｅｒ  Ａｄｒｉｂｌａｓｔｉｎａ（商標）を、すぐに使用できる注射用溶液ドキソルビシン（ｄｏｘ）として使用した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＮＧＦ２．５Ｓ神経成長因子をＰＢＳ／０．１％ウシ血清アルブミンで希釈し、−２０℃で保存した。
【００４５】
３種の細胞株を試験に使用した。第１の細胞株として、ヒト乳房非腫瘍形成性上皮細胞株ＭＣＦ１０Ａを、５％ウマ血清、表皮成長因子ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）２０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）０．５ｍｇ／ｍｌ）、コレラ毒素（Ｇｅｎｔａｕｒ（商標）１００ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）１０ｍｇ／ｍｌ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で増殖させた。
【００４６】
第２の細胞株として、ＨＳ−５ストロマ細胞株を、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン中で培養した。
【００４７】
第３の細胞株として、埋め込み可能なラット副腎髄質の神経内分泌腫瘍由来のＰＣ−１２細胞株を、１０％ウマ血清、５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンで増殖させた。このモデルの神経細胞表現型は、７２時間、ＤＭＥＭ−１％ウマ血清中の１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子を用いて誘導される。神経成長因子で処理した場合、ＰＣ１２細胞は分裂を停止し、最終的に分化する。このことで、ＰＣ１２細胞が神経細胞分化のためのモデル系として有用になる。
【００４８】
全ての細胞株は、５％のＣＯ２および９５％の湿度を有する周囲環境において３７℃の温度に維持した。
【００４９】
細胞生存率は、製造者の説明書に従って比色分析法Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＸＴＴ  ＴＭアッセイを用いて測定した。１ウェルあたり３'０００の細胞を、異なるエレメントを含むかまたは含まない４８ウェルプレート上に４６〜９６時間プレートした。暴露終了４時間前にＸＴＴを追加した。暴露終了時に、上清の光学密度を４９０ｎｍで読み取った。毒性の陽性対照は、ドキソルビシン処置で得られた。
【００５０】
図２ａおよび図２ｂは、サファイア、ＧａＮ、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ（１２．５％Ｇａおよび２５％Ｇａ）、およびＩｎＮのそれぞれの細胞接触層上におけるＭＣＦ１０乳腺上皮細胞（図２ａ）およびＨＳ５間質細胞（図２ｂ）の生存率を示す。対照（Ｃｔｒｌ）およびｄｏｘサンプルを含む異なるサンプルの存在下で、細胞を４８時間、７２時間または９６時間インキュベートした。後者は細胞死を誘導する陽性対照である。結果はパーセンテージ（光学濃度（ＯＤ）、対照サンプルについて計算した所与のサンプル／ＯＤについて計算）で表す。観察されるように、観察できるように、ＭＣＦ１０細胞生存率のＨＳ５は、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの存在下では影響を受けない。興味深いことに、ＩｎＮとサファイアについても同様である。Ｄｏｘ陽性対照は、試験した細胞が過剰耐性でないことを証明している。
【００５１】
図３ａ、図３ｂおよび図３ｃは、ＧａＮ、ＩｎＮおよびＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの異なる層について、上記のように得られた細胞の生体接着の結果を示す。ＨＳ５およびＭＣＦ１０細胞の他に、ＰＣ１２細胞を神経細胞のモデルとして試験した。ＩｎＮの場合、実質的に細胞は基板上に付着することができない。ペトリ皿において、細胞は対照サンプルと同様にプラスチック部分の上で増殖し、誘導毒性の兆候は見られなかった。これにより、図２ａおよび図２ｂに示す生存率の結果が確認される。Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎでは、細胞増殖はＧａＮに類似していることが観察されるが、これはＩｎＮ合金中のＧａの割合が低いために驚くべきことである。ＨＳ５細胞では、細胞増殖は、ＩｎＮ合金中に存在するＧａの割合に明らかに依存することが観察されている。従って、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）ＮのＧａ比を変化させることによって、すなわち割合ｘを変化させることによって細胞成長を制御することが可能である。
【００５２】
細胞の形状は、共焦点顕微鏡法でのヒト胎児腎臓、ＨＥＫ細胞を用いて制御した。図４は、異なるサンプル上のＨＥＫ細胞の形態を示す。ＨＥＫ細胞は、蛍光タンパク質を産生する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をトランスフェクトしたものであった。細胞の形状は、ＧａＮおよびＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ材料のガラスと異ならず、両方の基板上での正常な細胞の発達を示している。
【００５３】
神経細胞はコラーゲンを産生することができず、一般にプレコートなしにガラス／サファイア基材に付着することはできない。本発明者の結果は、接着だけでなく、プレコートなしで神経細胞ネットワークを促進することを可能にするＩｎＧａＮの優れた特性を示す。
【００５４】
［Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを官能化する方法］
ＧａＮを官能化するいくつかの方法が文献に記載されている。当業者は、同様の方法をＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ表面に対して適用することができる。これにより、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ表面が、細胞選択性の増強または細胞分化の促進などの特定の用途のための化学的機能により生体官能化／そのような特定の用途のための生体分子とバイオコンジュゲート（生体共役）されることが可能となる。これらの方法のうちの１つは、官能性アルケンの光化学的グラフト化（２５４ｎｍ）に基づく。この反応では、Ｇａ−Ｈ結合を得るためにＨプラズマによってＧａＮを処理する必要がある。あるいは、ＧａＮをピラニア溶液で酸化し、次いで「官能化シラン」（例えばＡＰＴＥＳ）でコーティングすることができる。しかし、これらの２つの技術は、重要なバンドギャップ変更を誘発し得る。電子特性を維持しつつ、ＧａＮ表面上に遊離アミノ基を得ることを可能にする方法が提案されている。この方法は、加湿空気を用いた高周波グロー放電プラズマを用いてアミノ残基を生成する。これらの異なる技術は、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ／ＧａＮ表面上に遊離アミノ基を生成するために使用することができる（図７ａ）。アミノ基は、チオール反応性部分（例えばマレイミド）を含むヘテロ二官能性リンカーと反応し得る。チオール官能基またはカルボン酸誘導体を含む生体分子は、マレイミド−ＧａＮ層（図７ｂ）またはアミノ層上に、このようにして容易に結合させることができる。
【００５５】
［利用］
図５に示す本発明の好ましい実施形態では、埋め込み可能なデバイスの基板１００は、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ／ＧａＮを含む第１の部分１１０を有する表面１０２を有し、ここでｘは０．００１〜０．９９９の範囲内の値である。Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ／ＧａＮの存在および割合ｘは、基板１００への細胞接着を選択的に増強すなわち促進する。
【００５６】
基板１００は平坦なものとして示されているが、任意の幾何学的形状で提供され得る。基板の用途に応じて形状は制約されるが、それは、一般的に当業者が過度の負担なしに適切に適合させることが可能な範囲の制約である。
【００５７】
部分１１０は、表面１０２の全体または基板のすべての表面を覆うことができる。あるいは、基板自体をバルクＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ／ＧａＮ材料として提供することができ、その上に異なる割合ｘの領域を設けて、その上の細胞接着および細胞成長速度を選択的に調整することができる。
【００５８】
図６に示す本発明の別の実施形態によれば、基板２００の表面２０２は、第１の部分２１０とは異なる第２の部分２２０を更に含む。第２の部分２２０は、基板２００への細胞接着を阻害し、窒化インジウム（ＩｎＮ）を含む。両方の材料が非毒性であるため、基板は試験管内および生体内の用途に使用することができる。例えば、基板は、神経細胞を含む細胞の増殖を局所的に増強する埋め込み可能なデバイスを作製するために使用可能である。
【００５９】
支持基板上に薄い（数ナノメートルから数マイクロメーターの厚さの範囲にある）層または厚い層ならびにＩｎＮおよび／またはＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎのパターンを形成する方法は、本明細書では詳細には説明されない。具体的には、選択的細胞接着促進経路すなわち表面のパターンが、そのパターンがなければ細胞接着が阻害される基板上に形成され得る。この目的のために、ＩｎＮからなる基板に対して、パターンを形成する経路または表面に沿ってＧａを局所的にドープしてもよい。
【００６０】
例示的な基板３００が図８ａの上面図に示されている。第１の細胞接着促進表面部分３１０は、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含み、第２の細胞接着阻害表面部分３２０は、ＩｎＮを含む。このような表面パターンは、異なる技術を用いて得ることができる。図８ｂは、図８ａに示す構造を得ることができる第１の例を示す側面図である。第２の細胞接着阻害表面部分３２０であるＩｎＮの第１の層は、基板３００上に設けられても、または形成されてもよい。基板は例えばサファイア製であり得る。更なるステップにおいて、第１の細胞接着促進表面部分３１０である所望の表面パターンに対応する位置に、ＩｎＮの層の上に形成された場合、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの付加層が形成される。このような層の形成を達成するための堆積方法、例えば金属有機化学気相堆積、ＭＯＣＶＤ、およびハードマスクの使用を含む堆積方法は、当該技術分野において周知である。
【００６１】
図８ｃは、図８ａに示された構造が得られる別の例を示す側面図である。先の実施例のサファイアに対応する支持基板３００上に、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの第１の層が設けられている。第１の層は、例えば４０００ｎｍの厚さを有し得る。ＩｎＮの第２の層は第１の層の上に形成され、第１の層を実質的に一体的に覆う。第２の層の厚さは、好ましくは第１の層の厚さよりも薄く、例えば約２００ｎｍでもよい。次いで、接触した細胞が付着すべき所望の表面パターン（３１０）が、ＩｎＮの薄層（３２０）を局所的に選択的に除去し、それによりその下に位置するＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの接着促進層を露出させることによって形成される。
【００６２】
本発明の一実施形態によれば、このように形成された積層体からの上部ＩｎＮ層の除去は、当技術分野で知られているリソグラフィ法を用いて選択的エッチングによって達成される。
【００６３】
代替的な実施形態によれば、上部ＩｎＮ層の除去は、イオンビームを用いた直接的なミリングによって達成される。この方法は、約１μｍのオーダーの微細な隆起部および溝を形成し、約２μｍの深さ／高さを有するパターンが達成可能であるという利点を提示する。
【００６４】
上述した技術を用いて、図９に示すように、埋め込み可能なデバイスの基板上にいくつかの表面パターンを形成することができる。表面パターンは、例えば、基板内／表面上に設けられた三次元構造の表面を含み得る。基板４００の第１の部分４１０によって提供されるパターンは、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ材料を含み、生物学的組織に直接接触するために使用され、例えば埋め込み可能デバイスの基材上の所定の方向に細胞成長を方向付けさせるために使用され得る。例えば、ｌｎ（ｘ）Ｇａ（ｉ−ｘ）Ｎの表面の第１の部分４１０は、生体適合性であるがそこへの細胞接着を促進しないＩｎＮのピラー４２０'または誘導壁構造４２０"によって局所的に区切られてもよい。第１の部分４１０に付着している細胞の細胞増殖は、細胞接着に物理的な制限を課す第２の部分の各構造４２０、４２０'、４２０"によって区切られた経路に沿って促進される。構造４２０、４２０'、４２０"によって誘導される細胞増殖の好ましい方向は矢印で示されている。
【００６５】
図１０は対応する実験結果を示す図であり、ヒト初代神経細胞（図に強調表示されている）が、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含む基板の第１の部分に付着しているところが示されている。神経細胞の軸索は、ＩｎＮのピラーの位置によって決定される方向に沿って成長する。
【００６６】
図１０の結果は、以下のプロトコルに従って得られている。パターン形成されたＩｎＧａＮ、ＧａＮ、またはＩｎＮ基板上の初代神経細胞の挙動を評価するために、ヒト初代ニューロン（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ（商標）、スペイン）を、パターン化要素を含む４８ウェル培養プレートに１２５０００細胞／ウェルで、製造者プロトコルに従って播種した。ウェルを１ｍｌの滅菌０．２％ゼラチン溶液で１時間被覆し、滅菌水溶液で３回洗浄した。異なる要素をエタノールで洗浄し、ＰＢＳでリンスし、ウェルに設置した。神経細胞成長補助剤（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ（商標）、スペイン）およびペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加した無血清神経栄養培地中の１ｍｌの細胞懸濁液を添加した。培養を確立した翌日、およびその後３日ごとに培地を新鮮な補充培地に交換した。培養８日後、要素をＰＢＳで３回洗浄し、カコジル酸ナトリウム中の２．５％グルタルアルデヒドを用いて室温で１時間かけて固定した。カコジル酸ナトリウムで３回洗浄した後、要素をエタノール（５０％、７０％および無水エタノール）中で脱水し、１００％エタノール中に保存した。培養培地中のゼラチン放出に関連する可能性のあるゼラチン・プレコートの効果を排除するために、実験は、パターン化されていない要素上にプレコートすることなく、９６ウェルプレート中の神経細胞の継代培養を用いて行った。２３５００個の細胞を補充した神経細胞培地２００μｌに播種して８日間おき、前述のように固定し、乾燥させた。要素は、最終的に走査型電子顕微鏡を用いて視覚化した。
【００６７】
本発明の更なる実施形態によれば、生物学的細胞または組織に直接接触するために使用されるＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含む部分を有する少なくとも１つの表面を備える基板を含む埋め込み可能な電子デバイスが提供される。Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎを含む表面の部分は、デバイスの半導体構成要素を画定し、そのバンドギャップは、Ｉｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ材料中のＧａの割合の関数である。従って、半導体構成要素の感度は、Ｇａの割合を調節することによって調整することができる。
【００６８】
移植可能な装置は、当業者には周知の信号処理手段等の信号処理手段を備え、この手段については本明細書では詳細には説明しない。信号処理手段は、半導体構成要素から受信され／または同要素に送信される信号を増幅またはフィルタリングするための手段を含むことができる。信号処理手段は、生体組織と直接接触するＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎの表面部分によって実現される半導体構成要素に動作可能に接続される。
【００６９】
従って、基板表面のＩｎ（ｘ）Ｇａ（１−ｘ）Ｎ部分は、細胞または組織によって発せされた信号を信号処理手段に伝達するか、または処理された信号を細胞または組織に伝達するために使用され得る。後者の場合、埋め込み可能なデバイスは、調整可能な電圧源または電流源などの信号生成手段と、信号処理経路への入力としての適切な制御／処理手段とを更に備えていてもよい。このような手段は当業者には公知である。
【００７０】
好ましい実施形態では、埋め込み可能なデバイスは、接触した細胞／組織に接触し、選択的に刺激および／またはモニタリングするために、好ましくはその縁に配置された少なくとも１つの電極を含む。
【００７１】
埋め込み可能なデバイスは、埋め込まれたデバイスへの信号、またはそれから受信した信号を処理または送信するために、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）、または単一ゲート極トランジスタ（ＳＥＴ）などの機能化された半導体を更に含むことができる。前記構成要素は、好ましくは、埋め込み可能なデバイスの共通基板上に設けられる。好ましい実施形態では、埋め込み可能なデバイスは、脳−機械インタフェースの生体内構成要素であり得る。
【００７２】
本発明の範囲内の様々な変更および修正は当業者には明らかであることから、特定の好ましい実施形態の詳細な説明は、例示のためだけに与えられていることを理解されたい。別段の指定がない限り、本発明の記載された実施形態の特徴は、他の実施形態の文脈で説明された特徴と組み合わせることができる。本発明の範囲は、特許請求の範囲の請求項の記載によって特定される。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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