(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブを用いる標的遺伝子の塩基多型検出のための融解曲線分析方法であって、前記ＰＮＡプローブは、二つの負電荷を持つアミノ酸の側鎖が二つの塩基を挟んでＰＮＡプローブと結合していることを特徴とする融解曲線分析方法。
【請求項２】
前記ＰＮＡプローブは、インターカレーティング蛍光物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の融解曲線分析方法。
【請求項３】
前記負電荷を持つアミノ酸の側鎖は、ＰＮＡプローブのＰＮＡ骨格のアルファ、ベータ、若しくはガンマ位に結合することを特徴とする請求項１又は２に記載の融解曲線分析方法。
【請求項４】
検体試料から標的ＤＮＡを分離するステップと、
レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブと標的ＤＮＡを混成化するステップと、
温度を変化させながら前記混成化された生成物を融解させて融解曲線を得るステップと、前記得られた融解曲線を分析するステップと、を含む標的ＤＮＡの塩基多型分析方法であって、前記ＰＮＡプローブは、二つの負電荷を持つアミノ酸の側鎖が二つの塩基を挟んでＰＮＡプローブと結合していることを特徴とする塩基多型分析方法。
【請求項５】
レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブの融解曲線分析法を用いた標的遺伝子の塩基多型分析用キットであって、前記ＰＮＡプローブは、二つの負電荷を持つアミノ酸の側鎖が二つの塩基を挟んでＰＮＡプローブと結合していることを特徴とするキット。
【請求項６】
前記キットは多重標的ＤＮＡまたは単一標的ＤＮＡの塩基多型を分析するためであることを特徴とする請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の塩基多型を検出するための変形されたＰＮＡプローブ、レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブを用いた融解曲線分析方法、これを用いた標的遺伝子の塩基多型を分析する方法、およびＰＮＡプローブを含む標的遺伝子の塩基多型検出用キットに関し、より詳細には、前記ＰＮＡプローブが負電荷分子を含むことを特徴とする融解曲線分析方法、融解曲線分析による塩基多型分析方法および塩基多型分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一塩基多型（ＳＮＰ、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）は、ＤＮＡ塩基配列において一つの塩基配列が置換されて現れる遺伝的変異であり、病気の原因または治療剤に対する反応など、各々の人に応じて個人差をもたらす。一塩基多型の検出と確認は、オーダーメイド医薬だけでなく、新薬開発にもつながることから関心が集中している。
【０００３】
一塩基多型の迅速な検出のために、リアルタイムＰＣＲ技術を応用した様々な検出方法が使用されている。代表的には、ＤＮＡインターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光物質を使用して分析する方法、ＤＮＡプローブを用いる方法、またはＰＮＡプローブを用いる方法などがある。
【０００４】
ＤＮＡインターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光物質を使用した一塩基多型分析法は、ＰＣＲ反応後、生成物に対する更なる操作を行うことなく、ＤＮＡインターカレーティング蛍光物質の飽和濃度によってＰＣＲアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の塩基変化を区別することができる。しかし、ＤＮＡインターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光物質を使用するにあたり制約があり、一回に一つの一塩基多型のみを分析することができ、融解曲線を分析するためのプログラムを使用しなければならないという欠点を有する［Ｋｉｒｋ  Ｍ．Ｒｉｒｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ２４５：１５４１６０，１９９７；Ｕ．Ｈｌａｄｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２：１０５１０８，２００２］。
【０００５】
融解曲線分析のために使用されるＤＮＡプローブは、ＭＧＢタックマン（Ｔａｑｍａｎ）プローブ、分子ビーコン（ＭＢ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）、両面（Ｂｉｎａｒｙ）プローブがある。これらの方法は、優れた一塩基多型の区別能を示すという利点がある一方、ＤＮＡプローブの最小長さが２０〜４０ｍｅｒ程度に長く、互いに隣接して存在する一塩基多型は、一つの反応で検出することが困難であるという欠点がある［Ｈｉｄｅｆｕｍｉ  Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２９２４‐２９２９，２００５；Ｍａｎｎａ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ  ３６：３，２００２］。
【０００６】
負電荷分子を含むことを特徴とするＰＮＡプローブを用いた融解曲線分析法は、既存のＰＮＡプローブより迅速且つ強く標的ＤＮＡと結合することができ、強い結合によって短い長さのプローブを使用することができ、互いに隣接して存在する一塩基多型の検出が可能であるという利点を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ５０：４８１‐４８９，２００４
【非特許文献２】Ｍ  Ｂｅａｕ-Ｆａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  １００：９８５‐９９２，２００９
【発明の要約】
【０００８】
本発明の目的は、標的遺伝子の塩基多型を検出するためのＰＮＡプローブを提供することにある。特に、前記ＰＮＡプローブは、負電荷分子を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ＰＮＡプローブを用いた標的遺伝子の塩基多型検出のための融解曲線分析方法およびこれを含む塩基多型分析方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＮＡプローブを含む標的遺伝子の塩基多型検出用キットを提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰＮＡプローブが標的ＤＮＡと結合した模式図および融解曲線グラフであり、（ａ）は負電荷を有するアミノ酸の側鎖を結合したＰＮＡプローブを使用した場合を示し、（ｂ）は変形されていないＰＮＡプローブを使用した場合を示す。
【図２】ＰＮＡプローブと、一塩基多型がある異型接合（Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）試料との結合による融解曲線グラフを示しており、（ａ）は変形されていないＰＮＡプローブと表２における配列番号１０、１１のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｂ）はガンマグルタミン酸を結合したＰＮＡプローブと表２における配列番号１０、１１のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｃ）は変形されていないＰＮＡプローブと表２における配列番号１０、１２のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｄ）はガンマグルタミン酸を結合したＰＮＡプローブと表２における配列番号１０、１２のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｅ）は変形されていないＰＮＡプローブと表２における配列番号１０、１３のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｆ）はガンマグルタミン酸を結合したＰＮＡプローブと表２における配列番号１０、１３のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示す。
【図３】ＰＮＡプローブと、一塩基多型がある異型接合試料との結合による融解曲線グラフを示しており、（ａ）はガンマグルタミン酸を結合していないＰＮＡプローブの場合を示し、（ｂ）は二つのガンマグルタミン酸が二つの塩基を挟んで結合したＰＮＡプローブの場合を示し、（ｃ）は二つのガンマグルタミン酸が塩基を挟むことなく連続して結合したＰＮＡプローブの場合を示し、（ｄ）は二つのガンマグルタミン酸が一つの塩基を挟んで結合したＰＮＡプローブの場合を示す。
【図４】ガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブが多重検出されることを示し、黒色線は配列番号２のＰＮＡプローブによる融解曲線、青色線は配列番号７のＰＮＡプローブによる融解曲線、赤色線は配列番号８のＰＮＡプローブによる融解曲線を示しており、（ａ）はガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブとそれぞれのプローブと相補結合をする標的ＤＮＡオリゴマーからなる同型接合試料と実験を行った場合を示し、（ｂ）はガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブとそれぞれのプローブと一塩基多型があり、不完全相補結合をする標的ＤＮＡオリゴマーからなる同型接合試料と実験を行った場合を示し、（ｃ）はガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブとそれぞれのプローブと前記の（ａ）、（ｂ）で使用された標的ＤＮＡオリゴマーを１：１の割合で混合した異型接合試料と実験を行った場合を示す。
【図５】ガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブが、一塩基多型が互いに隣接して位置した場合に多重検出を行うことを示す図であり、黒色線は配列番号２のＰＮＡプローブによる融解曲線、青色線は配列番号７のＰＮＡプローブによる融解曲線、赤色線は配列番号８のＰＮＡプローブによる融解曲線を示しており、（ａ）はガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブと表２における配列番号１９のＤＮＡオリゴマーを使用した場合を示し、（ｂ）はガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブと表２における配列番号２０のＤＮＡオリゴマーを使用した場合を示し、（ｃ）はガンマグルタミン酸が結合した三つのＰＮＡプローブと表２における配列番号１９、２０のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合して使用した場合を示す。
【図６】ＰＮＡプローブと、一塩基多型がある様々な異型接合試料との結合による融解曲線グラフを示す図であり、（ａ）は表１における配列番号９のＰＮＡプローブと表２における配列番号２１、２２のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｂ）は表１における配列番号９のＰＮＡプローブと表２における配列番号２５、２６のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｃ）は表１における配列番号９のＰＮＡプローブと表２における配列番号２１、２３のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｄ）は表１における配列番号９のＰＮＡプローブと表２における配列番号２５、２７のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｅ）は表１における配列番号９のＰＮＡプローブと表２における配列番号２１、２４のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示し、（ｆ）は表１における配列番号９のＰＮＡプローブと表２における配列番号２５、２８のＤＮＡオリゴマーを１：１で混合した試料を使用した場合を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
本発明は、標的遺伝子の塩基多型を検出するためのレポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブを提供する。
【００１３】
前記ＰＮＡプローブは、負電荷分子を含むことを特徴としており、前記負電荷分子は、リン酸、カルボン酸、スルホン酸、硝酸、ホウ酸系のすべての酸の群から選択される少なくとも一つ以上であってもよい。
【００１４】
また、前記負電荷分子は、ＰＮＡプローブのＮ末端、Ｃ末端またはＰＮＡ骨格のアルファ、ベータ、ガンマ位に結合することができ、少なくとも一つ以上の負電荷分子が連続的、断続的にプローブの塩基に結合することができる。
【００１５】
本発明は、レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブを用いる融解曲線分析方法を提供する。
【００１６】
前記融解曲線分析方法に用いられるＰＮＡプローブは、負電荷分子を含むことを特徴としており、負電荷が含まれたＰＮＡプローブを用いることに伴い融解曲線解像度が増加することから異型接合試料の分析において容易である。
【００１７】
本発明に係る負電荷分子を含むＰＮＡプローブは、リン酸、カルボン酸、スルホン酸、硝酸、ホウ酸系のすべての酸の群から選択される一つ以上の負電荷分子を含むことができる。負電荷分子は、ＰＮＡプローブのＮ末端、Ｃ末端またはＰＮＡ骨格のアルファ、ベータ、ガンマ位に結合することができ、少なくとも一つ以上の負電荷分子が連続的、断続的にプローブの塩基に結合することができる。
【００１８】
また、前記ＰＮＡプローブは、蛍光物質を含むことができる。蛍光物質は、レポーターおよびクエンチャーであってもよく、インターカレーティング蛍光物質であってもよい。
【００１９】
本発明は、負電荷分子を含むＰＮＡプローブを用いた標的遺伝子の塩基多型分析方法を提供する。
【００２０】
前記標的遺伝子の塩基多型分析方法は、融解曲線分析を用いることができる。
【００２１】
ＰＮＡは、ＤＮＡよりも、熱および生物学的安定性と標的ＤＮＡに対する認識能力および結合能力に優れており、一塩基多型を検出するリアルタイムＰＣＲ技術のプローブとして使用することができる。しかし、リアルタイムＰＣＲ方法は、試料内の標的ＤＮＡを検出するにあたり蛍光物質を使用することから、一箇所の一塩基変異を検出するためには、二つの互いに異なる波長の蛍光物質を有するプローブが必要となるという問題がある。これは、多重検出（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を行うにあたり大きな制限事項として作用し、かかる問題は、本発明では、蛍光プローブの融解曲線分析により解決することができる。しかし、変形されていないＰＮＡプローブを使用して融解曲線分析を行う場合に、融解曲線グラフのピーク半値半幅（ｈａｌｆ  ｗｉｄｔｈ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍｕｍ）が広く、異型接合試料の場合、結果の分析が明確でないという欠点がある。これに対し、本発明者らは、ＰＮＡプローブの基本骨格に負電荷を有するアミノ酸の側鎖を結合して、温度が高くなるにつれてＰＮＡプローブと標的ＤＮＡが迅速に解離され、融解曲線の分析を明確にすることができた。これに関する簡単な模式図を図１に示す。
【００２２】
本発明に係るＰＮＡプローブは、融解曲線グラフのピーク半値半幅（ｈａｌｆ  ｗｉｄｔｈ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍｕｍ）が狭いという特徴から、下記の例のような様々な分子診断技術に適用することができる。例えば、短い塩基配列内で様々な位置のコドンにおいて塩基多型が発生した場合に、融解曲線の解像度が高いことから、一箇所で塩基多型が発生したか、二箇所または様々な位置で塩基多型が発生したかについて、一つのＰＮＡプローブを用いて検出することができる。また、融解曲線の解像度が高いことから、塩基多型が発生した位置の塩基に応じて融解曲線が互いに区分され、これにより、変異が生じた塩基配列をシーケンシング分析のような別の分析を行うことなく、簡単に塩基配列を知ることができる。
【００２３】
本発明に係るＰＮＡプローブを用いる塩基多型検出のための融解曲線分析方法は、融解曲線解像度が増加するにつれて塩基多型の多重検出が可能となり、また、一塩基多型が互いに隣接して存在する場合にも多重検出を可能にすることができる。
【００２４】
また、本発明に係る負電荷を有するアミノ酸の側鎖を結合したＰＮＡプローブだけでなく、標的ＤＮＡの一塩基多型位置以外の他の位置に不完全相補結合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）をなす塩基を導入した場合にも類似の効果を得ることができる。
【００２５】
本発明は、検体試料から標的ＤＮＡを分離するステップと、レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブと標的ＤＮＡを混成化するステップと、温度を変化させながら前記混成化された生成物を融解させて融解曲線を得るステップと、前記得られる融解曲線を分析するステップと、を含む標的ＤＮＡの塩基多型分析方法を提供する。
【００２６】
前記標的遺伝子の塩基多型分析方法および融解曲線分析方法で用いられるＰＮＡプローブは、負電荷分子を含むことを特徴としており、負電荷分子を含むＰＮＡプローブは、リン酸、カルボン酸、スルホン酸、硝酸、ホウ酸系のすべての酸の群から選択される一つ以上の負電荷分子を含むことができる。負電荷分子は、ＰＮＡプローブのＮ末端、Ｃ末端またはＰＮＡ骨格のアルファ、ベータ、ガンマ位に結合することができ、少なくとも一つ以上の負電荷分子が連続的、断続的にＰＮＡプローブの各塩基に結合することができる。
【００２７】
また、本発明に係る前記塩基多型分析方法および融解曲線分析方法で用いられるＰＮＡプローブは、蛍光物質を含むことができる。前記プローブは、両末端にレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とレポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）することができるクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）の蛍光物質が結合することができ、インターカレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光物質を含むことができる。前記レポーターは、ＦＡＭ（６‐ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５、ＣＹ３からなる群から選択される一つ以上であってもよく、前記クエンチャーは、ＴＡＭＲＡ（６‐ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＤａｂｙｓｙｌを使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。前記インターカレーティング蛍光物質は、アクリジンホモダイマー（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）およびその誘導体、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）およびその誘導体、７‐アミノアクチノマイシンＤ（７‐ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ、７‐ＡＡＤ）およびその誘導体、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）およびその誘導体、ＡＣＭＡ（９‐ａｍｉｎｏ‐６‐ｃｈｌｏｒｏ‐２‐ｍｅｔｈｏｘｙａｃｒｉｄｉｎｅ）およびその誘導体、ＤＡＰＩおよびその誘導体、ジヒドロエチジウム（Ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ）およびその誘導体、臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）およびその誘導体、エチジウムホモダイマー‐１（ＥｔｈＤ‐１）およびその誘導体、エチジウムホモダイマー‐２（ＥｔｈＤ‐２）およびその誘導体、エチジウムモノアジド（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｍｏｎｏａｚｉｄｅ）およびその誘導体、よう化ヘキシジウム（Ｈｅｘｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）およびその誘導体、ビスベンズイミド（ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）およびその誘導体、ヘキスト３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）およびその誘導体、ヘキスト３４５８０（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０）およびその誘導体、ヒドロキシスチルバミジン（ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ）およびその誘導体、ＬＤＳ７５１およびその誘導体、よう化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ＰＩ）およびその誘導体、Ｃｙ‐ｄｙｅｓ誘導体からなる群から選択されることができる。
【００２８】
前記標的遺伝子の塩基多型分析方法で用いられる負電荷分子が結合したＰＮＡプローブは、レポーターおよびクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）を含むことができる。前記負電荷分子とレポーターおよびクエンチャーが含まれたＰＮＡプローブは、標的ＤＮＡと混成化した後に蛍光信号が発生し、温度が上がるにつれて負電荷効果によってプローブの最適融解温度で標的ＤＮＡと迅速に融解されて蛍光信号が消光され、前記負電荷が含まれたＰＮＡプローブは、負電荷のないＰＮＡプローブに比べて標的ＤＮＡとの解離が速く、融解曲線の解像度を増加させる。かかる温度変化による前記蛍光信号から得られた高解像度の融解曲線分析により標的ＤＮＡの塩基多型を分析することができる。
【００２９】
また、標的遺伝子の塩基多型分析方法で用いられる負電荷分子が結合したＰＮＡプローブは、インターカレーティング蛍光物質を含むことができる。負電荷分子とインターカレーティング蛍光物質が結合したプローブは、標的ＤＮＡと混成化した後、蛍光信号が発生し、負電荷効果によってプローブの最適融解温度で標的ＤＮＡと迅速に融解されて信号が消光され、前記蛍光信号の温度に応じて得られた高解像度の融解曲線分析により標的ＤＮＡの塩基多型を分析することができる。
【００３０】
また、本発明に係る標的遺伝子の塩基多型分析方法は、インターカレーティング蛍光物質がプローブに直接的な結合なく蛍光信号検出を用いて得られた融解曲線を分析することを含むことができる。
【００３１】
本発明は、レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブの融解曲線分析法を用いた標的遺伝子の塩基多型分析用キットを提供する。
【００３２】
前記ＰＮＡプローブは、負電荷を含むことを特徴としており、また、前記キットは、レポーターおよびクエンチャーが結合したＰＮＡプローブを含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】
前記塩基多型分析用キットは、多重標的ＤＮＡまたは単一標的ＤＮＡの塩基多型を分析するために用いることができる。
【００３４】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００３５】
実施例１：融解曲線分析実験に使用されたＰＮＡプローブおよび標的ＤＮＡオリゴマー合成および融解曲線分析方法
本発明における融解曲線分析のために、表１のようなＰＮＡプローブを合成し使用した。
【００３６】
【表１】
0006523429.tif 000002
【００３７】
前記表１において、Ｏはリンカー、太字はガンマグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）‐ＰＮＡモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）、Ｋはリジン（ｌｙｓｉｎｅ）を意味する。
【００３８】
ＰＮＡプローブは、韓国登録特許第４６４，２６１号に記載の方法によりＰＮＡオリゴマーをベンゾチアゾールスルホニル（Ｂｔｓ：Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）基で保護されたＰＮＡモノマーと官能化された樹脂から固相合成法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）で合成した［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，９：３２９１‐３２９３，２００７］。この方法の他にも、公知の９‐フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ：９‐ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）またはｔ‐Ｂｏｃ（ｔｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）合成法を使用してＰＮＡを合成することもできる［Ｋｉｍ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５７６７‐５７７３、１９９４；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１：６１７９‐６１９４，１９９５］。レポーター物質および消光物質は、当業界において広く公知となっている方法によりＰＮＡプローブに標識した。
【００３９】
前記のＰＮＡプローブと結合をなす標的ＤＮＡオリゴマーは、表２のように（株）バイオニア（韓国）に合成を依頼して使用した。
【００４０】
【表２】
0006523429.tif 000003
【００４１】
前記の表１に記載のＰＮＡプローブ１．２５μＭ、表２に記載のＤＮＡオリゴマー０．２５μＭとＰＣＲ増幅液（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ社製、韓国）を入れて混合した後、リアルタイム遺伝子増幅器（Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ，ＣＦＸ９６ＴＭ  Ｒｅａｌ‐ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社製、米国）を用いて９５℃で５分間反応させた。次に、４０℃まで１秒当たり０．１℃の速度で温度を下げてから５分間維持した後、４０℃から９５℃まで０．５℃ずつ上昇させて蛍光を測定する融解曲線分析を行った。
【００４２】
実施例２：ガンマグルタミン酸が結合したＰＮＡプローブを用いた一塩基多型がある異型接合試料の融解曲線分析
ガンマグルタミン酸が結合したＰＮＡプローブと変形されていないＰＮＡプローブとの融解曲線の差を比較するために、表１における配列番号１、２のＰＮＡプローブを表２における配列番号１０と配列番号１１〜１２〜１３のいずれか一つを１：１の割合で混合したオリゴマーとそれぞれ前記の実施例１の方法を用いて実験を行い、融解曲線を分析した。
【００４３】
その結果を図２に示す。ガンマグルタミン酸が結合したＰＮＡプローブ、すなわち負電荷分子が導入されたＰＮＡプローブを使用した場合に、負電荷効果によって温度の上昇に伴う標的ＤＮＡとの解離が迅速に行われて、一塩基多型がある異型接合試料で融解曲線の解像度が著しく増加することを確認することができた。
【００４４】
実施例３：ＰＮＡプローブに結合したガンマグルタミン酸の位置による一塩基多型がある異型接合試料の融解曲線分析
ＰＮＡプローブに結合した負電荷分子であるガンマグルタミン酸の位置による融解曲線の差を比較するために、表１における配列番号３、４、５、６のＰＮＡプローブを表２における配列番号１３、１４のＤＮＡオリゴマーを１：１の割合で混合した試料とそれぞれ前記の実施例１の方法を用いて融解曲線を分析した。その結果を図３に示す。
【００４５】
二つのガンマグルタミン酸が二つの塩基を挟んで結合したＰＮＡプローブを使用した場合に、一塩基多型がある異型接合試料で二つの融解曲線が最も明確に分離された。
【００４６】
実施例４：ガンマグルタミン酸が結合した互いに異なる三つのＰＮＡプローブを用いてＰＮＡプローブと三つの互いに異なる同型接合試料または一塩基多型を含む異型接合試料における融解曲線分析
前記の実施例２を多重検出に適用することができるか否かを確認した。表１における配列番号２のＰＮＡプローブと表２における配列番号１０〜１１または両方を１：１の割合で混合した標的オリゴマーとの組み合わせ、表１における配列番号７のＰＮＡプローブと表２における配列番号１５〜１６または両方を１：１の割合で混合した標的オリゴマーとの組み合わせ、また、表１における配列番号８のＰＮＡプローブと表２における配列番号１７〜１８または両方を１：１の割合で混合した標的オリゴマーとの組み合わせを前記の実施例１の方法を用いて実験を行い、融解曲線を分析した。
【００４７】
その結果を図４に示す。ガンマグルタミン酸が結合したＰＮＡプローブを用いて多重検出も可能であることを確認した。
【００４８】
実施例５：ガンマグルタミン酸が結合した互いに異なる三つのＰＮＡプローブを用いて三つの互いに異なる一塩基多型が互いに隣接して存在する異型接合試料における融解曲線の分析
前記の実施例４で確認した多重検出能力が一塩基多型が互いに隣接して存在する場合にも可能であるかを確認した。表１における配列番号２、７、８のＰＮＡプローブを表２における配列番号１９〜２０または両方を１：１の割合で混合した標的オリゴマーと前記の実施例１の方法を用いて実験を行い、融解曲線を分析した。
【００４９】
その結果を図５に示す。ガンマグルタミン酸が結合したＰＮＡプローブを用いて、一塩基多型が互いに隣接して存在する場合にも多重検出も可能であることを確認した。
【００５０】
実施例６：標的ＤＮＡの一塩基多型位置以外の他の位置に不完全相補結合をなす塩基を導入したＰＮＡプローブを用いた一塩基多型がある異型接合試料における融解曲線分析
標的ＤＮＡの一塩基多型位置以外の他の位置に不完全相補結合をなす塩基を導入したＰＮＡプローブの効果を確認するために、表１における配列番号９のＰＮＡプローブを表２における配列番号２１と配列番号２２〜２３〜２４のいずれか一つと１：１の割合で混合した標的オリゴマー、また、配列番号２５と配列番号２６〜２７〜２８のいずれか一つと１：１の割合で混合した標的オリゴマーとそれぞれ前記の実施例１の方法を用いて実験を行い、融解曲線を分析した。
【００５１】
その結果を図６に示す。標的ＤＮＡの一塩基多型位置以外の他の位置に不完全相補結合をなす塩基を導入したＰＮＡプローブも一塩基多型がある異型接合試料において二つの融解曲線が明確に分離されることを確認した。
【００５２】
本発明において開発されたＰＮＡ蛍光プローブは、実施例で明確にした融解曲線分析方法だけでなく、蛍光プローブを使用して標的ＤＮＡを分析することができるすべての方法、例えば、リアルタイムＰＣＲ方法に用いられることができるが、これは一例であって、これに限定されるものではなく、他の可能なすべての方法に使用可能であることは、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者にとって自明である。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係るＰＮＡプローブは、基本骨格に負電荷を有するアミノ酸の側鎖を結合することにより、標的ＤＮＡに対する高い認識能力および結合能力を有するとともに、熱によって迅速に解離されることができる。したがって、本発明における負電荷を含むＰＮＡプローブを用いる塩基多型分析方法は、二つの融解曲線グラフが示される異型接合試料においても分析が比較的容易であり、また、互いに隣接した二つ以上の一塩基多型を同時に分析することができるという利点を有する。ここで、融解曲線分析の容易性は、異型接合試料でのみ限定されるものではなく、同型接合（Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）試料でも全て適用可能である。
【００５４】
以上、本発明における内容の特定の部分について詳細に記述しており、当業界における通常の知識を有する者にとってかかる具体的技術は、単に好ましい実施様態であって、これにより本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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