(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡスプリントリガーゼと、
少なくとも１つのスプリントＲＮＡと
を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド断片を連結するための方法に使用される組成物であって、
前記ＲＮＡスプリントリガーゼは、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、ここで前記方法は、
（ａ）前記組成物と前記スプリントＲＮＡに対するスプライス部位における相補性領域を有するＤＮＡポリヌクレオチド断片とを一緒にし、そして
（ｂ）前記ＤＮＡポリヌクレオチド断片を連結して単一のポリヌクレオチドを形成すること
を含み、
前記ＲＮＡスプリントリガーゼを使用する連結は、同じ反応条件下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用する場合より少なくとも５倍速い、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのスプリントＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、二本鎖ＤＮＡ、部分的に二本鎖であるＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＲＮＡスプリントリガーゼがビーズ上に固定化されている、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
ＲＮＡスプリントリガーゼが耐熱性である、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、１μＭ〜１．５ｍＭ  ＡＴＰを含むバッファー中に存在する、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ＤＮＡポリヌクレオチド断片を連結するための方法であって、
（ａ）以下の（i）〜（iii）：
（i）少なくとも１つのスプリントＲＮＡ；
（ii）配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡスプリントリガーゼ；及び
（iii）前記スプリントＲＮＡに対するスプライス部位における相補性領域を有する、ＤＮＡポリヌクレオチド断片
を一緒にして、混合物を形成し；そして
（ｂ）前記ＤＮＡポリヌクレオチド断片を連結して単一のポリヌクレオチドを形成すること
を含み、
前記ＲＮＡスプリントリガーゼを使用する連結は、同じ反応条件下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用する場合より少なくとも５倍速い、方法。
【請求項８】
（ａ）請求項２から６のいずれか１項に記載の組成物を２つのＤＮＡポリヌクレオチドと一緒にし、ここで、ＤＮＡポリヌクレオチドの少なくとも一部は組成物中の少なくとも１つのスプリントＲＮＡに対するスプライス部位における相補性領域を有し、
（ｂ）２つのＤＮＡポリヌクレオチドが連結して単一ポリヌクレオチドを形成すること
を含む、一本鎖ポリヌクレオチド断片を連結するための方法。
【請求項９】
少なくとも１μＭ〜１．５ｍＭ  ＡＴＰを含有するバッファー中で連結反応を行うことを更に含む、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）が少なくとも７０％〜９０％のポリヌクレオチド連結を達成するために６時間未満にわたってインキュベートすることを更に含む、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）が少なくとも７０％〜９０％のポリヌクレオチド連結を達成するために１時間未満にわたってインキュベートすることを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡスプリントリガーゼを使用する連結が、同じポリヌクレオチドを使用する同じ反応条件下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用する場合より迅速に生じる、請求項７から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡスプリントリガーゼを使用する連結反応が、同じポリヌクレオチドを使用する同じ反応条件下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用する場合より少なくとも１０倍速い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
スプライス化ＤＮＡポリヌクレオチドが定量的ＰＣＲのための鋳型であり、スプライス化ＤＮＡポリヌクレオチドの増幅が、ＲＮＡスプリントリガーゼがＴ４  ＤＮＡリガーゼで置換された場合に認められるものより低い、非鋳型ポリヌクレオチドのバックグラウンド増幅を与える、請求項７から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ｍＲＮＡをそのスプライシング履歴に関して分析するための方法であって：
（ａ）前記ｍＲＮＡを、それに対するスプライス部位における相補性領域を有するＤＮＡポリヌクレオチド断片及び配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＲＮＡスプリントリガーゼと一緒にし、
（ｂ）前記ＤＮＡポリヌクレオチド断片を連結して単一のポリヌクレオチドを形成し、
（ｃ）単一のポリヌクレオチドを増幅し、そして
（ｄ）増幅産物を検出し、場合により定量すること、
によりスプライス部位、スプライス部位におけるスプライシング変異体または突然変異を特定することを含む、方法。
【請求項１６】
（ａ）スプリントＲＮＡに連結結合部において相補的である領域を有するポリヌクレオチドをアニーリングし、
（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＲＮＡスプリントリガーゼを使用してポリヌクレオチドを互いに連結し、
（ｃ）連結産物を増幅し、
（ｄ）増幅産物を検出し、場合により定量することを含む、
ＲＮＡ配列を検出するための方法。
【請求項１７】
スプリントＲＮＡがマイクロＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規リガーゼ活性に関する。
【背景技術】
【０００２】
相補的ＲＮＡによりスプリント（ｓｐｌｉｎｔ）された一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドの連結はＲＮＡ媒介性アニーリング、選択および連結（ＲＡＳＬ）のような技術における必須工程である。ＲＡＳＬには、そして他のＲＮＡ分析および検出技術、例えば分子反転プローブ、修飾リガーゼ鎖反応およびリガーゼ検出反応には、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが使用されている（例えば、Ｙｅａｋｌｅｙら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（４）：３５３−８（２００２），ＢｕｌｌａｒｄおよびＢｏｗａｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３９８（１）：１３５−４４（２００６）；Ｌｉら，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：Ｕｎｉｔ  ４．１３．１−９（２０１２）；米国公開出願第２０１１／００９２３７５号，米国特許第７，３６１，４８８号；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：７１（２０００）；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，２０８５−２０８８（１９９４）；Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，１：５−１６（１９９１）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１５：７６１−７６５（１９９３）；Ｗｉｅｄｍａｎｎら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３：Ｓ５１−６４（１９９４）；Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：２５２−２５５（１９９７）；Ｂａｎｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：５０７３−５０７８（１９９３）；Ｈａｒｄｅｎｂｏｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：６７３−６７８（２００３）；ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７５：７８７−７９７（２００４））。
【０００３】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの働きは乏しく、アデニル化ＤＮＡ副産物の優先的形成を克服して連結を達成するためには、例えば、長いインキュベーション時間、高濃度のリガーゼおよび低いＡＴＰ濃度を要する。
【０００４】
ＲＮＡ鋳型またはスプリントにハイブリダイズしたＤＮＡ鎖を連結するためのもう１つの選択肢として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼが試験された（米国特許第６，３６８，８０１号）。メラノプルス・サングイニペス・エントモポックスウイルス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）からのＮＡＤ＋依存的リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに類似した、ＲＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡに対する連結活性を有するが、これはＭｎ２＋の存在下に限られることが報告された（Ｌｕら，Ｂｉｏｃｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７０１：３７−４８（２００４））。Ｓｒｉｓｋａｎｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（１５）：３５３６−３５４１（１９９８）はパラメシウム・ブルサリア・クロレラ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ  Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスからのＰＢＣＶ−１  ＤＮＡリガーゼを報告しており、ここで、このリガーゼはＤＮＡ鋳型またはＤＮＡスプリント上のオリゴヌクレオチドを連結しうるが、ＲＮＡ鋳型またはＲＮＡスプリント上のオリゴヌクレオチドを連結し得ないことを実験データは示した。これらの結果は結晶構造研究により説明され、ここで、ＰＢＣＶ−１リガーゼはニック化基質の一方の側では基質をＲＮＡ型Ａ形ヘリックスへと強要するが、５’ホスファートを与えるニックの側ではＤＮＡ型Ｂ形へリックを要することを、該著者は示した（Ｈｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（３）：１９３１（１９９７）；Ｓｒｉｓｋａｎｄａら，（１９９８）；Ｎａｉｒら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：７７０−７７８（２００７））。ＮＡＤ依存的大腸菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼの結晶構造（Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２６：２５７−２７１（２００７））およびヒトＤＮＡリガーゼ１（Ｐａｓｃａｌら，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：４７３−４７８（２００４））において、類似した結果が報告され、これらのリガーゼは連結基質としてＲＮＡスプリント化ＤＮＡを受容し得ないという結論が得られた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／００９２３７５号明細書
【特許文献２】米国特許第７，３６１，４８８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３６８，８０１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｅａｋｌｅｙら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（４）：３５３−８（２００２）
【非特許文献２】ＢｕｌｌａｒｄおよびＢｏｗａｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３９８（１）：１３５−４４（２００６）
【非特許文献３】Ｌｉら，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：Ｕｎｉｔ  ４．１３．１−９（２０１２）
【非特許文献４】Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：７１（２０００）
【非特許文献５】Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，２０８５−２０８８（１９９４）
【非特許文献６】Ｂａｒａｎｙ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，１：５−１６（１９９１）
【非特許文献７】Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１５：７６１−７６５（１９９３）
【非特許文献８】Ｗｉｅｄｍａｎｎら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．，３：Ｓ５１−６４（１９９４）
【非特許文献９】Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．，１６：２５２−２５５（１９９７）
【非特許文献１０】Ｂａｎｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：５０７３−５０７８（１９９３）
【非特許文献１１】Ｈａｒｄｅｎｂｏｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：６７３−６７８（２００３）
【非特許文献１２】Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７５：７８７−７９７（２００４）
【非特許文献１３】Ｌｕら，Ｂｉｏｃｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７０１：３７−４８（２００４）
【非特許文献１４】Ｓｒｉｓｋａｎｄａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６（１５）：３５３６−３５４１（１９９８）
【非特許文献１５】Ｈｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（３）：１９３１（１９９７）
【非特許文献１６】Ｎａｉｒら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：７７０−７７８（２００７）
【非特許文献１７】Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２６：２５７−２７１（２００７））
【非特許文献１８】Ｐａｓｃａｌら，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：４７３−４７８（２００４）
【発明の概要】
【０００７】
一般に、１つの態様においては、ＲＮＡスプリントリガーゼと、少なくとも８ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つのポリヌクレオチドとをバッファー中に含む組成物を提供する。１つの態様においては、ＲＮＡスプリントリガーゼは耐熱性である。もう１つの態様においては、ＲＮＡスプリントリガーゼはビーズ上に固定化されている。もう１つの態様においては、該スプリントリガーゼはＰＢＣＶ−１リガーゼである。
【０００８】
該組成物の実施形態は以下の特徴の１以上を含みうる：ＲＮＡスプリントリガーゼおよび前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドは１００：１以上または１００：１未満、１０：１未満もしくは１：１未満の、リガーゼ対ポリヌクレオチドのモル比で存在する；該バッファーは１μＭ〜１．５ｍＭ  ＡＴＰを含む。
【０００９】
一般に、１つの態様においては、相補的領域を有するＤＮＡポリヌクレオチド断片のような少なくとも２つのポリヌクレオチド断片をＲＮＡスプリントおよびＲＮＡスプリントリガーゼと一緒にし、前記の２つのポリヌクレオチドが連結して単一ポリヌクレオチドを形成することを可能にすることを含む、一本鎖である又は一本鎖領域を有する又は二本鎖であるが変性を受けやすい２つのポリヌクレオチド断片を連結するための方法を提供する。もう１つの態様においては、該ポリヌクレオチド断片は、複合混合物の一部であるＤＮＡ断片であり、一方、ＲＮＡスプリントは所定配列を有する。あるいは該ＤＮＡ断片は一定の配列を有し、一方、ＲＮＡスプリントはＲＮＡの複合混合物の一部である。
【００１０】
該方法の実施形態は以下の特徴の１以上を含みうる：少なくとも１μＭ〜１．５ｍＭ  ＡＴＰを含有するバッファー中で連結反応を行うこと；８ヌクレオチドを超える長さを有するＲＮＡスプリントと、８ヌクレオチドを超える長さをそれぞれが有する複数のポリヌクレオチドとを利用すること；該反応を６時間未満にわたってインキュベートしてポリヌクレオチドの少なくとも７０％〜９０％の連結を達成させること；該反応を１時間未満にわたってインキュベートしてポリヌクレオチドの少なくとも７０〜９０％の連結を達成させること；および／または１００：１を超える又は１００：１未満、１０：１未満もしくは１：１未満の酵素：基質モル比で連結反応を行うこと。ある実施形態においては、該連結は、ＲＮＡスプリントリガーゼの場合には、類似条件下でＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用する連結の場合より迅速に生じることが可能であり、一本鎖ポリヌクレオチドは、定量ＰＣＲのための鋳型であることが可能であり、したがって、該連結一本鎖ポリヌクレオチドの増幅は、ＲＮＡスプリントリガーゼがＴ４  ＤＮＡリガーゼで置換された場合に観察されるものより低い、非鋳型ポリヌクレオチドのバックグラウンド増幅をもたらし、および／または、該スプリントリガーゼは、同一反応条件下および同一ポリヌクレオチドに関してＴ４  ＤＮＡリガーゼより少なくとも５倍または１０倍速い速度で該ポリヌクレオチドを連結しうる。
【００１１】
一般に、もう１つの態様においては、ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡおよびＲＮＡスプリントリガーゼと一緒にすることによりスプライス部位、スプライス部位におけるスプライシング変異体または突然変異を特定することを含む、ｍＲＮＡをそのスプライシング履歴に関して分析するための方法を提供する。
【００１２】
一般に、もう１つの態様においては、スプリントＲＮＡに連結結合部において相補的である領域を有するポリヌクレオチドをアニーリングし、ＲＮＡスプリントリガーゼを使用して該ポリヌクレオチドを連結し、連結産物を増幅し、増幅産物を検出し、場合により定量することを含む、ＲＮＡ配列を検出するための方法を提供する。
【００１３】
該方法の実施形態は以下の特徴の１以上を含みうる：ＲＮＡ配列はマイクロＲＮＡである；および／またはＲＮＡスプリントリガーゼはＰＢＣＶ−１リガーゼである。
【００１４】
１つの態様においては、驚くべきことに且つ高い効率で、ｓｓＲＮＡによりスプリントされた一本鎖領域を有するＤＮＡを連結するリガーゼを、本明細書に記載する。この連結効率は、ＲＡＳＬおよびＲＡＳＬ−ｓｅｑのような方法ならびにＲＮＡの分析および検出のために分子反転プローブおよび修飾リガーゼ鎖反応／リガーゼ検出反応を用いる方法における２以上のオリゴヌクレオチドを使用するＲＮＡスプリンティングに基づく技術の有用性を相当に改善する。
【００１５】
特に示されていない限り、「ＲＮＡスプリントリガーゼ」なる語は、相補的ｓｓＲＮＡポリヌクレオチドによりスプリント（ｓｐｌｉｎｔ；支持）された２つのｓｓＤＮＡポリヌクレオチドを連結しうる、そして基質と比較してモル過剰で存在することが絶対的に要求されるわけではない酵素のモル濃度で６時間以内で連結を達成しうる酵素を意味する。非常に低い濃度の基質の場合、該酵素は、便宜上、過剰に存在しうる。ＲＮＡスプリントリガーゼの例としては、天然に存在するＤＮＡリガーゼ、または野生型リガーゼに対して少なくとも９０％、９５％、９８％もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する密接に関連した変異体が挙げられ、ここで、該リガーゼは、藻類ウイルス、例えばクロレラウイルス、例えばＰＢＣＶ−１リガーゼ（配列番号１）から誘導可能であり、あるいは例えば２０１３年３月１４日現在、クエリーｉｄ  ｇｉ｜９６３２１０９｜ｒｅｆ｜ＮＰ ０４８９００．１．を使用してｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいて見出される基本的な局所アライメント検索ツールを使用するＧｅｎＢａｎｋまたはＮＣＢＩまたは他のデータベースのＢｌａｓｔ検索により特定されうる。該ＲＮＡスプリントリガーゼは、精製タグ（例えば、ＨｉｓＴａｇ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ビオチン）、またはＤＮＡ結合ドメイン融合体（例えば、ｓｓｏ７ｄまたはアルキルグアニントランスフェラーゼ（ＡＧＴ））との該ＲＮＡスプリントリガーゼのタンパク質融合体を含む。スプリントリガーゼは耐熱性であることが可能であり、ＲＮＡおよびｄｓポリヌクレオチドとの共存に適したものとなることが可能であり、この場合、温度を上昇させることにより該ｄｓポリヌクレオチドをｓｓポリヌクレオチドへと変性させ、ついで本明細書に記載されているとおりにＲＮＡにハイブリダイズさせた場合、該リガーゼはＲＮＡスプリント化ｓｓポリヌクレオチドへの結合に関して尚も活性である。
【００１６】
該ＲＮＡスプリントリガーゼ、一本鎖（ＳＳ）ポリヌクレオチドおよび／またはスプリントＲＮＡは、自動化法および多重反応を促進させるために、マトリックス、例えば反応表面、または磁気ビーズ上に固定化されうる。
【００１７】
ＲＮＡスプリント上で複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドを互いに連結するのにＰＢＣＶ−１リガーゼは不活性であると記載している刊行物（Ｓｒｉｓｋａｎｄａら，（１９９８））に反して、８ヌクレオチドを超えるサイズのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド、または８ヌクレオチドを超えるサイズの一本鎖領域を有する二本鎖ＤＮＡは、驚くべきことに、相補的ＲＮＡによりスプリントされた場合、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼより１０倍〜１００倍大きな効率で互いに連結されて少なくとも１６ヌクレオチド長の単一ＤＮＡを形成しうることが、本発明において示された。
【００１８】
「ＲＮＡスプリント」なる語は、ＲＮＡスプリントリガーゼによる断片の互いの連結を可能にするように、８ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドを超える、例えば、１２または１５または１８または２０または２２または２４または２６または２８または１００ヌクレオチドを超えるサイズを有するｓｓＲＮＡ、あるいは例えば少なくとも８または１０または１２または１４または１６または２０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのサイズを有する少なくとも２個、３個またはそれ以上の一本鎖ポリヌクレオチドに少なくとも部分的にハイブリダイズしうるＲＮＡウイルスゲノムと同等の大きさのサイズを有するｓｓＲＮＡを含む。ＲＮＡスプリントは一定配列を有することが可能であり、あるいはＲＮＡの複合的混合物中に含有されうる。
【００１９】
ＲＮＡスプリントはハイブリダイズ性ポリヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイズするポリヌクレオチド）に、または部分的に二本鎖であるＤＮＡの一本鎖部分に完全に相補的であることが可能であり、あるいはハイブリダイズ性ポリヌクレオチド上の相補的領域を超えて伸長することが可能であり、例えば、該スプリントはハイブリダイズ性ポリヌクレオチドより２、４、６、８、１０ヌクレオチド以上長いこと、および／または該ＲＮＡのハイブリダイズ領域より長いことが可能である。該スプリントは、遥かに大きなＲＮＡ構造体、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他の細胞ＲＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノムの一部であることが可能であり、この場合、該ＲＮＡの領域はハイブリダイズ性ポリヌクレオチドに相補的であるが、該構造体の大部分はハイブリダイズ性ポリヌクレオチドに対する相補性を有さない。
【００２０】
ＲＮＡスプリントは任意の起源に由来しうる。例えば、スプリントＲＮＡは化学合成により製造可能であり、あるいはｍＲＮＡサンプル、全ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、長い非コードＲＮＡまたは他の天然に存在するＲＮＡ、核酸ライブラリー、細胞、培養、組織、病原体、体液、尿、血清、生検サンプルおよび環境サンプルから入手可能である。公知である又は開発されうる任意の他のＲＮＡ源が該開示方法で用いられうる。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」なる語は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは部分ＤＮＡおよび部分ＲＮＡを含む。ＲＮＡスプリントとの連結反応において使用される場合のポリヌクレオチドまたはその一部は好ましくは一本鎖であり、ＲＮＡスプリントの少なくとも一部に部分的または全体的に相補的でありうる。本明細書に記載されているポリヌクレオチドの一例は、少なくとも８ヌクレオチドを含むｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドである。もう１つの例は、少なくとも８ヌクレオチドを有する一本鎖領域を有する二本鎖ＤＮＡである。もう１つの例は、スプリントＲＮＡに相補的である少なくとも８ヌクレオチドの一本鎖領域を有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。
【００２２】
ハイブリダイズ性ポリヌクレオチドがＲＮＡスプリントに対する相補的領域を有する場合、これは他の部位の非相補的領域との連結結合部に限定されうる。具体例には、ＰＣＲ増幅のためのプライマー結合領域、逆分子ビーコン設計のための自己相補性領域、非相補的リンカー領域、またはＲＮＡスプリントの長さを越えて伸長する非相補的領域が含まれる。ハイブリダイズ性ポリヌクレオチドは、例えばローリングサークル増幅（ＲＣＡ）用の分子反転プローブのための長い非相補的領域により互いに連結可能であり、この場合、それらは、２つの異なるハイブリダイゼーション領域を有する単一ポリヌクレオチドである。該ポリヌクレオチドは、それらが、ギャップを伴うことなく連結部位において該スプリントと完全に塩基対形成するようにハイブリダイズ可能であり、あるいはそれらは、連結がスプリントＲＮＡ上でｓｓＲＮＡループアウト（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）領域を生成するように、ＲＮＡスプリント上で例えば４、６、８、１０ヌクレオチドまたはそれ以上の離れたギャップを伴ってハイブリダイズ可能である。
【００２３】
この文脈における「ハイブリダイゼーション」は、連結されるべきポリヌクレオチド上の一本鎖領域に選択的に結合するための、該スプリント上の相補的な又はほぼ相補的な塩基の特異的アニーリングに十分である、当技術分野で公知のハイブリダイズする条件の選択を意味する。
【００２４】
ＲＮＡスプリントにハイブリダイズさせるためのｓｓポリヌクレオチドおよび／またはＲＮＡおよび／またはＲＮＡスプリントリガーゼの１以上は、基体、例えばマトリックス、例えば磁気ビーズ、ガラスもしくはシリカ基体、またはミクロ流体装置もしくは他の反応チャンバ内の表面にカップリング（結合）されうる。ビーズは、本出願の出願日において商業的に入手可能なタイプのいずれかを含むことが可能であり、被覆ビーズ、例えば、アミロースまたはキチンなどのような炭水化物で被覆されたビーズを更に含みうる。あるいはビーズはタンパク質、例えばＳＮＡＰｔａｇ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）などで被覆されうる。
【００２５】
オリゴヌクレオチドが直接的または間接的にカップリングされうる追加的な固体基体には、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロス、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン  酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリラート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリカート、ポリカルボナート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコーンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ酢酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメラート、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸が含まれる。固体基体は、薄フィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、皿、繊維、織物繊維、成型ポリマー、粒子および微粒子を含む任意の有用な形態を有しうる（Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）；Ｋｈｒａｐｋｏら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）；Ｓｔｉｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６３７９−６３８３（１９９５）；Ｇｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）；米国特許第５，８７１，９２８号；米国特許第５，５４，４１３号；米国特許第５，４２９，８０７号；米国特許第５，５９９，６９５号；および米国特許第６，３６８，８０１号）。
【００２６】
基体へのポリヌクレオチドのカップリングは、複数のサンプルを個別に又は多重反応において及び反応の自動化において取り扱うことを容易にしうる。連結の産物を特定するために使用される適当な標識および捕捉タグは当技術分野で公知であり、米国特許第６，３６８，８０１号に記載されている。
【００２７】
ＲＮＡスプリント上でのポリヌクレオチドの連結の特徴は以下の１以上を含みうる。
【００２８】
温度範囲：連結は４℃〜５０℃、例えば１６℃、２５℃および３７℃の範囲の温度で達成されうる。
【００２９】
酵素濃度：連結は例えば１ｎＭ〜１ｍＭ  酵素の範囲の濃度で達成されうる。少なくとも７０％、８０％または９０％の効率でＲＮＡスプリント上でｓｓＤＮＡを連結するためには、比較的少量のＲＮＡスプリントリガーゼが使用されうる。基質対酵素の比の例には、６時間以内、例えば５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内または１５分以内の連結の完了の場合、１：１０〜１０：１または１００：１〜１：１００または１：１０００〜１０００：１または１：１０，０００〜１０，０００：１の範囲が含まれる。連結の完了はアガロースもしくはポリアクリルアミドゲルまたはキャピラリー電気泳動により判定されうる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、反応産物を得るためには１０：１〜１００：１の酵素対基質比を要し、連結を行うためには１２時間以上を要することがあり、その連結は不完全でありうる。ＲＮＡスプリントリガーゼとＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ＲＮＡリガーゼとの間の活性における劇的な相違の一例を図３（Ａ）〜３（Ｂ）に示す。
【００３０】
ＡＴＰ濃度：連結は、１．５ｍＭ  ＡＴＰ未満、例えば１μＭ〜１ｍＭ  ＡＴＰ、例えば１ｍＭ、０．９ｍＭ、０．８ｍＭ、０．７ｍＭ、０．６ｍＭ、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、９０μＭ、８０μＭ、７０μＭ、６０μＭ、５０μＭ、４０μＭ、３０μＭ、２０μＭ、１０μＭまたは１μＭの範囲のＡＴＰの存在下で達成されうる。ここに示されている範囲の高いほうの末端のＡＴＰの使用が好ましいかもしれない。なぜなら、貯蔵中または反応条件下で幾らかのＡＴＰ加水分解が生じた場合、バッファーは、ＲＮＡスプリントリガーゼ反応を安定化するのに依然として有効だからである。更に、ＲＮＡスプリントリガーゼがアデニル化形態で存在する場合、反応はＡＴＰの非存在下で行われうる。
【００３１】
反応時間：連結は１２時間未満で達成されうる。該反応は、有効な連結を達成するためには５分間〜６０分間、または前記のとおり、より長時間にわたってインキュベートされうる。
【００３２】
ｐＨ：連結はｐＨ６〜ｐＨ９の範囲のｐＨで達成可能であり、その範囲内で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの場合より少なくとも１０倍速い、ＲＮＡスプリントリガーゼに関する連結速度が示される。
【００３３】
高い及び低いＡＴＰ濃度におけるＴ４  ＤＮＡリガーゼとＲＮＡスプリントリガーゼとの反応速度の比：該方法の実施形態においては、高いＡＴＰ濃度における連結の速度は、基質配列には無関係に、ＲＮＡスプリントリガーゼ（ＰＢＣＶ−１リガーゼ）の場合には、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼの場合より一貫して１００：１も大きかった。低いＡＴＰ濃度では、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに関して最適化された条件下、ＲＮＡスプリントリガーゼはＴ４  ＤＮＡリガーゼより少なくとも５倍または１０倍（１０：１）大きな活性を示す。
【００３４】
全ての被験基質を使用してＴ４  ＤＮＡリガーゼと比較した場合のＲＮＡリガーゼを使用する連結における一貫した改善：前記のとおりに改善された連結は基質配列には無関係であった。これは、基質感受性であったＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用する連結反応の場合とは対照的である。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、低いＡＴＰの最適条件下、ＲＮＡスプリント（配列番号４）を使用して、遅いながらも２つのオリゴヌクレオチド（配列番号２および配列番号３）を連結することが可能であった。一方、第１ヌクレオチドを配列番号３においてＴからＧへ変化させた場合、同じ反応条件下のＴ４  ＤＮＡリガーゼは検出可能なリガーゼ活性を示さなかった。これとは対照的に、ＲＮＡスプリントリガーゼは、この改変基質を未改変基質と同様に効率的に連結することが可能であった。
【００３５】
実際、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して試験された最良基質と最悪基質との間の反応相違の比は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼのためのＡＴＰの示されている低い濃度を用いた場合でさえも１０００倍以上であった（１０μＭ  ＡＴＰ対１ｍＭ  ＡＴＰ）。
【００３６】
ＲＮＡスプリントリガーゼを使用する本実施形態を用いた場合、ＲＮＡスプリントリガーゼを使用して（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに関して）試験された同じ最良基質と同じ最悪基質との間の反応相違は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼに用いられたのと同じ反応条件下、５０倍未満（例えば、４０倍未満、３０倍未満または２０倍未満）であった。
【００３７】
ＲＮＡによりスプリントされた一本鎖ポリヌクレオチドの間の効率的連結反応に関するＲＮＡスプリントリガーゼの前記特徴は、ＲＡＳＬ、ＲＡＳＬ−ｓｅｑおよび分子反転プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ）（パドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブとしても公知である）の方法を改善するために用いられうる。他の用途には、短い断片の連結により長いｓｓＤＮＡを構築することを補助するためのＲＮＡスプリントの使用が含まれうる。該連結の後、ＲＮＡスプリントを除去するためのＲＮアーゼ処理（例えば、ＲＮアーゼＨまたはその突然変異体を使用するもの）（図８（Ａ）〜８（Ｂ）を参照されたい）およびマイクロＲＮＡの検出（図１０および１１を参照されたい）が行われる。
【００３８】
ＲＡＳＬによる定量的ｍＲＮＡプロファイリングは、一般に、関心のあるＲＮＡに相補的な２つのｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＮＡプローブ）の連結により達成される。標準的なＲＡＳＬにおいては、細胞ｍＲＮＡを単離し、隣接５’および３’末端を形成するように標的ｍＲＮＡ配列の存在下でアニーリングする一定のＤＮＡプローブで処理する。ギャップまたは誤対形成を伴うことなく正しくアニーリングした構造体はスプリントＲＮＡリガーゼにより連結されて連結プローブを形成しうる。該プローブは、ＲＮＡ相補性領域に隣接したｑＰＣＲプライマー領域をも含有していて、それらの２つのプローブが連結された場合に、ｑＰＣＲにより産物が増幅され、検出され、定量されうる。ｑＰＣＲシグナルの度合は元のサンプル中の標的ＲＮＡ配列の量に関連づけられうる。スプリントＲＮＡリガーゼは、正しく塩基対形成した配列およびギャップを欠く配列に対する強力な優先性を有するため、標的ｍＲＮＡにおけるスプライシング変異体および一塩基多型が検出されうる（Ｙｅａｋｌｅｙら，（２００２））。
【００３９】
ＲＡＳＬ−ｓｅｑは、全ＤＮＡ配列決定により検出が達成されるＲＡＳＬの変異体である。ＲＡＳＬ−ｓｅｑにおいては、ｑＰＣＲプライマー領域を、増幅およびいずれかのハイスループットＤＮＡ配列決定法による配列決定に適したＰＣＲ配列で置換する。数百個のプローブセットがＲＡＳＬ−ｓｅｑで並行して処理されることが可能であり、したがって、数百個の遺伝子の発現レベルが同時に定量されうる（Ｌｉら，（２０１２））。
【００４０】
ｍＲＮＡ相補性領域以外のプローブ配列の適当な設計により、他の方法による検出が行われうる。一例はループ媒介性等温増幅（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）であり、この場合、プローブは、連結に際してＬＡＭＰ標的構造を形成するように設計される（Ｎｏｔｏｍｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８（１２）：ｅ６３（２０００））。ついで標的ＲＮＡの存在がＬＡＭＰ増幅により検出され、等温反応条件、迅速な検出および現場またはフィールドオブケア診断のような利点が可能となる。連結が成功したら、標的核酸の増幅の検出が通常のｑＰＣＲ色素およびプローブ（前記のとおり）で、または以下の追加的方法で行われうる：沈殿ピロリン酸マグネシウムの濁度検出（Ｍｏｒｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８９：１５０−１５４（２００１））；金属感受性指示薬を使用する比色検出（Ｔｏｍｉｔａら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，３（５）：８７７−８２（２００８）；Ｇｏｔｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４６（３）：１６７−７１（２００９））；ピロホスファート変換による生物発光（Ｇａｎｄｅｌｍａｎら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５：ｅ１４１５５（２０１０））；または弱緩衝条件中の増幅によるｐＨ変化による検出（Ｐｏｕｒｍａｎｄら，ＰＮＡＳ，１０３（１７）：６４６６−７０（２００６）；米国特許第７，８８８，０１５号；および米国特許出願第１３／７９９，９９５号）。
【００４１】
配列決定法における予備工程としての及びＹアダプターの代替手段としてのポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションのためのアダプターには、ループアダプターが含まれる（例えば、ＵＳ  ２０１２０２４４５２５を参照されたい）。一本鎖末端を形成するようにループを切断するための部位でありうる修飾ヌクレオチドを含むループアダプターの代替手段は、該アダプターの非連結末端を除く一本鎖にハイブリダイズしたＲＮＡスプリントによりループを維持することである。該末端は、本明細書に記載されているスプリントリガーゼの存在下で連続的ループを形成するように修飾および／または未修飾ヌクレオチドの存在下で連結されうる。この工程は標的ＤＮＡへの該アダプターの連結の前または後で達成されうる。前記のとおり、２つのＤＮＡポリヌクレオチドにアニーリングした後でスプリントを使用して連結を行う場合、産物は直鎖状ポリヌクレオチド、例えば直鎖状ｓｓＤＮＡなどでありうる。このアプローチの利点は、長い一本鎖ＤＮＡが合成可能であることである。
【００４２】
分子反転プローブはプローブとしてＤＮＡの単一直鎖を使用する。分子反転プローブの使用は、ＤＮＡの５’および３’末端が隣接してアニーリングして、ｓｓＤＮＡのループにより接続されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドヘリックスを形成するように、ＲＮＡ標的配列に対する相補性領域を有するように設計されたＤＮＡプローブの使用を含む。ＲＮＡスプリントリガーゼによるＲＮＡ相補体の存在下のＤＮＡ末端の連結は例えばＲＣＡによる検出のための小さな環状ＤＮＡ基質を形成する。環化ＤＮＡは、ＲＣＡプライマーの付加および増幅のいずれかにより、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド領域をＲＣＡ用プライマーとして作用させるためのＲＮアーゼ処理によるｓｓＲＮＡの除去により検出されうる。ついで、濁度、ｐＨ変化またはゲルによるＤＮＡ産物の測定によりＲＣＡ産物が検出されうる（Ｌｉら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８１（１２）：４９０６−４９１３（２００９）；ＡｂｓａｌａｎおよびＲｏｎａｇｈｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３９６：３１５−３３０（２００７）；Ｈａｒｄｅｎｂｏｌら，（２００３））。
【００４３】
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを現在使用しているＲＮＡスプリンティングに基づく反応の他の例は米国特許第６，３６８，８０１号に記載されている。これらの方法は、この酵素をＲＮＡスプリントリガーゼと交換することにより改善可能であり、リガーゼ連鎖反応、連結およびそれに続くＰＣＲ、パドロック（Ｐａｄｌｏｃｋ）プローブの使用、ならびに連結により生じるＦＲＥＴ検出分子ビーコンの使用を包含する（Ｐｅｎｇら，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，８２（２３）：９７２７−３５（２０１０））。
【００４４】
本明細書中に引用されている全ての参考文献ならびに２０１２年１２月２１日付け出願の米国特許出願第６１／７４５，２４４号および２０１３年３月１４日付け出願の米国特許出願第１３／８２９，４８９号を参照により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型によりスプリント化されたＤＮＡの連結に関するアッセイの概要を示す。予めアニーリングしたニック化基質、例えば、２０デオキシヌクレオチド受容ＤＮＡ、３０デオキシヌクレオチド、ＦＡＭタグ付きおよび５’−リン酸化供与ＤＮＡ、およびＤＮＡまたはＲＮＡ逆相補体（スプリント）のいずれかを適当なリガーゼと共にインキュベートし、ついで１００ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチし、ホルムアミドで変性させる。断片を分離し、ＦＡＭ標識ｓｓＤＮＡ連結産物をキャピラリー電気泳動により検出することが可能である。
【図２】２（Ａ）〜２（Ｄ）は、ＤＮＡまたはＲＮＡによりスプリント化された２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−ＤＮＡ連結）の連結を示す。示されているピークは、真正標準との共溶出により特定された未反応ｐＤＮＡ（Ｉ）および連結産物（ＩＩ）である。１００ｎＭの標準オリゴヌクレオチドを１００ｎＭのＰＢＣＶ−１  ＤＮＡリガーゼ（２（Ｂ）および２（Ｄ））または１００ｎＭのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（２（Ａ）および２（Ｃ））と２０℃で３０分間反応させた。  パネル２（Ａ）および２（Ｂ）：２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ２（Ａ）および２（Ｂ）にハイブリダイズさせた。該ピークは完全な連結に対応する。  パネル２（Ｃ）および２（Ｄ）：２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドをＲＮＡ逆相補体にハイブリダイズさせた。完全な連結に対応するピークは、ＰＢＣＶ−１リガーゼ２（Ｄ）を使用する反応からのみ認められ、一方、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ２（Ｃ）を使用した場合には連結は認められなかった。
【図３】３（Ａ）〜３（Ｂ）は、１ｍＭ  ＡＴＰを含有する標準連結バッファー中、２０℃で１ｐＭ〜１０μＭの濃度範囲でＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１またはＰＢＣＶリガーゼを使用した場合の、ＤＮＡによりスプリントされた１００ｎＭ  前アニーリング標準オリゴヌクレオチド基質の連結を示す。  ３（Ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡ：ＤＮＡによりスプリントされた連結。  ３（Ｂ）ＤＮＡ−ＤＮＡ：ＲＮＡ逆相補体によりスプリントされた連結。  ＰＢＣＶ−１  ＤＮＡリガーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼは共に、類似した連結活性で、ＤＮＡによりスプリントされたＤＮＡオリゴヌクレオチドを連結することが可能であったが、ＰＢＣＶ−１リガーゼのみが、ＲＮＡ逆相補体によりスプリントされたオリゴヌクレオチド基質の、検出可能な量の連結産物を形成することが可能であった。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１はＤＮＡスプリント化連結に対しては僅かな活性を示し、ＲＮＡスプリント化連結に対しては検出可能な活性を示さなかった。
【図４】４（Ａ）〜４（Ｂ）は、１ｍＭ  ＡＴＰまたは１０μＭ  ＡＴＰのいずれかと１００ｎＭ  前アニーリングニック化基質とを含有する標準連結バッファー中、２０℃で１ｐＭ〜１０μＭの濃度範囲でＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＰＢＣＶ−１リガーゼを使用した場合の、ＲＮＡ逆相補体によりスプリントされた同じオリゴヌクレオチド基質の連結を示す。  ４（Ａ）：１ｍＭ  ＡＴＰの存在下のＲＮＡ逆相補体によりスプリントされたＤＮＡ−ＤＮＡ連結。  ４（Ｂ）：１０μＭ  ＡＴＰの存在下のＲＮＡ逆相補体によりスプリントされたＤＮＡ−ＤＮＡ連結。  ＰＢＣＶ−１リガーゼは、１ｍＭ  ＡＴＰまたは１０μＭ  ＡＴＰを含有するバッファー中、類似した連結活性で、ＲＮＡによりスプリントされたＤＮＡオリゴヌクレオチドを連結した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは１０μＭ  ＡＴＰにおいて、活性を改善していたが、その活性は同一条件下のＰＢＣＶ−１リガーゼの場合より少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍または１００倍低かった。ＰＢＣＶ−１リガーゼは、高いＡＴＰ濃度を含有するバッファー中、ＲＮＡ逆相補体によりスプリントされた検出可能な量のオリゴヌクレオチド基質を連結することが可能であったが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはそうではなかった。
【図５】種々の温度におけるＰＢＣＶ−１リガーゼＲＮＡスプリント化ＤＮＡ連結活性を示す。２つの異なるＲＮＡ鋳型によりスプリントされたＤＮＡ−ＤＮＡ連結を１６℃、２５℃および３７℃で行った。第１  ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびそれらの逆相補体は、図９に記載されている標準的な鋳型であり（四角印）、Ｓｒｉｓｋａｎｄａら，（１９９８）に記載されている配列を有する第２の鋳型（丸印）も使用したが、該配列は連結にほとんど又は全く影響を及ぼさなかったことが示されている。反応条件は、３０分間のインキュベーション、標準的なリガーゼバッファー中の１μＭ  ＰＢＣＶ−１リガーゼ、２５０ｎＭ  ＲＮＡスプリント化オリゴヌクレオチド基質であった。
【図６】ＲＮＡスプリントリガーゼを使用する、ｑＰＣＲにより検出されるＲＡＳＬアッセイ設計を示す。ＤＮＡプローブを、ＲＮＡ標的に相補的な領域とｑＰＣＲプライミング領域とを有するように設計した。正しくアニーリングしたプローブは、ＲＮＡスプリントリガーゼにより連結可能な、ギャップを有さないバックボーン−ニックを形成する。プローブの存在下の連結の成功は、ｑＰＣＲにより定量されうる増幅可能なＤＮＡ配列を与える。
【図７】７（Ａ）〜７（Ｂ）は、バックグラウンドシグナルおよび反応速度を測定するための、図１に記載されているｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド基質上でＰＢＣＶ−１リガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用するＲＡＳＬアッセイの結果を示す。  ７（Ａ）：２．５ｎＭ  ルシフェラーゼｍＲＮＡスプリント。  ７（Ｂ）：２５ｎＭ  ルシフェラーゼｍＲＮＡスプリント。  ＰＢＣＶ−１リガーゼは、より速いＣｑ値により示されるとおり、ＲＮＡ基質の存在下、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼより速い速度で陽性シグナルを示した。また、鋳型ＲＮＡが供給されなかった場合には、より高いＣｑ値により示されるとおり、バックグラウンド応答は、ＰＢＣＶ−１リガーゼを使用した場合には、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用した場合と比較して有意に遅延した。
【図８】８（Ａ）〜８（Ｃ）：ＰＢＣＶ−１リガーゼを使用するＲＮＡ媒介性スプリント連結による長いｓｓＤＮＡの合成。  ｓｓＲＮＡスプリントと共にｓｓＤＮＡの２つの小断片を使用して、１２１ｎｔのｓｓＤＮＡを効率的に構築した。ついで該ＲＮＡスプリントをＲＮアーゼＨで除去し、該ｓｓＤＮＡをＨＰＬＣで精製した。２５℃でｐＨ７．６のリガーゼ反応バッファー（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、７．５％  ＰＥＧ６０００）中に０．２５μＭ  アニール化オリゴヌクレオチドおよび１．４５μＭ  ＰＢＣＶ−１リガーゼを含有する連結反応を行った。反応を２５℃で３０分間（パネル８（Ｂ））または１６℃で一晩（パネル８（Ｃ））インキュベートした。パネル８Ａに無酵素対照を示した。  標準的な化学合成法と比較した場合、酵素的なスプリント連結による長いｓｓＤＮＡの合成は高純度、精製の単純化およびコストの相当な削減という利点を有する。これらの結果は、合成された１５０マーの粗製溶液が４７％の完全長産物および５３％の不全配列を含有する９９．５％のカップリング効率を有する現在のホスホラミダイト技術とは対照的である。
【図９】クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスポリヌクレオチドリガーゼ（ＰＢＣＶ−１リガーゼ）および標準的なｓｓオリゴヌクレオチド基質（実施例において使用したもの）のアミノ酸配列を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｂｅ／ｄｏｃ／ＴｅｃｈＭＩＰ．ｓｈｔｍｌ）。
【図１０】ＰＢＣＶ−１リガーゼを使用するマイクロＲＮＡの検出のためのアッセイを示す。マイクロＲＮＡ  １２２の５’半分に相補的な５’−リン酸化３２ｎｔ  ＤＮＡプローブと、ｍｉＲ−１２２  ｍｉＲＮＡの３’半分に相補的な３３ヌクレオチドＤＮＡプローブとを、種々の濃度の標的ｍｉＲＮＡへのハイブリダイゼーションの後、ＰＢＣＶ−１リガーゼで連結する。ＰＣＲプライマーを加え、増幅を行う。
【図１１】ＰＢＣＶ−１リガーゼを使用するＲＮＡスプリント連結による全ラット肝ＲＮＡからのｍｉＲ−１２２の検出。  ＤＮＡプローブを全ラット肝ＲＮＡ中のｍｉＲ−１２２（約５０ｐｇ  ｍｉＲＮＡ／ｇ全ＲＮＡ）にハイブリダイズさせ、ＰＢＣＶ−１リガーゼにより連結した。非変性アクリルアミドゲルは、未消化ＰＣＲ産物（−）、および所望の産物をＧＴ（Ｃ／Ｇ）ＡＣにおいて特異的に切断するＴＳｐ４５Ｉで消化された産物（＋）を示す。矢印により示されている、ＴＳｐ４５Ｉの存在下で正しく切断された９５塩基のバンドが、２つのラット肝ＲＮＡサンプルに関して、および０．１ｐｇの合成ｍｉＲ−１２２を含有する陽性対照において見出された。ＲＮＡを含有しない陰性対照、およびｍｉＲ−１２２を含有しないＨｅＬａ細胞ＲＮＡは、Ｔｓｐ４５Ｉにより消化された場合に適切な断片を与えなかった、より小さいＰＣＲ産物を有する。  レーンは以下のとおりであった：Ａ  １μｇラット肝ＲＮＡ；Ｂ  １００ｎｇラット肝ＲＮＡ；Ｃ  ０．１ｐｇ  ｍｉＲ−１２２；Ｄ  １μｇ  ＨｅＬａ  ＲＮＡ；Ｅ  ＲＮＡ無し。
【実施例】
【００４６】
［実施例１］：ＲＮＡスプリントを使用するＤＮＡオリゴヌクレオチド基質の連結のアッセイ
インビトロ連結アッセイ
種々の配列からリガーゼ基質を調製した。標準として使用した配列は、５’−ホスファートおよび３’−発蛍光団で修飾された３０ｎｔデオキシヌクレオチドｓｓＤＮＡ断片（配列番号３）、およびＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成される未修飾相補鎖（配列番号４）にアニーリングする未修飾末端を有する２０デオキシヌクレオチドｓｓＤＮＡ受容断片（配列番号２）であった。１００ｎＭの標識された前アニール化オリゴヌクレオチド構造体の連結を連結バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６−９，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０μＭ  ＡＴＰ〜１ｍＭ  ＡＴＰ）中、１５〜４０℃で行った。リガーゼ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはＰＢＣＶ−１リガーゼ）を１０ｐＭ〜１０μＭの最終濃度まで加えることにより、該アッセイを開始させ、１６℃または２０℃でインキュベートした。反応を１００ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチし、水で１ｎＭ（ＤＮＡ中）まで希釈し、ハイスループットキャピラリー電気泳動により分析した。
【００４７】
ハイスループットキャピラリー電気泳動（ＣＥ）による断片分析
ｄｄＨ２Ｏを使用する全ＦＡＭ標識中の０．５ｎＭ〜２ｎＭへの希釈により、ＣＥサンプルを調製した。ＧｅｎｅＳｃａｎ（商標）  １２０  ＬＩＺ（Ｒ）サイズ標準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をホルムアミド中で１：４０希釈し、この溶液の１０μｌを１μｌの各サンプルと一緒にした後、３１３０×１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（１６キャピラリーアレイ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）または３７３０×１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（９６キャピラリーアレイ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にＰＯＰ７ポリマーで３６ｃｍのキャピラリー長で適用した。データをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎソフトウェアで収集し、ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒ（商標）  ソフトウェア（Ｖ  １．０）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して分析した。青（ＦＡＭ）チャネルにおける全ピークの面積および保持時間を記録した。オリゴヌクレオチド（３０マーの出発物質、アデニル化３０マー、および５０マーの連結産物）を合成標準との共溶出により特定した。サンプルにおける各オリゴヌクレオチドの画分を、それぞれのピーク面積を全３個のオリゴヌクレオチドの全ピーク面積で割り算することにより決定した。結果をＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＰＢＣＶ−１リガーゼに関して図２（Ａ）〜２（Ｄ）に示す。ピーク面積から図３〜５におけるグラフを決定した。
【００４８】
［実施例２］：増幅用ＲＡＳＬプローブの設計
ＲＡＳＬプローブ
Ｌ（／５ｐｈｏｓ／ＣＧＧＴＡＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＧＴＡＣＴＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣ）（配列番号５）；および
Ｒ（ＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣＧＴＴＧＣＧＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣ）（配列番号６）を、ルシフェラーゼＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の３’領域を標的化するように設計した。２．５ｎＭ  ルシフェラーゼＲＮＡの存在下または非存在下の２．５ｎＭまたは２５ｎＭのプローブを２５μｌのｌｘＴ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中で一緒にした。該混合物を、該ＲＮＡを変性させるために６５℃まで１０分間、ついで該プローブのアニーリングのために４５℃で６０分間加熱した。０．２５μｇのＰＢＣＶ−１リガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ（Ｍ０２０２Ｓ，〜２５０  ＮＥＢ単位））を加え、該連結混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。９５℃で２分間、ついで９５℃で１０分間、５２℃で１５分間および６８℃で３０分間の５０サイクルのＰＣＲ条件を伴う標準的な条件を用いて、プライマー（ＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号７）およびＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧ（配列番号８））をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと共に使用するｑＰＣＲ分析のために、１μｌの該連結混合物を使用した。結果を図７に示す。
【００４９】
ここで、鋳型の非存在下、ＰＢＣＶ−１リガーゼを使用するバックグラウンドシグナルは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと比較して低下しており、バックグラウンドシグナルが検出される前に、少なくとも１０％および５０％（５〜１５サイクル）も多くの加熱サイクルがＰＣＲ増幅中に必要であろう。
【００５０】
ＲＮＡスプリント連結ＤＮＡの増幅からの陽性シグナルが検出された場合、これは、同じＤＮＡに関してＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用する陽性シグナルの場合より１０％〜５０％（５〜１５）少ない増幅サイクルの後で生じた。
【００５１】
［実施例３］：リガーゼおよびＡＴＰの種々の濃度におけるＴ４  ＤＮＡリガーゼとの比較におけるＰＢＣＶ−１リガーゼの特徴づけ
図４（Ａ）〜４（Ｂ）は、１ｍＭ  ＡＴＰを含有する標準的なリガーゼバッファーまたはＡＴＰの量が１０μＭ  ＡＴＰに低減された修飾バッファー中の１０ｐＭ〜１０μＭ  ＰＢＣＶ−１リガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼとオリゴヌクレオチド基質（図９に示されている）との３７℃で１５分間の反応の結果を示す。１μＭを超えるＴ４  ＤＮＡリガーゼ濃度では、ＡＴＰ濃度に無関係に、基質のほとんどがＡｐｐＤＮＡに変換される。
【００５２】
図４（Ａ）〜４（Ｂ）に示されている結果は、標準量（１ｍＭ）のＡＴＰを含有するバッファーで、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとは対照的に、ＰＢＣＶ−１リガーゼでは、連結効率における１００倍以上もの改善が認められたことを示している。Ｔ４リガーゼ活性を増加させた１０μＭ  ＡＴＰのみを含有する非最適バッファーにおいては、標準的な基質を使用した場合、Ｔ４リガーゼ活性と比較してＰＢＶＣ−１リガーゼ活性における少なくとも１００倍の改善が尚も認められた。
【００５３】
［実施例４］：単一遺伝子に関するスプライス変異体の決定
遺伝子内の各エキソンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを製造することが可能である。種々の組合せのオリゴヌクレオチドを一緒に混合し、連結を起こすことが可能である。連結産物に対するＱＰＣＲは種々のスプライス変異体の頻度の決定を可能にするであろう。例えば、ある遺伝子が１０個のエキソンを有する場合、エキソン１をコードするＤＮＡを、別々の検出可能な標識をそれぞれが有するエキソン２〜１０とハイブリダイズさせる。ｍＲＮＡスプリントを使用して連結を行い、スプライス変異体の表現を決定する。
【００５４】
［実施例５］：スプリント連結によるマイクロＲＮＡ検出
ＰＢＣＶ−１リガーゼを使用するスプリント連結によるｍｉＲ−１２２の検出。
【００５５】
図１０は、連結によるマイクロＲＮＡの検出およびそれに続くＰＣＲ増幅のためのアッセイの概要を示す。合成ｍｉＲ−１２２  ５’ｐＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（配列番号９）（０．１ｐｇ）、全ラット肝ＲＮＡ（１μｇまたは１００ｎｇ）または１μｇの全Ｈｅｌａ細胞ＲＮＡを、ｐＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＣＧＣＡＧＧＧ（配列番号１０）およびＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴ（配列番号１１）を有する、ｍｉＲＮＡ−１２２に相補的である２つのＤＮＡプローブ（それぞれ１ｎｇ）にハイブリダイズさせた。ＲＮＡおよびＤＮＡオリゴを８５℃で熱変性させ、ついでゆっくり冷却した。該連結物（１０μｌの全体積中に、プローブおよびＲＮＡ源に加えて１μＭ  ＰＢＣＶ−１リガーゼおよび１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を含有する）を１６℃で２時間インキュベートした。２つのＰＣＲプライマー：ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１２）およびＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ（配列番号１３）ならびに１２．５μｌのＯｎｅＴａｑ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、２５μｌの反応において、５μｌの該連結混合物を増幅した。該ＰＣＲ反応を２５サイクルにわたって行った。図１１は、生物学的サンプルと共に使用した場合の結果を示す。この実施例においては、ＤＮＡを制限酵素Ｔｓｐ４５Ｉで消化することにより、ＰＣＲ産物が何であるかを確認した。この酵素は、ｍｉＲ−１２２配列内に見出されるＧＴ（Ｃ／Ｇ）ＡＣにおいてＤＮＡを切断する。消化されたＰＣＲ産物および未消化のＰＣＲ産物を非変性アクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した。２つのラット肝ＲＮＡサンプルにおいて、および０．１ｐｇの合成ｍｉＲ−１２２を含有する陽性対照において、９５塩基の予想産物バンドが観察された。この実験は、ＰＢＣＶ−１を使用するＲＮＡスプリント連結、およびそれに続く、感度を増強するＰＣＲにより、生物学的サンプルからのマイクロＲＮＡが検出されうることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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