(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料における１つ以上のＧＣＣ発現癌細胞に結合する抗ＧＣＣ抗体分子またはその抗原結合断片を含む組成物であって、
該抗ＧＣＣ抗体分子または抗原結合断片が、それぞれ配列番号２１、２２、および２３のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含み、
該１つ以上の癌細胞を含む生体試料が、患者から採取され、該抗ＧＣＣ抗体分子または抗原結合断片が、該試料における癌細胞上に発現されるＧＣＣタンパク質と複合体を形成することができる、組成物。
【請求項２】
前記複合体を、免疫組織化学アッセイにより検出することができることをさらに特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記試料におけるＧＣＣタンパク質発現を、前記複合体から定量化することができることをさらに特徴とする、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記試料におけるＧＣＣタンパク質発現の定量化が、頂端のＧＣＣタンパク質発現、細胞質ＧＣＣタンパク質発現、または両方の定量化を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記試料におけるＧＣＣタンパク質発現の定量化が、Ｈスコア法を含む、請求項３または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗ＧＣＣ抗体分子または抗原結合断片が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗ＧＣＣ抗体分子が、モノクローナル抗体、ウサギ抗体、ウサギモノクローナル抗体、および／またはヒト化ウサギモノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗ＧＣＣ抗体分子がＩｇＧ抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗ＧＣＣ抗体分子が抗原結合断片である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗ＧＣＣ抗体分子または抗原結合断片が、検出可能な標識と結合体化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記検出可能な標識が、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；アルカリホスファターゼ；ガラクトシダーゼ；グルコアミラーゼ；リゾチーム；糖質酸化酵素；複素環式酸化酵素；ラクトペルオキシダーゼ；ミクロペルオキシダーゼ；ビオチン；アビジン；スピン標識；バクテリオファージ標識；安定な遊離ラジカル；フルオロフォア；および放射性薬剤から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記フルオロフォアが、フルオレセインまたはその誘導体、ローダミンまたはその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオンから選択され、放射性薬剤が、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１８８Ｒｈ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１ＭＫｒ、８７ＭＳｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１３ＭＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、および２１３Ｂｉから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記生体試料が腫瘍生検試料である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＧＣＣ発現癌が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、軟部組織肉腫、神経外胚様性腫瘍、および神経内分泌腫瘍から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
（ａ）前記肺癌が、扁平上皮癌または腺癌であり；
（ｂ）前記軟部組織肉腫が、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫であり；そして／または
（ｃ）前記神経内分泌腫瘍が、消化管または気管支肺神経内分泌腫瘍である、
請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗ＧＣＣ抗体分子または抗原結合断片と複合体を形成している前記試料におけるＧＣＣタンパク質の存在またはレベルが、１以上の癌細胞がＧＣＣ標的化療法に対して感受性であることを示すことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗ＧＣＣ抗体分子または抗原結合断片と複合体を形成している前記試料におけるＧＣＣタンパク質の存在またはレベルが、前記患者がＧＣＣ標的化療法に対する候補であることを示すことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＧＣＣ標的化療法が、治療用抗ＧＣＣ抗体分子を含む、請求項１６または請求項１７の組成物。
【請求項１９】
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子がモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子がヒトＩｇＧ１抗体である、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、それぞれ配列番号６７、６８、および６９のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）とを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、細胞傷害性薬剤と結合体化されている、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／６３９，３７６号の利益および優先権を主張する。米国仮特許出願第６１／６３９，３７６号の全体の内容は、本明細書中にこの参照により援用される。
【０００２】
本発明は、ＧＣＣに結合する抗体分子、および治療剤のような薬剤に結合体化する抗ＧＣＣ抗体分子またはその断片を含む免疫結合体のようなＧＣＣ標的化療法による処置に対して患者を選択するために、それを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
グアニリルシクラーゼＣ（「ＧＣＣ」）は、腸液の維持、電解質の恒常性、および細胞増殖において機能する膜貫通細胞表面受容体であり、例えばＣａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：３０１８−３０２０（２００３）を参照されたい。ＧＣＣは、小腸、大腸、および直腸を裏打ちする粘膜細胞で発現される（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６））。ＧＣＣの発現は、全ての原発性および転移性結腸直腸腫瘍における発現を伴い、腸上皮細胞の新生物性形質転換に際して維持される（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６）、Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７（２００５）、Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１６５３−１６６１（１９９４））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：３０１８−３０２０（２００３）
【非特許文献２】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６）
【非特許文献３】Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７（２００５）
【非特許文献４】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１６５３−１６６１（１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、少なくとも一部分において、新規抗ＧＣＣ抗体の発見に基づく。したがって、一態様では、本発明は、本明細書において開示されるように、抗ＧＣＣ抗体分子を特徴とする。抗ＧＣＣ抗体分子は、裸の抗体分子としても、免疫結合体の構成要素としても有用である。したがって、別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子、および治療剤または標識を含む免疫結合体を特徴とする。本発明はまた、例えばＧＣＣおよびＧＣＣを発現する細胞または組織の検出のための、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子および免疫結合体を使用する方法を特徴とする。そのような方法は、とりわけ、ＧＣＣ媒介性の疾患の診断、予後、画像診断、または病期分類のために有用である。したがって、一部の態様では、本発明は、ＧＣＣ標的化療法、例えば抗ＧＣＣ抗体療法、例えば治療剤と結合体化された抗ＧＣＣ抗体を含む免疫結合体による処置への対象を同定する方法を特徴とする。本発明はまた、癌を有する対象が、ＧＣＣ標的化療法、例えば本明細書に記載のＧＣＣ標的化療法に対して可能性のある候補であることを判定するインビトロまたはインビボ方法を特徴とする。
【０００６】
抗ＧＣＣ抗体、例えば本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体も、本明細書に記載の通り、例えばＧＣＣタンパク質の活性または機能の調節のため、およびＧＣＣ媒介性の疾患の処置のためにまた有用である。一部の態様では、本処置は、ＧＣＣ発現レベルを判定するために、知識を獲得すること、および／または試料もしくは対象を評価することと、対象がＧＣＣを発現する場合には、ＧＣＣ標的化療法、例えば本明細書に記載のＧＣＣ標的化療法を施行することとを含む。他の態様では、本方法は、対象からの試料を採取することと、例えば本明細書に記載の検出方法、例えば本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体を使用して、ＧＣＣ発現レベルを判定することと、その判定に基づいて対象に対して標的化処置レポートを選択することと、によって、個別の処置レポート、例えばＧＣＣ標的化処置レポートを作成することを特徴とする。
【０００７】
別の態様では、本発明はまた、抗ＧＣＣ抗体分子アミノ酸配列をコードする単離および／または組換え核酸、ならびにそのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに抗ＧＣＣ抗体分子を産生するための方法を特徴とする。また本明細書で特徴とされることは、ＧＣＣ発現を検出するために、抗ＧＣＣ抗体、例えば本明細書に記載の免疫組織結合体と、例えば本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体を含むインビトロアッセイとを含む、反応混合物およびキットである。
【０００８】
本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は全て、それらの全体が参照によって組み込まれる。
【０００９】
本明細書において開示される本発明（複数可）の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに本特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
それぞれ配列番号２１、２２、および２３、またはそれぞれ配列番号３３、３４、および３５のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９のアミノ酸配列、またはそれぞれ配列番号３９、４０、および４１のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む、抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目２）
それぞれ配列番号２１、２２、および２３のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む、抗ＧＣＣ抗体と同じエピトープへの結合について競合する、またはそれに結合する、抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目３）
それぞれ配列番号３３、３４、および３５のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号３９、４０、および４１のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む、抗ＧＣＣ抗体と同じエピトープへの結合について競合する、またはそれに結合する、抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目４）
前記抗ＧＣＣ抗体分子は、モノクローナル抗体である、項目１〜３のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目５）
前記抗ＧＣＣ抗体分子は、ウサギまたはウサギ由来抗体である、項目１〜４のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目６）
前記抗体は、ウサギモノクローナル抗体である、項目５に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目７）
配列番号１１または配列番号１５によるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１３または配列番号１７によるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とをさらに含む、項目１に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目８）
前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２１、２２、および２３による前記アミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲは、それぞれ配列番号２７、２８、および２９による前記アミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目９）
前記重鎖可変領域は、配列番号１１によるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３によるアミノ酸配列を含む、項目７に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目１０）
前記抗ＧＣＣ抗体分子は、検出可能な標識と結合体化されている、項目１〜９のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体。
（項目１１）
前記検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質酸化酵素、例えば、グルコース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、およびグルコース‐６‐リン酸脱水素酵素、過酸化水素を用いて、例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオシターゼ、またはミクロペルオキシダーゼ等の色素前駆体を酸化させる酵素と結合される、ウリカーゼならびにキサンチン酸化酵素等の複素環式酸化酵素、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、ならびに安定遊離ラジカルからなる群から選択される、項目１０に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目１２）
前記検出可能な標識は、フルオレセインまたはその誘導体、ローダミンまたはその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオンから選択されるフルオロフォアである、項目１０に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目１３）
前記検出可能な標識は、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１８８Ｒｈ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ／８１ＭＫｒ、８７ＭＳｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１３Ｍ  Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、および２０６Ｂｉ、ならびに２１３Ｂｉからなる群から選択される放射性薬剤である、項目１０に記載の抗ＧＣＣ抗体分子。
（項目１４）
項目１、７、８、および９のいずれかに記載の抗体分子をコードする、単離核酸配列。（項目１５）
項目１４に記載の単離核酸配列を含む、細胞。
（項目１６）
項目１、７、８、または９に記載の抗体分子を産生する方法であって、抗体分子の産生を可能にする条件下で項目１５に記載の前記細胞を培養し、それによって項目１、７、８、または９に記載の前記抗体分子を産生することを含む、方法。
（項目１７）
項目１、７、８、または９に記載の抗体分子の前記軽鎖および重鎖の一方または両方を含む、ベクター。
（項目１８）
生体試料におけるＧＣＣ分子を検出する方法であって、前記生体試料を項目１〜１３のいずれかに記載の抗体分子と接触させて、前記抗体分子が前記ＧＣＣ分子に結合するかどうかを判定することを含む、方法。
（項目１９）
前記方法検出方法が免疫組織化学アッセイを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記生体試料が、ＧＣＣを発現する癌を有する疑いのある患者に由来する腫瘍生検である、項目１８または項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記生体試料におけるＧＣＣ発現を定量化するステップをさらに含む、項目１８〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記ＧＣＣ発現の定量化が、前記生体試料における頂端のＧＣＣ発現、前記生体試料における細胞質ＧＣＣ発現、または両方を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記定量化ステップが、Ｈスコア法を含む、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ＧＣＣを発現する癌が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、軟部組織肉腫、神経外胚様性腫瘍、および神経内分泌腫瘍からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記肺癌が、扁平上皮癌または腺癌である、項目２４に記載の方法
（項目２５）
前記軟部組織肉腫が、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記神経内分泌腫瘍が、消化管または気管支肺神経内分泌腫瘍である、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
項目１〜１３に記載のいずれかの前記抗ＧＣＣ抗体分子、および使用説明書を含むキット。
（項目２８）
ＧＣＣ標的化治療剤をさらに含む、項目２７に記載のキット。
（項目２９）
前記ＧＣＣ標的化治療剤が、抗ＧＣＣ抗体分子を含む、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、モノクローナル抗体である、項目２９に記載のキット。
（項目３１）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、ヒトＩｇＧ１抗体である、項目２９または３０に記載のキット。
（項目３２）
項目２９、３０、または３１に記載のキットであって、前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子は、それぞれ配列番号６７、６８、および６９によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む、キット。
（項目３３）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、項目３２に記載のキット。
（項目３４）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、細胞傷害性薬剤と結合体化されている、項目２９〜３３に記載のキット。
（項目３５）
前記細胞傷害性薬剤が、オーリスタチン分子である、項目３４に記載のキット。
（項目３６）
前記オーリスタチン分子が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
前記細胞傷害性薬剤が、マレイミド部分を含むリンカーを介して前記抗体と結合体化されている、項目３４〜３６に記載のキット。
（項目３８）
前記マレイミドリンカーが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン−ｐ−アミノベンジルカルバメート、およびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ）からなる群から選択される、項目３７に記載のキット。
（項目３９）
前記ＧＣＣ標的化治療剤が、式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、または（Ｉ−６）のうちのいずれか１つを特徴とする免疫結合体であり、
【化１０１】
0006517267.tif 000002
【化１０２】
0006517267.tif 000003
【化１０３】
0006517267.tif 000004
式中、Ａｂは、それぞれ配列番号６７、６８、および６９によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子であり、ｍは１〜８の整数である、項目２８に記載のキット。
（項目４０）
ｍが３〜５である、項目３９に記載のキット。
（項目４１）
ｍが約４である、項目３９に記載のキット。
（項目４２）
１つ以上のＧＣＣ発現細胞を特徴とする疾患を有する患者を治療する方法であって、
ａ．例えば項目１８〜２６のいずれかに記載の方法によって、前記患者から採取した生体試料におけるＧＣＣタンパク質発現を検出することと、
ｂ．生体試料がＧＣＣを発現する場合、前記患者に、本明細書に記載のＧＣＣ標的化治療剤のようなＧＣＣ標的化治療剤を投与することと、
を含む、方法。
（項目４３）
前記検出ステップが、
ｉ）それぞれ配列番号２１、２２、および２３、または配列番号３３、３４、および３５によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９、または配列番号３９、４０、および４１によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子のような、項目１〜１３のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体分子のような、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子に前記生体試料を接触させるステップと、
ｉｉ）前記抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出するステップと、
を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記検出ステップが、免疫組織化学を用いて行われる、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ＧＣＣ標的化治療剤が、抗ＧＣＣ抗体分子を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、モノクローナル抗体である、項目４５に記載の方法。（項目４７）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、ヒトＩｇＧ１抗体である、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記抗ＧＣＣ抗体分子が、それぞれ配列番号６７、６８、および６９によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記抗ＧＣＣ抗体分子が、配列番号７９によるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８０によるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記抗ＧＣＣ抗体分子が、細胞傷害性薬剤と結合体化されている、項目４５に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞傷害性薬剤が、オーリスタチン分子である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記オーリスタチン分子が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞傷害性薬剤が、マレイミド部分を含むリンカーを介して結合体化されている、項目５０〜５３に記載の方法。
（項目５４）
前記マレイミドリンカーが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン−ｐ−アミノベンジルカルバメート、およびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ）からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
項目４２に記載の方法であって、前記ＧＣＣ標的化療法が、式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、または（Ｉ−６）のうちのいずれか１つによって特徴付けられる免疫結合体：
【化１０４】
0006517267.tif 000005
【化１０５】
0006517267.tif 000006
【化１０６】
0006517267.tif 000007
（式中、Ａｂは、それぞれ配列番号６７、６８、および６９によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子であり、式中ｍは１〜８の整数である。）
（項目５６）
ｍが約３〜約５である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
ｍが約４である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
１つ以上のＧＣＣ発現細胞によって特徴付けられる疾患が、癌、炎症性腸症候群、クローン病、またはパーキンソン病からなる群から選択される、項目４２〜５７のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、軟部組織肉腫、神経外胚様性腫瘍、および神経内分泌腫瘍からなる群から選択される、項目５８に記載の方法。（項目６０）
前記肺癌が、扁平上皮癌または腺癌である、項目５９に記載の方法
（項目６１）
前記軟部組織肉腫が、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫である、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記神経内分泌腫瘍が、消化管または気管支肺神経内分泌腫瘍である、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
前記生体試料が細胞または組織生検である、項目４２〜６２に記載の方法。
（項目６４）
前記細胞または組織生検が腫瘍生検である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
ＧＣＣ標的化治療剤への癌細胞の感受性を判定する、および／または対象がＧＣＣ標的化療法に対して可能性のある候補であるかどうかを評価する方法であって、
ｉ）癌を有する患者からの癌細胞からの試料を提供するステップと、
ｉｉ）それぞれ配列番号２１、２２、および２３、または配列番号３３、３４、および３５によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９、または配列番号３９、４０、および４１によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子のような、項目１〜１３のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体のような、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子に、前記試料を接触させるステップと、
ｉｉｉｉ）前記抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出し、それによって、本明細書に記載のＧＣ標的化治療剤のような前記ＧＣＣ標的化治療剤に対する前記癌の前記感受性を判定する、および／または対象が本明細書に記載のＧＣＣ標的化療法のようなＧＣＣ標的化療法による治療に対する候補であるかどうかを判定するステップと、
を含む、方法。
（項目６６）
前記検出ステップが、免疫組織化学を用いて行われる、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記癌が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、軟部組織肉腫、神経外胚様性腫瘍、および神経内分泌腫瘍からなる群から選択される、項目６５または６６に記載の方法。
（項目６８）
前記肺癌が、扁平上皮癌または腺癌である、項目６７に記載の方法
（項目６９）
前記軟部組織肉腫が、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫である、項目６７に記載の方法。
（項目７０）
前記神経内分泌腫瘍が、消化管または気管支肺神経内分泌腫瘍である、項目６７に記載の方法。
（項目７１）
前記患者に、本明細書に記載のＧＣＣ標的化治療剤のような前記ＧＣＣ標的化治療剤を投与するステップをさらに含む、項目６５〜７０のいずれかに記載の方法。
（項目７２）
前記ＧＣＣ標的化治療剤は、抗ＧＣＣ抗体分子を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子は、モノクローナル抗体である、項目７２に記載の方法。（項目７４）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子は、ヒトＩｇＧ１抗体である、項目７２または７３に記載の方法。
（項目７５）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、それぞれ配列番号６７、６８、および６９によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む、項目７２、７３、または７４のいずれかに記載の方法。
（項目７６）
前記治療用抗ＧＣＣ抗体分子が、配列番号７９によるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８０によるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とをさらに含む、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記抗ＧＣＣ抗体分子が、細胞傷害性薬剤と結合体化されている、項目７２〜７６のいずれかに記載の方法。
（項目７８）
前記細胞傷害性薬剤が、オーリスタチン分子である、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記オーリスタチン分子が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記細胞傷害性薬剤が、マレイミド部分を含むリンカーを介して結合体化されている、項目７７、７８、または７９のいずれかに記載の方法。
（項目８１）
前記マレイミドリンカーが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン−ｐ−アミノベンジルカルバメート、およびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ）からなる群から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
項目６５〜７１に記載の方法であって、前記ＧＣＣ標的化治療剤が、式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、または（Ｉ−６）のうちのいずれか１つによって特徴付けられる免疫結合体：
【化１０７】
0006517267.tif 000008
【化１０８】
0006517267.tif 000009
【化１０９】
0006517267.tif 000010
（式中、Ａｂは、それぞれ配列番号６７、６８、および６９によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号７０、７１、および７２によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子であり、式中ｍは１〜８の整数である。）
（項目８３）
ｍが約３〜約５である、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
ｍが約４である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
それぞれ配列番号２１、２２、および２３、または配列番号３３、３４、および３５によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９、または配列番号３９、４０、および４１によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子のような、項目１〜１３のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体のような、本明細書に記載の生体試料および抗ＧＣＣ抗体分子を含む反応混合物。（項目８６）
前記生体試料が、１つ以上の細胞を含む、項目８５に記載の反応混合物。
（項目８７）
前記生体試料が、組織試料を含む、項目８５に記載の反応混合物。
（項目８８）
前記組織試料が、パラフィン包埋組織試料である、項目８７に記載の反応混合物。
（項目８９）
前記生体試料が、原発性または転移性腫瘍生検試料である、項目８５に記載の反応混合物。
（項目９０）
前記生体試料が、スライド上に載置される、項目８５に記載の反応混合物。
（項目９１）
前記腫瘍が、大腸腫瘍、胃腫瘍、小腸腫瘍、食道腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、柔部組織肉腫、神経外胚様性腫瘍、または神経内分泌腫瘍である、項目８９に記載の反応混合物。
（項目９２）
前記肺腫瘍が、扁平上皮癌または腺癌である、項目９１に記載の反応混合物。
（項目９３）
前記軟部組織肉腫が、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫である、項目９１に記載の反応混合物。
（項目９４）
前記神経内分泌腫瘍が、消化管または気管支肺神経内分泌腫瘍である、項目９１に記載の反応混合物。
（項目９５）
前記生体試料が、ＧＣＣタンパク質を含む疑いがある、項目８５に記載の反応混合物。（項目９６）
前記抗ＧＣＣ抗体とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出するために好適な試薬をさらに含む、項目８５〜９５のいずれかに記載の反応混合物。
（項目９７）
個別の癌治療レポートを作成するための方法であって、前記方法が、
ＧＣＣ発現癌を有する疑いのある癌患者から採取された１つ以上の癌細胞を含む生体試料を、それぞれ配列番号２１、２２、および２３、または配列番号３３、３４、および３５によるアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）と、それぞれ配列番号２７、２８、および２９、または配列番号３９、４０、および４１によるアミノ酸配列を含む３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）とを含む抗ＧＣＣ抗体分子のような、項目１〜１３のいずれかに記載の抗ＧＣＣ抗体分子のような、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子に接触させるステップと、
項目１８〜２６のいずれかに記載のような方法によって、前記生体試料における前記抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出するステップと、
前記生物試料におけるＧＣＣ発現を定量化するステップと、
前記ＧＣＣ発現レベルを、本明細書に記載のＧＣＣ標的化療法のようなＧＣＣ標的化療法を含むデータベースと比較するステップと、
前記ＧＣＣ発現レベルに基づいて、ＧＣＣ標的化療法、および必要に応じて投与計画を選択するステップと、
を含む、方法。
（項目９８）
前記ＧＣＣ発現癌が、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、軟部組織肉腫、神経外胚様性腫瘍、または神経内分泌腫瘍である、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記肺腫瘍が、扁平上皮癌または腺癌である、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記軟部組織肉腫が、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫である、項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
前記神経内分泌腫瘍が、消化管または気管支肺神経内分泌腫瘍である、項目９８に記載の反応混合物。
（項目１０２）
前記検出ステップが、免疫組織化学を用いて行われる、項目９７〜１０１のいずれかに記載の方法。
（項目１０３）
前記ＧＣＣ発現の定量化が、前記生体試料における頂端のＧＣＣ発現、前記生体試料における細胞質ＧＣＣ発現、または両方を含む、項目９７〜１０２のいずれかに記載の方法。
（項目１０４）
前記定量化ステップが、Ｈスコア法を含む、項目９７〜１０３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のヒトＧＣＣ（ｈＧＣＣ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）マウスＦｃ（ｍＦｃ）融合タンパク質（ｈＧＣＣ−ＥＣＤ−ｍＦｃ）を生成するために使用されるタンパク質発現ベクターの円形地図である。
【図２Ａ】ＧＣＣ標的化免疫結合体の第Ｉ相臨床試験Ｃ２６００１研究への登録のためにスクリーニングされた癌患者からの腫瘍型全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図２Ａ）スクリーニングされた結腸直腸癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｂ）スクリーニングされた胃癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｃ）スクリーニングされた膵臓癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｄ）スクリーニングされた食道癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。
【図２Ｂ】ＧＣＣ標的化免疫結合体の第Ｉ相臨床試験Ｃ２６００１研究への登録のためにスクリーニングされた癌患者からの腫瘍型全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図２Ａ）スクリーニングされた結腸直腸癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｂ）スクリーニングされた胃癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｃ）スクリーニングされた膵臓癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｄ）スクリーニングされた食道癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。
【図２Ｃ】ＧＣＣ標的化免疫結合体の第Ｉ相臨床試験Ｃ２６００１研究への登録のためにスクリーニングされた癌患者からの腫瘍型全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図２Ａ）スクリーニングされた結腸直腸癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｂ）スクリーニングされた胃癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｃ）スクリーニングされた膵臓癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｄ）スクリーニングされた食道癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。
【図２Ｄ】ＧＣＣ標的化免疫結合体の第Ｉ相臨床試験Ｃ２６００１研究への登録のためにスクリーニングされた癌患者からの腫瘍型全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図２Ａ）スクリーニングされた結腸直腸癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｂ）スクリーニングされた胃癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｃ）スクリーニングされた膵臓癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。（図２Ｄ）スクリーニングされた食道癌患者全体の総計集合Ｈスコア分布を示す。
【図３Ａ】スクリーニングされた様々な腫瘍特異的なマイクロアレイ全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図３Ａ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた様々な結腸直腸腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。（図３Ｂ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた胃腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。（図３Ｃ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた様々な膵臓腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。
【図３Ｂ】スクリーニングされた様々な腫瘍特異的なマイクロアレイ全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図３Ａ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた様々な結腸直腸腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。（図３Ｂ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた胃腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。（図３Ｃ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた様々な膵臓腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。
【図３Ｃ】スクリーニングされた様々な腫瘍特異的なマイクロアレイ全体のＧＣＣ発現の総計／集合（頂端および細胞質）Ｈスコア分布を要約する棒グラフを示す。（図３Ａ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた様々な結腸直腸腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。（図３Ｂ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた胃腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。（図３Ｃ）ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた様々な膵臓腫瘍マイクロアレイ上の試料全体の総計／集合Ｈスコア分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）（ＳＴＡＲ、ＳＴ受容体、ＧＵＣ２Ｃ、およびＧＵＣＹ２Ｃとしても公知）は、腸液の維持、電解質の恒常性、および細胞増殖において機能する膜貫通細胞表面受容体である（その全体において各々が参照によって本明細書において組み込まれる、Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：３０１８−３０２０（２００３）、Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３９：４６３−４６６（１９９７）、Ｐｉｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：２６９５−２６９９（２００３））、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９６３）。この機能は、グアニリンの結合を通して媒介される（Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１１：１５０−１５４（１９９２））。ＧＣＣはまた、大腸菌および他の感染性生物によって産生されるペプチドである熱安定性エンテロトキシン（例えば、ＮＴＦＹＣＣＥＬＣＣＮＰＡＣＡＧＣＹ、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＴ）に対する受容体でもある（Ｒａｏ，Ｍ．Ｃ．Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１１２：７４−９３（１９８５）、Ｋｎｏｏｐ  Ｆ．Ｃ．ａｎｄ  Ｏｗｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：６７−７２（１９９２））。ＧＣＣへのＳＴの結合は、腸疾患、例えば下痢をもたらすシグナルカスケードを活性化する。
【００１２】
ヒトＧＣＣについてのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９６３、配列番号２）：
１  ｇａｃｃａｇａｇａｇ  ａａｇｃｇｔｇｇｇｇ  ａａｇａｇｔｇｇｇｃ  ｔｇａｇｇｇａｃｔｃ  ｃａｃｔａｇａｇｇｃ  ｔｇｔｃｃａｔｃｔｇ
６１  ｇａｔｔｃｃｃｔｇｃ  ｃｔｃｃｃｔａｇｇａ  ｇｃｃｃａａｃａｇａ  ｇｃａａａｇｃａａｇ  ｔｇｇｇｃａｃａａｇ  ｇａｇｔａｔｇｇｔｔ
１２１  ｃｔａａｃｇｔｇａｔ  ｔｇｇｇｇｔｃａｔｇ  ａａｇａｃｇｔｔｇｃ  ｔｇｔｔｇｇａｃｔｔ  ｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇ  ｔｃａｃｔｇｃｔｃｔ
１８１  ｔｃｃａｇｃｃｃｇｇ  ｇｔｇｇｃｔｇｔｃｃ  ｔｔｔａｇｔｔｃｃｃ  ａｇｇｔｇａｇｔｃａ  ｇａａｃｔｇｃｃａｃ  ａａｔｇｇｃａｇｃｔ
２４１  ａｔｇａａａｔｃａｇ  ｃｇｔｃｃｔｇａｔｇ  ａｔｇｇｇｃａａｃｔ  ｃａｇｃｃｔｔｔｇｃ  ａｇａｇｃｃｃｃｔｇ  ａａａａａｃｔｔｇｇ
３０１  ａａｇａｔｇｃｇｇｔ  ｇａａｔｇａｇｇｇｇ  ｃｔｇｇａａａｔａｇ  ｔｇａｇａｇｇａｃｇ  ｔｃｔｇｃａａａａｔ  ｇｃｔｇｇｃｃｔａａ
３６１  ａｔｇｔｇａｃｔｇｔ  ｇａａｃｇｃｔａｃｔ  ｔｔｃａｔｇｔａｔｔ  ｃｇｇａｔｇｇｔｃｔ  ｇａｔｔｃａｔａａｃ  ｔｃａｇｇｃｇａｃｔ
４２１  ｇｃｃｇｇａｇｔａｇ  ｃａｃｃｔｇｔｇａａ  ｇｇｃｃｔｃｇａｃｃ  ｔａｃｔｃａｇｇａａ  ａａｔｔｔｃａａａｔ  ｇｃａｃａａｃｇｇａ
４８１  ｔｇｇｇｃｔｇｔｇｔ  ｃｃｔｃａｔａｇｇｇ  ｃｃｃｔｃａｔｇｔａ  ｃａｔａｃｔｃｃａｃ  ｃｔｔｃｃａｇａｔｇ  ｔａｃｃｔｔｇａｃａ
５４１  ｃａｇａａｔｔｇａｇ  ｃｔａｃｃｃｃａｔｇ  ａｔｃｔｃａｇｃｔｇ  ｇａａｇｔｔｔｔｇｇ  ａｔｔｇｔｃａｔｇｔ  ｇａｃｔａｔａａａｇ
６０１  ａａａｃｃｔｔａａｃ  ｃａｇｇｃｔｇａｔｇ  ｔｃｔｃｃａｇｃｔａ  ｇａａａｇｔｔｇａｔ  ｇｔａｃｔｔｃｔｔｇ  ｇｔｔａａｃｔｔｔｔ
６６１  ｇｇａａａａｃｃａａ  ｃｇａｔｃｔｇｃｃｃ  ｔｔｃａａａａｃｔｔ  ａｔｔｃｃｔｇｇａｇ  ｃａｃｔｔｃｇｔａｔ  ｇｔｔｔａｃａａｇａ
７２１  ａｔｇｇｔａｃａｇａ  ａａｃｔｇａｇｇａｃ  ｔｇｔｔｔｃｔｇｇｔ  ａｃｃｔｔａａｔｇｃ  ｔｃｔｇｇａｇｇｃｔ  ａｇｃｇｔｔｔｃｃｔ
７８１  ａｔｔｔｃｔｃｃｃａ  ｃｇａａｃｔｃｇｇｃ  ｔｔｔａａｇｇｔｇｇ  ｔｇｔｔａａｇａｃａ  ａｇａｔａａｇｇａｇ  ｔｔｔｃａｇｇａｔａ
８４１  ｔｃｔｔａａｔｇｇａ  ｃｃａｃａａｃａｇｇ  ａａａａｇｃａａｔｇ  ｔｇａｔｔａｔｔａｔ  ｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔ  ｃｃａｇａｇｔｔｃｃ
９０１  ｔｃｔａｃａａｇｃｔ  ｇａａｇｇｇｔｇａｃ  ｃｇａｇｃａｇｔｇｇ  ｃｔｇａａｇａｃａｔ  ｔｇｔｃａｔｔａｔｔ  ｃｔａｇｔｇｇａｔｃ
９６１  ｔｔｔｔｃａａｔｇａ  ｃｃａｇｔａｃｔｔｔ  ｇａｇｇａｃａａｔｇ  ｔｃａｃａｇｃｃｃｃ  ｔｇａｃｔａｔａｔｇ  ａａａａａｔｇｔｃｃ
１０２１  ｔｔｇｔｔｃｔｇａｃ  ｇｃｔｇｔｃｔｃｃｔ  ｇｇｇａａｔｔｃｃｃ  ｔｔｃｔａａａｔａｇ  ｃｔｃｔｔｔｃｔｃｃ  ａｇｇａａｔｃｔａｔ
１０８１  ｃａｃｃａａｃａａａ  ａｃｇａｇａｃｔｔｔ  ｇｃｔｃｔｔｇｃｃｔ  ａｔｔｔｇａａｔｇｇ  ａａｔｃｃｔｇｃｔｃ  ｔｔｔｇｇａｃａｔａ
１１４１  ｔｇｃｔｇａａｇａｔ  ａｔｔｔｃｔｔｇａａ  ａａｔｇｇａｇａａａ  ａｔａｔｔａｃｃａｃ  ｃｃｃｃａａａｔｔｔ  ｇｃｔｃａｔｇｃｔｔ
１２０１  ｔｃａｇｇａａｔｃｔ  ｃａｃｔｔｔｔｇａａ  ｇｇｇｔａｔｇａｃｇ  ｇｔｃｃａｇｔｇａｃ  ｃｔｔｇｇａｔｇａｃ  ｔｇｇｇｇｇｇａｔｇ
１２６１  ｔｔｇａｃａｇｔａｃ  ｃａｔｇｇｔｇｃｔｔ  ｃｔｇｔａｔａｃｃｔ  ｃｔｇｔｇｇａｃａｃ  ｃａａｇａａａｔａｃ  ａａｇｇｔｔｃｔｔｔ
１３２１  ｔｇａｃｃｔａｔｇａ  ｔａｃｃｃａｃｇｔａ  ａａｔａａｇａｃｃｔ  ａｔｃｃｔｇｔｇｇａ  ｔａｔｇａｇｃｃｃｃ  ａｃａｔｔｃａｃｔｔ
１３８１  ｇｇａａｇａａｃｔｃ  ｔａａａｃｔｔｃｃｔ  ａａｔｇａｔａｔｔａ  ｃａｇｇｃｃｇｇｇｇ  ｃｃｃｔｃａｇａｔｃ  ｃｔｇａｔｇａｔｔｇ
１４４１  ｃａｇｔｃｔｔｃａｃ  ｃｃｔｃａｃｔｇｇａ  ｇｃｔｇｔｇｇｔｇｃ  ｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔ  ｃｇｔｃｇｃｔｃｔｃ  ｃｔｇａｔｇｃｔｃａ
１５０１  ｇａａａａｔａｔａｇ  ａａａａｇａｔｔａｔ  ｇａａｃｔｔｃｇｔｃ  ａｇａａａａａａｔｇ  ｇｔｃｃｃａｃａｔｔ  ｃｃｔｃｃｔｇａａａ
１５６１  ａｔａｔｃｔｔｔｃｃ  ｔｃｔｇｇａｇａｃｃ  ａａｔｇａｇａｃｃａ  ａｔｃａｔｇｔｔａｇ  ｃｃｔｃａａｇａｔｃ  ｇａｔｇａｔｇａｃａ
１６２１  ａａａｇａｃｇａｇａ  ｔａｃａａｔｃｃａｇ  ａｇａｃｔａｃｇａｃ  ａｇｔｇｃａａａｔａ  ｃｇａｃａａａａａｇ  ｃｇａｇｔｇａｔｔｃ
１６８１  ｔｃａａａｇａｔｃｔ  ｃａａｇｃａｃａａｔ  ｇａｔｇｇｔａａｔｔ  ｔｃａｃｔｇａａａａ  ａｃａｇａａｇａｔａ  ｇａａｔｔｇａａｃａ
１７４１  ａｇｔｔｇｃｔｔｃａ  ｇａｔｔｇａｃｔａｔ  ｔａｃａａｃｃｔｇａ  ｃｃａａｇｔｔｃｔａ  ｃｇｇｃａｃａｇｔｇ  ａａａｃｔｔｇａｔａ
１８０１  ｃｃａｔｇａｔｃｔｔ  ｃｇｇｇｇｔｇａｔａ  ｇａａｔａｃｔｇｔｇ  ａｇａｇａｇｇａｔｃ  ｃｃｔｃｃｇｇｇａａ  ｇｔｔｔｔａａａｔｇ
１８６１  ａｃａｃａａｔｔｔｃ  ｃｔａｃｃｃｔｇａｔ  ｇｇｃａｃａｔｔｃａ  ｔｇｇａｔｔｇｇｇａ  ｇｔｔｔａａｇａｔｃ  ｔｃｔｇｔｃｔｔｇｔ
１９２１  ａｔｇａｃａｔｔｇｃ  ｔａａｇｇｇａａｔｇ  ｔｃａｔａｔｃｔｇｃ  ａｃｔｃｃａｇｔａａ  ｇａｃａｇａａｇｔｃ  ｃａｔｇｇｔｃｇｔｃ
１９８１  ｔｇａａａｔｃｔａｃ  ｃａａｃｔｇｃｇｔａ  ｇｔｇｇａｃａｇｔａ  ｇａａｔｇｇｔｇｇｔ  ｇａａｇａｔｃａｃｔ  ｇａｔｔｔｔｇｇｃｔ
２０４１  ｇｃａａｔｔｃｃａｔ  ｔｔｔａｃｃｔｃｃａ  ａａａａａｇｇａｃｃ  ｔｇｔｇｇａｃａｇｃ  ｔｃｃａｇａｇｃａｃ  ｃｔｃｃｇｃｃａａｇ
２１０１  ｃｃａａｃａｔｃｔｃ  ｔｃａｇａａａｇｇａ  ｇａｔｇｔｇｔａｃａ  ｇｃｔａｔｇｇｇａｔ  ｃａｔｃｇｃａｃａｇ  ｇａｇａｔｃａｔｃｃ
２１６１  ｔｇｃｇｇａａａｇａ  ａａｃｃｔｔｃｔａｃ  ａｃｔｔｔｇａｇｃｔ  ｇｔｃｇｇｇａｃｃｇ  ｇａａｔｇａｇａａｇ  ａｔｔｔｔｃａｇａｇ
２２２１  ｔｇｇａａａａｔｔｃ  ｃａａｔｇｇａａｔｇ  ａａａｃｃｃｔｔｃｃ  ｇｃｃｃａｇａｔｔｔ  ａｔｔｃｔｔｇｇａａ  ａｃａｇｃａｇａｇｇ
２２８１  ａａａａａｇａｇｃｔ  ａｇａａｇｔｇｔａｃ  ｃｔａｃｔｔｇｔａａ  ａａａａｃｔｇｔｔｇ  ｇｇａｇｇａａｇａｔ  ｃｃａｇａａａａｇａ
２３４１  ｇａｃｃａｇａｔｔｔ  ｃａａａａａａａｔｔ  ｇａｇａｃｔａｃａｃ  ｔｔｇｃｃａａｇａｔ  ａｔｔｔｇｇａｃｔｔ  ｔｔｔｃａｔｇａｃｃ
２４０１  ａａａａａａａｔｇａ  ａａｇｃｔａｔａｔｇ  ｇａｔａｃｃｔｔｇａ  ｔｃｃｇａｃｇｔｃｔ  ａｃａｇｃｔａｔａｔ  ｔｃｔｃｇａａａｃｃ
２４６１  ｔｇｇａａｃａｔｃｔ  ｇｇｔａｇａｇｇａａ  ａｇｇａｃａｃａｇｃ  ｔｇｔａｃａａｇｇｃ  ａｇａｇａｇｇｇａｃ  ａｇｇｇｃｔｇａｃａ
２５２１  ｇａｃｔｔａａｃｔｔ  ｔａｔｇｔｔｇｃｔｔ  ｃｃａａｇｇｃｔａｇ  ｔｇｇｔａａａｇｔｃ  ｔｃｔｇａａｇｇａｇ  ａａａｇｇｃｔｔｔｇ
２５８１  ｔｇｇａｇｃｃｇｇａ  ａｃｔａｔａｔｇａｇ  ｇａａｇｔｔａｃａａ  ｔｃｔａｃｔｔｃａｇ  ｔｇａｃａｔｔｇｔａ  ｇｇｔｔｔｃａｃｔａ
２６４１  ｃｔａｔｃｔｇｃａａ  ａｔａｃａｇｃａｃｃ  ｃｃｃａｔｇｇａａｇ  ｔｇｇｔｇｇａｃａｔ  ｇｃｔｔａａｔｇａｃ  ａｔｃｔａｔａａｇａ
２７０１  ｇｔｔｔｔｇａｃｃａ  ｃａｔｔｇｔｔｇａｔ  ｃａｔｃａｔｇａｔｇ  ｔｃｔａｃａａｇｇｔ  ｇｇａａａｃｃａｔｃ  ｇｇｔｇａｔｇｃｇｔ
２７６１  ａｃａｔｇｇｔｇｇｃ  ｔａｇｔｇｇｔｔｔｇ  ｃｃｔａａｇａｇａａ  ａｔｇｇｃａａｔｃｇ  ｇｃａｔｇｃａａｔａ  ｇａｃａｔｔｇｃｃａ
２８２１  ａｇａｔｇｇｃｃｔｔ  ｇｇａａａｔｃｃｔｃ  ａｇｃｔｔｃａｔｇｇ  ｇｇａｃｃｔｔｔｇａ  ｇｃｔｇｇａｇｃａｔ  ｃｔｔｃｃｔｇｇｃｃ
２８８１  ｔｃｃｃａａｔａｔｇ  ｇａｔｔｃｇｃａｔｔ  ｇｇａｇｔｔｃａｃｔ  ｃｔｇｇｔｃｃｃｔｇ  ｔｇｃｔｇｃｔｇｇａ  ｇｔｔｇｔｇｇｇａａ
２９４１  ｔｃａａｇａｔｇｃｃ  ｔｃｇｔｔａｔｔｇｔ  ｃｔａｔｔｔｇｇａｇ  ａｔａｃｇｇｔｃａａ  ｃａｃａｇｃｃｔｃｔ  ａｇｇａｔｇｇａａｔ
３００１  ｃｃａｃｔｇｇｃｃｔ  ｃｃｃｔｔｔｇａｇａ  ａｔｔｃａｃｇｔｇａ  ｇｔｇｇｃｔｃｃａｃ  ｃａｔａｇｃｃａｔｃ  ｃｔｇａａｇａｇａａ
３０６１  ｃｔｇａｇｔｇｃｃａ  ｇｔｔｃｃｔｔｔａｔ  ｇａａｇｔｇａｇａｇ  ｇａｇａａａｃａｔａ  ｃｔｔａａａｇｇｇａ  ａｇａｇｇａａａｔｇ
３１２１  ａｇａｃｔａｃｃｔａ  ｃｔｇｇｃｔｇａｃｔ  ｇｇｇａｔｇａａｇｇ  ａｃｃａｇａａａｔｔ  ｃａａｃｃｔｇｃｃａ  ａｃｃｃｃｔｃｃｔａ
３１８１  ｃｔｇｔｇｇａｇａａ  ｔｃａａｃａｇｃｇｔ  ｔｔｇｃａａｇｃａｇ  ａａｔｔｔｔｃａｇａ  ｃａｔｇａｔｔｇｃｃ  ａａｃｔｃｔｔｔａｃ
３２４１  ａｇａａａａｇａｃａ  ｇｇｃａｇｃａｇｇｇ  ａｔａａｇａａｇｃｃ  ａａａａａｃｃｃａｇ  ａｃｇｇｇｔａｇｃｃ  ａｇｃｔａｔａａａａ
３３０１  ａａｇｇｃａｃｔｃｔ  ｇｇａａｔａｃｔｔｇ  ｃａｇｃｔｇａａｔａ  ｃｃａｃａｇａｃａａ  ｇｇａｇａｇｃａｃｃ  ｔａｔｔｔｔｔａａａ
【００１３】
ヒトＧＣＣについてのアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿００４９５４、配列番号３）：
１  ｍｋｔｌｌｌｄｌａｌ  ｗｓｌｌｆｑｐｇｗｌ  ｓｆｓｓｑｖｓｑｎｃ  ｈｎｇｓｙｅｉｓｖｌ  ｍｍｇｎｓａｆａｅｐ  ｌｋｎｌｅｄａｖｎｅ
６１  ｇｌｅｉｖｒｇｒｌｑ  ｎａｇｌｎｖｔｖｎａ  ｔｆｍｙｓｄｇｌｉｈ  ｎｓｇｄｃｒｓｓｔｃ  ｅｇｌｄｌｌｒｋｉｓ  ｎａｑｒｍｇｃｖｌｉ
１２１  ｇｐｓｃｔｙｓｔｆｑ  ｍｙｌｄｔｅｌｓｙｐ  ｍｉｓａｇｓｆｇｌｓ  ｃｄｙｋｅｔｌｔｒｌ  ｍｓｐａｒｋｌｍｙｆ  ｌｖｎｆｗｋｔｎｄｌ
１８１  ｐｆｋｔｙｓｗｓｔｓ  ｙｖｙｋｎｇｔｅｔｅ  ｄｃｆｗｙｌｎａｌｅ  ａｓｖｓｙｆｓｈｅｌ  ｇｆｋｖｖｌｒｑｄｋ  ｅｆｑｄｉｌｍｄｈｎ
２４１  ｒｋｓｎｖｉｉｍｃｇ  ｇｐｅｆｌｙｋｌｋｇ  ｄｒａｖａｅｄｉｖｉ  ｉｌｖｄｌｆｎｄｑｙ  ｆｅｄｎｖｔａｐｄｙ  ｍｋｎｖｌｖｌｔｌｓ
３０１  ｐｇｎｓｌｌｎｓｓｆ  ｓｒｎｌｓｐｔｋｒｄ  ｆａｌａｙｌｎｇｉｌ  ｌｆｇｈｍｌｋｉｆｌ  ｅｎｇｅｎｉｔｔｐｋ  ｆａｈａｆｒｎｌｔｆ
３６１  ｅｇｙｄｇｐｖｔｌｄ  ｄｗｇｄｖｄｓｔｍｖ  ｌｌｙｔｓｖｄｔｋｋ  ｙｋｖｌｌｔｙｄｔｈ  ｖｎｋｔｙｐｖｄｍｓ  ｐｔｆｔｗｋｎｓｋｌ
４２１  ｐｎｄｉｔｇｒｇｐｑ  ｉｌｍｉａｖｆｔｌｔ  ｇａｖｖｌｌｌｌｖａ  ｌｌｍｌｒｋｙｒｋｄ  ｙｅｌｒｑｋｋｗｓｈ  ｉｐｐｅｎｉｆｐｌｅ
４８１  ｔｎｅｔｎｈｖｓｌｋ  ｉｄｄｄｋｒｒｄｔｉ  ｑｒｌｒｑｃｋｙｄｋ  ｋｒｖｉｌｋｄｌｋｈ  ｎｄｇｎｆｔｅｋｑｋ  ｉｅｌｎｋｌｌｑｉｄ
５４１  ｙｙｎｌｔｋｆｙｇｔ  ｖｋｌｄｔｍｉｆｇｖ  ｉｅｙｃｅｒｇｓｌｒ  ｅｖｌｎｄｔｉｓｙｐ  ｄｇｔｆｍｄｗｅｆｋ  ｉｓｖｌｙｄｉａｋｇ
６０１  ｍｓｙｌｈｓｓｋｔｅ  ｖｈｇｒｌｋｓｔｎｃ  ｖｖｄｓｒｍｖｖｋｉ  ｔｄｆｇｃｎｓｉｌｐ  ｐｋｋｄｌｗｔａｐｅ  ｈｌｒｑａｎｉｓｑｋ
６６１  ｇｄｖｙｓｙｇｉｉａ  ｑｅｉｉｌｒｋｅｔｆ  ｙｔｌｓｃｒｄｒｎｅ  ｋｉｆｒｖｅｎｓｎｇ  ｍｋｐｆｒｐｄｌｆｌ  ｅｔａｅｅｋｅｌｅｖ
７２１  ｙｌｌｖｋｎｃｗｅｅ  ｄｐｅｋｒｐｄｆｋｋ  ｉｅｔｔｌａｋｉｆｇ  ｌｆｈｄｑｋｎｅｓｙ  ｍｄｔｌｉｒｒｌｑｌ  ｙｓｒｎｌｅｈｌｖｅ
７８１  ｅｒｔｑｌｙｋａｅｒ  ｄｒａｄｒｌｎｆｍｌ  ｌｐｒｌｖｖｋｓｌｋ  ｅｋｇｆｖｅｐｅｌｙ  ｅｅｖｔｉｙｆｓｄｉ  ｖｇｆｔｔｉｃｋｙｓ
８４１  ｔｐｍｅｖｖｄｍｌｎ  ｄｉｙｋｓｆｄｈｉｖ  ｄｈｈｄｖｙｋｖｅｔ  ｉｇｄａｙｍｖａｓｇ  ｌｐｋｒｎｇｎｒｈａ  ｉｄｉａｋｍａｌｅｉ
９０１  ｌｓｆｍｇｔｆｅｌｅ  ｈｌｐｇｌｐｉｗｉｒ  ｉｇｖｈｓｇｐｃａａ  ｇｖｖｇｉｋｍｐｒｙ  ｃｌｆｇｄｔｖｎｔａ  ｓｒｍｅｓｔｇｌｐｌ
９６１  ｒｉｈｖｓｇｓｔｉａ  ｉｌｋｒｔｅｃｑｆｌ  ｙｅｖｒｇｅｔｙｌｋ  ｇｒｇｎｅｔｔｙｗｌ  ｔｇｍｋｄｑｋｆｎｌ  ｐｔｐｐｔｖｅｎｑｑ
１０２１  ｒｌｑａｅｆｓｄｍｉ  ａｎｓｌｑｋｒｑａａ  ｇｉｒｓｑｋｐｒｒｖ  ａｓｙｋｋｇｔｌｅｙ  ｌｑｌｎｔｔｄｋｅｓ  ｔｙｆ
【００１４】
ＧＣＣタンパク質は、各々がＧＣＣ分子に分離可能な機能を提供する、いくつかの一般に認められたドメインを有する。ＧＣＣの部分は、配列番号３のアミノ酸残基１〜残基約２３または残基１〜残基約２１のシグナル配列（細胞表面にタンパク質を誘導するための）（成熟のために切り取られて、配列番号３のアミノ酸残基約２２または２４〜１０７３の機能的成熟タンパク質を産出する）、配列番号３のアミノ酸残基約２４〜残基約４２０または残基約５４〜残基約３８４に結合するリガンド、例えばグアニリンまたはＳＴに対する細胞外ドメイン、配列番号３のアミノ酸残基約４３１〜残基約４５４または残基約４３６〜残基約４５２の膜貫通ドメイン、配列番号３のアミノ酸残基約４８９〜残基約７４９または残基約５０８〜残基約７４５の、チロシンキナーゼ活性を有することが予測されるキナーゼ相同性ドメイン、および配列番号３の残基約７５０〜残基約１００７または残基約８１６〜残基約１００２のグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む。
【００１５】
正常なヒト組織において、ＧＣＣは、小腸、大腸、および直腸を裏打ちする粘膜細胞で、例えば、頂端の刷子縁膜で発現される（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ
Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６））。ＧＣＣの発現は、全ての原発性および転移性結腸直腸腫瘍における発現を伴い、腸上皮細胞の新生物性形質転換に際して維持される（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６）、Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７（２００５）、Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１６５３−１６６１（１９９４））。胃、食道、および胃食道接合部由来の新生細胞もまた、ＧＣＣを発現する（例えば米国特許第６，７６７，７０４号、Ｄｅｂｒｕｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３０：１１９１−１２０６（２００６）を参照されたい）。その組織特異的発現および癌、例えば胃腸起源の癌（例えば結腸直腸癌、胃癌、食道癌、または小腸癌）との関連は、この疾患についての診断マーカーとしてのＧＣＣの使用のために活用することができる（Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６）、Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７（２００５））。加えて、本明細書の実施例において実証されるように、膵臓癌、肺癌、軟部組織肉腫（例えば、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫）、胃腸または気管支肺神経内分泌腫瘍、および神経外胚様性腫瘍を含むがこれに限定されない、非胃腸起源の癌の異なる数種類は、ＧＣＣを発現することが示されている。
【００１６】
細胞表面タンパク質として、ＧＣＣはまた、抗体またはリガンドなどの受容体結合タンパク質についての診断用または治療用標的として役立てることができる。正常な腸組織において、ＧＣＣは、管腔環境および血管区画の間の不透過性障壁を形成する上皮細胞密着結合の頂端側で発現される（Ａｌｍｅｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８：８６５−８７３）、Ｇｕａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ
３２：１０１７−１０２６（１９８７））。そのため、ＧＣＣ結合タンパク質治療剤の全身静脈内投与は、侵襲性または転移性結腸癌細胞、腸管外または転移性結腸腫瘍、食道腫瘍または胃腫瘍、胃食道接合部の腺癌を含む胃腸系の新生細胞に到達するが、腸ＧＣＣ受容体に最小限の影響しか有さないであろう。加えて、ＧＣＣは、リガンド結合に際して、受容体媒介性のエンドサイトーシスを通して内部移行する（Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７（２００５）、Ｕｒｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２４５：２９−３６（１９９５））。
【００１７】
ＧＣＣの細胞外ドメインに対して産生されたポリクローナル抗体（Ｎａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８：１５１−１５９（１９９６））は、ヒトおよびラットＧＣＣに結合するＳＴペプチドを阻害することができ、かつヒトＧＣＣによるＳＴ媒介性のｃＧＭＰ産生を阻害することができた。
【００１８】
ＧＣＣは、結腸癌を含む癌に関与するタンパク質として特徴付けられている。Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓ  Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３９：１７１−１８１（１９９６）、Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１６１８−１６２７（２００５）、Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０７：１６５３−１６６１（１９９４）、Ｕｒｂａｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２４５：２９−３６（１９９５）も参照されたい。ＧＣＣに対する抗体分子は、したがって、非結合体形態で単独で使用して、ＧＣＣ発現癌性細胞を阻害することができる。加えて、ＧＣＣに対する抗体分子は、ＧＣＣ発現癌性細胞を検出するために、裸または標識された形態で使用され得る。本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、ヒトＧＣＣを結合することができる。一部の実施形態では、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、リガンド、例えばグアニリンまたは熱安定性エンテロトキシンのＧＣＣへの結合を阻害することができる。他の実施形態では、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、リガンド、例えばグアニリンまたは熱安定性エンテロトキシンのＧＣＣへの結合を阻害しない。
【００１９】
ＧＣＣに特異的なモノクローナル抗体は、ＧＣＣ：Ｂ１０（Ｎａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：５００−５１１（１９９７））、ＧＣＣ：４Ｄ７（Ｖｉｊａｙａｃｈａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１６０７５−１６０８３（２０００））、およびＧＣＣ：Ｃ８（Ｂａｋｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１７９−１８７（２０００））を含む。ＧＣＣ：Ｂ１０は、カッパ軽鎖およびＩｇＧ２ａアイソタイプを有し、かつラット、ブタ、およびサルＧＣＣに交差反応する。ＧＣＣ：Ｂ１０は、ＧＣＣの細胞内ドメイン、特に配列番号３の残基４７０〜４８０の最初の６３個のアミノ酸に結合する（Ｎａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：２１７５−２１８３（１９９８））。ＧＣＣ：４Ｄ７は、ＧＣＣの残基４９１〜５６８内のキナーゼ相同性ドメインに結合する（Ｂｈａｎｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：９１９６−９２０６（２００１））。ＧＣＣ：Ｃ８は、ＧＣＣの細胞質部分におけるプロテインキナーゼ様ドメインに結合する。
定義
【００２０】
本明細書において他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者によって共通して理解される意味を有する。一般に、本明細書に記載の細胞培養および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレチドまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野において公知であるものである。ＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ならびに有用な核酸配列およびペプチド配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄによって維持されるウェブサイトで見出すことができる。標準的な技術は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養、ならびに形質転換および形質移入（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の説明書に従って、または当技術分野において共通して行われるように、または本明細書に記載のとおり実行される。前述の技術および手順は、例えば、本明細書の全体にわたって引用され、考察される様々な、一般的なおよびより特定の参考文献に記載のとおり、当技術分野において公知の方法に従って一般に実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００））を参照されたく、または一般に、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。本明細書に記載の、関連して利用される命名法ならびにその検査法および技術は、当技術分野において公知である。さらに、文脈によって他に定めがない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００２１】
本明細書において使用されるように、用語「抗体分子」は、抗体、抗体ペプチド（複数可）、もしくは免疫グロブリンまたは前述のもの、例えば抗体のいずれの抗原結合断片をも指す。抗体分子は、単鎖抗体分子、例えばｓｃＦｖ（例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）を参照されたい）、ならびに単一ドメイン抗体分子（例えば国際公開第ＷＯ９４０４６７８号を参照されたい）を含む。用語「抗体分子」の範囲内にはないが、本発明はまた、「抗体アナログ（複数可）」、他の非抗体分子タンパク質ベースのスキャフォールド、例えば、ＣＤＲを使用して特異的な抗原結合を提供する融合タンパク質および／または免疫結合体をも含む。
【００２２】
「抗ＧＣＣ抗体分子」は、ＧＣＣ、例えばヒトＧＣＣと相互作用し、またはそれを認識する、例えばそれに結合する（例えば特異的に結合する）抗体分子（つまり抗体、抗体の抗原結合断片、または抗体アナログ）を指す。例示的な抗ＧＣＣ抗体分子は、表１および表２に要約されるものなどである。
【００２３】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」、「抗体ペプチド（複数可）」、または「免疫グロブリン」は、単鎖、二本鎖、および複数鎖のタンパク質ならびに糖タンパク質を指す。抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト抗体またはヒト化抗体を含み、これらはすべて、本明細書における他のところでより詳細に考察される。ラクダ科の動物の抗体（例えばＵＳ２００５／００３７４２１を参照されたい）、およびナノボディ、例えばＩｇＮＡＲ（サメ抗体）（例えば国際公開第ＷＯ０３／０１４１６１号を参照されたい）もまた、用語の範囲内に含まれる。用語「抗体」はまた、合成変異体および遺伝子操作された変異体をも含む。
【００２４】
本明細書において使用されるように、用語「抗体断片」または抗体の「抗原結合断片」は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、単鎖抗体、機能的重鎖抗体（ナノボディ）ならびに特異的な結合について完全な抗体と競合する、少なくとも１つの所望のエピトープに対して特異性を有する抗体の任意の部分（例えば、エピトープに特異的に結合するのに十分なＣＤＲ配列を有し、かつ十分なフレームワーク配列を有する断片）を指す。例えば、抗原結合断片は、抗体からその断片が誘導される該抗体に結合するエピトープへの結合について競合することができる。誘導されるとは、この文脈および同様の文脈において使用される場合、誘導の任意の特定の方法または工程を意味しないが、単に配列類似性を指し得る。抗原結合断片は、組換え技術によってまたは完全な抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、産生することができる。抗原結合断片という用語は、単鎖、例えば軽鎖および重鎖を有する抗体のうちの重鎖と共に使用される場合、鎖の断片が、他方の鎖、例えば軽鎖の完全可変領域と対になる場合に、それが、重鎖および軽鎖可変領域全体で見られるものの少なくとも２５、５０、７５、８５、または９０％の結合を可能にするのに十分であることを意味する。
【００２５】
用語「ＣＤＲの抗原結合集合体」または「結合を可能にするのに十分な多くのＣＤＲ」（および同様の言葉）は、本明細書において使用される場合、フレームワークに配置され、かつ他方の鎖の完全可変領域と対、または同様の長さの他方の鎖の可変領域一部と対で、例えば軽鎖などの同数のＣＤＲを有するような場合に、重鎖および軽鎖可変領域全体で見られるものの例えば少なくとも２５、５０、７５、８５、または９０％の結合を可能にするのに十分な鎖、例えば重鎖のＣＤＲを指す。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、親抗体の抗原結合特性を保持する、または実質的に保持するが、ヒトにおいてそれほど免疫原性ではない非ヒト抗体、例えばウサギ、げっ歯動物（例えばマウス）、ヒツジまたはヤギから誘導される抗体を指す。本明細書において使用されるヒト化は、脱免疫抗体（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含むように意図される。典型的に、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ、ならびにヒトまたはヒト誘導のフレームワークおよび定常領域を含む。
【００２７】
本明細書において使用される用語「改変」抗体は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな非ヒト動物（例えばウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、もしくはヤギ）から単離される抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製される、発現される、作製される、もしくは単離される抗体などの、組換え手段によって調製される、発現される、生成される、または単離される抗体を指す。そのような改変抗体は、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体（例えば、第１の抗体由来のＣＤＲおよび異なる供給源、例えば第２の抗体またはコンセンサスフレームワーク由来のフレームワーク領域を有する抗体）、キメラ抗体、インビトロ生成（例えばファージディスプレイによって）抗体を含み、必要に応じて、代替の免疫グロブリン配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の手段によって調製される、発現される、生成される、または単離される、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列またはヒト免疫グロブリン遺伝子もしくは抗体から誘導される可変領域または定常領域を含んでいてもよい。実施形態では、改変抗体分子は、参照抗体からの配列の変化を有する抗体分子を含む。
【００２８】
用語「単一特異性抗体」は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および結合親和性を示す抗体または抗体調製物を指す。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含む。
【００２９】
用語「二重特異性抗体」または「二機能性抗体」は、２つのエピトープに対して二重の結合特異性を示す抗体を指し、各々の結合部位は異なり、異なるエピトープを認識する。
【００３０】
用語「非結合体化抗体」および「裸の抗体」は、非抗体部分、例えば薬剤または標識と結合体化させていない抗体分子を指すように区別なく使用される。
【００３１】
用語「免疫結合体」、「抗体薬物結合体」、および「抗体結合体」の各々は、区別なく使用され、非抗体部分、例えば薬剤または標識と結合体化させている抗体を指す。用語「作用物質」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、または生物学的材料から作製される抽出物を示すために本明細書において使用される。用語「治療剤」は、生物学的活性を有する作用物質を指す。例示的な治療剤は、化学療法剤である。
【００３２】
用語「抗癌剤」または「化学療法剤」は、ヒトにおける新生物、特に、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病などの悪性（癌性）病変の発症または進行を阻害する機能的な特性を有する作用物質を指すように本明細書において使用される。転移または新脈管形成の阻害は、抗癌剤または化学療法剤の特性であることが多い。化学療法剤は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤であってもよい。用語「細胞増殖抑制剤」は、細胞成長および／または細胞の増殖を阻害または抑制する作用物質を指す。
【００３３】
「細胞傷害剤」は、アルキル化剤、腫瘍壊死因子阻害剤、干渉物質、微小管阻害剤、キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、およびトポイソメラーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない、主として、細胞の機能に直接干渉することによって細胞死を引き起こす化合物を指す。本明細書において使用される「毒素負荷量」は、細胞に送達される場合に、細胞死をもたらす、十分な量の細胞傷害剤を指す。毒素負荷量の送達は、本発明の抗体または抗原結合断片および細胞傷害剤を含む、十分な量の免疫結合体の投与によって行われてもよい。毒素負荷量の送達はまた、細胞傷害剤を含む、十分な量の免疫結合体の投与によって行われてもよく、免疫結合体は、本発明の抗体または抗原結合断片を認識し、かつ結合する第２の抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３４】
本明細書において使用されるように、語句「から誘導される」配列または「指定される配列に対して特異的な」配列は、例えば、指定される配列の隣接領域に対応する、つまり同一であるまたは相補的である、おおよそ、少なくとも６個のヌクレオチドもしくは少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも約９個のヌクレオチドもしくは少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチドもしくは４個のアミノ酸、または少なくとも約１５〜２１個のヌクレオチドもしくは５〜７個のアミノ酸の隣接配列を含む配列を指す。ある実施形態では、配列は、指定されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をすべて含む。配列は、当技術分野における公知の技術によって判定される、特定の配列に特有である配列領域に相補的（ポリヌクレオチド配列の場合には）であってもよくまたは同一であってもよい。配列が誘導されてもよい領域は、特異的なエピトープをコードする領域、ＣＤＲをコードする領域、フレームワーク配列をコードする領域、定常ドメイン領域をコードする領域、可変ドメイン領域をコードする領域、ならびに非翻訳および／または非転写領域を含むが、これらに限定されない。誘導配列は、必ずしも、研究中の、係る配列から物理的に誘導されないが、ポリヌクレオチドが誘導される領域（複数可）中の塩基の配列によって提供される情報に基づく、化学合成、複製、逆転写、または転写を含むが、これらに限定されない、任意の方法において生成されてもよい。そのため、それは、元のポリヌクレオチドのセンスまたはアンチセンス配向のいずれを表わしてもよい。さらに、指定される配列の領域に対応する領域の組み合わせは、意図される使用と一致するように、当技術分野において公知の方法において改変されても組み合わせられてもよい。例えば、配列は、指定される配列の一部を各々含み、かつ指定される配列と同一でない領域により中断される２つ以上の隣接配列を含んでいてもよいが、指定される配列から誘導される配列を表わすように意図される。抗体分子に関して、「それから誘導される」は、比較抗体に機能的にまたは構造的に関連する抗体分子を含み、例えば、「それから誘導される」は、類似するか、または実質的に同じ配列または構造物を有する、例えば、同じまたは類似するＣＤＲ、フレームワーク領域または可変領域を有する抗体分子を含む。抗体についての「それから誘導される」もまた、隣接していても隣接していなくてもよいが、番号付け方式または一般的な抗体構造に対する相同性または三次元の近似に従って明確化または同定され、つまり、比較配列のＣＤＲまたはフレームワーク領域内の残基、例えば１つ以上の、例えば２、３、４、５、または６以上の残基をも含む。用語「それから誘導される」は、それから物理的に誘導されることに限定されないが、任意の方法による、例えば別の抗体を設計するための、比較抗体由来の配列情報の使用による生成を含む。
【００３５】
本明細書において使用される場合、語句「によってコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、そのポリペプチド配列またはその部分は、その核酸配列によってコードされるポリペプチド由来の少なくとも３〜５個のアミノ酸、少なくとも８〜１０個のアミノ酸、または少なくとも１５〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
本明細書において使用される場合、結腸癌または大腸癌としても一般に公知の用語「結腸直腸癌」は、結腸もしくは直腸（大腸の部分）における、または虫垂における制御されない細胞増殖由来の癌を指す。
【００３７】
用語「胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）」および「胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）」は、本明細書において区別なく使用される。
【００３８】
２つの配列の間の「相同性」の計算は、以下のとおり実行することができる。配列は、最適な比較目的のためにアライメントされる（例えば、ギャップは、最適なアライメントのために、第１のおよび第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列は、比較目的のために無視することができる）。比較目的のためにアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、または５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位置で同一となる（本明細書において使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各々のギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００３９】
配列の比較および２つの配列の間の相同性パーセントの判定は、数学的なアルゴリズムを使用して行うことができる。２つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して判定することができる。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））によればアルゴリズムは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５、または６の長さウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれている。２つのヌクレオチド配列の間の相同性パーセントはまた、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）中のＧＡＰプログラムを使用して判定することもできる。相同性の判定のためのパラメータの例示的なセットは、１２のギャップペナルティー、４のギャップ伸長ペナルティー、および５のフレームシフトギャップペナルティーを用いるＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【００４０】
本明細書において使用されるように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実行するための手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出すことができる。水性および非水性の方法は、その参考文献において記載されており、どちらでも使用することができる。本明細書において言及される特異的なハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：１）少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄が後続する、約４５℃での、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件については５５℃まで上昇させることができる）、２）６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄が後続する、約４５℃での、６×ＳＳＣ中での中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、３）６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄が後続する、約４５℃での、６×ＳＳＣ中での高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；および４）超高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、６５℃での０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳであり、６５℃での、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄が後続する。超高ストリンジェンシー条件（４）は、多くの場合、好ましい条件であり、別段の定めがない限り使用されるべきものである。
【００４１】
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、ポリペプチドの機能に実質的な影響を有していないさらなる保存的置換または非必須アミノ酸置換を有していてもよいことが理解される。特定の置換が許容されるかどうか、つまり、結合活性などの所望の生物学的特性に有害な影響を及ぼさないかどうかは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）またはＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ
Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５）に記載のとおり判定することができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００４２】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を消失させることなく、または生物学的活性を実質的に改変することなく、結合剤、例えば抗体の野生型配列から改変することができる残基であるのに対して、「必須」アミノ酸残基は、そのような変化をもたらす。抗体において、必須アミノ酸残基は、特異性判定残基（ＳＤＲ）とすることができる。
【００４３】
本明細書において使用される場合、用語「単離された」は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から取り出される物質を指す。例えば、生きている動物に存在する、自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、自然分類において共存する物質のうちのいくつかまたはすべてから分離されたその同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ベクターの一部とすることができ、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物（例えば混合物、溶液、または懸濁物）またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを含む単離細胞もしくは培養細胞を含む組成物の一部とすることができ、ベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないという点でなお単離されているものとすることができる。
【００４４】
本明細書において使用される場合、用語「レプリコン」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自律的な単位として振る舞う、プラスミド、染色体、またはウイルスなどの任意の遺伝因子を指す。
【００４５】
本明細書において使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、記載される構成要素が、それらの意図される方法においてそれらが機能するのを可能にする関係にある状況を指す。したがって、例えば、コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合性の条件下で達成される方法などでライゲーションされる。
【００４６】
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、連結されたセグメントの複製および／または発現を引き起こすためなどの、別のポリヌクレオチドセグメントが連結されるレプリコンを指す。
【００４７】
本明細書において使用される場合、用語「制御配列」は、それがライゲーションされるコード配列の発現を達成するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる。原核生物において、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターならびにいくつかの場合においてエンハンサーを含む。したがって、用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現に必要である構成要素をすべて含むように意図され、また、その存在が有利であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列を含んでいてもよい。
【００４８】
本明細書において使用される場合、用語「精製産物」は、産物が通常関連している細胞構成成分から、および／または目的の試料に存在し得る他のタイプの細胞から単離される、産物の調製物を指す。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質の判定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ）を指す。エピトープ判定因子は、普通、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面の群から成り、普通、特異的な三次元構造の特徴ならびに特異的な電荷の特徴を有する。いくつかのエピトープは、線状エピトープであるが、他のものは、高次構造エピトープである。線状エピトープは、隣接アミノ酸一次配列が、認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、典型的に、少なくとも３個、より普通には、少なくとも５個、例えば約８〜約１０個の隣接アミノ酸を含む。高次構造的なエピトープは、ａ）例えばリガンド結合に依存するもしくはシグナル伝達分子による修飾（例えばリン酸化）に依存するあるタンパク質高次構造においてのみ抗体結合に曝露される線状配列；またはｂ）タンパク質の一部分より大きな部分由来の、もしくは多サブユニットタンパク質における１つを超えるサブユニット由来の、構造的特徴（その特徴は、結合に参加するのに、３次元空間において十分に極めて接近している）の組み合わせなどの少なくとも２つの状況に起因し得る。
【００５０】
本明細書において使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ）を指す。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「検出可能な作用物質」、「標識」、または「標識された」は、ポリペプチドまたは糖タンパク質上の検出可能なマーカーの組み込みを指すために使用される。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野において公知であり、それらが使用されてもよい。ポリペプチドについての標識の例は、以下を含むが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えばインジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉもしくは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、ビスマス（２１２Ｂｉもしくは２１３Ｂｉ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、プラセオジム、またはリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）（３２Ｐ）または陽電子放出放射性核種、例えば炭素１１（１１Ｃ）、カリウム４０（４０Ｋ）、窒素１３（１３Ｎ）、酸素１５（１５Ｏ）９、フッ素１８（１８Ｆ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、およびヨウ素１２１（１２１Ｉ））、蛍光標識（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基（マークされたアビジン、例えば、ストレプトアビジン部分および光学的な方法または熱量測定法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有する分子によって検出することができる）、ならびに第２のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低下させるために様々な長さのスペーサーアームが付加される。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「特異的な結合」、「特異的に結合する」、または「結合特異性」は、抗ＧＣＣ抗体分子については、抗体分子が、非ＧＣＣタンパク質、例えばＢＳＡに結合するよりも大きな親和性でＧＣＣ、例えばヒトＧＣＣタンパク質に結合することを意味する。典型的に、抗ＧＣＣ分子は、ＧＣＣ、例えばヒトＧＣＣタンパク質に対するそのＫｄの、２倍を超える、１０倍を超える、１００倍を超える、１，０００倍を超える、１０４倍を超える、１０５倍を超える、または１０６倍を超える、非ＧＣＣタンパク質、例えばＢＳＡに対するＫｄを有する。Ｋｄの判定において、ＧＣＣおよび非ＧＣＣタンパク質、例えばＢＳＡに対するＫ  Ｋｄは、同じ条件下で行われるべきである。
【００５３】
用語「親和性」または「結合親和性」は、見かけの会合定数またはＫａを指す。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。抗体は、例えば、特定の標的分子に対して、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、および１０１１  Ｍ−１の結合親和性を有してよい。第２の標的に相対する第１の標的への抗体のより高い親和性結合は、第２の標的の結合に対するＫＡ（または数値ＫＤ）よりも高い第１の標的の結合に対するＫＡ（またはより小さな数値ＫＤ）によって示されることができる。そのような場合には、抗体は、第２の標的（例えば、第２の構造もしくはその模倣体にある同じタンパク質、または第２のタンパク質）に相対する第１の標的（例えば、第１の構造もしくはその模倣体にあるタンパク質）に対する特異性を有する。結合親和性における差異（例えば、特異性または他の比較に対する）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、または１０５倍であり得る。
【００５４】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲルろ過、ＥＬＩＳＡ、界面１９活性ｃｃ共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを使用する）を含む様々な方法により判定され得る。例えば、抗ＧＣＣ抗体分子の相対的親和性は、ＧＣＣ発現細胞を用いるＦＡＣＳ測定によって、ＧＣＣタンパク質（例えば、抗ＧＣＣ抗体分子を育てるために使用される免疫原）に対するＥＬＩＳＡ測定から測定され得る。
【００５５】
結合親和性の評価のための例示的な条件は、ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．５で、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）においてである。これらの技法は、結合タンパク質（または標的）濃度の関数として、結合された、および遊離した結合タンパク質の濃度を測定するために使用され得る。結合された結合タンパク質（［結合］）の濃度は、遊離した結合タンパク質（［遊離］）の濃度、および、以下の式によって（Ｎ）が標的分子ごとの結合部位の数である、標的上の結合タンパク質の結合部位の濃度に関係する：
［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／ＫＡ）＋［遊離］）。
【００５６】
しかし、ＫＡに比例し、したがって、例えば機能アッセイ、例えばインビトロまたはインビボアッセイにおける活性によって、親和性の定性的測定を得るために、または親和性の推定を得るために、より高い親和性、例えば２倍高いかどうかを判定することのような比較に対して使用され得る、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析のような方法を使用して判定される親和性の定量的測定を得ることがときには十分であるため、ＫＡの正確な判定をすることは必ずしも必要ではない。抗ＧＣＣ抗体分子の親和性はまた、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）のような技術を使用して測定され得る（例えばＳｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ，ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５を参照されたい）。本明細書で使用される場合、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、いずれの反応体をも標識化することなく、生体特異的相互作用をリアルタイムに研究するための技術である（例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標））。結合表面での質量における変化（結合事象を示す）は、生体分子間のリアルタイムな反応の兆候として使用され得る検出可能なシグナルをもたらす、表面付近での光の屈折率の改変（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらす。
【００５７】
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｔ１００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する抗ＧＣＣ抗体分子の親和性の測定は、その全体において参照によって組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１１０９３６号の実施例１に記載される。簡潔に述べれば、抗ＧＣＣ抗体（前処理Ａ）は、ｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で適切な濃度（例えば２０μｇ／ｍＬ）に希釈され、基準／対照抗体（前処理Ｂ）は、ｐＨ４．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中で適切な濃度（例えば１０μｇ／ｍＬ）に希釈される。各々の抗体は、標準のアミン結合を使用して、数個のＣＭ４  ＢＩＡＣＯＲＥチップに共有結合的に固定される。調製された各々のＣＭ４チップに対して、前処理Ａ抗体は、約７５〜１００ＲＵで２個のフローセル上に固定され、一方で、前処理Ｂ抗体は、約７０〜８０ＲＵで１個のフローセルに固定される。各々のＣＭ４チップの残りの４番目のフローセルは、基準フローセルとして使用される。ＧＣＣタンパク質の濃度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４：２４１１（１９９５）においてＰａｃｅら、ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３．１．１−３．１．９（２００３）においてＰａｃｅおよびＧｒｉｍｓｌｅｙによって詳しく述べられる方法を使用して判定され得る。各々の調製されたＣＭ４チップに対して、ＧＣＣタンパク質は、２０２ｎＭ〜１．６ｎＭの濃度範囲（２回の連続希釈）で２分間注入され、その後に７分の解離が続く。試料は、二重の参照のために組み入れられた数回の緩衝液注入周期をもって、３回で無作為に注入される。より有意なオフレート崩壊データを得るために、３回の追加的な１０１ｎＭ  ＧＣＣタンパク質注入および３回の追加的な緩衝液注入が、２分の注入および４時間の解離時間をもって行われる。１００μＬ／分の流量が全ての実験に対して使用され、全ての表面は１０ｍＭグリシン−ＨＣＩ（ｐＨ２．０）の２０秒パルスで再生される。全ての試料は、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡの添加をもって緩衝液（例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、０．００５％ポリソルベート２０、Ｐｈ７．４（ＨＢＳ−Ｐ））において調製される。全てのセンサーグラム（表面プラズモン共鳴対時間を表す図表）データは、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をもって処理され、ＣＬＡＭＰ（商標）ソフトウェア（Ｍｙｓｚｋａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｏｎ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：１４９−１５０（１９９８））を使用して、質量移送定数ｋｍの項を含む１：１相互作用モデルに包括的に適合され得る。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、対象、例えば患者への抗ＧＣＣ抗体分子の投与または例えば、対象に戻される、対象由来の単離組織もしくは単離細胞への塗布による投与として定義される。抗ＧＣＣ抗体分子は、単独でまたは第２の作用物質と組み合わせて投与することができる。処置は、障害、障害の症状、または障害に対する素因、例えば癌を治癒する、治す、軽減する、緩和する、改変する、治療する、回復させる、和らげる、改善する、またはそれに影響を及ぼすことであり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、処置は、インビトロもしくはインビボにおける細胞の阻害、消失、もしくは死滅または別の方法では、細胞、例えば異常な細胞が、障害、例えば本明細書に記載の障害（例えば癌）を媒介する能力の低下を引き起こすと考えられる。
【００５９】
本明細書において使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、霊長類、ヒト、および非ヒト動物を含むように意図される。例えば、対象は、胃腸起源の癌（例えば結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、または食道癌）、膵臓癌、肺癌（例えば扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腺癌）、軟部組織肉腫（例えば平滑筋肉腫または横紋筋肉腫）、神経内分泌腫瘍（例えば胃腸または気管支肺）、または神経外胚葉性腫瘍のような、細胞のうちの少なくとも一部がＧＣＣを発現する癌、そのようなＧＣＣを発現する癌の症状、またはそのようなＧＣＣを発現する癌に対する素因を有する患者（例えばヒト患者または家畜患者）とすることができる。別の実施例としては、対象は、炎症性腸症候群、クローン病および便秘におけるような、胃腸系の細胞のうちの少なくとも一部がＧＣＣを発現する胃腸障害を有する患者であってよい。また別の実施例では、対象は、パーキンソン病のような、患者の中枢神経系内の少なくとも一部のニューロンがＧＣＣを発現する神経障害を有する患者であってよい。本発明の「非ヒト動物」という用語は、特に断りのない限り、全ての非ヒト脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、ハ虫類、マウス、ラット、ウサギまたはヤギなどの、非ヒト哺乳動物および非哺乳動物を含む。一実施形態では、「対象」は、マウス、ラット、ウサギ、またはヤギの１つ以上、またはすべてを除外する。
【００６０】
本明細書において使用される場合、障害を処置するのに「有効な」もしくは「十分な」抗ＧＣＣ抗体分子の量または「治療有効量」もしくは「治療的に十分な量」は、細胞、例えば癌細胞（例えばＧＣＣ発現腫瘍細胞）を処置するのに、またはそのような処置が存在しない場合に予想されるものを上回って、本明細書に記載の障害を有する対象の治癒、軽減、緩和、もしくは改善を延長するのに、対象へ１回または複数回の用量を投与することで有効である、抗体分子の量を指す。本明細書において使用される場合、腫瘍または癌の「成長の阻害」は、その成長および／または転移を遅らせる、中断する、阻止する、または停止させることを指し、腫瘍成長の完全な排除を必ずしも示すものではない。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「ＳＴＡＲ」、「ＧＵＣ２Ｃ」、「ＧＵＣＹ２Ｃ」、または「ＳＴ受容体」タンパク質としても公知である「ＧＣＣ」は、哺乳動物のＧＣＣ、好ましくはヒトＧＣＣタンパク質を指す。ヒトＧＣＣは、配列番号３において示されるタンパク質およびその天然に存在する対立遺伝子タンパク質変異体を指す。配列番号３における対立遺伝子は、配列番号２において示されるＧＣＣの核酸配列によってコードすることができる。他の変異体は、当技術分野において公知である。例えば残基２８１にロイシンを有する受託番号Ｅｎｓｐ００００２６１１７０、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＷｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国特許出願公開第２００６００３５８５２号の配列番号１４、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ１９９３４を参照されたい。典型的に、天然に存在する対立遺伝子変異体は、配列番号３のＧＣＣの配列と少なくとも９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。転写物は、１０７３のアミノ酸のタンパク質産物をコードし、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４９６３において記載される。ＧＣＣタンパク質は、膜貫通細胞表面受容体タンパク質として特徴付けられ、腸液、電解質の恒常性、および細胞増殖の維持に重要な役割を果たすと考えられる。
抗ＧＣＣ抗体
【００６２】
本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子は、とりわけＧＣＣ発現を検出するために有用である。例えばＧＣＣ検出に有用な抗ＧＣＣ抗体分子は、例えば少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、および１０１１  Ｍ−１のＧＣＣへの結合親和性をもってＧＣＣに特異的に結合する、非ヒト抗ＧＣＣ抗体分子（例えば非ヒトおよび非マウス抗体分子）を含むことができる。抗ＧＣＣ抗体分子は、例えば本明細書に記載のように、非ヒト、非マウス、および非ラット抗体分子、例えばウサギ抗ＧＣＣ抗体分子であり得る。
【００６３】
特定の態様では、本発明は、表１および表２に要約されるものなどの特徴を含む抗ＧＣＣ抗体分子に関する。他の態様では、本発明は、表３、４、５、および／または６に要約されるものなどの特徴を含む抗ＧＣＣ抗体分子に関する。
【００６４】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ウサギハイブリドーマ抗体であり、抗体ＭＩＬ−４４−１４８−２またはＭＩＬ−４４−６７−４のうちの１つである。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、抗体ＭＩＬ−４４−１４８−２またはＭＩＬ−４４−６７−４から誘導される。
【００６５】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、例えば、直接結合アッセイまたは競合結合アッセイによって測定されるような、ＧＣＣへの親和性を有する。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１２Ｍ未満、または１×１０−１３Ｍ未満のＫｄを有する。一実施形態では、抗体分子は、ＩｇＧまたはその抗原結合断片であり、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、または１×１０−９Ｍ未満のＫｄを有する。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子、例えばＭＩＬ−４４−１４８−２抗体またはそれから誘導される抗体は、約８０〜約２００ｐＭ、好ましくは約１００〜約１５０ｐＭまたは約１２０ｐＭのＫｄを有する。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子、例えばＭＩＬ−４４−１４８−２抗体またはそれから誘導される抗体は、約０．９〜約１．２５×１０５  Ｍ−１  ｓ−１、好ましくは約１．１×１０５  Ｍ−１  ｓ−１のｋａを有する。一実施形態では、抗体分子は、ＳｃＦｖであり、１×１０−６Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１２Ｍ未満、または１×１０−１３Ｍ未満のＫｄを有する。
【００６６】
実施形態では、抗体分子は、免疫結合体ではない、つまり、「裸」であり、実施形態において、ＧＣＣへの結合に際して細胞反応を引き起こす。関連する実施形態では、細胞反応は、抗体が結合するＧＣＣ発現細胞によって実行される。そのような細胞反応は、例えば、抗体分子がＧＣＣの作動剤である場合、ＧＣＣによって媒介されるシグナル伝達とすることができる（例えば米国特許出願公開第ＵＳ２００４０２５８６８７号を参照されたい）。他の実施形態では、細胞反応は、第１の細胞上のＧＣＣに結合した抗体分子を認識する第２の細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えばナチュラルキラー細胞）によって実行される。一部の実施形態では、監視分子、例えば補体分子は、細胞反応に先立って、ＧＣＣに結合した抗体分子と接触する。これらの実施形態における細胞反応は、ＧＣＣ発現細胞の死を引き起こすことができる。
【００６７】
さらなる実施形態では、免疫結合体である抗体分子は、ＧＣＣへの結合に際して細胞反応を引き起こすことも、内部移行して、それが結合するＧＣＣ発現細胞に作用物質を送達することもできる。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣへのリガンド結合を妨害することができる。
【００６９】
一実施形態では、抗体分子は、ＧＣＣ：Ｂ１０でも、ＧＣＣ：４Ｄ７でも、またはＧＣＣ：Ｃ８でもない。別の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣの細胞内ドメイン、配列番号３のアミノ酸残基約４５５〜１０７３に結合しない。例えば、この実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣのキナーゼ相同性ドメインまたはグアニリルシクラーゼドメインに結合しない。
【００７０】
天然に存在する哺乳動物の抗体構造単位は、四量体によって典型的に表される。各々の四量体は、２対のポリペプチド鎖から構成され、各々の対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各々の鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主として担う定常領域を定める。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類することができる。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類することができ、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定めることができる。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によってつながれ、重鎖はまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。軽／重鎖対の各々の可変領域は、抗体結合部位を形成する。抗ＧＣＣ抗体分子についての好ましいアイソタイプは、異なるガンマ重鎖を有する、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類することができるＩｇＧ免疫グロブリンである。ほとんどの治療用抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ウサギＩｇＧ抗体である。
【００７１】
重鎖および軽鎖対の各々の可変領域は、抗原結合部位を形成する。したがって、完全なＩｇＧ抗体は、同じである２つの結合部位を有する。しかしながら、二機能性または二重特異性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対を有し、２つの異なる結合部位をもたらす人工ハイブリッド構築物である。
【００７２】
鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によってつながれた比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的な構造物を示す。各々の対の２つの鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域に関して整列し、それにより特定のエピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各々のドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＫａｂａｔのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。本明細書において使用される場合、ＣＤＲは、重鎖（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）および軽鎖（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）の各々について言及される。
【００７３】
抗ＧＣＣ抗体分子は、上で参照されるウサギ抗体のうちの１つの重鎖および軽鎖の一方または両方のＣＤＲのすべてまたは抗原結合サブセットを含むことができる。可変領域およびＣＤＲを含むウサギハイブリドーマ抗体のアミノ酸配列は、表３および表５に見出すことができる。
【００７４】
したがって、一実施形態では、抗体分子は：
（ａ）上で参照されるウサギハイブリドーマ抗体のうちの１つの、１個、２個、３個、または抗原結合数の軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／またはＬＣＤＲ３）。実施形態では、このＣＤＲ（複数可）は、以下のとおり、ＬＣＤＲ１〜３のうちの１個以上またはすべてのアミノ酸配列を含んでいてもよい：ＬＣＤＲ１または１〜７個のアミノ酸が保存的に置換された改変ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２または１もしくは２個のアミノ酸が保存的に置換された改変ＬＣＤＲ２）、またはＬＣＤＲ３または１もしくは２個のアミノ酸が保存的に置換された改変ＬＣＤＲ３、ならびに
（ｂ）上で参照されるウサギハイブリドーマ抗体のうちの１つの、１個、２個、３個、または抗原結合数の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３）。実施形態では、このＣＤＲ（複数可）は、以下のとおり、ＨＣＤＲ１〜３のうちの１個以上またはすべてのアミノ酸配列を含んでいてもよい：ＨＣＤＲ１または１もしくは２個のアミノ酸が保存的に置換された改変ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２または１〜４個のアミノ酸が保存的に置換された改変ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３または１もしくは２個のアミノ酸が保存的に置換された改変ＨＣＤＲ３、のうちの一方または両方を含む。
【００７５】
抗ＧＣＣ抗体分子の産生に有用な免疫原は、ＧＣＣ、例えばヒトＧＣＣ発現細胞（例えば腫瘍細胞系、例えばＴ８４細胞または新鮮なもしくは凍結させた結腸腫瘍細胞、ＧＣＣを発現する組換え細胞）；ＧＣＣ発現細胞の膜画分（例えば結腸腫瘍細胞系、例えばＴ８４細胞）、または新鮮なもしくは凍結させた結腸腫瘍細胞；ＧＣＣを発現する組換え細胞；単離または精製ＧＣＣ、例えばヒトＧＣＣタンパク質（例えば、ＧＣＣを発現する胃腸腫瘍細胞もしくは組換え細胞またはその変異体から単離された、生化学的に単離されたＧＣＣなど）、またはその部分（例えばＧＣＣの細胞外ドメイン、ＧＣＣのキナーゼ相同性ドメイン、またはＧＣＣのグアニリルシクラーゼ触媒ドメインまたは例えば、配列番号３の少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、２０、２４、２８、もしくは３２のアミノ酸残基を含むその部分に対応するペプチド）；または配列番号４６を含むもしくはそのシグナル配列がない（つまり、配列番号４６のアミノ酸残基１〜約２１もしくは２３がない）その成熟部分を含む免疫原、例えば成熟ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲ  ｒ−ｍｕｔＩＩ（「ｐＬＫＴＯＫ１０８」としても本明細書で言及される）タンパク質、配列番号４８を含む。
【００７６】
免疫原は、生化学的操作、精製、免疫、または抗体価測定を促進するために異種の配列に融合することができる。そのような免疫原は、ＧＣＣの一部、例えば細胞外ドメインおよび非ＧＣＣポリペプチドを含む部分を含むことができる。精製を容易にする、または固体支持体、例えばアフィニティーカラム、またはマイクロタイタープレート、または他の好適なアッセイ基材／チップ上への固定を容易にするために、多くの選択肢が、融合タンパク質の構築に関して存在する。例えば、融合部分は、ドメイン、例えば、グルタチオンに結合することができるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／キナーゼ（ＧＳＴ）；プロテインＡもしくはプロテインＧに結合することができる免疫グロブリンのＦｃ領域；アフィニティーカラム上のニッケルもしくはコバルトに結合することができるアミノ酸残基、例えば２、３、４、５、好ましくは６つのヒスチジン残基；エピトープタグ、例えば、タグ特異的抗体に結合することができるｃ−ｍｙｃ癌遺伝子（ｍｙｃ−タグ）、ＦＬＡＧタグ（米国特許第４，７０３，００４号）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｔ７遺伝子１０タグ、Ｖ５タグ、ＨＳＶタグ、もしくはＶＳＶ−Ｇタグの一部；または補因子、例えば、ストレプトアビジンに結合することができるビオチンを追加することができる。
【００７７】
免疫グロブリンのＦｃ部分を含む免疫原は、効率的な抗体生成のために宿主免疫監視構成要素によってＧＣＣのエピトープへの構造的な到達を可能にする配置で、溶解した状態または細胞に付加された状態のいずれかで、ＧＣＣを保持することができる。Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖が、会合して、鎖間ジスルフィド結合を通して二量体になるので、Ｆｃ領域を有する融合物に起因する免疫原は、二量体となる。融合タンパク質の価（ｖａｌｅｎｃｙ）は、Ｆｃ領域を提供する免疫グロブリンのタイプを反映することができる。例えば、ＩｇＧタンパク質を有する融合物は、二量体であり得、ＩｇＡ融合物は、四量体の免疫原を作製することができ、ＩｇＭ融合物は、十量体の免疫原を作製することができ、後者の２つは、Ｊ鎖の同時形質移入により促進される。Ｆｃ融合タンパク質についての例示的な免疫グロブリンは、ＩｇＧ１である。典型的に使用される部分は、単一のエクソンによってコードされるＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを有する。このエクソンはまた、軽鎖由来のシステインとのジスルフィド結合に適応したシステインを有する、ＣＨ１領域の一部をも有するので、有用な改変は、不対システインが融合タンパク質にないことを確実にするために、ＣＨ１システインを例えばセリンに変異させることである。そのような変異はまた、ヒンジの可撓性を増加させもする。
【００７８】
宿主種、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギにおける免疫のために免疫原に融合させるための、非宿主種から誘導されるＦｃ部分、例えばヒトＩｇ  Ｆｃ領域は、アジュバントとして作用する。このアジュバント機能は、ＦｃエピトープおよびＧＣＣエピトープの両方に対して特異的な抗体を誘発することができる。Ｆｃ反応性の抗体は、スクリーニングの間に同定し、廃棄することができる。Ｆｃ部分は、野生型配列またはエフェクター機能を改変するために変異させる配列を有することができる。例えば、変異させた定常領域（変異体）は、Ｆｃ受容体への結合および／または補体を固定を最小限にするために、融合タンパク質に組み込むことができる（例えばＷｉｎｔｅｒら、英国第２，２０９，７５７  Ｂ号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、国際公開第ＷＯ  ８９／０７１４２号、Ｍｏｒｇａｎら、国際公開第ＷＯ９４／２９３５１号を参照されたい）。好ましい実施例では、Ｆｃ領域の基準に従って番号付けされたリシン２３５およびグリシン２３７は、例えばアラニンに変異させる。Ｆｃ変異ＩｇＧを有する免疫原／融合タンパク質は、宿主においてＦｃ受容体との相互作用を低下させることができる。好ましい可溶性免疫原融合タンパク質（シグナルペプチドを切断するための成熟および分泌の後の）は、ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲ  ｒ−ｍｕｔＩＩ  （ｐＬＫＴＯＫ１０８）であり、これは、変異マウスＩｇＧ２ａ免疫グロブリンＦｃ（集合的に配列番号４８）に融合された配列番号３のアミノ酸残基２４〜４３０から成る。
【００７９】
細胞発現免疫原を調製するために、免疫グロブリン部分は、Ｂ細胞受容体の免疫グロブリン部分を模倣するように構築することができる。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃα／μ受容体、またはＦｃε受容体などの免疫受容体由来の膜貫通領域を含むポリペプチドにさらに融合することができる。そのようなＦｃ受容体細胞結合免疫原の適切な配向は、細胞表面上の適切な露出と共に、免疫原融合タンパク質を発現する細胞が抗原受容体複合体、例えばＢ細胞ＩｇＭ受容体またはＩｇＤ受容体のさらなる構成要素をさらに含む場合、改善され得る。複合体の好適な構成要素は、ヘテロ二量体を形成する、ＭＢ−１およびＢ２９などの免疫グロブリン（Ｉｇ）シースタンパク質（ｓｈｅａｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む（ＩｇＭ受容体についてはＣＤ７９ＡおよびＣＤ７９Ｂ、Ｈｏｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２７９５−２７９９（１９９０））。Ｉｇシースタンパク質は、例えば、Ｂ細胞リンパ腫細胞系を形質移入する場合、形質移入細胞によって；または例えば別個のベクターもしくは同じベクターにおけるシースタンパク質との免疫原の同時形質移入によって、内因的に提供することができる。
【００８０】
抗ＧＣＣ抗体分子、例えば本明細書に記載のウサギモノクローナル抗体、またはそのヒト化型が結合することができる有用なエピトープ、例えばＧＣＣ分子由来の参照エピトープは、ＧＣＣの細胞外部分に見出すことができる。そのようなＧＣＣのエピトープは、細胞の表面上で、例えば細胞外部で、抗体分子に結合することができる。
【００８１】
例えば、抗ＧＣＣ抗体分子に対するエピトープは、配列番号３の残基１〜５０または本発明の抗ＧＣＣ抗体分子に結合するその断片、例えばそのＭＩＬ−４４−１４８−２結合断片由来の残基（複数可）内に存在するか、またはそれを含むことができる。そのような断片は、配列番号３の残基１〜２５、５〜３０、１０〜３５、１５〜４０、２０〜４５、２５〜５０、５〜４５、１０〜４０、１５〜３５、２０〜３０、または３３〜５０を含むことができる。一部の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子、例えばＭＩＬ−４４−１４８−２抗体についてのエピトープは、残基５０以降のＧＣＣアミノ酸配列における、つまり、配列番号３の残基約５０〜１０７３から選択される、１つ以上のさらなるアミノ酸残基をさらに含む高次構造エピトープである。
【００８２】
そのようなエピトープまたは細胞外ドメイン、例えば、配列番号３のアミノ酸残基２４〜４２０またはその参照部分、例えばＧＣＣの残基２４〜７５、７５〜１５０、１５０〜２２５、２２５〜３００、３００〜３７５、もしくは３７５〜４２０由来の残基（複数可）内に存在するもしくはそれを含むエピトープに対して産生される抗体、またはそれから誘導される抗体分子は、本明細書に記載のとおり、治療用抗体または診断用抗体として有用であり得る。
【００８３】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、１つ以上の以下の特性を有する：
ａ）結合について、例えば、細胞表面ＧＣＣまたは精製ＧＣＣへの結合について、表１および表２に要約される、上で参照される抗ＧＣＣ抗体分子のうちの１つ、例えばウサギハイブリドーマ抗体（例えばＭＩＬ−４４−１４８−２）と競合する；
ｂ）表１および表２に要約される、上で参照される抗ＧＣＣ抗体分子のうちの１つとして、例えば、例えば、ウサギハイブリドーマ抗体（例えばＭＩＬ−４４−１４８−２）として、同じまたは実質的に同じ、ＧＣＣのエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は同じエピトープに結合するが、それは１つ以上のペプチドアレイアッセイによって判定されるとおりであるかまたは例えば、細胞表面上に発現される切断変異体、キメラ、もしくは点変異体または膜調製物への結合によって判定されるとおりであり、それらのアッセイは本明細書に記載のとおりである；
ｃ）表１および表２に要約される、上で参照される抗ＧＣＣ抗体分子のうちの１つ、例えばウサギハイブリドーマ抗体（例えばＭＩＬ−４４−１４８−２）のエピトープと共通の、少なくとも１、２、３、４、５、８、１０、１５、または２０の隣接アミノ酸残基を有するエピトープに結合する；
ｄ）本発明の抗ＧＣＣ抗体が結合するヒトＧＣＣの領域に結合し、その領域、例えば細胞外領域または細胞質領域は、長さが１０〜１５、１０〜２０、２０〜３０、または２０〜４０の残基であり、その結合は、例えば、切断変異体への結合によって判定される。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ヒトＧＣＣの細胞外領域に結合する。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、配列番号３のアミノ酸残基２４〜４２０によって定められる細胞外ドメインのヒトＧＣＣの部分に結合することができる。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、配列番号３のアミノ酸残基９３１〜９５４のグアニル酸シクラーゼ識別特性部位（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｉｔｅ）に結合することができる；または
ｅ）本明細書に記載の参照エピトープに結合する。
【００８４】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣ配列ＩＬＶＤＬＦＮＤＱＹＦＥＤＮＶＴＡＰＤＹＭＫＮＶＬＶＬＴＬＳ（配列番号８）に結合する。
【００８５】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣ配列ＦＡＨＡＦＲＮＬＴＦＥＧＹＤＧＰＶＴＬＤＤＷＧＤＶ（配列番号９）に結合する。
【００８６】
一実施形態では、抗体分子は、高次構造エピトープに結合する。他の実施形態では、抗体分子は、線状エピトープに結合する。
【００８７】
抗ＧＣＣ抗体分子は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、キメラ抗体（米国特許第６，０２０，１５３号を参照されたい）、またはヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは誘導体とすることができる。前述のもののいずれの合成変異体および遺伝子操作された変異体（米国特許第６，３３１，４１５号を参照されたい）もまた、本発明によって企図される。各々がその全体において参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４０２，４０９号、同第７，４２９，４８７号、同第７，４６２，６９７号、同第７，５７５，８９６号、同第７，７３２，１６８号、および同第８，０６２，８６７号に記載されるように、モノクローナル抗体は、従来のマウスモノクローナル抗体の方法論（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、一般にＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい）、ならびに、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ所有の融合パートナー細胞系をもって免疫化ウサギからの単離Ｂ細胞を融合することで生成されるウサギ−ウサギハイブリドーマを使用して特注のウサギモノクローナル抗体（ＲａｂＭＡｂｓ（登録商標））を製造するＥｐｉｔｏｍｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によって提供される、ウサギモノクローナル抗体技術およびサービスを含む様々な技術によって産生することができる。
【００８８】
タンパク質、例えばＧＣＣまたは可溶性部分またはＧＣＣの一部を含む融合タンパク質（例えばｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩ（ｐＬＫＴＯＫ１０８）、または細胞もしくはそれ由来の膜画分、例えば、表面露出ＧＣＣもしくはその部分（例えばｐＬＫＴＯＫ４産物）を発現する細胞を用いる免疫は、応答を誘導する方法において、例えば、アジュバント、例えばフロイント完全アジュバントで、注射のために調製された免疫原を用いて実行することができる。他の好適なアジュバントは、Ｔｉｔｅｒｍａｘ  ＧＯＬＤ（登録商標）アジュバント（ＣＹＴＲＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）およびミョウバンを含む。低分子ペプチド免疫原は、キーホールリンペットヘモシニアンなどのより大きな分子に連結することができる。マウスまたはウサギは、多くの部位に、例えば腹膜（ｉ．ｐ．）、尾のつけ根、もしくは足蹠、または部位の組み合わせ、例えばｉＰおよび尾のつけ根（ＢＩＰ）に、多くの方法で、例えば皮下、静脈内、または筋肉内に、注射することができる。ブースター注射は、同じまたは異なる免疫原を含むことができ、アジュバント、例えばフロイント不完全アジュバントをさらに含むことができる。ＤＮＡ、例えば、ＧＣＣもしくはその部分またはＧＣＣもしくはその部分を含む融合タンパク質をコードする（例えばｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩをコードする）ＤＮＡを用いる免疫は、遺伝子銃技術を使用して注射することができる。例えば、ＤＮＡは、微視的金粒子上に負荷され、短い期間にわたって、頻繁な間隔でマウスまたはウサギに注射される。
【００８９】
一般に、モノクローナル抗体が所望される場合、ハイブリドーマは、不死細胞系由来の好適な細胞（例えばＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、またはヘテロミエローマなどのミエローマ細胞系）を抗体産生細胞と融合することによって産生される。抗体産生細胞は、ヒトの末梢血または好ましくは脾臓もしくはリンパ節、ヒト抗体トランスジェニック動物、または目的の抗原を用いて免疫された他の好適な動物（例えばウサギ）から得ることができる。ヒト起源の抗体（例えばヒト抗体）を産生する細胞は、好適な方法、例えば、ヒト抗体産生細胞およびヘテロミエローマもしくはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）の融合またはエプスタイン−バーウイルスによる感染を介しての活性化ヒトＢ細胞の不死化を使用して産生することができる（例えば米国特許第６，１９７，５８２号（Ｔｒａｋｈｔ）、Ｎｉｅｄｂａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７：２９９−３０４（１９９８）、Ｚａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５６：２０５−２１５（１９９２）、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，２：２６−３２（１９９１）を参照されたい）。融合または不死化抗体産生細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離し、限界希釈法によってクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイを使用して同定することができる（例えばＥＬＩＳＡ（例えばマイクロタイターウェル上に固定された免疫原、例えばｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩを用いる）またはＧＣＣもしくはその部分を発現する細胞、例えばｐＬＫＴＯＫ４産物を発現する細胞に対するＦＡＣＳによって）。例えば、ＧＣＣ免疫原が親和性試薬である融合部分を含む場合、この部分は、ＧＣＣを含む融合タンパク質またはその部分がマトリックス、例えばプロテインＧコート、ストレプトアビジンコート、グルタチオン誘導体化、または抗体コートマイクロタイタープレートまたはアッセイチップに結合するのを可能にすることができ、これは、次いで、免疫血清またはハイブリドーマまたは抗体発現組換え細胞由来の順化培地と組み合わせられ、その混合物は、複合体形成を伝導する条件下で（例えば塩およびｐＨについての生理学的条件で）培養される。インキュベーションに続いて、マイクロタイタープレートウェルまたはチップの細胞を洗浄し、あらゆる非結合構成要素を除去し、抗ＧＣＣ抗体による結合を測定する。
【００９０】
実施形態では、治療上の適用については、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体の利点は、それらが、宿主レシピエントにおける抗体の免疫原性を潜在的に減少させまたは排除し、それにより生物学的利用能の増加および有害な免疫反応の可能性の低下を可能にし、したがって、潜在的に、複数回の抗体投与を可能にすることである。
【００９１】
改変抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはＣＤＲ移植抗体を含む。ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答により、キメラ抗体または別の方法でヒト化抗体の開発に至った。キメラ抗体は、ヒト定常領域および非ヒト可変領域を有するが、特に、抗体の慢性的なまたは多用量の利用において、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が観察されるということが予想される。そのような非ヒト（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）誘導タンパク質の存在は、抗体の急速な排除をもたらし得るか、または患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。非ヒト誘導抗体の利用を回避するために、配列が抗体配列に導入され、その抗体配列をヒト抗体配列により近いものにしたヒト化抗体、またはマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、もしくはヤギのような非ヒト種へヒト抗体機能を導入することによって生成される完全ヒト抗体が開発され、それにより非ヒト種が完全ヒト配列を有する抗体を産生するようになった。ヒト抗体は、ウサギ、げっ歯類、ヒツジ、またはヤギの可変および／または定常領域を有する抗体と関連するいくつかの問題を回避する。
ヒト化およびディスプレイ技術および抗体に対する改変
【００９２】
ヒト化抗体分子は、非ヒトまたは非ヒト誘導体化ｍＡｂに固有の免疫原性応答およびアレルギー性応答を最小限にすることができ、したがって、投与される抗体の効力および安全性を増加させることができる。ヒト化抗体分子の使用は、繰り返しの抗体投与を必要とする、炎症、自己免疫、および癌などの、慢性的なおよび再発性のヒト疾患の処置において実質的な利点を提供することができる。
【００９３】
免疫原性が低下したヒト化抗体の産生は、ヒト化の技術および適切なライブラリーを使用したディスプレイ技術に関連して行うことができる。マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギなどのような非ヒト種由来の抗体は、当技術分野において公知の技術を使用して、ヒト化または霊長類化する（ｐｒｉｍａｔｉｚｅ）ことができることが十分に理解される。例えばＷｉｎｔｅｒand  Ｈａｒｒｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３−４６（１９９３）およびＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５〜１６８（１９９２）を参照されたい。目的の抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換するための組換えＤＮＡ技術によって操作されてもよい（国際公開第ＷＯ９２／０２１９０号、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７９２号、同第５，７１４，３５０号、および同第５，７７７，０８５号を参照されたい）。さらに、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用は、当技術分野において公知である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８４：３４３９（１９８７）およびＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１（１９８７））。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、ｃＤＮＡを生成するために使用される：目的のｃＤＮＡは、特異的なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されてもよい（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）。
【００９４】
あるいは、ファージディスプレイ技術（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい）は、免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子から、例えば、非免疫ドナー由来のレパートリーからインビトロにおいてヒト抗体または他の種からの抗体および抗体断片を産生するために使用することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの、糸状バクテリオファージの主要なまたは微量のコートタンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能的な抗体断片として示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的な特性に基づく選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をももたらす。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性のうちのいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、様々な方式において実行することができる；それらの総説については、例えばＪｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源は、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫マウスの脾臓から誘導されたＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様な配列を単離した。非免疫ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載される技術に本質的に従って、多様な配列の抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および同第５，５７３，９０５号もまた参照されたい。ディスプレイライブラリーは、人工アミノ酸配列を含有する抗体または抗体の抗原結合断片を含有することができる。例えば、そのライブラリーは、人工ＣＤＲ（例えばランダムアミノ酸配列）およびヒトフレームワーク領域を含有するＦａｂ断片を含有することができる（例えば米国特許第６，３００，０６４号（Ｋｎａｐｐｉｋ，ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい）。
【００９５】
ヒト定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎ．Ｉ．Ｈ．ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２において見出してもよい。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体固定または抗体依存性細胞傷害における活性などの所望のエフェクター機能によって導かれる。アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４とすることができる。特定の実施形態では、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２である。ヒト軽鎖定常領域（カッパまたはラムダ）のどちらでも使用されてもよい。次いで、キメラ抗体、ヒト化抗体は、従来の方法によって発現される。
【００９６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣを発現する細胞（例えば腫瘍細胞）に対して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き出すことができる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプを有する抗体は、Ｆｃ受容体に結合するそれらの能力により、抗体依存性の細胞傷害性能力においてエフェクター機能を誘発するのに有用である。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低いために、ＡＤＣＣ応答を最小限にするのに有用である。関連する実施形態では、例えば改変真核生物細胞系における成長による、Ｆｃ領域における置換または抗体のグリコシル化組成における変化は、抗ＧＣＣ抗体が結合する細胞を認識する、その細胞に結合する、および／またはその細胞に対する細胞傷害性を媒介する、Ｆｃ受容体の能力を増強させることができる（例えば米国特許第７，３１７，０９１号、同第５，６２４，８２１号、および国際公開第ＷＯ００／４２０７２号、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：４００５−４０１０（２００６）、Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３（２００６）を含む刊行物を参照されたい）。ある実施形態では、抗体または抗原結合断片（例えばヒト起源の抗体、ヒト抗体）は、機能（例えばエフェクター機能）を改変するまたは調整するアミノ酸置換または交換を含むことができる。例えば、ヒト起源の定常領域（例えばγ１定常領域、γ２定常領域）は、補体活性化および／またはＦｃ受容体結合を低下させるように設計することができる。（例えば、これらの全教示が参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第５，６４８，２６０号（Ｗｉｎｔｅｒら）、同第５，６２４，８２１号（Ｗｉｎｔｅｒら）、および同第５，８３４，５９７号（Ｔｓｏら）を参照されたい）。好ましくは、そのようなアミノ酸置換または交換を含有するヒト起源の定常領域のアミノ酸配列は、ヒト起源の非改変定常領域のアミノ酸配列に対して完全長にわたって少なくとも約９５％同一である、より好ましくは、ヒト起源の非改変定常領域のアミノ酸配列に対して完全長にわたって少なくとも約９９％同一である。
【００９７】
さらに別の実施形態では、エフェクター機能はまた、抗体のグリコシル化パターンを調整することによって改変することができる。改変とは、抗体において認められる１つ以上の炭水化物部分の欠失および／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の追加を意味する。例えば、抗体のＦｃ領域に結合するフコースを欠く成熟炭水化物構造物を有する増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗体は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ）において記載されている。米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）もまた参照されたい。Ｇｌｙｃｏｆｉもまた、抗体の特定のグリコフォームを産生することができる酵母細胞系を開発した。
【００９８】
加えて、またはあるいは、フコシル残基の量が低下した低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または２つに枝分かれした（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造物が増加した抗体などの改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物改変物は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって行うことができる。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現するように操作される宿主細胞として使用し、それによって、グリコシル化が改変された抗体を産生することができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号は、そのような細胞系において発現される抗体が低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載する。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、アスパラギン（２９７）連結炭水化物にフコースを付加する能力が低下した変異体ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞を記載し、これもまた、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらす（例えばＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、操作された細胞系において発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす、２つに枝分かれしたＧｌｃＮａｃ構造物の増加を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えばベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系を記載する（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０もまた、参照されたい）。
【００９９】
ヒト化抗体はまた、ＣＤＲ移植アプローチを使用して作製することもできる。そのようなヒト化抗体の生成の技術は、当技術分野において公知である。一般に、ヒト化抗体は、ＧＣＣに結合する抗体の可変重配列および可変軽配列をコードする核酸配列を得、可変重配列および可変軽配列における相補性決定領域または「ＣＤＲ」を同定し、かつヒトフレームワーク核酸配列にＣＤＲ核酸配列を移植することによって産生される（例えば米国特許第４，８１６，５６７号および同第５，２２５，５３９号を参照されたい）。ＣＤＲおよびフレームワーク残基の位置は、判定することができる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ
ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたい）。本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子は、表５および表６に列挙されるＣＤＲをコードするＣＤＲアミノ酸配列およびＣＤＲ核酸配列を有する。一部の実施形態では、表５および表６由来の配列は、本明細書に記載の治療方法または診断方法における使用のためにＧＣＣを認識する分子に組み込むことができる。選択されるヒトフレームワークは、インビボ投与に好適なものであり、それが免疫原性を示さないことを意味する。例えば、そのような判定は、そのような抗体のインビボにおける使用を伴う先の知見およびアミノ酸類似性に関する研究によって成すことができる。好適なフレームワーク領域は、ドナー抗体、例えば抗ＧＣＣ抗体分子（例えば３Ｇ１）の等価な部分（例えばフレームワーク領域）のアミノ酸配列内のフレームワーク領域の全長にわたって、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸配列同一性を有するヒト起源の抗体から選択することができる。アミノ酸配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗなどの好適なアミノ酸配列アライメントアルゴリズムを使用して判定することができる。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））。
【０１００】
ヒト化されることとなるクローニング抗体のＣＤＲおよびＦＲが一度同定されたら、ＣＤＲをコードするアミノ酸配列が、同定され、対応する核酸配列が、選択されるヒトＦＲ上に移植される。これは、公知のプライマーおよびリンカーを使用して行うことができ、これらの選択は、当技術分野において公知である。特定のヒト抗体のＣＤＲはすべて、非ヒトＣＤＲの少なくとも１つの部分と置き換えられてもよいし、またはＣＤＲのうちのごく一部が非ヒトＣＤＲで置き換えられてもよい。所定の抗原へのヒト化抗体の結合に必要とされるＣＤＲの数を置き換えることのみが必要である。ＣＤＲが選択されたヒトＦＲ上に移植された後に、結果として生じる「ヒト化」可変重配列および可変軽配列は、ＧＣＣに結合するヒト化Ｆｖまたはヒト化抗体を産生するように発現される。好ましくは、ＣＤＲ移植（例えばヒト化）抗体は、ドナー抗体に類似する、実質的にドナー抗体と同じ、またはドナー抗体の親和性より好適な親和性で、ＧＣＣタンパク質に結合する。典型的に、ヒト化可変重配列および軽配列は、ＧＣＣに結合する完全な抗体が得られるように、ヒト定常ドメイン配列を有する融合タンパク質として発現される。しかしながら、定常配列を含有しないヒト化Ｆｖ抗体を産生することができる。
【０１０１】
特定のアミノ酸が置換された、欠失した、または付加されたヒト化抗体もまた、本発明の範囲内である。特に、ヒト化抗体は、抗原への結合を改善するように、フレームワーク領域におけるアミノ酸置換を有することができる。例えば、ヒト化免疫グロブリン鎖の、選択される少数のアクセプターフレームワーク残基は、対応するドナーアミノ酸によって置き換えることができる。置換の位置は、ＣＤＲに近接するまたはＣＤＲと相互作用することができるアミノ酸残基を含む（例えば米国特許第５，５８５，０８９号または同第５，８５９，２０５号を参照されたい）。アクセプターフレームワークは、成熟ヒト抗体フレームワーク配列またはコンセンサス配列とすることができる。本明細書において使用される場合、用語「コンセンサス配列」は、最も頻繁に認められるまたは関連するファミリーメンバーの間で領域内の配列における各々の位置で最も共通する残基から考えられる配列を指す。ヒト可変領域の異なるサブグループについてのコンセンサス配列を含む、多くのヒト抗体コンセンサス配列が、入手可能である（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ（１９９１）を参照されたい）。Ｋａｂａｔデータベースおよびそのアプリケーションは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤのＩｇＢＬＡＳＴを介してオンラインで自由に入手可能である（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．ａｎｄ  Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：２０５−２０６（２００１）もまた参照されたい）。
【０１０２】
抗体をヒト化するための他の技術は、１９９２年１２月２３日に公開されたＰａｄｌａｎらによる、欧州特許第５１９５９６  Ａ１号において記載されている。
【０１０３】
抗ＧＣＣ抗体分子は、ヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失またはこれらの内容が参照によって本明細書において組み込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５２９７６号および国際公開第ＷＯ００／３４３１７号において開示される方法による「脱免疫」によってまた改変されてもよい他のヒト化抗体を含む。簡潔に述べれば、抗ＧＣＣ抗体のウサギ、または他の非ヒト種重鎖可変領の域および軽鎖可変領域は、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて分析することができる；これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープを表す。潜在的なＴ細胞エピトープの検出については、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と称されるコンピューターモデリングアプローチを適用することができ、さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースは、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５２９７６号および国際公開第ＷＯ００／３４３１７号に記載のとおりウサギＶＨおよびＶＬ配列に存在するモチーフについて検索することができる。これらのモチーフは、１８の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれにも結合し、したがって潜在的なＴ細胞エピトープを構築する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変領域における少数のアミノ酸残基の置換によってまたは好ましくは単一アミノ酸置換によって排除することができる。可能な限り、保存的置換は、排他的ではないが多くの場合に行なわれ、ヒト生殖細胞系列抗体配列におけるこの位置で共通の、アミノ酸が使用されてもよい。ヒト生殖細胞系列配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８（１９９２）、Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２（１９９５）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９−８１７（１９９２）において開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリーを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって編集）。抗ＧＣＣ抗体の脱免疫ＶＨおよびＶＬをウサギＶＨおよびＶＬ遺伝子の変異誘発によって構築した後に、その変異誘発された可変配列は、必要に応じて、ヒト定常領域、例えばヒトＩｇＧ１定常領域またはκ（ｋａｐｐａ）定常領域に融合することができる。
【０１０４】
他の実施形態では、ＣＤＲ移植抗体による免疫原性応答の低下は、ＣＤＲ中のアミノ酸残基の変化、例えば欠失、置換によって達成することができる（Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ．ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）、米国特許第６，８１８，７４９号、Ｔａｎ  ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５（２００６））。例えば、抗原との接触に関与する位置の残基は、好ましくは、変化されない。典型的に、そのような残基、特異性判定残基（ＳＤＲ）は、抗体の間で高レベルの変動性を示す位置にある。抗ＧＣＣ抗体分子から、例えば、本明細書に記載の抗体から、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２（１９９６））によって誘導されるコンセンサス配列は、ＳＤＲを同定するのを促進する。本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子において、ＳＤＲは、以下の、重鎖ＣＤＲ１の少なくとも最初の残基、または一部の実施形態では、最初の４つの残基；重鎖ＣＤＲ２の少なくともＮ末端部分、例えば最初の７個、１０個、または１３個の残基；重鎖ＣＤＲ３のほぼすべて；軽鎖ＣＤＲ１のＣ末端部分、例えば、残基６、８、または９；軽鎖ＣＤＲ２のほぼ最初の、中央の、および／または最後の残基；ならびに軽鎖ＣＤＲ３のほとんど、または少なくとも残基２もしくは残基３の後、である。したがって、抗ＧＣＣ抗体分子のヒト化または改変の後にＧＣＣタンパク質への結合を維持するために、抗ＧＣＣ抗体分子のＣＤＲのそのようなＳＤＲ残基は、ＣＤＲの他の残基またはフレームワーク領域の残基よりも、変化、例えば、ウサギ残基からヒトコンセンサス残基への変化を受けにくい。反対に、非ヒト、例えばウサギＣＤＲ中の残基を、ヒトＣＤＲ、例えばその全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０１１０９３６号に記載の抗ＧＣＣ抗体分子のＣＤＲ中のコンセンサスとして同定される残基に変化させることは有益であり得る。
【０１０５】
完全な抗体でない抗ＧＣＣ抗体もまた、本発明に有用である。そのような抗体は、上に記載される抗体のいずれから誘導されてもよい。このタイプの有用な抗体分子は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインから成る一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉｉ）ＶＨＨドメイン（ナノボディとして公知）から成る単一ドメイン機能的重鎖抗体、例えばＣｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：２８５３−２８５７（２００４）およびその中に引用される参考文献を参照されたい；ならびに（ｖｉｉ）単離ＣＤＲ、例えば、抗原結合断片を提供するのに十分なフレームワークと一緒の１つ以上の単離ＣＤＲを含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは合成リンカーによって組換え法を使用して連結することができる。その合成リンカーにより、ＶＬおよびＶＨは、そのＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成する単一タンパク質鎖として作製することが可能となる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照されたい。そのような単鎖抗体もまた、抗体の用語「抗原結合断片」の範囲内に包含されるように意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、その断片は、完全な抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂなどの抗体断片は、完全なタンパク質の切断によって、例えば、プロテアーゼによる切断または化学的な切断によって調製されてもよい。
【０１０６】
実施形態では、重鎖および軽鎖の一方または両方のＣＤＲ配列のうちの一部またはすべては、別の抗体分子に、例えばＣＤＲ移植、ヒト化、またはキメラ抗体分子に使用することができる。
【０１０７】
実施形態は、細胞表面ＧＣＣへの結合を可能にするために、本明細書に記載されるウサギハイブリドーマ抗体のうちの１つから由来の十分なＣＤＲ、例えば６つのＣＤＲすべてを含む抗体分子を含む。
【０１０８】
一実施形態では、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲのすべてまたはＬＣＤＲのすべてまたは６つすべては、ヒトまたはヒト誘導フレームワーク領域（複数可）に埋め込まれる。ヒトフレームワーク領域の例は、ヒト生殖細胞系列フレームワーク配列、親和性成熟したヒト生殖細胞系列配列（インビボもしくはインビトロのいずれかにおいて）、または合成ヒト配列、例えばコンセンサス配列を含む。一実施形態では、重鎖フレームワークは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２フレームワークである。一実施形態では、軽鎖フレームワークは、カッパフレームワークである。
【０１０９】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子、例えばＣＤＲ移植抗体分子またはヒト化抗体分子は、ＧＣＣへの結合を可能にするように、十分なＣＤＲ、例えば、本明細書に記載の抗体、例えば表５に列挙される配列のうちの１つから由来の６つのＣＤＲすべてを含む。（表５に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列をコードすることができる例示的な核酸配列は、本明細書において表６に提供される）。特定の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、ＭＩＬ−４４−１４８−２またはＭＩＬ−４４−６７−４由来のＣＤＲを含むことができる。
【０１１０】
インビボにおける治療用または診断用の使用のための抗体断片は、それらの血清半減期を改善する改変から利益を得ることができる。抗体のインビボ血清半減期を増加させるように意図される好適な有機部分は、親水性のポリマー基（例えば線状または分枝ポリマー（例えばポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、およびその他同種のものなどのポリアルカングリコール）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、多糖、およびその他同種のもの）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリシン、ポリアスパルテート、およびその他同種のもの）、ポリアルカンオキシド、ならびにポリビニルピロリドン）、脂肪酸基（例えばモノカルボン酸もしくはジカルボン酸）、脂肪酸エステル基、脂質基（例えばジアシルグリセロール基、スフィンゴリピド基（例えばセラミジル））、またはリン脂質基（例えばホスファチジルエタノールアミン基）から選択される１または２以上の線状部分または分枝部分を含むことができる。好ましくは、有機部分は、所定の部位に結合され、その有機部分は、非結合体化抗体部分と比較して、結果として得られる免疫結合体の機能を損なわない（例えば、抗原結合親和性を減少させない）。その有機部分は、約５００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａ、好ましくは約２０００、５０００、１０，０００、または２０，０００Ｄａの分子量を有することができる。有機部分を用いてポリペプチド、例えば抗体を改変するための例および方法は、例えば、米国特許第４，１７９，３３７号および同第５，６１２，４６０号、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９５／０６０５８号および国際公開第ＷＯ００／２６２５６号、ならびに米国特許出願公開第２００３００２６８０５号に見出すことができる。
【０１１１】
抗ＧＣＣ抗体分子は、上で参照されるウサギハイブリドーマ抗体のうちの１つの重鎖および軽鎖の一方または両方の可変領域のすべてまたはその抗原結合断片を含むことができる。
【０１１２】
一実施形態では、（ａ）の軽鎖アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、１０、または１５もの数の残基に対して（ａ）（ｉ〜ｉｉ）において言及される参照アミノ酸配列（複数可）のうちの１つと異なり得る。実施形態では、その差異は、保存的置換である。実施形態では、その差異は、フレームワーク領域にある。一実施形態では、（ｂ）の重鎖アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、１０、または１５もの数の残基に対して（ｂ）（ｉ〜ｉｉ）において言及される参照アミノ酸配列（複数可）のうちの１つと異なり得る。実施形態では、その差異は、保存的置換である。実施形態では、その差異は、フレームワーク領域にある。
【０１１３】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、以下：
（ａ）（ｉ）表３由来の軽鎖可変領域アミノ酸配列、例えば配列番号１３もしくは（ｉｉ）表４由来のヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域アミノ酸、例えば配列番号１２のいずれかの、すべての軽鎖アミノ酸配列または上記いずれかの抗原結合断片；および
（ｂ）（ｉ）表３由来の重鎖可変領域アミノ酸配列、例えば配列番号１１もしくは（ｉｉ）表４由来のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、例えば配列番号１０のいずれかの、すべての重鎖アミノ酸配列または上記いずれかの抗原結合断片、の一方または両方を含む。
【０１１４】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、以下：
ａ）本発明の抗ＧＣＣ抗体分子の軽鎖可変領域と少なくとも８５、９０、９５、９７、または９９％の相同性を有する軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および
ｂ）本発明の抗ＧＣＣ抗体分子の重鎖可変領域と少なくとも８５、９０、９５、９７、または９９％の相同性を有する重鎖可変領域またはその抗原結合断片、の一方または両方を含む。
【０１１５】
本発明の抗ＧＣＣ抗体の可変領域のアミノ酸配列は、表３に見出すことができる。
【０１１６】
１つのアプローチにおいて、重鎖Ｊ領域および軽鎖Ｊ領域をコードするコンセンサス配列は、ヒトＣ領域セグメントへのＶ領域セグメントのその後の連結のためにＪ領域に有用な制限酵素認識部位を導入するためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを設計するのに使用してもよい。Ｃ領域ｃＤＮＡは、ヒト配列における類似の位置に制限酵素認識部位を配置するために部位特異的変異誘発によって改変することができる。
【０１１７】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソーム、およびその他同種のものを含む。好都合なベクターは、任意のＶＨまたはＶＬの配列が容易に挿入され、発現することができるように操作された、適切な制限酵素認識部位を有する、機能的に完全なヒトＣＨ免疫グロブリン配列またはヒトＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは、普通、挿入されたＪ領域におけるスプライスドナー部位とヒトＣ領域に先行するスプライスアクセプター部位との間で生じ、またヒトＣＨエクソン内に生じるスプライス領域でも生じる。好適な発現ベクターは、多くの構成要素、例えば複製起点、選択マーカー遺伝子、転写制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）などの１つ以上の発現制御エレメント、ならびに／または１つ以上の翻訳シグナル、シグナル配列もしくはリーダー配列、およびその他同種のものを含有することができる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位で生じる。結果として生じるキメラ抗体は、任意の強力なプロモーターにつながれてもよい。使用することができる好適なベクターの例は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、パポバウイルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）、またはマウスおよびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、天然のＩｇプロモーターなどの、哺乳動物の宿主に好適であり、ウイルス複製系をベースとするベクターを含む。単一のコピーもしくは複数のコピーで維持されるかまたは例えば、ＬＴＲを介してもしくは複数の組込み部位を用いて操作された人工染色体を介して宿主細胞染色体に組込まれるようになるベクターを含む様々な好適なベクターが、当技術分野において公知である（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ１７２（２００４）、Ｋｅｎｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｏｎｌｉｎｅ  ２００９年５月２０日）。好適なベクターのさらなる例は、後の部において列挙される。
【０１１８】
したがって、本発明は、抗体、抗体の抗原結合断片（例えば、前述のもののうちのあらゆるヒト化抗体、キメラ抗体、もしくは抗原結合断片）、抗体鎖（例えば重鎖、軽鎖）、またはＧＣＣタンパク質に結合する抗体鎖のうちの抗原結合部分をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【０１１９】
真核生物の宿主細胞における発現は、そのような細胞が、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性のある抗体を構築し、分泌する可能性が原核生物細胞よりも高いので、有用である。しかしながら、不適切な折り畳みにより不活性である、産生されたあらゆる抗体は、公知の方法に従って復元することができる（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１，ｐｐ．４５９−８９（１９８２））。宿主細胞が、軽鎖二量体または重鎖二量体などの、無処理の抗体の一部を産生することは可能であり、これらもまた、本発明によれば抗体相同体である。
【０１２０】
さらに、本明細書において別記されるように、抗体またはヒトもしくは非ヒト種由来の抗体は、当技術分野において周知の技術を使用する、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および他の技術を含むがそれに限定されないディスプレイ型の技術を通して生成することができ、結果として生じる分子は、そのような技術が当技術分野において公知のように、親和性成熟などのさらなる成熟に供することができる。Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３−４６（１９９３）およびＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５−１６８（１９９２）、Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｔｈａｕ  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ）、Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ  ＴＩＢＳ  １７：２４１−２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０８１−１０８５（１９９３）、Ｈｏｇａｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３−６８（１９９２）、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １０：８０−８４（１９９２）、および米国特許第５，７３３，７４３号。ディスプレイ技術がヒトでない抗体を産生するために利用される場合、そのような抗体は、上に記載されるようにヒト化することができる。
【０１２１】
生成される抗体は、特定の所望のアイソタイプを最初に有する必要はないが、むしろ、生成される場合、その抗体は、任意のアイソタイプを有することができることが十分に理解される。例えば、ＭＩＬ−４４−１４８−２ウサギハイブリドーマによって産生される抗体は、ＩｇＧアイソタイプを有する。その抗体のアイソタイプは、当技術分野において公知の従来の技術を使用して、その抗体が細胞上のＧＣＣに結合する場合に、ＡＤＣＣ反応を誘発するために、その後、例えばＩｇＧ２またはＩｇＧ３に切り替えることができる。そのような技術は、とりわけ、直接組換え技術（例えば米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい）、細胞間融合技術（例えば米国特許第５，９１６，７７１号を参照されたい）の使用を含む。細胞間融合技術において、任意の所望のアイソタイプを有する重鎖を有するミエローマ細胞系または他の細胞系が調製され、軽鎖を有する別のミエローマ細胞系または他の細胞系が調製される。そのような細胞は、その後、融合することができ、完全な抗体を発現する細胞株を単離することができる。
【０１２２】
ある実施形態では、ＧＣＣ抗体分子は、ウサギ抗ＧＣＣ  ＩｇＧ１抗体である。そのような抗体が、ＧＣＣ分子への所望の結合を有するので、そのような抗体のうちの任意の１つは、なお同じ可変領域（これは、ある程度まで、抗体の特異性および親和性を判定する）を有しながら、容易にアイソタイプを切り替え、別のアイソタイプを生成することができる。したがって、上で考察される所望の「構造的な」属性を満たす抗体候補が、生成されるので、それらに、一般に、アイソタイプ切り替えを通して、所望される少なくともある種のさらなる「機能的な」属性を提供することができる。
【０１２３】
一実施形態では、可変領域またはその抗原結合断片は、それが共に生成される定常領域以外の定常領域（もしくはその断片）例えば、別の抗体由来の定常領域（もしくはその断片）に、または合成定常領域（もしくはその断片）に結合することができる。実施形態では、その定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域（またはその断片）である。配列変化は、抗体分子のエフェクター活性を改変するために可変領域または定常領域において成すことができる。
他の治療剤の設計および生成
【０１２４】
ＧＣＣに関して本明細書において産生され、特徴付けられる抗体は、他の抗体、他の拮抗剤、または抗体以外の化学的な部分を含む他の治療様式の設計を提供し、促進される。そのような様式は、限定されることなく、類似する結合活性または機能性を有する抗体、二重特異性抗体、免疫結合体、および放射標識治療薬などの高度な抗体治療薬、ペプチド治療薬、特にイントラボディの生成、ならびに小分子を含む。さらに、上で考察されるように、本発明の抗体のエフェクター機能は、様々な治療用の使用について、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、またはＩｇＭにアイソタイプを切り替えることによって変化させてもよい。
【０１２５】
二重特異性抗体に関連して、（ｉ）２つの抗体（一方はＧＣＣに対する特異性を有し、他方は一緒に結合体化させる第２の分子に対する特異性を有する）、（ｉｉ）ＧＣＣに特異的な１つの鎖および第２の分子に特異的な第２の鎖を有する単一抗体、または（ｉｉｉ）ＧＣＣおよび他の分子に対する特異性を有する単鎖抗体を含む二重特異性抗体を生成することができる。そのような二重特異性抗体は、公知の技術を使用して生成することができる。例えば、二重特異性抗体は、２つ以上の抗体（同じタイプまたは異なるタイプの）を架橋することによって産生されてもよい。好適な架橋剤は、適切なスペーサーによって分離された２つの別個に反応性の基を有するヘテロ二官能性のもの（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性のもの（例えばジスクシンイミジルスベレート）を含む。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手可能である。例えばＦａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）、およびＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３−４６（１９９３）、およびＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５−１６８（１９９２）、ならびに（ｉｉｉ）に関連して、例えばＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１〜５２（１９９２）．Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）もまた、参照されたい。
【０１２６】
さらに「カッパボディ（Ｋａｐｐａｂｏｄｙ）」（Ｉｌｌ．ｅｔ  ａｌ．「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０：９４９−５７（１９９７））、「ミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０３−９（１９９４）、米国特許第５，８３７，８２１号）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））、または「Ｊａｎｕｓｉｎ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ７：５１−５２（１９９２））もまた、調製されてもよい。
核酸およびポリペプチド
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体分子をコードするまたはそれを表わすポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に関する。そのようなポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖の各々の可変領域および定常領域の両方をコードするが、他の組み合わせが、本明細書に記載の組成物に従って本発明によってまた企図される。本発明はまた、開示されるポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から誘導されるオリゴヌクレオチド断片を企図する。
【０１２８】
ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態とすることができる。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸アナログ、および合成ＤＮＡの形態をしているポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは、二本鎖であっても一本鎖であってもよく、一本鎖である場合、コード（センス）鎖であっても、または非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書において提供されるコード配列と同一であってもよく、またはコード配列が、遺伝子コードの重複性または縮重の結果として、本明細書において提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコードする、異なるコード配列であってもよい。
【０１２９】
提供される実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば表４に要約されるように、本発明の少なくとも１つの重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域をコードする。
【０１３０】
本発明はまた、ポリヌクレオチドの欠失、置換、または付加などの改変を含有する改変ポリヌクレオチドおよび改変ポリヌクレオチド配列に起因する任意のポリペプチド改変を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、本明細書において提供されるコード配列の変異体であるコード配列を有していてもよい。例えば、改変ポリヌクレオチドは、表４に列挙されるポリヌクレオチドと、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有することができる。実施形態では、改変ポリヌクレオチドは、抗ＧＣＣ抗体分子をコードする。
【０１３１】
本発明は、さらに、本発明の抗体を表わすポリペプチドならびにそのようなポリペプチドの断片、アナログ、および誘導体に関する。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然に産生されるポリペプチド、または合成ポリペプチドであってもよい。本発明のポリペプチドの断片、誘導体、またはアナログは、１つ以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置換されるものであってもよく、そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸残基であってもなくてもよい；またはそれは、１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであってもよい；またはそれは、ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えばポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合されるものであってもよい；またはそれは、さらなるアミノ酸が、リーダー配列もしくは分泌配列またはポリペプチド配列もしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列などのポリペプチドに融合されるものであってもよい。そのような断片、誘導体、およびアナログは、本発明の範囲内である。様々な態様では、本発明のポリペプチドは、部分的に精製されてもよく、または精製産物であってもよい。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、例えば表２もしくは表３に要約される本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列または１つ以上のアミノ酸置換に起因するわずかな変化により異なるアミノ酸配列を有することができる。変化は、典型的に、約１〜５個のアミノ酸の範囲での「保存的変化」であってもよく、置換されたアミノ酸は、例えば、ロイシンのイソロイシンとの交換またはトレオニンのセリンとの交換；リシンのアルギニンまたはヒスチジンとの交換などの、類似する構造的または化学的特性を有する。対照的に、変化は、非保存的変化、例えばグリシンのトリプトファンとの交換を含んでいてもよい。類似するわずかな変化はまた、アミノ酸の欠失もしくは挿入またはその両方を含んでいてもよい。生物学的または免疫学的活性を変化させることなく、どのアミノ酸残基およびどれだけのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させてもよいかを判定する際の手引きは、当技術分野において公知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用して見出してもよい。
【０１３３】
他の態様では、本発明は、抗ＧＣＣ抗体分子をコードする単離核酸および／または組換え核酸を特徴とする。実施形態では、その核酸は、１つ以上の抗体分子、重鎖、軽鎖、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、本明細書に記載の抗体分子の重鎖および軽鎖の一部（例えば完全長重鎖可変領域と対になった場合に、抗原結合性となる軽鎖可変領域断片、または完全長軽鎖可変領域と対になった場合に、抗原結合性となる重鎖可変領域断片）、ならびにＣＤＲをコードする。実施形態は、ベクター（例えば発現ベクター）に配置されたそのような核酸を含む。さらに、本発明は、例えば、プラスミドなどによってコードされる抗体分子を発現する宿主細胞によって産生される抗体分子を包含する。
【０１３４】
一実施形態では、
軽鎖可変領域をコードする配列、例えば表３に記載の軽鎖可変領域、例えば表４に列挙される配列、その抗原結合断片、または本明細書に記載の、軽鎖由来の１、２、もしくは３個のＣＤＲ（および必要に応じてフレームワーク領域）、例えば表５に記載のＣＤＲ、例えば表６に記載のＣＤＲをコードする配列；ならびに
重鎖可変領域をコードする配列、例えば表３に記載の重鎖可変領域、例えば表４に列挙される配列、その抗原結合断片、または本明細書に記載の、重鎖由来の１、２、もしくは３個のＣＤＲ（および必要に応じてフレームワーク領域）、例えば表５に記載のＣＤＲ、例えば表６に記載のＣＤＲをコードする配列、
の一方または両方を含む、ベクター、例えば発現ベクターが提供される。
【０１３５】
提供される実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明の抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域または少なくとも１つの軽鎖可変領域をコードする。提供される実施形態では、ポリペプチドは、本発明の抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域をコードすることができる。
【０１３６】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、以下：
（ａ）（ｉ）本明細書に記載の、例えば表４に記載の抗ＧＣＣ抗体分子コード核酸配列の相補体または（ｉｉ）本発明の抗ＧＣＣ抗体分子、例えば、表１および表２に要約される上で参照されるウサギ抗体のうちの１つの軽鎖をコードする任意の核酸配列と、選択されるストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、ならびに
（ｂ）（ｉ）本明細書に記載の、例えば表４に記載の抗ＧＣＣ抗体分子コード核酸配列の相補体または（ｉｉ）本発明の抗ＧＣＣ抗体分子、例えば、表１および表２に要約される上で参照されるウサギ抗体のうちの１つの重鎖をコードする任意の核酸配列と、選択されるストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる重鎖可変領域またはその抗原結合断片の、一方または両方を含む。
【０１３７】
一実施形態では、選択されるストリンジェンシー条件は、例えば、それらの条件が本明細書に記載のとおり、高ストリンジェンシー条件または超高ストリンジェンシー条件である。
【０１３８】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技法による本発明の抗体の産生をも提供する。
【０１３９】
適切なＤＮＡ配列は、様々な手順によってベクターに挿入されてもよい。一般に、ＤＮＡ配列は、当技術分野において公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。発現ベクター中のポリヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡの合成を指示するために適切な発現制御配列（つまりプロモーター）に作用的に連結される。そのようなプロモーターの例は、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲまたは初期もしくは後期ＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃもしくはｔｒｐ、ファージラムダＰＬプロモーター、および原核生物（例えば大腸菌についてのｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）細胞もしくは真核生物（例えばサイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ＥＦ−１ａプロモーター）細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーターを含むが、これらに限定されない。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターは、エンハンサーを含有することができ、これは、ＳＶ４０などのシミアンウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、またはモロニー肉腫ウイルスから誘導されたものなどのウイルス起源またはゲノム起源の転写刺激ＤＮＡ配列である。ベクターはまた、好ましくは、複製起点をも含有する。ベクターは、外因性の複製起点を含有するように構築することができるか、またはそのような複製起点は、ＳＶ４０もしくは別のウイルス供給源から誘導することができるか、もしくは宿主細胞の染色体複製メカニズムによるものとすることができる。
【０１４０】
さらに、ベクターは、様々な宿主においてメトトレキセートを用いる選択を可能にするためのジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子、またはベータ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン抵抗性）、原核生物細胞において使用されるＴｅｔ遺伝子（テトラサイクリン抵抗性のための）もしくはネオマイシン、ＧＡ４１８（ジェネテシン、ネオマイシン誘導体）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはヒグロマイシン抵抗性遺伝子などの抗生物質、またはチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの非存在などの、宿主細胞の遺伝的傷害を補完する遺伝子などの、形質移入した宿主細胞の選択のためのマーカー遺伝子を必要に応じて含有する。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、多くの場合、酵母における選択マーカーとして使用される。
【０１４１】
本発明の抗体を得るために、本発明の抗体の軽鎖および重鎖可変領域ならびに軽鎖および重鎖定常領域をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列が、ベクターに組み込まれるべきである。本発明の抗体の軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数のベクターに組み込むことができ、次いで、宿主細胞に組み込まれる。
【０１４２】
哺乳動物の細胞における発現に好適な発現ベクターは、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＥＦ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＣＭＶ（ＳＣＲＩＰＴ、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＣＤＥＦ３（Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１：１０１３−１０１５（１９９６））、ｐＳＶＳＰＯＲＴ（ＧＩＢＣＯ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＦ−Ｂｏｓ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５３２２（１９９０））、Ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ＧＰＥＸ（登録商標）Ｒｅｔｒｏｖｅｃｔｏｒ（Ｇａｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓ．）、およびその他同種のものを含む。原核生物細胞（大腸菌）、昆虫細胞（ショウジョウバエシュナイダー  Ｓ２細胞、Ｓｆ９）、および酵母（Ｐ．メタノリカ、Ｐ．パストリス、Ｓ．セレビシエ）などの様々な発現宿主において使用するのに好適な発現ベクターもまた、入手可能である。例示的なベクターは、ｐＬＫＴＯＫ５８（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ配列）およびｐＬＫＴＯＫ５９（変異ＩｇＧ１  Ｆｃ配列）である（米国特許出願公開第２００６０１４７４４５号を参照されたい）。
【０１４３】
十分に理解されるように、本発明による抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系において発現することができる。特定の抗体についてのｃＤＮＡまたはゲノムクローンをコードする配列は、好適な哺乳動物または非哺乳動物の宿主細胞に使用することができる。形質転換は、例えば、ウイルスに（またはウイルスベクターに）ポリヌクレオチドをパッケージすること、ならびにウイルス（もしくはベクター）を用いてまたは哺乳動物細胞に異種のポリヌクレオチドを導入するための当技術分野において公知の形質移入手順によって、例えばデキストラン媒介性の形質移入、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介性の形質移入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）のカプセル化、およびＤＮＡ分子の直接的なマイクロインジェクションによって、宿主細胞を形質導入することを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する任意の公知の方法によるものとすることができる。使用される形質転換手順は、形質転換されることとなる宿主に依存する。哺乳動物の細胞への異種のポリヌクレオチドの導入のための方法は、当技術分野において公知であり、デキストラン媒介性の形質移入、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介性の形質移入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソームへのポリヌクレオチド（複数可）のカプセル化、ペプチド結合体、デンドリマー、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含むが、これらに限定されない。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞を特徴とする。実施形態では、細胞は、本明細書に記載の抗体分子またはその構成要素を発現する。なおさらなる実施形態は、抗体分子、例えば本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子、例えばウサギ抗体分子またはそのヒト化型を産生する方法であって、発現に適切な条件下で宿主細胞を維持することを含み、それによって、免疫グロブリン鎖（複数可）は、発現され、抗体分子が産生される、方法を提供する。さらなる実施形態は、重鎖および軽鎖抗体配列をコードする前述の発現ベクターのいずれをも含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または原核生物細胞、例えば大腸菌とすることができる。例えば、哺乳動物細胞は、培養細胞または細胞系とすることができる。例示的な哺乳動物細胞は、リンパ球細胞系（例えばＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞を含む。特定の実施形態では、培養宿主細胞は、ＭＩＬ−４４−１４８−２抗体分子をコードする核酸配列を含むＣＨＯ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、ハイブリドーマＭＩＬ−４４−１４８−２（ＰＴＡ−８１３２）である。加えて、細胞は、卵母細胞およびトランスジェニック動物由来の細胞、例えば乳腺上皮細胞を含む。例えば、本明細書に記載の抗体分子をコードする核酸は、トランスジェニック非ヒト動物において発現することができる。
【０１４５】
発現のために宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当技術分野において公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ
Ｇ２）、および多くの他の細胞系を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である多くの不死化細胞系を含む。細菌、酵母、昆虫、および植物を含むが、これらに限定されない非哺乳動物細胞もまた、組換え抗体を発現するために使用することができる。グリコシル化を排除するための抗体ＣＨ２ドメインの部位特異的変異誘発は、非ヒトグリコシル化に起因する免疫原性、薬物動態、および／またはエフェクター機能のいずれかにおける変化を防止するのに好ましい場合がある。発現方法は、どの系が最も高い発現レベルを生じさせ、構成的ＧＣＣ結合特性を有する抗体を産生するかを判定することによって選択される。
【０１４６】
なおさらなる実施形態は、抗ＧＣＣ抗体分子、例えばウサギ抗体分子またはそのヒト化型を産生する方法であって、免疫グロブリンの発現に適切な条件下で、本明細書に記載の核酸、例えば表４または表６に列挙される１つ以上の核酸配列を含む宿主細胞を維持することを含み、それによって、免疫グロブリン鎖が発現され、抗体分子、例えばＧＣＣに結合するウサギ抗体分子もしくはそのヒト化型またはその断片もしくは変異体が産生される、方法を提供する。例えば、抗体分子の発現の方法は、宿主細胞の使用を含み、ここで、抗体分子、例えばウサギ抗体軽鎖またはそのヒト化型をコードする第１の組換え核酸分子、および抗体分子、例えばウサギ抗体重鎖またはそのヒト化型をコードする第２の組換え核酸分子は、単一の発現ベクターに含まれる。他の実施形態では、それらは、別個のベクターに存在する。所望の場合、本方法は、抗体、抗体の抗原結合断片、抗体鎖、または抗体鎖の抗原結合断片を単離するまたは回収するステップをさらに含むことができる。
【０１４７】
例えば、ＧＣＣタンパク質に結合するウサギ（またはヒト化）抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子（つまり１つ以上の核酸分子）またはそのような核酸分子（複数可）を含む発現構築物（つまり１つ以上の構築物）は、選択される宿主細胞に適切な任意の方法を使用して（例えば形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、感染）、組換え宿主細胞を作製するために、好適な宿主細胞に導入することができ、その結果、核酸分子（複数可）は、１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結される（例えばベクターにおいて、細胞における工程によって作製される構築物において、宿主細胞ゲノムに組み込まれる）。結果として生じる組換え宿主細胞は、発現に好適な条件下で維持することができ（例えば、誘発因子の存在下において、好適な非ヒト動物において、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養サプリメントなどを補充した好適な培地において、など）、それによってコードされたポリペプチド（複数可）が、産生される。所望の場合、コードされたタンパク質は、単離するかまたは回収することができる（例えば動物、宿主細胞、培地、ミルクから）。この工程は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、国際公開第ＷＯ９２／０３９１８号、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌを参照されたい）または植物の宿主細胞における発現を包含する。
【０１４８】
さらに、産生細胞系由来の本発明の抗体（またはそれ由来の他の部分）の発現は、多くの公知の技術を使用して増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼおよびＤＨＦＲ遺伝子発現系は、ある特定の条件下での発現を増強するための共通のアプローチである。高発現細胞クローンは、限界希釈法クローニング（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ技術、または当技術分野において公知の任意の他の方法などの従来の技術を使用して同定することができる。ＧＳ系は、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号、および同第０  ３２３  ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して、全体的または部分的に考察される。
【０１４９】
本発明の改変抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための例示的な系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介性の形質移入によって、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子は、各々、遺伝子の高レベルの転写を駆動するために、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどの、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス、およびその他同種のものに由来する）に作用的に連結される。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子を担持し、これは、メトトレキセート選択／増幅を使用するベクターによって形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、完全な抗体が培地から回収される。標準的な分子生物学技術は、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞を形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、および培地から抗体を回収するために使用される。
【０１５０】
本発明の抗体はまた、係る免疫グロブリン重鎖配列および軽鎖配列についてトランスジェニックである哺乳動物または植物の生成によって、ならびにそれから回収可能な形態をしている抗体の産生によって、トランスジェニックに（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｌｙ）産生することもできる。哺乳動物におけるトランスジェニック産生に関連して、抗体は、ヤギ、ウシ、または他の哺乳動物のミルク中に産生し、それから回収することができる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号、同第５，７５６，６８７号、同第５，７５０，１７２号、および同第５，７４１，９５７号を参照されたい。
【０１５１】
本明細書に記載の抗体、その抗原結合断片、抗体鎖、および抗原結合部分はまた、好適なインビトロ発現系において、化学合成によって、または任意の他の好適な方法によって産生することができる。
融合タンパク質および免疫結合体
【０１５２】
本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体は、１つ以上の非抗体分子実体に、任意の好適な方法（例えば化学的結合、遺伝子融合、非共有結合、または別の方法）によって機能的に連結することができる。
【０１５３】
本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子および非抗体成分が、単一の連続的なポリペプチド鎖の構成要素である、融合タンパク質を産生することができる。非抗体成分は、抗体成分に関して、Ｎ−末端に、Ｃ−末端に、または内部に配置することができる。例えば、一部の実施形態は、ｐＥＴベクター（例えばｐＥＴ−１５ｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）、ファージベクター（例えばｐＣＮＡＴＡＢ  ５  Ｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、または他のベクター、例えばｐＲＩＴ２ＴプロテインＡ融合ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの好適な発現ベクターへの、免疫グロブリン配列をコードする核酸の挿入によって産生することができる。結果として生じる構築物は、非抗体成分（例えばヒスチジンタグ、Ｅタグ、またはプロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン）を含む抗体鎖を産生するために発現させることができる。融合タンパク質は、好適な親和性マトリックスを使用するクロマトグラフィーなどの任意の好適な技術を使用して、単離するかまたは回収することができる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｖｏｌ．２、Ｓｕｐｐｌ．２６，ｐｐ．１６．４．１−１６．７．８（１９９１）を参照されたい）。
【０１５４】
本発明は、細胞に対してであり、実施形態では、細胞に内部移行される抗ＧＣＣ抗体分子を提供する。それらはＧＣＣを発現する細胞にまたはその細胞中に、治療剤または検出可能な作用物質を送達することができるが、標的が発現していない細胞にまたはその細胞中に送達することはできない。したがって、本発明はまた、治療剤または検出可能な作用物質と結合体化させている、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子を含む抗ＧＣＣ免疫結合体を提供する。実施形態では、抗ＧＣＣ免疫結合体のＧＣＣに対する親和性は、結合体化させていない抗体の親和性の少なくとも１０、２５、５０、７５、８０、９０、または９５％である。これは、細胞表面ＧＣＣまたは単離ＧＣＣを使用して、判定することができる。一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子、例えば免疫結合体は、１，０００、５００、２５０、１００、または５０ｐＭ未満の、本明細書に記載のアッセイによって判定されるＬＤ５０を有する。
【０１５５】
抗ＧＣＣ抗体分子は、当技術分野において公知の技術を利用して、免疫結合体として作用するように改変することができる。例えばＶｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照されたい。米国特許第５，１９４，５９４号もまた参照されたい。放射標識抗体の調製物もまた、当技術分野において公知の技術を利用して容易に調製することができる。例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ中の６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照されたい。米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０号（米国再発行特許第３５，５００号）、同第５，６４８，４７１号、および同第５，６９７，９０２号もまた参照されたい。
【０１５６】
一部の実施形態では、抗体分子および非抗体部分は、リンカーの手段によってつながれる。そのような実施形態では、免疫結合体は、式（Ｉ）
【０１５７】
【化１】
0006517267.tif 000011
によって表され、式中、
Ａｂは、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子であり、
Ｘは、ＡｂとＺとを接続する部分、例えば、ＡｂおよびＺの一方または両方への共有結合の後の、本明細書に記載のリンカーの残基であり、
Ｚは、治療剤または標識であり、ならびに
ｍは、約１〜約１５の範囲である。
【０１５８】
変数ｍは、式（Ｉ）の免疫結合体における抗体分子当たりの−−Ｘ−−Ｚ部分の数を表す。様々な実施形態では、ｍは、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の範囲である。一部の実施形態では、ｍは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、または２〜３の範囲である。他の実施形態では、ｍは、１、２、３、４、５、または６である。式（Ｉ）の複数の免疫結合体を含む組成物において、ｍは、平均薬剤負荷量とも呼ばれる、Ａｂ当たりの−−Ｘ−−Ｚ部分の平均数である。平均薬剤負荷量は、Ａｂ当たり１〜約１５の−Ｘ−−Ｚ部分の範囲であってもよい。一部の実施形態では、ｍが平均薬剤負荷量を表す場合、ｍは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、または約８である。例示的な実施形態では、ｍは、約２〜約８である。一実施形態では、ｍは、約８である。別の実施形態では、ｍは、約４である。別の実施形態では、ｍは、約２である。
【０１５９】
Ａｂ当たりの−−Ｘ−−Ｚ部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けられてもよい。ｍに関しての免疫結合体の定量的分布もまた、判定されてもよい。いくつかの場合において、ｍが、他の薬剤負荷を有する免疫結合体と区別されるように、一定の値をしている場合の、均質な免疫結合体の分離、精製、および特徴付けは、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成されてもよい。
【０１６０】
式（Ｉ）の免疫結合体は、混合物として存在してもよく、その混合物の各々の構成要素は、異なるｍ値を有する。例えば、式（Ｉ）の免疫結合体は、２つの別個の免疫結合体構成要素の混合物として存在してもよく、一方の免疫結合体構成要素は、ｍが７であり、他方の免疫結合体構成要素は、ｍが８である。
【０１６１】
一実施形態では、式（Ｉ）の免疫結合体は、３つの別個の免疫結合体の混合物として存在し、ここでその３つの別個の免疫結合体についてのｍは、それぞれ、１、２、および３、それぞれ、３、４、および５、それぞれ、５、６、および７、それぞれ、７、８、および９、それぞれ、９、１０、および１１、それぞれ、１１、１２、および１３、またはそれぞれ、１３、１４、および１５である。
【０１６２】
免疫結合体を調製するのに好適な様々なリンカー（例えば治療剤または標識に抗体分子を接続するためのヘテロ二官能性試薬）および方法は、当技術分野において公知である。（例えばＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）を参照されたい）。リンカーは、リンカーの切断により、細胞内環境中に薬剤（つまり、治療剤または標識）が放出されるように、例えば生理学的条件下で、例えば細胞内条件下で、切断可能とすることができる。他の実施形態では、リンカーは、切断可能ではなく、薬剤は、例えば抗体分解によって放出される。
【０１６３】
リンカーは、抗体部分上の化学的反応基に、例えば、遊離アミノ基、遊離イミノ基、遊離ヒドロキシル基、遊離チオール基、または遊離カルボキシル基に（例えばＮ末端もしくはＣ末端に、１つ以上のリシン残基のイプシロンアミノ基に、１つ以上のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基に、または１つ以上のシステイニル残基のスルフヒドリル基に）結合することができる。リンカーが結合する部位は、抗体部分のアミノ酸配列における天然の残基とすることができるか、またはそれは、例えばＤＮＡ組換え技術によって（例えばアミノ酸配列にシステインもしくはプロテアーゼ切断部位を導入することによって）またはタンパク質生化学（例えば還元、ｐＨ調整、もしくはタンパク質分解）によって抗体部分に導入することができる。
【０１６４】
共有結合の最も共通して使用される非特異的な方法のうちの１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体分子のアミノ（またはカルボキシ）基に連結するためのカルボジイミド反応である。加えて、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二機官能性作用物質は、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に連結するために使用されてきた。シッフ塩基反応もまた、抗体分子への薬剤（つまり、治療剤または標識）の付加に利用可能である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬剤の過ヨウ素酸酸化を伴い、したがって、抗体分子と次に反応するアルデヒドを形成する。付加は、抗体分子のアミノ基とのシッフ塩基の形成を介して生じる。イソチオシアネートもまた、抗体分子に薬剤を共有結合させるための結合剤として使用することができる。他の技術は、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０１６５】
ある実施形態では、リンカー（Ｘ）の前駆体である中間体は、適切な条件下で薬剤（Ｚ）と反応する。ある実施形態では、反応基は、薬剤および／または中間体上で使用される。薬剤（つまり、治療剤または標識）および中間体の間の反応の産物または誘導された薬剤は、続いて、適切な条件下で抗体分子と反応させる。
【０１６６】
免疫結合体は、当業者に周知の方法論、例えばカラムクロマトグラフイー（例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィー）、透析、ダイアフィルトレーション、または沈澱を用いることによって、反応物から精製することができる。免疫結合体は、当業者に周知の方法論、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析、またはキャピラリー電気泳動を利用することによって評価することができる。
【０１６７】
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境において（例えばリソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内に）存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーとすることができる。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンを含むことができ、これらはすべて、ジペプチド薬剤誘導体を加水分解し、標的細胞の内部で活性薬剤（つまり、治療剤または標識）の放出をもたらすことが公知である（例えばＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照されたい）。最も典型的なものは、ＧＣＣ発現細胞に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーである。例えば、癌性組織において高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼのカテプシンＢによって切断可能なペプチジルリンカーを使用することができる（例えばＰｈｅ−ＬｅｕリンカーまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー（配列番号３１９））。そのようなリンカーの他の例は、例えば、その全体がすべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２１４，３４５号において記載されている。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーを有するドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照されたい）。薬剤（つまり、治療剤または標識）の細胞内のタンパク分解性の放出を使用するという１つの利点は、その薬剤が、結合体化させた場合、典型的に弱毒化され、その結合体の血清安定性が典型的に高いということである。
【０１６８】
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である、つまり、ある特定のｐＨ値で加水分解に感受性である。典型的に、ｐＨ感受性のリンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸不安定なリンカー（例えばヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シスアコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる。（例えば米国特許第５，１２２，３６８号、同第５，８２４，８０５号、同第５，６２２，９２９号、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３、Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照されたい）。そのようなリンカーは、血液中におけるものなどの中性のｐＨ条件下で比較的安定しているが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０より下では不安定となる。ある実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカーである（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に付加されるチオエーテルなど（例えば米国特許第５，６２２，９２９号を参照されたい）。
【０１６９】
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えばジスルフィドリンカー）。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオアセタート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成することができるものを含む、様々なジスルフィドリンカーは、当技術分野において公知である（例えばＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７を参照されたい。米国特許第４，８８０，９３５号もまた参照されたい）。
【０１７０】
さらに他の特定の実施形態では、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、または３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０１７１】
さらに他の実施形態では、リンカー単位は、切断可能ではなく、薬剤（つまり、治療剤または標識）は、抗体分解によって放出される。（例えば、その全体がすべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号を参照されたい）。
【０１７２】
典型的に、リンカーは、細胞外環境に実質的に感受性ではない。本明細書において使用されるように、リンカーの文脈における「細胞外環境に実質的に感受性ではない」は、免疫結合体が細胞外環境に（例えば血漿中に）存在する場合に、その免疫結合体の試料中のリンカーの約２０％以下、典型的には約１５％以下、より典型的には約１０％以下、そしてさらに典型的には約５％以下、約３％以下、または約１％以下しか切断されないことを意味する。リンカーが細胞外環境に実質的に感受性ではないかどうかは、例えば、所定の期間（例えば２、４、８、１６、または２４時間）、免疫結合体を血漿とインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離薬剤の量を定量化することによって判定することができる。
【０１７３】
他の相互に排他的でない実施形態では、リンカーは、細胞の内部移行を促進する。ある実施形態では、リンカーは、治療剤または標識（Ｚ）と結合体化させた場合、細胞の内部移行を促進する。さらに他の実施形態では、リンカーは、Ｚ部分および抗ＧＣＣ抗体分子の両方と結合体化させた場合、細胞の内部移行を促進する。
【０１７４】
本発明の組成物および方法と共に使用することができる、様々な例示的なリンカーは、国際公開第ＷＯ２００４−０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号、および米国特許出願公開第２００６００２４３１７号において記載されている（これらの各々は、その全体がすべての目的のために参照によって本明細書において組み込まれる）。
【０１７５】
治療剤または標識に抗体分子を結合するのに使用することができるリンカーの例は、例えばマレイミドカプロイル（ｍｃ）；マレイミドカプロイル−ｐ−アミノベンジルカルバメート；マレイミドカプロイル−ペプチド−アミノベンジルカルバメートリンカー、例えばマレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リシン−ｐ−アミノベンジルカルバメートおよびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエートまたはＳＰＰとしても公知である）；４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−２−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）；Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）；２−イミノチオラン；Ｓ−アセチルコハク酸無水物；ジスルフィドベンジルカルバメート；カルボネート；ヒドラゾンリンカー；Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル；Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＭＡＳ）；Ｎ−［ベータ−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］（ＬＣ−ＳＭＣＣ）；スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）；Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド（ＳＰＤＰ）；［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）；Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）；４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート）（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）；スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）；エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＥＧＳ）；酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）；およびチオ尿素リンカーを含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、治療剤は、細胞増殖抑制剤または細胞傷害剤である。例として、限定されないが、代謝拮抗薬（例えばアザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、メトトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン、ペメトレキセド）；アルキル化剤（例えばシクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、チオテパ／クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、ジブロモマンニトール、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、トリプラチンテトラニトレート、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド）；アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン）；抗生物質（例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ストレプトゾトシン、グラミシジンＤ、マイトマイシン類（例えばマイトマイシンＣ）、デュオカルマイシン類（例えばＣＣ−１０６５）、カリケアマイシン類）；有糸分裂阻害剤（メイタンシノイド類、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）類、ドラスタチン類、クリプトフィシン類、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビンを含む）、タキサン類（例えばパクリタキセル、ドセタキセル、または新規なタキサン（例えば、２００１年５月３１日に公開された国際特許出願公開第ＷＯ０１／３８３１８号を参照されたい）、およびコルヒチン類；トポイソメラーゼ阻害剤（例えばイリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ミザントロン）；およびプロテアソーム阻害剤（例えばペプチジルボロン酸）を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、治療剤は、メイタンシノイドである。メイタンシノイド化合物および抗体へのそれらの結合体化のための方法は、例えば、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２：１２７−１３１（１９９２）；Ｗｉｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：４３９２−４４０８（２００６）；ならびに米国特許第５，２０８，０２０号および同第６，３３３，４１０号において記載されている。メイタンシノイドの例は、修飾芳香環を有するメイタンシン類似体（例えばＣ−１９−デクロロ、Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ）および他の位置に修飾を有するもの（例えばＣ−９−ＣＨ、Ｃ−１４−アルコキシメチル、Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ、Ｃ−１５−メトキシ、Ｃ−１８−Ｎ−デメチル、４，５−デオキシ）を含む。ある実施形態では、メイタンシノイドは、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ３）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）である。
【０１７８】
スルフヒドリル基を含むメイタンシノイド化合物は、チオエーテルまたはジスルフィド結合によってメイタンシノイド化合物につながれるヘテロ二官能性リンカーを使用して、抗体に結合することができる。一部のそのような実施形態では、リンカーは、抗体上のアミノ基（例えば末端アミノ基またはリシン残基のイプシロンアミノ基）に結合される。一部の実施形態では、メイタンシノイド化合物を抗体に結合するために使用されるヘテロ二官能性リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート、もしくはＳＰＰとしても公知）、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−２−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）、２−イミノチオラン、またはＳ−アセチルコハク酸無水物である。
【０１７９】
いくつかの他の実施形態では、治療剤は、ドラスタチンである。一部の実施形態では、治療剤は、オーリスタチンＥ（ドラスチン−１０の誘導体としてもまた当技術分野において公知）などのオーリスタチンまたはその誘導体である。オーリスタチン化合物および抗体へのそれらの結合体形成のための方法は、例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２１：７７８−７８４（２００３）、Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０：７０６３−７０７０（２００４）、Ｃａｒｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．，１４  １５４−１６９（２００８）、米国特許第７，４９８，２９８号、同第７，０９１，１８６号、同第６，８８４，８６９号；同第６，３２３，３１５号；同第６，２３９，１０４号；同第６，０３４，０６５号；同第５，７８０，５８８号；同第５，６６５，８６０号；同第５，６６３，１４９号；同第５，６３５，４８３号；同第５，５９９，９０２号；同第５，５５４，７２５号；同第５，５３０，０９７号；同第５，５２１，２８４号；同第５，５０４，１９１号；同第５，４１０，０２４号；同第５，１３８，０３６号；同第５，０７６，９７３号；同第４，９８６，９８８号；同第４，９７８，７４４号；同第４，８７９，２７８号；同第４，８１６，４４４号；および同第４，４８６，４１４号；米国特許出願公開第２００９００１０９４５号、同第２００６００７４００８号、同第２００８０３００１９２号、同第２００５０００９７５１号、同第２００５０２３８６４９号、および同第２００３００８３２３６号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ０４／０１０９５７号および国際公開第ＷＯ０２／０８８１７２号において記載されており、これらの各々は、その全体がすべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
オーリスタチンは、例えばオーリスタチンＥおよびケト酸の間で形成されるエステルであり得る。例えば、オーリスタチンＥは、それぞれ、ＡＥＢおよびＡＥＶＢを産生するためにパラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させることができる。他の典型的なオーリスタチンは、オーリスタチンフェニルアラニンフェニレンジアミン（ＡＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、治療剤は、放射性核種である。放射線療法において毒素として有用な放射性核種の実施例は、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂおよび２１２Ｂを含む。当業者によって使用されている他の放射性核種は、３２Ｐおよび３３Ｐ、７１Ｇｅ、７７Ａｓ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、１９１Ｏｓ、１９３ＭＰｔ、１９７Ｈｇ、すべてのベータマイナス、ならびに／またはオージェ放射体を含む。いくつかの好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、および２１２Ｐｂ／２１２Ｂｉを含む。
【０１８２】
当業者は、公知の技法を使用して、抗ＧＣＣ抗体分子を放射性核種に結合体化させてもよい。例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍａｇｅｒｓｔａｄｔ，Ｍ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，、およびＢａｒｃｈｅｌ，Ｓ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ｈ．，（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．は、様々な治療用および診断用放射性核種の、抗体のアミノ酸への結合体化を教示する。そのような反応は、適切なキレート剤および／またはリンカーを用いて、放射性核種を本発明の抗ＧＣＣ抗体分子に結合体化させるために適用されてもよい。
抗ＧＣＣ抗体配列
【０１８３】
実施例においてより詳細に考察されるように、ウサギモノクローナル抗ＧＣＣ抗体は、いくつかの方法によって生成された。簡潔に述べれば、ウサギモノクローナル抗体ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４は、ウサギにおける従来の免疫化技術によって生成された。本物のウサギ−ウサギハイブリドーマは、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ所有の融合パートナー細胞系を用いて、免疫化されたウサギからの単離Ｂ細胞を融合することで、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で生成された（米国特許第７，４０２，４０９号、同第７，４２９，４８７号、同第７，４６２，６９７号、同第７，５７５，８９６号、同第７，７３２，１６８号、および同第８，０６２，８６７号を参照されたい）。ＧＣＣに対する抗体の特異性は、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー（ＦＣＭ）によって試験された。
【０１８４】
以下の表１は、ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）／ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲ−ｍｕｔＩＩ免疫原を使用して生成された本発明のウサギモノクローナル抗ＧＣＣ抗体を要約する。
【０１８５】
軽鎖および重鎖可変領域の配列を判定した。以下の表２は、いくつかの抗体の可変領域についての配列番号の要約である。ウサギ抗ＧＣＣ抗体に対する重鎖および軽鎖の各々の可変領域についてのアミノ酸および核酸配列は、それぞれ表３および４に示される。
【０１８６】
抗ＧＣＣ抗体に対する重鎖および軽鎖のＣＲＤの各々についてのアミノ酸および核酸配列は、それぞれ表５および６に示される。
【０１８７】
ＣＤＲの配列決定は、毒素結合体化部位として働く可能性のある残基の存在量の判定を可能にした。例えば、抗原結合領域にある不対遊離システインは、オーリスタチン結合体化のための部位となり得、かつリシンは、メイタンシン結合体化のための部位となり得る。ＣＤＲのアミノ酸への毒素結合体化は、ＧＣＣへの抗体の結合親和性を改変することへの懸念を引き起こす可能性がある。したがって、実施形態では、ＣＤＲは、治療剤に結合体化され得るアミノ酸を欠く。
【０１８８】
【表１】
0006517267.tif 000012
【０１８９】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｈ２  核酸（配列番号４）
ＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＣＣＣＴＣＡＧＴＡＧＴＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＣＡＡＴＣＡＴＴＡＣＴＣＡＴＡＡＴＡＧＴＡＴＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＧＴＣＣＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＧＣＧＣＣＣＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＧＧＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ
【０１９０】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｈ２  アミノ酸（配列番号４２）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＶＫＥＳＧＧＧＬＦＫＰＴＤＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＨＲＭＮＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＩＡＩＩＴＨＮＳＩＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＳＴＩＴＲＮＴＳＥＮＴＶＴＬＫＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＥＤＳＭＧＹＹＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＩＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ
【０１９１】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｌ５  核酸（配列番号５）
ＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＴＡＡＣＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＴＡＴＡＣＴＡＡＴＡＡＴＣＡＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＡＧＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＡＧ
【０１９２】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｌ５  アミノ酸（配列番号４３）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＹＤＭＴＱＴＰＡＳＶＥＶＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＳＮＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＰＬＩＹＲＡＳＴＬＡＳＧＶＳＳＲＦＲＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＱＴＹＴＮＮＨＬＤＮＧＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＲＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１９３】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｈ２  核酸（配列番号６）
ＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＣＡＡＴＡＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＡＴＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＡＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＡＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＴＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＴＣＣＧＴＣＣＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＧＣＧＣＣＣＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＡＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＧＧＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＧＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ
【０１９４】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｈ２  アミノ酸（配列番号４４）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＡＳＧＳＤＩＳＮＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＩＧＹＩＳＹＧＫＳＩＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＡＩＳＫＴＳＳＴＴＶＤＬＥＩＴＳＰＴＴＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＥＤＳＡＴＹＳＰＮＬＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＱＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧＫ
【０１９５】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｌ４  核酸（配列番号７）
ＡＴＧＧＡＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧＣＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＣＴＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＧＡＡＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＡＧＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＡＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＧＴＴＡＧ
【０１９６】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｌ４  アミノ酸（配列番号４５）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＡＹＤＭＴＱＴＰＡＳＶＥＶＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＮＴＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＶＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＱＧＹＳＹＮＮＬＤＲＡＦＧＧＧＴＥＶＶＶＴＧＤＰＶＡＰＴＶＬＩＦＰＰＡＡＤＱＶＡＴＧＴＶＴＩＶＣＶＡＮＫＹＦＰＤＶＴＶＴＷＥＶＤＧＴＴＱＴＴＧＩＥＮＳＫＴＰＱＮＳＡＤＣＴＹＮＬＳＳＴＬＴＬＴＳＴＱＹＮＳＨＫＥＹＴＣＫＶＴＱＧＴＴＳＶＶＱＳＦＮＲＧＤＣ
【０１９７】
【表２】
0006517267.tif 000013
【０１９８】
【表３】
0006517267.tif 000014
【０１９９】
【表４】
0006517267.tif 000015
【０２００】
【表５】
0006517267.tif 000016
【０２０１】
【表６−１】
0006517267.tif 000017
【表６−２】
0006517267.tif 000018
治療用の使用
【０２０２】
本明細書に記載のウサギモノクローナル抗ＧＣＣ抗体分子は、インビトロおよびインビボの有用性を有する。例えば、これらの抗体分子は、様々な障害を治療する、および／または予防するために、培養中の細胞に、例えばインビトロもしくはエクスビボで投与することができるか、または対象に、例えばインビボで投与することができる。本発明の治療用の適用のある実施形態では、本発明のウサギモノクローナル抗ＧＣＣ抗体分子は、本明細書の上に記載の１つ以上の技法を使用して、ヒト化される。
【０２０３】
本明細書に記載の抗体分子、免疫結合体、および融合タンパク質は、ＧＣＣタンパク質の活性または機能、例えば、リガンド結合性（例えば、ＳＴまたはグアニリンの結合性）、ＧＣＣに媒介されるシグナル伝達、腸液の維持、電解質の恒常性、細胞内のカルシウムの放出（カルシウム流）、細胞分化、細胞増殖、または細胞活性化などを調節するために使用され得る。
【０２０４】
一態様では、本発明は、ＧＣＣ発現細胞を死滅させる、その成長を阻害もしくは調節する、またはその代謝に干渉する方法を特徴とする。一実施形態では、本発明は、ＧＣＣに媒介される細胞シグナル伝達を阻害する方法または細胞を死滅させる方法を提供する。本方法は、癌性細胞などのＧＣＣを発現する任意の細胞または組織と一緒に使用することができる。ＧＣＣを発現する癌性細胞の例は、胃腸起源の癌（例えば結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、または食道癌）、膵臓癌、肺癌（例えば扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腺癌）、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫などの軟部組織肉腫、胃腸もしくは気管支肺神経内分泌腫瘍、もしくは神経外胚葉性腫瘍、または任意のそれらの転移性病変を含むがこれらに限定されない。ＧＣＣを発現する細胞の非限定的な例としては、Ｔ８４ヒト結腸腺癌細胞、新鮮なまたは凍結された結腸腫瘍細胞、およびＧＣＣまたはその一部分をコードする組換え核酸を含む細胞が挙げられる。
【０２０５】
本発明の方法は、有効量、すなわち、ＧＣＣに媒介される細胞シグナル伝達を阻害するのに十分な量または細胞を死滅させるのに十分な量の本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体と細胞を接触させるステップを含む。この方法は、培養中の細胞に対して、例えば、インビトロ、インビボ、エクスビボ、またはインサイツで使用することができる。例えば、ＧＣＣを発現する細胞（例えば、腫瘍または転移性の病変の生検によって採取された細胞；樹立癌細胞系由来の細胞；または組換え細胞）をインビトロにおいて培地中で培養することができ、培地に抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体を加えることによって接触させるステップに影響を及ぼすことができる。細胞を死滅させる方法において、方法は、裸の抗ＧＣＣ抗体分子、または、抗ＧＣＣ抗体分子および細胞傷害性薬を含む免疫結合体を使用するステップを含む。この方法により、特にＧＣＣ発現腫瘍細胞（例えば、結腸腫瘍細胞）を含めた、ＧＣＣ発現細胞を死滅させる。
【０２０６】
本発明のウサギモノクローナル抗体またはそのヒト化型は、当業者に公知の免疫蛍光顕微鏡検査技法を使用して、ＧＣＣに結合した後に、細胞内部移行を検査することができる。内部移行することが確認されるそのような抗体は、治療的な目的のための細胞傷害性部分または細胞を画像処理するための部分に連結させる場合に有用だと思われる。内部移行しない抗体は、抗体依存性細胞により媒介される細胞傷害性反応を引き出すように設計された裸の抗体を使用する診断的な目的のため、もしくは治療方法のために、または、おそらくリポソーム送達法に使用することができる。
【０２０７】
本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、抗原発現細胞において、ＧＣＣの細胞外ドメインまたはその部分に結合する。結果として、癌性細胞を死滅させるため、抑制するため、または検出するために本発明の方法を実施した場合、抗体または抗原結合性断片は、固定された細胞、または細胞内の抗原性ドメインがその他の方法で細胞外の環境に曝露される細胞だけではなく、そのような細胞の全てに結合する。その結果、抗体または抗原結合性断片の結合は、これらの細胞が固定されているかまたは固定されていないか、生存可能であるかまたは壊死性であるかに関係なく、ＧＣＣ発現細胞が存在する領域に集中する。加えて、またはあるいは、抗ＧＣＣ抗体分子は、抗原発現細胞に結合する際、ＧＣＣに結合し、内部移行する。
【０２０８】
本方法は、対象内に存在する細胞に対して、インビボプロトコルの一部として実施することもできる。一実施形態では、対象はヒト対象である。あるいは、対象は、本明細書に開示されている抗ＧＣＣ抗体分子と交差反応するＧＣＣ抗原を発現している哺乳動物であってよい。抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体は、ヒト対象に治療目的で投与することができる。抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体は、抗体と交差反応するＧＣＣ様抗原を発現している非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）にも、獣医科用に、またはヒト疾患の動物モデルとして投与することができる。動物モデルは、本発明の抗体の治療効果を評価する（例えば、投与の用量および時間経過を試験する）のに有用であり得る。インビボの実施形態では、接触させるステップは、対象において作用し、抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体を、細胞で発現されたＧＣＣの細胞外ドメインに抗体分子が結合すること、および細胞を処理することの両方を可能にするために有効な条件下で、対象に投与することを含む。
【０２０９】
一実施形態では、本発明は、抗ＧＣＣ抗体分子、または抗ＧＣＣ抗体分子および細胞傷害性薬を含む免疫結合体を、そのような処置を必要とする患者に投与することによって癌を治療する方法を提供する。この方法は、ＧＣＣ抗原を発現する少なくともいくつかの細胞を含む任意の癌性障害を治療するために使用することができる。本明細書で使用される場合、用語「癌」は、その組織病理学的な種類または侵襲性の段階に関係なく、全種類の癌性成長または発癌性工程、転移性組織または悪性に形質転換した細胞、組織または器官を含むことが意図される。用語「癌」および「腫瘍」は、互換的に使用することができる（例えば、治療方法と関連して使用する場合、「癌を治療すること」および「腫瘍を治療すること」は、同じ意味を有する）。
【０２１０】
実施形態において、処置は、対象の腫瘍の成長を低下させる、もしくは阻害する、転移性の病変の数もしくはサイズを低下させる、腫瘍の負荷を低下させる、原発腫瘍の負荷を低下させる、侵襲性を低下させる、生存時間を延長する、または生活の質を維持もしくは改善するのに十分である。
【０２１１】
癌性障害の例としては、これらに限定されないが、固形腫瘍、軟組織腫瘍、および転移性の病変が挙げられる。固形腫瘍の例としては、結腸に影響を及ぼす腫瘍などの、種々の器官系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌、および癌腫が挙げられる。腺癌としては、肺の非小細胞癌などの悪性腫瘍が挙げられる。上述の癌の転移性の病変もまた、本発明の方法および組成物を使用して治療または予防することができる。
【０２１２】
一部の実施形態では、治療されるＧＣＣを発現する癌は、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、または食道癌などの、胃腸系由来の原発性または転移性の癌である。一部の実施形態では、治療されるＧＣＣを発現する癌は、原発性または転移性の膵臓癌である。一部の実施形態では、治療されるＧＣＣを発現する癌は、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、または腺癌などの、原発性または転移性の肺癌である。一部の実施形態では、治療されるＧＣＣを発現する癌は、平滑筋肉腫または横紋筋肉腫などの肉腫である。一部の実施形態では、治療れるＧＣＣを発現する癌は、クロム親和性細胞腫または傍神経節腫などの、原発性または転移した神経外胚葉性腫瘍である。一部の実施形態では、治療されるＧＣＣを発現する癌は、原発性または転移した気管支肺または胃腸系の神経内分泌腫瘍である。
【０２１３】
本方法は、任意の病期または細分類の関連性のある障害を治療することにおいて有用であり得る。例えば、方法は、早期または後期の結腸癌、または、第０期、第Ｉ期、第ＩＩＡ期、第ＩＩＢ期、第ＩＩＩＡ期、第ＩＩＩＢ期、第ＩＩＩＣ期、および第ＩＶ期のいずれの結腸癌をも処置するために使用することができる。
【０２１４】
一部の実施形態では、ＧＣＣを発現する癌（例えば、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、神経内分泌腫瘍、神経外胚葉性腫瘍など）を治療するための方法は、そのような治療を必要とする患者に、本明細書に記載の裸の抗ＧＣＣ抗体分子を投与することを含む。他の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子、および、メイタンサノイドならびにオーリスタチン、またはその誘導体などの細胞傷害性薬を含む免疫結合体を投与することを含む。抗体分子および免疫結合体を投与する方法は、上記されている。使用する分子の好適な用量は、対象の年齢および体重ならびに使用する特定の化合物に依存する。
【０２１５】
一部の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体は、治療周期で投与する。「治療周期」は、上記のように抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体を投与する治療期間と、その後の抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体を投与しない休止期間とからなる。治療周期は、所望の効果を実現するために必要に応じて繰り返すことができる。
【０２１６】
本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体（例えば、裸の抗ＧＣＣ抗体分子または抗ＧＣＣ抗体分子および治療剤を含む免疫結合体）は、他の療法と組み合わせて使用することができる。例えば、併用療法は、１種以上の追加的な治療剤、例えば、１種以上の抗癌剤、例えば、細胞傷害性薬または細胞増殖抑制剤、ホルモン治療、ワクチン、および／もしくは他の免疫療法と共に製剤化し、ならびに／または共投与する、本発明の組成物を含んでよい。他の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体は、外科手術、放射線照射、冷凍外科療法、および／または温熱療法を含めた他の治療的な処置様式と組み合わせて投与する。そのような併用療法は、投与される治療剤を低用量で有利に利用してもよく、したがって、種々の単独療法に伴う、可能性のある毒性または合併症を回避する。
【０２１７】
「組み合わせて」投与することは、本明細書で使用される場合、障害がある対象の苦痛の過程の間、２つの（またはそれ以上の）異なる治療を対象に送達すること、例えば、２つ以上の治療を、対象が障害に罹患していると診断された後、および障害が治癒する、または排除される前に送達することを意味する。一部の実施形態では、１種の治療の送達が、第２の送達が始まる際にまだ起こっている、したがって、重複している。このことは、時には、本明細書で「同時に起こる」または「同時発生的な送達」と言及される。他の実施形態では、１種の治療の送達は、他の治療の送達が始まる前に終わる。いずれかの事例の一部の実施形態では、治療は、組み合わせて投与したゆえに、より有効である。例えば、第２の処置は、より有効であり、例えば、第１の治療なしに第２の治療を投与した場合に見られると思われるよりも少ない第２の治療で、相当する効果が見られるか、または第２の治療により症状が大きく低下する、または同様の状況が第１の治療で見られる。一部の実施形態では、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメータの低下が、他の治療なしに１種の治療を送達すると観察される低下を超えるものである。２種の治療の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または相加的を超えるものであってよい。送達は、送達された第１の治療の効果が、第２の治療が送達されるときになお検出可能なようなものであってよい。
【０２１８】
一部の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体は、化学療法剤と組み合わせて使用する。ＤＮＡ損傷性化学療法剤の非限定的な例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびそれらの類似体または代謝産物、およびドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、およびダウノルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、およびシクロホスファミド）；ＤＮＡインターカレーター（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン）；ブレオマイシンなどのＤＮＡインターカレーターおよび遊離ラジカル生成剤；ならびにヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、およびヒドロキシウレア）が挙げられる。
【０２１９】
細胞の複製を撹乱する化学療法剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル、および関連する類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、および関連する類似体；サリドマイド、レナリドマイド、および関連する類似体（例えば、ＣＣ−５０１３およびＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブおよびゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤を含めたＮＦ−κＢ阻害剤；癌において過剰発現されているタンパク質に結合し、それによって細胞の複製を下方制御する抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ）；ならびに、癌において上方制御、過剰発現、または活性化され、それを阻害することによって細胞の複製が下方制御されることが公知である他のタンパク質または酵素の阻害剤が挙げられる。
【０２２０】
本発明の抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体と組み合わせる治療剤（複数可）または治療様式の選択は、治療される障害に依存する。追加的な作用物質（複数可）または治療様式は、例えば、治療されている適応症に対する標準の認可された療法を含んでよい。例えば、抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体を、結腸癌を治療するために使用する場合、それは、例えば、外科手術；放射線療法；５−フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｃｉｌ）（５−ＦＵ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔｉｂｉｎｅ）、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、またはそれらの組み合わせ（例えば、オキサリプラチン／カペシタビン（ＸＥＬＯＸ）、５−フルオロウラシル／ロイコボリン／−オキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）、５−フルオロウラシル／ロイコボリン／イリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）、ＦＯＬＦＯＸ＋ベバシズマブ、またはＦＯＬＦＩＲＩ＋ベバシズマブ）と組み合わせて使用することができる。
【０２２１】
別の態様では、本発明は、医薬品の製造における本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体の使用を特徴とする。一実施形態では、医薬品は、癌、例えば、胃腸癌を治療するためのものである。一部の実施形態では、医薬品は、表１〜６に要約されている特徴を有する抗ＧＣＣ抗体分子を含む。一部の実施形態では、医薬品は、ＭＩＬ−４４−１４８−２もしくはＭＩＬ−４４−６７−４抗体分子、またはそのヒト化型を含む。
抗体の標識化および検出
【０２２２】
本明細書に記載の方法、例えば、インビボ検出およびインビトロ検出、例えば、診断方法、病期分類方法、または画像診断方法において使用する抗ＧＣＣ抗体分子は、結合した、または結合していない結合剤の検出を容易にするために、検出可能な物質を使用して直接的に、または間接的に標識することができる。好適な検出可能な物質としては、種々の生物学的に活性な酵素、リガンド、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、化学発光物質、生物発光物質、発色団物質、高電子密度物質、常磁性の（例えば、核磁気共鳴活性な）物質、および放射性物質が挙げられる。一部の実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、放射性イオン、例えば、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、プラセオジム、もしくはリン（３２Ｐ）；または陽電子放出放射性核種、例えば、炭素１１（１１Ｃ）、カリウム４０（４０Ｋ）、窒素１３（１３Ｎ）、酸素１５（１５Ｏ）、フッ素１８（１８Ｆ）、ガリウム（６８Ｇａ）、およびヨウ素１２１（１２１Ｉ）に結合している。インビボまたはインビトロ診断／検出方法における使用のための、本発明の抗体に結合体化され得る追加的な放射性薬剤は、以下に記載される。
【０２２３】
例示的な標識としては、希土類キレートまたはフルオレセインなどのフルオロフォアおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオンが挙げられる。他の例示的な標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ（例えば、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼなど）と共役した、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカルなどが挙げられる。
【０２２４】
フルオロフォアおよび発色団で標識した抗体分子は、当技術分野において公知の標準部分から調製することができる。抗体および他のタンパク質は約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は、３１０ｎｍを上回る波長、好ましくは４００ｎｍを上回る波長において相当な吸収を有するように選択するべきである。種々の適切な蛍光化合物および発色団は、Ｓｔｒｙｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６（１９６８）およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８（１９７２）に記載されている。抗体は、蛍光発色団のグループを用いて、米国特許第３，９４０，４７５号、同第４，２８９，７４７号、および同第４，３７６，１１０号に開示されているものなどの従来の手順によって標識することができる。
【０２２５】
いくつもの上記の望ましい特性を有する蛍光剤の１つのグループはキサンテン色素であり、それらとしては、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール（ｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｈｙｄｒｏｌ）から誘導されるフルオレセイン、ならびに３，６−ジアミノ−９−フェニルキサントヒドロールから誘導されるローダミンおよびレサミン、ならびにリッサミンローダミンＢが挙げられる。９−ｏ−カルボキシフェニルキサントヒドロールのローダミン誘導体およびフルオレセイン誘導体は、９−ｏ−カルボキシフェニル基を有する。アミノ基およびイソチオシアネート基などの反応性カップリング基を有するフルオレセイン化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネートおよびフルオレスカミンなどが容易に入手可能である。蛍光化合物の別のグループは、α位またはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。
【０２２６】
標識した抗体分子は、例えば、（ｉ）アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準の技法によって所定の抗原を単離すること、（ｉｉ）所定の抗原（例えば、細胞溶解物中または細胞の上清中の）を、タンパク質の存在量および発現パターンを評価するために検出すること、（ｉｉｉ）臨床的試験手順の一部として、例えば、所与の治療レジメンの効力を決定するために、組織におけるタンパク質レベルをモニターすることを含めた、いくつもの状況において、診断上および／または実験的に使用することができる。
インビトロ診断
【０２２７】
本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体および免疫結合体は、ＧＣＣの存在もしくは非存在の検出するために、例えば、対象から採取されたエクスビボ生体試料においてＧＣＣの存在もしくは非存在を検出するために（つまりインビトロ検出）、または対象においてＧＣＣの存在、もしくは分布、もしくは非存在を検出するために（つまりインビボ検出）、使用され得る。そのような検出方法は、様々な障害を検出する、もしくは診断するために、または治療の決定を導くために有用である。本明細書で使用されるように、本明細書で使用される場合、用語「検出する」は、定量的または定性的検出を包含する。本明細書で使用される場合、ＧＣＣまたはＧＣＣタンパク質の検出は、完全なＧＣＣタンパク質の検出、または抗ＧＣＣ抗体分子が結合するエピトープを含むＧＣＣタンパク質の一部分の検出を意味する。
【０２２８】
したがって、別の態様では、本発明は、細胞または組織などの生体試料、例えば腫瘍細胞、またはＧＣＣを発現する１つ以上の細胞を有する腫瘍においてＧＣＣ発現を検出する方法を特徴とする。本方法は、抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を可能にする条件下で、生体試料を、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子（例えばＭＩＬ−４４−１４８−２またはＭＩＬ−４４−６７−４）に接触させること、および、それによってＧＣＣタンパク質の存在を検出するために、例えばＧＣＣを発現する細胞または腫瘍を検出するために、抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出することを含む。
【０２２９】
一実施形態では、抗ＧＣＣ抗体分子は、検出可能な標識を含む免疫結合体である。検出可能な標識は、放射性薬剤であり得る。あるいは、検出可能な標識は、非放射性薬剤である（例えば上記のフルオロフォアまたは発色団）。
【０２３０】
ある実施形態では、生体試料は、ＧＣＣを発現する正常および／または癌性の細胞もしくは組織を含む。ＧＣＣを発現する正常な細胞または組織の例は、細胞もしくは組織、または胃腸起源の、特に正常な結腸直腸の細胞もしくは組織が挙げられるがこれらに限定されない。ＧＣＣを発現する癌性細胞または組織の例は、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、および食道癌などの胃腸起源の癌；膵臓癌；扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、および腺癌などの肺癌；平滑筋肉腫および横紋筋肉腫などの軟部組織肉腫；胃腸系および気管支肺神経内分泌腫瘍；ならびに神経外胚葉性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、正常および／または癌性の細胞組織は、他の組織、例えばＢ細胞および／またはＢ細胞関連組織と比較して、より高いレベルでＧＣＣを発現してもよい。
【０２３１】
インビトロであろうと、またはインビボであろうと、本明細書に記載の検出方法は、対象における障害を評価するために使用され得る。ある実施形態では、障害は、癌または腫瘍、例えば結腸直腸癌、胃癌、または膵臓癌のような細胞増殖性障害である。
【０２３２】
一実施形態では、本発明は、インビトロで生体試料における（例えば、例えば、対象から採取した細胞または組織生検における）ＧＣＣタンパク質の存在または不在を検出するための方法を提供する。本方法は、（ｉ）対象から採取された生体試料を、抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体に接触させることと、（ｉｉ）抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出することと、を含む。複合体形成は生体試料におけるＧＣＣタンパク質の存在またはレベルを示し、一方で、複合体形成がないことは生体試料におけるＧＣＣタンパク質の非存在を示す。
【０２３３】
本明細書に記載の方法のための例示的な生体試料は、細胞、複数の細胞、組織、または、炎症性滲出液、血液、血清、腸液、便試料などの体液を含む。特定の実施形態では、生体試料は、癌性細胞（複数可）または組織を含む。例えば、試料は、腫瘍生検、例えば結腸直腸腫瘍、胃腫瘍、食道腫瘍、小腸腫瘍、肺腫瘍、軟部組織肉腫、神経内分泌腫瘍、神経外胚葉性腫瘍の、または任意のその転移部位からの組織試料からの腫瘍生検であり得る。他の実施形態では、生体試料は、血液、またはその液体が癌細胞を含む別の液体であり得る。生体試料は、当技術分野における多くの方法のうちのいずれを使用して採取されてもよい。さらに、生体試料は、ホルムアルデヒドなどの固定液で処理され、かつパラフィンに包埋され、かつ使用のために分割され得る。あるいは、新鮮または凍結させた組織が用いられ得る。他の実施形態では、細針吸引が使用されてもよい。
【０２３４】
ある実施形態では、試験細胞または組織は、ＧＣＣ発現に関連する障害を有する疑いのある個人から採取される。ある実施形態では、試験細胞または組織は、腸上皮細胞の頂端表面以外の位置でのＧＣＣ発現（例えば、腸上皮細胞における細胞質ＧＣＣ発現）に関連する障害、または、膵臓、肺、軟部組織、もしくは神経内分泌もしくは神経外胚葉起源の組織などの、非腸細胞もしくは組織におけるＧＣＣ発現に関連する障害を有する疑いのある個人から採取される。ある実施形態では、試験細胞または組織は、ＧＣＣの発現増加に関連する障害を有する疑いのある個人から採取される。
【０２３５】
一実施形態では、対象からの試料における、または対象におけるＧＣＣのレベルは、基準レベル、例えば対照物質におけるＧＣＣのレベル、例えば対象の細胞と同じ組織起源の正常な細胞、またはそのような正常な細胞と比較可能なレベルにあるＧＣＣを有する細胞と、比較される。本方法は、例えば、診断、予後、治療の有効性の評価、または障害の病期分類を提供する、検出されたＧＣＣのレベルへの応答を含み得る。対照物質と比較したときの、試料または対象におけるＧＣＣのより高いレベルは、ＧＣＣの発現増加に関連する障害の存在を示唆する。対照物質と比較したときの、試料または対象におけるＧＣＣのより高いレベルはまた、治療の有効性の相対的欠如、相対的な予後不良、または疾患の後期を示唆し得る。ＧＣＣのレベルはまた、将来的な治療、例えばより積極的な、もしくはより積極的でない治療の必要性、または一方の治療異レジメンから他方へと切り替えることの必要性を評価または選択するために使用され得る。一部の実施形態では、本方法は、ＧＣＣ標的化療法、例えば、判定されるＧＣＣレベルに少なくとも一部分において基づく、本明細書に記載のＧＣＣ標的化療法、および必要に応じて、選択されるＧＣＣ標的化療法を対象に投与することをさらに含む。
【０２３６】
抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣとの間の複合体形成は、ＧＣＣ抗原に結合した抗体（もしくは抗体断片）または非結合抗体分子のいずれかを測定または可視化することによって検出され得る。当業者は、ＧＣＣへの抗ＧＣＣ抗体の結合を検出するための多数の方法を、容易に理解することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法、および免疫組織化学検査（ＩＨＣ）などの、当技術分野において公知の抗原結合アッセイを含むがこれらに限定されない。
【０２３７】
特定の実施形態では、ＧＣＣは、本発明の抗ＧＣＣ抗体を使用する免疫組織化学によって検出または測定される。免疫組織化学技法は、ＧＣＣを発現する細胞を同定、および本質的に染色するために使用されてもよい。そのような「染色」は、転移性遊走の解析を可能にする。本明細書に記載されるものなどの抗ＧＣＣ抗体は固定細胞と接触させられ、かつ細胞内に存在するＧＣＣは抗体と反応する。抗体は、検出可能なように標識されるか、または細胞を染色するために、標識された第２の抗体またはプロテインＡを使用して検出される。特定の一実施形態では、ＭＩＬ−４４−１４８−２抗体は、生体試料においてＧＣＣ発現を検出または測定するために、ＩＨＣアッセイにおいて使用される。
【０２３８】
他の従来の検出アッセイ、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降アッセイ、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法、および免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が使用され得る。
【０２３９】
抗ＧＣＣ抗体分子を標識する代わりに、検出可能な物質で標識された標準物質および標識されていない抗ＧＣＣ抗体分子を利用する競合免疫測定法によって試料中のＧＣＣの存在をアッセイすることができる。このアッセイでは、生物学的試料、標識した標準物質およびＧＣＣ結合剤を組み合わせ、標識されていない抗体に結合した標識された標準物質の量を判定する。試料中のＧＣＣの量は、ＧＣＣ結合剤に結合した標識された標準物質の量に反比例する。
【０２４０】
構成成分（ＧＣＣまたは抗体分子）のいずれかをさらに操作または標識化することなく、例えば、蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照されたい）の技法を利用することによって、抗ＧＣＣ抗体分子複合体の形成に対してＧＣＣを直接検出することも可能である。第１の「供与体」分子上のフルオロフォア標識は、適切な波長の入射光で励起されると、その放出蛍光エネルギーが第２の「受容体」分子上の蛍光標識に吸収され、それが今度は吸収されたエネルギーによって蛍光を発することができるように選択する。あるいは、「供与体」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用することができる。標識は、異なる波長の光を放出するように選択し、したがって、「受容体」分子の標識は、「供与体」の標識と区別することができる。標識間のエネルギー転移の効率は分子を隔てている距離に関連するので、分子間の空間的な関連性を評価することができる。分子間で結合が起こる状況では、アッセイにおける「受容体」分子の標識の蛍光放出が最大になるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当技術分野で周知の標準的な蛍光定量的な検出手段（例えば、蛍光光度計を使用すること）によって好都合に測定することができる。
【０２４１】
別の例では、抗体分子の、ＧＣＣを認識する能力の決定は、アッセイの構成成分（ＧＣＣまたは抗体分子）のいずれをも標識化せずに、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）などの技術を利用することによって実現することができる（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、およびＳｚａｂｏ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５を参照されたい）。本明細書で使用される場合、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、生体特異的な相互作用を、リアルタイムで、相互作用体のいずれをも標識化せずに試験するための技術である（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））。結合表面における質量の変化（結合事象を示す）により、表面近くの光の屈折率が変化し（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）、その結果、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる検出可能なシグナルがもたらされる。
【０２４２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の抗体分子（例えば本明細書に記載の抗体分子を含む免疫結合体、および例えば標識）、ならびに生体試料、例えば本明細書に記載の生体試料を含む反応混合物を特徴とする。他の実施形態では、反応混合物は、本明細書に記載の抗体分子（例えば本明細書に記載の抗体分子を含む免疫結合体、および例えば標識）、ならびに生体試料、例えば本明細書に記載の生体試料から採取したＧＣＣを含むことができる。
【０２４３】
ある実施形態では、上記のものなどの方法は、細胞の表面上に、またはその表面上にＧＣＣを発現する細胞から採取された膜調製物中に発現するＧＣＣへの抗ＧＣＣ抗体の結合を検出することを含む。ある実施形態では、本方法は、ＧＣＣへの抗ＧＣＣ抗体の結合に許容的な条件下で細胞を抗ＧＣＣ抗体に接触させること、および複合体が抗ＧＣＣ抗体と細胞表面上のＧＣＣとの間に形成されるかどうかを検出することを含む。細胞の表面上に発現したＧＣＣへの抗ＧＣＣ抗体の結合を検出するための例示的なアッセイは、「ＦＡＣＳ」アッセイである。
インビボ診断
【０２４４】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＧＣＣを発現する細胞または組織の存在または非存在をインビボで検出するための方法を提供する。本方法は、（ｉ）対象（例えば、癌を有する患者）に、検出可能な標識またはマーカーに結合体化させた、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子（つまり、ＭＩＬ−４４−１４８−２もしくはＭＩＬ−４４−６７−４）またはその抗原結合断片、好ましくは、抗体もしくはその抗原結合断片を投与することと；（ｉｉ）対象を、ＧＣＣを発現する組織または細胞に対する前述の検出可能な標識またはマーカーを検出するための手段に曝露させることとを含む。そのようなインビボ方法は、癌などの障害を患う患者の評価、診断、病期分類、および／または予後のために使用され得る。本方法は、（ｉ）対象に、抗ＧＣＣ抗体分子またはその免疫結合体を投与することと；（ｉｉ）抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検出することとを含む。複合体形成は対象におけるＧＣＣの存在またはレベルを示し、一方で、複合体形成がないことは対象におけるＧＣＣの非存在を示す。
【０２４５】
そのような個人は、転移したＧＣＣを発現する癌を患っていると診断されてよく、かつ転移したＧＣＣを発現する癌細胞は、薬剤的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物、および活性部分が放射性薬剤である抗ＧＣＣ抗体分子と活性部分とを含む結合体化合物を、好ましくは静脈内投与によって個人に投与すること、ならびにＧＣＣを発現している細胞の存在を示す放射能の局部的な蓄積または凝集の存在を検出することによって、検出されてよい。本発明の一部の実施形態では、医薬組成物は、薬剤的に許容される担体または希釈剤、および活性部分が放射性薬剤であり、ならびに抗ＧＣＣ抗体分子が本明細書に記載のＭＩＬ−４４−１４８−２抗体、または断片もしくはその誘導体である抗ＧＣＣ抗体分子および活性部分を含む結合体化合物を含む。
【０２４６】
１つの特定の実施形態では、放射性核種は、インビボ画像診断の手順における造影剤としての使用のために、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子に結合体化されてもよい。造影剤は、転移した細胞の位置を同定するために使用される手順同様、有用な診断手順である。例えば、個人は、転移した結腸直腸癌を患っていると診断されてよく、かつ転移した結腸直腸癌細胞は、薬剤的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物、ならびに活性部分が放射性核種である、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子および活性部分を含む結合体化合物を、好ましくは静脈内投与によって個人に投与すること、ならびにＧＣＣを発現する細胞の存在を示す放射能の局部的な蓄積または凝集の存在を検出することによって、検出されてよい。
【０２４７】
画像診断は当業者に公知の多くの手順によって行われることができ、そのような手順において有用な適切な造影剤は、公知の手段によって、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子に結合体化されてよい。本発明による画像診断法に有用な標識の例は、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１８８Ｒｈ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ／８１ＭＫｒ、８７ＭＳｒ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１３Ｍ、Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、および２０６Ｂｉ、ならびに２１３Ｂｉなどの放射性標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性な標識、単一光子放出型コンピュータ断層撮影法（「ＳＰＥＣＴ」）検出器または陽電子放出断層撮影法（「ＰＥＴ」）スキャナーによって検出可能な、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウム（例えば６８Ｇａ、１８Ｆ）の陽電子放出同位元素、ルシフェリンなどの化学発光体、ならびにペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素マーカーである。短距離の放射線放射体、例えば、経直腸プローブなどの、短距離の検出プローブによって検出可能な同位元素なども用いることができる。画像診断もまた、例えば、ラジオシンチグラフィ、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴスキャン）によって行われ得る。ＣＴスキャンによる画像診断は、鉄キレートなどの重金属を用いてもよい。ＭＲＩスキャニングは、ガドリニウムまたはマンガンのキレートを用いてもよい。
【０２４８】
抗体は、そのような試薬を用いて、当技術分野で公知の技法を使用して標識することができる。例えば、各々参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍａｇｅｒｓｔａｄｔ，Ｍ．（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．、およびＢａｒｃｈｅｌ，Ｓ．Ｗ．ａｎｄ  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．Ｈ．，（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，は、様々な治療用および診断用放射性核種の、抗体のアミノ酸への結合体化を教示する。そのような反応は、適切なキレート剤および／またはリンカーをもって、放射性核種を本発明の抗ＧＣＣ抗体分子に結合体化させるために適用されてもよい。抗体を放射標識することに関する技法については、Ｗｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．も参照されたい。Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６（１９８６）も参照されたい。
【０２４９】
放射標識した抗体の場合では、患者に投与された抗体は、抗体が反応する腫瘍担持抗原に局在化し、それを、例えば、ガンマカメラを使用する放射性核種スキャンまたは放出断層撮影法またはコンピュータ断層撮影法などの公知の技法を使用してインビボで検出または「画像化」する。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ」，Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐｐ６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい。あるいは、放射性標識が陽電子（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ、６８Ｇａ）を放出する場合、例えばＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに設置されているＰｅｔ  ＶＩと称される陽電子放出横断断層撮影スキャナーを使用することができる。
【０２５０】
他の実施形態では、本発明は、対象、例えば、ヒト対象に、放射性同位元素と結合体化させた抗ＧＣＣ抗体分子を投与する場合に、異なる組織に曝露する用量、例えば、放射線量を判定するための方法を提供する。本方法は、（ｉ）本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子、例えば、放射性同位元素で標識した抗ＧＣＣ抗体分子を対象に投与することと；（ｉｉ）異なる組織、例えば、腫瘍、または血液に位置する放射性同位元素の量を、放射性同位元素の一部または全部が対象の体から排除されるまで、さまざまな時点で測定することと；（ｉｉｉ）解析された各組織が受けた放射線の総線量を算出することとを含む。測定値は、指定した時点、例えば、放射標識した抗ＧＣＣ抗体分子を対象に投与した（０日目）後、１日目、２日目、３日目、５日目、７日目、および１２日目に取得してよい。ある期間にわたって積分し、放射性同位元素の特異的活性を掛けた所与の組織内に存在する放射性同位元素の濃度を使用して、所与の組織が受ける線量を算出することができる。１種の放射性同位元素、例えば、ガンマ放射体、例えば１１１Ｉｎで標識した抗ＧＣＣ抗体分子を使用して生成した薬理学的な情報を使用して、同じ組織が、容易に測定することができない異なる放射性同位元素、例えば、ベータ放射体、例えば９０Ｙから受けると思われる予測線量を算出することができる。
ＧＣＣ標的化療法のためのコンパニオン診断
【０２５１】
本明細書に記載のインビトロおよびインビボ診断方法は、患者の細胞もしくは組織の表面上もしくはその内のＧＣＣ発現の存在または非存在それぞれに基づいて、患者が、癌などの増殖性疾患、または炎症性腸症候群、クローン病もしくは便秘などの胃腸障害を患っているかどうか、またはＧＣＣ標的化療法をもって治療されるべきか否かを知らせるために有用である。細胞表面上または細胞内にＧＣＣを発現する１つ以上の細胞を有する患者は、ＧＣＣ標的化療法による治療の候補者である。
【０２５２】
ある態様では、本発明は、（ｉ）対象から採取された生体試料を、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子に接触させることと、（ｉｉ）複合体形成は生体試料におけるＧＣＣタンパク質の存在またはレベルを示し、一方で、複合体形成がないことは生体試料におけるＧＣＣタンパク質の非存在を示すことである、抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体の形成を検知し、それによって、ＧＣＣ標的化療法への患者の感受性を判定することとを含む、ＧＣＣを発現する疾患または障害を患っている疑いのある患者のＧＣＣ標的化療法への感受性を判定する方法を提供する。特定の実施形態では、生体試料における抗ＧＣＣ抗体分子とＧＣＣタンパク質との間の複合体形成は、本明細書に記載の抗体分子、例えば本明細書に記載のＭＩＬ−４４−１４８２抗体を使用する免疫組織化学を介して検出される。
【０２５３】
例示的な生体試料は、細胞、複数の細胞、組織、または、炎症性滲出液、血液、血清、腸液、便試料などの体液を含むことができる。特定の実施形態では、生体試料は、癌細胞（複数可）または組織を含む。例えば、試料は、腫瘍生検、例えば結腸直腸腫瘍、胃腫瘍、食道腫瘍、小腸腫瘍、肺腫瘍、軟部組織肉腫、神経内分泌腫瘍、神経外胚葉性腫瘍の、または任意のそれらの転移部位からの組織試料からの生検であり得る。他の実施形態では、生体試料は、血液、またはその液体が癌細胞を含む別の液体であり得る。生体試料は、当技術分野における多くの方法のうちのいずれをも使用して採取され得る。さらに、生体試料は、ホルムアルデヒドなどの固定液で処理され、かつパラフィンに包埋され、かつ使用のために分割され得る。あるいは、新鮮なまたは凍結させた組織が用いられ得る。他の実施形態では、細針吸引が使用されてもよい。
【０２５４】
本明細書に記載のコンパニオン診断方法を使用して評価（例えば診断）および治療されてよい例示的な疾患／障害は、結腸直腸癌、胃癌、小腸癌、食道癌、膵臓癌、肺癌（例えば、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、腺癌）、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫などの軟部組織肉腫、胃腸系および気管支肺神経内分泌腫瘍、ならびに神経外胚葉性腫瘍を含むがこれらに限定されない増殖性障害、炎症性腸症候群、クローン病および便秘などの胃腸障害、ならびにパーキンソン病などの神経障害を含むがこれらに限定されない。
【０２５５】
本発明の方法は、患者をＧＣＣ標的化療法をもって治療するかどうかの判定において医師の決定を導く。本明細書で提供される方法はまた、個別の治療レポート、例えば本明細書に記載のＧＣＣ標的化療法をともなう、例えば個別の癌治療レポートの作成を可能にする。
【０２５６】
ＧＣＣ標的化療法は、ＧＣＣを発現する疾患またはＧＣＣ媒介性疾患、例えば本明細書に記載のＧＣＣを発現する疾患またはＧＣＣ媒介性疾患を治療または防止する治療剤である。本発明のある実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、治療剤などの薬剤に結合体化される抗ＧＣＣ抗体分子またはペプチドリガンド（例えばＳＴペプチド）などのＧＣＣ‐リガンドである。治療剤に結合体化された例示的なＧＣＣ‐リガンド（つまり免疫結合体）は、例えばその全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０１１０９３６号に記載される。特定の実施形態では、ＧＣＣ標的化治療剤は、細胞傷害性剤に結合体化される抗ＧＣＣヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、そのｍＡｂは、以下の表７（アミノ酸配列）および８（対応する核酸配列）に列挙される、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに３つ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに以下の表９（アミノ酸配列）および１０（対応する核酸配列）に列挙される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【０２５７】
【表７】
0006517267.tif 000019
【０２５８】
【表８】
0006517267.tif 000020
【０２５９】
【表９】
0006517267.tif 000021
【０２６０】
【表１０】
0006517267.tif 000022
【０２６１】
表７および８に示される、ＶＬ  ＣＤＲおよびＶＨ  ＣＤＲを含む、完全ｈＩｇＧ１重鎖およびｈカッパ軽鎖配列についての、アミノ酸および対応する核酸配列、ならびに表９および１０に示される可変重鎖および軽鎖領域は、以下に列挙される。
【０２６２】
ｈＩｇＧ１重鎖ヌクレオチド配列：
ＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＡＣＴＡＧＡＧ（配列番号８３）
【０２６３】
ｈＩｇＧ１重鎖タンパク質配列：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＦＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＲＧＮＴＮＤＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＡＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＲＧＹＴＹＧＮＦＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
（配列番号８４）
【０２６４】
カッパ軽鎖ヌクレオチド配列：
ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＴＣＴＡＧＡ（配列番号８５）
【０２６５】
ｈカッパ軽鎖タンパク質配列：
ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＲＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＧＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＫＴＷＰＲＴＦＧＱＧＴＮＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８６）
【０２６６】
本発明の一実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、オーリスタチン分子に結合体化される抗ＧＣＣ抗体分子を有する免疫結合体である。一実施形態では、免疫結合体は、オーリスタチン分子に結合体化される、配列番号６７、６８、および６９による３つの重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ、ならびに配列番号７０、７１、および７２による３つの軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ領域を含む、抗ＧＣＣ抗体分子を含む。別の実施形態では、免疫結合体は、オーリスタチン分子に結合体化される、配列番号７９による重鎖可変領域、および配列番号８０による軽鎖可変領域を含む、抗ＧＣＣ抗体分子を含む。さらに別の実施形態では、免疫結合体は、オーリスタチン分子に結合体化される、それぞれ配列番号７９および８０による重鎖および軽鎖可変領域を含む、抗ＧＣＣ抗体分子を含む。
【０２６７】
一部の実施形態では、オーリスタチン分子は、マレイミド部分、例えばマレイミドカプロイル部分を含むリンカーを手段として、抗ＧＣＣ抗体分子上でシステイン部分に連結される。
【０２６８】
一部の実施形態では、オーリスタチン分子は、オーリスタチン分子上のヒドロキシル基に接続されるヘテロ二官能性リンカーを使用して、抗ＧＣＣ抗体分子に結合される。一部のそのような実施形態では、リンカーはヒドラゾンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、マレイミドカプロイルヒドラジドとケトカルボン酸、例えば５−ベンゾイル吉草酸との反応によって形成されるヒドラゾン化合物である。特定の実施形態では、リンカーは、（Ｚ）−６−（２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル）ヒドラゾノ）−６−フェニルへキサン酸である。
【０２６９】
一部の他の実施形態では、オーリスタチン分子は、オーリスタチン分子上のモノメチルアミノ基に接続されるヘテロ二官能性リンカーを使用して、抗ＧＣＣ抗体分子に結合される。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能な部分、例えばペプチド部分、および自壊性ｐ−アミノベンジルカルバメートスペーサーを含む。例示的なリンカーとしては、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、マレイミドカプロイル−Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−リジン−ｐ−アミノベンジルカルバメート、およびマレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメート（ｖｃ）などが挙げられる。
【０２７０】
ある実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、式中、Ａｂが表７、８、９、または１０のいずれか１つに記載される特徴のような特徴を含む抗ＧＣＣ抗体分子であり、Ｓが抗体の硫黄原子であり、ｍが約１〜約１５の範囲にある式、Ａｂ−（ｖｃ−ＭＭＡＦ）ｍ（式（Ｉ−４））；Ａｂ−（ｖｃ−ＭＭＡＥ）ｍ（式（Ｉ−５））；Ａｂ−（ｍｃ−ＭＭＡＥ）ｍ（式（Ｉ−６））；またはＡｂ−（ｍｃ−ＭＭＡＦ）ｍ，（式（Ｉ−７））を特徴とする免疫結合体である。ある実施形態では、ｍは１〜約５の整数である。
【０２７１】
【化２】
0006517267.tif 000023
【０２７２】
【化３】
0006517267.tif 000024
【０２７３】
【化４】
0006517267.tif 000025
【０２７４】
【化５】
0006517267.tif 000026
【０２７５】
一部の実施形態では、式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、（Ｉ−６）、または（Ｉ−７）における変数ｍは、約２〜約１０、約６〜約８、約４〜約６、約３〜約５、または約１〜約３の範囲である。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、標的化ＧＣＣ療法は、式中Ａｂが、配列番号６７、６８、および６９による３つの重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ、ならびに配列番号７０、７１、および７２による３つの軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ領域を含む抗体分子であり、ｍが約３〜約５（例えば約４）である式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、（Ｉ−６）、または（Ｉ−７）の免疫結合体である。ある態様では、それぞれ配列番号６７、６８、および６９による重鎖ＣＤＲ、ならびにそれぞれ配列番号７０、７１、および７２による３つの軽鎖ＣＤＲを含むＡｂは、ヒトモノクローナル抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。
【０２７７】
他の特定の実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、式中Ａｂが、配列番号７９による重鎖可変領域、および配列番号８０による軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体分子であり、ｍが約３〜約５（例えば約４）である式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、（Ｉ−６）、または（Ｉ−７）の免疫結合体である。ある態様では、それぞれ配列番号７９および８０による重鎖および軽鎖可変領域を含むＡｂは、ヒトモノクローナル抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。
【０２７８】
さらに他のある実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、式中Ａｂが、配列番号８４による重鎖ＩｇＧ１配列、および配列番号８６によるカッパ軽鎖配列を含むヒトＩｇＧモノクローナル抗体分子であり、ｍが約３〜約５（例えば約４）である式（Ｉ−４）、（Ｉ−５）、（Ｉ−６）、または（Ｉ−７）の免疫結合体である。
【０２７９】
さらに別の実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、血管脳関門を通過することができるＧＣＣ−リガンド結合体である。例えば、ある態様では、本発明は、血管脳関門を通過することができる、Ｌ−ドーパなどの神経保護剤に結合体化するＧＣＣ−リガンドに関する。そのようなＧＣＣ−リガンド結合体の例は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる、公開されているＰＣＴ出願国際公開第ＷＯ２０１３／０１６６６２号に記載される。本発明の実施形態では、そのニューロンがＧＣＣを発現する、神経障害（例えばパーキンソン病）を患う、または有する疑いのある患者は、神経保護剤に結合体化されるＧＣＣ−リガンドでの治療に対するふさわしい候補者と見なされるであろう。
【０２８０】
本発明の一部の様態では、ＧＣＣ標的化療法はＧＣＣ拮抗剤である。一実施形態では、ＧＣＣ標的化療法は、ペプチド拮抗剤（例えばＳＴペプチド）またはＧＣＣの小分子阻害剤である。
【０２８１】
一部の態様では、ＧＣＣ標的化療法はＧＣＣ作動剤である。一実施形態では、ＧＣＣ作動剤はＳＴペプチドである。特定の実施形態では、ＧＣＣ作動剤はＳＴペプチドであり、ＳＴペプチドは、Ｃｙｓ１とＣｙｓ６との間、Ｃｙｓ２とＣｙｓ１０との間、およびＣｙｓ５とＣｙｓ１３との間の３つのジスルフィド結合がある、アミノ酸配列Ｈ−Ｃｙｓ１−Ｃｙｓ２−Ｇｌｕ３−Ｔｙｒ４−Ｃｙｓ５−Ｃｙｓ６−Ａｓｎ７−Ｐｒｏ８−Ａｌａ９−Ｃｙｓ１０−Ｔｈｒ１１−Ｇｌｙ１２−Ｃｙｓ１３−Ｔｙｒ１４−ＯＨ（配列番号８７）を含む。特定の実施形態では、ＧＣＣ作動剤は、リナクロチド（Ｉｒｏｎｗｏｏｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などの、ＧＣＣを結合するペプチド作動剤である。
【０２８２】
本発明のある実施形態では、腫瘍細胞がその表面上にＧＣＣを発現する患者は、本明細書に記載の免疫結合体などの毒素結合体化された抗ＧＣＣ抗体分子、またはその全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１０１１０９３６号に記載される通りの毒素結合体化された抗体での治療に対する、ふさわしい候補者と見なされるであろう。いかなる理論にも束縛されるものではないが、腫瘍細胞がその表面上に少量のＧＣＣを発現する患者は、これに対してそれほどふさわしい候補者ではない場合があり、またはＧＣＣ標的化療法を追加的な治療方法と組み合わせることにふさわしい候補者、もしくは裸の抗体療法にふさわしい候補者であるかもしれない。別の実施例では、ＧＣＣ標的化療法の用量は、腫瘍細胞の表面上に発現するＧＣＣ分子の数を反映するように調節され得る。例えば、腫瘍細胞表面上のＧＣＣ分子の数が多い患者は、腫瘍細胞表面上に発現するＧＣＣ分子の数が少ない患者よりも、低い用量のＧＣＣ標的化療法で治療されてもよい。インビボでＧＣＣを発現する腫瘍細胞の存在を検出することは、原発性ＧＣＣ発現腫瘍が転移していることへの組織の同定を可能にすることができる。どの組織が転移を有するかを知ることは、腫瘍療法の的を絞った適用をもたらし得る。
【０２８３】
上で考察されるように、本明細書に記載の抗体分子は、正常な組織と腫瘍性組織との比較におけるＧＣＣタンパク質の存在の査定を可能にし、それを通して、疾患の存在もしくは重症度、疾患の進行、および／または療法の有効性が査定され得る。例えば、療法は観察され、有効性の査定がされ得る。一実施形態では、ＧＣＣタンパク質は、増殖性疾患を有する対象から採取された第１の試料において検出および／または測定されることができ、そして療法が開始され得る。その後、第２の試料が対象から採取され得、試料におけるＧＣＣタンパク質が検出および／または測定され得る。第２の試料において検出または測定されたＧＣＣタンパク質の量の減少は、治療効果を示し得る。
【０２８４】
いかなる理論にも束縛されるものではないが、特にＧＣＣ標的化治療薬が静脈内投与される場合には、血管新生が、ＧＣＣ標的化治療薬がＧＣＣを発現する腫瘍に到達するために必要とされてよい。したがって、本発明の方法のある実施形態では、それはＧＣＣタンパク質の検出に加えて、またはそれと併せて、腫瘍血管系を評価または特徴化するのに有用であってよい。例えば、組織試料は、ＧＣＣ発現および組織血管新生を同時にまたは同時期に特徴化するために、抗ＣＤ−３１抗体または抗フォンヴィレブランド因子抗体分子などの血管内皮細胞、ならびに本発明の抗ＧＣＣ抗体を同定する薬剤で染色され得る。本発明のある態様では、そのようなＧＣＣ発現および血管系の同時または同時期の特徴化は、標的標的化治療薬に対する患者選択ツールとして有用である。
【０２８５】
別の態様では、ＧＣＣの細胞表面発現は、ＧＣＣ標的化治療薬がＧＣＣを発現する腫瘍細胞を殺すことに作用するために必要とされてよい。例えば、一部の腫瘍細胞は、ＧＣＣを発現し得るが、細胞表面上ではないことがある。治療薬が細胞表面ＧＣＣ発現に依存すると、ＧＣＣが主に細胞内にある場合、そのような治療薬は細胞を殺すことができないことがある。したがって、本発明の一部の実施形態では、診断用または予後用アッセイは、ＧＣＣの細胞位置の解析および／または定量化、例えば、細胞表面発現と細胞内発現とを区別および／または定量化できる方法をさらに含んでよい。いかなる理論にも束縛されるものではないが、腫瘍が主に細胞内ＧＣＣ発現を有する患者は、ＧＣＣの細胞外ドメインに結合する抗ＧＣＣ抗体分子に対するふさわしい候補者ではないことがある。あるいは、そのような解析結果は、ＧＣＣの細胞表面発現を誘導する薬剤をもって、初期治療を促進してよい（例えばＰＣＴ国際公開第ＷＯ０４／０７１４３６号を参照されたい）。ＧＣＣ細胞表面誘導に続き、またはそれと併せて、細胞外に発現したＧＣＣに到達、またはそれのみに結合する抗ＧＣＣ抗体分子が投与され得る。
キット
【０２８６】
また、本発明の範囲内で、キットは、本明細書に記載の抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体を含む。抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体を含むリポソーム組成物を含むキットがさらに含まれる。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば標識、治療剤、または抗体を標識もしくは治療剤にキレートする、もしくは結合させることに有用な薬剤、または放射線防護組成物；投与のために抗体を調製するための装置または他の物質；薬剤的に許容される担体；および対象への投与のための装置または他の物質を含む１つ以上の他の要素を含むことができる。説明書は、インビトロで、例えば試料、例えば癌を有する患者からの生検または細胞において、またはインビボでＧＣＣを検出するために、抗ＧＣＣ抗体分子または免疫結合体を診断的に適用するための説明を含むことができる。説明書は、例えば癌（例えば、結腸癌、胃癌、食道癌などの胃腸起源の癌など）を有する患者における、推奨される用量および／または投与方法を含む、治療薬の適用の手引きを含んでもよい。他の説明書は、抗体をキレート剤、標識、もしくは治療剤へ結合することについての説明、または、例えば未反応の結合体化構成要素からの、結合体化された抗体の精製のための説明を含んでもよい。上で考察されるように、キットは、標識、例えば本明細書に記載の任意の標識を含むことができる。上で考察されるように、キットは、治療剤、例えば本明細書に記載の治療剤を含むことができる。一部の適用では、抗体は、他の構成要素、例えばキレート剤もしくは標識、または治療剤、例えば放射性同位元素、例えばイットリウムもしくはルテチウムで反応されるであろう。そのような場合、キットは、反応、または出発物質もしくは反応中間体から最終生成品を分離することに使用される分離装置、例えばクロマトグラフィーカラムを実行するために、反応槽のうちの１つ以上を含むことができる。
【０２８７】
キットは、診断用もしくは治療用の薬剤、例えば本明細書に記載の診断用もしくは治療用の薬剤などの、少なくとも１つの追加的な試薬、および／または、１つ以上の別個の医薬品において必要に応じて製剤される、１つ以上の追加的な抗ＧＣＣ抗体分子もしくは免疫結合体をさらに含むことができる。
【０２８８】
キットは、放射線防護体をさらに含むことができる。同位元素ｓ、例えば９０イットリウム（９０Ｙ）の放射線分解性質は公知である。この放射線分解を克服するために、放射線防護体は、そのような放射線防護体が抗体に対して無害である、つまりそれらが例えば９０Ｙなどの同位元素の標識化反応を阻害しない、またはそれに悪影響を及ぼさない限り、例えば反応緩衝液内に含まれ得る。本発明の製剤緩衝液は、イットリウムまたは他の強い放射性核種による放射線分解を最小限にする、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはアスコルビン酸塩などの放射線防護体を含んでよい。他の放射線防護体は、当技術分野において公知であり、また本発明の製剤緩衝液、つまり遊離ラジカル捕捉剤（フェノール、亜硫酸塩、グルタチオン、システイン、ゲンチシン酸、ニコチン酸、パルミチン酸アスコルビル、ＨＯＰ（：Ｏ）Ｈ２Ｉグリセロール、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、Ｎａ２Ｓ２Ｏ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３、およびＳＯ２など）においても使用され得る。
【０２８９】
提供されるキットは、患者への投与のために、キレート剤結合体化タンパク質またはペプチドを治療用の放射性同位元素で放射性標識するために有用なものである。キットは、（ｉ）キレート剤結合体化抗体を含むバイアルと、（ｉｉ）放射性標識された抗体の安定化および患者への投与のための製剤緩衝液を含むバイアルと、（ｉｉｉ）放射性標識手順を行うための説明書とを含む。キットは、例えば説明書で推奨されるように、友好的な条件下で十分な時間、放射性同位元素またはその塩へとキレート剤結合体化抗体を暴露することを提供する。十分な純度、比活性度、および結合特異性を有する放射性標識された抗体が産生される。放射性標識された抗体は、例えば製剤緩衝液において適切な濃度に希釈され、さらなる精製の有無にかかわらず、患者に直接投与されてよい。キレート剤結合体化抗体は、凍結乾燥された形で供給されてもよい。
【０２９０】
次の例は例示的であるが、本発明を限定することは意図されない。
【実施例】
【０２９１】
実施例１：ヒトＧＣＣ細胞外ドメイン−マウスＦｃ（ｈＧＣＣ−ＥＣＤ−ｍＦｃ）融合タンパク質の生成
【０２９２】
免疫付与およびスクリーニングのための、分泌されるヒト（ｈ）グアニリルシクラーゼ（ＧＣＣ）（ｈＧＣＣ）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）／マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ２ａ重鎖定常（Ｆｃ）（受容体結合領域変異（ＦｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩ）融合タンパク質（つまり、ｐＬＫＴＯＫ１０８およびＭＩＬ−４４しても本明細書で参照される、ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＲｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩ融合タンパク質）の生成は、次のように行われた。ＧＣＣ抗原は、次のＧＣＣ配列（シグナル配列および細胞外ドメイン）を含む配列をｐＬＫＴＯＫ４発現ベクターへとコードするＧＣＣ遺伝子の一部分をサブクローニングすることによって調製された。
【０２９３】
ＭＫＴＬＬＬＤＬＡＬＷＳＬＬＦＱＰＧＷＬＳＦＳＳＱＶＳＱＮＣＨＮＧＳＹＥＩＳＶＬＭＭＧＮＳＡＦＡＥＰ  ＬＫＮＬＥＤＡＶＮＥＧＬＥＩＶＲＧＲＬＱＮＡＧＬＮＶＴＶＮＡＴＦＭＹＳＤＧＬＩＨＮＳＧＤＣＲＳＳＴＣ  ＥＧＬＤＬＬＲＫＩＳＮＡＱＲＭＧＣＶＬＩＧＰＳＣＴＹＳＴＦＱＭＹＬＤＴＥＬＳＹＰＭＩＳＡＧＳＦＧＬＳ  ＣＤＹＫＥＴＬＴＲＬＭＳＰＡＲＫＬＭＹＦＬＶＮＦＷＫＴＮＤＬＰＦＫＴＹＳＷＳＴＳＹＶＹＫＮＧＴＥＴＥ  ＤＣＦＷＹＬＮＡＬＥＡＳＶＳＹＦＳＨＥＬＧＦＫＶＶＬＲＱＤＫＥＦＱＤＩＬＭＤＨＮＲＫＳＮＶＩＩＭＣＧ  ＧＰＥＦＬＹＫＬＫＧＤＲＡＶＡＥＤＩＶＩＩＬＶＤＬＦＮＤＱＹＦＥＤＮＶＴＡＰＤＹＭＫＮＶＬＶＬＴＬＳ  ＰＧＮＳＬＬＮＳＳＦＳＲＮＬＳＰＴＫＲＤＦＡＬＡＹＬＮＧＩＬＬＦＧＨＭＬＫＩＦＬＥＮＧＥＮＩＴＴＰＫ  ＦＡＨＡＦＲＮＬＴＦＥＧＹＤＧＰＶＴＬＤＤＷＧＤＶＤＳＴＭＶＬＬＹＴＳＶＤＴＫＫＹＫＶＬＬＴＹＤＴＨ  ＶＮＫＴＹＰＶＤＭＳＰＴＦＴＷＫＮＳＫＬ（配列番号４６）
【０２９４】
位置４２７〜４３０のアミノ酸配列ＧＬｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（配列番号６６）が、細胞外ＧＣＣ断片を終始するために選択された。ＧＣＣにおいて、この配列に、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質を始動するために歴史的に使用されるＰｒｏと相同する位置にあるＰｒｏと、よく整列するＰｒｏが直後に続く。
【０２９５】
ｐＬＫＴＯＫ１０８のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域は、機能的にＣＨ１ドメイン［Ｐｒｏ−Ａｒｇ−バリン（Ｖａｌ）−Ｐｒｏ−イソロイシン（Ｉｌｅ）−トレオニン（Ｔｈｒ）−Ｇｌｕ−アスパラギン（Ａｓｎ）］（配列番号５８）の末端であるアミノ酸配列から開始するように設計された。２つの領域は、マウスＩｇＧ２ａ定常領域において変異した。ロイシン（Ｌｅｕ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５９）からＬｅｕ−アラニン（Ａｌａ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号６０）への変異（位置２３４〜２３７リシン［Ｌｙｓ］−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号６１）からＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（配列番号６２）に加えて、位置３１８〜３２２にある第２のＦｃ受容体領域もまた、次のように変異した：グルタミン酸（Ｇｌｕ）−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）−Ｌｙｓ−システイン（Ｃｙｓ）−Ｌｙｓ（配列番号６３）からＡｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号６４）、そしてその後、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号６５）。
【０２９６】
完全融合タンパク質が設計されたら、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩについての隣接制限酵素配列、ならびにコザック配列（ＣＴＣＡＣＣ）および終止コドンを加え、融合タンパク質ｃＤＮＡを完成した。ヌクレオチド、および融合タンパク質ｐＬＫＴＯＫ１０８（ｈＧＣＣ／ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲｍｕｔＩＩ）のアミノ酸配列は、以下に提供される（ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位は、配列番号４７において小文字で示される）。
【０２９７】
ヒトＧＣＣ−ＥＣＤ／マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃヌクレオチド配列（配列番号４７）
ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃｔｃａｃｃＡＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＡＣＴＧＣＣＧＧＡＧＴＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＡＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＣＡＡＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＴＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＣＣＡＣＧＡＡＣＴＣＧＧＣＴＴＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＡＴＴＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＧＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＣＡＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＧＧＧＧＧＡＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＴＣＴＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧＧＣＡＴＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＡＣＧＡＣＴＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＡＡｔｃｔａｇａｇｃａ
【０２９８】
ヒトＧＣＣ−ＥＣＤ／マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ  アミノ酸配列（配列番号４８）：
【化６−１】
0006517267.tif 000027
【化６−２】
0006517267.tif 000028
【０２９９】
上述の通り、組み換えタンパク質ｐＬＫＴＯＫ１０８は、２つの変異Ｆｃ受容体結合領域（ＦｃＲｓ）が変異し、Ｆｃ受容体結合を防止した（ｍＩｇＧ２ａ  ＦｃＲｍｕｔＩＩ）、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域に融合されたヒトＧＣＣの細胞外領域を組み合わせる。ｐＬＫＴＯＫ１０８のための組み換えＤＮＡ挿入は、次のように３ステップのＰＣＲ工程によって作製された。
【０３００】
第１のステップは、重複配列の３５個のヌクレオチドを含む適応した細胞外ヒトＧＣＣおよび適応したマウスＩｇＧ２ａ  ＦｃＲｍｕｔＩＩ  ＤＮＡ断片を作製した。これらのＰＣＲ反応は、２個の断片を作製するために、表１３に記載のプロトコルをもって、表１１および１２に記載の鋳型およびプライマーを使用した。これらのＤＮＡ断片は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して１％アガロースゲルから単離された。ヒトＧＣＣ鋳型は、ヒトＧＣＣについての配列を含む、タンパク質発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡによって提供された。Ｆｃドメインのための鋳型は、それ自体は鋳型としてベクターｐＬＫＴＯＫ６１（その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０５３，２０２号に記載される）を使用して作製された、ｐＬＫＴＯＫ８４として言及される、２つの変異Ｆｃ受容体結合領域（ＦｃＲｍｕｔＩＩ）をもってマウスＩｇＧ２ａＦｃに融合された、ヒト１２２８のための発現構築物から採取された。
【０３０１】
【表１１】
0006517267.tif 000029
【０３０２】
【表１２−１】
0006517267.tif 000030
【表１２−２】
0006517267.tif 000031
【０３０３】
【表１３】
0006517267.tif 000032
【０３０４】
第２のＰＣＲ反応は、表１４に列挙される濃度で鋳型を組み合わせた。表１５に列挙される反応プロトコルは、単一組み換え融合タンパク質遺伝子を作製した。この反応の産物は、第３のＰＣＲ反応において、鋳型として直接使用された。
【０３０５】
【表１４】
0006517267.tif 000033
【０３０６】
【表１５】
0006517267.tif 000034
【０３０７】
第３のＰＣＲ反応は、完全断片を作製するために、以下表１７に記載のプロトコルをもって、表１６および表１２に記載の鋳型およびプライマーを使用した。これらのＤＮＡ断片は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（別表Ｆ）およびチアミンアデノシン（ＴＡ）突出ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（別表Ｆ）を使用して、０．７％アガロースゲルから単離された。ＱｉａｇｅｎのＤＮＡミニプレップキット（別表Ｆ）を使用して、固有のクローンを単離し、ＤＮＡを精製した。このＤＮＡを、所望の配列を持つものを同定するために、プライマーＭ１３ｆ、Ｍ１３ｒ、およびｐＳＭＵＣＨ２を用いて配列決定した。中間体ＴＯＰＯクローンＴＯＫ１０８−１５は、所望の組み換えＤＮＡ配列を含んだ。
【０３０８】
【表１６】
0006517267.tif 000035
【０３０９】
【表１７】
0006517267.tif 000036
【０３１０】
発現ベクターｐＬＫＴＯＫ４を作製するために、ｐｃＤＮＡ３．１（商標）を骨格ベクターとして使用した。それは、研究条件下における容易な選択を可能にするために、Ｇ−４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））に抵抗性のネオマイシン（ＮＥＯ）遺伝子を含む。ＳｐｅＩ制限酵素認識部位は、部位特異的変異誘発によって、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１から排除された。プラスミドｐｃＤＥＦ３（元はｐＥＦ−ＢＯＳ４）由来のＥＦ１αプロモーターはｐｃＤＮＡ（商標）３．１の中へと挿入され、結果、ＣＭＶプロモーターを排除した。ｐＬＫＴＯＫ４発現ベクターに対する円形地図は、図１に示される。
【０３１１】
クローニングは、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用して、最終ＰＣＲ産物上で行った。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素消化の後、ＴＯＰＯクローン由来の所望の断片は、同様にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化された発現ベクターｐＬＫＴＯＫ４にライゲーションされた。ライゲーション反応を使用して、Ｋ１２を化学的に有能な大腸菌細胞に形質転換し、その後、Ｌ培地（ＬＢ）／アンピシリン寒天培地上で選択した。個々の大腸菌クローン由来のプラスミドは、ＱＩＡＧＥＮのＤＮＡミニプレップキットを使用して単離され、プライマーＳＰ６（配列番号５５）、ＥＦ５Ｓ（配列番号５４）、およびｐＳＭＵＣＨ２（配列番号５３）をもって配列決定された。
【０３１２】
クローンは、ＤＮＡ配列決定によって所望の組み換えＤＮＡを含むことを判定され、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用して、大量の純プラスミドＤＮＡを作るために使用された。このマキシプレップＤＮＡは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＤＧ４４）細胞への形質移入のために使用された。
【０３１３】
Ｓ１−ＣＨＯ−ＤＧ４４と呼ばれる無血清の懸濁液適応ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系を、ｐＬＫＴＯＫ１０８産生細胞系の開発のために使用した。簡潔に述べれば、形質移入は、線形化されていない環状ＤＮＡ、またはＰｖｕ  Ｉ制限酵素で処理された、線形化されたプラスミドＤＮＡのどちらかを使用して、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）装置、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）キットＶを使用して行われた。形質移入細胞は、Ｇ−４１８選択培地へと交換する前に、４８時間、ＩＳ−ＣＨＯ−Ｖ−ＧＳ増殖培地で維持された。生きた形質移入細胞は、新鮮なＧ−４１８選択培地で給餌され、コンフルエンスまで（約１０日から１４日間）培地で維持された。各形質移入プールのｐＬＫＴＯＫ１０８産生性はマウスＩｇＧ２ａＥＬＩＳＡアッセイを使用して査定され、細胞は凍結された細胞バンクを作るために拡張された。マウスＩｇＧ２ａ  ＥＬＩＳＡによる最も高い産生性の形質移入プールは、細胞がＧ−４１８選択培地（ウェル１つおきに約１個の細胞）において５×９６−ウェル組織培養プレートへと蒔かれた、限界希釈クローニングに対して同定された。９６−ウェルプレートは、給餌なしで２週間、５％のＣＯ２で３７℃のインキュベータ内でインキュベートされた。単一コロニーを有した各ウェルからの上清５０μＬは、マウスＩｇＧ２ａ  ＥＬＩＳＡアッセイを行うために、９６ウェルアッセイプレートへと直接移された。高い産生性を持つ２３個のクローンは同定され、２４−ウェル細胞培養プレート、その後６−ウェル細胞培養プレートを通して連続的に拡張された。これらのクローン由来の上清の抗体力価は、マウスＩｇＧ２ａ  ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、３つの異なる希釈で測定された。
【０３１４】
マウスＩｇＧ２ａ力価に基づいた最上の６個のクローンは、凍結細胞バンクを作るためにＧ−４１８選択培地において拡張され、無血清の懸濁液Ｓｉｇｍａ  ＃２１培地に適応された。細胞密度および生存は、Ｃｅｄｅｘ自動細胞培養解析器を使用して判定され、上清中のタンパク質濃度は、マウスＩｇＧ２ａ  ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定された。細胞が対数増殖期に達すると、細胞は採集され、一晩−８０℃で凍結され、その後、保存のため液体窒素低温室に移された。
【０３１５】
融合タンパク質を産生するために、細胞は解凍され、蒔かれ、そして続いて、３．０×１０５細胞／ｍＬの開始密度で大型のＴ型フラスコ中、その後振とうフラスコの中へと順次拡張され、そして１０５ｒｐｍに設定された旋廻式振とう機において、５％のＣＯ２で３７℃に設定された加湿インキュベータの中でインキュベートされた。最終培養は、４日目および７日目にＳｉｇｍａ  ＃２１Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍの１０％の量、そして１０日目に５％の量で給餌された。Ｓｉｇｍａ  ＃２１  Ｆｅｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍは、グルコース４０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、および大豆ペプトン１０ｇ／Ｌを補充されたＳｉｇｍａ  ＃２１  Ｍｅｄｉｕｍからなる。振とう培養は、遠心分離によって採集された。分泌ｐＬＫＴＯＫ１０８タンパク質を含む上澄は、精製に備えられた、または後の精製のために−８０℃で保存された粗ｐＬＫＴＯＫ１０８含有ろ液で、０．２−μｍ低タンパク質結合ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜ろ過装置を通してろ過された。
【０３１６】
初期精製は、ｐＬＫＴＯＫ１０８を含むろ過された上澄を、約４℃でプロテインＡセファロースカラム上で循環することを含む。樹脂はその後、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄され、タンパク質はｐＨ３．０でＰＢＳにおいてグリシン０．１Ｍで溶出され、ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム１Ｍで中和された。中和された溶出液は、３０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を用いたＶｉｖａｓｐｉｎ濃縮機を使用して濃縮され、このタンパク質の凝集体を分離するためにＰＢＳ  ｐＨ７．４緩衝液で事前に平衡化された、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（別表Ｇ）の上へと装填された。精製されたｐＬＫＴＯＫ１０８タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色で確認された純度をもって、単峰として溶出する。ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）／ｍＩｇＧ２ａ  Ｆｃホモ二量体を含む画分はプールされた。プールされた材料の濃縮が、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ１０００分光光度計上で２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって判定された後、精製されたｐＬＫＴＯＫ１０８タンパク質は、等分され、−８０℃で保存された。
実施例２：タンパク質免疫によるウサギｍＡｂｓの生成
【０３１７】
ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＲｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩ融合タンパク質（ｐＬＫＴＯＫ１０８）に対するウサギモノクローナル抗体は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）により提供されるＲａｂＭＡｂ（登録商標）サービスを使用して生成された。ＭＡｂ生成の目的のために、ｈＧＣＣ（ＥＣＤ）−ｍＩｇＧ２ａ  ＲｃＲｂｒ−ｍｕｔＩＩ融合タンパク質（ｐＬＫＴＯＫ１０８）融合タンパク質は、本明細書においてＭＩＬ−４４として言及される。
【０３１８】
３匹のウサギ（ＭＬ１００９、ＭＬ１０１０、およびＭＬ１０１１）は、従来の免疫化技法を使用してＭＩＬ−４４で免疫化された。ＭＩＬ−４４および非ＧＣＣカウンタースクリーン抗体（ｈＭａｄＣＡＭ−ｍＦｃ）に対する血清力価は、試験ブリードを使用して評価された。追加免疫は、初回の免疫化の後で与えられた。最も高い血清力価を持つウサギ、ウサギＭＬ１０１０が、脾臓摘出、ならびにＥｐｉｔｏｍｉｃｓ所有の融合パートナー細胞系および方法を使用するモノクローナル融合への候補として選ばれた。
【０３１９】
別々の２日（１日目および２日目）に、２億個のリンパ球が１億個の融合パートナー細胞と融合され、それぞれ２０×９６−ウェルプレート上に蒔かれた。プレートは、標準条件下の組織培養インキュベータの中で保存した。細胞増殖は融合から２〜３週間後に検証され、融合効率は、検証されたウェルの総数で割った増殖のあるウェルの数を使用して計算された。１日目の融合に対する融合効率は、融合効率７２％と測定されたのに対し、２日目の融合効率は７９％であった。最低で２枚のプレートが、次のように各々の融合に対して検証された。
【０３２０】
４０枚全てのプレートは、ウェルごとに５０ｎｇのＭＩＬ−４４でコートされたプレートをもって、標準ＥＬＩＳＡ法を使用してスクリーニングされた。１：１００００希釈のＭＬ１０１０のブリードが、陽性対照として使用された。０．５より大きいＯ．Ｄ．を有する１５１個のクローンは、推定的に陽性であると考えられ、２４−ウェルプレートの中へとさらに拡張された。
【０３２１】
続く確認スクリーニングは、ウェルごとに５０ｎｇのＭＩＬ−４４または５０ｎｇのｈＭａｄＣＡＭ−ｍＦｃでコートされたプレートを使用して、ＥＬＩＳＡによって行われた。１４３個のクローンはＭＩＬ−４４に対して陽性であることが確認され、そのうち７２個はＭＩＬ−４４特異的、つまりそれらはｈＭａｄＣＡＭ−ｍＦｃタンパク質に対して陰性であるとして同定された。
【０３２２】
多クローン上清評価に続いて、多クローン＃１４８および＃６７を含む数個のＭＩＬ−４４特異的多クローンがサブクローニングされた。サブクローニングは限界細胞希釈法を使用してなされた。数個のサブクローン上清がＥＬＩＳＡによってスクリーニングされた。サブクローン第１４８−２番および第６７−４番に対するハイブリドーマ細胞は、実施例３に記載されるように、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイにおけるＧＣＣ検出試薬として、凍結／貯蔵ならびに更なるスクリーニングおよび解析のために選択された。
【０３２３】
ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４抗体もまた、哺乳動物細胞中の一過性導入による産生のために、および配列決定のために、ｐｃＤＮＡ３．１＋ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローン化された。ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４抗体に対する重鎖および軽鎖についての核酸およびアミノ酸配列は以下に提供される。各々のＩｇＧ鎖におけるシグナル配列は斜体で示され、各々のＩｇＧ鎖における可変領域は太字で示され、ＣＤＲのものは下線で示される。
【０３２４】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｈ２核酸配列（配列番号４）
【化７−１】
0006517267.tif 000037
【化７−２】
0006517267.tif 000038
【０３２５】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号４２）
【化８】
0006517267.tif 000039
【０３２６】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｌ５核酸配列（配列番号５）
【化９】
0006517267.tif 000040
【０３２７】
ＭＩＬ−４４−１４８−２  Ｌ５アミノ酸配列（配列番号４３）
【化１０】
0006517267.tif 000041
【０３２８】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｈ２核酸配列（配列番号６）
【化１１−１】
0006517267.tif 000042
【化１１−２】
0006517267.tif 000043
【０３２９】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｈ２アミノ酸配列（配列番号４４）
【化１２】
0006517267.tif 000044
【０３３０】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｌ４核酸配列（配列番号７）
【化１３−１】
0006517267.tif 000045
【化１３−２】
0006517267.tif 000046
【０３３１】
ＭＩＬ−４４−６７−４  Ｌ４アミノ酸配列（配列番号４５）
【化１４】
0006517267.tif 000047
実施例３：抗ＧＣＣ抗体を使用した免疫組織化学
ｍＣＲＣのヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるＧＣＣ発現の検出
【０３３２】
ＭＩＬ−４４−１４８−２抗体を使用したＩＨＣアッセイは、雌のＳＣＩＤマウスにおける、転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）患者試料由来の、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ異種移植腫瘍および数個の原発性ヒト腫瘍異種移植片（ＰＨＴＸ）においてＧＣＣ発現を評価するために開発された。
【０３３３】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織におけるＧＣＣタンパク質レベルは、厚さ５μｍの切片上で査定され、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ（登録商標）自動染色器上で１時間、ＭＩＬ−４４−１４８−２抗体（３．５μｇ／ｍＬ）をもってインキュベートされた。抗体は、ウサギ抗ヤギ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でビオチン化され、３，３’−ジアミノベキシジン（ＤＡＢ）基質地図システム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で育てられた。スライドは、ヘマトキシリンで対比染色され、Ａｐｅｒｉｏ全体スライドスキャニングシステムを使用して画像化された。
【０３３４】
ＧＣＣレベルは、様々なＰＨＴＸ腫瘍異種移植片において、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍異種移植片において４＋から、および１＋、１〜２＋、２＋、２〜３＋、および４＋からの範囲のＨスコア（以下に記載の採点システム）で、これらの腫瘍の間で著しく異なった。一般に、極性化上皮性構造を維持した中／高分化型腫瘍細胞を伴う腫瘍においては、ＧＣＣは腫瘍組織の管腔側に集中した。
ヒト結腸試料および腫瘍マイクロアレイにおけるＧＣＣ発現の検出
【０３３５】
本明細書に記載のＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４抗体はまた、悪性および良性ヒト結腸試料（ＦＦＰＥおよび腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ））に加えて、上で参照される原発性ヒト腫瘍異種移植片（ＰＨＴＸ）、ＨＴ２９、およびＨＥＫ２９３ＧＣＣ形質移入細胞ペレットを使用して、上記のＩＨＣプロトコルにおいて、ＧＣＣ検出試薬としてスクリーニングされた。
【０３３６】
ＨＴ２９およびＨＥＫ２９３ＧＣＣ形質移入細胞ペレットは、予想通り染色された。ＰＨＴＸは、ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４クローンで、広範な染色強度を実証した。ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４の両方は、インサイツでの高もしくは中分化型結腸上皮内癌または転移について陽性の染色がされた。低分化型腫瘍は、より低い強度で染色された。正常な結腸組織は、ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４サブクローンの両方によって産生された抗体を使用して、陽性頂端染色を実証した。
【０３３７】
ＭＩＬ−４４−１４８−２およびＭＩＬ−４４−６７−４サブクローンの両方に由来の抗体は、ＨＥＫ２９３およびＨＴ２９親細胞系におけるいかなる非特異的染色もなく、ＧＣＣを形質移入されたＨＥＫ２９３細胞およびＨＴ２９細胞において、見て容易に分かる、強く、特異的な染色を提供した。両方のクローンもまた、インサイツの高もしくは中分化型結腸上皮内癌または転移について陽性の染色がされた。より弱い染色が低分化型癌における両方のサブクローンに対して見られた。正常な結腸は、予想通り、両方のクローンに対して陽性頂端染色を実証した。ＭＩＬ−４４−１４８−２は、ＩＨＣにおけるＭＩＬ−４４−６７−４よりも全般的に高い感受性および特異性を実証した。ＭＩＬ−４４−６７−４は細胞ペレットにおいてＭＩＬ−４４−１４８−２よりも良いダイナミックレンジを実証し、ＭＩＬ−４４−１４８−２はＴＭＡにおいてＭＩＬ−４４−６７−４よりも優れたダイナミックレンジを実証した。全般的に、ＭＩＬ−４４−１４８−２サブクローンは、ＩＨＣにおけるより高い感受性および特異性、ならびにＴＭＡにおける完全なダイナミックレンジ、ならびに低濃度で正常な結腸における強い染色（＋２ＩＨＣスコア）を実証し、ＭＩＬ−６７−４に対して優位性を示した。
【０３３８】
上記の初回ＩＨＣ実験の結果に基づき、ＭＩＬ−４４−１４８−２サブクローンが、Ｔｅｋ  Ｍａｔｅ自動染色器を使用して、上記のＩＨＣプロトコルに相当する自動プロトコルの開発および妥当性確立のために選択された。自動ＩＨＣアッセイは、ＧＣＣ標的化癌治療薬のための臨床試験登録基準として、またＧＣＣ標的化療法を受けるべき患者（例えば癌患者）を選択するためのスクリーニングツールとして一般的に、ＧＣＣを発現する腫瘍に対して癌患者をスクリーニングするために有用なツールである。
【０３３９】
表１８に示されるＩＨＣプロトコルは、ＦＦＰＥヒト細胞および組織におけるＧＣＣの検出のために開発され、約５３個の結腸直腸腫瘍および２０個の正常な結腸組織、ならびに２個の結腸癌ＴＭＡ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘから購入）が、ＧＣＣ発現に対してスクリーニングされた。これらの腫瘍は、ある範囲の腫瘍悪性度および結腸癌転移組織を含めた。
【０３４０】
４ミクロンの切片は、様々な組織試料から調製された。組織切片は、段階的なアルコール系の前に、キシレンの蒸留水への４、５分の変化を通して脱ろうされた。蒸気熱誘導エピトープ回収（ＳＨＩＥＲ）は、Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｄｅｃｋｅｒ  Ｓｔｅａｍｅｒの上方室の中で毛細管の間隙に２０分間、ＳＨＩＥＲ２溶液をもって使用された。
【０３４１】
【表１８Ａ】
0006517267.tif 000048
【０３４２】
【表１８Ｂ】
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【０３４３】
当業者は、一次抗体エンハンサーは、ＭＩＬ−４４−１４８−２もしくはＭＩＬ−４４−６７ウサギｍＡｂｓ（ウサギＩｇＧ）、またはＭＩＬ−４４シグナルを増幅するために好適な類似の試薬と同じアイソタイプを有する、ウサギ以外の種（例えばヒト、ラット、ヤギ、マウス等）において産生された抗ウサギ二次抗体であり得ることを認識するであろう。
【０３４４】
上のプロトコルは、ビオチンに基づかないペルオキシダーゼ検出（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂ  ＶｉｓｉｏｎからのＵｌｔｒａｖｉｓｉｏｎキット）を用いる１．０μｇ／ｍｌでのＭＩＬ−４４−１４８−２の一晩の抗体インキュベーション、および色原体としてＤＡＢを使用した。この手順は、ＴｅｃｈＭａｔｅ５００またはＴｅｃｈＭａｔｅ１０００（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、完全に自動化された。染色の後、スライドは、アルコール系を通して無水エタノールへと脱水され、続いてキシレンですすがれた。スライドは、ガラスのカバースリップおよびＣｙｔｏＳｅａｌで恒久的にカバースリップされた。スライドは、染色を査定するために、顕微鏡下で検証された。陽性染色は、茶色（ＤＡＢ−ＨＲＰ）の反応生成物の存在によって示される。ヘマトキシリン対比染色は、細胞および組織形態を査定するために、青い核染色を提供する。
【０３４５】
ＧＣＣ染色の評価にあたって、Ｈスコアアプローチが、ＧＣＣ発現を定量化するためには最善のアプローチであると判定された。Ｈスコアアプローチは、腫瘍型の中またはその間での染色の強度および腫瘍割合における多様性を判定するために、最適データ分解能を提供する。それはまた、陽性染色に対する閾値を判定するための良いツールを提供する。この方法では、０〜３＋の範囲の染色強度を持つ腫瘍中の細胞の割合（０〜１００）が提供される。即座の方法で、強度が０、０．５、１、２および３のスコアが提供された。マーカーにより、０．５染色は陽性または陰性として採点され得、マーカーに対して淡いが認知可能な染色を反映する。Ｈスコアを得るために、腫瘍細胞の割合は、各々の強度を乗じられ、共に加えられる。
【０３４６】
Ｈスコア＝（腫瘍％＊１）＋（腫瘍％＊２）＋（％腫瘍＊３）。例えば、腫瘍が２０％陰性（０）である場合、３０％＋１、１０％＋２、４０％＋３、これはＨスコア１７０をとなる。
【０３４７】
最高のＨスコアは、腫瘍細胞標識の１００％が強度３＋を有する場合、細胞内局在（つまり、頂端または細胞質）ごとに、３００（１００％＊＋３）である。最初は、総Ｈスコア単独では対照群として試料を比較するためには使用されなかったが、各々の強度にある細胞の割合の分析結果の総括に加えて評価された。例えば、９０のスコアは、腫瘍細胞染色の９０％が強度１＋を有すること、または細胞の３０％が強度３＋であることを表す。これらの試料は、同じＨスコアだが非常に異なるＧＣＣ発現を有する。各々の強度で採点される細胞の割合は異なり得るが、通常は１０％単位で採点される；しかしながら単一成分のわずかな割合の採点は、染色のあるレベルが存在することを実証するために、１％および５％とも見積もられ得る。ＧＣＣに対しては、頂端染色は、１および５％などの低レベルの増加で評価するために考慮されてよい。
【０３４８】
２個の異なる細胞内局在が、Ｈスコアアプローチを使用してＧＣＣに対して採点された。これらは、細胞質染色および頂端関連染色を含む。細胞質染色パターンは、腫瘍細胞の細胞質全体に渡る広範性として概して観察された。しかしながら、一部の場合では、強い球状の染色、または点状、粗い顆粒上の染色を含む、細胞質染色の多様性があった。強い球状の染色は、細胞質染色３＋として採点された。点状の染色は、頂端染色に関連し、この型の細胞質染色に対して個別のスコアは与えられなかった（ｎ＝点状の染色に対して４個の試料）。ＧＣＣ頂端染色は、管腔が存在した場合に観察された。観察された他のＧＣＣ染色パターンは、膜様の、非管腔染色（ひとつの場合）、および腫瘍管腔中に存在する細胞外染色を含んだ。正常な結腸組織では、染色は、広範性の細胞質染色と並んで、概して頂端であった。
【０３４９】
Ｈスコアは細胞質および頂端ＧＣＣ発現の両方に対して得られたため、かつ、１つの局在の型が、ＧＣＣ標的化療法の有効性にとって、別のものよりも危機的であるかどうかが不明であるため、全てのデータが収集され、一部の場合、集合Ｈスコアは、頂端および細胞質ＧＣＣ発現の両方の合計を使用して生成された。そのような場合には、最大のＨスコアは、集合スコアについて６００となった（頂端３００＋細胞質３００）。
【０３５０】
全般的に、正常な結腸試料における染色は、ＧＣＣが、頂端表面上に発現されることで、解剖学的特権を持つことを例示する。ＧＣＣは、腫瘍試料の９５％以上に発現し、正常な組織とは対照的に、一部の場合では広範な細胞質染色を実証した。ヒトＣＲＣ肝臓転移試料における強い限局性のＧＣＣ染色もまた見られた。
【０３５１】
表１９Ａは、スクリーニングされた正常および腫瘍組織に対する細胞質および頂端Ｈスコア染色結果を示す。表１９Ａに示されるデータは、試料起源（インハウス（ＭＬＮＭとして表される）、ＴＭＡ（ＢＩＯＭＡＸとして表される）、およびＣＲＯ（ＱｕａｌＴｅｋとして表される））、ならびに腫瘍悪性度に準じて分類される。陽性の要約データは、染色強度０．５および１．０＋の閾値を使用する場合に提供される。合計１７３個の腫瘍試料が採点された。細胞質または頂端染色どちらかの陽性染色強度に対する０．５＋のカットオフを使用する場合、腫瘍の９５％は陽性と考えられる。１．０＋のカットオフを使用する場合、試料の９２％が陽性と考えられる。
【０３５２】
組織源は、Ｈスコアと同様に陽性腫瘍細胞の割合における多様性を示す。１＋の染色陽性閾値に対しては、範囲は８４％（ＣＲＯ腫瘍ＭＴＢ試料）〜１００％（インハウス試料またはＣＲＯ単一組織試料−これらの群では試料がより少ない数であることに注意）である。インハウス腫瘍細胞は、２５３（ｎ＝９試料）という非常に高い頂端Ｈスコアを示した。ＴＭＡ２個の採点結果においてもまた差異があった。ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  ＴＭＡ  Ｃ０９９２は、Ｃ０７０１よりも強く染色した。いかなる理論にも束縛されるものではないが、ＴＭＡにおける差異は、組織源との固化との差異による可能性があり、または１個のブロックは他方よりも直近に切り取られたのかもしれない。
【０３５３】
切り取られた切片における抗体の安定性、および切り取られた試料の新鮮さが考慮された。即時研究を試験された試料は、切り取られ保存された試料、および新たに切り取られた試料を含み、時を経ての組織試料の安定性をさらに研究する必要性を示した。
【０３５４】
一部の差異は、高分化型腫瘍対低分化型腫瘍の比較に関連したより大きい陽性染色をもって（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘからの６個の腫瘍は悪性度を含まなかった）、ＧＣＣ陽性および腫瘍悪性度において観察された（表１９Ｂを参照されたい）。悪性度１腫瘍（ｎ＝２０）は１００％の陽性を示し、悪性度２腫瘍（ｎ＝９５）は陽性症例の９８％で標識し、悪性度３腫瘍（ｎ＝４４）は８８％の陽性率で標識した。低分化型腫瘍は概して管腔を欠き、それは、頂端染色の欠如による、染色におけるこの減少の一部に対する原因である可能性がある。この陽性割合は、染色強度閾値０．５＋に基づいた。７個の遠隔転移のうち７個が陽性であった（インハウスおよびＣＲＯ組織から）。ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  ＴＭＡからの転移性腫瘍は、リンパ節への転移として列挙された。
【０３５５】
全般的に、ＧＣＣは、組織源または腫瘍悪性度に関わらず、非常に高い割合の結腸腫瘍および正常な結腸組織を染色する。
【０３５６】
【表１９Ａ】
0006517267.tif 000050
【０３５７】
【表１９Ｂ】
0006517267.tif 000051
【０３５８】
ＧＣＣ  ＩＨＣアッセイのアッセイ内精度は、各々３個の細胞ペレット、および１４個の異なる結腸癌細胞由来の５回の再現を利用して、１実行内で評価された。細胞ペレットは個別のスライド上で調製された。結腸腫瘍試料は２個の異なる多発性腫瘍ブロックに含まれた。これらの組織は、ＧＣＣ  ＩＨＣ反応性に対して採点された。
【０３５９】
細胞ペレットの精度染色：３個の細胞ペレットの５回の実行内再現の全てにおいて、ほぼ等しい染色が観察された。
【０３６０】
結腸腫瘍試料の精度染色：１４個の結腸腫瘍試料の５回の実行内再現の間で、非常に類似〜ほぼ等しい染色が観察された。試料は、上に前述されるように、Ｈスコアアプローチを使用して、有資格の病理医によって採点された。標準偏差は、全ての症例において分散は最小限だったことを実証し、したがって、同じ実行内の染色の良好な精度を実証した。全般的に、試験された細胞ペレットおよび結腸癌試料の実行内ＧＣＣ  ＩＨＣ染色は、非常に一貫していた。
【０３６１】
実行間アッセイ変動性、および操作者の違いによる変動性は、５回の別々のＧＣＣ  ＩＨＣ染色の実行において評価された。４回の実行は１人の操作者によって異なる日に行われ、第２の操作者が５回目の実行を行った。染色は、上述の精度試験と同じ組織の試験を含んだ。
【０３６２】
細胞ペレットの再現性染色：３個の細胞ペレットの５回の実行間再現の全てにおいて観察されたように、ほぼ等しい染色。
【０３６３】
結腸腫瘍試料の再現性染色：非常に類似〜ほぼ等しい染色が、１４個の結腸腫瘍試料の５回の実行内再現の間で観察された。試料は、前述されるように、Ｈスコアアプローチを使用して、有資格の病理医によって採点された。標準偏差は、全ての症例において分散は最小限だったことを実証し、したがって、異なる操作者による日ごとの染色の良好な精度を実証した。全般的に、試験された細胞ペレットおよび結腸癌試料の実行間および操作者間ＧＣＣ  ＩＨＣ染色は、非常に一貫していた。
【０３６４】
ＧＣＣ  ＩＨＣアッセイの特異性は、正常なヒト組織のパネルを試験することによって評価された。これらの正常なヒト組織は、３０個の異なる組織型を含んだ：副腎、膀胱、骨髄、乳房、大脳皮質、頸部、卵管、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経、卵巣、膵臓、耳下腺（唾液腺）、下垂体、胎盤、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、尿管、および子宮。各々の組織型に対して、少なくとも３個の固有の標本が染色され、ＧＣＣ免疫反応性が評価された。
【０３６５】
全般的に、ＭＩＬ−４４−１４８−２抗体を使用したＧＣＣ  ＩＨＣアッセイは、特に頂端染色に対しては、正常な組織の染色と比較して、結腸腫瘍試料に非常に特異的であることが、本明細書に記載のＩＨＣアッセイによって示された。頂端染色は胃試料の２個において検出されただけだったが、しかしながら、この染色は陰性対照においても観察された。概して淡い細胞質染色は、卵胞（３個の試料のうちの１個）、皮膚（濾胞および真皮、３個の試料のうちの２個）、胃壁細胞（３個の試料のうちの２個）、前立腺上皮（３つの症例のうちの３つが淡い）、下垂体（３つの症例のうちの２つ）、子宮上皮（３つの症例のうちの３つ）、卵管上皮（３つの症例のうちの２つ）、胎盤栄養膜細胞（３つの症例のうちの２つが淡い）、および肺（３つの症例のうちの３つで内皮に、および３つの症例のうちの１つで細気管支上皮に）を含む数個の組織型において観察された。最も強い細胞質染色（２＋）は、卵管の１症例および下垂体の１症例に存在した。両方の症例では、陰性対照において同じ区画に、より淡い染色があった。形質細胞は、脾臓、扁桃腺、およびリンパ節を含む多数の組織において陽性であった。組織球は、脾臓、肺、およびリンパ節において陽性であった。間質染色は、精巣（３つの症例のうち２つ）、子宮（３つの症例のうち３つ）、および卵巣（３つの症例のうち１つ）において存在した。血管の細胞外染色は広く観察され、血清の非特異的結合であると思われる。
【０３６６】
ＴｅｃｈＭａｔｅ染色プラットフォーム上でウサギモノクローナル抗体ＭＩＬ−４４−１４８−２を使用するＧＣＣアッセイは、腫瘍および対照細胞ペレットの一貫した実行間および実行内染色を示す。ＧＣＣアッセイは、試験された結腸腫瘍試料の圧倒的な大部分を染色するため、結腸癌において感受性が高いと思われる。ＧＣＣアッセイもまた、正常な組織と比較して、結腸腫瘍に対してはるかに特異的であると思われる。多くの結腸腫瘍において観察されたＧＣＣ発現は、各組織型の少なくとも３回の再現をもって、３０個の組織の正常なパネルにおいて観察されたいずれの染色よりもずっと強い。特異的な頂端ＧＣＣ染色はいずれの正常な組織においても検出されなかったが、一方で頂端染色はＧＣＣ試料の大部分においてよく見られる。細胞質染色のみが一部の正常な組織型において観察され、この染色は概して淡い。ＭＩＬ−４４−１４８−２抗体は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）結腸腫瘍に対して、再現可能で、感受性があり、比較的特異的なＩＨＣマーカーであると思われる。
実施例４：非結腸直腸ＰＨＴＸモデルおよび腫瘍マイクロアレイ、ならびに結腸直腸および非結腸直腸ヒト臨床試料における追加的な免疫組織化学
【０３６７】
実施例３に記載の自動ＩＨＣアッセイは、雌のＳＣＩＤマウスにおける胃癌および膵臓癌患者試料に由来する原発性ヒト腫瘍異種移植断片（ＰＨＴＸ）、ならびに、膵臓癌、胃癌、食道癌、肺癌、および平滑筋肉腫／横紋筋肉種に特異的な、ＵＳ  ＢｉｏＭａｘ、Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ、およびその他の商業的供給源）から購入された様々な腫瘍マイクロアレイ（ＴＭＡ）を含む、異なる供給源からの多様な非結腸直腸試料におけるＧＣＣ発現（つまり、頂端、細胞質、および／または集合ＧＣＣ発現）を評価するために使用された。ＧＣＣ発現もまた、自動ＩＨＣアッセイを実行するために従事する特殊ＣＲＯ（ＱｕａｌＴｅｋ）の組織データベースから得られたヒト胃、膵臓、および食道腫瘍試料、ならびに、グアニル酸シクラーゼＣを発現している進行性胃腸悪性腫瘍を患う成人患者における、ＭＬＮ０２６４として指定される、ＧＣＣ標的化抗体医薬結合体の非盲検、多施設、用量増加、初めてのヒトにおける試験（研究Ｃ２６００１、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  識別名ＮＣＴ０１５７７７５８）への登録の前に、ＧＣＣ発現を試験された癌患者に由来する、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、食道癌、および小腸癌を含む様々なヒト臨床試料において、実施例３に記載の自動ＩＨＣアッセイを介して査定された。
【０３６８】
様々な供給源（ＰＨＴＸ、ヒト臨床試料、および腫瘍マイクロアレイ）からの、様々な正常および癌性の結腸直腸組織試料および非結腸直腸組織（胃、膵臓、小腸、食道、肺、横紋筋肉種、平滑筋肉腫）におけるＩＨＣ染色の結果は、以下の表２０〜３２に示される。表２０〜３２は、ＩＨＣスコア（０、０．５＋、１＋、２＋、および３＋）、ならびに、試験された様々な組織における頂端（「Ａ」）および細胞質（「Ｃ」または「細胞質」）ＧＣＣ染色の両方に対するＩＨＣスコアに基づいて計算された対応するＨスコアを含む。さらに、表３２は、各々の症例において同じ患者から得られた原発性および転移性癌のヒト臨床試料におけるＧＣＣ  ＩＨＣ発現データの比較を示す。第１の左側のカラムに示されるように、「Ａ」試料（つまり、１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ、１０Ａなど）は原発性腫瘍試料に言及する一方で、「Ｂ」試料（１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂなど）は、対応する原発性腫瘍（対応する「Ａ」試料）が得られた同じ患者から得られた転移性腫瘍試料に言及する。換言すれば、記号「１Ａ」および「１Ｂ」は、それぞれ同じ患者から得られた原発性および転移性腫瘍に言及する。記号「２Ａ」および「２Ｂ」は、それぞれ別の患者から得られた原発性および転移性腫瘍に言及する（以降同様）。非結腸直腸癌の特定の型が指定される場合である、「注釈」と名付けられたカラム中に反映されるように他に指示がある場合を除き、表３２に示される腫瘍試料の大部分は、原発性および転移性結腸直腸癌を患う患者から得られた。表３２における「注釈」カラムに見られるように、神経内分泌腫瘍、腎細胞癌、胃腫瘍、胃ＧＩＳＴ、膵臓腫瘍、および子宮平滑筋肉腫の一部の試料もまた、ＩＨＣアッセイによるＧＣＣ発現に対してであった。
【０３６９】
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【０３７０】
【表２１−１】
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【表２１−２】
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【０３７１】
【表２２Ａ−１】
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【表２２Ａ−２】
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【表２２Ａ−３】
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【表２２Ａ−４】
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【表２２Ａ−５】
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【表２２Ａ−６】
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【表２２Ａ−７】
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【表２２Ａ−８】
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【表２２Ａ−９】
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【表２２Ａ−１０】
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【表２２Ａ−１１】
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【０３７２】
【表２２Ｂ】
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【０３７３】
【表２３Ａ−１】
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【表２３Ａ−２】
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【表２３Ａ−３】
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【０３７４】
【表２３Ｂ】
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【０３７５】
【表２４Ａ−１】
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【表２４Ａ−２】
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【０３７６】
【表２４Ｂ】
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【０３７７】
【表２４Ｃ−１】
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【表２４Ｃ−２】
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【０３７８】
【表２４Ｄ】
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【０３７９】
【表２５−１】
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【表２５−２】
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【表２５−３】
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【表２５−４】
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【表２５−５】
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【０３８０】
【表２５Ｂ】
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【０３８１】
【表２５Ｃ−１】
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【表２５Ｃ−２】
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【表２５Ｃ−３】
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【表２５Ｃ−４】
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【０３８２】
【表２５Ｄ】
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【０３８３】
【表２６Ａ−１】
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【表２６Ａ−２】
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【表２６Ａ−３】
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【表２６Ａ−４】
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【表２６Ａ−５】
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【表２６Ａ−６】
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【０３８４】
【表２６Ｂ】
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【０３８５】
【表２７Ａ−１】
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【表２７Ａ−２】
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【０３８６】
【表２７Ｂ】
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【０３８７】
【表２７Ｃ−１】
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【表２７Ｃ−２】
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【表２７Ｃ−３】
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【０３８８】
【表２７Ｄ】
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【０３８９】
【表２８Ａ−１】
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【表２８Ａ−２】
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【表２８Ａ−３】
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【表２８Ａ−４】
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【表２８Ａ−５】
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【表２８Ａ−６】
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【表２８Ａ−７】
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【表２８Ａ−８】
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【表２８Ａ−９】
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【表２８Ａ−１０】
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【表２８Ａ−１１】
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【０３９０】
【表２８Ｂ】
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【０３９１】
【表２９Ａ−１】
0006517267.tif 000115
【表２９Ａ−２】
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【表２９Ａ−３】
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【表２９Ａ−４】
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【表２９Ａ−５】
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【表２９Ａ−６】
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【表２９Ａ−７】
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【０３９２】
【表２９Ｂ−１】
0006517267.tif 000122
【表２９Ｂ−２】
0006517267.tif 000123
【表２９Ｂ−３】
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【表２９Ｂ−４】
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【表２９Ｂ−５】
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【表２９Ｂ−６】
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【０３９３】
【表３０Ａ】
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【０３９４】
【表３０Ｂ−１】
0006517267.tif 000129
【表３０Ｂ−２】
0006517267.tif 000130
【表３０Ｂ−３】
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【表３０Ｂ−４】
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【表３０Ｂ−５】
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【０３９５】
【表３１−１】
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【表３１−２】
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【表３１−３】
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【表３１−４】
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【表３１−５】
0006517267.tif 000138
【表３１−６】
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【表３１−７】
0006517267.tif 000140
【表３１−８】
0006517267.tif 000141
【表３１−９】
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【０３９６】
【表３２−１】
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【表３２−２】
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【表３２−３】
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【表３２−４】
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【表３２−５】
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【表３２−６】
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【表３２−７】
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【表３２−８】
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【表３２−９】
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【表３２−１０】
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【表３２−１１】
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【表３２−１２】
0006517267.tif 000154
ＧＣＣ  ＩＨＣ染色結果の要約
【０３９７】
実施例３および４に示されるＧＣＣ  ＩＨＣ染色結果は、結腸直腸、胃、小腸、および食道腫瘍を含む様々な胃腸系悪性腫瘍、ならびに膵臓腫瘍および肺腺癌を含む非胃腸系腫瘍、肺扁平上皮癌、平滑筋肉腫、ならびに横紋筋肉腫においてＧＣＣが発現されることを実証する。様々な腫瘍のマイクロアレイ解析の要約は、以下表３３に示される。
【０３９８】
【表３３】
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【０３９９】
胃腸系および胃腸系関連悪性腫瘍のヒト臨床試料もまた、以下表３４に要約されるように、ＧＣＣ発現の様々なレベルで陽性と試験された。
【０４００】
【表３４】
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表３４に要約される結果は、表３３に要約されるＴＭＡスクリーニング中で通して観察された結果に類似している。
【０４０１】
Ｃ２６００１試験に対する患者登録スクリーニングからの腫瘍型全体のＧＣＣ発現の総計／集合Ｈスコア分布は、図２Ａ〜２Ｄに示される。
【０４０２】
スクリーニングされた様々な結腸直腸、胃、および膵臓腫瘍マイクロアレイからのＧＣＣ発現の総計／集合Ｈスコア分布は、図３Ａ〜３Ｃに示される。
【０４０３】
本発明は、その提供される実施形態への参照とともに示され、また記載されてきたが、添付の特許請求の範囲によって網羅される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更がその中でなされてよいことは、当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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