(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）、（ｉｖ）及び（ｖ）から選択される、インテグリンＡ６Ｂ４に対する抗体であって、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４複合体を特異的に認識し、細胞間接着を阻害する抗体。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
（ｉｖ）配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号２４のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２８のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号３０のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
【請求項２】
抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１又は２に記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、請求項１又は２に記載の抗体の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の抗体を含有する、がん細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項８】
他の抗がん剤と併用された際、がん細胞の前記抗がん剤に対する感受性を向上させるのに用いられる、請求項１又は２に記載の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の抗体と医薬上許容される担体とを含む白血病治療のための医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の抗体を含有する白血病治療のための医薬組成物であって、
白血病細胞の薬剤感受性を上昇させ、白血病細胞の増殖阻害および／または白血病細胞を死滅させるために、それを必要とする患者に、
（ａ）請求項１又は２に記載の抗体、および
（ｂ）イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤；シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤；エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド；アクチノマイシンＤ、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンＣから選択される抗がん性抗生物質；カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤から選択される抗がん剤を、前記抗体が、白血病細胞に結合するための条件下および十分な量で提供し、それにより白血病細胞の増殖阻害および／または白血病細胞の死滅を引き起こす、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４と特異的に反応する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人急性骨髄性白血病(AML)の半数以上は抗がん剤による化学療法に耐性を示し、難治性である。この難治性白血病は骨髄移植を行っても予後不良であり、新規治療法の開発は急務である。本発明者らは、これまで難治性白血病の発症機構解明のためゲノム解析及び発症因子の機能解析を行っており、数多くの発症関連因子群を単離してきた。特に転写因子EVI1高発現の難治性白血病の病態解析を行っており、網羅的遺伝子発現解析からα6-integrin(ITGA6)並びにβ4(ITGB4)の高発現を同定した。このITGA6/B4はEVI1高発現白血病のみならず、治療後の白血病再発患者群においても高発現があることがわかり、難治性白血病全般に見られる現象である。さらにこの高発現は、骨芽細胞並びに細胞外マトリックスであるラミニンへの接着性の亢進、さらには各種抗がん剤耐性の獲得に寄与することを同定した(非特許文献１)。【０００３】
この白血病細胞の細胞接着能の亢進は、細胞接着依存性化学療法耐性(CAM-DR)としてよく知られた現象であり、白血病幹細胞(以後LSCと表記)が造血幹細胞(以後HSCと表記)の骨髄ニッチ(以後、骨芽細胞と表記)をのっとり（骨髄ニッチ環境を利用した生着）、抗がん剤耐性を獲得する機構が近年明らかになって来た。HSCの骨髄ニッチの接着に関わるインテグリンファミリーはVLA-4(ITGA4/B1)が主体であるが（非特許文献２）、LSCではITGA6/B4に依存していることがわかった。従って難治性に繋がるCAM-DRに関わる特異的な接着分子ITGA6/B4を標的とした治療法の開発は、これまで治療法がなかった難治性白血病の効果的治療法の開発に繋がると考えられる（特許文献１）。【０００４】
抗ITGA6B4に反応できる抗体としては、バイオジェンアイデック  MA  INCによって作製され２００７年に報告されている。この抗体は、細胞の増殖を阻害し、ラミニンとの接着を阻害する能力を有するとされている（特許文献２）。【０００５】
本発明者らは、PhageDisplay法を基盤に多くのがん細胞を標的としたヒト抗体の網羅的な単離方法により（特許文献３）、がん細胞に特異的抗原（抗体）の探索をしている。その結果、得られた２９種類の標的にはITGA6/B4（抗体）が含まれており、抗体医薬標的としての妥当性が別の観点からも証明されている(非特許文献３)。【０００６】
医薬品の副作用と言う観点から、化学療法剤はがん細胞特異的ではなく、正常細胞も含め、細胞分裂が活性化している細胞に対して効果を示すために従来より投薬のコントロールが非常に重要であった。一方、分子標的薬剤は特定の標的分子に対して選択的に設計された薬剤であるため、化学療法剤に比べて副作用が軽減されることが特徴である。抗体も分子標的薬剤であり、酵素阻害剤（キナーゼ阻害剤）等に比べるとさらに標的への特異性は向上している。その分、副作用も軽減されることが期待されているが、個別の抗体医薬においてはそれぞれ特徴的な副作用が観察されている。それは抗体分子の特性に由来するＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）やＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）などの免疫反応を誘導するために起こるものや、標的分子に作用して誘起されるアゴニスト、アンタゴニスト活性に由来するものが考えられる。また近年では免疫反応を増強したり、薬剤修飾などで強力な効果を示すことが出来る一方でより副作用に関しては繊細な注意が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０９８１６６号
【特許文献２】ＷＯ２００８／１２７６５５号
【特許文献３】特許４８７０３４８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】The Increased Expression of Integrin α6 (ITGA6)  Enhances Drug Resistance in EVI1high Leukemia, Yamakawa, N., et al.  ProsOne Vol.7 Issue1 e30706 (2012)
【非特許文献２】Interaction between leukemic-cell VLA-4 and stromal fibronectin is a decisive factor for minimal residual disease of acute myelogenous leukemia. Matsunaga, T., et al. Nat Med; 9: 1158-65. (2003)
【非特許文献３】Comprehensive screening for antigens overexpressed on carcinomas via isolation of human mAbs that may be therapeutic, Kurosawa G et al., Proc Nat Acad Sci USA 105, 7287-7292<2008>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞膜上に発現するインテグリンA6B4（ITGA6B4）複合体を特異的に認識し、ITGA6B4複合体とラミニンとの接着を阻害することによってがん細胞の骨髄ニッチへの生着を阻害し、更に抗がん剤耐性株に対する抗がん剤の効果を著しく増強することができる抗ITGA6/B4ヒト抗体を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、その利用にあたり副作用の少ない上記抗ITGA6/B4ヒト抗体を用いたがん細胞の細胞接着阻害剤並びに医薬組成物を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、難治性白血病幹細胞は骨髄ニッチに生着することにより抗がん剤耐性を取得していることに着目し、骨髄ニッチへの安定的生着を阻害し、結果的に遊離させたり接着阻害させたりすることにより（この現象を、「追い出し」と呼ぶ）、抗がん剤の効果を改善できることを予想し、そしてニッチからの追い出しには抗体分子が有用であるという考えに基づいて、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４複合体を認識し、がん細胞のニッチへの接着を阻害することによってがん細胞の抗がん剤に対する感受性を上昇させる活性を有する抗体を探索することにした。【００１１】
本発明者らは、 phage display 法を基盤にした細胞表面上のintactな蛋白に対する完全ヒト抗体を単離する方法を樹立している。この方法は、巨大なレパートリーを保持するファージライブラリーを用いるため抗体の多様性が高く、また、がん細胞を直接スクリーニングすることから、細胞表面上にある複合蛋白質に対する抗体も容易に取得できる方法である。本発明では、この方法を用いて、がん細胞膜上に発現しているITGA6/B4複合体に対する抗体を複数取得した。そして、白血病幹細胞を含め、腎臓がん、肺がん等、数多くのがん細胞に反応するがん特異性を示す抗体が選別された。さらに、得られた抗体から、組み換えDNA技術を用いて完全ヒトIgG抗体を作製した。【００１２】
次に、本発明者らは、難治性白血病幹細胞は、骨髄ニッチに生着することにより抗がん剤耐性を獲得しているから、骨髄ニッチから「追い出し」することにより、抗がん剤の効果を改善でき、ニッチからの「追い出し」には抗体が有用であるという考えから、抗体による「追い出し治療」を考案した。この治療の場合、主に必要な薬効は骨髄への生着阻害であり、それ以外の副効果はITGA6B4を発現するすべての細胞に対して考えると、予期せぬ作用を示す懸念がある。そのため、本発明においては細胞の増殖に影響を及ぼさない抗ITGA6B4抗体を選択した。前述の考えの上に立ちヒト抗体を用いて、「追い出し治療」に関する基礎的な検討を行った。その結果、本発明の抗ITGA6/B4抗体が、白血病幹細胞の骨髄ニッチへの生着を阻害できること、そして生着阻害作用を有する抗体は抗がん剤耐性を低下させることをモデル系で確認することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１３】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  インテグリンＡ６Ｂ４に対する抗体であって、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４複合体を特異的に認識し、細胞間接着を阻害する抗体。
（２）  インテグリンＡ６Ｂ４に対する抗体であって、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４複合体を特異的に認識し、標的抗原を発現するがん細胞の抗がん剤への感受性を上昇させる抗体。
（３）  実質的に細胞の増殖に影響を及ぼさない（１）又は（２）に記載の抗体【００１４】
（４）  インテグリンＡ６Ｂ４に対する抗体であって、前記抗体はヒトインテグリンＡ６Ｂ４複合体を特異的に認識し、かつ前記抗体は、
（ａ） インテグリンＡ６Ｂ４を介した細胞間接着を阻害する能力；
（ｂ） がん細胞の抗がん剤への感受性を上昇させる能力；
（ｃ） 実質的に細胞の増殖に影響を及ぼさない特性；
のうち少なくとも２つ以上を有する抗体。
（５）  抗がん剤が下記（ｉ）から（ｖ）から選択される（２）又は（４）に記載の抗体
（ｉ）イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤；
（ｉｉ）シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤；
（ｉｉｉ）エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド；
（ｉｖ）アクチノマイシンＤ、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンＣから選択される抗がん性抗生物質；
（ｖ）カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤：
（６）  ヒト抗体あるいはヒト化抗体である（１）から（５）の何れかに記載の抗体。【００１５】
（７）  重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む、（１）から（６）の何れかに記載の抗体。
（８）  重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含み、軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０の何れかのアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含む、（１）から（７）の何れかに記載の抗体。【００１６】
（９）  下記（ｉ）から（ｖ）から選択される（１）から（８）の何れかに記載の抗体
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号３のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
（ｉｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号１６のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号１７のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号１８のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
（ｉｖ）配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２２のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号２３のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号２４のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；
（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号２６のアミノ酸配列からなる重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号２７のアミノ酸配列からなる重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号２８のアミノ酸配列からなる軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号２９のアミノ酸配列からなる軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、配列番号３０のアミノ酸配列からなる軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を含む抗体；【００１７】
（１０）  配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７、４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０の何れかのアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されていて、ヒトＩＴＧＡ６Ｂ４と特異的に反応する活性を有する、（７）又は（８）に記載の抗体。
（１１）  抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（１）から（１０）のいずれかに記載の抗体。
（１２）  （７）から（１０）のいずれかに記載の抗体をコードするＤＮＡ。
（１３）  （１２）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（１４）  （１２）に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１５）  （１４）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）から（１１）の何れかに記載の抗体を生成蓄積させ、培養物から抗体を採取することを含む、（１）から（１１）の何れかに記載の抗体の製造方法。【００１８】
（１６）  （１）から（１１）の何れかに記載の抗体を含有する、がん細胞の細胞接着阻害剤。
（１７）  他の抗がん剤と併用された際、がん細胞の前記抗がん剤に対する感受性を向上させるのに用いられる、（１）から（１１）のいずれかに記載の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤。
（１８）  （１）から（１１）の何れかに記載の抗体と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
（１９）  （１）から（１１）の何れかに記載の抗体を含有する医薬組成物であって、
がん細胞の薬剤感受性を上昇させ、がん細胞の増殖阻害および／またはがん細胞を死滅させるために、それを必要とする患者に、
（ａ）（１）から（１１）のいずれかに記載の抗体、および
（ｂ）イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジンおよびチオテバから選択されるアルキル化剤；シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフールおよびフルオロウラシルから選択される代謝拮抗剤；エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビンブラスチンから選択される植物アルカロイド；アクチノマイシンＤ、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロンおよびマイトマイシンＣから選択される抗がん性抗生物質；カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチンおよびオキサリプラチンから選択される白金系製剤から選択される抗がん剤を、前記抗体が、がん細胞に結合するための条件下および十分な量で提供し、それによりがん細胞の増殖阻害および／またはがん細胞の死滅を引き起こす、前記医薬組成物。【００１９】
（２０）  がん細胞が、骨髄ニッチに生着したがん細胞である、（１９）に記載の医薬組成物
（２１）  がんが、固形がんまた血液がんである、（１９）又は（２０）に記載の医薬組成物。
（２２）  固形がんが肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、又は皮膚がんである、（２１）に記載の医薬組成物。
（２３）  血液がんが白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である、（２１）に記載の医薬組成物。【００２０】
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、がんを抑制又は治療する方法が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、抗がん剤の効果を高める方法が提供される。
本発明によればさらに、上記した本発明の抗体を対象者に投与することを含む、がん細胞の細胞接着を阻害する方法が提供される。
本発明によればさらに、がん細胞の細胞接着阻害剤又は医薬組成物の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の抗体は、ヒトITGA6B4複合体を特異的に認識し、ITGA6B4複合体を細胞膜上に発現している難治性がん細胞を特異的に認識することができる。本発明の抗体はまた、がん細胞の骨髄ニッチへの生着を阻害し、抗がん剤耐性株に対する抗がん剤の効果を増強することができる。さらに本発明の抗体は、抗体単独では細胞増殖に影響を及ぼさない性質から、予期しない効果、つまり副作用を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例５で行った免疫沈降における２本のバンドを示す。
【図２】図２は。実施例６で行った質量分析計による抗原同定の結果、ITGA6が得られたことを示す。本データは質量分析計（Thermo社LCQ）にて得られたマスデータを解析ソフトMascot search（MATRIX  SCIENCE  社）で解析させた時のアウトプット図である。
【図３】図３は、実施例６で行った質量分析計による抗原同定の結果、ITGB4が得られたことを示す。本データは質量分析計（Thermo社LCQ）にて得られたマスデータを解析ソフトMascot search（MATRIX  SCIENCE  社）で解析させた時のアウトプット図である。
【図４】図４は、実施例３で作製したIgG抗体について、精製可溶性ヒトITGA6B4抗原（Recombinant Human Integrin alpha 6 (X1) beta 4  R＆D社）を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した結果を示す。
【図５】図５は、難治性白血病の網羅的遺伝子発現解析からα6-integrin(ITGA6)並びにβ4(ITGB4)の高発現を同定したことを示す図である。
【図６】図６は、白血病細胞の抗がん剤耐性の獲得には、ITGA6/B4を介した接着が必要であるということを示した図である。本発明の抗ITGA6/B4抗体は接着能の減弱に寄与することを示す。
【図７】図７は、AML細胞株UCSD/AML1、 Kasumi3、MOLM1そしてHNT34の４株に対して細胞接着阻害実験を行った結果を示す。抗ITGA6/B4抗体の投与により、接着性が低下することが示される。
【図８】図８は、抗がん剤 [AraC（シタラビン）、DXR（ドキソルビシン）、VP16（エトポシド）]との併用による影響を示す。抗ITGA6/B4抗体が抗がん剤の効果を増強していることが分かる。
【図９】図９は、白血病幹細胞におけるITGA6B4の発現量を調べた結果を示す。
【図１０】図１０は、ITGA6及びITGB4遺伝子のshRNA導入した細胞による、遺伝子発現抑制試験における抗体の反応性変化の評価を行った結果を示す。
【図１１】図１１は、静脈移植モデルを用いて抗体併用による浸潤抑制効果を検証した結果を示す。抗ITGA6B4抗体の投与により単剤、併用において骨髄への浸潤が有意に抑制されていることが示された。
【図１２】図１２−１はITGA6B4抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果を検証した結果を示す。また図１２−２は結果をＰＢＳを１００とした増殖度合の割合を示し、抗ITGA6B4抗体は単剤で細胞増殖抑制効果はないことが示された。
【図１３】図１３は、静脈移植モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。抗体、抗がん剤併用において生存率の延長が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について更に詳細に説明する。なお、本明細書においては、本発明の抗体が特異的に認識する抗原であるインテグリンα6β4複合体を、ITGA6/B4、ITGA6B4、ITGA6B4複合体、A6B4複合体などと記す場合がある。
本発明者らは難治性白血病の病態解析を行っており、網羅的遺伝子発現解析からα6-integrin(ITGA6)並びにβ4(ITGB4)の高発現を同定した。更にこのITGA6/B4はEVI1高発現白血病のみならず、治療後の白血病再発患者群においても高発現があることがわかり（図５）、難治性白血病全般に見られる現象であることから、特に白血病治療において有効な効果が期待できる。本発明の抗体によれば、ITGA6B4を介した骨髄ニッチへの接着を阻害することにより既存の抗がん剤に対して抵抗性を示していたがんの薬剤感受性を増大させることができ、その結果、抗がん剤の効果を復活若しくは増大させ、効果的な治療を行うことが可能になる。本発明の抗体は、特に患者のがん細胞に対する特異性及び親和性が高いもので上記抗がん剤の感受性を高める効果を保持する抗体を選抜しているため、がん細胞について良好な治療結果が得られる。本発明の抗体は、ITGA6B4複合体に対する抗体であり、特に上記した「追い出し治療」を行うことが可能であり、がん細胞の既存の抗がん剤の感受性を飛躍的に高めることができるという特徴を有する。特許文献１においてはインテグリンＡ６又はインテグリンＢ４の単独についての効果が記載されているが、本発明の抗体はインテグリンＡ６Ｂ４複合体に対する抗体である。本発明の抗体はインテグリンＡ６Ｂ４を認識し、本発明において提唱する「追い出し治療」に適正化された抗体であることから、白血病再発患者に対しても顕著な治療効果が期待できる。
【００２４】
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
【００２５】
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。
【００２６】
イテングリンＡ６Ｂ４（ITGA6B4）
イテングリンα６とインテグリンβ４からなる複合体で細胞外マトリックスとの相互作用、細胞間接着、細胞の組織への生着、シグナリング等多くの現象に関与している事が知られている。イテングリンα６はβ４以外にもβ１と複合体を形成し、VLA6という複合体を取ることも知られている。なお本抗原はCD49ｆとして知られ、血小板や巨核球に存在し、  T細胞のサブポピュレーションに弱く発現すると考えられている。一方で本研究対象の複合体は主に正常細胞では気管支上皮とがん細胞では大腸がんを始め多くのがんで発現すると考えられている。
【００２７】
ITGA6B4は、構造上特別に限定せず、単量体、多量体、細胞膜に発現しているｉｎｔａｃｔ  ｆｏｒｍ、細胞外領域に構成された可溶化ｆｏｒｍ、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍ、また、遺伝子の変異や、欠損などによりｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍ、リン酸化などにより翻訳後修飾を受けたｆｏｒｍなども含め、すべてヒトITGA6B4を意味する。
【００２８】
反応する及び反応性
本明細書において、「反応する」と「反応性」は特別に示さない限り、同じのことを意味する。すなわち、抗体が抗原を認識することを意味する。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ  ITGA6B4でもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったITGA6B4でもよいし、変性したITGA6B4でもよい。反応性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）、免疫染色、免疫沈降などが挙げられる。
【００２９】
フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ITGA6B4抗体（通常最終濃度が０．０１〜１０μｇ／ｍＬ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。
【００３０】
抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）
【００３１】
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。
【００３２】
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変領域および定常領域の配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、様々な形で調製することができる。
【００３３】
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１４：４３〜４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照できる。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。
【００３４】
本発明の抗体の可変領域においてフレームワーク領域（ＦＲ）の配列は、対応する抗原に対する特異的結合性に実質的な影響のない限り、特に限定されない。ヒト抗体のＦＲ領域を用いることが好ましいが、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）のＦＲ領域を用いることもできる。
【００３５】
本明細書において、「ファージ抗体」という用語は、ファージにより産生されたｓｃＦｖ抗体を意味する。つまり、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体断片である。この断片は、Ｌｉｎｋｅｒとしてのアミノ酸以外、タグとしてのアミノ酸配列を含むことでもよい。
【００３６】
本発明の抗体の一態様においては、可変領域に加えて定常領域を含む（例えばIgG型抗体）。定常領域の配列は特に限定されない。例えば、公知のヒト抗体の定常領域を用いることができる。ヒト抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）としては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、軽鎖定常領域（ＣＬ）としては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。また、ヒト以外の動物種（例えばマウスやラット）の定常領域を用いることもできる。
【００３７】
本発明の抗体における可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）または定常領域のアミノ酸配列は、由来となる元のＦＲまたは定常領域のアミノ酸配列をそのまま用いてもよいし、ヒトITGA6B4を特異的に認識できる限り、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸を欠失、付加、置換及び／または挿入して異なるアミノ酸配列にして用いてもよい。
【００３８】
本発明の抗体は好ましくは、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列を含み、さらに軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０の何れかのアミノ酸配列含むものである。
【００３９】
さらに本発明の抗体は、重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１、２５〜２７の何れかのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むものでもよいし、さらに軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）としてそれぞれ配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４、２８〜３０の何れかのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むものでもよい。
【００４０】
「ヒトITGA6B4を特異的に認識できる」とは、改変前の抗体と同様にヒトインテグリンＡ６Ｂ４と特異的に反応する活性を有するということである。この抗原は、細胞膜に発現するｉｎｔａｃｔ  ITGA6B4でもよいし、ｔｒｕｎｃｔｅｄ  ｆｏｒｍや、可溶化ｆｏｒｍでも良い。また、立体構造を保ったITGA6B4でもよいし、変性したITGA6B4でもよい。たとえば、結合活性を検討する手段として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ、蛍光微量測定技術（ＦＭＡＴ）表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）などが挙げられる。
【００４１】
本発明において、「改変前の抗体と同様に」とは、必ずしも同程度の活性である必要はなく、活性が増強されていてもよいし、又、活性を有する限り活性が減少していてもよい。活性が減少している抗体としては、例えば、元の抗体と比較して３０％以上の活性、好ましくは５０％以上の活性、より好ましくは８０％以上の活性、さらに好ましくは９０％以上の活性、特に好ましくは９５％以上の活性を有する抗体を挙げることができる。
【００４２】
本発明の抗体は、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４と特異的に反応する活性を有する限り、可変領域（ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列）のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよい。アミノ酸配列において、１または数個（例えば、１から８個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から３個、特に好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、付加、置換及び／または挿入されており、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４と特異的に反応する抗体のアミノ酸配列を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, anＤＮＡkagawa, M. (１995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene １5２, ２7１-２75、Zoller, MJ, and Smith, M.(１98３) Oligonucleotide-directed mutagenesis of ＤＮＡ fragments cloned into M１３ vectors.Methods Enzymol. １00, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V,Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(１984) The gapped duplex ＤＮＡ approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. １２,944１-9456、Kramer W, and Fritz HJ(１987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex ＤＮＡ Methods. Enzymol. １54, ３50-３67、Kunkel,TA(１985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc NAML Acad Sci U S A. 8２, 488-49２）などを用いて、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４と特異的に反応する抗体のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、上記抗体と機能的に同等な変異体を調製することができる。
このように、可変領域において、１または数個のアミノ酸が変異しており、ヒトインテグリンＡ６Ｂ４と特異的に反応する抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
【００４３】
本発明の抗体は、その由来で限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、如何なる動物由来の抗体でもよい。又、キメラ化抗体、ヒト化抗体などでもよい。
【００４４】
本発明の抗体は、後述する抗体を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。得られた抗体が、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明で記載されているアミノ酸配列に翻訳後に修飾を受ける場合も本発明に含まれる。更に、既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。また、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列のN末端にメチオニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。既知の翻訳後修飾以外の部位に対する翻訳後修飾も、本発明の抗体と同等の活性を有している限り、本発明に含まれる。
【００４５】
抗体の作製
（１）ファージディスプレイライブラリーにより抗原と反応するｓｃＦｖ
本発明の抗体の取得は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ITGA6B4に対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、ITGA6B4に対する抗体を同定し単離することができる。好ましくは、ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ヒトITGA6B4を抗原としてスクリーニングした反応性を示すファージクローンから遺伝物質を回収する。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列を決定することができる。このｓｃＦｖの配列を用いて、ｓｃＦｖをＩｇＧ化すれば、ヒト抗体を取得することができる。
【００４６】
（２）ｓｃＦｖのＩｇＧ化（ヒト抗体の作製）
Ｈ鎖またＬ鎖の発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。また、ＶＨ及びＶＬを同一ベクターに発現すること（タンデム型）によりヒト抗体の取得もできる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２/０１０４７、ＷＯ９２/２０７９１、ＷＯ９３/０６２１３、ＷＯ９３/１１２３６、Ｗ０９３/１９１７２、ＷＯ９５/０１４３８、ＷＯ９５/１５３８８、ＷＯ９７/１０３５４などを参考にすることができる。
【００４７】
具体的には、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長重鎖遺伝子を取得することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。
【００４８】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と連結することによって、完全長Ｌ鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）を取得することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。
【００４９】
上記のように得られたＨ鎖またＬ鎖コードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入することにより、発現ベクターを作製し、宿主細胞に発現させ、分泌した上清の回収・精製によりヒト抗体を取得する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができるし、また両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入することもできる。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。
【００５０】
好適なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
【００５１】
本発明の抗体の発現ベクターは、抗体遺伝子および制御配列に加えて、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
【００５２】
以上の方法で作製された抗体遺伝子発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、本発明の抗体を産生させる可能であればいかなる細胞でもよいが、動物細胞が好ましい。動物細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ/ｄｈｆｒ (−)細胞ＣＨＯ/ＤＧ４４細胞、サル由来細胞ＣＯＳ細胞(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.１60, ３３９３-３４０２ (１９９８))、ＳＰ２／Ｏ細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.５,５１２-５１９9(１９９６),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.５０,１４９５-１５０２ (１９９０)) など挙げられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.NAML.Acad.Sci.USA ８６,６００７ (１９８９), P.L.Felgner et al., Proc.NAML.Acad.Sci.USA  ８４,７４１３ (１９８７)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology ５２,４５６-４６７(１９７３))、ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００５３】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト抗体を分離する。抗体の分離・精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００５４】
抗原結合フラグメント
本発明の抗体を基にして又は本発明の抗体をコードする遺伝子の配列情報を基にして、抗体結合フラグメントを作製することができる。抗体結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、F(ab')2、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化V領域（ｄｓＦｖ）、又は抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含むペプチドを挙げることができる。
【００５５】
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。
【００５６】
Ｆａｂ'は、後述のF(ａｂ')2のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ'をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００５７】
Ｆ(ａｂ')2は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨ１ドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ(ａｂ')2をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
【００５８】
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）3などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。
【００５９】
二量体化V領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）は、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、scFv等）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、2つのVLと2つのVHを含む。Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でもよいが、好ましくは非共有結合である。
【００６０】
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。
【００６１】
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
【００６２】
医薬
本発明によれば、本発明の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤、並びに本発明の抗体を含有する医薬組成物が提供される。本発明一つの実施形態としては難治性白血病であるが、これに限らない。ITGA6B4複合体の高発現による難治性白血病以外の疾患についても、本発明の抗体を用いて治療することができる。好ましくは難治性白血病であるが、固形がん（例えば、肺がん、大腸がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、肝がん、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、皮膚がんなど）、または血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫など）なども治療対象に含まれる。
【００６３】
本発明の抗体を含有するがん細胞の細胞接着阻害剤及び医薬組成物には、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明のがん細胞の細胞接着阻害剤及び医薬組成物は、例えば注射剤として製剤することができる。本発明のがん細胞の細胞接着阻害剤及び医薬組成物の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常１日当たり約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【００６４】
細胞の検出
細胞に結合した本発明の抗体の検出は、フローサイトメトリー法や、ELISA法等  およびその組み合わせによって行うことが可能である。本発明の抗体が結合した細胞を検出又は定量する装置としては、フローサイトメーター（FACS:Fluorescence Activagted Cell  Sorter）が好ましい。血中循環がん細胞（CTC:CirculatingTumorCells）の測定の可能な他の測定器を用いる方法も考えられる。最も好ましくは、本発明の抗体が結合した細胞をフローサイトメーターにより測定することができる。この場合、本発明の抗体は、蛍光色素により標識されていることが好ましい。血液検体より得られた、血球細胞に本発明の抗体の蛍光標識物を接触させた後、フローサイトメーターにより解析することができる。
【００６５】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１：がん細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）がん細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング（AML株USCD-AML1）
USCD-AML1細胞（Oval et al., Blood 76: 1369-1374 (1990)；Taetle et al.,Cancer Res. 53: 3386-3393 (1993)；Hu et al., Leukemia 10: 1025-1040 (1996)）を任意の方法で培養した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０13ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリー（特開２００５−１８５２８１号公報、ＷＯ２００８／００７６４８号公報、ＷＯ２００６／０９０７５０号公報を参照）を混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれ事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液(ｄｉｂｕｔｙｌ  ｐｈｔａｌａｔｅ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１)に重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒に重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。【００６７】
凍結した細胞を３７℃で解凍し、２０ｍＬの大腸菌ＤＨ１２Ｓ（ＯＤ０．５）に１時間で感染させた。ファージに感染した大腸菌を６００ｍＬの２×ＹＴＧＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、１％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に入れ、３０℃で一晩培養した。その後１０ｍＬを取り、２００ｍＬ  ２×ＹＴＡ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ）に入れ、３７℃で１．５時間培養した。１×１０11ヘルパーファージＫＯ７を入れ、更に３７℃で１時間培養した。８００ｍＬの２×ＹＴＧＡＫ培地（２×ＹＴ、２００μｇ/ｍＬ ａｍｐｉｃｉｓｕｌｆａｔｅ、０．０５％  Ｇｌｕｃｏｓｅ、５０μｇ/ｍＬｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加し、３０℃で一晩培養した。１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）により上清を回収した。回収した上清に２００ｍＬのＰＥＧ液（２０％  ｐｏｌｙｅｔｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ６０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）を入れよく攪拌した後、１０分間の遠心（８０００ｒｐｍ）によりファージを沈殿させた。これを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、これが１ｓｔスクリーニングのファージとした。【００６８】
次は、２ｎｄスクリーニングを行った。２×１０7培養細胞と１×１０10１ｓｔスクリーニングのファージを混合し、最終容積０．８ｍＬになるように反応液を（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）入れた。その後は上記１ｓｔスクリーニングと同様の手法を行い、２ｎｄスクリーニングのファージを取得した。【００６９】
３ｒｄスクリーニングは１×１０9の２ｎｄスクリーニングのファージを使用し、上記と同じように行った。【００７０】
（２）ファージ抗体の解析
３ｒｄスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりＤＮＡ配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した（特許第４８７０３４８を参照）。【００７１】
実施例２：ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
精製可溶性ヒトITGA6B4抗原（Recombinant Human Integrin alpha 6 (X1) beta 4  R＆D社）を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ITGA6B4抗原をＰＢＳで１0μg/ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ  Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に50μＬ/ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性ITGA6B4抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％ スキムミルク / ０．０５％ ＮａＮ３/ ＰＢＳ)２００μＬ/ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記２ｎｄスクリーニングのファージの培養上清を１00μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ  ｉｎ  ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ2Ｏ2 を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ2ＳＯ2を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、可溶性ITGA6B4抗原と顕著な陽性反応を示すファージクローンのＤＮＡ配列を解析し、それぞれのＣＤＲ配列を確認し、独立配列を有するものを分類した。その結果、特に反応性の強い５抗体を選別し、PPMXITG−００１〜００５とした。【００７２】
PPMXITG−００１〜００５の重鎖第１相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１）、重鎖第２相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ２）、重鎖第３相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ３）、軽鎖第１相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１）、軽鎖第２相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ２）、及び軽鎖第３相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ３）を以下に示す。【００７３】
【表１】
0006552412.tif 000002
【００７４】
実施例３：ファージ抗体（ｓｃＦｖ）のIgG化抗体作製
（１）ITGA6B4ＩｇＧ抗体を発現するｐｌａｓｍｉｄの作製
ファージ抗体のIgG化はITGA6B4のＩｇＧ化を例として下記のように説明する。
ITGA6B4のファージ抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子はＶＨ-ＶＬの順で並んでおり、ＶＨとＶＬはリンカー以下の配列で接続したｓｃＦｖの構造をしている。
＜リンカー配列＞
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(配列番号３１)【００７５】
ITGA6B4のＶＨ,ＶＬで使用していると推定されるヒト生殖系列の遺伝子をＩＭＧＴ (*)で検索し(* ＩＭＧＴ : http://www.imgt.org)、  ＩＭＧＴの検索結果を参考にして、ファージ抗体のＩｇＧ化をおこなった。ITGA6B4のＶＨをヒトＩｇG１の定常領域と連結した。ITGA6B4のＶＬは5'側にＮｈｅＩ、3'側にＥｃｏＲＩを付加したH鎖、Ｌ鎖遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社で全合成した。。合成した重鎖、軽鎖の遺伝子はそれぞれ別々の発現ベクターに組み込んだ。すなわちH鎖、L鎖それぞれの人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗ITGA6B4抗体Ｈ鎖発現ベクター、およびＬ鎖発現ベクターを得た。
同様な方法で、他の抗体の発現ベクターを作製した。【００７６】
（２）ＩｇＧ抗体の一過性発現
ＩｇＧ抗体の一過性発現にはＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  （ライフテクノロジーズ）を用いた。遺伝子導入用浮遊細胞である２９３-Ｆ  （ライフテクノロジーズ）  は前日に継代した。トランスフェクション当日、一種類の抗体発現には、１ｘ１０6細胞／ｍＬの細胞濃度に調整した４００ｍＬの細胞懸濁液を準備した。これに抗体重鎖発現ベクターを１００  μｇ、軽鎖発現ベクターを１００μｇ合計２００μｇのプラスミドをＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭに懸濁した溶液（Ｉ）を調整した。次に２００μＬのＭＡＸ  ｒｅａｇｅｎｔを８ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭに加えた（溶液ＩＩ）。  溶液（Ｉ）と（ＩＩ）を混合して室温で１０分から２０分静置した。この合計１６ｍＬの反応液を２９３-F細胞を懸濁した４００ｍＬの２９３発現培地に加え、６日から７日間３７°C、８％ＣＯ2で細胞培養震盪機のＴＡＩＴＥＣ  ＢｉｏＳｈａｋｅｒ  ＢＲ-４３ＦＬで培養した。６日から７日間後、それぞれの組換え抗体を含む培養上清を回収し、これを材料に精製をおこなった。【００７７】
（３）ＩｇＧ抗体の精製
上記で発現した培養上清に含まれるＩｇＧ抗体タンパク質は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅを用いたＡｂ-Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ）アフィニティーカラムで精製した。得られたピークフラクションは、溶媒としてダルベッコのＰＢＳで平衡化したセファクリルＳ-３００カラムによるゲルろ過をして、さらに精製した。精製したＩｇＧ抗体タンパク質の定量は、吸光係数を用いて算出した。ＩｇＧ抗体の吸光係数はＥＸＰＡＳＹのＰｒｏｔＰａｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）に各抗体の全アミノ酸配列を用いて計算して求めた。【００７８】
（４）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による抗ITGA6B4ＩｇＧ抗体の定量
上記で発現させ、精製済みの抗ITGA6B4ＩｇＧ抗体生産細胞の培地上清に含まれる抗体や、精製した抗体の濃度は、吸光度による定量とともに、酵素免疫測定法（ELISA）による定量も行った。固相抗体としてプレートにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）（コスモバイオ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．；ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ-１１０ＵＤ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ（５μｇ／ｍＬの濃度）で加えて４℃で一昼夜静置した。次にブロックエースを２００μＬ／ｗｅｌｌで加えて室温で１時間ブロックした後、試料の抗体を段階希釈し、各ｗｅｌｌに加えて１時間インキュベーションして反応させた。ＰＢＳＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ)で５回洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（マウス、ウサギ、ウシ、マウスＩｇＧに対して吸収済み）-ＨＲＰ（コスモバイオ：ＡＱＩ，Ｃａｔ．Ａ-１１０ＰＤ）をＰＢＳＴで１００００倍希釈した検出抗体溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌの割合で加えた。１時間インキュベーション後、ＰＢＳＴで5回洗浄してから基質緩衝液TMBを１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えた。室温暗所で１5分間インキュベーションした後、反応停止液を１００μL/ｗｅｌｌの割合で加えて反応を停止してから、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。標準品として精製ヒトＩｇＧを用いて検量線を作成し、これを用いてヒト抗体の濃度を算出した。【００７９】
実施例４：ＩｇＧ化したITGA6B4抗体の細胞株への反応性
ITGA6B4発現細胞株、AML株USCD-AML1を用いて、ＩｇＧ化した抗ITGA6B4抗体の反応性を検討した。USCD-AML1細胞を遠心により回収した。回収した細胞をＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％ＮａＮ３  入りＰＢＳ）で細胞を１×１０6／ｍＬなるように懸濁し、この細胞懸濁液１００μＬを９６- ｗｅｌｌ Ｖ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３８９７）に分注した。それぞれの抗ITGA6B4ＩｇＧ抗体をＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで０．０２〜２μｇ／ｍＬに調製し、調製した抗体溶液１００μＬを細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣS  Ｂｕｆｆｅｒにより回洗浄した後、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  で７５０倍に希釈したＡｌｅｘａ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ）溶液１００μＬを添加し、更に４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  で遠心により２回洗浄した後、ＦＡＣS  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）のＨＴＳにセットして各ｗｅｌｌのＦＬ１蛍光強度を測定した。その結果各抗体（a:１０ｎｇ/ｍＬ；ｂ：１００ｎｇ/ｍＬ；ｃ：１μｇ/ｍＬ）がUSCD-AML1と強い反応性を示した。また、精製ITGA6B4抗原への反応性の消失が無いかも検討する為、実施例２と同様の手順でELISAを行い、その反応性を確認した。その一例を図４に示す。図４に示される様に、明らかな陽性反応が得られた。なお、ネガティブコントロール抗体として、同様の手順で作製された抗ハブ毒ヒトIgG抗体と、検出用抗体のみ（PBSと表記）を用いた。なお抗ITGA6B4抗体で示される抗体は代表例としてPPMXITG−００１である。【００８０】
実施例５：抗ITGA6B4抗体と高発現細胞株を使用した免疫沈降
（１）免疫沈降用固相化抗体の調製
まず、上記作製された抗ITGA6B4体溶液をカップリング緩衝溶液（0.1M NaHCO3-NaOH pH9）にて透析した。すなわち、抗体溶液を透析膜（Snake Skin Pleated Dialysis Tubing 10,000 MWCO）に封入し、これをカップリング緩衝溶液（0.1M NaHCO3-NaOH pH9）1.5Lに沈め、4℃でスターラーにて2〜3時間撹拌したのち、緩衝溶液を交換して更に2〜3時間透析した。その後もう一度緩衝溶液を交換して一昼夜透析した。【００８１】
次に固相化に使用する活性化CNBr-activated Sepharose 4Bを調製した。即ち、Amersham Biosciences社製CNBr-activated Sepharose 4Bを1mM HClにて膨潤させた後、アスピレーターで吸引した。これにカップリング緩衝溶液50mlを添加し撹拌してからアスピレーターで吸引し、吸引したまま更にカップリング緩衝溶液を加えた。
抗体の固相化は以下のようにして行った。即ち、5mgの抗体溶液10mlに対して活性化ゲル1mlを加え、室温にて2時間反応させた。反応終了後、ゲルをカラムに移し、カップリング緩衝溶液1mlにて10回洗浄し、未反応抗体の有無をO.D.測定により確認した。固相化ゲルは、0.2M Glycine-NaOH pH8溶液5mlにて2回置換し、さらに同液5mlを添加して室温にて2時間静置したのち、液を自然滴下し、これに0.2M Glycine-HCl pH3 5mlを添加して置換、さらに同液5ml添加し5分間静置したのち自然滴下した。最後にカラムをPBS 20mlにて置換したのち自然滴下し、1%NP40、プロテアーゼインヒビター、0.05%NaN3/PBSを添加してゲルを回収した。【００８２】
（２）細胞膜上蛋白のビオチン標識およびcell lysateの作製
培養肝がん細胞株のビオチン標識は以下のようにして行った。即ち、１０7〜１０8程度の細胞数まで培養した培養細胞PC14をPBSにて2回洗浄したのち、cell dissociation buffer(GIBCO社製)にて5mg/ml濃度に調整したcollagenaseI(GIBCO社製)を加えて、CO2インキュベーターにて37℃で反応させ、細胞を遊離させたのち、培地にて回収し、これをPBS(-)にて2回洗浄したのち、血球計算盤にて細胞数を算出し、約5x107/mlになるようPBS(-)にて懸濁した。これにPBSにて1mg/mlになるように調整したEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit（PIERCE社）を等量加え、室温にて30分静置したのち、PBSにて2回洗浄した。【００８３】
ビオチン標識細胞についてのcell lysateは以下のように調製した。即ち、上記のビオチン標識細胞に4mlのlysis buffer(1% NP40/detergent base solution, detergent base solutionの組成は20mM HEPES pH8.0, 140mM NaCl, プロテアーゼインヒビター)を加え、細胞を懸濁し、これを冷却しておいたダウンスホモジナイザーに入れてホモジナイズしたのち、溶液に1/2量(2ml)のdetergent mix solution（1%NP40, tritonX-100,b-D-Maltoside,n-Octyl b-D-Glucoside, ,n-Octyl b-D-Maltoside, ,n-Decyl b-D-Maltoside,デオキシコール酸各0.5%/detergent base solution）を加え4℃にて4時間回転混和した。この溶液を100,000rpmにて30分間遠心したのちMILLEX-GP 0.22μmフィルターにて濾過した。【００８４】
（３）免疫沈降反応
まず、固相化された抗体（以降、抗体ビーズと表記）約60μl分（溶液として約150μl）を2mlチューブに入れ、そこに4mM biotinを1/10 volume（15μl程）添加した。これに、培養皿0.5枚分のlysate (600μl)と60μlのbiotin液を混合したものを加え、4℃にて撹拌させながら数時間反応させた後、チューブを遠心（5500g,1分, 4℃）し、上清を除いた。これに洗浄用biotin/lysis-T buffer(0.5mM biotin, 0.1%Tween20/PBS)を800μl加え、転倒混和を２、３回行ったのち、チューブを遠心（5500g, 1分, 4℃）し、上清を除いた。この洗浄操作を再度行った後、抗体ビーズに溶出用クエン酸液（50mMクエン酸pH2.5）を30μl加え、撹拌したのち、チューブを遠心（5500g, 1min, 4℃）し、上清を回収した。残った抗体ビーズに再度溶出用クエン酸溶液を30μl加え、撹拌し、チューブを遠心（5500g, 1min, 4℃）し、上清を回収した。この溶出操作をさらに3回繰り返してサンプル溶液を回収し、それに3M Trisを加えて中和した。このサンプルをSDS-PAGEにて泳動し、銀染色にてバンドの確認を行った。このサンプルについては、同時にストレプトアビジン−HRP（Anti-Streptavidin, IgG Fraction, Conjugated to Peroxidase CORTEX biochem 社）を使用したウエスタンブロットを行いビオチン化された膜蛋白のバンドを検出した。その結果、図１に示される様に２本のバンドが検出された。図１に示される抗ITGA6B4抗体１，２，３抗体はそれぞれPPMXITG−００１、００４、００５である。【００８５】
実施例６  免疫沈降されたバンドについてのマススペクトル解析
（１）ゲル内トリプシン消化
上記実施例５にて検出された膜蛋白に対応する部分をゲル内でトリプシン消化し、ペプチドを回収した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従い行い、クマシーブリリアントブルーで染色することで得られたバンドを切り出した。これを200mM重炭酸アンモニウム-50%アセトニトリル溶液に浸し、37℃で45分間振盪後、溶液を廃棄して、同じ操作を2回繰り返すことでクマシーブリリアントブルーを除いた。このゲルを減圧乾燥し、それに40mM重炭酸アンモニウム(pH8.1)-10%アセトニトリルに溶かしたトリプシン（20μg/ml）をゲルスライスの単位面積（mm2）あたり4μl加えて、室温で1時間置いて充分に浸潤させた。これに先に加えた量の2.5倍量のトリプシン溶液を加えて、37℃で18時間静置した。これをポアサイズが0.22μmのフィルター付きチューブで濾過して、トリプシンにより抗原が切断されて生じたペプチドを回収した。【００８６】
（２）質量分析による抗原の同定
ゲル内トリプシン消化により得られた試料を、エレクトロスプレーイオン化方式イオントラップ四重極型質量分析装置につないだHPLCにかけた。HPLCの逆相クロマトグラフィーカラムから、0.1%TFAを含む0%から80%のアセトニトリルの直線濃度勾配変化により、疎水性の違いで順次溶出される各ペプチドをエレクトロスプレー法でイオン化し、各ペプチドの質量を分析した。【００８７】
同時に、それらのイオンの飛行経路の途中に置いたヘリウム原子との衝突により生じる各ペプチドの限定分解産物の質量を分析した。限定分解によりひとつのアミノ酸がはずれると、はずれたアミノ酸の質量分だけ小さいイオンが観測されるので、その質量差によりはずれたアミノ酸の種類を同定できる。さらにもうひとつアミノ酸がはずれると、はずれたアミノ酸の質量分だけ小さいイオンが観測されるので、その質量差によりはずれたアミノ酸の種類を同様に同定できる。同様の実験データ解析を進めることで、内部アミノ酸配列を決定することができる。得られたアミノ酸内部配列のセットを、公開されているアミノ酸配列データベースを用いて検索することにより、抗原の同定を行った。その結果、実施例５で得られた２本のバンドはそれぞれITGA6（図２）及びITGB4（図３）であることが示された。【００８８】
実施例７：抗ITGA6/B4抗体を用いた接着阻害能の解析
本発明の抗ITGA6/B4抗体による難治性白血病細胞株に対する接着性の阻害能を解析した。解析対象の細胞株として難治性白血病のマーカー分子の一つであるEVI1を高発現している細胞株を3株選定した。（UCSD/AML1、Kasumi-3、MOLM1、HNT34）。
基底膜マトリクスであるマトリゲル（BD Bioscience）をプレートにコートし、骨髄ニッチ類似の易接着性の環境下を作成した。この条件で抗体処理による接着性を比較し、その結果、抗ITGA6/B4抗体（PPMXITG−００１，００４，００５）の添加により、各抗体とも接着性が低下することが明らかとなった（図６）。【００８９】
実施例８：本発明の抗体の抗がん剤併用効果の検討実験
本発明の抗ITGA6/B4抗体は抗がん剤の効果を増強することが期待された。そこで難治性白血病細胞株であるUCSD/AML1、Kasumi3、MOLM1、HNT34を用い、白血病の治療に一般的に使われている抗がん剤であるAraC（シタラビン）、DXR（ドキソルビシン）、VP16（エトポシド）との併用による影響を検討した。
白血病細胞株に対し、抗がん剤単剤及び抗体との併用条件において、生存率を比較した。その結果、抗体（PPMXITG−００１、００４、００５）添加によるIC50の明らかな低減が確認された（図８−１及び８−２）。なお、図８−１はDXR（ドキソルビシン）とAML1細胞で行った併用効果測定試験の１例である。
このことより、抗ITGA6/B4抗体には、抗がん剤の効果を増強する働きがあると考えられ、より少量の抗がん剤で高い効果を上げられる事が示唆された。さらには抗がん剤の有効投与量を抑えることで副作用を低減させることも期待できた。【００９０】
（参考）
（１）アルキル化剤
イホスファミド、塩酸ニムスチン、塩酸プロカルバジン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテバなど
（２）代謝拮抗剤
シタラビン、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、テガフール、フルオロウラシルなど
（３）植物アルカロイド
エトポシド、イリノテカン、ドセタキシル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなど
（４）抗がん性抗生物質
アクチノマイシンＤ、イダルビシン、ドキソルビシン、ヒドラルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンＣなど
（５）白金系製剤
カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンなど
明細書内記載の製品名と略号の対応
AraC（シタラビン）：血液がんを中心に使われる。急性骨髄性白血病では第一選択。
DXR（ドキソルビシン）：リンパ腫に対して主に使われる。
VP16（エトポシド）：悪性リンパ腫、急性白血病に対して使われる。【００９１】
UCSD/AML1：Taetel UCSDにおいて樹立されたt(3;3)の核型を持つ細胞株。欧米人由来。
Kasumi3:広島大学において樹立されたt(3;7)の核型を持つ細胞株。日本人由来。
MOLM1: 林原研究所において樹立されたt(9;22), inv(3)の核型を持つ細胞株。日本人由来。
HNT34: 武蔵野病院において樹立されたt(3;3)の核型を持つ細胞株。日本人由来。【００９２】
実施例９：抗ITGA6B4抗体によるＡＭＬ１細胞株の細胞接着阻害能の解析
AML細胞株UCSD/AML1、 Kasumi3、MOLM1そしてHNT34の４株に対して細胞接着阻害実験を行った。基底膜マトリクスであるマトリゲル（BD Bioscience）をプレートにコートし、骨髄ニッチ類似の易接着性の環境下を作成し、抗体処理による接着性を比較した。
具体的には、細胞１００００個／１００μＬに対して、実施例２で選抜され実施例３、及び４で作製され、評価された抗ITGA6B4IgG抗体を使用し最終濃度が0〜10μｇ／ｍＬとなるように加え、４℃にて３０分間インキュベートした後、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで洗浄した。次いで、１００μＬのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳで懸濁し、マトリゲル（登録商標）がコートされてなる９６穴プレートのウェルに加え、３７℃にて２時間インキュベートした後、ＰＢＳにて３回洗浄を行なった。ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳを９０μＬ、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ ８（同仁科学研究所製）を１０μＬずつ加え、３７℃にて３０分間インキュベートした後、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍにて測定した。なお、コントロールとしては、未処理の細胞株を用いた。【００９３】
図７は、上述した細胞接着アッセイの結果を示すグラフである。図７に示すように、ＡＭＬ１細胞の細胞接着能（総細胞数に対する接着細胞数の比）は、PPMXITG−００１、PPMXITG−００４、PPMXITG−００５で優位に低下している事が示された。【００９４】
実施例１０：白血病幹細胞におけるITGA6B4の発現量の調査
ヒトの健常者並びに白血病患者におけるITGA6/B4のmRNAの発現パターンを、特許文献１に記載の方法に準じて解析した。難治性発決病の患者並びにボランティアより提供された血液において、造血幹細胞及び白血病幹細胞分画におけるITGA4/B1(VLA4)ならびにITGA6/B4の発現確認を実施した。その結果、図９に示されるデータが得られた。健常人由来 HSCは正常検体からのCD34+分画(Hematopoietic Stem Cell: HSC)、白血病患者由来 HSCは白血病患者検体からのCD34+分画、そして白血病患者由来 LSCは白血病患者検体からのCD34+CD38-分画(白血病幹細胞分画Leukemia Stem Cell: LSC)である。これにより、白血病患者においては、白血病幹細胞におけるITGA6とB4の発現が特に高く、治療標的として有用なことが改めて確認された。【００９５】
実施例１１：ITGA6及びITGB4遺伝子のshRNA導入による、抗体の反応性評価
本発明の抗体が、intactにがん細胞膜上に発現するITGA6B4複合体に反応していることを確認するため、ITGA6及びITGB4遺伝子のshRNA導入した細胞による、抗体の反応性評価を行った。具体的にはUCSD/AML1細胞株に対して、ITGA6及びITGB4遺伝子のmRNAを切断する活性を有するショートヘアピンRNA（shRNA）であるshITGA6及びshITGB4をトランスフェクションして各々の遺伝子の発現抑制を行った細胞株を用いて、FACSによる抗体の反応性の変化を評価した。shRNAを用いた遺伝子発現抑制細胞株作製の具体的手順並びにFACSによる抗体の反応性試験は、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法に準じて行った。【００９６】
また、ITGA６、ITGB4の市販品ポジティブコントロール抗体も非特許文献１に記載されている、抗ヒトITGA6ラット抗体（サンタクルーズ社）、抗ヒトITGB4マウス抗体（Millipore社）を使用した。
その結果、図１０に示される以下のデータが取得された。図に示される、未処理と示されるグラフはshRNA処理が行われていないもの、コントロールと示されているグラフはディテクション抗体＜anti-human IgG-Alexa647(Invitrogen)＞のみで処理したグラフそしてshITGA6並びにｓｈITGB4と示されるグラフはそれぞれの遺伝子に対しshRNAで発現抑制をしかけたサンプルのグラフを示す。
（１）shITGA6による遺伝子発現抑制の結果(UCSD/AML1;shITGA6)
ITGA6を発現抑制した結果、抗ITGB4ポジティブコントロールの反応性は変化せず（D.BL-ITGB4）、本発明の抗ITGA6B4抗体の反応性はほぼ消失した（A.PPMXIYG-001, B.PPMXITG-004, C.PPMXITG-005）。
（２）shITGB4による遺伝子発現抑制の結果(UCSD/AML1:shITGB4)
ITGB4を発現抑制した結果、抗ITGA6ポジティブコントロールの反応性は変化せず（D.BLITGA6）、本発明の抗ITGA6B4抗体の反応性はほぼ消失した（A.PPMXITG-001, B.PPMXITG-004, C.PPMXITG-005）。【００９７】
（３）発現抑制試験における結論と複合体特異的認識に対する結論及び解説
本実施例において、解析対象細胞であるAML1のITGA6及びB4の発現抑制は５０〜６０％程度の効率で行われた。発現抑制導入が成功した細胞はGFPによってgatingする事によって発現抑制された細胞のみを対象に解析可能である。これらを踏まえ、上記（１）、（２）に示される様に、本発明抗体はITGA6、ITGB4いずれの発現抑制試験においても反応性を消失しており、実施例２、４そして５の結果と合わせて、ITGA6B4の複合体のみを認識し、ITGA6、ITGB4の単独認識は行っていないことが示された。【００９８】
実施例１２：静脈移植モデルにおける抗体治療効果（浸潤抑制能）の検証
免疫不全マウス（NOGマウス）を用い、難治性白血病細胞UCSD/AML1,およびHNT34細胞株の静脈移植モデルを作製し、薬剤投与（AraC）、抗体投与、またその併用による骨髄浸潤抑制効果を検証した。マウス静脈に白血病細胞株を注入した後にPPMXITG-005を投与、その後実験体より臓器を取り出してヒト細胞の浸潤度を解析した。具体的には取り出した臓器をセルストレーナー(BD 352340)ですりつぶし、分離した細胞を取得した後に溶血試薬(BD 555899)により赤血球を溶血させる。1x106細胞を100μLのMACS Buffer (2mM EDTA, 5% BSAを含むPBS (-))に懸濁し、ヒト細胞を同定する為にhuman CD45抗体(PEラベル BioLegend 304008)で反応させた。その後MACS Bufferで洗浄3回を行い、 フローサイトメーター (BD FACS Calibur)にて評価した。
その結果、白血病細胞の骨髄への浸潤を指標として、開発抗体の併用または単剤による薬効を評価したところ、抗体の併用または単剤により、有意に骨髄への白血病細胞の浸潤が抑えられた。このことは、本抗体による骨髄ニッチへの生着阻害は細胞接着依存性の化学療法耐性獲得を阻害する上で有用であると考えられる（図１１）。【００９９】
実施例１３：ＩｇＧ化したITGA6B4抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖抑制効果
ITGA6B4発現細胞ＡＭＬ１およびＳＷ４８０、を１０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ密度になるよう培養液で調製し、９６ｗｅｌｌ平底プレート（ＮＵＮＣ  １６７００８）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ2、９５％空気で２４時間培養した後、１０μｇ／ｍＬのITGA6B4抗体を作製し、その１００μＬを、培養中のプレートに添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ2、 ９５％空気で９６時間培養した。培養終了後、Cell counting kit-8(DOJIN  CK04)を１０μL添加しさらに呈色を観察しながら数時間３７℃、５％ＣＯ2、 ９５％空気反応させる。その後プレートリーダーを用い、450 nmの吸光度を測定する
増殖率＝抗体添加したウェルの吸光度 / 抗体添加なしウェルの吸光度 Ｘ１００％
これらの解析結果から、各ITGA6B4抗体の細胞への増殖抑制効果は観察されなかった（図１２）。このことは抗体単独の作用では細胞に対して増殖を抑制するような薬効がないことを意味し、本発明の副作用の軽減に関して有効に働く事が示唆される。【０１００】
実施例１４：静脈移植モデルによる抗体・抗がん剤併用試験
in vivoにおける抗体・薬剤併用の効果を確認する為に静脈移植モデル実験を実施した。重度免疫不全マウス(NOGマウス: IL2RγKOマウス)に、白血病細胞株２種類（UCSD/AML1, HNT34）をそれぞれ静脈移植し、実験条件として無処理のコントロール、抗がん剤、抗体のそれぞれ単剤投与、抗体と抗がん剤併用、の４条件を検討した。投与条件は抗体を週１回3mg/kg、抗がん剤を週１回150mg/kgとし、各条件に付きn=5の生存率から薬効の検証を行った。その結果コントロールと抗体単剤投与群が同様の生存率に対し、薬剤単剤では生存率が上昇し、さらに抗体と併用した群においては抗がん剤単独に比べ有意に生存の延長が認められた（図１３）。【０１０１】
同様のマウス静脈投与における骨髄浸潤性を解析した実施例１２（図１１）の結果から総合すると、（１）抗体と抗がん剤の併用は、静脈に投与された白血病細胞の骨髄への浸潤を抑制する。（２）その結果としてマウスモデルにおいて生存率の回復が認められる。  という薬効薬理効果が考察され、本発明における抗体の有用性が根拠をもって示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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