(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃに結合する抗体であって、未分化多能性細胞に対して細胞傷害性であり、二価ＩｇＧ抗体またはその二価の断片であり、
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
を取り込む軽鎖可変領域；および
以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）
を取り込む重鎖可変領域を含む、前記抗体。
【請求項２】
寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＴＡＧ−Ａ１から産生される、モノクローナル抗体。
【請求項３】
重鎖および軽鎖可変領域配列を含み、
重鎖配列が、図１５Ａに示すＡ１Ｈ重鎖配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして
軽鎖配列が、図１５Ｂに示すＡ１Ｌ軽鎖配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する
請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項の抗体および少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項の抗体をコードする単離核酸。
【請求項６】
請求項５の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項の抗体を作製するための方法であって、請求項７の宿主細胞を、該抗体をコードするベクターの発現に適した条件下で培養し、そして該抗体を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
単数または複数の未分化多能性細胞を含有する試料において、こうした細胞を破壊するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、単数または複数の未分化多能性細胞を含有する細胞の試料を、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
単数または複数の未分化多能性細胞を含有する試料から、こうした細胞を取り除くｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、単数または複数の未分化多能性細胞を含有する細胞の試料を、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体と接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１１】
未分化多能性細胞、および分化を経たかまたは経ている細胞を含む混合物から、分化を経たかまたは経ている細胞を濃縮するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、該混合物を、請求項１〜３のいずれか１つに記載の抗体と、該抗体が未分化多能性細胞を殺すために十分な期間、接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
死んだ細胞から生存細胞を分離する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
未分化多能性細胞から分化した細胞を含有し、実質的に未分化多能性細胞を含有しない組成物を調製するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって：
（ｉ）未分化多能性細胞および未分化多能性幹細胞から分化した細胞を含む細胞集団を提供し；
（ｉｉ）該集団を、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体と、該抗体が未分化多能性細胞を殺すことを可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に残っている生存細胞を死んだ細胞から分離する；
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
分離された細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体に結合した未分化多能性細胞を含む、単離されていてもよい、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体。
【請求項１６】
寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＴＡＧ−Ａ１。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化多能性細胞に対して細胞傷害性である抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、初期段階ヒト胚の内部細胞塊から単離される１−４。これらは、無制限に複製可能であり（自己再生）５−８、そして適切な条件下で、三胚葉（外胚葉、内胚葉および中胚葉）４、９、１０すべての細胞に分化可能であることによって区別される。ますます多くの研究が、ｈＥＳＣの胚様体（ＥＢ）１１、ならびにいくつかの細胞系譜特異的細胞タイプ、例えば心筋細胞１２−１６、肝細胞１７、ニューロン１８−２２、内皮細胞２３−２８、骨芽細胞２９、３０、角化細胞３１および網膜色素上皮（ＲＰＥ）３２、３３への分化の成功を報告してきている。これらの成功は、糖尿病、心不全、パーキンソン病、変性性眼疾患、および骨格組織傷害などの多様な疾患を治療するために、組織操作および再生医学において、ｈＥＳＣが大きな潜在能力を持つことを立証した。しかし、大きな安全性の懸念として、腫瘍原性は、なおも、ｈＥＳＣに基づく療法の進展を妨げている３４−３６。簡潔には、ｈＥＳＣの腫瘍原性は、残った未分化ｈＥＳＣの存在による、分化した細胞産物における奇形腫（良性腫瘍）またはさらに奇形癌腫（悪性腫瘍）の形成を指す。
【０００３】
以前、ｈＥＳＣ集団を特徴付け、そして新規ｈＥＳＣ表面マーカーを発見するために、ｈＥＳＣに対する一団のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が生成された３７。ＷＯ２００７／１０２７８７およびＷＯ２０１０／０３３０８４を参照されたい。これらの抗体のうち、ｍＡｂ８４は未分化ｈＥＳＣを殺すことが可能であることが最初に見出された。しかし、ｍＡｂ８４はＩｇＭ五量体であるため、分子サイズが比較的大きく、そして凝集体を形成する傾向があるため、腫瘍塊内への浸透効率が妨げられる可能性があった。続いて、ｍＡｂ８４のより小さい抗体断片形式、ｓｃＦｖ８４−ＨＴＨが操作され、そして浸透が改善されていることがＬｉｍら３８によって立証された。しかし、ｈＥＳＣに対する細胞傷害性を同じレベルで達成するために、ｓｃＦｖ８４−ＨＴＨは、ｍＡｂ８４よりも２０倍多い量を必要とする。さらに、ｍＡｂ８４およびｓｃＦｖ８４−ＨＴＨは、多価または二価のいずれかであるため、著者は抗体の細胞傷害性はその価数と関連すると推測した。
【０００４】
ｈＥＳＣの腫瘍原性を防止するためには、いくつかの戦略３６、３７があり、これらは３つの段階に分類可能である。第一に、移植前段階において、ｈＥＳＣを望ましい細胞タイプに最終分化させるか、または多様なソーティング技術によって、分化した細胞産物から未分化細胞を除去することも可能である。第二に、初期移植後段階において、遺伝的操作または細胞傷害性薬剤などの方法で、腫瘍進行を中断させることも可能である。第三に、後期移植後段階において、操作された「自殺遺伝子」を所持すると検出された腫瘍を薬剤によって除去することも可能である。異なる段階で、未分化ｈＥＳＣまたは腫瘍形成を排除する多様な技術、ならびにそれらの利点および欠点を図１に要約する。しかし、これらの方法はいずれも、ｉｎ  ｖｉｖｏで、奇形腫または奇形癌腫形成を完全には排除可能ではない。
【０００５】
細胞傷害性抗体の適用は多様である。第一に、細胞傷害性抗体誘導性細胞死を細胞モデルとして用いて、分子および細胞機能を研究することも可能である。１９９５年、Ｂａｚｉｌらは、ヒト造血前駆細胞（ＨＰＣ）の表面接着分子ＣＤ４３を認識し、そしてＣＤ４３の架橋を通じてＨＰＣを直接殺す、モノクローナル抗体ＭＥＭ−５９を生成した６１。ＭＥＭ−５９誘導性ＨＰＣ死により、ＣＤ４３は、初期造血事象の負の制御因子と同定された。第二に、細胞傷害性抗体を用いて、細胞死の新規経路を同定し、そして細胞死を特徴付けることも可能である。Ｍａｔｓｕｏｋａらは、活性化インターロイキン２依存性Ｔ細胞の新規タイプの細胞死を誘導可能なモノクローナル抗体ＲＥ２を生成した６２。Ｚｈａｎｇらもまた、Ｊｕｒｋａｔ細胞に向けた細胞傷害性抗体、抗ポリミンを見出した６３。この研究において、彼らは細胞死のまさに最初の細胞表面受容体仲介性経路、ならびに細胞死に際しての細胞反応のいくつかのユニークな特徴、例えば細胞凝集、形質膜透過処理および膜ブレブを紹介した。第三に、先のセクションに言及するように、細胞傷害性抗体は、望ましくない細胞を除去するため、例えば癌治療に意図的に用いられてきている。Ｂリンパ球上のＣＤ２０抗原をターゲティングするモノクローナル抗体であるリツキシマブは、Ｂ細胞悪性腫瘍、例えば非ホジキンリンパ腫を、化学療法と組み合わせて治療するために認可された最初の細胞傷害性抗体であった６４。リツキシマブは、インキュベーション２０時間後、ヤギ抗ヒト二次抗体とハイパークロスリンクした際に細胞死を誘導する。何人かの患者におけるリツキシマブ耐性を克服するため、多くの次世代抗ＣＤ２０細胞傷害性抗体が生成されてきている６５、６６。ＧＡ１０１は、リソソーム内容物を細胞質および周囲環境にまき散らすことによってＢリンパ球死を誘導する、新規抗ＣＤ２０細胞傷害性抗体である６７。また、再発性腺癌細胞死を誘導するＲＡＶ１２６８および肺癌細胞を直接殺す抗ＮｅｕＧｃＧＭ３抗体６９、７０などの、他の細胞傷害性抗体もある。これらの細胞傷害性抗体は、すべて細胞死を誘導可能であるが、細胞死の様式は多様である（図２）。
【０００６】
長い間、プログラム細胞死はアポトーシスと同義に用いられてきており、そして腫瘍症は偶発的な細胞死と見なされてきた。しかし、この概念は常に正しいわけではないことが立証され７１、この場合、腫瘍症もまた、プログラム細胞死のパターンである可能性もある。実際、パターン（アポトーシスまたは腫瘍症）は細胞タイプおよび刺激の間で多様であるが、すべての細胞は、適切な刺激に際して、「プログラム」された細胞死を経験しうる７２、７３。一般的に、細胞は、致死性損傷に際して３つの期を経る７２：
ａ）可逆性「臨終期」；
ｂ）不可逆性細胞死、「復帰不能点」；
ｃ）死後自己溶解性および変性性変化。
【０００７】
異なるタイプの細胞死を区別する１つの方法およびその用語法は、細胞死の各期における細胞反応によってこれらを定義することである。臨終期において、細胞死の２つの主な様式：アポトーシスおよび腫瘍症がある。これらは主に、細胞体積改変および細胞形態変化によって区別される。アポトーシスおよび腫瘍症の特徴を、以下に詳細に論じる。対照的に、死後細胞変化の大部分は、「壊死」と称され７２、これは細胞死後の細胞変化を記述する古典的な用語である。
【０００８】
アポトーシスは、制御された細胞欠失のパターンを記述するため、Ｋｅｒｒらによって、１９７２年に最初に提唱された。正常な発生および細胞集団の制御において、アポトーシスは、有糸分裂と相補性であるが、反対の役割を演じると考えられた７４。アポトーシスの制御不全は、癌、アルツハイマーおよび自己免疫疾患などの多くの疾患を生じるであろう７５、７６。
【０００９】
アポトーシス・プロセスは、緊密に制御され、そして構築される。アポトーシスは、１セットの形態変化、例えば細胞収縮、核クロマチン凝縮および形質膜出芽、ならびに生化学的変化、例えばタンパク質切断、架橋、パターン化されたＤＮＡ断片化および食作用性認識によって特徴付けられる７７。アポトーシスは通常、誘発事象の１２〜２４時間後のカスパーゼ活性化で始まる。形質膜タンパク質および細胞骨格における変化は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）形質膜により核および細胞内小器官断片を被包する、アポトーシス小体の形成を生じるであろう７４、７８。続いて、外膜上に発現されるホスファチジルセリンを含むアポトーシス小体が認識され、そして隣接する細胞、特にマクロファージおよび内皮細胞によって貪食される。最終的に、細胞破片は組織から取り除かれて、炎症反応が回避される７８。一般的に、カスパーゼ活性化には３つの主要経路がある：受容体−リガンド結合を通じた外因性カスパーゼ−８活性化、ミトコンドリアを通じた内因性カスパーゼ−９活性化、および小胞体を通じたカスパーゼ−１２活性化７９。細胞死の他の様式からアポトーシスを区別するため、アポトーシスの特徴およびそれぞれのアッセイを図３に要約する。
【００１０】
腫瘍症は、Ｖｏｎ  Ｒｅｃｈｋｌｉｎｇ−ｈａｕｓｅｎによって、１９１０年に、膨張を伴う細胞死を記載するために最初に提唱され、そして後に、アポトーシスとは異なる虚血性細胞死を記載するために用いられた８０。傷害後、腫瘍症が数秒から数分以内に誘発されて、その後、初期段階において、顕著な細胞形状および体積改変が起こりうる７２。腫瘍症は、いくつかの形態学的および生化学的変化によって特徴付けられ、例えば細胞および小器官の明らかな膨張、巨視的空胞化、膜透過処理および細胞骨格タンパク質分解によって特徴付けられた７２、８０。アポトーシスの理解と比較すると、腫瘍症の機構はなお研究中である。ある研究は、形質膜のイオン性ポンプにおける不全、および細胞ＡＴＰレベルの減少が、腫瘍症の原因となっている可能性もあることを示してきている７３、８０。現在の理解では、腫瘍症は、図４Ａに要約するように、それぞれのアッセイで特徴を同定することによって検出可能である。
【００１１】
一般的に、アポトーシスおよび腫瘍症は臨終プロセスであり、これらは、死後壊死につながる可能性もある。アポトーシスおよび腫瘍症期の後、壊死期では、変化は同様であり、アポトーシス性壊死または腫瘍症壊死と称される。
【００１２】
上述のように、細胞傷害性抗体は、細胞死を誘導可能である。これらのいくつかの細胞傷害性抗体に関する研究は、細胞傷害性抗体とのインキュベーションに際して、細胞が、細胞死の異なる様式（アポトーシスまたは腫瘍症）を経ることを示してきている（図２）。
【００１３】
ＭＥＭ−５９は、細胞収縮およびＤＮＡ断片化が検出されるにつれて、造血前駆細胞におけるアポトーシスを誘導することが示された６１。別の抗体、リツキシマブもまた、インキュベーション１８〜２０時間後、非ホジキンリンパ腫アポトーシスを誘導する。他の検出されるアポトーシス特徴には、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶによって検出されるホスファチジルセリン曝露、およびカスパーゼ−３活性増加が含まれる６４。
【００１４】
また、細胞において腫瘍症を誘導する抗体もある。ＲＡＶ１２処理腺癌細胞の迅速な膨張は、１時間以内に観察された８１。タイムラプス顕微鏡検査下で、膜損傷が検出され、その後、細胞膨張が見られた。さらに、アクチン細胞骨格破壊およびＬＤＨ上昇もまた、ＲＡＶ１２処理に際して観察された。抗体誘導性腫瘍症の別の例は、抗ポリミンである６３。抗ポリミン処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の膜透過性増加が、ＰＩ取り込みによって検出された。さらに、細胞膜上の孔の形成もまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）下で視覚化された。孔ポリミン誘導性腫瘍症の別の特徴は、細胞骨格タンパク質の再編成である。より明らかな例は、腫瘍症を通じたｍＡｂ８４誘導性ｈＥＳＣ死である。研究はまた、ｍＡｂ８４誘導性ｈＥＳＣ死のいくつかの腫瘍症性の特徴、例えば迅速な細胞死、細胞凝集の形成、膜完全性の喪失およびアクチン細胞骨格関連タンパク質の分解も示した８２。しかし、多くの言及した研究に関して、細胞死の様式は同定されたが、抗体誘導性細胞死の詳細な機構はなお不明である。
【００１５】
ＷＯ２０１２／０１１８７６は、抗体が結合するポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）を発現する細胞に対する細胞傷害性活性を有する候補として、抗体を選択する方法であって、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンへのＰＯＤＸＬ結合抗体分子の結合を、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンへの非細胞傷害性ＰＯＤＸＬ結合抗体分子の結合と比較する工程を含む、前記方法を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１０２７８７
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０３３０８４
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０１１８７６
【発明の概要】
【００１７】
本発明の１つの側面において、抗体を提供し、該抗体のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ｉ）〜ｉｉｉ）、またはアミノ酸配列ｉｖ）〜ｖｉ）、または好ましくはアミノ酸配列ｉ）〜ｖｉ）：
ｉ）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ｉｉ）ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ｉｉｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
ｉｖ）ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ｖ）ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ｖｉ）ＦＧＹ（配列番号６）
あるいは配列（ｉ）〜（ｖｉ）の１またはそれより多くにおける１または２または３のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、その変異体
を含むことも可能である。
【００１８】
抗体は、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
を取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むことも可能である。
【００１９】
抗体は、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）
を取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を含むことも可能である。
【００２０】
抗体は、図１５に示すＣＤＲを取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むことも可能である。抗体は、図１５に示すＣＤＲを取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を含むことも可能である。
【００２１】
抗体は、図１５に示すアミノ酸配列、あるいは図１５に示すｍＡｂ  Ａ１のＶＬ鎖アミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むことも可能である。
【００２２】
抗体は、図１５に示すアミノ酸配列、あるいは図１５に示すｍＡｂ  Ａ１のＶＨ鎖アミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖可変領域を含むことも可能である。
【００２３】
抗体は、図１５に示すようなアミノ酸配列（あるいは図１５に示すｍＡｂ  Ａ１のＶＬ鎖アミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列）を含む、少なくとも１つの軽鎖可変領域、および図１５に示すようなアミノ酸配列（あるいは図１５に示すｍＡｂ  Ａ１のＶＨ鎖アミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列）を含む、少なくとも１つの重鎖可変領域を含むことも可能である。
【００２４】
抗体は、場合によって、１またはそれより多いグリコシル化タンパク質に結合することも可能であり、ここで、グリコシル化は、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含む。
【００２５】
本発明の別の側面において、グリコシル化タンパク質に結合する抗体であって、グリコシル化が、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含む、前記抗体を提供する。抗体は、場合によって、上述のようなアミノ酸配列構成要素を有することも可能である。
【００２６】
本発明の任意の側面において、抗体は、好ましくは未分化多能性細胞に対して細胞傷害性である。未分化多能性細胞との接触に際して、該抗体は、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、２分未満または１分未満の１つで、細胞を殺すことも可能である。
【００２７】
本発明の任意の側面において、抗体は、好ましくは、未分化多能性細胞から分化した細胞よりも、未分化多能性細胞に特異的に結合する。例えば、抗体は、未分化多能性細胞（単数または複数）から形成される胚様体よりも、未分化多能性細胞に対する特異的結合を示す。
【００２８】
本発明の１つの側面において、単離重鎖可変領域ポリペプチドを提供し、重鎖可変領域ポリペプチドは、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）
を含む。
【００２９】
本発明の１つの側面において、抗体を提供し、該抗体は、重鎖および軽鎖可変領域配列を含み：
それぞれ、重鎖は、ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）、ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）、ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）に少なくとも８５％の全体の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、そして軽鎖は、ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）、ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）に少なくとも８５％の全体の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、配列同一性の度合いは、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つであることも可能である。
【００３１】
本発明の別の側面において、重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、場合によって単離された抗体を提供し、ここで：
重鎖配列は、図１５Ａに示すＡ１Ｈ重鎖配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有し、そして
軽鎖配列は、図１５Ｂに示すＡ１Ｌ軽鎖配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００３２】
いくつかの態様において、配列同一性の度合いは、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の１つであることも可能である。
【００３３】
いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、ＣＤＲ間の可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む。フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来することも可能である。
【００３４】
本発明の１つの側面において、場合によって本明細書に記載するような重鎖可変領域ポリペプチドと組み合わされた、単離軽鎖可変領域ポリペプチドを提供し、軽鎖可変領域ポリペプチドは、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、抗体またはポリペプチドは、ＣＤＲ間の可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列に由来することも可能である。
【００３６】
本発明の別の側面において、組成物、例えば薬学的組成物または薬剤を提供する。組成物は、本明細書に記載するような抗体またはポリペプチド、および少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアー、賦形剤、アジュバントまたは希釈剤を含むことも可能である。
【００３７】
抗体はＩｇＧであることも可能である。該抗体は、約１４０〜１６０ｋＤａ、好ましくは約１５０ｋＤａの分子量を有することも可能である。
いくつかの態様において、好ましい抗体は二価である。
【００３８】
いくつかの態様において、抗体はｍＡｂ  Ａ１であることも可能である。
抗体ｍＡｂ  Ａ１は、ハイブリドーマ細胞ＴＡＧ−Ａ１から産生され、該細胞は、Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １  Ｆｕｓｉｏｎｏｐｌｏｉｓ  Ｗａｙ，  ＃２０−１０  Ｃｏｎｎｅｘｉｓ，  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  １３８６３２によって、２０１４年３月２０日、寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４の下に、ブダペスト条約の条項にしたがって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州マナサスに寄託されている。
【００３９】
したがって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４で寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＴＡＧ−Ａ１を提供する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４で寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＴＡＧ−Ａ１から産生されるモノクローナル抗体を提供する。
【００４０】
抗体は、好ましくは、１より多いグリコシル化タンパク質抗原、特に未分化多能性細胞中に、または該細胞上に存在するグリコシル化タンパク質抗原に対して、特異的な結合を示し、ここで、タンパク質抗原上のグリコシル化は、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含む。このモチーフは、場合によってより大きいグリカンの一部として存在してもよいし、または完全グリカンに相当してもよい。グリカンは、好ましくは、タンパク質にＯ連結されることも可能である。
【００４１】
多能性細胞は、細胞中および／または細胞表面上のいずれかに、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを有する、１またはそれより多いグリコシル化タンパク質を発現することも可能である。本明細書において、未分化多能性細胞は、未分化多能性幹細胞であることも可能である。好ましくは、これらはヒトまたは哺乳動物である。
【００４２】
本発明の別の側面において、本明細書記載の抗体またはポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
本発明の１つの側面において、本明細書記載の核酸を含むベクターを提供する。本発明の別の側面において、ベクターを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞は、真核、または哺乳動物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、またはヒトであってもよく、あるいは原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）であってもよい。
【００４３】
本発明の１つの側面において、本明細書記載の抗体またはポリペプチドを作製するための方法であって、本明細書記載の宿主細胞を、抗体またはポリペプチドをコードするベクターの発現に適した条件下で培養し、そして抗体またはポリペプチドを回収する工程を含む、前記方法を提供する。
【００４４】
本発明の別の側面において、単数または複数の未分化多能性細胞を含有する試料において、こうした細胞を破壊する方法であって、未分化多能性細胞を含有する細胞の試料を、本発明記載の抗体と接触させる工程を含む、前記方法を提供する。
【００４５】
本発明の別の側面において、単数または複数の未分化多能性細胞を含有する試料から、こうした細胞を取り除く方法であって、未分化多能性細胞を含有する細胞の試料を、本発明記載の抗体と接触させる、前記方法を提供する。
【００４６】
本発明の別の側面において、未分化多能性細胞、および分化を経たかまたは経ている細胞を含む混合物から、分化を経たかまたは経ている多能性細胞を濃縮する方法であって、混合物を、本発明記載の抗体と、該抗体が未分化多能性細胞を殺すために十分な期間、接触させる工程を含む、前記方法を提供する。方法は、死んだ細胞から生存細胞を分離する工程をさらに含むことも可能である。
【００４７】
本発明の別の側面において、未分化多能性細胞から分化した細胞を含有し、実質的に未分化多能性細胞を含有しない組成物を調製する方法であって：
（ｉ）未分化多能性細胞および未分化多能性幹細胞から分化した細胞を含む細胞集団を提供し；
（ｉｉ）該集団を、本発明記載の抗体と、該抗体が未分化多能性細胞を殺すことを可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に残っている生存細胞を死んだ細胞から分離する；
工程を含む、前記方法を提供する。
【００４８】
該方法は、（ｉｉｉ）由来の分離された細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含むことも可能である。
本発明の別の側面において、本発明記載の抗体に結合した未分化多能性細胞を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体を提供する。該複合体を単離してもよい。
【００４９】
本発明記載の方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行可能である。該方法は、細胞および抗体を、該抗体が細胞傷害性効果を発揮するために十分である、あらかじめ決定された期間、一緒にインキュベーションする工程を含むことも可能である。こうした期間は、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、または少なくとも６０分間の１つであることも可能である。
【００５０】
本発明の別の側面において、細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、患者に、未分化多能性細胞から分化した細胞を含有する組成物を投与する工程を含み、該組成物が実質的に未分化多能性細胞を含有せず、組成物が本明細書記載の方法によって得られる、前記方法を提供する。
【００５１】
細胞療法を必要とする患者を治療するための薬剤製造において、本明細書記載の方法によって得られる未分化多能性細胞から分化した細胞の使用もまた提供する。
細胞療法を必要とする患者を治療する際の使用のための、未分化多能性細胞から分化し、そして本明細書記載の方法によって得られる単数または複数の細胞もまた、提供する。
【００５２】
図面の簡単な説明
本発明の原理を例示する態様および実験を、ここで、付随する図を参照しながら論じる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｈＥＳＣ腫瘍原性を防止する方法の概観を示す表。
【図２】特定のターゲット細胞において、細胞死を誘導することが可能な細胞傷害性抗体を示す表。
【図３】アポトーシスの特徴およびそれぞれのアッセイを示す表。
【図４−１】（Ａ）腫瘍症の特徴およびそれぞれのアッセイ、ならびに（Ｂ）腫瘍症およびアポトーシスの間の相違を示す表。
【図４−２】（Ａ）腫瘍症の特徴およびそれぞれのアッセイ、ならびに（Ｂ）腫瘍症およびアポトーシスの間の相違を示す表。
【図５】ｈＥＳＣおよびｉＰＳ（ＥＳＩＭＲ９０）細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すチャート。（左）ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞（ＥＳＩＭＲ９０）へのＡ１の結合。（右）ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞両方に対するＡ１の細胞傷害性。左のバーは、未処理対照を示し、そして右のバーは、Ａ１処理細胞を示す。
【図６−１】分化したｈＥＳＣに対するＡ１のフローサイトメトリー分析。ＥＢ形成（ａ）およびＦＧＦ−２飢餓（ｂ）を通じて、ｈＥＳＣから分化した細胞へのＡ１の結合を示すＦＡＣｓチャート。ＥＢ形成（ｃ）およびＦＧＦ−２飢餓（ｄ）を通じて、ｈＥＳＣから分化した細胞に対するＡ１の細胞傷害性を示すチャート。
【図６−２】分化したｈＥＳＣに対するＡ１のフローサイトメトリー分析。ＥＢ形成（ａ）およびＦＧＦ−２飢餓（ｂ）を通じて、ｈＥＳＣから分化した細胞へのＡ１の結合を示すＦＡＣｓチャート。ＥＢ形成（ｃ）およびＦＧＦ−２飢餓（ｄ）を通じて、ｈＥＳＣから分化した細胞に対するＡ１の細胞傷害性を示すチャート。
【図７】ｈＥＳＣに対するＡ１およびｍＡｂ８４両方の細胞傷害性が投薬量依存性であることを示すチャート。
【図８】ｈＥＳＣに対するＡ１およびｍＡｂ８４の細胞傷害性が時間依存性であることを示すチャート。
【図９】Ａ１細胞傷害性の動力学のフローサイトメトリー分析を示すチャート。（ａ）１０分ごとに０．２５μｇ〜４μｇのＡ１の多様な投薬量で細胞を処理した。（ｂ）２分ごとに０．５μｇ〜２μｇのＡ１の多様な投薬量で細胞を処理した。
【図１０】ｍＡｂ８４およびＡ１の間の競合的阻害のフローサイトメトリー分析を示すＦＡＣＳチャート。（ａ）処理を伴わない二重陰性対照；（ｂ）Ａ１に関する陽性対照：細胞をＡ１で処理し、そしてＦＩＴＣで標識した；（ｃ）ｍＡｂ８４に関する陽性対照：細胞をｍＡｂ８４で処理し、そしてＡＰＣで標識した；（ｄ）細胞をＡ１およびｍＡｂ８４で同時に処理した；（ｅ）細胞を、Ａ１に先行して、まずｍＡｂ８４で処理した；（ｆ）細胞を、ｍＡｂ８４に先行して、まずＡ１で処理した。
【図１１−１】それぞれ、（Ａ）４０ｋＤａ、（Ｂ）７０ｋＤａおよび（Ｃ）２０００ｋＤａデキストランビーズでの孔サイズの決定を示すチャート。細胞をｍＡｂ８４、ｍＡｂ８５とインキュベーションするか、またはいかなるｍＡｂでも処理せず、その後、蛍光デキストランビーズで処理した。陽性対照として、細胞を固定し、そして透過処理した。細胞内蛍光の増加は細胞内へのデキストランビーズの進入と相関する。高い蛍光を持つ細胞集団をゲート処理し、そして割合をグラフ中に示す。
【図１１−２】それぞれ、（Ａ）４０ｋＤａ、（Ｂ）７０ｋＤａおよび（Ｃ）２０００ｋＤａデキストランビーズでの孔サイズの決定を示すチャート。細胞をｍＡｂ８４、ｍＡｂ８５とインキュベーションするか、またはいかなるｍＡｂでも処理せず、その後、蛍光デキストランビーズで処理した。陽性対照として、細胞を固定し、そして透過処理した。細胞内蛍光の増加は細胞内へのデキストランビーズの進入と相関する。高い蛍光を持つ細胞集団をゲート処理し、そして割合をグラフ中に示す。
【図１２−１】ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の分析。（ａ）過ヨウ素酸塩処理を伴う／伴わない；（ｃ）シアリダーゼ、ＰＮＧアーゼおよびβ脱離処理を伴う／伴わない；（ｆ）糖ブロックＡ１またはｍＡｂ８４を伴う／伴わない、免疫沈降Ａ１抗原のウェスタンブロット分析。ｈＥＳＣに対する糖ブロックＡ１またはｍＡｂの結合（ｄ）および殺傷（ｇ）のフローサイトメトリー分析。（ｂ）ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の４つの分類。（ｅ）ｈＥＳＣ上のＡ１の結合および殺傷をブロックする３つのグリカンの模式的構造。共通のグリカンモチーフを円で強調する。
【図１２−２】ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の分析。（ａ）過ヨウ素酸塩処理を伴う／伴わない；（ｃ）シアリダーゼ、ＰＮＧアーゼおよびβ脱離処理を伴う／伴わない；（ｆ）糖ブロックＡ１またはｍＡｂ８４を伴う／伴わない、免疫沈降Ａ１抗原のウェスタンブロット分析。ｈＥＳＣに対する糖ブロックＡ１またはｍＡｂの結合（ｄ）および殺傷（ｇ）のフローサイトメトリー分析。（ｂ）ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の４つの分類。（ｅ）ｈＥＳＣ上のＡ１の結合および殺傷をブロックする３つのグリカンの模式的構造。共通のグリカンモチーフを円で強調する。
【図１２−３】ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の分析。（ａ）過ヨウ素酸塩処理を伴う／伴わない；（ｃ）シアリダーゼ、ＰＮＧアーゼおよびβ脱離処理を伴う／伴わない；（ｆ）糖ブロックＡ１またはｍＡｂ８４を伴う／伴わない、免疫沈降Ａ１抗原のウェスタンブロット分析。ｈＥＳＣに対する糖ブロックＡ１またはｍＡｂの結合（ｄ）および殺傷（ｇ）のフローサイトメトリー分析。（ｂ）ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の４つの分類。（ｅ）ｈＥＳＣ上のＡ１の結合および殺傷をブロックする３つのグリカンの模式的構造。共通のグリカンモチーフを円で強調する。
【図１２−４】ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の分析。（ａ）過ヨウ素酸塩処理を伴う／伴わない；（ｃ）シアリダーゼ、ＰＮＧアーゼおよびβ脱離処理を伴う／伴わない；（ｆ）糖ブロックＡ１またはｍＡｂ８４を伴う／伴わない、免疫沈降Ａ１抗原のウェスタンブロット分析。ｈＥＳＣに対する糖ブロックＡ１またはｍＡｂの結合（ｄ）および殺傷（ｇ）のフローサイトメトリー分析。（ｂ）ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の４つの分類。（ｅ）ｈＥＳＣ上のＡ１の結合および殺傷をブロックする３つのグリカンの模式的構造。共通のグリカンモチーフを円で強調する。
【図１２−５】ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の分析。（ａ）過ヨウ素酸塩処理を伴う／伴わない；（ｃ）シアリダーゼ、ＰＮＧアーゼおよびβ脱離処理を伴う／伴わない；（ｆ）糖ブロックＡ１またはｍＡｂ８４を伴う／伴わない、免疫沈降Ａ１抗原のウェスタンブロット分析。ｈＥＳＣに対する糖ブロックＡ１またはｍＡｂの結合（ｄ）および殺傷（ｇ）のフローサイトメトリー分析。（ｂ）ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原の４つの分類。（ｅ）ｈＥＳＣ上のＡ１の結合および殺傷をブロックする３つのグリカンの模式的構造。共通のグリカンモチーフを円で強調する。
【図１３】糖阻害アッセイで用いる糖タイプの図示。
【図１４】ｈＥＳＣに対する糖ブロックＡ１またはｍＡｂ８４の結合（ｄ）のフローサイトメトリー分析を示すチャート。
【図１５−１】ｍＡｂ８４（上列）およびＡ１（下列）の間の可変領域のアミノ酸配列の整列および相違。（Ａ）完全重鎖、（Ｂ）完全軽鎖。ＣＤＲ配列を太字で示す。Ａ１  ＣＤＲの配列中の相違を下線で示す。
【図１５−２】ｍＡｂ８４（上列）およびＡ１（下列）の間の可変領域のアミノ酸配列の整列および相違。（Ａ）完全重鎖、（Ｂ）完全軽鎖。ＣＤＲ配列を太字で示す。Ａ１  ＣＤＲの配列中の相違を下線で示す。
【図１６】未処理およびＡ１処理ｈＥＳＣの透過型電子顕微鏡写真。未処理ｈＥＳＣは均一に分布し（ａ）、そして直径約１０μｍの規則的なサイズおよび均一に染色されるタンパク質を有した；（ｃ）Ａ１処理ｈＥＳＣは同型接着を形成する；（ｄ）４細胞によって形成される同型接着のユニット；細胞は均一には染色されず、そして異なる度合いで膜および細胞完全性を失った；２つの膨張している細胞に関して直径を示した；（ｅ）ミトコンドリアの膨張およびミトコンドリアの細胞間接着部位への末梢再局在（黄色い円）。（ｆ）３細胞によって形成される同型接着の別のユニット；赤で囲んだ細胞は膨張しており、ミトコンドリアが有意に濃縮され（円）、そして細胞質の空胞化（矢印）が見られる；（ｇ）よく発達したクリステを示すミトコンドリアの拡大図、細胞がエネルギー産生期であることを示唆する。
【図１７】未処理ｈＥＳＣの走査型電子顕微鏡写真。（ａ１、上部左）未処理ｈＥＳＣは、正常に分布し、そして均一な細胞サイズを有する；（ａ２、下部左）未処理ｈＥＳＣ表面上の滑らかな膜輪郭および豊富な微絨毛；（ａ３、右）損なわれていない細胞膜の拡大図および微絨毛の提示。
【図１８】Ａ１処理ｈＥＳＣの走査型電子顕微鏡写真。（ｂ１、上部左）Ａ１処理ＥＳＣは同型接着を形成する；（ｂ２、中央左）Ａ１処理ｈＥＳＣは、膜孔を形成し、そして微絨毛を喪失した；（ｂ３、上部右）膜領域は多くの孔を形成し、そして微絨毛を完全に喪失した；（ｂ４、下部左）膜領域は膜完全性および微絨毛を部分的に喪失した；（ｂ５、下部右）膜領域はなお損なわれておらず、そして微絨毛に覆われている。
【図１９】Ａ１処理ｈＥＳＣの膨張および収縮を示す走査型電子顕微鏡写真。（左）Ａ１処理ｈＥＳＣのサイズは１０μｍより大きい；（右）Ａ１処理ｈＥＳＣのサイズは１０μｍより小さい。
【図２０】アクチン細胞骨格再編成およびｈＥＳＣに対するＡ１細胞傷害性の関連。（ａ）アクチン阻害剤（サイトカラシンＢ、サイトカラシンＤおよびラトランクリンＡ）での処理が、ｈＥＳＣに対するＡ１細胞傷害性を防止しうることを示すチャート。対照＝アクチン阻害剤処理を伴わないｈＥＳＣ。（ｂ）Ａ１処理に際してのアクチン細胞骨格関連タンパク質のウェスタンブロット分析。
【図２１−１】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ細胞死はアポトーシスを介してではない。Ａ１処理ｈＥＳＣに対する２つのアポトーシスアッセイのフローサイトメトリー分析を示すチャート。ＤＮＡ断片化および増加したアポトーシス活性は、アポトーシスを経ている細胞の特徴である。ＵＶへの曝露は、ｈＥＳＣのアポトーシスを導く。（Ａ）ＴＵＮＥＬアッセイは、ＤＮＡ断片化を測定する：ＵＴＰ陽性細胞は、ＤＮＡ断片化増加に相関した；（ＢおよびＣ）カスパーゼアッセイは、カスパーゼ９およびカスパーゼ３＆７の活性を測定する。同時に、細胞死を７−ＡＡＤ取り込みによって測定する。
【図２１−２】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ細胞死はアポトーシスを介してではない。Ａ１処理ｈＥＳＣに対する２つのアポトーシスアッセイのフローサイトメトリー分析を示すチャート。ＤＮＡ断片化および増加したアポトーシス活性は、アポトーシスを経ている細胞の特徴である。ＵＶへの曝露は、ｈＥＳＣのアポトーシスを導く。（Ａ）ＴＵＮＥＬアッセイは、ＤＮＡ断片化を測定する：ＵＴＰ陽性細胞は、ＤＮＡ断片化増加に相関した；（ＢおよびＣ）カスパーゼアッセイは、カスパーゼ９およびカスパーゼ３＆７の活性を測定する。同時に、細胞死を７−ＡＡＤ取り込みによって測定する。
【図２２−１】ＳＥＭ下での、ｈＥＳＣの段階的形態変化。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）下での、Ａ１によって誘発された５段階ｈＥＳＣ形態変化を示す走査型電子顕微鏡写真。（Ａ）未処理ｈＥＳＣは均一な形状、豊富な微絨毛および損なわれていない膜を有する；（Ｂ、左）段階１でのＡ１処理ｈＥＳＣ：膜は比較的損なわれていないが、分解された／短くなった微絨毛および細胞膨張が見られる；（Ｂ、右）融合した微絨毛は、段階１から段階２への遷移である可能性がある；（Ｃ、左）段階２でのＡ１処理ｈＥＳＣ：多様なサイズの膜孔の形成、および強調するような円形の部分的に損傷を受けた膜領域；（Ｃ、右）この円形領域は、通常、融合した微絨毛によって取り囲まれ、一方、この領域内には、微絨毛はなく、細胞骨格様構造が存在する；（Ｄ、左）段階３のＡ１処理ｈＥＳＣ：微絨毛がさらに短くなるかまたは完全に消失する；（Ｄ、右）円形領域周囲の融合した微絨毛、ならびに細胞骨格様構造の消失；（Ｅ、左）段階４のＡ１処理ｈＥＳＣ：大規模な膜損傷；（Ｅ、右）膜損傷は、段階３の損傷を受けた円形領域から悪化し、そして可視核は、大規模な細胞骨格構造に覆われた；（Ｅ、左）段階５のＡ１処理ｈＥＳＣ：損傷を受けた膜が核から剥がれ落ちる；（Ｆ、右）Ａ１処理ｈＥＳＣの覆いが取れた核。細胞膨張および膜孔の形成は、腫瘍性細胞死の特徴である。スケールバー＝１μｍ。
【図２２−２】ＳＥＭ下での、ｈＥＳＣの段階的形態変化。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）下での、Ａ１によって誘発された５段階ｈＥＳＣ形態変化を示す走査型電子顕微鏡写真。（Ａ）未処理ｈＥＳＣは均一な形状、豊富な微絨毛および損なわれていない膜を有する；（Ｂ、左）段階１でのＡ１処理ｈＥＳＣ：膜は比較的損なわれていないが、分解された／短くなった微絨毛および細胞膨張が見られる；（Ｂ、右）融合した微絨毛は、段階１から段階２への遷移である可能性がある；（Ｃ、左）段階２でのＡ１処理ｈＥＳＣ：多様なサイズの膜孔の形成、および強調するような円形の部分的に損傷を受けた膜領域；（Ｃ、右）この円形領域は、通常、融合した微絨毛によって取り囲まれ、一方、この領域内には、微絨毛はなく、細胞骨格様構造が存在する；（Ｄ、左）段階３のＡ１処理ｈＥＳＣ：微絨毛がさらに短くなるかまたは完全に消失する；（Ｄ、右）円形領域周囲の融合した微絨毛、ならびに細胞骨格様構造の消失；（Ｅ、左）段階４のＡ１処理ｈＥＳＣ：大規模な膜損傷；（Ｅ、右）膜損傷は、段階３の損傷を受けた円形領域から悪化し、そして可視核は、大規模な細胞骨格構造に覆われた；（Ｅ、左）段階５のＡ１処理ｈＥＳＣ：損傷を受けた膜が核から剥がれ落ちる；（Ｆ、右）Ａ１処理ｈＥＳＣの覆いが取れた核。細胞膨張および膜孔の形成は、腫瘍性細胞死の特徴である。スケールバー＝１μｍ。
【図２３】ｈＥＳＣへのｍＡｂ  Ａ１またはｍＡｂ８４の結合に対する糖の影響を示す表。
【図２４】化学量論アッセイにおいて未結合Ａ１および結合Ａ１の量の間の関連、ならびにＡ１の異なる初期量でのｈＥＳＣに対する対応するＡ１殺傷を示すグラフ。（Ａ）ｈＥＳＣあたりのＡ１分子数を化学量論アッセイから測定した。フローサイトメトリーを通じて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって、Ａ１殺傷を測定した。結合飽和および殺傷飽和点を垂直の点線で強調する。結合飽和および殺傷飽和は同じ点で達成され、ここで、ｈＥＳＣあたり、約３．０ｘ１０７  Ａ１分子がある。（Ｂ）結合したＡ１の量は、化学量論アッセイから測定される、Ａ１の初期量および未結合Ａ１の量の間の差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）である。飽和Ａ１殺傷点を垂直な点線で強調する。殺傷飽和は、未結合Ａ１の量が結合Ａ１の量よりも有意に高い場合にのみ達成される。
【図２５−１】Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化は、阻害剤処理に際して部分的に阻害された。ツニカマイシンおよびベンジル−ａ−ＧａｌＮａｃを用いて、それぞれ、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化を阻害した。異なる治療条件におけるＨＥＳ−３をビオチン・コンジュゲート化コンカナバリンＡ（Ａ）またはＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂ（Ｂ）で染色した。ＣｏｎＡは、Ｎ連結グリカンに特異的に結合し、そしてＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂは、ｈＥＳＣ上のＯ連結グリカンエピトープを認識する。細胞に結合したレクチンまたは抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化ストレプトアビジンまたは抗マウス抗体で検出した。影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。（Ａ）ツニカマイシン処理の影響を示す結合ヒストグラム、ビオチンコンジュゲート化ＣｏｎＡの結合ヒストグラムは、左方向にシフトし、これは、Ｎ−グリコシル化の減少を示した。（Ｂ）Ｂ−ＧａｌＮａｃ処理の影響を示す結合ヒストグラム、Ｔｒａ−１−６０に対するｍＡｂの結合ヒストグラムは、左方向にシフトし、これは、Ｏ−グリコシル化の減少を示した。（Ｃ）阻害剤処理に際して、ｈＥＳＣ多能性における変化はない。異なる処理条件におけるＨＥＳ−３をＯｃｔ３／４に対するｍＡｂで染色した。細胞に結合した抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。ツニカマイシン処理またはＢ−ＧａｌＮａｃ処理いずれかに際して、Ｏｃｔ３／４抗体の結合ヒストグラムは、陰性対照のこれらに匹敵し、阻害剤処理に際してｈＥＳＣ多能性には変化がないことを示す。
【図２５−２】Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化は、阻害剤処理に際して部分的に阻害された。ツニカマイシンおよびベンジル−ａ−ＧａｌＮａｃを用いて、それぞれ、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化を阻害した。異なる治療条件におけるＨＥＳ−３をビオチン・コンジュゲート化コンカナバリンＡ（Ａ）またはＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂ（Ｂ）で染色した。ＣｏｎＡは、Ｎ連結グリカンに特異的に結合し、そしてＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂは、ｈＥＳＣ上のＯ連結グリカンエピトープを認識する。細胞に結合したレクチンまたは抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化ストレプトアビジンまたは抗マウス抗体で検出した。影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。（Ａ）ツニカマイシン処理の影響を示す結合ヒストグラム、ビオチンコンジュゲート化ＣｏｎＡの結合ヒストグラムは、左方向にシフトし、これは、Ｎ−グリコシル化の減少を示した。（Ｂ）Ｂ−ＧａｌＮａｃ処理の影響を示す結合ヒストグラム、Ｔｒａ−１−６０に対するｍＡｂの結合ヒストグラムは、左方向にシフトし、これは、Ｏ−グリコシル化の減少を示した。（Ｃ）阻害剤処理に際して、ｈＥＳＣ多能性における変化はない。異なる処理条件におけるＨＥＳ−３をＯｃｔ３／４に対するｍＡｂで染色した。細胞に結合した抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。ツニカマイシン処理またはＢ−ＧａｌＮａｃ処理いずれかに際して、Ｏｃｔ３／４抗体の結合ヒストグラムは、陰性対照のこれらに匹敵し、阻害剤処理に際してｈＥＳＣ多能性には変化がないことを示す。
【図２６】Ａ１は、ｈＥＳＣ上のＯ連結グリカンを認識し、そしてＯ連結グリカンに対する結合は、ｈＥＳＣに対するＡ１細胞傷害性に必須である。異なる処理条件において、ＨＥＳ−３をキメラＡ１で処理した。（Ａ）細胞に結合した抗体をＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒト抗体で検出した。影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。Ｂ−ＧａｌＮａｃ処理に際して、Ａ１の結合ヒストグラムは、陰性対照およびツニカマイシン処理に比較して左方向にシフトし、Ｏ−グリコシル化が阻害された際にのみ、Ａ１結合が下方制御されることを示す。Ａ１は、Ｏ連結グリカンのみを認識し、Ｎ連結グリカンを認識しない。（Ｂ）細胞生存度をＰＩ取り込みによって概算した。異なる処理条件における細胞生存度を、対応する陰性対照（Ａ１処理なし）に対して規準化した。Ｂ−ＧａｌＮａｃ処理に際して、Ａ１処理に際しての細胞生存度は、陰性対照（ＣＭ対照およびＤＭＳＯ対照）ならびにツニカマイシン処理のものよりも有意により高かった。これは、ｈＥＳＣに対するＯ−グリコシル化もまた、Ａ１が細胞傷害性を誘発するために必須であることを示唆する。バーは、少なくとも３回の別個の実験からの平均±ＳＥＭに相当する。
【図２７−１】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死および活性酸素種（ＲＯＳ）産生は直接相関する。（Ａ）フローサイトメトリーの結果を示すチャート。ＲＯＳ産生を、フローサイトメトリーを通じたジヒドロエチジウム（ＨＥ）染色で概算した。ゲート処理集団は、ＲＯＳ産生レベルに相当する。（Ｂ）顕微鏡写真：あるいは、ＲＯＳ産生をカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡで測定した。ＲＯＳの存在下で、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡは、緑色蛍光を放出するカルボキシ−ＤＣＦに酸化される。（Ｃ）チャート：バーは、少なくとも３回の独立の実験由来の平均ＲＯＳ産生±ＳＥＭに相当する。Ａ１処理に際して、ｈＥＳＣにおける大規模なＲＯＳ産生がある。（Ｄ）チャート：細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。Ａ１処理後、上部右象限における細胞集団の有意な増加があり、これは高レベルのＲＯＳ産生を伴う死んだ細胞に相当する。ＲＯＳ産生および細胞死は直接相関する。
【図２７−２】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死および活性酸素種（ＲＯＳ）産生は直接相関する。（Ａ）フローサイトメトリーの結果を示すチャート。ＲＯＳ産生を、フローサイトメトリーを通じたジヒドロエチジウム（ＨＥ）染色で概算した。ゲート処理集団は、ＲＯＳ産生レベルに相当する。（Ｂ）顕微鏡写真：あるいは、ＲＯＳ産生をカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡで測定した。ＲＯＳの存在下で、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡは、緑色蛍光を放出するカルボキシ−ＤＣＦに酸化される。（Ｃ）チャート：バーは、少なくとも３回の独立の実験由来の平均ＲＯＳ産生±ＳＥＭに相当する。Ａ１処理に際して、ｈＥＳＣにおける大規模なＲＯＳ産生がある。（Ｄ）チャート：細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。Ａ１処理後、上部右象限における細胞集団の有意な増加があり、これは高レベルのＲＯＳ産生を伴う死んだ細胞に相当する。ＲＯＳ産生および細胞死は直接相関する。
【図２８】ＲＯＳ産生（Ｏ２−）は、Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死に必要である。（Ａ）チャート：Ａ１を添加する前、ｈＥＳＣをＰＢＳあるいはＲＯＳスカベンジャー、Ｔｉｒｏｎ（５０ｍＭ）またはＴｅｍｐｏｌ（１２０ｍＭ）で１時間処理した。ＴｉｒｏｎおよびＴｅｍｐｏｌ両方のＲＯＳターゲットは、スーパーオキシド（Ｏ２−）である。次いで、細胞生存度をＰＩ取り込みによって測定した。バーは、少なくとも３回の独立の実験由来の平均細胞生存度±ＳＥＭに相当する；ＲＯＳスカベンジャーは、ｈＥＳＣに対するＡ１殺傷を部分的にブロック可能である。（Ｂ）チャート：細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。Ｔｉｒｏｎの存在下で、Ａ１処理後のｈＥＳＣは、細胞死ならびにＲＯＳ産生の有意な減少を有する。ＲＯＳスカベンジャーによるＲＯＳの枯渇は、ｈＥＳＣ死の減少と直接相関する。
【図２９−１】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによって仲介され、これはＮｏｘ２を通じる可能性が最も高い。（Ａ）チャート：ＨＥＳ−３を、Ａ１処理（４５分間）前に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤、ＤＰＩ（２４０μＭ）、Ａｐｏ（４０ｍＭ）、またはＭＰＡ（３．１２ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。異なる処理条件における細胞生存度をＰＩ取り込みによって概算し、そしてそれぞれの非Ａ１処理対照に規準化した。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は、Ａ１殺傷を部分的にブロック可能である。（Ｂ）チャート：細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。Ａ１処理後、阻害剤処理したｈＥＳＣは、細胞死およびＲＯＳ産生において有意な減少を有する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤によるＲＯＳ産生の阻害は、ｈＥＳＣ死減少と直接相関する。（Ｃ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤のターゲットのための要約表。（Ｄ）ＨＥＳ−３を、Ｎｏｘ２に対する２つの異なるｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＯＸ２＿３７８７およびｓｉＮｏｘ２＿３７８８）でトランスフェクションした。Ｎｏｘ２のノックダウンは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ（Ｄ）およびウェスタンブロッティング（Ｅ）によって確認された。ノックダウンに際して、次いで、細胞をＡ１（０．５μｇ／ｍｌ）で処理し、そしてＰＩ取り込みによって、４５分後に細胞死に関して評価した（Ｆ）。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。Ｎｏｘ２は、Ａ１処理ｈＥＳＣにおけるＲＯＳ産生の主な供給源である。
【図２９−２】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによって仲介され、これはＮｏｘ２を通じる可能性が最も高い。（Ａ）チャート：ＨＥＳ−３を、Ａ１処理（４５分間）前に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤、ＤＰＩ（２４０μＭ）、Ａｐｏ（４０ｍＭ）、またはＭＰＡ（３．１２ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。異なる処理条件における細胞生存度をＰＩ取り込みによって概算し、そしてそれぞれの非Ａ１処理対照に規準化した。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は、Ａ１殺傷を部分的にブロック可能である。（Ｂ）チャート：細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。Ａ１処理後、阻害剤処理したｈＥＳＣは、細胞死およびＲＯＳ産生において有意な減少を有する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤によるＲＯＳ産生の阻害は、ｈＥＳＣ死減少と直接相関する。（Ｃ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤のターゲットのための要約表。（Ｄ）ＨＥＳ−３を、Ｎｏｘ２に対する２つの異なるｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＯＸ２＿３７８７およびｓｉＮｏｘ２＿３７８８）でトランスフェクションした。Ｎｏｘ２のノックダウンは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ（Ｄ）およびウェスタンブロッティング（Ｅ）によって確認された。ノックダウンに際して、次いで、細胞をＡ１（０．５μｇ／ｍｌ）で処理し、そしてＰＩ取り込みによって、４５分後に細胞死に関して評価した（Ｆ）。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。Ｎｏｘ２は、Ａ１処理ｈＥＳＣにおけるＲＯＳ産生の主な供給源である。
【図２９−３】Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによって仲介され、これはＮｏｘ２を通じる可能性が最も高い。（Ａ）チャート：ＨＥＳ−３を、Ａ１処理（４５分間）前に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤、ＤＰＩ（２４０μＭ）、Ａｐｏ（４０ｍＭ）、またはＭＰＡ（３．１２ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。異なる処理条件における細胞生存度をＰＩ取り込みによって概算し、そしてそれぞれの非Ａ１処理対照に規準化した。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は、Ａ１殺傷を部分的にブロック可能である。（Ｂ）チャート：細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。Ａ１処理後、阻害剤処理したｈＥＳＣは、細胞死およびＲＯＳ産生において有意な減少を有する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤によるＲＯＳ産生の阻害は、ｈＥＳＣ死減少と直接相関する。（Ｃ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤のターゲットのための要約表。（Ｄ）ＨＥＳ−３を、Ｎｏｘ２に対する２つの異なるｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＯＸ２＿３７８７およびｓｉＮｏｘ２＿３７８８）でトランスフェクションした。Ｎｏｘ２のノックダウンは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ（Ｄ）およびウェスタンブロッティング（Ｅ）によって確認された。ノックダウンに際して、次いで、細胞をＡ１（０．５μｇ／ｍｌ）で処理し、そしてＰＩ取り込みによって、４５分後に細胞死に関して評価した（Ｆ）。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。Ｎｏｘ２は、Ａ１処理ｈＥＳＣにおけるＲＯＳ産生の主な供給源である。
【図３０−１】Ａ１誘導性細胞死におけるＲＯＳ産生は、同型接着の下流、およびアクチン再編成の上流にある。（Ａ）顕微鏡写真：Ａ１処理（４５分間）の前、ＨＥＳ−３をＰＢＳあるいはＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）またはＡｐｏ（４０ｍＭ）と１時間インキュベーションした。光学顕微鏡検査によって、同型接着に関して細胞を評価した。同型接着は、ＴｉｒｏｎまたはＡＰＯの存在下で形成される。（Ｂ）顕微鏡写真：Ａ１処理（４５分間）の前、ＨＥＳ−３をＰＢＳまたはＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。走査型電子顕微鏡検査によって、細胞形態を評価した。Ｔｉｒｏｎの存在下で、Ａ１処理は、微絨毛の短縮化のみを導き、大規模な膜破壊は起こさない。（Ｃ、Ｄ）チャート：ＨＥＳ−３をＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）を含みまたは含まず、１時間プレインキュベーションし、その後、Ａ１処理（４５分間）の前に、ＰＢＳ、またはラトランクリンＡ（０．４μｇ／ｍｌ）、またはサイトカラシンＢ（０．４μｇ／ｍｌ）、またはサイトカラシンＤ（０．４μｇ／ｍｌ）で５分間処理した。ＰＩ取り込みによって細胞生存度を概算し（Ｃ）、そしてＨＥ染色でＲＯＳ産生を評価した（Ｄ）。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。Ｔｉｒｏｎの存在下で、アクチン阻害剤は、ｈＥＳＣに対してさらなる阻害効果を持たない。アクチン阻害剤処理を含むまたは含まないＲＯＳ産生において、有意な相違はない。
【図３０−２】Ａ１誘導性細胞死におけるＲＯＳ産生は、同型接着の下流、およびアクチン再編成の上流にある。（Ａ）顕微鏡写真：Ａ１処理（４５分間）の前、ＨＥＳ−３をＰＢＳあるいはＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）またはＡｐｏ（４０ｍＭ）と１時間インキュベーションした。光学顕微鏡検査によって、同型接着に関して細胞を評価した。同型接着は、ＴｉｒｏｎまたはＡＰＯの存在下で形成される。（Ｂ）顕微鏡写真：Ａ１処理（４５分間）の前、ＨＥＳ−３をＰＢＳまたはＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。走査型電子顕微鏡検査によって、細胞形態を評価した。Ｔｉｒｏｎの存在下で、Ａ１処理は、微絨毛の短縮化のみを導き、大規模な膜破壊は起こさない。（Ｃ、Ｄ）チャート：ＨＥＳ−３をＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）を含みまたは含まず、１時間プレインキュベーションし、その後、Ａ１処理（４５分間）の前に、ＰＢＳ、またはラトランクリンＡ（０．４μｇ／ｍｌ）、またはサイトカラシンＢ（０．４μｇ／ｍｌ）、またはサイトカラシンＤ（０．４μｇ／ｍｌ）で５分間処理した。ＰＩ取り込みによって細胞生存度を概算し（Ｃ）、そしてＨＥ染色でＲＯＳ産生を評価した（Ｄ）。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。Ｔｉｒｏｎの存在下で、アクチン阻害剤は、ｈＥＳＣに対してさらなる阻害効果を持たない。アクチン阻害剤処理を含むまたは含まないＲＯＳ産生において、有意な相違はない。
【図３１−１】ｈＥＳＣに対するその細胞傷害性には、Ａ１が二価であることが必要であるが、結合にその必要はない。細胞を、Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）、またはＦ（ａｂ）２＿Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）、またはＦａｂ＿Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）と４５分間インキュベーションした。（Ａ）チャート：ｈＥＳＣへの結合を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗カッパ軽鎖特異的抗体で検出した；Ｆ（ａｂ）２＿Ａ１およびＦａｂ＿Ａ１両方のｈＥＳＣへの結合は、ｈＥＳＣに対するＡ１結合に匹敵する。（Ｂ）チャート：ＰＩ取り込みによって、細胞生存度を概算した；二価Ｆ（ａｂ）２＿Ａ１のみが、ｈＥＳＣに対するＡ１の細胞傷害性を再現する。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。（Ｃ）顕微鏡写真：光学顕微鏡検査によって、同型接着を評価した。同型接着の形成には、Ａ１が二価であることが必要である。
【図３１−２】ｈＥＳＣに対するその細胞傷害性には、Ａ１が二価であることが必要であるが、結合にその必要はない。細胞を、Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）、またはＦ（ａｂ）２＿Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）、またはＦａｂ＿Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）と４５分間インキュベーションした。（Ａ）チャート：ｈＥＳＣへの結合を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗カッパ軽鎖特異的抗体で検出した；Ｆ（ａｂ）２＿Ａ１およびＦａｂ＿Ａ１両方のｈＥＳＣへの結合は、ｈＥＳＣに対するＡ１結合に匹敵する。（Ｂ）チャート：ＰＩ取り込みによって、細胞生存度を概算した；二価Ｆ（ａｂ）２＿Ａ１のみが、ｈＥＳＣに対するＡ１の細胞傷害性を再現する。バーは、少なくとも３回の別個の実験由来の平均±ＳＥＭに相当する。（Ｃ）顕微鏡写真：光学顕微鏡検査によって、同型接着を評価した。同型接着の形成には、Ａ１が二価であることが必要である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
抗体
本発明記載の抗体は、好ましくは、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンに対するか、あるいはグリコシル化がグリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含むグリコシル化タンパク質に対する。
【００５５】
いくつかの態様において、本発明記載の抗体は、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンまたはグリコシル化タンパク質に結合する。
【００５６】
いくつかの態様において、本発明記載の抗体は、グリカンモチーフ（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを含むグリカンまたはグリコシル化タンパク質に結合する。
【００５７】
いくつかの態様において、本発明記載の抗体は、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含むグリカンまたはグリコシル化タンパク質に結合する。
抗体は、好ましくは、未分化多能性細胞に対して細胞傷害性である。未分化多能性細胞との接触に際して、本発明記載の抗体は、３０分未満、２０分未満、１０分未満、５分未満、２分未満または１分未満の１つで、細胞を殺すことも可能である。
【００５８】
未分化多能性細胞に対する抗体の細胞傷害性は、好ましくは、時間および投薬量依存性である。抗体は、好ましくは、腫瘍症を通じた、そして好ましくはアポトーシスを通じない細胞死を誘導する。
【００５９】
抗体で処理された未分化多能性細胞は、好ましくは、形態変化、例えば膜微絨毛喪失、膜孔の形成、細胞膨張、ミトコンドリア濃縮および末梢再局在、アクチン細胞骨格の破壊および核の曝露を示す。
【００６０】
好ましくは、抗体は、未分化多能性細胞から分化した細胞（分化子孫細胞）よりも、未分化多能性細胞（親多能性細胞）に特異的に結合する。例えば、抗体は、未分化多能性細胞（単数または複数）から形成された胚様体よりも、こうした細胞に対する特異的結合を示す。
【００６１】
本発明記載の抗体は、単離型で提供されてもよい。
「抗体」によって、本発明者らは、その断片または誘導体、あるいは合成抗体または合成抗体断片も含める。
【００６２】
モノクローナル抗体技術に関連した今日の技術を考慮すると、抗体は、大部分の抗原に対して調製可能である。抗原結合部分は、抗体の部分（例えばＦａｂ断片）または合成抗体断片（例えば一本鎖Ｆｖ断片［ＳｃＦｖ］）であってもよい。選択した抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）に、そして“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８２）に開示されるものによって調製可能である。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８８，  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｐａｒｔ  ２，  ７９２−７９９）によって論じられる。
【００６３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、本発明の方法において有用であり、そして抗原上の単一のエピトープを特異的にターゲティングする抗体の均質な集団である。したがって、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを有するグリコシル化タンパク質に結合するｍＡｂは、潜在的に、未分化細胞または特定の細胞系譜に分化しつつある単数または複数の未分化細胞を特徴付ける抗原のレパートリーを示す生存細胞サブセットを精製するかまたは除去するのに使用可能である。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、本発明の方法において有用である。単一特異的ポリクローナル抗体が好ましい。当該技術分野に周知の方法を用いて、適切なポリクローナル抗体を調製してもよい。
【００６５】
ＦａｂおよびＦａｂ２断片などの抗体断片もまた用いてもよく、遺伝子操作した抗体および抗体断片もまた用いてもよい。抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与し、この事実は、初期のプロテアーゼ消化実験によって最初に認識された。さらなる確認は、齧歯類抗体の「ヒト化」によって見出された。齧歯類起源の可変ドメインを、ヒト起源の定常ドメインに融合させて、生じる抗体が、齧歯類親抗体の抗原特異性を保持するようにしてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１，  ６８５１−６８５５）。
【００６６】
抗原特異性は可変ドメインによって与えられ、そして定常ドメインからは独立であることは、すべて１またはそれより多くの可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を伴う実験から知られる。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １０４１）；  Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，  １０３８）；  ＶＨおよびＶＬパートナードメインが可動性（flexible）オリゴペプチドを通じて連結される、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，  ４２３；  Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５，  ５８７９）；ならびに単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，  ５４４）が含まれる。特異的結合部位を保持する抗体断片合成に関与する技術の一般的な概説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ２９３−２９９中に見出されるはずである。
【００６７】
「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、例えば可動性オリゴペプチドによって、共有結合されている分子を意味する。
Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、すべて大腸菌において発現可能であり、そして大腸菌から分泌可能であり、したがって、多量の前記断片の容易な産生が可能になる。
【００６８】
全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は一価であり、１つの抗原結合部位しか持たない。また、当該技術分野に周知であるようなファージディスプレイ技術を用いて、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを有するグリコシル化タンパク質に結合する合成抗体も作製してもよい。
【００６９】
特定の方法において、抗体は、ｍＡｂ  Ａ１またはｍＡｂ  Ａ１の変異体である。ｍＡｂ  Ａ１は、以下のＣＤＲ配列を含む：
軽鎖：
ｉ）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ｉｉ）ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ｉｉｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
重鎖：
ｉｖ）ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ｖ）ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ｖｉ）ＦＧＹ（配列番号６）
ＣＤＲ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａ／ＡｂＭ定義によって決定される。
【００７０】
本発明記載の抗体は、ｍＡｂ  Ａ１のＣＤＲを含むことも可能である。本発明記載の抗体において、配列（ｉ）〜（ｖｉ）の１または２または３または４は多様であることも可能である。変異体は、配列（ｉ）〜（ｖｉ）の１または２において、１または２のアミノ酸置換を有することも可能である。
【００７１】
ｍＡｂ  Ａ１のＶＨおよびＶＬ鎖のアミノ酸配列（およびコードポリヌクレオチド配列）は、図１５に示すように決定されてきている。
ｍＡｂ  Ａ１の軽鎖および重鎖ＣＤＲ  １〜３はまた、多くの異なるフレームワーク領域と組み合わされて特に有用である可能性もある。したがって、ｍＡｂ  Ａ１のＣＤＲ  
１〜３を有する軽鎖および／または重鎖は、別のフレームワーク領域を所持することも可能である。適切なフレームワーク領域は当該技術分野に周知であり、そして例えば、本明細書に援用される、Ｍ．  Ｌｅｆｒａｎｃ  ＆  Ｇ．  Ｌｅ：ｆｒａｎｃ（２００１）  ”Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載される。
【００７２】
本明細書において、抗体は、図１５のｍＡｂ  Ａ１  ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列に高い割合の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖を有することも可能である。
【００７３】
例えば、本発明記載の抗体には、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（好ましくは、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを有するグリコシル化タンパク質）に結合し、そして図１５に示すｍＡｂ  Ａ１のＶＨ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ鎖を有する、抗体が含まれる。
【００７４】
本発明記載の抗体には、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（好ましくは、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを有するグリコシル化タンパク質）に結合し、そして図１５に示すｍＡｂ  Ａ１のＶＬ鎖アミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ鎖を有する、抗体が含まれる。
【００７５】
本発明記載の抗体を用いて、分化後に、そして場合によって分化細胞の機能を試験するための動物移植試験前に、残った未分化多能性細胞を除去することも可能である。
移植前に、本発明記載の抗体を（場合によって、ＷＯ２００７／１０２７８７に記載されるような他のｍＡｂと組み合わせて）用いて、残った未分化ｈＥＳＣまたは未分化人工多能性幹細胞を除去し、こうして再生臨床適用において、移植片の成功および安全性を増加させることも可能である。
【００７６】
本発明記載の抗体を潜在的に用いて、未分化多能性細胞を特徴付ける抗原レパートリーを示す生存細胞サブセットを除去することも可能である。
本発明記載の抗体は、検出可能に標識されているか、または少なくとも検出が可能である。例えば、抗体を放射性原子または着色分子または蛍光分子または任意の他の方式で容易に検出可能な分子で標識してもよい。適切な検出可能分子には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、酵素基質、および放射標識が含まれる。結合部分を、検出可能標識で直接標識してもよいし、または間接的に標識してもよい。例えば、結合部分は、それ自体が標識されている別の抗体によって検出可能な非標識抗体であってもよい。あるいは、第二の抗体が、結合しているビオチンを有してもよく、そしてビオチンに対する標識ストレプトアビジンの結合を用いて、第一の抗体を間接的に標識する。
【００７７】
方法
本発明記載の方法は：
（ａ）親未分化多能性細胞から、多能性細胞から分化した細胞を単離する工程；
（ｂ）親未分化多能性細胞から、多能性細胞から分化した細胞を分離する工程；
（ｃ）親未分化多能性細胞から、多能性細胞から分化した細胞を濃縮する工程；
（ｄ）未分化多能性細胞を実質的に含まない、多能性細胞から分化した細胞の組成物を調製する工程；
を含んでもよい。
【００７８】
各方法は、未分化多能性細胞（親多能性細胞）および親多能性細胞から分化した細胞（分化子孫細胞）を含有する試料と、本発明記載の抗体を、抗体が細胞傷害性効果を発揮し、そして試料中に含有される未分化多能性細胞を殺すために十分な期間、接触させる工程を含むことも可能である。好ましくは、用いる抗体量および期間は、試料中の未分化細胞のすべてまたは実質的にすべてが殺され、分化した子孫細胞の精製された集団である試料が残るために十分である。十分な時間は、例えば、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも６０分間、９０分間、または２時間より長くの１つであることも可能である。
【００７９】
抗体および細胞の接触は、試料中に存在するグリコシル化タンパク質抗原への抗体の結合を可能にするのに適した条件下であってもよい。こうした条件は、一般の当業者に周知であり、例えば、生理学的ｐＨおよび生理学的緩衝液を含む。
【００８０】
本発明記載の方法は、抗体によって殺されない細胞を分配するか、取り除くか、単離するか、分離するか、精製するかまたは濃縮する工程を含んでもよい。本発明記載の方法は、抗体が結合している細胞を破壊する工程を含んでもよい。本発明記載の方法は、分配されているか、取り除かれているか、単離されているか、分離されているか、精製されているかまたは濃縮されている細胞を定量化する工程をさらに含んでもよい。
【００８１】
本発明の方法において、未分化多能性細胞（単数または複数）がアフィニティ結合によって結合可能であるように、抗体を、固体支持体上に固定してもよく、例えば固体支持体にコンジュゲート化してもよい。好適には、固体支持体は、アガロース、アクリルアミド、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭおよびＳｅｐｈａｄｅｘＴＭなどの任意の適切なマトリックスを含む。固体支持体は、マイクロタイタープレートまたはチップ、あるいはカラムなどの固体支持体であってもよい。
【００８２】
いくつかの態様において、結合した際に、適切な磁場の提供に際して、未分化多能性細胞（単数または複数）が試料の残りから分離可能であるように、抗体は、磁気的に標識されている（直接または間接的のいずれかで）。磁気細胞ソーティングに用いられるマイクロビーズは、しばしば、ＭＡＣＳコロイド状超常磁性マイクロビーズと呼ばれる。この方式で標識された未分化多能性細胞は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）によってソーティング可能である。
【００８３】
特異的細胞マーカーを含む細胞を分離する他の方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、抗体が蛍光分子で標識されるＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）が含まれる。
【００８４】
本発明記載の方法は、分配されているか、取り除かれているか、単離されているか、分離されているか、精製されているかまたは濃縮されている分化子孫細胞を培養する工程を含んでもよい。
【００８５】
本発明記載の方法を用いて、分化子孫細胞の濃縮されたかまたは実質的に単離された組成物を提供してもよい。こうした組成物を多様な方式で用いてもよく、例えばこれを細胞療法で用いてもよいし、またはこれを細胞供給源として用いて、これを次いで、特定の療法に有用な特定の細胞系譜に（連続してまたはさらに分化させて）分化させるよう促してもよいし、またはこれを用いて、細胞が他の細胞に分化することを可能にする因子を調べてもよい（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【００８６】
典型的には、分化子孫細胞の濃縮組成物は、分化子孫細胞としての細胞を少なくとも５０％含有し、好ましくは少なくとも７０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％含有する。好ましくは、組成物中の細胞はすべて、前記分化子孫細胞である。
【００８７】
細胞集団を濃縮するための方法は、好ましくは、試料中の細胞濃度を増加させるか、あるいは絶対的にまたは試料中の他の細胞の数に対して相対的にのいずれかで、細胞集団（すなわち所定のタイプの細胞数）を増加させることを伴う。
【００８８】
本発明はまた、単数または複数の未分化多能性細胞を破壊する方法であって、未分化多能性細胞（単数または複数）と本発明の抗体を接触させる工程を含む、前記方法も提供する。
【００８９】
いくつかの方法において、抗体は、腫瘍症機構によって細胞死を仲介し、該機構は、細胞浸透性（ヨウ化プロピジウム／トリパンブルーなどの色素に対する透過性によって立証されるようなもの）および細胞収縮の増加を導く、膜損傷から生じる細胞死の型である。本発明の方法によって誘導される細胞死には、細胞膜の孔形成（ｐｏｒａｔｉｏｎ）、ブレブ化および／または細胞凝集が先行する可能性もある。
【００９０】
未分化多能性細胞を破壊するための方法を用いて、分化するように誘導されている細胞集団から、未分化多能性細胞を除去することも可能である。組織または臓器の移植前に、未分化多能性細胞を破壊するための方法を用いて、残ったＩＰＳＣを除去し、こうして、特に奇形腫形成リスクを減少させることによって、移植片の成功および安全性を増加させることも可能である。
【００９１】
本発明記載の方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、培養中の細胞を用いた実験を含むように意図され、一方、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、損なわれていない多細胞生物を用いた実験を含むように意図される。
【００９２】
キット
本発明のいくつかの側面にしたがって、本発明記載の抗体を含む、部分のキットを提供する。
【００９３】
キットはさらに、多能性マーカーを検出可能な剤を含むことも可能である。マーカーは、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１およびＧＣＴＭ−２の１またはそれより多くであることも可能である。剤は、こうしたマーカーに結合する抗体、例えばｍＡｂ  ５、ｍＡｂ  ８、ｍＡｂ  １４、ｍＡｂ  ６３、ｍＡｂ  ８４、ｍＡｂ  ８５、ｍＡｂ  ９５、ｍＡｂ  ３７５、ｍＡｂ  ４３２、ｍＡｂ  ５２９の１つであることも可能である。
【００９４】
いくつかの態様において、キットは、本発明記載の抗体、ならびにＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１およびＧＣＴＭ−２の１またはそれより多くに対する抗体を含む。典型的には、キットはまた：免疫化学において使用するための試薬；固体支持体に固定された抗体；抗体を標識するための手段；細胞毒性部分に抗体を連結するための手段の１またはそれより多くも含有してもよい。
【００９５】
試料
本発明のいくつかの方法は、細胞を含有する試料を伴う。試料は、１またはそれより多くの未分化多能性細胞を含有するかまたは含有すると推測される任意の量の細胞であってもよい。試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する細胞の培養物であってもよい。例えば、培養物は、細胞懸濁物あるいは培養プレートまたはディッシュ中で培養される細胞を含んでもよい。
【００９６】
好ましい態様において、試料は、未分化多能性細胞を含有する。いくつかの態様において、試料は、未分化多能性細胞、および分化を経たかまたは分化を経ている多能性細胞を含有する。分化を経たかまたは分化を経ている多能性細胞は、もはや多能性ではない可能性もあり、そして好ましくは、本発明記載の抗体によって結合されない。
【００９７】
試料は、未分化多能性細胞が、胚様体に、または特定の細胞系譜に分化するよう促されている（または促進されている）ものであってもよく、そしてしたがって、試料は、未分化および分化細胞の混合物を含有する可能性もある（分化はしばしば効率的なプロセスではないため）。典型的には、こうした試料中で、未分化多能性細胞は、細胞総数の数パーセントを構成する。典型的には、試料中の分化細胞は、外胚葉、内胚葉、中胚葉（分化細胞の３つの主な系譜に相当する）、心筋細胞、膵島細胞、ニューロン前駆体細胞または間葉幹細胞の１つまたはそれより多くであってもよく、これらは（分化によって）多能性細胞から得られる。潜在的に、未分化多能性細胞は望ましくない奇形腫を形成しうるため、分化細胞を含有する試料の臨床適用前に、こうした試料から（またはこうした試料において）未分化多能性細胞を除去（または破壊）することは、有用であろう。典型的には、本発明の方法において、未分化多能性細胞の少なくとも９５％を取り除くか、分配するか、または破壊する。好ましくは、前記細胞すべてを取り除くか、分配するか、または破壊する。
【００９８】
幹細胞
用語「幹細胞」は、一般的に、分裂に際して、２つの発生オプションに直面する細胞を指す：娘細胞は元来の細胞と同一であってもよいし（自己再生）、またはこれらはより特殊化された細胞タイプの子孫であってもよい（分化）。したがって、幹細胞は、１つまたは別の経路を採用可能である（各細胞タイプを１つ形成可能である、さらなる経路が存在する）。したがって、幹細胞は、最終的に分化しておらず、そして他のタイプの細胞を産生可能な細胞である。
【００９９】
多能性幹細胞
多能性幹細胞は真の幹細胞であり、体の中で任意の分化した細胞を作製する潜在能力を持つが、完全な生物は作製できない。これらは胚体外膜を作製するのに寄与できず、該膜は栄養膜に由来する。胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含む、いくつかのタイプの多能性幹細胞が見出されてきている。
【０１００】
本明細書において、未分化多能性細胞は、未分化多能性幹細胞であることも可能である。
多能性幹細胞は、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類あるいは他の非ヒト脊椎動物生物に由来することも可能である。好ましい態様において、多能性幹細胞はヒトである。
【０１０１】
胚性幹細胞
胚性幹（ＥＳＣ）細胞は、着床が起こる胚発生段階である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離可能である。
【０１０２】
本出願において、胚性幹細胞は、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類あるいは他の非ヒト脊椎動物生物に由来することも可能である。好ましい態様において、胚性幹細胞はヒトである。
【０１０３】
胚性幹細胞は、胚盤胞から得られることも可能であるが、いくつかの態様において、本発明は、胚の破壊を引き起こす方法によって得られた胚性幹細胞（特にヒト）を含まない。
【０１０４】
人工多能性幹細胞
一般的にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、特定の遺伝子を挿入することによって、非多能性細胞、典型的には成体体細胞に人工的に由来する多能性幹細胞のタイプである。ｉＰＳ細胞は、すべて本明細書に援用される、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．  ＆  Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）、Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓら（２００７）、Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍら（２００７）、Ｍａｈｅｒａｌｉ  Ｎら（２００７）、Ｙｕ  Ｊら（２００７）およびＴａｋａｈａｓｈｉら（２００７）に概説され、そして論じられる。
【０１０５】
ｉＰＳ細胞は、典型的には、非多能性細胞、例えば成体線維芽細胞内に特定の幹細胞関連遺伝子をトランスフェクションすることによって得られる。トランスフェクションは、典型的には、ウイルスベクターを通じて、例えばレトロウイルス再プログラミングを通じて達成される。トランスフェクション遺伝子には、マスター転写制御因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２が含まれるが、他の遺伝子が誘導効率を増進させると示唆される。３〜４週間後、少数のトランスフェクション細胞が、形態学的におよび生化学的に多能性幹細胞と類似となり始め、そして典型的には、形態学的選択、倍加時間を通じて、またはレポーター遺伝子および抗生物質感染を通じて単離される。
【０１０６】
ＩＰＳＣは、１またはそれより多くの転写因子でのトランスフェクションによって、線維芽細胞などの体細胞から誘導可能である。いくつかの場合、細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４で形質転換する。転写因子および／またはマーカー遺伝子を含む他の遺伝子で、細胞をさらにトランスフェクションしてもよい。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え系などのトランスポゾン系を用いて、または外因性再プログラミング遺伝子を含まないｉＰＳＣを生じるため、非組込みベクターを用いて、遺伝子を導入してもよい。レトロウイルスなどのウイルスベクターを用いて、トランスフェクションを達成してもよい。ウイルスは両種指向性ウイルスであってもよい。細胞がトランスフェクションされたら、細胞をＥＳＣ培地にトランスファーする前に、フィーダー細胞上で増殖させてもよい。
【０１０７】
ＩＰＳＣは、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類あるいは他の非ヒト脊椎動物生物に由来してもよい。好ましい態様において、ＩＰＳＣは、ヒト細胞に由来する。
【０１０８】
本発明で有用なｉＰＳ細胞は、肺、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、角化細胞、血液前駆体細胞、骨髄細胞、肝細胞、胃上皮細胞、膵臓細胞、神経幹細胞、Ｂリンパ球、ＥＳ由来体細胞および胚性線維芽細胞を含む、任意の適切な細胞タイプに由来してもよい。ｉＰＳ細胞は、ヒト、マウスまたは他の哺乳動物に由来してもよい。好ましくは、ｉＰＳ細胞はヒトである。いくつかの場合、細胞はヒト皮膚線維芽細胞でない。ＩＰＳＣは、ＥＳＣに類似の遺伝子発現パターンおよび表現型を示してもよい。
【０１０９】
ＥＳＣ同様、分化人工多能性幹細胞の将来の療法的適用は、残った未分化ＩＰＳＣが混入することによる、奇形腫形成のリスクを負う。この問題にもかかわらず、現在、これらの細胞集団を分離するために開発された戦略はそれほど多くはない。
【０１１０】
多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞
多分化能幹細胞は、真の幹細胞であるが、限定された数のタイプにしか分化しえない。例えば、骨髄は、血液細胞のすべてを生じさせるが、他のタイプの細胞を生じさせない、多分化能幹細胞を含有する。多分化能幹細胞は、成体動物において見られる。体内のすべての臓器がこうした細胞を含有すると考えられ、これらは死んだ細胞または損傷を受けた細胞を置換しうる。
【０１１１】
幹細胞を特徴付ける方法が当該技術分野に知られ、そしてこれには、クローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期培養、ならびに分子生物学的技術、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングなどの標準的なアッセイ法の使用が含まれる。
【０１１２】
成体幹細胞
成体幹細胞は、非常に多様なタイプを含み、ニューロン、皮膚、および骨髄移植における活性構成要素である血液形成幹細胞を含む。
【０１１３】
これらの後者の幹細胞タイプはまた、臍帯由来幹細胞の主な特徴でもある。成体幹細胞は、実験室内および体内の両方で、機能するより特殊化された細胞タイプに成熟可能であるが、細胞タイプの正確な数は、選択した幹細胞のタイプによって制限される。
【０１１４】
幹細胞培養
幹細胞を培養する任意の適切な方法を、本明細書に記載する方法および組成物において用いてもよい。
【０１１５】
任意の適切な容器を用いて、本明細書に記載する方法および組成物にしたがって、幹細胞を増殖させてもよい。適切な容器には、米国特許公報ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）に記載されるものが含まれる。
【０１１６】
容器には、例えば、バイオリアクターおよびスピナーが含まれてもよい。本文書で用いる際、用語「バイオリアクター」は、真核細胞、例えば動物細胞または哺乳動物細胞を、例えば大規模に培養するのに適した容器である。制御バイオリアクターの典型的な培養体積は、２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。
【０１１７】
バイオリアクターは、１またはそれより多くの条件、例えば酸素分圧を調節または監視可能な制御バイオリアクターを含んでもよい。これらの条件を測定しそして制御するためのデバイスが当該技術分野に知られる。例えば、酸素分圧に関して、酸素電極を用いてもよい。選択するガス混合物（例えば空気、あるいは空気および／または酸素および／または窒素および／または二酸化炭素の混合物）の量および組成を通じて、酸素分圧を制御してもよい。酸素分圧を測定しそして制御するのに適したデバイスは、Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ  Ｅ．（Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ  Ｅ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，  第２版，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｃ．  ＩＳＢＮ  ０−０７−００３２１２−２  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，  （１９８６））またはＪａｃｋｓｏｎ  Ａ  Ｔ．  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ａ  Ｔ．，  Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ｉｎ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ＩＳＢＮ  ３５４０５６１９００（１９９３））に記載される。
【０１１８】
他の適切な容器にはスピナーが含まれる。スピナーは、ガラスボール攪拌装置、羽根車攪拌装置、および他の適切な攪拌装置などの多様な攪拌機構を用いて攪拌可能な、制御または非制御バイオリアクターである。スピナーの培養体積は、典型的には２０ｍｌ〜５００ｍｌの間である。回転ボトルは、４００〜２０００ｃｍ２の間の培養面積を有するプラスチックまたはガラス製の丸い細胞培養フラスコである。これらのフラスコの全内表面に沿って、細胞を培養する；細胞は培地で覆われ、これは「回転」運動によって達成され、すなわちボトルをそれ自体の個々の軸の周りに回転させる。
【０１１９】
あるいは、培養は静的であってもよく、すなわち培養／培地の能動的な攪拌を使用しなくてもよい。培養の攪拌を減少させることによって、細胞凝集体の形成が可能になりうる。何らかの攪拌を使用して、培養細胞上への培地の分布および流動を促してもよいが、凝集体形成を実質的に妨害しないようにこの攪拌を適用してもよい。例えば、低いｒｐｍ、例えば３０ｒｐｍ未満または２０ｒｐｍ未満の攪拌を使用してもよい。
【０１２０】
継代による増殖
本明細書に記載する方法および組成物は、培養中の継代または分割を含んでもよい。該方法は、連続的なまたは頻繁な継代を伴ってもよい。
【０１２１】
「頻繁な」または「連続的な」によって、本発明者らは、本発明者らの方法が、幹細胞が継代される、例えば増殖中のプレートまたはマイクロキャリアーから剥がされ、そして他のプレート、マイクロキャリアーまたは粒子にトランスファーされるのを可能にする方式で該細胞の増殖を可能にすることを意味し、そしてこのプロセスを少なくとも１回、例えば２回、３回、４回、５回等、反復してもよいことを意味する。いくつかの場合、これを任意の回数、例えば不確定にまたは無限に反復してもよい。
【０１２２】
培養中の細胞を、支持体またはフラスコから解離させ、そして組織培地内に希釈しそして再プレーティングすることによって、「分割する」か、継代培養するか、または継代してもよい。
【０１２３】
粒子上で増殖している細胞を、粒子培養に継代し直してもよい。あるいは、これらを慣用的な（２Ｄ）培養に継代し直してもよい。プレート上で増殖している組織培養細胞を粒子培養に継代し直してもよい。
【０１２４】
用語「継代」は、一般的に、細胞培養のアリコットを取り、細胞を完全にまたは部分的に解離させ、希釈し、そして培地に接種するプロセスを指してもよい。継代を１回またはそれより多く反復してもよい。アリコットは、細胞培養のすべてまたは一部を含んでもよい。アリコットの細胞は、完全に集密、部分的に集密、または集密でなくてもよい。継代は、工程の以下の順列の少なくともいくつかを含んでもよい：吸引、リンス、トリプシン処理、インキュベーション、除去、反応停止（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、再植え付けおよびアリコット。カリフォルニア大学サンディエゴ校のＨｅｄｒｉｃｋ研究室によって公表されたプロトコルを用いてもよい（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）。
【０１２５】
当該技術分野に知られる機械的または酵素的手段などの任意の適切な手段によって、細胞を解離させてもよい。機械的解離によって、例えば細胞スクレーパーまたはピペットを用いて、細胞を破壊してもよい。１００ミクロンまたは５００ミクロン篩を通じるなど、適切な篩サイズを通じて篩にかけることによって、細胞を解離させてもよい。酵素的解離によって、例えばコラゲナーゼまたはｔｒｙｐＬＥでの処理によって採取し、分割してもよい。解離は完全であってもまたは部分的であってもよい。
【０１２６】
希釈は任意の適切な希釈であってもよい。細胞培養中の細胞を任意の適切な比で分割してもよい。例えば、細胞を１：２またはそれより多く、１：３またはそれより多く、１：４またはそれより多くあるいは１：５またはそれより多くの比で分割してもよい。したがって、幹細胞を１継代またはそれより多く、継代してもよい。例えば、幹細胞を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５継代またはそれより多く、継代してもよい。継代を細胞増殖の世代として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５世代またはそれより多く、増殖することを可能にする。
【０１２７】
また、継代を細胞倍加の回数として表してもよい。本発明者らの方法および組成物は、幹細胞が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５細胞倍加またはそれより多く、増殖することを可能にする。
【０１２８】
幹細胞特性の維持
増殖した幹細胞は、親幹細胞の少なくとも１つの特性を維持しうる。幹細胞は、１回またはそれより多くの継代後、該特性を維持しうる。幹細胞は、複数回の継代後、その特性を維持しうる。幹細胞は、上述のような言及する回数の継代後、該特性を維持しうる。
【０１２９】
特性は、形態学的特性、免疫組織化学的特性、分子生物学的特性等を含んでもよい。特性は、生物学的活性を含んでもよい。
幹細胞特性
本発明者らの方法によって増殖する幹細胞は、以下の幹細胞特性のいずれを示してもよい。
【０１３０】
幹細胞は、Ｏｃｔ４および／またはＳＳＥＡ−１および／またはＴＲＡ−１−６０の発現増加を示しうる。自己再生性である幹細胞は、自己再生性でない幹細胞に比較して短い細胞周期を示しうる。
【０１３１】
幹細胞は定義される形態を示しうる。例えば、標準的顕微鏡画像の二次元において、ヒト胚性幹細胞は、画像平面における高い核／細胞質比、顕著な仁、および細胞接合がほとんど認識不能な緊密なコロニー形成を示す。
【０１３２】
幹細胞はまた、以下にさらに詳細に記載するような、発現細胞マーカーによっても特徴付け可能である。
多能性マーカーの発現
維持される生物学的活性は、１またはそれより多くの多能性マーカーの発現を含んでもよい。
【０１３３】
ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚性細胞タイプに特徴的である。ＳＳＥＡマーカーに対する抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（メリーランド州ベセスダ）より入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称される抗体を用いて検出可能である（Ａｎｄｒｅｗｓら，  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒｓ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  １９８７，  上記中）。ヒト胚性幹細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陰性およびＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、典型的には、ＳＳＥＡ−１陽性である。霊長類多能性幹細胞（ｐＰＳ）細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１発現の喪失、ならびにＳＳＥＡ−１発現増加を生じる。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリホスファターゼ活性の存在によっても特徴付け可能であり、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、そして次いで、製造者によって記載されるように、基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄで現像することによって検出可能である（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）。
【０１３４】
胚性幹細胞はまた、典型的には、テロメラーゼ陽性およびＯＣＴ−４陽性である。テロメラーゼ活性は、商業的に入手可能なキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．  ＸＫテロメラーゼ検出キット、カタログ番号ｓ７７０７；  Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、ニューヨーク州パーチェス；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡプラス、カタログ番号２，０１３，８９；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  インディアナポリス）を用い、ＴＲＡＰ活性アッセイ（Ｋｉｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１，  １９９７）を用いて決定可能である。また、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルでｈＴＥＲＴ発現を評価してもよい。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｅｌｏＴＡＧＧＧＴＭ  ｈＴＥＲＴ定量化キット（カタログ番号３，０１２，３４４；  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が、研究目的のため、商業的に入手可能である。
【０１３５】
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４等を含む、これらの多能性マーカーの任意の１またはそれより多くが、増殖幹細胞によって保持されうる。
【０１３６】
マーカーの検出は、当該技術分野に知られる任意の手段を通じて、例えば免疫学的に達成可能である。組織化学染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、酵素連結イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）等が使用可能である。
【０１３７】
フロー免疫細胞化学を用いて、細胞表面マーカーを検出してもよい。細胞内または細胞表面マーカーに関して、免疫組織化学（例えば固定細胞または組織切片の）を用いてもよい。細胞抽出物に対してウェスタンブロット分析を行ってもよい。細胞抽出物または培地内に分泌される産物に関して、酵素連結イムノアッセイを用いてもよい。
【０１３８】
この目的のため、商業的供給源から入手可能であるような、多能性マーカーに対する抗体を用いてもよい。
ステージ特異的胎児抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）ならびに腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含む幹細胞マーカーの同定のための抗体は、例えばＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ（米国カリフォルニア州テメキュラ）より得られうる。モノクローナル抗体を用いたこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特徴付けるために広く用いられてきている（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）  ＰＮＡＳ  ９５：１３７２６−１３７３１；  Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ．ら（２０００）．  ＰＮＡＳ  ９７：１１３０７−１１３１２；  Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｊ．Ａ．ら（１９９８）．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７；  Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  Ｂ．Ｅ．ら（２０００）．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９−４０４；  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｋ．ら（２００２）．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：３２９−３３７；  Ｐｅｒａ  Ｍ．ら（２０００）．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１３：５−１０．）。
【０１３９】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロット分析によって、あるいは標準的増幅法において配列特異的プライマーを用いた逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで検出可能である。本開示に列挙する特定のマーカーに関する配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）などの公的データベースから得られうる。さらなる詳細に関しては、米国特許第５，８４３，７８０号を参照されたい。
【０１４０】
実質的にすべての増殖細胞、またはそのかなりの部分が、マーカー（単数または複数）を発現しうる。例えば、単数または複数のマーカーを発現する細胞の割合は、５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０１４１】
細胞生存度
生物学的活性は、言及する回数の継代後の細胞生存度を含んでもよい。細胞生存度は、例えばトリパンブルー排除によるなど、多様な方式でアッセイされうる。
【０１４２】
生存染色のプロトコルは以下の通りである。適切な試験管に、適切な体積の細胞懸濁物（２０〜２００μＬ）および等体積の０．４％トリパンブルーを入れ、そして穏やかに混合し、室温で５分間放置する。１０μｌの染色細胞を血球計数板に入れ、そして生存（未染色）および死亡（染色）細胞の数を計数する。各象限の未染色細胞の平均数を計算し、そして２ｘ１０４を乗じて、細胞／ｍｌを見出す。生存細胞の割合は、生存細胞数を死亡細胞および生存細胞の数で割ったものである。
【０１４３】
細胞生存度は、５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０１４４】
核型
増殖幹細胞は、増殖中または増殖後、正常な核型を保持しうる。「正常な」核型は、幹細胞が由来する親幹細胞の核型と同一であるか、類似であるかまたは実質的に類似である核型、あるいは親幹細胞と異なるが、いかなる実質的な方式でも異ならないものである。例えば、転座、染色体の喪失、欠失等のいかなる全体的な異常もあってはならない。
【０１４５】
核型は、いくつかの方法によって、例えば光学顕微鏡検査のもとで視覚的に評価可能である。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７）、ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３）に記載されるように、調製および分析可能である。また、標準的なＧバンド形成技術（カリフォルニア州オークランドのＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂなどの、ルーチンの核型決定サービスを提供する多くの臨床診断実験室で利用可能）を用いて細胞の核型を決定し、そして公表される幹細胞核型と比較してもよい。
【０１４６】
増殖細胞のすべてまたはかなりの部分が正常な核型を保持しうる。この比率は、５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０１４７】
多能性
増殖幹細胞は、３つの細胞系譜すべて、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持しうる。幹細胞を誘導して、これらの細胞系譜の各々に分化させる方法が当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、増殖幹細胞の能力をアッセイしてもよい。増殖細胞のすべてのまたはかなりの部分がこの能力を保持しうる。これは、増殖幹細胞の５０％またはそれより多く、６０％またはそれより多く、７０％またはそれより多く、８０％またはそれより多く、９０％またはそれより多く、９３％またはそれより多く、９５％またはそれより多く、９７％またはそれより多く、９８％またはそれより多く、９９％またはそれより多く、あるいは実質的に１００％でありうる。
【０１４８】
生成される幹細胞の多能性は、適切なアッセイの使用によって決定可能である。こうしたアッセイは、多能性の１またはそれより多くのマーカー、例えばＳＳＥＡ−１抗原、アルカリホスファターゼ活性、Ｏｃｔ−４遺伝子および／またはタンパク質発現を検出する工程を含んでもよいし、ＳＣＩＤマウスにおける奇形腫形成または胚様体形成の度合いを観察することによってもよい。Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＳＯＸ−２およびＧＣＴＭ−２などの１またはそれより多くのマーカーの発現によって、ｈＥＳＣの多能性を定義してもよい。
【０１４９】
共培養およびフィーダー
方法は、共培養の存在下または非存在下で、幹細胞を培養する工程を含んでもよい。用語「共培養」は、一緒に増殖する２またはそれより多くの異なる種類の細胞混合物、例えば間質フィーダー細胞の混合物を指す。２またはそれより多くの異なる種類の細胞を、同じ表面上で、例えば粒子または細胞容器表面上で、または異なる表面上で、増殖させてもよい。異なる種類の細胞を異なる粒子上で増殖させてもよい。
【０１５０】
本文書で用いる場合、用語、フィーダー細胞は、異なるタイプの細胞の培養のために用いられるかまたは必要とされる細胞を意味する。幹細胞培養の状況において、フィーダー細胞は、生存、増殖、および細胞多能性の維持を確実にする機能を有する。細胞多能性は、フィーダー細胞を直接共培養することによって達成されうる。あるいは、またはさらに、フィーダー細胞を培地中で培養して、培地を馴化させてもよい。馴化培地を用いて、幹細胞を培養してもよい。
【０１５１】
培養ディッシュなどの容器の内表面を、分裂しないように処理してあるマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層でコーティングしてもよい。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞増殖に必要な栄養分を培地内に放出する。したがって、粒子上で増殖する幹細胞は、こうしたコーティングされた容器中で増殖可能である。
【０１５２】
フィーダー細胞が存在しないか、または必要とされない設定もまた可能である。例えば、フィーダー細胞または幹細胞によって馴化された培地中で細胞を増殖させてもよい。
培地およびフィーダー細胞
多能性幹細胞を単離しそして増殖させるための培地は、得られる細胞が望ましい特性を有し、そしてさらに増殖可能である限り、いくつかの異なる配合のいずれを有してもよい。
【０１５３】
適切な供給源は以下の通りである：ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウト・ダルベッコの修飾イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；  ２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；ベータ−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＤＭＥＭ（典型的にはＫＯ  ＤＭＥＭ）、熱不活化されていない２０％定義ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。培地をろ過し、そして４℃で２週間以内、保存する。血清不含胚性幹（ＥＳ）培地は、８０％  ＫＯ  ＤＭＥＭ、２０％血清代用品（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールで作製される。有効な血清代用品は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８である。培地をろ過し、そして４℃で２週間以内、保存する。使用直前、ヒトｂＦＧＦを最終濃度４ｎｇ／ｍＬまで添加する（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、国際特許公報ＷＯ  ９９／２０７４１）。
【０１５４】
培地は、１０％血清置換培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）、５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）および５ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）を補充したノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
【０１５５】
フィーダー細胞（用いる場合）は、９０％  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃３００７１−０３）、および２ｍＭグルタミンを含有するｍＥＦ培地中で増殖可能である。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０８２５）中で増殖させ、トリプシンを用いて、１日おきに１：２で細胞を分割し、細胞を集密以下に維持する。フィーダー細胞層を調製するため、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を支持する、重要な因子の合成を可能にする線量（約４０００ｒａｄガンマ照射）で、細胞を照射する。６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３０４など）を、ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンと、３７℃で一晩インキュベーションすることによってコーティングし、そしてウェルあたり３７５，０００の照射ｍＥＦをプレーティングする。フィーダー細胞層は、典型的には、プレーティング５時間後〜４日後に用いられる。
【０１５６】
他の幹細胞を培養するための条件が知られ、そして細胞タイプに応じて、適切に最適化可能である。先のセクションに言及する特定の細胞タイプのための培地および培養技術は、引用する参考文献中に提供される。
【０１５７】
血清不含培地
本明細書に記載する方法および組成物には、血清不含培地中の幹細胞の培養が含まれてもよい。
【０１５８】
用語「血清不含培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎児血清を含まない細胞培地を含んでもよい。血清不含培地は、当該技術分野に知られ、そして例えば、米国特許５，６３１，１５９および５，６６１，０３４に記載される。血清不含培地は、例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から商業的に入手可能である。
【０１５９】
血清不含培地は、タンパク質、加水分解物、および未知の組成の構成要素を欠いていてもよいという点で、タンパク質不含であってもよい。血清不含培地は、すべての構成要素が既知の化学構造を有する、化学的に定義された培地を含んでもよい。化学的に定義される血清不含培地は、変動を排除し、そして改善された再現性およびより一貫した性能を可能にし、そして不定の剤による混入の可能性を減少させる、完全に定義された系を提供するため、好適である。
【０１６０】
血清不含培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでもよい。
血清不含培地に、例えば５％、１０％、１５％等の濃度で、血清置換培地などの１またはそれより多くの構成要素を補充してもよい。血清不含培地に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（ニューヨーク州グランドアイランド）の血清置換培地を１０％補充してもよい。
【０１６１】
解離または脱凝集された胚性幹細胞を培養する血清不含培地は、１またはそれより多くの増殖因子を含んでもよい。ＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、ノギン、アクチビンＡ、ＴＧＦベータ１、ＨＲＧ１ベータ、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａおよびその他を含む、いくつかの増殖因子が当該技術分野に知られる。増殖因子（単数または複数）を、１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの間などの任意の適切な濃度で用いてもよい。
【０１６２】
培地補充物
培地に１またはそれより多くの添加物を補充してもよい。例えばこれらは：脂質混合物、ウシ血清アルブミン（例えば０．１％  ＢＳＡ）、大豆タンパク質の加水分解物の１またはそれより多くから選択可能である。
【０１６３】
多能性幹細胞の供給源
現在、胚の破壊につながらない、例えば成体体細胞または生殖細胞の形質転換（誘導）による、多能性幹細胞の単離のためのいくつかの方法が提供されてきている。これらの方法には、以下が含まれる：
１．核トランスファーによる再プログラミング。この技術は、体細胞から卵母細胞または接合子内への核のトランスファーを伴う。いくつかの状況において、これは、動物−ヒト・ハイブリッド細胞の生成を導きうる。例えば、ヒト体細胞と動物卵母細胞または接合子の融合、あるいはヒト卵母細胞または接合子と動物体細胞の融合によって、細胞を生成することも可能である。
【０１６４】
２．胚性幹細胞との融合による再プログラミング。この技術は、体細胞と胚性幹細胞の融合を伴う。この技術はまた、上記１におけるように、動物−ヒト・ハイブリッド細胞の生成を導きうる。
【０１６５】
３．培養による自発的再プログラミング。この技術は、長期培養後の非多能性細胞からの多能性細胞の生成を伴う。例えば、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養によって、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞が生成されてきている（本明細書に援用される、Ｍａｔｓｕｉら，  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｃｅｌｌ  ７０，  ８４１−８４７，  １９９２）。骨髄由来細胞の長期培養後の多能性幹細胞の発生もまた報告されてきている（本明細書に援用される、Ｊｉａｎｇら，  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，  ４１−４９，  ２００２）。Ｊｉａｎｇらは、これらの細胞を多分化能成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）と称した。Ｓｈｉｎｏｈａｒａらもまた、新生マウス精巣由来の生殖系列幹（ＧＳ）細胞の培養経過中に多能性幹細胞が生成可能であることを示し、これを多分化能生殖系列幹（ｍＧＳ）細胞と称した（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａら，  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １１９，  １００１−１０１２，  ２００４）。
【０１６６】
４．定義される因子による再プログラミング。例えば、レトロウイルスが仲介する、例えば上述のようなマウス胚性または成体線維芽細胞内への転写因子（例えばＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４）の導入による、ｉＰＳ細胞の生成。Ｋａｊｉら（Ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  １  Ｍａｒｃｈ  ２００９）はまた、２Ａペプチドと連結されたｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のコード配列を含む、単一多タンパク質発現ベクターの非ウイルストランスフェクションを記載し、これは、マウスおよびヒト線維芽細胞をどちらも再プログラミング可能であった。この非ウイルスベクターで産生されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーの頑強な発現を示し、再プログラミング状態が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化アッセイおよび成体キメラマウスの形成によって、機能的に確認されることを示した。Ｋａｊｉらは、胚性線維芽細胞から、多能性マーカーを頑強に発現する再プログラミングヒト細胞株を確立するのに成功した。
【０１６７】
方法１〜４は、本明細書に援用される、山中伸弥による、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １，  Ｊｕｌｙ  ２００７ａ２００７  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｉｎｃ）に記載され、そして論じられる。
【０１６８】
５．単一卵割球または生検卵割球由来のｈＥＳＣ株の誘導。すべて本明細書に援用される、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓ，  Ｌｕ  ＳＪ，  Ｌａｎｚａ  Ｒ．  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００６；  ４４４：５１２、Ｌｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２−６８８、Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６；４３９：２１６−２１９．  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００６；４４４：４８１−４８５．  Ｃｈｕｎｇ  Ｙ，  Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｓら  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｍｂｒｙｏ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２００８；２：１１３−１１７およびＤｕｓｋｏ  Ｉｌｉｃら（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｐｓｉｅｄ  ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｅｄｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ｘｅｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ−公表前の論文）を参照されたい。
【０１６９】
６．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、卵割を停止し、そして桑実胚および胚盤胞まで発生するのに失敗した停止胚から得られるｈＥＳＣ株。どちらも本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ  Ｘ，  Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ  Ｐ，  Ｐｒｚｙｂｏｒｓｋｉ  Ｓら  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：２６６９−２６７６およびＬｅｉら  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ，  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００７）１７：６８２−６８８を参照されたい。
【０１７０】
７．単為生殖。この技術は、未受精卵を化学的または電気的に刺激して、胚性幹細胞を得られうる桑実胚に発生させる工程を伴う。例えば、幹細胞を産生するために未受精中期ＩＩ卵母細胞の化学的活性化を使用した、Ｌｉｎら  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｏｏｃｙｔｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２００３；２１（２）：１５２−６１を参照されたい。
【０１７１】
８．胎児起源の幹細胞。これらの細胞は、可能性の観点からは胚性および成体幹細胞の間に位置し、そしてこれを用いて、多能性または多分化能細胞を得ることも可能である。多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１、β−ガラクトシダーゼ染色によって示されるような老化の証拠が最小限であること、およびテロメラーゼ活性の一貫した発現を含む）を発現するヒト臍帯由来胎児間質幹細胞（ＵＣ  ｆＭＳＣｓ）が、Ｃｈｒｉｓ  Ｈ．  Ｊｏら（本明細書に援用される、Ｆｅｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ（２００８）３３４：４２３−４３３）によって成功裡に得られている。Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｃｏｓｔａ  Ｐｅｒｅｉｒａら（本明細書に援用される、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；２：３９４−３９９）は、ヒト臍帯のＷｈａｒｔｏｎゼリーから、間葉幹細胞の純粋な集団を単離した。Ｗｈａｒｔｏｎゼリー由来の間葉幹細胞はまた、Ｔｒｏｙｅｒ  ＆  Ｗｅｉｓｓ（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：  Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ  Ｊｅｌｌｙ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｅ  ａ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８：２６：５９１−５９９）にも概説されている。Ｋｉｍら（本明細書に援用される、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００７  Ｗｉｎｔｅｒ；９（４）：５８１−９４）は、ヒト羊膜からヒト羊膜由来間葉細胞を単離することに成功した。臍帯は、通常廃棄される組織であり、そしてこの組織由来の幹細胞は、道徳的または倫理的な反対を招かない傾向がある。
【０１７２】
９．  Ｃｈｕｎｇら［（２００８）Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ２（２）１１３−１１７．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｊａｎ  １０］は、胚の破壊を伴うヒト胚性幹細胞株の精製を記載する。
【０１７３】
人工多能性幹細胞は、これらが胚の破壊を引き起こさない方法によって、より具体的には、ヒトまたは哺乳動物胚の破壊を引き起こさない方法によって得られうるという利点を有する。
【０１７４】
Ｃｈｕｎｇらによって記載される方法（上記項目９）はまた、ヒト胚の破壊を引き起こさない方法によって、ヒト胚性幹細胞を得ることも可能にする。
こうしたものとして、こうした細胞が得られうるヒトまたは動物胚の破壊を必然的に伴う方法のみによって調製されたのではない細胞を用いることによって、本発明の側面を行うかまたは実施してもよい。この場合による限定は、欧州特許庁拡大審判廷の２００８年１１月２５日の決定Ｇ０００２／０６を考慮に入れることが特に意図される。
【０１７５】
未分化細胞の分化
未分化多能性細胞を誘導して、多様な異なる細胞タイプに分化させることも可能である。例えば未分化多能性細胞を誘導して、心臓細胞（心筋細胞）、肝細胞、神経細胞、軟骨（軟骨細胞）、筋肉、脂肪（脂肪細胞）、骨（骨細胞）または他の細胞に分化させることも可能である。未分化多能性細胞を誘導して、上皮組織、中胚葉、内胚葉、外胚葉または表皮などの組織を形成することも可能である。
【０１７６】
幹細胞を分化させる方法は当該技術分野に知られ、そして例えば、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（２０００）およびＧｒａｉｃｈｅｎら（２００７）に記載され、そして未分化多能性細胞でこれらを用いてもよい。また、胚様体を形成するために培養幹細胞を用いてもよい。胚様体および胚様体を作製するための方法が当該技術分野に知られる。用語「胚様体」は、懸濁中で胚性幹細胞を増殖させることによって産生可能な、培養中に見られる球状コロニーを指す。胚様体は、混合細胞タイプのものであり、そして特定の細胞タイプの分布および出現タイミングは、胚内で観察されるものに対応する。半固形培地などの培地上に胚性幹細胞をプレーティングすることによって、胚様体を生成することも可能である。Ｌｉｍら，  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７；９０：１２９１−１２９９に記載されるように、メチルセルロース培地を用いてもよい。
【０１７７】
例えばＩｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ（２０００）に記載される方法を用いて、胚性幹細胞を誘導して胚様体を形成してもよい。胚様体は、３つの胚性胚葉すべて（内胚葉、外胚葉、中胚葉）の細胞を含有する。
【０１７８】
例えば適切な誘導因子または環境変化への曝露によって、胚様体をさらに誘導して、異なる細胞系譜に分化させることも可能である。Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７）は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の操作によって、ヒト胚性幹細胞からの心筋細胞の形成を記載する。Ｇｒａｉｃｈｅｎは、１０μｍ未満のＳＢ２０３５８０などのｐ３８  ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤に曝露することによって、幹細胞から心筋細胞形成が誘導されることを示す。
【０１７９】
当該技術分野に知られるような、再生療法および細胞移植などの、任意の適切な目的のために、分化細胞を使用してもよい。
療法使用
本発明の方法によって得られる分化子孫細胞は、医学において、例えば細胞療法において、多様な使用を有する。細胞療法は、個々の細胞の集団として、あるいは細胞凝集体または組織の形で、ならびに／あるいは再生療法、例えば組織再生、置換および／または修復のいずれでもよい、細胞の移入または移植を含んでもよい。分化子孫細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養で拡大して、そして患者に直接投与してもよい。外傷後の損傷組織の再増殖および／または修復のために、これらを用いてもよい。
【０１８０】
分化子孫細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大によって作製してもよいし、または患者に直接投与してもよい。また、外傷後の損傷組織の再増殖および／または修復のために、これらを用いてもよい。
【０１８１】
したがって、骨髄置換のために造血前駆細胞を用いてもよいし、一方、心臓不全患者のために心臓前駆細胞を用いてもよい。患者のための皮膚移植片を増殖させるために皮膚前駆細胞を使用してもよく、そしてステントまたは人工心臓などの人工装具の内皮化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｚａｔｉｏｎ）のために内皮前駆細胞を使用してもよい。
【０１８２】
本明細書記載の方法および組成物によって産生される分化子孫細胞を、疾患治療のために、または疾患治療用の薬学的組成物調製のために用いてもよい。こうした疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚病、火傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病および癌などの変性疾患を含む、再生療法によって治療可能な疾患を含むことも可能である。
【０１８３】
分化子孫細胞を、必要があるヒト患者における組織再構成または再生に用いてもよい。細胞が意図される組織部位に移植され、そして機能的に欠陥がある領域を再構成するかまたは再生するのを可能にする方式で、細胞を投与する。
【０１８４】
例えば、本明細書記載の方法および組成物を用いて、幹細胞の分化を調節してもよい。分化細胞を組織操作のため、例えば皮膚移植片の増殖のため、用いてもよい。人工臓器または組織のバイオエンジニアリングのため、あるいはステントなどの装具のため、幹細胞分化の調節を用いてもよい。
【０１８５】
別の例において、治療中の疾患に応じて、中枢神経系の実質部位またはクモ膜下腔内部位に、神経幹細胞を直接移植する。μＬあたり２５，０００〜５００，０００細胞の密度で単細胞懸濁物または小凝集体を用いて、移植を行う（米国特許第５，９６８，８２９号）。ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５：１４１０，  １９９９）によって記載されるように、急性脊髄傷害のラットモデルにおいて、神経細胞移植の有効性を評価してもよい。成功した移植は、２〜５週間後に、病変中に存在する移植片由来細胞が、アストロサイト、オリゴデンドロサイトおよび／またはニューロンに分化し、そして病変端から脊髄に沿って移動し、そしてゲート、協調および重量負荷が改善していることを示すであろう。
【０１８６】
神経系に対する急性または慢性損傷の治療のため、特定の神経前駆細胞を設計する。例えば、癲癇、脳卒中、虚血、ハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む多様な状態において、興奮毒性が関連付けられてきている。本明細書に記載する方法にしたがって作製するような特定の分化細胞はまた、ペリツェウス・メルツバッヘル病、多発性硬化症、白質ジストロフィー、神経炎および神経疾患などのミエリン形成不全障害（ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）を治療するのにもまた適切でありうる。これらの目的に適しているのは、再ミエリン形成を促進する、オリゴデンドロサイトまたはオリゴデンドロサイト前駆体が濃縮された細胞培養である。
【０１８７】
本発明者らの方法を用いて調製した肝細胞および肝細胞前駆体が肝臓損傷を修復する能力に関して、動物モデルにおいて評価してもよい。１つのこうした例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注射によって引き起こされる損傷である（Ｄａｂｅｖａら，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４３：１６０６，  １９９３）。肝臓細胞マーカーに関する免疫組織化学染色、増殖中の組織において毛細胆管構造が形成されるかどうかの微視的決定、および治療が肝臓特異的タンパク質の合成を回復する能力によって、治療有効性を決定してもよい。直接投与によって、または被験体の肝臓組織が、劇症肝不全後に再生する間、一時的な肝機能を提供する生体補助（ｂｉｏａｓｓｉｓｔ）デバイスの一部として、療法において肝細胞を用いてもよい。
【０１８８】
Ｇｒａｉｃｈｅｎら（２００７）に記載されるような、特異的ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤であるＳＢ２０３５８０を用いて、ＭＰＡキナーゼ経路を調節することにより、幹細胞の分化を誘導することによって、心筋細胞を調製してもよい。治療を伴わないと左心室壁組織の５５％を瘢痕組織にする、心臓凍結傷害（ｃｒｙｏｉｎｊｕｒｙ）の動物モデルにおいて、こうした心筋細胞の有効性を評価してもよい（Ｌｉら，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ６２：６５４，  １９９６；  Ｓａｋａｉら，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｓｕｒｇ．  ８：２０７４，  １９９９、  Ｓａｋａｉら，  Ｊ．  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｓｕｒｇ．  １１８：７１５，  １９９９）。治療が成功すると、瘢痕面積が減少し、瘢痕拡大が限定され、そして収縮期圧、拡張期圧、および最大圧によって決定されるように、心臓機能が改善されるであろう。また、左前下行枝の遠位部分において塞栓コイルを用いて、心臓傷害をモデリングしてもよく（Ｗａｔａｎａｂｅら，  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ７：２３９，  １９９８）、そして組織学および心臓機能によって、治療有効性を評価してもよい。療法において、心筋細胞調製物を用いて、心筋を再生し、そして不十分な心臓機能を治療してもよい（米国特許第５，９１９，４４９号およびＷＯ  ９９／０３９７３）。
【０１８９】
未分化多能性細胞が多様な細胞タイプに分化するように導き、そして置換細胞および組織の再生可能供給源が、ある範囲の疾患および障害を治療する可能性を提供することも可能である。これらの疾患および障害には、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脊髄傷害、骨傷害（例えば骨折）、脳卒中、火傷、心臓疾患、糖尿病、骨関節炎、および関節リウマチが含まれる。移植可能組織および臓器を必要とする疾患および障害が治療可能であり、そして特に例えば奇形腫の形成を防止するために、移植前に未分化細胞を破壊することが有用である場合にあてはまる。
【０１９０】
本発明は、本発明の方法のいずれかによって単離された分化子孫細胞を含んでもよい、薬剤および薬学的組成物を提供する。該薬剤および薬学的組成物は、上述のような医学的治療法で使用するため、提供可能である。適切な薬学的組成物は、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含んでもよい。
【０１９１】
したがって、本発明はまた、本発明の方法を用いて、未分化多能性細胞を破壊するように処理されている細胞を含む、薬学的組成物および薬剤も提供する。
本発明記載の方法によって単離される分化子孫細胞を、医学的治療法において用いてもよい。医学的治療法は、治療の必要がある個体に、療法的に有効な量の前記薬剤または薬学的組成物を投与する工程を含んでもよい。
【０１９２】
治療しようとする被験体は、任意の動物またはヒトであってもよい。被験体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被験体は男性（雄）または女性（雌）であってもよい。被験体は患者であってもよい。療法的使用は、ヒトまたは動物（獣医学的使用）におけるものであってもよい。
【０１９３】
本発明の側面にしたがった薬剤および薬学的組成物を、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内、経口および経鼻を含む、いくつかの経路による投与のために配合してもよい。薬剤および組成物を注射用に配合してもよい。
【０１９４】
投与は、好ましくは、「療法的に有効な量」であり、これは、個体に対して利益を示すのに十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の指示、例えば投薬量に関する決定等は、開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法、および医師に知られる他の要因が考慮されるであろう。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第２０版，  ２０００，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【０１９５】
薬学的に有用な組成物および薬剤の配合
本発明にしたがって、こうして得られる単数または複数の細胞に基づいてもよい、薬学的に有用な組成物を産生するための方法もまた提供する。本明細書に記載する方法の工程に加えて、こうした産生法は：
（ａ）分化子孫細胞を単離しそして／または得る工程；
（ｂ）分化子孫細胞と、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤を混合する工程
より選択される１またはそれより多くの工程をさらに含んでもよい。
【０１９６】
工程（ｂ）は、好ましくは、療法的使用に適した薬学的組成物または薬剤の配合／調製を生じる。
タンパク質発現
本発明記載のポリペプチドを産生するために適した分子生物学技術が当該技術分野に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９に示されるものがある。ポリペプチドは、ヌクレオチド配列から発現させることも可能である。ヌクレオチド配列は、細胞中に存在するベクター中に含有されてもよいし、または細胞ゲノム内に取り込まれてもよい。
【０１９７】
「ベクター」は、本明細書において、細胞内に外因性遺伝物質をトランスファーするためのビヒクルとして用いられるオリゴヌクレオチド分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ベクターは、細胞において、遺伝物質を発現させるための発現ベクターであることも可能である。こうしたベクターには、発現しようとする遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されたプロモーター配列が含まれることも可能である。ベクターにはまた、末端コドンおよび発現エンハンサーも含まれることも可能である。当該技術分野に知られる任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび終結コドンを用いて、本発明記載のベクターからポリペプチドを発現させることも可能である。適切なベクターには、プラスミド、バイナリーベクター、ウイルスベクターおよび人工染色体（例えば酵母人工染色体）が含まれる。
【０１９８】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結される」には、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列（例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー）が、制御配列の影響または調節下で、ヌクレオチド配列の発現を達成するような方式で、共有連結される（それによって発現カセットを形成する）。したがって、制御配列がヌクレオチド配列の転写を達成可能であるならば、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に、機能可能であるように連結されている。適切な場合、生じた転写物は、次いで、望ましいタンパク質またはポリペプチドに翻訳されることも可能である。
【０１９９】
本発明記載のペプチドを産生するため、ポリペプチドの発現に適した任意の細胞が使用可能である。細胞は、原核細胞または真核細胞であることも可能である。適切な原核細胞には大腸菌が含まれる。真核細胞の例には、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が含まれる。いくつかの場合、ある原核細胞は、真核細胞と同じ翻訳修飾を可能にしないため、細胞は原核細胞ではない。さらに、真核細胞では非常に高い発現レベルが可能であり、そして適切なタグを用いると、真核細胞からタンパク質を精製することがより容易でありうる。培地へのタンパク質の分泌を増進させる特定のプラスミドもまた、利用可能である。
【０２００】
関心対象のポリペプチドを産生する方法は、ポリペプチドを発現するように修飾された細胞の培養または発酵を伴うことも可能である。培養または発酵は、栄養素、空気／酸素および／または増殖因子の適切な供給を提供されるバイオリアクター中で実行可能である。細胞から、培地／発酵ブロスを分配し、タンパク質内容物を抽出し、そして個々のタンパク質を分離して、分泌されたポリペプチドを単離することによって、分泌タンパク質を収集することも可能である。培養、発酵および分離技術は、当業者に周知である。
【０２０１】
バイオリアクターには、その中で細胞を培養可能である１またはそれより多い容器が含まれる。バイオリアクター中の培養は、連続して生じてもよく、リアクター内への反応物の連続流動、およびリアクターからの培養細胞の連続流動が伴う。あるいは、培養はバッチで生じてもよい。バイオリアクターは、培養中の細胞のために最適な条件が提供されるように、ｐＨ、酸素、容器内へのおよび容器外への流速、および容器内の攪拌などの環境条件を監視し、そして調節する。
【０２０２】
関心対象のポリペプチドを発現する細胞の培養後、好ましくはそのポリペプチドを単離する。当該技術分野に知られる、細胞培養からポリペプチド／タンパク質を分離するための任意の適切な方法が使用可能である。培養から関心対象のポリペプチド／タンパク質を単離するため、まず、関心対象のポリペプチド／タンパク質を含有する培地から、培養された細胞を分離する必要がある可能性もある。関心対象のポリペプチド／タンパク質が細胞から分泌される場合、分泌されたポリペプチド／タンパク質を含有する培養から、遠心分離によって細胞を分離することも可能である。関心対象のポリペプチド／タンパク質が細胞内に集積する場合、遠心分離前に、例えば超音波、迅速凍結融解または浸透圧溶解を用いて、細胞を破壊する必要があるであろう。遠心分離は、培養細胞を含有するペレット、または培養細胞の細胞破片、ならびに培地および関心対象のポリペプチド／タンパク質を含有する上清を生じるであろう。
【０２０３】
次いで、他のタンパク質および非タンパク質構成要素も含有しうる上清または培地から、関心対象のポリペプチド／タンパク質を単離することが望ましい可能性もある。上清または培地からポリペプチド／タンパク質構成要素を分離するための一般的なアプローチは、沈殿による。異なる溶解度のポリペプチド／タンパク質は、硫酸アンモニウムなどの沈殿剤の異なる濃度で沈殿する。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性タンパク質が抽出される。したがって、増加する濃度の沈殿剤を添加することによって、異なる溶解度のタンパク質が区別可能である。続いて、透析を用いて、分離されたタンパク質から硫酸アンモニウムを除去することも可能である。
【０２０４】
異なるポリペプチド／タンパク質を区別するための他の方法が当該技術分野に知られ、例えばイオン交換クロマトグラフィおよびサイズクロマトグラフィがある。これらを沈殿の代替法として用いてもよいし、または沈殿に続いて行ってもよい。
【０２０５】
関心対象のポリペプチド／タンパク質が、ひとたび培養から単離されたら、タンパク質を濃縮する必要がある可能性もある。関心対象のタンパク質を濃縮するためのいくつかの方法が当該技術分野に知られ、例えば限外濾過または凍結乾燥がある。
【０２０６】
配列同一性
配列同一性パーセント（％）は、配列を整列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさずに、所定の列挙する配列（配列番号によって言及する)中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。配列同一性は、好ましくは、各配列の全長に渡って計算される。
【０２０７】
整列させる配列が異なる長さである場合、より短い比較配列の配列同一性を、より長い所定の配列の全長に渡って決定してもよいし、または比較配列が所定の配列より長い場合、比較配列の配列同一性を、より短い所定の配列の全長に渡って決定してもよい。
【０２０８】
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列を、当業者に知られる多様な方式で達成してもよく、例えば公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２．  Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いてもよい。こうしたソフトウェアを用いる場合、好ましくは、デフォルトパラメーター、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関するものを用いる。ＣｌｕｓｔａｌＷ  １．８２のデフォルトパラメーターは：タンパク質ギャップ・オープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
【０２０９】
本発明には、記載する側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれるが、こうした組み合わせが明らかに許容されえないかまたは明らかに回避される場合を除く。
本明細書に用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは意図されないものとする。
【０２１０】
例えば、付随する図に言及して、本発明の側面および態様がここで例示される。さらなる側面および態様が当業者には明らかであろう。本明細書に言及するすべての文書は、本明細書に援用される。
【０２１１】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、初期段階ヒト胚の内部細胞塊に由来し、無制限に複製可能であり（自己再生）、そして適切な条件下で、三胚葉すべての派生物に分化可能である（多能性）。多様な研究が、組織操作および再生医学において、ｈＥＳＣが大きな潜在能力を持つことを立証した。しかし、ｈＥＳＣ適用の大きな懸念は、残った未分化ｈＥＳＣによる奇形腫形成のリスクである。現在、ｈＥＳＣ産物における奇形腫形成を完全に排除する解決策は利用可能ではない。本発明者らは、以前、未分化ｈＥＳＣを殺すことが可能であることが見出されたｍＡｂ８４を同定した。しかし、ｍＡｂ８４は、ＩｇＭ五量体として凝集体を形成する傾向があり、腫瘍塊への浸透効率が妨げられる可能性もあった。
【０２１２】
本発明者らは、本明細書において、未分化ｈＥＳＣを殺すことが可能なｍＡｂ  Ａ１を同定している。ＩｇＧ単量体としてのＡ１は、ｍＡｂ８４の欠点を補完する。ｈＥＳＣ療法におけるＡ１の有効な使用を促進するため、本発明者らは、異なる側面からＡ１を研究した：Ａ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付け、Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死機構の解明。本発明者らは、Ａ１が未分化ｈＥＳＣに特異的に結合し、そして未分化ｈＥＳＣを殺すことを見出した。その細胞傷害性は、時間および投薬量依存性である。大部分の殺傷は最初の５分以内に起こる。ｈＥＳＣに対するＡ１の結合および細胞傷害性は、Ａ１抗原上の共通のグリカンモチーフ：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１に依存する。これらの抗原は、４つのタンパク質群に分類可能である：細胞接着タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、ＡＴＰアーゼタンパク質および輸送体タンパク質。Ａ１処理に際して、ｈＥＳＣは、細胞内および細胞外形態に有意な変化を有し、例えば異なるサイズの膜孔の形成、同型接着、膜完全性および微絨毛の喪失、細胞膨張、ミトコンドリア濃縮および末梢再局在化、ならびに細胞質の空胞化を有する。本発明者らはまた、Ａ１細胞傷害性がアクチン再編成と緊密に関連することも見出した。
【０２１３】
以下に記載する実験結果は、Ａ１が未分化ｈＥＳＣに特異的に結合し、そして腫瘍症様経路を通じて細胞死を誘導することを示唆する。細胞傷害性は時間および投薬量依存性である。大部分の殺傷は最初の５分以内に起こる。Ａ１はＯ連結グリカンターゲット抗原を認識する。ｈＥＳＣに対するＡ１の結合および細胞傷害性は、ターゲット抗原上の共通のグリカンモチーフ：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１に依存する。さらに、Ａ１ターゲット抗原は、４つのタンパク質群に分類可能である：細胞接着タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、ＡＴＰアーゼタンパク質および輸送体タンパク質。Ａ１処理に際して、ｈＥＳＣは、細胞内および細胞外形態に有意な変化を有し、例えば同型接着の形成、膜完全性および微絨毛の喪失、細胞膨張、ミトコンドリア濃縮および末梢再局在化、ならびに細胞質の空胞化を有する。本発明者らはまた、Ａ１細胞傷害性がアクチン重合と緊密に関連することも見出した。
【実施例】
【０２１４】
実施例１−Ａ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付け
モノクローナル抗体Ａ１の生成
未分化ヒト胚性幹細胞でＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫接種した後、ｍＡｂ  Ａ１を得た。マウスからＢ細胞を単離し、そしてマウス骨髄腫と融合させて、Ａ１を産生するハイブリドーマを生成した。Ａ１はまた、ヒトＩｇＧ１定常領域とキメラ形成しており、そしてｍＡｂはマウスｍＡｂ  Ａ１に対する特異性および活性を保持する。
【０２１５】
Ａ１の結合および細胞傷害性は、未分化細胞に対して特異的である
Ａ１結合および細胞傷害性の特異性を調べるため、未分化ｈＥＳＣおよびヒト胎児肺線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（ＥＳＩＭＲ９０）に対して、フローサイトメトリー分析を行った。図５から、Ａ１は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞（ＥＳＩＭＲ９０）の両方に結合する。さらに、Ａ１は、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞に対して細胞傷害性でもある。したがって、Ａ１は多能性ヒト幹細胞の両方のタイプに反応性である。
【０２１６】
Ａ１結合および細胞傷害性が、未分化表現型にのみ特異的であるかどうかを決定するため、胚様体（ＥＢ）形成またはＦＧＦ−２飢餓によって、ｈＥＳＣを誘導して分化させた。
【０２１７】
ＥＢは、未分化ｈＥＳＣから得られる三次元凝集体である。高発現されたＣａ２＋依存性接着分子Ｅ−カドヘリンの出血性結合によって、ＥＢ形成が促進される。ＥＢ内の細胞は、自発的分化、ならびに三胚葉細胞系譜：内胚葉、外胚葉、および中胚葉に沿った細胞特異化を経る１１、８３。ＥＢ形成から自発的に分化したｈＥＳＣを、第２日、第５日、第８日、第１５日、および第２２日に、フローサイトメトリー分析のために採取した。本発明者らは、生存ｈＥＳＣおよび分化細胞を、Ａ１および多能性マーカー、抗ＴＲＡ−１−６０で同時染色した。同時に、ＰＩ排除アッセイを通じて、細胞の生存度を評価した。図６は、多様な分化段階での細胞に対するＡ１の結合および殺傷特異性を示す。ｈＥＳＣに対するＡ１の結合は、細胞が第５日〜第２２日に多能性を減少し始めるにつれて、下方制御されることが観察された（図６ａ）。細胞殺傷の効率はまた、Ｔｒａ−１−６０陽性細胞の割合とも緊密に対応した（図６ｃ）。
【０２１８】
あるいは、ｈＥＳＣは、ＦＧＦ−２飢餓を通じても分化し、これは、ＦＧＦ−２がｈＥＳＣ多能性の維持に重要であるためである８４。類似の傾向が観察されたが、Ａ１結合および細胞傷害性の下方制御はより遅かった（図６ｂ、ｄ）。総合すると、本発明者らは、Ａ１の結合および細胞傷害性が、未分化ｈＥＳＣにのみ特異的であると結論づける。
【０２１９】
Ａ１殺傷に対する投薬量の効果
以前、ｍＡｂ８４が未分化ｈＥＳＣに結合し、そして未分化ｈＥＳＣを殺すことが示されてきているため、これを、Ａ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けの基準として用いた。最初に、フローサイトメトリー分析を実行して、Ａ１およびｍＡｂ８４の細胞傷害性に対する投薬量の影響を調べた。Ａ１およびｍＡｂ８４の濃度を、１００μｌの体積中、１ｘ１０５ｈＥＳＣに関して、０．７８〜１０μｇの範囲に渡って、４５分間のインキュベーションで、力価決定した。ＰＩ排除アッセイによって、細胞生存度を評価した。本発明者らは、Ａ１およびｍＡｂ８４が、ｈＥＳＣに対する細胞傷害性に対して、類似の投薬量依存性を有することを見出した（図７）。
【０２２０】
Ａ１殺傷の動力学
次に、本発明者らはＡ１殺傷の動力学を調べた。この時間経過研究において、ｈＥＳＣ（１ｘ１０５）を５μｇのＡ１またはｍＡｂ８４で処理した。ＰＩ排除アッセイのため、最初の１分のインキュベーション後、そして続いて、５分ごとに細胞を採取した。本発明者らは、ｍＡｂ８４およびＡ１が、類似の時間依存性方式で、ｈＥＳＣに対して細胞傷害性であることを観察した（図８）。細胞生存度は、ｍＡｂ８４またはＡ１との１分間のインキュベーション後、８０％低下した。
【０２２１】
Ａ１殺傷の動力学に対する投薬量の影響
図８に示すＡ１動力学研究の結果に基づいて、Ａ１殺傷は非常に迅速な速度で進行する。細胞殺傷速度を遅らせる試みの中で、本発明者らは、Ａ１殺傷の動力学に対する投薬量の影響を調べた。細胞を、多様な投薬量のＡ１で処理し、そして１０分ごとに、ＰＩ排除アッセイのために採取した。その結果、各Ａ１投薬量に関して、大部分の殺傷は、最初の１０分以内に達成された（図９ａ）。アッセイを反復したが、中央の３つのＡ１投薬量を用いて最初の１０分間にのみ焦点を当てた。細胞生存度を２分ごとに評価した。本発明者らは、大部分の殺傷がなお最初の１分以内に達成されたことを見出した（図９ｂ）。したがって、抗体投薬量を減少させることによって、殺傷プロセスを遅延させることは困難であり、殺傷効率のみが減少される。
【０２２２】
ｍＡｂ８４およびＡ１の間の競合的阻害
ｍＡｂ８４およびＡ１は、投薬量および時間依存性において非常に類似であるため、本発明者らはまた、ｈＥＳＣに対するｍＡｂ８４およびＡ１の結合の間の競合的阻害があるかどうかも調べた。細胞（１ｘ１０５）を、同量のｍＡｂ８４およびＡ１で、同時にまたは連続してのいずれかで処理した。Ａ１をＦＩＴＣで標識し、そしてｍＡｂ８４をＡＰＣで標識した。図１０は、ＦＩＴＣおよびＡＰＣシグナルの読み取り値を示し、これは、ｈＥＳＣに対するｍＡｂの結合に相当する。本発明者らは、同時のまたは連続した処理に関わらず、ＦＩＴＣおよびＡＰＣシグナルが、陽性対照におけるそれぞれの対応するシグナルと同程度に強いことを観察した。したがって、本発明者らは、ｈＥＳＣに対するｍＡｂ８４およびＡ１の結合の間に競合的阻害はないと結論づけた。
【０２２３】
Ａ１誘導性形質膜損傷
Ａ１で処理したｈＥＳＣの迅速な殺傷効果およびＰＩ取り込みによって、Ａ１が腫瘍症を介してｈＥＳＣを殺すことが示唆され、これは典型的には膜孔形成を生じる。したがって、多様な分子量のデキストラン・ビーズを用いて、これらの孔のサイズを概算した。図１１において、３つの異なるサイズ（４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、２０００ｋＤａ）のデキストラン・ビーズは、Ａ１処理ｈＥＳＣおよびｍＡｂ８４処理ｈＥＳＣ内に拡散可能であり、固定されそして透過処理された細胞に匹敵する蛍光レベル増加を導いた。対照的に、陰性対照およびｍＡｂ８５対照の蛍光レベルは最小限であり、死んだ細胞のバックグラウンドに相当する。このデータによれば、形質膜上に形成される孔サイズは、２，０００ｋＤａより大きく、これは約２０ｎｍである。
【０２２４】
ｈＥＳＣ上のＡ１ターゲット抗原
Ａ１のターゲット抗原を同定するため、ＰｈｙＮｅｘｕｓ自動化系を用いて、免疫沈降（ＩＰ）を行った。抗原スメアが検出され（図１２ａ）、一方、ｍＡｂ８４の抗原は：ＰＯＤＸＬ３７と同定される単一タンパク質バンドである。銀染色ゲル上の対応するバンドを切り出し、そして質量分析（ＭＳ）によって分析した。Ｕｎｉｐｒｏｔタンパク質データベースでペプチドをマッピングすることによって、スメア由来の抗原は４つのタンパク質群：細胞接着タンパク質、細胞骨格関連タンパク質、ＡＴＰアーゼタンパク質および輸送体タンパク質に分類可能である（図１２ｂ）。さらに、７０％を超える抗原は糖タンパク質である。
【０２２５】
次に、本発明者らは、さらに、これらの抗原に対するＡ１の結合がグリカンに依存するかどうかを調べた。免疫沈降された抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、いかなる存在する糖環も開放し、そしてＡ１で免疫ブロットした。ウェスタンブロット分析（図１２ａ）から、Ａ１の結合の大部分が過ヨウ素酸塩処理に際して消失し；Ａ１の結合が抗原上のグリカンと会合することが示唆される。
【０２２６】
本発明者らは、次いで、Ａ１の結合がＮ連結またはＯ連結グリカンと関連するかどうかを調べた。Ａ１による抗原の免疫沈降後、溶出した抗原をシアリダーゼ、ＰＮＧａｓｅ  Ｆおよびβ脱離で消化した。各酵素消化から試料を採取し、そしてＡ１で免疫ブロットした。Ｎ連結またはＯ連結グリカンを曝露可能であるように、シアリダーゼを用いて、末端シアル酸を除去した。ウェスタンブロット分析（図１２ｃ）から、Ａ１の結合は、シアリダーゼでのシアル酸除去およびＰＮＧａｓｅ  ＦでのＮ−グリカン除去後に喪失しなかった。Ａ１結合は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化およびβ脱離（Ｏ連結グリカンを除去する）の両方の後にのみ失われた。このデータから、本発明者らは、Ａ１がｈＥＳＣ抗原上のＯ連結グリカンに結合すると結論づけた。
【０２２７】
Ａ１が、ｈＥＳＣ抗原上のＯ連結グリカンに結合することが判明したため、本発明者らはさらに、Ａ１が認識するグリカンの糖組成を調べた。ｈＥＳＣの単細胞懸濁物と４５分間インキュベーションする前に、Ａ１を、９つの異なる糖、すなわち、１型Ｈ（Ｈ１）、２型Ｈ（Ｈ２）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース１（ＬＮＦＰ１）、１型Ａ（ｂｇＡ）、１型Ｂ（ｂｇＢ）、ＬＮＦＰ１、Ｌｅｗｉｓａ、Ｌｅｗｉｓｂ、ＬｅｗｉｓｘおよびＬｅｗｉｓｙと、別個に３０分間プレインキュベーションした。異なるプレインキュベーション条件におけるＡ１の結合ならびにｈＥＳＣ生存度をフローサイトメトリーによって評価した。ＦＡＣｓ結合データ（図１２ｄ）から、１型Ｈ、ＬＮＦＰ１およびＬｅｗｉｓｂとプレインキュベーションしたＡ１は、いかなるプレインキュベーションも伴わないＡ１に比較して、ｈＥＳＣへの結合が減少した。図１２ｅに強調するように、９つの糖のうち、１型Ｈ、ＬＮＦＰ１およびＬｅｗｉｓ−Ｂのみが４つの単糖およびその連結に共通点を共有するため、本発明者らは、Ａ１がｈＥＳＣ抗原上の共通の糖モチーフ（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−）を認識すると結論づける。
【０２２８】
本発明者らは、ウェスタンブロット分析を行って、３つの糖によってブロックされる特異的抗原または抗原バンドを探した。ターゲット抗原を免疫沈降し、そしてウェスタンブロットに用いた。糖ブロックＡ１を一次抗体として用いた。図１２ｆにおける４つのウェスタンブロット膜を、対応して、通常のＡ１、Ｈ１ブロックしたＡ１、ＬＮＦＰ１ブロックしたＡ１およびＬｅｗｉｓｂブロックしたＡ１でブロットした。その結果、通常のＡ１でブロットした膜における抗原の大部分が、他の３つのブロットにおいては同定されない。これは、フローサイトメトリー分析からの先の結合プロファイルと一致する。
【０２２９】
同じ糖阻害アッセイから、本発明者らはさらに、Ａ１を、１型Ｈ、ＬＮＦＰ１およびＬｅｗｉｓｂとプレインキュベーションした後、ｈＥＳＣ生存度はＡ１処理を伴わないものに匹敵することを観察し（図１２ｇ）、１型Ｈ、ＬＮＦＰ１およびＬｅｗｉｓｂは、Ａ１がｈＥＳＣを殺すことを防止することが示された。総合して、本発明者らは、ｈＥＳＣ上のＡ１の結合および細胞傷害性が、グリカンモチーフ：−Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−に依存すると結論づける。
【０２３０】
Ａ１可変領域における配列
ｍＡｂ８４およびＡ１が異なる抗体であることを確認するため、ｍＡｂ重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子配列を決定した。予期されるように、Ａ１およびｍＡｂ８４の可変領域は異なる（図１５）。重鎖可変領域において、３つのＣＤＲすべてに５つの異なるアミノ酸があり；そして軽鎖可変領域において、３つのＣＤＲすべてに４つの異なるアミノ酸がある。ＣＤＲは抗原に対する抗体の特異性を決定するため、ＣＤＲ配列のこれらの相違は、抗原における相違を説明する。
【０２３１】
実施例２−Ａ１が誘導する死の機構の解明：Ａ１処理ｈＥＳＣの形態および構造変化、ならびに機構研究
共焦点顕微鏡下でのＡ１誘導性ｈＥＳＣ死の動力学
Ａ１が処理数分でｈＥＳＣ死を誘導可能であることが分かったため、本発明者らは、タイムラプス回転円盤共焦点顕微鏡下でＡ１処理ｈＥＳＣの細胞間および細胞外形態変化を観察する。その結果、ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ａ１処理直後、ｈＥＳＣは互いに撤退し始め、そして培養プレート上で丸くなる（ｒｏｕｎｄ  ｕｐ）。細胞形態は、最初の１分後であっても劇的に変化し、孔形成が細胞死の非常に初期段階であるはずであることが示唆された。
【０２３２】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）下でのｈＥＳＣの視覚化
抗体誘導性細胞死に対するいくつかの先の研究は、ＴＥＭを用いて細胞死の機構を調べていた。Ｍａｔｓｕｏｋａ６２によれば、ｍＡｂ  ＲＥ２はリンパ球死を誘導すると報告された。ＴＥＭ下で、かれらは形質膜の破壊、ＥＲの拡張、ミトコンドリアの変形および凝縮を観察した。これらの観察とともに、彼らは、この抗体が腫瘍症を通じてリンパ球死を誘導すると結論づけた。Ｉｖａｎｏｖ６６による抗体誘導性腫瘍症に関する最近の研究もまた、ＴＥＭ下で、初期段階細胞間接着および同型接着における微絨毛の関与を明らかにした。
【０２３３】
本発明者らもまたＴＥＭを用いて、Ａ１処理ｈＥＳＣの細胞内および細胞間形態変化を研究した。細胞をＡ１で処理し、収集し、そしてＴＥＭのためにプロセシングした。対照として、Ａ１処理を伴わない細胞試料もまた調製した。予備的研究で、Ａ１処理ｈＥＳＣのいくつかの形態改変が観察されてきている。Ａ１処理を伴わない細胞は、直径約１０μｍ（図１６ｂ）の通常のサイズで均一に分布した（図１６ａ）。特徴的なことに、３０分間Ａ１処理すると、細胞は、細胞間同型接着または細胞凝集を形成する（図１６ｃ）。
【０２３４】
図１６ｄは、４つの細胞によって形成される細胞間接着の単位を示す。これらの細胞から、異なる染色強度が観察された。１つのありうる理由は、これらが細胞死の異なる段階にあり、そしてしたがって染色されるタンパク質の量が異なるためである可能性もある。下部右隅の細胞は最も低く染色され、そして膜完全性および細胞形態を失っており、この細胞が、死後腫瘍症壊死を経ていることが示唆される。中央の細胞は上部の２つの細胞よりもより低い染色強度を有する。しかし、この細胞は最も明らかな細胞膨張およびミトコンドリア膨張を有する。これは膨張が細胞死のより遅い段階で起こることを示唆しうる。さらに、細胞接着部位に向かうこの細胞におけるミトコンドリアの末梢再局在もまた観察された（図１６ｅ）。
【０２３５】
図１６ｆは、３つの細胞によって形成される細胞間接着の別の単位を示す。ミトコンドリア量は有意に濃縮され、そして細胞質の大規模な空胞化があった。拡大図（図１６ｇ）において、ミトコンドリア中のよく発達したクリスタもまた観察され、これらがエネルギー産生期にあることが示唆された。これらの観察はさらに、Ａ１が腫瘍症を通じてｈＥＳＣを殺すという本発明者らの仮説をさらに証明し、そしてまた、Ａ１誘導性細胞死がミトコンドリア、ＡＴＰおよび接着タンパク質と関連することもまた暗示しうる。
【０２３６】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）下でのｈＥＳＣの視覚化
ｈＥＳＣに対するＡ１の致死的効果をさらに調べるため、ＳＥＭを通じて、正常ｈＥＳＣおよびＡ１処理ｈＥＳＣを形態および構造変化に関して調べた（図１７および１８）。ＴＥＭにおける先の観察に一致して、未処理ｈＥＳＣは通常のサイズを有し、そして均一に分布した（図１７上部左および下部左）；一方、Ａ１処理ｈＥＳＣは同型接着を迅速に形成し、そして細胞サイズを変えた（図１８上部左）。同型接着の誘導は数分以内に起こり、そして細胞が分解されるまで続いた。正常ｈＥＳＣは平滑な膜輪郭および微絨毛を有する（図１７右）。しかし、Ａ１の存在下で、ｈＥＳＣは表面微絨毛および膜完全性の喪失を示した（図１８中央左）。膜孔（図１８上部右）が回旋状表面を持つ細胞の形質膜上に形成された。これらの膜孔は、通常、破片ネットワークによって覆われ、これは分解された微絨毛または細胞膜のようであった。
【０２３７】
図１８中央左から、本発明者らは、別個の表面形態を持つ３つの領域を観察した。図１８上部右において、多くの膜孔が形成され、そしてこの領域は完全に微絨毛を含まない。図１８下部左において、領域の一部は形成された膜孔を有する一方、残りの部分は部分的に分解された微絨毛によって覆われる。図１８下部右において、この領域の細胞膜はなお損なわれておらず、そして示される微絨毛の形態は、未処理ｈＥＳＣ上のものと非常に似ている。したがって、本発明者らは、微絨毛の分解が膜孔の形成に先立つか、またはさらに膜孔の形成の原因であると推測する。
【０２３８】
より興味深いことに、ＳＥＭ下で、Ａ１処理ｈＥＳＣは、細胞膨張および細胞収縮の両方を有することが見出された（図１９）。特徴的なことに、収縮細胞は、通常、膨張細胞に比較して、より高い度合いの形態変化ならびに膜損傷、およびより多くの表面の皺または凹みを有する。これらの観察によって、細胞膨張は細胞収縮に先行する一方、膜完全性の破壊は、Ａ１処理直後および細胞死前の連続プロセスであることが示唆される。
【０２３９】
Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死におけるアクチン細胞骨格の役割
アクチン細胞骨格は、一定の構成およびリモデリングを経て、これは細胞運動、細胞シグナル伝達、ならびに細胞接合および細胞形状の確立および維持における役割に寄与する８５。ｍＡｂ  ＲＥ２仲介Ｔ細胞死に関する先の研究によって、サイトカラシンＢ／Ｄでの処理がＴ細胞に向かうｍＡｂ  ＲＥ２の細胞傷害性を完全にブロックすることが同定された６２。ヒトリンパ腫細胞株および初代慢性リンパ球性白血病細胞両方におけるＩＩ型ＣＤ２０特異的ｍＡｂおよびＨＬＡ−ＤＲ特異的ｍＡｂに関する別の研究もまた、アクチン細胞骨格の末梢再局在が、同型接着および細胞死に非常に重要であることを示した６６。
【０２４０】
本発明者らはまず、サイトカラシンＢ、サイトカラシンＤおよびラトランクリンＡのＡ１誘導性ｈＥＳＣ死に対する影響を調べた。一般的に、サイトカラシンＢ／Ｄは、アクチンポリマーの迅速に成長する端をブロックすることによって、アクチン重合を阻害する８６一方、ラトランクリンＡはＧアクチンに結合し、そしてアクチン単量体の重合を防止する８７。単一ｈＥＳＣ懸濁物を、５μｇ  Ａ１、および異なる量のサイトカラシンＢ／ＤまたはラトランクリンＡと４５分間インキュベーションし、そしてｈＥＳＣの生存度をＰＩ排除アッセイによって評価した。その結果（図２０ａ）、アクチン阻害剤で処理されたｈＥＳＣは、未処理細胞に比較して、Ａ１処理に際して、有意に増加した生存度を有し、アクチン重合阻害が、ｈＥＳＣに対するＡ１殺傷を防止することが示唆された。
【０２４１】
さらに、Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死において、４つのアクチン関連タンパク質、α−アクチニン、パキシリン、タリンおよびビンキュリンにおいて、未処理ｈＥＳＣに比較して、有意な減少があった（図２０ｂ）。総合すると、これらの結果は、Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死とアクチン再編成の緊密な関連を立証する。
【０２４２】
実施例３−化学量論アッセイにおける未結合Ａ１および結合Ａ１量、ならびに異なる初期量でのｈＥＳＣに対する対応するＡ１殺傷の間の関係
ｈＥＳＣあたりのＡ１分子の数を、化学量論アッセイから測定した。フローサイトメトリーを通じてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって、Ａ１殺傷を測定した。結果を図２４Ａに示す。結合飽和点および殺傷飽和点を垂直の点線で強調する。結合飽和および殺傷飽和は同じ点で達成され、ここでは、ｈＥＳＣあたり約３．０ｘ１０７のＡ１分子がある。
【０２４３】
結合したＡ１の量は、Ａ１の初期量および化学量論アッセイから測定される未結合Ａ１の量の間の相違であった。結果を図２４Ｂに示す。飽和Ａ１殺傷点を垂直な点線で強調する。殺傷飽和は、未結合Ａ１量が結合Ａ１量よりも有意に高い場合にのみ達成された。
【０２４４】
実施例４−Ａ１はｈＥＳＣ上のＯ連結グリカンを認識し、そしてＯ連結グリカンへの結合は
ｈＥＳＣに対するＡ１細胞傷害性に必須である
ツニカマイシンおよびベンジル−ａ−ＧａｌＮａｃを用いて、それぞれ、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化を阻害した。異なる処理条件のＨＥＳ−３細胞（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｉｔｔｕｔｅ，  Ｉｎｃ．、米国ウィスコンシン州マディソンのＥＳ０３ヒト胚性幹細胞株）を、ビオチンコンジュゲート化コンカナバリンＡまたはＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂで染色した。ＣｏｎＡは、Ｎ連結グリカンに特異的に結合し、そしてＴｒａ−１−６０に対するｍＡｂは、ｈＥＳＣ上のＯ連結グリカンエピトープを認識する。細胞に結合したレクチンまたは抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート化ストレプトアビジンまたは抗マウス抗体で検出した。結果を図２５に示し、ここで影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。
【０２４５】
図２５Ａにおいて、ビオチンコンジュゲート化ＣｏｎＡの結合ヒストグラムは、左方向にシフトし、これは、Ｎ−グリコシル化の減少を示した。図２５Ｂにおいて、Ｔｒａ−１−６０に対するｍＡｂの結合ヒストグラムは、左方向にシフトし、これは、Ｏ−グリコシル化の減少を示した。
【０２４６】
異なる処理条件のＨＥＳ−３を、Ｏｃｔ３／４に対するｍＡｂで染色した。細胞に結合した抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化抗マウス抗体で検出した。結果を図２５Ｃに示す。影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。ツニカマイシン処理またはＢ−ＧａｌＮａｃ処理いずれかに際して、Ｏｃｔ３／４抗体の結合ヒストグラムは、陰性対照のこれらに匹敵し、阻害剤処理に際してｈＥＳＣ多能性には変化がないことを示す。
【０２４７】
実施例５−Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死および活性酸素種（ＲＯＳ）産生は、直接相関する
異なる処理条件のＨＥＳ−３をキメラＡ１で処理した。細胞に結合した抗体をＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒト抗体で検出した。結果を図２６に示す。図２６Ａにおいて、影つきのヒストグラムは、陰性対照での染色に相当し、そして白抜きのヒストグラムは、一次抗体での染色に相当する。Ｂ−ＧａｌＮａｃ処理に際して、Ａ１の結合ヒストグラムは、陰性対照およびツニカマイシン処理に比較して左方向にシフトし、Ｏ−グリコシル化が阻害された際にのみ、Ａ１結合が下方制御されることを示し、そしてＡ１がＯ連結グリカンを認識するが、Ｎ連結グリカンを認識しないことを示す。
【０２４８】
図２６Ｂは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって概算した細胞生存度を示す。異なる処理条件における細胞生存度を、対応する陰性対照（Ａ１処理なし）に対して規準化した。Ｂ−ＧａｌＮａｃ処理に際して、Ａ１処理に際しての細胞生存度は、陰性対照（ＣＭ対照およびＤＭＳＯ対照）ならびにツニカマイシン処理のものよりも有意により高かった。これは、ｈＥＳＣに対するＯ−グリコシル化もまた、Ａ１が細胞傷害性を誘発するために必須であることを示唆する。
【０２４９】
実施例６−Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死およびＲＯＳ産生は直接相関する
ｈＥＳＣのＡ１処理後、死んだ細胞の集団の有意な増加および高レベルのＲＯＳ産生があり、これは、ＲＯＳ産生および細胞死が直接相関することを示す。
【０２５０】
ＲＯＳ産生を、フローサイトメトリーを通じたジヒドロエチジウム（ＨＥ）染色で概算した（図２７Ａ）。ゲート処理集団は、ＲＯＳ産生レベルに相当する。Ａ１処理に際して、ｈＥＳＣにおいて大規模なＲＯＳ産生がある（図２７Ｃ）。
【０２５１】
ＲＯＳ産生をまた、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡでも測定した。ＲＯＳの存在下で、カルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡは、緑色蛍光を放出するカルボキシ−ＤＣＦに酸化される（図２７Ｂ）。
【０２５２】
細胞をＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した（図２７Ｄ）。
実施例７−ＲＯＳ産生（Ｏ２−）はＡ１誘導性ｈＥＳＣ死に必要である
Ａ１を添加する前、ｈＥＳＣをＰＢＳあるいはＲＯＳスカベンジャー、Ｔｉｒｏｎ（５０ｍＭ）またはＴｅｍｐｏｌ（１２０ｍＭ）で１時間処理した。ＴｉｒｏｎおよびＴｅｍｐｏｌ両方のＲＯＳターゲットは、スーパーオキシド（Ｏ２−）である。次いで、細胞生存度をＰＩ取り込みによって測定した（図２８Ａ）。
【０２５３】
細胞をまた、ＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した（図２８Ｂ）。
Ｔｉｒｏｎの存在下で、Ａ１処理後のｈＥＳＣは、細胞死ならびにＲＯＳ産生の有意な減少を有する。ＲＯＳスカベンジャーによるＲＯＳの枯渇は、ｈＥＳＣ死の減少と直接相関する。
【０２５４】
実施例８−Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死はＮＡＤＰＨオキシダーゼによって仲介される
ＨＥＳ−３細胞を、Ａ１処理（４５分間）前に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤、ＤＰＩ（２４０μＭ）、Ａｐｏ（４０ｍＭ）、またはＭＰＡ（３．１２ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。異なる処理条件における細胞生存度をＰＩ取り込みによって概算し、そしてそれぞれの非Ａ１処理対照に規準化した。細胞をまた、ＳｙｔｏｘグリーンおよびＨＥで二重染色して、それぞれ、細胞死およびＲＯＳ産生を検出した。結果を図２９に示す。
【０２５５】
また、ＨＥＳ−３を、Ｎｏｘ２に対する２つの異なるｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＯＸ２＿３７８７およびｓｉＮｏｘ２＿３７８８）でトランスフェクションした。Ｎｏｘ２のノックダウンは、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ（図２９Ｄ）およびウェスタンブロッティング（図２９Ｅ）によって確認した。ノックダウンに際して、次いで、細胞をＡ１（０．５μｇ／ｍｌ）で処理し、そしてＰＩ取り込みによって、４５分後に細胞死に関して評価した（図２９Ｆ）。
【０２５６】
Ａ１処理後、阻害剤処理したｈＥＳＣは、細胞死およびＲＯＳ産生の有意な減少を有する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤によるＲＯＳ産生阻害は、ｈＥＳＣ死減少と直接相関する。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害剤は、Ａ１殺傷を部分的にブロックすることが可能である。Ｎｏｘ２は、Ａ１処理ｈＥＳＣにおけるＲＯＳ産生の主要供給源である。Ａ１誘導性ｈＥＳＣ死は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼによって仲介され、Ｎｏｘ２を介する可能性が最も高い。
【０２５７】
実施例９−Ａ１誘導性細胞死におけるＲＯＳ産生は、同型接着の下流、およびアクチン再編成の上流にある
Ａ１処理（４５分間）の前、ＨＥＳ−３をＰＢＳあるいはＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）またはＡｐｏ（４０ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。光学顕微鏡検査によって、同型接着に関して細胞を評価した（図３０Ａ）。同型接着は、ＴｉｒｏｎまたはＡＰＯの存在下で形成される。Ａ１処理（４５分間）の前、ＨＥＳ−３をＰＢＳまたはＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした。走査型電子顕微鏡検査によって、細胞形態を評価した。Ｔｉｒｏｎの存在下で、Ａ１処理は、微絨毛の短縮化のみを導き、大規模な膜破壊は起こさない（図３０Ｂ）。
【０２５８】
ＨＥＳ−３をＴｉｒｏｎ（５０ｍＭ）を含みまたは含まず、１時間プレインキュベーションし、その後、Ａ１処理（４５分間）の前に、ＰＢＳ、またはラトランクリンＡ（０．４μｇ／ｍｌ）、またはサイトカラシンＢ（０．４μｇ／ｍｌ）、またはサイトカラシンＤ（０．４μｇ／ｍｌ）で５分間処理した。ＰＩ取り込みによって細胞生存度を概算し（図３０Ｃ）、そしてＨＥ染色でＲＯＳ産生を評価した（図３０Ｄ）。Ｔｉｒｏｎの存在下で、アクチン阻害剤は、ｈＥＳＣに対してさらなる阻害効果を持たない。アクチン阻害剤処理を含むまたは含まないＲＯＳ産生において、有意な相違はない。Ａ１誘導性細胞死におけるＲＯＳ産生は、同型接着の下流、およびアクチン再構成の上流にある。
【０２５９】
実施例１０−Ａ１の二価性
細胞を、Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）、またはＦ（ａｂ）２＿Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）、またはＦａｂ＿Ａ１（０．５μｇ／ｍｌ）と４５分間インキュベーションした。ｈＥＳＣへの結合を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗カッパ軽鎖特異的抗体で検出した；Ｆ（ａｂ）２＿Ａ１およびＦａｂ＿Ａ１両方のｈＥＳＣへの結合は、ｈＥＳＣに対するＡ１結合に匹敵する（図３１Ａ）。
【０２６０】
ＰＩ取り込みによって、細胞生存度を概算した；二価Ｆ（ａｂ）２＿Ａ１のみが、ｈＥＳＣに対するＡ１の細胞傷害性を再現する（図３１Ｂ）。
光学顕微鏡検査によって、同型接着を評価した。同型接着の形成には、二価であることが必要である（図３１Ｃ）。
【０２６１】
Ａ１の二価性はｈＥＳＣに対する細胞傷害性には必要だが、結合には必要ではなかった。
本発明は以下の態様を含む。
［態様１］グリコシル化タンパク質に結合する抗体であって、グリコシル化が、グリカンモチーフＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃを含む、前記抗体。
［態様２］未分化多能性細胞に対して細胞傷害性である、態様１の抗体。
［態様３］アミノ酸配列ｉ）〜ｉｉｉ）、またはアミノ酸配列ｉｖ）〜ｖｉ）、または好ましくはアミノ酸配列ｉ）〜ｖｉ）：
ｉ）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ｉｉ）ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ｉｉｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
ｉｖ）ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ｖ）ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ｖｉ）ＦＧＹ（配列番号６）
あるいは配列（ｉ）〜（ｖｉ）の１またはそれより多くにおける１または２または３のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、その変異体
を有する、態様１または２の抗体。
［態様４］以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
を取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様１〜３のいずれかの抗体。
［態様５］以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）
を取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様１〜４のいずれかの抗体。
［態様６］アミノ酸配列ｉ）〜ｉｉｉ）、またはアミノ酸配列ｉｖ）〜ｖｉ）、または好ましくはアミノ酸配列ｉ）〜ｖｉ）：
ｉ）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ｉｉ）ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ｉｉｉ）ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
ｉｖ）ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ｖ）ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ｖｉ）ＦＧＹ（配列番号６）
あるいは配列（ｉ）〜（ｖｉ）の１またはそれより多くにおける１または２または３のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、その変異体
を有する、抗体。
［態様７］以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
を取り込む少なくとも１つの軽鎖可変領域を有する、態様６の抗体。
［態様８］以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）
を取り込む少なくとも１つの重鎖可変領域を有する、態様６または７の抗体。
［態様９］寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＴＡＧ−Ａ１から産生される、モノクローナル抗体。
［態様１０］重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体であって：
それぞれ、重鎖が、ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）、ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）、ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）に少なくとも８５％の全体の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、そして軽鎖が、ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）、ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）、ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）に少なくとも８５％の全体の配列同一性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む
前記抗体。
［態様１１］重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体であって：
重鎖配列が、図１５Ａに示すＡ１Ｈ重鎖配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有し、そして
軽鎖配列が、図１５Ｂに示すＡ１Ｌ軽鎖配列に対して、少なくとも８５％の配列同一性を有する
前記抗体。
［態様１２］以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＦ（配列番号１）
ＣＤＲ２：  ＬＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）
ＣＤＲ３：  ＱＱＷＳＳＮＰＹＴ（配列番号３）
を含む、単離軽鎖可変領域ポリペプチド。
［態様１３］以下のＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＮ（配列番号４）
ＣＤＲ２：  ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号５）
ＣＤＲ３：  ＦＧＹ（配列番号６）
を含む、単離重鎖可変領域ポリペプチド。
［態様１４］態様１３記載の重鎖可変領域ポリペプチドと組み合わされた、態様１２の単離軽鎖可変領域ポリペプチド。
［態様１５］態様１〜１４のいずれかの抗体またはポリペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアーを含む、組成物。
［態様１６］態様１〜１４のいずれかの抗体またはポリペプチドをコードする単離核酸。
［態様１７］態様１６の核酸を含むベクター。
［態様１８］態様１７のベクターを含む宿主細胞。
［態様１９］態様１〜１４のいずれかの抗体またはポリペプチドを作製するための方法であって、態様１８の宿主細胞を、抗体またはポリペプチドをコードするベクターの発現に適した条件下で培養し、そして抗体またはポリペプチドを回収する工程を含む、前記方法。
［態様２０］未分化多能性細胞に対して細胞傷害性である、態様１〜１１のいずれかの抗体。
［態様２１］単数または複数の未分化多能性細胞を含有する試料において、こうした細胞を破壊する方法であって、単数または複数の未分化多能性細胞を含有する細胞の試料を、態様１〜１１のいずれか記載の抗体と接触させる工程を含む、前記方法。
［態様２２］単数または複数の未分化多能性細胞を含有する試料から、こうした細胞を取り除く方法であって、単数または複数の未分化多能性細胞を含有する細胞の試料を、態様１〜１１のいずれか記載の抗体と接触させる工程を含む、前記方法。
［態様２３］未分化多能性細胞、および分化を経たかまたは経ている細胞を含む混合物から、分化を経たかまたは経ている細胞を濃縮する方法であって、混合物を、態様１〜１１のいずれか１つに記載の抗体と、抗体が未分化多能性細胞を殺すために十分な期間、接触させる工程を含む、前記方法。
［態様２４］死んだ細胞から生存細胞を分離する工程をさらに含む、態様２３の方法。
［態様２５］未分化多能性細胞から分化した細胞を含有し、実質的に未分化多能性細胞を含有しない組成物を調製する方法であって：
（ｉ）未分化多能性細胞および未分化多能性幹細胞から分化した細胞を含む細胞集団を提供し；
（ｉｉ）該集団を、態様１〜１１のいずれか記載の抗体と、抗体が未分化多能性細胞を殺すことを可能にする条件下で接触させ；そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に残っている生存細胞を死んだ細胞から分離する；
工程を含む、前記方法。
［態様２６］分離された細胞を、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と混合する工程をさらに含む、態様２５の方法。
［態様２７］態様１〜１１のいずれかに記載の抗体に結合した未分化多能性細胞を含む、場合によって単離された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体。
［態様２８］寄託番号ＰＴＡ−１２１１３４の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている、ハイブリドーマ細胞株ＴＡＧ−Ａ１。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【配列表】
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