(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプルから平滑筋細胞マーカーを用いて収集または分離された平滑筋細胞由来の細胞外小包（extracellular vesicle）のインターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、血管疾患診断用組成物。
【請求項２】
前記血管疾患診断用の組成物が、平滑筋細胞マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーをさらに含むものである、請求項１に記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項３】
前記平滑筋細胞マーカーが、血小板由来成長因子受容体-β（platelet-derived growth factor receptor-β、PDGFRβ）、またはα-平滑筋アクチン（alpha-smooth muscle actin）である、 請求項２に記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項４】
前記組成物が、エキソソームマーカーであるＣＤ８１、ＣＤ９またはＣＤ６３に特異的な抗体またはアプタマーをさらに含むものである、請求項１〜３のいずれかに記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項５】
前記インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する製剤が、インターロイキン１２受容体β２タンパク質に特異的な抗体またはアプタマーを含むものである、請求項１〜４のいずれかに記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項６】
前記インターロイキン１２受容体β２タンパク質が、全長（full-length）インターロイキン１２受容体β２タンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項７】
血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、血管再狭窄（in-stent restenosis）、心筋梗塞または不安定狭心症である、請求項１〜６のいずれかに記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項８】
前記組成物が、心臓発作の危険性がある疾患群の早期診断用に使用されるものである、請求項７に記載の血管疾患診断用組成物。
【請求項９】
請求項１〜８に記載のいずれか一項の組成物を含む、血管疾患診断用キット。
【請求項１０】
前記キットが、マイクロアレイ、アプタマーチップキット、エライザ（ELISA、enzyme linked immunosorbent assay）キット、ブロッティング（blotting）キット、免疫沈殿法キット、免疫蛍光検査キット、タンパク質チップキット及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項９に記載の血管疾患診断用キット。
【請求項１１】
（ａ）血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料中の平滑筋細胞由来の細胞外小包を収集または分離する段階；
（ｂ）前記（ａ）段階で収集または分離された細胞外小包中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する段階；及び
（ｃ）前記（ａ）段階で測定されたインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルと正常対照群の試料とを比較する段階を含む、血管疾患診断のための情報提供方法。
【請求項１２】
エキソソームマーカーを用いて（ａ）段階から得られた平滑筋細胞由来の細胞外小包のレベルを測定する段階をさらに含む、請求項１１に記載の血管疾患診断のための情報提供方法。
【請求項１３】
前記エキソソームマーカーが、ＣＤ８１、ＣＤ９またはＣＤ６３である、請求項１２に記載の血管疾患診断のための情報提供方法。
【請求項１４】
前記（ａ）段階の血液試料が、血漿試料である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の血管疾患診断のための情報提供方法。
【請求項１５】
前記平滑筋細胞由来の細胞外小包を収集または分離する（ａ）段階が、平滑筋マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて行うものである、請求項１１〜１４のいずれかに記載の血管疾患診断のための情報提供方法。
【請求項１６】
前記血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料から収集または分離された平滑筋細胞由来の細胞外小包から測定されたインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルが、正常対照群の試料より高い場合、前記個体が血管疾患を有するとの情報を提供する、請求項１１〜１５のいずれかに記載の血管疾患診断のための情報提供方法。
【請求項１７】
前記血管疾患が、心筋梗塞、急性冠症候群または不安定狭心症である、請求項１１〜１６のいずれかに記載の血管疾患診断のための情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中インターロイキン１２受容体β２（interleukin12 receptorβ2）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、血管疾患診断用組成物及びこれを含む血管疾患診断用キットに関する。また、本発明は、血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、血管疾患診断のための情報提供方法に関する。さらに、本発明は、インターロイキン１２受容体β２活性の阻害剤を含む血管疾患の予防または治療用組成物、及び血管疾患治療のための候補物質で平滑筋細胞に処理する段階及びインターロイキン１２受容体β２の発現レベルを測定する段階を含む、血管疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、欧米諸国では死亡率の約５０％を占めている二つ疾患である、冠動脈疾患及び脳血管疾患の初期原因として知られている。アテローム性動脈硬化症の初期病変はいわゆる「脂肪線条（fatty streak）」病変と代表される内皮下脂質蓄積マクロファージ（泡沫細胞、foam cells）の蓄積が起こる。脂肪線条は医学的に有害なものではないが、脂質豊富壊死破片及び平滑筋細胞（smooth muscle cells、SMCs）の蓄積を特徴とする、進展した形態の繊維性及びプラーク型病変の前駆体であり得る。
【０００３】
病気が進行されている間に、動脈血管壁は徐々に厚く、かつ、硬くなって、アテローム性動脈硬化性プラークを形成し、そのため、動脈内の面積は狭くなる。これらの動脈血管の内膜肥厚による血管内径の狭窄がさらに進み、プラークが壊れやすい状態になると不安定狭心症（unstable angina）が伴われる。続いて、プラークが突然破裂して虚血性の症状や血栓を引き起こす可能性があり、これにより、心筋梗塞または心臓発作を起こすことがある。しかし、アテローム性動脈硬化症などによる血管内膜肥厚の症状は、顕著な自覚症状がなくて数十年間に行われるため、直接的な虚血性症状が現れる前に、血管内膜肥厚の症状を診断することは容易でない。
【０００４】
血管内膜肥厚による狭窄部位が確認されると、血管内径の狭窄を除去して血管を拡張するために、ステントや経皮的冠動脈形成術を含む血管形成術を通じた血管介入（vascular intervention）手術を行うことが一般的であるが、前記のような手術後に血管内皮細胞が剥離されて、血管平滑筋細胞の過増殖による血管内膜肥厚症状として再狭窄の症状が再び発生することがある。これに当該分野では、血管内膜肥厚症状を非侵襲的に容易に診断する方法の開発が緊急に必要とされている。
【０００５】
これまでヒト由来試料及び動物モデルで、アテローム性動脈硬化症の早期診断バイオマーカーを同定するための数多くの試みがあった。フレーミンハム心臓研究における、７年以上の期間の間に３，２０９人の参加者に対して追跡（follow-up）研究した臨床データを介して数個の有意なバイオマーカー[Ｃ反応性タンパク（C-reactive protein）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、B-type natriuretic peptide）、レニン（renin）、尿中アルブミン（urinary albumin）及びホモシステイン]を明らかにした。病気の進行と関連する循環バイオマーカーを見つけるための血清プロテオミクス及びメタボロミクス実験が数年間積極的に進められてきた。それにもかかわらず、すべて個人差及び血管肥厚症を伴う人間組織を得るのに難しいという問題のため、臨床適用可能なバイオマーカー、特に血漿由来のバイオマーカーは全くないのが実情である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kohler＆Milstein（1976）European Jounral of Immunology 6：511-519
【非特許文献２】Clackson et al, Nature, 352：624 -628, 1991
【非特許文献３】Marks et al. J. Mol. Biol., 222：58, 1-597, 1991
【非特許文献４】DH Kang, et al., Circulation 2013; 128 ：pp 834-844
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記のような背景下、本発明者らは、遺伝子的に類似遺伝子型のラットの風船形成術による頸動脈損傷血管に対する差動プロテオミクス分析（differential proteomics strategy）を適合させ、ヒト大動脈平滑筋細胞（human aortic SMCs、HASMCs）を用いた試験管内（in vitro）検証により、平滑筋細胞肥大症とは関係ないタンパク質を除外した。その後、試験管内及び生体内（in vivo）検証を通じて新生内膜平滑筋肥大症との関連性が知られてなかった候補タンパク質を同定した。その結果、血清に存在するインターロイキン１２受容体β２タンパク質が血斑（plaque）不安定性から起因する臨床徴候との関連性を発見し、血液中インターロイキン１２受容体β２タンパク質を血管疾患のバイオマーカーとして用いられることを確認し、本発明を完成した。 
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、血液中インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、血管疾患診断用組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記血管疾患診断用組成物を含む、血管疾患診断用キットを提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、血管疾患診断のための情報提供方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、インターロイキン１２受容体β２活性の阻害剤を含む、血管疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、血管疾患治療のための候補物質で平滑筋細胞に処理する段階及びインターロイキン１２受容体β２の発現レベルを測定する段階を含む、血管疾患治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、インターロイキン１２受容体β２を血管疾患、特に心筋梗塞または不安定狭心症に対するバイオマーカーとして使用する場合、既存の血管造影術のみで診断が可能であった血管疾患に対して、血液を用いた非侵襲的であり、かつ経済的に急速な診断が可能となる。従って、疾病が悪化され虚血症状の出現後の自覚症状により診断していた血管疾患分野での早期診断が可能になることにより、従来は不可能であった早期及び予防治療を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】風船形成術によって損傷した頸動脈から新生内膜組織を染色して回復時間帯別の肥厚症動態を確認した結果である。
【図２ａ】風船形成術を用いて頸動脈損傷モデルを製造した後、得られた損傷した頸動脈組織からタンパク質を抽出して、２Ｄ-差動電気泳動（2-dimensional differential gel electrophoresis、2D-DIGE）を介してプロテオミックス分析を行う実験過程を示した模式図である。
【図２ｂ】風船形成術を用いて頸動脈損傷モデルを製造した後、得られた損傷した頸動脈組織から細胞小器官を分画した試料をマーカーで確認した結果である。
【図２ｃ】血管損傷後の回復時間帯別に収得した頸動脈組織の抽出液における、各同定されたタンパク質の差動発現をそれぞれに特異的な抗体を用いて免疫ブロットにより確認した結果である。
【図３ａ】風船形成術を用いて頸動脈損傷モデルを製造した後、得られた傷ソンガイした頸動脈組織から細胞質タンパク質（Ｓ-１００分画）を抽出して２Ｄ-差動電気泳動（2-dimensional differential gel electrophoresis、2D-DIGE）を実施したゲルの代表的な蛍光画像である。
【図３ｂ】風船形成術を用いて頸動脈損傷モデルを製造した後、得られた損傷した頸動脈組織からタンパク質を抽出し、２Ｄ-差動電気泳動（2-dimensional differential gel electrophoresis、2D-DIGE）を介してプロテオミクス分析を行い、同定されたタンパク質スポット（spot）の中でインターロイキン１２受容体β２タンパク質を確認した結果である。グラフは、蛍光画像分析によって定量されたインターロイキン１２受容体β２タンパク質の発現増加を損傷後の回復時間ごとに示す。
【図４】ＩＬ-１２Ｒβ２のノックダウン後、３つのＳＭＣ細胞活性（ヒト大動脈平滑筋細胞の増殖と走化性の移動、平滑筋細胞に対する単核球の付着）に及ぼす影響を確認した結果である。
【図５】頸動脈血管壁に風船形成術を用いて損傷した後、ＩＬ-１２Ｒβ２ｓｉＲＮＡを伝達した後、ＩＬ-１２Ｒβ２発現量を比較して（図５のＡ）、新生内膜組織の厚さをＨ＆Ｅ組織染色で確認してグラフ化（図５のＢ）した図である。
【図６ａ】本発明で使用する抗ＩＬ-１２Ｒβ２抗体の抗原特異性をＵ９３７細胞株で内生的に発現されたＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質を用いて、免疫ブロットで確認した結果である。
【図６ｂ】血漿サンプルにおける微量タンパク質の検出を改善するために、Ｐｉｅｒｃｅアルブミン/ＩｇＧ除去キットを用いて患者の血漿サンプルからアルブミンと免疫グロブリンを含む豊富な血漿タンパク質を除去したことを確認した図である。ろ過された画分２は図７で使用されたサンプルである。
【図７】正常群と安定狭心症または急性心筋梗塞を有する患者から収得した血漿サンプルをＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質に対してウェスタンブロット分析を行った結果（図７のＡ）と、正常群と安定狭心症または急性心筋梗塞を有する患者から収得した血漿サンプルをＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質に対してウェスタンブロット分析を行った結果である（図７のＢ）。図７のＣは、正常群と不安定狭心症の患者から収得した血漿サンプルをＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質に対してウェスタンブロット分析を行った結果である。ＰｏｎＳ染色により、等量のタンパク質がローディングされたことを示す。矢印はＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質の位置を示す。
【図８ａ】正常群と安定狭心症（ＳＡ）、不安定狭心症（ＵＡ）または急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を有する患者から収得した血漿サンプルに対する、ＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質の発現レベルを示した図７のＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質バンドの定量及び統計分析したグラフである。
【図８ｂ】病理学的内膜肥厚症を伴うヒト患者（n = 3）の頸動脈血管におけるＩＬ-１２Ｒβ２に対する組織染色した図である。
【図９ａ】急性心筋梗塞及び不安定狭心症の患者から収得した血漿サンプルを 超遠心分離を用いて細胞外小包分画を分離し、ＩＬ-１２Ｒβ２、エキソソームマーカーであるＣＤ９及びＣＤ８１をウエスタンブロットで確認した図である。
【図９ｂ】急性心筋梗塞及び不安定狭心症の患者から収得した血漿サンプルをポリマーベース沈殿（polymer-based precipitation）を用いて細胞外小包分画を分離し、ＩＬ-１２Ｒβ２、エキソソームマーカーであるＣＤ８１及び平滑筋マーカーであるＰＤＧＦＲβをウェスタンブロットで確認した図である。
【図９ｃ】急性心筋梗塞及び不安定狭心症の患者から収得した血漿サンプルにおけるＰＤＧＦＲβを免疫沈殿（immunoprecipitation）して、沈殿物におけるＩＬ-１２Ｒβ２をウェスタンブロットで確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は血液中インターロイキン１２受容体β２（interleukin12 receptorβ2）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、血管疾患診断用組成物を提供する。
【００１６】
本発明における用語、「血管疾患」は、血管組織の損傷が起こり、そのため血管内膜が厚くなる症状を有する疾患を制限なく含む。本発明の血管疾患に該当する場合、前記した血管内膜肥厚が進むにつれて、血管の狭窄が起こることがあり、血管壁の弾力が低下し、血管破裂による出血が発生することがある。本発明において、血管疾患は血管肥厚症、不安定狭心症（unstable angina）、心筋梗塞（acute myocardial infarction）、アテローム性動脈硬化症、血管再狭窄（in-stent restenosis）であってもよいが、これに限定されない。
【００１７】
本発明においては、血液中インターロイキン１２受容体β２は、損傷されて血管内膜の肥厚症状を現すバイオマーカーであり、不安定狭心症（unstable angina）、心筋梗塞（acute myocardial infarction）などの心臓発作のリスクのある疾患群を診断しうることを確認した。従って、血液中インターロイキン１２受容体β２タンパク質を測定することにより、すなわち、本発明の血管疾患予測または診断用組成物を用いて、危険性の早期診断を達成するために使用され得る。
【００１８】
本発明における用語、「インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2、IL-12Rβ2）」は、インターロイキン１２リガンドに結合する受容体タンパク質のサブユニットβ２を意味する。該当タンパク質は、ＪＡＫ２/ＳＴＡＴ４経路に関与し、T細胞とＮＫ細胞の増殖を促進する機能をし、特にＴ細胞をＴｈ１細胞への分化を促進することが知られている。本遺伝子またはタンパク質に対する情報は公知のデータベースから取得することができ、その例としてＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋであってもよいが、これに限定されない。本発明において、インターロイキン１２受容体β２タンパク質は、全長（full-length）ヒトインターロイキン１２受容体β２タンパク質であってもよく、配列番号１のアミノ酸配列で構成されているものであってもよい。
【００１９】
本発明の血管疾患診断用組成物は、インターロイキン１２受容体β２タンパク質に特異的な抗体またはアプタマーを含むことができる。特に、本発明におけるインターロイキン１２受容体β２タンパク質に特異的な抗体はサンタクルーズバイオテック社（Santa Cruz Biotech.）、クローンＥ−２０、カタログ＃ｓｃ-１８６４８及び/またはアトラス抗体社（Atlas antibodies）、製品＃ＨＰＡ０２４１６８であってもよい。
【００２０】
本発明の具体的な一実施例では、インターロイキン１２受容体β２タンパク質に特異的な抗体として、サンタクルーズバイオテック社、クローンＥ−２０、カタログ＃ｓｃ-１８６４８及び/またはアトラス抗体社、製品＃ＨＰＡ０２４１６８を使用してインターロイキン１２受容体β２タンパク質レベルを測定した。
【００２１】
一方、本発明の血管疾患診断用組成物は、血液中における血管内膜の平滑筋細胞由来インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定するものであってもよい。
【００２２】
インターロイキン１２受容体β２タンパク質は、インターロイキン１２リガンドに結合する受容体タンパク質のサブユニットに該当する。特に、インターロイキン１２受容体β２タンパク質は膜通過タンパク質として細胞膜に存在するのが一般的であるため、該当タンパク質が血液中に存在するかについては知られていない。本発明では、血液中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することができるということだけではなく、インターロイキン１２受容体β２タンパク質の血管疾患、例えば、不安定狭心症、心筋梗塞などとの関連性に関しては、本発明者らが初めて究明した。
【００２３】
本発明では、血液で発見されたインターロイキン１２受容体β２タンパク質は、血管肥厚症によって損傷した血管内膜の細胞、すなわち、平滑筋（Smooth muscle cells、SMCs）由来であってもよい。つまり、血管肥厚症が起こる損傷した血管内膜でインターロイキン１２受容体β２タンパク質が過発現され、損傷した組織に由来する細胞外小包（エキソソームなど）に膜タンパク質であるインターロイキン１２受容体β２タンパク質が含まれることがあり、前記細胞外小包は血液内に存在しうることにより、血液中の前記インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することができる。
【００２４】
本発明の血管疾患診断用組成物は、正常対照群の血液試料に比べ血管疾患、例えば、心筋梗塞または不安定狭心症を有する個体の血液試料から差動的レベルを有するインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する製剤を含むことによって、個体の血管疾患の有無を判断できるようにする。すなわち、本発明の組成物を用いて測定した個体の血液中インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルが正常対照群の血液中インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルよりも高い場合、該当個体は、血管疾患と判断することができる。
【００２５】
本発明の具体的な一実施例では、正常対照群、血管内膜肥厚症や心臓発作のリスクが低い安定狭心症（stable angina）と不安定狭心症及び心筋梗塞患者群の血液試料からインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定した。その結果、正常人のサンプルと比較して、患者のサンプルからＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質が著しく高いレベルで発現されていることを確認した（図７及び図８ａ）。
【００２６】
本発明で前記血管内膜の平滑筋細胞由来インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する組成物は、i）インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する製剤はインターロイキン１２受容体β２タンパク質に特異的な抗体またはアプタマー；及びii）平滑筋マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーを含んでもよい。また、本発明の組成物は、前記i）とii）にiii）細胞外小包マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーをさらに含むものであってもよい。
【００２７】
具体的には、前記平滑筋マーカーは、血小板由来成長因子受容体（platelet-derived growth factor receptor、PDGFR）であってもよいが、これに限定されない。
【００２８】
本発明の一態様であり、血液中の血管内膜の平滑筋細胞由来インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定するために、まず、血液で平滑筋細胞マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて、当該マーカーを含む細胞外小包を分離した後、当該細胞外小包においてインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することができる。
【００２９】
本発明の具体的な一実施例では、代表的に平滑筋マーカー、ＰＤＧＦＲに特異的に結合する抗体（サンタクルーズバイオテック社、クローンＰ-２０、カタログ＃ｓｃ-３３９）を用いており、これを利用して分離したエキソソームでインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定した（図９ｃ）。
【００３０】
本発明で、前記血液中インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することは、血液に存在する細胞外小包（extracellular vesicle）のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することであってもよく、前記細胞外小包は、特にエキソソーム（exosome）であってもよいが、これに限定されない。
【００３１】
そのため、本発明の組成物は、細胞外小包マーカー、特にエキソソームマーカーに特異的な抗体またはアプタマーを含んでもよく、前記エキソソームマーカーはＣＤ８１、ＣＤ９またはＣＤ６３であってもよい。前記エキソソームマーカーに特異的な抗体として、ＣＤ６３に特異的に結合する抗体であるシステムバイオサイエンス社（System Biosciences Inc.）、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ６３Ａ-１、ＣＤ９に特異的に結合する抗体であるシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ９Ａ-１及び/またはＣＤ８１に特異的に結合する抗体であるシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ８１Ａ-１を使用してもよい。本発明の目的上、前記インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する細胞外小包、エキソソームなどは、血管由来であってもよく、特に損傷した血管内膜由来であってもよい。本発明の具体的な一実施例では、エキソソームマーカーに特異的な抗体として、ＣＤ６３に特異的に結合する抗体であるシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ６３Ａ-１、ＣＤ９に特異的に結合する抗体であるシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ９Ａ-１及び/またはＣＤ８１に特異的に結合する抗体であるシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ８１Ａ-１を使用した。
【００３２】
本発明における用語、「マーカー（marker）」とは、血管疾患を有する個体、特に心筋梗塞や不安定狭心症を有する個体を、正常群個体または心臓発作非危険群個体と区別して診断することができる物質であって、本発明の血管疾患を有する個体で増加または減少を示すポリペプチド、タンパク質または核酸、脂質、糖脂質、糖タンパク質、または糖のような有機生体分子をすべて含む。特に、本発明では、本発明の血管疾患を有する個体で増加されるタンパク質であってもよいが、これに限定されない。
【００３３】
本発明における、「タンパク質のレベルを測定」することは、本発明の血管疾患の有無を診断するために生物学的試料（例えば、全血、血漿、血清、これらの分画など）で、前記マーカータンパク質の存在の有無と発現レベルを確認する過程であり、特に前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて、タンパク質の量を確認することができる。前記生物学的試料は、個体から分離された生物学的試料であってもよい。
【００３４】
そのための分析の方法としては、ウエスタンブロット、エライザ（ELISA、enzyme linked immunosorbent assay）、放射線免疫分析（Radioimmunoassay、RIA）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクタロニー（ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Immunoprecipitation assay）、補体固定分析法（complement fixation assay）、フローサイトメトリー分析（Fluorescence Activated cell sorter、FACS）、アプタマーチップ（aptamer chip）、マイクロアレイ（microarray）、タンパク質チップ（protein chip）などがあるが、これに制限されるものではない。前記分析方法を介して、正常対照群での抗原抗体複合体の形成量と血管疾患の疑いのある患者からの抗原抗体複合体の形成量を比較することができ、血管疾患の疑いのある患者の実際の血管疾患の発症可否を診断することができる。
【００３５】
本発明における用語、「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体はマーカータンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体及び抗原結合性を有するものであれば、その一部もすべて含む。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊な抗体も含まれる。
【００３６】
本発明の血管疾患、特に心筋梗塞または不安定狭心症に対するマーカータンパク質であるインターロイキン１２受容体β２タンパク質に特異的な抗体を生成することは、当業界に広く公知された技術を利用して容易に行うことができる。ポリクローナル抗体は、インターロイキン１２受容体β２タンパク質抗原（全長または断片）を動物に注射し、動物から採血して抗体を含む血清を収得する、当業界に広く公知された方法によって生産することができる。これらのポリクローナル抗体はヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、馬、豚、牛、犬などの任意の動物種宿主から製造可能である。モノクローナル抗体は、当業界に広く公知されたハイブリドーマ方法（hybridoma method）（非特許文献１ を参照）、またはファージ抗体ライブラリー（非特許文献２、非特許文献３ ）の技術を用いて製造されてもよい。前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの方法を用いて分離、精製することができる。
【００３７】
また、本発明の抗体は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する完全な形だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')、Ｆ(ａｂ’')２及びＦｖなどがある。
【００３８】
本発明における用語、「アプタマー（aptamer）」は、一本鎖オリゴヌクレオチドであって、２０〜６０ヌクレオチド程度の大きさであり、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。配列に応じて様々な３次元構造を有し、抗原抗体反応のように、特定の物質に対する高い親和性を有しうる。アプタマーは所定の標的分子と結合することにより、所定の標的分子を検出したり、この活性を抑制することができる。本発明のアプタマーはＲＮＡ、ＤＮＡ、変形された（modified）核酸またはこれらの混合物であってもよく、また、直鎖状または環状の形態であってもよい。好ましくは、前記アプタマーはインターロイキン１２受容体β２に結合して、インターロイキン１２受容体β２を検出したり、活性を抑制する役割をすることができる。このようなアプタマーは、インターロイキン１２受容体β２の配列から当業者が公知の方法により製造することができる。
【００３９】
一方、本発明における用語、抗原抗体（またはアプタマー）複合体とは、前記インターロイキン１２受容体β２タンパク質とこれに特異的な抗体またはアプタマーの結合物を意味し、抗原抗体複合体の形成量は、検出ラベル（detection label）のシグナルの大きさにより定量的に測定可能である。
【００４０】
これらの検出ラベルは、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（microparticle）、レドックス分子及び放射線同位元素からなるグループから選択することができ、必ずしもこれに制限されるものではない。検出ラベルとして酵素が用いられる場合、利用可能な酵素には、β-グルクロニダーゼ、β-Ｄ-グルコシダーゼ、β-Ｄ-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β-ラクタマーゼなどがあり、これに限定されない。蛍光物には、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ-フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどがあり、これに限定されない。リガンドには、ビオチン誘導体などがあり、これに限定されない。発光物には、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに限定されない。微小粒子には、コロイド金、着色されたラテックスなどがあり、これに限定されない。レドックス分子には、フェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１,４-ベンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４ Ｗ（ＣＮ）８、[Ｏｓ（ｂｐｙ）３] ２+、 [ＲＵ（ｂｐｙ）３] ２+、[ＭＯ（ＣＮ）８] ４-などが含まれ、これに限定されない。放射線同位元素には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅなどが含まれ、これに限定されない。
【００４１】
タンパク質発現レベルの測定は、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法を用いるものである。 ＥＬＩＳＡは、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体またはアプタマーを利用する直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体またはアプタマーの複合体で捕獲抗体またはアプタマーを認知する標識された抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体またはアプタマーと抗原の複合体で抗原を認知する標識された別の抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体またはアプタマーと抗原の複合体で抗原を認知する別の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された二次抗体を利用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡなど、様々なＥＬＩＳＡ方法を含む。
【００４２】
本発明における用語、「診断」は、病理学的状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は血管疾患、特に心筋梗塞または不安定狭心症の発症の有無、病気の進展の程度、及びこれによる心臓発作の危険性を確認することである。
【００４３】
もう一つの様態として、本発明は、前記血管疾患診断用組成物を含む血管疾患診断用キットを提供する。
【００４４】
本発明のキットは、血管疾患、特に心筋梗塞または不安定狭心症のマーカーであるインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを確認することにより、マーカーを検出することができる。本発明のマーカー検出用キットは、インターロイキン１２受容体β２タンパク質を検出することができるマイクロアレイ、アプタマーチップキット、エライザ（ELISA、enzyme linked immunosorbent assay）キット、ブロッティング（blotting）キット、免疫沈殿法キット、免疫蛍光検査キット、タンパク質チップキット及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。
【００４５】
本発明のマーカー検出用キットは、インターロイキン１２受容体β２タンパク質を検出し、インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定するためのアプタマーまたは抗体を含むことができる。
【００４６】
もう一つの具体的な一例として、本発明でインターロイキン１２受容体β２タンパク質レベルを測定するためのキットは、アプタマーまたは抗体の免疫学的検出のために基質、適度な緩衝溶液、検出ラベルで標識された抗体またはアプタマー及び/または発色基質などを含むことができる。前記の基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート及びガラスでできたスライドグラスなどを利用してもよく、検出ラベルは、前記説明した通りである。前記の発色基質液は、ＡＢＴＳ（２,２'-アジノ-ビス（３-エチルベンゾチアゾリン-６-スルホン酸））またはＯＰＤ（ｏ-フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）などの検出ラベルに応じて、当業界で自明に使用する基質を使用してもよい。
【００４７】
もう一つの様態として、本発明は、血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する段階を含む、血管疾患診断のための情報提供方法を提供する。
【００４８】
具体的には、本発明は、（ａ）血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定する段階；（ｂ）前記（ａ）段階で測定されたインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルと正常対照群の試料とを比較する段階を含む、血管疾患診断のための情報提供方法を提供する。
【００４９】
本発明では、血管疾患、診断、インターロイキン１２受容体β２などは、前記で説明した通りである。
【００５０】
本発明では、前記血液試料とは、血管疾患の疑いのある個体における血管疾患を診断するために収集した血液試料（例えば、全血、血漿、血清、これらの画分など）を意味し、特に血漿試料又は細胞外小包分画であってもよいが、これに限定されない。本発明では、細胞外小包はエキソソームであってもよい。
【００５１】
本発明の血管疾患診断のための情報提供方法は、血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料から測定されたインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルが正常対照群試料のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルよりも高い場合、血管疾患と診断することを特徴とする。
【００５２】
本発明の血管疾患診断のための情報提供方法は、特に、前記血管疾患の疑いのある個体から分離された血液試料中のインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することは、血液試料に存在する血管内膜の平滑筋細胞由来インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定するものであってもよく、これは血液試料から血管内膜の平滑筋細胞由来細胞外小包（例えば、エキソソーム）を分離または抽出して、これに存在するインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することを介して行うことができる。
【００５３】
本発明の一態様として、血液中の血管内膜の平滑筋細胞由来インターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定するために、まず、血液から平滑筋マーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーを用いて、当該マーカーを含む細胞外小包を分離した後、当該細胞外小包においてインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定することができる。
【００５４】
本発明の具体的な一実施例では、代表的に平滑筋マーカーであるＰＤＧＦＲβに特異的に結合する抗体を用いており、これを利用して分離したエキソソームでインターロイキン１２受容体β２タンパク質のレベルを測定した（図９ｃ）。
【００５５】
もう一つの様態として、本発明は、インターロイキン１２受容体β２活性の阻害剤を含む、血管疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【００５６】
本発明で、血管疾患、インターロイキン１２受容体β２などは、前記説明した通りである。
【００５７】
本発明における用語、「インターロイキン１２受容体β２活性阻害剤」は、インターロイキン１２受容体β２の発現または活性を減少させる製剤の両方を総称する意味で使用され、具体的には、インターロイキン１２受容体β２の発現を転写レベルで減少させたり、その活性を妨害することによりインターロイキン１２受容体β２の発現レベルまたは活性を減少させるすべての製剤を含むことができる。
【００５８】
前記インターロイキン１２受容体β２の活性阻害剤は、インターロイキン１２受容体β２を標的にインターロイキン１２受容体β２の発現または活性を抑制することができる化合物、核酸、ペプチド、ウイルス、または前記核酸を含むベクターなど、その形態に制限なく使用可能である。前記インターロイキン１２受容体β２活性阻害剤は、これに限定されないが、好ましくはインターロイキン１２受容体β２ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２受容体β２タンパク質の活性を抑制する抗体またはその抗原結合断片であってもよい。特に、前記インターロイキン１２受容体β２ｍＲＮＡの発現を抑制するオリゴヌクレオチドは、インターロイキン１２受容体β２に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー（aptamer）またはｓｉＲＮＡであってもよい。すなわち、本発明でインターロイキン１２受容体β２活性阻害剤は、抗インターロイキン１２受容体β２タンパク質抗体、及びインターロイキン１２受容体β２遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びｍｉｃｒｏＲＮＡで構成される群から選択されるものであってもよく、前記インターロイキン１２受容体β２遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡは、インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）の塩基配列を参照して、当業界に公知された方法に基づいて製作されたものであってもよい。
【００５９】
本発明の具体的な実施例では、４種のインターロイキン１２受容体β２遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを風船形成術による頸動脈損傷のマウスモデルに処理して、実質的に血管内膜肥厚症状が顕著に減少することを確認した。
【００６０】
本発明における用語、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、特定のｍＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡまたはＲＮＡ、またはこれらの誘導体であり、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する作用をする。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、前記インターロイキン１２受容体β２ｍＲＮＡに相補的であり前記ｍＲＮＡに結合することができるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。これは、前記インターロイキン１２受容体β２ｍＲＮＡの翻訳、細胞質内の電位（translocation）、成熟（maturation）または他のすべての全体的な生物学的機能に必須な活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは６〜１００塩基、好ましくは８〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基であってもよい。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常の方法で試験管内で合成され、生体内に投与するか、生体内でアンチセンスオリゴヌクレオチドが合成されるようにすることができる。試験管内でアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する１つの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩを利用することである。生体内でアンチセンスＲＮＡが合成されるようにする一つの例は、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）の起源が反対方向にあるベクターを使用してアンチセンスＲＮＡが転写されるようにすることである。前記アンチセンスＲＮＡは、配列内に翻訳終止コドンが存在するようにしてペプチド配列に翻訳されないようにすることが望ましい。
【００６１】
本発明で用いることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計は、インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）の塩基配列を参照して、当業界に公知された方法に基づいて容易に製作することができる。
【００６２】
本発明における用語、「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイレンシング（silencing）を媒介することができる核酸分子であって、標的遺伝子の発現を抑制することができるため、効率的な遺伝子ノックダウン（knockdown）方法または遺伝子治療の方法として使用される。前記ｓｉＲＮＡは、二本鎖のＲＮＡがダイサーによって切断されて生成された２１〜２５ヌクレオチドの大きさの小さなＲＮＡ断片であり、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合して発現を抑制することができる。本発明の目的上、インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）に特異的に作用して、インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）分子を切断してＲＮＡ干渉（RNAi、RNA interference）現象を誘導することにより、前記インターロイキン１２受容体β２（interleukin 12 receptorβ2）を抑制することができる。 ｓｉＲＮＡは、化学的にまたは酵素的に合成することができる。ｓｉＲＮＡの製造方法としては、特に限定されず、当業界に公知された方法を使用してもよい。例えば、ｓｉＲＮＡを直接化学的に合成する方法、試験管内（in vitro）転写を用いたｓｉＲＮＡの合成法、試験管内（in vitro）転写によって合成された長い二本鎖ＲＮＡを酵素を用いて切断する方法、ｓｈＲＮＡ発現プラスミドやウイルスベクターの細胞内伝達を通じた発現法及びＰＣＲ（polymerase chain reaction）誘導ｓｉＲＮＡ発現カセット（cassette）の細胞内伝達を通じた発現法などがあるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
本発明の具体的な実施例では、ＧＥダーマコン（GE Dharmacon）で製造したヒトインターロイキン１２受容体β２を特異的に抑制するカタログ＃Ｍ_００７９３２-００とラットインターロイキン１２受容体β２を特異的に抑制するカタログ＃Ｍ_０９５０６９-０１を使用して効果を確認した。
【００６４】
本発明における用語、「治療」は、治療しようとする一人一人または細胞の天然の過程を変更させるために、臨床的に介入することを指し、これは、臨床病理状態の進行中またはこれを予防するために実行することができる。目的とする治療効果には、疾患の発生または再発を予防して、症状を緩和させ、病気に伴うすべての直接または間接的な病理学的結果を低下させ、転移を予防し、疾患の進行速度を減少させ、疾患状態を軽減または一時的緩和させて、回復させたり予後を改善させることが含まれる。好ましくは、本発明ではインターロイキン１２受容体β２を抑制する物質を含む組成物の投与により、血管疾患、特に血管肥厚症、心筋梗塞または不安定狭心症の経過を好転させる全ての行為を含む。また、「予防」は、本発明に係るインターロイキン１２受容体β２を抑制する物質を含む組成物の投与により、前記血管疾患、特に血管肥厚症、心筋梗塞または不安定狭心症の発症を抑制または遅延させる全ての行為をいう。
【００６５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常的に使用される適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製してもよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれてもよく、これらの固形製剤は、一つまたは複数の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤してもよい。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用されてもよい。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使われる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれてもよい。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤には、ウイテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
【００６６】
また、本発明の薬学的組成物は、これに限定されないが、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有してもよい。
【００６７】
もう一つの様態として、本発明はインターロイキン１２受容体β２阻害剤を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、血管疾患の治療方法を提供する。
【００６８】
本発明における用語、「個体」は、本発明の血管疾患、特に血管肥厚症、心筋梗塞または不安定狭心症を保有するか、または発症した人間を含むすべての動物を意味する。本発明の薬学的組成物を個体に投与することにより、血管疾患、特に血管肥厚症、心筋梗塞または不安定狭心症を緩和または治療することができる。前記緩和は、本発明に係る組成物の投与で血管疾患、特に血管肥厚症、心筋梗塞または不安定狭心症が好転したり、有利になるすべての行為をいう。
【００６９】
前記本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。
【００７０】
本発明における用語、「投与」は、任意の適切な方法で対象に本発明の薬学的組成物を導入することをいい、投与経路は目的組織に到達することができる限り、経口または非経口の多様な経路を介して投与してもよい。
【００７１】
前記薬学的組成物は、目的や必要に応じて、当業界で使用される通常の方法、投与経路、投与量に応じて適宜個体に投与することができる。投与経路の例としては、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内、局所内及び鼻腔内に投与されてもよく、非経口注入には、局所内（ステント利用）、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。また、当業界に公知された方法に応じて適切な投与量及び投与回数が選択されることができ、実際に投与される本発明の薬学的組成物の量及び投与回数は、治療しようとする症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食餌、個体の年齢及び体重、及び疾患の重症度のような様々な因子によって適切に決定してもよい。
【００７２】
本発明での用語、「薬学的に有効な量」は、医学的用途に適用可能な合理的な恩恵/リスク比で、血管透過性の増加を抑制または緩和するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、及び排出速度、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定されてもよい。本発明の組成物は、個々の治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療法とは順次的または同時に投与してもよい。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素のすべて考慮して副作用のない最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されてもよい。
【００７３】
もう一つの様態として、本発明は血管疾患の治療用の候補物質をインターロイキン１２受容体β２を発現する平滑筋細胞に処理する段階；及び前記インターロイキン１２受容体β２の発現レベルを測定する段階を含む、血管疾患治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【００７４】
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、血管疾患治療用の候補物質処理により、インターロイキン１２受容体β２の発現レベルが低下する場合、血管疾患治療剤として判断されるものであってもよい。
【００７５】
前記の「候補物質（test agent）」は、任意の物質（substance）、分子（molecule）、元素（element）、化合物（compound）、エンティティー（entity）またはこれらの組み合わせを含む。例えば、これらに限定されるわけではないが、タンパク質、ポリペプチド、小有機分子（small organic molecule）、多糖類（polysaccharide）、ポリヌクレオチドなどを含む。また、天然産物（natural product）、合成化合物または化学化合物または２つ以上の物質の組み合わせであってもよい。それ以外の指示がない限り、製剤、物質及び化合物は互換的に（interchangeably）使用してもよい。
【００７６】
本発明の方法でスクリーニングされたり、同定される候補物質は、ポリペプチド、 ベータターン模倣物（betaturnmimetics）、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン（benzodiazepines）、オリゴマーリックＮ-置換グリシン（oligomeric N-substituted glycines）、オリゴカルバメート（oligocarbamates）、糖類（saccharides）、脂肪酸、プリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体、構造的類似体または組み合わせを含む。前記試験物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出処から得ることができる。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
実施例１：風船形成術により誘導された血管損傷マウスモデルの製作
本発明において、動物実験は梨花女子大学の動物管理及び使用委員会機関（Institutional Animal Care and Use Committee、IACUC）のガイドラインに準拠して、アメリカ国立衛生研究所が出版した「実験動物の管理及び使用のためのガイド（ The National Academies Press、8th Edition、2011）」に基づいて実施した。
【００７９】
本発明では、風船形成術により誘導された頸動脈損傷モデルには、１０週齢のオススプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラットを使用し、ラットは既存に記載されているように（非特許文献４）頸動脈損傷モデルを製造し、まずイソフルランガス（Ｎ２Ｏ：Ｏ２/７０％：３０％）の吸入により麻酔させた。
【００８０】
プロテオミクス分析のために、手術後にラットは異なる時点（１８時間、３日、５日及び７日）までに、ケージ中で回復した。各実験群は、８匹のラットを使用し、シャム（sham）実験群を０時間対照群として使用した。
【００８１】
組織学的及び免疫学的分析のために、ラットは１０日間回復した。各実験群の大きさは、図面の説明に記載した通りであり、すべての動物実験は３回繰り返して実施した。
【００８２】
実施例２：カテーテル媒介血管壁内の伝達方法による頸動脈へのｓｉＲＮＡ伝達
前記実施例１で製造した頸動脈損傷動物モデルの損傷された頸動脈組織にｓｉＲＮＡを伝達して分子生物学的な変化を確認するために、カテーテル媒介血管壁内のｓｉＲＮＡ伝達の実験を行った。
【００８３】
具体的には、ラット-特異的ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴプール（GE Healthcare Dharmacon、カタログ＃Ｍ_０９５０６９-０１、２００ｎＭ）を製造元（Ambion）の指示に従ってｓｉＰＯＲＴＴＭ ＮｅｏＦＸＴＭ試薬と、まず混合した。風船‐形成術による損傷直後に、総頸動脈（common carotid arteries）をＯｐｔｉ-ＭＥＭで洗浄し、カテーテルを介して前記予め混合しておいた形質転換試薬を投与した。形質転換効率を高めるために１５分間静置した後、決着させた。血管壁内のｓｉＲＮＡ伝達を確認するために蛍光染料-結合対照群ｓｉＲＮＡであるｓｉＧＬＯ-Ｒｅｄ（Dharmacon）を使用した。
【００８４】
実施例３：組織学的分析
組織学的分析のために、前記実施例１で開示されたように、ラットはイソフルランガス（Ｎ２Ｏ：Ｏ２/７０％：３０％）を用いて麻酔させ、３．７％ホルムアルデヒドを含むヘパリン生理食塩水で経心臓灌流固定（transcardiac perfusion -fixation）をした後、頸動脈を切除した。切除した頸動脈の血管は、パラフィン包埋（paraffin embedded）して、回転式ミクロトーム（Leica RM2255）を用いて切断した。総頸動脈の中の部位から２つの連続した組織切片（４ｕｍ厚）を得て、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。内腔（luminal）、内部弾力層（internal elastic laminal）及び外部弾力層（external elastic laminal）の面積は、ＮＩＨ ｉｍａｇｅ ｖ１．６２を用いて測定した。内膜と内層面積は、内部弾力層の面積から内腔面積と外部弾力層の面積を除外することにより測定した。各ラットごとに二連の組織切片から測定された値の平均値を分析に使用した。
【００８５】
実施例４：ヒト血液標本の分析
本発明で使用される血液標本は、正常-健康対照群と血管造影術を介して冠動脈疾患と診断された患者群から採取した。これは梨花女子大学医療院（ソウル、韓国）の臨床試験審査委員会の承認を得て行った。
【００８６】
前記冠動脈疾患の患者のうち、虚血を有する患者は、臨床基準に基づいて安全狭心症（stable angina）、不安定狭心症（unstable angina）及び急性心筋梗塞（acute myocardial infarction）に分類した。本実験に参加したすべての応募者は、彼らの情報提供に対して同意した後に参加した。
【００８７】
前記得られた全血液（whole blood）サンプルは遠心分離し、血漿サンプルはＰｉｅｒｃｅ ａｌｂｕｍｉｎ/ＩｇＧ除去ｋｉｔを製造社の指示に従って使用して、さらに分離した。
【００８８】
実施例５：統計分析
統計学的有意性（P value）を確認するためには、Ｓｔｕｄｅｎｔ's t-ｔｅｓｔを用いた二集団間の比較または多数集団に対するＴｕｋｅｙ′ｓ「正直有意差」（「honestly significant difference」）ｐｏｓｔ ｈｏｃテスト（Windows版SPSS12.0K、SPSS、シカゴ、IL、USA）を用いた一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて、結果を分析した。Ｐ値が０．０５以下の場合（P<0.05）は、統計学的に有意であると見た。血液標本を用いたデータは、 クラスカル・ウォリス順位和検定（Kruskal-Wallis rank sum test）とウィルコクソン順位和検定（Wilcoxon rank sum test）の二つのノンパラメトリック検定（non-parametric test）を介して分析した。
【００８９】
実験例１：ラット頸動脈の物理的な損傷によるプロテオーム変化の分析
風船形成術によって誘導されたラット頸動脈損傷は、血栓症によって誘導された平滑筋（SMC、smooth muscle cell）肥大症と典型的な新生内膜（neointimal）肥厚症を誘導する内皮剥離の症状を現す。これにより、前記風船形成術によって誘導されたラット頸動脈損傷は、風船型塞栓除去用カテーテルを用いて動脈血管に物理的な損傷を与えた場合と同様の症状を現す。本生体内モデルは、ＳＭＣ肥大症と関連した組織学的及び生化学的研究に使用することができる。
【００９０】
まず、風船形成術によって損傷した頸動脈から新生内膜肥厚症の動態を確認した。既知のように、風船形成術による損傷は損傷部位の内膜側面（lumen）において、胃内膜の厚さの徐々の増加を誘導する（図１）。これらの動態に基づいて、５つの順次的な時点を選択して（シャム対照群、損傷後１８時間、３日、５日及び７日）、２Ｄ-差動電気泳動（2-dimensional differential gel electrophoresis、2D-DIGE）によりプロテオミックス分析を行った（図２ａ）。
【００９１】
ＤＩＧＥ分析に必要な十分な量のタンパク質を得るために、各時点毎に得られた８つの損傷した頸動脈組織からタンパク質を抽出し、超遠心細胞分画法（subcellular fractionation）を用いて分離した（図２ｂ）。このように分けられたタンパク質画分は、Ｃｙ３/Ｃｙ５蛍光染色した後２Ｄ-差動電気泳動により分離され、総２，１００以上のタンパク質スポットに対する発現分析を行った。内部標準（Cy2-labeled）に対して、各損傷実験サンプルのタンパク質発現をプラッティングした結果、１４０個のタンパク質スポットが時間依存的に発現変化を起こすことを確認した。前記１４０個のタンパク質スポットのうち、質量分析計を用いて分析可能な４４個のタンパク質を成功的に同定した。同定されたタンパク質の差動的発現は、それぞれに特異的な抗体（ＩＬ-１２Ｒβ２特異的抗体；サンタクルーズバイオテック、クローンＥ−２０、カタログ＃ｓｃ-１８６４８/Ａｔｌａｓ抗体社、製品＃ＨＰＡ０２４１６８）を利用した免疫ブロッティングで確認し、これにより、前記プロテオーム分析を定量的かつ正確に行われたことを確認した（図２ｃ）。
【００９２】
実験例２：インターロイキン１２受容体β２の試験管内（in vitro）及び動物（in vivo）での機能確認
前記実験例１で同定された４４個のタンパク質のうち、インターロイキン１２受容体β２の変化に注目して、ヒト大動脈平滑筋細胞（Human Aortic SMCs、HASMCs）での細胞機能の有効性検査を実施した。
【００９３】
具体的には、ヒト大動脈平滑筋細胞に、前記ＩＬ-１２Ｒβ２（interleukin 12 receptorβ2）に特異的なｓｉＲＮＡ（small-interference RNAs）４種（GE Healthcare Dharmacon、Cat＃M_007932-00）を混合処理して、ノックダウンした。血小板由来成長因子（PDGF）とＴＮＦ-αは、風船形成術による損傷患部の血小板/大食細胞によって生成される重要な因子であるため、大動脈平滑筋細胞の増殖と 走化性移動はＰＤＧＦ-ＢＢが誘導し、平滑筋細胞に対する単核球の付着は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α）が誘導する。
【００９４】
結果としてインターロイキン１２受容体β２のノックダウンは、前記３つの細胞活性をすべて著しく減少させた（図４）。
【００９５】
また、実施例２に述べたようにカテーテルを介してラットに特異的なＩＬ-１２Ｒβ２（Interleukin 12 receptorβ2）ｓｉＲＮＡを伝達して、風船形成術によって損傷した頸動脈を形質転換した時、ＩＬ-１２Ｒβ２のノックダウンが成功的に確立され（図５のＡ）、対照群ｓｉＲＮＡに比べて新生内膜肥厚症が顕著に減少した（図５のＢ）。これはＩＬ-１２Ｒβ２が血管平滑筋細胞で発現され、平滑筋肥大症に重要な機能を果たすということを証明する。
【００９６】
実験例３：血管肥厚症に対する潜在的バイオマーカーであるＩＬ-１２Ｒβ２
急速に成長したり、損傷した細胞は、細胞タンパク質またはｍｉｃｒｏＲＮＡをエキソソーム（exosomes）の形で放出するため、本発明者らは、前記検証されたＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質が冠動脈疾患を有する患者、特に急性心筋梗塞または不安定狭心症のような不安定な症状を有する患者の血液において高発現を現すことを確認した。
【００９７】
そのためには細胞株で内生的に発現されたＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質を特異的に認識する抗体（サンタクルーズバイオテック、クローンＥ−２０、カタログ＃ｓｃ-１８６４８；Ａｔｌａｓ抗体社、製品＃ＨＰＡ０２４１６８）を使用した（図６ａ）。微量のタンパク質検出を改善するために、アルブミンと免疫グロブリンを含む豊富な血漿タンパク質を患者の血漿サンプルから除去した（図６ｂ）。
【００９８】
前記狭心症の症状を伴う冠状動脈造影術を施行した患者から得られた血漿サンプルのウェスタンブロット分析を行い、正常人のサンプルと比較した。その結果、正常人のサンプルに比べて、患者のサンプルからＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質が著しく高いレベルで発現されることが確認された（図７）。
【００９９】
図８ａで確認できるように、定量及び統計分析を介して血漿からのＩＬ-１２Ｒβ２発現レベルがヒト患者の疾患重症度と密接な関係があることを確認した（４集団間のＰ = ３．４４８ Ｘ １０-６）。
【０１００】
また、血漿ＩＬ-１２Ｒβ２が、血管が狭くなる症状と関連があることを確認するために、病理学的内膜肥厚症を伴うヒト患者（n = 3）の頸動脈血管で組織染色を介してＩＬ-１２Ｒβ２の発現を測定した。その結果、ＩＬ-１２Ｒβ２が正常動脈血管の壁よりも肥厚した内膜病変で顕著に高く発現することを確認した（図８ｂ）。
【０１０１】
血漿で発見されたＩＬ-１２Ｒβ２タンパク質の分子量は、全長形態の分子量に対応するため、タンパク質加水分解によって分散されず、エキソソーム形で放出されると考えた。これを確認するために、本発明者らは、血漿サンプルを超遠心分離及びポリマーベース沈殿（polymer-based precipitation）を用いて細胞外小包を分離した。実際に、ＩＬ-１２Ｒβ２はエキソソームマーカーであるＣＤ９及びＣＤ８１と共に沈殿物に存在した（図９ａ及び図９ｂ）。前記エキソソームマーカーと関連して、ＣＤ６３に特異的に結合する抗体としてはシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ６３Ａ-１、ＣＤ９に特異的に結合する抗体としてはシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ９Ａ-１、ＣＤ８１に特異的に結合する抗体ではシステムバイオサイエンス社、カタログ＃ＥＸＯＡＢ-ＣＤ８１Ａ-１を使用した。また、平滑筋マーカーであるＰＤＧＦＲβもエキソソーム画分から検出され、これは患者の血清サンプルに平滑筋細胞由来エキソソームが存在することを示す。
【０１０２】
最後に、ＩＬ-１２Ｒβ２とＰＤＧＦＲβが同じエキソソームに存在するかどうかを確認するために、患者の血清からＰＤＧＦＲβをＰＤＧＦＲβに特異的に結合する抗体（サンタクルーズバイオテック社、クローンＰ-２０、カタログ＃ｓｃ-３３９）を用いて免疫沈殿（immunoprecipitation）し、ここからＩＬ-１２Ｒβ２を検出した結果、図９ｃで確認したようにＰＤＧＦＲβ免疫沈殿物からＩＬ-１２Ｒβ２が検出されることを確認した。すなわち、前記二つのタンパク質がエキソソームに共局在し、当該エキソソームは平滑筋細胞由来であることを確認した。
【０１０３】
前記のような結果を総合すると、肥厚していく大動脈血管からＩＬ-１２Ｒβ２の発現が誘導され、これは血斑（plaque）不安定性により患者の血液中に放出されることを確認した。したがって、本発明では、血管疾患における疾患の重症度を測定するマーカーとしてＩＬ-１２Ｒβ２を使用することができることを確認した。
【０１０４】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【配列表】
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