(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞を肝細胞様細胞（ｉＨｅｐ）に誘導するための方法であって、
（ａ）以下の肝細胞誘導因子をアップレギュレートするように、前記線維芽細胞を処理する工程；
肝細胞核因子１−α（ＨＮＦ１Ａ）、肝細胞核因子４−α（ＨＮＦ４Ａ）、肝細胞核因子６−α（ＨＮＦ６）、成熟因子の活性化転写因子５（ＡＴＦ５）、プロスペロホメオボックスタンパク質１（ＰＲＯＸ１）およびＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）
（ｂ）前記工程（ａ）からの線維芽細胞を体細胞培地中で培養する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）からの細胞を肝細胞培養培地中で増殖させる工程；および
（ｄ）前記工程（ｃ）からの細胞を肝細胞成熟培地中で培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）が、ＭＹＣをアップレギュレートし、ｐ５３をダウンレギュレートするように前記細胞を処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）が、前記細胞を、ｐ５３  ｓｉＲＮＡを発現するベクターでトランスフェクトすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）において、前記細胞を、それぞれ配列番号１〜７に記載されている核酸で形質転換する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）において、前記細胞を前記体細胞培養培地中で少なくとも７日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）において、前記細胞を前記肝細胞培養培地中で１５〜３０日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）において、前記細胞を前記肝細胞培養培地中で１８〜３０日間培養する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）において、前記細胞を前記肝細胞培養培地中で１８日間培養する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｄ）において、前記細胞を前記肝細胞成熟培地中で少なくとも５日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｃ）の終了時に、ｐ５３  ｓｉＲＮＡの発現を阻害することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記線維芽細胞が哺乳動物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物が、ヒト、ラット、マウス、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマおよびブタからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アルブミン、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４およびＣＹＰＢ６からなる群より選択される少なくとも１つの肝マーカーの発現、グリコーゲンの合成および貯蔵、ならびに／または脂肪滴の蓄積を検出することによって、ｉＨｅｐを同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
線維芽細胞をｉＨｅｐにリプログラミングするためのキットであって、以下の肝細胞誘導因子をアップレギュレートするための要素を含む、キット。
ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡ
【請求項１６】
ＭＹＣをアップレギュレートするための要素と、ｐ５３をダウンレギュレートするための要素とをさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
単独でまたは組み合わせて、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＣＥＢＰＡおよび／またはＭｙｃを過剰発現し、ｐ５３遺伝子発現を阻害するレンチウイルスまたは他の方法を含む、請求項１５に記載のキット。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般に、本発明は、真核細胞を肝細胞にリプログラミングするための肝細胞運命転換因子および成熟因子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療および薬物開発の分野では、機能的ヒト細胞型の需要が高い。それらは、罹患組織または損傷組織の修復または交換に大きな可能性を示し、医薬用途のための有益なツールであり得る。しかしながら、ドナーの不足により、これらの領域における機能的ヒト細胞型の適用は制限されている（Ｃａｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２：１８３−２１２（２００６））。このジレンマを解決するために、機能的に成熟した細胞を作製するための新規戦略の需要が高い。最近、体細胞の運命を変更するための有効な方法として、系列リプログラミング（ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）が登場した（Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４７：８２７−８３８（２０１２））。原理的には、ある細胞型を別の細胞型の最終成熟状態に直接転換することができ、系列リプログラミングの間の中間状態を省略することができる。したがって、この戦略を使用して、機能的に成熟した細胞を得ることができ、機能的ヒト細胞の有望な供給源を提供することができる可能性がある。
【０００３】
機能的ヒト肝細胞は、薬物代謝を評価するための最も重要なインビトロモデルであり、医薬開発において広く適用可能な可能性がある。肝臓に対する許容され得ない代謝および毒性効果は、創薬における新規化学物質の失敗の大きな原因であるので（Ｂａｒａｎｃｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．，５８：４５３−４７２（２００６））、良好な薬物動態を示す化合物を同定するためには、吸収、分布、代謝、排泄および毒性（ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ）のアッセイにおいて、ヒト肝臓の最も近いインビトロモデルとして機能するヒト肝細胞を使用することが必須である（Ｓａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，７：１８８−１９８（２０１０））。現在、薬物開発では、異なる遺伝的背景を有する個体に由来する初代ヒト肝細胞が頻繁に使用されているが、その結果として生じる遺伝的背景の多様性は、これらの細胞を使用した医薬研究から得られた結果の再現性を損なう。加えて、ヒト肝ドナーの不足により、初代ヒト肝細胞の使用が大幅に制限されており（Ｃａｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２：１８３−２１２（２００６））、その結果、高い再現性を有する別のヒト肝細胞源が、創薬に使用するために緊急に必要とされている。
【０００４】
機能的肝細胞を作製するための様々な戦略が研究されている。ヒト肝細胞は、定方向分化によってヒト多能性幹細胞から誘導された（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４５：１２２９−１２３９（２００７）；Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４０：３２８５−３２９６（２０１３）；Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４９９：４８１−４８４（２０１３）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１５７−１６１（２０１３））。近年、この戦略は急激に進歩したが、多能性幹細胞から誘導された細胞の未成熟表現型は、依然として技術的障害である。原理的には、プロセス全体が、肝細胞形成の最終段階に影響を与える複数の重要な工程を含むので、完全に機能的な肝細胞は、この方法を使用して得ることが比較的困難である。対照的に、系列リプログラミングは、中間状態を経ない体細胞の系列転換を可能にする。線維芽細胞からマウス肝細胞が分化形質転換されているが（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３８６−３８９  ２０１１；Ｓｅｋｉｙａ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３９０−３９３（２０１１））、これらの細胞は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などのいくつかの肝芽細胞マーカーを依然として発現し、薬物代謝に関与するいくつかの重要なシトクロムＰ４５０酵素（ＣＹＰ）の発現を欠くが、これは、これらの細胞の機能的に未成熟な表現型を示唆している（Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｇ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，９：８９−９１（２０１１））。
【０００５】
したがって、非肝細胞を、公知の誘導肝細胞と比較して改善された肝細胞機能活性を示す機能的誘導肝細胞に誘導するための方法が必要である。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、代謝機能を有する誘導肝細胞（ｉＨｅｐ）への非肝細胞の転換を誘導する方法を提供することである。
【０００７】
また、本発明の目的は、代謝機能を有する誘導肝細胞を提供することである。
【０００８】
また、本発明の目的は、薬物開発、バイオ人工肝臓システムならびにインビボおよびインビトロ肝用途に誘導肝細胞を使用する方法を提供することである。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、非肝細胞をｉＨｅｐにリプログラミングするためのキットを提供することである。
【発明の概要】
【００１０】
機能的肝薬物代謝能力および輸送能力によって示される肝細様細胞への、肝細胞ではない初期型の細胞（すなわち、非肝細胞）のリプログラミングを誘導するための方法が開示される。これらの細胞は、本明細書では誘導肝細胞（ｉＨｅｐ）と示される。肝運命転換因子および成熟因子（総称して「肝細胞誘導因子」）をアップレギュレートするように非肝細胞を処理し、体細胞培養培地中で培養し（形質転換段階）、肝細胞培養培地中で増殖させ（増殖段階）、肝細胞成熟培地中で、前記細胞を肝細胞様特性を有する細胞に転換するのに十分な時間さらに培養する（成熟段階）。
【００１１】
好ましい実施形態では、非肝細胞は、以下の肝細胞誘導因子：肝細胞核因子１−α（ＨＮＦ１Ａ）、肝細胞核因子４−α（ＨＮＦ４Ａ）および肝細胞核因子６−α（ＨＮＦ６）、活性化転写因子５（ＡＴＦ５）、プロスペロホメオボックスタンパク質１（ＰＲＯＸ１）ならびにＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）の少なくとも１つを過剰発現するように形質転換される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、肝細胞誘導因子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つを発現するように形質転換される。好ましい実施形態では、前記細胞は、６つの肝細胞誘導因子すべてを過剰発現するように形質転換される。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＭＹＣをアップレギュレートすること、ならびに／またはｐ５３遺伝子発現および／もしくはタンパク質活性をダウンレギュレートすることをさらに含む。次いで、（肝細胞誘導因子をアップレギュレートし、場合によりＭＹＣをアップレギュレートし、場合によりｐ５３をダウンレギュレートするように処理した）非肝細胞をインビトロで増殖させて、ｉＨｅｐを得る。一実施形態では、トランスフェクト細胞を体細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭ）中で、約８０％コンフルエントまで少なくとも７日間培養する。次いで、前記細胞を再プレーティングし、肝細胞培養培地（ＨＣＭ）中で、約１５〜３０日間、好ましくは約１８〜３０日間、より好ましくは約１８日間増殖させ、その後、前記細胞を肝細胞成熟培地に約５日間移す。誘導肝細胞（ｉＨｅｐ）は、この細胞培養スキームにしたがって得られる。
【００１２】
前記細胞は、肝細胞の公知の構造的および機能的特性に基づいて、ｉｈｅｐと同定される。
【００１３】
機能的誘導肝細胞（ｉＨｅｐ）も開示される。好ましい実施形態では、誘導肝細胞は、ヒト誘導肝細胞（ｈｉＨｅｐ）である。ｉＨｅｐは、アルブミン、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ）３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９からなる群より選択される少なくとも１つの肝細胞マーカーを発現する。好ましい実施形態では、ｉＨｅｐは、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９の少なくとも２つ、３つまたは４つまたは５つまたは６つを発現する。
【００１４】
移植ｈｉＨｅｐは、Ｔｅｔ−ｕＰＡ／Ｒａｇ２-/-γｃ-/-マウスの肝臓の最大３０％を再生させ、インビボで３００ｍｇ／ｍｌ超のヒトアルブミンを分泌する。したがって、系列リプログラミングによって、薬物代謝機能を有するヒト肝細胞を作製して、肝疾患／肝不全との関連でのインビトロ薬物開発およびインビボ用途のための細胞源を提供し得る。
【００１５】
ｉＨｅｐへの非肝細胞のリプログラミングを誘導するためのキットも開示される。キットは、本明細書に開示される肝細胞誘導因子をアップレギュレートする要素と、場合により、ＭＹＣをアップレギュレートし、ｐ５３遺伝子発現および／またはタンパク質レベルをダウンレギュレートする要素とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、Ｆ−ＨＥＰ、ＨＥＦおよび３Ｈ細胞におけるＡＬＢの遺伝子発現分析を示す棒グラフである。ｎ＝２。図１Ｂは、３Ｈ細胞、胎児肝細胞（ＦＬＣ）およびＦ−ＨＥＰにおける肝転写因子の発現の定量比較を示す棒グラフである。ｎ＝２。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。図１Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲによる、３Ｈ細胞、ＦＬＣおよびＦ−ＨＥＰにおける肝臓に豊富に存在する転写因子の遺伝子発現分析を示す棒グラフである。ｎ＝２。図１Ｄは、４つの個々のＦ−ＨＥＰにおける肝転写因子の存在量の定量分析を示す棒グラフである。ｎ＝２。図１Ｅは、ｈｉＨｅｐリプログラミングダイアグラムの概略図である。図１Ｆは、異なる段階の誘導細胞の増殖速度の決定を示す。上のパネル：ＭＴＴアッセイ。０日目は、ＨＣＭ（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰサイレンシング前）または改変ＷＥＭ（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰサイレンシング後）に誘導細胞を移した日として設定されている。下のパネル：増殖段階の誘導細胞の倍加時間の計算（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰサイレンシング前）。Ｔｄ、倍加時間。図１Ｇは、ｈｉＨｅｐ、ＨＥＦおよびＦ−ＨＥＰの間のアルブミン発現の定量分析を示す棒グラフである。図１Ｈおよび１Ｉは、ＡＬＢおよびＡＡＴによってマーキングしたフローサイトメトリー分析によって測定したリプログラミング効率を示す。ｎ＝３。ＡＰＣ、アロフィコシアニン。図１Ｊは、ＥＬＩＳＡによる、ｈｉＨｅｐ、ＨＥＦおよびＦ−ＨＥＰの間のアルブミン分泌の定量分析を示す棒グラフである。ｎ＝３。図１Ｋは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出した、個々の因子の除去後の肝機能遺伝子の発現に対する効果を示す。ｎ＝２。データを平均＋／−ｓ．ｄ．として示す。
【図２】図２Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによる、ｈｉＨｅｐにおける肝転写因子および線維芽細胞マーカーの内因性遺伝子発現分析を示す。図２Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した外因性遺伝子のサイレンシングを示す。７日目、感染７日後。図２Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した肝転換プロセス中のＭＹＣの相対的発現を示す。７日目および１４日目、感染７日後および１４日後。ｎ＝２。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＨＥＦ、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＳ−Ｈｅｐ、ｈｉＨｅｐおよびＦ−ＨＥＰにおける薬物代謝第Ｉ相（図３Ａ）および第ＩＩ相酵素（図３Ｂ）ならびに第ＩＩＩ相トランスポーター（図３Ｃ）の発現の定量分析を示す。各遺伝子の相対的発現をＨＥＦに対して正規化した；不検出の場合、それをＨｅｐＧ２細胞に対して正規化した。ｎ＝２。１＝ＨＥＦ；２＝ＨｅｐＧ２細胞；３＝ＥＳ−Ｈｅｐ；４＝ｈｉＨｅｐ；５＝Ｆ−Ｈｅｐ。図３Ｄは、ＨＥＦ、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＳ−Ｈｅｐ、ｈｉＨｅｐおよびＦ−ＨＥＰにおける薬物代謝第ＩＩ相酵素および第ＩＩＩ相トランスポーターの発現の定量分析を示す棒グラフである。各遺伝子の相対的発現をＨＥＦに対して正規化した；不検出の場合、ＨｅｐＧ２細胞に対して正規化した。ｎ＝２。図３Ｅは、ｈｉＨｅｐおよびＨＥＦとＦ−ＨＥＰとにおける第Ｉ相、第ＩＩ相、第ＩＩＩ相ｍＲＮＡの定量比較を示す棒グラフである。図３Ｆは、ｈｉＨｅｐとＦ−ＨＥＰとにおける核内受容体ｍＲＮＡの定量比較を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａは、ＨＰＬＣ−ＭＳによって決定した場合の、ｈｉＨｅｐ、ＥＳ−Ｈｅｐ、Ｆ−ＨＥＰ１、Ｆ−ＨＥＰ２、ＨｅｐＧ２細胞およびＨＥＦにおけるＣＹＰ３Ａ４（３Ａ４−Ｔ、テストステロン；３Ａ４−Ｍ、ミダゾラム）、ＣＹＰ１Ａ２（フェナセチン）、ＣＹＰ２Ｂ６（ブプロピオン）、ＣＹＰ２Ｃ９（ジクロフェナク）およびＣＹＰ２Ｃ１９［（Ｓ）−メフェニトイン］の代謝活性を示す。ｎ＝３。２バッチの新たに単離した初代ヒト肝細胞（Ｆ−ＨＥＰ１およびＦ−ＨＥＰ２）を陽性対照として適用した。結果を、ｐｍｏｌ／分／細胞１００万個として示す。データを平均±ＳＤとして示す。図４Ｂは、異なる誘導因子で処理したｈｉＨｅｐにおけるＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６の誘導倍率の定量分析を示す棒グラフである。ｎ＝２。Ｒｉｆ、リファンピン；ＰＢ、フェノバルビタール；ＥＴＯＨ、エタノール；ΒＮＦ、β−ナフトフラボン。図４Ｃは、複数のモデル肝毒素に対するｈｉＨｅｐの感受性の分析を示す棒グラフである。Ｆ−ＨＥＰを陽性対照として使用した。データを平均として示す。ｎ＝３。図４Ｄは、ｑＲＴ−ＰＣＲによる、ｈｉＨｅｐ形成後の肝臓遺伝子の遺伝子発現分析を示す棒グラフである。相対的発現を０日目のものに対して正規化した。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＬＩＳＡによってモニタリングしたマウス血清中のヒトアルブミンのレベルを示す線グラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＳ−Ｈｅｐ（ｎ＝１６）、ｈｉＨｅｐ（ｎ＝５）およびＦ−ＨＥＰ（ｎ＝６）の間のマウス血清中のヒトＡＬＢ分泌を比較した棒グラフである
【図５Ｃ】図５Ｃは、ｈｉＨｅｐの生着効率のフローサイトメトリー分析を示す。マウス１およびマウス２は、それぞれ２６７および３１３ｕｇ／ｍｌのヒトＡＬＢを分泌した。ＨＮ、ヒト核。ＰＥ、フィコエリトリン。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「培養物」は、培地中で成長させ、場合により継代した細胞の集団を意味する。細胞培養物は、初代培養物（例えば、継代されていない培養物）であり得るか、または２代目もしくはそれ以降の培養物（例えば、１回以上二次培養または継代された細胞の集団）であり得る。
【００１８】
本明細書で使用される「ダウンレギュレーション」または「ダウンレギュレート」は、細胞が、外部変数に応じて、細胞成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の量および／または活性を減少させるプロセスを指す。
【００１９】
本明細書で使用される「胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来肝細胞（ＥＳ−Ｈｅｐ）」は、Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３（１）：１５７−１６１（２０１３）に開示されている方法にしたがって誘導される誘導肝細胞を指す。
【００２０】
本明細書で使用される「機能的誘導肝細胞（ｉＨｅｐ）」は、同じ生物から得られたＥＳ−Ｈｅｐにおける同じ酵素の活性よりも５０％高いレベルで、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９またはＣＹＰ２Ｃ１９の少なくとも１つの活性を示す誘導肝細胞を指す。酵素の活性は、ＥＳ−Ｈｅｐにおける活性よりも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上であり得る。
【００２１】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、ベクターなどの組換えヌクレオチドを導入し得る非肝細胞真核細胞を指す。
【００２２】
本明細書で使用される用語「誘導肝細胞」（ｉＨｅｐ）は、天然に存在する肝細胞ではない細胞であって、非肝細胞から人工的に誘導される細胞を指す。
【００２３】
用語「単離された」または「精製された」は、ｈｉＨＥＰに言及する場合、非肝細胞などの夾雑細胞型を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％含まない化学的誘導多能性幹細胞を意味する。単離されたｉｈｅｐはまた、天然に存在する可溶性分子を実質的に含まないものであり得る。
【００２４】
用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、一般に、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。用語「核酸」または「核酸配列」はまた、上記で定義されるポリヌクレオチドを包含する。
【００２５】
加えて、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域における鎖は、同じ分子に由来し得るか、または異なる分子に由来し得る。領域は、分子の１つ以上のすべてを含み得るが、より典型的には、分子の一部の領域のみを含む。三重ヘリックス領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。
【００２６】
本明細書で使用される用語ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基を含有する上記ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。したがって、安定性のために、または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるように「ポリヌクレオチド」である。また、例を２つ挙げると、特殊塩基（例えば、イノシン）または修飾塩基（例えば、トリチル化塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で使用されるようにポリヌクレオチドである。
【００２７】
用語「配列同一性のパーセント（％）」は、配列同一性の最大パーセントを達成するように配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入した後の、参照核酸配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一の候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の割合として定義される。配列同一性のパーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野の技術範囲内の様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。比較される配列の全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法によって決定され得る。
【００２８】
本明細書の目的のために、所定の核酸配列Ｄに対する所定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃの配列同一性％（あるいは、所定の配列Ｄと特定の配列同一性％を有しまたは含む所定の配列Ｃと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｗ／Ｚ
（式中、Ｗは、配列アライメントプログラムによって、そのプログラムによるＣおよびＤのアライメントにおいて同一マッチとしてスコア化されたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である）。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、Ｄに対するＣの配列同一性％は、Ｃに対するＤの配列同一性％と等しくないことが理解されよう。
【００２９】
本明細書で使用される「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、当技術分野で公知のいくつかの技術によって、核酸（例えば、ベクター）を細胞に導入することを包含する。
【００３０】
本明細書で使用される「ベクター」は、挿入セグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメントが挿入され得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドである。本明細書に記載されるベクターは、発現ベクターであり得る。
【００３１】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターである。
【００３２】
本明細書で使用される「リプログラミング」は、ある特定の細胞型を別のものに転換することを指す。例えば、肝細胞ではない細胞を、形態学的および機能的に肝細胞のような細胞にリプログラミングし得る。
【００３３】
本明細書で使用される「細胞／複数の細胞の処理」は、細胞を本明細書に開示される因子（例えば、核酸）と接触させて、細胞成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の量および／または活性をダウンレギュレートまたはアップレギュレートすることを指す。この語句はまた、細胞を、目的の遺伝子／タンパク質をダウンレギュレートまたはアップレギュレートし得る任意の因子（タンパク質および小分子を含む）と接触させることを包含する。
【００３４】
用語「発現をアップレギュレートする」は、発現に影響を与えること、例えば、発現もしくは活性を誘導すること、または未処理細胞と比べて増加した／大きい発現もしくは活性を誘導することを意味する。
【００３５】
本明細書で使用される「アップレギュレーション」または「アップレギュレート」は、細胞が、外部変数に応じて、細胞成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の量および／または活性を増加させるプロセスを指す。
【００３６】
「変異体」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと異なるが、本質的な特性を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が別の参照ポリペプチドと異なる。一般に、差異は、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に密接に類似しており、多くの領域で同一であるようなものに限定される。変異体および参照ポリペプチドは、１つ以上の改変（例えば、置換、付加および／または欠失）によってアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものでもよいし、またはコードされるものではなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、天然に存在するもの（例えば、対立遺伝子変異体）であり得るか、またはそれは、天然に存在することが公知ではない変異体であり得る。
【００３７】
ＩＩ．組成物
Ａ．非肝細胞を肝細胞様特性に誘導する因子
完全に機能的な細胞型の取得は、創薬、バイオ人工肝臓および再生医療の主な課題である。現在のところ、この重要な問題の根本的な解決策はまだない。機能的ヒト誘導肝細胞（ｈｉＨｅｐ）は、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡからなる群より選択される少なくとも１つの因子、ならびにＭＹＣ遺伝子ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルをアップレギュレートすることによって、線維芽細胞から作製され得る。本明細書に開示される肝細胞誘導因子のすべての公知の機能的変異体およびアイソフォームが企図される。これらの公知の配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＧｅｎｅｂａｋデータベースで容易に入手可能である。
【００３８】
好ましくは、ｐ５３遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルのダウンレギュレーションによって示されるように、ｐ５３活性がさらにダウンレギュレートされる。
【００３９】
１．肝細胞誘導因子をコードする核酸
ｉ．ＨＮＦ１Ａ
ＨＮＦ１Ａ（ＴＣＦ１としても公知である）は、肝腫瘍形成に関与する腫瘍抑制遺伝子である。それは、１２番染色体の長腕に位置し、２３キロベースに及ぶ１０個のエクソンによってコードされ、肝臓、腎臓、膵臓および消化管を含む様々な組織で発現される。それは、肝臓では肝細胞の分化に関与し、特定の肝臓特異的遺伝子（アルブミン、β−フィブリノーゲンおよびα1−アンチトリプシンを含む）の発現に必要な転写因子ＨＮＦ１をコードする。Ｃｏｕｒｔｏｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０（４８２７：６８８−６９２（１９８７）。チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびカエルでは、ＨＮＦ１Ａ遺伝子は保存されている。
【００４０】
好ましい実施形態では、ＨＮＦ１Ａをコードするヌクレオチドは、配列番号１によって以下に示される。
atggtttcta aactgagcca gctgcagacg gagctcctgg cggccctgct cgagtcaggg
ctgagcaaag aggcactgat ccaggcactg ggtgagccgg ggccctacct cctggctgga
gaaggccccc tggacaaggg ggagtcctgc ggcggcggtc gaggggagct ggctgagctg
cccaatgggc tgggggagac tcggggctcc gaggacgaga cggacgacga tggggaagac
ttcacgccac ccatcctcaa agagctggag aacctcagcc ctgaggaggc ggcccaccag
aaagccgtgg tggagaccct tctgcaggag gacccgtggc gtgtggcgaa gatggtcaag
tcctacctgc agcagcacaa catcccacag cgggaggtgg tcgataccac tggcctcaac
cagtcccacc tgtcccaaca cctcaacaag ggcactccca tgaagacgca gaagcgggcc
gccctgtaca cctggtacgt ccgcaagcag cgagaggtgg cgcagcagtt cacccatgca
gggcagggag ggctgattga agagcccaca ggtgatgagc taccaaccaa gaaggggcgg
aggaaccgtt tcaagtgggg cccagcatcc cagcagatcc tgttccaggc ctatgagagg
cagaagaacc ctagcaagga ggagcgagag acgctagtgg aggagtgcaa tagggcggaa
tgcatccaga gaggggtgtc cccatcacag gcacaggggc tgggctccaa cctcgtcacg
gaggtgcgtg tctacaactg gtttgccaac cggcgcaaag aagaagcctt ccggcacaag
ctggccatgg acacgtacag cgggcccccc ccagggccag gcccgggacc tgcgctgccc
gctcacagct cccctggcct gcctccacct gccctctccc ccagtaaggt ccacggtgtg
cgctatggac agcctgcgac cagtgagact gcagaagtac cctcaagcag cggcggtccc
ttagtgacag tgtctacacc cctccaccaa gtgtccccca cgggcctgga gcccagccac
agcctgctga gtacagaagc caagctggtc tcagcagctg ggggccccct cccccctgtc
agcaccctga cagcactgca cagcttggag cagacatccc caggcctcaa ccagcagccc
cagaacctca tcatggcctc acttcctggg gtcatgacca tcgggcctgg tgagcctgcc
tccctgggtc ctacgttcac caacacaggt gcctccaccc tggtcatcgg cctggcctcc
acgcaggcac agagtgtgcc ggtcatcaac agcatgggca gcagcctgac caccctgcag
cccgtccagt tctcccagcc gctgcacccc tcctaccagc agccgctcat gccacctgtg
cagagccatg tgacccagag ccccttcatg gccaccatgg ctcagctgca gagcccccac
gccctctaca gccacaagcc cgaggtggcc cagtacaccc acacgggcct gctcccgcag
actatgctca tcaccgacac caccaacctg agcgccctgg ccagcctcac gcccaccaag
caggtcttca cctcagacac tgaggcctcc agtgagtccg ggcttcacac gccggcatct
caggccacca ccctccacgt ccccagccag gaccctgccg gcatccagca cctgcagccg
gcccaccggc tcagcgccag ccccacagtg tcctccagca gcctggtgct gtaccagagc
tcagactcca gcaatggcca gagccacctg ctgccatcca accacagcgt catcgagacc
ttcatctcca cccagatggc ctcttcctcc cag
（配列番号１）
【００４１】
ＨＮＦ１Ａをコードする核酸は、配列番号１または配列番号１の機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００４２】
ＨＮＦ１Ａをコードする核酸の多くの天然に存在する変異体およびそれらの活性は当技術分野で公知であり、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿００５２５３９３１．１によって示されるＨＮＦ１Ａの転写変異体が挙げられる。
【００４３】
ｉｉ．ＨＮＦ６
ＨＮＦ６は、当初、６−ホスホフルクト−２−キナーゼ（ｐｆｋ−２）遺伝子の肝臓プロモーターの転写活性化因子として特性評価され、肝臓、脳、脾臓、膵臓および精巣で発現される。Ｌａｎｎｏｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１３５５２−１３５６２（１９９８）。選択的スプライシングは、複数の転写変異体をもたらす。
【００４４】
一実施形態では、ＨＮＦ６は、配列番号２によって示される。
atgaacgcgc agctgaccat ggaagcgatc ggcgagctgc acggggtgag ccatgagccg
gtgcccgccc ctgccgacct gctgggcggc agcccccacg cgcgcagctc cgtggcgcac
cgcggcagcc acctgccccc cgcgcacccg cgctccatgg gcatggcgtc cctgctggac
ggcggcagcg gcggcggaga ttaccaccac caccaccggg cccctgagca cagcctggcc
ggccccctgc atcccaccat gaccatggcc tgcgagactc ccccaggtat gagcatgccc
accacctaca ccaccttgac ccctctgcag ccgctgcctc ccatctccac agtctcggac
aagttccccc accatcacca ccaccaccat caccaccacc acccgcacca ccaccagcgc
ctggcgggca acgtgagcgg tagcttcacg ctcatgcggg atgagcgcgg gctggcctcc
atgaataacc tctatacccc ctaccacaag gacgtggccg gcatgggcca gagcctctcg
cccctctcca gctccggtct gggcagcatc cacaactccc agcaagggct cccccactat
gcccacccgg gggccgccat gcccaccgac aagatgctca cccccaacgg cttcgaagcc
caccacccgg ccatgctcgg ccgccacggg gagcagcacc tcacgcccac ctcggccggc
atggtgccca tcaacggcct tcctccgcac catccccacg cccacctgaa cgcccagggc
cacgggcaac tcctgggcac agcccgggag cccaaccctt cggtgaccgg cgcgcaggtc
agcaatggaa gtaattcagg gcagatggaa gagatcaata ccaaagaggt ggcgcagcgt
atcaccaccg agctcaagcg ctacagcatc ccacaggcca tcttcgcgca gagggtgctc
tgccgctccc aggggaccct ctcggacctg ctgcgcaacc ccaaaccctg gagcaaactc
aaatccggcc gggagacctt ccggaggatg tggaagtggc tgcaggagcc ggagttccag
cgcatgtccg cgctccgctt agcagcatgc aaaaggaaag aacaagaaca tgggaaggat
agaggcaaca cacccaaaaa gcccaggttg gtcttcacag atgtccagcg tcgaactcta
catgcaatat tcaaggaaaa taagcgtcca tccaaagaat tgcaaatcac catttcccag
cagctggggt tggagctgag cactgtcagc aacttcttca tgaacgcaag aaggaggagt
ctggacaagt ggcaggacga gggcagctcc aattcaggca actcatcttc ttcatcaagc
acttgtacca aagca
（配列番号２）
【００４５】
ＨＮＦ６をコードする核酸は、配列番号２または配列番号２の機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００４６】
ＨＮＦ６をコードする核酸の多くの天然に存在する変異体およびそれらの活性は当技術分野で公知である。ヒト肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３５５８１の下で記載されている。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ転写変異体ｍＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４９８．２の下で開示されている。
【００４７】
ｉｉｉ．ＨＮＦ４Ａ
肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α、ＮＲ２Ａ１、遺伝子記号ＨＮＦ４Ａ）は、リガンド依存性転写因子の核内受容体（ＮＲ）スーパーファミリーの高度に保存されたメンバーである（Ｓｌａｄｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，４（１２Ｂ）：２３５３−６５（１９９０）。ＨＮＦ４Ａ１は、肝臓（肝細胞）、腎臓、小腸などで発現される。ＨＮＦ４Ａ２は、肝臓で最も優勢なアイソフォームである。ＨＮＦ４Ａは、肝臓におけるアポリポタンパク質遺伝子のすべてではないがほとんどをレギュレートし、多くのシトクロムＰ４５０遺伝子（例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６）および第ＩＩ相酵素の発現をレギュレートするので、薬物代謝において役割を果たし得る（Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，２３（１）：２−７（２００８）。
【００４８】
一実施形態では、ＨＮＦ４は、配列番号３によって示される。
atgcgactct ccaaaaccct cgtcgacatg gacatggccg actacagtgc tgcactggac
ccagcctaca ccaccctgga atttgagaat gtgcaggtgt tgacgatggg caatgacacg
tccccatcag aaggcaccaa cctcaacgcg cccaacagcc tgggtgtcag cgccctgtgt
gccatctgcg gggaccgggc cacgggcaaa cactacggtg cctcgagctg tgacggctgc
aagggcttct tccggaggag cgtgcggaag aaccacatgt actcctgcag atttagccgg
cagtgcgtgg tggacaaaga caagaggaac cagtgccgct actgcaggct caagaaatgc
ttccgggctg gcatgaagaa ggaagccgtc cagaatgagc gggaccggat cagcactcga
aggtcaagct atgaggacag cagcctgccc tccatcaatg cgctcctgca ggcggaggtc
ctgtcccgac agatcacctc ccccgtctcc gggatcaacg gcgacattcg ggcgaagaag
attgccagca tcgcagatgt gtgtgagtcc atgaaggagc agctgctggt tctcgttgag
tgggccaagt acatcccagc tttctgcgag ctccccctgg acgaccaggt ggccctgctc
agagcccatg ctggcgagca cctgctgctc ggagccacca agagatccat ggtgttcaag
gacgtgctgc tcctaggcaa tgactacatt gtccctcggc actgcccgga gctggcggag
atgagccggg tgtccatacg catccttgac gagctggtgc tgcccttcca ggagctgcag
atcgatgaca atgagtatgc ctacctcaaa gccatcatct tctttgaccc agatgccaag
gggctgagcg atccagggaa gatcaagcgg ctgcgttccc aggtgcaggt gagcttggag
gactacatca acgaccgcca gtatgactcg cgtggccgct ttggagagct gctgctgctg
ctgcccacct tgcagagcat cacctggcag atgatcgagc agatccagtt catcaagctc
ttcggcatgg ccaagattga caacctgttg caggagatgc tgctgggagg gtcccccagc
gatgcacccc atgcccacca ccccctgcac cctcacctga tgcaggaaca tatgggaacc
aacgtcatcg ttgccaacac aatgcccact cacctcagca acggacagat gtccacccct
gagaccccac agccctcacc gccaggtggc tcagggtctg agccctataa gctcctgccg
ggagccgtcg ccacaatcgt caagcccctc tctgccatcc cccagccgac catcaccaag
caggaagtta tc
（配列番号３）
【００４９】
ＨＮＦ４をコードする核酸は、配列番号３または配列番号３の機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【００５０】
ＨＮＦ４をコードする核酸の多くの天然に存在する変異体およびそれらの活性は当技術分野で公知である。ヒト肝細胞核因子４遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ１３７５３９．１の下で記載されている。
【００５１】
ｉｖ．ＡＴＦ５
ＡＴＦ５は、活性化転写因子５をコードする。ＡＴＦ５転写産物およびタンパク質は、多種多様な組織で発現され、特に、転写産物は、肝臓で高発現される。
【００５２】
一実施形態では、ＡＴＦ５は、配列番号４によって示される。
atgtcactcc tggcgaccct ggggctggag ctggacaggg ccctgctccc agctagtggg
ctgggatggc tcgtagacta tgggaaactc cccccggccc ctgcccccct ggctccctat
gaggtccttg ggggagccct ggagggcggg cttccagtgg ggggagagcc cctggcaggt
gatggcttct ctgactggat gactgagcga gttgatttca cagctctcct ccctctggag
cctcccttac cccccggcac cctcccccaa ccttccccaa ccccacctga cctggaagct
atggcctccc tcctcaagaa ggagctggaa cagatggaag acttcttcct agatgccccg
cccctcccac caccctcccc gccgccacta ccaccaccac cactaccacc agccccctcc
ctccccctgt ccctcccctc ctttgacctc ccccagcccc ctgtcttgga tactctggac
ttgctggcca tctactgccg caacgaggcc gggcaggagg aagtggggat gccgcctctg
cccccgccac agcagccccc tcctccttct ccacctcaac cttctcgcct ggccccctac
ccacatcctg ccaccacccg aggggaccgc aagcaaaaga agagagacca gaacaagtcg
gcggctctga ggtaccgcca gcggaagcgg gcagagggtg aggccctgga gggcgagtgc
caggggctgg aggcacggaa tcgcgagctg aaggaacggg cagagtccgt ggagcgcgag
atccagtacg tcaaggacct gctcatcgag gtttacaagg cccggagcca gaggacccgt
agctgc
（配列番号４）
【００５３】
ＡＴＦ５をコードする核酸は、配列番号４または配列番号４の機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。ＡＴＦ５をコードする核酸の多くの天然に存在する変異体およびそれらの活性は当技術分野で公知である。ヒトＡＴＦ５転写産物変異体３（ｍＲＮＡ）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２９０７４６．１の下で記載されている（Ａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８９（７）：３８８８−３９００（２０１４））。
【００５４】
ｖ．ＰＲＯＸ１
一実施形態では、ＰＲＯＸ１は、配列番号５によって示される。
atgcctgacc atgacagcac agccctctta agccggcaaa ccaagaggag aagagttgac
attggagtga aaaggacggt agggacagca tctgcatttt ttgctaaggc aagagcaacg
ttttttagtg ccatgaatcc ccaaggttct gagcaggatg ttgagtattc agtggtgcag
catgcagatg gggaaaagtc aaatgtactc cgcaagctgc tgaagagggc gaactcgtat
gaagatgcca tgatgccttt tccaggagca accataattt cccagctgtt gaaaaataac
atgaacaaaa atggtggcac ggagcccagt ttccaagcca gcggtctctc tagtacaggc
tccgaagtac atcaggagga tatatgcagc aactcttcaa gagacagccc cccagagtgt
ctttcccctt ttggcaggcc tactatgagc cagtttgata tggatcgctt atgtgatgag
cacctgagag caaagcgcgc ccgggttgag aatataattc ggggtatgag ccattccccc
agtgtggcat taaggggcaa tgaaaatgaa agagagatgg ccccgcagtc tgtgagtccc
cgagaaagtt acagagaaaa caaacgcaag caaaagcttc cccagcagca gcaacagagt
ttccagcagc tggtttcagc ccgaaaagaa cagaagcgag aggagcgccg acagctgaaa
cagcagctgg aggacatgca gaaacagctg cgccagctgc aggaaaagtt ctaccaaatc
tatgacagca ctgattcgga aaatgatgaa gatggtaacc tgtctgaaga cagcatgcgc
tcggagatcc tggatgccag ggcccaggac tctgtcggaa ggtcagataa tgagatgtgc
gagctagacc caggacagtt tattgaccga gctcgagccc tgatcagaga gcaggaaatg
gctgaaaaca agccgaagcg agaaggcaac aacaaagaaa gagaccatgg gccaaactcc
ttacaaccgg aaggcaaaca tttggctgag accttgaaac aggaactgaa cactgccatg
tcgcaagttg tggacactgt ggtcaaagtc ttttcggcca agccctcccg ccaggttcct
caggtcttcc cacctctcca gatcccccag gccagatttg cagtcaatgg ggaaaaccac
aatttccaca ccgccaacca gcgcctgcag tgctttggcg acgtcatcat tccgaacccc
ctggacacct ttggcaatgt gcagatggcc agttccactg accagacaga agcactgccc
ctggttgtcc gcaaaaactc ctctgaccag tctgcctccg gccctgccgc tggcggccac
caccagcccc tgcaccagtc gcctctctct gccaccacgg gcttcaccac gtccaccttc
cgccacccct tcccccttcc cttgatggcc tatccatttc agagcccatt aggtgctccc
tccggctcct tctctggaaa agacagagcc tctcctgaat ccttagactt aactagggat
accacgagtc tgaggaccaa gatgtcatct caccacctga gccaccaccc ttgttcacca
gcacacccgc ccagcaccgc cgaagggctc tccttgtcgc tcataaagtc cgagtgcggc
gatcttcaag atatgtctga aatatcacct tattcgggaa gtgcaatgca ggaaggattg
tcacccaatc acttgaaaaa agcaaagctc atgttttttt atacccgtta tcccagctcc
aatatgctga agacctactt ctccgacgta aagttcaaca gatgcattac ctctcagctc
atcaagtggt ttagcaattt ccgtgagttt tactacattc agatggagaa gtacgcacgt
caagccatca acgatggggt caccagtact gaagagctgt ctataaccag agactgtgag
ctgtacaggg ctctgaacat gcactacaat aaagcaaatg actttgaggt tccagagaga
ttcctggaag ttgctcagat cacattacgg gagtttttca atgccattat cgcaggcaaa
gatgttgatc cttcctggaa gaaggccata tacaaggtca tctgcaagct ggatagtgaa
gtccctgaga ttttcaaatc cccgaactgc ctacaagagc tgcttcatga g
（配列番号５）
【００５５】
ＰＲＯＸ１をコードする核酸は、配列番号５または配列番号５の機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。ＰＲＯＸ１をコードする核酸の多くの天然に存在する変異体およびそれらの活性は当技術分野で公知である。
【００５６】
ｖｉ．ＣＥＢＰＡ
ＣＥＢＰＡは、ホモ二量体として特定のプロモーターおよびエンハンサーに結合し得る塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写因子をコードする。
【００５７】
一実施形態では、ＣＥＢＰＡは、配列番号６によって示される。
atggagtcgg ccgacttcta cgaggcggag ccgcggcccc cgatgagcag ccacctgcag
agccccccgc acgcgcccag cagcgccgcc ttcggctttc cccggggcgc gggccccgcg
cagcctcccg ccccacctgc cgccccggag ccgctgggcg gcatctgcga gcacgagacg
tccatcgaca tcagcgccta catcgacccg gccgccttca acgacgagtt cctggccgac
ctgttccagc acagccggca gcaggagaag gccaaggcgg ccgtgggccc cacgggcggc
ggcggcggcg gcgactttga ctacccgggc gcgcccgcgg gccccggcgg cgccgtcatg
cccgggggag cgcacgggcc cccgcccggc tacggctgcg cggccgccgg ctacctggac
ggcaggctgg agcccctgta cgagcgcgtc ggggcgccgg cgctgcggcc gctggtgatc
aagcaggagc cccgcgagga ggatgaagcc aagcagctgg cgctggccgg cctcttccct
taccagccgc cgccgccgcc gccgccctcg cacccgcacc cgcacccgcc gcccgcgcac
ctggccgccc cgcacctgca gttccagatc gcgcactgcg gccagaccac catgcacctg
cagcccggtc accccacgcc gccgcccacg cccgtgccca gcccgcaccc cgcgcccgcg
ctcggtgccg ccggcctgcc gggccctggc agcgcgctca aggggctggg cgccgcgcac
cccgacctcc gcgcgagtgg cggcagcggc gcgggcaagg ccaagaagtc ggtggacaag
aacagcaacg agtaccgggt gcggcgcgag cgcaacaaca tcgcggtgcg caagagccgc
gacaaggcca agcagcgcaa cgtggagacg cagcagaagg tgctggagct gaccagtgac
aatgaccgcc tgcgcaagcg ggtggaacag ctgagccgcg aactggacac gctgcggggc
atcttccgcc agctgccaga gagctccttg gtcaaggcca tgggcaactg cgcg
（配列番号６）
【００５８】
ＣＥＢＰＡをコードする核酸は、配列番号６または配列番号６の機能的断片もしくは変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。ＣＥＢＰＡをコードする核酸の多くの天然に存在する変異体およびそれらの活性は当技術分野で公知である。
【００５９】
ｖｉｉ．ＭＹＣ
Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ）は、細胞周期進行、アポトーシスおよび細胞形質転換において役割を果たす多機能性核リンタンパク質である転写因子をコードする調節遺伝子である。
【００６０】
一実施形態では、ＭＹＣは、配列番号７によって示される。
ctggattttt ttcgggtagt ggaaaaccag cagcctcccg cgacgatgcc cctcaacgtt
agcttcacca acaggaacta tgacctcgac tacgactcgg tgcagccgta tttctactgc
gacgaggagg agaacttcta ccagcagcag cagcagagcg agctgcagcc cccggcgccc
agcgaggata tctggaagaa attcgagctg ctgcccaccc cgcccctgtc ccctagccgc
cgctccgggc tctgctcgcc ctcctacgtt gcggtcacac ccttctccct tcggggagac
aacgacggcg gtggcgggag cttctccacg gccgaccagc tggagatggt gaccgagctg
ctgggaggag acatggtgaa ccagagtttc atctgcgacc cggacgacga gaccttcatc
aaaaacatca tcatccagga ctgtatgtgg agcggcttct cggccgccgc caagctcgtc
tcagagaagc tggcctccta ccaggctgcg cgcaaagaca gcggcagccc gaaccccgcc
cgcggccaca gcgtctgctc cacctccagc ttgtacctgc aggatctgag cgccgccgcc
tcagagtgca tcgacccctc ggtggtcttc ccctaccctc tcaacgacag cagctcgccc
aagtcctgcg cctcgcaaga ctccagcgcc ttctctccgt cctcggattc tctgctctcc
tcgacggagt cctccccgca gggcagcccc gagcccctgg tgctccatga ggagacaccg
cccaccacca gcagcgactc tgaggaggaa caagaagatg aggaagaaat cgatgttgtt
tctgtggaaa agaggcaggc tcctggcaaa aggtcagagt ctggatcacc ttctgctgga
ggccacagca aacctcctca cagcccactg gtcctcaaga ggtgccacgt ctccacacat
cagcacaact acgcagcgcc tccctccact cggaaggact atcctgctgc caagagggtc
aagttggaca gtgtcagagt cctgagacag atcagcaaca accgaaaatg caccagcccc
aggtcctcgg acaccgagga gaatgtcaag aggcgaacac acaacgtctt ggagcgccag
aggaggaacg agctaaaacg gagctttttt gccctgcgtg accagatccc ggagttggaa
aacaatgaaa aggcccccaa ggtagttatc cttaaaaaag ccacagcata catcctgtcc
gtccaagcag aggagcaaaa gctcatttct gaagaggact tgttgcggaa acgacgagaa
cagttgaaac acaaacttga acagctacgg aactcttgtg cg
（配列番号７）
【００６１】
２．肝細胞誘導因子をコードするベクター
肝細胞誘導因子は、適切な形質転換ベクターを使用して宿主細胞に導入される。上記のものなどの核酸は、細胞で発現させるためにベクターに挿入され得る。本明細書で使用される「ベクター」は、挿入セグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメントが挿入され得るレプリコン、例えばプラスミド、ファージ、ウイルスまたはコスミドである。ベクターは、発現ベクターであり得る。「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御およびレギュレートするＤＮＡ配列である。
【００６２】
ベクター中の核酸は、１つ以上の発現制御配列に作動可能に連結され得る。例えば、制御配列は、発現制御配列が目的のコード配列の発現を有効に制御するように、遺伝子構築物に組み込まれ得る。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結領域が挙げられる。プロモーターは、（一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の近くの）通常は転写開始点の上流１００ヌクレオチド以内のＤＮＡ分子領域から構成される発現制御配列である。コード配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置することが必要である。エンハンサーは、時間、位置およびレベルの点で発現特異性をもたらす。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位から様々な距離に配置されて機能し得る。エンハンサーはまた、転写開始部位の下流に配置され得る。ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写することができる場合、コード配列は、細胞において発現制御配列の「制御下」で「作動可能に連結されており」、次いで、ｍＲＮＡが、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳され得る。
【００６３】
適切な発現ベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ならびに例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターが挙げられる。多数のベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの企業から市販されている。
【００６４】
Ｂ．誘導すべき細胞
リプログラミングされ得る細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経由来幹細胞、血液細胞、ケラチノサイト、腸上皮細胞および他の非肝細胞体細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、非肝細胞は、線維芽細胞、例えば胎児線維芽細胞（ＨＥＦ）または包皮線維芽細胞である。細胞は、好ましくは、哺乳動物、例えばラット、マウス、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマ、ブタから得られる。好ましくは、細胞は、ヒト被験体から得られる。
【００６５】
Ｃ．誘導肝細胞
例えば、成熟因子ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡと一緒に肝運命転換因子ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４ＡおよびＨＮＦ６を過剰発現するように非肝細胞を処理することを含む方法によって得られるｉＨｅｐが開示される。非肝細胞は、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡからなる群より選択される少なくとも１つの肝細胞誘導因子を過剰発現するように処理される。いくつかの実施形態では、非肝細胞は、肝細胞誘導因子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つもしくは少なくとも５つを過剰発現するように処理され、またはこれらを発現するように形質転換される。好ましい実施形態では、細胞は、６つの肝細胞誘導因子すべてを過剰発現するように形質転換される。
【００６６】
ｉＨｅｐは、その誘導細胞が得られた生物における肝細胞の典型的および機能的な特徴を示す。例えば、ｉＨｅｐは、初代ヒト肝細胞の典型的な形態を示す。ｉＨｅｐは、アルブミン、シトクロムＰ４５０（Ｃｙｐ）３Ａ４およびＣｙｐＢ６からなる群より選択される少なくとも１つの肝マーカーを発現する。初代ヒト肝細胞のように、ｈｉＨｅｐは、さらに広範囲の第Ｉ相および第ＩＩ相薬物代謝酵素ならびに第ＩＩＩ相薬物トランスポーターならびにアルブミンを発現する。ｈｉＨｅｐと新たに単離した初代ヒト肝細胞との間で、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰＢ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９の少なくとも１つの代謝活性は同程度である。好ましくは、これらの酵素の代謝活性が、同じ生物から得られたＥＳ−Ｈｅｐにおける同じ酵素の活性よりも少なくとも５０％高いと決定されるように、ｉＨｅｐは機能的である。酵素の活性は、ＥＳ−Ｈｅｐにおける活性よりも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上高いものであり得る。最も好ましくは、ｈｉＨｅｐにおけるこれらすべてのＣＹＰ酵素の活性は、ＥＳ−Ｈｅｐのものよりも少なくとも１００倍高い。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ｉＨｅｐにおけるＭＹＣ発現レベルは、例えば、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって測定した場合、対応する生物における正常肝細胞に見られるレベルよりも低い（すなわち、誘導すべき非肝細胞のドナー生物がヒト被験体である場合、レベルを、ヒトに見られる正常肝細胞と比較する）。
【００６８】
機能的ｈｉＨｅｐはまた、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ９、ＧＳＴＡ１、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２５１５、ミクロソームグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ１（ＭＧＳＴ１）、ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＮＮＭＴ）、ＮＴＣＰ、有機アニオン輸送ポリペプチド１Ｂ３（ＯＡＴＰ１Ｂ３）、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）６、ＭＲＰ２、フラビン含有モノオキシゲナーゼ５（ＦＭＯ５）、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）Ａ、ＭＡＯＢおよびエポキシドヒドロラーゼ１（ＥＰＨＸ１）からなる群より選択される少なくとも１つの薬物代謝第ＩＩ相酵素および第ＩＩ相トランスポーターを発現し得る。好ましくは、ｈｉＨｅｐでは、フォークヘッドボックス（ＦＯＸ）Ａ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３および肝受容体ホモログ１（ＬＲＨ１）の内因性発現が活性化される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、例えばＲＴ−ＰＣＲによって測定すると、誘導される細胞が上皮細胞ではない場合、ｈｉＨｅｐは、少なくとも１つの上皮細胞マーカー、例えばＥ−カドヘリンをさらに発現し、細胞が線維芽細胞である場合、本明細書に開示される方法を使用して線維芽細胞の誘導後に得られたｈｉＨｅｐは、線維芽細胞マーカー遺伝子、例えばＣＯＬ１Ａ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＨＹ１およびα−フェトプロテインを発現しない。
【００７０】
成熟肝細胞に関連する機能的特徴に関して、ｈｉＨｅｐは、アルブミンの分泌、ＬＤＬの取り込み、細胞培養培地からのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込み、ならびに使用中止後の吸収ＩＣＧの排除、ならびにグリコーゲンの合成および貯蔵、ならびに脂肪滴の蓄積からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する。
【００７１】
ＩＩＩ．製造方法
Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３８６−３８９（２０１１）には、Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１αおよびＦｏｘａ３のトランスダクション、ならびにｐ１９（Ａｒｆ）の不活性化によって、マウス尾先端線維芽細胞から肝細胞様細胞を直接誘導することが開示されている。誘導細胞は、典型的な上皮形態を示す。Ｓｅｋｉｙａ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３９０−３９３（２０１１））は、マウス胚線維芽細胞および成体線維芽細胞を、インビトロで肝細胞に似た細胞に転換し得る２つの転写因子Ｈｎｆ４α＋Ｆｏｘａ１、Ｆｏｘａ２またはＦｏｘａ３の３つの特定の組み合わせを同定した。Ｃａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４５（５）：１２２９−３９（２００７）には、無血清培地中で肝細胞へのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の分化を指令する３段階法が開示されている。最初に、３日間のアクチビンＡ処理によって、ヒトＥＳＣを確定内胚葉細胞に分化させた。次に、線維芽細胞成長因子−４および骨形態形成タンパク質−２を培養培地中に５日間存在させて、確定内胚葉細胞からの効率的な肝分化を誘導し、続いて、インビトロでさらに１０日間成熟させた。Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３（１）：１５７−１６１（２０１３）には、ＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６の発現を誘導することによって、肝細胞様特性を有する細胞へのｈＥＳＣの成熟を促進する方法が開示されている。
【００７２】
本明細書に開示される方法では、ＭＹＣをアップレギュレートすること、およびｐ５３をダウンレギュレートすることを場合により組み合わせて、細胞における肝細胞誘導因子をアップレギュレートし、前記細胞を肝細胞様特性を有する細胞に転換するのに十分な時間にわたって、前記細胞を培養することによって、非肝細胞をｉＨｅｐにリプログラミングする。誘導すべき非肝細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、ドナー動物から得られる。細胞を培養液中に置き、当技術分野で公知の方法を使用して培養する。
【００７３】
リプログラミング方法は、以下の工程：（ａ）肝細胞誘導因子をアップレギュレートするように細胞を処理し、細胞を細胞培養培地中で培養すること（形質転換段階）；（ｂ）再プレーティングし、細胞をＨＣＭ中で培養すること（増殖段階）、および（ｃ）細胞を肝細胞成熟培地中で培養すること（成熟段階）を含む。開示される方法の概略図を図１Ｅに示す。形質転換段階では、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡからなる群より選択される少なくとも１つの肝細胞誘導因子をアップレギュレートするように、細胞を処理する。好ましくは、ＭＹＣをアップレギュレートし、および／またはｐ５３をダウンレギュレートするように、細胞をさらに処理する。
【００７４】
形質転換段階では、通常の細胞培養培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、十分な長さの時間にわたって、処理細胞を培養する。好ましくは、この第１の工程では、細胞を約８０％コンフルエンスまで少なくとも７日間培養する。次いで、細胞を再プレーティングし、ＨＣＭ中で約１５〜３０日間、好ましくは約１８〜３０日間、より好ましくは約１８日間増殖させ（増殖段階）、次いで、改変ウィリアムズＥ培地に約５日間移し（成熟段階）、その後、誘導肝細胞を回収する。好ましくは、増殖段階の終了時、例えば感染後約２０〜３０日目、好ましくは感染後約２５日目に、ｐ５３  ｓｉＲＮＡをダウンレギュレートしてから、細胞を改変ウィリアムズＥ培地に移す（図１Ｅ）。本発明者らは、感染後約２５日目に、ｐ５３  ｓｉＲＮＡのサイレンシングを観察している。サイレンシングは、肝転写因子を導入することによって主に引き起こされる。例えば、ＨＮＦ４ＡおよびＣＥＢＰＡは、ｉＨｅｐの増殖速度を実質的に減少させ得る。さらに、内因性肝成熟シグナル伝達ネットワークの自己確立はまた、他の転写因子の外因性発現の信頼性を減衰させる（図２）。
【００７５】
前記方法は、形態学的および機能的特徴ならびに遺伝子発現を使用して、非肝細胞が肝細胞様特性を獲得したことを確認する工程を含む。
【００７６】
形態学的確認方法は、肝細胞（例えば、位相差顕微鏡によって観察される複数の核、および電子顕微鏡によって観察される細胞質中に豊富な顆粒、特にグリコーゲン顆粒の存在を有する細胞）に特異的な形態学的特徴の確認を含む。
【００７７】
処理細胞は、以下の特徴の１つ以上を使用して、誘導肝細胞として同定され得る：初代ヒト肝細胞のものと同程度のレベルでＡＬＢを発現する能力；５つの主要なシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９の１つ以上の発現；ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ９、ＧＳＴＡ１、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２５１５、ＭＧＳＴ１、ＮＮＭＴ、ＮＴＣＰ、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＭＲＰ６、ＭＲＰ２、ＦＭＯ５、ＭＡＯＡ、ＭＡＯＢおよびＥＰＨＸ１からなる群より選択される第ＩＩ相酵素または第ＩＩ相トランスポーターの発現。誘導の成功は、上皮マーカーの存在、および細胞が誘導中であることのマーカーの不存在によって確認され得る。例えば、誘導される細胞は線維芽細胞であり、細胞が肝細胞様細胞に誘導されたというさらなる指標は、例えばＲＴ−ＰＣＲによって測定した場合の、少なくとも１つの上皮細胞マーカー、例えばＥ−カドヘリンの発現、ならびに線維芽細胞マーカー遺伝子、例えばＣＯＬ１Ａ１、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＨＹ１およびα−フェトプロテインの発現の不存在であり得る。
【００７８】
Ａ．肝細胞誘導因子およびＭＹＣのアップレギュレート
肝細胞誘導因子およびＭＹＣは、非肝細胞を、肝細胞誘導因子およびＭＹＣの遺伝子発現およびまたはタンパク質レベル／活性をアップレギュレートする因子と接触させることによってアップレギュレートされる。これらの因子としては、限定されないが、核酸、タンパク質および小分子が挙げられる。
【００７９】
例えば、アップレギュレーションは、肝細胞誘導因子および場合によりＭＹＣをコードする核酸を非肝細胞（宿主細胞）に外因的に導入することによって達成され得る。核酸は、同種または異種であり得る。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであり得る。好ましくは、核酸分子は、レンチウイルス発現によって、非肝細胞に導入される。
【００８０】
宿主細胞は、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡからなる群より選択される少なくとも１つの肝細胞誘導因子を過剰発現するように形質転換される。好ましくは、細胞は、増殖因子ＭＹＣを過剰発現するようにさらに形質転換される。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞誘導因子の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つを発現するように形質転換される。好ましい実施形態では、細胞は、６つの肝細胞誘導因子すべてを過剰発現するように形質転換される。
【００８１】
発現させるべき核酸を含有するベクターは、宿主細胞に導入され得る。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションを含む技術によって、哺乳動物細胞にトランスフェクトされ得る。本明細書に開示されるエクスビボ方法は、例えば、被験体／ドナーから細胞を回収する工程、細胞を培養する工程、発現ベクターでそれらをトランスダクションする工程、およびコードされるポリペプチドの発現に適切な条件下で細胞を維持する工程を含み得る。これらの方法は、分子生物学の分野で公知である。
【００８２】
アップレギュレーションはまた、肝細胞誘導因子／ＭＹＣをコードする遺伝子の発現を増加させることが公知の因子、および／または対応するタンパク質レベルを増加させることが公知の因子で、細胞を処理することによって達成され得る。例えば、Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３（１）：１５７−１６１（２０１３）には、誘導因子ＦＧＦ７、ＢＭＰ２およびＢＭＰ４を使用して、ｈＥＳＣからＰＲＯＸ１およびＨＮＦ６発現細胞の出現を促進するための方法が開示されている。肝細胞誘導因子遺伝子発現またはタンパク質レベルをアップレギュレートする小分子および／またはタンパク質を含む公知の因子も使用され得る。
【００８３】
Ｂ．ｐ５３のダウンレギュレート
ｐ５３は、ｐ５３遺伝子発現、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルをダウンレギュレートするように細胞を処理することによって、ダウンレギュレートされ得る。この工程は、細胞を、ｐ５３遺伝子発現、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルをダウンレギュレートすることが公知の任意の分子（限定されないが、核酸分子、小分子およびタンパク質を含む）と接触させることを含む。
【００８４】
ｐ５３遺伝子発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイムおよびアプタマーからなる群より選択されるものをコードする機能的核酸またはベクターを使用して阻害され得る。好ましくは、ｐ５３遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを使用して阻害される。
【００８５】
１．ＲＮＡ干渉
いくつかの実施形態では、ｐ５３遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉によって阻害される。遺伝子発現はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって高特異的に有効にサイレンシングされ得る。最初、このサイレンシングは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）（ｄｓＲＮＡ）の追加によって観察された（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−１１；Ｎａｐｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−８９；Ｈａｎｎｏｎ，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−５１）。ｄｓＲＮＡが細胞に入ると、それは、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素のダイサーによって、３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを含有する２１〜２３ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８−２００；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−６；Ｈａｍｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３−６）。ＡＴＰ依存性の段階において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に誘導するマルチサブユニットタンパク質複合体（ＲＮＡｉ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般に公知である）に統合される（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ，１０７：３０９−２１）。いくつかの時点において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は巻き戻され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合した状態で、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的ｍＲＮＡ配列の分解を指令する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５６３−７４）。しかしながら、ｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡまたはそれらの使用の効果は、いかなる種類の機構にも限定されない。
【００８６】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それにより遺伝子発現を減少させ、または阻害さえし得る二本鎖ＲＮＡである。一例では、ｓｉＲＮＡは、そのｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、相同ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）の特異的分解をトリガーする。例えば、国際公開第０２／４４３２１号には、３’オーバーハング末端と塩基対形成すると標的ｍＲＮＡを配列特異的に分解することができるｓｉＲＮＡが開示されている（これは、これらのｓｉＲＮＡを作製する方法について、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって生成されるｓｉＲＮＡを模倣する合成低分子二本鎖ＲＮＡを使用して、哺乳動物細胞で達成され得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４  ４９８）（Ｕｉ−Ｔｅｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４７９：７９−８２）。ｓｉＲＮＡは、化学的にもしくはインビトロで合成され得るか、または細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる低分子二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者としては、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が挙げられる。ｓｉＲＮＡはまた、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用して、インビトロで合成され得る。
【００８８】
ベクターからのｓｉＲＮＡの生産は、より一般には、低分子ヘアピンＲＮＡｓｅ（ｓｈＲＮＡ）の転写によって行われる。ｓｈＲＮＡを含むベクターを生産するためのキット、例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）誘導ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターなどが利用可能である。
【００８９】
２．アンチセンス
ｐ５３遺伝子発現は、アンチセンス分子によって阻害され得る。アンチセンス分子は、カノニカルまたは非カノニカル塩基対合のいずれかによって標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解による標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、標的分子に対して通常行われるプロセシング機能（例えば、転写または複製）を妨げるように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計され得る。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによってアンチセンス効率を最適化するため多くの方法がある。例示的な方法としては、インビトロ選択実験、ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用したＤＮＡ修飾研究が挙げられる。アンチセンス分子は、１０-6、１０-8、１０-10または１０-12以下の解離定数（Ｋd）で標的分子に結合することが好ましい。
【００９０】
「アンチセンス」核酸配列（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、またはｐ５３コードｍＲＮＡに相補的な）ヌクレオチド配列を含み得る。アンチセンス核酸配列および送達方法は、当技術分野で周知である（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６（２）：１２０−１２８（２００４）；Ｃｌａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１１（１７）：１３３１−１３４１（２００４））。アンチセンス核酸は、標的配列のコード鎖全体に、またはその一部のみに相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０ヌクレオチド長またはそれ以上であり得る。
【００９１】
アンチセンス核酸配列は、それがｐ５３  ｍＲＮＡ配列全体に相補的であるように設計され得るが、ｐ５３  ｍＲＮＡの一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドでもあり得る。アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を使用して化学合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）を使用して化学的に合成され得る。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクター（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下のサブセクションにさらに記載されている目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のものである）を使用して生物学的に生産され得る。
【００９２】
有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、α−アノマー核酸が挙げられる。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特定の二本鎖ハイブリッド（通常のβ−ユニットとは反対に、鎖が互いに平行である）を形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２１５：３２７−３３０（１９８７））を含み得る。
【００９３】
３．アプタマー
いくつかの実施形態では、阻害分子は、アプタマーである。アプタマーは、好ましくは特定の方法で標的分子と相互作用する分子である。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子に結合し得る。例えば、標的分子と、分子上のわずか１つの位置で異なる別の分子との間の結合親和性が１０，０００倍超異なるアプタマーが単離されている。それらの強固な結合特性により、および多くの場合、アプタマー標的の表面特徴がタンパク質標的の機能的関連部分に対応していることにより、アプタマーは、強力な生物学的アンタゴニストであり得る。典型的には、アプタマーは、１５〜５０塩基長の範囲の小さな核酸であり、規定の二次および三次構造、例えばステム−ループまたはＧカルテットにフォールディングされる。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリンなどの小分子、ならびに逆転写酵素およびトロンビンなどの大分子に結合し得る。アプタマーは、１０-12Ｍ未満の標的分子からのＫdで、非常に強固に結合し得る。アプタマーは、１０-6、１０-8、１０-10または１０-12未満のＫdで、標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのＫdよりも少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００または１００，０００倍低い標的分子とのＫdを有することが好ましい。ポリペプチドなどの分子の比較を行う場合、バックグラウンド分子は、異なるポリペプチドであることが好ましい。
【００９４】
４．リボザイム
ｐ５３遺伝子発現は、リボザイムを使用して阻害され得る。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかの化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。天然系に見られるリボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム）に基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型反応を触媒するいくつかの異なる種類のリボザイムがある。天然系に見られないが、デノボで特定の反応を触媒するように設計されたいくつかのリボザイムもある。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合と、それに続く切断によって、核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合、カノニカルまたは非カノニカル塩基対相互作用に主に基づくものである。標的基質の認識は、標的基質の配列に基づくので、この特性により、リボザイムは、核酸の標的特異的切断のための特に優れた候補となる。
【００９５】
５．三重鎖形成オリゴヌクレオチド
ｐ５３遺伝子発現は、三重鎖形成分子を使用して阻害され得る。三重鎖形成機能的核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、ワトソン−クリックおよびフーグスティーン型塩基対合の両方に依存する複合体を形成する３本のＤＮＡ鎖が存在する三重鎖と称される構造が形成される。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域に結合し得るので好ましい。三重鎖形成分子は、１０-6、１０-8、１０-10または１０-12未満のＫdで標的分子に結合することが好ましい。
【００９６】
６．外部ガイド配列
ｐ５３発現は、外部ガイド配列を使用して阻害され得る。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、ＲＮＡｓｅＰによって認識される複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であり、次いで、ＲＮＡｓｅＰが標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計され得る。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを支援する。標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、実質的にあらゆるＲＮＡ配列を切断するために、細菌ＲＮＡｓｅＰがリクルートされ得る。同様に、真核細胞内の所望の標的を切断するために、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ指向性のＲＮＡ切断が利用され得る。ＥＧＳ分子を作製および使用して様々な異なる標的分子の切断を容易にする方法の代表例は、当技術分野で公知である。
【００９７】
７．ｓｈＲＮＡ
ｐ５３発現は、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびｓｈＲＮＡを発現するように設計された発現構築物を使用して阻害され得る。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターで開始され、４−５チミン転写終結部位の２位で終了すると考えられる。発現すると、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵ−オーバーハングを有するステム−ループ構造にフォールディングされると考えられる；続いて、これらのｓｈＲＮＡの末端がプロセシングされて、ｓｈＲＮＡが約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換される（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３（２００２）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００−５０５（２００２）；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７−５００（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８（２００２）；Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５−５０８（２００２）；Ｓｕｉ（２００２）前掲；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（９）：６０４７−６０５２（２００２）。
【００９８】
Ｃ．送達ビヒクル
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイムおよびアプタマーなどの機能的核酸のインビボ発現のためのベクターを作製および使用する方法は、当技術分野で公知である。
【００９９】
例えば、送達ビヒクルは、ウイルスベクター、例えば市販の調製物、例えばアデノウイルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）であり得る。ウイルスベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージし得るレトロウイルスベクター系などのウイルス系によるものであり得る。次いで、組換えレトロウイルスを使用して感染させ、それにより、肝細胞誘導因子をコードする核酸を感染細胞に送達し得る。当然のことながら、改変核酸を宿主細胞に導入する正確な方法は、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。この手順のために、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、および（Ｓｏｏｆｉｙａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，３（２）：２４９−２５５（２０１３）に記載されている他のものの使用を含め、他の技術が広く利用可能である。ウイルスは、安全性を増強し、特定の取り込みを増加させ、効率を改善するように改変され得る（例えば、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３０（３）：１８２−８（２０１１）、Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，９（２）：１９０−９（１９９５）、Ｖｅｒｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７４：７１１−３８（２００５）を参照のこと）。
【０１００】
リポソーム送達ならびに受容体媒介性機構および他のエンドサイトーシス機構などの物理的なトランスダクション技術も使用され得る（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８７：４７２−４７８（１９９６）を参照のこと）。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの市販のリポソーム調製物、ならびに当技術分野の標準的な手順にしたがって開発された他のリポソームが周知である。加えて、肝細胞誘導因子をコードする核酸またはベクターは、エレクトロポレーションによって、およびソノポレーションによってインビボで送達され得る。エレクトロポレーションでは、電気パルスを細胞膜全体に適用して膜貫通電位差を作り出し、不安定化された膜を介した核酸の一時的な膜透過およびトランスフェクションを可能にする（Ｓｏｏｆｉｙａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，３（２）：２４９−２５５（２０１３））。ソノポレーションは、超音波の局所適用と、ガスマイクロバブルの血管内投与または組織内投与とを組み合わせて、血管および組織の透過性を一時的に増加させる（Ｅｓｃｏｆｆｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１３（１）：２−１４（２０１３））。電気パルスまたは超音波は標的組織または器官にフォーカスすることができ、したがって、遺伝子送達および発現はそこに限定されるはずであるから、エレクトロポレーションおよび超音波ベースの技術は、標的化トランスフェクション法である。開示される肝細胞誘導因子の発現または過剰発現は、限定されないが、流体力学的注入、遺伝子銃の使用を含むこれらのまたは他の一般に使用される遺伝子導入法のいずれかを用いて達成される。
【０１０１】
ＩＶ．使用方法
本明細書に開示される研究は、系列リプログラミングによって、薬物代謝機能を有するヒト肝細胞を作製して、医薬用途のための細胞源を提供し得ることを示す。
【０１０２】
Ａ．インビトロおよび研究用途
（i）薬物試験
肝臓は、薬物の代謝活性において中心的な役割を果たすので、肝実質細胞は、薬物開発において重要な役割を果たす。現時点では、薬物候補の失敗の主な原因は、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、排泄）が理想的ではないことである。創薬研究の本質的部分は、肝細胞、薬物代謝の完全参加を伴うヒト肝実質細胞に対する候補薬物の代謝的および毒性学的効果である。現在、インビトロ薬物開発に使用される主な肝細胞は、ヒト成人初代肝細胞である。供給源が不足しているため、およびインビトロで初代肝細胞の機能を維持することが困難であるため、薬物開発におけるそれらの応用が極めて制限されている。
【０１０３】
第Ｉ相、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相薬物代謝酵素を発現する本明細書に開示されるｈｉＨｅｐは、インビトロ薬物代謝研究で使用され得る。
【０１０４】
（ii）研究
感染症に関する研究で遭遇する問題は、適切な動物モデルの欠如である。ｈｉＨｅｐは、感染性疾患、例えばＢ型およびＣ型肝炎感染症の研究のためのヒト化マウスモデルを構築するために使用され得る。これらの動物モデルは、感染性疾患、特に肝臓に感染する疾患を治療するためのワクチンおよび薬物の開発に使用するための信頼性のあるインビボプラットフォームを提供し得る。
【０１０５】
Ｂ．インビボ適用
肝不全および機能喪失は、肝疾患の最も重篤な結果の１つである。その急速な発症、急速な進行により、肝臓移植は、これらの疾患の主な治療手段である。しかしながら、ドナーの不足が深刻な問題を提起し、多くの患者が、肝臓移植を待ちながら死亡している。
【０１０６】
本明細書に開示される研究は、移植ｈｉＨｅｐが、Ｔｅｔ−ｕＰＡ／Ｒａｇ２-/-γｃ-/-マウスの肝臓の最大３０％を再生させ、インビボで３００ｍｇ／ｍｌ超のヒトアルブミンを分泌することを示す。したがって、ｈｉＨｅｐは、例えば、肝不全および機能喪失型疾患の治療において使用され得る。
【０１０７】
単離されたｉＨｅｐを門脈に経皮注入もしくは経頸静脈注入し、または脾髄もしくは腹腔に注入することによる移植は、肝移植と比較して低侵襲的な手法である。ｉＨｅｐは、好ましくは、治療される同じ動物から得られる。宿主の肝臓は摘出または切除されないので、移植片機能の喪失は、肝機能を悪化させないはずである。さらに、単離されたｉＨｅｐは、即時利用のために潜在的に凍結保存され得る。ｉＨｅｐは、例えば、肝腫瘍のための放射線療法に起因する放射線誘発性肝損傷から患者をレスキューするために、エクスビボ遺伝子治療のビヒクルとして使用され得る。ｉＨｅｐは、肝細胞移植のための公知のマトリックスなどの担体を使用して、レシピエント生物に移植され得る。例えば、Ｚｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．，１７（４）：４１８−２７（２０１１）には、肝細胞移植のための担体として脱細胞化肝臓マトリックス（ＤＬＭ）を使用することが開示されている。Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ．，１０（１）には、組織サンプルから肝細胞および膵臓細胞を単離し、ポリ−Ｌ−乳酸マトリックスに播種し、同じ患者の腸間膜に再移植することが開示されている。
【０１０８】
ｈｉＨｅｐはまた、バイオ人工肝臓サポートシステムにおいて使用され得る。移植の適切なドナー源が利用可能になるまで、開示される細胞に基づくバイオ人工肝臓サポートシステムは、肝不全の主な機能を一時的に代替する（有害物質を除去し、生物学的に活性な合成物質を肝臓に提供する）ために、患者の内部環境を安定化および改善するために構築される。バイオ人工肝臓を作製するための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０２０６７３３号に開示されている。
【０１０９】
Ｖ．キット
機能的肝細胞代謝特性を有する誘導肝細胞への非肝細胞のインビトロリプログラミングを誘導するためのキットが開示される。キットは、肝細胞誘導因子ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４Ａ、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＣＥＰＢＡおよび／またはＭＹＣをアップレギュレートする因子と、ｐ５３遺伝子発現および／またはタンパク質活性をダウンレギュレートする因子とを含む。一実施形態では、キットは、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４Ａ、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＣＥＰＢＡおよび／またはＭＹＣのいずれかのＤＮＡ配列と、ｐ５３遺伝子発現をダウンレギュレートするためのＤＮＡ配列とを含む。好ましい実施形態では、キットは、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４Ａ、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＣＥＰＢＡおよび／またはＭＹＣ遺伝子を過剰発現するレンチウイルスと、ｐ５３遺伝子発現を阻害する核酸とを含む。
【実施例】
【０１１０】
材料および方法
ヒト初代細胞の単離および培養
本研究は、中日友好病院（Ｃｈｉｎａ−Ｊａｐａｎ  Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の臨床研究倫理委員会（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（倫理委員会承認番号（Ｅｔｈｉｃａｌ  ａｐｐｒｏｖａｌ  Ｎｏ）：２００９−５０）、北京大学（Ｐｅｋｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の幹細胞研究監査部門（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｖｅｒｓｉｇｈｔ）（ＳＣＲＯ２０１１０３−０３）によって承認され、ヘルシンキ宣言の原則にしたがって行われた。
【０１１１】
患者のインフォームドコンセントを得て、妊娠１４週目のヒト胚性皮膚および胎児肝臓組織を得た。以前に記載されているように（Ｌｉｌｊａ  ｅｔ  ａｌ．，６４：１２４０−１２４８（１９９７））、胎児肝細胞を得た。１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ）を補足した１０ｍｌの培地（ＲＰＭＩ１６４０）中で、消化のために、胎児肝臓組織を１〜３ｍｍ3の断片に切断した。消化を３７℃で１５〜２０分間実施し、低速遠心分離によって赤血球を除去した。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。トリパンブルー排除により、細胞生存率が９０％であったと推定された。
【０１１２】
新鮮ヒト胚皮膚組織（ＨＥＦ）およびエクスビボヒト成人包皮組織（ＨＦＦ）を７５％エタノール水溶液で滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。組織を、眼科ハサミを用いて皮下組織から慎重に分離した。組織をＰＢＳで数回洗浄し、小さな組織ブロックをペトリ皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに入れた。２時間後、以下のものを追加した：ＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃｏｍｐａｎｙから購入、製品カタログ番号ＳＨ３００２２．０１Ｂ）、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸および１ｍＭグルタミン酸、８単位／ｍｌゲンタマイシン）。細胞を、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡによって室温で５分間消化した。細胞を、新たなペトリ皿中の上記ＤＭＥＭ高グルコース培地に１：３で播種した。培地を２日ごとに交換し、細胞を４日ごとに１：３継代して、（胎児皮膚由来）ヒト線維芽細胞および（成人包皮由来）ヒト線維芽細胞を得た。約５〜７日間の細胞培養後、ヒト皮膚線維芽細胞は、約８０％のコンフルエンスに達する。
【０１１３】
インフォームドコンセントの後、ヒト初代肝細胞を、肝臓移植に使用されないヒトドナー肝臓から単離し（Ｓｅｇｌｅｎ，１３：２９−８３（１９７６））、ＨＣＭ（ＬＯＮＺＡ）と共に培養した。
【０１１４】
ｈｉＨｅｐの作製
本研究は、中日友好病院の臨床研究倫理委員会（倫理委員会承認番号（ｅｔｈｉｃａｌ  ａｐｐｒｏｖａｌ）２００９−５０）および北京大学の幹細胞研究監査部門（ＳＣＲＯ２０１１０３−０３）によって承認され、ヘルシンキ宣言の原則にしたがって行われた。
【０１１５】
ヒト線維芽細胞を一晩感染させ、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清中で１週間培養してから、増殖のための肝細胞培養培地（ＨＣＭ）（Ｌｏｎｚａ）に移した。
【０１１６】
ウイルス感染の前日に、ヒト線維芽細胞を、細胞２０，０００個／ウェルで、哺乳動物体細胞培養培地を含有する１２ウェル細胞培養プレートに播種し、３７℃および５％二酸化炭素培養液で１２時間培養した；次いで、これに、以下のレンチウイルス発現ベクター：それぞれＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４Ａ、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＣＥＢＰＡおよびＭＹＣを発現するレンチウイルス発現ベクター、ならびにｐ５３の発現を阻害するためのＤＮＡを発現するレンチウイルス発現ベクターを、ＨＮＦ１Ａの場合には１０μｌ、ＨＮＦ６の場合には１０μｌ、ＨＮＦ４Ａの場合には６μｌ、ＡＴＦ５の場合には１０μｌ、ＰＲＯＸ１の場合には３μｌ、ＣＥＢＰＡの場合には３μｌ、ＭＹＣの場合には１０μｌ、およびｐ５３（ｐ５３の発現を阻害するためのレンチウイルス）の場合には１０μｌ追加した。２０時間後に培地を交換し、その後、培地を毎日交換した。細胞をＤＭＥＭ中で７日間培養し、次いで、ＨＣＭに移した。
【０１１７】
３週間の培養後、ＨＣＭを改変ウィリアムＥ培地（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌｓｔａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と交換した。細胞を４日ごとに継代し、３０日後にヒト肝細胞様細胞を回収した。ｈｉＨｅｐのリプログラミングの概略を図１Ｅに示す。
【０１１８】
成長曲線および倍加時間
ＭＴＴアッセイでは、増殖段階および成熟段階の誘導細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞１０００個／ウェル）、ＨＣＭ（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰサイレンシング前）または改変ＷＥＭ（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰサイレンシング後）中で別々に７日間培養した。製造業者の説明書（Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＭＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にしたがって、ＭＴＴアッセイを毎日行った。増殖段階の誘導細胞の倍加時間を計算するために、増殖段階の誘導細胞（ｐ５３  ｓｉＲＮＡ−ＧＦＰサイレンシング前）を細胞３００００個／ウェルの密度でプレーティングし、マトリゲルでコーティングした１２ウェルプレートで培養した。血球計を使用して細胞数をカウントすることによって、時間の関数として、成長速度を決定した。指数増殖期（１２、２４、３６および４８時間のデータ点）からのデータを使用して、指数増殖曲線を得た。次いで、式：Ｔｄ＝ｔ＊ｌｎ２／ｌｎ（Ｎｔ／Ｎ０）（式中、Ｎｔは、ｔ時点の細胞数であり；Ｎ０は、開始時点の細胞数である）を使用して、倍加時間（Ｔｄ）を求めた。
【０１１９】
肝分化
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ、ＥＳ細胞株Ｈ１、ＷｉＣｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、ｈＥＳＣ培地中、照射マウス胚線維芽細胞上で維持した（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７（１９９８））。以前に報告されているように（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３：１５７−１６１（２０１３））、ｈＥＳＣを肝細胞に分化させた。
【０１２０】
分子クローニング、レンチウイルス生産およびトランスダクション
転写因子の相補的ＤＮＡをｈｕｍａｎ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＴｒｕｅＣｌｏｎｅｓ（商標）（Ｏｒｉｇｅｎｅ）から増幅し、ユーザーズマニュアルにしたがって、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入する（ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４Ａ、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡの各レンチウイルス発現ベクターについて、配列番号１〜６を、ｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏの制限酵素部位にそれぞれ挿入する）。配列番号７を発現ベクターｐＬＬ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（Ｚｈａｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００８  Ｎｏｖ  ６；３（５）：４７５−９；Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌｓｔａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．または北京大学から入手可能。完全な配列情報については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｇａｔｅｗａｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ／ｐｌｌｍａｐ．ｈｔｍｌを参照のこと）の制限酵素部位（Ｘｈｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉ）に挿入することによって、ＭＹＣのレンチウイルス発現ベクターを構築する。ｐ５３の発現を阻害するためのレンチウイルスを以下のように構築する：ｐ５３の発現を妨げるためのＤＮＡ分子を発現ベクターｐｌｌ３．７（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３；Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌｓｔａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．または北京大学から入手可能）の制限酵素部位（Ｈｐａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ）に挿入する。ｐ５３の発現を妨げるためのＤＮＡ分子は、センス鎖（５’−ＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣ−３’）およびアンチセンス鎖（５’−ＴＣ  ＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＴＧ  ＡＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴ  ＣＡ−３’）とのアニーリングによって得られる。以前に記載されているように（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９（２００８））、ウイルスのパッケージを行う。ヒト線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む１０μｇ／ｍｌポリブレン含有ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で１２時間感染させる。感染７日後に、線維芽細胞を再プレーティングし、ＨＣＭ（ＬＯＮＺＡ）中で培養した。感染２５日後に、ＧＦＰレポーターによって示されるように、ｐ５３  ｓｉＲＮＡがサイレンシングし、ｈｉＨｅｐを改変ウィリアムＥ培地（Ｖｉｔａｌｓｔａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で培養した。
【０１２１】
アルブミンＥＬＩＳＡ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込みおよび放出、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込み、ならびにオイルレッド染色
ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Ｈｕｍａｎ  Ａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して、ヒトアルブミンを測定した。ＰＡＳ染色システムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。培養物を４％パラホルムアルデヒド（ＤｉｎｇＧｕｏ）で固定し、製造業者の説明書にしたがって染色した。以前に記載されているように（（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４５：１２２９−１２３９（２００７）））、ＩＣＧの取り込みおよび放出を実施した。ＬＤＬ取り込みアッセイでは、１０μｇ／ｍｌ  ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｈｉＨｅｐと共に３７℃で４時間インキュベートし、蛍光顕微鏡によって観察した。脂質検出では、培養物を４％パラホルムアルデヒドで固定し、６０％イソプロパノールで５分間処理した。次いで、イソプロパノールを除去し、オイルレッドＯ希釈標準溶液を追加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、オイルレッドＯを除去し、培養物を透明になるまで洗浄した。
【０１２２】
ＣＹＰ代謝アッセイ
以前に記載されているように（Ｇｅｂｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３５：１４５−２１３（２００３））、従来の懸濁法を使用して、薬物代謝活性を評価した。ｈｉＨｅｐを、５０ｍＭリファンピシン、５０ｍＭｂ−ナフトフラボンおよび１ｍＭフェノバルビタールを含む培地中で７２時間培養し、２４時間ごとに交換した。解離ｈｉＨｅｐ、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＳ−Ｈｅｐ、線維芽細胞、および新たに単離した初代ヒト肝細胞の細胞生存率を、トリパンブルーによって測定した。総細胞１×１０6個（細胞懸濁液）当たり１ミリリットルの予熱インキュベーション培地（ウィリアムズＥ培地、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４］、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ）を追加した。同じインキュベーション培地［４００ｍＭテストステロン、１０ｍＭミダゾラム、２００ｍＭフェナセチン、１ｍＭブプロピオン、５００ｍＭ（Ｓ）−メフェニトイン、５０ｍＭジクロフェナク］を用いて、基質溶液を調製した。５ｍｌポリスチレン丸底チューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）中で、２５０ｍｌの基質溶液を２５０ｍｌの細胞懸濁液と混合することによって、反応を開始した。チューブをインキュベーター内のオービタルシェーカーに入れ、振盪速度を２１０ｒｐｍに調整した。３７℃で１５〜２４０分間インキュベートした後、チューブを室温で遠心分離して、上清を回収した。３倍容量のクエンチング溶媒（メタノール）を含有するチューブにサンプルアリコートを追加することによって反応を停止し、−８０℃で凍結した。同位体標識した参照代謝産物を内部標準として使用した。テストステロン、ミダゾラム、（Ｓ）−メフェニトイン、ジクロフェナク、ブプロピオンおよびフェナセチンの内部参照代謝産物は、それぞれ６ｂ−ヒドロキシテストステロン−［Ｄ７］、ヒドロキシミダゾラム−［１３Ｃ３］、４０−ヒドロキシメフェニトイン−［Ｄ３］、４０−ヒドロキシジクロフェナク−［１３Ｃ６］、ヒドロキシブプロピオン−［Ｄ６］およびアセトミドフェノール−［１３Ｃ２，１５Ｎ］である。これらの代謝産物を使用して、代謝産物分析のための標準曲線を作成した。標準代謝産物は、６ｂ−ヒドロキシテストステロン、１０−ヒドロキシミダゾラム、ヒドロキシブプロピオン、４０−ヒドロキシジクロフェナク、（±）−４０−ヒドロキシメフェニトインおよびアセトアミノフェンであった。これらの代謝産物は、有効な従来のＬＣ−ＭＳ法を使用してＰｈａｒｍａｒｏｎによって定量された。結果を、形成された代謝産物ピコモル／分／細胞１００万個として表す。Ｂ−ナフトフラボン、リファンピシン、テストステロン、ミダゾラム、ジクロフェナクおよびフェナセチンを含め、化学物質はＳｉｇｍａから購入した。標準代謝産物および内部参照代謝産物は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。フェノバルビタールは、Ｊｉｎｎｉｎｇ  Ｌｏｕの厚意による提供であった。
【０１２３】
ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離し、次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写した。製造業者の説明書にしたがって２×ＥａｓｙＴａｑ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ）によって、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。内因性遺伝子発現の特異的検出に使用したプライマーを表１および２に示す。
【表１】
0006535028.tif 000002
【表２】
0006535028.tif 000003
【０１２４】
Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＭＸ３０００Ｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。使用したプライマーを表３に示す。
【表３】
0006535028.tif 000004
0006535028.tif 000005
0006535028.tif 000006
【０１２５】
１８Ｓ  ｒＲＮＡのためのプライマーは、ＱＩＡＧＥＮから購入した。２つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨまたはＲＲＮ１８Ｓ）によって決定したインプットに対して、定量値を正規化した。ｑＲＴ−ＰＣＲの陽性対照のために、５つの異なるバッチの新たに単離した初代ヒト肝細胞をＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって収集し、−２０℃で保存した。全ＲＮＡを単離し、次いで、上記のようにｃＤＮＡに逆転写した。５つの異なるバッチの新たに単離した初代ヒト肝細胞から得られた等量のｃＤＮＡを混合して、陽性対照として用いた。
【０１２６】
免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析
細胞または組織切片を４％パラホルムアルデヒド（Ｄｉｎｇｇｕｏ）によって室温で１５分間固定し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および５％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を含有するＰＢＳによって室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングした。サンプルを一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、適切な二次抗体と共に暗所の室温で１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。実験を３回繰り返し、典型的な結果を示した。免疫蛍光に使用した一次抗体は、以下の通りである：ウサギ抗ＣＹＰ３Ａ４、ウサギ抗ＣＹＰ２Ｃ９、ウサギ抗ＹＰ１Ａ２、ウサギ抗ＣＹＰ２Ｅ１、ウサギ抗ＣＹＰ２Ｄ６（すべて、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ製）、ヤギ抗ＡＬＢ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ）、ウサギ抗ＮＲ５Ａ２／ＬＲＨ１（Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＣＯＬ１Ａ１（Ａｂｃａｍ）、マウス抗Ｅ−ＣＡＤ（Ａｂｃａｍ）、マウス抗ヒト核（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。免疫蛍光に使用した二次抗体は、以下の通りである：ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０ロバ抗ウサギおよびＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０ロバ抗ヤギ（Ａｂｃａｍ製）、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８ロバ抗ヤギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９ロバ抗ヤギ、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８ロバ抗マウス、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９ロバ抗マウス、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８ロバ抗ウサギ、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９ロバ抗ウサギ（すべて、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）。以前に報告されているように（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１５７−１６１（２０１３））、フローサイトメトリーアッセイを行った。
【０１２７】
ＲＮＡ配列分析
ＨＥＦ、ＨｅｐＧ２細胞、ＥＳ−Ｈｅｐ、ｈｉＨｅｐおよび新たに単離した初代ヒト肝細胞から、全ＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを調製した。断片化し、ランダムプライミングした２００ｂｐのペアエンドライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００シーケンシングシステムによって配列決定した。
【０１２８】
毒性アッセイ。
ｈｉＨｅｐを、培養培地に溶解した様々な濃度の化合物と共に２４時間インキュベートした。製造業者の説明書にしたがって、および以前に記載されているように（Ｋｈｅｔａｎｉ  ａｎｄ  Ｂｈａｔｉａ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６，１２０−１２６（２００８））、ＭＴＴアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって、細胞生存率を測定した。
【０１２９】
動物および移植
ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＴｅｔ−ｕＰＡ／Ｒａｇ２-/-／γｃ-/-マウスは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌｓｔａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ｈｉＨｅｐ、ＥＳ−Ｈｅｐおよび初代ヒト肝細胞（細胞２×１０6個／動物）をマウスの脾臓に注射した。血液サンプルを収集し、ヒトアルブミンを、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して定量した。レシピエントマウスの肝臓をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ）に包埋し、次いで、液体窒素で凍結した。クリオスタット切片（１０ｍｍ）を染色した。
【０１３０】
統計分析
統計分析では、対応のない両側ｔ検定を使用した。結果を平均±ＳＤとして表す。ｐ値は、以下の通りである：*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１。
【０１３１】
アクセッション番号
ＲＮＡ配列決定データは、ＮＣＢＩ遺伝子発現オムニバスデータベースにおいてアクセッション番号ＧＳＥ５４０６６の下で寄託されている。
【０１３２】
結果
肝運命を誘導する因子の同定
ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）を肝細胞に誘導する転写因子の組み合わせを同定するために、ヒト肝細胞で発現されており、肝細胞運命の決定に重要であることが以前に示された転写因子（表４）のプールを選択した（Ｎａｇａｏｋａ  ａｎｄ  Ｄｕｎｃａｎ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｃｉ．．，９７：７９−１０１（２０１０）；Ｚａｒｅｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，９：３２９−３４０（２００８））。
【表４】
0006535028.tif 000007
【０１３３】
以前の研究では、増殖停止および細胞死が、細胞のリプログラミングの一般的な障害であることも示された（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３８６−３８９（２０１１）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９（２００８））。したがって、ＭＹＣをリプログラミングプロセスに用いただけではなく、ｐ５３低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もリプログラミングプロセスで用いた。簡潔に言えば、１７個の転写因子のうち、胚および成人の両方の肝臓におけるそれらの重要な役割により、ＨＮＦ１ＡおよびＨＮＦ４Ａを優先的に検討する。次いで、「２＋１」戦略を使用して、一度に１つの候補因子をＨＮＦ１ＡおよびＨＮＦ４Ａの組み合わせに追加することによって、さらなる因子をスクリーニングした。
【０１３４】
データにより、ＨＮＦ６は、ＨＮＦ４ＡおよびＨＮＦ１Ａと協働して、２０日以内に、高い割合のアルブミン（ＡＬＢ）陽性細胞をもたらし得ることが示された（データは示さず）。これら３つの因子によって誘導された肝細胞様細胞（３Ｈ細胞）は、グリコーゲンの合成および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込みを含むいくつかの肝臓特性を示した（データは示さず）。しかしながら、これらの細胞におけるＡＬＢの発現レベルは、非常に低かった（図１Ａ）。また、肝細胞における主要なシトクロムＰ４５０酵素の発現は、これらの細胞では検出されなかった（データは示さず）。したがって、３Ｈ細胞は機能的に未成熟であると思われ、これは、それらの完全な成熟には、さらなる因子が必要であることを暗示している。
【０１３５】
成熟肝細胞を生成する因子の同定
肝細胞様細胞の機能的成熟を誘導することができる因子を同定するために、３Ｈ細胞、新たに単離した初代ヒト肝細胞（Ｆ−ＨＥＰ）および胎児肝細胞において、グローバルな遺伝子発現分析を実施した。３つのサンプル間では、ＣＥＢＰＡ、ＡＴＦ５およびＰＲＯＸ１を含むいくつかの肝転写因子の差次的発現が観察された（データは示さず）。これら３つの遺伝子は、３Ｈ細胞および胎児肝細胞では、成人肝細胞におけるレベルと比較して比較的低いレベルで発現していた。定量的ＰＣＲによって、この差異をさらに確認した（図１Ｂおよび１Ｃ）。これらの遺伝子のうち、ＰＲＯＸ１は、最近の研究において、肝細胞の代謝成熟に重要な主要な転写因子であることが示された（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１５７−１６１（２０１３））。ＣＥＢＰＡおよびＡＴＦ５は、非常に大量に肝臓に豊富に存在する転写因子であり、これは、肝機能における転写調節の重要性を示している。さらに、遺伝子発現研究により、Ｆ−ＨＥＰでは、これら３つの遺伝子が高発現していたことが示された（図１Ｄ）。まとめると、これらのデータにより、これらの因子の過剰発現は、３Ｈ細胞の機能的成熟をもたらし得ることが示された。
【０１３６】
線維芽細胞から成熟ヒト肝細胞を作製するために、これら３つの因子をＣＥＢＰＡ、ＰＲＯＸ１およびＡＴＦ５と組み合わせ、図１Ｅに示されているスキームにしたがって、ＨＥＦで過剰発現させた。上皮細胞への線維芽細胞の劇的な形態学的変化が、１週間で観察された。これらの細胞は、肝細胞培養培地（ＨＣＭ）中で急速に増殖し、倍加時間は９〜１１時間であった（図１Ｆ）。感染２週間後に、再プレーティングした細胞は、初代ヒト肝細胞の典型的な形態を示した（データは示さず）。感染約２５日後に、ＧＦＰレポーターによって示されるように、ｐ５３  ｓｉＲＮＡがサイレンシングし（データは示さず）、誘導細胞を改変ウィリアムズＥ培地に移した（図１Ｅおよび１Ｆ）。定量的ＰＣＲの結果により、誘導肝細胞様細胞は、初代ヒト肝細胞（図１Ｇ）のものと同程度のレベルであって、３Ｈ細胞（図１Ａ）のものよりも有意に高いレベルで、ＡＬＢを発現していたことが示された。リプログラミング効率をさらに分析したところ、誘導細胞の９０％がＡＬＢ陽性であり、ほぼ１００％がα−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）陽性であったことが見出された（図１Ｈおよび１Ｉ）。ＡＬＢの分泌が劇的に増強され、初代ヒト肝細胞のものと同程度であった（図１Ｊ）。さらに、免疫染色によって検出したところ、誘導細胞では、４つの主要なシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９も発現していた（データは示さず）。これら６つの因子のいずれかの除去は、薬物代謝酵素およびトランスポーターの発現の実質的な減少につながるであろう（図１Ｋ）。これらの結果は、ｈｉＨｅｐと命名したこれらの誘導肝細胞様細胞において、機能的肝臓特性が得られたことを示している。
【０１３７】
ｈｉＨｅｐは、ヒト肝細胞の典型的な特性を有する
肝運命転換を評価するために、典型的な肝臓の特徴を最初に分析した。免疫蛍光顕微鏡検査により、ｈｉＨｅｐでは、上皮マーカーＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）がＡＬＢと共発現していたことが示された（データは示さず）。加えて、線維芽細胞マーカーＣＯＬ１Ａ１は検出されなかった（データは示さず）。これらの結果は、ｈｉＨｅｐにおける間葉上皮移行の成功を示している。次に、ｈｉＨｅｐにおける内因性肝転写ネットワークの活性化を、ＲＴ−ＰＣＴを使用してさらに調べた。
【０１３８】
ＲＴ−ＰＣＲの結果により、ｉＨｅｐでは、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２およびＦＯＸＡ３（Ｚａｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，９：３２９−３４０（２００８））の内因性発現が活性化されていたことが示された（図２Ａ）。ｈｉＨｅｐでは、肝臓の交差調節ネットワークに関与する別のコア転写因子であるＬＲＨ１（Ｎａｇａｏｋａ  ａｎｄ  Ｄｕｎｃａｎ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｓｃｉ．，９７：７９−１０１（２０１０））も内因性発現していた（図２Ａ）。
【０１３９】
免疫蛍光を使用して、ＦＯＸＡ２およびＬＲＨ１の発現を確認した（データは示さず）。加えて、ｈｉＨｅｐでは、ＣＯＬ１Ａ１、ＰＤＧＦＲＢおよびＴＨＹ１を含む線維芽細胞マーカー遺伝子は検出されなかった（図２Ａ）。ｈｉＨｅｐでは、ｐ５３  ｓｉＲＮＡのサイレンシングと一致して、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４Ａ、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡの外因性発現がサイレンシングしていた（図２Ｂ）。図２Ａで使用したプライマーは、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡの内因性転写産物を特異的に同定し得る。これらのプライマーは、コード配列ではなく内因性転写産物のユニークな５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに結合するように設計されている。加えて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって示されるように、ｉＨｅｐでは、ＭＹＣは、新たに単離した初代ヒト肝細胞のものよりも低いレベルに減少していた（図２Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ｈｉＨｅｐが肝転写ネットワークを獲得していることを示している。
【０１４０】
次に、ヒト肝細胞の機能的特徴について、ｈｉＨｅｐを評価した。ＬＤＬの取り込みについて、ｈｉＨｅｐはコンピテントであった（データは示さず）。加えて、ｈｉＨｅｐは、培地からインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を取り込み、吸収したＩＣＧを使用中止後に排除することができた（データは示さず）。ｈｉＨｅｐにおけるオイルレッドＯ染色により、脂肪滴の蓄積が示され、過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色により、グリコーゲンの合成が示された（データは示さず）。成人肝細胞と同様に、ｈｉＨｅｐはＡＦＰ陰性であった（データは示さず）。Ｇバンディング分析により、７週間の培養後、ｈｉＨｅｐは正常な核型を有していたことが明らかになった（データは示さず）。ＨＥＦの他に、同じ因子を使用して、本明細書に記載されているように成人包皮線維芽細胞を転換したところ、同様の結果が得られた（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、ｈｉＨｅｐが典型的な肝臓の機能的特徴を示すことを示している。
【０１４１】
ｈｉＨｅｐおよびＦ−ＨＥＰにおけるグローバルな遺伝子発現パターンを、ＲＮＡ配列決定によって比較した。主成分分析および階層的クラスタリング分析により、異なるドナーから確立されたｈｉＨｅｐはヒト肝細胞とクラスタ形成しており、ヒト線維芽細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来肝細胞（ＥＳ−Ｈｅｐ）から分離していたことが明らかになった（データは示さず）。実際、ｈｉＨｅｐでは、肝転写因子はアップレギュレートしており（図２Ａに示されているように、これらの因子は、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＡ３、ＣＥＢＰＡ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＰＲＯＸ１およびＬＲＨ１である）、線維芽細胞シグネチャ遺伝子の発現（図２Ａに示されているように、これらの因子は、ＰＤＧＦＢ１、ＴＨＹ１およびＣＯＬ１Ａ１である）はダウンレギュレートしていた（データは示さず）。加えて、ｈｉＨｅｐは、リポタンパク質、コレステロール、脂質、グルコースおよび薬物代謝に関与する一連の遺伝子について、肝細胞の遺伝子発現パターンを示した（データは示さず）。要するに、これらの結果は、ｈｉＨｅｐが、初代ヒト肝細胞に類似する発現プロファイルを示すことを示している。
【０１４２】
ｈｉＨｅｐにおける薬物代謝の中央ネットワークの確立
ｈｉＨｅｐが、薬物代謝における重要な酵素を発現していたかを評価するために、ｈｉＨｅｐにおける５つの重要なＣＹＰ酵素ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４の発現を定量的に確認した。５つの重要なＣＹＰは、ヒト薬物酸化の６０％を占める主要な第Ｉ相酵素である（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，４１：８９−２９５（２００９））。陽性対照として、５人の個々のドナーからプールしたＦ−ＨＥＰを使用した。注目すべきことに、ヒトＥＳＣおよびＨｅｐＧ２細胞に由来する肝細胞における発現とは対照的に、ｈｉＨｅｐおよびＦ−ＨＥＰでは、これらの主要なＣＹＰの同程度のｍＲＮＡレベルが検出され得る（図３Ａ）。次に、生体異物薬物の排泄に重要な第ＩＩ相酵素および第ＩＩＩ相トランスポーターの存在について、ｈｉＨｅｐを分析した。これらの遺伝子の発現レベルは、Ｆ−ＨＥＰにおけるものと同様であった（図３Ｂ〜３Ｄ）。加えて、ｈｉＨｅｐは、広範囲の第Ｉ相および第ＩＩ相代謝酵素ならびに第ＩＩＩ相トランスポーターを発現していた（図３Ｅ）。まとめると、これらの知見は、ｈｉＨｅｐでは、薬物代謝の中央ネットワークが上手く確立されており、プールした新たに単離した初代ヒト肝細胞のものと似ていたことを示している。
【０１４３】
ｈｉＨｅｐにおける重要な薬物代謝活性のレベルは、新たに単離した初代ヒト肝細胞におけるものと同程度である
ｈｉＨｅｐの薬物代謝活性を評価するために、本研究では最初に、ＣＹＰ３Ａ４に焦点を当てた。超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析技術を使用して、ｈｉＨｅｐにおけるＣＹＰ３Ａ４の薬物代謝活性を、２つの構造的に異なる基質（テストステロンおよびミダゾラム）を使用することによって検出した。薬物クリアランスの個体間変動が顕著であるので、２バッチの新たに単離した初代ヒト肝細胞を陽性対照として使用した。ＨｅｐＧ２細胞株、ＥＳ−ＨｅｐおよびＨＥＦとは対照的に、ｈｉＨｅｐは、２つのＣＹＰ３Ａ４選択的基質を効率的に代謝することができ、代謝効率は、新たに単離した肝細胞（Ｆ−ＨＥＰ）で見られる代謝と同程度である（図４Ａ）。Ｚｈａｏらは、ＥＳ−Ｈｅｐが、２５週齢胎児肝細胞およびヒト成人初代肝細胞で見られるものよりも低いレベルで、活性を有するＣＹＰ３Ａ４を発現することを開示している（Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１５７−１６１（２０１３））。さらに、ｈｉＨｅｐにおけるＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６の代謝活性は、Ｆ−ＨＥＰのものと同程度であることが見出された（図４Ａ）。ｈｉＨｅｐにおけるＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｃ１９の活性は、Ｆ−ＨＥＰの約３０％であった（図４Ａ）。ｈｉＨｅｐにおけるこれらのＣＹＰ酵素すべての代謝活性は、ＥＳ−Ｈｅｐのものよりも少なくとも１００倍高かった。これらのデータは、ｈｉＨｅｐが、新たに単離した初代ヒト肝細胞のものと同程度の重要なＣＹＰ酵素の代謝活性を示すことを示している。
【０１４４】
ｈｉＨｅｐにおける薬物代謝の機能的中央ネットワークをさらに評価するために、ｈｉＨｅｐとＦ−ＨＥＰとの間の核内受容体（これは、代謝酵素の発現の調節において重要である）の発現を比較した。ｈｉＨｅｐでは、生体異物代謝系に関与する核内受容体が発現していた（図３Ｆ）。また、ｈｉＨｅｐは、ｍＲＮＡレベルで、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６の標準誘導因子に反応した（図４Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ｈｉＨｅｐにおける核内受容体ネットワークの機能的確立を示している。
【０１４５】
肝毒性の研究おけるｈｉＨｅｐの適用可能性を評価するために、モデル肝毒素の急性毒性を定量した。肝毒性は、薬物障害をもたらす最も一般的な有害事象であるので（Ｓａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，７：１８８−１９８  ２０１０）、薬物毒性の感受性は、創薬におけるヒト肝細胞の適用可能性の重要な指標である。一連のモデル肝毒素と共にインキュベートしたところ、ｈｉＨｅｐは、初代ヒト肝細胞のものと同程度の感受性レベルを示したが（図４Ｃ）、これは、薬物毒性試験におけるｈｉＨｅｐの使用可能性を示している。
【０１４６】
ｈｉＨｅｐによるＴｅｔ−ｕＰＡ／Ｒａｇ２-/-／γｃ-/-マウス肝臓の再生
ｈｉＨｅｐがマウス肝臓を再生させる能力を調査するために、ｈｉＨｅｐをＴｅｔ−ｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子）／Ｒａｇ２-/-／γｃ-/-マウスに脾臓内注射した（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１７５：１９７５−１９８３（２００９））。マウス血清中のヒトアルブミンの分泌が徐々に増加し、ｈｉＨｅｐ移植７週間後に達した最高レベルは３１３ｍｇ／ｍｌであり（図５Ａ〜５Ｃ）、これは、ＥＳ−Ｈｅｐよりも１０００倍高く、初代ヒト肝細胞と同程度であった（図５Ｂ）。生着効率を分析するために、２匹のマウスの肝臓全体から肝細胞を単離し、フローサイトメトリー分析によって測定した。３１３ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを分泌したマウスでは、再生効率は３０％であった（図４Ｃ）。ｈｉＨｅｐ移植２カ月後、腫瘍形成は観察されなかった。ｈｉＨｅｐの移植片も分析した。移植６週間後、レシピエントマウスでは、ヒトＡＬＢを発現する細胞のクラスタが観察された（データは示さず）。インビボにおけるｈｉＨｅｐの代謝機能を確認するために、ＣＹＰ発現を分析した。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６（データは示さず）を含む主要なＣＹＰの発現により、ｈｉＨｅｐはインビボで機能的であり得ることが示された。まとめると、これらの結果は、ｈｉＨｅｐが、Ｔｅｔ−ｕＰＡ／Ｒａｇ２-/-／γｃ-/-マウスの肝臓を確実に再生させることができ、インビボで機能的であったことを示している。
【０１４７】
考察
これらの研究は、成熟因子ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１およびＣＥＢＰＡと一緒に肝運命転換因子ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４ＡおよびＨＮＦ６の組み合わせを使用して、ＨＥＦからヒトｈｉＨｅｐが容易かつ再現可能に作製されることを示している。初代ヒト肝細胞と同様に、ｈｉＨｅｐは、それらの上皮形態、肝細胞特異的マーカーの発現、肝細胞の基本的な機能特性、およびグローバルな遺伝子発現パターンを含む多くの典型的な肝臓の特徴を示す。重要なことに、第Ｉ相および第ＩＩ相薬物代謝酵素ならびに第ＩＩＩ相薬物トランスポーターの統合スペクトルは、ｈｉＨｅｐにおいて十分に確立されている。さらに、移植ｈｉＨｅｐは、Ｔｅｔ−ｕＰＡ／Ｒａｇ２-/-／γｃ-/-マウスの肝臓の最大３０％を再生させ、インビボで３００ｍｇ／ｍｌ超のヒトアルブミンを分泌し得る。このデータは、系列リプログラミングを使用して、線維芽細胞から、薬物代謝機能を有するヒト肝細胞を作製し得ることを示している。系列リプログラミングの１つの重要な問題は、完全に機能的な細胞を得る方法である。肝分化転換では、線維芽細胞における肝運命決定因子の発現を介して、いくつかの重要な肝臓の特徴を有するマウス誘導肝細胞様細胞が作製された（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｅｋｉｙａ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎａｔｕｒｅ，４７５：３９０−３９３（２０１１））。しかしながら、不完全な肝細胞分化、およびｈｉＨｅｐによる特定の肝芽細胞マーカーの発現は、未成熟または前駆様状態と親和性がある（Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｇ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，９：８９−９１（２０１１））。これらの研究はまた、特定の肝運命決定因子がＨＥＦを肝細胞様細胞にリプログラミングし得ることを示している。しかしながら、これらの細胞は、３つのさらなる因子を追加するまで機能的ではない（図１Ｇ〜１Ｊ）。さらなる３つの因子は、ｈｉＨｅｐのさらなる代謝成熟を促進する（データは示さず）。したがって、肝運命の決定および肝臓の機能的成熟は異なるマスター遺伝子によって支配されている可能性があり、互いにある程度独立している。完全に機能的な細胞を得るために、細胞運命決定因子の異所性発現は十分ではない可能性があり、このプロセスを促進するためには、さらなる機能的成熟因子が必要である。
【０１４８】
ヒト肝細胞の薬物代謝能力は、肝細胞を他の系列と区別する最も重要な機能の１つであり、薬物開発において幅広い用途を有する。ヒト多能性幹細胞を肝細胞に分化させる試みは、機能的に未成熟な細胞をもたらした。最近の研究により、ヒトＥＳ−Ｈｅｐは、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４を発現することが示された（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１５７−１６１（２０１３））。しかしながら、これら２つのＣＹＰ酵素の活性は、初代肝細胞のものよりも有意に低かった。別の研究では、分化肝細胞は、培養初代肝細胞のものと同程度に過ぎないＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ１Ａ２活性を示した（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４０：３２８５−３２９６  ２０１３）。しかしながら、培養初代肝細胞では、肝臓に必須のいくつかの機能が時間と共に徐々に失われた（Ｅｌａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．７：６２９−６６０（２００６））。本明細書に開示される研究では、ゴールドスタンダードである新たに単離した初代ヒト肝細胞を陽性対照として使用した。本明細書に開示されるｈｉＨｅｐは、新たに単離した初代ヒト肝細胞のものと同程度のレベルで、重要な第Ｉ相（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｂ６およびＣＹＰ１Ａ２）および第ＩＩ相薬物代謝酵素ならびに第ＩＩＩ相薬物トランスポーターを発現する。重要なことに、ｈｉＨｅｐにおける５つのＣＹＰ酵素の代謝活性は、新たに単離した初代ヒト肝細胞のものと同程度であったが、これは、これらのＣＹＰ酵素によって代謝される薬物の評価におけるｈｉＨｅｐの適用可能性を示している（図４Ａ）。これらの細胞では、生体異物代謝系に関係する内因性核内受容体の発現も検出された（Ｎａｋａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，２１：４３７−４５７（２００６））（図３Ｆ）。また、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ２Ｂ６の発現は、標準誘導因子によって増加された（図４Ｂ）。加えて、肝細胞における統合代謝経路（第Ｉ相および第ＩＩ相酵素ならびに第ＩＩＩ相薬物トランスポーター）は、創薬に非常に重要であるので（Ｃａｓｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２：１８３−２１２（２００６））、ｈｉＨｅｐの薬物代謝ネットワークを密接に分析した。薬物代謝マーカーをコードする遺伝子の発現パターンは、初代ヒト肝細胞におけるものに類似していたが、これは、ｈｉＨｅｐにおける薬物代謝ネットワークのアップレギュレーションを暗示している（図３Ａ〜３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ｈｉＨｅｐでは、機能的薬物代謝の中央ネットワークが一体的に確立されているので、これらの細胞は、前臨床スクリーニングアッセイの代替候補となることを示している。
【０１４９】
薬物開発におけるヒト肝細胞の別の重要な特徴は、薬物毒性に対する感受性である。ヒト多能性幹細胞から誘導されたヒト肝細胞は、薬物毒性に対して比較的低い感受性を有する（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１５７−１６１（２０１３））。対照的に、複数のモデル肝毒素に対する本明細書に開示されるｈｉＨｅｐの感受性は、初代ヒト肝細胞のものと同程度である（図４Ｃ）。したがって、ｈｉＨｅｐは、新薬発見のための肝毒性アッセイにおける有益な代替細胞源であり得る。重要なことに、本発明者らの結果は、誘導細胞を初期段階で大規模に増殖させることができ（図１Ｆ）、ｈｉＨｅｐの機能を１６日間維持することができる（図４Ｄ）ことを実証している。リプログラミング効率を考慮すると（図１Ｈおよび１Ｉ）、１０4個の線維芽細胞から１０11個超の機能的ｈｉ−Ｈｅｐを得ることができる（データは示さず）。これらの結果は、医薬開発のために、ｈｉＨｅｐを実際的に使用することができることを示している。
【０１５０】
肝細胞移植は、同所性肝移植の有望な代替手段である（Ｄｈａｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ，７：２８８−２９８（２０１０））。しかしながら、良質な細胞を提供し得るドナー器官の供給不足は、依然として主な課題である。本明細書に記載される研究では、ｈｉＨｅｐは、マウス肝臓を確実に再生させることができ、最大３１３ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミン（これは、ヒト胚性幹細胞から誘導されたヒト肝細胞を使用した最近の研究よりも２桁大きい）を分泌した（図５Ａおよび５Ｂ）（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４９９：４８１−４８４（２０１３）；Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４２：６０２−６１１（２０１２））。さらに、移植ｈｉＨｅｐは主要なＣＹＰ酵素を発現したが（データは示さず）、これは、ｈｉＨｅｐがインビボで薬物代謝能力を保持していたことを示している。まとめると、ｈｉＨｅｐは、ヒト化マウスモデルの確立および肝細胞移植のための細胞源候補として役立ち得る。
【０１５１】
結論として、細胞運命決定因子および細胞成熟因子の複合発現を使用して、薬物代謝機能を有するヒト肝細胞を作製した。系列リプログラミングによる機能的ヒト肝細胞の作製は、医薬用途のための十分に特徴付けられた再現性のある機能的ヒト肝細胞を得るための方法を提供する。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｆ】
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【図１Ｇ−Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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