(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅからなる群から選択されるいずれか１種以上のトリペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤。
【請求項２】
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅからなる群から選択されるいずれか１種以上のトリペプチドを有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤。
【請求項３】
請求項１記載のＤＰＰ−４阻害剤を含む、ＤＰＰ−４阻害用食品（黄酒を除く）。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のトリペプチドを有効成分として含有するＤＰＰ−４阻害剤および血糖値上昇抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、膵臓のβ細胞が何らかの理由によって破壊されて血糖値を調節するインスリンが枯渇する１型と、血中にインスリンは存在するがインスリンの働きが悪く、あるいは膵臓のβ細胞からのインスリン分泌量が減少し、結果として血糖値の調整不全となる２型とに大別される。２型糖尿病の血糖値を調整するホルモンに、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１：ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）が知られている。一定濃度以上の血中糖濃度下でインスリン分泌を促進するため低血糖が起きる危険性が少なく安全性に優れ、ＧＬＰ−１補充療法等に応用されている。
【０００３】
一方、ＧＬＰ−１は、生体内に広範に存在するジペプチジルペプチダーゼ４（ＥＣ３．４．１４．５、以下単にＤＰＰ−４と称す。）で急速に分解される。ＤＰＰ−４は、Ｎ末端から２番目にＰｒｏまたはＡｌａを持つペプチドに対して特異的に作用し、Ｎ末端からジペプチドを遊離させ、この作用によりＧＬＰ−１を不活化するという。このため、ＤＰＰ−４の活性を阻害して内因性ＧＬＰ−１の作用を持続増強させる薬剤が開発され、例えば、Ｎ末端から２番目にＰｒｏが配列されたペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤がある（特許文献１）。これらはチーズの水溶性画分に含まれるアミノ酸数２〜１２のペプチドである。特許文献１では、ＤＰＰ−４阻害剤を構成するトリペプチドとして、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎを記載する。
【０００４】
また、乳タンパク質加水分解物からなり、ＧＬＰ−１の分泌を刺激し、およびＤＰＰ−４阻害作用を有するペプチドもある（特許文献２）。特許文献２では、ＤＰＰ−４阻害作用を有するトリペプチドとして、ＬＰＬ、ＩＰＩを記載する。
【０００５】
更に、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｘ（式中、ＸはＬ−プロリン残基を除くアミノ酸残基を示す）からなるペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤もある(特許文献３）。カゼインを特定の酵素で加水分解して得られたカゼイン加水分解物中に、ＤＰＰ−４阻害作用を有する新規ペプチドが含まれることを見出したものであり、食品由来の成分であったため安全性が高いという。具体的なトリペプチドとして、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓを記載する。
【０００６】
また、コラーゲンまたはゼラチン由来のペプチドであって、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−（Ｇｌｙ−Ｚ−Ｗ）ｎ（式中、ｎは０〜４の整数、ＸはＰｒｏまたはＬｅｕ、Ｙ、ＺおよびＷはそれぞれ独立して同一または異なる任意のアミノ酸残基（ただし、Ｇｌｙを除く）を示す。）で示すペプチドをＤＰＰ−４阻害剤とするものもある（特許文献４）。好ましいトリペプチドとして、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを記載する。
【０００７】
更に、コラーゲンのアミノ酸一次構造に由来するＤＰＰ−４阻害剤もある（特許文献５）。好ましいトリペプチドとして、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、およびＩｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを記載する。
【０００８】
加えて、Ａｃｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＲ、Ａｃｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＲ、Ａｃｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＲ、Ａｃｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＲ、またはＡｃｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＲで表される（Ｒは水素、または炭素数１〜５のアルキル基を表し、Ａｃｅはアセチル基を表す。）トリペプチド化合物を含む、血糖値低減剤もある（特許文献６）。一般的にペプチドは、「+Ｈ３Ｎ−（Ｒ１）ＣＨ−ＣＯＯ−」で示すことができ、上記トリペプチド化合物のＲが水素（Ｈ）の場合はそれぞれ、Ａｃｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｃｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ａｃｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ａｃｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、およびＡｃｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと表記できる。実施例では、Ａｃｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎを２型糖尿病モデルマウスに７週間経口投与すると、その長期投与時においても蒸留水を投与したネガティブコントロール群より血糖値を低減でき、その効果はＤＰＰ−４阻害薬であるリナグリプチン投与群とほぼ同等であったと記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−３９４２４号公報
【特許文献２】特表２００９−５１７４６４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１３３０３１号
【特許文献４】国際公開第２００８／０６６０７０号
【特許文献５】国際公開第２０１３／０６５８３２号
【特許文献６】特開２０１６−３４９３０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】橋本昭彦等、「ショウガ根茎のプロテイナーゼおよびコラゲナーゼ活性」、日本栄養・食糧学会誌、１９９１、ｖｏｌ．４４、Ｎｏ．２、ｐｐ．１２７−１３２
【非特許文献２】The 2.1 A structure of a cysteine protease with proline specificity from ginger rhizome, Zingiber officinale、Biochemistry、1999年、vol.38、11624-11633
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記特許文献１〜５に記載するＤＰＰ−４阻害剤は、いずれもチーズや乳タンパク質、コラーゲン、その他の天然物を原料とするため安全性に優れる。ペプチドの中でも、アミノ酸数が少ないペプチドは血中移行率に優れると予測され、上記特許文献にはいずれもＤＰＰ−４阻害活性を有するトリペプチドが記載されている。これらには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がプロリンであるトリペプチドも含まれるが、原料に含まれるペプチド配列に由来するため、記載されたアミノ酸配列以外のペプチドのＤＰＰ−４阻害活性は不明である。したがって、トリペプチドを有効成分とする、新たなＤＰＰ−４阻害剤の開発が望まれる。
【００１２】
また、特許文献６では、２型糖尿病モデルマウスにＡｃｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎを７週間経口投与して血糖値低減効果を評価しており、その長期投与時においても血糖値低減作用を奏することを示している(図７）。さらに、マウス膵β細胞に添加してインスリン分泌量を評価すると、１００μＭの添加で高濃度グルコース添加時と同等のインスリンの分泌活性が観察され(図１）、これをラットＧＬＰ−１産生細胞に投与すると、グルコース投与群よりもＧＬＰ−１分泌量が上昇している(図４）。これらの結果より、Ａｃｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｎはＧＬＰ−１濃度を上昇させることでインスリン濃度を上昇させ、血糖値を低減させていると推定されるが、ＧＬＰ−１濃度の上昇が、ＧＬＰ−１の生成亢進によるものか、ＤＰＰ−４阻害剤の存在によるかは不明である。
【００１３】
更に、特許文献６は、化学合成して得たトリペプチドアセチル化合物を使用するものである。化学合成されたペプチドには、予期せぬ不純物が含まれる場合がある。したがって、天然物を分解して製造されるトリペプチドを用いた、安全性が高いＤＰＰ−４阻害剤の開発が望まれる。
【００１４】
このような状況下、本発明は、安全性が高いトリペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤および血糖値上昇抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、グルテンをショウガ根茎由来酵素で分解してなるトリペプチドについてＤＰＰ−４阻害活性を評価したところ、Ｎ末端から２番目がプロリンであり、Ｎ末端またはＣ末端がグルタミンであるトリペプチドに、ＤＰＰ−４阻害活性が存在することを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
すなわち本発明は、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅからなる群から選択されるいずれか１種以上のトリペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅからなる群から選択されるいずれか１種以上のトリペプチドを有効成分として含有する血糖値上昇抑制剤を提供するものである。
【００１８】
また本発明は、前記ＤＰＰ−４阻害剤を含む、ＤＰＰ−４阻害用食品（黄酒を除く）を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、トリペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＧｌｎのＤＰＰ−４阻害曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、またはＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドを有効成分とするＤＰＰ−４阻害剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
（１）ＤＰＰ−４阻害剤
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、またはＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドを有効成分とする。Ｘは、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸や、アスパラギン、グルタミン、セリンなどの中性アミノ酸であることが好ましい。これらの中でも、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、セリンなどが好ましい。一方、Ｙはグリシンなどの中性アミノ酸や、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸であることが好ましい。本発明で使用するトリペプチドとしては、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅが好ましく、より好ましくはＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅである。これらは１種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
【００２３】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤で使用する上記トリペプチドは、医学的に許容可能な塩を構成するものであってもよい。なお、医学的に許容可能な塩とは、薬理学的に許容可能であり、かつ投与された被験者に対して略無毒の本発明の化合物である塩形態をいう。上記トリペプチドの医薬的に許容可能な塩として、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ヒドロキシブチル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、琥珀酸塩、アジピン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルタル酸塩などの有機酸塩、塩酸塩、リン酸塩、塩化水素酸塩、硫酸塩、カルボン酸塩、ホスホン酸塩、スルホン酸塩などの付加塩がある。ただし、Ｎ末端アミノ酸にアセチル基が導入されたアセチル化トリペプチドは含まない。後記する実施例に示すように、ＤＰＰ−４阻害活性が極めて低値だからである。なお、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、トリペプチドを構成するアミノ酸の、第１級アミン、第２級アミンにアシル基が結合するＮ−アシル化合物を含まない。
【００２４】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、経口的に投与して、生体においてＤＰＰ−４を阻害することにより血糖値を低下させることができ、糖尿病の予防薬、治療薬として使用することができる。経口投与する場合、本発明のＤＰＰ−４阻害剤の剤型としては、トリペプチドをそのまま使用する他、他のふ形剤を配合して錠剤、細粒剤、丸剤、トローチなどに調製してもよく、カプセルに収納してカプセル剤としてもよく、更には液剤などに調製することができる。経口投与の場合は、治療や予防の目的、症状、体重、年齢などの条件を考慮して、適宜選択することができる。また、サプリメントとして摂取することもできる。
【００２５】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤の投与量は、投与形態、投与目的、被験者の年齢その他に応じて適宜、選択することができる。一般には、経口投与の場合、成人一日当り０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜２０ｍｇ／ｋｇである。注射剤の場合は、例えば０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００２６】
本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、これを食品に配合して経口摂取することができる。このような本発明のＤＰＰ−４阻害剤が配合された食品としては、野菜やフルーツ、乳酸菌などを含むジュースその他の飲料、ゼリー、ヨーグルト、プリン、アイスクリームなどの半流動性食品の他、他の食材に混練して固形食品に調製することができる。
【００２７】
また、ＤＰＰ−４阻害剤は、Ｔリンパ球の増殖効果を有し、また自己免疫性脊椎炎、多発性硬化症、関節炎、リューマチなどの自己免疫疾患を緩和することが指摘されている。したがって、本発明のＤＰＰ−４阻害剤も上記疾患に使用しうる可能性がある。この際の用途は、内服に限定されず炎症部位に注入するなどの外科的処方であってもよい。
【００２８】
（２）製造方法
本発明で使用するトリペプチドの製造方法は、特に限定はない。したがって、従来公知の方法で化学合成したものを使用することができる。一方、豆類、魚類、肉類その他のタンパク質含有食品を酵素分解し、分解物の中から上記トリペプチドを分取して使用することもできる。このようなタンパク質含有食品として、グルテンを原料とすることが好適である。グルテンは、グリアジンとグルテニンからなるタンパク質複合体であり、グルタミン残基とプロリン残基の含有量が多いからである。更に、脂肪や糖分の含有量が少なく、分解物からトリペプチドを分取することも容易である。
【００２９】
グルテン分解酵素としては、従来公知のプロテアーゼを使用することができる。例えば、パパイヤ、キウイ、パイナップル、イチジク、ショウガなどに含まれるプロテアーゼがある。本発明では、ショウガ根茎由来酵素を使用することが好ましい。上記トリペプチドの生成率に優れるからである。
【００３０】
（３）ショウガ根茎由来酵素
ショウガ根茎由来酵素が、プロテアーゼ活性を有することは公知である（非特許文献１）。ショウガ根茎由来酵素であるジンジベインは、プロリン特異的システインプロテアーゼであり、Ｎ末端側から読んだときに、ＰｒｏのＣ末端側に隣接するアミノ酸残基とその次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を切断する（非特許文献２）。グルテンにこのショウガ根茎由来酵素を作用させると、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、およびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドを含むペプチド組成物を生成することができる。なお、ショウガ根茎は、プロテアーゼ活性を有するものであれば特に制限はなく、市販のショウガ根茎を広く使用することができる。
【００３１】
ショウガ根茎由来酵素は、グルテンを分解して上記トリペプチドを生成できることを条件に、生ショウガ根茎から抽出した酵素であってもよく、乾燥ショウガ根茎から得た酵素であってもよい。なお、ショウガ根茎には多量の繊維が含まれているが、繊維を含んだまま粉砕した粉砕物であってもよい。粉砕は、乳鉢、スタンプミル、ボールミル、ホモジナイザー、カッティングミルなどで行うことができる。ショウガ粉砕物、乾燥ショウガ粉砕物を直接グルテンに添加することで、酵素抽出、酵素精製の工程を経ることなく、簡便に分解反応を行うことができる。
【００３２】
（４）プロテアーゼ反応
本発明において、グルテンに添加するショウガ根茎由来酵素の量は、使用するショウガ根茎由来酵素の形状その他によって適宜選択することができ、例えばショウガ根茎の乾燥粉砕物の場合、グルテンの１〜３０質量％、より好ましくは２〜２０質量％、特に好ましくは５〜１０質量％である。
【００３３】
反応は、ｐＨ３．０〜７．０で行うことが好ましい。この範囲で、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、およびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドの生成率に優れるからである。より好ましくは、ｐＨ３．６〜５．６、特に好ましくはｐＨ４．０〜５．２である。また、反応温度は、室温〜８０℃、より好ましくは４０〜６０℃である。この範囲でプロテアーゼ活性に優れるからである。なお、反応時間は、３〜２４時間、より好ましくは８〜１６時間である。上記したトリペプチドが生成しているか否かは、反応液の一部を採取してペプチドの定量分析を行うことで簡便に確認することができる。上記プロテアーゼ反応により、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、およびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドが生成される。
【００３４】
反応には還元剤を添加してもよい。グルテン溶液にシステイン、ジチオスレイトール、グルタチオン、グルタチオン含有酵母エキスなどのＳＨ基含有還元剤を添加すると、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、およびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドの生成率に優れる。例えばジチオスレイトールの場合、０．１ｍＭ以上で添加の効果が発揮され、好ましい添加量は０．５〜５０ｍＭである。特に、還元剤濃度が１〜５ｍＭの場合には、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、およびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドの生成量が大きく向上する。ＳＨ基含有還元剤はＳＨ基の保護作用を有するため、ショウガ根茎由来酵素に含まれる酵素のＳＨ基に作用し、反応率を向上させると推定される。なお、反応の終了は、上記トリペプチドの生成量によって決定することができる。
【００３５】
得られた分解組成物には、上記Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、およびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドが含まれている。本発明は、上記トリペプチドを含有する分解組成物を、そのままＤＰＰ−４阻害剤として使用することができる。また、従来公知の方法で特定のトリペプチドを分取および精製してもよい。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
【００３７】
（１）ＤＰＰ−４阻害率の測定方法
５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に試料を溶解したサンプル液３５μｌと、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解したＤＰＰ−４（シグマ社製、豚腎臓由来；８．６ｍＵ／ｍｌ）１５μｌとをマイクロプレートウェル（ＮＵＮＣ社製、商品名「２３７０１５」）中で混合し３７℃、１０分間インキュベートした。
これに、予め３７℃に保温しておいた基質溶液（グリシルプロリン−４−メチルクマリン−７−アミド（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ）を１０μＭとなるよう５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）に溶解したもの）５０μｌを添加および混合し、３７℃で２０分間反応させた。
ＤＰＰ−４によって遊離される７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の蛍光強度をマイクロプレートリーダー型蛍光検出器（コロナ電気社製、商品名「ＳＨ−９０００」）で経時的に測定した。なお、測定波長は励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで行った。なお、サンプルに代えて５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を同量使用したものを対照として蛍光強度を測定した。
ＤＰＰ−４の活性は、反応時間中における蛍光強度変化量の平均勾配で表し、ＤＰＰ−４阻害率は、対照を１００％とし、サンプルの活性を前記対照から差し引いた分を阻害率（％）として算出した。
【００３８】
（２）ＩＣ５０値の測定方法
上記したＤＰＰ−４阻害率の測定方法に準じて、サンプル濃度を変化させて得た阻害率から、反応系１ｍｌ換算におけるＤＰＰ−４活性の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。
【００３９】
（製造例１）
ショウガ根茎を、皮を剥いてから細切して−３０℃で凍結した後、凍結ショウガに対して５倍量（容量／重量）の冷アセトンを添加し、ポリトロンホモジナイザーで十分粉砕してスラリーを得た。前記スラリーをろ過してアセトンを除去し、更にこの残渣を５倍量（容量／重量）の冷アセトンで洗浄、ろ過してから風乾し、ショウガ粉末を得た。
【００４０】
（実施例１）
ｐＨ４．４の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで小麦グルテン（東京化成工業製）２質量％懸濁溶液を調製した。この溶液に、製造例１で調製したショウガ粉末を、グルテンに対して質量換算で１／１０倍量加え、ジチオスレイトール（和光純薬工業製）を２ｍＭとなるように添加し、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。反応終了後０．８０μｍフィルターを通してペプチド溶液を得た。
得られたペプチド溶液を下記ＬＣ／ＭＳ測定条件で分離し、トリペプチドの一部の含有量を定量した。結果を表１に示す。グルテンをショウガ根茎由来酵素で分解することで、分解物からＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを製造することができた。
【００４１】
（１）ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム：Ascentis Express F5 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(SUPELCO)、
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜２．５分：Ａ液１００％、
２．５〜１５分：Ａ液１００〜５％；Ｂ液０〜９５％、
１５〜１７．５分：Ａ液５％；Ｂ液９５％、
１７．５〜２０分：Ａ液１００％、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
（２）質量分析条件：
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧：３ｋＶ、
イオンソース温度：７００℃
【００４２】
（実施例２）
実施例１で、ショウガ粉末によるグルテンの分解により生成が確認されたＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅについて、Ａｎｙｇｅｎ社のカスタム合成サービスによりこれらトリペプチドを化学合成し、上記測定法にてそのＤＰＰ−４阻害率とＩＣ５０値とを測定した。測定したＩＣ５０値およびペプチド濃度０．１ｍｇ／ｍｌ時の阻害率を表２に示す。また、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＧｌｎのＤＰＰ−４阻害曲線を図１に示す。
【００４３】
(比較例１）
Ａｎｙｇｅｎ社のカスタム合成サービスにより、Ｎ末端にアセチル基を導入したＡｃ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ａｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、およびＡｃ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎを化学合成した。これらアセチル化トリペプチドについて、実施例２と同様に操作して、ＤＰＰ−４阻害率とＩＣ５０値とを測定した。なお、ＤＰＰ−４阻害作用が弱くＩＣ５０値を算出できなかったため、ペプチド濃度０．１ｍｇ／ｍｌ時の阻害率を記載した。結果を表２に示す。
【００４４】
（結果）
表２に示すように、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（式中、Ｘは、Ｇｌｙ、ＶａｌおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）、またはＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｙ（式中、Ｙは、Ｐｒｏ以外のアミノ酸残基を示す。）で示されるＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＧｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅは、ＩＣ５０値が低く、ＤＰＰ−４阻害活性に優れた。
また、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙにおける０．１ｍｇ／ｍｌ時の阻害率は、８５．３％であるが、Ｎ末端をアセチル化したＡｃ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの同阻害率は５．１％と極めて低値であった。本発明で使用するトリペプチドは、アセチル基を導入したトリペプチドと比較し、ペプチド濃度０．１ｍｇ／ｍｌ時で約１７倍もＤＰＰ−４阻害活性に優れた。なお、表２に示すように、Ｎ末端にアセチル基を導入したトリペプチドは、いずれもＤＰＰ−４阻害活性が低い結果となった。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【図１】
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