(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリン残基を含み、
赤血球細胞の細胞外表面の構成要素に対する抗体であり、
グリコホリンに反応することを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記グリコホリンは、グリコホリンＡであることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
対象に由来する試料中の関節リウマチに特異的な抗体を検出する方法であって、
前記試料を、請求項１または２に記載の抗体に接触させ、前記試料が、請求項１または２に記載の抗体に特異的に反応する抗体を含むか否かを決定することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記シトルリン化抗体は、固体支持体上に固定化されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記固体支持体は、ニトロセルロース膜であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固体支持体は、ポリスチレン支持体、好ましくはＥＬＩＳＡプレートであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記検出は、赤血球凝集アッセイにおいて行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ａ 請求項１または２に記載の抗体を、試料および赤血球細胞に接触させる工程と、
ｂ  前記赤血球細胞の凝集が起こるか否か検出する工程とを含む、請求項７に記載の方法であって、
凝集が、前記試料中に関節リウマチに特異的な抗体が存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記抗体と、前記赤血球細胞は、同一の試料中に含まれることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記赤血球細胞は、前記対象に由来することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断方法の分野に属するものである。本発明は、関節リウマチのための新規マーカ抗体と、関節リウマチの新規検出方法とを提供する。また、本発明は、対象が、将来関節リウマチに罹患するか否かを予測する手段および方法を提供する。本発明は、関節リウマチの患者が、シトルリン化抗体に特異的に反応する抗体を血液循環中に有するとの発見に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
血清学的な診断試験は、関節リウマチ（ＲＡ）の早期検出および差別化にとって益々重要度を増している。リウマチ因子の従来の検出とは異なり、シトルリン化抗原に対する新規の特異的自己抗体は、ＲＡの診断に大きく寄与している［２６］。
【０００３】
リウマチ因子は、自己抗体であり、ＩｇＭ、ＩｇＧ、またはＩｇＡであってもよく、１９２２年に初めて言及された［１］。そこでは、ヒトＩｇＧのＦｃセグメントのＣＨ２およびＣＨ３ドメインが認められ、それはアメリカリウマチ学会によって発表されたＲＡの分類基準の構成要素となっている［２］。
【０００４】
リウマチ因子（ＲＦ）は、様々な試験方法によって検出することができる。ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、および比濁分析は、標準化された方法である。ＲＦ検出の平均特異度は、約６０％の感度で、約７９％である［３］。近年、新規自己抗体が、ＲＡ患者の血清において検出および特定された。これらは、高い特異性を示し、したがって、血清学的な診断試験の改良を促進することができる。
【０００５】
近年において最も重要な血清学的な発見の１つは、シトルリン化フィラグリンに対する自己抗体の性質決定であった［４］。この発見の出発点は、抗ケラチン抗体（ＡＫＡ）に対する標的抗原の性質決定であった。これらは、１９７９年に最初に記載され、ＲＡに非常に特異的である［４］。
【０００６】
標的抗原フィラグリンは、上皮細胞においてのみ発現され、関節または他の器官において発現せず、この病的機序の重要性は、したがって、初期には不明確であった。Schellekensら［６］は、フィラグリンのシトルリン化形態のみがＡＫＡによって認識されることを示した。
【０００７】
フィラグリンは、シトルリン残基をもたらすために、アルギニン残基の酵素的脱イミノ化によってシトルリン化されてもよい。シトルリン化は、翻訳後修飾であり、タンパク質の電荷を変え、その三次元構造の変化をもたらし、同様に、抗原特性に変化をもたらす［７］。シトルリン化は、細胞分化と、プログラム細胞死（アポトーシス）とにおいて必須の生理学的および生化学的役割を有する。
【０００８】
抗シトルリン化フィラグリンの検出のための第一世代ＥＬＩＳＡは、６５％〜７０％の感度で、ＲＡに対して約８５％の特異性を示した。第二世代ＥＬＩＳＡは、抗原として、分子内ジスルフィド結合形成によって環状構造を有する合成ペプチドを使用した。これらのシトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）の使用は、感度を変化させることなく、特異性を９６％〜９８％に向上させた［８］。
【０００９】
いくつかの研究は、抗ＣＣＰ抗体が、高度に特異的であるのみではなく、疾患のびらん性進行についての高い的中率と、したがって、高い予後値とを示した［９］。
【００１０】
フィブリンとフィブリノゲンとのシトルリン化ペプチド誘導体を用いる研究は、フィラグリンとシトルリン化フィブリンとの間の交差反応を示した［１２］。いくつかの刊行物は、ＲＡの患者における抗シトルリン化フィブリノゲン抗体の検出について、高い診断特異性および感度を有することを見出した［１３］。ＥＬＩＳＡを用いると、ＲＡの感度は、９８％の特異性で約７５％であった。
【００１１】
別の重要なシトルリン化自己抗原は、アルファエノラーゼ、つまり解糖において重要な役割を果たす酵素のシトルリン化形態である［１５］。シトルリン化アルファエノラーゼは、関節リウマチの患者の滑膜組織において、他のシトルリン化抗原とともに検出された［１６］。
【００１２】
シトルリン化ビメンチンは、滑膜組織において発現される関連自己抗原として記載された。その後、シトルリン化ビメンチンは、以前に知られた抗原Ｓａと同一であることが明らかになった。Ｓａは、それぞれの自己抗体応答が最初に特定された患者の名前であるSavoieを表す。抗Ｓａ抗体は、関節リウマチの患者に対して、９８％を超える高い特異性をもたらすが、２２％〜４０％の限定された感度をもたらした［１７］。
【００１３】
変異導入シトルリン化ビメンチン（ＭＣＶ）に基づくＥＬＩＳＡは、しばらくの間、関節リウマチの診断用に市販され、抗ＣＣＰ抗体とほぼ同一の診断感度および特異性を有するものであった［１８，１９，２０］。
【００１４】
カルバミル化タンパク質（ホモ−シトルリン残基を含むタンパク質）に対する抗体は、ＲＡの患者の血清に生じることが記載された（２８，２９）。ホモシトルリンは、シトルリンと共にリウマトイド結節に存在することが見出され（２８）、カルバミル化タンパク質に対する抗体は、関節の損傷を予測することが見出された（２９）。
【００１５】
ＲＡの早期検出のための血清的なポイントオブケア試験（ＰＯＣＴ）は、つい最近開発された。Rheuma-Chec試験（Orgentec社、マインツ、ドイツ）は、ＲＡ−リウマチ因子と、ＭＣＶに対する抗体との２つの診断用バイオマーカを含む。ＣＣＰに対する抗体は、CCPointアッセイを用いて検出される（Euro-Diagnostica社、マロメ、スウェーデン）［２５］。試験は、全血の一滴のみを必要とし、全ての一般的な医師は、それらを数分以内に実施することができる。
【００１６】
上述の利点にも関わらず、特に、感度、特異性、および取扱いの容易さの点で、現存する関節リウマチの血清学的試験を改良する余地がある。
【発明の概要】
【００１７】
驚くべきことに、関節リウマチ（ＲＡ）の患者が、シトルリン化抗体に対する抗体を産生することが見出された。このことは、様々な形式で、新規診断試験の製造を可能にする。
【００１８】
本発明は、したがって、シトルリン残基を含む抗体に関する。また、本発明は、ＲＡの患者、またはＲＡを発症するおそれのある対象の血液循環中の抗シトルリン化抗体（ＡＣＡ）の存在を決定するための、そのような抗体の、たとえば抗原としての診断的使用に関する。本発明は、したがって、対象がＲＡを罹患しているか、またはＲＡを発症するか否かを予測する方法に向けられている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＥＬＩＳＡアッセイの結果である。通常のコントロール対象（ｎ＝７）からの、およびリウマチ因子を有さないＲＡ患者（ｎ＝７）からの血清は、抗原としての、固定されたシトルリン化ウサギＩｇＧ抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて１：１００希釈で試験された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
我々は、関節リウマチ（ＲＡ）の患者が、シトルリン、またはホモシトルリン残基を含む抗体に特異的に向けられた抗体を産生することを見出した。これらの抗体は、本明細書において、シトルリン化抗体として表わされる。
【００２１】
我々は、シトルリン化抗体を二種類の方法で作製した。第１に、我々は、ウサギＩｇＧの精製された調製物を、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）を用いる処理にさらすことによってシトルリン化抗体を作製した。この酵素は、タンパク質結合アルギニンをシトルリンに変換することを触媒する［２７］。我々は、化学的なカルバミル化によってシトルリン化抗体を作製した。この処理において、抗体に存在するリジン残基は、ホモシトルリン残基に変換された。我々は、それによって、シトルリン化されたウサギＩｇＧ抗体を得た（実施例１および２）。
【００２２】
本明細書に記載されたように、用語「抗体」は、通常、抗原として表わされる標的化合物に特異的に結合することができる、タンパク質、またはその一部のような特異的結合分子を表すために使用される。
【００２３】
そのような特異的結合分子の好ましい例は、単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、ＶＨＨ抗体としても知られる単一ドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、ナノボディ（単一ドメイン抗体に由来するラクダ）、またはＶＮＡＲと称される単一ドメイン抗体フラグメントに由来するサメＩｇＮＡＲ、またはタンパク性アプタマーなどのそれらの他の活性成分のような、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの一部である。別の実施形態において、特定の結合分子は、抗体の抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。
【００２４】
機能的表現において、用語「複数の抗体」または「抗体」は、多くの場合「抗原」と称される標的分子に特異的に結合することができる、タンパク質、またはポリペプチドを表す。抗体（イムノグロブリンとしても知られる）は、好ましくは、脊椎動物の、血中または他の体液中に見出されるガンマグロブリンタンパク質であり、細菌およびウイルスなどの外来物質を特定し中和するための免疫システムによって使用される。
【００２５】
天然に生じるヒト抗体は通常、基本構造ユニットであって、それぞれ２つの重鎖と２つの軽鎖とを有する基本構造ユニットからなり、たとえば、１つのユニットを有するモノマー、２つのユニットを有するダイマー、または５つのユニットを有するペンタマーを形成する。
【００２６】
抗体は、Ｂ細胞と称される白血球の１種によって産生される。いくつかの異なる種類の抗体重鎖が存在し、いくつかの異なる種類の抗体は、それらが有する重鎖に基づいて異なるアイソタイプにグループ分けされる。５つの異なる抗体アイソタイプが哺乳類において知られており、異なる機能を果たし、それらが遭遇する外来物質の各種類に対する好適な免疫応答を直接に促進する。ラクダ（たとえば、リャマ）、およびサメなどのいくつかの動物種は、異常型の抗体構造を有してもよい。
【００２７】
全ての抗体の一般的な構造は、非常に類似しているが、タンパク質の先端部分における小領域は、非常に変わりやすく、わずかに異なる先端部分の構造を有する多数の抗体が存在することを可能にする。この領域は、高頻度可変領域として知られている。これらの変異体のそれぞれは、抗原として知られる様々な標的に結合することができる。この抗体の多様性は、免疫システムが、同様に広範な抗原の多様性を認識することを可能にする。抗体によって認識される抗原の特有部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、高度に特異的な相互作用であって、抗体が、生物を構成する数百万の様々な分子の中からそれらの特有の抗原のみを認識し結合することを可能にする相互作用でそれらの抗体に結合する。抗体による抗原の認識は、免疫システムの他の部分による攻撃のためにそれに標識を付する。抗体は、たとえば、感染をもたらす必要がある病原体の一部に結合することによって、標的を直接に中和することができる。
【００２８】
抗体の多種多様な集団は、様々な抗原結合部位（またはパラトープ）をコードする遺伝子セグメントのセットのランダムな組み合わせによって生じ、さらなる多様性を生み出す、抗体遺伝子のこの領域におけるランダム変異に続く。また、抗体遺伝子は、重鎖の塩基を別のものに変化させ、抗原特異的可変領域を保持する抗体の様々なアイソタイプを生じるクラススイッチングと称される過程で再編成される。このことは、単一の抗体を、免疫系のいくつかの異なる部分ごとに、いくつかの異なるアイソタイプで使用することを可能にする。
【００２９】
本明細書において「抗体」との用語は、したがって、単一鎖抗体、フラグメント抗原結合領域、組み換えて作製された抗体、モノクローナル抗体、ナノボディ、単一ドメイン抗体などを明確に含む。
【００３０】
抗体または他の特異的結合分子の文脈において「またはそれらの一部」との用語は、抗体、または特異的結合分子の特異的結合部位を構成する、抗体、または特異的結合分子の一部を表すことを意味し、フラグメントが由来する、全長抗体、または特異的結合分子と同一のエピトープに反応することができる、抗体、または特異的結合分子の一部として解釈されてもよい。
【００３１】
抗体、抗体の特異的結合ドメインを含む融合タンパク質、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体フラグメント、アンチカリンなどの他のタンパク質様の結合ドメイン、ならびにシトルリン化エピトープに特異的に結合する小分子などの全ての種類の特異的結合分子、およびそれらの誘導体は、本発明において使用することが可能である。
【００３２】
「シトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体」などの用語は、ポリペプチド、またはペプチド、またはペプチド核酸、またはタンパク質様アプタマー、またはペプチド模倣構造体などのより大きな構造体の文脈において、シトルリン残基、またはホモシトルリン残基に特異的に反応するが、シトルシン残基がアルギニン残基によって置換された同様の構造体とは反応しない抗体として解釈されるべきである。
【００３３】
シトルリンは、翻訳中にタンパク質に組み込まれないアミノ酸であるが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によってアルギニン残基の翻訳後修飾によって産生されてもよい。
【００３４】
シトルリン化は、アルギニン残基をシトルリン残基に翻訳後に変換することであり、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒される。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ；ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質中においてアルギニン残基をシトルリン残基に変換することを触媒する。ｔＲＮＡは、シトルリンについて存在せず、タンパク質中のシトルリン残基の存在は、翻訳後修飾の結果に限られる。哺乳類（ヒト、マウス、およびラット）において、それぞれ異なる遺伝子によってコードされる５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６；「ＰＡＤ４」および「ＰＡＤ５」は、同一のアイソタイプに使用される）が同定された（Vossenaar et al, Bioessays 25, 1106-1118, 2003）。これら全ての酵素は、活性についてＣａ２＋の存在に強く依存し、遊離のＬ−アルギニンを遊離のＬ−シトルリンに変換することができない。遊離のＬ−アルギニンは、真核生物において一酸化窒素合成酵素（ＥＣ  １．１４．１３．３９）によって、または細菌においてアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．６）によって、遊離のＬ−シトルシンに変換されてもよい。これらの酵素は、Ｃａ２＋依存性ではない。微生物のＰＡＤ酵素が好ましい。フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）に由来するＰＡＤ酵素が特に好ましい。そのような酵素は、アルペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などの異種発現システムにおいて発現されることが記載された（EP 2032697 A1）。
【００３５】
高度に類似したＰＡＤ酵素の間における最も著しい相違は、それらの組織特異的発現である。表皮において、ＰＡＤ１（同義語：ＰＡＤ  Ｉ、ＰＡＤＩ型）は、角化膜の再構築にとって重要であるケラチノサイト分化の最終段階の間におけるケラチンフィラメントのシトルリン化に関与する。表皮におけるシトルリン化の別の部位は、ＰＡＤ３（同義語  ＰＡＤＩＩＩ、ＰＡＤＩＩＩ型）と、その天然基質トリコヒアリン（ＴＨＨ）とを含む毛包である。ＴＨＨは、内毛根鞘細胞と、毛包、およびそれほどではないが、他の特定上皮の髄層との主な構造タンパク質である。最近同定されたＰＡＤアイソタイプであるＰＡＤ６（同義語：ｅＰＡＤ）は、初期の胚発生において重要な役割を果たすマウス卵母細胞の細胞性シートにおいて見出された。そのヒト相同分子種の発現は、卵巣、精巣、および末梢血白血球に限定されることが見出された（Chavanas et al., Gene vol 330; 19-27, 2004）。本来、このＰＡＤアイソタイプは、ｅＰＡＤと命名されたが、他のＰＡＤの系統的な番号付けに基づいて、このアイソタイプは、ＰＡＤ６に改名された（Vossenaar et al., Bioessays vol 25 1106-1118, 2003）。最も広く発現されるアイソタイプであるＰＡＤ２（同義語  ＰＡＤＩＩ、ＰＡＤＩＩ型、ＰＡＤ−Ｈ１９）は、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺、およびマクロファージなど多くの異なる組織に存在する。この広範な発現パターンにも関らず、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびビメンチンのみが、天然基質として同定された。多発性硬化症（ＭＳ）において、患者は、ＭＢＰに対する自己免疫応答を生じる。ＭＢＰは、ミエリン鞘の豊富なタンパク質であり、そのシトルリン化は、中枢神経系の発生の間に起こる。ビメンチンのシトルリン化は、カルシウムイオノフォア誘導性の、ヒトおよびマウスマクロファージのアポトーシスの間に観察され、上述のように、シトルリン化ビメンチンは、ＲＡ特異的な抗Ｓａ自己抗体の標的であることが示された。細胞の細胞質に主に局在する上述されたＰＡＤに対して、ＰＡＤ４アイソタイプ（同義語：ＰＡＤ  ＩＶ、ＰＡＤ  ＩＶ型、ＨＬ−６０  ＰＡＤ、ＰＡＤ  Ｖ、ＰＡＤ  Ｖ型、ＰＡＤＩ４）は、核内に局在する。ＰＡＤ４の核移行シグナルは、タンパク質のＮ末端領域において見出された。ＰＡＤ４は、末梢血顆粒球および単球において主に発現される。核内におけるＰＡＤ４の基質は、ヒストンコアタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ３、およびＨ４）、ならびにリボソームアセンブリ、核細胞質間輸送、および中心体複製において機能する核タンパク質ヌクレオフォスミン／Ｂ２３である。
【００３６】
また、シトルリン化された、イムノグロブリンまたは抗体は、リジン残基をホモシトルリン残基に変換することによって化学的に得られてもよい。この処理は、多くの場合、カルバミル化と称される（実施例２）。
【００３７】
実施例１または２に記載されたようなシトルリン化抗体は、固体支持体上に固定化され、実施例３において用意されたようなＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＲＡの患者から得られた血液試料が、シトルリン化抗体におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体を含んでいるか否か測定された。
【００３８】
我々は、ＲＡの患者に由来する血清が、シトルリン化抗体、特にＩｇＧに特異的に反応する抗体を含むことを見出した。この目的のために、我々は、リウマチ因子を血清に含まない、ＲＡに罹患した７人の患者を選択した。これらの患者から得られた血清を実施例３のＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験したとき、７人の患者のうち６人（８６％）が、シトルリン化ＩｇＧに対する循環抗体を有するようであった（図１）。これらの６人の患者は、非シトルリン化ＩｇＧに対する抗体を有さず、ランダムに選択された７つの正常ヒト血清において、抗シトルシン化抗体（ＡＣＡ）が見出されなかった。
【００３９】
我々は、シトルリン化抗体が、ＲＡ特異的な自己抗体の検出のための有用な試薬であると結論付けた。一態様において、本発明は、したがって、シトルリン残基を含む抗体に向けられている。
【００４０】
そのような抗体は、上述のような任意の種から得られてもよい。好ましくは、抗体は、ウサギ、マウス、またはラット抗体などの哺乳類抗体のような脊椎動物抗体であり、さらに好ましくはＩｇＧ抗体、そのＦａｂフラグメント、またはナノボディである。シトルリン化ヒトＩｇＧ抗体が使用されてもよいが、あるアッセイフォーマットにおいては好ましくない。たとえば、シトルリン化ヒトＩｇＧ抗体は、ＡＣＡ抗体の検出に使用される標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に交差反応することによって、本明細書において記載されたような間接ＥＬＩＳＡアッセイにおいて非特異的なバックグラウンド反応をもたらし得る。
【００４１】
さらに、本発明は、対象に由来する試料中の関節リウマチに特異的な抗体を検出するための方法であって、試料が、シトルリン化抗体に接触し、当該試料が、シトルリン化抗体に特異的に反応する抗体を含むか否かを測定する方法に向けられている。
【００４２】
本明細書において使用されるように、「特異的に反応する」との用語は、ＲＡの個体に由来する第１抗体が、第２抗体に存在するシトルリン化エピトープに反応するが、第１抗体は、エピトープ中のシトルリン残基がアルギニン残基によって置換されたとき、第２抗体に反応しない免疫反応を表す。
【００４３】
本明細書に記載されたようなＡＣＡの特異的反応性は、リウマチ因子（ＲＦ）と混同されてはならない。リウマチ因子（ＲＦ）は、ＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体である。ＲＦおよびＩｇＧは、疾患過程に寄与する免疫複合体の形成に関わってもよい。リウマチ因子は、クリオグロブリン（血液試料の冷却において沈降する抗体）であってもよく、モノクローナル、またはポリクローナルＩｇＭであってもよい。まれに、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＤなどの他のアイソタイプが見出される。リウマチ因子は、しかしながら、ＡＣＡと特異的に反応しない。なぜなら、ＲＦは、通常の非シトルリン化抗体と、シトルリン化抗体とを識別しないからである。さらに、ＲＦは、ＩｇＧに向けられているが、ＡＣＡは、全てのアイソタイプのシトルリン化抗体に向けられている。
【００４４】
本発明に係る好ましい方法において、ＲＦが分析結果に干渉しないこと注意が払われる。このことは、当業者に公知の多くの方法で実施されてもよい。
【００４５】
本発明に係る方法においてＲＦの干渉は、たとえば、シトルリン化エピトープに特異的に向けられていない抗体の結合を検出するコントロールを実施することによって防止されてもよい。コントロール値は、続いて、上述のような方法で得られる値から減算されてもよい。
【００４６】
別の実施形態において、シトルリン化抗体に対するＲＦの結合は、回避されてもよい。たとえば、本方法において使用されるシトルリン化抗体は、ＲＦに反応しないような方法で選択されてもよい。そのようなものは、たとえば、ＩｇＧ分子のＦｃ部分を欠くシトルリン化Ｆａｂフラグメントを用いることによってもたらされる。別の実施形態において、シトルリン化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤアイソタイプであってもよい。
【００４７】
さらなる別の変形例において、シトルリン化抗体は、単一ドメイン抗体などの組み換え抗体のような非ヒト起源のものであってもよい。
【００４８】
本明細書において使用されるように、「単一ドメイン抗体」との用語は、天然に生じる重鎖抗体の、特有の構造的、および機能的な特性を備える抗体由来のタンパク質を表す。この技術は、当初、ラクダ科（ラクダ、およびラマ）が軽鎖を欠く完全に機能的な抗体を有するとの発見に続いて開発された。これらの重鎖抗体は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）と、２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）とを含む。重要なことに、クローン化され、単離されたＶＨＨドメインは、本来の重鎖抗体の完全な抗原結合能力を有する完全に安定なポリペプチドである。
【００４９】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、開発元Ablynx社によってナノボディとも称される）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。全長抗体のように、特異的な抗原に選択的に結合することができる。１２〜１５ｋＤａのみの分子量を有し、単一ドメイン抗体は、２つの重タンパク質鎖と２つの軽鎖とからなる通常の抗体（１５０〜１６０ｋＤａ）よりも非常に小さく、Ｆａｂフラグメント（５０ｋＤａ以下、１つの軽鎖、および半分の重鎖）、ならびに単一鎖可変フラグメント（２５ｋＤａ以下、２つの可変ドメイン、１つは軽鎖に由来し、１つは重鎖に由来する）よりもさらに小さい。
【００５０】
軟骨性の魚類は、ＶＮＡＲフラグメントと称される単一ドメイン抗体を得ることができる重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「イムノグロブリン新規抗原受容体」）を有する。別の手段は、ウサギ、マウス、ラット、またはヒトなどの哺乳類に由来する通常のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）に由来する二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体に向けられた大部分の研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づくものであるが、軽鎖に由来するナノボディは、標的のエピトープに特異的に結合することが示された。
【００５１】
単一ドメイン抗体は、重鎖抗体、または通常のＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む約１１０アミノ酸の長さのペプチド鎖である。これらのペプチドは、抗原に対して全長抗体と同様の親和性を有するが、より耐熱性であり、界面活性剤、および高い尿素濃度に対して安定である。ラクダ科および魚類抗体に由来するものは、通常、軽鎖に結合する新油性部位を被覆する伸長したループを形成するそれらの相補性決定領域３（ＣＤＲ３）によって、新油性が低く、水中でさらに安定である。通常の抗体に対して、いくつかの単一ドメイン抗体は、９０℃まで耐熱性である。
【００５２】
さらなる別の実施形態において、試験される対象に由来する試料は、ＲＦを減少させられてもよく、またはＲＦは、試験前に不活性化されてもよい。この目的のために、特異的なＩｇＭ阻害剤が市販されている。当業者は、現在開示された方法とともに、ＲＦの干渉を防ぐために採用され得る方法の多様性を十分に理解している。
【００５３】
そのような方法の好ましい実施形態において、シトルリン化抗体は、固体支持体上に固定化される。そのような方法を実施する多数の方法が存在し、当業者は、特定の利点と欠点とを有する様々な固体支持体を十分に理解している。固体支持体は、ガラス、ニトロセルロース、ポリスチレン、紙、または市販されている任意の他の種類の支持体からなる群から有利に選択されてもよい。特に好ましい実施形態において、固体支持体は、たとえばＥＬＩＳＡプレートなどのポリスチレンである。さらに好ましい実施形態において、本発明は、ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットで実施される方法に関する。
【００５４】
ＲＡの患者がシトルリン化抗体（ＡＣＡ）に対する抗体を産生するという発見は、従来技術に記載されたアッセイを超える特有の利点を有するアッセイフォーマットを製造することを可能にした。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態に係る方法において、シトルリン化抗体は、赤血球細胞に付着する。このことは、赤血球細胞と、ＩｇＧ抗体、または任意の他のアイソタイプの抗体などのランダムな特異性を有するシトルリン化抗体とをインキュベートすることによってなされてもよい。それは、特定の方法によって、つまり、赤血球細胞の細胞外表面の構成要素と特異的に反応するシトルリン化抗体を用いることによってなされてもよい。
【００５６】
たとえば、我々は、赤血球細胞の細胞外表面の構成要素であるグリコホリンＡに対するシトルリン化抗体を作製した。実施例１は、抗体とＰＡＤを用いるそのシトルリン化とを詳細に示す。
【００５７】
「赤血球細胞の細胞外表面の構成要素」との用語は、赤血球細胞の外側に発現される抗原決定基を示すために本明細書において使用される。現在、国際輸血学会によって認知された３００を超える赤血球細胞表面抗原決定基が存在する。これらの大部分は、２９の血液型の１つに属する（Daniels, G., ISBT Science Series, 1: 3 - 8 (2006)）。ＭＮＳ抗原システムは、４番染色体における２つの遺伝子（グリコホリンＡおよびグリコホリンＢ）に基づくヒト血液型である。
【００５８】
別の、および／または好ましい細胞外表面の構成要素は、Daniels（同上）の表１に挙げられ、尿素輸送体（ＵＴ）−Ｂ、アクアポリン１、アクアポリン３、ＣＤ２３３、ＣＤ２４１、ＣＤ２４０Ｄ、ＣＤ２４０ＣＥ、Ｘｋタンパク質、ＣＤ２３４、ＣＤ３２９、ＣＤ２４２、ＥＲＭＡＰ、ＣＤ１４７、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ９９、ＣＤ１０８、ＣＤ１５１、アセチルコリンエステラーゼ、ＣＤ２３８、ＣＤ２９７、ＣＤ２３６Ｃ、ＣＤ２３６Ｄ、ＣＤ２３５Ａ、およびＣＤ２３５Ｂを含む。
【００５９】
グリコホリンＡ（ＧＹＰＡ）、およびＢ（ＧＹＰＢ）は、その中で好ましく、Ｍ、Ｎ、およびＳｓ血液型についての抗原決定基を有する主なヒト赤血球膜シアロ糖タンパク質である。全ての集団において一般に生じる、Ｍ、またはＮ、およびＳ、またはｓ抗原に加えて、約４０の関連する変異表現型が特定された。これらの変異体は、Miltenberger複合体の全ての変異体と、Ｓｔａのいくつかのアイソフォーム、Ｄａｎｔｕ、Ｓａｔ、Ｈｅ、Ｍｇ、ならびに欠失変異体Ｅｎａ、Ｓ−ｓ−Ｕ−、およびＭｋとを含む。変異体の大部分は、ＧＹＰＡおよびＧＹＰＢの間の遺伝子組み換えの結果である。［http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=2993］。
【００６０】
ヒトグリコホリンＡに対する抗体は、たとえば、BioLegend社（http://www.biolegend.com/pacific-blue-anti-human-cd235a-glycophorin-a-antibody-7880.html）から、Abcam社、ケンブリッジ、イギリスから、またはAntibodies Onlineから、GlycAのＮ末端部分に対するウサギポリクローナルＩｇＧ抗体であるABIN337240として市販されている。グリコホリンＡに特異的なナノボディも報告された（３０）。
【００６１】
実施例１に概説された手順に従って得られたシトルリン化グリコホリンＡ抗体は、赤血球凝集アッセイフォーマットを用いてＲＡ患者から得られた試料におけるシトルリン化抗原（ＡＣＡ）に対する抗体の存在を決定することを可能にした（実施例４）。
【００６２】
その実施形態の１つにおいて、本発明は、したがって、検出が、赤血球凝集アッセイにおいて行われる上述されたような方法に関する。
【００６３】
さらに詳細には、本発明は、上述されたような方法であって、ａ）シトルリン化抗体を提供する工程、ｂ）対象に由来する抗体を含む試料を提供する工程、ｃ）赤血球細胞を提供する工程、ｄ）シトルリン化抗体を、試料と赤血球細胞とに接触させる工程、およびｅ）赤血球細胞の凝集が生じるか否か検出する工程を含み、凝集が、試料中の関節リウマチに特異的な抗シトルリン化抗体の存在を示す方法に関する。
【００６４】
上述の方法の工程ｄ）は、シトルリン化抗体と試料および赤血球細胞との接触を、同時に実施する必要があると非常に狭く解釈されるべきではない。本方法は、シトルリン化抗体が、最初に赤血球細胞に接触し、その後にのみ、シトルリン化抗体（ＡＣＡ）に対する抗体を含む試料に接触する場合、良好に作用する。使用の効率化の観点から、しかしながら、同時に、またはほぼ同時に接触を実施することが好ましい。
【００６５】
本明細書において「ほぼ同時」との用語は、４分間、または３、２、もしくは１分間未満などの５分間未満の間隔を意味する。
【００６６】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、自己の赤血球細胞が使用される凝集アッセイに関する。言い換えれば、本発明は、工程ｂ）からの抗体と、工程ｃ）からの赤血球細胞とが、同一の試料に含まれる上述されたような方法に関する。さらに好ましい実施形態において、赤血球細胞は、対象に由来する。
【００６７】
我々は、そのような自己凝集アッセイを開発し、上述のような７人のＲＡ患者に由来する試料を試験した。自己凝集アッセイの結果は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて得られた結果を裏付けた（表１）。
【表１】
0006543332.tif 000002
【００６８】
我々は、関節リウマチの患者の８０％以上が、彼らの血中にＡＣＡ循環を有することを見出した。試験されたコントロール患者は、そのような抗体を有さなかった。我々は、ＡＣＡが信頼でき、非常に感受性が高く、ＲＡについて特異的なマーカ抗体であると結論付けた。
【００６９】
理論に束縛されることを望むものではないが、我々は、シトルリン化ＧｌｙｃＡ抗体が、シトルリン化エピトープを有する赤血球細胞を覆い、それによって、赤血球細胞を、ＲＡ患者の血清および血液に存在するＡＣＡに向けると考える。ＡＣＡ抗体が存在するとき、赤血球細胞は、凝集する。自己凝集アッセイにおいて、ＲＡ患者の赤血球細胞は、シトルリン化エピトープによって覆われ始め、患者自身の抗体は、ＡＣＡが血中に存在する場合、赤血球細胞を凝集させるであろう。
【００７０】
計画的研究において、我々は、関節リウマチの臨床徴候を示さないが、１０年以内に関節リウマチを発症した多くの対象は、血中にＡＣＡを有することを見出した。我々は、ＡＣＡがＲＡの予後マーカであると結論付けた。
【００７１】
［実施例］
実施例１：シトルリン化ＩｇＧの作製
ウサギＩｇＧ（２５ｕｇ）は、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて脱イミノ化緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＤＴＴ）中でウサギ骨格筋ＰＡＤ（７５ｍＵ；Sigma-Aldrich社；ＥＣ３．５．３．１５）によってシトルリン化され、３７℃で３時間インキュベートされた。反応は、５０ｍＭの濃度までｐＨ８．０のＥＧＴＡを添加することによって停止された。シトルリン化されたウサギＩｇＧは、２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６に対して一晩透析後に得られた。
【００７２】
Abcam社、イギリス、から得られたヤギグリコホリンＡ抗体（２５ｕｇ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ウサギ骨格筋ＰＡＤ（７５ｍＵ；Sigma-Aldrich社；ＥＣ３．５．３．１５）によって脱イミノ化緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５ｍＭ  ＣａＣｌ２，および１ｍＭ  ＤＴＴ）中でシトルリン化され、３時間にわたって３７℃でインキュベートされた。反応は、５０ｍＭの濃度までＥＧＴＡ  ｐＨ８．０を添加することによって停止された。シトルリン化されたヤギＩｇＧは、２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６に対して一晩透析後に得られた。
【００７３】
別のグリコホリンＡ抗体は、Santa Cruz Biotechnology社から得られた。R10 sc-53905は、グリコホリンＡの細胞外ドメインに対するモノクローナルＩｇＧ１マウス抗体である。この抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ウサギ骨格筋ＰＡＤ（７５ｍＵ；Sigma-Aldrich社；ＥＣ３．５．３．１５）によって脱イミノ化緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＤＴＴ）中でシトルシン化され、３時間にわたって３７℃でインキュベートされた。この反応は、５０ｍＭの濃度まで、ＥＧＴＡ  ｐＨ８．０を添加することによって停止された。シトルリン化マウスＩｇＧは、２ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６に対して一晩透析後に得られた。
【００７４】
ＰＡＤ酵素が添加されない、種が一致するＩｇＧ調製物の並行インキュベーションは、ネガティブコントロールとして扱われた。
【００７５】
実施例２：カルバミル化ＩｇＧの作製
カルバミル化ＩｇＧは、３７℃で３時間にわたって０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４−緩衝液中で１ｍＬの０．２Ｍ  ＫＣＮＯを有する１ｍＬ  ＰＢＳ中に溶解された１．１８ｍｇのラビットＩｇＧをインキュベートすることによって得られた。カルバミル化ＩｇＧは、続いて０．９％  ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析され、使用まで４℃で保存された。このＩｇＧは、ＲＡの患者に由来する血清における抗シトルリン化抗体の検出についてのＥＬＩＳＡアッセイにおける抗原として使用された。非カルバミル化ＩｇＧは、そこでコントロールとして使用された。
【００７６】
実施例３：シトルリン化抗体を用いるＥＬＩＳＡ
シトルリン化抗体に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイは、以下のように開発された。上述のように作製されたシトルリン化ＩｇＧは、１ミリリットルあたり１００マイクログラムのシトルリン化ＩｇＧをウェル毎に５０マイクロリットルで一晩３７℃でインキュベートすることによってＮＵＮＣ  ＥＬＩＳＡプレート上に固定化された。余剰の結合部位は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に１ミリリットルあたり１００マイクログラムのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を５０マイクロリットル添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによってブロックされた。プレートは、続いてＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）を用いて３回洗浄され、直ちに使用されない場合、４℃で乾燥保存された。
【００７７】
コントロールプレートは、固相に固定化された種が一致するコントロールに由来する非シトルリン化抗体を含むコントロールプレートを除いて、正確に同じ方法で作製された。
【００７８】
リウマチ因子について陰性であることが既知のＲＡ患者に由来するヒト血清の連続的な希釈（１／１０〜１／１００，０００）は、シトルリン化ＩｇＧに対する抗体の存在を調べるために使用された。５０マイクロリットルの各連続的希釈液は、マイクロタイタープレートのウェルを満たし、３時間にわたって３７℃でインキュベートされた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いる３回の洗浄後、ＰＢＳにおけるウサギホースラディッシュペロキシダーゼ標識された抗ヒトＩｇＧの１：１０００希釈液の５０マイクロリットルが、添加され、３７℃で２時間にわたってインキュベートされた。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いる３回の洗浄後、１００マイクロリットルのＴＭＢが、各ウェルに添加され、プレートは、３７℃で３０分間にわたって暗所でインキュベートされた。反応は、５０マイクロリットルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加することによって停止され、吸光度は、TiTerTek multiscan（Flow laboratories社、アーバイン、イギリス）を用いて４５０ｎｍで読み取られた。
【００７９】
シトルリン化ウサギＩｇＧを用いて得られた代表的な結果は、図１に示される。上述されたような他のシトルリン化イムノグロブリンは、同等の結果をもたらした。
【００８０】
実施例４：赤血球凝集アッセイ
自己凝集試験は、５０マイクロリットルの、患者血液、またはコントロール血液を、１ミリリットルあたり２０マイクログラムのシトルリン化グリコホリンＡ抗体の有無で０．１％ＢＳＡを含む５０マイクロリットルのＰＢＳに混合することによってガラスカバースリップ上で実施された。混合液は、約１センチメートルの直径を有する円までガラス表面上に広げられ、凝集は、２分後に目視で評価された。
【００８１】
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【図１】
0006543332.tif 000003