(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ  有効量の４−ヘキシルレゾルシノールと、
ｂ  有効量のガラルジンとを含む、美白組成物。
【請求項２】
０．００００１〜１０重量％のガラルジンを含む、請求項１に記載の美白組成物。
【請求項３】
０．００１〜１０重量％のヘキシルレゾルシノールを含む、請求項１または請求項２に記載の美白組成物。
【請求項４】
美白剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の美白組成物。
【請求項５】
局所用組成物の形態での、請求項１〜４のいずれか１項に記載の美白組成物。
【請求項６】
美白のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物の非治療的使用。
【請求項７】
ヒトの皮膚を明るくする非治療的方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を前記皮膚に塗布するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーソナルケア組成物、特に美白組成物の分野における発明である。
【背景技術】
【０００２】
大半の人々は、自身の皮膚における色素沈着の程度を気にしている。例えば、加齢斑またはそばかすのある人々は、このような色素斑がより目立たなくなることを望む場合がある。その他の人々は、日光を浴びることに起因する皮膚の黒ずみを軽減すること、または自身の本来の皮膚色を明るくすることを望む場合がある。この要望を満たすために、メラノサイトの色素産生を減少させる製品を開発する多くの試みがなされてきた。しかしながら、これまでに同定された物質は、低い効力または望ましくない副作用、例えば、毒性もしくは皮膚刺激などのいずれかを有する傾向がある。したがって、全般的に改善された有効性を有する新規の化粧用美白剤に対する必要性が引き続き存在する。
【０００３】
従来の美白組成物は、メラニンの分散を制御する、またはチロシナーゼを阻害すると考えられている美白剤の使用に基づく。これらの美白剤としては、ナイアシンアミド、アゼライン酸およびコウジ酸のようなカルボン酸、植物抽出物ならびにヒドロキノンなどが挙げられる。ヘキシルレゾルシノールは、局所適用のための組成物中で非常に幅広く使用されている美白剤の１種である。
【０００４】
色素沈着過剰を招く皮膚の経路を標的とするヘキシルレゾルシノールの能力により、これは美白成分のカテゴリーへと推進されてきた。ヘキシルレゾルシノールは、さらに他の利益を有し、例えば、小じわおよびしわの出現を軽減する能力、ＵＶＢおよびＵＶＡ線に対する保護を高める能力、ならびに汚染および日光曝露に対する皮膚のバリアを改善する能力を含むとも考えられている。
【０００５】
ヘキシルレゾルシノールは、チロシナーゼ酵素活性を直接阻害するその能力によりメラノサイト中のメラニン含有量を減少させることが実証され、それにより美白効力を提供するその能力に大きな役割を果たすと考えられている。
【０００６】
しかしながら、メラノサイト中のメラニン含有量を減少させる、より効果的な方法が、依然として望まれている。
【０００７】
特許文献１（ＭｃＤａｎｉｅｌ）は、哺乳動物の皮膚からの活性剤輸送を増強する方法について開示していて、これは皮膚を超音波に曝露して活性剤を皮膚に塗布することを含み、活性剤を皮膚に塗布するステップは、活性剤を皮膚に注入することを含み、活性剤は、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＡ、ビタミンＫ、ビタミンＦ、レチンＡ（トレチノイン）、アダパレン、レチノール、ヒドロキノン、コウジ酸、成長因子、エキナセア、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、漂白剤、αヒドロキシ酸、βヒドロキシ酸、サリチル酸、抗酸化剤３種化合物、海草誘導体、塩水誘導体、抗酸化剤、フィトアントシアニン、植物栄養素、植物生成物、草本生成物、ホルモン、酵素、鉱物、遺伝子組換え物質、補因子、触媒、老化防止物質、インスリン、微量元素、鉱物、Ｒｏｇａｉｎｅ、育毛刺激物質、育毛阻害物質、色素、天然または合成メラニン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、プロリン、ヒドロキシプロリン、麻酔物質のうち少なくとも１つを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／１２０２２５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＭＭＰ阻害剤であるガラルジンと組み合わせた４−ヘキシルレゾルシノールは、メラノサイト中のメラニン含有量を相乗的に減少させることが見出された。したがって、本発明は、美白に使用するための４−ヘキシルレゾルシノールおよびガラルジンの相乗的組合せを含む組成物に関する。それゆえ、組成物は、インビボにおいて適切な時間の長さで局所的に塗布される場合、皮膚を明るくするために、または、加齢斑もしくはそばかすを軽減するために使用されてよい。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、第１の態様では、本発明は、有効量の４−ヘキシルレゾルシノール、および有効量のガラルジンを含む美白組成物を提供する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、美白のための本発明による組成物の使用を提供する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、ヒトの皮膚を明るくする方法を提供し、本方法は本発明による組成物を皮膚上に塗布するステップを含む。
【００１３】
これらおよびその他の態様、特徴ならびに利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を読むことで、当業者に明らかになるであろう。誤解を避けるため、本発明の１つの態様における任意の特徴は、本発明におけるその他の任意の態様で利用されてよい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味するが、必ずしも「からなる」または「から構成される」を意味することを意図するものではない。言い換えれば、列挙したステップまたは選択肢が網羅的である必要はない。以下の記載で示されている実施例は、本発明を明確にすることを意図するものであって、本発明をこれらの実施例それ自体に限定することを意図するものではないことに留意する。同様に、全ての百分率は、別段の指示がない限り重量／重量百分率である。操作実施例および比較実施例、または別段の明示的な指示がある場合を除いて、材料の量もしくは反応の条件、材料の物理的特性および／または使用量を示す本記載における全ての数値は、「約」という単語で修飾されると理解されるべきである。「ｘからｙまで」という形式で表現される数値範囲は、ｘおよびｙを含むと理解される。特定の特徴について、複数の好ましい範囲が「ｘからｙまで」という形式で記載されている場合、異なる端点を組み合わせる全ての範囲も考察されると理解される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様では、美白組成物が提供され、この組成物は４−ヘキシルレゾルシノールおよびガラルジンを含む。
【００１５】
４−ヘキシルレゾルシノール
４−ヘキシルレゾルシノールは、局所麻酔特性および防腐特性を有する有機化合物である。化学的には、これは黄白色の置換フェノール化合物である。本発明で使用される４−ヘキシルレゾルシノールの構造は、以下に示される。
【化１】
0006609317.tif 000002
【００１６】
本発明の組成物は、有効量の４−ヘキシルレゾルシノールを含み、典型的にはその濃度は、組成物の０．００１〜１０重量％、好ましくは少なくとも０．０１重量％、より好ましくは少なくとも０．１重量％、さらに好ましくは少なくとも０．２５重量％、より一層好ましくは少なくとも０．５重量％、なおさら好ましくは少なくとも１重量％、あるいは少なくとも２重量％で、ただし、好ましくは組成物の８重量％以下、より好ましくは６重量％以下、さらに好ましくは５重量％以下、なおさら好ましくは４重量％以下、あるいは３重量％以下である。
【００１７】
ガラルジン
ＧＭ６００１またはイロマスタットとしても知られるガラルジンは、以下の構造を有する広域スペクトルのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である。
【化２】
0006609317.tif 000003
【００１８】
ガラルジンは、可逆的なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤のヒドロキサム酸類のメンバーである。ヒドロキサム酸基のアニオン状態は、活性部位の亜鉛と二座錯体を形成する。
【００１９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、マトリックスリモデリングにおけるそれらの役割で知られ、皮膚細胞、例えばメラノサイト、ケラチノサイトおよび線維芽細胞などを含む、様々な細胞から分泌される。ガラルジンは、広域スペクトルの合成マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤であって、ＭＭＰ−１、２、３、７、８、９、１２、１４、２６に対して強力な活性を有する。１９９０年代に最初に報告されたガラルジンは、ＭＭＰの活性部位への結合を促進するコラーゲン様主鎖およびＭＭＰの触媒ドメインに位置する亜鉛イオンをキレート化するヒドロキサメート構造（Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＯＨ、式中、Ｒは有機残基である）を有する。プロＭＭＰがそれらの活性型に変換されるのを防ぐことにより、ＭＭＰを調節すると報告されている。
【００２０】
メラニンが、アミノ酸のチロシンの酸化、続いて重合により形成される色素群であることを考慮すると、ガラルジンが４−ヘキシルレゾルシノールと共にメラノサイト中のメラニン含有量を減少させる役割も果たすことは、驚くべきことである。さらに、ガラルジンは、チロシナーゼの阻害に対して効果を有するようにも見えず、チロシナーゼはチロシンのオキシダーゼであって銅含有タンパク質であるが、メタロプロテイナーゼではなく、効果は本明細書の以下の実施例で実証される通りである。
【００２１】
本発明は、４−ヘキシルレゾルシノールと組み合わせることにより、一次ヒトメラノサイト中のメラニン含有量を相乗的に調節するガラルジンの役割を強調する。
【００２２】
本発明の組成物は、有効量のガラルジンを含み、典型的にはその濃度は、組成物の０．００００１〜１０重量％、好ましくは少なくとも０．０００１重量％、より好ましくは少なくとも０．００１重量％、さらに好ましくは少なくとも０．００１重量％、より一層好ましくは少なくとも０．１重量％、なおさら好ましくは少なくとも０．５重量％、あるいは少なくとも１重量％で、ただし、好ましくは組成物の８重量％以下、より好ましくは５重量％以下、さらに好ましくは４重量％以下、より一層好ましくは３重量％以下、なおさら好ましくは２重量％以下あるいは１．５重量％以下である。
【００２３】
その他の成分
本発明の組成物は、化粧品として許容されるビヒクルをさらに含んでよく、これは組成物中で使用される美白剤のための希釈剤、分散剤および／または担体として、組成物が皮膚に塗布される場合に、それらの分散を促進するように機能する場合がある。本発明での使用に好適な化粧品として許容されるビヒクルは、水性、無水またはエマルジョン、水性またはエマルジョン、特に最も好ましくは油中水型または水中油型エマルジョンであってよい。水は、存在する場合、組成物の残部を通常構成する。好ましくは、水は、組成物の５〜９９重量％、より好ましくは２０〜８０重量％、さらに好ましくは４０〜８０重量％の濃度で存在する。
【００２４】
水の他に、有機溶媒も本発明の組成物内で担体として働いてよい。
【００２５】
皮膚軟化剤も、本発明の組成物中で化粧品として許容される担体として使用されてよい。皮膚軟化剤は、一般にシリコーンオイルおよび合成エステルの形態である。シリコーンオイルは、揮発性および不揮発性であってよい。揮発性シリコーンオイルは、３〜９個、好ましくは４〜５個のケイ素原子を含有する環状または直鎖ポリジメチルシロキサンから好ましくは選択される。皮膚軟化剤材料として有用な不揮発性シリコーンオイルとしては、ポリアルキルシロキサン、ポリアルキルアリールシロキサンおよびポリエーテルシロキサンコポリマーが挙げられる。本明細書で有用な本質的に不揮発性のポリアルキルシロキサンとしては、例えば、ポリジメチルシロキサンが挙げられる。
【００２６】
使用されてよいエステル皮膚軟化剤は、以下の通りである。
【００２７】
ａ）１０〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸のアルケニルまたはアルキルエステル。その例としては、ネオペンタン酸イソアラキジル、イソナノン酸イソノニル、ミリスチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、およびオレイン酸オレイルが挙げられる。
【００２８】
ｂ）エトキシ化脂肪族アルコールの脂肪酸エステルなどのエーテルエステル。
【００２９】
ｃ）多価アルコールエステル。エチレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ジエチレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール（２００〜６０００）モノおよびジ脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノおよびジ脂肪酸エステル、モノオレイン酸ポリプロピレングリコール２０００、モノステアリン酸ポリプロピレングリコール２０００、モノステアリン酸エトキシ化プロピレングリコール、グリセリルモノおよびジ脂肪酸エステル、ポリグリセロールポリ脂肪酸エステル、モノステアリン酸エトキシ化グリセリル、モノステアリン酸１，３−ブチレングリコール、ジステアリン酸１，３−ブチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが、満足のいく多価アルコールエステルである。
【００３０】
ｄ）蜜蝋、鯨蝋、ミリスチン酸ミリスチル、ステアリン酸ステアリルおよびベヘン酸アラキジルなどのワックスエステル。
【００３１】
ｅ）ステロールエステル、そのコレステロール脂肪酸エステルが例である。
【００３２】
皮膚軟化剤は、組成物の０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％の範囲で組成物中に存在してよい。
【００３３】
１０〜３０個の炭素原子を有する脂肪酸も、本発明の組成物中に化粧品として許容される担体として含まれてよい。このような脂肪酸の実例は、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リシノール酸、アラキジン酸、ベヘン酸、エルカ酸およびこれらの混合物である。
【００３４】
多価アルコール型の保湿剤も、本発明の組成物中で化粧品として許容される担体として用いられてよい。保湿剤は、皮膚軟化剤の有効性を高めるのに役立ち、落屑を軽減し、堆積した鱗屑の除去を促して肌触りを改善する。典型的な多価アルコールとしては、グリセロール、ポリアルキレングリコール、より好ましくはアルキレンポリオールおよびそれらの誘導体、例えば、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの誘導体を含み、ソルビトール、ヒドロキシプロピルソルビトール、ヘキシレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２，６−ヘキサントリオール、エトキシ化グリセロール、プロポキシル化グリセロールならびにこれらの混合物が挙げられる。最良の結果のためには、保湿剤は、好ましくはプロピレングリコールまたはヒアルロン酸ナトリウムである。組成物中の保湿剤の濃度は、組成物の０．５〜３０重量％、好ましくは１〜１５重量％の範囲であってよい。
【００３５】
増粘剤も、本発明による組成物において化粧品として許容される担体の一部として利用されてよい。典型的な増粘剤としては、架橋アクリレート（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９８２）、疎水変性アクリレート（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  １３８２）、セルロース誘導体および天然ガムが挙げられる。有用なセルロース誘導体の中には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロースおよびヒドロキシメチルセルロースがある。本発明に好適な天然ガムとしては、グアーガム、キサンタンガム、スクレロチウムガム、カラギーナンガム、ペクチンガムおよびこれらのガムの組合せが挙げられる。組成物中の増粘剤の濃度は、０．０００１〜５重量％、通常は０．００１〜１重量％、最適には０．０１〜０．５重量％の範囲であってよい。
【００３６】
水、溶媒、シリコーン、エステル、脂肪酸、保湿剤および／または増粘剤を合わせると、化粧品として許容される担体を組成物の１〜９９．９重量％、好ましくは８０〜９９重量％の量で構成するだろう。
【００３７】
界面活性剤も、本発明の組成物中に存在してよい。界面活性剤の総濃度は、組成物の０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２０重量％、最適には１〜５重量％の範囲だろう。界面活性剤は、アニオン、非イオン、カチオンおよび両性の活性物質からなる群から選択されてよい。特に好ましい非イオン性界面活性剤は、疎水性物質１モル当たり２〜１００モルのエチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと縮合したＣ１０〜Ｃ２０脂肪族アルコールまたは酸性疎水性物質、２〜２０モルのアルキレンオキシドと縮合したＣ２〜Ｃ１０アルキルフェノール、エチレングリコールのモノおよびジ脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリド、ソルビタン、モノおよびジＣ８〜Ｃ２０脂肪酸、ブロックコポリマー（エチレンオキシド／プロピレンオキシド）、ならびにポリオキシエチレンソルビタンに加えてこれらの組合せを含むものである。アルキルポリグリコシドおよび糖脂肪アミド（例えば、メチルグルコンアミド）も、好適な非イオン性界面活性剤である。
【００３８】
好ましいアニオン性界面活性剤としては、石鹸、アルキルエーテル硫酸塩およびスルホン酸塩、アルキル硫酸塩およびスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルおよびジアルキルスルホコハク酸塩、Ｃ８〜Ｃ２０アシルイセチオン酸塩、アシルグルタミン酸塩、Ｃ８〜Ｃ２０アルキルエーテルリン酸塩ならびにこれらの組合せが挙げられる。
【００３９】
日焼け止めは、紫外線をブロックするために通常用いられるこれらの材料を含む。例示的な化合物は、ＰＡＢＡ、ケイ皮酸塩およびサリチル酸塩の誘導体である。例えば、アボベンゾフェノン（Ｐａｒｓｏｌ  １７８９（登録商標））メトキシケイ皮酸オクチルおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）が使用され得る。メトキシケイ皮酸オクチルおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれＰａｒｓｏｌ  ＭＣＸおよびＢｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ−３という商標で市販されている。組成物中で用いられる日焼け止めの正確な量は、太陽のＵＶ放射からの望ましい保護程度に応じて変動し得る。太陽光線を反射または散乱させる添加剤も用いられてよい。これらの添加剤としては、酸化亜鉛および二酸化チタンのような酸化物が挙げられる。
【００４０】
本発明の組成物は、幅広いその他の任意構成成分を含むことができる。ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれ、これはスキンケア産業で通常使用されている多種多様の非限定的な化粧品成分および医薬成分について記載し、それらは本発明の組成物での使用に好適である。例としては、抗酸化剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝剤、着色剤、ポリマー、収斂剤、芳香剤、乳白剤、コンディショナー、剥離剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、天然抽出物、精油、皮膚感覚剤、皮膚鎮静剤、および皮膚治癒剤が挙げられる。
【００４１】
本発明の組成物を作製する場合、所望の成分は順不同で、通常は約７０〜約８０℃の温度で大気圧下において混合される。
【００４２】
本発明の組成物の包装は、パッチ、ボトル、チューブ、ロールボールアプリケータ、噴射剤駆動エアゾールデバイス、スクイズ容器または蓋付きのジャーであり得る。
【００４３】
第２の態様では、本発明は、美白のための本発明による組成物の使用に関する。
【００４４】
第３の態様では、本発明は、ヒトの皮膚を明るくする方法に関し、本方法は本発明による組成物を皮膚上に塗布するステップを含む。
【００４５】
本発明は、下記非限定的実施例によって以下に説明される。
【００４６】
［実施例］
［実施例１］メラニン阻害に対する４−ヘキシルレゾルシノールおよびガラルジンの効果に関するインビトロ研究
材料
（ｉ）一次ヒト新生児包皮メラノサイト、Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４およびＨｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
（ｉｉ）ガラルジン（Ｒ）−Ｎ４−ヒドロキシ−Ｎ１−［（Ｓ）−２−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチルカルバモイル−エチル］−２−イソブチル−スクシンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｉｉｉ）ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃ）
（ｉｖ）ヘキシルレゾルシノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｖ）カルセイン−ＡＭ、すなわちカルセインアセトキシメチルエステル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｖｉ）ＤＭＳＯ、すなわちジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｖｉｉ）水酸化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ  Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．）
（ｖｉｉｉ）ＨＥＰＥＳ、すなわち（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｉｘ）ＮａＣｌ、すなわち塩化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
（ｘ）ＮＰ４０、すなわちＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ  ４０（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
（ｘｉ）ＰＭＳＦ、すなわちフッ化フェニルメタンスルホニル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｘｉｉ）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
（ｘｉｉｉ）Ｌ−チロシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
方法
（ｉ）細胞培養：
新生児包皮一次ヒトメラノサイトを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国から調達した。細胞を、ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２を補充したＭｅｄｉｕｍ  ２５４中で増殖させて、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベータ内で維持した。細胞の維持および継代培養を、製造者の指示に従って実施した。３〜６回継代した細胞を実験に使用した。
【００４７】
（ｉｉ）活性物質の添加：
細胞を、２４ウェルプレートのＭｅｌａｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ（ＭＧＭ）中に５×１０４／ウェルの密度で播種して、２４時間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。活性物質を関連の対照物と共に細胞に添加した。活性物質処理後７２時間で、カルセイン法を使用して細胞生存能を決定し、続いて細胞メラニン含有量を測定した（以下のセクションに記載した）。
【００４８】
（ｉｉｉ）細胞生存能アッセイ：
簡潔に述べると、使用済み培地を除去して、細胞を０．２ｍｌの１倍ＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇ溶液で１回洗浄した。ＰＢＳ緩衝液中の新しい１μＭのカルセイン−ＡＭを各ウェルに添加した。プレートを３０分間３７℃でＣＯ２インキュベータ内においてインキュベートした。次いで、カルセイン蛍光をＴＥＣＡＮ製Ｍ１０００プレートリーダで測定した（４９０ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光）。
【００４９】
（ｉｖ）メラニン含有量アッセイ：
カルセイン測定後、培養物をＰＢＳ（１倍）ですすいで、ＮａＯＨ／ＤＭＳＯ混合物を使用して振盪インキュベータ内において１時間６０℃で溶解した。メラニン含有量をＴｅｃａｎ製プレートリーダ（４０５ｎｍフィルタ）で測定し、細胞数を補正して％阻害として表した。
【００５０】
（ｖ）インビトロでのヒトチロシナーゼ活性アッセイ：
一次ヒトメラノサイト溶解物をチロシナーゼ酵素の供給元として使用した。ヒトメラノサイト溶解物および試験活性物質を（異なる濃度で）チロシン／ＤＯＰＡ基質混合物の添加前に一緒に１５分間インキュベートした。次いで、アッセイプレートを３７℃で約１４〜１６時間インキュベートした。光学密度を４０５ｎｍで測定し、チロシナーゼ活性の％阻害を算出した。
【００５１】
結果
【表１】
0006609317.tif 000004
【表２】
0006609317.tif 000005
【００５２】
結論
上記の表（表Ｉ）は、ガラルジンを４−ヘキシルレゾルシノールと組み合わせることにより得られたメラニン含有量の相乗的減少を強調している。表Ｉのデータは、ガラルジン単独では、一次ヒトメラノサイト中のメラニン含有量は全く減少しなかったか（１μＭにて）、または、わずかに減少したか（１０μＭにて）のいずれかであったが、４−ヘキシルレゾルシノールでは、メラニン含有量が有意に減少したことを示している。しかしながら、ガラルジンおよび４−ヘキシルレゾルシノールを異なる比率で互いに組み合わせた場合、各活性物質の特定の試験濃度でメラニン含有量の相乗的な減少を得て、これは活性物質個々の減少の相加効果よりも高かった。
【００５３】
表ＩＩは、メラニン含有量の減少が、ガラルジンによるチロシナーゼ酵素活性の直接調節によるものではなく、４−ヘキシルレゾルシノールによるチロシナーゼ酵素活性の直接調節によるものであったことをさらに示している。