(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトンで修飾されたポリペプチドをオキシムで修飾されたポリペプチドに変換する方法であって、
還元可能なジスルフィド結合を含むポリペプチド、水性緩衝液、および１，３−ジハロアセトンの混合物を形成し、次いで前記ジスルフィド結合を還元できる還元剤を添加することによって、前記還元可能なジスルフィド結合を含むポリペプチドを、式［ＰＰ］−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−［ＰＰ］の連結基（式中、各Ｓは前記ジスルフィド結合に由来する硫黄であり、［ＰＰ］は前記連結基の末端が前記ポリペプチドに結合している場所を示す）を含むケトンで修飾されたポリペプチドに変換することと、
前記ケトンで修飾されたポリペプチドをアミン系促進剤の存在下で式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基と少なくとも１ｍｇ／ｍＬのポリペプチド濃度で接触させることを含み、式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基が、式Ｈ２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬの化合物（式中、Ｌはリンカーを表し、ＰＬはペイロード基を表す）である、前記方法。
【請求項２】
前記１，３−ジハロアセトンが、１，３−ジクロロアセトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元剤が、水溶性のホスフィンまたはホスフィン塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、抗体または抗体フラグメントである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記アミン系促進剤が、カルボキシ置換アニリンまたはアシルヒドラジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ケトンで修飾されたポリペプチドが、式：
【化１】
0006609563.tif 000064
（式中、円は前記ポリペプチドを表し、各硫黄原子は、前記ポリペプチドのシステイン残基のスルフヒドリルである）のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記オキシムで修飾されたポリペプチドが、式：
【化２】
0006609563.tif 000065
（式中、ＸはＯであり、Ｌはリンカーを表し、ｚは１〜１０の整数であり、ｍおよびｎはそれぞれ独立に１〜１０の整数であり、ＰＬ、ＰＬ１およびＰＬ２は、出現する毎に独立に、ペイロード基を表す）のものである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドがワクチン担体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペイロードが、治療薬を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペイロードが、検出可能な標識または結合基を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｌが、開裂可能な連結部分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｌが、
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０
）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン［式中、Ｚは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、および前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン部分は、それぞれ独立に、前記部分内に散在する１〜１０個の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］；
（ｃ）（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で、任意選択で置換されていてもよい］；
（ｄ）−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ−または−Ｊ−｛ＣＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ｝ｗ−（式中、ｖは１〜２，０００であり、ｗは１〜４であり、ＪはＣＨ２またはＮＨである）；
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸を含むペプチド；および
（ｆ）デンドリマー、デンドロン、および超分岐ポリマーを含む樹状高分子から選択される少なくとも１つのスペーサーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
広範な種類の化学的部分（「ペイロード」）が、酵素、抗体、およびその他の大きなポ
リペプチドまたはタンパク質に共有結合で結合し、複合体を形成している。ペイロードは
、それらが結合しているタンパク質の位置を特定するために（例えば、標識）、タンパク
質の物理化学的性質または安定性を改変するために（例えば、ＰＥＧ化）、タンパク質を
別の分子またはタンパク質に結合することを可能にするために（複合体を別の化合物また
は別の複合体に連結するためのカップリング基）、あるいはペイロードまたはタンパク質
の機能または活性を改変するために（例えば、ワクチン複合体）使用することができる。
タンパク質は、また、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）のように、結合したペイロードを特定
の組織または細胞型に送達するための担体として作用することができる。タンパク質に有
用的に連結させることのできる部類のペイロードとしては、検出可能な部分（標識）、タ
ンパク質を表面または別の化合物に結合するための繋留部分、タンパク質に複合された場
合に免疫応答を誘発する抗原、化学相補性カップリングパートナーと容易に反応する（し
たがって、タンパク質を別の存在物に連結する）カップリング基、および細胞毒およびそ
の他の生物活性薬剤などの治療部分が挙げられる。これらの多様な構造体をタンパク質に
、制御されおよび再現性のある様式で結合することは、複合体が正しく機能するために、
しばしば決定的に重要である。したがって、多くの種類のペイロードを多くの異なるタン
パク質またはポリペプチドに結合するための種々の方法が求められている。
【０００２】
ペイロードをタンパク質に結合してタンパク質複合体を形成するためのいくつかの方法
が開発されている。例えば、Sletten,E.M and Bertozzi,C.R.Angew.Chem. Int.Ed.2009,4
8,6974〜6998、Basle',E.,Joubert,N.,and Pucheault,M.Chemistry & Biology 2010,17,2
13〜227を参照されたい。一部のタンパク質複合体において、タンパク質とペイロードを
連結する方法は、複合体の活性または関連特性に検知できない影響を及ぼす可能性があり
、他の例において、タンパク質とペイロードとの間の連結部の性質が、複合体の活性また
は特性に重大な影響を及ぼすことがある。時には、例えば、タンパク質当たりのペイロー
ド部分の数を調節すること、またはペイロードがタンパク質の機能を妨害しないようにペ
イロードが結合する位置を精密に調節することが決定的に重要である。例えば、ＡＤＣは
、選択性を付与するために、タンパク質が標的細胞上の表面構造体を認識し、それに結合
することを必要とし、それゆえ、ペイロードは、抗体が認識しなければならない表面構造
体（抗原）への抗体の結合を妨害するように配置されてはならない。例えば、Expert Opi
n.Biol.Ther.2012,12,1191〜1206、Toxins 2011,3,848〜883、およびLaurent Ducry Drug
Delivery in Oncology:From Basic Research to Cancer Therapy,1st Edition Wiley-VC
H Verlag GmbH & Co.KGaA,2012,12,355〜374を参照されたい。
【０００３】
ペイロードをタンパク質に結合するためのほとんどの方法は、タンパク質と注目の特定
ペイロードとの間に連結化学構造（リンカー）を付加することを含む。リンカーは、それ
ぞれの部分上の利用可能な官能基を使用して、注目のペイロードをタンパク質に連結する
ための手段を提供する。リンカーは、しばしば、ペイロードとタンパク質との間の距離を
調節することを可能にし、インビボで溶解または分解して、タンパク質からペイロードを
放出することのできる開裂性部分を含むこともでき、ここで、該放出は、ペイロードがそ
の目的を達成するために重要である。例えば、ＡＤＣにおいて、複合体が所望の効果を有
することのできる場所で分解し、ペイロードを放出することが、決定的に重要である可能
性がある。ペイロードとタンパク質とを連結する方式に対して様々な要求を提起する多様
な部類のタンパク質−ペイロード複合体のために、ペイロードをタンパク質に堅実および
効率的に連結するための新規な方法が、求め続けられている。
【０００４】
タンパク質複合体を形成するための最も一般的な方法は、多くの天然タンパク質中に天
然に存在する特定のアミノ酸の化学反応性に依拠し、リシンおよびシステインは、ペイロ
ードをタンパク質に連結するための反応部位を提供するので、しばしば利用される。リシ
ンは、連結基またはペイロード上の適切な求電子性官能基と反応することのできる遊離ア
ミノ基を有し、システインは、その遊離スルフヒドリル基を介して反応することができる
。しかし、これらの天然に存在する反応部位に依拠することは、複雑になることがあり、
注目のタンパク質中に特定の種類のアミノ酸が、あまりに多くまたはあまりに少なく存在
すると、例えば、タンパク質上へのペイロードのまさに適切な「付加（loading）」を得
ることが困難になる。タンパク質表面上でのリシンの高い存在度は、部位およびレギオ選
択的複合を困難にし、不均一生成物をもたらす。対照的に、システインは、比較的まばら
であり、主として、ジスルフィドで連結された対の状態でタンパク質中に存在する。シス
テインにおける複合化は、しばしば、ジスルフィドの還元、それに続く個々のシステイン
を別々に標識するための複合試薬（例えば、マレイミド）との反応を必要とする。これは
ジスルフィド連結部を除去するので、タンパク質の構造および安定性が、この過程によっ
て傷つけられる可能性がある。
【０００５】
タンパク質は、また、しばしば、結合するペイロードの最適数に比べてより多くのリシ
ンを有し、堅実で均一な生成物を保証するために、利用可能なリシンのすべてを占拠する
のに十分なペイロード部分を付加することは、最適な効力に対してあまりに多くのペイロ
ード分子を付加する可能性がある。このことは、リシンの一部のみを複合化のために使用
することによって回避できるが、このような部分的または不完全な付加は、一般に、種々
の理由により問題となる可能性のある不均一生成物を提供し、例えば、最初に商業化され
たＡＤＣであるＭｙｌｏｔａｒｇ（商標）の場合、ＡＤＣ製品の不均一性は、製品の登録
を撤回する決定につながった問題の一因になったと思われる。Fuenmayor,et al.,Cancers
,vol.3,3370〜93(2011)。また、最適な付加のために十分な個々の種類（例えば、リシン
）のアミノ酸基が存在する場合でさえ、タンパク質がその溶液中での立体配座の状態で存
在するなら、それらのアミノ酸基の一部または全部は、該タンパク質の内部に「埋蔵」さ
れている可能性があり、効果的にそれらを複合化に利用できないようにするか、あるいは
それらを「部分的」に接近可能にし、このことが複合体の不均一性をもたらすこともある
。したがって、リシンは、複合化のために有用な部位であり得るとはいえ、多くの状況下
で、それは理想的ではない。
【０００６】
天然タンパク質中でのシステインの出現頻度は、リシンのそれに比べてより低く、シス
テインは、適切な数で利用できる複合化のための部位として使用するのに適している可能
性があり、存在するシステインがあまりにも少ないなら、標準的なタンパク質修飾法によ
り、１つまたは複数を、挿入することができる。しかし、しばしば、システインの挿入に
よる天然タンパク質の配列改変を回避することが好ましく、そのうえ、天然タンパク質中
の表面接近可能なシステインは、しばしば、他のシステインの近傍に配置され、タンパク
質の活性な立体配置を維持するために重要である可能性のあるジスルフィドを形成する。
ジスルフィドを還元することによって２つの遊離システインに変換することは困難ではな
いが、そうすることは、タンパク質の二次または三次構造を混乱させる可能性がある。
【０００７】
タンパク質上のジスルフィドを還元することによって形成されるシステイン残基の間に
テザー（tether）を挿入することを試みるためのいくつかの方法が報告されている。この
ような方法の１つは、スルホン置換メタクリレート誘導体を必要とする（米国特許出願公
開第２００６／０２１０５２６号）。この方法は、環化の前に脱離ステップを必要とする
反応性中間体を形成し、その複数ステップ法のための条件は、システイン間のリンカー（
テザー）の不完全な形成をもたらすことがあり、反応条件は、タンパク質の変性を引き起
こすことさえある。別の手段は、マレイミド誘導体を使用する（国際公開第２０１１／０
１８６１３号）。しかし、この方法で形成される複合体は、マレイミドへのチオールのマ
イケル付加が可逆性なので、安定性の問題で苦慮する。したがって、化学的部分を、ジス
ルフィド連結部を含むタンパク質に複合化してタンパク質複合体を形成するための改善さ
れた方法が必要とされている。とりわけ、ジスルフィドの立体配置を制御する効果を放棄
することなしに、効率的な複合化、安定性、および一貫したペイロード／タンパク質比も
提供しながら、ジスルフィドの構成要素（スルフヒドリル）を利用する方法が求められて
いる。さらに、タンパク質を特定の立体配置に保持するように固定化する方法（例えば、
Expert Opin.Drug Discov.(2011),6(9):937〜963、Tetrahedron 55(1999)11711〜11743参
照）、また、固定化されたタンパク質をペイロードと複合化するための手段を提供する方
法が必要とされている。本発明は、ケトンで修飾されたタンパク質またはポリペプチドと
アルコキシアミン化合物との間のオキシムを形成するための改善された方法を含むこのよ
うな方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記反応で例示するように、ケトンで修飾されたポリペプチドまたはタンパ
ク質をアミノオキシ化合物（例えば、アルコキシアミンまたはアリールオキシアミン）と
複合化して、オキシムで修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を形成するための改善
された方法を提供する。該方法は、高効率のオキシム形成を促進し、オキシムのより高い
収率およびより完全なオキシム形成を提供する条件を選択することを含み、結果として、
オキシム形成の収率が改善され、かつ２つ以上のケトンで修飾されたポリペプチドまたは
タンパク質に関して生成物の均一性が改善される。該方法は、典型的にはｐＨ３〜８の緩
衝液中での、促進剤としてのアミンまたはアミン塩の使用を含む。一般に、促進剤または
緩衝液あるいはその双方は、カルボン酸を含み、例えば、酢酸塩または安息香酸塩の緩衝
液を使用することができる。任意選択で、該アミンをカルボン酸塩として使用することが
でき、あるいは、そのアミンは、双性イオンであってもよいカルボキシ置換アミン化合物
でもよい。アニリン、アミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、ヒドラジン、および
３，５−ジカルボキシアニリンは、これらの方法で使用するのに適したアミンである。
【０００９】
【化１】
0006609563.tif 000002
【００１０】
好ましい実施形態において、ケトンで修飾されたポリペプチドおよびオキシムは、下記
で示される式のものであり、ここで、その硫黄原子は、ポリペプチド中のシステイン基に
由来する：
【００１１】
【化２】
0006609563.tif 000003
式中、ｎは、２〜８、好ましくは２または４であり、ｎは、ポリペプチド上に存在するケ
トン修飾またはケトン修飾に由来するオキシムの個数を示す。ポリペプチドは、抗体また
は抗体フラグメントでよく、その２つの硫黄原子は、ポリペプチドの鎖間ジスルフィド結
合に由来する。改善された方法は、オキシムの形成効率を高めるので、それらの方法は、
ｎが１を超えるペプチドにおいて、複合生成物の均一性を改善するのでとりわけ有用であ
る。特に、ケトン修飾に利用可能な４つのジスルフィドが典型的には存在する抗体におい
て、改善された方法は、１つの抗体分子につき４つのペイロード基を有する抗体−薬物複
合体（ＡＤＣ）などの複合生成物（ＤＡＲ＝４）の収率を高める。その不均一性が米国Ｆ
ＤＡにより最初に承認されたＡＤＣの市場からの撤退の一因となったと考えられるＭｙｌ
ｏｔａｒｇ（登録商標）の顛末によって例示されるように、ＡＤＣにおける均一性の重要
性は、広く確認されている。
【００１２】
一態様において、本発明は、タンパク質表面上でジスルフィドを形成する２つのシステ
イン残基を利用して、ペイロードをタンパク質に連結して、タンパク質複合体を形成する
方法を提供する。該方法は、ジスルフィドを還元して２つの遊離チオール基を提供するこ
と、および２つのチオール基を、それらがジスルフィドを形成した場合に占拠するのとほ
ぼ同一の場所にそれらを保持するテザーを用いて相互に結び付けることを含む。システイ
ン基をそれらのほぼ同一場所に保持することは、ジスルフィドの還元で生じる可能性のあ
るタンパク質の立体配置に対するいかなる有害効果をも最小化する。２つのチオール基を
相互に連結するために導入されるテザーは、注目のペイロードを結合するのに使用できる
反応性官能基を含む。一部の実施形態において、テザーは、外部のアミン基とイミン、オ
キシム、またはヒドラゾン連結部を形成するのに十分な反応性のあるカルボニル基を含み
、ペイロードは、このような連結部を形成することによって活性化タンパク質に複合化さ
れる。例えば、還元されたタンパク質は、ジクロロアセトンまたはジブロモアセトンなど
の１，３−ジハロアセトンと反応し、それによって、２つの硫黄原子を相互に連結する３
炭素テザーを挿入することができる。このことは、ジスルフィドの効果、すなわち、タン
パク質を、ジスルフィドが存在した場合に有したものに極めて類似した立体配置に保持す
ることを適切に模擬している可能性があり、同時に、それは、ジスルフィドに比べてより
大きな安定性およびペイロードに結合するための場所も提供する。本発明の方法および組
成物中で使用されるテザーは、化学的に反応性のある官能基を提供し、２つのシステイン
の硫黄原子間にこの種のテザーを含むタンパク質は、本明細書中で活性化タンパク質と呼
ばれる。好ましいテザーは、還元されたジスルフィド基を１，３−ジクロロアセトンと反
応させることによって得られるケトンリンカー、すなわち−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−
である。ペイロードは、テザー上の官能基を使用して活性化タンパク質に結合することが
できる。
【００１３】
タンパク質のチオールをジハロアセトンと反応させることによって形成されるテザーは
、例えば、複合用部位としてカルボニルを提供する。適切なアミンを含むペイロード（ア
ミノ化ペイロード）、好ましくは、本明細書中でさらに説明するような式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２
のアミノオキシを、このような活性化タンパク質に、ペイロードのアミノオキシ官能基と
テザーのカルボニル基（ケトン）との間でオキシムを形成することによって容易に複合化
することができる。好ましい実施形態において、２つのシステイン残基の間に挿入された
ケトンを有する活性化ポリペプチドまたはタンパク質を、アミン系促進剤の存在下でアル
コキシアミン（ＲＯＮＨ２）（ここで、アルコキシ基（Ｒ）は、治療薬、または治療薬を
結合するのに使用できる反応性基などのペイロードを含む）と接触させる。適切なアミン
系促進剤としては、アニリンまたはアニリニウム塩（例えば、酢酸アニリニウム、安息香
酸アニリニウムなど）、アシルヒドラジン（例えば、アセチルヒドラジン）、アミノ安息
香酸（ＰＡＢＡ、３−アミノ安息香酸など）、３，５−ジアミノ安息香酸、３，５−ジカ
ルボキシアニリンなどが挙げられる。効率的なオキシム形成を促進するのに適した反応条
件は、本明細書中で提供される。
【００１４】
これらの方法は、１つまたは複数の接近可能なジスルフィド連結部を有する任意のタン
パク質に適用することができ、５００Ｄａを超える、典型的には２，０００Ｄａを超える
分子量を有し、ジスルフィドが本来の形態または活性形態のタンパク質中に存在する、天
然タンパク質に対して概して有用である。それらの方法は、１つを超えるジスルフィド、
例えば、２〜１０個、あるいは典型的には６個までのジスルフィド基（その少なくとも１
つは、通常的なジスルフィド還元剤によって還元されるように十分に表面に接近できる）
を含むタンパク質と共に使用することができる。これらの方法は、利用される各ジスルフ
ィド基に対して少なくとも１つのペイロードを含む複合体をもたらし、テザーは、実質上
、タンパク質の本来のまたは活性な立体配置を保持する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、２つのシステイン残基を相互に結び付けることによ
ってタンパク質を固定化し、強固な立体配置を提供する手段を提供し、ここで、固定化す
る方法は、次には固定化されたタンパク質をペイロードに複合化させるのに使用できるケ
トンを含む連結部を用いて、２つのシステインを相互に結び付ける。固定化は、本明細書
中でさらに説明するように、少なくとも２つのシステイン残基を含むタンパク質を１，３
−ジクロロアセトンまたは１，３−ジブロモアセトンなどのジハロケトンと反応させて、
［Ｃｙｓ１］−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−［Ｃｙｓ２］連結部を含む環化タ
ンパク質を形成すること、次いで、該連結部が式Ｈ２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬのアミノオキシ化
合物と反応してオキシムの形成を介して複合体を形成することを可能にすることによって
完遂される。本発明は、固定化されたこれらの複合ペプチドの改善された調製方法を提供
する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ジスルフィドを含むタンパク質から始まり、タンパク質−ペイロード複合体を提供する、本発明の適用（ＸがＯである場合）を説明するスキームを示す図である。
【図２】複合体のペイロードとして相補的カップリング基を有する２つのタンパク質−ペイロード複合体のカップリングを説明する図である。
【図３】出発タンパク質、活性化タンパク質、および実施例１のタンパク質複合体に関する質量スペクトルを示す図である。
【図４】実施例１からのアジド置換ＣＲＭ１９７構築物のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。
【図５】実施例４に関する活性化タンパク質の概略図、および活性化（ケトンで修飾された）タンパク質に関するＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【図６】実施例４に記載のタンパク質−ペイロード複合体の概略図、および生成物に関するＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【図７】実施例６、方法Ａの複合体および還元型複合体のゲルを、比較のための分子量ラダーを添えて示す図である。図は、さらに、方法Ｂの生成物のＬＣ−ＭＳを示し、該ＬＣ−ＭＳはいくつかの異なる複合体の形成を示している。
【図８】実施例７からの、ステップ１；ステップ２の方法Ａ（ＰＬ１）；およびステップ２の方法Ｂ（ＰＬ２）の生成物に関するＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【図９】実施例８の生成物に関するＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルおよびＬＣ−ＭＳデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「タンパク質」およびポリペプチドは、本明細書中で使用する場合、アミド（ペプチド
）結合により連結された５個以上、典型的には１０個以上のアミノ酸残基を含むペプチド
を指す。典型的には、本明細書に記載のタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を主とし
て含むか、それらのアミノ酸のみを含むが、本発明の方法は、１つまたは複数の非天然ア
ミノ酸を含むポリペプチドに対しても等しく有用である。一般に（しかし必須ではないが
）、アミノ酸は、ほとんどが、または完全にＬ配置を有し、普通の「必須」アミノ酸から
選択される。
【００１８】
＜省略形＞
ＤＡＲ        薬物／抗体比
ＤＣＭ        ジクロロメタン
ＤＩＣ        ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ    ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＴ        エタンジチオール
ＨＢＴＵ      Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−
１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＭｅＣＮ      アセトニトリル
ＮＭＰ        Ｎ−メチルピロリジノン
ＰＢＳ        リン酸緩衝化生理食塩水
ＴＣＥＰ      トリス（カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＦＡ        トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ      トリイソプロピルシラン
【００１９】
本発明は、ケトンで修飾されたポリペプチドを置換アルコキシアミンと複合化する場合
に、オキシムを形成するための改善された条件を提供する。改善された条件は、オキシム
の形成を促進するためにアミン系促進剤を使用し：アニリンも使用できるが、置換アニリ
ン、とりわけ本明細書中で開示されるようなカルボキシ置換アニリンがより適している。
アセチルヒドラジンまたはベンゾイルヒドラジドなどのアシルヒドラジドも使用できる。
アミン系促進剤は、遊離アミンとして、または任意の適切な対イオンを有するアミン塩と
して添加することができ、一部の実施形態において、酢酸またはクエン酸などのカルボキ
シレートの対イオンが好ましい。典型的には、過剰のアミン系促進剤が使用される。
【００２０】
反応は、典型的には、ｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜８の緩衝液中で実行される。種
々の緩衝液、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ギ酸ナト
リウム、クエン酸ナトリウムなどを使用して適切なｐＨを維持することができる。反応に
適したポリペプチド濃度は、通常的に使用される濃度に比べてより高く、一部の実施形態
において、ポリペプチド濃度は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも２ｍｇ／ｍ
Ｌであり、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬ以上で、溶解が危うくなる濃度まで、例えば約２５
ｍｇ／ｍＬまでである。
【００２１】
反応は、典型的にはポリペプチドの構造および機能を維持するのに適した温度で実施さ
れ；温度は、通常、４〜７０℃の間、好ましくは１０〜３０℃の間である。０．５〜４８
時間の反応時間を費やすことができる：妥当な反応時間は、既知の方法で反応の進行を監
視することによって容易に決定することができる。約４℃〜約２５℃の間の温度で、一般
には１時間未満から約４時間までの反応時間で十分である。
【００２２】
一部の実施形態において、該方法は、１，３−ジクロロアセトンの存在下でポリペプチ
ドのジスルフィドを還元することを含む。本明細書中で提供されるデータは、ポリペプチ
ドの緩衝溶液にジクロロアセトンを添加した後にジスルフィド結合を開く還元剤を添加す
ると、予想外にも、生成物の収率の実質的な改善を示すことを立証している。ジスルフィ
ドの還元を開始する際にジクロロアセトンを存在させることは、ポリペプチド上で１つを
超えるジスルフィド結合を還元する場合にとりわけ重要である。例えば、ポリペプチドが
抗体である場合、ＴＣＥＰでの還元は、４つの鎖間ジスルフィド結合を還元し、ジクロロ
アセトンと反応して４つのケトン含有テザー基を導入することを可能にする。最初にＴＣ
ＥＰを添加して還元ステップを開始した後にジクロロアセトンを添加することによって反
応を行うと、完全に修飾された抗体の収率は、約３３〜３５％であった（ｐＨ８．０、緩
衝液として５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、外界温度）。ポリペプチド生成物の約５０％が、軽鎖フ
ラグメントに共有結合で連結された重鎖フラグメントを含んでいた。１，３−ジクロロア
セトンをポリペプチド基質と共にプレインキュベートした後に同一条件下でＴＣＥＰを添
加すると、完全に修飾された抗体の収率は、７５〜７７％まで増加した。これらの反応に
関する生成物の組成は、マイクロチップ電気泳動ＳＤＳ法によって評価した（参照：Elec
trophoresis 2012,33,765〜772）。ＨＣ−ＨＣ、ＨＣ−ＬＣ、およびＨＣ−ＨＣ−ＬＣフ
ラグメントの検出は、共有結合で繋ぎ留められた注目の生成物（鎖間ジスルフィドの１つ
または２つが、ジクロロアセトン由来のテザーで置き換えられている）に対する部分的修
飾の存在を示し、（ＨＣ）２（ＬＣ）２に相当する「インタクトな」抗体は、ジクロロア
セトン由来のテザーによって置き代えられた鎖間ジスルフィドのそれぞれを有する完全に
修飾された四量体型抗体に対応する。
【００２３】
本発明の適用の実施例を図１に示す。図は、露出されたジスルフィド基を有し、円とし
て表現されたタンパク質を描写している。ジスルフィドは、還元され、ジスルフィドに由
来する２つの遊離チオールを有する還元型タンパク質を形成している。還元型タンパク質
は、次いで、ジハロアセトンまたは類似のビス−求電子剤（例えば、１，３−ジクロロア
セトンまたは１，３−ジブロモアセトン）と反応して、活性化タンパク質を形成すること
ができ、ここで、２つのチオールは、官能化されたテザーを介して相互に連結され、この
実施例中のテザーは、シッフ塩基の形成に対して比較的反応性のあるケトン基を含む。次
いで、ペイロード分子は、活性化タンパク質のテザーにシッフ塩基の形成を介して連結さ
れて、タンパク質複合体を提供する。実施例中のペイロードは、連結基を介してテザー結
合する。式Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｌ−ＰＬ（式中、ＰＬはペイロード化合物である）の化合物は、
リンカーＬによってＰＬに連結されている活性化アミン基（Ｈ２Ｎ−）を含み、アミンは
、ケトンのカルボニルとＰＬに結合したアミンとの間でのシッフ塩基の形成を促進するア
ミノオキシまたは類似の活性化アミン、−Ｘ−ＮＨ２（式中、ＸはＯである）を使用する
ことによって特に活性にされる。代わりの実施形態は、図１の還元型タンパク質のような
２つの遊離システイン基を有するタンパク質から始まり、それらのシステイン基を使用し
て、タンパク質を拘束された立体配置に「固定化し」、同時に、固定化されたタンパク質
上に複合化されるペイロードのための結合点をも提供する。
【００２４】
本発明の方法は、ケトンで修飾された任意のポリペプチドと共に使用するのに適してい
るが、２つのシステイン間に少なくとも１つのジスルフィド連結部を含む、または１，３
−ジハロアセトン反応物との反応によって相互に連結され得る２つの遊離システイン残基
を含むタンパク質から複合体を形成するのに特に有用である。典型的には、タンパク質は
、２つのチオールが、ジクロロアセトンまたはジブロモアセトンと本明細書に記載の条件
下で反応して、２つのチオールの少なくとも５０％の相互連結をもたらすタンパク質であ
り、相互連結の程度は、しばしば、少なくとも約７０％、８０％または９０％である。
【００２５】
相互に連結される２つのシステインは、単一のポリペプチド上に存在することができ、
あるいはタンパク質コンプレックスを形成する別個のポリペプチド上に存在することがで
きる。特定の実施形態において、該方法は、１〜６個のジスルフィド連結部または２〜６
個の遊離システイン残基を有するタンパク質を利用し、これらのジスルフィドの少なくと
も１つの還元を必要とする。ジスルフィドを含むタンパク質は、単一のポリペプチド配列
内にジスルフィド連結部を含む、またはジスルフィドが１つのポリペプチド配列を別のア
ミノ酸またはポリペプチドに連結しているタンパク質コンプレックスである、少なくとも
５個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸を有する任意のポリペプチ
ドであり得るが、ただし硫黄原子間にテザーを挿入するためにジスルフィドを還元した場
合に、複合体は急速には解離しない。本発明の方法中で使用するための典型的なタンパク
質としては、約５〜約５０００個のアミノ酸、典型的には少なくとも１０〜約１０００個
までのアミノ酸を含む環状ペプチドおよび線状ペプチド、例えば、酵素または受容体など
の機能性タンパク質；少なくとも１つのジスルフィド連結部（しばしば、２つの別個のポ
リペプチド鎖を連結している）を有するタンパク質コンプレックス；構造タンパク質；ワ
クチンの足場として使用されるＣＲＭ１９７またはアジュバント活性を有するその他のタ
ンパク質などのタンパク質；ならびに抗体または抗体フラグメントが挙げられる。これら
の方法にとってとりわけ有用なタンパク質としては、抗体、特に、遺伝子操作された抗体
をはじめとするモノクロナール抗体、修飾抗体および抗体フラグメント；ＣＭＲ１９７な
どのワクチン担体タンパク質；および少なくとも１つのジスルフィド連結部または少なく
とも２つのシステイン残基を有し、および５００〜５００，０００、典型的には１，００
０〜２００，０００の分子量を有する単鎖タンパク質が挙げられる。抗体またはその他の
タンパク質を操作して１つまたは複数のシステイン残基を導入するための、例えば、抗体
を修飾するための方法は、当技術分野で周知である。
【００２６】
該方法は、少なくとも２つの鎖間ジスルフィドを有する抗体および抗体変異体、例えば
ＩｇＧおよびＦｃにとって特に有用である。該方法は、また、ジフテリアトキソイド、ジ
フテリア毒素（１９７）の非毒性交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）、破傷風トキソイド、
キーホールリンペット・ヘモシアニン、髄膜炎菌（N.meningitidis）外膜タンパク質、お
よび分類不能型インフルエンザ由来タンパク質Ｄなどのワクチン担体タンパク質に対して
有用である。これらのワクチン担体タンパク質は、既知の方法によっておよび／または本
明細書に開示の方法によって、抗原を用いて官能化できる。本発明の方法は、また、ＴＬ
Ｒアゴニスト（ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９のリ
ガンド）などのアジュバント化合物、例えば、イミキモド、イミダゾキノリン、およびガ
ルジキモド、ＰＲＲリガンド、ＲＬＲリガンド、ＮＯＤ２リガンド、環状ｄｉ−ＡＭＰ、
環状ｄｉ−ＧＭＰ、フラゲリン、モノホスホリル脂質Ａ、Ｎ−グリコール化ムラムルジペ
プチド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）、トリアシル化リポタン
パク質、またはポリ（Ｉ：Ｃ）を結合して、高められた免疫応答を提供するのに使用でき
る。
【００２７】
本発明の方法および組成物中で使用するためのジスルフィド含有タンパク質のジスルフ
ィド連結部は、還元されて２つの遊離チオール基を形成し、このような還元のための方法
は、当技術分野で周知である。一部の実施形態において、還元は、タンパク質の周囲の溶
媒に容易に接近できるジスルフィド連結部を選択的に還元する還元剤を使用して実施され
、１つの適切な還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およ
びその塩である（Analytical Biochemistry 273,73〜80(1999)参照）。その他の公知のジ
スルフィド還元剤、例えば、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、システア
ミン、ジチオブチルアミン（JM Perkel,Chem.Eng'g News,Feb.29,2012、Lukesh,et al.,J
.Am.Chem.Soc.,134,4057〜59(2012)）、およびトリブチルホスフィンなどのトリアルキル
ホスフィン（国際公開第２００８／１５７３８０号）も使用できる。タンパク質中のジス
ルフィドを還元する方法は、当技術分野で周知である。
【００２８】
連結基Ｌは、ペイロード化合物を−Ｘ−ＮＨ２に連結する任意の適切な有機連結部でよく、ここで、ＸはＯを表す。適切な連結部のいくつかの例としては、［Ｘ］−（ＣＨ２）１−６−［ＰＬ］、［Ｘ］−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−［ＰＬ］、［Ｘ］−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−［ＰＬ］、［Ｘ］−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［ＰＬ］、［Ｘ］−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−［ＰＬ］、［Ｘ］−フェニル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−［ＰＬ］、［Ｘ］−（ＣＨ２）１−１０−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−１０−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）０−１０−（ＯＣＨ２ＣＨ２）０−１０−（ＡＡ）０−１０−［ＰＬ］（ＡＡは、必須アミノ酸のいずれか、例えば、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｓｐなどでよい）などが挙げられ、ここで、ｎは、典型的には、１〜２０であり、［Ｘ］および［ＰＬ］は、それぞれ、リンカーの末端がＸおよびＰＬに結合することを示す。一部の実施形態において、リンカーＬは、複合体上に付加されるペイロードを増加させるために結合した２つまたは３つのペイロードを有することができ、ここで、１つを超えるペイロードは、所定のリンカーに結合し、ペイロードは同一または異なっていてもよい。適切なリンカーは、また、これらの基の構成要素の組合せを含むことができ：リンカーの性質は、本発明の実施にとって重要ではなく、少なくとも１つのペイロードＰＬへ結合するための方法の利便性および利用能に、または複合体に対して所望の物理化学的特性に基づくことができる。適切なリンカーの選択は、通常的技術レベルに包含され、ペイロードの構造、およびペイロードをリンカーＬに結合するように修飾するのに利用可能な方法に依存する。典型的には、リンカーは、アミドまたはエステル基を介して、一方のまたは双方の末端で結合し；しばしば、リンカーＬは、プロテアーゼまたはエステラーゼの活性によるインビボでの溶解を可能にするためのペプチド結合（例えば、カテプシンＢにより開裂されるＶａｌ−Ｃｉｔジペプチド、またはカテプシンＢによって同様に開裂可能なＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１））またはエステルを含み；任意選択で、リンカーは、１つまたは複数のエチレンオキシド単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２）を含み；多くの実施形態において、リンカーは、少なくとも１〜６つまでのアミノ酸部分を含む。Ｌの適切な実施形態は、また、１つまたは複数のスペーサーを含むことができ、スペーサーは、次の群：
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン［式中、Ｚは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、および前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン部分は、それぞれ独立に、酸素原子が、少なくとも１つ、好ましくは２つの炭素原子で隔てられるように、前記部分内に散在された１つまたは複数の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］、
（ｃ）（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換されていてもよい］、
（ｄ）−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ−（式中、ｖは１〜２，０００、好ましくは１〜１０である）、
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個、または１〜６個のアミノ酸を含むペプチド、
（ｆ）２、３、４、５または６、あるいは２〜１０個のペイロード部分を保持できる多価リンカー、から選択することができる。
【００２９】
さらに、Ｌは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン、カテプシンＢにより選択的に開
裂されるジペプチド）またはＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ（バリン−シトルリンｐ−アミノ
ベンジルカルバメート、Bioconjugate Chem.19(10),1960〜63(2008)参照）などの開裂可
能なリンカー、ジスルフィド、あるいは次式：
【００３０】
【化３】
0006609563.tif 000004
［式中、タンパク質は、複合化のためのタンパク質を表し、ＰＬは、本明細書に記載のよ
うなペイロードであり、Ｌ１およびＬ２は、独立に、前に記載したような基Ｌなどの任意
選択のリンカーである（ACS Med.Chem.Letters,vol.1,277〜280(2010)）］で表されるリ
ンカーのような、グルクロニダーゼによって開裂されるリンカーであるか、あるいはそれ
らを含むことができる。
【００３１】
ペイロード（ＰＬ）は、タンパク質に結合するのに有用な任意の部分でよい。タンパク
質に有効に結合し得る化合物の多くの例が、当技術分野で周知である。例には、金属イオ
ンに結合して複合体の検出可能性を提供するキレート化剤をはじめとする、使用者がタン
パク質を捜し当てるまたは同定することを可能にする標識部分；タンパク質を精製または
単離するのを、または表面に貼り付けるのを容易にするビオチンまたはアビジン、ポリヌ
クレオチド、抗体またはそのフラグメント、５〜１５個のアミノ酸残基を含むポリ−Ａｒ
ｇまたはポリ−Ｌｙｓなどの結合形成部分；脂肪酸基またはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）などの特性修飾基；特定タイプの細胞または細菌に特有な多糖または細胞表面タン
パク質などの抗原性基；修飾型タンパク質またはペプチドが別の分子に結合して二重特異
性抗体などのより複雑な複合体を調製することを可能にするカップリング基（図２参照）
；ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびこれらのフラグメントなどの核酸を含
む生物活性化合物；種々の治療薬物などの医薬化合物；ならびに所望の効果をもたらすこ
とのできる所望の組織または細胞までタンパク質上に便乗（hitchhike）できる放射性核
種および細胞毒が含まれる。これらのヒッチハイキング化合物は、それらがタンパク質ま
たはその一部に複合化されたままで機能を発揮することができるか、あるいは連結基がイ
ンビボで容易に開裂できる基であるなら、それらの化合物は、タンパク質から最初に離れ
ることができる。これらの方法で使用するのに適した医薬ペイロードとしては、微小管阻
害薬、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害薬、挿入薬、細胞内シグナル伝達経路阻害薬、キナーゼ
阻害薬、ｓｉＲＮＡ、ａＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどの転写阻害薬、ならびにＤＮＡ副溝
バインダーが挙げられ；これらのペイロードとしては、例えばマイタンシノイド、アウリ
スタチン、アマニチン、カリチアマイシン、プシンベリン、ジュオカルマイシン、アント
ラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、タキソール、ピロロベンゾジアゼピン
などの部類の化合物が挙げられる。
【００３２】
治療または診断での用途を有するこれらの医薬ペイロードの具体例としては、パクリタ
キセル、ドセタキセル、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コ
ルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、アクチノマイシン、グル
コルチコイド、プロマイシン、エピルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、
シタラビン、ｆ−フルオロウラシル、プラチン、ストレプトゾトシン、ミノマイシンＣ、
アントラサイクリン、ダクチノマイシンまたはアクチノマイシン、ブレオマイシン、ミト
ラマイシン、アントラマイシン、ジュオカルマイシン、イフォスファミド、ミトキサント
ロン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アニモテリン、メルファラン、エスペラミシ
ン、レキシトロプシン、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ
、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、エロイトロビン、ネトロプシン
、ポドフィロトキシン、マイタンシノイド（マイタンシンおよびＤＭ１を含む）、および
コンブレタスタチン（combretestatin）が挙げられる。
【００３３】
ペイロードとして使用できる適切なカップリング基（複合体を別の部分にカップリング
するのに使用できる基）としては、マレイミド、チオール、α−ハロケトン（例えば、−
Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｘ、ここで、Ｘはクロロ、ブロモまたはヨードである）、カルボン
酸、アミン、ヒドロキシル、アルケン、アルキン（銅不含−遊離「クリック」化学で使用
できる環状オクチンを含む）、アジドなどが挙げられる。これらのカップリング基を使用
して、本発明の複合体を、相補的カップリング基を有する他の化合物に連結するための方
法は、当技術分野で周知であり、チオールのマレイミドへのマイケル付加、チオールのα
−ハロケトンでのアルキル化、アミンとカルボン酸との間でのアミド結合の形成、アジド
をアルキンに１，２，３−トリアゾール環を形成することによって連結するための「クリ
ック」化学（例えば、Meldal,et al.,Chem Rev.,vol 108,2952〜3015(2008)参照）、およ
び「銅不含クリック」化学（例えば、Meeuwissen,et al.Polymer Chemistry,vol.3.1783
〜95(2012)参照）が挙げられる。「相補的」カップリング基は、容易に化合して共有結合
を形成する２つのカップリング基、例えば前に言及した対（アミドを形成するためのカル
ボキシレート＋アミン；１，２，３−トリアゾールを形成するためのアジド＋アルキン；
チオールがマイケル付加を介して二重結合に付加する、マレイミド＋チオール；チオール
のアルキル化によってα−チオケトンを形成する、α−ハロケトン＋チオール、など）で
ある。相補的カップリング基を含む第２複合体とカップリングするペイロードとしてのカ
ップリング基を含む複合体の描写が、図２に示される。特定の例において、ペイロード（
ＰＬ）として役立つためのカップリング基は、ハロゲン、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−
ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｎ３、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ
）２、−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｉ、マレイミ
ジル、３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−４−イル、１Ｈ−ピロール−２
，５−ジオン−１−イル、ピリジン−２−イル−ジスルファニル、テトラヒドロ−１Ｈ−
チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン−４−イル、１−カルボニルオキ
シ−２，５−ジオキソピロリジン、１−カルボニルオキシ−２，５−ジオキソピロリジン
−３−スルホン酸ナトリウム、−ＳＳＲ１、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１、−Ｎ（Ｒ１）Ｈ、およ
び−ＮＨ−Ｎ（Ｒ１）Ｈからなる群から選択され、ここで、Ｒ１は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ
６）アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２であり、Ｒ２は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、
ハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｎ（Ｒ１）Ｈ、または−ＮＨ−Ｎ（
Ｒ１）Ｈである。これらのペイロードが、最初のペイロード（ＰＬａ）として使用される
場合、複合体は、第２のペイロード（ＰＬｂ）を含む化合物と反応することができ、新た
な複合体を形成する際にはさらなるリンカーＬ’を導入することができる：
【００３４】
【化４】
0006609563.tif 000005
【００３５】
これらの反応において、当業者は、ＬおよびＬ’が、新たなペイロードＰＬｂを連結す
るのに使用される反応に応じて、ＰＬａおよび／またはＲの一部を保持できることに留意
されたい。
【００３６】
次に挙げる実施形態は、本発明の個々の態様を例示する。
１．ケトンで修飾されたポリペプチドをオキシムで修飾されたポリペプチドに変換する方
法であって、ケトンで修飾されたポリペプチドをアミン系促進剤の存在下で式Ｒ−Ｏ−Ｎ
Ｈ２の基と接触させることを含む方法。
２．アミン系促進剤が、アニリン、置換アニリン、例えば３，５−ジアミノ安息香酸また
は３，５−ジカルボキシアニリン、あるいはアセチルヒドラジドなどのアシルヒドラジド
である、実施形態１の方法。
これらの方法の一実施形態において、ケトンで修飾されたポリペプチドは、ジスルフィ
ドからジスルフィドを還元して２つの遊離チオールを形成すること、および該遊離チオー
ルを、１，３−ジクロロアセトンまたは１，３−ジブロモアセトンとの反応によって相互
に連結することによって形成される。この方法の特定の実施形態において、還元可能なジ
スルフィド結合を有するポリペプチドを、限定はされないがＴＲＩＳまたはＰＢＳなどの
緩衝液中、限定はされないがＴＣＥＰなどの還元剤および１，３−ジクロロアセトンと接
触させる。好ましくは、ポリペプチドおよび緩衝液は、還元剤を添加する前に１，３−ジ
クロロアセトンと混合され、したがって、還元が行われる際に１，３−ジクロロアセトン
が存在する。
３．式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基が、式Ｈ２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬの化合物（ここで、Ｌはリンカー
を表し、ＰＬはペイロード基を表す）である実施形態１または２の方法。
４．ケトンで修飾されたポリペプチドが式：
【００３７】
【化５】
0006609563.tif 000006
（式中、円はポリペプチドを表し、各硫黄原子は、ポリペプチドのシステイン残基のスル
フヒドリルであり、ｚは１〜１０の整数である）のものである、実施形態１の方法。
５．タンパク質−ペイロード複合体が式：
【００３８】
【化６】
0006609563.tif 000007
（式中、ＸはＯであり、Ｌはリンカーを表し、ＰＬ、ＰＬ１およびＰＬ２は、出現する毎
に独立に、ペイロード基を表し、ｍおよびｎは、それぞれ独立に１〜１０であり、ｚは、
ｍおよびｎが双方とも０であることはないとの前提で、１〜１０、好ましくは１〜５であ
る）のものである、前記実施形態のいずれかの方法。
６．ポリペプチドが抗体（例えば、ＩｇＧ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２、Ｆｃ）である、
前記実施形態のいずれかの方法。
７．ポリペプチドがワクチン担体である、実施形態１〜５のいずれかの方法。
８．ペイロードが、治療薬を含む、実施形態１〜８のいずれかの方法。
９．ペイロードが、検出可能な標識、または相補的反応性基を含むペイロード基を結合す
るのに適した反応性基を含む、実施形態１〜７のいずれかの方法。
１０．Ｌが開裂可能な連結部分を含む、実施形態８の方法。
１１．Ｌが、
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−Ｎ
Ｈ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０
）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニ
レン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ
１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケ
ニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン［式中、Ｚ
は、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ
）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテ
ロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、前記（
Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、および前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン部分は、それぞ
れ独立に、前記部分内に散在する１〜１０個の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］
；
（ｃ）（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ
３〜Ｃ７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、−
Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレ
ン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン
、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレ
ン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ
）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ
Ｈ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ３〜Ｃ７）シク
ロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分
は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）ア
ルキルから選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換されていてもよい］；
（ｄ）−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ−、−Ｘ｛ＣＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ｝ｗ（式中、ｖ
は１〜２，０００であり、ｗは１〜４であり、ＸはＣまたはＮである）；
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸を含むペプチド；および
（ｆ）デンドリマー、デンドロン、および超分岐ポリマーを含む樹状高分子
から選択される少なくとも１つのスペーサーを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つの
方法。
１２．還元可能なジスルフィド結合を含むポリペプチドを、式［ＰＰ］−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ
（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−［ＰＰ］の基（ここで、各Ｓはジスルフィド結合に由来する硫黄
であり、［ＰＰ］は連結基の末端がポリペプチドに結合している場所を示す）を含むケト
ンで修飾されたポリペプチドに変換する方法であって、
還元可能なジスルフィド結合を含むポリペプチド、水性緩衝液、および１，３−ジハロア
セトンの混合物を形成し、次いでジスルフィド結合を還元できる還元剤を添加することを
含む方法。
１３．１，３−ジハロアセトンが１，３−ジクロロアセトンである、実施形態１２の方法
。
１４．還元剤が水溶性のホスフィンまたはホスフィン塩である、実施形態１２または１３
の方法。ＴＣＥＰは適切な還元剤である。
１５．ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントである、実施形態１２〜１４のいずれ
かの方法。適切には、ポリペプチドは、モノクロナールでよく、かつヒト化されていても
よい抗体である。がん細胞に特有な抗原に対する抗体は、適切なポリペプチドである。
１６．ケトンで修飾されたポリペプチドをオキシムで修飾されたポリペプチドに変換する
方法であって、ケトンで修飾されたポリペプチドをアミン系促進剤の存在下で少なくとも
約１ｍｇ／ｍＬのポリペプチド濃度で式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基と接触させることを含む方法
。典型的には、これらの方法におけるＲは、本明細書中に記載のようなペイロードおよび
リンカーを含む。適切なペイロードとしては、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１、ＤＭ
４）、アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、アマニチン、カリチアマイシン
、プシンベリン、ジュオカルマイシン、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソル
ビシン、タキソール、ピロロベンゾジアゼピンなどが挙げられる。
１７．ケトンで修飾されたポリペプチドが、実施形態１２〜１６のいずれかの方法によっ
て調製される、請求項５の方法。
１８．アミン系促進剤が、カルボキシ置換アニリンまたはアシルヒドラジンである、実施
形態１７の方法。
１９．式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基が、式Ｈ２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬの化合物（ここで、Ｌはリンカ
ーを表し、ＰＬはペイロード基を表す）である、実施形態１２〜１７のいずれかの方法。
２０．ケトンで修飾されたポリペプチドが式：
【００３９】
【化７】
0006609563.tif 000008
（式中、円はポリペプチドを表し、各硫黄原子は、ポリペプチドのシステイン残基のスル
フヒドリルである）のものである、実施形態１６の方法。
２１．タンパク質−ペイロード複合体が、式：
【００４０】
【化８】
0006609563.tif 000009
（式中、ＸはＯであり、Ｌはリンカーを表し、ｚは１〜１０の整数であり、ＰＬ、ＰＬ１
およびＰＬ２は、出現する毎に独立に、ペイロード基を表す）のものである、実施形態１
６〜２０のいずれかの方法。
２２．ポリペプチドが抗体である、実施形態１２〜２１のいずれかの方法。
２３．ポリペプチドがワクチン担体である、実施形態１２〜２１のいずれかの方法。
２４．ペイロードが治療薬を含む、実施形態１６〜２３のいずれかの方法。
２５．ペイロードが検出可能な標識または結合基を含む、実施形態１６〜２４のいずれか
の方法。
２６．Ｌが開裂可能な連結部分を含む、実施形態２５の方法。
２７．Ｌが、
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−Ｎ
Ｈ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０
）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニ
レン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ
１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケ
ニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン［式中、Ｚ
は、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（
Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘ
テロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、前記
（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、および前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン部分は、それ
ぞれ独立に、前記部分内に散在する１〜１０個の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい
］；
（ｃ）（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ
３〜Ｃ７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、−
Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレ
ン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン
、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレ
ン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ
）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ
Ｈ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ３〜Ｃ７）シク
ロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分
は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）ア
ルキルから選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換されていてもよい］；
（ｄ）−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ−または−Ｊ−｛ＣＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ｝ｗ−（
式中、ｖは１〜２，０００であり、ｗは１〜４であり、ＪはＣＨ２またはＮＨである）；
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸を含むペプチド；および
（ｆ）デンドリマー、デンドロン、および超分岐ポリマーを含む樹状高分子
から選択される少なくとも１つのスペーサーを含む、実施形態１６〜２６のいずれか１つ
の方法。
【００４１】
本発明の方法は、図１に要約するように、修飾される予定のタンパク質のジスルフィド
を還元すること、２つの遊離チオール基を含む還元型タンパク質を形成することを含む。
還元型タンパク質を、還元型タンパク質上の双方の遊離チオールと反応する能力のある官
能化されたテザー形成化合物と接触させて、テザー上にペイロードを結合するのに適した
少なくとも１つの官能基も保持しながら、遊離チオールを相互につなぐ。一部の実施形態
において、テザー上の官能基はカルボニル基、例えば、遊離チオールが１，３−ジハロケ
トンと反応することが可能である場合に得られるケトンである。遊離チオールは、強力に
求核性であるので、それらのチオールは、ハロゲン化アルキルまたはトシル酸アルキルな
どの求電子剤と、脱離基の置換および硫黄−炭素共有結合の形成を含む非可逆反応を介し
て容易に反応する。官能化されたカルボニル含有テザー形成化合物のいくつかの適切な例
としては、１，３−ジクロロアセトンおよび１，３−ジブロモアセトンが挙げられる。こ
れらの試薬は、スルフヒドリルを相互につなぐことによって小さな環状ペプチド中のジス
ルフィド部分の安定化を提供するのに使用されてきた。例えば、国際公開第２００８／１
５７３８０号（ジクロロアセトンと還元型環状ペンタペプチドとの反応、それに続くカル
ボニルの還元）を参照されたい。１，３−ジヒドロキシアセトンのスルホン酸エステル（
例えば、メシル酸エステル、トリフル酸エステル、フェニルスルホン酸エステル、トシル
酸エステルなど）も使用することができる。これらの試薬は、還元型タンパク質の遊離チ
オールに対して十分に反応性であり、適度に迅速な反応を提供して、相互に繋ぎ留められ
た２つのシステイン残基を備えた活性化タンパク質を形成し、ここで、それぞれの遊離チ
オールは、官能化されたテザー基に共有結合で結合している。
【００４２】
還元型タンパク質および官能化されたテザー形成化合物は、テザー形成化合物と還元型
タンパク質の２つの遊離チオールとの間の反応を促進するのに適した条件下で、とりわけ
以前にはジスルフィド結合で連結されていた双方の遊離チオールを、今や直接的ジスルフ
ィド結合に代わってそれらを連結する短いテザーを用いてもう一度相互に結び付けるよう
にテザー形成化合物の単一分子と反応させるのに有利である濃度および温度の条件下で接
触させる。この反応は、図１に例示するように、２つの硫黄原子間に官能化されたテザー
［−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−］を有する活性化タンパク質を形成する。図１のテザーは
、明瞭および効率的なシッフ塩基形成化学を介してペイロードを効率的に結合するのに使
用することができるカルボニルを含む。
【００４３】
本考察中で、タンパク質は、たとえそれが円または球として描かれていても、１０個よ
りも少ないアミノ酸からなる小さなポリペプチド、あるいは大きな酵素または２つ以上の
サブユニットまたは別個のタンパク質からなる複合体でよいと解釈される。ジスルフィド
の２つの硫黄原子は、多重複合体の１つのサブユニット上に存在することができるか、あ
るいは異なるサブユニット上に存在することができる。本明細書に記載の変換に関与する
ジスルフィドに加えて、タンパク質は、また、還元され官能化され得るか、あるいはタン
パク質内でのそれらの位置により、還元される可能性のないその他のジスルフィド連結部
を含むことができる。単一のジスルフィド、テザー基、または複合のみが示されているが
、１つのこのようなジスルフィド、テザー基、または複合を含むポリペプチドまたはタン
パク質は、また、１つを超えるこれらを含むことができると解釈される。本発明の方法は
、公知の方法を利用して、タンパク質の全体的形状および機能を維持するために、または
相互に連結された２つのサブユニットを複数サブユニット複合体中に保持するために必須
である可能性のある「埋蔵」ジスルフィドをしばしば還元することなしに、折りたたまれ
たタンパク質の表面近傍の溶媒に接近可能なジスルフィドを選択的に還元することができ
る。単純化のために１つのみを典型的に描写しているが、実施例が例示するように、タン
パク質またはポリペプチドは、１つを超える官能化されたテザー基を含むことができ、か
くして、１つを超える複合部位を含むことができる。
【００４４】
一旦、活性化タンパク質が形成されると、ペイロードを官能化されたテザーに結合する
ことができる。例えば、アミンを含む（アミノ化）ペイロードをジハロアセトンから形成
されたテザーに、ペイロードのアミンとテザーのケトンとの間でシッフ塩基を形成するこ
とによって結合することができる。適切なペイロード化合物は、接近可能で反応性のある
ＮＨ２アミン基を含み、好ましい実施形態において、アミンは、シッフ塩基の形成に向け
て活性化されているアミンである。適切なアミンの例としては、例えば、オキシアミン（
Ｘ＝Ｏ）、チオアミン（Ｘ＝Ｓ）、およびヒドラジン（Ｘ＝ＮＨ）が挙げられ、これらの
ヘテロ原子置換アミンは、図１に示すように、ジハロアセトンから形成された活性化タン
パク質のテザー上のケトンのようなケトンと容易に縮合することが知られている。
【００４５】
典型的には、活性化タンパク質を、活性化タンパク質の精製または単離なしに、アミノ
含有ペイロードと接触させる。利用可能なら、ペイロード（ＰＬ）上の遊離ＮＨ２基を使
用することができ、利用できないなら、図１および実施例中で例示するように、連結基を
介して遊離ＮＨ２基を付加することができる。一部の実施形態において、一旦、活性化タ
ンパク質が生成されたら、アミノ−ペイロードを反応混合物に添加し、そこで、活性化タ
ンパク質が、所望のシッフ塩基の形成を促進する条件下で形成される。アミノ−ペイロー
ドは、次いで、図１に例示するように、そのアミノ基を介して、活性化タンパク質のカル
ボニルと反応し、それによって、所望のタンパク質−ペイロード複合体（式中、Ｘは、Ｏ
、ＮＨまたは置換されたＮであり、Ｌは連結基であり、ＰＬはペイロードを表す）を形成
する。
【実施例】
【００４６】
＜以下の実施例では、次のＨＰＬＣ法が使用される＞
方法Ａ：溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０８％ギ酸、グ
ラジエント：２分間でＢを３％から８０％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ｐｒｏｓ
ｗｉｆｔ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ４．６×５０ｍｍ、４０℃
方法Ｂ：溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸、グ
ラジエント：２分間でＢを３％から８０％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ｐｒｏｓ
ｗｉｆｔ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ４．６×５０ｍｍ、４０℃
方法Ｃ：溶離液Ａ：水＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム＋２％アセトニトリル、溶離液Ｂ
：アセトニトリル、グラジエント：１．７分間でＢを２％から９８％へ、流速：１．０ｍ
Ｌ／分、カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  ２．１×５０ｍｍ、５０℃
方法Ｄ（ＨＲＭＳ）：溶離液Ａ：水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、
溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸、グラジエント：４．４分間でＢを２％から
９８％へ、流速：１．０ｍＬ／分、カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  ２．１×５０ｍｍ
、５０℃
【００４７】
＜リンカーの合成＞
【００４８】
【化９】
0006609563.tif 000010
１００ｍＬのガラス器具中で、２−クロロトリチルクロリド樹脂（１．５５ｍｍｏｌ／
ｇ）（０．５００ｇ、０．７７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）で３０分間膨潤させ、
ＤＣＭを排出した。樹脂に、２−（アミノオキシ）酢酸ヘミ塩酸塩（０．３３８ｇ、３．
１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．３５４ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（７ｍ
Ｌ）／ＤＣＭ（４ｍＬ）懸濁液を添加し、５時間振盪した。溶媒を排出した。樹脂を、Ｄ
ＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１、４０ｍＬ）、ＤＣＭ（５０ｍＬ）、ＮＭＰ
（５０ｍＬ）、およびＤＣＭ（５０ｍＬ）でそれぞれすすぎ洗った。得られた樹脂を、Ｋ
ＯＨ／ＮａＯＨで終夜乾燥した。
【００４９】
【化１０】
0006609563.tif 000011
１００ｍＬのガラス器具中で、樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）で３
０分間膨潤させ、ＤＣＭを排出した。２−アミノエチルカルバミン酸（９Ｈ−フルオレン
−９−イル）メチル塩酸塩（０．０８１ｇ、０．７７５ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（０．４２
２ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．３５４ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ）のＮ
ＭＰ（８ｍＬ）懸濁液中に、ＨＢＴＵ（１．１７６ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２
．５ｍＬ）溶液を添加し、室温で２時間振盪した。溶媒を排出し、樹脂を、ＮＭＰ（１０
ｍＬ）およびＤＣＭ（１０ｍＬ）で逐次的にすすぎ洗った。得られた樹脂を、終夜乾燥し
た。
【００５０】
【化１１】
0006609563.tif 000012
樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）を反応容器中に仕込んだ。１０ｍＬの２０％ピペリジン／
ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を添加し、懸濁液を、室温で５分間かき混ぜた。溶媒を排出した後、さ
らなる１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を添加し、室温で２０分間かき混
ぜた。ＨＯＡｔ（０．３１６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）および１−（９Ｈ−フルオレン−
９−イル）−３−オキソ−２，７，１０−トリオキサ−４−アザドデカン−１２−酸（０
．８９６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）溶液を樹脂に添加し、ＤＩＣ（０
．３６２ｍＬ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を
室温で２時間かき混ぜ、樹脂を濾別し、ＮＭＰ（１０ｍＬ）で４回すすぎ洗った。得られ
た樹脂を終夜乾燥した。
【００５１】
【化１２】
0006609563.tif 000013
樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）を反応容器中に仕込んだ。１０ｍＬの２０％ピペリジン／
ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を樹脂に添加し、懸濁液を、室温で５分間かき混ぜた。溶媒を排出した
後、さらなる１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（ｖ／ｖ）を添加し、室温で２０分間
かき混ぜた。ＨＯＡｔ（０．３１６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−
ＯｔＢｕ（０．９８９ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）溶液を樹脂に添加し
、ＤＩＣ（０．３６２ｍＬ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．００ｍＬ）溶液を添加
した。反応混合物を室温で２時間かき混ぜた。樹脂を濾別し、ＮＭＰ（１０ｍＬ）で４回
すすぎ洗った。得られた樹脂を終夜乾燥した。
【００５２】
＜リンカーへのペイロードの結合＞
【００５３】
【化１３】
0006609563.tif 000014
樹脂（２−クロロトリチルクロリド樹脂、０．７７５ｍｍｏｌ）を反応容器中に仕込ん
だ。１０ｍＬの２０％ピペリジン／ＮＭＰ（０．７７５ｍｍｏｌ、ｖ／ｖ）を樹脂に添加
し、懸濁液を、室温で５分間かき混ぜた。溶媒を排出した後、さらなる１０ｍＬの２０％
ピペリジン／ＮＭＰ（０．７７５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２０分間かき混ぜた。１８
−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１８−オキソオクタデカン酸（０．８６２ｇ、２．３２５ｍｍｏ
ｌ）およびＨＯＡｔ（０．３１６ｇ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（８ｍＬ）溶液を樹
脂に添加し、ＤＩＣ（０．３６２ｍＬ、２．３２５ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（２．００ｍＬ）
溶液を添加した。反応混合物を室温で４時間かき混ぜた。樹脂を濾別し、ＮＭＰ（１０ｍ
Ｌ）で４回すすぎ洗った。得られた樹脂を終夜乾燥した。
【００５４】
【化１４】
0006609563.tif 000015
前記ステップからの樹脂（０．７７５ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの開裂用カクテル液（ＴＦ
Ａ／ＴＩＰＳ／水＝９５／２．５／２．５、ｖ／ｖ）と共に室温で１．５時間処理した。
樹脂を、濾過により除去し、ＴＦＡですすぎ洗った。濾液を真空下で濃縮した。１５〜５
０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離するＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより
、２，２，２−トリフルオロ酢酸を１：１で含む（Ｓ）−１−（アミノオキシ）−１９−
カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ−３，６，１５，
２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸を得た（２０７ｍｇ、０．２９４ｍｍ
ｏｌ、収率３７．９％）（ＰＬ１）。ＨＲＭＳ［Ｍ＋１］（方法Ｄ）；７０４．４４５９
（実測値）、７０４．４４８６（予測値）。
【実施例１】
【００５５】
ＣＲＭ１９７（G.Giannini and R.Rappuoli,Nucleic Acids Res.,1984,25,4063参照）
をＴＣＥＰ（ｘｘ）で処理し、Ｃ４５１−Ｃ４７１ジスルフィドをほとんどまたは全く還
元することなしに、Ｃ２０１−Ｃ１８５ジスルフィドを還元した（実施例３参照）。還元
されたＣＲＭ１９７を１，３−ジクロロアセトンで処理して、インタクトなＣ４５１−Ｃ
４７１ジスルフィドを有し、Ｃ２０１が−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−連結部を介して
Ｃ１８５に繋ぎ留められた活性化タンパク質を得た。この活性化タンパク質を、アミノオ
キシ基を含むアミノ化脂肪酸誘導体（その調製は前に記載されている）であるＰＬ１と接
触させて、脂肪酸誘導体をタンパク質に連結するオキシムを形成した。結合した脂肪酸基
を含む複合体は、腎クリアランスを低下させ、かくして、循環しているＣＲＭ１９７タン
パク質の半減期を延長し、複合ワクチンにおける担体としてのその有用性を高めると予想
される。本来のタンパク質（図３Ａ、方法Ａを使用）、活性化タンパク質（図３Ｂ）、お
よびタンパク質複合体（図３Ｃ）に関する質量スペクトルデータを、図３に示す。
【００５６】
【化１５】
0006609563.tif 000016
【００５７】
＜部位限定型アジド化合物を所持するＣＲＭ１９７の合成＞
方法Ａ−
溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋＋０．１％ギ酸、グラジエン
ト：２分間でＢを３％から８０％へ、流速：１．８ｍＬ／分、カラム：ＡｃＱｕｉｔｙ  
ＢＥＨ３００  ＳＥＣ  ４．６×３０ｍｍ、５０℃
ＳＤＡ  ＰＡＧＥ  ゲル分析−ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル；１．５
ｍｍ×１０ウェル
【００５８】
【化１６】
0006609563.tif 000017
ＣＲＭ１９７のリン酸ナトリウム緩衝液（２３０μＬ、ｐＨ７．４）溶液（３２．５ｍ
ｇ／ｍＬ、１８５μＬ、０．１０３μｍｏｌ）に、ＴＣＥＰ  ＨＣｌ水溶液（３ｍｇ／ｍ
Ｌ、水、５８．９μＬ、０．６１６μｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１６時間撹拌
し、続いて１，３−ジクロロプロパン−２−オンのＤＭＳＯ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、１３
．０４μＬ、２．０５４μｍｏｌ）を添加した。反応物を３．５時間撹拌し、次いで、０
．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転サイズ排除カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃからの７Ｋ  ＭＷＣＯ）に通過させ、緩衝液を０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６）に交換して、ケトンを保持するＣＲＭ１９７（６．７８ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍＬ、
ナノドロップ法）を得た。ＬＣＭＳ［Ｍ＋１］＝５８４６５。
【００５９】
【化１７】
0006609563.tif 000018
ケトンで修飾されたＣＲＭ１９７のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）溶液（６．７８
ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍＬ、０．１５１μｍｏｌ）に、Ｏ−（２−（２−（２−（２−アジ
ドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）ヒドロキシルアミンのＤＭＳＯ溶液（３００
ｍｇ／ｍＬ、０．０４４ｍＬ、０．０４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３℃で
３６時間かき混ぜ、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶離する５ｍＬのＺｅｂａ（商標）
回転カラムに通し、標題化合物を得た（４．４１ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍＬ、収率８０％、
ナノドロップ法）。ＬＣＭＳ［Ｍ＋１］＝５８６８２．５
図４に、標題化合物である修飾されたＣＲＭ１９７に関するＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【実施例２】
【００６０】
出発材料の調製：ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ６−Ｃ１２）(配列番号２)（８）の合成。以下の配列は、記載順にそれぞれ配列番号３、４および２として開示されている。
【００６１】
【化１８】
0006609563.tif 000019
【００６２】
・中間体８ａの調製
（Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨを用いる２−クロロトリチルクロリド樹脂の付加、Ｆｍｏｃ除去、
および樹脂付加量の測定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（４０．０ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３×）
で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（２４．８ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４００ｍ
Ｌ）溶液およびＤＩＰＥＡ（４４．７ｍＬ、２５６ｍｍｏｌ）を添加し、懸濁液を室温で
２２時間振盪した。樹脂を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）（３×）、
ＤＣＭ（３×）、ＤＭＡ（３×）、ＤＣＭ（３×）で徹底的に洗浄した。次いで、樹脂を
、ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）の混合物（４００ｍＬ）で１０分間処理することを４回
繰り返し、続いて、ＤＭＡ（２×１８０ｍＬ）で洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ溶液およ
びＤＭＡ洗浄溶液を、樹脂の付加量を求めるために捕集した。合わせた溶液の１ｍＬを、
ＭｅＯＨで５００ｍＬまで希釈すると、２９９．８ｎｍでのＵＶ吸収は、Ａ＝０．３６８
と測定された。これは、４６．２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ量に相当する。樹脂を、ＤＣＭ（３
×）、ＤＭＡ（３×）、ＤＣＭ（３×）で徹底的に洗浄し、真空下で乾燥して、中間体８
ａを得た（５０．７ｇ、付加量＝０．９１ｍｍｏｌ／ｇ）。
【００６３】
・中間体８ｂの調製（線状ペプチドの組み立て）
中間体８ａ（２．６４ｇ、２．４０ｍｍｏｌ）を、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合
成装置での固相ペプチド合成に供した。カップリングは次のように実施した。
【００６４】
【表１】
0006609563.tif 000020
【００６５】
・中間体８ｃの調製（保護基の除去を伴う樹脂からの開裂）
中間体８ｂ（２．４０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４×）で注意して洗浄した。９５％水性Ｔ
ＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）の混合物（５０ｍＬ）を添加し、懸濁
液を室温で１時間振盪した。開裂溶液を濾別し、新たな開裂溶液（３５ｍＬ）を添加した
。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで開裂溶液を濾別した。新たな溶液（３５ｍＬ）を
添加し、懸濁液を室温で１時間振盪した。開裂溶液を濾別した。合わせた開裂溶液を、冷
ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の撹拌された混合物（５００ｍＬ）上に徐々に注
ぎ入れ、沈殿物を得た。懸濁液を、室温で２時間撹拌し、次いで、沈殿物を沈降させた。
上澄み液を、フリットを用いて吸引除去した。残留物を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル
（１：１）（２×１００ｍＬ）で洗浄し、上澄み液を、フリットを用いて吸引除去した。
固体を高真空下で乾燥して、類白色固体として中間体８ｃを得た（３．７５ｇ、１．８８
ｍｍｏｌ）。
【００６６】
＜環状ペプチド８の調製＞（環化および精製）
中間体８ｃ（３．７５ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（３７５ｍＬ）に溶解した。Ｉ
２のＡｃＯＨ溶液（５０ｍＭ、４５．１ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）を、撹拌された溶液に
一度に添加し、溶液を室温で１０分間撹拌した。アスコルビン酸水溶液（０．５Ｍ、５．
６４ｍＬ、２．８２ｍｍｏｌ）を添加して、過剰のＩ２を失活させた。溶液を、乾固近く
まで濃縮した。反応は、２つの温度（two poroom temperatureions）：０．１８８ｍｍｏ
ｌの規模および１．６９ｍｍｏｌの規模で実施した。精製のために粗製物を合わせた。粗
製物を、分取ＨＰＬＣで精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、白色固体として化合
物８を得た（１．５３ｇ、０．７６７ｍｍｏｌ）。
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析法Ｃ：ｔＲ＝３．４３分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ
（分析方法Ｂ；測定値［Ｍ＋３］／３＝５１２．４、計算値［Ｍ＋３］／３＝５１２．６
）で分析した。
【００６７】
この実施例は、環状ペプチド８から出発する活性化タンパク質の形成を例示する。
【００６８】
【化１９】
0006609563.tif 000021
環状ペプチド８（１２ｍｇ、６．７６μｍｏｌ）をリン酸Ｎａ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
６．５、１．５ｍＬ）に溶解し、この溶液にＴＣＥＰ  ＨＣｌ（２．９１ｍｇ、１０．１
３μｍｏｌ）を室温で添加した。この反応混合物を室温で１時間撹拌した。上記溶液に１
，３−ジクロロプロパン−２−オン（４．２９ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を室温で添加
し、室温で３０分間撹拌した。１５〜６０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離す
る逆相ＨＰＬＣにより、活性化タンパク質８ｄを得た（６ｍｇ、２．９３μｍｏｌ、収率
４３．４％）。ＨＲＭＳ［Ｍ＋１］（方法Ｄ）；１５９０．７９１１（実測値）、１５９
０．７９１２（予測値）。
【００６９】
６位および１２位（Ｃ６−Ｃ１２）の２つのシステイン間に−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｚ）−
ＣＨ２−Ｓ−連結部を有し、Ｚが、
【００７０】
【化２０】
0006609563.tif 000022
である、ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｃ−Ｈ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｃ−Ｆ−ＯＨ(配列番号２）。
化合物８すなわち（（Ｓ）−２−（（３Ｓ，６Ｒ，１４Ｒ，１７Ｓ，２０Ｓ，２８ａＳ
）−１７−（（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）−２０−（４−アミノブチル）
−３−ブチル−１４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−５−グアニジノ−２−（（Ｓ）−１−（
（Ｓ）−５−グアニジノ−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）
ペンタノイル）ピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタンアミド）−４−メチルペンタ
ンアミド）−１，４，１０，１５，１８，２１，２４−ヘプタオキソヘキサコサヒドロピ
ロロ［２，１−ｉ］［１，２３，４，７，１０，１３，１６，１９］ジチアヘキサアザシ
クロヘキサコシン−６−カルボキサミド）−３−フェニルプロパン酸（１１．５ｍｇ、５
．６２μｍｏｌ）、および２，２，２−トリフルオロ酢酸と１：１で一緒になった（Ｓ）
−１−（アミノオキシ）−１９−カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，
１２−ジオキサ−３，６，１５，２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸化合
物（９．１９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）の１００ｎＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０、
１ｍＬ）中溶液に、アニリン（２．０５１μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ）を室温で添加した
。ＤＭＳＯ（５０μＬ）を添加すると均一溶液が得られた。この反応混合物を室温で２時
間撹拌した。１５〜６０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣに
より、予想される複合体すなわち（１−（（Ｚ）−（（３Ｓ，６Ｒ，１４Ｒ，１７Ｓ，２
０Ｓ，２８ａＳ）−１７−（（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）メチル）−２０−（４−
アミノブチル）−３−ブチル−６−（（Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチルカル
バモイル）−１４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−５−グアニジニノ−２−（（Ｓ）−１−（
（Ｓ）−５−グアニジニノ−２−（（Ｓ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド
）ペンタノイル）ピロリジン−２−カルボキサミド）ペンタンアミド）−４−メチルペン
タンアミド）−１，４，１５，１８，２１，２４−ヘキサオキソドコサヒドロピロロ［２
，１−ｉ］［１，２３，４，７，１０，１３，１６，１９］ジチアヘキサアザシクロヘキ
サコシン−１０（１Ｈ，９Ｈ，１１Ｈ）−イリデン）アミノオキシ）−１９−カルボキシ
−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ−３，６，１５，２０−テト
ラアザオクタトリアコンタン−３８−酸が得られた（４．５ｍｇ、１．６４６μｍｏｌ、
収率２９．３％）。ＨＲＭＳ（方法Ｄ）［（Ｍ＋３）／３］；７５９．７４８７（実測値
）、７５９．７４６２（予測値）。保持時間：４．１２分。
【実施例３】
【００７１】
【化２１】
0006609563.tif 000023
ＣＲＭ１９７（２００μｇ、６．２μＬ、０．００３４μｍｏｌ）のリン酸Ｎａ緩衝液
（５０ｍＭ、ｐＨ７．４、１０μＬ）溶液に、ＴＣＥＰ  ＨＣｌ（５．８９μｇ、０．０
２１μｍｏｌ）の水溶液を添加した。この反応混合物を室温で１５時間放置した。混合物
に１，３−ジクロロプロパン−２−オン（４．５８μｇ、０．０３４μｍｏｌ、１０当量
）を添加した。この反応物を室温で２時間放置した。粗製物を、Ｚｅｂａ（商標）サイズ
排除カラムに通した。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］＝５８４６５。この活性化タンパク質を、Ｔ
ＬＲ作動薬などのアミノ化ペイロードと反応させて、担体タンパク質に付加された任意の
抗原に対する免疫応答を高める可能性のある化合物と複合化された担体タンパク質を形成
することができる。
【００７２】
【化２２】
0006609563.tif 000024
ケトンで修飾されたＣＲＭ１９７のリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．０）中溶液（５ｍｇ／
ｍＬ、５０μｇ、０．０００８６μｍｏｌ）に、Ｎ−（３−（４−（２−（４−（２−（
５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−２−イル）エチル）−３
−メチルフェノキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）プロピル）−２−（アミノオキシ
）アセトアミド（６６．８μｇ、０．０６４μｍｏｌ）およびアニリン（０．００２０μ
Ｌ、０．０２１μｍｏｌ）を添加した。ＬＣＭＳ分析によれば、この反応物を２３℃で１
４時間放置すると、所望の複合体Ａが生成した。反応混合物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．
２）で溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）サイズ排除カラムに通した。ＬＣＭＳ；［
Ｍ＋１］＝５９０３２。
【００７３】
＜ＰＬの合成＞
【００７４】
【化２３】
0006609563.tif 000025
２−（３−ブロモプロピルアミノ）−２−オキソエトキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチ
ル（５３．３ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）および８−メチル−２−（２−メチル−４−（
２−ピペラジン−１−イル）エトキシ）フェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジ
ン−５−アミン（５２ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．５ｍＬ）溶液に、炭酸
カリウム（３９．４ｍｇ、０．２８５ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で２４時間撹拌し
た。水およびＥｔＯＡｃを添加した。有機層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。
合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮して、Ｂｏｃで保護
された物質の粗製物を得た。これをＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（０．５ｍＬ
、６．４９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、１５〜６
０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより精製し、Ｎ−（３
−（４−（２−（４−（２−（５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリ
ジン−２−イル）エチル）−３−メチルフェノキシ）エチル）ピペラジン−１−イル）プ
ロピル）−２−（アミノオキシ）アセトアミドを得た（２５ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、
収率２１．０２％）。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］＝５８６。
【実施例４】
【００７５】
次の実施例では、抗−ＶＥＧＦ抗体フラグメント（ＶＥＧＦ−Ｆａｂ）、および該抗体
フラグメントの血清中半減期を増加させるために付加される脂肪酸誘導体を使用する。い
くつかのより接近し難い鎖内ジスルフィド連結部の存在下での鎖間ジスルフィドの選択的
還元は、ｐＨ７のＰＢＳ中でＴＣＥＰを使用して達成される。還元されたタンパク質をジ
ハロアセトン（ジブロモアセトンまたはジクロロアセトン）と反応させて、硫黄原子を相
互に連結する３炭素テザー−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−を有する活性化タンパク質を
得る。活性化タンパク質を、反応性部分としてアミノオキシを有するリンカー−ペイロー
ド部分と接触させて、ジハロアセトンに由来するケトンとのオキシムを形成する。
実施例における連結基Ｌは、
【００７６】
【化２４】
0006609563.tif 000026
（式中、［Ｘ］および［ＰＬ］は、それぞれ−Ｘ−ＮＨ２およびペイロードＰＬに対する
結合箇所を示し、ペイロードはＣ１８脂肪酸基である。実施例において、Ｘは−ＯＮＨ２
であり、それは、活性化タンパク質のアセトニルケトンのカルボニルとのオキシムを形成
する。図５に、この実施例に関する活性化タンパク質の形成を図示し、その形成に関する
証拠を質量スペクトルで示す。
【００７７】
【化２５】
0006609563.tif 000027
Ａ（７２．７２μｇ、６．０ｕＬ、０．００１５μｍｏｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４、８
μＬ）溶液にＴＣＥＰ  ＨＣｌ（２．６３μｇ、０．００９２μｍｏｌ）を添加した。こ
の反応混合物を室温で３時間放置した。１，３−ジクロロプロパン−２−オン（１．９４
５μｇ、０．０１５μｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間静置した。Ａは、消費さ
れ、所望の生成物Ｂに変換された。粗製物を、サイズ排除カラムに通した。ＬＣＭＳ；［
Ｍ＋１］＝４７５３８。
【００７８】
【化２６】
0006609563.tif 000028
Ｂ（３６．３６μｇ、０．０００７６μｍｏｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４、２２．５μＬ
）溶液に、２，２，２−トリフルオロ酢酸と１：１で一緒になった（Ｓ）−１−（アミノ
オキシ）−１９−カルボキシ−２，７，１６，２１−テトラオキソ−９，１２−ジオキサ
−３，６，１５，２０−テトラアザオクタトリアコンタン−３８−酸化合物（６４．３３
μｇ、０．０７９μｍｏｌ）およびアニリン（０．００１０５μＬ、０．０１１μｍｏｌ
）を室温で添加し、２３℃で１４時間撹拌した。Ｂは、消費され、所望の生成物Ｃに変換
された。粗製物を、Ｚｅｂａ（商標）回転脱塩カラム、７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの）に通過させた。ＬＣＭＳ；［Ｍ＋１］（方法Ａ）＝４８２
２２。図６に、タンパク質複合体の形成を図示し、複合体の形成に関する証拠を質量スペ
クトルで示す。
【実施例５】
【００７９】
【化２７】
0006609563.tif 000029
ペプチドＡ（１ｍｇ、０．５１９μｍｏｌ）を緩衝液（２．５ｍＬ、ｐＨ６．５の５０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を１．５ｍＬ、４０％ＭｅＣＮを０．９ｍＬ、２．５％ＤＭ
Ｆを０．１ｍＬ）に溶解し、ＴＣＥＰ  ＨＣｌ（０．１６４ｍｇ、０．５７１μｍｏｌ）
を室温で添加した。この反応混合物を６０分間撹拌した。反応混合物に１，３−ジブロモ
アセトン（０．１６４ｍｇ、０．５７１μｍｏｌ）のＤＭＦ（０．１ｍＬ）溶液を室温で
添加した。３分間撹拌した後、ＬＣＭＳ分析により、アセトン付加体Ｂが、定量的変換率
で形成されたことが観察された。ＬＣＭＳ（方法Ｃ）［Ｍ＋２］／２＝９９１。
【実施例６】
【００８０】
抗Ｈｅｒ２抗体−薬物複合体の調製
方法Ａ：
ステップ１．
【００８１】
【化２８】
0006609563.tif 000030
ステップ１：
抗−ＨＥＲ２  ＩｇＧの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ中溶液（２０．３６ｍｇ／ｍＬ、
３０μＬ、６１０．８μｇ、０．００４１μｍｏｌ）および１，３−ジクロロプロパン−
２−オン（６６．１μｇ、０．４９５μｍｏｌ）に、ＴＣＥＰ  ＨＣｌ（１４．１７μｇ
、０．０４９μｍｏｌ）を添加し、４℃で１６時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳ緩
衝液（ｐＨ７．２）で溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。４つ
の鎖間ジスルフィドの修飾が、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されるＰＮ
ＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−
Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲ
ル、コロイダルブルー染色）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１
４５３９４（ＰＮＧアーゼＦでの脱グリコシル化の後で）。
ステップ２：
【００８２】
【化２９】
0006609563.tif 000031
ステップ１で調製された修飾型抗−ＨＥＲ２  ＩｇＧの１００ｍＭアニリン酢酸緩衝液
中溶液（７．１４ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ４．８、６００μｇ、０．００４０μｍｏｌ）に、（
Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ
）−２−（（Ｓ）−２−（６−（アミノオキシ）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メ
チルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプ
タノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−
フェニルプロパン酸（３０ｍｇ／ｍＬ、１０４μｇ、０．１２１μｍｏｌ）を室温で添加
した。生じた混合物を室温で１９時間かき混ぜた。混合物を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２
）で一度に溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。ケトンの修飾は
、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施されるＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇ
ｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還
元／還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色、
下記）を用いる分析によって確認された。ＤＡＲ（薬物−抗体比）は３．２であった。Ｌ
ＣＭＳ（方法Ｂ）；１４８７７０（脱グリコシル化後）。
【００８３】
図７に、複合体および還元後の複合体を示す（後記参照）。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ
２（登録商標）事前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、見かけ分子量ラダーとして使
用した。これは、複合生成物中に非複合抗体が、ほとんどまたは全く存在しないことを立
証しており、非複合抗体は、ジスルフィド結合のみで相互に保持されていた抗体の還元に
よる解離のため、より低分子量のバンドをもたらす。−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｘ）−ＣＨ２
−Ｓ−連結部を介して共有結合で連結されたフラグメントを有する複合体は、還元で解離
できない。
方法Ｂ：
ステップ１：
【００８４】
【化３０】
0006609563.tif 000032
抗−ＨＥＲ２  ＩｇＧの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ中溶液（２０．３６ｍｇ／ｍＬ、
３０ｕＬ、６１０．８μｇ、０．００４１μｍｏｌ）および１，３−ジクロロプロパン−
２−オン（６６．１μｇ、０．４９５μｍｏｌ）に、ＴＣＥＰ  ＨＣｌ（１４．１７μｇ
、０．０４９μｍｏｌ）を添加し、４℃で１６時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳ（
ｐＨ７．２）で溶離する０．５ｍＬのＺｅｂａ（商標）回転カラムに通した。４つアセト
ン形成による鎖間ジスルフィドの成功裡の修飾は、反応溶液から採取されたサンプルを用
いて実施されたＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、エンドプロ
テイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（４〜１２％
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色）を用いる分析によって確認された。ＬＣ
ＭＳ（方法Ｂ）；１４５３９４（脱グリコシル化後）。ＳＤＳ  ＰＡＧＥのための還元サ
ンプルは、前に記載の手順に従って調製された。
ステップ２：
【００８５】
【化３１】
0006609563.tif 000033
修飾された抗−ＨＥＲ２  ＩｇＧの１００ｍＭ酢酸アニリン緩衝液中溶液（７．１４ｍ
ｇ／ｍＬ、ｐＨ４．８、６００μｇ、０．００４０μｍｏｌ）に、（Ｓ）−２−（（２Ｒ
，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−
２−（６−（アミノオキシ）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）
−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジ
ン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸
（３０ｍｇ／ｍＬ、１０４μｇ、０．１２１μｍｏｌ）を室温で添加し、室温で１９時間
かき混ぜた。生じた混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で一度に溶離する０．５ｍＬのＺｅ
ｂａ（商標）回転カラムに通した。ケトンの成功裡の修飾は、反応溶液から採取されたサ
ンプルを用いて実施されたＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）、
エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）および非還元／還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（
４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色、図８に示す）を用いる分析に
よって確認された。ＤＡＲは３．８であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４８７７０（脱グ
リコシル化後）。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（商標）事前染色標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を、見かけ分子量ラダーとして使用した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥのための還元サンプル
は、前に記載の手順に従って調製された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥを図８に示す。
【実施例７】
【００８６】
抗体Ｂ−ＤＭ１複合体の調製
ステップ１：
【００８７】
【化３２】
0006609563.tif 000034
ジクロロアセトン（７．３５ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ、３６８ｕＬ）のＴｒｉｓ緩衝
液（４８００ｕＬ）中溶液に、抗体Ｂ  ＩｇＧ（抗体Ｂ  ＩｇＧは、Ｈｅｒ２と異なる抗
原を認識する、６８．２ｍｇ、０．４５８μｍｏｌ、４００ｕＬ）を添加し、４℃に６０
分間冷却した。ＴＣＥＰ  ＨＣｌ（１．５７６ｍｇ、５．５０μｍｏｌ、５２４ｕＬ）を
４℃で添加し、４℃の部屋で１６時間放置した。混合物を１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商
標）膜濾過を介して濃縮し、ＰＢＳで希釈した。このサイクルを２回繰り返した。濾過後
、サンプルを、５ｍＬの  Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラムに通した。４つアセトン形成によ
る鎖間ジスルフィドの成功裡の修飾は、反応溶液から採取されたサンプルを用いて実施さ
れたＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）および非還元／還元ＳＤ
Ｓ  ＰＡＧＥ（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、コロイダルブルー染色）を用いる分析
によって確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４６０２０（脱グリコシル化後）。ＳＤＳ
ＰＡＧＥのための還元サンプルは、前に記載の手順に従って調製された。
ステップ２：
ＰＬ１（方法Ａ）：
【００８８】
【化３３】
0006609563.tif 000035
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（４８ｍｇ、０．３２２μｍｏｌ、１．２ｍＬ）の溶液に、
ＤＭ−１誘導体（１０．００ｍｇ、８．０５μｍｏｌ、６７ｕＬ）および３，５−ジアミ
ノ安息香酸（１４．７０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ、３０ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を添加し
、２３℃で１５時間撹拌した。混合物を１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）膜濾過を介し
て濃縮し、ＰＢＳで希釈した。このサイクルを３回繰り返した。濾過後、サンプルを、５
ｍＬの  Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラムに通した。ケトンの成功裡の修飾は、ＰＮＧアーゼ
Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いる分析によって確認された。ＬＣＭ
ＳによればＤＡＲは４であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０９１５（脱グリコシル化後
）。
ＰＬ１（方法Ｂ）：
【００８９】
【化３４】
0006609563.tif 000036
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（６７９μｇ、０．００４６μｍｏｌ）の０．１Ｍリン酸Ｎ
ａ（ｐＨ６．０）中溶液に、２−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（２，５−ジオキソ−２
，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，１３−ジオキソ−６，９，１５，１
８−テトラオキサ−３，１２−ジアザイコサン−２０−イル）アセトアミド（５６３μｇ
、０．９１１μｍｏｌ、２．２５ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、２３℃で２０時
間撹拌した。反応混合物を、ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳで溶離する０．５ｍ
Ｌの脱塩カラムに３回通した。３．８のマレイミドリンカー／抗体（ＤＡＲ＝３．８）の
導入が、ＬＣＭＳで確認された。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１４７９６８（ＰＮＧアーゼＦ（
Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いる脱グリコシル化の後）。
【００９０】
【化３５】
0006609563.tif 000037
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（１７７μｇ、０．００１２μｍｏｌ）のＥＤＴＡを１０ｍ
Ｍで含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中溶液に、ＤＭ−１（８．６５μｇ、０．０１２
μｍｏｌ、０．２８８ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、２３℃で６時間かき混ぜた
。反応溶液にＮ−メチルマレイミドのＤＭＳＯ溶液（１．３ｍｇ／ｍＬ、２．０８３μｇ
、０．０１９μｍｏｌ）を添加し、１０分間かき混ぜた。反応混合物を、１００ｍＭ  Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液で溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは
３．７であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５３９６７（ＤＡＲ４）（グリコシル化後）。
ＰＬ２：
【００９１】
【化３６】
0006609563.tif 000038
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（４２０μｇ、０．００２８μｍｏｌ）のＥＤＴＡを１０ｍ
Ｍで含むＨＥＰＥＳ緩衝液中溶液に、ＤＭ−１（１０．６１μｇ、０．０１４μｍｏｌ、
０．５５ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、室温で８時間かき混ぜた。反応混合物を
、ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳで溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに３回通し
た。反応混合物を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに
通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは３．６であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０１０１
（ＤＡＲ４）（ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いる脱グ
リコシル化後）。
【００９２】
【化３７】
0006609563.tif 000039
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（４２０μｇ、０．００２８μｍｏｌ）のＥＤＴＡを１０ｍ
Ｍで含むＨＥＰＥＳ緩衝液中溶液に、ＤＭ−１（１０．６１μｇ、０．０１４μｍｏｌ、
０．５５ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を室温で添加し、室温で８時間かき混ぜた。反応混合物を
、ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳで溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに３回通し
た。反応混合物を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶離する０．５ｍＬの脱塩カラムに
通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは３．６であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０１０１
（ＤＡＲ４）（ＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いる脱グ
リコシル化後）。
ＰＬ３：
【００９３】
【化３８】
0006609563.tif 000040
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（４７．３ｍｇ、０．３１７μｍｏｌ、１．１ｍＬ）の溶液
に、ＤＭ−１誘導体（６．３４ｍｇ、６．３５μｍｏｌ、４２．３ｕＬ）および３，５−
ジアミノ安息香酸（１３．５２ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、２７ｕＬ）のＤＭＳＯ溶液を
添加し、２３℃で１５時間撹拌した。混合物を１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）膜濾過
を介して濃縮し、ＰＢＳで希釈した。このサイクルを２回繰り返した。濾過後、サンプル
を、５ｍＬの  Ｚｅｂａ（商標）脱塩カラムに通した。ケトンの成功裡の修飾は、ＰＮＧ
アーゼＦ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いる分析によって確認された。
ＬＣＭＳによればＤＡＲは４であった。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；１５０９１０（脱グリコシ
ル化後）。
ＰＬ４：
【００９４】
【化３９】
0006609563.tif 000041
修飾された抗体Ｂ  ＩｇＧ（２５０μｇ、０．００１７μｍｏｌ、１０ｕＬ）のＰＢＳ
溶液に、上に示した所要のアルコキシアミン（２１．６６μｇ、０．０２５μｍｏｌ、０
．２４５ｕＬ）および３，５−ジアミノ安息香酸（３８３μｇ、２．５２μｍｏｌ、０．
４３ｕＬ）を室温で添加し、２３℃で２４時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳで溶離
する０．５ｍＬの脱塩カラムに２回通した。ＬＣＭＳによればＤＡＲは４であった。ＬＣ
ＭＳ（方法Ｂ）；１５２４４６（グリコシル化後）。
ＰＬ１の合成：
【００９５】
【化４０】
0006609563.tif 000042
２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル
）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２４５ｍｇ、０．７４
６ｍｍｏｌ）を４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（２ｍＬ、８．００ｍｍｏｌ）に室温で溶解し
、室温で１時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗製物を、さらなる精製なしに、次の反応
に使用した。
【００９６】
【化４１】
0006609563.tif 000043
２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（１８５ｍｇ、０．
９７０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．５２０ｍＬ、３．７３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８ｍＬ
）溶液に、ＥＤＣ（１７２ｍｇ、０．８９５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（１１４ｍｇ、０
．７４６ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で５分間撹拌した。上記反応混合物に、１−（
２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオ
ン（１９７ｍｇ、０．７４６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４ｍＬ）溶液を添加した。１時間撹拌
した後、ＤＣＭおよび水を添加した。有機層を分離し、水層をＤＣＭで抽出した。合わせ
た有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。１５〜６５％ＭｅＣ
Ｎ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣで精製して、２−（（２−（２−（
２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エトキシ）エ
トキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエトキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを無色オ
イルとして得た（６２ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、収率：２ステップで２０．７０％）。
ＥＳＩ−ＭＳ（方法Ａ）ｍ／ｚ：４０２［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．６０分。1H-NMR (
CDCl3-d, 400 MHz); 1.48 (s, 9H), 3.49-3.75 (m, 14H), 6.71 (s, 2H).
【００９７】
【化４２】
0006609563.tif 000044
２−（（２−（２−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−
１−イル）エトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−２−オキソエトキシカルバミン酸ｔ
ｅｒｔ−ブチル（６２ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４００μＬ）溶液に、ＴＦ
Ａ（４００μＬ）を室温で添加し、室温で１時間撹拌した。溶媒を除去した後、粗製物を
、さらなる精製なしに使用されるＯ．Ｎ．のために真空下に貯蔵した。ＥＳＩ−ＭＳ（方
法Ａ）ｍ／ｚ：３０２［Ｍ＋１］＋。
ＰＬ２の合成：
【００９８】
【化４３】
0006609563.tif 000045
２−ＣｌＴｒｔ樹脂（１．７０ｍｍｏｌ／ｇ、０．０８６ｇ、１．７ｍｍｏｌ）および
１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０−トリオキサ−４−ア
ザドデカン−１２−酸（２ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（８ｍＬ）／ＤＭＦ（４ｍＬ
）懸濁液中に、ＤＩＰＥＡ（２．６７ｍＬ、１５．３０ｍｍｏｌ）を滴加し、室温で１５
時間撹拌した。溶媒を排出した。樹脂を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７／２／１
、４０ｍＬ）、ＤＣＭ（８ｍＬ×２）、ＤＭＦ（８ｍＬ×２）、ＤＣＭ（８ｍＬ×２）で
すすぎ洗い、真空下で乾燥した。
【００９９】
【化４４】
0006609563.tif 000046
反応容器に樹脂（０．６７９ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を仕込んだ。５ｍＬの２０％ピペリ
ジン／ＤＭＦが、添加され、１分間穏やかに撹拌され、除去された。新たな１０ｍＬの２
０％ピペリジン／ＤＭＦが、添加され、間欠的に撹拌しながら２０分間放置され、除去さ
れた。ＤＭＦ（１０ｍＬ）が、添加され、１５秒間撹拌され、真空濾過で除去された。こ
のステップを４回繰り返した（Ｋａｉｓｅｒ試験でチェック、陽性、紫−深青）。樹脂に
、ＨＯＡｔ（０．４６３ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）および２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカ
ルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（０．６５０ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ
）溶液を添加し、ＤＩＣ（０．５３０ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液
を添加した。反応混合物を室温で１．５時間かき混ぜた。樹脂を、濾別し、ＤＭＦ（１０
ｍＬ）で４回すすぎ洗い、真空下で乾燥した。
【０１００】
【化４５】
0006609563.tif 000047
反応容器に樹脂（０．９２６ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を仕込んだ。５ｍＬの２０％ピペリ
ジン／ＤＭＦが、添加され、１分間穏やかに撹拌され、除去された。新たな１０ｍＬの２
０％ピペリジン／ＤＭＦが、添加され、間欠的に撹拌しながら２０分間放置され、除去さ
れた。ＤＭＦ（１０ｍＬ）が、添加され、１５秒間撹拌され、真空濾過で除去された。こ
のステップを４回繰り返した（Ｋａｉｓｅｒ試験でチェック、陽性、紫−深青）。樹脂に
、ＨＯＡｔ（０．４６３ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）および２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカ
ルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（０．６５０ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ
）溶液を添加し、ＤＩＣ（０．５３０ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液
を添加した。反応混合物を室温で１．５時間かき混ぜた。樹脂を、濾別し、ＤＭＦ（１０
ｍＬ）で４回すすぎ洗い、真空下で乾燥した。
【０１０１】
【化４６】
0006609563.tif 000048
樹脂を、３０％ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）／ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ
、１．７００ｍｍｏｌ）に懸濁し、室温で２時間かき混ぜた。排出された溶媒を濃縮して
、粗の２，２−ジメチル−４，８，１７−トリオキソ−３，６，１２，１５，２１，２４
−ヘキサオキサ−５，９，１８−トリアザヘキサコサン−２６−酸を得た（１．１３ｇ、
２．３４７ｍｍｏｌ、収率１３８％）。これを、さらなる精製なしに次の反応に使用した
。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：４８２［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．１０分（方法Ｂ）。
【０１０２】
【化４７】
0006609563.tif 000049
２，２−ジメチル−４，８，１７−トリオキソ−３，６，１２，１５，２１，２４−ヘ
キサオキサ−５，９，１８−トリアザヘキサコサン−２６−酸（８１９ｍｇ、１．７ｍｍ
ｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液に、ＨＯＡｔ（４６３ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）およびＤ
ＩＣ（０．５３０ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）をそれぞれ室温で添加し、室温で５分間撹拌
した。上記混合物に１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（５１
８ｍｇ、２．０４０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン、０．５
９４ｍＬ、３．４０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を水
およびＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）で希釈した。有機層を分離した。水層をＥｔＯＡｃで抽
出した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。ＬＣ
ＭＳによれば、所望の化合物は、大部分水層中に存在した。水層を凍結乾燥した後、粗製
物を、１５〜７０％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより精
製して、２３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−
２，１１，２０−トリオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２，２１−ト
リアザトリコシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た（６００ｍｇ、０．９９
４ｍｍｏｌ、収率５８．５％）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：６０４［Ｍ＋１］＋、保持時間
：１．１４分（方法Ｂ）。1H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 1.48 (s, 7.5H),1.55 (s, 1.5H)
, 3.47-3.71 (m, 20H), 3.97 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.37 (s, 1.65 H), 4.47 (s, 0.3
5H), 6.72 (s, 2H).
【０１０３】
【化４８】
0006609563.tif 000050
２３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２，１
１，２０−トリオキソ−６，９，１５，１８−テトラオキサ−３，１２，２１−トリアザ
トリコシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）
のＤＣＭ（１００μＬ）溶液にＴＦＡ（１００μＬ）を室温で添加し、室温で１時間かき
混ぜた。溶媒を除去して、２−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（２，５−ジオキソ−２，
５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，１３−ジオキソ−６，９，１５，１８
−テトラオキサ−３，１２−ジアザイコサン−２０−イル）アセトアミドを得た。これを
、さらなる精製なしで次の反応に使用した。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５０４［Ｍ＋１］＋
、保持時間：０．６９分（方法Ａ）。
【０１０４】
【化４９】
0006609563.tif 000051
ＰＬ３の合成：２−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒド
ロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，１３−ジオキソ−６，９，１５，１８−テトラオ
キサ−３，１２−ジアザイコサン−２０−イル）アセトアミド（２２．７９ｍｇ、０．０
３１ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（０．６ｍＬ）溶液に、ＤＭ−１（２３ｍｇ、０．０３１ｍｍｏ
ｌ）およびｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸Ｎａ（０．６００ｍＬ）を５℃で添加した。Ｄ
ＩＰＥＡ（１０．８８μＬ、０．０６２ｍｍｏｌ）を同一温度で添加した。この反応混合
物を、室温まで戻し、１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭおよび重炭酸ナトリウム
飽和水溶液で希釈した。有機層を、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液およびブラインで洗浄した。合
わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空下で濃縮した。０〜１５％Ｍｅ
ＯＨ／ＤＣＭで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーにより、所望の化合物を得た（２
１ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、収率５４．３％）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：１２４２［Ｍ
＋１］＋、保持時間：１．００分（方法Ａ）。1H-NMR (CDCl3-d, 400 MHz); 0.80 (s, 3H
), 1.21-1.33 (m, 9H), 1.41-1.51 (m, 1H), 1.56-1.59 (m, 1H), 2.31-2.39 (m, 1H), 2
.57-2.65 (m, 2H), 2.79-2.88 (m, 1H), 2.86 (s, 3H), 2.91-3.13 (m, 5H), 3.16-3.24 
(m, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.36 (s, 3H), 3.43-3.76 (m, 25H), 3.90 (d, J = 3.6Hz, 2H)
, 3.98 (s, 3H), 4.02 (s, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.25-4.32 (m, 1H), 4.77-4.80 (m, 1H)
, 5.30-5.37 (m, 1H), 5.62-5.69 (m, 1H), 6.26 (s, 1H), 6.38-6.45 (m, 1H), 6.63-6.
68 (m, 2H), 6.82-6.84 (m, 1H), 6.92 (brs, 1H), 7.14-7.24 (2H).
【０１０５】
【化５０】
0006609563.tif 000052
２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（３２０ｍｇ、１．２８９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液に、２−ブロモアセチルブ
ロミド（０．２２５ｍＬ、２．５８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．５６３ｍＬ、３．
２２ｍｍｏｌ）を５℃で添加し、１５分間撹拌して、室温に戻した。溶媒を除去した後、
０〜４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーで精製して、２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ）エチ
ル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た（３１７ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ、収率６６
．６％）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：２６９［Ｍ＋１−Ｂｏｃ］＋、保持時間：１．４１分
（方法Ａ）。H-NMR (CDCl3, 400 MHz); 1.45 (s, 9H), 3.34 (brs, 2H, 3.48-3.52 (m, 2
H), 3.53-3.60 (m, 4H), 3.63 (s, 4H), 3.88 (s, 2H).
【０１０６】
【化５１】
0006609563.tif 000053
２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバミ
ン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３１７ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１ｍＬ）溶液にＴ
ＦＡ（１ｍＬ）を添加し、室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、得られた粗製物
を、さらなる精製なしに次の反応に使用した。
【０１０７】
【化５２】
0006609563.tif 000054
Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−２−ブロモアセトアミ
ド（３２９ｍｇ、０．８５８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．５ｍＬ）溶液に、事前活性化エス
テル［ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中、２（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキ
シ）酢酸（３２８ｍｇ、１．７１６ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（１７５ｍｇ、１．２８７ｍｍ
ｏｌ）およびＤＩＣ（０．２６７ｍＬ、１．７１６ｍｍｏｌ）から室温で５分間撹拌して
調製された］およびＤＩＰＥＡ（０．７４９ｍＬ、４．２９ｍｍｏｌ）を５℃で添加し、
２０分間撹拌して室温に戻した。ＥｔＯＡｃおよび水を添加した。有機層を分離した。水
層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真空
下で濃縮した。０〜５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離するシリカゲルクロマトグラフィーで精
製して、１４−ブロモ−２，１３−ジオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザテト
ラデシル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルを得た（１５０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏ
ｌ、収率３９．５％）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：３４３［Ｍ＋１−Ｂｏｃ］＋、保持時間
：１．３０分（方法Ａ）。H-NMR (CDCl3, 400 MHz); 1.49 (s, 9H), 3.47-3.55 (m, 4H),
3.59-3.63 (m, 4H), 3.65 (s, 4H), 3.88 (s, 2H), 4.34 (s, 2H).
【０１０８】
【化５３】
0006609563.tif 000055
（１４−ブロモ−２，１３−ジオキソ−６，９−ジオキサ−３，１２−ジアザテトラデ
シル）オキシカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１５０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）をＤＣ
Ｍ（容積：１ｍＬ、比率：１．０００）に溶解し、ＴＦＡ（容積：１、比率：１．０００
）を室温で添加した。この反応混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を除去した後、１
０〜２５％ＭｅＣＮ／水（＋０．１％ＴＦＡ）で溶離する逆相ＨＰＬＣにより、２−（ア
ミノオキシ）−Ｎ−（２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ）エトキシ
）エチル）アセトアミドを得た（１１０ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ、収率７１．１％）。
ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ：３４４［Ｍ＋２］＋、保持時間：０．４４分（方法Ａ）。
【０１０９】
【化５４】
0006609563.tif 000056
２−（アミノオキシ）−Ｎ−（２−（２−（２−（２−ブロモアセトアミド）エトキシ
）エトキシ）エチル）アセトアミド（４２．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（１
ｍＬ）溶液に、ＤＭ−１（３７ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）および７５ｍＭリン酸Ｎａ（
ｐＨ８．５、１ｍＬ）を５℃で添加した。ＤＩＰＥＡ（０．０２６ｍＬ、０．１５０ｍｍ
ｏｌ）を同一温度で添加した。この反応混合物を室温まで戻し、１時間撹拌した。反応混
合物を、ＤＣＭおよび重炭酸ナトリウム飽和水溶液で希釈し、有機層をＮＨ４Ｃｌ飽和水
溶液およびブラインで洗浄した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、真
空下で濃縮した。０〜１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭで溶離するシリカゲルクロマトグラフィー
により、所望の化合物を得た（３１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ、収率６１．９％）。ＥＳ
Ｉ−ＭＳ  ｍ／ｚ：１０００［Ｍ＋１］＋、保持時間：１．６１分（方法Ａ）。1H-NMR (
CDCl3-d, 400 MHz); 0.79 (s, 3H), 1.20-1.33 (m, 9H), 1.41-1.50 (m, 2H), 2.17-2.22
(m, 1H), 2.50-2.63 (m, 2H), 2.70-2.81 (m, 2H), 2.86-2.94 (m, 3H), 2.99-3.01 (m,
1H), 3.10-3.13 (m, 1H), 3.18-3.20 (m, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.45-3.62 (m, 14H), 3.
98 (s, 3H), 4.17 (s, 2H), 4.25-4.31 (m, 1H), 4.78-4.82 (m, 1H), 5.30-5.35 (m, 1H
), 5.63-5.69 (m, 1H), 6.27 (s, 1H), 6.39-6.45 (m, 1H), 6.61-6.64 (m, 2H), 6.83 (
s,1H), 6.87 (brs, 1H).
【実施例８】
【０１１０】
抗体Ｃ  Ｆａｂ複合体
ステップ１：
【０１１１】
【化５５】
0006609563.tif 000057
抗体Ｃ  Ｆａｂ（抗体ＣはＨｅｒ２および抗体Ｂと異なる標的抗原に結合する：１６６
８μｇ、０．０３５μｍｏｌ、１２０ｕＬ）のＥＤＴＡ含有１００ｍＭリン酸Ｎａ（ｐＨ
７．４）中溶液に、ＴＣＥＰ  ＨＣｌ（３５．２μｇ、０．１２３μｍｏｌ、１１．７３
ｕＬ）を室温で添加し、２３℃で１．５時間かき混ぜた。反応混合物に１，３−ジクロロ
プロパン−２−オン（１１７μｇ、０．８７８μｍｏｌ、５．８５ｕＬ）を添加し、２３
℃で４０分間かき混ぜた。ＬＣＭＳにより１つのアセトン橋での修飾が観察された。反応
混合物を、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．２）で溶離する０．５脱塩カラムに
通した。ＬＣＭＳ（方法Ｂ）；４７５５４。
ステップ２：
【０１１２】
【化５６】
0006609563.tif 000058
修飾された抗体Ｃ  Ｆａｂ（１６６８μｇ、０．０３５μｍｏｌ、１４８ｕＬ）の、１
００ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５．２）中溶液および示したアミノオキシ置換脂肪酸
（１８５２μｇ、２．６３μｍｏｌ）に、３，５−ジアミノ安息香酸（６９４μｇ、４．
５６μｍｏｌ、５．３４ｕＬ）を室温で添加し、２３℃で２０時間かき混ぜた。混合物に
さらなるアミノオキシ−脂肪酸（１８５２μｇ、２．６３μｍｏｌ）を添加し、室温で２
４時間かき混ぜた。反応混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶離する５ｍＬの脱塩カラム
に通し、予想される抗体Ｃ  Ｆａｂ−脂肪酸複合体を得た（収率３０％）。ＬＣＭＳ（方
法Ｂ）；４８２３８。
【０１１３】
複合体に関するＳＤＳ  ＰＡＧＥ画像および質量スペクトルを図９に示す。
【実施例９】
【０１１４】
ジクロロアセトンおよびＴＣＥＰの添加順序の効果
すべての反応は、２５℃で５０ｍＭ緩衝液（特記しない限りＴＲＩＳ）を使用してｐＨ
８．０で実行した。反応は、ウェル中で、（５８．８μＬ）および緩衝液（２０μＬの１
Ｍ緩衝液）を用い、次いでＩｇＧ１（６．６μＬの１７０．５ｍｇ／ｍＬ含有溶液）およ
びＴＣＥＰ（８．６μＬの３ｍｇ／ｍＬ  ＴＣＥＰ水溶液）を添加して実行した。示した
時間放置した後、１，３−ジクロロアセトン（６μＬの２０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液）
を添加した。
【０１１５】
最初の実験系列では、反応を、最初に還元剤（ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）を添加すること、１
時間後に１，３−ジクロロアセトンを添加することによって実行した。生成混合物をＤＴ
ＴまたはＴＣＥＰで還元した後、生成物の分布をマイクロチップ電気泳動−ＳＤＳ法によ
って分析した（Electrophoresis 2012,vol.33,765〜72）。結果を次表に示す：ＬＣ＝軽
鎖、ＨＣ＝重鎖、ＨＬ＝重鎖＋軽鎖、ＨＨ＝重鎖＋重鎖、ＨＨＬ＝ＨＣ＋ＨＣ＋ＬＣ、お
よびＬＨＨＬ＝ＬＣ＋ＨＣ＋ＨＣ＋ＬＣ。データは、任意の残留ジスルフィドを開裂する
ための還元後で、主要生成物がＨＣ−ＬＣ（重鎖−軽鎖）付加物であることを示す。この
ことは、これらの条件下では部分的な反応が起こるにすぎないことを立証している。この
データは、反応が本質的に最初の半時間以内に行われたことも立証している。
【０１１６】
【表２】
0006609563.tif 000059
【０１１７】
次の実験セットは、ポリペプチド／緩衝液の反応混合物に１，３−ジクロロアセトンを
添加した後に還元剤を添加したこと以外は、同一条件下で実行した。これらの実験からの
結果を次表に示すが、表は、ＬＨＨＬ有意な増加を示し、この増加は、抗体の４つのジス
ルフィドの中の少なくとも３つのジスルフィドの、１，３−ジクロロアセトンとジスルフ
ィド由来の双方の硫黄原子との反応によって形成される共有連結部への変換に対応してい
る。さらに、反応は、本質的に３０分以内に完了していると思われる。
【０１１８】
【表３】
0006609563.tif 000060
【０１１９】
これらの実験は、ジクロロアセトンを添加した後にジスルフィドの還元を開始すると、
スルフヒドリルからスルフヒドリルへの架橋反応の効率が驚くほど大きく増大することを
立証している。緩衝液としてＰＢＳを用いると、生成物の収率はより低かった。
【０１２０】
別の実験で、使用するジクロロアセトンの量を１０倍に増加すると反応が阻害されるこ
と、ならびにｐＨを７．４０、７．１０、６．８０および６．６０に低下させるとＬＨＨ
Ｌ生成物の収率は、同様であるかわずかに向上することが立証された。
【実施例１０】
【０１２１】
緩衝液の選別
反応は、１，３−ジクロロアセトンとＩｇＧとの緩衝液（１００ｍＭ）中の事前混合溶
液に還元剤（ＴＣＥＰ−ＨＣＬ）を室温で添加することによって実行した。７時間後に生
成混合物をＤＴＴまたはＴＣＥＰで還元した後に、マイクロチップ電気泳動−ＳＤＳ法に
よって生成物の分布を分析した。結果を次表に示す：ＬＣ＝軽鎖、ＨＣ＝重鎖、ＨＬ＝重
鎖＋軽鎖、ＨＨ＝重鎖＋重鎖、ＨＨＬ＝ＨＣ＋ＨＣ＋ＬＣ、および「インタクトな」＝（
ＨＣ）２（ＬＣ）２、ＬＨＨＬ＝ＬＣ＋ＨＣ＋ＨＣ＋ＬＣ。収率は、ＬＨＨＬの割合から
求めた。
【０１２２】
【表４】
0006609563.tif 000061
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
還元可能なジスルフィド結合を含むポリペプチドを、式［ＰＰ］−Ｓ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−［ＰＰ］の基（式中、各Ｓは前記ジスルフィド結合に由来する硫黄であり、［ＰＰ］は連結基の末端が前記ポリペプチドに結合している場所を示す）を含むケトンで修飾されたポリペプチドに変換する方法であって、
還元可能なジスルフィド結合を含むポリペプチド、水性緩衝液、および１，３−ジハロアセトンの混合物を形成し、次いで前記ジスルフィド結合を還元できる還元剤を添加することを含む、前記方法。
［２］
前記１，３−ジハロアセトンが、１，３−ジクロロアセトンである、［１］に記載の方法。
［３］
前記還元剤が、水溶性のホスフィンまたはホスフィン塩である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記ポリペプチドが、抗体または抗体フラグメントである、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
ケトンで修飾されたポリペプチドをオキシムで修飾されたポリペプチドに変換する方法であって、前記ケトンで修飾されたポリペプチドをアミン系促進剤の存在下で式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基と少なくとも約１ｍｇ／ｍＬのポリペプチド濃度で接触させることを含む、前記方法。
［６］
前記ケトンで修飾されたポリペプチドが、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法で調製される、［５に記載の方法。
［７］
前記アミン系促進剤が、カルボキシ置換アニリンまたはアシルヒドラジンである、［６］に記載の方法。
［８］
式Ｒ−Ｏ−ＮＨ２の基が、式Ｈ２Ｎ−Ｏ−Ｌ−ＰＬの化合物（式中、Ｌはリンカーを表し、ＰＬはペイロード基を表す）である、［５］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
前記ケトンで修飾されたポリペプチドが、式：
【化５７】
0006609563.tif 000062
（式中、円は前記ポリペプチドを表し、各硫黄原子は、前記ポリペプチドのシステイン残基のスルフヒドリルである）のものである、［５］に記載の方法。
［１０］
前記タンパク質−ペイロード複合体が、式：
【化５８】
0006609563.tif 000063
（式中、ＸはＯであり、Ｌはリンカーを表し、ｚは１〜１０の整数であり、ＰＬ、ＰＬ１およびＰＬ２は、出現する毎に独立に、ペイロード基を表す）のものである、［５］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記ポリペプチドが抗体である、［５］から［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記ポリペプチドがワクチン担体である、［５］から［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
前記ペイロードが、治療薬を含む、［５］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
前記ペイロードが、検出可能な標識または結合基を含む、［５］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
Ｌが、開裂可能な連結部分を含む、［１４］に記載の方法。
［１６］
Ｌが、
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）Ｈ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；
（ｂ）（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン［式中、Ｚは、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、および前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン部分は、それぞれ独立に、前記部分内に散在する１〜１０個の酸素原子を任意選択で含んでいてもよい］；
（ｃ）（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン［式中、Ｙは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で、任意選択で置換されていてもよい］；
（ｄ）−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ−または−Ｊ−｛ＣＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ｝ｗ−（式中、ｖは１〜２，０００であり、ｗは１〜４であり、ＪはＣＨ２またはＮＨである）；
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸を含むペプチド；および
（ｆ）デンドリマー、デンドロン、および超分岐ポリマーを含む樹状高分子から選択される少なくとも１つのスペーサーを含む、［５］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
0006609563.tif 000066
【図２】
0006609563.tif 000067
【図３】
0006609563.tif 000068
【図４】
0006609563.tif 000069
【図５】
0006609563.tif 000070
【図６】
0006609563.tif 000071
【図７】
0006609563.tif 000072
【図８】
0006609563.tif 000073
【図９】
0006609563.tif 000074