(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第１の結合因子および第２の結合因子からなる、前記特定塩基配列を含む核酸を検出するための結合因子セットであって、
前記第１の結合因子および第２の結合因子の組み合わせが、以下から選択される１以上である、結合因子セット：
第１の結合因子が配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１５、１６、および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１６および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；第１の結合因子が配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１６および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１０、１１、１２および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１０、１２、１３および１５から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７および２１から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７、１９および２１から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１３、１５および１９から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７および２１から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１３、１５および１９から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２４および２６から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２および２６から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２および２６から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２および２３から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；並びに
第１の結合因子が配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ。
【請求項２】
第１の結合因子には標識物質が結合されており、第２の結合因子にはメンブレンが結合されている、請求項１に記載の結合因子セット。
【請求項３】
標識物質が可視光を吸収または反射する物質である、請求項２に記載の結合因子セット。
【請求項４】
インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーを用いて、前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する工程、および
増幅した前記核酸と請求項２または３に記載の結合因子セットとをハイブリダイズさせ、前記核酸と第１の結合因子および第２の結合因子との複合体を形成することで、前記核酸を検出する工程を含む、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
第一のプライマーおよび第二のプライマーが、以下の組み合わせから選択される１以上である、
請求項４に記載の検出方法：
第一のプライマーが配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドであって、第二のプライマーが配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第一のプライマーが配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドであって、第二のプライマーが配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドである組み合わせ；並びに
第一のプライマーが配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドであって、第二のプライマーが配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドである組み合わせ。
【請求項６】
インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、第一のプライマーおよび第二のプライマーにより増幅された前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を検出するための前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第１の結合因子および第２の結合因子とを含む、インフルエンザウイルスＲＮＡの検出キットであって、
第一のプライマーおよび第二のプライマーの組み合わせが、
第一のプライマーが配列番号１に記載のオリゴヌクレオチドであって、第二のプライマーが配列番号２に記載のオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第一のプライマーが配列番号３に記載のオリゴヌクレオチドであって、第二のプライマーが配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドである組み合わせ；並びに
第一のプライマーが配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドであって、第二のプライマーが配列番号６に記載のオリゴヌクレオチドである組み合わせ
から選択される１以上であり、
前記第１の結合因子および第２の結合因子の組み合わせが、
第１の結合因子が配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１５、１６、および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１６および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１６および１７から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１０、１１、１２および１７から選択されるいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１０、１２、１３および１５から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７および２１から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７、１９および２１から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１３、１５および１９から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１７および２１から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号１３、１５および１９から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２４および２６から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２および２６から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２および２６から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；
第１の結合因子が配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２および２３から選択される１以上に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ；並びに
第１の結合因子が配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、第２の結合因子が配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ
から選択される１以上である、
前記検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に検出可能な結合因子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルス（ゲノムとしてＲＮＡを有するウイルス）であり、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。さらにＡ型は、ウイルス表面上のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質に基づいて、亜型へと分類される。インフルエンザウイルスのうちＡ型（中でもＨ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）ならびにＢ型は、季節性インフルエンザとして毎年流行を繰り返している。
【０００３】
インフルエンザに対する治療法としては、抗インフルエンザウイルス薬の投与が効果的である。しかしながら抗インフルエンザウイルス薬の多くはウイルスの増殖を阻害する作用機構のため、発症後早期に投与する必要がある。また類似の症状を示す他のウイルスや病原菌に対しては効果がない。従って、季節性インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出することが、臨床上重要である。
【０００４】
インフルエンザウイルスの検出法としては種々の方法が知られており、中でも臨床的にはイムノクロマト法による検出法が最も用いられている。しかしながら、イムノクロマト法による検出法は検出感度が低く、インフルエンザウイルス数が少ない感染初期では検出できないことが課題となっている。
【０００５】
イムノクロマト法よりも高感度にインフルエンザウイルスを検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＴＲＣ法（特許文献２、非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）等の核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に増幅して検出するため、インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出できる可能性を有している。しかしながらインフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出するには、増幅したインフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に捕捉可能なオリゴヌクレオチドを最適化する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献２】特許第４４３８１１０号公報
【特許文献３】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献４】特許第３１５２９２７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、増幅したインフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に捕捉し、かつ高感度な検出が可能なオリゴヌクレオチド、および前記オリゴヌクレオチドを用いたインフルエンザウイルスＲＮＡ検出法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に捕捉し、かつ高感度な検出が可能な結合因子セット（オリゴヌクレオチドの組み合わせ）を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第１の結合因子および第２の結合因子からなる、前記特定塩基配列を含む核酸を検出するための結合因子セットであって、
第１の結合因子および第２の結合因子が、それぞれ、配列番号７から９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイス可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドである、前記結合因子セットである。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、第１の結合因子および第２の結合因子が、それぞれ、配列番号３０から３２のいずれかに記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドである、前記第一の態様に記載の結合因子セットである。
【００１２】
また本発明の第三の態様は、第１の結合因子および第２の結合因子が、それぞれ、配列番号１０から２６のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドである、前記第二の態様に記載の結合因子セットである。
【００１３】
また本発明の第四の態様は、第１の結合因子および第２の結合因子が、それぞれ、配列番号１０から２１のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチド、および配列番号２２から２６のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドである、前記第三の態様に記載の結合因子セットである。
【００１４】
また本発明の第五の態様は、第１の結合因子には標識物質が結合されており、第２の結合因子にはメンブレンが結合されている、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の結合因子セットである。
【００１５】
また本発明の第六の態様は、標識物質が可視光を吸収または反射する物質である、前記第五の態様に記載の結合因子セットである。
【００１６】
さらに本発明の第七の態様は、
インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーを用いて、前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する工程、および
増幅した前記核酸と前記第五または第六の態様に記載の結合因子キットとをハイブリダイズさせ、前記核酸と第１の結合因子および第２の結合因子との複合体を形成することで、前記核酸を検出する工程を含む、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法である。
【００１７】
また本発明の第八の態様は、
第一のプライマーが、配列番号１、３、５のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号２、４、６のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記第七の態様に記載の検出方法である。
【００１８】
さらに本発明の第九の態様は、
インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーと、第一のプライマーおよび第二のプライマーにより増幅された前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を検出するための前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第１の結合因子および第２の結合因子とを含む、インフルエンザウイルスＲＮＡの検出キットであって、
第一のプライマーが、配列番号１、３、５のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号２、４、６のいずれかに記載の塩基配列からなる、一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第１の結合因子が、標識物質を結合した配列番号１０から２６のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、
第２の結合因子が、メンブレンに結合された配列番号１０から２６のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドである、
前記検出キットである。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明において特定塩基配列とは、インフルエンザウイルスＲＮＡのうち、第１の結合因子（または第２の結合因子）との相同領域の５’末端側から第２の結合因子（または第１の結合因子）との相同領域の３’末端側までの塩基配列を少なくとも含む塩基配列をいう。特に本発明の結合因子セットを、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーおよび前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーにより増幅された核酸に対し適用する場合は、インフルエンザウイルスＲＮＡのうち、第二のプライマーとの相同領域の５’末端から第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。
【００２１】
本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。
【００２２】
本発明は、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第１の結合因子および第２の結合因子として、配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の６４０番目から７１８番目までの塩基配列）、配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の６８５番目から７５９番目までの塩基配列）、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４（Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（−鎖））の４６４番目から５４０番目までの塩基配列）のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。オリゴヌクレオチドの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲、さらに好ましくは１５塩基から３０塩基までの範囲、最も好ましくは１８塩基から２０塩基の範囲である。
【００２３】
なお本発明の結合因子セットは、第１の結合因子および第２の結合因子とも、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相同的な配列、すなわち前記特定塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。従って、第１の結合因子が前記特定塩基配列の相補鎖にハイブリダイズする領域と、第２の結合因子が前記特定塩基配列の相補鎖にハイブリダイズする領域とは重ならないほうが好ましく、重なるとしても３塩基以内が好ましい。
【００２４】
本発明の結合因子セットは、検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡの種類により、前述したオリゴヌクレオチドの中から適宜選択して用いればよい。例えば、
検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＨ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、第１の結合因子および第２の結合因子として、配列番号７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いればよく、
検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＨ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、第１の結合因子および第２の結合因子として、配列番号８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いればよく、
検出対象とするインフルエンザウイルスＲＮＡがＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡであれば、第１の結合因子および第２の結合因子として、配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いればよい。さらに複数の種類のインフルエンザウイルスＲＮＡを同時に検出したい場合は、前述した各種インフルエンザウイルスＲＮＡに適した検出因子セット（オリゴヌクレオチドの組み合わせ）を選択すればよい。例えば、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡとＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡとを合わせて検出したい場合は、第１の結合因子および第２の結合因子として、
配列番号７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
配列番号８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
をそれぞれ用いればよい。
【００２５】
配列番号７に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６４０番目から７１８番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６９９番目から７１８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６９９番目から７１６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６９７番目から７１４番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６８２番目から７０１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６８１番目から６９８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６７９番目から６９６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６６１番目から６８０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６５２番目から６６９番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６４０番目から６５９番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２６】
配列番号８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６８５番目から７５９番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号１３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２７番目から７４６番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２６番目から７４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２４番目から７４１番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号１９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７４２番目から７５９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７０６番目から７２５番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６８５番目から７０４番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２７】
配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６４番目から５４０番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１８塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、さらに具体的な例として、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５２１番目から５４０番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５０２番目から５１９番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４８８番目から５０５番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４８３番目から５００番目までの塩基配列の相補配列）および配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６４番目から４８１番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２８】
本発明の結合因子セットは、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせとして有用である。特に本発明の結合因子セットによる検出の前に、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーを用いて、前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅する工程を行なうと、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡを高感度に検出できるため、好ましい。第一のプライマーの具体例として、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の６１６番目から６３５番目までの塩基配列）、配列番号３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６６２番目から６８１番目までの塩基配列）、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４３２番目から４５２番目までの塩基配列）のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドがあげられ、
第二のプライマーの具体例として、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の７１７番目から７４３番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６２番目から７８８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の５４２番目から５６５番目までの塩基配列の相補配列）のいずれかに記載の塩基配列からなる一つ以上のオリゴヌクレオチドがあげられる。また第一のプライマーの５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸からＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法を用いて、ＲＮＡを増幅させることができる点で好ましい。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの例として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（Ｔ７プロモーター）である配列番号３３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００２９】
本発明の結合因子セットのうち、第１の結合因子に標識物質が、第２の結合因子にメンブレンが、それぞれ結合されていると、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の相補配列を含む核酸と第１の結合因子および第２の結合因子とのハイブリダイゼーションを、展開液を用いたクロマトグラフィーにより行なえるため、検出工程が容易となる点で好ましい。第１の結合因子に結合させる標識物質は、メンブレンに結合した第２の結合因子および前記第１の結合因子と標的核酸とが結合し、前記第１の結合因子が前記メンブレンに一定量集まることで検出可能となる物質であればよく、着色高分子粒子、金コロイド、色素、蛍光物質が例示できる。特に可視光を吸収または反射する物質を標識物質として用いると、前記第１の結合因子が一定量集まることで目視での検出が可能となるため、好ましい。第１の結合因子と標識物質との結合は、結合因子の態様により、適宜選択でき、例えば、共有結合、静電気力による結合、抗原−抗体結合、リガンド−レセプター結合、ビオチン−アビジン結合、ヌクレオチド間のハイブリダイズ、またそれらの組み合わせがあげられる。また第２の結合因子を固定させるメンブレンは、
第２の結合因子と直接または間接的に結合可能な物質であり、
前記（１）の工程で得られた、標的核酸と第１の結合因子との複合体を含む溶液から展開液を用いたクロマトグラフィーにより前記複合体を分離可能な物質であり、
かつ前記複合体と第２の結合因子とが結合した際、第１の結合因子に結合した標識物質を集積可能な物質、
であれば限定はなく、例えば、ニトロセルロース、ナイロンなどの多孔質メンブレンがあげられる。さらに第２の結合因子との結合を強固にするために、前記固相に適当な加工や官能基、結合因子の導入を行なってもよい。第２の結合因子と固相との結合は、結合因子の態様により適宜選択でき、例えば、共有結合、静電気力による結合、抗原−抗体結合、リガンド−レセプター結合、ビオチン−アビジン結合、ヌクレオチド間のハイブリダイズ、またそれらの組み合わせがあげられる。
【００３０】
前述した第一のプライマーと第二のプライマーを用いたインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅させる工程と、標識物質を結合した第１の結合因子とメンブレンに結合した第２の結合因子とを用いて検出する工程を組み合わせることで、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡを行なう場合、
前記核酸を増幅させる工程と増幅した前記核酸と第１の結合因子とのハイブリダイゼーション（すなわち、前記核酸と第１の結合因子との複合体の形成）とを同時に行なった後、第２の結合因子とのハイブリダイゼーションを行なうことで、前記核酸と第１の結合因子および第２の結合因子との複合体を形成させてもよいし、
前記核酸を増幅させる工程の後、増幅した前記核酸と第１の結合因子および第２の結合因子とのハイブリダイゼーションを第１の結合因子、第２の結合因子の順、または同時に行なうことで、前記核酸と第１の結合因子および第２の結合因子との複合体を形成させてもよい。
【００３１】
展開液を用いたクロマトグラフィーを用いて、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列を含む核酸と第１の結合因子および第２の結合因子との複合体を形成させる場合、前記展開液に非イオン界面活性剤を含ませるとよい。展開液に非イオン界面活性剤を添加することでクロマトグラフィーによる分離が促進されるからである。非イオン界面活性剤としては、当業者が通常用いる非イオン界面活性剤の中から適宜選択することができ、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ６０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（以上、商品名）が例示できる。中でもＴｗｅｅｎ  ２０が、展開液に添加する非イオン界面活性剤として好ましい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の結合因子セットは、第１の結合因子および第２の結合因子が、それぞれ、配列番号７から９のいずれかに記載の塩基配列とストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイス可能な一つ以上のオリゴヌクレオチドであり、試料中に含まれるインフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の相補配列を含む核酸に特異的に捕捉することで、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に検出することができる。
【００３３】
さらに第１の結合因子に標識物質を、第２の結合因子にメンブレンを、それぞれ結合させることで、前記核酸と第１の結合因子および第２の結合因子との複合体を形成する工程を、展開液を用いたクロマトグラフィーにより行なえるため、検出を容易に行なえる。さらに前記標識物質が可視光を吸収または反射する物質であると、前記検出を目視で行なうことができる。
【００３４】
また本発明の結合因子セットによる検出を行なう前に、インフルエンザウイルスＲＮＡの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと前記特定核酸の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとを用いて前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸をあらかじめ増幅させると、インフルエンザウイルスＲＮＡを高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の結合因子セットを用いた、インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出結果を示す図（クロマトストリップ）。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３７】
実施例１  インフルエンザウイルス標準ＲＮＡの調製
後述の実施例で使用する、インフルエンザウイルスＲＮＡ（以下、標準ＲＮＡと表記）は、以下に示す方法で調製した。
（１）配列番号２７（Ｈ１Ｎ１亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ９６９５３６の４１０番目から９３０番目までの塩基配列）、配列番号２８（Ｈ３Ｎ２亜型Ａ型インフルエンザウイルス、セグメント５、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＣ＿００７３６９の４５５番目から９７５番目までの塩基配列（ただし６６３番目のＣはＴ））および配列番号２９（Ｂ型インフルエンザウイルス、セグメント７、ｃＤＮＡ部分配列、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の２０６番目から７３５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを調製し、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ製）へ挿入した（なお、当該ｃＤＮＡ配列の相補鎖の５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製したプラスミドＤＮＡを、挿入したインフルエンザウイルスｃＤＮＡ配列の５’末端側で制限酵素消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（３）（２）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写を行なった。その後、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記鋳型ＤＮＡを完全消化し、精製することで標準ＲＮＡを調製した。調製したＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００３８】
なお、本例で調製した標準ＲＮＡの全長は約５００塩基と、インフルエンザウイルスＲＮＡの全長（セグメント５：約１５００塩基、セグメント７：約１１００塩基）の一部であるが、インフルエンザウイルスＲＮＡの測定には十分適用可能である。
【００３９】
実施例２  標識物質を結合した第１の結合因子の作製
標識物質として、直径５００ｎｍのラテックス粒子Ｅｓｔａｐｏｒ（メルク製）を使用し、以下に示す方法で、当該標識物質をインフルエンザウイルスＲＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイス可能なオリゴヌクレオチド（第１の結合因子）に結合させた。
（１）ラテックス粒子１．４×１０１０個に対し、３’末端側をアミノ基で修飾した配列番号１０から２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ１５０ｎｇ添加し、３０分室温で静置した。
（２）さらに水溶性カルボジイミドを終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるよう添加し、室温で２時間反応させ、ラテックス粒子を当該オリゴヌクレオチドに結合させた。
（３）遠心により得られた沈殿（標識物質を結合した第１の結合因子）は、Ｔｗｅｅｎ  ２０およびＳＤＳを含む溶液により洗浄し、バッファー（０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中に保存した。
【００４０】
実施例３  メンブレンに結合した第２の結合因子の作製
メンブレンとして、ニトロセルロースメンブレンＨＦ１２０（メルク製）を台紙（メルク製）に結合させたものを使用し、以下に示す方法で当該メンブレンにインフルエンザウイルスＲＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイス可能なオリゴヌクレオチド（第２の結合因子）を結合させた。
（１）配列番号１０から２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド５０μＭを塗布機を用いて、メンブレンに塗布した。
（２）ＵＶを２分間照射後、３７℃で２時間乾燥することで、前記オリゴヌクレオチドをメンブレンに結合させた。
【００４１】
実施例５  Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出
下記に示す方法で、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）ウイルスＲＮＡを増幅させた後、目視による検出を試みた。
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２７）を、ＴＥバッファーを用いて１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、これをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成を含む反応液１４μＬ、３μＬの０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０および実施例２で作製した標識物質を結合した第１の結合因子１０９個（２μＬ）を０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４２】
反応液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
９０ｍＭ  トレハロース
０．２μＭ  第一のプライマー（配列番号１）（当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号３３）が付加されている
０．２μＭ  第二のプライマー（配列番号２）
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（自社製）
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
【００４３】
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ  塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ  塩化カリウム
１．２％  グリセロール
１１．５％  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で８分間保温することで、増幅反応を行なった。
（５）増幅反応後、実施例３で作製した第２の結合因子を結合したメンブレンをＰＣＲチューブに入れ、クロマトグラフィーを１から２分間実施した。
【００４４】
結果を表１に示す。
第１の結合因子として配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１５、１６または１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１６または１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１６または１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１０、１１、１２または１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１０、１２、１３または１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
それぞれ目視検出できることを確認した。特に、第１の結合因子と第２の結合因子との組み合わせとして、配列番号１０と配列番号１６との組み合わせ、配列番号１０と配列番号１７との組み合わせ、配列番号１１と配列番号１７との組み合わせ、配列番号１５と配列番号１７との組み合わせ、配列番号１７と配列番号１０との組み合わせ、のいずれかを用いたときに、良好な目視検出ができた。
【００４５】
【表１】
0006623534.tif 000002
実施例６  Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出
ＲＮＡ試料として、実施例１で調製したＡ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２８）をＴＥバッファーを用いて１０３コピー／５μＬにしたものを、第一のプライマーとして配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、第二のプライマーとして配列番号４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は、実施例５と同様な方法で、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡの増幅および目視検出を試みた。
【００４６】
結果を表２に示す。
第１の結合因子として配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１７または２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１７、１９または２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１３、１５または１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１７または２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号１３、１５または１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
それぞれ目視検出できることを確認した。特に、第１の結合因子と第２の結合因子との組み合わせとして、配列番号１３と配列番号１７との組み合わせ、配列番号１３と配列番号２１との組み合わせ、配列番号１５と配列番号２１との組み合わせ、配列番号１７と配列番号１９との組み合わせ、配列番号２１と配列番号１９との組み合わせ、のいずれかを用いたときに、良好な目視検出ができた。
【００４７】
【表２】
0006623534.tif 000003
実施例７  Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出
ＲＮＡ試料として、実施例１で調製したＢ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２９）をＴＥバッファーを用いて１０３コピー／５μＬにしたものを、第一のプライマーとして配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、第二のプライマーとして配列番号６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は、実施例５と同様な方法で、Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡの増幅および目視検出を試みた。
【００４８】
結果を表３に示す。
第１の結合因子として配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号２４または２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号２２または２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号２２または２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号２２または２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
第１の結合因子として配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを第２の結合因子としたときに、
それぞれ目視検出できることを確認した。特に、第１の結合因子と第２の結合因子との組み合わせとして、配列番号２２と配列番号２６との組み合わせ、配列番号２３と配列番号２２との組み合わせ、配列番号２４と配列番号２２との組み合わせ、配列番号２５と配列番号２２との組み合わせ、配列番号２６と配列番号２２との組み合わせ、のいずれかを用いたときに、良好な目視検出ができた。
【００４９】
【表３】
0006623534.tif 000004
実施例８  結合因子セットの交差検出
実施例５から７の結果、各型のインフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出が確認された、第１の結合因子と第２の結合因子との組み合わせ（結合因子セット）が、他の型のインフルエンザウイルスＲＮＡも検出するか確認した。実験は、Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡの検出については実施例５と同様な方法で、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスＲＮＡの検出については実施例６と同様な方法で、Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡの検出については実施例７と同様な方法で、それぞれ実施した。
【００５０】
結果を表４に示す。
【００５１】
第１の結合因子と第２の結合因子との組み合わせとして、配列番号１３と配列番号１７との組み合わせ、配列番号１５と配列番号１７との組み合わせ、配列番号１９と配列番号１７との組み合わせ、のいずれかを用いたときは、Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡを亜型（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）に関係なく検出することができた。また配列番号２２と配列番号２６との組み合わせ、配列番号２４と配列番号２６との組み合わせ、配列番号２５と配列番号２２との組み合わせ、のいずれかを用いたときは、Ｂ型インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に検出することができた。そして配列番号２３と配列番号２２との組み合わせ、または配列番号２６と配列番号２２との組み合わせを用いたときは、インフルエンザウイルスＲＮＡを型（Ａ型、Ｂ型）に関係なく検出することができた。
【００５２】
【表４】
0006623534.tif 000005
実施例９  Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスＲＮＡの目視検出
（１）実施例１で調製したＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２７）、Ａ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２８）およびＢ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡ（配列番号２９）を、ＴＥバッファーを用いてそれぞれ１０３コピー／５μＬとなるように希釈し、これらをＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成を含む反応液１４μＬ、３μＬの０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０ならびに標識物質を結合した配列番号１３、１９および２２に記載の配列からなる第１の結合因子（実施例２で作製）各１０９個を含む溶液２μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料のいずれかを５μＬ添加した。
【００５３】
反応液の組成：濃度は開始液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
７０ｍＭ  トレハロース
各０．２μＭ  第一のプライマー（配列番号１、３および５）：当該プライマーには、各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側にＴ７プロモーター配列（配列番号３３）が付加されている
各０．２μＭ  第二のプライマー（配列番号２、４および６）
６．４Ｕ        ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成の開始液８μＬを添加した。
【００５４】
開始液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ  塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ  塩化カリウム
１．２％  グリセロール
１１．５％  ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを４６℃で８分間保温することで、増幅反応を行なった。
（５）増幅反応後、配列番号１７および２６に記載の配列からなる第２の結合因子を結合したメンブレン（実施例３で作製した）をＰＣＲチューブに入れ、クロマトグラフィーを１から２分間実施した。
【００５５】
結果を図１に示す。Ａ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡおよびＡ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルス標準ＲＮＡをＲＮＡ試料としたときは、配列番号１７（Ａ型インフルエンザウイルス検出用オリゴヌクレオチド）を結合したメンブレンの位置に、Ｂ型インフルエンザウイルス標準ＲＮＡをＲＮＡ試料としたときは、配列番号２６（Ｂ型インフルエンザウイルス検出用オリゴヌクレオチド）を結合したメンブレンの位置に、それぞれ目視検出可能なバンドを確認した。
【図１】
0006623534.tif 000006
【配列表】
0006623534000001.app