(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、非脂肪細胞の生体膜における飽和長鎖脂肪酸およびステロールの過度の存在と関連する低酸素症による脂肪毒性の予防および／または処置のための治療用組成物の調製における化合物の使用であって、前記化合物が少なくとも１つのヒドロキシル残基を含み、その上に１６〜２４個の炭素原子を含み、１〜６個の不飽和をシス型立体配置に有する固有の不飽和脂肪酸がグラフトされた極性頭部を含み、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロメチル）プロピルオレエート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、およびその混合物の中から選択され、前記低酸素症による脂肪毒性が、呼吸不全を導く前記対象における肺の病態と関連する、前記化合物の使用。
【請求項２】
前記低酸素症による脂肪毒性が、前記非脂肪細胞の細胞膜および／またはその小器官の膜の流動性を低減するまたは排除さえすることによる、前記非脂肪細胞の機能障害および／またはアポトーシスの供給源にあることを特徴とする、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
前記化合物が、中性脂質を合成する能力がある細胞に対して毒性がないことを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物の使用。
【請求項４】
前記中性脂質がトリグリセリドおよび／またはエステル型ステロールであることを特徴とする、請求項３に記載の化合物の使用。
【請求項５】
前記中性脂質を合成する能力がある細胞が、気管支上皮細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の化合物の使用。
【請求項６】
Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、あるいは、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロメチル）プロピルオレエート、およびその混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７】
前記治療用組成物が、前記生体膜の流動性を回復させることにより、低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置することを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項８】
前記治療用組成物が、（ｉ）脂質中毒の酵母サッカロマイセス・セレビシエのｈｅｍ１Δ変異体の成長を回復させることができる、（ｉｉ）ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）を低減もしくは排除できる、（ｉｉｉ）酵母サッカロマイセス・セレビシエのＱＭ変異体に対して毒性がない、および／または（ｉｖ）脂質中毒の哺乳類細胞のアポトーシスによる細胞死を低減もしくは排除できることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
前記肺の病態が、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１０】
前記治療用組成物が、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患である肺の病態を予防および／または処置するために使用するためのものである、請求項１から９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
前記対象が、動物である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
前記動物が、哺乳類である、請求項１１に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
前記哺乳類が、ヒトである、請求項１２に記載の化合物の使用。
【請求項１４】
対象における、非脂肪細胞の生体膜における飽和長鎖脂肪酸およびステロールの過度の存在と関連する低酸素症による脂肪毒性の予防および／または処置のための治療用組成物であって、少なくとも１つのヒドロキシル残基を含み、その上に１６〜２４個の炭素原子を含み、１〜６個の不飽和をシス型立体配置に有する固有の不飽和脂肪酸がグラフトされた極性頭部を含む化合物を含み、前記化合物がマンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロメチル）プロピルオレエート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、およびその混合物の中から選択され、前記低酸素症による脂肪毒性が、呼吸不全を導く前記対象における肺の病態と関連する、治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。本発明は、より詳細には、対象における脂肪毒性、特に、低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置するための化合物の使用に関する。脂肪毒性、またはその広い意味で異常脂質血症は、典型的には、非脂肪細胞の生体膜を含む生体膜における脂肪酸、特に、飽和長鎖脂肪酸、および／またはステロールの過度の存在に関する。本発明は、より詳細には、脂肪毒性、特に、低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置するためのかかる化合物を含む組成物、特に、医薬組成物、および栄養補助剤または補助物質、ならびにその使用に関する。本発明の化合物および組成物は、特に、肺の病態の中からの病態、特に、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患を予防および／または処置するために有利に用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症は、多くの器官の腺上皮に特に影響する疾患である。常染色体劣性伝達を伴うこの致死的な遺伝性疾患は、７番染色体に位置するＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）遺伝子における変異と結び付けられ、これがＣＦＴＲタンパク質の変質を導く。１，９００種より多くの異なる変異が、今までに同定された。最も頻繁な変異は、「Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲ」（ΔＦ５０８）変異であり、ここで、３つのヌクレオチドが、遺伝子の１０番目のエクソンのレベルで欠失され、これが５０８位のアミノ酸であるフェニルアラニンの消失を導く。ＣＦＴＲタンパク質の機能障害は、粘液の粘度の増大、および呼吸器および消化管におけるその蓄積を特に促進する。臨床上の観点から、最も頻繁な形態は、呼吸器疾患、消化障害、および身長と体重の成長障害と関連する。肺障害は、罹患率および死亡率の主要な原因である。嚢胞性線維症は、呼吸状態の段階的悪化を導く、細菌性重複感染を伴う気管支の慢性炎症を導き、逐次発作を通じて発症し、咳嗽などの症状で始まり、そして重度の呼吸障害に終わる。種々の対症緩和処置が利用可能であり、これらは、理学療法、抗生剤療法、粘液溶解薬の投与を含む。しかしながら、医薬プロトコール、または遺伝子治療プロトコールの使用にも関わらず、治癒的処置は今までのところ存在しない。現在市販されている唯一の医薬は、Ｇ５５１Ｄ変異を有する慢性嚢胞性線維症対象でＣＦＴＲタンパク質を増強する分子を含む、Ｉｖａｃａｆｔｏｒ（登録商標）である。加えて、治療対象の分子についてのいくつかの薬理学研究および／または臨床研究が報告されている。これらの候補分子は、機能障害ＣＦＴＲタンパク質を正し、調節し、可能性を持たせ、および／または介添えすることを一般に目的とする（例えば、Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｐｅｄｅｍｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｖａｎ  Ｇｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｖａｎ  Ｇｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照）。これらの分子のいくつかは、適切な３次元構造を取得し、分泌チャネルに沿って進み、そしてその目的部位、すなわち、細胞膜に到達することを妨げる、タンパク質Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲにおけるミスフォールディング欠陥を正すことを特に目的とする。しかしながら、これらの候補分子の大部分は、インビボ研究および／または臨床試験において有効性がないことに悩まされる。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、呼吸器起源のいくつかの全身性慢性疾患におよび、気管支に影響する。この疾患の主な原因は喫煙である。ＣＯＰＤは、肺胞の永久的な膨張と関連する、気道および肺のゆっくりかつ逐次的な閉塞により特に特徴付けられる。臨床上の観点から、ＣＯＰＤは、可能性のある神経学的合併症、心血管系合併症、または筋肉の合併症を伴う呼吸器疾患と関連する。ＣＯＰＤは、呼吸障害を特に導き、これは、重度であり得る。利用可能な種々の症候性対症療法、例えば、抗生物質処置、コルチコステロイド療法、呼吸器作用薬または機械的換気補助の使用、もしくはこの疾患の最も重度の形態のための長期間の酸素療法さえ存在する。
【０００４】
最近の研究は、嚢胞性線維症の患者の生検から新たに分離された気管支上皮細胞が、細胞膜のホスファチジルコリン（ＰＣ）内においてパルミチン酸（ＳＦＡ）の異常に多い蓄積を示すことを示した（Ｐａｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照）。以前、内在性細胞ＳＦＡのＵＦＡへの変換は、酸素依存性酵素に触媒されることが確立された（Ｐｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｐｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。従って、低酸素症が、嚢胞性線維症を有する患者の生検において誘導されること、または逆に、低酸素症が、インビトロで、気管支上皮細胞において脂肪毒性を導くことが示された（Ｐａｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照）後に、嚢胞性線維症を有する患者の気管支上皮細胞が、低酸素症により引き起こされるパルミチン酸の蓄積を介して脂肪毒性を被ったと結論付けられた。加えて、本発明者らまた、肺癌に罹患した喫煙者の偽健常生検（これらの生検は、癌に冒された肺ゾーンの外側から採取された）において、低酸素症を脂肪毒性に結び付ける、同一タイプの観察を行うこともできた。
【０００５】
広く理解される通り、異常脂質血症（または脂肪毒性）は、脂質、典型的には、遊離脂肪酸または非エステル化脂肪酸、ステロール（例えば、血中のコレステロール、トリグリセリドまたはリン脂質）の異常高濃度または異常に低減された濃度と特に定義される。次に、異常脂質血症は、脂質ホメオスタシスの調節解除と定義される。
【０００６】
非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）または遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、生物の主要なエネルギー成分を表す。これらは、その炭化水素鎖を構成する、その二重結合の数および炭素原子の数により異なる脂肪酸の複雑な混合により構成される。内在性起源について、これらは、細胞の細胞質において生合成により形成され、アシル−ｃｏＡの形態で用いられて、脂肪組織および肝臓においてトリグリセリドが特に合成される。
【０００７】
血漿において、ＮＥＦＡの８５％となる、主に４種の脂肪酸が存在し、これらは、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸およびステアリン酸である。ＮＥＦＡの大部分は、アルブミンに結合する。これらは、絶食中に、組織および血液リポタンパク質リパーゼの作用下で、グリセロールおよび脂肪酸に加水分解される、脂肪組織のトリグリセリドからもたらされる。その濃度は、年齢、食物摂取、および運動に依存して高い割合で変動する。その放出は、食後期間中に徐々に停止される。
【０００８】
ステロールは、ステランコアを有する脂質であり、その炭素３が、水酸化物基の担体である。ステロールは、ステロイドのサブクラスであるとみなされる。最も一般的かつ広範なステロールの１つであるコレステロールは、細胞作動に極めて重要であり、ビタミンおよび脂溶性ステロイドホルモンの前駆体である。
【０００９】
典型的には、広く理解される通り、細胞レベルでの異常脂質血症は、生体膜における脂質の異常高濃度、特に、生体膜における飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の蓄積に対応する。用語「細胞異常脂質血症」もまた用いられる。生体膜におけるＳＦＡのかかる蓄積は、細胞レベルでの膜柔軟性の全体的な妨害を導く。この現象は、脂肪毒性として知られる。確立された脂肪毒性は、全ての膜機序の妨害（タンパク質分泌経路における各段階で検出可能）に関与する。ヒトにおいて、従って、単独で中性脂質を合成し、それを貯蔵する能力がある脂肪細胞を除き、全ての細胞が脂肪毒性の懸念を有し得る。
【００１０】
現在までに、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）、特に、オレイン酸（オリーブオイル）のみが、ＳＦＡの蓄積と関連付けられる中毒の有害な作用に対抗することが公知であった（Ｃｕｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｄｉａｋｏｇｉａｎｎａｋｉｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｋａｔｓｏｕｌｉｅｒｉｓｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｐｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｄｅｇｕｉｌｅｔ  ａｌ．，２０１１）。しかしながら、ニュートラシューティカルおよび／または医薬としてのその使用は、２つの主要な制限に直面する。一方では、ＵＦＡは、予防的特性を本質的に有し、それ故、確立された脂肪毒性、すなわち、全ての膜機序の妨害（タンパク質分泌経路の全ての段階で検出可能）に関与する脂肪毒性の処置という状況で制限された対象である。実際に、ＵＦＡは、食物摂取中、膜リン脂質（ＰＬ）の合成において、ＳＦＡとの直接的な競合に入ることにより、作用する。他方では、ＵＦＡの毒性が、過度の遊離脂肪酸、特に、ＵＦＡを変換し（緩衝し）、次に、中性脂質、典型的には、トリグリセリド（ＴＧ）および／またはエステル型ステロールとして貯蔵する能力がない細胞において示された。これは、例えば、４種のアシルトランスフェラーゼ酵素Ｌｒｏ１ｐ、Ｄｇａ１ｐ、Ａｒｅ１ｐおよびＡｒｅ２ｐの不存のせいで、中性脂質合成の調節解除が観察される、酵母株についての場合である。この変異株の、ＵＦＡの外在性供給源への曝露中、脂質調節解除は、ＵＰＲ（小胞体ストレス応答、本明細書において以下を参照）の独立したプロセスによる、細胞内膜の大量の増殖、次に、細胞死により、表される（Ｋｏｈｌｗｅｉｎ  ＆  Ｐｅｔｓｃｈｎｉｇｇ，２００７、Ｐｅｔｓｃｈｎｉｇｇｅｔ  ａｌ．，２０１１）。興味深いことに、同一の現象が、哺乳類の細胞において観察された（Ｌｉｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これは、細胞が脂肪中毒状態を既に被っているとき、なぜ不飽和脂肪酸がこれらの細胞に対して毒性があるかを説明する。これは、不飽和脂肪酸を中性脂質の形態で貯蔵する細胞の能力が過度である状態である（脂肪中毒の細胞は、「代謝的に不活性な」細胞とみなされる）。あるいは、正常状態下で、非常に低いＴＧ合成能力を有する細胞、例えば、膵臓の非β細胞について、同一の現象も観察された（Ｃｎｏｐ  Ｍｅｔ  ａｌ．，２００１）。ヒトにおいて、脂肪細胞（中性脂質を合成し、それらを貯蔵する能力のある、唯一の細胞である）を除き、全ての細胞タイプは、従って、脂肪毒性の対象となることを免れない。ＳＦＡの蓄積と関連付けられる妨害が、インスリン合成に関与する膵β細胞のアポトーシス（Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）または肝細胞のアポトーシス（Ｅｇｎａｔｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を導くことは特に公知である。
【００１１】
従って、本明細書において上述の通り、脂肪中毒の細胞および器官の機能を根本的に回復させることを目的とする現在の治療ストラテジーはなく、それ故、特に、呼吸不全を導く肺の病態において直面する有害な作用のカスケードの初期段階、典型的には、既存の処置により標的とされる段階のそれぞれの上流にて作用する能力があるストラテジーは存在しない。加えて、本発明者らによる研究は、肺の病態、特に、詳細な嚢胞性線維症の枠組みにおいて、脂肪毒性の状況を考慮しないことが、科学技術的な制限に関与し得、現在までの治癒的処置の不存を説明し得ることを示す。
【００１２】
本発明者らは、生体膜内における脂肪毒性、典型的には、脂肪酸、特に、飽和脂肪酸の細胞蓄積の出現を予防するか、または全ての脂肪中毒の組織において一般的に損なわれた現象、すなわち、膜柔軟性において作用することにより、確立された脂肪毒性を処置するために用いられる、分子または化合物、およびかかる分子または化合物を含む組成物をここで説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、本明細書において上で特に説明された、先行技術の欠点を取り除くことを目的とする。
【００１４】
特に、少なくとも１つの実施態様において、対象における低酸素症による脂肪毒性を予防または処置することが、本発明の目標である。従って、本発明は、対象において、非脂肪細胞の生物学的細胞膜における飽和脂肪酸および／またはステロールの過度の存在と関連付けられる低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置することを特に目的とする。
【００１５】
少なくとも１つの実施態様によると、対象における肺の病態、特に、呼吸不全を導く肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患である肺の病態を予防およびまたは処置することが、本発明の別の目標である。本発明は、従って、嚢胞性線維症を予防および／または処置することを特に目的とする。本発明はまた、特に、慢性閉塞性肺疾患を予防および／または処置することも目的とする。
【００１６】
少なくとも１つの実施態様によると、特に、細胞膜および／または小器官の膜の流動性の減少または排除が関連する低酸素症による脂肪中毒の非脂肪細胞の機能障害またはアポトーシスを制限または予防さえすることが、本発明の別の目標である。
【００１７】
少なくとも１つの実施態様によると、対象における低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置する能力があり、一方、同時に、中性脂質、典型的には、トリグリセリドおよび／またはエステル型ステロールを合成する能力がない細胞に対して毒性がない化合物を提供することが、本発明の別の目標である。本発明は、対象における低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置する能力がある化合物であって、その特性においてオレイン酸に代わるか、またはこれより優れてさえおり、一方、同時に毒性がない化合物を提供することを特に目的とする。本発明は、従って、対象における低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置する能力があり、一方、同時に、気管支上皮細胞に対して毒性がない化合物を提供することを特に目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
これらの目標、ならびに本明細書において以下でより明確に明らかになる他の目標は、本発明による化合物、組成物、および対応する使用により達成される。
【００１９】
本発明は、脂肪酸、典型的には、飽和長鎖および／またはトランス脂肪酸による脂肪毒性と関連する病態を予防および／または処置することを意図した新規種類の分子に関する。用語、長鎖脂肪酸は、典型的には、炭素鎖が、少なくとも１４個の炭素原子、典型的には、１４〜２４個の炭素原子、例えば、１６個または少なくとも１８個の炭素原子、典型的には、１４〜２２個または１４〜１８個の炭素原子を含む脂肪酸を意味すると解される。
【００２０】
脂肪毒性は、生体膜内に存在するリン脂質におけるＳＦＡ／ＵＦＡ（不飽和脂肪酸）比の逆である形態を取り得、ＳＦＡが、優勢に存在するようになり、またはＵＦＡと完全にとって代わりさえする。
【００２１】
本発明の分子は、異常脂質血症、メタボリックシンドローム、メタボリックシンドロームの症候群または異常な特徴の予防および／または処置、好ましくは、２型糖尿病の予防および／または処置を意図し得る。
【００２２】
本発明の分子は、内在性起源の脂肪毒性（または「内在性」脂肪毒性）、特に、低酸素症による脂肪毒性（または「低酸素性」脂肪毒性）の予防および／または処置を意図し得る。用語「低酸素症」は、ある種の細胞、ある種の組織、および／または器官の不十分な酸素供給の状態を導く、組織の酸素要求と流入の間のミスマッチを意味すると解される。酸素正常状態の条件下で、Ｏ２およびＮ２の割合は、典型的には、９５％および５％である。従って、本発明の分子は、肺の病態、特に、呼吸不全と関連する肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤの中から選択される呼吸障害と関連する肺の病態を予防および／または処置することを意図し得る。
【００２３】
実際に、外在性起源の脂肪毒性（「外在性」脂肪毒性）と内在性起源の脂肪毒性（または「内在性」脂肪毒性）を見分けることは可能である。外在性脂肪毒性は、細胞の、ＳＦＡの環境供給源への過度の曝露により誘導される。内在性脂肪毒性は、その一部については、ＵＦＡとＳＦＡの間の内在性バランスの調節解除により誘導される。脂肪毒性のこれらの形態は、細胞が、ＳＦＡとＵＦＡの間のバランスの要求、および考慮される内膜コンパートメントに特異的な膜柔軟性の制約により、空間において、または時間内に、その脂肪酸含有量を制御または調節する能力がもはやないとき、特に出現する。低酸素症を模倣する条件下で培養される酵母細胞モデルにより、本発明者らは、酵母が、ＳＦＡを（例えば、内在性ＳＦＡのＵＦＡへの無変換により）蓄積すること、および誘導された脂肪毒性が、一定数の有害な作用、例えば、小胞体へのストレス、ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）の誘発、小胞化の欠陥、およびタンパク質分泌経路の遠位相における小胞輸送の欠陥を引き起こすことを示した。
【００２４】
本発明者らの出発点は、嚢胞性線維症およびＣＯＰＤに罹患している患者の臨床上の表が、いくつかの類似性を共有するという知見であった。これらの共通点は、（１）肺組織における炎症の憎悪、（２）粘液のレオロジー特性の変質と関連付けられる呼吸チャネルにおけるうっ帯、（３）アポトーシスの誘発の高い傾向、および（４）気管支性高血圧を含む。本発明者らは、これらの相違点を、ＳＦＡを伴った脂肪毒性の存在と関連付け、文献と比較し、この特徴が、全ての症状が生じる、鍵となる要因であり得ると提案した。この仮定を確かめるために、および可能な治療的解決を同定するために、本発明者らは、次に、いくつかの実験的研究を行った。
【００２５】
第１の段階において、新たに分離された気管支組織の、特に、パルミチン酸による脂肪毒性が、健常気管支組織の生検もしくは嚢胞性線維症またはＣＯＰＤに罹患した患者から得られた組織の生検を用いた、精製されたリン脂質の脂肪酸含有量の分析により、明らかにされた。加えて、この状態が、酸素依存性である、内在性ＳＦＡのＵＦＡへの変換に関与する酵素、細胞内不飽和化酵素の作用様式に基づき、呼吸不全および低酸素症の状態と相互に関連し得ると提案された。
【００２６】
第２の段階において、これらの結論が、患者における生検において観察された脂肪毒性を人工的に再構成したインビトロモデルにより、立証された。このモデルは、呼吸障害、特に、気管支上皮におけるＳＦＡによる脂肪毒性の形態の誘導における低酸素症の改善を立証した。
【００２７】
第３の段階において、パルミチン酸による気管支上皮細胞の脂肪毒性が、ＵＰＲプロセス、および最終的にアポトーシスを活性化したことが観察された。本発明者らはまた、本発明による化合物および組成物が、アポトーシスの誘発を有意に阻害すること、およびこれらの化合物が、それ故、脂肪毒性、特に、低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置するのに有用であることも示した。この点において、本発明によるこれらの化合物および組成物は、特に、肺の病態、特に、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患の中から選択される病態を予防および／または処置するために有利に用いられ得る。
【００２８】
第２に、本発明者らは、本発明による化合物および組成物が、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤにより影響された患者の気管支に対する作用を発揮することを示した。この点において、本発明による化合物および組成物は、特に、肺の病態、特に、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患と関連する気管支性高血圧を予防および／または処置するために、有利に用いられ得る。
【００２９】
本発明の分子（または化合物）が、過度のＳＦＡを補うために先行技術において用いられるＵＦＡ、特に、オレイン酸を超えて有する顕著な利点は、これらの後者の要因と対照的に、細胞毒性を起こさない、特に、中性脂質を合成する能力がない細胞、特に、非脂肪細胞、例えば、膵細胞または気管支上皮細胞において毒性を引き起こさないことである。
【００３０】
本発明の分子は、先行技術において予防的に用いられるＵＦＡと対照的に、例えば、膜柔軟性に対して作用することにより細胞機能を回復させるその能力のため、これらはまた治療上用いられ得るという別の主要な利点を有する。従って、これらは、確立された脂肪毒性、すなわち、検出可能な細胞機能障害に関与する、典型的には、コンパートメント間の細胞内コミュニケーションにおける基本的な機序であり、かつ細胞の生命に不可欠である、その膜小胞化機能および小胞輸送を行う細胞の能力の変質またはその無能力に関与する脂肪毒性を処置するために、有利に用いられ得る。
【００３１】
従って、本発明の１つの特定の目的は、対象における低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置するための使用のための、少なくとも１つのヒドロキシル残基を含み、その上に１６〜２４個、例えば、１６〜２２個または１６〜２０個の炭素原子を含み、および１〜６個、例えば、３個の不飽和をシス型立体配置に有する固有の不飽和脂肪酸がグラフトされた極性頭部を含む化合物に関する。
【００３２】
異常脂質血症または脂肪毒性は、典型的には、非脂肪細胞の生体膜を含む、生体膜に影響する。本出願において、広義の用語「異常脂質血症」、および用語「脂肪毒性」は、互換的に用いられる。異常脂質血症または脂肪毒性は、当該生体膜における過度の脂肪酸および／またはステロールの存在と一般に関連付けられる。脂肪酸は、特に、飽和長鎖脂肪酸である。ＳＦＡおよび／またはステロールの量は、例えば、それが、膜柔軟性を低下させることにより、細胞機能障害を促進するとき、過度であると特にみなされる。
【００３３】
本発明の別の目的は、対象における脂肪毒性、典型的には、本明細書において上で定義された脂肪毒性を予防および／または処置するための使用のための、極性頭部が、式（Ｉ）：
【化１】
0006594866.tif 000002
（式中、
Ａは、窒素または酸素原子であり、好ましくは、酸素原子であり、
ｎは、２または３と等しく、好ましくは、ｎは２と等しく、
Ｒは、何であれ、任意の化学基である）
のものである、化合物に関する。
【００３４】
１つの特定の実施態様において、本発明の文脈において用いられ得る、目的の化合物は、例えば、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール、１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート、２−アラキドノイルグリセロール、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピルオレエート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、プロピレングリコールモノオレエート、１−オレオイルグリセロール、２−オレオイルグリセロール、トリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、９−オクタデセン酸（Ｚ）−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルエステル、ジエチレングリコールモノオレエート、およびそれらの混合物の中から、好ましくは、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（１−オレオイルリソホスファチジン酸またはＬＰＡ）、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピルオレエート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、プロピレングリコールモノオレエート、トリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、および（９−オクタデセン酸（Ｚ）−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルエステル、およびそれらの混合物の中から選択される。
【００３５】
別の特定の実施態様において、本発明による目的の化合物は、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロメチル）プロピルオレエート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、およびそれらの混合物、あるいは、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、あるいは、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロメチル）プロピルオレエート、およびその混合物の中から選択される。
【００３６】
別の特定の実施態様において、脂肪毒性を予防および／または処置するために、本発明の文脈において用いられ得る、目的の化合物は、１−オレオイルグリセロール、２−オレオイルグリセロール、プロピレングリコールモノオレエート、およびトリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、ならびにその混合物、好ましくは、プロピレングリコールモノオレエート、およびトリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、ならびにその混合物の中から選択される。
【００３７】
本発明はまた、対象における肺の病態、特に、呼吸不全を導く肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患である、肺の病態を予防および／または処置するための使用のための、本発明において記載される化合物に関する。
【００３８】
本発明はまた、少なくとも１つの本発明による化合物を含む、医薬組成物、ニュートラシューティカルまたは食品栄養補助剤の形態を取る化合物に関する。１つの特定の目的は、典型的には、当該少なくとも１つの本発明による化合物に加えて、治療計画において有効な（および当業者により、そのようなものとして認識される）、少なくとも１つの他の化合物（本発明による化合物とは異なる）を含む、医薬組成物に関する。
【００３９】
本発明はまた、対象における低酸素症による脂肪毒性、典型的には、非脂肪細胞の生体膜を含む、生体膜における低酸素症による脂肪毒性、特に、脂肪酸、より詳細には、飽和および／またはトランス長鎖脂肪酸のある種の生体膜における過度の存在と関連付けられる低酸素症による脂肪毒性を予防および／または処置するための、かかる組成物の使用に関する。本発明はまた、対象における肺の病態、特に、呼吸不全を導く、肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患である、肺の病態を予防および／または処置するための、かかる組成物の使用にも関する。記載される使用はまた、特に、肺の病態、特に、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤの処置において、少なくとも１つの他の治療上有効な化合物（当業者により、そのようなものとして認識され、かつ本発明による化合物とは異なる）との併用で、有利に実施され得る。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明者らは、外在性供給源（食物）または内在性供給源からもたらされるＳＦＡ（低酸素症、または脂肪酸の不飽和化の工程の変異による変質）が、細胞膜を構成するリン脂質内に蓄積し、これにより、タンパク質分泌経路において役割を果たす、細胞内小器官の機能を損なうことにより、多数のプロセスを妨害することを示した（図１を参照）。
【００４１】
この証明を行うために、本発明者らは、哺乳類細胞において観察されるＳＦＡおよびコレステロールという全ての衝撃、特に、メタボリックシンドロームの発症に関与する、全ての異常を再生成する、簡単な単細胞モデル（パン酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から調製された、ｈｅｍ１Δ株）を開発した（Ｐｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、およびＰｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００４２】
ＹＰＧ培地（すなわち、エルゴステロール（Ｅｒｇ）もオレイン酸（Ｏｌｅ）のいずれも含有しない培地）において、ｈｅｍ１Δ株は、そのリン脂質、特に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）において飽和脂肪酸（特に、パルミチン酸、Ｃ１６：０）を蓄積する。エルゴステロールは、酵母において主に存在するステロールであることは、注意されなければならない。それ故、酵母において、それは、ヒトにとってのコレステロールの均等物を構築する。
【００４３】
トリグリセリドおよびステロールのエステルの合成に関与する酵素のコード遺伝子が欠損している、ＱＭ株（Ｐｅｔｓｃｈｉｎｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）は、その一部について、オレイン酸Ｃ１８：１タイプである遊離脂肪酸の外在性流入を、中性脂肪に変換する能力がなく、つまりこれは、この流入が、それが引き起こす膜柔軟性のバランスの妨害のせいで、有害なストレスを導く。ＱＭ株の使用は、本発明者らが、かかる状況におけるオレイン酸の毒性の明確な証明を可能にする、毒性の試験を行うことを特に可能にした（図４を参照）。
【００４４】
より詳細には、本発明者らは、ｈｅｍ１Δ株において、分泌小胞の形成の際に、細胞内小器官の膜において飽和鎖を有するリン脂質（飽和ＰＬ）の蓄積という負の作用を観察した。この脂肪毒性（ｈｅｍ１Δ株の細胞系は、ここで、ＳＦＡのみを合成するので、内在性である）は、小胞体（ＥＲ）の膜の脂質環境を妨害し、タンパク質のフォールディングのプロセスを損ない（これは、「ミスフォールディング」として公知である）、次に、当該ＥＲにおける複雑な応答、「小胞体ストレス応答」（ＵＰＲ）として公知の応答を誘発する。この絶対安全な系の飽和は、アポトーシスによる細胞死を導く。同時に、本発明者らは、ゴルジ体の小胞化の妨害、ならびにゴルジ体と細胞膜の間の参照タンパク質（例、Ｆｕｒ４ｐ）の輸送の変質を観察した。具体的には、本発明者らは、全体の分泌経路の、脂肪毒性に起因した変質を観察した。言い換えると、酵母のｈｅｍ１Δ株は、本発明者らが、ＲＥストレス、ならびに細胞膜へのタンパク質の輸送に対するＳＦＡの衝撃を確かめることを可能にした。
【００４５】
小胞体（ＥＲ）は、脂質合成、カルシウムホメオスタシスの調節、および異なる細胞小器官および細胞表面を意図するタンパク質（例えば、イオンチャネルおよび輸送体のような膜タンパク質）の合成を含む、いくつかの基本的な細胞プロセスに関与する。ＥＲはまた、膜または分泌されたタンパク質が集められ、フォールディングされる部位でもある。結果として、ＵＰＲは、この細胞小器官が、ミスフォールディングされたタンパク質の蓄積を管理することを可能にする際に、ＥＲの完全性および機能を維持することにおいて本質的な役割を果たす（Ｋｉｎｃａｉｄ  ＆  Ｃｏｏｐｅｒ，２００７、Ｚｈａｎｇ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎ，２００６）。ＳＦＡの毒性が、膵β細胞（哺乳類においてインスリンの合成に関与する）において、ＵＰＲ応答の誘導と関連することに注意しなければならない（Ｃｕｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｄｉａｋｏｇｉａｎｎａｋｉ  ＆  Ｍｏｒｇａｎ，２００８、Ｌａｙｂｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。加えて、Ａｌｋｈａｔｅｅｂら（２００７）およびＫａｔｏら（２００８）は、ＳＦＡの蓄積が、インスリン受容体、および筋細胞の表面へのグルコース輸送体Ｇｌｕｔ４の対処を損なうことを観察した。
【００４６】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９９）は、小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体の膜が、不飽和リン脂質（ＰＬ）により第一に構築され、一方、飽和ＰＬのレベルが、分泌経路チャネルにおける最も遠位のコンパートメントにおいて徐々に増大して、細胞膜でのその最大値に達することを観察した。不飽和ＰＬの主要な割合は、小胞の形成に必須のある種のタンパク質の動員の重大なパラメーターである、高い膜流動性をもたらす。古典的な例が、Ａｒｆ−ＧＡＰ１ファミリーのタンパク質（その１つが酵母におけるＧｃｓ１ｐである）により提供される。Ｇｃｓ１ｐが、両方の、ゴルジ体とＥＲ間、およびＥＲと細胞膜間の小胞輸送のメディエーターであることが示された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。興味深いことに、ＧＣＳ１遺伝子の欠損は、ゴルジ体の断片化、およびポストゴルジ小胞輸送の妨害を促進し（Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、そしてこれは、本発明者らが、酵母モデルｈｅｍ１Δにおいて、すなわち、ＳＦＡの蓄積の状態で、自身で観察した現象である（Ｐａｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１３を参照）。
【００４７】
Ａｒｆ−ＧＡＰ１ファミリーのタンパク質は、ＡｒｆＧＡＰ１脂質パッキングセンサー（ＡＬＰＳ、（Ｂｉｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５））と呼ばれる特定のモチーフを介して膜表面に吸着されることにより、膜湾曲に応答する。具体的に言うと、ＡＬＰＳモチーフは、膜湾曲自体を、すなわち、曲がった形状として認識しないが、膜湾曲の結果である、リン脂質の極性頭部の緩いパッキング（緩い脂質パッキング）を認識する（Ｂｉｇａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。本発明者らは、脂肪毒性の状態における飽和ＰＬの高い割合が、膜脂質パッキングの増加と関連すること（Ｄｅｇｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、およびこの増加が、細胞質から来たＧｃｓ１ｐのゴルジ体による動員を損なうこと（Ｐａｙｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を示すことができた。より一般的には、本発明者らは、生体膜における脂肪酸、特に、ＳＦＡの蓄積が、ゴルジ体および小胞体（ＥＲ）を含む、細胞内小器官または細胞小器官の機能の調節解除、特に、細胞表面におけるある種の膜輸送体および受容体の転位の低減に関与する小胞化の割合の低減を生じることを示した。
【００４８】
本発明者らによりもたらされた細胞脂肪毒性は、インビトロで、もっぱら飽和形態の脂肪酸の外在性供給源への曝露（外在性脂肪毒性）、またはあるいは、脂肪酸の不飽和の形態を生じる、細胞の固有の無能（「内在性」脂肪毒性）に起因する。
【００４９】
本発明者らのｈｅｍ１Δ酵母モデルを用いて、本発明者らは、オレイン酸（Ｏｌｅ）が、リン脂質（ＰＬ）において代謝される（図１、ＰＬのＵＦＡでの消失と引き換えのＰＬのＳＦＡでの消失を参照）際に、既にＳＦＡによる脂質中毒の膜の柔軟性を回復させることを示した。ＱＭ酵母株を用いて、本発明者らはまた、観察される有益な作用が、中性脂質の形態の過度の外在性ＵＦＡを緩衝する能力を有する細胞に限定されることも示した。この能力を有しない細胞において、過剰な外在性オレイン酸が、細胞にストレスを与える際に、そのアポトーシスを誘発する、細胞内膜の異常増殖を最終的に導く。
【００５０】
本発明者らは、自身のｈｅｍ１ΔモデルおよびＱＭ株を用いて、現象を予防するか、または制限し、過度に存在する、および／または不完全に代謝された（すなわち、エステル化）飽和脂肪酸の毒性作用を理想的に無効にし、ならびに全ての妨害された現象を正しやすい目的の分子をスクリーニングした。本発明者らはまた、特に、細胞機能を非病態状態において見出されるものに匹敵するレベルまで回復させる（例えば、膜流動性を回復させることによる）能力がある分子を発見した。
【００５１】
本発明者らにより予め選択された分子の有効性、すなわち、確かめられた異常脂質血症の場合でさえ、細胞機能を、非病態状態において見出されるものに匹敵するレベルまで回復させる能力が、哺乳類の膵β細胞、特に、ラットの膵β細胞（ＢＲＩＮ−ＢＤ１１株）において、同じ本発明者らにより試験され、示された。
【００５２】
従って、本発明は、対象における脂肪毒性を予防および／または処置するために使用するための、少なくとも１つのヒドロキシル残基を含み、その上に１６〜２４個、例えば、１６〜２０個、典型的には、１８個の炭素原子を含み、および１〜６個、例えば、３個の不飽和をシス型立体配置に有する単一の不飽和脂肪酸がグラフトされた極性頭部を含む化合物（本明細書において、「目的の化合物」として同定される）に関する。
【００５３】
関与する対象は、動物、典型的には、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ブタ、またはヒトの中から選択される哺乳類である。関与する対象は、好ましくは、ヒトである。
【００５４】
本明細書の文脈において、予防および／または処置が求められる、異常脂質血症または脂肪毒性は、典型的には、生体膜、特に、非脂肪細胞の生体膜に影響する。これは、脂肪酸、特に、飽和および／またはトランス長鎖脂肪酸および／またはステロールの当該生体膜における過度の存在に一般に関連付けられる。異常脂質血症または脂肪毒性は、非脂肪細胞の機能障害および／またはアポトーシスを引き起こす当該細胞の中毒に、その細胞膜および／またはその小器官の膜の流動性を低減または消去さえすることにより、関与する。
【００５５】
本発明の１つの特定の実施態様において、脂肪毒性は、対象における、肺の病態、特に、呼吸障害を導く肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤである、呼吸障害を導く肺の病態の存在と関連する。
【００５６】
脂肪酸、特に、ＳＦＡおよび／またはステロールの表現「過度の存在」が、脂肪毒性と同義であり、さらに上述のタンパク質分泌経路を妨害し、これにより、細胞機能（典型的には、タンパク質分泌経路、それ故、当該タンパク質の機能）を損なうか、またはより高いレベルで、対応する器官の機能を結果的に損なうことでさえ十分な量の特に、飽和脂肪酸および／またはトランス脂肪酸および／またはステロールの、非脂肪細胞における存在を指すことは、本発明から明らかである。
【００５７】
細胞レベルにおいて、脂肪毒性は、典型的には、生体膜のＰＬの脂肪酸含有量の修飾を（特に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のリン脂質種のレベルで）明らかにすることにより、および特に、ＵＦＡを有するＰＬの形態のＳＦＡを有するＰＬの利点への喪失により、診断される。本明細書の実施例部分に記載される操作モデルにおける通り、かかる高脂血症痕跡は、トータルの細胞脂質の抽出、そのリン脂質の精製、および質量分析によるこれらのリン脂質の分析後に、示され得る（Ｄｅｇｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００５８】
加えて、この細胞脂肪毒性は、ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）の誘導により、示され得る。実施例部分により示される通り、レポーター遺伝子（例えば、酵素活性が定量され得る、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子）であって、そのプロモーター配列において、１個または複数、例えば、４個の、特定のＵＰＲ（「ＵＰＲＥ」）への応答の誘発中に特徴的に誘導される遺伝子の当該応答のエレメントを含有する遺伝子であって、例えば、ＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＧＲＰ７８およびＡＴＦ４の中から選択される遺伝子の発現の分析により、このＵＰＲ応答をインビトロで検出し、測定することが可能である（Ｌａｙｂｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。あるいは、脂肪毒性への応答におけるＵＰＲの誘発は、細胞現象のこのカスケードにおけるある種の鍵となるタンパク質の活性形態の割合を定量することにより、検出され、測定され得る。これは、大量の活性なリン酸化形態が、ＵＰＲの活性化の状態に比例する、タンパク質ｅＩＦ２αを伴う場合である。実施例部分において説明される通り、活性なリン酸化形態の量は、ウエスタンブロット技術後に得られた画像の濃度測定により、評価され得る（Ｄｈａｙａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，２０１１）。
【００５９】
本発明の文脈において、ＵＰＲ応答は、本明細書において上で説明される、ＵＰＲ応答において関与する、遺伝子の発現またはタンパク質の活性の検出または測定により、有利に検出されるか、または測定され得る。
【００６０】
特定の目的の化合物は、本明細書において上で定義された化合物であり、式（Ｉ）：
【化２】
0006594866.tif 000003
（式中、
Ａは、典型的には、酸素原子またはＮＲ１基であり、Ｒ１＝Ｈ、またはＯＨにより置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６のアルキルであり、Ａは、好ましくは、酸素原子、またはＮＨもしくはＮＣＨ３もしくはＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、なおより好ましくは、Ａは酸素原子であり、
ｎ＝２または３であり、好ましくは、ｎ＝２であり、
Ｒは、任意の化学基であり、１つの基（ＣＨＲ）と他の基が異なっていてもよい）
の極性頭部。
【００６１】
式（Ｉ）において、Ｚ字型により中断される結合は、極性頭部と不飽和脂肪酸の炭素を含む鎖との間の結合を表し、式（Ｉ）のＣ＝Ｏ基は、不飽和脂肪酸のＣ＝Ｏである。
【００６２】
好ましくは、Ｒは、炭素原子、水素原子、および酸素原子のみを含む基である。
【００６３】
好ましくは、Ｒは、炭素原子、水素原子、および酸素原子のみを含む飽和基である。
【００６４】
好ましくは、基（ＣＨＲ）ｎ−ＯＨは、グリセロール、エリトリトール、または単糖、例えば、マンノースの誘導体である。
【００６５】
本発明において、それぞれのヒドロキシル残基は、独立してリン酸化され得る。
【００６６】
脂肪毒性を予防および／または処置するために、本発明の文脈において用いられ得る、目的の化合物の２つの例は、本明細書において以下で特定される：
【化３】
0006594866.tif 000004
１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、
【化４】
0006594866.tif 000005
１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（（１−オレオイルリソホスファチジン酸またはＬＰＡ）、
【化５】
0006594866.tif 000006
２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、
【化６】
0006594866.tif 000007
マンニドモノオレエート、
【化７】
0006594866.tif 000008
３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピルオレエート、
【化８】
0006594866.tif 000009
Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、
【化９】
0006594866.tif 000010
プロピレングリコールモノオレエート、
【化１０】
0006594866.tif 000011
１−オレオイルグリセロール、
【化１１】
0006594866.tif 000012
２−オレオイルグリセロール、
【化１２】
0006594866.tif 000013
トリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、
【化１３】
0006594866.tif 000014
９−オクタデセン酸（Ｚ）−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルエステル
【化１４】
0006594866.tif 000015
ジエチレングリコールモノオレエート。
【００６７】
異常脂質血症を予防または処置するために本発明の文脈において用いられ得る目的の化合物は、例えば、以下の化合物、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（１−オレオイルリソホスファチジン酸またはＬＰＡ）、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピルオレエート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、プロピレングリコールモノオレエート、トリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、および９−オクタデセン酸（Ｚ）−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルエステル、ならびにその混合物の中から選択される。
【００６８】
好ましくは、脂肪毒性を予防および／または処置するために本発明の文脈において用いられ得る目的の化合物は、以下の化合物、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピルオレエート、およびＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、あるいは、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、あるいは、マンニドモノオレエート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロメチル）プロピルオレエート、およびその混合物の中から選択される。
【００６９】
脂肪毒性を予防および／または処置するために特に好ましい目的の１つの化合物は、マンニドモノオレエートである。
【００７０】
あるいは、脂肪毒性を予防および／または処置するために本発明の文脈において用いられ得る目的の化合物は、１−オレオイルグリセロール、２−オレオイルグリセロール、グリコールモノオレエート、およびトリグリセリンとのオレイン酸モノエステル、好ましくは、プロピレングリコールモノオレエートおよびトリグリセリンとのオレイン酸モノエステルの中から選択される。
【００７１】
目的の化合物は、典型的には、生体膜の流動性の回復において、脂肪毒性、例えば、低酸素性脂肪毒性を予防および／または処置するために、本発明の文脈において用いられる。これらの化合物の１つの有利な特徴は、先行技術において用いられるＵＦＡと異なり、これらの化合物が、中性脂質、典型的には、トリグリセリドおよび／またはエステル型ステロールを合成する能力が無い細胞に対して毒性がないことである。これらの化合物は、膵細胞（膵β細胞、および膵α細胞）に対して特に毒性がない。これらはまた、好ましくは、腎臓、肝臓、心臓、および筋細胞に対して毒性がない。これらはまた、好ましくは、気管支上皮細胞に対して毒性がない。これらは、さらに好ましくは、脂質中毒の細胞の機能、ならびに必要であれば、関与する器官、例えば、呼吸器、および特に、気管支の機能を回復させる有利な能力がある。
【００７２】
本発明の目的の１つの典型的な化合物は、有利には、以下の特性、
脂質中毒の酵母サッカロマイセス・セレビシエの変異体ｈｅｍ１Δの成長を回復させる、
ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）を低減または排除する、
酵母サッカロマイセス・セレビシエのＱＭ変異体に対して毒性がなく、および／または
脂質中毒の哺乳類細胞のアポトーシスによる細胞死を低減また排除する、
を有する。
【００７３】
本発明の文脈において用いられる特定の化合物は、脂質中毒の酵母サッカロマイセス・セレビシエの変異体ｈｅｍ１Δの成長を回復させる能力を有し、および／またはＵＰＲ（小胞体ストレス応答）、典型的には、脂肪毒性（内在性または外在性のいずれか）により誘導されるＵＰＲを低減または排除する。
【００７４】
本発明の文脈において用いられる特定の化合物は、ＱＭ株酵母に対して毒性がない。
【００７５】
本発明の文脈において用いられる特定の化合物は、脂質中毒の哺乳類細胞のアポトーシスによる細胞死を低減または排除することができる。
【００７６】
本発明の好ましい実施態様において、目的の化合物は、肺の病態、特に、呼吸不全を導く肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤである、呼吸障害を導く肺の病態を予防および／または処置するために用いられる。
【００７７】
本発明の好ましい実施態様において、本明細書において記載される目的の少なくとも１つの化合物は、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤを予防および／または処置するために用いられる。化合物マンニドモノオレエートは、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤを予防および／または処置するために好ましく用いられる目的の化合物の例である。
【００７８】
目的のこの少なくとも１つの化合物は、本発明の１つの特定の実施態様において、当業者に公知の異なる化合物と併用して用いられ、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤを予防および／または処置するために従来通り用いられ得、当該異なる化合物は、好ましくは、粘液溶解性化合物、抗生物質、およびＣＦＴＲタンパク質矯正剤の中から選択される。
【００７９】
本発明の別の目的はまた、本発明による目的の少なくとも１つの化合物を含む、医薬組成物、ニュートラシューティカル、食品栄養補助剤または補助物質の形態を取る、組成物（本明細書において、「目的の組成物」として特定される）にも関する。
【００８０】
本発明の１つの特定の目的は、典型的には、本発明による対象の当該少なくとも１つの化合物、治療レベルで有効な（当業者により、それ自体として認識される）、少なくとも１つの他の化合物（非脂肪細胞における毒性を誘導することなく、低酸素症による脂肪毒性を予防または処置するために本発明の文脈において用いられる、目的の化合物と異なる）、特に、呼吸不全と特に関連する、肺の病態の症状または異常な特徴の予防または処置において有効な化合物をさらに含む、医薬組成物に関する。
【００８１】
本発明はまた、低酸素症による脂肪毒性、典型的には、肺の病態の中から選択される病態を予防および／または処置するための、好ましくは、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤを予防および／または処置するための使用のための、本明細書において記載される組成物に関する。
【００８２】
用語「処置」は、治癒的、対症的、または予防的処置を指す。従って、本発明の化合物は、確立された疾患に罹患した対象（例えば、哺乳類、特に、ヒト）の間で用いられ得る。本発明の化合物はまた、病気の進行を遅延させるか、もしくは遅くし、またはさらなる進行を予防するために用いられ、これにより、対象の状態を改善し得る。本発明の化合物はまた、病気ではないが、決まった疾患を通常発症し得るか、または疾患に罹患する高いリスクを有する対象に、予防的に投与され得る。
【００８３】
本発明による目的の化合物もしくは複数の化合物、または組成物は、異なる方法および異なる形態で投与され得る。
【００８４】
従って、１つの典型的な実施態様において、目的の化合物もしくは複数の化合物は、対象に一緒にまたは別々に投与され、本発明による目的の化合物もしくは複数の化合物、または組成物は、処置の継続中、すなわち、処置される病態の症状の改善、好ましくは、当該症状の全てまたは一部の消失があるまで、１日当たり１回もしくは複数回（連日投与）、１週間当たり１回もしくは複数回（毎週投与）、または１月当たり１回もしくは複数回（毎月投与）、継続的または連続的に投与される。
【００８５】
必要であれば、１日用量が、例えば、１日当たり２回、３回、４回、５回、６回、もしくはそれ以上の用量で、または１日の中で適当な間隔で投与される複数のサブ用量で、投与され得る。
【００８６】
これらの化合物または組成物は、例えば、全身性、経口的、非経口的、吸入によりもしくは注射により、例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内手段により、皮下、経皮、動脈内手段などにより、投与され得る。長期処置のため、投与の好ましい様式は、舌下、経口、腹膜内、または経皮である。
【００８７】
組成物は、注射可能な懸濁剤、油剤、坐剤、錠剤、カプセル剤、スプレー剤などの形態、場合により、持続放出および／または遅延放出を可能にする、ガレヌス形態または装置の形態に製剤され得る。注射のため、化合物は、例えば、シリンジまたは灌流を用いて注射され得る、液体懸濁剤の形態で一般にパッケージングされる。
【００８８】
流速および／または注射される用量は、患者、病態、投与の様式などに依存して、当業者により適合され得ることは理解される。一般に、化合物の１日用量は、治療作用を得るために必要な最小用量である。
【００８９】
治療用組成物に存在する化合物の量を調節して、特定の患者、組成物、投与様式に対して所望される治療作用を得るために必要な有効物質の循環レベル、および好ましくは、患者に対する毒性がなく、それを得ることができる。選択される量は、多数の要因、特に、投与の様式、投与の持続時間、投与の時間、化合物、化合物と併用して用いられる異なる製品または複数の製品の消失の速度、患者の年齢、体重および身体状態、ならびに彼または彼女の病歴、および医薬において公知の全ての他の情報に依存する。
【００９０】
典型的には、化合物は、１回投与当たり１μｇ〜２ｇ、好ましくは、１回投与当たり０．１ｍｇ〜１ｇに変動する用量で投与される。さらに、本発明の組成物は、加えて、本明細書において上で説明された、他の剤または有効な物質を含み得る。本発明の組成物はまた、医薬的なレベルで許容可能な、１つまたは複数の賦形剤またはビークルを含み得る。これらは、例えば、薬剤使用と両立できる生理食塩水、生理学的溶液、等調溶液、緩衝液などであってもよく、当業者に公知である。組成物は、分割剤、溶解剤、安定化剤、保存剤などの中から選択される、１つまたは複数の剤またはビークルを含有し得る。
【００９１】
本発明はまた、脂肪毒性を予防および／または処置するための、当該脂肪毒性、例えば、低酸素性脂肪毒性に罹患しているか、または脂肪毒性、例えば、低酸素性脂肪毒性を発症する能力がある対象への、本明細書において記載される、目的の化合物または組成物の投与を含む、対象における脂肪毒性、例えば、低酸素性脂肪毒性を予防または処置する方法にも関する。
【００９２】
本発明はまた、肺の病態、特に、呼吸障害を導く肺の病態、より詳細には、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤである、呼吸障害を導く肺の病態の中の病態により影響される対象を予防および／または処置する方法に関する。これらの方法は、当該病態を予防および／または処置するための、かかる病態に罹患しているか、またはかかる病態を発症しやすい対象への、本明細書において記載される、目的の化合物または組成物の投与の全ての工程を含む。
【００９３】
以下の図および実施例は、本発明を、その範囲を制限することなく、説明する。
【００９４】
以下の図が記載される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】分泌経路および膜柔軟性の図である。合成後、膜タンパク質または分泌されたタンパク質（細胞の分子「ツール」）は、細胞内で成熟の工程を受けなければならない。「分泌プロセス」として公知の、このプロセスの工程のそれぞれが、特異的なサブ細胞コンパートメント（小胞体（ＥＲ）、および特に、ゴルジ体）において生じる。成熟タンパク質の取得は、それ故、異なる内膜系間の機能的な細胞内輸送を必要とする。この流れは、とりわけ、膜を形成するリン脂質（ＰＬ）の性質と直接的に相関するそれ自体である、細胞内コンパートメントの膜の柔軟性により、影響される。特に、ＰＬにおけるＳＦＡの存在が、膜流動性を低減し、一方、ＰＬが、ＵＦＡをより流動な膜から保護するということが通説である。オレイン酸（Ｏｌｅ）の有益な作用が、中性脂質（脂質液滴（ＧＬ）の形態で貯蔵される、トリグリセリド（ＴＧ）またはエステル型ステロール（ＳＥ））の形態の過度の外在性ＵＦＡを緩衝する能力を有する細胞において、観察される。この能力を有しない細胞において、余剰の外在性オレイン酸が、アポトーシスを誘発する細胞ストレスを促進する際に、細胞内膜の増殖を最終的に導く。
【図２】高等真核生物におけるＵＰＲ経路の図である（Ｐｉｎｅａｕ  ＆  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，２０１０）。
【図３】オレイン酸、ＯＡＧ、およびＬＰＡが、脂質中毒の酵母の成長を回復させる図である。図３Ａ、オレイン酸、ＯＡＧ、およびＬＰＡの図。図３Ｂ、示したＳＦＡ蓄積の条件下で、ｈｅｍ１Δ酵母を培養した。次に、示した濃度のＯＡＧ、ＬＰＡおよびオレイン酸の５μｌの滴を、寒天培地の表面に沈着させた。３日後のコロニー形成において、ｈｅｍ１Δ酵母の成長の回復を観察する。
【図４】ＯＡＧおよびＬＰＡは、トリグリセリドを合成しない細胞に対して毒性がない図である。示した濃度のストック溶液から、ＯＡＧ、ＬＰＡ、またはオレイン酸の５μｌの滴を、ＱＭ株を予め広げた寒天培地の表面に沈着させた。３日後、オレイン酸の場合において、成長阻害のハロー（コロニーの不存）を観察することができる。対照的に、ＬＰＡおよびＯＡＧの存在下では、これらのハローを観察しない。
【図５】ＯＡＧおよびＬＰＡが、脂質中毒の酵母においてＵＰＲ応答を低減する図である。４つのＵＰＲエレメント（ＵＰＲＥ）を含有する人工プロモーターの依存下に置いた遺伝子ＬａｃＺのコード配列に対応する、融合遺伝子を保有するプラスミド構築を、Ｐｉｎｅａｕら（２００９）において記載される通り、ｈｅｍ１Δｆ酵母株に導入した。ＵＰＲ応答の誘導中、Ｈａｃ１ｐ／ＸＢＰ１ｐ転写を活性化し、融合遺伝子のＵＰＲエレメントに固定し、これにより、ＬａｃＺ遺伝子の転写を導く。β−ガラクトシダーゼをコードするＬａｃＺで、ＵＰＲの誘導のレベルを測定して、対応する酵素活性を検出する。他の添加物なしでＳＦＡの蓄積を誘導する液体培地（φ）、または示した、２００μＭ  オレイン酸、ＯＡＧ、またはＬＰＡを添加した同一の培地において、ｈｅｍ１Δ酵素株を培養した。Ａ．Ｕ．は、任意単位である。
【図６】ＯＡＧが、脂質中毒の酵母において、オレイン酸、およびＬＰＡと異なり、ジ−不飽和リン脂質の産生を回復しない図である。標準的条件（対照）において、あるいは添加なし（φ）、または示した、１００μＭ  オレイン酸、ＬＰＡ、もしくはＯＡＧを添加したＳＦＡ蓄積の条件下で、ｈｅｍ１Δ酵母を培養した。図６Ａ、７時間培養後、リン脂質（ＰＬ）を抽出し、主に存在するＰＬを構成する、異なる種類のホスファチジルコリン（ＰＣ）を、Ｐｉｎｅａｕら（２００８）に従い、ポジティブモードの質量分析により分析した。２つのオレイン酸鎖を含有するＰＣに対応する、種３６：２を制御した。見られる通り、オレイン酸またはＬＰＡの添加は、この種のレベルの増大をもたらし、これはＯＡＧの場合ではない。図６Ｂ、質量分析のこれらの条件下で検出可能なＰＬの全ての種を分析して、ＳＦＡ形態における含有量を全体的に定量した。これにより得た飽和の指標は、オレイン酸およびＬＰＡと異なり、ＯＡＧが、対照条件で観察したものに匹敵する飽和の指標を回復しないことを示した。
【図７】ＯＡＧおよびＬＰＡが、ＵＰＲの誘導率を低減する際に、飽和脂肪酸の存在下で膵β細胞のアポトーシスを予防する図である。対照条件下、またはＯＡＧもしくはＬＰＡの添加あり、もしくはなしで、脂肪毒性の状態を生じるために、Ｄｈａｙａｌ＆  Ｍｏｒｇａｎ（２０１１）により記載される通り、飽和脂肪酸（２００μＭ  パルミチン酸）の外在性供給源の存在下で、ＢＲＩＮ−ＢＤ１１膵β細胞を培養した。図７Ａ、上昇する濃度のＯＡＧおよびＬＰＡについて、不存下（Ｃｔｒｌ）またはパルミチン酸の存在下（Ｐａｌｍ）で、死細胞の割合を評価した。図７Ｂ、不存下（φ）またはＯＡＧまたはＬＰＡの存在下、ウエスタンブロット法による異なる条件下で、ｅＩＦ２αのリン酸化率も分析し、トータルのｅＩＦ２αの量で標準化した。リン酸化率は、ＵＰＲ応答の強度と相関するので、この実験は、ＯＡＧが、パルミテートの蓄積により誘導されるＵＰＲを低減することを示す。Ａ．Ｕ．は、任意単位である。
【図８】嚢胞性線維症またはＣＯＰＤにより影響を受けた患者の気管支組織を、ＳＦＡにより脂質中毒にする図である。図８Ａ、気管支構成要素のみを維持するために、肺生検を分離した（左から右への流れ）。図８Ｂ、気管支上皮細胞のトータルの脂質を抽出し、リン脂質を精製し、次に、主に存在するＰＬを構成する、異なる種類のホスファチジルコリン（ＰＣ）を、Ｐｉｎｅａｕら（２００８）に従い、ポジティブモードの質量分析により分析した。種３２：０および３６：２は、２つのパルミチン酸鎖、および２つのオレイン酸鎖を含有するＰＣに対応する。見られる通り、対照の生検由来のＰＣを、嚢胞性線維症またはＣＯＰＤに罹患した患者の生検のＰＣと比較するとき、ＳＦＡ／ＵＦＡ比が逆になる。
【図９】気管支上皮細胞株１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥにおける、ＳＦＡによる脂肪毒性の誘導の図である。図９Ａ、ヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥを用いて、インビトロの培養条件下でそのリン脂質の脂肪酸含有量を試験した。嚢胞性線維症またはＣＯＰＤを有する患者の肺生検について観察した高脂血症特性（図７Ｂを参照）と異なり、１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥ株のＰＣにおけるＳＦＡ／ＵＦＡ比は、脂肪毒性の不存を示す。図９Ｂ、増加する量のパルミチン酸と共に、ＣＦＢＥ細胞を１６時間培養した。かかる条件における細胞の高脂血症特性の分析は、ＳＦＡにおける外在性インプットが、嚢胞性線維症（１００μＭ  Ｐａｌｍ）またはＣＯＰＤ（２５０μＭ  Ｐａｌｍ）に罹患した患者の中で観察される脂肪毒性を模倣することを明らかにする。
【図１０】低酸素症の状態が、患者の生検において観察される低酸素性脂肪毒性を人工的に再構成する、１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥ細胞株の脂肪毒性をインビトロで誘導する図である。標準的条件（酸素正常状態、９５％  Ｏ２＋５％  ＣＯ２）、または無酸素の環境（低酸素、９５％  Ｎ２＋５％  ＣＯ２）において、１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥを２４時間培養した。トータルの脂質の抽出、およびリン脂質の精製後、全体的脂肪酸含有量を分析した。これらの条件のそれぞれの下でのリン脂質の飽和率を決定するために、ＳＦＡ／ＵＦＡ比を計算した。結果は、脂肪毒性が、人工的低酸素症によりインビトロで誘導され得ることを示す。
【図１１】気管支上皮細胞における脂肪毒性のアポトーシス促進に対する抗ＳＦＡ化合物の図である。ＣＦＢＥを、標準的条件下（対照）で培養するか、または添加なし（φ）、もしくは示した、１００μＭ  対象化合物の添加ありで、外在性ＳＦＡの供給源（２５０μＭ  パルミチン酸）の対象にした。次に、細胞を溶解し、「実施例」部分において示す通り、アポトーシスを定量した。
【図１２】マンニドモノオレエートが、病理組織の気管支性高血圧を消失する図である。図１２Ａ、健常患者（対照）、嚢胞性線維症または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）により影響を受けた患者の気管支リングを解体し、次に、その基調を測定した。結果は、２種の呼吸性病態が、気管支の高血圧と相関することを示す。図１２Ｂ、示した通り、１００μＭ  マンニドモノオレエートを添加した（＋）または添加していない生理学的溶液において３７℃で４時間リングを予め培養後、同一の操作を行った。それぞれのヒストグラムについて、比Ｎ／ｎを示す。Ｎは、試験したリングの数に対応し、ｎは、分析した患者の数に対応する。
【実施例】
【００９６】
本発明は、以下の実施例からより明確に理解されるだろう。
【００９７】
Ａ／酵母株、哺乳類細胞株、および生物学的試料
毒性を明らかにするために、成長回復の異なる試験のため、細胞リン脂質の脂肪含有量の分析のため、ならびに小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を誘発するための試験のため、表１に挙げるサッカロマイセス・セレビシエ酵母株を用いる。
【００９８】
ＵＰＲの活性化の状態、および脂肪毒性による細胞死の誘導も、ラットの膵β細胞株ＢＲＩＮ−ＢＤ１１において分析した。
【００９９】
加えて、アポトーシスの誘導、ＩＬ−８の分泌、およびＳＦＡ下での脂肪毒性への応答における高脂血症特性も、ヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥ（ＣＦＴＲ遺伝子の野生型ホモ接合体）、および／またはＣＦＢＥ（ホモ接合体Ｆ５０８ｄｅｌ−ＣＦＴＲ）において分析した。
【０１００】
加えて、対応する脂質特性、ならびに肺高血圧の現象に対する目的の化合物の影響を決定するために、健常患者、および嚢胞性線維症またはＣＯＰＤに罹患した患者の生検において、エクスビボ実験を行った。生検の使用は、Ｃｏｍｉｔｅ  ｄｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｐｅｒｓｏｎｎｅｓ  Ｏｕｅｓｔ  ＩＩＩまたはＣＰＰ  Ｏｕｅｓｔ  ＩＩＩと呼ばれる、研究倫理委員会のフランスの同等物により定義される、倫理的チャートに従う。
【０１０１】
【表１】
0006594866.tif 000016
【０１０２】
Ｂ／ｈｅｍ１Δ酵母の脂肪毒性
好気性条件下で、撹拌しながら、２８℃にて、８０μｇ／ｍＬ  δ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加した、ＹＰＧＡ液体培地（ＹＰＧ（１％（ｍ／ｖ）  酵母抽出物、１％（ｍ／ｖ）  ペプトン、および２％（ｍ／ｖ）  グルコース）において、ｈｅｍ１Δ株を有する株を培養した。ＹＰＧ＋培地（これらの条件下で得られるステロールにおける喪失を補うために、８０μｇ／ｍＬ  エルゴステロールを添加したＹＰＧ）に移すことによって、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）の喪失により、飽和脂肪酸（ＳＦＡ）による脂肪毒性を促進する（その合成は、ヘム（特に、酵素Ｏｌｅ１ｐの補欠分子族）の存在に依存する）。３５００個の細胞（ＹＰＧＡにおける事前培養に由来するｈｅｍ１Δ）／ｃｍ２を移す際に固形培地ＹＰＧ＋＋２％（ｍ／ｖ）  寒天において、＊あるいは、ＹＰＧ＋２×１０６細胞／ｍＬを播種する際に液体培地において、脂肪毒性を誘導することができる。古典的には、ＹＰＧ＋培地に移した７時間後に、ＳＦＡに対する脂肪毒性の作用を分析する。細胞を播種後のＹＰＧ＋移行培地にて（または、これにおいて）、この化合物の添加で、ＳＦＡでの脂肪毒性の有害な作用に対抗する化合物の能力を、その一部について連続して評価する。
【０１０３】
Ｃ／パルミチン酸によるラットの膵β細胞の脂肪毒性
１）脂質試薬の調製
エタノール中にて脂質種を調製し、次に、３７℃で１時間のインキュベーションにより、ウシ血清アルブミン（最初は、脂肪酸を欠くＢＳＡ）と組み合わせる。大量のエタノールの添加により、パルミテートのストックを得た後、全体の混合物を、ホモジナイゼーションのため７０℃まで加熱する。周囲温度で、１００％エタノール中にて、ＯＡＧおよびＬＰＡ溶液を調製する。哺乳類細胞のインキュベーションのため、培養培地中の最終濃度のＢＳＡおよびエタノールを、それぞれ１％および５％（ｍ／ｖ）に維持する。
【０１０４】
２）細胞生存率の試験
１１ｍＭ  グルコースを含有し、１０％（ｖ／ｖ）  仔ウシ血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを添加した、ＲＰＭＩ−１６４０完全培地において、ラットの膵β細胞株（ＢＲＩＮ−ＢＤ１１）を培養する。それぞれの実験のため、６ウェルディッシュ中０．５×１０５細胞／ｍＬの密度にて２４時間、細胞をまず播種する。次に、全培地を、ＦＣＳを欠くが、ＢＳＡと混合した、所望の濃度の目的の脂質試薬を含有する均等物により、置き換えた。対照条件の場合、次に、同一量のＢＳＡおよびエタノールを用いた。インキュベーションの終わりに、全ての細胞（死んだ、および生きている）を集め、３００ｇにて５分間遠心する。次に、細胞壁を、培地２００μＬ中に懸濁し、次に、ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、２％（ｖ／ｖ）  ＦＣＳ、１０ｍＭ  アジ化ナトリウム）中２０μｇ／ｍＬ  ＰＩ溶液２００μＬを加えることにより、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で、死細胞（細胞膜の完全性を失っている）のＤＮＡをマークした。氷上で１０分間インキュベーション後、このようにして得られた試料を、流入細胞数測定により分析する。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＭＣＬを定量のため用い、ＦＬ３チャネルが、ＤＮＡに挿入されたＰＩ由来の放出を検出するのに働き、ソフトウエアＥＸＰＯ３２  ＡＤＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖ  １．１  ｂｕｉｌｄ  ２０７）により、分析を行う。
【０１０５】
３）ウエスタンブロット
細胞ＢＲＩＮ−ＢＤ１１を、Ｔ２５フラスコ中、０．５×１０５細胞／ｍＬの密度で２４時間播種する。本明細書において上で示した通り、次に、完全培地を、ＦＣＳを欠くが、目的の脂質試薬を含有する均等物により置き換える。６時間インキュベーション後、タンパク質分解酵素、およびホスフェート阻害剤を含有する溶解バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％（ｖ／ｖ）  トリトン−Ｘ）により、トータルのタンパク質の抽出を行う。次に、これらのンパク質を、アクリルアミドゲル１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での電気泳動の対象にし、次に、ＰＶＤＦ膜に移し、次に、１／１０００倍に希釈した抗体、抗ホスホｅＩＦ２α（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））により探索する。第２の段階において、膜を、緩衝液Ｒｅ−Ｂｌｏｔ  Ｐｌｕｓ−Ｓｔｒｏｎｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で取り除き、次に、１／１０００倍に希釈したトータルの抗ｅＩＦ２α抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇ（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））で２回目の探索を行う。タンパク質ｅＩＦ２αのリン酸化形態および非リン酸化形態の相対的存在量の濃度測定による分析を、ソフトウエアプログラムＱｕａｎｔｉｆｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏｒａｄ  ＵＫ  Ｌｔｄ）と組み合わせたＦｌｕｏｒ−Ｓ  Ｍｕｌｔｉ−ｉｍａｇｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍを用いて行う。
【０１０６】
Ｄ／成長の回復
１）化合物のスクリーニング：ＳＦＡでの脂肪毒性の誘導（固形培地において培養したｈｅｍ１Δについて）後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、またはエタノール（ＥｔＯＨ）中１０ｍＭの異なる化合物の溶液５μ滴を、寒天の表面に沈着させる。細胞成長の脂質により誘導される停止に対抗する化合物の能力を、２８℃で３日間培養後、当該化合物の沈着位置のｈｅｍ１Δコロニーのハローの出現により、推定する（Ｄｅｇｕｉｌｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照）。
【０１０７】
２）増殖の速度：ＳＦＡでの脂肪毒性の誘導（液体培地におけるｈｅｍ１Δ酵母について）と合同して、異なる化合物を、開始濃度２００μＭで培養物に加える。一定の時間間隔（観察継続中４時間毎）での分光測定によって細胞密度を測定することにより、増殖の追跡を行う。波長６００ｎｍにおいて、１単位の光学密度（ＤＯ６００ｎｍ）が、２×１０７細胞／ｍＬに対応する。
【０１０８】
Ｅ／毒性試験
同時に、好気性条件下で、撹拌しながら２８℃にてＹＰＧ液体培地において、野生株（ＷＴ）およびＱＭを培養し、その後、ＹＰＧ＋２％（ｍ／ｖ）  寒天１ｃｍ２当たり３５００細胞を播種する。これを固形培地に移した後、ＤＭＳＯまたはＥｔＯＨ中の１、１０、および１００ｍＭの異なる化合物の溶液１μＬ滴を、寒天の表面に沈着させる。別に、これらの２つの溶媒の固有の毒性を評価するために、ＤＭＳＯおよびＥｔＯＨの沈着も行う。２８℃で３日間培養後、溶解していない溶媒の沈着について得られた成長阻害ハローの直径を、異なる濃度の試験した化合物の沈着のものと比較することにより、試験した化合物の毒性を評価する。ＷＴ株と比較して、ＱＭ株は、脂質滴中の中性脂質（トリグリセリド（ＴＧ）、またはステロールエステル（ＳＥ））の形態の過度の外在性オレイン酸を緩衝する能力がない。従って、ＷＴ株と比較した毒性の不存の場合、ＱＭ株と比較した化合物の毒性の観察は、この化合物が、酵母による遊離脂肪酸の供給源として認知されることを示す。
【０１０９】
Ｆ／トータルの脂質の抽出
ＹＰＧＡ、ＹＰＧ＋、またはＹＰＧ＋液体培地＋２００μＭの好気性条件下で試験すべき化合物において、撹拌しながら２８℃で７時間、開始細胞密度２×１０６細胞／ｍＬで出発して、ｈｅｍ１Δ株を培養する。培養の終わりに、トータルの脂質の抽出を行うために、１０８細胞を集める。４℃の蒸留水１ｍＬ中の懸濁液に細胞を入れた後、ガラスビーズ（φ０．６ｍｍ）５００μＬを加え、次に、全混合物を、３回の一連の、撹拌機での５０００ｒｐｍ、２０秒間を経験させる（チューブを、３回の一連のそれぞれの間、氷上にて維持する）。次に、細胞相を得て、ビーズを洗浄するための水（１ｍＬ）を添加し、次に、４０ｍＬのガラスチューブ（Ｃｏｒｅｘ（商標））に移し、次に、２：１（ｖ／ｖ）の比のメタノール：クロロホルムを用いることにより、脂質を抽出する。まず、メタノール６ｍＬを加え、全混合物を３０秒間ボルテックスし、次に、６５℃で１５分間インキュベーションする。混合物を周囲温度まで冷却したら、クロロホルム３００ｍＬを加え、次に、全混合物を３０秒間再度ボルテックスし、その後、そのまま１６時間抽出を行う。続いて、試料を１００００ｇにて１２分間遠心し、次に、上清を新しいＣｏｒｅｘ（商標）チューブに移す。クロロホルム２ｍＬ、次に、蒸留水４ｍＬの添加後、全混合物を３０秒間ボルテックスし、次に、３０００ｇにて８分間遠心する。得られた上相を除去後、下の有機相を、ガラス製の溶血管に集める。最後に、溶媒を窒素流下８０℃にて蒸発させて、トータルの細胞脂質試料を得る。
【０１１０】
患者の生検の場合、肺葉の切開、および気管支の抽出後、気管支上皮細胞をＰＢＳにて３回洗浄し、次に、本明細書において上で示した通り、１０５細胞から出発して、トータルの脂質を調製した。
【０１１１】
Ｇ／リン脂質の精製、および質量分析による分析
トータルの細胞脂質の試料を、３０秒間ボルテックスする際に、ジクロロメタン１ｍＬ中に懸濁させる。連続して、メタノール３ｍＬ、次に、ジクロロメタン２ｍＬで条件付けした、シリカカラム（ＢＯＮＤ  ＥＬＵＴ−ＳＩ、１００ｍｇ、１ｍＬ）に、全混合物を沈着させる。次に、カラムにより保持された分画を、ジクロロメタン２ｍＬ、次に、アセトン２ｍＬで連続して洗浄する。最後に、クロロホルム／メタノール／水  ５０：４５：５（ｖ／ｖ／ｖ）の混合物２ｍＬを、カラムに沈着させ、これにより、溶出したリン脂質を、ガラス溶血管に集める。溶媒を、窒素流下８０℃で蒸発させ、細胞のリン脂質の試料を得る。
【０１１２】
混合物Ｍｉｘ−（イソプロパノール／アセトニトリル／水  ２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）＋１％（ｖ／ｖ）  トリエチルアミン）、または混合物Ｍｉｘ＋（イソプロパノール／アセトニトリル／水  ２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）＋１％（ｖ／ｖ）  ギ酸）１００μＬ中に懸濁したら、それぞれ、ネガティブモードまたはポジティブモードの質量分析（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＥＳＩ−ＭＳ））により、試料を分析し、得られた結果は、異なる種類のリン脂質の脂肪酸含有量を分析するのに働く。
【０１１３】
Ｈ／ＵＰＲ誘発試験
液体培地ＹＰＧＡ、ＹＰＧ、またはＹＰＧ＋２００μＭの好気性条件下で試験されるべき化合物において、撹拌しながら２８℃で７時間、開始細胞密度２×１０６細胞／ｍＬで出発して、プラスミドｐＰＷ３４４［２μ、ＵＲＡ３  ４×ＵＰＲＥ−ＬａｃＺ（Ｐａｔｉｌｅｔ  ａｌ．，２００４）］により形質転換されたｈｅｍ１Δ株を培養する。培養の終わりに、ＬａｃＺ導入遺伝子の発現から生じる、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性を定量する（ＵＰＲの誘発の場合）ために、１０８細胞を集める。第１の段階で、細胞を、緩衝液Ｚ（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７の溶液）１．５ｍＬ中に懸濁し、次に、この懸濁液の１／１５を用いて、ＤＯ６００ｎｍの測定を行う。第２の段階で、懸濁液を、０．１％（ｖ／ｖ）  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１００μＬ、およびクロロホルム２００μＬで補完し、次に、２回、連続して３０秒間ボルテックスする。デカンテーション（沈降）後、次に、このようにして得られた溶液４００μＬ（容量Ｖ）を、ガラス溶血管に移し、次に、緩衝液Ｚ６００μＬで補完する。次に、緩衝液Ｚ中の４ｍｇ／ｍＬのオルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）基質２００μＬを加え、その後、全混合物をボルテックスによりホモジナイズし、次に、３０℃のウォーターバスにおいて３０℃でインキュベーションして、反応を開始させる。全混合物が、若干黄色がかった色になったら、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３５００μＬの添加により、周囲温度にて反応を中断する（時間ｔにて）。最後に、８００ｇにて５分間試料を遠心後、次に、上清を、新しいガラス溶血管に集め、反応産物（ｏ−ニトロフェノール）、ならびに、細胞細片を、波長４２０ｎｍ、および５５０ｎｍのそれぞれの波長での分光測定に注入する。それぞれの試料について、活性β−ｇａｌ（Ｕ）を、式Ｕ＝（１０００×［ＤＯ４２０ｎｍ−（１．７５×ＤＯ５５０ｎｍ）］）／（ｔ×Ｖ×ＤＯ６００ｎｍ）を用いてコンピューター処理する（任意単位で表す）。
【０１１４】
Ｉ／気管支上皮細胞株１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥのインビトロ脂肪毒性
１）外在性パルミチン酸による脂肪毒性。本明細書においてＢＲＩＮ−ＢＤ１１について上で提示されたものと同様に、５μｇ／ｍＬ  プラスモシン、および１０％（ｖ／ｖ）  ウマ血清を添加したＭＥＭにおいて、３７℃で、１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥを培養し、次に、５０、１００、または２５０μＭのパルミチン酸濃度に１６時間曝露する。次に、一連の外在性脂肪毒性を試験する。
【０１１５】
２）低酸素性脂肪毒性。標準的方法で、酸素正常状態の条件下で、１６ＨＢＥおよびＣＦＢＥを培養する。この方法で、９５％  Ｏ２および５％  ＣＯ２により形成される混合物を与えたチャンバーにおいて細胞を維持する。低酸素症の誘導の条件において、９５％  Ｎ２および５％  ＣＯ２を含む、無酸素ガス混合物に４８時間、細胞をさらし、次に、低酸素性脂肪毒性として公知の、一連の脂肪毒性を試験する。
【０１１６】
３）アポトーシス試験。外在性脂肪毒性の条件下で、細胞死検出キットＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（ＲＯＣＨＥ）の使用により、アポトーシスの誘導を分析した。９６ウェルディッシュにおいて、１ウェル当たり１００００個の細胞密度で、ＣＦＢＥを播種する。１６時間の脂肪毒性の終わりに、細胞を溶解し、アポトーシスと関連するＤＮＡ変質を明らかにする、細胞質オリゴヌクレオゾームの定量により、所定の指示に従い、アポトーシスを測定する。
【０１１７】
Ｊ／気管支基調の測定
肺葉の切開後、気管支リングを単離し、単離した器官の技術による分析のため、装置に乗せ、ＫＲＥＢＳ生理学的緩衝液に浸す。環のトーンの安定化後、基調を測定する。代わりとして、１００μＭ  マンニドモノ−オレエートのさらなるＫＲＥＢＳ緩衝液において、４時間、リングをインキュベーションする。
【０１１８】
［参考文献］
【表２Ａ】
0006594866.tif 000017
【表２Ｂ】
0006594866.tif 000018
【表２Ｃ】
0006594866.tif 000019
【表２Ｄ】
0006594866.tif 000020
【図１】
0006594866.tif 000021
【図２】
0006594866.tif 000022
【図３】
0006594866.tif 000023
【図４】
0006594866.tif 000024
【図５】
0006594866.tif 000025
【図６Ａ】
0006594866.tif 000026
【図６Ｂ】
0006594866.tif 000027
【図７】
0006594866.tif 000028
【図８】
0006594866.tif 000029
【図９】
0006594866.tif 000030
【図１０】
0006594866.tif 000031
【図１１】
0006594866.tif 000032
【図１２】
0006594866.tif 000033