(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
0006543272.tif 000046
によって表されるＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
有効量の請求項１に記載のＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩を含む、酵母菌または真菌感染を阻害するための薬学的組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩を、治療的に有効な量で含む、酵母菌または真菌感染の治療用薬学的組成物。
【請求項４】
局所投与される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
全身投与される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
経口投与される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
静脈内投与される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
筋肉内投与される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１４年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／９９４，４５０号、及び２０１４年９月４日に出願された米国仮特許出願第６２／０４５，９０７号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた補助金番号ＧＭ０８０４３６の下、政府支援によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、低減された毒性を有するアンホテリシンＢ誘導体に関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリエンマクロライド天然物であるアンホテリシンＢ（ＡｍＢ）は、生細胞においてイオンチャネルを形成する小分子１、及び微生物抵抗性に対して本質的に不応性である抗生物質２の両方の原型である。ＡｍＢはまた、残念ながら非常に有毒であり３、これが、生死にかかわる全身真菌感染に対する防御の最後の砦としてのその有効な利用をしばしば制限している。そのような真菌感染の発生率、及び全ての他の分類の抗真菌剤に対する抵抗性の両方が増加しつつあるため２、ＡｍＢの治療指数を改善するための方法を見出すことが、ますます重要な問題となっている。リポソーム製剤についていくらかの進展がなされているが、それらは法外に高価である場合が多く４、実質的な毒性が依然として残っている５。世界中での５０年間の広範な努力にも関わらず、改善された治療指数を有する、臨床的に実行可能なＡｍＢの誘導体は未だ出現していない６。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、
【化１】
0006543272.tif 000002
によって表されるＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩である。
【０００６】
本発明の一態様は、 
【化２】
0006543272.tif 000003
によって表されるＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物である。
【０００７】
本発明の一態様は、酵母菌または真菌の増殖を阻害する方法であって、酵母菌または真菌を、
【化３】
0006543272.tif 000004
によって表される有効な量のＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩と接触させることを含む、方法である。
【０００８】
本発明の一態様は、酵母菌または真菌感染を治療する方法であって、それを必要とする対象に、
【化４】
0006543272.tif 000005
によって表される治療的に有効な量のＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ステロールスポンジとしてのＡｍＢの活性を描写する。描写される円板は、エルゴステロールを表す。
【図１Ｂ】アンホテリシンＢ（ＡｍＢ、（１））、ならびにその合成誘導体ＡｍｄｅＢ（４）及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢ（５）の構造を描写する。ミコサミン、エルゴステロール（２）、及びコレステロール（３）の構造もまた描写される。
【図１Ｃ】ＡｍＢとエルゴステロール（Ｅｒｇ）との間の２つの推定接触点を示す図である。
【図２Ａ】２つの極性分子内接触によって安定化された基底状態立体配座コレステロールを有するＮ−ヨードアシルＡｍＢ結晶構造の表現を描写する。
【図２Ｂ】Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢがコレステロールに結合不能であることを描写する。
【図２Ｃ】Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢがコレステロールに結合不能であることを描写する。
【図２Ｄ】先行技術の化合物Ｃ２’ｅｐｉＡｍＥを描写する。
【図３】Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの合成のスキームを描写する。
【図４】Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの合成のスキームを描写する。
【図５】Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの結合親和性、抗真菌活性、及び毒性データを表す図表である。Ｃｈｏｌ、コレステロール；Ｅｒｇ、エルゴステロール；ＩＴＣ、等温滴定熱量測定；ＭＨＣ、最小溶血濃度；ＭＩＣ、最小阻害濃度；ＭＴＣ、最小毒性濃度；ＲＢＣ、ヒト赤血球；ＲＥＣ、ヒト腎臓上皮細胞。
【図６Ａ】エルゴステロールに対する、ＡｍＢ、ＡｍｄｅＢ、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ、及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢの結合を描写するグラフである。ＬＵＶ、大単層小胞；ＮＳ、統計学的に有意でない。
【図６Ｂ】コレステロールに対する、ＡｍＢ、ＡｍｄｅＢ、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ、及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢの結合を描写するグラフである。ＬＵＶ、大単層小胞；ＮＳ、統計学的に有意でない。
【図７】静脈内にカンジダ・アルビカンスを植え付け、２時間後に単回腹腔内用量のビヒクルまたは１６ｍｇ／ｋｇのＡｍＢもしくはＣ２’ｅｐｉＡｍＢで治療した、好中球減少マウスにおける腎臓真菌負荷（コロニー形成単位、ＣＦＵ）を描写する棒グラフである。
【図８】ＡｍＢまたはＣ２’ｅｐｉＡｍＢの示される用量における単回静脈内投与に起因する、健康なマウスにおける致死率を描写するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）は、ミコサミン付属物を有するポリエンマクロライドであり、完全な化合物は、以下の構造を有する。
【化５】
0006543272.tif 000006
【００１１】
アンホテリシンＢ（ＡｍＢ）は臨床的に重要な抗真菌剤であるが、その使用は、その毒性によって制限される。結合エルゴステロールは、チャネル形成とは無関係に、ＡｍＢが酵母菌を死滅させる主要な機序であり、結合コレステロールは主にヒト細胞に対する毒性の原因となる。主要な構造モデルは、ミコサミン付属物上のＣ２’ヒドロキシル基が両方のステロールに対する結合の鍵となることを予想する。
【００１２】
ＡｍＢは、一般的にストレプトマイセス・ノドサス株から得られる。それは、現在米国において、全身カンジダ症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症、ヒストプラズマ症、及びムコール症などの感染を含む、進行性で、潜在的に生死にかかわる真菌感染の治療のための臨床的使用に承認されている。ＡｍＢは、一般的に静脈内注射用に製剤化される。アンホテリシンＢは、例えば、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（Ｓｑｕｉｂｂ）、Ａｍｐｈｏｃｉｎ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ａｂｅｌｃｅｔ（登録商標）（Ｅｎｚｏｎ）、及びＡｍｂｉｓｏｍｅ（登録商標）（Ａｓｔｅｌｌａｓ）として商業的に入手可能である。その望まれない有毒な副作用のため、投薬は一般的に約１．０ｍｇ／ｋｇ／日の最大値に制限され、総累積用量はヒトにおいて約３ｇを超えない。
【００１３】
ＡｍＢが、膜透過処理を介して酵母菌及びヒト細胞の両方を主に死滅させることが、何十年もの間広く認められてきた７。このモデルに導かれ、広範な努力は、ヒト細胞に対して酵母菌におけるイオンチャネルを選択的に形成する誘導体の開発に集中してきた７ｂ−ｅ。
【００１４】
この伝統的モデルとは対照的に、近年、ＡｍＢが、ステロールに結合し、それをミコサミン依存様式で抽出することによって細胞を主に死滅させる８膜外「ステロールスポンジ」へと自己組み立てする８ｄ（図１Ａ）ことが発見された。ミコサミン付属物上のＣ２’−ＯＨ及びＣ３’−ＮＨ３＋が、エルゴステロール（Ｅｒｇ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）の両方の結合を可能にするＡｍＢの基底状態立体配座の安定化（すなわち、チャネル形成が必要とされない）８に関与するモデルを、証拠が支持する。Ｃ２’−ＯＨまたはＣ３’−ＮＨ３＋のいずれかが欠失されるとき、ＡｍＢはＥｒｇには依然として結合するが、Ｃｈｏｌにはもはや結合しない９。これらの結果は、Ｃ２’−ＯＨ及びＣ３’−ＮＨ３＋が、ステロールに直接結合はしないが、アロステリック修飾の潜在的部位であることを示唆する（図１Ｃ）。更に、ステロール結合におけるこの変化は、ヒト細胞に対する観察される毒性の実質的低下と直接相関する９。これは、単純結合コレステロールが、代わりにヒト細胞に対するＡｍＢの毒性の原因となり得ること、及びこの臨床的に重要な抗真菌剤の治療指数を改善するための努力が、コレステロールに対するエルゴステロールの相対結合親和性を最大化するというずっと単純な問題に集中し得ることを示唆する。
【００１５】
以前には、ＡｍＢからのミコサミン付属物の欠失は、エルゴステロール及びコレステロールの両方に結合するその能力を取り除くことが見出された８。得られた誘導体、つまりアンホテロノリドＢ（ＡｍｄｅＢ）もまた、酵母菌に対して無毒性であることが見出された８。しかしながら、ミコサミン付属物中に含有される各ヘテロ原子が果たした役割は、不明のままであった。
【００１６】
主要な既存の構造モデルにおいて、ＡｍＢは、ＡｍＢのＣ２’ヒドロキシル基が各ステロール上の３−βヒドロキシル基に対する臨界水素結合を形成する類似した複合体を介して、エルゴステロール及びコレステロールの両方に結合する（図１Ｂ）１０。しかしながら、この仮説を支持するか、またはそれに反対する強い証拠は不足していた。例えば、コンピュータシミュレーション１１は、そのような水素結合がエルゴステロールの結合においては重要な役割を果たすが、コレステロールの結合においては重要な役割を果たさないことを示唆している。あるいは、ＡｍＢの立体配座的に制限された誘導体の膜透過処理活性を比較する以前の研究１０ｃは、そのような水素結合が両方のステロールについて重要な役割を果たすと結論付けた。これらの先行研究のうちのいずれも、ステロール結合を直接測定していない。
【００１７】
等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）アッセイにおいて観察される相対的発熱量、及び最小阻害濃度（ＭＩＣ）対最小溶血濃度（ＭＨＣ）は、ＡｍＢがＣｈｏｌに勝ってＥｒｇに優先的に結合することを示唆する。この素因は、ＣｈｏｌがＥｒｇよりもわずかに嵩高いことによることが示唆される。更に、ＡｍＢに対するアロステリック修飾（すなわち、Ｃ２’−ＯＨまたはＣ３’−ＮＨ３＋のいずれかの欠失）がなされるとき、天然ステロールの選択性は、Ｅｒｇ結合のみを支持するように拡大される（図２Ｂ）。アロステリーのこれらの２つの潜在的な部位を特定して、我々は、Ｃ２’−位置に対するわずかな修飾が、結合Ｅｒｇのための選択性を更に拡大し得ることについての調査へと進んだ。
【００１８】
我々は、Ｃ２’−ＯＨのエピマー化が、Ｃ２’−ＯＨが欠失されるときに観察されるものと類似した、Ｅｒｇ結合の拡大につながることを仮定した。ＡｍＢの可能性のある基底状態立体配座（図２Ａ）についての我々の理解（Ｎ−ヨードアシルＡｍＢ結晶構造８により情報を得る）に基づいて、我々は、Ｃ２’−ＯＨと、水分子と、Ｃ１３−ＯＨとの間の潜在的な水素結合相互作用は、Ｅｒｇ及びＣｈｏｌに結合するＡｍＢの能力に関連付けられることを提案した。したがって、Ｃ２’−位置でのエピマー化は、潜在的にこの推定上の「水橋」の崩壊または変化を引き起こし、ステロール結合ポケットの形状変化につながる可能性があり、これは、Ｅｒｇ結合に対する優先度の増加をもたらすであろう（図２Ｃ）。
【００１９】
二重に修飾されたＣ２’ｅｐｉＡｍＢメチルエステル（Ｃ２’ｅｐｉＡｍＥ、図２Ｄ）の合成は、２０１１年にＣａｒｒｅｉｒａ及び共同研究者らによって以前に報告されている９。興味深いことに、彼らは、彼らの酵母菌ＭＩＣアッセイにおいて、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＥがＡｍＢと等力であることを観察した。彼らはまた、それが、１μＭのＥｒｇ含有リポソーム及びＣｈｏｌ含有ＰＯＰＣリポソームの両方から、カリウムイオンを流出させることを観察した。これらのデータから、Ｃａｒｒｅｉｒａ及び共同研究者らは、「Ｃ２’−位置の構成は重要ではなかった」と結論付けた９。Ｃａｒｒｅｉｒａ及び共同研究者らは、ヒト毒性またはＣｈｏｌ結合についてはＣ２’ｅｐｉＡｍＥをアッセイしなかった。
【００２０】
本発明に従って、ＡｍＢと比較して、Ｃ２’ヒドロキシル基をエピマー化し、結合エルゴステロール及びコレステロールに対するこの修飾の影響を決定した。実験結果のうちの多くは、例証節及び図面において提示される。注目すべきことに、我々は新しい効果的な無毒性ＡｍＢ誘導体であるＣ２’ｅｐｉＡｍＢを発見し、これはこれまでのところ臨床的に実行可能なＡｍＢの治療代替品として最も有望であることが示されている。ＡｍＢと比較して、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢはＡｍＢの双性イオン特徴を保持し、単一立体中心の反転においてのみ異なる。
【００２１】
これらの注目すべきインビトロ結果を以って、我々はまた、ＡｍＢ及びＣ２’ｄｅＯＡｍＢと直接比較して、マウス研究においてＣ２’ｅｐｉＡｍＢの有効性及び毒性を試験した。インビボ研究は、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢがＡｍＢと等力であるが、マウスに対する毒性が実質的により少ないことを示す。更に、Ｃ２’−位置にヒドロキシル基が存在するため、我々は、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢがインビボでＡｍＢと同等に安定していると予想する。
【００２２】
本発明の一態様は、
【化６】
0006543272.tif 000007
によって表されるＣ２’ｅｐｉＡｍＢ及びその薬学的に許容される塩である。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢを作製するための方法を、本明細書以下に開示する。
【００２３】
「本発明の化合物」とは、本明細書で使用される場合、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ及び前述のその薬学的に許容される塩のうちのいずれかを指す。
【００２４】
本発明の一態様は、
【化７】
0006543272.tif 000008
によって表されるＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物である。以下に更に詳細に説明するように、「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトまたは他の対象への投与に好適である、１つ以上の適合する固体もしくは液体充填剤、希釈剤、または封入物質を意味する。
【００２５】
本発明の一態様は、酵母菌または真菌の増殖を阻害する方法であって、酵母菌または真菌を、
【化８】
0006543272.tif 000009
によって表される有効な量のＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩と接触させることを含む、方法である。
【００２６】
酵母菌は、真菌界に分類される真核生物である。酵母菌は、典型的には真菌の出芽形態として説明される。本発明に関連して特に重要なのは、哺乳動物宿主において感染を引き起こし得る酵母菌種である。そのような感染は、最も一般的には、感染に対して易感染性の障壁を有する宿主（例えば、熱傷被害者）、ならびに易感染性の免疫系を有する宿主（例えば、化学療法または免疫抑制療法を受ける宿主、及びＨＩＶに感染した宿主）を含む易感染性宿主において発生する。病原性酵母菌としては、非限定的に、カンジダ属及びクリプトコッカス属の様々な種が挙げられる。カンジダ属の病原性酵母菌の中でも特に留意すべきなのは、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ステラトイデア、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラプローシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・ビスワナチ、及びカンジダ・ルシタニエである。リプトコッカス属としては、特にクリプトコッカス・ネオフォルマンスが挙げられる。酵母菌は、例えば、人における口腔感染、食道感染、及び腟感染などの粘膜の感染、ならびに骨、血液、泌尿生殖器管、及び中央神経系の感染を引き起こし得る。この一覧は例示的であり、決して限定的ではない。
【００２７】
真菌は、酵母菌に加えて、カビ及びキノコを含む他の真核生物を含む。いくつかの真菌（酵母菌以外）は、哺乳動物宿主において感染を引き起こし得る。そのような感染は、最も一般的には、感染に対して易感染性の障壁を有する宿主（例えば、熱傷被害者）、ならびに易感染性の免疫系を有する宿主（例えば、化学療法または免疫抑制療法を受ける宿主、及びＨＩＶに感染した宿主）を含む易感染性宿主において発生する。病原性真菌（酵母菌以外）としては、非限定的に、アスペルギルス種、リゾプス種、ムコール種、ヒストプラズマ種、コクシジオイデス種、ブラストミセス種、トリコフィトン種、ミクロスポルム種、及びエピデルモフィトン種が挙げられる。前述のものの中でも特に留意すべきなのは、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・フラバス、クロコウジカビ、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、及びブラストミセス・デルマチチジスである。真菌は、いくつか例を挙げると、肺、骨、血液、泌尿生殖器管、中央神経系において深部組織感染を引き起こし得る。いくつかの真菌は、皮膚及び爪の感染の原因である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」は、対照と比較して、客観的に測定可能な量または程度だけ低減することを意味する。一実施形態において、阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）は、対照と比較して、少なくとも統計学的に有意な量だけ低減することを意味する。一実施形態において、阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）は、対照と比較して、少なくとも５パーセントだけ低減することを意味する。様々な個々の実施形態において、阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）または阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）は、対照と比較して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３３、４０、５０、６０、６７、７０、７５、８０、９０、または９５パーセントだけ低減することを意味する。
【００２９】
本発明の一態様は、酵母菌または真菌感染を治療する方法であって、それを必要とする対象に、
【化９】
0006543272.tif 000010
によって表される治療的に有効な量のＣ２’ｅｐｉＡｍＢまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、（ａ）病態もしくは疾病を発症する危険性があるか、またはそれを有する素因があり得るが、未だそれを有すると診断されていない対象において、病態もしくは疾病が発生するのを予防すること、（ｂ）病態もしくは疾病を阻害すること、例えば、その発症を緩徐化または停止すること、あるいは（ｃ）病態もしくは疾病を緩和または寛解させること、例えば、病態もしくは疾病の退行を引き起こすこと、をもたらす介入を実行することを指す。一実施形態において、本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、（ａ）病態もしくは疾病を阻害すること、例えば、その発症を緩徐化または停止すること、あるいは（ｂ）病態もしくは疾病を緩和または寛解させること、例えば、病態もしくは疾病の退行を引き起こすこと、をもたらす介入を実行することを指す。
【００３１】
「酵母菌感染」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に定義される酵母菌による感染を指す。
【００３２】
「真菌感染」とは、本明細書で使用される場合、本明細書に定義される真菌による感染を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「対象」とは、生きた哺乳動物を指す。様々な実施形態において、対象は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、または非ヒト霊長類を非限定的に含む、非ヒト哺乳動物である。一実施形態において、対象はヒトである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「酵母菌または真菌感染を有する対象」は、酵母菌または真菌感染の少なくとも１つの客観的徴候を呈する対象を指す。一実施形態において、酵母菌または真菌感染を有する対象は、酵母菌または真菌感染を有すると診断されており、その治療を必要とする対象である。酵母菌または真菌感染を診断する方法は周知であり、本明細書において詳細に説明する必要はない。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「投与する」は、その通常の意味を有し、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、（例えば、腫瘍内への）直接注射、粘膜、吸入、経口、及び局所を非限定的に含む、任意の好適な投与経路によって投与することを網羅する。
【００３６】
一実施形態において、投与は全身投与である。
【００３７】
一実施形態において、投与は局所投与である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「有効な量」という語句は、所望される生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。本明細書で使用される場合、「治療的に有効な量」という語句は、所望される治療的効果を達成するのに、例えば、酵母菌または真菌感染を治療するのに十分な任意の量を指す。
【００３９】
本発明の化合物及び塩は、他の治療剤と組み合わせられてもよい。本発明の化合物及び他の治療剤は、同時または経時的に投与されてもよい。他の治療剤が同時に投与されるとき、それらは同一または別個の製剤で投与され得るが、それらは実質的に同時に投与される。他の治療剤及び本発明の化合物の投与が時間的に分離されるとき、他の治療剤は、互いに経時的に、及び本発明の化合物と経時的に投与される。これらの化合物の投与間の時間の分離は、わずか数分であっても、より長くてもよい。
【００４０】
他の治療剤の例としては、ＡｍＢを含む他の抗真菌剤、ならびに他の抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、及び抗癌剤が挙げられる。
【００４１】
上述するように、「有効な量」とは、所望される生物学的効果を達成するのに十分な任意の量を指す。本明細書に提供される教示と組み合わせて、様々な活性化合物、ならびに効力、相対的生物学的利用能、患者体重、有害な副作用の重症度、及び好ましい投与様式などの重み係数の中から選択することによって、望まれない毒性を実質的に引き起こさないながらも、特定の対象を治療するのに有効である、有効な予防的または治療的処置レジメンを計画することができる。任意の特定の用途にとって有効な量は、治療される疾病もしくは病態、投与される本発明の特定の化合物、対象の大きさ、または疾病もしくは病態の重症度などの要因によって変動し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、本発明の特定の化合物及び／または他の治療剤の有効な量を経験的に決定することができる。一般的に、最大用量、つまりいくらかの医学的判断に従って安全である最高用量が使用されることが好ましい。化合物の適切な全身レベルを達成するために、１日当たり複数の用量が企図され得る。適切な全身レベルは、例えば、その薬物の、患者のピークまたは持続血漿レベルの測定によって決定され得る。「用量」及び「投与量」は、本明細書において互換的に使用される。
【００４２】
一般的に、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの１日静脈内用量は、ヒト対象では、ＡｍＢの通常の１日静脈内用量と類似するか、またはそれよりも多い。同様に、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの他の１日非経口用量は、ヒト対象では、ＡｍＢの通常の１日非経口用量と類似するか、またはそれよりも多い。
【００４３】
一実施形態において、本発明の化合物の静脈内投与は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。一実施形態において、本発明の化合物の静脈内投与は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜２ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。一実施形態において、本発明の化合物の静脈内投与は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。一実施形態において、本発明の化合物の静脈内投与は、典型的には、１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。一実施形態において、本発明の化合物の静脈内投与は、典型的には、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり得る。したがって、静脈内投薬は、ＡｍＢの最大許容用量と類似してもよく、または有利には、それを超えてもよい。
【００４４】
一般的に、活性化合物の１日経口用量は、ヒト対象では、１日当たり約０．０１ミリグラム／ｋｇ〜１日当たり１０００ミリグラム／ｋｇである。１日当たり１回以上の投与において、０．５〜５０ミリグラム／ｋｇの範囲内の経口用量が、治療的結果をもたらすことが期待される。投与量は、投与様式によって、局所的または全身的な所望される薬物レベルを達成するために、適切に調節され得る。例えば、静脈内投与は、１日当たり１桁から数桁少ない用量であることが期待される。そのような用量で、対象における応答が不十分である場合、患者許容度が容認する程度まで、更により高い用量（またはより局所的な異なる送達経路による、より高い有効用量）が用いられてもよい。化合物の適切な全身レベルを達成するために、１日当たり複数の用量が企図される。
【００４５】
本明細書に説明する任意の化合物について、治療的に有効な量は、まず動物モデルから決定され得る。治療的に有効な用量はまた、ヒトにおいて試験されている本発明の化合物に対するヒトデータ、及び他の関連する活性剤（例えば、ＡｍＢ）などの類似した薬理学的活性を呈することが既知である化合物に対するヒトデータから決定され得る。非経口投与には、より高い用量が必要とされ得る。適用される用量は、投与される化合物の相対的生物学的利用能及び効力に基づいて調節され得る。上述する方法及び当該技術分野において周知である他の方法に基づいて、最大有効性を達成するために用量を調節することは、ゆうに当業者の能力の範囲内である。
【００４６】
本発明の製剤は、通例、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合する担体、アジュバント、及び任意で他の治療成分を含有し得る、薬学的に許容される溶液において投与される。
【００４７】
治療における使用では、有効な量の本発明の化合物は、本発明の化合物を所望の表面に送達する任意の様式によって対象に投与され得る。本発明の薬学的組成物の投与は、当業者にとって既知である任意の手段によって達成され得る。投与経路としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、膀胱内（膀胱）、経口、皮下、（例えば、腫瘍または膿瘍内への）直接注射、粘膜（例えば、眼に対して局所的）、吸入、及び局所が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
静脈内及び他の非経口投与経路では、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、一般的にＡｍＢと類似して製剤化されてもよい。例えば、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、デスオキシコール酸を有する凍結乾燥調製物として、リポソーム挿入または封入活性化合物の凍結乾燥調製物として、水性懸濁液中の脂質複合体として、またはコレステロール硫酸複合体として製剤化され得る。凍結乾燥製剤は、一般的に好適な水性溶液中で、例えば、無菌水または生理食塩水中で投与直前に再構成される。
【００４９】
経口投与のため、化合物（すなわち、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ及びその薬学的に許容される塩、ならびに他の治療剤）は、活性化合物（複数可）を、当該技術分野において周知である薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化され得る。そのような担体は、本発明の化合物が、治療される対象による経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。経口用途用の薬学的調製物は固体賦形剤として得ることができ、得られた混合物を任意で粉砕し、所望される場合、好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得る。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が添加されてもよい。任意で、経口製剤はまた、生理食塩水または緩衝剤（例えば、体内酸状態を中和するためのＥＤＴＡ）中に製剤化されてもよく、またはいかなる担体もなくして投与されてもよい。
【００５０】
上記の構成成分（複数可）の経口剤形もまた特に企図される。構成成分（複数可）は、誘導体の経口送達が効果的であるように化学修飾されてもよい。一般的に、企図される化学修飾は、少なくとも１つの部分の、構成成分分子自体への結合であり、該部分は、（ａ）酸加水分解の阻害、及び（ｂ）胃または腸からの血流内への取り込みを容認する。構成成分（複数可）の全体的な安定性の増加、及び体内循環時間の増加もまた所望される。そのような部分の例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリプロリンが挙げられる。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ”，Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ，Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３６７−３８３（１９８１）、Ｎｅｗｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４：１８５−９（１９８２）。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。上に示すように、薬学的使用のために好ましいのは、ポリエチレングリコール部分である。
【００５１】
構成成分（または誘導体）について、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、もしくは回腸）または大腸であってもよい。当業者は、胃内で溶解しないが、十二指腸または腸内の他の場所で材料を放出する入手可能な製剤を有する。好ましくは、放出は、本発明の化合物（もしくは誘導体）の保護、または腸におけるような胃環境を超える生物活性材料の放出のいずれかによって胃環境の有害作用を避ける。
【００５２】
完全な胃抵抗性を確保するためには、少なくともｐＨ５．０に対して不透過性のコーティングが必須である。腸内コーティングとして使用され得るより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、及びシェラックである。これらのコーティングは、混合薄膜として使用されてもよい。
【００５３】
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、錠剤に使用されてもよく、これは、胃に対する保護を意図するものではない。これは、糖コーティングまたは錠剤の嚥下をより容易にするコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥治療剤（例えば、粉末）の送達用の硬質シェル（ゼラチンなど）からなってもよく、液体形態では、軟質ゼラチンシェルが使用されてもよい。カシェ剤のシェル材料は、濃厚デンプンまたは他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、湿製錠剤、または擦り込み錠剤には、湿潤塊化技術が使用され得る。
【００５４】
治療剤は、約１ｍｍの粒径の顆粒またはペレットの形態の微細な多微粒子として製剤中に含まれ得る。カプセル投与用の材料の製剤はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤としてでさえあってもよい。治療剤は、圧縮によって調製され得る。
【００５５】
着色剤及び香味剤が全て含まれてもよい。例えば、本発明の化合物（または誘導体）は、（リポソームまたはマイクロスフェアの封入などによって）製剤化され、次いで、着色剤及び香味剤を含有する冷蔵飲料などの食用品中に更に含有されてもよい。
【００５６】
不活性材料によって治療剤の体積を希釈しても、それを増加させてもよい。これらの希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾デキストラン、及びデンプンが挙げられ得る。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、及び塩化ナトリウムを含む特定の無機塩もまた、充填剤として使用されてもよい。いくつかの商業的に入手可能な希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ、及びＡｖｉｃｅｌｌである。
【００５７】
治療剤の製剤中、固体剤形の中に、崩壊剤が含まれてもよい。崩壊剤として使用される材料としては、デンプンに基づく商業的崩壊剤であるＥｘｐｌｏｔａｂを含むデンプンが挙げられるが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ、及びベントナイトが、全て使用されてもよい。崩壊剤の別の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。崩壊剤及び結合剤として粉末ゴムが使用されてもよく、これらは、寒天、カラヤ、またはトラガカントなどの粉末ゴムを含む。アルギン酸及びそのナトリウム塩もまた、崩壊剤として有用である。
【００５８】
結合剤は、治療剤をともに保持して、硬質錠剤を形成するために使用され得、アカシア、トラガカント、デンプン、及びゼラチンなどの天然物からの材料を含む。他のものとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はともに、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用されてもよい。
【００５９】
製剤プロセス中の固着を予防するために、治療剤の製剤中に抗摩擦剤が含まれてもよい。治療剤とダイ壁との間の層として、滑沢剤が使用されてもよく、これらの滑沢剤としては、ステアリン酸（そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、野菜油、及びワックスが挙げられるが、これらに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００及び６０００などの好適な滑沢剤もまた使用されてもよい。
【００６０】
製剤化中の薬物の流動特性を改善し得、圧縮中の再配置を助けるための滑剤が添加されてもよい。滑剤としては、デンプン、タルク、発熱シリカ、及び水和シリコアルミネートが挙げられ得る。
【００６１】
水性環境への治療剤の溶解を助けるために、湿潤剤として界面活性剤が添加されてもよい。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホサクシネート、及びジオクチルナトリウムスルホネートなどの陰イオン性洗剤が挙げられ得る。陽イオン性洗剤が使用されてもよく、例えば、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムが挙げられ得る。界面活性剤として製剤中に含まれ得る潜在的非イオン性洗剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０、及び６０、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート４０、６０、６５、及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は、本発明の化合物または誘導体の製剤中に、単独でまたは異なる比率の混合物として存在し得る。
【００６２】
経口使用され得る薬学的調製物としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、及びゼラチン及び可塑剤（グリセロール及びソルビトールなど）製の軟質密封カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、任意で安定剤との混合において、活性成分を含有し得る。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解もしくは懸濁され得る。更に、安定剤が添加されてもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアもまた、使用されてもよい。そのようなマイクロスフェアは、当該技術分野において明確に定義されている。経口投与のための全ての製剤は、そのような投与に好適な投与量であるべきである。
【００６３】
頬側投与では、組成物は、従来の様式で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態を取り得る。
【００６４】
吸入による投与では、本発明に従う使用のためのＣ２’ｅｐｉＡｍＢは、好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガス）を使用して、便宜的に加圧パックまたは噴霧吸入器からのエアロゾルスプレー形の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または気腹器における使用のための、例えばゼラチンのカプセル及び薬包は、化合物と好適な粉末ベース（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有して製剤化されてもよい。
【００６５】
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ（またはその塩）の肺送達もまた、本明細書に企図される。本発明の化合物（または誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層を横切って血流へと横断する。吸入された分子についての他の報告としては、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ７：５６５−５６９（１９９０）、Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）、Ｂｒａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３（ｓｕｐｐｌ．５）：１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）、Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ  ３：２０６−２１２（１９８９）（α１−アンチトリプシン）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８４：１１４５−１１４６（ａ−１−プロテイナーゼ）、Ｏｓｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，Ｍａｒｃｈ，（組み換えヒト増殖ホルモン）、Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４０：３４８２−３４８８（インターフェロン−ガンマ及び腫瘍壊死因子アルファ）、及びＰｌａｔｚらの米国特許第５，２８４，６５６号明細書（顆粒球コロニー刺激因子、参照によって組み込まれる）が挙げられる。全身的作用のための薬物の肺送達のための方法及び組成物は、１９９５年９月１９日にＷｏｎｇらに対して発行された米国特許第５，４５１，５６９号明細書（参照によって組み込まれる）に説明される。
【００６６】
本発明の実施における使用のために、噴霧吸入器、定用量吸入器、及び粉末吸入器（その全てが当業者に知られる）を含むが、これらに限定されない、治療製品の肺送達用に設計された多種多様な機械装置が企図される。
【００６７】
本発明の実施に好適な商業的に入手可能な装置のいくつかの具体的な例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．製造のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧吸入器、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．製造のＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧吸入器、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ製造のＶｅｎｔｏｌｉｎ定用量吸入器、及びＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．製造のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【００６８】
全てのそのような装置は、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ（またはその塩）の吐出に好適な製剤の使用を必要とする。典型的には、各製剤は、用いられる装置の種類に特異的であり、治療において有用である通常の希釈剤、アジュバント、及び／または担体に加えて、適切な噴霧剤材料の使用に関与し得る。また、リポソーム、マイクロカプセル、もしくはマイクロスフェア、包接複合体、または他の種類の担体の使用が企図される。化学修飾された本発明の化合物はまた、化学修飾の種類または用いられる装置の種類によって、異なる製剤中に調製され得る。
【００６９】
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧吸入器との使用に好適な製剤は、典型的には１ｍＬの溶液当たり、本発明の生物活性化合物の約０．１〜２５ｍｇの濃度で水中に溶解した本発明の化合物（または誘導体）を含むであろう。製剤はまた、緩衝剤及び単純糖を含んでもよい（例えば、本発明の化合物では、浸透圧の安定化及び制御）。噴霧吸入器製剤はまた、エアロゾル形成時の溶液の微粒化によって引き起こされる本発明の化合物の表面誘起凝集を低減または予防するために、界面活性剤を含有してもよい。
【００７０】
定用量吸入器装置での使用のための製剤は、一般的に、界面活性剤の助けを借りて噴霧剤中に懸濁した本発明の化合物（またはその塩）を含有する微細に分割された粉末を含むであろう。噴霧剤はまた、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、もしくはこれらの組み合わせを含む、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンなどの、この目的のために用いられる任意の従来の材料であってもよい。好適な界面活性剤としては、ソルビタントリオレエート及び大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用であり得る。
【００７１】
粉末吸入器装置から吐出するための製剤は、本発明の化合物（または誘導体）を含有する微細に分割された乾燥粉末を含み、装置からの粉末の分散を促進する量（例えば、製剤の５０〜９０重量％）のラクトース、ソルビトール、スクロース、またはマンニトールなどの増量剤もまた含んでもよい。本発明の化合物（または誘導体）は、肺深部への最も効果的な送達のため、１０マイクロメートル（μｍ）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する微粒子形態で有利に調製されるべきである。
【００７２】
本発明の薬学的組成物の経鼻送達もまた、企図される。経鼻送達は、製品を肺内に沈着させる必要性なく、治療製品の鼻への投与直後に、本発明の薬学的組成物が血流へと通過することを可能にする。経鼻送達用の製剤としては、デキストランまたはシクロデキストランを有するものが挙げられる。
【００７３】
経鼻投与では、有用な装置は、定用量スプレー器が取り付けられる小型硬質ビンである。一実施形態において、定用量は、本発明の溶液の薬学的組成物を規定体積のチャンバ内へと引くことによって送達され、このチャンバは、チャンバ内の液体が圧縮されるときにスプレーを形成することによって、エアロゾル化するように寸法形成された開口及びエアロゾル製剤を有する。チャンバが圧縮されて、本発明の薬学的組成物が投与される。特定の一実施形態において、チャンバはピストン配置である。そのような装置は、商業的に入手可能である。
【００７４】
あるいは、圧搾されるときにスプレーを形成することによって、エアロゾル製剤をエアロゾル化するように寸法形成された開口または開口部を有するプラスチック圧搾ビンが使用される。開口部は通常ビンの上部に見られ、上部は一般的に、エアロゾル製剤の効率的な投与のため、鼻道内に部分的に適合するように細くなる。好ましくは、経鼻吸入器は、定用量の薬物の投与のために定量のエアロゾル製剤を提供するであろう。
【００７５】
化合物は、それらを全身的に送達することが望ましい場合、注射による（例えば、ボーラス注射または持続注射による）非経口投与用に製剤化されてもよい。注射用の製剤は、単位剤形で、例えば、保存剤が添加されたアンプルまたは複数用量容器中に提供されてもよい。本組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ってもよく、懸濁液、安定剤、及び／または分散剤などの製剤用剤を含有してもよい。
【００７６】
非経口投与用の薬学的製剤は、水溶性形態の活性化合物の水性溶液を含む。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。任意で、懸濁液はまた、好適な安定剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤を含有して、高濃度の溶液の調製を可能にしてもよい。
【００７７】
あるいは、活性化合物は、好適なビヒクル（例えば、発熱物質を含有しない水）による構成のために、使用前には粉末形態であってもよい。
【００７８】
化合物はまた、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを含有する、坐剤もしくは停留浣腸剤などの直腸組成物または腟組成物中に製剤化されてもよい。
【００７９】
上述する製剤に加えて、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢはまた、デポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長時間作用性製剤は、（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）好適なポリマー材料もしくは疎水性材料によって、またはイオン交換樹脂として、あるいは難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化されてもよい。
【００８０】
本薬学的組成物はまた、好適な固相もしくはゲル相の担体または賦形剤を含んでもよい。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
好適な液体または固体薬学的組成物形態は、例えば、吸入用の水溶液または生理食塩水溶液、マイクロカプセル化されたもの、蝸牛状化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）されたもの、微視的金粒子上にコーティングされたもの、リポソームに含有されたもの、噴霧化されたもの、エアロゾル、皮膚内への埋め込み用のペレット、または皮膚に擦り付けられるように鋭利な物体上に乾燥されたものである。本薬学的組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、液滴、または活性化合物を遅延放出する調製物を含み、これらの調製において、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香味剤、甘味剤、もしくは可溶化剤などの賦形剤及び添加剤及び／または補助剤が、上述の通り習慣的に使用され得る。本薬学的組成物は、様々な薬物送達系における使用に好適である。薬物送達のための方法の簡潔な概説については、Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−３３（１９９０）を参照されたい。
【００８２】
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ及び任意で他の治療剤は、それ自体（未希釈）で、または薬学的に許容される塩の形態で投与され得る。医薬において使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、その薬学的に許容される塩を調製するために、薬学的に許容されない塩が便宜的に使用されてもよい。そのような塩としては、以下の酸、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸から調製される塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製され得る。
【００８３】
好適な緩衝剤としては、酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）、クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）、ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）、ならびにリン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）、及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００８４】
本発明の薬学的組成物は、有効な量のＣ２’ｅｐｉＡｍＢ及び任意で薬学的に許容される担体中に含まれる治療剤を含有する。「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に好適である、１つ以上の適合する固体もしくは液体充填剤、希釈剤、または封入物質を意味する。「担体」という用語は、適用を促進するために活性成分が組み合わされる、天然もしくは合成の有機または無機成分を表す。薬学的組成物の構成成分はまた、所望される薬学的効率を実質的に損なう相互作用が存在しないような様式で、本発明の化合物と、及び互いに混成されることができる。
【００８５】
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢを特に含むが、これらに限定されない治療剤（複数可）は、粒子で提供されてもよい。本明細書で使用される場合、粒子は、全体もしくは一部分が本発明の化合物または本明細書に説明する他の治療剤（複数可）からなる、ナノ粒子もしくはマイクロ粒子（またはいくつかの場合より大きな粒子）を意味する。粒子は、腸内コーティングを含むが、これに限定されないコーティングに包まれたコアに、治療剤（複数可）を含有してもよい。治療剤（複数可）はまた、粒子を通して分散されてもよい。治療剤（複数可）はまた、粒子内に吸収されてもよい。粒子は、ゼロ次放出、１次放出、２次放出、遅延放出、持続放出、即時放出、及びこれらの任意の組み合わせなどを含む、任意の次数の放出速度論のものであり得る。粒子は、治療剤（複数可）に加えて、侵食性、非侵食性、生分解性、もしくは非生分解性材料、またはこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない、薬学及び医学の当該技術分野において通例使用されるこれらの材料のうちのいずれかを含んでもよい。粒子は、溶液中の、または半固体状態の本発明の化合物を含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、実質的にいかなる形状のものであってもよい。
【００８６】
非生分解性または生分解性ポリマー材料の両方が、治療剤（複数可）を送達するための粒子の製造において使用され得る。そのようなポリマーは、天然ポリマーまたは合成ポリマーであり得る。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて選択される。特に対象となる生体付着性ポリマーは、Ｓａｗｈｎｅｙ  Ｈ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２６：５８１−７に説明される生侵食性ヒドロゲルを含み、その教示は本明細書に組み込まれる。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）が挙げられる。
【００８７】
治療剤（複数可）は、制御された放出系内に含有されてもよい。「制御された放出」という用語は、製剤からの薬物放出の様式及びプロファイルが制御される、任意の薬物含有製剤を指すことが意図される。これは、即時及び非即時放出製剤を指し、非即時放出製剤としては、持続放出製剤及び遅延放出製剤が挙げられるが、これらに限定されない。「持続放出」という用語（「徐放」とも呼ばれる）は、その従来の意味において使用されて、長期間にわたって薬物の徐々の放出を提供し、必然的ではないものの、好ましくは、長期間にわたって実質的に一定の薬物の血中レベルをもたらす薬物製剤を指す。「遅延放出」という用語は、その従来の意味において使用されて、製剤の投与とそこからの薬物の放出との間に時間遅延が存在する薬物製剤を指す。「遅延放出」は、長期間にわたる薬物の徐々の放出に関与しても、しなくてもよいため、「持続放出」であっても、なくてもよい。
【００８８】
長期間の持続放出埋め込み剤の使用は、慢性病態の治療に特に好適であり得る。「長期間の」放出は、本明細書で使用される場合、埋め込み剤が、少なくとも７日間、好ましくは３０〜６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構築され、配置されることを意味する。長期間の持続放出埋め込み剤は、当業者に周知であり、上述する放出系のいくつかを含む。
【００８９】
本明細書に説明される組成物及び方法に対する好適な修飾及び適合は、当業者に既知である情報に照らして、本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかであり、本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。ここまで本発明を詳細に説明しているが、それは、説明のみのために本明細書とともに含まれ、本発明を限定することが意図されない、以下の実施例への参照により、よりはっきりと理解されるであろう。
【実施例】
【００９０】
一般的な方法
材料
商業的に入手可能な材料をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｓｔｒｅｍ、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、別段述べない限り更に精製せずに使用した。アンホテリシンＢは、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙからの寛大な贈答品であった。樟脳スルホン酸を、使用前に酢酸エチルから再結晶化させた。Ｐａｎｇｂｏｒｎ及び共同研究者らの方法に従い、充填カラムを通す通過によって溶媒を精製する溶媒精製系から全ての溶媒を分注した（ＴＨＦ、Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３Ｎ、ジオキサン、ヘキサン：乾燥中性アルミナ；ベンゼン、トルエン：乾燥中性アルミナ及びＱ５反応体；ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＣＨ３ＯＨ：活性化分子篩）。Ｅｒｍｉｓｈｋｉｎ，ＬＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｎａｔｕｒｅ  ２６２：６９８−６９９。水は、２回蒸留するか、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ＭｉｌｌｉＱ水蒸留系から得た。窒素雰囲気下、ＣａＨ２からトリエチルアミンを新たに蒸留した。（±）−１０−樟脳スルホン酸をＥｔＯＡｃから再結晶化した。
【００９１】
反応
ポリエンの光及び空気感受性のため、ポリエンの全ての操作を低光条件下で実行し、化合物をアルゴン雰囲気下で貯蔵した。別段示さない限り、炉乾燥（約１２５℃）または火炎乾燥したガラス器具中、アルゴン雰囲気下で全ての反応を実行した。Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（０．２５ｍｍ）上の指示された溶媒を使用して実行される分析用薄層クロマトグラフィーによって、反応を監視した。紫外線（λ２５４）ランプを使用して化合物を可視化するか、またはｐ−アニスアルデヒド染色溶液によって染色し、その後、Ｖａｒｉｔｅｍｐヒートガンで加熱した。Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーを実行した。
【００９２】
精製及び分析
以下の機器、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ５００（５００ＭＨｚ）、Ｖａｒｉａｎ  ＶＸＲ５００（５００ＭＨｚ）、またはＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  Ｉｎｏｖａ５００ＮＢ（５００ＭＨｚ）のうちの１つを使用して、周囲温度で１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフトを、テトラメチルシランからの百万分率（ｐｐｍ）低磁場で報告し、ＮＭＲ溶媒中の残留プロチウムを基準とする（ＣＤＣｌ３、δ＝７．２６；（ＣＤ３）２ＣＯ、δ＝２．０５、中心線）。スペクトルデータを以下の通り提示する。化学シフト、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｓｅｘｔ＝六重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｄｔ＝三重線の二重線、ｄｄｄ＝二重線の二重線の二重線、ｍ＝多重線、ｂ＝幅広い、ａｐｐ＝見かけ）、結合定数（Ｊ）、及び積分。以下の機器、Ｖａｒｉａｎ  ＶＸＲ５００（１２５ＭＨｚ）、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ５００（１２５ＭＨｚ）、またはＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ４００（１０１ＭＨｚ）機器のうちの１つを使用して、周囲温度で１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを記録した。化学シフトを、テトラメチルシランからのｐｐｍ低磁場で報告し、ＮＭＲ溶媒中の炭素共鳴を基準とする（ＣＤＣｌ３、δ＝７７．１６、中心線；ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３、δ＝２９．８４、中心線）。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＭｒ．Ｐｕｌｉｎ  Ｗａｎｇ、Ｍｒ．Ｆｕｒｏｎｇ  Ｓｕｎ、またはＤｒ．Ｈａｉｊｕｎ  Ｙａｏから高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を取得した。データをｍ／ｚの形態で報告する。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ７８９０Ａ機器上でガスクロマトグラフィー分析を行った。
【００９３】
吸光係数決定
Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ  ＭＴ５微量天秤を使用して、乾燥した化合物の試料を風袋計量したバイアル中で質量測定した。次いで、この試料をＤＭＳＯ中に溶解して、濃縮ストック溶液を作製した。この濃縮ストック溶液のうちの一部分を、ＤＭＳＯで５倍に希釈して、希釈ストック溶液を作製した。紫外／可視実験のための最終濃度を達成するために、希釈ストック溶液のある体積をＭｅＯＨで０．５ｍＬに希釈した。各化合物について、５つの異なる最終濃度を使用して紫外／可視実験を実行し、各濃度を３回調製して、平均吸光度を得た。平均吸光度を、濃度に対してプロットした。Ｅｘｃｅｌを使用して線形最小二乗適合にデータを適合させ、適合線の勾配を吸光係数として使用した。吸光係数は以下の通りであった。ＡｍＢ（ε４０６＝１６４，０００）、ＡｍｄｅＢ（ε４０６＝１０２，０００）、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ（ε４０６＝７３，０００）。
【００９４】
実施例１．Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの合成
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの第１世代合成において、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＥのカレイラ合成を修飾して、脱保護された材料へのアクセスを可能にした。具体的には、容易に除去可能なアリルエステルをＣ４１−位置に用いた。以前に報告された完全保護されたアグリコン５．５３ｂ、５への経路を用いて、Ｃ３’ｄｅＮＨＡｍＢの構築において以前に使用されたミコサミン供与体及び糖化条件５によって、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢを合成した（図３）。
【００９５】
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの合成は、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ４及びＣ３’ｄｅＮＨＡｍＢ５に類似したハイブリッド糖化経路から可能であったものの、我々は、以前に報告した我々のＡｍＢの部位選択的アシル化法が、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢのより効率的かつ実用的な合成を提供し得ることを理解した１１。
【００９６】
図４に描写されるＣ２’ｅｐｉＡｍＢの第２世代合成において、異なる保護基戦略を用いた。窒素上の保護基としてアロックを導入した。Ｃ４１カルボキシレートをアリル基で保護した。これらの基の両方を、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４及びチオサリチル酸によって最終ステップにおいて同時に除去する。ＰＭＰケタールは選択的アシル化法にとって重要であり、弱酸性条件下、最後から２回目のステップとしてＣ１３メチルケタールとともに同時に除去されることができた。ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）エーテル基を使用したが、これは、それらが、両方のＣ２’ベンゾエート中間体のＫＣＮ媒介加水分解を生き延びるのに十分に頑強でありながら、ピリジン緩衝剤ＨＦ−ピリジン条件で容易に除去される１１ためであった。
【００９７】
先を見越して、アロック基、ケタール、ＰＭＰケタール、及びアリル基を３ステップでＡｍＢから導入し、１回のクロマトグラフィー分離によって５５％の収率で５．１１を得た。この時点で、５．１１のＣ２’−ＯＨを、以前に報告した条件下、ｐ−ｔｅｒｔブチルベンゾイルクロリドで選択的にアシル化して、分取に有用な３０％の収率で４．１２を生成した。対応するトリフレートを使用してＤＥＩＰＳ基を導入し、７２％収率で５．１３を得た。Ｃ２’ｐ−ｔｅｒｔブチルベンゾエートの続くＫＣＮ媒介加水分解によって、６３％収率で遊離Ｃ２’−ＯＨ５．１４を得た。５．１４のＣ２’−ＯＨの反転を光延条件下で進め、６５％収率でＣ２’エクアトリアルｐ−ニトロベンゾエート５．１５を得た。得られたＣ２’−ニトロベンゾエート５．１５を類似したＫＣＮ条件で開裂させて、完全に保護されたＣ２’ｅｐｉＡｍＢ５．１６を生成した。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢへの第２世代経路に、３回の全体的脱保護ステップ、つまり、１）ＨＦ−ピリジン脱シリル化、２）ＤＭＦ中トリフルオロ酢酸でのケタール加水分解、及び３）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４及びチオサリチル酸によるアリルエステル及びアロック基の同時除去、が残る。
【００９８】
図３及び図４に描写される合成の詳細は、以下の通りである。
【００９９】
中間体５．２の合成
【化１０】
0006543272.tif 000011
１００ｍＬの丸底フラスコにおいて、０℃、２７ｍＬのＤＣＭ中、アジドアルコール５．１（１．１４ｇ、２．６９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びピリジン（２．１７ｍＬ、２６．８７ｍｍｏｌ、１０．０当量）の撹拌された溶液に、無水酢酸（１．２７ｍＬ、１３．４ｍｍｏｌ、５．０当量）及びＤＭＡＰ（１６．４ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ、０．０５当量）を経時的に添加した。１５分後、溶液を２３℃まで温め、１０分間撹拌し、Ｅｔ２Ｏ及び飽和水性重炭酸塩を含有する分液漏斗中に注いだ。Ｅｔ２Ｏ（３×２０ｍＬ）で水相を抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。ベンゼン（３×１５ｍＬ）によってピリジンを共沸除去した。フラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出、５％のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ〜１０％のＥｔｏＡｃ：Ｈｅｘ）によって精製し、アセテート５．２（１．０９ｇ、２．３４ｍｍｏｌ、８７％）を無色透明の油として得た。
【化１１】
0006543272.tif 000012
Ｒｆ＝０．６５（１：１のＥｔ２Ｏ／Ｈｅｘ、ＣＡＭ染色）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ７．３３−７．２８（ｍ，２Ｈ）、６．９５−６．９０（ｍ，２Ｈ）、４．９７（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．６８（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６４（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．４７（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．８０（ｓ，３Ｈ）、３．７７−３．７２（ｍ，２Ｈ）、３．２３（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、２．０９（ｓ，１Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、１．２４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）、０．９３（ｓ，１１Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ２２Ｈ３５Ｎ３Ｏ６Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：４８８．２１９３
実測値：                          ４８８．２１９３
【０１００】
中間体５．３の合成
【化１２】
0006543272.tif 000013
箔で被覆した４０ｍＬのｉＣｈｅｍバイアルにおいて、０℃、ＤＣＭ：Ｈ２Ｏ（２３．４ｍＬ、１０：１）の混合物中、アセテート５．２（１．０９ｇ、２．３４ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された溶液に、ＤＤＱ（６２３ｍｇ、２．８１ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。５分後、反応物を２３℃まで温め、１２時間撹拌し、Ｅｔ２Ｏ及び飽和水性重炭酸塩を含有する分液漏斗中に注いだ。有機物を飽和ブラインで洗浄した。Ｅｔ２Ｏ（３×２０ｍＬ）で合わせた水層を抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出、１０％のＥｔｏＡｃ：Ｈｅｘ〜１５％のＥｔｏＡｃ：Ｈｅｘ〜２０％のＥｔｏＡｃ：Ｈｅｘ）による精製によって、ヘミケタール５．３（７１６ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ、８９％）を無色透明の油として得た。
【化１３】
0006543272.tif 000014
Ｒｆ＝０．４５（１：１のＥｔ２Ｏ／Ｈｅｘ、ＣＡＭ染色）
１Ｈ  ＮＭＲ：１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ５．２３（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．６１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．６Ｈｚ，１Ｈ）、３．９２（ｄｑ，Ｊ＝９．２，６．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．７７（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，９．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．１９（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、２．０８（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ）、１．２４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，０Ｈ）、１．１９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，４Ｈ）、０．９４（ｓ，１０Ｈ）、０．９３（ｓ，２Ｈ）、０．２１（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，４Ｈ）、０．１５（ｓ，４Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ１４Ｈ２７Ｎ３Ｏ５Ｓｉ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：３６８．１６１８
実測値：                            ３６８．１６２０
【０１０１】
中間体５．４の合成
【化１４】
0006543272.tif 000015
４０ｍＬのｉＣｈｅｍバイアルにおいて、２３℃、１０．３５ｍＬのＤＣＭ中、ヘミケタール５．３（７１６ｍｇ、２．０７ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された溶液に、トリクロロアセトニトリル（１．０４ｍＬ、１０．３５ｍｍｏｌ、５．０当量）及び炭酸セシウム（３３７．２ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、０．５当量）を経時的に添加した。３０分後、反応物を、ヘキサン及び水を含有する分液漏斗中に注いだ。相を分離させ、ヘキサン（３×３０ｍＬ）で水相を抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。ベンゼン（３×１０ｍＬ）によって外部発生の水を共沸除去し、続く反応において、トリクロロアセトイミダート５．４を更なる精製なしで使用した。この生成物は安定していなかったため、それを、形成直後に使用するか、またはベンゼンアルゴンマトリクス中に冷凍して使用するかのいずれかにした。
【化１５】
0006543272.tif 000016
Ｒｆ＝０．９５（０．１％のＥｔ３Ｎ  ＣＡＭ染色を有する１：１のＥｔ２Ｏ／Ｈｅｘ）
【０１０２】
中間体５．６の合成
【化１６】
0006543272.tif 000017
ＡｍＢアグリコン５．５（２．１９ｇ、１．３４ｍｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×１０ｍＬ）で共沸乾燥させ、５００ｍＬの丸底フラスコ中、高真空で一晩放置した。ベンゼン中、溶液として５．５を含有するフラスコに、トリクロロアセトイミダート５．４（９４４ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１．４４当量）を添加し、濃縮した。ヘキサン（７０ｍＬ）を添加し、系をＮ２雰囲気下に置いた後、続けて０℃に冷却した。２−クロロ−６−メチルピリジン（１４７ｍＬ、１．３４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、その後、固体として一度に２−クロロ−６−メチルピリジニウムトリフレート（１８６．０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ、０．５当量）を添加した。８分後、橙色から緑がかった黄色への色変化、及びわずかな沈殿物の形成が観察された。トリフレート塩の添加の３０分後、ヘキサン及び水性重炭酸塩を含有する分液漏斗中に注ぐことによって反応物の反応を停止させた。ヘキサン（２×５０ｍＬ）で水相を抽出し、続く有機層を飽和ブラインで洗浄し、次いで、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出、５：９５のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ〜１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）による精製によって、β−グリコシド５．６とそのオルトエステル（１．２１ｇ、４６％収率）との分離不能な１：１の混合物を、黄色がかった橙色の固体として得た。アセテート基の開裂が単離可能な生成物を提供する続く反応に、この混合物を続けて使用した。
【化１７】
0006543272.tif 000018
Ｒｆ＝０．７３（１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、ＣＡＭ染色）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ６．５２（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．０，１０．５，３．３Ｈｚ，５Ｈ）、６．４６−５．９７（ｍ，３１Ｈ）、５．５３（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３，９．５，３．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．７６−４．５４（ｍ，１１Ｈ）、４．４５（ｔｄ，Ｊ＝１０．５，４．７Ｈｚ，３Ｈ）、４．２９−４．１９（ｍ，４Ｈ）、４．１５（ｓ，３Ｈ）、４．０７−３．９９（ｍ，４Ｈ）、３．９２−３．８３（ｍ，３Ｈ）、３．７７−３．６７（ｍ，４Ｈ）、３．６７−３．５９（ｍ，４Ｈ）、３．１５（ｓ，３Ｈ）、３．０７（ｓ，４Ｈ）、２．６８−２．５２（ｍ，５Ｈ）、２．４４（ｑ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．２４（ｓ，３Ｈ）、２．１３−１．９８（ｍ，１５０Ｈ）、１．９８−１．５９（ｍ，３９Ｈ）、１．５２（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，３Ｈ）、１．２８（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，３Ｈ）、１．２５（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，７Ｈ）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，８Ｈ）、１．１３−０．９１（ｍ，１９１Ｈ）、０．９１−０．８２（ｍ，５Ｈ）、０．８１−０．５６（ｍ，１１２Ｈ）、０．２２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，７Ｈ）、０．１６（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，７Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ：（１２６ＭＨｚ、アセトン）δ１７２．８９、１３９．３３、１３５．５０、１３４．８９、１３３．８５、１３３．６９、１３３．０６、１３２．８１、１３２．７６、１３１．６４、１３０．３１、１２９．８３、１１９．３４、１１９．０４、１０１．５５、９８．５２、７７．２０、７６．９３、７５．９２、７４．２８、７４．２０、７２．９７、７１．３５、７０．５０、６９．６３、６９．２７、６８．９３、６７．７１、６７．１１、６６．２７、６６．１７、５８．１７、４８．３３、４８．２６、４３．７２、４１．４９、３２．５１、３０．５１、３０．３５、３０．２０、３０．０５、２９．８９、２９．７４、２９．６６、２９．５８、２７．７４、２６．４６、２６．３８、２４．３７、２１．１２、２０．１８、１９．５３、１８．８８、１８．８１、１８．７５、１８．７３、１４．５８、１１．３３、７．９１、７．８８、７．８７、７．７５、７．６９、７．５６、７．５４、７．４８、７．３８、７．３７、６．６８、６．６５、６．４１、６．１３、６．０８、６．０４、６．０２、５．９６、５．９０、５．８６、１．３３、−３．８３、−３．８６、−４．０１、−４．０４。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ１０１Ｈ１９１Ｎ３Ｏ１８Ｓｉ８（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１９８１．２１７５
実測値：３０００                          １９８１．２１６９
【０１０３】
中間体５．７の合成
【化１８】
0006543272.tif 000019
２００ｍＬの丸底フラスコにおいて、０℃、ＴＨＦ：ＭｅＯＨ（５１ｍＬ：５１ｍＬ）中、５．６と対応するオルトエステルとの１：１の混合物としての混合物（１．０１ｇ、０．５１５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された溶液に、Ｋ２ＯＣ３（２．８５ｇ、２０．６ｍｍｏｌ、４０．０当量）を添加した。０℃で２．５時間撹拌した後、反応物を２３℃まで温め、更に１．５時間撹拌した。次いで、飽和ブライン及びヘキサンを含有する分液漏斗に移動させることによって反応物をワークアップした。飽和水性重炭酸塩、その後、脱イオン水、飽和ブラインで合わせた有機相を洗浄し、次いで、それらを硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（勾配溶出、５：９５のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、均一濃度）による精製によって、純粋ペルシリル−Ｃ４１アリル−Ｃ２’ｅｐｉＯＨ−メチルケタール−アジドＡｍＢ５．７（３３３ｍｇ、０．１７４ｍｍｏｌ、０．２５７５ｍｍｏｌに基づいて６８％）を橙色〜黄色の固体として得た。
【化１９】
0006543272.tif 000020
Ｒｆ＝０．６２（１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ、ＣＡＭ染色）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ６．５７−５．９７（ｍ，１４Ｈ）、４．７４−４．５９（ｍ，３Ｈ）、４．４３（ｑ，Ｊ＝６．２，５．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．３８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．２１（ｓ，１Ｈ）、４．０５（ｑｄ，Ｊ＝８．１，７．６，４．８Ｈｚ，３Ｈ）、３．７１（ｄｔ，Ｊ＝６．５，４．５Ｈｚ，１Ｈ）、３．６４（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，４．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．３５（ｄｄｔ，Ｊ＝１０．３，４．１，２．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．２８（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．１５（ｓ，３Ｈ）、３．０８（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．６３−２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，１Ｈ）、１．９９−１．６９（ｍ，１４Ｈ）、１．６９−１．５７（ｍ，５Ｈ）、１．５７−１．４６（ｍ，３Ｈ）、１．４０−１．２３（ｍ，３３Ｈ）、１．２３−１．０９（ｍ，１０Ｈ）、１．０９−０．９１（ｍ，９０Ｈ）、０．９１−０．８２（ｍ，２９Ｈ）、０．８０−０．５５（ｍ，４８Ｈ）、０．２１（ｓ，３Ｈ）、０．１４（ｓ，３Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ：（１２６ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ１７２．８１、１６９．９１、１３４．７６、１３４．１７、１３３．３２、１３２．８１、１３２．４８、１３２．００、１３１．８０、１３１．６９、１３０．７３、１３０．０６、１２９．８８、１１８．４１、１０１．８２、１００．７７、７６．５８、７６．０７、７５．１４、７３．９０、７３．４０、７２．９６、７０．９４、７０．４７、６８．４１、６６．８７、６６．７１、６５．５３、５９．８７、５６．８５、４７．５２、４３．６５、４２．８３、４０．７０、３６．８３、３６．２１、３４．６０、３１．６６、２９．６５、２８．７３、２６．８７、２５．６６、２５．５２、２５．１５、２２．６４、２０．２６、２０．１７、１９．３１、１８．３７、１８．１０、１８．０７、１３．８５、１３．７１、１１．０４、１０．５６、７．０３、７．０１、６．８９、６．７７、６．７０、６．６７、６．５３、５．７７、５．７１、５．５５、５．２９、５．２７、５．２４、５．２１、５．１７、５．０２、−４．５３、−４．７３．
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ９９Ｈ１８９Ｎ３Ｏ１７Ｓｉ８（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１９３９．２０６９
実測値：                              １９３９．２１２６
【０１０４】
中間体５．８の合成
【化２０】
0006543272.tif 000021
５０ｍＬのＴｅｆｌｏｎバイアルにおいて、０℃、ＭｅＯＨ２５０μＬ中、ピリジン（５ｍＬ、６２ｍｍｏｌ、３５１当量）の撹拌された溶液に、ＨＦ−ピリジン７０％複合体（１．０４ｍＬ、３２８当量）を滴加した。この溶液に、カニューレを介して、ＴＨＦ中、溶液（１．５ｍＬ）として５．７（３３３ｍｇ、１７４μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。５．７を含有するバイアルをＴＨＦ（３×５００μＬ）で洗浄して、材料の定量的移動を確保した。次いで、反応物を２３℃まで温め、１８時間撹拌した。次いで、反応物を０℃に冷却し、ＭｅＯＳｉＭｅ３（全体過剰）の緩徐な添加によって反応を停止させ、次いで、２３℃まで温め、１時間撹拌した。次いで、反応物を減圧下で濃縮し、ベンゼン（３×１５ｍＬ）によってピリジンを共沸除去した。分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８ＳｉＯ２、５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、２０分間にわたり２５ｍＬ／分）による精製によって、Ｃ４１アリル−Ｃ２’ｅｐｉＯＨ−メチルケタール−アジドＡｍＢ５．８（４８．６ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、２７％収率）を黄色の鱗状固体として得た。余分なシリル基が残る材料もまた回収した（１１１ｍｇ）。この材料を、類似の反応条件に再度供した（完全にシリル化した５．７を分子量として想定：ピリジン５８５μＬ、７．２５ｍｍｏｌ、１２５当量；ＨＦ−ｐｙｒ７０％、３４５μＬ、１９ｍｍｏｌ、３２８当量；１．２ｍＬ：０．２ｍＬのＴＨＦ：ＭｅＯＨ）。第２のサイクル及びＨＰＬＣ精製が、５．８（１５２．６ｍｇ、１５２μｍｏｌ、８８％の合計収率）を黄色の鱗状固体としてもたらした。
【化２１】
0006543272.tif 000022
Ｒｆ＝１５．６８分間（Ｃ１８ＳｉＯ２分析的ＨＰＬＣ、５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、２０分間にわたり１ｍＬ／分）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ６．５５−６．１５（ｍ，２３Ｈ）、６．０６−５．８９（ｍ，３Ｈ）、５．５４−５．４６（ｍ，２Ｈ）、５．４１（ｄｑ，Ｊ＝１７．３，１．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．３８−５．３１（ｍ，１Ｈ）、５．２４（ｄｑ，Ｊ＝１０．５，１．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．７６−４．６１（ｍ，８Ｈ）、４．３６−４．３２（ｍ，１Ｈ）、４．３２−４．１５（ｍ，４Ｈ）、４．１５−４．０５（ｍ，５Ｈ）、３．９７（ｄｔ，Ｊ＝１９．０，４．２Ｈｚ，３Ｈ）、３．９１−３．８４（ｍ，２Ｈ）、３．８４−３．７１（ｍ，５Ｈ）、３．６４−３．４９（ｍ，１２Ｈ）、３．４４−３．２６（ｍ，９Ｈ）、３．２２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，７Ｈ）、３．０１（ｔｄ，Ｊ＝９．０，５．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．４９−２．２０（ｍ，８Ｈ）、２．１７−２．０８（ｍ，３Ｈ）、２．０４−１．７２（ｍ，１３Ｈ）、１．７１−１．５３（ｍ，１６Ｈ）、１．５３−１．３９（ｍ，１２Ｈ）、１．２１（ｑｄ，Ｊ＝７．２，６．４，３．１Ｈｚ，１２Ｈ）、１．１２（ｄｄ，Ｊ＝６．９，３．７Ｈｚ，６Ｈ）、１．０２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，６Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ：（１２６ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ１７２．９２、１７２．３０、１３７．６０、１３６．９１、１３５．０４、１３４．９８、１３４．３５、１３３．８９、１３３．８２、１３３．７６、１３３．６８、１３３．３６、１３３．１８、１３２．７９、１３１．２４、１１８．４６、１０４．３９、１０２．５４、１０２．５１、７８．８１、７７．９０、７６．００、７５．２４、７５．１７、７３．９９、７３．５４、７２．９１、７１．１４、７０．６３、６９．４７、６８．６６、６８．３０、６７．４９、６７．１８、６７．０６、６５．９４、６２．５７、６２．３６、５６．４５、４８．６８、４４．４９、４３．６０、４２．７４、４２．４３、４１．３８、３８．４６、３６．８２、３３．０３、３１．７９、３０．６６、３０．６３、３０．４０、３０．３１、３０．２５、３０．２３、３０．１９、３０．０９、３０．０７、３０．０１、２７．２１、２４．２４、１８．９７、１８．２０、１７．５２、１２．４６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ５１Ｈ７７Ｎ３Ｏ１７（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１０２６．５１５１
実測値：                          １０２６．５１１５
【０１０５】
中間体５．９の合成
【化２２】
0006543272.tif 000023
中間体５．８（１０４ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×２ｍＬ）で共沸乾燥させ、２０ｍＬのｉＣｈｅｍバイアル中、高真空に一晩置いた。グローブボックス中、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３５．９ｍｇ、０．０３１０５ｍｍｏｌ、３０ｍｏｌ％）及びチオサリチル酸（７９．８ｍｇ、０．５１７ｍｍｏｌ、５．０当量）を添加し、その後ＤＭＦ（３．５ｍＬ）を添加し、Ａｒ雰囲気下で密閉し、２３℃で１時間撹拌した。反応物を、急速に撹拌するＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）中に液滴で移動させた。ｋｉｍ−ｗｉｐｅ（商標）の一小片をフィルタとして含有する５インチのピペットを通して沈殿物を濾過した。次いで、濾過ケーキを追加のＥｔ２Ｏで洗浄し、次いで、ＤＭＳＯによってフィルタを通して溶出させた。最少のＤＭＳＯによってフィルタを更に洗浄した。合わせたＤＭＳＯ分画を凍結乾燥させて、５．９（６８．９ｍｇ、０．７１４ｍｍｏｌ、６９％）を黄色の粉末もたらし、追加の精製なしで次の反応に使用した。分析的ＨＰＬＣによって、単一ピークへの完全変換を観察した。
【化２３】
0006543272.tif 000024
Ｒｆ＝１８．７分間（Ｃ１８ＳｉＯ２分析的ＨＰＬＣ、０．１％のギ酸を有する５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、２０分間にわたり１ｍＬ／分）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ４８Ｈ７３Ｎ３Ｏ１７（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：９８６．４８３８
実測値：                          ９８６．４８２５
【０１０６】
中間体５．１０の合成
【化２４】
0006543272.tif 000025
７ｍＬのバイアルにおいて、２３℃、ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（１．５９ｍＬ：０．８ｍＬ、２：１）中、５．９（６８．９ｍｇ、０．０７１５ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された溶液に、ＣＳＡ（４．５ｍｇ、０．０１７８ｍｍｏｌ、０．２５当量）を添加し、２時間撹拌した。水性飽和重炭酸塩（０．５ｍＬ）を添加し、次いで、ＨＰＬＣフィルタを通して濾過し、その後、分取逆相ＨＰＬＣ精製（Ｃ１８ＳｉＯ２、０．１％のギ酸を有する５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、２５分間、２５ｍＬ／分）をし、５．１０（３０．８ｍｇ、３２．２μｍｏｌ、４５％）を黄色の粉末としてもたらした。
【化２５】
0006543272.tif 000026
Ｒｆ＝１９．３分間（Ｃ１８ＳｉＯ２分析的ＨＰＬＣ、５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ、２０分間にわたり１ｍＬ／分）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ４７Ｈ７１Ｎ３Ｏ１７（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：９７２．４６８１
実測値：                          ９７２．４６６１
【０１０７】
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの合成
【化２６】
0006543272.tif 000027
７ｍＬのバイアルにおいて、２３℃、Ａｒ雰囲気下、ＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）及びＨ２Ｏ（５８μＬ、１００当量）中、５．１０（３０．８ｍｇ、３２．２μｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された溶液に、ＴＨＦ（９７μＬ、９７．０μｍｏｌ、３．０当量）中１．０Ｍ溶液としてＰＭｅ３を添加し、次いで、５５℃まで６時間温めた。次いで、反応物を減圧下で濃縮し、その後、分取逆相ＨＰＬＣ精製（Ｃ１８ＳｉＯ２、５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：ＮＨ４ＯＡｃ（１５ｍＭ）、２５ｍＬ／分で２０分間）をし、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ（１１．２ｍｇ、１７．２μｍｏｌ、５４％）を黄色の粉末としてもたらした。
【化２７】
0006543272.tif 000028
Ｒｆ＝１１．１７分間（Ｃ１８ＳｉＯ２分析的ＨＰＬＣ、５：９５〜９５：５のＭｅＣＮ：ＮＨ４ＯＡｃ（５ｍＭ）、２０分間にわたり１ｍＬ／分）
吸光係数：９２，０００ｃｍ２／ｍｏｌ
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｓ（Ｏ）ＣＤ３）δ６．５５−６．０３（ｍ，１０Ｈ）、５．９７（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，８．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ）、５．４４（ｄｄ，Ｊ＝１５．０，１０．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．３４（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．８９−４．７１（ｍ，３Ｈ）、４．６２（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．４１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．３９−４．３０（ｍ，２Ｈ）、４．２５（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．０６（ｓ，１Ｈ）、３．９１（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．４９（ｄ，Ｊ＝３１．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．１７−３．０４（ｍ，２Ｈ）、３．０４−２．８４（ｍ，２Ｈ）、２．６６（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．４０（ｓ，１Ｈ）、２．２８（ｄｄ，Ｊ＝１４．６，７．５Ｈｚ，１Ｈ）、２．１７（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．０５−１．６８（ｍ，５Ｈ）、１．６５−１．４７（ｍ，５Ｈ）、１．４７−１．２９（ｍ，７Ｈ）、１．２４（ｑ，Ｊ＝５．６，４．６Ｈｚ，６Ｈ）、１．２０−１．０８（ｍ，６Ｈ）、１．０４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）、０．９１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）、０．８６（ｔｄ，Ｊ＝７．１，４．２Ｈｚ，１Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ４７Ｈ７３ＮＯ１７（Ｍ＋Ｈ）＋に対する計算値：９２４．４９５７
実測値：                        ９２４．４９６０
【０１０８】
中間体５．１１の合成
【化２８】
0006543272.tif 000029
３００ｍＬの丸底において、２３℃、ＤＭＦ：ＭｅＯＨ（７５ｍＬ：７５ｍＬ）中、ＡｍＢ（４．０ｇ、４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された懸濁液に、ピリジン（５．０ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ、１１．５当量）、及びアロック−スクシンイミド（２．４ｇ、１２．０５ｍｍｏｌ、２．８当量）を経時的に添加した。２３℃で１６時間撹拌した後、暗橙色の均質な溶液を、急速に撹拌するＥｔ２Ｏ（３．５Ｌ）中に緩徐に注いだ。黄色の懸濁液を、Ｗｈａｔｍａｎ（商標）４２濾紙を通して濾過し、Ｅｔ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で洗浄してから、ケーキを完全に乾燥させた。完全に乾燥したアロック−ＡｍＢの黄色の粉末（４．３ｍｍｏｌ、定量）を、追加の精製なしで続く反応に使用した。
３００ｍＬの丸底フラスコにおいて、２３℃、ＭｅＯＨ（３５ｍＬ、０．１Ｍ）中、アロック−ＡｍＢ（４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された懸濁液に、アニスアルデヒドジメチルアセタール（４．０ｍＬ、２３．５ｍｍｏｌ、５．５当量）を添加し、非常に微細な均一な懸濁液が形成されるまで１０分間撹拌した。次いで、白色結晶固体としてのＣＳＡ（２５０ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ、０．２５当量）を一度に添加した。２３℃で３０分間撹拌した後、Ｅｔ３Ｎ（約１６０μＬ）を添加し、その後、ＴＨＦ（８１ｍＬから、０．０３Ｍまで希釈）を添加した。反応物を、急速に撹拌するヘキサン（３．５Ｌ）中に緩徐に注いだ。続く黄色の懸濁液を、Ｗｈａｔｍａｎ４２濾紙を通して濾過し、Ｅｔ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で洗浄してから、ケーキを完全に乾燥させた。完全に乾燥したアロック−ビスＰＭＰ−メチルケタール（４．３ｍｍｏｌ、定量）を、追加の精製なしで黄色の粉末として続く反応に使用した。
３００ｍＬの丸底において、２３℃、ＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１０：１）中、アロック−ビスＰＭＰ−メチルケタール（４．０ｇ、４．３ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌された懸濁液に、ヒューニッヒ塩基（３．７５ｍＬ、２１．５ｍｍｏｌ、５．０当量）及び臭化アリル（１１．２ｍＬ、１２９．０ｍｍｏｌ、３０当量）を経時的に添加した。２３℃で８時間撹拌した後、暗橙色の均質な溶液を、ＥｔＯＡｃ及び脱イオンＨ２Ｏ（１：１）を含有する分液漏斗中に移動させた。有機相を水（３×２００ｍＬ）で洗浄し、その後、ブラインで洗浄した。合わせた水相を、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相を飽和ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出、５０：４９：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ：ＭｅＯＨ〜７５：２４：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ：ＭｅＯＨ）による濾過によって、５．１２（２．８３ｇ、２．１９ｍｍｏｌ、５１％）を橙色の個体として得た。
【化２９】
0006543272.tif 000030
Ｒｆ＝０．２１（５０：４９：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ：ＭｅＯＨ）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ７．４３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）、７．３８−７．３３（ｍ，２Ｈ）、６．９０−６．８２（ｍ，４Ｈ）、６．４８−６．１８（ｍ，１１Ｈ）、６．０５−５．８４（ｍ，３Ｈ）、５．５９（ｄｄ，Ｊ＝１４．３，９．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．５２（ｓ，１Ｈ）、５．４６（ｓ，１Ｈ）、５．４５−５．３８（ｍ，１Ｈ）、５．２８−５．２２（ｍ，１Ｈ）、４．７１−４．６２（ｍ，３Ｈ）、４．６０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．５３（ｑ，Ｊ＝７．２，４．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．１７（ｔｔ，Ｊ＝１０．４，６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．９５（ｄｄ，Ｊ＝９．９，６．９Ｈｚ，３Ｈ）、３．７９（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，７Ｈ）、３．７７−３．６６（ｍ，３Ｈ）、３．６１（ｔｄ，Ｊ＝９．０，３．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．３９（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．３３（ｑ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，３Ｈ）、３．０８（ｓ，２Ｈ）、２．３６−２．２５（ｍ，３Ｈ）、１．９６−１．８８（ｍ，２Ｈ）、１．８８−１．７８（ｍ，３Ｈ）、１．７３（ｄｔ，Ｊ＝１６．４，８．１Ｈｚ，３Ｈ）、１．６９−１．４２（ｍ，８Ｈ）、１．４１−１．２１（ｍ，２８Ｈ）、１．１９（ｐ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ）、１．１３−１．０８（ｍ，５Ｈ）、１．０２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，４Ｈ）、０．９５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）、０．８７（ｄｔ，Ｊ＝１２．０，７．０Ｈｚ，２２Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ７１Ｈ９５ＮＯ２１（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１３２０．６２９４
実測値：                          １３２０．６２８５
【０１０９】
中間体５．１２の合成
【化３０】
0006543272.tif 000031
中間体５．１１（２．８３ｇ、２．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×１０ｍＬ）で共沸乾燥させ、３００ｍＬの丸底フラスコ中、高真空に一晩置いた。中間体５．１１にＴＨＦ（７４ｍＬ）を添加し、その後、ＤＩＰＥＡ（０．６１ｍＬ、３．４９ｍｍｏｌ、１．６当量）を添加した。別個の２００ｍＬの丸底フラスコに、ＴＨＦ（４６ｍＬ）、ＤＭＡＰ（４２６ｍｇ、３．４９ｍｍｏｌ、１．６当量）、及び滴下でｐ−ｔｅｒｔブチルベンゾイルクロリド（５９５μＬ、３．０５ｍｍｏｌ、１．４当量）を経時的に添加し、微細な白色の懸濁液を形成した。この懸濁液のほとんどを、ＴＬＣによって判断される、開始材料の大部分が変換されるまで、カニューレを介して、ＴＨＦ、ＤＩＰＥＡ、及び５．１１溶液に５０分間かけて緩徐に滴加した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、水性飽和重炭酸ナトリウムを含有する分液漏斗に移動させ、ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出剤、６５：３３：２のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ：ＭｅＯＨ、均一濃度）による精製によって、５．１１（９３０ｇ、０．６５４ｍｍｏｌ、３０％収率）を橙色の固体として得た。
【化３１】
0006543272.tif 000032
Ｒｆ＝０．２４（６５：３３：２のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ：ＭｅＯＨ）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ８．０７−７．８９（ｍ，２Ｈ）、７．６４−７．４８（ｍ，２Ｈ）、７．３８（ｄｄｔ，Ｊ＝２５．４，８．０，２．２Ｈｚ，４Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，４．６，２．４Ｈｚ，４Ｈ）、６．４６−６．１１（ｍ，１０Ｈ）、６．１０−５．９６（ｍ，３Ｈ）、５．９６−５．８２（ｍ，３Ｈ）、５．８２−５．６５（ｍ，１Ｈ）、５．５８（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ）、５．５２−５．３８（ｍ，２Ｈ）、５．３３−５．１８（ｍ，１Ｈ）、５．１１（ｔｄ，Ｊ＝９．２，７．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．８８（ｓ，０Ｈ）、４．７３−４．５６（ｍ，２Ｈ）、４．４９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．２４−４．１０（ｍ，１Ｈ）、４．０１−３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．８２−３．７５（ｍ，４Ｈ）、３．７５−３．６３（ｍ，１Ｈ）、３．５９（ｔｄ，Ｊ＝９．６，６．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．５６−３．４６（ｍ，１Ｈ）、３．４５−３．３４（ｍ，１Ｈ）、２．８５（ｓ，１Ｈ）、２．６０（ｓ，１Ｈ）、２．４５−２．３５（ｍ，１Ｈ）、２．３５−２．２３（ｍ，１Ｈ）、２．０２−１．９４（ｍ，１Ｈ）、１．９１−１．８２（ｍ，１Ｈ）、１．８０−１．４０（ｍ，６Ｈ）、１．３６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，８Ｈ）、１．３２−１．２６（ｍ，３Ｈ）、１．２２−１．１５（ｍ，２Ｈ）、１．１２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ）、１．０１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ８２Ｈ１０７ＮＯ２２（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１４８０．７１８２
実測値：                          １４８０．７１７２
【０１１０】
中間体５．１３の合成
【化３２】
0006543272.tif 000033
中間体５．１２（９１０ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×１０ｍＬ）で共沸乾燥させ、３００ｍＬの丸底フラスコ中、高真空に一晩置いた。中間体５．１３にＤＣＭ（１０．５ｍＬ）及びヘキサン（１０．５ｍＬ）を添加し、その後、新たに蒸留した２，６−ルチジン（６５４μＬ、５．６１ｍｍｏｌ、９．１当量）を添加し、０℃に冷却した。ＤＥＩＰＳＯＴｆ（７４３μＬ、３．７４ｍｍｏｌ、６．０当量）を１０分間かけて滴加し、更に１時間撹拌した。反応物を、Ｅｔ２Ｏ及び水性飽和重炭酸塩を含有する分液漏斗に移動させ、Ｅｔ２Ｏで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出剤、１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ〜１：４のＥｔＯＡｘ：Ｈｅｘ）による精製によって、５．１３（９８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、８０％収率）を橙色の固体として得た。
【化３３】
0006543272.tif 000034
Ｒｆ＝０．２１（１：４のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ８．０７−７．９５（ｍ，２Ｈ）、７．６５−７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．３７−７．３１（ｍ，４Ｈ）、６．９４−６．８１（ｍ，６Ｈ）、６．４１−６．３２（ｍ，５Ｈ）、６．３２−６．２４（ｍ，３Ｈ）、６．２０−６．１３（ｍ，３Ｈ）、６．１０−５．８４（ｍ，４Ｈ）、５．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝２１．６、１５．２，６．４Ｈｚ，２Ｈ）、５．５２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．４５（ｑ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，０Ｈ）、５．４１（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，３Ｈ）、５．３４（ｄｔ，Ｊ＝１０．３、１．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．２７（ｄｑ，Ｊ＝１７．３，１．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１３（ｄｑ，Ｊ＝１０．４，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．９１（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）、４．７５（ｓ，１Ｈ）、４．７１−４．６２（ｍ，２Ｈ）、４．６２−４．５５（ｍ，２Ｈ）、４．５２（ｄｔ，Ｊ＝５．６，１．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．３３−４．２５（ｍ，１Ｈ）、４．１９−４．０８（ｍ，１Ｈ）、４．０７−３．９４（ｍ，１Ｈ）、３．９３−３．８１（ｍ，３Ｈ）、３．８１−３．７３（ｍ，１０Ｈ）、３．７２−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．５１（ｄｑ，Ｊ＝８．８，６．１Ｈｚ，１Ｈ）、２．７５（ｓ，３Ｈ）、２．５３−２．３９（ｍ，２Ｈ）、２．２７（ｄｄ，Ｊ＝１７．７，４．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．２３−２．１１（ｍ，２Ｈ）、２．０９（ｓ，７Ｈ）、１．９９−１．９４（ｍ，１Ｈ）、１．８９（ｄｄｔ，Ｊ＝１２．５，８．０，３．９Ｈｚ，１Ｈ）、１．７８−１．５６（ｍ，５Ｈ）、１．５６−１．４１（ｍ，４Ｈ）、１．３７（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１４Ｈ）、１．３２−１．２１（ｍ，６Ｈ）、１．２１−１．１１（ｍ，７Ｈ）、１．０９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）、１．０７−０．７６（ｍ，７９Ｈ）、０．７６−０．６５（ｍ，１２Ｈ）、０．６１−０．４９（ｍ，７Ｈ）、０．４３（ｄｑｄ，Ｊ＝１４．１，７．９，１．７Ｈｚ，５Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ：（１２６ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ１７２．６０、１７０．０１、１６６．２８、１６０．９３、１６０．８０、１５７．４８、１５７．０１、１３８．６６、１３５．１７、１３４．９３、１３４．６６、１３４．４０、１３４．２７、１３４．０１、１３３．６７、１３３．０５、１３２．９２、１３２．７９、１３２．２９、１３１．２６、１３０．９３、１３０．９０、１２９．２９、１２９．１２、１２８．８７、１２８．４７、１２７．２４、１２６．２８、１１９．４３、１１７．２８、１１４．０９、１１４．０８、１１３．９９、１０２．０２、１０１．１８、１００．７８、９６．７３、８１．５７、７５．８９、７５．０３、７４．９７、７４．１７、７３．１４、７３．０２、７２．９８、６８．９２、６６．８２、６５．９５、６５．８４、５８．５６、５７．０１、５５．６８、４８．５８、４３．９９、４２．９１、４１．２９、３８．０８、３６．９０、３５．９０、３３．７５、３２．９７、３１．６４、３０．７７、２８．１４、１９．２７、１８．２４、１８．１９、１８．０７、１８．０１、１７．７０、１７．６８、１４．１９、１４．１７、１４．０３、１３．７６、７．９４、７．９０、７．８２、７．７７、７．７２、７．７１、７．４８、７．３６、５．２１、５．１０、４．９４、４．８９、４．６９、４．４４。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ１１０Ｈ１７１ＮＯ２２（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１９９３．１２６８
実測値：                            １９９３．１１８９
【０１１１】
中間体５．１４の合成
【化３４】
0006543272.tif 000035
中間体５．１３（９８０ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×１０ｍＬ）で共沸させ、４０ｍＬのｉＣｈｅｍ中、高真空に一晩置いた。中間体５．１３にＴＨＦ（６．２ｍＬ）及びＭｅＯＨ（１２．３ｍＬ）を添加し、その後、ＫＣＮ（４８．５ｍｇ、０．７４５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、Ａｒ雰囲気下に置き、４０℃まで温め、７２時間撹拌した。反応物を、Ｅｔ２Ｏ及び水性飽和重炭酸塩を含有する分液漏斗に移動させた。有機相を水で洗浄し、その後、ブラインで洗浄した。合わせた水相を、Ｅｔ２Ｏで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出剤、１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ〜１：４のＥｔＯＡｘ：Ｈｅｘ）による精製によって、５．１４（５４２ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ、６０％収率）を橙色の固体として得た。
【化３５】
0006543272.tif 000036
Ｒｆ＝０．２２（３：７のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ７．４３−７．３０（ｍ，５Ｈ）、６．９２−６．７９（ｍ，５Ｈ）、６．４８−６．１４（ｍ，１２Ｈ）、６．１１（ｄｄ，Ｊ＝１５．０，１０．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．０３−５．８９（ｍ，３Ｈ）、５．８８−５．７３（ｍ，２Ｈ）、５．４３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，３Ｈ）、５．３７（ｄｑ，Ｊ＝２１．８，１．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３３−５．２６（ｍ，２Ｈ）、５．１７（ｄｑ，Ｊ＝１０．６，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．７９（ｓ，１Ｈ）、４．７１−４．４８（ｍ，７Ｈ）、４．２７（ｔｄ，Ｊ＝１０．６，４．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．２１−４．１１（ｍ，１Ｈ）、３．９５−３．８２（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，４Ｈ）、３．７８（ｓ，４Ｈ）、３．７７−３．６３（ｍ，６Ｈ）、３．５４（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．３８−３．２６（ｍ，１Ｈ）、２．４９（ｄｄ，Ｊ＝１７．６，７．６Ｈｚ，１Ｈ）、２．４３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ）、２．３２−２．２４（ｍ，３Ｈ）、１．９６（ｓ，３Ｈ）、１．９４−１．８６（ｍ，２Ｈ）、１．８２−１．６７（ｍ，３Ｈ）、１．６６−１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．５８−１．２７（ｍ，７Ｈ）、１．２６（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ）、１．２３−１．１０（ｍ，８Ｈ）、１．１０−０．８６（ｍ，５８Ｈ）、０．８６−０．７６（ｍ，１５Ｈ）、０．７０（ｔｄｔ，Ｊ＝８．２，４．４，２．９Ｈｚ，１１Ｈ）、０．６３−０．４８（ｍ，５Ｈ）、０．４８−０．３６（ｍ，４Ｈ）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ９９Ｈ１５９ＮＯ２１（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１８３３．０３７９
実測値：                          １８３３．０３５５
【０１１２】
中間体５．１５の合成
【化３６】
0006543272.tif 000037
中間体５．１４（２７１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×１０ｍＬ）で共沸させ、４０ｍＬのｉＣｈｅｍ中、高真空に一晩置いた。中間体５．１４に、ｐ−ニトロ安息香酸（１０３ｍｇ、０．６２１ｍｍｏｌ、４．１５当量）、ＰＰｈ３（１７９ｍｇ、０．６７４ｍｍｏｌ、４．５当量）、及びトルエン（５ｍＬ）を添加した。溶液を０℃に冷却し、ＤＩＡＤ（１３２μＬ、０．６７４ｍｍｏｌ、４．５当量）を滴加し、０℃で１時間撹拌した。次いで、反応物を７０℃まで３時間加熱した。反応物を、Ｅｔ２Ｏ及び水性飽和重炭酸ナトリウムを含有する分液漏斗に移動させた。有機相を水で洗浄し、その後、ブラインで洗浄した。合わせた水相を、Ｅｔ２Ｏで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出剤、１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ〜１：４のＥｔＯＡｘ：Ｈｅｘ）による精製によって、Ｃ２’ｅｐｉニトロベンゾエート５．１５（８０．４ｍｇ、４０．４μｍｏｌ、２７％収率）を橙色の固体として得た。
【化３７】
0006543272.tif 000038
Ｒｆ＝０．２（１：４のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ８．３７（ｓ，４Ｈ）、７．３７−７．３０（ｍ，４Ｈ）、６．８９−６．８１（ｍ，５Ｈ）、６．５０（ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）、６．４５−６．０９（ｍ，１５Ｈ）、６．０７−５．９５（ｍ，１Ｈ）、５．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝１９．１，１４．５，５．８Ｈｚ，２Ｈ）、５．６７（ｄｄｔ，Ｊ＝１７．３，１０．６，５．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．４７−５．３９（ｍ，２Ｈ）、５．３５（ｓ，１Ｈ）、５．３０（ｄｑ，Ｊ＝１０．４，１．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．１５（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，７．９Ｈｚ，１Ｈ）、５．０８（ｄｑ，Ｊ＝１７．２，１．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．９２（ｄｑ，Ｊ＝１０．５，１．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．８２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．７９−４．６９（ｍ，２Ｈ）、４．６１（ｑｄｔ，Ｊ＝１３．１，６．０，１．４Ｈｚ，３Ｈ）、４．３３（ｑｄｔ，Ｊ＝１３．６，５．４，１．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．１８−４．０９（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｔｄ，Ｊ＝１０．６，４．６Ｈｚ，１Ｈ）、３．９０−３．８１（ｍ，３Ｈ）、３．７７（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，８Ｈ）、３．７５−３．６３（ｍ，７Ｈ）、３．５２（ｄｑ，Ｊ＝９．０，６．１Ｈｚ，１Ｈ）、２．６９（ｓ，３Ｈ）、２．５３−２．３９（ｍ，２Ｈ）、２．３４−２．２１（ｍ，１Ｈ）、２．１９−２．０７（ｍ，２Ｈ）、２．０４−１．９８（ｍ，１Ｈ）、１．８８（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１２．９，１０．２，６．６，３．８Ｈｚ，１Ｈ）、１．７９（ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ，１Ｈ）、１．７６−１．６４（ｍ，２Ｈ）、１．６１（ｄｔ，Ｊ＝１３．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ）、１．５６−１．４０（ｍ，５Ｈ）、１．３７−１．２４（ｍ，１４Ｈ）、１．２３−１．１２（ｍ，８Ｈ）、１．１０−０．９５（ｍ，４５Ｈ）、０．９４−０．８４（ｍ，１９Ｈ）、０．８４−０．７６（ｍ，１３Ｈ）、０．７４−０．６０（ｍ，１５Ｈ）、０．５３（ｄｑｄ，Ｊ＝２６．８，７．８，３．２Ｈｚ，５Ｈ）、０．４２−０．２８（ｍ，５Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ：（１２６ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ１７３．００、１７０．０５、１６４．８７、１６０．９３、１６０．７９、１５７．０６、１５１．６７、１３８．０５、１３６．５４、１３４．８７、１３４．７３、１３４．６４、１３４．５６、１３４．４５、１３４．１６、１３３．８２、１３３．６５、１３３．３５、１３２．９１、１３２．７５、１３２．４８、１３２．４０、１３１．８４、１３０．９６、１２８．８６、１２８．４７、１２７．６５、１２４．３９、１１９．５７、１１７．１１、１１４．０７、１１３．９８、１０１．９７、１０１．２１、１００．７１、９８．４７、８１．５３、７６．０９、７６．００、７５．０９、７４．９２、７３．６７、７３．０４、７２．９４、６８．８４、６６．８４、６６．１２、６５．５６、５９．６０、５８．１２、５５．６６、５５．１２、４８．３９、４３．９４、４２．９９、４１．３２、３８．０８、３６．３５、３３．６８、３２．９６、２８．２１、２２．０１、１８．８７、１８．２０、１８．１４、１８．００、１７．９８、１７．９３、１７．６２、１７．６０、１４．１５、１４．１２、１４．０２、１３．６７、７．９０、７．８６、７．７６、７．７３、７．６９、７．６６、７．３６、５．１５、５．０６、４．９３、４．９１、４．８８、４．６３、４．３６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ１０６Ｈ１６２Ｎ２Ｏ２４Ｓｉ４（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１９８２．０４９２
実測値：                              １９８２．０４６４
【０１１３】
中間体５．１６の合成
【化３８】
0006543272.tif 000039
中間体５．１５（８０．４ｇ、４０．４μｍｏｌ、１．０当量）をベンゼン（３×１０ｍＬ）で共沸させ、７ｍＬのｉＣｈｅｍ中、高真空に一晩置いた。中間体５．１５にＴＨＦ（１．０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）を添加し、その後、ＫＣＮ（４．０８ｍｇ、６１．４μｍｏｌ、１．５当量）を添加し、Ａｒ雰囲気下に置き、４０℃まで温め、７２時間撹拌した。反応物を、Ｅｔ２Ｏ及び水性飽和重炭酸塩を含有する分液漏斗に移動させた。有機相を水で洗浄し、その後、ブラインで洗浄した。合わせた水相を、Ｅｔ２Ｏで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、勾配溶出剤、１：９のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ〜１：４のＥｔＯＡｘ：Ｈｅｘ）による精製によって、５．１６（４２．６ｍｇ、２３．４μｍｏｌ、５７％収率）を橙色の固体として得た。
【化３９】
0006543272.tif 000040
Ｒｆ＝０．２（３：７のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）
１Ｈ  ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ７．４３−７．３２（ｍ，４Ｈ）、６．８７（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．９，８．９，２．１Ｈｚ，４Ｈ）、６．４７−６．１５（ｍ，１３Ｈ）、６．１０（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，１０．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．０６−５．８２（ｍ，３Ｈ）、５．７８（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，８．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．４３（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）、５．３６（ｄｔ，Ｊ＝３１．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３１−５．２５（ｍ，１Ｈ）、５．１６（ｄｔ，Ｊ＝１０．７，１．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．８１（ｓ，１Ｈ）、４．６６−４．５５（ｍ，３Ｈ）、４．５１（ｔｄ，Ｊ＝４．９，３．９，１．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．３７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．３３−４．２３（ｍ，１Ｈ）、４．２２−４．１２（ｍ，１Ｈ）、４．０１−３．８２（ｍ，３Ｈ）、３．７９（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，３Ｈ）、３．７８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，３Ｈ）、３．７６−３．６６（ｍ，４Ｈ）、３．４３（ｔｔ，Ｊ＝９．２，３．９Ｈｚ，３Ｈ）、３．３４（ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．０５（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，３Ｈ）、２．４９（ｄｄ，Ｊ＝１７．６，７．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．４６−２．３８（ｍ，１Ｈ）、２．２７（ｄｔ，Ｊ＝１４．３，４．６Ｈｚ，３Ｈ）、２．０９（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，４Ｈ）、２．０１−１．９３（ｍ，１Ｈ）、１．９３−１．８５（ｍ，２Ｈ）、１．８５−１．７７（ｍ，１Ｈ）、１．７３（ｑ，Ｊ＝１０．２，９．４Ｈｚ，１Ｈ）、１．６８−１．３８（ｍ，７Ｈ）、１．３１（ｑ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，５Ｈ）、１．２４（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，４Ｈ）、１．２２−１．１６（ｍ，６Ｈ）、１．１０−０．８６（ｍ，５２Ｈ）、０．８６−０．７５（ｍ，１４Ｈ）、０．６９（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．６，１１．６，８．０，３．８Ｈｚ，１０Ｈ）、０．６３−０．４９（ｍ，４Ｈ）、０．４９−０．３４（ｍ，４Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ：（１２６ＭＨｚ、ＣＤ３Ｃ（Ｏ）ＣＤ３）δ１７３．３７、１７０．１５、１６０．９５、１６０．８１、１５７．３４、１３７．９７、１３４．８７、１３４．８４、１３４．７７、１３４．７４、１３４．３５、１３４．１５、１３３．９６、１３３．７７、１３３．５６、１３３．３６、１３２．９０、１３２．７８、１３２．４２、１３１．０８、１２９．６９、１２８．９０、１２８．５０、１１９．５５、１１７．３０、１１４．０８、１１４．０１、１０３．１２、１０２．０７、１０１．２７、１００．９０、８１．６０、７６．２９、７６．２０、７５．２３、７４．５９、７３．３２、７３．２８、７２．９７、６９．０７、６７．６３、６６．２７、６５．６４、６１．３８、５７．６７、５５．６６、４８．５８、４４．１４、４３．３３、４１．４１、３８．０８、３７．６６、３３．７３、３２．９３、３０．７６、２８．３３、１９．２６、１９．１１、１８．２１、１８．１４、１８．０５、１８．０２、１８．００、１７．６９、１７．６７、１４．１５、１４．０４、１３．７２、７．９０、７．８７、７．８０、７．７８、７．７５、７．７１、７．４７、７．４５、５．１８、５．０６、５．０２、４．９６、４．９０、４．８８、４．６６、４．４３。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）
Ｃ９９Ｈ１５９ＮＯ２１Ｓｉ４（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する計算値：１８３３．０３７９
実測値：                              １８３３．０３０９
【０１１４】
実施例２．Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢはエルゴステロールには結合するが、コレステロールには結合しない
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの結合能力を調査して、Ｃ２’でのエピマー化がエルゴステロールに結合するＡｍＢの能力に影響を与えるのかどうかを決定した。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、図６に示すように、結合アッセイの限界において、エルゴステロールには結合するが、コレステロールには結合しない。
Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢのＩＴＣデータは以下の通りである。
ステロールなし：総発熱量＝−６．７０±０．１１μｃａｌ。
１０％のエルゴステロール：総発熱量＝−１５．２４±１．６６μｃａｌ。
１０％のコレステロール：総発熱量＝−６．４３±２．８０μｃａｌ。
結合アッセイを行う例示的方法を、以下に説明する。
【０１１５】
等温滴定熱量測（ＩＴＣ）
最適化された等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）に基づくアッセイにおいて、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）のみで構成される大単層小胞（ＬＵＶ）の懸濁液でＡｍＢの水溶液を滴定し、正味発熱量を記録した。１０％のエルゴステロールを含有するＰＯＰＣ  ＬＵＶを使用して、滴定を繰り返した。エルゴステロール含有ＬＵＶに切り替えたとき、正味発熱量における有意な増加が観察され、これは、直接的ＡｍＢステロール結合相互作用を示した。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢを使用して、滴定を繰り返した。正味発熱量における有意な増加は、エピマー誘導体がエルゴステロールに結合する能力の保持を示した。ＩＴＣアッセイを、エルゴステロールの代わりにコレステロールでも行った。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、コレステロールに結合することは見出されなかった。
【０１１６】
一般的情報
実験は、ＮａｎｏＩＴＣ等温滴定熱量計（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して実行した。試験される化合物の溶液は、ＤＭＳＯ中、化合物の６０．０ｍＭのストック溶液を、Ｋ緩衝剤で６００μＭに希釈する（５．０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．４）ことによって調製した。溶液中の最終ＤＭＳＯ濃度は、１％ｖ／ｖであった。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ  ＬＵＶ）のみで構成される大単層小胞を調製し、リン及びエルゴステロール含有量を以下に説明するように定量化した。ＬＵＶ溶液を緩衝剤及びＤＭＳＯで希釈し、１％のＤＭＳＯ／Ｋ緩衝剤溶液中、１２．０ｍＭの最終リン脂質濃度を得た。使用直前に、全ての溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、３７℃、真空下で１０分間脱気した。機器（体積＝０．１９０ｍＬ）の基準セルに、１ｖ／ｖ％のＤＭＳＯ／Ｋ緩衝剤の溶液を充填した。
【０１１７】
ＬＵＶ調製
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から、ＣＨＣｌ３中、２０ｍｇ／ｍＬ溶液として得、乾燥アルゴン雰囲気下、−２０℃で貯蔵し、１ヶ月以内に使用した。ＣＨＣｌ３中、エルゴステロールの４ｍｇ／ｍＬ溶液を毎月調製し、乾燥アルゴン雰囲気下、４℃で貯蔵した。脂質薄膜の調製前、溶液を周囲温度まで温めて、凝結が溶液に混入するのを予防した。１３×１００ｍｍの試験管に、８００μＬのＰＯＰＣ及び２３０μＬのエルゴステロール溶液を充填した。コレステロール含有リポソームについては、１３×１００ｍｍの試験管に、８００μＬのＰＯＰＣ及び２２４μＬのエルゴステロール溶液を充填した。ステロールを含有しないリポソームについては、１３×１００ｍｍの試験管に、８００μＬのＰＯＰＣを充填した。穏やかな窒素流によって溶媒を除去し、得られた脂質薄膜を、高真空下、使用前に最低８時間貯蔵した。次いで、薄膜を１ｍＬのＫ緩衝剤で水和し、約３分間勢いよくボルテックスして、多層小胞の懸濁液を形成した。得られた脂質懸濁液をＨａｍｉｌｔｏｎ（Ｒｅｎｏ，ＮＶ）の１ｍＬの気密シリンジへと引き、シリンジをＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ内に置いた。次いで、脂質溶液を０．２０μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）ポリカーボネートフィルタに２１回通過させ、ＬＵＶ溶液中へのＭＬＶのキャリーオーバーを予防するため、元のＭＬＶ懸濁液を含有しないシリンジ内に、新たに形成された大単層小胞（ＬＵＶ）懸濁液を回収した。
【０１１８】
リン含有量の決定
総リン量の決定を、Ｃｈｅｎ及び共同研究者らの報告から適合した。Ｃｈｅｎ，ＰＳ  ｅｔ  ａｌ．（１９５６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：１７５６。ＬＵＶ溶液をＫ緩衝剤で１０倍に希釈し、希釈したＬＵＶ懸濁液の３つの１０μＬ試料を３つの別個の７ｍＬバイアルに添加した。続いて、Ｎ２流によって溶媒を除去した。それぞれの乾燥したＬＵＶ薄膜、及びブランクとして使用した脂質を含有しないバイアルに、４５０μＬの８．９ＭのＨ２ＳＯ４を添加した。４つの試料を、２２５℃のアルミニウム加熱ブロック中、周囲雰囲気に開放して２５分間インキュベートし、次いで２３℃へと除去し、５分間冷却した。冷却後、１５０μＬの３０ｗ／ｖ％の水性過酸化水素を各試料に添加し、バイアルを２２５℃の加熱ブロックに３０分間戻した。次いで、試料を２３℃へと除去し、５分間冷却してから、３．９ｍＬの水を添加した。次いで、５００μＬの２．５ｗ／ｖ％のモリブデン酸アンモニウムを各バイアルに添加し、次いで、得られた混合物を手早くかつ勢いよく５回ボルテックスした。続いて、５００μＬの１０ｗ／ｖ％のアスコルビン酸を各バイアルに添加し、次いで、得られた混合物を手早くかつ勢いよく５回ボルテックスした。バイアルにＰＴＦＥスクリューキャップで封をし、次いで、１００℃のアルミニウム加熱ブロック内に７分間置いた。試料を２３℃へと除去し、紫外／可視分光法による分析前に約１５分間冷却した。８２０ｎｍでの吸光度を観察し、この値を、この方法及び既知の濃度の標準リン溶液を通して得られる標準曲線と比較することによって、総リン量を決定した。
【０１１９】
エルゴステロール含有量の決定
エルゴステロール含有量を分光光度的に決定した。ＬＵＶ懸濁液の５０μＬ部分を、４５０μＬの２：１８：９のヘキサン：イソプロパノール：水（ｖ／ｖ／ｖ）に添加した。３つの独立した試料を調製し、次いで、約１分間勢いよくボルテックスした。次いで、紫外／可視分光法によって溶液を分析し、２８２ｎｍの紫外最大での１０４００Ｌのｍｏｌ−１ｃｍ−１の吸光係数によって、溶液中のエルゴステロールの濃度を決定し、リンの濃度と比較して、ステロール含有量パーセントを決定した。上記の三元溶媒系において、吸光係数を独立して決定した。この方法によって調製されたＬＵＶは、７〜１４％のエルゴステロールを含有した。
【０１２０】
滴定実験
周囲温度のＬＵＶ懸濁液を、２５℃の当化合物の６００μＭ溶液を含有する試料細胞（体積＝０．１９１ｍＬ）中に注射することによって、滴定を実行した。第１の注射の体積は、０．２３μＬであった。標準手順（Ｈｅｅｒｋｌｏｔｚ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１５０８：６９）と一貫し、ＩＴＣ実験の第１の注射と一般的に関連付けられる大きな誤差のため、この注射の熱は、データの分析に含めなかった。次に、ＬＵＶ懸濁液の６回の７．４９μＬの注射を実行した。各注射間の間隔は、次の注射がなされる前に機器が安定したベースラインに戻ることを確保するために、７２０秒間であった。各実験の撹拌速度は、３００ｒｐｍであった。
【０１２１】
データ分析
ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅソフトウェア（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ベースライン決定及び注射熱の積分をし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して、希釈熱の減算及び発生した全体熱の計算をした。希釈熱及び混合熱を補正するために、各実行の最終注射の熱を、その特定の実験の全ての注射熱から減算した。例えば、ｔｅ  Ｗｅｌｓｃｈｅｒ，ＹＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：６３９３を参照されたい。この方法により、実験中に発生した全体熱を、以下の式を使用して計算した。
【数１】
0006543272.tif 000041
式中、ｉ＝注射数、ｎ＝注射の総数、 
【数２】
0006543272.tif 000042
【数３】
0006543272.tif 000043
【０１２２】
実施例３．Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢはインビトロで抗真菌剤活性を発揮する
酵母菌、サッカロマイセス・セレビシエ、及びカンジダ・アルビカンスの２つのエルゴステロール含有株に対する、ＡｍＢ、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ、及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢの活性を試験した。カンジダ・アルビカンスは、ヒトにおける生死にかかわる全身真菌感染の最も一般的な原因となる。図５に示すように、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、サッカロマイセス・セレビシエ（ＭＩＣ＝２μＭ）及びカンジダ・アルビカンス（ＭＩＣ＝２μＭ）の両方に対する強力な抗真菌剤活性を実証した。
抗真菌剤活性アッセイの例示的方法は、以下の通りである。
【０１２３】
サッカロマイセス・セレビシエの増殖条件
サッカロマイセス・セレビシエを、１０ｇ／Ｌの酵母菌抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのブドウ糖、及び２０ｇ／Ｌの固体培地用寒天からなる酵母菌ペプトンブドウ糖（ＹＰＤ）増殖培地で維持した。培地を、２５０°Ｆ、３０分間の高圧蒸気殺菌によって滅菌した。続けて、無菌４０ｗ／ｖ％水溶液としてブドウ糖を添加した（ブドウ糖溶液は濾過滅菌した）。寒天（２０ｇ／Ｌ）を含有する無菌培地をＣｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の１００×２０ｍｍポリスチレンプレート上に注ぐことによって、固体培地を調製した。液体培養物を、回転式振盪機上、３０℃でインキュベートし、固体培養物を、インキュベーター内、３０℃で維持した。
【０１２４】
カンジダ・アルビカンスの増殖条件
カンジダ・アルビカンスを、液体培養物及び固体培養物の両方を３７℃でインキュベートしたことを除いて、サッカロマイセス・セレビシエと類似した様式で培養した。
【０１２５】
微量液体希釈最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイ
微量液体希釈アッセイ用のプロトコルを、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｍ２７−Ａ２から適合した。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｂｒｏｔｈ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｍ２７−Ａ２，Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２ｎｄＥｄ．Ｖｏｌ．２２，Ｎｕｍｂｅｒ１５，２００２。５０ｍＬのＹＰＤ培地を植え付け、振盪インキュベーター内、３０℃（サッカロマイセス・セレビシエ）または３７℃（カンジダ・アルビカンス）で一晩インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ  ＵＶ−１７００紫外／可視分光光度計によって測定される、０．１０のＯＤ６００（約５×１０５ｃｆｕ／ｍＬ）までＹＰＤで希釈した。溶液をＹＰＤで１０倍に希釈し、希釈細胞懸濁液の１９５μＬアリコートを無菌Ｆａｌｃｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ９６ウェルプレートに３連で添加した。化合物を、ＤＭＳＯ中、４００μＭ（ＡｍＢ、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ）または２ｍＭ（ＡｍｄｅＢ）ストック溶液として調製し、以下の濃度、１６００、１２００、８００、４００、３２０、２４０、２００、１６０、１２０、８０、４０、２０、１０、及び５μＭにＤＭＳＯで段階希釈した。各溶液の５μＬアリコートを９６ウェルプレートに３連で添加し、各カラムは異なる濃度の試験化合物となった。各ウェル内のＤＭＳＯの濃度は２．５％であり、生存率を確認するための２．５％のＤＭＳＯのみを使用する対照ウェルもまた、３連で実行した。この４０倍の希釈によって、以下の最終濃度、５０、４０、３０、２０、１０、８、６、４、１、０．５、０．２５、及び０．１２５μＭを得た。プレートを被覆し、分析前に３０℃（サッカロマイセス・セレビシエ）または３７℃（カンジダ・アルビカンス）で２４時間インキュベートした。ＭＩＣを、酵母菌の目に見える増殖をもたらさない化合物の濃度であると決定した。実験を２連で実行し、報告されるＭＩＣは２つの実験の平均を表した。
【０１２６】
実施例４．Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、インビトロでヒト細胞対して有毒ではない
最後に、ＡｍＢ、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ、及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢのヒト細胞に対する活性を探索した。ＡｍＢと関連付けられる最も重要な有毒な副作用のうちの２つは、それぞれ、赤血球及び腎近位尿細管細胞に対する損傷によって引き起こされる、貧血及び腎毒性である５ａ、１５。文献の先例と一貫し、ＡｍＢは、８．５μＭの濃度でヒト赤血球の９０％の溶血を引き起こす。これは、最小溶血濃度（ＭＨＣ）として定義される。全く対照的に、我々は、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢ（どちらもコレステロールに結合しない）の対応するＭＨＣが、５００μＭ超であることを見出した（図５）。同様に、ＡｍＢは、２．４μＭの濃度（最小毒性濃度（ＭＴＣ））で、主要ヒト腎近位尿細管上皮細胞の細胞生存率の９０％の損失を引き起こす。繰り返すと、ＡｍＢとは全く対照的に、Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢはともに、それらの最大溶解度限界まで、毒性の証拠を示さなかった１６。
毒性アッセイの例示的方法は、以下の通りである。
【０１２７】
溶血アッセイ
【０１２８】
赤血球調製
溶血アッセイ用のプロトコルを、Ｐａｑｕｅｔ及び共同研究者らの報告から適合した。Ｐａｑｕｅｔ，Ｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１４：２４６５−２４８１。ヒト全血液（ヘパリンナトリウム）をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  ＬＬＣ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入し、４℃で貯蔵し、受け取ってから２日以内に使用した。２．０ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に、１ｍＬのヒト全血液を添加し、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、赤血球ペレットを１ｍＬの無菌生理食塩水で洗浄し、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。合計３回の洗浄回数で、生理食塩水洗浄を繰り返した。赤血球ペレットを１ｍＬのＲＢＣ緩衝剤（１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中に懸濁して、赤血球ストック懸濁液を形成した。
【０１２９】
最小溶血濃度（ＭＨＣ）アッセイ
化合物を、ＤＭＳＯ中、１．０３ｍＭ（ＡｍＢ）または１２．８ｍＭ（Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ及びＣ２’ｅｐｉＡｍＢ）ストック溶液として調製し、以下の濃度、７６８９、５１２６、２５６３、２０５０、１５３８、１０２５、７６９、５１３、３８４、２５６、２０５、１５４、１０３、７７、５１、２６μＭにＤＭＳＯで段階希釈した。０．２ｍＬのＰＣＲ管に、２４μＬのＲＢＣ緩衝剤及び１μＬの化合物ストック溶液を添加し、これにより、５００、３００、２００、１００、８０、６０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、４、３、２、１μＭの最終濃度をもたらした。１μＬのＤＭＳＯを、ＭｉｌｌｉＱ水またはＲＢＣ緩衝剤に、０．２ｍＬのＰＣＲ管へとそれぞれ添加することによって、正の対照及び負の対照を調製した。各ＰＣＲ管に、０．６３μＬの赤血球ストック懸濁液を添加し、転倒混合した。試料を３７℃で２時間インキュベートした。試料を転倒混合し、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。各試料から１５μＬの上清を３８４ウェルプレートに添加した。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｈ１  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｗａｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、５４０ｎｍで吸光度を読み取った。実験を３連で実行し、報告されるＭＨＣは３つの実験の平均を表した。
【０１３０】
データ分析
以下の等式に従って、溶血パーセントを決定した。
【数４】
0006543272.tif 000044
濃度対溶血パーセントをプロットし、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８．６を使用して、４係数ロジスティック曲線（４ＰＬ）用量応答適合に適合させた。Ｓｅｂａｕｇｈ，ＪＬ（２０１１）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｔａｔｉｓｔ．１０：１２８−１３４。ＭＨＣを、９０％の溶血を引き起こす濃度として定義した。
【０１３１】
ＷＳＴ−８細胞増殖アッセイ
【０１３２】
主要ヒト腎近位尿細管上皮細胞調製
主要ヒト腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、受け取った直後に培養した。腎臓上皮細胞基本培地（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ−４００−０３０）、腎臓上皮細胞増殖キット（ＡＴＣＣ、ＰＣＳ−４００−０４０）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（１０単位／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬ）を使用して、完全増殖培地を調製した。完全培地を４℃、暗所で貯蔵し、２８日以内に使用した。主要ＲＰＴＥＣを、９５％の空気／５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で増殖させた。
【０１３３】
ＷＳＴ−８試薬調製
ＷＳＴ−８細胞増殖アッセイキット（１００１０１９９）をＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）から購入し、−２０℃で貯蔵し、受け取ってから６ヶ月以内に使用した。ＷＳＴ−８試薬及び電子メディエータ溶液を解凍、混合して、ＷＳＴ−８試薬溶液を調製した。溶液を−２０℃で貯蔵し、１週間以内に使用した。
【０１３４】
ＷＳＴ−８アッセイ
完全増殖培地中、主要ＲＰＴＥＣの懸濁液を、１×１０５細胞／ｍＬの濃度にした。９６ウェルプレートに、９９μＬの細胞懸濁液を播種し、９５％の空気／５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃で３時間インキュベートした。１００μＬの細胞懸濁液または１００μＬの完全培地を播種することによって、正の対照及び負の対照を調製した。化合物を、ＤＭＳＯ中、５ｍＭ（ＡｍＢ）、２０ｍＭ（Ｃ２’ｄｅＯＡｍＢ）、または５０ｍＭ（Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢ）ストック溶液として調製し、以下の濃度、５００００、４００００、２００００、３００００、１００００、８０００、６０００、４０００、３０００、２０００、１５００、１０００、８００、６００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．５、０．２５、及び０．１μＭにＤＭＳＯで段階希釈した。各溶液の１μＬアリコートを９６ウェルプレートに３連で添加し、各カラムは異なる濃度の試験化合物となった。９６ウェルプレートを、９５％の空気／５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を吸引し、１００μＬの血清を含有しない培地を添加し、１０μＬのＷＳＴ−８試薬溶液を各ウェルに添加した。９６ウェルプレートを、２００ｒｐｍの振盪インキュベーター内で１分間混合し、９５％の空気／５％のＣＯ２の雰囲気で、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレートを、２００ｒｐｍの振盪インキュベーター内で１分間混合し、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｈ１  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｗａｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用して、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。実験を３連で実行し、報告される細胞毒性は３つの実験の平均を表した。
【０１３５】
データ分析
以下の等式に従って、溶血パーセントを決定した。
【数５】
0006543272.tif 000045
濃度対溶血パーセントをプロットし、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８．６を使用して、４係数ロジスティック曲線（４ＰＬ）８用量応答適合に適合させた。ＭＴＣを、細胞生存率の９０％の損失を引き起こす濃度として定義した。
【０１３６】
顕微鏡法
ＡＭＧ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）ＥＶＯＳ  ｆｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、細胞を撮像した。１０倍対物レンズで、透過光を使用して、画像を撮影した。
【０１３７】
実施例５．生物学的活性のインビボ評価
播種性カンジダ症のマウスモデルにおいて、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢの抗真菌剤有効性を試験した。この実験において、好中球減少マウスを、それらの尾静脈を介してカンジダ・アルビカンスに感染させ、次いで、感染の２時間後、１６ｍｇ／ｋｇのＡｍＢまたはＣ２’ｅｐｉＡｍＢの単回腹腔内注射でマウスを治療した。次いで、感染の２４時間後、マウスを屠殺し、それらの腎臓内に存在する真菌負荷量を定量化した。結果を図７に示す。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、腎臓内に存在する真菌負荷量の低減において、ＡｍＢよりも有効であった。ＡｍＢと比較して、Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは、０．５ｌｏｇ単位だけ真菌負荷量を低減した。
【０１３８】
別個の実験において、健康なマウスへのＡｍＢまたはＣ２’ｅｐｉＡｍＢの単回静脈内投与によって、急性毒性を決定し、その後、致死率を監視した。結果を図８に示す。４ｍｇ／ｋｇのＡｍＢ投与量群の全てのマウスは、数秒以内に死亡した。Ｃ２’ｅｐｉＡｍＢは有意に毒性がより低く、最大１６ｍｇ／ｋｇの用量ですら死亡は確認されなかった。
【０１３９】
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（１０）（ａ）Ｃｒｏａｔｔ，Ｍ．Ｐ．；Ｃａｒｒｅｉｒａ，Ｅ．Ｍ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１１，１３，１３９０−１３９３。（ｂ）Ｎｅｕｍａｎｎ，Ａ．；Ｃｚｕｂ，Ｊ．；Ｂａｇｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２００９，１１３，１５８７５−１５８８５。（ｃ）Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ，Ｎ．；Ｓａｗａｄａ，Ｙ．；Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７，１０６６７−１０６７５。（ｄ）Ｂａｒａｎ，Ｍ．；Ｍａｚｅｒｓｋｉ，Ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２００２，９５，１２５−１３３。（ｅ）Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１９９８，１６２，１１７−１２６。
（１１）Ｎｅｕｍａｎｎ，Ａ．；Ｂａｇｉｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｃｚｕｂ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１８２６６−１８２７２。
（１２）（ａ）Ｎｏｇｕｉｅｒａ，Ｊ．Ｍ．；Ｉｓｓａ，Ｊ．Ｐ．；Ｃｈｕ，Ａ．−Ｈ．Ａ．；Ｓｉｓｅｌ，Ｊ．Ａ．；Ｓｃｈｕｍ，Ｒ．Ｓ．；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２０１２，４９２７−４９３０。（ｂ）Ｈｏｕ，Ｄ．；Ｌｏｗａｒｙ，Ｔ．Ｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００９，３４４，１９１１−１９４０。（ｃ）Ｏｂｅｒｈｕｒ，Ｍ．；Ｌｅｉｍｋｕｈｌｅｒ，Ｃ．；Ｋａｈｎｅ，Ｄ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，２８７３−２８７６。（ｄ）Ｎｉｃｏ−ｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｌａｄｄｕｗａｈｅｔｔｙ，Ｔ．；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｌ．；Ｃｈｕｃｈｏｌｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８６，１０８，２４６６−２４６７。（ｅ）Ｏｖｅｒｅｎｄ，Ｗ；Ｒｅｅｓ，Ｃ．；Ｓｅｑｕｅｉｒａ，Ｊ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６２，３４２９−３４４０。
（１３）Ｗｉｌｃｏｃｋ，Ｂ．Ｃ．；Ｕｎｏ，Ｂ．Ｅ．；Ｂｒｏｍａｎｎ，Ｇ．Ｌ．；Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ｊ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．；Ｂｕｒｋｅ，Ｍ．Ｄ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１２，４，９９６−１００３。
（１４）（ａ）Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｄａｉｎｅｓ，Ｒ．Ａ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｔ．Ｋ．；Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９，２８２１−２８２２。（ｂ）Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｄａｉｎｅｓ，Ｒ．Ａ．；Ｏｇａｗａ，Ｙ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｔ．Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８，１１０，４６９６−４７０５。（ｃ）Ｓｚｐｉｌｍａｎ，Ａ．Ｍ．；Ｍａｎｔｈｒｏｐｅ，Ｊ．Ｍ．；Ｃａｒｒｅｉｒａ，Ｅ．Ｍ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，４３３９−４３４２。（ｄ）Ｓｚｐｉｌｍａｎ，Ａ．Ｍ．；Ｃｅｒｅｇｈｅｔｔｉ，Ｄ．Ｍ．；Ｍａｎｔｈｒｏｐｅ，Ｊ．Ｍ．；Ｗｕｒｔｚ，Ｎ．Ｒ．；Ｃａｒｒｅｉｒａ，Ｅ．Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２００９，１５，７１１７−７１２８。
（１５）Ｇｕｏ，Ｈ．；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｇ．Ａ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，５２０６−５２０８。
（１６）（ａ）Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｄａｉｎｅｓ，Ｒ．Ａ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｔ．Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８７，１０９，２２０８−２２１０。（ｂ）Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｔ．Ｋ．；Ｏｇａｗａ，Ｙ．；Ｄａｉｎｅｓ，Ｒ．Ａ．；Ｓｉｍｐｋｉｎｓ，Ｎ．Ｓ．；Ｆｕｒｓｔ，Ｇ．Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８８，１１０，４６６０−４６７２。（ｃ）Ｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｋ．Ｃ．；Ｄａｉｎｅｓ，Ｒ．Ａ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ｔ．Ｋ．；Ｏｇａｗａ，Ｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８８，１１０，４６８５−４６９６。
（１７）（ａ）Ｓｕｎｄａｒ，Ｓ．；Ｊｈａ，Ｔ．Ｋ．；Ｔｈａｋｕｒ，Ｃ．Ｐ．；Ｓｉｎｈａ，Ｐ．Ｋ．；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ２００７，３５６，２５７１−２５８１。（ｂ）Ｚａｇｅｒ，Ｒ．Ａ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ．Ｄｉｓ．２０００，３６，２３８−２４９。（ｃ）Ｓａｗａｙａ，Ｂ．Ｐ．；Ｂｒｉｇｇｓ，Ｊ．Ｐ；Ｓｃｈｎｅｒｒｍａｎｎ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９５，６，１５４−１６４。（ｄ）Ｋｅｉｍ，Ｇ．Ｒ．；Ｐｏｕｔｓｉａｋａ，Ｊ．Ｗ．；Ｋｉｒｐａｎ，Ｊ．；Ｋｅｙｓｓｅｒ，Ｃ．Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９７３，１７９，５８４−５８５。
（１８）腎細胞培地中の、ＡｍＢ及びその誘導体の限定された溶解度のため、８０μＭが、我々が研究することができた最高濃度である。より高い濃度では、凝集物がプレートリーダーの光路を遮断し、偽の高い吸光度の読み取り値をもたらす。しかしながら、最大２００μＭの濃度ですら、ＡｍｄｅＢ及びＣ２’ｄｅＯＡｍＢでの治療後の腎細胞の顕微鏡画像は、毒性の視覚的証拠を呈さなかった。
（１９）（ａ）Ｆｏｗｌｅｒ，Ｂ．Ｓ．；Ｌａｅｍｍｅｒｈｏｌｄ，Ｋ．Ｍ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，９７５５−９７６１。（ｂ）Ｄｕｇｇａｎ，Ｋ．Ｃ．；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．；Ｍｕｓｅｅ，Ｊ．；Ｐｒｕｓａｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．；Ｓｃｈｅｉｂ，Ｊ．Ｌ．；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｄ．；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．；Ｏａｔｅｓ．Ｊ．Ａ．；Ｍａｒｎｅｔｔ，Ｌ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１，７，８０３−８０９。（ｃ）Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，Ｂ．Ｓ．；Ｓｅｉｄｌ，Ｋ．Ｍ．；Ｃｈａｂｏｔ，Ｊ．Ｒ．ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２０１０，４，２３−３９。（ｄ）Ｎｅ−ａｎｔ−Ｆｅｒｙ，Ｍ．；Ｇａｒｃｉａ−Ｏｒｄｏｎｅｚ，Ｒ．Ｄ．；Ｌｏｇａｎ，Ｔ．Ｐ．；Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．；Ｌｉ，Ｌ．；Ｒｅｉｎｓｔａｔｌｅｒ，Ｌ．；Ｌｅｉｓｓｒｉｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００８，１０５，９５８２−９５８７。（ｅ）Ｋｎｉｇｈｔ，Ｚ．Ａ．；Ｓｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５，１２，６２１−６３７。（ｆ）Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．；Ｏｌｅｓｃｈｕｋ，Ｃ．Ｊ．；Ｈａｉｍｅｕｒ，Ａ．；Ｏｌｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．；Ｄｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．；Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，４９４９５−４９５０３。（ｇ）Ｃｈａｎｇｅｕｘ，Ｊ．Ｐ．；Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ１９９８，２１，９５９−９８０。
（２０）（ａ）Ｇａｎｉｓ，Ｐ．；Ａｖｉｔａｂｉｌｅ，Ｇ．；Ｍｅｃｈｌｉｎｓｋｉ，Ｗ．；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｃ．Ｐ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７１，９３，４５６０−４５６４。（ｂ）Ｊａｒｚｅｍｂｓｋａ，Ｋ．Ｎ．；Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｄ．；Ｈｏｓｅｒ，Ａ．Ａ．；Ｍａｌｉｎｓｋａ，Ｍ．；Ｓｅｎｃｚｙｎａ，Ｂ．；Ｗｏｚｎｉａｋ，Ｋ．；Ｇａｇｏｓ，Ｍ．Ｃｒｙｓｔ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｅｓ．２０１２，１２，２３３６−２３４５。
【０１４０】
等価物
ここまで、明確な理解のために、説明及び実施例によって本発明をいくらか詳細に完全に説明しているが、本発明またはその任意の特定の実施形態の範囲に影響を与えることなく、幅広い及び等価の範囲の条件、製剤化、及び他のパラメータにおいて本発明を修正または変更することによって、それが実行され得ること、ならびにそのような修正または変更が添付の特許請求の範囲の範囲内に網羅されることが意図されることは、当業者に明らかであるだろう。
【０１４１】
参照による組み込み
上記の説明において言及される全ての特許及び公開特許出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
0006543272.tif 000047
【図１Ｂ】
0006543272.tif 000048
【図１Ｃ】
0006543272.tif 000049
【図２Ａ】
0006543272.tif 000050
【図２Ｂ】
0006543272.tif 000051
【図２Ｃ】
0006543272.tif 000052
【図２Ｄ】
0006543272.tif 000053
【図３】
0006543272.tif 000054
【図４】
0006543272.tif 000055
【図５】
0006543272.tif 000056
【図６Ａ】
0006543272.tif 000057
【図６Ｂ】
0006543272.tif 000058
【図７】
0006543272.tif 000059
【図８】
0006543272.tif 000060