(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染させた接着性細胞を繊維材質の支持体に接着させ、該支持体を培養容器内に充填して細胞培養を行うことを含み、その際、培地の排出と添加を制御しながら培養開始後２０日目における該接着性細胞の接着率を９０％以上に維持することを特徴とするウイルスの培養方法であって、ウイルス感染させた接着性細胞を繊維材質の支持体に接着させることが下記工程（ａ）〜（ｂ）を含み、培地の排出と添加を制御することが下記工程（ｃ）を含む方法；
（ａ）繊維材質の支持体を充填した培養容器に、ウイルス感染細胞を含む培地を投入した後、培養容器容量の１割分の培地を出し入れすることで当該細胞を支持体に接着させる工程；
（ｂ）培地のほぼ全量を複数回出し入れすることにより接着を確実なものとする工程；
（ｃ）古い培地の排出と新しい培地の投入を繰り返すことにより、培地を新鮮なものと交換しながら培養を行う工程。
【請求項２】
該繊維材質がポリエチレンテレフタレートである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該支持体がシングルユース品である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該ウイルスがピコルナウイルス科のウイルスである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該ピコルナウイルス科のウイルスがＡ型肝炎ウイルスである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該接着性細胞が、アフリカミドリザル腎臓由来細胞である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該アフリカミドリザル腎臓由来細胞が、ＧＬ３７細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法によってウイルスを培養し、得られたウイルスを用いることを特徴とする免疫原性組成物の作製方法。
【請求項９】
請求項５から７のいずれかに記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを培養し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とするＡ型肝炎ワクチンの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染させた接着性細胞を、支持体から剥離することなく長期間にわたって培養維持することにより当該細胞内のウイルスを増殖する方法、すなわち接着性細胞感受性のウイルス培養方法、特にＡ型肝炎ウイルスの培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａ型肝炎ウイルスは、直径２７ｎｍの正２０面体のピコルナウイルス科のＲＮＡウイルスである。遺伝子型は７種類あり、世界の各地域に流行型に差が存在するが、血清型は１種類であるため、遺伝子型による免疫抗原性に違いは見られない。
【０００３】
Ａ型肝炎ウイルスは、培養細胞において増殖性があるが、その速度は遅く、２〜３週間かけてゆっくり増殖する。一般的に細胞変性効果（Cytopathic effect）を示さず、細胞内に貯留する。
【０００４】
Ａ型肝炎ウイルスが人に感染した場合は、２〜６週間の潜伏期間を経て、発熱、倦怠感などに続いて血清トランスアミラーゼが上昇する。また、食欲不振、嘔吐などの症状の他、黄疸、肝腫大、濃色尿、灰白色便などの症例が見られる。一般的には慢性化することはなく、１〜２ヶ月経過後に回復するが、まれに劇症肝炎を発症する場合もある。
【０００５】
近年、海外渡航者の増加により、Ａ型肝炎ウイルスへの感染リスクが増加しており、Ａ型肝炎ワクチンの需要が増している。一方で需要増に十分に応え得る供給が難しくなっているため、生産方法の見直しによる量産化への取り組みが求められている。
【０００６】
現行のＡ型肝炎ワクチンの生産方法は次の通りである。（特許文献１）
［１］  ワクチン製造用のＡ型肝炎ウイルスを、アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞であるＧＬ３７細胞に接種して感染させる；
［２］  ３週間のローラーボトル培養を行うことによって、感染したＡ型肝炎ウイルスをＧＬ３７細胞内で増殖させる；
［３］  培養終了後、細胞を界面活性剤により溶解してＡ型肝炎ウイルスを回収し、細胞溶解液を得る；
［４］  細胞溶解液をろ過にて清澄化し、塩析及び遠心で濃縮後、クロロホルム、酵素及び有機溶媒で処理し、精製ウイルス液とする；
［５］  精製ウイルス液をホルマリンで不活化し、ワクチン原液とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平１―２７９８４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現行のＡ型肝炎ワクチン生産方法におけるローラーボトル培養は生産性が低く、大量生産には適していないことから、ビーズなどのマイクロキャリアーを支持体として利用した浮遊培養による生産方法が検討されてきた。しかしながら、マイクロキャリアーにＧＬ３７細胞を接着させて浮遊培養を行うと、３週間の培養期間に細胞が耐えきれず、マイクロキャリアーから剥離してしまうため、生産性向上の課題が解決できないでいた。
【０００９】
したがって、本発明はウイルス感染させた接着性細胞を、支持体から剥離することなく２０日間以上の長期間にわたって培養維持することにより当該細胞内のウイルスを増殖する方法、すなわち接着性細胞感受性のウイルス培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、ウイルス感染させた接着性細胞を繊維材質の支持体に接着させ、該支持体を培養容器内に充填して行う細胞培養において、培地の排出と添加を制御することで、当該細胞の接着率を９０％以上に維持したまま培養できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
したがって、本発明は接着性細胞に感染させたウイルス培養法を提供するものであり、具体的には以下の発明が含まれる。
［１］  ウイルス感染させた接着性細胞を繊維材質の支持体に接着させ、該支持体を培養容器内に充填して細胞培養を行うことを含み、その際、培地の排出と添加を制御しながら該接着性細胞の接着率を９０％以上に維持することを特徴とする、ウイルスの培養方法；
［２］  培養開始後２０日目における該接着性細胞の接着率が９０％以上である上記［１］に記載の方法；
［３］  該繊維材質がポリエチレンテレフタレートである上記［１］または［２］に記載の方法；
［４］  該支持体がシングルユース品である上記［１］から［３］のいずれかに記載の方法；
［５］  該ウイルスがピコルナウイルス科のウイルスである上記［１］から［４］のいずれかに記載の方法；
［６］  該ピコルナウイルス科のウイルスがＡ型肝炎ウイルスである上記［５］に記載の方法；
［７］  該接着性細胞が、アフリカミドリザル腎臓由来細胞である上記［１］から［６］のいずれかに記載の方法；
［８］  該アフリカミドリザル腎臓由来細胞が、ＧＬ３７細胞である上記［７］に記載の方法；
［９］  上記［１］から［８］のいずれかに記載の方法によって培養したウイルスを用いて作製した免疫原性組成物；
［１０］  上記［６］から［８］のいずれかに記載の方法によって培養したＡ型肝炎ウイルスを用いて作製したＡ型肝炎ワクチン。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、ローラーボトル培養の１０倍以上の細胞密度で三次元的に培養を行う高密度培養法であり、接着性細胞に感染させたウイルス培養のために必要な長期間の細胞培養維持が可能となる。これにより、ウイルス培養の生産性が向上し、当該ウイルスを用いたワクチン生産の量産化も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ウイルス感染細胞を繊維材質支持体に確実に接着させるための工程、すなわち、培養容器の培地の出し入れ（培養容器容量の１割分の培地の出し入れ）を示した図である。
【図１Ｂ】ウイルス感染細胞を繊維材質支持体に確実に接着させるための工程、すなわち、培養容器の培地の出し入れ（培地のほぼ全量を出し入れ）を示した図である。
【図２】５００ｍＬスケールでＡ型肝炎ウイルスを３５日間培養した際の細胞数を示した図である。２種類の培地（ＭＥＭ及びＶＰ−ＳＦＭ）を用いた結果を示している。
【図３】２ＬスケールでＡ型肝炎ウイルスを大量培養した際の細胞数と抗原量を示した図である。ＶＰ−ＳＦＭ培地を用いた結果を示している。
【図４】繊維材質支持体を用いた培養とマイクロキャリアーを支持体として用いた浮遊培養の細胞数を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、接着性細胞に感染するウイルスについて用いられる。具体的にはＡ型肝炎ウイルス感受性細胞にＡ型肝炎ウイルスを接種し、当該細胞を培養する工程からなるＡ型肝炎ウイルスの培養方法によって特徴付けられる。
【００１５】
細胞培養にあたっては、繊維材質の支持体を充填した培養容器に、ウイルス感染細胞を含む培地を投入した後、培養容器容量の１割分の培地を出し入れすることで当該細胞を支持体に接着させる（図１Ａ）。この培養容器容量の１割分の培地を出し入れする培養は、一昼夜ほど行えば良い。さらに培地のほぼ全量を複数回出し入れすることにより接着を確実なものとする（図１Ｂ）。培養期間中は、培地を新鮮なものと交換しながら培養を行うことで、当該細胞が気相と液相の両環境下に置かれ、ガス交換と育成成分の取得が効率的に行われるよう制御する。これにより、当該細胞が長期間にわたって培養維持され、ウイルスを培養することができる。
【００１６】
上記、培地を新鮮なものと交換するための方法は、古い培地の排出と新しい培地の投入を繰り返すことにより行う。培養期間中は、温度調節可能な装置内に培養容器を入れ、一定温度下にて培養を行う。
【００１７】
本発明に用いる接着性細胞としては、アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞であるＶｅｒｏ細胞やＧＬ３７細胞などが挙げられる。
【００１８】
培地は、通常細胞培養に用いられる培地、例えば、ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、特注品）、イーグルＭＥＭ（日水製薬）、ダルベッコ変法ＭＥＭ（日水製薬）、ＶＰ−ＳＦＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられるが、いずれを使用しても良い。ウイルス培養時には、ウシ胎児血清を添加した培地を用いることもできる。
【００１９】
支持体は繊維材質であれば特に限定されないが、好適な材質はポリプロピレンであり、より好適な材質はポリエチレンテレフタレートである。支持体の形状は、特に限定されないが、円形のものや矩形のもの、さらには機能性を高めるために独特の幾何学的形状としたものも用いられる。通常、一片１０ｍｍ程度の小さくて軽いものであるが、繊維材質であることから大きな表面積を持つことに特徴がある。
【００２０】
このような繊維材質の支持体を用いることによって、細胞は支持体の表面だけでなく、その内部にも付着するため、三次元的な高密度培養が可能となる。また、培地の出し入れによるシェアストレスがなくなるため、長期間にわたって細胞を培養することができる。さらには、細胞が三次元的な構造をとることで、ｉｎ  ｖｉｖｏに似た形態をとることができ、ウイルスの増殖性が向上する。
【００２１】
支持体は市場で提供されているものが利用できる。例えば、ＣＥＳＣＯ社から「ＢｉｏＮＯＣＩＩＲ」の商品名で提供されている支持体が利用可能である。シングルユース品であってもよく、滅菌済みのものや表面処理を施したものであっても構わない。
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（１）Ａ型肝炎ウイルスの培養（５００ｍＬスケール）
ＶＰ−ＳＦＭ培地で接着培養したＧＬ３７細胞を、初期細胞数７．６×１０７ｃｅｌｌｓとなるようにウシ胎児血清加ＭＥＭ培地５００ｍＬに懸濁し、これにＡ型肝炎ウイルス（m.o.i. 0.1）を接種した。
繊維材質支持体（商品名：ＢｉｏＮＯＣＩＩＲ、ＣＥＳＣＯ社）を充填した高密度培養容器（商品名：ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ５００ＡＲ、ＣＥＳＣＯ社）に、当該ＭＥＭ培地を投入し、一昼夜、当該培養容器の１割分の容量の培地を出し入れすることで細胞を支持体に接着させた。その後、培地のほぼ全量を出し入れすることで接着を確実なものとした。３７℃、５％ＣＯ２の環境下で３週間の培養を行い、培養期間中、容器全容量の古い培地の排出と新しい培地の投入を２〜３日毎に繰り返し、培養を維持した。
【００２４】
（２）細胞接着率
培養開始１５日目と２２日目に、培養上清よりサンプリングを行い、血球計算版を用いたトリパンブルー法による脱落細胞数計測を実施したところ、両日ともに計測細胞数は０であった。
培養上清量が５００ｍＬであるため、細胞数の検出感度としては計測細胞数が１でもあれば１×１０７ｃｅｌｌｓの細胞数を検出できる。１５日目及び２２日目の接着細胞数が２．８×１０９ｃｅｌｌｓと２．９×１０９ｃｅｌｌｓであったことから、９９％の細胞は接着していることが確認された。
【００２５】
（３）ウイルス抗原量測定
ウイルス抗原量はＡ型肝炎ウイルスに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0006609110.tif 000002
【実施例２】
【００２７】
（１）Ａ型肝炎ウイルスの長期培養（５００ｍＬスケール）
Ａ型肝炎ウイルスの培養を３５日間実施した。初期細胞数を７．７×１０７ｃｅｌｌｓとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。そのウイルス抗原量測定結果を表２に示す。また、細胞数の計測結果を図２に示す。なお、図２には、ＶＰ−ＳＦＭ培地を用いて同様に培養を行った結果もプロットした。図２の結果から、ＭＥＭ培地のみならず、ＶＰ−ＳＦＭ培地による培養も可能であることがわかった。
【００２８】
【表２】
0006609110.tif 000003
【実施例３】
【００２９】
（１）Ａ型肝炎ウイルスの培養（２Ｌスケール）
ＶＰ−ＳＦＭ培地で接着培養したＧＬ３７細胞を、初期細胞数１．２×１０９ｃｅｌｌｓとなるようにウシ胎児血清加ＭＥＭ培地１６００ｍＬに懸濁し、２Ｌ容量高密度培養容器を用いて培養を行った。３週間の培養期間中、古い培地の排出と新しい培地の投入を、２Ｌ容量の培養担体に対して５Ｌ／ｄａｙの割合で繰り返した以外は、実施例１と同様に行った。そのウイルス抗原量測定結果を表３及び図３に示す。細胞数の計測結果は図３に示すとおりである。
【００３０】
【表３】
0006609110.tif 000004
【実施例４】
【００３１】
（１）Ａ型肝炎ウイルスの培養（マイクロキャリアーとの比較）
繊維材質支持体を用いた培養とマイクロキャリアーを支持体として用いた浮遊培養を比較するための実験を行った。繊維材質支持体を用いた培養は、初期細胞数を３．６×１０７ｃｅｌｌｓとしたこと以外は、実施例１と同様に行った。マイクロキャリアー（商品名：Ｃｙｔｏｄｅｘ１、ＧＥヘルスケア社）を用いた浮遊培養は、ＧＬ３７細胞の初期細胞数を５．２×１０７ｃｅｌｌｓとし、ウシ胎児血清加ＭＥＭ培地１４０ｍＬを使用して行った。培養開始２日目までは、マイクロキャリアーにＧＬ３７細胞を付着させるための培養を行い、培養開始３日目にＡ型肝炎ウイルス（m.o.i. 0.1）を接種して、引き続き浮遊培養を行った。培養期間中、７日毎に７０％の培地を交換し、培養を維持した。
【００３２】
（２）細胞数計測及びウイルス総抗原量測定
培養期間中の細胞数計測結果を図４に示す。また、培養２１日目におけるウイルス総抗原量測定結果を表４に示す。図４及び表４から明らかなように、マイクロキャリアーを支持体として用いた浮遊培養では、３週間の培養期間に細胞が耐えきれず、マイクロキャリアーから剥離してしまうため、繊維材質支持体を用いた培養と比べて細胞数が伸びず、総抗原量も大幅に低下することがわかった。
【００３３】
【表４】
0006609110.tif 000005
【００３４】
上記実施例１〜４により、繊維材質支持体を用い、培地の排出と添加を制御することにより、接着性細胞が剥離することなく、Ａ型肝炎ウイルスの長期培養・維持が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、接着性細胞感受性ウイルスを用いたワクチン、特にＡ型肝炎ワクチンの生産方法として利用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0006609110.tif 000007
【図２】
0006609110.tif 000008
【図３】
0006609110.tif 000009
【図４】
0006609110.tif 000010