(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法。
（１）宿主（但し、ヒトを除く）に下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【請求項２】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）において、宿主にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入する、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項１〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記微生物が酵母である、請求項６記載の製造方法。
【請求項９】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項１０】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
宿主（但し、ヒトを除く）に、請求項１１記載の遺伝子を導入して得られる形質転換体。
【請求項１３】
宿主（但し、ヒトを除く）に請求項１１記載の遺伝子、及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入して得られる、請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
前記宿主が微生物又は植物である、請求項１２又は１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記植物がシロイヌナズナである、請求項１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
前記微生物が酵母である、請求項１４記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いた脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられる。
【０００３】
トリアシルグリセロールは、１分子のグリセロールに３分子の脂肪酸がエステル結合してなる化合物である。グリセロールに結合する脂肪酸の種類は多岐にわたり、結合する脂肪酸の組み合わせによって、様々なトリアシルグリセロール化合物が生じる。生体内では、トリアシルグリセロールは主にエネルギー貯蔵物質として働き、動物の脂肪組織や植物の種子等に蓄積されている。
生体内においてトリアシルグリセロールは、ジアシルグリセロールに脂肪酸由来のアシル−ＣｏＡからアシル基が転移して合成される。この転移反応にはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）が関与する。ＤＧＡＴは、哺乳類、植物、真菌などに存在し、ＤＧＡＴ１とＤＧＡＴ２の２タイプが存在することが知られている。ＤＧＡＴ１とＤＧＡＴ２は、共にジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するが、両者はアミノ酸配列の共通性に乏しい。
植物のＤＧＡＴ１として、シロイヌナズナ（Genbank  NP_179535.1）、Tung  Tree（Genbank  ABC94471.1）、ヤトロファ（Genbank  ABB84383.1）、ヒマワリ（Genbank  ADT91687.1）、ヒマ（Genbank  XP_002514132.1）由来のものが知られている。また、植物のＤＧＡＴ２として、シロイヌナズナ（Genbank  NP_566952.1）、Tung  Tree（Genbank  ABC94473.1）、ヒマ（Genbank  XP_002528531.1）、ヤトロファ（Genbank  AEZ56254.1）、ヒマワリ（Genbank  ADT91688.1）由来のものが知られている。
【０００４】
ＤＧＡＴの基質となる脂肪酸アシル−ＣｏＡの種類は多岐にわたり、どのような炭素数・不飽和度のアシル基がジアシルグリセロールに導入されるかを決めているのがＤＧＡＴであると考えられている。これまでに報告されているＤＧＡＴの多くは、長鎖アシル基を選択的に導入するものである。植物においても、長鎖不飽和脂肪酸の導入に関与するＤＧＡＴが報告されている（例えば、特許文献１）。一方、中鎖アシル基を選択的に導入するようなＤＧＡＴについてはほとんど報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７９００５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、植物由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを用いた脂質の製造方法、特に中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の製造方法の提供に関する。また、本発明は、植物由来の新たなジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、これをコードする遺伝子、及びこれを含む形質転換体の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、植物由来のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼについて研究を行い、ココヤシ（Cocos nucifera）から、新たなジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを見出した。そして、これを用いて宿主を形質転換したところ、形質転換体では中鎖脂肪酸又はこれを含むトリアシルグリセロールの生産性が有意に向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち本発明は、下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう。）に関する。
（１）宿主に下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【０００９】
また、本発明は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質（以下、「本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」ともいう。）、及び当該タンパク質をコードする遺伝子（以下、「本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子」ともいう。）に関する。
【００１０】
また、本発明は、宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体は、脂質、特に中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産能に優れる。当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、脂質、特に中鎖脂肪酸及びこれらを構成成分とする脂質を生産することができる。
本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、脂質、特に中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を用いて、近隣結合法（NJ法）により作製した系統樹である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、脂質には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
また本発明で、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において、Ｃｘ：ｙとあるのは炭素原子数ｘで二重結合の数がｙであることを表し、Ｃｘは炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基であることを表す。
以下、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、これを用いた形質転換体、及び脂質の製造方法について順に説明する。
【００１４】
１．ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。具体的に、本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼには、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が包含される。
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
【００１５】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、単子葉植物のココヤシ（Cocos nucifera）由来の新規ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである。
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ、ＤＧＡＴ）は、トリアシルグリセロール合成の最終段階に関与する酵素である。植物や藻類では、葉緑体にある脂肪酸合成系において各種アシル−ＡＣＰが合成され、このアシル−ＡＣＰから酵素アシル−ＡＣＰチオエステラーゼによって遊離脂肪酸が切り出される。遊離脂肪酸はアシル−ＣｏＡに変換されて、トリアシルグリセロール合成系に供される。トリアシルグリセロール合成系では、アシル−ＣｏＡのアシル基が、グリセロール骨格に導入される。最終段階では、ジアシルグリセロールにアシル−ＣｏＡからアシル基が転移してトリアシルグリセロールが合成される。この反応を触媒する酵素がＤＧＡＴである。
このようにトリアシルグリセロールは、グリセロール骨格に３つのアシル基（脂肪酸残基）が導入されてなるが、導入されるアシル基の種類（炭素数及び不飽和度）は多岐にわたる。グリセロール骨格にどのような炭素数・不飽和度を有したアシル基を導入するかを決めているのは、各反応工程で働くアシルトランスフェラーゼであると考えられている。すなわち、トリアシルグリセロール合成の最終段階では、ＤＧＡＴの基質特異性によって、ジアシルグリセロールに結合する脂肪酸アシル−ＣｏＡの種類が変わると考えられている。
【００１６】
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有する。本発明において、タンパク質の「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」とは、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）をアシル化してトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）に変換する活性をいう。
なお、タンパク質がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有することは、トリアシルグリセロール合成遺伝子欠損株を用いた系により確認することができる。トリアシルグリセロール合成遺伝子欠損株の一例としては、実施例で用いた酵母のΔdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株が挙げられる。目的タンパク質をコードする遺伝子を当該欠損株において発現させ、トリアシルグリセロールの生成が確認されれば、当該タンパク質はジアシルグリセロールアシルトランスフェラ−ゼ活性を有すると判断できる。
【００１７】
前記（Ａ）のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、後述の実施例で示されているように、ジアシルグリセロールにＣ１２：０アシル基（ラウロイル基）又はＣ１４：０アシル基（ミリストイル基）を優先的に取り込む性質を持つ。すなわち、中鎖アシル−ＣｏＡに対して基質特異性を示すジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである。
本発明において「中鎖アシル−ＣｏＡ特異的」なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼとは、基質として中鎖アシル−ＣｏＡを、それ以外のアシル−ＣｏＡよりも優先的に利用する、すなわち、中鎖アシル−ＣｏＡ由来のアシル基を優先的にジアシルグリセロールに転移する性質を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである。以下、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを、中鎖特異的ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼともいう。
また、本発明において、中鎖脂肪酸、中鎖アシル−ＣｏＡ、中鎖アシル−ＡＣＰにおける中鎖とは、アシル基の炭素数が６以上１４以下であることをいう。
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの中鎖アシル−ＣｏＡ特異性については、例えば、宿主細胞にジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子及びアシル−ＣｏＡを生産するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を導入し、これらの導入遺伝子が発現する条件で細胞を培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析する方法、または精製したジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼタンパク質と、アシル−ＣｏＡ及びジアシルグリセロールとを混合して反応させた溶液から薄層クロマトグラフィー法などによりトリアシルグリセロールを単離し、トリアシルグリセロール中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析する方法により確認することができる。
【００１８】
中鎖脂肪酸の生産性向上の観点から、（Ｂ）のタンパク質も、中鎖特異的ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質であることが好ましい。
（Ｂ）において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の点から、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９３％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましく、９７％以上であることが特に好ましい。
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法（Science，227，1435，（1985））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（homology  search）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１９】
（Ｂ）のタンパク質のアミノ酸配列として、配列番号１のアミノ酸配列に変異を導入したアミノ酸配列、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列も好ましい。１又は数個の変異アミノ酸は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の点から、１〜２０個であることが好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個がよりさらに好ましく、１〜２個が特に好ましい。
アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
【００２０】
上述したタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ココヤシから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を用いることができる。
【００２１】
２．ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子
本発明のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の例として、配列番号２に示す塩基配列が挙げられる。配列番号２に示す塩基配列は、ココヤシ由来の野生型ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。
【００２２】
（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が例示できるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（ａ）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
後述の実施例に示すように、（ａ）のＤＮＡからなる遺伝子は、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子も、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることが好ましい。
【００２３】
（ｂ）において、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の点から、配列番号２で表される塩基配列との同一性は、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９３％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがよりさらに好ましく、９７％以上であることが特に好ましい。
【００２４】
また、（ｂ）の塩基配列として、配列番号２の塩基配列に変異を導入した塩基配列、すなわち、配列番号２の塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列も好ましい。１又は数個の変異塩基は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性の点から、１〜２０個であることが好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個がよりさらに好ましく、１〜２個が特に好ましい。
【００２５】
塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR反応（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２６】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２に示す塩基配列に基づいて、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子を人工合成により取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ココヤシからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００２７】
３．アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ
本発明の形質転換体は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子と共に、脂質や脂肪酸の合成に関与する他の酵素をコードする遺伝子を共導入してなることが好ましい。脂質や脂肪酸の合成に関与する他の酵素としては、例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが挙げられる。
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは脂肪酸合成の出発反応に関与し、アセチル−ＣｏＡとＣＯ２との縮合反応により、マロニル−ＣｏＡを生成する。マロニル−ＣｏＡは、ＡＣＰ(アシルキャリアプロテイン)に転移され、マロニル−ＡＣＰを生じる。
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼは、脂肪酸合成経路においてアシル基の鎖長制御に関与する酵素である。植物の脂肪酸合成経路は葉緑体に局在し、マロニル−ＡＣＰを利用して炭素鎖の伸長反応を繰り返し、種々の鎖長のアシル−ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とＡＣＰとからなる複合体）が合成される。
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、脂肪酸合成系で合成されたアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する酵素である。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
宿主にＤＧＡＴ遺伝子とともにこれらの酵素をコードする遺伝子を導入することで、形質転換体の脂質や脂肪酸生産性を一層向上させることができる。
【００２８】
特に、本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子が共導入されていることが好ましい。
本発明で用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であればよい。本発明において、「アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する」とは、アシル−ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性を有することをいう。
【００２９】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、基質であるアシル−ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
上述のように、前記（Ａ）のタンパク質は、中鎖特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼであるため、共導入するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼも、中鎖アシル−ＡＣＰに特異的なチオエステラーゼ（以下、「中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ」という）が好ましい。本発明において「中鎖アシル−ＡＣＰ特異的」なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼとは、炭素数６〜１４のアシル−ＡＣＰのチオエステル結合を選択的に加水分解する活性を有するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである。このようなアシル−ＡＣＰチオエステラーゼを用いることで、中鎖脂肪酸の生産性を一層向上させることができる。
【００３０】
本発明では、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼとして、公知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼや、それらと機能的に均等なタンパク質を用いることができる。用いるアシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、宿主の種類等に応じて適宜選択することができる。
具体的には、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAA34215.1）；Cuphea calophylla  subsp.  mesostemonアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABB71581）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照、配列番号３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４）；Cinnamomum camphoraアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAC49151.1）；Myristica fragransアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71729）；Myristica fragransアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71730）；Cuphea lanceolataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAA54060）；Cuphea hookerianaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  Q39513）；Ulumus americanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71731）；Sorghum bicolorアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EER87824）；Sorghum bicolorアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EER88593）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CnFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB1：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB2：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Cuphea viscosissimaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（CvFatB3：Jing  et  al.  BMC  Biochemistry  2011,  12:44参照）；Elaeis guineensisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAD42220）；Desulfovibrio vulgarisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ACL08376）；Bacteriodes fragilisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAH09236）；Parabacteriodes distasonisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABR43801）；Bacteroides thetaiotaomicronアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAO77182）；Clostridium asparagiformeアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EEG55387）；Bryanthella formatexigensアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EET61113）；Geobacillus  sp.アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EDV77528）；Streptococcus dysgalactiaeアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  BAH81730）；Lactobacillus brevisアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABJ63754）；Lactobacillus plantarumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAD63310）；Anaerococcus tetradiusアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  EEI82564）；Bdellovibrio bacteriovorusアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAE80300）；Clostridium thermocellumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  ABN54268）；Nannochloropsis oculataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号５、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号６）；Nannochloropsis gaditanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号７、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号８）；Nannochloropsis granulataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号９、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１０）；Symbiodinium microadriaticumアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号１１、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号１２）、等が挙げられる。
また、これらと機能的に均等なタンパク質として、上述したいずれかのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質も用いることができる。
【００３１】
上述したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの中でも、中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが好ましく、Cocos nuciferaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（配列番号３、これをコードする遺伝子の塩基配列：配列番号４）、Umbellularia californicaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAA34215.1）、Cuphea lanceolataアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  CAA54060）、Cuphea hookerianaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  Q39513）、Ulumus americanaアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（GenBank  AAB71731）、又はこれらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列と５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質が好ましい。
これらのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びそれらをコードする遺伝子の配列情報等は、例えば、国立生物工学情報センター（National  Center  for  Biotechnology  Information,  NCBI）などから入手することができる。
【００３２】
タンパク質がアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性又は中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を宿主細胞へ導入し、導入したアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan  L,  Voelker  TA,  Hawkins  DJ.  “Modification  of  the  substrate  specificity  of  an  acyl-acyl  carrier  protein  thioesterase  by  protein  engineering”  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  1995  Nov  7;92(23),  p.10639-10643）によって調製した各種アシル−ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
【００３３】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、及びそれらをコードする遺伝子の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、各アミノ酸又は塩基配列に基づいて、人工的に合成することができる。また、生物から通常の方法に従って単離してもよい。遺伝子クローニングは、例えば、Molecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W.  Russell，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
【００３４】
４．形質転換体（組換え体）
本発明の形質転換体は、宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して得られる。当該形質転換体では、宿主に比べ、中鎖脂肪酸又はそのエステル、及びこれらを構成成分とする脂質の生産能が有意に向上する。また、当該形質転換体では、宿主に比べ、中鎖脂肪酸含有量の高いトリアシルグリセロールを生産できる。また、当該形質転換体では、脂質中の脂肪酸組成が宿主に比べ改変される。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００３５】
本発明の形質転換体は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。本発明の形質転換体は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主に共導入したものであることが好ましい。具体的には、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
【００３６】
アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、好ましくは中鎖特異的アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入した形質転換体も、同様にして作製することができる。
【００３７】
形質転換体の宿主としては特に限定されず、微生物、植物体、又は動物体を用いることができる。なお、本発明において微生物には藻類や微細藻類が含まれる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、植物であることがより好ましい。
前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよい。
原核生物として、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物やバシラス（Bacillus）属に属する微生物等を用いることができる。
真核微生物として、酵母や糸状菌等を用いることができ、サッカマイセス(Saccharomyces)属、クリベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属、又はモルチエラ（Mortierella）属に属する微生物を用いることが好ましい。なかでも、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、赤色酵母（Rhodosporidium toruloides）、またはモルチエラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
【００３８】
また、前記微生物としては、微細藻類も好ましい。前記微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。
前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、スナモモ、ダイズ、トウモロコシ、イネ、ヒマワリ、クスノキ、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
【００３９】
発現ベクターの母体となるベクターとしては、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子やアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現可能なベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）  II  SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.  et  al.,（1986）,Plasmid  15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript  II  SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas  Center）、P-322（Chlamydomonas  Center）、pPha-T1（Yangmin  Gong,  Xiaojing  Guo,  Xia  Wan,  Zhuo  Liang,  Mulan  Jiang,  “Characterization  of  a  novel  thioesterase  （PtTE）  from  Phaeodactylum  tricornutum”,  Journal  of  Basic  Microbiology,  2011  December,  Volume  51,  p.666-672.参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。
植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
【００４０】
発現ベクターや遺伝子発現カセットに用いるプロモーターやターミネーター等の発現調節領域や選択マーカーの種類も特に限定されず、通常使用されるプロモーターやマーカー等を導入する宿主の種類に応じて適宜選択して用いることができる。
具体的なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、又はナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーターが挙げられる。
また、選択マーカーとしては、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子）等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
【００４１】
上記ベクターに前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子やアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって組み込むことにより形質転換に用いる発現ベクターを構築することができる。
形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS  Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu及びJ．Sekiguchi，Archives  of  Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu及びH．Taguchi，Bioscience，Biotechnology，and  Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主が植物の場合、アグロバクテリウムを用いた方法(C.  R.  Acad.  Sci.  Paris.  Life  Science  316,  1194(1993)等)、パーティクルガン法(BioRad社PDS-1000/He等)等を用いることができる。
【００４２】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４３】
５．脂質の製造方法
次いで、上記で得られた形質転換体を用いて脂質を生産する。
本発明の製造方法は、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体から脂質を採取する工程を含む。当該工程は、脂質の生産性向上の観点から、前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養液はもちろん、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
【００４４】
培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
【００４５】
一例として、酵母を宿主として用いた形質転換体の場合、ＹＰＧ培地又はＳＤ培地で、２５〜３２℃、０．５〜１日間培養を行うことが挙げられる。また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０〜２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１〜２か月間栽培を行うことが挙げられる。
【００４６】
形質転換の宿主が藻類の場合、以下の培地及び培養条件を用いることができる。
培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。藻類の生育促進、中鎖脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
【００４７】
形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００４８】
本発明の製造方法を用いることで、脂質、特に中鎖脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質を効率的に生産することができる。
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質であることが好ましく、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質であることがより好ましい。
中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質として好ましくは中鎖脂肪酸のエステルである。具体的には中鎖アシル基を有するトリアシルグリセロールが好ましい。
さらに界面活性剤等への利用性から、中鎖脂肪酸又はそのエステルは、炭素原子数１２又は１４の脂肪酸又はそのエステルがより好ましく、炭素数１２の脂肪酸又はそのエステルがさらに好ましく、ラウリン酸又はそのエステルが特に好ましい。これらの高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として利用できる。
【００４９】
本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００５０】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。
【００５１】
＜１＞
下記（１）及び（２）の工程を含む脂質の製造方法。
（１）宿主に下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程
（Ａ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）  配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質
（２）得られた形質転換体から脂質を採取する工程
【００５２】
＜２＞
前記（Ｂ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上である、＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである、＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞
前記脂質が、中鎖脂肪酸又はそのエステルである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜５＞
前記工程（１）において、宿主にアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜６＞
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、＜５＞項記載の製造方法。
＜７＞
前記宿主が微生物又は植物である、＜１＞〜＜６＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜８＞
前記植物がシロイヌナズナである、＜７＞項記載の製造方法。
＜９＞
前記微生物が酵母である、＜７＞項記載の製造方法。
＜１０＞
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、＜９＞項記載の製造方法。
【００５３】
＜１１＞
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
＜１２＞
前記（Ｂ）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上である、＜１１＞項記載のタンパク質。
＜１３＞
前記（Ｂ）のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列である、＜１１＞又は＜１２＞項記載のタンパク質。
＜１４＞
前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質が、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼである、＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載のタンパク質。
【００５４】
＜１５＞
＜１１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜１６＞
下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
＜１７＞
前記（ｂ）において、配列番号２で表される塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上である、＜１６＞項記載の遺伝子。
＜１８＞
前記（ｂ）の塩基配列が、配列番号２の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、よりさらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列である、＜１６＞又は＜１７＞項記載の遺伝子。
＜１９＞
前記（ａ）又は（ｂ）の遺伝子が、中鎖アシル−ＣｏＡ特異的なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である、＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１項記載の遺伝子。
【００５５】
＜２０＞
宿主に、＜１５＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の遺伝子を導入して得られる形質転換体。
＜２１＞
宿主に＜１５＞〜＜１９＞のいずれか１項記載の遺伝子、及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を共導入して得られる、＜２０＞項記載の形質転換体。
＜２２＞
前記アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、中鎖アシル−ＡＣＰ特異的なアシル−ＡＣＰチオエステラーゼである、＜２１＞項記載の形質転換体。
＜２３＞
前記宿主が微生物又は植物である、＜２０＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の形質転換体。
＜２４＞
前記植物がシロイヌナズナである、＜２３＞項記載の形質転換体。
＜２５＞
前記微生物が酵母である、＜２３＞項記載の形質転換体。
＜２６＞
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である、＜２５＞項記載の形質転換体。
【００５６】
＜２７＞
宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、脂質中の脂肪酸組成を改変する方法。
【００５７】
＜２８＞
宿主に前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、脂質の生産性を向上させる方法。
＜２９＞
前記脂質が中鎖脂肪酸又はそのエステルである、＜２８＞項に記載の方法。
【００５８】
＜３０＞
宿主に前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を導入して形質転換する工程を含む、形質転換体の産生するトリアシルグリセロール中の中鎖脂肪酸含有量を向上させる方法。
【００５９】
＜３１＞
脂質を製造するための、＜２０＞〜＜２６＞のいずれか１項に記載の形質転換体の使用。
＜３２＞
前記脂質が中鎖脂肪酸又はそのエステルである、＜３１＞項に記載の形質転換体の使用。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６１】
実施例で用いたプライマーを表１−１、表１−２に示す。
【００６２】
【表１−１】
0006520008.tif 000002
【００６３】
【表１−２】
0006520008.tif 000003
【００６４】
実施例１  ココヤシ由来ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼを導入したシロイヌナズナ形質転換体の作製、及び脂質生産性の評価
１．ココヤシのRNA抽出
ココヤシ固形胚乳を液体窒素で凍結した後、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて破砕した。破砕した固形胚乳に対してフェノール／クロロホルム、50mM  Tris-HCl  （pH9）を添加しよく混ぜ、7500rpmで10分間遠心操作を行い、上清を回収した。回収した上清に再度同様のフェノール／クロロホルム処理を行った。上層を回収し、これに対してエタノール沈殿操作を行い、そこに含まれる核酸成分を精製した。RNA成分の精製のために、RNeasy  Plant  Mini  Kit  （Qiagen,  Valencia,  California製）を用いた。エタノール沈殿後の核酸ペレットに、1M  DTTを1/100容量添加したRLT  Bufferを加えてボルテックスしたものを、QIA  shredder  spin  columnにアプライした。以降はキット添付のマニュアルに従って操作を行い、最終的に脱イオン水（dH2O）でココヤシ由来のtotal  RNAを溶出した。得られたRNA溶液に対し、DNaseI（サーモサイエンティフィック製）をバッファーとともに添加し、1時間37℃にて処理を行った。その後、フェノール／クロロホルム処理・エタノール沈殿処理を行い、ココヤシ胚乳由来RNA溶液とした。
続いて、PrimeScript  II  1st  strand  cDNA  Synthesis  Kit（タカラバイオ製）を用いて、得られたRNAからcDNAを調製した。
【００６５】
２．ココヤシ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
茨城県潮来市で採取した野生のアブラナ様植物から、Brassica rapa由来の  Napin遺伝子プロモーターを、栃木県益子町で採取した野生のアブラナ様植物から、Napin遺伝子ターミネーターをそれぞれ取得した。PowerPlant  DNA  Isolation  Kit（MO  BIO  Laboratories製,  USA）を用いて、野生のアブラナ様植物のゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAをテンプレートとし、DNAポリメラーゼPrimeSTAR（タカラバイオ製）を用いたPCR反応により、上記プロモーターとターミネーター領域を増幅した。具体的には、プライマーNo.1とNo.2を用いてBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターを、プライマーNo.3とNo.4を用いてBrassica rapa由来のNapin遺伝子ターミネーターをそれぞれ増幅した。増幅が見られたPCR産物をテンプレートとし、Napin遺伝子プロモーターはプライマーNo.5とNo.6、Napin遺伝子ターミネーターはプライマーNo.3とNo.7を用いて、再度PCR反応を行った。Napin遺伝子プロモーター配列を配列番号１４、Napin遺伝子ターミネーター配列を配列番号１５に示す。これらの増幅断片をMighty  TA-cloning  Kit（タカラバイオ製）で処理した後、pMD20-Tベクター（タカラバイオ製）にライゲーション反応により挿入することで、Napin遺伝子プロモーターを含むプラスミドpPNapin1、およびNapin遺伝子ターミネーターを含むプラスミドpTNapin1をそれぞれ構築した。
【００６６】
植物導入用ベクターとして、pRI909ベクター（タカラバイオ製）を用いた。pRI909ベクターに、下記の手順でBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターとNapin遺伝子ターミネーターを導入した。プラスミドpPNapin1をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.8とNo.9を用いたPCR反応により、両末端に制限酵素認識配列を付加したプロモーター配列を増幅した。また、プラスミドpTNapin1をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.10とNo.11を用いたPCR反応によりターミネーター配列を増幅した。増幅産物は、Mighty  TA-cloning  Kit（タカラバイオ製）を用いて処理した後、pMD20-Tベクターにライゲーション反応により挿入し、プラスミドpPNapin2及びプラスミドpTNapin2をそれぞれ構築した。プラスミドpPNapin2を制限酵素Sal  IとNot  Iで、プラスミドpTNapin2を制限酵素Sma  IとNot  Iでそれぞれ処理し、Sal  IとSma  Iで処理したpRI909ベクターにライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapinを構築した。
次に、カリフォルニア・ベイ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、BTEとも略記する）遺伝子の葉緑体移行シグナルペプチドをコードする遺伝子配列（配列番号１６）を、Invitrogen社（Carlsbad,  California）の提供する受託合成サービスを利用して取得した。取得した配列を含むプラスミドをテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.12とNo.13を用いたPCR反応により、シグナルペプチドをコードする遺伝子断片を増幅した。Mighty  TA-cloning  Kit（タカラバイオ製）を用いて、増幅した遺伝子断片の両末端にデオキシアデニン（dA）を付加した後、pMD20-Tベクター（タカラバイオ製）にライゲーション反応により挿入し、プラスミドpSignalを構築した。
プラスミドpSignalを制限酵素Not  Iで処理し、プラスミドp909PTnapinのNot  Iサイトにライゲーション反応で連結し、プラスミドp909PTnapin-Sを得た。
【００６７】
前記で調製したココヤシ胚乳由来のcDNAをテンプレートとし、制限酵素PrimeSTAR  MAX（タカラバイオ製）、プライマーNo.14とNo.15を用いたPCR反応により、ココヤシ由来のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、CTEとも略記する）をコードする遺伝子配列（配列番号４）を増幅した。また、p909PTnapin-Sをテンプレートとし、プライマーNo.16とNo.17を用いて、p909PTnapin-Sを直鎖状断片として増幅した。CTE遺伝子断片とp909PTnapin-S断片とを、In-Fusion  Advantage  PCR  Cloning  Kit（クロンテック製）を用いたIn-fusion反応により連結し、植物導入用プラスミドp909CTEを構築した。当該プラスミドは、CTE遺伝子がBrassica rapa由来のNapin遺伝子プロモーターにより発現制御され、BTE遺伝子由来の葉緑体移行シグナルペプチドによって葉緑体へと移行するよう設計された。
【００６８】
３．ココヤシ由来ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子
下記の手順により、植物導入用ベクターpRI909が本来保持するカナマイシン耐性遺伝子を、Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子（Bar遺伝子）に置換した。Bar遺伝子は、ホスフィノトリシンアセチル転移酵素をコードする。Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子は、NCBIのGene  Bankで開示された形質転換用ベクターpYW310（ACCESSION  NO.  DQ469641）の配列を参考に、Gene  Script社の提供する受託合成サービスを利用して取得した（配列番号１７）。人工合成遺伝子をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.18とNo.19を用いたPCR反応により、Bar遺伝子配列を増幅した。一方、pRI909をテンプレートとし、PrimeSTAR、プライマーNo.20とNo.21を用いたPCR反応により、pRI909ベクターからカナマイシン耐性遺伝子を除いた領域を増幅した。両増幅断片をNde  IとSpe  Iで処理し、ライゲーション反応で連結して、プラスミドpRI909  Barを構築した。
【００６９】
西洋アブラナ（Brassica napus）の種子で発現するBrassica napus  Oleosinプロモーター（配列番号１８）を取得した。西洋アブラナより取得したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、プライマーNo.22とNo.23を用いて、Brassica napus  Oleosinプロモーター配列を増幅した。また、プラスミドpRI909  Barをテンプレートとし、プライマーNo.24とNo.25のプライマーを用いて、pRI909  Barの直鎖状断片を増幅した。さらに、プラスミドp909CTEをテンプレートとし、プライマーNo.26とNo.27を用いて、CTE-Tnapin配列を増幅した。これらの増幅産物を、前記と同様にIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909Poleosin-CTE-Tnapinを構築した。
【００７０】
プラスミドp909Poleosin-CTE-Tnapinをテンプレートとし、プライマーNo.28とNo.29を用いて、CTE遺伝子領域を含まないp909Pnapus-Tnapinの直鎖状断片を増幅した。さらに、ココヤシ胚乳由来cDNAをテンプレートとし、プライマーNo.30とNo.31を用いて、配列番号２に示すCnDGAT2096遺伝子を増幅した。得られた増幅産物を、前記と同様にIn-fusion反応により連結し、プラスミドp909Poleosin-DGAT2096-Tnapinを構築した。
【００７１】
４．シロイヌナズナの形質転換
前記で構築したプラスミドp909CTEを、インプランタイノベーションズ（株）によるシロイヌナズナ形質転換受託サービスに供し、CTE遺伝子を導入したシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana，  Colombia株）の形質転換体を得た。シロイヌナズナは、野生型及び形質転換体を、室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間（約4000ルクス）の条件で育成した。約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
【００７２】
次に、p909CTEを導入したシロイヌナズナ形質転換体を親株として、以下の形質転換体を作成した。
プラスミドp909Poleosin-DGAT2096-TnapinをAgrobacterium tumefaciens  GV3101株に導入し、これを用いてp909CTEを導入したシロイヌナズナを形質転換した。播種後1.5ヶ月程度育成したシロイヌナズナの花序を切除し、さらに6〜7日間育成したものに、プラスミドを導入したアグロバクテリウムを感染させた。得られた種子を、MS寒天培地（100μg/mlクラフォラン、7μg/mlビアラフォスを含む）に播種し、形質転換体を選抜した。得られた形質転換体を室温22℃、蛍光灯照明を用いて明期24時間の条件で育成し、約2ヶ月の栽培の後、種子を収穫した。
【００７３】
５．脂質の抽出とメチルエステル化
シロイヌナズナ種子を、マルチビーズショッカー（安井器械製）を用いて粉砕し、そこに20μlの7-ペンタデカノン（0.5mg/ml  メタノール）（内部標準）と20μlの酢酸を添加したクロロホルム0.25ml、メタノール0.5mlを加え、十分に攪拌した後、15分間静置した。さらに、1.5％KCl  0.25mlとクロロホルム0.25mlを添加し、十分に攪拌した後、15分間静置した。室温、1500rpmで5分間遠心分離を行った後、下層部分を採取し、窒素ガスで乾燥した。乾燥したサンプルに、0.5Ｎ水酸化カリウム−メタノール溶液を100μl加え、70℃で30分間恒温することによりトリアシルグリセロールを加水分解した。3‐フッ化ホウ素メタノール錯体溶液を0.3ml添加して乾燥物を溶解し、80℃で10分間恒温することにより脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、飽和食塩水0.2mlとヘキサン0.3mlを添加し、十分に攪拌した後、30分間静置した。脂肪酸のメチルエステルが含まれるヘキサン層（上層部分）を採取し、ガスクロマトグラフィ（GC）分析に供した。
【００７４】
６．GC分析
GCによりメチルエステル化した試料の分析を行った。使用したGCは、カラム：DB1-MS  （J&W  Scientific,  Folsom,  California）、分析装置：6890  （Agilent  technology,  Santa  Clara,  California）を用いて、[カラムオーブン温度：150℃保持0.5分→150〜320℃（20℃/分昇温）→320℃保持2分、注入口検出器温度：300℃、注入法：スプリットモード（スプリット比=75:1）、サンプル注入量5μl、カラム流速：0.3ml/min  コンスタント、検出器：FID、キャリアガス：水素、メイクアップガス：ヘリウム]の条件で行った。
GC解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。なお、種子中の各脂質に対応するGCのピークは、各脂肪酸の標準品のメチルエステルの保持時間（Retention  Time,  RT）により同定した。また、各ピーク面積を内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、解析に供した全種子中に含まれる脂肪酸量を算出した。
各形質転換シロイヌナズナ種子における、総脂肪酸中の各脂肪酸の割合を表２に示す。なお、表２は、独立した３ラインの平均値を示した。また、Ｃ１８：ｎは、Ｃ１８不飽和脂肪酸(Ｃ１８：１〜Ｃ１８：３)の総計を表す。
【００７５】
【表２】
0006520008.tif 000004
【００７６】
表２に示すように、野生型の種子に比べ、CTE遺伝子のみを導入した形質転換体の種子ではＣ１２：０脂肪酸が約３％、Ｃ１４：０脂肪酸が約１３％、Ｃ１６：０脂肪酸が約１５％増加した。
CTE遺伝子とCnDGAT2096遺伝子を共導入した形質転換体の種子では、CTE遺伝子のみを発現する形質転換体の種子に比べ、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸の含有率が増加した。一方、Ｃ１６：０脂肪酸の含有率は変化が見られなかった。これらの結果から、CnDGAT2096遺伝子がコードするタンパク質は、CTEにより増加したＣ１２：０、Ｃ１４：０及びＣ１６：０脂肪酸を均等にトリアシルグリセロールへと導入しているのではなく、Ｃ１２：０脂肪酸とＣ１４：０脂肪酸を選択的にトリアシルグリセロールに導入していると考えられる。
【００７７】
実施例２  ココヤシ由来ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの基質特異性の検証
１．酵母トリアシルグリセロール合成遺伝子欠損株の作製
酵母（Saccharomyces cerevisiae）のトリアシルグリセロール合成遺伝子を全て欠損させた株を下記の手順により取得した。トリアシルグリセロール合成遺伝子は、文献（Line  Sandager,  et  al.,  J  Biol  Chem.  Feb  22;277(8):6478-82,  2002）情報を参考に、DGA1、LRO1、ARE1、ARE2遺伝子を標的とした。遺伝子欠損はアミノ酸マーカー遺伝子をＤＮＡ断片として用いた相同組み換えによる一般的な手法で行った。
【００７８】
Saccharomyces cerevisiae  S288C株のコロニーを、YPD培地5ml、30℃、160rpmの条件で24時間培養した。得られた菌体に対してGenとるくん（酵母用）High  Recovery(タカラバイオ社製)を用い、ゲノムＤＮＡの抽出及び精製を行った。
【００７９】
トリアシルグリセロール合成遺伝子を破壊するためのプラスミドを構築した。上記で得られたSaccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーNo.32及びNo.33を用いたＰＣＲ反応により、HIS3遺伝子のＯＲＦ上流３５０ｂｐ〜下流２５０ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマーNo.34及びNo.35、又はプライマーNo.36及びNo.37を用いたＰＣＲ反応によりARE1遺伝子上流５００ｂｐの領域、又は下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。また、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、プライマーNo.38及びNo.39を用いたＰＣＲ反応により、pUC19ベクターを増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）処理により鋳型の消化を行った。これらの断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した後に、In-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ΔARE1プラスミドを得た。
同様に、プライマーNo.40及びNo.41を用いたＰＣＲ反応により、LEU2遺伝子のＯＲＦ上流７００ｂｐ〜下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマーNo.42及びNo.43、又はプライマーNo.44及びNo.45を用いたＰＣＲ反応により、ARE2遺伝子上流５００ｂｐ、又は下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。得られた遺伝子断片を、ΔARE1プラスミドと同様にpUC19ベクターに接続し、ΔARE2プラスミドを得た。
続いて、プライマーNo.46及びNo.47を用いたＰＣＲ反応により、MET15遺伝子のＯＲＦ上流３００ｂｐ〜下流３００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマーNo.48及びNo.49、又はプライマーNo.50及びNo.51を用いたＰＣＲ反応により、LRO1遺伝子上流５００ｂｐ、又は下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。得られた遺伝子断片を、ΔARE1プラスミドと同様にpUC19ベクターに接続し、ΔLRO1プラスミドを得た。
ΔARE1プラスミドを鋳型として、プライマーNo.34及びNo.37を用いたＰＣＲ反応により、遺伝子断片を取得した。これを用いて、酢酸リチウム法により、Saccharomyces cerevisiae  BY4741ΔDGA1株（ΔDGA1::kanMX  his3Δ1  leu2Δ0  met15Δ0  ura3Δ0）（Yeast  Knock  Out  Strain  Collection：Open  Biosystems）を形質転換した。得られた株を、ΔARE2プラスミドを鋳型としプライマーNo.42及びNo.45を用いたＰＣＲ反応により取得した遺伝子断片を用いて、上記と同様の手法で形質転換した。得られた株をさらに、ΔLRO1プラスミドを鋳型としてプライマーNo.48及びNo.51を用いたＰＣＲ反応により取得した遺伝子断片を用いて、形質転換した。その結果、Saccharomyces cerevisiae  Δdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株を得た。
【００８０】
２．酵母Δdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株へのＤＧＡＴ遺伝子導入
（１）ＤＧＡＴ遺伝子発現プラスミドの構築
Saccharomyces cerevisiaeのゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマーNo.52及びNo.53を用いたＰＣＲ反応により、URA3遺伝子のＯＲＦ上流３００ｂｐからＯＲＦ終止コドンまでの領域の遺伝子断片を、プライマーNo.54及びNo.55を用いたＰＣＲ反応により、CYC1遺伝子のＯＲＦ下流５００ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマーNo.56及びNo.57を用いたＰＣＲ反応により、GAL1遺伝子のＯＲＦ上流５０ｂｐの領域の遺伝子断片を、プライマーNo.58及びNo.59を用いたＰＣＲ反応により、URA3遺伝子のＯＲＦ下流２００ｂｐの領域の遺伝子断片をそれぞれ取得した。
配列番号１３に示すシロイヌナズナ由来のDGAT遺伝子（AtDGAT1遺伝子）を人工遺伝子の受託合成サービスを利用して取得し、プライマーNo.60及びNo.61を用いたＰＣＲ反応により、AtDGAT1遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片をpUC19ベクターに接続し、AtDGAT1遺伝子発現プラスミドpUC-URAm-GAL1p-AtDGAT1を構築した。
また、実施例１で作製したココヤシcDNAをテンプレートとし、プライマーNo.62及びNo.63を用いたＰＣＲ反応により、ココヤシ由来のDGAT遺伝子（CnDGAT2096遺伝子、配列番号２）断片を取得した。得られた遺伝子断片をpUC19ベクターに接続し、CnDGAT2096遺伝子発現プラスミドpUC-URAm-GAL1p-CnDGATを構築した。
これらのプラスミドは、URA3プロモーター配列、URA3遺伝子断片、CYC1ターミネーター配列、GAL1プロモーター配列、各種DGAT遺伝子配列、及びURA3ターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列とからなる。
なお、配列番号１３に示すAtDGAT1遺伝子の塩基配列は、配列番号２に示すCnDGAT2096遺伝子の塩基配列と６８％の同一性を示す。また、配列番号１３の塩基配列がコードするアミノ酸配列は、配列番号１に示すCnDGAT2096のアミノ酸配列と６６％の同一性を示す。
【００８１】
（２）形質転換株の取得
プラスミドpUC-URAm-GAL1p-AtDGAT1を鋳型とし、プライマーNo.52及びNo.59を用いてＰＣＲを行った。得られた増幅ＤＮＡ断片を用いて、酢酸リチウム法によりSaccharomyces cerevisiae  Δdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株を形質転換し、+AtDGAT1株を得た。
同様にpUC-URAm-GAL1p-CnDGATを鋳型とし、プライマーNo.52及びNo.59を用いてＰＣＲを行うことでSaccharomyces  cerevisiae  Δdga1、Δlro1、Δare1、Δare2株を形質転換し、+CnDGAT株を得た。
各形質転換株を、Yeast  Nitrogen  base  w/o  Amino  Acid  0.67%、Raffinose  2%からなる液体培地20ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液を遠心分離し、菌体を回収した。菌体をＯＤ６００＝１となるよう、Yeast  Nitrogen  base  w/o  Amino  Acid  0.67%、Galactose  2%からなる液体培地（Ｂｒｉｊｉ  ５８（シグマアルドリッチ社製）１％添加、及びラウリン酸またはミリスチン酸を２ｍＭ含有）20  mlに植菌した。２４時間、３０℃で培養した後、遠心分離によって菌体を集菌し、水洗後、凍結乾燥した。
【００８２】
（３）脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
凍結乾燥菌体を、８ｍＬのクロロホルム・メタノール溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）に懸濁し、薄層クロマトグラフィーを行い、脂質を分画した。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０  プレート（メルク製）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：蟻酸＝４２：２４：０．３の条件で行った。０．０１％プリムリン（メタノール中に溶解）を噴霧し、ＵＶ照射して脂質を可視化した。
次いで、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）画分のみをかきとり、かきとったシリカ粒子をＫＯＨと３−フッ化ホウ素メタノールによってメチルエステルに誘導し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分間恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）を添加し、８０℃にて１０分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー（GC）分析に供した。
【００８３】
GC分析
脂肪酸メチルエステル試料をGCにて分析した。使用したGCは、カラム：DB1-MS  （J&W  Scientific,  Folsom,  California）、分析装置：6890  （Agilent  technology,  Santa  Clara,  California）を用いて、[カラムオーブン温度：150℃保持0.5分→150〜320℃（20℃/分昇温）→320℃保持2分、注入口検出器温度：300℃、注入法：スプリットモード（スプリット比=75:1）、サンプル注入量5μl、カラム流速：0.3ml/min  コンスタント、検出器：FID、キャリアガス：水素、メイクアップガス：ヘリウム]の条件で行った。
GC解析により得られた波形データのピーク面積より、実施例１と同様に、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。形質転換体から抽出したトリアシルグリセロール中の脂肪酸組成を、表３及び表４に示す。表３は各形質転換株をラウリン酸（Ｃ１２：０）含有培地で培養した結果であり、表４は各形質転換株をミリスチン酸（Ｃ１４：０）含有培地で培養した結果である。
【００８４】
【表３】
0006520008.tif 000005
【００８５】
【表４】
0006520008.tif 000006
【００８６】
表３から明らかなように、CnDGAT2096遺伝子を導入した株では、AtDGAT1遺伝子を導入した株と比べて、トリアシルグリセロール中のＣ１２：０脂肪酸の含有量が増加していた。この結果から、CnDGAT2096遺伝子は、Ｃ１２：０アシル基をジアシルグリセロールに選択的に導入してトリアシルグリセロールを合成していることがわかった。
また、表４から明らかなように、CnDGAT2096遺伝子を導入した株では、AtDGAT1遺伝子を導入した株と比べて、トリアシルグリセロール中のＣ１４：０脂肪酸の含有量が増加していた。この結果から、CnDGAT2096遺伝子は、Ｃ１４：０アシル基をジアシルグリセロールに選択的に導入してトリアシルグリセロールを合成していることがわかった。
【００８７】
実施例３  DGAT遺伝子のアミノ酸配列の系統解析
配列番号１に示すジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの系統解析を行った。
系統解析には、配列番号１に示すアミノ酸配列とともに、表５に示すジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を用いた。表５に示すアミノ酸配列は、NCBI（National  Center  for  Biotechnology  Information）が提供するデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、又は特許文献から取得した。
これらの配列をClustalX（http://www.clustal.org/）を用いたマルチプルアライメント解析に供し、近隣結合法（NJ法）にて系統樹を作製した。結果を図１に示す。
また、各配列について、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性を遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winを用いて調べ、表５に示した。なお、表５の「配列番号１のアミノ酸配列との同一性」において、*は全長アミノ酸配列ではなく、相同領域として選択された部分配列に対しての同一性を示す。例えば、DGAT2_Mortierella_ramannianaの全長配列は355アミノ酸であるが、この中から相同領域として77アミノ酸からなる部分配列が選択され、この部分配列と配列番号１の配列との同一性が18％であったことを示している。
【００８８】
【表５】
0006520008.tif 000007
【００８９】
図１から、配列番号１のアミノ酸配列からなるCnDGAT2096は、DGAT1のクラスターに属することがわかった。また、図１でDGAT1クラスターに属した配列のうち、いくつかについてはタンパク質の機能が報告されており、いずれも長鎖アシル基の導入に関与するDGATであると報告されている。
【図１】
0006520008.tif 000008
【配列表】
0006520008000001.app