(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカン認識受容体に対するエピトープを実質的に含まない、修飾スルファミダーゼであって、前記スルファミダーゼの天然グリカン部分が、単結合切断及び二重結合切断によって破壊されたものであって、全結合切断あたりの単結合切断の程度がオリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％であり、それにより、哺乳動物の血液脳関門を通じた前記スルファミダーゼの輸送を可能にするものであり、ここで、前記スルファミダーゼが、前記哺乳動物の脳において触媒活性を有する、修飾スルファミダーゼ。
【請求項２】
非修飾組換えスルファミダーゼの天然グリカン部分の含量に対する天然グリカン部分の相対含量が約２５％である、請求項１に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項３】
前記エピトープが、マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分及びガラクトース部分から選択される少なくとも１つのタイプの部分を示す、請求項１又は２に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項４】
マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分及びガラクトース部分を含まない、請求項３に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項５】
前記エピトープが、マンノース−６リン酸受容体タイプ１及び２、マンノース受容体及びガラクトース受容体から選択される少なくとも１つのグリカン認識受容体によって認識される、請求項３又は４に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項６】
配列番号１で定義されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項７】
前記エピトープが、５つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置２１のＮ（Ｎ（２１））、位置１２２のＮ（Ｎ（１２２））、位置１３１のＮ（Ｎ（１３１））、位置２４４のＮ（Ｎ（２４４））及び位置３９３のＮ（Ｎ（３９３）、の少なくとも４つを有さない、請求項６に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項８】
前記エピトープが、前記修飾スルファミダーゼポリペプチドのＮ−グリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１２２）、Ｎ（２４４）、及びＮ（３９３）を有さない、請求項７に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項９】
Ｎ（１３１）部位のオリゴマンノースグリカンを含み、前記オリゴマンノースグリカンが単結合切断及び二重結合切断によって破壊されており、前記破壊が、全結合切断あたりの少なくとも６０％の単結合切断の程度を特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項１０】
前記スルファミダーゼは、そのＣ末端部分が無傷であって、前記Ｃ末端部分が任意の方法で、配列番号１のアミノ酸４３６〜４８４によって表される、請求項６〜９のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項１１】
前記触媒活性を提供する配列番号１の位置５０のＣα−ホルミルグリシン残基（ＦＧｌｙ５０）を含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項１２】
前記触媒活性が、リソソーム蓄積症を罹患している前記哺乳動物の脳におけるリソソーム蓄積の減少を提供する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼ。
【請求項１３】
過ヨウ素酸アルカリ金属塩（alkali metal periodate）及び水素化ホウ素アルカリ金属塩（alkali metal borohydride）との逐次反応によりスルファミダーゼが調製され、それによりスルファミダーゼのグリカン認識受容体に対するエピトープを修飾し、哺乳動物の脳において前記スルファミダーゼの触媒活性を保持する一方、前記受容体に対するスルファミダーゼの活性を低下させた、修飾スルファミダーゼであって、前記スルファミダーゼの天然グリカン部分が、単結合切断及び二重結合切断によって破壊されたものであって、全結合切断あたりの単結合切断の程度がオリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％であって、前記グリカン認識受容体に対するエピトープを実質的に含まない修飾スルファミダーゼ。
【請求項１４】
グリカン認識受容体のためのエピトープを実質的に有さない修飾スルファミダーゼを含む、スルファミダーゼ組成物であって、前記スルファミダーゼの天然グリカン部分が、単結合切断及び二重結合切断によって破壊されたものであって、全結合切断あたりの単結合切断の程度がオリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％であり、それにより哺乳動物の血液脳関門を通じた前記スルファミダーゼの輸送を可能にし、活性部位において１を超えるＣα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）対セリン（Ｓｅｒ）比を有し、それにより前記哺乳動物の脳において触媒活性を提供する、スルファミダーゼ組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼを含む、請求項１４に記載のスルファミダーゼ組成物。
【請求項１６】
１０１０ｋＤa超の分子量を有する多量体形態のスルファミダーゼを５％以下（重量）含む、請求項１４又は１５のいずれか１項に記載のスルファミダーゼ組成物。
【請求項１７】
修飾スルファミダーゼを調製する方法であって、前記方法が：
ａ）４時間以内の時間、グリコシル化スルファミダーゼを過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、及び、
ｂ）前記スルファミダーゼを水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以下の時間反応させることであって、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩が、１０〜８０ｍＭの濃度で使用されること；を含み、
それによって前記スルファミダーゼのグリカン部分を修飾し、前記スルファミダーゼの触媒活性を保持する一方、グリカン認識受容体に対する前記スルファミダーゼの活性を低下させることであり、前記修飾スルファミダーゼは哺乳動物の脳において触媒活性を示すものであって、
ここで前記修飾スルファミダーゼの天然グリカン部分が、単結合切断及び二重結合切断によって破壊されたものであって、全結合切断あたりの単結合切断の程度がオリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％であり、前記修飾スルファミダーゼは、前記グリカン認識受容体に対するエピトープを実質的に含まない、方法。
【請求項１８】
前記工程ａ）が、３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ａ）及び工程ｂ）が中間工程を実行することなく順番に実施される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程ａ）が、以下のｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩が、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである；
ｉｉ）前記過ヨウ素酸塩が、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの濃度で使用される、及び、
ｉｉｉ）前記反応が、０〜２２℃の温度、例えば０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度、例えば約８℃、例えば約０℃にて実施される、
の少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば全てによって、さらに特徴づけられる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程ａ）の前記反応が、ｐＨ３〜７で実施される、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程ｂ）が、以下のｉ）〜ｉｖ）：
ｉ）前記水素化ホウ素アルカリ金属塩が、水素化ホウ素ナトリウムであり；
ｉｉ）前記水素化ホウ素塩が、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍の濃度で使用される；
ｉｉｉ）前記反応が、１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される；
ｉｖ）前記反応が、０〜８℃の温度で実施される、
の少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば全てによってさらに特徴づけられる、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程ａ）及び工程ｂ）の各々が、個別に２時間以下の期間実施され、かつ、前記水素化ホウ素塩が、任意に、前記過ヨウ素酸塩の０．５〜４倍の濃度で使用される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程ａ）が３時間以下の期間実施され、かつ、前記工程ｂ）が１時間以下実施され、かつ、前記水素化ホウ素塩が、任意に、前記過ヨウ素酸の４倍以下の濃度で使用される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ２）工程ａ）より生じる反応を反応停止すること（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、をさらに含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ｂ２）工程ｂ）より生じる反応を反応停止すること、をさらに含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記グリコシル化スルファミダーゼポリペプチドが、少なくとも４つのアスパラギン残基にグリカン部分を含む、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩が、グリカン部分のシス−グリコール基をアルデヒド基に酸化する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記水素化ホウ素アルカリ金属塩が、前記アルデヒドをアルコールに還元する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の方法によって得られる修飾スルファミダーゼ。
【請求項３１】
治療に使用するための、請求項１〜１６及び３０のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼ又はスルファミダーゼ組成物。
【請求項３２】
リソソーム蓄積症、特にムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）に罹患した哺乳動物の治療に使用するための、請求項３１に記載の修飾スルファミダーゼ又はスルファミダーゼ組成物。
【請求項３３】
リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）に罹患している哺乳動物を治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量の修飾スルファミダーゼを含み、前記修飾スルファミダーゼが：
ａ）請求項１〜１３及び３０のいずれか１項に記載の修飾スルファミダーゼ；
ｂ）請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のスルファミダーゼ組成物、及び、
ｃ）修飾スルファミドであって、ここで、前記修飾が、前記修飾スルファミダーゼを過ヨウ素酸アルカリ金属塩及び水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することを含み、それにより、触媒活性を維持する一方でグリカン認識受容体に対する活性を低下させるように化学的に修飾されたグリカン部分を有する、修飾スルファミド、
から選択される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、修飾スルファミダーゼ、修飾スルファミダーゼを含む組成物、及び修飾スルファミダーゼを調製する方法に関する。さらに、リソソーム蓄積症の処置のような治療における修飾スルファミダーゼの使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積症
リソソームコンパートメントは、細胞内の廃棄物を分解する異化機構として機能する。分解は、リソソームに特異的に区画されたいくつかの加水分解酵素及び輸送体によって達成される。今日、リソソームタンパク質をコードする遺伝子における突然変異と疾患との間に関連性が確立されている遺伝性疾患が４０以上同定されている。これらの疾患は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）と定義され、不十分な分解能力により分解することができない代謝産物（又は代謝産物（複数））を蓄積することを特徴とする。代謝産物の過剰なリソソーム蓄積の結果として、リソソームはサイズが増加する。蓄積された蓄積物質がどのように病理を引き起こすかについては完全には理解されていないが、オートファジーの阻害及び細胞アポトーシスの誘導などの機構を含む可能性がある（Ｃｏｘ＆Ｃａｃｈｏｎ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２６：２４１−２５４（２０１２））。
【０００３】
酵素補充療法
蓄積は、異種の供給源からのリソソーム酵素の投与によって減少させることができる。リソソーム酵素の静脈内投与は、受容体媒介エンドサイトーシスと呼ばれる機構を介した、細胞による迅速な取り込みをもたらすことが十分に確立されている。このエンドサイトーシスは、細胞表面上の受容体が媒介しており、特に、２つのマンノース−６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）は、特定のリソソーム酵素の取り込みに重要であることが示されている（Ｎｅｕｆｅｌｄ；Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｏｒｉｇ  １６：７７−８４（１９８０））。Ｍ６ＰＲは、リソソームタンパク質に特徴的なリン酸化オリゴマンノースグリカンを認識する。
【０００４】
受容体媒介性エンドサイトーシスの原理に基づいて、６つのＬＳＤに対し酵素置換療法（ＥＲＴ）が今日利用可能である（Ｇａｕｃｈｅｒ，Ｆａｂｒｙｓ，Ｐｏｍｐｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ，ＩＩ  ａｎｄ  ＶＩ）。これらの療法は、様々な末梢器官におけるリソソーム蓄積を減少させるのに有効であり、それによって病理に関連するいくつかの症状を改善する。
【０００５】
しかし、ＬＳＤの大部分は中枢神経系（ＣＮＳ）においてリソソーム蓄積を引き起こし、結果としてＣＮＳ関連の徴候及び症状のレパートリーを提示する。静脈内投与されたＥＲＴの主な欠点は、ＣＮＳへの不良分布である。ＣＮＳは、ＣＮＳ血管内皮によって形成された血液脳関門（ＢＢＢ）によって、血液を介する化合物への暴露から保護される。傍細胞の通過を妨げるタイトジャンクションを示すＢＢＢの内皮細胞は、制限した受動的エンドサイトーシスを示し、さらに、他の組織に見られるいくつかの受容体媒介トランスサイトーシス能力を欠く。特に、マウスにおいて、ＢＢＢを通過するＭ６ＰＲ媒介輸送は、出生後２週間までしか観察されない（Ｕｒａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１２６１−１２６６（２００８））。
【０００６】
リソソーム酵素のグリコシル化
一般に、Ｎ−グリコシル化は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列モチーフで起こり得る。このモチーフに対して、Ｎ−グリカンの最初のコア構造は、グリコシルトランスフェラーゼオリゴサッカリルトランスフェラーゼによって、網状管腔内（ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｌｕｍｅｎ）に転移される。すべてのＮ−結合型グリカンのこの共通基盤は１４残基;３グルコース、９マンノース、及び２Ｎ−アセチルグルコサミン、から構成されている。この前身は、次に、初期コアをトリミングして新しい糖部分を追加する多数の酵素の作用により、３つの一般的なタイプのＮ−グリカン；オリゴマーノース、複合体及びハイブリッド（図７）へと変換される。各成熟Ｎ−グリカンは、Ａｓｎがタンパク質への結合点である共通のコア、Ｍａｎ（Ｍａｎ）２−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎを含んでいる。
【０００７】
さらに、リソソームを指向するタンパク質は、リン酸化された１つ以上のＮ−グリカンを保持する。リン酸化はゴルジ体で起こり、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンのマンノース残基のＣ−６にＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸の付加によって開始される。Ｎ−アセチルグルコサミンは、Ｍ６ＰＲによって認識され、リソソームタンパク質のリソソームへの輸送を開始するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を生成するように切断される。次いで、得られたＮ−グリカンを、Ｍ６ＰがＮ−グリカン鎖の末端基であるポイントまでトリミングする（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｖａｒｋｉ  Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｅｓｋｏ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００９））。
【０００８】
糖部分及びリン酸基の両方が受容体への結合に関与するので、Ｍ６ＰＲの結合部位は、完全な末端Ｍ６Ｐ基を必要とする（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １９（５）：５３４−４２（２００９））。
【０００９】
グリカン修飾による脳を標的とする酵素補充療法
リソソーム酵素のＣＮＳへの分布を増加させる潜在的な戦略は、国際公開第２００８／１０９６７７号に開示されている。この公開された出願では、メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び水素化ホウ素ナトリウムを使用するβ−グルクロニダーゼの化学修飾が記載されている（Ｇｒｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２６１６−２６２１（２００８）も参照のこと）。２０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムによる６．５時間の酸化、その後の反応停止（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）、透析及び１００ｍＭの水素化ホウ素ナトリウムでの一晩の還元（以後、既知の方法と呼ぶ）からなるこの修飾は、β−グルクロニダーゼのＣＮＳ分布を実質的に改善し、ＬＳＤムコ多糖症ＶＩＩのマウスモデルにおける神経記憶のクリアランスをもたらす。脳の分布の根底にあるメカニズムは不明であるが、化学修飾がβ−グルクロニダーゼ上のグリカン構造を破壊することに注目し、Ｍ６ＰＲによる受容体媒介エンドサイトーシスが著しく減少することがさらに証明された。
【００１０】
化学修飾戦略は、他のリソソーム酵素についても研究されている。例えば、既知の方法による修飾は、静脈内投与されたプロテアーゼトリペプチジルペプチダーゼＩの脳への分布を改善しなかった（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２））。スルファミダーゼについても満足のいく結果は実証されていない。既知の方法に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼは、実際にはマウスで半減期の増加を示したが、ＭＰＳ  ＩＩＩＡマウスの脳では効果を示さなかった。化学的に修飾されたスルファミダーゼは、静脈内投与によって繰り返し投与された場合、脳実質には分布しなかった（Ｒｏｚａｋｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２３０：１２３−１３０（２０１１））。
【００１１】
従って、例えばＭＰＳ  ＩＩＩＡのような、神経学的に関与があるＬＳＤの治療に有効なＥＲＴは依然として存在しない。酵素活性を維持したまま、ＢＢＢを通過して輸送することができる新規スルファミダーゼ化合物は、ＭＰＳ  ＩＩＩＡのようなＣＮＳ関連病理を有するＬＳＤを治療するための酵素補充療法用の全身投与化合物の開発において多大な価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の開示
本発明の目的は、ＭＰＳ  ＩＩＩＡのようなＬＳＤのための酵素補充療法の開発を可能にする新規スルファミダーゼ化合物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、哺乳動物の血液脳関門を通過して輸送され得、該哺乳動物の脳において酵素的（触媒的）活性を呈し得る新規なスルファミダーゼ化合物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、改善された安定性を示す新規なスルファミダーゼ化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本開示から当業者には明らかであろうこれらの目的及び他の目的は、添付の特許請求の範囲において定義され、本明細書に一般的に開示される本発明の異なる態様によって達成される。
【００１６】
本発明の１つの態様では、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない修飾スルファミダーゼが提供され、それにより哺乳動物の血液脳関門を通じた前記スルファミダーゼの輸送を可能にし、ここで、前記スルファミダーゼは、前記哺乳動物の脳において触媒活性を有している。
【００１７】
従って、本発明の修飾スルファミダーゼは、例えば修飾されていないスルファミダーゼ（配列番号１）と比較して、グリカン認識受容体のエピトープが除去されている点で修飾されている。例えば、添付の実施例において出願人によって実証されたように、そのような修飾スルファミダーゼは、２つのマンノース−６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）のようなグリカン認識受容体のエピトープの除去の結果、細胞取り込みを受けにくい（実施例６及び７参照）。前記エピトープのほぼ完全な欠如は、グリカン認識受容体に対する修飾スルファミダーゼの親和性を低下させる。特に、これは末梢組織中の修飾スルファミダーゼの受容体媒介性エンドサイトーシスを減少させる可能性があり、例えば、哺乳動物に静脈内投与される時に、次々に血漿から修飾スルファミダーゼの除去を減少させ得る。これはおそらく、少なくとも部分的に、スルファミダーゼの化学修飾後の末梢組織における受容体媒介性取り込みの阻害によるものであろう（実施例６の細胞摂取試験において実証される）。投与の観点からは、修飾スルファミダーゼのクリアランスの減少は、患者にあまり頻繁に投与することができない長時間作用させる医薬品の開発を有利にし得る。
【００１８】
グリカン認識受容体とは、主としてタンパク質のグリカン部分を介してタンパク質を認識して結合する受容体を意味する。そのような受容体は、マンノース６−リン酸受容体に加えて、マンノース受容体によって例示され得；グリカンが露出した末端マンノース残基を示すタンパク質に選択的に結合する。レクチンは、グリカン上の末端ガラクトース残基を認識するアシアロ糖タンパク質受容体１を認識する末端ガラクトースによって例示され得るグリカン認識受容体の別の大きなファミリーを構成する。従って、グリカン認識受容体のエピトープは、そのような受容体によって認識される（一部の）グリカン部分として理解され得る。
【００１９】
これに関連して、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に含まない修飾スルファミダーゼは、好ましくは、グリカン認識受容体のエピトープをほとんど含まないか、又は少量のそのようなエピトープを含む修飾スルファミダーゼとして理解されるべきである。好ましい実施形態では、修飾スルファミダーゼは、グリカン認識受容体のための（検出可能な）エピトープを含まない。特に、修飾スルファミダーゼは、エンドサイトーシスＭ６ＰＲタイプ１及び２、マンノース受容体及びガラクトース受容体それぞれのエピトープを構成する（検出可能な）マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分又はガラクトース部分を含まない。従って、一実施形態において、前記エピトープは、Ｍ６ＰＲタイプ１及び２、マンノース受容体及びガラクトース受容体から選択される少なくとも１つのグリカン認識受容体によって認識され得る。特に、前記少なくとも１つのグリカン認識受容体は、Ｍ６ＰＲタイプ１及び２から選択することができる。上記で定義したものに対応して、天然グリカン部分に見出される前記エピトープは、マンノース−６−リン酸部分、マンノース部分及びガラクトース部分から選択される少なくとも１つのタイプの部分を示す。特定の実施形態において、これらは、本明細書中に開示される修飾スルファミダーゼには存在しない。
【００２０】
さらに、本明細書に記載の態様による修飾スルファミダーゼは、哺乳動物の脳に分布するだけでなく、該哺乳動物の脳内において（保持された）酵素活性又は触媒活性を示す。修飾スルファミダーゼの酵素活性は、少なくとも部分的に未修飾形態のスルファミダーゼから保持される。さらに、酵素活性は、マウスの脳において（分布も）酵素活性も示さない先行技術の方法に従って修飾されたスルファミダーゼと比較して、保持されている。従って、本明細書中に開示される修飾スルファミダーゼは、リソソーム蓄積、例えば、実施例８において実証されるように、ヘキソサミンＮ−硫酸［α−１，４］ウロン酸（ＨＮＳ−ＵＡ）のリソソーム蓄積を減少させるなど、哺乳動物の脳におけるリソソーム蓄積に影響し得る。保持された触媒活性は、例えば、スルファミダーゼの活性部位における触媒アミノ酸残基の修飾に対する保存レベルに依存し得る。
【００２１】
スルファミダーゼは、スルファターゼのタンパク質ファミリーに属する。スルファターゼは、種々の基質からの硫酸エステル結合の加水分解を触媒する共通の進化的起源を有するタンパク質ファミリーである。従って、本明細書で使用する修飾スルファミダーゼの「触媒活性」は、好ましくは哺乳動物の脳における末梢組織のリソソーム及び／又はリソソームにおける、硫酸エステル結合の加水分解を指してもよい。従って、修飾スルファミダーゼの触媒活性は、リソソーム蓄積症に罹患している哺乳動物の脳におけるヘパラン硫酸蓄積などのリソソーム蓄積の減少をもたらし得る。触媒活性は、例えば、実施例８に概説されるように、動物モデルにおいて測定され得る。
【００２２】
スルファターゼは、１０個のβ鎖からなる中央のβシートと共通の折り畳みを共有する。スルファミダーゼの活性部位は中央のβシートの末端に位置し、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に翻訳後修飾された配列番号１の位置５０に保存されたシステインを含む。この反応は、小胞体においてＦＧｌｙ生成酵素によって起こる。位置５０のこのＦＧｌｙ残基（ＦＧｌｙ５０）は、硫酸エステル結合の加水分解に直接関与しており、該修飾が活性化には必要であるようである。特に、アリールスルファターゼＡ及びＢ中の保存されたシステインからセリン（Ｓｅｒ）への変異は、ＦＧｌｙの形成を妨げ、不活性酵素を生じる（Ｒｅｃｋｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １３；２７３（１１）：６０９６−１０３（１９９８））。本明細書において活性部位の保存について述べられる場合、それは主として配列番号１の翻訳後ＦＧｌｙ５０の保存として理解されるべきである。従って、このような場合、修飾スルファミダーゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列又はこのようなアミノ酸配列で以下に定義される配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものとして理解されるべきである。
【００２３】
一実施形態において、前記活性部位は、前記触媒活性を提供する配列番号１の位置５０に対応する位置に触媒残基を含んでいる。この触媒残基はさらなる実施形態ではＦＧｌｙ５０である。
【００２４】
一実施形態では、修飾スルファミダーゼは、非修飾組換えスルファミダーゼの天然グリカン部分の含量に対する天然グリカン部分の相対含量が約２５％である。従って、グリカン認識受容体に対する前記エピトープは、天然グリカン部分上に見出され得、従って、このような天然グリカン部分は、本明細書に記載の修飾スルファミダーゼにおいて実質的に存在しない。修飾スルファミダーゼ中の天然グリカン部分の相対的含量は、好ましい実施形態では２５％未満、例えば２０％未満、例えば１５％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満であり得る。特定の実施形態では、天然グリカン部分の含量は１％未満である。グリカン部分の相対的含量は、スルファミダーゼの修飾後に残存する無傷の天然グリカン部分の含量として理解することができる。添付の実施例に示すように、糖ペプチドの相対定量は、ＬＣ−ＭＳ及び再構成イオンクロマトグラムのピーク面積に基づくことができる。別の定量方法は当業者に公知である。２５％未満のレベルの天然グリカンの相対的含量は、グリカン認識受容体を介してスルファミダーゼの受容体媒介性エンドサイトーシスを有利に低下させ、血液脳関門を通じた輸送を改善し得る。以下にさらに例示されるように、天然グリカンの２５％のレベルの相対含量は、１つの天然グリカンによって表され得る。天然グリカン部分は、この点において、真核細胞の小胞体及びゴルジコンパートメントにおいて、翻訳後に修飾されたスルファミダーゼに自然に生じるグリカン部分として理解されるべきである。
【００２５】
一実施形態では、前記天然のグリカン部分は、単結合の切断によるグリカンの破壊が優位である、前記修飾されたスルファミダーゼ中の単結合切断及び二重結合切断によって破壊される。特に、前記スルファミダーゼの天然グリカン部分は、単結合切断及び二重結合切断によって破壊され、ここで、該単結合切断の程度は、オリゴマンノースグリカンにおいて少なくとも６０％である。特定の実施形態では、単結合切断の程度は、オリゴマンノース型のグリカンの少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８２％、例えば少なくとも８５％である。単結合切断対二重結合切断の程度は、実施例１０及び１１において記載されるように測定され得る。本明細書の他の態様に記載されているように、スルファミダーゼは、スルファミダーゼ上に天然に生じるグリカン部分の構造を破壊するように、過ヨウ素酸塩（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）との反応によって修飾されてもよい。修飾スルファミダーゼの残存するグリカン構造は、少なくとも１つの過ヨウ素酸塩触媒による切断、すなわち少なくとも１つの単結合切断が自然に生じるグリカン部分のそれぞれに起こり、少なくとも部分的に破壊されている可能性がある。前記修飾スルファミダーゼの「修飾」とは、非天然スルファミダーゼと比較して、少なくとも部分的に天然グリカン部分の前記破壊によって表される。
【００２６】
一実施形態では、修飾スルファミダーゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。非限定的な例において、前記ポリペプチドは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性、例えば配列番号１で定義されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性、例えば配列番号１に定義されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する。従って、本発明の修飾スルファミダーゼは、配列番号１に高度に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。しかし、前記ポリペプチドは、例えば、１以上のＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸（単数又は複数）によって伸長され、実際の修飾スルファミダーゼ配列を配列番号１の配列よりも長くすることができる。同様に、他の場合には、修飾スルファミダーゼは配列番号１のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有していてもよく、例えば、その配列の特定の位置（単数又は複数）にあるアミノ酸残基（単数又は複数）の欠損に起因する。
【００２７】
一実施形態では、前記エピトープは、５つのＮグリコシル化部位：配列番号１の位置２１（Ｎ（２１））のアスパラギン（Ｎ）、位置１２２のＮ（Ｎ（１２２））、位置１３１のＮ（Ｎ（１３１））、位置２４４のＮ及び位置３９３のＮ（Ｎ（３９３））、の少なくとも４つにおいて存在しない。代替的に製剤化された、前記修飾スルファミダーゼは、前記Ｎ−グリコシル化部位のわずか１つの天然のグリカン部分を含む。特定の実施形態では、前記修飾スルファミダーゼは、前記Ｎ−グリコシル化部位の１つに天然グリカン部分を含み；該Ｎ−グリコシル化部位は、任意にＮ（１３１）である。あるいは、前記エピトープ又はグリカン部分は、前記修飾スルファミダーゼポリペプチドのＮ（２１）、Ｎ（１２２）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３）には存在しない。同定された部位においてグリカン部分を欠くこのような修飾スルファミダーゼの利点は、上記で説明されている。すなわち、細胞取り込みがさらに減少し、血液脳関門を通じた輸送がさらに促進される可能性がある。
【００２８】
一実施形態では、前記スルファミダーゼの前記天然のグリカン部分は、配列番号１の位置２１のＮ（Ｎ（２１））、位置１３１のＮ（１３１）、位置２４４のＮ（２４４）及び位置３９３のＮ（Ｎ（３９３））に相当する。従って、未修飾スルファミダーゼは、これらの４つの部位で天然にグリコシル化され得る。この実施形態では、修飾スルファミダーゼは、未修飾組換えスルファミダーゼの対応する位置におけるグリカン部分の含有量の約２５％又は２５％未満であるこれらの位置における天然グリカン部分の相対含量を有し得る。修飾スルファミダーゼの１つの特定の実施形態において、上記で同定された４つの天然に存在するグリコシル化部位の少なくとも３つは、グリカン認識受容体のエピトープを欠く。
【００２９】
上記のように、スルファミダーゼのＮ−グリコシル化部位Ｎ（１３１）のグリカン部分は、未修飾の組換えスルファミダーゼ上に天然に存在するグリカン部分である。Ｎ（１３１）は、グリコシル化されると、他のグリコシル化部位と比較して末梢組織における受容体媒介性の取り込みの大部分を引き起こすと考えられる、スファミダーゼ上のグリコシル化部位である。従って、オリゴマンノース型のＮ（１３１）上に天然に存在するグリカン部分の破壊は、血漿由来の修飾スルファミダーゼのクリアランスに影響し得る。前記Ｎ（１３１）オリゴマーゼの破壊は、少なくとも６０％の単結合切断の程度を特徴とし得る。従って、単結合切断による破壊は、二重結合切断による破壊よりも頻出する。
【００３０】
一実施形態では、前記エピトープは、修飾スルファミダーゼの前記５つのＮ−グリコシル化部位の全てに存在しない。従って、グリカン部分は、５つのＮグリコシル化部位：配列番号１の位置２１のＮ（Ｎ（２１））、位置１２２のＮ（Ｎ（１２２））、位置１３１のＮ（Ｎ（１３１））、位置２４４のＮ（Ｎ（２４４））及び位置３９３のＮ（Ｎ（３９３））、の全てが存在しない。これらの５つの部位におけるグリカン部分を欠く修飾スルファミダーゼは、例えば、哺乳動物における血漿クリアランスをさらに低下させることができるなど、修飾酵素の薬物動態をさらに改善し得る。結果として、修飾されたスルファミダーゼの投薬頻度もまた、さらに低減され得る。
【００３１】
ヒトスルファミダーゼ（ＥＣ３．１０．１．１；配列番号１）は、ＳＧＳＨ遺伝子によってコードされる。スルファミダーゼはまた、スルファミダーゼ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（Ｎ−ｓｕｌｐｈｏｇｌｕｃｏｓ−ａｍｉｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、Ｎ−スルフォグルコサミンスルフォヒドラーゼ（Ｎ−ｓｕｌｆｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、スルファメートスルホヒドロラーゼ、ヘパラン硫酸スルファターゼ、ヘパリンスルファミダーゼ、２−デスオキシ−Ｄ−グルコシド−２−スルファメートスルホヒドロラーゼ及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンスルホヒドラーゼの名称で知られており、本明細書で使用される用語「スルファミダーゼ」は、これらの代替名と同等であると理解されるべきである。
【００３２】
一実施形態では、前記修飾スルファミダーゼが単離される。
【００３３】
一実施形態では、前記スルファミダーゼはヒトスルファミダーゼである。
【００３４】
一実施形態では、修飾前の前記スルファミダーゼはグリコシル化されている。
【００３５】
一実施形態では、前記修飾スルファミダーゼは例えば実施例１に記載されるように組換え体である。スルファミダーゼは、これらに限定されないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓細胞、又はネズミ由来のリンパ系細胞株などの、真核細胞中において産生され得る。さらに、スルファミダーゼは、昆虫細胞、植物細胞、又は酵母細胞において産生され得る。組換えヒトスルファミダーゼは、例えば、米国特許第５，８６３，７８２号；米国特許第５，９７２，３３３号；米国特許第６，２００，５６３号；米国特許第６，４５８，５７９号；及び米国特許第６，４９１，９１３号のものが知られている。本発明の目的のために、ヒトスルファミダーゼは、引用された米国特許のいずれかの記載のように産生され得ることが理解されるべきであり、参照により本明細書に援用される。
【００３６】
一実施形態では、前記修飾スルファミダーゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１で定義されるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、ここで、グリカン部分が、５つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置２１のＮ（Ｎ（２１））、位置１２２のＮ（Ｎ（１２２））、位置１３１のＮ（Ｎ（１３１））、位置２４４のＮ及び位置３９３のＮ（Ｎ（３９３））、の少なくとも４つが存在せず、前記スルファミダーゼは、任意に、完全なｃ末端を有している。その一実施形態では、配列番号１のアミノ酸４３６〜４８４によって表されるｃ末端部分は無傷である。
【００３７】
１つの態様では、グリカン認識受容体のエピトープを実質的に有さない修飾スルファミダーゼを含むスルファミダーゼ組成物が提供されるものであり、それにより該スルファミダーゼを哺乳動物の血液脳関門を通じて輸送することを可能にし、Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）対セリン（Ｓｅｒ）比が１よりも大きく、それにより哺乳動物の脳内で触媒活性を提供する。例えば、前記修飾スルファミダーゼは、配列番号１で定義されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１で定義されるポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。そのような例では、ＦＧｌｙ対Ｓｅｒの比は、ＦＧｌｙ５０対Ｓｅｒ５０比と呼ばれることがある。このように、定義された比は、ＦＧｌｙ５０がＳｅｒ５０より大きい程度に存在することを意味する。好ましくは、比は１．５より大きく、より好ましくは２．３より大きく、より好ましくは４より大きく、最も好ましくは、比は約９である。より大きな比は、より大きいほど、修飾スルファミダーゼの触媒活性が、スルファミダーゼの未修飾形態から維持され得ることを示す。
【００３８】
修飾スルファミダーゼを含む組成物の利点は、それ自体修飾されたスルファミダーゼの利点と同様である。従って、修飾スルファミダーゼを含む組成物は、未修飾スルファミダーゼ又は未修飾スルファミダーゼを含む組成物と比較して、血漿中で改善された半減期を示し得る。さらに、前記修飾スルファミダーゼは、例えば、未修飾スルファミダーゼと比較して、哺乳動物の脳への改善された分布、並びに脳における保持された触媒活性を示しうる。
【００３９】
一実施形態では、スルファミダーゼ組成物は、非修飾組換えスルファミダーゼにおける天然グリカン部分の含量に対する天然グリカン部分の相対含量が約２５％のである。従って、グリカン認識受容体に対する前記エピトープは、天然のグリカン部分上に見出され得、このような天然グリカン部分は、本明細書に記載のスルファミダーゼ組成物において実質的に存在しない。組成物の天然グリカン部分の相対含量が約２５％である修飾スルファミダーゼの組成物は、例えば、各スルファミダーゼが１つの天然のグリカン、例えば前述のＮ−グリコシル化部位の１つの天然のグリカン部分を含む、修飾スルファミダーゼの組成物によって表すことができる。スルファミダーゼ組成物中の天然グリカンエピトープの相対的含量は、好ましい実施形態では２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満であり得る。場合によっては、天然グリカン部分の相対含量は、４％未満、３％、２％、１％、０．５％、例えば０．１％未満、例えば０．０１％未満である。これらのレベルにおける天然グリカン部分の相対含量を有するスルファミダーゼの組成物は、微量の天然グリカン部分のみが見出される組成物である。従って、組成物は、天然のグリカン部分が多かれ少なかれ破壊されている修飾スルファミダーゼの混合物である。特定の実施形態では、天然のグリカン部分の含量は１％未満である。約２５％又は２５％未満のレベルの天然グリカンの相対含量は、グリカン認識受容体を介して細胞中へのスルファミダーゼの受容体媒介性エンドサイトーシスを有利に低下させ、血液脳関門を通じた輸送を改善し得る。
【００４０】
組成物の態様の１つの特定の実施形態では、前記エピトープは、５つのＮ−グリコシル化部位：配列番号１の位置２１のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ（２１））、位置１２２のＮ（Ｎ（１２２））、位置１３１（Ｎ（１３１））のＮ、位置２４４のＮ（Ｎ（２４４））及び位置３９３（Ｎ（３９３）、の少なくとも４つに存在せず、好ましくは、前記エピトープはＮ（２１）、Ｎ（１２２）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３）には存在しない。選択的に製剤化された、組成物の前記修飾スルファミダーゼは、前記Ｎ−グリコシル化部位のわずか１つの天然のグリカン部分を含み、前記Ｎ−グリコシル化部位は、任意にＮ（１３１）である。
【００４１】
組成物の態様の１つの実施形態において、５％（重量）以下の前記スルファミダーゼは、１０１０ｋＤａを超える分子量を有する多量体型で存在する。
【００４２】
組成物の態様の１つの実施形態では、前記修飾されたスルファミダーゼの５％（重量）以下はオリゴマー形態で存在し、該オリゴマー形態は１８０〜４８０ｋＤａの分子量を有する。オリゴマー、多量体又は凝集形態の存在は、例えば、動的光散乱によって又はサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。この文脈において、凝集形態は、ネイティブに折り畳まれたモノマーから折り畳まれていないモノマーまでの範囲の構造から構成される高分子量タンパク質形態として理解されるべきである。タンパク質の凝集形態は、タンパク質のモノマー形態に対する免疫応答を増強することができる。増強された免疫応答の最も可能性の高い説明は、抗原の多価提示がＢ細胞受容体にクロスリンクし、従って免疫応答を誘導することである。これは、高い免疫応答を確実にするために、凝集形態にて抗原が宿主に提示されるワクチン製造に利用されている現象である。治療用タンパク質の場合、定説（ｄｏｇｍａ）とは反対である。免疫応答を最小限に抑えるために、高分子量形態の任意の含量を最小限にするか、又は避けるべきである（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＡＰＳ  Ｊ，８：Ｅ５０１−７（２００６））。従って、オリゴマー、多量体及び／又は凝集体の形態の減少は、治療における使用により適した酵素を提供し得る。
【００４３】
凝集の別の態様は、試料中に少量の発生が、正常に折りたたまれたタンパク質の凝集を誘導し得ることである。凝集した材料は、一般に、残存活性がない、又は低い残存活性であり、不十分な溶解性を有する。凝集体の出現は、生物学的薬剤の貯蔵寿命を決定する因子の１つであり得る（Ｗａｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，１８５：１２９−８８（１９９９））。
【００４４】
本明細書で使用される用語「組成物」は、固体及び液体の形態を含むものとして理解されるべきである。組成物は、好ましくは、患者（例えば、哺乳動物）に、例えば注射又は経口投与するのに適した医薬組成物であり得る。
【００４５】
さらに、修飾スルファミダーゼの態様に関連して開示された実施形態及びその利点は、組成物の態様の実施形態でもあることを理解すべきである。同様に、組成物の態様の実施形態は、適用可能である修飾スルファミダーゼの態様の実施形態とみなされるべきである。
【００４６】
一実施形態では、前記修飾スルファミダーゼ又は前記スルファミダーゼ組成物は、治療に使用するためのものである。
【００４７】
一実施形態では、前記哺乳動物の脳は、ヒトの脳である。関連する実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【００４８】
一実施形態では、前記哺乳動物の脳はマウスの脳である。関連する実施形態では、前記哺乳動物はマウスである。
【００４９】
一実施形態では、前記修飾スルファミダーゼ又はスルファミダーゼ組成物は、リソソーム蓄積症、特にムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）に罹患した哺乳動物の治療に使用するためのものである。
【００５０】
一実施形態では、使用のための前記修飾スルファミダーゼ又はスルファミダーゼ組成物は、前記哺乳動物の脳におけるヘパラン硫酸蓄積を減少させる。特に、前記ヘパラン硫酸蓄積は、例えば動物モデルにおいて、少なくとも３０％、例えば少なくとも３５％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％減少する。
【００５１】
１つの態様において、修飾スルファミダーゼを提供するものであって、ここで、前記スルファミダーゼは、過ヨウ素酸アルカリ金属塩（ａｌｋａｌｉ  ｍｅｔａｌ  ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）及び水素化ホウ素アルカリ金属塩（ａｌｋａｌｉ  ｍｅｔａｌ  ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）との逐次反応によって調製され、それによってスルファミダーゼのグリカン認識受容体のエピトープを修飾し、スルファミダーゼの触媒活性を保持しながら、前記グリカン認識受容体に対する前記スルファミダーゼの活性を低下させる。従って、スルファミダーゼは、修飾前のその天然のグリコシル化形態で存在するそのエピトープ又はグリカン部分が前記修飾によって本質的に不活性化されている点で修飾されている。従って、グリカン認識受容体に対するエピトープの存在は、修飾スルファミダーゼにおいて低減されている。修飾スルファミダーゼ、組成物及び調製方法に関連する態様のような、本明細書に開示される他の態様に関連して開示される実施形態及びその利点は、この態様の実施形態でもあることを理解すべきである。特に、以下に開示される様々な方法の実施形態は、特異的反応条件の点で前記修飾スルファミダーゼの調製のさらなる例示的な定義を提供する。同様に、上記の修飾スルファミダーゼ及び組成物の態様に関して開示された実施形態は、修飾スルファミダーゼのさらなる例示的な定義を提供する。
【００５２】
一態様では、修飾スルファミダーゼを調製する方法であって、前記方法が：ａ）グリコシル化スルファミダーゼを過ヨウ素酸アルカリ金属塩と反応させ、ｂ）前記スルファミダーゼを水素化ホウ素アルカリ金属塩と２時間以上反応させ；それによって前記スルファミダーゼのグリカン部分を修飾し、前記スルファミダーゼの触媒活性を保持しながら、グリカン認識受容体に対する前記スルファミダーゼの活性を低下させる。前記ホウ水素化物は、任意に１０〜８０ｍＭの濃度で、例えば１０〜８０ｍＭの濃度で使用される。
【００５３】
従って、上記の方法は、グリカン認識受容体のエピトープの存在を減少させるスルファミダーゼのマイルドな化学修飾を提供し、前記エピトープは、例えば、本明細書に記載の天然のグリカン部分によって表される。これは、有利には、哺乳動物の脳の標的化するのに適した修飾スルファミダーゼを提供し得る。マイルドな方法はさらにスルファミダーゼの触媒活性を実質的に変えることなく前記エピトープを修飾する。特に、スルファミダーゼの活性部位にＦＧｌｙ５０を保持することにより、触媒活性を保持することができる。従って、酵素の分布特性を改善する一方で、この方法は触媒活性を排除しない。マイルドな方法によって調製された修飾スルファミダーゼの更なる利点は、上記に説明されているように、例えば、スルファミダーゼ及び組成物の態様に対するものである。
【００５４】
この方法は、グリカン（炭水化物）部分の２つの隣接するヒドロキシル基間の炭素結合の過ヨウ素酸切断によるグリカン修飾を可能にする。一般に、過ヨウ素酸酸化開裂は、隣接のジオールが存在する場所で起こる。ジオールは、赤道−赤道又は軸−赤道位置に存在しなければならない。ジオールが剛性軸−軸位置に存在する場合、反応は起こらない（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒ．Ｒｅｓ（２０１０））。過ヨウ素酸塩処理は、Ｍ６Ｐ部分のＣ２とＣ３及び／又はＣ３とＣ４の間の結合を切断し、Ｍ６Ｐ受容体に結合することができない構造を生じる。一般的に、他の末端ヘキソースも同様の方法で処理される。非末端の１−４結合残基は、Ｃ２とＣ３の間のみが切断されるが、一方で、非末端（１−３）結合残基は、切断に耐性である。図７において、可能性がある修飾のポイントは、３つの一般的なタイプのＮ−グリカン；オリゴマンノース、複合体及びハイブリッド、にアスタリスクでマークされている。添付の図８〜１０にさらに示されるように、本明細書に開示される方法は、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼと比較して、限られた数の結合の切断によって天然のグリカン部分が破壊された修飾スルファミダーゼを提供する。現在開示されている方法は、主にスルファミダーゼのグリカン部分の糖部分において単一タイプの結合破壊をもたらす（図８参照）。グリカン部分の糖部分における優先的に単結合切断を伴う部分的なグリカン酸化は、本明細書に記載の比較的マイルドな化学修飾方法の特徴である。グリカン部分の糖部分において部分的グリカン酸化及び主に単結合切断を伴うスルファミダーゼを達成するために、下記に記載される条件及び実施例４に例示される条件を用いることができる。
【００５５】
本明細書に記載の修飾スルファミダーゼを調製する方法、及び修飾スルファミダーゼは、従来技術の方法及び化合物よりも改善されている。主に、本発明者らは驚くべきことに、新規な修飾スルファミダーゼが哺乳動物の脳に分布して触媒活性を示すことを見出した。実施例３及び５はさらに、先行技術の方法及びスルファミダーゼと、本明細書中に開示される方法及びスルファミダーゼとの比較を提供する。これらの実施例の結果は、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼがアミノ酸残基修飾を含み、ポリペプチド鎖切断及びタンパク質凝集を示すことを示す。特に興味深いのは、先の方法に従って修飾されたスルファミダーゼ中の活性部位の触媒ＦＧｌｙ残基からＳｅｒ残基への変換が観察されたことである。新規方法における還元工程の比較的短い期間は、修飾酵素の触媒活性に正の影響を与えるようである。
【００５６】
方法の態様の一実施形態において、前記グリコシル化スルファミダーゼポリペプチドは、少なくとも４つのアスパラギン残基（Ｎグリコシル化部位）にグリカン部分を含む。
【００５７】
方法の態様の一実施形態において、前記グリコシル化アスパラギン残基は：配列番号１の位置２１のＮ（Ｎ（２１））、位置１３１のＮ（Ｎ（１３１））、位置２４４のＮ（Ｎ（２４４））及び位置３９３のＮ（Ｎ（３９３））である。従って、これらのＮ−グリコシル化部位は、天然のグリカン部分に対応する。
【００５８】
方法の態様の一実施形態において、前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩は、グリカン部分のシス−グリコール基をアルデヒド基に酸化する。
【００５９】
方法の態様の一実施形態において、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記アルデヒドをアルコールに還元する。
【００６０】
方法の態様の一実施形態において、工程ａ）及び工程ｂ）は、中間工程を実行することなく、順番に実行される。本発明者らは、工程ｂ）が、工程ａ）の直後に、又は以下に記載される任意の反応停止工程ａ２）の後に実施され得、それによって反応試薬の除去するための中間工程、例えば、限外濾過、沈殿又は緩衝液の交換が省かれることを見出した。これにより、スルファミダーゼが反応性アルデヒド中間体に長時間さらされることを回避する。工程ａ）、又は任意にａ２）の後に工程ｂ）を進行させると、全体の反応時間も有利に短縮される。
【００６１】
以下の段落において、工程ａ）の特定の実施形態が開示される。他に定義されない限り、本明細書に開示される態様の特定の実施形態を組み合わせることができることを理解すべきである。
【００６２】
一実施形態では、前記過ヨウ酸アルカリ金属塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
【００６３】
一実施形態では、工程ａ）の前記反応は、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間、実施される。特定の実施形態において、工程ａ）の反応は、少なくとも０．５時間実施される。反応は、好ましくは、約３時間、２時間、１時間、又は１時間未満の持続時間を有する。本発明者らは、工程ａ）の持続時間が４時間以下であることにより、グリカン認識受容体のエピトープを効率的に不活性化することを見出した。さらに、４時間以下の持続時間は、既知の方法に従って製造されたスルファミダーゼに観察された鎖切断の程度と比較して、ポリペプチド鎖の鎖切断の程度をなお低下させる。これは、例えば実施例４及び５において本発明者らによって実証されている。
【００６４】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、（最終）濃度が２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用される。過ヨウ素酸塩は、８〜２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭの濃度で使用することができる。あるいは、過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ未満、例えば１０ｍＭ〜１９ｍＭの濃度で使用される。より低濃度の過ヨウ素酸アルカリ金属塩、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムが、ポリペプチド鎖の鎖切断の程度、並びにアミノ酸側鎖上の関連する酸化、例えば、配列番号１の位置２２６のメチオニン残基（Ｍｅｔ２２６）の酸化を減少させることを見出した。
【００６５】
一実施形態では、工程ａ）の前記反応は、周囲温度、好ましくは０〜２２℃の温度で実施される。好ましい実施形態において、前記工程ａ）の反応は、０〜８℃の温度、例えば０〜４℃の温度で実施される。好ましい実施形態において、工程ａ）の反応は、約８℃の温度、約４℃の温度又は約０℃の温度で実施される。
【００６６】
一実施形態では、工程ａ）の前記反応は、ｐＨ３〜７ので実施される。当該ｐＨは、反応の開始時のｐＨとして理解されるべきである。特定の実施形態では、工程ａ）で使用されるｐＨは３〜６、例えば４〜５である。特定の実施形態において、工程ａ）で使用されるｐＨは、約６、約５、又は約４である。工程ａ）のｐＨを低下させることによって、過ヨウ素酸塩の濃度又は工程ａ）の反応時間を短縮してもよい。
【００６７】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用される。一実施形態では、前記メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、８〜２０ｍＭの濃度で使用される。好ましい実施形態において、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、約１０ｍＭの濃度で使用される。
【００６８】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用され、工程ａ）の前記反応が、４時間以下、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間実施される。従って、従来技術の方法と比較して、２０ｍＭの過ヨウ素酸塩の濃度及び４時間以下の反応時間は、より少ない鎖切断（ｓｔｒａｎｄ−ｂｒｅａｋ）及び酸化をもたらし得る。比較的短い反応時間を維持しながら過ヨウ素酸塩濃度をさらに低下させることは、鎖切断及び酸化にさらに影響を及ぼす。２０ｍＭ未満の濃度では、鎖切断及び酸化がさらに少なくなり、１５ｍＭ以下の濃度では鎖切断及び酸化がさらに少なくなり、約１０ｍＭの濃度では鎖切断及び酸化が最も少なくなる。実施例５に示されるように、本明細書に記載の態様による修飾スルファミダーゼは、特に、例えば、配列番号１のアミノ酸４３６〜４８４によって示されような、スルファミダーゼのｃ末端部分において、より少ない鎖切断を示す。このｃ末端部分は、本明細書に記載のように調製されたスルファミダーゼにおいて無傷であることが見出された。さらに、位置２２６（Ｍｅｔ２２６）のメチオニンの酸化は、それほど頻出ではない。
【００６９】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭの（最終）濃度で使用され、工程ａ）の前記反応が４時間以下の時間、例えば３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間、０〜２２℃の温度で、例えば約８℃、例えば約０℃で実施される。
【００７０】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用され、工程ａ）の前記反応は、４時間以下、例えば約３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で、実施される。
【００７１】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記工程ａ）の反応は、４時間以下、例えば約３時間以下、例えば２時間以下、例えば１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で実施される。
【００７２】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、２０ｍＭ以下の濃度、例えば１５ｍＭ以下、例えば約１０ｍＭで使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記工程a）の反応は、０〜２２℃の温度で、例えば０〜８℃の温度で、例えば０〜４℃の温度で、例えば約８℃で、例えば約０℃で、実施される。
【００７３】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、約１０ｍＭの濃度で使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記工程ａ）の反応は、約８℃の温度で、２時間以下の期間実施される。
【００７４】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩は、約１０ｍＭの濃度で使用されるメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記工程ａ）の反応は、０〜８℃の温度で、３時間以下の期間実施される。
【００７５】
以下の段落において、工程ｂ）の特定の実施形態が開示される。他に定義されない限り、特定の実施形態、特に工程ａ）及び工程ｂ）の特定の実施形態を組み合わせることができることを理解されたい。
【００７６】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、水素化ホウ素ナトリウムである。
【００７７】
いくつかの例において、工程ｂ）に使用される条件は、工程ａ）に使用される条件に部分的に依存することが見出されている。工程ｂ）において使用される水素化ホウ素塩（ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）の量は、好ましくは、できるだけ低く保たれる一方、水素化ホウ素塩対過ヨウ素酸塩（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）のモル比は、そのような場合０．５〜４：１である。従って、工程ｂ）において、水素化ホウ素塩は、工程ａ）において使用される過ヨウ素酸塩の量の４倍のモルで使用される。一実施形態では、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の（最終）濃度の４倍以下の（最終）モル濃度で使用される。例えば、水素化ホウ素塩は、過ヨウ素酸塩の濃度の３倍以下の濃度、例えば過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下、例えば過ヨウ素酸塩の濃度の２倍以下、前記過ヨウ素酸塩の濃度の１．５倍以下、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度におおよそ対応する濃度で使用されてもよい。しかし、特定の実施形態では、過ヨウ素酸塩濃度の半分、又は過ヨウ素酸塩濃度の０．５倍に相当する濃度で、水素化ホウ素塩が使用される。従って、過ヨウ素酸塩が約２０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は、８０ｍＭ以下の濃度、又は１０〜８０ｍＭの濃度、例えば１０〜５０ｍＭの濃度で使用されてもよい。過ヨウ素酸塩が１０〜２０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は２５〜８０ｍＭ、例えば５０ｍＭの濃度で使用され得る。同様に、過ヨウ素酸塩が約１０ｍＭの濃度で使用される場合、水素化ホウ素塩は、４０ｍＭ以下の濃度、例えば、２５ｍＭ以下の濃度で使用され得る。さらに、そのような実施形態において、水素化ホウ素塩は、好ましくは、１２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度で使用され得る。本発明者らは、水素化ホウ素塩の濃度がスルファミダーゼの活性部位における触媒アミノ酸残基の保存度に影響を及ぼし、従って比較的低い濃度の水素化ホウ素塩が触媒活性を保持する修飾スルファミダーゼを提供し得ることを見出した。
【００７８】
一実施形態では、前記工程ｂ）の反応は、１．５時間以下、例えば１時間以下、例えば０．７５時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される。反応時間は、好ましくは約１時間、又は１時間未満である。さらなる例において、工程ｂ）の反応は、約０．２５時間の持続時間を有する。さらなる実施形態において、工程ｂ）の反応は、０．２５時間〜２時間の期間実施することができる。上記で説明されるように、還元工程の持続時間は、スルファミダーゼの触媒活性に影響を与えることが見出されている。従って、比較的短い反応時間は、Ｓｅｒ５０ではなくＦＧｌｙ５０を含む修飾スルファミダーゼを提供し得る。より短い反応時間は、酵素の全体的な構造的完全性に有利に影響することが見出されている。特に、スルファミダーゼの高分子量形態並びに鎖切断の発生を生じるタンパク質凝集は、少なくとも部分的に反応時間と関連しているようである。従って、工程ｂ）の比較的短い反応時間は、凝集の発生及び鎖切断を減少させ得る。本明細書の他の箇所で説明されているように、凝集した形態の存在が減少すると、治療に使用するのに適したタンパク質になり得る。
【００７９】
一実施形態では、前記工程ｂ）の反応は、０〜８℃の温度で実施される。工程ｂ）の反応温度は、反応生成物の触媒活性に少なくとも部分的に影響を及ぼすことが見出されている。特に、スルファミダーゼの活性部位における触媒残基の変換は、反応温度に関連する。従って、工程ｂ）を８℃未満の温度で実施することが有利であり得る。温度は好ましくは約０℃である。
【００８０】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムである。
【００８１】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記工程ｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間の期間実施される。
【００８２】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記工程ｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間の期間、０〜８℃の温度で実施される。
【００８３】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度で、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用され、前記工程ｂ）の反応は１時間以下、例えば約０．５時間、０〜８℃の温度で実施される。
【００８４】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は水素化ホウ素ナトリウムであり、前記工程ｂ）の反応は、１時間以下、例えば約０．５時間、０〜８℃の温度で実施される。
【００８５】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記工程ｂ）の反応は０〜８℃の温度で実施される。
【００８６】
一実施形態では、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍〜４倍の濃度、例えば前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍の濃度で使用される水素化ホウ素ナトリウムであり、前記工程ｂ）の反応は、約０℃の温度で約０．５時間の期間実施される。
【００８７】
一実施形態では、前記過ヨウ素酸塩はメタ過ヨウ素酸ナトリウムであり、前記水素化ホウ素アルカリ金属塩は水素化ホウ素ナトリウムである。
【００８８】
一実施形態では、工程ａ）及び工程ｂ）のそれぞれは、２時間以下、例えば１時間以下、例えば約１時間又は約０．５時間の期間、個別に実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜４倍、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の０．５〜２．５倍の濃度で使用される。特定の実施形態において、前記水素化ホウ素塩は、過ヨウ素酸塩の濃度の０．５倍の濃度で、又は前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍の濃度で使用される。
【００８９】
一実施形態では、工程ａ）は３時間以下の期間実施され、工程ｂ）は１時間以下実施される。任意に、前記水素化ホウ素塩は、前記過ヨウ素酸塩の濃度の４倍以下、好ましくは前記過ヨウ素酸塩の濃度の２．５倍以下で使用される。
【００９０】
当業者は、化学反応の反応持続時間、例えば工程ａ）及びｂ）のそれぞれの反応持続時間を制御する方法を認識している。従って、一実施形態では、前記方法の態様は、ａ２）工程ａ）から生じる反応の反応停止（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）をさらに含む。前記反応停止は、３０分未満、例えば１５分未満の持続時間を有する。いくつかの例において、前記反応停止は、工程ａ）の直後に実施される。反応停止は、例えば、エチレングリコールの添加によって実施してもよい。エチレングリコールは、１９２ｍＭの最終濃度まで添加されてもよい。好ましくは、工程ｂ）は、反応停止の直後に続く。これにより、スルファミダーゼが反応性アルデヒド基に暴露される期間を最短にすることができる。反応性アルデヒドは、タンパク質の不活性化及び凝集を促進することができる。
【００９１】
一実施形態では、前記方法は、ｂ２）工程ｂ）から生じる反応の停止をさらに含む。この反応停止は、ケトン又はアルデヒド基、例えばシクロヘキサノン又はアセトンを含有する分子を添加することによって実施することができ、前記分子は好ましくは水に可溶性である。あるいは、前記反応停止は、酢酸又は他の酸の添加によって反応混合物をｐＨ６以下に低下させることによって行うことができる。いくつかの例において、前記反応停止は、約０．１Ｍの最終濃度までのアセトンの添加によって実施される。任意の反応停止工程は、工程ｂ）の反応時間の正確な制御を可能にする。このようにして反応時間を制御することは、ＦＧｌｙ５０含量に関してプロセスの再現性をさらに提供し得る。
【００９２】
従って、本明細書に開示される方法は、先行技術に従って修飾されたスルファミダーゼに対して多くの利点を有する修飾スルファミダーゼを提供する。従って、本発明者らは、スルファミダーゼポリペプチド鎖の構造的完全性に対する最小の負の影響を伴うスルファミダーゼの化学修飾条件を見出し、同時に、触媒活性を保持しながら４つの天然グリコシル化部位すべてにおいて、グリカンのほぼ完全な修飾を示唆する天然グリカン構造の実質的な欠如をもたらすことを見出した。驚くべきことに、特定の例において、工程ａ）に使用される条件は、工程ｂ）を実施するための条件を促進することを見出した。この方法の例示的な実施形態は、図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄに示す。
【００９３】
１つの態様では、上記で定義した方法の態様による方法によって得ることができる修飾スルファミダーゼが提供される。
【００９４】
１つの態様では、治療に使用するための上記方法の態様によって得ることができる修飾スルファミダーゼが提供される。
【００９５】
一態様では、リソソーム蓄積症、特にムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）の治療に使用するための上記方法の態様によって得られる修飾スルファミダーゼが提供される。
【００９６】
一態様では、哺乳動物の脳における、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）を治療するために血液脳関門を通過する、修飾のスルファミダーゼの薬物製造における使用が提供されるものであって、前記修飾は、酵素を過ヨウ素酸アルカリ金属塩及び水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することによって化学的に修飾されたグリカン部分を有することを含み、それによって、前記スルファミダーゼの触媒活性を維持する一方、グリカン認識受容体、例えばマンノース及びマンノース−６−リン酸細胞送達系に対するスルファミダーゼの活性を減少させる。
【００９７】
一態様では、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩＩＡ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）に罹患した哺乳動物を治療する方法が提供され、該方法は、哺乳動物に、治療上有効量の修飾スルファミダーゼを投与することを含み、前記修飾スルファミダーゼは、以下：
ａ）本明細書の態様及び実施形態に記載の修飾スルファミダーゼ；
ｂ）本明細書の態様及び実施形態に記載のスルファミダーゼ組成物、及び
ｃ）修飾スルファミダーゼであって、ここで、該修飾が、前記修飾スルファミダーゼと、過ヨウ素酸アルカリ金属塩及び水素化ホウ素アルカリ金属塩で逐次処理することにより、該スルファミダーゼが、触媒酵素活性を維持する一方で、グリカン認識受容体、例えばマンノース及びマンノース６リン酸細胞送達系に対するその活性を減少させるように化学的に修飾されたそのグリカン部分を有する、
から選択される。
【００９８】
その１つの実施形態では、前記治療が、７０日間の期間にわたり、１０用量の修飾スルファミダーゼの投与後に、哺乳動物の脳からの少なくとも約４８％のリソソーム蓄積のクリアランスをもたらす。さらに、前記治療は、２５日間の期間にわたり、１３用量の修飾スルファミダーゼの投与後に、哺乳動物の脳からの少なくとも約３０％のリソソーム蓄積のクリアランスをもたらす。
【００９９】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、実施例４に開示される発明者によって開発された化学修飾方法と、国際公開第２００８／１０９６７７号に開示されている既知の方法との違いを概説する図である。
【図２Ａ】図２Ａは、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。グリカン修飾手順によって生成された４つのタンパク質バンド（１〜４で示す）が同定された。
【図２Ｂ】図２Ｂは、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼ並びに本明細書に開示される新規な方法１に従って修飾されたスルファミダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼのＳＥＣクロマトグラムを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書に開示される新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼのＳＥＣクロマトグラムを示す。矢印によって示されているのは、修飾されたスルファミダーゼの多量体形態の量である。
【図４Ａ】図４Ａは、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼの動的光散乱によって測定された散乱強度を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本明細書に記載の新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼの動的光散乱によって測定された散乱強度を示す。
【図５】図５は、未修飾組換えスルファミダーゼ、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼ、及び本明細書に記載の新規方法１及び２に従って修飾されたスルファミダーゼのＭＥＦ−１細胞における受容体媒介エンドサイトーシスを視覚化する図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＭＰＳ  ＩＩＩＡ欠損マウスのインビボ処置の結果を示す。この図は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを３０ｍｇ／ｋｇで１日おきにｉ．ｖ．投与（１３回投与）した後のマウスの脳におけるヘパラン硫酸蓄積のクリアランスを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＭＰＳ  ＩＩＩＡ欠損マウスのインビボ処置の結果を示す。この図は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを３０ｍｇ／ｋｇで１日おきにｉ．ｖ．投与（１３回投与）した後のマウスの脳におけるヘパラン硫酸蓄積のクリアランスを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＭＰＳ  ＩＩＩＡ欠損マウスのインビボ処置の結果を示す。この図は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを３０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇそれぞれを、毎週１回ｉ．ｖ．投与（１０回投与）した後のマウスの脳におけるヘパラン硫酸蓄積のクリアランスを示す。
【図７】図７は、タンパク質中に一般的に存在する３つの典型的なＮ−グリカン構造の概略図である。左のグリカンはオリゴマンノース型、中央は複合型、右はハイブリッド型を表す。図では、以下の化合物が示されている：黒塗りのダイヤモンドは、Ｎ−アセチルノイラミン酸に対応する；黒塗りの円はマンノースに対応する；四角はＮ−アセチルグルコサミンに対応する；黒塗りの三角はフコースに対応する；円はガラクトースに対応する。アスタリスクでマークされた糖部分は、本明細書に開示されている過ヨウ素酸／水素化ホウ素塩処理によって修飾され得る。
【図８Ａ】図８Ａは、化学修飾後のマンノースの予想される結合切断を示す概略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｍａｎ−６グリカンのモデルを示す概略図である。過ヨウ素酸塩で酸化した場合に結合の切断に感受性がを有する糖部分が示される。灰色の円はマンノースに対応し、黒い四角はＮ−アセチルグルコサミンに対応し、Ｔ１３はＮ−グリコシル化部位Ｎ（１３１）を含むトリプシンペプチドＮＩＴＲに対応する。
【図９】図９は、既知の方法に従って化学修飾する前（Ａ）及び化学修飾後（Ｂ〜Ｄ）のＮ（１３１）に結合したＭａｎ−６グリカンを有するトリプシンペプチドＴ１３（Ｔ１３＋Ｍａｎ−６グリカン）に対応する二価荷電イオンの質量スペクトルを示す（Ｓ．＝単結合切断；Ｄ．＝二重結合切断；例えばＤ．ｘ３＝三重結合切断）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、既知の方法（黒色バー）、新規方法１（黒色ドット）、新規方法３（白色）、及び新規方法４（クロスチェッカー）に従って化学修飾した後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの結合切断合の程度を視覚化する図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、既知の方法（黒色バー）、新規方法１（黒色ドット）、新規方法３（白色）、及び新規方法４（クロスチェッカー）に従って化学修飾した後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの単結合切断の相対的存在量を視覚化する図である。
【図１１】図１１は、ヒトスルファミダーゼのアミノ酸配列を列挙する表であって、ここで、配列番号１はヒトスルファミダーゼのアミノ酸配列に対応し、配列番号２はＧＳ−スルファミダーゼに対応し、配列番号３はスルファミダーゼ−ＧＳに対応する。
【実施例】
【０１０１】
実施例
以下の実施例は、本開示による修飾スルファミダーゼポリペプチドの開発を開示する。
【０１０２】
実施例１
スルファミダーゼの培養、精製及び特性評価
【０１０３】
材料と方法
スルファミダーゼ発現ベクターの構築：ヒトスルファミダーゼをコードする合成遺伝子は、ホモサピエンス又はＣ．グリセウス（ＣＨＯ細胞）及び元のヒト配列の両方にコドン最適化されたバージョンであり、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成された。合成遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐＱＭＣＦ１（Ｉｃｏｓａｇｅｎ）などの異なる哺乳動物発現ベクターにクローニングした。
【０１０４】
スルファミダーゼの産生：スルファミダーゼ産生、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを用いたＨＥＫ２９３細胞における一過性発現及びｐＱＭＣＦ１ベクターを用いた及びＱｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）の２つの一過性発現系を評価した。両方の系において、細胞を標準培地中で増殖させ、トランスフェクションの６〜８日後に典型的には分泌タンパク質を採取した。さらに、市販のＣＨＯ発現系を用いて確立された安定な細胞系のスルファミダーゼの産生について評価した。
【０１０５】
スルファミダーゼは、２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で平衡化したＱセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ）によって培地から捕獲し、ＮａＣｌ勾配で溶出させた。捕獲されたスルファミダーゼを、４−メルカプト−エチル−ピリジン（ＭＥＰ）クロマトグラフィーによりさらに精製した。スルフェアミダーゼ含有画分を、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌクロマトグラフィーカラムにロードし、続いて５０ｍＭ  ＮａＡｃ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ４．６の定組成溶出によって溶出した。最後の磨き工程（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）は、２５ｍＭ  ＮａＡｃ、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ４．５で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）によって達成した。溶出にはＮａＣｌ勾配を用いた。様々な発現系からのスルファミダーゼバッチの純度及び同一性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した（データは示さず）。
【０１０６】
グリコシル化分析：生成された種々のスルファミダーゼバッチについてグリコシル化パターンを決定した。糖ペプチド分析の前に、スルファミダーゼ（約１０μｇ）を還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。タンパク質の還元は、７０℃で１時間、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の５μＬのＤＴＴ  １０ｍＭ中でインキュベーションした。その後のアルキル化を５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミド５μＬを用いて室温（ＲＴ）及び暗所で４５分間行った。最後に、トリプシン消化を、３０μＬの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８、及び５０ｍＭ酢酸中の０．２μｇ／μＬトリプシン（プロテアーゼ：タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ））の添加によって実施した。消化は３７℃で一晩行った。
【０１０７】
トリプシン消化スルファミダーゼの５つのペプチド断片は潜在的なＮ−グリコシル化部位を含んでいた。潜在的なグリコシル化部位Ｎ（ｘ）（式中、ｘは配列番号１で定義されたスルファミダーゼアミノ酸配列中のアスパラギンの位置を示す）を含むこれらのペプチドフラグメントは：
【０１０８】
Ｎ（２１）含有フラグメント（配列番号１の残基４〜３５、3269.63Da）、
Ｎ（１２２）含有フラグメント（配列番号１の残基１０５〜１３０、2910.38Da）、
Ｎ（１３１）含有フラグメント（配列番号１の残基１３１〜１３４、502.29Da）、
Ｎ（２４４）含有フラグメント（配列番号１の残基２３９〜２６２、2504.25Da）、
Ｎ（３９３）含有フラグメント（配列番号１の残基３７４〜３９４、2542.22Da）
である。
【０１０９】
各潜在的グリコシル化部位のアスパラギンは太字で示され、各ペプチドフラグメントの分子量を示す。
【０１１０】
５つのトリプシンペプチドフラグメントの可能なグリコシル化変異体を、糖ペプチド分析によって調べた。これは、液体クロマトグラフィーに続き、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５１０四極子（Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）飛行時間型質量分析計（Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ）に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムを用いた質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって行った。いずれのシステムもＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎによって制御した。Ｗａｔｅｒｓ  ＸＳＥＬＥＣＴ  ＣＳＨ  １３０  Ｃ１８カラム（１５０ｘ２．１ｍｍ）を用いてＬＣ分離を行い、カラム温度を４０℃に設定した。移動相Ａは、５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸、及び０．０２％ＴＦＡから成り、移動相Ｂは、９５％アセトニトリル、０．１％プロピオン酸及び０．０２％ＴＦＡからなる。０％〜１０％Ｂの勾配で１０分間、次いで１０％〜７０％Ｂでさらに２５分間、０．２ｍＬ／分の流速で使用した。注入量は１０μＬであった。Ｑ−ＴＯＦは、正のエレクトロスプレーイオンモードで操作した。データ取得の過程で、フラグメンター電圧、スキマー電圧、及びオクトポールＲＦはそれぞれ９０、６５及び６５０Ｖに設定した。質量範囲は３００〜２８００ｍ／ｚであった。
【０１１１】
結果
ＨＥＫ２９３細胞における一過性発現は、低レベルの分泌スルファミダーゼが得られた（０．３ｍｇ／Ｌ培地未満、配列番号３）。ＱＭＣＦ安定エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）は、ＣＨＯ細胞において１０ｍｇ／Ｌを超える力価でスルファミダーゼ（配列番号２）産生をもたらした。ＣＨＯ発現系から確立された安定な細胞系は、４０ｍｇ／Ｌを超えるスルファミダーゼ（配列番号１）力価をもたらした。
【０１１２】
スルファミダーゼは、６１〜６３ｋＤａの範囲の分子量にて、見かけ上均質に精製された。５５ｋＤａの理論上のペプチド鎖質量から、これは総分子量６〜８ｋＤａのグリカンの存在を示している。スルファミダーゼバッチの純度及び同一性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した（結果は示さず）。
【０１１３】
トリプシン消化ペプチドのグリコシル化分析は、ＬＣ−ＭＳによって実施した。各糖ペプチド上の３０種類のグリコシル化の手動検索を行った。相対定量は、再構成されたイオンクロマトグラム（イオン化効率の補正なし）のピーク面積を測定することによって行った。５つの推定Ｎ−グリコシル化部位のうち、４つ（Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３））は、全てのスルファミダーゼバッチを介して一貫してグリコシル化されていた。Ｎ（２１）及びＮ（３９３）は、複合型グリカンによって占められていたが、フルシアル化の程度は低かった。Ｎ（１３１）はオリゴマンノース型グリカンによって完全に占有されていた。グリカンのリン酸化の程度は、全てのバッチについて約５０％であった。Ｎ（１３１）部位は、アルカリホスファターゼによる脱リン酸化に耐性であった。ＣＨＯ細胞（配列番号２）とＨＥＫ２９３細胞（配列番号３）の比較で異なる第４の部位であるＮ（２４４）は、ＣＨＯ細胞バッチ中ではオリゴマンノース、ＨＥＫ２９３バッチ中ではオリゴマンノース／複合型混合のスルファミダーゼを産生した。Ｎ（１２２）を含むトリプシンペプチドは、いかなるグリカンも結合していなかった。
【０１１４】
実施例２：
既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾
【０１１５】
材料と方法
公知の方法による化学的修飾（国際公開第２００８／１０９６７７号）：スルファミダーゼのグリカン部分を修飾するために、Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）を用いて、実施例１に記載したようにして製造したスルファミダーゼ（配列番号２）は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、０℃で６．５時間、２０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムとともに最初にインキュベートした。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止（ｑｕｅｎｃｈ）した。反応停止を０℃で１５分間進行させた後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に対して４℃で一晩透析を行った。透析後、反応混合物を１００ｍＭの最終濃度まで水素化ホウ素ナトリウムを添加して還元を行った。還元反応を一晩進行させた。最後に、酵素調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した。全てのインキュベーションは暗所で行った。
【０１１６】
結果
修飾スルファミダーゼは、図１Ａに示された一連の工程に従ってトリプリケートで生成された。
【０１１７】
実施例３：
既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼの分析
【０１１８】
材料と方法
既知の方法に対応する実施例２により修飾されたスルファミダーゼを以下の分析に供した。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：５μｇの修飾スルファミダーゼをＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上の各ウェルに充填した。シーブルー２プラスマーカーを使用し、ゲルをインスタントブルー（Ｃ．Ｂ．Ｓサイエンティフィック）で着色した。
【０１２０】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析：修飾酵素をＡＫＴＡｍｉｃｒｏシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。４０μＬ／分の製剤緩衝液の流速を有するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＰＣ  ３．２／３０カラムを使用した。サンプル量は１０μＬであり、１０μｇの酵素を含有していた。
【０１２１】
動的光散乱（ＤＬＳ）分析：修飾スルファミダーゼを１２０００ｒｐｍで３分間室温（ＲＴ）遠心分離することによって脱気した。ＤｙｎａＰｒｏ  Ｔｉｔａｎ装置（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）上で２５％レーザー出力を用いて、それぞれ７５μＬを３回反復でＤＬＳ実験を行った。
【０１２２】
ゲル内消化及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、いくつかの余分なバンドが明らかとなり、切り取り、脱染色し、トリプシンを用いたゲル内消化で処理した。手順は以下の通り行った：
【０１２３】
ｉ．クーマシーの脱染色：切り出したゲルバンドをエッペンドルフチューブに入れた。チューブを５０％アセトニトリル中の１００ｍＭ  ＮＨ３ＨＣＯ３中で３０℃にて１時間２回撹拌した。上清を捨てた。
【０１２４】
ｉｉ．還元及びアルキル化：ゲル片をアセトニトリル中で脱水し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃで乾燥させ、続いて１００ｍＭ  ＮＨ３ＨＣＯ３中の１０ｍＭ  ＤＴＴでカバーした。還元を５７℃で１時間進行させた。上清を捨て、１００ｍＭのＮＨ３ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミドで置換した。アルキル化は、暗所で、わずかに撹拌しながら、ＲＴで４５分間行った。上清をもう一度捨てた。ゲルを５０％アセトニトリル中１００ｍＭのＮＨ３ＨＣＯ３で３０℃にて２０〜３０分間洗浄し、その後上清を捨てた。ゲル片をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃで完全に乾燥させた。
【０１２５】
ｉｉｉ．トリプシンによるゲル内消化：２〜５μＬの５０ｍＭ  ＮＨ３ＨＣＯ３を乾燥ゲル片に添加し、その後５μＬのトリプシン溶液（１％酢酸中０．１μｇ／μＬ）を添加した。５０ｍＭＮＨ３ＨＣＯ３をさらに添加してゲルを膨潤させた。３７℃で一晩（攪拌しながら）消化した。上清を新しいチューブに移し、室温で６０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ（３×２０分）で抽出した。得られた上清をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃで乾燥近くまで蒸発させた。濃縮溶液をα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と１：１で混合し、０．６μＬをＭＡＬＤＩプレートに適用した。
【０１２６】
Ｓｃｉｅｘ  ５８００マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ）を用いてトリプシンペプチドフラグメントの分子質量を測定した。分析は、３５５０ショット及び４００ショットのレーザーエネルギーを用いた陽イオンリフレクトロンモードで行った。
【０１２７】
活性部位の保存：スルファミダーゼの活性部位に対する化学修飾の影響をＬＣ−ＭＳ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて調べた。サンプルは、実施例１のグリコシル化分析セクションに記載されたＬＣ−ＭＳ法に従って調製した。システイン５０変異体（システイン５０（アルキル化）、酸化システイン５０、ＦＧｌｙ５０及びＳｅｒ５０）を含む得られたトリプシンペプチドを、再構成されたイオンクロマトグラムを利用して半定量化した。ペプチドの同一性は、ＭＳＭＳシークエンスによって行った。ＭＳＭＳパラメータは、以下の通りであった：衝突エネルギーを１０、１５、２０Ｖ、走査範囲１００〜１８００ｍ／ｚ、スキャン速度１スキャン／秒に設定した。
【０１２８】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で明らかなように、全長スルファミダーゼとは異なるサイズのいくつかのペプチドが、化学修飾の結果、形成された（図２Ａ）。
【０１２９】
ＳＥＣ及びＤＬＳによる分析：化学修飾手順は、図３Ａのクロマトグラムのプレピークとして示されるように、スルファミダーゼの凝集を促進することが見出された。クロマトグラムにおけるプレピークのピーク高さは、主ピークの高さの約３％であることが見出された。
【０１３０】
さらに、ＤＬＳ分析は、同じ物質が、高分子量形態（すなわち、１０１０ｋＤａを超える）の全タンパク質含量の１５〜２０％のタンパク質を含有することを明らかにした（図４Ａ）。
【０１３１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの分析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された４つのゲルバンド＃１−４（図２Ａ）は、化学修飾中に鎖切断によって生成されたスルファミダーゼのフラグメントとして同定することができた。
【０１３２】
図２Ａのゲルバンド＃１及び＃２は、化学修飾の結果形成された、６ｋＤａ及び３０ｋＤａの分子量を有する２つのＣ末端トランケーションとして、ゲルバンド＃３は１つの４１ｋＤａのＮ末端トランケーションとしてとして、及びゲルバンド＃４は１つのスルファミダーゼの二量体フォームのとして（１１１ｋＤａバンド）決定された（ＭＡＬＤＩスペクトルは示されていない）。
【０１３３】
従って、既知の方法に従ってスルファミダーゼの化学修飾がグリカンを修飾するだけでなく、スルファミダーゼポリペプチド鎖の特定の位置で鎖切断を生成することも見出された。
【０１３４】
また、公知の方法による化学修飾により、スルファミダーゼ上のいくつかのメチオニン残基、特に、ほぼ完全に酸化された、メチオニン１８４及びメチオニン４４３に酸化が導入されることも見出された。メチオニン２２６（アミノ酸残基２２６〜２３８に対応するトリプシンペプチドＴ２３に見出される）は、はるかに低い程度しか酸化されないが、この酸化はスルファミダーゼよりも不安定なタンパク質を生じ、４１ｋＤａのＮ末端トランケーション（図２Ａのゲルバンド＃３）を生じる。従って、ＭＳ分析で観察されるように、メチオニン２２６の酸化及び鎖切断は相関しているようであった。さらに、二量体バンド（図２Ａの＃４）はまた、主に酸化メチオニン２２６を含有していた（図２Ａ）。
【０１３５】
その結果、グリカンの修飾の既知の手順は、酵素の構造的完全性に重要なアミノ酸残基の酸化を触媒する。
【０１３６】
活性部位の保存：さらに、ＬＣ−ＭＳＭＳの使用により、還元工程（図１Ａ）は、配列番号１の活性部位５０位のＦＧｌｙ残基をＳｅｒに還元することが判明した。この位置のＳｅｒは、効率的な触媒作用に適合しない（（Ｒｅｃｋｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１１）：６０９６−１０３（１９９８））。ＦＧｌｙから生成した相対量のＳｅｒを、ＦＧｌｙ５０及びＳｅｒ５０を含む２つのトリプシンペプチド断片に対応する、質量スペクトル中の二価荷電イオンのピーク面積測定に基づいて推定した。ピーク面積は、イオン化効率の補正を伴わないＭＳ反応に基づくものであった。以下の表１は、既知の方法（実施例５、表２も参照のこと）に従って修飾後、ＦＧｌｙからＳｅｒへの変換率が約５６％であることを示す。
【０１３７】
【表１】
0006594896.tif 000002
【０１３８】
従って、上記の修飾に加えて、既知の化学修飾手順は、酵素の触媒活性にとって重要なアミノ酸残基の還元を引き起こす。
【０１３９】
実施例４：
スルファミダーゼの化学修飾の新規方法
【０１４０】
材料及び方法
新規方法１：実施例１に記載のＱｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）で産生したスルファミダーゼを、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液中にて、２０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０℃で１２０分間暗所にてインキュベートすることにより酸化した。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を停止させた。反応液に水素化ホウ素ナトリウムを最終濃度が５０ｍＭになるまで６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で１２０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を２０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０に対して限外濾過を行った。化学修飾のための新規方法１を図１Ｂに示す。
【０１４１】
新規方法２：還元工程における水素化ホウ素ナトリウムの濃度が１０ｍＭであったことを除き、新規方法１のように実施した。化学修飾の新規方法２を図１Ｃに示す。
【０１４２】
新規方法３：実施例１の安定細胞株で産生されたスルファミダーゼを、初期のｐＨが４．５〜５．７の酢酸塩緩衝液中、０℃、暗所で１８０分間、メタ過ヨウ素酸ナトリウム１０ｍＭと共にインキュベートすることによって酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を反応停止した。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で６０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過した。化学修飾の新規方法３を図１Ｄに示す。
【０１４３】
新規方法４：実施例１に記載の安定細胞株で産生されたスルファミダーゼを、初期ｐＨ４．５の酢酸緩衝液中、暗所で８℃にて、１０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共に６０分間インキュベートすることによって酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を反応停止した。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で６０分間インキュベートした後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過した。
【０１４４】
第２の反応停止工程の調査：第２工程の反応停止の効果を、新規方法１の水素化ホウ素ナトリウムのインキュベーション工程の後に０．１Ｍのアセトンを添加することによって調べた。材料は、水素化ホウ素ナトリウムの添加及びインキュベーションを含む新規方法１に従って、並行して製造した後、１つのサンプル中の反応をアセトンの添加により停止させた。次に両方のサンプルを新規方法１の限外濾過工程に従って処理した。
【０１４５】
新規方法５：実施例１の安定細胞株で産生されたスルファミダーゼを、初期ｐＨ４．５の酢酸塩緩衝液中、暗所にて８℃で、１０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムと共にインキュベートすることにより酸化させた。エチレングリコールを最終濃度１９２ｍＭになるように添加することにより、グリカン酸化を反応停止した。反応混合液に水素化ホウ素ナトリウムを２５ｍＭの最終濃度まで添加する前に、６℃で１５分間反応停止を進行させた。暗所にて０℃で４５分間インキュベートし、反応を０．１Ｍアセトンで反応停止した後、得られたスルファミダーゼ調製物を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して限外濾過を行った。
【０１４６】
結果
既に本明細書の他の部分で説明したように、メタ過ヨウ素酸ナトリウムは、炭水化物のシス−グリコール基をアルデヒド基に変換する酸化剤であるのに対し、水素化ホウ素塩は、アルデヒドをより不活性なアルコールに還元する還元剤である。従って、炭水化物構造は不可逆的に破壊される。
【０１４７】
グリカンの化学修飾の改良方法を提供するために、特に改善された特性を有する修飾スルファミダーゼを提供する手順を提供するために、異なる反応条件が評価された。メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化と水素化ホウ素ナトリウムによる還元の両方が、触媒活性及び免疫原性傾向に悪影響を与える特性の、ポリペプチドの修飾及び凝集を導入したと結論付けることができた。
【０１４８】
改善された化学修飾手順についての条件が発見された。驚くべきことに、これらの条件は、緩衝液の交換及びスルファミダーゼの反応性アルデヒド中間体への長時間の曝露を省略して、エチレングリコール反応停止工程の直後に還元工程を実施できることを促進した。新規化学修飾手順を図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄに示す。
【０１４９】
実施例５：
新規方法に従って修飾されたスルファミダーゼの分析
【０１５０】
材料と方法
実施例４の新規方法に従って修飾されたスルファミダーゼを以下の分析に供した。
【０１５１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：既知の方法（実施例２）並びに新規方法１及び２（実施例４）に従って修飾した５μｇのスルファミダーゼを、実施例３の記載に従って個別のウェルに充填した。同様に、新規方法１（実施例４）並びに新規方法３、４及び５に従って修飾した５μｇのスルファミダーゼを、実施例３の記載に従って個別のウェルに充填した。
【０１５２】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析：新規方法１〜４に従って修飾されたスルファミダーゼを、実施例３に従って分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１５３】
動的光散乱（ＤＬＳ）分析：新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼを実施例３に従ってＤＬＳにより分析した。
【０１５４】
活性部位の保存：実施例３の記載に従って、新規方法１〜５並びに第２の調査された反応停止工程に従って製造されたスルファミダーゼの活性部位に対する化学修飾の影響を調査した。
【０１５５】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：新規化学修飾法１の結果として、全長スルファミダーゼとは異なるサイズのいくつかのペプチドが形成された（図２Ｂ）。しかし、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼと比較して、新規方法１は、より少ないフラグメント化を生じた。Ｃ末端アミノ酸４３４〜４８２として同定されたフラグメント＃１（図２Ａ）は、新規方法１、３及び４によって生成されたスルファミダーゼ試料では検出されず、他のフラグメント量が大幅に減少した。この傾向は、新規方法２によって生成された物質においてさらに顕著であった。しかしながら、新規方法２では、ゲル上により高分子量の形態が存在し、還元剤の量が酸化工程で生成される全ての反応性アルデヒドを還元するのに不十分であることを示唆している（データは示さず）。新規方法３、４及び５は、新規方法１によって産生されたものと類似した修飾スルファミダーゼ物質を産生した（データ示さず）。
【０１５６】
従って、新規方法によって調製されたスルファミダーゼポリペプチドの鎖切断は、実施例２に従って調製されたスルファミダーゼにおける鎖切断の発生と比較して制限される。
【０１５７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析：新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼは、既知の方法によって修飾されたスルファミダーゼと比較して凝集体が少ないことが見出された。これは、図３のクロマトグラムで実証されており、高分子量の形態がクロマトグラムにプレピークとして存在している。図３Ｂのプレピークのピーク高さは、メインピーク高さに対して０．５％であり、図３Ａのピーク高さ（３％）と比較して減少している。これは、新規方法３、４及び５によって修飾されたスルファミダーゼの場合にも当てはまる（データ示さず）。
【０１５８】
動的光散乱（ＤＬＳ）分析：ＤＬＳ分析（図４Ｂ）は、ＳＥＣ分析の結果を確認した。新規方法に従って製造されたスルファミダーゼは、高分子量形態（１０１０ｋＤａ以上）で５％のタンパク質を含有した。従って、スルファミダーゼの凝集形態の形成は、公知の方法と比較して新規方法によって制限されると結論づけることができた（実施例３参照）。
【０１５９】
活性部位の保存：スルファミダーゼの活性部位における位置５０のＦＧｌｙからＳｅｒへの還元をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定し、ＦＧｌｙ及びＳｅｒを含有するトリプシンペプチドを陽性に同定した。ペプチドフラグメントの相対量を、二重荷電イオンの再構成イオンクロマトグラムからのピーク面積（イオン化効率の補正なし）を測定することによりＬＣ−ＭＳで分析した。化学修飾のために実施例４で使用された方法から生成された試料を調製し分析した。（表２）
【０１６０】
【表２】
0006594896.tif 000003
【０１６１】
活性部位ＦＧｌｙの欠損は、新規方法によってかなり制限される。スルファミダーゼ上のグリカンを修飾する新規方法は、既知の方法を用いた５６％（表１、実施例３参照）から、４５％、４４％、３６％及び４２％（それぞれ新規方法１、３、４及び５、表２）までＳｅｒ形成量を有意に減少させた。新規方法２のＳｅｒ形成は約１１％であり、従ってＦＧｌｙのＳｅｒへの変換は水素化ホウ素ナトリウム濃度に大きく依存することが示された。
【０１６２】
反応の第２反応停止工程は、反応を停止させることなく生成されたスルファミダーゼに匹敵する修飾スルファミダーゼを提供した（新規方法１に従って生成された修飾スルファミダーゼは、第２反応をアセトンで反応停止した後、４３％Ｓｅｒ形成と比較して、４５％Ｓｅｒ形成であった）。これは、新規方法５によってさらに確認され、これもまた、反応停止工程を包含する。
【０１６３】
実施例６：
インビトロでの受容体媒介エンドサイトーシス
【０１６４】
材料と方法
スルファミダーゼは、実施例１、２及び４に記載のように調製され、Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）で産生し、公知の方法及び新規方法１及び２に従って修飾した。エンドサイトーシスはＭ６Ｐ受容体を発現するＭＥＦ−１線維芽細胞で評価した。ＭＥＦ−１細胞を、７５ｎＭのスルファミダーゼを補充したＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートした。細胞をＤＭＥＭで２回、０．９％ＮａＣｌで１回洗浄した後、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を用いて細胞溶解した。溶解物スルファミダーゼ活性及び総タンパク質含量を決定し、溶解物比活性を計算した。活性は、１４．５ｍＭジエチルバルビツール酸、１４．５ｍＭ酢酸ナトリウム、０．３４％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、及び０．１％ＢＳＡ中の基質として、０．２５ｍＭ  ４メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−スルホグルコサミニドを用いて、４６０ｎｍの蛍光強度でモニターした。全タンパク質濃度は、標準としてＢＳＡを含むＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として示される。
【０１６５】
結果
エンドサイトーシスアッセイで評価された全ての調製物について、細胞ホモジネート中でスルファミダーゼ活性を検出することができた。既知の方法並びに新規の方法１及び２によって調製された修飾スルファミダーゼは、非修飾組換えスルファミダーゼで得られたものの１０％未満の細胞ホモジネートで特異的活性を示した（図５）。スルファミダーゼとともに最初にロードされ、次いでスルファミダーゼの非存在下で２日間増殖された細胞に保持された活性は、化学修飾がリソソームの安定性に悪影響を及ぼさないことを示す全ての調製物と同等であった。
【０１６６】
従って、化学修飾により、Ｍ６ＰＲとしてのグリカン認識受容体に対するエピトープの除去の結果、スルファミダーゼの細胞への取り込みが起こりにくくなると結論付けることができる。巨視的レベルでは、この分子相互作用の喪失は、静脈内投与された場合に、血漿からのクリアランスの減少につながる。タンパク質クリアランスの減少は、患者への投与頻度を低減することが可能となる。
【０１６７】
実施例７：
新規方法１により製造された修飾スルファミダーゼのインビボ血漿クリアランス
【０１６８】
材料と方法
実施例１に記載のように、Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）で産生し、実施例４の新規方法１に従って修飾した、未修飾及び修飾組換えスルファミダーゼの血漿クリアランス（ＣＬ）をマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）で調べた。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇのスルファミダーゼ及び１０ｍｇ／ｋｇの修飾スルファミダーゼを尾静脈に単回静脈内投与した。スルファミダーゼ及び修飾スルファミダーゼを２ｍｇ／ｍＬで処方し、５ｍＬ／ｋｇで投与した。投与後２４時間までの異なる時点（時間点あたり３匹のマウス）で、血液サンプルを静脈伏在静脈又は大静脈から採取した。血液を氷上に保存したＥＤＴＡチューブに集め、血漿を遠心分離によって調製した。スルファミダーゼ及び修飾スルファミダーゼの血漿レベルをＥＣＬにより分析した。血漿クリアランスは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン６．３（非コンパートメント分析、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）を用いて計算した。
【０１６９】
電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイによるスルファミダーゼ及び修飾スルファミダーゼの定量：血漿中のスルファミダーゼ及び修飾スルファミダーゼＰＫサンプルを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プラットフォームを用いたＥＣＬイムノアッセイにより決定した。ストレプトアビジン被覆ＭＳＤプレートをＰＢＳ中の５％ブロッカー−Ａでブロックした。プレートを洗浄し、標準及びＰＫサンプルの異なる希釈液をプレートに分注した。ビオチン化抗スルファミダーゼマウスモノクローナル抗体とＳｕｌｆｏ−Ｒｕ−標識ウサギ抗スルファミダーゼ抗体との混合物を加え、プレートを室温でインキュベートした。スルファミダーゼ及び標識抗体の複合体は、ビオチン化ｍＡｂを介してストレプトアビジン被覆プレートに結合する。洗浄後、ウェルに読み取り緩衝液を添加することによって結合複合体量を決定し、プレートをＭＳＤ  ＳＩ２４００装置で読み取った。記録されたＥＣＬカウントは、試料中のスルファミダーゼの量に比例し、比較のスルファミダーゼ標準に対して評価した。
【０１７０】
結果
修飾スルファミダーゼのマウスにおける血漿クリアランスは、未修飾スルファミダーゼと比較して約１０倍低かった（下記表３参照）。これはおそらく、少なくとも部分的に、スルファミダーゼの化学修飾後の末梢組織における受容体媒介性取り込み阻害によるものであろう（実施例６の細胞摂取試験において実証される）。
【０１７１】
実施例１の安定細胞株で産生され、実施例４の新規方法３に従って修飾された修飾スルファミダーゼに対して得られたマウスのクリアランスに関するデータは、ＱＭＣＦシステムで産生され、新規方法１によって修飾された修飾スルファミダーゼに対して表３に提示されたデータと一致した。タンパク質のクリアランスが減少することにより、患者への投与回数が減少させる可能性がある。
【０１７２】
【表３】
0006594896.tif 000004
【０１７３】
実施例８：
脳ヘパラン硫酸蓄積に対する修飾スルファミダーゼのインビボ効果
【０１７４】
材料及び方法
インビボでの脳ヘパラン硫酸蓄積に関し、実施例１に記載のようにＱｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）で産生し、実施例４の新規方法１に従って修飾した修飾スルファミダーゼの静脈内（ｉｖ）投与の効果を調べた。
【０１７５】
試験物の調製：修飾スルファミダーゼを６ｍｇ／ｍＬで調製し、滅菌濾過し、使用するまで−７０℃で凍結させた。凍結修飾スルファミダーゼ及び対応するビヒクル溶液を、注射する日に使用前に室温で最低１時間、最高２時間解凍した。クロロフェニラミンを等張食塩水に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、−２０℃で保存した。
【０１７６】
動物：ｍｐｓ３ａ遺伝子に自発的ホモ接合突然変異を有する雄マウス、Ｂ６．Ｃｇ−Ｓｇｓｈｍｐｓ３ａ／ＰｓｔＪ（ＭＰＳ  ＩＩＩＡ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＥ、ＵＳＡ）を使用した。動物は２３±１℃及び湿度４０〜６０％のケージに単独で飼育し、水及び標準実験室用飼料を自由に摂取した。１２時間／１２時間の明／暗サイクルは、午後７時に点灯するように設定した。研究を開始する前に、動物を少なくとも２週間調整した。同じ育種単位由来の野生型兄弟を対照として含めた。研究Ａでは、マウスは２３〜２４週齢であったが、研究Ｂではマウスは９〜１０週齢であった。
【０１７７】
実験手順研究Ａ：３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝８）及びビヒクル（ｎ＝７）の修飾スルファミダーゼを、ＭＰＳ  ＩＩＩＡマウスに２５日間、２日に１度（１３回の注射）静脈内投与した。修飾スルファミダーゼ又はビヒクルの投与の３０〜４５分前に、クロルフェニラミンを皮下投与した（２．５ｍｇ／ｋｇ）。投薬は、朝の７時頃に開始した。試験品及びビヒクルを５ｍＬ／ｋｇで投与した。最終投与量は、各投与機会において実際の体重に対して補正した。このスキームはビヒクルにも繰り返した。この試験は、最後の注射の２時間後に終了した。未処置の月齢が一致した野生型マウス（ｎ＝５）を、試験物質処置群と併せて含めた。マウスをイソフルランで麻酔した。血液は後眼窩叢から採取した。灌流後、心臓の左心室に２０ｍＬの生理食塩水を流した。組織を解剖（脳、肝臓、脾臓、肺、及び心臓）し、秤量し、液体窒素中で急速に凍結させた。組織及び血液は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてヘキソサミンＮ−硫酸［α−１，４］ウロン酸（ＨＮＳ−ＵＡ）レベルを測定するために調製した。ＨＮＳ−ＵＡはヘパラン硫酸蓄積の二糖マーカーであり、従ってＨＮＳ−ＵＡレベルの減少はヘパラン硫酸の分解を反映する。ＨＮＳ−ＵＡデータは、ｍｇ組織当たりで表され、対照群の平均に対して標準化し、相対的単位対内部標準で計算した。全体的な有意性が、グループ間の有意性の試験のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定でも実証された場合、データは一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって分析した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１７８】
実験手順研究Ｂ：３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）の修飾スルファミダーゼ及びビヒクル（ｎ＝６）をＭＰＳ  ＩＩＩＡマウスに週１回１０週間（１０回）静脈内投与した。修飾スルファミダーゼ又はビヒクルの投与の３０〜４５分前に、クロルフェニラミンを皮下投与した（２．５ｍｇ／ｋｇ）。最終投与量は、各投与機会において実際の体重に対して補正した。このスキームをビヒクルにも繰り返した。研究は最後の注射の２４時間後に終了した。未処置の月齢が一致した野生型マウス（ｎ＝６）を、試験物処置群と併せて含めた。マウスをイソフルランで麻酔した。血液は後眼窩叢から採取した。灌流後、心臓の左心室に２０ｍＬの生理食塩水を流した。組織を解剖（脳、肝臓、脾臓）し、秤量し、液体窒素中で迅速に凍結させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてＨＮＳ−ＵＡレベルを測定するために組織及び血液を調製した。ＨＮＳ−ＵＡデータは、ｍｇ組織当たりで表し、対照群の平均に対して標準化し、相対的単位対内部標準で計算した。全体的な有意性が、グループ間の有意性の試験のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定でも実証された場合、データは一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって分析した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【０１７９】
組織試料のＨＮＳ−ＵＡのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：組織試料中のヘキソサミンＮ−硫酸［α−１，４］ウロン酸（ＨＮＳ−ＵＡ）の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析は、Ｆｕｌｌｅｒら（Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ５６：７３３−７３８（２００４））及びＲａｍｓａｙら（Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ７８：１９３−２０４（２００３））に記載された方法に従って部分的に実施した。Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄ装置（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＬＣＣ、Ｏｈａｉｏ、ＵＳ）を用いて、基質緩衝液（２９ｍＭジエチルバルビツール酸、２９ｍＭ酢酸ナトリウム、０．６８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１００ｍＬ水、ｐＨ６．５）中でホモジナイズした。Ｓａｖａｎｔ  ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０／Ｂｉｏ１０１ホモジナイザー（ＬａｂＷｒｅｎｃｈ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）で２５秒間ホモジナイズし、ホモジネートを１００００ｒｃｆにてエッペンドルフ遠心分離機５４１７Ｒで遠心分離した。上清を蒸発乾固させた。
１５０μLの誘導化溶液（２５０ｍＭの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（ＰＭＰ）、４００ｍＭのＮＨ３、ｐＨ９．１）及び内部標準コンドロイチン二糖Δジ−４Ｓナトリウム（ΔＵＡ−ＧａｌＮＡｃ４Ｓ、０．１ｍｇ／ｍＬ）ストック溶液を添加した。誘導は、７０℃で９０分間攪拌した後、溶液を２００μＬの８００ｍＭギ酸で酸性化した。脱イオン水を試料に加えて最終容量５００μＬとし、抽出をクロロホルム（３×５００μＬ）で行い、過剰のＰＭＰを除去した。遠心分離を１３０００×ｇで５分間行い、上相を新しいバイアルに移した。過剰のギ酸及びＮＨ４ＣＯＯＨを除去するために、水相をスピードバック（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）で蒸発乾固させた。サンプルを合計１００μＬの５％アセトニトリル／０．１％酢酸／０．０２％ＴＦＡに再構成した。
【０１８０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００三重四重極質量分析計に連結したＷａｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）で行った。機器の制御、データの取得と評価はＡｎａｌｙｓｔソフトウェアで行った。
【０１８１】
Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｃ１８  ＣＳＨカラム（５０×２．１ｍｍ、１．７μｍ）を用いてＬＣ分離を行った。移動相Ａは５％アセトニトリル／０．５％ギ酸から成り、移動相Ｂは９５％アセトニトリル／０．５％ギ酸から構成された。７分間で１％〜９９％Ｂの勾配を流速０．３５ｍＬ／分で使用した。注入量は１０μＬであった。ＡＰＩ４０００は、エレクトロスプレー陰イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。イオンスプレー電圧は４．５ｋＶで動作し、ソース温度は４５０℃であった。アルゴンを衝突ガスとして使用した。衝突エネルギーは３４Ｖであった。ＭＲＭ遷移は７６４．４／３３１．２（ＰＭＰ−ＨＮＳ−ＵＡ）及び７８８．３／５３４．３（ＰＭＰ−内部標準）であった。ＨＮＳ−ＵＡの相対量は、内部標準のレベルに対して計算した。
【０１８２】
結果
図６Ａに示される研究Ａの結果は、新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼが、３０ｍｇ／ｋｇの用量で２５日間、１日おき（１３回）に静脈内投与を繰り返した後に脳内のＨＮＳ−ＵＡのレベルを３０％減少させることを示している。
【０１８３】
さらに、修飾スルファミダーゼによる処理は、肝臓（図６Ｂ）及び肺（図示せず）におけるＨＮＳ−ＵＡレベルを完全に消失させた。
【０１８４】
研究Ｂの結果は図６Ｃに示されており、新規方法１による修飾スルファミダーゼは、週３０ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで１０週間それぞれ繰り返し静脈内投与した後、脳内のＨＮＳ−ＵＡレベルを４８％及び１４％減少させることを示している。
【０１８５】
従って、これらの結果は、本明細書に記載の新規方法１に従って修飾されたスルファミダーゼタンパク質が、長期治療後に、脳におけるＨＮＳ−ＵＡレベルの堅牢な低下、並びに末梢器官におけるＨＮＳ−ＵＡレベルの本質的に完全な低下を引き起こすことを実証する。
【０１８６】
実施例９：
スルファミダーゼ修飾の最適化
【０１８７】
化学修飾工程は、酸化工程が第１工程であり（以下ではＲ１と称される）、還元が第２工程である（Ｒ２で表される）２つの部分に分けられる。２つの工程を最適化するために、２つの工程の温度、濃度、及び時間の影響を調べる完全な設計の実験（ＤｏＥ）を設定した。
【０１８８】
材料及び方法
Ｑｕａｔｔｒｏｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（ＱＭＣＦ）エピソーム発現系（Ｉｃｏｓａｇｅｎ  ＡＳ）において実施例１に記載のように製造したスルファミダーゼは、新規方法１に関して本質的に実施例４に記載したように修飾したが、調査するパラメータは、表４（以下）に従って変化させた。Ｒ１の調査は、実施例４（方法１）に記載されているのと同様の減少及びパラメータ精密検査（ｗｏｒｋ−ｕｐ）を実施した。分析のエンドポイントは、実施例１に記載されたグリカンの酸化の程度、及び実施例６に記載の修飾タンパク質の細胞取り込みのレベルである。
【０１８９】
【表４】
0006594896.tif 000005
【０１９０】
パラメータの数及び選択された設計のタイプにより、各工程について１０回の実験が行われ、その結果はＭＯＤＤＥ  １０ソフトウェア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ  ＡＢ）を用いて評価した。
【０１９１】
さらに、第２の反応停止工程の影響を、Ｒ１パラメータ８℃、６０分及び２０ｍＭのメタ過ヨウ素酸ナトリウムで生成したスルファミダーゼについて試験した。ＤｏＥ実験と並行して２つのさらなる反応を行い、０．１Ｍアセトンを用いて、又はｐＨ６．０以下になるまで酢酸を添加することによって反応停止した。最後の精密検査は、他の反応のスキームに従った。このようにして製造されたスルファミダーゼを、実施例５に記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて評価した。
【０１９２】
Ｒ２実験は、Ｒ１のＤｏＥ分析後に最適であることが判明したパラメータに従って修飾されたスルファミダーゼを用いて行った。
【０１９３】
結果
Ｒ１の結果を以下の表５に要約する。
【０１９４】
【表５】
0006594896.tif 000006
【０１９５】
さらに、実施例１によるグリコシル化分析は、既知の方法に従って修飾されたスルファミダーゼについて実施した。残存する元のＮ−グリカンは、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３）で検出されなかった。
【０１９６】
Ｒ１（酸化）のＭＯＤＤＥ評価は、約８℃の温度、約１時間の反応持続時間及び約１０ｍｍｏｌ／Ｌのメタ過ヨウ素酸ナトリウムの濃度でＲ１に最適性を示した。タンパク質全体の健康状態（例えば、構造的完全性）は、グリカン認識受容体を介した細胞取り込みを新規方法１のレベルに制限する、可能な限り低い酸化剤濃度より利益を得るようである（詳細については実施例６を参照）。
【０１９７】
Ｒ１反応時間に関して開示された種々の条件が、グリカン修飾の程度の重要なパラメータと考えられた。さらに、過ヨウ素酸濃度は、グリカン修飾の程度に影響を及ぼし得る。
【０１９８】
従って、Ｒ２（還元）設計は、Ｒ１についての上記同定された好ましいパラメータを使用した。すなわち、スルファミダーゼの酸化に使用した。Ｒ２の重要な終点は、修飾スルファミダーゼの活性に影響を及ぼすことが判明しているので（実施例３及び５参照）、ＦＧｌｙ含量である。結果は下記の表６を参照のこと。ＦＧｌｙ５０及びＳｅｒ５０を含有するペプチドフラグメントの相対量を、ＬＣ−ＭＳを用いて再構成されたイオンクロマトグラム（イオン化効率の補正なし）からピーク面積を測定することによって分析した。
【０１９９】
【表６】
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【０２００】
Ｒ２のＤｏＥは、Ｓｅｒ形成が水素化ホウ素ナトリウムの濃度及び温度に関連することを示した。Ｓｅｒ形成及び高分子量形態の存在を考慮に入れると（データは示さない、結果は実施例４の新規方法２について得られたものと類似している）、Ｒ２の好ましい条件は、約０℃の温度、反応時間が約１時間以下、及び水素化ホウ素ナトリウム濃度が１２ｍｍｏｌ／Ｌ超５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
【０２０１】
還元工程が反応停止された反応で生成されたスルファミダーゼが、反応停止なしで生成されたスルファミダーゼに匹敵することがＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ示さず）で確認された。これは、０．１Ｍアセトンで反応停止すること、又は酢酸を添加してｐＨ６未満に低下させることによる第２の反応停止工程の導入が、材料の品質に悪影響を及ぼさないことを示す。
【０２０２】
実施例１０：
既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾後のグリカン構造解析
【０２０３】
材料と方法
既知の方法による化学修飾：既知の方法によるスルファミダーゼの化学修飾は、実施例２に記載したように実施した。
【０２０４】
グリコシル化分析：化学修飾後のスルファミダーゼ上のグリカン構造の分析を、実施例１に記載のＬＣ−ＭＳ法に従って実施した。
【０２０５】
実施例１に記載されたＮグリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３）を含む４つのトリプシンペプチド断片上のグリカン部分の得られた修飾をＬＣ−ＭＳ分析によって調べた。
【０２０６】
結果
グリコシル化分析：実施例１に記載したように、化学修飾前の４つのグリコシル化部位に見出されるグリコシル化のタイプは、主にＮ（２１）及びＮ（３９３）上では複合型グリカン、及び、Ｎ（１３１）及びＮ（２４４）上ではオリゴマンノース型グリカンであった。
【０２０７】
化学修飾の後、最も豊富に化学的に修飾された糖ペプチド上に対し、修飾されたグリカン構造の詳細な特徴付けを実施した（化学的に修飾した後のグリカンの不均一性が増加した結果、有意な感度の低下が理由でグリカンは検出されなかった）。この実施例では、既知の方法による化学修飾後のＭａｎ−６グリカンの修飾が調べられる。
【０２０８】
グリカンの過ヨウ素酸塩処理は、炭水化物部分の２つの隣接するヒドロキシル基間の炭素結合を切断し、グリカン鎖の分子量を変化させる。図８Ａは、化学修飾後のマンノースの予想される結合切断の例を示す。図８Ｂは、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に起こりうる理論的な結合切断を示すＭａｎ−６グリカンのモデルを示す。
【０２０９】
図９には、既知の方法による化学修飾の前後に、Ｎ（１３１）に結合したＭａｎ−６グリカンを有するトリプシンペプチドＮＩＴＲ（Ｔ１３＋Ｍａｎ−６グリカン）の質量スペクトルが示されている。様々な程度の結合切断を有する化学修飾された糖ペプチドに対応するイオンが同定された。Ｍａｎ−６グリカンについては、理論的には、最大で３個の二重結合切断及び１個の単結合切断があり得る。修飾が既知の方法に従って行われた場合、マススペクトルにおいて最も強いイオンシグナルは、２重結合切断及び２個の単結合切断に対応し、一方で２番目に強いイオンシグナルは３個の二重結合切断及び１個の単結合切断に相当することが見出され、それらは、最も可能性のある広範囲な結合切断である。既知の方法に従って化学修飾後のＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンに見られる結合決断の程度を可視化する図を図１０Ａに示す（観察されたイオンからの同位体分布により、結果は近似的であるが比較可能である）。化学修飾の再現性は、以前に知られている方法に従って製造された化学的に修飾されたスルファミダーゼの３つの異なるバッチを用いて試験された。異なる程度の結合切断に対応するイオンは、３つの異なるバッチからのＭＳスペクトルにおいて非常に類似した分布を示した。
【０２１０】
実施例１１：
新規方法１、３及び４によるスルファミダーゼの化学修飾後のグリカン構造の分析
【０２１１】
新規方法１、３及び４：新規方法によるスルファミダーゼの化学修飾を、実施例４の記載のように実施した。
【０２１２】
グリコシル化分析：グリコシル化分析は、実施例１に記載のＬＣ−ＭＳ法に従って実施した。Ｎグリコシル化部位Ｎ（２１）、Ｎ（１３１）、Ｎ（２４４）及びＮ（３９３）を含む４つのトリプシンペプチド断片のグリカン変異体上の得られる修飾をＬＣ−ＭＳ分析によって調べた。
【０２１３】
結果
グリコシル化分析：新規方法１、３及び４に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼ上の修飾されたグリカンプロフィールの詳細な特徴付けを、最も豊富に化学的に修飾された糖ペプチドに対して実施した。この実施例１１では、新規方法１、３及び４による化学修飾後のＭａｎ−６グリカンの修飾を調べた。
【０２１４】
様々な程度の結合切断を伴う化学的に修飾された糖ペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンに対応するイオンが同定された。理論的には、最大で３個の二重結合切断及び１個の単結合切断が存在し得る（図８Ｂ参照、Ｍａｎ−６グリカンのモデルは、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に起こり得る結合切断を示す）。修飾を新規方法１に従って行った場合、質量スペクトルにおける最も強いイオンシグナルは、１つの二重結合切断及び３つの単結合切断に対応することが見出され、２番目に強いイオンシグナルは、２つの二重結合切断及び２つの単結合が切断に対応することが見出された。新規方法３及び４に従って修飾を行った場合、Ｍａｎ−６グリカンの結合切断は、さらに優先的に単結合切断へとシフトした。図１０Ａには、化学修飾後のトリプシンペプチドＴ１３＋Ｍａｎ−６グリカンの結合切断の程度を視覚化する図を示す。
【０２１５】
化学的修飾の再現性は、化学的に修飾されたスルファミダーゼのトリプリケート（新規方法１）又はデュプリケート（新規方法３）を使用することによって試験した。
【０２１６】
既知の方法に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼに由来するＭａｎ−６グリカン修飾と、新規方法１、３及び４に従って化学的に修飾されたスルファミダーゼに由来するＭａｎ−６グリカン修飾とを比較すると、結合切断の程度に大きな違いがあった。これは図１０Ａに示されており、異なる程度の結合切断の分布が４つの方法についてプロットされている（観察されたイオンからの同位体分布のため、結果は近似的であるが比較可能である）。
【０２１７】
図１０Ｂは、使用された方法に対する単結合切断の相対的存在量を示す。既知の方法は、調べられたＭａｎ−６グリカン中に４５％の単結合切断を有する修飾スルファミダーゼを提供するが、新規方法１、３及び４は、化学修飾後にそれぞれ７０、８０及び８２％を有する。
【図１】
0006594896.tif 000008
【図２Ａ】
0006594896.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
0006594896.tif 000011
【図３Ｂ】
0006594896.tif 000012
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
0006594896.tif 000015
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006594896.tif 000017
【図６Ｃ】
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【図７】
0006594896.tif 000019
【図８Ａ】
0006594896.tif 000020
【図８Ｂ】
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【図９】
0006594896.tif 000022
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0006594896.tif 000024
【図１１】
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【配列表】
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