(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測光アッセイによって特定の被検体の量を決定するための方法であって、
試料中のその特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応し、
下記の工程を含む、前記方法：
ａ）少なくとも２つの校正曲線を作成し、
−  第１波長および第１反応時間で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、及び、
−  第２波長および第２反応時間で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する、
ここで前記第１反応時間および前記第２反応時間は異なるものであり、前記第１波長および前記第２波長は異なるものである；
ｂ）反応混合物中の試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を、少なくとも第１および第２波長で同時に測定する；
ｃ）特定の被検体の定量のために下記の基準により第１または第２のいずれかの校正曲線を選択する：
上昇型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定し；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
下降型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定し；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；および、
ｄ）選択した校正曲線との比較によって特定の被検体の量を定量する。
【請求項２】
タービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイにおいて、特定の被検体と被検体特異的結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化から特定の被検体を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
比色アッセイにおいて呈色試薬の補助によって特定の被検体を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
反応混合物中の試料の決定すべき特定の被検体についての光信号の同時測定を、少なくとも第１および第２波長で全反応時間にわたって実施する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
測定結果を計器プラットフォームのデータ管理システムに記憶させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
干渉の補正および光度計ノイズの補償のためのブランク値として、さらなる波長を決定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
被検体特異的反応パートナーが、結合タンパク質、抗原、抗原フラグメント、抗体、抗体フラグメント、核酸、受容体および粒子増強型の結合パートナー、酵素、基質または被検体の存在下で色の変化または濁度の変化をもたらす特異的試薬を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
測光アッセイの感度および／またはダイナミックレンジを拡大するための方法であって、
試料中の特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応し、
下記の工程を含む、前記方法：
ａ）少なくとも２つの校正曲線を作成し、
−  第１波長および第１反応時間で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、
−  第２波長および第２反応時間で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する、
ここで前記第１反応時間および前記第２反応時間は異なるものであり、前記第１波長および前記第２波長は異なるものである；
ｂ）反応混合物中の試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を、少なくとも第１および第２波長で同時に測定する；
ｃ）特定の被検体の定量のために下記の基準により第１または第２のいずれかの校正曲線を選択する：
上昇型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定し；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
下降型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定し；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；および、
ｄ）選択した校正曲線との比較によって特定の被検体の量を定量する。
【請求項９】
測光アッセイの特定の被検体の量を定量するための少なくとも２つの校正曲線を作成するための、特定の被検体について前決定した少なくとも２つの波長および少なくとも２つの反応時間の使用であって、
試料中のその特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応し、
−  第１波長および第１反応時間で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、及び、
−  第２波長および第２反応時間で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化し、
ここで前記第１反応時間および前記第２反応時間は異なるものであり、前記第１波長および前記第２波長は異なるものである、前記使用
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従って最適な波長、反応時間および閾値を決定する、下記の工程を含むコンピューター実装された方法：
ａ）分析計で同時に得られる、多重波長で全反応時間にわたって記録された吸光値を表わすデータセットを受信し、そのデータセットは下記についての複数のデータポイントを含む：
−  校正のための標準品
−  ＬＤＬの決定のためのブランク試料
−  精度の決定のための少なくとも２つの試料
−  希釈系列
ｂ）低い方の濃度については被検体定量のために第１校正曲線を用い、高い方の濃度については被検体定量のために第２校正曲線を用いて、校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化する濃度に閾値を設定する；および、
ｃ）第１および第２波長ならびに第１および第２反応時間を決定する；動態曲線を解析して、請求項１〜７のいずれか１項の第１校正曲線および第２校正曲線に最適なセットアップを選択する。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に従って最適な波長、反応時間および閾値を決定するためのプロセッサーを制御するコードを含み、そのコードが下記のための指示を含む、コンピューター可読媒体：
ａ）分析計で同時に得られる、多重波長で記録された試料の吸光値を表わすデータセットを受信し、そのデータセットは下記についての複数のデータポイントを含む：
−  校正のための標準品
−  ＬＤＬの決定のためのブランク試料
−  精度の決定のための少なくとも２つの試料
−  希釈系列
ｂ）低い方の濃度については被検体定量のために第１校正曲線を用い、高い方の濃度については被検体定量のために第２校正曲線を用いて、校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化する濃度に閾値を設定する；および、
ｃ）第１および第２波長ならびに第１および第２反応時間を決定する；動態曲線を解析して、請求項１〜７のいずれか１項の第１校正曲線および第２校正曲線に最適なセットアップを選択する。
【請求項１２】
下記のものを含むシステム分析計：
ａ）試料容器およびアッセイ試薬容器；
ｂ）試料およびアッセイ試薬を収容して混合するための反応器；
ｃ）工程ｂの反応混合物を測定するための光度計；および、
ｄ）請求項１に記載の特定の被検体を定量するために、分析結果を出力する手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測光アッセイによって特定の被検体の量を決定するための方法であって、試料中のその特定の被検体が反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応するものである方法に関する。少なくとも２つの校正曲線を作成し、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する；
上昇型の校正曲線の場合：反応混合物中の試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を少なくとも第１および第２波長で同時に測定し、それにより、特定の被検体の定量のために下記の基準により第１または第２のいずれかの校正曲線を選択する。第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
下降型の校正曲線の場合：第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。最終的に、選択した校正曲線との比較によって特定の被検体の量を定量する。
【０００２】
本方法は、特に、特定の被検体の量を決定するために異なる主波長を用いることにより少なくとも２つの校正曲線を作成することによって、測光アッセイの感度および／またはダイナミックレンジ(dynamic range)を増大することに関する。それにより、第１校正曲線は特定の被検体の高感度検出を記録し、これに対し第２校正曲線は特定の被検体の上側測定範囲を記録する。
【背景技術】
【０００３】
凝集は、主に、高分子間の表面相互作用により架橋および大型複合体の形成が生じる化学的現象であり、その結果、光散乱が増大する。この大型高分子複合体の形成はタービディメトリー、ネフェロメトリーまたは比色法による検出を用いて観察できる。
【０００４】
タービディメトリー、ネフェロメトリーまたは比色法によるアッセイは、準均質アッセイであって何らかの分離または洗浄の工程を必要としないという有益性をもつ。均質イムノアッセイ(homogeneous immunoassay)（ＨＩＡ）は、それらの簡易な１工程法およびそれらの短いターンアラウンド時間のため、自動分析計に適用するのに理想的な候補である。均質イムノアッセイは、臨床化学分析計での血清タンパク質、療法薬物および乱用薬物の定量のための臨床診断に日常的に用いられる。これまで、標準法は、タービディメトリー、ネフェロメトリーまたは比色法によるアッセイにおいて被検体を決定するために、１つの主波長を用いて１つの校正曲線を作成するものである。
【０００５】
ＨＩＡを用いて臨床化学分析計で卓越したアッセイ性能を達成できるが、測定範囲外の濃度をもつ患者試料が依然としてある。その結果、試料濃度が検出上限を超える場合は希釈後に、あるいは検出限界より低い濃度をもつ試料についてはより多量の試料を用いて、試料を再測定しなければならない。再測定は追加経費および時間損失の原因となり、両要因ともこれらのアッセイを実施する検査室にとって重大である。したがって、ダイナミックレンジが増大されれば再試験回数が低減するであろう。従来の技術水準に由来するこの問題点を解決するためには幾つかの方法がある。
【０００６】
EP 1845373は、高濃度の被検体を含む試料の検査を簡略化する方法を提供する。試料が高濃度の被検体（プロゾーン陽性(prozone-positive)）を含有するか否かに応じて、異なる校正曲線または単一の校正曲線の異なる部分を用いて被検体濃度を計算する。検体を抗体と混合し、３４０ｎｍの一次波長で試料のタービディメトリー測定を実施した。干渉を補正するために８００ｎｍの二次波長を用いる。
【０００７】
US 6,284,472は、２つの反応速度測定曲線、すなわちより多い体積の試料を用いて作成した第１曲線およびより少ない体積をもつ同じ試料を用いた第２曲線を作成することからなる校正方法を記載している。濁度を３４０ｎｍでモニターし、７００ｎｍによりブランキングしている。アッセイ範囲より高い抗原濃度については、２つの速度を用いる高い抗原信号によって、偽性結果が報告されるのを避けている。
【０００８】
JP 06109740は、異なる濃度をもつ複数種類の標準検体についての光学測定値を実装することによる、免疫ネフェロメトリー分析法に関する。反応の初期段階と進行後で２倍の光学測定値間の相異度に応じた校正曲線を選択し、回帰方程式から実際の値を計算する。
【０００９】
JP 06094717は、試料が適正な抗原−抗体条件または抗原−抗体反応のプロゾーン条件で測定されているかどうかを判定するための方法を記載している。２タイプの波長を抗原−抗体反応溶液に照射して、吸光度の比を求める。プロゾーン条件と判定された場合、シフト係数を計算し、シフトに応じた分析条件で再試験を実施する。
【００１０】
JP 08075740は、ネフェロメトリー分析法により複数の波長について校正曲線を得ることによって抗原−抗体反応を定量する方法に関する。各波長について線形性を満たす吸光度の上限を定量決定限界として前決定する。それにより、その定量決定以下の最短波長についての校正曲線によって対象分析成分の濃度が求められる。
【００１１】
しかし、上記の各方法は、特に自動化システムについて測定範囲外の患者試料をどのように続行するかという課題を解決していないので、以上に述べたツールは最適とはほど遠い。その結果、それらの試料はやはり再測定しなければならない：試料濃度が検出上限を超える場合は希釈後に、あるいは検出限界より低い濃度をもつ試料についてはより多量の試料を用いて。再測定、いわゆる再試験は、追加経費および時間損失の原因となり、両要因ともこれらのアッセイを実施する検査室にとって重大である。
【００１２】
さらに、幾つかの被検体について、高い被検体濃度の測定のための２つの試験システムおよび低い被検体濃度の測定のための高感度試験システムを利用できる。たとえば、被検体ＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）について、さらに、低い被検体濃度を測定するための心血管リスクアセスメント用高感度Ｃ−反応性（ｈｓ−ＣＲＰ）イムノアッセイがある(Tina-quant Cardiac C-reactive protein (Latex) high sensitive)。
【００１３】
結果として、測光アッセイにおいて感度を増大させ、ダイナミックレンジを拡大することについて、高い要望がある。新規方法は、試薬およびそれらの配合を何ら変更せずに、最小の実装および卓越した精度の保持をもたらすべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第1845373号（EP 1845373）
【特許文献２】米国特許第6,284,472号（US 6,284,472）
【特許文献３】特開平06‐109740号公報（JP 06109740）
【特許文献４】特開平06‐094717号公報（JP 06094717）
【特許文献５】特開平08‐075740号公報（JP 08075740）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明が対処する課題は、増大したダイナミックレンジおよび感度をもたらす改良されたタービディメトリー、ネフェロメトリーまたは比色法によるアッセイを提供することである。今回意外にも、少なくとも２つの校正曲線、すなわち第１波長で記録した第１校正曲線であって低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化したもの、および第２波長で記録した第２校正曲線であって高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化したものを作成することによって、測光アッセイのダイナミックレンジおよび感度が改善されることが見出された。本発明は試料の再測定の問題を（少なくとも部分的に）解決すると期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
これらの目的のうち少なくとも１つは、特許請求の範囲および以下の本明細書に定める主題により達成される。第１観点において、本発明は、測光アッセイによって特定の被検体の量を決定するための方法であって、試料中のその特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応するものである方法に関する。
【００１７】
少なくとも２つの校正曲線を作成し、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する。
【００１８】
試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を、反応混合物において少なくとも第１および第２波長で同時に測定する。特定の被検体の定量のために下記の基準により第１または第２のいずれかの校正曲線を選択する：
上昇型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
下降型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。選択した校正曲線との比較によって特定の被検体の量を定量する。
【００１９】
タービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイにおいては、特定の被検体と被検体特異的結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化から試料中の特定の被検体を定量し、比色イムノアッセイにおいては、呈色試薬の補助によって特定の被検体を定量する。
【００２０】
第２観点において、本発明は、測光アッセイの感度および／またはダイナミックレンジを拡大するための方法に関するものであり、その際、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する。
【００２１】
第３観点において、本発明は、測光アッセイの特定の被検体の量を定量するための少なくとも２つの校正曲線の使用に関するものであり、その際、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、種々の波長におけるＣＲＰアッセイの校正曲線を示す。６つの標準品を、ｃｏｂａｓ  ｃ（登録商標）計器で得られる１２の異なる波長で同時に測定した。この検出器の光学範囲内（０．００００〜３．００００の吸光度）にある吸光値のみを考慮に入れた。この図には、１２の可能な波長のうち５つの異なる主波長、すなわち主波長４８０−、５０５ｎｍ、５４６ｎｍ、５７０−ｎｍおよび６００−ｎｍで記録した５つの校正曲線を例として示す。すべての曲線を波長８００ｎｍで補正し、２．０分の反応時間で取得した。
【図２】図２は、ＣＲＰアッセイについて、本発明方法を異なる粒子サイズおよび異なる抗体装填量の粒子と組み合わせて適用することにより得られた改善を示す；  第１例において、感度（ＬＤＬ）の増大を目的として新規方法を粒子適合と組み合わせた。新規方法と、光散乱効果を高めるためのより大きい粒子サイズ（直径２２０ｎｍの代わりに２９０ｎｍのＭＰ２粒子）および免疫反応性を高めるためのより高い抗体装填度（大型粒子とのコンジュゲーションのために６０ｍｇのＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度）との組み合わせは、感度（ＬＤＬ）を約８倍増大させ、ダイナミックレンジを８倍拡大した。  第２例において、両粒子、すなわち大型粒子ＭＰ２および小型粒子ＭＰ１のサイズ、ならびに抗体装填量を改変した：  −  大型ＭＰ２粒子（２２０ｎｍの代わりに２９０ｎｍ）を７０ｍｇのＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度でコンジュゲートさせた；  −  小型ＭＰ１粒子（１１０〜１４０ｎｍの代わりに９０ｎｍ）を５０ｍｇのＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度でコンジュゲートさせた；  これらの新規粒子は、標準アッセイ（ＭＰ１：１１０〜１４０ｎｍで４５ｍｇのＩｇＧ／ｇ、およびＭＰ２：２２０ｎｍで５０ｍｇのＩｇＧ／ｇ）と比較して３倍改善されたＬＤＬおよび約２倍改善されたＵＤＬを与えた。
【図３】図３は、本発明の２つの校正曲線のうち１つを選択するためにどのようにして閾値を設定できるかを模式的に示す。
【図４】図４は、ＣＲＰアッセイについての校正曲線を示す。この標準校正曲線は５７０−８００ｎｍで測定することにより得られる。５０５−８００ｎｍおよび反応時間２．０分で記録した校正曲線１（Ｃａｌ  １）は最良のＬＤＬ（０，０３６ｍｇ／Ｌ）を与えた。６００−８００ｎｍおよび反応時間１．２分で記録した校正曲線２（Ｃａｌ  ２）は、最良のＵＤＬ（６６０ｍｇ／Ｌ）を生じた。ＣＲＰについての閾値は、７３ｍｇ／Ｌにおける２つの吸光値のうち少なくとも１つとして定義できる。
【図５】図５は、Ｒｏｃｈｅの製品ｐｏｒｔｆｏｌｉｏからの市販試験を用いて新規方法の有益性を示す。決定した被検体はフェリチン、ミオグロビン、Ｄ−ダイマー、リウマチ因子ＩＩ（ＲＦ  ＩＩ）、ＣＲＰ、ジゴキシン（ＤＩＧ）、フェノバルビタール（ＰＨＥＮＯ）である。第２列に標準校正曲線についての条件を示す。３列および４列は、校正曲線１および２についての新規条件を示す。特定の被検体それぞれにつき、ＬＤＬおよびＵＤＬについて最良の波長、ならびにＬＤＬ、ＵＤＬについての改善係数を決定した。大部分の場合、新規方法は試薬または配合を何ら改変せずにダイナミックレンジを改善する。
【図６】図６は、フェリチンアッセイについての代表的な動態曲線(kinetic curve)を示し、２つの異なる主波長５０５ｎｍ（図６ａ）および５７０ｎｍ（図６ｂ）における低濃度試料（１０μｇ／ｍｌのフェリチン；２１回反復）およびブランク試料（０μｇ／ｍｌのフェリチン；２１回反復）の信号の大きさ（吸光度）を示す。これらの動態曲線は、吸光値をｙ軸に、時間（ｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１の場合、時間を測定ポイントとして表わす）をｘ軸に記載する。第１校正曲線についての最適反応時間は、最終試薬の添加前または添加直後に初期時点（または測定ポイント）を選択し、下記の指針を満たす最終時点（または測定ポイント）を選択することにより決定される：  −  ブランク試料（２１回反復）の信号変動が最小であり、かつブランク試料の信号が初期時点で低い；  −  低濃度試料についての吸光度の読みが初期時点で低く、かつ最終時点で高い；すなわち、初期吸光度の読みと最終吸光度の読みの差が最大である；  反応時間は、初期時点と最終時点の差である。大部分の場合、ブランク試料の標準偏差が同等である限り、低濃度試料の信号の大きさが高いほど、より良好なＬＤＬ値が得られる。
【図７】図７は、フェリチンアッセイについての代表的な動態曲線を示し、主波長５７０ｎｍで記録した種々の高濃度試料（９８１〜４９５０μｇ／ｍｌのフェリチン）の信号の大きさ（吸光度）を、波長８００ｎｍにおける吸光度により補正したものを示す。これらの動態曲線は、吸光値をｙ軸に、時間（ｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１の場合、時間を測定ポイントとして表わす）をｘ軸に記載する。第２校正曲線についての最適反応時間は、最終試薬の添加前または添加直後に初期時点（または測定ポイント）を選択し、下記の基準を満たす最終時点（または測定ポイント）を選択することにより決定される：  −  最終試薬の添加前または添加直後の時点に、初期時点を選択する；  −  希釈系列の最高濃度の試料が区別可能なかつ濃度の漸増に伴なって漸増する信号を示すように、すなわち、ある濃度の試料についての初期吸光度の読みと最終吸光度の読みの差がその次に低い濃度の試料についての対応する差の値より高くなるように、最終時点を選択する；  反応時間は、初期時点と最終時点の差である。通常は、高濃度試料の信号が区別可能である場合、および信号が試料濃度に伴なって増大する場合、良好なＵＤＬ値が得られる。
【図８】図８：表４および実施例６、７、８、９に示すように、本発明を適用すると市販アッセイの測定範囲が拡大する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
第１観点において、本発明は、測光アッセイによって特定の被検体の量を決定するための方法であって、試料中のその特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応するものである方法に関する。
【００２４】
少なくとも２つの校正曲線を作成し、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する。
【００２５】
試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を、反応混合物において少なくとも第１および第２波長で同時に測定する。特定の被検体の定量のために下記の基準により第１または第２のいずれかの校正曲線を選択する：
上昇型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
−  第１および／または第２波長の少なくとも１つの光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
下降型の校正曲線について：
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
−  第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。選択した校正曲線との比較によって特定の被検体の量を定量する。
【００２６】
本発明の発明者らは意外にも、特定の被検体を２つの異なる波長および異なる反応時間で同時に測定して１回の試験（１回の測定）で少なくとも２つの校正曲線を作成することによって測光アッセイのダイナミックレンジが増大することを見出した。
【００２７】
測光アッセイにはタービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイならびに比色アッセイが包含される。タービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイでは、特定の被検体と被検体特異的結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化から特定の被検体を定量し、一方、比色アッセイでは呈色試薬の補助によって特定の被検体を定量する。
【００２８】
大部分の場合は第１の短い波長での第１反応時間における測定が感度に関して最適な検出を可能にし、大部分の場合はより大きい第２波長での第２反応時間における並行した測定がより高い検出上限を保証し、両方とも１つの波長のみでの１つの反応時間における測定と比較して拡大したダイナミックレンジをもたらす。その結果、アッセイ試薬およびそれらの配合を改変する必要なしにダイナミックレンジの拡大が達成され、したがって迅速かつ経費効率の高い実現が保証される。続いて、ある試料について得られた信号値に応じて、その特定の被検体の定量に適切な校正曲線を用いる。こうして標準法と比較してアッセイのダイナミックレンジを拡大することができる。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、第１反応時間での大きい波長が感度に関して最適な検出を可能にし、より小さい第２波長での第２反応時間における並行した測定がより高い検出上限を保証し、両方とも１つの波長のみでの１つの反応時間における測定と比較して拡大したダイナミックレンジをもたらす場合があることである。
【００３０】
凝集アッセイを競合阻害様式で実施すると、大部分の場合はより大きい第１波長での第１反応時間における測定が感度に関して最適な検出を可能にし、大部分の場合はより短い第２波長での第２反応時間における並行した測定がより高い検出上限を保証し、両方とも１つの波長のみでの１つの反応時間における測定と比較して拡大したダイナミックレンジをもたらす。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、第１反応時間での小さい波長が感度に関して最適な検出を可能にし、より大きい第２波長での第２反応時間における並行した測定がより高い検出上限を保証し、両方とも１つの波長のみでの１つの反応時間における測定と比較して拡大したダイナミックレンジをもたらす場合があることである。
【００３２】
定義：
本明細書中で用いる用語“決定”は、査定、診断、判定、同定、評価、または分類することを意味する；特定の被検体と被検体特異的結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化からタービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイにより試料中の特定の被検体を定量し、あるいは比色アッセイにおいて呈色試薬の補助によって特定の被検体を定量する。
【００３３】
本明細書中で用いる用語“量”は、被検体の絶対量、あるいは被検体の相対量および／または濃度、ならびに／あるいはそれらに相関づけることができる、および／またはそれらから誘導できる、いずれかの数値および／またはパラメーターを包含する。
【００３４】
本明細書中で用いる用語“試料”は、各個体の血液、すなわち全血、血漿、もしくは血清、または尿、ＣＳＦ、喀痰から選択される体液の試料、あるいは分離した細胞の試料、あるいは組織または臓器からの試料を表わす。体液の試料は、周知の方法により分離できる。組織または臓器の試料は、いずれかの組織または臓器から、たとえば生検により摘出できる。分離した細胞は、体液または組織もしくは臓器から、遠心分離または細胞選別などの分離法により単離できる。好ましくは、本明細書中で述べるペプチドを発現または産生する細胞、組織または臓器から、細胞、組織または臓器の試料からの溶解物を分離する。
【００３５】
本明細書中で用いる用語“凝集”は、主に化学的現象であって、高分子間の表面相互作用により架橋および大型複合体の形成が生じる。この大型複合体の形成により光散乱性の増大が生じ、それを複合体のサイズに応じて肉眼で観察でき、あるいはタービディメトリーおよびネフェロメトリーによる検出を用いて測光法によりモニターできる(参照：Christopher P. Price, Encyclopedia of Life Sciences 2001, p. 1-7)。
【００３６】
本発明のアッセイ法はいずれかの種類の光散乱アッセイ、特にタービディメトリー、ネフェロメトリーおよび比色法によるアッセイであってもよい。タービディメトリー、ネフェロメトリーおよび比色法によるアッセイにより決定するのに適したいずれか特定の被検体、すなわちその被検体を特異的に認識する結合しやすい反応パートナーがあるいずれかの被検体の量を決定するために、このアッセイを使用できる。
【００３７】
用語“タービディメトリーおよびネフェロメトリー”は、溶液における混濁の量、すなわち濁度を測定するための当技術分野で既知の方法であり、光の透過および散乱に対するこの混濁の影響を測定することに基づく。液体の混濁は微細な懸濁粒子の存在により引き起こされる。光のビームが混濁試料を通過すれば、散乱によりそれの強度が低下し、その光の散乱量はそれらの粒子の濃度および粒度分布に依存する。分光光度計は、免疫凝集反応から生じる粒子サイズ増大による濁度増大（すなわち、透過光の光の強度の低下）を測定する。この濁度増大は、被検体により引き起こされた免疫凝集の直接的尺度、または被検体により引き起こされた免疫凝集阻害の間接的尺度である。ネフェロメトリーでは散乱光の強度を測定し、一方、タービディメトリーでは試料を透過した光の強度を測定する。
【００３８】
タービディメトリーアッセイは、入射ビームが試料を通過するのに伴なうその強度の測定を伴なう。光ビームは懸濁液を通過するか、あるいは粒子により吸収、反射または散乱される可能性がある。その結果、光が懸濁液を透過するのに伴なって光の強度は低下する。非吸光性粒子について、散乱による光の強度の低下は濁度として表わされる。
【００３９】
ネフェロメトリーアッセイとは、入射ビームが試料を通過する際に入射ビームから一定の角度θで散乱した光の測定を表わす。散乱性の粒子種は急速にサイズが増大するので、ネフェロメトリーではある時間後の散乱光の強度の変化を測定する。一定の抗体−ラテックス複合体の存在下で測定した場合、散乱光は初期の抗原濃度に比例する。さらなる説明は、J.A. Molina-Bolivar et al., Journal of Macromolecular Science, Part C-Polymer Review, 45:59-98, 2005に記載されている。
【００４０】
本発明のイムノアッセイ法は、微粒子増強を伴なうかまたは伴なわない既知の凝集試験すべてについて作動する。
【００４１】
本発明において使用するのが好ましいのは、“微粒子増強型の光散乱凝集試験”であり、これは“粒子増強型タービディメトリーイムノアッセイ(particle-enhanced turbidimetric immunoassays（ＰＥＴＩＡ）)”とも呼ばれる。粒子増強型イムノアッセイは準均質アッセイであって何らかの分離または洗浄の工程を必要としないという有益性をもつので、臨床化学分析計での血清タンパク質、療法薬物および乱用薬物の定量のために臨床診断で日常的に用いられる。反応混合物中の特定の被検体と被検体特異的結合パートナーの間の光学検出を増強するために、被検体または被検体特異的結合パートナーを適切な粒子に連結させる。それにより、被検体は被検体特異的結合パートナーで被覆された粒子と反応して凝集する。被検体の量が増加するのに伴なって、凝集および複合体サイズが増大し、さらに光散乱の変化をもたらす。凝集した粒子をタービディメトリーおよびネフェロメトリーによる測定により決定する。
【００４２】
微粒子の材料は、微粒子増強型の光散乱アッセイに適したいずれかの無機、有機またはポリマー材料であってよい。微粒子の材料は、微粒子増強型の光散乱アッセイに適したいずれかの無機、有機またはポリマー材料であってよい。そのような材料には、たとえばセレン、炭素、金；炭素、ケイ素またはゲルマニウムの窒化物、たとえばＳｉ３Ｎ４；鉄、チタンまたはケイ素の酸化物、たとえばＴｉＯ２またはＳｉＯ２；およびポリマー材料、たとえばポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、エポキシ樹脂、ポリ（塩化ビニリデン）、ポリ（アルファナフチルメタクリレート）、ポリ（ビニルナフタレン）、またはそのコポリマー、特にスチレンと共重合性エチレン性不飽和化合物とのコポリマー、たとえばスチレン−（メタ）アクリレートコポリマーが含まれる。ポリマー材料から作成した微粒子、ならびにスチレンから重合した内側コアおよびスチレンと共重合性エチレン性不飽和化合物から共重合により形成された外側シェルからなるコア−シェル粒子、たとえばUS Patent No. 4,210,723に記載されたものが、特に適切である。粒子をベースとする大部分のアッセイは、ラテックス粒子を用い、その主なタイプはポリスチレンである。ラテックス凝集試験の総説は下記に記載されている(J. L. Ortega-Vinuesa, J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 12, No. 4 pp.379-408 (2001)。
【００４３】
粒子増強型タービディメトリーイムノアッセイ（ＰＥＴＩＡ）には種々の試験様式がある；それは競合様式および直接様式である。
【００４４】
直接様式は、好ましくは大きいサイズをもつ被検体に適用される。これらの被検体は、多重エピトープを備えた多価抗原、たとえばタンパク質および微生物である。直接様式については、被検体と共に凝集する抗体で粒子を被覆する。
【００４５】
タービディメトリーおよびネフェロメトリーによるアッセイは、競合阻害様式で実施することもできる。この様式は、小分子、たとえばハプテンを測定するために用いられることが最も多く、通常は乱用薬物検査および療法薬物モニタリングのための診断に適用される。この様式において、アッセイ試薬は、被検体特異的結合パートナーだけでなく、被検体をマイクロスフェア表面または他のキャリヤー分子、たとえばタンパク質（たとえば、ウシ血清アルブミン）または可溶性のポリマーもしくはオリゴマーに結合させることにより得られた化学修飾された被検体をも含有する。修飾されていない被検体と対照的に、この試薬は、分子中に多数コピーの被検体が存在するため、被検体特異的結合パートナーの存在下で凝集することができる。修飾された被検体の存在下での特定の被検体と被検体特異的結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化から、試料中の被検体を定量する。
【００４６】
抗原を架橋剤に連結させる：たとえばポリハプテン；これは、EP 545350に示されるように抗体の結合部位に対して試料の抗原と競合する。この場合、可溶性ポリマー、タンパク質または微粒子が、多数コピーの抗原のためのキャリヤー分子として作用する。検査試料中の非標識抗原の量を、イムノアッセイにおいてそれが標識抗原と競合する能力により測定する。抗体上の結合部位は既に占有されているので、非標識抗原は標識抗原の結合能力を遮断する。したがって、競合イムノアッセイにおいては、アッセイに際して測定された標識がより少ないことはより多量の非標識（検査試料）抗原が存在することを意味する。
【００４７】
好ましくは、微粒子増強型の光散乱凝集アッセイを被検体の量の測定に使用する；これは、被検体に対する反応性が高い少なくとも１種類の結合パートナーを保有する強い光散乱性の粒子と、被検体に対する反応性が低い少なくとも１種類の結合パートナーを保有する弱い光散乱性の粒子との混合物の使用を含む；EP 0898169に記載。強い光散乱性の粒子は、弱い光散乱性の粒子より大きいサイズおよび／またはより高い屈折率をもつ。被検体の量を測定するための微粒子増強型の光散乱イムノアッセイに用いる微粒子試薬は、直径３０〜６００ｎｍの微粒子の混合物を含み、これは、被検体に対する反応性が高いパートナーである少なくとも１種類の結合パートナーを保有する強い光散乱性の粒子と、被検体に対する反応性が低い少なくとも１種類の結合パートナーを保有する弱い光散乱性の粒子を含有する。微粒子は通常はほぼ球状であって狭い粒度分布をもち、これはそれらのサイズがそれらの平均直径であることを良く表わしている。光散乱の法則(D: J. Newman et al., 1992, Ann. Clin. Biochem. 29, 22-42)によれば、強い光散乱性は大きい粒子サイズおよび／またはその粒子の屈折率と媒体の屈折率との比が高いことから生じ、これに対し弱い光散乱は小さい粒子サイズおよび／またはその粒子の屈折率と媒体の屈折率との比が低いことから生じる。
【００４８】
用語“分光測光アッセイ”は、“測光アッセイ”とも呼ばれ、当技術分野で周知である。測光アッセイにはタービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイならびに比色アッセイが包含される。タービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイでは、特定の被検体と被検体特異的結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化から特定の被検体を定量し、一方、比色アッセイでは呈色試薬の補助によって特定の被検体を定量する。分光測光アッセイでは、アッセイ溶液が吸収した光の量の変化により反応経過を追跡する。この光が可視領域であれば、アッセイの色の変化を実際に見ることができ、これらを比色アッセイと呼ぶ。ＭＴＴアッセイ、すなわちテトラゾリウム色素を基質として用いる酸化還元アッセイは、比色アッセイの一例である。紫外線がしばしば用いられる；一般的な補酵素ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはそれらの還元型では紫外線を吸収するが、それらの酸化型では吸収しないからである。したがって、ＮＡＤＨを基質として使う酸化還元酵素は、それがこの補酵素を消費するのに伴なう３４０ｎｍの波長の紫外線吸収の低下を追跡することによりアッセイできる。
【００４９】
酵素反応の結果として光の吸収が変化しない場合ですら、連携アッセイを用いることにより、なおその酵素に分光測光アッセイを使用できる。この場合、一方の反応の生成物を、もうひとつの容易に検出できる反応の基質として用いる。連携アッセイの例は酵素ヘキソキナーゼであり、これはそれのグルコース−６−リン酸産生を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤＰＨ産生に連携させることによってアッセイできる。
【００５０】
本発明による用語“比色アッセイ”は、高度に自動化された臨床化学分析計における臨床診断で日常的に用いられる。均質比色アッセイは、それらの簡易な１工程法およびそれらの短いターンアラウンド時間のため、自動分析計に適用するのに理想的な候補である。臨床化学分析計のための広範な検査メニューが実際に提供されている；たとえば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｃｏｂａｓ（登録商標）ｃ比色アッセイは、定量すべき被検体の存在下での色の形成または変化または消失を特徴とする。検査室分析計で行なわれる代表的な比色試験は、臨床化学試験および酵素免疫試験（ＣＥＤＩＡ、ＥＭＩＴ）である。そのようなアッセイは、分光計で分光測光法により検出される。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｃ計器におけるこれらのアッセイの検出は、照射線源としてのタングステンハロゲンランプおよび検出器としてのフォトダイオードアレイ（３４０〜８００ｎｍの１２種類の波長を生じる１２のダイオード）を備えた光度計に基づく。そのＯ．Ｄ．は有色化合物の濃度に正比例する。発色を溶液中の物質の濃度に関連づければ、その濃度は適宜な波長における光の吸収の程度を決定することにより測定できる。本発明のある態様は、比色イムノアッセイにおいて特定の被検体を呈色試薬の補助により定量する本発明方法である。
【００５１】
用語“呈色試薬”は、３４０ｎｍから８００ｎｍまでの範囲の一般的波長をもつ光度計で測定できるアッセイの色の変化、色の形成または色の消失をもたらすいずれかのアッセイ試薬またはアッセイ試薬混合物を包含する。多くの比色アッセイが、１工程以上の反応で有色生成物を生じる酵素および対応する基質を伴なう；色の変化は、基質自体ではなくＮＡＤ／ＮＡＤＨなど対応する酵素補因子により誘導されてもよい。被検体と１工程以上の反応で有色生成物を生じる試薬との特異的反応に基づく比色アッセイもある。ＥＭＩＴまたはＣＥＤＩＡなどの比色イムノアッセイにおいては、一般にβ−ガラクトシダーゼまたはデヒドロゲナーゼなどのレポーター酵素とそれの対応する基質が反応して特徴的で検出可能な吸光特性をもつ生成物を生じることにより、色が形成される。レポーター酵素と基質の反応は、一般に被検体と抗体の間の免疫反応の後に行なわれ、次いでその免疫反応により酵素反応が誘発または阻害される。他の比色試験、たとえば検査室分析計に一般的な臨床化学試験においては、被検体と酵素もしくは他のいずれかの特異的試薬またはその組合わせとの反応により、色が形成、変化または消失する。ある場合には、被検体自体が酵素として作用する。酵素反応の結果として光の吸収が変化しない場合ですら、連携アッセイを用いることにより、なおその酵素に分光測光アッセイを使用できる。この場合、一方の反応の生成物を、もうひとつの容易に検出できる反応の基質として用いる。連携アッセイの例は酵素ヘキソキナーゼであり、これはそれのグルコース−６−リン酸産生を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによりＮＡＤＰＨ産生に連携させることによってアッセイできる。
【００５２】
用語“レイリー散乱(Rayleigh scattering)”は、光の波長よりはるかに小さい粒子による光または他の電磁線の弾性散乱である。粒子は個々の原子または分子であってもよい。それは光が透明な固体および液体を通過する場合に起きる可能性があるが、気体中で最も顕著に見られる。レイリー散乱は、粒子の電気分極の関数である。光の波長と類似するかまたはより大きい粒子による散乱は、一般にミー理論(Mie theory)、離散双極子近似法(discrete dipole approximation)および他の計算法により扱われる。レイリー散乱は、光の波長に対して小さくかつ光学的に“ソフト”である粒子（すなわち、１に近い屈折率をもつもの）に適用される。ある光のビームに対して起きるレイリー散乱の量は、粒子のサイズおよび光の波長に依存する。
【００５３】
本発明による用語“被検体(analyte)”は、いずれかの“インビトロ診断化合物”、たとえば血清タンパク質、療法薬物および乱用薬物を包含する。代表的な被検体には、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、核酸、および農薬が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる用語“被検体”または“特定の被検体”は、試料中におけるそれの存在および／または濃度を判定すべき物質を表わす。用語“被検体”には、それに対する特異的反応パートナー（たとえば、被検体を特異的に結合する結合分子または結合物質）があるか、あるいはそれに対する特異的反応パートナーを調製できる、いずれかの物質が含まれる。
【００５４】
本発明のアッセイにより決定できる被検体には抗原性被検体が含まれ、その場合の結合パートナーは、適切には免疫結合パートナーである。抗原性被検体は、モノマー型またはポリマー型で、反復エピトープを含むものまたは含まないものであってもよい。
【００５５】
適切な抗原性被検体には下記のものが含まれる：
ａ）特定のタンパク質、たとえばアルファ−１−酸  糖タンパク質（ＡＡＧＰ）、アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、血清中アルブミン（ＡＬＢＳ）、マイクロアルブミン（ＡＬＢＵ）、アポリポタンパク質Ａ−１（ＡＰＯＡ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）、アンチストレプトリシンＯ（ＡＳＯ）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ  ＩＩＩ）、補体Ｃ３ｃ（Ｃ３Ｃ）、補体Ｃ４（Ｃ４）、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン（ＦＩＢＧ）、フィブロネクチン（ＦＩＢＲ）、ハプトグロブリン(haptoglobulin)（ＨＡＰＴ）、免疫グロブリンＡ、Ｇ、Ｍ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、リポタンパク質ａ（ＬＰＡ）、リウマチ因子（ＲＦ）、トランスフェリン（ＴＲＳＦ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）；
ｂ）腫瘍マーカー、たとえばアルファ-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン  ベータ−サブユニット（ｂ−ＨＣＧ）、ベータ−２−ミクログロブリン、炭水化物抗原、たとえばＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、ムチン様癌関連抗原（ＭＣＡ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；
ｃ）心血管マーカーまたはフィブリン溶解マーカー、たとえば脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）、フィブリンおよびフィブリノーゲンの分解産物（ＦＤＰ）、ＦＤＰ  Ｄ−ダイマー、トロポニン、ミオグロビン、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）；
ｄ）ウイルスマーカー、たとえばインフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；
ｅ）免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、インスリン、シスタチンＣ(Cystatin C)；
ｆ）免疫抑制剤、たとえばサイクロスポリン(cyclosporine)、エベロリムス(Everolimus)、ＭＰＡ(ミコフェノール酸)、シロリムス(Sirolimus)、タクロリムス(Tacrolimus)；
ｇ）治療薬物、たとえばアセトアミノフェン、アミノグリコシド類、アンフェタミン類、アミカシン(Amikacin）、バルビツレート、ベンゾジアゼピン類、ブプレノルフィン（Buprenorphine）、カルバマゼピン（Carbamazepine）、コカイン、ジゴキシン、ジギトキシン、エクスタシー（Ecstasy）、ゲンタマイシン、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、リドカイン（Lidcaine）、ＬＳＤ、ＭＤＥＡ、メサドン（Methadone）、メタンフェタミン（Methamphetamine）、メタカロン（Methaqualone）、６−モノアセチル−モルフィン、ナパ（Napa）、プロカインアミド（Procainamide）、フェニトイン（Phenytoin）、フェンシクリジン（Phencyclidine）、フェノバルビタール（Phenobarbital）、プロポキシフェン（Propoxyphene）、キニジン（Quinidine）、サリチレート、テオフィリン（Theophylline）、ＴＨＣ、三環系抗うつ剤、トブラマイシン（Tobramycin）、バンコマイシン（Vancomycin)、ＶＰＡ。
【００５６】
本発明のアッセイにより決定できる被検体には、さらに核酸が含まれ、その場合の結合パートナーは、適切には、ハイブリダイゼーションが起きるのに十分な配列相補性を示すオリゴヌクレオチド捕獲プローブである。適切な核酸被検体にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびその誘導体が含まれ、その量の決定は診断または医薬の分野で重要である。本発明のアッセイを用いて定量決定できるそのような核酸の例は、ＨＩＶ１−ＲＮＡ、ＨＩＶ２−ＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡ、腸内ウイルスＲＮＡ、ＨＴＬＶ−ＤＮＡ、ＣＭＶ−ＤＮＡ、および結核菌(Mycobacterium tuberculosis)ＤＮＡである。
【００５７】
一例として、試料中の被検体ＣＲＰ（Ｃ−反応性タンパク質）、フェリチン、ミオグロビン、Ｄ−ダイマー、ＲＦ  ＩＩ（リウマチ因子ＩＩ）、ＤＩＧ（ジゴキシン）およびフェノバルビタールを本発明の方法に従って決定した。
【００５８】
本明細書中で用いる用語“被検体特異的反応パートナー”は、特定の被検体と反応して、それにより抗原−抗体免疫複合体のような反応複合体を形成するか、あるいは酵素−基質反応から生じる生成物のような新たな生成物を形成することができる。代表的な被検体特異的反応パートナーには、結合タンパク質、抗原、抗原フラグメント、抗体、抗体フラグメント、核酸、受容体、および粒子増強型の結合パートナー、酵素、基質（被検体が酵素である場合）、被検体の存在下で色の変化をもたらす特異的試薬が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の被検体に特異的であるそのような反応パートナーは、業者から入手できるか、あるいは当業者に既知の標準法に従って調製できる。被検体特異的反応パートナー対の例には、ハプテン：抗体、ビオチン：アビジン、ホルモン：受容体、ポリペプチド：抗体、およびオリゴヌクレオチド：相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ、酵素−基質が含まれるが、これらに限定されない。抗体の場合のように被検体との結合複合体の形成をもたらす被検体特異的反応パートナーについては、“被検体特異的反応パートナー”の代わりに用語“被検体特異的結合パートナー”を同等に使用できる。
【００５９】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、外来物質の検知に応答して産生される免疫グロブリンを表わし、無傷分子、ならびにその機能性フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む。本発明のアッセイに免疫結合パートナーとして使用できる抗体には、いずれかの種のポリクローナル抗体、いずれかの種のモノクローナル抗体（キメラ抗体および／または組換え抗体を含む）が含まれる。モノクローナル抗体またはそのフラグメントは同一状態で無限量に製造できるので、一般に好ましい。
【００６０】
本明細書中で用いる用語“抗原”は、抗体の抗原結合部位に結合されるそれの能力を特徴とする。抗体により認識され、それに抗体が結合する抗原領域は、“エピトープ”と呼ばれる。抗原は、動物またはヒトの体内に導入された際に、免疫応答、すなわち抗体産生を誘導できる物質である。ハプテンは、タンパク質などの大型キャリヤーに付着している場合にのみ免疫応答を誘発できる小分子である。キャリヤーは、同様にそれ自体では免疫応答を誘発しないものであってよい。身体がハプテン−キャリヤー付加物に対する抗体をいったん産生すると、小分子ハプテンも抗体に結合できる。
【００６１】
標準試料中の被検体の既知濃度と標準試料の分析測定値、たとえば光学濃度との相互関係をプロットすることにより予め描かれた“校正曲線（検量線）(calibration curve)”（一般に、標準曲線(standard curve)または作業曲線(working curve)とも呼ばれる）を用いて被検体の濃度を決定することは一般に実施されている。校正曲線が定量分析領域の比較的広い範囲にわたって適切な線形性をもつ場合、校正曲線は、定量分析の決定範囲の上限、下限および中間点付近にある比較的少数の標準試料を用いて作成できる。
【００６２】
しかし実際には、全般に線形であるというわけではない多数の校正曲線がある。特定の波長の吸光度から作成したタービディメトリー、ネフェロメトリーまたは比色法によるアッセイの校正曲線は、一般に非線形Ｓ字形校正曲線であり、その場合、ゼロ付近の濃度では感度が損なわれ、高い方の濃度側では飽和状態である。Ｓ字形校正の決定にはマルチポイント校正が必要であり、その場合、複数濃度の標準試料を使用しなければならない。さらにこのＳ字形校正曲線は、きわめて低い濃度およびきわめて高い濃度では報告価値のある測定範囲がない。幾つかの方法があるけれども、なお測定範囲外の濃度をもつ患者試料がある。その結果、試料濃度が検出上限を超える場合には試料を希釈し、あるいは検出限界より低い濃度をもつ試料についてはより多量の試料を用いなければならない。これらの再測定、いわゆる再試験は、追加経費および時間損失の原因となり、両要因ともこれらのアッセイを実施する検査室にとって重大である。これらの欠点を避けるために、タービディメトリー、ネフェロメトリーまたは比色法によるアッセイの感度を増大させかつダイナミックレンジを拡大するための新規方法をここに提供する。
【００６３】
反応混合物の濁度測定に基づく凝集アッセイのための校正曲線を作成する際、反応時間のほかに波長の選択が曲線の傾き（分析感度）および達成可能な上側測定範囲にとって重要な役割をもつ。直接アッセイ様式について、小さい波長は高い傾きおよび高い信号をもつ校正曲線をもたらすことができるのに対し、高濃度領域について曲線は早期に平坦になってそれに匹敵する信号値を高濃度について生じ、結果的に検出上限も低くなる。他方、より大きい波長は小さい傾きをもつ曲線を生じる可能性はあるが、高濃度領域について区別可能な信号値を生じることができる。したがって、校正曲線を作成する目的で信号計算をするために１つの波長および対応する反応時間を選択するのは、分析感度と上側測定範囲との妥協である可能性がある。比色アッセイにおいても同様な状況に遭遇する。形成された有色生成物の吸光最大付近の波長を選択すると、高い信号および高い感度が保証されるが、他方で高い被検体濃度についての信号は検出器の指定光学範囲外になる可能性がある。
【００６４】
本発明においては、２つの異なる波長および反応時間について同時に２つの校正曲線を作成し、これによって意外にも試料中の特定の被検体を拡大したダイナミックレンジで定量できる。この目的で、同様に少なくともこれら２つの異なる波長および反応時間を用いて試料を測定する。試料の少なくとも１つの光信号またはこれから計算した少なくとも１つの信号値により、それの定量のためにどちらの校正曲線を使用すべきであるかが決まる。
【００６５】
本明細書中で用いる用語“第１校正曲線”は、共に低い検出限界を達成するために最適化した第１波長および第１反応時間における反応混合物の光信号から作成される。第１波長および第１反応時間で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化する。
【００６６】
本明細書中で用いる用語“第２校正曲線”は、共に高い検出上限を達成するために最適化した第２波長および第２反応時間における反応混合物の光信号から作成される。第２波長および第２反応時間で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する。本発明において行なうように、１つではなく２つの校正曲線を用いて作業することにより、必要なキャリブレーター（校正用物質）(calibrator)の数および濃度ならびに校正曲線についての曲線フィッティング操作に関する事柄が軽減されるなど、さらなる利点が示される可能性もある。本発明の校正曲線は、標準試料を用いて特定の被検体について前決定される。
【００６７】
試料を被検体特異的反応パートナーおよび被検体（化学修飾されていてもよい）と混合することにより測定試料を調製した後、反応混合物を一定の全反応時間(complete reaction time)、反応させる。反応混合物中の試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を、少なくとも第１および第２波長で同時に全反応時間にわたって測定する。
【００６８】
それぞれ、第１波長および第１反応時間で記録した、または第２波長および第２反応時間で記録した、第１または第２校正曲線のいずれかを、特定の被検体の定量のために選択する；その際、試料の少なくとも１つの光信号に基づいて、またはこれから計算した少なくとも１つの信号値に基づいて、下記の基準により被検体濃度の計算のために第１または第２校正曲線のいずれかを選択する：
上昇型の校正曲線について：
第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長および第１反応時間で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
第１および／または第２波長の少なくとも１つの光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長および第２反応時間で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
下降型の校正曲線について：
第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長および第２反応時間で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；
第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長および第１反応時間で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。選択した校正曲線との比較によって特定の被検体の量を定量する。
【００６９】
本発明は、測光アッセイによって特定の被検体の量を決定するための方法であって、試料中のその特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応するものである方法を提供する。分光光度計および使用する波長に応じて、特定の被検体につき前決定した第１および第２波長について第１および第２反応時間で、少なくとも２つの校正曲線を作成する。それにより、試料の決定すべき特定の被検体についての光信号が、反応混合物において第１および第２波長で同時に測定される。
【００７０】
本明細書中で用いる用語“第１波長”および第１反応時間は、低濃度の特定の被検体に最適化され、それにより検出下限が最大化される。それは、第１波長が第１反応時間との組合わせで、たとえば直接アッセイ様式の場合は高い信号を発生して、高い分析感度をもつ校正曲線を生じることを意味する。感度、分析感度、検出下限（ＬＤＬ）、ブランク限界（ＬＯＢ）、検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）は、ある分析法によって信頼性をもって測定できる被測定物(measurand)の最小濃度を表わすために用いられる用語である。これらの用語はすべて関連性があるが、別個の定義をもつ(参照：Lit. clin biochem rev 2008, 29, 49)。たとえば、用語“分析感度”は、校正曲線の傾きと定義される。
【００７１】
本明細書中で用いる用語“検出下限(lower detection limit)”（ＬＤＬ）は、本明細書中で下側測定範囲(lower measuring range)とも呼ばれる。ＬＤＬを推定するための代表的方法は、反復回数（たとえば、ｎ＝２１）のゼロキャリブレーターまたはブランク試料を測定し、平均値ｘおよび標準偏差（ＳＤ）を決定することからなる。ＬＤＬは、ｘ＋２ＳＤまたはｘ＋３ＳＤとして計算される。ＬＤＬ決定のためのこの方法は、Kaiser (H. Kaiser, Fresenius Zeitschrift fuer analytische Chemie, 1965, 209, Nr.1, pages 1-18)により記載された方法によるものである。上昇型の校正曲線を伴なうアッセイについては、試料の少なくとも１つの光信号（少なくとも第１および第２波長で同時に全反応時間にわたって測定した試料の光信号のうち）またはこれから計算した少なくとも１つの信号値が対応する前決定した閾値よりより低ければ、第１波長および第１反応時間の校正曲線との比較により被検体の濃度を決定する。下降型の校正曲線を伴なう競合凝集アッセイの場合または比色アッセイの場合、試料の少なくとも１つの光信号（少なくとも第１および第２波長で同時に全反応時間にわたって測定した試料の光信号のうち）またはこれから計算した少なくとも１つの信号値が対応する前決定した閾値よりより低ければ、第２波長および第２反応時間の校正曲線を用いる。
【００７２】
本明細書中で用いる用語“第２波長”および第２反応時間は、高濃度の特定の被検体に最適化され、それにより検出上限が最大化される。それは、第２波長および第２反応時間が、たとえば直接アッセイ様式の場合は上側測定範囲における異なる被検体濃度について区別可能な信号を発生して、高い上側測定範囲をもつ校正曲線を生じることを意味する。
【００７３】
第１波長と第２波長は理想的には少なくとも５ｎｍの差があり、一方、第１反応時間と第２反応時間は異なってもよく同一でもよい。
【００７４】
本明細書中で用いる用語“検出上限(upper detection limit)”（ＵＤＬ）は、本明細書中で上側測定範囲(upper measuring range)とも呼ばれる。ＵＤＬは、信頼性をもって決定できる、試料中の被検体の最高量である。本発明において、ＵＤＬは、本方法の線形性を査定し、次いでその線形範囲内の最高濃度値をＵＤＬとして選択することにより決定された。この方法は、一連の試料溶液からの被検体の復元率(recovery)（測定値）が被検体の実際の濃度（真の値）に比例する場合に、線形であると言われる(Arch Pathol Lab Med 2004, 128, pages 44-48)。校正曲線の形状（放物線状またはＳ字形の場合がある）を、その方法の測定値と真の値との関係を述べた線形性と混同してはならない。校正曲線は信号と濃度の関係を描いたものである。
【００７５】
本発明に関して、用語“ダイナミックレンジ(dynamic range)”は、アッセイの測定範囲の大きさを表わし、本明細書中では検出上限（ＵＤＬ）と検出下限（ＬＤＬ）の比と定義する。別途指示しなければ、測定範囲という用語をＬＤＬから始まってＵＤＬで終わる濃度値として用いる。原則として、ダイナミックレンジを計算するために、ＬＤＬ以外の感度用語、たとえばＬＯＤまたはＬＯＱを使用でき、同様に上側測定範囲を表わすＵＤＬ以外の用語を使用できる。
【００７６】
第１および第２波長の両波長とも、被検体測定の技術水準によるいわゆる“主波長”である。
【００７７】
本明細書中で用いる用語“光信号”は、反応混合物の吸光度測定を実施することにより得られる信号を表わす。光信号は、タービディメトリーおよび比色法によるアッセイの場合は吸光値であってもよく、ネフェロメトリーアッセイについては散乱光信号値であってもよい。
【００７８】
本発明に関して、用語“これから計算した信号値”は、反応混合物の光信号の変化を意味し、２つの吸光度測定値、すなわち初期測定値と最終測定値の差であってもよく、あるいは時間当たりの吸光度の変化を表わす動態パラメーターであってもよい。通常は、初期測定は反応混合物に最終試薬を添加する前または添加した直後に実施できる。
【００７９】
本明細書中で用いる用語“反応時間”は、本発明の信号値をそれから計算するのに用いる光信号の第１（または初期）測定と第２（または最終）測定の間の期間である。第１（または初期）測定は、反応混合物に最終試薬を添加する前または添加した直後に実施される。動態測定の場合、反応時間は時間当たりの吸光度の変化を表わす数値の計算に用いる期間であってもよい。“反応時間”は、“全反応時間(complete reaction time)”と同一であるか、あるいはそれより短い可能性がある。
【００８０】
本発明に関して、用語“特定の被検体”は、試料中の測定すべき被検体それぞれについて、濃度を定量する特定の被検体それぞれに最適化されかつ被検体毎に異なる可能性がある特定の校正曲線ならびに特定の波長および反応時間を決定できることを意味する。一般的な光度計は、分光光度計、またはタービジメトリーによるイムノアッセイのためのタービジメーターおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイのためのネフェロメーターである。当技術分野で既知の多重波長分光光度計を、本発明に従って反応混合物において試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を測定するために用いる。好ましくは、比色アッセイならびにタービジメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイに用いられるのは分光光度計である。
【００８１】
選択した分光光度計の構造および波長（デバイス毎に異なる可能性がある）に応じて、多重波長から第１および第２波長を選択する。本発明に用いる光度計は、３００ｎｍ〜８００±２ｎｍの１２の波長を同時に測定する性能をもつＲｏｃｈｅの分析計ｃｏｂａｓ  ｃ（登録商標）３１１である。好ましくは、波長３４０、３７６、４１５、４５０、４８０、５０５、５４６、５７０、６００、６６０、７００、８００±２ｎｍを用いる。本発明の方法は、多重波長を同時に測定する性能をもつｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１のような自動分析計に用いると、特に有利である。測定は、好ましくは一定の温度、好ましくは２０〜４０℃の間で実施される。
【００８２】
一例として、数種類の特定の被検体の定量を目的とした第１および第２校正曲線を作成するための第１および第２波長ならびに第１および第２反応時間を、本発明に従ってＲｏｃｈｅの分析計ｃｏｂａｓ  ｃ（登録商標）３１１で標準条件下に決定した。この計器は自動的に試料およびアッセイ試薬を反応セル（＝キュベット）内へピペッティングする。この計器は、１２の異なる波長：３４０、３７６、４１５、４５０、４８０、５０５、５４６、５７０、６００、６６０、７００、８００±２ｎｍで自動的に吸光度を測定する。各反応セルについて、水ブランクを測定し、次いで吸光度の読みを１０分に５７回取得し、こうして各波長における吸光度につき合計５７の測定ポイントが得られる。これらの測定ポイントのうち少なくとも１つを用いて濃度を計算することができる。測定を３７℃で実施する。
【００８３】
被検体ＣＲＰ（直接アッセイ様式）について、第１波長を５０５ｎｍ、第２波長を６００ｎｍに決定した；一方、標準波長は５７０ｎｍである。第１反応時間を２．０分、第２反応時間を１．２分に決定した；一方、標準反応時間は２．０分である。第１および第２校正曲線ならびに標準校正曲線について８００ｎｍを記録し、ブランキング(blanking)による補正の目的に用いた。
【００８４】
被検体フェリチン（直接アッセイ様式）について、第１波長を５０５ｎｍ、第２波長を５７０ｎｍに決定した；一方、標準波長は５７０ｎｍである。第１反応時間を４．９分、第２反応時間を５．１分に決定した；一方、標準反応時間は５．１分である。第１および第２校正曲線ならびに標準校正曲線について８００ｎｍを記録し、ブランキングによる補正の目的に用いた。
【００８５】
被検体ミオグロビン（直接アッセイ様式）について、第１波長を５０５ｎｍ、第２波長を６６０ｎｍに決定した；一方、標準波長は５７０ｎｍである。第１反応時間を６．７分、第２反応時間を２．６分に決定した；一方、標準反応時間は４．７分である。第１および第２校正曲線ならびに標準校正曲線について８００ｎｍを記録し、ブランキングによる補正の目的に用いた。
【００８６】
被検体Ｄ−ダイマー（直接アッセイ様式）について、第１波長を８００ｎｍ、第２波長を７００ｎｍに決定した；一方、標準波長は８００ｎｍである。第１反応時間を４．３分、第２反応時間を１．４分に決定した；一方、標準反応時間は４．３分である。
【００８７】
被検体リウマチ因子ＩＩ（直接アッセイ様式）について、第１波長を５４６ｎｍ、第２波長を６６０ｎｍに決定した；一方、標準波長は５７０ｎｍである。第１反応時間を８．５分、第２反応時間を１．４分に決定した；一方、標準反応時間は２．２分である。第１および第２校正曲線ならびに標準校正曲線について８００ｎｍを記録し、ブランキングによる補正の目的に用いた。
【００８８】
被検体ＤＩＧ（ジゴキシン）（競合アッセイ様式）について、第１波長を６６０ｎｍ、第２波長を５０５ｎｍに決定した；一方、標準波長は６６０ｎｍである。第１反応時間を４．７分、第２反応時間を４．７分に決定した；一方、標準反応時間は４．７分である。第１および第２校正曲線ならびに標準校正曲線について８００ｎｍを記録し、ブランキングによる補正の目的に用いた。
【００８９】
被検体フェノバルビタール（競合アッセイ様式）について、第１波長を６００ｎｍ、第２波長を５０５ｎｍに決定した；一方、標準波長は６００ｎｍである。第１反応時間を６．５分、第２反応時間を７．９分に決定した；一方、標準反応時間は６．５分である。第１および第２校正曲線ならびに標準校正曲線について８００ｎｍを記録し、ブランキングによる補正の目的に用いた。
【００９０】
大部分の場合、本発明による方法を用いてアッセイのＬＤＬおよび／またはＵＤＬのいずれかが改善されることによって、ダイナミックレンジが改善された。ジゴキシンおよびＤ−ダイマーの場合のみ、改善は中等度である。
【００９１】
上記に示したこれらのアッセイ例から、直接アッセイ様式について幾つかの傾向を推論できる。第１校正曲線および被検体の高感度検出に用いる第１波長は、通常は第２校正曲線および高い被検体濃度の検出に用いる第２波長より小さい。Ｄ−ダイマーアッセイについて例外が示される。さらに、大部分の場合、第１反応時間は第２反応時間より長いかまたは等しい。フェリチンアッセイについて例外が確認され、第２反応時間より短い第１反応時間を示す。直接アッセイ様式とは逆の挙動をすると思われる競合アッセイ様式を用いるアッセイについて、類似の傾向が観察される。
【００９２】
本発明の１態様は、所望により干渉の補正および光度計ノイズの補償のためのブランク値として、さらなる波長を決定することである；これはバイクロマチック(bichromatic)測定としても知られる(clin. Chem. 1979, 25, 1482 - 1484)。２つの主波長それぞれについて、補正波長における信号を主波長における信号から減算することにより補正する目的でさらなる波長を記録するかどうかは任意である。好ましくは、被検体ＣＲＰについては、補正のためのこのさらなる波長を８００ｎｍで記録する。
【００９３】
“第１波長”および第１反応時間ならびに“第２波長”および第２反応時間について、特定の被検体に対する標準試料（それらを同時に測定する）を用いて校正曲線を構築する。本発明によれば、第１波長（λ１）および第１反応時間（ｔ１）で記録する第１校正曲線を、感度または検出下限（ＬＤＬ）に最適化する。第２波長（λ２）および第２反応時間（ｔ２）で記録する第２校正曲線を、検出上限（ＵＤＬ）に最適化する。一例として、ＣＲＰアッセイについて、標準試料をλ１（＝５０５ｎｍ）およびλ２（＝６００ｎｍ）ならびに補正波長（８００ｎｍ）を含めてｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１で得られる１２の波長すべてにおいて、１０分（＝全反応時間）にわたって同時に測定する。校正曲線１が下記により得られる：全反応時間（約１０分）中に５０５ｎｍで測定したすべての吸光値を８００ｎｍにおける対応する吸光値を減算することにより補正し、続いてこれから反応混合物に最終試薬を添加した直後の吸光値と反応混合物に最終試薬を添加した２．０分後の吸光値の差を計算することにより、第１反応時間（ｔ１）についての信号値を計算する；同時に、校正曲線２が下記により得られる：全反応時間（約１０分）中に６００ｎｍで測定したすべての吸光値を８００ｎｍにおける対応する吸光値を減算することにより補正し、続いてこれから反応混合物に最終試薬を添加した直後の吸光値と反応混合物に最終試薬を添加した１．２分後の吸光値の差を計算することにより第２反応時間（ｔ２）についての信号値を計算する。
【００９４】
さらなる態様は、同じ波長および異なる反応時間で記録した２つの校正曲線を作成する本発明方法である。
【００９５】
特定の被検体について校正曲線１および２を構築した後、試料の濃度を決定できる。そのために、決定すべき特定の被検体を含有する試料をキュベット内の検査試薬に添加する。この混合物を一定の反応時間、インキュベートする；この場合、全反応時間はたとえば１０分である。
【００９６】
本明細書中で用いる用語、この被検体についての“光信号”（吸光度とも呼ばれる）は、全反応時間にわたる１回の試験で、反応混合物中において少なくとも２つの前決定した波長である第１および第２波長で同時に測定される。所望により補正波長における光信号も記録する。
【００９７】
本明細書中で用いる用語“閾値”は、“カットオフ値”とも呼ばれ、本発明方法の被検体の規定された吸光値または規定された量を定義するために用いられる；好ましくは吸光値が用いられる。理想的には、閾値は本発明方法の２つの校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化するポイントから求められる。１つの吸光値のみ、すなわち第１波長および第１反応時間についての値（Ａ［λ１，ｔ１］）または第２波長および第２反応時間についての値（Ａ［λ２，ｔ２］）を閾値と規定するか、あるいは２つの閾値（Ａ［λ１，ｔ１］およびＡ［λ２，ｔ２］）を並行して考慮に入れることができる。一例として、ＣＲＰアッセイについて、Ａ［λ１，ｔ１］および／またはＡ［λ２，ｔ２］を閾値と定義することができ、それはＣＲＰについて７３ｍｇ／ｌの濃度に対応する。ＣＲＰの場合のように上昇型の校正曲線を用いるアッセイの場合、値Ａ［λ１，ｔ１］は校正曲線１の最高信号値であり、Ａ［λ２，ｔ２］は校正曲線２の最低信号値である。吸光値Ａ［λ１，ｔ１］および／またはＡ［λ２，ｔ２］に対応する生の吸光信号を閾値と定義することもできる。試料の少なくとも１つの光信号またはこれから計算した少なくとも１つの信号値が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長および第２反応時間の第２校正曲線との比較により被検体の濃度を決定する。ＩＶＤアッセイについては、臨床判定値と一致しない濃度に閾値を選択することが重要である。
【００９８】
本発明の２つの校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化するポイントの選択について、通常は幅広い柔軟性がある。重要なことは、選択したポイントにおいて両曲線がその方法の線形性ならびに精度および感度に関連する要件を満たすことである。たとえば、校正曲線２は、理想的には少なくとも選択したポイントにおける濃度をカバーするＬＤＬをもつべきである；また、校正曲線１は、理想的には少なくともその選択したポイントまではその方法の線形性を示すべきである。
【００９９】
最適ＬＤＬを与えることを特徴とする第１校正曲線に最適な第１波長および第１反応時間の選択、ならびに最適ＵＤＬを与えることを特徴とする第２校正曲線に最適な第２波長および第２反応時間の選択を、試行錯誤方法で実施した。最適な波長および反応時間の選択については何らかの傾向があるけれども、これらの傾向からの例外もあり、その結果、波長および反応時間のすべての組合わせをそれらが最適なＬＤＬまたはＵＤＬを与える能力について検討しなければならない。しかし、手動で、すなわち自動化された計算ツールまたはアルゴリズムの補助なしにこれらの計算をすると、波長および反応時間のすべての組合わせについてＬＤＬおよびＵＤＬの計算を妥当な努力で妥当な期間内に行なうことはできない。このため、本発明においては、特定のアッセイのための方法、言い換えると最適な第１の波長および反応時間ならびに第２の波長および反応時間ならびに閾値の選択のための方法を開発するのに、下記の操作を用いた：
【０１００】
１）下記の試料の吸光値を、たとえばｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１分析計で得られる１２の波長で同時に全反応時間にわたって測定する：
−  校正のために、少なくとも６つの標準品を２回反復
−  ＬＤＬの決定のために、ブランク試料を２１回反復
−  精度（変動係数）の決定のために、少なくとも２つの試料を２１回反復
−  ＵＤＬおよび本方法の線形性の決定のために、既知ＵＤＬよりたとえば２〜４倍高い濃度をカバーする希釈系列。
【０１０１】
２）第１校正曲線のための第１反応時間ｔ１および第１波長λ１の選択を、１２の異なる主波長で全反応時間にわたって記録したブランク試料（２１回反復）および低濃度試料の１２の動態曲線の解析により実施する。所望により補正波長をさらに考慮に入れ、それによって最良の波長および反応時間を選択するために解析される動態曲線の数を増加させることができる。低濃度試料は既知ＬＯＱ値の１〜５倍の範囲の濃度をもち、ポイント１）で測定した標準試料のうちの１つまたは精度試料のうちの１つであってもよい。動態曲線は、吸光値をｙ軸に、時間（ｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１の場合、時間を測定ポイントとして表わす）をｘ軸に記載する。この検出器の指定光学範囲内の吸光値（０．００００〜３．００００の吸光度）のみを考慮に入れる。第１工程で、各波長について対応する動態曲線から最終試薬の添加前または添加直後に初期時点（または測定ポイント）を選択し、下記の指針を満たす最終時点（または測定ポイント）を選択することにより、幾つかの最適反応時間を決定する：
ブランク試料（２１回反復）の信号変動が最小であり、かつブランク試料の信号が初期時点で低い；
低濃度試料についての吸光度の読みが初期時点で低く、かつ最終時点で高い；すなわち、初期吸光度の読みと最終吸光度の読みの差が最大である；
本明細書中で用いる用語“反応時間”は、初期時点と最終時点の差である。各波長について幾つかの最適な反応時間を選択した後、これらの反応時間で１２の波長すべてについてＬＤＬを計算する。最良のＬＤＬを与える波長および反応時間を、第１校正曲線の作成のための第１波長および第１反応時間として選択する。
【０１０２】
３）第２校正曲線のための第２反応時間ｔ２および第２波長λ２の選択を、１２の異なる主波長で全反応時間にわたって記録した、既知ＵＤＬよりたとえば２〜４倍高い濃度をカバーする希釈系列の、１２の動態曲線の解析により実施する。所望により補正波長をさらに考慮に入れ、それによって最良の波長および反応時間を選択するために解析される動態曲線の数を増加させることができる。検出器の指定光学範囲内の吸光値（０．００００〜３．００００の吸光度）のみを考慮に入れる。第１工程で、各波長について対応する動態曲線から最終試薬の添加前または添加直後に初期時点（または測定ポイント）を選択し、下記の基準を満たす最終時点（または測定ポイント）を選択することにより、幾つかの最適反応時間を決定する：
−  最終試薬の添加前または添加直後の時点に、初期時点を選択する；
−  希釈系列の最高濃度の試料が区別可能なかつ濃度の漸増に伴なって漸増する信号を示すように、すなわち、ある濃度の試料についての初期吸光度の読みと最終吸光度の読みの差の絶対値がその次に低い濃度の試料についての対応する差の値の絶対値より高くなるように、最終時点を選択する；
各波長について幾つかの最適な反応時間（初期時点と最終時点の差）を選択した後、これらの反応時間で１２の波長すべてについてＵＤＬを計算する。最良のＵＤＬを与える波長および反応時間を、第２校正曲線の作成のための第２波長および第２反応時間として選択する。
【０１０３】
４）閾値の設定：閾値は、校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化する濃度に設定される；すなわち、低い方の濃度については被検体定量のために第１校正曲線を用い、高い方の濃度については被検体定量のために第２校正曲線を用いる；校正曲線が変化するポイントまたは濃度の選択については、通常は幅広い柔軟性がある。
【０１０４】
このポイントにおいて、下記の基準を満たすことが重要である：
−  両方の校正曲線がこの方法の線形性を示すこと；第１校正曲線はＬＤＬから閾値の濃度までの範囲、第２校正曲線は閾値の濃度からＬＤＬまでの範囲
−  第２校正曲線が少なくとも閾値の濃度をカバーするＬＤＬを示すこと
−  閾値の濃度がＩＶＤ試験の臨床判定値と同一ではないこと。
【０１０５】
したがって、ある態様は、本発明に従って最適な波長、反応時間および閾値を決定する、下記の工程を含むコンピューター実装された方法である：
ａ）分析計で同時に得られる、多重波長で全反応時間にわたって記録された吸光値を表わすデータセットを受信し、そのデータセットは下記の複数のデータポイントを含む：
−  校正のための標準品（２回反復）
−  ＬＤＬの決定のためのブランク試料
−  精度の決定のための少なくとも２つの試料（２回反復）
ｂ）濃度をカバーする希釈系列；異なる主波長で全反応時間にわたって記録したブランク試料および低濃度試料の動態曲線を解析することにより、第１校正曲線のための第１反応時間および第１波長を決定する。
ｃ）異なる主波長で全反応時間にわたって記録した動態曲線を解析することにより、第２校正曲線のための第２反応時間および第２波長を決定する。
ｄ）低い方の濃度については被検体定量のために第１校正曲線を用い、高い方の濃度については被検体定量のために第２校正曲線を用いて、校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化する濃度に閾値を設定する。
【０１０６】
さらなる態様は、本発明に従って最適な波長、反応時間および閾値を決定するためのプロセッサーを制御するコードを含み、そのコードが下記のための指示を含む、コンピューター可読媒体である：
ａ）分析計で同時に得られる、試料の吸光値を表わすデータセットを受信し、そのデータセットは下記についての複数のデータポイントを含む：
−  校正のための標準品（２回反復）
−  ＬＤＬの決定のためのブランク試料
−  精度の決定のための少なくとも２つの試料（２回反復）
ｂ）濃度をカバーする希釈系列；異なる主波長で全反応時間にわたって記録したブランク試料および低濃度試料の動態曲線を解析することにより、第１校正曲線のための第１反応時間および第１波長を決定する。
ｃ）異なる主波長で全反応時間にわたって記録した動態曲線を解析することにより、第２校正曲線のための第２反応時間および第２波長を決定する。
ｄ）低い方の濃度については被検体定量のために第１校正曲線を用い、高い方の濃度については被検体定量のために第２校正曲線を用いて、校正曲線が第１校正曲線から第２校正曲線に変化する濃度に閾値を設定する。
【０１０７】
本発明の代表的態様において、本方法は一般的なパーソナルコンピューターシステムを用いて実装でき、このシステムは下記のものを含むが、それらに限定されない：データセットを入力するための入力デバイス、たとえばキーボード、マウスなど；曲線の領域内の目的とする特定のポイントを表示するためのディスプレーデバイス、たとえばモニター；本方法の各工程を実施するのに必要な処理デバイス、たとえばＣＰＵ；ネットワークインターフェース、たとえばモデム、データセットを記憶するためのデータ記憶デバイス、プロセッサーを操作するコンピューターコードなど。さらに、本方法を分析計、たとえばｃｏｂａｓ  ｃ  ３１１分析計に実装することもできる。
【０１０８】
いずれかの濃度における閾値についてこれらの基準が満たされない場合、基準が満たされるように、第１校正曲線についての条件（第１波長および第１反応時間）および／または第２校正曲線についての条件（第２波長および第２反応時間）を変更しなければならない。そのような変更は、ダイナミックレンジについて達成された改善係数を損なう可能性がある。校正曲線１および２に最適な波長および反応時間の選択に関して前記に述べた操作では、信号を計算するために２ポイントエンド法(two-point-end method)のみを適用した。２ポイントエンド法は、試料ブランクを実施するエンドポイントアッセイである。この場合、２つの異なる測定ポイントにおける２つの吸光度の読みを考慮に入れる：第１の読みは通常は最終試薬の添加前または添加直後に取得される；第２の読みは最終試薬の添加後にいずれかの時点で取得される。原則として、最適な第１波長および第１反応時間ならびに第２波長および第２反応時間を選択するために、動態信号計算法をさらに考慮に入れ、それによって特定のアッセイについては２ポイントエンド法と比較してより良い結果が得られる可能性がある。
【０１０９】
特定の被検体の定量のために第１または第２校正曲線のいずれかを選択することにより（これは決定すべき試料の光信号に依存する）、拡大したダイナミックレンジまたは測定範囲が達成される。
【０１１０】
本明細書中で用いる用語“拡大したダイナミックレンジ”は、１つの波長および１つの校正曲線のみを用いる標準法の場合には決定できないきわめて低い濃度の特定の被検体を含む試料および／またはきわめて高い濃度の特定の被検体を含む試料を決定できることを意味する。本発明によれば、検出下限および／または検出上限の改善の結果、ダイナミックレンジが改善される。
【０１１１】
本発明によれば、本明細書中で用いる用語“高濃度の特定の被検体”は、高用量“フック効果(Hook-effect)”を引き起こさないものである。フック効果は臨床検査室の日常作業に一般的な現象である。主として、フック効果は被検体濃度に依存し、それは捕獲抗体の結合能を圧倒する過剰量の被検体である。
【０１１２】
その結果、不適切に低い信号を生じ、それは過剰に高い被検体濃度をもつ試料について誤った低い結果または普通の結果（“フックされた”結果）の原因となる。それは、抗体上のすべての結合部位を飽和する大過剰の被検体の存在を示唆する。希釈した試料において希釈していない試料より高い数値が測定されれば、フック効果が存在する。若干の自動分析計は、試料を同時希釈する際に過剰の被検体を認識するシステムをもつ。本発明によれば、高用量“フック効果”を引き起こす過剰量の特定の被検体を第２校正曲線との比較によって阻止することはできない。
【０１１３】
本発明の１態様は、校正曲線を補正する事例を提示することである。被検体ＣＲＰは、高感度検出のための第１波長として５０５ｎｍで、また検出上限のための第２波長として６００ｎｍで測定される。第１および第２校正曲線において大部分の光度計ノイズの干渉および補償を補正するために、８００ｎｍで第３波長を記録する。
【０１１４】
本明細書中で用いる用語“全反応時間”は、特定の被検体を複数の波長で測定する期間である。２つの校正曲線の作成を目的として最良の２つの波長を選択するために、ｃｏｂａｓ  ｃ（登録商標）計器で得られる１２の異なる波長で標準品を同時に測定した。この検出器の光学範囲内にある吸光値（０．００００〜３．００００の吸光度）のみを考慮に入れた。
【０１１５】
本発明のイムノアッセイの一般的な全反応時間は、１〜２０分の間の範囲である。好ましくは、多重波長分光光度計型の光度計の全反応時間は、好ましくは約１０分である。本発明のある態様は、特定の被検体の光信号を全反応時間中に測定するものである。最も好ましくは、特定の被検体の光信号を少なくとも第１および第２の主波長で同時に測定する。本明細書中で用いる用語“時間遅れ”は、特定の被検体を検出するための第１と第２の主波長間の期間である。本明細書中で用いる用語“同時に”は、６０ｘ秒未満の時間遅れ、たとえば１０ｘ秒未満の時間遅れ、好ましくは１ｘ秒未満の時間遅れ、最も好ましくは１ミリ秒未満の時間遅れ、またはさらには０．１ｘミリ秒未満の時間遅れを意味することができる。最も好ましくは、用語“同時に”は時間遅れがないことを意味する。
【０１１６】
本発明のさらなる観点は、測光アッセイの感度および／またはダイナミックレンジを拡大するための方法であって、試料中の特定の被検体は反応混合物中の被検体特異的反応パートナーと反応し、その方法は下記の工程を含む：少なくとも２つの校正曲線を作成し、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化する。反応混合物中の試料の決定すべき特定の被検体についての光信号を、少なくとも第１および第２波長で同時に測定する。特定の被検体の定量のために下記の基準により第１または第２のいずれかの校正曲線を選択する：
上昇型の校正曲線について：
第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。第１および／または第２波長の少なくとも１つの光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；最終的に特定の被検体の量を定量する。
【０１１７】
下降型の校正曲線について：
第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値より低ければ、第２波長で記録した第２校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する。第１および／または第２波長の光信号が対応する前決定した閾値を超えれば、第１波長で記録した第１校正曲線を用いて被検体の濃度を決定する；最終的に特定の被検体の量を定量する。好ましくは、特定の被検体につき前決定した第１および第２の波長および反応時間について、２つの校正曲線を作成する。本発明によれば、検出下限と検出上限の両方が感度および／またはダイナミックレンジの拡大をもたらす。その有益性は再試験回数の低減であり、それによって試料処理量が増加し、ターンアラウンド時間が短縮される。さらに、検査コストが低減し、信頼性が改善される。
【０１１８】
本発明は、検出下限（ＬＤＬ）および／または検出上限（ＵＤＬ）について示される改善をもたらす。好ましくは、検出下限（ＬＤＬ）および／または検出上限（ＵＤＬ）について１〜２倍の改善が示される。より好ましくは、検出下限（ＬＤＬ）および／または検出上限（ＵＤＬ）について３〜４倍の改善が示される。最も好ましくは、本発明は検出下限（ＬＤＬ）および／または検出上限（ＵＤＬ）について示される５倍の改善をもたらす。ＲＦ  ＩＩの直接アッセイについて示されるように、好ましくは改善係数は係数１より大きく、好ましくはこの係数は係数３より大きく、最も好ましくはこの係数は係数５より大きい。
【０１１９】
本発明のさらなる観点は、タービディメトリーおよびネフェロメトリーによるイムノアッセイによりＣＲＰの量を測定する方法であり、その際、ＣＲＰとＣＲＰ結合パートナーとの凝集に基づく反応混合物の濁度の変化から試料中のＣＲＰを定量する。ＣＲＰについて前決定した第１および第２波長ならびに対応する第１および第２反応時間について、２つの校正曲線を作成する。試料の決定すべきＣＲＰに関する光信号を、反応混合物において少なくとも第１および第２波長で全反応時間中に同時に測定する。第１波長を低濃度のＣＲＰに最適化してそれにより検出下限を最大化し、高濃度のＣＲＰに最適化した第２波長を用い、それにより検出上限を最大化する。第１または第２波長および第１または第２反応時間のいずれかをＣＲＰの定量のために選択する。全反応時間中に測定した試料の少なくとも１つの光信号またはこれから計算した少なくとも１つの信号値が対応する前決定した閾値より低ければ、第１波長および第１反応時間の校正曲線との比較によりＣＲＰの濃度を決定する。これに対し、全反応時間中に測定した試料の少なくとも１つの光信号またはこれから計算した少なくとも１つの信号値が対応する前決定した閾値を超えれば、第２波長および第２反応時間の校正曲線との比較によりＣＲＰの濃度を決定する。
【０１２０】
ＣＲＰ試験の場合、５０５ｎｍで２．０分の反応時間を用いて記録し、８００ｎｍで補正した校正曲線が最良のＬＤＬ（０，０３６ｍｇ／Ｌ）を与えた。標準性能と本発明方法を比較すると、感度（ＬＤＬ）が１．８倍増大し、ダイナミックレンジが約３．１倍拡大した。６００ｎｍで１．２分の反応時間を用いて記録し、８００ｎｍで補正した校正曲線２は、最良のＵＤＬ（６６０ｍｇ／Ｌ）を生じた。このＵＤＬは標準条件と比較して１．８倍の増大を示す。
【０１２１】
さらに、粒子増強型タービディメトリーアッセイについて、本発明方法と、適合した粒子サイズおよび抗体装填度との組合わせを、リードパラメーターとしてＣＲＰ  Ｌ３アッセイを用いて査定した。ＣＲＰ  Ｌ３アッセイは、EP 0898169に記載される２つの異なるタイプの粒子を含む：高アフィニティー抗体でコートした大型ラテックス粒子（ＭＰ２）、およびより低アフィニティー抗体（クローン２１Ｆ１２，ラテックスコーティングに対する濃度：４５ｍｇ／ｇ（ラテックス））でコートした小型ラテックス粒子（ＭＰ１）。
【０１２２】
光散乱効率を高めるために２３０〜４００ｎｍ、より好ましくは２５０〜３５０ｎｍ、最も好ましくは２８０〜３２０ｎｍの間の直径の大型粒子を使用し、粒子への抗体のコンジュゲーションのために５５〜７０ｍｇのＩｇＧ／ｇ（粒子）、好ましくは６０〜７０ｍｇのの間ＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度を用いて得られる高い抗体装填度の粒子を使用することにより、ＣＲＰアッセイ感度のさらなる改善が得られた。本発明方法と、コンジュゲーション反応のための２３０〜３３０ｎｍの間の大きい粒子サイズおよび５５〜７０ｍｇの間のＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度との組み合わせは、標準アッセイ（大型粒子：２２０ｎｍ，大型粒子のコンジュゲーションのための５０ｍｇのＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度；小型粒子のサイズ：１１０〜１４０ｎｍ）と比較して、約８倍のさらなる感度（ＬＤＬ）増大をもたらし、したがって約８倍のダイナミックレンジ拡大をもたらす。
【０１２３】
したがって、本発明のさらなる態様は、特定の被検体ＣＲＰについて、大型粒子につき２３０〜４００ｎｍの間および小型粒子につき約１１０〜１４０ｎｍの粒子サイズ、ならびに大型粒子のコンジュゲーションのために５５〜７０ｍｇのＩｇＧ／ｇ（粒子）の抗体濃度をコンジュゲーション反応に用いる、本発明による方法である。第１校正曲線を、５０５ｎｍの第１波長および補正波長としての８００ｎｍならびに２．８分の第１反応時間で記録した；第２校正曲線を、主波長としての５７０ｎｍおよび補正波長としての８００ｎｍならびに２．０分の第２反応時間で測定した。標準法は、主波長としての５７０ｎｍおよび補正波長としての８００ｎｍならびに２．０分の反応時間で測定した１つの校正曲線のみをもつ。
【０１２４】
本発明のさらなる観点は、測光アッセイの特定の被検体の量を定量するための少なくとも２つの校正曲線を作成するための、特定の被検体について前決定した少なくとも２つの波長および少なくとも２つの反応時間の使用であり、その際、第１波長で記録した第１校正曲線を低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化し、第２波長で記録した第２校正曲線を高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化し、第１および第２波長における特定の被検体の光信号を全反応時間にわたって同時に測定する。
【０１２５】
本発明の他の観点は、下記のものを含むシステム分析計である：試料容器およびアッセイ試薬容器、試料およびアッセイ試薬を収容して混合するための反応器、工程ｂの反応混合物を測定するための光度計、ならびに本発明に従って特定の被検体を定量するために分析結果を出力する手段。
【０１２６】
この測定範囲の拡大の１つの有益性は、自動化した検査室分析計で行なわれるアッセイについて、測定範囲を超える被検体濃度をもつ試料により起きる再試験率を低減できることである。達成できる再試験率低減の規模のおおまかな推定を行なうために、ｃｏｂａｓ  ｃ５０１分析計でアッセイ当たり少なくとも１０００の臨床試料について得られた結果を、標準法および本発明方法に関して解析した。測定範囲をはずれる被検体濃度をもつ試料は、この分析計では自動的再試験の原因となる。標準法で達成できる測定範囲は、市販試験のパッケージ添付文書に示されている。
【０１２７】
ＡＬＴＬ例：本発明方法の使用により、このアッセイの測定範囲は標準法と比較して１２．１倍拡大した。このダイナミックレンジ改善は、標準法と比較して再試験の低減をもたらす：標準測定範囲より低い被検体濃度をもつ試料により起きたすべての再試験のうち８７％を、本発明方法の適用により避けることができる；また、標準測定範囲を超える被検体濃度をもつ試料により起きたすべての再試験のうち９９％を避けることができる。この試験に用いた試料は、標準滴な中央検査室でみられるものに匹敵する健康状態プロフィールをもつドナーからの試料である。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：ＣＲＰ  Ｌ３試験のダイナミックレンジの決定
１．１  計器：
検出ユニットとして多重波長分光光度計を備えたＲｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）のｃｏｂａｓ  ｃ３１１分析計を実験に用いた。この計器は自動的に試料およびアッセイ試薬を反応セル内へピペッティングする。最大３種類の異なる試薬、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３を試料に添加できる。この計器は、タングステンハロゲンランプ（１２Ｖ／５０Ｗ）を照射線源として用い、１２の異なる波長で（３４０、３７６、４１５、４５０、４８０、５０５、５４６、５７０、６００、６６０、７００および８００±２ｎｍで）同時に、１２のフォトダイオードから構成されるダイオードアレイにより吸光度を測定する。光路長は５．６ｍｍであり、検出器の光学範囲は０．００００〜３．００００の吸光度である。各反応セルについて、水ブランクを測定し、次いで吸光度の読みを１０分（本明細書中で全反応時間とも呼ばれる）に５７回取得し、こうして各波長における吸光度につき合計５７の測定ポイント（本発明において測光ポイントまたはアッセイポイントとも呼ばれる）が得られる。これらの測定ポイントのうち少なくとも１つを用いて濃度を計算することができる。この計器における２つの基本的タイプの測光アッセイがある：エンドポイントアッセイおよび速度アッセイ(rate assay)。測定を３７℃で実施する。
【０１２９】
１．２  標準法を用いるＣＲＰアッセイのための手順
ＲｏｃｈｅのＣＲＰ  Ｌ３試験（ＣＲＰＬ３，カタログＮｏ．０４９５６８４２）、すなわち粒子増強型イムノタービディメトリーアッセイをこの試験のために選択した。ヒトＣＲＰは、モノクローナル抗ＣＲＰ抗体でコートしたラテックス粒子と共に凝集する；その凝集体をタービディメトリーにより測定する。すべてのＲｏｃｈｅ試験のための試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに備えられている。これらのカセットは、１〜３つの特別にデザインされた試薬ボトルを収容し、詳細な試薬および試験関連事項を含むバーコードラベルを備えている。ＣＲＰ  Ｌ３試験には、カセット内の２つの試薬を用いる：Ｒ１（ウシ血清アルブミンを含むＴＲＩＳ緩衝液、および保存剤）およびＲ２（抗ＣＲＰ（マウス）でコートしたラテックス粒子（グリシン緩衝液中）、免疫グロブリン（マウス）および保存剤）。ＣＲＰ  Ｌ３試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０１３０】
１．３  ピペッティング計画
２μＬの試料および１５０μＬのアッセイ用緩衝液（Ｒ１）を次いで反応セルに添加し、続いて２４μｌの希釈剤（水）で希釈したラテックス試薬（Ｒ２）を添加し、反応混合物を混合した。
【０１３１】
１．４  校正曲線の作成のための条件：
測定のために、５７０ｎｍを主波長として用い、８００ｎｍを補正波長として用いた。アッセイタイプは２ポイントエンドアッセイであった。２ポイントエンドアッセイは、試料ブランクを実施するエンドポイントアッセイである。この場合、２つの異なる測定ポイントにおける２つの吸光度の読みを考慮に入れる：第１の読みは通常は最終試薬の添加前または添加直後に取得される；第２の読みは最終試薬の添加後にいずれかの時点で取得される。校正曲線のための、したがって濃度計算のための吸光値は、第１の読みを第２の読みから減算することにより得られる。ＣＲＰ  Ｌ３について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１８におけるものであり、これは２．０分の反応時間に対応する。校正曲線を作成するために、Ｒｏｃｈｅ（カタログＮｏ．１１３５５２７９）からの６つの標準品を２回反復で、校正タイプとしてスプラインを用いて測定する；これは測定したキャリブレーターの三次多項式により概算したデータポイント間の範囲にフィットし、したがって滑らかな曲線が得られる。
【０１３２】
１．５  本発明によるＣＲＰアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は標準法に用いたものと同じであった：実施例１．２を参照。波長および反応時間を除いて、ＣＲＰ  Ｌ３試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１３３】
１．６  ピペッティング計画：ピペッティング計画１．３と同じ
１．７  校正曲線の作成のための条件：
両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：５０５ｎｍを第１波長、８００ｎｍを補正波長、２．０分を第１反応時間として用いた；６００ｎｍを第２波長、８００ｎｍを補正波長、１．２分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。
【０１３４】
第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１８におけるものであり、これは２．０分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１４におけるものであり、これは１．２分の反応時間に対応する。両方の校正曲線を作成するために、対応する濃度範囲をカバーする６つの標準品それぞれを２回反復で、校正タイプとしてスプラインを用いて測定する；これは測定したキャリブレーターの三次多項式により概算したデータポイント間の範囲にフィットし、したがって滑らかな曲線が得られる。両方の校正曲線について標準法（カタログＮｏ．１１３５５２７９）からの６つの標準品を用いた場合、類似の結果が得られた。
【０１３５】
低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。ＣＲＰの定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。ＣＲＰの閾値は、ＣＲＰについての校正曲線における７３ｍｇ／Ｌ（参照：図３または新たな図）に対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、５０５ｎｍ−８００ｎｍで反応時間２．０分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［５０５ｎｍ−８００ｎｍ，２．０分］）および／または６００ｎｍ−８００ｎｍで反応時間１．２分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［６００ｎｍ−８００ｎｍ，１．２分］）。
【０１３６】
５０５ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間２．０分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５０５ｎｍ−８００ｎｍ，２．０分］より低ければ、および／または６００ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間１．２分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［６００ｎｍ−８００ｎｍ，１．２分］より低ければ、それの定量に第１校正曲線を使用する。
【０１３７】
５０５ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間２．０分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５０５ｎｍ−８００ｎｍ，２．０分］を超えれば、および／または６００ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間１．２分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［６００ｎｍ−８００ｎｍ，１．２分］を超えれば、それの定量に第２校正曲線を使用する。その結果、ＣＲＰ決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から７３ｍｇ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および７３ｍｇ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０１３８】
標準法および本発明方法を用いるＣＲＰアッセイの結果：
１．８  ＬＤＬの決定：
２１回反復ブランク試料を調製し、対応する信号値ｘ１、ｘ２、…ｘ２１を下記により計算した：５７０ｎｍの主波長で記録した吸光値を８００ｎｍにおける吸光度の減算により補正し、続いて測定ポイント８で取得した値を測定ポイント１８で取得した値から減算する。最終的に、これら２１の信号値ｘ１、ｘ２、…ｘ２１の平均値ｘおよび対応する標準偏差を計算する。ＬＤＬを、信号値（ｘ＋３ＳＤ）に対応する濃度として決定する。この新規方法には、第１波長および第１反応時間で作成したデータならびに対応する第１校正曲線のみを用いる。
【０１３９】
１．９  ＵＤＬの決定：
Ｒｏｃｈｅアッセイから分かったＵＤＬより約２〜４倍高い濃度をカバーする試料希釈系列を測定し、続いて測定値と閾値の比を求めることにより被検体復元率を計算する。９０％〜１１０％の間の数値については、その方法を線形であるとみなした。ＵＤＬを、この線形範囲内の最高濃度として選択した。この新規方法には、第２波長および第２反応時間で作成したデータならびに対応する第２校正曲線のみを用いる。
【０１４０】
１．１０  変動係数（ＣＶ）の決定：
特定濃度の血清試料を２１回反復測定し、測定濃度値のＣＶを標準偏差と平均値の比により計算した。新規方法には、査定すべき被検体濃度に応じて下記のいずれかを用いる：
−  第１波長および第１反応時間で作成したデータならびに対応する第１校正曲線、または
−  第２波長および第２反応時間で作成したデータならびに対応する第２校正曲線。
２つの低濃度試料（１および５ｍｇ／ＬのＣＲＰ）をこのアッセイについて査定した。
【０１４１】
１．１１  結果の概要と結論：
結果の概要を表１に示す。新規なＣＲＰ試験法の適用は、感度（ＬＤＬ，下限）の１．８倍増大、および検出上限ＵＤＬの１．８倍拡大を示す。対応するダイナミックレンジの改善は、３．１倍である。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。校正のための標準品の数および濃度を適合させるだけでよい。
【０１４２】
【表１】
0006523163.tif 000002
【０１４３】
実施例２：その他のアッセイのダイナミックレンジの決定
２．１  計器：実施例１を参照
２．２  標準法によるフェリチンアッセイのための手順：
Ｒｏｃｈｅのフェリチン試験（ＦＥＲＲ４，カタログＮｏ．０４８８５３１７）、すなわち粒子増強型イムノタービディメトリーアッセイをこの試験のために選択した。ヒト  フェリチンは、抗フェリチン抗体でコートしたラテックス粒子と共に凝集する；その凝集体をタービディメトリーにより測定する。すべてのＲｏｃｈｅ試験のための試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに備えられている。これらのカセットは、１〜３つの特別にデザインされた試薬ボトルを収容し、詳細な試薬および試験関連事項を含むバーコードラベルを備えている。フェリチン試験には、カセット内の２つの試薬を用いる：Ｒ１（ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．５、免疫グロブリン（ウサギ）および保存剤）およびＲ３（抗ヒトフェリチン抗体（ウサギ）でコートしたラテックス粒子、保存剤）。フェリチン試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０１４４】
２．３  ピペッティング計画：
１０μＬの試料および８０μＬのアッセイ用緩衝液（Ｒ１）を次いで反応セルに添加し、続いてラテックス試薬（Ｒ３）を添加し、反応混合物を混合した。
【０１４５】
２．４  校正曲線の作成のための条件：
測定のために、５７０ｎｍを主波長として用い、８００ｎｍを補正波長として用いた。アッセイタイプは、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。フェリチンについて、第１の読みは測定ポイント２４におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５７におけるものであり、これは５．１分の反応時間に対応する。校正曲線を作成するために、Ｒｏｃｈｅ（カタログＮｏ．１１３５５２７９）からの６つの標準品を２回反復で、校正タイプとしてスプラインを用いて測定する；これは測定したキャリブレーターの三次多項式により概算したデータポイント間の範囲にフィットし、したがって滑らかな曲線が得られる。
【０１４６】
２．５  本発明によるフェリチンアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は実施例２．２に記載した標準法に用いたものと同じであった。波長および反応時間を除いて、フェリチン試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１４７】
２．６  ピペッティング計画：２．３に記載したピペッティング計画と同じ
２．７  校正曲線の作成のための条件：
両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：５０５ｎｍを第１波長、８００ｎｍを補正波長、４．９分を第１反応時間として用いた；５７０ｎｍを第２波長、８００ｎｍを補正波長、５．１分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント２５におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５７におけるものであり、これは４．９分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント２４におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５７におけるものであり、これは５．１分の反応時間に対応する。両方の校正曲線を作成するために、対応する濃度範囲をカバーする６つの標準品それぞれを２回反復で、校正タイプとしてスプラインを用いて測定する；これは測定したキャリブレーターの三次多項式により概算したデータポイント間の範囲にフィットし、したがって滑らかな曲線が得られる。両方の校正曲線について標準法（カタログＮｏ．１１３５５２７９）からの６つの標準品を用いた場合、類似の結果が得られた。閾値は、フェリチンについての校正曲線における１００μｇ／Ｌの濃度に対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる。
【０１４８】
標準法および本発明方法を用いるフェリチンアッセイの結果：
２．８  ＬＤＬ／ＵＤＬ／ＣＶの決定：実施例１を参照
２．９  結果の概要と結論：
結果の概要を表２に示す。Ｒｏｃｈｅのフェリチン試験への新規方法の適用は、感度（ＬＤＬ，検出下限）の１．７倍増大、および検出上限ＵＤＬの保持を示す。対応するダイナミックレンジの改善は、１．７倍である。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。校正のための標準品の数および濃度を適合させるだけでよい。
【０１４９】
【表２】
0006523163.tif 000003
【０１５０】
実施例３：Ｒｏｃｈｅからのさらに他の試験のダイナミックレンジを拡大する効力の査定
３．１  計器：実施例１を参照
３．２  標準法を用いるアッセイのための手順：
下記のＲｏｃｈｅからの粒子増強型イムノタービディメトリーアッセイを査定した：直接試験様式を用いる３つのアッセイ：ミオグロビン（ＭＹＯ２，カタログＮｏ．０４５８００１０）、Ｄ  ダイマー（Ｄ−ＤＩ２，Ｎｏ．０４９１２５５１）およびリウマチ因子（ＲＦ−ＩＩ，カタログＮｏ．２０７６４５７４）、ならびに競合試験様式（ＫＩＭＳ：kinetic interaction of microparticles in solution（溶液中における微粒子の力学的相互作用）)を用いる２つのアッセイ：ジゴキシン（ＤＩＧ，カタログＮｏ．２０７３７８３６）およびフェノバルビタール（ＰＨＮＯ２，カタログＮｏ．０４４９０９２４）。ＤＩＧアッセイでは、粒子はジゴキシンでコートされ、試料のジゴキシン濃度に応じて抗体溶液の存在下で速やかに凝集する。ＰＨＮＯ２アッセイでは、フェノバルビタール抗体を微粒子に共有結合させ、フェノバルビタール誘導体を高分子に連結させる；高分子上の抗体へのフェノバルビタール誘導体の結合は、試料中にフェノバルビタールが存在することによって阻害される。上記試験からの対応するパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０１５１】
３．３  試薬、ピペッティングおよび校正に関する概要：
手順は、試験からの対応するパッケージ添付文書に記載され、次表（表３）にまとめたとおりであった。
【０１５２】
【表３】
0006523163.tif 000004
【０１５３】
＊  ＲＣＭ：Ｒｏｄｂａｒｄフィッティング；＊＊  主波長−補正波長；反応時間は分；かっこ内は第１および第２の読みについての測定ポイント
３．４  本発明によるアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は実施例３．２に記載した標準法に用いたものと同じであった。波長および反応時間を除いて、フェリチン試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１５４】
３．５  試薬、ピペッティングおよび校正に関する概要：
手順は、別途言及しない限り、各試験からの対応するパッケージ添付文書に記載され、表３にまとめたとおりであった。
【０１５５】
標準法および本発明の新規方法を用いるミオグロビン、Ｄ  ダイマー、ＲＦ  ＩＩ、ＤＩＧおよびＰＨＥＮＯアッセイの結果：
３．６  ＬＤＬ／ＵＤＬ／ＣＶの決定：実施例１を参照
３．７  結果の概要と結論：
結果の概要を表４に示す。第１および第２校正曲線に最適な波長および反応時間を前記に従って決定した。市販のＲｏｃｈｅ試験への新規方法の適用は、大部分の場合、感度（ＬＤＬ，検出下限）の改善および／または上側測定範囲の改善をもたらす。ダイナミックレンジの改善は、１．５〜５．８倍である。Ｄ  ダイマーおよびＤｉｇの２例では、改善は中等度である。改善が中等度であった場合、改善係数をかっこに入れた。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。校正のための標準品の数および濃度を適合させるだけでよい。
【０１５６】
【表４】
0006523163.tif 000005
【０１５７】
ａ  計器係数なし、ｂ  校正をスプラインに変更、ｃ  新規条件で標準条件からの良好な精度が保持されている、ｄ  １列目：  主波長−補正波長；２列目：反応時間（分）；かっこ内：測定ポイント
実施例４：本発明と改変した粒子ＭＰ２との組合わせアッセイについてのダイナミックレンジのさらなる改善
４．１  さらに、本発明方法と、適合した粒子サイズおよび抗体装填度との組合わせを、リードパラメーターとしてＣＲＰ  Ｌ３アッセイを用いて査定した。ＣＲＰ  Ｌ３アッセイは、EP 0898169に記載される２つの異なるタイプの粒子を含む：高アフィニティー抗体（クローン３６Ｆ１２；ラテックスコーティングに対する濃度：５０ｍｇ／ｇ（ラテックス））でコートした大型ラテックス粒子（ＭＰ２，約２２０ｎｍの直径）、およびより低アフィニティー抗体（クローン２１Ｆ１２，ラテックスコーティングに対する濃度：４５ｍｇ／ｇ（ラテックス））でコートした小型ラテックス粒子（ＭＰ１，約１１０〜１４０ｎｍの直径）。この場合、分析感度を高めるために、より大きいサイズおよび抗体装填度を用いてＭＰ２粒子を改変し、最終的に、達成できるＬＤＬおよびダイナミックレンジを下記のアッセイで決定した。
【０１５８】
【化１】
0006523163.tif 000006
【０１５９】
４．２  改変したＭＰ２粒子の合成：
７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中における固形分２％濃度のラテックス粒子（カルボキシレート修飾した微粒子，２９０ｎｍのサイズ）に、３０μｌのスルホ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液および３０μｌのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液を順に添加した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で１時間、混合ホイール上で反応させた。その後、６０ｍｇの抗体３６Ｆ１２／ｇ（ラテックス）を、３７μｌのＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５溶液（１％，ＭＥＳ中）を含有する７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中で、スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化したラテックス粒子と混合した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で２時間、混合ホイール上で反応させた。反応混合物に４５μｌのグリシン溶液（２Ｍ，ｐＨ１１）を添加し、音波処理し、１５分間、混合ホイール上で混合した。最後に、遠心、および０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５を含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中への再懸濁により、粒子を２回洗浄した。最後の遠心および再懸濁の工程後に、０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のナトリウムアジドを含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中に、ラテックス粒子（１％の固形分）を保存した。
【０１６０】
４．３  標準ＭＰ１粒子の合成：
７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中における固形分２％濃度のラテックス粒子（カルボキシレート修飾した微粒子，サイズ１１０〜１４０ｎｍ）に、３０μｌのスルホ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液および３０μｌのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液を順に添加した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で１時間、混合ホイール上で反応させた。その後、４５ｍｇの抗体２１Ｆ１２／ｇ（ラテックス）を、７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中で、スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化したラテックス粒子と混合した。２０分後、３７μｌのＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５溶液（１％，ＭＥＳ中）を混合物に添加した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で１００分間、混合ホイール上で反応させた。反応混合物に４５μｌのグリシン溶液（２Ｍ，ｐＨ１１）を添加し、音波処理し、１５分間、混合ホイール上で混合した。最後に、遠心、および０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５を含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中への再懸濁により、粒子を２回洗浄した。最後の遠心および再懸濁の工程後に、０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のナトリウムアジドを含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中に、ラテックス粒子（１％の固形分）を保存した。
【０１６１】
４．４  計器アッセイのための試薬Ｒ１およびＲ２の調製：
試薬Ｒ１およびＲ２は、試験からのパッケージ添付文書に記載されたとおりである。Ｒ２試薬は、工程ａ）およびｂ）で合成したＭＰ１およびＭＰ２粒子を混合することにより調製される。試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに充填されている。
【０１６２】
４．５  計器：実施例１を参照
４．６  標準法を用いるＣＲＰアッセイのための手順は実施例１．２と同じである
４．７  ピペッティング計画：実施例１．３のピペッティング計画と同じ
４．８  校正曲線の作成のための条件は実施例１．４と同じである
４．９  本発明の新規方法を用いるＣＲＰアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は、前記の実施例１．２の記載に従って調製された。波長および反応時間を除いて、ＣＲＰ  Ｌ３試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１６３】
４．１０  ピペッティング計画：実施例１．３のピペッティング計画と同じ
４．１１  校正曲線の作成のための条件：
両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：５０５ｎｍを第１波長、８００ｎｍを補正波長、２．８分を第１反応時間として用いた；５７０ｎｍを第２波長、８００ｎｍを補正波長、２．０分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント２２におけるものであり、これは２．８分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１８におけるものであり、これは２．０分の反応時間に対応する。両方の校正曲線を作成するために、対応する濃度範囲をカバーする６つの標準品それぞれを２回反復で、校正タイプとしてスプラインを用いて測定する；これは測定したキャリブレーターの三次多項式により概算したデータポイント間の範囲にフィットし、したがって滑らかな曲線が得られる。両方の校正曲線について標準法（カタログＮｏ．１１３５５２７９）からの６つの標準品を用いた場合、類似の結果が得られた。低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。ＣＲＰの定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。ＣＲＰの閾値は、ＣＲＰについての校正曲線における１０ｍｇ／Ｌの濃度に対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、５０５ｎｍ−８００ｎｍで反応時間２．８分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［５０５ｎｍ−８００ｎｍ，２．８分］）および／または５７０ｎｍ−８００ｎｍで反応時間２．０分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［５７０ｎｍ−８００ｎｍ，２．０分］）。
【０１６４】
５０５ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間２．８分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５０５ｎｍ−８００ｎｍ，２．８分］より低ければ、および／または５７０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間２．０分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５７０ｎｍ−８００ｎｍ，２．０分］より低ければ、それの定量に第１校正曲線を使用する。
【０１６５】
５０５ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間２．８分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５０５ｎｍ−８００ｎｍ，２．８分］を超えれば、および／または５７０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間２．０分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５７０ｎｍ−８００ｎｍ，２．０分］を超えれば、それの定量に第２校正曲線を使用する。その結果、ＣＲＰ決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から１０ｍｇ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および１０ｍｇ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０１６６】
標準法および本発明方法を用いるＣＲＰアッセイの結果：
４．１２  ＬＤＬ、ＵＤＬおよびＣＶの決定：実施例１を参照
４．１３  結果の概要と結論：
図２および表５に示すように、より大きいＭＰ２粒子（２２０ｎｍの代わりに２９０ｎｍ）をより高い抗体装填量（５０ｍｇ／ｇの代わりに６０ｍｇの３６Ｆ１２／ｇ（ラテックス））と共に多重適用法と組み合わせて用いると、標準条件（改変していないＭＰ１およびＭＰ２粒子を含むラテックス試薬；５７０ｎｍの１波長で測定し、８００ｎｍにより補正，２．０分の反応時間）を用いる市販の標準ＣＲＰ  Ｌ３アッセイと比較して、ＬＤＬおよびダイナミックレンジの８倍改善がもたらされる。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の条件は、５０５ｎｍおよび補正波長としての８００ｎｍおよび２．８分の反応時間で記録した第１校正曲線、ならびに５７０ｎｍおよび補正波長としての８００ｎｍおよび２．０分の反応時間で記録した第２校正曲線である。
【０１６７】
【表５】
0006523163.tif 000007
【０１６８】
実施例５：多重適用法と改変した粒子ＭＰ１およびＭＰ２との組合わせアッセイについてのダイナミックレンジのさらなる改善
５．１  さらに、多重適用法と、適合した粒子サイズおよび抗体装填度との組合わせを、リードパラメーターとしてＣＲＰ  Ｌ３アッセイを用いて査定した。ＣＲＰ  Ｌ３アッセイは、EP 0898169に記載される２つの異なるタイプの粒子を含む：高アフィニティー抗体（クローン３６Ｆ１２；ラテックスコーティングに対する濃度：５０ｍｇ／ｇ（ラテックス））でコートした大型ラテックス粒子（ＭＰ２，約２２０ｎｍの直径）、およびより低アフィニティー抗体（クローン２１Ｆ１２，ラテックスコーティングに対する濃度：４５ｍｇ／ｇ（ラテックス））でコートした小型ラテックス粒子（ＭＰ１，約１１０〜１４０ｎｍの直径）。この場合、分析感度を高めるために、より大きいサイズおよび抗体装填度を用いてＭＰ２粒子を改変し、より小さい粒子を用いてＭＰ１粒子を改変し、最終的に、達成できるＬＤＬ、ＵＤＬおよびダイナミックレンジを下記のアッセイで決定した。
【０１６９】
５．２  改変したＭＰ２粒子の合成：
７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中における固形分２％濃度のラテックス粒子（カルボキシレート修飾した微粒子，２９０ｎｍのサイズ）に、３０μｌのスルホ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液および３０μｌのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液を順に添加した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で１時間、混合ホイール上で反応させた。その後、７０ｍｇの抗体３６Ｆ１２／ｇ（ラテックス）を、３７μｌのＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５溶液（１％，ＭＥＳ中）を含有する７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中で、スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化したラテックス粒子と混合した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で２時間、混合ホイール上反応させた。反応混合物に４５μｌのグリシン溶液（２Ｍ，ｐＨ１１）を添加し、音波処理し、１５分間、混合ホイール上で混合した。最後に、遠心、および０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５を含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中への再懸濁により、粒子を２回洗浄した。最後の遠心および再懸濁の工程後に、０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のナトリウムアジドを含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中に、ラテックス粒子（１％の固形分）を保存した。
【０１７０】
５．３  改変したＭＰ１粒子の合成：
７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中における固形分２％濃度のラテックス粒子（カルボキシレート修飾した微粒子，サイズ９０ｎｍ）に、３０μｌのスルホ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液および３０μｌのＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，１００ｍＭ，ＭＥＳ緩衝液中）溶液を順に添加した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で１時間、混合ホイール上で反応させた。その後、５０ｍｇの抗体２１Ｆ１２／ｇ（ラテックス）を、７５０μｌのＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．１）中で、スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化したラテックス粒子と混合した。２０分後、３７μｌのＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５溶液（１％，ＭＥＳ中）を混合物に添加した。反応混合物を短時間、音波処理し、室温で１００分間、混合ホイール上で反応させた。反応混合物に４５μｌのグリシン溶液（２Ｍ，ｐＨ１１）を添加し、音波処理し、１５分間、混合ホイール上で混合した。最後に、遠心、および０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５を含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中への再懸濁により、粒子を２回洗浄した。最後の遠心および再懸濁の工程後に、０．０３％のＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ  Ｐ８５、０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のナトリウムアジドを含有するグリシン（５０ｍＭ，ｐＨ８）中に、ラテックス粒子（１％の固形分）を保存した。
【０１７１】
５．４  計器アッセイのための試薬Ｒ１およびＲ２の調製：
試薬Ｒ１およびＲ２は、試験からのパッケージ添付文書に記載されたとおりである。Ｒ２試薬は、工程ａ）およびｂ）で合成したＭＰ１およびＭＰ２粒子を混合することにより調製される。試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに充填されている。
【０１７２】
５．５  計器：実施例１を参照
５．６  標準法を用いるＣＲＰアッセイのための手順は実施例１．２と同じである
５．７  ピペッティング計画：実施例１．３のピペッティング計画と同じ
５．８  校正曲線の作成のための条件は実施例１．４と同じである
５．９  本発明の新規方法を用いるＣＲＰアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は、前記の実施例１．２に従って調製され、その後ｃｏｂａｓ  ｃパックに充填された：Ｒ１（ＴＲＩＳ緩衝液）およびＲ２（抗ＣＲＰ（マウス）でコートされたラテックス粒子，グリシン緩衝液中）。波長および反応時間を除いて、ＣＲＰ  Ｌ３試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１７３】
５．１０  ピペッティング計画：実施例１．３のピペッティング計画と同じ
５．１１  校正曲線の作成のための条件：
両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：５６４ｎｍを第１波長、８００ｎｍを補正波長、７．１分を第１反応時間として用いた；６６０ｎｍを第２波長、８００ｎｍを補正波長、０．８分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント７におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５０におけるものであり、これは７．１分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント７におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１１におけるものであり、これは０．８分の反応時間に対応する。両方の校正曲線を作成するために、対応する濃度範囲をカバーする６つの標準品それぞれを２回反復で、校正タイプとしてスプラインを用いて測定する；これは測定したキャリブレーターの三次多項式により概算したデータポイント間の範囲にフィットし、したがって滑らかな曲線が得られる。両方の校正曲線について標準法（カタログＮｏ．１１３５５２７９）からの６つの標準品を用いた場合、類似の結果が得られた。
【０１７４】
低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。ＣＲＰの定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。ＣＲＰの閾値は、ＣＲＰについての校正曲線における５０ｍｇ／Ｌの濃度に対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、５４６ｎｍ−８００ｎｍで反応時間７．１分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［５４６ｎｍ−８００ｎｍ，７．１分］）および／または６６０ｎｍ−８００ｎｍで反応時間０．８分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［６６０ｎｍ−８００ｎｍ，０．８分］）。
【０１７５】
５４６ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間７．１分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５４６ｎｍ−８００ｎｍ，７．１分］より低ければ、および／または６６０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間０．８分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［６６０ｎｍ−８００ｎｍ，０．８分］より低ければ、それの定量に第１校正曲線を使用する。
【０１７６】
５４６ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間７．１分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［５４６ｎｍ−８００ｎｍ，７．１分］を超えれば、および／または６６０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間０．８分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［６６０ｎｍ−８００ｎｍ，０．８分］を超えれば、それの定量に第２校正曲線を使用する。その結果、ＣＲＰ決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から５０ｍｇ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および５０ｍｇ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０１７７】
標準法および本発明方法を用いるＣＲＰアッセイの結果：
５．１２  ＬＤＬ、ＵＤＬおよびＣＶの決定：実施例１を参照
５．１３  結果の概要と結論：
図２および表６に示すように、より大きいＭＰ２粒子（２２０ｎｍの代わりに２９０ｎｍ）をより高い抗体装填量（５０ｍｇ／ｇの代わりに７０ｍｇの３６Ｆ１２／ｇ（ラテックス））およびより小さいＭＰ１粒子（１１０〜１４０ｎｍの代わりに９０ｎｍ；ラテックスコンジュゲーション反応のために５０ｍｇの２１Ｆ１２／ｇ（ラテックス））と共に多重適用法と組み合わせて用いると、標準条件（改変していないＭＰ１およびＭＰ２粒子を含むラテックス試薬；５７０ｎｍの１波長で測定し、８００ｎｍにより補正，２．０分の反応時間）を用いる市販の標準ＣＲＰ  Ｌ３アッセイと比較して、それぞれＬＤＬ、ＵＤＬおよびダイナミックレンジの３．０倍、２．３倍および６．９倍改善がもたらされる。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の条件は、５４６ｎｍおよび補正波長としての８００ｎｍおよび７．１分の反応時間で記録した第１校正曲線、ならびに６６０ｎｍおよび補正波長としての８００ｎｍおよび０．８分の反応時間で記録した第２校正曲線である。
【０１７８】
【表６】
0006523163.tif 000008
【０１７９】
実施例６：比色アッセイのダイナミックレンジの決定：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴＬ）
６．１  計器：実施例１を参照
６．２  標準法を用いるＡＬＴＬ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）アッセイのための手順：
Ｒｏｃｈｅのアラニンアミノトランスフェラーゼ試験（ＡＬＴＬ，カタログＮｏ．２０７６４９５７）、すなわち比色アッセイをこの試験のために選択した。酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は、Ｌ−アラニンと２−オキソグルタル酸の間の反応を触媒する。形成されたピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）により触媒される反応でＮＡＤＨにより還元されてＬ−乳酸およびＮＡＤ＋を形成する。ＮＡＤＨ酸化の速度はＡＬＴの触媒活性に正比例し、測光法で測定される。それは吸光度の低下を測定することにより決定される。
【０１８０】
【化２】
0006523163.tif 000009
【０１８１】
すべてのＲｏｃｈｅ試験のための試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに備えられている。これらのカセットは、１〜３つの特別にデザインされた試薬ボトルを収容し、試薬および試験に関連する詳細な情報を含むバーコードラベルを備えている。ＡＬＴＬ試験について、カセットは２つの試薬から構成される：Ｒ１（ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ７．３，Ｌ−アラニン，アルブミン（ウシ），ＬＤＨ（微生物），安定剤および保存剤）およびＲ２（２−オキソグルタル酸，ＮＡＤＨ，添加剤および保存剤）。ＡＬＴＬ試験のパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０１８２】
６．３  ピペッティング計画：
次いで、９μＬの試料および５９μＬのアッセイ試薬Ｒ１を３２μＬの希釈剤（水）で希釈したものを反応セルに添加し、続いて１７μｌの２−オキソグルタル酸およびＮＡＤＨ試薬（Ｒ２）を２０μＬの希釈剤（水）で希釈したものを添加した。その後、すべての反応成分を混合した。
【０１８３】
６．４  校正曲線の作成のための条件：
吸光度の読取りを、主波長としての３４０ｎｍおよび補正波長としての７００ｎｍで実施した。このアッセイタイプは動態Ａアッセイ(kinetic A assay)（速度Ａアッセイ(rate A assay)とも呼ばれる）であった。
【０１８４】
速度アッセイについては、吸光度を時間の関数として反応のタイムコースを追跡する。すなわち、反応の進行に伴なって測定値を取得する。速度アッセイにこれらの測定値を用いる理由は、それらの濃度計算が吸光度の変化速度の測定に基づくからである。速度Ａアッセイは、多重測定ポイントについてプログラムされる。つまり、ある測定ウインドウがあり、このウインドウ内のあらゆる測光測定値−プログラムされた第１測定ポイントにおける読みから始まってプログラムされた第２測定ポイントまでの読み−を速度計算のために考慮に入れる。最小二乗解析により吸光値を吸光度の変化速度に換算する。ＡＬＴＬについて、プログラムされた第１測定ポイント（初期測定ポイント）は測定ポイント１２であり、これは試料および最終試薬を反応セル内にピペッティングした直後（最終試薬添加の６６秒後）を意味する。プログラムされた第２測定ポイント（最終測定ポイント）は測定ポイント３１に取得され、これは４．１分の反応時間に対応する。初期と最終の測定ポイント間のあらゆる読みから信号を計算した。これら２つの測定ポイント間の吸光度の変化速度（傾き）を最小二乗法により計算した。校正曲線の作成のためにＲｏｃｈｅからの２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，カタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られる。
【０１８５】
６．５  本発明によるＡＬＴＬアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は実施例６．２に記載した標準法に用いたものと同じであった。波長および反応時間を除いて、ＡＬＴＬ試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１８６】
６．６  ピペッティング計画：ピペッティング計画６．３と同じ
６．７  校正曲線の作成のための条件：
２つの校正曲線を作成するために２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，ＲｏｃｈｅからのカタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られた。両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：３４０ｎｍを第１波長、８００ｎｍを補正波長、８．５分を第１反応時間として用いた；３７６ｎｍを第２波長、７００ｎｍを補正波長、１．４分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、第１および第２校正曲線の両方について、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント７におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５７におけるものであり、これは８．５分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント７におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１４におけるものであり、これは１．４分の反応時間に対応する。第１および／または第２校正曲線の計算のために他のアッセイタイプ、たとえば動態Ａを用いた場合、類似の結果が得られた。さらに、ここで用いたもの（Ｒｏｃｈｅから販売されるキャリブレーター，カタログＮｏ．１０７５９３５０）以外の標準濃度を用いた場合、ならびにそれぞれの校正曲線の作成のために２より多い標準品、たとえば最大６つの標準品、および２つの校正曲線それぞれについて異なる校正タイプ（たとえば、スプライン）を用いた場合も、類似の結果が達成された。
【０１８７】
低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。ＡＬＴＬの定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。ＡＬＴＬの閾値は、ＡＬＴＬについての校正曲線における２００Ｕ／Ｌに対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、３４０ｎｍ−８００ｎｍで反応時間８．５分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［３４０ｎｍ−８００ｎｍ，８．５分］）および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍで反応時間１．４分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，１．４分］）。
【０１８８】
３４０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間８．５分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−８００ｎｍ，８．５分］より低ければ、および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間１．４分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，１．４分］より低ければ、それの定量に第２校正曲線を使用する。
【０１８９】
３４０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間８．５分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−８００ｎｍ，８．５分］を超えれば、および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間１．４分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，１．４分］を超えれば、それの定量に第１校正曲線を使用する。その結果、ＡＬＴＬ決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から２００Ｕ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および２００Ｕ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０１９０】
標準法および本発明方法を用いるＡＬＴＬアッセイの結果：
６．８  ＬＤＬ／ＵＤＬ／ＣＶの決定：実施例１を参照
６．９  結果の概要と結論：
結果の概要を表７に示す。市販のＲｏｃｈｅのＡＬＴＬ試験への新規方法の適用は、２．９倍の感度（ＬＤＬ，検出下限）増大および４．２倍の検出上限ＵＤＬ拡大を示す。最終的に、ダイナミックレンジは１２．２倍拡大した。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。必要に応じて校正のための標準品の数および／または濃度を適合させるだけでよい。
【０１９１】
【表７】
0006523163.tif 000010
【０１９２】
実施例７：比色アッセイのダイナミックレンジの決定：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴＬ）
７．１  計器：実施例１を参照
７．２  標準法を用いるＡＳＴＬ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）アッセイのための手順：
Ｒｏｃｈｅのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ試験（ＡＳＴＬ，カタログＮｏ．２０７６４９４９）、すなわち比色アッセイをこの試験のために選択した。酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は、Ｌ−アスパラギン酸と２−オキソグルタル酸の間の反応を触媒する。形成されたオキサロ酢酸は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）により触媒される反応でＮＡＤＨにより還元されてＬ−リンゴ酸およびＮＡＤ＋を形成する。ＮＡＤＨ酸化の速度はＡＳＴの触媒活性に正比例し、測光法で測定される。それは吸光度の低下を測定することにより決定される。
【０１９３】
【化３】
0006523163.tif 000011
【０１９４】
すべてのＲｏｃｈｅ試験のための試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに備えられている。これらのカセットは、１〜３つの特別にデザインされた試薬ボトルを収容し、試薬および試験に関連する詳細な情報を含むバーコードラベルを備えている。ＡＳＴＬ試験について、カセットは２つの試薬から構成される：Ｒ１（ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ７．８，Ｌ−アスパラギン酸，アルブミン（ウシ），ＭＤＨ（微生物），ＬＤＨ（微生物），安定剤および保存剤）およびＲ２（２−オキソグルタル酸，ＮＡＤＨ，および保存剤）。ＡＳＴＬ試験のパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０１９５】
７．３  ピペッティング計画：
次いで、９μＬの試料および４０μＬのアッセイ試薬Ｒ１を５１μＬの希釈剤（水）で希釈したものを反応セルに添加し、続いて１７μｌの試薬Ｒ２を２０μＬの希釈剤（水）で希釈したものを添加した。その後、反応混合物を混合した。
【０１９６】
７．４  校正曲線の作成のための条件：
吸光度の読取りを、主波長としての３４０ｎｍおよび補正波長としての７００ｎｍで実施した。このアッセイタイプは動態Ａアッセイ（速度Ａアッセイとも呼ばれる）であった。
【０１９７】
速度アッセイについては、吸光度を時間の関数として測定することにより、反応のタイムコースを追跡する。すなわち、反応の進行に伴なって測定値を取得する。速度アッセイにこれらの測定値を用いる理由は、それらの濃度計算が吸光度の変化速度の決定に基づくからである。速度Ａアッセイは、多重測定ポイントについてプログラムされる。つまり、ある測定ウインドウがあり、このウインドウ内のあらゆる測光測定値−プログラムされた第１測定ポイントにおける読みから始まってプログラムされた第２測定ポイントまでの読み−を速度計算のために考慮に入れる。最小二乗解析により吸光値を吸光度の変化速度に換算する。ＡＬＴＬについて、プログラムされた第１測定ポイント（初期測定ポイント）は測定ポイント１２であり、これは試料および最終試薬を反応セル内にピペッティングした直後（最終試薬添加の６６秒後）を意味する。プログラムされた第２測定ポイント（最終測定ポイント）は測定ポイント３１に取得され、これは４．１分の反応時間に対応する。初期と最終の測定ポイント間のあらゆる読みから信号を計算した。これら２つの測定ポイント間の吸光度の変化速度（傾き）を最小二乗法により計算した。校正曲線を作成するために、Ｒｏｃｈｅからの２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，カタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られる。
【０１９８】
７．５  本発明によるＡＳＴＬアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は実施例７．２に記載した標準法に用いたものと同じであった。波長および反応時間を除いて、ＡＳＴＬ試験からのパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０１９９】
７．６  ピペッティング計画：ピペッティング計画７．３と同じ
７．７  校正曲線の作成のための条件：
２つの校正曲線を作成するために２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，ＲｏｃｈｅからのカタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られた。両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：３４０ｎｍを第１波長、７００ｎｍを補正波長、８．３分を第１反応時間として用いた；３７６ｎｍを第２波長、８００ｎｍを補正波長、１．２分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、第１および第２校正曲線の両方について、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５７におけるものであり、これは８．３分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１４におけるものであり、これは１．２分の反応時間に対応する。第１および／または第２校正曲線の計算のために他のアッセイタイプ、たとえば動態Ａを用いた場合、類似の結果が得られた。さらに、ここで用いたもの（Ｒｏｃｈｅから販売されるキャリブレーター，カタログＮｏ．１０７５９３５０）以外の標準濃度を用いた場合、ならびにそれぞれの校正曲線の作成のために２より多い標準品、たとえば最大６つの標準品、および２つの校正曲線それぞれについて異なる校正タイプ（たとえば、スプライン）を用いた場合も、類似の結果が達成された。
【０２００】
低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。ＡＳＴＬの定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。ＡＳＴＬの閾値は、ＡＳＴＬについての校正曲線における２００Ｕ／Ｌに対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、３４０ｎｍ−７００ｎｍで反応時間８．３分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［３４０ｎｍ−７００ｎｍ，８．３分］）および／または３７６ｎｍ−８００ｎｍで反応時間１．２分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［３７６ｎｍ−８００ｎｍ，１．２分］）。
【０２０１】
３４０ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間８．３分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−７００ｎｍ，８．３分］より低ければ、および／または３７６ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間１．２分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−８００ｎｍ，１．２分］より低ければ、それの定量に第２校正曲線を使用する。
【０２０２】
３４０ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間８．３分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−７００ｎｍ，８．３分］を超えれば、および／または３７６ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間１．２分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−８００ｎｍ，１．２分］を超えれば、それの定量に第１校正曲線を使用する。その結果、ＡＳＴＬ決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から２００Ｕ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および２００Ｕ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０２０３】
標準法および本発明方法を用いるＡＳＴＬアッセイの結果：
７．８  ＬＤＬ／ＵＤＬ／ＣＶの決定：実施例１を参照
７．９  結果の概要と結論：
結果の概要を表８に示す。市販のＲｏｃｈｅのＡＳＴＬ試験への新規方法の適用は、２．２倍の感度（ＬＤＬ，検出下限）増大および３．４倍の検出上限ＵＤＬ拡大を示す。最終的に、ダイナミックレンジは７．５倍拡大した。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。必要に応じて校正のための標準品の数および／または濃度を適合させるだけでよい。
【０２０４】
【表８】
0006523163.tif 000012
【０２０５】
実施例８：比色アッセイのダイナミックレンジの決定：血中尿素窒素（Ｕ−ＢＵＮ）
８．１  計器：実施例１を参照
８．２  標準法を用いるＵ−ＢＵＮ（血中尿素窒素）アッセイのための手順：
Ｒｏｃｈｅの血中尿素窒素試験（ＵＲＥＡＬ，カタログＮｏ．０４４６０７１５）、すなわち比色アッセイをこの試験のために選択した。酵素ウレアーゼは、尿素をウレアーゼの存在下で加水分解して、アンモニアおよび炭酸を形成する。後続の反応でグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）は２−オキソグルタル酸、アンモニアおよびＮＡＤＨの間の反応を触媒して、Ｌ−グルタミン酸およびＮＡＤ＋を形成する。ＮＡＤＨ濃度の低下速度は検体の尿素濃度に正比例し、測光法で測定される。それは吸光度の低下を測定することにより決定される。
【０２０６】
【化４】
0006523163.tif 000013
【０２０７】
すべてのＲｏｃｈｅ試験のための試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに備えられている。これらのカセットは、１〜３つの特別にデザインされた試薬ボトルを収容し、試薬および試験に関連する詳細な情報を含むバーコードラベルを備えている。Ｕ−ＢＵＮ試験について、カセットは２つの試薬から構成される：Ｒ１（ＮａＣｌ  ９％）およびＲ２（ＴＲＩＳ緩衝液，ｐＨ８．６，２−オキソグルタル酸，ＮＡＤＨ，ＡＤＰ，ウレアーゼ（タチナタマメ(jack bean)），ＧＬＤＨ（ウシ肝臓）、非反応性の安定剤および保存剤）。Ｕ−ＢＵＮ試験のパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０２０８】
８．３  ピペッティング計画：
次いで、２μＬの試料および１０μＬのアッセイ試薬Ｒ１を９０μＬの希釈剤（水）で希釈したものを反応セルに添加し、続いて３８μｌの試薬Ｒ２を１１０μＬの希釈剤（水）で希釈したものを添加した。その後、反応成分を混合した。
【０２０９】
８．４  校正曲線の作成のための条件：
吸光度の読取りを、主波長としての３４０ｎｍおよび補正波長としての７００ｎｍで実施した。このアッセイタイプは動態Ａアッセイ（速度Ａアッセイとも呼ばれる）であった。
【０２１０】
速度アッセイについては、吸光度を時間の関数として測定することにより、反応のタイムコースを追跡する。すなわち、反応の進行に伴なって測定値を取得する。速度アッセイにこれらの測定値を用いる理由は、それらの濃度計算が吸光度の変化速度の決定に基づくからである。速度Ａアッセイは、多重測定ポイントについてプログラムされる。つまり、ある測定ウインドウがあり、このウインドウ内のあらゆる測光測定値−プログラムされた第１測定ポイントにおける読みから始まってプログラムされた第２測定ポイントまでの読み−を速度計算のために考慮に入れる。最小二乗解析により吸光値を吸光度の変化速度に換算する。Ｕ−ＢＵＮについて、プログラムされた第１測定ポイント（初期測定ポイント）は測定ポイント１０であり、これは試料および最終試薬を反応セル内にピペッティングした直後（最終試薬添加の４２秒後）を意味する。プログラムされた第２測定ポイント（最終測定ポイント）は測定ポイント１９に取得され、これは１．８分の反応時間に対応する。初期と最終の測定ポイント間のあらゆる読みから信号を計算した。これら２つの測定ポイント間の吸光度の変化速度（傾き）を最小二乗法により計算した。校正曲線を作成するために、Ｒｏｃｈｅからの２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，カタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られる。
【０２１１】
８．５  本発明によるＵ−ＢＵＮアッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は実施例８．２に記載した標準法に用いたものと同じであった。波長および反応時間を除いて、Ｕ−ＢＵＮ（ＵＲＥＡＬ）試験のパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０２１２】
８．６  ピペッティング計画：ピペッティング計画８．３と同じ
８．７  校正曲線の作成のための条件：
２つの校正曲線を作成するために２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，ＲｏｃｈｅからのカタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られた。両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：第１校正曲線には、３４０ｎｍを第１波長、８００ｎｍを補正波長、８．３分を第１反応時間として用いた；第２校正曲線には、３７６ｎｍを第２波長、７００ｎｍを補正波長、１．４分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、第１および第２校正曲線の両方について、実施例１．４に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント５７におけるものであり、これは８．３分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは測定ポイント８におけるものであって最終試薬の添加直後を意味し、第２の読みは測定ポイント１５におけるものであり、これは１．４分の反応時間に対応する。第１および／または第２校正曲線の計算のために他のアッセイタイプ、たとえば動態Ａを用いた場合、類似の結果が得られた。さらに、ここで用いたもの（Ｒｏｃｈｅから販売されるキャリブレーター，カタログＮｏ．１０７５９３５０）以外の標準濃度を用いた場合、ならびにそれぞれの校正曲線の作成のために２より多い標準品、たとえば最大６つの標準品、および２つの校正曲線それぞれについて異なる校正タイプ（たとえば、スプライン）を用いた場合も、類似の結果が達成された。
【０２１３】
低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。Ｕ−ＢＵＮの定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。Ｕ−ＢＵＮの閾値は、Ｕ−ＢＵＮについての校正曲線における１０ｍｍｏｌ／Ｌに対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、３４０ｎｍ−８００ｎｍで反応時間８．３分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［３４０ｎｍ−８００ｎｍ，８．３分］）および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍで反応時間１．４分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，１．４分］）。
【０２１４】
３４０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間８．３分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−８００ｎｍ，８．３分］より低ければ、および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間１．４分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，１．４分］より低ければ、それの定量に第２校正曲線を使用する。
【０２１５】
３４０ｎｍ−８００ｎｍおよび反応時間８．３分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−８００ｎｍ，８．３分］を超えれば、および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間１．４分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，１．４分］を超えれば、それの定量に第１校正曲線を使用する。その結果、Ｕ−ＢＵＮ決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から１０ｍｍｏｌ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および１０ｍｍｏｌ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０２１６】
標準法および本発明方法を用いるＵ−ＢＵＮ（ＵＲＥＡＬ）アッセイの結果：
８．８  ＬＤＬ／ＵＤＬ／ＣＶの決定：実施例１を参照
８．９  結果の概要と結論：
結果の概要を表９に示す。市販のＲｏｃｈｅのＵ−ＢＵＮ試験への新規方法の適用は、２．２倍の感度（ＬＤＬ，検出下限）増大および１．４倍の検出上限ＵＤＬ拡大を示す。最終的に、ダイナミックレンジは３倍拡大した。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。必要に応じて校正のための標準品の数および／または濃度を適合させるだけでよい。
【０２１７】
【表９】
0006523163.tif 000014
【０２１８】
実施例９：比色アッセイのダイナミックレンジの決定：グルコース（Ｇｌｕｃ３）
９．１  計器：実施例１を参照
９．２  標準法を用いるグルコース（Ｇｌｕｃ３）アッセイのための手順：
Ｒｏｃｈｅのグルコース試験（Ｇｌｕｃ３，カタログＮｏ．０４４０４４８３）、すなわち比色アッセイをこの試験のために選択した。酵素ヘキソキナーゼは、グルコースをＡＴＰによりリン酸化してグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）にするのを触媒する。後続の反応において、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）はグルコース−６−リン酸をＮＡＤＰ＋の存在下で酸化し、その結果、グルコン酸−６−リン酸ＮＡＤＰＨを形成する。ＮＡＤＰＨ形成速度は検体のグルコース濃度に正比例し、測光法で測定される。それは吸光度の増大を測定することにより決定される。
【０２１９】
【化５】
0006523163.tif 000015
【０２２０】
すべてのＲｏｃｈｅ試験のための試薬はｃｏｂａｓ  ｃパックに備えられている。これらのカセットは、１〜３つの特別にデザインされた試薬ボトルを収容し、試薬および試験に関連する詳細な情報を含むバーコードラベルを備えている。Ｇｌｕｃ３試験について、カセットは２つの試薬から構成される：Ｒ１（ＭＥＳ緩衝液，ｐＨ６．０，Ｍｇ２＋，ＡＴＰ，ＮＡＤＰおよび保存剤）およびＲ２（ＨＥＰＥＳ緩衝液，ｐＨ８．０，Ｍｇ２＋，ヘキソキナーゼ（酵母），グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（大腸菌(E.coli)）および保存剤）。Ｇｌｕｃ３試験のパッケージ添付文書に記載された手順を標準法として用いた。
【０２２１】
９．３  ピペッティング計画：
次いで、２μＬの試料および２８μＬのアッセイ試薬Ｒ１を１４１μＬの希釈剤（水）で希釈したものを反応セルに添加し、続いて１０μｌの試薬Ｒ２を２０μＬの希釈剤（水）で希釈したものを添加した。その後、反応成分を混合した。
【０２２２】
９．４  校正曲線の作成のための条件：
吸光度の読取りを、主波長としての３４０ｎｍおよび補正波長としての７００ｎｍで実施した。吸光度の読取りを、２つの異なる測定ポイントで実施した。このアッセイタイプは２ポイントエンドアッセイであった。２ポイントエンドアッセイは、試料ブランクを実施するエンドポイントアッセイである。この場合、２つの異なる測定ポイントにおける２つの吸光度の読みを考慮に入れる：第１の読みは通常は最終試薬の添加前または添加直後に取得される；第２の読みは最終試薬の添加後にいずれかの時点で取得される。校正曲線のための、したがって濃度計算のための吸光値は、第１の読みを第２の読みから減算することにより得られる。
【０２２３】
Ｇｌｕｃ３について、第１の読みは測定ポイント６におけるものであって最終試薬の添加直前を意味し、第２の読みは測定ポイント３２におけるものであり、これは５．５分の反応時間に対応する。校正曲線を作成するために２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，ＲｏｃｈｅからのカタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られる。
【０２２４】
９．５  本発明によるＧｌｕｃ３アッセイのための手順：
これらの実験に用いた試薬類は実施例９．２に記載した標準法に用いたものと同じであった。波長および反応時間を除いて、Ｇｌｕｃ３試験のパッケージ添付文書に記載された手順を用いた。
【０２２５】
９．６  ピペッティング計画：ピペッティング計画９．３と同じ
９．７  校正曲線の作成のための条件：
２つの校正曲線を作成するために２つの標準品（標準品１：ブランク測定のための水；標準品２，ＲｏｃｈｅからのカタログＮｏ．１０７５９３５０）を２回反復として線形校正タイプで測定した；これは線形モードにより測定したキャリブレーターのデータポイントにフィットし、したがって線形校正曲線が得られた。両方の校正曲線に最良の条件を前記に従って決定し、下記の結果を得た：第１校正曲線には、３４０ｎｍを第１波長、７００ｎｍを補正波長、８．７分を第１反応時間として用いた；第２校正曲線には、３７６ｎｍを第２波長、８００ｎｍを補正波長、５．５分を第２反応時間として用いた。アッセイタイプは、第１および第２校正曲線の両方について、Ｇｌｕｃ３試験の標準法について既に記載した２ポイントエンドアッセイであった。第１校正曲線について、第１の読取りは測定ポイント６（最終試薬添加の６秒前）で実施され、第２の読取りは測定ポイント５７で実施され、これは８．７分の反応時間に対応する；第２校正曲線について、第１の読みは同様に測定ポイント６におけるものであり、第２の読みは測定ポイント３２におけるものであり、これは５．５分の反応時間に対応する。第１および／または第２校正曲線の計算のために他のアッセイタイプ、たとえば動態Ａを用いた場合、類似の結果が得られた。さらに、ここで用いたもの（Ｒｏｃｈｅから販売されるキャリブレーター，カタログＮｏ．１０７５９３５０）以外の標準濃度を用いた場合、ならびにそれぞれの校正曲線の作成のために２より多い標準品、たとえば最大６つの標準品、および２つの校正曲線それぞれについて異なる校正タイプ（たとえば、スプライン）を用いた場合も、類似の結果が達成された。
【０２２６】
低濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出下限を最大化した第１校正曲線を使用し、高濃度の特定の被検体に最適化してそれにより検出上限を最大化した第２校正曲線を使用する。Ｇｌｕｃ３の定量には、試料の定量すべき被検体含量または対応する吸光度に応じて、第１校正曲線または第２校正曲線のいずれかを選択すべきである。このために、試料の信号を前決定した閾値と比較する。Ｇｌｕｃ３の閾値は、Ｇｌｕｃ３についての校正曲線における１０ｍｍｏｌ／Ｌに対応する２つの吸光値のうちの一方または両方として定めることができる；言い換えると、３４０ｎｍ−７００ｎｍで反応時間８．７分の吸光度（Ａ［λ１，ｔ１］＝Ａ［３４０ｎｍ−７００ｎｍ，８．７分］）および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍで反応時間５．５分の吸光度（Ａ［λ２，ｔ２］＝Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，５．５分］）。
【０２２７】
３４０ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間８．７分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−７００ｎｍ，８．７分］より低ければ、および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間５．５分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，５．５分］より低ければ、それの定量に第１校正曲線を使用する。
【０２２８】
３４０ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間８．７分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３４０ｎｍ−７００ｎｍ，８．７分］を超えれば、および／または３７６ｎｍ−７００ｎｍおよび反応時間５．５分について計算した試料の光信号が前決定した閾値Ａ［３７６ｎｍ−７００ｎｍ，５．５分］を超えれば、それの定量に第２校正曲線を使用する。その結果、Ｇｌｕｃ３決定のための測定範囲をカバーする２つの校正曲線が得られる：０から１０ｍｍｏｌ／Ｌまでの被検体濃度をカバーする第１、および１０ｍｍｏｌ／ＬからＵＤＬまでの範囲をカバーする第２。
【０２２９】
標準法および本発明方法を用いるＧｌｕｃ３アッセイの結果：
９．８  ＬＤＬ／ＵＤＬ／ＣＶの決定：実施例１を参照
９．９  結果の概要と結論：
結果の概要を表１０に示す。市販のＲｏｃｈｅのＧｌｕｃ３試験への新規方法の適用は、１．５倍の感度（ＬＤＬ，検出下限）増大および１．６倍の検出上限ＵＤＬ拡大を示す。最終的に、ダイナミックレンジは２．４倍拡大した。新規方法で得られた精度（ＣＶ）は標準法に匹敵する。新規方法の実施は最小限に抑えられる：この方法の適用には、試薬およびそれらの配合を何ら変更する必要がない。必要に応じて校正のための標準品の数および／または濃度を適合させるだけでよい。
【０２３０】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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