(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の染色体異数性を検出する方法であって、
検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行うことで、すべての染色体を含むシークエンスデータを得ること；
前記シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割することにより、該染色体のカバレッジを計算し、前記染色体の各々の補正前カバレッジを得ること；
前記検出対象妊婦の各ウインドウ中に含まれる固有の配列の数量に対してＺ検定を行ってＺｃｎｖ値を得、さらに得られたＺｃｎｖ値の大きさに基づいて前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得ること、
ここで、前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントは、前記シークエンスデータ中の３００Ｋｂ以上の長さを有するフラグメントであって、当該フラグメントに含まれるすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウのＺｃｎｖ値が４以上であるか、または−４以下であるフラグメントであり；
前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントによる前記染色体の補正前カバレッジに対する影響を利用することにより、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、これにより各染色体の補正後カバレッジを得ること；及び
各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺ検定を行うことによりＺａｎｅｕ値を得、さらにＺａｎｅｕ値の絶対値が３以上であるか否かによって前記染色体が異数性を有するか否かを判定することを含むことを特徴とし、
ここで、前記Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３以上である場合、前記染色体は異数性を有すると判定され、
ここで、前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントによる前記染色体の補正前カバレッジに対する影響は以下のパラメータαによって示され、
【数１】
0006623400.tif 000053
前記式（２）において、ｍは前記コピー数異常染色体フラグメントが存在する染色体の有効配列長であって、単位はＭｂで表され；ｎは前記検出対象妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの長さであって、単位はＭｂで表され；ｃｎは前記妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの出現する回数であり、
前記式（２）において、ｆは前記検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり、且つ前記胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆは５０％未満であり、
ここで、前記染色体の補正前カバレッジに対する補正は、
【数２】
0006623400.tif 000054
を用いて行われ、
式中、
【数３】
0006623400.tif 000055
は各前記染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各前記染色体の補正後染色体カバレッジを示すものである、方法。
【請求項２】
前記シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する形でカバレッジを計算することで、前記染色体の補正前カバレッジを得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
それぞれの前記ウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つの前記ウインドウ間の重複度は５０％であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出対象妊婦の各ウインドウに含まれる固有の配列の数量に対してＺ検定を行ってＺｃｎｖ値を得、さらに得られたＺｃｎｖ値の大きさに基づいて前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得るステップにおいて、
各前記染色体のＧＣ含有量とマッピング率に基づいて前記ウインドウの前記固有の配列の数量について計算を行い、各前記ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジを得ること、及び
前記ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、前記ウインドウの前記固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得て、さらに前記Ｚｃｎｖ値の大小により前記検出対象妊婦が前記コピー数異常染色体フラグメントを有するか否かを判定すること、
前記シークエンスデータ中に３００Ｋｂ以上のフラグメントが存在し、且つ前記３００Ｋｂ以上のフラグメント中のすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウにおける前記固有の配列の数量のＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さい場合、３００Ｋｂ以上のフラグメントが前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントであると判定することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記染色体の補正後カバレッジを用いて各前記染色体に対してＺ検定を行い、Ｚａｎｅｕ値を得るステップにおいて、前記Ｚａｎｅｕ値は
【数４】
0006623400.tif 000056
に従って計算され、そのうち、
【数５】
0006623400.tif 000057
はＬＯＥＳＳアルゴリズムによるものであり、既知の陰性サンプル群によって得られる補正前カバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【数６】
0006623400.tif 000058
の標準偏差であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胎児の染色体異数性を検出する装置であって、シークエンスデータ取得モジュール、第一カバレッジ計算モジュール、Ｚｃｎｖ値計算モジュール、コピー数異常染色体フラグメント検索モジュール、コピー数異常染色体フラグメント認定モジュール、α計算モジュール、補正モジュール、第二カバレッジ計算モジュール、Ｚａｎｅｕ値判定モジュール、染色体異数性認定モジュールを備え、前記シークエンスデータ取得モジュールは、妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行うことで、すべての染色体を含むシークエンスデータを得るためのものであり、前記第一カバレッジ計算モジュールは、前記シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、各前記染色体の補正前カバレッジを得るためのものであり、
前記Ｚｃｎｖ値計算モジュールは、前記検出対象妊婦の前記ウインドウに含まれる固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を計算するためのものであり、
前記コピー数異常染色体フラグメント検索モジュールは、前記シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントであって、且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウの染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４以上であるか、または−４以下であるフラグメントを検索するものであり、
前記コピー数異常染色体フラグメント認定モジュールは、前記シークエンスデータにおける検索により得られる、前記３００Ｋｂ以上のフラグメントで且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウの染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４以上であるか、または−４以下であるフラグメントを検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントとして認定するものであり、
α計算モジュールは、式（２）に示される計算式に従ってパラメータαを計算するものであり、前記パラメータαは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各前記染色体の補正前カバレッジに対する影響であり、
【数７】
0006623400.tif 000059
前記式（２）において、ｍは前記コピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効配列長であり、単位はＭｂである；ｎは前記検出対象妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは前記妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である、ｆは前記検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり、且つ前記胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆは５０％未満であり、前記補正モジュールは、
【数８】
0006623400.tif 000060
を用いて、各前記染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各前記染色体の補正後カバレッジを得るものであり、そのうち、
【数９】
0006623400.tif 000061
は各染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各前記染色体の補正後染色体カバレッジを示している、前記第二カバレッジ計算モジュールは、各前記染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を計算するものであり、前記Ｚａｎｅｕ値判定モジュールは、前記Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きいかを判定するものであり、前記染色体異数性認定モジュールは、前記Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きい場合、前記染色体が異数性を有すると認定するものであることを特徴とする、前記装置。
【請求項７】
前記第一カバレッジ計算モジュールは、前記シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する染色体ウインドウ分割サブモジュール、
前記同じサイズのウインドウの形でカバレッジを計算することで、各前記染色体の補正前カバレッジを得る第一カバレッジ計算サブモジュールを含むことを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記染色体ウインドウ分割サブモジュールにおいて、それぞれの前記ウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つの前記ウインドウの間の重複度は５０％である、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
Ｚｃｎｖ値計算モジュールは、固有の配列カバレッジ計算ユニット、固有の配列Ｚｃｎｖ値計算ユニットを備え、前記固有の配列カバレッジ計算ユニットは、前記各染色体のＧＣ含有量及びマッピング率に基づいて各前記ウインドウの前記固有の配列の数量について計算を行い、前記ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジを得るためのものであり、前記固有の配列Ｚｃｎｖ値計算ユニットは、各前記ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各前記ウインドウの前記固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得るためのものであることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項１０】
前記第二カバレッジ計算モジュールにおいて、
前記Ｚａｎｅｕは
【数１０】
0006623400.tif 000062
に従って計算され、そのうち、
【数１１】
0006623400.tif 000063
はＬＯＥＳＳアルゴリズムにより、既知の陰性サンプル群から得られるカバレッジの値であり、ｓは陰性サンプル群における
【数１２】
0006623400.tif 000064
の標準偏差であることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
【請求項１１】
胎児の染色体異数性を検出するためのキットであり、検出試薬及び検出機器、第一カバレッジ計算機器、Ｚｃｎｖ値計算機器、コピー数異常染色体フラグメント検索機器、コピー数異常染色体フラグメント認定機器、α計算機器、補正機器、第二カバレッジ計算機器、Ｚａｎｅｕ値判定機器、染色体異数性認定機器を備え、前記検出試薬及び検出機器は、検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行うことで、すべての染色体を含むシークエンスデータを得るためのものであり、前記第一カバレッジ計算機器は、前記シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、各前記染色体の補正前カバレッジを得るためのものであり、
前記Ｚｃｎｖ値計算機器は、前記検出対象妊婦の前記ウインドウに含まれる固有の配列の数量を用いてＺ検定を行い、Ｚｃｎｖ値を得るためのものであり、
前記コピー数異常染色体フラグメント検索機器は、前記シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントであって、且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４以上であるか、または−４以下であるフラグメントを検索するものであり、
前記コピー数異常染色体フラグメント認定機器は、前記Ｚｃｎｖ値の大小により前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得るためのものであり、
前記α計算機器は、式（２）に示される計算式に従ってパラメータαを計算するものであり、そのうち、前記パラメータαは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各前記染色体の補正前カバレッジに対する影響である、
【数１３】
0006623400.tif 000065
ｍは前記コピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効配列長であり、単位はＭｂである；ｎは前記検出対象妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは前記妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である、ｆは前記検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり且つ前記胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆは５０％未満であり、前記補正機器は、
【数１４】
0006623400.tif 000066
を用いて、各前記染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各前記染色体の補正後カバレッジを得るものであり、そのうち、
【数１５】
0006623400.tif 000067
は各前記染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各前記染色体の補正後染色体カバレッジを示している、前記第二カバレッジ計算機器は、各前記染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を計算するものであり、前記Ｚａｎｅｕ値判定機器は、前記Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きいか否かを判定するものであり、前記染色体異数性認定機器は、前記Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きい場合、前記染色体が異数性を有すると認定するものであることを特徴とする、前記キット。
【請求項１２】
前記第一カバレッジ計算機器は、前記シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割するための染色体ウインドウ分割部材、前記同じサイズのウインドウの形でカバレッジを計算し、各前記染色体の補正前カバレッジを得る第一カバレッジ計算部材を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記染色体ウインドウ分割部材において、前記ウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つの前記ウインドウの間の重複度は５０％であることを特徴とする、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記固有の配列Ｚｃｎｖ値計算機器は、前記染色体のＧＣ含有量とマッピング率を用いて各前記固有の配列の数量について計算を行い、各前記ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジを得る固有の配列カバレッジ計算部材、及び、各前記ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの前記固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得る固有の配列Ｚｃｎｖ値計算部材を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
前記第二カバレッジ計算機器において、Ｚａｎｅｕは
【数１６】
0006623400.tif 000068
に従って計算され、そのうち、
【数１７】
0006623400.tif 000069
はＬＯＥＳＳアルゴリズムにより、既知の陰性サンプル群により得られる補正前カバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【数１８】
0006623400.tif 000070
の標準偏差であることを特徴とする、前記請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ医薬分野に属し、具体的に言えば、染色体異数性を測定するためのキット、装置及び方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
胎児遊離ＤＮＡ（ｃｆｆ−ＤＮＡ）は１９９７年にＬｏによって発見されてから二十数年になるが、この発見は非侵襲性の出産前診断方法（ＮＩＰＴ）に可能性を提供している。非侵襲性の出産前診断の方法は主に以下の二つの優位性がある：第一に、ＮＩＰＴは流産のリスクを負うことがなく、臨床上において羊水検査及び臍帯穿刺（Ｃｏｒｄｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）などの侵襲的方式によって行われる染色体核型分析は１／２０００の流産リスクがあり、研究により早すぎる臍帯穿刺は胎児の位置の傾斜をもたらす可能性がある。もう一方で、ＮＩＰＴは最も早い場合は妊娠８週目で測定を行うことができ、より早期にリスクを判定することができ、中絶が妊婦にもたらすリスクを低減させることができる。
【０００３】
これらのメリットにより、非侵襲の出産前関連の研究法は日進月歩であり、応用の範囲はますます広くなり、現在の方法例えばＮＩＰＴ胎児染色体異数性検出、ＮＩＰＴ胎児単一遺伝子障害検出、ＮＩＰＴ胎児（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＮＶ）検出、ＮＩＰＴ胎児全ゲノム測定、ＮＩＰＴ胎児親子鑑定などがある。
【０００４】
現在、すべてのＮＩＰＴ応用において、応用がもっとも広く比較的最も成熟しているのは胎児染色体異数性検出である。胎児染色体に対する異数性検出の多くのアルゴリズムにおいて、Ｃｈｕｉが２００８年に発明したハイスループットシーケンシング（ＭＰＳ）法は臨床的に適用されるものであり、頑健性を示している。ダウン症候群について、偽陽性率（ＦＰＲ）は０．４４３％に、偽陰性率（ＦＮＲ）は０．００４％にまで低下する。エドワーズ症候群について、ＦＰＲは０．２２％、ＦＮＲは０．０２５％である。
【０００５】
前記方法は非常に低いエラー率に達しているものの、判定ミスのリスクは依然存在する。そのため、現在の方法に対して改善を行い、測定のエラー率をできるだけ低下させる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願の主な目的は染色体異数性を検出するキット、装置及び方法を提供することで、検出の偽陽性率を低下させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を実現するために、本出願は一方では、染色体異数性を検出する方法を提供するものであり、該方法は以下のステップを含む：妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行うことで、すべての染色体を含むシークエンスデータを得る、前記シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、各染色体の補正前カバレッジを得る、前記検出対象妊婦の各ウインドウ中の固有の配列の数量に対してＺ検定を行い、Ｚｃｎｖ値を得て、さらに前記Ｚｃｎｖ値の大小に基づいて検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得る、前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントはシークエンスデータにおける３００Ｋｂ以上のフラグメントであり、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントであり、検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響を利用することにより、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、これにより各染色体の補正後カバレッジを得る、及び各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体に対してＺ検定を行い、Ｚａｎｅｕ値を得て、さらにＺａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きいか否かによって前記染色体が異数性を有するかを判定する、前記Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きい場合、前記染色体は異数性を有する、そのうち、前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響はパラメータαによって示され、胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝している場合、パラメータαの計算式は式（１）に示す通りである：
【０００８】
【数１】
0006623400.tif 000002
【０００９】
胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝していない場合、パラメータαの計算式は式（２）に示す通りである：
【００１０】
【数２】
0006623400.tif 000003
【００１１】
式（１）及び（２）において、ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは検出対象妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である；式（２）において、ｆは検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり且つ仮に胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆが５０％未満であり、さらに
【００１２】
【数３】
0006623400.tif 000004
を用いて、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行う、そのうち
【００１３】
【数４】
0006623400.tif 000005
は各記染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各染色体の補正後染色体カバレッジを示すものである。
【００１４】
さらに、シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する形でカバレッジを計算することで、各染色体の補正前カバレッジを得る。
【００１５】
さらに、それぞれのウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つのウインドウ間の重複度は５０％である。
【００１６】
さらに、検出対象妊婦の各ウインドウ中の固有の配列の数量に対してＺ検定を行い、Ｚｃｎｖ値を得て、さらにＺｃｎｖ値に基づいて検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得るステップにおいて、前記シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計する、各染色体のＧＣ含有量とマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量について計算を行い、各ウインドウの単一配列の数量の補正前カバレッジを得る、及び各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得て、さらにＺｃｎｖ値の大小により検出対象妊婦がコピー数異常染色体フラグメントを有するか否かを判定する、シークエンスデータ中に３００Ｋｂ以上のフラグメントが存在し、且つ前記３００Ｋｂ以上のフラグメント中のすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウにおける固有の配列の数量のＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さい場合、３００Ｋｂ以上のフラグメントが検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントであると判定する。
【００１７】
さらに、各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体に対してＺ検定を行い、Ｚａｎｅｕ値を得るステップにおいて、Ｚａｎｅｕ値は
【００１８】
【数５】
0006623400.tif 000006
に従って計算され、そのうち、
【００１９】
【数６】
0006623400.tif 000007
はＬＯＥＳＳアルゴリズムによるものであり、既知の陰性サンプル群によって得られる補正前カバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【００２０】
【数７】
0006623400.tif 000008
の標準偏差である。
【００２１】
前記目的を実現するために、本出願は一方において、染色体異数性を検出する装置を提供し、該装置は以下のモジュールを含む：シークエンスデータ取得モジュール、第一カバレッジ計算モジュール、Ｚｃｎｖ値計算モジュール、コピー数異常染色体フラグメント検索モジュール、コピー数異常染色体フラグメント認定モジュール、α第一計算モジュール、α第二計算モジュール、補正モジュール、第二カバレッジ計算モジュール、Ｚａｎｅｕ値判定モジュール、染色体異数性認定モジュール。前記シークエンスデータ取得モジュールは、妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行うことで、すべての染色体を含むシークエンスデータを得るためのものであり、前記第一カバレッジ計算モジュールは、シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、各染色体の補正前カバレッジを得るためのものであり、前記Ｚｃｎｖ値計算モジュールは、検出対象妊婦のウインドウ中の固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を計算するためのものであり、前記コピー数異常染色体フラグメント検索モジュールは、前記シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントを検索するものであり、且つ前記３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントであり、コピー数異常染色体フラグメント認定モジュールは、シークエンスデータにおける検索により得られる３００Ｋｂ以上のフラグメントで且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントを検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントとして認定するものであり、α第一計算モジュールは、胎児が母体のコピー異常フラグメントを遺伝している場合、式（１）に示される計算式に従ってパラメータαを計算するものであり、そのうち、前記パラメータαは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響である。
【００２２】
【数８】
0006623400.tif 000009
ｍはコピー数異常染色体フラグメントが存在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である、α第二計算モジュールは、胎児が母体のコピー数異常の染色体を遺伝していない場合において、式（２）に示す計算式に従って前記パラメータαを計算するものであり、
【００２３】
【数９】
0006623400.tif 000010
ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である、ｆは検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり且つ仮に胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆが５０％未満であり、補正モジュールは、
【００２４】
【数１０】
0006623400.tif 000011
を用いて、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得るものであり、そのうち、
【００２５】
【数１１】
0006623400.tif 000012
は各染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各染色体の補正後染色体カバレッジを示している、第二カバレッジ計算モジュールは、各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を計算するものであり、Ｚａｎｅｕ値判定モジュールは、Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きいかを判定するものであり、染色体異数性認定モジュールは、Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きい場合、染色体が異数性を有すると認定するものである。
【００２６】
さらに、第一カバレッジ計算モジュールは、シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する染色体ウインドウ分割サブモジュール、同じサイズのウインドウの形でカバレッジを計算することで、各染色体の補正前カバレッジを得る第一カバレッジ計算サブモジュールを含む。
【００２７】
染色体ウインドウ分割サブモジュールにおいて、それぞれのウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つのウインドウの間の重複度は５０％である。
【００２８】
さらに、固有の配列計算モジュールは、固有の配列統計ユニット、固有の配列カバレッジ計算ユニット、固有の配列Ｚｃｎｖ値計算ユニットを備え、固有の配列統計ユニットは、シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計するためのものであり、固有の配列カバレッジ計算ユニットは、各染色体のＧＣ含有量及びマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量について計算を行い、ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジを得るためのものであり、固有の配列Ｚｃｎｖ値計算ユニットは、各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得るためのものである。
【００２９】
さらに、第二カバレッジ計算モジュールにおいて、Ｚａｎｅｕは
【００３０】
【数１２】
0006623400.tif 000013
に従って計算され、そのうち、
【００３１】
【数１３】
0006623400.tif 000014
はＬＯＥＳＳアルゴリズムにより、既知の陰性サンプル群から得られるカバレッジ値であり、ｓは陰性サンプル群における
【００３２】
【数１４】
0006623400.tif 000015
の標準偏差である。
【００３３】
本発明はもう一方において、染色体異数性を検出するためのキットを提供し、該キットは検出試薬及び検出機器、第一カバレッジ計算機器、Ｚｃｎｖ値計算機器、コピー数異常染色体フラグメント検索機器、コピー数異常染色体フラグメント認定機器、α第一計算機器、α第二計算機器、補正機器、第二カバレッジ計算機器、Ｚａｎｅｕ値判定機器、染色体異数性認定機器を備え、検出試薬及び検出機器は、検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行うことで、すべての染色体を含むシークエンスデータを得るためのものであり、第一カバレッジ計算機器は、シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、各染色体の補正前カバレッジを得るためのものであり、Ｚｃｎｖ値計算機器は、検出対象妊婦の前記ウインドウ中の固有の配列の数量を用いてＺ検定を行い、Ｚｃｎｖ値を得るためのものであり、コピー数異常染色体フラグメント検索機器は、シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントを検索するものであり、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントであり、コピー数異常染色体フラグメント認定機器は、Ｚｃｎｖ値の大小により検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得るためのものであり、α第一計算機器は、胎児が母体の前記コピー異常フラグメントを遺伝している場合、式（１）に示される計算式に従ってパラメータαを計算するものであり、そのうち、パラメータαは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響である、
【００３４】
【数１５】
0006623400.tif 000016
ｍはコピー数異常染色体フラグメントが存在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは検出対象妊婦の前記コピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である、α第二計算機器は、胎児が母体のコピー数異常の染色体を遺伝していない場合において、式（２）に示す計算式に従ってパラメータαを計算するものであり、
【００３５】
【数１６】
0006623400.tif 000017
ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である、ｆは検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり且つ仮に胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆが５０％未満であり、補正機器は、
【００３６】
【数１７】
0006623400.tif 000018
を用いて、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得るものであり、そのうち、
【００３７】
【数１８】
0006623400.tif 000019
は各染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各染色体の補正後染色体カバレッジを示している、
第二カバレッジ計算機器は、各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を計算するものであり、
Ｚａｎｅｕ値判定機器は、Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きいか否かを判定するものであり、
染色体異数性認定機器は、Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しくもしくはそれより大きい場合、染色体が異数性を有すると認定するものである。
【００３８】
さらに、第一カバレッジ計算機器は、シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割するための染色体ウインドウ分割部材、同じサイズのウインドウの形でカバレッジを計算し、各染色体の補正前カバレッジを得る第一カバレッジ計算部材を含む。
【００３９】
さらに、染色体ウインドウ分割部材において、ウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つのウインドウの間の重複度は５０％である。
【００４０】
さらに、固有の配列Ｚｃｎｖ値計算機器は、シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度により、各ウインドウの固有の配列の数量を統計する固有の配列統計部材、染色体のＧＣ含有量とマッピング率を用いて各前記固有の配列の数量について計算を行い、各ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジを得る固有の配列カバレッジ計算部材、
各ウインドウの前記固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得る固有の配列Ｚｃｎｖ値計算部材を含む。さらに、第二カバレッジ計算機器において、Ｚａｎｅｕは
【００４１】
【数１９】
0006623400.tif 000020
に従って計算され、そのうち、
【００４２】
【数２０】
0006623400.tif 000021
はＬＯＥＳＳアルゴリズムにより、既知の陰性サンプル群により得られる補正前カバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【００４３】
【数２１】
0006623400.tif 000022
の標準偏差である。
【発明の効果】
【００４４】
本出願の技術構成を用いて、母体染色体上に存在する特定サイズのコピー数異常染色体フラグメントをスクリーニングし、さらに染色体に異数性が存在するかを判定し、該母体のコピー数異常染色体フラグメントによる各染色体のカバレッジに対する影響を除去することにより、各染色体の補正後のカバレッジを得て、本出願の補正後のカバレッジの計算及び判定により得られた染色体異数性の結果はより正確である。
【００４５】
本出願の一部となる図面を用いて本出願に対してさらに理解を深め、本出願の例示的実施例及びその説明を本出願の解釈に用いるが、これらは本出願を不当に限定するものではない。図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本出願の典型的な実施形態における染色体異数性を測定する方法のフロー模式図である。
【図２】本出願の典型的な実施形態における染色体異数性の検出装置の構造模式図である。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃはそれぞれ本出願の実施例１の１３号染色体、１８号染色体及び２１号染色体異数性検出の補正結果の模式図である。
【図４】本出願の実施例２のサンプルＥＫ０１８７５及びＢＤ０１４６２の２１号染色体上における異数性の補正結果の模式図である。
【図５】本出願の実施例３のサンプルＥＫ０１８７５の２１号染色体の異数性検出の補正結果の模式図である。
【図６】本出願の実施例４のサンプルＢＤ０１４６２の２１号染色体異数性検出の補正結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
説明すべきことは、矛盾しない前提下において、本出願の実施例及び実施例中の特徴は互いに組み合わせることができる。以下において実施例を参照しながら本出願を説明する。
【００４８】
本出願中において、ＺｃｎｖまたはＺａｎｅｕは統計学中のＺ検定の計算値であり、大量サンプル（即ちサンプル容量が３０より多い）の平均値差異性検出に用いられる方法である。それは標準正規分布の理論により差異発生の確率を推測することで、二つの平均数の差異が顕著かを比較するものである。
【００４９】
マッピング率とはウインドウ内のシーケンス配列をゲノム参照配列上にマッピングした場合の比率である。シーケンス配列は同時にゲノム参照配列上の複数の位置にマッピングでき、唯一の配列ではない可能性があり、そのためウインドウ内のマッピング率は単一配列のマッピング率より大きいものである。
【００５０】
説明しておきたいことは、本出願の出願人は従来の方法を用いて大量に分析を行ったところ、少なくとも以下三種類のＮＩＰＴ判定ミスに繋がる可能性が存在することを発見した。
【００５１】
まず、Ｌｏは１９９８年にｃｆｆ−ＤＮＡが胎盤に由来することを発見しているが、これは胎盤モザイク（ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍｏｓａｉｃｉｓｍ：ＣＰＭ））が出現した際、我々はＮＩＰＴの結果により胎児の状況を正確に予測することができず、結果が正確性を失いやすいことを意味している。次に、妊婦自身に一定のＣＮＶが存在する場合、ＭＰＳに基づいてカバレッジを統計することにより、Ｚ値に変換する方法は正確性に欠ける。妊婦に重複フラグメントが存在する場合、染色体上にマッピングした場合対応する固有の配列数が多くなり、カバレッジの向上によりＺ値が大きくなり、偽陽性のリスクが大きくなる。逆に、妊婦にフラグメントの欠失が存在する場合、Ｚ値が低下し、偽陰性のリスクが大きくなる。以前の研究でもわかるように、胎盤にモザイク（ＣＰＭ）が出現し及び妊婦コピー数フラグメント異常（ＣＮＶ）が出現することは、偽陽性判定の重要な原因となる。最後に、染色体カバレッジの計算またはＧＣ含有量を利用したカバレッジ補正プロセスにはデータ変動が生じ、これにより誤差が生じる場合がある。
【００５２】
そのため、前記判定ミスの原因に対して総合的に分析した上で、本出願は染色体異数性を測定する方法を提供し、図１に示すように、該方法は以下のステップを含む：検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行い、すべての染色体を含むシークエンスデータを得る。シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、各染色体の補正前カバレッジを得る。検出対象妊婦の各ウインドウにおける固有の配列の数量のＺｃｎｖ値について計算を行い、さらにＺｃｎｖデータの大小により検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得る。検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントとは、シークエンスデータ中の３００Ｋｂ以上のフラグメントである。さらに３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいのである。検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響を利用して、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得る。及び各染色体の補正後カバレッジを用いて、各染色体のＺａｎｅｕ値を計算し、さらにＺａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きいかによって染色体が異数性を有するかを判定する。Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きい場合、染色体は異数性である。そのうち、検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響をパラメータαで表示し、胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝した場合、パラメータαの計算式は式（１）に示す通りである：
【００５３】
【数２２】
0006623400.tif 000023
胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝していない場合、パラメータαの計算式は式（２）に示す通りである：
【００５４】
【数２３】
0006623400.tif 000024
式（１）及び式（２）において、ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さを示すものであり、単位はＭｂである。ｎは検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さを示し、単位はＭｂである。ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である。式（２）において、ｆは検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり、且つ仮に胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆが５０％未満の場合、
【００５５】
【数２４】
0006623400.tif 000025
を利用して、各染色体のカバレッジに対して補正を行い、そのうち、
【００５６】
【数２５】
0006623400.tif 000026
は各染色体の補正前カバレッジであり、ｘ'は各染色体の補正後の染色体カバレッジである。
【００５７】
本出願の前記方法は、従来技術と同じように、シークエンスデータ中の母体にコピー数異常染色体フラグメントを直接除去して考慮しないではなく、母体染色体上に存在する特定サイズのコピー数異常染色体フラグメントをスクリーニングし、さらに染色体に異数性が存在するか否かを判定する際において、コピー数異常染色体フラグメントの各染色体のカバレッジに対する影響を除き、これにより染色体補正後のカバレッジを得て、これにより本出願の方法により測定される染色体異数性の結果はより正確である。
【００５８】
本出願の前記方法において、前記検出対象妊婦由来の末梢血の遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆの計算方法は本分野の通常の計算方法である。例えば、胎児が男性で、且つコピー数異常染色体フラグメントがＸ染色体にある場合、胎児遊離ＤＮＡの濃度は
【００５９】
【数２６】
0006623400.tif 000027
によって計算され、そのうち、
【００６０】
【数２７】
0006623400.tif 000028
はＸ染色体上のウインドウ平均固有の配列及びすべてのウインドウ平均固有の配列の比であり、コピー数異常染色体フラグメントが２１、１８または１３号染色体にある場合、胎児遊離ＤＮＡの濃度は
【００６１】
【数２８】
0006623400.tif 000029
によって計算され、そのうち、
【００６２】
【数２９】
0006623400.tif 000030
は２１、１８または１３号染色体のウインドウの平均固有の配列数及びすべてのウインドウの平均固有の配列数の比である。胎児が女性である場合、妊婦由来の末梢血の遊離ＤＮＡに対して特定遺伝子のメチル化測定を行う。その原理は以下である：特定の遺伝子の妊婦ＤＮＡ中及び胎児ＤＮＡ中におけるメチル化の形は異なるものである。例えば、胎児と胎盤由来のＲＡＳＳＦ１Ａ（３号染色体上）遺伝子は高度にメチル化されたものであり、母体自身由来のＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子は非メチル化されたものであり、メチル化感受性酵素、例えＨｈａＩ、ＢｓｔＵＩ（３０Ｕ）及びＨｐａＩＩを用いてｃｆｆＤＮＡを処理することで、非メチル化の遺伝子は消化されるが、メチル化された遺伝子は消化されなく、これによりＱ−ＰＣＲによって胎児ｃｆｆＤＮＡの含有量の測定を行うことができる。具体的なステップは以下の文献を参照できる：ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ９：７１−７（２０１４），Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ：Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ。
【００６３】
本出願の前記方法において、各染色体の補正前カバレッジに対して計算を行う場合、染色体をウインドウに分割する形で計算を行うことで、相対的に安定的な染色体カバレッジを得ることができる。そのため、本出願の好ましい実施例において、シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、これにより染色体の補正前カバレッジを得る。
【００６４】
本出願のさらに好しい実施例において、ウインドウに分割した形でカバレッジを計算し、それぞれのウインドウのサイズは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つのウインドウ間の重複度は５０％である。それぞれのウインドウのサイズを１００Ｋｂに制御してさらに隣り合う二つのウインドウ間の重複度を５０％に制御することで、相対的に安定的な染色体カバレッジが得られるだけでなく、さらにウインドウ間の重複度を向上させることでコピー数異常染色体フラグメントの正確度を向上させることができ、これにより妊婦コピー数異常染色体フラグメントの検出効率を向上させることができる。
【００６５】
本出願の前記方法において、通常のコピー数異常染色体フラグメントを計算する方法とステップに基づいて、シークエンスデータ品質または検出精度の違いにより、適宜コピー数異常染色体フラグメントが満たす条件を調整することで得られるようにする。本出願の好ましい実施例において、検出対象妊婦の各ウインドウ中の固有の配列数のＺｃｎｖ値に対して計算を行い、さらにＺｃｎｖ値により妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを得るステップは以下を含む：シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計する。各染色体のＧＣ含有量及びマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量について計算を行い、各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジを得る。及び各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得て、さらにＺｃｎｖ値の大小のフラグメントにより検出対象妊婦がコピー数異常染色体フラグメントを有するか判定する。シークエンスデータ中に３００Ｋｂ以上のフラグメントが存在し、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメント中のすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さい場合、３００Ｋｂ以上のフラグメントは検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントとする。
【００６６】
本出願の前記各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得るステップにおいて、標準化処理は各ウインドウの固有の配列の数量の補正値に対して、（ｘ−ｕ）／ｓｄ（ｘ−ｕ）を行い、そのうちｘが補正後の値で、ｕはｘの平均値であり、ｓｄは標準偏差である。前記検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを測定するステップにおいて、「少なくとも３００Ｋｂの領域及び該領域中の８０％のウインドウのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さい」という条件に設定することで、本出願の前記検出ステップは信頼度の高い妊婦コピー数異常染色体フラグメントを検出することができ、さらにこれらのコピー数異常染色体フラグメントを利用してその所在する染色体のＺｃｎｖ値に対して補正を行うことで、妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの測定結果のエラーにより偽陰性の判定となることを回避できる。
【００６７】
本出願の前記方法において、各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体に対してＺ検出を行い、Ｚａｎｅｕ値を得るステップにおいて、Ｚａｎｅｕ値は
【００６８】
【数３０】
0006623400.tif 000031
によって計算され、そのうち、
【００６９】
【数３１】
0006623400.tif 000032
はＬＯＥＳＳアルゴリズムにより、既知の陰性サンプル群により得られるカバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【００７０】
【数３２】
0006623400.tif 000033
の標準偏差である。前記式の計算により得られる補正後のＺａｎｅｕ値は染色体異数性をより正確に反応することができ、これにより測定結果はより正確となる。
【００７１】
本出願のもう一つの典型的な実施形態において、染色体異数性を検出する装置を提供し、図２に示すように、該装置は以下のモジュールを含む：シークエンスデータ測定モジュール：検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシーケンシングを行い、これにより染色体のシークエンスデータが得られる。第一カバレッジ計算モジュール：シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、これにより各染色体の補正前カバレッジが得られる。Ｚｃｎｖ値計算モジュール：検出対象妊婦の各ウインドウ中の固有の配列の数量のＺｃｎｖ値に対して計算を行う。コピー数異常染色体フラグメント検索モジュール：シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントを検索するものであり、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいものである。コピー数異常染色体フラグメント決定モジュール：シークエンスデータから検索により得られる３００Ｋｂ以上のフラグメントですべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントを検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントとする。α第一計算モジュール：胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝している状況において、式（１）に示す計算式によりパラメータαを計算し、そのうち、パラメータαは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響である。ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである。ｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである。ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントが出現する回数である。
【００７２】
【数３３】
0006623400.tif 000034
【００７３】
α第二計算モジュール：胎児が母体のコピー数異常染色体を遺伝していない場合、式（２）に示す計算式でパラメータαを計算し、ｍはコピー数異常染色体フラグメントの染色体における有効長さであり、単位はＭｂである。ｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである。ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現回数である。ｆは検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度であり、且つ胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆは５０％未満である。
【００７４】
【数３４】
0006623400.tif 000035
【００７５】
補正モジュール：
【００７６】
【数３５】
0006623400.tif 000036
を用いて、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得る、そのうち、
【００７７】
【数３６】
0006623400.tif 000037
は染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各染色体の補正後の染色体カバレッジを示している。第二カバレッジ計算モジュール：各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を得る。Ｚａｎｅｕ値判定モジュール：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きいかを判定する。染色体異数性認定モジュール：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きい場合において、染色体が異数性を有すると認定する。
【００７８】
本出願の前記装置において、コピー数異常染色体フラグメント検索モジュール、コピー数異常染色体フラグメント認定モジュール及び補正モジュールを追加し、本出願は母体の染色体上に存在する少なくとも３００Ｋｂの領域で該領域中の８０％のウインドウのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントをスクリーニングすることにより本出願の前記装置は信頼できる妊婦コピー数異常染色体フラグメントを検出し、さらにこれらのコピー数異常染色体フラグメントをその所在する染色体のＺ検定値に対して補正を行い、さらに妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの検出結果の間違いによって偽陰性の判定となることを回避できる。補正モジュールにより、該コピー数異常染色体フラグメントの各染色体のカバレッジに対する影響について補正を行い、これにより本出願の染色体異数性認定モジュールにより染色体異数性の認定結果をより正確にする。本出願の前記装置の補正モジュールにおいて、パラメータαの計算式中の胎児濃度は本分野の通常の計算方法であり、具体的には前記の通りであり、ここでは詳しく説明しない。
【００７９】
説明しなければならないことは、本出願の前記モジュールは装置の一部として一つの計算端末で稼働することができ、該計算機端末が提供するプロセッサにより前記シークエンスデータ検出モジュール、第一カバレッジ計算モジュール、固有の配列計算モジュール、コピー数異常染色体フラグメント検索モジュール、コピー数異常染色体フラグメント認定モジュール、α第一計算モジュール、α第二計算モジュール、補正モジュール、第二カバレッジ計算モジュール及び染色体異数性認定モジュールにより実現する技術構成であり、明らかにわかるように該計算機端末はハードウェアが実現する設備であり、プロセッサはプログラムを実行するためのハードウェア装置である。且つ本出願が提供する前記各機能性サブモジュールは移動端末、計算機端末または類似の計算装置中で稼働でき、記録媒体の一部として記憶することもできる。
【００８０】
本出願の前記装置において、前記第一カバレッジ計算モジュールは本分野の通常の計算モジュールに基づいて、シークエンスデータの違いにより適宜調整することで得られるものである。本出願の好ましい実施例において、前記第一カバレッジ計算モジュールは以下を含む：染色体ウインドウ分割サブモジュール：シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する；第一カバレッジ計算サブモジュール：同じサイズのウインドウの形でカバレッジを計算し、これにより各染色体の補正前カバレッジを得る。本出願の染色体ウインドウ分割サブモジュール及び第一カバレッジ計算サブモジュールの第一カバレッジ計算モジュールを用いて同じサイズのウインドウに分割する形で計算を行い、これにより比較的安定的なカバレッジを得ることができる。
【００８１】
本出願のより好ましい実施例において、前記染色体ウインドウ分割サブモジュールにおいて、それぞれのウインドウの大きさは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つのウインドウの間の重複度は５０％である。それぞれのウインドウを１００Ｋｂの大きさに分割する形で計算する計算モジュールは比較的安定的なカバレッジを得ることができ、もう一方ではウインドウ間のカバレッジを向上することでコピー数異常染色体フラグメントの精密度を向上させ、さらには妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの検出効率を向上させることができる。
【００８２】
本出願の前記装置において、固有の配列計算モジュールは通常の計算モジュールで得ることができる。本出願の好ましい実施例において、前記固有の配列計算モジュールはさらに以下を含む：固有の配列統計ユニット：シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計する；固有の配列のカバレッジ計算ユニット：各染色体のＧＣ含有量及びマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量について補正を行い、各ウインドウの固有の配列の数量の補正値を得る；固有の配列Ｚｃｎｖ値計算ユニット：各ウインドウの固有の配列の数量の補正値に対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得る。
【００８３】
本出願の前記固有の配列の計算モジュールは、まず固有の配列統計ユニットにより、シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計し、それから固有の配列カバレッジ計算ユニットを実行し、各染色体のＧＣ含有量とマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量について計算を行い、各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジを得て、それから固有の配列Ｚｃｎｖ値計算サブユニットを実行し、各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジについて標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得る。前記ユニットは本分野の通常の計算ユニットに基づいて適宜調整したものであり、これはコピー数異常染色体フラグメント検索モジュールで検索及びコピー数異常染色体フラグメント認定モジュールで認定を行う根拠及び前提であり、これは検出対象サンプル中の母体ＤＮＡコピー数異常染色体フラグメントの存在の正確な認定に根拠を提供している。
【００８４】
本出願の前記装置において、第二カバレッジ計算モジュールにおいて、Ｚａｎｅｕは
【００８５】
【数３７】
0006623400.tif 000038
によって計算され、そのうち、
【００８６】
【数３８】
0006623400.tif 000039
はＬＯＥＳＳアルゴリズムによるもので、既知の陰性サンプル群により得られる補正前のカバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【００８７】
【数３９】
0006623400.tif 000040
の標準偏差である。前記式の計算により得られる補正後のＺａｎｅｕ値はより正確に染色体異数性を反映することができ、これにより検出結果はより正確である。
【００８８】
本出願のもう一つの典型的な実施形態において、さらに染色体異数性を検出するキットを提供し、キットは以下を含む：シークエンスデータ取得機器：検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシークエンシングを行い、これによりすべての染色体を含むシークエンスデータを得る；第一カバレッジ計算機器：シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、これにより各染色体の補正前カバレッジを得る；Ｚｃｎｖ値計算機器：検出対象妊婦の各ウインドウ中の単一配列の数量のＺｃｎｖ値に対して計算を行う；コピー数異常染色体フラグメント検索機器：シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントを検索し、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントであり、コピー数異常染色体フラグメント認定機器：シークエンスデータ中から検索される３００Ｋｂ以上のフラグメントで且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントは検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントである；α第一計算機器：胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝している場合において、式（１）に示される計算式でパラメータαを計算し、そのうち、パラメータαは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体の補正前カバレッジに対する影響である；ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントが出現する回数である；
【００８９】
【数４０】
0006623400.tif 000041
α第二計算機器：胎児が母体のコピー数異常染色体を遺伝していない場合、式（２）に示されるようにパラメータαを計算し、ｍはコピー数異常染色体フラグメントが所在する染色体の有効長さであり、単位はＭｂである；ｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの長さであり、単位はＭｂである；ｃｎは妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの出現する回数である；ｆは検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに含まれる胎児遊離ＤＮＡの濃度を示し且つ仮に胎児遊離ＤＮＡの濃度ｆは５０％未満である；
【００９０】
【数４１】
0006623400.tif 000042
補正機器：
【００９１】
【数４２】
0006623400.tif 000043
を用いて各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得る、そのうち、
【００９２】
【数４３】
0006623400.tif 000044
は各染色体の補正前カバレッジを示し、ｘ'は各染色体の補正後の染色体カバレッジを示す；第二カバレッジ計算機器：各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を得る；Ｚａｎｅｕ値判定機器：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きいかを判定する；染色体異数性第一認定機器：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きい場合、染色体が異数性を有すると認定する。
【００９３】
本出願の前記キットは、コピー数異常染色体フラグメント検索機器、コピー数異常染色体フラグメント認定機器及び補正機器を追加し、本出願は母体染色体上に存在する少なくとも３００Ｋｂの領域で且つ該領域中の８０％のウインドウのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントであり、これにより本出願の前記キットは信頼できる妊婦コピー数異常染色体フラグメントを検出することができ、さらにこれらのコピー数異常染色体フラグメントを用いてその所在する染色体のＺｃｎｖ値に対して補正を行うことで、妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの測定結果の間違いにより偽陰性となる判定を回避できる。補正機器により該コピー数異常染色体フラグメントの各染色体のカバレッジに対する影響に対して補正を行い、これにより本出願の染色体異数性認定機器により染色体異数性の認定結果をより正確にする。本出願の前記キットの補正機器において、パラメータαの計算式中の胎児濃度は本分野の通常の計算方法であり、具体的には前記の通りであり、ここでは再度説明しない。
【００９４】
説明したいことは、本出願の前記部材、部品は機器の一部として一つの計算端末で稼働することができ、該計算機端末が提供するプロセッサを用いて前記シークエンスデータ検出機器、第一カバレッジ計算機器、固有の配列計算機器、コピー数異常染色体フラグメント検索機器、コピー数異常染色体フラグメント認定機器、α第一計算機器、α第二計算機器、補正機器、第二カバレッジ計算機器及び染色体異数性認定機器により実現する技術構成であり、明らかなように、該計算機端末はハードウェアで実現する設備であり、プロセッサはプログラムの実行に用いるハードウエアキットである。さらに、本出願が提供する前記各機能サブ機器は移動端末、計算機端末または類似の演算キット中で実行でき、記憶媒体の一部としても記憶することもできる。
【００９５】
本出願の前記キットにおいて、前記第一カバレッジ計算機器は、本分野の通常の計算機器に、シークエンスデータの違いにより適切に調整することで得られるものである。本出願の好ましい実施例において、前記第一カバレッジ計算機器は以下を含む：染色体ウインドウ分割サブ機器：シークエンスデータ中のすべての染色体を同じサイズのウインドウに分割する；第一カバレッジ計算サブ機器：同じサイズのウインドウの形でカバレッジを計算することで、各染色体の補正前カバレッジを得る。本出願の染色体ウインドウ分割サブ機器及び第一カバレッジ計算サブモジュールの第一カバレッジ計算モジュールを同じサイズのウインドウに分割する形で計算を行うことで、比較的安定的なカバレッジを得ることに有利である。
【００９６】
本出願のさらなる実施例において、前記染色体ウインドウ分割サブモジュールにおいて、それぞれのウインドウの大きさは１００Ｋｂであり、且つ隣り合う二つのウインドウの間の重複度は５０％である。それぞれのウインドウを１００Ｋｂの大きさに分割する形で計算を行う計算機器は相対的に安定的なカバレッジを得ることができ、もう一方ではウインドウ間のカバレッジを増加させることでコピー数異常染色体フラグメントの精密度を向上させることができ、これにより妊婦コピー数異常染色体フラグメントの検出効率を向上させることができる。
【００９７】
本出願の前記キットにおいて、固有の配列計算機器は通常の計算機器を用いることで得られる。本出願の好ましい実施例において、前記固有の配列計算機器は以下を含む：固有の配列統計ユニット：シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計する；固有の配列のカバレッジ計算ユニット：各染色体のＧＣ含有量及びマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量について計算を行い、各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジを得る；固有の配列Ｚｃｎｖ値計算モジュール：各ウインドウの固有の配列の数量の補正前カバレッジに対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列のＺｃｎｖ値を得る。
【００９８】
本出願の前記固有の配列計算機器は、まず固有の配列統計ユニットを稼働させることで、シークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計でき、それから固有の配列カバレッジ計算モジュールを実行し、各染色体のＧＣ含有量とマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量に対して補正を行い、各ウインドウの固有の配列の数量の補正値を得て、それから固有の配列Ｚｃｎｖ値計算サブユニットを実行し、各ウインドウの固有の配列の数量の補正値に対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得る。前記ユニットは本分野の通常の計算及び補正ユニットに基づいて適切に調整を行うものであり、コピー数異常染色体フラグメント検索装置に対して検索及びコピー数異常染色体フラグメント認定機器について認定する根拠と前提であり、正確に検出対象サンプル中の母体ＤＮＡコピー数異常染色体フラグメントの存在に根拠を提供する。
【００９９】
本出願の前記キットにおいて、第二カバレッジ計算機器において、Ｚａｎｅｕ値は
【０１００】
【数４４】
0006623400.tif 000045
によって計算され、そのうち、
【０１０１】
【数４５】
0006623400.tif 000046
はＬＯＥＳＳアルゴリズムであり、陰性サンプル群により得られる補正前カバレッジであり、ｓは陰性サンプル群における
【０１０２】
【数４６】
0006623400.tif 000047
の標準差である。前記式の計算により得られる補正後のＺａｎｅｕ値は、より正確に染色体異数性を反映することができ、検出結果はより正確である。
【０１０３】
以下に具体的な実施例を参照しながら本出願の有益な効果について説明する。
【実施例１】
【０１０４】
本出願の妊婦コピー数異常染色体フラグメント補正における染色体異数性検出に対する補正効果を測定するために、本実施例はポアソン分布に基づいて妊婦のシミュレーションデータを生成し、該シミュレーションデータにおいて、それぞれ単独に１３、１８及び２１号染色体に定量のコピー数異常染色体フラグメントを添加し、コピー数異常染色体フラグメントのサイズは０．５Ｍｂ〜５Ｍｂ、歩長は０．２５Ｍｂである。それから、コピー数異常染色体フラグメントを含むシミュレーションデータ中に３種類の異なる濃度の健常人ＤＮＡ（５％、１０％、１５％）をそれぞれ混入する。全体のプロセスは異なる胎児濃度下において、異なるコピー数異常染色体フラグメントサイズの１３、１８及び２１号染色体カバレッジに対する影響をシミュレーションするものであり、さらにこれにより妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの染色体異数性検出の補正効果を検出する。すべての計算は、胎児が妊婦コピー数異常染色体フラグメントを遺伝していない仮定下で行われたものである。
【０１０５】
測定結果は図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃを参照する。前記３つの図において、横の座標はサンプルが所在する妊婦コピー数異常染色体フラグメントのサイズであり、縦座標はこのサンプルの染色体Ｚ値である。図中の実線が示すのは補正前の染色体Ｚ値であり、点線は妊婦コピー数異常染色体フラグメントの補正後の染色体カバレッジの計算によるＺ値であり、即ちＺａｎｅｕ値である。四角形、円形及び三角形はそれぞれ該サンプルの胎児濃度が５％、１０％及び１５％であることを示している。
【０１０６】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃから明らかに分かるように、直接染色体カバレッジでＺ値を計算する場合、妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの向上により、サンプルのＺ値も大きくなる。２１号染色体を例として、１０％胎児濃度下において、妊婦に３Ｍｂの２１号染色体上の重複が存在するであれば、仮に胎児が２１トリソミー症候群患児でなくでも、以前のカバレッジで計算されたＺ値は３より大きく、陽性と判定されてしまう。図中の点線は、即ち本出願の方法で補正した後のカバレッジで計算された染色体のＺ値であり、即ちＺａｎｅｕ値であり、いずれも０のベースライン附近に安定している。これは、各種状況下において、本出願の妊婦コピー数異常染色体フラグメントを用いたものにより補正した染色体異数倍の検出方法は極めて有効である。
【０１０７】
さらに本出願の思想により提供した検出方法、検出装置及びキットは実際の患者例のサンプル中において染色体異数倍を測定する効果であり、さらに本出願の検出方法、検出装置及びキットを用いてそれぞれ以下の患者例サンプルを検出することができ、具体的には実施例２及び実施例３である。
【実施例２】
【０１０８】
６６１５件の検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡサンプルに対してハイスループットシーケンシングを行い、各サンプルにすべての染色体が含まれているシークエンスデータを得た。
【０１０９】
各サンプルのシークエンスデータ中の各配列のシークエンス深度に基づいて、各ウインドウの固有の配列の数量を統計する。各染色体のＧＣ含有量及びマッピング率に基づいて各ウインドウの固有の配列の数量に対して補正を行い、各ウインドウの固有の配列の数量の補正値を得る。各ウインドウの固有の配列の数量の補正値に対して標準化処理を行い、各ウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値を得て、さらにＺｃｎｖ値の大小に基づいて検出対象妊婦がコピー数異常染色体フラグメントを有するかについて判定する。シークエンスデータ中には３００Ｋｂ以上のフラグメントが存在し、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメント中のすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウの固有の配列の数量のＺｃｎｖ値は４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さい場合、３００Ｋｂ以上のフラグメントは検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントであると考える。
【０１１０】
検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントを用いて各染色体の補正前カバレッジの影響αを利用して、さらに
【０１１１】
【数４７】
0006623400.tif 000048
を利用して、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得る；そのうち、
【０１１２】
【数４８】
0006623400.tif 000049
は各染色体の補正前カバレッジであり、ｘ'は各染色体の補正後染色体カバレッジである；そのうち、検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの各染色体に対する補正前カバレッジの影響は、パラメータαを用いて式（１）または（２）によって計算される；  各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を計算し、具体的には式
【０１１３】
【数４９】
0006623400.tif 000050
の計算によりＺａｎｅｕ値を得て、さらにＺａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きいことで染色体が異数性を有するかを判定する；Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きい場合、染色体は異数性を有する；Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３未満の場合、染色体は異数性を有しない；
本出願の前記検出方法によりサンプルＥＫ０１８７５及びＢＤ０１４６２の２１号染色
体上に存在する妊婦コピー数異常染色体フラグメントを発見し、さらにこの二つのサンプ
ルを以前の陽性の結果から陰性の結果に補正し、具体的な結果は図４を参照すること。
【０１１４】
図４の左図（カラー図面参照）は現在の検出方法によって検出されるすべてのサンプルの２１号染色体のＺ値統計図であり、これから分かるように陰性サンプルのＺ値はほとんど３未満であり、正規分布に近い。図中の円形はサンプルＥＫ０１８７５であり、Ｚ値は４．６６である。三角形はサンプルＢＤ０１４６２であり、Ｚ値は３．８７である。
図４における右図は本出願の検出方法によって検出することで得られる２１号染色体のＺ値統計図であり、この場合のサンプルＥＫ０１８７５はＺａｎｅｕ＝２．３６で、サンプルＢＤ０１４６２はＺａｎｅｕ＝１．８３である。
【実施例３】
【０１１５】
本出願の染色体異数性の検出装置を用いて前記サンプルの添加を行い（サンプルＥＫ０１８７５、妊婦年齢２９歳、妊娠約１８週）、該装置は以下を含む：
シークエンスデータ検出モジュール：検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシークエンシングを行い、これによりすべての染色体のシークエンスデータを得る；第一カバレッジ計算モジュール：シークエンスデータ中のすべての染色体のウインドウに分割する形でカバレッジを計算することで、各染色体の補正前カバレッジを得る；Ｚｃｎｖ値計算モジュール：検出対象妊婦の各ウインドウ中の固有の配列の数量のＺｃｎｖ値に対して計算を行う；コピー数異常染色体フラグメント検索モジュール：シークエンスデータ中において３００Ｋｂ以上のフラグメントを検索し、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントが、Ｚｃｎｖが４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントである。
【０１１６】
コピー数異常染色体フラグメント認定モジュール：シークエンスデータ中から検索することで得られる３００Ｋｂ以上のフラグメントで、且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントを、検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントと認定する。
α第一計算モジュール：胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントを遺伝している場合、式（１）に示す計算式でパラメータαを計算する；
α第二計算モジュール：胎児が母体のコピー数異常の染色体を遺伝していない場合、式（２）に示す計算式でパラメータαを計算する；
補正モジュール：
【０１１７】
【数５０】
0006623400.tif 000051
を用いて、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得る；
第二カバレッジ計算モジュール：各染色体の補正後カバレッジで各染色体のＺａｎｅｕ値を計算する；
Ｚａｎｅｕ値判定モジュール：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きいかの判定に用いる；
染色体異数性認定モジュール：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きい場合、染色体が異数性を有すると認定する。
【０１１８】
本出願の前記染色体異数性を検出する装置を用いて分析した後、妊婦は２１号染色体上に８５０Ｋｂの重複が存在することを検出した。図５に示すように、コピー数に重複が存在する領域はそれぞれ５００Ｋｂの２１ｑ２２．１１（３２３６１１９４ｂｐ〜３２８６１１９３ｂｐ）及び３５０Ｋｂの２１ｑ２２．１２（３７２６１１９４ｂｐ〜３７６１１１９３ｂｐ）であり、コピー数はいずれも３である。
【０１１９】
それから、従来技術中のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｙｔｏＳｃａｎ  ７５０ｋ  ＳＮＰチップを用いて該妊婦の染色体コピー異常フラグメントの結果に対して検証を行い、同じように、２１ｑ２２．１１（３２３９９１１４ｂｐ〜３２８１１２０２ｂｐ）領域と２１ｑ２２．１２（３７２９２４３２ｂｐ〜３７６０２７０１ｂｐ）において、コピー数は３であると検出した。
【０１２０】
これから分かるように、チップ検出結果の位置と本出願の装置により検出される位置はほとんど百パーセントマッチする。本出願の装置において、妊婦コピー数異常染色体フラグメントの該染色体カバレッジ計算に対する影響のパラメータα値は１．０１２であり、染色体が異数性を有するかを示すＺ値は元の４．６６から２．３６に補正され、これにより判定結果は陰性となる。
【実施例４】
【０１２１】
本出願の染色体異数性を検出するキットを用いて前記サンプル（サンプルＢＤ０１４６２、妊婦年齢２４歳、妊娠約２４週）を添加して検出を行い、該キットは以下を含む：
シークエンスデータ検出試薬及び機器：検出対象妊婦由来の末梢血遊離ＤＮＡに対してハイスループットシークエンシングを行い、これによりすべての染色体を含むシークエンスデータを得る；
第一カバレッジ計算機器：シークエンスデータ中のすべての染色体をウインドウに分割する形でカバレッジを計算し、これにより各染色体の補正前カバレッジを得る；
固有の配列計算機器：検出対象妊婦の各ウインドウにおける固有の配列の数量のＺｃｎｖについて計算を行う；
コピー数異常染色体フラグメント検索機器：シークエンスデータ中で３００Ｋｂ以上のフラグメントを検索し、且つ３００Ｋｂ以上のフラグメントにおいて、すべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントである。
【０１２２】
コピー数異常染色体フラグメント認定機器：シークエンスデータ中から検索により得られる３００Ｋｂ以上のフラグメントで且つすべてのウインドウのうち８０％以上のウインドウ中の染色体フラグメントのＺｃｎｖ値が４と等しいかそれより大きく、または−４と等しいかそれより小さいフラグメントを検出対象妊婦のコピー数異常染色体フラグメントと認定する。
【０１２３】
α第一計算機器：胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメント遺伝している場合、式（１）に示す計算式でパラメータαを計算する。
α第二計算機器：胎児が母体のコピー数異常染色体フラグメントの染色体を遺伝していない場合、式（２）に示す計算式に従ってパラメータαを計算する。
【０１２４】
補正機器：
【０１２５】
【数５１】
0006623400.tif 000052
を用いて、各染色体の補正前カバレッジに対して補正を行い、各染色体の補正後カバレッジを得る；
第二カバレッジ計算機器：各染色体の補正後カバレッジを用いて各染色体のＺａｎｅｕ値を計算する；
Ｚａｎｅｕ値判定機器：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きいかを判定する；
染色体異数性認定機器：Ｚａｎｅｕ値の絶対値が３と等しいかそれより大きい場合、染色体が異数性を有すると判定する。
【０１２６】
本出願の前記検出キットを用いて検出分析した後、図６に示すように、妊婦が２１号染色体上に全部で７００Ｋｂの重複が存在し、領域は２１ｑ２３．１（２８９１１１９４ｂｐ〜２９６１１９３０）であり、コピー数は３であると検出した。
【０１２７】
同じように、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｙｔｏＳｃａｎ  ７５０ｋ  ＳＮＰチップ検証結果が示すように、２１ｑ２１．３（２８９７３７９２ｂｐ〜２９５４２４００）に重複が存在する。
【０１２８】
検出されるコピー数は４であるが、本出願の検出結果と異なって、該結果の位置と本出願のキットによって検出される位置はほとんど百パーセントマッチするものであり、同じように本出願の検出方法の正確性を示している。本出願のキット中の妊婦コピー数異常染色体フラグメントの該染色体のカバレッジ計算の影響パラメータαの値は１．００９であり、染色体が異数性を有するかを示すＺ値は元の３．８７から１．８３に補正され、このため判定結果は陰性である。
【０１２９】
以上の記載から分かるように、本出願の前記実施例は以下の技術効果を実現している：本出願は妊婦自身のコピー数異常染色体フラグメントの染色体異数性を計算する際の影響を考慮して、従来技術おけるシークエンスデータ中の母体中のコピー数異常染色体フラグメントを直接除去して考慮しないという考え方に基づいて、創造的に母体染色体上に存在する特定の大きさのコピー数異常染色体フラグメントの染色体異数性に対する影響をパラメータαで示し、さらにパラメータαにより各染色体のカバレッジに対して補正を行い、これによりコピー数異常染色体フラグメントの異数性に対する判定の影響を低減できるのであって、該コピー数異常染色体フラグメントの存在を無視することのではない。本出願の方法によって検出することで得られる染色体異数性の結果はより正確である。
【０１３０】
本出願の方法、装置またはキットは、ほとんど妊婦のコピー数異常染色体フラグメントの影響を受けないＮＩＰＴ胎児染色体異数性に影響されない検出方法を提供し、これにより検出の制度を向上させ、大規模使用に適している。
【０１３１】
明らかなように、当業者は以下のように理解すべきである。前記の本出願のモジュール、部品またステップは通用の計算装置によって実現され、これらは単一の計算装置に集中することもできるが、複数の計算装置からなるネットワークに分布することもでき、また、これらは計算装置の実行できるプログラムコードによっても実現することもでき、このため、これらを記憶装置中に記憶して計算装置によって実行でき、またはこれらをそれぞれの集積回路モジュールにして、またはこれら中の複数のモジュールまたはステップを単一の集積回路モジュールにすることで実現することもできる。このようにすることで、本出願はいかなる特定のハードウェア及びソフトウェアの組み合わせに制限されるものではない。
【０１３２】
以上は本出願の好ましい実施例に過ぎず、本出願を制限するものではない。当業者にとって、本出願は各種変更及び変化を有することができる。本出願の趣旨の原則に背かないであれば、いかなる修正、均等的な置換、改善も、いずれも本出願の保護範囲に含まれるものである。
【図１】
0006623400.tif 000071
【図２】
0006623400.tif 000072
【図３】
0006623400.tif 000073
【図４】
0006623400.tif 000074
【図５】
0006623400.tif 000075
【図６】
0006623400.tif 000076