(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の流体試料中の、酸化・還元成分を生成する物質の存在及び／又は量を決定する方法であって、前記酸化・還元成分は、酸化成分又は還元成分であり、前記少なくとも１種の試料を、検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも一つのチャンバを含む検知システムに導入することを含み、前記少なくとも１つのチャンバが流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、
前記官能性部分は酸化・還元反応部分であって、酸化・還元成分との接触によって、前記官能性部分の有する原子の1つ以上の酸化数が変化するものであり、さらに前記酸化・還元成分との前記接触によって、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものであり、前記電気特性の検出可能な変化が、前記少なくとも１種の試料における前記物質の存在及び／又は量の指標となる、方法。
【請求項２】
少なくとも１種の流体試料を、前記物質が前記酸化・還元成分を生成する反応条件下におくことを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記条件下におくことが、前記チャンバを前記条件を提供する他のチャンバに流体連通させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種の流体試料が細胞を含み、前記酸化成分又は前記還元成分を生成する前記物質の前記細胞における存在及び／又は量を決定するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記物質が代謝産物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種の流体試料が細胞を含み、前記細胞の代謝活性の決定又はモニタリングのための、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞を含む少なくとも１種の流体試料が、治療薬を更に含み、前記治療薬と接触した前記細胞の活性の決定又はモニタリング、および前記細胞に対する前記治療薬の有効性の決定の少なくとも一方を実施するための、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記物質が代謝産物であり、前記細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤を同定するための、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の診断、および被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の治療のモニタリングの少なくとも一方を実施するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の流体試料中の酸化・還元成分の存在及び／又は量を決定する方法であって、前記酸化・還元成分は、酸化成分又は還元成分であり、前記少なくとも１種の試料を、検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも一つのチャンバを含む検知システムに導入することを含み、前記少なくとも１つのチャンバは流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、前記官能性部分は酸化・還元反応部分であって、酸化・還元成分との接触によって、前記官能性部分の有する原子の1つ以上の酸化数が変化するものであり、さらに前記酸化・還元成分との前記接触によって、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものであり、前記電気特性の検出可能な変化が、前記少なくとも１種の試料における酸化・還元成分の存在及び／又は量の指標となる、方法。
【請求項１１】
検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも一つのチャンバを含むシステムであって、前記少なくとも１つのチャンバが流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、前記官能性部分は酸化・還元反応部分であって、酸化成分又は還元成分である酸化・還元成分との接触によって、前記官能性部分の有する原子の１つ以上の酸化数の変化が生じ、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものである、システム。
【請求項１２】
少なくとも２つのチャンバを含み、それぞれのチャンバは流体を収容するように構成され、前記検知コンパートメントと流体連通しており、前記チャンバの少なくとも１つは、分析するべき試料を保持するように構成されており、前記チャンバの少なくとも１つは、前記酸化・還元反応部分が生成される条件を提供するように選択された流体を保持するように構成されている、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
光学検知装置をさらに含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記官能性部分は、酸化数が可逆的に変化しうる原子を少なくとも１つ有する官能基を少なくとも１つ含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記流体連通が、マイクロチャネルを用いて達成される、請求項１〜１０および１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記官能性部分は、酸化数が可逆的に変化しうる原子を少なくとも１つ有する官能基を少なくとも１つ含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記流体連通が、マイクロチャネルを用いて達成される、請求項１１〜１３および１６のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のいくつかの実施形態は検知に関し、より詳細には、これらに限定されるものではないが、例えば、さまざまな試料のリアルタイム同時検出、及び／又は、酸化・還元反応部分、例えば代謝産物により生成された酸化性部分、のリアルタイム検出に使用され得るシステム及び方法に関する。本明細書に記載されるシステム及び方法は、例えば、細胞の代謝活性のモニタリング及び／又は分析に使用でき、従ってさまざまな診断及び／又は治療用途に使用できる。
【背景技術】
【０００２】
代謝は、エネルギーを生成又は消費する、生体における全体的な生化学的プロセスと定義される。代謝プロセスは、細胞の増殖及び死を、細胞による構造の再編成、および細胞の環境に対する応答を調節する。異常な代謝反応は、正常な生理機能を妨げて重篤な組織不全をもたらし、多くの疾病に関連する。
【０００３】
癌は、代謝の変化を伴う一般的なヒト疾病の一例である。改変された細胞代謝は癌の特徴であり、細胞の悪性化、並びに腫瘍の発生、増殖及び維持の一因となる。改変されたグルコース代謝は癌の発達を促進し、癌細胞は正常な組織と比較してはるかに大量のグルコースを消費し、はるかに大量の乳酸塩を分泌することなどが研究からわかってきた。
【０００４】
従って、癌の代謝をモニタリングするために癌代謝に関連した複雑なネットワークを理解することは、癌における代謝の重要性を理解し、治療の効果を予測し、個別治療を促進するために必要だと考えられる。例えば、非特許文献１及び２を参照されたい。
【０００５】
細胞の代謝活性のモニタリングには、これまでにいくつかの方法論が用いられてきた。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又は液体クロマトグラフィー（ＬＣ）等の分離方法とリンクした質量分析（ＭＳ）技術は、最も一般的に行われている。ＭＳでは、化合物種がイオン化され、それらの質量と電荷の比に基づいて分離される。ＭＳは、代謝産物の生理学的濃度の範囲内では感度が高いが、その結果は終点様式で得られ、リアルタイムではなく、試料の代謝活性を停止させてデータを収集する。加えて、この方法論では試料の前処理が必要であり、血液又は血清等の生体試料を直接テストするにはそぐわない。ＭＳに代わる分離方法としては、前処理が改善されたエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、及び生理学的溶液の直接検出が可能なナノ構造イニシエータＭＳ（ＮＩ−ＭＳ）が挙げられる。例えば非特許文献３および４を参照されたい。
【０００６】
生理学的試料における多重プロファイリングを伴うリアルタイム検知のために、電気化学的検知技術と蛍光検知技術とを組み合わせた方法論が模索されてきた。リアルタイム検知のために、Ｈ２Ｏ２検出電極と代謝産物をＨ２Ｏ２に変換する酵素修飾膜とを組み合わせた酵素反応性電気化学センサが開発されてきた（非特許文献５）。生体試料のＯ２消費及びｐＨ変化をリアルタイムで検出する、埋め込まれたフルオロフォアを有する蛍光センサも開発されてきた（非特許文献６）。
【０００７】
特許文献１は、細胞の代謝活性を測定するために、細胞外環境における、非揮発性の可溶代謝産物、非揮発性の可溶代謝産物と揮発性の可溶代謝産物、及び揮発性の可溶代謝産物の分泌による時間依存性の酸性化プロファイルを別々に測定する方法を開示しており、またそういった方法を病気の診断及び治療のモニタリングに使用している。
【０００８】
マイクロ流体技術及びナノ技術における最近の開発も、微小容積の代謝産物の超高感度リアルタイム検出のために活用されてきた。溶液中のマイクロレベルの代謝産物を分離するマイクロ流体装置が開示されており、そのような装置には電気泳動（非特許文献７、８、９及び１０）又は液体クロマトグラフィー（非特許文献１１及び１２）が使用されている。しかしながら、現在使用されているマイクロ流体チップは、他の検出技術と一緒に使用しなければならず、前処理が必要である（非特許文献１３）。
【０００９】
標的代謝産物の検出のための、電気化学的、光化学的、及び抗体／酵素機能化ナノワイヤーセンサも開示されている。例えば、非特許文献１４および１５を参照されたい。
【００１０】
結合親和性を使って代謝産物を標的とする抗体／酵素ナノワイヤーＦＥＴが、例えば非特許文献１６、１７及び１８に開示されている。
【００１１】
酸化反応によって代謝産物を検出する、電気化学的に高感度のナノワイヤーセンサは、例えば非特許文献１９、２０、２１、２２及び２３に開示されている。
【００１２】
半導体ナノワイヤーは、それらの表面上に吸着された化合物種に対して極めて高い感度を示すことが知られている。ナノワイヤー装置では、帯電した検体をナノワイヤー表面に結合することによって、コンダクタンス変化、又はワイヤー中を流れる電流の変化がもたらされる。１Ｄ（１次元）ナノスケール形態及び極めて大きい体積に対する表面比のおかげで、コンダクタンス変化は平面型のＦＥＴ（電界効果トランジスタ）よりもナノワイヤーベースのセンサにおいてはるかに高く、単一の分子検出が可能である程度まで感度を増大できる。
【００１３】
従って、ナノワイヤーベースの電界効果トランジスタ（ＮＷ−ＦＥＴ）は、ここ１０年で化学的及び生物学的な化合物種を検出するための強力な新しいセンサになりうると考えられてきた。例えば、その全てが本明細書に示されるかのように、参照により組み込まれる非特許文献２４、２５、２６及び２７を参照されたい。
【００１４】
例えばＤＮＡ及びタンパク質等の、医療診断に関連する多数の生体分子種の同時多重検出のためのナノワイヤー電気装置の研究も行われきた（非特許文献２８、２９及び３０）。
【００１５】
一般に、ＮＷ−ＦＥＴ構成では、ゲート電位が所定のソースドレイン電圧（ＶＳＤ）のチャネルコンダクタンスを制御し、ゲート電圧（ＶＧＤ）の調節によって測定されるソースドレイン電流（ＩＳＤ）が変化する。ＦＥＴとして動作するＮＷセンサの場合、ＮＷ内部の担体伝導に対する帯電した分子の電場ゲーティング効果が検知機構となる。マイクロサイズの材料又はバルク材料から形成されている装置と比較して、ナノ装置の高い感度は、小さい寸法とより大きい表面／体積比とに密接に関連している。生物学的検体分子の殆どが固有の電荷を有するため、ナノワイヤー表面に対する結合は、半導体ＳｉＮＷに対する分子ゲートの役割をはたすことができる（非特許文献２６）。
【００１６】
特許文献２、特許文献３および対応出願は、とりわけ、センサとして使用できる官能化ナノワイヤーから構成されたナノスケール装置を教示している。
【００１７】
非特許文献３１では、化学的に官能化されたケイ素ナノリボン電界効果トランジスタを使用した、神経剤のサブｐｐｍ検出のための方法が開示される。
【００１８】
ＳｉＯ２表面化学は、分散された応答を介してアセトン蒸気及びヘキサン蒸気を区別することができる「ナノ電子鼻」ライブラリーの構成に使用されている（非特許文献３２）。
【００１９】
特許文献４は、気体状のＮＯを吸収するように設計されたナノ装置を開示している。特許文献５は、官能化ナノワイヤーを使用して、ニトロ含有化合物を検出するナノ装置を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開２０１２／１３７２０７
【特許文献２】米国特許第７，６１９，２９０号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／００２２０１２
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０３２０７３
【特許文献５】国際公開第２０１１／０００４４３号
【特許文献６】国際公開第２０１０／０５２７０４号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｍｕｎｏｚ−Ｐｉｎｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ２０１２，３：ｅ２４８
【非特許文献２】Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｃｋｃｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４，４（７）：５５１−５６１
【非特許文献３】Ｓｈｕｌａｅｖ  Ｖ．Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ  ２００６，７（２）：１２８−１３９
【非特許文献４】Ｎｏｒｔｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００７，４４９（７１６５）：１０３３−Ｕ１０３３
【非特許文献５】Ｐｏｒｔｎｅｒ  Ｒ．Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ  ｅｄｎ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００７
【非特許文献６】Ｍａｒｘ  Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３，４９４（７４３５），ｐ．１３１
【非特許文献７】Ｇａｒｃｉａ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ２００８，１２０４（２）：１３０−１３９
【非特許文献８】Ｇａｒｃｉａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｙ  Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２００４，５０８（１）
【非特許文献９】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２００７，５８５（１）：１１−１６；ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ  ２００９，１３４（３）：４８６−４９２
【非特許文献１０】Ｖｌｃｋｏｖａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ２００７，４２（２）：２１４−２２１
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ  Ｌｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈ  Ｓ  ２００８，１７（２）：３１８−３２７
【非特許文献１２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００８，８０（２１）：８０４５−８０５４
【非特許文献１３】Ｋｒａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２００９，６５３（１）：２３−３５
【非特許文献１４】Ｒａｍｇｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ２０１０，６（１６）：１７０５−１７２２
【非特許文献１５】Ｐｅｒｅｔｚ−Ｓｏｒｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  ２０１３，１３（７）：３１５７−３１６８
【非特許文献１６】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００７，７１（２）：２１１−２１６
【非特許文献１７】Ｐａｔｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｗｉｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００６，７８（１３）：４２６０−４２６９
【非特許文献１８】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００６，１７（１１）：Ｓ２７６−Ｓ２７９
【非特許文献１９】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２００９，２５（１）：２１８−２２３
【非特許文献２０】Ｋｒｉｖｉｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１２，１２（９）：４７４８−４７５６
【非特許文献２１】Ｓｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ  Ｆｕｎｃｔ  Ｍａｔｅｒ  ２００５，１５（９）：１４７８−１４８２
【非特許文献２２】Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｒｔ  Ｐａｒｔ  Ｓｙｓｔ  Ｃｈａｒ  ２０１３，３０（４）：３２６−３３１
【非特許文献２３】Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ２００９，８１（２４）：９９７９−９９８４
【非特許文献２４】Ｐａｔｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，４２６０−４２６９（２００６）
【非特許文献２５】Ｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ５５，３１１９−３１３０（２００８）
【非特許文献２６】Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，１２８９−１２９２（２００１）
【非特許文献２７】Ｐａｔｏｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０１，１４０１７−１４０２２（２００４）
【非特許文献２８】Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１２９４−１３０１（２００５）
【非特許文献２９】Ｔｉｍｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．９，９１４−９１８（２００９）
【非特許文献３０】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．４，２４５−２４７（２００４）
【非特許文献３１】Ｃｌａｖａｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９，１−５
【非特許文献３２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｖｏｌ．６，２００７，ｐｐ．３７９−３８４
【非特許文献３３】Ｈｕｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２００９，９（１）：７９−８６
【非特許文献３４】Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９９８，１６（３）：２９１−３０３
【非特許文献３５】Ｗａｃｈａｒａｓｉｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｈｏｃｋ  ２０１２，３８（１）：４−１０
【非特許文献３６】Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １９９８，１６（３）：２９１−３０３
【非特許文献３７】Ｖａｌｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂ  ２００７，３９（１）：４４−８４
【非特許文献３８】Ｃａｔｈｃａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８３，１３４（１）：１１１−１１６）
【非特許文献３９】Ｓａｂｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００５，１１（１２）：１３０６−１３１３
【非特許文献４０】Ｌoｐｅｚ−Ｌaｚａｒｏ  Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００７，２５２（１）：１−８
【非特許文献４１】ｒａｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１０，２９（１１）：１６４１−１６５２
【非特許文献４２】Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎ  ＣＦ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９１，５１（３）：７９４−７９８
【非特許文献４３】Ｚｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００，９４（８）：８００−８０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
多重化かつリアルタイムの検出、生体試料の直接検出、および必須試料量が最小である検出の全てを満たす検知方法論が最も必要とされている。そのようなシステムは、例えば細胞の代謝活性をモニタリング及び分析するために使用することができる。そのような方法論は、代謝産物の生成を改変することなく、又は関連する化合物種の細胞外濃度を乱すことなく、検出を行う必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、１つ以上の試料チャンバと流体連通した官能化（例えば酸化・還元反応性）ナノ構造ＦＥＴアレイを特徴とする１つ以上の検知コンパートメントからなる一体化されたマイクロ流体ナノ構造検知システムを考案し、該システムの調製及び実践に成功した。このシステムは、生理学的溶液における細胞代謝活性の多重リアルタイムモニタリングが可能であることが示されており、代謝ネットワークと、オーダーメード医療のための癌の要件との理解を進めるうえで効率的なツールであることが明示されている。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも１つのチャンバを含むシステムであって、前記少なくとも１つのチャンバが流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、前記官能性部分は酸化・還元成分（ａｇｅｎｔ）との接触によって、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものである、システムが提供される。
【００２５】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は、酸化・還元反応部分である。
【００２６】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は、酸化数が可逆的に変化しうる原子を少なくとも１つ有する官能基を少なくとも１つ含む。
【００２７】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は、キノンを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は、芳香族キノンを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は置換又は非置換の、キノン、ベンゾキノン、アントラキノン、及びフェナントレンキノンからなる群から選択される官能基を含む。
【００２８】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、電気特性は、ナノ構造の表面上の電子密度を含む。
【００２９】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、ナノ構造は、ナノワイヤーである。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、半導体ナノ構造は、ケイ素を含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、電気特性の変化量を決定するように構成及び配置された検出器を更に含む。
【００３０】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、半導体ナノ構造は、トランジスタである。
【００３１】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、複数のナノ構造を備える。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、複数のナノ構造は、実質的に同一である。
【００３２】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、複数のナノ構造は、同じ検知コンパートメント内に含まれ、前記ナノ構造間で常に流体連通している。
【００３３】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、更に基板を含み、前記基板の上及び／又は中に単数又は複数のナノ構造が形成されている。
【００３４】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、少なくとも２つのチャンバを含み、それぞれのチャンバは流体を収容するように構成され、前記検知コンパートメントと流体連通している。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記少なくとも２つのチャンバが互いに流体連通している。
【００３５】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、前記チャンバのそれぞれと前記検知コンパートメントとの間の流体連通、及び／又は前記チャンバ間の流体連通を制御するように構成された弁を更に含む。
【００３６】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、流体連通は、マイクロチャネルを用いて達成される。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、前記少なくとも１つのチャンバから前記検知コンパートメントへの流れを可能にする、又は防止する少なくとも１つの弁を更に含む。
【００３７】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、前記少なくとも１つのチャンバから前記検知コンパートメントへの流体の流れを制御するように、前記少なくとも１つの弁を選択的に操作するためのコントローラを更に含む。
【００３８】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、追加の検知装置を更に含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、追加の検知装置は、光学検知装置を含む。
【００３９】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、前記半導体ナノ構造を有さず、かつ前記少なくとも１つのチャンバと流体連通している追加のチャンバを更に含み、前記追加の検知装置は、前記追加のチャンバからの信号を受信するように構成されている。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、少なくとも１つの流体試料中の酸化・還元成分の存在及び／又は量を決定する方法が提供され、該方法は、前記少なくとも１種の試料を、本明細書に記載される実施形態の任意の１つによる検知システムに導入することを含み、前記電気特性の検出可能な変化が、前記少なくとも１種の試料における前記物質の存在及び／又は量の指標となる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、少なくとも１種の流体試料中の、酸化・還元成分を生成する物質の存在及び／又は量を決定する方法が提供され、該方法は、該少なくとも１種の試料を、本明細書に記載される実施形態の任意の１つによる検知システムに導入することを含み、前記電気特性の検出可能な変化が、前記少なくとも１種の試料における酸化・還元成分の存在及び／又は量の指標となる。
【００４２】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、本方法は、少なくとも１種の流体試料を、前記物質が前記酸化・還元成分を生成する反応条件下におくことを更に含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件下におくことが、前記チャンバを前記条件を提供する他のチャンバに流体連通させることを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件下におくことが、前記条件を提供する他のチャンバを前記検知コンパートメントに流体連通させることを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件が、前記物質からの前記酸化成分又は前記還元成分の生成を触媒する酵素反応を含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件を提供する他のチャンバが、前記検知システムの一部を形成する。
【００４３】
本発明の任意の実施形態のいくつかは、少なくとも１種の流体試料が細胞を含み、前記酸化成分又は前記還元成分を生成する前記物質の前記細胞における存在及び／又は量を決定するための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、物質は、代謝産物である。
【００４４】
本発明の任意の実施形態のいくつかは、少なくとも１種の流体試料が細胞を含み、前記細胞の代謝活性を決定又はモニタリングのための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかは、前記細胞を含む少なくとも１種の流体試料が、治療薬を更に含み、前記治療薬と接触した前記細胞の活性を決定又はモニタリングするための方法である。
【００４５】
本発明の任意の実施形態のいくつかは、前記細胞に対する前記治療薬の有効性を決定するための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかは、前記物質が代謝産物であり、前記細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤を同定するための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記流体試料が、被験体の生物学的試料である。
【００４６】
本発明の任意の実施形態のいくつかは、被験体における改変された代謝活性に関連した疾病を診断するための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかは、被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の治療のモニタリングのための方法である。
【００４７】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記酸化成分が、活性酸素種、又は活性酸素種を生成する成分である。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、酸化成分は、過酸化物である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、検知システムが提供され、該検知システムは：
標的分子を検出するように構成された検知コンパートメントと、
複数のチャンバであって、それぞれが対応するマイクロチャネルと、該チャネル上に装着された対応する弁とを介して、前記検知コンパートメントと制御可能に流体連通している複数のチャンバと、
少なくとも２つの前記チャンバから前記検知コンパートメントへの流体の流れを制御するように、それぞれの弁を選択的に操作するためのコントローラと、を含む。
【００４９】
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、検知コンパートメントが、標的分子との接触によって電気特性の検出可能な変化を生じるように構成されている半導体ナノ構造を含む。
【００５０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が下記に記載されている。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
【００５１】
本発明の実施形態の方法及び／又はシステムの実施は、選択されたタスクを手動、自動、又はそれらの組み合わせで実行又は完了することを含み得る。更に、本発明の方法及び／又はシステムの実施形態の実際の器具類及び設備によれば、いくつかの選択されたタスクは、ハードウェア、ソフトウエア、若しくはファームウェア、又は、オペレーティングシステム、またはそれらの組み合わせを使用して実施され得る。
【００５２】
例えば、本発明の実施形態において選択されたタスクを実行するためのハードウェアは、チップ又は回路として実施してもよい。ソフトウエアとしては、本発明の実施形態において選択されたタスクを、任意の好適なオペレーティングシステムを使用して、コンピュータにより実行される複数のソフトウエア命令として実施してもよい。本発明の例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法及び／又はシステムの例示的な実施形態による１つ以上のタスクは、複数の命令を実行するための計算プラットフォーム等のデータプロセッサにより実行される。データプロセッサは、命令及び／またはデータを格納する揮発性メモリ、並びに／もしくは、命令及び／またはデータを格納する不揮発性記憶装置、例えば磁気ハードディスク及び／又はリムーバブルメディアを含んでもよい。ネットワーク接続が提供されてもよい。ディスプレイ及び／又はキーボード若しくはマウス等のユーザー入力装置が提供されてもよい。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面を詳細に参照して示される事項（particulars）は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の詳細な説明を目的とすることを強調する。同様に、図面と共に為される説明は、本発明の実施形態をどのように実践し得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による例示的なバイオ検知システムの画像（図１Ａ、Ｂ）及び概略図（図１Ｃ、Ｄ）を示す。バイオ検知システムは、多重検知のために異なる試料を容易に切り替えることができる培養コンパートメントと、ＮＷ−ＦＥＴ検知コンパートメントとを含む（図１Ａ、Ｂ）。検知コンパートメントにおいて、ＳｉＮＷ  ＦＥＴアレイは、例示的な酸化・還元反応基としての９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリドにより修飾されている（図１Ｃ）。代謝産物の酵素酸化により生成されたＲＯＳ又はそれによって得られるＨ２Ｏ２は、ＦＥＴ表面上の９，１０−ジヒドロキシアントラセンを酸化して９，１０−アントラキノンを形成し、それにより表面電子密度を低下させる。その一方で、還元成分のＮ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン（ＤＥＨＡ）は、９，１０−アントラキノンを９，１０−ジヒドロキシアントラセンに還元することにより表面電子密度を増大させる（図１Ｄ）。（ＬＯＸ：ラクテートオキシダーゼ；ＧＯＸ：グルコースオキシダーゼ；ＰＯＸ：ピルベートオキシダーゼ；Ｐｉ：無機リン酸塩）。
【図２−１】図２Ａ〜Ｄは、表面修飾中に行ったＸＰＳ測定にて得られたデータ、及び酸化・還元反応性ＳｉＮＷ  ＦＥＴの特性評価を示す。修飾手順：９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウムのスルホネート基をスルホン酸クロリドに変換（差し込み図）；アミン基によりＳｉＮＷ表面をシラン化（図２Ｂ）；及び、９，１０−アントラキノン基を修飾表面に結合するスルホンアミドを形成（図２Ｃ）。未修飾（図２Ａ）と修飾ステップ後のそれぞれにおける、ＳｉＮＷ  ＦＥＴの修飾表面の炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）及び硫黄（Ｓ）のＸＰＳスペクトル及び原子組成を示す。
【図２−２】図２Ｄは、酸化された９，１０−アントラキノン修飾シリコンナノワイヤー表面（青色の曲線）及び還元された９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾シリコンナノワイヤー表面（赤色の曲線）の代表的なＸＰＳ検査スペクトルを示す。Ｃ＝Ｏ結合の割合は、Ｃ１ｓ曲線に適合させることにより計算した。
【図３−１】図３Ａ、Ｂは、血清添加培地中でのＨ２Ｏ２に反応した９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴの検知特性を示す。図３Ａは、ＡＰＤＭＥＳ修飾ＦＥＴから獲得した信号と比較した、異なる濃度のＨ２Ｏ２中の９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＦＥＴの酸化動力学、及び還元成分溶液を流すことによっておこったＦＥＴ表面の還元を示す。（ΔＩｄｓ：測定された電流とベースラインとの差；Ｉ０：正規化係数；Ｖｇ＝０Ｖ；Ｖｄｓ＝０．２Ｖ；検知は血清添加培地中ｐＨ７．４で行った）。酸化及び還元における関連官能基に関する表面化学的結合集団の比較を、差し込み図に示す。
【図３−２】図３Ｂは、Ｈ２Ｏ２濃度及びｐＨの関数として作成された９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴの検知応答を示す（データは、平均±標準偏差（ＳＤ）、４回以上反復）。
【図４−１】図４Ａ〜Ｃは、血清添加培地中でのオキシダーゼによる小分子代謝産物である乳酸塩（図４Ａ）に応答した９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴの検知特性を示す。差し込み図は、対応する標準曲線を示す。（ＬＯＸ：ラクテートオキシダーゼ；ＧＯＸ：グルコースオキシダーゼ、ＰＯＸ：ピルベートオキシダーゼ；Ｖｇ＝０Ｖ、Ｖｄｓ＝０．２Ｖ）。
【図４−２】図４Ａ〜Ｃは、血清添加培地中でのオキシダーゼによる小分子代謝産物であるグルコース（図４Ｂ）に応答した９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴの検知特性を示す。差し込み図は、対応する標準曲線を示す。（ＬＯＸ：ラクテートオキシダーゼ；ＧＯＸ：グルコースオキシダーゼ、ＰＯＸ：ピルベートオキシダーゼ；Ｖｇ＝０Ｖ、Ｖｄｓ＝０．２Ｖ）。
【図４−３】図４Ａ〜Ｃは、ＰＢＳ中での小分子代謝産物であるピルビン酸塩（図４Ｃ）に応答した９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴの検知特性を示す。差し込み図は、対応する標準曲線を示す。（ＬＯＸ：ラクテートオキシダーゼ；ＧＯＸ：グルコースオキシダーゼ、ＰＯＸ：ピルベートオキシダーゼ；Ｖｇ＝０Ｖ、Ｖｄｓ＝０．２Ｖ）。
【図５−１】図５Ａ〜Ｃは、９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＮＷ  ＦＥＴを使用した、還元成分添加培地中のｐＨの検知を示す。図５Ａは、還元成分の添加による、ｐＨセンサへの修飾ＦＥＴの変換の概略図を示し、測定電流を変化させる、プロトン化又は脱プロトン化に応答した表面プロトン密度の変化を示す。
【図５−２】図５Ｂは、Ｈ２Ｏ２内容物を有さない還元成分添加培地中のｐＨ依存性検知応答を示す（Ｖｇ＝−０．３Ｖ；Ｖｄｓ＝０．２Ｖ）。図５Ｃは、還元成分添加培地中のＨ２Ｏ２に対するセンサの非感応性を示す。基準レベルは、還元成分を流すことにより得られた（Ｖｇ＝０Ｖ（還元成分なし）、−０．３Ｖ（還元成分添加）；Ｖｄｓ＝０．２Ｖ）。信号は、注入から７００秒後に得られ、検知は、血清添加培地中、ｐＨ８．００で行った。
【図６−１】図６Ａ〜Ｉは、９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＮＷ  ＦＥＴを使用した細胞代謝活性のモニタリング中に得られたデータを示す。代謝産物の測定されたレベルは、生細胞の数に対して正規化された。図６ＡはＭＴＸ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の２４時間モニタリング中に得られたデータを示す。図６Ｂおよび図６Ｃは２４時間後のＭＴＸ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＲＯＳレベルと得られた細胞増殖率との間の相関を示す。相対的な細胞数は、ｔ＝２４時間における細胞数と初期細胞数との比である。図６Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥの全ての差し込み図内の対照実験のデータは、ジクロロジヒドロフルオレセインを使用することにより得られた。図６ＣはＭＴＸ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のｐＨを示す。測定されたＣＬＬ細胞の代謝レベルは、正常なＢ細胞の代謝レベルに対して正規化した。データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で３回以上反復；装置数はｎ＝６；スチューデントのｔ検定を用いた；＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。
【図６−２】図６Ｄは２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の２４時間モニタリング中に得られたデータを示す。図６Ｂは、２４時間後の２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＲＯＳレベルと得られた細胞増殖率との間の相関を示す。相対的な細胞数は、ｔ＝２４時間における細胞数と初期細胞数との比である。図６Ｆは、２４時間後の２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の乳酸塩レベルと得られた細胞増殖率との間の相関を示す。図６Ａ、Ｂ、Ｄ及びＥの全ての差し込み図内の対照実験のデータは、ジクロロジヒドロフルオレセインを使用することにより得られた。図６Ｇは２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のｐＨを示す。測定されたＣＬＬ細胞の代謝レベルは、正常なＢ細胞の代謝レベルに対して正規化した。データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で３回以上反復；装置数はｎ＝６；スチューデントのｔ検定を用いた；＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。
【図６−３】図６Ｈ、６Ｉは、それぞれＭＴＸ処理及び２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の２４時間生存率観察にて得られたデータを示す。
【図７】図７Ａ、Ｂは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞及び正常なＢ細胞の代謝レベル（図７Ａ）と、それらの生存率（図７Ｂ）とを示す。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）；装置数はｎ＝６；スチューデントのｔ検定を用い；＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示し；一次ヒトＢ細胞（ＣＬＬ：慢性リンパ性白血病細胞；正常：正常なＢ細胞）の２４時間生存率観察に関して得られたデータである。
【図８】インキュベーターを備えた顕微鏡上のオール・インクルーシブ  ラボ・オン・チップ（all-inclusive lab-on-a-chip）を使用した、代謝産物の例示的な多重リアルタイムモニタリングの概略図を示す。ラボ・オン・チップは多細胞試料から標的細胞を単離し、単離した標的細胞は中間細胞培養ウェルに分注する。次いで、代謝産物を反応させてＲＯＳを生成し、溶液を下流の検知ウェルに移送する（ＬＯＸ：ラクテートオキシダーゼ；ＧＯＸ：グルコースオキシダーゼ；ＰＯＸ：ピルベートオキシダーゼ；ＳＯＤ：スーパーオキシドジスムターゼ；Ｐｉ：無機リン酸塩）。
【図９−１】図９Ａ及び９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による検知システムの概略図である。
【図９−２】図９Ａ及び９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による検知システムの概略図である。
【図１０】ナノ構造がトランジスタを形成している、本発明の実施形態におけるナノ構造の概略図である。
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｃは、本発明のいくつかの実施形態による、２つ以上の検知コンパートメントを含むシステムの概略図である。
【図１１−２】図１１Ａ〜Ｃは、本発明のいくつかの実施形態による、２つ以上の検知コンパートメントを含むシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態は検知に関し、より詳細には、これらに限定されるものではないが、検知に使用可能なシステムや方法、例えば、さまざまな試料のリアルタイム同時検出、及び／又は、例えば代謝産物により生成された酸化性部分等の酸化・還元反応部分のリアルタイム検出に使用され得るシステム及び方法に関する。本明細書に記載されるシステム及び方法は、例えば、細胞の代謝活性のモニタリング及び／又は分析に使用でき、従ってさまざまな診断及び／又は治療用途に使用できる。
【００５６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が、以下の記載に示される、並びに／又は、図面及び／若しくは実施例に説明される、成要素及び／又は方法の構造及び配置の詳細に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は、さまざまな方法で実践若しくは遂行されることが可能である。
【００５７】
本発明者らは、１つ以上のチャンバと流体連通した官能化（例えば、酸化・還元反応性）ナノワイヤーＦＥＴアレイを特徴とする１つ以上の検知コンパートメントからなる、一体化されたマイクロ流体ナノワイヤー検知システムを考案し、該システムの調製及び実践に成功し、またこのシステムを、生理学的溶液における細胞代謝活性の多重リアルタイムモニタリングに利用することに成功した。
【００５８】
本発明者らは、そのようなシステムを使用して、試料を前処理することなく、また、その本質的な特徴に干渉する及び／又は有害な薬剤を使用することなく、さまざまな試料のリアルタイム多重モニタリングを実行できることを示した。
【００５９】
そのようなシステムは、さまざまな診断及び治療用途に使用することができ、例えば、代謝活性に関連した疾病の診断、診断後の好適な（例えば、個別の）治療の選択、疾病治療の有効性のモニタリング、及び、細胞の代謝活性を改変する治療薬のスクリーニング方法において使用することができる。
【００６０】
本明細書に記載されるシステムによる多重リアルタイムモニタリングでは、分析前に試料を前処理する必要がなく、また、検知されるべき部分の生成に追加の１種以上の試薬を使用する必要がある場合、これらの試薬をシステム内で試験試料と直接混合することができる。このように直接混合することによって、試薬の使用を少量（例えば、微小容積）に抑え、検知されるべき部分を穏やかな条件及び手順で生成することができ、しかも検知されるべき部分は最大化し、検知の信頼性を向上させ、検知システムの寿命を延長することができる。
【００６１】
加えて、本明細書に記載される検知システムは、他の技術を用いた場合よりも試料の検知に必要な時間を実質的に短縮し、またさまざまな試料についての多重検知が同時に行えるよう所定の標的部分に対して非特異的であるように設計することができる。検知は、生体試料がシステムに導入される前に、その細胞プロセス及び／又は代謝プロセスを妨げることなく実行することができる。
【００６２】
検知システム：
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、検知コンパートメントと制御可能な流体連通にある少なくとも１つのチャンバを備えたシステムが提供される。
【００６３】
「制御可能な流体連通」とは、流れ制御手段を用いてその中を通る流体を流すか防止することが可能な流体通路を意味し、ここで流れ制御手段は、弁等であるが、これに限定されない。本発明のいくつかの実施形態では、制御可能な流体連通は、その中を通る流体の流速が変更され得る流体通路を包含する。
【００６４】
本明細書全体で使用される「コンパートメント」という用語は、システム内の開放系又は閉鎖系の囲まれた部分を指すと理解されたい。コンパートメントは、少なくとも基部及び側壁を有してもよい。コンパートメントは前記とは別にその位置によって、システムの他の部分から分離可能なシステムの一部分であってもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、流体連通は、マイクロチャネルを用いて達成される。そのような検知システムは、本明細書ではマイクロ流体検知システムとも称される。
【００６６】
検知コンパートメント：
ここで図面を参照すると、図９Ａ、Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による検知システム１０の概略図である。
【００６７】
システム１０は、１つ以上の半導体ナノ構造１４を有する検知コンパートメント１２を備えてもよい。ナノ構造１４は、細長いことが好ましい。複数（即ち、２つ以上）のナノ構造１４が使用される場合、ナノ構造１４は、場合によりアレイに配置されることが好ましい。例えば、ナノ構造は、図９Ａ、Ｂに示すように、互いに略平行に配置されてもよい。
【００６８】
本明細書で使用する「細長いナノ構造」は、概して、固体物質で形成されている３次元体を指し、また、その長手方向に沿った任意の地点で、少なくとも１つの断面寸法を有し、いくつかの実施形態では、１マイクロメートル未満、又は５００ナノメートル未満、又は２００ナノメートル未満、又は１５０ナノメートル未満、又は１００ナノメートル未満、又は更には７０ナノメートル未満、５０ナノメートル未満、２０ナノメートル未満、１０ナノメートル未満、又は５ナノメートル未満の２つの直断面寸法を有する。いくつかの実施形態では、断面寸法は、２ナノメートル未満又は１ナノメートル未満であってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ナノ構造は、０．５ナノメートル〜２００ナノメートル又は１ｎｍ〜１００ｎｍ、又は１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲の少なくとも１つの断面寸法を有する。
ナノ構造の長さは、その断面に略直交する、その伸長範囲を表す。本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造の長さは、１０ｎｍ〜５０マイクロメートルの範囲である。
【００７０】
細長い半導体の断面は、円形、正方形、矩形、楕円形及び管状を含むがこれらに限定されない任意の形状を有してもよい。規則的形状及び不規則形状が含まれる。
【００７１】
本発明のさまざまな例示的な実施形態において、ナノ構造は、本明細書で「ナノワイヤー」と称される非空洞構造である。
「ワイヤー」は伝導性を有する、即ちそれ自体に電荷を通過させる能力を有する任意の材料を指す。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ナノワイヤーは、０．５ナノメートル〜２００ナノメートル、又は１ｎｍ〜１００ｎｍ、又は１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲の平均直径を有する。
本発明のいくつかの実施形態において、ナノ構造は、中空チューブとして成形されており、中空チューブは、長手方向軸線に沿って完全に中空である、本明細書で「ナノチューブ」又は「ナノチューブ構造」と称されるものであることが好ましい。
ナノチューブは、単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ナノチューブの平均内径は、０．５ナノメートル〜２００ナノメートル、又は１ｎｍ〜１００ｎｍ、又は１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。
多層ナノチューブの場合、いくつかの実施形態では、壁間距離は、０．５ナノメートル〜２００ナノメートル、又は１ｎｍ〜１００ｎｍ、又は１ｎｍ〜５０ｎｍの範囲であってもよい。
【００７４】
本明細書に記載されるナノ構造を形成するための好適な半導体材料の選択は、本発明の実施形態を有利に実践するために提供されるガイドラインを考慮すれば、当業者に明白かつ容易に再現できるであろう。例えば、本発明の実施形態のナノ構造は、ＩＶ族の元素半導体、並びに、元素の周期律表のＩＩ族、ＩＩＩ族、ＩＶ族、Ｖ族及びＶＩ族のいずれかから選ばれる２つ以上の元素のさまざまな組み合わせから形成されてもよい。
本明細書で使用する「族」は、当業者が理解するその通常の定義が付与される。例えば、ＩＩＩ族元素は、Ｂ、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ及びＴｌを含み；ＩＶ族元素は、Ｃ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ及びＰｂを含み；Ｖ族元素は、Ｎ、Ｐ、Ａｓ、Ｓｂ及びＢｉを含み；ＶＩ族元素は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｔｅ及びＰｏを含む。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態において、ナノ構造は、「ドーパント」として既知のドナー原子でドープされた半導体材料から形成されている。本発明の実施形態は、ドーピングして、ｎ型（格子構造の完成に必要とされるよりも過剰の電子）及びｐ型（格子構造の完成に必要とされるよりも不足する電子）の両方のドーピングを達成することを想定している。ｎ型材料中の過剰な電子、又はｐ型材料中に残された正孔（電子の不足）は、それぞれ、負電荷担体及び正電荷担体としての役割を果たす。ｐ型ドーパント及びｎ型ドーパントとして好適なドナー原子は、当技術分野にて既知である。
【００７６】
例えば、ナノ構造は、例えばＢ（これらに限定されるものではないが、典型的にはジボランである）、Ｇａ若しくはＡｌでドープされたケイ素から形成されて、ｐ型半導体ナノ構造を提供するか、又は、Ｐ（これらに限定されるものではないが、典型的にはホスフィンである）、Ａｓ若しくはＳｂでドープされたケイ素から形成されて、ｎ型半導体ナノ構造を提供してもよい。
本発明者らが行った実験では、Ｓｉナノワイヤーと、ジボランドーパントを有するｐ型Ｓｉナノワイヤーとを使用した。
【００７７】
いくつかの実施形態において、検知コンパートメントは、例えば化学蒸着を用いることにより基板上で成長された複数のナノワイヤー及び／又はナノチューブを含む。ナノワイヤー及び／又はナノチューブが得られた後に（例えば、フォトリソグラフィーにより）基板をエッチングし、ナノワイヤー及び／又はナノチューブを検知コンパートメント内に所望のように配置してもよい。あるいはレーザー触媒成長（ＬＣＧ）を用いてナノワイヤーを形成してもよい。本明細書に記載される半導体ナノ構造を形成する、及び複数のナノ構造のアレイを構成する、任意の方法が考えられる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、検知コンパートメントは、複数のナノ構造、例えば１平方センチメートル当たり２〜２０００のナノ構造を含む。ナノ構造は、本明細書に記載されるナノワイヤーやナノチューブ、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。
例示的なナノチューブ、及びこれを調製する方法は、その全体が本明細書に示される、参照により組み込まれる特許文献６に開示されている。
【００７９】
下記に更に詳細に記載される任意の他の半導体ナノ構造も考えられる。
検知コンパートメント１２は、好ましくは、ナノ構造１４に共有結合した官能性部分１６を含んでもよい。官能性部分１６は、検出可能な標的種（例えば、部分又は化合物）１８との接触によってナノ構造１４の電気特性に検出可能な変化を生じるように選択される。
【００８０】
例えば、ナノ構造１４は、ナノ構造１４のある領域、又はナノ構造１４の全長に亘って、電子又は正孔の密度の変化を示してもよい。密度変化に加えて、あるいはその代わりに、ナノ構造１４その伝導率又は抵抗率の変化を示してもよい。
【００８１】
複数のナノ構造１４が使用される場合、ナノ構造の全部が同じ官能性部分に共有結合されてもよく、あるいは、少なくとも２つのナノ構造が、異なる官能性部分に共有結合されてもよい。対応する２つ以上のナノ構造上に２つ以上の官能性部分を使用することは、コンパートメント１２が２種以上の標的分子を連続又は同時に検知することを可能にするために有利である。本明細書の実施形態のいくつかに好適な官能性部分を、下記に提供する。
【００８２】
本明細書に記載される検知コンパートメント１２の任意の実施形態のいくつかにおいて、複数のナノ構造１４が使用される場合、ナノ構造は、同じ検知コンパートメント内に含まれ、かつ常にそれらの間で流体連通している。
【００８３】
本明細書に記載される任意の検知システム１０のいくつかにおいて、複数のナノ構造１４が使用され、２つ以上の検知コンパートメント内に含まれ、各検知コンパートメント内で、複数のナノ構造は常にそれらの間で流体連通している。システム１０が複数の検知コンパートメントを備える実施形態を、下記に記載する。
【００８４】
ナノ構造１４の特性の変化は、通信回線３４を介してナノ構造１４と通信する検出器３２により検出することができる。複数のナノ構造が使用される場合、ナノ構造のそれぞれは、別個の通信チャネル上で検出器３２と通信することが好ましい。
【００８５】
検出器３２は、半導体特性の検出が可能なタイプのものであればよい。
例えば、検出器３２は、電気特性の変化に対応する電気的な量を測定するように構成されてもよい。電気的な量は、例えば電圧、電流、伝導率、抵抗、インピーダンス、インダクタンス、電荷等であってもよい。
【００８６】
検出器は、典型的には電源と電圧計又は電流計を含む。一実施形態において、１ｎＳ未満の伝導率を検出することができる。いくつかの実施形態において、数千ｎＳの範囲内の伝導率を検出することができる。
【００８７】
例えば、検出可能な種１８がナノ構造１４の電子又は正孔の密度を変化させる場合、検出器３２は、ナノ構造１４に電圧を印加し、ナノ構造１４を通る電流を測定するように構成されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ナノ構造１４は、ソース電極及びドレイン電極（図示せず、図１０参照）と接触している。これらの実施形態では、検出器３２は、好ましくは、ソース電極とドレイン電極との間にソースドレイン電圧を印加し、ソースドレイン電流の変化を測定するように構成されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、ナノ構造１４は、ソース電極、ドレイン電極及びゲート電極と接触することにより、これに限定されるものではないが、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）などのトランジスタを形成している。これらの実施形態では、検出器３２は好ましくは、ソース電極とドレイン電極との間にソースドレイン電圧を印加し、またゲート電極にもゲート電圧を印加して、ソースドレイン電流の変化を測定するように構成されていてもよい。
【００８８】
図１０は、ナノ構造１４がトランジスタ１５０（例えばＦＥＴ）を形成する実施形態におけるナノ構造１４の概略図である。トランジスタ５０はソース電極１５２、ドレイン電極１５４、ゲート電極１５６を含み、ナノ構造１４はチャネルとしての役割を果たす。ゲート電圧は、ゲート電極１５６を介してチャネルナノ構造１４に印加されてもよい。いくつかの実施形態では、ゲート電極１５６の電圧がゼロの場合、ナノ構造１４は、いずれの自由電荷担体も含まず、本質的に絶縁体である。ゲート電圧が増大するにつれ、ゲート電圧により生じる電場は、ソース電極１５２及びドレイン電極１５４から電子（又はより一般的には、電荷担体）を引き込み、ナノ構造１４は伝導性になる。いくつかの実施形態では、ゲート電圧が印加されず、電荷担体密度の変化は、ナノ構造１４と標的分子１８との間の相互作用のみにより達成される。
【００８９】
ナノ構造の電気特性が、ニトロ含有化合物を含む試料との相互作用に応答して変動する場合、検出可能な信号が生成され得ることがわかっている。例えば、チャネルの電気特性の変化によってゲート電圧に対してトランジスタの特徴的な応答が（例えば、ゲート電圧の関数としてのソースドレイン電流）変化し、この変化は検出及び分析され得る。
【００９０】
ナノ構造１４は基板２８上に形成される、又は基板２８中に部分的に若しくは完全に埋めこまれていてもよい。
【００９１】
基板は、例えばエラストマー系ポリマー基板であってもよい。好適なエラストマー系ポリマー基板材料は一般的に、製造プロセス（ソフトリソグラフィー、ステレオリソグラフィー及び３次元のジェット印刷等）と、マイクロ流体システムにより実行される特定の動作中の状態とに対する適合性に基づいて選択される。そのような状態としては、強い酸性やアルカリ性、マイクロチャネル内の圧力、温度、イオン濃度等が挙げられる。エラストマー系ポリマー基板材料は、システムにより実行されるべき分析又は合成の必須成分に対して不活性であるがゆえに選択されることもある。エラストマー系ポリマー基板材料はまた、下記に詳細に記載するように、好適な材料で被覆されてもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態において、エラストマー系ポリマー基板材料は、透明であることが好ましい。これらの実施形態は、システム１０が光学若しくは視覚検出装置と共に使用される、又は備える場合、特に有用である。あるいはこのタイプの検出の場合、例えばガラス又は石英の透明な窓をシステムに組み込んでもよい。エラストマー系ポリマーは、直鎖状又は分枝鎖状の骨格を有してもよく、架橋又は非架橋であってもよい。
【００９３】
ポリマー化学構造、前駆体、合成方法、反応条件、及び可能な添加剤について極めて多くの選択肢があることから、本実施形態のマイクロ流体システムの製作には多数のエラストマーを使ったシステムが可能である。
【００９４】
エラストマー系ポリマーの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリウレタン及びシリコーンが挙げられる。圧電アクチュエーターのストロークが小さい（ナノメートル範囲）ため本発明者らは上記で詳細に説明したように、形成されたマイクロチャネルの壁が十分弾性であることを条件として、一般的には非エラストマー系のポリマーの使用も想定している。そのようなポリマーの代表的な例としては、これらに限定されるものではないが、ＰＭＭＡ及びポリカーボネートが挙げられる。
【００９５】
試料コンパートメント：
システム１０はまた、チャネル２２と、チャネル２２上に装着された弁２４とを介して、検知コンパートメント１２と制御可能に流体連通している１つ以上のチャンバ２０も備え得る。複数のチャンバが使用される場合、各チャンバは対応するチャネル２２と、対応するチャネル２２上に装着された対応する弁２４とを介して、同じ検知コンパートメント１２と制御可能に流体連通していてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、２つ以上の検知コンパートメント１２などの検知コンパートメントが使用され、この少なくとも２つのチャンバは、異なる検知コンパートメントと制御可能に流体連通している。本発明のいくつかの実施形態では、異なるチャンバにより供給される検知コンパートメント間に流体連通は存在せず、本発明のいくつかの実施形態では、異なるチャンバにより供給される検知コンパートメント間に流体連通が存在する。システムが２つ以上の検知コンパートメントを備える実施形態の代表的な例を後に提供する。
【００９６】
試料コンパートメントに関して本明細書全体を通して記載される任意の実施形態のいくつかでは、２つ以上のチャンバが含まれる場合、２つ以上のチャンバは（検知コンパートメントと流体連通にあることに加えて）互いに流体連通していてもよい。
【００９７】
「チャンバ」は、本明細書で使用する場合、流体（例えば、試料溶液、試薬溶液）を収容するように構成された閉鎖又は開放された囲まれた部分を指す。チャンバ２０は、マイクロチャネルの表層（例えば、本明細書に記載される基板２８）の上、又はマイクロチャネルの表層（例えば、本明細書に記載される基板２８）の中に配置されてもよい。複数のチャンバが使用される場合、各チャンバは独立して、本明細書に記載される任意の構成を採用してもよい。
【００９８】
試料溶液を収容するチャンバは、本明細書で試料チャンバと称されることもあり、試薬を収容するチャンバは、本明細書で試薬チャンバと称されることもある。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるチャンバ２０のそれぞれは独立して、マイクロリットル〜ミリリットルの範囲内の流体の量を収容するように構成されている。
いくつかの実施形態において、チャンバはウェルの形態である。
【０１００】
チャネル２２はマイクロチャネルであることが好ましい。
本明細書で使用する「マイクロチャネル」という用語は、断面寸法が最大でも１ｍｍ未満、より好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは４００μｍ未満、より好ましくは３００μｍ未満、より好ましくは２００μｍ未満、例えば１００μｍ以下である、流体チャネルを指す。
【０１０１】
コンパートメント１２、マイクロチャネル２２及びチャンバ２０は、全て、基板内に形成されてもよく、この基板は所望によりナノ構造１４を支持するものと同じ基板（基板２８）であってもよいし、又は異なる基板であってもよい。
【０１０２】
一般に、複数のマイクロチャネル２２は、必ずしもそうではなくともよいが、同じ面に係合している。例えば、コンパートメント１２、複数のマイクロチャネル２２及びチャンバ２０は全て、マイクロチャネル２２が基板上で同じ面に係合するように、基板内に形成されてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、主チャネル２６はチャンバ１２に直接接続され、マイクロチャネル２２のそれぞれは、対応するチャンバ２０と主チャネル２６との間に配置され、チャンバ２０の少なくとも１つについては、チャンバからコンパートメント１２への流体通路が、対応するマイクロチャネル２２及び主チャネル２６の両方を含んでいる。これらに限定されるものではないが、主チャネル２６もマイクロチャネルであってもよい。本発明のいくつかの実施形態では、主チャネル２６は、少なくとも１ｍｍの直径を有する。主チャネル２６は、マイクロチャネル２２が係合するのと同じ面に係合し得るが、いくつかの実施形態では、主チャネル２６の一部分はマイクロチャネル２２により係合される面の上方又は下方にある。
【０１０４】
本発明のいくつかの実施形態においてシステム１０は追加のチャンバ２１を備え、追加チャンバ２１は検知コンパートメント１２と流体連通し、また、チャンバ２０からコンパートメント１２への流体通路が追加のチャンバ２１を通過するように、チャンバ２０の２つ以上とも流体連通している。この実施形態は、図９Ｂに概略的に示されている。追加のチャンバ２１は例えば、２つ以上の異なるチャンバ２０から物質が流入する反応又は混合チャンバとしての役割を果たし得る。異なる物質は、追加のチャンバ２１内で反応又は混合されてもよく、混合物及び／又は反応生成物は、検知コンパートメント１２内に流れてもよい。追加のチャンバ２１と検知コンパートメント１２との間の連絡は、例えばチャネル２６を介してであってもよい。
【０１０５】
チャンバ２０及びチャネル２２は共にシステムの一部分を形成し、この部分は本明細書では「培養コンパートメント」又は「試料コンパートメント」と称されることもある。
【０１０６】
マイクロチャネル２２は、これらに限定されるものではないが、ソフトリソグラフィー、熱エンボス加工、ステレオリソグラフィー、３次元のジェット印刷、ドライエッチング及び射出成形などの当技術分野にて既知の任意の技術によって基板２８上に形成され得る。
【０１０７】
本発明のいくつかの実施形態において検知コンパートメント、マイクロチャネル及びチャンバは、同じ基板上に形成され、本発明のいくつかの実施形態において検知コンパートメントは、マイクロチャネル及びチャンバとは異なる基板上に形成される。異なる基板が使用される場合、異なる基板は、チャンバと検知コンパートメントとの間の制御可能な流体連通を維持するような接続、又は分離状態であってもよい。例えば、２つの別個の基板の間の制御可能な流体連通は、主チャネル２６をマイクロチャネル２２から検知コンパートメント１２に延びる可撓性チューブとすることにより行うことができる。検知コンパートメント及びチャンバが同じ基板上に形成される場合、それらは任意の位置関係で基板上に配置されてもよい。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、検知コンパートメントは、基板上ですべてのチャンバから離れた領域に配置され、本発明のいくつかの実施形態では、検知コンパートメントが中心に存在すると共に、チャンバが検知コンパートメントを少なくとも部分的に包囲するように分布させてもよい。
【０１０８】
システム１０は、弁２４のそれぞれを選択的に操作して、チャンバ２０からコンパートメント１２への流体の流れを制御するように構成されたコントローラ３０を備えることが好ましい。明確に図示するために、図９には、コントローラ３０と弁２４の１つとの間の１つのみの通信回線が示されている。しかしながら、少なくともいくつかの実施形態では、コントローラ３０と弁２４のそれぞれとの間に別個の通信回線が存在して、コントローラ３０が各弁を個々に、場合によっては独立して制御することが可能であることを理解されたい。
【０１０９】
コントローラ３０は、データプロセッサ（図示せず）を含む、又は汎用コンピュータ又は専用電気回路であってもよいプロセッサとつながっていてもよい。コントローラ３０は、データプロセッサのメモリ内に格納され得る所定の検知プロトコルに従って、弁２４を自動的に操作することが好ましい。例えば、コントローラは、２つの弁を開放して２つの流体を主チャネル２６内に流すことができ、主チャネル２６内で流体は混合し、また場合により反応し得る。コントローラ３０は、所定の量の流体がチャネル２６を通過した後、弁を閉鎖してもよい。あるいは、弁は、それらの開放状態のまま留まって、連続的な検知を可能にしてもよい。混合物及び場合により反応の生成物は、チャネル２６からコンパートメント１２内に流れてもよい。混合物又は反応生成物は、少なくとも標的分子１８を含む。コンパートメント１２内で、標的分子１８はナノ構造１４と官能性部分１６に接触してナノ構造１４の特性を変化させる。この特性の変化は、検出器３２により検出され得る。
【０１１０】
検出完了後コントローラ３０は（開放したままの場合は）弁を閉鎖して、コンパートメント１２への標的分子１８の供給を停止してもよい。その後、コントローラは他の弁を開放して、チャンバ２０の１つから洗浄流体を流してもよい。洗浄流体は好ましくはナノ構造１４の特性を分子１８との接触前の状態又はレベルに復元するように選択されてもよい。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態において、コンパートメント１２は、（例えば、洗浄操作の後）流体を排出することができる出口ポート３６を含む。コンパートメント１２からの流体の除去を容易にする出口チャネル３８がポート３６に接続されていてもよい。チャネル２６からコンパートメント１２内へ流体が流れる間にコンパートメント１２内で生成されるプラス圧力によって、流体をポート３６からチャネル３８内に流してもよい。あるいは、更に流体を当技術分野にて知られているように、チャネル３８内に（例えば、図示はしないがポンプを使用して）マイナス圧力を加えることによって、ポート３６を通ってチャネル３８内に流してもよい。
【０１１２】
検知システムのいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される試料コンパートメントは、１つ以上の検知システムとの組み合わせで使用され、１つ以上の検知システムは、ナノ構造を含む検知システムについて本明細書に記載されている通りのものであり、及び／又は、１つ以上の検知システムは、任意の他の検知システムである。
【０１１３】
本明細書に記載される任意の実施形態において、システム１０は、光学検査を可能にする少なくとも１つの透明な壁、基部又はカバーを有する１つ以上のチャンバを備えてもよい。そのようなチャンバは、チャンバ２０のいずれかであってもよく、又は専用チャンバであってもよい。光学検査専用のチャンバの代表的な例を図８に示し、当業者は本明細書を見ればそのような専用チャンバを他の実施形態（例えば、図１Ａ、９Ａ、９Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ及び１１Ｃに示す実施形態）に組み込む方法を理解するであろう。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、標的分子を検出するように構成された検知コンパートメントと、本明細書に記載される試料コンパートメントとを含む検知システムが提供される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、試料コンパートメントは複数のチャンバを含み、複数のチャンバは、それぞれ、対応するチャネル（例えばマイクロチャネル）と、チャネルに装着された対応する弁とを介して、同じ検知コンパートメントとの制御可能な流体連通にある。
【０１１６】
これらの実施形態のいくつかにおいて、システムは、各弁を選択的に操作するためのコントローラを更に備えて、チャンバから検知コンパートメントへの流体の流れを制御する。
そのようなシステムは、下記に更に詳細に記載するように、複数の試料をシステムに導入することにより多重モニタリングを行うことを可能にする。
【０１１７】
試料コンパートメントのマイクロチャネル、チャンバ、弁、基板、及び任意の他の特徴は、試料コンパートメントについて本明細書に記載される実施形態の任意の１つ、及び任意のそれらの組み合わせによるものであってもよい。
【０１１８】
検知コンパートメントは、標的分子との接触によって検出可能な変化を生じる任意の１つ又は複数の構造を含んでもよく、当技術分野にて既知の方法に基づいてそのように設計されてもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、検知コンパートメントは半導体ナノ構造を含み、本明細書に記載されるように、半導体ナノ構造は標的分子との接触によってその電気特性における検出可能な変化を示すように構成されている。ナノ構造は、その表面に官能性部分を生成する、若しくは官能性部分を結合することにより官能化されてもよく、又は官能化されていなくてもよい。
【０１２０】
本明細書の実施形態の検知システムは、これらに限定されるものではないが、化学的用途、遺伝学的用途、生化学的用途、薬学的用途、生物医学的用途、医療用途、放射線学的用途及び環境への用途を含む多数の用途に使用することができる。
【０１２１】
検知は標的分子が検知コンパートメントと接触すると検出可能な変化が生じるように選択され得る。
【０１２２】
医療用途の場合、本実施形態の検知システムは、後に記載及び例示するように、診断及び患者の管理に好適である。環境への用途の場合、本実施形態の検知システムは、空気又は水の汚染物質、化学的薬剤、生物有機体又は放射線の状況等の有害な材料又は状態を検出するのに好適である。遺伝学的及び生化学的用途の場合、本実施形態の検知システムは、「ラボ・オン・チップ」として知られる手法において、ＤＮＡ、及び他の巨大分子若しくはより小さい分子、又はそれらの分子間の反応を試験及び／又は分析するのに好適である。
【０１２３】
本実施形態の検知システムはまた、単一細胞の生化学的及び生物物理学的研究の領域にて使用することができる。例えば、検知システムは所定のタイプの細胞又細胞群を単離することができる。
【０１２４】
本実施形態のシステム及び方法は、多数のタイプの流体媒質中の標的分子、及び流体媒質中に存在する物体の存在の検知に使用することができる。この物体は、有機材料、無機材料、生物学的材料、高分子材料又は任意の他の材料を含んでもよい。例えば、流体媒質は、全血又は血液成分のいずれかである血液製剤を含んでもよく、その場合、物体は赤血球、白血球、血小板等であってもよい。流体媒質はまた、これらに限定されるものではないが唾液、脳脊髄、尿等を含む他の体液を含んでもよい。さまざまな緩衝液、及びこれらに限定されるものではないが、核酸溶液、タンパク質溶液、ペプチド溶液、抗体溶液などの溶液も考えられる。これらに限定されるものではないが、酸化成分、還元成分、酵素、受容体リガンド、細胞外成分、代謝産物、脂肪酸、ステロイドなどさまざまな生物学的及び化学的な成分も考えられる。
【０１２５】
流体媒質中の物体はまた、細胞、細菌、細胞小器官、血小板、巨大分子、ベシクル、リガンド等の可溶性因子に特異的な抗体で覆われたマイクロビーズ、遮られた（shaded）受容体、及び脂肪組織又は微生物を含む生物学的材料等が挙げられるが、これらに限定されない他の材料を含んでもよい。本明細書の実施形態のシステム及び方法により操作される物体はまた、ラテックス、ケイ素ポリアミド等の合成（高分子又は非高分子）材料から形成されてもよく、又はそのような材料を含んでもよい。物体は、光学的に可視又は透明であってもよい。物体は、光を放射し又は他の物体に接合されて、その検出を容易にしてもよい。
【０１２６】
２つ以上の検知コンパートメントを有する検知システム：
図１１Ａ〜Ｃは、本発明のいくつかの実施形態による、２つ以上の検知コンパートメント１２を備えたシステム２００の概略図である。本発明のいくつかの実施形態では検知コンパートメントは同じ基板の異なる領域上に形成され、本発明のいくつかの実施形態では検知コンパートメントは異なる基板上に形成されている。
【０１２７】
システム２００のチャンバ、チャネル及び検知コンパートメントの構造及び原理は、システム１０のチャンバ、チャネル及び検知コンパートメントと同様である。システム１０内で任意である特徴は、システム２００内でも任意である。明確に図示するために、図９Ａ、Ｂに見られるいくつかの参照番号は、図１１Ａ及び１１Ｂでは省略されている。
【０１２８】
複数の検知コンパートメントを有することの利点は、数個の検知アッセイが同じシステムによって同時に又は連続して実行できることである。本発明のいくつかの例示的な実施形態では各検知コンパートメント内のナノ構造が異なるタイプの標的分子を検知するように設計され、本発明のいくつかの例示的な実施形態では２つ以上の検知コンパートメント内のナノ構造が同じ標的分子を検知するように設計されているが、その同じ標的分子は、異なる物質若しくは活性を表すものであってもよいし、及び／又は、異なる試料由来であってもよい。
【０１２９】
各コンパートメントからの信号は別々に分析されて、例えばそこに含まれる異なった標的分子の存在、不在又はレベルを別々に決定してもよい。２つ以上のコンパートメント（例えば、全部のコンパートメント）からの信号はまた、各検知コンパートメントから信号の集合が標的分子（１種又は複数種）の存在を示すように集合的に分析されてもよい。
【０１３０】
図１１Ａの図面において、システム１０に関連して上記に更に詳細に説明したように、各検知コンパートメント１２は複数のチャンバ２０から供給を受けている。従って、例えばこれらの実施形態では、システム１０のような数個のシステムは、同じ基板上に形成されてシステム２００を形成してもよい。
【０１３１】
図１１Ｂの図面において、少なくとも１つのチャンバから（対応する弁２４を制御することにより）２つ以上の検知コンパートメント１２へ流体連通されてもよい。これらの実施形態によって、同じ物質に異なる検知アッセイを行うことが可能となる。
【０１３２】
図１１Ｃは、各検知コンパートメント１２が異なるチャンバ２０から供給を受ける構成を示す。対応する検知コンパートメント１２に供給するチャンバは、それ自体は他のチャンバから供給を受けてもよい。検知コンパートメント１２に直接供給するチャンバは、２０’で示され、チャンバ２０’に直接供給するチャンバは２０”で示されている。チャンバ２０”は、例えば、分析するべき試料を保持してもよく、チャンバ２０’は、標的分子が生成又は作製される条件を提供するように選択された流体を保持してもよい。例えば、チャンバ２０’は、生物学的及び／又は化学的試薬を収容してもよい。対応する弁が開放された際、試料がチャンバ２０”からチャンバ２０’へ流れ、それにより標的分子が作製される条件が満たされ、標的分子が対応する検知コンパートメント１２へ流れる。
【０１３３】
限定することを意図しない、より具体的な例を図８に示す。図８は、インキュベーターを備えた顕微鏡上のオール・インクルーシブ  ラボ・オン・チップを使用した、代謝産物の例示的な多重リアルタイムモニタリングの概略図を示す。ラボ・オン・チップは多細胞試料から標的細胞を単離し、単離された標的細胞は、中間の細胞培養ウェルに分注される。次いで、代謝産物を反応させてＲＯＳを生成し、溶液は下流の検知ウェルに移送される（ＬＯＸ：ラクテートオキシダーゼ；ＧＯＸ：グルコースオキシダーゼ；ＰＯＸ：ピルベートオキシダーゼ；ＳＯＤ：スーパーオキシドジスムターゼ；Ｐｉ：無機リン酸塩）。
【０１３４】
酸化・還元成分を検出するための検知システム：
本明細書に記載される検知システムとして、１つ以上の検知コンパートメント内にＳｉＮＷ（シリコンナノワイヤー）ＦＥＴアレイを使用する例を示した。本検知システムでは、シリコンナノワイヤーの少なくともいくつかが、その表面に官能基を導入することにより修飾され、官能基と酸化成分又は還元成分を含む試料との接触により、複数のナノワイヤーが電気特性における検出可能な変化を示す。この変化は、例えば代謝産物等の還元成分生成又は酸化成分生成物質の存在及び／又は量の指標となる。官能基は、例えば、酸化・還元反応を、好ましくは可逆的にできることが可能な基であってもよく、その酸化又は還元の結果、ナノワイヤー上の電子密度が変化する。
【０１３５】
より詳細には、本明細書に記載されるシステムとして、アミノ官能化シリコンナノワイヤーを９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリドと反応させて９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷを生成する例を示した（図１Ｃ参照）。例示的なアッセイでは、代謝産物を含有する溶液が検知コンパートメント内のＦＥＴアレイに到達する前に、オキシダーゼ酵素とのマイクロ流体混合を用いて培養コンパートメント内で小分子の水素生成代謝産物を過酸化物（Ｈ２Ｏ２）に変換するように、システムを操作した。次いで、得られた溶液をＦＥＴアレイに導入し、生成された過酸化物によってＦＥＴ表面上の９，１０−ジヒドロキシアントラセンを酸化して、９，１０−アントラキノンを形成する。この酸化反応は、表面電子密度を低下させて、ｐ型ＳｉＮＷ  ＦＥＴを通って流れる電流を増大させる。別のアッセイでは、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン（ＤＥＨＡ）等の還元成分の溶液を検知コンパートメントに導入し、９，１０−アントラキノンを９，１０−ジヒドロキシアントラセンに還元して表面電子密度を増大させる。こうして表面電子密度は酸化又は還元により変動し、測定される電流を変化させる。
【０１３６】
本明細書に記載される９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）センサアレイを含むシステムの構築に成功し、その特性を評価した（例えば、図１Ａ、１Ｂ、及び２Ａ〜２Ｄ参照）。その結果、前処理なしでも、過酸化物（図３Ａ、Ｂ参照）や過酸化物生成代謝産物（図４Ａ〜Ｃ参照）の検知、またはｐＨ検知（図５Ａ〜Ｃ参照）を生理学的溶液及び／又は培地中で行うと共に、生理学的濃度範囲全体に亘って濃度依存性の検知が実施可能であることが示された。本明細書に記載される例示的なシステムはまた、代謝活性とそれによる増殖率とをモニタリングすると共に、細胞の検知を行うことが示された（図６Ａ〜Ｉ参照）。ヒト慢性リンパ性白血病における代謝の有意性も検証された（図７Ａ、Ｂ及び表１参照）。
【０１３７】
本発明のいくつかの実施形態による、酸化・還元反応性ナノワイヤー検知コンパートメントとマイクロ流体ネットワークとを一体化した例示的なシステムは、生理学的溶液中で、所望により前処理なしで、細胞の代謝活性の多重リアルタイムモニタリングを実行することに成功した。例示的なシステムによる代謝活性のモニタリングをまた、癌代謝と抗癌剤の薬学的機構とを検証するために使用することに成功した。
【０１３８】
下記の実施例で示される結果は、本明細書に記載されるバイオ検知方法論が、例えばさまざまなＲＯＳ生成代謝産物を検出することにより、さまざまな代謝活性のモニタリング及び／又は分析に使用できることを明白に示している。そのようなシステムは、システムそのものとして、または本明細書に記載し、例えば、図８に示したようなオール・インクルーシブ  ラボ・オン・チップの一部としての使用に成功した。このような使用は、標的細胞の単離から、検知、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の促進、治療の有効性のモニタリング及び個別治療の促進のための治療中の代謝変化の検出に至るさまざまな診断及び治療用途において有効である。
【０１３９】
本明細書に記載される検知システムのいくつかの実施形態の態様によれば、酸化成分又は還元成分、あるいは酸化成分若しくは還元成分を生成する物質の検出に使用することができるシステムであって、上記成分のいずれかが一旦システム内に導入されたとき、又は成分がシステム内で生成されたときに、検出可能な変化を生じるものが提供される。
この態様による検知システムは、検知コンパートメントと制御可能な流体連通にある少なくとも１つのチャンバを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態によれば、チャンバは本明細書に記載され、かつ図９Ａ、Ｂに示されるように、流体を収容するように構成されている。
いくつかの実施形態によれば、検知システムは、本明細書に記載され、かつそれぞれ独立に図９Ａ、Ｂ、図１Ａ又は図１Ｂに示されたようなものである。
【０１４１】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかによれば、検知コンパートメントは、本明細書に記載され、かつ図９Ａ、Ｂに示されるような半導体ナノ構造を含む。
【０１４２】
本発明のこの態様によるシステムに関する任意の実施形態のいくつかによれば、検知は、ナノ構造に取り付けられた官能性部分であって、酸化・還元反応種との接触によって、ナノ構造が検出可能な電気特性の変化を生じるように選択された官能性部分を用いて実行される。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、また当技術分野においては、「酸化・還元反応種」とは酸化成分又は還元成分のいずれかとして酸化・還元反応又は還元−酸化反応に関与でき、かつ他の物質の１つ以上の原子の酸化数を変更することが可能な部分又は化合物を指す。この表現は、本明細書全体を通して、酸化成分及び還元成分の両方を指すように使用される。
【０１４４】
本明細書全体を通して、本発明の任意の態様に関して本明細書に記載される実施形態の任意の１つにおいて、「酸化／酸化性成分（oxidizing/oxidative agent）」又は「酸化／酸化性部分（oxidizing/oxidative moiety）」又は「酸化／酸化性種（oxidizing/oxidative species）」と称されることもある「酸化成分（oxidizer）」は、他の物質の１つ以上の原子の酸化数を増大させることが可能な部分、種又は化合物を示す。一般に、そのような変更は、他の物質からのプロトンを酸化部分又は酸化性化合物に転換することを含む。
【０１４５】
本明細書に記載される検知システムを使用して検出されるのに好適な例示的な酸化成分としては、活性酸素種（ＲＯＳ）、又は活性酸素種により生成される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本明細書全体で使用されるとき、また当技術分野において周知のように、活性酸素種は、酸素原子がフリーラジカル型である（不対電子を有する）酸素含有分子及び／またはイオン、あるいは酸素フリーラジカルまたは一重項状態の酸素を１つ以上用いる化合物種を容易に生成する分子及び／またはイオンを含む。例としては、これらに限定されるものではないが、オゾン、過酸化物、ＲＯ・、及びＲＯＯ・（式中、Ｒは、有機部分又は水素である）が挙げられる。水又は任意の他のプロトン性溶媒の存在下、ＲＯＳは一般に過酸化水素を生成する。従って、過酸化水素又は任意の他の過酸化物は、本発明のいくつかの実施形態における例示的な酸化成分である。
【０１４７】
本明細書全体を通して、本発明の任意の態様に関して本明細書に記載される実施形態の任意の１つにおいて、「還元／還元性成分（reducing/reductive agent）」又は「還元／還元性部分（reducing/reductive moiety）」又は「還元／還元性種（reducing/reductive species）」と称されることもある「還元成分（reductant）」は、他の物質の酸化数を低下させることが可能な部分、化学種又は化合物を意味する。典型的には、そのような変更は、還元成分からプロトンを他の物質へ転換することを含む。
【０１４８】
好適な還元成分は、例えば１つ以上のプロトンを放出した時に安定なアニオンを形成する部分又は化合物種を含む。そのような例示的な成分としては、例えば、１つ以上のプロトンの放出後に安定なエノラートアニオンを形成するヒドロキシル基含有成分が挙げられる。アミン−オキシド基を含む化合物又は部分も、本明細書に例として挙げられる。Ｎ−アルキル−又はＮ，Ｎ−ジアルキル−ヒドロキシルアミン（例えばＤＭＨＡ）は、代表例として挙げられる。任意の他の既知の還元成分も考えられる。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば官能性部分は酸化・還元反応部分であり、その部分は酸化・還元成分との接触によりその原子のうちの１つ以上の酸化数に変化が生じる。
【０１５０】
好ましくは、官能性部分は、還元状態から酸化状態、及びその逆に容易に転換できるものである、即ち、低いエネルギー障壁でその原子の酸化数が変化することを特徴とするようなものである。官能性部分は１つ以上の原子の酸化数が可逆的に変化する、即ち、可逆的酸化・還元変化又は転換を特徴とするようなものと見なすことができる。部分又は基の可逆的酸化・還元変化は、例えばサイクリック・ボルタンメトリー測定によって決定することができる。
【０１５１】
例示的な官能性部分は、約−１．０〜約１．０ボルト、又は−０．８〜０．８ボルト、又は−０．６〜０．６ボルト、又は−０．５〜０．５ボルト、又は−０．４〜０，４ボルト、又は−０．３〜０．３ボルト又は−０．２〜０．２ボルト、又は−０．１〜０．１ボルトの範囲、及びより低い電位、及びそれらの間の任意の値の酸化・還元電位を特徴とするものである。
【０１５２】
官能性部分は、本明細書に記載される可逆的酸化・還元変化をすることが可能な少なくとも１つの官能基を含んでもよい。
【０１５３】
官能性部分に関して本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、官能性部分の長さは、２ｎｍ未満、１．５ｎｍ未満、更には１ｎｍ未満である。これにより、電荷移動錯体の形成がナノ構造の表面付近で生じ、それにより装置の感度を向上させることが可能となる。
【０１５４】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、官能性部分は、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、更には１マイクロメートル以上のデバイ長を有するように選択される。
【０１５５】
本明細書で使用する場合、また当技術分野においては、「デバイ長」とはその全体にわたって有意な電荷分離が生じ得る距離を示す。
【０１５６】
例示的な官能性部分は、当技術分野にて周知のケト−エノール互変異性化を経ることが可能な少なくとも１つの官能基を含む。
ケト−エノール互変異性化を経ることが可能な１つ以上の官能基を含む部分としては、例えばキノン部分が挙げられ、以下のスキーム１により集合的に表すことができる：
【０１５７】
【化１】
0006609247.tif 000002
【０１５８】
式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、ハロ、トリハロアルキル、アルコキシ、カルボキシ、及び本明細書に記載される任意の他の化学的な適合性を有する置換基からなる群から選択される、あるいは、Ｒ１とＲ２及び／又はＲ３とＲ４は共に置換又は非置換であってもよい炭素環を形成する。
【０１５９】
炭素環は、５員又は６員の芳香族環又は脂環式環を包含する。本明細書に定義される複素環及び複素芳香族環もでもよい。
【０１６０】
Ｒ１とＲ２及びＲ３とＲ４の一方又は両方は置換又は非置換であってもよい芳香族環（複素芳香族環を含む）を共に形成することが好ましい。そのような部分は、本明細書では芳香族キノンと称され、例えば、本明細書に記載されるような、それぞれ置換又は非置換のベンゾキノン、アントラキノン、フェナントレンキノンを含む。
【０１６１】
上記のスキーム１において、左の部分（Ａ）は、還元状態（酸化数の減少した）原子を特徴とし、右の部分（Ｂ）は、酸化数の増加した原子を特徴とし、２つの状態間の転換は、プロトン移動により達成され、本明細書で酸化・還元変化又は酸化・還元転換と称される。
【０１６２】
酸化成分の検出のために、スキーム１の左の部分は、ナノ構造表面上の官能性部分の生成に使用される。そのような部分は、酸化成分の存在下で電子非局在化及びプロトン損失を経て、スキーム１の右の部分Ｂを生成する。
還元成分の検出のために、右の部分が使用される。
【０１６３】
本明細書に記載される酸化・還元反応性官能性部分に含まれ得る更なる例示的な官能基としては、下記のスキーム２〜４に示すＮＡＤＨ及びその類似体、スキーム５に示すＦＡＤＨ２及びその類似体、スキーム６に示すフェロセン並びにその類似体、誘導体及び金属錯体、ポルフィリンを生成させる有機金属錯体、フェロシアニド及びその類似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
【化２】
0006609247.tif 000003
【０１６５】
【化３】
0006609247.tif 000004
【０１６６】
式中、Ｒ及びＲ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、ハロ、トリハロアルキル、アルコキシ、カルボキシ、及び本明細書に記載される任意の他の化学的な適合性を有する置換基からなる群から選択される、あるいは、Ｒ１とＲ２及び／若しくはＲ３とＲ４は共に本明細書に定義される置換又は非置換であってもよい炭素環を共に形成する。
【０１６７】
例示的なそれらの官能性部分を、下記のスキーム４に示す。
【０１６８】
【化４】
0006609247.tif 000005
【０１６９】
【化５】
0006609247.tif 000006
【０１７０】
式中、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、ハロ、トリハロアルキル、アルコキシ、カルボキシ、及び本明細書に記載される任意の他の化学的な適合性を有する置換基からなる群から選択される、あるいは、Ｒ２〜Ｒ６の２つ以上は本明細書に定義される置換又は非置換であってもよい炭素環を共に形成する。
【０１７１】
【化６】
0006609247.tif 000007
【０１７２】
式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、ハロ、トリハロアルキル、アルコキシ、カルボキシ、及び本明細書に記載される任意の他の化学的に適合性を有する置換基からなる群から選択される、あるいは、Ｒ１〜Ｒ４の２つ以上は、本明細書に定義される置換又は非置換であってもよい炭素環を共に形成し；
Ｘは、水素、又は、好ましくは金属原子若しくはイオンであり、追加の１つ以上の同じ又は異なってもよいフェロセン部分で更に置換されていてもよい。なお、複数のフェロセン部分が存在する場合、酸化・還元反応でフェロセン部分の数に対応する電子移動が行われる。
【０１７３】
例示的であるが、限定されることのないポルフィリンを生成する有機金属錯体としては、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）及び銅（Ｃｕ）等の遷移金属と錯化したポルフィリン、テトラメチルピリジルポルフィリン［５，１０，１５，２０−テトラキス（１−メチル−４−ピリジニオ）−ポルフィン］（ＴＭＰｙＰ）；テトラヒドロキシフェニルポルフィリン［５，１０，１５，２０−テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン）（ＴＰ（ＯＨ）Ｐ）；テトラフェニルポルフィリン［５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン）（ＴＰＰ）；４，４’，４”，４”’−（ポルフィン−５，１０，１５，２０−テトライル）テトラキス（ベンゼンスルホン酸）（ＴＢＳＰ）；ヘマトポルフィリン；プロトポルフィリンＩＸ、クロロフィル、ヘム及びコリンが挙げられる。他の金属とポルフィリンを生成するリガンド及び任意のそれらの組み合わせも考えられる。
【０１７４】
酸化・還元反応部分を検出するための検知システムに関して本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかによれば、酸化・還元反応部分は酸化成分であり、官能性部分は、その還元状態にあり、従って酸化成分との接触によって酸化されることによって、ナノ構造の電気特性の変化を生じる。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、官能性部分が酸化成分によって酸化された際、ナノ構造表面上の電子密度が低下する。官能性部分が還元された際、ナノ構造表面上の電子密度が増大する。
【０１７６】
この点に関して、図１Ｄと実施例１の記載とを参照すると、この態様に記載される検知システムの操作モードに関する実施形態が例示されているが、これらは例示的であるが、限定されることのない実施形態を記載するものとして解釈すべきである。
【０１７７】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかでは、官能性部分は、直接又はリンカーを介して、官能性部分内の反応性基と、ナノ構造の表面上の適合性を有する反応性基との間に形成される共有結合を用いて、ナノ構造の表面に共有結合される。
【０１７８】
ナノ構造の表面上の反応性基は、ナノ構造表面に固有のもの、または好適な処理によって生成されたものでもよい。ナノ構造がＳｉＮＷ又はケイ素ナノチューブであるいくつかの実施形態では、ナノ構造の表面上に遊離ヒドロキシル基がもともと存在し、官能性部分を取り付けるために使用され得る。
【０１７９】
あるいは、本明細書に記載されるナノ構造は、表面反応性基を生成するように最初に表面修飾される。そのような表面修飾は、例えば、ナノ構造表面上の固有の官能基に二官能性リンカー分子を取り付けることにより行われてもよく、その二官能性リンカー分子は、これら固有の官能基と結合を形成可能な反応性基を一端に含み、本明細書に記載される官能性部分又はその中の反応性基と結合を形成できる反応性基を他端に含む。
【０１８０】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、官能性部分は、ナノ構造に取り付けられる前に、ナノ構造表面上の反応性基と容易に反応しうる反応性基を含む。これは、本明細書に記載されるナノ構造表面と共有結合を形成するためである。
【０１８１】
所望のナノ構造上の官能基に対して適合性を有する反応性基の選択は、特に本明細書に提供されるガイドラインを考慮すれば当業者であればだれでもなしうる。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、ナノ構造がＳｉＮＷ又はケイ素ナノチューブの場合、官能性部分は、ナノ構造表面上の遊離ヒドロキシ基と共有結合を形成可能な反応性基を含む。例示的なそのような反応性基としては、脱離基として作用してエーテル結合を形成できるハロゲン化物及びアルコキシド、エステル化又はエステル交換を介してエステル結合を形成できるカルボン酸又はエステル、並びに−Ｓｉ−Ｏ−結合を形成できるハロシラン及びオルトシリケートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、官能性部分は、本明細書に記載される結合の任意の１つを介してナノ構造に結合される。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、官能性部分は、本明細書に記載されるように二官能性リンカーを介してナノ構造に取り付けられる。
【０１８５】
例示的なそのようなリンカーは、ケイ素ナノ構造表面に固有のヒドロキシル基と−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形成するためのＳｉに結合された１つ、２つ又は３つの−ＯＲ基と、本明細書に記載される官能性部分の反応性基と反応することが可能な反応性基を末端とする１つ、２つ又は３つの炭化水素基（例えばアルキル、アルキレン、シクロアルキル、アリール）とを含み、Ｓｉ原子に結合した基の総数が４となるようなオルトシリケートから誘導されたものである。
【０１８６】
例示的な実施形態では、リンカーは、Ｓｉ原子に結合したアミノアルキル基、１つ以上のアルキル基、及び１つ以上のアルコキシ基を含むオルトシリケートである。一例において、リンカーは、（３−アミノアルキル）−オルトシリケートジメチル−エトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）から誘導されたものである。そのようなリンカーは、ナノ構造の表面上に反応性アミン基を生成する。他の反応性基を末端とする、例えば本明細書に記載されるものと同様のオルトシリケートも考えられる。
【０１８７】
上述したように、官能性部分は、ナノ構造表面上の反応性基に対して適合性を有する反応性基を用いてナノ構造に取り付けることができる。本明細書に記載される官能性部分は、本明細書に記載される酸化・還元反応性を特徴とする化合物に由来し、その化合物は、直接又は間接的に（例えばリンカーを介して）結合した、本明細書に記載される反応性基を更に含む。
【０１８８】
本明細書のスキーム１、３、５及び６に示された化合物に関して、反応性基は、任意の１つ、又は本明細書に記載されるＲ１〜Ｒ４、又はＲ１〜Ｒ６、又はＲ１とＲ２及び／またはＲ３とＲ４から形成された炭素環上の置換基、又はＲ１〜Ｒ４、又はＲ２〜Ｒ６であってもよく、又はそれらの一部を（置換基として）形成してもよい。
【０１８９】
ポルフィリンを生成する錯体の場合、反応性基は、ポルフィリン型配位子の置換基であってもよい。
【０１９０】
例示的な実施形態において、官能性部分は、スルホネート反応性基及びアミン反応性基によって形成されたスルホンアミド結合を介して、ナノ構造に取り付けられる。
【０１９１】
例示的な実施形態において、官能性部分は、本明細書に記載されるキノンであり、好ましくは、スルホネート含有置換基を１つ以上含む芳香族キノンである。例示的な実施形態では、そのような官能性部分は、スルホンアミド結合を用いて、アミン基を有する修飾ナノワイヤーに取り付けられる。
【０１９２】
金属含有錯体である官能性部分は、上述したようにナノ構造に共有結合することができる。その代わりに、または追加として、ナノ構造表面に非共有結合的に吸収されてもよい。
【０１９３】
多成分システム：
本明細書に記載した検知システムの任意の１つ、及び検知システムの実施形態の任意の１つに関して、検知システムは、本明細書に記載されるナノ構造を含む複数の、同じ又は異なってもよい検知コンパートメントを備えてもよい。
【０１９４】
これらの実施形態のいくつかにおいて、複数の検知コンパートメントの１つ以上又はそれぞれは、独立して、本明細書に記載される酸化・還元成分又は化合物種を検出するための検知コンパートメントであってもよく、本明細書に記載される実施形態の任意の１つによる検知コンパートメントであってもよい。
【０１９５】
本明細書に記載される検知システムの任意の１つ、及びその実施形態の任意の１つに関して、検知システムは、本明細書に記載されるナノ構造ベースの検知コンパートメントに加えて、追加の検知コンパートメント又は装置を更に備えてもよい。あるいは、任意の他の検知コンパートメントを備えてもよい実施形態に関しては、ナノ構造ベースの検知コンパートメントの代わりに、追加の検知コンパートメント又は装置を備えてもよい。
【０１９６】
例示的な検知装置又はコンパートメントとしては、例えば、光学検知装置又はコンパートメントが挙げられる。
【０１９７】
半導体ナノ構造検知コンパートメントを備えた検知システムに関して本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、システムは、半導体ナノ構造を有さず、かつ試料コンパートメントのチャンバの１つ以上と流体連通している追加の１つ以上の検知コンパートメントを備えてもよく、前記追加の検知コンパートメント又は装置は、この追加のコンパートメントからの信号を受信するように構成されている。
【０１９８】
検知方法：
本明細書に記載される任意の実施形態のうちのいくつかの態様によれば、標的分子の検出方法が提供される。
【０１９９】
本明細書に記載される検知システムの任意のものは、標的分子を含む又は標的分子を生成する試料を、本明細書に記載される試料コンパートメントに導入することにより、標的分子を検出するのに有用である。
【０２００】
「導入する」とは、配置する、注入する、インキュベートする、流す（例えばマイクロチャネルを用いて）等、及び任意のそれらの組み合わせを包含する。
【０２０１】
検知システムが試料コンパートメント内に２つ以上のチャンバを備える場合、２つ以上の試料を試料コンパートメントに導入し、それぞれを異なるチャンバに導入してもよい。次いで、各チャンバと検知コンパートメントとの間の流体連通を制御することにより、両方の試料について同時に又は連続して検知を達成し得る。
【０２０２】
検知が連続して行われる場合、連続的な検知の間に検知コンパートメントの洗浄を行ってもよい。
いくつかの実施形態において、試料コンパートメントは、以降更に詳細に記載されるように、洗浄流体（例えば洗浄溶液）を収容するチャンバを更に含む。
【０２０３】
本明細書で使用する場合、また当技術分野においては、「検出する」とは標的分子の存在及び／又は量を決定することを包含する。
【０２０４】
本明細書で使用する、「標的部分」や「標的種」と称されることもある「標的分子」、検出可能な部分又は検出可能な化合物種は、検知コンパートメントと接触し、検出可能な変化を誘導する化合物、部分又は化合物種を示す。
【０２０５】
本方法で使用する検知コンパートメントは、本明細書に記載されるように、標的分子が検知コンパートメントと接触した際に検出可能な変化が生じるように設計されている。
【０２０６】
この態様による実施形態のいくつかにおいて、標的分子の存在及び／又は量の決定は、標的分子を生成又は製造する、試料の成分の存在及び／又は量の指標となる。
【０２０７】
これらの実施形態のいくつかにおいて、標的分子の生成又は作製はインサイチューで行われる、即ち、標的分子が生成／作製される条件下に導入した試料を供した後に行われる。
【０２０８】
そのような条件としては、例えば、試料又は試料の成分と反応して、標的分子を直接又は間接的に生成する試薬が挙げられる。
他の条件としては、例えば試料をｐＨ調整剤と接触させることにより、試料のｐＨを変更することが挙げられる。
【０２０９】
標的分子が生成される条件下に導入した試料を供するとは、例えば、試薬の溶液を試料コンパートメント内のチャンバの１つに収容し、試料を収容するチャンバと試薬を収容するチャンバとをそれぞれ検知コンパートメントと流体連通させることにより達成することができる。流体連通は、両方のチャンバから同時に行われることが好ましいが、短い時間間隔で連続して行われてもよい。
【０２１０】
あるいは、２つのチャンバ間と、場合により追加のチャンバとに流体連通させた後に、検知コンパートメントへの流体連通を行う。
【０２１１】
これらの実施形態の任意の１つにおいて、標的分子を生成する条件を提供するチャンバは、検知システムの一部を形成する。
【０２１２】
更に、上記に代わり、チャンバと検知コンパートメントとの間を流体連通させるに先だって、試料が導入されたものと同じチャンバに試薬を添加する。試薬及び試料はまた、同じチャンバに同時に導入してもよい。
【０２１３】
２つ以上の試料について、検出可能な部分を分析する場合、試料のそれぞれは、独立して、本明細書に記載される条件に供してもよい。
【０２１４】
検知方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、使用される検知システムは、本明細書に記載されるように、酸化・還元成分を検知するためである。
【０２１５】
本明細書に記載される検出方法の実施形態のうちの任意の１つの態様によれば、１つ以上の流体試料中の酸化・還元成分の存在及び／又は量を決定する方法が提供される。
【０２１６】
この態様のいくつかの実施形態において、この方法は、酸化・還元成分について本明細書に記載される検知システムに試料（１つ又は複数）を導入することにより実施する。
【０２１７】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、試料が試料コンパートメント内のチャンバに導入された後、又は酸化・還元成分が生成される条件に試料が供された後、チャンバを検知コンパートメントと流体連通させることにより検出が行われる。
【０２１８】
上述したように、検知コンパートメントは、酸化・還元成分との接触によって検知コンパートメントを形成しているナノ構造の電気特性における検出可能な変化が達成され、試験された試料中の酸化・還元成分の存在及び／又は量の指標となるようなものである。
【０２１９】
本方法は、１つ以上の試料を試料コンパートメントに導入することにより、及び／又は、これらの試料の１つ以上を、酸化・還元反応種を生成する条件に供することにより実施してもよい。
【０２２０】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、本方法は、１つ以上の流体試料中の、酸化成分又は還元成分を生成する物質の存在及び／又は量を決定するためのものであり、流体試料の１つ以上を物質を酸化・還元成分を生成する反応条件に供することを更に含んでもよい。
【０２２１】
これらの任意の実施形態のいくつかの例示的な実施形態において、試料中の物質が酸化・還元成分を生成するような反応条件としては、酸化又は還元条件が挙げられ、いくつかの例示的な実施形態では、条件はｐＨ調整を含む。
【０２２２】
これらの条件は、例えば、好適な化学的試薬、又は例えば、酵素、受容体リガンド、ホルモン等の生物学的活性化剤を用いて提供することができる。
【０２２３】
これらの任意の実施形態のいくつかにおいて、試薬は、物質からの酸化成分又は還元成分の生成を触媒する、例えばオキシダーゼ又はレダクターゼ等の酵素である。
【０２２４】
これらの任意の実施形態のいくつかにおいて、異なる試料には異なる反応条件（例えば、試薬）が使用され、本方法は、本明細書に記載されるように、（その条件に供された後に）試料を検知コンパートメントに流体連通させるに先だって、各試料をその対応する条件に供することにより達成される。
【０２２５】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、酸化・還元成分は、本明細書に記載される酸化成分、例えばＲＯＳ又はそれによって生成された過酸化物である。
【０２２６】
これらの実施形態において、検知コンパートメント内の官能性部分としては、酸化成分と相互作用することが可能であると同時に、本明細書に記載されるように、ナノ構造の電気特性の変化を達成するものが選択される。
【０２２７】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、試験試料は、本明細書に記載される酸化成分（例えばＨ２Ｏ２）を含む。
【０２２８】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、試験試料は、酸化成分を生成する物質を含み、本方法は、試料中のこの物質の存在及び／又は量を決定するためである。
【０２２９】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、物質は、好適な条件下で酸化成分を生成する代謝産物である。
ほぼいずれの生物学的代謝産物も、例えば、酵素反応又は化学的試薬等の生物学的代謝産物からＲＯＳを生成し、続いてＨ２Ｏ２を生成する条件に供され得る。
【０２３０】
非限定的な例としていくつか列挙すれば：
ラクテートオキシダーゼの触媒する反応においてＨ２Ｏ２を生成する乳酸塩；
グルコースオキシダーゼの触媒する反応においてＨ２Ｏ２を生成するグルコース；
無機リン酸塩及び酸素の存在下でＨ２Ｏ２を生成するピルビン酸塩；
キサンチンオキシダーゼの触媒する反応においてＨ２Ｏ２を生成するヒポキサンチン；
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの触媒する反応において超酸化物を生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ；
スーパーオキシドジスムターゼの触媒する反応においてＨ２Ｏ２を生成する超酸化物（Ｏ２−）、
対応するアルデヒドオキシダーゼの触媒する反応においてＨ２Ｏ２を生成するアルデヒドが挙げられる。
【０２３１】
同様に、いくつかの代謝産物は、対応する酵素レダクターゼ、デヒドロゲナーゼ又は還元的な化学環境（例えばＨ２存在環境）に供された後、本明細書に記載されるように還元成分を生成する。代謝産物又は任意の他の物質（例えば、生物学的物質）が酸化成分又は還元成分を生成する任意の他の条件も本明細書にて考えられる。
【０２３２】
酸化・還元反応部分又は酸化・還元反応部分を生成する物質を検出する例示的な一般的方法においては、本明細書に記載される試料を試料コンパートメント内のチャンバに導入し、所望により、１種以上の条件、例えば培養条件、化学的条件、治療条件、及び／又は、酸化・還元反応部分を生成するための条件、に供した後、酸化・還元成分の検知に関して本明細書に記載される実施形態の任意の１つに従って、酸化・還元成分を検出するために検知コンパートメントに流体連通する。
【０２３３】
例示的な一実施形態において、酸化・還元成分、例えば過酸化水素等を含有する溶液は、試料コンパートメント内のチャンバに導入した後、本明細書に記載されるように、酸化・還元成分のための検知コンパートメントと流体連通する。検知コンパートメントにより生成される信号は、代謝産物の存在及び／又は量の指標となる。
【０２３４】
例示的な一実施形態において、代謝産物を含有する溶液、所望により生理学的溶液（例えば、生理学的媒質）は、本明細書に記載される試料コンパートメント内の１つのチャンバ（例えば、試料チャンバ）に導入される。代謝産物が酸化・還元成分を生成する条件（例えば、好適なオキシダーゼ又は化学的試薬）を含む溶液が、試料コンパートメント内の他のチャンバ（例えば、試薬チャンバ又は条件チャンバ）に導入される。２つのチャンバは流体連通され、所望により第３のチャンバ（例えば、試験チャンバ）に流され、次いで第３のチャンバは、本明細書に記載される検知コンパートメントと流体連通される。検知コンパートメントにより生成される信号は、代謝産物の存在及び／又は量の指標となる。
【０２３５】
さまざまな濃度のさまざまな代謝産物に関してこの方法によって生成された信号の参照データを使用して、後に更に詳細に述べるように、より複雑な試料から獲得されたデータを処理して、細胞の代謝活性のモニタリング及び分析を行えば、それにより、例えば異常な代謝活性又は代謝活性の改善を測定することができる。
【０２３６】
本明細書全体を通して、「条件」は、化学的試薬、生物学的試薬、生物学的条件（例えば、培地）、加熱、放射線、療法（例えば、医薬、又は放射線等の任意の他の治療）等を包含する。
【０２３７】
例示的な一実施形態において、細胞は、試料コンパートメント内の１つのチャンバに導入され、培養条件に供される。例えば、試料コンパートメント内の１つのチャンバ（例えば、第１の試薬チャンバ）内に保管されている培地は、細胞を収容するチャンバ（例えば、試料チャンバ）と流体連通される。その後、培養された細胞が、場合により生存率アッセイに供されて、生存細胞の数、及び／又は細胞の増殖率が決定される。例えば、チャンバ内の培養細胞の一部分は、生存率アッセイ又は増殖アッセイのための条件を含む他のチャンバと流体連通されてもよい。又、培養細胞の一部分は、他の条件、例えば、療法又は療法薬（例えば、医薬、又は任意の他の治療）に供され、医薬又は治療の存在下（例えば、第１の試薬チャンバ内）で培養されてもよい。更に、細胞は、最初に培養された後、医薬又は治療を含むチャンバ（例えば、第２の試薬チャンバ）に流されることにより、医薬又は他の治療に供されてもよい。あるいは、細胞は他のチャンバに流されてもよく、また医薬又は治療を含む溶液は異なるチャンバに導入され、細胞と同じチャンバ（例えば、試料チャンバ）に流されてもよい。
【０２３８】
療法又は療法薬（例えば、医薬又は治療）の条件の代替として、又はその条件に加えて、細胞溶液（療法あり及び／又はなし）は、上記に記載した酸化・還元反応部分を生成する条件に供されてもよい。例えば、療法に供された細胞は、更なる他のチャンバ（例えば、試験チャンバ）に流され（流体連通され）、条件溶液もそのチャンバに流される（流体連通される）。次いで、このチャンバは検知コンパートメントと流体連通される。療法に供されていない未処理の細胞は、同様に酸化・還元成分を生成する条件に供され、検知コンパートメントと流体連通される。
【０２３９】
本明細書に記載される複数の検知コンパートメントを備えたシステム内で、本明細書に記載される細胞試料はそれぞれ１つの検知コンパートメントに流体連通されてもよい（例えば、図１１Ｃ参照）。
【０２４０】
上述したすべてのチャンバで獲得された検知データは、細胞、所望により医薬又は他の治療等の条件に供された後の細胞の代謝活性の指標となり得るものである。
【０２４１】
方法に関して本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかにおいて、チャンバが本明細書に記載されるように検知コンパートメントと流体連通された後、試料コンパートメントの１つ以上のチャンバ内に存在する１つ以上の洗浄溶液が検知コンパートメントと流体連通される。これらの実施形態のいくつかでは、洗浄溶液は、官能性部分を「正常化」、即ち官能性部分の酸化状態を初期の酸化状態に変化させるために使用される。例えば、洗浄溶液を使用して、酸化標的部分により酸化された官能性部分をその還元状態に変える、又は、還元成分標的部分により還元された官能性部分をその酸化状態に変える。上記に代えて、または上記に加えて、ｐＨ調整剤を含有する溶液を洗浄溶液として使用する。
【０２４２】
あるいは、本明細書に記載される方法のステップの任意の１つにおいて、下記の実施例に例示されるように、ｐＨ検知も行うことができる。
【０２４３】
試料：
本明細書に記載される検知システムの任意の１つに導入される試料は、例えば、本明細書に記載するように、標的部分や、標的部分を生成する物質を含有する溶液であってもよい。
【０２４４】
あるいは、より複雑な試料、例えば細胞、生物学的試料、細胞を含む生物学的試料などであり、それぞれの試料は、更に上記一般記載に述べたような、薬剤、試薬、媒質等を追加で含み得る。
【０２４５】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかでは、試料は細胞を含み、本方法は細胞内の標的部分（例えば、本明細書に記載される酸化・還元成分）又は酸化・還元成分を生成する物質の存在及び／又は量を決定するのに使用されてもよい。
【０２４６】
物質が代謝産物である場合、本方法は、細胞の代謝活性を決定、モニタリング及び／又は分析するのに使用されてもよい。
【０２４７】
本明細書では、「細胞」は、上記の代謝活性が測定され得る原核生物又は真核生物細胞を指す。細胞は、細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物の細胞であってもよい。特定の実施形態によれば、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、単一細胞を指し得るが、複数の細胞も指し得ることが理解されるであろう。細胞は、（組織を構成していない）単離された細胞、又は組織若しくは組織断片中の細胞であってもよい。特定の実施形態によれば、細胞がＰＢＭＣである場合、アッセイは１０３〜１０１０の細胞に対して行われる。特定の実施形態によれば、細胞の数は１０６〜１０７である。
【０２４８】
細胞は、分化した細胞、分化していない細胞（例えば、幹細胞）又は脱分化した細胞であってもよい。
一実施形態によれば、細胞は、免疫系の細胞、即ち白血球（white blood cell）（即ち、白血球細胞（leukocyte））である。例としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球（Ｔ細胞又はＢ細胞）、単球、マクロファージ及び樹状細胞が挙げられる。
【０２４９】
別の実施形態によれば、細胞は、例えば癌細胞等の、任意の組織の病原性細部又は罹患細胞である。本教示に従って検出され得る他の疾病及び医学的状態を、下記に示す。
【０２５０】
本教示に従って分析され得る他の細胞としては、胚細胞（ＩＶＦ適格性診断のため）、赤血球、血小板、細菌感染細胞、真菌感染細胞、及びウィルス感染細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５１】
すなわち細胞は、単離した細胞集団であって、特定細胞からなる高純度のサブセット、例えば、同型遺伝子細胞集団（例えば、純度＞８０％）であるＴ細胞など、またはさまざまな種類の免疫細胞を含む異型遺伝子細胞集団である末梢血白血球（ＰＢＬ）や単核細胞などであり得る。
【０２５２】
細胞は、培養されていない一次細胞、培養された一次細胞、又はクローン細胞（例えば細胞株）であってもよい。
細胞は、付着細胞、又は懸濁液中の細胞であってもよい。
【０２５３】
更なる実施形態によれば、細胞は、遺伝子操作されていなくても、又は遺伝子操作されていてもよい。
【０２５４】
本明細書に記載される任意の実施形態のいくつかによれば、それぞれが異なる細胞又は異なる細胞の溶液を含む２つ以上の試料を、システムに同時に導入してもよい（例えば各試料を、試料コンパートメント内の異なるチャンバに導入する）。試料は前処理をせずに導入されてもよい。
【０２５５】
これらの試料のそれぞれは、本明細書に記載されるように、検知を行う前に同じ又は異なる条件に供されてもよい。
同じ試料は異なる条件に供されてもよく、検知はそれぞれ供された後に行われる。
【０２５６】
本明細書に記載される試料は、細胞生物学的試料であってもよい。
例示的な細胞生物学的試料としては、血液（例えば、末梢血白血球、末梢血単核細胞、全血、臍帯血）、固形組織生検材料、脳脊髄液、尿、リンパ液、並びに呼吸器、腸管及び泌尿生殖器管のさまざまな外分泌物、滑液、羊水、並びに絨毛膜絨毛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５７】
生検材料としては、切開若しくは切除生検を含む外科生検材料、細針吸引物等、完全切除物、又は体液が挙げられるが、これらに限定されない。生検材料の回収方法は、当技術分野にて周知である。
【０２５８】
システムに導入する際に、本明細書に記載される任意の試料中の細胞は、導入したチャンバ内において、生理学的培地中や追加の試薬（例えば、本明細書に記載されるような医薬）の存在下で増殖させてもよい。
【０２５９】
用途：
本明細書に記載される検知方法は、多様な診断及び療法の用途に使用することができる。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、細胞を含む少なくとも１つの流体試料は更に療法薬を含み、本明細書に記載される方法は、治療薬との接触後の細胞の活性を決定又はモニタリングするために使用される。
このような方法は、細胞に対する治療薬の有効性を決定するのに使用することができる。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、物質は代謝産物であり、本方法は細胞の代謝活性（ＭＡ）をモニタリングするためのものである。
【０２６２】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、細胞の代謝活性のモニタリング方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される任意の検知システムに細胞を導入することにより達成され、代謝産物が標的部分を生成する条件下に細胞を供し、標的部分を検知コンパートメントと流体連通させてもよい。
【０２６３】
この態様のいくつかの実施形態では、細胞を本明細書に記載されるシステムに導入し、そこで培養した後、培養細胞の一部をそれぞれ異なるチャンバと流体連通させて、それぞれを異なる条件に供してもよい。次いで各条件の各チャンバを、本明細書に記載されるように好適な検知コンパートメントと流体連通させてもよい。
【０２６４】
この態様のいくつかの実施形態では、検知コンパートメントの１つ以上は、酸化・還元反応部分の検出のための検知コンパートメントであり、細胞は本明細書に記載されるように、代謝産物が酸化・還元反応部分を生成する条件に供される。
【０２６５】
細胞の代謝活性のモニタリング方法は、例えば細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤の同定に使用することができ、例えば本明細書に記載されるシステム内で培養した細胞を試験薬剤を含む条件に供した後、本明細書に記載されるように、その代謝活性を決定する。培養した細胞は、異なるチャンバ内の異なる薬剤に同時に供してもよく、次にチャンバのそれぞれを、本明細書に記載されるように、１つ以上の代謝産物の量及び／又は存在を決定するための異なる更なる条件に供してもよい。
【０２６６】
被験体となる、本明細書に記載される生物学的試料を、本明細書に記載される任意の実施形態における方法の流体試料として使用して、改変された代謝活性に関連した被験体の疾病の診断に使用することができる。
あるいは、そのような方法は、改変された代謝活性に関連した被験体の疾病の治療のモニタリングに使用されてもよい。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、検知システムは流体試料を収容するための少なくとも２つのチャンバを備え、本方法は、少なくとも２つの試料を検知システムに導入することを含み、少なくとも２つの試料のそれぞれは少なくとも２つのチャンバのそれぞれに導入される。このような方法は、前記少なくとも２つの流体試料中の物質の存在及び／又は量を同時に又は連続して決定するための方法である。例示的な一実施形態において、前記２つの試料の１つは健康な細胞、もう１つは罹患細胞であり、本方法は罹患細胞における代謝活性変化の比較を可能にする。例示的な一実施形態において、前記２つの試料は罹患細胞を含み、１つは療法条件（例えば医薬又は治療）に供され、もう１つは他の療法条件に供されるか、いずれの条件にも供されず、本方法は、療法条件の結果である罹患細胞の代謝活性変化の比較を可能にする。従ってこの実施態様は、試験した療法薬の治療有効性の指標を提供する。
【０２６８】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、診断を必要とする被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の診断方法が提供される。本方法は、被験体の細胞試料（本明細書に記載される生物学的細胞試料）を、本明細書に記載される検知システムに導入し、本明細書に記載されるように、試料中の１つ以上の代謝産物の存在及び／又は量を決定することにより達成される。
【０２６９】
被験体は、通常の健康診断を受けている健康な動物又はヒトであってもよい。あるいは、被験体は、癌等の改変された代謝活性に関連した疾病の危険度の高いもの（例えば、遺伝学的に罹患しやすい被験体、癌の病歴及び／又は家族歴を有する被験体、発癌性物質、職業危険や環境危険に暴露されている被験体）、及び／又は、癌の疑わしい臨床的兆候（例えば、排泄物中の血液又は下血、不明な疼痛、発汗、不明な発熱、拒食症に至るまでの不明な体重減少、用便習慣の変化（便秘及び／又は下痢）、しぶり腹（不完全な排便の感覚、特に直腸癌の場合）、貧血及び／又は全身の脱力感）を有する被験体であってもよい。
【０２７０】
本明細書で使用する「診断」又は「診断する」は、病状（例えば、疾病、疾患、状態又は症候群）の有無の決定、病状又は症状の分類、病状の重篤度の決定、病状の進行のモニタリング、病状の予後及び／又は回復の見込みの予測、並びに特定の疾病に関する被験体のスクリーニングの実施を指す。
【０２７１】
本明細書で使用する「改変された代謝活性に関連した疾病」は、正常で健康な（疾病を発症していない）被験体から得た同種の細胞集団と比較して、代謝活性のシフトを経た細胞集団により特徴付けられる疾病を指す。代謝活性のシフトを経た細胞集団とは、病原性細胞集団（即ち、疾病の原因となる細胞、例えば癌細胞）又は非病原性細胞集団（例えば、疾病と闘う細胞、例えば固形癌に対する免疫細胞）であってもよい。例えば、腫瘍学においては、癌細胞の大部分、およびクローン性増殖を経ている免疫系のいくつかの集団は、大部分の正常な細胞のような比較的低速の解糖とその後のミトコンドリア内でのピルビン酸塩の酸化によるのではなく、高速の解糖とその後の細胞質内での乳酸産生によりエネルギーを生成する。
【０２７２】
いくつかの実施形態によれば、同一の細胞組成の正常で健康な（非罹患）試料中の１種以上の代謝産物のレベル（存在及び／又は量）は、被験細胞のモニタリングに使用されたものと同一の条件下で決定する。
【０２７３】
被験細胞と、対照（正常な、非罹患）細胞との間に見られる代謝活性（１種以上の代謝産物のレベル）におけるシフト（即ち、変化）は、同一条件下で得られる代謝産物レベルによってから立証されるものであり、改変された代謝活性プロファイルに関連した疾病の指標となる。
【０２７４】
従って、例えば、本明細書に記載される方法により得られた、乳酸塩のような代謝産物のレベル（量）に関するデータを、場合によりグルコース及び／又はピルビン酸塩のレベルに関するデータと組み合わせて、正常な細胞内のこれら代謝産物のうちの１種以上のレベルを表すデータと比較し、被験体が癌を有するか否かを決定することができる。更に、そのようなデータを他のデータと比較して、生物学的細胞試料中のこれら代謝産物のうちの１種以上のレベルに基づいて、癌のタイプ、及び／又はその起源、及び／又はそのステージをより正確に決定することができる。
【０２７５】
代謝活性アッセイの結果は、結果を分類し、最終的な診断を補助する決定ツリーモデルに供してもよい。好ましい実施形態によれば、少なくとも２種のモデルを組み合わせる（図９Ａ、Ｂ及び１０参照）。そのようなモデルの例としては、ＣＨＡＩＤ、Ｃ５及びＣ＆Ｒ  Ｔｒｅｅが挙げられるが、これらに限定されない。ロジスティックモデルを更に適用してもよい。
【０２７６】
本教示に従って（下記に更に記載するように）診断及び治療が可能な医学的状態の例としては、癌、病原性感染症及び自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例を以下に提供する。
【０２７７】
炎症性疾患としては、慢性炎症性疾患及び急性炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７８】
過敏症疾患に関連した炎症性疾患としては、これらに限定されるものではないが、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時型過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Ｔリンパ球媒介過敏症及びＤＴＨなどが挙げられる。これらに限定されるものではないが、例として以下が含まれる。
【０２７９】
喘息等のＩ型又は即時型過敏症。
【０２８０】
これらに限定されるものではないが、以下のＩＩ型過敏症リウマチ様疾患：リウマチ様自己免疫疾患、関節リウマチ、脊椎炎、強直性脊椎炎、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリトマトーデス、硬化症、全身性硬化症、腺性疾患、腺性自己免疫疾患、自己免疫性膵炎、糖尿病、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、特発性自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、粘液水腫、特発性粘液水腫；自己免疫生殖疾患、卵巣疾患、卵巣自己免疫、自己免疫抗精子不妊症（autoimmune antisperm infertility）、習慣性流産（repeated fetal loss）、神経変性疾患、神経疾患、神経性自己免疫疾患、多発性硬化症、アルツハイマー病、重症筋無力症、運動神経障害、ギラン・バレー症候群、神経障害及び自己免疫性神経障害、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症症候群、傍腫瘍性神経疾患、小脳萎縮症、傍腫瘍性小脳萎縮症、非傍腫瘍性全身硬直症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病（Sydeham chorea）、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、多腺性内分泌障害、自己免疫多腺性内分泌障害；神経障害、免疫異常神経障害（dysimmune neuropathy）；神経性筋強直症、後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症、心血管系疾患、心血管系自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、血栓症、肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎及び川崎症候群；抗第八因子自己免疫疾患；脈管炎、壊死性小血管脈管炎（necrotizing small vessel vasculitises）、顕微鏡的多発性血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、微量免疫型巣状性壊死性糸球体腎炎（pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis）、半月体形成性糸球体腎炎；抗リン脂質症候群；心不全、心不全における作動薬様アドレナリン受容体抗体、血小板減少性紫斑病；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾病、慢性炎症性肝疾患、セリアック病、筋肉組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫筋炎、シェーグレン症候群；平滑筋自己免疫疾患、肝疾患、自己免疫性肝疾患、自己免疫性肝炎及び原発性胆汁性肝硬変等。
【０２８１】
これらに限定されるものではないが、以下のＩＶ型又はＴ細胞媒介過敏症：リウマチ様疾患、関節リウマチ、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリトマトーデス、腺性疾患、腺性自己免疫疾患、膵疾患、自己免疫性膵炎、１型糖尿病；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺性疾患、グレーブス病；卵巣疾患、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎、多腺性症候群、自己免疫多腺性症候群、Ｉ型自己免疫多腺性症候群、神経疾患、自己免疫性神経疾病、多発性硬化症、神経炎、視神経炎、重症筋無力症、全身硬直症候群、心血管系疾患、シャーガス病における心臓性自己免疫、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫、溶血性貧血、肝疾患、自己免疫性肝疾患、肝炎、慢性活動性肝炎、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、腎疾患、自己免疫性腎疾患、腎炎、間質性腎炎、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性耳疾患、内耳の疾病、皮膚疾患（skin disease）、皮膚疾患（cutaneous disease）、皮膚疾患（dermal disease）、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、類天疱瘡及び落葉状天疱瘡。
【０２８２】
遅延型過敏症の例としては、接触性皮膚炎及び薬物発疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８３】
Ｔリンパ球媒介過敏症のタイプの例としては、ヘルパーＴリンパ球及び細胞毒性Ｔリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８４】
ヘルパーＴリンパ球媒介過敏症の例としては、Ｔｈ１リンパ球媒介過敏症及びＴｈ２リンパ球媒介過敏症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８５】
心血管系疾患、リウマチ様疾患、腺性疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経疾患、筋疾患、腎疾患、生殖に関連した疾患、結合組織疾患、及び全身性疾患等であるがこれらに限定されない自己免疫疾患。
【０２８６】
心血管系疾患の例としては、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、血栓症、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群、抗因子ＶＩＩＩ自己免疫疾患、壊死性小血管炎、顕微鏡的多発性血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型（pauci-immune）巣状壊死性及び半月体形成性糸球体腎炎、抗リン脂質症候群、抗体誘導性心不全、血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、シャーガス病における心臓自己免疫、及び抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８７】
自己免疫リウマチ様疾患の例としては、関節リウマチ及び強直性脊椎炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８８】
自己免疫性腺疾患の例としては、膵疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、特発性自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎及びＩ型自己免疫多腺性症候群が挙げられるが、これらに限定されない。疾病としては、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、特発性自己免疫甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎及びＩ型自己免疫多腺性症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
自己免疫性胃腸疾患の例としては、慢性炎症性腸疾患、セリアック病、結腸炎、回腸炎及びクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
自己免疫性皮膚疾患の例としては、尋常性天疱瘡、類天疱瘡及び落葉状天疱瘡などの自己免疫性水疱皮膚疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９１】
自己免疫性肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変及び自己免疫性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９２】
自己免疫性神経疾患の例としては多発性硬化症、アルツハイマー病、重症筋無力症、神経障害、運動神経障害；ギラン・バレー症候群及び自己免疫性神経障害、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症症候群；傍腫瘍性神経疾患、小脳萎縮症、傍腫瘍性小脳萎縮症及び全身硬直症候群；非傍腫瘍性全身硬直症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群及び自己免疫多内分泌疾患；免疫異常神経障害；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症、神経炎、視神経炎及び神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９３】
自己免疫性筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫筋炎及び原発性シェーグレン症候群及び平滑筋自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９４】
自己免疫性腎疾患の例としては、腎炎及び自己免疫間質性腎炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９５】
生殖に関連した自己免疫疾患の例としては、習慣性流産が挙げられるが、これに限定されない。
【０２９６】
自己免疫性結合組織疾患の例としては、耳疾患、自己免疫耳疾患、及び内耳の自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
自己免疫全身性疾患の例としては、全身性エリトマトーデス及び全身性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９８】
慢性感染性疾患、亜急性感染性疾患、急性感染性疾患、ウィルス性疾患、細菌性疾患、原生動物性疾患、寄生虫症、真菌症、マイコプラズマ疾患及びプリオン疾患等であるがこれらに限定されない感染性疾患。
【０２９９】
移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶及び移植片対宿主病等であるがこれらに限定されない、移植片の移植に関連した疾患を含む移植片拒絶疾患。
【０３００】
喘息、蕁麻疹、じん麻疹、花粉アレルギー、粉塵ダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学的アレルギー、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、動物鱗屑アレルギー、棘植物（stinging plant）アレルギー、ツタウルシアレルギー及び食物アレルギーを含むがこれらに限定されないアレルギー疾病。
【０３０１】
特定の実施形態によれば、疾病は、癌である。
癌疾患としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。癌疾患の特定の例としては、これらに限定されるものではないが、以下のものがあげられる：慢性骨髄性白血病、成熟を伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球の増大を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血病、好酸球増加症を有する急性骨髄単球性白血病等の骨髄性白血病；バーキット型非ホジキン悪性リンパ腫等の悪性リンパ腫；急性リンパ性（lumphoblastic）白血病、慢性リンパ性白血病等のリンパ性（Lymphoctyic）白血病；固形腫瘍良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、結腸腺腫等の骨髄増殖性疾患；小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液性肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（alveolar）、骨外性粘液型軟骨肉腫（chonodrosarcoma）、ユーイング腫瘍等の腺癌。その他には、精巣及び卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳房、皮膚、膵臓、子宮頸部、前立腺、及び卵巣の腫瘍が挙げられる。
【０３０２】
よって、本発明の教示は、疾病の検出に使用され得る。以下は、早期の癌の検出に関する非限定的な実施形態である。
【０３０３】
本教示に従って行われる疾病診断に続き、ゴールドスタンダード法を用いたスクリーニング結果の実証が行われる。診断が本発明の教示によって、又はゴールドスタンダード法を用いて実証された後、被験者には診断が通知され、必要に応じて治療される。
【０３０４】
従って本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、それを必要とする被験者における疾病治療の方法が提供される。当該方法は以下を含む。
（ａ）上述した方法に従って、被験者における疾病の存在を診断し；
（ｂ）該診断に基づいて被験者を治療する。
【０３０５】
本発明の実施形態は、疾病治療の個々の被験者に対する最適化、被験者における疾病治療のモニタリング、被験者のための治療の決定、及び異常な代謝活性に関連した疾病の治療を可能にする薬剤の同定に関係する多様な用途を有する。
【０３０６】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、疾病治療を個々の被験体に対して最適化する方法が提供される。当該方法は：
被験体から得た、少なくとも１種の医薬と共に細胞を含む生物学的試料について、本明細書に記載されるいずれかの関連方法（その態様も含む）から選ばれた任意の１種を用いて、試料中の代謝産物の存在及び／又は量を決定することを含み、
（本明細書に記載されるように、１種以上の代謝産物のレベルを測定して得られた）細胞の代謝活性における、同一条件下で試験された正常かつ健康な細胞試料の代謝活性に近づくようなシフトは、疾病に効果的な医薬であるという指標となる。
【０３０７】
本明細書で使用する「個々の被験体に対して最適化した治療」は、それぞれに合わせた治療計画（treatment regimen）（例えば、医薬の種類や用量）を作製するためのエクスビボの方法を指す。
【０３０８】
本明細書で使用する「医薬」は、薬、医薬品又は製剤の処方を意味し、本明細書においては相互に交換可能に使用される。医薬の例としては、化学療法薬、抗生物質、抗寄生虫薬、抗ウィルス薬等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０９】
本明細書全体を通じて、任意の関連した実施形態に関して使用する「療法」は、本明細書で医薬とも称される療法薬、及び放射線、脱水、失活等の他の治療を示す。
【０３１０】
本明細書全体を通じて、生物学的試料の細胞は、本明細書に記載されるように、検知システムの試料コンパートメント内の医薬又は任意の他の治療と接触する。本明細書全体を通して「接触する」とは、医薬が細胞膜と接触し、必要であれば細胞内に取り込まれるような条件下で、医薬を細胞に近づけることを指す。従って、例えば、接触は、緩衝条件下において、医薬が細胞の表現型（例えば、細胞毒性又は細胞増殖抑制効果）に影響し得るのに十分な温度と時間で行われるべきである。接触は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで実施することができる。
【０３１１】
特定の実施形態によれば、「同一条件下で試験された正常かつ健康な細胞試料の代謝活性に近づくようなシフト」は、少なくとも１０％の局所的又は全体的（プロファイル全体に亘る）シフトを指し、好ましくは、対照の正常かつ健康な細胞試料と１００％同じになるようなシフトを指す。
【０３１２】
当業者により所定の閾値を超えたと認識されるシフトは、効果的な治療であったことの指標となる。
【０３１３】
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、被験体における疾病治療のモニタリング方法が提供される。当該方法は以下を含む。
（ａ）疾病に対する少なくとも１種の医薬を被験体に投与し；
（ｂ）投与後、被験体の細胞を含む生物学的試料を回収し；
（ｃ）該生物学的試料を、本明細書に記載される実施形態の任意の１種による検知システムに導入し；
試料中の１種以上の代謝産物のレベルを決定する。
【０３１４】
ここで少なくとも１種の代謝産物、好ましくは数種の代謝産物のレベルは、細胞の代謝活性の指標となり、一方、細胞の代謝活性が同一条件下で試験された正常かつ健康な細胞試料の代謝活性に近づくようなシフトは、疾病に対する効果的な治療の指標となる。
【０３１５】
同様に、細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤の同定方法が提供される。当該方法は以下を含む。
（ａ）細胞を薬剤に暴露し；
（ｂ）薬剤に暴露する前と後の細胞の代謝活性を測定し、１種以上の代謝産物のレベルのシフトは、薬剤が代謝活性を変更することが可能であることの指標となる。
【０３１６】
本明細書で使用する「薬剤」は、生物学的薬剤又は化学的薬剤を含む試験組成物を指す。
【０３１７】
代謝活性の潜在的な調節剤として、本発明の方法に従って試験され得る生物学的薬剤の例としては、核酸、例えばポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス分子（これらに限定されるものではないがＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ペプチド核酸、及び改変された骨格構造又は他の化学的修飾を有するポリヌクレオチド類似体を含む）；タンパク質、ポリペプチド（例えば、ペプチド）、炭水化物、脂質、並びに「小分子」薬物候補が挙げられるが、これらに限定されない。「小分子」は、例えば、天然に存在する化合物（例えば、植物抽出物、微生物培養液等を由来とする化合物）又は分子量が約１０，０００ダルトン未満、好ましくは約５，０００ダルトン未満、最も好ましくは約１，５００ダルトン未満の合成有機化合物若しくは有機金属化合物であり得る。
【０３１８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、薬剤は、抗癌剤、抗ウィルス剤又は抗生剤である。
【０３１９】
本明細書で使用するシフトはまた、同じプロファイルにおける異なるレベル（例えば、より高いレベル）のＭＡ；基礎的状態における変化、及び／又は、最大ＭＡ効果を誘導する薬剤濃度におけるシフトであり得ることを理解されたい。
【０３２０】
上記の教示に従って細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤が同定された後、本発明は、その薬剤を医薬組成物／医薬に配合することを更に含む。
【０３２１】
この態様について記載される方法は、疾病に対して治療的活性を有する薬剤のリード候補のスクリーニングや、特定の被験体における疾病を治療するための治療的活性を有する薬剤のスクリーニング等に使用することができる。
【０３２２】
いくつかの実施形態によれば、被験体における疾病治療のモニタリング方法は、次のように実施する。
（ａ）疾病に対する少なくとも１種の医薬を被験体に投与し；
（ｂ）前記投与後に、被験体の細胞を含む生物学的試料を回収し；
（ｃ）前記細胞の細胞外環境において酸化成分又は還元成分を生成する代謝産物の存在及び／又は量を、本明細書に記載される実施形態の任意の１種に記載される任意の検知方法及びシステムを使用して、モニタリングする。
【０３２３】
ここで代謝産物の存在及び／又は量の変化は、細胞の代謝活性の指標となり、一方、細胞の代謝活性が同一条件下で試験された正常かつ健康な細胞試料の代謝活性に近づくようなシフトは、疾病に対する効果的な治療の指標となる。
【０３２４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意のシステム及び方法は、標的細胞を生物学的試料から分離するための、本明細書に記載されるような手段を更に含む。そのような手段には、例えば、試料を試料コンパートメント内のチャンバに導入し、その試料をマーカー、ファクター、活性化剤、阻害剤、又は標的細胞を単離するのに好適な任意の他の生物学的物質と流体連通させることが含まれる。次いで、標的細胞を、例えば培地と流体連通させる、及び／又は、本明細書に記載した条件の存在下または非存在下で検知に供する。例示的な標的細胞は、癌細胞である。
【０３２５】
そのような方法論は、本明細書にラボ・オン・チップとしても記載されている。
【０３２６】
本明細書に記載した任意の用途においては、検出可能な部分を生成する代謝産物以外の物質も、生物学的試料中の当該物質の存在及び／又は量を本明細書に記載したように決定することにより、本明細書に記載した診断、治療及び／又は治療のモニタリングを行うことができる。
【０３２７】
本明細書に記載した方法について、その用途に関して本明細書に記載した任意の実施形態のいくつかにおいては、本明細書で定義した酸化・還元成分を検出する検知システムを使用し、所望により、本明細書に記載した１種以上の他の検知システム又は検知コンパートメントと組み合わせて使用する。
【０３２８】
本願に基づく特許の権利存続期間中には、多数の関連したナノ構造、官能性部分及びその製造方法が開発されることが想定され、これら用語の範囲には、先天的に、そのような新しい技術の全てが含まれることを意図している。
【０３２９】
本明細書で使用する「約」は、±１０％を指す。
「含む（comprise）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（include）」「含んでいる（including）」、「有している（having）」及びそれらの活用形は、「含むが、限定されない」ことを意味する。
【０３３０】
「からなる」は、「含み、限定される」ことを意味する。
「から本質的になる」は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び／又は部分を含み得ると定義する。しかし、追加の成分、工程及び／又は部分は、特許請求される組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０３３１】
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数を対象とする。例えば、「化合物（a compound）」又は「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
【０３３２】
本願全体を通して、本発明のさまざまな実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限でではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、及びその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も特異的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
【０３３３】
本明細書に数値範囲が示される場合、それは常に示される範囲内の任意の引用数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、それらの間の分数及び整数の全部を含むことを意図する。
【０３３４】
本明細書で使用する「方法」は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療の各分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０３３５】
本明細書で使用する「治療する」とは、状態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延、若しくは逆転、状態の臨床的若しくは審美的症状の実質的な寛解、又は状態の臨床的若しくは審美的症状の悪化の実質的な予防を含む。
【０３３６】
本明細書で使用する「アミン」は、−ＮＲ’Ｒ”基及び−ＮＲ’−基の両方を示し、Ｒ’及びＲ”は以下に定義されるように、それぞれ独立して水素、アルキル、シクロアルキル、アリールである。
【０３３７】
従って、アミン基は、Ｒ’及びＲ”の両方が水素である第１級アミン、Ｒ’が水素であり、Ｒ”がアルキル、シクロアルキル若しくはアリールである第２級アミン、又はＲ’及びＲのそれぞれが独立してアルキル、シクロアルキル若しくはアリールである第３級アミンであり得る。
【０３３８】
あるいは、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、ヒドロキシアルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式アミン、ハロゲン化物、スルホネート、スルホキシド、ホスホネート、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ニトロ、アゾ、スルホンアミド、カルボニル、Ｃ−カルボキシレート、Ｏ−カルボキシレート、Ｎ−チオカルバメート、Ｏ−チオカルバメート、尿素、チオ尿素、Ｎ−カルバメート、Ｏ−カルバメート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、グアニル、グアニジン及びヒドラジンであってもよい。
【０３３９】
「アミン」は、アミンが末端基の場合、−ＮＲ’Ｒ”基を示すものとして本明細書で使用し、アミンが結合基の場合、−ＮＲ’−基を示すものとして本明細書で使用する。
【０３４０】
本明細書全体を通して、「末端基」は、置換基の１つの原子を介して化合物中の他の部分に結合している基（置換基）を示す。
「結合基」は、結合基の２つ以上の原子を介して化合物中の２つ以上の部分に結合している基（置換基）を示す。
例えば、アミン基がナノ構造の表面上に生成される場合、このアミン基は末端基であり、官能性部分に共有結合した後のアミン基は、結合基である。
【０３４１】
「アルキル」は、直鎖及び分岐鎖基を含む飽和脂肪族炭化水素を示す。アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有することが好ましい。本明細書で数値範囲、例えば「１〜２０」が述べられる場合、この範囲は置換基、この場合アルキル基が、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子等、２０個迄の炭素原子を含みうることを意味する。アルキルは、炭素原子数が１〜１０の中間サイズのアルキルであることがより好ましい。特に示さない限り、アルキルは、炭素原子数が１〜６又は１〜４の低級アルキルであることが最も好ましい。アルキル基は、本明細書で定義した置換されたものでも、非置換のものでもよい。
【０３４２】
アルキル基は、末端基であってもよく、その場合は上記で定義したように、隣接する１つの原子に結合し、又は結合基であってもよく、その場合は上記で定義したように、鎖中の少なくとも２つの炭素を介して２つ以上の部分と結合している。
【０３４３】
本明細書において「アミノアルキル」は、本明細書に定義されるアミンで置換されたアルキルとして使用される。いくつかの実施形態では、アミンはアルキルの末端炭素原子を置換する。
【０３４４】
「シクロアルキル」は、炭素のみからなる単環基又は縮合環基（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）であって、環のうちの１つ以上が、完全に共役したｐｉ電子系を有さないものを示す。シクロアルキル基は、本明細書で定義した置換されたものでも、非置換のものでもよい。シクロアルキル基は、末端基であってもよく、その場合は上記で定義したように、隣接する１つの原子に結合し、又は結合基であってもよく、その場合は上記で定義したように、２つ以上の位置で２つ以上の部分に結合する。
【０３４５】
「アリール」は、炭素のみからなる単環基又は縮合多環基（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）を示す。アリール基は、本明細書で定義した置換されたものでも、非置換のものでもよい。アリール基は、末端基であってもよく、その場合は上記で定義したように、隣接する１つの原子に結合し、又は結合基であってもよく、その場合は上記で定義したように、２つ以上の位置で２つ以上の部分に結合する。例としては、フェニル、ナフタレン、アントラセン等が挙げられる。
【０３４６】
「ヘテロアリール」は、（１つ又は複数の）環内に１種以上の原子、例えば窒素、酸素及び硫黄等、を有し、更に完全に共役したｐｉ電子系を有する単環基又は縮合環基（即ち、隣接する炭素原子対を共有する環）を示す。ヘテロアリール基の例としては、これらに限定されるものではないが、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン及びプリンが挙げられる。ヘテロアリール基は、本明細書で定義した置換されたものでも、非置換のものでもよい。ヘテロアリール基は、末端基であってもよく、その場合は上記で定義したように、隣接する１つの原子に結合し、又は結合基であってもよく、その場合は上記で定義したように、２つ以上の位置で２つ以上の部分に結合する。代表的な例は、ピリジン、ピロール、オキサゾール、インドール、プリン等である。
【０３４７】
「複素脂環基」は、（１つ又は複数の）環内に１種以上の原子、例えば窒素、酸素及び硫黄等、を有する単環基又は縮合環基を示す。環は、１つ以上の二重結合も有し得る。しかしながら、環は、完全に共役したｐｉ電子系を有さない。複素脂環基は、本明細書で定義した置換されたものでも、非置換のものでもよい。複素脂環基は、末端基であってもよく、その場合は上記で定義したように、隣接する１つの原子に結合し、又は結合基であってもよく、その場合は上記で定義したように、２つ以上の位置で２つ以上の部分に結合する。代表的な例は、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、モルホリノ等である。
【０３４８】
「アミン−オキシド」は、−Ｎ（ＯＲ’）（Ｒ”）基又は−Ｎ（ＯＲ’）−基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書で定義した通りである。この用語は、アミン−オキシドが上記で定義しれたような末端基の場合、−Ｎ（ＯＲ’）（Ｒ”）基を指し、アミン−オキシドが上記で定義したような結合基の場合、−Ｎ（ＯＲ’）−基を指す。
【０３４９】
本明細書に記載した基、部分又は化合物が置換されている場合は、置換基は、例えば、本明細書に定義したようなヒドロキシアルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素脂環式アミン、ハロゲン化物、スルホネート、スルホキシド、ホスホネート、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、チオヒドロキシ、チオアルコキシ、チオアリールオキシ、シアノ、ニトロ、アゾ、スルホンアミド、Ｃ−カルボキシレート、Ｏ−カルボキシレート、Ｎ−チオカルバメート、Ｏ−チオカルバメート、尿素、チオ尿素、Ｎ−カルバメート、Ｏ−カルバメート、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、グアニル、グアニジン及びヒドラジンのうちの１種以上であり得る。
【０３５０】
「ハロゲン化物」及び「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を示す。
【０３５１】
「ハロアルキル」は、１種以上のハロゲン化物で置換した、上記に定義したアルキル基を示す。
【０３５２】
「スルフェート」は、上記で定義したような−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＲ’末端基、又は上記で定義したような−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｏ−結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
「チオスルフェート」は、上記で定義したような−Ｏ−Ｓ（＝Ｓ）（＝Ｏ）−ＯＲ’末端基又は−Ｏ−Ｓ（＝Ｓ）（＝Ｏ）−Ｏ−結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
【０３５３】
「スルファイト」は、上記で定義したような−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ’末端基又は−Ｏ−Ｓ（＝Ｏ）−Ｏ−基結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
「チオスルファイト」は、上記で定義したような−Ｏ−Ｓ（＝Ｓ）−Ｏ−Ｒ’末端基又は−Ｏ−Ｓ（＝Ｓ）−Ｏ−基結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
「スルフィネート」は、上記で定義したような−Ｓ（＝Ｏ）−ＯＲ’末端基又は−Ｓ（＝Ｏ）−Ｏ−基結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
【０３５４】
「スルホキシド」又は「スルフィニル」は、上記で定義されたような−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’末端基又は−Ｓ（＝Ｏ）−結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
「スルホネート」は、上記で定義したような−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ’末端基又は−Ｓ（＝Ｏ）２−結合基を示し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
【０３５５】
「Ｓ−スルホンアミド」は、上記で定義したような−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ’Ｒ”末端基又は−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
「Ｎ−スルホンアミド」は、上記で定義したようなＲ’Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ”−末端基又は−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
【０３５６】
「ジスルフィド」は、上記で定義したような−Ｓ−ＳＲ’末端基又は−Ｓ−Ｓ−結合基を指し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
【０３５７】
「カルボニル」又は「カーボネート」は、本明細書で使用する場合、上記で定義したような−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’末端基又は−Ｃ（＝Ｏ）−結合基を示し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
「チオカルボニル」は、本明細書で使用する場合、上記で定義したような−Ｃ（＝Ｓ）−Ｒ’末端基又は−Ｃ（＝Ｓ）−結合基を示し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
【０３５８】
「オキシム」は、上記で定義したような＝Ｎ−ＯＨ末端基又は＝Ｎ−Ｏ−結合基を示す。
「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を示す。
【０３５９】
「アルコキシ」は、本明細書に定義した−Ｏ−アルキル及び−Ｏ−シクロアルキル基の両方を示す。
「アリールオキシ」は、本明細書に定義した−Ｏ−アリール及び−Ｏ−ヘテロアリール基の両方を示す。
【０３６０】
「チオヒドロキシ」は、−ＳＨ基を示す。
「チオアルコキシ」は、本明細書に定義した−Ｓ−アルキル基、及び−Ｓ−シクロアルキル基の両方を示す。
「チオアリールオキシ」は、本明細書に定義した−Ｓ−アリール及び−Ｓ−ヘテロアリール基の両方を示す。
【０３６１】
「シアノ」は、−Ｃ≡Ｎ基を示す。
「イソシアネート」は、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基を示す。
「ニトロ」は、−ＮＯ２基を示す。
「アシルハロゲン化物」は、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ””基を示し、Ｒ””は、上記で定義したハロゲン化物である。
「アゾ」又は「ジアゾ」は、上記で定義したＮ＝ＮＲ’末端基又は−Ｎ＝Ｎ−結合基を示し、Ｒ’は、上記に定義した通りである。
【０３６２】
「Ｃ−カルボキシレート」は、上記で定義したＣ（＝Ｏ）−ＯＲ’末端基又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−結合基を示し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
「Ｏ−カルボキシレート」は、上記で定義したＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’末端基又は−ＯＣ（＝Ｏ）−結合基を示し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
【０３６３】
「Ｃ−チオカルボキシレート」は、上記で定義したＣ（＝Ｓ）−ＯＲ’末端基又は−Ｃ（＝Ｓ）−Ｏ−結合基を示し、Ｒは、本明細書に定義した通りである。
「Ｏ−チオカルボキシレート」は、上記で定義したＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’末端基又は−ＯＣ（＝Ｓ）−結合基を示し、Ｒ’は、本明細書に定義した通りである。
【０３６４】
「Ｎ−カルバメート」は、上記で定義したＲ”ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’−末端基又は−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
「Ｏ−カルバメート」は、上記で定義したＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’Ｒ”末端基又は−ＯＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
【０３６５】
「Ｏ−チオカルバメート」は、上記で定義したＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’Ｒ”末端基又は−ＯＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
「Ｎ−チオカルバメート」は、上記で定義したＲ”ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−末端基又は−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
【０３６６】
「Ｓ−ジチオカルバメート」は、上記で定義したＳＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’Ｒ”末端基又は−ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
「Ｎ−ジチオカルバメート」は、上記で定義したＲ”ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−末端基又は−ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
【０３６７】
「尿素」は、本明細書で「ウレイド」とも称され、上記で定義したＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ”Ｒ”’末端基又は−ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ”−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りであり、Ｒ”’は、Ｒ’及びＲ”に関して本明細書に定義した通りである。
「チオ尿素」は、本明細書で「チオウレイド」とも称され、−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ”Ｒ”’末端基又は−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ”−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’は、本明細書に定義した通りである。
【０３６８】
「Ｃ−アミド」は、上記で定義したＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’Ｒ”末端基又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ’−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
「Ｎ−アミド」は、上記で定義したＲ’Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ”−末端基又はＲ’Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
【０３６９】
「グアニル」は、上記で定義したＲ’Ｒ”ＮＣ（＝Ｎ）−末端基又は−Ｒ’ＮＣ（＝Ｎ）−結合基を示し、Ｒ’及びＲ”は、本明細書に定義した通りである。
「グアニジン」は、上記で定義したＲ’ＮＣ（＝Ｎ）−ＮＲ”Ｒ”’末端基又は−Ｒ’ＮＣ（＝Ｎ）−ＮＲ”−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’は、本明細書に定義した通りである。
「ヒドラジン」は、上記で定義したＮＲ’−ＮＲ”Ｒ”’末端基又は−ＮＲ’−ＮＲ”−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ”’は、本明細書に定義した通りである。
【０３７０】
「シリル」は、上記で定義したＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’末端基又は−ＳｉＲ’Ｒ”−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’のそれぞれは、本明細書に定義した通りである。
「シロキシ」は、上記で定義したＳｉ（ＯＲ’）Ｒ”Ｒ”’末端基又は−Ｓｉ（ＯＲ’）Ｒ”−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’のそれぞれは、本明細書に定義した通りである。
【０３７１】
「シラザ（silaza）」は、上記で定義したＳｉ（ＮＲ’Ｒ”）Ｒ’”末端基又は−Ｓｉ（ＮＲ’Ｒ”）−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’のそれぞれは、本明細書に定義した通りである。
「テトラオルトシリケート」は、上記で定義したＯ−Ｓｉ（ＯＲ’）（ＯＲ”）（ＯＲ”’）末端基又は−Ｏ−Ｓｉ（ＯＲ’）（ＯＲ”）−結合基を示し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ”’は、本明細書に定義した通りである。
【０３７２】
本明細書で使用するように、「ヒドラジド」は、上記で定義したＣ（＝Ｏ）−ＮＲ’ −ＮＲ”Ｒ”’末端基又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ’−ＮＲ”−結合基を表し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ’”は、本明細書に定義した通りである。
本明細書で使用されるように、「チオヒドラジド」は、上記で定義したＣ（＝Ｓ）−ＮＲ’ −ＮＲ”Ｒ”’末端基又は−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＲ’−ＮＲ”−結合基を表し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ’”は、本明細書に定義した通りである。
【０３７３】
本明細書で使用されるように、「メチレンアミン」は、上記で定義したＮＲ’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＲ”Ｒ’”末端基又は−ＮＲ’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＲ”−結合基を表し、Ｒ’、Ｒ”及びＲ’”は、本明細書に定義した通りである。
【０３７４】
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、又は任意の好適な部分的な組み合わせ、又は適当な他の記載された実施形態に対しても提供され得る。さまざまな実施形態に関連して記載される所定の特徴は、その要素なしでは特定の実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須要件であると捉えてはならない。
【０３７５】
上述したように本明細書に記載され、特許請求の範囲に請求される本発明のさまざまな実施形態及び態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。
【０３７６】
実施例
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する
【実施例１】
【０３７７】
システムの製作
代謝産物の多重リアルタイムモニタリング用のナノワイヤーバイオセンサとして使用され得る、本発明のいくつかの実施形態に係る例示的なマイクロ流体バイオ検知システム（本明細書でマイクロ流体アレイ又はチップとも称される）を、図１Ａ及び１Ｂに示す。
【０３７８】
例示的なシステムは、独立してあるいは組み合わせて配置される１種類以上の溶液（例えば、細胞、還元成分及び／又はオキシダーゼ酵素を含む溶液など）を収容する数個のウェルを有する培養コンパートメントを含んでいた。ウェルは、マイクロチャネルを介して検知コンパートメントと流体連通していた。検知コンパートメントは、複数の官能化ナノ構造を含んでいた。溶液は、流体連通チャネルを閉鎖又は開放するように操作可能なソレノイド弁を用いて、ウェルから検知コンパートメントに導入することが可能であった。
【０３７９】
弁によって、異なる試料を切り替えて多重検知を行うことが可能であった。
検知コンパートメント内で、ＳｉＮＷ  ＦＥＴアレイは、ＲＯＳの検知、及びＲＯＳを生成する他の小分子代謝産物の検知のために、例えば９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリド等の酸化・還元反応性官能基で修飾されている。図１Ｃ及び１Ｄに例示するように、ＲＯＳ生成代謝産物を、ＦＥＴアレイと接触させる前に、例えばオキシダーゼ酵素の存在下で反応させて、Ｈ２Ｏ２（例えば過酸化物、Ｈ２Ｏ２）を生成する。
次いで、ＲＯＳ又はそれによって得られるＨ２Ｏ２は、ＦＥＴ表面上の９，１０−ジヒドロキシアントラセンを酸化して９，１０−アントラキノンを形成する（図１Ｄ）。この酸化反応は表面電子密度を低下させ、一方、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン（ＤＥＨＡ）等の還元成分は、９，１０−アントラキノンを９，１０−ジヒドロキシアントラセンに還元して表面電子密度を増大させる。
【０３８０】
酸化又は還元により変動した表面電子密度は、測定される電流を変化させる。
【０３８１】
上述のマイクロ流体チップを以下のように製作した。
【０３８２】
ナノワイヤーＦＥＴの製作：
検知コンパートメントの主要部であるＳｉＮＷ−ＦＥＴアレイをフォトリソグラフィーにより製作した。ＦＥＴのソース電極及びドレイン電極を、ＬＯＲ５Ａ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）及びＳ１８０５（Ｓｈｉｐｌｅｙ）からなる多層フォトレジスト構造により作成した。ＦＥＴのソース電極とドレイン電極との間の間隙は、２μｍであった。フォトレジストの暴露及び現像後、パターンをＴｉ／Ｐｄ／Ｔｉ（それぞれ、５／６０／１０ｎｍ）の電子ビーム蒸着により金属化した。その後、８０℃でのプラズマ増強化学蒸着（ＩＣＰ−ＰＥＣＶＤ，Ａｘｉｃ  Ｉｎｃ．）により、蒸着したＳｉ３Ｎ４の６０ｎｍの層と、原子層堆積（ＡＬＤ）により作製した２０ｎｍのアルミナ層（Ｓａｖａｎｎａｈ  ２００システム、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ）とにより電極を絶縁した。
【０３８３】
表面修飾：スルホン酸クロリド
ＳｉＮＷ  ＦＥＴアレイの製作後、細胞代謝産物を検知するために（例えば図１Ｄおよび図２Ａ〜Ｄに示すように）チップを化学的に修飾した。
【０３８４】
９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリドの調製：
図２の差し込み図に示すように、９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウムのスルホネート基を、トルエン中で塩化オキサリル及びＤＭＦを使用してスルホン酸クロリドに変換した。
【０３８５】
アントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム（５グラム、０．０１５８ｍｏｌ）とトルエン（１５０ｍｌ）との混合物を、自動気水分離器（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップ）及び冷却器を備えた０．２５Ｌの丸底フラスコ内に入れ、混合物を還流下で２時間加熱して反応混合物を乾燥した。その後、混合物を６０℃に冷却し、塩化オキサリル（６ｍｌ）及びＤＭＦ（２滴）を加えた。得られた混合物を還流下で８時間加熱した後、トルエンと過剰の塩化オキサリルとの混合物（３０ｍｌ）を留去した。塩化ナトリウムの沈殿物を濾過により収集し、減圧下で濾液から溶媒を除去した。固体残留物を真空中で一晩乾燥して、アントラキノン−２−スルホン酸クロリド（４．３６グラム、収率９０％）を得た。
【０３８６】
９，１０−アントラキノン官能化ＳｉＮＷ  ＦＥＴの調製：
作成したＳｉＮＷ  ＦＥＴアレイチップをアセトン、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、及び脱イオン水（ＤＩＷ）の順で洗浄し、その後、窒素乾燥した。酸素プラズマ（１００Ｗ、０．２トル）で１５分間処理した。その直後、チップをおよそ１００μｌの（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ；ＳＩＡ０６０３．０，Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．）で１０分間覆った。次いで、チップを６５℃のホットプレート上に２時間静置した。その後、チップ表面を再度ＩＰＡで洗浄し、その後窒素乾燥した。
【０３８７】
次いで、ＡＰＤＭＥＳ処理チップを１１５℃のホットプレート上に２５分間静置した後、５０ｍｇの９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリド、２０ｍｌの超乾燥トルエン（２０１５４７，Ｂｉｏ−ｌａｂ  Ｌｔｄ．）及び１ｍｌの超乾燥ピリジン（２７０９７０，ＳＩＧＭＡ）を含む混合物中に室温で２４時間浸漬して、９，１０−アントラキノン基をＳｉＮＷ修飾表面に結合させるスルホンアミドを形成した。
【０３８８】
表面の特性評価：
以下のパラメータを使用する質量分析法（Ａｕｔｏｓｐｅｃ  Ｍ２５０Ｑ，Ｗａｔｅｒｓ）を用いて、表面修飾に使用した９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリドの元素組成を確認した：  電子衝突の測定モード、７０ｅＶで正イオン化、溶媒はＣＨ２Ｃｌ２。
【０３８９】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いて、９，１０−アントラキノン−２−スルホン酸クロリド処理済みの修飾ＦＥＴ上の単層の特性を評価した。
ＸＰＳ測定は、超高真空（２．５×１０−１０トル基準圧力）中で行った（Ｍｕｌｔｉ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｓｙｓｔｅｎ  ５６００，ＰＨＩ）。試料にＡｌＫα単色化線源（１４８６．６ｅＶ）を照射し、０．８ｍｍのスリット開口部を使用した球状キャパシタアナライザにより、放出された電子を分析した。
【０３９０】
図２Ａ〜Ｃは、表面修飾中に行ったＸＰＳ測定にて得られたデータ、及び酸化・還元反応性ＳｉＮＷ  ＦＥＴの特性評価を示す。図２Ａは、修飾前のＳｉＮＷ表面のＸＰＳ測定結果を示す。図２Ｂは、アミン基を生成するための、ＡＰＤＭＥＳを使用したＳｉＮＷ表面のシラン化の後のＸＰＳ測定結果を示す。図２Ｃは、９，１０−アントラキノン基をアミン修飾表面に結合するスルホンアミド結合の形成を示す。図２Ａ〜２Ｃのそれぞれに、各修飾ステップにおけるＸＰＳスペクトルと、修飾表面の炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）及び硫黄（Ｓ）についての原子組成とを示す。
図２Ａ〜Ｃの示す修飾表面のＸＰＳスペクトル及び原子組成の結果は、各修飾ステップ後の炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）及び硫黄（Ｓ）の増大を示す。
【０３９１】
図２Ｄは、酸化された９，１０−アントラキノン修飾シリコンナノワイヤー表面（青色の曲線）及び還元された９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾シリコンナノワイヤー表面（赤色の曲線）の代表的なＸＰＳ検査スペクトルを示す。Ｃ＝Ｏ結合の割合は、Ｃ１ｓ曲線適合により計算した。表面の還元後、Ｃ＝Ｏ結合集団が減少したことが観察された。
【０３９２】
酸化・還元中の表面を化学的に評価するための試料は、１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を使用して酸化するか、又は１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡ（Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン）により還元した。試料は、測定中に僅かに帯電していたため、入力値は、２８５ｅＶに位置するＣ１ｓのエネルギー基準として数学的に補正した。測定は全て、２５°の浅い取り出し角で行った。
【０３９３】
ソレノイド作動ＰＤＭＳ弁を備えるＰＤＭＳ細胞培養コンパートメント：
図１Ａ及び１Ｂに示すような、細胞の培養及び複数の溶液の制御のためにソレノイド作動弁を有するＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）培養コンパートメントを、ソフトリソグラフィーを用いて製作した。ソレノイド作動ＰＤＭＳ弁の製作は、非特許文献３３に従った。その後、この弁をＰＤＭＳ培養コンパートメントに組み込んだ。
【実施例２】
【０３９４】
検知
実験方法：
一般的な検知設定：
検体溶液中の検体の酸化中に検出されるＲＯＳ又はＨ２Ｏ２、又は検体溶液中の検体の還元中に検出される還元成分のいずれかの表面電荷により誘導されるＳｉＮＷ  ＦＥＴ（Ｉｄｓ）の電流を、データ収集システムを使用して測定した。
【０３９５】
細胞の代謝産物／活性を測定するために、細胞をチップ内、即ちチップの培養コンパートメント（例えば、図１Ａ参照）内で培養し、測定中はチップをインキュベーター内に放置した。シリンジポンプを用いて試料を２０μｌ／分で検知コンパートメントに導入した。
【０３９６】
ドレイン及びソースに印加された電圧（Ｖｄｓ）は０．２Ｖであり、一方、ゲートに対する電圧（Ｖｇ）は、検知前にＩｄｓ−Ｖｇ特性から決定した。
時間に対する電流の信号を１秒間隔で記録した。
【０３９７】
獲得した全信号を、データ収集システムのプリセットのために逆転させた。測定中は、試料の切り替えによって電気的読み出しに幾分かのノイズが導入された可能性があるため、各測定後には、検体溶液を還元成分である１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡで置き換えることでＦＥＴ表面を還元し（図１Ｄ参照）、続く測定のために電気的基準レベルに戻した。
【０３９８】
Ｈ２Ｏ２の検知：
さまざまな濃度のＨ２Ｏ２を含む溶液に関して、データ収集システムを使用して、Ｈ２Ｏ２による表面電荷により誘導されたＳｉＮＷ  ＦＥＴの電流を測定した。
【０３９９】
乳酸塩、グルコース及びピルビン酸塩の検知：
乳酸塩の検知のためには、乳酸塩がＦＥＴアレイに到達する前に、０．１単位／ｍｌのラクテートオキシダーゼ（ＬＯＸ；Ｌ０６３８，ＳＩＧＭＡ）をフェノールレッド不含有培地に加えて、（図１Ｄに示すように）乳酸塩をピルビン酸塩及びＨ２Ｏ２に変換した。
【０４００】
ＰＢＳにおけるグルコースの検知も、４０単位／ｍｌのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ；Ｇ２１３３，ＳＩＧＭＡ）を用いて同様に行った。
【０４０１】
ピルビン酸塩の検知のためには、０．６２５単位／ｍｌのピルベートオキシダーゼ（ＰＯＸ；Ｐ４１０５、ＳＩＧＭＡ）、２１．９０ｍＭ塩化マグネシウム、１．０６ｍＭチアミンピロホスフェート、及び０．２７ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチドを含むＰＢＳ中で測定を行った。
検知は、血清添加培地中、ｐＨ７．０で行ってもよい。
【０４０２】
ｐＨの検知：
還元成分添加溶液を使用することによって、修飾ＦＥＴをｐＨセンサに変換した。培地に０．１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡを添加して修飾ＦＥＴ表面を還元した後、プロトン化又は脱プロトン化により変動する表面プロトン密度は、測定電流を顕著に変化させる。観察によると、培地への０．１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡの添加によってｐＨの有意な変化は生じなかった。
【０４０３】
統計解析：
ＳＤは、試験したナノワイヤー装置の平均値における変動性の指数と見なされるため、検知特性のデータは平均±ＳＤで表した。
【０４０４】
結果：
血清添加培地中のＨ２Ｏ２に反応した９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴによる検知を、図３Ａ、Ｂに示す。
図３Ａは、異なる濃度のＨ２Ｏ２中の修飾ＦＥＴの酸化動力学と、還元成分を流した後の対応還元動力学とを示す。
【０４０５】
得られたデータから、Ｈ２Ｏ２を添加しない血清添加培地も検出可能な信号を生じたことがわかる。Ｈ２Ｏ２を添加しない血清添加培地から得られる信号は、培地成分の複雑な組成による可能性があると思われる。従って、この信号はバックグラウンド信号と考えられる。そこで試料から獲得した信号からバックグラウンド信号を差し引いて、Ｈ２Ｏ２による真の信号を得た。
【０４０６】
図３Ａに示すように、９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＦＥＴから得られた信号は、濃度に依存して変化し、一方、ＡＰＤＭＥＳ修飾ＦＥＴを使用した場合、有意な検知応答は見られなかった。
【０４０７】
得られたデータからは、更に、Ｈ２Ｏ２試料をＦＥＴに導入した約６００秒後に、獲得した信号の濃度依存性が有意であり、一方、ＡＰＤＭＥＳ修飾ＦＥＴを使用した場合は、有意な検知応答は見られなかったことがわかる。これらの知見から、まず、９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＳｉＮＷ  ＦＥＴがＨ２Ｏ２を特異的に検知できることが確認され、更に、Ｈ２Ｏ２濃度が１０分以内に認識できることが示唆される。これらの知見により、数時間継続する代謝変化のモニタリングに対して、このシステムがふさわしいことが証明された。
【０４０８】
得られたデータからは、更に、１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡ等の還元成分を流すことにより、還元されたＦＥＴ表面の信号が約３００秒で基準レベルに到達するため、このような短時間のうちにシステムを次の検知に使用することができることが示された。また酸化・還元反応性ＦＥＴバイオセンサによる検知は良好な可逆性を持つことがわかる。溶液の還元成分への切り替えは、還元成分がＦＥＴアレイに到達する前の電気的読み出しの急上昇をもたらした。
【０４０９】
図３Ａ（差し込み図）では、更に、酸化及び還元における修飾単層における分子差を区別するために、各官能基に対応する表面における化学結合種同士の比較を示す。この図で示されるように、表面の還元によってＣ＝Ｏ結合集団が減少した。図２も参照されたい。
【０４１０】
さらに濃度及びｐＨの関数としてのＨ２Ｏ２検知応答を測定した。得られたデータを図３Ｂに示す。結果から、Ｈ２Ｏ２に対する検知限界が１００ｎＭであることが示され、検知応答はＨ２Ｏ２の生理学的な濃度範囲をカバーしていた。例えば非特許文献３４を参照されたい。
【０４１１】
小分子代謝産物の検知：
小分子代謝産物の検知には、代謝産物をＨ２Ｏ２に変換するオキシダーゼ酵素を使用した。
図４Ａは、血清含有培地中の乳酸塩の濃度依存性の検知特性を示す。この図に示すように、乳酸塩を含まない溶液の場合、ＬＯＸ添加試料（左から一番目の赤色の曲線）の信号は、ＬＯＸ無添加の対応試料（黒色の曲線）よりも高かった。これもまた２つの信号の間の差が、血清添加培地の複雑な組成による可能性がある。従って、２つの信号の間の差は、バックグラウンド信号と定義した。
【０４１２】
ＬＯＸ無添加の乳酸塩試料では、測定電流を変化させる酸化・還元は生じないため、乳酸塩から真の信号を得るために、ＬＯＸ添加試料の読み取り値から、ＬＯＸ無添加の対応試料の読み取り値を差し引いた、つまりＬＯＸ無添加のブランク培地の信号を差し引き、獲得した乳酸塩信号から更にバックグラウンド信号を差し引いた。対応する標準曲線を図４Ａの差し込み図に示す。
【０４１３】
得られたデータから、血清添加培地中の乳酸塩に対する検知限界が１μＭであることが示され、検出範囲は乳酸塩の生理学的範囲をカバーしていた。例えば非特許文献３５を参照されたい。
【０４１４】
図４Ｂは、ＰＢＳ中のグルコース検知応答に関して得られたデータを示す。ＧＯＸが存在しない場合、グルコースを添加しても酸化・還元反応性ＦＥＴセンサと反応するＨ２Ｏ２は生成されなかったため、乳酸塩検知と同様に、グルコースからの信号を得るために、ＧＯＸ添加試料（赤色の曲線）の読み取り値から、１０ｍＭグルコース含有ＧＯＸ無添加試料（黒色の曲線）の読み取り値を差し引いた。対応する標準曲線を差し込み図に示す。
【０４１５】
得られたデータは、ＰＢＳ中のグルコースに対する検知限界が１０μＭであることを示し、検出範囲はグルコースの生理学的範囲をカバーしていた。例えば前出の非特許文献１９を参照されたい。
【０４１６】
図４Ｃは、ＰＢＳ中のピルビン酸塩検知応答を示す。ＰＯＸ添加試料の読み取り値を赤色で、ＰＯＸ無添加試料の読み取り値を黒色で示す。ＰＯＸ無添加のピルビン酸塩試料は、測定電流を変化させる酸化・還元を生じないため、ピルビン酸塩から真の信号を得るために、ＰＯＸ添加試料の読み取り値から、ＰＯＸ無添加の対応試料の読み取り値を差し引いた、即ち１０ｍＭピルビン酸塩含有ＰＯＸ無添加試料の信号を差し引いた。
【０４１７】
なお、有意なバックグラウンド信号はＰＢＳ中のピルビン酸塩検知では見いだせず、背景検知信号は検知培地の複雑な組成に依存することが示唆される。
【０４１８】
ｐＨ検知：
図５Ａに概略的に示されるように、上記の修飾ＦＥＴは、単に還元成分を加えることにより、ｐＨセンサへと変換された。培地にＤＥＨＡを添加し、修飾単層を９，１０−ジヒドロキシアントラセン及びＨ２Ｏ２含有物に還元した後は、プロトン化又は脱プロトン化により変化する表面プロトン密度が、測定電流を顕著に変化させる。
【０４１９】
ｐＨ検知のために、０．１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡを検知培地中に添加してＦＥＴ表面上の９，１０−アントラキノン単層を還元し、９，１０−ジヒドロキシアントラセン（図１ｄも参照）及びＨ２Ｏ２を同時に得た。従って、ＤＥＨＡ添加培地中の有意な量のＨ２Ｏ２が測定信号を変化させることはなかった。その結果、プロトン化又は脱プロトン化により変化する表面プロトン密度が、得られる信号を顕著に変化させる。
【０４２０】
本発明者らの観察によると、０．１％ｖ／ｖ  ＤＥＨＡを培地に添加することによって、ｐＨの有意な変化は生じなかった。
【０４２１】
図５Ｂは、還元成分添加培地中のｐＨに依存した検知応答を示す。この図に示されるように、ｐＨ検知感度は０．２ｐＨ単位であり、検出能力は生理学的ｐＨ範囲カバーしていた。
【０４２２】
図５Ｃは、還元成分無添加培地中のＨ２Ｏ２の検知、及び還元成分添加培地中のＨ２Ｏ２の検知の比較を示す。この図に示されるように、血液中の過酸化水素の正常な生理学的レベルをすべてカバーする、１ｍＭよりも低い濃度のＨ２Ｏ２（非特許文献３６及び３７）によって得られる還元成分添加培地中の信号は、還元成分無添加培地中で得られる信号と比較して有意な差を生じなかった。換言すれば、還元成分添加培地中のセンサは、正常な生理学的濃度のＨ２Ｏ２に対して反応しなかった。従って、還元成分添加溶液を使用することにより、９，１０−ジヒドロキシアントラセン修飾ＮＷ  ＦＥＴ特有のｐＨ検知が可能となる。
【実施例３】
【０４２３】
細胞の代謝活性のモニタリング
実験方法：
細胞培養、薬物処理及び生存率評価：
ヒトＴリンパ球、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＩＢ−１５２，ＡＴＣＣ）を、５％  ＣＯ２雰囲気下にて３７℃で培養及びインキュベートした。培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；０４−００１−１Ａ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１５１４０，ＧＩＢＣＯ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（５２４００，ＧＩＢＣＯ）を使用した。
【０４２４】
実験中、メトトレキサート水和物（ＭＴＸ；Ｍ８４０７，ＳＩＧＭＡ）又は２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ；Ｄ６１３４，ＳＩＧＭＡ）のいずれかの薬物を含むまたは含まない、フェノールレッド不含有培地（１１８３５−０６３，ＧＩＢＣＯ）に、密度が１×１０６細胞／ｍｌとなるように細胞を再懸濁した。
【０４２５】
細胞試料を、インキュベーター内の検知チップのウェル内（図１Ａ及び１Ｂ参照）に分注した。
血球計数器を使用してトリパンブルー染色細胞を計数することにより、細胞生存率を評価した。
【０４２６】
初期ヒトＢ細胞の単離：
健康なドナーと、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の患者とから末梢血（ＰＢ）細胞を得た。
低密度細胞を単離するために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢ細胞を分別した。検知のために、単離された細胞をフェノールレッド不含有血清添加培地中に再懸濁した。
【０４２７】
Ｂ−リンパ球（ＣＤ１９＋）を単離するために、患者試料からのＰＢ低密度細胞、又は、健康なドナー試料からのＰＢを、Ｂ細胞精製キットマイクロイムノマグネティックビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を説明書に従って使用して分別し、分別したＢ細胞を直ちに検知のために使用した。
【０４２８】
検知は、上記のように行った。
フローサイトメトリー分析により、分析上、９３％を超える正常な細胞又はＣＬＬ分別細胞がＣＤ１９＋であることが確認された。
【０４２９】
ジクロロジヒドロフルオレセインを使用した細胞外ＲＯＳ／乳酸塩アッセイ：
細胞のナノワイヤー検知との比較のために、ジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦＨ）を使用した対照実験を行った。理論的には、ＲＯＳによってＤＣＦＨは酸化されて蛍光ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）となる。
【０４３０】
非特許文献３８に記載されているようにＤＣＦＨを調製した。
１０％  ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むフェノールレッド不含有ＲＰＭＩ  １６４０培地中、１×１０６生細胞／ｍｌの密度でＪｕｒｋａｔ細胞を培養した。
【０４３１】
測定前に、細胞を除去して細胞不含有培地を得た。次いで、細胞不含有培地試料にＤＣＦＨを加え、９６ウェル黒色プレートのウェル内に１００μｌ／ウェルずつ入れた。このプレートを遮光し、室温で１０分間インキュベートした後、プレートリーダー（ｉ−２００，Ｔｅｃａｎ）を使用して分析し、５２５ｎｍでの蛍光ＤＣＦから出る発光の強度を決定した。
【０４３２】
ＤＣＦＨを使用して、乳酸塩代謝産物の濃度を同様に評価した。新たに行った手順の主なものとして、細胞試料を０．００４単位／ｍｌのＬＯＸと共に３７℃で５分間インキュベートした後、測定のためにＤＣＦＨを試料に加えた。乳酸塩からの信号を得るために、ＬＯＸ添加試料の読み取り値からＬＯＸ無添加の対応試料の読み取り値を差し引いた。
【０４３３】
統計解析：
細胞代謝産物に関するデータを、平均±標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）にて示す。加えて、両側２標本ｔ検定を行って、細胞代謝産物に関するデータの有意性を統計的に分析した。
【０４３４】
結果：
Ｔ細胞株を使用した検知：
活性酸素種（ＲＯＳ）は、酸素の正常な代謝の天然副産物として形成され、多様な生物学的プロセスの調節におけるシグナリング分子としての重要な役割を有する。シグナリング分子として、ＲＯＳの１つの重要な特徴は、例えば細胞膜を横切るなど異なるコンパートメント間を移動する能力である。従って、段階的に増大する細胞内ＲＯＳは、細胞膜を通って細胞外空間に拡散し、代謝活性を表す指標となりうる。
【０４３５】
ナノワイヤーバイオセンサを使用して細胞外ＲＯＳレベルを測定することにより、薬物処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の代謝活性の２４時間モニタリングを行った。得られたデータを図６Ａ〜Ｇに示す。
【０４３６】
ＭＴＸで処理したＪｕｒｋａｔ細胞に関するデータを図６Ａ〜６Ｃに示し、２ＤＧで処理した細胞を図６Ｄ〜６Ｆに示す。
測定したＲＯＳレベルを、生細胞の数に対して正規化した。
図６Ｂ及び６Ｅ、６Ｆに示した相対的な細胞数は、ｔ＝２４時間における細胞数の、初期細胞数に対する割合である。
【０４３７】
結果からＭＴＸ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞及び２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のＲＯＳレベルは、両方ともｔ＝６時間にかなり低下したことがわかる（図６Ａ及び６Ｄ参照）。これは、低濃度の過酸化水素と反応する抗酸化剤によって説明することができる（非特許文献３７及び３５）。
【０４３８】
結果から更に、２４時間処理後、薬物処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のＲＯＳレベルが顕著に増加し（図６Ａ及び６Ｄ参照）、細胞増殖率が低下した（図６Ｂ及び６Ｅ参照）ことがわかる。
【０４３９】
得られたデータを使用して、作用機構を分析することができる。ＲＯＳレベルを下げようすると、酸化促進成分（ｐｒｏ−ｏｘｉｄａｎｔ）の発現が刺激されるのではないかということが示唆される。その結果、酸化促進成分は、活性酸素種を生成すること、又は抗酸化成分を阻害することのいずれかにより、酸化ストレスを誘導し（非特許文献３９）、それにより細胞増殖を阻害し得る（非特許文献４０）。なお、上記記載のようにＤＣＦＨを使用して得られた対照実験の蛍光分光分析におけるデータ（図６Ａ〜Ｆの差し込み図に示す）は、ＮＷバイオセンサ検出に基づいた観察と一致する。
【０４４０】
癌細胞は、「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」として既知の現象において、早いスピードで解糖することによりエネルギーを生成し、正常な組織と比較してより多くの乳酸塩を分泌する。従って、細胞外乳酸塩は、細胞代謝活性の重要な指標である。
【０４４１】
処理２４時間後の２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞外乳酸塩レベルと、得られた細胞増殖率との間の相関を調べた。得られたデータを図６Ｆに示す。２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞乳酸塩分泌が低下し、細胞の増殖率も低下したこと示す。これは、２ＤＧを使用して解糖を阻害することにより、細胞死受容体誘導性アポトーシスのアップレギュレーションされると結論付けた以前の研究と一致する（非特許文献４１）。
【０４４２】
更に、薬物処理Ｊｕｒｋａｔ細胞のｐＨ検知を行った。得られたデータを図６Ｃ及び６Ｇに示す。この図に示されるように、全培養細胞において、ｐＨは時間の経過と共により酸性となり、おそらく（図６Ｆに示すように）乳酸塩分泌の低下が原因で、２ＤＧ処理細胞のｐＨは対照よりも塩基性に近かった（図６Ｇ参照）。乳酸のｐＫａは３．９であるため、生理学的ｐＨでは、乳酸塩アニオン及びプロトンに解離する。その結果、２ＤＧ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞の乳酸塩分泌が低下することによる細胞外酸性化への影響は、対照と比較して低い。
【０４４３】
図６Ｈ及び６Ｉはそれぞれ、薬物の抗増殖活性を裏付ける、ＭＴＸ処理試料及び２ＧＤ処理試料の細胞生存率を示す。
【０４４４】
初期ヒトＢ細胞を使用した検知：
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞及び正常なＢ細胞の代謝レベルを２４時間モニタリングし、代謝有意性を決定した。
【０４４５】
ＣＬＬ細胞の測定された代謝レベルを、最初に生細胞の数に対して正規化した後、更に正常なＢ細胞の代謝レベルに対して正規化した。得られたデータを図７Ａに示す。ＣＬＬ細胞のＲＯＳレベル及び乳酸塩レベルは、正常なＢ細胞のものよりも高かったことが示される。これらの知見は、癌細胞が正常な細胞よりも高いレベルのＨ２Ｏ２を生成することを示す以前の研究と一致する（非特許文献４２及び４３）。
【０４４６】
またこの結果により、癌細胞が正常な組織と比較して大量の乳酸塩を分泌するという仮説が実証される。
データから更に、酸化・還元反応性ナノワイヤーバイオセンサによって、治療中の癌細胞の代謝変化が評価でき、オーダーメード医療が可能となるであろう。
【０４４７】
図７Ａ及び７Ｂは、ＣＬＬ細胞の病理学的特徴（図７Ａ）と、試験試料の細胞生存率（図７Ｂ）とを示す。ＣＬＬ細胞のＲＯＳレベル及び乳酸塩レベルは、正常なＢ細胞のものよりも有意に高かった。
下記の表１は、ＣＬＬ細胞の生物学的パラメータを示す。
【０４４８】
【表１】
0006609247.tif 000008
【０４４９】
本発明をその特定の実施形態との関連で記載してきたが、多数の変更、修正及び変化が当業者には明らかであろう。従って、そのような変更、修正及び変化の全ては、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に含まれることが意図される。
【０４５０】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが具体的及び個別に参照により本明細書に組み込まれる場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、本明細書中の任意の参考文献の引用又は特定は、それらの参考文献が本発明の先行技術として使用できることの容認として解釈されるべきではない。また、各節の表題が使用される範囲において、必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】
0006609247.tif 000009
【図２−１】
0006609247.tif 000010
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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