(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＫＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＫ（配列番号３）からなるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸を薬学的に許容される担体と共に含む、医薬組成物。
【請求項５】
細胞膜ガングリオシドへの結合を伴う病状の予防または処置のための、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該病状が神経変性疾患である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
該神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、またはギラン・バレー症候群からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該病状が感染症である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
該感染症がウイルス感染症である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該感染症がＨＩＶまたはインフルエンザウイルス感染症である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該感染症が細菌感染症である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該感染症がヘリコバクター・ピロリ菌またはコレラ菌感染症である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該病状が腫瘍である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該病状が癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
転移細胞の拡散または増殖の阻止のための、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面糖脂質と相互作用し、神経変性疾患、感染症および癌における治療用途を有する、キメラペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜糖脂質は、多くの種類の感染性タンパク質およびアミロイドタンパク質のための一次結合部位として機能する（Fantini, 2003）。例えば、ＧＭ１およびＧＭ３ガングリオシドは両方とも、アルツハイマー病およびパーキンソン病の病態生理に関与している（Oikawa et al, 2009; Wu et al, 2012）。
【０００３】
α−シヌクレインの糖脂質結合特異性の最近の研究では、パーキンソン病に関連するタンパクは、Fantiniらによって、該タンパク質の３４−４５フラグメントが最も短い活性な糖脂質結合ドメインとして同定されている（Fantini and Yahi, 2011a）。この短い１２アミノ酸残基の直鎖状モチーフは、当該タンパク質に、アストロサイトに優先的に発現されるガングリオシドであるＧＭ３に対して高い特異性の相互作用を付与する。このモチーフは、アルツハイマー病のβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の５−１６フラグメントと構造的相同性を有する。Ａβの糖脂質結合ドメインはＧＭ３を認識しないが、シナプス後膜に豊富に発現されるガングリオシドであるＧＭ１を認識する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Daniotti et al, Frontiers in Oncology, 2013, vol 3, article 306:1−12;
【非特許文献２】Di Scala C, Troadec JD, Lelieuvre C, Garmy N, Fantini J, Chahinian H (2014). Mechanism of cholesterol−assisted oligomeric channel formation by a short Alzheimer β−amyloid peptide. J Neurochem 128: 186−195.
【非特許文献３】Fantini J (2003) How sphingolipids bind and shape proteins: molecular basis of lipid−protein interactions in lipid shells, rafts and related biomembrane domains. Cell Mol Life Sci 60: 1027−1032.
【非特許文献４】Fantini J, Yahi N (2010) Molecular insights into amyloid regulation by membrane cholesterol and sphingolipids: common mechanisms in neurodegenerative diseases. Expert Rev Mol Med 12:e27.
【非特許文献５】Fantini J, Yahi N (2011a) Molecular basis for the glycosphingolipid−binding specificity of α−synuclein: key role of tyrosine 39 in membrane insertion. J Mol Biol 408: 654−669.
【非特許文献６】Fantini J, Carlus D, Yahi N (2011b) The fusogenic tilted peptide (67−78) of α−synuclein is a cholesterol binding domain. Biochim Biophys Acta 1808: 2343−2351.
【非特許文献７】Fantini J, Yahi N, Garmy N (2013) Cholesterol accelerates the binding of Alzheimer's β−amyloid peptide to ganglioside GM1 through a universal hydrogen−bond−dependent sterol tuning of glycolipid conformation. Front Physiol 4: 120.
【非特許文献８】Fantini J, Di Scala C, Yahi N, Troadec JD, Sadelli K, Chahinian H, Garmy N (2014). Bexarotene blocks calcium−permeable ion channels formed by neurotoxic Alzheimer's β−amyloid peptides. ACS Chem Neurosci, Jan 2. [Epub ahead of print]
【非特許文献９】Guex, N. and Peitsch, M.C. (1997) SWISS−MODEL and the Swiss−PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18, 2714−2723.
【非特許文献１０】Lingwood D, Binnington B, Roeg T, Vattulainen I, Grzybek M, Coskun U, Lingwood CA, Simons K (2011) Cholesterol modulates glycolipid conformation and receptor activity. Nat Chem Biol 7: 260−262.
【非特許文献１１】Oikawa, N., Yamaguchi, H., Ogino, K., Taki, T., Yuyama, K., Yamamoto, N., Shin, R.W., Furukawa, K. & Yanagisawa, K. (2009). gangliosides determine the amyloid pathology of Alzheimer's disease. Neuroreport 20, 1043−1046.
【非特許文献１２】Radhakrishnan A, Anderson TG, McConnell HM (2000) Condensed complexes, rafts, and the chemical activity of cholesterol in membranes. Proc Natl Acad Sci USA 97:12422−12427.
【非特許文献１３】Thakur G, Micic M, Leblanc RM (2009) Surface chemistry of Alzheimer's disease: A Langmuir monolayer approach. Colloids Surf. B Biointerfaces 74: 436−456.
【非特許文献１４】Thomsen R, Christensen MH (2006) MolDock: A New Technique for High−Accuracy Molecular Docking. J Med Chem 49: 3315−3321.
【非特許文献１５】Yahi N, Aulas A, Fantini J (2010)  How cholesterol constrains glycolipid conformation for optimal recognition of Alzheimer's beta amyloid peptide (Abeta1−40). PLoS One 5: e9079.
【非特許文献１６】Wu G, Lu ZH, Kulkarni N, Ledeen RW (2012) Deficiency of ganglioside GM1 correlates with Parkinson’s disease in mice and humans. J Neurosci Res 90, 1997−2008.
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、今般、Ａβおよびα−シヌクレインの糖脂質結合特異性を制御する生化学的コードを解読し、両タンパク質のガングリオシド結合特性を示すキメラペプチドを作製した。
【０００６】
従って、本発明は、
ａ）アミノ酸配列Ｅ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３−ＹＶＧＨＨ−Ｘ４（配列番号９）、
（ここで、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３のうち少なくとも１つは、グリシンまたはセリン残基であり、その他のＸ１、Ｘ２またはＸ３は何らかのアミノ酸であり、そして
Ｘ４は、スレオニンまたはグルタミン残基である。）；
ｂ）ペプチドをタンパク質分解から保護する１つまたはそれ以上の化学修飾により、配列番号９のアミノ酸配列に由来する配列、または
ｃ）１つまたはそれ以上の保存的置換により、配列番号９のアミノ酸配列に由来する実質的に相同な配列、
を含む、ペプチド（該ペプチドは、２つの連続したヒスチジン残基を含むと理解される。）を提供する。
【０００７】
該ペプチドは、１０から３０アミノ酸を有する。
【０００８】
好ましい態様において、本発明は、１２から２０アミノ酸を含むことが好ましく、
ａ）アミノ酸配列ＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴ（配列番号１）、または
ｂ）ペプチドをタンパク質分解から保護する１つまたはそれ以上の化学修飾により、配列番号１のアミノ酸配列に由来する配列、または
ｃ）１つまたはそれ以上の保存的置換により、配列番号１のアミノ酸配列に由来する実質的に相同な配列、
を含む、ペプチド（該ペプチドは、２つの連続したヒスチジン残基を含むと理解される。）を提供する。
【０００９】
好ましいペプチドは、ＫＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＫ（配列番号３）からなる。
【００１０】
かかるペプチドは、神経変性疾患、感染症または腫瘍を含む、細胞表面受容体部位としてガングリオシドを伴う病状の予防または処置に有用である。
【００１１】
本発明の別の目的は、本明細書に記載のキメラペプチドをコードする核酸である。本発明のさらなる目的は、該核酸を含むベクターであり、それは、好ましくは、アデノウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｈｉｓ−１３およびＨｉｓ−１４残基の両方が、ＧＭ１へのＡβ５−１６の結合に関与することを示す。Ａ。ガングリオシドＧＭ１の単分子層（monolayer）を、１７．５ｍＮ．ｍ−１の初期表面圧で調製した。平衡化後、野生型Ａβ５−１６（□）、または変異体Ａβ５−１６／Ｈ１３Ａ（▲）、Ａβ５−１６／Ｈ１４Ａ（●）、Ａβ５−１６／Ｈ１３Ａ／Ｈ１４Ａ（△）ペプチドを、単分子層膜の真下の水性副相(aqueous subphase)に注入した。データは、単分子層膜の真下の水性副相にペプチド（１０μＭ）を注入後の表面圧の変化を示す。核実験を三重(triplicate)にて行い、１つの代表的な曲線を示す（標準偏差（S.D.）＜１０％）。Ｂ。杯状（chalice−like receptacle）に配置された２つのＧＭ１分子と相互作用するＡβ５−１６の分子モデル。図１Ｃは、キメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨペプチドとＧＭ１の杯状の二量体との分子間相互作用を示す。
【図２】図２：α−ｓｙｎのＳＢＤ内へのＨｉｓ残基の導入は、ＧＭ３認識を変更せず、ＧＭ１に対するその親和性を増加させる。左パネル。野生型α−ｓｙｎ３４−４５（▲）および二重変異体α−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ（□）とＧＭ３（Ａ）またはＧＭ１（Ｃ）の単分子層との相互作用の速度論的解析。それぞれの場合において、単分子層を、１７．５ｍＮ．ｍ−１の初期表面圧で調製した。全ての実験を三重で行い、１つの代表的な曲線を示す（Ｓ．Ｄ.＜１５％）。右パネル。野生型α−ｓｙｎ３４−４５（▲）および二重変異体α−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ（□）と、種々の初期表面圧値で調製されたＧＭ３単分子層（Ｂ）またはＧＭ１単分子層（Ｄ）との相互作用。最大表面圧上昇（Δπｍａｘ）は、平衡に達した後に測定した。挿入の臨界圧力は、斜線とｘ軸との交点（ｘ切片）により示される。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、野生型およびキメラα−ｓｙｎ３４−４５ペプチドの分子モデルを示す。Ａ。野生型（左パネル）またはキメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ（右パネル）ペプチドの正の静電ポテンシャル面の可視化。Ｂ。ガングリオシドＧＭ１の単量体または二量体と相互作用する、野生型（左パネル）またはキメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ（右パネル）ペプチドの分子モデルシミュレーション。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、α−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ−ＧＭ１複合体の分子モデリング研究の実験的検証を示す。Ａ。単分子層アッセイ（実験条件は、図１Ａのものと同じである）における、キメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨペプチドとＧＤ１ａ（■）、ＧＭ１（□）、アシアロ−ＧＭ１（▲）、ＬａｃＣｅｒ（○）およびＧｌｃＣｅｒ（△）との相互作用。Ｂ。α−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨとＧＭ１：コレステロールまたはＧＭ１：ホスファチジルコリン（１：１、ｍｏｌ：ｍｏｌ）の混合した単分子層との相互作用。図４Ｃ：ＧＭ１単分子層に対する、α−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの挿入の臨界圧力の決定。ＧＭ１単分子層を、種々の初期表面圧πｉ値で調製し、水性副相に添加したキメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨペプチドでプローブした。最大表面圧上昇Δπｍａｘを平衡時に記録した。挿入の臨界圧力πｃ（３７．５ｍＮ．ｍ−１）を、線形回帰直線の傾きとｘ軸との切片として決定した。
【図５】図５：アミロイド細孔の形成におけるα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨまたはα−ｓｙｎ３４−４５の効果。Ａ。最初の実験では、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ１−４２ペプチド（２２０ｎＭ）で処理し、Ｃａ２＋依存的蛍光を分析した（上の曲線）。第二の一連の実験では、Ａβ１−４２およびキメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨペプチド（両方とも２２０ｎＭ）を、即時に直接細胞上に注入して混合した（Ｃ１およびＣ２曲線が、２つの別個の実験に対応する）。Ｃ３曲線は、キメラペプチド単独で誘導されるカルシウム応答に対応する。結果を平均±ＳＤ（ｎ＝１００）として表す。パネルＢにおいて、同じ色を使用したが、キメラペプチドは、野生型α−ｓｙｎ３４−４５ペプチドに置き換えられている。
【図６】図６：純粋なｂＥｎｄ−３細胞の単層を通過する、キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの経内皮通過の速度論的解析。細胞を、経内皮電気抵抗＞１００Ωｃｍ２を有する接着単層（tight monolayer）が形成されるまで、二区画培養チャンバーのフィルター上で培養した。０時点で、ペプチド（６００μＭ）を下部区画に注入し、上部区画内におけるその出現を定量的分光光度法によって決定した。
【図７】図７：Ｃ６細胞と共培養したｂＥｎｄ−３細胞の単層を通過する、キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの経内皮通過の速度論的解析。この場合、ｂＥｎｄ−３細胞を、下部区画のプラスチック壁上に培養されたグリアＣ６細胞の存在下で二区画培養チャンバーのフィルター上で培養した。ｂＥｎｄ−３細胞が経内皮電気抵抗＞１００Ωｃｍ２を有する接着単層を形成したとき、フィルターを新たな培養プレートに移し、その後、実験をＣ６細胞不存在下で行った。０時点で、ペプチド（６００μＭ）を下部区画に注入し、上部区画におけるその出現を定量的分光光度法によって決定した。
【図８】図８：ＣＴＸ細胞と共培養したｂＥｎｄ−３細胞の単層を通過する、キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの経内皮通過の速度論的解析。図７に記載の実験と同じ実験であるが、ｂＥｎｄ３細胞を、最初にアストロサイトＣＴＸ細胞の存在下で共培養した。
【図９】図９：血液脳関門の３つのインビトロモデルによる、キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの経内皮通過の速度論的解析。血液脳関門の細胞モデルは、ｂＥｎｄ−３細胞のみ（ｂ）、Ｃ６細胞と共培養したｂＥｎｄ−３細胞（ｃ）またはＣ６細胞と共培養したｂＥｎｄ−３細胞（ｄ）。ペプチド追加なしの対照実験（ａ）を並行して行った（この場合、同量のＰＢＳを細胞に添加した）。ヒストグラムは、１時間後（Ａ）または２４時間後（Ｂ）に該関門を通過したキメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの濃度を示す。
【図１０】図１０：ｂＥｎｄ−３細胞の単層を通過するキメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの経内皮通過の速度論的解析。上の曲線は、ドナー（すなわち、下部）区画中のペプチドの進行性消失を示す。下の曲線は、アクセプター（すなわち、上部）区画中のペプチドの段階的増加を示す。
【図１１】図１１：アミロイド細孔形成における、キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの共通の抗アルツハイマー病および抗パーキンソン病効果Ａ。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ１−４２ペプチド（２２０ｎＭ）で処理し、Ｃａ２＋依存性蛍光を分析した。ヒストグラムは、１００細胞の分析結果を示す（平均±ＳＤ）。キメラペプチドの不存在下（−Ｐｅｐ  Ｃｈｉｍ）において、Ａβ１−４２ペプチドにより誘導されるアミロイド細孔形成が、細胞内のＣａ２＋蛍光の増加により証明された。Ａβ１−４２をキメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの存在下（＋Ｐｅｐ  Ｃｈｉｍ）で細胞に添加したとき（両方とも２２０ｎＭ）、Ｃａ２＋蛍光の検出可能な増加はなかった。Ａβ１−４２（左顕微鏡写真）またはＡβ１−４２＋キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ（右顕微鏡写真）で処理した細胞の代表的な顕微鏡視野を、ヒストグラムの下に表す。暖色はより強い蛍光（左軸）に相当する。Ｂ。同様の実験を、Ａβ１−４２の代わりにα−シヌクレインを用い、キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨの不存在下（−Ｐｅｐ  Ｃｈｉｍ）または存在下（＋Ｐｅｐ  Ｃｈｉｍ）で行った。＊＊＊、有意差；Ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２：キメラペプチドＫＥＨＨＧＶＬＹＶＧＴＫ（配列番号１１）（１０μＭ）とガングリオシドＧＭ１（■）またはＧＭ３（□）の単分子層との相互作用の速度論的解析。相互作用は、ペプチドの添加後の時間の関数として表面圧（π）の増加によって測定される。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明：
本発明者らは、Ａβおよびα−シヌクレインが、共に、ほとんど配列相同性を有しないで、共通の構造的に関連する糖脂質結合ドメインを提示することを示した。ガングリオシドＧＭ１に対するＡβの高い親和性は、ヒスチジン残基のペア（Ｈｉｓ−１３およびＨｉｓ−１４）の存在により決定される。次いで、本発明者らは、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ３４−４５）の最小の糖脂質結合ドメインのアミノ酸Ｓｅｒ−４２およびＬｙｓ−４３を２つのヒスチジン残基によって置換した。得られたキメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドは、ガングリオシドＧＭ３を認識する能力を完全に保持し、高い表面圧でＧＭ１の凝集複合体に結合する能力を獲得していた。
【００１４】
キメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドは、シアル酸（ＧａｌＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒ、アシアロ−ＧＭ１）を含まない中性糖脂質以外のガングリオシドとほとんど相互作用した。
【００１５】
その天然脂質環境においてこれらのガングリオシドに対する本発明のキメラペプチドの高い親和性は、幅広い治療用途を開拓する。
【００１６】
定義
用語“患者”または“対象”は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは男性、女性、大人および小児を含む哺乳動物を意味する。
【００１７】
本明細書で用いる用語“処置”または“治療”には、治癒および／または予防的処置が含まれる。より具体的に、治療的処置は、緩和、改善および／または除去、症状の低減および／または安定化（例えば、より進んだ段階への進行の停止）、ならびに特定の疾患の症状の進行遅延のいずれかを意味する。
【００１８】
予防的処置または“予防”は、次のいずれかを意味する：発症の停止、発症リスクの低減、発症予防、発症遅延、発症の低減、ならびに特定の疾患の症状の発症までの時間の延長。本発明の文脈において、用語“予防する”は、より具体的には、特定の疾患を発症するリスクのある対象、すなわち、神経変性疾患、感染症または腫瘍を含む、細胞表面受容体部位としてガングリオシドを含む何らかの状態にある対象に適用される。
【００１９】
２つのアミノ酸配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似の残基で置換されているとき、またはアミノ酸の８０％超が同一であるか、または９０％超、好ましくは約９５％超が類似（機能的に同一）であるとき、“相同”、“実質的に相同”または“実質的に同じ”である。好ましくは、類似または相同配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、または当技術分野で公知のプログラムのいずれか（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を用いるアライメントにより同定される。好ましくは、これらの相同ペプチドは、環化が阻止されるように、２つのシステイン残基を含まない。好ましくは、相同配列は、１つもしくはいくつかのアミノ酸の置換、挿入および／または欠失などの変異によって異なる。好ましくは、相同配列は、保存的置換（複数可）によってのみ異なる。
【００２０】
本明細書で用いる用語“保存的置換”は、１つのアミノ酸を同様の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、形、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸に置換することを含むが、これに限定されない、ペプチドの全体的な立体構造および機能を変更することなく、１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することを意味する。同様の特性を有するアミノ酸は、当技術分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンは、いずれも親水性−塩基性アミノ酸であり、置換可能である。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換可能である。互いに置換可能な中性の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。
【００２１】
“ガングリオシド”とは、糖鎖に連結された１つまたはそれ以上のシアル酸（例えば、ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ）を有するスフィンゴ糖脂質（セラミドおよびオリゴ糖）からなる分子を意味する。炭水化物シアル酸のアセチル化誘導体であるＮｅｕＮＡｃは、ｐＨ７にてガングリオシドのアニオン性の頭部基をつくる。ガングリオシドは、細胞膜に埋め込まれたセラミド部分の２個の炭化水素鎖および細胞外表面上に位置するオリゴ糖を有して、細胞表面上に濃縮されて存在しており、それらは、細胞外分子または隣接する細胞の表面に対する認識点を提示する。一般的なガングリオシド（ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１）の構造は、当技術分野で公知である。
【００２２】
本発明のキメラペプチド：
本発明は、アミノ酸配列Ｅ−Ｘ１Ｘ２Ｘ３−ＹＶＧＨＨ−Ｘ４（配列番号９）、好ましくはＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴ（配列番号１）を含むペプチドを提供する。
【００２３】
本発明はさらに、例えば下記に定義するような、ペプチドをタンパク質分解から保護する１つまたはそれ以上の化学修飾により、配列番号１から配列番号９に由来する配列を示すタンパク質分解抵抗性ペプチドを提供する。
【００２４】
１つまたはそれ以上の保存的置換により配列番号１から配列番号９に由来する配列を示す実質的に相同なペプチドもまた、本発明に包含される。
【００２５】
本発明の全てのペプチドは、２つの連続するヒスチジン残基を含む。
【００２６】
本発明のペプチドは、好ましくは、１０から３０アミノ酸、さらに好ましくは１２から２０アミノ酸、好ましくは１２から１６アミノ酸を有する。
【００２７】
有利には、Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸の両方が塩基性アミノ酸であり、好ましくは、リシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群より独立して選択される。
【００２８】
特定の態様において、該ペプチドは、Ｘ５−ＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴ−Ｘ６（配列番号２）（ここで、Ｘ５およびＸ６は、独立して、リシン、アルギニンまたはヒスチジンである。）を含むか、またはそれからなる。
【００２９】
好ましいペプチドは、ＫＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＫ（配列番号３）からなる。
【００３０】
他のペプチドは、
ＲＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＲ（配列番号６）；
ＲＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＫ（配列番号７）；
ＫＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＲ（配列番号８）
を含むか、またはそれからなる。
【００３１】
逆(reversed)ペプチド：
ヒスチジン残基のペアをキメラペプチドのＮ末端部分に移動させたペプチドが、さらに記載される。
【００３２】
かかるペプチドは、本明細書中で、“逆キメラペプチド”とも言われ、１０から３０アミノ酸長である。
【００３３】
かかるペプチドは、Ｘ５−ＥＨＨＧＶＬＹＶＧＴ−Ｘ６（配列番号１０）（ここで、Ｘ５およびＸ６は、独立して、リシン、アルギニンまたはヒスチジンである。）を含むか、またはそれからなる。
【００３４】
特定のペプチドは、ＫＥＨＨＧＶＬＹＶＧＴＫ（配列番号１１）である。
【００３５】
以下のセクションは、本明細書に記載のこれらの逆ペプチドならびに全てのキメラペプチドに適用される。これらの逆ペプチドは、α−シヌクレインおよびβ−アミロイドペプチドの両方のガングリオシド結合特性を示す。従って、これらのペプチド、または該ペプチドをコードする核酸はまた、神経変性疾患、感染症または腫瘍を含む、細胞表面受容体部位としてガングリオシドを伴う何らかの病状の予防または治療のために開示される。
【００３６】
ペプチド調製：
本明細書に記載のペプチドは、当業者に公知の標準的合成法、例えば化学的合成法または遺伝子組換え法を用いて合成され得る。好ましい態様において、ペプチドは、適当な順序でアミノ酸配列を既に含む予め形成されたフラグメントを縮合することによるか、または予め調製された幾つかのフラグメントを縮合することにより、アミノ酸残基の段階的な縮合により得られ、その間、縮合中にペプチド結合に関与するもの以外のアミノ酸の官能基を保護する。特に、ペプチドは、Merrifieldにより最初に報告された方法に従って合成され得る。
【００３７】
化学的合成法の例は、固相合成法および液相合成法である。固相合成法としては、例えば、合成されるべきペプチドのＣ末端に相当するアミノ酸を、有機溶媒に不溶性の支持体に結合させ、適当な保護基で保護されたそれらのアミノ基および側鎖官能基を有するアミノ酸を、Ｃ末端からＮ末端に順に１つずつ縮合させ、そして樹脂に結合されているアミノ酸またはペプチドのアミノ基の保護基をはずす、反応の交互の繰り返しによって、ペプチド鎖を伸長させる。固相合成法は、使用する保護基の種類に応じて、ｔＢｏｃ法およびＦｍｏｃ法に主に分類される。典型的に使用される保護基には、アミノ基についてｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４、４’−ジメトキシベンゾヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２、３、６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）およびＣｌｚ−Ｂｚｌ（２、６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基についてについて、ＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２、５，７、８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；ならびに、ヒドロキシル基についてｔＢｕ（ｔ−ブチル）が含まれる。所望のペプチドの合成後、これを脱保護反応に付し、固体支持体から切り離す。かかるペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法に関してフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸を用いて、Ｆｍｏｃ法に関してＴＦＡを用いて行われ得る。
【００３８】
あるいは、ペプチドは、組換え技術を用いて合成され得る。この場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成される核酸および／または遺伝子構築物、上記の配列またはストリンジェントな条件下で該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列のうち１つに相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチドを製造する。
【００３９】
本発明はさらに、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、および宿主細胞における本発明のペプチドの発現(例えば、転写および翻訳)を可能にする調節配列（例えば、適当なプロモーター(複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）など）からなる、またはそれを含む遺伝子構築物に関する。
【００４０】
従って、別の面において、本発明は、本発明のペプチドを発現する（または、好適な条件下でそれを発現することができる）宿主または宿主細胞；および／または、本発明のポリヌクレオチドもしくは本発明の遺伝子構築物を含む宿主または宿主細胞に関する。
【００４１】
ペプチドの製造法は、必要に応じて、該ペプチドの精製工程、該ペプチドの化学的修飾工程、および／または該ペプチドの医薬組成物への製剤化工程を含んでいてよい。
【００４２】
タンパク質分解からのさらなる保護：
本明細書に記載のペプチドのＮ末端およびＣ末端は、必要に応じて、タンパク質分解から保護され得る。例えば、Ｎ末端は、アセチル基の形態でもよく、および／またはＣ末端は、アミド基の形態でもよい。タンパク質分解に抵抗性であるようにペプチドの内部修飾もまた想定され、例えば少なくとも−ＣＯＮＨ−ペプチド結合は、（ＣＨ２ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）レトロインベルソ結合、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合、（ＣＯ−ＣＨ２）セトメチレン結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合）、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン（alcene）結合または−ＣＨ＝ＣＨ−結合により修飾および置換される。
【００４３】
例えば、ペプチドは、アセチル化、アシル化、アミド化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合架橋形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、リン酸化などによって修飾されてよい。
【００４４】
本発明のペプチドは、ペプチドをタンパク質分解に対して抵抗性にする、Ｄ配置のアミノ酸(複数可)から構成されてよい。それらはまた、Walenskyら（2004）に記載の所謂“ステープル”技術により、少なくとも２つのアミノ酸残基をオレフィン側鎖、好ましくはＣ３−Ｃ８アルケニル鎖、好ましくは、ペンテン−２−イル鎖で修飾し、次いで、その鎖を化学的架橋することにより、分子内架橋によって安定化され得る。例えば、位置ｉおよびｉ＋４からｉ＋７のアミノ酸は、反応性オレフィン残基を示す非天然アミノ酸により置換されていてよい。全てのこれらのタンパク質分解−抵抗性の化学的に修飾されたペプチドは、本発明に包含される。
【００４５】
本発明の別の面において、尿クリアランスおよび使用する治療用量の低減のため、ならびに血漿中半減期の延長のために、ペプチドは、それらのＣ末端またはリシン残基によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、特に１５００または４０００ＭＷのＰＥＧに共有結合されている。さらに別の態様において、ペプチド半減期は、マイクロスフェアを形成する薬物送達システムのための生分解性および生体適合性ポリマー材料中にペプチドを含むことによって延長される。ポリマーおよびコポリマーは、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である（ＵＳ２００７／０１８４０１５に記載、SoonKap Hahn et al）。
【００４６】
他の態様において、本発明のペプチドは、デンドリマーもしくは他の分枝した分子により、またはそれらをカプセル化し得るか、もしくは必要に応じて結合することができるナノ粒子もしくはナノキャリアにより保護されていてよい。
【００４７】
核酸
本発明はまた、本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれから構成されるポリヌクレオチドにも関する。
【００４８】
本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ならびに宿主細胞における本発明のペプチドの発現（例えば、転写および翻訳）を可能にする調節配列（例えば、適当なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）など）からなる、またはそれを含む遺伝子構築物に関する。
【００４９】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、好ましくはｃＤＮＡであり、また好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、意図する宿主細胞または宿主生物の形質転換に適する形態、意図する宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むのに適する形態、または意図する宿主生物における複製、維持および／または遺伝（inheritance）に適する形態であってもよい。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンのようなベクターの形態であってよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、インビトロおよび／またはインビボ（例えば、適当な宿主細胞、宿主生物および／または発現系）での発現を可能にするベクターであり得る。
【００５０】
好ましいが非限定的な面において、本発明の遺伝子構築物は、ｉ）本発明の少なくとも１つの核酸；ｉｉ）プロモーターおよび要すれば適当なターミネーターなどの、１つまたはそれ以上の調節要素（上記ｉ）はこれに作動可能に連結されている）；ならびに、要すれば、ｉｉｉ）３’−または５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、および／または形質転換もしくは組み込み（の効率）を促進もしくは高め得る要素のような遺伝子構築物の１つまたはそれ以上のさらなる要素、を含む。
【００５１】
核酸は、とりわけ、エクスビボまたはインビボ感染および本発明のペプチドの発現のために、例えば、アデノウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスベクターによって運ばれてもよい。
【００５２】
治療適用：
本明細書に記載のペプチドまたは核酸は医薬として有用である。
【００５３】
本明細書中、患者における細胞膜ガングリオシドへの接着を伴う病状の予防または処置のための方法を提供し、該方法は、該患者に有効量の本発明のペプチド、またはかかるペプチドをコードする核酸を投与することを含む。好ましい態様において、患者における神経変性疾患の予防または処置のための方法を提供し、該方法は、該患者に有効量の本発明のペプチド、またはかかるペプチドをコードする核酸を投与することを含む。
【００５４】
神経変性疾患には、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）が含まれ、それらは全て、ＧＭ１および／またはＧＭ３ガングリオシドへの結合を伴うことが知られている。
【００５５】
神経変性疾患はまた、ＧＭ１およびＧＤ１ａガングリオシドを伴う、ギラン・バレー症候群であり得る。別の態様において、患者における感染症の予防または処置のための方法を提供し、該方法は、該患者に有効量の本発明のペプチド、またはかかるペプチドをコードする核酸を投与することを含む。一般的には、全ての病原性微生物は、感染細胞の表面にて受容体としてガングリオシドを使用すると考えられている。
【００５６】
感染症は、主に、ウイルス、例えばＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ロタウイルス、ＢＫウイルス、エボラウイルスによる感染、または細菌、例えばヘリコバクター・ピロリ、またはマイコプラズマ肺炎による感染である。感染症は、大腸菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、またはコレラ菌などの細菌毒素を含み得る。プリオン病、ならびに熱帯熱マラリア原虫（ＧＭ１ａへの結合を伴う）などの寄生虫による感染症もまた、包含される。
【００５７】
当業者は、微生物のタンパク質（例えば、ウイルスの表面糖タンパク質、例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０）と細胞膜ガングリオシド（例えば、ＧＭ３）との相互作用、ならびに本発明のキメラペプチドによるこれらの相互作用の阻害を測定することができる。その目的のために、ガングリオシドは、水−空気界面に脂質単分子層を形成するために水相の表面に露出されていてよい。次いで、微生物タンパク質が水性副相に注入されると、それらのガングリオシドとの相互作用は、表面張力を測定することにより決定される。感染試験は、感染を阻止するペプチドの能力を確認するためにさらに実施されてよい。
【００５８】
さらに別の態様において、患者における腫瘍の予防または処置のための方法を提供し、該方法は、該患者に有効量の本発明のペプチド、またはかかるペプチドをコードする核酸を投与することを含む。
【００５９】
特定の決定要因としてのガングリオシドの機能は、実際に、組織の増殖および分化ならびに発癌におけるその重要な役割を示唆している。また、Daniotti（2013）らの、腫瘍関連ガングリオシドの概要も参照のこと。
【００６０】
本発明の抗腫瘍治療は、任意の悪性腫瘍の持続的な顕微鏡的根絶、および／または再発の予防もしくは遅延に有用である。
【００６１】
さらに、ペプチド（またはかかるペプチドをコードする核酸）は、転移を予防または処置するために使用することができる。
【００６２】
本発明のペプチド（またはかかるペプチドをコードする核酸）は、実際に、特に血液脳関門を介する、転移性細胞の拡散または増殖を防止する上でとりわけ有用である。
【００６３】
腫瘍は、固形癌または血液の癌などの癌であり得る。好ましい態様において、腫瘍は、黒色腫、神経芽腫、神経膠腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病、乳癌、腎臓癌からなる群より選択される。
【００６４】
医薬組成物：
本発明のペプチド（またはかかるペプチドをコードする核酸）は、静脈内、経口、経皮、皮下、粘膜、筋肉内、肺内、鼻腔内、非経腸、直腸、膣および局所を含む任意の都合の良い経路により投与され得る。
【００６５】
ペプチドは、薬学的に許容される担体と共に製剤され得る。従って、本明細書に上記のペプチド（またはかかるペプチドをコードする核酸）を薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
医薬組成物はまた、他の活性成分を含んでいてよい。
そこに溶解または分散された活性成分を含む医薬組成物の調製は当技術分野でよく理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。典型的には、そのような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。しかしながら、使用前に溶液または懸濁液に適する固体形態としても調製できる。調製物は乳化することもできる。特に、医薬組成物は、固体の投与量形態、例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉剤、糖衣錠または顆粒に製剤されてよい。
【００６７】
ビヒクルの選択およびビヒクル中の活性物質の含有量は、一般に、活性化合物の溶解性および化学的性質、特定の投与方法、その他、薬物取扱業務において遵守されるべき方法に従って決定される。例えば、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、ならびにデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、およびステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの潤滑剤と組み合わせたある種の複合ケイ酸塩を、錠剤を製造するために使用することができる。カプセルを製造するために、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールを使用することが有利である。水性懸濁剤が使用される場合、それらは乳化剤または懸濁を促進する物質を含み得る。スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロールおよびクロロホルムまたはそれらの混合物などの希釈剤もまた、使用できる。
【００６８】
調製物は、生成物の制御放出または持続放出を提供することができる、注射可能なミクロスフェア、生体分解可能な粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの物質を含む所望の分子の製剤を含み得る。
【００６９】
特定の態様において、ペプチド（または、かかるペプチドをコードする核酸）は、エレクトロポレーションによって投与することができる。エレクトロポレーションは、エレクトロパーミアビリゼーションまたはエレクトロインジェクションとしても公知であり、細胞膜、細胞または組織を横断する一定の短い強力な電磁場の適用の結果としての、細胞膜の透過化である。
【００７０】
投与法は、当業者により、用いる投与経路および投与量形態に依存して選択される。単一用量または分割用量で対象に投与されるペプチドの総１日用量は、例えば、１日当たり、約０．００１から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／日の量であり得る。約５ｍｇ／ｋｇの１日投与量が好ましい。投与量単位組成物は、１日用量を構成するために使用することができるようにその適切な量を含んでいてよい。しかしながら、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間および経路、吸収および排泄の速度、他の薬剤との組合せ、ならびに処置される特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存し得ることが理解されるだろう。
【００７１】
好ましくは、ペプチドは、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間の間、１日１回投与される。
【００７２】
本発明のさらなる面および利点は、以下の実施例部分に記載され、それは例示であって、本願の範囲を限定するものではないとみなされるべきである。
【実施例】
【００７３】
実施例１：本発明のキメラペプチドと細胞膜ガングリオシドとの相互作用
材料および方法
材料。純度＞９５％の合成ペプチドを、Ｓｃｈａｆｅｒ−Ｎ（Copenhagen, Denmark）から入手した。超純非発熱性水を、Ｂｉｏｒａｄ（Marnes La Coquette, France）から入手した。全ての脂質は、Ｍａｔｒｅｙａ（Pleasant Gap, PA）から購入した。
【００７４】
分子モデリング。ペプチド−ガングリオシド相互作用の室内（in silico）での実験を、既報のＨｙｐｅｒｃｈｅｍ  ８プログラム（ChemCAD, Obernay, France）（Fantini and Yahi, 2011a）を用いて行った。分子をＨｙｐｅｒｃｈｅｍ  ８、ＰＤＢ−ｖｉｅｗｅｒ（Guex et al, 1997）およびＭｏｌｅｇｒｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｅｗｅｒ（Thomsen et al, 2006）ソフトウェアを用いて可視化した。
【００７５】
脂質単分子層アッセイ。ペプチド−コレステロール相互作用を、既報の通り（Fantini and Yahi, 2011a）、Ｋｉｂｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｔｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒを用いて、ラングミュアフィルムバランス技術を用いて実験した。
【００７６】
カルシウム測定。細胞を３５ｍｍの培養皿に播種し、７２時間増殖させ、暗所で３０分間、５μΜのＦｌｕｏ−４ ＡＭ（Invitrogen−Life Technologies, Saint Aubin, France）をローディングし、ＨＢＳＳ（Gibco−Life Technologies, Saint−Aubin, France）で３回洗浄し、そして３７℃で２０分間インキュベートした。カルシウムフラックスを照明システムＭＴ２０モジュールを備えた正立顕微鏡対物レンズ（BX51W Olympus, Rungis, France）上の記録チャンバー中で直接、ペプチド注入後の細胞の蛍光強度の変化を測定することによって推定した。５２５ｎｍでの蛍光発光を４９０ｎｍで蛍光励起後にデジタルカメラＣＤＤ（ORCA−ER Hamanatsu, Japan）で画像化した。タイムラプス画像（１フレーム／１０秒）を、ＣｅｌｌＲソフトウェア（オリンパス）を用いて集めた。シグナルは処理後の蛍光（Ｆｔ）を処理前の蛍光（Ｆ０）で割り１００を乗じて表した。結果を平均し、対照の蛍光割合を、各値から減算した（Di Scala et al, 2014; Fantini et al, 2014）。
【００７７】
結果
α−シヌクレインおよびＡβの最小の糖脂質−結合ドメインのアミノ酸配列を以下に示す：
ヒトα−シヌクレイン３４−４５：ＫＥＧＶＬＹＶＧＳＫＴＫ（配列番号４）
ヒトＡβ５−１６：ＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号５）
キメラα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ：ＫＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＫ（配列番号３）。
【００７８】
Ａβ５−１６中の２つのヒスチジン残基のアラニンによる置換は結果として、ＧＭ１との相互作用の完全な喪失をもたらした（図１Ａ）。この実験において、ガングリオシドＧＭ１の単分子層を空気−水界面で調製し、ペプチドを水性副相に注入した。ペプチドとガングリオシドとの相互作用は、白金プローブを用いてリアルタイムで追跡した単分子層の表面圧の増加によって証明された（Thakurら（2009）、完全な技術説明およびアミロイドタンパク質へのその適用を参照のこと）。野生型Ａβ５−１６ペプチドについては、表面圧がペプチドの注射後すぐに増加し始め、インキュベーションの３０分後に最大に達した。これとは対照的に、二重変異体Ｈｉｓ−１３Ａｌａ／Ｈｉｓ−１４ＡｌａはＧＭ１と相互作用しなかった（図１Ａ）。その後、単一変異体をアッセイして、２つのＨｉｓのどちらが実際にＧＭ１認識に重要であるのかを識別した。驚くことに、相互作用の全体的な喪失が、各単一変異体（Ｈｉｓ−１３ＡｌａおよびＨｉｓ−１４Ａｌａ）で観察されたため、両方が関与することが明らかとなった。分子モデリング・シミュレーションは、この結果にある種の解を与える（図１Ｂ）。Ａβ５−１６とＧＭ１との安定な複合体の形成には、ペプチドについて杯状を形成する２つのＧＭ１分子を必要とする。このモデルにおいて、Ｈｉｓ−１３は１つのＧＭ１と相互作用し、そしてＨｉｓ−１４は第２の１つと相互作用する。明らかに、両方のＧＭ１分子間の相互作用は、ヒスチジン残基によってもたらされるＡβ５−１６ペプチドとの最適な相互作用を可能にした。逆に、これらのヒスチジン残基の欠失のため、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ３４−４５）の糖脂質結合ドメインは、ＧＭ１の代わりにガングリオシドＧＭ３に対して顕著な結合性を有する。
【００７９】
Ａβ５−１６とＧＭ１二量体との高い親和性の相互作用についてのヒスチジン残基の重要な役割を考慮して、本発明者らは、α−ｓｙｎ３４−４５中に隣接するＨｉｓ残基の同様のペアを導入することを決定し、キメラα−ｓｙｎ３４−４５Ｓｅｒ−４２Ｈｉｓ／Ｌｙｓ−４３Ｈｉｓ（α−ｓｙｎ／ＨＨとも言う、図１Ｃ）を合成した。Ｓｅｒ−４２もＬｙｓ−４３もいずれもＧＭ３結合に関与しないと考えられたため、本発明者らは、この二重変異体は、キメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドとＧＭ３単分子層との相互作用を妨害しないであろうと推測した。図２に示す通り、α−ｓｙｎ／ＨＨペプチドは予測通りに挙動した。ＧＭ３との相互作用の速度論的解析は、野生型α−ｓｙｎ３４−４５ペプチドと正確に同じであり（図２Ａ）、挿入の臨界圧力（πｃ）は、野生型およびキメラペプチドの両方とも３７．５ｍＮ．ｍ−１と推定された（図２Ｂ）。πｃは、結合親和性に比例する。このパラメーターは、糖脂質が密集し過ぎているため相互作用が起こらない、上記の単分子層の表面圧に相当する（Thakur et al, 2009; Fantini et al, 2011b）。従って、α−ｓｙｎ３４−４５中のＨｉｓ残基のペアの導入は、ペプチドのＧＭ３結合能力を全く妨害しなかった。対照的に、キメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドは、リアルタイム動態実験で観察された、ＧＭ１に対する顕著に増加した親和性を得た（図２Ｃ）。さらに、ＧＭ１単分子層で測定されたπｃの値は、野生型α−ｓｙｎ３４−４５ペプチドの２５ｍＮ．ｍ−１からα−ｓｙｎ／ＨＨの場合には３７．５ｍＮ．ｍ−１へ増加し、これは、ＧＭ１に対するキメラペプチドの顕著に強い親和性を示している（図２Ｄ）。
【００８０】
野生型およびα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドの室内での分析は、それらが同じ分子量を占めることを示した。しかし、α−ｓｙｎ／ＨＨペプチド中のＨｉｓ残基のペアの導入により、静電ポテンシャルのより対称な分布が得られた（図３Ａ）。従って、野生型α−ｓｙｎ３４−４５およびキメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドは、ＧＭ１のアニオン性グリコン頭部基と相互作用する方法が顕著に異なっていた。図３Ｂ（左パネル）に示す通り、α−ｓｙｎ３４−４５は、ＧＭ１単量体の突出した糖部分の周りに湾曲した形状を採った。そのよりバランスのとれた分布の静電界ため、キメラペプチドは、典型的な杯状容器に配置されたＧＭ１分子の二量体と安定な複合体を形成することができた（図３Ｂ、右パネル）。Ａβ５−１６／ＧＭ１複合体については、α−ｓｙｎ／ＨＨのＨｉｓ残基のそれぞれが、花びら（chalice of a flower）上の蝶の羽に例えるように、それ自体ＧＭ１ガングリオシドと相互作用した。α−ｓｙｎ／ＨＨとＧＭ１二量体との分子間相互作用の詳細な説明は図１Ｃに示される。全体的に、これらのデータは、Ｈｉｓ残基が、アミロイドタンパク質の糖脂質−結合ドメインに対応できる機能的な杯状の二量体にＧＭ１分子を集めるために重要であるという考えを強く支持する。
【００８１】
いくつかの実験が、この結論を検証するために行われた。まず、本発明者らは、α−ｓｙｎ／ＨＨペプチドと種々の糖脂質との相互作用を分析した。実際のところ、このキメラペプチドは、ガングリオシド（ＧＭ１、ＧＭ３、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ３およびＧＴ１ｂ）に対して選択的親和性を示し、中性の糖脂質（ＧａｌＣｅｒ、ＬａｃＣｅｒ、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１）とほとんど反応しなかった（図４Ａおよび表１）。
【００８２】
【表１】
0006609565.tif 000002
【００８３】
これは、糖脂質のグリコン部分における少なくとも１つのシアルの存在が、分子モデリングデータ（図１Ｃ）と完全に一致して、結合のために必要であることを示している。そして、本発明者らは、ＧＭ１およびキメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチド間の相互作用上の脂質環境の影響を分析した。この実験において、本発明者らは、ＧＭ１／コレステロールおよびＧＭ１／ホスファチジルコリンの混合単分子層を製造し、これらの単分子層を用いてα−ｓｙｎ／ＨＨの相互作用の動態を追った。図４Ｂに示す通り、コレステロールは、α−ｓｙｎ／ＨＨペプチドとＧＭ１との相互作用を著しく加速させたが、一方で、ホスファチジルコリンは、反応が遅くなる傾向があった。これは、糖脂質コンフォメーション上のステロール制御を可能にする（Yahi et al, 2001; Lingwood et al, 2011）、ＧＭ１と縮合した複合体を形成するコレステロールの周知の作用（Radhakrishnan et al, 2000）に沿ったものである。さらに、コレステロールとＧＭ１との相互作用は、ＧＭ１二量体の杯状コンフォメーションを安定化することが示されている（Fantini et al, 2013）。この点において、コレステロールは、ＧＭ１に対するα−ｓｙｎ／ＨＨの親和性を増大させることなく、相互作用を加速することが予期される（図４Ｂに示すように、活性なコンフォメーションはコレステロールなしで達成され得るが、その速度は遅い。）。混合ＧＭ１／コレステロール単分子層（３７．５ｍＮ．ｍ−１）についてのπｃの実験結果は、この予想を強く支持する（図４Ｃ）。
【００８４】
神経毒性Ａβ１−４２ペプチドを、蛍光感受性色素Ｆｌｕｏ−４ＡＭを予めローディングしたヒト神経芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と共にインキュベートしたとき、細胞内Ｃａ２＋濃度の劇的な増加が観察された（図５）。誘発されたＣａ２＋濃度のこの上昇は、等モル量のキメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドの存在下で顕著に低下した（図５Ａ）。この効果は、ごくわずかしか阻害活性を有しなかった野生型キメラα−ｓｙｎ３４−４５ペプチドと比較してみると、２つのＨｉｓ残基の存在に大きく依存していた（図５Ｂ）。これは、アルツハイマーのβ−アミロイドペプチドの神経毒性では、ＧＭ１が重要な役割を果たし、ＧＭ３は役割を果たさないことと一致している（Fantini et al, 2010; Fantini et al, 2013）。最後に、キメラα−ｓｙｎ／ＨＨペプチドはそれ自体では、内因性神経毒性の欠如を示すＣａ２＋流動にはほとんど影響がなかったことに留意すべきである。
【００８５】
実施例２：血液脳関門の通過輸送
キメラペプチドα−ｓｙｎ３４−４５／ＨＨ：ＫＥＧＶＬＹＶＧＨＨＴＫ（配列番号３）の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送の実験をするために、本発明者らは、単分子層の内皮細胞（マウスｂＥｎｄ−３細胞、ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−２２９９）に基づく機能的な細胞系を再構成した。これらの細胞を、二区画細胞チャンバー（Greiner Bio−one）に１ウェル当たり１０．０００から５０．０００細胞の範囲の種々の密度で播種した。該チャンバーの下部区画は、１２ウェル培養プレートの一部のウェルである。上部チャンバーには、細胞が播種される場所の上に透過フィルター（０．４μｍの平均細孔径）が装備されている。細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １０％ウシ胎仔血清中で培養する。
【００８６】
コンフルエントで、細胞は、１５０−２００Ω．ｃｍ２の経内皮電気抵抗（ＥＶＯＭ装置で測定、ＷＰＩ）を有する均一な単分子層を形成した。経内皮電気抵抗は、培養全体のタイトジャンクションの存在を反映する。これらのタイトジャンクションは、傍細胞経路での分子（物質）の通過を効率よく防ぐ。この値が＞１００Ω．ｃｍ２であるとき、内皮が密着していると考えられる。従って、全ての実験は、機能内皮バリアーを用いて行われる。
【００８７】
バリアーの３つのモデルが用いられた：ｉ）純粋なｂｅｎｄ−３細胞の単層、ｉｉ）ｂＥｎｄ−３細胞と培養チャンバーの下部区画に播種したアストロサイトＣＴＸ−ＴＮＡ２細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−２００６）とを共培養した単分子層、およびｉｉｉ）ｂｅｎｄ−３細胞と培養チャンバーの下部区画に播種したグリアＣ６細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−１０７）とを共培養した単分子層。共培養系を使用するための理論的根拠は、グリア細胞による栄養因子の分泌によって再構成された内皮の分化を改善することである。全ての場合において、これらの異なる培養系における経内皮電気抵抗の値は、常に、１５０−２００Ω．ｃｍ２以上であった。
【００８８】
経内皮電気抵抗の典型的な値は次のとおりである：
−純粋なｂＥｎｄ−３単分子層：１８５Ω．ｃｍ２
−ｂＥｎｄ−３／ＣＴＸ−ＴＮＡ２：１５３Ω．ｃｍ２
−ｂＥｎｄ−３／Ｃ６：１８６Ω．ｃｍ２。
【００８９】
キメラペプチドを培養チャンバーの下部区画に注入し、下部区画および上部区画の両方におけるその濃度を、時間関数として分析した。こうして、内皮バリアーを通るペプチドの通過をリアルタイムで追跡する。キメラペプチドの濃度は分光光度法により決定する。実験の終了時には、回収された全容量が、最初の容量の＜１０％になるように、２μＬのアリコートをペプチドの添加後の異なる時点で培養培地から回収した。ペプチドの全体のスペクトル分析を、６つの特徴的な値を示すＡ２３０／Ａ２７５比を決定するために行った（該ペプチドは、２３０ｎｍの吸収スペクトルを有する１１個のペプチド結合ならびに２７５ｎｍのピークを有するチロシン残基を有する）。
【００９０】
２．１．純粋なｂｅｎｄ−３バリアーを通過する速度論的解析
この実験において、ペプチドを、１８５Ω．ｃｍ２の経皮内電気抵抗を有する純粋なｂｅｎｄ−３細胞の密接な単分子層の下に注入した。細胞をＰＢＳ−Ｃａ２＋で２回濯ぎ、その後、ペプチドなし（上部区画、ＰＢＳ−Ｃａ２＋のみ）または６００μＭのキメラペプチド（下部区画）でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｃａ２＋などのカルシウム含有緩衝液の使用は、実験中を通してタイトジャンクションの完全性を維持する必要があった（インキュベーションの２４時間後に、経内皮電気抵抗が未だ１６２Ω．ｃｍ２と高かった。）。従って、ペプチドは、内皮細胞への何らの毒性を誘発せず、最も重要なことには、タイトジャンクションに直接作用して細胞のバリアー機能に影響を及ぼさなかった。
キメラペプチドは、分光光度分析によって評価したように、徐々に上部区画に現れた。
【００９１】
Ａ２３０／Ａ２７５比は、全てのスペクトルについて６に等しく、それは、キメラペプチド−細胞タンパク質ではない−が、実際に、上部区画から回収されたことを示した。
【００９２】
２．２．ｂＥｎｄ−３／Ｃ６バリアー通過の速度論
同様のデータがｂＥｎｄ−３／Ｃ６システムで得られた。この場合、ｂｅｎｄ−３細胞を、培養チャンバーの下部区画に播種したＣ６細胞の存在下で６日間共培養した。この実験のため、上部区画を、共培養したグリア細胞が輸送分析中に存在しないように、新しいプレートに移した。実際には、共培養した細胞は、ｂＥｎｄ−３細胞の増殖および分化の間のみ存在した。
【００９３】
この共培養系において、経内皮電気抵抗の値は、ｔｏ（ペプチド注入時）に１８６Ω．ｃｍ２ａであり、ペプチドとのインキュベーションの２４時間後に１５２Ω．ｃｍ２であった。従って、ペプチドの存在は、経内皮電気抵抗が＞１００Ω．ｃｍ２残っているため、タイトジャンクションの機能に顕著な影響は及ぼさなかった。
上部区画において回収したペプチド濃度を図７に示す。
【００９４】
２．３．ｂＥｎｄ−３／ＣＴＸ−ＴＮＡ２バリアー通過の速度論
最後に、本発明者らは、ｂｅｎｄ−３／ＣＴＸ系を通るキメラペプチドの経内皮通過を実験した。この場合、ｂＥｎｄ−３細胞を、培養チャンバーの下部区画に播種したＣＴＸ−ＴＮＡ２細胞の存在下で６日間共培養した。該上部区画を新しいプレートに移し、実験をパラグラフ２（ｂＥｎｄ−３／Ｃ６システム）に示す通りに行った。
【００９５】
この場合、経内皮電気抵抗の値は、ｔ0（ペプチド注入時）に１５４Ω．ｃｍ２ａであり、ペプチドとのインキュベーションの２４時間後に１５３Ω．ｃｍ２であった。もう一度、ペプチドの存在は、経内皮電気抵抗が＞１００Ω．ｃｍ２残っているため、タイトジャンクションの機能に顕著な影響は及ぼさなかった。
【００９６】
上部区画において回収したペプチド濃度を図８に示す。
ｂＥｎｄ−３／ＣＴＸバリアーシステムの場合には、最初の２分で非常に高速の二相性の輸送過程を示し、その後より典的な動態が続いたことが特記されるべきである。
【００９７】
２．４．結論
キメラペプチドの通過を実験するのに用いた３つのＢＢＢシステムの効率を比較する目的で、本発明者らは、インキュベーションの１時間後および２４時間後に上部区画に回収されたペプチドの濃度をプロットした。ヒストグラムは、図９Ａおよび９Ｂに示され、得られた結果は顕著に一致していることが示された。
【００９８】
ＰＢＳのみの実験では、細胞は、キメラペプチドのための本発明者らの投与法に支障をきたす可能性のある汚染物質を生成しないことが示された（Ａ２３０／Ａ２７５）。全体的に、ｂＥｎｄ−３／Ｃ６共培養系は、１時間および２４時間で最良の組合せ結果を与えた。
【００９９】
最後に、図１０に示す通り、本発明者らは、再構成した内皮バリアーを通る上部（アクセプター、三角形）区画におけるキメラペプチドの出現が、下部（ドナー、丸型）区画からその漸進的消失によって平衡を保っていることを調べた。
【０１００】
結論として、これらのデータは、キメラペプチドが、再構成したＢＢＢ（純粋培養または２種類のグリア細胞と共培養されたｂＥｎｄ−３細胞）の一方側から他方側へ輸送されることを示した。
【０１０１】
実施例３：キメラペプチドは、パーキンソン病に関連するタンパク質であるα−シヌクレインのオリゴマーアミロイド細孔の形成により誘発されるＣａ２＋流出を阻止する
実施例１（図５）において、本発明者らは、キメラペプチドが、アルツハイマーβ−アミロイドペプチドによって侵された神経細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を治したことを示した。具体的には、アルツハイマーβ−アミロイドペプチド１−４２（２２０ｎＭ）と共にインキュベート後、これらの細胞には、その細胞膜にオリゴマーアミロイド細孔の形成がなされたことが示された。これらの細孔は、細胞外培地からのＣａ２＋イオンの大量流入を誘導した。等モル濃度のキメラペプチド（“Ｐｅｐ  Ｃｈｉｍ”、２２０ｎＭ）の存在下では、該ペプチドが、神経細胞表面にてアルツハイマーβ−アミロイドペプチド１−４２がガングリオシドＧＭ１と相互作用するのを効率的に阻止したため、これらの細孔はもはや形成されなかった。これを図１１Ａに示す。
【０１０２】
アルツハイマーβアミロイドペプチド１−４２とは対照的に、パーキンソン病関連α−シヌクレインは、ガングリオシドＧＭ３と相互作用するが、ＧＭ１と相互作用しない。キメラペプチドは、ＧＭ１およびＧＭ３の両方と同様の親和性で相互作用する共通ガングリオシド結合ペプチドである。これに基づき、本発明者らは、該キメラペプチドは、α−シヌクレインのオリゴマーによって形成された毒性アミロイド細孔から神経細胞を治癒し得ることを期待した。
【０１０３】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、最初に、Ｃａ２＋感受性プローブＦＬＵＯ４−ＡＭをローディングし、その後、２２０ｎＭのα−シヌクレインと共にインキュベートした。これは、細胞内への大量のＣａ２＋流入を誘発するＣａ２＋透過性アミロイド細孔の形成を誘発する（図１１Ｂ）。キメラペプチド（２２０ｎＭ）を、α−シヌクレインと共に用いて細胞培養したとき、該キメラペプチドが、神経細胞膜上でα−シヌクレインがＧＭ３と相互作用するのを阻止するため、細孔形成はもはや起こらなかった。従って、まとめると、キメラペプチドは、α−シヌクレインにより誘発されるＣａ２＋流入を阻止した。
【０１０４】
結論として、キメラペプチドは、神経細胞培養において、抗アルツハイマー特性および抗パーキンソン特性を示すことが証明された。
【０１０５】
実施例４：“逆ペプチドの合成”および試験
配列番号３のキメラペプチドは、相互作用の対称的杯状表面を形成するガングリオシドの二量体と相互作用するため、本発明者らは、キメラペプチドのＮ末端部分からヒスチジン残基のペアが取り除かれたキメラペプチドの、ガングリオシド結合能を試験した。従って、この所謂“逆キメラペプチドの合成”のアミノ酸配列は、ＫＥＨＨＧＶＬＹＶＧＴＫ（配列番号１１）である。
【０１０６】
ガングリオシドＧＭ１またはＧＭ３の単分子層は、空気−水界面に拡がり、逆キメラペプチドを、１０μＭの濃度で水性副層に注入した。これらのガングリオシドとのペプチドの相互作用を、単分子層の表面圧（π）のリアルタイム測定によって評価し、ｍＮ／ｍで表した。ガングリオシドＧＭ１およびＧＭ３の単分子層との逆キメラペプチドの相互作用の動力学を図１２に示す。
【０１０７】
これらのデータは、逆キメラペプチドが、ＧＭ１およびＧＭ３ガングリオシドの両方を認識していることを示す。この二重認識は、α−シヌクレイン３４−４５配列のフレームに導入されたヒスチジン残基の対によって付与される。本明細書に記載の配列番号３のプロトタイプキメラペプチドと比較すると、配列番号１１の“逆キメラペプチド”は、ヒスチジン残基の対の別の場所を有している。キメラペプチドの生物学的活性がヒスチジン残基の対によって与えられた共通のガングリオシド結合特性に依存しているため、本発明者らは、逆キメラペプチドは、興味深い抗アルツハイマー特性、抗パーキンソン特性、抗クロイツフェルト−ヤコブ特性、抗ウイルス特性、抗菌特性および抗腫瘍特性なども示すことを予期する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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