(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭの第４の定常領域に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ａ）前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１の核酸配列によってコードされ；
（ｂ）前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号３の核酸配列によってコードされる、
単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭの第４の定常領域に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ａ）前記重鎖可変領域は、配列番号２（重鎖）のアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記軽鎖可変領域は、配列番号４（軽鎖）のアミノ酸配列を含む、
単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭの第４の定常領域に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１と、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３と、
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１と、
（ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２と、
（ｆ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と、
を含み、
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭに特異的に結合する、
単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ、単一ドメイン抗体、抗原結合断片、ダイアボディ、トリアボディ、またはミニボディである、請求項１、２または３の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
標識、細胞毒素、放射性同位元素または免疫毒素をさらに含む、請求項１、２、３または４の単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
請求項１、２、３または４の抗体またはその抗原結合断片と、生理学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤または安定剤の内の少なくとも１種と、を含む組成物。
【請求項７】
配列番号１および配列番号３の核酸配列を含む、抗体をコードする単離された核酸であって、配列番号１の核酸配列は重鎖可変領域（ＶＨ）をコードし、配列番号３の核酸配列は軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする、核酸。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）をコードし、および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする、単離された核酸。
【請求項９】
請求項７または８の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記発現ベクターが請求項７または８の単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１１】
抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ．請求項７または８の核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培地中で培養することであって、前記核酸配列が発現されることにより軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含むポリペプチドが産生される条件下で培養することと、
ｂ．前記ポリペプチドを前記宿主細胞または培地から回収することと、
を含む方法。
【請求項１２】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭの第４の定常領域に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体であって、
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１６）により産生されるｍＡｂ４−２ｂと命名されたモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項１３】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭの第４の定常領域に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体であって、
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１７）により産生されるｍＡｂ２−２ｂと命名されたモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項１４】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭの第４の定常領域に位置するエピトープに特異的に結合する、単離された抗体であって、
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１８）により産生されるｍＡｂ３−２ｂと命名されたモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項１５】
Ｂ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭに特異的に結合する、単離された抗体であって、
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１９）により産生されるｍＡｂ１−１と命名されたモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項１６】
請求項１２に記載のモノクローナル抗体を産生するための、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１７１６と命名されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１７】
請求項１３に記載のモノクローナル抗体を産生するための、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１７１７と命名されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１８】
請求項１４に記載のモノクローナル抗体を産生するための、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１７１８と命名されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項１９】
請求項１５に記載のモノクローナル抗体を産生するための、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１７１９と命名されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項２０】
抗体を産生する方法であって、前記抗体の産生に適する条件下で請求項１６、１７、１８または１９に記載のハイブリドーマ細胞株を培養することと、前記抗体の単離と、を含む方法。
【請求項２１】
試料中のＢ細胞ｍＩｇＭの検出のための方法であって、前記試料を請求項１、２、３、４または１２に記載の抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
Ｂ細胞受容体を精製するための方法であって、請求項１、２、３、４または１２に記載の抗体を使用する、方法。
【請求項２３】
１つの容器に所定量で請求項１、２、３、４または１２に記載の抗体を含み、および別の容器に緩衝液を含む、キット。
【請求項２４】
１つの容器に所定量で請求項６に記載の組成物を含み、および別の容器に緩衝液を含む、キット。
【請求項２５】
対象におけるＢ細胞リンパ腫および白血病の処置のための医薬の製造における請求項１、２、３、４または１２に記載の単離された抗体または抗原結合断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明の一部は、米国国立衛生研究所により授与されたＳＢＩＲ認可番号第１Ｒ４３ＡＩ０８１３３２−０１Ａ１号による政府支援に基づいて行われた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０１４年１２月１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、１０１９９−００３５７１−ＷＯ０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、７，２０７バイトのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本発明はＢ細胞リンパ腫および白血病において認められるＢ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）を標的とする抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｂ細胞悪性病変には、今日では年間１００，０００件を超える新規症例を伴う主要サブタイプのリンパ腫が含まれる。よく使われる多くの薬剤および生物学的製剤に対するこれらの疾患の感受性が明白であるにもかかわらず、大多数の患者は治癒できない。多くのＢ細胞リンパ腫および白血病の特徴は、化学療法応答および／または生物学的応答は容易に得られるが、治癒はそれより難しいことである。Ｂ細胞リンパ腫は非常に侵攻性の疾患である場合があり、多くの患者は従来の処置には応答しない。化学療法および／または生物学的療法によるｌｏｇ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌ（死滅細胞数の対数値）後も腫瘍性細胞の残余クローンが残ることは明らかである。これらの疾患を治癒する能力は、腫瘍細胞、特に腫瘍幹細胞の根絶が成功するかどうかに依存するであろう。
【０００５】
リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、およびトシツモマブなどの抗ＣＤ２０抗体もまた、単独薬剤として、化学療法の相乗剤として、維持療法としておよび放射性同位元素／薬剤送達用のビークルとして、Ｂ細胞由来悪性病変の処置に使われてきた。これらの抗体は、正常および悪性のＢ細胞のみにより発現される拘束性細胞分化抗原であるＣＤ２０に結合する。正常および悪性の両Ｂ細胞上でのＣＤ２０抗原の発現のために、抗ＣＤ２０抗体は、一部の正常なＢ細胞の破壊も生じることがあり、その長期にわたる結果は分かっていない。（Ｓｍｉｔｈ  ＭＲ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：７３５９−７３６８（２００３）；Ｊａｃｏｂｓ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏ  Ｔｈｅｒ  ７：１７４９−１７６２，（２００７）を参照されたい）。
【０００６】
ＣＤ２０とは対照的に、Ｂ細胞受容体複合体（ＢＣＲＣ）は、免疫系のＢ細胞アームの中心的な分化シグナル伝達要素であり、この分子は、全てのＢ細胞悪性病変の表面上に発現している。ＢＣＲＣは、細胞表面膜結合Ｉｇ（ｍＩｇ）（例えば、ｍＩｇＭ、ｍＩｇＧ、ｍＩｇＡ、ｍＩｇＥおよびｍＩｇＤ）および密接に関連する共シグナル伝達分子ＣＤ７９αβを含む。Ｂ細胞悪性病変中のＢＣＲＣ分子を標的とする以前の方法は、それぞれのモノクローナル腫瘍に特異的なユニークＣＤＲ配列に焦点を絞っていた。（Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３０６：５１７，（１９８２）；Ｌｅｖｙ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  １０：６１（１９９０）；Ｄａｖｉｓ  ＴＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２：１１８４−１１９０（１９９８）を参照されたい）。しかし、それぞれのＣＤＲの特異性の結果として、この手法はそれぞれの患者に特異的な薬剤の生成を必要とし、これは医院においては実施可能ではないことが明らかになった。しかし、これらのＢＣＲＣを標的とする初期の臨床試験では、抗腫瘍作用が実証された。
【０００７】
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）はＢ細胞リンパ腫−白血病における牽引的な経路を開始する。１つの戦略は、ＢＣＲＣ随伴細胞質分子、例えば、ＢＣＲＣシグナル伝達経路の下流メディエーターであるＳｙｋチロシンキナーゼを標的として、下流経路チロシンキナーゼを阻害することであった。垂直および水平の膜ＢＣＲＣ相互作用の両方により、この下流経路は複雑で重複的である。Ｓｋｙチロシンキナーゼ経路はＢ細胞系列組織に限定されないので、その阻害は不必要な免疫効果、胸部組織で起こり得る腫瘍促進効果、および非造血細胞での他の毒性をもたらす。ＢＣＲＣのさらに下流は、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）である。ブルトンチロシンキナーゼの阻害も、ＢＣＲ下流の注目すべき標的として登場したが、これは、現在、薬剤イブルチニブの利用による承認された戦略である。強力な作用を示す最初のＢＴＫ阻害剤であるイブルチニブの認可は、Ｂ細胞悪性病変を牽引する上でのＢＣＲＣの重要性の有力な証拠を提供する。ＰＩ３ＫδおよびＢＣＬ２などの追加の分子標的がＢＣＲＣの下流で特定されており、これらの標的の作用をブロックする薬剤もまた顕著な臨床的作用を有することが示されている。
【０００８】
血清ＩｇとのＢＣＲの配列相同性の結果のために、特異的抗膜Ｉｇ療法の開発は困難であった。特異的ｍＩｇＭのインビボ標的化は実施可能ではないと考えられた。理由は、薬剤または生物製剤が、細胞表面細胞膜ｍＩｇＭに到達する前に血液中の循環ＩｇＭに結合すると思われるからである。近位ドメイン（ＰＤ）と命名されている、膜結合型のＩｇで以前に特定されたユニークな一連の配列は、血清Ｉｇには発現しない。これらのＰＤはＩｇクラス特異的であり、ｍＩｇＭでは１３アミノ酸ペプチドを構成する。しかし、抗ｍＩｇＭ  ＰＤ抗体を作製する試みは、ＰＤペプチドの低い免疫原性、その疎水性、および生成抗体の結果的に低い親和性が原因で成功しなかった。対照的に、ｍＩｇＥ  ＰＤを作製する試みにより、いくつかの機能上異なるタイプが得られた。例えば、米国特許第８，１３７，６７０号；同第８，４０４，２３６号；Ｐｏｇｇｉａｎｅｌｌａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：３５９７−３６０５（２００６）；Ｆｅｉｃｈｔｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５４９９−５５０５（２００８）を参照されたい。
【０００９】
受容体を内部移行させる、細胞増殖を抑制する、アポトーシスを誘導するまたは薬剤、毒素もしくは放射性同位元素をこれらのｍＩｇＭ  Ｂ細胞に送達し、同時に、正常なリンパ球（非ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞）および非リンパ組織を毒性から逃れさせるために、Ｂ細胞ｍＩｇＭに対し高レベルの特異性を有する抗体が必要とされている。このような抗体はまた、Ｂ細胞リンパ腫およびＢ細胞白血病の診断にも使用できる。これらのユニークに特異的な抗体は、免疫アフィニティー法により膜ＩｇＭを血清ＩｇＭから分離することを初めて可能にするであろう。
【発明の概要】
【００１０】
本発明はＢ細胞リンパ腫および白血病におけるＢ細胞受容体複合体の膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）を特異的に標的とする単離抗体に関する。本発明の抗体は組換え型抗体であってよい。本発明の抗体はモノクローナルまたは本発明のモノクローナル抗体由来のクラススイッチモノクローナルであってよく、モノクローナル抗体はマウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってよい。
【００１１】
本発明には、上記抗体の軽鎖および／または重鎖可変領域由来の抗原結合領域（ＣＤＲ）も含まれる。本発明の抗体は組換え型抗体であってよい。本発明の抗体はモノクローナルであってよく、モノクローナル抗体はヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であってよい。
【００１２】
本発明は、配列番号１の核酸配列によりコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または配列番号３の核酸配列によりコードされる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を含む。
【００１３】
本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）および／または配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を含む。
【００１４】
本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および／または配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および／または配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を含む。
【００１５】
本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；および／または配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および配列番号１０のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体を含む。
【００１６】
本発明は、ＶＨが配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補配列に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる抗体；および／または配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の相補配列に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるＶＬを含む。
【００１７】
本発明は、配列番号４で示される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列、および配列番号２で示される配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列を含む。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体の、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ディアボディ、トリアボディ、またはミニボディを含むヒト抗原結合抗体断片を含む。
【００１９】
本発明は、融合体１１７（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１９）およびそのクローン由来のハイブリドーマ細胞株により作製されるｍＡｂ１−１と命名されたモノクローナル抗体を含む。
【００２０】
本発明は、融合体１１８（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１７）およびそのクローン由来のハイブリドーマ細胞株により作製されるｍＡｂ２−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を含む。
【００２１】
本発明は、融合体１１８（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７１８）およびそのクローン由来のハイブリドーマ細胞株により作製されるｍＡｂ３−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を含む。
【００２２】
本発明は、融合体１１９（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１６）およびそのクローン由来のハイブリドーマ細胞株により作製されるｍＡｂ４−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を含む。
【００２３】
本発明は、Ｂ細胞受容体活性を低下させる本発明の抗体または抗原結合断片に関する。
【００２４】
本発明は、標識をさらに含む本発明の抗体を含む。
【００２５】
本発明は、上記Ｂ細胞リンパ腫および白血病におけるＢ細胞受容体複合体中のｍＩｇＭを標的とし、細胞毒素、放射性同位元素または免疫毒素をさらに含む抗体を含み、かつＢ細胞リンパ腫および白血病の処置におけるそれらの使用を含む。
【００２６】
本発明はまた、抗体ｍＡｂ４−２ｂと同じエピトープに結合する抗体を含む。
【００２７】
本発明はまた、膜近位ドメインの全ての異性体型に結合する抗体を含む、抗体ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂまたはｍＡｂ３−２ｂと同じエピトープに結合する抗体を含む。
【００２８】
本発明は、本発明の抗体および少なくとも１種の生理学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、または安定剤を含む組成物を含む。
【００２９】
本発明は、対象においてＢ細胞リンパ腫および白血病を処置するための薬物の調製のための本発明の抗体または抗原結合断片の使用に関する。
【００３０】
本発明は、Ｂ細胞受容体複合体の活性を低下させる薬物の調製のための本発明の抗体または抗原結合断片の使用に関する。
【００３１】
本発明は、患者においてＢ細胞リンパ腫または白血病を回復させるまたは処置する方法を含み、Ｂ細胞ｍＩｇＭに結合しかつ細胞増殖抑制および／またはアポトーシスを誘導する有効量の抗体を患者に投与することを含む。
【００３２】
本発明は、生理学的に許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、または安定剤と組み合わせた、本発明による抗体を含む組成物を含む。
【００３３】
本発明は、対象におけるＢ細胞の増殖を止めるまたは抑制する方法を含み、本発明による有効量の抗体をそれを必要としている対象に投与し、それにより対象におけるＢ細胞の増殖を止めるまたは抑制することを含む。
【００３４】
本発明は、対象におけるＢ細胞の増殖を止めるまたは抑制する方法を含み、有効量の請求項１に記載の抗体を、抗Ｂ細胞抗体、細胞毒素、および／または放射性同位元素の内の１種または複数種と組み合わせて、それを必要としている対象に投与し、それにより対象におけるＢ細胞の増殖を止めるまたは抑制することを含む。
【００３５】
本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを含む。
【００３６】
本発明は、ｍＡｂ１−１と命名されたモノクローナル抗体を作製するための、ＡＴＣＣＰＴＡ−１２１７１９と命名されたハイブリドーマ細胞株を含む。
【００３７】
本発明は、ｍＡｂ２−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を作製するための、ＡＴＣＣＰＴＡ−１２１７１７と命名されたハイブリドーマ細胞株を含む。
【００３８】
本発明は、ｍＡｂ３−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を作製するための、ＡＴＣＣＰＴＡ−１２１７１８と命名されたハイブリドーマ細胞株を含む。
【００３９】
本発明は、ｍＡｂ４−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を作製するための、ＡＴＣＣＰＴＡ−１２１７１６と命名されたハイブリドーマ細胞株を含む。
【００４０】
本発明は、細胞膜ＩｇＭおよび本明細書で記載の抗体または抗原結合断片のいずれか１つを含む複合体に関する。
【００４１】
本発明は、抗体の産生に適する条件下で本発明のハイブリドーマ細胞株を培養すること、および抗体の単離を含む、抗体を作製する方法を含む。
【００４２】
本発明は、本発明のいずれかの抗体または抗原結合断片をコードする単離核酸に関する。
【００４３】
本発明は、本発明の抗体をコードする単離核酸分子を含み、ヌクレオチド配列は配列番号１および／または３を含む。
【００４４】
本発明は、配列番号２または４のアミノ酸配列を含む本発明の抗体をコードする単離核酸分子を含む。
【００４５】
本発明は、配列番号２で示される重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列、および／または配列番号４で示される軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００４６】
本発明は、本発明のいずれかの抗体または抗原結合断片をコードする単離核酸を含む発現ベクターに関する。一実施形態では、単離核酸は、本明細書で記載のＶＨまたはＶＬ鎖のいずれかをコードする。本発明はまた、本明細書で記載のいずれかの発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【００４７】
本発明は、本発明のＶＨもしくはＶＬドメインまたはいずれかの抗体もしくは抗原結合断片を含む単離ポリペプチドに関する。
【００４８】
特定の実施形態では、本発明のこれらの核酸、発現ベクターまたはポリペプチドは抗体の作製方法に有用である。
【００４９】
本発明は、試料中のＢ細胞ｍＩｇＭの検出のための方法を含み、試料を本発明の抗体と接触させることを含む。
【００５０】
本発明は、微小残存病変の測定を含む、患者の試料中のＢ細胞ｍＩｇＭの検出のための方法を含み、試料を本発明の抗体と接触させることを含む。
【００５１】
本発明は、Ｂ細胞ｍＩｇＭのマイクロクラスタ化を検出しそれによりＢ細胞悪性病変の細分類を可能にしかつ試料中の患者特異的予後情報を提供するための方法を含み、試料を本発明の抗体と接触させることを含む。
【００５２】
本発明は、本発明の抗体を使ってＢ細胞受容体を精製するための方法を含む。
【００５３】
本発明は、１つの容器中に所定の量の本発明の抗体、および別の容器中に緩衝液を含むキットを含む。
【００５４】
本発明は、１つの容器中に所定の量の上述の本発明の組成物、および別の容器中に緩衝液を含むキットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ａ−Ｄ。細胞株ＣＲＬ１６４８の走査型免疫電子顕微鏡写真（バーキットリンパ腫）である。図１Ａは、対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対応対照抗体プラス二次ヤギ抗マウスＩｇ−ｇｏｌｄを示す顕微鏡写真である。図１Ｂおよび１Ｃは、２つの異なるＣＲＬ１６４８細胞に結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ４−２ｂ（以降では「ｍＡｂ４」と呼ぶ）を示す、図１Ａの対照抗体と同じ倍率の顕微鏡写真である。図１Ｄは、第３のＣＲＬ１６４８細胞に結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ４を示す、図１Ａの対照抗体に比較して高倍率の顕微鏡写真である。明るい白色スポットは、細胞表面のｍＡｂ４モノクローナル抗体と反応する免疫金粒子ヤギ抗マウスＩｇを表す。
【図２】Ａ−Ｅ。細胞株ＣＲＬ１６４８走査型免疫電子顕微鏡写真（バーキットリンパ腫）である。図２Ａは、グルタルアルデヒド固定ＣＲＬ１６４８細胞に結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ４を示す顕微鏡写真である。図２Ｂは、ＢＣＲＣのマイクロクラスタを示す顕微鏡写真である。図２Ｃは、ＣＲＬ１６４８細胞をｍＡｂ４と３７℃で３０分間インキュベートし、固定してヤギ抗マウスＩｇで染色した場合、ＢＣＲＣの内部移行により、膜上に検出可能なモノクローナル抗体ｍＡｂ４が存在しないことを示す顕微鏡写真である。図２Ｄは、ＣＲＬ１６４８細胞をｍＡｂ４と３７℃で１５分間インキュベートし、固定してヤギ抗マウスＩｇで染色した場合、内部移行が不完全なために、残留結合モノクローナル抗体ｍＡｂ４が認められることを示す顕微鏡写真である。図２Ｅは、ＣＲＬ１６４８細胞をｍＡｂ４と３７℃で３０分間インキュベートし、固定してヤギ抗−ｈｕ−ＩｇＭで染色した場合、ＢＣＲＣが検出されないことを示す顕微鏡写真である。
【図３】細胞株ＣＲＬ１５９６の走査型免疫電子顕微鏡写真（バーキットリンパ腫）である。図３は、モノクローナル抗体ｍＡｂ４結合が金粒子ヤギ抗マウスＩｇ反応性により示され、ＣＲＬ１５９６の長い突起ならびに細胞表面への特異的な結合を示す顕微鏡写真である。
【図４】Ａ−Ｂ。細胞株ＣＲＬ２２６０走査型免疫電子顕微鏡写真（びまん性混合型Ｂ細胞リンパ腫）である。図４Ａは、金粒子ヤギ抗マウスＩｇの反応性により表される、モノクローナル抗体ｍＡｂ４のＣＲＬ２２６０に対する特異的結合を示す密なマイクロクラスタの高拡大率の顕微鏡写真である。図４Ｂは、金粒子ヤギ抗マウスＩｇの反応性により表される、モノクローナル抗体ｍＡｂ４のＣＲＬ２２６０、びまん性混合型Ｂ細胞リンパ腫に対する特異的結合を示す、図４Ａと同じ視野のトポグラフィック図を示す顕微鏡写真である。
【図５】Ａ−Ｂ。細胞株ＣＲＬ３００６の走査型免疫電子顕微鏡写真（マントル細胞リンパ腫）である。図５Ａは、金粒子ヤギ抗マウスＩｇの反応性により表される、ＣＲＬ３００６の深い裂け目中のモノクローナル抗体ｍＡｂ４の特異的結合を示す密なマイクロクラスタの高拡大率の顕微鏡写真である。図５Ｂは、金粒子ヤギ抗マウスＩｇの反応性により表される、モノクローナル抗体ｍＡｂ４のＣＲＬ３００６、マントル細胞リンパ腫に対する特異的結合を示す、図５Ａと同じ視野のトポグラフィック図を示す顕微鏡写真である。
【図６】Ａ−Ｆ。図６Ａは、モノクローナル抗体ｍＡｂ４対アイソタイプ対応対照抗体の、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ１６４８（ＣＲＬ１６４８Ｍκ）（バーキットリンパ腫）の増殖の阻害に対する効果の比較を示すグラフである。図６Ｂは、モノクローナル抗体ｍＡｂ２−２ｂ（以降では、「ｍＡｂ２」）対アイソタイプ対応対照抗体の、ｍＩｇＭ発現細Ｂ胞株ＣＲＬ１６４８（ＣＲＬ１６４８Ｍκ）の増殖の抑制に対する効果の比較を示すグラフである。図６Ｃは、モノクローナル抗体ｍＡｂ４対アイソタイプ対応対照抗体の、ｍＩｇＧ発現対照Ｂ細胞株、ＣＲＬ２６３２（ＣＲＬ１６４８Ｇκ）（びまん性大細胞型リンパ腫）の増殖の抑制に対する効果の比較を示すグラフである。図６Ｄは、モノクローナル抗体ｍＡｂ４対アイソタイプ対応対照抗体の、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ２９５８（ＣＲＬ２９５８Ｍλ）（びまん性大細胞型リンパ腫）の増殖の抑制に対する効果の比較を示すグラフである。図６Ｅは、モノクローナル抗体ｍＡｂ４対アイソタイプ対応対照抗体の、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ１５９６（ＣＲＬ１５９６Ｍλ）（バーキットリンパ腫）の増殖の抑制に対する効果の比較を示すグラフである。図６Ｆは、モノクローナル抗体ｍＡｂ４対アイソタイプ対応対照抗体の、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ１４３２（ＣＲＬ１４３２Ｍλ）（バーキットリンパ腫）の増殖の抑制に対する効果の比較を示すグラフである。
【図７】２０細胞／ウエル、１００細胞／ウエル、２５０細胞／ウエル、５００細胞／ウエルおよび１，０００細胞／ウエルの細胞希釈におけるｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ１６４８の増殖に対するモノクローナル抗体ｍＡｂ４の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、本明細書で記載の特定の方法、プロトコル、細胞株、または試薬に限定されない。理由は、それらは変わってもよいからである。さらに、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、本発明の範囲を制限することを意図していない。本明細書および添付の請求項において使用される場合、文脈上別段の明確な記載がない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含む。例えば、「ａ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ（宿主細胞）」への言及は、複数のこのようなｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ（宿主細胞）を含む。特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語および任意の頭字語は、本発明の分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本願に記載されているものと類似のまたは等価な任意の方法および部材を本発明の実施において使用することができるが、代表的な方法、装置、および材料が本明細書で記載される。
【００５７】
略語
詳細な説明および実施例の全体を通して、次の略語が使用される：
ＡＤＣＣ  抗体依存性細胞傷害
ＡＴＣＣ  アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関
ＢＣＬ２またはＢｃｌ−２  Ｂ細胞リンパ腫２
ＢＣＲ  Ｂ細胞受容体
ＢＣＲＣ  Ｂ細胞受容体複合体
ＢＴＫ  チロシンプロテインキナーゼＢＴＫ
ＣＤＣ  補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ  Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使って決定される、免疫グロブリン可変領域中の相補性決定領域
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ＣＬＬ  慢性リンパ性白血病
ＥＬＩＳＡ  酵素結合免疫吸着測定法
ＦＭ  蛍光顕微鏡
ＦＲ  抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ  西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＦＮ  インターフェロン  
ＩＣ５０  ５０％阻害を生じる濃度
Ｉｇ  免疫グロブリン
ＩｇＡ  免疫グロブリンＡ
ＩｇＤ  免疫グロブリンＤ
ＩｇＥ  免疫グロブリンＥ
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ
ＩｇＭ  免疫グロブリンＭ
Ｋａｂａｔ  Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔにより開拓された免疫グロブリン整列化およびナンバリングシステム（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）。
ｍＡｂ、Ｍａｂ、またはＭＡｂ  モノクローナル抗体
ｍＡｂ  １またはｍＡｂ１  モノクローナル抗体ｍＡｂ１−１
ｍＡｂ  ２またはｍＡｂ２  モノクローナル抗体ｍＡｂ２−２ｂ
ｍＡｂ  ３またはｍＡｂ３  モノクローナル抗体ｍＡｂ３−２ｂ
ｍＡｂ  ４またはｍＡｂ４  モノクローナル抗体ｍＡｂ４−２ｂ
ｍＩｇ  細胞表面膜結合免疫グロブリン
ｍＩｇＡ  細胞表面膜結合免疫グロブリンＡ
ｍＩｇＤ  細胞表面膜結合免疫グロブリンＤ
ｍＩｇＥ  細胞表面膜結合免疫グロブリンＤ
ｍＩｇＧ  細胞表面膜結合免疫グロブリンＧ
ｍＩｇＭ  細胞表面膜結合免疫グロブリンＭ
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＤ  近位ドメイン
ＰＩ３Ｋ  フォスフォイノシチド３キナーゼ
ＰＫ  薬物動態学
ＳＥＭ  走査型免疫電子顕微鏡
Ｖ領域  異なる抗体間の配列で可変であるＩｇＧ鎖のセグメント。Ｖ領域は、軽鎖のＫａｂａｔ残基１０９および重鎖の１１３まで伸びている。
ＶＨ  免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ  免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
ＶＬ  免疫グロブリン軽鎖可変領域
【００５８】
定義
本出願を通して使用される用語は、当業者にとって通常の典型的な意味を有するものと解釈されるべきである。しかし、出願者らは次の用語が以降で定義される特定の定義を与えられるべきであることを要求する。
【００５９】
抗体鎖ポリペプチド配列に関連する「実質的に同一の」という語句は、抗体鎖が参照ポリペプチド配列に対し、少なくとも７０％、または８０％、または９０％、または９５％の配列同一性を示すと解釈できる。核酸配列に関連する場合のこの用語は、ヌクレオチドの配列が参照核酸配列に対し、少なくとも８５％、または９０％、または９５％、または９７％の配列同一性を示すと解釈できる。
【００６０】
「同一性」または「相同性」という用語は、配列の整列後に、および全体配列に対し最大パーセント同一性を得るために必要に応じてギャップの導入後に、配列同一性の部分としていずれの保存的置換も考慮していない場合の、それが比較される対応する配列の残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合を意味すると解釈される。ＮまたはＣ末端の伸張および挿入のいずれも、同一性または相同性を低下させると解釈されないものとする。整列化のための方法とコンピュータプログラムは、当技術分野でよく知られている。配列同一性は配列解析ソフトウエアを使って測定できる。
【００６１】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原を結合する抗原結合部位を含む分子、を含み、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、および多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）を包含する。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特異的標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体およびその他の標的特異性を持たない抗体様分子を含む。天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖とから構成される。それぞれの重鎖は可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有し、これに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）、および他端に定常ドメインを有する。さらに、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、インタクト分子、ならびにタンパク質に特異的に結合できる抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片など）の両方を包含することを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、インタクト抗体のＦＣ断片を欠き、動物または植物の循環系からより急速に除去され、インタクト抗体より非特異的組織結合が少ない場合がある（Ｗａｈｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２４：３１６（１９８３））。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体」という用語は、細胞増殖を抑制する、ｍＩｇＭを内部移行させるまたはこのｍＩｇＭエピトープを有するＢ細胞のアポトーシスを誘導するような様式で、ヒトＢ細胞ｍＩｇＭに結合する抗体を意味する。
【００６３】
抗体の可変ドメインとの関係における「可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）」という用語は、可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列で広範囲にわたって異なり、その特定の標的に対するそれぞれの特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって、均一に分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方において高頻度可変性領域としても知られる相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。従来技術で公知であるように、当該技術分野において既知の文脈および種々の定義に応じて、抗体の高頻度可変領域を示すアミノ酸位置／境界は変わり得る。可変ドメイン内のいくつかの位置はハイブリッド高頻度可変位置と見なすことができ、そこでのこれらの位置は、１つのセットの基準下では高頻度可変領域内にあると見なすことができ、異なるセットの基準下では高頻度可変領域外であると見なすことができる。１つまたは複数のこれらの位置はまた、拡張高頻度可変領域でも見出される。本発明は、これらのハイブリッド高頻度可変位置の変更を含む抗体を提供する。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、主にβシート配置をとり３つのＣＤＲで連結される４つのＦＲ領域を含み、ＣＤＲはβシート構造をつなぐループを形成し、およびいくつかの例ではβシート構造の部分を形成している。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の標的結合部位の形成に関与する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）を参照されたい）。  本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、免疫グロブリンアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基ナンバリングシステムにより行われる。
【００６４】
「抗体フラグメント」という用語は、完全長抗体の部分、通常は抗原結合領域または可変領域を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体の「抗原結合断片」という語句は、完全長抗体と共通の定性的生物活性を有する化合物である。例えば、抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体の抗原結合断片はＢ細胞ｍＩｇＭ受容体に、このような分子がＢ細胞ｍＩｇＭに結合する能力を持つことを妨げるまたは実質的に減らすような様式で、結合できる抗体である。本明細書で使用される場合、抗体に関する「機能性断片」という用語は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片を意味する。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合による１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマー（ＶＨ−ＶＬダイマー）から構成される。この配置において、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の標的結合部位を決定する。６つのＣＤＲは、協調して、標的結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえ、完全な結合部位より親和性は低いが、標的を認識して結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインはポリペプチド単鎖中に存在する。一般に、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これはｓｃＦｖが標的結合のために所望の構造を形成することを可能にする。
【００６５】
Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル基末端でのいくつかの残基の付加の分、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインの位置でのジスルフィド結合切断により産生される。抗体断片の追加の化学カップリングは、当業者には既知である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する場合がある天然に生じ得る変異体および同一のＣＤＲ配列を含む天然に存在するクラススイッチ変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の標的部位に対して向けられる。さらに、異なった決定基（エピトープ）に対する異なった抗体を通常は含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は標的上の単一の決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成することができ、他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするようには解釈されるべきではない。例えば、本発明で用いるためのモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーからよく知られた技術を使って単離できる。本発明で使用される親モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製でき、または組換え法により作製できる。モノクローナル抗体は、融合多発性骨髄腫パートナー（例えば、ＳＰ２／０）として、おなじ遺伝的背景を有するマウスで通常作製されるが、  以前に、Ｙｉｎらは、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４４：１６５−１７３（１９９１）で、異なるマウス株における遺伝的に高められた免疫反応性および親和性を利用するために、同一でないパートナーの使用について報告している。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「キメラ」抗体という用語は、ラットまたはマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリン由来の可変配列、および典型的には、ヒト免疫グロブリンテンプレートから選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を意味する。さらに最近では、モノクローナル抗体の結合可変配列および細胞受容体を含むキメラ構造が開発されている。キメラはまた、ヒト化可変領域配列およびマウス定常領域配列を有し、マウス試薬に最適化されたルーチン免疫組織化学、フローサイトメトリーまたはその他のアッセイを可能にする抗体を意味する。
【００６８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の標的結合配列）であり、これらは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的に全てを有し、全てもしくは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ全てもしくは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、選択されたヒト免疫グロブリンテンプレートの少なくとも一部を含んでよい。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつヒト免疫グロブリンライブラリーからから単離された抗体、または１種もしくは複数種のヒト免疫グロブリン遺伝子を導入され、内在性免疫グロブリンを発現していない動物から単離された抗体を含む。これらに関しては、後で、および、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ｅｔ  ａｌ）に記載されている。
【００７０】
「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という用語は、子孫を含む。全ての子孫は、意図的なまたは故意でない変異に起因して、ＤＮＡの内容が正確に同一ではない可能性があるということも理解されよう。最初に形質転換された細胞中で選別される際、同じ機能または生物学的性質を有する変異子孫が含まれる。本発明で使用する場合、「宿主細胞」は原核または真核生物宿主である。
【００７１】
ＤＮＡでの細胞生物の「形質転換」は、染色体外要素として、または染色体統合によりＤＮＡが複製可能であるように、ＤＮＡを生物体中に導入することを意味する。細胞生物のＤＮＡでの「形質移入」は、なんらかのコード配列が実際に発現されているかどうかに関係なく、細胞または生物によるＤＮＡ、例えば、発現ベクターの取り込みを意味する。「形質移入宿主細胞」および「形質転換された」は、ＤＮＡが導入された細胞を意味する。細胞は「宿主細胞」と命名され、その細胞は原核または真核生物細胞であってよい。典型的な原核宿主細胞には、大腸菌の種々の株が挙げられる。典型的な真核生物の宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト起原の細胞など、哺乳動物細胞である。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来または宿主細胞と異なる種であってよく、またはいくつかの外来性ＤＮＡおよびいくつかの相同なＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。
【００７２】
「ベクター」という用語は、適切な宿主中でＤＮＡの発現を生じさせることが可能な適切な制御配列に機能的に連結されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。このような制御配列には、転写を行うプロモータ、このような転写を制御する任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終止を制御する配列が含まれる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単純に潜在的なゲノムインサートであってもよい。適切な宿主中に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは独立に複製および機能でき、または、場合によっては、ゲノムそれ自体の中に一体化し得る。本明細書では、プラスミドが最もよく使われる形態のベクターであるため、「プラスミド」および「ベクター」は同義に用いられることもある。しかし、本発明は、等価な機能を果たし、当該技術分野で知られている、または知られるようになるこのような他の形態のベクターを含むことを意図している。
【００７３】
処置のための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、飼育動物および家畜、非ヒト霊長類、ならびに動物園の、スポーツの、またはペットの動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、雌ウシなどが含まれる。
【００７４】
本明細書で使われる場合、単語「標識」は、分子またはタンパク質に、例えば、抗体に直接的にまたは間接的にコンジュゲートできる検出可能な化合物または組成物を意味する。標識それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「固相」は、それに対し本発明の抗体が付着できる非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例には、ガラス（例えば、気孔制御ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコーンから部分的にまたは全体として形成されるものが挙げられる。特定の実施形態では、文脈に応じて、固相は、アッセイプレートのウエルを含んでよく、他の例では、固相は精製カラム（例えば、親和性クロマトグラフィーカラム）である。
【００７６】
「活性化」、「刺激」、および「処置」という用語は、細胞または受容体に適用される場合、文脈によりまたは明示的に特に指示がない限り、例えば、リガンドによる細胞または受容体の活性化、刺激、または処置と、同じ意味を有してよい。「リガンド」は天然および合成リガンド、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、ムテイン、および抗体に由来する結合化合物を包含する。「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣物質および抗体のペプチド模倣物質を包含する。「活性化」は、内部機序ならびに外部または環境要因により調節されるような細胞活性化を意味する。例えば、細胞、組織、器官、または生物の「応答」は、生化学的または生理的な挙動、例えば、生物学的区画内での濃度、密度、付着、または遊走、遺伝子発現の速度、または分化の状態の変化を包含し、その変化は、活性化、刺激、または処置、または遺伝的プログラムなどの内部機序と相関付けられる。
【００７７】
分子の「活性」は、分子のリガンドもしくは受容体への結合、触媒活性；遺伝子発現もしくは細胞内シグナル伝達、分化、もしくは成熟を刺激する能力；抗原活性、その他の分子の活性の調節などを説明するまたはそれらを意味してよい。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば、付着の調節もしくは維持における活性、または細胞の構造、例えば、細胞膜または細胞骨格の維持における活性を意味する。「活性」はまた、比活性、例えば、免疫学的な活性／ｍｇタンパク質、生物学的区画中の濃度などを意味する場合もある。「活性」は、自然免疫系または適応免疫系の構成要素の調節を意味してもよい。
【００７８】
「増殖活性」という用語は、例えば、正常細胞分裂、ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞形質転換、転移、および血管新生を促進する、それらに必要である、またはそれらに特異的に関連する活性を包含する。
【００７９】
「投与」および「処置」という用語は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、外来の医薬、治療薬、診断薬、または組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生体液への接触を意味する。「投与」および「処置」は、例えば、治療の、薬物動態学的、診断の、研究の、および実験の方法を意味してもよい。細胞の処置は、試薬の細胞への接触、ならびに試薬の体液への接触を包含し、この場合、体液は細胞と接触している。「投与」および「処置」はまた、例えば、細胞の、試薬、診断薬、結合化合物、または別の細胞によるインビトロおよびエクスビボ処置も意味する。「対象」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）および最も好ましくはヒトを含む。
【００８０】
「処置する」または「処置すること」という用語は、治療薬、例えば、本発明のいずれかの抗体または抗原結合断片を含む組成物を、内部的にまたは外部的に、その治療薬が治療活性を有する１種または複数種の病徴を有する、または疾患であると疑われるまたは疾患になるリスクが高い対象または患者に投与することを意味する。通常、薬剤は、いずれかの臨床的に測定可能な程度でこのような症状（単一または複数）の退行を誘導するかまたは進行を抑制することにより、処置される対象または集団における１種または複数種の病徴を改善するのに効果的な量で投与される。いずれかの特定の病徴を改善するのに効果的な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、疾患状態、年齢、および患者の体重、ならびに対象における所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子に応じて変わってもよい。病徴が改善されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価する医師またはその他の熟練保健医療提供者により通常使われる任意の臨床的測定により、評価できる。本発明の一実施形態（例えば、処置方法または製品）は全ての患者で標的病徴（単一または複数）の改善に効果的でない場合もあるが、それは、当該技術分野において既知の、例えば、スチューデントのｔ検定、χ２検定、ＭａｎｎおよびＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、クラスカル・ワリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー・テルプストラ検定およびウィルコクソン符号付き順位検定などのいずれかの統計的検定により測定して、統計的に有意な数の対象において標的病徴（単一または複数）を改善するはずである。
【００８１】
「処置」という用語は、ヒト対象、獣医学的対象、または研究対象に適用される場合、治療処置、予防または防止手段、研究および診断適用を意味する。「処置」は、ヒト対象、獣医学的対象、または研究対象、または細胞、組織、または器官に適用される場合、ヒトまたは動物対象、細胞、組織、生理的区画、または生理液に対するアゴニストまたはアンタゴニストの接触を包含する。「細胞の処置」はまた、アゴニストまたはアンタゴニストが、例えば、液体相またはコロイド状相中で受容体に接触する状況を包含するが、アゴニストまたはアンタゴニストが細胞または受容体に接触しない状況もまた包含する。
【００８２】
細胞株
以降で示すように、本発明の詳細説明および実施例の全体を通して、以下の１１種のヒトＢ細胞系列細胞株および１種のマウス細胞株が参照される：
１．ＣＲＬ１４３２−Ｎａｍａｌｗａ  ｍＩｇＭ−Ｌ  バーキットリンパ腫
２．ＣＲＬ１５９６−Ｒａｍｏｓ  ｓＩｇＭ  ｍＩｇＭ−Ｌ  バーキットリンパ腫
３．ＣＲＬ１６４７−ＳＴ４８６  ｓＩｇＭ  ｍＩｇＭ−Ｋ  バーキットリンパ腫
４．ＣＲＬ１６４８−ＣＡ４６  ｍＩｇＭ−Ｋ  バーキットリンパ腫
５．ＣＲＬ１６４９−ＭＣ１１６  ｍＩｇＭ−Ｌ  未分化リンパ腫
６．ＣＲＬ２２６０−ＨＴ  ｍＩｇＭ−Ｋ  びまん性混合型Ｂ細胞リンパ腫
７．ＣＲＬ２２８９−ＤＢ  ｍＩｇＧ−Ｌ  大細胞型Ｂ細胞型リンパ腫
８．ＣＲＬ２５６８−Ｈ２．８  マウス  ＩｇＧ１−Ｋ  骨髄腫
９．ＣＲＬ２６３２−びまん性大細胞型リンパ腫  ＩｇＧｋ
１０．ＣＲＬ２９５８−ＳＵ−ＤＨＬ−５  びまん性大細胞型リンパ腫  ｍＩｇＭ
１１．ＣＲＬ３００６−ＪｅＫｏ−１−Ｌ  マントル細胞リンパ腫  ｍＩｇＭ
１２．ＳＫ００７−リンパ腫  ｍＩｇＥ
【００８３】
これらの細胞株はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０から入手し、ＲＴ−ＰＣＲによりＰＤ発現の試験を行った。細胞質および分泌ＩｇＭ画分を、上清および洗浄した０．０１％ＮＰ−４０細胞ライセートのＥＬＩＳＡにより確認した。
【００８４】
抗体生成
本発明の抗体は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって生成できる。本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体の作製方法は当業者に既知である（Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）、この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００８５】
例えば、上述の免疫原は、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物に投与されて抗原特異的ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導できる。免疫用の特定のマウス株の選択は、応答不良を誘発する免疫原にとって重大な意味を持つ場合がある。マウス株の寛容性は、自己免疫欠陥またはより野生型の免疫反応性を有する株を試験するなどのプレスクリーニングを行って株を選択することにより、克服可能である。免疫原の投与は、免疫化剤および必要に応じアジュバントの１回または複数回の注射を伴う場合がある。宿主種に応じ、種々のアジュバントを使用して免疫応答を高めることができる。アジュバントとしては、フロイントのアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノール、多抗原ペプチド、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲランウシ型結核菌）およびコリネバクテリウムパルブムが挙げられるが、これらに限定されない。採用可能なアジュバントの追加の例としては、結合免疫原ペプチドを有するスカシ貝ヘモシアニン、結合免疫原ペプチドを有する多抗原ポリペプチド、およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫化プロトコルは当該技術分野において周知であり、選択した動物宿主中で免疫応答を誘発する任意の方法によって実施できる。アジュバントも当該技術分野において周知である。
【００８６】
通常、免疫原（アジュバントありまたはなしで）は、複数回の皮下または腹腔内注射により、または筋肉内または静脈内注射により哺乳動物に注射される。免疫原としては、膜ＩｇＭに対する：ＥＧＥＶＳＡＤＥＥＧＦＥＮ（配列番号１１）または膜ＩｇＧに対する：ＥＬＱＬＥＥＳＣＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号１２）の標的ペプチド、精製されたＢ細胞ｍＩｇＭ、融合タンパク質、またはその変異体を含んでよい。膜ＩｇＭ用の標的ペプチド、ＥＧＥＶＳＡＤＥＥＧＦＥＮ（配列番号１１）は、配列ＥＧＥＶＳＥＤＥＥＧＦＥ（配列番号１３）を有するヒトＩｇＭペプチドｈＣＧ２０３８９４２（受入番号ＥＡＷ８１９３８．１）に１００％相同性を有する。ペプチドの性質（すなわちパーセント疎水性、パーセント親水性、安定性、実効電荷、等電点、複数の異性体型など）に応じて、免疫化される哺乳動物において免疫原性があることが分かっているタンパク質に免疫原をコンジュゲートするのが有用な場合がある。このようなコンジュゲーションは、コンジュゲートされる免疫原および免疫原性タンパク質の両方への化学官能基の活性誘導により共有結合が形成されるような化学コンジュゲーション、または融合タンパク質ベースの方法による化学コンジュゲーション、またはその他の当業者に既知の方法を含む。このような免疫原性タンパク質の例としては、スカシ貝ヘモシアニン、多抗原ペプチド、卵白アルブミン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、大豆トリプシン阻害剤、およびプロミスキャスＴヘルパーペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。上述のように、種々のアジュバントを使用して免疫応答を高めることができる。
【００８７】
本発明の抗体はモノクローナル抗体を含んでもよい。モノクローナル抗体は単一の抗原性部位を認識する抗体である。それらの一定の特異性はモノクローナル抗体をポリクローナル抗体より遥かに有用性の高いものにしている。ポリクローナル抗体は、通常、種々の異なる抗原性部位を認識する抗体を含んでいる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８１）に記載されるようなハイブリドーマ技術方法、組換えＤＮＡ法、または当業者に既知のその他の方法を使って調製できる。  その他の方法の例としては、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６（１９８３））、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＡ、ＩｇＤならびにこれらの任意のサブクラスを含むいずれの免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養できる。
【００８８】
ハイブリドーマモデルでは、マウス、ヒト化マウス、ヒト免疫系を有するマウス、ハムスター、ウサギ、ラクダ、または任意のその他の適切な宿主動物などのホストを免疫して、免疫に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を誘発する。本発明では、初期Ｂ細胞それ自体が所望の抗体の標的となりＢ細胞のアポトーシスが生じ得ることから、ヒトＩｇ遺伝的レパートリーを利用するマウスは使用できない。その代わりに、リンパ球をインビトロで免疫できる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使ってリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。
【００８９】
一般に、抗体産生ハイブリドーマの作製では、ヒト起原の細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使われ、または非ヒト哺乳動物起源が望まれる場合は脾臓細胞またはリンパ節細胞が使われる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使ってリンパ球を不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、特に、げっ歯類、ウシまたはヒト起原の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは非融合不死化細胞の成長または生存を抑制する１種または複数種の物質を含有する、適切な培地中で培養できる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培地は通常、ＨＧＲＴ欠損細胞の成長を防止する物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含む。
【００９０】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合して、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支援し、かつＦＩＡＴ培地などの培地に敏感な細胞株である。これらの骨髄腫細胞株には、ＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のものならびにＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡから入手可能なＳＰ２／０またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫株がある。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の作製用として記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ｐｐ．５１−６３（１９８７））。マウス骨髄腫細胞株ＮＳＯも使用できる（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｓｈｉｒｅ，ＵＫ）。
【００９１】
その中でハイブリドーマ細胞が増殖される培地は、ペプチドに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされ、ペプチドは、例えば、ＩｇＭ用の、ＥＧＥＶＳＡＤＥＥＧＦＥＮ（配列番号１１）およびＩｇＧ用の、ＥＬＱＬＥＥＳＣＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号１２）である。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイにより、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫ウェスタンブロットもしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定できる。このような技術は当技術分野および当業者に既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、スキャチャード解析によって決定できる（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０））。
【００９２】
ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生すると特定されると、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的方法により増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９−１０３（１９８６））。この目的のための適切な培地には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は腹水腫瘍として動物中でインビボで増殖させることができる。
【００９３】
サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡセファローズ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィーなどにより、培地、腹水、または血清から適切に分離または単離される。
【００９４】
当該技術分野には、モノクローナル抗体の種々の作製方法が存在し、したがって、本発明はそれらのハイブリドーマによる産生のみに限定されるものではない。例えば、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法により作製できる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡのソースとして機能する。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に配置され、これは次に、大腸菌、ＮＳ０細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、または他の方法で免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞中に形質移入され、組換え型宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が行われる。ＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することにより、改変できる。このような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常ドメインと置換して、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換して、キメラの二価抗体を形成できる。
【００９５】
Ｂ細胞受容体複合体（ＢＣＲＣ）の膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）に結合する本発明の抗体またはそのその抗原結合断片は、本明細書で開示の抗体の１、２、３、４、５、または６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでよい。１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲは、本発明の単一の記載抗体のＣＤＲ配列（例えば、表１、表２）から独立に選択できる。特定の実施形態では、１、２または３個のＣＤＲが記載抗体のＶＬのＣＤＲ（例えば、表１；配列番号８〜１０）から選択され、および／または１、２または３個のＣＤＲが記載発明のＶＨのＣＤＲ（例えば、表２；配列番号５〜７）から選択される。
【００９６】
ＢＣＲＣのｍＩｇＭに結合する本発明の単離抗体またはその抗原結合断片は、抗体ｍＡｂ４−２ｂのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２またはＣＤＲ−Ｌ３の内の１つまたは複数を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む。
【００９７】
ＢＣＲＣのｍＩｇＭに結合する本発明の単離抗体またはその抗原結合断片は、抗体ｍＡｂ４−２ｂのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２またはＣＤＲ−Ｈ３の内の１つまたは複数を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。
【００９８】
さらなる実施形態では、ＢＣＲＣのｍＩｇＭに結合する単離抗体またはその抗原結合断片は、抗体ｍＡｂ４−２ｂのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２またはＣＤＲ−Ｌ３の内の１つまたは複数を含む抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、および抗体ｍＡｂ４−２ｂのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２またはＣＤＲ−Ｈ３の内の１つまたは複数を含む抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む。本発明のｍＡｂ４−２ｂ抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲを、それぞれ表１および２に示す。
【表１】
0006535668.tif 000002
【表２】
0006535668.tif 000003
【００９９】
本発明は、本発明の抗体のＶＬドメイン（例えば、配列番号４）を含む単離ポリペプチドおよびＶＨドメイン（例えば、配列番号２）を含む単離ポリペプチドも提供する。他の実施形態では、本発明は、ＢＣＲＣのｍＩｇＭに特異的に結合し、配列番号２および４と、少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを有し、同時に、依然として所望の結合および機能特性を示す、抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０のまたはそれを超える保存的または非保存的アミノ酸置換を有するＶＬおよびＶＨドメイン（シグナル配列を有するまたは有しない場合の）を含み、同時に、依然として所望の結合および機能特性を示す。
【０１００】
「保存的に改変された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中におけるアミノ酸の、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖構造および剛性など）を有する他のアミノ酸との置換であって、その変化が多くの場合そのタンパク質の生物活性を変えることなく行うことができるような置換を意味する。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変えないことを理解している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．）を参照されたい）。さらに、構造上または機能上類似のアミノ酸の置換は、生物活性を破壊しにくい。本発明の抗体または抗原結合断片の種々の実施形態は、本明細書で開示の配列、例えば、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、および１０を有するポリペプチド鎖、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０の、またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド鎖を含む。代表的保存的置換を表３に示す。
【表３】
0006535668.tif 000004
【０１０１】
本発明では、本発明の抗体の機能保存的変異体も意図されている。本明細書で使用される場合、「機能保存的変異体」は、１種または複数種のアミノ酸残基が抗原親和性および／または特異性などの所望の性質を変えることなく変化している抗体または断片を意味する。このような変異体としては、表３の保存的アミノ酸置換などの、類似の性質を有するアミノ酸でのアミノ酸の置換、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明は、ＢＣＲＣのヒトｍＩｇＭに特異的に結合し、本明細書で記載の１種または複数種のＶＬドメインまたはＶＨドメインと、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または５０％の配列相同性を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを有し、かつＢＣＲＣのヒトｍＩｇＭに対し特異的結合を示す抗体またはその抗原結合断片を提供する。別の実施形態では、本発明の結合抗体またはその抗原結合断片は、１、２、３、４、または５のもしくはそれを超えるアミノ酸置換を有するＶＬおよびＶＨドメイン（シグナル配列を有するまたは有しない場合の）を含み、ＢＣＲＣのヒトｍＩｇＭに対する特異的結合を示す。
【０１０３】
抗体は一価抗体であってよい。一価抗体を調製する方法は当該技術分野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変された重鎖の組換え体発現を含む。重鎖は、重鎖架橋結合を防ぐように、通常ＦＣ領域の任意の位置で切り詰められる。あるいは、関連するシステイン残基が、架橋結合を防ぐように別のアミノ酸残基で置換されるか、または欠失される。
【０１０４】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術により生成できる。従来、これらの断片はインタクト抗体のタンパク分解性消化を介して導出された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生成するために）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生成するために）などの酵素を用いる、免疫グロブリン分子のタンパク質切断により生成できる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。しかし、今日では、これらの断片は組換え型宿主細胞から直接的に産生できる。例えば、抗体断片は抗体ファージライブラリーから単離できる。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２））。別の手法では、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞培養物から直接単離できる。抗体断片の作製のためのその他の技術は熟練した専門家には明らかであろう。他の実施形態では、選択抗体は、単鎖Ｆｖ断片（Ｆｖ）である（国際公開第ＷＯ９３／１６１８５号）。
【０１０５】
ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの使用のために、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体などの、抗体の異なる部分が異なる動物種由来である分子である。キメラ抗体を生成する方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照されたい。これらの文献は、参照により全体が本明細書に援用される。
【０１０６】
ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンに対し、動物由来モノクローナル抗体より高い相同性を有するように設計される。ヒト化はキメラ抗体を作製するための技術であり、実質的に一つの無傷なヒト可変領域に満たない部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されている。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１種または複数種の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク（ＦＲ）領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種中で生成される抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基はＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換されて、抗原結合を変える、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野において周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置での独特なフレームワーク残基を特定するための配列比較により特定される。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照されたい。この文献は参照により全体が本明細書に援用される。抗体は当該技術分野において既知の様々な技術を使ってヒト化でき、これらの技術は、例えば、ＣＤＲグラフト化（欧州特許出願ＥＰ２３９，４００号；国際出願第ＷＯ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｆａｃｉｎｇ）（欧州特許出願第ＥＰ５９２，１０６号；同第ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８：４８９（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：９６９（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む。
【０１０７】
一般に、ヒト化抗体は、非ヒトソース由来の、それに組み込まれる１個または複数個のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と呼ばれ、通常「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８））の方法に従って、非ヒトＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することにより実施できる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であって（米国特許第４，８１６，５６７号）、実質的に一つの無傷なヒト可変領域に満たない部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は通常ヒト抗体であり、その中でいくつかのＣＤＲ残基といくつかの想定されるＦＲ残基とが、げっ歯類抗体中の類似部位から置換される。
【０１０８】
ヒト化抗体が抗原に対する高い親和性と他の好ましい生物学的性質を保持していることはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法にしたがって、ヒト化抗体が、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列と種々の概念上のヒト化産物とを分析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体構造を図解し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における特定の残基のあり得る役割の分析、すなわち、その抗原への候補免疫グロブリンの結合能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原（単一または複数）に対する親和性の増大など、望ましい抗体特性が最大化されるように、レシピエントからＦＲ残基を選択してインポート配列と組合せることができる。
【０１０９】
ヒト化抗体作製で使用されるヒト可変領域（重鎖および軽鎖の両方）の選択は、抗原性を減らす上で重要である。いわゆる「最良適合」法にしたがって、非ヒト抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次に、非ヒト親抗体の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れる（Ｓｉｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１（１９８７））。
【０１１０】
別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なる非ヒト抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１：２６２３（１９９３））。本発明の抗体は、抗体が所望の生物学的特徴（例えば、所望の結合親和性）を示す限りにおいて、任意の好適なヒトのまたはヒトコンセンサスの軽鎖または重鎖フレームワーク配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ヒトのおよび／またはヒトコンセンサスの非高頻度可変領域配列中に、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれを超える）追加の改変が存在する。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト軽鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部（または全て）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒト重鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部（または全て）を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の少なくとも一部（または全て）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。一実施形態では、本発明の抗体のフレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３および／または７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施形態では、位置７１はＡ、７３はＴおよび／または７８はＡである。
【０１１１】
完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療処置のために特に望ましい。ヒト抗体は、当該技術分野において既知の種々の方法により作製でき、この方法には、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法が含まれる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびに国際公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号も参照されたい。これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に援用される。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｒｉｓｓ（１９８５）；およびＢｏｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：８６（１９９１））。
【０１１２】
ヒト抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できる遺伝子導入マウスを使っても作製できる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えにより、マウス胚性幹細胞中に導入できる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、マウス胚性幹細胞中に導入できる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々にまたは相同組換えによるヒト免疫グロブリン座位の導入と同時に非機能性となる場合がある。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は内在の抗体産生を妨害する。改変された胚性幹細胞は増殖され、胚盤胞中に微量注入されて、キメラマウスを産生する。キメラマウスはその後交配されて、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３（１９９３）；Ｄｕｃｈｏｓａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照されたい。
【０１１３】
遺伝子導入マウスは、選択された抗原により、例えば、本発明のポリペプチドの全てまたは一部により通常の方法で免疫される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使って、免疫された遺伝子導入マウスから得ることができる。遺伝子導入マウスに含まれるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中の間に再構成され、その後にクラススイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技術を使って、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することが可能である。ヒト抗体作製のためのこの技術の概要に関しては、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体作製のためのこの技術の詳細な考察、およびこのような抗体を作製するためのプロトコルに関しては、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９２／０１０４７号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号；欧州特許第０５９８８７７号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。これらの特許は参照によりその全体が本明細書に援用される。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．），Ｇｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）などの会社は、上記と類似の技術を使って選択された抗原に対するヒト抗体を提供できる。
【０１１４】
ヒトｍＡｂはまた、ヒト末梢血白血球、脾細胞または骨髄を移植されたマウスを免疫することにより作製することも可能である（例えば、ＸＴＬのトリオーマ技法）。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を使って作製できる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使って、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９（１９８８））。注目すべきことに、モノクローナル抗体は応答を開始する一次免疫化Ｂ細胞と自己反応性であるはずなので、ヒトＢ細胞を、要求される特異的モノクローナル抗体を作製するために使用できない。
【０１１５】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を使って本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体の作製に利用できる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７：４３７（１９８９）；Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２４２９（１９９１）を参照されたい）。例えば、本発明のポリペプチドに結合して、そのポリペプチドのポリペプチド多量体化およびリガンドへの結合を競合的に抑制する抗体を使って、ポリペプチド多量体化および／または結合ドメインを「模倣」し、結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合して中和する抗イディオタイプを作製できる。このような抗イディオタイプの中和または抗イディオタイプのＦａｂ断片は、ポリペプチドリガンドを中和する治療法に使用できる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体を使って、本発明のポリペプチドを結合、および／またはそのリガンド／受容体を結合でき、それによりその生物活性をブロックできる。
【０１１６】
本発明の抗体は二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。本発明では、結合特異性の片方をＢ細胞ｍＩｇＭに向け、もう一方を任意の他の抗原、好ましくは、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスにコードされたエンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質、または細菌表面タンパク質などに向けることができる。
【０１１７】
二重特異性抗体を作製する方法は良く知られている。従来、二重特異性抗体の組換えによる作製は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいており、ここで２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の混合物を生成する可能性があり、そのうちの１種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、親和性クロマトグラフィーステップにより行われる。類似の方法は、国際公開第ＷＯ９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５（１９９１）に開示されている。
【０１１８】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原混合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行うのが好ましい。そのドメインは、融合体の少なくとも１つ中に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有してよい。免疫グロブリン重鎖融合体および必要に応じ、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物中に同時形質転換される。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ  １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１１９】
本発明では、ヘテロコンジュゲート抗体も意図されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合的につながれた２つの抗体から構成される。例えば、このような抗体は、免疫系細胞を不必要な細胞へ標的させることが提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。架橋剤を伴う方法を含む合成タンパク質化学の既知の方法を使用して、抗体がインビトロで調製されることが意図されている。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使って、またはチオエステル結合を形成することにより構築できる。この目的のための適切な試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のものが含まれる。
【０１２０】
さらに、Ｂ細胞ｍＩｇＭに対する単一ドメイン抗体を作製できる。この技術の例は、ラクダ科重鎖Ｉｇ由来の抗体についての国際公開第ＷＯ９４２５５９１号に、ならびにファージライブラリーからの単一ドメイン完全ヒト抗体の分離についての米国特許出願公開第２００３０１３０４９６号に記載されている。
【０１２１】
また、重鎖および軽鎖Ｆｖ領域が連結されている単一ペプチド鎖結合分子を作製することも可能である。単鎖抗体（「ｓｃＦｖ」）およびそれらの構築方法は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。あるいは、Ｆａｂを構築し、類似の手段で発現させることが可能である。全ての完全および部分的ヒト抗体は完全マウスｍＡｂより免疫原性が低く、断片および単鎖抗体もまた免疫原性が低い。
【０１２２】
抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２（１９９０）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４（１９９１）およびＭａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１（１９９１）の技術を使って生成される抗体ファージライブラリーから単離でき、それらはファージライブラリーを用いるマウス抗体およびヒト抗体の単離についてそれぞれ記載している。その後の論文では、高親和性（ｎＭレベル）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる作製（Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：２２６５（１９９３））について記載されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する有効な代替方法である。
【０１２３】
ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより改変できる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４））。
【０１２４】
別の選択肢は、ハイブリドーマを形成するために、化学融合ではなく電気融合を使うことである。この技術は十分に確立されている。融合の代わりに、例えば、エプスタイン・バーウイルス、または形質転換遺伝子を使って、Ｂ細胞を形質転換して不死にすることも可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｋｅｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１９−３３．（１９８０）中の”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”  Ｚｕｒａｗａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．、を参照されたい。げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）を、真核生物系または原核生物系により発現されたＢ細胞ｍＩｇＭタンパク質、融合タンパク質、またはその断片で免疫することにより、抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ  ｍＡｂを作製できる。その他の動物、例えば、非ヒト霊長類、免疫グロブリン発現遺伝子導入マウス、およびヒトＢリンパ球を移植された重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを、免疫に使用できる。ハイブリドーマは、前述（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））のように、免疫された動物由来のＢリンパ球を骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０およびＮＳＯ）と融合することによる、従来の方法で生成できる。さらに、抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体は、ファージディスプレーシステムにおいてヒトＢリンパ球由来の組換え型単鎖ＦｖまたはＦａｂライブラリーのスクリーニングにより生成できる。Ｂ細胞ｍＩｇＭに対するｍＡｂの特異性は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンイムノブロッティング、または他の免疫化学的技術により試験できる。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化に対する抗体の阻害活性は、増殖、サイトカイン放出、およびアポトーシスアッセイにより評価できる。陽性ウエル中のハイブリドーマは限界希釈法によりクローン化される。上記アッセイによるヒトＢ細胞ｍＩｇＭに対する特異性のキャラクタリゼーションのために、抗体が精製される。
【０１２５】
抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗体およびその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたは核酸、例えば、ＤＮＡをさらに提供する。代表的ポリヌクレオチドとしては、配列表（例えば、配列番号１および３）に記載の１種または複数種のアミノ酸配列を含む抗体鎖をコードするものが含まれる。本発明はまた、ストリンジェントな条件下、またはより低い厳密度のハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【０１２６】
好ましくは、核酸は、低い、中程度のまたは高い厳密度の条件下でハイブリダイズし、ＢＣＲＣのｍＩｇＭに特異的に結合する能力を維持している抗体をコードする。温度および溶液イオン強度の適切な条件下で、単鎖型の第１の核酸分子が第２の核酸分子にアニーリングできる場合、第１の核酸分子は、第２の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９９０），３ｒｄ  ｅｄ．（２００１）を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「厳密度」を決定する。典型的な低厳密度ハイブリダイゼーション条件には、５５℃、５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよびフォルムアミドなし；または４２℃にて、３０％フォルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳが挙げられる。典型的な中等度の厳密度のハイブリダイゼーション条件は、４２℃にて、４０％フォルムアミド、５Ｘまたは６Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳである。高厳密度ハイブリダイゼーション条件は、４２℃にて５０％フォルムアミド、５Ｘまたは６Ｘ  ＳＳＣまたは、任意選択で、より高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃または６８℃）である。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションの厳密度に応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切な厳密度は、当該技術分野において周知の変数である、核酸の長さ、および相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性または相同性の度合いが大きいほど、その条件下で核酸がハイブリダイズできる厳密度は高い。１００ヌクレオチドの長さを超えるハイブリッドに対しては、融解温度を計算する式が得られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，９．５０−９．５１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９９０），３ｒｄ  ｅｄ．（２００１）を参照されたい）。より短い核酸の、例えば、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに対しては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１１．７−１１．８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９９０），３ｒｄ  ｅｄ．（２００１）を参照されたい）。
【０１２７】
当該技術分野において既知の任意の方法により、ポリヌクレオチドが得られ、かつそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定できる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されるオリゴヌクレオチドから構築できる（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載のように）。この方法は、簡単に説明すると、抗体をコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびにＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドのその後の増幅を含む。
【０１２８】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切なソース由来の核酸から生成できる。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンを利用できないが抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成されるかまたは適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または本発明の抗体から生成されるｃＤＮＡライブラリー、または本発明の抗体から単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ、、例えば、本発明の抗体を発現のために選択されるハイブリドーマ細胞など、抗体を発現している任意の組織細胞）から、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅により、または、例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンを識別するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングにより得ることができる。ＰＣＲにより生成された増幅核酸は、その後、当該技術分野において周知のいずれかの方法を使って、複製可能なクローニングベクターに挿入できる。
【０１２９】
抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなどの方法（例えば、いずれも参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９９０），３ｒｄ  ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９８）に記載の技術を参照されたい）を使って操作して、例えば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入を形成して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成できる。
【０１３０】
特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＣＤＲの配列を特定するために、周知の方法、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較し、超可変性配列領域を決定することにより、検査できる。通常の組換えＤＮＡ技術を使って、１つまたは複数のＣＤＲをフレームワーク領域、例えば、ヒトフレームワーク領域中に挿入し、前述のように、非ヒト抗体をヒト化できる。フレームワーク領域は天然の領域でも、コンセンサスフレームワーク領域でもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストに関しては、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７８：４５７（１９９８）を参照されたい）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせにより生成されるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、前で考察したように、１個または複数個のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で生成され、かつ好ましくは、そのアミノ酸置換が抗体のその抗原に対する結合を改善する。さらに、そのような方法を使って、鎖内ジスルフィド結合に関与する１個または複数個の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行い、１個または複数個の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成できる。ポリヌクレオチドに対するその他の改変は、本発明に包含され、当該技術の範囲内にある。
【０１３１】
さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：８５１（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２（１９８５））を使用できる。前述のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種由来である分子であり、例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えば、ヒト化抗体である。
【０１３２】
あるいは、単鎖抗体の作製用に記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９（１９８８）；およびＷａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４（１９８９））を単鎖抗体の作製に適合できる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖断片をアミノ酸架橋を介して連結し、単鎖ポリペプチドを生成することにより形成される。大腸菌中での機能性Ｆｖ断片の構築のための技術も使用できる（Ｓｋｅｒｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８（１９８８））。
【０１３３】
ベクターおよび宿主細胞
別の態様では、本発明は本明細書で開示の抗体をコードする単離核酸配列、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物、このようなベクターを含む宿主細胞、および抗体の作製のための組換え技術を提供する。
【０１３４】
抗体の組換え産生に関しては、その抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のためまたは発現のために複製可能ベクター中に挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を使って容易に単離、配列決定される（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使うことにより）。クローニングおよび形質転換の標準的な技術を、本発明の抗体を発現する細胞株の調製に使用できる。
【０１３５】
ベクター
多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は、通常、下記の内の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１個または複数個のマーカー遺伝子、エンハンサー配列、プロモータ、および転写終止配列。本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え体発現ベクターはよく知られた技術を使って調製できる。発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来のものなど適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能的に連結されるヌクレオチド配列を含んでよい。調節配列の例には、転写プロモータ、オペレータ、エンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに／または転写および翻訳反応の開始および終止を制御する他の適切な配列が含まれる。調節配列が適切なポリペプチドのヌクレオチド配列に機能的に関連する場合、ヌクレオチド配列は「機能的に連結」されている。したがって、プロモータヌクレオチド配列が適切なヌクレオチド配列の転写を制御する場合、プロモータヌクレオチド配列は、例えば、抗体重鎖配列に、機能的に連結されている。本発明の抗体を発現するための有用な発現ベクターの例は、国際公開第ＷＯ０４／０７００１１号に見出される。この特許は参照により本明細書に援用される。
【０１３６】
加えて、天然の場合は抗体重鎖および／または軽鎖配列に関連していない適切なシグナルペプチドをコードする配列を、発現ベクター中に組み込むことができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のヌクレオチド配列をポリペプチド配列にインフレームで融合でき、それにより、抗体が細胞周辺腔または培地中に分泌される。意図される宿主細胞中で機能的なシグナルペプチドは、適切な抗体の細胞外分泌を高める。このシグナルペプチドは、抗体の細胞からの分泌時にポリペプチドから切断され得る。このような分泌シグナルは良く知られており、例えば、米国特許第５，６９８，４３５号；同第５，６９８，４１７号；および同第６，２０４，０２３号に記載のものが含まれる。
【０１３７】
宿主細胞
本発明において有用な宿主細胞は、原核、酵母、または高等真核細胞であり、抗体コード配列を含む組換え型バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）などの微生物；抗体コード配列を含む組換え型酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス、ピキア）；抗体コード配列を含む組換え型ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換え型ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されたまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）または哺乳動物ウイルス由来のプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含む組換え体発現構築物を含む哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の宿主細胞として有用な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌、枯草菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、セラチア、および赤痢菌、ならびに桿菌、シュードモナス、およびストレプトマイセスが含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も好適である。これらの例は、限定的であるよりむしろ例示的である。
【０１３９】
原核宿主細胞で使うための発現ベクターは通常、１個または複数個の表現型選択可能なマーカー遺伝子を含む。表現型選択可能なマーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するまたは独立栄養要求を満たすタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に対し有用な発現ベクターの例には、市販のプラスミド、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）、およびｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）およびｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）シリーズのベクターに由来するものが含まれる（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１９：３７（１９９１）；Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ，Ｇｅｎｅ  １２４：８３（１９９３））。組換え型原核宿主細胞発現ベクターによく使われるプロモータ配列には、Ｔ７、（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５６：１２５（１９８７））；β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモータシステム（Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８），Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ８：４０５７（１９８０））；およびｔａｃプロモータ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０））が含まれる。
【０１４０】
本発明に有用な酵母または糸状菌には、サッカロマイセス、ピキア、放線菌、クリベロマイセス、分裂酵母、カンジダ、トリコデルマ、パンカビ、ならびに糸状菌、例えば、パンカビ、アオカビ、トリポクラジウム、およびアスペルギルス由来のものが含まれる。酵母ベクターは多くの場合、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモータ領域、ポリアデニル化配列、転写終止配列、および選択可能マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターのための適切なプロモータ配列には、特に、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：２０７３（１９８０））または他の糖分解酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７：４９００（１９７８））例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート異性化酵素、イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのためのプロモータが含まれる。酵母発現で使われる他の適切なベクターおよびプロモータは、Ｆｌｅｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０７：２８５（１９９１）にさらに記載されている。酵母のための他の適切なプロモータおよびベクターならびに酵母形質転換プロトコルは当該技術分野で周知である。酵母形質転換プロトコルは良く知られている。１つのこのようなプロトコルは、Ｈｉｎｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７５：１９２９（１９７８）により記載されている。Ｈｉｎｎｅｎプロトコルは、選択的培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択する。
【０１４１】
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養システムを、組換え型抗体を発現するために用いることもできる。原理的には、脊椎動物培養由来でも無脊椎動物培養由来でも、任意の高等真核細胞培養が使用可能である。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる（Ｌｕｃｋｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−９，Ｐｌｅｎａｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８６）；Ｍｓｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２（１９８５））。例えば、バキュロウイルスシステムを異種タンパク質の作製に使用できる。昆虫システムでは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使って外来性遺伝子を発現できる。ウイルスはヨトウガ細胞中で増殖する。抗体コード配列を個別に、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えば、ポリヘドリンプロモータ）の制御下に置くことができる。特定されているその他の宿主には、ヤブカ、キイロショウジョウバエ、およびカイコが含まれる。形質移入用の種々のウイルス株、例えば、ＡｃＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、特に、ヨトウガ細胞の形質移入用に、このようなウイルスを本発明によりウイルスとして使用できる。さらに、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養を、宿主として利用することも可能である。
【０１４２】
脊椎動物細胞培養、および培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、通常の手順になっている。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｒｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７３）を参照されたい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、サル腎臓；ヒト胚腎臓株；ベビーハムスター腎臓細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞；ヒト肺細胞；ヒト肝臓細胞；マウス乳房腫瘍；およびＮＳ０細胞である。
【０１４３】
宿主細胞は抗体作製のために上記ベクターで形質転換され、プロモータ、転写および翻訳制御配列の誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増殖に適切なように修正された従来の栄養素培地中で培養される。よく使われるプロモータ配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列を使って、哺乳動物宿主細胞中の構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝的要素、例えば、ＳＶ４０オリジン、初期および後期プロモータ、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を提供できる。ウイルス初期および後期プロモータは特に有用である。理由は、両方とも、ウイルスゲノムから断片として容易に得られ、この断片はウイルス複製起点も含み得るためである。哺乳動物宿主細胞中で使用するための代表的な発現ベクターは市販されている。
【０１４４】
本発明の抗体を作製するために使用される宿主細胞は種々の培地中で培養できる。市販の培地、例えば、ハムＦ１０培地（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）は宿主細胞の培養に適する。さらに、Ｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０２：２５５（１９８０）、および米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，５６０，６５５号；同第５，１２２，４６９号；同第５，７１２，１６３号；または同第６，０４８，７２８号、に記載のいずれの培地も宿主細胞用の培地として使用できる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、Ｘ−塩化物、ここでＸはナトリウム、カルシウム、マグネシウム；およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬剤）、微量成分（ミリモルレベルの最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価エネルギー源を補充できる。任意の他の必要なサプリメントを、当業者に既知の適切な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択される宿主細胞で従来から使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４５】
また、本発明に含まれるのは、アルゴリズムのパラメータがそれぞれの参照配列の全長にわたりそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を行った場合、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７０％同一の、好ましくは少なくとも約８０％同一の、より好ましくは少なくとも約９０％同一の、および最も好ましくは少なくとも約９５％同一の（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％同一の）アミノ酸配列を含むポリペプチドである。アルゴリズムのパラメータがそれぞれの参照配列の全長にわたりそれぞれの配列の間で最大マッチを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムにより比較を行った場合、参照アミノ酸配列のいずれかに対し、少なくとも約７０％類似の、好ましくは少なくとも約８０％類似の、より好ましくは少なくとも約９０％類似の、および最も好ましくは少なくとも約９５％類似の（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％類似の）アミノ酸配列を含むポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【０１４６】
配列同一性は、２つの配列が最適に整列される場合に、２つのポリペプチドのアミノ酸が同じ位置で同一である度合いを意味する。配列類似性は同一の残基および非同一の、生化学的に関連するアミノ酸を含む。類似の特性を共有し置き替え可能である生化学的に関連するアミノ酸は、前に考察している。
【０１４７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関連する以下の文献は配列解析に使用されることが多い：ＢＬＡＳＴ  ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、中のＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＣＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”；Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、中のＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＧｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），（１９９７）  ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、中のＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．”Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”  ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａ���ｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明は、本発明の単離抗体または抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする単離核酸または核酸、例えば、ＤＮＡに関する。一実施形態では、単離核酸は、少なくとも１つの成熟抗体抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび少なくとも１つの成熟抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含む抗体またはその抗原結合断片をコードし、ＶＬドメインは配列番号３の配列を有する少なくとも３つのＣＤＲ、およびＶＨドメインは配列番号１の配列を有する少なくとも３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、単離核酸は単一核酸分子上の軽鎖および重鎖をコードし、他の実施形態では、軽鎖および重鎖は別の核酸分子上にコードされる。別の実施形態では、核酸はシグナル配列をさらにコードする。
【０１４９】
抗体の作製方法
本発明の抗体は、抗体の合成のために当該技術分野において既知のいずれかの方法、特に、化学合成または好ましくは、組換え体発現技術により作製できる。
【０１５０】
本発明の抗体、または断片、誘導体、またはそれらの類似体（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え体発現は、抗体または抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体作製用ベクターは組換えＤＮＡ技術により作製できる。発現ベクターは、抗体コード配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含んで構築される。これらの方法としては、例えば、組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えが挙げられる。
【０１５１】
発現ベクターは従来技術によって宿主細胞に移入され、形質移入された細胞はその後、従来技術によって培養され本発明の抗体を産生する。本発明の一態様では、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以降で詳述するように、全体免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞中で同時発現される。
【０１５２】
上述のように、種々の宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる。このような宿主発現系は、それによって目的のコード配列が生成され、その後精製されるビークルに相当するが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換された場合または適切なヌクレオチドコード配列で形質移入された場合、本発明の抗体分子をインサイチューに発現する細胞にも相当する。大腸菌などの細菌細胞、および真核細胞は、組換え型抗体分子の発現に、特に全組換え型抗体分子の発現によく使われる。例えば、ヒトサイトメガロウィルス由来の主要中間体初期遺伝子プロモータ配列などのベクターと併用して、ＣＨＯなどの哺乳動物細胞は、抗体用の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０１５３】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、または遺伝子産物を所望の特定の方法で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択できる。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要な場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関して特徴的で特異的な機序を有する。適切な細胞株または宿主系を、発現される外来性タンパク質の適切な修飾とプロセシングを保証するように選択できる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用できる。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、３ｔ３、または骨髄腫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
組換えタンパク質の長期で高収率な産生のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作できる。ウイルス複製オリジンを含む発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞を、適切な発現制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ、および選択可能マーカーで形質転換できる。外来性ＤＮＡの導入後、操作された細胞を栄養強化培地中で１〜２日間増殖させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定に組み込むことを可能にし、かつ増殖して細胞増殖巣を形成し、これが次にクローン化され細胞株中に拡大される。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために有利に使用できる。このような操作された細胞株は、抗体分子と直接にまたは間接的に相互作用する化合物の選別と評価に特に有用である場合がある。
【０１５５】
多くの選択システムを使用でき、これらには、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｉｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔまたはａｐｒｔ細胞で用いることができる。また、代謝拮抗薬耐性を次の遺伝子に対する選択の基準として使用できる：ｄｈｆｒ、これはメトトレザトに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７（１９９１））；およびｈｙｇｒｏ、これはヒグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野でよく知られている方法は、所望の組換え型クローンを選択するためにルーチン的に適用でき、このような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：１（１９８１）に記載されている。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１５６】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により高めることができる（概説としては、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，”  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤の量の増加は、マーカー遺伝子の複製物の数を増やすことになる。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７（１９８３））。
【０１５７】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、ポリペプチド由来の重鎖をコードする第１のベクターおよびポリペプチド由来の軽鎖をコードする第２のベクター、により同時形質移入され得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの対等の発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含んでいてもよい。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現できる単一ベクターを使ってもよい。このような状況では、過剰な有毒性の遊離重鎖を避けるために、軽鎖は重鎖の前に配置する必要がある（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖用のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでもよい。
【０１５８】
動物により、化学的合成により、または組換え発現により、本発明の抗体分子が作製されると、その抗体分子は免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野において既知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対する親和性、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術により、精製できる。さらに、本発明の抗体またはその断片を、本明細書で記載されるまたは当該技術分野において既知の異種ポリペプチド配列に融合して、精製を促進できる。
【０１５９】
本発明は、ポリペプチドに組換えで融合された、または化学的にコンジュゲート（共有結合的および非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）された抗体を包含する。本発明の融合されたまたはコンジュゲートされた抗体は、精製を容易にするために使用できる。例えば、国際公開第ＷＯ９３／２１２３２号；欧州特許出願第ＥＰ４３９，０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３９：９１（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｉｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１４２８（１９９２）；Ｆｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６：２４４６（１９９１）を参照されたい。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１６０】
さらに、本発明の抗体またはその断片を、ペプチドなどのマーカー配列に融合し、精製を促進できる。好ましい実施態様では、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）で提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチド（配列番号１８）であり、これらの多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８２１（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号１８）は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用なその他のペプチドタグには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））および「ｆｌａｇ」タグが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
抗体精製
組換え技術を使う場合、抗体は、細胞内で産生され、細胞周辺腔中で産生され、または媒質中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第一ステップとして、粒子状壊死組織片、宿主細胞または溶解断片を、例えば、遠心分離または限外濾過により除去できる。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する方法を記載する。簡単に説明すると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分にわたり解凍する。細胞壊死組織片を遠心分離により除去できる。抗体が媒質中に分泌される場合は、通常最初に、このような発現系由来の上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使って濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれかで加えてタンパク質分解を抑制し、抗生物質を加えて外来性混入物の増殖を防ぐことができる。
【０１６２】
細胞から調製した抗体組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、および親和性クロマトグラフィーを使って精製できるが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在するいずれかの免疫グロブリンＦＣドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使って、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖をベースにする抗体を精製できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６２：１（１９８３））。プロテインＧは、全マウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３に対し推奨されている（Ｇｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ５：１５６７（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリックスは、アガロースの場合が最も多いが、その他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば、気孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースで達成され得るよりも速い流速と、より短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製用のその他の技術、例えば、イオン交換カラム上の分留、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカを使ったクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂上のヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）を使ったクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。任意の予備的な精製ステップ（単一または複数）後に、目的の抗体および混入物を含む混合物は、約２．５〜４．５のｐＨの溶出緩衝液を使って、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。
【０１６３】
Ｂ細胞受容体複合体のｍＩｇＭに対する抗体
本発明は、Ｂ細胞受容体複合体（ＢＣＲＣ）の膜結合ＩｇＭ（ｍＩｇＭ）成分を特異的に標的とする抗体に関する。大部分のＢ細胞リンパ腫および白血病はそれらの細胞表面上にｍＩｇＭを発現しているので、これらの抗体をこの分子の研究およびｍＩｇＭ随伴疾患の診断と処置に使用できる。
【０１６４】
Ｂ細胞受容体複合体は分化、細胞増殖およびアポトーシスを制御する免疫系Ｂ細胞アームの中心的シグナル伝達要素である。この細胞表面分子複合体は、全てのＢ細胞悪性病変中で発現され、恒常的に活性化されている（Ｔｓｕｂａｔａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．２０：６７５−６７８（２０００）；Ｇａｕｌｄ  ＳＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１６４１−１６４２（２００２）；Ｇｉｒｕｒａｊａｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：５７１５−５７１９（２００６））。ＢＣＲＣは、分泌型Ｉｇの膜貫通型（受容体）からなり、ＣＤ７９αβ（シグナル伝達配列）と密接に関連している（Ｒｅｔｈ  Ｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：３８３−３８４（１９８９）；Ｇｏｌｄ  ＭＲ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：３４３６−３４４０（１９９１）；Ｊｕｇｌｏｆｆ  Ｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：１１３９−１１４６（１９９１）；Ｃａｍｂｉｅｒ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ６：３２０７−３２１７（１９９２）；Ｆｌａｓｗｉｎｋｅｌ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：８３−８９（１９９４）；Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ  ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４：１０９５−１１０３（１９９４）；Ｒｏｗｌｅｙ  ＲＢ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１１５９０−１１５９４（１９９５）；Ｋａｂａｋ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２４：１２４９−１２５５（２００４）；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ＨＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５：５５−６５（２００６）；Ｐｏｌｓｏｎ  ＡＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１０：６１６−６２３（２００７）を参照されたい）。小さい細胞外ペプチドセグメント（細胞外近位ドメイン、ＥＣＰＤまたはＰＤ）も、ｍＩｇの膜貫通配列と膜型および分泌型Ｉｇの両方に存在する相同Ｉｇコンセンサス配列との間に存在する（Ｂｅｓｔａｇｎｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１０６８６−１０６９２（２００１）；Ｐｏｇｇｉａｎｅｌｌａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：３５９７−３６０５（２００６））。このＰＤは、それぞれの膜Ｉｇクラスに対しユニークであり、対応する分泌Ｉｇ型には存在しない。さらに、ヒトゲノムデータベースの探索に基づくと、各Ｉｇ膜クラスのＰＤ配列はそこに含まれる全ての配列に対しておよび報告された対応するマウス配列と比べてユニークである。したがって、クラス特異的ＰＤのそれぞれに対する特異的配列のゲノムデータバンク探索により、その対応する膜Ｉｇクラスのみが得られる。遺伝子バンク探索により決定されるように、これらの配列を使うその他の膜タンパク質は特定されなかった。さらに、これらの小さいドメインの進化的誘導を示唆する相同ペプチド配列も見つからなかった。
【０１６５】
循環血液中の大量のＩｇの存在のために、同族体膜結合Ｉｇ（ｍＩｇ）は薬物開発の適切な標的であるとは考えられなかった。本出願は、ＢＣＲＣが、膜貫通疎水性のアミノ酸配列と、コンセンサス分泌Ｉｇ同族体配列との間の細胞外に存在する短ペプチドリンカー、すなわちＰＤを標的にすることにより、循環Ｉｇの干渉なしに標的化され得ることを示した。さらに、ｍＩｇＭ定常ドメイン４（μＣ４）を含むｍＲＮＡスプライスバリアントは新しい重要な特異的エピトープを提供する。これらの知見は、本明細書における抗ＰＤ  ｍＡｂ、すなわち、抗ｍＩｇＭおよび抗ｍＩｇＧ  ＰＤ  ｍＡｂならびにユニークμＣ４エピトープを結合する抗体の生成をもたらした。これらのｍＡｂは、ｍＩｇＭまたはｍＩｇＧクラス特異的ＢＣＲＣを標的とし、それにより、これらの抗体を使用してこれらのＩｇ受容体を精製し、かつ対応する血清型に比較して、ｍＩｇ中に存在する他の新抗原をさらに探索および発見できる。それらのユニークな配列のために、シグナルがＰＤにより媒介される場合、抗ＰＤ  ｍＡｂがｍＩｇからＣＤ７９αβへのシグナル伝達における下流シグナル伝達経路を調節可能であると推測されている。この抗ＰＤ  ｍＡｂを利用する標的化手法の利点は、ＢＣＲＣと関連する下流経路の破壊がＢ細胞中においてのみ調節され、かつ標的化Ｉｇクラス、例えば、ｍＩｇＭを発現する細胞のみに限定されると予測され得ることである。ＰＤ中に含まれる特異的エピトープに加えて、ＩｇＭの定常領域４、μＣ４、内に含まれる隣接するまたは近位の配列は、このドメインの２０個の近位アミノ酸の欠失により、ｓＩｇＭに比べてｍＩｇＭ中で切り詰められている。したがって、ｍＩｇＭ定常領域４、μＣ４、中でｓＩｇＭからｍＩｇＭをさらに識別する、追加の免疫学的に定義された新エピトープを検出することが期待されるであろう。切り詰めは、グリコシル化部位の喪失の原因でもあり；Ｊ−Ｃｈａｉｎ結合が存在せず、この領域はμＣ４ドメインのｍＩｇクラスタリング部位の近位にある（Ｔｏｌａｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０（１）：４４−５５（２００９）を参照されたい）。ｍＩｇＭ定常ドメイン４中の新エピトープに対してｍＡｂを生成することが可能となり、ＢＣＲＣを介するシグナル伝達も調節する１つのこのようなｍＡｂが単離されたことが明らかになった。ｍＩｇＭはＢＣＲＣの受容体成分であるので、細胞内ホスホキナーゼが存在する場合それはＣＤ７９αβに活性化シグナルを伝達するはずである。１つの分子からその他の分子へのシグナル伝達の正確な位置はまだ分かっていない。
【０１６６】
ＢＣＲＣを特異的に調節することを目的として、ｍＩｇ分子をそのＰＤで標的にする特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗ＰＤ  ｍＡｂを生成した。ｍＩｇＭ分子特異的１３マーペプチドＰＤ配列（ＥＧＥＶＳＡＤＥＥＧＦＥＮ）（配列番号１１）およびｍＩｇＧ特異的１８マーペプチドＰＤ配列（ＥＬＱＬＥＥＳＣＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ）（配列番号１２）を検出する多数のペプチド特異的ｍＡｂが生成され、ペプチド特異的結合およびペプチド発現細胞に対する細胞結合を有することが明らかになった。高親和性抗ＰＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を以下に記載する免疫化技術により生成した。ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび走査型免疫電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、これらのモノクローナル抗体が、ｍＩｇＭプロテインＡおよびｍＩｇＭ＋発現細胞株ＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）、ＳＵ−ＤＨＬ−５（ＣＲＬ２９５８）、Ｒａｍｏｓ（ＣＲＬ−１５９６）、Ｎａｍａｌｗａ（ＣＲＬ−１４３２）、ＳＴ４８６（ＣＲＬ−１６４７）、ＭＣ１１６（ＣＲＬ−１６４９）、およびＨＴ（ＣＲＬ−２２６０）に結合することが示された。これらの高親和性抗ＰＤモノクローナル抗体を使って、ｍＩｇＭを免疫アフィニティー精製し、マウスの免疫に使用した。ＥＬＩＳＡ／ウエスタン／ＳＥＭアッセイでＢＣＲＣ上の立体構造エピトープを検出しｓＩｇＭとは反応しない第二世代抗体を収集した。以降で記載のようにＭＴＴ／ＣＡＳＰＡＳＥおよびクローン原性の限界希釈アッセイにより増殖抑制を評価した。ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂおよびｍＡｂ４−２ｂと命名した四種のモノクローナル抗体を、さらなる調査のために選択した。
【０１６７】
これらのｍＩｇＭ  ＰＤ／精製ｍＩｇＭに対する特異的ｍＡｂの生成および評価の過程において、いくつかの問題および課題が生じた：
１．収集した初期のクローンは、抗原標的のユニークな配列にもかかわらず低親和性であった。免疫したＢａｌｂ／ｃマウスのスクリーニングは、血清応答が不良であることを示した。種々のアジュバントを検討したが、測定できるほどの血清試料の力価または親和性の増加は得られなかった。その後、種々の株のマウスを試験し、ＣＤ−１マウスのみが高親和性抗体の生成に適する宿主であることが分かった。
２．標的ポリペプチドは少なくとも、３種の異性体型として存在する。臨床的に適切なｍＡｂ試薬を生成するために、標的ＰＤのすべての異性体型を認識するｍＡｂについてｍＡｂをスクリーニングした。
３．マウス抗体免疫応答の親和性を高めるために、および追加のエピトープの探索を広げるために、細胞抽出物（ｍＡｂ１−１免疫アフィニティカラムから取得）由来の精製ｍＩｇＭ調製物を免疫原中に組み込んだ（ｍＩｇＭ  ＰＤ−ペプチド−ＭＡＰ免疫原との同時投与により）。
４．抗体ｍＡｂ１は、ｍＩｇＭ−ＰＤペプチド−ＭＡＰ免疫原のみを含む融合体から得て、一方、全ての他の抗体（ｍＡｂ２、ｍＡｂ３およびｍＡｂ４）は、ｍＩｇＭ−ＰＤペプチド−ＭＡＰ免疫原に加えて精製ｍＩｇＭを使って生成した。これらのｍＡｂが異なる免疫原を使った融合体由来であることを示すために、接尾辞１をｍＡｂ１に加え（ｍＡｂ１−１）、その他の抗体に接尾辞２を加えた（ｍＡｂ２−２、ｍＡｂ３−２およびｍＡｂ２−４）。さらに、抗体ｍＡｂ２、ｍＡｂ３およびｍＡｂ４の生成に使用した精製ｍＩｇＭは、細胞株ｂ（ＣＡ４６、ＣＲＬ１６４８）抽出物から得られるので、接尾辞２に文字ｂを付加した（ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂおよびｍＡｂ４−２ｂ）。
５．精製ｍＩｇＭによる免疫中に、血清ＩｇＭ上では検出されないｍＩｇＭの第４定常領域を共有するエピトープに対してｍＡｂが生成された。これは、血清ＩｇＭ  ｍＲＮＡスプライスバリアントに比較して、膜ＩｇＭ中の遠位の２０アミノ酸の末端欠失に起因して生成された新抗原の結果である。ｍＡｂ４−２ｂは、ｍＩｇＭの第４定常領域中の構造変化がＩｇＭドメインμＣ４中でユニークな高次構造エピトープを誘導したことを立証する。
【０１６８】
次の調査は、ｍＡｂ特異性を明らかにし生物活性の不可欠な側面を調査するために必要とされ、本出願において以降で次の順番で提示される：
１．ハイブリドーマパネルの生成と選択
２．生存標的細胞および細胞抽出物に対する特異性の調査（表４）
３．標的ペプチド、異性体および細胞抽出物に対する特異性の調査（表５、６）
４．免疫アフィニティーｍＩｇＭまたはＰｅｒｆｅｃｔ−ＦＯＣＵＳ（商標）抽出物に対する直接結合の抑制の分子特異性調査（表７、８）
５．競合的ｍＡｂ結合および６マー抑制による分子エピトープマッピング（表９、１０）
６．走査電子顕微鏡結合調査（表１１〜１８、図１〜５）
７．ｍＡｂ結合媒介ＢＣＲＣ内部移行（表１９、図２）
８．ｍＡｂ４−２ｂ媒介増殖抑制、抗クローン原性活性およびアポトーシス（表２０〜２４および図６〜７）
【０１６９】
本出願で後程示すように、細胞表面結合アッセイは、一連のｍＩｇＭ＋対ｍＩｇＭ−（ｍＩｇＧ＋）生細胞／固定細胞または抽出物に対する試験により、これらのモノクローナル抗体の特異性を実証した。さらに、正常なまたはワルデンシュトレームマクログロブリン血症血清は、ｍＩｇＭ＋細胞に対するｍＡｂ結合をブロックするまたは減少させることができなかった。この結果は、ＳＥＭでも確認された。これらの２つの調査は、インビボでＢ細胞を特異的に標的とする能力が達成されたことを明確に実証している。
【０１７０】
３７℃で、抗ＰＤモノクローナル抗体（ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂ）はｍＩｇＭ（ＢＣＲＣ）を３０分までに内部移行させたが、細胞増殖抑制を調節しなかった。第二世代ｍＡｂ４−２ｂもｍＩｇＭ（ＢＣＲＣ）の内部移行を媒介したが、加えて、低密度培養において、細胞増殖抑制、抗クローン原性活性およびアポトーシスが観察された。アポトーシスは、高および低ｍＩｇＭ／ＣＤ７９αβ発現細胞を含む種々の悪性細胞株で認められた。
【０１７１】
（１）ｍＩｇＭ発現細胞に特異的に結合する抗体および（２）ヒト血清ＩｇＭと反応せず、免疫アフィニティー精製ｍＩｇＭに対し十分高い結合力を有する抗体は、これまで報告されていない。市販のｍＩｇＭ調製物は低品質である。本発明は、これらのＢ細胞の細胞質中で血清または分泌Ｉｇの存在にかかわらずｍＩｇＭ精製できるこのような抗体を提供する。
【０１７２】
以下に提示されるデータは、細胞増殖抑制アッセイにより明らかなように、ＢＣＲＣ内部移行がＢＣＲＣシグナル伝達カスケードを阻止するには不十分であったことを示している。細胞表面上に検出可能な残余ｍＩｇＭおよびＣＤ７９αβを欠いているにもかかわらず、増殖抑制は観察されなかった。これらのデータは、ｍＩｇＭからＣＤ７９αβへのシグナル伝達はＰＤペプチド配列を介して媒介されず、内部移行されたＢＣＲＣはその内部移行された区画内でリン酸化ＣＤ７９αβを提示し続けることを強く示唆する。ｍＡｂ４−２ｂのｍＩｇＭの非リガンド結合部位への結合時に、ｍＡｂ４−２ｂはＢＣＲＣ内部移行および別の異なるイベントにおいて、増殖抑制とアポトーシスの両方を誘導した。競合的ｍＡｂ調査により、アポトーシス媒介立体構造エピトープは共有されているように見えるが、主に直鎖ＰＤ配列の外側に存在している。ｍＡｂ４−２ｂは、直鎖ｍＩｇＭ−ＰＤペプチドに比べて、精製ｍＩｇＭに対し強化された結合を示し、その結合は、可溶性ＰＤ６マーにより実質的に遮断されないので、ｍＡｂ４−２ｂ標的エピトープは立体構造的であるか、もしくは定常領域４がその結合に影響しているか、またはそのエピトープが定常領域４に主に存在しているかである。実験結果は、薬剤／放射性同位元素標的化ビークルとして、またはＢＣＲＣシグナル伝達経路の抑制のメディエーターとしてのこれらのモノクローナル抗体の使用を支持する。これらの薬剤は非ｍＩｇＭ  Ｂ細胞に結合せず、高レベルの特異性を有するために、正常なリンパ球および非リンパ組織は、この薬剤の毒性を免れることができる。
【０１７３】
実施例１
抗ＥＣＰＤハイブリドーマパネルの生成
標的ペプチドと反応性のモノクローナル抗体を単離するために、ＩｇＭ−ＥＧＥＶＳＡＤＥＥＧＦＥＮ（配列番号１１）およびＩｇＧ−ＥＬＱＬＥＥＳＣＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号１２）、免疫原を有するこれらのペプチドを生成（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））または購入した（多抗原ペプチド（ＭＡＰ（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）およびＫＬＨペプチド（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ））。ＧＳＴ、ＭＡＰおよびＫＬＨ構築物を免疫原性キャリアタンパク質として使用し、複数組のマウスを標的ペプチド保持タンパク質の１つまたは組み合わせで免疫した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを宿主として使用した最初の実験で、これらのペプチドは市販のアジュバント調製物を加えても免疫原性がないことがすぐに明らかになった。低免疫原性は、前に行った抗ｍＩｇＭおよびｍＩｇＧ  ＰＤ  ｍＡｂ作製の試みと一致するが、対照的に、ｍＩｇＥを作製する試みにより、いくつかの機能上異なるタイプが得られた（Ｐｏｇｇｉａｎｅｌｌａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：３５９７−３６０５（２００６）；Ｆｅｉｃｈｔｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０：５４９９−５５０５（２００８））。Ｂａｌｂ／ｃマウスから生成された１１個のモノクローナル抗体の第一のパネルは、反応性が弱すぎて臨床的価値がないと思われた。
【０１７４】
試験した全てのマウス株（Ｂａｌｂ／ｃ自己免疫性マウス株など）の中で、ＣＤ−１のみがこれらの免疫原に対し大きな免疫応答が可能であると見出された。対照不含ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）もインビトロアッセイ用として入手した。さらに、ｍＩｇＭおよびｍＩｇＧ画分をＰｅｒｆｅｃｔ−ＦＯＣＵＳ（商標）−膜タンパク質抽出技術（Ｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）により集めて、これにより、ヒト細胞株、ＭＣ１１６（ＣＲＬ１６４９）（未分化リンパ腫発現ｍＩｇＭ）、ＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）（バーキットリンパ腫発現ｍＩｇＭ）、ＳＴ４８６（ＣＲＬ１６４７）（バーキットリンパ腫／ＣＬＬ様細胞株発現ｍＩｇＭ）、ＨＴ（ＣＲＬ２２６０）（びまん性混合型Ｂ細胞リンパ腫ｍＩｇＭ）またはＤＢ（ＣＲＬ２２８９）（大細胞型Ｂ細胞型リンパ腫発現ｍＩｇＧ）由来の、初期ＥＬＩＳＡ調査に好適な富化ｍＩｇＭまたはｍＩｇＧ調製物を得た。これらの膜ＩｇＭまたはＩｇＧ富化画分を使って複数組のＣＤ１マウスを免役して、第二世代モノクローナル抗体ｍＡｂ４−２ｂを生成した。種々のアジュバントを使って、免疫前および後の血清を集めて、１：１００に希釈し、ペプチド特異的活性をＥＬＩＳＡで試験した。
【０１７５】
新しい免疫化方法を開発した。追加免疫用に高度精製標的タンパク質を用いならびにＣＤ１マウスおよび新アジュバントを使って可能な立体構造エピトープを捕捉するために、ペプチドをμＣ４ドメイン４領域に伸長した（「伸長ペプチド」１８マー）結果、免疫化後血清力価＞１：１０，０００を有する６匹のマウスを得た。これらのマウスを標準的な技術を使いハイブリドーマ生成用として選択した。ＥＬＩＳＡで、ペプチド／伸長ペプチドおよびｍＩｇＭの膜抽出画分への結合に活性であった４個のクローンを単離し、２個のクローンはｍＩｇＧ特異的であった。２つのＰＤに特異的なプライマーを用いるＲＴ  ＰＣＲにより、ｍＩｇＭ／ｍＩｇＧ分子は、ＣＲＬ１６４７またはＣＲＬ２２８９によりそれぞれ発現されることが分かり、ウェスタンブロット分析により細胞膜画分中に存在することが示された。さらなる選別目的のために、構築物（ＧＳＴ、ＭＡＰおよびＫＬＰ＋／−ペプチドまたは伸長ペプチド）をＰＤペプチドｍＩｇＭまたはｍＩｇＧ用に、およびｍＩｇＥとペプチドｍＩｇＡの共通の重複配列などの対照ペプチド用に集めた。ｍＩｇＤペプチドを、全Ｂ細胞抽出物がこのペプチドも含むので、ここでの分析で使用した。特定の免疫原の組み合わせを用い、および膜抽出物画分で追加免疫をした免疫のみが、良好な反応性を有するクローンをもたらした；ＰＤ−ＫＬＨペプチド免疫のみで融合体１１７由来のハイブリドーマ細胞株により産生された１個のＩｇＧ２ｂクローン（ｍＡｂ１−１）、融合体１１８由来のハイブリドーマ細胞株により産生された２個のＩｇＧ２ｂクローン（ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂ）、ならびに融合体１１９由来のハイブリドーマ細胞株により産生された１個のＩｇＧ１クローン（ｍＡｂ４−２ｂ）。
【０１７６】
ハイブリドーマ上清の初期選別は、適切なＰＤペプチドｍＩｇＭまたはｍＩｇＧを有するＫＬＨとの反応性、遊離ＫＬＨとの非反応性、正常なヒト血清、精製されたＩｇＭ調製物ならびにＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡ用のペプチドを有するＫＬＨを必要とした。ＣＲＬ１６４７−ｍＩｇＭおよびＣＲＬ２２８９−ｍＩｇＧの細胞抽出物を試験するために、特異的「マウスＩｇ吸着」ヤギ抗ヒトＩｇＭＦｃまたはヤギ抗ＩｇＧＦｃ抗血清キャプチャー抗体を固相プラスチックに付着させた。ＣＲＬ１６４７またはＣＲＬ２２８９のＮＰ−４０ライセートまたはヒト血清または対照乳癌細胞ライセートＢＴ−４７４をウエルに結合させた。ＣＲＬ１６４７ライセートがヒトｍＩｇＭをもたらし、ＣＲＬ２２８９がヒトｍＩｇＧをもたらしてキャプチャー抗体に結合させ、その後、ウエルを３回洗浄した。次に、ハイブリドーマ上清を加え、ここで、「特異的」モノクローナル抗体が捕捉されたヒトｍＩｇＭまたはｍＩｇＧに結合し、これはプラスチックに結合した捕捉された抗ヒトＩｇＭＦｃまたはＩｇＧＦｃにより結合されており、ヤギ抗ヒト−ＩｇＭＦｃ−ｍＩｇＭ−ｍＡｂ複合体またはヤギ抗ヒト−ＩｇＧＦｃ−ｍＩｇＧ−ｍＡｂ複合体を形成する。その後、マウスｍＡｂをＨＲＰ標識した特異的ヤギ抗マウスＩｇ（ヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＧで予備吸着させた）で検出した。その他の陽性細胞抽出物、例えば、Ｎａｍａｌｗａ（ＣＲＬ１４３２）およびＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）は、類似の結果を与えた。
【０１７７】
パネルに収集したモノクローナル抗体は、ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂ、ｍＡｂ４−２ｂ、およびｍＡｂ１１−１と命名されたモノクローナル抗体を含んだ。モノクローナル抗体ｍＡｂ１−１はＩｇＧ２ｂアイソタイプである。モノクローナル抗体ｍＡｂ１−１を、融合体１１７由来のハイブリドーマ細胞株により作製した。モノクローナル抗体ｍＡｂ２−２ｂおよびｍＡｂ３−２ｂは、ＩｇＧ２ｂアイソタイプであり、ｍＡｂ４−２ｂはＩｇＧ１アイソタイプである。クラススイッチ変異体を発生させてＩｇＧ１アイソタイプを得て、特定の実験のために、標的細胞上および細胞抽出物中の両方に存在する非特異的細胞Ｆｃ受容体結合を減らした。モノクローナル抗体ｍＡｂ２−２ｂおよびｍＡｂ３−２ｂを融合体１１８由来のハイブリドーマ細胞株により作製し、ｍＡｂ４−２ｂを融合体１１９由来のハイブリドーマ細胞株により作製した。モノクローナル抗体ｍＡｂ１１−１はＩｇＧ１アイソタイプである。モノクローナル抗体ｍＡｂ１１−１を融合体２００由来のハイブリドーマ細胞株により作製し、これはｍＩｇＧと反応性である。第２の抗ｍＩｇＧ  ｍＡｂも同様に収集したが、本明細書で記載の実験には使用しなかった。
【０１７８】
ヒトＢ細胞株ＳＫ００７（ｍＩｇＭなしにｍＩｇＥを発現しているヒトＢ細胞株）のＨＰ−４０溶解によりＳＫ００７細胞から抽出したヒトｍＩｇＥを使って、反応性の特異性をさらに確認し、特異的ヤギ抗ヒトＩｇＥキャプチャー抗体を使ってＥＬＩＳＡで試験した。まとめると、これらのアッセイは、ＥＬＩＳＡにおいて、モノクローナル抗体パネルが、免疫原に含まれる合成ペプチド配列と、ＮＰ−４０溶解およびＰｅｒｆｅｃｔ−ＦＯＣＵＳ（商標）画分から得られるヒトｍＩｇＭまたはｍＩｇＧ天然タンパク質ペプチド配列との両方を識別することを示した。それらが膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインと反応しなかったことをチェックするために、ｍＩｇＭ発現ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）細胞を予備吸着させた蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇを用いる生存細胞の蛍光顕微鏡（ＦＭ）を使って生存ＣＬＬ細胞に結合したｍＡｂを検出した。結果は、ｍＡｂ特異的であるが、予測通り弱い細胞膜染色で、また、抗軽鎖活性に類似であり、低レベルのｍＩｇＭ細胞表面発現を示す。一般に、ＣＬＬ細胞はほとんどのＢ細胞リンパ腫に比べて少量のＢＣＲＣを発現する。通常、臨床では、ｍＩｇＭの軽鎖のカッパまたはラムダとしての型判定により、ＣＬＬ細胞はモノクローナル集団であると決定され、したがって、悪性であると決定される。しかし、４個全てのクローンは、試験した全てのｍＩｇＭ＋細胞株でそれらが強く陽性であったので、赤血球吸着アッセイにおいてインタクト生存細胞に適切に結合したように見えた。
【０１７９】
さらに、これらのモノクローナル抗体の存在下で培養したＣＬＬ細胞は、フローサイトメトリーの側方散乱プロットにより、対照またはポリクローナル抗ＩｇＭに比べて増大した複雑さを示し、新規細胞効果の可能性を示唆する。
【０１８０】
この初期選別方法の結果として、パネルのクローンは次の特徴を有した：次記に関してＥＬＩＳＡで陽性であった：（１）ＫＬＨペプチド／伸長ペプチド（ｍＩｇＭ）および（２）キャプチャー抗ヒトＩｇＭＦｃを使った、陽性発現細胞株ＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）およびＮａｍａｌｗａ（ＣＲＬ１４３２）のＮＰ−４０ライセートとの反応性。クローンは次記とのＥＬＩＳＡにおいて全て陰性であった：（１）ＫＬＨ単独、（２）無関係のペプチドを含むＫＬＨ、（３）キャプチャー抗ヒトＩｇＭＦｃを用いる乳癌細胞株ＢＴ−４７４  ＮＰ−４０ライセート、（４）キャプチャー抗ヒトＩｇＭＦｃを用いるヒト血清、（５）キャプチャー抗ヒトＩｇＭＦｃを用いるヒトワルデンストレームマクログロブリン血症血清、および（６）対照としてのＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞株およびＨ２．８（ＣＲＬ２５６８）マウス骨髄腫細胞株のライセート（ＨＲＰ標識ｍＡｂ）。しかし、ＥＬＩＳＡによる膜抽出物ＣＡ４６（Ｐｅｒｆｅｃｔ−ＦＯＣＵＳ（商標）、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に対する反応性の試験およびＣＡ４６  ＮＰ−４０ライセートのウェスタンブロット分析は、トリトン（商標）Ｘ−１００による抽出および／またはＳＤＳへの暴露後に、クローン間でエピトープを認識または結合するそれらの能力の差異を示した。このことは、小さいペプチド標的１３マーまたは伸長された１８マーであっても、ペプチド立体構造の変化はｍＡｂ結合にとって重要であることを示唆した。例えば、ウェスタンブロットでｍＩｇＭバンドを検出した、ＥＬＩＳＡでＫＬＨペプチドまたはＰｅｒｆｅｃｔ−ＦＯＣＵＳ（商標）に対し陽性であった、およびトリトン（商標）Ｘ１００  ＥＬＩＳＡで反応性であったクローンが存在したという事実は、これらのクローンのサブセットが界面活性剤中に保存されるエピトープを認識したことを示唆する。さらに、ウェスタンブロットは複雑であり、ｍＩｇＭおよびＣＤ７９αβの複合体に関連する複数の分子量バンドへの結合を示す。
【０１８１】
ｍＩｇＭは低レベルで発現されるので、フローサイトメトリーは、陰性であることを実証する信頼性の高い方法ではないと思われ、したがって、走査電子顕微鏡観察を行った。いくつかの事例では放射標識がモノクローナル抗体の親和性を低下させたので（Ｃｅｓａｎｏ  Ａ，Ｇａｙｋｏ  Ｕ，Ｓｅｍ  Ｏｎｃｏｌ  ３０：２５３−２５７（２００３））、結合およびエピトープマッピングを直接標識抗体で（ＨＲＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）および抑制を小さい６マーペプチドまたは伸長ｍＩｇＭ  ＰＤペプチドで行った。
【０１８２】
モノクローナル抗体ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂおよびｍＡｂ４−２ｂを産生するハイブリドーマ細胞株を２０１４年１１月１２日に、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関パテントデポジトリー（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託した。この寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下で行われた。ｍＡｂ１−１と命名されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１９を与えられた。ｍＡｂ２−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１７を与えられた。ｍＡｂ３−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１８を与えられた。ｍＡｂ４−２ｂと命名されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２１７１６を与えられた。
【０１８３】
実施例２
抗体精製
ｐＨ８．６のトリス溶液中のそれぞれのハイブリドーマ株由来の上清を適用するプロテインＡセファロースカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、抗体精製を行った。さらなる洗浄をｐＨ７．０のＰＢＳで行った後、ｐＨ４．０でｍＩｇＭを溶出した。無菌濾過したモノクローナル抗体を、アジド含有／不含の無菌ＰＢＳ中に５００マイクログラム／ｍｌで４℃にて貯蔵した。ＡＤＣＣ、補体溶解、増殖抑制アッセイおよび生物学的アッセイ用の抗体調製物は、１０００マイクログラム／ｍｌにてアジド不含ＰＢＳ中で無菌濾過した。
【０１８４】
実施例３
ｍＩｇＭの抗体免疫アフィニティー精製
ｍＡｂ１−１、またはｍＡｂ２−２ｂおよびｍＡｂ３−２ｂを含むｍＡｂ１−１共有結合免疫アフィニティービーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使い、ＣＲＬ−１６４８  ＮＰ−４０抽出物を適用し、その後ビーズをｐＨ８．６のトリス溶液で洗浄して、ｍＩｇＭの抗体精製を行った。さらなる洗浄をｐＨ７．０のＰＢＳで行った後、ｐＨ４．０でｍＩｇＭを溶出した。無菌濾過したｍＩｇＭバッチを、アジド含有／不含の無菌ＰＢＳ中に５００マイクログラム／ｍｌで４℃にて貯蔵した。
【０１８５】
実施例４
特異性分析
抗体の上皮細胞株バンクに対するパネルの赤血球吸着試験を行い、非特異的交差反応性を有するクローンを除去した（Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５８：３８５−３９２（１９９４）；Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１２９５７−  １２９６１（１９９４）；Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ９：４６５−４７１（１９９６）；Ｒａｄｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５；１３６６８−１３６７６（２０００））。真の陰性細胞を確定するために、これらの上皮細胞株のサブセットをＰＤ配列に対するＲＴ−ＰＣＲで試験したが、しかし、これまでｍＩｇＭがＢ細胞系列のもの以外の悪性細胞により発現されるという報告はなく、本明細書での調査は、パネル中のいずれの細胞株においてもこれらの配列を示さなかった。ＰＤ１３マーｍＩｇＭおよび１８マーｍＩｇＧに対する黒色腫および肉腫のパネルのＲＴ−ＰＣＲによりこの観察は拡大され、これらの非Ｂ細胞系列細胞においてこのペプチドの発現を示すシグナルは認められなかった。したがって、いずれの結合も交差反応性を示し、ＢＣＲＣ抗原検出を示さないであろう。抗体の腫瘍細胞の細胞表面への結合は、抗マウスＩｇ抗体またはプロテインＡでコートされた赤血球の吸着により顕微鏡的に検出された。力価は、最大ロゼッティングを与える試薬の最大希釈として定義される（Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５８：３８５−３９２（１９９４）；Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１２９５７−１２９６１（１９９４）；Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ９：４６５−４７１（１９９６）；Ｒａｄｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１３６６８−１３６７６（２０００））。出願人および共同研究者により以前に開発された、ｍＡｂ  Ａ３３、ｍＡｂ  ３Ｓ１９３、ｍＡｂ  Ｇ２５０およびｍＡｂ  Ｆ１９を含む抗体パネル中に、陽性対照抗体を含めた（Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５８：３８５−３９２（１９９４）；Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１２９５７−１２９６１（１９９４）；Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ９：４６５−４７１（１９９６）；Ｒａｄｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１３６６８−１３６７６（２０００））。ヒト上皮細胞株のパネル：乳癌（９）、肺癌（９）、結腸癌（１２）、腎臓癌（６）、前立腺癌（３）、卵巣癌（３）、黒色腫（６）および肉腫（２）に対する結合アッセイにおける、モノクローナル抗体ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂおよびｍＡｂ４−２ｂの広範囲にわたる選別は、全て陰性であった。
【０１８６】
ＣＲＬ１６４７は真の陽性で、弱いプラスチック粘着性であったが、ポリＬ−リシンによるプレートのプレコーティングによりより高い粘着性が得られた。非粘着性標的細胞に対しては、スライド・ガラス上で細胞を顕微鏡的に検査することによりロゼッティングを評価した。
【０１８７】
実施例５
生存細胞株とのｍＡｂの特異的反応性およびＮＰ−４０ライセートアッセイ
プロテインＧコートｈｕＲＢＣを用いる赤血球吸着アッセイ（ＨＡ）では、位相差顕微鏡（１００ｘ）を使って、陰性（ｎｅｇ）、＋、＋＋、または＋＋＋としてスコア化した。細胞株パネルは、（１）ｍＩｇＭラムダ、ＣＲＬ１４３２、ＣＲＬ１５９６、ＣＲＬ１６４９、ＣＲＬ３００６、ＣＲＬ２９５８、（２）ｍＩｇＭカッパ、ＣＲＬ１６４７、ＣＲＬ１６４８、ＣＲＬ２２６０、（３）ｍＩｇＧラムダ２２８９、（４）ｍＩｇＧ、ＣＲＬ２６３２、および（５）ＳＫ００７から構成した。上皮癌および黒色腫細胞株を、アイソタイプ対応対照ｍＡｂとの反応性のために選択した。マウスＩｇ予備吸着キャプチャーヤギ抗ヒトＩｇＭ定常領域血清を使ってＣＬのＥＳＡ（細胞ライセートのＥＬＩＳＡサンドイッチ法）を行い、ヒトＩｇ予備吸着ヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰで検出した。留意すべきは、全てのリンパ腫株は、血清ＩｇＭと類似の細胞質ＩｇＭを有することである。したがって、このアッセイは、ｍＩｇＭと血清または細胞質ＩｇＭとの間の反応性を区別するｍＡｂの特異性を確認または評価しない。下表４に結果を示す。
【表４】
0006535668.tif 000005
【０１８８】
統計分析：スチューデントのｔ検定を使ってＥＬＩＳＡの示されたデータポイントの統計的妥当性を評価した。全データポイントは、それぞれ３つの実験が行われた１２ウエルから構成され、代表的な平均値が示される。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、およびｍＡｂ４は、全ての＋＋＋または＋＋に関し、それらのそれぞれの対照に比べて、ｐ＜０．５を超えることが示された。太字の値は統計的に有意である。
【０１８９】
細胞株：陽性細胞株をＡＴＣＣから取得することにより確認し、各アッセイの最初の５行に示した。これらは、次のように識別される：ｍＩｇＭカッパ＝ＣＲＬ１６４７、ＣＲＬ１６４８、ＣＲＬ２２６０；ｍＩｇＭラムダ＝ＣＲＬ１４３２、ＣＲＬ１５９６、ＣＲＬ１６４９、ＣＲＬ２９５８；ｍＩｇＧカッパ＝ＣＲＬ２６３２；ｍＩｇＧラムダ＝ＣＲＬ２２８９；ｍＩｇＥ＝ＳＫ００７。結腸癌、乳癌、肺癌および黒色腫細胞株をＡＴＣＣから入手し、血清学的に試験し、それらの同一性を確認した。結腸癌、乳癌、肺癌および黒色腫細胞株のこの非リンパ系癌細胞パネルは次の細胞株から構成される：
（１）結腸癌：Ｔ８４、ＳＷ１２２２、Ｃｏｌｏ  ２０５、Ｌｉｍ  １２１５、ＨＴ−２９、ＤＬＤ−１、ＳＷ１１１６、ＳＷ  ６２０、ＳＷ  ４８０、ＬｏＶｏ、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６
（２）乳癌：ＢＴ  ４７４、ＳＫ  ＢＲ７、ＣａＭａ−１、ＢＴ−２０、ＭＣＦ−７、ＳＫ  Ｂｒ−３、ＭＤＡ−ＭＢ４５３、ＭＤＡ−  ＭＢ４３６、ＭＤＡ−ＭＢ４６８
（３）肺癌：Ｈ６４、ＳＷ１２７１、ＤＭＳ７８、ＳＫ−ＬＵ−９、ＮＣＩ  Ｈ５９６、Ａ５４９、ＮＣＩ  Ｈ１１０５、ＮＣＩ  Ｈ６９、ＤＭＳ５３。
（４）黒色腫：ＳＫ  ＭＥＬ−２９、ＭｅＷｏ
【０１９０】
実施例６
相対的結合調査
上述のようにＥＬＩＳＡを使って、精製モノクローナル抗体ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂ、ｍＡｂ４−２ｂ、およびｍＡｂ１１−１を１：４に系列希釈した後、添加して、キャプチャー抗ヒトＩｇＭにより結合されるヒトｍＩｇＭに結合させた。その後、結合されたマウスｍＡｂをＨＲＰ標識特異的ヤギ抗マウスＩｇ試薬で検出した。同じアイソタイプのモノクローナル抗体は相互に比較することが可能である。下表５〜８で特定された他の陽性標的を使って類似のアッセイを行った。
【０１９１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
【表５】
0006535668.tif 000006
【表６】
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【０１９２】
統計分析：スチューデントのｔ検定を使って示されたデータポイントの統計的妥当性を評価した。全データポイントは、それぞれ３つの実験が行われた１２ウエルから構成され、代表的な平均値が示される。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、およびｍＡｂ４のデータは、行１、３、５、７、８、９および１０に関し、それらのそれぞれの対照に比べて、ｐ＜０．５を超えることが示された。太字の値は統計的に有意である。略語：ＰＤ、近位ドメイン；ｍＩｇＭ、膜結合ＩｇＭ；ＫＬＨ、スカシ貝ヘモシアニン；ＭＡＰ、多抗原ペプチド（ＰＤの）；Ｐ−Ｆｏｃｕｓ（商標）、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＦＯＣＵＳ（商標）細胞抽出物；ＩＡ、免疫アフィニティカラム（ｍＡｂ１）。
【表７】
0006535668.tif 000008
【表８】
0006535668.tif 000009
【０１９３】
Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＦＯＣＵＳ（商標）標的細胞抽出物に対するｍＡｂ結合の、血清、血漿およびＣＬＬ細胞による抑制は、標的抗原に対するｍＡｂ結合をブロッキングできる血液中の特異的抗原を欠いていることを示したが、対照的に、ＣＬＬ細胞はｍＡｂを吸着し、それにより標的に対するｍＡｂ結合を低下させた。
【０１９４】
統計分析：スチューデントのｔ検定を使って示されたデータポイントの統計的妥当性を評価した。全データポイントは、それぞれ３つの実験が行われた１２ウエルから構成され、代表的な平均値が０〜＋＋＋のスコアとして示される。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、およびｍＡｂ４のデータは、ＣＬＬ細胞による予備吸着の場合以外は、結合の大きな低下を示さなかった。これらの結果は、最下段に示すポリクローナル抗ヒトＩｇＭとは大きく異なり、正常血清、正常血漿、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症血清およびリンパ腫、乳癌または結腸癌血清に関しｐ＜０．５を超えた。示したスコアリング：＋＋＋＝統計的な結合の低下なし、＋＋＝ｐ＞０．０５低下、＋＝ｐ＞０．０１低下および０＝バックグラウンドに対し検出可能な結合なし。試験した血清は、４．２グラム／デシリットルのＩｇＭを含むワルデンシュトレームマクログロブリン血症血清（Ｗ−Ｍｓ）、２２ｍｇ／デシリットルのＩｇＭを含むＣＬＬ血清、びまん性大細胞性Ｂ細胞リンパ腫ＡＢＣ型（ＤＬＢＣＬ）無痛性非ホジキンリンパ腫（ｉＮＨＬ）を含んだ。
【０１９５】
実施例７
ペプチド抑制による結合調査およびエピトープマッピング
最初の放射標識調査では、ＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体は、放射免疫反応性アッセイにより良好に標識されなかった（Ｂａｒｅｎｄｓｗａａｒｄ  ＥＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １２：４５−５３（１９９８）；Ｂａｒｅｎｄｓｗａａｒｄ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４２：１２５１−１２５６（２００１）；スキャッチャードプロット  ｗｗｗ．ｃｕｒｖｅｆｉｔ．ｃｏｍ／ｓｃａｔｃｈａｒｄ＿ｐｌｏｔｓ．ｈｔｍ＃ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ＿ｄａｔａ＿ｔｏ＿ｃｒｅａｔｅ＿ａ＿ｓｃａｔｃｈａｒｄ）。固相ラベリング技術でＨＲＰ用タンパク質ラベリングキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使った。標識抗体結合をブロックする過剰の非標識抗体を使って、次の群のクローンに分類した：１．標識抗体をブロックするもの（同じエピトープ）、２．エピトープをブロックしないもの（異なるエピトープ）および３．部分的にブロックするもの（近いエピトープまたは弱い結合剤）。全てのクローンのエピトープが分類されるまでこのプロセスを繰り返した。抑制アッセイにより追加の情報が得られ、ｍＡｂは６マーによりブロックされ、このデータは確証された。結合調査の結果は、下表９および１０に示す。
【表９】
0006535668.tif 000010
【０１９６】
統計分析：スチューデントのｔ検定を使って示されたデータの統計的妥当性を評価した。全データポイントは、それぞれ３つの実験が行われた１２ウエルから構成され、代表的な平均値が示される。統計的有意性比較は、ｍＩｇＭ−ＰＤ、ＫＬＨ−ｍＩｇＭ−ＰＤおよびｐ−Ｆｏｃｕｓ＋ＩＡをそれぞれ、非標識ｍＡｂで予備ブロックされたｍＡｂ−ＨＲＰの反応性試験に含んだ（例えば、ｍＡｂ１−１−ＨＲＰは非標識ｍＡｂ１−１によりブロックされ、それぞれのＨＲＰ標識したｍＡｂについてそのパートナーｍＡｂによる類似の結果を太字で示した）。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、およびｍＡｂ４のデータポイントは、それぞれ自己ブロッキング対非ブロッキングについてｐ＜０．５を超えることが示された（データは示さず）。さらなる試験は、ｍＡｂ１はｍＡｂ２、ｍＡｂ３またはｍＡｂ４をブロックしなかった；ｍＡｂ２はｍＡｂ１およびｍＡｂ４をブロックしなかった；しかし、ｍＡｂ３は、ｍＡｂ１およびｍＡｂ４に比べて、結合を部分的に低下させたこと、を示した。これらの結果は、ｍＡｂ２の部分的なブロッキングを示すｍＡｂ３の分析と類似であった。ｍＡｂ４の分析は、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ４のブロッキングの欠如を示した。結論：ｍＩｇＭ−ＰＤ、ＫＬＨ−ｍＩｇＭ−ＰＤおよびＰ−Ｆｏｃｕｓ＋ＩＡ標的に対し、ｍＡｂ１およびｍＡｂ４はそれぞれ異なるエピトープを検出したが、一方、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３は別に分類された、部分的に共有されているエピトープを検出した。ｍＡｂ４は、その他のｍＡｂに比べて、精製ｍＩｇＭ（Ｐ−Ｆｏｃｕｓ＋ＩＡ）に対し相対的に改善された結合を示した。
【表１０】
0006535668.tif 000011
【０１９７】
６マーＡペプチド＝ＥＧＥＶＳＡ（配列番号１６）および６マーペプチドＢ＝ＥＥＧＦＥＮ（配列番号１７）を、ｍＡｂ−ＨＲＰに比べてモル過剰Ｘ１００で使用した。統計分析は、ｍＡｂ４が、ＡまたはＢ６マーによりブロックされない、異なるエピトープを検出したことを示した。ｍＡｂ１はＢによりブロックされないが、ｍＡｂ１はＡにより強くブロックされ、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３はＡとＢの両方により部分的にブロックされた。ペプチド抑制アッセイにおける制約要因は、小さいペプチド断片の疎水性の特性を含んだ。
【０１９８】
これらの調査は、１１マーに比べて、ｍＡｂ４−２ｂは伸長ペプチドに対する強化された結合を有したが、どちらの６マーもそれを完全にはブロックしなかったことを示す。これらのデータは、そのエピトープは、ＥＣＰＤおよび末端ミュードメイン４にまたがり、かつそのエピトープは立体構造的であり、したがって、小さい直鎖ペプチドによって完全には抑制されないことを示唆する。留意すべきは、抗体、ｍＡｂ４−２ｂは、赤血球吸着アッセイおよびＦＭにおいて最強であった。
【０１９９】
ＨＲＰ標識実験で常にある程度の部分的なブロッキングが存在したという事実にも関わらず、その他の３つのｍＡｂ、すなわち、ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂおよびｍＡｂ３−２ｂは２つのエピトープに分割され、ＥＤＰＤ内で１つは近位、１つは遠位である。３つの異なるエピトープに対する結合は分類可能であるが、オーバーラップ（部分ブロッキング）が存在する。ペプチド抑制により測定して延長されたＥＣＰＤ内のエピトープをそれぞれ検出する、この最終パネルの４つのｍＡｂの最高の結合力および限定的特異性を有するエピトープ特異的クローンを、３つのモノクローナル抗体の「エピトープパネル」に集めた。
【０２００】
実施例８
走査型免疫電子顕微鏡による結合調査
細胞株ＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）は、フローサイトメトリー分析による「ＤＩＭ」軽鎖反応性に基づくと、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞に類似の、比較的低いｍＩｇＭ発現を有するＢ細胞株であり、走査型免疫電子顕微鏡（ＳＥＭ）によるモノクローナル抗体の結合を調査するために使用された。ＳＥＭ結果を下表１１〜１８に示す。図１Ａの顕微鏡写真は、対照−ＩｇＧ２ｂアイソタイプ対応対照抗体＋２次ヤギ抗マウスＩｇ−ｇｏｌｄを示す。図１Ｂおよび１Ｃの顕微鏡写真は、写真中でｍＡｂ４と表示される、ＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）の２つの異なる細胞に結合したモノクローナル抗体ｍ−Ａｂ４−２ｂを、図１Ａの対照抗体と同じ倍率で示す。図１Ｄの顕微鏡写真は、第３のＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）細胞に結合した、写真中でｍＡｂ４と表示されるモノクローナル抗体ｍ−Ａｂ４−２ｂを、図１Ａの対照抗体に比較して高倍率で示す。明るい白色スポットは、細胞表面のｍＡｂ４モノクローナル抗体と反応する免疫金粒子ヤギ抗マウスＩｇを表す。バックグラウンドのヤギ抗マウスＩｇ反応性は図１Ａの対照抗体では認められず、ヒトｍＩｇＭとの交差反応性のないこと、およびＢ細胞上のＦｃ受容体による非特異的結合がないことを示している。これらの顕微鏡写真から、ｍＩｇＭは細胞当たり５，０００〜１０，０００分子で存在していると推定された。これらのＳＥＭ顕微鏡写真は、細胞表面上でｍＡｂ４−２ｂがｍＩｇＭに結合することを示す。
【表１１】
0006535668.tif 000012
【０２０１】
直接ｍＡｂ結合調査は細胞表面結合を示し、および標的ｍＩｇＭの存在が抗ヒトＩｇＭ、抗ヒトカッパ軽鎖、抗ヒトＩｇＭ重鎖試薬により示された。
【表１２】
0006535668.tif 000013
【０２０２】
ｍＡｂは、高レベルの血清ＩｇＭを含むワルデンシュトレーム血清とのプレインキュベーションにより細胞表面結合をブロックされなかった。対照的に、抗ヒトＩｇＭ、抗ヒトカッパ軽鎖、および抗ヒトＩｇＭ重鎖試薬はブロックされ、それらの細胞表面結合が欠如した。
【表１３】
0006535668.tif 000014
【０２０３】
ｍＡｂは、ｍＩｇＭ発現ＣＲＬ１４３２とのプレインキュベーションにより細胞表面結合をブロックされ、抗ヒトＩｇＭ、抗ヒトカッパ軽鎖、抗ヒトＩｇＭ重鎖試薬は、それらもＣＲＬ１４３２上のｍＩｇＭに結合するので、ブロックされた。
【表１４】
0006535668.tif 000015
【０２０４】
過剰のｍＩｇＭ  ＰＤは、ＣＲＬ１６４８の細胞表面へのｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂおよびｍＡｂ３−２ｂの結合をブロックし、一方、ｍＡｂ４−２ｂはブロックされず、ＣＲＬ１６４８細胞表面への結合を検出できた。
【表１５】
0006535668.tif 000016
【０２０５】
３０分間のｍＡｂ１−１媒介ｍＩｇＭの内部移行により、ｍＡｂまたは抗ヒトＩｇＭ重鎖試薬によるＣＲＬ１６４８細胞の表面上のｍＩｇＭが検出されなくなる。
【表１６】
0006535668.tif 000017
【０２０６】
３０分間のｍＡｂ４−２ｂ媒介ｍＩｇＭの内部移行により、ｍＡｂまたは抗ヒトＩｇＭ重鎖試薬によるＣＲＬ１６４８細胞の表面上のｍＩｇＭが検出されなくなる。
【表１７】
0006535668.tif 000018
【０２０７】
抗マウスＩｇＧ１−Ｇｏｌｄ試薬は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプｍＡｂ１−１抗体とプレインキュベーションしたＣＲＬ１６４８の表面に結合したマウスＩｇＧ１アイソタイプであるｍＡｂ４−２ｂを検出し、これは、ｍＡｂ１−１がｍＡｂ４−２ｂとは異なるエピトープに結合し、ｍＡｂ４−２ｂをブロックしないことを示す。
【表１８】
0006535668.tif 000019
【０２０８】
抗マウスＩｇＧ１−Ｇｏｌｄ試薬は、ＩｇＧ２ｂアイソタイプｍＡｂ２−２ｂ抗体とプレインキュベーションしたＣＲＬ１６４８の表面に結合したマウスＩｇＧ１アイソタイプであるｍＡｂ４−２ｂを検出し、これは、ｍＡｂ２−２ｂがｍＡｂ４−２ｂとは異なるエピトープに結合し、ｍＡｂ４−２ｂをブロックしないことを示す。
【０２０９】
実施例９
ｍＡｂ結合がＢＣＲＣ内部移行を媒介する
走査型免疫電子顕微鏡（ＳＥＭ）を行って、モノクローナル抗体ｍＡｂ４の細胞株ＣＲＬ１６４８の細胞への結合を検出した。図２Ａは、グルタルアルデヒド固定ＣＲＬ１６４８細胞に結合するモノクローナル抗体ｍＡｂ４を示す。図２Ｂは、ＢＣＲＣのマイクロクラスタに結合するｍＡｂ４を示す。ＣＲＬ１６４８細胞をｍＡｂ４と３７℃で３０分間インキュベートし、固定してヤギ抗マウスＩｇで染色した場合、図２Ａで認められるｍＡｂ４結合とは対照的に、図２Ｃで示すように、検出可能なモノクローナル抗体ｍＡｂ４は存在しなかった。膜上の検出可能なｍＡｂ４の欠如は、ＢＣＲＣ内部移行が原因であった。図２Ｄでは、ＣＲＬ１６４８細胞をｍＡｂ４と３７℃で１５分間インキュベートし、固定してヤギ抗マウスＩｇで染色した場合、内部移行が不完全で、残留結合モノクローナル抗体ｍＡｂ４が認められる（図２Ｄ）。ＣＲＬ１６４８細胞をｍＡｂ４と３７℃で３０分間インキュベートし、固定してヤギ抗−ｈｕ−ＩｇＭで染色した場合、ＢＣＲＣが検出されなかった。これは図２Ｅに示される。
【０２１０】
実施例１０
酸洗浄ありまたはなしの場合の前処理細胞株によるｍＡｂ４結合の抑制
ｍＡｂが誘導するｍＩｇＭの内部移行の評価
各種条件下の相対的細胞表面ｍＩｇＭレベルを測定するために、Ｂ細胞株をグルタルアルデヒド固定細胞に暴露し（表１９の行１および２）（下記のＳＥＭプロトコルにより）または生存細胞を使用した。細胞をｍＡｂ４、１０ｍｃｇ／ｍｌに４℃で０分間（表１９の行３および４）、および３７℃で５分間（表１９の行５および６）、１５分間（表１９の行７および８）、または３０分間（表１９の行９および１０）暴露した。次に、ｍＡｂ４−ＨＲＰ結合抑制アッセイに使用する前に、細胞をｐＨ７．０のＰＢＳまたはｐＨ４．０の０．５Ｍ酢酸塩緩衝液０．１５ＮのＮａＣｌで洗浄した。行１を各細胞株の１００％結合として設定し、行２は、細胞結合ｍＡｂ４を取り除き細胞によりｍＡｂ４−ＨＲＰを吸着させて結合アッセイに利用可能なｍＡｂ４−ＨＲＰを減らす、酸洗浄能力を示した。類似の結果は、氷上でインキュベートした細胞にも認められ、グルタルアルデヒド固定および低温の両方がｍＩｇＭのｍＡｂ媒介内部移行を減らすことを示す。時間を限定した実験は、３７℃で３０分までに、細胞抑制は低減され、ＰＢＳ洗浄と酢酸塩洗浄との間の差異はないことを示し、ｍＩｇＭのほとんどが内部移行されたことを示唆している。結果を下表１９に示す。
【表１９】
0006535668.tif 000020
【０２１１】
実施例１１
生物活性
ｍＡｂ４−２ｂは増殖抑制、抗クローン原性活性およびアポトーシスを媒介する
ｍＩｇＭ  ＰＤ中の配列の特異性および膜貫通細胞シグナル伝達がＣＤ７９αβに送られるという証拠から、ＣＡ４６（ＣＲＬ１６４８）細胞の増殖曲線（ＭＴＴ）およびクローン原性の試験を行って、このプロセスの調節があるか否かを判定した（Ｋｉｋｕｓｈｉｇｅ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０（２）：２４６−５９（２０１１）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔ  ＪＡ，Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９５（２）：２９３−３０２（２０１０）；Ｆｒａｎｋｅｎ  ＮＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：２３１５−２３１９（２００６））。９６ウエルプレートにおける限界希釈での単一クローン生存の最初の試験は、３つのモノクローナル抗体がある程度の活性を有することを示した。最大の活性は、ＰＤおよびドメイン４の両方で結合し、および立体構造的エピトープ領域に結合する、モノクローナル抗体ｍＡｂ４−２ｂが有していた。モノクローナル抗体ｍＡｂ４−２ｂは、ある程度界面活性剤感受性で、パラホルムアルデヒドおよび還元抵抗性のエピトープに結合する。その他の３つのｍＡｂは、ＰＤ中のより近位のエピトープに結合する。これらの細胞増殖抑制効果が、直接的にシグナルを伝達するエピトープのブロッキングに関連するのか、またはｍＡｂの大きなサイズおよび／またはマイクロクラスタ化による立体構造に関連するのかは、明らかでない。
【０２１２】
全体としは、下表２０〜２３の抑制アッセイで示されるように、最も強力なｍＡｂであるｍＡｂ４−２ｂは、ＣＡ４６クローン原性能力を１００倍低減させた（Ｋｉｋｕｓｈｉｇｅ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０（２）：２４６−５９（２０１１）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｌｉｍｅｎｔ  ＪＡ，Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９５（２）：２９３−３０２（２０１０）；Ｆｒａｎｋｅｎ  ＮＰ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：２３１５−２３１９（２００６））。
【０２１３】
抑制アッセイ
細胞を２４ウエルプレートに播種し、下表２０〜２３に示すように、１：２系列希釈を使って９６ウエルプレートに移した。ＭＴＴアッセイを実施する。各値は８ウエルの平均／希釈点である。ｎｇ＝増殖なし、生存細胞なし。
【表２０】
0006535668.tif 000021
【表２１】
0006535668.tif 000022
【表２２】
0006535668.tif 000023
【表２３】
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【０２１４】
実施例１２
限界希釈アッセイおよび細胞密度実験
１マイクログラムのｍＡｂ４を含むまたは含まない限界希釈アッセイは、１０日までに、顕著な細胞生存および増殖特性を示した。結果を下表２４に示す。値は、（ｍＡｂ４処理の場合の％生存細胞）／（対照ｍＡｂ処理の場合の％生存細胞）として示した。４８と２４培養プレートとの間の培地体積の倍増の間の細胞増殖における、大きな差異に留意されたい。細胞を、９６ウエルプレート中の１００マイクロリットル、４８ウエルプレート中の２５０マイクロリットル、および２４ウエルプレート中の５００マイクロリットルで播種した。５００〜１０００播種細胞まで、顕著な増殖抑制が観察された。これは、ｍＡｂ４により死滅させられる、幹細胞により産生されるパラクリン増殖因子に対する効果を示していると考えられる。これらの実験はまた、異なる細胞密度で細胞増殖を救済できるいくつかの異なる幹細胞集団が異なる頻度で存在することを示唆している。
【表２４】
0006535668.tif 000025
【０２１５】
統計分析：スチューデントのｔ検定を使って示されたデータポイントの統計的妥当性を評価した。全データポイントは、それぞれ３つの実験が行われた１２ウエルから構成され、代表的な平均値が示される。第１の分析は、（ｍＡｂ４処理の場合の％生存細胞）／（対照ｍＡｂ処理の場合の％生存細胞）を比較する各データポイントによって示される。示した１８のデータポイントぞれぞれは、ｐ＜０．５の統計的レベルに到達した。第２の分析は、比較細胞株のそれぞれで対になっている４８ウエル生存細胞数と、２４ウエル生存細胞数との間で統計的差異を示した。これらもまたいずれの場合でもｐ＜０．５を超えた。増殖抑制調査では、ＭＴＴ生存数は、抑制が播種細胞の数に反比例することを示した。対照ｍＩｇＭ−、ｍＩｇＧ＋発現細胞に対する類似の実験は、何らの生物学的効果も示さず、ポリクローナルウサギまたはヤギ抗ＩｇＭは、抗クローン原性ではなかった。これは、特異性決定抑制が、細胞膜近くの新エピトープ中に位置することを示唆している。
【０２１６】
増殖曲線：ｍＩｇＭＢ細胞株を、１μｇ／ｍｌのｍＡｂ４−２ｂの存在下で増殖させた（表２０〜２３に示す）。細胞を２０細胞／ｍｌで播種した。プレートを２日毎に収集し、生存細胞をＭＴＴアッセイにより測定した。相対的ＭＴＴ  ＯＤを各時点でプロットした。アポトーシスを生存細胞の非存在（１０日目）によりスコア化した。これは、抗体の非存在下で生存細胞の再クローニング培養により求めた。結果を図６Ａ〜６Ｆに示す。図６Ａ、６Ｂ、および６Ｄ〜６Ｆに示すように、アイソタイプ対応対照抗体および対照抗ＰＤｍＡｂ２の両方とも、ＣＲＬ１６４８細胞株の増殖抑制を誘導しなかった。ｍＩｇＧ発現対照Ｂ細胞株、ＣＲＬ２６３２が使われた場合、図６Ｃに示すように、ｍＡｂ４は、ｍＩｇＧに結合せず、この細胞株の増殖を抑制しなかった。図６Ｄ〜６Ｆは、ｍＡｂ４が、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株、ＣＲＬ１６４８、ＣＲＬ２９５８、ＣＲＬ１５９６およびＣＲＬ１４３２の増殖抑制を誘発したことを示す。
【０２１７】
モノクローナル抗体ｍＡｂ４による、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ１６４８の、１０日間にわたる増殖の抑制を、２０細胞／ウエル、１００細胞／ウエル、２５０細胞／ウエル、５００細胞／ウエルおよび１，０００細胞／ウエルの細胞希釈で試験した。図７に示すように、モノクローナル抗体ｍＡｂ４は、ｍＩｇＭ発現Ｂ細胞株ＣＲＬ１６４８の増殖を１０日の期間抑制したが、播種細胞濃度が＞５００細胞／ウエルの場合は、抑制しなかった。
【０２１８】
実施例１３
補体溶解およびＡＤＣＣ
目的は、これらのモノクローナル抗体の、ヒト補体（Ｃ’）（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＭ）およびヒトエフェクター細胞媒介抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）に関する免疫細胞傷害能力を評価することであった（Ｐａｎｅｅｒｓｅｌｖａｍ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３６：２５３４−２５４１（１９８６）；Ｗｅｌｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ４５：２１４−２２９（１９８７））。これらのモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体であるので、この分析は、部分的には、Ｃ’またはＡＤＣＣがこれらのマウス抗体で陽性であるかどうか、およびしたがって、ヒト化抗体の臨床製品開発で保持すべき重要な因子であるかどうかを判定するのを支援するためにのみ用いられた。マウスＩｇＧ１モノクローナル抗体はそれらのＩｇサブクラスのために、エフェクター機能の能力を持たない可能性があるが、狙いは、何れかの個別のクローンが優れた活性を有するかどうかを判定することである。
【０２１９】
最初の結合調査に基づいて更なる分析のために保存された最終パネルのクローンから収集したアイソタイプの最終の分析では、４つのＩｇＧ２ｂおよび２つのＩｇＧ１モノクローナル抗体があり、これらは抗ｍＩｇＭ−ｍＡｂ１−１、ｍＡｂ２−２ｂ、ｍＡｂ３−２ｂ、およびｍＡｂ４−２ｂを含んだ。アッセイが３７℃で行われ、内部移行が急速に起こったので、これらの抗体のいずれもアッセイでは陽性ではなかった。これらの結果は急速内部移行の結果であったので、それらの抗体は、これらの免疫機序を媒介すると報告されている、近位ドメインエピトープに結合する他の抗体とは明確な対照をなす。これらの結果はまた、低抗原レベル、抵抗因子またはアイソタイプに起因する可能性もあると思われる（Ｐａｎｅｅｒｓｅｌｖａｍ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３６：２５３４−２５４１（１９８６）；Ｗｅｌｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  ４５：２１４−２２９（１９８７））。リツキシマブおよびポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭを、陽性対照として使用した。
【０２２０】
医薬製剤
ポリペプチドまたは抗体の治療製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、当該技術分野で通常用いられる任意選択の「薬学的に許容される」キャリア、賦形剤または安定剤（これらはすべて「賦形剤」と呼ばれる）、すなわち、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤およびその他の種々の添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤あるいは水溶液として保管用に調製できる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい。このような添加剤は、用いられる服用量および濃度においてレシピエントに無毒である必要がある。
【０２２１】
緩衝剤は、ｐＨを生理的条件に近い範囲に維持するのに役立つ。緩衝剤は約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在するのが好ましい。本発明で使用するのに適切な緩衝剤には、有機、無機両方の酸およびその塩、例えば、クエン酸塩緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸塩緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸塩緩衝剤（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸塩緩衝剤（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸塩緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸塩緩衝剤（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸塩緩衝剤（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などが挙げられる。さらに、リン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、およびトリスなどのトリメチルアミン塩が挙げられることもある。
【０２２２】
微生物の増殖を遅らせるために保存剤を添加してもよく、通常、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加できる。本開示で使用するのに適した保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物またはヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、およびメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および３−ペンタノールが挙げられる。「安定剤」として知られていることもある等張化剤は、本発明の液体組成物の等張性を確保するために添加でき、多価糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどが挙げられる。
【０２２３】
安定剤は、機能的に、増量剤から、治療剤を可溶化するあるいは変性または容器壁への付着を防ぐのに役立つ添加剤までの範囲に及び得る、広範な種類の賦形剤を意味する。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上で列挙した）、アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなどのアミノ酸；イノシトールなどのシクリトールを含む、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、果糖およびブドウ糖などの単糖類；ラクトース、マルトースおよびショ糖などの二糖類；ラフィノースなどの三糖類；ならびにデキストランなどの多糖類であってよい。安定剤は、活性タンパク質重部あたり、０．１〜１０，０００重量の範囲で存在してよい。
【０２２４】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬を可溶化するのを容易にするために、および治療タンパク質を撹拌誘発凝集から保護するために添加でき、タンパク質の変性を起こすことなく製剤を表面剪断応力に曝すことも可能にする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０、など）、ポロクサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、プルロン酸ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ツイーン（登録商標）−２０、ツイーン（登録商標）−８０、など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在してもよい。
【０２２５】
他の種々の賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が挙げられる。本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な１種または複数種の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含んでもよい。例えば、免疫抑制剤をさらに提供するのが望ましい場合がある。このような分子は、意図する目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。また活性成分は、例えば、コアセルべーション技術または界面重合化により調製されるマイクロカプセル中に、例えば、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）における、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中にそれぞれ封入でき、またはマクロエマルジョンに封入できる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２２６】
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。無菌化は、例えば、無菌濾過膜を介する濾過によって、容易に達成される。徐放製剤を調製できる。徐放製剤の好適例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ／２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能微粒子）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日間を越える長期間にわたる分子の放出が可能であるが、特定のヒドロゲルはより短い時間でタンパク質を放出する。封入された抗体が長期間にわたって体内に残る場合は、それらは３７℃での湿気への暴露の結果として変性するかまたは凝集し、結果として生物活性がなくなり、場合によっては免疫原性が変化する。
【０２２７】
関与する機構に応じて安定化のための合理的な方法を考案できる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間Ｓ−−Ｓ結合形成であると見出される場合、スルフヒドリル残基を修飾する、酸性溶液から凍結乾燥する、湿分含量を制御する、適切な添加物を使用する、および特殊ポリマーマトリックス組成物を開発することにより安定化を達成できる。
【０２２８】
特定の障害または状態の処置において効果的であると思われる治療ポリペプチド、抗体、またはこれらの断片の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的臨床技術により決定できる。可能な場合には、ヒトで試験する前に、用量反応曲線および最初はインビトロで、その後有用な動物モデル系で本発明の医薬組成物を決定することが望ましい。
【０２２９】
好ましい実施形態では、治療ポリペプチド、抗体またはこれらの断片の水溶液が皮下注射により投与される。それぞれの用量は、約０．５μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約３μｇ〜約３０μｇ／ｋｇ体重の範囲であってよい。
【０２３０】
皮下投与の投薬スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度、および対象の治療薬に対する感受性を含む多くの臨床因子に応じて月１回〜毎日で変化してもよい。
【０２３１】
抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体の診断的使用
本発明の抗体は、修飾、すなわち、共有結合がＢ細胞ｍＩｇＭに対する結合を妨害しないように、抗体への任意のタイプの分子の共有結合により修飾されている誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体は、例えば、ビオチン化、ＨＲＰ、または何れか他の検出可能成分により修飾されている抗体を含む。
【０２３２】
本発明の抗体を使用して、例えば、限定されないが、インビトロおよびインビボの両方の診断法を含み、ＢＣＲＣを精製または検出できる。例えば、抗体は、定性的におよび定量的に生物試料中のＢＣＲＣのレベルを測定するためのイムノアッセイでの用途がある。例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）を参照されたい。この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２３３】
以降でさらに詳細に考察するように、本発明の抗体は、単独でまたはその他の組成物と組み合わせて使用できる。抗体は、組換えによりＮ−またはＣ−末端で異種のポリペプチドにさらに融合される、またはポリペプチドまたはその他の組成物にコンジュゲート（共有結合的なでおよび非共有結合的なコンジュゲーションを含む）されてよい。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイでの標識として有用な分子に組換えにより融合またはコンジュゲートされてよい。
【０２３４】
本発明は、診断薬にコンジュゲートした抗体またはその断片をさらに包含する。抗体を診断的に使って、例えば、特定細胞、組織、または血清中の対象標的の発現を検出する；または、例えば、所定の処置計画の有効性を決定する臨床試験手順の一部として、免疫性応答の発生または進行をモニターできる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合させることにより容易にできる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々のポジトロン放出トモグラフィを使用するポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質を、当該技術分野において既知の技術を使用して介在物（例えば、当該技術分野において既知のリンカーなど）により、抗体（またはその断片）に直接的にまたは間接的に結合またはコンジュゲートできる。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖酸化酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素）、ヘテロ環式オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。
【０２３５】
酵素を抗体にコンジュゲートする技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｌａｎｇｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ｐｐ．１４７−６６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）中の、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，”に記載されている。例えば、本発明による診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートできる金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンアビジン／アセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の一例には、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；および適切な放射性の材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。
【０２３６】
場合によっては、標識は抗体と間接的にコンジュゲートされる。当業者なら、これを実現する種々の技術を知っているであろう。例えば、抗体はビオチンとコンジュゲートでき、前述の３つの広範なカテゴリーの何れかの標識をアビジンとコンジュゲートでき、逆もまた同様である。ビオチンは選択的にアビジンに結合し、したがって、標識は間接的方法で抗体とコンジュゲートできる。あるいは、抗体との標識の間接的コンジュゲーションを行うために、抗体を小さいハプテン（例えば、ジグロキシン（ｄｉｇｌｏｘｉｎ））とコンジュゲートさせて、前述の異なるタイプの標識の１つを抗ハプテン抗体（例えば、抗ジグロキシン抗体）とコンジュゲートさせる。このようにして、標識の抗体との間接的コンジュゲーションを実現できる。
【０２３７】
本発明の別の実施形態では、抗体は標識を必要とせず、その存在は、その抗体に結合する標識抗体を使って検出できる。
【０２３８】
本発明の抗体を、任意の既知のアッセイ、例えば、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチ法、および免疫沈降アッセイで採用できる。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照されたい。
【０２３９】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について試験試料と競合する標識された標準物の能力に依存する。試験試料中の標的の量は、抗体に結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量の決定を容易にするために、通常、抗体は競合の前後で不溶化される。その結果、抗体に結合する標準物および試験試料は、結合せずに残る標準物および試験試料から便宜的に分離できる。
【０２４０】
サンドイッチ法は２つの抗体の使用を含み、異なる免疫原性部分、またはエピトープ、または検出されるべきタンパク質にそれぞれが結合可能である。サンドイッチ法では、分析される試験試料は固体支持上に固定された第一抗体により結合され、その後、第二抗体が試験試料に結合し、それにより不溶性の３つの部分からなる複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照されたい。第二抗体はそれ自体が検出可能な成分で標識されてよく（直接サンドイッチ法）または検出可能な成分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使って測定される（間接サンドイッチ法）。例えば、１つのタイプのサンドイッチ法はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な成分は酵素である。
【０２４１】
抗体は固体支持体に取り付けることができ、これは、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。このプロセスでは、抗体は、当該技術分野において周知の方法を使って、固体支持体、例えば、セファデックス（商標）樹脂または濾紙などに固定される。固定化抗体は精製されるべき標的を含む試料と接触され、その後、支持体は、試料中の精製されるべき標的（固定化抗体に結合される）以外の実質的に全ての材料を除去する好適な溶媒で洗浄される。最終的に、支持体は、抗体から標的を遊離させる、グリシン緩衝液などの別の好適な溶媒で洗浄される。
【０２４２】
Ｂ細胞ｍＩｇＭに特異的に結合する標識された抗体、および誘導体ならびにその類似体を使って、診断目的のために、Ｂ細胞悪性病変の異常な発現および／または活性に関連する疾患、障害、および／または状態を検出、診断、またはモニターできる。本発明は、Ｂ細胞ｍＩｇＭの異常発現の検出を提供し、（ａ）Ｂ細胞ｍＩｇＭに特異的な１種または複数種の本発明の抗体を使って個体の細胞または体液中のＢ細胞ｍＩｇＭの発現をアッセイすること、および（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準発現レベルと比較し、それにより、標準発現レベルに比べてアッセイしたＢ細胞ｍＩｇＭ発現レベルの増加または減少が異常発現の指標となること、を含む。
【０２４３】
試料、例えば、体液または組織試料中のＢ細胞ｍＩｇＭの存在および／またはレベルを検出するために、抗体を使用することができる。検出方法は、試料をＢ細胞ｍＩｇＭ抗体と接触させること、および試料に結合した抗体の量を決定することを含んでよい。免疫組織化学に対しては、試料は新鮮であるかまたは凍結されていてよく、またはパラフィン中に包埋され、例えば、ホルマリンなどの防腐剤で固定されていてもよい。
【０２４４】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、（ａ）１種または複数種の本発明の抗体を使って個体のＢ細胞または体液中のＢ細胞ｍＩｇＭの発現をアッセイすること、および（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準発現レベルと比較し、それにより、標準発現レベルに比べてアッセイした遺伝子発現レベルの増加または減少が特定の障害の指標となること、を含む。
【０２４５】
本発明の抗体を使い、当業者に既知の典型的な免疫組織学的方法を使って生物試料中のタンパク質レベルをアッセイできる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０１：９７６（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０５：３０８７（１９８７）を参照されたい）。そのタンパク質遺伝子発現の検出に有用な抗体ベースの他の方法には、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当技術分野において既知であり、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；放射性同位元素、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）；発光標識、例えば、ルミノール；および蛍光標識、例えば、フルオレセイン、ローダミン、およびビオチンが含まれる。免疫シンチグラフィーを使って、放射性同位元素結合同位体の場所を特定できる。
【０２４６】
本発明の一態様は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおけるＢ細胞ｍＩｇＭの異常発現に関連する疾患または障害の検出および診断である。一実施形態では、診断は、ａ）Ｂ細胞ｍＩｇＭに特異的に結合する標識分子の有効量を対象に投与すること（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）；ｂ）投与後に、ポリペプチドが発現される対象の部位で標識分子を選択的に濃縮させる（および非結合標識分子がバックグラウンドレベルまで除去される）期間待つこと；ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること；およびｄ）対象中の標識分子を検出し、バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出により対象がＢ細胞ｍＩｇＭの異常発現に関連する特定の疾患または障害を有すると示されること、を含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系について以前に決定した標準値と比較することを含む、種々の方法により決定できる。
【０２４７】
対象のサイズおよび使われるイメージングシステムが、診断画像の生成に必要なイメージング部分の量を決定することは、当技術分野で理解されよう。放射性同位元素成分の場合には、ヒト対象に対し、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲９９Ｔｃであろう。標識抗体または抗体断片は、その後、特定のタンパク質を含む細胞の部位で選択的に蓄積する。インビボでのイメージングに関しては、Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８２）中の、Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．”  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３に記載されている。
【０２４８】
使用される標識のタイプおよび投与方法を含むいくつかの変数に応じて、投与後に標識分子が選択的に対象中の部位で濃縮され、非結合標識分子がバックグラウンドレベルにまで除去されることを許容する時間間隔は、６〜４８時間、６〜２４時間、または６〜１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５〜２０日または５〜１０日である。
【０２４９】
一実施形態では、疾患または疾患の診断方法を繰り返すことにより、疾患または障害のモニタリングが行われる。例えば、最初の診断の１ヶ月後、最初の診断の６ヶ月後、最初の診断の１年後など。
【０２５０】
インビボスキャン関する当該技術分野において既知の方法を使用して、患者における標識分子の存在を検出できる。これらの方法は使われる標識のタイプに依存する。当業者なら特定の標識を検出する適切な方法を決定できるであろう。本発明の診断法で使用できる方法および装置としては、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、全身スキャン、例えば、陽電子放出断層撮影（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５１】
特定の実施形態では、分子は放射性同位元素で標識され、患者において、照射応答性手術器具（米国特許第５，４４１，０５０号）を使って検出される。別の実施形態では、分子は蛍光化合物で標識され、患者において、蛍光応答性走査装置を使って検出される。別の実施形態では、分子はポジトロン放出金属で標識され、患者（ｐａｔｅｎｔ）において、陽電子放出断層撮影を使って検出される。さらに別の実施形態では、分子は常磁性標識で標識され、患者において、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を使って検出される。
【０２５２】
別の態様では、本発明は、特定の患者の細胞または体液中のＢ細胞ｍＩｇＭの存在に関して試験することにより、患者がＢ細胞リンパ腫または白血病であるかどうかを診断する方法を提供する。一実施形態では、方法は、対象から細胞または体液試料を集めること、体液をＢ細胞ｍＩｇＭの存在に関し分析すること、その量を、正常細胞または体液に対し決定または試験されたレベルと比較すること、および体液中のＢ細胞ｍＩｇＭの発現レベルに基づいて患者がＢ細胞リンパ腫または白血病であるかどうかを判定すること、を含む。Ｂ細胞ｍＩｇＭの決定されたレベルは、文献値に基づく既知の量であってもよく、または前もって正常細胞または体液中の量を測定することにより決定してもよい。特に、特定の体液中のＢ細胞ｍＩｇＭの決定は、患者における、好ましくは疾患発病前の、特定の、早期の疾患の検出を可能にする。本方法を使って診断可能な疾患としては、本明細書で記載のＢ細胞悪性病変が挙げられるが、これに限定されない。好ましい実施形態では、体液は末梢血または末梢血白血球である。
【０２５３】
本発明の抗体はキットで、すなわち、所定量の試薬と診断アッセイを行うためのインストラクションのパッケージ化された組み合わせで提供できる。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素に必要な基質および補助因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆物質）を含んでよい。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加物が含まれてよい。アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を得るために、種々の試薬の相対量は広範に変わってもよい。特に、溶解時に適切な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む試薬は、通常、凍結乾燥された乾燥粉末として提供できる。
【０２５４】
抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体の治療上の使用
本発明の抗体は哺乳動物を処置するために使用されることが意図されている。一実施形態では、抗体は、例えば、前臨床のデータを得るために非ヒト哺乳動物に投与される。治療される代表的な非ヒト哺乳動物には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類および前臨床調査が行われるその他の哺乳動物が含まれる。このような哺乳動物は、抗体で処置される疾患用の樹立動物モデルであってもよく、または対象抗体の毒性試験に使用されてもよい。これらの実施形態のそれぞれでは、用量漸増調査は哺乳動物で行われる。
【０２５５】
治療成分をコンジュゲートしたまたはしない、単独でまたは細胞傷害性の因子（単一または複数）と組み合わせて投与される抗体を、治療薬として使用してもよい。本発明は抗体ベースの治療に関し、この治療は、Ｂ細胞リンパ腫または白血病を処置するために、本発明の抗体を動物、哺乳動物、またはヒトに投与することを含む。動物または対象は、特定の処置を必要としている動物、例えば、特定の障害、例えば、Ｂ細胞リンパ腫または白血病に関連する疾患であると診断されている動物であってよい。Ｂ細胞ｍＩｇＭに対する抗体は、限定されないが、雌ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類など、およびヒトを含む動物におけるＢ細胞リンパ腫または白血病に有用である。例えば、治療的に許容可能な用量の本発明の抗体または複数抗体、または本発明の抗体の混合物を投与すること、または様々なソースの他の抗体と組み合わせて投与することにより、処置される哺乳動物での病徴を減らすかまたは取り除くことができる。
【０２５６】
本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書で記載の断片、類似体およびこれらの誘導体を含む）および後述する本発明の抗体をコードする核酸（本明細書で記載の断片、類似体およびこれらの誘導体ならびに抗イディオタイプの抗体）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体を使用して、Ｂ細胞ｍＩｇＭの異常発現および／または活性に関連する、限定されないが、本明細書で記載の疾患、障害、または状態の何れか１種または複数種の疾患、障害、または状態を処置、抑制、または予防できる。Ｂ細胞ｍＩｇＭの異常発現および／または活性に関連する疾患、障害、または状態の処置および／または予防には、限定されないが、これらの疾患、障害、または状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和することが含まれる。本発明の抗体は、当技術分野において既知のまたは本明細書で記載の薬学的に許容可能な組成物中で提供できる。
【０２５７】
本発明の抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体は、種々の疾患で治療的に使用できる。本発明は、哺乳動物でＢ細胞悪性疾患を予防または処置する方法を提供する。前記方法は、疾患を予防するまたは処置する量の抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体を哺乳動物に投与することを含む。抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体はＢ細胞ｍＩｇＭに結合し、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する。
【０２５８】
Ｂ細胞ｍＩｇＭの異常発現および／または活性に関連する疾患または障害の処置、抑制、および予防に効果的であると思われる抗体の量は、標準的臨床技術により決定できる。投与量は、治療する疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体が予防目的または治療目的で投与されるのかどうか、前治療、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の慎重さに依存するであろう。抗体は、疾患に合った治療計画で、例えば、疾患状態を回復させるために単回または複数回用量を１日〜数日間で、またはアレルギーまたは喘息を予防するために定期的用量を長期間にわたり投与できる。さらに、所望により、インビトロアッセイを用いて最適な用量範囲を特定できる。製剤で使用される正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度にも依存し、開業医の判断およびそれぞれの患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿してもよい。
【０２５９】
抗体の場合、患者に投与される用量は通常、０．１ｍｇ／ｋｇ患者の体重〜１５０ｍｇ／ｋｇ患者の体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ患者の体重〜２０ｍｇ／ｋｇ患者の体重、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ患者の体重〜１０ｍｇ／ｋｇ患者の体重である。一般に、ヒト抗体は、外来性ポリペプチドに対する免疫応答に起因して、ヒトの身体中でその他の種由来の抗体よりも長い半減期を有する。したがって、より少ない用量のヒト抗体およびより少ない頻度の投与が可能である場合が多い。さらに、例えば、脂質化などの修飾により抗体の取り込みおよび組織浸透を高めることにより、本発明の抗体の投与量および投与頻度を減らすことができる。数日間にわたる反復投与の場合は、状態に応じて、病徴の所望の抑制が起こるまで、処置が持続される。しかし、他の投与計画が有用な場合がある。この治療の進行は、従来技術およびアッセイにより容易にモニターされる。抗ＬＦＡ−１または抗ＩＣＡＭ−１抗体の例示的な投与計画は、国際公開第９４／０４１８８号に開示されている。
【０２６０】
本発明の抗体は、組成物の形態であってもよいが、良質の医療のための原則に準拠するように、処方、服用および投与すべきである。これに関して考慮すべき因子には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個別患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与スケジュール、およびその他の開業医に既知の因子が挙げられる。投与される抗体組成物の「治療有効量」は、このような考察により決定され、疾患または障害を予防する、回復させる、または処置するのに必要な最少量である。抗体は、必要ではないが、任意選択で、問題になっている障害を予防するまたは処置するために現在使用されている１種または複数種の薬剤と共に処方される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または処置のタイプ、および上記で考察した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量でおよび上記で使用されるような投与経路により、またはこれまで用いられている用量の約１〜９９％量で用いられる。
【０２６１】
本発明の抗体は、他のモノクローナルまたはキメラ抗体キメラ抗体と組み合わせて、または、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数と活性を高めるのに役立つリンホカインもしくは造血因子（例えば、Ｉｌ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、およびＩＦＮ−γ）と組み合わせて、有利に利用できる。
【０２６２】
本発明の抗体は、単独でまたは他のタイプの処置、例えば、免疫療法、化学療法、および放射性同位元素と組み合わせて投与できる。
【０２６３】
一態様では、抗体は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するまたは好ましくない副作用を起こす物質を含まない）。種々のデリバリーシステムが知られており、本発明の抗体の投与に使用できる。これらには、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルに封入された注射剤、化合物を発現できる組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６２：４４２９（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルスのまたは他のベクターの一部としての核酸の構築、などが含まれる。
【０２６４】
抗Ｂ細胞ｍＩｇＭ抗体は、任意の許容可能な方法で哺乳動物に投与できる。導入方法としては、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、硬膜外、吸入、および経口経路、ならびに免疫抑制処置が望ましい場合、病巣内投与、が挙げられるが、これらに限定されない。非経口注入には、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内、または腹腔内投与が含まれる。抗体または組成物は、任意の都合のよい経路、例えば、注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜）の裏層を通る吸収により投与でき、また、他の生理活性薬剤と共に投与できる。投与は全身性または局所的であってよい。さらに、本発明の治療抗体または組成物を、脳室内注射およびくも膜下腔内注射などの、任意の適当な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は、例えば、オマヤレザバーなどの、リザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に行うことができる。さらに、抗体は、特に抗体の用量を減少して、パルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は注射により与えられ、投与が短期か長期かに一部は依存して、最も好ましくは静脈内または皮下注射により与えられる。
【０２６５】
例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を含む製剤の使用により、肺内投与を用いることもできる。抗体はまた、乾燥粉組成物の形態で患者の肺に投与されてもよい（例えば、米国特許第６，５１４，４９６号を参照されたい）。
【０２６６】
特定の実施形態では、本発明の治療抗体または組成物を、処置を必要とする領域へ局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、限定するものではないが、例えば、局所注入、局所投与、注射により、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって実現でき、インプラントは、サイラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料であってよい。好ましくは、本発明の抗体を投与する場合、タンパク質が吸収されない材料を使うように注意する必要がある。
【０２６７】
別の実施形態では、抗体は、小胞中で、特にリポソーム中で送達できる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）；Ｔｒｅａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同上、ｐｐ．３１７−２７を参照されたい；概要についても同上文献を参照されたい）。
【０２６８】
さらに別の実施形態では、抗体は徐放システムで送達できる。一実施形態では、ポンプを用いることができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７（１９９０）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｆ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ  １４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２１：５７４（１９８９）を参照されたい）。別の実施形態では、高分子材料を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｓｃｉ  Ｒｅｖ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２３：６１（１９８３）を参照されたい；また、Ｌｅｖｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７１：１０５（１９８９）も参照されたい）。さらに別の実施形態では、徐放システムを治療標的の近傍に配置できる。
【０２６９】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の抗体および生理学的に許容可能なキャリアを含む。特定の実施形態では、「生理学的に許容可能な」という用語は、動物での使用、およびより具体的にはヒトでの使用のために連邦政府または州政府の規制当局により承認されているまたは米国薬局方または他の一般に認められている薬局方にリストされていることを意味する。「キャリア」という用語は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビークルを意味する。このような生理的なキャリアは、石油、動物、植物、または人工起源のもの、例えば、ピーナッツオイル、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油などを含む、水および油などの無菌の液体であってよい。医薬組成物が静脈内に投与される場合は、水が好ましいキャリアである。生理食塩水と水性デキストロースおよびグリセリン溶液も、液体キャリア、特に注射可能溶液として使用可能である。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じ、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態を取ることができる。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドなどのキャリアとともに坐剤として処方できる。経口製剤には、標準的なキャリア、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含めてよい。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は、有効量の抗体を、好ましくは精製された形態で、患者への適切な投与のための形態を与えるような適量のキャリアとともに含む。製剤は、投与方法に適合する必要がある。
【０２７０】
一実施形態では、組成物は、人間に対する静脈内投与に適応する医薬組成物として通常の方法に従って処方される。通常、静脈内投与用組成物は、無菌等張水性緩衝液中の水溶液である。組成物は、必要に応じて、注射の部位での疼痛を緩和するための可溶化剤およびリグノカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。通常、成分は、例えば、活性薬剤の量を表示するアンプルまたは小袋などの密閉容器中の凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として、別々にもしくは一緒に混合して単位剤形で供給される。組成物が注入によって投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで投薬可能である。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合されるように、注射用無菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２７１】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１種または複数種の成分で充填された１つまたは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。任意選択で、医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式の、ヒトへの投与のための製造、使用または販売についてその機関によって承認されていることを示す注意書きをこのような容器（単一または複数）に添付できる。
【０２７２】
さらに、本発明の抗体は、種々のエフェクター分子、例えば、異種のポリペプチド、薬剤、放射性ヌクレオチド、炭水化物、マイクロＲＮＡおよびＤＮＡ、合成ヌクレオチドを含むヌクレオチド、または毒素にコンジュゲートできる。例えば、国際公開第ＷＯ９２／０８４９５号、同第ＷＯ９１／１４４３８号、同第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許出願第ＥＰ３９６，３８７号を参照されたい。抗体またはその断片を、治療成分、例えば、細胞毒素（例えば、細胞分裂停止剤または細胞破壊剤）、治療薬、または放射性金属イオン（例えば、α放射体、例えば、２１３Ｂｉ）にコンジュゲートできる。細胞毒素剤または細胞傷害性薬物は、細胞にとっては有害である任意の薬剤を含む。実施例としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにこれらの類似体または同族体が挙げられる。治療薬としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレザト、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、有糸分裂阻害薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）および高有毒性薬剤（例えば、カリチアマイシン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７３】
このような治療成分の抗体へのコンジュゲート技術は良く知られており、例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ（１９８５）中の、Ａｒｎｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．６２３−５３，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（１９８７）中の、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）中の、Ｔｈｏｒｐｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ｐｐ．３０３−１６．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）中の、”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”；およびＴｈｏｒｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：１１９（１９８２）を参照されたい。  あるいは、抗体を第二抗体にコンジュゲートして、抗体ヘテロコンジュゲートを形成できる。例えば、米国特許第４，６７６，９８０号を参照されたい。
【０２７４】
本発明のコンジュゲートを所定の生物学的応答を変えるために使用でき、治療剤または薬剤成分は、典型的な化学治療薬に限定されるものと解釈されるべきではない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照されたい）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照されたい）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：１５６７（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照されたい）などのタンパク質；血栓薬；抗血管新生薬、例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン；または  生物学的応答調節物質、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子が挙げられる。
【０２７５】
本明細書で引用された全ての文献は、あたかもそれぞれの出版物、データベースエントリ（例えば、ジェンバンク配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願、または特許が、具体的および個別に、参照により援用されると示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。この参照による組み込みの記載は、出願者により、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に基づき、それぞれのおよび全ての個別の出版物、データベースエントリ（例えば、ジェンバンク配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願、または特許に関連することが意図され、このような引用が専用の参照による援用の記載に直接隣接していない場合でも、これらのそれぞれは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）にしたがって、明確に識別される。参照による援用の専用の記載の包含が明細書内に、たとえあったにしても、これは決してこの参照による援用の一般的記載を弱めるものではない。本明細書による参照の引用は、この参照が先行技術に関連するという承認を意図するものではなく、また、これらの出版物または文書の内容または日付に関しなんらかの承認を与えるものでもない。
【０２７６】
本発明は本明細書で記載の特定の実施形態により範囲が限定されるべきではない。当業者なら、単に定型の実験を使うだけで、本明細書で記載の特定の本発明の実施形態に対する多くの等価物を認める、または確認することができるであろう。このような等価物は、次の請求項により包含されることが意図されている。
【図１】
0006535668.tif 000026
【図２Ａ】
0006535668.tif 000027
【図２Ｂ】
0006535668.tif 000028
【図２Ｃ】
0006535668.tif 000029
【図２Ｄ】
0006535668.tif 000030
【図２Ｅ】
0006535668.tif 000031
【図３】
0006535668.tif 000032
【図４】
0006535668.tif 000033
【図５】
0006535668.tif 000034
【図６】
0006535668.tif 000035
【図７】
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