(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリン産生能を有する微生物を培地に接種し、４０℃以上６０℃以下の温度で培養することを含んでなり、
前記シトルリン産生能を有する微生物が、ラクトコッカス・ラクティスであることを特徴とする、シトルリンの調製方法。
【請求項２】
前記シトルリン産生能を有する微生物が、４０℃以上の培養温度においてシトルリン産生がオルニチン産生より優位なものである、請求項１に記載のシトルリンの調製方法。
【請求項３】
前記シトルリン産生能を有する微生物がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis spp. lactis） OLS3789株、OLS3797株、およびOLS3818株からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１または２に記載のシトルリンの調製方法。
【請求項４】
シトルリン産生能を有する微生物を原料に添加し、４０℃以上６０℃以下の温度で発酵することを含んでなり、
前記シトルリン産生能を有する微生物が、ラクトコッカス・ラクティスであることを特徴とする、シトルリン含有組成物の製造方法。
【請求項５】
前記シトルリン産生能を有する微生物が、４０℃以上の培養温度においてシトルリン産生がオルニチン産生より優位なものである、請求項４に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
【請求項６】
前記シトルリン産生能を有する微生物がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis spp. lactis） OLS3789株、OLS3797株、およびOLS3818株からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項４または５に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
【請求項７】
原料が原料乳である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
【請求項８】
シトルリン含有組成物が飲食品である、請求項４〜７のいずれか一項に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
【請求項９】
シトルリン産生能を有し、かつ４０℃以上６０℃以下の培養温度におけるアルギニンからシトルリンへの変換効率が高められた微生物を含む培養液の調製方法であって、シトルリン産生能を有する微生物を、アルギニンを添加した培地で培養することを含んでなり、
前記シトルリン産生能を有する微生物が、ラクトコッカス・ラクティスであることを特徴とする、調製方法。
【請求項１０】
前記シトルリン産生能を有する微生物が、４０℃以上の培養温度においてシトルリン産生がオルニチン産生より優位なものである、請求項９に記載の調製方法。
【請求項１１】
培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、
培養の途中で断続的にアルギニンを添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを添加する、請求項９または１０に記載の培養液の調製方法。
【請求項１２】
シトルリン産生能を有し、３５℃以上６０℃以下の培養温度におけるアルギニンからシトルリンへの変換効率が高められた微生物を含み、かつ当該微生物の濃度が高められた培養液の調製方法であって、シトルリン産生能を有する微生物を、アルギニンを添加し、かつｐＨが５以上７以下の範囲にある培地で培養して前記微生物の濃度を高めることを含んでなり、
前記シトルリン産生能を有する微生物が、ラクトコッカス・ラクティスであることを特徴とする、調製方法。
【請求項１３】
前記シトルリン産生能を有する微生物が、４０℃以上の培養温度においてシトルリン産生がオルニチン産生より優位なものである、請求項１２に記載の調製方法。
【請求項１４】
培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、
培養の途中で断続的にアルギニンを添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを添加する、請求項１２または１３に記載の培養液の調製方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法によって得られた培養液を、遠心分離および／または膜分離して得られる、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めたシトルリン産生能を有する微生物の調製方法。
【請求項１６】
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の培養液の調製方法によって得られた培養液または請求項１５に記載の微生物の調製方法によって得られた微生物を、培地に接種して培養する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシトルリンの調製方法、もしくは原料に添加して発酵する、請求項４〜８のいずれか一項に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトルリンの調製方法に関し、さらに詳しくは、乳酸菌などの微生物を用いたシトルリンの調製方法に関する。また、本発明は、シトルリンを高濃度で含む組成物（例えば、乳製品）の製造方法に関する。さらに、本発明は、アルギニンからシトルリンへの変換効率が高められた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法、および、菌体濃度が高められた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトルリンは機能性のアミノ酸であり、日本では、医薬品として使用が認められた後に、２００７年に食品として使用が認められている。また、シトルリンは海外では、２００７年以前から食品として摂取され、例えば、血流改善、動脈硬化予防、精力増強の機能から、サプリメントとして販売されてきた実績がある。さらに、シトルリンは他にも、冷性改善、皮膚機能改善、疲労軽減・回復、筋肉成長、運動機能向上などの機能を有することが報告されている。【０００３】
一方、シトルリンは食品素材として極めて高価であり、さらに、その機能を発揮させるために必要な摂取量は比較的に多量（例えば、数百ｍｇ）である。従って、シトルリンを食品等に有効量で配合しようとすると、その高価であることが問題となる。【０００４】
シトルリンは現状では、主に発酵法で生産される。例えば、特開昭６３−０６８０９１号公報（特許文献１）には、コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属に属する微生物を培養し、培養液中にＬ−シトルリンを生成蓄積させるＬ−シトルリンの製造法が開示されている。また、特開平０５−１６８４８６号公報（特許文献２）には、ペディオコッカス属に属する乳酸菌にバクテリオファージを感染させて溶菌したものを、Ｌ−アルギニンに作用させて、Ｌ−シトルリンを生成させるＬ−シトルリンの製造方法が開示されている。また、特開平０８−０８９２６９号公報（特許文献３）には、水溶性有機溶剤で乾燥したＬ−オルニチン生産能欠如菌体を、Ｌ−アルギニンに接触作用させて、Ｌ−シトルリンを生成させるＬ−シトルリンの製造方法が開示されている。この公報には、バチルス属、シュードモナス属、ストレプトコッカス属に属する細菌が例示されている。また、特開２０１０−０８８３０１号公報（特許文献４）には、ビブリオ属細菌の発酵法によるＬ−シトルリンの製造方法が開示されている。【０００５】
しかしながら、これら従来技術には、シトルリンの生産効率および生産費の観点から、まだ改善の余地があり、依然として、生産効率や費用対効果の高いシトルリンの調製方法への希求が存在しているといえる。【０００６】
ここで、本発明者らの知る限りでは、乳酸菌の一種であるラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）を用いて、アルギニンからシトルリンやオルニチンを生産することは報告されていないが、L. lactisにより、アルギニンが代謝されることは幾つか報告されている（非特許文献１、２、および３）。例えば、非特許文献１および２には、L. lactisによって、アルギニンの全部がオルニチンに変換されたことが記載されている。また、非特許文献３には、L. lactisによって、アルギニンを代謝した場合に、アルギニンの全部がオルニチンに変換されることが既知の事実として記載されている。そして、特開２００９−１１２２０５号公報（特許文献５）には、チーズ等の製造の発酵過程において、Ｌ−オルニチンを産生させ、オルニチン含有組成物を製造することが記載されている。【０００７】
さらに、アルギニンの代謝に関する遺伝子の発現の研究では、L. lactisにおいて、アルギニンからシトルリンに変換する酵素のアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）と、シトルリンからオルニチンに変換する酵素のオルニチンカーボミルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）の遺伝子が隣接してコードされていることや、これら２つの遺伝子が同一のプロモーターによって、その発現を制御されていることが報告されている（非特許文献４）。【０００８】
また、アルギニンの代謝に関する遺伝子の発現の研究では、L. lactis以外の乳酸菌として、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus planturum）においても、ＡＤＩとＯＴＣの遺伝子が隣接してコードされていることや、これら２つの遺伝子が同一のプロモーターによって、その発現を制御されていることが報告されている（非特許文献５および６）。【０００９】
これらの研究では、リアルタイムＰＣＲを用いて、ＡＤＩとＯＴＣの遺伝子の発現が同時に制御されていることを確認している。そして、L. lactisでは、様々な培養条件において、ＡＤＩとＯＴＣの活性が測定されており（非特許文献１）、その何れの培養条件においても、ＡＤＩよりもＯＴＣの活性が高くなることが報告されている。【００１０】
つまり、これらの研究から、アルギニン代謝能を有する微生物にあっては、ＡＤＩにより、アルギニンはシトルリンへ変換されるが、ＯＴＣにより、シトルリンは直ちにオルニチンへ変換されるため、シトルリンは培養液中に蓄積しないことが示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭６３−０６８０９１号公報
【特許文献２】特開平０５−１６８４８６号公報
【特許文献３】特開平０８−０８９２６９号公報
【特許文献４】特開２０１０−０８８３０１号公報
【特許文献５】特開２００９−１１２２０５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Crow V. L., T. D. Thomas. 1982. Arginine metabolism in lactic streptococci. J. Bacteriol. 150:1024-1032.
【非特許文献２】Poolman B., A. J. M. Driessen, W. N. Konings. 1987. Regulation of arginine-ornithine exchange and arginine deiminase pathway in Streptococcus lactis. Bacteriol., 169: 5597-5604
【非特許文献３】Larsen R., G. Burist, O. P. Kuipers, J. Kok. 2004. ArgR and AhrC are required for regulation of arginine metabolism in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 186: 1147-1157
【非特許文献４】Budin-Verneuil A., E. Maguin, Y. Auffray, D. S. Ehrlich, V. Pichereau. 2006. Genetic structure and trascriptional analysis of the arginine deiminase (ADI) cluster in Lactococcus lactis MG1363. Can. J.Microbiol. 52: 617-622
【非特許文献５】Barcelona B., A. Marina, V. Rubio. 2002. Gene structure, organization, expression, and potential regulatory mechanisms of arginine catabolism in Enterococcus faecalis. J. Bacteriol. 184: 6289-6300
【非特許文献６】Spano G., G. Chieppa, L. Beneduce, S. Massa, 2004. Expression analysis of putative arcA, arcB and arcC genes partially cloned from Lactobacillus plantarum isolated from wine. J. Appl. Microbiol. 96 185-193
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
乳酸菌などの微生物を用いて、アルギニンの大部分をシトルリンへ効率的に変換するためには、シトルリンがオルニチンへ変換されることを抑制することが有効であると考えられた。ところが、本発明者らの知る限りでは、これまでに、アルギニンの大部分をシトルリンへ効率的に変換する方法に関しては報告されていない。【００１４】
本発明者らは、今般、シトルリン産生能を有する微生物を用いて、通常（微生物の培養の至適温度）よりも高い温度で、培地を培養することにより、シトルリンを効率的に微生物に生産させることができるとの知見を得た。また、本発明者らは、シトルリン産生能を有する微生物を用いて、通常（微生物の発酵の至適温度）よりも高い温度で、原料（例えば、原料乳など）を発酵させることにより、シトルリンを高濃度で含む組成物（例えば、発酵乳製品などの飲食品）を製造することができるとの知見を得た。【００１５】
さらに、本発明者らは、アルギニンを培地や原料へ添加して培養や発酵することにより、微生物のシトルリン産生能を高めることができるとの知見を得た。そして、本発明者らは、培地（培養液）のｐＨを制御して培養することにより、微生物の濃度（個数）を高めることができるとの知見を得た。本発明は、これらの知見に基づくものである。【００１６】
従って、本発明は、シトルリンを効率的に生産できるシトルリンの調製方法の提供をその目的としている。また、本発明は、シトルリンを高濃度で含むシトルリン含有組成物の製造方法の提供をその目的としている。【００１７】
さらに、本発明は、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた微生物の培養方法や発酵方法の提供をその目的としている。そして、本発明は、シトルリン産生能を有する微生物の濃度を高めた培養方法の提供をその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
すなわち、本発明は以下の態様（１）〜（１８）に関する。
（１）シトルリン産生能を有する微生物を培地に接種し、４０℃以上７０℃以下の温度で培養することを特徴とする、シトルリンの調製方法。
（２）シトルリン産生能を有する微生物が乳酸菌、ビフィズス菌またはプロピオン酸菌である、（１）に記載のシトルリンの調製方法。
（３）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびラクトバチルス・ブフネリからなる群から選択される１種または２種以上である、（２）に記載のシトルリンの調製方法。
（４）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis spp. lactis） OLS3789株、OLS3797株、およびOLS3818株からなる群から選択される１種または２種以上である、（２）に記載のシトルリンの調製方法。【００１９】
（５）シトルリン産生能を有する微生物を原料に添加（配合）し、４０℃以上７０℃以下の温度で発酵することを特徴とする、シトルリン含有組成物の製造方法。
（６）シトルリン産生能を有する微生物が乳酸菌、ビフィズス菌またはプロピオン酸菌である、（５）に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
（７）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびラクトバチルス・ブフネリからなる群から選択される１種または２種以上である、（６）に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
（８）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis spp. lactis） OLS3789株、OLS3797株、およびOLS3818株からなる群から選択される１種または２種以上である、（６）に記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
（９）原料が原料乳である、（５）〜（８）のいずれかに記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
（１０）シトルリン含有組成物が飲食品である、（５）〜（９）のいずれかに記載のシトルリン含有組成物の製造方法。【００２０】
（１１）シトルリン産生能を有し、かつ４０℃以上７０℃以下の培養温度におけるアルギニンからシトルリンへの変換効率が高められた微生物を含む培養液の調製方法であって、シトルリン産生能を有する微生物を、アルギニンを添加した培地で培養することを特徴とする、調製方法。
（１２）培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、
培養の途中で断続的にアルギニンを添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを添加する、（１１）に記載の培養液の調製方法。
（１３）シトルリン産生能を有する微生物を含み、かつ当該微生物の濃度が高められた培養液の調製方法であって、シトルリン産生能を有する微生物を、ｐＨが５以上７以下の範囲にある培地で培養し、前記微生物の濃度を高めることを特徴とする、調製方法。
（１４）アルカリの添加によって培地のｐＨを調整する、（１３）に記載の培養液の調製方法。【００２１】
（１５）シトルリン産生能を有し、３５℃以上７０℃以下の培養温度におけるアルギニンからシトルリンへの変換効率が高められた微生物を含み、かつ当該微生物の濃度（菌体濃度）が高められた培養液の調製方法であって、シトルリン産生能を有する微生物を、アルギニンを添加し、かつｐＨが５以上７以下の範囲にある培地で培養して前記微生物の濃度を高めることを特徴とする、調製方法。
（１６）培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、
培養の途中で断続的にアルギニンを添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを添加する、（１５）に記載の培養液の調製方法。
（１７）（１１）〜（１６）のいずれかに記載の方法によって得られた培養液を遠心分離および／または膜分離して得られる、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めたシトルリン産生能を有する微生物の調製方法。
（１８）（１１）〜（１６）のいずれかに記載の培養液の調製方法によって得られた培養液または（１７）に記載の微生物の調製方法によって得られた微生物を、培地に接種して培養する、（１）〜（４）のいずれかに記載のシトルリンの調製方法、もしくは原料に添加して発酵させる、（５）〜（１０）のいずれかに記載のシトルリン含有組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のシトルリンの調製方法によれば、シトルリンを効率的に生産できる。また、本発明のシトルリン含有組成物の製造方法によれば、シトルリンを高濃度で含む乳製品などの栄養組成物を得られる。また、本発明の微生物の培養方法や発酵方法によれば、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高められる。そして、本発明の微生物の培養方法によれば、微生物の濃度を高められる。さらに、本発明のシトルリンの調製方法やシトルリン含有組成物の製造方法によれば、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、および／または微生物の濃度を高めた、シトルリン産生能を有する微生物ならびに／もしくは当該培養液を用いて、シトルリンを効率的に生産できるし、シトルリンを高濃度で含む乳製品などの栄養組成物を得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】水酸化ナトリウムを用いて、培地（培養液）のｐＨを５．５に制御して、L. lactis OLS3797株を培養したときのL. lactis OLS3797株の菌体濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】培地（培養液）のｐＨを制御して、L. lactis OLS3797株を培養（ｐＨ制御培養）したときの培養開始から１０、１１、１２時間後の培養液と、L. lactis OLS3797株を静置培養したときの培養液における、アルギニンからシトルリンへの変換効率の比較を示すグラフである。
【図３】培養の前にアルギニンをＭＲＳ培地に添加して、L. lactis OLS3797株を培養したときのｐＨの経時変化、菌体濃度の経時変化、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】培養開始から１０時間後にアルギニンを断続的にＭＲＳ培地に添加して、L. lactis OLS3797株を培養したときのｐＨの経時変化、菌体濃度の経時変化、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】培養開始から４時間後にアルギニンを継続的にＭＲＳ培地に添加して、L. lactis OLS3797株を培養したときのｐＨの経時変化、菌体濃度の経時変化、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
シトルリンの調製方法
本発明のシトルリンの調製方法は、シトルリン産生能を有する微生物を培地に接種し、通常（微生物の培養の至適温度）よりも高い温度で培養することを特徴とする。培養温度は、具体的には４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下である。また本発明の別の態様によれば、前記培養温度は４０℃以上７０℃以下であり、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。
【００２５】
前記したとおり、本発明における培養温度は、シトルリン産生能を有する微生物の通常の培養温度（例えば、至適温度）よりも高い温度である。このような温度域で、微生物を培養することによって、シトルリンを効率的に産生させることができる。この理由について、次のように考えられるが、以下の説明（理論）は、あくまでも仮定であって、本発明は、この理論によって、何ら限定されるものではない。すなわち、従来技術において記載したとおり、例えば、アルギニン代謝能を有するL. lactisは、アルギニンをシトルリンに変換する酵素のアルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）と、シトルリンからオルニチンに変換する酵素のオルニチンカーボミルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）の遺伝子を有しており、これら両者は同一のプロモーターにより発現が制御されていると考えられている。このとき、本発明のように、培養温度が高い温度の場合には、ＡＤＩにより、アルギニンからシトルリンへの変換が亢進されるか、ＯＴＣにより、シトルリンからオルニチンへの変換が抑制されるか、または、これら両方の作用や現象に伴って、シトルリンが培地（培養液）に蓄積されると考えられる。つまり、本発明のように、培養温度が高い場合には、アルギニンがシトルリンへ効率的に変換され、このため、シトルリンの効率的な調製方法を実現できると考えられる。
【００２６】
本発明の培養時間は、シトルリン産生能を有する微生物を培養できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されないが、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは３〜３６時間、さらに好ましくは４〜２４時間である。
【００２７】
本発明のシトルリン産生能を有する微生物は、シトルリンを産生するものであれば、特に限定されないが、好ましくは４０℃以上４８℃以下、より好ましくは４２℃以上４７℃以下、さらに好ましくは４４℃以上４６℃以下の温度で培養して、シトルリンを効率的に産生するものであることが好ましい。また本発明の別の態様によれば、前記温度は４０℃以上７０℃以下であり、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。そして、本発明におけるシトルリン産生能を有する微生物は、好ましくは、シトルリン産生能を有する乳酸菌、ビフィズス菌またはプロピオン酸菌であり、より好ましくは、シトルリン産生能を有する乳酸菌またはビフィズス菌であり、さらに好ましくは、シトルリン産生能を有する乳酸菌である。
【００２８】
本発明のシトルリン産生能を有する乳酸菌は、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ブフネリ、エンテロコッカス・フェーカリス、オエノコッカス・オエニ、ペディオコッカス・ペントサセウス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス、およびラクトバチルス・ロイテリからなる群から選択される１種または２種以上であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびラクトバチルス・ブフネリからなる群から選択される１種または２種以上であり、さらに好ましくは、ラクトコッカス・ラクティスである。
【００２９】
本発明のシトルリン産生能を有するラクトコッカス・ラクティスは、好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスおよびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスからなる群から選択される１種または２種以上であり、より好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、さらに好ましくは、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis spp. lactis）OLS3789株、OLS3797株、およびOLS3818株からなる群から選択される１種または２種以上である。なお、これらの菌株は、後記したとおり、寄託機関に寄託されている。
【００３０】
本発明のシトルリン産生能を有するラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスは、前記したとおり、Lactococcus lactis spp. lactis OLS3789であって、独立行政法人 製品評価技術機構 特許微生物寄託センターに受領番号：NITE BP-1387（識別の表示：Lactococcus lactis spp. lactis OLS3789、寄託日：2012年7月18日）で寄託されているもの、Lactococcus lactis spp. lactis OLS3797であって、独立行政法人 製品評価技術機構 特許微生物寄託センターに受領番号：NITE BP-1388（識別の表示：Lactococcus lactis spp. lactis OLS3797、寄託日：2012年7月18日）で寄託されているもの、Lactococcus lactis spp. lactis OLS3818であって、独立行政法人 製品評価技術機構 特許微生物寄託センターに受領番号：NITE BP-1389（識別の表示：Lactococcus lactis spp. lactis OLS3818、寄託日：2012年7月18日）で寄託されているものである。
【００３１】
ここで、Lactococcus lactis spp. lactis OLS3789は、次のような科学的な性質（形態的、培地上の特徴、生理学的な性質など）を有する。
（ａ）形態的な性質
培地(Lactobacilli MRS Agar、DIFCO)上のコロニー性状：円形、白色、Smooth型、扁平状
（ｂ）生理学的な性質
菌形態：球菌、グラム染色：陽性、乳酸発酵形式：ホモ乳酸発酵、好気的発育：＋
【００３２】
（ｃ）その他、当該微生物を特徴付ける性質
16srDNA配列は、以下のとおりである。（OLS3789）
GCTGGCGGGCGTGCCTAATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGT（配列番号：１）
【００３３】
また、Lactococcus lactis spp. lactis OLS3797は、次のような科学的な性質（形態的、培地上の特徴、生理学的な性質など）を有する。
（ａ）形態的な性質
培地(Lactobacilli MRS Agar、DIFCO)上のコロニー性状：円形、白色、Smooth型、扁平状
（ｂ）生理学的な性質
菌形態：球菌、グラム染色：陽性、乳酸発酵形式：ホモ乳酸発酵、好気的発育：＋
【００３４】
（ｃ）その他、当該微生物を特徴付ける性質
16srDNA配列は、以下のとおりである。（OLS3797）
GAAGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGT（配列番号：２）
【００３５】
さらに、Lactococcus lactis spp. lactis OLS3818は、次のような科学的な性質（形態的、培地上の特徴、生理学的な性質など）を有する。
（ａ）形態的な性質
培地(Lactobacilli MRS Agar、DIFCO)上のコロニー性状：円形、白色、Smooth型、扁平状
（ｂ）生理学的な性質
菌形態：球菌、グラム染色：陽性、乳酸発酵形式：ホモ乳酸発酵、好気的発育：＋
【００３６】
（ｃ）その他、当該微生物を特徴付ける性質
16srDNA配列は、以下のとおりである。（OLS3818）
GCGAAGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCGACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGT（配列番号：３）
【００３７】
本発明の培地は、シトルリン産生能を有する微生物を培養できるものから適宜選択されればよく、特に限定されないが、例えば、脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元脱脂乳、及びこれらのタンパク質分解物、ホエイ、ホエイ濃縮物、還元ホエイ、及びこれらのタンパク質分解物、生乳、全脂乳（殺菌乳）、全脂濃縮乳、還元全脂乳等を含むものであり、好ましくは、脱脂乳、還元脱脂乳、及びこれらのタンパク質分解物、ホエイ、還元ホエイ、及びこれらのタンパク質分解物を含むものである。
【００３８】
本発明のシトルリンの調製方法において、シトルリンは培地中に産生される。このとき、シトルリンを含有する培地を、飲食品の原料や素材等として、好ましくは、乳製品の原料や素材等として、そのまま利用してもよいし、この培地からシトルリンを分離（単離等）や濃縮等の処理により加工してから、所望の純度のシトルリンを調製して利用してもよい。このとき、飲食品には、機能性食品、栄養食品等が挙げられ、乳製品には、例えば、乳飲料、発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム等が挙げられる。
【００３９】
シトルリン含有組成物の製造方法
本発明のシトルリン含有組成物の製造方法は、シトルリン産生能を有する微生物を原料に添加（配合）し、通常（微生物の発酵の至適温度）よりも高い温度で発酵することを特徴とする。発酵温度は、具体的には、４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下である。また本発明の別の態様によれば、前記発酵温度は４０℃以上７０℃以下であり、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。
【００４０】
前記したとおり、本発明における発酵温度は、シトルリン産生能を有する微生物の通常の発酵温度（例えば、至適温度）よりも高い温度である。このような温度域で、微生物を培養することによって、シトルリンを効率的に産生させることができる。この理由については、本発明のシトルリンの調製方法において既に説明した理由と同様に考えられる。
【００４１】
また、本発明のシトルリンの調製方法において、シトルリンを含有する培地からシトルリンを単離せずに、そのまま培地をシトルリン含有組成物として利用してもよいし、または、所望の操作（例えば、遠心分離、膜分離など）で処理した培地をシトルリン含有組成物として利用してもよい。
【００４２】
本発明の発酵時間は、シトルリン産生能を有する微生物が発酵できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されないが、好ましくは２〜２４時間、より好ましくは３〜１６時間、さらに好ましくは４〜１２時間である。
【００４３】
本発明の原料は、シトルリン産生能を有する微生物が発酵できるものから適宜選択されればよく、特に限定されないが、例えば、脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元脱脂乳、及びこれらのタンパク質分解物、ホエイ、ホエイ濃縮物、還元ホエイ、及びこれらのタンパク質分解物、生乳、全脂乳（殺菌乳）、全脂濃縮乳、還元全脂乳等を含むものであり、好ましくは、脱脂乳、還元脱脂乳、及びこれらのタンパク質分解物、ホエイ、還元ホエイ、及びこれらのタンパク質分解物を含むものである。
【００４４】
本発明の好ましい一態様によれば、原料として、原料乳を用いれば、シトルリン含有組成物として、乳原料または乳製品等が得られる。この得られた乳原料または乳製品等（シトルリン含有組成物）には、シトルリンに由来する機能が付加されており、その栄養的な価値が高められている。さらに、本発明の乳原料または乳製品等では、シトルリンを外部から添加（配合）するのではなく、その製造工程において、シトルリン含有量を高めることができるため、その乳原料または乳製品等に基づく最終製品の製造費等を低く抑えることができる。
【００４５】
本発明の別の好ましい一態様によれば、原料として、発酵乳ミックス（より好ましくは、ヨーグルトミックス）を用いれば、シトルリン含有組成物として、発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）が得られる。この得られた発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）には、シトルリンに由来する機能が付加されており、その栄養的な価値が高められている。さらに、本発明の発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）では、シトルリンを外部から添加（配合）するのではなく、その製造工程において、シトルリン含有量を高めることができるため、その発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）に基づく最終製品の製造費等を低く抑えることができる。
【００４６】
本発明のシトルリン含有組成物の製造方法において、シトルリンは原料中に産生される。このとき、シトルリンを含有する原料を、飲食品の原料や素材等として、好ましくは、乳製品の原料や素材等として、そのまま利用してもよいし、この原料からシトルリンを分離（単離等）や濃縮等の処理により加工してから、所望の純度のシトルリンを調製して利用してもよい。このとき、飲食品には、機能性食品、栄養食品等が挙げられ、乳製品には、例えば、乳飲料、発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム等が挙げられる。
【００４７】
シトルリン含有飲食品
前記したとおり、本発明のシトルリンの調製方法により得られるシトルリンを含む培地、または本発明によるシトルリン含有組成物の製造方法により得られるシトルリンを含む原料、あるいはこれらの加工品は、前記培地や原料として飲食品に適切な任意のものを選択して用いることにより、各々を飲食品そのものあるいは飲食品の原料または素材とすることができる。従って、本発明によれば、本発明のシトルリンを含む培地、またはシトルリンを含む原料、あるいはこれらの加工品を、飲食品そのものあるいは飲食品の原料または素材として利用した、シトルリン含有飲食品を提供することができる。
【００４８】
また、前記した本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法により得られる、シトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいはこれらの加工品を、飲食品（好ましくは、乳製品、より好ましくは、発酵乳）に添加（配合）して、その飲食品にシトルリンに由来する機能を付加することができる。従って、本発明によれば、本発明のシトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいは、これらの加工品を、飲食品に添加して、シトルリン含有飲食品を提供することができる。
【００４９】
本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法によれば、シトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいはこれらの加工品について、その調製費（加工費）や製造費等を低く抑えて効率的に提供することができる。従って、本発明のシトルリンまたはシトルリン含有組成物を用いることで、シトルリンに由来する機能を付加する等して商品価値を高めながら、シトルリン含有飲食品について、その製造工程においてシトルリン含有量を高めることができる等の理由により、その製造費等を低く抑えて効率的に提供することができる。
【００５０】
本発明のシトルリン含有飲食品は、シトルリンの含有を許容するものであればよく、特に限定されないが、例えば、乳飲料、発酵乳（より好ましくは、ヨーグルト）、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム等の乳製品が挙げられる。
【００５１】
アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法
本発明のアルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法は、前記微生物を通常（微生物の発酵の至適温度）よりも高い培養温度において、アルギニンを添加した培地で培養することを特徴とする。前記培養温度は、具体的には４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下である。また本発明の別の態様によれば、前記培養温度は４０℃以上７０℃以下であり、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。
【００５２】
本発明の好ましい一態様によれば、本発明のシトルリン産生能を有する微生物を、４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下の温度で培養する、前記微生物のシトルリン産生能の向上方法が提供される。また本発明の別の態様によれば、前記培養を４０℃以上７０℃以下で行い、好ましい培養の上限温度は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限温度は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。このとき、本発明のシトルリン産生能を有する微生物には、本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法で得られた培養物または組成物を適切に処理することにより得られた、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた微生物を用いることができる。
【００５３】
前記したとおり、本発明の好ましい一態様の培地は、アルギニンを添加した培地である。このような培地の組成（配合）で、微生物を培養することによって、シトルリンを効率的に産生させることができる。この理由について、次のように考えられるが、以下の説明（理論）は、あくまでも仮定であって、本発明は、この理論によって、何ら限定されるものではない。すなわち、従来技術において記載したとおり、例えば、上記の非特許文献１および２には、L. lactisのアルギニンの代謝活性について、アルギニンを培地に添加すると、ＡＤＩおよびＯＣＴをコードする遺伝子の転写量が増大することが報告されている。この知見によれば、アルギニンを培地へ添加することにより、ＡＤＩをコードする遺伝子の転写量の増大が予想され、４０℃以上７０℃、ある場合には４８℃以下という培養温度が高い温度の場合にも、この現象が維持されていることが考えられる。なお、アルギニンを培地に添加することにより、ＡＤＩをコードする遺伝子の転写量が増大することや、４０℃以上７０℃以下、ある場合には４８℃以下という培養温度が高い温度の場合にも、この現象が維持され、あるいはＯＣＴをコードする遺伝子の転写量が抑制されることは、直ちには予想しにくい。従って、本発明が非特許文献１および２から自明であると判断することは妥当でない。
【００５４】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、培養の途中で断続的にアルギニンを培地に添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを培地に添加する。これにより、シトルリン産生能を有する微生物のシトルリン産生能を高めることができる。このとき、シトルリン産生能を有する微生物が、十分な濃度のアルギニンと接触する時間が長いことが好ましい。従って、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、培養の前にアルギニンを培地に添加（配合）することが好ましく、培養の前にアルギニンを培地に添加すると共に、培養の途中で断続的又は継続的にアルギニンを培地に添加（追加）することがより好ましく、とりわけ、培養の途中で継続的にアルギニンを培地に添加することがさらに好ましい。
【００５５】
本発明のアルギニンの添加量は、シトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいは、これらの加工品を調製や製造できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されないが、培地に対し、好ましくは０．５〜５質量％、より好ましくは０．７〜４質量％、さらに好ましくは１〜３質量％である。
【００５６】
本発明のアルギニンの添加方法は、培地に対し、アルギニンを無菌的に添加（配合）できればよく、特に限定されないが、培地に対し、アルギニンを添加した後に、当該培地を加熱殺菌や濾過滅菌してもよく、あるいは、アルギニン水溶液を別途調製し、当該アルギニン水溶液を加熱殺菌や濾過滅菌した後に、培地に対し、これを添加してもよい。
【００５７】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、ｐＨが５以上７以下の範囲にある培地を使用し、好ましくはｐＨが５以上６．５以下の範囲にある培地を使用し、より好ましくはｐＨが５以上６以下の範囲にある培地を使用し、さらに好ましくはｐＨが５．５以上６以下の範囲にある培地を使用する。これにより、シトルリン産生能を有する微生物の濃度（菌体濃度）を高めることができ、シトルリン産生能を高めることができる。このとき、アルカリの添加によって培地のｐＨを調整することが好ましく、アルカリとしてアルギニンまたはアルカリ金属水酸化物を用いることがより好ましい。
【００５８】
本発明の一態様において、「ｐＨが５以上７以下の範囲の培地で培養する」とは、好ましくは、培養の初期から終了まで、培地のｐＨが５以上７以下の範囲にあることを意味するが、必ずしも、培養の初期から終了まで常に、培地のｐＨが５以上７以下の範囲にあることを意味するものではない。すなわち、培地のｐＨが５以上７以下の範囲にある状態において、アルギニンからシトルリンへの変換効率が高まるために十分な時間で培養すればよく、具体的には１〜６０時間、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは３〜３６時間、さらに好ましくは４〜２４時間で培養すればよい。
【００５９】
本発明のアルカリの添加方法は、培地のｐＨを所定の範囲に制御又は管理できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されない。例えば、ｐＨ計とコンピューター等を用いて、培地のｐＨを断続的又は継続的に観察しながら、培地のｐＨを所定の範囲で断続的又は継続的に制御又は管理することが好ましく、培地のｐＨを継続的に観察しながら、培地のｐＨを所定の範囲で継続的に制御や管理することがより好ましい。
【００６０】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する前に、その微生物を賦活培養してもよい。賦活培養の培養条件は、シトルリン産生能を有する微生物の種類に応じて適宜選択されればよく、特に限定されない。
【００６１】
本発明の一つの態様によれば、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液から、その微生物の菌体を遠心分離や膜分離などの処理に付してから、本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法に、その菌体を用いてもよい。
【００６２】
アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む組成物の製造方法
本発明のアルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む組成物の製造方法は、前記微生物を通常（微生物の発酵の至適温度）よりも高い培養温度において、アルギニンを添加した原料で発酵することを特徴とする。前記培養温度は、具体的には４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下である。また本発明の別の態様によれば、前記培養温度は４０℃以上７０℃以下であり、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。
【００６３】
本発明の好ましい一態様によれば、本発明のシトルリン産生能を有する微生物を、４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下の温度で発酵する、前記微生物のシトルリン産生能の向上方法が提供される。また本発明の別の態様によれば、前記発酵温度は４０℃以上７０℃以下であり、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である。このとき、本発明のシトルリン産生能を有する微生物には、本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法で得られた培養物または組成物を適切に処理することにより得られる、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた微生物を用いることができる。
【００６４】
前記したとおり、本発明の好ましい一態様の原料は、アルギニンを添加した原料である。このような原料の組成（配合）で、微生物を発酵することによって、シトルリンを効率的に産生させることができる。この理由について、本発明のアルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法において説明した理由と同様に考えられる。
【００６５】
本発明のアルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法において、シトルリンを含有する培地からシトルリンを単離せずに、そのまま培地をシトルリン含有組成物として利用してもよいし、または、所望の操作（例えば、遠心分離、膜分離など）で処理した培地をシトルリン含有組成物として利用してもよい。
【００６６】
本発明のアルギニンの添加量は、シトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいは、これらの加工品を調製や製造できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されないが、原料に対し、好ましくは０．５〜５質量％、より好ましくは０．７〜４質量％、さらに好ましくは１〜３質量％である。
【００６７】
本発明のアルギニンの添加方法は、培地に対し、アルギニンを無菌的に添加（配合）できればよく、特に限定されないが、原料に対し、アルギニンを添加した後に、当該原料を加熱殺菌や濾過滅菌してもよく、あるいは、アルギニン水溶液を別途調製し、当該アルギニン水溶液を加熱殺菌や濾過滅菌した後に、原料に対し、これを添加してもよい。
【００６８】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、培養の途中で断続的にアルギニンを培地に添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを培地に添加する。これにより、シトルリン産生能を有する微生物のシトルリン産生能を高めることができる。このとき、シトルリン産生能を有する微生物にとって、十分な濃度のアルギニンと接触する時間が長いことが好ましい。従って、培養の前にアルギニンを培地又は原料に添加（配合）することが好ましく、培養の前にアルギニンを培地に添加すると共に、培養の途中で断続的（例えば、所定量を一括して）又は継続的（例えば、少量ずつで徐々に）にアルギニンを培地に添加（追加）することがより好ましく、とりわけ、培養の途中で継続的にアルギニンを培地に添加することがさらに好ましい。これにより、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めることができる。
【００６９】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を用いて発酵する前に、その微生物を賦活培養してもよい。賦活培養の培養条件は、シトルリン産生能を有する微生物の種類に応じて適宜選択されればよく、特に限定されない。
【００７０】
本発明の一つの態様によれば、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む組成物から、その微生物の菌体を遠心分離や膜分離などしてから、本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法に、その菌体を用いてもよい。
【００７１】
微生物の濃度（菌体濃度）を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法
本発明の微生物の濃度（菌体濃度）を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法は、前記微生物を通常（微生物の発酵の至適温度）の培養温度において、ｐＨが５以上７以下の範囲にある培地で培養することを特徴としており、前記微生物を、３５℃以上４８℃以下、好ましくは３８℃以上４８℃以下、より好ましくは４０℃以上４８℃以下、さらに好ましくは４２℃以上４７℃以下、特に好ましくは４４℃以上４６℃以下の培養温度において、ｐＨが５以上７以下の範囲、好ましくはｐＨが５以上６．５以下の範囲、より好ましくはｐＨが５以上６以下の範囲、さらに好ましくはｐＨが５．５以上６以下の範囲にある、アルギニンを添加した培地で培養することを特徴とする。つまり、ここでは、シトルリン産生能を有する微生物の培養に適した温度（例えば、至適温度）において、前記微生物を培養してもよい。本発明の別の態様によれば、前記微生物を、３５℃以上７０℃以下の培養温度（ここで、下限は好ましくは３８℃、より好ましくは４０℃、さらに好ましくは４２℃、特に好ましくは４４℃であり、上限は好ましくは６８℃、さらに好ましくは６５℃である）において、ｐＨが５以上７以下の範囲、好ましくはｐＨが５以上６．５以下の範囲、より好ましくはｐＨが５以上６以下の範囲、さらに好ましくはｐＨが５．５以上６以下の範囲にある、アルギニンを添加した培地で培養することを特徴とする。
【００７２】
本発明の好ましい一態様によれば、本発明のシトルリン産生能を有する微生物を、３５℃以上４８℃以下、好ましくは３８℃以上４８℃以下、より好ましくは４０℃以上４８℃以下、さらに好ましくは４２℃以上４７℃以下、特に好ましくは４４℃以上４６℃以下の温度で培養する、前記微生物の濃度（菌体濃度）の向上方法が提供される。本発明の別の態様によれば、前記微生物を、３５℃以上７０℃以下の培養温度（ここで、下限は好ましくは３８℃、より好ましくは４０℃、さらに好ましくは４２℃、特に好ましくは４４℃であり、上限は好ましくは６８℃、さらに好ましくは６５℃である）で培養する、前記微生物の濃度（菌体濃度）の向上方法が提供される。このとき、本発明のシトルリン産生能を有する微生物には、本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法で得られた培養物または組成物を適切に処理することにより得られる、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた微生物を用いることができる。
【００７３】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、ｐＨが５以上７以下の範囲にある培地を使用し、好ましくはｐＨが５以上６．５以下の範囲にある培地を使用し、より好ましくはｐＨが５以上６以下の範囲にある培地を使用し、さらに好ましくはｐＨが５．５以上６以下の範囲にある培地を使用する、前記微生物の濃度（菌体濃度）の向上方法が提供される。これにより、シトルリン産生能を有する微生物の濃度（菌体濃度）を高めることができ、シトルリン産生能を高めることができる。このとき、アルカリの添加によって培地のｐＨを調整することが好ましく、アルカリとしてアルギニンまたはアルカリ金属水酸化物を用いることがより好ましい。
【００７４】
本発明のアルギニンの添加量は、シトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいは、これらの加工品を調製や製造できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されないが、培地に対し、好ましくは０．５〜５質量％、より好ましくは０．７〜４質量％、さらに好ましくは１〜３質量％である。
【００７５】
本発明の一態様において、「ｐＨが５以上７以下の範囲の培地で培養する」とは、好ましくは、培養の初期から終了まで、培地のｐＨが５以上７以下の範囲にあることを意味するが、必ずしも、培養の初期から終了まで常に、培地のｐＨが５以上７以下の範囲にあることを意味するものではない。すなわち、培地のｐＨが５以上７以下の範囲にある状態において、菌体濃度が高まるために十分な時間で培養すればよく、具体的には１〜６０時間、好ましくは２〜４８時間、より好ましくは３〜３６時間、さらに好ましくは４〜２４時間で培養すればよい。
【００７６】
アルカリの添加方法は、培地のｐＨを所定の範囲に制御又は管理できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されない。例えば、ｐＨ計とコンピューター等を用いて、培地のｐＨを断続的又は継続的に観察しながら、培地のｐＨを所定の範囲に制御又は管理することが好ましく、培地のｐＨを継続的に観察しながら、培地のｐＨを所定の範囲に制御又は管理することがより好ましい。
【００７７】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する前に、その微生物を賦活培養してもよい。賦活培養の培養条件は、シトルリン産生能を有する微生物の種類に応じて適宜選択されればよく、特に限定されない。
【００７８】
本発明の一つの態様によれば、菌体濃度を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液から、その微生物の菌体を遠心分離や膜分離などの処理に付してから、本発明のシトルリンの調製方法またはシトルリン含有組成物の製造方法に、その菌体を用いてもよい。
【００７９】
本発明の一態様において、アルギニンをアルカリとして用いる際に、当該アルギニンは、本発明のシトルリンの調製方法、本発明のシトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法などで培地に添加するアルギニンと共通する。従って、前記の調製方法などでアルギニンを培地に過剰に添加した場合には、当該培地のｐＨがアルカリ側に変化し、当該培地のｐＨが５以上７以下の範囲から大きく外れてしまうことがある。このようにアルギニンを培地に過剰に添加した場合には、シトルリン産生能を幾らか高められるため、シトルリン産生能を高めることのみを目的とすれば許容されるが、菌体濃度を十分には高められないこともある。そのため、このような場合には、シトルリン産生能を有する微生物（菌体）当たりのシトルリンの産生量（シトルリンの相対量）を高められるものの、当該微生物を含む培養液（培地）当たりのシトルリンの産生量（シトルリンの絶対量）を十分に高められない可能性があるため、留意が必要である。
【００８０】
アルギニンからシトルリンへの変換効率を高め、かつ微生物の濃度（菌体濃度）を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法
本発明のアルギニンからシトルリンへの変換効率を高め、かつ微生物の濃度（菌体濃度）を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製方法は、前記微生物を通常（微生物の発酵の至適温度）よりも高い培養温度において、ｐＨが５以上７以下の範囲にある培地で培養することを特徴としており、前記微生物を、４０℃以上４８℃以下、好ましくは４２℃以上４７℃以下、より好ましくは４４℃以上４６℃以下の培養温度において、ｐＨが５以上７以下の範囲、好ましくはｐＨが５以上６．５以下の範囲、より好ましくはｐＨが５以上６以下の範囲、さらに好ましくはｐＨが５．５以上６以下の範囲にある、アルギニンを添加した培地で培養することを特徴とする。また本発明の別の態様によれば、本発明による調製方法は、前記微生物を、４０℃以上７０℃以下の温度範囲（ここで、好ましい上限は６８℃、より好ましい上限は６５℃であり、好ましい下限は４２℃、より好ましい下限は４３℃である）において、ｐＨが５以上７以下の範囲、好ましくはｐＨが５以上６．５以下の範囲、より好ましくはｐＨが５以上６以下の範囲、さらに好ましくはｐＨが５．５以上６以下の範囲にある、アルギニンを添加した培地で培養することを特徴とする。
【００８１】
つまり、本発明のアルギニンからシトルリンへの変換効率を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製条件、および本発明の微生物の濃度（菌体濃度）を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液の調製条件を併用することで、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高め、かつ微生物の濃度（菌体濃度）を高めた、シトルリン産生能を有する微生物を含む培養液を調製できることとなる。
【００８２】
本発明の一態様において、アルギニンの培地（培養液）への添加方法と、培地（培養液）のｐＨの調整（制御）方法には、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高め、かつ微生物の濃度（菌体濃度）を高められる限りにおいて、前記の方法を適用することができる。
【００８３】
本発明の好ましい一態様によれば、シトルリン産生能を有する微生物を培養する際に、培養の前にアルギニンを培地に添加する、および／または、培養の途中で断続的にアルギニンを培地に添加する、もしくは、培養の途中で継続的にアルギニンを培地に添加する。これにより、シトルリン産生能を有する微生物のシトルリン産生能を高めることができる。このとき、シトルリン産生能を有する微生物にとって、培養の開始時に培地のｐＨが中性程度であることが好ましい。従って、培養の前にアルギニンを培地に添加（配合）しないことが好ましく、培養の前にアルギニンを培地に添加せずに、培養の途中で断続的（例えば、所定量を一括して）又は継続的（例えば、少量ずつで徐々に）にアルギニンを培地に添加（追加）することがより好ましく、とりわけ、培養の途中で継続的にアルギニンを培地に添加することがさらに好ましい。これにより、シトルリン産生能を有する微生物を培養又は発酵する際に、アルギニンからシトルリンへの変換効率を高め、かつ微生物の濃度（菌体濃度）を高めることができる。
【００８４】
本発明のアルギニンの添加量は、シトルリンまたはシトルリン含有組成物、あるいは、これらの加工品を調製や製造できる条件から適宜選択されればよく、特に限定されないが、培地に対し、好ましくは０．５〜５質量％、より好ましくは０．７〜４質量％、さらに好ましくは１〜３質量％である。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。【００８６】
本発明の実施例において、菌体濃度は「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（乳等省令）（日本国）」に記載の乳酸菌数の測定法により測定した。ただし、ＢＣＰ培地の培養温度は３０℃とした。また、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度はＨＰＬＣ法により測定した。【００８７】
実施例１： 乳酸菌とビフィズス菌のアルギニンの代謝能力
下記の第１表に記載した、乳酸菌とビフィズス菌について、アルギニンの代謝能力を調べた。まず、ＭＲＳ培地またはＧＡＭ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。その後、アルギニン水溶液を濾過滅菌してから、これら培地に添加し、アルギニン濃度が２７mMとなるように調整した。これら調整した培地に、下記の第１表に示される乳酸菌とビフィズス菌のＭＲＳ培地の賦活培養液を１重量％で接種した。ラクトコッカスでは、培養温度を３０℃、培養時間を１６時間として、静置状態において好気培養し、その他の菌体では、培養温度を３７℃、培養時間を１６時間として、静置状態において好気培養した。【００８８】
この結果は、下記の第１表に示されるとおりであった。Lactobacillus fermentum JCM1173T、Lactobacillus buchneri NCIMB8007T、Lactococcus lactis ssp.lactis JCM5805T、およびIFO12007において、アルギニンの代謝能力が確認された。【００８９】
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【００９０】
実施例２： Lactococcus lactis ssp.lactisとLactococcus lactis ssp.diacetylactisのアルギニンの代謝能力
実施例１の結果から、Lactococcus lactis ssp.lactisでは、２菌株のうち２菌株ともに、アルギニンの代謝能力が確認された。しかし、これら２菌株では、アルギニンの全部をシトルリンに変換した後に、そのシトルリンの大部分をオルニチンに変換していた。【００９１】
そこで、次に、下記の第２表に記載した、Lactococcus lactis ssp.lactisの２９株と、 Lactococcus lactis ssp.lactisの近縁種であるLactococcus lactis ssp.diacetylactisの１株について、シトルリンをオルニチンに変換しない菌株を探索した。第２表中のNO.1〜NO.29は、Lactococcus lactis ssp.lactisであり、NO.30は、Lactococcus lactis ssp.diacetylactisである。【００９２】
まず、ＭＲＳ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。その後、アルギニン水溶液を濾過滅菌してから、これら培地に添加し、アルギニン濃度が２７mMとなるように調整した。これら調整した培地に、下記の第２表の菌株のＭＲＳ培地の賦活培養液を１重量％で接種した。これら菌株では、培養温度を３０℃、培養時間を１６時間として、静置状態において好気培養した。【００９３】
この結果は、下記の第２表に示されるとおりであった。Lactococcus lactis ssp.lactisの２９菌株の全部において、アルギニンの代謝能力が確認された。ただし、アルギニンの大部分がオルニチンへと変換されており、オルニチンに対するシトルリンの生産比率（「Cit/Orn」）は０．０２〜０．１３と低値であった。また、Lactococcus lactis ssp.diacetylactisの１菌株において、アルギニンの代謝能力は確認されなかった。【００９４】
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【００９５】
実施例３：Lactococcus lactis ssp.lactisのアルギニンの代謝における培養温度（３７℃、４０℃）の影響
培養温度を３７℃または４０℃とした以外は、実施例２と同様にして、菌体を培養し、アルギニンの代謝能力を調べた。この結果は、下記の第３表に示されるとおりであった。ここでは、Cit/Ornが比較的高い菌株を探索し、６菌株を選抜した。【００９６】
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【００９７】
実施例４：還元脱脂乳中のLactococcus lactis ssp. lactisのアルギニンの代謝能力の検証（１）
実施例３の結果から、Cit/Ornが比較的高い菌株を探索し、５菌株を選抜して使用した。すなわち、下記の第４表に記載した５菌株について、アルギニンの代謝能力を調べた。このとき、培地として、アルギニンを１重量％で添加した還元脱脂乳（脱脂粉乳の濃度：１０重量％）（以降「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」と記す）を使用した。【００９８】
下記の第４表に記載した５菌株のＭＲＳ培地の賦活培養液の２０ｍＬを遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、これら５菌株の菌体を回収した。その後、「1% Arg + 10%還元脱脂乳」の４０ｍＬを９５℃、３分間で殺菌したところに、前記のように回収した５菌株の菌体を接種した。なお、還元脱脂乳にアルギニンを添加する際には、まずアルギニンの水溶液を調製し、塩酸でｐＨを調整してから、還元脱脂乳と混合した。これら５菌株では、培養温度を４０℃および４３℃、培養時間を４時間および８時間として、静置状態において好気培養した。【００９９】
この結果は、下記の第４表に示されるとおりであった。ここでは、Cit/Ornが比較的高い菌株を探索するとともに、Cit/Ornが比較的高い培養温度と培養時間を探索した。これら菌株では、全体として、培養温度が高いほど、そして、培養時間が長いほど、Cit/Ornが高くなる傾向が確認された。【０１００】
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【０１０１】
実施例５：還元脱脂乳中のLactococcus lactis ssp. lactisのアルギニンの代謝能力の検証（２）
培養温度を４４．５℃、４６℃、さらに５０℃から５度刻みで７０℃までとした以外は、実施例４と同様にして、菌体を培養し、アルギニンの代謝能力を調べた。この結果は、下記の第５表に示されるとおりであった。なお、実施例４の結果から、Cit/Ornが比較的高い菌株を探索し、３菌株を選抜して使用した。【０１０２】
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【０１０３】
実施例６：Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株またはOLS3818株を使用したシトルリンを含むヨーグルトの製造
Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株またはOLS3818株を使用し、シトルリンを含む発酵乳（ヨーグルト）を製造した。すなわち、下記の第６表に記載した原料乳（ヨーグルトベース）を調合し、９５℃、３分間で殺菌した。そして、この原料乳に、ヨーグルトスターターとして、Lactobacillus bulgaricusおよびStreptococcus thermophilusの混合スターターを２重量%で添加するとともに、Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株またはOLS3818株を添加し、４５℃で発酵させて、ヨーグルトを製造した。なお、ここで、Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株およびOLS3818株として、ＭＲＳ培地の培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体のみを回収して使用した。このとき、ＭＲＳ培地の使用量は、下記の第６表に記載した原料乳の使用量と同じ重量とした。【０１０４】
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【０１０５】
Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株を使用した場合には、５時間３０分で酸度が０．８０％に達した。また、Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3818株を使用した場合には、４時間３０分で酸度が０．８３％に達した。これら２菌株を使用した場合には、発酵が順調に進行したことが確認された。また、これら発酵乳（ヨーグルト）の風味と物性は、通常品や従来品と比較して大差はなかった。【０１０６】
これら発酵乳（ヨーグルト）のアルギニン、シトルリン、オルニチンの濃度を測定した。この結果は、下記の第７表に示されるとおりであった。アルギニンの大部分が代謝され、その大半がシトルリンへ変換されることが確認された。つまり、Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株またはOLS3818株を使用し、シトルリンを高濃度で含む発酵乳（ヨーグルト）を製造できることが明らかとなった。【０１０７】
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【０１０８】
実施例７：アルギニンからシトルリンへの変換効率の高い菌株（Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株）の培養液の調製方法の検討（１）
アルギニンからシトルリンへの変換効率（活性）の高い培養液の調製方法について検討した。上記の実施例では、L. lactisをＭＲＳ培地で静置培養して培養液を調製した。その結果として、L. lactisを静置培養すると、培養液のｐＨの低下に伴い、L. lactisの増殖が停止し、菌体濃度が高まらないことが観察された。そこで、アルカリを培養液に添加し、培養液のｐＨの低下を抑制して、そのｐＨを制御しながら、L. lactisをＭＲＳ培地で攪拌培養（ｐＨ制御培養）することで、菌体濃度への影響を検討した。つまり、L. lactisをＭＲＳ培地でｐＨ制御培養することで、L. lactisの培養液における単位容量当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まる可能性について検討した。なお、ＭＲＳ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。【０１０９】
水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨ：１０重量％）を培養液に添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら、L. lactis OLS3797株を攪拌培養（ｐＨ制御培養）し、菌体濃度を経時的に測定した。具体的には、L. lactis OLS3797株のＭＲＳ培地の賦活培養液（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）を、ＭＲＳ培地に１重量%で接種して攪拌培養（培養温度：３０℃、撹拌速度：２００ｒｐｍ）した。この菌体濃度の経時的な変化は、図１に示されるとおりであった。【０１１０】
培養開始から１０、１１、１２時間後におけるｐＨ制御培養の培養液を採取し、これら培養液を氷水中で冷却保存した。そして、この培養液を「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量%で接種して静置培養（培養温度：４４．５℃、培養時間：８時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。このとき、比較対照として、前記の培養液をＭＲＳ培地に５重量%で接種して静置培養（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。この結果は、図２および下記の第８表に示されるとおりであった。【０１１１】
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【０１１２】
以上のとおり、ＭＲＳ培地で静置培養した場合に比較して、ＭＲＳ培地でｐＨ制御培養した場合では、L. lactisの培養液における単位容量当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まることが確認された。一方、ＭＲＳ培地で静置培養した場合に比較して、ＭＲＳ培地でｐＨ制御培養した場合では、L. lactisの培養液における単位時間・単位菌体当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率に差はなかった。つまり、静置培養に比較して、ｐＨ制御培養では、菌体濃度は高まるが、単位菌体当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率は変化しないと判断できた。なお、単位時間・単位菌体当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率は、培養開始から４時間後と８時間後のシトルリンの濃度を、初発の生菌数と培養時間（４時間と８時間）で除した数値として算出した。【０１１３】
さらに、ｐＨ制御培養の培養開始から１２時間後の培養液を使用した場合について、「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」における培養開始から４時間後と８時間後の菌数を調べた。その結果として、これら菌数は、それぞれ1×10 6 cfu/mLと1×10 4 cfu/mL （cfu ： colony forming unit）であり、培養開始から時間の経過に伴い、菌数が低下していた。よって、アルギニンからシトルリンへの変換効率の測定中に、ＡＤＩが産生される可能性は低く、菌体自身が保有していたＡＤＩにより、アルギニンからシトルリンへ変換されていると推測できた。このとき、培養開始から時間の経過に伴い、ＡＤＩの活性が幾らか低下している可能性はあるが、培養開始から４時間と８時間後の変換効率に大差はなかった。【０１１４】
実施例８：アルギニンからシトルリンへの変換効率の高い菌株（Lactococcus lactis ssp.lactis 3797株）の培養液の調製方法の検討（２）
実施例７において、L. lactisをｐＨ制御培養すると、菌体濃度（菌数）は高まったが、単位時間・単位菌体当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率は変化しなかった。そこで、L. lactisの培養を開始する前に、アルギニンをＭＲＳ培地に添加して静置培養することで、L. lactisの培養液における単位容量当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まる可能性について検討した。すなわち、L. lactis OLS3797株を通常のＭＲＳ培地と、アルギニンを０．５重量%で含むＭＲＳ培地で静置培養し、その培養液を使用して、「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」におけるアルギニンからシトルリンへの変換効率を測定した。ここで、ＭＲＳ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。【０１１５】
具体的には、L. lactis 3797株の賦活培養液（培養温度３０℃、培養時間１６時間）を、ＭＲＳ培地に１重量％で接種して静置培養（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）した。そして、この培養液の２０ｍＬを遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体のみを回収してから、「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」の４０ｍＬに接種して、攪拌培養（培養温度：４４．５℃、培養時間：４時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。この結果は、下記の第９表に示されるとおりであった。【０１１６】
一方、前記の賦活培養液を、アルギニンを０．５重量％で含むＭＲＳ培地に１重量％で接種して静置培養（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）した。そして、この培養液の２０ｍＬを遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、菌体のみを回収してから、「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」の４０ｍＬに接種して、攪拌培養（培養温度：４４．５℃、培養時間：４時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。この結果は、下記の第９表に示されるとおりであった。【０１１７】
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【０１１８】
以上のとおり、通常の（従来の）ＭＲＳ培地で静置培養した場合に比較して、アルギニンを含むＭＲＳ培地で静置培養した場合では、L. lactisの培養液における単位時間、単位菌体当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が２倍以上に高まることが確認された。【０１１９】
実施例９：アルギニンからシトルリンへの変換効率の高い菌株（Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株）の培養液の調製方法の検討（３）
実施例８において、アルギニンを培地に添加すると、L. lactisのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まった。そこで、L. lactisの培養を開始する前に、アルギニンをＭＲＳ培地に添加してからｐＨ制御培養することで、L. lactisの培養液における単位容量当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まる可能性について検討した。すなわち、L. lactis OLS3797株を、アルギニンを０．５重量%で含むＭＲＳ培地でｐＨ制御培養し、その培養液を使用して、「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」におけるアルギニンからシトルリンへの変換効率を測定した。ここで、ＭＲＳ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。その後、アルギニン水溶液を濾過滅菌してから、この培地に添加し、アルギニン濃度が０．５重量%となるように調整した。【０１２０】
水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨ：１０重量％）を培養液に添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら、L. lactis OLS3797株を攪拌培養（ｐＨ制御培養）し、菌体濃度などを経時的に測定した。具体的には、L. lactis OLS3797株のＭＲＳ培地の賦活培養液（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）を、アルギニンを０．５重量%で含むＭＲＳ培地に１重量%で接種してから、ＮａＯＨを添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら攪拌培養（培養温度：３０℃、撹拌速度：２００ｒｐｍ）した。この菌体濃度、ｐＨ、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度の経時的な変化は、図３に示されるとおりであった。【０１２１】
以上のとおり、L. lactisの培養を開始する前に、アルギニンを培地へ添加したところ、培養開始時の培地のｐＨが８．３に上昇した。そして、この培養開始時（培養の初期）の培地のｐＨの上昇により、菌株の増殖が遅延したと思われる。ただし、培養の後期（後半）では、乳酸菌（菌体）が順調に増殖し、培養開始から１０時間以降にアルギニンの消費が開始され、１３時間後にアルギニン濃度は０となった。なお、この培養では、最高到達の菌体濃度が2.7×10 9 cfu/mLとなり、実施例７と比較して、菌体濃度が半分（２分の１）以下に低下した。【０１２２】
培養開始から８、９、１０、１１、１２、１３時間後における培養液を採取し、これら培養液を氷水中で冷却保存した。そして、この培養液を「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量%で接種して静置培養（培養温度：４４．５℃、培養時間：８時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。この結果は、下記の第１０表に示されるとおりであった。【０１２３】
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以上のとおり、培養開始から１１時間以降にアルギニンの消費が急激に増加した。これらのアルギニンの消費が速い培養液を使用すると、アルギニンからシトルリンへの変換効率が高まることが確認された。【０１２４】
実施例１０：アルギニンからシトルリンへの変換効率の高い菌株（Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株）の培養液の調製方法の検討（４）
実施例９において、乳酸菌（菌体）の培養を開始する前に、アルギニンを培地へ添加すると、アルギニンからシトルリンへの変換効率が大幅に高まるが、アルギニンを添加しない場合に比較して、最高到達の菌体濃度が低下した。ここで、培養開始時の培地のｐＨが高いと、最高到達の菌体濃度が低下しやすいと考えられた。そこで、L. lactisを培養している途中で、アルギニンを培地（培養液）へ一括して（断続的に）添加して、ｐＨ制御培養することで、L. lactisの培養液における単位容量当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まる可能性について検討した。ここで、ＭＲＳ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。【０１２５】
水酸化ナトリウム水溶液（ＮａＯＨ：１０重量％）を培養液に添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら、L. lactis OLS3797株を攪拌培養（ｐＨ制御培養）して、菌体濃度などを経時的に測定した。このとき、培養開始から１０時間後に、アルギニン水溶液（アルギニン：１０重量％）を濾過滅菌してから、この培地（培養液）に添加し、アルギニン濃度が０．５重量%となるように調整した。具体的には、L. lactis OLS3797株のＭＲＳ培地の賦活培養液（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）を、ＭＲＳ培地に１重量%で接種してから、ＮａＯＨを添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら攪拌培養（培養温度：３０℃、撹拌速度：２００ｒｐｍ）するとともに、培養開始から１０時間後に、アルギニン水溶液を濾過滅菌してから、この培地に添加し、アルギニン濃度が０．５重量%となるように調整した。この菌体濃度、ｐＨ、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度の経時的な変化は、図４に示されるとおりであった。【０１２６】
培養開始から８、１０、１２、１３時間後における培養液を採取し、この培養液を氷水中で冷却保存した。そして、この培養液を「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量%で接種して静置培養（培養温度：４４．５℃、培養時間：４．５時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。この結果は、下記の第１１表に示されるとおりであった。【０１２７】
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以上のとおり、最高到達の菌体濃度が7.1×10 9 cfu/mLとなり、実施例７と比較して、菌体濃度が同程度となった。一方、実施例９と比較して、アルギニンからシトルリンへの変換効率は低下した。【０１２８】
実施例１１：アルギニンからシトルリンへの変換効率の高い菌株（Lactococcus lactis ssp.lactis OLS3797株）の培養液の調製方法の検討（５）
実施例１０において、乳酸菌（菌体）を培養している途中で、アルギニンを培地（培養液）へ一括して（断続的に）添加して、ｐＨ制御培養すると、通常（従来）のｐＨ制御培養する場合と比較して、最高到達の菌体濃度は同程度となるが、乳酸菌（菌体）の培養を開始する前に、アルギニンを培地へ添加する場合と比較して、アルギニンからシトルリンへの変換効率が低下した。そこで、L. lactisを培養している途中で、アルギニンを培地（培養液）へ少量ずつで（継続的に）添加しながら、ｐＨ制御培養することで、L. lactisの培養液における単位容量当たりのアルギニンからシトルリンへの変換効率が高まる可能性について検討した。ここで、ＭＲＳ培地を１２１℃、１５分間で滅菌した。【０１２９】
アルギニン水溶液（アルギニン：１０重量％）を培養液に添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら、L. lactis OLS3797株を攪拌培養（ｐＨ制御培養）して、菌体濃度などを経時的に測定した。このとき、培養開始から４時間後に、アルギニン水溶液（アルギニン：１０重量％）を濾過滅菌してから、この培地（培養液）に添加し、培地のｐＨが５．５となるように調整した。具体的には、L. lactis OLS3797株のＭＲＳ培地の賦活培養液（培養温度：３０℃、培養時間：１６時間）を、ＭＲＳ培地に１重量%で接種してから、アルギニンを添加し、培養液のｐＨを５．５に制御しながら攪拌培養（培養温度：３０℃、撹拌速度：２００ｒｐｍ）するとともに、培養開始から４時間後に、アルギニン水溶液を濾過滅菌してから、この培地に添加し、培地のｐＨが５．５となるように調整した。この菌体濃度、ｐＨ、アルギニン濃度、シトルリン濃度、オルニチン濃度の経時的な変化は、図５に示されるとおりであった。【０１３０】
培養開始から８、１０、１２、１３時間後の培養液を採取し、この培養液を氷水中で冷却保存した。そして、この培養液を「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量％で接種して静置培養（培養温度：４４．５℃、培養時間：４．５時間）し、アルギニンからシトルリンへの変換効率を調べた。この結果は、下記の第１２表に示されるとおりであった。ここで、表中、「Culture」は、培養液をそのままで「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量%で接種したものである。また、「Supernatant」は、培養液を遠心分離して得た上清を「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量%で接種したものである。さらに、「Cell」は、培養液を遠心分離して上清を除いて回収した菌体を−８０℃で凍結保存し、その後に解凍したものを「1% Arg + 10% 還元脱脂乳」に５重量%で接種したものである。【０１３１】
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【０１３２】
ここでは、培養開始から４時間後に、アルギニン（中和剤、基質）の培地（培養液）への添加を開始し、培養終了まで継続した。このとき、アルギニンの培地への添加を開始してから暫くの間、アルギニンは直ちにオルニチンへ変換されていたが、培養の後半では、アルギニンの幾らかはオルニチンへ変換されず、そのまま蓄積されていた。【０１３３】
以上のとおり、最高到達の菌体濃度が6.5×10 9 cfu/mLとなり、実施例７および実施例１０と比較して、菌体濃度が同程度となった。そして、実施例９と比較して、アルギニンからシトルリンへの変換効率が同程度となった。つまり、ここでは、菌体濃度が高まると共に、アルギニンからシトルリンへの変換効率が高まった。【０１３４】
また、菌体の培養液をそのままで使用した場合と比較して、菌体のみを回収して凍結保存した場合にも、アルギニンからシトルリンへの変換効率は同程度となった。そして、培養開始から４〜８時間後には、アルギニンの全部が代謝され、アルギニンの大部分がシトルリンへ変換されていた。【０１３５】
そして、菌体の培養液をそのままで使用する場合に比較して、菌体のみを回収して使用する場合には、培地（培養液）への添加濃度（接種量）は２０分の１〜５０分の１程度へ減少する。ここでは、培地への添加濃度が５重量%であることから、菌体のみを回収して使用する場合には、培地への添加濃度は０．２５〜０．１重量％と試算できる。すなわち、アルギニンを（中和剤として）培養の途中で継続的に（例えば、培養終了まで）添加しながら、ｐＨ制御培養して培養液を調製した場合には、菌体のみを回収して使用すると、シトルリンを高濃度で含む乳製品を効率的に製造できることとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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