(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシン（チオレドキシンリダクターゼを含むものを除く）からなる皮膚におけるカリクレイン７産生促進剤（レドックス制御機構の正常化、または、皮膚炎予防治療を目的として使用するものを除く）。
【請求項２】
請求項１に記載のカリクレイン７産生促進剤を含有する皮膚におけるカリクレイン７産生促進用の組成物（レドックス制御機構の正常化、または、皮膚炎予防治療を目的として使用するものを除く。チオレドキシンリダクターゼを含むものを除く）。
【請求項３】
医薬品、化粧品、食品、飲料のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の皮膚におけるカリクレイン７産生促進用の組成物（レドックス制御機構の正常化、または、皮膚炎予防治療を目的として使用するものを除く。チオレドキシンリダクターゼを含むものを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化に伴って減少するカリクレイン７（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ７）（以下、ＫＬＫ７という。）の産生を促進する剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚から採取した角層におけるＫＬＫ７の発現量は、目尻の弾力性の低下に伴って有意に減少すること、及び目尻のしわ体積率の増加に伴って有意に減少することが知られている（特許文献１）。
また、ヒト表皮角化細胞におけるＫＬＫ７発現量は、カルシウム、ビタミンＤ３、レチノイン酸といった細胞分化に影響を与える分子によって変動することが知られている（非特許文献１）。また、ＫＬＫ７は、銅イオンや亜鉛イオン等の遷移金属イオンがＫＬＫ７アミノ酸側鎖のヒスチジン残基にμＭオーダーで共有結合することで阻害されることが知られている（非特許文献２）。
ＫＬＫ７産生促進剤としては、既に塩化カルシウム、レチノイン酸が知られているが、さらに皮膚外用剤への応用に適した物質の探索が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５３６２２１９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J Invest Dermatol. 2010;130(5):1297-306
【非特許文献２】Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(41):16086-91.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
皮膚老化に伴って減少するＫＬＫ７の産生を促進する剤を提供する。
【０００６】
本発明は以下の構成である。
（１）チオレドキシン、シリビン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物、パントテン酸またはその塩、セダノリド、環状フォスファチジン酸から選ばれる１種以上からなるカリクレイン７産生促進剤。
（２）（１）に記載のカリクレイン７産生促進剤を含有する組成物。
（３）医薬品、化粧品、食品、飲料のいずれかであることを特徴とする（２）に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＫＬＫ７の産生を促進する剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒト組換え体チオレドキシンがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【図２】清酒ＴＲＸがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【図３】シリビンがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【図４】６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物がヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【図５】パントテン酸カルシウムがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【図６】セダノリドがヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【図７】環状フォスファチジン酸がヒト培養表皮角化細胞を用いた試験で、ＫＬＫ７の産生を促進することを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
ＫＬＫ７は分子質量２７，５２５Ｄａの分泌タンパク質である。ＫＬＫ７は、角質層の細胞間どうしの結合部分を切断することにより皮膚表面からの細胞の落屑を促し、組織中では皮膚で多く発現される一方、脳、乳腺、脊髄、腎臓等でも発現が見られる。
皮膚の弾力性低下や、シワの増加は、皮膚内のＫＬＫ７量が低下しているか否かを指標として評価することができる。ＫＬＫ７産生促進剤により、皮膚内のＫＬＫ７量を増加させることで皮膚の抗老化作用が期待できる。
【００１０】
本発明のＫＬＫ７産生促進剤は、チオレドキシン、シリビン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物、パントテン酸またはその塩、セダノリド、環状フォスファチジン酸から選ばれる一種以上からなる。
【００１１】
本発明のチオレドキシンとして、ヒト組換え体チオレドキシン、チオレドキシンを高含有する清酒抽出物を用いることができる。
ヒト組換え体チオレドキシンとはヒトオリゴペプチド−４と称されるE.coliを使った組換え体のペプチドで、市販品としては、オリエンタル酵母工業株式会社製「組換え型ヒト・チオレドキシン」やアリスタヘルスアンドニュートリションサイエンス株式会社製「ｒｈｕＴＲＸ」を用いることができる。
チオレドキシンを高含有する清酒抽出物としては、市販品のアリスタヘルスアンドニュートリションサイエンス株式会社製「清酒ＴＲＸ」を用いることができる。
【００１２】
本発明に用いるシリビンは、抗酸化能、肝臓保護、抗老化作用などが知られているマリアアザミ（Silybum marianum）シリマリン混合物に含まれるフラボノリグナンである。本発明に用いるシリビンとして、シリビンを含有するマリアアザミシリマリン混合物を用いることができる。シリビンとして、市販品のシリビン（Sigma-Aldrich社製）を用いることができる。
【００１３】
本発明には、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物を用いられる。６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネートはワサビに含まれる成分で、ＮＡＤＰＨオキシダーゼに作用して活性酸素生成を阻害して生体内抗酸化物質（グルタチオン、チオレドキシン）を誘導することが知られている食品成分である。６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物として、市販品を使用することが可能であり、例えば金印株式会社製「金印ワサビスルフィニルＫＰＣ−１」が挙げられる。
【００１４】
本発明に用いるパントテン酸は、肉類、小麦胚芽、腎臓、肝臓、ナッツ類、ビール酵母などに含まれている水溶性のビタミンである。パントテン酸はカルシウム塩等の金属塩として用いることができ、パントテン酸カルシウムは化学的な合成法で作られている食品添加物である。パントテン酸またはその塩が不足すると、栄養障害、低血糖症、血液や皮膚の障害などが生じることがある。パントテン酸またはその塩として、市販品を用いることができ、例えば、D-Pantothenic acid hemi calcium salt（パントテン酸カルシウム、Sigma-Aldrich社製）が挙げられる。
【００１５】
本発明に用いるセダノリドは、糖尿病の治療及び予防剤として知られている化合物であり、Apium graveolens（セロリ）やLigusticum officinale（センキョウ）に含まれる成分である。セダノリドとして、市販品を用いることができ、例えば、(＋)-Sedanolide（セダノリド、Enzo Life Science社製）が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いる環状フォスファチジン酸は、大豆を出発物質として製造される環状フォスファチジン酸で、ヒアルロン酸産生増強効果を有することが知られている。環状ファオスファチジン酸として市販品を用いることができ、例えば、ＳＡＮＳＨＯ株式会社製「ｃＰＡ」、日油株式会社製「水添大豆環状リン脂質ＣＰ７」が挙げられる。
【００１７】
本発明のＫＬＫ７産生促進剤を含有する組成物として医薬品、化粧品、食品、飲料などを例示できる。その投与経路も、経口投与、経皮投与のいずれもが可能である。なかでも経皮投与が特に好ましく、化粧品や皮膚外用医薬などの経皮組成物の形態を採用することが好ましい。経口投与などにより、有効成分を皮膚に到達させることもできる。
【００１８】
本発明のＫＬＫ７産生促進剤である、チオレドキシン、シリビン、６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート、パントテン酸またはその塩、セダノリド、環状フォスファチジン酸を含む組成物の製剤化にあたっては、通常の食品、医薬品、化粧料などの製剤化で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、経口投与組成物であれば、例えば、乳糖や白糖などの賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステルなどの界面活性剤、マルチトールやソルビトールなどの甘味剤、クエン酸などの酸味剤、リン酸塩などの緩衝剤、シェラックやツェインなどの皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲルなどの流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などの希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料などが好適に例示出来る。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の非イオン界面活性剤類、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を含有することができる。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を示し、本発明を詳細に説明する。
「ＫＬＫ７産生促進効果の測定方法」
細胞は、NHEK-Neo（ヒト表皮角化細胞、新生児皮膚由来、Life Technologies Japan社製）を用いた。培養液は、EpiLife（登録商標）Medium with 60μM Calcium（Life Technologies Japan社製）にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤セット（倉敷紡績株式会社製）を加えた培地を用いた。
【００２０】
NHEK-Neoを50,000cells/wellの細胞密度で平板12well plateに播種し、一晩３７℃５％ＣＯ２インキュベーターにて細胞定着後、培養液を交換時に４日間成分を暴露して３７℃５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養終了後、培養液を回収し、PBS(−)で細胞を洗浄後、Cell lysis Bufferで細胞を溶解し、Cell Lysateとしてサンプル保存した。
Cell Lysate サンプルはPierce（登録商標）BCA Protein Assay Kit（Pierce社製）にて全タンパク量を定量した。
また、ＫＬＫ７タンパク発現量は、ELISA法で測定した。
【００２１】
市販のELISAプレート（Coster（登録商標） 96well EIA/RIA plate、Fisher Scientific社製）にCapture抗体として、Anti-hKLK7 goat polyclonal antibody（R&D systems社製）1.11μg/ml（希釈培養液はPBS（−）、和光純薬工業株式会社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、シーリングして２０℃で一晩インキュベートした。
ELISAプレートは、Phosphate Buffered Saline (PBS) with Tween（登録商標）20 (PBS-T) （タカラバイオ株式会社製）３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液はReagent Diluent Concentrate（×10蒸留水希釈、R&D systems社製）２００μＬ／ｗｅｌｌを滴下し、シーリングして３７℃１ｈインキュベートした。ブロッキング終了後、ELISAプレートをPBS-T  ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。Cell Lysateサンプルを50倍Pierce RIPA Buffer(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製)で希釈した溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した。併せて、別途のｗｅｌｌに抗原として精製ＫＬＫ７タンパク試料（KLK7,Recombinant,CF,Human、R&D systems社製）を250,000pg/mlから公比１／２で希釈して７点でＫＬＫ７タンパク発現量の検量線を作成した。この抗原−抗体反応は３７℃１．５ｈインキュベートで行った。抗原−抗体反応終了後、ELISAプレートをPBS-T  ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ抗体として、anti-Kallilrein7,goat-poly,Biotin (R&D systems社製)０．２μｇ／ｍｌ（希釈培養液はPBS-T、タカラバイオ株式会社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、３７℃１ｈインキュベートした。反応終了後、ELISAプレートをPBS-T  ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。引き続き、Streptavidin-HRP反応としてStreptavidin-HRP（R&D Systems社製）の５００倍希釈溶液（希釈培養液はPBS-T、タカラバイオ株式会社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、３７℃３０ｍｉｎインキュベートした。反応終了後、ELISAプレートをPBS-T  ３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。発色反応として、室温にてTMB One Solution（Promega社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌ滴下し、１０分間反応させ、反応終了液として０．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ｗｅｌｌを加えて、全量２００μＬ／ｗｅｌｌで吸光度４５０ｎｍをプレートリーダー（装置名：SPECTRAMAX190、モレキュラーデバイス社製）にて読み取って、検量線に対するＫＬＫ７タンパク発現量を算出した。
予め測定した全タンパク量との比でＫＬＫ７タンパク発現量（pg/μg protein）を求めた。
【００２２】
「実施例１」
チオレドキシンのＫＬＫ７産生促進効果
チオレドキシンとして、ヒト組換え体チオレドキシン（rhuTRX、アリスタヘルスアンドニュートリションサイエンス株式会社製）を用いて、ＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図１に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=3,  mean±S.D.で表記した。rhuTRXは１〜１０μｇ／ｍｌの範囲で、濃度依存的に細胞内ＫＬＫ７を増加させた。
また、既にＫＬＫ７産生促進が知られている塩化カルシウムは１ｍＭから０．１ｍＭにおいて、レチノイド（All trans レチノイン酸、和光純薬工業株式会社製）は１００ｎＭから１０ｎＭ添加でそれぞれＫＬＫ７発現量が増加していることを確認し、試験系が妥当であることを確認した。図１中のＣａＣｌ２は塩化カルシウムを表し、ＲＡはAll trans レチノイン酸を表す。なお、All trans レチノイン酸は脂溶性に富む化合物で、そのままでは培養液に溶解できないので、まずAll trans レチノイン酸をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのＤＭＳＯ溶液を培養液に希釈したため、レチノイドの試験系は、ＤＭＳＯを０．０２５％含有している。
ヒト組み換え体チオレドキシンは、塩化カルシウム、レチノイドと比較して、ＫＬＫ７の産生を促進した。
【００２３】
チオレドキシンを高含有する清酒抽出物（アリスタヘルスアンドニュートリションサイエンス株式会社製  清酒ＴＲＸ）を用いて、ＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図２に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=3,  mean±S.D.で表記した。清酒ＴＲＸは５μｇ／ｍｌから１５μｇ／ｍｌにおいて、濃度依存的に細胞内ＫＬＫ７の産生を促進した。
【００２４】
「実施例２」
シリビンのＫＬＫ７産生促進効果
シリビン（Sigma-Aldrich社製）のＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図３に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=2の平均値で表記した。シリビンは０．０５ｍｇ／ｍｌ添加で細胞内ＫＬＫ７の産生を促進した。その他にビタミンＣ（和光純薬工業株式会社製）、ビタミンＥ（関東化学株式会社製）、ＣｏＱ１０（Sigma社製）、アスタキサンチン（Sigma社製）、レスベラトロール（和光純薬工業株式会社製）、αリポ酸（Sigma社製）の効果を調べたが、ＫＬＫ７産生促進効果は認められなかった。この試験系で、コントロール以外のサンプルは、ＤＭＳＯを０．０２５％含有する。
【００２５】
「実施例３」
６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物のＫＬＫ７産生促進効果
６−メチルスルフィニルヘキシルイソチオシアネート含有ワサビ抽出物として、金印株式会社製、金印ワサビスルフィニルＫＰＣ−１を用いて、ＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図４に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=3,  mean±S.D.で表記した。金印ワサビスルフィニルＫＰＣ−１は５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌにおいて、細胞内ＫＬＫ７の産生を促進した。図４中の「ＫＰＣ−１」は金印株式会社製  金印ワサビスルフィニルＫＰＣ−１を表す。
【００２６】
「実施例４」
パントテン酸カルシウムのＫＬＫ７産生促進効果
パントテン酸カルシウム（Sigma-Aldrich社製  D-Pantothenic acid hemi calcium salt）を用いて、ＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図５に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=3,  mean±S.D.で表記した。パントテン酸カルシウムは１０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌにおいて濃度依存的に細胞内ＫＬＫ７タンパク発現量を増加させた。
【００２７】
「実施例５」
セダノリドのＫＬＫ７産生促進効果
セダノリド（Enzo Life Science社製  (＋)−Sedanolide）を用いて、ＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図６に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=3,  mean±S.D.で表記した。セダノリドは０．５μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌにおいて濃度依存的に細胞内ＫＬＫ７タンパク発現量を増加させた。
【００２８】
「実施例６」
環状フォスファチジン酸のＫＬＫ７産生促進効果
環状フォスファチジン酸（ＳＡＮＳＨＯ株式会社製  ｃＰＡ）を用いて、ＫＬＫ７産生促進効果を測定した。測定結果を図７に示す。ＫＬＫ７タンパク発現量は各群n=3,  mean±S.D.で表記した。環状フォフファチジン酸は５μｇ／ｍｌから１５μｇ／ｍｌにおいて濃度依存的に細胞内ＫＬＫ７タンパク発現量を増加させた。
【図１】
0006609401.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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