(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質と連結した三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質複合体であって、前記三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質が、２つの部分からなるアダプター系によって前記異種タンパク質と非共有結合で連結しており、前記アダプター系の一方の部分が前記三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質に融合された第１のアダプターポリペプチドによって形成され、前記アダプターの他方の部分が前記異種タンパク質に融合された第２のアダプターポリペプチドによって形成され、それにより、前記アダプター系の両部分が互いと安定な複合体を形成しており、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、キメラ表面タンパク質複合体。
【請求項２】
前記第１のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質に融合される、請求項１に記載のキメラ表面タンパク質複合体。
【請求項３】
前記第２のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して前記異種タンパク質に融合される、請求項１または２に記載のキメラ表面タンパク質複合体。
【請求項４】
前記第１のアダプターポリペプチドおよび前記第２のアダプターポリペプチドが７アミノ酸反復配列を含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質複合体。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質複合体を含むロタウイルス粒子。
【請求項６】
異種タンパク質と連結した三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質複合体を含む組成物であって、前記三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質が、２つの部分からなるアダプター系によって前記異種タンパク質と非共有結合で連結しており、前記アダプター系の一方の部分が前記三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質に融合された第１のアダプターポリペプチドによって形成され、前記アダプターの他方の部分が前記異種タンパク質に融合された第２のアダプターポリペプチドによって形成され、それにより、前記アダプター系の両部分が互いと安定な複合体を形成しており、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体で再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、組成物。
【請求項７】
前記第１のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質に融合される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第２のアダプターポリペプチドが、リンカー配列を介して前記異種タンパク質に融合される、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ならびに
（ｂ）異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含む、核酸組成物であって、
前記第１のアダプターポリペプチドおよび前記第２のアダプターポリペプチドが互いと安定な複合体を形成し、したがって、キメラ表面タンパク質複合体をもたらすことができ、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、核酸組成物。
【請求項１０】
（ａ）の前記オープンリーディングフレームがさらにリンカー配列をコードする、請求項９に記載の核酸組成物。
【請求項１１】
（ｂ）の前記オープンリーディングフレームがさらにリンカー配列をコードする、請求項９または１０に記載の核酸組成物。
【請求項１２】
前記オープンリーディングフレームがプロモーター配列と作動的に連結している、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項１３】
前記アダプターポリペプチドが７アミノ酸反復配列を含む、請求項９から１２までのいずれか一項に記載の核酸組成物。
【請求項１４】
（ａ）（ｉ）三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸、ならびに（ｉｉ）第２のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含む第２の核酸であって、異種タンパク質のコード領域を前記多重クローニング部位に挿入することにより、前記異種タンパク質および前記第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされる、第２の核酸、あるいは
（ｂ）（ｉ）三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸、ならびに（ｉｉ）異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第２の核酸
を含む、キットであって、
前記第１のアダプターポリペプチドと前記第２のアダプターポリペプチドとが安定な複合体を形成し、したがって、キメラ表面タンパク質複合体をもたらすことができ、前記キメラ表面タンパク質複合体は、二層ロタウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記キメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る、キット。
【請求項１５】
前記キットは、前記三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質と同じ種のロタウイルスに由来するかまたは異なるロタウイルス種に由来するロタウイルス粒子をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
請求項５に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、
外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、
前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、
前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルス二層粒子（ＤＬＰ）を得るステップ、および
前記ロタウイルスＤＬＰを請求項１から４までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質複合体を用いて再外被形成して請求項５に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。
【請求項１７】
請求項５に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、
外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、
前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、
前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルスＤＬＰを得るステップ、ならびに、
前記ロタウイルスＤＬＰを、三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質、７アミノ酸反復配列を含む第１のアダプターポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用いて再外被形成するステップ、ならびに、
再外被形成された前記ロタウイルスＤＬＰを、三量体形成性異種タンパク質、７アミノ酸反復配列を含む第２のアダプターポリペプチドを含む第２の融合タンパク質と混合して請求項５に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記第１の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項５に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、三量体形成性ロタウイルスＶＰ７表面タンパク質、７アミノ酸反復配列を含む第１のアダプターポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を含むロタウイルス粒子を、三量体形成性異種タンパク質、７アミノ酸反復配列を含む第２のアダプターポリペプチドを含む第２の融合タンパク質と混合するステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記第１の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の融合タンパク質がさらにリンカー配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１３年７月８日に出願された欧州特許出願第１３１７５６３７．１号の利益を主張する。上記出願の教示全体は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
参照により本明細書に組み込まれ、出願当初の本出願の一部を形成する配列表の電子コピーをここに提出する。
【０００３】
政府の支援
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより付与された助成金第Ｐ０１−ＧＭ０６２５８０号およびＡＩ−８９６１８号の下、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、異種タンパク質を単独でまたは別の分子との複合体として提示するためのロタウイルス粒子の使用に関する。本発明は、さらに、クライオ電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＥＭ）を使用して異種タンパク質または複合体の構造を迅速に決定するためにこれらの改変ロタウイルス粒子を使用する方法に関する。本発明は、患者を免疫化する方法であって、患者に本発明の改変ロタウイルス粒子を投与するステップを含む方法にも関する。
【背景技術】
【０００５】
Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科は、構造的に関連するウイルスの群を含む。この科のウイルスのメンバーは、哺乳動物および鳥類において胃腸系および気道の感染症を引き起こし得る。この科のいくつかのウイルスは植物にも感染し得る。
【０００６】
Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅは、一般には外側のタンパク質層と１つまたは複数の内部のタンパク質層で構成される正二十面体カプシドから構成される、エンベロープを有さない二本鎖ＲＮＡウイルスである。ロタウイルス属はＲｅｏｖｉｒｉｄａｅ科の一部を形成する。ロタウイルスは三層ウイルス粒子を形成する。ロタウイルス粒子の外層は殻タンパク質、ＶＰ７、およびスパイクタンパク質、ＶＰ４からなり、中央の層はＶＰ６からなり、内層はＶＰ２により形成される。三層ウイルス粒子はトリプシンによって活性化された後に感染性になる。ロタウイルス細胞侵入の間に、ウイルス粒子の外層は「脱外被」と称される機構によって取り除かれ、二層粒子が細胞質に侵入する。細胞侵入の間に、ロタウイルスは細胞膜、ことによるとエンドソーム膜を透過する。二層ロタウイルス粒子は転写的に活性である。細胞質において、二層ロタウイルス粒子はゲノムを転写し、ｍＲＮＡが孔を通ってその表面に押し出される。新しい転写物はロタウイルスタンパク質および新しい二本鎖ＲＮＡゲノムセグメントの生成に使用され、これが新しく形成されるウイルス粒子にパッケージングされる。
【０００７】
いくつかのＲｅｏｖｉｒｉｄａｅに関しては、精製されたウイルス粒子を使用して脱外被プロセスをｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートすることができる。ロタウイルスの場合では、カルシウムキレート化または熱ショックにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてウイルス粒子の脱外被が引き起こされる。外側のタンパク質層が取り除かれたら、生じたロタウイルス二層粒子を、外層を形成するタンパク質の組換えによって発現させたバージョンを用いて「再外被形成」することができる。組換えＶＰ４およびＶＰ７を用いて再外被形成することにより、成熟ビリオンによく似た感染性の再外被形成されたロタウイルス粒子を形成することができる。ＶＰ７を単独で用いて再外被形成することにより、感染性が最小限である、三層のスパイクを欠く粒子を形成することができる。外層の個々のタンパク質のコード領域を遺伝子改変し、それらを組換えによって発現させることにより、再外被形成実験において完全な組換えウイルスの作製を必要とせずに外層を構成するタンパク質の性質を研究することができる。これらの種類の実験を記載するために、「再外被形成遺伝学（ｒｅｃｏａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」という用語を造った。
【０００８】
レオウイルスの場合では、感染性サブウイルス粒子（ｓｕｂｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）が準安定状態であることにより、レオウイルスがそれらの宿主細胞に侵入するために使用する刺激機構の構造的な基礎の解明においてクライオ電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＥＭ）を使用することが可能になっている。同様に、ｃｒｙｏ−ＥＭを使用してロタウイルス集合および脱外被における分子相互作用を研究するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再外被形成されたロタウイルス粒子が使用されてきた。本発明は、これらの再外被形成およびｃｒｙｏ−ＥＭ研究によってもたらされた技術的な進歩を基礎とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
高分解能ｃｒｙｏ−ＥＭと再外被形成遺伝学の組合せにより、ロタウイルス自体の研究を越えて、ロタウイルスモデルの使用を進歩させることが可能になった。本発明者らは、ロタウイルス粒子を、改変ロタウイルス粒子の表面上に提示された異種三量体タンパク質の迅速な構造決定のために使用することができることを見いだした。表面上に異種三量体タンパク質を提示するように改変されたロタウイルス粒子は、広範囲の新規ワクチンを作製することにおいても有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、異種タンパク質と連結したロタウイルス表面タンパク質で構成されるキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子を提供する。本発明の一態様では、ロタウイルス表面タンパク質はリンカー配列を介して異種タンパク質と連結している。本発明の別の態様では、ロタウイルス表面タンパク質はアダプター系を介して異種タンパク質と連結している。本発明の好ましい態様では、異種タンパク質は、２つの部分からなるアダプター系によってロタウイルス表面タンパク質と非共有結合で結合しており、アダプター系の一方の部分はロタウイルス表面タンパク質に連結しており、アダプター系の他方の部分は異種タンパク質と連結しており、それにより、アダプター系の両部分が安定な複合体を形成し、したがって、異種タンパク質をロタウイルス表面タンパク質に非共有結合で付着させている。キメラ表面タンパク質は、それにより二層ロタウイルス粒子（ＤＬＰ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る。
【００１１】
本発明は、ロタウイルス表面タンパク質、第１のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む第１の核酸をさらに提供する。本発明は、異種タンパク質、第２のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸も提供する。第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドは、安定な複合体を形成することができる。一般には、本発明の核酸のオープンリーディングフレームはプロモーター配列と作動的に（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ）連結している。一部の実施形態では、アダプターポリペプチドは、７アミノ酸反復配列を含む。本発明の核酸を含有する細胞も提供される。核酸およびそれを含有する細胞を使用して、本発明のキメラ表面タンパク質を調製することができる。
【００１２】
本発明は、さらに、本発明の第１および第２の核酸配列を含むキットに関する。一部の実施形態では、本発明によるキットは、ロタウイルス表面タンパク質および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸、ならびに第２のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含む第２の核酸であって、それにより、異種タンパク質のコード領域を多重クローニング部位に挿入することによって異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされる第２の核酸を含んでよく、第１のアダプターポリペプチドと第２のアダプターポリペプチドは、安定な複合体を形成することができる。本発明のキットは、ロタウイルス粒子をさらに含んでよい。ロタウイルス粒子は、ロタウイルス表面タンパク質が由来するものと同じ種のロタウイルスに由来するものであっても異なる種に由来するものであってもよい。例えば、アカゲザルロタウイルスＶＰ７を使用してウシロタウイルスから調製したＤＬＰを再外被形成することができ、逆もまた同じである。
【００１３】
キメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子は、種々の方法によって調製することができる。本発明の好ましい方法は、外層を含むネイティブなロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、粒子を培養培地から精製するステップ、粒子から外層を取り除いてロタウイルスＤＬＰを得るステップ、およびロタウイルスＤＬＰを１つまたは複数のキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、キメラ表面タンパク質（複数可）を含むロタウイルス粒子を形成するステップを伴う。ネイティブなロタウイルス粒子は三層粒子であり、最も外側の第３の層がロタウイルス粒子の外側の殻を形成する。
【００１４】
特定の態様では、本発明は、三量体形成性ロタウイルス表面タンパク質、７アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第１の融合タンパク質に関する。本発明は、三量体形成性異種タンパク質、７アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第２の融合タンパク質をさらに提供する。第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質は、それらのそれぞれに含まれる７アミノ酸反復配列を介して安定な複合体を形成することができる。一部の実施形態では、本発明は、第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質によって形成されるキメラ表面タンパク質を提供する。キメラ表面タンパク質は、ロタウイルス粒子の表面上に提示され得る。
【００１５】
本発明の一態様では、キメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子を、キメラ表面タンパク質の一部を形成する異種タンパク質の構造を決定するために使用する。例えば、本発明は、キメラ表面タンパク質の３次元モデルを得るための方法であって、（ｉ）ロタウイルスＤＬＰを、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、キメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、（ｉｉ）懸濁物を凍結させるステップ、（ｉｉｉ）ｃｒｙｏ−ＥＭを使用してロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および（ｉｖ）複数の顕微鏡写真を解析してキメラ表面タンパク質の３次元モデルを得るステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ステップ（ｉ）を２つのステップ、すなわち、（ａ）ロタウイルスＤＬＰを、第１のアダプターを含むロタウイルス表面タンパク質を用いて再外被形成してロタウイルス粒子を形成する再外被形成ステップ、および（ｂ）再外被形成されたロタウイルスＤＬＰを第２のアダプターを含む異種タンパク質の存在下でインキュベートし、それにより、第１のアダプターと第２のアダプターの間で複合体が形成され、その結果、キメラ表面タンパク質がロタウイルス粒子上に提示される、結合ステップに細分することができる。いくつかの場合には、当該方法を、異種タンパク質に特異的に結合する分子と結合した異種タンパク質の構造が決定されるように改変することができる。改変された方法は、（ｉ）ロタウイルスＤＬＰを、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、キメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、（ｉｉ）懸濁物に、異種タンパク質に特異的に結合する分子を添加するステップであって、分子がキメラ表面タンパク質と複合体を形成するステップ、（ｉｉｉ）懸濁物を凍結させるステップ、（ｉｖ）ｃｒｙｏ−ＥＭを使用してロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および（ｖ）複数の顕微鏡写真を解析して分子と複合体を形成したキメラ表面タンパク質の３次元モデルを得るステップを含む。分子はタンパク質性分子であってよい。例えば、タンパク質性分子は、異種タンパク質に特異的に結合する受容体または抗体の全部または一部であってよい。あるいは、タンパク質性分子は、異種タンパク質に特異的に結合するポリペプチドまたはペプチドであってよい。他の実施形態では、分子は非タンパク質性分子である。例えば、非タンパク質性分子は核酸であってよい。
【００１６】
さらなる態様では、本発明に従って調製したロタウイルス粒子を医薬として使用する。一実施形態では、本発明は、本発明のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子を含む免疫原性組成物に関する。本発明は、さらに、それを必要とする患者を治療する方法であって、前記患者に本発明のロタウイルス粒子を、例えば本発明の免疫原性組成物の形態で投与するステップを含む方法に関する。
【００１７】
本発明の基礎をなす概念は、本明細書に記載の方法を適合させることによって他の（三量体または非三量体）異種タンパク質および他のウイルス（特にレオウイルス）または集合体（例えば、ウイルス様粒子、フェリチンケージ（ｆｅｒｒｉｔｉｎ  ｃａｇｅ）など）に拡張することができる。
【００１８】
発明の詳細な説明
ウイルス粒子
ロタウイルスは、５種の公知の型（ロタウイルスＡ〜Ｅ）を含むＲｅｏｖｉｒｉｄａｅ科の中の二本鎖ＲＮＡウイルスの属である。ロタウイルスは小児胃腸炎の主要な原因である。ロタウイルスは、エンベロープを有さない三層正二十面体の粒子である。感染性三層粒子（ＴＬＰ）またはビリオンは、非感染性二層粒子（ＤＬＰ）から、ＤＬＰが殻タンパク質ＶＰ７およびスパイクタンパク質ＶＰ４で被覆されることによって形成される。ＶＰ７は三量体であり、被覆された粒子の外側はそのような三量体２６０個によって装飾されている。ＤＬＰは同心性のＶＰ２およびＶＰ６の正二十面体タンパク質層で構成され、直径が約７００Åであり、１１本の二本鎖ＲＮＡゲノムセグメント、ウイルスポリメラーゼ（ＶＰ１）、およびキャップ形成酵素（ＶＰ３）をカプシドで包む（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）。細胞の感染の間に、低カルシウム環境（おそらくエンドソーム区画内）でロタウイルス粒子の外層を形成するＶＰ４およびＶＰ７タンパク質は、ＤＬＰから解離し（これは「脱外被」と称されるプロセスである）、ウイルスＲＮＡ転写機構を含有するＤＬＰを細胞質に送達する。そこで、ＤＬＰは、１１本のｍＲＮＡ種のコピーを合成し、それにキャップを形成し、それを放出する。
【００１９】
ロタウイルス粒子からのＶＰ４およびＶＰ７の解離または「脱外被」は、ロタウイルス粒子をＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡなどのカルシウムキレート化剤の存在下でインキュベートすることによって、または熱ショックによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。生じたＤＬＰを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、組換えによって発現させたＶＰ４およびＶＰ７を用いて再外被形成して十分に感染性のロタウイルス粒子を形成することができる。このように再外被形成された粒子は、非常に規則正しく、高分解能のｃｒｙｏ−ＥＭ画像および密度マップをもたらす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再構成したＴＬＰを使用すると、ｃｒｙｏ−ＥＭを使用してロタウイルス集合および脱外被における分子相互作用がＸ線結晶構造解析の分解能に匹敵する分解能で研究されている（参考文献１および２を参照されたい）。
【００２０】
本発明者らは、本明細書において、異種三量体タンパク質（例えば、インフルエンザ赤血球凝集素など）を三量体ＶＰ７タンパク質に付着させ、したがって、適切に再外被形成されたロタウイルスＤＬＰの表面から突出し得るキメラ表面タンパク質を形成することができ、したがって、以前にロタウイルスおよびそのサブ粒子（ｓｕｂｐａｒｔｉｃｌｅ）のほぼ原子レベルの分解能構造をもたらしたものと同じｃｒｙｏ−ＥＭ法を用いて異種タンパク質の構造を決定することを可能にできることを実証する。当該方法により、抗原−抗体複合体の構造決定のためのハイスループットなアッセイを開発することが初めて可能になる。これは、抗原−抗体複合体の構造を決定するための最適な方法であったＸ線結晶構造解析の制約に起因して以前は不可能であった。
【００２１】
原理上は、内層および外層を含むエンベロープを有さない正二十面体ウイルス粒子のいずれをも、本発明の方法を実施するために使用することができる。例えば、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を提示することは、ウイルス粒子の産生に関する逆遺伝学系が確立されている任意の正二十面体ウイルスを使用して容易に可能である。哺乳動物レオウイルスに関しては、１０種のレオウイルスｃＤＮＡ構築物からなる、プラスミドに基づく逆遺伝学系が確立されている（参考文献３を参照されたい）。フェリチンケージの八量体対称性も３回対称軸を有し、本発明の実施に適している。３回対称軸を有する粒子状の規則的な構造に集合する他のタンパク質も本発明の実施に適し得る。
【００２２】
理想的には、エンベロープを有さない正二十面体ウイルスのウイルス粒子の外層を、例えば、プロテアーゼ処理によってまたは低カルシウム条件下で取り除くまたは剥がして、内層（複数可）のみを含むサブウイルス粒子をもたらすことができ、組換えによって作製された外層タンパク質を用いて再外被形成することができる。キメラ表面タンパク質の存在が、逆遺伝学的手法を使用して細胞培養で増殖させたウイルスの適切な集合に干渉すると思われる場合には、組換えによって発現させた外層タンパク質（複数可）を付加することによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサブウイルス粒子の完全なウイルス粒子への再集合または再外被形成が特に有利である。さらに、外層タンパク質の発現ベクターのみを構築すればよく、効率的なプラスミドに基づく逆遺伝学系を実施する必要性は排除される。ネイティブなウイルスを組織培養細胞において単純に増殖させることができ、ウイルス粒子から外層を剥がし、組換えによって発現させた外層タンパク質を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて再集合させることができる。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサブウイルス粒子の完全なウイルス粒子への再外被形成を利用する方法を使用すると、多数のプラスミドをトランスフェクトする必要性が排除され、一般にはプラスミドに基づく逆遺伝学系から多数のウイルス粒子をもたらすために必要である追加的な増殖ステップが除かれ、それにより、そのような方法がハイスループットな適用により好ましいものになる。
【００２３】
本発明者らの知見によると、ウイルス粒子の外層を剥がすことができ、サブウイルス粒子を組換えによって発現させた外層タンパク質を用いて再外被形成して感染性ウイルス粒子を形成することができる、公知のエンベロープを有さない正二十面体ウイルスは全てＲｅｏｖｉｒｉｄａｅ科に属する。この科は、２つの亜科、ＳｅｄｏｒｅｏｖｉｒｉｎａｅおよびＳｐｉｎａｒｅｏｖｉｒｉｎａｅに細分され、これらはそれぞれ６つの属および９つの属を含む。Ｓｅｄｏｒｅｏｖｉｒｉｎａｅ亜科は、Ｃａｒｄｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属、Ｍｉｍｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属、Ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ属、Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ属、およびＳｅａｄｏｒｎａｖｉｒｕｓ属を含む。Ｓｐｉｎａｒｅｏｖｉｒｉｎａｅ亜科は、Ａｑｕａｒｅｏｖｉｒｕｓ属、Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ属、Ｃｙｐｏｖｉｒｕｓ属、Ｄｉｎｏｖｅｒｎａｖｉｒｕｓ属、Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ属、Ｉｄｎｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属、Ｍｙｃｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属、Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ属、およびＯｒｙｚａｖｉｒｕｓ属を含む。
【００２４】
ロタウイルスに加えて、哺乳動物オルトレオウイルスが本発明の実施において有用であり得る。これらのウイルスに関しては、外側のカプシドの完全なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける集合のための適切な条件およびｃｒｙｏ−ＥＭの使用がよく確立されている（参考文献１、２、４および５を参照されたい）。ｃｒｙｏ−ＥＭが使用されており、構造情報がすでに入手可能である他のオルトレオウイルス（例えば、ヒヒまたはトリオルトレオウイルス）、オリザウイルス（例えば、イネラギットスタントウイルス（ｒｉｃｅ  ｒａｇｇｅｄ  ｓｔｕｎｔ  ｖｉｒｕｓ））およびアクアレオウイルス（参考文献６、７および８を参照されたい）も本発明の実施に適し得る。
【００２５】
サイポウイルスとジノベルナウイルス（ｄｉｎｏｖｅｒｎａｖｉｒｕｓ）は内部カプシドのみが等価であり、したがって、一般には本発明の実施に適するとは考えられず、したがって、あまり好ましくないと考えられる。ある特定の実施形態では、本発明において使用するためのエンベロープを有さない正二十面体ウイルスは、サイポウイルスおよびジノベルナウイルスを含まない。好ましい実施形態では、本発明のウイルスは、バイオセーフティレベル２またはそれ未満で操作することができる（参考文献９を参照されたい）。
【００２６】
本発明の実施において使用するウイルス粒子は、３つまたはそれ未満の外層タンパク質を有することが好ましい。ウイルス粒子の外層は、キメラ表面タンパク質の調製に使用した外面タンパク質である単一の外層タンパク質によって形成できることがより好ましい。外層タンパク質が少数であることは、剥がす処理後にサブウイルス粒子を再外被形成するために組換えによって発現させる必要があるタンパク質が少なくなるので、有利である。
【００２７】
例えば、ロタウイルスは２つの外層タンパク質、ＶＰ４およびＶＰ７を有するが、ロタウイルス粒子の外層を形成するために必要な殻タンパク質はＶＰ７のみである。ほとんどの場合、本発明を実施するためには、ロタウイルスＤＬＰを１種の外層タンパク質、ＶＰ７を用いて再外被形成するだけで十分である。
【００２８】
キメラ表面タンパク質
一態様では、本発明は、共有結合で異種タンパク質と連結したロタウイルス表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質に関する。ロタウイルス表面タンパク質は、リンカー配列を介して異種タンパク質と連結することができる。特定の実施形態では、異種タンパク質を外面に露出した部分であるロタウイルス表面タンパク質の可撓性ループに挿入する。いくつかの場合には、リンカー配列および／または異種タンパク質によりよく適応させるために、ロタウイルス表面タンパク質の部分を欠失させる。例えば、短いＮ末端およびＣ末端の短縮（≦１０アミノ酸）は、一般にはロタウイルスＶＰ７タンパク質のロタウイルスＤＬＰを再外被形成する能力に影響を及ぼさない。さらに、ＶＰ７タンパク質がＤＬＰの再外被形成に使用された場合には、ウイルス粒子から離れて伸長する表面ループを形成するアミノ酸配列は必ずしも必要でない。欠失がＶＰ７タンパク質のＤＬＰを再外被形成する能力に影響を及ぼすかどうかは、組換えによって発現させたＶＰ７タンパク質をＤＬＰの存在下でインキュベートし、再外被形成されたウイルス粒子の形成を観察することによって評価することができる。
【００２９】
本発明の別の態様では、ロタウイルス表面タンパク質は、アダプター系を介して異種タンパク質と非共有結合で連結している。本発明の好ましい態様では、異種タンパク質は、２つの部分からなるアダプター系によってロタウイルス表面タンパク質と非共有結合で結合しており、ここで、アダプター系の一方の部分はロタウイルス表面タンパク質に連結しており、アダプター系の他方の部分は異種タンパク質と連結しており、それにより、アダプター系の両部分が安定な複合体を形成し、したがって、異種タンパク質をロタウイルス表面タンパク質に非共有結合で付着させている。アダプター系は、一般には、第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドで構成される。第１のアダプターポリペプチドは、任意選択でリンカー配列を介してロタウイルス表面タンパク質と融合している。第２のアダプターポリペプチドは、任意選択でリンカー配列を介して異種タンパク質と融合している。第１および第２のアダプターポリペプチドは互いと相互作用して安定な複合体を形成しており、したがって、ロタウイルス表面タンパク質が異種タンパク質に非共有結合で付着し、したがって、キメラ表面タンパク質が形成される。
【００３０】
ウイルス表面タンパク質
本発明の実施に適するウイルス粒子の外層は、一般には、いくつかの異なる外面タンパク質を含む。主要な表面タンパク質は、ウイルス粒子の表面の大部分を覆っているので、異種タンパク質の提示に特に適している。例えば、ロタウイルスの外面（スパイクを除く）は、ホモ三量体を形成する７８０コピーのＶＰ７タンパク質によって形成される。ホモ三量体を形成する主要な表面タンパク質を用いたウイルス粒子の選択が本発明の実施に特に好ましい。
【００３１】
特定の一実施形態では、ウイルス表面タンパク質はロタウイルス表面タンパク質である。別の特定の実施形態では、ウイルス表面タンパク質は糖タンパク質である。
【００３２】
本発明の実施に適し得るウイルス表面タンパク質を有する他のウイルスの例としては、オルトレオウイルスが挙げられる。例えば、アクアレオウイルスの外側のウイルスカプシドは、ＶＰ５と称されるタンパク質の２００個の三量体によって形成される。哺乳動物オルトレオウイルスでは、感染性レオウイルス粒子の外層は、６００コピーの三量体膜透過タンパク質μ１を含有し、これにはシャペロンタンパク質σ３が点在し（同様に６００コピーで存在する）、したがって、ヘテロ六量体が形成される。
【００３３】
異種タンパク質
三量体ロタウイルス表面タンパク質を使用して多くの異種タンパク質を提示することができるが、ただし、三量体の集合の間の単量体間の立体的な障害を回避するために、適切な長さのリンカーおよび／または表面タンパク質内の適切な挿入部位を選択する。異種タンパク質が他のマウントされた異種タンパク質の隣接する体積と重複する体積を形成しない限りは、異種タンパク質のサイズに上限はない。異種タンパク質を三量体ロタウイルス表面タンパク質上に提示するためにアダプター系を使用することが好ましい。高次オリゴマーまたは凝集体を形成する、可溶性ではない異種タンパク質は一般には本発明の実施に適するとは考えられない。
【００３４】
立体的な障害に起因するサイズの制約のいずれも、適切なリンカーまたはアダプター系を選択することによって克服することができる。
【００３５】
異種タンパク質に関しては、「異種」という用語は、一般には、当該タンパク質がロタウイルスタンパク質ではないことを意味する。一部の実施形態では、「異種タンパク質」という表現は、当該タンパク質がタンパク質を提示するために使用するものと同じロタウイルス株に由来するものではないことを意味する。
【００３６】
三量体表面タンパク質は三量体異種タンパク質を提示するために特に適している。三量体異種タンパク質の例としては、三量体ウイルス細胞侵入タンパク質および他の三量体ウイルス表面タンパク質、特に、中和抗体によって標的化されるものが挙げられる。特定の例は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１４０、エボラウイルス糖タンパク質、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルスのＥｎｖタンパク質、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質、ヒト単純ヘルペスウイルスおよびヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に見いだされるｇＢタンパク質およびその複合体などである。
【００３７】
一部の実施形態では、ロタウイルス表面タンパク質および／または異種タンパク質は、三量体ロタウイルス表面タンパク質と三量体異種タンパク質によって形成されるヘテロ六量体複合体の集合を補助する三量体形成タグを含む。三量体形成タグ、特にコイルドコイルに基づく三量体形成タグ（例えば、ＧＣＮ４、［１０］）は、改変ロタウイルスＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成されたロタウイルス粒子の表面上に提示される異種タンパク質が利用可能な空間を広げるための構造モジュールとしても機能し得る。別の適切な三量体形成タグは、バクテリオファージＴ４フィブリチンに由来するものであってよい［１１］。
【００３８】
ある特定の実施形態では、三量体ではない異種タンパク質がロタウイルス表面タンパク質上に存在する三量体形成タグと相互作用し得る。例として、異種タンパク質が、コイルドコイルに基づく三量体形成タグのα−へリックスと相互作用し得る接近可能なα−へリックスを有する場合、その異種タンパク質は三量体形成タグに結合し得る。立体的な障害が存在しなければ、そのような異種タンパク質が３つまで同時に三量体形成タグに結合し、それにより６−へリックスバンドルが形成され得る。そのような異種タンパク質が３つ未満結合した場合、６−ヘリックスバンドルは不完全になり、ロタウイルスタンパク質上に存在する三量体形成タグが寄与する内側の３つのへリックスを含有するが、バンドルの外側のへリックスは１つまたは２つしか含有しない。非三量体異種タンパク質は、サブユニットの少なくとも１つが、ロタウイルス表面タンパク質上に存在する三量体形成タグと相互作用し得るα−へリックスを有するのであれば、１つ、２つ、４つ、またはそれ超のサブユニットを有し得る（すなわち単量体、二量体、四量体、または他のオリゴマーであり得る）。
【００３９】
ある特定の実施形態では、単量体異種タンパク質は、２つ以上のへリックスがロタウイルス表面タンパク質上に存在する三量体形成タグのα−へリックスと相互作用し、完全なまたは部分的な６−ヘリックスバンドルを形成し得るように配置された多数のα−へリックスを含んでよい。ある特定の実施形態では、単量体の少なくとも３つが適切に配置されたα−へリックスを含有する四量体（またはより高次の構造）は、ロタウイルス表面タンパク質に付着した三量体形成タグと会合して６−ヘリックスバンドルを形成し得る。ある特定の実施形態では、単量体の少なくとも２つが適切に配置されたα−へリックスを含有する四量体（またはより高次の構造）は、ロタウイルス表面タンパク質と会合した三量体形成タグと会合して、外側のへリックスのうちの１つが欠けた部分的な６−ヘリックスバンドルを形成し得る。異種タンパク質のサブユニットは同一であってもよく（すなわち、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体など）、同一でなくてもよい（すなわち、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体など）。
【００４０】
ロタウイルス表面タンパク質上に存在する三量体形成タグがα−ヘリックスコイルドコイルではない場合、異種タンパク質上の相互作用性構造要素は、三量体形成タグに結合するがα−ヘリックスではない二次構造を有し得る。
【００４１】
異種タンパク質はロタウイルス表面タンパク質に特異的に結合する抗体ではないことが好ましい。
【００４２】
アダプター系
本発明の一部の実施形態では、アダプター系を使用して異種タンパク質をロタウイルス粒子上に提示する。アダプター系は、一般には２つのアダプター分子で構成される。第１のアダプター分子は、異種タンパク質が提示されるように選択されたロタウイルス表面タンパク質と共有結合で連結している。第２のアダプター分子は、異種タンパク質と共有結合で連結している。第１のアダプター分子および第２のアダプター分子は互いと相互作用して安定な複合体を形成する。
【００４３】
アダプター系は、一般には、２つのアダプターポリペプチドで構成される。第１のアダプターポリペプチドは、異種タンパク質が提示されるように選択されたロタウイルス表面タンパク質と融合する。第２のアダプターポリペプチドは、異種タンパク質と融合する。第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドは、互いと相互作用して安定な複合体を形成し得る。
【００４４】
互いと会合して安定な複合体を形成する多くのポリペプチドが公知である。いくつかの場合には、これらのポリペプチドは、異なるタンパク質、例えば、受容体とリガンドまたは抗体と抗原に由来するものである。他の場合では、これらのポリペプチドは、同じタンパク質、例えば、ＨＩＶ  ｇｐ４１の２つの７アミノ酸反復配列などに由来するものであってよい。
【００４５】
２つのアダプターポリペプチド間の相互作用に依存しない適切なアダプター系も構想することができる。例えば、ロタウイルス表面タンパク質を、特異的なグリコシル化部位を含むように改変することができ、異種タンパク質を、グリコシル化部位においてグリカンを特異的に認識するレクチンドメインを含むように改変することができる。特異的なグリカン構造を認識するレクチンの例は当技術分野で周知である。
【００４６】
２つのアダプターポリペプチド間の相互作用に依存しない別の適切なアダプター系は、ストレプトアビジン−ビオチン系である。四量体の形成が妨げられるように、および溶解度が増強されるように変異させた単量体ストレプトアビジンを使用することが好ましい［１２］。単量体ストレプトアビジンを、異種タンパク質が提示されるように選択されたロタウイルス表面タンパク質と融合することができる。複合体の形成が起こるように、異種タンパク質をビオチン化する。ビオチン化するタンパク質内に存在するアミノ酸残基にビオチンを特異的に連結することが可能になるので、酵素によるビオチン化が好ましい。例えば、異種タンパク質は、ビオチンおよびＡＴＰの存在下でビオチンリガーゼ（例えば、ＢｉｒＡ）によって特異的にビオチン化することができる「ＡｖｉＴａｇ」または「アクセプターペプチド」（ＡＰ）を挿入することによって改変することができる（詳細に関しては参考文献１３を参照されたい）。
【００４７】
２つのアダプターポリペプチド間の相互作用に依存しない別のアダプター系としては、ハプテン（例えば、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ））と結合した抗体を挙げることができる。あるいは、キレート化剤ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡを金属イオンと配位させて複合体を形成することができる。
【００４８】
アダプター系の使用は本発明の実施に必須ではない。しかし、異種タンパク質、特に、ロタウイルス粒子上に提示される他のウイルスの三量体表面タンパク質の構造的特徴を最適に保存するためには、アダプター系の使用が好ましい場合がある。アダプター系の使用は、第１のアダプターを含有するように改変されたロタウイルス表面タンパク質は１回だけ調製する必要があり、その後は、適合する第２のアダプターを含有するように改変された任意の異種タンパク質と一緒に使用することができるので、特に有利である。
【００４９】
アダプター系を使用することのさらなる利点は、キメラ表面タンパク質の成分のそれぞれについて別々に発現および精製を最適化できることである。ほとんどの場合、アダプターポリペプチド配列を挿入することによって、ウイルス表面タンパク質または異種タンパク質の、それらの発現または精製に関連する特性は変化しない。したがって、一般には、第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドを含む異種タンパク質を含むウイルス表面タンパク質を大量に調製するために改変することなく現存する発現系および精製方法を使用することができる。対照的に、共有結合で異種タンパク質と連結したウイルス表面タンパク質で構成されるキメラ表面タンパク質は、ウイルス表面タンパク質または異種タンパク質それぞれ単独での特性とは実質的に異なる特性を有する可能性がある。
【００５０】
ロタウイルス表面タンパク質および多くのレオウイルス表面タンパク質は三量体を形成する。したがって、本発明の一態様では、最適なアダプター系は三量体複合体を形成するものであることが好ましい。第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドが７アミノ酸反復配列を含み、６−ヘリックスバンドルの形成を可能にするα−ヘリックス構造を形成するアダプター系が特に好ましい。３コピーの第２のアダプターポリペプチドが内側のコイルドコイル三量体を形成し、３コピーの第１のアダプターポリペプチドがこの三量体の表面上の溝を詰め、６−ヘリックスバンドルが完成することが最も好ましい。しかし、その逆も可能であり得、その場合、３コピーの第１のアダプターポリペプチドが内側のコイルドコイル三量体を形成し、３コピーの第２のアダプターポリペプチドがこの三量体の表面上の溝を詰める。７アミノ酸反復配列を含み、６−ヘリックスバンドルを形成する種々のポリペプチド対が当技術分野で公知である。これらは、一般には、ウイルス融合タンパク質に由来する。ウイルス融合タンパク質は、その６−ヘリックスバンドルの回転性の対称性および安定性に起因してアダプターポリペプチド配列の好ましい供給源である。
【００５１】
最も徹底的に研究されているウイルス融合タンパク質のうちの１つは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のエンベロープ糖タンパク質である。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の外部ドメインは、ｇｐ１２０およびｇｐ４１からなる。ｇｐ４１はウイルスの膜と細胞膜の融合を媒介する。ｇｐ４１は、ネイティブなタンパク質における６−ヘリックスバンドルを形成し得る２つの７アミノ酸反復配列、「ヘリックス領域１」（ＨＲ１）および「ヘリックス領域２」（ＨＲ２）を含む［１４］。好ましい実施形態では、アダプター系の第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドは、それぞれｇｐ４１  ＨＲ２（配列番号１）およびｇｐ４１  ＨＲ１（配列番号２）に対応する。さらに好ましい実施形態では、アダプター系の第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドは、それぞれニパーウイルスＦタンパク質ＨＲ２（配列番号３）およびＨＲ１（配列番号４）に対応する。しかし、第１および第２のアダプターポリペプチドを調製するために使用することができる、相互作用性ＨＲ１およびＨＲ２ポリペプチドの供給源であり得る種々の他のウイルス融合タンパク質が公知である。これらとしては、インフルエンザ赤血球凝集素２（ＨＡ２）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）の膜貫通（ＴＭ）サブユニット、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来のパラミクソウイルスＦタンパク質（トリパラミクソウイルスＦタンパク質、例えば、ヘンドラウイルスＦタンパク質を含む）、コロナウイルスのスパイクタンパク質（例えば、マウス肝炎ウイルスおよびＳＡＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質）、エプスタイン・バーウイルスのＺＥＢＲＡタンパク質、サルウイルス５融合タンパク質などが挙げられる（参考文献１４、１５、１６および１７を参照されたい）。
【００５２】
異種タンパク質自体が７アミノ酸反復配列を含み、これらの配列が改変ロタウイルス表面タンパク質に含まれる７アミノ酸反復配列に適合する場合、７アミノ酸反復配列を異種タンパク質に付加する必要がない場合がある。そのような場合では、異種タンパク質のネイティブな７アミノ酸反復配列は、改変ロタウイルス表面タンパク質の７アミノ酸反復配列との６−ヘリックスバンドルを形成することができ、異種タンパク質に対して外来である７アミノ酸反復配列を付加することによって異種タンパク質を改変する必要がない場合がある。
【００５３】
例えば、上で列挙されているウイルス融合タンパク質はいずれも、相互作用性７アミノ酸反復配列を含有し、これらのネイティブな７アミノ酸反復配列は、７アミノ酸反復配列を含有するように改変されたロタウイルス表面タンパク質内の７アミノ酸反復配列と相互作用することができ得る。一部の実施形態では、特に同じ改変ロタウイルス表面タンパク質を使用して種々の異なる異種タンパク質を提示するモジュラー手法を可能にするために２つの部分からなるアダプター系を選択する場合、ウイルス融合タンパク質に対して異種の７アミノ酸反復配列に依存することが好ましい場合がある。
【００５４】
６−ヘリックスバンドルを形成する７アミノ酸反復配列を含む他のタンパク質ドメインが公知である。これらとしては、ヒトＡｐａｆ−１およびＲＡＩＤＤのＣＡＲＤドメイン、ＦＡＤＤのデスエフェクタードメインならびにｐ７５およびＦａｓのデスドメインが挙げられる。６−ヘリックスバンドル形成性ペプチド配列の他の供給源としては、ＳＮＡＲＥおよびＧＣＮ４−ｐＩＩが挙げられる。これらのドメインまたはペプチド配列はいずれも、本発明における使用に同様に適合させることができる。例えば、第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドに、それぞれＣＡＲＤドメインの３つのＮ末端へリックスおよび３つのＣ末端へリックスを使用して、単量体または二量体の表面タンパク質に適したアダプター系を形成することができる。
【００５５】
他のペプチドに基づくアダプター系も使用することができる。例えば、ウイルス表面上に提示したい異種タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合性部分（例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体（ＤＡｂ））をロタウイルス表面タンパク質に挿入することができる。抗体またはその抗原結合性部分は、異種タンパク質（例えば、ペプチドタグの形態で）に挿入することができるまたは異種タンパク質に天然に存在し得る特異的なエピトープを認識し得る。
【００５６】
一部の実施形態では、適切な２つの部分からなるアダプター系では、異種タンパク質のみを改変すればよい。例えば、本発明の一実施形態では、ロタウイルス表面タンパク質は糖タンパク質である。そのような場合では、異種タンパク質を、糖タンパク質内のグリカンに特異的に結合するレクチンドメインを含有するように改変することができる。例えば、ロタウイルスＶＰ７タンパク質を、タンパク質の表面に露出した部分への単一のグリコシル化部位の導入によって改変することができ、したがって、改変異種タンパク質のレクチンドメインが改変ＶＰ７タンパク質内のグリカンに特異的に結合する。
【００５７】
あるいは、異種タンパク質を、ロタウイルス表面抗原上のエピトープに対して特異的な抗体の抗原結合性ドメインを含有するように改変することができる。例えば、異種タンパク質を、ロタウイルス表面抗原に高親和性で結合する抗体のＦａｂ断片と融合することができる。
【００５８】
リンカー配列
リンカー配列は、異なるタンパク質に由来するドメインを分離し、これらのドメインが適正にフォールディングされることを可能にする。多くのリンカー配列が当技術分野で公知である（参考文献１８を参照されたい）。ロタウイルス表面タンパク質および／または異種タンパク質をアダプター配列から分離するためにリンカー配列を含めることができる。あるいは、ロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質が同じタンパク質の２つの部分を形成する場合、リンカー配列によって両方の部分を互いから分離することができる。
【００５９】
剛性リンカーおよび可撓性リンカーの両方が公知である。可撓性リンカーの典型的な配列は、アミノ酸ＧおよびＳの反復で構成される。例えば、リンカーは以下の配列：ＧＳ、ＧＳＧ、ＳＧＧ、ＧＧＳＧＧ（配列番号５）またはＧＳＧＳＧＳＧＴ（配列番号６）を有し得る。一部の実施形態では、同じ配列を複数回（例えば、２、３、４、５または６回）繰り返して、より長いリンカーを創出する。他の実施形態では、ＳまたはＧなどの単一のアミノ酸をリンカーとして使用することができる。剛性リンカーは、アミノ酸配列ＥＡＡＡＲ（配列番号７）のいくつかの反復で構成され得る。
【００６０】
リンカー配列を選択する際には、改変ロタウイルス表面タンパク質または異種タンパク質の凝集を回避するために、親水性リンカーを選択するように注意を払うべきである。
【００６１】
一般には、リンカーはプロテアーゼ非感受性であるが、一部の実施形態では、リンカーは、プロテアーゼ切断部位を含有する。プロテアーゼ切断部位は、例えば本発明の改変ロタウイルス表面タンパク質の検出／精製のために含まれるタグを除去するために有用であり得る。プロテアーゼ切断部位は、改変ロタウイルス表面タンパク質に挿入されたアミノ酸配列を露出させ、したがって、部位特異的なプロテアーゼを用いた切断後にそのアミノ酸配列を改変ロタウイルス表面タンパク質の外面上でより接近しやすいものにするためにも有用であり得る。例えば、プロテアーゼ切断部位は、ロタウイルス粒子の表面上に提示させる異種タンパク質と融合した２つの部分からなるアダプター系の対応するアダプターポリペプチドへのアダプターポリペプチドの結合を改善するために、アダプターポリペプチドを露出させるために使用することができる。いくつかの場合には、改変ロタウイルス表面タンパク質の一部を形成するアダプターポリペプチドを露出させるためにプロテアーゼ切断を使用することにより、追加的なリンカー配列が必要なくなり、したがって、異種タンパク質との安定な複合体を形成するために改変ロタウイルス表面タンパク質に挿入する必要がある追加的なアミノ酸配列の数が減少し得る。
【００６２】
特異的なプロテアーゼに対するプロテアーゼ切断部位は、いくつかのタンパク質に見いだすことができる。例えば、血液凝固カスケードおよび補完カスケードは、カスケード内のさらに下流のタンパク質の切断部位を認識するいくつかの非常に特異的なプロテアーゼを含有する。通常、カスケードの早期の段階の酵素は後の段階の酵素よりも特異的である。例えば、第Ｘ因子はトロンビンよりも特異的である。トロンビンを使用する場合、最も好ましいトロンビン感受性切断部位は、フィブリノーゲン、第ＸＩＩＩ因子、およびプロトロンビンに見いだされるものである。血液凝固カスケードのプロテアーゼ、それらの標的タンパク質および特異的な切断部位のさらなる例が以下の表１に列挙されている。表１に示されている配列の下線が引かれている部分は、プロテアーゼによる標的の認識のために含める必要がある最小の切断部位である。
【００６３】
【表１−１】
0006594306.tif 000002
【００６４】
融合タンパク質を切断するために使用されてきた他のプロテアーゼとしては、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、キモシン、ウロキナーゼ、レニン、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、タバコエッチ病ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）プロテアーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、フューリン、およびある特定のシグナルペプチダーゼが挙げられる（例えば、参考文献１９を参照されたい）。
【００６５】
切断部位は、最終的な構築物において、ロタウイルス表面タンパク質または異種タンパク質に付加された任意のタグを容易に除去することができるように位置づけられることが好ましい。
【００６６】
一部の実施形態では、リンカーは、検出および／または精製のためのタグを含有する。タンパク質の検出を容易にするための多くのタグが当技術分野で公知である。頻繁に使用されるペプチドタグとしては、ＦＬＡＧ−タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１２）、ＨＡ−タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１３）、Ｈｉｓ−タグ（例えば、ＨＨＨＨＨＨ；配列番号１４）、Ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１５）、Ｓｔｒｅｐ−タグＩ（ＡＷＲＨＰＱＦＧＧ；配列番号１６）、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ（ＮＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号１７）、およびプロテインＣ−タグ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ；配列番号１８）が挙げられる。Ｈｉｓ−タグは、抗Ｈｉｓ抗体により容易な検出が可能になり、タグを付けたタンパク質をニッケル−カラムを使用して精製することが可能になるので、好ましい。Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩにより、組換えにより発現させたタンパク質をストレプトアビジンカラムを使用して単純かつ容易に精製することが可能になる。いくつかの場合には、タンパク質タグを使用する。例えば、固定化したグルタチオンを含むカラムを使用して本発明のタンパク質を容易に精製することを可能にするために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−タグを含めることができる。蛍光顕微鏡法による容易な検出が必要な場合には、緑色蛍光タンパク質−タグを使用することができる。
【００６７】
本発明の一部の実施形態では、タグ（例えば、プロテインＣタグ）をリンカー配列の一部分として含める。なぜなら、これは、例えば、タンパク質の検出および精製に一般に使用されるタグが、タグを付けたタンパク質の機能およびフォールディングに干渉せず、一般に表面に露出しているからである。したがって、タグは、他の人工的に設計されたリンカー配列に対して有利な性質をもたらし得る。
【００６８】
他の実施形態では、リンカー配列はエピトープ配列を含んでよい。エピトープ配列を含めることは、２つの部分からなるアダプター系を介して改変ロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質によって形成される複合体をさらに安定化させるために前記エピトープを認識する抗体断片をパッキングするために有用であり得る。複合体の安定化は、構造研究のための高分解能画像を達成するために特に重要であり得る。
【００６９】
シグナルペプチド
本発明の一部の実施形態では、ロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質を、異種シグナルペプチド配列を含むようにさらに改変し、好ましくはネイティブなシグナルペプチド配列を置き換える。異種シグナルペプチドを使用することは、改変ロタウイルス表面タンパク質およびロタウイルスＤＬＰを再外被形成するための異種タンパク質を大量に調製するために使用する発現系においてより高い発現レベルを達成するために有利であり得る。したがって、異種シグナルペプチドは、選択された発現系において高レベルで発現することが公知であるタンパク質に由来する。例えば、ＨＩＶコンセンサスシグナル配列またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）のシグナルペプチドはヒト細胞における発現に特に適している。昆虫細胞における発現のためには、バキュロウイルスｇｐ６４シグナルペプチドまたはミツバチメリチンシグナル配列を使用することができる。一般には、リンカーは、効率的なシグナルペプチド切断を保証するために異種シグナルペプチド配列の後ろに配置する。一般に、シグナルペプチドは選択された発現系に対して内在性であるシグナルペプチダーゼによって除去され、したがって、最終的なタンパク質（すなわち、発現系から回収されるロタウイルス表面タンパク質および異種タンパク質）には存在しない。
【００７０】
核酸
本発明は、キメラ表面タンパク質が発現系において大量に発現するようにプロモーター配列と作動的に連結した本発明のキメラ表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸にも関する。
【００７１】
本発明は、ロタウイルス表面タンパク質の全部または一部、第１のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする核酸構築物にも関する。本発明は、さらに、異種タンパク質、第２のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸であって、オープンリーディングフレームが、融合タンパク質が発現系において大量に発現するようにプロモーター配列と作動的に連結している、核酸に関する。一実施形態では、本発明は、第２のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、任意選択でリンカー配列および多重クローニング部位を含む核酸構築物であって、異種タンパク質のコード領域を多重クローニング部位に挿入することにより、異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされる、核酸構築物に関する。核酸構築物は、発現系における異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を駆動することができるプロモーター配列をさらに含む。
【００７２】
第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドが２つの部分からなるアダプター系の一部を形成し、したがって、異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質と第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質が互いと安定な複合体を形成する。
【００７３】
発現系
本発明は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質を発現させるための発現系にも関する。
【００７４】
一実施形態では、第１の発現系を使用して、ロタウイルス表面タンパク質の全部または一部、第１のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む改変ロタウイルス表面タンパク質を発現させる。第２の発現系を使用して、異種タンパク質、第２のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む融合タンパク質を発現させる。任意選択で、第３の発現系を使用して、ロタウイルス表面タンパク質と一緒にロタウイルス粒子の外層を形成する１つまたは複数のロタウイルスタンパク質を発現させる。第１および第２のアダプターポリペプチドは、互いと相互作用して安定な複合体を形成している。第１の発現系は、改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む第１の核酸構築物を含み、オープンリーディングフレームはプロモーター配列と作動的に連結している。第２の発現系は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む第２の核酸構築物を含み、オープンリーディングフレームはプロモーター配列と作動的に連結している。第３の発現系は１つまたは複数のロタウイルスタンパク質に対する１つまたは複数の発現ベクターを含む。次いで、改変ロタウイルス表面タンパク質および融合タンパク質、ならびに任意選択で、１つまたは複数のロタウイルスタンパク質を精製する。改変ロタウイルス表面タンパク質および融合タンパク質を適切な比率で混合してキメラ表面タンパク質を形成することができる。次いで、キメラ表面タンパク質および任意選択で１つまたは複数のロタウイルスタンパク質を使用してロタウイルスＤＬＰを再外被形成し、それらの表面上に異種タンパク質を提示するロタウイルス粒子を形成する。あるいは、ロタウイルスＤＬＰを改変ロタウイルス表面タンパク質、および任意選択で１つまたは複数のロタウイルスタンパク質を用いて再外被形成してロタウイルス粒子を形成する。次いで、ロタウイルス粒子を融合タンパク質と混合して第１のアダプターポリペプチドと第２のアダプターポリペプチドの複合体を形成させることができ、それによりキメラ表面タンパク質をもたらし、したがって、異種タンパク質をロタウイルス粒子の表面上に提示させる。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ロタウイルス表面タンパク質の全部または一部、第１のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、プロモーター配列と作動的に連結しているオープンリーディングフレームを含む第１の核酸構築物、および（ｉｉ）異種タンパク質、第２のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームであって、プロモーター配列と作動的に連結しているオープンリーディングフレームを含む第２の核酸構築物を含む発現系に関する。いくつかの場合には、発現系は、ロタウイルス表面タンパク質と一緒にロタウイルス粒子の外層を形成する１つまたは複数のロタウイルスタンパク質に対する発現ベクターをさらに含む。
【００７６】
発現系は、細菌細胞、酵母細胞、原生動物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞であってよい。発現系として細菌細胞または酵母細胞を使用することは、特に、発現されたタンパク質の妥当なグリコシル化が望まれる場合にはあまり好ましくない。
【００７７】
キット
本発明は、ロタウイルス表面タンパク質の全部または一部および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸構築物、ならびに第２の核酸構築物を含むキットであって、第２の核酸構築物が、第２のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含み、異種タンパク質のコード領域を多重クローニング部位に挿入することにより、異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされ、キメラ融合タンパク質の第１のアダプターポリペプチドと融合タンパク質の第２のアダプターポリペプチドが互いと相互作用して安定な複合体を形成する、キットをさらに提供する。
【００７８】
本発明は、さらに、ロタウイルス表面タンパク質の全部または一部および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸構築物、ならびに異種タンパク質の全部または一部および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第２の核酸構築物を含むキットであって、改変ロタウイルス表面タンパク質の第１のアダプターポリペプチドと融合タンパク質の第２のアダプターポリペプチドが互いと相互作用して安定な複合体を形成し、したがって、キメラ表面タンパク質がもたらされる、キットに関する。
【００７９】
キットは、ロタウイルス粒子をさらに含んでよい。ロタウイルス粒子は、ロタウイルス表面タンパク質が由来する種と同じ種由来であっても異なる種由来であってもよい。例えば、アカゲザルロタウイルスＶＰ７を使用してウシロタウイルスから調製したＤＬＰを再外被形成することができ、逆もまた同じである。ロタウイルスは脱外被されていても、キメラ表面タンパク質を用いて再外被形成されていてもよい。あるいは、キットは、キメラ表面タンパク質を用いて再外被形成するためのＤＬＰを含んでよい。ロタウイルスＤＬＰは、ネイティブなロタウイルス粒子の脱外被によって、またはロタウイルスの内側の殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ６を組換え発現させることによって調製することができる。
【００８０】
外層タンパク質の組換え発現
ロタウイルスＤＬＰの再外被形成には、１つまたは２つの組換えウイルスタンパク質、外層タンパク質ＶＰ７、または外層スパイクタンパク質ＶＰ４と一緒になった外層タンパク質ＶＰ７のみが必要である。ＶＰ４およびＶＰ７の発現および精製は、それぞれ参考文献２０および２１に詳しく記載されている。
【００８１】
本発明のキメラ表面タンパク質を含む外層タンパク質は、当業者に公知の従来の発現系を使用して作製することができる。正しいフォールディング、およびいくつかの場合には妥当なグリコシル化を保証するためには、原核生物または酵母発現系以外の発現系が好ましい。例えば、ＣＨＯ細胞または２９３細胞などの哺乳動物細胞を、ロタウイルスＤＬＰを再外被形成するために必要な外層タンパク質を過剰発現させるために使用することができる。あるいは、原生動物Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅを、外層タンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞系も外層タンパク質を発現させるのに適している。例えば、昆虫細胞株Ｓｆ９、Ｓｆ２１およびＨｉ−５が、グリコシル化されたタンパク質を過剰発現させるために適している。いくつかの場合には、バキュロウイルスに基づく昆虫細胞系が好ましい。参考文献２、４および５に記載の発現系が本発明の実施に特に適している。
【００８２】
過剰発現させた外層タンパク質を回収し精製するための種々のやり方が当技術分野で公知である。一般には、一連のクロマトグラフィーのステップを使用して、発現系として使用した細胞の細胞質抽出物または上清から過剰発現させたタンパク質を精製する。例えば、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用することができる。外側の殻タンパク質にペプチドタグまたはタンパク質タグを用いてタグ付けしている場合には、このタグを精製に有利に使用することができる。プロテアーゼ切断部位がタグの前にある配列内に存在すれば、精製後に、プロテアーゼ切断部位を特異的に認識するプロテアーゼを使用してタグを除去することができる。
【００８３】
いくつかの場合には、組換えによって発現させた外層タンパク質の粗製調製物を再外被形成反応のために使用することができる。例えば、外層タンパク質を発現させるために使用する細胞の溶解物は、溶解緩衝液および／または細胞の機械的な破壊（例えば、細胞を掻爬することまたは超音波処理することによる）を使用して調製することができる。あらゆる細胞破片を遠心分離によって除去し、組換え外層タンパク質の粗製調製物を含有する上清を再外被形成反応に使用することができる。再外被形成反応に使用する前に、限外濾過を使用して粗製調製物を濃縮することができる。
【００８４】
異種タンパク質とロタウイルス表面タンパク質が第１のアダプターポリペプチドおよび第２のアダプターポリペプチドを含む２つの部分からなるアダプター系によって非共有結合で結合している本発明の態様では、第１のアダプターポリペプチドと融合したロタウイルス表面タンパク質および第２のアダプターポリペプチドと融合した異種タンパク質を異なる細胞において別々に発現させる。両方のタンパク質を、タンパク質のそれぞれに対して公知の精製プロトコールを使用して別々に精製することができるので、別々の発現が好ましい場合がある。精製後、タンパク質を、ロタウイルスＤＬＰを再外被形成するために必要な適切な比率で混合することができる。例えば、ロタウイルスの外層におけるＶＰ７とＶＰ４のモル比は１３：１である。第１のアダプターポリペプチドを含む改変ＶＰ７タンパク質と第２のアダプターポリペプチドを含む異種タンパク質のモル比は、一般には１：１である。あるいは、ロタウイルス外層タンパク質を用いてＤＬＰを再外被形成してロタウイルス粒子を形成する。次いで、ロタウイルス粒子を異種タンパク質と混合して第１のアダプターポリペプチドと第２のアダプターポリペプチドの複合体を形成させ、したがって、異種タンパク質をロタウイルス粒子の表面上に提示させる。
【００８５】
あるいは、ロタウイルス表面タンパク質と異種タンパク質の両方を同じ細胞において発現させることができる。同時発現により、２つの部分からなるアダプター系によって媒介されるロタウイルス表面タンパク質と異種タンパク質の安定な複合体が形成される（詳細に関しては上記を参照されたい）。アダプター配列をロタウイルス表面タンパク質または異種タンパク質に接続するリンカー配列がタグを含有する場合には、このタグを、発現系の細胞／細胞の上清から複合体を精製するために使用することができる。
【００８６】
レオウイルスコア粒子を異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成できるようにするために、外層を形成するための全てのタンパク質がもたらされる必要はない。例えば、哺乳動物レオウイルスの外層はμ１、σ１およびσ３から形成される。本発明の目的に関してレオウイルスコア粒子を再外被形成するためには、一般には、ウイルス粒子を形成するのにμ１の組換えバージョンを提供すれば十分である。任意選択で、σ１およびσ３の組換えバージョンをもたらすこともできる。組換えタンパク質は、上記の発現系のうちの１つを用いて調製することができ、次いで、公知のプロトコールを使用して精製することができる。
【００８７】
ウイルス粒子の増殖
ロタウイルスは、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、マウス、イヌ、ネコ、トリならびにアダックス、サイガ、オジロヌー、ハイイログマ、およびアカカンガルーなどの外来動物種を含めた多数の動物種において見いだされている。したがって、ある特定の細胞型のそれらの増殖に対する適合性は、選択されたウイルスの宿主域に依存する。確立された細胞培養系における高収量の増殖を可能にするウイルスを選択することが好ましい。
【００８８】
例えば、アカゲザルロタウイルスを増殖させるために細胞株ＭＡ１０４を使用することができる。ロタウイルスは、感染細胞を溶解させることによって、例えば、感染させたＭＡ１０４細胞を培地中で凍結融解することによって回収することができる。低速遠心分離によって細胞破片を溶解物から取り除き、超遠心分離を使用してウイルス粒子をペレット化することによってまたは限外濾過によってそれらを濃縮する。ウイルス粒子の濃縮された懸濁物を、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を使用してさらに精製することができる［２］。ＣｓＣｌ勾配を調製するために適した緩衝液はＴＮＣ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２）である。
【００８９】
ロタウイルスを増殖させるためには、十分に特徴付けられた細胞を使用することが好ましい。ヒト、ウシおよびアカゲザルロタウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞において増殖させることができる。適切なＶｅｒｏ細胞株（ＣＣＬ８１）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手することができる。
【００９０】
同様に、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーは、広範囲の哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、昆虫、マダニ、クモ類、植物および真菌から単離されている。Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科の他のウイルスのための培養系も確立されている。例えば、イネラギットスタントウイルス（ＲＲＳＶ）は、感染させたイネ葉から十分な量で調製することができる［７］。Ｃ６／３６細胞を使用してＢａｎｎａウイルス（ＢＡＶ）を増殖させることができる［２２］。マウスＬ細胞、特に細胞株Ｌ９２９、およびマウス赤白血病（ＭＥＬ）細胞を使用して、哺乳動物レオウイルス株１型Ｌａｎｇ（Ｔ１Ｌ）および３型Ｄｅａｒｉｎｇ（Ｔ３Ｄ）を増殖させることができる［５］。ソウギョアクアレオウイルス（ＧＣＲＶ）は、Ｃｔｅｎｏｐｈａｒｙｎｇｏｄｏｎ  ｉｄｅｌｌｕｓ腎臓（ＣＩＫ）細胞培養物において増殖させることができる［８］。
【００９１】
ウイルス粒子は、一般には、細胞の上清または溶解させた細胞から回収することができる。例えば、あらゆる細胞破片を低速遠心分離によって除去することができ、超遠心分離を使用して上清からウイルス粒子をペレット化する。ペレットは、必要であればさらに精製することができるウイルス粒子を含有する。
【００９２】
ＤＬＰの調製
ロタウイルスＤＬＰは、精製したロタウイルス粒子から外層タンパク質を取り除くことによって調製する。ロタウイルス粒子は、ウイルス粒子をＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのカルシウムキレート化剤の存在下でインキュベートすることによって脱外被させることができる。ロタウイルス粒子の脱外被に適した緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含有する［２］。ロタウイルス粒子は、熱ショックによっても脱外被させることができる。生じたＤＬＰは、２つの連続的な前もって形成したＣｓＣｌ勾配（ρ＝１．２５〜１．５０ｇ／ｃｍ３）でバンド形成させることによって精製することができる。
【００９３】
外層タンパク質を取り除くための最適な方法は、選択されたウイルス粒子に依存する。例えば、哺乳動物レオウイルス粒子は、粒子をα−キモトリプシン（ＣＨＴ）と一緒に３７℃で２時間インキュベートすることによってコアにまで剥がすことができる［４］。
【００９４】
上記の方法は、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科の他のウイルスに対して、それらの外層タンパク質のプロテアーゼ処理または低カルシウム条件に対する感度に応じて適合させることができる。
【００９５】
いくつかの場合には、ウイルスを増殖させるために使用した細胞を溶解させることによってサブウイルス粒子を回収することができる。次いで、Ｂａｎｎａウイルスに関して記載されている通り、サブウイルス粒子を、例えばＣｓＣｌ勾配によって細胞溶解物から回収することができる［２２］。
【００９６】
あるいは、ＤＬＰまたはサブウイルス粒子は、関連するウイルスタンパク質を上記の発現系のうちの１つにおいて組換えにより発現させることによって調製することができる。例えば、ロタウイルスの内側の殻タンパク質ＶＰ２およびＶＰ６を組換えによって発現させて、ＤＬＰに似たウイルス様粒子を形成することができる。
【００９７】
再外被形成
ロタウイルスＤＬＰの再外被形成は、ｐＨ４．５および６．５を含むｐＨ範囲で起こるが、ｐＨ５から５．５の間（好ましくはｐＨ５．２）が最も効率的である。再外被形成は、４℃および３７℃を含む温度で起こるが、３７℃よりも４℃から３０℃の間の方が効率的である。
【００９８】
レオウイルスコア粒子の再外被形成は、一般には、細胞においてウイルス粒子の集合が起こる条件を模倣する条件下で行うことができる。例えば、哺乳動物オルトレオウイルスコア粒子は、３７℃で再外被形成させることができる。しかし、精製されたウイルスコアおよび組換えによって発現させた外層タンパク質からウイルス粒子を効率的に再集合させるために、ｐＨおよび温度などの個々のパラメータをさらに最適化することが必要な場合がある。
【００９９】
再外被形成されたウイルス粒子は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって回収することができる。ＣｓＣｌ勾配精製を２回繰り返して、回収されたウイルス粒子の純度を上昇させることができる。
【０１００】
再外被形成されたロタウイルス粒子の表面上に異種タンパク質を提示するためにアダプター系を使用する場合、ロタウイルスＤＬＰを、第１のアダプターポリペプチドを含むロタウイルス表面タンパク質を用いて再外被形成させることができる。その後、第１のアダプターポリペプチドと安定な複合体を形成する第２のアダプターポリペプチドを含む異種タンパク質を再外被形成されたウイルス粒子に付加することができる。これは、異種タンパク質およびロタウイルス表面タンパク質によって形成される複合体を用いた再外被形成が、例えば異種タンパク質のサイズに起因してあまり効率的でないと思われる場合に有利であり得る。あるいは、アダプターポリペプチドを介した異種タンパク質とロタウイルス表面タンパク質の複合体をまず形成することができ、再外被形成のためにこの複合体をロタウイルスＤＬＰに付加することができる。
【０１０１】
複合体の形成
本発明のいくつかの態様では、キメラ表面タンパク質の一部を形成する（例えば、２つの部分からなるアダプター系を介してロタウイルス表面タンパク質と非共有結合で結合することによって）異種タンパク質と異種タンパク質に特異的に結合する分子との間で形成される複合体の構造を研究するために、キメラ表面タンパク質を使用する。
【０１０２】
本発明の一態様では、分子はタンパク質性分子である。タンパク質性分子は、一般には、異種タンパク質と相互作用する受容体もしくはリガンド、または異種タンパク質の表面上に見いだされるエピトープを認識する抗体もしくは抗体断片などの別のタンパク質である。
【０１０３】
例えば、ロタウイルス粒子の表面上に提示される三量体ウイルス細胞侵入タンパク質（例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１４０またはＲＳＶ  Ｆタンパク質）と結合した三量体ロタウイルス表面タンパク質の六量体複合体を、ウイルス細胞侵入タンパク質とその宿主細胞の表面受容体の間の相互作用を研究するために使用することができる。
【０１０４】
異種タンパク質とタンパク質性分子の間の複合体の形成のための最適な条件は、相互作用の性質に依存する。受容体−リガンド相互作用には、抗体−抗原相互作用とは異なる条件が必要な場合がある。一般には、複合体の形成は、室温で、緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）中で実施される。
【０１０５】
一実施形態では、タンパク質性分子を、キメラ表面タンパク質を提示している再外被形成されたロタウイルス粒子の懸濁物に添加する。緩衝溶液は、追加的な成分、例えば、ロタウイルス粒子の脱外被を防止するためのＣａ２＋、および任意選択で、タンパク質の分解を遮断するための１種または複数のプロテアーゼ阻害剤などを含有してよい。タンパク質性分子を再外被形成されたロタウイルス粒子の存在下でインキュベートした後、ロタウイルス粒子に結合した、タンパク質性分子の新たに形成された複合体を遠心分離または限外濾過によって結合していないあらゆるタンパク質性分子から分離することができる。しかし、結合していないタンパク質性分子の除去は、再外被形成されたロタウイルス粒子をｃｒｙｏ−ＥＭ解析に使用する場合には必要ではない可能性がある。
【０１０６】
あるいは、タンパク質性分子とキメラ表面タンパク質を一緒にインキュベートして、複合体の形成を起こさせる。まず、異種タンパク質およびロタウイルス表面抗原を一緒にインキュベートしてキメラ表面タンパク質を形成することができる。キメラ表面タンパク質が形成されたら、タンパク質性分子を付加する。次いで、任意選択でロタウイルス表面タンパク質と一緒にネイティブなロタウイルス粒子の外層を形成する任意の追加的なロタウイルスタンパク質の存在下でタンパク質性分子とキメラ表面タンパク質の複合体をロタウイルスＤＬＰに付加してロタウイルス粒子を形成することができる。
【０１０７】
本発明の特定の態様では、抗原−抗体複合体の構造を決定するために本発明のキメラ表面タンパク質を使用する。本発明のこの態様では、異種タンパク質は、ウイルスまたは細菌などの病原体由来であってよい。例えば、免疫優性抗原を異種タンパク質として選択して、その抗原に対する免疫応答の間にタンパク質のどの部分が抗体によって標的化されるかを研究することができる。異種タンパク質は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、呼吸器合胞体ウイルスＦ、またはＨＩＶ  ｇｐ１４０などの三量体ウイルス表面タンパク質であることが好ましい。抗原−抗体複合体の構造を決定するために、隣接するキメラ表面タンパク質間の立体的な障害を回避するため、および異種タンパク質上に見いだされるエピトープの最大の占有率を保証するために、全長抗体の代わりにＦａｂ断片を使用することが一般には好ましい。
【０１０８】
本発明の別の態様では、異種タンパク質と非タンパク質性分子の間の複合体の形成を研究することができる。非タンパク質性分子は核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、多糖またはオリゴ糖（例えば、グリカン）であってよい。例えば、異種タンパク質は、転写因子または特定のＤＮＡ配列と複合体を形成する他のＤＮＡ結合性タンパク質であってよい。あるいは、異種タンパク質は、グリカンと複合体を形成するレクチンであってよい。
【０１０９】
Ｃｒｙｏ−ＥＭ
構造決定のためにｃｒｙｏ−ＥＭを使用することは、Ｘ線結晶構造解析などのより伝統的な手法と比較して、いくつかの利点を有する。具体的には、ｃｒｙｏ−ＥＭでは、解析される試料に対して純度、均一性および量に関して課される要件は厳しくはない。重要なことに、ｃｒｙｏ−ＥＭは、構造決定に適した結晶を形成しない標的に適用することができる。
【０１１０】
精製されたまたは精製されていない再外被形成されたロタウイルス粒子の、それ単独、または抗体などのタンパク質性分子もしくは核酸などの非タンパク質性分子との複合体の懸濁物を、ｃｒｙｏ−ＥＭによって画像化するためにカーボングリッドに適用することができる。コーティングしたグリッドを、通常は液体エタン中で急速凍結させて、粒子を懸濁物中、凍結湿潤化した（ｆｒｏｚｅｎ−ｈｙｄｒａｔｅｄ）状態で保存する。より大きな粒子は凍結固定によってガラス化することができる。ガラス化した試料をクライオウルトラミクロトームで薄い切片（一般には厚さ４０〜２００ｎｍ）に切断することができ、画像化のために切片を電子顕微鏡グリッドの上に載せることができる。
【０１１１】
約３．３Åもの高さの分解能を得るために並行した照明およびより良好な顕微鏡アラインメントを使用することにより、画像から得られるデータの品質を改善することができる。そのような高分解能では、完全な原子構造の非経験的モデルの構築が可能である。しかし、選択されたまたは密接に関連するロタウイルス粒子および選択された異種タンパク質または密接な相同体に関する原子レベルの分解能での構造データが制限された比較モデリングのために利用可能である場合には、低分解能画像化で十分である可能性がある（以下を参照されたい）。
【０１１２】
データの品質をさらに改善するために、顕微鏡を、画像化に使用したものと同じ条件下で記録された炭素膜画像のフーリエ変換において１／３Å−１を超える可視コントラスト伝達関数（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＣＴＦ）環が示されるように慎重にアラインメントすることができる。次いで、ＣＴＦＦＩＮＤなどのソフトウェアを使用して、各顕微鏡写真についての焦点はずし値を決定することができる［２３］。密度マップの最終的な画素サイズを、例えばタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を使用して較正することができる。
【０１１３】
ロタウイルス粒子の構造研究にｃｒｙｏ−ＥＭを適用することに関する有用な説明は参考文献２４および２５において見いだされる。
【０１１４】
画像解析および構造決定
ｃｒｙｏ−ＥＭによって得られる画像を解析して、単一粒子の顕微鏡写真を同定する。単一粒子の選択は、ＳＩＧＮＡＴＵＲＥなどのソフトウェアツールを利用して行うことができる［２６］。各顕微鏡写真の非点収差焦点はずし（ａｓｔｉｇｍａｔｉｃ  ｄｅｆｏｃｕｓ）、検体傾斜軸、および傾斜角度を、コンピュータプログラムＣＴＦＴＩＬＴを使用して決定することができる［２３］。各粒子について、元の画像におけるその座標に応じて別々の焦点はずし値を得ることにより、ロタウイルス粒子の単一粒子の顕微鏡写真を平均することによって得られるｃｒｙｏ−ＥＭ密度マップのデータの品質が改善される。
【０１１５】
ｃｒｙｏ−ＥＭ密度マップ内の既知原子モデルをフィッティングすることは、ウイルス粒子などの複雑な構造のモデルを構築するための一般的な手法である。Ｓｉｔｕｓ［２７］、Ｆｏｌｄｈｕｎｔｅｒ［２８］およびＭｏｄ−ＥＭ［２９］などのタンパク質構造の単純な剛体局在化から、既知の構造を密度マップに変形させるＮＭＦＦ［３０］、Ｆｌｅｘ−ＥＭ［３１］、ＭＤＦＦ［３２］およびＤｉｒｅＸ［３３、３４］のような複雑かつ動的に柔軟なフィッティングアルゴリズムまでにわたる、コンピュータによるいくつかのフィッティングツールが利用可能である。
【０１１６】
原子モデルが既知でない場合、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで構築される潜在的なモデルのギャラリーからの構造モデルの構築および／または評価においてｃｒｙｏ−ＥＭ密度マップを使用することができる（参考文献２９、３５、３６、３７および３８を参照されたい）。制限された比較モデリングのために、または制限された非経験的モデリングのために、関連する鋳型構造が既知でなければならず、モデリングされるフォールディングは比較的小さなものでなければならない。例えば、ＩＭＩＲＳを使用して最初の構造を得ることができる［３９］。ＦＲＥＡＬＩＧＮを用い、既知のロタウイルス構造および既知構造の異種タンパク質または密接な相同体を鋳型として使用して、さらなるアラインメントおよび再構築を実施することができる［４０］。
【０１１７】
意味のある構造上および機能上の情報は、密度マップ自体から直接得ることができる。例えば、５〜１０Åの分解能では、ｃｒｙｏ−ＥＭ密度マップにおいていくつかの二次構造要素を目で見ることができる：α−へリックスは円柱として現れ、β−シートは薄い曲がった板として現れる。これらの二次構造要素は、タンパク質構造を説明するまたは個々のタンパク質の機能を推測するための特徴認識ツールを使用して確実に同定し、数量化することができる。ほぼ原子レベルの分解能（３〜５Å）では、α−へリックスのピッチ、β−ストランドの分離、ならびにそれらを接続する密度を一義的に可視化することができる（例えば、参考文献４１、４２、４３および４４を参照されたい）。
【０１１８】
ｃｒｙｏ−ＥＭにおいて構築される新規モデルは、特徴認識、配列解析、二次構造要素対応、Ｃαの配置およびモデル最適化を含む。種々のソフトウェアアプリケーション、例えば、密度マップの分割および操作のためのＥＭＡＮ［４５］、二次構造要素を検出するためのＳＳＥＨｕｎｔｅｒ［４６］、ＵＣＳＦ’ｓ  Ｃｈｉｍｅｒａでの可視化［４７］およびＣｏｏｔでの原子操作［４８、４９］を使用することができる。
【０１１９】
ＳＳＥＨｕｎｔｅｒのような二次構造同定プログラムは、密度マップにおいて視覚的に観察可能な二次構造要素を検出および提示するための半自動化機構をもたらす［４６］。配列および構造における二次構造要素の登録を幾何的および生物物理学的情報と組み合わせて使用して、タンパク質バックボーンを密度マップに固定することができる［４１、４３］。この配列と構造の対応は、密度において観察される二次構造要素を配列において予測されたものに関連付ける。モデリングツールキットＧＯＲＧＯＮは、配列に基づく二次構造予測と特徴検出および幾何的モデリング技法を併せて、最初のタンパク質バックボーンモデルを生成する［５０］。タンパク質モデルの局所的な構造を構築、改変および精緻化するためには、ｃｒｙｏ−ＥＭマップを制約として使用してＥＭ−ＩＭＯ（電子顕微鏡反復モジュラー最適化（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ））などの自動モデリング法を使用することができる［５１］。
【０１２０】
二次構造要素を使用して対応を決定したら、Ｃα原子を、α−へリックスから始まり、その後にβ−ストランドおよびループが続く密度に割り当てることができる。例えば、Ｃα原子に関する明らかな衝突を利用することにより、結晶学的プログラムＯ［５２］および／またはＣｏｏｔ［４８］のＢａｔｏｎ＿ｂｕｉｌｄ  ｕｔｉｌｉｔｙを使用してＣαモデルを構築することができる。Ｃα位を、妥当な幾何学的配置を維持し、モデル内での衝突を排除しながら密度に最適に適合するように相互作用的に調整することができる。粗い完全原子モデルを、ＣＮＳを使用して擬似結晶様式で精緻化することができる［５３］。モデルを、Ｒｏｓｅｔｔａなどのコンピュータによるモデリングソフトウェアを使用してさらに最適化することができる［３６］。完全原子モデルは、ＲＥＭＯなどの他のコンピュータによるツールを利用して構築することもできる［５４］。モデルの品質は、モデルを密度マップと視覚的に比較することによって確認することができる。擬似結晶Ｒ因子／Ｒｆｒｅｅ解析［５５］は、観察された構造因子振幅と計算された構造因子振幅の間の一致の尺度をもたらし、得られた原子モデルがｃｒｙｏ−ＥＭ密度マップとの良好な適合をもたらすことを確認するために使用することができる。タンパク質モデルの幾何学的形状はＰＲＯＣＨＥＣＫによって確認することができる［５６］。
【０１２１】
免疫原の設計のためのスクリーニング方法
Ｘ線結晶構造解析の代わりにｃｒｙｏ−ＥＭを使用することにより、迅速な構造決定が容易になる。Ｘ線結晶構造解析と比較して、ｃｒｙｏ−ＥＭでは、解析される試料の純度、均一性および量に関して課される要件は厳しくはない。これらの特性により、ｃｒｙｏ−ＥＭが、特に抗原ドリフトを受ける病原体に対するワクチン用の免疫原の設計に関して魅力的なものになる。
【０１２２】
特に同じ病原体の改変体または密接に関連する病原体により共有されるエピトープに関する構造情報をより多く有することにより、同じ病原体の多数の改変体または密接に関連する病原体に対する広範な防御をもたらすワクチンに使用することができる免疫原を合理的に設計することが可能になり得る。そのようないわゆる「普遍的な」ワクチンは、同じ病原体の種々の改変体または密接に関連する病原体を同じワクチン組成物に含める（例えば、現在利用可能なポリオワクチンならびに連鎖球菌および髄膜炎菌コンジュゲートワクチンについての場合のように）、または以前の流行期の病原体集団において生じた抗原ドリフトを考慮して毎年新しいワクチン組成物をもたらす（インフルエンザワクチンの場合のように）必要がなくなるので、伝統的なワクチンよりも対費用効果が大きいと考えられる。
【０１２３】
多様な病原体に対するワクチン接種のための免疫原の合理的な設計には、同じ病原体の種々の改変体／亜型の中で、または密接に関連する病原体の中で保存されている免疫優性タンパク質の領域を同定することが伴う。キメラロタウイルス表面タンパク質上に異種タンパク質を提示させるためのロタウイルス粒子の使用により、多数の構造を比較的短い時間で迅速に決定することが可能になる。したがって、本発明の方法は、免疫原性タンパク質の保存されたエピトープの同定において特に有用であり得る。
【０１２４】
同じ病原体のいくつかの改変体／亜型に対しておよび／または密接に関連する病原体に対して惹起されることが見いだされている抗体または対応する抗原結合性断片と複合体を形成した免疫原の構造を決定することにより、この病原体および／または密接に関連する病原体の免疫優性免疫原における保存された領域を同定することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、抗体と複合体を形成した免疫原の３次元モデルを得るための方法であって、（ｉ）免疫原を含むキメラ表面タンパク質でロタウイルスＤＬＰを再外被形成させてキメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、（ｉｉ）懸濁物に、免疫原に特異的に結合する抗体または抗体断片を添加するステップであって、抗体または断片がキメラ表面タンパク質と複合体を形成するステップ、（ｉｉｉ）懸濁物を凍結させるステップ、（ｉｖ）ｃｒｙｏ−ＥＭを使用してロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および（ｖｉ）複数の顕微鏡写真を解析して抗体と複合体を形成した免疫原の３次元モデルを得るステップを含む方法に関する。免疫原は、一般には、ロタウイルス粒子に対して異種のものである。抗体と複合体を形成した免疫原の３次元モデルを使用して、抗体により認識される免疫原の表面上のエピトープを定義することができる。
【０１２５】
この方法を使用して、いくつかの関連する病原体または抗原ドリフトに起因して生じる病原体の改変体に対して広範に中和活性を有する抗体によって結合されるエピトープを同定することができる。あるいは、この方法を使用して、例えば、ウイルス細胞侵入タンパク質の機能に干渉し、ウイルス増殖を予防または阻害するために使用することができるエピトープを認識することができる抗体によって結合されるエピトープを同定することができる。特定の３次元立体配置のタンパク質に結合する抗体も、例えば、製造されたタンパク質の、このタンパク質の変性またはミスフォールディングしたコピーを多数含有するロットを排除するためにタンパク質の製造中の品質管理用試薬として有用であり得る。この方法は、さらに、診断用試薬として使用される抗体によって結合される場合に特に有用なエピトープ（例えば、密接に関連する病原体の群の中の特定の病原体に特異的なエピトープ）を同定するために使用することができる。
【０１２６】
抗体と複合体を形成した免疫原の３次元モデルを得るための方法を、同じ病原体のいくつかの改変体／亜型による感染に応答して、かつ／または密接に関連する病原体に対して惹起されることが見いだされている抗体またはそれらの対応する抗原結合性断片のパネルに対して繰り返すことにより、免疫原の表面上の各抗体に対するエピトープを同定することができる。パネル内の各抗体に対するエピトープが同定されたら、この情報を、免疫原を合理的に設計するために使用することができる。例えば、当該方法は、同じ病原体の多数の改変体／亜型および／または密接に関連する病原体に対して広範な中和活性をもたらす免疫原を設計するための同じ病原体のいくつかの改変体／亜型に対しておよび／または密接に関連する病原体に対して中和活性を有することが見いだされている抗体のパネルに対するエピトープを同定するために使用することができる。
【０１２７】
あるいは、現存するワクチンを用いた免疫化に応答して惹起される抗体により認識されるエピトープのレパートリーをマッピングするために上記の方法を使用することができる。これらの抗体により最も一般的に認識されるエピトープをマッピングすることにより、免疫優性エピトープを同定することができる。この情報は、現存するワクチンをさらに最適化するために有利に使用することができる。例えば、現存するワクチンが不活化病原体で構成される場合、ワクチンの最適化されたバージョンには、前記病原体の免疫優性部分のみを含めることができる（例えば、同定された免疫優性抗原またはエピトープの組換えバージョンを含むサブユニットワクチンの形態で）。これらの技法を使用して得られる免疫優性抗体エピトープの構造決定因子の理解を最も有用なエピトープ（例えば、広範に中和性のエピトープなど）を免疫優性にするように作出された抗原の調製に適用することができる。
【０１２８】
免疫原の設計を補助するためのエピトープのマッピングの例は当技術分野で公知であるが、一般に、Ｘ線結晶構造解析によって免疫原−抗体複合体の構造データを得ることに伴う労力が原因で、免疫原上の少数のエピトープに限定されている。多くの場合、単一の抗体のみが試験される（参考文献５７、５８および５９を参照されたい）。本発明は、ハイスループットな手法を使用して免疫原−抗体複合体に関する構造情報を得ることを初めて可能にする。本発明は、免疫原と弱くしか会合せず、したがって、結晶化に重要な難題を提示する抗体に対して特に有用である。
【０１２９】
同じ病原体のいくつかの改変体または密接に関連する病原体に対して広範に防御的である免疫原を設計するための種々の手法が当技術分野で公知である。近年、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶに対する「普遍的な」ワクチンを設計するための多くの試みがなされてきた（参考文献６０、６１および６２を参照されたい）。改変された免疫原の合理的な設計は、このプロセスを導く構造データの欠如により妨げられてきた。キメラロタウイルス表面タンパク質上に異種タンパク質を提示させるためのロタウイルス粒子の使用により、タンパク質のアミノ酸配列の改変がどのようにその３次元構造に影響を及ぼすかを迅速に決定することが可能になる。タンパク質の構造を変化させるアミノ酸の改変は、結晶を形成するその能力に影響を及ぼす可能性がある。したがって、これらの改変の影響を評価するための構造情報は、改変されたタンパク質が改変されていないタンパク質と同じ条件で結晶化しない場合があるので、容易には入手可能でない場合がある。ｃｒｙｏ−ＥＭの使用は、タンパク質構造の決定に関して結晶の形成に依存せず、さらに、異なる型のタンパク質に対して基本的な実験の設定のいかなる適応も必要としないので、改変されたタンパク質の迅速な構造の特徴付けが可能である。
【０１３０】
同じ病原体のいくつかの改変体／亜型、および／または多くの密接に関連する病原体に存在する病原体の免疫原性タンパク質上のエピトープが同定されたら、この情報を、普遍的なワクチンを設計するために使用することができる。いくつかの場合、これは、特に、ネイティブなタンパク質において共有されるエピトープを含む保存された領域に抗体が容易に接近可能でない場合には、免疫原の改変を必要とする場合がある。なぜなら、エピトープの接近可能性が乏しいことは通常不十分な免疫原性に変換されるからである。抗体により認識され得るネイティブなエピトープを保持するように免疫原を改変するが、エピトープはより接近可能なものにすることにより、改変された免疫原は、同じ病原体の広範囲の改変体／亜型または広範囲の密接に関連する病原体に対して防御的である抗体応答をもたらし得る。親和性成熟させた抗体に対するエピトープのマッピングに加えて、これらの抗体の変異していない祖先によって認識されるエピトープも、Ｂ細胞レパートリークローニング実験から推定されたら、この技法によってマッピングすることができる。この情報は、所望の変異していない祖先抗体を選択的に増幅する免疫原を設計し、次いで、広範かつ強力な中和抗体へのその親和性成熟化を導くことの補助になり得る。
【０１３１】
ネイティブな免疫原から改変された（普遍的なワクチンを調製するためにまたは他の理由で）候補免疫原を、目的のネイティブなエピトープの存在について本発明の方法を使用して試験することができる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、さらに、異種タンパク質の２つの改変体間の構造的な差異を決定するための方法であって、（ｉ）異種タンパク質の第１の改変体を含む第１のキメラ表面タンパク質を用いてロタウイルスＤＬＰを再外被形成させて、第１のキメラ表面タンパク質を提示する第１のロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、（ｉｉ）懸濁物を凍結させるステップ、（ｉｉｉ）ｃｒｙｏ−ＥＭを使用して第１のロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、（ｉｖ）複数の顕微鏡写真を解析して第１のキメラ表面タンパク質の３次元モデルを得るステップ、（ｖ）異種タンパク質の第２の改変体を含む第２のキメラ表面タンパク質を用いてステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すステップであって、第１および第２のキメラ表面タンパク質が、第１の改変体と第２の改変体の差異以外は互いと同一であるステップ、および（ｖｉ）第１のキメラ表面タンパク質の３次元モデルと第２のキメラ表面タンパク質の３次元モデルを比較して、異種タンパク質の第１の改変体と第２の改変体の間の構造的な差異を決定するステップを含む方法に関する。この方法を同じ異種タンパク質のさらなる改変体に対して繰り返して、ある特定の所望の構造特性を有する改変体を同定するためのスクリーニングアッセイをもたらすことができる。
【０１３２】
いくつかの場合には、それぞれエピトープを認識する抗体と複合体を形成した、ネイティブな免疫原の構造および複数の改変された免疫原の構造を決定することができる。改変された免疫原の構造とネイティブな免疫原を比較することは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるさらなる試験のための、ネイティブなエピトープを最もよく保存する候補免疫原の選択に役立つ。
【０１３３】
免疫原性組成物
さらなる態様では、本発明は、医薬の調製における、本発明のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子の使用に関する。具体的には、本発明のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子をヒトワクチン接種に適した免疫原性組成物に使用することができる。例えば、キメラ表面タンパク質を、患者に投与した際に防御免疫応答を惹起する異種タンパク質が提示されるように設計することができる。
【０１３４】
病原体由来の抗原に対する免疫応答を惹起するためのキメラウイルスの使用は当技術分野で周知である。伝統的に、この手法には、病原体由来の抗原のベクターとして選択された宿主ウイルスのゲノムの再操作（ｒｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）が必要である。そのような手法にはいくつかの限定がある。一般には、ウイルスゲノムを、抗原をコードする病原体由来の遺伝子を含有するように改変する。したがって、選択されたウイルスのゲノムサイズにより、発現させることができる病原体由来の抗原のサイズが限定される可能性がある。同様に、病原体由来の抗原をコードする遺伝子の挿入は、ウイルスの増殖に干渉し、達成することができる収量を限定する可能性がある。したがって、病原体由来の抗原のそれぞれに対してキメラウイルスの調製を最適化する必要がある。
【０１３５】
病原体由来の抗原のコード領域を挿入することによって宿主ウイルスのゲノムを変更する組換え遺伝学を使用して新しい表面タンパク質を有するキメラウイルスを創出することにより、キメラウイルスの宿主域が潜在的に変化し得、したがって、新しく創出されたウイルスの病原性に対する結果は予測不可能である。したがって、ワクチン接種される被験体において複製することができない十分に弱毒化されたキメラウイルスをもたらすために追加的なステップをとる必要がある。
【０１３６】
本発明は、ロタウイルスＤＬＰを再外被形成するために使用することができるあらゆる種類のキメラ表面タンパク質の調製を可能にするので、伝統的な手法に付随する問題を克服する。再外被形成されたロタウイルス粒子は、病原体由来の抗原に関するいかなる遺伝情報も含有しない。したがって、再外被形成されたロタウイルス粒子が宿主細胞に最初に感染した後は、病原体由来の抗原を有する後代ウイルスは形成されない。
【０１３７】
２つの部分からなるアダプター系を使用することにより、最適化ステップの数がさらに減少する。第１のアダプターポリペプチドと融合した改変ロタウイルスタンパク質が調製されたら、任意の既知の病原体由来の抗原を第１のアダプターポリペプチドと安定な複合体を形成する第２のアダプターポリペプチドと融合することができる。これにより、ロタウイルスの遺伝子操作についてあらゆる必要性が排除される。ほとんどの場合、病原体由来の抗原の発現および精製は、病原体由来の抗原における第２のアダプターポリペプチドの存在の影響を受けず、したがって、抗原の現存する発現および精製方法の改変は必要ではない。２つの部分からなるアダプター系を介して病原体由来の抗原と連結した改変ロタウイルスタンパク質を含むキメラ表面タンパク質を用いてロタウイルスＤＬＰを再外被形成するための現存するプロトコールを使用して、キメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子を調製することができる。次いで、これらのロタウイルス粒子を、病原体由来の抗原に対する免疫応答を惹起するための免疫原性組成物に含めることができる。
【０１３８】
ロタウイルス粒子が異種三量体ウイルス細胞侵入タンパク質を含有する三量体キメラ表面タンパク質を含む免疫原性組成物の調製にはワクチンプラットフォームが特に有用である。三量体ウイルス細胞侵入タンパク質は多くのウイルスの免疫優性表面抗原である。どちらもウイルス様粒子を形成するＢ型肝炎表面抗原およびヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質、ならびにロゼットを形成するインフルエンザＨＡを例外として、免疫優性ウイルス表面抗原に基づくサブユニットワクチンは、一般には、臨床的に有効なワクチンをもたらすことはできない。これらのウイルス表面抗原をそれらのネイティブなコンフォメーションでロタウイルス粒子上に提示させることにより、表面抗原が元々由来するウイルスに対する防御免疫応答を惹起する免疫原性組成物を調製することができる。
【０１３９】
三量体ウイルス細胞侵入タンパク質の特定の例としては、インフルエンザＨＡ、ＨＩＶ  ｇｐ１４０、エボラウイルス糖タンパク質、狂犬病ウイルス糖タンパク質、ヤギ関節炎脳炎ウイルスのＥｎｖタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ｇＢおよび任意選択でヒト単純ヘルペスウイルスの他のタンパク質およびＨＣＭＶの他のタンパク質とのその複合体が挙げられる。
【０１４０】
ロタウイルス粒子
ロタウイルスは、定義済みの宿主域を有する種々の動物株が存在するので、特に有用である。例えば、いくつかの株はウシに特異的であり、他の株はサルに特異的である。大多数の動物株は、一般には、ヒトに感染する株とは抗原性が異なり、したがって、大部分はヒトでは疾患を引き起こすことができない。したがって、一般には、ヒトは、これらのロタウイルス株に対して、これらの動物株をヒトワクチン接種のための免疫原性組成物のベクターとして使用した際にキメラ表面タンパク質に対する免疫応答に干渉し得るいかなる既存の免疫も有さない。さらに、これらのウイルスはヒトでは自然に弱毒化される。
【０１４１】
さらに、２種の認可された生の弱毒化ロタウイルスワクチンが現在販売されている：Ｒｏｔａｒｉｘ（商標）およびＲｏｔａＴｅｑ（商標）。Ｒｏｔａｒｉｘ（商標）は、初代ミドリザル腎臓細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ）（ＡＧＭＫ）において２６回継代し、Ｖｅｒｏ細胞において増殖させた、弱毒化されたヒトロタウイルス株ＲＩＸ４４１４を含有する。ＲｏｔａＴｅｑ（商標）は、５種のヒトロタウイルス（ＨＲＶ）−同じくＶｅｒｏ細胞において増殖させた、それぞれＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、およびＰ１と称されるウシロタウイルス（ＢＲＶ）リアソータント株の組合せを含有する。リアソータントは全て、ヒトＶＰ７またはＶＰ４タンパク質を発現するＢＲＶ株ＷＣ３（Ｇ６Ｐ７［５］）ゲノムバックグラウンドで構成される。
【０１４２】
以前に認可されたアカゲザルロタウイルス（ＲＲＶ）に基づくワクチンであるＲｏｔａＳｈｉｅｌｄ（商標）は、ＲＲＶ（Ｇ３Ｐ５Ｂ［３］）および３種のＲＲＶ−ＨＲＶリアソータントロタウイルスからなる。各リアソータントはＲＲＶ由来の１０種の遺伝子ならびにＧ血清型１、２、または４特異性（Ｇ１Ｐ５Ｂ［３］、Ｇ２Ｐ５Ｂ［３］、およびＧ４Ｐ５Ｂ［３］）についてＶＰ７タンパク質をコードする単一のＨＲＶ遺伝子を導く。
【０１４３】
さらに、ワクチンとして使用するための一価ウシ（ＮＣＤＶ  ＲＩＴ４２３７  Ｇ６Ｐ６）およびサル（ＲＲＶ株ＭＭＵ１８００６  Ｇ３Ｐ５Ｂ）ロタウイルス株の安全性は確立されている。
【０１４４】
これらのワクチン株の免疫化、臨床的な安全性および製造の経験を本発明のロタウイルス粒子に直接適用することができる。例えば、認可されたロタウイルスワクチンに含有されるロタウイルスのいずれか１つを、本発明のキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成させるためのＤＬＰを調製するために使用することができる。
【０１４５】
調製
免疫原性組成物に含まれる改変ロタウイルス粒子は、上記の方法のいずれかを使用して調製することができる。ネイティブなロタウイルス粒子を増殖させ、精製することができる。次いで、精製されたロタウイルス粒子を脱外被してＤＬＰを調製することができ、次いでそれを、病原体由来の抗原を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成させることができる。
【０１４６】
一般には、第１のアダプターポリペプチドと融合した改変ロタウイルスタンパク質をＤＬＰに付加してロタウイルス粒子を形成する。ロタウイルス表面タンパク質と一緒にネイティブなロタウイルス粒子の外層を形成するさらなるロタウイルスタンパク質の付加は任意選択である。次いで、ロタウイルス粒子を、第１のアダプターポリペプチドと安定な複合体を形成する第２のアダプターポリペプチドと融合した病原体由来の抗原と一緒にインキュベートして、キメラ表面タンパク質をもたらす。
【０１４７】
製剤
本発明の免疫原性組成物は、凍結乾燥したロタウイルス粒子を含む第１の容器および凍結乾燥したロタウイルス粒子の即時再懸濁用の溶液を含む第２の容器を含むキットの形態で提供することができる。凍結乾燥したロタウイルス粒子は、凍結乾燥の間ロタウイルス粒子を安定化するために、スクロース、デキストラン、ソルビトールおよびアミノ酸などの１種または複数の凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含んでよい。
【０１４８】
あるいは、免疫原性組成物は、懸濁物中ロタウイルス粒子を含む単一の容器中で提供される。免疫原性組成物が注射用である場合には、シリンジ中で提供され得る。
【０１４９】
各溶液は、１種または複数の賦形剤を含有してよい。
【０１５０】
溶液は、一般には水に基づくものである。したがって、精製水が主要な賦形剤を形成してよい。例えば、所望の最終濃度をもたらすためのロタウイルス粒子の希釈は、通常、注射用水（ＷＦＩ）を用いて実施する。
【０１５１】
一般には、溶液は緩衝液を含有する。したがって、さらなる賦形剤として、緩衝剤およびｐＨ調節剤、例えばクエン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、および水酸化ナトリウムなどが挙げられる。免疫原性組成物を経口的に投与する場合には、胃を通過する間のウイルスの不活化を予防するために炭酸カルシウムなどの制酸薬を添加することができる。アジピン酸二ナトリウムなどの酸性度調節剤（ａｃｉｄｉｔｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）も、好ましくは制酸薬の代わりに含めることができる。
【０１５２】
いくつかの場合には、キサンタンなどの増粘剤がさらなる賦形剤として存在してよい。
【０１５３】
界面活性物質、具体的にはポリソルベート８０などの非イオン性界面活性物質も存在してよい。
【０１５４】
他の賦形剤としては、スクロース、ソルビトール、無機塩、アミノ酸およびビタミンが挙げられる。
【０１５５】
組成物の質量オスモル濃度は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入ることがより好ましい。
【０１５６】
本発明の組成物のｐＨは、最適な安定性のためには、一般に、５．０から７．５の間、より一般には５．０から６．０の間である。
【０１５７】
本発明の組成物は、用量当たり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な尺度；１ＥＵはＦＤＡ参照標準内毒素ＥＣ２「ＲＳＥ」０．２ｎｇと同等である）、好ましくは用量当たり＜０．１ＥＵを含有することが好ましい。
【０１５８】
本発明の組成物は、グルテンを含まないことが好ましい。さらに、本発明の組成物は、滅菌されていることが好ましい。
【０１５９】
投与
免疫原性組成物は、粘膜免疫応答を刺激するために使用することができる。したがって、免疫原性組成物は、経口的にまたは気管内に投与することができる。本発明の免疫原性組成物に含まれる改変ロタウイルス粒子の表面上に提示される病原体由来の抗原に応じて、筋肉内注射などの他の投与経路を選択することができる。
【０１６０】
一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから排他的になってもよく、追加的な何かを含み、例えばＸ＋Ｙであってもよい。
【０１６１】
「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物はＹを完全に含まなくてもよい。必要であれば、「実質的に」という単語は本発明の定義から省くことができる。
【０１６２】
数値ｘと関連した「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％またはｘ＋その値の２標準偏差を意味する。ある特定の実施形態では、「約」は、特定の技術分野の範囲内で許容される変動および許容差と理解される。文脈から明らかでない限り、本明細書における数値的な用語は全て、約によって修飾されているものと理解される。「抗体」という用語は、例えば抗原結合性断片（Ｆａｂ）、単鎖可変性断片（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を包含する。抗体の「抗原結合性部分」（または「抗体部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を包含する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合性部分」という用語の範囲内に包含される結合性断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片［６３］；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーによってこれらをつなげることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、参考文献６４および６５を参照されたい。そのような単鎖抗体も抗体の「抗原結合性部分」という用語の範囲内に包含されるものとする。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」とは、包含的であり、文脈により特に明示されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」と交換することができると理解される。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「その（ｔｈｅ）」とは、文脈により特に明示されない限り、単数と複数の両方を含むことが理解される。
【０１６５】
特に明記されていなければ、２つまたはそれ超の成分を混合するステップを含むプロセスでは、いかなる特定の混合の順序も必要ではない。したがって、成分を任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合には、２つの成分を互いと組み合わせることができ、次いで、その組合せを第３の成分と組み合わせることができる、などである。
【０１６６】
動物、特にヒトに投与するための材料を調製するための細胞の培養において動物（特にウシ）材料を使用する場合、当該材料は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）が存在しない、特に牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が存在しない供給源から得るべきである。全体的に、動物、特にヒトに投与するための製品を調製する場合、動物由来材料が全く存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１６７】
再集合または逆遺伝学の手順に細胞基材を使用する場合、それは、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ５．２．３章にある通り、ヒトワクチンの作製における使用に関して認可されたものであることが好ましい［６６］。
【０１６８】
ポリペプチド配列間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより、ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を使用して決定することが好ましい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
異種タンパク質と連結したロタウイルス表面タンパク質を含むキメラ表面タンパク質を含む組成物であって、前記ロタウイルス表面タンパク質が、２つの部分からなるアダプター系によって前記異種タンパク質と非共有結合で連結しており、前記アダプター系の一方の部分が前記ロタウイルス表面タンパク質と連結し、前記アダプターの他方の部分が前記異種タンパク質と連結し、それにより、前記アダプター系の両部分が互いと安定な複合体を形成している、組成物。
（項目２）
前記アダプターの一方の部分が第１のアダプターポリペプチドによって形成され、前記アダプターの他方の部分が第２のアダプターポリペプチドによって形成され、前記第１のアダプターポリペプチドと前記第２のアダプターポリペプチドが互いと相互作用して安定な複合体を形成している、項目１に記載のキメラ表面タンパク質。
（項目３）
前記第１のアダプターポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して前記ロタウイルス表面タンパク質と融合しており、前記第２のアダプターポリペプチドが、任意選択でリンカー配列を介して前記異種タンパク質と融合している、項目２に記載のキメラ表面タンパク質。
（項目４）
前記第１のアダプターポリペプチドおよび前記第２のアダプターポリペプチドが７アミノ酸反復配列を含む、項目２または３に記載のキメラ表面タンパク質。
（項目５）
項目１から４までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質を含むロタウイルス粒子。
（項目６）
医薬として使用するための、項目５に記載のロタウイルス粒子。
（項目７）
（ａ）ロタウイルス表面タンパク質、第１のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、ならびに
（ｂ）異種タンパク質、第２のアダプターポリペプチド、および任意選択でリンカー配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム
を含む、核酸組成物であって、
任意選択で、前記オープンリーディングフレームはプロモーター配列と作動的に連結している、核酸組成物。
（項目８）
前記アダプターポリペプチドが７アミノ酸反復配列を含む、項目７に記載の核酸組成物。
（項目９）
（ａ）ロタウイルス表面タンパク質および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸、ならびに第２のアダプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および多重クローニング部位を含む第２の核酸であって、異種タンパク質のコード領域を前記多重クローニング部位に挿入することにより、前記異種タンパク質および前記第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがもたらされる、第２の核酸、あるいは
（ｂ）ロタウイルス表面タンパク質および第１のアダプターポリペプチドを含む改変ロタウイルス表面タンパク質をコードする第１の核酸、ならびに異種タンパク質および第２のアダプターポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする第２の核酸
を含む、キットであって、
前記第１のアダプターポリペプチドと前記第２のアダプターポリペプチドとが安定な複合体を形成することができ、
任意選択で、前記キットは、前記ロタウイルス表面タンパク質と同じ種のロタウイルスに由来するかまたは異なるロタウイルス種に由来するロタウイルス粒子をさらに含む、キット。
（項目１０）
項目５に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルス二層粒子（ＤＬＰ）を得るステップ、および前記ロタウイルスＤＬＰを項目１から４までのいずれか一項に記載のキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して項目５に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。
（項目１１）
項目５に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、外層を含むロタウイルス粒子を、培養培地中で成長させた細胞において増殖させるステップ、前記ロタウイルス粒子を前記培養培地から精製するステップ、前記外層を前記ロタウイルス粒子から取り除いてロタウイルスＤＬＰを得るステップ、ならびに、前記ロタウイルスＤＬＰを、三量体形成性ロタウイルス表面タンパク質、７アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第１の融合タンパク質を用いて再外被形成するステップ、ならびに、再外被形成された前記ロタウイルスＤＬＰを、三量体形成性異種タンパク質、７アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第２の融合タンパク質と混合して項目５に記載のロタウイルス粒子をもたらすステップを含む、方法。
（項目１２）
項目５に記載のロタウイルス粒子を調製するための方法であって、前記方法は、三量体形成性ロタウイルス表面タンパク質、７アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第１の融合タンパク質を含むロタウイルス粒子を、三量体形成性異種タンパク質、７アミノ酸反復配列、および任意選択でリンカー配列を含む第２の融合タンパク質と混合するステップを含む、方法。
（項目１３）
異種タンパク質の構造を決定するための方法であって、前記方法は、（ｉ）ロタウイルスＤＬＰを、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、前記キメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、（ｉｉ）前記懸濁物を凍結させるステップ、（ｉｉｉ）ｃｒｙｏ−ＥＭを使用して前記ロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および（ｉｖ）前記複数の顕微鏡写真を解析して前記キメラ表面タンパク質の３次元モデルを得るステップを含む、方法。
（項目１４）
分子との複合体中の異種タンパク質の構造を決定するための方法であって、前記方法は、（ｉ）ロタウイルスＤＬＰを、異種タンパク質の全部または一部を含むキメラ表面タンパク質を用いて再外被形成して、前記キメラ表面タンパク質を提示しているロタウイルス粒子の懸濁物をもたらすステップ、（ｉｉ）前記懸濁物に、前記異種タンパク質に特異的に結合する分子を添加するステップであって、前記分子が前記キメラ表面タンパク質と複合体を形成するステップ、（ｉｉｉ）前記懸濁物を凍結させるステップ、（ｉｖ）ｃｒｙｏ−ＥＭを使用して前記ロタウイルス粒子を画像化して複数の顕微鏡写真を得るステップ、および（ｖｉ）前記複数の顕微鏡写真を解析して前記分子と複合体を形成した前記キメラ表面タンパク質の３次元モデルを得るステップを含む、方法。
（項目１５）
前記分子が、タンパク質性分子、例えば（ａ）前記異種タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはその断片、または（ｂ）細胞表面受容体であって、ここで前記異種タンパク質がウイルス細胞侵入タンパク質であり、かつ前記タンパク質性分子に前記ウイルス細胞侵入タンパク質が結合する、細胞表面受容体である、項目１４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、（Ａ）ロタウイルスＶＰ７タンパク質および（Ｂ）異種タンパク質に対して行った改変の概略図である。ＨＲ１およびＨＲ２が異種タンパク質とロタウイルスＶＰ７タンパク質を非共有結合で結合させるための、２つの部分からなるアダプター系の一部を形成する。異種シグナルペプチド配列は、選択された発現系において高い発現レベルを達成する目的を果たす。アフィニティータグにより、容易な精製が可能になる。プロテアーゼ認識部位Ｐ１を使用して、精製後にアフィニティータグＡ１を除去することができる。親和性およびプロテアーゼ認識部位（Ａ２およびＰ２）の第２のセットは、適切なリンカー配列で置き換えることができ、大きな異種タンパク質の提示に必要な場合があるスペーサー配列としての機能を果たし得る。三量体形成タグは任意選択であり、いくつかの異種タンパク質の三量体形成の補助に使用することができ、それにより今度は、三量体ロタウイルスＶＰ７タンパク質との結合が容易になる。三量体形成タグ、特にコイルドコイルに基づく三量体形成タグ（例えば、ＧＣＮ４）は、改変ロタウイルスＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成されたロタウイルス粒子の表面上に提示される異種タンパク質が利用可能な空間を広げるための構造モジュールとしても機能し得る。
【図２】図２は、改変された三量体ロタウイルスＶＰ７タンパク質および三量体異種タンパク質によって形成される複合体の概略図である。ロタウイルスＶＰ７タンパク質は２つの部分からなるアダプター系を介して異種タンパク質と非共有結合で結合しており、アダプター系の一方の部分（ＨＲ２）はロタウイルスＶＰ７タンパク質と連結しており、アダプター系の他方の部分（ＨＲ１）は異種タンパク質と連結している。ＨＲ１およびＨＲ２は６−ヘリックスバンドルを形成し、その結果、異種タンパク質とロタウイルスＶＰ７タンパク質を非共有結合で付着させるための安定な複合体が生じる。キメラ表面タンパク質は、ＤＬＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再外被形成することによってロタウイルス粒子の外層の一部になり得る。
【図３】図３は、（Ａ）精製ＤＬＰ、（Ｂ）ロタウイルスＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成したＤＬＰおよび（Ｃ）異種タンパク質としてインフルエンザウイルスＨＡを提示するＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成したＤＬＰの電子顕微鏡写真である。画像を取得する前に粒子を陰性染色した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシー染色したアクリルアミドゲルを示す図である。レーン１は分子量マーカー（ＭＷ）を示す。レーン２には、再外被形成反応に使用した精製ＤＬＰをローディングした（ＤＬＰ）。レーン３には、ＤＬＰの再外被形成のために使用した精製ＶＰ７−ＨＡタンパク質複合体（ｐｒｏ）をローディングした。レーン４には、ＤＬＰ、再外被形成反応のための改変ＶＰ７タンパク質およびＨＡタンパク質のインプット混合物（ｉｎｐ）をローディングした。レーン５〜７には、再外被形成された粒子の精製後にＣｓＣｌ勾配で観察されたバンド（バンド１および２ならびに一番上のバンド）をローディングした。レーン８〜１４には、レーン１〜７と同じ試料を同じ順序でローディングするが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に試料に還元剤を添加しなかった。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣｓＣｌ勾配でのＶＰ７−ＨＡタンパク質複合体を用いて再外被形成したロタウイルスＤＬＰを示す図である。バンド１および２ならびに一番上のバンドは、パネルＡのレーン５〜７にローディングした試料に対応する。再外被形成された粒子およびＤＬＰが一般に移動すると思われる位置が点線の矢印で示されている。
【図５】図５は、（Ａ）ＨＡを提示する改変ＶＰ７タンパク質、（Ｂ）ＨＡを、抗体ＣＲ６２６１の結合したＳｃＦｖ断片と一緒に提示する改変ＶＰ７タンパク質、および（Ｃ）ＨＡを、抗体ＣＲ６２６１の結合したＦａｂ断片と一緒に提示する改変ＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成したロタウイルスＤＬＰの３次元再構築による断面を示す図である。ＣＲ６２６１は、ＨＡ１／ＨＡ２の膜近位ステム内の高度に保存されたヘリックス領域を認識する。再構築は、再外被形成されたＤＬＰに対してｃｒｙｏ−ＥＭを実施することによって得られた画像に基づく。
【図６】図６は、ＤＬＰ（白色）を、改変ロタウイルスＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成されたＤＬＰおよび改変異種タンパク質としてのインフルエンザウイルスＨＡの３次元再構築に重ね合わせた図である。再構築は、再外被形成されたＤＬＰに対してｃｒｙｏ−ＥＭを実施することによって得られた画像に基づく。
【図７】図７は、抗体ＣＲ６２６１のＦａｂ断片と結合したインフルエンザウイルスＨＡを提示するロタウイルス粒子の３次元再構築の詳細を示す図である。アダプター配列（ＨＲ２）を含有する改変ＶＰ７タンパク質を用いてＤＬＰを再外被形成することによってロタウイルス粒子を調製した。ＨＡタンパク質を、ＶＰ７タンパク質のＨＲ２  ７アミノ酸反復配列と６−ヘリックスバンドルを形成する、Ｃ末端に融合したＨＲ１  ７アミノ酸反復配列を介して改変ＶＰ７タンパク質と非共有結合で結合させた。ＣＲ６２６１は、各ＨＡサブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）の膜近位端に結合する。再構築は、再外被形成されたＤＬＰに対してｃｒｙｏ−ＥＭを実施することによって得られた画像に基づく。
【発明を実施するための形態】
【０１７０】
（実施例１）
改変組換えＶＰ７、ＨＡおよびＨＩＶ  ｇｐ１４０タンパク質のための発現ベクターの構築
アカゲザルロタウイルス（ＲＲＶ）Ｇ３株の野生型ＶＰ７遺伝子を標準の手順によってｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））のＢａｍＨ  Ｉ制限部位とＮｏｔ  Ｉ制限部位の間にクローニングした。ＶＰ７コード配列の５’末端側、開始コドンの前にコザック配列（ＧＣＣＡＣＣ；配列番号１９）を設計した。ＶＰ７コード配列の改変を逆ＰＣＲによって行った。プライマーの末端に関連する改変を含有する、適切なアニーリング温度のプライマーを設計した。図１Ａは、ロタウイルスコード配列に加えた種々の改変を示す。
【０１７１】
改変ＶＰ７コード配列によりコードされる最終的なタンパク質は以下の特徴を有する：最初の２１アミノ酸は、改変タンパク質を昆虫細胞において発現させるためのミツバチメリチンシグナル配列をコードする。ＶＰ７タンパク質シグナルペプチドは除去されている。必要に応じて、ＨＩＶコンセンサスシグナル配列またはヒト細胞において発現させるためのヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｈｔＰＡ）のシグナルペプチドなどの他のシグナル配列を使用することができる。（ｂ）アミノ酸残基２２〜３３はタンパク質を精製するための任意選択のアフィニティータグ（より効率的なシグナルペプチド切断のためのＳｔｒｅｐ−タグＩＩ＋リンカー）を形成し、例えばＨｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ−タグなどの任意の他のアフィニティータグで置き換えることができる。（ｃ）アミノ酸残基３４〜４０はアフィニティータグを切断するためのＴＥＶプロテアーゼ認識配列を形成し、例えばＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（すなわち、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、フューリンなどの任意の他のプロテアーゼの認識配列で置き換えることができる。（ｄ）アミノ酸残基４１〜１３６はアカゲザルロタウイルスＶＰ７のＮ末端部分（ＶＰ７アミノ酸残基５１〜１４６）の配列である。（ｅ）アミノ酸残基１３７は１アミノ酸リンカーであり、別の適切なリンカー配列で置き換えることができる。（ｆ）アミノ酸残基１３８〜１６５はＨＩＶ  ｇｐ４１  ＨＸＢ２株のＣ−７アミノ酸反復の一部であり、置き換え配列が改変ＨＡまたはｇｐ１４０タンパク質構築物において使用される７アミノ酸反復配列と適合する限りは、別のレトロウイルス、パラミクソウイルスなど由来の７アミノ酸反復配列で置き換えることができる（以下を参照されたい）。（ｇ）アミノ酸残基１６６〜１８７はリンカーで挟まれた第Ｘａ因子プロテアーゼ認識配列とその後のプロテインＣ−タグである。この改変は任意選択であり、例えば設計されたエピトープまたは単にＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２０）もしくはＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２１）などのリンカー配列などの他の配列で置き換えることができる。エピトープの提示（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）は、構造研究のために、エピトープを認識する抗体断片をパッキングして、提示された集合体（異種タンパク質を含む）をさらに安定化させるために有用であり得る。前記のように、構造研究を設計することは、抗原の提示（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）を設計することよりも複雑な方法である。（ｈ）アミノ酸残基１８８〜３６７はアカゲザルロタウイルスＶＰ７のＣ末端部分（ＶＰ７アミノ酸残基１４７〜３２６）である。この改変コード配列によりコードされる改変ＶＰ７タンパク質は配列番号２２のアミノ酸配列を有する。
【０１７２】
前の段落に記載されている改変のいくつかを含有する代替構築物を調製した。例えば、これらの構築物のいくつかは、抗ＨＩＶ抗体２Ｆ５によって認識される追加的なエピトープタグ（例えば、配列番号２９および３１）を含む。他の構築物では、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＨＸＢ２株のＣ−７アミノ酸反復をニパーウイルスのＣ−７アミノ酸反復（例えば、配列番号３２〜４１）で置き換えた。いくつかの構築物では７アミノ酸反復配列の長さを変動させた（例えば、配列番号２７および２８）。同様に、構築物のいくつかでは、Ｃ−７アミノ酸反復配列とＶＰ７タンパク質コード配列の残りを接続するリンカーを短縮した（例えば、配列番号２４〜２６を参照されたい）。異なる改変体が表１に要約されている。配列番号２２の改変ＶＰ７タンパク質配列は参照配列として含まれる。表１中の配列はＮ末端からＣ末端へ示されている。
【０１７３】
【表１−２】
0006594306.tif 000003
【０１７４】
【表１−３】
0006594306.tif 000004
【０１７５】
【表１−４】
0006594306.tif 000005
【０１７６】
ベクターと改変遺伝子の両方からなるＤＮＡをＰＣＲによって生成した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ処理に供してリン酸化末端を生成した。次いで、生じたＤＮＡに対して、ＤＮＡを適量のＴ４リガーゼと一緒に室温で２時間または一晩インキュベートすることによって平滑末端ライゲーションを行った。次いで、ライゲーション産物を、Ｄｐｎ  Ｉを用いて３７℃で３０分処理した後、標準のプロトコールによってＤＨ５α細胞を形質転換するために使用した。
【０１７７】
一般には、３〜４コロニーを採集し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（商標））を使用して一晩細胞培養物を成長させてプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドをアガロースゲル電気泳動によって検査し、正しい配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。正しい配列のプラスミドを使用してＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を標準の手順によって形質転換した。２つ〜３つの白色コロニーを各構築物について選択し、イソプロパノール／エタノール沈殿によって組換えバクミドＤＮＡを抽出するために一晩細胞培養物を成長させた（溶液Ｉ：１５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および１００μｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素Ａ；溶液ＩＩ：０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＡ；ならびに溶液ＩＩＩ：３Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ５．５；全て濾過滅菌したもの）。精製されたバクミドを、Ｍ１３プライマーを使用してＰＣＲによって検査し、正しいＤＮＡを使用して、各ウェルに細胞百万個を播種した６ウェルプレートにおいて、単層のｓｆ９細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後にＰ１ウイルスを採取し、ｓｆ９細胞（１ｍＬ当たり１．５〜２百万個の密度）に０．０５〜０．１％のＰ１ウイルスを感染させることによってＰ２ウイルスを作製した。感染の５〜７日後にＰ２ウイルスを採取し、タンパク質の発現のために使用した。
【０１７８】
上記の改変ＶＰ７タンパク質構築物を使用して、三量体形成性異種タンパク質を対応して改変された三量体形成性異種タンパク質と一緒に提示することができる（適切な改変の概略図については図１Ｂを参照されたい）。図２に示されている通り、改変ＶＰ７タンパク質のＨＲ２  ７アミノ酸反復配列および対応して改変された三量体形成性異種タンパク質のＨＲ１  ７アミノ酸反復配列は、異種タンパク質をロタウイルスＶＰ７タンパク質に非共有結合でマウントするためのアダプターとして現れる６−ヘリックスバンドルを介し、安定な複合体を形成する。Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質およびＨＩＶ−１のｇｐ１４０融合タンパク質を三量体形成性異種タンパク質の例として選択した。
【０１７９】
Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１  Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ  ２００６のＨＡ遺伝子を、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）法によってｐＦａｓｔＢａｃ  ＬＩＣ（商標）ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））にクローニングした。ｐＦａｓｔＢａｃ  ＬＩＣ（商標）ベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＬＩＣ部位を挿入することによって創出した。開始コドンの５’末端側、コード配列の前にコザック配列（配列番号１９）を設計した。ＨＡ遺伝子のコード配列の改変は逆ＰＣＲによって導入した。
【０１８０】
改変ＨＡコード配列によりコードされる最終的なタンパク質は以下の特徴を有する：（ａ）最初の３８アミノ酸は改変タンパク質を昆虫細胞において発現させるためのバキュロウイルスｇｐ６４シグナルペプチドをコードする。ＨＡタンパク質シグナルペプチドは除去されている。必要に応じて、ＨＩＶコンセンサスシグナル配列またはヒト細胞において発現させるためのヒトｔＰＡのシグナルペプチドなどの他のシグナル配列を使用することができる。（ｂ）アミノ酸残基４２〜４７はタンパク質を精製するための任意選択のアフィニティータグ（より効率的なシグナルペプチド切断のためのＨｉｓ−タグ＋リンカー）を形成し、例えばｓｔｒｅｐ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ−タグなどの任意の他のアフィニティータグで置き換えることができる。（ｃ）アミノ酸残基４８〜５４はアフィニティータグを切断するためのＴＥＶプロテアーゼ認識配列を形成する。リンカー配列も包含される。ＴＥＶプロテアーゼ認識配列は、例えばＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（すなわち、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、フューリンなどの任意の他のプロテアーゼの認識配列で置き換えることができる。（ｄ）アミノ酸残基５５〜３８１はＡ型インフルエンザ  Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ  ２００６株の赤血球凝集素のＨＡ１部分の配列であり、これは必要に応じて改変すること／変異させることもでき、以下に示されている任意の他のインフルエンザ株のものと置き換えることもできる。（ｅ）アミノ酸残基３８２〜３８６は切断のためにＨＡ１とＨＡ２の間に作出されたエンテロキナーゼの認識配列である。この部位は任意選択であり、必要に応じて、第Ｘａ因子、ＴＥＶプロテアーゼ、または他のものの認識配列で置き換えることができる。（ｆ）アミノ酸残基３８７〜５６５はＨＡのＨＡ２部分の配列である。（ｇ）アミノ酸残基５６６〜５９５はバクテリオファージＴ４フィブリチン由来の三量体形成タグ（Ｆｏｌｄｏｎ）であり、これは任意選択であり、任意の他の三量体形成タグまたはリンカー配列で置き換えることができる。（ｈ）アミノ酸残基５９６〜６２９はＨＩＶ  ｇｐ４１  ＨＸＢ２株のＮ−７アミノ酸反復の一部であり、例えば、任意の他のレトロウイルス、パラミクソウイルスなどに由来する他の適切な７アミノ酸反復配列で置き換えることができる。改変ＨＡコード配列についての記載で使用されるＨＡアミノ酸配列の番号付けは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＢＵ５０５８６．１（先の出願の出願日に入手可能なバージョンで参考として本明細書に援用される）に従ったものである。この構築物のアミノ酸配列は配列番号４６に示されている。
【０１８１】
前の段落に記載されている改変のいくつかを含有する代替構築物を調製した。例えば、代替構築物からは三量体形成ドメインを省いた（例えば、配列番号４８および４９）。いくつかの構築物では、エンテロキナーゼ認識配列を第Ｘａ因子認識配列で置き換えた（例えば、配列番号５２）。また、この構築物にはＨＡコード配列とＣ−７アミノ酸反復配列の間にリンカーを含めなかった。他の構築物では、三量体形成ドメインとエンテロキナーゼ認識配列の両方を省いた（配列番号５１）。時にはＨＩＶ  ｇｐ４１  ＨＸＢ２株のＮ−７アミノ酸反復の代わりにニパーウイルスのＮ−７アミノ酸反復を使用した（例えば、配列番号４７および４９を参照されたい）。いくつかの構築物では、７アミノ酸反復配列の長さを変動させた（例えば、配列番号５４、５６および５８）。他の構築物では、ＨＡコード配列とＮ−７アミノ酸反復配列を接続するリンカーの長さを変動させた（例えば、配列番号５６および５８を参照されたい）。Ｈ３  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ２００５の改変ＨＡ遺伝子（配列番号６０および６１を参照されたい）およびＨ５  Ｖｉｅｔｎａｍ  ２００４（配列番号６２および６３を参照されたい）をコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））によって合成した後、これらを改変構築物に含めた。これらの構築物の説明において使用されるＨＡアミノ酸配列の番号付けは、それぞれＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＡＴ７３２７４．１およびＡＣＶ４９６４４．１（どちらも先の出願の出願日に入手可能なバージョンで参考として本明細書に援用される）に従ったものである。これらの改変ＨＡコード配列の構造は表２に要約されている。配列番号４６の改変ＨＡタンパク質配列は参照配列として含まれる。表２中の配列はＮ末端からＣ末端へ示されている。
【０１８２】
【表２−１】
0006594306.tif 000006
【０１８３】
【表２−２】
0006594306.tif 000007
【０１８４】
【表２−３】
0006594306.tif 000008
【０１８５】
３種の改変ＨＡ遺伝子のそれぞれをｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））に、Ｓａｌ  Ｉ部位とＮｏｔ  Ｉ部位の間にサブクローニングした。改変ＨＡ遺伝子を有する組換えバキュロウイルスをＶＰ７に関して記載されているものと同様の手順に従って創出した。
【０１８６】
ＨＩＶ−１クレードＡ  １９９２  Ｕｇａｎｄａ  ０３７．８血清型およびクレードＣ  １９９７の改変ｇｐ１４０遺伝子をコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））によって合成した。改変遺伝子を、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））に、Ｓａｌ  Ｉ部位とＮｏｔ  Ｉ部位の間にサブクローニングした。
【０１８７】
ＨＩＶ−１クレードＡ株の改変ｇｐ１４０コード配列によりコードされる最終的なタンパク質は以下の特徴を有する：（ａ）最初の２１アミノ酸は改変タンパク質を昆虫細胞において発現させるためのミツバチメリチンシグナルペプチドをコードする。ｇｐ１４０シグナルペプチドは除去されている。必要に応じて、ＨＩＶコンセンサスシグナル配列または哺乳動物／ヒト細胞において発現させるためのヒトｔＰＡのシグナルペプチドなどの他のシグナル配列を使用することができる。（ｂ）アミノ酸残基２２〜２９はタンパク質を精製するための任意選択のアフィニティータグ（より効率的なシグナルペプチド切断のためのＨｉｓ−タグ＋リンカー）を形成し、例えばｓｔｒｅｐ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ−タグなどの任意の他のアフィニティータグで置き換えることができる。（ｃ）アミノ酸残基３０〜３６はアフィニティータグを切断するためのＴＥＶプロテアーゼ認識配列を形成し、例えばＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（すなわち、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、トロンビン、フューリンなどの任意の他のプロテアーゼの認識配列で置き換えることができる。（ｄ）アミノ酸残基３７〜６８５はＨＩＶ株１９９２  Ｕｇａｎｄａ  ０３７．８のｇｐ１４０コード配列であり、これは必要に応じて改変すること／変異させることもでき、任意の他のＨＩＶ／ＳＩＶ株のものと置き換えることもできる。（ｅ）アミノ酸残基６８６〜６９４はリンカーであり、任意の適切な他のリンカー配列で置き換えることができる。（ｆ）アミノ酸残基６９５〜７２１はバクテリオファージＴ４フィブリチン由来の三量体形成タグ（Ｆｏｌｄｏｎ）であり、これは任意選択であるまたは任意の他の三量体形成タグもしくはリンカー配列で置き換えることができる。（ｇ）アミノ酸残基７２２〜７５５はＨＩＶ  ｇｐ４１  ＨＸＢ２株のＮ−７アミノ酸反復の一部であり、例えば任意の他のレトロウイルス、パラミクソウイルスなどに由来する他の適切な７アミノ酸反復配列で置き換えることができる。この構築物のアミノ酸配列は配列番号６４に示されている。
【０１８８】
前の段落に示されている可能な改変のいくつかを含有する代替構築物を調製した。例えば、これらの構築物のいくつかは、三量体形成タグを含まず、ｇｐ１４０コード領域とＮ−７アミノ酸反復の間のリンカー配列が短縮されている（例えば、配列番号６６および６７）。他の構築物は、シグナルペプチドを置き換えることにより、哺乳動物細胞における発現に適合させたものである（例えば、配列番号６５および６７）。いくつかの構築物では、ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＨＸＢ２株のＮ−７アミノ酸反復がニパーウイルスのＮ−７アミノ酸反復で置き換えられており（配列番号６８〜７１および７６〜７９）、他の構築物では、ＨＩＶ−１クレードＡ  １９９２  Ｕｇａｎｄａ  ０３７．８血清型由来のｇｐ１４０コード配列がＨＩＶ−１クレードＣ  １９９７由来のｇｐ１４０コード配列で置き換えられている（配列番号７２〜７９）。クレードＡ  ｇｐ１４０およびクレードＣ  ｇｐ１４０についての番号付けは、それぞれＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＡＢ０５０２７．１およびＡＦ２８６２２７．１（どちらも先の出願の出願日に入手可能なバージョンで参考として本明細書に援用される）に従ったものである。
【０１８９】
種々の改変体が表３に要約されている。配列番号６４の改変ｇｐ１４０タンパク質配列も参照配列として含まれる。表３中の配列はＮ末端からＣ末端へ示されている。
【０１９０】
【表３−１】
0006594306.tif 000009
【０１９１】
【表３−２】
0006594306.tif 000010
【０１９２】
（実施例２）
安定なＶＰ７−ＨＡ複合体の調製
ＨＡ−ＶＰ７複合体を作製するために、１ｍＬ当たり２×１０６個の密度のＨｉ５細胞に０．５％ＶＰ７バキュロウイルスおよび１．０％ＨＡバキュロウイルスを５．０％熱失活ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で感染させた。感染の５日後に、細胞を４０００×ｇで４５分遠心沈殿することによって培地を採取した。上清を、Ｃｏｇｅｎｔ  Ｍ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において、１０ＫＤａのカットオフのフィルターを使用して、１×ＴＮＣ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、および１．０ｍＭのＣａＣｌ２；０．０２％アジ化ナトリウムを補充した）８リットルに対してダイアフィルトレーションした。緩衝液を交換した試料に１．０ｍＭのＰＭＳＦを補充し、ＪＡ１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ（商標））において１０，０００ＲＰＭで１時間遠心分離することによって清澄化した。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ（登録商標）カラム（ＩＢＡ（商標））、その後、ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ（商標））、およびＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標））によってタンパク質複合体を上清から精製した。
【０１９３】
精製ＨＡ−ＶＰ７複合体を、０．００２％（ｗ／ｗ）エンテロキナーゼを用いて４℃で４８時間処理した。ＨＡ０からＨＡ１およびＨＡ２への切断をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査した。１×ＥＤＴＡ不含完全プロテアーゼ阻害錠剤を添加することによってエンテロキナーゼを不活化した。試料に、酸化還元緩衝液（ＧＳＨとＧＳＳＧのモル比１０：１）を０．２〜０．５ｍＭの最終濃度で補充し、ＴＥＶプロテアーゼ（１／５０〜２００、ｗ／ｗ）を用いて室温で４時間または４℃で一晩処理した。タグの除去についてもＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査した。
【０１９４】
（実施例３）
安定なＨＩＶ  ｇｐ１４０−ＶＰ７複合体の調製
それぞれ配列番号２２、２６、３２および３６ならびに配列番号６４、６６、６８および７０のタンパク質をコードする改変ＶＰ７およびｇｐ１４０遺伝子を、哺乳動物細胞において発現させるために、ｐＶＲＣ８４００およびｐＶＲＣ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターに、Ｓａｌ  ＩとＮｏｔ  Ｉの間にサブクローニングした。ＶＰ７遺伝子のシグナルペプチドをヒトｔＰＡシグナルペプチドに変え、ｇｐ１４０遺伝子のシグナルペプチドをＨＩＶコンセンサスシグナルペプチド配列に変えた。生じた改変ＶＰ７タンパク質および改変ｇｐ１４０タンパク質は、それぞれ配列番号４２〜４５ならびに配列番号６５、６７、６９および７１のアミノ酸配列を有する。改変ＶＰ７タンパク質と改変ｇｐ１４０タンパク質の以下の組合せについて同時発現および複合体の形成を試験した：配列番号４２＋６５、配列番号４２＋６７、配列番号４３＋６５、配列番号４３＋６７、配列番号４４＋６９、配列番号４４＋７１、配列番号４５＋６９、配列番号４５＋７１。
【０１９５】
ＨＩＶ  ｇｐ１４０−ＶＰ７複合体を、２９３Ｔ細胞にｇｐ１４０−ＨＲ１遺伝子を有するプラスミドおよびＶＰ７−ＨＲ２遺伝子を有する別のプラスミドを同時トランスフェクトすることによって発現させた。標準のプロトコールに従い、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ＫＤａ、直鎖または分枝）を使用して一過性トランスフェクションを行った。タンパク質収量をより高くするために、ピューロマイシンに対して安定な細胞株を選択した。簡単に述べると、７０％コンフルエントの２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））と２つのプラスミドのｐＶＲＣ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏバージョンの混合物（ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅと総ＤＮＡの質量比２：１）を標準の手順に従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後に、培地を、１０％ウシ胎仔血清（アトラス）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、および２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））と交換した。培地を、コロニー（裸眼で見える）が形成されるまで３〜４日ごとに交換することによって新鮮に保った。個々のコロニーを採集し、小規模発現試験のために２４ウェルプレートで培養した。ウエスタンブロットでの両方のタンパク質の検出に基づいて両方の遺伝子を有するコロニーを選択した。複合体の収量が最も高いコロニーをスケールアップし、液体窒素中でストックとして保存した。細胞を、ピューロマイシンを含有する培地中でスケールアップし、５％熱失活ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を補充した２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中、接着細胞培養または浮遊細胞培養のいずれかを使用してタンパク質の発現を行うことができた。５日後に、細胞を４０００×ｇで４５分遠心沈殿することによって培地を採取した。ダイアフィルトレーションおよびタンパク質の精製をＨＡ−ＶＰ７複合体について記載されているものと同じ手順に従って行った。
【０１９６】
（実施例４）
ＦａｂおよびＦｖの調製
モノクローナル抗体ＣＲ６２６１は、インフルエンザＨＡタンパク質の膜近位ステム内の高度に保存されたヘリックス領域を認識する［６７］。ＣＲ６２６１  ｓＨｇＬ  Ｆａｂ断片についての構造因子および座標はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに受託４ＥＶＮの下に寄託されており（先の出願の出願日に入手可能なバージョンで参考として本明細書に援用される）、以前に記載されている［６８］。
【０１９７】
モノクローナル抗体ＣＲ６２６１の抗原結合性断片（Ｆａｂ）および単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のコード配列を、上記の通り標準の手順に従ってｐＶＲＣ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターに、Ｓａｌ  ＩとＮｏｔ  Ｉの間にクローニングした。これらの構築物を哺乳動物発現系において効率的に分泌させるためにヒトｔＰＡシグナルペプチドを使用した。最終的な構築物のアミノ酸配列が配列番号８１〜８３に示されている。細菌細胞において発現させるためのモノクローナル抗体ＣＲ６２６１のｓｃＦｖも調製した（配列番号８０を参照されたい）。
【０１９８】
ローラーボトル中で２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによってＦａｂを発現させた。各ローラーボトルについて、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を有する精製プラスミドＤＮＡのそれぞれ１２５μｇを補充なしのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））１２．５ｍＬ中に混合し、フード内で１５分インキュベートした。ＰＥＩ（５００μｇ、直鎖または分枝）も補充なしのＤＭＥＭ１２．５ｍＬ中に希釈し、フード内で１５分インキュベートした後、一滴ずつ添加し、ＤＮＡ混合物中に入れ十分に混合した。合計２５ｍＬの混合物をフード内でさらに１５分インキュベートして、ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を形成した後、ローラーボトル中５０〜７０％コンフルエントの細胞に添加した。細胞をＤＮＡ−ＰＥＩ複合体と一緒に３７℃で５時間超インキュベートし、培地を、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを補充した２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））２５０ｍＬと交換した。トランスフェクションの５日後に培地を採取し、ＣａｐｔｕｅｒＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＬｃカッパまたはＬｃラムダ親和性樹脂、その後にＳ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標））でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用してＦａｂを精製した。
【０１９９】
ＳｃＦｖを２９３Ｔ細胞において分泌タンパク質として、またはＥ．ｃｏｌｉにおいて封入体としてのいずれかで発現させ、次いで、そこからタンパク質を抽出し、リフォールディングさせた。哺乳動物細胞発現については、上記と同じ一過性トランスフェクション手順に従った。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、０．６〜０．８のＯ．Ｄ．６００ｎｍの細胞密度で１ｍＭのＩＰＴＧを使用して約５時間にわたってタンパク質の発現を誘導した。細胞を採取し、１×ＰＢＳを用いて洗浄し、氷上で超音波処理によって溶解させた。２００００×ｇで１５分遠心分離することによって細胞の可溶性画分を除去した後に封入体を抽出した。封入体を１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、８Ｍの尿素、および１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールに溶解させ、遠心分離することによって清澄化し（４００００×ｇで２０分）、ＮｉＮＴＡカラムで上清を精製した。溶出した試料を、変性した形態も同様に、リフォールディング緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１Ｍのアルギニン、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、および１ｍＭのＥＤＴＡ）中に４℃で一滴ずつ希釈して、最終的なタンパク質の濃度を０．１ｍｇ／ｍＬ未満にした。リフォールディング試料を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌに対して、４回、毎回２０体積で透析した。次いで、透析した試料を、ＪＡ１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ（商標））において１０，０００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化し、上清を、ＮｉＮＴＡカラムを通過させてタンパク質を濃縮した。次いで、溶出画分を合わせ、濃縮し、Ｓ２００サイズ排除カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ（商標））でさらに精製した。
【０２００】
（実施例５）
ＤＬＰの調製
アカゲザルロタウイルス血清型Ｇ３をＭＡ−１０４細胞に感染させることによって増幅した。簡単に述べると、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中でＭＡ１０４細胞を成長させた。細胞を維持し、１０−スタック細胞培養チャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標））またはローラーボトルにスケールアップした。細胞がコンフルエントになったら、ロタウイルス接種および増幅のために培地を１μｇ／ｍＬのブタ膵臓トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を補充した無血清ＭＡ１９９と交換した。感染の約３６〜４２時間後に、感染させたＭＡ１０４細胞の培地を採取し、後で使用するために−８０℃で保管した。
【０２０１】
感染させたＭＡ１０４細胞の凍結培地を４℃で一晩解凍した。３０００×ｇで約１０分低速遠心分離することにより細胞破片を取り除いた。生じた上清をＷｈａｔｍａｎ（登録商標）濾紙で濾過して残留する細胞破片を除去した後、さらに０．４５μｍのＥｘｐｒｅｓｓＰｌｕｓフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））を減圧下で通過させた。次いで、ウイルス粒子を４５Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ（商標））において４℃で１時間、４５，０００ｒｐｍでペレット化した。
【０２０２】
ペレットを合計１０ｍＬの１×ＴＮＥ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁させ、簡単に超音波処理し、Ｆｒｅｏｎ１１３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を用いて２回抽出した。水性相を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心分離濾過デバイス（１００ＫＤａカットオフ）において３０００×ｇで約１０分にわたり約１ｍＬに濃縮した。濃縮した試料を数回ピペッティングすることにより再懸濁させ、１×ＴＮＥ（屈折率測定によって決定して１．２６〜１．４５ｇ／ｍＬの密度）中、前もって形成したＣｓＣｌ勾配で層にした。試料をＳＷ  ５５Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ（商標））において５５０００ｒｐｍで、４℃で約２時間遠心分離した。ＤＬＰバンドを収集し、０．０２％アジ化ナトリウムを補充した１×ＴＮ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）に対して４℃で一晩透析した。
【０２０３】
ＤＬＰを陰性染色し、電子顕微鏡法を使用して可視化した（ＥＭ；図３Ａ）。
【０２０４】
（実施例６）
ＨＡ−ＶＰ７複合体を用いたＤＬＰの再外被形成
実施例５で得られたＤＬＰと実施例１で調製された改変ロタウイルスＶＰ７タンパク質を混合し、５〜１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下、４℃で少なくとも１時間インキュベートした。生じた粒子を陰性染色し、ＥＭを使用して可視化した。各粒子を覆う単一のＶＰ７層が観察され、これにより、改変ＶＰ７タンパク質によりＤＬＰの再外被形成ができることが確認された（図３Ｂ）。
【０２０５】
実施例２で得られたＨＡ−ＶＰ７複合体を用いたＤＬＰの再外被形成を、４℃で少なくとも１時間、５〜１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下でそれらを１：１．５〜１：２のモル比で混合することによって行った。再外被形成されたロタウイルス粒子を陰性染色し、ＥＭを使用して可視化した。ＤＬＰを覆う単一のＶＰ７層に加えて、再外被形成された粒子の周囲のさらなる層が観察され、これにより、ＤＬＰの表面上にＨＡ−ＶＰ７複合体が正確に集合したことが示唆される（図３Ｃ）。
【０２０６】
追加的な層がＨＡタンパク質によって形成されたことを確認するために、再外被形成された粒子を１×ＴＮＣ（密度１．２５ｇ／ｍＬ〜１．４５ｇ／ｍＬ）中、前もって形成したＣｓＣｌ勾配でローディングし、ＳＷ６０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ（商標））において５８，０００ｒｐｍで２時間遠心分離した。生じたバンドを収集し、１×ＴＮＣに対して透析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査した。対照として、再外被形成反応において使用したＤＬＰ、ＨＡ−ＶＰ７複合体およびその両方の混合物もゲルの別々のレーンにローディングした。分離後、ＤＬＰのＶＰ２およびＶＰ６タンパク質、ＶＰ７タンパク質ならびにＨＡタンパク質に対応する別々のバンドが、再外被形成された粒子に対応する、試料中の正しい化学量論で観察された（図４）。これにより、再外被形成された粒子の周囲のさらなる層がＨＡタンパク質から完全な占有率で構成されることが確認された。
【０２０７】
（実施例７）
ＨＡ−ＶＰ７−抗体複合体の３次元画像再構築
高分解能ｃｒｙｏ−ＥＭは、特に多数の分子複合体の迅速な構造解明が必要とされる分野で大きな分子複合体を解析するための最適な方法としてのＸ線結晶構造解析と置き換わる潜在性がある。そのような分野の１つは、抗原ドリフトにより免疫優性表面抗原であるＨＡタンパク質の配列に急速な変化が生じるインフルエンザのワクチン設計である。広範に防御的なモノクローナル抗体が以前に同定されており、これらの抗体の多くは、急速な変化を受けない保存されたエピトープを認識する。新興のインフルエンザ株に対する防御剤としてのそれらの適合性を調査するために、これらの広範な中和性抗ＨＡ抗体をＨＡタンパク質の種々の改変体に対してスクリーニングする必要がある。
【０２０８】
ｃｒｙｏ−ＥＭ解析を使用したそのような手法の実現性を試験した。実施例６に記載の通り、改変ＶＰ７タンパク質を単独でまたはＨＡ−ＶＰ７複合体と一緒に用いてＤＬＰを再外被形成した。精製ＨＡ−ＶＰ７複合体を実施例４で調製されたモノクローナル抗体ＣＲ６２６１のＦａｂまたはｓｃＦｖと１：１．５〜２．０のモル比で混合することにより、ＨＡ−ＶＰ７−抗体で再外被形成された粒子を得た。混合物を４℃で３０分インキュベートした。インキュベーション期間終了後に混合物をＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６カラムにローディングすることによって複合体を精製した。次いで、実施例６に記載のものと同じ手順に従い、精製された複合体を使用してＤＬＰを再外被形成した。あるいは、ＣｓＣｌ勾配精製ステップの前またはその後に、抗体断片をＨＡ−ＶＰ７複合体を用いて再外被形成された粒子に１：１．２〜１．５のモル比で直接添加した。
【０２０９】
Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｌｕｎｇｅｒ（ＦＥＩ）を用いてＣｒｙｏ−グリッドを調製した。Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｈｏｌｅｙカーボングリッドをグロー放電させ、室温で一晩放置した後に使用した。各グリッドについて、約５ｍｇ／ｍＬのロタウイルスＤＬＰと同等の濃度の試料４μＬをグリッドの一方の側面に適用した。プランジング中、チャンバーの湿気を１００％近くに維持し、温度を約２２℃に維持した。次いで、濾紙を用いてグリッドを両側から４秒ブロットし、その後すぐに、ガラス化のために液体エタン中にプランジングした。次いで、グリッドを液体窒素中で保管した後、データ収集のために使用した。
【０２１０】
３００ｋＶで作動させたＴｅｃｎａｉ（商標）  Ｆ３０電子顕微鏡（ＦＥＩ）でデータを収集した。標準の手順を使用して光学系をアラインメントした（ビームシフト、ビーム傾斜、ユーセントリック高さ、ピボットポイント、回転中心、非点収差など）。画像取得手順には、所望の画像化領域を見つけるステップ、焦点はずしを調整するステップ（０．６から３．０μｍの間）、グリッドドリフト速度を試験するステップ（毎秒２Å未満）、および最終的な画像露光のステップが伴った。これらの手順を、プログラムＳｅｒｉａｌＥＭ（Ｃｒｙｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ−Ｂｏｕｌｄｅｒ）を使用して半自動的に達成した。データをＫ２  Ｓｕｍｍｉｔ（商標）直接検出カメラ（Ｇａｔａｎ（商標））で超分解能モード（画素サイズ：０．９９Å）を使用して動画として記録した。参考文献２４の「動画」プロトコールを使用した。試料に対する線量速度は毎秒約３電子／Å２であった。各フレームに０．５秒の露光が記録され、最終的な動画は２４フレームからなり、累積線量は約３６電子／Å２であった。
【０２１１】
画像相互相関に基づくＩＭＯＤ（Ｃｒｙｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ−Ｂｏｕｌｄｅｒ）スクリプトを使用して各動画のフレームをアラインメントした。最初の画像加工のために、アラインメントしたフレームを単純に平均した。分解能は後で改善されたが、約２０電子の照射に対応する、各動画の最初の１３フレーム（または最良の一連のフレーム）からの平均画像を使用した。ＥＭＡＮ２画像加工スイートのｅ２ｂｏｘｅｒ．ｐｙを使用して粒子画像を選び取った［６９］。目視検査後、明白な欠陥、異常、異常な焦点、コンタミネーション、重複、または大きな試料ドリフトがある画像を手動で排除した。ＥＭＡＮ２画像加工スイートのｐｒｏｃ２ｄを使用して１６００×１６００画素寸法の個々の粒子の画像スタックを切り出すために粒子座標を使用した［６９］。プログラムＣＴＦＦＩＮＤ３を使用して焦点はずし値を決定した［２３］。
【０２１２】
プログラムＦＲＥＡＬＩＧＮを使用して構造の精緻化および再構築を行った［４０］。４×ビンに入れたデータ、および３次元参照として、ＶＰ７で再外被形成された粒子（７ＲＰ）の予め算出したマップ（参考文献１を参照されたい）を使用して最初の方位検索を実施した。１°の角度間隔で系統的な検索（モード３）によって決定された、切り出された粒子の最初のアラインメントパラメータを、分解能がさらに改善されなくなるまで最新の再構築に対してさらに精緻化した（モード１）。アラインメントの間、ロタウイルス部分に対応する密度を保持するため、およびＲＮＡおよびＨＡスパイクに対応する密度を排除するために２２０から４００Åの間の放射状シェルマスクを適用した。また、アラインメントプロセスにおける可能性のあるオーバーフィッティング（ｏｖｅｒｆｉｔｔｉｎｇ）を回避するために、画像を低域通過フィルターにかけた（最大１５Å）。次いで、アラインメントパラメータを使用して粒子全体の再構築を算出した（タンパク質含有量について、６００Åの放射状シェルの範囲内または２２０と６００Åの間の半径）。
【０２１３】
その後、２×ビンに入れた画像および後のビンに入れなかった画像を使用して、４×ビンに入れたデータに使用したものと同様の戦略、すなわち、最初の系統的な検索（モード３）、その後の、分解能のさらなる改善が観察されなくなるまでの角度および位置の精緻化（モード１）の多数のサイクルに従ってアラインメントパラメータをさらに精緻化した。精緻化の各段階の間に、２２０から４００Åの間のシェルマスクを適用し、データを最も信頼できる分解能に限定した（２×ビンに入れたデータについて最大１０Åおよびビンに入れなかったデータに対して最大８Å）。６００Åの放射状シェル内の粒子全体について再構築を算出した。
【０２１４】
図５Ａは、改変ＶＰ７タンパク質のみを用いて再外被形成したロタウイルスＤＬＰの３次元再構築の断面を示す。図５Ｂは、実施例６に記載の通りＨＡ−ＶＰ７複合体を用いて再外被形成したロタウイルスＤＬＰの３次元再構築の断面を示す。図６は、ＤＬＰを図５Ｂに示されている再外被形成された粒子の３次元再構築に重ね合わせたものを示す。図５Ｃは、ＨＡと、抗体ＣＲ６２６１の結合したＳｃＦｖ断片を一緒に提示する改変ＶＰ７タンパク質を用いて再外被形成したロタウイルスＤＬＰの３次元再構築の断面を示す。
【０２１５】
精緻化の信頼度を評価するために、粒子の種々の領域を遮蔽することによって精緻化の種々のセットを行い、アラインメントパラメータを使用して、精緻化の間含まれなかった省略領域についての再構築を算出した。例えば、ＨＡ部分（４２５から６００Åの間のシェルマスクを適用することによる）の精緻化によって得られるアラインメントパラメータを使用して、ロタウイルス部分（２２０から４００Åの間のシェルマスクを適用することによる）についての再構築を算出した。生じたマップは、ＶＰ２、ＶＰ６、およびＶＰ７を明白に表す密度を含有し、これにより、モデルの偏りが最小であることが示唆された。ロタウイルスＶＰ６およびＶＰ７層のＴ＝１３準等価配置は、粒子のアダプターおよびＨＡ部分まで明白に延長した。局所１３倍平均は適用しなかったが、分解能をさらに改善するために実施してもよい。ロタウイルスＶＰ２、ＶＰ６、およびＶＰ７、６−ヘリックスバンドル、ＨＡ、ならびにＦａｂの電子密度マップへの剛体フィッティングを、ＵＣＳＦキメラを使用して実施した［４７］。
【０２１６】
前の段落に記載の通りｃｒｙｏ−ＥＭから得られた再構築をさらに精緻化することによって実現することができる詳細レベルの例が図７に示されている。抗体ＣＲ６２６１のＦａｂ断片と結合したインフルエンザウイルスＨＡを提示するロタウイルス粒子の３次元再構築の詳細が示されている。算出されたマップでは、いくつかの二次構造を可視化することができる。予測通り、ＣＲ６２６１の可変ドメインがＨＡ１とＨＡ２の両方と相互作用しているのが見られる。
【０２１７】
（実施例８）
ロタウイルスＤＬＰ上にマウントしたＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体を用いた免疫化研究
雌６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを、それぞれカルシウムを含有する緩衝液１００μｌ中に製剤化した３つの異なる製剤のうちの１つを用いて、３週間の間隔で３回、筋肉内に（ＩＭ）免疫化する。第１群にはロタウイルスＤＬＰ上にマウントした製剤化ＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体を与え、第２群には、精製ＨＡを与え、第３群にはＶＰ７で再外被形成されたＤＬＰと混合した精製ＨＡを与える。マウスの第４群には緩衝液１００μｌを模擬注射する。実験は、各群に対して様々な用量を含み得る。等価な量の抗原を使用して、種々の形式の相当する用量の抗原に対する免疫応答を比較することができる。あるいは、等価な量の総タンパク質を使用して、種々の量の総タンパク質に対する免疫応答を比較することができる。
【０２１８】
１つまたは複数の群はアジュバントを含んでよい。アジュバントは、精製ＨＡ抗原を与える第２群のマウスにおける免疫応答の刺激に特に有用であり得る。
【０２１９】
各ワクチン群は、８匹のマウスを含有し、「緩衝液単独」の対照群は、５匹のマウスを含有する。最初の注射の投与から−１日目、２０日目、４１日目、５６日目および８４日目に採血する。
【０２２０】
免疫化後、マウスを体重変化、注射部位反応、および他の臨床的な観察についてモニターする。投与した抗原に対する抗体応答を当技術分野で公知の方法を使用して解析して、抗体特異性（例えば、ＨＡおよびＶＰ７タンパク質を含むロタウイルスタンパク質に対するＥＬＩＳＡアッセイおよび競合ＥＬＩＳＡアッセイ）および中和活性（例えば、インフルエンザ赤血球凝集阻害アッセイ、例えば、参考文献７０および７１を参照されたい）を解析する。
【０２２１】
結果は、ロタウイルスＤＬＰ上にマウントしたＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体に対する免疫応答が、アジュバントと一緒に製剤化した精製ＨＡを含めた精製ＨＡと比較して実質的に高いことを実証している。競合ＥＬＩＳＡは、ＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体に対する抗体応答が、主に、複合体のＶＰ７またはロタウイルス部分ではなく複合体のＨＡ部分に対するものであることを実証している。結果は、ロタウイルスＤＬＰ上にマウントしたＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体を用いた免疫化の結果としての中和抗体力価が、アジュバントと一緒に製剤化した精製ＨＡを含めた精製ＨＡと比較して実質的に高いことを実証している。これらの結果は、ｆｌｕ抗原の免疫原性が、ロタウイルスＶＰ７で被覆されたＤＬＰ上にマウントした場合に、ＶＰ７で被覆されたＤＬＰ上にマウントしていないｆｌｕ抗原と比較して増大することを実証している。
【０２２２】
全ての動物実験をＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコールに従って実施する。
【０２２３】
（実施例９）
アジュバントを用いた場合と用いていない場合の、ロタウイルスＤＬＰ上にマウントしたＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体を用いた免疫化研究
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目、２１日目、および４２日目に、以下の表４に示されている通り０．３〜１５μｇの精製抗原Ｈ１Ｎ１赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質複合体を用いて、後部四頭筋に２回、両側に５０μｌを筋肉内注射することにより免疫化する。
【０２２４】
複合体を、免疫化の１〜２時間前にＰＢＳまたはアジュバントを用いて製剤化する。製剤化サブユニットワクチンは投与するまで氷上で維持する。
【０２２５】
免疫化後、マウスを体重変化、注射部位反応、および他の臨床的な観察についてモニターする。動物から血清試料を、２０日目（最初の免疫化の３週間後）および４１日目（２回目の免疫化の３週間後）に後眼窩洞出血によって、ならびに６３日目（３回目の免疫化の３週間後）に安楽死させた動物の失血によって得る。
【０２２６】
投与した抗原に対する抗体応答を当技術分野で公知の方法を使用して（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、中和アッセイ）解析する。結果は、ロタウイルスＤＬＰ上にマウントしたＨＡ−ＶＰ７タンパク質複合体に対する免疫応答が、アジュバントと一緒に製剤化した精製ＨＡまたはＶＰ７で被覆されたＤＬＰと一緒に製剤化したが、その上にマウントしていない精製ＨＡを含めた精製ＨＡと比較して実質的に高いことを実証している。
【０２２７】
全ての動物実験をＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコールに従って実施する。
【０２２８】
【表４】
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【０２２９】
本明細書において引用されているおよび以下に列挙されている参考文献、特許、および特許出願のそれぞれは、それぞれが個別に組み入れられているのと同じくその全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において引用されている各受託番号は、本出願が基づく先の出願の出願日に入手可能なバージョンで参考として本明細書に援用される。
【０２３０】
本発明は単に例として記載されており、本発明の範囲および主旨内にとどまりつつ改変を行うことができることが理解されよう。
【０２３１】
【化１】
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【０２３２】
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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