(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分をCD34陰性であることを指標として分画して得られたヒト由来CD34陰性造血幹細胞含有細胞画分を、GPI-80陽性であることを指標として分画することを特徴とする、細胞画分中のCD34陰性造血幹細胞濃縮方法。
【請求項２】
さらに、血球系細胞マーカー陰性であることを指標として分画する、請求項１に記載の濃縮方法。
【請求項３】
さらに、CD133陽性であることを指標として分画する、請求項１又は２に記載の濃縮方法。
【請求項４】
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分をCD34陰性であることを指標として分画して得られたヒト由来CD34陰性造血幹細胞含有細胞画分におけるヒト由来CD34陰性造血幹細胞数を、GPI-80陽性であることを指標として計測することを特徴とする、CD34陰性造血幹細胞数の測定方法。
【請求項５】
ヒトGPI-80タンパク質を特異的に認識する抗体を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の濃縮方法に用いるための、細胞画分中のCD34陰性造血幹細胞濃縮用組成物。
【請求項６】
ヒトGPI-80タンパク質を特異的に認識する抗体を含有する、請求項４に記載の測定方法に用いるための、細胞画分中のCD34陰性造血幹細胞数の測定用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面抗原を指標とした、ヒト造血幹細胞濃縮画分の製造方法、及び該方法によって得られたヒト造血幹細胞濃縮画分に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト造血幹細胞（HSC）は古くから再生医療に用いられてきた。現在、本邦においては、年間約5,000例もの造血幹細胞移植が行われている。しかしながら、ヒトHSCの完全な純化が達成できていないこともあり、ヒトHSCの性質等の解析にはいまだ不十分な点がある。【０００３】
HSCの純化に関して、CD34抗原は、長い間、HSCの陽性マーカーであるといわれてきた。しかしながら、Osawaらにより、マウスHSCがCD34陰性c-kit陽性Sca-1陽性Lineage陰性 (CD34-KSL)画分に存在することが明らかにされた（非特許文献１）。その後、Ogawaらの一連の研究により、マウスHSCにおけるCD34の発現は、幹細胞の活性化状態や発育過程で変化することが明らかにされた（非特許文献２、非特許文献３）。これらの研究により、マウスHSCがCD34陽性と陰性の両方の細胞画分に存在することが示された。【０００４】
また、マウスHSCの分化経路に関して、河本らにより古典的モデルを否定する新たなmyeloid基本モデルが提唱されている（非特許文献４）。【０００５】
さらに、最近、マウスHSCについて、興味ある2つの報告がなされた。Jacobsenらの研究グループは、血小板産生能の高いHSCが、長期の骨髄再構築能を保持しており、myeloid-biased HSCやlymphoid-biased HSCを産生することができる、HSC hierarchy （階層制）の頂点にあるHSCであることを示した（非特許文献５）。一方、GekasとGrafらは、血小板等に発現することが知られているCD41をマーカーとして解析を進めた結果、CD41陽性であるHSCが、長期の骨髄再構築能を持つmyeloid-biased HSCであることを示した（非特許文献６）。これら2つの報告は、血小板産生能の高いHSCがhierarchy （階層制）の頂点にある幹細胞であるという、新たな概念を提唱するものである。【０００６】
以上のように、マウスにおいては、HSCの性質等に関する研究は急速に進んでいる。【０００７】
一方、ヒトにおいては、倫理上の問題により実験的なHSC移植が不可能であるため、HSCは、通常、重症免疫不全マウス（NOD/SCIDあるいはNOGマウス）を用いる異種間移植実験系で測定される、SCID-repopulating cell (SRC)として同定されている（非特許文献７）。このため、ヒトHSCの性質等に関する研究は、マウスにおける研究よりも遅れているのが現状である。【０００８】
ヒトHSCについて、従来の研究では、Lineage陰性CD34陽性CD38陰性画分中に最も未分化なヒトHSCが存在すると考えられていた（非特許文献８、非特許文献９）。その後、Majetiらは、Lineage陰性CD34陽性CD38陰性CD45RA陰性CD90陽性画分中に存在するHSCが、最も未分化なヒトHSCであると報告している（非特許文献１０）。最近、Nottaらは、Lineage陰性CD34陽性CD38陰性CD45RA陰性CD90陽性画分中のCD49f陽性細胞が、移植細胞が1個でも、効率的に造血機能を再構築することを報告している（非特許文献１１）。このように、CD34陽性であるヒトHSCに関しては多くの知見が報告されていた。しかし、ヒトHSCにおいてCD34が可逆的に発現する可能性については限られた報告しかなく結論は得られていない（非特許文献１２、非特許文献１３）。【０００９】
このような状況下で、SRC測定系を開発したDickらの研究グループは、ヒト臍帯血中のLineage陰性CD34陰性CD38陰性細胞分画にHSCの存在を示唆したが、その頻度は1/125,000と非常に低いものであった（非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Osawa M, et al.: Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 273:242-245,1996.
【非特許文献２】Sato T, et al.: Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells. Blood 94:2548-2554,1999.
【非特許文献３】Ito T, et al.: Developmental changes of CD34 expression by murine hematopoietic stem cells. Exp Hematol 28:1269-1273,2000.
【非特許文献４】Wada H, et al.: Adult T-cell progenitors retain myeloid potential. Nature 452:768-772,2008.
【非特許文献５】Sanjuan-Pla A, et al.: Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature 502:232-236,2013.
【非特許文献６】Gekas C, Graf T: CD41 expression marks myeloid-biased adult hematopoietic stem cells and increases with age. Blood 121:4463-4472,2013.
【非特許文献７】Larochelle A, et al.: Identification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating NOD/SCID mouse bone marrow: Implications for gene therapy. Nat Med 2:1329-1337,1996.
【非特許文献８】Wang JCY, et al.: Primitive human hematopoietic cells are enriched in cord blood compared with adult bone marrow or mobilized peripheral blood as measured by the quantitative in vivo SCID-repopulating assay. Blood 89:3919-3924,1997.
【非特許文献９】Hogan CJ, et al.: Differential long-term and multilineage engraftment potential from subfractions of human CD34+ cord blood cells transplanted into NOD/SCID mice. Proc Natl Acad Sci 99:413-418,2002.
【非特許文献１０】Majeti R, et al.: Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell 1:635-645,2007.
【非特許文献１１】Notta F, et al.: Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science 333:218-221,2011.
【非特許文献１２】Dao MA, et al. Reversibility of CD34 expression on human hematopoietic stem cells that retain the capacity for secondary reconstitution. Blood 101:112-118,2003.
【非特許文献１３】Zanjani ED, et al.: Reversible expression of CD34 by adult human bone marrow long-term engrafting hematopoietic stem cells. Exp Hematol 31:406-412,2003.
【非特許文献１４】Bhatia M, et al.: A newly discovered class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity. Nat Med 4:1038-1045,1998.
【非特許文献１５】Wang J, et al.: SCID-repopulating cell activity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone marrow injection. Blood 101:2924-2931,2003.
【非特許文献１６】Kimura T, et al.: Proliferative and migratory potentials of human cord blood-derived CD34- severe combined immunodeficiency repopulating cells that retain secondary reconstituting capacity. Int J Hematol 79:328-333,2004.
【非特許文献１７】Kimura T, et al.: Identification of long-term repopulating potential of human cord blood-derived CD34-flt3- severe combined immunodeficiency-repopulating cells by intra-bone marrow injection. Stem Cells 25:1348-1355,2007.
【非特許文献１８】Sonoda Y: Immunophenotype and functional characteristics of human primitive CD34-negative hematopoietic stem cells: The significance of the intra-bone marrow injection. J Autoimmun 30:136-144,2008.
【非特許文献１９】Kimura T, et al.: In vivo dynamics of human cord blood-derived CD34- SCID- repopulating cells using intra-bone marrow injection. Leukemia 24:162-168,2010.
【非特許文献２０】Ishii M, et al.: Development of a high-resolution purification method for precise functional characterization of primitive human cord blood-derived CD34-negative SCID-repopulating cells. Exp Hematol 39:203-213,2011.
【非特許文献２１】Takahashi M, et al.: CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia advance online publication, 26 November 2013; doi:10.1038/leu.2013.326
【非特許文献２２】Hu Y, et al: ELDA:Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods 347:70-78,2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、長年に渡り、ヒトCD34陰性HSCに関する研究を続けてきた。一連の研究においては、まず、ヒトCD34陰性HSCの細胞表面に発現しているホーミング関連分子について網羅的に解析した結果、ヒトCD34陰性HSCにおいては、骨髄ニッチへのホーミングに重要な分子であるCXCR4の発現レベルが低いことを明らかにした。本発明者らは、この結果から、ヒトCD34陰性HSCは骨髄ニッチにホーミングすることが困難であると推測し、これがヒトCD34陰性HSCの確実な同定を妨げていると考えた。このような問題を踏まえ、13種類のLineage抗体と独自に開発した骨髄内直接移植（IBMI）法を用いることにより、ヒト臍帯血中にCD34陰性HSCが存在することを世界で初めて直接的に証明した（非特許文献１５）。【００１２】
本発明者らは、さらに研究を続け、1）ヒトCD34陰性HSCがヒトCD34陽性HSCよりも増殖能力が大きいこと（非特許文献１６）、2）ヒトCD34陰性HSCの表面抗原特性が、Lineage陰性CD34陰性c-kit陰性flt3陰性であること（非特許文献１７）、3）ヒトCD34陰性HSCがCD34陽性CD38陰性HSCと同等、あるいはそれ以上の幹細胞活性を示し、T細胞系を含むすべての血球系統に分化すること（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）、4）特定のLineageマーカーを指標として用いることにより、ヒトCD34陰性HSCの頻度を1/1000程度にまで濃縮できること（非特許文献２０）、5）CD133を指標として用いることにより、ヒトCD34陰性HSCの頻度を1/142にまで濃縮できること（非特許文献２１）等を明らかにしてきた。【００１３】
以上の研究を踏まえ、本発明は、従来用いられていなかった表面抗原を指標とした、ヒトHSC濃縮画分の新規な製造方法を提供することを目的とする。さらには、CD34陰性であるヒトHSC濃縮画分の製造に適した方法、及びより効率的にヒトHSCを濃縮・純化できる方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、細胞画分をGPI-80陽性であることを指標として分画することにより、ヒト造血幹細胞（特にCD34陰性造血幹細胞）を効率的に濃縮・純化できることを見出した。本発明者らは、当該知見に基づきさらに研究を重ね、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の構成を包含する。
項１．  ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分を、GPI-80陽性であることを指標として分画することを特徴とする、造血幹細胞濃縮画分の製造方法。
項２．  さらに、CD34陰性であることを指標として分画する、項１に記載の製造方法。
項３．  さらに、CD34陽性であることを指標として分画する、項１に記載の製造方法。
項４．  さらに、CD38陰性であることを指標として分画する、項３に記載の製造方法。
項５．  さらに、血球系細胞マーカー陰性であることを指標として分画する、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
項６．  さらに、CD133陽性であることを指標として分画する、項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
項７．  項１〜６のいずれかに記載の製造方法で製造された、造血幹細胞濃縮画分。
項８．  （ａ）GPI-80陽性であり、（ｂ）CD34陰性であり、且つ（ｃ）血球系細胞マーカー陰性である造血幹細胞濃縮画分。
項９．  さらに、（ｄ）CD133陽性である、項８に記載の造血幹細胞濃縮画分。
項１０−１．  ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分におけるヒト由来造血幹細胞数を、GPI-80陽性であることを指標として計測することを特徴とする、造血幹細胞数の測定方法。項１０−２．  さらに、CD34陰性であることを指標として分画する、項１０−１に記載の測定方法。
項１０−３．  さらに、CD34陽性であることを指標として分画する、項１０−１に記載の測定方法。
項１０−４．  さらに、CD38陰性であることを指標として分画する、項１０−３に記載の測定方法。
項１０−５．  さらに、血球系細胞マーカー陰性であることを指標として分画する、項１０−１〜１０−４のいずれかに記載の測定方法。
項１０−６．  さらに、CD133陽性であることを指標として分画する、項１０−１〜１０−５のいずれかに記載の測定方法。
項１１．  ヒトGPI-80タンパク質を特異的に認識する抗体を含有する、細胞画分中の造血幹細胞濃縮用組成物。
項１２．  ヒトGPI-80タンパク質を特異的に認識する抗体を含有する、細胞画分中の造血幹細胞数の測定用組成物。
項１３．  下記の工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、ヒト造血幹細胞増殖調節物質のスクリーニング方法：
（ａ）項７〜９のいずれかに記載の造血幹細胞濃縮画分と被検物質とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記造血幹細胞濃縮画分中の細胞の増殖率を測定し、該増殖率を、被検物質を接触させない場合の前記造血幹細胞濃縮画分中の細胞の増殖率と比較する工程、
（ｃ）被検物質を接触させた場合の増殖率と、被検物質を接触させない場合の増殖率とが有意に相違している場合に、被検物質を、ヒト造血幹細胞増殖調節物質として選択する工程。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、GPI-80陽性であることを指標とした、ヒト造血幹細胞濃縮画分の新規な製造方法を提供することができる。この方法によれば、ヒト造血幹細胞（特にCD34陰性造血幹細胞）を効率的に濃縮・純化することができる。また、GPI-80は、ヒト造血幹細胞のマーカーとしては新規のマーカーであるので、他の既知のマーカーと組み合わせることにより、ヒト造血幹細胞を従来よりも高度に濃縮・純化することが可能となる。【００１６】
本発明の製造方法により高度に濃縮・純化されたヒト造血幹細胞画分を用いれば、造血幹細胞移植において、従来よりも少ない数の移植細胞でより高い生着率を達成することや、移植細胞中のリンパ球等によって引き起こされるGVHDの発症リスクを低減することが可能となる。【００１７】
また、このようなヒト造血幹細胞濃縮画分を用いれば、遺伝子発現解析等において、ヒト造血幹細胞以外の細胞に由来するバックグラウンドを、より低く抑えることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】参考例１（1-3）の、造血幹細胞陽性マーカーの探索結果を示す。
【図２】参考例２（2-3）の、CD133を指標とした分画結果を示す。
【図３】参考例３（3-5）の、移植細胞（CD133陽性）の分化能を示す。
【図４】参考例３（3-6）の、移植細胞（CD133陽性）の生着率の経時的変化を示す。
【図５】参考例３（3-7）の、CD133陽性画分中の造血幹細胞の割合を示す。
【図６】実施例１（4-3）の、GPI-80を指標とした分画結果を示す。
【図７】実施例２（5-5）の、GPI-80陽性画分中の造血幹細胞の割合を示す。
【図８】実施例２（5-6）の、移植細胞（GPI-80陽性）の生着率及び分化能を示す。
【図９】実施例３（6-3）の、GPI-80及びCD133の両方を指標とした分画結果を示す。
【図１０】実施例４（7-4）の、移植細胞（GPI-80陽性CD133陽性）の分化能を示す。
【図１１】実施例５（8-4）の、GPI-80陽性CD133陽性細胞を少数移植した場合の生着率及び分化能を示す。
【図１２】実施例６（9-4）の、GPI-80陽性CD133陽性細胞を1個移植した場合の生着率及び分化能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．造血幹細胞濃縮画分の製造方法、及び造血幹細胞濃縮画分
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分を、GPI-80陽性であることを指標として分画することを特徴とする、造血幹細胞濃縮画分の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と示す場合もある。）について説明する。
【００２０】
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分は、ヒト由来であり、且つ造血幹細胞を含有する細胞画分である限り特に限定されない。ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分としては、例えば、骨髄、末梢血、臍帯血、及び胎盤に限らず、これらから精製された細胞画分、造血幹細胞よりも未分化な細胞（全能性或いは多能性幹細胞）に造血幹細胞への分化処理を施して得られた細胞画分等も挙げられる。これらの中でも、より確実に本発明の効果を発揮できるという観点から、好ましくは骨髄、臍帯血、及び胎盤、これらから精製された細胞画分等が挙げられ、より好ましくは臍帯血、及び胎盤、これらから精製された細胞画分等、さらに好ましくは臍帯血、これから精製された細胞画分等が挙げられる。
【００２１】
骨髄、末梢血、臍帯血、及び胎盤は、公知の方法に準じて得たものを用いることができる。骨髄は、例えば、腸骨内に針を刺して、吸引することにより採取することができる。末梢血は、例えば、G-CSFの投与により被検体の末梢血中の造血幹細胞濃度を上げてから、連続血液成分分離装置を用いて採取することができる。この際、アフェレーシスによって採取した末梢血から、一部の成分を血管内に戻してもよい。臍帯血は、例えば、臍帯の血管に針を刺して吸引することにより採取することができる。
【００２２】
骨髄、末梢血、及び臍帯血の精製は、骨髄や血液から造血幹細胞を含む細胞画分を得ることができる公知の方法に従って行うことができる。精製方法としては、例えば、Ficall-Paque比重遠心法により単核細胞含有画分を得る方法、1%デキストランを加えて赤血球を沈降除去する方法、あるいは公知の精製キットを用いる方法等が挙げられる。
【００２３】
胎盤から造血幹細胞を含む細胞画分を得るためには、公知の方法を採用することができる。例えば、胎盤娩出後できるだけ速やかに（数時間以内）以下の処理を行うことが好ましい。すなわち、胎盤を十分量のPBS (phosphate-buffered saline)で洗浄して血液成分を洗い流す。次に、胎盤を細切して、0.15％ collagenase+0.2% dispase含有培地中で37度C、1時間の酵素処理を行う。その後、PBSで洗浄、遠心して細胞浮遊液を得る。
【００２４】
造血幹細胞よりも未分化な細胞としては、全能性（Totipotency）又は多能性（pluripotency）を有する細胞であり、造血幹細胞に分化可能な細胞であれば特に限定されず、例えばiPS細胞、ES細胞、EG細胞、VSEL細胞等が挙げられる。これらの細胞に対して施す、造血幹細胞への分化処理は、公知の処理を採用することができる。例えば、ヒトiPS細胞等の多能性幹細胞を、支持細胞（OP9細胞、間葉系幹細胞等）、及び特定のサイトカインと共にin vitroで培養することで血球系細胞へ分化誘導可能なことが知られている。また、iPS細胞を、支持細胞（OP9細胞、間葉系幹細胞等）、及び特定のサイトカインと共にマウスに注射すると、テラトーマが形成されたマウスの骨髄中に、iPS細胞由来の造血幹細胞が検出されることが知られている。
【００２５】
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分は1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００２６】
本発明の製造方法は、上記ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分を、GPI-80陽性であることを指標として分画することを特徴とする。GPI-80（GlycosylPhosphatidyl-Inositol-80）は細胞膜表面に存在する糖タンパク質である。従来は、ヒト好中球に発現する因子として知られていたが、本発明により初めて、ヒト造血幹細胞の陽性マーカーとして有用であることが見出された。GPI-80は、Vanin 2、VNN2、FOAP-4等の名称でも知られている。
【００２７】
本発明の製造方法においては、さらに、ヒト造血幹細胞、幹細胞、或いは生細胞全般の公知の性質等を指標として分画することができる。
【００２８】
ヒト造血幹細胞の公知の性質としては、例えば、CD34陰性、CD34陽性、CD38陰性、血球系細胞マーカー陰性、CD133陽性、CD90陽性、CD49f陽性等が挙げられる。したがって、GPI-80陽性に加えてこれらも指標とすることにより、ヒト造血幹細胞をより効率的に濃縮することができる。
【００２９】
また、上記した通りGPI-80は好中球に発現する因子であるため、GPI-80を指標とすることにより、好中球も混入する可能性がある。これを排除するという観点から、GPI-80陽性に加えて、好中球マーカー陰性も指標とすることが好ましい。
【００３０】
CD34については、陰性細胞及び陽性細胞の両方にヒト造血幹細胞が存在するが、より未分化な（すなわち、より長期にわたって造血機能を維持することができる）ヒト造血幹細胞を濃縮するという観点から、CD34陰性であることを指標とすることが好ましい。また、CD34陽性であることを指標とした場合でも、さらにCD38陰性であることを指標とすることにより、より未分化なヒト造血幹細胞を濃縮することができる。なお、本発明の製造方法においては、CD34陰性であることを指標として用いる方が、CD34陽性CD38陰性であることを指標として用いる場合よりも、GPI-80陽性であることを指標とすることによる、ヒト造血幹細胞の濃縮率（細胞画分中のヒト造血幹細胞数／細胞画分中の全細胞数）の増加の程度が高い。よって、本発明の製造方法は、CD34陰性ヒト造血幹細胞濃縮画分の製造に、より適している。
【００３１】
血球系細胞マーカーとしては、血球系細胞、例えば好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、若しくはマクロファージ等の白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、又は樹状細胞等の陽性マーカーとして公知のマーカーである限り特に限定されない。具体的には、例えばCD2、CD3、CD4、CD7、CD10、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD33、CD41、CD45RA、CD56、CD66c、CD127、CD235a等を挙げることができる。なお、血球系細胞マーカーとしては、CD2、CD3、CD4、CD7、CD10、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD33、CD41、CD45RA、CD56、CD66c、CD127、及びCD235aからなる群より選択される少なくとも1種以上が好ましく、少なくとも4種以上がより好ましく、少なくとも8種以上がさらに好ましく、少なくとも12種以上がさらに好ましく、少なくとも16種以上がよりさらに好ましく、18種全てが特に好ましい。血球系細胞マーカーは1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００３２】
CD133が陽性であるという指標は、非常に効率的にヒト造血幹細胞を濃縮することができることが知られている（非特許文献２１）。すなわち、ヒト臍帯血由来の造血幹細胞活性はCD133陽性画分にのみ認められる（非特許文献２１）。このCD133陽性画分の一部（5％以下）がGPI-80を発現している。結果として、CD34の発現に関わらず、CD133陽性かつGPI-80陽性画分にヒト造血幹細胞が高度に濃縮されることになる（図9）。
したがって、本発明の製造方法において、GPI-80陽性であるという指標と共にCD133陽性であるという指標を組み合わせることによって、特に血液由来の細胞画分から、さらに効率的にヒト造血幹細胞を濃縮できると考えられる。
【００３３】
好中球マーカーとしては、好中球の陽性マーカーとして公知のマーカーである限り特に限定されない。具体的には、例えば、CD10、CD15s、CD16b、CD17、CD24、CD32、CD35、CD43、CD65、CD65s、CD66a、CD66c、CD66d、CD89、CD92、CD93、CD111、CD112、CD114、CD116、CD123、CD131、CD157、CD170、CD177、CD181、CD281、CD282、CD312等を挙げることができる。好中球マーカーは1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００３４】
生細胞全般の公知の性質としては、例えば、アポトーシスマーカー及び／又は死細胞マーカーが陰性であることが挙げられる。よって、これらを指標として採用してもよい。アポトーシスマーカーとしては、例えばAnnexinV、TUNEL、JC-1、cytochrome C、Rhodamine 123、又はTMRE/TMRM等が挙げられ、好ましくはAnnexinVが挙げられる。死細胞マーカーとしては、例えば7AAD、PI、又はHoechst 33258等が挙げられ、好ましくは7AADが挙げられる。これらは1種単独でもよいし、2種又は3種以上の組み合わせであってもよい。
【００３５】
幹細胞の公知の性質としては、例えばFACS解析において、SSC（側方散乱光）が低く、且つFSC（前方散乱光）が低〜中程度であることが知られている。よって、これを指標として採用してもよい。
【００３６】
GPI-80陽性以外の上記指標を採用する場合は、1種単独で採用してもよいし、2種又は3種以上の組み合わせで採用してもよい。
【００３７】
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分の分画は、上記指標を用いて公知の方法に従って行うことができる。例えば、細胞を染色し、染色された細胞が発する蛍光量に基づき陽性又は陰性を判断し、陽性又は陰性の細胞を分取することにより行われる。具体的には、これら一連の作業は、例えば細胞分取機能を有するフローサイトメーター（セルソーター）を用いて行うことができる。
【００３８】
細胞の染色は、例えばマーカーが細胞表面タンパク質である場合は、マーカーに対する標識抗体を用いて細胞を免疫染色することにより行うことができ、マーカーがタンパク質以外の細胞表面因子（例えば細胞表面のフォスファチジルセリン等）に結合する非標識物（例えばAnnexinV（アポトーシスマーカー））である場合は、該マーカーの標識物を用いて細胞を染色することにより行うことができ、マーカーがタンパク質以外の細胞内在性因子（例えばDNA等）に結合する標識物（蛍光物質）（例えば7AAD（死細胞マーカー））である場合は、該マーカーを用いて細胞を染色することにより行うことができる。
【００３９】
マーカーに対する標識抗体や、標識されたマーカーは、各種市販されたものを用いることができる。或いは、公知の方法に従って、マーカーに対する抗体やマーカーを細胞に結合させた後、該抗体や該マーカーに対して標識物をさらに結合させてもよい。標識物の種類としては、FITC、PE、Pacific Blue、APC、PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP、Brilliant Violet 510、Brilliant Violet 421等が挙げられる。標識物の選択は、使用するマーカー間で、標識物の蛍光励起波長や蛍光波長のピークができるだけ重ならないものを選択する方が好ましい。
【００４０】
陽性又は陰性の判断は、公知の方法に従って、染色された細胞が発する蛍光量に基づいて行われる。この判断は、公知の手法に従って行うことができる。例えば、ネガティブコントロール細胞（具体的には、例えばアイソタイプコントロール抗体で染色された細胞）が発する蛍光量をバックグラウンドの蛍光量とし、バックグラウンドに対して十分に高い蛍光量を基準に、該基準よりも蛍光量が低い細胞を陰性細胞と判断し、該基準よりも蛍光量が高い細胞を陽性細胞と判断する。
【００４１】
陽性又は陰性の細胞の分画は、公知の方法に従って、例えば液滴荷電方式、又はセルキャプチャー方式等により行うことができる。
【００４２】
斯かる本発明の製造方法により、ヒト造血幹細胞（特にCD34陰性造血幹細胞）が高度に濃縮された造血幹細胞濃縮画分（以下、「本発明の造血幹細胞濃縮画分」と示すこともある。）を得ることができる。
【００４３】
本発明の造血幹細胞濃縮画分は、よりヒト造血幹細胞が濃縮されているという観点、及びより未分化なヒト造血幹細胞を多く含むという観点から、（ａ）GPI-80陽性であり、（ｂ）CD34陰性であり、且つ（ｃ）血球系細胞マーカー陰性であることが好ましい。また、さらにヒト造血幹細胞が濃縮されているという観点から、（ｄ）CD133陽性であることが好ましい。
【００４４】
本発明の造血幹細胞濃縮画分におけるヒト造血幹細胞の濃縮率（本発明の造血幹細胞濃縮画分中のヒト造血幹細胞数／本発明の造血幹細胞濃縮画分中の全細胞数）は、好ましくは1/500以上、より好ましくは1/200以上、より好ましくは1/100以上、より好ましくは1/50以上、より好ましくは1/30以上、より好ましくは1/10以上、より好ましくは1/5以上、より好ましくは1/2以上、より好ましくは3/5以上、より好ましくは9/10以上であることができる。なお、この濃縮率は、参考例３の3-7に記載の方法に従って算出することができる。
【００４５】
斯かる本発明の造血幹細胞濃縮画分によれば、造血幹細胞移植において、従来よりも少ない数の移植細胞でより高い生着率を達成することや、移植細胞中のリンパ球等によって引き起こされるGVHDの発症リスクを低減することが可能となる。また、遺伝子発現解析等において、ヒト造血幹細胞以外の細胞に由来するバックグラウンドをより低く抑えることも可能となる。
【００４６】
２．造血幹細胞数の測定方法
ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分におけるヒト由来造血幹細胞数を、GPI-80陽性であることを指標として計測することを特徴とする、造血幹細胞数の測定方法（以下、「本発明の測定方法」と示す場合もある。）について説明する。
【００４７】
本発明の測定方法は、より具体的には、ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分におけるGPI-80陽性細胞をヒト由来造血幹細胞と判定し、その細胞数を計測することにより行うことができる。この細胞数をヒト由来造血幹細胞含有細胞画分の総細胞数で除すことにより、ヒト由来造血幹細胞含有細胞画分中のヒト由来造血幹細胞の割合も算出することもできる。
【００４８】
本発明の測定方法は、さらに、ヒト造血幹細胞、幹細胞、或いは生細胞全般の公知の性質等を指標として計測することにより、より精度を高めること、すなわち計測されるヒト由来造血幹細胞数又は算出されるヒト由来造血幹細胞の割合と、「真の（具体的には、移植した場合に生着することができ、且つ血球系細胞に分化できる能力を有する）」ヒト由来造血幹細胞数又はヒト由来造血幹細胞の割合との差異をより小さくすることができる。
【００４９】
計測は、上記指標を用いて公知の方法に従って行うことができる。例えば、細胞を染色し、染色された細胞が発する蛍光量に基づき陽性又は陰性を判断し、陽性又は陰性の細胞を計測することにより行われる。具体的には、これら一連の作業は、例えばフローサイトメーターを用いて行うことができる。
【００５０】
本発明の測定方法は、上記以外については、本発明の製造方法と同様に行うことができる。
【００５１】
３．細胞画分中の造血幹細胞濃縮用組成物、及び細胞画分中の造血幹細胞数の測定用組成物
ヒトGPI-80タンパク質を特異的に認識する抗体（以下、「本発明の抗体」と示す場合もある。）を含有する、細胞画分中の造血幹細胞濃縮用組成物又は細胞画分中の造血幹細胞数の測定用組成物（以下、これらの組成物を総称して「本発明の組成物」と示す場合もある。）について説明する。
【００５２】
本発明でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００５３】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、ヒトGPI-80タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに当該ヒトGPI-80タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００５４】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したヒトGPI-80タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該ヒトGPI-80タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したヒトGPI-80タンパク質、あるいはタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞あるいはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００５５】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるヒトGPI-80タンパク質は、公知の配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００５６】
具体的には、ヒトGPI-80タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。またヒトGPI-80タンパク質の部分ペプチドは、公知の配列情報に基づいて、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００５７】
また本発明の抗体は、ヒトGPI-80タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、ヒトGPI-80タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つヒトGPI-80タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【００５８】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００５９】
本発明の抗体は、標識されていてもよい。標識物の種類としては、特に限定されるものではなく、例えばFITC、PE、Pacific Blue、APC、PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP、Brilliant Violet 510、Brilliant Violet 421等が挙げられる。
【００６０】
本発明の組成物には、本発明の抗体以外にも、抗体のヒトGPI-80タンパク質認識活性を著しく損なわない限りにおいて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、溶媒、緩衝剤、塩等が挙げられる。他の成分は1種単独でもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００６１】
本発明の抗体はヒトGPI-80タンパク質に特異的に結合する性質を有することから、該抗体は上記本発明の製造方法及び本発明の測定方法における使用に適している。
【００６２】
４．細胞画分中の造血幹細胞濃縮用キット、及び細胞画分中の造血幹細胞数の測定用キット
本発明は、上記本発明の組成物を含む、細胞画分中の造血幹細胞濃縮用キット、及び細胞画分中の造血幹細胞数の測定用キットも提供する。これらのキットは、本発明の組成物の他、必要に応じて細胞画分の免疫染色用の試薬、他のマーカーに対する抗体や標識マーカー、緩衝液など、本発明の製造方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。他のマーカーに対する抗体としては、CD34抗体、血球系細胞マーカー抗体、CD133抗体、CD38抗体等が挙げられる。標識マーカーとしては、アポトーシスマーカー、死細胞マーカー等が挙げられる。
【００６３】
５．ヒト造血幹細胞増殖調節物質のスクリーニング方法
下記の工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を含む、ヒト造血幹細胞増殖調節物質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と示す場合もある。）について説明する：
（ａ）本発明の造血幹細胞濃縮画分と被検物質とを接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、前記造血幹細胞濃縮画分中の細胞の増殖率を測定し、該増殖率を、被検物質を接触させない場合の前記造血幹細胞濃縮画分中の細胞の増殖率と比較する工程、
（ｃ）被検物質を接触させた場合の増殖率と、被検物質を接触させない場合の増殖率とが有意に相違している場合に、被検物質を、ヒト造血幹細胞増殖調節物質として選択する工程。
【００６４】
本発明の造血幹細胞濃縮画分は、ヒト造血幹細胞が高度に濃縮されている（すなわち他の細胞の混入量が少ない）。したがって、これを用いる本発明のスクリーニング方法は、他の細胞の影響をより少なくすることができ、ヒト造血幹細胞増殖調節物質をより高精度にスクリーニングすることができる。
【００６５】
ヒト造血幹細胞増殖調節物質とは、ヒト造血幹細胞に作用し、該細胞の増殖を調節（促進又は抑制）する物質である。現在、ヒト造血幹細胞を効率的に増殖させる技術は確立されていないところ、ヒト造血幹細胞の増殖を促進する物質（ヒト造血幹細胞増殖促進物質）をスクリーニングする意義は大きい。また、抗がん剤等の医薬を被検物質として、ヒト造血幹細胞の増殖を抑制する物質（ヒト造血幹細胞増殖抑制物質）をスクリーニングすることによって、抗がん剤等の医薬のヒト造血幹細胞への毒性を評価することもできる。
【００６６】
工程（ａ）は、本発明の造血幹細胞濃縮画分と被検物質とを接触させる工程である。
【００６７】
被検物質は、ヒト造血幹細胞増殖調節物質か否かをスクリーニングする対象物質である。被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。
【００６８】
本発明の造血幹細胞濃縮画分と被検物質とを接触させる態様は、本発明の造血幹細胞濃縮画分中の細胞に被検物質が接触することができる限り特に限定されない。例えば、細胞を培養している培養液中に被検物質を溶解する態様や、細胞を培養している培養液を、予め被検物質を溶解した培養液に置換する態様が挙げられる。
【００６９】
細胞と被検物質との接触時間は、特に限定されず、被検物質の種類等に応じて適宜設定することができる。接触時間は、例えば３０分間〜３週間程度であることができる。
【００７０】
培養液は、細胞を培養するための培地である。培養液としては、細胞を培養することができる限り特に限定されない。例えば、StemPro34、StemSpan等のヒト造血幹細胞用無血清培地、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、α-MEM培地等が挙げられる。培養液は、必要に応じて、血清が添加されていてもよい。また、培養液には種々の成分（糖、アミノ酸、塩類、金属成分等）も加えることができ、その濃度も細胞の培養に適している限り特に限定されない。
【００７１】
培養は、細胞の生存に適切な条件下、例えばCO2濃度5％、37℃、湿潤条件下でインキュベーションすることによって行われる。
【００７２】
工程（ａ）の後は、必要に応じて、被検物質の非存在下で細胞を培養してもよい。
【００７３】
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後、前記造血幹細胞濃縮画分中の細胞の増殖率を測定し、該増殖率を、被検物質を接触させない場合の前記造血幹細胞濃縮画分中の細胞の増殖率と比較する工程である。
【００７４】
増殖率の測定は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、被検物質と接触させる直前の細胞数（初期細胞数）を定法に従って計測しておき、同様に計測された工程（ａ）後の細胞数を初期細胞数で除して得られた値を増殖率とすることができる。
【００７５】
被検物質と接触させない場合とは、工程（ａ）において被検物質と接触させていない以外は、工程（ａ）を経て工程（ｂ）に供する細胞と同じ又は同等の処理をした場合である。この場合の増殖率も、上記した被検物質と接触させた場合の増殖率と同様に測定することができる。
【００７６】
工程（ｃ）は、被検物質を接触させた場合の増殖率と、被検物質を接触させない場合の増殖率とが有意に相違している場合に、被検物質を、ヒト造血幹細胞増殖調節物質として選択する工程である。
【００７７】
被検物質と接触させた場合の増殖率と、被検物質と接触させない場合の増殖率とが有意に相違しているか否かの判断は、一定の基準、例えば統計学的基準に基づき判断すればよい。具体的には、複数回測定してＰ値を求め、Ｐ値が一定値以下、例えば０．０５以下である場合に有意に相違すると判断する方法等が挙げられる。判断の結果、有意に相違している場合は、被検物質をヒト造血幹細胞増殖調節物質として選択する。
【００７８】
このように選択されたヒト造血幹細胞増殖調節物質は、ヒト造血幹細胞増殖調節物質の候補物質として、２次スクリーニングの被検物質として使用してもよい。
【００７９】
２次スクリーニングは、例えば被検物質（ヒト造血幹細胞増殖調節物質の候補物質）との接触によって生じた増殖率の変化が、ヒト造血幹細胞の増殖率の変化に起因するか否かを判定することにより行うことができる。具体的には、次のように行うことができる。
【００８０】
第１に、上記工程（ｃ）後に得られる、被検物質（ヒト造血幹細胞増殖調節物質の候補物質）との接触により増殖率が変化した細胞画分（被検細胞画分）を回収する。第２に、これをＮＯＧマウス等の免疫不全動物に移植し、そのＳＲＣ（SCID-repopulating cell）活性を測定する。ＳＲＣ活性を指標として、限界希釈実験（参考例３の3-7等）を実施し、被検細胞画分における、免疫不全動物に生着可能なヒト造血幹細胞の頻度を決定する。この頻度に基づいて、被検細胞画分に含まれる該ヒト造血幹細胞の実数を測定することができる。これを、上記工程（ａ）に供する前の細胞画分についても同様に行う。第３に、被検細胞画分のHSC数と、工程（ａ）に供する前の細胞画分のHSC数とを比較し、有意な差があれば、工程（ａ）で接触させた被検物質（ヒト造血幹細胞増殖調節物質の候補物質）を、ヒト造血幹細胞増殖調節物質として選択することができる。
【００８１】
ヒト造血幹細胞増殖促進物質をスクリーニングする場合は、工程（ｃ）において、被検物質を接触させた場合の増殖率が、被検物質を接触させない場合の増殖率よりも有意に高い場合に、被検物質を、ヒト造血幹細胞増殖促進物質として選択すればよい。
【００８２】
ヒト造血幹細胞増殖抑制物質をスクリーニングする場合は、工程（ｃ）において、被検物質を接触させた場合の増殖率が、被検物質を接触させない場合の増殖率よりも有意に低い場合に、被検物質を、ヒト造血幹細胞増殖抑制物質として選択すればよい。
【実施例】
【００８３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００８４】
参考例１：造血幹細胞陽性マーカーの探索
従来、造血幹細胞はCD34陽性画分に存在するといわれていたが、近年、CD34陰性画分にも造血幹細胞が存在すること、及びより未分化な造血幹細胞はCD34陰性であることが報告されている（非特許文献1、15〜20）。また、非特許文献20では、特定の18種類のLineageマーカーが陰性であることを指標とすることにより、造血幹細胞を効率的に濃縮、純化できることが報告されている。そこで、CD34陽性又は陰性であり且つ上記18種類Lineageマーカー陰性である細胞画分を用いて、造血幹細胞陽性マーカーの探索を行った。具体的には次のように行った。【００８５】
＜1-1．細胞液の調製＞
関西医科大学倫理委員会の承認（関医倫第608号）の下に、臍帯血検体の提供を受けた。該検体から、EasySep Human Progenitor Cell Enrichment Kit（StemCell Technologies社製）を用いて、8種類のLineage（CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、及びGPA）強陽性細胞が除去された単核細胞含有画分を得た。【００８６】
＜1-2．免疫染色＞
単核細胞含有画分中の細胞を、FITC標識された18種のLineageマーカー（CD2、CD3、CD4、CD7、CD10、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD33、CD41、CD45RA、CD56、CD66c、CD127、及びCD235a）抗体、APC標識されたCD34抗体、及びPacific Blue標識されたCD45抗体、陽性マーカー候補（GPI-80、CD133、CD9、CD26、CD36、CD38、CD41、CD44、CD47、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD61、CD62L、CD73、CD90、CD105、CD106、c-Mpl(CD110)、c-kit(CD117)、CD138、CD150、CXCR4(CD184)、Tie-2(CD202b)、CD271、KDR(CD309)、ABCG2、HLA-DR、h-Mer、integrinα9β1、integrinβ5、SSEA-4、TRA-1-60、及びTRA-1-81）のいずれかに対するPE標識抗体、並びに7AADを用いて、定法に従って免疫染色した。【００８７】
＜1-3．FACS解析＞
FACS（FACS Aria III（BD Bioscience））により、細胞が免疫染色された単核細胞含有画分から、まず、18種のLineageマーカー陰性であり且つCD34陽性である細胞、及び18種のLineageマーカー陰性であり且つCD34陰性である細胞を分画した。得られた両画分を、各陽性マーカー候補について、陽性画分及び陰性画分に分画した。さらに、各陽性マーカー候補の陽性画分を、FSC（前方散乱光）/SSC（側方散乱光）ゲートにback gateをかけて、それらのFSC/SSCに対する分布を解析した。なお、陽性であるか陰性であるかの境界の設定は、定法に従って行った。【００８８】
＜1-4．結果＞
図１上段に、各陽性マーカー候補についての陽性／陰性分画結果の一部を示す。図１上段の各分画図について、縦軸は分画図の上方に示す陽性マーカー候補の発現量を示し、横軸はCD45の発現量を示す。図１上段の結果より、従来、幹細胞マーカーとして報告されていたtie-2、KDR、ABCG2、及びCD150は、造血幹細胞が高度に濃縮された画分（18種のLineageマーカー陰性であり且つCD34陽性又は陰性である画分）の細胞には全く発現していなかった。一方、GPI-80、CD133、c-kit、CD90、CXCR4、CD49f、及びCD93については、造血幹細胞が高度に濃縮された画分中に、陽性細胞及び陰性細胞が存在していた。【００８９】
図１下段に、各陽性マーカー候補の18 Lineage陰性CD34陰性細胞における陽性画分をFSC/SSC分布図にback gateして解析した結果を示す。図１下段の各分画図中に分布するプロット中、色の濃いプロットが、分画図の上方に示す陽性マーカー候補が陽性である細胞のプロットを示す。また、各分画図中、囲み枠は、幹細胞が検出されることが知られているSSCとFSCの範囲（blast window）を示す。図１下段の結果より、c-kit、CD90、CXCR4、CD49f、又はCD93の陽性細胞は、blast windowの内外に分布していた。一方、CD133の陽性細胞は、ほぼblast window内に分布していた。また、GPI-80の陽性細胞は、blast window内外に分布しているものの、blast window外の細胞の多くは、より細胞が未分化である指標となる低FSC側に分布していた。以上の結果に基づいて、CD133及びGPI-80に焦点を当ててさらに解析を進めた。【００９０】
参考例２：CD133を用いた細胞の分画
CD133の発現を指標として細胞を分画した。具体的には次のように行った。【００９１】
＜2-1．細胞液の調製＞
参考例１と同様に、臍帯血検体から単核細胞含有画分を得た。【００９２】
＜2-2．免疫染色＞
単核細胞含有画分中の細胞を、FITC標識された18種のLineageマーカー（CD2、CD3、CD4、CD7、CD10、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD33、CD41、CD45RA、CD56、CD66c、CD127、及びCD235a）抗体、APC標識されたCD34抗体、Pacific Blue標識されたCD45抗体、PE標識されたCD133抗体、及び7AADを用いて、定法に従って免疫染色した。【００９３】
＜2-3．FACS解析＞
まず、細胞が免疫染色された単核細胞含有画分の、FSC/SSCに対する分布を解析し、blast window内の細胞を分画した（図２（Ａ））。次に、7AAD陰性であり且つ18種のLineageマーカー陰性の細胞を分画した（図２（Ｂ））。続いて、CD34陽性細胞、及びCD34陰性細胞をそれぞれ分画した（図２（Ｃ））。さらに、CD34陽性画分及びCD34陰性画分それぞれについて、CD133陽性細胞、及びCD133陰性細胞を分画した（図２（Ｄ）及び（Ｅ））。なお、本解析は合計19回行われ、図２はそれらのうちの代表的な結果を示したものである。全19回の解析について、CD34陽性画分におけるCD133陽性細胞の割合の平均値±s.dは79.19±8.97％であり、CD34陰性画分におけるCD133陽性細胞の割合の平均値±s.dは39.62±14.5％であった。なお、陽性であるか陰性であるかの境界の設定は、定法に従って行った。【００９４】
参考例３：CD133陽性画分中の造血幹細胞の有無の評価
NOGマウスにCD133陽性画分を移植しヒト細胞の生着の有無を調べることにより、該画分中の造血幹細胞の有無を評価した。具体的には次のように行った。【００９５】
＜3-1．NOGマウスへの細胞画分の移植＞
8週齢NOGマウスに対して、137Cs−γ線照射器を用いて250 cGyの放射線を照射した。参考例２で得られたCD34陽性であり且つCD133陽性である細胞、CD34陽性であり且つCD133陰性である細胞、CD34陰性であり且つCD133陽性である細胞、又はCD34陰性であり且つCD133陰性である細胞5000個を、照射後のNOGマウスの左脛骨内にIBMI（Intra-Bone Marrow Injection）法（非特許文献15）で移植した。【００９６】
＜3-2．各種臓器からの細胞画分の採取＞
移植から6、12、及び18週経過後に、マウスの右脛骨から骨髄液を吸引法により採取した。移植から20週経過後にマウスを殺処分し、骨髄、胸腺、及び脾臓から細胞液を採取した。【００９７】
＜3-3．免疫染色＞
採取された細胞画分を、7AAD、PE-Cy7標識されたマウスCD45.1抗体、及びPacific Blue標識されたヒトCD45抗体を用いて定法に従って免疫染色した。また、骨髄から採取された細胞画分については、さらに、FITC標識されたヒトCD19抗体、FITC標識されたヒトCD11b抗体、FITC標識されたヒトCD235a抗体、PE標識されたヒトCD33抗体、PE標識されたヒトCD14抗体、PE標識されたヒトCD41抗体、又はAPC標識されたヒトCD34抗体を用いて定法に従って免疫染色し、胸腺から採取された細胞画分については、さらにFITC標識されたヒトCD3抗体、PE標識されたヒトCD4抗体、及びAPC標識されたヒトCD8抗体を用いて定法に従って免疫染色し、脾臓から採取された細胞画分については、さらにFITC標識されたヒトCD56抗体を用いて定法に従って免疫染色した。【００９８】
＜3-4．移植細胞の生着率、及び生着検体の割合の解析＞
移植から18週経過後に採取された骨髄細胞画分について、FACSで7AAD陰性であり且つヒトCD45陽性である細胞を分画し、該細胞の骨髄細胞中の割合（生着率）を求めた。また、試験に供した各検体について、生着率が0.01％以上の場合に生着していると判断し、生着検体の割合を求めた。【００９９】
結果を表１に示す。表１より、CD133陰性細胞を移植した場合は試験検体全てにおいて生着が認められなかったが、CD133陽性細胞を移植した場合は試験検体全てにおいて生着が確認された。このことより、CD133陽性画分には、CD133陰性画分に比べて、はるかに多くの造血幹細胞が存在することが示唆された。すなわち、CD133が造血幹細胞の陽性マーカーとして有用であることが示唆された。【０１００】
【表１】
0006517190.tif 000002
【０１０１】
＜3-5．移植細胞の分化能の解析＞
移植から20週経過後に採取された細胞画分について、FACSで7AAD陰性であり且つヒトCD45陽性である細胞を分画した。骨髄細胞画分については、さらにCD19（B細胞マーカー）、CD11b（単球系細胞マーカー）、CD235a（赤血球系細胞マーカー）、CD33（顆粒球系細胞マーカー）、CD14（単球系細胞マーカー）、CD41（巨核球−血小板系細胞マーカー）、又はCD34が陽性である細胞を分画した。胸腺細胞画分については、さらにCD3（T細胞マーカー）陽性である細胞、及びCD3が陽性であり、且つCD4及びCD8の少なくとも1つが陽性である細胞を分画した。脾臓細胞画分については、さらにCD56（NK細胞マーカー）陽性である細胞を分画した。【０１０２】
結果を図３に示す。図３中、BMは骨髄細胞画分の分画結果を示し、Thymusは胸腺細胞画分の分画結果を示し、Spleenは脾臓細胞画分の分画結果を示す。図３より、移植細胞が、多様な血球系細胞（B細胞、単球系細胞、赤血球系細胞、顆粒球系細胞、巨核球系細胞、血小板系細胞、T細胞、及びNK細胞）に分化したことが示された。【０１０３】
＜3-6．移植細胞の生着率の経時的解析＞
移植から6、12、及び18週経過後に採取された骨髄細胞画分を用いて、上記3-4.と同様に生着率を求めた。図４に、生着率の平均値の推移グラフを示す。図４中、縦軸が生着率を示す。図４より、CD34陽性であり且つCD133陽性である細胞、又はCD34陰性であり且つCD133陽性である細胞を移植した場合は、移植から6週経過後で生着が認められ、その後生着率が上昇し、18週後にはほぼピークに到達していた。一方、CD34陽性であり且つCD133陰性である細胞、又はCD34陰性であり且つCD133陰性である細胞を移植した場合は、移植から6〜18週の間に生着が確認できなかった。【０１０４】
＜3-7．CD133陽性画分中の造血幹細胞の割合の解析＞
上記3-1と同様の方法で、NOGマウスに対して、参考例２で得られたCD34陽性であり且つCD133陽性である細胞（20個、50個、若しくは100個）、又はCD34陰性であり且つCD133陽性である細胞（200個、400個、若しくは800個）を移植した。移植から12週経過後に上記3-2と同様に骨髄液を採取し、得られた骨髄細胞画分を上記3-3と同様に免疫染色した。上記3-4と同様に生着率を求め、さらに該生着率に基づいて、各試験検体について生着しているか否かを判断した。移植細胞数が異なる場合それぞれについて、非生着検体の割合［＝（非生着検体数／試験検体数）×100］を求めた。得られた値から、Extreme Limiting Dilution Analysis（非特許文献２２）に基づいて、具体的にはhttp://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/で利用可能な解析ソフトを用いて、CD133陽性画分中の造血幹細胞の割合を算出した。【０１０５】
結果を図５に示す。図５中、（Ａ）はCD34陽性であり且つCD133陽性である細胞についての結果を表し、（Ｂ）はCD34陰性であり且つCD133陽性である細胞についての結果を表す。図５中、縦軸（% negative mice）は非生着検体の割合を示し、横軸は移植細胞数を示す。（Ａ）及び（Ｂ）に示すそれぞれの３つのプロットは、異なる移植細胞数で観察された非生着マウスの割合を示している。また、太字のｆは、ELDAに基づいて算出された、CD34陽性であり且つCD133陽性である細胞、又はCD34陰性であり且つCD133陽性である細胞中の造血幹細胞の頻度を示し、その他のｆは95％信頼区間の上限及び下限を示す。【０１０６】
図５より、CD34陽性であり且つCD133陽性である細胞中では、造血幹細胞が1/98.8個にまで濃縮されており、またCD34陰性であり且つCD133陽性である細胞中では、造血幹細胞が1/142個にまで濃縮されていることが示された。CD34陰性細胞については、CD133をマーカーとして用いない従来の手法の濃縮率は約1/1000個であったことを考慮すると（非特許文献20）、この濃縮率は極めて高い値であるといえる。【０１０７】
実施例１：GPI-80を用いた細胞の分画
GPI-80の発現を指標として細胞を分画した。具体的には次のように行った。【０１０８】
＜4-1．細胞液の調製＞
参考例１と同様に、臍帯血検体から単核細胞含有画分を得た。【０１０９】
＜4-2．免疫染色＞
単核細胞含有画分中の細胞を、FITC標識された18種のLineageマーカー（CD2、CD3、CD4、CD7、CD10、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD33、CD41、CD45RA、CD56、CD66c、CD127、及びCD235a）抗体、APC標識されたCD34抗体、Pacific Blue標識されたCD45抗体、PE-Cy7標識されたCD38抗体、PE標識されたGPI-80抗体、及び7AADを用いて、定法に従って免疫染色した。【０１１０】
＜4-3．FACS解析＞
まず、細胞が免疫染色された単核細胞含有画分の、FSC/SSCに対する分布を解析し、blast window内の細胞を分画した。次に、7AAD陰性であり且つ18種のLineageマーカー陰性の細胞を分画した。続いて、CD34陽性細胞、及びCD34陰性細胞をそれぞれ分画した。さらに、CD34陰性画分について、GPI-80陽性細胞及びGPI-80陰性細胞を分画した。一方、CD34陽性画分については、CD38陰性細胞を分画し、得られた画分からGPI-80陽性細胞及びGPI-80陰性細胞を分画した。なお、本解析は合計5回行った。代表的な結果を図６に示す。全5回の解析について、CD34陽性且つCD38陰性画分におけるGPI-80陽性細胞の割合の平均値±s.dは10.12±4.13％であり、CD34陰性画分におけるGPI-80陽性細胞の割合の平均値±s.dは14.39±10.23％であった。なお、陽性であるか陰性であるかの境界の設定は、定法に従って行った。【０１１１】
実施例２：GPI-80陽性画分中の造血幹細胞の有無の評価
NOGマウスにGPI-80陽性画分を移植しヒト細胞の生着の有無を調べることにより、該画分中の造血幹細胞の有無を評価した。具体的には次のように行った。【０１１２】
＜5-1．NOGマウスへの細胞画分の移植＞
上記3-1と同様の方法で、実施例１で得られたCD34陽性CD38陰性であり且つGPI-80陽性である細胞（1〜8個）、CD34陽性CD38陰性であり且つGPI-80陰性である細胞（40〜160個）、CD34陰性であり且つGPI-80陽性である細胞（10〜400個）、又はCD34陰性であり且つGPI-80陰性である細胞（500〜2000個）を、NOGマウスに移植した。【０１１３】
＜5-2．各種臓器からの細胞画分の採取＞
上記3-2と同様の方法で、移植から8週経過後に骨髄液を採取した。【０１１４】
＜5-3．免疫染色＞
上記3-3と同様の方法で、採取された細胞画分を、7AAD、PE-Cy7標識されたマウスCD45.1抗体、及びPacific Blue標識されたヒトCD45抗体、FITC標識されたヒトCD19抗体、PE標識されたヒトCD33抗体、及びAPC標識されたヒトCD34抗体を用いて免疫染色した。【０１１５】
＜5-4．移植細胞の生着率、及び生着検体の割合の解析＞
上記3-4と同様の方法で、生着率、及び試験検体数に対する生着検体数の割合を求めた。【０１１６】
結果を表２に示す。表２より、GPI-80陽性細胞は、GPI-80陰性細胞よりもはるかに少ない移植細胞数で生着することが示された。このことより、GPI-80陽性画分には、GPI-80陰性画分に比べて、はるかに多くの造血幹細胞が存在することが示唆された。すなわち、GPI-80が造血幹細胞の陽性マーカーとして有用であることが示唆された。【０１１７】
【表２】
0006517190.tif 000003
【０１１８】
＜5-5．GPI-80陽性画分中の造血幹細胞の割合の解析＞
上記5-4で求めた生着率に基づいて、上記3-7と同様の方法で、GPI-80陽性画分中の造血幹細胞の割合を算出した。【０１１９】
結果を図７に示す。図７の解釈については図５と同様である。図７より、CD34陽性CD38陰性であり且つGPI-80陽性である細胞中では、造血幹細胞が1/20.7個にまで濃縮されており、またCD34陰性であり且つGPI-80陽性である細胞中では、造血幹細胞が1/27.5個にまで濃縮されていることが示された。CD34陰性細胞については、GPI-80をマーカーとして用いない従来の手法の濃縮率は約1/1000個であったことを考慮すると（非特許文献20）、この濃縮率は極めて高い値であるといえる。また、CD133をマーカーとして用いた図５の結果と比較すると、GPI-80をマーカーとした方が、CD133をマーカーとするよりも効率的に造血幹細胞を濃縮できることが示唆された。【０１２０】
＜5-6．移植細胞の分化能の解析＞
上記3-5と同様の方法で、採取された骨髄細胞画分から、7AAD陰性であり且つヒトCD45陽性である細胞を分画し、そこからさらにCD19（B細胞マーカー）、又はCD33（顆粒球系細胞マーカー）陽性細胞を分画した。【０１２１】
結果を図８に示す。図８中、上段はCD34陽性CD38陰性であり且つGPI-80陽性である細胞2個を移植した場合の結果を示し、下段はCD34陰性であり且つGPI-80陽性である細胞10個を移植した場合の結果を示す。図８より、極めて少ない細胞しか移植していないにも関わらず、生着細胞が、B細胞、顆粒球系細胞等の多系統に分化していることが示された。また、CD34陽性CD38陰性であり且つGPI-80陽性である細胞2個を移植した場合の生着率（骨髄細胞に占めるヒトCD45陽性細胞の割合）は0.066％であり、CD34陰性であり且つGPI-80陽性である細胞10個を移植した場合の生着率は0.16％であった。【０１２２】
実施例３：GPI-80及びCD133をマーカーとして用いた造血幹細胞濃縮画分の製造
造血幹細胞の濃縮に有用であることが示されたGPI-80（実施例２）及びCD133（参考例３）の両方をマーカーとして用いて、造血幹細胞濃縮画分を製造した。具体的には次のように行った。【０１２３】
＜6-1．細胞液の調製＞
参考例１と同様に、臍帯血検体から単核細胞含有画分を得た。【０１２４】
＜6-2．免疫染色＞
単核細胞含有画分中の細胞を、FITC標識された18種のLineageマーカー（CD2、CD3、CD4、CD7、CD10、CD11b、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD33、CD41、CD45RA、CD56、CD66c、CD127、及びCD235a）抗体、Brilliant Violet 421標識されたCD34抗体、Brilliant Violet 510標識されたCD45抗体、PE-Cy7標識されたCD38抗体、PE標識されたGPI-80抗体、APC標識されたCD133抗体、及び7AADを用いて、定法に従って免疫染色した。【０１２５】
＜6-3．FACS解析＞
まず、細胞が免疫染色された単核細胞含有画分の、FSC/SSCに対する分布を解析し、blast window内の細胞を分画した。次に、7AAD陰性であり且つ18種のLineageマーカー陰性の細胞を分画した。続いて、CD34陽性細胞、及びCD34陰性細胞をそれぞれ分画した。さらに、CD34陰性画分について、GPI-80陽性CD133陽性細胞を分画した。一方、CD34陽性画分については、CD38陰性細胞を分画し、得られた画分からGPI-80陽性CD133陽性細胞を分画した。なお、本解析は合計6回行った。代表的な結果を図９に示す。全6回の解析について、CD34陽性CD38陰性画分におけるGPI-80陽性CD133陽性細胞の割合の平均値±s.dは4.08±5.56％であり、CD34陰性画分におけるGPI-80陽性CD133陽性細胞の割合の平均値±s.dは3.26±3.88％であった。なお、陽性であるか陰性であるかの境界の設定は、定法に従って行った。【０１２６】
実施例４：GPI-80陽性CD133陽性画分の移植
NOGマウスにGPI-80陽性CD133陽性画分を移植し、ヒト細胞の生着の程度を調べた。具体的には次のように行った。【０１２７】
＜7-1．NOGマウスへの細胞画分の移植＞
上記3-1と同様の方法で、実施例３で得られたCD34陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞（2000個）を、NOGマウスに移植した。【０１２８】
＜7-2．各種臓器からの細胞画分の採取＞
上記3-2と同様の方法で、移植から11週経過後に骨髄液及び末梢血を採取した。【０１２９】
＜7-3．免疫染色＞
上記3-3と同様の方法で、採取された細胞画分を、7AAD、PE-Cy7標識されたマウスCD45.1抗体、及びPacific Blue標識されたヒトCD45抗体、FITC標識されたヒトCD19抗体、PE標識されたヒトCD33抗体、及びAPC標識されたヒトCD34抗体を用いて免疫染色した。【０１３０】
＜7-4．移植細胞の生着率、及び分化能の解析＞
上記3-5と同様の方法で、採取された細胞画分からヒトCD45陽性細胞を分画し、そこからさらにCD34、CD19（B細胞マーカー）、又はCD33（顆粒球系細胞マーカー）陽性細胞を分画した。【０１３１】
結果を図１０に示す。図１０より、移植後11週という比較的短い期間しか経過していないにも関わらず、骨髄の82.4％、末梢血の33.7％もの細胞がヒト細胞（ヒトCD45陽性細胞）に置き換わっていた。また、生着細胞には、CD34陽性細胞が骨髄で38.9%、末梢血で11.1%含まれており、かつ、B細胞、顆粒球系細胞等の多系統に分化していることも示された。【０１３２】
実施例５：GPI-80陽性CD133陽性画分の少数細胞の移植
NOGマウスにGPI-80陽性CD133陽性画分の少数細胞（10個）を移植し、ヒト細胞の生着の程度を調べた。具体的には次のように行った。【０１３３】
＜8-1．NOGマウスへの細胞画分の移植＞
上記3-1と同様の方法で、実施例３で得られたCD34陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞（10個）、又は実施例３で得られたCD34陽性CD38陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞（10個）を、NOGマウスに移植した。【０１３４】
＜8-2．各種臓器からの細胞画分の採取＞
上記3-2と同様の方法で、移植から12週経過後に骨髄液を採取した。【０１３５】
＜8-3．免疫染色＞
上記3-3と同様の方法で、採取された細胞画分を、7AAD、PE-Cy7標識されたマウスCD45.1抗体、及びPacific Blue標識されたヒトCD45抗体、FITC標識されたヒトCD19抗体、PE標識されたヒトCD33抗体、及びAPC標識されたヒトCD34抗体を用いて免疫染色した。【０１３６】
＜8-4．移植細胞の生着率、及び分化能の解析＞
上記3-5と同様の方法で、採取された細胞画分からヒトCD45陽性細胞を分画し、そこからさらにCD34、CD19（B細胞マーカー）、又はCD33（顆粒球系細胞マーカー）陽性細胞を分画した。【０１３７】
結果を図１１に示す。図１１より、10個という極めて少数の細胞しか移植しておらず、しかも移植後12週という比較的短い期間しか経過していないにも関わらず、生着率（骨髄細胞に占めるヒトCD45陽性細胞の割合）は、CD34陽性CD38陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞を移植した場合（図１１上段）で60.9％、CD34陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞を移植した場合（図１１下段）で39.8％であった。この生着率は、CD133を指標として分画していない細胞を移植した以外はほぼ同条件の場合の生着率（実施例２の5-6、及び図８）と比べて、遥かに高い値であった。このことから、GPI-80陽性に加えてCD133陽性を指標とすることにより、より効率的に造血幹細胞を濃縮できることが示された。【０１３８】
また、CD34陽性CD38陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞を移植した場合（図１１上段）、及びCD34陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞を移植した場合（図１１下段）の両方において、移植細胞が、B細胞（CD19陽性）、顆粒球系細胞（CD33陽性）、未分化細胞（CD34陽性）等の多系統に分化していることも示された。【０１３９】
実施例６：GPI-80陽性CD133陽性画分の単一細胞の移植
NOGマウスにGPI-80陽性CD133陽性画分の単一細胞を移植し、ヒト細胞の生着の程度を調べた。具体的には次のように行った。【０１４０】
＜9-1．NOGマウスへの細胞画分の移植＞
上記3-1と同様の方法で、実施例３で得られた実施例３で得られたCD34陽性CD38陰性GPI-80陽性CD133陽性細胞（1個）を、倒立顕微鏡下にマイクロシリンジで吸引し、NOGマウスに移植した。【０１４１】
＜9-2．各種臓器からの細胞画分の採取＞
上記3-2と同様の方法で、移植から19週経過後に骨髄液を採取した。【０１４２】
＜9-3．免疫染色＞
上記3-3と同様の方法で、採取された細胞画分を、7AAD、PE-Cy7標識されたマウスCD45.1抗体、及びPacific Blue標識されたヒトCD45抗体、FITC標識されたヒトCD19抗体、PE標識されたヒトCD33抗体、及びAPC標識されたヒトCD34抗体を用いて免疫染色した。【０１４３】
＜9-4．移植細胞の生着率、及び分化能の解析＞
上記3-5と同様の方法で、採取された細胞画分からヒトCD45陽性細胞を分画し、そこからさらにCD34、CD19（B細胞マーカー）、又はCD33（顆粒球系細胞マーカー）陽性細胞を分画した。【０１４４】
結果を図１２に示す。図１２より、1個の細胞しか移植していないにも関わらず、顕著なヒトCD45陽性細胞の生着（生着率18.4％）が認められた。また、移植細胞が、B細胞（CD19陽性）、顆粒球系細胞（CD33陽性）、未分化細胞（CD34陽性）等の多系統に分化していることも示された。1個の細胞移植で生着させることができたことから、GPI-80陽性に加えてCD133陽性を指標とすることにより、ヒト造血幹細胞をほぼ完全に純化できることが示された。
【図１】
0006517190.tif 000004
【図２】
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【図３】
0006517190.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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