(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示される化合物を含む光音響イメージング用造影剤。
【化１】
0006552236.tif 000038
（式（Ｉ）においてＴＦはトランスフェリン、Ｌはリンカー、Ｄは近赤外色素を表す。ｎは色素標識数である。色素標識数はトランスフェリンならびに近赤外色素の吸光度とその波長におけるモル吸収係数を用いて算出された値である。ｎは２．０以上８．４以下である。Ｌは無くてもよい。式（Ｉ）においてＤは下記式（ｄ５）又は（ｄ６）で表わされる。式（ｄ５）及び（ｄ６）において、＊はＬに結合することを示す。式（ｄ６）において、Ｙ−はハロゲンイオン、または有機酸イオンである。）
【化２】
0006552236.tif 000039
【化３】
0006552236.tif 000040
【請求項２】
式（Ｉ−１）で示される化合物を含む光音響イメージング用造影剤。
【化４】
0006552236.tif 000041
（式（Ｉ−１）においてＴＦはトランスフェリン、Ｄは近赤外色素である。ｎは色素標識数である。色素標識数はトランスフェリンならびに近赤外色素の吸光度とその波長におけるモル吸収係数を用いて算出された値である。ｎは２．０以上８．４以下である。式（Ｉ−１）においてＤは下記式（ｄ５）又は（ｄ６）で表わされる。式（ｄ５）及び（ｄ６）において、＊は、トランスフェリンに結合していることを示す。式（ｄ６）において、Ｙ−はハロゲンイオン、または有機酸イオンである。）
【化５】
0006552236.tif 000042
【化６】
0006552236.tif 000043
【請求項３】
前記ｎが、４以上７以下である請求項１又は２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項４】
式（Ｉ−１）で表される化合物を含む光音響イメージング用造影剤であって、
前記Ｄが、前記式（ｄ５）で表わされる請求項２に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項５】
前記トランスフェリンがヒトトランスフェリン、ヒトトランスフェリンの改変体、ヒトトランスフェリンの断片、ヒトトランスフェリンの改変体の断片のいずれかである請求項１乃至４のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項６】
捕捉分子をさらに有する請求項１乃至５のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項７】
分散媒をさらに含む請求項１乃至６のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項８】
腫瘍の造影に用いられる請求項１乃至７のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【請求項９】
添加剤をさらに有する請求項１乃至８のいずれか一項に記載の光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外色素結合トランスフェリン、前記近赤外色素結合トランスフェリンを有する光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤（光音響造影剤と略すことがある）として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記式の構造で示される化合物を指す。
【化１】
0006552236.tif 000002
【０００４】
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンを用いることができる。
【０００５】
しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。
非特許文献１〜２では、血清タンパク質であるトランスフェリン（TFと略すことがある）に近赤外波長領域の光を吸収する有機色素（以下、近赤外色素と略すことがある）を結合させた化合物が開示されている。なお、本明細書における近赤外色素とは、近赤外波長領域の光を吸収する有機色素である。本明細書において近赤外波長領域の光とは６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長の光を意味する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２，２３４−２４１（２０００）
【非特許文献２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ，６，８５−９５（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に開示された近赤外色素を結合させたトランスフェリンでは、固定化される色素の数は２．４個／分子であり、また色素はスルホン酸を分子内に複数有する親水性近赤外色素である。この化合物は腫瘍の蛍光造影剤として機能することが示されている。本文献に記載の動物実験結果によれば、腫瘍と正常組織の蛍光コントラスト（以後、イメージングコントラストと略すことがある）は投与後２４時間で１．９であり、光音響腫瘍造影のためにはさらなるコントラストの向上が望まれていた。
【０００８】
非特許文献２に開示されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０色素を結合させたトランスフェリンでは、固定化される色素の数は２個／分子であり、またその色素はスルホン酸を分子内に複数有する親水性近赤外色素である。本明細書内の比較例で後述するように、非特許文献２に開示されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０色素を結合させたトランスフェリンの腫瘍と正常組織のイメージングコントラストは投与後２４時間後で１．２であり、光音響腫瘍造影のためにはさらなるイメージングコントラストの向上が望まれていた。
【０００９】
したがって、光音響腫瘍造影剤として、高い近赤外波長領域の吸収係数、高い腫瘍集積性、高い腫瘍血中比、ならびに高いイメージングコントラストを示す化合物が望まれていた。
【００１０】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、高い近赤外波長領域の吸収係数、高い腫瘍集積性、高い腫瘍血中比、ならびに高いイメージングコントラストを示す新規な近赤外色素結合トランスフェリンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、トランスフェリンと近赤外色素とが結合した近赤外色素結合トランスフェリンを有することを特徴とする。
【００１２】
別の本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、下記式（Ｉ）で示される化合物を有することを特徴とする。
【化２】
0006552236.tif 000003
式（Ｉ）においてＴＦはトランスフェリン、Ｌはリンカー、Ｄは近赤外色素を表す。ｎは２．０以上８．４以下である。Ｌは無くてもよい。
【００１３】
式（Ｉ）においてＤは下記式（ｄ５）又は（ｄ６）で表わされる。
【化３】
0006552236.tif 000004
【化４】
0006552236.tif 000005
【００１８】
式（Ｉ）において前記Ｌが含まれる場合は、Ｌは下記式（ｌ１）乃至（ｌ５）のいずれかで表わされる。
【化７】
0006552236.tif 000006
【化８】
0006552236.tif 000007
【化９】
0006552236.tif 000008
【化１０】
0006552236.tif 000009
【化１１】
0006552236.tif 000010
上記式（ｌ１）乃至（ｌ５）において＊は前記トランスフェリンまたは前記近赤外色素と結合することを示す。上記式（ｌ１）においてｎは１〜５００の範囲であり、好ましくは１〜１２０の範囲である。トランスフェリン受容体への結合能を考慮すると、上記式（ｌ１）のｎは１〜５０の範囲が好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤によれば、トランスフェリンと、ＩＣＧなどの近赤外波長領域に吸収がある近赤外色素と、が結合した化合物を有するため、ＩＣＧを単独で投与した場合に比べて、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が高い。またトランスフェリンはトランスフェリン受容体によりがん細胞へ取り込まれる性質があり、その結果、腫瘍血液比が高くなるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例で調製したｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、比較例のＩＣＧ、ならびに比較例のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）の投与後２４時間目の担癌マウスの蛍光イメージを示す図である。矢印は腫瘍部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の実施形態に係る化合物ならびに、それを含む光音響イメージング（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ、以下ＰＡＩと略すことがある）用造影剤について説明する。
【００２２】
本実施形態に係る化合物は、トランスフェリンと、近赤外色素とが共有結合していることを特徴とする。すなわち本実施形態は、近赤外色素結合トランスフェリンを提供する。本明細書において近赤外波長領域の光とは６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長の光を意味する。
ＩＣＧなどの近赤外色素は、血中に投与した場合、血中のタンパク質と吸着した上で体外へと排出されやすい。その結果、単独の近赤外色素を生体の血中に投与しても、血中滞留性が低く、腫瘍への集積性が低い。したがって、単独の近赤外色素を光音響イメージング用造影剤として用いた場合、腫瘍から発せられる光音響信号強度は小さい。
【００２３】
一方、本実施形態に係る化合物は、近赤外色素がトランスフェリンと共有結合しているため、トランスフェリンが、近赤外色素への血中タンパク質吸着を抑制する。そのため、本実施形態に係る化合物を生体の血中に投与しても、血中のタンパク質と吸着しにくく、体外へと排出されにくい。さらにトランスフェリンは、がん細胞で高く発現するトランスフェリン受容体を介して細胞内に取り込まれ得るという性質を有するため、近赤外色素を単独で投与した場合に比べて腫瘍集積性が向上する。このような理由で、本実施形態に係る化合物は近赤外色素を単独で投与した場合に比べて血中滞留性や腫瘍集積性が高いため、腫瘍から発せられる光音響信号強度が高くなる効果が期待される。また、本発明の化合物は、腫瘍組織のがん細胞への取り込みにより、その腫瘍集積性は投与後短時間で高くなり、かつ長期間細胞内に維持されることが期待される。よって、腫瘍血中比が高くなる効果が得られる。よって本実施形態に係る化合物は、ＰＡＩ用造影剤、特に腫瘍のＰＡＩ用造影剤として良好に機能する。
【００２４】
また、本実施形態に係る化合物は、インドール環に結合するベンゼン環、またはナフチル環、に親水性の高いスルホン酸基を有しない構造である。ベンゼン環、ナフチル環といった疎水性の高い構造は、化合物全体の疎水性に大きく寄与する。したがってベンゼン環、ナフチル環にスルホン酸基を有しない本実施形態に係る化合物は、疎水性を示し、血中から速やかに排出されずに循環し、その間にＥＰＲ効果により腫瘍に集積していく。一方、２つのインドール環の窒素のうち、トランスフェリンが結合しない方の窒素に直接またはリンカーを介してスルホン酸基を有する場合、親水性をある程度付与できる。その親水性によって、血中の本実施形態に係る化合物は排出され、一定時間経過すると血中濃度が低下する。すなわち、本実施形態に係る化合物の有する、疎水性と親水性のバランスによって、腫瘍集積性が高く、かつ、腫瘍血中比を高くすることができる。
【００２５】
本実施形態に係る化合物において、少なくとも１つのトランスフェリンと、少なくとも１つの近赤外色素とが共有結合していればよく、複数のトランスフェリンと複数の近赤外色素とが共有結合していてもよい。また、化合物が、トランスフェリンと複数の近赤外色素を有する場合、少なくとも１つの近赤外色素がトランスフェリンと共有結合していればよく、それ以外の近赤外色素は非共有結合していてもよい。同様に、近赤外色素と複数のトランスフェリンを有する場合、少なくとも１つのトランスフェリンが近赤外色素と共有結合していればよく、それ以外のトランスフェリンは非共有結合していてもよい。
【００２６】
なお、本発明及び本明細書でいう「トランスフェリンと近赤外色素が共有結合した」とは、厳密にいえば、トランスフェリンの一部（代表的にはＨまたはＯＨ）を除いた部位（これは基ということもできる）と、近赤外色素の一部（代表的にはＨまたはＯＨ）を除いた部位とが共有結合した、ということである。また、「化合物」は別の見方をすれば「分子」ということもできる。また、非共有結合するとは、共有結合以外の結合、例えば、イオン結合、配位結合、金属結合、水素結合、分子間力等により結合することを言う。
【００２７】
（色素標識数）
本明細書においてトランスフェリン１分子に対して共有結合している近赤外色素の平均の数を、色素標識数とよぶ。本実施形態に係る化合物が１分子の場合は、色素標識数ｎは整数値である。一方、本実施形態に係る化合物が複数集まって混合物を形成している場合、化合物における色素標識数とは、その混合物を構成する化合物の色素標識数の平均値で表わす。よって、本明細書における色素標識数は整数に限らないが、実際のトランスフェリンに標識されている数は整数値をとる。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、色素標識数は、１以上が好ましく、９以下が好ましい。さらには、２以上が好ましく、８以下が好ましい。特に、４以上が好ましく、７以下が好ましい。これは、色素標識率が上記範囲内にあるときに、腫瘍集積性ならびに腫瘍血中比が高いからである。
なお、色素標識数は近赤外色素の濃度およびトランスフェリンの濃度をそれぞれ求め、それらの比（近赤外色素の濃度／トランスフェリンの濃度）から算出することで求める。近赤外色素の濃度は、その色素の特異的な吸収波長における吸光度と吸収係数から算出した。特異的な吸収波長とは、例えば、近赤外色素としてＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（下記式（ｄ５−１）で示される化合物）を用いた場合は７９０ｎｍを採用することができるが、特異的な吸収波長は他の値を採用してもよい。トランスフェリンの濃度はタンパク質特有の吸収である２８０ｎｍの吸光度と、その波長におけるトランスフェリンの吸収係数を用いて求めることができるし、ＢＣＡ法等によって求めることもできる。なおトランスフェリンの２８０ｎｍにおけるモル吸収係数は、非特許文献１に記載された、９２３００（Ｍ−１×ｃｍ−１）を用いた。
【００２８】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、下記式（Ｉ）で示される化合物を有することが好ましい。
【化１２】
0006552236.tif 000011
式（Ｉ）においてＴＦはトランスフェリン、Ｌはリンカー、Ｄは近赤外色素を表す。ｎは色素標識数である。色素標識数はトランスフェリンならびに近赤外色素の吸光度とその波長におけるモル吸収係数を用いて算出された値である。Ｌは無くてもよい。
【００２９】
式（Ｉ）においてDは下記式（ｄ１）乃至（ｄ４）のいずれかで表わされる。
【化１３】
0006552236.tif 000012
【化１４】
0006552236.tif 000013
【化１５】
0006552236.tif 000014
【化１６】
0006552236.tif 000015
【００３０】
上記式（ｄ１）において、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１５を表しＲ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１−ＳＯ３−、−ＲＥ１−ＳＯ３Ｘ１１を表す。ＲＤ１、ＲＥ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１−ＳＯ３−、−ＲＧ１−ＳＯ３Ｘ１５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１４を表す。Ｘ１４、Ｘ１５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ１、ＲＦ１、ＲＧ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１１は水素原子、またはＺ１１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、で置換されていてよい。＊はＬに結合する、または近赤外色素結合トランスフェリンがＬを含まない場合は、トランスフェリン内のアミノ基に結合していることを示す。
【００３１】
上記式（ｄ２）において、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１０５を表しＲ１０５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１１−ＳＯ３−、−ＲＥ１１−ＳＯ３Ｘ１０１を表す。ＲＤ１１、ＲＥ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１０１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１１−ＳＯ３−、−ＲＧ１１−ＳＯ３Ｘ１０５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１０４を表す。Ｘ１０４、Ｘ１０５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ１１、ＲＦ１１、ＲＧ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１０１は水素原子、またはＺ１０１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、で置換されていてよい。Ｘ１０２、Ｘ１０３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬに結合する、または近赤外色素結合トランスフェリンがＬを含まない場合は、トランスフェリン内のアミノ基に結合していることを示す。
【００３２】
上記式（ｄ３）において、Ｒ２０１乃至Ｒ２１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、―ＳＯ３Ｘ２４を表す。Ｘ２４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ２５を表しＲ２５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ２−ＳＯ３−、−ＲＥ２−ＳＯ３Ｘ２１を表す。ＲＤ２、ＲＥ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ２１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ２−ＳＯ３−、−ＲＧ２−ＳＯ３Ｘ２５、または、−ＲＦ２−ＣＯ２Ｘ２６を表す。Ｘ２５、Ｘ２６は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ２、ＲＦ２、ＲＧ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ２が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬに結合する、または近赤外色素結合トランスフェリンがＬを含まない場合は、トランスフェリン内のアミノ基に結合していることを示す。
【００３３】
上記式（ｄ４）において、Ｒ３０１乃至Ｒ３１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ３４を表す。Ｘ３４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ３５を表しＲ３５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ３−ＳＯ３−、−ＲＥ３−ＳＯ３Ｘ３１を表す。ＲＤ３、ＲＥ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ３１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ３−ＳＯ３−、−ＲＧ３−ＳＯ３Ｘ３５、または、−ＲＦ３−ＣＯ２Ｘ３４を表す。Ｘ３４、Ｘ３５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ３、ＲＦ３、ＲＧ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ３が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬに結合する、または近赤外色素結合トランスフェリンがＬを含まない場合は、トランスフェリン内のアミノ基に結合していることを示す。
【００３４】
上記各式において、ＲＡ１、ＲＡ1１、ＲＡ2、ＲＡ3、ＲＡ１、−ＲＣ１−ＳＯ３−、または−ＲＧ１−ＳＯ３Ｘ１５、であることが好ましい。ＲＡ１、ＲＡ1１、ＲＡ2、ＲＡ3、ＲＡ１、がスルホン酸基を有することにより、前述のように、本実施形態に係る化合物にある程度の親水性を付与することができるため、一定時間経過後に、血中から排出されやすくなる。
【００３５】
式（Ｉ）において前記Ｌは下記式（ｌ１）乃至（ｌ５）のいずれかで表わされる。
【化１７】
0006552236.tif 000016
【化１８】
0006552236.tif 000017
【化１９】
0006552236.tif 000018
【化２０】
0006552236.tif 000019
【化２１】
0006552236.tif 000020
上記式（ｌ１）乃至（ｌ５）において＊は前記トランスフェリンあるいは前記近赤外色素と結合することを示す。上記式（ｌ１）においてｎは１〜５００の範囲であり、好ましくは１〜１２０の範囲である。トランスフェリン受容体への結合能を考慮すると、上記式（ｌ１）のｎは１〜５０の範囲が好ましい。
【００３６】
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、式（Ｉ）においてＤが、下記の式（ｄ５）乃至（ｄ６）のいずれかで表されることが好ましい。
【化２２】
0006552236.tif 000021
【化２３】
0006552236.tif 000022
式（ｄ５）及び（ｄ６）において、＊はＬに結合する、または近赤外色素結合トランスフェリンがＬを含まない場合は、トランスフェリン内のアミノ基に結合していることを示す。式（ｄ６）において、Ｙ−は塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンのいずれかである。
【００３７】
なお、本実施形態に係る化合物は、さらに、捕捉分子を有することができる。また、本実施形態の化合物が複数集まった混合物として用いることができ、その際は、ｎの平均値が、１以上であることが好ましく、さらには、ｎの平均値が４以上７以下であることが好ましい。
【００３８】
本実施形態において、本発明の化合物は、下記式（Ｉ−１）で示されることが特に好ましい。
【化２４】
0006552236.tif 000023
式（Ｉ−１）においてＴＦはトランスフェリン、Ｄは下記式（ｄ５）で示される近赤外色素である。ｎは色素標識数である。色素標識数はトランスフェリンならびに近赤外色素の吸光度とその波長におけるモル吸収係数を用いて算出された値である。
【化２５】
0006552236.tif 000024
【００３９】
上記式（Ｉ−１）において、ＴＦはトランスフェリンのうち、近赤外色素との結合に使われる１またはそれ以上のアミノ基を除いた部位を表す。本実施形態において、好ましい例としては、式（Ｉ−１）においてｎが４以上７以下の範囲である。
【００４０】
また、本実施形態における化合物あるいはＰＡＩ用造影剤は標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。また、本実施形態の化合物は混合物として用いることができ、その際は、ｎの平均値が、１以上であることが好ましく、さらには、ｎの平均値が４以上７以下であることが好ましい。
【００４１】
（トランスフェリン）
本実施形態に係るトランスフェリンは、血漿に存在し、分子量が約８０ｋＤａからなるタンパク質である。トランスフェリンは主に鉄イオンを輸送する役割を有する。本実施形態に係るトランスフェリンとしては、ヒト血清由来以外にも、ウシ血清由来、ラット血清由来、マウス血清由来など、人以外の動物種由来のものであってもよく、またこれらの断片であってもよい。本実施形態に係るトランスフェリンとしては、人体での安全性が高いと考えられる、ヒト血清由来トランスフェリン、その改変体、その断片のいずれかであることが好ましい。また、本実施形態に係るトランスフェリンはヒト血液からの抽出物であってもよいし、遺伝子組換え体でもよく、大腸菌、酵母、あるいは培養細胞等からの生産物でもあっても構わない。
【００４２】
ヒトトランスフェリンの配列の例を示す。この例のトランスフェリンは、アミノ酸６９８残基よりなり、分子量は７６９６０である。
【００４３】
MRLAVGALLVCAVLGLCLAVPDKTVRWCAVSEHEATKCQSFRDHMKSVIPSDGPSVACVKKASYLDCIRAIAANEADAVTLDAGLVYDAYLAPNNLKPVVAEFYGSKEDPQTFYYAVAVVKKDSGFQMNQLRGKKSCHTGLGRSAGWNIPIGLLYCDLPEPRKPLEKAVANFFSGSCAPCADGTDFPQLCQLCPGCGCSTLNQYFGYSGAFKCLKDGAGDVAFVKHSTIFENLANKADRDQYELLCLDNTRKPVDEYKDCHLAQVPSHTVVARSIGGKEDLIWELLNQAQEHFGKDKSKEFQLFSSPHGKDLLFKDSAHGFLKVPPRMDAKMYLGYEYVTAIRNLREGTCPEAPTDECKPVKWCALSHHERLKCDEWSVNSVGKIECVSAETTEDCIAKIMNGEADAMSLDGGFVYIAGKCGLVPVLAENYNKSDNCEDTPGAGYFAVAVVKKSASDLTWDNLKGKKSCHTAVGRTAGWNIPMGLLYNKINHCRFDEFFSEGCAPGSKKDSSLCKLCMGSGLNLCEPNNKEGYYGYTGAFRCLVEKGDVAFVKHQTVPQNTGGKNPDPWAKNLNEKDYELLCLDGTRKPVEEYANCHLARAPNHAVVTRKDKEACVHKILRQQQHLFGSNVTDCSGNFCLFRSETKDLLFRDDTVCLAKLHDRNTYEKYLGEEYVKAVGNLRKCSTSSLLEACTFRRP
（配列番号１）
【００４４】
本実施形態に係るトランスフェリンは上記の全配列あるいは全配列中から取り出してきた部分配列と比較して少なくとも９５％以上の相同性を有することを特徴とする。トランスフェリンは近赤外色素が共有結合できる位置に複数のリジン残基を有している。トランスフェリンと近赤外色素との化学結合を形成する場合の一例として、トランスフェリンのリジン残基のアミノ基と近赤外色素のカルボキシル基とによるアミド結合が挙げられる。
【００４５】
（近赤外色素）
本実施形態において近赤外色素としては、近赤外波長領域の光を吸収して音響波を発する有機色素であれば特に限定されない。本実施形態における近赤外色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、インジゴイド系色素を挙げることが出来る。上記シアニン系色素としては、例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）やその誘導体が挙げられる。
【００４６】
本実施形態において、本発明の化合物を調製するための近赤外色素は、当該色素内にトランスフェリンと共有結合できる官能基を有する。たとえば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などである。好適に用いられる本発明の化合物を調製するための近赤外色素の一例としては、下記式（ｄ５−１）で表される色素である。この色素を用いる場合、色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基がトランスフェリンの求核基、たとえばリジン残基のアミノ基とアミド結合を形成することで色素がトランスフェリンに固定される。
【化２６】
0006552236.tif 000025
【００４７】
（化合物の調製方法）
本実施形態において、トランスフェリンと近赤外色素は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基を介して公知のカップリング反応によって共有結合させることができる。特に、トランスフェリンのアミノ基を介して結合させることが好ましい。アミノ基はトランスフェリン中に複数存在し、特にリジン残基の１級アミノ基は、弱アルカリ性のｐＨ領域において効率的かつ選択的に近赤外色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基に求核反応する。前記反応によりトランスフェリンと結合した近赤外色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法、透析等の公知のタンパク質精製法により洗浄、精製することができる。
【００４８】
（リンカー）
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤において、トランスフェリンと近赤外色素の結合はトランスフェリン表面に存在する前記アミノ基、チオール基、カルボキシル基、またはヒドロキシル基と近赤外色素の誘導体とで直接結合されていても良いし、種々のリンカー（架橋材やクロスリンカーともいわれる）を介してトランスフェリンと近赤外色素が結合されていても良い。
【００４９】
本実施形態において、下記式（ｌ１）乃至（ｌ５）で示されるリンカーが好適に用いられる。
【化２７】
0006552236.tif 000026
【化２８】
0006552236.tif 000027
【化２９】
0006552236.tif 000028
【化３０】
0006552236.tif 000029
【化３１】
0006552236.tif 000030
上記式（ｌ１）乃至（ｌ５）において＊は前記トランスフェリンまたは前記近赤外色素と結合することを示し、２つの＊のうち、いずれがトランスフェリンあるいは前記赤外色素と結合しても構わない。
【００５０】
（分散媒）
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、上記化合物以外に分散媒を有していてもよい。なお、ＰＡＩは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば界面活性剤などを有していても良い。
【００５１】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
【００５２】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  （ＥＰＲ）効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は腫瘍の造影に用いられることが好ましい。また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、トランスフェリンを母体とする化合物であり、がん細胞に発現しているトランスフェリン受容体を介してがん細胞内に取り込まれる性質を有する。従って、上記のＥＰＲ効果に加えて、本発明の化合物の細胞への取り込みにより、腫瘍集積性が長期間維持されると期待され、一方で血中濃度は時間とともに減少していくため、結果として高い腫瘍血中比を示すことが期待できる。
【００５３】
（捕捉分子）
本実施形態における化合物あるいはＰＡＩ用造影剤は標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、ポリペプチド、ペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された化合物を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。本実施形態において、タンパク質とは、アミド結合によって天然または非天然アミノ酸が９０個以上連結されたものを言う。本実施形態においてポリペプチドとは、アミド結合によって天然または非天然アミノ酸が３０個以上９０個未満で連結されたものを言う。本実施形態において、ペプチドとは、アミド結合によって天然または非天然アミノ酸が３０個未満で連結されたものを言う。本実施形態において、タンパク質とポリペプチドとペプチドの分類は、アミノ酸の連結数によってなされるものであり、種々の修飾の有無を問わない。本実施形態において捕捉分子はタンパク質、または、ポリペプチド、または、ペプチドであることが好ましい。
【００５４】
（添加剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、凍結乾燥時に使用する添加剤を含んでいてもよい。添加剤の一例としてグルコース、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコール、グリシン、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムが挙げられる。添加剤は１種類のみを用いても、複数種類を併用してもよい。
【００５５】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程
【００５６】
また、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
【００５７】
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を投与された検体を用いることができる。
【００５８】
また、上記（ａ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。
【００５９】
上記（ａ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４  ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【００６０】
光音響イメージング装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００６１】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する色素修飾トランスフェリンが得られる範囲で自由に変えることができる。
【００６３】
（色素標識数の算出）
本発明の実施例においてトランスフェリンに対する色素標識数は化合物の吸光度測定により算出した。つまり、化合物の水溶液を調製し、色素ならびにトランスフェリンの吸光度を測定することで、色素ならびにトランスフェリン濃度を求め、色素濃度をトランスフェリン濃度で割ることにより、色素標識数が求められる。
具体的には、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（下記式（ｄ５−１）で示される化合物）を用いて調製された化合物の場合は、５％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｕｌｆｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｏｄｅｃｙｌ、以後ＳＤＳと略す）で希釈された化合物の水溶液中における７９０ｎｍの吸光度を計測した。この吸光度はＩＣＧ由来のものである。ＩＣＧ濃度は予め作成しておいたＳＤＳ中での検量線から算出した７９０ｎｍの吸収係数１２００００（Ｍ−１×ｃｍ−１）を用いて色素濃度を算出した。トランスフェリン濃度は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳと略すことがある）中でトランスフェリンの２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、トランスフェリンのモル吸収係数９２３００（Ｍ−１×ｃｍ−１）を用いて算出した。色素標識数は、色素濃度をトランスフェリン濃度で割ることで求めた。なお、トランスフェリンの２８０ｎｍの吸光度は、測定された２８０ｎｍの吸光度から、ＩＣＧの７９０ｎｍの吸光度に０．４をかけた値を引くことで、トランスフェリンの２８０ｎｍの吸光度に対する、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの２８０ｎｍの吸光度の寄与を補正した。
【００６４】
（実施例１：近赤外色素が結合したトランスフェリンの調製）
本実施例における化合物はトランスフェリン表面のアミノ基に対して近赤外色素を共有結合させたものである。以下に調製方法の一例を示す。
まず、１０ｍｇのトランスフェリン（トランスフェリン  ヒト、Ｔ３３０９、ＳＩＧＭＡ社製）を１ｍＬの炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解してトランスフェリン溶液とした。下記式（ｄ５−１）で示される１ｍｇの近赤外色素（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ、Ｉ２５４、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を０．１ｍＬのジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下ＤＭＳＯと略すことがある）に溶解した。それぞれの溶液をプラスチックチューブ内で混合して室温で３時間、回転撹拌した。得られた反応溶液を０．２２μｍシリンジフィルターでろ過し、ろ液を回収した。回収した溶液に、セファクリルゲルＳ−４００を加え、室温で1時間回転撹拌した。次いで、このゲル含有溶液を遠心分離し、プラスチックチューブ底にあるゲルを分取しないようにして、上清部分を回収した。最後に、回収した緑色溶液を０．２２μｍシリンジフィルターでろ過することで本発明にかかる近赤外色素とトランスフェリンが共有結合した化合物（以後ｉＴＦと略すことがある）を得た。
【００６５】
表１に反応時の仕込モル比（近赤外色素：トランスフェリン）を変化させて得られた化合物の色素標識数を示す。表１よりトランスフェリンに対する近赤外色素の仕込モル比を変化させることで任意の範囲で色素標識数を変化させることが出来ることがわかった。以後、色素標識数２．０個、４．８個、７．０個、８．３個、ならびに８．４個であるこれらの化合物を、ｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）と略す。
【化３２】
0006552236.tif 000031
【００６６】
【表１】
0006552236.tif 000032
【００６７】
（実施例２：光音響信号の測定）
実施例１で得られたｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）の水溶液、ならびに比較例として、下記式で表されるＩＣＧの水溶液の光音響信号を測定した。
【化３３】
0006552236.tif 000033
【００６８】
光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプル水溶液に照射し、圧電素子を用いてサンプルから光音響信号を検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。レーザー波長は７９０ｎｍとした。エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０  ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。
【００６９】
表２に、本発明の実施例に係るｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）の水溶液、ならびに比較例としてのＩＣＧの水溶液の光音響信号強度を示した。表２は、ＩＣＧの光音響信号強度を１とした相対強度として示したものである。表２から明らかなように、トランスフェリンへ多数の近赤外色素が結合できるため、ＩＣＧに比較して、トランスフェリンからの光音響信号が１．８倍から１０．８倍にまで増加することがわかった。この結果より、本発明のｉＴＦは高い感度で光音響イメージングできる光音響イメージング用造影剤であることが示された。
【００７０】
【表２】
0006552236.tif 000034
【００７１】
（実施例３：がん細胞への取り込み能評価）
実施例１で得られたｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、ならびに比較例として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０近赤外色素が結合したトランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ライフテクノロジー社製、製品番号：Ｔ３５３５７、色素標識数２．０）のがん細胞への取り込み能を測定した。以後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６８０近赤外色素が結合したトランスフェリンをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）と略す。
【００７２】
取り込み能の測定方法は、以下のように行った。まずｃｏｌｏｎ２６マウス腸癌細胞（理研）を２４ウェルプラスチックプレートに播種して培養した。翌日、培養培地を除去して、新鮮な培養培地に交換後、ｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、ならびにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）をそれぞれ色素濃度１０μＭになるように加えた。３７℃で５％ＣＯ２の条件で２４時間インキュベートした。次いで、培養培地を除去して、ＰＢＳで２回細胞を洗浄後、トリプシンーＥＤＴＡにより細胞をはがして回収した。細胞数をカウント後、細胞を１％トライトンＸ１００溶液を用いて溶解した。細胞の溶解液にＤＭＳＯを添加後、その溶液のＩＣＧ蛍光強度を測定することで、細胞に取り込まれたＩＣＧ量を測定した。
【００７３】
表３に、色素取り込み量の相対値を示す。比較例であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）に比べ、本発明のｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ならびにｉＴＦ（８．４）は、約２０〜６０倍高い細胞取り込み能を示した。色素標識数が近いＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）と本発明のｉＴＦ（２．０）を比較すると、本発明のｉＴＦ（２．０）の方が、６０倍も細胞取り込み能が向上した。この違いの原因は、色素の親疎水性が影響していると思われる。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０の構造は未公開であるが、その構造にはスルホン酸が導入され高い親水性が付与されていると思われる。一方でｉＴＦ（２．０）の色素骨格にはスルホン酸は有しておらず、疎水性である。したがって、トランスフェリンが色素標識により疎水性になり、細胞への吸着が促進され、その結果、細胞の取り込み能が増加したと思われる。がん細胞への取り込みに基づく腫瘍造影剤として非常に有用な化合物であることが示された。
【００７４】
【表３】
0006552236.tif 000035
【００７５】
（実施例４：蛍光イメージングによる腫瘍のイメージングコントラスト評価）
実施例１で得られたｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、ならびに比較例として、ＩＣＧとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）について、担癌マウスを用いた蛍光イメージングにより、腫瘍のイメージングコントラストを評価した。蛍光イメージング実験においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約１週間前に１×１０６個のｃｏｌｏｎ２６マウス腸癌細胞（理研）を、マウスの大腿部に皮下注射することで担癌モデルマウスを調製した。
【００７６】
ｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、ＩＣＧ、ならびにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）を投与した担癌マウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与２４時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。ｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、ならびにＩＣＧの投与量はマウス当たり、色素量として１０ｎｍｏｌ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）の投与量はマウス当たり、色素量として３１ｎｍｏｌとして、１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。
【００７７】
図１はｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）、ＩＣＧ、ならびにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）の投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージの代表的な例である。図１中、矢印は大腿部の腫瘍の位置を示している。図１から明らかなように、比較例のＩＣＧでは腫瘍部で蛍光信号が全く見られなかったが、本発明のｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ならびにｉＴＦ（８．４）では、腫瘍部位からの蛍光信号が見られた。この結果より、本発明のｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ならびにｉＴＦ（８．４）は、腫瘍へ集積することができることがわかった。
【００７８】
腫瘍のイメージングコントラストを評価するために、図１で示されるような蛍光イメージングデータから、腫瘍部（計測面積０．５×０．５ｃｍ）の蛍光強度と足の付け根の蛍光強度（正常部位として選択、計測面積０．５×０．５ｃｍ）を定量化した。これらの比、つまり腫瘍部蛍光強度の値を正常部蛍光強度の値で割った値をイメージングコントラストとして数値化した。イメージングコントラストは、それぞれの化合物の腫瘍造影能を示すパラメータであり、イメージングコントラストが高いほど腫瘍の造影剤として有効であることになる。表４に各化合物のイメージングコントラストを示す。本発明のｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ならびにｉＴＦ（８．４）のイメージングコントラストは２．３以上であり、比較例のＩＣＧ、ならびにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）に比べても高かった。この結果より、本発明の実施例に係る、近赤外色素が結合したトランスフェリンは腫瘍造影能に優れていることが示された。本発明の化合物のイメージングコントラストが、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）に比べて大きいのは、後述するように腫瘍集積性の違いによるものであると考えられる。イメージングコントラストが最も高くなる色素標識数は４．８であった。一方、色素標識数が８を超えると、イメージングコントラストが減少する傾向が見られた。
【００７９】
【表４】
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【００８０】
（実施例５：化合物の腫瘍集積率と血中残存率の評価）
実施例４で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量と血中色素量を定量することで、化合物の腫瘍集積率と血中残存率を評価した。
【００８１】
腫瘍集積率は、腫瘍１ｇあたりの色素投与量に対する腫瘍への色素移行率（％ＩＤ／ｇ）で表わした。まず、投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍をプラスチックチューブに移し、腫瘍重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いて破砕した。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、前記の通り処理された腫瘍破砕溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍中の色素量を測定した。
【００８２】
血中残存率は、血液１ｇ（比重を１として１ｍＬ）あたりの色素投与量に対する血液への色素移行率（％ＩＤ／ｇ）として表わした。投与２４時間後にマウス尾静脈から血液を採取し、プラスチックチューブ内で血液、１％Ｔｒｉｒｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、ならびにＤＭＳＯを２：９：９で混合した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、プラスチックチューブの状態で、前記の通り処理された血液溶液の蛍光強度を測定することで血中の色素量を測定した。
【００８３】
以上の測定より、腫瘍血中比を算出した。これは腫瘍集積率と血中残存率の比であり、この値が高いほど、腫瘍造影能が高いことを意味する。
【００８４】
結果を表５に示す。本発明のｉＴＦ（２．０）、ｉＴＦ（４．８）、ｉＴＦ（７．０）、ｉＴＦ（８．３）、ｉＴＦ（８．４）の腫瘍集積性は０．８から７．１％ＩＤ／ｇであり、ｉＴＦ（４．８）では最も高い腫瘍集積性７．１％ＩＤ／ｇを示した。比較例であるＩＣＧは腫瘍集積性を持たないため、腫瘍集積率はゼロであった。比較例であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）の腫瘍集積率は０．６％ＩＤ／ｇであった。本発明の化合物の腫瘍集積率がＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）に比べて高い理由は、色素の親疎水性が影響していると思われる。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０の構造は未公開であるが、その構造にはスルホン酸が導入され高い親水性が付与されていると思われる。一方で本発明のｉＴＦの色素骨格にはスルホン酸は有しておらず、疎水性である。したがって、トランスフェリンが色素標識により疎水性になり、細胞の取り込み能が増加した結果、腫瘍集積率が増加したと考えられる。本発明の化合物の中でも、色素標識数の違いで腫瘍集積性が変化した。
【００８５】
色素標識数が４．８であるｉＴＦ（４．８）において最大の腫瘍集積率が得られた。これは腫瘍集積率に対する化合物の親水疎水バランスが最も良い状態であることが考えられる。それ以上の色素標識数になると、化合物全体の疎水性が強くなり、血中でのタンパク質吸着が促進され、あるいはトランスフェリン自体の変性を誘起するため、血中滞留性が低下し、その結果、腫瘍集積率が低下したと考えられる。
【００８６】
腫瘍血中比は、比較例のＩＣＧとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０−ＴＦ（２．０）に比べて、３．５倍から１１倍も高くなった。これは、本発明のｉＴＦは、高い腫瘍集積率を示す一方で、血中残存率が低いためである。つまり、本発明の化合物の腫瘍集積維持性が高いことを意味している。この結果からも、腫瘍細胞への取り込み能の高さが示唆される。
【００８７】
表４のイメージングコントラストからも明らかなように、色素標識数が４．８であるｉＴＦ（４．８）において最大の腫瘍血中比３．３が得られた。以上の結果より、本発明の実施例に係るｉＴＦは、高い感度かつ高い腫瘍選択的な腫瘍の光音響イメージングを可能にする光音響イメージング用造影剤であることが示された。
【００８８】
【表５】
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【図１】
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【配列表】
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