(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効性分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記配列リスト１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプI  α１由来であることを特徴とする請求項１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプII  α１由来であることを特徴とする請求項１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
前記配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されることを特徴とする請求項１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項５】
前記配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することを特徴とする請求項１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【請求項６】
前記薬学組成物は、点眼剤の剤型であることを特徴とする請求項１に記載の乾性眼の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペプチドを有効性分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾性眼は、年を取ることによって発病率が増加する疾患であって、４０歳人口の６％が乾性眼疾患を示しており、年齢の増加によって発病率が１５％に増加して、６５歳以上では２５％まで乾性眼が表われると報告された。
【０００３】
乾性眼は、涙が不足であるか、涙が過度に蒸発して、涙の構成成分の均衡が合わなくて、眼球表面が損傷され、異物感、乾燥感のような目の刺激及び視力低下のような症状を伴う疾患である。このような乾性眼は、機能的視力を減少させ、運転、読書及びテレビ視聴のような日常的な作業遂行に困難を与えて、生活の質に影響を及ぼす。
【０００４】
乾性眼の場合、ほとんど、涙膜を補完する層である油層、水層または粘膜層のうち１つに異常が生じて、角膜／結膜障害が引き起こされる。その中でも、粘膜層の異常は、深刻な角膜障害の原因となるが、乾性眼は、角膜上皮細胞のフルオレセイン透過性、結膜変形及び杯状細胞の損失を増加させて、角膜表面の上皮細胞に病理学的な変化を起こすことによって、角膜上皮障害または角膜上皮びらんだけではなく、角膜潰瘍及び眼瞼炎まで起こし、一部の場合、角膜移植が必要となる。
【０００５】
現在、最も多く使われる乾性眼治療法は、ムチンの置換剤としてメチルセルロース、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸のような粘弾性化合物を含有する人工涙の局所処方があるが、前記化合物は、物理学的及び生理学的にムチンと異なるために、治療の効能が制限的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規なペプチドを有効性分として含有する組成物を用いて眼球の涙量の減少、角膜表面の不規則性及び結膜杯状細胞の損失のような角膜上皮細胞の病理学的変化を抑制または改善して、乾性眼を予防または治療することができる薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効性分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新規なペプチドは、乾燥ストレスで誘導された乾性眼の涙の生成及び角膜表面の滑らかさを向上させ、角膜上皮細胞の剥離、結膜杯状細胞の減少及び炎症性因子の生成を抑制する効果を表わすことが確認されることによって、それを有効性分として含有する組成物を乾性眼の予防または治療用薬学組成物として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスにＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉを処理し、涙量の変化を確認した結果であって、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに３、５、７及び１０日間ＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉを眼球に投与した後、マウスの涙量を測定し、平均±標準偏差で定量的結果を示した。＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄグループ。＃ｐ＜０．０５ｖｓ．ＰＢＳグループ。§＜０．０５ｖｓ．ペプチドIグループ。¶＜０．０５ｖｓ．ペプチドIIグループ。†ｐ＜０．０５ｖｓ．ｈｙａｌｕｎｉグループ。
【図２】ＧＤＲＧＤペプチド及びＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの角膜表面屈曲性に及ぼす影響を確認した結果であって、図２の（Ａ）は、乾燥ストレスが除去されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに３、５、７及び１０日間ＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉが処理された各グループの眼球イメージ結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１ｍｍ）であり、図２の（Ｂ）は、ＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉが処理されたマウスの角膜表面滑らかさ点数の変化を確認した結果であって、平均±標準偏差で定量的結果を示した（＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄグループ）。
【図３】角膜上皮細胞の剥離に及ぼすＧＤＲＧＤペプチド及びＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチドの影響を確認した結果であって、図３の（Ａ）は、ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの角膜にＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉ投与１０日後、角膜上皮細胞の剥離程度を確認したヘマトキシリン＆エオシン染色結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝１００μｍ）であり、図３の（Ｂ）は、角膜上皮細胞の剥離程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄグループ）。
【図４】結膜杯状細胞の分布に及ぼすペプチドI（ＧＤＲＧＤ）及びペプチドII（ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ）の影響を確認した結果であって、図４の（Ａ）は、ＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉ投与されたＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの結膜をＰＡＳ染色した結果（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝２００μｍ）であり、図４の（Ｂ）は、結膜杯状細胞の分布程度を平均±標準偏差で表わした定量的結果である（＊ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＳ  １０Ｄグループ）。
【図５】ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの結膜でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発現程度を確認した免疫組織化学の分析結果であって、乾燥ストレスを除去させたマウスにＰＢＳ、ペプチドI、ペプチドII及びｈｙａｌｕｎｉ投与１０日後、マウスの結膜で前記炎症性因子の発現程度を確認した結果である（Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝３００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効性分として含有する乾性眼の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１１】
前記配列リスト１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプＩ  α１（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  I  α１）由来であり、前記配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、コラーゲンタイプII  α１（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  II  α１）由来であり得る。
【００１２】
より詳細には、前記配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、軟骨細胞由来細胞外基質（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＣＤＥＭ）から分離されたペプチドであり、前記軟骨細胞由来細胞外基質は、動物の軟骨組織及び／または軟骨由来軟骨細胞から分泌されて形成された軟骨細胞由来細胞外基質から分離されたものであり、前記動物は、豚、馬、牛、羊、山羊、及び猿からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
前記配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、乾燥ストレスによる涙の生成の減少及び角膜表面の不均衡を回復させ、角膜上皮細胞の剥離及び炎症性因子の生成を抑制することができる。
【００１４】
本発明の一実施例によれば、図１のように、乾燥ストレスによってＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの涙量が正常群（０．１６±０．０２μＬ）と比較して８６％ほど有意なレベルに減少（ＤＳ  １０  Ｄグループ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）した。前記乾燥眼動物モデルに乾燥ストレスを除去し、ペプチドI（ＧＤＲＧＤ）とペプチドII（ＧＱＤＧＬＡＧＰＫ）とを処理した実験グループは、対照群であるＰＢＳ処理グループと比較して約２．５２倍（ｐ＜０．０５）程度涙量を増加させ、前記結果は、眼球乾燥症治療剤であるヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）処理グループと類似したレベルであると確認された。
【００１５】
前記結果からペプチドI及びIIは、乾性眼から誘発される涙量の減少を有意的に治療して、正常眼球から分泌される涙量のレベルに回復させる効果があることが確認された。
【００１６】
前記配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、薬学組成物総１００重量部に対して、０．１〜５０重量部で含有されうる。
【００１７】
前記薬学組成物は、点眼剤、注射剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル、シロップ、懸濁剤、乳剤、点滴剤、及び液剤からなる群から選択された何れか１つの剤型であり得るが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の他の具体例で、配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効性分として含む眼球表面疾患の予防または治療用薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常使う適切な担体、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤、香味剤、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤からなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。
【００１９】
具体的に、担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を使用し、経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、前記組成物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例を挙げれば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などがあり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例を挙げれば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【００２０】
本発明の一実施例によれば、前記薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、腹腔内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で対象体に投与することができる。
【００２１】
前記配列リスト１または配列リスト２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの望ましい投与量は、対象体の状態及び体重、疾患の種類及び程度、薬物形態、投与経路及び期間によって変わり、当業者によって適切に選択されうる。本発明の一実施例によれば、これに制限されるものではないが、１日投与量が０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ、具体的には、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり得る。投与は、一日一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない。
【００２２】
本発明において、前記‘対象体’は、ヒトを含む哺乳動物であり得るが、これら例に限定されるものではない。
【００２３】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００２４】
＜実験例１＞ペプチド合成
【００２５】
あらゆる実験に使われたペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）は、コラーゲンタイプI  α１を基盤とするＧＤＲＧＤペプチド（以下、ペプチドI；配列リスト１）とコラーゲンタイプII  α１を基盤とするＧＱＤＧＬＡＧＰＫペプチド（以下、ペプチドII；配列リスト２）とでＰＥＰＴＲｏｎ（大田、大韓民国）で合成した。
【００２６】
＜実験例２＞実験動物及び乾性眼モデルの製作
【００２７】
ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。動物実験は、目と視力研究のための動物使用に対して大韓民国の仁済医科大学（Ｎｏ．；２０１４−０２９）とＡＲＶＯに承認された指針によって行われた。１２〜１６週齢のＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに乾燥ストレスで一日１８時間４０〜５０％の周囲湿度とファンとを利用した通風に露出させ、皮下に０．５ｍｇ／０．２ｍＬムスカリン受容体遮断剤を注射した。また、１０日間、午前９時、午後１２時、午後３時及び午後６時の一日４回スコポラミン臭化水素酸（ｓｃｏｐｏｌａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をマウスの尻側に交互に注射した。前記方法で処理されたマウスを１０日後、安楽死させ、実験期間の間の動物の行動と食べ物及び水の摂取とを制限しなかった。
【００２８】
眼球乾燥ストレス１０日後、スコポラミン注射を中断し、一般湿度と温度環境に転換し、乾燥ストレス除去した後、ペプチドIまたはペプチドII処理グループに分け、１０ｍｇ／ｍｌペプチドIまたは１０ｍｇ／ｍｌペプチドIIをＰＢＳに溶解して、５μＬずつ一日に５回１０日間眼球に投与した。また、対照群であるＰＢＳまたはＨｙａｌｕｎｉ（ＨＡ）処理グループは、ＰＢＳまたは０．１％ＨＡを５μＬずつ一日に５回１０日間眼球に投与した。前記あらゆるグループは、それぞれ５匹ずつマウスの両側目を用いて、前記実験を進行し、あらゆる実験は、繰り返して進められた。
【００２９】
＜実施例１＞涙の生成に及ぼすペプチドの影響確認
【００３０】
涙の生成程度をフェノールレッド−浸潤綿スレッド（ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ−ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ  ｃｏｔｔｏｎ  ｔｈｒｅａｄｓ；Ｚｏｎｅ−Ｑｕｉｃｋ；Ｏａｓｉｓ、Ｇｌｅｎｄｏｒａ、ＣＡ）を用いて報告された方法（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ  ＡＬ，Ｆａｒｌｅｙ  Ｗ，Ｐｆｌｕｇｆｅｌｄｅｒ  ＳＣ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｅｐｉｎａｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｌｏｐａｔａｄｉｎｅ  ｏｎ  ｔｅａｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｅｙｅ  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｌｅｎｓ．２００６；３２（６）：２７２−２７６．）で測定した。涙量は、医療用ピンセットを用いてスレッドを２０秒間側面眼角に位置させ、涙に濡れて赤色に変わったスレッドを顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｃｏｒｐ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察して、ｍｍで表示した。
【００３１】
前記測定されたｍｍ内の涙液を２０秒間マウスの涙量と予想される容量の塩基性溶液（０．９％塩分１５００ｍＬと５ｍＬの５Ｎ  ＮａＯＨ）で濡らした綿スレッドで表わした標準曲線と比較した。
【００３２】
その結果、図１のように、乾燥ストレスによってＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの涙量が正常群（０．１６±０．０２μＬ）と比較して８６％ほど有意なレベルに減少した（ＤＳ  １０  Ｄ  ｇｒｏｕｐ、０．０３±０．０１μＬ、ｐ＜０．０５）。前記乾燥眼動物モデルに乾燥ストレス除去後、ペプチドIとペプチドIIとを処理した結果、対照群であるＰＢＳ処理グループと比較して約２．５２倍（ｐ＜０．０５）程度涙量が増加したことを確認することができ、前記結果は、眼球乾燥症治療剤であるヒアルロン酸処理グループと類似したレベルであると確認された。
【００３３】
前記結果からペプチドI及びIIは、乾性眼から誘発される涙量の減少を有意的に治療して、正常眼球から分泌される涙量のレベルに回復させる効果があることが確認された。
【００３４】
＜実施例２＞角膜表面屈曲性に及ぼすペプチドの影響確認
【００３５】
１．角膜表面の滑らかさの評価
【００３６】
ペプチドI及びペプチドII実験グループと対照群であるＰＢＳ、ＨＡ処理グループとの角膜表面の滑らかさを評価した。２つの実験群の動物を安楽死後、即時実体顕微鏡（ＳＺＸ７；Ｏｌｙｍｐｕｓ）の光繊維リング照明から白色リングの反射イメージを得た。
【００３７】
角膜の滑らかさをデジタルイメージの白色リングに反射された角膜上皮細胞の不規則性を等級化して評価した。角膜不規則性の深刻度点数は、反射リングを４等分に分けて不規則性程度によって５等級で計算した。不規則性ないは０等級、１／４等分の不規則性を１等級；２／４等分の不規則性は２等級；３／４等分の不規則性を３等級；いずれも不規則な程度を４等級；深刻な程度を５等級にしてあらゆるリングを確認した。
【００３８】
２．ＧＤＲＧＤ及びＧＱＤＧＬＡＧＰＫの角膜屈曲性の改善効果の確認
【００３９】
前記角膜表面の滑らかさの評価方法で乾性眼マウス角膜の屈曲程度を数値化した結果、図２のように、正常角膜と比較して１０日間乾燥ストレスに露出されたマウスの角膜表面の屈曲程度は、約９．０２倍増加した。しかし、ＰＢＳ処理グループは、３、５、７及び１０日目に角膜表面の屈曲性に変化が表われない一方、ペプチド処理グループでは、経時的にＰＢＳ処理グループよりも角膜屈曲性が改善される効果が確認され、眼球乾燥症治療剤であるヒアルロン酸処理グループよりも角膜表面の屈曲性の改善効果が良いことを確認することができた。
【００４０】
＜実施例３＞角膜細胞に及ぼすペプチドの影響確認
【００４１】
１．組織学的分析
【００４２】
対照群であるＰＢＳまたはＨＡ処理グループとペプチドI、ペプチドII実験グループとの目と付属器官とを外科的に摘出して、１０％ホルマリンで固定させ、パラフィンとＯＣＴ混合物とに深く打ち込んだ。
【００４３】
前記方法で処理された６μｍ組織試料をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）と過ヨウ素酸シッフ試薬（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ  ｒｅａｇｅｎｔ；ＰＡＳ）とを使用して染色した。
【００４４】
各グループの動物５匹を前記方法で染色し、仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮影及び分析を行った。
【００４５】
２．角膜上皮細胞の剥離に及ぼすＧＤＲＧＤ及びＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果確認
【００４６】
ＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスの角膜をＨ＆Ｅ染色した結果、図３のように、乾燥ストレスによって角膜の上皮細胞の剥離が約４．１７倍増加（２．２９±０．６１／０．１ｍｍ２、ｐ＜０．０５）したことを確認することができた。前記乾燥ストレスに角膜の上皮細胞の剥離が誘導されたマウス角膜にＰＢＳ（１．４３±０．３４／０．１ｍｍ２）またはヒアルロン酸（１．７１±０．００／０．１ｍｍ２）が処理されたグループでは、角膜の上皮細胞の剥離が改善されていない一方、ペプチドＩが処理された実験グループでは、剥離された上皮細胞数が０．１９±０．１４／０．１ｍｍ２に著しく減少した。特に、ペプチドIIを処理した実験グループは、対照群と比較して角膜上皮細胞の剥離が約４倍程度抑制されたことを確認することができ、前記ペプチドI及びIIの処理による角膜上皮細胞の剥離改善程度は、正常角膜と類似したレベルであると確認された。
【００４７】
３．結膜杯状細胞の分布に及ぼすＧＤＲＧＤ及びＧＱＤＧＬＡＧＰＫの効果確認
【００４８】
乾性眼マウス動物モデルを対象にしてペプチドI、ペプチドII及びヒアルロン酸点眼による結膜杯状細胞の分布を観察した。
【００４９】
その結果、図４のように、乾燥ストレスは、正常結膜と比較して約４４．３２％（７．４３±１．５２／０．１ｍｍ２、ｐ＜０．０５）程度杯状細胞を減少させた。前記杯状細胞が減少したマウス角膜にＰＢＳまたはヒアルロン酸を処理したグループで結膜の杯状細胞分布の改善効果が表われなかったが、ペプチドI及びIIを処理した実験グループでは、乾燥ストレスによって減少した結膜杯状細胞がそれぞれ１．８倍（１３．３３±２．４１／０．１ｍｍ２、ｐ＜０．０５）及び１．６３倍（１２．１０±１．１１／０．１ｍｍ２、ｐ＜０．０５）顕著に増加したことを確認することができた。
【００５０】
＜実施例４＞ペプチドの抗炎症の効果確認
【００５１】
乾性眼マウスモデルを対象にして炎症反応マーカーの発現において、ペプチドの効果を評価するために、結膜でＴＮＦ−α、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の免疫染色して、免疫組織分析を遂行った。
【００５２】
まず、組織を６μｍの厚さの切片で切った。前記切片を３．５％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トリトンＸ−１００を浸透させ、２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ａｌｌ  ｆｒｏｍ  ｓｉｇｍａ）で不活性化させた後、１次抗体で抗ＴＮＦ−α、抗ＭＭＰ−２（１：１０００；ａｌｌ  ｆｒｏｍ  Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、抗ＭＭＰ−９（１：１０００；Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、抗ＩＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１（１：１０００；ａｌｌ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を常温で１時間間反応させた。その後、前記切片を２次抗体（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ、Ｇｌｏｓｔｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で２０分間反応させた。この際、免疫反応は、ジアミンベンジジン（ＤＡＢ）発色体で可視化させ、切片をＭａｙｅｒｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で室温で３０秒間対比染色させた。その後、前記切片のイメージを仮想顕微鏡（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ  ２．０  ＲＳ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。
【００５３】
その結果、図５のように、乾燥ストレスは、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α付着分子であるＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の結膜組織内の発現を著しく増加させ、結膜内のＭＭＰ２及びＭＭＰ９の発現をまた非常に増加した。一方、ペプチドI及びIIを処理した実験グループでは、このような炎症関連マーカーの結膜内の発現が著しく減少し、前記結果は、ヒアルロン酸処理効果と類似したと確認された。
【００５４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施様態であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図１】
0006543760.tif 000002
【図２】
0006543760.tif 000003
【図３】
0006543760.tif 000004
【図４】
0006543760.tif 000005
【図５】
0006543760.tif 000006
【配列表】
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