(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者由来の血液検体、リン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子、トロンビン、カルシウムおよび活性化凝固第X因子に対する基質を混合することで調製された第１測定試料から、前記第１測定試料中に生成された反応生成物の量を示す第１情報を取得する工程と、
前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、前記カルシウムおよび前記基質を混合することで調製された第２測定試料から、前記第２測定試料中に生成された前記反応生成物の量を示す第２情報を取得する工程と、
前記第１情報と前記第２情報とに基づいて、複合体形成能に関する情報を取得する工程と、を含み、
前記反応生成物は、前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、および前記カルシウムを混合することで生成された活性化凝固第X因子と前記基質との反応により生成され、
前記第２測定試料における、前記リン脂質および前記活性化凝固第IX因子からなる群から選択される一の成分の終濃度は、前記第１測定試料における前記一の成分の終濃度と異なっており、
前記複合体形成能に関する情報は、前記一の成分と凝固第VIII因子との複合体形成能に関する情報である、凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報の取得方法。
【請求項２】
前記第１測定試料における前記一の成分の終濃度は、以下の式１：
【数１】
0006552286.tif 000009
で表される値であり、
前記第２測定試料における前記一の成分の終濃度は、以下の式２：
【数２】
0006552286.tif 000010
で表される値である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、および前記カルシウムを混合することで第１試料を調製する工程と、
前記第１試料と前記基質を混合することで前記第１測定試料を調製する工程と、
前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、および前記カルシウムを混合することで第２試料を調製する工程と、
前記第２試料と前記基質を混合することで前記第２測定試料を調製する工程と、をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記一の成分がリン脂質であり、前記第１測定試料における前記リン脂質の終濃度と前記第２測定試料における前記リン脂質の終濃度は、0.1μM以上1000μM以下の範囲から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記一の成分が活性化凝固第IX因子であり、前記第１測定試料における前記活性化凝固第IX因子の終濃度と前記第２測定試料における前記活性化凝固第IX因子の終濃度は、0.01nM以上500nM以下の範囲から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記複合体形成能に関する情報の取得工程において、前記第１情報と前記第２情報とに基づいて、前記一の成分と凝固第VIII因子との親和性を表す値を取得し、前記一の成分と凝固第VIII因子との親和性を表す値に基づいて、前記複合体形成能に関する情報を取得する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体形成能に関する情報の取得工程において、前記一の成分と凝固第VIII因子との親和性を表す値と所定の基準値とに基づいて、前記複合体形成能に関する情報を取得する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記所定の基準値が、健常人の血液検体中に存在する凝固第VIII因子活性と同等の活性を有する凝固第VIII因子を含む血漿と、凝固第VIII因子を含まない血液検体とを混合することによって得られた対照血液検体における前記一の成分と前記凝固第VIII因子との親和性を表す値、または健常人の血液検体における前記一の成分と前記凝固第VIII因子との親和性を表す値である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複合体形成能に関する情報は、前記一の成分と凝固第VIII因子との親和性を表す値である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体形成能に関する情報は、前記一の成分が、前記凝固第VIII因子との低親和性を示すかについての情報である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、前記カルシウムおよび前記基質を混合することで調製された第３測定試料から、前記第３測定試料中に生成された前記反応生成物の量を示す第３情報を取得する工程と、
前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、前記カルシウムおよび前記基質を混合することで調製された第４測定試料から、前記第４測定試料中に生成された前記反応生成物の量を示す第４情報を取得する工程と
をさらに含み、
前記第２測定試料における前記リン脂質の終濃度は、前記第１測定試料における前記リン脂質の終濃度と異なっており、
前記第３測定試料における前記活性化凝固第IX因子の終濃度は、前記第１測定試料における前記活性化凝固第IX因子の終濃度と異なっており、且つ
前記第４測定試料における前記凝固第X因子の終濃度は、前記第１測定試料における前記凝固第X因子の終濃度と異なっており、
前記複合体形成能に関する情報を取得する工程において、前記第１情報、前記第２情報、前記第３情報および前記第４情報に基づいて、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子および前記凝固第X因子のうち、いずれの成分が、前記凝固第VIII因子との低親和性を示すかについての情報を取得する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記被検者が、血友病Ａ患者である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記血液検体が、血漿または希釈した血漿である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
リン脂質を含む試薬を収容した第１試薬容器と、
活性化凝固第IX因子を含む試薬を収容した第２試薬容器と、
凝固第X因子を含む試薬を収容した第３試薬容器と、
トロンビンおよびカルシウムを含む試薬を収容した第４試薬容器と、
活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬を収容した第５試薬容器と
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法に用いられる、凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報を取得するための試薬キット。
【請求項１５】
リン脂質を含む試薬を収容した第１試薬容器と、
活性化凝固第IX因子を含む試薬を収容した第２試薬容器と、
凝固第X因子を含む試薬を収容した第３試薬容器と、
トロンビンを含む試薬を収容した第４試薬容器と、
カルシウムを含む試薬を収容した第５試薬容器と、
活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬を収容した第６試薬容器と
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法に用いられる、凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報を取得するための試薬キット。
【請求項１６】
前記リン脂質を含む試薬は凍結乾燥品または液体試薬であり、
前記活性化凝固第IX因子を含む試薬は凍結乾燥品または液体試薬であり、
前記凝固第X因子を含む試薬は凍結乾燥品または液体試薬である、請求項１４または１５に記載の試薬キット。
【請求項１７】
血液検体、第１試薬容器に収容されたリン脂質を含む試薬、第２試薬容器に収容された活性化凝固第IX因子を含む試薬、及び第３試薬容器に収容された凝固第X因子を含む試薬からなる群より選択される少なくとも一つを希釈する希釈液を収容した第７試薬容器をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項１８】
被検者由来の血液検体、リン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子、トロンビン、カルシウムおよび活性化凝固第X因子に対する基質を混合することで調製された第１測定試料から、前記第１測定試料中に生成された反応生成物の量を示す第１情報を取得する工程と、
前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、前記カルシウムおよび前記基質を混合することで調製された第２測定試料から、前記第２測定試料中に生成された前記反応生成物の量を示す第２情報を取得する工程と、
前記第１情報と前記第２情報とに基づいて、複合体形成能に関する情報を取得する工程と、を含み、
前記反応生成物は、前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、および前記カルシウムを混合することで生成された活性化凝固第X因子と前記基質との反応により生成され、
下記i)またはii)の条件を満足し、
i) 前記第1測定試料における前記リン脂質の終濃度と、前記第２測定試料における前記リン脂質の終濃度とが異なっており、且つその他の成分の終濃度が実質的に同じである；
ii) 前記第1測定試料における前記活性化凝固第IX因子の終濃度と、前記第２測定試料における前記活性化凝固第IX因子の終濃度とが異なっており、且つその他の成分の終濃度が実質的に同じである、
前記複合体形成能に関する情報は、前記一の成分と凝固第VIII因子との複合体形成能に関する情報である、凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報の取得方法およびそれに適した試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、凝固第VIII因子(FVIII)または凝固第IX因子(FIX)の先天的欠損または機能不全に起因する出血性疾患である。FVIIIが原因である場合は血友病Ａと呼ばれ、FIXが原因である場合は血友病Ｂと呼ばれる。血友病患者においては、関節内、筋肉内などの深部組織に出血症状が見られ、重篤な例では頭蓋内出血も生じる。
【０００３】
血友病の重篤度の判定方法として、凝固因子活性を合成基質法で測定する方法が用いられている。凝固因子活性を合成基質法で測定する方法として、非特許文献１には、凝固第VIII因子(FVIII) 活性を合成基質法で測定する方法が記載されている。非特許文献１記載の方法では、ヒト凝固第X因子を含有する試薬、ヒト活性化凝固第IX因子(FIXa)、ヒトトロンビン、カルシウムおよび合成リン脂質を含有する試薬、活性化凝固第X因子(FXa)の合成基質およびトロンビンインヒビターを含有する試薬、トリスヒドロキシメチルアミノメタンおよび1％ウシ血清アルブミン含有緩衝液を含有する試薬を用いて、凝固第VIII因子(FVIII) 活性を測定することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hyphen BioMed社 BIOPHEN FVIII:C Ref. 221402添付文書(Chromogenic assay for measuring Factor VIII:C in plasma, or in concentrates; D750-02/BI/1402), 2014年6月24日(最新版)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１記載の方法ではFVIII活性を測定可能であるが、複数ある血友病の治療製剤から適切なものを選択するためには、FVIIIの異常の原因を解明することが好ましい。FVIIIの異常の原因解明を行う方法として、遺伝子解析により、FVIIIの変異を同定してFVIIIの異常の原因解明を行う方法があるが、それには時間とコストを要する。よって、より簡便かつ低コストにFVIIIの異常の原因解明を行う方法が求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、血液凝固の異常が疑われる被検者由来の血液検体、リン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子、トロンビン、カルシウムおよび活性化凝固第X因子に対する基質を混合することで調製された第１測定試料、および前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、前記カルシウムおよび前記基質を混合することで調製された第２測定試料を用いる凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報の取得方法によって上記の課題を解決できることを意外にも見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、血液凝固の異常が疑われる被検者由来の血液検体、リン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子、トロンビン、カルシウムおよび活性化凝固第X因子に対する基質を混合することで調製された第１測定試料から、前記第１測定試料中に生成された反応生成物の量を示す第１情報を取得する工程と、前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、前記カルシウムおよび前記基質を混合することで調製された第２測定試料から、前記第２測定試料中に生成された前記反応生成物の量を示す第２情報を取得する工程と、前記第１情報と前記第２情報とに基づいて、複合体形成能に関する情報を取得する工程と、を含み、前記反応生成物は、前記血液検体、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子、前記凝固第X因子、前記トロンビン、および前記カルシウムを混合することで生成された活性化凝固第X因子と前記基質との反応により生成され、前記第２測定試料における、前記リン脂質、前記活性化凝固第IX因子および前記凝固第X因子からなる群から選択される一の成分の終濃度は、前記第１測定試料における前記一の成分の終濃度と異なっており、前記複合体形成能に関する情報は、前記一の成分と凝固第VIII因子との複合体形成能に関する情報である、凝固第VIII因子の複合体形成能に関する情報の取得方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、より簡便かつ低コストに凝固第VIII因子の異常の原因解明を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図２】試薬キットの外観の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
第１測定試料は、血液凝固の異常が疑われる被検者由来の血液検体、リン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子、トロンビン、カルシウムおよび活性化凝固第X因子に対する基質を混合することで調製される。
【００１１】
血液検体は、血液凝固の異常が疑われる被検者由来のものであれば特に限定されない。血液検体としては、具体的には全血および血漿が挙げられ、血漿であることが特に好ましい。血漿は、当業者に公知の方法、例えば採血により取得した全血から遠心分離またはフィルター分離等によって血小板を除去することによって取得することができる。
血液検体は、HEPES(-)を含む緩衝液等のような適切な溶媒に希釈して用いられてもよい。この場合、希釈率は、好ましくは2倍以上30倍以下である。
【００１２】
血液凝固の異常とは、例えば、臨床的に出血傾向が認められること、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)測定における凝固時間延長が認められること等が挙げられる。本実施形態の方法は、「血液凝固の異常が疑われる被検者」として血友病患者を対象とすることが好ましく、血友病A患者を対象とすることがより好ましい。
【００１３】
ここで、血友病Aとは、当該技術分野において慣用される意味と同様、凝固第VIII因子の異常に起因する血友病を意味する。血友病Aのより具体的な原因としては、凝固第VIII因子の欠失や凝固第VIII因子の複合体形成の異常等が挙げられる。複合体形成の異常の態様としては、凝固第VIII因子と、リン脂質、活性化凝固第IX因子または凝固第X因子のいずれかとの親和性が低減していること等が挙げられる。
【００１４】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)およびホスファチジルセリン(PS)等ならびにそれらの混合物が挙げられる。リン脂質は、天然に存在するものであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。また、リン脂質は、固体または液体のいずれの形態であってもよいが、適切な溶媒に溶解して液体の形態で用いることが好ましい。
第１測定試料中におけるリン脂質の終濃度は、好ましくは0.1 μM以上1000 μM以下、より好ましくは1 μM以上 200μM以下である。
【００１５】
ここで、終濃度とは、測定試料を調製するために成分を添加した時点における理論上の終濃度をいう。例えば、終濃度は、以下の式Xで表される。
【数１】
0006552286.tif 000002
【００１６】
より具体的には、第１および第２測定試料における、以下で説明する一の成分の終濃度は、以下の式１および２で表される：
【数２】
0006552286.tif 000003
【００１７】
ここで、添加量とは、測定試料調整のための混合される物質の質量を示す。
【００１８】
活性化凝固第IX因子としては、例えば、Coagulation Factor IX（Haematologic Technologies Inc.）が挙げられる。活性化凝固第IX因子は、採血等によって取得した全血や血漿等から取得したものであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。また、活性化凝固第IX因子は、固体または液体のいずれの形態であってもよいが、適切な溶媒に溶解して液体の形態で用いることが好ましい。
第１測定試料中における活性化凝固第IX因子の終濃度は、好ましくは0.01 nM以上500 nM以下、より好ましくは0.1 nM以上15 nM以下である。
【００１９】
凝固第X因子としては、例えば、Coagulation Factor X（Haematologic Technologies Inc.）が挙げられる。凝固第X因子は、採血等によって取得した全血や血漿等から取得したものであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。また、凝固第X因子は、固体または液体のいずれの形態であってもよいが、適切な溶媒に溶解して液体の形態で用いることが好ましい。
第１測定試料中における凝固第X因子の終濃度は、好ましくは0.1 nM以上8000 nM以下、より好ましくは5 nM以上250 nM以下である。
【００２０】
トロンビンは、天然に存在するものであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。また、トロンビンは、固体または液体のいずれの形態であってもよいが、適切な溶媒に溶解して液体の形態で用いることが好ましい。
第１測定試料中におけるトロンビンの終濃度は、好ましくは0.01 nM以上0.1 mM以下、より好ましくは0.05 nM以上100 nM以下である。
【００２１】
カルシウムは、塩として固体の形態またはイオンとして液体の形態のいずれの形態であってもよいが、適切な溶媒に溶解して液体の形態で用いることが好ましい。
第１測定試料中におけるカルシウムの終濃度は、好ましくは0.01 mM以上20 mM以下、より好ましくは0.1 mM以上5 mM以下である。
【００２２】
活性化凝固第X因子に対する基質は、活性化凝固第X因子と反応してシグナルを発する反応生成物を生ずるものであれば特に限定されない。基質は、自然界に天然に存在するものであっても、人工的に合成したものであってもよい。本実施形態では、例えば、FXaの作用によりペプチドと発色性のpNAに分解されるS-2765が用いられる。基質は、固体の形態または液体の形態のいずれであってもよいが、固体の形態で添加することが好ましい。
【００２３】
第１測定試料中における基質の終濃度は、好ましくは0.01 mg/ml以上10 mg/ml以下である。
また、上記のシグナルとしては、発色や蛍光等、特に限定されない。得られた反応生成物に基づくシグナルは、当業者に公知の方法を用いて測定できる。本実施形態では、例えば、市販装置を用いての波長405 nmにおける吸光度測定が用いられる。
なお、トロンビンと反応し得る基質を用いる場合は適量のトロンビンインヒビターを添加することが好ましい。
上記の各成分の混合は、当業者に公知の方法で行うことができる。第１測定試料には、EDTAのような反応停止液を適量添加してもよい。
【００２４】
第２測定試料は、第１測定試料について上述したことと同様、血液凝固の異常が疑われる被験者由来の血液検体、リン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子、トロンビン、カルシウムおよび活性化凝固第X因子に対する基質を混合することで調製される。
【００２５】
ただし、第２測定試料における、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれか一の成分の終濃度は、第１測定試料における終濃度とは異なっている。一の実施形態では、第１測定試料におけるリン脂質の終濃度と、第２測定試料におけるリン脂質の終濃度が異なる。この場合、第１測定試料および第２測定試料中の他の成分の終濃度は実質的に同じである。第１測定試料は、終濃度x1のリン脂質、終濃度yの活性化凝固第IX因子および終濃度zの凝固第X因子を含み、第２測定試料は、終濃度x2のリン脂質、終濃度yの活性化凝固第IX因子および終濃度zの凝固第X因子を含む。ここで、終濃度x1と終濃度x2とは異なる濃度を表す。他の実施形態では、第1測定試料における活性化凝固第IX因子の終濃度と、第２測定試料における活性化凝固第IX因子の終濃度が異なる。この場合、第１測定試料および第２測定試料中の他の成分の終濃度は実質的に同じである。他の実施形態では、第１測定試料における凝固第X因子の終濃度と、第２測定試料における凝固第X因子の終濃度が異なる。この場合、第１測定試料および第２測定試料中の他の成分の終濃度は実質的に同じである。
【００２６】
別の実施形態では、更に第３測定試料、第４測定試料、・・・第X測定試料、第(X+1)測定試料等のように、第１および第２測定試料に加えて、更に１以上の測定試料を用いてもよい。ただし、この場合、第(X+1)測定試料中におけるリン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれか一の成分の終濃度は、第１〜第X測定試料中における終濃度とは異なるものとする。このように、いずれか一の成分の終濃度が測定試料ごとに異なっていることによって、その成分と凝固第VIII因子との複合体形成能に関する情報を取得することができる。
【００２７】
上記のようにして調製された測定試料から、前記測定試料中に生成された反応生成物の量を示す情報を取得する。
このような情報としては、例えば親和性を表す値等が挙げられる。このような親和性を表す値としては、Km値およびそれと所定の基準値との比、１分子の活性化凝固第X因子が１秒間に生成するシグナル生成物質の数を表すターンオーバ数およびそれと所定の基準値との比等が挙げられる。
本実施形態では、第１測定試料について得られた情報を第１情報、第２測定試料について得られた情報を第２情報、…第X測定試料について得られた情報を第X情報と称し得る。
【００２８】
上記の情報の取得は、当業者に公知の適切な方法を用いて行うことができる。本実施形態では、情報の取得は、例えば、凝固第VIII因子と、終濃度が異なった一の成分との親和性を表す値と、所定の基準値との比較に基づいて行われる。親和性を表す値は、例えば、ミカエリス・メンテン式を用いてKmapp値を求める方法、当業者に公知のターンオーバ数を求める方法等を用いて算出することができる。
【００２９】
上記のようにして得られた、測定試料中に生成された反応生成物の量を示す情報に基づいて、複合体形成能に関する情報を取得する。
本実施形態では、凝固第VIII因子と、終濃度が異なった一の成分との親和性を表す値が所定の基準値から所定の範囲に収まっている場合、凝固第VIII因子とその成分との複合体形成に異常がないとの情報を取得でき、凝固第VIII因子と、終濃度が異なった一の成分との親和性を表す値が所定の基準値から所定の範囲に収まらなかった場合、凝固第VIII因子とその成分との複合体形成に異常があるとの情報を取得できる。特に、凝固第FVIII因子の異常として、リン脂質、活性化凝固第IX因子および／または凝固第X因子との複合体形成能の低減が想定され得る。よって、凝固第VIII因子と上記の各成分との親和性を表す値が低いことは、その被検者が血友病Aを罹患している場合に、血友病Aの原因であり得る。
【００３０】
上記の所定の基準値は、例えば、健常人の血漿中に存在する凝固第VIII因子活性と同等の活性を有する凝固第VIII因子を含む血漿と、凝固第VIII因子を含まない血漿とを混合することによって得られた対照血漿を用いて測定されたか、または健常人の血液検体を用いて測定された、凝固第VIII因子と一の成分との親和性を表す値である。
【００３１】
本実施形態では、例えば以下のようにして複合体形成能に関する情報の取得を行う。
まず、各測定試料について得られた測定結果をミカエリス・メンテン式に当てはめる。公知のプログラム、例えばKaleidaGraph ver 4.1（Synergy software)を用いて上記の測定結果に関して(濃度)-1および(反応速度)-1についてプロッティングを行い、最小二乗法により近似曲線を得、見かけのKm値(Kmapp)を得る。このKmappは、凝固第VIII因子と終濃度が異なった一の成分との親和性を表す値である。よって、測定して得られたKmapp値が健常人のKmapp値から所定の範囲に収まっている場合、凝固第VIII因子とその成分との複合体形成に異常がないとの情報を取得でき、測定して得られたKmapp値が健常人のKmapp値から所定の範囲に収まらなかった場合、凝固第VIII因子とその成分との複合体形成に異常があるとの情報を取得できる。
【００３２】
本実施形態では、複合体形成能に関する情報は、Kmapp値と対照血漿を用いて測定されたKmapp値との比であり得る。
【００３３】
本発明の範囲には、上記の方法での使用に適した試薬および試薬キットも含まれる。
本実施形態において、試薬キットは、例えば図１に示されるように、リン脂質を含む試薬を収容した第１試薬容器１１と、活性化凝固第IX因子を含む試薬を収容した第２試薬容器１２と、凝固第X因子を含む試薬を収容した第３試薬容器１３と、トロンビンおよびカルシウムを含む試薬を収容した第４試薬容器１４と、活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬を収容した第５試薬容器１５とを含み得る。
【００３４】
リン脂質については、上記の方法に関する説明において述べたことと同様である。ただし、リン脂質を含む試薬は、好ましくは凍結乾燥品または液体試薬である。リン脂質を含む試薬は、発明の実施を妨げない限り、その他の物質を含んでいてもよい。
リン脂質を含む試薬が凍結乾燥品であるか、または固体である場合、試薬は、試薬容器に好ましくは10μg以上10 g以下、より好ましくは0.05 mg以上1 mg以下収容されている。この収容量は、測定試料が通常0.5 ml以上10 ml以下に調製されることに基づいている。一方、リン脂質を含む試薬が液体である場合、試薬は、好ましくは0.5μM以上5000μM以下、より好ましくは5μM以上1000μM以下のリン脂質を含む。
上記の方法において試薬キットを使用する場合、リン脂質を含む試薬は、リン脂質の終濃度が好ましくは0.1μM以上1000μM以下、より好ましくは1μM以上200μM以下となるように混合されることが意図される。
【００３５】
リン脂質を含む試薬には、血液凝固反応に影響を与える量の活性化凝固第IX因子および凝固第X因子が含まれていてはならない。これは、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれかを種々の終濃度に調製した複数の測定試料を作製する必要があるためである。
【００３６】
活性化凝固第IX因子については、上記の方法に関する説明において述べたことと同様である。ただし、活性化凝固第IX因子を含む試薬は、好ましくは凍結乾燥品または液体試薬である。活性化凝固第IX因子を含む試薬は、発明の実施を妨げない限り、その他の物質を含んでいてもよい。
活性化凝固第IX因子を含む試薬が凍結乾燥品であるか、または固体である場合、試薬は、試薬容器に好ましくは10μg以上10 g以下、より好ましくは0.05 mg以上10 mg以下収容されている。この収容量は、測定試料が通常0.5 ml以上10 ml以下に調製されることに基づいている。一方、活性化凝固第IX因子を含む試薬が液体である場合、試薬は、好ましくは0.05 nM以上2500 nM以下、より好ましくは0.5 nM以上75 nM以下の活性化凝固第IX因子を含む。
上記の方法において試薬キットを使用する場合、活性化凝固第IX因子を含む試薬は、活性化凝固第IX因子の終濃度が好ましくは0.01 nM以上50 nM以下、より好ましくは0.1 nM以上15 nM以下となるように混合されることが意図される。
【００３７】
活性化凝固第IX因子を含む試薬には、血液凝固反応に影響を与える量のリン脂質および凝固第X因子が含まれていてはならない。これは、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれかを種々の終濃度に調製した複数の測定試料を作製する必要があるためである。
【００３８】
凝固第X因子については、上記の方法に関する説明において述べたことと同様である。ただし、凝固第X因子を含む試薬は、好ましくは凍結乾燥品または液体試薬である。凝固第X因子を含む試薬は、発明の実施を妨げない限り、その他の物質を含んでいてもよい。
凝固第X因子を含む試薬が固体である場合、試薬は、試薬容器に好ましくは10μg以上10 g以下、より好ましくは0.05 mg以上10 mg以下収容されている。この収容量は、測定試料が通常0.5 ml以上10 ml以下に調製されることに基づいている。一方、凝固第X因子を含む試薬が液体である場合、試薬は、好ましくは0.5 nM以上4μM以下、より好ましくは25 nM以上1250 nM以下の凝固第X因子を含む。
上記の方法において試薬キットを使用する場合、凝固第X因子を含む試薬は、凝固第X因子の終濃度が好ましくは0.1 nM以上8000 nM以下、より好ましくは5 nM以上250 nM以下となるように混合されることが意図される。
【００３９】
凝固第X因子を含む試薬には、血液凝固反応に影響を与える量のリン脂質および活性化凝固第IX因子が含まれていてはならない。これは、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれかを種々の終濃度に調製した複数の測定試料を作製する必要があるためである。
【００４０】
トロンビンについては、上記の方法に関する説明において述べたことと同様である。ただし、トロンビンを含む試薬は、好ましくは凍結乾燥品または液体試薬である。トロンビンは、以下で述べるカルシウムと同一の容器に収容されていてもよいし、別々の容器に収容されていてもよい。トロンビンを含む試薬は、発明の実施を妨げない限り、その他の物質を含んでいてもよい。
トロンビンを含む試薬が凍結乾燥品であるか、または固体である場合、試薬は、試薬容器に好ましくは10μg以上10 g以下、より好ましくは0.05 mg以上500 mg以下収容されている。この収容量は、測定試料が通常0.5 ml以上10 ml以下に調製されることに基づいている。一方、トロンビンを含む試薬が液体である場合、試薬は、好ましくは0.1 nM以上1 mM以下、より好ましくは0.05 nM以上100 nM以下の濃度のトロンビンを含む。
上記の方法において試薬キットを使用する場合、トロンビンを含む試薬は、トロンビンの終濃度が好ましくは0.01 nM以上0.1 mM以下、より好ましくは0.05 nM以上100 nM以下となるように混合されることが意図される。
【００４１】
トロンビンを含む試薬には、血液凝固反応に影響を与える量のリン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子が含まれていてはならない。これは、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれかを種々の終濃度に調製した複数の測定試料を作製する必要があるためである。
【００４２】
カルシウムについては、上記の方法に関する説明において述べたことと同様である。ただし、カルシウムを含む試薬は、好ましくは凍結乾燥品または液体試薬である。カルシウムは、上記で述べたトロンビンと同一の容器に収容されていてもよいし、別々の容器に収容されていてもよい。カルシウムを含む試薬は、発明の実施を妨げない限り、その他の物質を含んでいてもよい。
カルシウムを含む試薬が凍結乾燥品であるか、または固体である場合、試薬は、試薬容器に好ましくは1 mg以上10 g以下、より好ましくは0.1 g以上5 g以下収容されている。この収容量は、測定試料が通常0.5 ml以上10 ml以下に調製されることに基づいている。一方、カルシウムを含む試薬が液体である場合、試薬は、好ましくは0.05 mM以上100 mM以下、より好ましくは0.5 mM以上25 mM以下の濃度のカルシウムを含む。
上記の方法において試薬キットを使用する場合、カルシウムを含む試薬は、カルシウムの終濃度が好ましくは0.01 mM以上20 mM以下、より好ましくは0.1 mM以上5 mM以下となるように混合されることが意図される。
【００４３】
カルシウムを含む試薬には、血液凝固反応に影響を与える量のリン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子が含まれていてはならない。これは、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれかを種々の終濃度に調製した複数の測定試料を作製する必要があるためである。
【００４４】
活性化凝固第X因子に対する基質については、上記の方法に関する説明において述べたことと同様である。ただし、活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬は、好ましくは凍結乾燥品または液体試薬である。活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬は、発明の実施を妨げない限り、その他の物質を含んでいてもよい。
活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬が凍結乾燥品であるか、または固体である場合、試薬は、試薬容器に好ましくは10μg以上10 g以下、より好ましくは0.05 mg以上1 mg以下収容されている。この収容量は、測定試料が通常0.5 ml以上10 ml以下に調製されることに基づいている。一方、活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬が液体である場合、試薬は、好ましくは0.05 mg/ml以上50 mg/ml以下、より好ましくは0.1 mg/ml以上10 mg/ml以下の濃度の活性化凝固第X因子に対する基質を含む。
上記の方法において試薬キットを使用する場合、活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬は、活性化凝固第X因子に対する基質の終濃度が好ましくは0.01 mg/ml以上10 mg/ml以下、より好ましくは0.02 mg/ml以上2 mg/ml以下となるように混合されることが意図される。
【００４５】
活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬には、血液凝固反応に影響を与える量のリン脂質、活性化凝固第IX因子、凝固第X因子およびトロンビンが含まれていてはならない。リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子が含まれてはならないのは、リン脂質、活性化凝固第IX因子および凝固第X因子のいずれかを種々の終濃度に調製した複数の測定試料を作成する必要があるためである。トロンビンが含まれてはならないのは、基質とトロンビンが反応してしまうためである。
【００４６】
上記の試薬キットは、上記の方法を記載した添付文書１７と、第１試薬容器１１〜第５試薬容器１５と試薬添付文書１７を収容する箱１８と、をさらに含んでいてもよい。
【００４７】
試薬キットは、好ましくは、血液検体、第１試薬容器１１に収容されたリン脂質を含む試薬、第２試薬容器１２に収容された活性化凝固第IX因子を含む試薬、及び第３試薬容器１３に収容された凝固第X因子を含む試薬からなる群より選択される少なくとも一つを希釈する希釈液を収容した第６試薬容器１６を含む。このような希釈液としては、発明の実施を妨げない限り特に限定されない。例えば、水、適切な緩衝液、生理食塩水、それらの混合物等が挙げられる。適切な緩衝液としては、例えば、HEPES(-) (100mM NaCl, 0.01%(v/v)Tween20, 20mM HEPES, pH 7.2)が挙げられる。このような希釈液は、血液検体、リン脂質を含む試薬、活性化凝固第IX因子を含む試薬、及び凝固第X因子を含む試薬のいずれを希釈する場合においても用いることができる。
【００４８】
別の実施形態において、試薬キットは、例えば図２に示されるように、リン脂質を含む試薬を収容した第１試薬容器２１、活性化凝固第IX因子を含む試薬を収容した第２試薬容器２２と、凝固第X因子を含む試薬を収容した第３試薬容器２３と、トロンビンを含む試薬を収容した第４試薬容器２４と、カルシウムを含む試薬を収容した第５試薬容器２５と、活性化凝固第X因子に対する基質を含む試薬を収容した第６試薬容器２６とを含み得る。
【００４９】
上記の試薬キットは、上記の方法を記載した添付文書２８と、第１試薬容器２１〜第６試薬容器２６と試薬添付文書２８を収容する箱２９と、をさらに含んでいてもよい。
【００５０】
試薬キットは、好ましくは、血液検体、第１試薬容器２１に収容されたリン脂質を含む試薬、第２試薬容器２２に収容された活性化凝固第IX因子を含む試薬、及び第３試薬容器２３に収容された凝固第X因子を含む試薬からなる群より選択される少なくとも一つを希釈する希釈液を収容した第７試薬容器２７を含む。このような希釈液としては、発明の実施を妨げない限り特に限定されない。例えば、水、適切な緩衝液、生理食塩水、それらの混合物等が挙げられる。適切な緩衝液としては、例えば、HEPES(-) (100mM NaCl, 0.01%(v/v)Tween20, 20mM HEPES, pH 7.2)が挙げられる。このような希釈液は、血液検体、リン脂質を含む試薬、活性化凝固第IX因子を含む試薬、及び凝固第X因子を含む試薬のいずれを希釈する場合においても用いることができる。
【００５１】
本発明には、上記の方法での使用に適したコンピュータプログラム製品も含まれる。コンピュータプログラム製品は、インターネット等を介してダウンロード可能なプログラムや、当該プログラムを記録した媒体などが例示される。
【００５２】
本実施形態では、コンピュータプログラム製品は、上記の方法の第１情報を取得する工程、第２情報を取得する工程、及び複合体形成能に関する情報を取得する工程を、コンピュータに実行させる。コンピュータプログラム製品は、上記の方法の第１測定試料を調製する工程および第２測定試料を調製する工程を、上記試薬キットを収容した試薬設置部と試薬設置部に設置された試薬を分注する試薬分注部と、検体を分注する検体分注部とを備える検体分析装置に実行させてもよい。
【００５３】
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００５４】
実施例１
１．試薬
試薬として以下のものを用いた。
(1)検体希釈液  HEPES(-) (100mM NaCl, 0.01%(v/v)Tween20, 20mM HEPES, pH 7.2)
(2)ヒトトロンビン  ヒト血漿由来トロンビン  #T6884-1KU (SIGMA-ALDRICH)
(3)リン脂質溶液  以下の３種類のリン脂質をそれぞれ30μg/ml、60μg/mlおよび10μg/mlとなるように0.35 w/v% フェノール溶液に溶解した。
・1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)（Avanti Polar Lipids, Inc.）
・1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline (DOPC)（Avanti Polar Lipids, Inc.）
・1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS)（Avanti Polar Lipids, Inc.）
(4) FIXa  ヒト活性化凝固第IX因子  #HCIXA-0050 (Haematologic Technologies Inc.)
(5) FX  ヒト凝固第X因子  #HCX-0050 (Haematologic Technologies Inc.)
(6) 0.02M塩化カルシウム溶液  (シスメックス株式会社)
(7)合成基質  コアテスト(登録商標) SP FVIII(積水メディカル株式会社)に添付の基質剤  (S-2765 (Z-D-アルギニル-グリシル-アルギニル-p-ニトロアニリド・二塩酸塩)、I-2581 (ダンシル-Nα-(p-グアニジノ)-フェニルアラニル-ピペリジド・塩酸塩)
(8) EDTA溶液  #345-01865 0.5M EDTA・2Na (Dojindo)
【００５５】
２．血液検体
血液検体として、以下の３種類の血友病Ａ患者の血漿を用いた。
・A644V (FVIII活性10％)
・T677I（FVIII活性40％）
・R593H（FVIII活性10％）
・対照として、FVIII活性を同等レベルに調整した試料
【００５６】
３．活性化凝固第X因子(FXa)生成量の測定方法
９：１：２の容量比で凝固第X因子含有溶液(HEPES(-) (100mM NaCl, 0.01%(v/v)Tween20, 20mM HEPES(#346-01373 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinzyl] ethanesulfonic acid, Dojindo), pH 7.2)中480 nM)、活性化凝固第IX因子含有溶液(3-Morpholinopropanesulfonic acid緩衝液中0〜108 nM)ならびにリン脂質(フェノール溶液中0〜1280μM)およびトロンビン(トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液中1 nM)含有混液(FXの終濃度214 nM；FIXaの終濃度0〜5.3 nM；リン脂質の終濃度0〜108μM；トロンビンの終濃度0.014 nM)を混合した。得られた液体108μlと、HEPES(-)で10倍希釈した血漿54μlとをチューブ内で混合した。４〜５分間のインキュベート後、検体としての反応液をプレートに50μlずつ(２ウェル)、ブランクとして50μl (１ウェル)を分注した。次いで、検体には塩化カルシウム溶液(10μl)を、ブランクにはHEPES(-)バッファ(10μl)を添加した。次いで、正確に５分間加温し、EDTAを添加し、反応を停止させた。その後、S-2765基質を添加し、プレートリーダMultiskan JX (Thermo Labsystems)を用いて、波長405 nmにおける吸光度を測定した。具体的には、プレートリーダにマルチウェルプレートを設置後、20秒間1020 rpmで振盪し、波長405 nmにおける吸光度測定を10秒間35サイクル行った。Ascent Software Version 2.6 (Thermo Labsystems)を用いて、データを収集した。次いで、KaleidaGraph ver 4.1プログラム（Synergy software)を用いて、以下のミカエリス・メンテン式(式１)に測定結果を当てはめて、見かけのKm (Kmapp；apparent Km)値を算出した。
【数３】
0006552286.tif 000004
【００５７】
４．結果
上記のようにして算出したKmapp値を以下の表１に示す。
【表１】
0006552286.tif 000005
【００５８】
上記の表１の上段において、FIXaについての第１〜第８測定試料におけるFIXaの終濃度は、それぞれ0 nM、0.1 nM、0.2 nM、0.4 nM、0.8 nM、1.2 nM、2.5 nMおよび5.0 nMであった。上記の表１の中段において、PLについての第１〜第８測定試料におけるPLの終濃度は、それぞれ0μM、1.0μM、4.0μM、8.0μM、12μM、24μM、48μMおよび100μMであった。上記の表１の下段において、FXについての第１〜第８測定試料におけるFXの終濃度は、それぞれ0 nM、10 nM、25 nM、50 nM、75 nM、100 nM、150 nMおよび200 nMであった。
【００５９】
上記の表１に示すように、A644VのPLについて算出されたKmapp値は、A644Vと同等の凝固活性を有する対照試料のPLについて算出されたKmapp値の112%であり、A644VのFXについて算出されたKmapp値は、A644Vと同等の凝固活性を有する対照試料のFXについて算出されたKmapp値の90%であった。一方で、A644VのFIXaについて算出されたKmapp値は、A644Vと同等の凝固因子活性を有する対照試料のFIXaについて算出されたKmapp値の337%であった。A644VのPLとFXについて算出された各Kmapp値は、A644Vと同等の凝固活性を有する対照試料のPLとFXについて算出された各Kmapp値と比較してほぼ同等にも関わらず、A644VのFIXaについて算出されたKmapp値は、A644Vと同等の凝固活性を有する対照試料のFIXaについて算出されたKmapp値より明らかに高値を示しているため、FVIIIとFIXaとの親和性が低いと考えられる。
また、血友病A患者検体の出血原因は分子生物学的観点から考えると、FVIIIの遺伝子異常であり、FVIIIの遺伝子異常により、FVIIIと結合するFIXa、PL、および、FXからなる群から選択される一の成分との親和性が低く複合体を形成できないため、十分な凝固反応が起こらず出血するものと考えられる。
以上のことから、A644Vの血友病A患者における出血原因 は、FVIIIとFIXaとの親和性が低いことが原因であることが考えられる。
【００６０】
実施例２
被検血漿としてT677Iを用いたこと、測定試料ごとに終濃度が異なる成分としてFIXaのみを用いたこと、測定試料中におけるFIXaの終濃度を以下に記載の濃度としたこと以外は実施例１と同様にして、Kmapp値を算出した。結果を以下の表２に示す。
【表２】
0006552286.tif 000006
【００６１】
上記の表２において、第１〜第８測定試料におけるFIXaの終濃度は、それぞれ0 nM、0.1 nM、0.2 nM、0.4 nM、0.6 nM、1.2 nM、2.5 nMおよび5.0 nMであった。
もし、FVIIIとFIXaとの親和性に異常が無ければ、T677IのFIXaについて算出されたKmapp値と対照試料のFIXaについて算出されたKmapp値はほぼ同等となり、「（T677IのFIXaについて算出されたKmapp値）／（対照試料のFIXaについて算出されたKmapp値）」は100%付近の値を示すと考えられる。しかしながら、上記の表２に示すように、T677IのFIXaについて算出されたKmapp値は、T677Iと同等の凝固因子活性を有する対照試料のFIXaについて算出されたKmapp値の527%であり、大きく100%を超えていた。そのため、T677Iについては、FVIIIとFIXaとの親和性が低いと考えられる。
【００６２】
実施例３
被検血漿としてR593Hを用いたこと、測定試料ごとに終濃度が異なる成分としてPLのみを用いたこと、測定試料中におけるPLの終濃度を以下に記載の濃度としたこと以外は実施例１と同様にして、Kmapp値を算出した。結果を以下の表３に示す。
【表３】
0006552286.tif 000007
【００６３】
もし、FVIIIとPLとの親和性に異常が無ければ、R593HのPLに上記の表３において、第１〜第６測定試料におけるPLの終濃度は、それぞれ0μM、2.0μM、4.0μM、12μM、60μMおよび120μMであった。ついて算出されたKmapp値と対照試料のPLについて算出されたKmapp値はほぼ同等となり、「（R593HのFIXaについて算出されたKmapp値）／（対照試料のFIXaについて算出されたKmapp値）」は100%付近の値を示すと考えられる。しかしながら、上記の表３に示すように、R593HのPLについて算出されたKmapp値は、R593Hと同等の凝固因子活性を有する対照試料のPLについて算出されたKmapp値の327%であり、大きく100%を超えていた。そのため、R593Hについては、FVIIIとPLとの親和性が低いと考えられる。
【００６４】
実施例４
被検血漿としてR1781Hを用いたこと、測定試料ごとに終濃度が異なる成分としてFXのみを用いたこと、測定試料中におけるFXの終濃度を以下に記載の濃度としたこと以外は実施例１と同様にして、Kmapp値を算出した。結果を以下の表４に示す。
【表４】
0006552286.tif 000008
【００６５】
上記の表４において、第１〜第７測定試料におけるFXの終濃度は、0μM、10μM、50μM、75μM、100μM、150μMおよび200μMであった。
上記の表４に示すように、FXについて算出されたKmapp値は、同等の凝固因子活性の対照と比較して33%であり、FVIIIとFXとの親和性が高いと考えられた。これはR1781Hの遺伝子診断から得られた結果と一致していた。よって、本発明の方法に従って、FVIIIとFXとの親和性を推定できると考えられる。
【符号の説明】
【００６６】
１１：第１試薬容器
１２：第２試薬容器
１３：第３試薬容器
１４：第４試薬容器
１５：第５試薬容器
１６：第６試薬容器
１７：添付文書
１８：箱
２１：第１試薬容器
２２：第２試薬容器
２３：第３試薬容器
２４：第４試薬容器
２５：第５試薬容器
２６：第６試薬容器
２７：第７試薬容器
２８：添付文書
２９：箱
【図１】
0006552286.tif 000011
【図２】
0006552286.tif 000012