(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）排出活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群から選択された塩基配列からなる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを発現する、Ｏ‐ホスホセリンを生産するエシェリキア属（Escherichia sp.）微生物。
【請求項５】
前記微生物が、さらに内在的ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、SerB）の活性が弱化されるように変異された、請求項４に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項６】
前記微生物が、さらにホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、SerA）又はホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、SerC）の活性が内在的活性に比べて強化された、請求項４に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項７】
前記エシェリキア属微生物が、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）である、請求項４に記載のエシェリキア属微生物。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）を生産する方法。
【請求項９】
ａ）請求項４〜７のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養してＯ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）を生産する段階；及び
ｂ）Ｏ‐ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）又はそれを発現する微生物の存在下で、前記ａ）段階で生産されたＯ‐ホスホセリンを硫化物と反応させる段階を含む、システイン又はその誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記硫化物が、Ｎａ２Ｓ、ＮａＳＨ、（ＮＨ４）２Ｓ、Ｈ２Ｓ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３からなる群から選択される一つ以上である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＬ‐システイン前駆体であるＯ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出活性を示す、新規変異体ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するＯＰＳ生産微生物、前記微生物を用いてＯＰＳを生産する方法、及び前記方法で生産するＯＰＳをＯ‐ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）又はそれを発現する微生物の存在下で、硫化物と反応させる段階を含む、システイン又はその誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ‐システインは、すべて生物体の硫黄代謝において重要なアミノ酸であり、毛髪のケラチンなど生体内タンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン及びその他の硫黄を含有した代謝産物の合成に用いられるだけでなく、コエンザイムＡ生合成の前駆物質として用いられる。
【０００３】
微生物を用いてＬ‐システインを生産する方法で、１）まず、微生物を用いてＤ、Ｌ‐ＡＴＣ（D,L-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid）を生物学的に転換する方法が知られている。２）他の方法は、大腸菌を用いた直接発酵法であり、Ｌ‐システインを生産する方法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。また、微生物を用いてＯＰＳ（O-phosphoserine）を発酵生産した後、ＯＰＳＳ（O-phosphoserine sulfhydrylase）の触媒作用下で硫化物と反応してＬ‐システインに転換する方法が知られている（特許文献２）。その時、前記３）の方法で高収率のシステイン生産のために前駆体であるＯＰＳを過量生産すべき必要が存在した。
そこで、本発明者らはＯＰＳ生産菌株で生産されたＯ‐ホスホセリンを細胞外に円滑に排出させ得る適切な排出因子を究明しようと鋭意努力した。具体的に、ＯＰＳ排出活性を示すタンパク質でＲｈｔＢタンパク質変異体を発掘して（特許文献３）、新規Ｏ‐ホスホセリン排出タンパク質（特許文献４）を発掘して、ＯＰＳ生産菌株で前記タンパク質を強化させた場合、ＯＰＳ濃度が上がることを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州登録特許ＥＰ０８８５９６２Ｂ
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０-１３８１０４８号
【特許文献３】大韓民国公開特許第１０-２０１４-０１３３７５１号
【特許文献４】大韓民国公開特許第１０-２０１４-０１３３７５４号
【特許文献５】欧州登録特許ＥＰ０９４３６８７Ｂ
【特許文献６】大韓民国登録特許第１０-０６２００９２号
【特許文献７】米国公開特許第２０１２-０１９００８１号
【特許文献８】大韓民国公開特許第１０-２０１２-００４１１１５号
【特許文献９】大韓民国登録特許第１０-１２０８２６７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wada M and Takagi H, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006
【非特許文献２】Ehrhardt, A. et al. (2003) HumGene Ther 10: 215-25
【非特許文献３】Yet, N. S. (2002) MoI Ther 5: 731-38
【非特許文献４】Chen, Z. Y. et al. (2004) Gene Ther 11 : 856-64
【非特許文献５】Annu Rev Genet. 2003;37:3-29
【非特許文献６】Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999
【非特許文献７】Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000
【非特許文献８】Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276: 17844-17850, 2001
【非特許文献９】Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 437-441, 2002
【非特許文献１０】sauer UP et al., J Biol Chem. 20;279(8):6613-9. Epub 2003
【非特許文献１１】Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551: 133-138, 2003;
【非特許文献１２】Burns KE et al., J. Am. Chem. Soc., 127: 11602-11603, 2005
【非特許文献１３】Appl Microbiol Biotechnol.1999 Oct; 52（4）：541-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような背景下で、本発明者らはＯＰＳの排出活性が増進されＯＰＳ生産をより向上させ得るＯ‐ホスホセリン排出タンパク質を発掘してその変異体を開発するために努力した結果、ＯＰＳをＯＰＳ生産菌株から効果的に排出させ得るＯ‐ホスホセリン排出タンパク質変異体を開発して、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）排出活性を示すポリペプチド変異体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記ポリペプチドを発現する、Ｏ‐ホスホセリンを生産するエシェリキア属（Escherichia sp.）微生物を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、前記微生物を培養する段階を含む、Ｏ‐ホスホセリンを生産する方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記生産されたＯ‐ホスホセリンをＯ‐ホスホセリンスルフヒドリラーゼ又はそれを発現する微生物の存在下で、硫化物と反応させる段階を含む、システイン又はその誘導体の製造方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載されるポリペプチド変異体を優れたＯＰＳ排出活性を有するため、それをＯ‐ホスホセリン生産微生物に適用する場合、Ｏ‐ホスホセリンを高効率で生産でき、それを通じてシステインを効果的に生産できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
前記の目的を達成するための本発明を以下で詳細に説明する。
本発明の一様態は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載された、Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）排出活性を示すポリペプチドに関する。
【００１１】
本発明の他の様態は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載されたポリペプチドの、Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）排出のための用途に関する。
【００１２】
本発明で、用語、「Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）」は、セリンのリン酸（phosphoric acid）エステルであって、様々なタンパク質の構成要素である。前記ＯＰＳは、Ｌ‐システインの前駆体であって、ＯＰＳ（OPS sulfhydrylase、OPSS）の触媒作用下で硫化物と反応してシステインに転換されうる。
【００１３】
本発明で用語、「Ｏ‐ホスホセリン排出活性を示すポリペプチド」は、ＯＰＳを細胞外に排出できる活性を有する膜タンパク質を意味し、具体的には大腸菌由来の膜タンパク質であってもよい。本発明のＯ‐ホスホセリン排出活性を示すポリペプチドはＹｈｈＳ ＭＦＳ（major facilitator superfamily）トランスポーター又はその変異体であってもよい。具体的に、前記ポリペプチドは、過量のＯＰＳが存在する条件下で生育阻害が解除された大腸菌からＯＰＳ排出活性を示すタンパク質で究明された野生型ＹｈｈＳ ＭＦＳ（major facilitator superfamily）トランスポーターより増進されたＯＰＳ排出活性を示すＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターの変異体であってもよい。
【００１４】
具体的に前記ポリペプチドは配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載されたものであってもよく、前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上の相同性を示すアミノ酸配列として実質的に前記ポリペプチドと同一であるか、又は相応するＯＰＳ排出活性を示す膜タンパク質であれば、制限なく含んでもよい。また、このような相同性を有する配列として実質的にＯＰＳ排出活性を示すアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換又は付加されたポリペプチド変異体も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００１５】
本発明で用語、「相同性」は、共通進化起源を共有するかしないことができる与えられたポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の同一性又は相応性程度を意味し、パーセントとして示されうる。本明細書で、与えられたポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列と同一であるが、又は類似な活性を有するその相同性配列が「％相同性」として示される。 例えば、スコア（score）、同一性（identity）と類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ２．０を用いたり、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することで確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当業者によく知られている方法で決定されうる（例、Sambrook et al., 1989, infraを参照）。一つの具体例では、二つのアミノ酸配列がアミノ酸配列の所定の長さに対してポリペプチドのマッチが少なくとも２１％（具体的には、少なくとも約５０％、特に約７５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９９％）であるとき、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。
【００１６】
もう一つの様態として、前記Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、すなわち、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的には、本発明は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載される、Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出活性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
前記Ｏ‐ホスホセリン及びＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーター等については、前記で説明した通りである。
【００１８】
本発明で用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマーであり、一般的に一定の長さ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味する。
【００１９】
前記Ｏ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出活性能を示すポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、前記配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）により、又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域に多様な変形が行われてもよい。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を有してもよい。また、前記配列と７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上、最も具体的には、９８％以上の相同性を示すヌクレオチド配列として、実質的にＯＰＳ排出活性を有するポリペプチドをコードすることができるポリヌクレオチドを含んでもよい。また、一部の配列が欠失、変形、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有する変異体も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。
【００２０】
もう一つの様態として、本発明は、前記Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、すなわち、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターポリペプチド変異体を発現する、Ｏ‐ホスホセリンを生産する微生物、具体的にエシェリキア属（Escherichia sp.）微生物を提供する。
【００２１】
別の様態として、本発明は、前記Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、すなわち、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターポリペプチド変異体を発現する微生物、具体的には、エシェリキア属（Escherichia sp.）微生物のＯ‐ホスホセリン生産用途を提供する。
【００２２】
本発明でＯＰＳ及びＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターなどは、前記説明した通りである。
【００２３】
本発明で用語、「Ｏ‐ホスホセリン（OPS）を生産する微生物」は、ＯＰＳを生物体内で生産しうる原核又は真核微生物菌株であって、具体的には、遺伝的操作、又は自然突然変異によってＯＰＳを培地又は微生物体内に蓄積することができる微生物を意味する。
【００２４】
具体的には、前記微生物は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたポリペプチドを発現することができる微生物であれば、特にその種類が限定されず、原核細胞又は真核細胞の両方が可能であるが、具体的には原核細胞であってもよい。例としてエシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物であってもよく、例えばエシェリキアコリ・コリ（Eschrichia coli）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本発明で用語、「発現」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作動可能に含む組換えベクターで形質転換されるか、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に挿入されて達成されうるが、これで特に制限されない。
【００２６】
本発明で用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらのすべてを含む。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、どのような形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態として宿主細胞に導入することができ、これに限定されるものではない。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００２７】
また、本発明で用語、「作動可能に連結」されたというのは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００２８】
本発明で用語、「ベクター」は、宿主細胞への塩基のクローニング及び/又は転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合した断片の複製をもたらすことができる複製単位（replicon）であってもよい。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミッド、染色体、ウイルス）をいう。「ベクター」は、試験管内、生体外又は生体内で宿主細胞に塩基を導入するためのウイルス及び非ウイルス媒介物を含み、また、小さい環状ＤＮＡを含んでもよい。例えば、前記のベクターは、バクテリアＤＮＡ配列を有してないプラスミドであってもよい。ＣｐＧ領域で豊富なバクテリアＤＮＡ配列の削除は転移遺伝子の発現サイレンシングを減少させ、プラスミドＤＮＡベクターからより持続的な発現をもたらすために行われている（例えば、非特許文献２〜４）。また、前記ベクターはトランスポゾン（非特許文献５）、又は人工染色体を含んでもよい。具体的には、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ１９２０、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＭＷ１１８ベクターやこれらからプロモーターなどを変異させた変異ベクターなどを用いてもよいが、これに限定されるものではない。
【００２９】
特に、本発明でベクターは、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させうるように適合した発現調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物であってもよい。前記発現調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【００３０】
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミッド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター、又はコスミッドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよいが、これに限定されない。プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよいが、これに限定されない。
【００３１】
また、前記ＯＰＳを生産する微生物は、さらに、内在的ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、SerB）の活性が内在的活性に比べて弱化されたものであってもよい。
【００３２】
前記ＳｅｒＢはＯＰＳをＬ‐セリン（L-serine）に転換する活性を有したため、前記ＳｅｒＢ活性が弱化されるように変異された微生物は、ＯＰＳを蓄積する特徴を有し、ＯＰＳの生産に有用に用いられる。前記ＳｅｒＢは、配列番号１６で記載されるアミノ酸配列のタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。また、ＳｅｒＢの活性を示す限り、前記アミノ酸配列と８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％％以上同一なアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されない。
【００３３】
また、前記ＳｅｒＢを暗号化するポリヌクレオチド配列は、前記配列番号１６に記載されたアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域で多様な変形を行うことができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１７のポリヌクレオチド配列を有してもよく、これと相同性が８０％、具体的には、９０％以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これに限定されない。
【００３４】
本発明で用語、「活性弱化」は、本来微生物が天然の状態又は変異前の状態で有しているタンパク質の活性と比較したとき、その活性が減少したことを意味し、活性が削除された場合も含む。
【００３５】
前記の弱化は、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異などでタンパク質自体の活性が本来の微生物が有しているタンパク質の活性に比べて減少又は削除された場合と、これをコードする遺伝子の発現阻害又は翻訳（translation）阻害などで細胞内で、全体的なタンパク質活性の程度が天然型菌株に比べて低い場合、前記遺伝子の発現が全く行われていない場合、及び発現されても活性がない場合も含む概念である。
【００３６】
これらのタンパク質活性の弱化は、当該分野でよく知られている様々な方法で達成されうる。前記の方法の例として、前記タンパク質の活性が除去された場合を含めて、前記酵素の活性が減少するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記タンパク質を暗号化する遺伝子を代替する方法；前記タンパク質を暗号化する遺伝子の発現調節配列を変形する方法；前記タンパク質を暗号化する染色体上の遺伝子の全体又は一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記タンパク質を暗号化する遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させ、リボソーム（ribosome）の付着が不可能になる方法及び該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせでも達成できるが、前記例により特に制限されるものではではない。
【００３７】
具体的に、タンパク質を暗号化する遺伝子の一部又は全体を欠失する方法は、細菌内染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内の内在目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置き換えることで行うことができる。その一例として相同組換えによって遺伝子を欠失させる方法を用いてもよい。また、前記で「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、さらに具体的には、１〜５０であってもよいが、特にこれに限定されるものではない。
【００３８】
さらに、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するポリヌクレオチド配列に交替することにより、行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列を含んでもよい。
【００３９】
さらに、染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をさらに弱化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的又は保存的置換、又はこれらの組合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良された遺伝子配列又は活性がないように改良された遺伝子配列に交替することにより、行うことができる。
【００４０】
特に、本発明でＳｅｒＢの活性を弱化させることは、前記ＳｅｒＢの活性を除去する方法、前記ＳｅｒＢの活性が減少されるように突然変異された遺伝子に染色体上の前記ＳｅｒＢを暗号化する遺伝子を代替する方法、前記ＳｅｒＢを暗号化する染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記ＳｅｒＢを暗号化する遺伝子の発現調節配列を活性が弱い配列に交替する方法、前記ＳｅｒＢを暗号化する染色体上の遺伝子を欠損させる方法及び前記ＳｅｒＢを暗号化する染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して、前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入する方法、前記ＳｅｒＢを暗号化する遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させてリボソーム（ribosome）の付着が不可能にする方法及び該配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法からなる群から選択されるいずれか一つ以上の方法で行うことができる。
【００４１】
また、前記ＯＰＳを生産する微生物は、さらにホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（phosphoglycerate dehydrogenase、SerA）又はホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine aminotransferase、SerC）の活性が内在的活性に比べて強化されたものであってもよい。
【００４２】
前記ＳｅｒＡは、３‐ホスホグリセリン酸（3-phosphoglycerate）を３‐ホスホ‐ヒドロキシピルビン酸（3-phospho-hydroxypyruvate）に変換する活性を有するタンパク質であり、前記ＳｅｒＡは野生型又はセリンに対するフィードバックが解除された変異体が用いられてもよい。また、前記ＳｅｒＣは３‐ホスホヒドロキシピルビン酸をＯＰＳに転換する活性を有するタンパク質である。したがって、前記ＳｅｒＡ及び／又はＳｅｒＣの活性が強化された微生物はＯＰＳ生産菌株として有用に用いられてもよい。
【００４３】
前記ＳｅｒＡはこれに限定されないが、配列番号１８のアミノ酸配列又は配列番号１９のアミノ酸配列を有してもよい。前記配列番号１８は、野生型ＳｅｒＡの配列であり、配列番号１９は、セリンに対するフィードバックが解除された変異体の配列である。また、ＳｅｒＡの野生型又はセリンに対するフィードバックが解除された変異体の活性を示す限り、前記アミノ酸配列と８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上同一なアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されない。前記フィードバックが解除された変異体は、前記ＳｅｒＡを暗号化する遺伝子に挿入、置換などの方法で変異を導入して、セリンもしくはグリシンによるフィードバック阻害からその活性を維持するか、強化された場合を意味し、前記フィードバックが解除された変異体は、すでによく知られている（非特許文献６〜９、特許文献５）。
【００４４】
また、前記ＳｅｒＡの野生型又はセリンに対するフィードバックが解除された変異体を暗号化するポリヌクレオチド配列は、前記配列番号１８又は１９に記載されたいずれか一つのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチド配列を有してもよいが、これに限定されない。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域で多様な変形を行うことができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２０又は配列番号２５に記載されたいずれかのポリヌクレオチド配列を有してもよく、これと相同性が８０％、具体的には、９０％以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これに限定されることではない。
【００４５】
前記ＳｅｒＣは、例えば配列番号２１で記載されるアミノ酸配列のタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。また、ＳｅｒＣの活性を示す限り、前記アミノ酸配列と８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の同一なアミノ酸配列を含んでもよいが、これに限定されない。
【００４６】
また、前記ＳｅｒＣを暗号化するポリヌクレオチド配列は、前記配列番号２１に記載されたアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性又は前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域で多様な変形を行うことができる。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を有してもよく、これと相同性が８０％、具体的には、９０％以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これに限定されない。
【００４７】
本発明で用語、「内在的活性」は、本来微生物が天然の状態又は変異前の状態で示すポリペプチドの活性状態を意味する。「内在的活性に比べて強化」は、本来微生物が天然の状態又は変異前の状態で示すポリペプチドの活性と比較したとき、その活性が増加したことを意味し、特定のポリペプチドの活性を持たない微生物に、そのポリペプチドの活性を付与することも含む概念である。
【００４８】
前記「活性の強化」は、特にこれに限定されないが、ポリペプチド自体の活性が増大されて、本来の機能以上の効果を導出することを含むだけでなく、内在的遺伝子活性の増加、内部又は外部の要因から内在的遺伝子の増幅、外部からの遺伝子導入、プロモーターの交換又は変形及び突然変異による酵素活性の増加などにより、その活性が増加されることを含む。具体的に、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加、前記ポリペプチドを暗号化する遺伝子発現調節配列を変形する方法、前記ポリペプチドの活性が増加するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記ポリペプチドを暗号化する遺伝子を代替する方法及び前記ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドを暗号化する染色体上の遺伝子に変異を導入させる方法などによって行うことができ、前記記載の方法に制限されるものではない。これらの活性を強化する方法は、本明細書内の他のポリペプチドの活性強化時にも同様に参考になりうる。
【００４９】
具体的に、本発明の活性強化は、前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣをコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加、前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣを暗号化する染色体上の遺伝子発現調節配列に変異を導入する方法、前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣを暗号化する染色体上の遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列に交換する方法を、前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣ活性が増加するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣを暗号化する遺伝子を代替する方法及び前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣの活性が強化されるように、前記ＳｅｒＡ又はＳｅｒＣを暗号化する染色体上の遺伝子に変異を導入させる方法からなる群から選択されるいずれか一つ以上の方法で行うことができる。
【００５０】
前記で遺伝子のコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに動作可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行なわれてもよい。具体的に、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されたものであってもよい。又は、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させることができるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されたものであってもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行うことができる。
【００５１】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することは、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交換することによって行うことができる。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などを含んでもよい。
【００５２】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力なプロモーターが連結されてもよいが、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例には、ｃｊ１プロモーター（特許文献６）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター及びｔｅｔプロモーターがあるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
さらに、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的又は保存的置換、又はこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行うことができる。
【００５４】
このようなタンパク質活性の導入及び増進は、相応するタンパク質の活性又は濃度が野生型タンパク質や初期の微生物菌株での活性又は濃度を基準にして一般的に、少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大１，０００％又は２，０００％まで増加されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００５５】
また、前記微生物は、さらにＯＰＳの細胞内への流入又は分解能力を減少させた微生物であってもよい。具体的に、ＰｈｎＣ/ＰｈｎＤ/ＰｈｎＥアルキルホスホネートＡＢＣトランスポーター（PhnCDEオペロン）特異的ホスホネート伝達のＡＴＰ‐結合要素（ATP-binding component of phosphonate transport、PhnC; EG 10713）‐Ｐｎトランスポーターの周辺細胞質結合タンパク質要素（periplasmic binding protein component of Pn transporter, PhnD; EG 10714）‐アルキルホスホネートＡＢＣ輸送体の内在膜要素（integral membrane component of the alkylphosphonate ABC transpoＲＴＥr、PhnE; EG 11283）である）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase; PhoA）又は酸性ホスファーターゼ（acid phosphatase; AphA）の活性が内在的活性に比べて弱化されてもよい。
【００５６】
また、本発明の微生物は、さらにピリミジンヌクレオチドトランスハイドロゲナーゼ（nucleotide transhydrogenase、PntAB; EC 1.6.1.1）の活性が強化されてもよい。前記ＰｎｔＡＢは、既存の文献（非特許文献１０）に記載されているように、ＮＡＤＰＨ代謝作用に関与して細胞内レドックスバランス（redox balance）を調節することになる。
【００５７】
前記のようなＯＰＳを生産する微生物に対する内容は、前記で記述された内容の他に、特許文献２又は特許文献７などに開示された内容が、本発明の参考資料として用いられてもよい。
【００５８】
もう一つの様態として、本発明は、前記Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、すなわち、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターポリペプチド変異体を発現するＯ‐ホスホセリンを生産する微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ‐ホスホセリンを生産する方法を提供する。
【００５９】
本発明でＯ‐ホスホセリン、Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーター及びＯ‐ホスホセリンを生産する微生物は、前記説明したとおりである。
【００６０】
具体的に、前記方法は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載されるポリペプチドを発現する、Ｏ‐ホスホセリンを生産する微生物を培地で培養する段階；前記段階のＯ‐ホスホセリンを生産する微生物又は培地からＯ‐ホスホセリンを分離する段階を含んでもよいが、これに限定されない。
【００６１】
本発明で用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。これらの培養過程は選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して用いてもよい。具体的に、前記培養は回分式、連続式、及び流加式であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００６２】
前記ＳｅｒＢ活性が内在的活性に比べて弱化された遺伝子組換え微生物の培養は、前記微生物のセリン要求性が誘導され、培地にグリシン又はセリンがさらに含まれてもよい。グリシンは、精製されたグリシン、グリシンを含むイースト抽出物、トリプトンの形態で提供されてもよく、培養液に含まれる濃度は、通常、０．１〜１０ｇ/Ｌ、具体的には、０．５〜３ｇ/Ｌであってもよい。また、セリンは、精製されたセリン、セリンを含有するイースト抽出物、トリプトンなどの形態で提供されることができ、培養液に含まれている濃度は、通常、０．１〜５ｇ/Ｌ、具体的には、０．１〜１ｇ/Ｌであってもよい。
【００６３】
前記培地に含まれる炭素源はグルコース、スクロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれてもよく、これらの物質は、個別に、又は混合物として用いられてもよい。しかし、これらに限定されものではない。前記培地に含まれる窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、及び大豆、小麦のような有機窒素源、及び要素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれてもよく、これらの窒素源は、単独又は組み合わせて用いられてもよい。しかし、これらに限定されるものではない。前記培地に含まれるリン源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応されるナトリウム‐含有塩が含まれてもよいが、これに限定されるものではない。また、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。その他にアミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加されてもよいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加して、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入せずに、あるいは窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養物の温度は、通常、２７℃〜３７℃、具体的には、３０℃〜３５℃であってもよい。培養期間は、所望の有用物質の生産量が収得されるまで継続されてもよく、具体的には１０〜１００時間であってもよい。しかし、これらの例示に限定されるものではない。
【００６５】
本発明は、前記培養段階で生産されたＯＰＳをさらに分離及び精製してもよく、その方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式又は流加式培養方法などによって当該分野に公知された適切な方法を用いて培養液から目的とするＯＰＳを収集してもよい。
【００６６】
もう一つの様態として、本発明は、前記Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、すなわち、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターポリペプチド変異体を発現する、Ｏ‐ホスホセリンを生産する微生物を培地で培養してＯ‐ホスホセリンを生産する段階；及びＯ‐ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-Phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）又はこれを発現する微生物の存在下で、前記段階で生産されたＯ‐ホスホセリンを硫化物と反応させる段階を含む、システイン又はその誘導体の製造方法を提供する。
【００６７】
また、本発明は、前記Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、すなわち、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーターポリペプチド変異体を発現する、Ｏ‐ホスホセリンを生産する微生物を培地で培養する段階；前記段階のＯ‐ホスホセリンを生産する微生物又は培地からＯ‐ホスホセリンを分離する段階；及びＯ‐ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-Phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）又はこれを発現する微生物の存在下で、前記段階で分離されたＯ‐ホスホセリンを硫化物と反応させる段階を含む、システイン又はその誘導体の製造方法を提供する。
【００６８】
本発明でＯ‐ホスホセリン、Ｏ‐ホスホセリンの排出活性を示すポリペプチド、ＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーター及びＯ‐ホスホセリンを生産する微生物は、前記説明したとおりである。
【００６９】
本発明で用語、「Ｏ‐ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（O-phosphoserine sulfhydrylase、OPSS）」は、ＯＰＳにチオールグループ（thiol、group、SH基）を提供して前記ＯＰＳをシステインに変換する反応を触媒する酵素を意味する。前記酵素は、アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）、トリコモナス・バギナリス （Trichomonas vaginalis）（非特許文献１１〜１２）で初めて明らかになった。また、前記ＯＰＳＳは、野生型ＯＰＳＳタンパク質だけでなく、前記ＯＰＳＳをコードするポリヌクレオチド配列の一部の配列が欠失、置換又は付加された配列であって、野生型ＯＰＳＳタンパク質の生物学的活性と同等又はそれ以上の活性を示す変異体タンパク質も含み、特許文献８及び特許文献９に開示されたＯＰＳＳタンパク質及びその変異体タンパク質もすべて含む。
【００７０】
前記硫化物は、当該技術分野で通常的に用いる固形だけではなく、ｐＨ、圧力、溶解度の違いにより、液体又は気体の形態で提供されて硫化物（sulfide、S2-）、チオール硫酸（thiosulfate、S2O32-）などの形態でチオールグループ（thiol group、SH基）に変換されうるすべての硫化物であれば利用可能である。具体的には、チオールグループをＯＰＳに提供するＮａ２Ｓ、ＮａＳＨ、Ｈ２Ｓ、（ＮＨ４）２Ｓ、ＮａＳＨ及びＮａ２Ｓ２Ｏ３を用いてもよいが、これに限定されない。前記反応は、一つのＯＰＳ反応基に１つのチオール基を提供して、一つのシステインもしくはシステイン誘導体を製造する反応であって、前記反応時の硫化物の添加量は、ＯＰＳモル濃度の０．１〜３倍であってもよく、具体的に、１〜２倍であってもよいが、これに限定されるものではない。経済的に最適な変換反応は、ＯＰＳとチオールグループを提供する硫化物が１：１（一対一）モル比で提供された場合であってもよい。
【００７１】
また、本発明では、さらに前記反応段階を介して生産されたシステインを分離及び精製する段階を含んでもよい。このとき、当該分野で公知の適合した反応を用いて反応液から目的とするシステインを分離及び精製して収集してもよい。
また、本発明の方法で製造されたシステインは、当業界に公知された化学的合成反応を介してシステイン誘導体を容易に合成してもよい。
【００７２】
本発明で用語、「誘導体」は、任意の化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似化合物であって、通常、化合物の水素原子又は特定の原子団が、他の原子又は原子団によって置換された化合物を意味する。
【００７３】
本発明で用語、「システイン誘導体」は、システインの水素原子又は特定の原子団が、他の原子又は原子団によって置換された化合物を意味する。その例として、システインのアミン基（-ＮＨ２）の窒素原子又はチオール基（-ＳＨ）の硫黄原子に他の原子又は原子団が付着された形態であってもよく、その例としてＮＡＣ（N-acetylcysteine）、ＳＣＭＣ（S-Carboxymetylcysteine）、ＢＯＣ‐ＣＹＳ（ＭＥ）‐ＯＨ、（Ｒ）‐Ｓ‐（２-アミノ-２-カルボキシエチル）‐Ｌ‐ホモシステイン、（Ｒ）‐２-アミノ‐３‐スルホプロピオン酸 、Ｄ‐２‐アミノ‐４‐（エチルチオ） 酪酸、３‐スルフィノ‐Ｌ‐アラニン、Ｆｍｏｃ‐Ｃｙｓ（Ｂｏｃ‐メチル）‐ＯＨ、セレノ‐Ｌ‐システイン、Ｓ‐（２‐チアゾリル）‐Ｌ‐システイン、Ｓ‐（２‐チエニル）‐Ｌ‐システイン、Ｓ‐（４‐トリル）‐Ｌ‐システインなどがあるが、これらに限定されない。システインは、アセチル化剤（acetylation agent）と反応してＮＡＣ（N-acetylcysteine）に容易に合成されることができ、塩基性条件下では、ハロ酢酸（haloacetic acid）と反応させることによってＳＣＭＣ（S-Carboxymetylcysteine）に合成されうる。前記システイン誘導体は、主に医薬品原料として鎮咳剤、咳緩和剤、気管支炎、気管支喘息や咽喉炎などの治療剤として用いられる。
【００７４】
もう一つの様態として、本発明は、配列番号１、配列番号３及び配列番号５からなる群から選択されたアミノ酸配列で記載されるポリペプチドのＯ‐ホスホセリンを微生物から排出する用途を提供する。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００７６】
実施例１：ＹｈｈＳ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ）トランスポーター変異体の製造
Ｏ‐ホスホセリン生産菌株でＯ‐ホスホセリン（O-phosphoserine、OPS）の排出活性の増加のためにＯＰＳ排出タンパク質（exporter）の活性を増加させようと、新規同定したＯＰＳ排出タンパク質であるＹｈｈＳ ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ）トランスポーター（配列番号２３）と、これをコードする遺伝子ｙｈｈＳ（配列番号２４）に対して変異体を作製した。具体的な過程は、下記のとおりであった。
【００７７】
まず、ｙｈｈＳ遺伝子変異体ライブラリーを作製しようとした。このため、大腸菌（Escherichia coli K12_W3110、ATCC27325）ゲノミックＤＮＡを鋳型とし、遺伝子特異的プライマー（gene-specific primer）ペア（配列番号７及び８）を用いて、任意突然変異誘発ＰＣＲ（JENA error prone PCR）を行った。このような過程で製作した突然変異遺伝子断片を、ｒｈｔＢプロモーター（配列番号１３）が、遺伝子特異的プライマーペア（配列番号１４及び１５）でＰＣＲされＳａｃＩとＥｃｏＲＶを用いてｐＣＬ１９２０ベクター（GenBank No AB236930）に挿入し、ｐＣＬＰｒｈｔＢベクターにクローニングした。具体的に、ｐＣＬＰｒｈｔＢベクターをＥｃｏＲＶとＰｓｔＩで切った後、前記突然変異遺伝子断片をＩｎ-ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech Laboratories、Inc.）を用いてクローニングした。クローニングは、５０℃で１０間反応を介して行われ、これにより、ｐＣＬ ＰｒｈｔＢ ｙｈｈＳ変異体プラスミドライブラリーを完成した。
【００７８】
前記のような過程で製作した組換えプラスミドライブラリはＨＴＳ（High Throughput Screening）を用いてスクリーニングした。このとき、スクリーニング基盤菌株としては、菌株は大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０で内在的ホスホセリンホスファターゼ（phosphoserine phosphatase、serB）の活性が弱化されるように変異させた組換え微生物であるＣＡ０７‐００１２（ＫＣＣＭ１１１２１Ｐ）を用いた（特許文献２及び特許文献７）。
【００７９】
次に、ＯＰＳ排出活性が増加した変異体を収得するために、前記作製したプラスミドライブラリを前記基盤菌株であるＣＡ０７‐００１２に電気穿孔法で形質転換させた後、過量のＯＰＳが添加された培地条件で培養して、生育の低下が解除されるコロニー３種を選別した。その後、選別されたコロニー３種からプラスミドを獲得して、シーケンシング技法を用いて塩基配列を分析した。
【００８０】
前記のような過程を通じて、過量のＯＰＳ添加条件で生育低下を解除させるのに関与するｙｈｈＳ変異体３種を選別し、それぞれｙｈｈＳ Ｍ２、ｙｈｈＳ Ｍ２５、ｙｈｈＳ Ｍ４５と命名した。
【００８１】
前記ｙｈｈＳ Ｍ２、ｙｈｈＳ Ｍ２５、ｙｈｈＳ Ｍ４５に対して塩基配列を分析した結果、まず、ｙｈｈＳ Ｍ２は配列番号１のアミノ酸配列、ｙｈｈＳ Ｍ２５は配列番号３のアミノ酸配列、ｙｈｈＳ Ｍ４５は配列番号５のアミノ酸配列であることを確認した。
【００８２】
実施例２：ｙｈｈＳ変異体のＯＰＳ生産菌株でのＯＰＳ排出活性の確認
２−１. ＣＡ０７‐００１２を用いたＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーター強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
実施例１で同定した３種の変異体を含むプラスミドをそれぞれＯＰＳ生産株であるＣＡ０７‐００１２に当業界で通常に用いる電気パルスの方法で形質転換した。これにより、ｙｈｈＳ変異体が導入されたＯＰＳ生産菌株、ＣＡ０７‐００１２/ｐＣＬ‐ＰｒｈｔＢ−ｙｈｈＳ Ｍ２、ＣＡ０７‐００１２/ｐＣＬ-ＰｒｈｔＢ−ｙｈｈＳ Ｍ２５、ＣＡ０７‐００１２/ｐＣＬ-ＰｒｈｔＢ−ｙｈｈＳ Ｍ４５を製作した後、それぞれの菌株をEscherichia coliＣＡ０７-０３４５、Escherichia coli ＣＡ０７-０３４４、及びEscherichia coliＣＡ０７-０３４６と命名した。併せて、前記Escherichia coliＣＡ０７-０３４４、Escherichia coliＣＡ０７-０３４５、及びEscherichia coliＣＡ０７-０３４６菌株をブダペスト条約下で、２０１５年７月２３日付で韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１７３６Ｐ、ＫＣＣＭ１１７３７Ｐ及びＫＣＣＭ１１７３８Ｐを与えられた。
【００８３】
該菌株のＯ‐ホスホセリンの生産能を評価した。
具体的に、それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を表１の２５ｍＬ力価培地に接種した後、これを３４．５℃の温度で、２００ ｒｐｍで培養器で４８時間培養し、その結果を表２に示した。
【００８４】
【表１】
0006543763.tif 000002
【００８５】
【表２】
0006543763.tif 000003
【００８６】
前記表２に示すように、本発明のｙｈｈＳ変異体を導入した菌株の場合、野生型ｙｈｈＳ遺伝子を導入した菌株に比べてＯＰＳ生産量が１２８％から１６５％まで増加する優れた結果を示した。具体的に、ｙｈｈＳ Ｍ２の場合、野生型に比べて１２８％、ｙｈｈＳ Ｍ２５は１６５％、そしてｙｈｈＳ Ｍ４５変異体の場合は１５６％までＯＰＳ生産量が増加することを確認した。
【００８７】
２−２．ＳｅｒＡ及びＳｅｒＣ強化菌株を用いたＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーター強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
本発明のｙｈｈＳ変異体の活性を再確認するために、ＯＰＳ生産能の増加されたＯＰＳ生産菌株として、ＯＰＳ生合成経路であるＳｅｒＡ（３‐ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、D-3-phosphoglycerate dehydrogenase）及びＳｅｒＣ（３‐ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、3-phosphoserine aminotransferase）の活性を強化させた菌株であるＣＡ０７-００２２/ｐＣＬ-Ｐｒｍｆ-ｓｅｒＡ*（Ｇ３３６Ｖ）‐ｓｅｒＣ（KCCM11103P、特許文献２）を用いた。
【００８８】
ｐＣＬ-Ｐｒｍｆ-ｓｅｒＡ（ Ｇ３３６Ｖ ）-ｓｅｒＣ_ＰｒｈｔＢ-ｇｅｎｅｓベクターの製作のために、前記ｐＣＬ-ＰｒｈｔＢ-ｙｈｈＳ変異体を鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーペアを用いて、それぞれのｙｈｈＳ変異体を増幅し、これをｐＣＬ-Ｐｒｍｆ-ｓｅｒＡ*（Ｇ３３６Ｖ）-ｓｅｒＣベクターのＨｉｎｄIII制限酵素の位置にクローニングした。
【００８９】
具体的に、通常用いられる電気パルスの方法で、それぞれのプラスミドを形質転換した菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃培養器で一晩培養した。ＬＢ固体培地で一晩培養した菌株を、前記表１の２５ ｍＬの力価培地に接種した後、これを３４．５℃の温度で２００ｒｐｍで、培養器で４８時間培養し、その結果を下記表３に示した。
【００９０】
【表３】
0006543763.tif 000004
【００９１】
前記表３に示したように、本発明のｙｈｈＳ変異体をＯＰＳ生合成遺伝子が強化されたＯＰＳ生産菌株に導入した場合、ＯＰＳ生産量を１３０〜１７６％まで向上させることができることを確認した。この結果は、本発明のｙｈｈＳ変異体をＯＰＳ生産に有用に用いられることを示唆する。
【００９２】
２−３．染色体上プロモーターの強さに伴うＹｈｈＳ ＭＦＳトランスポーター強化菌株の製作及びＯＰＳ生産能の評価
前記の実験に加えて、染色体上にｙｈｈＳ変異体を導入する場合にも、ＯＰＳ排出活性が向上されるのかを確認するために、微生物の自己プロモーターをｐＣＪ１プロモーター（特許文献６）に置換して、本発明の変異体を導入した菌株を製作してＯ‐ホスホセリンの生産能を評価した。ｐＣＪ１プロモーター及び変異体を大腸菌の染色体に導入することは、当業界で通常的に広く用いられる下記方法を用いた。まず、形質転換は、１次的に電気パルス法（非特許文献１３）を用い、組換えベクターをＯＰＳ生産菌株であるＣＡ０７-００２２/ｐＣＬ-Ｐｒｍｆ-ｓｅｒＡ*（Ｇ３３６Ｖ）-ｓｅｒＣ（KCCM11103P、特許文献２）に挿入した。以降、相同性配列の組換えによって染色体上に挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ/Ｌで含有した培地で選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（Cross-over）を経て、ｐＣＪ１プロモーター及び変異体に置換されて、ベクターが除去された菌株を選定した。
【００９３】
最終的に形質転換された菌株のプロモーター及び変異体置換の有無は、配列番号１１及び１２のプライマーペアを用いてＰＣＲを行い、確認した。
【００９４】
それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃培養器で一晩培養した菌株を前記表１の２５ｍＬ力価培地に接種した後、これを３４．５℃、２００ｒｐｍの培養器で４０時間培養し、その結果を下記の表４に示した。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
前記表４に示したように、染色体上で各タンパク質変異体の活性を増加させた場合、野生型ｙｈｈＳ導入菌株に比べて、ＯＰＳ生産量が最大１７２％増加されることを確認できた。
【００９７】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００９８】
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【００９９】
0006543763.tif 000007
【０１００】
0006543763.tif 000008
【配列表】
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