(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
翻訳後修飾を異なる水準で有するＦｃ融合ポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触であり、
前記接触は、ｐＨ５〜６かつ／または６〜１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こり、
前記ＣＥＸ媒体に結合しないＦｃ融合ポリペプチドは、前記ＣＥＸ媒体に結合するＦｃ融合ポリペプチドから分離され、前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドは、結合したＦｃ融合ポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記接触を含む、前記方法。
【請求項２】
受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有するＦｃ融合ポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触であり、ｐＨ５〜６かつ／または６〜１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、前記接触と、
ｂ）前記ＣＥＸ媒体に結合しないＦｃ融合ポリペプチドの、前記ＣＥＸ媒体に結合するＦｃ融合ポリペプチドからの分離であり、
回収された前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドは、前記結合したＦｃ融合ポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記分離と、を含む、前記方法。
【請求項３】
受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有するＦｃ融合ポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触であり、ｐＨ５〜６かつ／または６〜１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、前記接触と、
ｂ）前記ＣＥＸ媒体に結合しないＦｃ融合ポリペプチドの、前記ＣＥＸ媒体に結合するＦｃ融合ポリペプチドからの分離と、
ｃ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの回収であり、
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドは、前記結合したＦｃ融合ポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記回収を含む、前記方法。
【請求項４】
受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有するＦｃ融合ポリペプチドの初期集団を含む組成物の提供と、
ｂ）前記組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触であり、ｐＨ５〜６かつ／または６〜１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、前記接触と、
ｃ）前記ＣＥＸ媒体に結合しないＦｃ融合ポリペプチドの、前記ＣＥＸ媒体に結合するＦｃ融合ポリペプチドからの分離と、
ｄ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの回収であり、
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドは、前記結合したＦｃ融合ポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記回収を含む、前記方法。
【請求項５】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの回収をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記翻訳後修飾が、シアリル化またはガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）形成である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記翻訳後修飾が、シアリル化である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの総シアル酸含量が、Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約６モル高い、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの総シアル酸含量が、Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約４モル高い、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの総シアル酸含量が、Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、約５％〜約１００％高い、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの総シアル酸含量が、Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、約５％〜約４０％高い、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１２〜約２０モルである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドの総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１４〜約１７モルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団の総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１０〜１４モルである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団の総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１３〜１４モルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記受容体が、ＴＮＦ受容体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、エタネルセプトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触が、約３０〜約１００ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触が、約３３〜約５４ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触が、少なくとも約４１ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
接触が、少なくとも約５．６のｐＨで起こる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触が、少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団の約２５％〜約８０％を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、Ｆｃ融合ポリペプチドの前記初期集団の約５５％〜約８０％を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＥＸ媒体が、スルホエチル（ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）、ＣＨ２−ＳＯ３−、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、ＳＯ３−、及びＣＨ２−ＣＯＯ−からなる群から選択されるリガンドを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＥＸ媒体が、スルホエチルリガンドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＥＸ媒体が、約１２０〜約１６０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂の結合容量を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、真核宿主細胞によって産生される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記真核宿主細胞が、哺乳類宿主細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記接触が、製造規模で実施される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、少なくとも１つの不純物をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記不純物が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、またはタンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記不純物が、タンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質不純物が、前記Ｆｃ融合ポリペプチドの切断型、前記Ｆｃ融合ポリペプチドの凝集型、または前記Ｆｃ融合ポリペプチドの誤って折り畳まれた型を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記Ｆｃ融合ポリペプチドを含む最終組成物であり、前記最終組成物が、ポリペプチドの前記初期集団を含んでいた前記組成物と比較して、少ない不純物を含む前記最終組成物を提供する、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記接触が、ｐＨ５〜６かつ６〜１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
規制当局は、ヒト投与を対象とする組換えポリペプチドに、特定の翻訳後修飾水準及び不純物水準を要求することが多い。試験管内で、細胞株において産生される組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準は、ヒト投与を対象とする組換えポリペプチドに必要な翻訳後修飾水準とは異なることが多い。ポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、産生細胞株の種類、増殖条件、及びポリペプチド配列を含む複数の因子に影響され得る。Ｓｈｉｅｓｔｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（４）：３１０（２０１１）。
製造工程、すなわち、許容可能な生成物の回収率及び収率を維持する製造工程として許容される規模で、特定の翻訳後修飾水準を有する組換えポリペプチドの濃縮を提供する方法が、当該技術領域で必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００２】
【非特許文献１】Ｓｈｉｅｓｔｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（４）：３１０（２０１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法を提供し、当該方法は、翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触を含み、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドから分離され、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、結合した組換ポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む。
【０００４】
本発明は、組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法提供し、当該方法は、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触と、
ｂ）ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの、ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドからの分離と、
を含み、回収されたＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む。
【０００５】
本発明は、組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法を提供し、当該方法は、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、
フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触と、
ｂ）ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの、ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドからの分離と、
ｃ）ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの回収と、
を含み、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む。
【０００６】
本発明は、組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法を提供し、当該方法は、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物の提供と、
ｂ）組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触と、
ｃ）ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの、ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドからの分離と、
ｄ）ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの回収と、
を含み、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、方法は、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの回収をさらに提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、シアリル化またはガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）形成である。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、シアリル化である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約６モル高い。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約４モル高い。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、約５％〜約１００％高い。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、約５％〜約４０％高い。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１２〜約２０モルである。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１４〜約１７モルである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団の総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１０〜約１４モルである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団のシアル酸量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１３〜１４モルである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、受容体は、ＴＮＦ受容体である。より特定の実施形態では、組換えポリペプチドは、エタネルセプトである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、凝固因子を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、単量体−二量体ハイブリッドである。凝固因子の例には、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、ＦＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、またはＦＩＸａ（ＦＩＸ）が含まれる。ＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩであってよい。ＦＶＩＩＩは、単鎖ＦＶＩＩＩまたは二重鎖ＦＶＩＩＩであってよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、接触は、約３０〜約１００ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、約３３〜約５４ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、少なくとも約４１ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、接触は、約４〜約７のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、接触は、約５〜約６のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、接触は、約５．５〜約５．８のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、接触は、少なくとも約５．６のｐＨで起こる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、接触は、約８〜約１２ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、約９．５〜約１１ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドの初期集団の約２５％〜約８０％を含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドの初期集団の約５５％〜約８０％を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、下記のリガンドの１つを含む。スルホエチル（ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）、ＣＨ２−ＳＯ３−、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、ＳＯ３−、またはＣＨ２−ＣＯＯ−。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、スルホエチルリガンドを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、約１２０〜約１６０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂の結合容量を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、真核宿主細胞によって産生される。特定の実施形態では、真核宿主細胞は、哺乳類宿主細胞である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、接触は、製造規模で実施される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの不純物をさらに含む。不純物の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、またはタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、不純物は、タンパク質を含む。タンパク質不純物の例には、組換えポリペプチドの切断型、組換えポリペプチドの凝集型、または組換えポリペプチドの誤って折り畳まれた型が含まれる。
【００２３】
いくつかの実施形態では、方法は、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドを含む最終組成物を提供し、当該最終組成物は、ポリペプチドの初期集団を含んでいた組成物と比較して、少ない不純物を含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触であり、
前記ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、前記ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドから分離され、前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドは、結合した組換ポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記接触を含む、前記方法。
（項目２）
組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触と、
ｂ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの、前記ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドからの分離であり、
回収された前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドは、前記結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記分離と、を含む、前記方法。
（項目３）
組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触と、
ｂ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの、前記ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドからの分離と、
ｃ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの回収であり、
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドは、前記結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記回収を含む、前記方法。
（項目４）
組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法であって、
ａ）翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物の提供と、
ｂ）前記組成物と、フロースルーモードにおいて作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触と、
ｃ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの、前記ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドからの分離と、
ｄ）前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの回収であり、
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドは、前記結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾を高水準で含む前記回収を含む、前記方法。
（項目５）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの回収をさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記翻訳後修飾が、シアリル化またはガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）形成である、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記翻訳後修飾が、シアリル化である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの総シアル酸含量が、組換えポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約６モル高い、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの総シアル酸含量が、組換えポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約４モル高い、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの総シアル酸含量が、組換えポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、約５％〜約１００％高い、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの総シアル酸含量が、組換えポリペプチドの前記初期集団のそれと比較して、約５％〜約４０％高い、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１２〜約２０モルである、項目７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドの総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１４〜約１７モルである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
組換えポリペプチドの前記初期集団の総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１０〜１４モルである、項目７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
組換えポリペプチドの前記初期集団の総シアル酸含量が、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１３〜１４モルである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記組換えポリペプチドが、Ｆｃドメインを含む、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記組換えポリペプチドが、抗体を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記組換えポリペプチドが、受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記受容体が、ＴＮＦ受容体である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記組換えポリペプチドが、エタネルセプトである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記組換えポリペプチドが、凝固因子を含む、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記組換えポリペプチドが、単量体−二量体ハイブリッドである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記凝固因子が、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、ＦＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、またはＦＩＸａ（ＦＩＸ）から選択される、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ＦＶＩＩＩが、全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＦＶＩＩＩが、単鎖ＦＶＩＩＩまたは二重鎖ＦＶＩＩＩである、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記接触が、約３０〜約１００ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記接触が、約３３〜約５４ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記接触が、少なくとも約４１ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記接触が、約４〜約７のｐＨで起こる、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記接触が、約５〜約６のｐＨで起こる、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記接触が、約５．５〜約５．８のｐＨで起こる、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
接触が、少なくとも約５．６のｐＨで起こる、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記接触が、約８〜約１２ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、項目１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記接触が、約９．５〜約１１ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記接触が、少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドが、組換えポリペプチドの前記初期集団の約２５％〜約８０％を含む、項目１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドが、組換えポリペプチドの前記初期集団の約５５％〜約８０％を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ＣＥＸ媒体が、スルホエチル（ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）、ＣＨ２−ＳＯ３−、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、ＳＯ３−、及びＣＨ２−ＣＯＯ−からなる群から選択されるリガンドを含む、項目１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記ＣＥＸ媒体が、スルホエチルリガンドを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ＣＥＸ媒体が、約１２０〜約１６０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂の結合容量を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記組換えポリペプチドが、真核宿主細胞によって産生される、項目１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記真核宿主細胞が、哺乳類宿主細胞である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記接触が、製造規模で実施される、項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記組成物が、少なくとも１つの不純物をさらに含む、項目１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記不純物が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、またはタンパク質を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記不純物が、タンパク質を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記タンパク質不純物が、前記組換えポリペプチドの切断型、前記組換えポリペプチドの凝集型、または前記組換えポリペプチドの誤って折り畳まれた型を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ＣＥＸ媒体に結合しない前記組換えポリペプチドを含む最終組成物であり、前記最終組成物が、ポリペプチドの前記初期集団を含んでいた前記組成物と比較して、少ない不純物を含む前記最終組成物を提供する、項目４４〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】シアリル化されたエタネルセプトの濃縮のためのＳＥ  Ｈｉｃａｐクロマトグラムを示す。負荷比は、３１ｍｇ／ｍｌ、負荷ｐＨは、５．６、そして負荷伝導率は、１０ｍＳ／ｃｍであった。生成物の収率は、６７％であり、生成物の総シアル酸は、シアル酸１５モル／タンパク質モルであった。ピーク１は、切断されたエタネルセプトからなる。ピーク２は、未変性エタネルセプトからなる。ピーク３は、誤って折り畳まれたエタネルセプトからなる。
【図２】様々なＣＥＸ樹脂（ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ、ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ、及びＧｉｇａＣａｐ  ＣＭ）による、エタネルセプトのＴＳＡ濃縮の比較を示す。結果は、５０％の生成物収率に規準化した。
【図３】様々なＣＥＸ樹脂（ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ、ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ、及びＧｉｇａＣａｐ  ＣＭ）によって、エタネルセプトを含む組成物から除去した不純物の比較を示す。結果は、５０％の生成物収率に規準化した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の詳細な説明
本発明は、クロマトグラフィー媒体の使用を介した、組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の濃縮方法に向けられている。好ましい実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、作動の際にフロースルーモードにおいて利用されるイオン交換クロマトグラフィー媒体である。
【００２６】
本明細書及び特許請求の範囲の明快な理解を提供するために、下記の定義を以下に提供する。
【００２７】
定義
「ａ」または「ａｎ」という用語付きの実体は、１つまたは複数のその実体を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」、及び「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。
【００２８】
さらに、本明細書で使用される「ａｎｄ／ｏｒ」は、もう一方を有するか、または有さない２つの特定された特徴または成分のそれぞれの特定の開示であるとみなされることになる。したがって、本明細書で「Ａ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｂ」などの語句において使用される「ａｎｄ／ｏｒ」という用語は、「Ａ  ａｎｄ  Ｂ」、「Ａ  ｏｒ  Ｂ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、ａｎｄ／ｏｒＣ」などの語句において使用される「ａｎｄ／ｏｒ」という用語は、下記の態様のそれぞれを包含することを意図する。Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ(単独)；Ｂ(単独)；ならびにＣ(単独)。
【００２９】
態様が、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という言葉と共に本明細書のどこで説明されようとも、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」及び／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」の用語において説明される他の類似態様もまた提供されると理解される。
【００３０】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本開示に関連する当業者によって共通に理解されるものと同一の意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、当業者に、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を提供する。
【００３１】
単位、接頭語、及び記号は、それらのＳｙｓｔeｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）許容型において示す。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。別段の記載がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの方向で、左から右に記載される。本明細書で提供される表題は、開示の様々な態様に限定されず、参照によって、全体を明細書に加えることができる。したがって、すぐ下に定義される用語は、参照によって、より完全な定義を本明細書全体に与える。
【００３２】
本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、大まかに（ｒｏｕｇｈｌｙ）、辺り（ａｒｏｕｎｄ）、または、の領域で（ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ）を指す。「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が、数値範囲と共に使用されるとき、示される数値の上下の境界を広げることによって、その範囲を改変する。一般に、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、例えば、１０パーセントの変動によって、記載値の上下の数値を、上または下に（より高く、またはより低く）改変できる。
【００３３】
本明細書では、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、２つ以上の天然アミノ酸または非天然アミノ酸のポリマーを指す。
【００３４】
ポリペプチドは、単量体または多量体のどちらでもよい。例えば、１つの実施形態では、本発明のタンパク質は、二量体である。本発明の二量体ポリペプチドは、二つのポリペプチド鎖を含んでよく、または１つのポリペプチド鎖からなってよい（例えば、ｓｃＦｃ分子の場合）。１つの実施形態では、本発明の二量体は、２つの同一の単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの同一Ｆｃ部分、または２つの同一の生物学的活性部分）を含むホモ二量体である。別の実施形態では、本発明の二量体は、２つの同一でない単量体サブユニットまたはポリペプチド（例えば、２つの異なる凝固因子若しくはその部分、または１つの凝固因子のみを含む）を含むヘテロ二量体である。例えば、米国特許第７，４０４，９５６号参照。当該特許は、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
「組換えで発現されたポリペプチド」及び「組換えポリペプチド」は、そのポリペプチドを発現するために遺伝学的に操作された宿主細胞から発現されたポリペプチドを指す。組換えで発現されたポリペプチドは、哺乳類宿主細胞において通常発現されたポリペプチドと同一であるか、または類似していてよい。組換えで発現されたポリペプチドは、宿主細胞に対して外来性であってもよく、すなわち、哺乳類宿主細胞において通常発現されるペプチドに対して異種性である。あるいは、組換えで発現されたポリペプチドは、哺乳類宿主細胞において通常発現されるポリペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を含むポリペプチドのその部分においてキメラであってよく、一方、他の部分は、宿主細胞にとって外来性である。宿主細胞において発現可能な何らかのポリペプチドが、本発明に従って産生されてよい。ポリペプチドは、宿主細胞に対して内在性の遺伝子から発現されてよく、または遺伝学的な操作を介して宿主へ導入された遺伝子から発現されてよい。ポリペプチドは、天然に存在するものであってよく、またはヒトの手によって操作若しくは選択された配列を代わりに有してよい。操作されたポリペプチドは、天然に個々に存在する他のポリペプチドセグメントから構築されてよく、または天然起源でない１つ若しくは複数のセグメントを含んでよい。本発明に従って望ましく発現され得るポリペプチドは、関心のある生物学的活性または化学活性に基づいて選択されることが多いであろう。例えば、本発明は、何らかの医薬的または商業的に関連性のある酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）等を発現するために用いてよい。
【００３６】
別のペプチドの「変異型（ｖａｒｉａｎｔ）」であるポリペプチドは、出発ポリペプチドに関連する１つまたは複数の変異を有してよく、例えば、別のアミノ酸残基で置換された１つ若しくは複数のアミノ酸残基、または１つ若しくは複数のアミノ酸残基の挿入若しくは欠失を有する１つ若しくは複数のアミノ酸残基を有してよい。１つの実施形態では、ポリペプチドは、天然起源ではないアミノ酸配列を含む。そのような変異型は、出発ポリペプチドと１００％未満の配列同一性または類似性を必然的に有する。別の実施形態では、変異型は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と、約７５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するであろう。当該アミノ酸配列同一性または類似性は、例えば、約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００%未満、約９０％〜１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）及び９５％〜１００％未満であり、例えば、変異型分子の長さにわたるものである。１つの実施形態では、出発ポリペプチド配列と、そこから得られた配列には、１つのアミノ酸差異が存在する。この配列に関する同一性または類似性は、必要であれば、配列同一性が最大パーセントとなるように、配列の位置合わせ及びギャップの導入を実施した後、出発アミノ酸残基と同一（すなわち、同一残基）である候補配列に存在するアミノ酸残基の割合として、本明細書では定義される。
【００３７】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、天然では自然に連結されない第二アミノ酸配列に連結された第一アミノ酸配列を含む。別々のタンパク質に通常存在するアミノ酸配列を、融合ポリペプチドに一緒にまとめてよく、または同一タンパク質に通常存在するアミノ酸配列を、新しい配置にして融合タンパク質にしてもよく、例えば、本発明の第ＶＩＩＩ因子ドメインと、ＩｇＦｃドメインとの融合である。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が望ましい関係でコードされるポリヌクレオチドの作成及び翻訳によって作成できる。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合、または非共有結合によって、第一アミノ酸配列と関連する第二アミノ酸配列をさらに含んでよい。
【００３８】
本明細書では、「凝集体」という用語は、ポリペプチド凝集体を指す。凝集体は、精製され、例えば、高分子量凝集体をもたらし得る組換えポリペプチドの多量体（二量体、四量体、または高次凝集体など）を包含する。
【００３９】
「クロマトグラフィー」という用語は、混合物中に存在する他の分子から関心組換えポリペプチドを分離する技術の何らかの種類を指す。通常、関心組換えポリペプチドは、結合親和性における差異の結果として他の分子から分離される。
【００４０】
分子のクロマトグラフィー樹脂への「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、適切な条件（例えば、ｐＨ／伝導率）下で、分子をクロマトグラフィー樹脂に暴露し、その結果、当該分子が、リガンド−タンパク質相互作用の効力によって、クロマトグラフィー樹脂内、または樹脂上に、可逆的に固定化されることを指す。非限定例には、分子と、荷電基とのイオン性相互作用、またはイオン交換物質の荷電基と、免疫グロブリンとのイオン性相互作用が含まれる。
【００４１】
本明細書で互換的に使用される「フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」、「フロースルー工程」、「フロースルーモード」、及び「フロースルークロマトグラフィー」という用語は、試料に含まれる少なくとも１つの生成物（例えば、特定の翻訳後修飾を有する組換えポリペプチド）が、クロマトグラフィー樹脂または媒体をフロースルーすることを意図し、一方で、少なくとも１つの潜在的な混入物または不純物が、クロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する生成物分離技術を指す。
【００４２】
「クロマトグラフィー樹脂」、「クロマトグラフィー媒体（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｄｉａ）」、及び「クロマトグラフィー媒体（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、互換的に使用され、混合物中に存在する他の分子から関心組換えポリペプチドを分離する固相の何らかの種類を指す。通常、関心組換え分子は、混合物中の他の分子と、関心組換えポリペプチドとの間の結合親和性における差異の結果として他の分子から分離される。何らかの既知の、または後に開示若しくは開発されるクロマトグラフィー媒体またはマトリックスの使用。そのような媒体の例には、限定無しに、イオン交換媒体、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、抗体親和性媒体（例えば、プロテイン−Ａまたはその変異型）、免疫グロブリンＦｃ領域親和性媒体（例えば、Ｆｃ受容体親和性媒体）、ならびにリガンド親和性媒体、受容体親和性媒体、及び混合モード媒体が含まれる。
【００４３】
本明細書では、「イオン交換」及び「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、関心組換えポリペプチドが、固相のイオン交換物質に（例えば、共有結合によって）連結された荷電化合物と、相互作用し、または相互作用せず、その結果、関心組換えポリペプチドが、混合物中の他の組換えポリペプチドまたは不純物と比較して、強く、または弱く、荷電化合物と、非特異的に相互作用するクロマトグラフィー工程を指すために使用される。混合物中の混入物は、関心組換えポリペプチドと比較して、速く、若しくは遅くイオン交換物質のカラムから溶出されるか、または関心組換えポリペプチドと比較して樹脂に結合、若しくは樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」には、具体的には、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、及び混合モードイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。
【００４４】
ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」は、ポリペプチドの正電荷と、その負電荷が釣り合うｐＨを指し、ｐＩは、アミノ酸残基、若しくはポリペプチドに結合した糖質のシアル酸残基の正味電荷から計算してよく、または等電点電気泳動によって決定してよい。
【００４５】
「イオン交換物質」という語句は、負に荷電した（すなわち、陽イオン交換樹脂）固相、または正に荷電した（すなわち、陰イオン交換樹脂）固相を指す。電荷は、例えば、共有結合によって、１つまたは複数の荷電リガンドを、固相に結合することによって付与されてよい。あるいは、またはさらに、電荷は、固相本来の特性（例えば、シリカの場合は、全体的な負電荷を有する）であってよい。
【００４６】
「陰イオン交換樹脂」または「ＡＥＸ」という語句は、例えば、それに結合した四級アミノ基などの１つまたは複数の正に荷電したリガンドを有することで、正に荷電した固相を指す。商業的に利用可能な陰イオン交換樹脂には、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）、及びＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、後に溶出される標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）に結合でき、または不純物に主に結合できる一方で、標的分子は、カラムを「フロースルー」する。
【００４７】
「陽イオン交換樹脂」または「ＣＥＸ」という語句は、負に荷電しており、したがって、固相上を通過、または固相を通り抜ける水溶液中の陽イオンと交換するための遊離の陽イオンを有する固相を指す。固相に結合し、陽イオン交換樹脂を形成する負荷電のリガンドは、例えば、カルボン酸またはスルホン酸であってよい。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーは、後に溶出される標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有標的タンパク質）に樹脂が結合する条件下で実施してよい（陽イオン交換結合及び溶出クロマトグラフィーまたは「ＣＩＥＸ」）。あるいは、ＣＥＸは、不純物と主に結合する一方で、標的分子は、カラムを「フロースルー」するモードで実行してよい（陽イオンフロースルークロマトグラフィー）。商業的に利用可能なＣＥＸ樹脂には、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、ＧＥ  ＳＰＸＬ、ＧＥ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ、Ｔｏｓｏｈ  Ｇｉｇａｃａｐ  ＣＭ、Ｔｏｓｏｈ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｓ−６５０、またはＢｉｏＲａｄ  Ｎｕｖｉａ  Ｓが含まれる。「陽イオン交換樹脂」または「ＣＥＸ」という語句は、クロマトグラフィーの陽イオン交換モードにおいて、部分的に、または完全に作動する混合モード樹脂も指す。商業的に利用可能な混合モード樹脂には、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣが含まれる。本明細書で開示される精製方法は、フロースルーモードにおいて実施される陽イオン交換クロマトグラフィーの段階を利用する。
【００４８】
クロマトグラフィー方法
本発明は、作動の際に「フロースルー」モードを利用し、組換えポリペプチドの、クロマトグラフィー媒体（または他のマトリックス）との接触が可能になる。接触中、選択された特性（特定の翻訳後修飾など）を有する組換えポリペプチドは、クロマトグラフィー媒体（または他のマトリックス）には優先的に結合しない一方で、選択された特性を有しないか、または選択された特性をあまり有しない組換えポリペプチド（及び他の不純物）（全体の正味負電荷が小さいか、またはシアル酸含量が少ない組換えポリペプチドなど）は、媒体（またはマトリックス）に結合する。濃縮された組換えポリペプチドを含むフロースルーを回収する。得られた組換えポリペプチド混合物は、クロマトグラフィー媒体との接触前に組換えポリペプチドの初期集団を含んでいた組成物と比較して、選択された（標的）特性を有する生成物濃度が高くなり、濃縮されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本発明は、組換えポリペプチドの選択濃縮に向けられており、選択される、または望ましい生成物特性は、シアル酸含量の全体（総）水準が増加した、または濃縮された特性である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、総シアル酸含量が増加した組換えポリペプチドは、交換クロマトグラフィー媒体（例えば、ＳＥ  Ｈｉｃａｐ）の集団を含む組成物と、組換えポリペプチドの混合物との接触によって得られる。望ましくない生成物（例えば、低シアル酸含量、及び他の不純物を有する生成物）は、クロマトグラフィー媒体に結合させることが可能であり、選択された生成物（高いシアル酸含量を有する）は、カラムをフロースルーし、回収される。
【００５０】
本発明の方法は、物理的、生物学的、及び／または化学的性質の何らかの数に基づき、組換えポリペプチドの分離／精製に適応及び適用してよい。例えば、生成物のアイソフォームが、適切な吸着剤（例えば、電荷に基づく分離向けには、強または弱陽イオン交換樹脂、そして疎水性に基づく分離向けには、疎水性吸着剤など）の使用によって、電荷及び／または疎水性に基づいて選択的に分離されてよい。さらに、本発明の方法は、２つの直行性の生成物属性（例えば、電荷及び疎水性）に基づく分離向けに、混合モードクロマトグラフィー（混合モード媒体）を使用して適用してよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、組換えポリペプチドの翻訳後修飾水準の、濃縮、増加、増進、または増強のための方法に関し、当該方法は、翻訳後修飾を異なる水準で有する組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物と、フロースルーモードで作動する陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）媒体と、の接触を含み、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、ＣＥＸ媒体に結合する組換えポリペプチドから分離され、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、結合した組換えポリペプチドと比較して、翻訳後修飾の水準が、高いか、または増加している。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、ＣＥＸ樹脂に結合するポリペプチドまたは他の不純物と比較して、より負に荷電している。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの回収をさらに含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、特定の翻訳後修飾を高水準で有する組換えポリペプチドは、フロースルーモードで作動するＣＥＸ媒体の使用を介して、翻訳後修飾を低水準で有する組換えポリペプチドから分離される。「分離」は、ポリペプチド及び１つまたは複数の不純物または混入物を含む組成物または試料からの、関心組換えポリペプチドの純度の程度の増加を指す。いくつかの実施形態では、関心組換えポリペプチドは、電荷の使用を介して、組成物中の他のポリペプチドまたは不純物から分離される。いくつかの実施形態では、関心組換えポリペプチドは、組成物中の他のポリペプチドまたは不純物と比較して、より負に帯電しており、その結果、関心組換えポリペプチドは、フロースルーモードで作動するＣＥＸ媒体に結合しない。いくつかの実施形態では、関心組換えポリペプチドの純度の程度は、組成物から少なくとも１つの不純物を（完全に、または部分的に）除去することによって、増加する。いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、シアリル化またはガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）形成である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、シアリル化である。シアリル化は、ヒトグリコシル化の最終段階である。総シアル残基は、所与の組換えポリペプチド上のシアル残基の総数を指す。グリコシル化タンパク質の生体内における生物学的活性は、分子当たりのシアル酸単位数に依存することが知られているように、タンパク質のシアリル化は、タンパク質機能に対して重大な意味を有する。Ｓｈｉｅｓｔｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（４）：３１０（２０１１）。シアル酸頻度の消失は、糖タンパク質溶解性の低下、及び循環半減期の低下につながる。結果として、組換えポリペプチドの精製及び治療有効性は、シアル酸含量に依存する。ポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、産生細胞株の種類、増殖条件、及びポリペプチド配列を含む多くの因子によって、影響を受け得る。Ｓｈｉｅｓｔｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（４）：３１０（２０１１）。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．５〜約６モル、約１〜約４モル、または約１〜約３モル高い。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約０．６〜約２．７モル高い。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質の総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、タンパク質モル当たりのシアル酸で、少なくとも約０．５モル、少なくとも約１．０モル、少なくとも約１．５モル、少なくとも約２．０モル、少なくとも約２．５モル、少なくとも約３．０モル、少なくとも約３．５モル、少なくとも約４．０モル、少なくとも約４．５モル、少なくとも約５．０モル、少なくとも約５．５モル、または少なくとも約６．０モル高い。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物のそれと比較して、約５％〜約１００％、約５％〜約９０％、約５％〜約８０％、約５％〜約７０％、約５％〜約６０％、約５％〜約５０％、及び約５％〜４０％高い。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物のそれと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％高い。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１３〜約２０モル、約１３．５〜約１９モル、約１４〜１８モル、約１４〜約１７モル、または約１４〜約１６．５モルである。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総シアル酸含量は、約１４．１〜約１６．２である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団の初期含量の総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、約１０〜約１４モル、約１０．５〜約１４モル、約１１〜約１４モル、約１１．５〜約１４モル、約１２〜約１４モル、約１２．５〜約１４モル、または約１３〜約１４モルである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団の総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、少なくとも約１０モル、少なくとも約１０．５モル、少なくとも約１１モル、少なくとも約１１．５モル、少なくとも約１２モル、少なくとも約１２．５モル、少なくとも約１３モル、少なくとも約１３．５モル、または少なくとも約１４モルである。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団の総シアル酸含量は、タンパク質モル当たりのシアル酸で、少なくとも約１３．５モルである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、翻訳後修飾は、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）形成である。カルボキシル化／ガンマ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメインは、ビタミン−Ｋ依存性ドメインである。ＧＬＡドメインにおいて、ビタミンＫは、グルタミン酸残基のカルボキシル化を媒介し、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を形成する。Ｖｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２６６：６２５−６３６（１９９０）。Ｇｌａは、カルシウム結合において、重要な役割を担い、凝固因子タンパク質における特異的立体構造転移に対して重大な意味を有することが明らかとなった。Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２７）：１６２２７−３６（１９９６）。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドのＧｌａ含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、約５％〜約１００％、約５％〜約９０％、約５％〜約８０％、約５％〜約７０％、約５％〜約６０％、約５％〜約５０％、及び約５％〜約４０％高い。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドの総Ｇｌａ含量は、組換えポリペプチドの初期集団のそれと比較して、約５％〜約１００％、約５％〜約９０％、約５％〜約８０％、約５％〜約７０％、約５％〜約６０％、約５％〜約５０％、及び約５％〜約４０％高い。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態では、「フロースルー」モードで作動するクロマトグラフィー媒体は、特定の翻訳後修飾を有する組換えポリペプチドの組成物を濃縮するために利用される。
【００６３】
負荷比は、媒体体積当たりの、クロマトグラフィー媒体に接触している組成物の総量を示す。負荷比が高すぎると、フロースルーモードにおいて実行するカラムの場合、不純物によっては、媒体に結合しない可能性がある。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触は、少なくとも約３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約３５ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約４０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約４５ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約５０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約５５ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約６０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約７０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約８０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約９０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約１００ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約１１０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約１２０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約１３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、少なくとも約１４０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、または少なくとも約１５０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、４１ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比でおこる。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触は、約３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体〜約１５０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、約３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体〜１２５ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、約３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体〜１００ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、約３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体〜７５ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、約３０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体〜６０ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体、または約３３ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体〜５４ｍｇ総タンパク質／ｍｌＣＥＸ媒体の負荷比で起こる。
【００６４】
接触段階のｐＨは、重大な意味を有する。なぜなら、接触段階のｐＨによって、どの荷電分子が、カラムに結合し、どれが結合しないことになるかが決定するからである。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触は、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、少なくとも約６．５、少なくとも約７、少なくとも約８、または少なくとも約９のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、接触は、５．６のｐＨで起こる。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触は、約３〜約９、約４〜約８、約４〜約７、約５〜約７、約５〜約６、または約５．５〜約５．８のｐＨで起こる。
【００６５】
接触段階の伝導率は、重大な意味を有する。なぜなら、接触段階の伝導率によって、どの分子が、カラムに結合し、どれが結合しないことになるかが決定するからである。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触は、少なくとも約８ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約８．５ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約９ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１０．５ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１１．５ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１２ｍＳ／ｃｍ、少なくとも約１２．５ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも約１３ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、１０ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる。いくつかの実施形態では、接触は、約８ｍＳ／ｃｍ〜約１２ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ〜１１．５ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ〜約１１．５ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ〜約１１ｍＳ／ｃｍ、または約９．５ｍＳ／ｃｍ〜１１ｍＳ／ｃｍの伝導率で起こる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、イオン交換媒体、陰イオン交換媒体、陽イオン交換媒体、ヒドロキシアパタイト媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、抗体親和性媒体（例えば、プロテイン−Ａまたはその変異型）、免疫グロブリンＦｃ領域親和性媒体（例えば、Ｆｃ受容体親和性媒体）、及びリガンド親和性媒体、受容体親和性媒体、または混合モード媒体である。好ましい実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、ＣＥＸ樹脂である。本発明の実施形態は、何らかの既知の、または後に開示若しくは開発されるＣＥＸクロマトグラフィー媒体またはマトリックスの使用を含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐ、ＧＥ  ＳＰＸＬ、ＧＥ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ、Ｔｏｓｏｈ  Ｇｉｇａｃａｐ  ＣＭ、Ｔｏｓｏｈ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｓ−６５０、ＢｉｏＲａｄ  Ｎｕｖｉａ  Ｓ、またはＣａｐｔｏ  ＭＭＣである。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、スルホエチル（ｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ）、スルホプロピル（ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）、ＣＨ２−ＳＯ３−、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、ＳＯ３−、ＣＨ２−ＣＯＯ−、または多様式弱陽イオン交換体（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｗｅａｋ  ｃａｔｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）である。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、架橋ポリメタクリル酸、デキストラン表面増量剤を含む６％架橋アガロース、アガロース、表面グラフト剛直ポリビニルエーテル親水性ポリマー、または高度架橋アガロースであるマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、何らかの既知のマトリックスである。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、スルホエチルリガンドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ  Ｈｉｃａｐである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体は、約１００〜約２００ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂、約１１０〜１９０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂、約１２０〜約１８０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂、約１２０〜約１７０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂、約１２０〜約１６０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂、または約１２５〜１６０ｍｇリゾチーム／ｍｌ樹脂の結合容量またはリガンド容量を含む。
【００６８】
媒体と、組成物との間のイオン交換速度は、温度の上昇に伴って上昇する。温度は、カラムの選択にも影響を与え得る。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触中の温度は、約１６〜約２６℃、約１８〜約２４℃、または約２０〜約２３℃である。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触中の温度は、少なくとも約１５℃、少なくとも約１６℃、少なくとも約１７℃、少なくとも約１８℃、少なくとも約１９℃、少なくとも約２０℃、少なくとも約２１℃、少なくとも約２２℃、少なくとも約２３℃、少なくとも約２４℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約２６℃、または少なくとも約３０℃である。いくつかの実施形態では、組成物と、媒体との接触中の温度は、約２２℃である。
【００６９】
高流速であれば、工程時間は減少するが、高流速では、組成物と、媒体との接触時間が減少するため、分離効率が低下する可能性がある。いくつかの実施形態では、工程流速は、約７５ｃｍ／時間〜約１５０ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間〜約１５０ｃｍ／時間、または約１２０ｃｍ／時間〜約１５０ｃｍ／時間である。いくつかの実施形態では、工程流速は、少なくとも約７５ｃｍ／時間、少なくとも約８０ｃｍ／時間、少なくとも約９０ｃｍ／時間、少なくとも約１００ｃｍ／時間、少なくとも約１１０ｃｍ／時間、少なくとも約１１５ｃｍ／時間、少なくとも約１２０ｃｍ／時間、少なくとも約１２５ｃｍ／時間、少なくとも約１３０ｃｍ／時間、少なくとも約１３５ｃｍ／時間、少なくとも約１４０ｃｍ／時間、または少なくとも約１５０ｃｍ／時間である。いくつかの実施形態では、工程流速は、約１２５ｃｍ／時間である。
【００７０】
本発明の実施形態は、製造規模での、選択された組換えポリペプチドの回収方法を含み、選択された組換えポリペプチドが、治療上有用または有益な化合物である方法を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物は、選択された特性を異なる水準で有する関心組換えポリペプチドのみを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物は、関心組換えポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する追加のポリペプチドも含む。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチドは、組換え体である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物は、不純物も含む。いくつかの実施形態では、不純物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、またはタンパク質分子である。いくつかの実施形態では、不純物は、組換えポリペプチドの切断型、組換えポリペプチドの凝集型、または組換えポリペプチドの誤って折り畳まれた型である。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドを含む組成物は、組換えポリペプチドの初期集団を含んでいた組成物と比較して少ない不純物を含む。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドを含む組成物は、組換えポリペプチドの初期集団を含んでいた組成物と比較して、不純物が、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％少ない。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、初期集団を含む組成物の組換えポリペプチドの約１０%〜約９０%、約２０%〜約８０%、約３０%〜約８０%、約４０%〜約８０%、約５０%〜約８０%、または約５５%〜約８０%である。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、初期集団を含む組成物の組換えポリペプチドの約５５％〜約８０％である。
【００７３】
１つの実施形態では、生成物は、例えば、ピーク生成物のｐＩ値に基づいて、選択的に濃縮／分離されてよく、例えば、高ｐＩを有するアイソフォームが、低ｐＩを有する生成物アイソフォームから、陽イオン交換吸着剤で分離されてよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドは、ＣＥＸクロマトグラフィー後の１つまたは複数のさらなる精製段階に供される。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物は、ＣＥＸ媒体との接触に先立ち、１つまたは複数の精製段階に供される。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドの初期集団を含む組成物のｐＨ及び伝導率は、組成物と、ＣＥＸ媒体との接触に先立って調整される。いくつかの実施形態では、ＣＥＸ媒体に結合しない組換えポリペプチドのｐＨは、ＣＥＸ媒体との接触後に調整される。
【００７５】
本発明の組換えポリペプチド
本発明の実施形態は、翻訳後修飾を特定水準で有する幅広い種類の組換えポリペプチドの高度に均一化された混合物を得るために有用である。そのような組換えポリペプチドのいくつかの例には、限定なしに、タンパク質及びタンパク質断片（すなわち、全長及び部分長のポリペプチド／ペプチド）、抗体（免疫グロブリン）、異種性融合タンパク質等が含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、二量体である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単量体である。
【００７６】
１つの実施形態では、組換えポリペプチドは、免疫グロブリン（またはドメイン、その断片の領域）と融合した非免疫グロブリンタンパク質（またはその断片）である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体を含む。１つの実施形態では、例えば、本発明の方法は、免疫グロブリンのＦｃ領域（ＩｇＧ分子のＦｃ領域など）と連結された（すなわち、融合された）細胞外受容体リガンド結合ドメインを含む組換えポリペプチドの分離／精製のために使用される。Ｆｃ融合タンパク質の例は、表１において参照可能である。
【表１−１】
0006609561.tif 000002
【表１−２】
0006609561.tif 000003
【表１−３】
0006609561.tif 000004
【００７７】
１つの実施形態では、組換えポリペプチドは、受容体のリガンド結合ドメインを含むＦｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、受容体は、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）受容体である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、エタネルセプトである。エタネルセプトは、二量体組換え治療用糖タンパク質であり、ヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）に連結したヒト７５キロダルトンヒト腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部からなる。ＴＮＦ受容体領域は、血流においてみられる可溶性ＴＮＦ−αに結合し、それによって、多くの自己免疫疾患を含む様々な炎症応答を低下させる。エタネルセプトは、ＴＮＦ阻害剤のようであり、ＴＮＦに結合するおとり受容体として働く。Ｚａｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９（３）：１８７２−８３。エタネルセプトは、天然起源の可溶性ＴＮＦ受容体に類似した機能を有して働く。しかしながら、エタネルセプトは、融合タンパク質であるため、血流における半減期は、長期化しており、したがって、天然起源の受容体と比較して、長期間影響を及ぼす。Ｍａｄｈｕｓｕｄａｎ，Ｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２３（２５）：５９５０−９。融合タンパク質のＦｃ部分は、内皮細胞の表面上に発現しているＦｃ受容体に一過性に固着し、分解を遅延させると共にエタネルセプトの半減期を増加させる。
【００７８】
エタネルセプトが、生物学的活性を有するにはＮ−グリコシル化が必要である。グリコシル化タンパク質は、複合分子であり、十分制御された生成物でさえ、同一のアミノ酸配列上に異なる糖鎖組成物を有した数百以上のグリコフォームから成り得る。グリコシル化タンパク質の生体内における生物学的活性は、分子当たりのシアル酸単位数に依存することが知られており、利用可能なシアリル化部位、Ｎ−グリカンのアンテナ性（ａｎｔｅｎｎｉａｒｉｔｙ）及びシアリル化の完全性の結果である。Ｓｈｉｅｓｔｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（４）：３１０（２０１１）。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、凝固因子を含む。いくつかの実施形態では、凝固因子は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、ＦＶＩＩａ、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、またはＦＩＸａ（ＦＩＸ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、単鎖ＦＶＩＩＩまたは二重鎖ＦＶＩＩＩである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、単量体−二量体ハイブリッドである。単量体−二量体ハイブリッドは、二量体の側面と、単量体の側面とを有するキメラタンパク質であり、二量体の側面は、それが免疫グロブリンの定常領域部分からそれぞれなる２つのポリペプチド鎖からなるという事実に関連しており、単量体の側面は、２つの鎖の内、１つのみが、治療用生物学的活性分子からなるという事実に関連する。単量体−二量体ハイブリッドは、米国特許第７，４０４，９５６号において説明されており、参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる。
【００８１】
「第ＶＩＩ因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ）」または「ＦＶＩＩ」は、肝臓で合成され、およそ５０ｋＤａの分子量を有する単鎖の酵素前駆体として、血液へ分泌される凝固因子タンパク質を指す。ＦＶＩＩ酵素前駆体は、タンパク質分解性開裂によって、活性型（ＦＶＩＩａ）へと変換される。ＦＶＩＩは、米国公開第２０１１／００４６０６１号及び国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／４４８４２号において開示されており、参照によって、それらの全体が、本明細書にそれぞれ組み込まれる。
【００８２】
「第ＶＩＩＩ因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ）」または「ＦＶＩＩＩ」は、血液凝固因子タンパク質、ならびにその種及び配列の変異型を指し、限定はされないが、２３５１アミノ酸単鎖前駆体タンパク質（１９アミノ酸疎水性シグナルペプチドを有する）、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する、およそ２７０〜３３０ｋＤａである成熟２３３２アミノ酸第ＶＩＩＩ因子タンパク質、ならびにアミノ酸１〜１６４８（成熟ＦＶＩＩＩ型に対して付番）のＡ１−Ａ２−Ｂ（９０〜２２０ｋＤ範囲内）、及びアミノ酸１６４９〜２２３２の、８０ｋＤａである軽鎖Ａ３−Ｃ１−Ｃ２からなる、重鎖型のＲ１６４８の後の位置におけるタンパク質分解性開裂の結果として形成される２つの鎖を有する循環ヘテロ二量体が含まれ、それらは、それぞれ模式的に図１において示されている。「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」は、天然の循環タンパク質の生物学的活性の少なくとも一部を保持する配列変異型でもよく、切断配列、異種性アミノ酸を含む配列、または重鎖及び軽鎖が、リンカーによって共有結合した単鎖ＦＶＩＩＩ（ｓｃＦＶＩＩＩ）が含まれる。本明細書では、「ＦＶＩＩＩ」は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の欠乏（例えば、血友病Ａ）を生体内または試験管内で補正可能である血液凝固第ＶＩＩＩ因子の典型的な特性を有する第ＶＩＩＩ因子分子の何らかの機能的な型となる。ＦＶＩＩＩまたは配列変異型は、米国特許または公開第４，７５７，００６号、第７，１３８，５０５号、第５，００４，８０４号、第５，１９８，３４９号、第５，２５０，４２１号、第５，９１９，７６６号、第２０１０／００８１６１５号、第２０１３／００１７９９７号、及び第２０１３／０１０８６２９号において説明されるとおり、単離、特徴付け、及びクローン化されており、参照によって、それらの全体が、本明細書にそれぞれ組み込まれる。
【００８３】
本明細書では、第ＶＩＩＩ因子の「Ｂドメイン」は、当該技術領域において知られるＢドメインと同一であり、内部アミノ酸配列同一性、及びトロンビンによるタンパク質分解性開裂部位によって定義され、例えば、全長ヒト第ＶＩＩＩ因子の残基Ｓｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８である。その他のヒト第ＶＩＩＩ因子ドメインは、下記のアミノ酸残基によって定義される：Ａ１、残基Ａｌａ１〜Ａｒｇ３７２；Ａ２、残基Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０；Ａ３、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２；Ｃ１、残基Ａｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２；Ｃ２、残基Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２を含む。残りの配列である、残基Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９は、第ＶＩＩＩ因子軽鎖活性化ペプチドとして通常は言及される。Ｂドメインを含むドメインのすべての境界位置が、ブタ、マウス、及びイヌの第ＶＩＩＩ因子でも、当該技術領域において知られている。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインは、欠失している（「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（Ｂ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ）」または「ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ」）。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（組換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）である。ＦＶＩＩＩのＢドメインは、米国公開第２０１３／０１０８６２９号において考察されており、参照によって、その全体が、本明細書に組み込まれる。
【００８４】
「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」は、米国特許第６，３１６，２２６号、第６，３４６，５１３号、第７，０４１，６３５号、第５，７８９，２０３号、第６，０６０，４４７号、第５，５９５，８８６号、第６，２２８，６２０号、第５，９７２，８８５号、第６，０４８，７２０号、第５，５４３，５０２号、第５，６１０，２７８号、第５，１７１，８４４号、第５，１１２，９５０号、第４，８６８，１１２号、及び第６，４５８，５６３号において開示される完全欠失または部分欠失を有してよく、参照によって、それらの全体が、本明細書にそれぞれ組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子の配列は、米国特許第６，３１６，２２６号の第４列４行目〜第５列２８行目、及び実施例１〜５において（同様に、米国特許第６，３４６，５１３号においても）開示される欠失のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，７８９，２０３号の第２列２６〜５１行目及び実施例５〜８において（同様に、米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８６号、及び米国特許第６，２２８，６２０号おいても)開示される欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号の第１列２５行目〜第２列４０行目、米国特許第６，０４８，７２０号の第６列１〜２２行目及び実施例１、米国特許第５，５４３，５０２号の第２列１７〜４６行目、米国特許第５，１７１，８４４号の第４列２２行目〜第５列３６行目、米国特許第５，１１２，９５０号の第２列５５〜６８行目、図２、及び実施例１、米国特許第４，８６８，１１２号の第２列２行目〜第１９列２１行目、及び表２、米国特許第７，０４１，６３５号の第２列１行目〜第３列１９行目、第３列４０行目〜第４列６７行目、第７列４３行目〜第８列２６行目、及び第１１列５行目〜第１３列３９行目、または米国特許第６，４５８，５６３号の第４列２５〜５３行目において説明される欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、Ｂドメインのほとんどの欠失を有するが、ＷＯ９１／０９１２２において開示されるように、一次翻訳産物の、生体内における、２つのポリペプチド鎖へのタンパク質分解性処理に必須であるＢドメインのアミノ末端配列は、依然として含み、ＷＯ９１／０９１２２は、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、アミノ酸７４７〜１６３８の欠失と共に構成されており、すなわち、Ｂドメインを実質的に完全に欠失している。Ｈｏｅｂｅｎ  Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８−７３２３（１９９０）が、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。Ａ．Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２の欠失も含んでよい。Ｍｅｕｌｉｅｎ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２（４）：３０１−６（１９８８）が、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。本発明の一部である追加のＢドメイン欠失には、例えば、���ミノ酸９８２〜１５６２または７６０〜１６３９（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３，５９３９−５９４２））、アミノ酸７９７〜１５６２（Ｅａｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３−８３４７））、アミノ酸７４１〜１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ（ＰＣＴ公開出願第ＷＯ８７／０４１８７号））、アミノ酸７４７〜１５６０（Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ（１９８７）６：５５３−５６４））、アミノ酸７４１〜１６４８（Ｐａｓｅｋ（ＰＣＴ出願第８８／００８３１号））、アミノ酸８１６〜１５９８またはアミノ酸７４１〜１６８９（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ８２：１６−２５，ＥＰ２９５５９７））の欠失が含まれ、参照によって、それらの全体が、本明細書にそれぞれ組み込まれる。前述の欠失は、それぞれが、何らかの第ＶＩＩＩ因子配列中に作成されてもよい。ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失は、米国公開第２０１３／０１０８６２９において開示されており、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８５】
本明細書では、「第ＩＸ因子（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ）」及び「ＦＩＸ」は、別段の特定がない限り、凝固におけるその通常の役割において機能性である第ＩＸ因子ポリペプチドを意味する。したがって、第ＩＸ因子という用語は、機能性である変異型ポリペプチド、及びそのような機能性変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。好ましい第ＩＸ因子ポリペプチドは、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、及びマウスの第ＩＸ因子ポリペプチドである。第ＩＸ因子の全長ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列には、多くの機能性変異型が知られており、例えば、断片型、変異体（ｍｕｔａｎｔ）型、及び改変型である。第ＩＸ因子ポリペプチドには、全長第ＩＸ因子、全長第ＩＸ因子からＮ末端のＭｅｔを除去したもの、全長第ＩＸ因子のシグナル配列を除去したもの、成熟第ＩＸ因子（からシグナル配列及びプロペプチドを除去したもの）、及びＮ末端に追加のＭｅｔを有する成熟第ＩＸ因子が含まれる。第ＩＸ因子は、組換え手法によって好ましくは作成され（「組換え第ＩＸ因子」または「ｒＦＩＸ」）、すなわち、天然起源または血漿由来ではない。ＦＩＸは、米国公開第２０１１／００４６０６０及び第２０１３／０２０２５９５号において開示されており、参照によって、それらの全体が、本明細書にそれぞれ組み込まれる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、キメラ抗体である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、米国特許第７，３００，７７３号において開示される抗体のいずれかであり、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、受容体である。いくつかの実施形態では、抗体は、受容体チロシンキナーゼである。いくつかの実施形態では、受容体は、米国特許第７，３００，７７３号において開示される抗体のいずれかであり、参照によって、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、成長因子または他のシグナル分子である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、Ｇタンパク質共役型受容体である。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、米国特許第７，３００，７７３号において開示されるポリペプチドのいずれかである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、真核宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、哺乳類宿主細胞によって産生される。
略語：
ＡＥＸ：    陰イオン交換クロマトグラフィー
ＣＥＸ：    陽イオン交換クロマトグラフィー
ＣＶ：      カラム体積
ＤＦ：      ダイアフィルトレーション
ＤｏＥ：    実験設計
ＨＩＣ：    疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＨＭＷ：    高分子量凝集体
ＬＭＷ：    低分子量凝集体
ＨＣＰ：    宿主細胞タンパク質
ピーク１：  切断されたエタネルセプト
ピーク２：  未変性エタネルセプト
ピーク３：  誤って折り畳まれたエタネルセプト
ＬＲＶ：    Ｌｏｇ１０（負荷液中の総不純物／溶出液中の総不純物）
ＣＶ：      カラム体積
ＰＳ：      パイロット規模
ＯＤ：      吸光度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）
ＴＳＡ：    総シアル酸
ＵＦ：      限外濾過
ＷＦＩ：    注入用水
【００９０】
当業者内の知見を適用することによって、過度の実験を伴わず、本発明の一般概念から逸脱することなく、本発明の実施例は、様々な応用に向けた、改変及び／または適応が可能である。したがって、そのような適応及び改変は、本明細書に記載の教示及びガイダンスに基づき、開示の実施例に相当するものの意図及び範囲の範疇であると意図する。
【実施例】
【００９１】
実施例１
ＳＥ  Ｈｉｃａｐカラムの使用を介したＴＳＡの濃縮及び不純物の除去
概要
同一初期混合物中に存在する、シアルリル化を減少水準または低下水準で有する組換えポリペプチドと比較して、シアルリル化を濃縮水準または増加水準で有する組換えポリペプチドを、単離／精製／濃縮するために、クロマトグラフィー工程を開発した。
【００９２】
この実施例で利用した組換えポリペプチドは、ＴＮＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプトである。組換えポリペプチドの高度シアリル化型は、治療上有利なタンパク質アイソフォームの非常に望ましいクラスになり得る。本実施例は、許容可能な生成物回収率及び生成物収率を維持しながら、組換えポリペプチドの、回収された／単離された高度シアリル化型の含量の濃縮を可能にする堅固な工程の開発について説明するものである。この特定の実施例において、工程を開発し、ＳＥ  Ｈｉｃａｐクロマトグラフィーを、Ｆｃ融合タンパク質の高度シアリル化型の回収／単離に使用した。
【００９３】
そのＴＳＡ濃縮効力、ピーク３及び凝集体の低減能力、堅固なＤＮＡクリアランス能力、及びその他の工程段階との接続容易性の理由から、フロースルーモードにおいて利用するＳＥ  Ｈｉｃａｐを、第一選択とした。ＳＥ  Ｈｉｃａｐは、そのｐＩ未満のｐＨで実行されるとき、より正に荷電した（シアリル化が少ない）タンパク質を保持しながら、負に荷電したシアリル化エタネルセプトを、フロースルーへと静電気的に反発してはじき出すことによって、ＴＳＡを濃縮する。このカラムでは、負荷ｐＨ、負荷伝導率、及び負荷比が、すべて重要かつ重大な意味を有するパラメーターであることが明らかとなった。試験した条件下で、工程温度、工程流速、及び樹脂リガンド容量が、収率及び生成物属性に対する影響は、無視でき、重要ではない工程パラメーターであると判断した。
【００９４】
物質
溶液：緩衝液のｐＨ及び伝導率は、それぞれ使用前に検証した。
【００９５】
負荷物質及び吸着剤：資料はすべて−７０℃で凍結し、クロマトグラフィー開始に先立ち、室温で解凍した。すべての実験で、負荷ｐＨは、１Ｍの酢酸、１Ｍのクエン酸、または２．４Ｍのトリス塩基を使用して調整した。その後、１ＭのＮａＣｌを含有する酢酸緩衝液またはクエン酸緩衝液を使用して負荷伝導率を調整した。負荷伝導率が高すぎた場合は、ＲＯ／ＤＩ水を添加した。
【００９６】
クロマトグラフィー方法
カラムはすべて２０％の圧縮係数で充填し、充填床の高さを１５ｃｍまたは１６ｃｍとした。クロマトグラフィー段階は、およそ２２℃で、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＵｎｉｃｏｒｎインターフェイスソフトウェア（バージョン５．１１）を使用し、ダウンフローモードにおいて実施した。フロースルーモードで作動する開発試験のすべてを通して、クロマトグラフィー方法は、平衡化段階、負荷段階、非結合タンパク質除去を行う洗浄段階、分析のために不純物除去を行う剥離段階、１ＮのＮａＯＨを使用した浄化段階、及び０．１ＮのＮａＯＨ中における保存段階から一般になる。この段階の浄化条件及び保存条件は試験せず、製造者の推奨事項に従った。別段の記載がない限り、洗浄画分は、フロースルー画分と共にプールした。フロースルー画分、洗浄画分、及び剥離画分は、収率及び生成物属性を分析した。
【００９７】
樹脂選別、カラム接続、及びマトリックスの緩衝方法
静電結合容量計算を使用して、それらのタンパク質結合能力で候補ＣＥＸ樹脂を選別した。これは、候補樹脂と、平衡化緩衝液とを緩衝液交換した後、エタネルセプトを含む組成物を、一晩振とう機上で既知体積の候補樹脂と共にインキュベートすることによって、決定した。樹脂及びタンパク質の混合物を遠心沈降させ、上清のＡ２８０を続いて測定した。その後、高静電容量樹脂をカラムに充填し、結合／溶出モードまたはフロースルーモードでさらに評価した。生成物収率、凝集体、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ＴＳＡ、ＨＣＰ、及びＤＮＡを測定し、分離性能を計測した。溶出の間、生成物関連不純物の分離が不十分であった高静電容量樹脂は、補足段階としてさらに評価したが、洗練段階として除外した。しかしながら、不純物の分離が良かった低容量樹脂は、ＳＥ  Ｈｉｃａｐの場合と同様に、フロースルーモードでさらに評価した。
【００９８】
ＳＥ  Ｈｉｃａｐを、特にそのＴＳＡ濃縮能力、ならびに凝集体、ＤＮＡならびに幾分かのピーク３及びＨＣＰの除去能力で選択した。さらに、フロースルーモードにおけるＳＥ  Ｈｉｃａｐは、それ以前及びその後に続く精製段階との接続に課題はなく、同時にいかなる中間段階も必要としなかった。酢酸緩衝液が、この工程において使用するのに最適な緩衝液であると決定した。
【００９９】
ＤＯＥ方法
ＤｏＥ（中心複合）試験を設計し、負荷比、負荷伝導率、及び負荷ｐＨの特徴付けを行い、同時に第二のＤｏＥ（選別）を設計し、工程温度、樹脂容量、及び工程流速の特徴付けを行った。両ＤｏＥ試験は、Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ（バージョン８．０．６）を使用して設計した。負荷比、負荷伝導率、及び負荷ｐＨを、第一のＤｏＥにおける変数として選んだ。なぜなら、先の試験により、それらが、生成物収率及び生成物属性に対して影響を与えることが示されたためである。工程温度、樹脂容量、及び工程流速は、別々のＤｏＥにおいて評価した。なぜなら、先の試験により、こうしたパラメーターは、生成物収率及び生成物属性に対して最小の効果しか与えないことが示されたからである。
【０１００】
データに対する回帰分析を実施するため、結果をＤｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔに入力し、正規分布及び異常値をそれぞれＢｏｘ  Ｃｏｘ及びＥｘｔｅｒｎａｌｌｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔｉｚｅｄ  Ｒｅｓｉｄｕａｌｓを介して最初に分析した。データが、正規分布になっていなければ、ソフトウェアの推奨事項に基づき、変換を実施した（例えば、ｌｏｇ１０）。モデルを有意に損なう異常値はすべて分析から排除した。その後、変数減少機能または手動変数減少機能を使用し、有意ではないパラメーター（ｐ値＞０．０５）を除去し、モデルを単純化した。少数例では、モデルにおいて、有意ではないパラメーターを保持し、Ｒ２及び適合の欠如を強化した。すべてのモデルは、主要な効果及び２水準相互作用のみが有意であり、交絡しないとする想定で構築した。
【０１０１】
分析方法
すべての実験に利用した分析方法を、表２にまとめた。出発物質は、十分に純粋であり、ＯＤ２８０法を使用する生成物収率の測定は、ＳＥ  Ｈｉｃａｐカラムに対して、的確なものである。
【表２】
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【０１０２】
ＤＯＥ１（中心複合）
負荷比、負荷ｐＨ、及び負荷伝導率を特徴付けるＤｏＥ試験は、試験設計から何ら逸脱することなく、成功裏に完了した。制御条件下の典型的なＳＥ  Ｈｉｃａｐクロマトグラムは、負荷の間にどのようにＵＶが前ピークを伴って偏向し、どのようにＵＶが減少し、その後、安定水準に達する前にどのようにＵＶが増加するかを示す（図１）。弱いタンパク質結合は、不十分なＴＳＡ濃縮に繋がり得ることが明らかとなった（データ未掲載）。強いタンパク質結合は、生成物の喪失に繋がり得ることが明らかとなった（データ未掲載）。
【０１０３】
低負荷ｐＨ及び低負荷伝導率は、生成物収率を減少させ、ＴＳＡ含量を濃縮し、ピーク１不純物を増加させ、凝集体水準を減少させ、そして単量体含量を増加させた（表３、及び表４も併せて参照）。低負荷ｐＨが、高負荷伝導率のこうした結果に対する効果を相殺でき、逆もまた同様であるという点で、負荷ｐＨ及び負荷伝導率は、相互作用を有する。負荷伝導率または負荷ｐＨが増加するにつれ、ピーク２水準は、ピーク３水準が増加した量だけ減少した（表３、及び表４も併せて参照）。これは、負荷伝導率及び負荷ｐＨを変えることで、ピーク１、２、及び３の相対的な分布を変更できること示す。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１０４】
高負荷伝導率または高負荷ｐＨは、ＤＮＡクリアランスを減少させた（表５）。しかしながら、負荷ｐＨは、伝導率と比較し、ＤＮＡクリアランスをより大幅に減少させた。また、高負荷ｐＨは、ＨＣＰクリアランスも減少させた（表５）。
【０１０５】
低負荷ｐＨ及び低負荷伝導率は、（すべての不純物と比較して）純度水準も減少させた（表５）。低負荷ｐＨが、純度水準に対する高負荷伝導率の効果を相殺できるという点で、負荷ｐＨ及び負荷伝導率は、相互作用を有する。負荷伝導率または負荷ｐＨが増加するにつれて、最高単一不純物水準（ｈｉｇｈｅｓｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ｌｅｖｅｌ）及びＬＭＷは、減少した（表５）。
【０１０６】
負に荷電した酸性アイソフォームは、低伝導率及び低ｐＨにおいて濃縮されたが、塩基性アイソフォーム及び主アイソフォームが、高伝導率または高ｐＨにおいてカラムから脱着したとき、濃度が低下した（表５）。したがって、負荷ｐＨが、アイソフォームに対する負荷伝導率の効果を相殺できるという点で、負荷ｐＨ及び負荷伝導率は、相互作用を有する。
【０１０７】
こうした実験は、ＳＥ  Ｈｉｃａｐのための作動空間は、標的負荷ｐＨが、５．５〜５．８の範囲を有する５．６、標的負荷伝導率が、９．５〜１１ｍＳ／ｃｍの範囲を有する１０．０ｍＳ／ｃｍ、及び標的負荷比が、３３〜５４ｍｇ／ｍＬ樹脂の範囲を有する４１ｍｇ／ｍＬ樹脂であるべきことを示している。こうした負荷条件であれば、フロースルー／洗浄プールが、１５〜１６．５モル／モルのＴＳＡ水準、６％未満の凝集体水準、６％未満のピーク１水準、約１．５ＬＲＶのＤＮＡクリアランス、及び５５〜８０％という十分な生成物収率を有すること確実にするであろう。
【０１０８】
ＤｏＥ２（選別）
工程温度、樹脂容量、及び工程流速を特徴付けるＤｏＥ試験は、プロトコールから何ら逸脱することなく、成功裏に完了した。このＤｏＥ試験から得られたデータを表６に示した。最も有意な変数は、樹脂容量及び工程温度であったが、それらの生成物収率及び生成物属性に対する影響は無視できた。したがって、工程は、堅固であって、温度、樹脂容量、及び流速の幅広い作動範囲に耐えることができる。
【表６】
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【０１０９】
結論
ＳＥ  Ｈｉｃａｐフロースルークロマトグラフィーは、第二精製段階として成功裏に開発され、標的作動条件下で、５５〜７５％（Ａ２８０）の高生成物回収率を維持しながら、ＴＳＡ水準を１５〜１６．５モル／モルに濃縮し、凝集体を約１２％減少させ、そしてＤＮＡを約１．５ＬＲＶ低下させた。こうした重要かつ重大な意味を有する生成物属性を満たすためには、ＳＥ  Ｈｉｃａｐ向けの推奨作動空間は、ＤｏＥ結果に基づき、標的負荷ｐＨが、５．６±０．２、標的負荷伝導率が、９．５〜１１ｍＳ／ｃｍの範囲を有する１０．０ｍＳ／ｃｍ、そして標的負荷比が、４１ｍｇ／ｍＬ樹脂±８ｍｇ／ｍＬ樹脂となるであろう。工程温度、工程流速、及び樹脂容量などの他の工程パラメーターの生成物収率及び生成物属性に対する影響は、無視できるものであった。
【０１１０】
実施例２
ＣＥＸ樹脂を使用したＴＳＡの濃縮
ＳＥ  Ｈｉｃａｐ  ＣＥＸ樹脂向けの濃縮パラメーターを決定したので、他のＣＥＸ樹脂向けに、凝集体及び／または誤って折り畳まれた型を除去しながらＴＳＡを濃縮するために必要な作動条件を決定した。試験した樹脂は、ＧＥ  ＳＰＸＬ、ＧＥ  ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｓ、Ｔｏｓｏｈ  Ｇｉｇａｃａｐ  ＣＭ、Ｔｏｓｏｈ  Ｇｉｇａｃａｐ  Ｓ−６５０、及びＢｉｏＲａｄ  Ｎｕｖｉａ  Ｓである。それぞれのカラム向けの最終的な作動条件は、以下の表７において参照可能である。
【表７】
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【０１１１】
それぞれのカラムによるＴＳＡ濃縮の比較は、生成物収率を５０％に規準化した結果として、図２において参照可能である。それぞれのカラムによって除去された凝集体及び誤って折り畳まれた型の比較は、生成物収率を５０％に規準化した結果として、図３において参照可能である。
【０１１２】
＊＊＊
本発明は、本発明の個々の態様の単一の実例を意図して説明した特定の実施形態による範囲に限定されず、機能的に相当する何らかの組成物または方法は、本発明の範囲内である。実際、本明細書で説明し、示したものに加え、本発明の様々な改変が、先に記載した説明及び付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることを意図する。
【０１１３】
本明細書において言及されるすべての文書、論文、出版物、特許、及び特許出願は、個々の出版物または特許出願を、それぞれ参照によって組み込むことを具体的かつ個々に示した場合と同程度に、参照によって、本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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