(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の流入口および第１の流出口と、細胞を収容する収容空間を形成する内壁面とを有し、前記内壁面が、複数の凹部および複数の凸部の少なくとも一方を含む非平坦構造を有する細胞培養容器と、
前記第１の流出口と前記第１の流入口とを接続する第１の流路と、
前記第１の流路内に設けられ、前記細胞培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器であって、前記第１の流出口に接続された第２の流入口および前記第１の流入口に接続された第２の流出口を有する第１の貯留容器と、
前記第２の流出口と前記第１の流入口との間に位置する前記第１の流路内の第１の部位と、前記第２の流入口と前記第１の流出口との間に位置する前記第１の流路内の第２の部位と、を接続する第２の流路と、
前記第２の流路内に設けられ、前記第１の部位を経由して前記第１の流路から流入する、前記細胞培養容器で培養された細胞の塊である細胞塊を分割する分割処理を行い、前記分割処理が施された細胞を前記第２の部位を経由して前記第１の流路内に流出させる分割処理部と、
前記第１の流路内に培地を供給する培地供給部と、
を更に含む細胞培養装置。
【請求項２】
前記第１の流路を形成する配管を更に含み、
前記配管の内壁面が、複数の凹部および複数の凸部の少なくとも一方を含む非平坦構造を有する
請求項１に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器、細胞培養装置および細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
接着培養に用いられる、培養細胞の足場を構成する細胞培養リアクターまたは細胞培養基板に関し、例えば以下の技術が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、多角形状の貫通孔の一辺の長さ若しくは直径が５０μｍ〜５００μｍの多孔構造部を各々有する複数の細胞培養担体基板を、細胞培養槽内に間隔をおいて積層することによって構成される細胞培養リアクターが記載されている。
【０００４】
また、特許文献２には、異なる種類の組織が接触配置されており、且つ、網状構造或いは多孔質構造を有する固形支持体を備えた組織接触部と、この組織接触部を介して分画された培地流通部を有する培養チャンバーと、培地流通部に培地を流通循環させる循環機構部とを有する二層バイオリアクターが記載されている。この二層バイオリアクターにおいて、循環機構部の作動によって培養チャンバーの各々の培地流通部に互いに異なる培地が供給され、組織接触部において階層構造を有する組織が培養される。
【０００５】
また、特許文献３には、基材の表面に、深さ１００μｍ〜５００μｍ、内径１００μｍ〜１０００μｍの凹陥部が複数設けられた細胞培養用基材が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１７２５３３号公報
【特許文献２】特開２００７−５４０２６号公報
【特許文献３】特開２０１２−２４９５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
例えば、肝疾患や心疾患などを、細胞移植によって治療するためには、１×１０９個以上の分化細胞の移植がひとりの患者に必要であると考えられており、これを実現するためには、ＥＳ細胞（Embryonic Stem cell）やｉＰＳ細胞（induced Pluripotent Stem cell）などのヒト多能性幹細胞の大量培養技術の開発が不可欠である。多能性幹細胞を、従来の接着培養法によって最適環境を維持しながら安定的に大量培養するためには、細胞の接着面積を大規模化することが必要となり、構造面およびコスト面において困難である。このように、従来の接着培養法では、大量培養は非効率となってしまう。
【０００８】
接着培養法における上記の問題を解決する手法として、細胞を培養液中に浮遊させた状態で培養する浮遊培養法が挙げられる。しかしながら、従来の浮遊培養においては、複数の細胞の凝集体である細胞塊（スフェアまたはスフェロイドともいう）同士の融合という問題がある。すなわち、多能性幹細胞の培養においては、細胞塊のサイズが過大となると、細胞塊同士が融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。
【０００９】
本発明は、浮遊培養において、細胞塊同士の融合を抑制することができる、細胞培養容器、細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る細胞培養容器は、細胞を収容する収容空間を形成する内壁面を有し、内壁面に、前記収容空間の内側に向けて突出し且つ先端側に向けて徐々に幅が狭くなるテーパ形状の複数のピラーが設けられている。
【００１１】
複数のピラーは、細胞培養容器の内壁面への細胞の接着を阻害する大きさおよび間隔で設けられていることが好ましい。複数のピラーは、内壁面が平坦構造を有する場合と比較して、細胞の内壁面との接着面積が減少する大きさおよび間隔で設けられていることが好ましい。細胞培養容器は、内壁面の全体に複数のピラーを有していてもよい。
【００１２】
複数のピラーは、規則配列されていることが好ましく、例えば、ハニカム状に配列されていてもよい。
【００１３】
複数のピラーにおける隣接するピラーとの中心間距離の変動係数が０．１以下であることが好ましい。また、複数のピラーの各々の先端の、細胞培養容器の内壁面と平行な方向における最長部の長さが、０．０１μｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。
【００１４】
細胞培養容器の内壁面は、複数のピラーを有するプラスチック素材で形成されていてもよい。プラスチック素材は、疎水性ポリマーを含み得る。細胞培養容器の収容空間は密閉されていることが好ましい。細胞培養容器は、表面に複数のピラーを有するプラスチックフィルムを貼り合せて構成されたものであってもよい。
【００１５】
本発明に係る細胞培養装置は、第１の流入口および第１の流出口と、細胞を収容する収容空間を形成する内壁面とを有し、内壁面が、複数の凹部および複数の凸部の少なくとも一方を含む非平坦構造を有する細胞培養容器と、第１の流出口と第１の流入口とを接続する第１の流路と、第１の流路内に設けられ、細胞培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器であって、第１の流出口に接続された第２の流入口および第１の流入口に接続された第２の流出口を有する第１の貯留容器と、第２の流出口と第１の流入口との間に位置する第１の流路内の第１の部位と、第２の流入口と第１の流出口との間に位置する第１の流路内の第２の部位と、を接続する第２の流路と、第２の流路内に設けられ、第１の部位を経由して第１の流路から流入する、細胞培養容器で培養された細胞の塊である細胞塊を分割する分割処理を行い、分割処理が施された細胞を第２の部位を経由して第１の流路内に流出させる分割処理部と、第１の流路内に培地を供給する培地供給部と、を更に含む。
【００１６】
細胞培養装置は、第１の流路を形成する配管を更に含んでいてもよく、配管の内壁面が、複数の凹部および複数の凸部の少なくとも一方を含む非平坦構造を有していてもよい。
【００１７】
本発明に係る細胞培養方法は、細胞を収容する収容空間を形成する内壁面を有し、内壁面に、収容空間の内側に向けて突出し且つ先端側に向けて徐々に幅が狭くなるテーパ形状の複数のピラーが設けられた細胞培養容器の収容空間に、細胞を培養液に浮遊させた状態で収容して細胞の培養を行うものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞塊同士の融合を抑制することができる、浮遊培養に用いられる細胞培養容器、細胞培養装置および細胞培養方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養容器の構成を示す平面図である。
【図２】図１における２−２線に沿った断面図である。
【図３】図３（ａ）は、細胞培養容器の内壁面の構造を示す平面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）における３ｂ−３ｂ線に沿った断面図である。
【図４】図４（ａ）〜図４（ｄ）は、ハニカム状に配列された複数の凹部を含む非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムの製造方法を示す断面図である。
【図５】複数の凹部を表面に有するプラスチックフィルムを走査型電子顕微鏡を用いて撮影した写真である。
【図６】図６（ａ）は、細胞培養容器の内壁面が平坦である場合における細胞塊の状態を模式的に示す図である。図６（ｂ）は、細胞培養容器の内壁面が複数の凹部を含む非平坦構造を有する場合における細胞塊の状態を模式的に示す図である。
【図７】図７（ａ）は、細胞培養容器の内壁面に形成される非平坦構造の他の例を示す平面図である。図７（ｂ）は、図７（ａ）における７ｂ−７ｂ線に沿った断面図である。図７（ｃ）は、図７（ｂ）において破線で囲まれた領域Ａの拡大図である。
【図８】ハニカム状に配列された複数の凸部を含む非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムの製造方法を示す図である。
【図９】複数の凸部を表面に有するプラスチックフィルムを走査型電子顕微鏡を用いて撮影した写真である。
【図１０】図１０（ａ）〜図１０（ｅ）は、それぞれ、実験１〜実験５に係る細胞培養容器を用いた場合の培養５日目における細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
【図１１】図１１（ａ）および図１１（ｂ）は、それぞれ比較実験１および比較実験２に係る細胞培養容器を用いた場合の培養５日目における細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
【図１２】本発明の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。
【図１３】本発明の実施形態に係る各配管の内部構造の一例を示す断面図である。
【図１４】本発明の実施形態に係る細胞培養装置が継代処理を実施する場合における、細胞および培地等の流れを示す図である。
【図１５】本発明の実施形態に係る細胞培養装置が培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図１６】本発明の実施形態に係る細胞培養装置が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図１７】本発明の実施形態に係る細胞培養装置が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図１８】本発明の実施形態に係る細胞培養装置が凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。
【図１９】本発明の実施形態に係る制御部が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態の一例を図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
【００２１】
（細胞培養容器）
図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養容器２０の構成を示す平面図である。細胞培養容器２０は、一例として、可撓性およびガス透過性を有する２枚のプラスチックフィルムを、ヒートシール（熱圧着）などの手法により貼り合せることにより形成される。細胞培養容器２０は、その外縁に沿って形成されたシール部２０１を有し、シール部２０１の内側に形成される、細胞を収容する収容空間２０３は密閉されている。すなわち、本実施形態において、細胞培養容器２０は、プラスチックで構成されたバッグの形態を有しており、シングルユースの細胞培養容器として好適に使用することが可能である。細胞培養容器２０をシングルユースとすることにより、交差汚染のリスクを排除するとともに、滅菌や洗浄およびそれらのバリデーションの実施が不要となる。なお、細胞培養容器２０は、１枚のプラスチックフィルムを折り返して、貼り合せて構成してもよい。また、プラスチックフィルムは、細胞培養容器２０内で培養される細胞の目視による観察を可能とするために、可視光を透過することが好ましい。
【００２２】
細胞培養容器２０を構成するプラスチックフィルムは、例えば、ビニル重合ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルカルバゾール、ポリテトラフルオロエチレンなど）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸など）、ポリラクトン(例えばポリカプロラクトンなど)、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロンやポリアミド酸など）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリブタジエン、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、およびセルロースアシレート（トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート）などを材料とするものであってもよい。これらのポリマーは、溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマーとしてもよいし、コポリマーやポリマーブレンドの形態をとってもよい。また、これらのポリマーは、必要に応じて２種以上のポリマーの混合物として用いてもよい。光学用途に使う場合には、例えば、セルロースアシレート、環状ポリオレフィンなどが好ましい。
【００２３】
細胞培養容器２０は、一例として、図１における上端部近傍に流入口２１を有し、図１における下端部近傍に流出口２２を有する。細胞培養容器２０内への細胞懸濁液や培養液の注入は、流入口２１を介して行うことができ、細胞培養容器２０からの細胞懸濁液や培養液の排出は、流出口２２を介して行うことができる。本実施形態において、流入口２１および流出口２２は、シール部２０１を貫くようにして細胞培養容器２０本体に挿入されたコネクタ２１ａおよび２２ａによって構成されている。このように、細胞培養容器２０の収容空間２０３は、流入口２１および流出口２２を介してのみ外部と連通する構成を有しており、高い密閉性が維持されている。これにより、収容空間２０３と大気との接触が制限され、シャーレやフラスコなどを用いる場合と比較して細菌汚染のリスクが低減される。なお、流入口２１および流出口２２の配置は、適宜変更することが可能である。また、シール部２０１には、収容空間２０３から離間して貫通孔２０４が設けられている。貫通孔２０４は、細胞培養容器２０の支持に使用することができる。
【００２４】
図２は、図１における２−２線に沿った断面図である。図２に示すように、細胞培養容器２０は、内壁面２０５によって形成される収容空間２０３内において、細胞Ｃを培養液Ｌ中に浮遊させた状態で培養する浮遊培養に好適に用いることができる。すなわち、培養期間中、収容空間２０３内に浮遊状態で存在する細胞Ｃは、細胞培養容器２０の内壁面２０５に囲まれる。なお、培養液Ｌ中で浮遊していない細胞が一部存在していても、多数の細胞が浮遊状態で存在している場合には、浮遊培養に含まれる。
【００２５】
図３（ａ）は、細胞培養容器２０の内壁面２０５の構造を示す平面図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）における３ｂ−３ｂ線に沿った断面図である。
【００２６】
細胞培養容器２０の内壁面２０５は、細胞培養容器２０の外壁面２０６側に向けて凹んだ複数の凹部２１０を含む非平坦構造を有する。本実施形態において、複数の凹部２１０は、細胞培養容器２０を構成するプラスチックフィルム自体に形成されている。また、本実施形態において、複数の凹部２１０は、細胞培養容器２０の内壁面２０５の全域に亘って形成されている。すなわち、内壁面２０５の全体が非平坦構造を有し、収容空間２０３の全体が非平坦構造で囲まれている。なお、「内壁面の全体が非平坦構造を有する」とは、内壁面２０５の大部分（例えば９０％以上）が非平坦構造を有することを意味し、例えば、収容空間２０３内に収容された細胞が接触し得ない一部の領域において、非平坦構造を有しない場合も含まれる。
【００２７】
本実施形態において、複数の凹部２１０は、規則配列されている。具体的には、複数の凹部２１０は、ハニカム状に配列（六方最密配列）されている。すなわち、図３（ａ）における第ｎ列に配列された凹部２１０の各々は、第（ｎ＋１）列に配列された、互いに隣接する凹部２１０間の列方向の中央に対応する位置に配置されている。複数の凹部２１０をハニカム状に規則配列させたプラスチックフィルムは、後述する方法で製造することが可能であり、他の配列とする場合と比較して製造コストを抑えることができる。なお、複数の凹部２１０は、マトリックス状（格子状）に配列されていてもよい。すなわち、複数の凹部２１０は、列方向および列方向と直交する行方向に沿って配列されていてもよい。また、複数の凹部２１０の配列をランダムとすることも可能であるが、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される凹部２１０の密度が不均一となった場合には、培養される細胞の均質性に悪影響を与えるおそれがあることから、複数の凹部２１０は、規則配列されることが好ましい。
【００２８】
凹部２１０の形状は、特に限定されるものではないが、本実施形態において、凹部２１０の各々は、球体の一部を切り取った球欠形状を有する。すなわち、凹部２１０の各々は、細胞培養容器２０の内壁面において円形の開口部２１０ａを形成している。凹部２１０の各々の形状を球欠形状とすることにより、後述する製造方法を使用することが可能となり、他の形状とする場合と比較して製造コストを抑えることができる。なお、凹部２１０の各々の形状は、円柱形状または角柱形状などであってもよい。
【００２９】
複数の凹部２１０は、細胞培養容器２０で培養される細胞の、内壁面２０５への接着を阻害する大きさおよび間隔で設けられている。複数の凹部２１０は、内壁面２０５が平坦構造を有する場合と比較して、細胞の内壁面２０５との接着面積が減少する大きさおよび間隔で設けられることが好ましい。すなわち、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される非平坦構造は、凹部２１０の開口部２１０ａにおける径Ｄｈ（以下、開口径Ｄｈという）および互いに隣接する凹部２１０の間に延在する平坦部の幅Ｗが、培養期間中に細胞培養容器２０内で形成される細胞塊Ｓの径Ｄｓよりも小さくなるように構成されている。凹部２１０の開口径Ｄｈを、細胞塊Ｓの径Ｄｓよりも小さくすることで、細胞塊Ｓの凹部２１０内への侵入を防止することができ、これにより、凹部２１０の内側の壁面への細胞塊Ｓの接着を阻害することが可能となる。また、互いに隣接する凹部２１０の間に延在する平坦部の幅Ｗを、細胞塊Ｓの径Ｄｓよりも小さくすることで、上記平坦部への細胞塊Ｓの接着を阻害することができる。なお、開口径Ｄｈは、凹部２１０によって内壁面２０５に形成される開口部２１０ａの、内壁面２０５と平行な方向における最長部の長さである。細胞塊Ｓの径Ｄｓは、細胞塊Ｓの最長部の長さである。
【００３０】
本実施形態に係る細胞培養容器２０での培養期間中における細胞塊Ｓの径Ｄｓの想定範囲は、例えば、１００μｍ以上４００μｍ以下である。上記のサイズの細胞塊Ｓに対して、凹部２１０の開口径Ｄｈを、例えば、１μｍ以上８０μｍ以下とすることができる。凹部２１０の開口径Ｄｈを１μｍ以上とすることで、細胞塊Ｓからみた細胞培養容器２０の内壁面２０５は、実質的な非平坦構造となり、細胞培養容器２０の内壁面２０５への細胞塊Ｓの接着を阻害する機能が発揮される。一方、凹部２１０の開口径Ｄｈを８０μｍ以下とすることで、細胞塊Ｓの凹部２１０内への侵入を阻害することができ、これにより、凹部２１０の内側の壁面への細胞塊Ｓの接着を阻害することが可能となる。
【００３１】
また、互いに隣接する凹部２１０の中心間距離Ｐ１の変動係数は、０．１以下であることが好ましい。変動係数は、母集団の標準偏差を算術平均で割った値であり、当該母集団の相対的なばらつきの度合いを示す指標である。互いに隣接する凹部２１０の中心間距離Ｐ１の変動係数を小さくする程、細胞培養容器２０の内壁面２０５における凹部２１０の密度の偏りが小さくなる。互いに隣接する凹部２１０の中心間距離Ｐ１の変動係数を０．１以下とすることで、凹部２１０の密度が均一化され、細胞培養容器２０で培養される細胞の均質性が確保される。互いに隣接する凹部２１０の中心間距離Ｐ１は、例えば、１．５μｍ以上１６０μｍ以下とすることができる。
【００３２】
以下において、細胞培養容器２０を構成する、非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムの製造方法の一例について説明する。図４（ａ）〜図４（ｄ）は、ハニカム状に配列された複数の凹部２１０を含む非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムの製造方法を示す断面図である。
【００３３】
はじめに、細胞培養容器２０を構成するプラスチックフィルムの材料となる疎水性を有するポリマーを溶媒に溶解した塗布液を用意する。続いて、この塗布液をガラスまたは高分子化合物などによって構成される支持体３００の上に塗布して支持体３００上に塗布膜３１０を形成する（図４（ａ））。
【００３４】
次に、加湿空気を塗布膜３１０の表面全体に亘って流すことにより、結露現象によって塗布膜３１０上に水滴３２０を形成する（図４（ｂ））。ここで、塗布膜３１０の近傍を流れる加湿空気の露点Ｔｄと、塗布膜３１０の表面温度Ｔｓとの差分ΔＴ（＝Ｔｄ−Ｔｓ）が、下記の（１）式を満たすように、ＴｄおよびＴｓの少なくとも一方を制御する。
３℃≦ΔＴ≦３０℃・・・（１）
【００３５】
次に、加湿空気の供給を継続することにより水滴３２０を成長させる。水滴３２０の各々は、互いに略同一の大きさに成長する。また、塗布膜３１０に含まれる溶媒の蒸発によりポリマーが析出する。水滴３２０は、溶媒の蒸発に伴って、毛細管力によりハニカム状配列をなすように規則的に配列されるとともに、塗布膜３１０の中に入り込む（図４（ｃ））。
【００３６】
次に、溶媒の蒸発に並行して、或いは溶媒を蒸発させた後に、水滴３２０を蒸発させる。これにより、塗布膜３１０における水滴３２０が入り込んだ部分が凹部２１０として残る（図４（ｄ））。その後、塗布膜３１０を支持体３００から剥離することによって表面に複数の凹部２１０を含む非平坦構造を有するプラスチックフィルムが得られる。図５は、上記の方法を用いて製造された、複数の凹部を表面に有するプラスチックフィルムを走査型電子顕微鏡を用いて撮影した写真である。
【００３７】
なお、凹部２１０の開口径Ｄｈの調整は、例えば、加湿空気に含まれる水蒸気の供給量や、水滴３２０を蒸発させるタイミングを変化させて水滴３２０の大きさを調整することで行うことが可能である。なお、上記したハニカム状に配列された複数の凹部を表面に有するプラスチックフィルムの製造方法の詳細は、例えば、特開２００７−２９１３６７号公報および特開２００９−２５６６２４号公報に記載されている。上記の製造方法によれば、水滴３２０を利用して非平坦構造のパターニングが行われるので、ハニカム状に配列された均一サイズの複数の凹部２１０を型やマスクを使用することなくプラスチックフィルム上に形成することができる。これにより、製造コストを抑制することができる。なお、細胞培養容器２０を構成する非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムを、エッチング、サンドブラストまたはプレス成形等の他の方法を用いて製造することも可能である。
【００３８】
図６（ａ）は、細胞培養容器２０の内壁面２０５が平坦である場合における細胞塊Ｓの状態を模式的に示す図である。細胞培養容器２０の内壁面２０５が平坦である場合には、細胞培養容器２０内を浮遊する細胞塊Ｓは、細胞培養容器２０の内壁面２０５に接着しやすく、接着した場合には、内壁面２０５に沿って広がるように変形し、内壁面２０５に沿って増殖する。これにより、内壁面２０５に接着した他の細胞塊Ｓとの融合が誘発される。細胞塊同士が融合すると、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。このため、浮遊培養においては、細胞塊同士の自発的な融合を抑制することが好ましい。
【００３９】
図６（ｂ）は、細胞培養容器２０の内壁面２０５が複数の凹部２１０を含む非平坦構造を有する場合における細胞塊Ｓの状態を模式的に示す図である。細胞培養容器２０の内壁面２０５が非平坦構造を有する場合には、細胞塊Ｓと内壁面２０５との接触面積が小さくなり、細胞塊Ｓが安定的に接着し得る領域がなくなるので、細胞塊Ｓの内壁面２０５への接着が阻害される。これにより、培養期間中、細胞塊Ｓの形状は維持され、細胞塊同士の融合が抑制される。細胞塊同士の融合が抑制されることにより、細胞の培養効率の低下を抑制することができ、また、多能性幹細胞の培養においては、細胞の分化を抑制することが可能となる。本実施形態に係る細胞培養容器２０においては、内壁面２０５の全体が非平坦構造を有し、収容空間２０３の全体が非平坦構造で囲まれているため、収容空間２０３内に収容された細胞塊同士の融合を抑制する効果が促進される。
【００４０】
図７（ａ）は、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される非平坦構造の他の例を示す平面図である。図７（ｂ）は、図７（ａ）における７ｂ−７ｂ線に沿った断面図である。図７（ｃ）は、図７（ｂ）において破線で囲まれた領域Ａの拡大図である。
【００４１】
細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される非平坦構造は、図７に示すように、細胞培養容器２０の内側に向けて突出した複数の凸部（ピラー）２２０を含んで構成されていてもよい。本実施形態において、複数の凸部２２０は、細胞培養容器２０を構成するプラスチックフィルム自体に形成されている。本実施形態において、凸部２２０は、細胞培養容器２０の内壁面２０５の全域に亘って形成されている。すなわち、内壁面２０５の全体が非平坦構造を有し、収容空間２０３の全体が非平坦構造で囲まれている。
【００４２】
本実施形態において、複数の凸部２２０は、規則配列されている。具体的には、複数の凸部２２０は、ハニカム状に配列されている。複数の凸部２２０をハニカム状に規則配列させたプラスチックフィルムは、後述する方法で製造することが可能であり、他の配列とする場合と比較して製造コストを抑えることができる。なお、複数の凸部２２０は、マトリックス状（格子状）に配列されていてもよい。すなわち、複数の凸部２２０は、列方向および列方向と直交する行方向に沿って配列されていてもよい。また、複数の凸部２２０の配列をランダムとすることも可能であるが、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される凸部２２０の密度が不均一となった場合には、培養される細胞の均質性に悪影響を与えるおそれがあることから、複数の凸部２２０は、規則配列されることが好ましい。
【００４３】
凸部２２０の形状は、特に限定されるものではないが、本実施形態において、凸部２２０の各々は、凸部２２０の先端側に向けて徐々に幅が狭くなるテーパ形状を有している。凸部２２０の各々は、円柱形状または角柱形状などであってもよい。
【００４４】
複数の凸部２２０は、細胞培養容器２０で培養される細胞の、内壁面２０５への接着を阻害する大きさおよび間隔で設けられている。複数の凸部２１０は、内壁面２０５が平坦構造を有する場合と比較して、細胞の内壁面２０５との接着面積が減少する大きさおよび間隔で設けられることが好ましい。すなわち、凸部２２０の先端部における径Ｄｐ（以下、先端径Ｄｐと称する）および互いに隣接する凸部２２０間の距離Ｐ２は、培養期間中に細胞培養容器２０内で形成される細胞塊Ｓの径Ｄｓよりも小さい。凸部２２０の先端径Ｄｐを、細胞塊Ｓの径Ｄｓよりも小さくすることで、凸部２２０の先端部への細胞塊Ｓの接着を阻害することができる。また、互いに隣接する凸部２２０間の距離Ｐ２を細胞塊Ｓの径Ｄｓよりも小さくすることで、互いに隣接する凸部２２０の間の領域への細胞塊Ｓの接着を阻害することができる。なお、凸部２２０の先端径Ｄｐは、細胞培養容器２０の内壁面２０５と平行な方向における凸部２２０の先端部の長さである。
【００４５】
上記したように、培養期間中における細胞塊Ｓの径Ｄｓの想定範囲は、例えば、１００μｍ以上４００μｍ以下である。上記のサイズの細胞塊Ｓに対して、凸部２２０の先端径Ｄｐを例えば、０．０１μｍ以上１０μｍ以下とすることができる。凸部２２０の先端径Ｄｐを０．０１μｍ以上とすることで、細胞塊Ｓからみた細胞培養容器２０の内壁面２０５は、実質的な非平坦構造となり、細胞培養容器２０の内壁面２０５への細胞塊Ｓの接着を阻害する機能が発揮される。一方、凸部２２０の先端径Ｄｐを１０μｍ以下とすることで、凸部２２０の先端への細胞塊Ｓの接着を阻害することができる。また、凸部２２０の先端径Ｄｐの大きさを上記の範囲とすることで、後述する方法によってプラスチックフィルムの表面に非平坦構造を形成することが可能となる。
【００４６】
一方、互いに隣接する凸部２２０間の中心間距離Ｐ２を、例えば、２μｍ以上９０μｍ以下とすることができる。互いに隣接する凸部２２０間の距離Ｐ２を、２μｍ以上とすることで、細胞塊Ｓからみた細胞培養容器２０の内壁面２０５は、実質的な非平坦構造となり、細胞培養容器２０の内壁面２０５への細胞塊Ｓの接着を阻害する機能が発揮される。一方、互いに隣接する凸部２２０の中心間距離Ｐ２を、９０μｍ以下とすることで、互いに隣接する凸部２２０の間の領域への細胞塊Ｓの接着を阻害することができる。
【００４７】
また、互いに隣接する凸部２２０の中心間距離Ｐ２の変動係数は、０．１以下であることが好ましい。互いに隣接する凸部２２０の中心間距離Ｐ２の変動係数を小さくすることは、細胞培養容器２０の内壁面２０５における凸部２２０の密度の偏りが小さくなることを意味する。互いに隣接する凸部２２０の中心間距離Ｐ２の変動係数を０．１以下とすることで、細胞培養容器２０の内壁面２０５における凸部２２０の密度が均一化され、細胞培養容器２０で培養される細胞の均質性が確保される。
【００４８】
図８は、ハニカム状に配列された複数の凸部２２０を含む非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムの製造方法を示す図である。複数の凸部２２０を表面に有するプラスチックフィルムは、上記した複数の凹部２１０を表面に有するプラスチックフィルムを用いて製造することが可能である。すなわち、図８に示すように、支持体３００上に形成された、複数の凹部２１０が形成されたプラスチックフィルムを構成する塗布膜３１０に粘着テープ３３０を貼り付けた後、粘着テープ３３０を剥離する。これにより、塗布膜３１０の上層部分が除去され、互いに隣接する凹部２１０の間の部位が凸部２２０として残る。図９は、上記の方法を用いて製造された、複数の凸部を表面に有するプラスチックフィルムを走査型電子顕微鏡を用いて撮影した写真である。上記の製造方法によれば、型やマスクを使用することなく、ハニカム状に配列された均一サイズの複数の凸部２２０をプラスチックフィルムに形成することができ、製造コストを抑えることが可能である。
【００４９】
細胞培養容器２０の内壁面２０５の非平坦構造が複数の凸部２２０を含んで構成される場合においても、非平坦構造が複数の凹部２１０を含んで構成される場合と同様、細胞塊Ｓと内壁面２０５との接触面積が小さくなる。これにより、細胞塊Ｓが安定的に接着し得る領域がなくなるので、細胞塊Ｓの内壁面２０５への接着が阻害される。これにより、培養期間中、細胞塊Ｓの形状は維持され、細胞塊同士の融合が抑制される。細胞塊同士の融合が抑制されることにより、細胞の培養効率の低下を抑制することができ、また、多能性幹細胞の培養においては、細胞の分化を抑制することが可能となる。本実施形態に係る細胞培養容器２０においては、内壁面２０５の全体が非平坦構造を有し、収容空間２０３の全体が非平坦構造で囲まれているため、収容空間２０３内に収容された細胞塊同士の融合を抑制する効果が促進される。
【００５０】
なお、細胞培養容器２０は、本発明における細胞培養容器の一例である。内壁面２０５は、本発明における内壁面の一例である。収容空間２０３は、本発明における収容空間の一例である。凹部２１０は、本発明における凹部の一例である。凸部２２０は、本発明における凸部の一例である。
【００５１】
（細胞培養実験）
細胞培養容器の内壁面を非平坦構造とすることによって得られる、細胞の内壁面への接着を阻害する効果および細胞塊同士の融合を抑制する効果を実証するために、細胞培養実験を行った。上記した非平坦構造を表面に有する複数種類のプラスチックフィルムを作成し、これらをそれぞれ市販のウェルプレートの底面に配置したものを細胞培養容器として用いて細胞の培養を行った。比較実験として、上記した非平坦構造を有するプラスチックフィルムを底面に配置しないウェルプレートを使用して細胞の培養を行った。すなわち、比較実験においては、平坦なウェルプレートの底面上で細胞の培養を行った。各実験に用いた細胞培養容器の構成の詳細および培養５日目における細胞の状態に関する評価結果を表１に示す。
【表１】
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【００５２】
実験１〜実験４に係る細胞培養容器は、図５に示すような複数の凹部を表面に有するプラスチックフィルムを市販のウェルプレートの底面に配置して構成されたものである。すなわち、実験１〜実験４では、複数の凹部を表面に有するプラスチックフィルム上で細胞の培養を行った。実験１〜実験４に係るプラスチックフィルムは、凹部の開口径Ｄｈが互いに異なる。すなわち、実験１〜実験４に係るプラスチックフィルムに形成された凹部の開口径Ｄｈは、それぞれ、０．８μｍ、１．５μｍ、５μｍおよび３５μｍである。
【００５３】
一方、実験５に係る細胞培養容器は、図９に示すような複数の凸部を表面に有するプラスチックフィルムを市販のウェルプレートの底面に配置して構成されたものである。すなわち、実験５では、複数の凸部を表面に有するプラスチックフィルム上で細胞の培養を行った。実験５に係るプラスチックフィルムに形成された凸部の先端径Ｄｐは、０．１μｍである。なお、実験１〜実験５に係るプラスチックフィルムの材質は、ポリブタジエンである。
【００５４】
比較実験１および比較実験２においては、非平坦構造を有するプラスチックフィルムを使用せずに、平坦構造を有するウェルプレートの底面上で細胞の培養を行った。比較実験２においては、底面に低接着処理を施したウェルプレートを使用した。
【００５５】
ｉＰＳ細胞（株：２０７Ｂ７）を、初期細胞密度２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように無血清培地ＴｅＳＲ（登録商標）−Ｅ８（登録商標）(STEMCELL Technologies社、品番：ST-05940)に懸濁し、それぞれの細胞培養容器に３ｍｌ播種して、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養を開始した。培養期間中、それぞれの細胞培養容器を静置状態に維持し、培養液の交換を毎日実施した。
【００５６】
表１に示される、細胞塊の細胞培養容器の底面への接着に関する評価の判定基準は、以下のとおりである。
Ａ：細胞塊の殆どが容器底面に接着していない。
Ｂ：細胞塊の一部が容器底面に接着している。
Ｃ：細胞塊の多くが容器底面に接着している。
【００５７】
表１に示される、細胞塊同士の融合に関する評価の判定基準は、以下のとおりである。
Ａ：細胞塊の殆どが他の細胞塊と融合していない。
Ｂ：細胞塊の一部が他の細胞塊と融合している。
Ｃ：細胞塊の多くが他の細胞塊と融合している。
【００５８】
図１０（ａ）〜図１０（ｅ）は、それぞれ、実験１〜実験５に係る細胞培養容器を用いた場合の培養５日目における細胞の状態を示す顕微鏡写真である。図１１（ａ）および図１１（ｂ）は、それぞれ、比較実験１および比較実験２に係る細胞培養容器を用いた場合の培養５日目における細胞の状態を示す顕微鏡写真である。
【００５９】
実験１〜実験５に係る細胞培養容器を使用した場合には、容器底面への細胞塊の接着は確認されなかった。また、図１０（ｂ）〜図１０（ｄ）に示すように、実験２〜実験５に係る細胞培養容器を用いた場合には、細胞塊の変形および細胞塊同士の融合は殆ど確認されなかった。一方、図１０（ａ）に示すように、実験１に係る細胞培養容器を用いた場合には、一部の細胞塊において、細胞塊の変形および細胞塊同士の融合が確認された。
【００６０】
一方、比較実験１および比較実験２に係る細胞培養容器を使用した場合には、一部の細胞塊において、培養容器底面への接着が確認された。また、図１１（ａ）および図１１（ｂ）に示すように、比較実験１および比較実験２に係る細胞培養容器を用いた場合には、多くの細胞塊において、細胞塊の変形および細胞塊同士の融合が確認された。
【００６１】
このように、細胞培養容器の内壁面が、細胞塊の径よりも小さい開口径Ｄｈを有する凹部または細胞塊の径よりも小さい先端径Ｄｐを有する凸部を含む非平坦構造を有することにより、細胞培養容器の内壁面への細胞塊の接着を阻害できることが確認され、また、細胞培養容器の内壁面に沿って広がるような細胞塊の変形および細胞塊同士の自発的な融合が抑制されることが確認された。さらに、図１０（ｂ）〜図１０（ｄ）に示されるように、細胞培養容器の内壁面を非平坦構造とすることで、細胞塊同士が近接している状態においても、細胞塊同士の融合が誘発されないことが明らかとなった。このことは、細胞培養容器の内壁面に形成された非平坦構造が、細胞塊同士の融合反応を停止または抑制するように細胞に対して直接的に作用していることを示唆するものである。
【００６２】
細胞塊同士の融合を抑制するために、メチルセルロース等の増粘作用をもたらす水溶性高分子を培養液中に添加する浮遊培養法が提案されている（ＷＯ２０１３／０７７４２３Ａ１）。本発明の実施形態に係る細胞培養容器２０によれば、増粘作用をもたらす水溶性高分子を培養液に添加することなく細胞塊同士の融合を抑制することが可能となるので、培養期間中において実施される培地交換処理等の煩雑さを緩和することができ、また、従来よりも低コストで細胞培養を行うことが可能となる。
【００６３】
以上の説明から明らかなように、本発明の実施形態に係る細胞培養容器２０によれば、収容空間２０３内において浮遊する細胞塊同士の融合を抑制することが可能となる。これにより、細胞の壊死を抑制することができ、多能性幹細胞の培養においては、細胞の分化を抑制することができ、培養効率を従来よりも向上させることが可能となる。
【００６４】
なお、上記の実施形態においては、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される非平坦構造が、複数の凹部２１０および複数の凸部２２０のいずれか一方を含む場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成される非平坦構造が複数の凹部２１０および複数の凸部２２０の双方を含んで構成されていてもよい。
【００６５】
また、プラスチックフィルムを熱圧着によって貼り合せて細胞培養容器２０を構成する場合には、プラスチックフィルム同士の密着性の観点から、シール部２０１（図１参照）の貼り合せ面は、非平坦構造を有していないことが好ましい。
【００６６】
また、上記の実施形態においては、非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムそのものを細胞培養容器として用いる場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。例えば、非平坦構造を表面に有するプラスチックフィルムを、これとは別の支持体に貼り付けたもので細胞培養容器２０を構成することも可能である。上記支持体は、例えば、プラスチック、ガラスまたは金属などで構成されていてもよい。
【００６７】
また、上記の実施形態においては、細胞培養容器の内壁面をプラスチック素材で構成する場合を例示したが、細胞培養容器の内壁面を、例えば、金属、ガラスまたはセラミックなどで構成してもよい。この場合、例えば、溶射、サンドブラスト加工またはエッチング加工によって非平坦構造を形成することが可能である。また、細胞培養容器の全体が、金属、ガラスまたはセラミックなどで構成されていてもよい。なお、細胞の接着を阻害する効果を高める観点から、細胞培養容器の内壁面をプラスチック素材で構成することが好ましい。また、本実施形態に係る細胞培養容器２０のように、表面に非平坦構造を有するプラスチックフィルムを細胞培養容器の基材として用いることで、安価なシングルユースの細胞培養バッグとして使用することが可能である。
【００６８】
（細胞培養装置）
図１２は、本発明の実施形態に係る細胞培養装置１０の構成を示す図である。細胞培養装置１０は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０を備える。また、細胞培養装置１０は、細胞培養容器２０、貯留容器３０、分割処理部４０、廃液回収容器１６および凍結部１７を備える。
【００６９】
細胞培養装置１０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地（培養液）とともに細胞培養容器２０内に収容し、細胞培養容器２０内において細胞を培地中に例えば浮遊させた状態で培養する。
【００７０】
＜細胞供給部＞
細胞供給部１００は、細胞培養装置１０による培養の対象となる細胞を凍結させた状態で収容する細胞収容部１０１と、細胞収容部１０１に収容された細胞を、配管ｃ１を含んで構成される流路Ｆ３に送出するポンプＰ１とを有する。また、細胞供給部１１０は、細胞収容部１０１と配管ｃ１とを接続する配管の、ポンプＰ１の下流側に設けられた開閉バルブＶ１を有する。細胞収容部１０１に収容された細胞は、ポンプＰ１が駆動され、開閉バルブＶ１が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
【００７１】
本実施形態に係る細胞培養装置１０による培養の対象となる細胞は、特に制限されず、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、プロトプラスト、樹立された細胞株、人為的に遺伝子改変が施された細胞、等のあらゆる細胞が対象となり得る。
【００７２】
培養対象となる細胞の一例は、幹細胞である。幹細胞は、自己複製能と分化能とを有する細胞であれば特に制限されず、多能性幹細胞でもよく、体性幹細胞でもよい。
【００７３】
多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（Embryonic Germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（Embryonal Carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（Multipotent Adult Progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（Adult Pluripotent Stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）などが挙げられる。
【００７４】
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。
【００７５】
培養対象となる細胞の他の例は、生体を構成する体細胞、及びその前駆細胞である。具体的には、リンパ球、好中球、単球、巨核球、マクロファージ、線維芽細胞、基底細胞、ケラチノサイト、上皮前駆細胞、周皮細胞、内皮細胞、脂肪前駆細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、膵β細胞、グリア細胞、等が挙げられる。
【００７６】
培養対象となる細胞の他の例は、CHO（chinese hamster ovary）、COS、HeLa、HepG2、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞；酵母、アスペルギルス等の真菌細胞；大腸菌、枯草菌等の細菌細胞；植物細胞、カルス；などである。これらの細胞は、タンパク質の大量発現を目的にタンパク質発現ベクターが導入された細胞であってもよい。
【００７７】
なお、細胞培養容器２０内に予め細胞および培地を収容した状態で細胞培養を開始する場合などにおいては、細胞培養装置１０において細胞供給部１００を省略することが可能である。
【００７８】
＜培地供給部＞
培地供給部１１０は、細胞の培養に使用する培地（培養液）を収容する培地収容部１１１および１１４と、培地収容部１１１および１１４にそれぞれ収容された培地を、流路Ｆ３に送出するポンプP２およびP３と、ポンプＰ２およびＰ３からそれぞれ送出された培地を除菌するためのフィルタ１１３および１１６とを有する。また、培地供給部１１０は、培地収容部１１１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１３の下流側に設けられた開閉バルブＶ２と、培地収容部１１４と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１６の下流側に設けられた開閉バルブＶ３とを有する。このように、本実施形態に係る培地供給部１１０は、培地収容部１１１、ポンプＰ２、フィルタ１１３および開閉バルブＶ２を含む第１の系統と、培地収容部１１４、ポンプＰ３、フィルタ１１６および開閉バルブＶ３を含む第２の系統と、からなる２系統の培地供給機能を備えており、互いに異なる２種類の培地が供給可能である。なお、培地供給部１１０における系統の数は、細胞の培養プロトコル等に応じて適宜増減することが可能である。すなわち、培地供給部１１０を、３種類以上の培地を供給可能とする構成としてもよいし、１種類の培地を供給可能とする構成としてもよい。培地収容部１１１に収容された培地は、ポンプＰ２が駆動され、開閉バルブＶ２が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。培地収容部１１４に収容された培地は、ポンプＰ３が駆動され、開閉バルブＶ３が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
【００７９】
本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養において適用し得る培地は、特に制限されず、あらゆる培地を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、DMEM/F-12（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）、BME（Basal Medium Eagle）、RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、E8 base medium、SkBM（Skeletal Muscle Cell Basal Medium）、MCDB104、MCDB153、199、L15）、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。
【００８０】
本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養において適用し得る培地は、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び／又は、細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培地に添加される高分子化合物は、例えば、培地の比重を調整する高分子化合物、培地の粘度を調整する高分子化合物、培地中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子化合物である。このような高分子化合物としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類；コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質；ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；などが挙げられる。
【００８１】
本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養に適用し得る培地は、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清、血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；増殖因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン；などが添加されていてもよい。
【００８２】
＜希釈液供給部＞
希釈液供給部１２０は、細胞の培養過程において適宜実施される希釈処理に用いられる希釈液を収容する希釈液収容部１２１を有する。また、希釈液供給部１２０は、希釈液収容部１２１に収容された希釈液を流路Ｆ３に送出するポンプＰ４と、ポンプＰ４から送出された希釈液を除菌するためのフィルタ１２３とを有する。また、希釈液供給部１２０は、希釈液収容部１２１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１２３の下流側に設けられた開閉バルブＶ４を有する。希釈液収容部１２１に収容された希釈液は、ポンプＰ４が駆動され、開閉バルブＶ４が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
【００８３】
本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養に適用し得る希釈液は、特に制限されず、例えば、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM、DMEM/F-12、MEM、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal Medium、E8 base medium）を希釈液として使用することが可能である。なお、細胞培養過程において希釈処理が不要である場合には、希釈液供給部１２０を省略することが可能である。
【００８４】
＜凍結液供給部＞
凍結液供給部１３０は、培養された細胞を凍結部１７において凍結保存する場合に用いられる凍結液を収容する凍結液収容部１３１を有する。また、凍結液供給部１３０は、凍結液収容部１３１に収容された凍結液を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ５と、ポンプＰ５から送出された凍結液を除菌するためのフィルタ１３３とを有する。また、凍結液供給部１３０は、凍結液収容部１３１、ポンプＰ５およびフィルタ１３３を接続する配管の、フィルタ１３３の下流側に設けられた開閉バルブＶ５を含む。凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、ポンプＰ５が駆動され、開閉バルブＶ５が開状態となることにより流路Ｆ３に送出される。なお、培養された細胞を凍結保存する必要がない場合には、細胞培養装置１０において凍結液供給部１３０を省略することが可能である。
【００８５】
＜細胞培養容器＞
細胞培養容器２０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地とともに収容し、収容された細胞を培養するための容器である。細胞培養容器２０は、上記したように、細胞を収容する収容空間２０３を囲む内壁面２０５が、複数の凹部および複数の凸部の少なくとも一方を含む非平坦構造を有する（図２、図３および図７参照）。細胞培養容器２０は、細胞および培地を細胞培養容器２０内に流入させるための流入口２１と、細胞培養容器２０に収容された細胞および培地を細胞培養容器２０の外部に流出させるための流出口２２と、を有する。
【００８６】
細胞培養容器２０は、例えば、温度３０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ２濃度２％〜１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ２４内に収容され得る。インキュベータ２４は、細胞培養容器２０内に培地とともに収容された細胞に酸素（Ｏ２）および二酸化炭素（ＣＯ２）を供給するためのガス供給機構２５を備える。また、インキュベータ２４は、細胞培養容器２０内の圧力を調整する圧力調整機構２６を備える。圧力調整機構２６は、細胞培養容器２０内にエアーを導入することにより細胞培養容器２０内の雰囲気を加圧し、または、細胞培養容器２０内の雰囲気を外部に排出することにより細胞培養容器２０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構２６は、細胞培養容器２０内の圧力を、後述する循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、細胞培養容器２０内に収容された細胞および培地を循環流路Ｆ１内に流出させる。細胞培養容器２０は、ガス供給機構２５から供給される二酸化炭素を受け入れるための流通口、細胞培養容器２０内におけるエアーの吸気および排気を行うための流通口が、流入口２１および流出口２２とは別に設けられていてもよい。
【００８７】
＜循環流路＞
細胞培養装置１０は、細胞培養容器２０の流出口２２と流入口２１とを接続する配管ａ１〜ａ７を含んで構成される循環流路Ｆ１を有する。細胞培養容器２０に収容された細胞および培地は、培養過程において、循環流路Ｆ１内を循環する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地は、流入口２１を経由して細胞培養容器２０内へ流入し、細胞培養容器２０の内部に収容された細胞および培地は、流出口２２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。
【００８８】
細胞培養容器２０の流入口２１に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ７には開閉バルブＶ１１が設けられ、細胞培養容器２０の流出口２２に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には開閉バルブＶ１２が設けられている。開閉バルブＶ１１は、循環流路Ｆ１から細胞培養容器２０内に細胞および培地を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。開閉バルブＶ１２は、細胞培養容器２０内から循環流路Ｆ１内に細胞および培地を流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【００８９】
細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０に接続された配管ｃ１によって構成される流路Ｆ３は、接続部位Ｘ３において循環流路Ｆ１に接続されている。すなわち、細胞収容部１０１に収容された細胞、培地収容部１１１および１１４にそれぞれ収容された培地、希釈液収容部１２１に収容された希釈液および凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、流路Ｆ３および接続部位Ｘ３を経由して循環流路Ｆ１内に供給される。
【００９０】
流路Ｆ３を構成する配管ｃ１には、接続部位Ｘ３の近傍において開閉バルブＶ６が設けられている。開閉バルブＶ６は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０からそれぞれ、細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路Ｆ１内に供給する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
【００９１】
＜貯留容器＞
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内、すなわち、循環流路Ｆ１の途中に設けられている。貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を一時的に貯留するための容器であり、培養期間中に実施される後述する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において使用される。貯留容器３０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
【００９２】
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を貯留容器３０内に流入させるための流入口３１と、貯留容器３０に収容された細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路Ｆ１内に流出させるための流出口３２を有する。貯留容器３０の流入口３１は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１、ａ２およびａ３によって細胞培養容器２０の流出口２２に接続されている。貯留容器３０の流出口３２は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ４、ａ５、ａ６およびａ７によって細胞培養容器２０の流入口２１に接続されている。また、本実施形態においては、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３とが接続される接続部位Ｘ３が貯留容器３０の流入口３１の近傍に配置されているが、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３との接続位置は、循環流路Ｆ１内におけるあらゆる位置に配置することが可能である。
【００９３】
循環流路Ｆ１を構成する配管ａ２には、貯留容器３０の流入口３１の近傍において開閉バルブＶ１３が設けられている。開閉バルブＶ１３は、循環流路Ｆ１から貯留容器３０内に細胞および培地等を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。また、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ５には、貯留容器３０の流出口３２の近傍において開閉バルブＶ１４が設けられている。開閉バルブＶ１４は、貯留容器３０内から循環流路Ｆ１内に細胞および培地等を細胞培養容器２０、分割処理部４０および凍結部１７に移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【００９４】
貯留容器３０は、貯留容器３０内の圧力を調整する圧力調整機構３３を備える。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内にエアーを導入することにより貯留容器３０内の雰囲気を加圧し、または、貯留容器３０内の雰囲気を外部に排出することにより貯留容器３０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、貯留容器３０内に貯留された細胞、培地、希釈液および凍結液を、流出口３２から循環流路Ｆ１内に流出させる。
【００９５】
細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と細胞培養容器２０の流入口２１との間に位置する接続部位Ｘ１と、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流入口３１と細胞培養容器２０の流出口２２との間に位置する接続部位Ｘ２と、を接続する配管ｂ１およびｂ２を含んで構成される流路Ｆ２を有する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入することが可能である。また、流路Ｆ２内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流入することが可能である。
【００９６】
＜分割処理部＞
分割処理部４０は、流路Ｆ２内、すなわち、流路Ｆ２の途中に設けられている。分割処理部４０は、細胞培養容器２０内において細胞を培養することによって生じる細胞塊を分割する分割処理を行うための処理容器４２を備える。処理容器４２内において行われる分割処理は、機械的分割処理であってもよいし、細胞解離酵素を用いた酵素処理であってもよい。機械的分割処理が適用される場合には、処理容器４２内には、メッシュフィルタが（図示せず）配置され得る。細胞塊をメッシュフィルタに通すことで、細胞塊はメッシュフィルタのメッシュサイズに応じたサイズに分割される。一方、酵素処理による分割処理が適用される場合には、処理容器４２内には、トリプシン−ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）等の細胞解離酵素が収容され得る。細胞塊を一定時間に亘り細胞解離酵素に浸漬することで、細胞塊が分割される。
【００９７】
分割処理部４０は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入する細胞塊を処理容器４２において分割する。分割処理が施された細胞は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。
【００９８】
分割処理部４０は、処理容器４２に連通する圧力容器４１と、圧力容器４１および処理容器４２内の圧力を調整する圧力調整機構４３と、を備える。圧力調整機構４３は、圧力容器４１内にエアーを導入することにより圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気を加圧し、または、圧力容器４１内の雰囲気を外部に排出することにより圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構４３は、圧力容器４１および処理容器４２内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる。
【００９９】
流路Ｆ２を構成する、分割処理部４０の上流側に配置される配管ｂ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ２１が設けられている。開閉バルブＶ２１は、貯留容器３０から分割処理部４０に細胞等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。一方、流路Ｆ２を構成する、分割処理部４０の下流側に配置される配管ｂ２には、接続部位Ｘ２の近傍に開閉バルブＶ２２が設けられている。開閉バルブＶ２２は、分割処理部４０によって分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【０１００】
循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には、接続部位Ｘ２の近傍であって接続部位Ｘ２の上流側に開閉バルブＶ１５が設けられている。開閉バルブＶ１５は、細胞培養容器２０から貯留容器３０に細胞および培地等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
【０１０１】
＜廃液回収容器＞
細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と細胞培養容器２０の流入口２１との間であって、接続部位Ｘ１よりも上流側（貯留容器３０寄り）に位置する接続部位Ｘ４において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｄ１を含んで構成される流路Ｆ４を有する。流路Ｆ４の端部には、廃液回収容器１６が設けられている。廃液回収容器１６は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ４を経由して流路Ｆ４内に流入する廃液を回収するための容器である。廃液回収容器１６に回収される廃液には、使用済みの培地、使用済みの希釈液、細胞供給部１００から凍結状態で供給される細胞に随伴する凍結液等が含まれる。廃液回収容器１６の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
【０１０２】
流路Ｆ４を構成する配管ｄ１には、接続部位Ｘ４の近傍において開閉バルブＶ３１が設けられている。開閉バルブＶ３１は、貯留容器３０から流出する廃液を廃液回収容器１６内に回収する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
【０１０３】
＜凍結部＞
細胞培養装置１０は、接続部位Ｘ１において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｅ１を含んで構成される流路Ｆ５を有する。流路Ｆ５の端部には、凍結部１７が設けられている。凍結部１７は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ５内に流入する細胞を凍結液供給部１３０から供給される凍結液とともに収容する保存容器１７ａを有する。保存容器１７ａは、例えば、バイアル、クライオチューブまたはバッグの形態を有するものであってもよい。凍結部１７は保存容器１７ａに収容された細胞および凍結液を凍結させるフリーザを含んで構成され得る。また、凍結部１７は、液体窒素を充填したタンクを備えていてもよく、タンク内に保存容器１７ａを収容し得るように構成されていてもよい。また、凍結部１７は、例えば、太陽日酸社製のクライオライブラリー（登録商標）システムを含んで構成されていてもよい。流路Ｆ５を構成する配管ｅ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ４１が設けられている。開閉バルブＶ４１は、貯留容器３０から凍結部１７に細胞および凍結液を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。なお、流路Ｆ５と循環流路Ｆ１との接続位置は、貯留容器３０の流出口３２と細胞培養容器２０の流入口２１と間であれば、いかなる位置であってもよい。また、細胞を凍結保存する必要がない場合には、凍結部１７を省略することが可能である。
【０１０４】
＜制御部＞
制御部１８は、ポンプＰ１〜Ｐ５、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ガス供給機構２５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を統括的に制御する。これにより、所定の細胞培養プロトコルに沿った細胞の培養が、人手を介在させることなく、自動で実施される。なお、図１２において、制御部１８と、制御部１８によって制御される上記の各構成要素との間の電気的な接続配線は、図面の煩雑さを回避する観点から図示を省略している。
【０１０５】
＜配管＞
図１３は、循環流路Ｆ１および流路Ｆ２〜Ｆ５を構成する各配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１の内部構造の一例を示す断面図である。図１３に示すように、配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１の内壁面４００は、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成された複数の凹部２１０または複数の凸部２２０を含む非平坦構造と同様の非平坦構造を有していてもよい。すなわち、各配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１の内壁面４００には、複数の凹部または複数の凸部の少なくとも一方が、細胞培養容器２０で培養される細胞の、内壁面４００への接着を阻害する大きさおよび間隔で設けられていてもよい。これにより、配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１内を流通する細胞の、内壁面４００への接着が阻害され、各配管内を流通する細胞塊同士の融合が抑制される。また、細胞が配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１内部に残留してしまうことを防止することができる。各配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１の材質は、特に限定されるものではないが、細胞培養装置１０全体をシングルユースとする場合には、各配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１は、プラスチック等の安価な材料で構成されることが好ましい。
【０１０６】
なお、細胞培養容器２０の流入口２１は、本発明における第１の流入口の一例である。細胞培養容器２０の流出口２２は、本発明における第１の流出口の一例である。貯留容器３０は、本発明における貯留容器の一例である。貯留容器３０の流入口３１は、本発明における第２の流入口の一例である。貯留容器３０の流出口３２は、本発明における第２の流出口の一例である。循環流路Ｆ１は、本発明における第１の流路の一例である。流路Ｆ２は、本発明における第２の流路の一例である。接続部位Ｘ１は、本発明における第１の部位の一例である。接続部位Ｘ２は、本発明における第２の部位の一例である。分割処理部４０は、本発明における分割処理部の一例である。培地供給部１１０は、本発明における培地供給部の一例である。
【０１０７】
以下に、本実施形態に係る細胞培養装置１０において実施され得る処理の一例を示す。細胞培養装置１０は、例えば、以下に例示する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理を実施する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより実現される。
【０１０８】
＜継代処理＞
細胞培養装置１０は、細胞収容部１０１に収容された細胞を、培地収容部１１１および１１４に収容された培地とともに細胞培養容器２０内に収容して細胞培養を開始する継代処理を以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図１４は、細胞培養装置１０が継代処理を実施する場合における、細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図１４において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【０１０９】
ステップＳ１において、開閉バルブＶ１、Ｖ４およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ１およびＰ４が駆動される。これにより、細胞収容部１０１において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。
【０１１０】
ステップＳ２において、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞に随伴する凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。上記の濃縮処理は、例えば、貯留容器３０内に希釈液とともに収容された細胞を、貯留容器３０内において沈降させ（自然沈降）、希釈液および凍結液を含む上澄み液を除去することにより行われる。具体的には、細胞を貯留容器３０内において沈降させた後、開閉バルブＶ１４を短期間開状態とする。これにより、貯留容器３０内に上澄み液を残しつつ、細胞を貯留容器３０から流出させ、配管ａ５内に滞留させる。その後、開閉バルブＶ１４を閉状態とし、開閉バルブＶ３１を開状態とする。これにより貯留容器３０内に残存する希釈液および凍結液を含む廃液が貯留容器３０の流出口３２から流出し、流路Ｆ４を経由して廃液回収容器１６に回収される。なお、貯留容器３０から配管ａ５への細胞の移送および貯留容器３０から廃液回収容器１６への希釈液および凍結液の移送は、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気を加圧することによって行われる。
【０１１１】
ステップＳ３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された培地Ａおよび培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂからなる混合培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【０１１２】
ステップＳ４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。なお、ここでの分割処理は、凍結状態とされた細胞を破砕する目的で行われる。
【０１１３】
ステップＳ５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構４３によって圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【０１１４】
ステップＳ６において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、循環流路Ｆ１を経由して細胞培養容器２０内に流入する。以上のステップＳ１〜Ｓ６の処理を経ることにより、継代処理が完了する。
【０１１５】
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
【０１１６】
＜培地交換処理＞
細胞培養においては、細胞から分泌される代謝物などによって培地が変質する。そのため、培養期間内における適切な時期に、細胞培養容器２０内における使用済みの培地を、新たな培地に交換する培地交換処理が必要とされる。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、上記の培地交換処理を、以下のようにして実施する。図１５は、細胞培養装置１０が培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図１５において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【０１１７】
ステップＳ１１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって細胞培養容器２０内の雰囲気が加圧される。これにより、細胞培養容器２０内に収容された細胞および使用済みの培地が、循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【０１１８】
ステップＳ１２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。
【０１１９】
ステップＳ１３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【０１２０】
ステップＳ１４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および新たな培地が細胞培養容器２０内に流入する。細胞培養容器２０内に収容された細胞は、新たな培地によって培養される。以上のステップＳ１１〜Ｓ１４の処理を経ることにより、培地交換処理が完了する。
【０１２１】
＜分割処理（機械的分割処理）＞
例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必要となる場合がある。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、上記の分割処理を、以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図１６は、細胞培養装置１０が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図１６において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【０１２２】
ステップＳ２１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって細胞培養容器２０内の雰囲気が加圧され、細胞培養容器２０内に生じた細胞塊および使用済みの培地が、循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される
【０１２３】
ステップＳ２２において、貯留容器３０内に貯留された細胞塊および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞塊は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。
【０１２４】
ステップＳ２３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞塊と合流する。
【０１２５】
ステップＳ２４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞塊および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。
【０１２６】
ステップＳ２５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構４３によって圧力容器４１内および処理容器４２内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【０１２７】
ステップＳ２６において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器３０内に貯留された分割処理が施された細胞および新たな培地が、細胞培養容器２０内に流入する。細胞培養容器２０内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップＳ２１〜Ｓ２６の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
【０１２８】
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
【０１２９】
＜分割処理（酵素処理）＞
図１７は、分割処理部４０における分割処理が、上記した細胞解離酵素を用いた酵素処理を含む場合の、細胞培養装置１０が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図１７において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【０１３０】
図１７におけるステップＳ３１〜Ｓ３３の処理は、上記したステップＳ２１〜Ｓ２３の処理と同様であるので、重複する説明は省略する。
【０１３１】
ステップＳ３４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞塊および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において細胞解離酵素を用いた分割処理が施される。
【０１３２】
ステップＳ３５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構４３によって圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、細胞解離酵素を含む培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【０１３３】
ステップＳ３６において、開閉バルブＶ４およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ４が駆動される。これにより、希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して、貯留容器３０内に流入する。貯留容器３０に収容された細胞および細胞解離酵素を含む培地に希釈液を添加することで、細胞解離酵素による細胞解離作用が停止される。
【０１３４】
ステップＳ３７において、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞解離酵素を含む培地および希釈液を含む混合物から細胞解離酵素を含む培地および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、細胞解離酵素を含む培地および希釈液は、廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。
【０１３５】
ステップＳ３８において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【０１３６】
ステップＳ３９において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する分割処理が施された細胞および新たな培地が細胞培養容器２０内に流入する。細胞培養容器２０内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップＳ３１〜Ｓ３９の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
【０１３７】
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
【０１３８】
＜凍結処理＞
培養された細胞を回収して保存する場合、細胞を保存容器内に回収して凍結保存することが一般的である。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、培養された細胞を回収して凍結させる凍結処理を、以下のようにして実施する。図１８は、細胞培養装置１０が凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図１８において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
【０１３９】
ステップＳ４１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって細胞培養容器２０内の雰囲気が加圧される。これにより、細胞培養容器２０内に収容された細胞および使用済みの培地が循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。
【０１４０】
ステップＳ４２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。
【０１４１】
ステップＳ４３において、開閉バルブＶ５およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ５が駆動される。これにより、凍結液収容部１３１に収容された凍結液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、凍結液は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。
【０１４２】
ステップＳ４４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ４１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および凍結液が流路Ｆ５を経由して凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容される。凍結部１７は、保存容器１７ａ内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。以上のステップＳ４１〜Ｓ４４の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
【０１４３】
なお、細胞を凍結保存する方法として、例えば、特許第４７０５４７３号に記載の方法を適用してもよい。この方法では、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、アセトアミド及び培地を所定量含む媒体中で、細胞を急速凍結させる工程、を含む。また、特許第４２２３９６１号に記載の方法を適用してもよい。この方法は、所定濃度の、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびポリビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一つを凍結保護剤として含有する凍結保存液を利用した細胞の凍結保存方法であって、細胞を凍結保存液に懸濁する工程と、所定の冷却速度で凍結保存液を−８０℃以下まで冷却し凍結させる冷却工程と、凍結保存液を-８０℃以下で保存する保存工程を含む。
【０１４４】
なお、上記の継代処理、培地交換処理および分割処理においては培地供給部１１０から２種類の培地Ａおよび培地Ｂを供給する場合を例示しているが、使用する培地の種類は、細胞の培養プロトコルに応じて適宜変更することが可能である。すなわち、使用する培地は、培養プロトコルに応じて１種類であってもよいし、３種類以上であってもよい。
【０１４５】
＜細胞培養処理＞
細胞培養装置１０は、制御部１８が以下に例示する細胞培養処理プログラムを実行することにより、細胞培養を、人手を介在させることなく自動で行うことが可能である。図１９は、制御部１８が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。
【０１４６】
ステップＳ１０１において、制御部１８は、上記の継代処理を実行することにより、細胞供給部１００から供給される細胞および培地供給部１１０から供給される培地を細胞培養容器２０内に収容し、細胞培養を開始する。
【０１４７】
ステップＳ１０２において、制御部１８は、細胞培養を開始してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（１回目）を実施することにより、細胞培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
【０１４８】
ステップＳ１０３において、制御部１８は、１回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（２回目）を実施することにより、細胞培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１内および１１４内に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
【０１４９】
ステップＳ１０４において、制御部１８は、２回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の分割処理を実施することにより、細胞塊を分割して細胞培養を継続する。
【０１５０】
ステップＳ１０５において、制御部１８は、上記のステップＳ１０２〜Ｓ１０４における処理を１サイクルとする培養サイクルのサイクル数が、所定数に達したか否かを判定する。制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定数に達していないと判定した場合には、処理をステップＳ１０２に戻す。一方、制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定のサイクル数に達したと判定した場合には、処理をステップＳ１０６に進める。培養サイクルの進行とともに、細胞の培養スケールは増大する。
【０１５１】
ステップＳ１０６において、制御部１８は、上記の凍結処理を実施することによって培養された細胞を凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容して凍結保存する
【０１５２】
なお、上記の例では、培養サイクルの１サイクル内において、培地交換処理を２回実施しているが、培養サイクルの１サイクル内における培地交換処理の実施回数は、適宜変更することが可能である。
【０１５３】
以上の説明から明らかなように、本実施形態に係る細胞培養装置１０は、細胞培養容器２０の流入口２１と流出口２２とを接続する循環流路Ｆ１を有する。また、細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内に設けられた貯留容器３０を有する。貯留容器３０は、細胞培養容器２０の流出口２２に接続された流入口３１および細胞培養容器２０の流入口２１に接続された流出口３２を有する。貯留容器３０は、上記の継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において実施される濃縮処理等の用に供される。また、細胞培養装置１０は、貯留容器３０の流出口３２と細胞培養容器２０の流入口２１との間に位置する循環流路Ｆ１内の接続部位Ｘ１と、貯留容器３０の流入口３１と細胞培養容器２０の流出口２２との間に位置する循環流路Ｆ１内の接続部位Ｘ２と、を接続する流路Ｆ２を有する。細胞培養装置１０は、流路Ｆ２内に設けられ、接続部位Ｘ１を経由して循環流路Ｆ１から流入する細胞塊を分割し、分割した細胞塊を、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出させる分割処理部４０を有する。また、細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内に培地を供給する培地供給部１１０を有する。
【０１５４】
細胞培養装置１０を上記のように構成することで、培地交換処理や分割処理等の細胞培養において必要とされる一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。これにより、均質な細胞の大量生産が可能となる。本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、継代処理から凍結処理までの細胞培養に必要な一連の処理を人手を介在させることなく行うことが可能である。
【０１５５】
また、本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、細胞培養容器２０から貯留容器３０への細胞の移送、貯留容器３０から分割処理部４０および細胞培養容器２０への細胞の移送、分割処理部４０から貯留容器３０への細胞の移送は、いずれも圧力調整機構２６、３３および４３による圧送により行われる。これにより、ダイヤフラムポンプ、チューブポンプ、ペリスタリックポンプおよびモーノポンプ等の接液ポンプを用いて細胞の移送を行う場合と比較して細胞に与えるダメージを軽減することができ、細胞の生存率の低下を抑制することが可能となる。なお、本実施形態に係る細胞培養装置１０は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより、継代処理から凍結処理までを自動化する場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３を、ユーザが手動で操作してもよい。
【０１５６】
また、本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、細胞培養容器２０の内壁面２０５が、複数の凹部および複数の凸部の少なくとも一方を含む非平坦構造を有するので、細胞培養容器２０の収容空間２０３内において浮遊する細胞塊同士の融合を抑制することが可能となる。これにより、細胞の壊死を抑制することができ、多能性幹細胞の培養においては、細胞の分化を抑制することができ、培養効率を従来よりも向上させることが可能となる。また、循環流路Ｆ１および流路Ｆ２〜Ｆ５を構成する各配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１の内壁面４００は、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成された非平坦構造と同様の非平坦構造を有するので、配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１内を流通する細胞の、内壁面４００への接着が阻害され、各配管内を流通する細胞塊同士の融合が抑制される。また、細胞が配管ａ１〜ａ７、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｄ１およびｅ１内部に残留してしまうことを防止することができる。なお、貯留容器３０の内壁面においても、細胞培養容器２０の内壁面２０５に形成された非平坦構造と同様の非平坦構造を形成してもよい。これにより、貯留容器３０の内壁面への細胞の接着が阻害され、貯留容器３０内に貯留された細胞塊同士の融合が抑制される。
【符号の説明】
【０１５７】
１０  細胞培養装置
１７  凍結部
２０  細胞培養容器
２１  流入口
２２  流出口
３０  貯留容器
３１  流入口
３２  流出口
３３、４３  圧力調整機構
４０  分割処理部
４２  処理容器
１００  細胞供給部
１１０  培地供給部
２０３  収容空間
２０５  内壁面
２１０  凹部
２２０  凸部
Ｆ１  循環流路Ｆ１
Ｆ２〜Ｆ７  流路
Ｘ１〜Ｘ４  接続部位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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