(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンキオリン加水分解物を有効成分として含有するＰｍｅｌ１７遺伝子発現抑制剤（但し、美白用途を除く）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｍｅｌ１７遺伝子発現を抑制し、美白に有効であり、さらには日焼け防止や黒色腫瘍に有効な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の色素沈着の原因は、基底層ケラチノサイト内に過剰に蓄積するメラニン色素である。皮膚の色素沈着の原因となるこのメラニンは、表皮基底層にある色素細胞（メラノサイト）内のメラノソームと呼ばれる小器官において生成される。
メラノソームは構造タンパク質Ｐｍｅｌ１７が骨格となって構造を形成し、そこにメラニン色素が沈着している。（非特許文献１）
生成したメラニンはケラチノサイトに受け渡される。そして取り込まれたメラニンはターンオーバーにより自然に排出されていく。しかし、メラニンが過剰に作られるとメラニンの排出が間に合わず、シミ等が発生する。
また、インビボでＰｍｅｌ１７はＵＶＢの暴露により遺伝子の発現が増加することが確認され、Ｐｍｅｌ１７ノックアウトマウスでは淡色化が起こることが確認されている。（非特許文献２）
【０００３】
真珠や貝殻の真珠層に含まれる不溶性蛋白質コンキオリンは加水分解され広く化粧品原料として利用され、肝機能改善剤、基底膜安定化剤、ＳＩＲＴ１活性化剤、皮膚角化促進剤、ストレスホルモン作用緩和剤、エラスチン産生促進剤、抗糖化作用剤、真皮タンパク質カルボニル化抑制剤、コラーゲン産生促進剤等の特許が公開されている。(特許文献１〜９)
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−０２４００８号公報
【特許文献２】特開２００６−２９０８２９号公報
【特許文献３】特開２００９−１６１４９４号公報
【特許文献４】特開２０１０−１０５９２５号公報
【特許文献５】特開２０１０−１５０２１６号公報
【特許文献６】特開２０１２−０５６９３３号公報
【特許文献７】特開２０１２−１２１８７４号公報
【特許文献８】特開２０１２−２４６２２６号公報
【特許文献９】特開２０１４−００９２１２号公報
【非特許文献１】Jan Borovansky, Patrick A. Riley 「Melanins and Melanosomes: Biosynthesis, Biogenesis, Physiological, and Pathological Functions」, Wiley-Blackwell June 2011 258-264
【非特許文献２】Wonseon Choi et.al J Invest Dermatol 2010 130(6)1685-1696
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はＰｍｅｌ１７遺伝子の発現を抑制することによって、メラニンの排出を促し美白に有効であり、さらには日焼け防止や黒色腫瘍に有効な製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが鋭意検討した結果、真珠や貝殻の真珠層に含まれる不溶性蛋白質コンキオリンの加水分解物にＰｍｅｌ１７遺伝子の発現を抑制する作用があることがわかった。
真珠や貝殻の真珠層はアコヤガイ、クロチョウガイ、シロチョウガイ等の真珠層を有する貝殻及びその真珠を、原料として用いる。
必要に応じて、真珠は核を取り除き、貝殻は付着物、稜柱層を取り除いたのち、粉砕する。
稜柱層を除くことはコストも係り、目的等に応じて必ずしも除く必要はないが、特公平０６−０４３３２０号公報、特開２００２−３３８４３０号公報の方法を取ることによってある程度容易に取り除くことができる。
これに酸やキレート剤を加える。酸は塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、乳酸等の有機酸から選択でき、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジ酒石酸、クエン酸、ポリリン酸、メタリン酸、又はこれらの塩が挙げられる。
酸やキレート剤は炭酸カルシウムが溶解する程度に加え、撹拌や加温を加え、炭酸カルシウムを溶解させる。
不溶物を集め、加水分解する。
加水分解の方法は、塩酸、硫酸、硝酸及びリン酸等の無機酸、酢酸、ギ酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸及びクエン酸等の有機酸等の１種以上を必要に応じて加温や撹拌を加えつつ加水分解する方法やパパイン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素で分解する方法等がある。
加水分解の方法やその後の脱塩には特公平０２−０１２９２１号公報、特公平０１−０４６４８６号公報、特開２０１４−００９２１０号公報等の技術を応用すると効率的である。
【０００７】
コンキオリン加水分解物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。
【０００８】
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。
【０００９】
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。
【００１０】
レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。
【００１１】
赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、 ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。
【００１２】
馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。
【００１３】
パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００１４】
これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
コンキオリン加水分解物の製剤への配合量は、固形分として好ましくは０．００００１〜１０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１．０重量％である。
【００１５】
実施例-１
貝殻の付着物を水、ブラシで除去し、約１〜５mm程度に粉砕したアコヤガイ貝殻５０kgに水４５０kgを加えて撹拌しつつ、塩酸１００kgを徐々に加えた。さらに水１００kgを加え３日間撹拌した。塩酸１０kgを徐々に加えた。さらに水２００kgを加え２日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム３kgを徐々に加えた。
ｐＨ７になるように２５％水酸化ナトリウムで調整した後水２００kg加えた。これをシャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、０．１モル塩酸２０kgを加えて２４日間ゆっくり撹拌した。これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
この沈殿２００ｇに１０倍希釈した硫酸を３kg加え、１１０℃のオイルバスで２４時間加水分解した。
放冷後、水酸化バリウムを徐々に加えながらｐＨ３．０に調整した後、遠心分離（６０００rpm、１５分間）し、上澄みにアンバーライトＩＲＡ９１０をｐＨ７．０になるまで徐々に加えた。これを濾過して濾液に活性炭を１０ｇ加え３０分間撹拌した。
これを濾過し、凍結乾燥した。
【００１６】
確認試験
２継代目の正常ヒト表皮メラニン細胞（クラボウ）を１．５×１０3個となるよう播種し、４日間培養した。その後、増殖添加剤を含まないＤｅｒｍａＬｉｆｅ（登録商標）Ｍ（クラボウ）へ、ホルスコリンを終濃度１００μＭとなるように加えた。そして、その培地へ検体（実施例-１）を添加し試験培地とした。
【００１７】
ＲＮＡの抽出
細胞からのＴｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用い、添付マニュアルに従い調整した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて算出した。
【００１８】
ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ
３０ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使い、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、添付マニュアルに従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲは、７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて実施した。
詳細には、前述のＲＴ産物と、Ｐｍｅｌ１７または内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのＴａｑＭａｎ（登録商標）  プライマー（ライフテクノロジーズ・ジャパン）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、ΔΔＣＴ法により遺伝子発現量の比較を行った。
【００１９】
結果を図１に示す。
左より、
１．検体（実施例-１）未添加、ホルスコリン未添加
２．検体（実施例-１）未添加、ホルスコリン終濃度１００μＭ添加
３．検体（実施例-１）終濃度５mg／ml添加、ホルスコリン終濃度１００μＭ添加
の結果を示す。
ホルスコリンによって発現が増加したＰｍｅｌ１７遺伝子発現を実施例-１は終濃度５mg／mlで約８０％抑制した。
【００２０】
また、コンキオリン加水分解物を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、美白は勿論、日焼け防にも有効な製剤が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例-１の確認試験（Ｐｍｅｌ１７の遺伝子発現量）の結果を示す図である。
【図１】
0006543091.tif 000002