(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞タイプにおいて化合物の毒性を予測するインビトロ方法であって、
試験化合物を、接触前には核因子(NF)-κBが活性化されていない前記特定の細胞タイプの細胞の試験集団と、約1時間以上にわたって接触させる段階であって、前記化合物の毒性が評価の対象となり、かつ前記化合物がNF-κBを活性化する能力または前記化合物がNF-κBの核移行を誘導する能力が、前記インビトロ方法を行う前には知られていない、前記段階；
接触後に、試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルを測定する段階； 
試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルを、試験化合物を接触させていない前記特定の細胞タイプの細胞の対照集団におけるNF-κBの核局在化レベルと比較する段階；および
対照集団と比べた試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルの増加に基づいて、試験化合物が前記特定の細胞タイプに毒性であることを予測する段階、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記NF-κBがNF-κBのp65サブユニットである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記NF-κBのp65サブユニットが、SEQ ID NO: 1〜4のいずれか1つに記載の配列を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記NF-κBのp65サブユニットが、SEQ ID NO: 5または6に記載の配列を含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
前記試験集団および対照集団の細胞が、ヒト細胞である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記試験集団および対照集団の細胞が、非ヒト動物細胞である、請求項1、2、および4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記試験集団および対照集団の細胞が、幹細胞を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、組織特異的幹細胞、または器官特異的幹細胞を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記試験集団および対照集団の細胞が、体細胞または幹細胞由来の細胞を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が初代細胞である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、肝臓細胞、腎臓細胞、心血管細胞、中枢神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、消化管細胞、眼細胞、耳細胞、骨髄細胞、または血液細胞を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が腎近位尿細管細胞を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
前記腎近位尿細管細胞が、ヒト初代腎近位尿細管細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、樹立された細胞株からの細胞を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、HK-2細胞またはLLC-PK1細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、または器官/組織特異的幹細胞から分化した幹細胞由来の細胞を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、肝臓細胞、腎臓細胞、心血管細胞、中枢神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、消化管細胞、生殖細胞もしくはそれらの前駆細胞、眼細胞、耳細胞、骨髄細胞、または血液細胞に似るように少なくとも部分的に分化している、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が腎近位尿細管様細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記接触させる時間が、約1時間〜約16時間、約12時間〜約16時間、または約30〜約36時間、または約3日間である、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記測定の前に、前記接触を、最大4週間の全期間にわたって一定の間隔で1回以上繰り返すことをさらに含み、該接触を各回の接触について同じ期間行うことを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記接触とその後の前記測定を、最大4週間の全期間にわたって一定の間隔で1回以上繰り返すことをさらに含み、該接触を各回の接触について同じ期間行うことを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年3月17日出願のシンガポール仮出願第10201400705X号の恩典および優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、器官特異的毒性または組織特異的毒性を含めて、化合物の毒性を予測するインビトロ方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
転写因子のNF-κBファミリー(本明細書ではまとめてNF-κBと称する)は、動物およびヒトにおける炎症およびストレス応答のマスター調節因子である[1, 2]。NF-κBは普遍的に発現されて、通常は、不活性な状態で細胞質[3, 4]に保持されている。
【０００４】
NF-κBは、多種多様な異なるストレス因子、例えば、サイトカイン、細菌毒素、ウイルス産物、低酸素、活性酸素種およびUV光などによって、活性化され得る[3-5]。活性化されると、NF-κBは速やかに核内に移行し、そこで多数の標的遺伝子を調節する。
【０００５】
NF-κBにより標的化される遺伝子の数および多様性のため、NF-κBの活性化は、癌[1, 6]および炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、喘息、多発性硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎[7]などの、多くの疾患と関連している。これらの疾患は、肺、腸、心血管系または中枢神経系など、さまざまな器官系に影響を与える。NF-κBの活性化はまた、さまざまな種類の腎疾患とも関連している[8, 9]。NF-κBは、疾患過程に関与するかまたは特定のストレス因子によって影響される、特定の細胞タイプにおいて活性化される。
【０００６】
転写因子のNF-κBファミリーは、異なるタンパク質サブユニットのホモ二量体またはヘテロ二量体から構成される。これまでに、5つのタンパク質サブユニットが同定されている[5]。NF-κBにより調節される標的遺伝子の多くは炎症反応に関与している；しかし、遺伝子のどの正確なセットが標的化されるかは、NF-κBのアイソフォームおよび含まれるサブユニットに依存する。NF-κBのp65サブユニットは、炎症誘発性インターロイキン(IL)IL-6およびIL-8の活性化に不可欠である[10-12]。
【発明の概要】
【０００７】
NF-κBを活性化して、その核移行を誘導する化合物の能力によって反映される、化合物の器官特異的なまたは組織特異的な毒性を予測するためのインビトロアッセイが提供される。
【０００８】
このアッセイは、NF-κBの核移行、例えば、NF-κBサブユニットp65の核移行、の検出に基づいている。簡単に説明すると、所定の細胞タイプを、最初に、スクリーニングすべき潜在的に毒性または非毒性の化合物で処理し、その後、化合物の毒性、およびNF-κBの活性化により炎症誘発性NF-κBシグナル伝達を誘導するその能力を予測するために、NF-κBの移行を測定する。このアッセイは、ハイコンテントスクリーニング(high content screening: HCS)に適しており、いくつかの態様では、HCSはNF-κBの移行を評価するための好適な方法であり得る。
【０００９】
前記アッセイは、初代体細胞の器官もしくは組織特異的細胞または幹細胞、幹細胞由来の器官特異的な脊椎動物細胞、生殖細胞もしくはそれらの前駆細胞、または器官もしくは組織特異的な樹立細胞株、すなわち不死もしくは不死化細胞株を使用することができる。
【００１０】
一局面において、本発明は、化合物の毒性をスクリーニングするインビトロ方法を提供し、該方法は、試験化合物を、接触前には核因子(NF)-κBが活性化されていない細胞の試験集団と接触させる段階；接触後に試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルを測定する段階；および試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルを、試験化合物を接触させていない細胞の対照集団におけるNF-κBの核局在化レベルと比較する段階を含み、対照集団と比べた試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルの増加により、試験化合物が細胞に損傷を与えかつ/または炎症誘発性応答を誘導することが示される。
【００１１】
前記方法で評価されるNF-κBは、NF-κBのアイソフォームまたはサブユニットであり得る。いくつかの態様では、該NF-κBは、NF-κBのp65サブユニットである。いくつかの態様では、NF-κBのp65サブユニットは、SEQ ID NO: 1〜4のいずれか1つに記載の配列、またはSEQ ID NO: 5もしくは6に記載の配列を含む。
【００１２】
試験集団と対照集団の細胞を含めて、前記方法において使用される細胞は、ヒト細胞であってもよいし、非ヒト動物細胞であってもよい。
【００１３】
前記細胞は、例えば、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、組織特異的幹細胞、または器官特異的幹細胞などの幹細胞を含むことができる。
【００１４】
前記細胞は、体細胞または幹細胞由来の細胞を含むことができる。
【００１５】
例えば、前記細胞は、腫瘍細胞、生殖細胞もしくはそれらの前駆細胞、または初代細胞を含むことができる。いくつかの態様では、前記細胞は、肝臓細胞、腎臓細胞、心血管細胞、中枢神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、消化管細胞、眼細胞、耳細胞、骨髄細胞、または血液細胞を含むことができる。前記細胞は、例えばヒト初代腎近位尿細管細胞を含めて、腎近位尿細管細胞を含むことができる。
【００１６】
例えば、前記細胞は、樹立された細胞株からの細胞、例えばHK-2細胞またはLLC-PK1細胞などを含むことができる。
【００１７】
例えば、前記細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、または器官/組織特異的幹細胞から分化した幹細胞由来の細胞を含むことができる。いくつかの態様では、該細胞は、肝臓細胞、腎臓細胞、心血管細胞、中枢神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、消化管細胞、生殖細胞もしくはそれらの前駆細胞、眼細胞、耳細胞、骨髄細胞、または血液細胞に似るように少なくとも部分的に分化していてよい。いくつかの態様では、該細胞は腎近位尿細管様細胞であり得る。
【００１８】
前記方法において、接触は、ある期間にわたって行われ、例えば、約1時間〜約16時間、約12時間〜約16時間、または約30〜約36時間、または約3日間行われる。
【００１９】
前記方法は、測定の前に、接触を、最大4週間の全期間にわたって一定の間隔で1回以上繰り返すことをさらに含むことができ、その際、接触を各回の接触について同じ期間行うことを含む。
【００２０】
前記方法は、接触とその後の測定を、最大4週間の全期間にわたって一定の間隔で1回以上繰り返すことをさらに含むことができ、その際、接触を各回の接触について同じ期間行うことを含む。
【００２１】
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
化合物の毒性をスクリーニングするインビトロ方法であって、
試験化合物を、接触前には核因子(NF)-κBが活性化されていない細胞の試験集団と接触させる段階；
接触後に、試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルを測定する段階；および
試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルを、試験化合物を接触させていない細胞の対照集団におけるNF-κBの核局在化レベルと比較する段階
を含み、
対照集団と比べた試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルの増加により、試験化合物が細胞に損傷を与えかつ/または炎症誘発性応答を誘導することが示される、方法。
［２］
前記NF-κBがNF-κBのp65サブユニットである、［1］記載の方法。
［３］
前記NF-κBのp65サブユニットが、SEQ ID NO: 1〜4のいずれか1つに記載の配列を含む、［2］記載の方法。
［４］
前記NF-κBのp65サブユニットが、SEQ ID NO: 5または6に記載の配列を含む、［2］記載の方法。
［５］
前記試験集団および対照集団の細胞が、ヒト細胞である、［1］〜［3］のいずれか一項記載の方法。
［６］
前記試験集団および対照集団の細胞が、非ヒト動物細胞である、［1］、［2］、および［4］のいずれか一項記載の方法。
［７］
前記試験集団および対照集団の細胞が、幹細胞を含む、［1］〜［6］のいずれか一項記載の方法。
［８］
前記幹細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、組織特異的幹細胞、または器官特異的幹細胞を含む、［7］記載の方法。
［９］
前記試験集団および対照集団の細胞が、体細胞または幹細胞由来の細胞を含む、［1］〜［6］のいずれか一項記載の方法。
［１０］
前記細胞が腫瘍細胞である、［9］記載の方法。
［１１］
前記細胞が初代細胞である、［9］記載の方法。
［１２］
前記細胞が、肝臓細胞、腎臓細胞、心血管細胞、中枢神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、消化管細胞、眼細胞、耳細胞、骨髄細胞、または血液細胞を含む、［9］記載の方法。
［１３］
前記細胞が腎近位尿細管細胞を含む、［9］記載の方法。
［１４］
前記腎近位尿細管細胞が、ヒト初代腎近位尿細管細胞である、［13］記載の方法。
［１５］
前記細胞が、樹立された細胞株からの細胞を含む、［9］記載の方法。
［１６］
前記細胞が、HK-2細胞またはLLC-PK1細胞である、［15］記載の方法。
［１７］
前記細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、または器官/組織特異的幹細胞から分化した幹細胞由来の細胞を含む、［9］記載の方法。
［１８］
前記細胞が、肝臓細胞、腎臓細胞、心血管細胞、中枢神経系細胞、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、消化管細胞、生殖細胞もしくはそれらの前駆細胞、眼細胞、耳細胞、骨髄細胞、または血液細胞に似るように少なくとも部分的に分化している、［17］記載の方法。
［１９］
前記細胞が腎近位尿細管様細胞である、［18］記載の方法。
［２０］
前記接触が、約1時間〜約16時間、約12時間〜約16時間、または約30〜約36時間、または約3日間の期間にわたって行われる、［1］〜［19］のいずれか一項記載の方法。
［２１］
前記測定の前に、前記接触を、最大4週間の全期間にわたって一定の間隔で1回以上繰り返すことをさらに含み、該接触を各回の接触について同じ期間行うことを含む、［1］〜［20］のいずれか一項記載の方法。
［２２］
前記接触とその後の前記測定を、最大4週間の全期間にわたって一定の間隔で1回以上繰り返すことをさらに含み、該接触を各回の接触について同じ期間行うことを含む、［1］〜［20］のいずれか一項記載の方法。
本発明の他の局面および特徴は、添付の表および図面と併せて本発明の具体的な実施態様の以下の説明を検討することにより、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明の実施態様を、ほんの一例として、説明する図面は、次のとおりである。
【図１】従来のNF-κBベースのアッセイおよび本発明の方法の実施態様を比較する概略図。
【図２】化合物により誘導されるNF-κB移行を検出するために使用される、本発明の方法のハイコンテントスクリーニング(HCS)の実施態様の概要。
【図３−１】(表1を含む) NF-κB移行を試験した41の異なる化合物についてのヒートマップ。
【図３−２】図３−１の続きの図である。
【図３−３】図３−２の続きの図である。
【図３−４】図３−３の続きの図である。
【図４−１】(表2を含む) 試験した41の異なる化合物について測定されたEC50値および陽性細胞の最高パーセンテージ。
【図４−２】図４−１の続きの図である。
【図５−１】(表3を含む) 試験した42の異なる化合物についてのNF-κB移行の定性分析。
【図５−２】図５−１の続きの図である。
【図６】感度、特異度、および臨床データとの全体的な一致を示すグラフ。
【図７−１】(表4を含む) 試験した43の異なる化合物についてのヒートマップ。
【図７−２】図７−１の続きの図である。
【図８】(表5を含む) 化合物によって誘導されるNF-κBの移行を指標として使用した、薬物誘発性近位尿細管毒性の予測。
【図９】HCSによって画像化されたHPTC1(対照)。
【図１０】ヒトの近位尿細管に直接的に損傷を与える腎毒物(示した濃度)で処理した後の、HCSによって画像化されたHPTC1。EC50およびIC50値を各化合物について測定した。
【図１１】ヒトの近位尿細管に直接的に損傷を与える腎毒物(1000μg/mL)で処理した後の、HCSによって画像化されたHPTC1。
【図１２】ヒトの近位尿細管細胞に対して直接的に毒性でない化合物(1000μg/mL)で処理した後の、HCSによって画像化されたHPTC1。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
転写因子NF-κBの活性化は、普遍的に発現されたNF-κBの細胞質から核への移行をもたらす。NF-κBの活性化は多くの疾患と関連している；結果として、活性化されたNF-κBの活性を調節または阻害する化合物を同定することに関心が集まっている[7, 13, 14]。
【００２４】
そのため、NF-κB活性に対する所与の試験化合物の影響を検出するアッセイは、以前に開発されている。こうした従来のアッセイは、NF-κBの核移行を誘発することが知られたアゴニストを使用し、続いて、アゴニストにより誘発されたNF-κBの核局在化に及ぼす試験化合物の効果をアッセイするものである。このようなアッセイで使用されるアゴニストとしては、典型的には、腫瘍壊死因子(TNF)-αまたはIL-1が挙げられる。したがって、以前に記載されたこれらのアッセイは、NF-κBを調節するシグナル伝達経路を含めて、細胞内シグナル伝達に対処しているが、スクリーニングすべき試験化合物による細胞毒性またはNF-κBを活性化する能力には対応していない。
【００２５】
NF-κBを活性化する活性化因子/アゴニストを使用する、以前に確立されたNF-κBベースのアッセイとは対照的に、本方法は、毒性化合物が細胞にストレスをかけ、そのストレスが次にNF-κBを活性化してその核移行を誘導し得る、という仮説に基づいている。かくして、本明細書に記載の方法では、試験化合物の毒性を測定する方法として、NF-κBの移行を誘導する(活性化因子またはアゴニストの非存在下での)試験化合物の能力が測定される。同様に、試験化合物によって誘導されるNF-κBの移行は、NF-κBシグナル伝達を活性化しかつ炎症誘発効果を誘導する該化合物の可能性を反映している。
【００２６】
本明細書に記載のアッセイ方法では、最初に、細胞を、毒性についてスクリーニングしようとする潜在的に毒性の試験化合物で処理する。その後、化合物の毒性およびその炎症誘発可能性を見極めるために、NF-κBの移行を測定する。NF-κBの移行を誘導する化合物は、陽性として分類され、使用した特定の細胞タイプに対して毒性であると予測される。
【００２７】
図1は、NF-κBの調節を判定するために使用された既知のアッセイの設計を示しており、それを本明細書に記載の方法の設計と比較している。
【００２８】
以前に知られていたNF-κBベースのアッセイ(図1の左側)は、活性化NF-κBに対する化合物の調節効果を検出するように設計されている。そのため、最初に、NF-κBの核移行がアゴニスト(例えば、TNF-αまたはIL-1)によって誘発される。活性状態は、ここでは、明るい細胞質と暗い核を有する細胞によって象徴される。NF-κBの核局在が増加している活性化サンプルは、その後、スクリーニングすべき化合物(矢印)で処理される。アゴニスト誘発性NF-κB活性に対するスクリーニングされる化合物の調節効果は、多くの場合、HCSによって検出される。
【００２９】
対照的に、本明細書に記載の方法(図1の右側)では、細胞はスクリーニングすべき化合物で処理されるだけである。NF-κBの核移行を誘導するためにアゴニストが使用されることはない。したがって、スクリーニングすべき化合物と接触する前には、NF-κBは細胞質に局在し、不活性である(ここでは、暗い細胞質と明るい核を有する細胞によって象徴される)。毒性の細胞傷害による潜在的なNF-κB活性化は、HCSによって検出され得る。
【００３０】
とりわけ、サイトカインまたは他のアゴニスト(例えば、TNFα)によるNF-κBの活性化は、本明細書に記載のアッセイ方法では使用されない。この特徴によって、本明細書に記載のアッセイは、以前から知られているNF-κBベースのHCSアッセイから区別される。すなわち、本明細書に記載のアッセイは、NF-κBの移行を誘導する化合物の能力を測定するものであり、別の化合物によってNF-κBの核移行を誘導した後に、試験化合物によるNF-κB活性の調節を測定するものではない。
【００３１】
したがって、一局面では、試験化合物の毒性をスクリーニングするためのインビトロ方法が提供される。
【００３２】
簡単に説明すると、本方法は、試験化合物を、接触前にはNF-κBが活性化されていない細胞の試験集団と接触させることを含む。その後、NF-κBの核局在化レベルが評価されて、試験化合物で処理されていない対照集団のNF-κBの核局在化レベルと比較される。
【００３３】
試験化合物は、その毒性が評価の対象となる任意の化合物であってよく、例えば、NF-κBを活性化する能力またはNF-κBの核移行を誘導する能力が本方法を行う前には知られていない化合物を含む。試験化合物は、例えば、対象者により吸入される、局所的に適用される、吸収される、摂取される、投与される、または対象者に移植されるなど、対象者と接触することが予想される任意の化合物であり得る。例えば、試験化合物は、医薬品、有機化合物、無機化合物、殺虫剤、除草剤、環境毒素、真菌毒素、微生物毒素、重金属含有化合物、有機溶媒、洗浄剤、防腐剤、食品添加物、栄養補助食品、ハーブ化合物、動物由来化合物、抗菌性化合物、化粧品成分、マイクロ粒子またはナノ粒子であり得る。
【００３４】
試験化合物は、細胞の試験集団と接触させる。
【００３５】
細胞の試験集団は、試験化合物との接触前には、NF-κBの活性化を誘導されていない。したがって、NF-κBの大部分は、接触前には試験集団の細胞の細胞質に存在し、そのため、接触の間の試験化合物の活性に応じて、活性化されて、その後核に移行するために利用可能である。
【００３６】
試験集団は、試験化合物の毒性を評価することが望まれる細胞の任意の集団であり得る。
【００３７】
細胞の対照集団または細胞の試験集団に属する1個の細胞に言及する場合を含めて、本明細書で使用する用語「細胞」(cell)とは、文脈に応じて、単一の細胞はもちろん、複数の細胞または細胞の集団をも指すことが意図される。同様に、用語「細胞」(cells)または細胞の「集団」は、文脈に応じて、単一の細胞をも指すことが意図される。
【００３８】
細胞の試験集団は、任意のタイプのヒト細胞または非ヒト動物細胞、例えばマウス細胞またはラット細胞など、任意のタイプの細胞から構成することができる。該細胞は、幹細胞であってもよいし、あるいは体細胞、例えば初代細胞、樹立細胞株、例えば不死または不死化細胞、腫瘍細胞、生殖細胞またはそれらの前駆細胞、ならびに幹細胞から誘導または分化した細胞、例えば人工多能性幹細胞から誘導または分化した細胞であってもよい。
【００３９】
細胞の試験集団は、単一の細胞タイプであっても、2つ以上の異なる細胞タイプを含む混合集団であってもよい。
【００４０】
こうして、試験集団は、幹細胞の集団を含むことができる。幹細胞としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、または組織特異的幹細胞もしくは器官特異的幹細胞が挙げられる。幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、例えば既存の細胞株からのヒト胚性幹細胞など、を含むことができる。
【００４１】
試験集団は、生殖細胞またはそれらの前駆細胞の集団を含むことができる。
【００４２】
使用する試験集団は、体細胞、体細胞に由来する細胞、または幹細胞を分化させることによって誘導される細胞を含むことができる。該細胞は、初代細胞、不死化細胞株などの樹立細胞株からの細胞、または腫瘍細胞を含むことができる。該細胞は、幹細胞から分化させてもよく、例えば、胚性幹細胞から、間葉系幹細胞から、人工多能性幹細胞から、組織特異的幹細胞から、または器官特異的幹細胞から分化させることができる。
【００４３】
体細胞および体細胞由来の細胞には、初代細胞、および樹立された不死または不死化細胞株由来の細胞が含まれる。例えば、体細胞は、任意のタイプの器官特異的または組織特異的細胞タイプであってよく、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：肝臓細胞(肝細胞または他の肝細胞タイプ)、腎臓細胞(糸球体細胞、尿細管細胞および他の腎細胞タイプ)、心血管細胞(心筋細胞、内皮細胞)、中枢神経系細胞(ニューロン、アストロサイト、グリア細胞)、皮膚細胞(ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、および副組織構造：腺および毛包に特異的な細胞タイプ)、肺細胞(気道上皮細胞、肺胞細胞)、膵臓細胞(β細胞および他の膵臓細胞タイプ)、消化管細胞(胃および小腸の異なる細胞タイプ)、生殖器官に特異的な細胞タイプ、感覚器官(眼および耳特異的細胞タイプ)、骨髄細胞、または血液細胞。いくつかの態様では、該細胞は、腎近位尿細管細胞、例えば、ヒト初代腎近位尿細管細胞、HK-2細胞、またはLLC-PK1細胞などである。
【００４４】
幹細胞由来の細胞には、胚性幹細胞から、間葉系幹細胞から、人工多能性幹細胞から、器官特異的幹細胞から、または組織特異的幹細胞から分化した細胞が含まれる。例えば、幹細胞由来の細胞は、肝臓細胞(肝細胞または他の肝細胞タイプ)、腎臓細胞(糸球体細胞、尿細管細胞および他の腎細胞タイプ)、心血管細胞(心筋細胞、内皮細胞)、中枢神経系細胞(ニューロン、アストロサイト、グリア細胞)、皮膚細胞(ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、および副組織構造：腺および毛包に特異的な細胞タイプ)、肺細胞(気道上皮細胞、肺胞細胞)、膵臓細胞(β細胞および他の膵細胞タイプ)、消化管細胞(胃および小腸のさまざまな細胞タイプ)、生殖細胞およびそれらの前駆細胞を含む生殖器官に特異的な細胞タイプ、感覚器官(眼および耳特異的細胞タイプ)、骨髄細胞、または血液細胞に似るように少なくとも部分的に分化させた細胞を含む。いくつかの態様では、該細胞は腎近位尿細管様細胞である。
【００４５】
未分化の幹細胞または部分的に分化した幹細胞の使用は、必ずしも組織特異性または器官特異性を評価することなく、化合物の胎児毒性および/または一般的な毒性を評価することを可能にする。
【００４６】
しかし、組織特異的毒性または器官特異的毒性の評価を含めて、特定の細胞タイプにおいて毒性を評価することが望ましい場合がある。NF-κBは、全てのヒトおよび動物の細胞タイプで普遍的に発現されており、NF-κBの活性化は、傷害、疾患および炎症に関連して多くの異なる器官系で発生する[7]。器官特異的毒性を予測するインビトロアッセイのための指標としてのNF-κB核移行の使用には、特に興味がもてる。以前は、そのようなインビトロアッセイに適した指標を特定することは困難であった。一般的な細胞毒性を測定するための指標(例えば、細胞死、代謝活性の低下、ATPの枯渇)は広く使用されているが、このような指標を用いた器官特異的毒性の予測は成功していない[16, 17]。現在、ヒト内臓器官に対する毒作用を予測するための容認されたインビトロアッセイは存在していない(検証されて容認された代替方法のリストは、alttox.org/mapp/table-of-validated-and-accepted-alternative-methods/で提供される)。
【００４７】
このような場合、使用する細胞は、部分的にまたは完全に分化した細胞であり得る。例えば、細胞集団は、特定のタイプの組織もしくは器官に特異的な初代体細胞、体細胞由来の細胞、例えば腫瘍細胞もしくは樹立細胞株、組織特異的幹細胞、器官特異的幹細胞、または幹細胞から、例えば胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞などから、部分的もしくは完全に分化した細胞であってよい。
【００４８】
試験化合物を細胞の試験集団と接触させる前に、その試験集団を、最初に、使用する細胞のタイプに適した標準的な組織培養方法に従って培養することができる。さまざまな細胞タイプのための組織培養条件および技術は知られており、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第4版, Michael R. Green and Joseph Sambrook, 2012, Cold Spring Harbor Laboratory Press、および参考文献[18]に記載されている。
【００４９】
細胞の試験集団は、任意のフォーマットで培養することができ、例えば、コンフルエント単層、サブコンフルエント単層、コンフルエント上皮、オルガノイド培養、コンフルエント2D培養、インビトロ尿細管、3Dオルガノイド培養、または静的3D培養もしくはマイクロ流体条件下で増殖させる3D培養などの3D培養として培養される。上述したように、試験集団は、単一の細胞タイプから構成されてもよいし、2つ以上の異なる細胞タイプの共培養物であってもよい。
【００５０】
いくつかの態様では、該細胞は、コンフルエントまたはサブコンフルエント単層などの、単層として増殖させる。自動検出方法が使用される場合は、単層培養が好ましい。というのは、3D培養は、現行のHCS法には適していない複数の細胞層を含むからである。
【００５１】
例えば、細胞は、マルチウェルプレートに高密度(例えば、約20,000細胞/cm2〜約50,000細胞/cm2)で播種することができる。不死の細胞株またはヒト初代腎近位尿細管細胞(HPTC)などの細胞が使用される場合、ポリスチレン製の組織培養プレートは、一般的に、コーティング、ゲルなどによる処理を必要としない。他の初代ヒト細胞タイプ(例えば、肝細胞、通常はコラーゲンIをコーティングして培養する)または幹細胞が使用される場合、組織培養プレートはMatrigel(商標)または合成コーティングなどのコーティングを必要とすることがある。例えば、hESCおよびhiPSCをHPTC様細胞に培養・分化させるには、組織培養プレート上でhESC-qualified Matrigel(商標)コーティングを使用する必要があるかもしれない。
【００５２】
細胞は、平衡化させ、単層を形成させ、所望により分化させる時間を該細胞に与えることを目的として、化合物と接触させる前に、適切な期間、例えば約1日以上、約3日以上、または約1〜約3日間、培養することができる。例えば、HPTCが使用される場合は、試験化合物との接触に先立って、単一の細胞層からなる分化した腎上皮(すなわち、単純な上皮)を形成させることができる。
【００５３】
いくつかの態様では、細胞は、マイクロ流体バイオリアクター内で、例えば、コンフルエントまたはサブコンフルエントな単層の形態として、増殖させることができる。マイクロ流体バイオリアクターは、本明細書に記載するように、長期培養および試験化合物への反復暴露に有用であり得る。このフォーマットは、培養物内に化合物の濃度勾配を生じさせるのに役立つかもしれない。
【００５４】
理解されるように、試験集団と対照集団では同じ細胞タイプが使用されるべきである。対照集団は、典型的には、試験化合物と接触させることを除いて、試験集団と同様に培養され、処理されるべきである。代わりに、対照集団は、ビヒクル対照、例えば試験化合物を溶解するために使用されるが試験化合物を一切含まない溶液または溶媒と接触させることが適切であり得る。
【００５５】
前記方法では、その後、試験化合物を試験集団と接触させる。
【００５６】
この接触は、細胞を培養している培地に該化合物を添加することによって行うことができる。例えば、該化合物は、溶媒または溶液などの液体ビヒクル中に溶解または分散され得る。
【００５７】
前記接触は、例えば、試験すべき化合物を培養中の細胞と共にインキュベートすることによって、ある期間にわたって行うことができる。
【００５８】
前記接触は、約1分以上、約5分以上、約15分以上、約1時間以上、約2時間以上、約4時間以上、約8時間以上、約16時間以上、約24時間以上、約36時間以上、約48時間以上、約60時間以上、または約72時間以上の期間にわたって行うことができる。前記接触は、約15分〜約72時間、約1時間〜約48時間、約1時間〜約24時間、約1時間〜約16時間、約8時間〜約36時間、約16時間〜約24時間、約12時間〜約16時間、または約30時間〜約36時間、または約3日間の期間にわたって行うことができる。
【００５９】
試験化合物は細胞培養培地の中に入れたままにしておくことができ、また、全インキュベーション期間が完了する前に培地を変える必要がある場合、追加される新鮮な培地は、接触を維持するために試験化合物を含有することができる。
【００６０】
使用される試験化合物の濃度は、さまざまであってよく、試験すべき化合物に依存し得る。
【００６１】
例えば、試験化合物は、細胞の集団と、約0.001μg/mL以上、約0.01μg/mL以上、約0.1μg/mL以上、約1μg/mL以上、約10μg/mL以上、約100μg/mL以上、約1000μg/mL以上、または約10,000μg/mL以上の濃度で接触させることができる。試験化合物は、細胞の集団と、約0.001μg/ml〜約10,000μg/ml、約0.001μg/ml〜約1000μg/ml、約0.005μg/ml〜約5000μg/ml、約0.005μg/ml〜約1000μg/ml、約0.01μg/ml〜約1000μg/ml、または約0.01μg/ml〜約500μg/mlの濃度で接触させることができる。
【００６２】
上述したように、細胞の対照集団は、試験化合物とは接触させないが、陰性対照溶液と接触させることができ、例えば、試験集団と接触させるための試験化合物を溶解または分散させるために使用される溶媒または溶液(ビヒクル対照)と接触させる。
【００６３】
前記接触は、例えば定期的に、繰り返すことができる。例えば、前記接触は、所定の期間にわたって2回以上、3回以上、4回以上、または5回以上行うことができ、任意で、試験集団が試験化合物と接触されていない期間を組み入れてもよい。
【００６４】
例えば、最初の接触期間が終了した後に、組織培養培地を、試験化合物を含有する新鮮培地と交換することができる。あるいは、該培地を、試験化合物を含有しない新鮮培地と交換し、接触なしのある期間の後に、試験化合物を細胞の試験集団と再度接触させることができる。
【００６５】
したがって、前記接触は、(1回目の接触を超えて)1回以上の追加の回数を繰り返すことができる。
【００６６】
例えば、前記接触は、約3〜約14日間、または約3日〜約4週間の期間にわたって、例えば定期的に繰り返すことができる。
【００６７】
試験化合物と接触させない(すなわち、細胞を新鮮培地にさらす)間隔は、接触期間と接触期間の間の、例えば、約16時間〜約14日間、約1日〜約10日間、約1日〜約3日間、約1日〜約5日間、または約2日〜約3日間持続し得る。
【００６８】
繰り返す場合は、前記接触を全期間内に一定の間隔で繰り返すことができる。各接触エピソードは、全期間内に同じ長さの時間行うことができる。
【００６９】
例えば、約2週間かけて、試験化合物を試験集団と約8時間接触させておき、これを2日に1回繰り返すことができる。
【００７０】
再度、対照集団は、試験化合物が対照集団との接触から除外されることを除いて、試験集団と同様に処理されるべきである。例えば、ビヒクル対照を対照集団の培地に添加し、試験化合物を試験集団と接触させるために行ったように、同じ全期間にわたって、同じ期間、同じ回数繰り返すことができる。
【００７１】
接触が完了したら、核NF-κBのレベルを試験集団と対照集団の両方について測定する。
【００７２】
NF-κBへの言及は、NF-κBのサブユニットまたはアイソフォームを含めて、NF-κB転写因子の任意のファミリーメンバーへの言及を含む。したがって、核局在化に関して評価されるNF-κBは、どのようなNF-κBであってもよく、細胞の試験集団で使用される細胞のタイプに依存し得る。NF-κBは至る所に存在するが、種々の細胞タイプに見られるNF-κBの形態は異なっていることがあり、したがって、アッセイのために核局在化に関して測定されるNF-κBは、使用する細胞のタイプに適切な形態のNF-κBとすべきである。
【００７３】
例えば、本方法で検出されるNF-κBは、例えばNF-κBのp65サブユニットを含めて、NF-κBの異なるアイソフォームまたはサブユニットを含む。
【００７４】
NF-κBは、いくつかの態様では、以下のSEQ ID NO: 1に記載のヒトNF-κB p65サブユニットのアイソフォーム1を含む、から本質的に成る、またはから成ることができる：
0006491671.tif 000002
。
【００７５】
NF-κBは、いくつかの態様では、以下のSEQ ID NO: 2に記載のヒトNF-κB p65サブユニットのアイソフォーム2を含む、から本質的に成る、またはから成ることができる：
0006491671.tif 000003
。
【００７６】
NF-κBは、いくつかの態様では、以下のSEQ ID NO: 3に記載のヒトNF-κB p65サブユニットのアイソフォーム3を含む、から本質的に成る、またはから成ることができる：
0006491671.tif 000004
。
【００７７】
NF-κBは、いくつかの態様では、以下のSEQ ID NO: 4に記載のヒトNF-κB p65サブユニットのアイソフォーム4を含む、から本質的に成る、またはから成ることができる：
0006491671.tif 000005
。
【００７８】
NF-κBは、いくつかの態様では、以下のSEQ ID NO: 5に記載のマウスNF-κB p65サブユニットを含む、から本質的に成る、またはから成ることができる：
0006491671.tif 000006
。
【００７９】
NF-κBは、いくつかの態様では、以下のSEQ ID NO: 6に記載のラットNF-κB p65サブユニットを含む、から本質的に成る、またはから成ることができる：
0006491671.tif 000007
。
【００８０】
いくつかの態様において、NF-κBは、NF-κBの機能をまだ保持しながら、SEQ ID NO: 1〜SEQ ID NO: 6のいずれか1つに対して約75％以上、約80％以上、約85％以上、約90％以上、約95％以上、約96％以上、約97％以上、約98％以上、または約99％以上の配列同一性を有するタンパク質を含む、から成る、またはから本質的に成る。
【００８１】
本明細書で使用する「から本質的に成る」とは、前記タンパク質配列が、該配列の一端もしくは両端に、および/または該配列内に、1個以上のアミノ酸残基、例えば、1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、1〜10個、または1〜5個のアミノ酸残基を含むが、その追加のアミノ酸が該タンパク質の機能に実質的に影響を与えないことを意味する。
【００８２】
こうして、試験化合物との接触に続いて、試験集団の核内のNF-κBのレベルが測定される。これは核内のNF-κBレベルの絶対値に関して行ってもよいし、あるいは、核と細胞質とのNF-κBの相対量を比較することによって達成してもよい。例えば、試験集団におけるNF-κBの核局在化レベルの測定は、試験集団内のNF-κBレベルの細胞質/核比を測定することによって達成され得る。
【００８３】
核NF-κBのレベルは、定量的画像解析と組み合わせたイメージング技術を用いて測定することができる。細胞内の分子を位置決めし、画像化し、定量するための種々の方法が知られており、例えば、NF-κBに対する蛍光標識抗体を用いる免疫染色技術、NF-κBに対する一次抗体と標識二次抗体を用いる検出方法、または一過性もしくは安定的にトランスフェクトされた細胞株で発現される蛍光NF-κB融合タンパク質のイメージングなどが含まれる。
【００８４】
核内および任意で細胞質内のNF-κBのレベルの測定は、自動イメージングおよび画像解析技術、例えばハイコンテントスクリーニング(HCS)技術を含むことができる。HCS技術は知られており、マルチウェルプレートに播種または培養された多数の細胞の自動イメージングと、これに続く定量的画像解析を含む。HCSの手法を用いた本方法の実施態様の概要は、図2に示される。よく使われるHCSの同義語には、ハイスループットスクリーニングおよびハイコンテンツイメージングが含まれる。実際、NF-κB移行の検出および定量に基づくHCSアッセイは、確立されている[13-15]。例えば、p65サブユニットを含めて、NF-κBの特定のサブユニットは、免疫染色によって検出されている。あるいは、融合タンパク質技術が使用されており、この方法では、NF-κBのサブユニットは、蛍光レポータータンパク質に融合される。こうしたHCSアッセイは、ヒトおよび動物の形質転換細胞株ならびに癌細胞株を用いて確立されている。
【００８５】
したがって、コンピュータ支援検出技術の使用は、核内および細胞質内のNF-κB局在化レベルを調べるのに役立ち得る。このアッセイは、スピードを速めるために、ロボットもしくは自動装置またはマイクロ流体デバイスを用いて行うことができる。
【００８６】
前記方法では、NF-κB局在化レベルが試験集団と対照集団の両方について評価されたら、試験集団について得られたNF-κB局在化レベルは、試験化合物との接触を除いて同一条件下で培養したときの細胞の対照集団について得られた値と比較される。
【００８７】
対照集団と比べた試験集団でのNF-κBの核局在化レベルの増加により、試験化合物が細胞に損傷を与えかつ/または炎症誘発性応答を誘導することが示され、これは、その試験化合物がその細胞タイプに対して毒性であることを意味する。こうして、例えば、対照集団と比べた試験集団でのNF-κBの細胞質/核局在化レベルの比率の減少(または核/細胞質局在化レベルの比率の増加)により、試験化合物が細胞に損傷を与えかつ/または炎症誘発性応答を誘導し、したがって、試験化合物がその細胞タイプに対して毒性であることが示される。
【００８８】
NF-κB局在化レベルを検出するための閾値レベルを設定することが望ましいことがある。それは、以下の化合物で処理された陽性および陰性対照集団を用いることによって行うことができる：使用するタイプの細胞に対して非毒性であることが知られている化合物；一般的に毒性であることが知られている化合物のセット；組織特異的または器官特異的毒性を評価しようとする場合は、使用する細胞タイプに特異的に毒性であることが知られている化合物のセット。陽性および陰性対照はまた、全体的なアッセイ性能を判断するためにも使用することができる。真陽性、偽陽性、真陰性および偽陰性の数は、インビトロアッセイの結果をインビボデータと比較することによって決定することができる。その後、主要性能指標(感度、特異度、バランスの取れた精度(balanced accuracy)、陽性予測値、陰性予測値および受信者動作特性曲線の曲線下面積(AUC))を求めることができる。
【００８９】
また、閾値は、試験結果が陽性であるか陰性であるかを判定するために、決定され得る。その閾値は、ビヒクル対照に対するNF-κB核局在化の増加倍率に関係する。
【００９０】
例えば、NF-κBの核局在化レベルの増加が閾値に類似するか、閾値を超える場合、試験結果は陽性であり得る。場合によっては、NF-κBの核局在化レベルは、NF-κBの細胞質/核の比率を求めることによって評価され得る。NF-κBの細胞質/核の比率の減少は、NF-κBの核局在化の増加に対応する、ことが理解されるであろう。こうして、細胞質/核の比率が使用される場合、正の値は、典型的には、閾値よりも低い。最適な閾値は、閾値のより広い範囲を試験することによって決定することができる。実際の閾値は、使用する細胞のタイプと採用する培養および接触条件に応じて変化しうる。
【００９１】
代替的に、自動的分類方法を結果のために使用することができる。これは、例えば、サポートベクターマシンまたはランダムフォレストなどの機械学習アルゴリズムを使用することによって、行うことができる。
【００９２】
所与の試験化合物について、用量応答曲線は、上昇する濃度の該化合物を試験し、各濃度の結果を対照集団の結果と比較することによって、算出することができる。このようにして、本方法で毒性であることが見出された試験化合物についてEC50値を得ることができる。
【００９３】
本発明の方法および使用は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００９４】
本発明者らは、NF-κB(例えば、サブユニットp65)の核移行を指標として使用する、ヒトにおける腎近位尿細管(PT)毒性を予測するためのHCSベースのインビトロモデルを開発した。
【００９５】
以下の実施例2および3に記載するように、ヒト初代腎近位尿細管細胞(HPTC)または近位尿細管細胞株(HK-2およびLLC-PK1)を用いて、該モデルのバランスの取れた精度は、少なくとも70％であることが見出された(表5(図8))。
【００９６】
下記のようにして得られた結果は、NF-κBの核移行が器官特異的毒性を予測するためのインビトロアッセイで指標として使用できることを実証しており、我々の以前の知見と一致している。以前、我々は、HPTC、HK-2およびLLC-PK1細胞[18]、またはヒト胚性幹細胞[20]もしくは人工多能性幹細胞由来のHPTC様細胞を用いて、IL-6およびIL-8のアップレギュレーションを測定することが、化合物のPT毒性に関して優れた予測性をもたらすことを示した(Kandasamy, Chuah et al., 投稿原稿)。IL-6およびIL-8は、NF-κBの標的遺伝子であり、p65によってアップレギュレートされる[10-12]。IL-6/IL-8ベースのアッセイ[18, 20]はqPCRに基づいており、HCSとは適合しないことに留意することが重要である。したがって、IL-6/IL-8ベースのアッセイは、HCSと組み合わせたNF-κBベースのアッセイに比べて、はるかに低いスループットを有し、かつ格段に費用がかかる。
【００９７】
実施例1
化合物により誘導されるNF-κB移行を検出するためのHCS方法の概要は、図2に提供される。この図は、細胞の播種および処理手順のフロー図(真っすぐの矢印)を示す。
【００９８】
図2に示した実施態様に示されるように、0日目に細胞をマルチウェルプレート(図2に示した例では、384ウェルプレートを使用した)に播種した。播種後、細胞を培養して、コンフルエントな単層を形成させた。3日目に、化合物による処理を一晩、約16時間行い、その後4日目に、細胞を固定し、例えば4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、細胞核)および細胞全体の可視化のために全細胞染色(whole cell stain: WCS)を用いて、染色した。NF-κB p65は免疫染色により検出した。染色後、該プレートをHCSにより画像化した。以下の実施例2および3に記載のいくつかの実験では、F-アクチンもまた検出された。
【００９９】
図2の右下部分は、1つのプレートのHCS結果を示しており、ウェルあたり1マルチチャンネル画像が表示される(ウェルあたり9マルチチャンネル画像が取得されたことに留意されたい；プレートのエッジにあるウェルは示されておらず、エッジ効果を回避するために使用しなかった)。プレート設計の概要は、この図の右上に示される。
【０１００】
各化合物(D1〜D9)は、下から上へ上昇する濃度(1.6μg/mL〜1000μg/mL)で2列(濃度あたり4ウェル(レプリケート))にアプライした。対照(Ctrl)の位置が示される。細胞死のため細胞が枯渇したウェルは暗く見えた(右下)。
【０１０１】
実施例2
方法
化合物および定義：  以前に記載したものと同じ41の化合物のセット(参考文献[18]および[20])を使用した。シンバスタチンを42番目の化合物として含めたが、その全般的な高い細胞毒性のためほとんどの分析から除外した。化合物1〜22(グループ1)は、ヒトでは腎毒性であり、近位尿細管(PT)細胞に対して毒性である。化合物23〜33(グループ2)は、ヒトでは腎毒性であるが、PT細胞に対して毒性でない。化合物34〜41(グループ3)は、ヒトにおいて腎毒性でない。真陽性(TP)は、インビトロで陽性の試験結果を与えるグループ1の化合物として定義された。真陰性(TN)は、グループ2およびグループ3の化合物として定義され、これらはインビトロで陰性の試験結果を与えた。感度は、TPの数/22(グループ1)の化合物として定義した。特異度は、TNの数/19(グループ2＋3)の化合物として定義した。
【０１０２】
細胞培養および化合物処理：  市販のHPTC (ATCC, PCS-400-010)は、腎上皮細胞増殖キット(ATCC, PCS-400-040)を補充した腎細胞基本培地(ATCC, PCS-400-030)で培養した。継代4または継代5の細胞を50,000細胞/cm2の密度で96ウェルファルコン(Falcon)黒色プレートに播種した。該細胞を3日間培養した後に、薬物で一晩(16時間)処理した。全ての化合物を1000、500、250、125、63、31、16および1.6μg/mLの濃度でスクリーニングした。25μg/mLの酸化ヒ素(III)を陽性対照として使用した。陰性対照(細胞を化合物またはビヒクルで処理しなかった)およびビヒクル対照を各プレートに含めた。各データポイントにつき3レプリケートを含めた。
【０１０３】
免疫染色：  化合物で一晩処理した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3.7％ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。5％ウシ血清アルブミン(BSA)および0.2％トリトンX-100を含有するPBSで細胞を1時間ブロックした。抗NF-κB p65抗体(1：100, sc-372; Santa Cruz Biotechnology社, Santa Cruz, CA, 米国)をサンプルと室温で1.5時間インキュベートした。二次抗体は、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG(H+L)(A11008; 1：200; Molecular Probes社, Life Technologies社, シンガポール)であった。サンプルを二次抗体およびローダミンファロイジン(Molecular Probes社, R415)と共に室温で1時間インキュベートした(ローダミンファロイジンで検出されたF-アクチンパターンをも評価したが、これはNF-κBとは無関係であった)。最後に、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(4ng/mL)を用いて細胞核を染色した。
【０１０４】
HCSおよび画像解析：  HCSは、ImageXpressMICROシステム バージョン2.0 (Molecular Devices社, Wokingham, 英国)を用いて行った。ウェルあたり4画像を取得した。MetaXpress(商標)画像解析ソフトウェア(バージョン2.0；Molecular Devices社)を用いて陽性細胞のパーセンテージを定量した。核領域(DAPI染色により特定)が、細胞質の特定領域に比べて、同等またはそれ以上の緑色蛍光の強度中央値を有していたとき、細胞はNF-κB移行について陽性と定義された。この細胞質領域は、核領域を取り囲む厚さ2μmのリングから成っていた。
【０１０５】
結果
表1(図3)は、アッセイで用いる41の異なる試験化合物のヒートマップを含む；HPTCを示した41の薬物で16時間処理した。次の薬物濃度を使用した：1000、500、250、125、63、31、16および1.6μg/mL。細胞をHCSにより画像化したが、そのHCSデータセットは、薬物番号42(シンバスタチン)が表1に含まれていないことを除いて、以下の表3で使用されるデータセットと同一である。
【０１０６】
画像解析は、「方法」のセクションで概説したように行った。各ボックス内の数字は、陽性でありかつNF-κBの核移行を示した細胞のパーセンテージ(レプリケートあたり4画像で、3レプリケートの平均)を示す。アスタリスクは、細胞数が細胞死のため低かったケースを表示する。
【０１０７】
表2(図4)は、表1に示した結果から導き出されたEC50値を提供し、試験した濃度範囲内の化合物の所与の濃度での陽性細胞の最高パーセンテージ(表1の各行における最高値)をまとめてある。
【０１０８】
NF-κB移行の定性分析の内容は、目視検査で測定して、表3(図5)に示される。表3にまとめた結果が導き出されたHCS研究は、2013年6月20日から2013年7月5日の期間中に行われた。スクリーニングは96ウェルプレートで行い、該プレートに細胞を播種し、薬物で処理し、免疫染色し、HCSにより画像化した。スクリーニングの間、個々の化合物により得られた結果を書きとめ、それらを、全スクリーニングが2013年7月5日に終了したとき再評価して、表3にまとめた。例えば、陽性の結果は、パラコート、酸化ヒ素(III)、酸化ビスマス(III)、塩化金(I)、酢酸鉛、二クロム酸カリウム、およびテトラサイクリンを用いて得られた。
【０１０９】
図6は、感度、特異度、および臨床データとの全体的な一致のパーセンテージ(y軸)を示す。カットオフ値(x軸)は、陽性細胞のパーセンテージを指す。例えば、70％のカットオフ値では、NF-κBの移行が細胞の70％以上において(試験した範囲内の濃度で)誘導された場合に、全ての結果は陽性と分類された(表2、右側欄)。70％のカットオフ値は、ヒト臨床データとの全体的な一致、および＞70％のバランスの取れた精度(感度＋特異度の平均)をもたらした。
【０１１０】
実施例3
方法
化合物および定義：  43の化合物のセットが使用され、実施例2からの41の化合物のセットのうちの38(トブラマイシン、イホスファミド、アトルバスタチンを除く)および5つの新しい化合物(セファロリジン、セファロチン、メトホルミン塩酸塩、アリストロキア酸およびオクラトキシンA)を含んでいた。化合物1〜24(グループ1)は、ヒトにおいて腎毒性であり、近位尿細管(PT)細胞に対して毒性である。化合物25〜43(グループ2)は、ヒトにおいて腎毒性でないか、またはヒトにおいて腎毒性であるが、PT細胞に対して直接的には毒性でない。真陽性(TP)は、インビトロで陽性の試験結果を与えるグループ1の化合物として定義された。真陰性(TN)は、インビトロで陰性の試験結果を与えるグループ2の化合物として定義された。感度は、(TPの数)/24(グループ1)の化合物として定義した。特異度は、(TNの数)/19(グループ2)の化合物として定義した。バランスの取れた精度は、感度と特異度の平均値である。
【０１１１】
細胞培養および化合物処理：  HPTCの3つの異なるバッチを使用した。市販のHPTC、ロット番号58488852(HPTC1)およびロット番号61247356(HPTC10)をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Manassas, VA, 米国)から購入した。HPTC6は、National University Health System (NUHS, シンガポール)から取得した腎摘出サンプルより分離した。病理学的変化のない正常組織のみを使用したが、これは病理学者によって選択された。HPTCの全3つのバッチは、腎上皮細胞増殖キット(ATCC, カタログ番号PCS-400-040)および1％ペニシリン・ストレプトマイシン(Gibco社, カタログ番号15140-122)を補充したATCC腎上皮細胞基本培地(ATCC, カタログ番号PCS-400-030)中で培養した。HPTCの継代(P)4およびP5のみを使用した。HK-2およびLLC-PK1細胞はATCCから購入した。これら2つの細胞株を、10％ウシ胎児血清(FBS)および1％ペニシリン・ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で維持した。ヒト腎臓サンプル(DSRB-E/11/143)および細胞タイプ(NUS-IRB参照コード: 09-148E)を用いた研究の承認は、得られていた。全ての細胞は、加湿雰囲気中37℃、5％CO2でインキュベートした。
【０１１２】
細胞を、透明な底を有する384ウェル黒色プレート(Greiner社, カタログ番号781091)に播種した。異なる細胞タイプおよび使用するバッチの異なった増殖速度を調整するために、HPTC1とHPTC6を50,000細胞/cm2で播種した；HPTC10を100,000細胞/cm2で播種した；HK-2細胞を20,000細胞/cm2で播種した；そしてLLC-PK1細胞を10,000細胞/cm2で播種した。全ての細胞を3日間培養し、分化させて単純な上皮を形成させ、その後薬物で一晩(16時間)処理した。スクリーニングされる43の薬物の濃度は、1000、500、250、125、63、16および1.6μg/mLとした。100μg/mLのピューロマイシンおよび100ng/mLのTNF-αを陽性対照として使用した。陰性対照は、未処理(ビヒクルなし、化合物なし)のままの細胞および100μg/mLデキサメタゾンで処理した細胞を含んでいた。ビヒクル対照も各プレートに含めた。各化合物および濃度につき4レプリケートを試験した。
【０１１３】
免疫染色：  化合物で一晩処理した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の3.7％ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。5％ウシ血清アルブミン(BSA)および0.2％トリトンX-100を含有するPBSで細胞を1時間ブロックした。サンプルを抗NF-κB p65抗体(Abcam社, カタログ番号ab16502)と4℃で一晩インキュベートした。Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギIgG(H+L)(Invitrogen社, カタログ番号A11008)を二次抗体として使用した。最後に、細胞をDAPI(Merck社, カタログ番号268298)、ローダミンファロイジン(Invitrogen社, カタログ番号R415)および全細胞染色レッド(Cellomics社, カタログ番号8403401)で対比染色した。ローダミンファロイジンによるF-アクチンの検出は、NF-κBについての研究に無関係であった。
【０１１４】
HCSおよび画像解析：  HCSによる画像取得は、実施例1および2に記載したのと同じ機器およびソフトウェアを用いて行った。4つの異なるチャンネルを、DAPI(細胞核)、Alexa Fluor 488(NF-κB；染色パターンのより良い認識のために、図9〜12ではNF-κB染色が赤で示される)、ローダミンファロイジン(F-アクチン)およびCy5(全細胞染色レッド)の検出のために使用した。ウェルあたり9サイトを画像化した(全4つのチャンネル)。画像は、Translocation-Enhancedモジュールを用いたMetaXpress(商標)画像解析ソフトウェア バージョン2.0を使用することによって、自動的に解析した[19]。DAPI染色された領域を用いて、核内領域(核)および核外領域(核を取り囲む細胞質)を特定した。DAPI染色された領域の縁から2μm以内の領域を核内領域(核)として特定した。DAPI染色された領域の外縁より0.1μmから2μmまでのリングを核外領域(細胞質)として特定した。核外領域対核内領域の強度比をMetaXpress(商標)画像解析ソフトウェア(バージョン2.0)により自動的に定量した。各データポイントの最終定量結果は、36の画像からの平均の結果であった(ウェルあたり9マルチチャンネル画像で4レプリケート(ウェル))。
【０１１５】
結果
表4(図7)は、ヒートマップを示す。HPTCの3つのバッチおよび2つの細胞株(HK-2とLLC-PK1)を、表示した43の化合物で16時間処理した。次の化合物濃度を使用した：1000、500、250、125、63、16および1.6μg/mL。細胞を、ImageXpressMICROシステムを用いてHCSにより画像化した。画像は、「方法」のセクションに記載したように、MetaXpress(商標)画像解析ソフトウェア バージョン2.0により自動的に解析した。核外領域(細胞質)対核内領域(核)の平均強度比を、試験した各濃度で各化合物について測定した。各ボックス内の数字は、試験した濃度の全範囲に対して各化合物について得られた最小強度比を示す(試験した7濃度について7つの値が得られ、最低値を選択して表4に示す)。
【０１１６】
表4に示した結果は、0.75のカットオフ値を用いることによって陽性または陰性として分類した(0.75以下の全ての結果を陽性と分類した)。表5(図8)は、このカットオフ値を用いることによって感度、特異度およびバランスの取れた精度について得られた結果を提供する。HPTCの3つの異なるバッチおよび2つの細胞株(HK-2とLLC-PK1)を使用した。
【０１１７】
図9に示すように、HPTC1を、未処理状態(最上段)で、または示した対照化合物による処理後に、HCSによって画像化した。DAPI染色された細胞核(青、左側)またはNF-κB染色(赤、真ん中)が示される。結合した画像を右側に示す。核領域は未処理細胞、ビヒクル対照および陰性対照においてNF-κBが枯渇していた(NF-κB(赤、真ん中)について染色された細胞の中心に「暗闇」(dark whole))。陽性対照サンプル(100μg/mLのピューロマイシンおよび100ng/mLのTNF-α)は、NF-κBの核移行を示した(DAPI陽性の核領域におけるNF-κBの強度増加)。スケールバー：50μm。
【０１１８】
図10に示すように、HPTC1を、示した化合物で処理した後に、HCSによって画像化した。DAPI染色された細胞核(青、左側)またはNF-κB染色(赤、真ん中)が示される。結合した画像を右側に示す。全ての化合物は、ヒトでは近位尿細管細胞に対して直接的に毒性である腎毒物であった。示した所定のケースで使用される濃度は、化合物名の下に提供される(どの化合物も全濃度範囲で試験したが、全ての画像をここに示すわけにはいかない)。ここで選択された濃度は、細胞質から核へのNF-κB移行が観察された化合物の最低濃度であった。試験した全濃度範囲で得られたHCS結果に基づいて、EC50(NF-κBの核移行が細胞の50％で起こった場合の化合物の濃度)およびIC50(細胞死が細胞の50％で起こった場合の化合物の濃度；細胞核のカウント数に基づく結果)値を算出した。＞1000μg/mLのIC50値は、細胞の＞50％が1000μg/mLの最高の化合物濃度でまだ存在していた場合を示す。細胞死が毒性を予測するための指標として使用されたならば、＞1000μg/mLという高いIC50値に基づいて、それぞれの化合物は、ヒトにおいて近位尿細管細胞に対して毒性ではないと予測されたであろう(この図に含まれる全ての化合物はこの細胞タイプに対して毒性である)。対照的に、全てのケースで、NF-κBの核移行が、試験した濃度範囲内で細胞の＞50％において観察された；これらの結果に基づいて、全ての化合物は毒性であると予測されるだろう。これらの結果は、細胞死と比較して、NF-κBの移行を指標として使用する場合に、感度がより高いことを示す。これはまた、EC50値がIC50値よりも低い(両方の値が比較的低い、タクロリムスを除く)という事実によっても反映される。スケールバー：50μm。
【０１１９】
図11に示すように、HPTC1を、示した化合物で処理した後に、HCSによって画像化した。図10に関する化合物と同じ化合物を使用した。図11の画像は、最大化合物濃度(1000μg/ml)で処理した後に取得された。NF-κBのかなりの核移行が観察された。一部の画像には、細胞死のために、数個の細胞が見えるにすぎない。スケールバー：50μm。
【０１２０】
図12に示すように、HPTC1を、示した化合物で処理した後に、HCSによって画像化した。画像は、最大化合物濃度(1000μg/mL)で処理した後に取得された。この図に含まれる全ての化合物は、ヒトにおいて近位尿細管細胞に対して直接的に毒性ではない。NF-κBの十分な核移行または細胞死は観察されなかった。全てのEC50およびIC50値は、＞1000μg/mLであった。スケールバー：50μm。
【０１２１】
考察
上述の実施例1および2は、初代および不死化ヒト腎細胞に関連するが、NF-κBの移行はまた、それぞれの器官特異的細胞タイプを使用することによって、他の器官に対する毒性効果をスクリーニングするために使用することができる。NF-κBは全てのヒトおよび動物の細胞タイプにおいて普遍的に発現されており、NF-κBの活性化は、傷害、疾患および炎症に関連して、多くの異なる器官系で発生している[7]。
【０１２２】
したがって、NF-κBの移行は、ヒトまたは動物において他の器官系に対する化合物の毒性および炎症誘発能を評価するためにも使用することができる。これは、それぞれの器官特異的なヒトまたは動物細胞タイプを使用することによって行うことができる。好ましくは、初代細胞、または成体、胚性もしくは人工多能性幹細胞に由来する同様の細胞タイプを使用すべきである。
【０１２３】
そのため、器官特異的な細胞タイプは、HCSに適した基板(例えば、マルチウェルプレート)上に播種される。このような基板上で、器官特異的細胞タイプは、この細胞タイプに対する潜在的な毒性および炎症誘発効果についてスクリーニングされる化合物で処理される。その化合物によるNF-κBの核移行の誘導は、HCSとその後の画像解析によって測定され、そしてNF-κBの活性化が陽性の結果として分類される。こうしたアッセイは、ヒトまたは動物の器官特異的な初代細胞タイプ(例えば、HPTCなどの初代腎細胞タイプ、初代ラット肝細胞または初代ヒト皮膚ケラチノサイト)を用いて行われる。あるいは、幹細胞由来の器官特異的細胞タイプを使用することができる。適切な幹細胞のタイプには、あらゆる種類のヒトもしくは動物の成体幹細胞(例えば、骨髄由来間葉系幹細胞または脂肪細胞由来幹細胞）、あるいはヒトもしくは動物由来の人工多能性幹細胞または胚性幹細胞が含まれる。
【０１２４】
このようなNF-κBベースのアッセイに含めることができる器官系および細胞タイプは、以下のとおりである：肝臓(肝細胞および他の肝細胞タイプ)、腎臓(糸球体、尿細管および他の腎細胞タイプ)、心血管系(心筋細胞、内皮細胞)、中枢神経系(ニューロン、アストロサイト、グリア細胞)、皮膚(ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、および副組織構造：腺および毛包に特異的な細胞タイプ)、肺(気道上皮細胞、肺胞細胞)、膵臓(β細胞および他の膵臓細胞タイプ)、消化管(胃および小腸の異なる細胞タイプ)、生殖細胞およびそれらの前駆細胞を含む生殖器官に特異的な細胞タイプ、感覚器官(眼および耳に特異的な細胞タイプ)、骨髄または血液細胞。
【０１２５】
本明細書に記載のアッセイと以前に確立されたNF-κBベースのHCSアッセイとの差異は、次のとおりである。(1)本明細書に記載のアッセイでは、NF-κB/p65の移行は、化合物の器官特異的な毒性およびNF-κBシグナル伝達を誘導するその能力を予測するための指標として使用される。このアッセイは、試験される化合物で処理する前に、活性化因子/アゴニスト(例えば、TNF-αまたはIL-1)によって誘導されたNF-κB移行の調節に対処していない。(2)NF-κBの活性化因子/アゴニスト、例えばTNF-αまたはIL-1は使用されていない。(3)HSCアッセイはヒト初代器官特異的細胞タイプを用いて行われているが、幹細胞由来の分化した細胞を用いて行うこともできる。
【０１２６】
本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。刊行物の引用は、それが出願日前に開示されたためであり、本発明が先行発明によってこのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきでない。
【０１２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数形の照応を含むものである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する用語「含む」(comprise, comprising, comprises)およびこれらの用語の他の形態は、非限定的な包括的意味で、すなわち、記載された特定の要素または成分を、その他の要素または成分を除外することなく、包含することを意図している。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する所与の全ての範囲またはリストは、そこに含まれる任意の中間値もしくは範囲または任意の項目もしくはサブリストを伝えることを意図している。別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【０１２８】
前述の本発明は、理解を明確にするために、例示および実施例によって多少詳しく説明されているが、特定の変更および修正が、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、なされ得ることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
【０１２９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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