(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＲ９に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ）重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌを含み、
あるいは、
ｂ）重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：９に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗原結合断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディおよびダイアボディからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
ａ）請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、および
ｂ）前記ａ）に定義される核酸の相補的核酸
からなる群から選択される、核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含んでなる、ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸または請求項４に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項６】
被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を判定および／または予後予測するためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を、前記被験体由来の細胞を含むサンプルと接触させること、
ｂ）前記被験体由来のサンプルにおけるＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｃ）前記被験体由来のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を、対照サンプルにおいて検出されたものと比較すること、そして
ｄ）得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の存在と相関させること
を含んでなる、方法。
【請求項７】
治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応をモニタリングするためのインビトロ方法であって、
ａ）請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を、第１の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第１のサンプルと接触させること、
ｂ）前記第１のサンプルにおけるＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片を、第２の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第２のサンプルと接触させること、
ｄ）前記第２のサンプルにおけるＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｅ）前記第１のサンプルおよび第２のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を比較すること、そして
ｆ）得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応と相関させること
を含んでなる、インビトロ方法。
【請求項８】
医薬として用いられる、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に用いられる、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
ＣＣＲ９発現細胞が関与する前記疾患または症状が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、固形腫瘍由来の循環細胞、クローン病、炎症性腸疾患、肝線維症および急性肝炎からなる群より選択される、請求項６に記載の判定および／もしくは予後予測するためのインビトロ方法、または請求項７に記載のモニタリングするためのインビトロ方法。
【請求項１１】
ＣＣＲ９発現細胞が関与する前記疾患または症状が、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、固形腫瘍由来の循環細胞、クローン病、炎症性腸疾患、肝線維症および急性肝炎からなる群より選択される、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
治療有効量の少なくとも１つの請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を、薬学的に許容され得る賦形剤または担体とともに含んでなる、医薬組成物。
【請求項１３】
標的ＣＣＲ９発現細胞を殺傷するため、または標的ＣＣＲ９発現細胞を殺傷することを含む治療方法に使用するため、またはイメージング技術を用いた腫瘍診断であり、当該腫瘍がＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む腫瘍診断に使用するため、またはＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む腫瘍に薬物をターゲティングするために使用するため、または炎症性疾患におけるＣＣＲ９発現細胞を除去することによる炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
サンプル中のＣＣＲ−９タンパク質を検出、位置決定および／もしくは定量するためのバイオテクノロジー技術におけるツールとしての、またはサンプル中に存在するＣＣＲ９もしくはＣＣＲ９発現細胞の検出および／もしくは定量における、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項１５】
サンプル中のＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の存在を検出および／または定量するためのインビトロ方法であって、
ｉ）前記試験サンプルを、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片との免疫複合体の形成を検出および／または定量すること
を含んでなる、インビトロ方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片を含んでなる、キット。
【請求項１７】
治療剤をさらに含んでなる、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
−ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状をインビトロで判定および／もしくは予後予測するための、または
−治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状の治療に対する反応をインビトロでモニタリングするための、または
−サンプルにおけるＣＣＲ９タンパク質を検出、位置決定および／もしくは定量するためのバイオテクノロジー技術におけるツールとしての、または
−サンプル中に存在するＣＣＲ９もしくはＣＣＲ９発現細胞をインビトロで検出および／もしくは定量するための、
請求項１６または１７に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣＲ９に特異的に結合する抗体、ならびにその使用、および前記抗体を使用する診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは、７つの膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体に結合する構造的に関連する低分子タンパク質のファミリーである。ケモカインおよびその受容体は、恒常性状態および炎症状態の両方における器官形成およびリンパ球輸送において重要な役割を有する。ケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ７）の異常な腫瘍細胞発現と、癌の進行、器官選択的転移および予後不良との間には強い関連性がある。ヒトケモカイン受容体ＣＣＲ９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４５９８２）は、Ｚａｂａｌｌｏｓら（１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：５６７１−５；ＥＭＢＬ  データベース受託番号ＡＪ１３２３３７）およびＹｏｕｎら（１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４：２５３３−６）によって同定された。ＣＣＲ９については多くのデータがないが、腫瘍細胞上のその発現は、小腸における転移と相関する（Ｌｅｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２２：６８５−９０；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ａ，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６２１−３；Ａｍｅｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：６３８−４５）。
【０００３】
ＣＣＲ９は、胸腺のリンパ系細胞、小腸の浸潤細胞、一部の循環メモリーＴリンパ球（ＣＣＲ９＋α４β７ｈｉ）、ＩｇＡ分泌形質細胞および形質細胞様樹状細胞においてのみ専ら発現している。唯一の公知のＣＣＲ９リガンドは、胸腺および小腸陰窩上皮由来の上皮細胞および樹状細胞によって分泌されるケモカインＴＥＣＫ（ＣＣＬ２５）である。ＣＣＲ９−ＣＣＬ２５相互作用は、胸腺における胸腺細胞の遊走および腸管への細胞ホーミングの重要な調節因子である。卵巣癌、前立腺癌、乳癌およびメラノーマにおける異常なＣＣＲ９発現は、ＣＣＬ２５に応じたインビトロ侵襲性と相関する。急性Ｔ細胞系白血病および慢性Ｔ細胞系白血病におけるＣＣＲ９過剰発現は、疾患の悪性度に関連する。ＣＣＲ９は、競争優位性を腫瘍細胞に提供する；ＣＣＬ２５の結合は、乳癌および卵巣癌において、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路を介して、細胞生存およびアポトーシス耐性を増強し、ＪＮＫ１抗アポトーシス経路を活性化し、白血病細胞におけるＮｏｔｃｈ１を活性化することによって増殖を増強する。
【０００４】
異種モデルにおいて成長中のヒトＣＣＲ９＋腫瘍を治療するための特定の治療ツールは、毒素結合性リガンド（ＣＣＬ２５−ＰＥ３８融合タンパク質）（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｒｅｓ  ３５：１２５４−６０）を使用すること、またはリガンド特異的抗体を単独でもしくは細胞傷害剤エトポシド（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２７：２０２０−３０）と組み合わせて使用することに限定されている。これらの戦略においては、腫瘍細胞を除去するために、ＣＣＬ２５−ＣＣＲ９相互作用をターゲティングしている；結果は限定的であったが、それらは、ＣＣＲ９が、癌免疫療法の潜在的な標的であるという証拠を提供している。
【０００５】
ＣＣＲ９ターゲティング治療の欠如を考えると、ＣＣＲ９を特異的に認識する薬剤であって、ＣＣＲ９発現細胞を伴う疾患または症状の診断、予後予測および／または治療に適切な薬剤を提供することが、当技術分野において依然として必要である。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、ＣＣＲ９に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ）少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖であって、
−配列番号：１に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］またはその変異体；
−配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］またはその変異体；および
−配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］またはその変異体
から選択されるもの、および
ｂ）少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖であって、
−配列番号：４に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ１］またはその変異体；
−配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ２］またはその変異体；および
−配列番号：６に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ３］またはその変異体
から選択されるもの
を含んでなる抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、
ｉ）前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ、および
ｉｉ）前記ｉ）に定義される核酸の相補的核酸
からなる群から選択される核酸に関する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、前記核酸を含む遺伝子構築物に関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、前記核酸または前記遺伝子構築物を含む発現カセットに関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、前記核酸または前記遺伝子構築物または前記発現カセットを含んでなるベクターに関する。特定の実施形態において、前記ベクターは、発現ベクターである。
【００１１】
別の態様において、本発明は、前記核酸または前記遺伝子構築物または前記発現カセットまたは前記ベクターを含んでなる細胞に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片を生産するための方法であって、前記抗体またはその抗原結合断片の産生を可能にする条件下において、前記細胞を成長させることを含んでなる方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状のインビトロ診断および／または予後予測のための、本発明の抗体の使用に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を診断および／または予後予測するための方法であって、
ａ）前記抗体またはその抗原結合断片を、前記被験体由来の細胞を含むサンプルと接触させること、
ｂ）前記被験体由来のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｃ）前記被験体由来のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を、対照サンプルにおいて検出されたものと比較すること、そして
ｄ）得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の存在と相関させること
を含んでなる方法に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測のための前記抗体もしくはその抗原結合断片の使用、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測のための方法における前記抗体もしくはその抗原結合断片の使用に関する；あるいは、この態様は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状のインビボ診断および／または予後予測のための組成物の製造における前記抗体またはその抗原結合断片の使用と表現され得る。別の代替的な表現において、この態様は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測に使用するための前記抗体もしくはその抗原結合断片、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測のための方法に使用するための前記抗体もしくはその抗原結合断片と表現され得る。
【００１６】
別の態様において、本発明は、治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応をモニタリングするためのインビトロ方法であって、
ａ）本発明の抗体を、第１の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第１のサンプルと接触させること、
ｂ）前記第１のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｃ）本発明の抗体を、第２の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第２のサンプルと接触させること、
ｄ）前記第２のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｅ）前記第１のサンプルおよび第２のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を比較すること、そして
ｆ）得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応と相関させること
を含んでなるインビトロ方法に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための前記抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に使用するための前記抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療のための医薬の調製における前記抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、疾患の治療方法に使用するための前記抗体またはその抗原結合断片の使用であって、前記治療方法が、標的細胞（すなわち、ＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋））を殺傷することを含む使用；またはあるいは、疾患の治療のための医薬の製造における抗体またはその抗原結合断片の使用であって、前記治療が、標的細胞を殺傷することを含む使用に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、イメージング技術を用いた腫瘍診断に使用するための前記抗体またはその抗原結合断片であって、前記腫瘍がＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む使用、またはあるいはイメージング技術を用いたインビボ腫瘍診断のための組成物の製造における前記抗体またはその抗原結合断片の使用であって、前記腫瘍がＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む使用に関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む腫瘍に薬物をターゲティングするために使用するための前記抗体またはその抗原結合断片、またはあるいはＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む腫瘍に薬物をインビボターゲティングするための組成物の製造における前記抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、炎症性疾患におけるＣＣＲ９発現細胞を除去することによる炎症性疾患の治療に使用するための前記抗体またはその抗原結合断片、またはあるいはＣＣＲ９発現細胞を除去することによって炎症性疾患を治療するための医薬組成物の製造における前記抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、サンプル中のＣＣＲ−９タンパク質を検出、位置決定および／または定量するためのバイオテクノロジー技術におけるツールとしての前記抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の検出および／または定量における前記抗体またはその抗原結合断片の使用に関する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片を使用することによって、サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞を検出および／または定量するための方法に関する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片の少なくとも１つを含んでなるキットに関する；特定の実施形態において、前記キットは、前記抗体またはその抗原結合断片に加えて、さらなる治療剤を含む。
【００２８】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状を診断するための、または治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状の治療に対する反応をモニタリングするための、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状を治療するための、またはＣＣＲ９＋細胞を含む腫瘍に薬物をターゲティングするための、またはサンプル中のＣＣＲ９タンパク質を検出、位置決定および／もしくは定量するためのバイオテクノロジー技術におけるツールとしての、またはサンプル中に存在するＣＣＲ９もしくはＣＣＲ９発現細胞を検出および／もしくは定量するための、前記キットの使用に関する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤または担体と一緒に、治療有効量の少なくとも前記抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ＡＢ】９１Ｒ  ｍＡｂは、ヒトケモカイン受容体ＣＣＲ９に特異的である。（Ａ）ｈＣＣＲ９、ｍＣＣＲ９、ｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６、ｈＣＣＲ８（白色のヒストグラム）または空のｐＣＩｎｅｏベクター（灰色のヒストグラム）によって安定トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を９１Ｒ  ｍＡｂによって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）抗ヒトＣＣＲ９  ｍＡｂ  ９１Ｒおよび１１２５０９（白色のヒストグラム）またはアイソタイプ適合対照ｍＡｂ（灰色のヒストグラム）によってヒト白血病ＭＯＬＴ−４およびＪｕｒｋａｔ細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【図１ＣＤ】（Ｃ）様々な用量（０．１２〜１０μｇ／ｍｌ）の９１Ｒ（灰色のヒストグラム）、１１２５０９（白色のヒストグラム）またはアイソタイプ適合ｍＡｂ（灰色の線）によって染色したＭＯＬＴ−４の代表的なフローサイトメトリー分析（ｎ＝５）。（Ｄ）抗ＣＤ４、−ＣＤ８および９１Ｒ抗体を使用したヒト胸腺細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ４／ＣＤ８プロットのゲートにおける陽性細胞の割合が示されている；各亜集団について、ｈＣＣＲ９発現が示されている。
【図１Ｅ】（Ｅ）９１Ｒおよび抗ＣＤ３によって染色したヒト末梢血細胞を示すフローサイトメトリー、リンパ球ゲートにおける全細胞集団およびＣＤ３対９１Ｒ染色。（Ｆ）９１Ｒと共にインキュベートしたｈＣＣＲ９−またはｐＣＩｎｅｏトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞、ＭＯＬＴ−４およびＪｕｒｋａｔ細胞の膜濃縮画分の代表的なウエスタンブロット；ローディング対照として抗ＣＤ７１  Ａｂによって同じ膜をプローブした（ｎ＝３）。
【図２】９１Ｒ  ｍＡｂは、ヒトＣＣＲ９  Ｎ末端ドメインを認識する。（Ａ）ヒトおよびマウスＣＣＲ９、ならびにＮ末端ドメイン（Ｎｔ）をマウス配列によって置換したヒトＣＣＲ９（ｍＮｔ／ｈＣＣＲ９）の配列を有するキメラＣＣＲ９ダイアグラム；９１Ｒ  ｍＡｂ（抗ｈＣＣＲ９；白色のヒストグラム）、ウサギポリクローナルＫ６２９（抗ｍＣＣＲ９；白色のヒストグラム）およびウサギ対照Ａｂ（灰色のヒストグラム）を用いたフローサイトメトリー。（Ｂ）ｐＣＩｎｅｏ−、ｈＣＣＲ９−ＨＥＫおよびＭＯＬＴ−４細胞由来の膜濃縮溶解物を、９１Ｒおよび抗ＣＤ７１  Ａｂ（ローディング対照として）によるウエスタンブロットに使用した。示されている場合、細胞溶解物をＰＮＧａｓｅ処理して、Ｎ−グリコシル化残基を除去した。代表的な実験を示す（ｎ＝２）。
【図３】ヒトＣＣＬ２５は、ＭＯＬＴ−４細胞に対する結合について９１Ｒ  ｍＡｂと部分的に競合する。単独で、または１０μｇ／ｍｌ  ｈＣＣＬ２５もしくはｈＣＸＣＬ１２（４０分間、４℃）と共にプレインキュベートし、９１Ｒまたはアイソタイプ適合ｍＡｂによって染色したヒトＭＯＬＴ−４細胞の代表的なフローサイトメトリー分析（ｎ＝３）。
【図４ＡＢＣＤ】９１Ｒ  ｍＡｂによって処理したマウスにおいて、白血病異種移植片の成長は阻害される。異種移植片分析において、０日目（ｄ０）に、ＭＯＬＴ−４細胞をＲａｇ２−／−マウスに皮下（ｓ．ｃ．）接種した。９１Ｒまたは非関連ＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（１回目および２回目４ｍｇ／ｋｇ；３回目および４回目２ｍｇ／ｋｇ）を実験群に４回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。キャリパーによって、腫瘍成長を３日ごとに測定した。マウスを屠殺した後、腫瘍を摘出し、計量した。（Ａ）各脇腹に注射した腫瘍細胞を担持するマウスの、１日目、７日目、１４日目および２１日目における抗体投与スケジュール。（Ｂ）腫瘍成長速度（ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）。示されている時点において、腫瘍体積を測定し、Ｖ＝［軸直径の長さ、ｍｍ］×［（回転直径、ｍｍ）２／２］（マウス６匹／群）として計算した。（Ｃ）ｄ５６におけるＩｇＧ２ｂ処理に対する腫瘍重量（％）。平均±ＳＥＭ（ｎ＝マウス６匹／群）。（Ｄ）屠殺時点（５６日目）におけるＩｇＧ２ｂ−および９１Ｒ処理したマウス由来の腫瘍の画像。バー＝１ｃｍ。
【図４ＥＦＧＨ】（Ｅ）一方の脇腹に注射したマウスの、７日目、１４日目、２１日目および２８日目における抗体投与スケジュール。（Ｆ）Ｃのように、腫瘍体積を計算した（マウス１０匹／群）。（Ｇ）ｄ７２におけるＩｇＧ２ｂ処理に対する腫瘍重量の割合。結果は、平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝マウス１０匹／群）。（Ｈ）屠殺時点（７２日目）におけるＩｇＧ２ｂ−および９１Ｒ処理したマウス由来の腫瘍の画像。バー＝１ｃｍ。スチューデントのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図５ＡＢＣ】白血病異種移植片の成長の９１Ｒ  ｍＡｂ誘導性減少の短期速度。（Ａ）ｄ０にＲａｇ２−／−マウスの各脇腹に皮下接種した発光ＭＯＬＴ−４細胞（ＭＯＬＴ−４−ｌｕｃ）を使用した処理スケジュール。ｄ１（４ｍｇ／ｋｇ）およびｄ６（２ｍｇ／ｋｇ）に、９１Ｒまたは対照ＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂを実験群に腹腔内接種した。１〜２８日目に、発光イメージングを分析した；ｄ６２にマウスを屠殺し、腫瘍を摘出した。（Ｂ）細胞接種後の示されている時点における各群の代表的なマウスの画像。（Ｃ）腫瘍移植後の腫瘍成長速度。相対生物発光単位を平均±ＳＥＭとして示す。
【図５ＤＥ】（Ｄ）ｄ６２におけるＩｇＧ２ｂ処理に対する腫瘍負荷の割合。結果は、平均±ＳＥＭを示す。（Ｅ）マウス１匹当たりの腫瘍重量。データは、平均±ＳＥＭを示す。Ｃ〜Ｅ、ｎ＝マウス７匹／群。スチューデントのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図６ＡＢ】９１Ｒ  ｍＡｂは、腫瘍異種移植片において、アポトーシスおよび壊死を促進し、細胞増殖および血管新生を減少させる。（Ａ〜Ｄ）異種移植ＭＯＬＴ−４腫瘍の組織学的分析（ｎ＝マウス５匹／群）。（Ａ）９１Ｒまたは対照ＩｇＧ２ｂ  ｍＡｂによって処理した異種移植ＭＯＬＴ−４腫瘍由来のヘマトキシリン／エオシン染色切片；バー＝２ｍｍ。右、高倍率の画像；バー＝２５μｍ。（Ｂ）グラフは、腫瘍当たりの壊死領域の割合として表した壊死段階による腫瘍分類を示す（＜１％、１〜３０％および＞３０％）。カイ二乗検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６Ｃ】（Ｃ）ＴＵＮＥＬアッセイによって、腫瘍におけるアポトーシスレベルを分析した。ＰＣＮＡ免疫染色によって、増殖レベルを決定した。ＣＤ３１染色によって、血管を検出した。組織切片をＤＡＰＩ対比染色した。バー＝５０μｍ。
【図６Ｄ】（Ｄ）光学視野当たりのＴＵＮＥＬ−およびＰＣＮＡ陽性核および血管の定量分析。マンホイットニー検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図７ＡＢ】９１Ｒ  ｍＡｂは、ヒト白血病ＭＯＬＴ−４細胞におけるインビトロ補体依存性細胞傷害を促進する。９１Ｒまたはアイソタイプ適合ｍＡｂ（４０μｇ／ｍｌ、３０分間、３７℃）によってＭＯＬＴ−４細胞をオプソニン化し、洗浄し、２５％活性（３７℃）または不活性（５６℃）仔ウサギ補体（ＢＲＣ）と共にインキュベート（１時間）した；７ＡＡＤ染色によるフローサイトメトリーによって、細胞生存を評価した。（Ａ）抗体の非存在下における、または９１Ｒ、１１２５０９ｍＡｂもしくはアイソタイプ適合ｍＡｂ（ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）による特異的補体溶解。各条件を３回反復で分析した。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。（Ｂ）示されている濃度の９１Ｒおよび対照ＩｇＧ２ｂを使用した特異的補体溶解の用量反応曲線。データは、４回のうちの１回の代表的な実験の平均±ＳＥＭを示す。
【図７ＣＤ】（Ｃ）ＢＲＣへの曝露時間の効果。データは、２回のうちの１回の代表的な実験の平均±ＳＥＭを示す（３回反復）。（Ｄ）ＢＲＣの用量反応曲線における特異的補体溶解。データは、２回のうちの１回の代表的な実験の％平均±ＳＥＭを示す（３回反復）。スチューデントのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図８ＡＢ】９２Ｒ  ｍＡｂは、内因性ケモカイン受容体ＣＣＲ９を発現するヒトＴ細胞を特異的に認識し、ＣＣＲ９結合について９１Ｒと競合する。（Ａ）抗ヒトＣＣＲ９  ｍＡｂ  ９２Ｒ（白色のヒストグラム）またはアイソタイプ適合対照ｍＡｂ（灰色のヒストグラム）によってヒトＴ細胞白血病ＭＯＬＴ−４およびＪｕｒｋａｔ細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）９１Ｒ  ｍＡｂは、ＭＯＬＴ−４細胞に対する結合について９２Ｒ  ｍＡｂと競合する。１０μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ（対照ＩｇＧ２ｂ、９２Ｒまたは９１Ｒ）と共にプレインキュベートし、ビオチン標識９２Ｒ  ｍＡｂ（９２Ｒ−Ｂｉｏｔ）とそれに続いてＦＩＴＣ結合アビジンによって染色したＭＯＬＴ−４細胞の代表的なフローサイトメトリー分析。
【図８Ｃ】（Ｃ）ｍＡｂ  ９１Ｒおよび９２Ｒは、ｈＣＣＲ９アミノ酸２〜２２を含む合成ペプチドに対する結合について互いに競合する。ｈＣＣＲ９のアミノ酸２〜２２に対応する合成ペプチドによってＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。ＰＢＳと共にインキュベートした後、対照ＩｇＧ２ｂ、９２Ｒまたは９１Ｒ、９１Ｒ−Ｂｉｏｔまたは９２Ｒ−ＢｉｏｔｍＡｂを追加した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンによってプレートを現像した。データは、１回の代表的な実験の平均±ＳＥＭを示す。スチューデントのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図９】９１Ｒ、９２Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂの６つのＣＤＲの配列アライメント。９１Ｒ、９２Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂの６つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）のアミノ酸配列をアライメントした。キー：「＊」は、同一の残基を表す；「：」は、保存的置換を表す；「．」は、半保存的置換を表す。
【図１０】９１Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂは、内因性ケモカイン受容体ＣＣＲ９を発現するヒトＴ細胞、およびｈＣＣＲ９トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞を特異的に認識する。（Ａ）９１Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂは、ＭＯＬＴ４細胞（ＣＣＲ９＋ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞株）に特異的に結合する。アイソタイプ適合対照ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、灰色のヒストグラム）または抗ヒスＣＣＲ９  ｍＡｂ  ９１Ｒまたは３Ｃ３（１０μｇ／ｍｌ、白色のヒストグラム）によって、ヒト白血病ＭＯＬＴ−４（ｈＣＣＲ９＋）およびＪｕｒｋａｔ（ｈＣＣＲ９−）細胞（細胞２×１０５個／ウェル）を染色した。洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体と共に細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。１回の代表的な実験を示す（ｎ＝３）。（Ｂ）９１Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂは、ｈＣＣＲ９トランスフェクトＨＥＫ−２９３の異なる認識パターンを有する。特に、３Ｃ３  ｍＡｂは、モックトランスフェクト細胞に対する非特異的結合が９１Ｒ  ｍＡｂよりも多い。ｈＣＣＲ９または空ｐＣＩｎｅｏベクターによって安定トランスフェクトしたヒトＨＥＫ−２９３細胞（細胞２×１０５個／ウェル）を、アイソタイプ適合対照ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ、灰色のヒストグラム）または抗ヒトＣＣＲ９  ｍＡｂ  ９１Ｒもしくは３Ｃ３（１０μｇ／ｍｌ、白色のヒストグラム）によって染色した。洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体と共に細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。１回の代表的な実験を示す（ｎ＝２）。
【図１１】ＥＬＩＳＡプレートにおけるｈＣＣＲ９由来ペプチドに対する９１Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂの結合。ｈＣＣＲ９のアミノ酸２〜２２（配列番号：１１）および１３〜３０（配列番号：１２）に対応する合成ペプチド、ペプチドＢＯＴ（無関係な対照合成ペプチド）、ヤギ抗マウスκ軽鎖抗体（ＧａＭκＬＣ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって、プレートをコーティングした。ＢＳＡによってブロッキングした後、３Ｃ３、９１Ｒ、ＢＯＴまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを追加した。洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンを追加し、インキュベートした。最後に、プレートを洗浄し、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２によって現像した。４９０ｎｍの吸光度を測定することによって、結果を定量した。ブランクを控除しなかった。１回の代表的な実験を示す（ｎ＝２）。
【図１２】９１Ｒ、９２Ｒおよび３Ｃ３  ｍＡｂならびにＭＯＬＴ４細胞を使用した競合結合アッセイ。５０μｌのＰＢＳｓｔ（灰色のヒストグラム）または３Ｃ３、９１Ｒ、９２Ｒもしくはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ、白色のヒストグラム）と共にＭＯＬＴ４細胞（細胞２×１０５個／ウェル）をプレインキュベートした。４℃において３０分間経過した後、５０μｌのビオチン標識３Ｃ３、９１Ｒまたは９２Ｒ  ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）を追加し、さらに２０分間インキュベートし続けた。洗浄した後、ＰＥ標識アビジンと共に細胞をインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。１回の代表的な実験を示す（ｎ＝２）。
【図１３】ＣＣＲ９リガンドＣＣＬ２５によって、ＭＯＬＴ−４細胞の遊走の遮断が誘導される。５μｍトランスウェルインサートを使用して、ＭＯＬＴ−４細胞の遊走に対する抗ＣＣＲ９抗体の効果を調べた。単独で、またはアイソタイプ対照、９１Ｒもしくは３Ｃ３  ｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）と共に予めプレインキュベートした３×１０５個のＭＯＬＴ−４細胞を、２００ｎＭ  ＣＣＬ２５を含有する培地にプレーティングし、遊走させた。３時間後、遊走した細胞の数を、フローサイトメーターを使用して評価した。データは、１回の代表的な実験の平均±ＳＥＭを示す（４回反復）（ｎ＝２）。スチューデントのｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の抗体
本発明は、ＣＣＲ９に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片（以下、「本発明の抗体」）であって、
ｉ）少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖であって、
−配列番号：１に示されているアミノ酸配列（ＮＦＷＭＮ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］またはその変異体；
−配列番号：２に示されているアミノ酸配列（ＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］またはその変異体；および
−配列番号：３に示されているアミノ酸配列（ＤＧＷＦＡＹ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］またはその変異体
から選択されるもの、および
ｉｉ）少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖であって、
−配列番号：４に示されているアミノ酸配列（ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＶＱ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ１］またはその変異体；
−配列番号：５に示されているアミノ酸配列（ＫＶＳＮＲＦＰ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ２］またはその変異体；および
−配列番号：６に示されているアミノ酸配列（ＡＱＳＴＨＶＰＲＴ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ３］またはその変異体
から選択されるもの
を含んでなる抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：１〜３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲまたはそれらの変異体から選択されるＣＤＲの２つを含む。
【００３３】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］またはその変異体、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］またはその変異体、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］またはその変異体を含む。
【００３４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］を含む。
【００３５】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖内に、配列番号：４〜６に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲまたはそれらの変異体から選択されるＣＤＲの２つを含む。
【００３６】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ１］またはその変異体、配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ２］またはその変異体、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ３］またはその変異体を含む。
【００３７】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ１］、配列番号：５に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ２］、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ３］を含む。
【００３８】
本発明の抗体は、その特徴が前述されているＣＤＲ配列の任意の組み合わせを含有し得る；それにもかかわらず、好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００３９】
より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：５に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３を含み、これは、実施例において９１Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体に対応する。
【００４０】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：７、２および３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲまたはそれらの変異体から選択されるＣＤＲの２つを含む。
【００４１】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列（ＫＦＷＭＮ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ１］またはその変異体、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］またはその変異体、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］またはその変異体を含む。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ２］、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｈ３］を含む。
【００４３】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖内に、配列番号：８〜１０に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲまたはそれらの変異体から選択されるＣＤＲの２つを含む。
【００４４】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列（ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＮ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ１］またはその変異体、配列番号：９に示されているアミノ酸配列（ＫＶＳＮＲＦＳ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ２］またはその変異体、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列（ＳＱＳＴＨＦＰＲＴ）を含むＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ３］またはその変異体を含む。
【００４５】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ１］、配列番号：９に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ２］、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ［ＣＤＲ−Ｌ３］を含む。
【００４６】
本発明の抗体は、その特徴が前述されているＣＤＲ配列の任意の組み合わせを含有し得る；それにもかかわらず、好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：９に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００４７】
より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：９に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３を含み、これは、実施例において９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体に対応する。
【００４８】
本明細書において使用される用語「抗体」は、「抗原」と称される特定のタンパク質に対して特異的な結合活性を示す糖タンパク質を指す。用語「抗体」は、全モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、またはそれらの断片を含み、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト起源の抗体を含む。「モノクローナル抗体」は、単一の部位または抗原「決定基」に対する均一で高特異的な抗体集団である。「ポリクローナル抗体」は、異なる抗原決定基に対する不均一な抗体集団を含む。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、非ヒト起源、好ましくはマウス起源の抗体である。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００５０】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものであり得る。アイソタイプの選択は、典型的には、ＡＤＣＣ誘導などの所望のエフェクター機能を指針とするであろう。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域、κまたはλのいずれかを使用し得る。所望であれば、公知の方法によって、本発明のＣＣＲ９抗体のクラスをスイッチし得る。
【００５１】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト起源の抗体またはヒト化抗体である。
【００５２】
本発明の抗体は、ＣＣＲ９に特異的に結合する。本明細書において使用される用語「ＣＣＲ９」または「ＣＣＲ９ケモカイン受容体」は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体９を指す。ＣＣＲ９を指定するための他の用語としては、ＧＰＲ２８；ＣＤｗ１９９；ＧＰＲ−９−６；ＣＣ−ＣＫＲ−９が挙げられる。特定のＣＣＲ９リガンドは、ＣＣＬ２５である。ケモカイン受容体ＣＣＲ９は、ほとんどの小腸粘膜固有層および上皮内リンパ球、ならびにごく一部の末梢血リンパ球において発現している。この受容体は、胸腺、小腸粘膜固有層および上皮内リンパ球の大部分、ごく一部の末梢血リンパ球、ならびに循環中に存在する一部の記憶Ｔ細胞α４β７において発現している。それはまた、ＩｇＡ分泌Ｂ細胞、マクロファージおよび形質細胞様樹状細胞において発現している。ＣＣＲ９発現は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞およびメラノーマ細胞において報告されている。ＣＣＲ９陽性細胞は、急性肝炎、炎症性腸疾患およびクローン病の病因において重要である。ＣＣＲ９をコードする遺伝子について、ＣＣＲ９アイソフォームＡおよびＣＣＲ９アイソフォームＢをもたらす２つの選択的スプライシング転写産物変異体が記載されている（それぞれＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号ＮＰ＿１１２４７７．１およびＮＰ＿００１２４３２９８．１、２０ｔｈＳｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１３）。
【００５３】
ＣＣＲ９は、Ｎ末端細胞外ドメイン（Ｎｔ）、７個の膜貫通ドメイン、３個の細胞内ドメイン、３個の細胞外ドメインおよび細胞内Ｃ末端ドメイン（Ｃｔ）に対応する１５個のドメインから構成される（図２Ａ）。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＣＲ９アイソフォームＡのＮ末端細胞外ドメイン（Ｎｔ）のアミノ酸２〜２２（配列番号：１１）を含有するエピトープに特異的に結合する
【００５４】
本発明の抗体は、様々な哺乳動物種由来のＣＣＲ９抗原に対するものであり得る。本発明に適切な哺乳動物の非限定的な例としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長類、例えばサル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えば、チンパンジー）およびヒトが挙げられる。特定の実施形態において、ＣＣＲ９は、ヒト起源のものである。
【００５５】
抗体の基本構造単位は、四量体を含むことが周知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアから構成され、これらはそれぞれ、軽鎖（２５ＫＤａ）および重鎖（５０〜７５ＫＤａ）から構成される。各鎖のアミノ末端領域は、抗原認識に関与する約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端領域は、エフェクター機能を媒介する定常領域を含む。軽鎖および重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は、２つの結合部位を有する。軽鎖は、κまたはλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δおよびεとして分類され、それらは、抗体のアイソタイプをそれぞれｌｇＧ、ｌｇＭ、ｌｇＡ、ｌｇＤまたはｌｇＥと規定する。
【００５６】
軽鎖および重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の結合部位を形成する。それらは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つの超可変領域によって連結された比較的保存された領域から構成される同じ一般構造を特徴とする（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−１７）。本明細書において使用される用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、このタンパク質が抗原の形状と相補的である抗体内領域を指す。したがって、ＣＤＲは、特定の抗原に対するタンパク質の親和性（およその結合強度）および特異性を決定する。各ペアの２本の鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によってアライメントされて、特定のエピトープに結合する機能を獲得する。その結果、重鎖および軽鎖は両方とも、３つのＣＤＲ（それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）を特徴とする。
【００５７】
ＣＤＲ配列は、従来の基準にしたがって、例えばＩｇＢＬＡＳＴの基準：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ：Ｗ３４−４０）によって、本出願において使用されているようにＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に示されているナンバリングにしたがって、またはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８３）に示されているナンバリングにしたがって決定され得る。
【００５８】
本明細書において使用される本発明の抗体は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ）だけではなく、その抗原結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト起源の抗体、組換え抗体、および遺伝子工学技術によって生産される免疫グロブリン由来のポリペプチド、例えば単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、重鎖もしくはその断片、軽鎖もしくはその断片、ＶＨもしくはその二量体、ＶＬもしくはその二量体、ジスルフィド架橋によって安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、単鎖可変領域ドメインを有する分子（Ａｂｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、および抗体を含む融合タンパク質、または所望の特異性の抗原認識部位を含む任意の他の改変型免疫グロブリン分子を包含する。本発明の抗体はまた、二重特異性抗体であり得る。抗体断片は、抗原結合断片を指し得る。抗体は、任意のクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（またはそれらのサブクラス）およびＩｇＭの抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスのものではなくてもよい。加えて、本発明の抗体はまた、さらなる化合物、例えば治療剤、毒素などにコンジュゲートされ得る。
【００５９】
多くのアプローチは、臨床用途または他の用途のために免疫グロブリンの特性を改善することを目的として、免疫グロブリンの遺伝的特徴および構造についての十分な知識などの分子生物学および遺伝子工学を利用して免疫グロブリン分子の様々な改変を構築する。それらのアプローチの中には、使用すべき種において分子の免疫原性を低減する傾向を有するものもあり、得られた分子は、この種とより相同な配列を有する。健常なヒトにおける倫理的に許容できない手順を避けて、ヒト由来のｍＡｂを得るために、様々な方法が使用されている。他のアプローチにおいては、例えば、固形腫瘍内への分子の分散を改善するために、分子量およびサイズが低減される。他の可能性としては、２つ以上の標的分子（二重特異性抗体または三重特異性抗体など）に対する結合ドメインの分子内における結合、または所望の機能を有する他の分子（例えば、毒剤、ホルモン、成長因子、免疫調節剤（免疫抑制剤または免疫刺激剤）、細胞成長阻害剤など）と、抗体または断片との結合である。一般に、得られたすべての分子は、抗体の少なくとも１つの可変ドメインを保持しており、このドメインにより、抗原−抗体結合の特異性および親和特性が高くなる。
【００６０】
このような抗体は、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳動物細胞培養における組換え発現、およびトランスジェニック動物における組換え発現を含む様々な方法によって生産され得る。特定の生産方法の選択について、文献、例えばＣｈａｄｄ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２：１８８−１９４（２００１）において十分なガイダンスがある。製造方法の選択は、所望の抗体構造、抗体上の炭水化物部分の重要性、培養および精製の容易性、ならびに費用を含むいくつかの要因に依存する。標準的な発現技術を使用して、全長抗体、抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦｖ断片）、ならびに異なる種由来の成分を含むキメラ抗体を含む多くの異なる抗体構造を作製し得る。エフェクター機能を有さず、限られた薬物動態活性を有する小型抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦｖ断片）は、細菌発現系において作製され得る。単鎖Ｆｖ断片は、低い免疫原性を示し、血液から迅速に排除される。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ＣＣＲ９に結合する能力を保持するモノクローナル抗体または前記抗体の断片である。前記抗体は、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００６２】
したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒト化抗体である。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、キメラ抗体である。
【００６３】
ヒト化抗体：
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体、典型的にはマウス抗体由来の抗体を意味し、この抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するが、ヒトにおける免疫原性はより低い。これは、（ａ）ヒト定常領域上に非ヒト可変ドメイン全体をグラフトし、キメラ抗体を生成すること、（ｂ）重要なフレームワーク残基を保持して、または保持しないで、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒトフレームワーク領域および定常領域内へグラフトすること、および（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様部分で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」こと、を含む様々な方法によって達成され得る。
【００６４】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において説明されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、典型的には「インポート」可変ドメインから採取される。
【００６５】
ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共働者らの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））にしたがって、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列に置換することにより行うことができる。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基と、おそらくはいくつかのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、齧歯類抗体における相同部位からの残基で置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体を作製する際に使用すべき（重鎖および軽鎖の両方の）ヒト可変ドメインの選択は、抗原に対する特異性および親和性を保持しつつ、免疫原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「最適な」方法にしたがって、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒトの配列は、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として認められる（Ｓｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１（１９８７））。別の方法においては、軽鎖または重鎖の特定サブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定フレームワーク領域が使用される。同じフレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体のために使用され得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【００６６】
抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しつつ抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および様々な概念上のヒト化生成物の分析プロセスによって調製される。
【００６７】
抗体をよりヒトに類似させるというこのアプローチにおけるさらなる工程は、いわゆる霊長類化抗体、すなわち、サル（または他の霊長類）抗体、特に、カニクイザル抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインを含有するように改変され、ヒト定常ドメイン配列、好ましくはヒト免疫グロブリンガンマ１またはガンマ４定常ドメイン（またはＰＥ変異体）を含有する組換え抗体を調製することである。このような抗体の調製は、Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５８−１４６０（１９９２）；米国特許第５，６５８，５７０号および米国特許第６，１１３，８９８号に記載されている。これらの抗体は、ヒト抗体と高い相同性、すなわち８５〜９８％の相同性を呈するものとして報告されており、ヒトエフェクター機能を示し、免疫原性が低下しており、ヒト抗原に対して高い親和性を示し得る。組換え抗体を作製するための別の非常に効率的な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）に開示されている。
【００６８】
ヒト抗体：
「ヒト抗体」は、公知の標準的な方法のいずれかによって生産される、ヒトの軽鎖および重鎖、ならびに定常領域を完全に含有する抗体を意味する。
【００６９】
ヒト化に替わり得るものとして、ヒト抗体を作製することができる。例えば、免疫化により、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することが現在可能である。例えば、キメラ型生殖系変異体マウスにおける抗体の重鎖結合領域ＰＨ遺伝子のホモ接合体が欠失することにより、内因性抗体の生成が完全に阻害されることが説明されている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系変異体マウスに移入することにより、免疫化後にヒト抗体が生成される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５  １（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３），Ｌｏｎｂｅｒｇ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−２５を参照のこと。
【００７０】
ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞、またはその免疫系をヒト細胞によって再構成したＳＣＩＤマウスによって生成され得る。
【００７１】
ヒト抗体が得られたら、そのＤＮＡコード配列を単離し、クローニングし、好ましくは哺乳類からの適切な発現系、すなわち細胞系に導入し、その後発現させて、抗体が単離され得る培養培地内にそれを遊離させる。
【００７２】
抗体断片：
抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびｓｃＦｖなどの抗体断片である。抗体断片を生産するために、様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体をタンパク分解することにより得られていたが、より近年においては、これらの断片は、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。他の実施形態において、最適な抗体は、さらに単一特異性または二重特異性であり得る単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片である。
【００７３】
抗体のパパイン分解により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する２つの同じ抗原結合断片（「Ｆａｂ」断片と称される）と、残りの「Ｆｃ」断片（この名称は、容易に結晶化するというこの断片の能力を反映している）とが生成される。ペプシン処理によりＦ（ａｂ’）２断片が生成され、この断片は２つの抗原結合部位を有し、抗原を依然として架橋することができる。
【００７４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域とが強固に、非共有的に結合した二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。集約すると、６つの超可変領域は、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）は、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性が低い。
【００７５】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含むいくつかの残基が付加されている点がＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においては、定常ドメインの１つ以上のシステイン残基が少なくとも１つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての名称である。Ｆ（ａｂ’）Ｚ抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として生産されていた。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【００７６】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための望ましい構造を形成することができる。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００７７】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小型抗体断片であって、同ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接合された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む小型抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間におけるペアリングを可能にするには短いリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインとのペアリングを余儀なくされ、２つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより詳細に記載されている。
【００７８】
本発明内に含まれるＣＣＲ９受容体に結合する抗体の機能的断片は、それらが由来する全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。好ましい機能的断片は、対応する全長抗体の抗原結合機能（例えば、哺乳類ＣＣＲ９受容体に結合する能力）を保持する。
【００７９】
二重特異性抗体：
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＣＣＲ９の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、ＣＣＲ９に結合し、第２の細胞表面マーカーに結合し得る。二重特異性抗体はまた、細胞傷害剤をＣＣＲ９発現細胞に局在化するために使用され得る。これらの抗体は、抗ＣＣＲ９結合アームと、細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ）２二重特異性抗体、ミニボディ、ダイアボディ）として調製され得る。
【００８０】
別のアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列と融合される。この融合は、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインと行われるのが好ましく、この定常ドメインは、少なくともヒンジ部、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を含む。前記融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター内に挿入され、適切な宿主生物にコトランスフェクトされる。構築に使用される３つのポリペプチド鎖の比が同じでないことによって最適な収量が得られる実施形態において、これは、３つのポリペプチド断片の相互比率の調整における高柔軟性を提供する。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖が同じ比で発現することによって収量が高くなる場合、またはそれらの比が特に重要ではない場合には２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖についてのコード配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。
【００８１】
抗体断片から二重特異性抗体を作製するための技術もまた文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。
【００８２】
ＣＣＲ９に結合する能力を有する断片は、当技術分野における通常の知識を有する者に公知の従来の方法によって得られ得る。前記方法は、目的のモノクローナル抗体のポリペプチド鎖（またはその断片）をコードするＤＮＡを単離すること、および組換えＤＮＡ技術によってＤＮＡを操作することを含み得る。目的の別のＤＮＡを作製するためにＤＮＡを使用してもよいし、または１アミノ酸以上を付加、削除または置換するための（例えば、突然変異誘発による）改変ＤＮＡ、例えば抗体（例えば、重鎖または軽鎖、可変領域または抗体全体）のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを、ＣＣＲ９を有する免疫マウス由来のマウスＢ細胞から単離してもよい。ＤＮＡは、従来の方法によって、例えばＰＣＲによって単離および増幅され得る。
【００８３】
単鎖抗体は、従来の方法によって、アミノ酸架橋を介して重鎖および軽鎖の可変領域（Ｆｖ領域）を結合することによって得られ得る。ｓｃＦｖは、可変領域（ＶＬおよびＶＨ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ間において、リンカーペプチドをコードするＤＮＡを融合させることによって調製され得る。ｓｃＦｖの生産は、多くの文献、例えば米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３，１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９，１９８８）およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４，１９８９）に記載されている。
【００８４】
当業者であれば、ポリペプチドの一次配列が変化する場合であっても、抗体のＣＣＲ９結合能が維持されるように、本発明の抗体のアミノ酸配列は１つ以上のアミノ酸置換を含み得ることを理解するであろう。前記置換は保存的置換であり得、これは一般に、類似の特性を有する別のアミノ酸によるあるアミノ酸の置換（例えば、アスパラギン酸によるグルタミン酸（負に荷電したアミノ酸）の置換は、保存的アミノ酸置換であろう）を示すために適用される。
【００８５】
本発明はまた、本明細書において同定された重鎖および軽鎖のＣＤＲの配列の変異体を企図し、これらは本発明の範囲内である。本明細書において使用される用語「変異体」または「機能変異体」は、本明細書において使用される場合、その同族抗原に結合する能力（すなわち、その親和性／結合力および／または特異性／選択性）を実質的に維持する実質的に同様の配列を指す。変異体は、一般に、ネイティブな配列として定性的な観点から、同じ生物学的活性を有する。ＣＤＲの変異体は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む本明細書において同定されたポリペプチド配列誘導体であり得る。本発明によれば、配列番号：１〜１０の１つに示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲの変異体は、配列番号：１〜１０の１つに示されている対応するアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは、配列番号：１〜１０の１つに示されている対応するアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む。変異体は、ＣＤＲのＮ末端、またはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、少なくとも１アミノ酸、または少なくとも２アミノ酸、または少なくとも３アミノ酸、または少なくとも４アミノ酸、または少なくとも５アミノ酸、または少なくとも６アミノ酸、または少なくとも７アミノ酸、または少なくとも８アミノ酸、または少なくとも９アミノ酸、または少なくとも１０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる付加を含むことも企図される。同様に、変異体は、ＣＤＲのＮ末端、またはＣ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、少なくとも１アミノ酸、または少なくとも２アミノ酸、または少なくとも３アミノ酸、または少なくとも４アミノ酸、または少なくとも５アミノ酸、または少なくとも６アミノ酸、または少なくとも７アミノ酸、または少なくとも８アミノ酸、または少なくとも９アミノ酸、または少なくとも１０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる欠失を含むことも企図される。本発明の抗体の機能変異体は、好ましくは、前記抗体の同族標的結合能の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同族標的結合能を有するであろう。
【００８６】
本発明の抗体のＣＣＲ９結合能は、当技術分野において利用可能な多くのアッセイによって決定され得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞のクローンによって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴によって、または免疫蛍光技術、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光顕微鏡検査もしくはフローサイトメトリーによって決定される。
【００８７】
本明細書において記載される抗体のアミノ酸配列改変が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合もある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸に、適切なヌクレオチドの変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらへの挿入、および／またはそれらの置換が挙げられる。欠失、挿入および置換のいずれかの組み合わせを行って最終構築物を達成するが、ただし、最終構築物が望ましい特性を有することが条件である。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変更するなど、タンパク質の翻訳後プロセスを変化させ得る。
【００８８】
アミノ酸配列の挿入としては、１残基から１００残基以上を含有するポリペプチドまでの長さを有するアミノおよび／またはカルボキシル末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有するペプチド、または細胞傷害性ポリペプチドと融合された抗体ポリペプチド鎖が挙げられる。分子の他の挿入変異体としては、Ｎ末端またはＣ末端と酵素または血清中半減期を増加させるポリペプチドとの融合物が挙げられる。
【００８９】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、分子内に、異なる残基で置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。抗体の置換型突然変異誘発のための最大の関心部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲの変更もまた企図される。
【００９０】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させる。変化は、分子内に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失する、および／または分子内に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が結合していることを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に炭水化物部分を酵素的に結合させるための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作る。Ｏ−結合型グリコシル化は、単糖類または単糖類の誘導体、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの１つをヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリンまたはトレオニンへ結合させることを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用され得る。グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって好都合に達成される。この変化はまた、（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）１つ以上のセリンまたはトレオニン残基を元の抗体の配列に付加することによって、または元の抗体の配列をそれら残基で置換することによって行われ得る。抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、限定されないが、天然供給源からの単離（天然由来のアミノ酸配列変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介型（または部位指向型）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および予め調製された抗体の変異体もしくは非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。
【００９１】
本発明において使用される抗体を改変してエフェクター機能を改善するために、例えば、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを改善することが望ましい場合もある。これは、抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成され得る。
【００９２】
抗体などの糖タンパク質のアミノ酸骨格に付加されたグリコシル基は、いくつかの単糖類または単糖類誘導体によって形成されるので、異なる哺乳類または組織からの細胞において生成された同じ抗体でも組成が異なる可能性がある。加えて、グリコシル基の異なる組成は、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する効力に影響を与え得ることが示されている。したがって、異なる供給源からの抗体のグリコシル化パターンを研究することにより、それらの特性を改善することが可能である。このようなアプローチの例は、Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４  Ｍａｒ  １５；６４（６）：２１２７−３３である。
【００９３】
したがって、別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、フコースを減少させてＡＤＣＣを増強するように糖操作される（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。フコシル残基を欠く抗体は、米国特許第８２０７３０３号にしたがって調製され得る。
【００９４】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、補体活性化を増強するように操作されている。
【００９５】
あるいはまたは加えて、１つ以上のシステイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスフフィド結合を形成し得る。このようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能力、ならびに／または増加した補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）ａｎｄ  Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作し得、それにより、補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２  １９−２３０（１９８９）およびＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２３：１９５−２０２（２０１０）を参照のこと。
【００９６】
抗体の血清中半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体に組み込み得る。本明細書において使用される用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープであって、ＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期の増加に関与するエピトープを指す。
【００９７】
好ましくは、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片）または本発明のモノクローナル抗体由来の他の結合組成物は、高いＣＣＲ９受容体親和性を有する。モノクローナル抗体および関連分子のＣＣＲ９受容体親和性は、従来技術によって測定され得る。
【００９８】
抗原に対する抗体の親和性は、このような抗原に結合するための抗体の効力と定義され得る。抗原−抗体結合は可逆的な結合であるので、十分な時間の後、両分子が同じ溶液で希釈されると、この溶液は平衡に達し、抗原−抗体複合体（ＡｇＡｂ）、遊離抗原（Ａｇ）および遊離抗体（Ａｂ）の濃度は一定である。したがって、［ＡｇＡｂ］／［Ａｇ］＊［Ａｂ］比はまた、Ｋａと称される結合定数として定義される定数であり、この定数は、そのそれぞれのエピトープに対するいくつかの抗体の親和性を比較するために使用され得る。
【００９９】
親和性を測定するための一般的な方法は、結合曲線を実験により決定することである。これは、遊離抗原の濃度の関数として、抗体−抗原複合体の量を測定することを含む。この測定を行う一般的な方法は２つある：（ｉ）Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いた伝統的な平衡透析、および（ｉｉ）抗体または抗原のいずれかが導電性表面に結合され、抗原または抗体それぞれの結合がこの表面の電気的特性に影響を及ぼす表面プラズモン共鳴法。
【０１００】
同じエピトープを接合する２つ以上の抗体（例えば、本発明の抗体またはその機能変異体の場合）の相対親和性を測定するだけでよいことも多い。この場合、抗体の一方の系列希釈物を一定量のリガンドと共にインキュベートし、次いで、任意の適切なトレーサーによって標識した第２の抗体を追加する競合アッセイを実施し得る。このｍＡｂを結合させ、未結合の抗体を洗浄した後、第２の抗体の濃度を測定し、第１の抗体の濃度に関してプロットし、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ法によって分析する。一例は、Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１４３２−１４４１（２０００）である。あるいは、本発明の場合のように、リガンドが膜結合抗原である場合、可溶性リガンドは、前記抗原を発現する細胞の表面上の抗体にディスプレイされ得る。したがって、一定量のリガンドと共に、様々な量の抗体をインキュベートする。
【０１０１】
本発明の抗体のＣＣＲ９親和性は、少なくとも１０−７Ｍ、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍまたは少なくとも１０−１２Ｍである。
【０１０２】
本発明の核酸、発現カセット、ベクターおよび細胞
別の態様において、本発明は、
ｉ）本発明の抗体をコードする核酸、および
ｉｉ）前記ｉ）に定義される核酸の相補的核酸
からなる群から選択される核酸（以下、「本発明の核酸」）に関する。
【０１０３】
本明細書において使用される用語「核酸」は、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドと称されるモノマーの繰り返しによって形成されたポリマーを指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。
【０１０４】
本発明の抗体の詳細は前述されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明の核酸は、ａ）重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ｂ）軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【０１０６】
別の特定の実施形態において、本発明の核酸は、ａ）重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３を含み、ｂ）軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：５に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体（これは、実施例において９１Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体に対応する）をコードする。
【０１０７】
別の特定の実施形態において、本発明の核酸は、ａ）重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ｂ）軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：９に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【０１０８】
別の特定の実施形態において、本発明の核酸は、ａ）重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３を含み、ｂ）軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：９に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体（これは、実施例において９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体に対応する）をコードする。
【０１０９】
本発明の核酸は、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列の発現のために作動可能に連結された調節配列を含有し、それにより、遺伝子構築物（以下、「本発明の遺伝子構築物」）を形成し得る。本明細書において使用される用語「作動可能に連結された」は、本発明の核酸配列によってコードされる抗体が、発現制御配列または発現調節配列の制御下において正しいリーディングフレームによって発現されることを意味する。したがって、別の態様において、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された本発明の遺伝子構築物を含む発現カセット（以下、「本発明の発現カセット」）を提供する。本発明の遺伝子構築物は、従来技術において広く公知の技術を使用することによって得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，３ａｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１−３）。
【０１１０】
制御配列は、前記抗体の転写および適切な場合には翻訳を制御および調節する配列であり、プロモーター配列、転写調節因子をコードする配列、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、および／または転写終結配列を含む。本発明の発現カセットは、エンハンサー（これは、プロモーター配列に隣接していてもよいし、またはプロモーター配列から離れていてもよく、これからの転写を増加させるように機能し得る）をさらに含み得る。特定の実施形態において、前記発現制御配列は、原核細胞および生物、例えば細菌などにおいて機能的である。一方、別の特定の実施形態において、前記発現制御配列は、真核細胞および生物、例えば昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞などにおいて機能的である。
【０１１１】
任意の利用可能なプロモーターをこの方法において使用し得る。本発明の好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物において使用されるプロモーターは、トランスフェクトすべき特定の細胞集団において活性である。本発明の発現カセット中に存在し得るユビキタスプロモーターの例示的で非限定的な例としては、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）、ＳＶ４０プロモーター、ＥＦ１−アルファプロモーターおよびユビキチンプロモーターＣが挙げられる。細胞型特異的プロモーターおよび／または組織特異的プロモーター（例えば、アルブミン）の例示的で非限定的な例としては、肝臓に対して特異的であるもの［Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：２６８−２７７］、リンパ系特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．；（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５］、特にＴ細胞受容体［Ｗｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３］および免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３７２９−７４０］のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター、例えばニューロフィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７］、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６］または乳腺特異的プロモーター、例えば乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許第２６４，１６６号）が挙げられる。発現カセットＣＡＧ−ＧＳは、ＣＭＶエンハンサーエレメント、ニワトリβ−アクチンのプロモーターおよび転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）ウイルスウッドチャック肝炎（ウッドチャック肝炎ウイルス、ＷＨＰ）から構成される［Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−９］。プロモーターおよびこの要素の組み合わせは、インビボにおける導入遺伝子の高い発現レベルを促す。
【０１１２】
有利なことに、本発明の発現カセットは、前記発現カセットを有する形質転換宿主細胞を選択することを可能にするモチーフまたは表現型をコードするマーカーまたは遺伝子をさらに含む。本発明の発現カセット中に存在し得る前記マーカーの例示的な例としては、抗生物質耐性遺伝子、毒性化合物耐性遺伝子、および一般に遺伝子形質転換細胞を選択することを可能にするすべてのものが挙げられる。
【０１１３】
本発明の遺伝子構築物または本発明の発現カセットは、適切なベクターに挿入され得る。したがって、別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子構築物または本発明の発現カセットを含んでなるベクター（例えば、発現ベクター）（以下、「本発明のベクター」）に関する。ベクターの選択は、それがその後に導入される宿主細胞に依存する。一例として、前記核酸配列が挿入されるベクターは、宿主細胞に導入されると前記細胞のゲノムに組み込まれるかまたは組み込まれないプラスミドまたはベクターであり得る。このベクターの取得は、当業者に公知の従来の方法によって実施され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１、前掲）。特定の実施形態において、前記組換えベクターは、動物細胞をトランスフェクトするために有用なベクターである。
【０１１４】
前記ベクターは、前記ベクターによって形質転換、トランスフェクトまたは感染しやすい細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染するために使用され得る。このような細胞は、原核生物または真核生物のものであり得る。したがって、別の態様において、本発明は、本発明のベクターによって形質転換、トランスフェクトまたは感染された細胞（以下、「本発明の細胞」）に関する。したがって、前記形質転換、トランスフェクトまたは感染された細胞は、本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物または本発明の発現カセットもしくはベクターを含む。
【０１１５】
形質転換、トランスフェクトまたは感染された細胞は、当業者に公知の従来の方法によって得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１、前掲）。本発明を実施するために適切な細胞としては、限定されないが、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞および細菌細胞が挙げられる。細菌細胞としては、限定されないが、グラム陽性細菌、例えば桿菌、ストレプトマイセスおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に由来する細胞、ならびにグラム陰性細菌細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびシュードモナス属の細胞が挙げられる。真菌細胞としては、好ましくは、酵母細胞、例えば酵母類、ピキア  パストリスおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが挙げられる。昆虫細胞としては、限定されないが、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられる。植物細胞としては、とりわけ、作物植物、例えば穀物、薬用作物、観賞植物または球根の細胞が挙げられる。本発明に適切な哺乳動物細胞としては、上皮細胞株、骨肉腫細胞株、神経芽腫細胞株、上皮癌、神経膠細胞、肝細胞株、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、２９３および２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＴＥＲＡ−２ヒトＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ系統のＤ３細胞、ヒト胚性幹細胞、例えばＨＳ２９３、ｈＭＳＣおよびＢＧＶ０１、ＳＨＥＦ１、ＳＨＥＦ２およびＨＳ１８１、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７細胞が挙げられる。
【０１１６】
特定の実施形態において、前記細胞は、適切なベクターによって形質転換、トランスフェクトまたは感染された動物細胞、本発明の抗体を発現することができる前記トランスフェクト、形質導入または感染された動物細胞であるので、前記ベクターは、動物細胞において本発明の抗体を発現させるために使用され得る。用語「抗体」およびその詳細は、本発明の抗体との関連において詳細に記載されており、本発明の核酸、発現カセット、ベクターおよび細胞との関連において同じ意味で使用される。
【０１１７】
本発明の核酸、遺伝子構築物、発現カセット、ベクターまたは細胞は、本発明の抗体を生産するために使用され得る。特定の実施形態において、本発明の核酸、遺伝子構築物、発現カセット、ベクターまたは細胞によって発現または産生される本発明の抗体は、実施例において９１Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体である。別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、実施例において９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体である。
【０１１８】
このように、用語「本発明の細胞」はまた、拡大によって、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む。本明細書において使用される用語「ハイブリドーマ」は、特定の抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞（これは、組織培養液中におけるその成長能および抗体鎖合成の欠如により選択される）と融合することによって形成されたハイブリッド細胞株を指す。ハイブリドーマによって産生される抗体は、通常、単一特異性であるので、（ポリクローナル抗体とは対照的に）モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の生産は、１９７５年にＣｅｓａｒ  ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＧｅｏｒｇｅｓ  Ｊ．Ｆ．Ｋｏｈｌｅｒ  によって発明された（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７）。
【０１１９】
したがって、別の態様において、本発明は、本発明の抗体を生産するための方法であって、前記抗体の産生を可能にする条件下において、本発明の細胞を成長させることを含んでなる方法に関する。前記細胞の培養を最適化するための条件は、使用される細胞に依存するであろう。所望であれば、本発明の抗体を生産するための方法は、前記抗体を単離および精製することをさらに含む。
【０１２０】
本発明による診断／予後予測方法
本発明の抗体は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状のインビトロ診断および／または予後予測に使用され得る。したがって、別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状のインビトロ診断および／または予後予測のための、本発明の抗体の使用に関する。
【０１２１】
さらに、別の態様において、本発明は、被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を診断および／または予後予測するためのインビトロ方法（以下、「本発明の第１の方法」）であって、
ａ）本発明の抗体を、前記被験体由来の細胞を含むサンプルと接触させること、
ｂ）前記被験体由来のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｃ）前記被験体由来のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を、対照サンプルにおいて検出されたものと比較すること、そして
ｄ）得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の存在と相関させること
を含んでなるインビトロ方法に関する。
【０１２２】
本発明の第１の方法は、高感度かつ特異的な方法であり、例えば、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を有する被験体または個体は、所定の細胞集団または細胞亜集団におけるＣＣＲ９陽性細胞の数が、絶対的に増加しているか、またはＣＣＲ９発現細胞が関与するこれらの疾患もしくは症状の病歴を有していない被験体由来の、もしくはＣＣＲ９を発現しない細胞の培養物由来の対照サンプル（陰性対照）における対応するレベルと比較して増加しているという事実に基づくものである。
【０１２３】
用語「抗体」および「ＣＣＲ９」は、本発明の抗体との関連において詳細に記載されており、それらの詳細は、本発明の抗体との関連において詳細に記載されており、本発明の第１の方法との関連における同じ意味で使用される。
【０１２４】
用語「被験体」または「個体」は、哺乳動物種のメンバーを指し、限定されないが、家畜、霊長類およびヒトが挙げられる；被験体は、好ましくは、任意の年齢または人種の男性または女性のヒトである。
【０１２５】
本発明の第１の方法を実施するために、細胞を含むサンプル、例えば生物学的サンプルは、研究すべき被験体から得られる。本明細書において使用される用語「サンプル」または「生物学的サンプル」は、様々な種類の生体液、罹患器官の組織切片などを含む。特定の実施形態において、サンプルは、研究中の被験体由来の細胞を含む。前記サンプルの例示的で非限定的な例としては、様々な種類の生体液、例えば腹水、胸膜液、滑液、尿、唾液、血液、精液、血清などが挙げられる。これらの生体液サンプルは、当業者に公知の任意の従来の方法によって得られ得る。あるいは、前記サンプルはまた、例えば、リンパ腺、乳房、前立腺、皮膚、小腸、大腸、膵臓、卵巣、肺、膀胱、腎臓などに由来する罹患器官組織サンプルの切片（これらは、任意の従来の方法によって、例えば生検、膀胱鏡検査、外科的切除などによって得られ得る）および組織学的目的により採取された凍結切片であり得る。
【０１２６】
分析すべきサンプルは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状と以前に診断されたかもしくは診断されていない被験体から、または治療を受けている被験体から、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状について以前に治療された被験体から得られ得る。
【０１２７】
本発明の第１の方法の工程（ａ）によれば、当業者に公知の適切な条件下において、本発明の抗体を、研究中の被験体由来のサンプルと接触させる。
【０１２８】
当業者であれば、サンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量するための多くの従来の方法であって、本発明の第１の方法の工程（ｂ）を行うために適切な従来の方法を使用し得る。特に有用なものは、免疫学的方法である。したがって、特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、前記サンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量するために、本発明の抗体を、前記個体由来の腫瘍細胞を含むサンプルと接触させることを含む。
【０１２９】
これらのアッセイにおいて使用すべき本発明の抗体は、標識されていてもよいし、または標識されていなくてもよい。本明細書において使用される用語「検出可能な標識」または「標識剤」は、適切な検出手順および検出装置を使用して、例えば、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段によって、それが結合している分子の検出、位置決定および／または同定を可能にする分子標識を指す。抗体を標識するために適切な標識剤としては、放射性核種、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、粒子、色素および誘導体などが挙げられる。当業者であれば理解するように、さらなる試薬、例えば標識された（標識されるであろう）二次抗体を用いて、標識されていない抗体を検出する必要がある。これは、シグナルの増幅を可能にするので、検出方法の感度を増加させるために特に有用である。
【０１３０】
本発明において使用され得る幅広い従来のアッセイであって、標識されていない本発明の抗体（一次抗体）および標識された本発明の抗体（二次抗体）を使用する従来のアッセイがある；これらの技術としては、ウエスタンブロットまたはイムノブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素免疫アッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学技術および免疫組織化学技術、タンパク質マイクロスフェアの使用に基づくフローサイトメトリーまたはマルチプレックス検出技術、本発明の抗体を含むバイオチップまたはマイクロアレイが挙げられる。本発明の抗体を使用してＣＣＲ９を検出および定量する他の方法としては、アフィニティークロマトグラフィー技術、リガンド結合アッセイまたはレクチン結合アッセイが挙げられる。
【０１３１】
本発明の第１の方法はまた、工程ｃ）において、研究の被験対象由来のサンプルにおいて検出および決定されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を、対照サンプル中のＣＣＲ９のもの（基準値）と比較する工程を含む。
【０１３２】
本明細書において使用される用語「対照サンプル」または「参照サンプル」は、通常の生理学的条件下において、ＣＣＲ９発現細胞を含まないかまたはＣＣＲ９発現細胞を含むサンプルを指すので、基準値を確立するために使用され得る。特定の実施形態において、参照サンプルは、健常被験体から採取されるが、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の病歴を有していない被験体（組織またはその一部が通常の生理学的条件下にあるかまたは健常である以外は同じ被験体）を含む他の被験体からも採取され得る。特定の実施形態において、対照サンプルは、健常被験体由来のサンプルである。別の特定の実施形態において、対照サンプルは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の病歴を有していない個体由来のサンプルであり、この場合、得られた結果は、被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の悪性度、侵襲性、病期および／または重症度の診断価値または予測価値を有し得る。別の特定の実施形態において、対照サンプルは、組織またはその一部が健常である以外は同じ被験体由来のサンプルである。所望であれば、陽性対照としては、例えば、ＣＣＲ９を発現する細胞株、および／または陰性対照としては、例えば、ＣＣＲ９を発現しない細胞株をさらに使用し得る。
【０１３３】
本明細書において使用される用語「分布」は、サンプル中のＣＣＲ９が発現している細胞集団または細胞型を指す。したがって、ＣＣＲ９は、１つまたは複数の特定の細胞集団または細胞型において発現され得る。細胞集団または細胞型は、形態および表現型が異なる細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、上皮細胞、筋細胞、破骨細胞、骨芽細胞、神経細胞などと理解される。したがって、分析すべきサンプルと参照サンプルとの間のＣＣＲ９の分布を比較することによって、前記サンプル中に存在する異なる細胞集団におけるＣＣＲ９の存在を比較している。
【０１３４】
本発明の第１の方法は、工程（ｄ）として、工程（ｃ）の比較から得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の存在、前記被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の悪性度、侵襲性、病期および／または重症度の決定または予後予測と相関させる工程をさらに含む。
【０１３５】
特定の実施形態において、分析されるサンプル中のＣＣＲ９の存在は、ＣＣＲ９が参照サンプル中に存在しない場合には、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を有する被験体を示す。
【０１３６】
別の特定の実施形態において、分析されるサンプル中のＣＣＲ９の分布の、参照サンプル中のＣＣＲ９の分布に対する変化は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を有する被験体を示す。ＣＣＲ９が、参照サンプルと異なる細胞集団において発現している場合、またはＣＣＲ９が、参照サンプルと異なる少なくとも１つのさらなる細胞集団において発現している場合、ＣＣＲ９の分布は「変化している」とみなされる。
【０１３７】
別の特定の実施形態において、前記被験体由来のサンプル中のＣＣＲ９の量の、前記参照サンプル中のＣＣＲ９の量に対する増加は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を示す。分析されるサンプル中のＣＣＲ９の量は、それが参照サンプルに対して少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％またはそれ以上増加している場合、参照サンプル中のＣＣＲ９の量に対して「増加している」とみなされる。
【０１３８】
前記情報はまた、前記被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の悪性度、侵襲性、病期および／または重症度を決定または評価または予測するために使用され得る；この意味において、当業者であれば、彼／彼女が得た経験を考慮して、研究中の被験体由来のサンプルにおいて決定されたＣＣＲ９の量を、前記被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の悪性度、侵襲性、病期および／または重症度と相関させることができるであろう。同様に、対照サンプルが、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状と診断され、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を治療するための治療の投与前または投与中に分析された被験体彼自身／彼女自身由来のサンプルである場合、前記治療の投与後の所定時点の前記被験体由来のサンプル中のＣＣＲ９の分布および／または量の検出または変動に関する情報は、下記のように、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を患っている被験体に投与される治療の効果または有効性をモニタリングまたは評価するために、および前記治療が有効ではない場合には、それを変化させる可能性を評価するために役立ち得る。
【０１３９】
当業者であれば理解するように、予測は、診断または評価すべき被験体の１００％に対して正しいことが好ましいが、その必要はない。しかしながら、この用語は、統計的に有意な一部の被験体が、所定の転帰を有する可能性が高いと判定され得ることを必要とする。当業者であれば、被験体から得られたデータが統計的に有意であるかを、様々な周知の統計評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ値の決定、交差検定分類率などを使用して、さらなる負担を伴わずに決定し得る。詳細は、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３に見られる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０１、０．００５またはそれ以下である。
【０１４０】
本明細書において使用される用語「ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状」は、ＣＣＲ９が前記疾患または症状の原因であるか否かに関係なく、ＣＣＲ９発現細胞が直接的または間接的に関与する疾患または症状（例えば、異なる様式、場所もしくは分布において、または通常もしくは参照の生理学的条件または基準値と異なる量、例えばより高い値において、ＣＣＲ９が発現している疾患または症状を含む）を指す。このように、用語「ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状」は、「ＣＣＲ９発現細胞を伴う疾患または症状」または「ＣＣＲ９発現細胞が直接的または間接的に暗示される疾患または症状」などと実質的に同等である。
【０１４１】
特定の実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、腫瘍性疾患および非腫瘍性疾患からなる群より選択される。
【０１４２】
好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、腫瘍性疾患である。より好ましい実施形態において、前記腫瘍性疾患は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、および固形腫瘍由来の循環細胞からなる群より選択される。
【０１４３】
本明細書において使用される用語「Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病」または「Ｔ−ＡＬＬ」は、血液および骨髄中のＴ細胞リンパ芽球の悪性増殖性障害の一種を指し、リンパ性白血病の一形態である。
【０１４４】
本明細書において使用される用語「前立腺癌」は、前立腺細胞の任意の悪性増殖性障害を指す。
【０１４５】
本明細書において使用される用語「乳癌」は、最も一般的には乳管の内壁、または乳を乳管に供給する小葉由来の乳腺細胞の任意の悪性増殖性障害を指す。管に由来する癌は乳管癌として公知であり、小葉に由来するものは小葉癌として公知である。
【０１４６】
本明細書において使用される用語「メラノーマ」は、メラニン細胞の悪性皮膚腫瘍を指す。
【０１４７】
本明細書において使用される用語「卵巣癌」は、卵巣から生じる癌性成長を指す。
【０１４８】
本明細書において使用される用語「結腸直腸癌」（「結腸癌」、「直腸癌」または「大腸癌」としても公知である）は、結腸もしくは直腸またはそれらの付属物における制御されていない細胞成長からの癌を指す。
【０１４９】
本明細書において使用される用語「肺癌」は、肺組織における悪性増殖性障害の一種を指す。
【０１５０】
本明細書において使用される用語「固形腫瘍由来の循環細胞」またはＣＴＣ（循環腫瘍細胞）は、原発腫瘍から血管系に流れて、血流中を循環する細胞を指す。ＣＴＣは、さらなる腫瘍（転移）が遠隔器官において成長する原因であり得る。
【０１５１】
別の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、非腫瘍性疾患である。特定の実施形態において、前記非腫瘍性疾患は、自己免疫疾患である。別の特定の実施形態において、前記非腫瘍性疾患または症状は、炎症性障害を含むか、または炎症反応もしくは炎症要素が存在する疾患である。特定の実施形態において、前記非腫瘍性疾患は、クローン病、炎症性腸疾患、肝線維症、急性肝炎からなる群より選択される。
【０１５２】
本明細書において使用される用語「クローン病」は、口から肛門までの胃腸管の任意の部分に影響を及ぼし得る炎症性腸疾患の一種であって、多種多様な症候を引き起こすものを指す。それは、主に、腹部の痛み、下痢（これは、炎症が最悪である場合には血性であり得る）、嘔吐（これは、持続的であり得る）または体重減少を引き起こすが、胃腸管外の合併症、例えば貧血、皮膚発疹、関節炎、眼の炎症、疲労感および集中力の欠如も引き起こし得る。クローン病は、遺伝的に感受性の個体において、環境的因子と免疫学的因子と細菌因子との間の相互作用によって引き起こされる。これは、身体の免疫系が胃腸管を攻撃する慢性炎症性疾患をもたらす。クローン病は免疫関連疾患であるが、（免疫系が体それ自体によってトリガーされないという点で）自己免疫疾患ではないと思われる。
【０１５３】
本明細書において使用される用語「炎症性腸疾患」は、結腸および小腸の炎症症状の一群を指し、潰瘍性大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、転換大腸炎、ベーチェット病、および不確定大腸炎が挙げられる。
【０１５４】
本明細書において使用される用語「肝線維症」は、「肝臓線維症」としても公知であり、肝臓が過剰な細胞外マトリックスタンパク質（コラーゲンを含む）を蓄積する症状を指し、ほとんどの種類の慢性肝疾患において生じる；それは、先天的条件に起因するものであり得るか、または繰り返される肝損傷によるものであり得る。進行性肝線維症は、肝硬変、肝不全および門脈圧亢進症をもたらし、多くの場合には肝移植を必要とする。
【０１５５】
本明細書において使用される用語「急性肝炎」は、肝細胞の破壊および肝組織における炎症細胞の存在を特徴とする症状を指す。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病である。
【０１５７】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞を伴う疾患または症状は、前立腺癌である。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、乳癌である。
【０１５９】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、メラノーマである。
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、卵巣癌である。
【０１６１】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、結腸直腸癌である。
【０１６２】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、肺癌である。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、固形腫瘍由来の循環細胞である。
【０１６４】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、クローン病である。
【０１６５】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、炎症性腸疾患である。
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、肝線維症である。
【０１６７】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、急性肝炎である。
【０１６８】
別の特定の実施形態において、ＣＣＲ９の発現が変化している細胞は、リンパ系細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞の亜集団を含み、これらは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ５１、ＣＤ８１、ＣＤ１４６、ＣＤ２２８、ＣＤ２３１、ＴＣＲおよびそれらの組み合わせを含むマーカーのさらに少なくとも１つによって定義される。
【０１６９】
好ましい実施形態は、蛍光標識された本発明の抗体によって組織学的組織サンプルを染色する手順において、組織の迅速な試験を含む。さらに好ましい方法において、本発明の抗体、好ましくはＩｇＧアイソタイプ抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ５１、ＣＤ８１、ＣＤ１４６、ＣＤ２２８、ＣＤ２３１、ＴＣＲを特異的に認識するさらなる抗体と組み合わされる。さらに好ましい実施形態において、抗体は、様々な蛍光色素、例えばＣｙ３およびＣｙ５またはＣｙ３およびＦＩＴＣによって直接的に標識される。
【０１７０】
シグナル増強が有利である実施形態において、抗体および／または認識分子は、標識二次抗体またはビオチン−ストレプトアビジン検出システムによって増加される。したがって、抗体の定常領域において、異なる種のアイソタイプおよび／または配列を使用することが有利である。本文書において使用される技術および方法、例えば免疫組織学、ならびに認識分子の適切なフォーマットの選択は、当業者に公知である。
【０１７１】
加えて、標的細胞（すなわち、ＣＣＲ９発現細胞またはＣＣＲ９＋細胞）に特異的に結合する能力の観点から、本発明の抗体は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状のインビボ診断および／または予後予測に使用され得る；例として、前記抗体は、医療イメージング（すなわち、臨床目的のために（例えば、疾患を明らかにし、診断し、または調べようとする医療処置）、または医療科学のために（通常の解剖学および生理学の研究を含む）、体（またはその一部および機能）、例えば人体の画像を作成するために使用される一連の技術および方法）に使用され得る。
【０１７２】
したがって、別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測のための本発明の抗体の使用、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測のための方法における本発明の抗体の使用に関する；あるいは、この態様は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状のインビボ診断および／または予後予測のための組成物の製造における本発明の抗体の使用と表現され得る。別の代替的な表現において、この態様は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測に用いられる本発明の抗体、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状のインビボ診断および／もしくは予後予測のための方法に用いられる本発明の抗体と表現され得る。
【０１７３】
この目的のために、本発明の抗体は、当技術分野において公知の適切な方法によって標識され、例えば、適切な分子、例えば放射性同位体または蛍光色素を用いてカップリングおよび／またはロードすることによって、診断イメージング方法、例えば放射免疫診断法、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、内視鏡検査免疫蛍光法などのための薬剤として提供される。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、ガンマ線放射同位体、例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉおよび１１１Ｉｎにカップリングされ、ガンマカメラを使用した放射免疫シンチグラフィーまたは単一光子放射型コンピュータ断層撮影法に使用される。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、陽電子放射体、例えば１８Ｆ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙおよび１２４Ｉにカップリングされ、ＰＥＴに使用される。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、蛍光色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ２、Ｃｙ５またはＦＩＴＣにカップリングされ、内視鏡検査免疫蛍光法に使用される。記載されるように改変された抗体は、個体のための適切な用量において、例えば静脈内的に、任意の適切な経路によって投与され、ＣＣＲ９の場所は、当技術分野において周知の方法によって検出、決定または測定される。診断イメージングを含む本明細書において使用される方法および技術は適切な投薬製剤も提供し得る当業者に公知である。
【０１７４】
さらに好ましい実施形態において、本発明の抗体は、例えば、１１１Ｉｎによって放射性標識され、腫瘍もしくは腫瘍の血管において局所的に、求心的に、または遠心的に、または全身的に投与され得る診断剤として提供される。これは、腫瘍サイズの決定の一実施形態、およびリンパ節の決定のさらなる実施形態において役立つ。診断イメージングを含む本明細書において使用される方法および技術は、適切な投薬製剤も提供し得る当業者に公知である。
【０１７５】
診断アッセイにおいて、または診断剤として使用される本発明の放射性標識認識分子はまた、他の適用経路によって投与され得る。このため、好ましい経路は、腹腔内経路、結節内経路、腫瘍内経路および静脈内経路である。
【０１７６】
さらに、本発明の抗体は、被験体への投与に適切な組成物中に製剤化される。このために、組成物は、必要な薬学的に許容され得る賦形剤または担体を含むであろう。前記組成物の例示的で非限定の例は、以下に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応をモニタリングするための方法
別の態様において、本発明は、治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応をモニタリングするためのインビトロ方法（以下、「本発明の第２の方法」と称される）であって、
ａ）本発明の抗体を、第１の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第１のサンプルと接触させること、
ｂ）前記第１のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｃ）本発明の抗体を、第２の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第２のサンプルと接触させること、
ｄ）前記第２のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量すること、
ｅ）前記第１のサンプルおよび第２のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を比較すること、そして
ｆ）得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応と相関させること
を含んでなるインビトロ方法に関する。
【０１７８】
用語「抗体」、「ＣＣＲ９」、「サンプル」、「被験体」、「ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状」、「分布」およびそれらの詳細は、本発明の抗体および第１の方法との関連において詳細に記載されており、本発明の第２の方法との関連において同じ意味で使用される。
【０１７９】
本明細書において使用される用語「治療」は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の改善に適切な治療を指す。ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状に適切な治療は、従来型で当業者に周知のものである。
【０１８０】
本発明の第２の方法は、本発明の抗体を、第１の時点において採取された前記被験体由来の細胞を含む第１のサンプルと接触させる第１の工程を含む。当業者であれば理解するように、本発明の第２の方法の工程（ａ）は、上記に詳細に記載されている本発明の第１の方法の工程（ａ）と同一である。したがって、本発明の第１の方法の工程（ａ）の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
本発明の第２の方法の工程（ｂ）は、前記第１のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量することを含む。本発明の第２の方法の工程（ｂ）は、上記に詳細に記載されている本発明の第１の方法の工程（ｂ）と同一である。したがって、本発明の第１の方法の工程（ｂ）の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
本発明の第２の方法は、本発明の抗体を第２のサンプルと接触させること、ならびに第２の時点において採取された前記第２のサンプル中のＣＣＲ９を検出および／または定量することを含む工程（ｃ）および（ｄ）をさらに含む。
【０１８３】
本明細書において使用される用語「時点」は、サンプルが、モニタリングされる被験体から採取される時点の瞬間を指す。本発明の第２の方法との関連において、第１のサンプルが採取される第１または最初の時点と、第２のサンプルが採取される第２または後の時点とがある。第１および第２の時点は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、少なくとも９０日、少なくとも１００日、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年またはそれ以上の時間的な隔たりがある。特定の実施形態において、第１のサンプルが第２のサンプルの前に採取されるように、第１の時点は、第２の時点の前に発生する。
【０１８４】
当業者であれば理解するように、特定の実施形態において、前記治療に対する反応を完全にモニタリングするためには、第１のサンプルは、被験体が、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療を開始する前に採取されることが特に有用である。したがって、特定の実施形態において、第１の時点は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始する前に発生する。別の特定の実施形態において、第１の時点は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始する際に発生する。同様に、特定の実施形態において、第１のサンプルは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始する前に採取されるのに対して、別の特定の実施形態において、第１のサンプルは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始する際に採取される。
【０１８５】
前記治療に対する前記被験体の反応をモニタリングするために、第２のサンプルは、被験体が前記治療を開始した後に採取されることが必要であろう。したがって、別の特定の実施形態において、第２の時点は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始した後に発生する。特定の実施形態において、第２の時点は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始した少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、少なくとも９０日、少なくとも１００日、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年またはそれ以上後に発生する。同様に、第２のサンプルは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始した後に採取される。特定の実施形態において、第２のサンプルは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療が開始した少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも１０日、少なくとも２０日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、少なくとも５０日、少なくとも６０日、少なくとも７０日、少なくとも８０日、少なくとも９０日、少なくとも１００日、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年またはそれ以上後に採取される。
【０１８６】
本発明の第２の方法はまた、工程（ｅ）の比較から得られた結果を、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応と相関させる相関工程［工程（ｆ）］の前に、前記第１および第２のサンプルにおいて検出されたＣＣＲ９の存在および／または量および／または分布を比較する工程［工程（ｅ）］を含む。
【０１８７】
特定の実施形態において、第１のサンプルに対する第２のサンプル中のＣＣＲ９の存在の欠如は、前記治療に対する好ましい反応を示す。あるいは、第１のサンプルに対する第２のサンプル中のＣＣＲ９の存在は、前記治療に対する好ましくない反応を示すかまたは示し得る。
【０１８８】
別の特定の実施形態において、第２のサンプル中のＣＣＲ９の分布の、第１のサンプルのものに対する変化（第１のサンプルよりも少数のまたは少ない第２のサンプルの細胞集団において、ＣＣＲ９が発現している）は、前記治療に対する好ましい反応を示す。一方、第２のサンプル中のＣＣＲ９の分布の、第１のサンプルのものに対する不変化、または第２のサンプル中のＣＣＲ９の分布の、第１のサンプルのものに対する変化（第１のサンプルよりも多くの第２のサンプルの細胞集団において、ＣＣＲ９が発現している）は、前記治療に対する好ましくない反応を示す。
【０１８９】
別の特定の実施形態において、第２のサンプル中のＣＣＲ９の量の、第１のサンプル中のＣＣＲ９の量に対する減少は、前記治療に対する好ましい反応を示す。第２のサンプル中のＣＣＲ９の量は、それが第１のサンプルに対して少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％またはそれ以上減少している場合、第１のサンプル中のＣＣＲ９の量に対して減少しているとみなされる。同様に、第２のサンプル中のＣＣＲ９の量の、第１のサンプル中のＣＣＲ９の量に対する増加は、前記治療に対する好ましくない反応を示す。分析されるサンプル中のＣＣＲ９の量は、それが参照サンプルに対して少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％またはそれ以上増加している場合、参照サンプル中のＣＣＲ９の量に対して増加しているとみなされる。
【０１９０】
本明細書において使用される用語「治療に対する反応」は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状であって、治療されている疾患または症状の進化を指し、好ましい反応または好ましくない反応であり得る。一般に、治療に対する好ましい反応は、前記疾患または症状によって引き起こされる症候および／または病変の部分的または完全な改善または消失を伴うのに対して、治療に対する好ましくない反応は、前記疾患または症状によって引き起こされる症候および／または病変の悪化または増悪を伴う。ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に対する反応を評価する様々な方法であって、従来型で当業者に周知の様々な方法がある。例示的で非限定的な例として、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状が癌の一種、特に固形腫瘍である場合、治療に対する反応は、
−完全奏効（ＣＲ）：すべての標的病変の消失；
−部分奏効（ＰＲ）：ＬＤのベースラインの合計を基準として、標的病変の最長径（ＬＤ）の合計の少なくとも３０％の減少；
−疾患（ＳＤ）：治療開始以来の最小ＬＤの合計を基準として、ＰＲとするには不十分な減少であり、ＰＤとするには不十分な増加である；または
−進行（ＰＤ）：治療開始以来に記録された最小ＬＤの合計を基準として、標的病変のＬＤの合計の少なくとも２０％の増加、または１つ以上の新たな病変の出現
と評価され得、
ＣＲおよびＰＲは、治療に対する好ましい反応であり、ＰＤは、治療に対する好ましくない反応である。
【０１９１】
本発明の使用
ＣＣＲ９のエピトープに特異的に結合する本発明の抗体は、治療的に使用され得るだけではなく、免疫化学アッセイ、例えば免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫組織化学アッセイ、免疫沈降、または当技術分野において公知の他の免疫化学アッセイにおいて使用され得る。
【０１９２】
したがって、本発明の別の態様は、医薬として使用（以下、「本発明の第１の使用」）するための本発明の抗体である。
【０１９３】
本発明はまた、医薬の製造における本発明の抗体の使用に関する。あるいは、この態様は、本発明の抗体を投与することを含む治療方法として再構築され得る。
【０１９４】
本発明者らは、この抗体が、ヒト急性リンパ芽球性白血病のＣＣＲ９発現異種移植片モデルのインビボ成長を阻害することができ、壊死およびアポトーシスだけではなく血管新生および細胞増殖の減少を促進することができ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介するので、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に特に有用であることを示した。
【０１９５】
したがって、本発明の別の態様は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療に使用（以下、「本発明の第２の使用」）するための本発明の抗体である。
【０１９６】
本発明はまた、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用に関する。あるいは、この態様は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の治療方法であって、本発明の抗体を投与することを含む治療方法として再構築され得る。
【０１９７】
用語「抗体」、「ＣＣＲ９」、「ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状」およびそれらの詳細は、本発明の抗体との関連において詳細に記載されており、本発明の第１の使用との関連において同じ意味で使用される。
【０１９８】
本発明の第１の使用の特定の実施形態において、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、クローン病、炎症性腸疾患、肝線維症、急性肝炎、固形腫瘍由来の循環細胞からなる群より選択される。
【０１９９】
用語「治療」または「治療法」は区別なく使用され、疾患もしくは障害または再発性疾患もしくは障害の１つ以上の症候の重症度を予防、治癒、遅延、軽減し、または前記１つ以上の症候を改善し、またはこのような治療の非存在下において予想される生存を超えて患者の生存を延長しようとする臨床的介入を指す。
【０２００】
当業者であれば認識するように、本発明の抗体は、様々な形態（限定されないが、インタクトな抗体の形態、別の治療剤にコンジュゲートされたもの、および別の治療剤との融合タンパク質の形態を含む）において、治療用途において有用であり得る。これらの治療用途は、治療有効量の本発明の抗体を投与することを含むであろう。
【０２０１】
本明細書において使用される用語「治療有効量」は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状の１つ以上の症候の重症度の認識可能な予防、治癒、遅延、軽減、または前記１つ以上の症候の改善を達成するために必要な本発明の抗体の量を指す。
【０２０２】
本発明の第１および第２の使用の特定の実施形態において、本発明の抗体は、インタクトな抗体の形態（すなわち、免疫グロブリンの形態）である。本発明の抗体は、免疫グロブリンの形態である場合、典型的には、ＣＣＲ９発現細胞に対する直接的な細胞傷害効果を使用する：（ｉ）それは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して、または（ｉｉ）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介して免疫系の成分と相互作用する。
【０２０３】
抗体が細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に係合すると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団は、規定のＦｃ受容体を特徴的に発現する。例えば、好中球は、一般的に、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のＢ（脂質アンカー）アイソフォームを発現する。対照的に、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＣＤ１６のＡ（膜貫通）アイソフォームのみを発現する。この構造は、抗体とＣＤ１６との係合によって、アダプタータンパク質の動員およびＮＫ細胞の活性化を促進する。
【０２０４】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、抗体によって指令され得る別の細胞殺傷方法である。ＡＤＣＣのように、異なるサブクラスの抗体は、ＣＤＣ反応を誘発する様々な能力を有する。ＩｇＭは、補体活性化の最も有効なアイソタイプであり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は両方とも、古典的な補体活性化経路を介してＣＤＣを指令するために非常に有効である。このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体が形成されると、複数のＣ１ｑ結合部位が、参加したＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインのごく近くに露出される（Ｃ１ｑは、補体Ｃ１の３つのサブコンポーネントの１つである）。露出されたこれらのＣ１ｑ結合部位が、以前の低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高結合力の相互作用に変換すると、一連の他の補体タンパク質が関与するカスケード事象がトリガーされて、エフェクター細胞走化性物質／活性化物質であるＣ３ａおよびＣ５ａがタンパク質分解放出される。補体カスケードは、膜傷害複合体（これは、細胞膜において、水および溶質の細胞内外への自由な通過を促進する１００Åの細孔を作る）の形成により終了する。
【０２０５】
本発明の第１および第２の使用の別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、別の治療剤にコンジュゲートされるか、または別の治療剤との融合タンパク質の形態である。
【０２０６】
本発明のイムノコンジュゲートを形成するために適切な治療剤としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、メイタンシンまたはその類似体もしくは誘導体、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−エヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン；カリケアマイシンまたはその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよび他の白金誘導体、例えばカルボプラチン；およびデュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ−１０６５（ａ．ｋ．ａ．レイチェルマイシン）またはＣＣ−１０６５の類似体もしくは誘導体）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、抗有糸分裂剤（例えば、チューブリン阻害剤）、例えばモノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦまたはドラスタチン１０の他の類似体もしくは誘導体；ジフテリア毒素および関連分子（例えば、ジフテリアＡ鎖およびその活性断片およびハイブリッド分子）；リシン毒素（例えば、リシンＡまたは脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボーマン−バークプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシン毒素が挙げられる。他の適切なコンジュゲート分子としては、抗菌性／溶解性ペプチド、例えばＣＬＩＰ、マガイニン２、メリチン、セクロピンおよびＰ１８；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素およびシュードモナスエンドトキシンが挙げられる。例えば、Ｐａ��ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７，６４１（１９８６）およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃａｌｉｆ．Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４，４３（１９９４）を参照のこと。
【０２０７】
本発明の第１および第２の使用の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、細胞毒素、放射性核種、免疫抑制剤、化学療法薬またはサイトカインからなる群より選択される別の治療剤にコンジュゲートされるか、または前記別の治療剤との融合タンパク質の形態である。
【０２０８】
癌の細胞傷害性化学療法または放射線療法は、悪性細胞に対して選択的ではないので、前記治療法は、深刻で時には生命を脅かす副作用であって、感受性の正常細胞に対する毒性から生じる副作用によって制限される。これらの問題を回避する１つの戦略は、腫瘍関連抗原を認識する抗体または他のリガンドに治療剤をカップリングすることである。これは、リガンドターゲティング治療薬への悪性細胞の曝露を増加させ、正常細胞の曝露を減少させる。
【０２０９】
治療剤は、細胞傷害性放射線をＣＣＲ９発現細胞に放出するように作用する放射性核種であり得る。本発明の抗体にコンジュゲートすると、得られる分子は、放射免疫療法剤として有用である。
【０２１０】
本発明の第１および第２の使用の好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、放射性核種にコンジュゲートされる。本発明との関連において有用な例示的な例としては、限定されないが、β放射体、例えば１３１Ｉ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕおよび６７Ｃｕならびにα放射体、例えば２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔが挙げられる。
【０２１１】
治療剤は、免疫抑制剤（すなわち、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制またはマスクするように作用する物質）であり得る。これは、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現をダウンレギュレートもしくは抑制し、またはＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。
【０２１２】
治療剤はまた、細胞傷害剤（すなわち、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、および／または細胞の破壊を引き起こす物質）であり得る。この用語は、放射性同位体（上記）、化学療法剤、すなわち癌の治療に有用な化合物、および毒素、例えば小分子毒素または細菌起源、真菌起源、植物起源もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素またはそれらの断片を含むことを意図する。
【０２１３】
治療剤はまた、サイトカイン、ホルモン、成長因子、壊死因子、すなわち、細胞間メディエーターとして、または同じ細胞集団においてさえ別の細胞に対して作用するある細胞集団によって放出されたタンパク質またはペプチドであり得る。本明細書において使用される用語サイトカインは、天然源由来の、または組換え細胞培養物由来のタンパク質およびペプチド、ならびにネイティブ配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０２１４】
本発明の第１および第２の使用の好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、１つ以上の毒素分子にコンジュゲートされる。使用され得る酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の）エクソトクシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。
【０２１５】
本発明は、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）、または細胞構造もしくは細胞小器官を損傷して細胞を殺傷するかもしくは細胞の生命力を減退することができる他の化合物に本発明の抗体がコンジュゲートされることをさらに企図する。
【０２１６】
抗体と細胞傷害剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤またはリンカーを使用して行われ得る。リンカーは、細胞内における細胞傷害薬の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーを使用し得る。
【０２１７】
あるいは、抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製され得る。
【０２１８】
治療剤はまた、プロドラッグ（これは、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態であって、腫瘍細胞に対する細胞傷害性が親薬物と比較して低く、酵素的に活性化されることができるか、またはより活性な親形態に変換されることができるものを指す）であり得る。
【０２１９】
本発明の第１および第２の使用の好ましい一実施形態において、本発明の抗体はまた、プロドラッグを活性抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化剤とコンジュゲートされ得る。このようなコンジュゲートの薬剤成分としては、プロドラッグをより活性な細胞傷害形態に変換するようにプロドラッグに対して作用することができる任意の薬剤が挙げられる。これは、抗体指向性酵素プロドラッグ治療法（ＡＤＥＰＴ）に特に有用である。
【０２２０】
本発明において有用な酵素としては、プロドラッグを活性治療剤（薬物）に変換し得る任意の酵素が挙げられる。特定の実施形態において、酵素は、哺乳動物由来の酵素、例えばヒトの酵素である。別の特定の実施形態において、酵素は、哺乳動物以外の生物由来の酵素である；この最後の実施形態において、酵素の免疫原性は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などへのコンジュゲーションによって場合により減少していてもよい。特定の実施形態によれば、前記酵素、および類似の基質特異性を有する酵素はいずれも、投与の経路またはプロドラッグの生体内分布によって、被験体にとって内因性のものではない。
【０２２１】
プロテアーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼなどは、本発明にしたがって使用され得る一般的な種類の酵素である。適切な酵素の具体例としては、限定されないが、グリコシダーゼ（β−グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、β−ラクタマーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、フルクターゼ、アミノペプチダーゼ、リゾチーム、シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、メチオニンγリアーゼおよびカルボキシエステラーゼが挙げられる。酵素は、選択されたプロドラッグをその活性薬物形態に変換するその能力について選択される。例えば、プロドラッグがデキストランと治療剤とのコンジュゲートを含む場合、適切な酵素は、デキストラナーゼであろう。同様に、セルラーゼは、セルロース基質を含むプロドラッグと共に使用され得、グルクロニダーゼは、グルクロニドを含むプロドラッグと共に使用され得る。
【０２２２】
好ましい実施形態において、酵素は、グリコシダーゼ（グルクロニダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、β−ラクタマーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、フルクターゼ、アミノペプチダーゼ、リゾチーム、シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、メチオニンγリアーゼおよびカルボキシエステラーゼ、または触媒活性を有するそれらの機能変異体もしくは断片からなる群より選択される。より好ましくは、酵素は、グリコシダーゼ（例えば、β−ガラクトシダーゼ）またはシトシンデアミナーゼである。
【０２２３】
本発明との関連において有用な薬物としては、毒素、抗生物質または化学療法薬、放射性同位体、常磁性イオン、ホウ素付加物、サイトカイン、光増感剤、放射線増感剤、血管拡張剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、（グルコ）コルチコイドなどが挙げられる。
【０２２４】
特定の実施形態において、薬物は、化学療法薬、例えば細胞傷害活性を有する薬物である。薬物またはプロドラッグの細胞傷害活性は、当技術分野において周知のアッセイによって実施され得る。例えば、細胞傷害効果を有する化合物は、細胞膜完全性を損なうことが多いので、細胞膜完全性の評価は、細胞生存および細胞傷害効果を測定するための最も一般的な方法の１つである。トリパンブルーまたはヨウ化プロピジウムなどのバイタル色素は、通常、正常細胞の内部から排除される；細胞膜が損なわれている場合、それらは膜を自由に通過し、細胞内成分を染色する。あるいは、膜完全性は、細胞内に通常隔離されている物質の外部への通過をモニタリングすることによって評価され得る。一般に測定される分子の１つは、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である。
【０２２５】
細胞傷害性はまた、ＭＴＴアッセイを使用してモニタリングされ得る。このアッセイは、比色反応を使用して細胞の還元電位を測定する。生存細胞は、ジメチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）試薬を着色ホルマザン生成物に還元する。酸化還元に基づく類似のアッセイもまた、蛍光色素レサズリンを使用して開発されている。細胞の酸化還元電位を示すための色素を使用してそれらの生存をモニタリングすることに加えて、生存マーカーとしてＡＴＰ含有量を使用するアッセイも使用され得る。このようなＡＴＰに基づくアッセイとしては、ＡＴＰがルシフェラーゼ反応の制限試薬である生物発光アッセイが挙げられる。細胞傷害性はまた、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ）アッセイおよびクローン原性アッセイによって測定され得る。接着動物細胞の細胞傷害反応をリアルタイム追跡する無標識アプローチは、金膜電極上において細胞を成長させた際の電気インピーダンス測定に基づくものである。この技術は、電気細胞−基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）と称される。
【０２２６】
別の特定の実施形態において、薬物は、薬物が放出されるその対応するプロドラッグよりも細胞傷害性である。化合物の細胞傷害性は、典型的には、そのＩＣ５０値として表される。本明細書において使用されるＩＣ５０値は、半最大阻害濃度を指し、インビボにおける最大効果の５０％を達成するために必要な化合物濃度を表す。特定の好ましい実施形態において、活性薬物は、その対応するプロドラッグよりも細胞傷害性である。これは、プロドラッグのＩＣ５０／薬物のＩＣ５０の比であるＱＩＣ５０値を用いて推定され得る。ＱＩＣ５０値は、５もしくは５超、例えば１０もしくは１０超、１０２もしくは１０２超、１０３もしくは１０３超、１０４もしくは１０４超、またはさらにそれ以上であり得る。好ましくは、ＱＩＣ５０は、１０２超、より好ましくは１０３超である。
【０２２７】
本発明との関連において使用され得るプロドラッグの例示的で非限定的な例としては、グリコシドプロドラッグ、例えばデュオカルマイシン由来のガラクトシルプロドラッグ、Ｎ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシカルボニル）−ドキソルビシンおよびＮ−［４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−３−ニトロベンジルオキシカルボニル］ダウノマイシン；５−フルオロシトシン；セファロスポリンプロドラッグ、例えばＰＲＯＴＡＸ（タキソールのセファロスポリン誘導体）、Ｃ−ＤＯＸ（ドキソルビシンのセファロスポリン誘導体）、ＣＣＭ（セファロスポリンマスタードプロドラッグ）など；パリトキシンプロドラッグＮＨＰＡＰ、ドキソルビシンプロドラッグＤＰＯ、コンブレタスタチンプロドラッグ、例えばコンブレタスタチンＡ−４プロドラッグ（ＣＡ−４ＰＤ）、ビスホスホネートプロドラッグ、例えばＢｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄａｔｅ  ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅなどが挙げられる。プロドラッグは、通常、周知の方法、例えばＢｕｒｇｅｒ“Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．（Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ  ｅｄ．，２００１，Ｗｉｌｅｙ）および“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  ｅｄ．，１９８５，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されているものを使用して調製され得る。
【０２２８】
あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された少なくとも本発明の抗体を含む融合タンパク質は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。
【０２２９】
ヒト抗体、部分的ヒト抗体またはヒト化抗体は、多くの用途（特に、ヒト被験体における治療のための医薬の調製における抗体の使用を含むもの）に適切であるが、他の種類の抗体（すなわち、異なる起源のもの）は、特定の用途に適切である。本発明の非ヒト抗体は、例えば、任意の抗体産生動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長類、例えばサル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）もしくは類人猿（例えば、チンパンジー）に由来し得る。本発明の非ヒト抗体は、例えば、インビトロおよび細胞培養ベースの用途において使用され得るか、または本発明の抗体に対する免疫反応が起こらず、重要ではなく、防止され得、懸案事項ではなく、もしくは望まれる任意の他の用途において使用され得る。
【０２３０】
別の態様において、本発明は、疾患の治療方法に用いられる本発明の抗体であって、前記治療方法が、標的細胞（すなわち、ＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋））を殺傷することを含む本発明の抗体に関する；または、別様に表現すると、この態様によれば、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用であって、前記治療が、標的細胞（すなわち、ＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋））を殺傷することを含む使用に関する。この用途において、本発明の抗体は、好ましくは、医薬組成物（その詳細は以下に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）によって投与されるであろう。特定の実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、例えば実施例において９１Ｒおよび９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体などである。別の特定の実施形態において、標的細胞は、前記細胞におけるＣＣＲ９の発現および／または量および／または分布が変化している疾患または症状に含まれる腫瘍ＣＣＲ９発現細胞または非腫瘍ＣＣＲ９発現細胞である。別の特定の実施形態において、前記疾患または症状は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、固形腫瘍由来の循環細胞、クローン病、炎症性腸疾患、肝線維症および急性肝炎からなる群より選択される。
【０２３１】
別の態様において、本発明は、イメージング技術を用いた腫瘍診断に用いられる本発明の抗体であって、前記腫瘍がＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む本発明の抗体に関する；または、別様に表現すると、この態様によれば、本発明は、イメージング技術を用いたインビボ腫瘍診断のための組成物の製造における本発明の抗体の使用であって、前記腫瘍がＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む使用に関する。この用途において、本発明の抗体は、好ましくは、医薬組成物によって投与されるであろう。特定の実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、例えば実施例において９１Ｒおよび９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体などである。別の特定の実施形態において、イメージング技術は、核医学において使用される技術である。これらの技術としては、限定されないが、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴおよびＰＥＴが挙げられる。当業者であれば、これらの技術を実施するためには、適切な放射性核種によって本発明の抗体を標識することが必要であることを理解するであろう。この態様において使用され得る適切な放射性核種は、本明細書の他の箇所に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。別の特定の実施形態において、前記腫瘍は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌および固形腫瘍由来の循環細胞からなる群より選択される。
【０２３２】
別の態様において、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む腫瘍に薬物をターゲティングするために用いられる本発明の抗体に関する；または、別様に表現すると、この態様によれば、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞（ＣＣＲ９＋）を含む腫瘍に薬物をインビボターゲティングするための組成物の製造における本発明の抗体の使用に関する。したがって、本発明の抗体は、腫瘍に対するビヒクル、例えばナノビヒクルとみなされ得る。この用途において、本発明の抗体は、好ましくは、医薬組成物（その詳細は以下に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）によって投与されるであろう。特定の実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、例えば実施例において９１Ｒおよび９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体などである。別の特定の実施形態において、薬物は、毒素、抗生物質または化学療法薬、放射性同位体、常磁性イオン、ホウ素付加物、サイトカイン、光増感剤、放射線増感剤、血管拡張剤、免疫調節剤、免疫抑制剤および（グルコ）コルチコイド（それらの詳細は以下に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）からなる群より選択される。別の特定の実施形態において、前記腫瘍は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌および固形腫瘍由来の循環細胞からなる群より選択される。
【０２３３】
別の態様において、本発明は、炎症性疾患におけるＣＣＲ９発現細胞を除去することによる炎症性疾患の治療に用いられる本発明の抗体に関する；または、別様に表現すると、この態様によれば、本発明は、ＣＣＲ９発現細胞を除去することによって炎症性疾患を治療するための医薬組成物の製造における本発明の抗体の使用に関する。したがって、本発明の抗体は、炎症性疾患に対するビヒクル、例えばナノビヒクルとみなされ得る。一実施形態において、炎症性疾患は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する炎症性疾患であり、本発明の抗体は、前記炎症性疾患に関与するＣＣＲ９発現細胞を除去する。この用途において、本発明の抗体は、好ましくは、医薬組成物（その詳細は以下に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）によって投与されるであろう。特定の実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、例えば実施例において９１Ｒおよび９２Ｒ  ｍＡｂとして同定した抗体などである。別の特定の実施形態において、薬物は、毒素、抗生物質または化学療法薬、放射性同位体、常磁性イオン、ホウ素付加物、サイトカイン、光増感剤、放射線増感剤、血管拡張剤、免疫調節剤、免疫抑制剤および（グルコ）コルチコイド（それらの詳細は以下に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）からなる群より選択される。別の特定の実施形態において、前記炎症性疾患は、クローン病、炎症性腸疾患、肝線維症および急性肝炎からなる群より選択される。
【０２３４】
本発明の別の態様は、サンプル中のＣＣＲ９タンパク質を検出、位置決定および／または定量するためのバイオテクノロジー技術におけるツールとしての本発明の抗体の使用（以下、「本発明の第３の使用」）に関する。
【０２３５】
したがって、本発明の抗体は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段によって、その位置決定および／または同定を可能にする検出可能な標識または標識剤によって標識され得る。したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体は、標識剤を含む。
【０２３６】
本明細書において使用される用語「検出可能な標識」または「標識剤」は、適切な検出手順および検出装置を使用して、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段または化学的手段のいずれかによって、それが結合している分子の検出、位置決定および／または同定を可能にする分子標識を指す。
【０２３７】
したがって、特定の実施形態において、本発明の抗体は、その後の検出が可能なように改変される。したがって、本発明は、抗体の検出を可能にする検出可能な薬剤によって本発明の抗体を改変する可能性を企図する。検出可能な薬剤の非限定的な例としては、放射性同位体および蛍光基が挙げられる。
【０２３８】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、放射性同位体によって改変される。本発明に適切な放射性同位体の非限定的な例としては、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔおよび２１３Ｂが挙げられる。放射性同位体標識は、典型的には、金属イオンを錯化することができるキレートリガンド、例えばＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＴＰＡおよびＴＥＴＡを使用することによって実施される。放射性同位体をタンパク質にコンジュゲートするための方法は、従来技術において周知である。
【０２３９】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、蛍光基によって標識される。蛍光基は、アミノ酸の側鎖に直接的に、または連結基を介して結合され得る。ポリペプチド蛍光試薬をコンジュゲートするための方法は、従来技術において周知である。
【０２４０】
蛍光基によってポリペプチド（例えば、抗体）を標識するために適切な試薬としては、アミノ基およびチオール基を含む、タンパク質の側鎖に記載されている様々な基と反応する能力を示す化学基が挙げられる。したがって、本発明の抗体を改変するために使用され得る化学基としては、限定されないが、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル、ホスホラミダイトなどが挙げられる。適切な反応性官能基の例は、カルボキシル基によって改変された検出可能な基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）である。典型的には、蛍光化合物を改変するカルボキシル基は、前記化合物をカルボジイミド試薬（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、ウロニウム、またはＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）、ＨＢＴＵ（（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）などの試薬、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのタイプの活性化剤と接触させることによって活性化されて、標識のＮＨＳエステルが得られる。
【０２４１】
本発明の第３の使用に使用するために適切な蛍光化合物としては、限定されないが、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルイソチオール（ＴＲＩＴ）、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、ローダミン、テトラメチルローダミン（Ｔａｍｒａ）、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン、アゾメタジナス、シアニン（Ｃｙ２，Ｃｙ３およびＣｙ５）、テキサスレッド、プリンストンレッド、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＤＡＢＣＹＬ、エオシン、エリスロシン、臭化エチジウム、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその類似体、無機系蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット）、蛍光標識系ランタニド、例えばＥｕ３＋およびＳｍ３＋などが挙げられる。
【０２４２】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、結合ペアの第１のメンバーにコンジュゲートすることによって標識される。好ましい実施形態において、この改変は、共有結合ビオチン化である。本明細書において使用される用語「ビオチン化」は、分子（典型的には、タンパク質）へのビオチンの共有結合を指す。ビオチン化は、タンパク質の側鎖にコンジュゲートすることができるビオチン試薬を使用して実施され、前記コンジュゲーションは、タンパク質の側鎖に含まれる第１級アミノ基およびチオール基に対して主に起こる。アミノ基のビオチン化に適切な試薬としては、ビオチンと、アミノ基と反応することができる基（例えば、スクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステルまたはハロゲン化アルキル）とを含有する分子であって、ビオチン部分および反応性基が、任意の長さ（例えば、８〜４０Ａの長さ）のスペーサーによって分離されている分子が挙げられる。これらの薬剤のいくつかの例としては、ビオチン化ＮＨＳ−ビオチン（ビオチンとＮＨＳ基との間に５個の炭素原子のエステル結合を含有する）、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン、ＰＦＰ−ビオチン、ＴＦＰ−ＰＥＯ−ビオチンなどの薬剤が挙げられ、「ＮＨＳ」は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを指し、「ＬＣ」は、ＮＨＳとビオチン基との間に位置する６個の炭素原子のアミド結合を指し、「ＰＥＯ」は、エチレンオキシド基（下付き文字は、ＰＥＯ単位の数を示す）を指し、「ＰＦＰ」は、ペンタフルオロフェニル基を指し、「ＴＦＰ」は、テトラフルオロフェニル基を指し、「スルホ」は、スルホン酸基（ＳＯ３）を指し、「ＳＳ」は、ジスルフィド基を指す。チオール基を有するビオチン化試薬の例としては、任意の長さのスペーサーによって分離されている、ビオチンの基と、マレイミドまたはハロゲン化アルキル型とを含む分子が挙げられる。ビオチン化試薬の例としては、マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン、ビオチン−ＢＭＣＣ（マレイミド基Ｎ末端およびシクロヘキシル基、２個のアミドおよび９個の炭素原子リンカーを含有する）、ＰＥＯ−ヨードアセチルビオチン、ヨードアセチル−ＬＣ−ビオチン、ビオチン−ＨＰＤＰ（ピリジルジスルフィドを含有する）などが挙げられる。
【０２４３】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、金属イオン、例えば金（Ａｕ）（コロイド状金ナノ粒子を含む）によって標識され、これらは、静電相互作用を介して抗体に直接結合され得る。別の特定の実施形態において、コロイド金ナノ粒子は、ビオチンにプレカップリングされており、抗体に共有結合され得る。
【０２４４】
本発明の別の態様は、サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の検出および／または定量における本発明の抗体の使用である。本発明の抗体による、サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の検出および／または定量は、インビトロにおいて行われ得る。本発明の抗体の使用は、サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の存在を検出、同定および／または定量するための任意の免疫化学アッセイまたは免疫蛍光アッセイによって行われ得る。免疫化学アッセイまたは免疫蛍光アッセイの例としては、限定されないが、免疫センサー、免疫沈降、ウエスタンブロット、ドットブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光、免疫細胞化学、免疫組織化学およびフローサイトメトリーが挙げられる。
【０２４５】
サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の存在を検出、同定および／または定量するための本発明の抗体の使用は、サンプル中に存在するＣＣＲ９またはＣＣＲ９発現細胞の存在を検出および／または定量するためのインビトロ方法であって、
ｉ）試験サンプルを本発明の抗体と接触させること、
ｉｉ）前記抗体との免疫複合体の形成を検出および／または定量すること
を含んでなるインビトロ方法の実施を必要とする。
【０２４６】
前記方法は、本発明のさらなる態様を構成する。
【０２４７】
本発明の方法を使用して、多種多様なフォーマットの免疫化学分析のいずれかを使用し得る。分析のこのような免疫化学技術としては、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、イムノアッセイストリップまたはＬＦＩＡ、免疫センサー、免疫親和性抽出システム、免疫沈降、ウエスタンブロット、ドットブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、免疫細胞化学および免疫組織化学が挙げられる。
【０２４８】
当業者であれば理解するように、サンプル中のＣＣＲ９の存在の検出、同定および／または定量は、多くの用途（ＣＣＲ９＋循環腫瘍細胞の検出、ＣＣＲ９＋細胞亜集団、特にＣＣＲ９＋幹細胞の表現型分析を含む）における本発明の抗体の使用を可能にする。
【０２４９】
ＣＣＲ９＋循環腫瘍細胞の検出は、通常、周囲の正常血液細胞と区別される循環腫瘍細胞の異なる特性（物理的特性（サイズ、密度、電荷、変形能）および生物学的特性（表面タンパク質発現、主にＥｐＣＡＭ発現およびＣＣＲ９発現）を含む）に基づく技術の大型パネルを含む、循環腫瘍細胞の濃縮工程を含む。濃縮後、循環腫瘍細胞画分は、通常、相当数の白血球を依然として含有するので、単一細胞レベルにおいて腫瘍細胞と正常血液細胞とを区別し得る方法によって、循環腫瘍細胞を同定しなければならない。タンパク質ベースの戦略においては、サイトケラチン（ＣＫ；陽性マーカー）、共通の白血球抗原ＣＤ４５（陰性マーカー）および核色素（ＤＡＰＩ）について、細胞を蛍光染色する；循環腫瘍細胞は、ＣＫ＋／ＣＤ４５−／ＤＡＰＩ＋細胞と同定されている。次いで、多くの異なるアッセイによって、例えば本発明の抗ＣＣＲ９抗体による直接的な検出によって、または本発明の抗ＣＣＲ９抗体によってコーティングされたマイクロポストのアレイからなる循環腫瘍細胞チップによって、循環腫瘍細胞が豊富なサンプルを、ＣＣＲ９＋細胞の存在について試験し得る。
【０２５０】
本発明の抗体はまた、ＣＣＲ９＋細胞亜集団、特にＣＣＲ９＋幹細胞の表現型分析において、例えば哺乳動物細胞を表現型決定するためのマイクロアレイの一部として使用され得る。
【０２５１】
本発明の抗体はまた、ＣＣＲ９発現細胞、例えば間葉系幹細胞の単離または精製において使用され得る。したがって、本発明の別の態様は、ＣＣＲ９発現細胞、例えば間葉系幹細胞の単離および／または精製における本発明の抗体の使用である。当業者であれば、この用途を使用して単離された間葉系幹細胞は、再生細胞治療において有用であることを理解するであろう。
【０２５２】
ＣＣＲ９発現細胞の単離および／または精製のために、固相または可溶性相のいずれかにおいて、多種多様なフォーマットを使用し得る。
【０２５３】
本発明の抗体の特定の用途は、白血球フェレーシスなどの技術である。本明細書において使用される用語「白血球フェレーシス」は、血液から白血球を分離し、残りの成分を血液循環に戻す手順を指す。したがって、それは、体外治療（体外において実施される医療処置）である。白血球フェレーシスを行うための方法の１つは、本発明の抗体とカップリングされた選択的白血球フェレーシスカラムを使用することによるものである。当業者であれば、この用途は、例えば、炎症性腸疾患の治療において有用であることを理解するであろう（Ｅｂｅｒｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７３−８２）。
【０２５４】
本発明によるキット
本発明はまた、上記方法および使用を行うためのキットを提供する。
【０２５５】
したがって、別の態様において、本発明は、少なくとも本発明の抗体を含んでなるキット（以下、「本発明のキット」）に関する。
【０２５６】
特定の実施形態において、本発明のキットは、本発明の抗体に加えて、さらなる治療剤を含む。前記治療剤の詳細は、本発明の抗体の治療用途に関連して既に記載されており（例えば、本発明の第１および第２の使用を参照のこと）、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、前記治療剤は、本発明の抗体にコンジュゲートされ得るか、または本発明の抗体と融合タンパク質を形成し得る。
【０２５７】
本発明との関連において、「キット」は、本発明の方法を行うために必要な様々な試薬であって、それらの輸送および保存を可能にするようにパッキングされた様々な試薬を含有する製品と理解される。キットの構成要素をパッキングするために適切な材料としては、クリスタル、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、封筒などが挙げられる。加えて、本発明のキットは、キット内の様々な構成要素の同時使用、連続使用または別個使用のための説明書を含有し得る。前記説明書は、印刷物の形態、またはサブジェクトによって読み取り可能な説明書を保存することができる電子支持体の形態、例えば電子記憶媒体（磁気ディスク、テープなど）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）などであり得る。加えてまたはあるいは、媒体は、前記説明書を提供するインターネットアドレスを含有し得る。
【０２５８】
本発明のキットは、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状を診断および／もしくは予後予測するために（とりわけ、イメージング技術を用いたＣＣＲ９＋腫瘍の診断を含む）、または治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状の治療に対する反応をモニタリングするために、またはＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状を治療するために（とりわけ、標的細胞（ＣＣＲ９＋）を殺傷することを含む治療方法、およびＣＣＲ９発現細胞を除去することによる炎症性疾患の治療方法を含む）、またはＣＣＲ９＋細胞を含む腫瘍に薬物をターゲティングするために、またはバイオテクノロジー技術（例えば、サンプル中のＣＣＲ９タンパク質を検出、位置決定および／もしくは定量するためのバイオテクノロジー技術など）におけるツールとして、またはサンプル中に存在するＣＣＲ９もしくはＣＣＲ９発現細胞を検出および／もしくは定量するために使用され得る。
【０２５９】
したがって、別の態様において、本発明は、
−ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状を診断および／もしくは予後予測するための、
−治療中の被験体におけるＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状の治療に対する反応をモニタリングするための、
−ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患もしくは症状を治療するための、
−ＣＣＲ９＋細胞を含む腫瘍に薬物をターゲティングするための、
−サンプル中のＣＣＲ９タンパク質を検出、位置決定および／もしくは定量するためのバイオテクノロジー技術におけるツールとしての、または
−サンプル中に存在するＣＣＲ９もしくはＣＣＲ９発現細胞を検出および／もしくは定量するための、
本発明のキットの使用に関する。
【０２６０】
用語「抗体」および「ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状」は、本発明の抗体および本発明の診断／予後予測方法との関連において詳細に記載されており、これらの用語およびそれらの詳細は、本発明の第１のキットに同様に適用される。
【０２６１】
本発明のキットの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：４に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：５に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：６に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０２６２】
本発明のキットの別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖内に、配列番号：７に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号：２に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号：３に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｈ３を含み、軽鎖内に、配列番号：８に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号：９に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号：１０に示されているアミノ酸配列からなるＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【０２６３】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、治療有効量の本発明の抗体またはその薬学的誘導体もしくはそのプロドラッグを、被験体に投与するための薬学的に許容され得る賦形剤、担体、アジュバントまたはビヒクルとともに含んでなる医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」）に関する。前記医薬組成物は、ＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患または症状を有する被験体に投与して、ＣＣＲ９発現細胞を殺傷するために、またはＣＣＲ９発現細胞のアポトーシスを誘導するために使用され得る。
【０２６４】
本明細書において使用される用語「薬学的に許容され得る担体」は、医薬投与に適合する任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤を使用することは当技術分野において周知である。いかなる従来の媒体および薬剤も活性化合物に不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が企図される。許容され得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに無毒であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンなど）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物類（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン類（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０２６５】
本発明の抗体は、同じ製剤であり得るか、または異なる製剤によって投与され得る。投与は、同時または連続であり得、いずれかの順序において有効であり得る。
【０２６６】
補助的な活性化合物もまた、本発明の医薬組成物に組み込まれ得る。したがって、特定の実施形態において、本発明の医薬組成物はまた、治療される特定の適応症に必要であるような２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物を含有し得る。例えば、化学療法薬、サイトカイン、鎮痛剤または免疫抑制剤をさらに提供することが望ましい場合がある。このような他の活性薬剤の有効量は、とりわけ、医薬組成物中に存在する本発明の抗体の量、疾患もしくは障害または治療の種類などに依存する。
【０２６７】
一実施形態において、本発明の抗体は、体内からの迅速な排出から前記化合物を保護する担体と共に調製される（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤）。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されている当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。
【０２６８】
本発明の抗体（またはその断片）の投与経路は、腫瘍内または非経口であり得る。
【０２６９】
本明細書において使用される用語「非経口」は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与または膣内投与を含む。非経口投与の静脈内形態が一般に好ましい。当然のことながら、治療効果または予防効果に必要な抗体の量は、選択される抗体、治療される症状の性質および重症度、ならびに患者によって変化するであろう。
【０２７０】
加えて、抗体は、例えば、漸減用量の抗体を用いてパルス注入によって適切に投与され得る。好ましくは、投薬は、投与が短期的または長期的であるかに部分的に応じて、注射、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。
【０２７１】
別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、適切な単位剤形において、非経口投与に適合され得る（例えば、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥製品）。注射用途に適切な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適切な担体としては、生理的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は滅菌性でなければならず、注射容易性が存在する程度に流動的であるべきである。それは、製造および保存の条件下において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、薬学的に許容され得るポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびこれらの適切な混合物を含有する溶剤または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には所要の粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類（例えば、マンニトール）、ソルビトールおよび塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射組成物の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンなどを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０２７２】
滅菌注射溶液は、先に列挙した成分の１つまたはその組み合わせを必要に応じて含む適切な溶剤に活性化合物（例えば、ポリペプチドまたは抗体）を所要量配合し、次いでろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、塩基性分散媒と、先に列挙したものからの他の所要成分とを含有する滅菌賦形剤に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分と、予め滅菌ろ過したその溶液からのさらなる所望成分との粉末が得られる。
【０２７３】
特定の実施形態において、前記医薬組成物は、静脈内または腫瘍内を介して投与される。増量剤、緩衝剤または界面活性剤などの適切な賦形剤が使用され得る。前記製剤は、標準的な方法、例えばスペインおよび米国の薬局方ならびに類似参考文献において記載または言及されているものを使用して調製される。
【０２７４】
容易な投与および投与量の均一性のための単位剤形において、医薬組成物（すなわち、経口または非経口組成物）を製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位剤形は、治療すべき被験体のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指す；各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物（本発明の抗体）を、必要な医薬担体と共に含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴、および達成すべき特定の治療効果、および個体の治療のためにこのような化合物を配合する分野に特有の制限によって決定され、これらに直接依存する。
【０２７５】
一般に、本発明の抗体の有効投与量は、選択された化合物の相対的効果、治療される障害の重症度および患者の体重に依存するであろう。しかしながら、活性化合物は、典型的には、１日１回以上、例えば１日１回、２回、３回または４回投与され、典型的な総１日用量は、０．００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、最も好ましくは約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内である。
【０２７６】
患者への抗体の投与とは別に、本出願は、遺伝子治療による抗体投与を企図する。国際公開第９６／０７３２１号は、細胞内抗体を作製するための遺伝子治療の使用に関する。
【０２７７】
医薬組成物は、投与説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサーに含められ得る。
【０２７８】
本発明の抗体および医薬組成物は、併用療法を提供するために他の薬物と共に使用され得る。他の薬物は、同じ組成物の一部を形成し得るか、または同じ時点もしくは異なる時点において投与するための別個の組成物として提供され得る。併用療法において適切な薬物の非限定的な例は、ＣＣＲ９アンタゴニスト、例えば米国特許出願公開第２００５／００４９２８６号に記載されているもの、ＣＣＬ２５−ＰＥ３８融合タンパク質（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、前掲）である。
【０２７９】
本発明の抗体および医薬組成物は、医学的症状、例えばＣＣＲ９発現細胞が関与する疾患および症状の治療において、特にＴ細胞急性リンパ芽球性白血病、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、クローン病、炎症性腸疾患を治療するために有用であろう。
【０２８０】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１つの治療剤がロードされたナノ容器にカップリングされる。したがって、本発明の抗体にカップリングされたナノ容器は、投与されると、標的細胞（すなわち、ＣＣＲ９発現細胞）に向かう。リポソームおよびナノ粒子は、一般に使用されるナノ容器の例示的な形態である。リポソームは、好ましくは、２００ナノメートル未満の直径を有する。５０〜１５０ナノメートルの直径を有するリポソームが好ましい。約８０ナノメートルの外径を有するリポソームまたは他のナノ容器が特に好ましい。適切な種類のリポソームは、リポソーム内のＤＮＡを安定化するための少量（１％）のカチオン性脂質、例えばジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）と共に、中性リン脂質、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）またはコレステロールから作られる。
【０２８１】
本発明の抗体を使用するための他の適切な容器としては、デンドリマーが挙げられる。用語「デンドリマー」は、コアを有する高分子であって、コアから生じる分岐構造の複数のシェルを有する高分子を指す。樹状担体の形状およびサイズは、変化し得る。いくつかの場合において、樹状担体は、形状がほぼ球状または球形であり得る。さらに、樹状担体は、約１５オングストローム（Ａ）〜約２５０Ａの範囲内の直径を有し得、対応する分子量の範囲は、例えば、約５００ダルトン〜約２００万ダルトン〜である。デンドリマーは、様々な供給元（例えば、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から商業的に入手され得るか、または当業者に公知の方法によって合成され得る。樹状分子は、大まかに低分子量種および高分子量種に分けられ得る。第１のカテゴリーは、デンドリマーおよびデンドロンを含むのに対して、第２は、樹状ポリマー、超分岐ポリマーおよびブラシポリマー（ボトルブラシとも称される）を包含する。デンドリマーおよびデンドロンは、通常は繰り返し分岐した高対称性の単分散化合物である。デンドリマーおよびデンドロンの定義に明確な違いはない。デンドロンは、通常、焦点と称される化学的にアドレス可能な単一基を含有する。モル質量分布の欠如により、高モル質量のデンドリマーおよびデンドロンは高分子であるが、ポリマーではない。デンドリマーの特性は、分子表面上の官能基によって決定される。樹状足場は、内部機能および外部機能を分離するので、官能性分子の樹状カプセル化は、活性部位（これは、生体材料内の活性部位の構造を模倣する構造である）の単離を可能にする。例えば、その末端基がカルボキシル基のような親水性基である場合、デンドリマーは水溶性であり得る。
【０２８２】
デンドリマーは、一般に、以下の特徴を特徴とし得る：（ｉ）１つ以上の反応性部位を有し得るイニシエーターコア（Ｉ）であって、デンドリマーの最終的なトポロジーをもたらすように点状または有意なサイズであり得るイニシエーターコア（Ｉ）；（ｉｉ）イニシエーターコアに結合している分岐状の反復単位の１つ以上の層；（ｉｉｉ）デンドリマーの表面に（場合により連結基を介して）結合している官能性末端基、例えばアニオン性基またはカチオン性基。
【０２８３】
本明細書において企図されるデンドリマーは、リジンまたはリジン類似体構成単位を含み得る。用語「リジン類似体」は、構成単位の前の層に結合するための単一の先端カルボキシル基と、さらなる構成単位に結合可能な２つまたは３つの第１級アミン基とを有する分子を指す。本明細書において企図される「リジン類似体」の例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２号に記載されており、例えばグリシル−ｌｙｓである。いくつかの特定の例において、デンドリマーは、構成単位としてリジンまたは一種のリジン類似体のみを含む。
【０２８４】
本明細書において企図される他のデンドリマーとしては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）またはポリプロピレンイミン構成単位を含むものが挙げられる。その特定の例において、デンドリマーは、構成単位としてポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）またはポリプロピレンイミンのみを有する。コア部分は、構成単位のための１つの結合点のみを含有し得るか、または２つ、３つまたはそれ以上の点（これらは、構成単位の結合のためにさらに利用されてもよいし、または利用されなくてもよい）を含有し得る。典型的には、結合点は、遊離アミノ基である。コア部分は、構成単位からなり得るか、構成単位を含み得るか、もしくは構成単位に由来し得るか、または構成単位と異なる分子であり得る。典型的なコア部分は、本明細書において例示されており、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００３５２号に記載されている。
【０２８５】
リポソームおよびデンドリマーは、静脈内投与のための任意の適切な医薬担体と組み合わされ得る。組成物の静脈内投与は、最も低侵襲的であるので、好ましい経路である。所望であれば、他の投与経路が可能である。適切な薬学的に許容され得る担体としては、生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液または任意の他の水溶液が挙げられる。適切な投与量は、当業者に周知の手順によって確立され得る。
【０２８６】
本発明の抗体にカップリングされたリポソームおよびデンドリマーは、標的細胞を殺傷することができる上記治療剤のいずれかを封入し得る。
【０２８７】
以下の実施例は本発明を例証するものであり、その限定的な意味において考慮してはならない。
【実施例】
【０２８８】
材料および方法
細胞および試薬
ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ならびにケモカイン受容体ｈＣＣＲ６およびｈＣＣＲ８によって安定トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、記載されているように培養した（Ｚａｂａｌｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：５６７１−５；Ｃａｒｒａｍｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ  ６６：８３７−４４；Ｇｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，１６０：１９７５−８１）。ｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５およびｈＣＣＲ９トランスフェクタントは、Ａ．Ｚａｂａｌｌｏｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｓａｌｕｄ  Ｃａｒｌｏｓ  ＩＩＩ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）の寄贈であった。ＭＯＬＴ−４（ＣＲＬ−１８２）およびＪｕｒｋａｔ（ＴＩＢ−１５２）ヒトＴ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＥＧＦＰおよび赤色ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をコードする組換えレンチウイルスを感染させることによって、生物発光ＭＯＬＴ−４細胞（ＭＯＬＴ−４−ｌｕｃ）を作製した。高レベルのＥＧＦＰを発現する感染細胞を、ＦＡＣＳによって単離し、クローニングし、増殖させ、インビボ生物発光アッセイに使用した。ＭＯＬＴ−４−ｌｕｃ細胞の成長は、親ＭＯＬＴ−４細胞に類似しており、それらは表面ＣＣＲ９発現を維持していた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（完全培地）において、細胞を培養した。ヘルシンキ宣言にしたがって患者からインフォームドコンセントを得た後、矯正心臓手術中に摘出された胸腺から、ヒト末梢血リンパ球および胸腺細胞を得た。
【０２８９】
組換えヒトＣＣＬ２５およびＣＸＣＬ１２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）から入手した。以下の抗体を使用した：抗ｈＣＣＲ９（１１２５０９、マウスｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ；Ｒ＆Ｄ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、ｍＣＣＲ９（Ｋ６２９；ウサギＡｂ；Ｃａｒｒａｍｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｌｏｏｄ  ９７：８５０−７）、ｈＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１）、ｈＣＤ４−Ｐｃｙ５（１３Ｂ８．２）、ｈＣＤ８−ＰＥ（Ｂ９．１１）（３つすべてをＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬから入手）、ｈＣＤ３１（ＭＥＣ  １３．３；ラットｍＡｂ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ｈＣＤ７１トランスフェリン受容体（Ｈ３００；ウサギＡｂ）、ＰＣＮＡ（ＰＣ１０；マウスｍＡｂ）（両方ともＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手）および対照抗体Ｐ−０２０（マウスｍＡｂ  ＩｇＧ２ｂ；本発明者らの研究室）およびＭＰＣ−１１（マウスｍＡｂ  ＩｇＧ２ａ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＬＳ１２３−３Ｃ３−Ｅ３−１ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２６５３）から、３Ｃ３抗ｈＣＣＲ９  ｍＡｂを生産した。
【０２９０】
ヒトＣＣＲ９特異的ｍＡｂの作製
遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）粒子を介して、ヒトＣＣＲ９配列を有するｐＣＩｎｅｏプラスミドをＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＮＡ投与することによって、ヒトＣＣＲ９に対するマウスｍＡｂを惹起した。ＤＮＡを１．６ｎｍ金粒子にコーティングし、ＤＮＡ／金錯体（２μｇ／日）を各マウスに送達した；３０日目および６０日目に、同量のプラスミドによって、マウスを追加免疫した。最後の追加免疫の７〜１０日後に血清を収集し、陰性対照として安定トランスフェクトｈＣＣＲ９−ＨＥＫ２９３およびｐＣＩｎｅｏ−ＨＥＫ２９３細胞を使用してフローサイトメトリーによって、特異的抗体について試験した。−３日目および−２日目に、１０７個のｈＣＣＲ９−ＨＥＫ２９３細胞を、選択したマウスに静脈内的に追加免疫し、続いて、脾細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫（Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３９：２４３：６０）と融合した。融合の２週間後、ｈＣＣＲ９−ＨＥＫ２９３細胞を使用してフローサイトメトリーによって、ＣＣＲ９特異的抗体について、培養上清をスクリーニングした。陽性ハイブリドーマをクローニングし、組織培養上清からｍＡｂを精製し、ＥＬＩＳＡ（Ｋｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、前掲）によって抗体アイソタイプを決定した。
【０２９１】
キメラＣＣＲ９の作製
ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入したヒトまたはマウスＣＣＲ９  ｃＤＮＡを有するｐＣＩｎｅｏ発現ベクターを使用して、キメラＣＣＲ９を作製した。ＮｈｅＩおよびＢｓｐＬＩによって両方のベクターを消化し、マウスＣＣＲ９配列のＮ末端の６２アミノ酸を含有する断片を、消化したヒトＣＣＲ９プラスミドにクローニングして、ｍＮｔ／ｈＣＣＲ９発現ベクターを作製し、これをＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクトした。フローサイトメトリーによって、キメラＣＣＲ９の発現を評価した。
【０２９２】
フローサイトメトリー
染色のために、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり２×１０５個の細胞を遠心分離し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウム（ＰＢＳｓｔ）を含有するＰＢＳによって洗浄した。４０μｇ／ｍｌラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；２０分間、４℃）と共に細胞をプレインキュベートすることによって、非特異的結合をブロッキングした。一次Ａｂ（３０分間、４℃）と共に細胞をインキュベートし、洗浄し、ＦＩＴＣ−またはＰＥ−ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；３０分間、４℃）と共にインキュベートした。Ｅｐｉｃｓ  ＸＬまたはＣｙｔｏｍｉｃｓ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、サンプルを分析した。
【０２９３】
特定のケモカインを使用した競合研究において、５０μｌのｈＣＣＬ２５またはｈＣＸＣＬ１２（１０μｇ／ｍｌ、４０分間、４℃）と共に細胞をインキュベートし、続いて、５０μｌの９１Ｒまたはアイソタイプ適合ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍｌ、３０分間、４℃）を追加した。洗浄後、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を追加した（３０分間、４℃）。フローサイトメトリーによって、ＣＣＲ９の発現を評価した。
【０２９４】
９１Ｒ、９２Ｒ  ｍＡｂおよび３Ｃ３抗ｈＣＣＲ９  ｍＡｂを用いた競合研究において、５０μｌのＰＢＳｓｔ（灰色のヒストグラム）と共に、または３Ｃ３、９１Ｒ、９２Ｒまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ、白色のヒストグラム）と共に、ＭＯＬＴ４細胞（細胞２×１０５個／ウェル）をプレインキュベートした。４℃において３０分間経過した後、別の５０μｌのビオチン標識３Ｃ３、９１Ｒまたは９２Ｒ  ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）を追加し、インキュベーションをさらに２０分間継続した。洗浄工程の後、フローサイトメトリーによって、ＭＯＬＴ４細胞に結合している抗体を評価した。
【０２９５】
ウエスタンブロットアッセイ
膜画分を抽出するために、細胞ペレット（５×１０６個の細胞）を低張緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＥＧＴＡ）に再懸濁し、４回の凍結融解サイクルに供し、遠心分離（７５０×ｇ、２分間、４℃）した。上清を遠心分離（１８，０００×ｇ、３０分間、４℃）した。Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含むＰＢＳに膜ペレットを再懸濁し、２０％ＳＤＳ、１００ｍＭジチオスレイトール（３０分間、室温（ＲＴ））によって可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に転写し、ブロッキング（５％ＢＳＡ、５％脱脂粉乳および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液）し、次いで、９１Ｒ  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ、２時間、室温）によってイムノブロッティングし、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。ローディング対照として抗ｈＣＤ７１  Ａｂ（０．４μｇ／ｍｌ、２時間、室温）によって、膜を再プローブした。ＥＣＬ（ＧＥ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）を使用して、ブロットを現像した。示されている場合、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ；１時間、３７℃）を使用して、サンプルをＮ脱グリコシル化した。
【０２９６】
ＥＬＩＳＡ
合成ペプチド［ｈＣＣＲ９アミノ酸２〜２２（配列番号：１１）もしくは１３〜３０（配列番号：１２）またはＢＯＴ、無関係な対照ペプチド］、ヤギ抗マウスκ軽鎖抗体（ＧａＭ  ｋａｐｐａ  ＬＣ；Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）またはＢＳＡによって、マイクロタイタープレートをコーティングした。ＢＳＡによってプレートをブロッキングし、３Ｃ３、９１Ｒ、ＢＯＴまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを追加した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用した。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ＯＰＤおよびＨ２Ｏ２によって現像した。４９０ｎｍの吸光度を測定することによって、結果を定量した。
【０２９７】
３Ｃ３  ｍＡｂのＣＤＲの配列決定
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ａｍｂｉｏｎ）によって、ハイブリドーマ３Ｃ３（ＬＳ１２９−３Ｃ３−Ｅ３−１；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２６５３）の全ＲＮＡを、凍結ハイブリドーマ細胞溶解物から抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）の技術マニュアルにしたがって、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＲＡＣＥの標準操作手順にしたがって、ＶＨおよびＶＬの抗体断片を増幅し、次いで、これを標準的なクローニングベクターに別個にクローニングし、配列決定（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）した。Ｋａｂａｔナンバリングにしたがって、ＣＤＲをマッチングした。
【０２９８】
遊走アッセイ
５μｍの孔径を有するトランスウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）を使用した。２００ｎＭ組換えｈＣＣＬ２５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した５００μｌの遊走培地（ＤＭＥＭ、０，１％ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を下部チャンバーに充填した。１００μｌの遊走培地において、対応するｍＡｂ（１００μｇ／ｍｌ）と共に、３×１０５個のＭＯＬＴ−４細胞を室温において１５分間プレインキュベートし、上部チャンバーに入れ、３７℃において３時間遊走させた。下部チャンバー中の遊走した細胞を、フローサイトメーターを使用してカウントした。
【０２９９】
異種移植アッセイ
ＣＮＢ動物施設において、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｒａｇ２−／−マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｈｕｄｓｏｎ，ＮＹ）を飼育し、８〜２２週齢の時に使用した。管理および治療プロトコールは、動物実験に関するＥＵおよび国内のガイドラインに従っており、ＣＮＢ／ＣＳＩＣ倫理委員会によって承認された。
【０３００】
インビボ実験においては、０日目に、ＭＯＬＴ−４細胞（２×１０６個）をＲａｇ２−／−マウスの各脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した；次いで、１日目、７日目、１４日目および２１日目に、抗ｈＣＣＲ９  ９１ＲまたはＩｇＧ２ｂ対照ｍＡｂを、６匹のマウスからなる２つの各群に腹腔内（ｉ．ｐ．）接種した（ｄ１および６に４ｍｇ／ｋｇ；ｄ１３および２１に２ｍｇ／ｋｇ）。第２の実験において、ＭＯＬＴ−４細胞（２×１０６個）を雌性Ｒａｇ２−／−マウスの脇腹に皮下接種した；７日目、１４日目、２１日目および２８日目に、抗ｈＣＣＲ９  ９１ＲまたはＩｇＧ２ｂ対照ｍＡｂを、１０匹のマウスからなる２つの各群に腹腔内接種した（ｄ７および１４に４ｍｇ／ｋｇ；ｄ２８および３５に２ｍｇ／ｋｇ）。ノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ，Ｋａｎａｗａｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、腫瘍サイズを測定し、Ｖ＝［軸直径の長さ、ｍｍ］×［（回転直径、ｍｍ）２／２］として腫瘍体積（ｍｍ３）を計算した。腫瘍負荷は、ＩｇＧ２ｂ処理マウスのものに対する％腫瘍体積として表す。実験に応じて、５６日目または６９日目に、マウスを屠殺した；マウスおよび腫瘍を計量し、組織学のために加工した。
【０３０１】
生物発光異種移植アッセイにおいては、ｄ０に、２×１０６個のＭＯＬＴ−４−ｌｕｃ細胞を雌性Ｒａｇ２−／−マウスの各脇腹に皮下接種した。２４時間後、マウスを麻酔し、イメージングを可能にするためにＤ−ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、実験群へのバランスの取れた割り当てのために発光を定量した。ｄ１（４ｍｇ／ｋｇ）およびｄ６（２ｍｇ／ｋｇ）に、９１Ｒまたはアイソタイプ対照Ｐ−０２０  ｍＡｂをマウス（７匹／群）に腹腔内接種した。ｄ６２にマウスを屠殺するまで、６つの時点において、発光イメージングを繰り返した。分析前に、Ｉｍａｌｇｅｎｅ  ５００（２ｍｌ／Ｋｇ；Ｍｅｒｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＸｉｌａｇｅｓｉｃ  ２％（０．６ｍｌ／Ｋｇ；Ｃａｌｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｐａｉｎ）によって、マウスを１０分間麻酔した。遮光チャンバー内において、１３９４  ＯＲＣＡ  ＩＩ  ＥＲＧカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて、イメージングを１００秒間行った；Ｗａｓａｂｉソフトウェア（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用して、データを定量し、擬似カラー画像を生成した。
【０３０２】
壊死領域の組織学および定量
解剖した腫瘍を半分に分割した；半分を４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）によって一晩固定し、ＰＢＳによって洗浄し、パラフィン包埋し、切片化（５μｍ）した。残りの半分をＯＣＴ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に包埋し、ドライアイス冷却イソペンタンによって急速凍結し、−８０℃で保存し、その後に切片化（８μｍ）した。
【０３０３】
標準的な手順によって、パラフィン包埋切片をヘマトキシリン／エオシン染色し、Ｍｉｃｒｏｍｏｕｎｔ  ｍｅｄｉａ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）にマウントした。Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔカメラ（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を備えるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、画像をキャプチャした。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、全腫瘍切片および壊死領域を定量した。
【０３０４】
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性のｄＮＴＰビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）
ＴＵＮＥＬによって細胞死を測定するために、パラフィン包埋切片を脱ろうおよび再水和し、次いで、透過処理（ＰＢＳ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；室温、１０分間）した。ＴｄＴ緩衝液ｐＨ６．６（Ｓｉｇｍａ）および１ｍＭ  ＣｏＣｌ２と共に、スライドをプレインキュベート（室温、１５分間、暗所、加湿チャンバー）した。反応ミックス（組換えターミナルトランスフェラーゼおよびビオチン−１６−ｄＵＴＰ；Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ）と共に切片をインキュベートし、プレインキュベーション緩衝液によって洗浄した（室温、１０分間）。ＰＢＳおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０によって反応を終了させ、ストレプトアビジン−Ｃｙ５（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｚｙｍｅｄ，ＵＳＡ；１時間、室温）と共にスライドをインキュベートした。
【０３０５】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
脱ろうおよび再水和したパラフィン包埋切片における増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を標識することによって、細胞増殖を定量した。クエン酸ナトリウム緩衝液において蒸気処理することによって（１５分間）抗原を曝露させ、抗ＰＣＮＡ（２μｇ／ｍｌ、ＰＣ１０マウスｍＡｂ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、Ｍｏｕｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍａｘ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）のＭａｘＦｌｕｏｒ  Ｍｏｕｓｅによって染色した。抗ｈＣＤ３１  ｍＡｂによって、腫瘍血管を染色した。ＯＣＴ包埋切片を１００％アセトン（−２０℃、１０分間）によって固定し、空気乾燥し、ＴＢＳによって洗浄した。２．５％ヤギ血清および０．５％ＢＳＡのＴＢＳ溶液（２時間、室温）によってサンプルをブロッキングし、抗ＣＤ３１（一晩、４℃、８０ｎｇ／ｍｌ）によって染色した。インキュベーションおよび洗浄の後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧを追加した。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ）によって核を染色し、すべての顕微鏡調製物に関して、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌ）によってスライドをマウントした。
【０３０６】
組織のイメージングおよび分析
Ｌｅｉｃａレーザー走査マルチスペクトル共焦点顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、デジタル画像を取得した。画像スタックは、２０倍レンズを介して取得された５つの画像平面から構成されていた（計算された最適ズーム比２、ｚ−ステップ１．３９μｍ）。各腫瘍について、少なくとも３個の切片および切片１個当たり１２〜３０個のランダムな非連続非重複領域を取得および調査した。ＴＵＮＥＬ−およびＰＣＮＡ陽性核ならびにＣＤ３１陽性血管断片の光学視野当たりの密度を定量し、すべての光学視野からのデータを使用して、陽性構造の推定平均数を計算した。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｔｏｏｌを使用して拡大画像を用いて、定量を実施した。
【０３０７】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
ＭＯＬＴ−４細胞（標的細胞１０５個／１００μｌ）を９６ウェルＶ底プレートにプレーティングし、示されている濃度の抗ｈＣＣＲ９またはアイソタイプ適合対照ｍＡｂ（３０分間、３７℃）と共にインキュベートし、遠心分離し、洗浄した。１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭにおいて、活性な仔ウサギ補体、または５６℃において熱不活性化した仔ウサギ補体（２５％；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）を細胞に追加した（１時間、３７℃）。生存排除マーカー７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０分間、４℃）によって細胞を染色し、フローサイトメトリーによって非生存細胞の数を評価した；各条件を３回反復で分析した。特異的溶解を１００×（活性補体による死細胞の％−不活性補体による死細胞の％）／（１００％−不活性補体による死細胞の％）として計算した。
【０３０８】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、統計分析を実施した。特に指示がない限り、スチューデントのｔ検定によって評価した場合の統計的有意性は、ｐ＜０．０５において確立した。結果を平均±ＳＥＭとして示す。
【０３０９】
実施例１
９１Ｒ  ｍＡｂは、ヒトケモカイン受容体ＣＣＲ９を特異的に認識する
真核生物発現ベクターに挿入された全長ｈＣＣＲ９コード配列によって免疫した後に、マウス抗ｈＣＣＲ９  ｍＡｂを作製した。最初に、ｈＣＣＲ９または空ベクターを安定発現するＨＥＫ２９３細胞に対するフローサイトメトリーによって、特異性を評価した。ヒトおよびマウスＣＣＲ９は８６％の配列同一性を共有するが、９１Ｒ  ｍＡｂは、ヒトＣＣＲ９を発現する細胞のみを認識した（図１Ａ）。９１Ｒは、ｈＣＣＲ９と３０〜３６％の同一性を示すｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６またはｈＣＣＲ８ケモカイン受容体を発現する安定ＨＥＫ２９３トランスフェクタントと交差反応せず（図１Ａ）、これは、９１Ｒの特異性を実証している。
【０３１０】
９１Ｒは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４細胞株上の内因性ヒトＣＣＲ９を認識したが、陰性対照のＪｕｒｋａｔ細胞を染色しなかった（図１Ｂ）（Ｚａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０：１２４１−５６）。市販の抗ｈＣＣＲ９（１１２５０９ｍＡｂ）を並行して比較した（図１Ｂ）；同じｍＡｂ濃度（１０μｇ／ｍｌ）において、９１Ｒは、ＭＯＬＴ−４細胞に対して、１１２５０９ｍＡｂよりも１３倍高い平均蛍光強度を示した（ＭＦＩ；４９．７対３．８）。最適以下濃度（０．１２／ｍｌ）において、９１Ｒは、ＭＯＬＴ−４細胞の１００％を依然として染色し、ＭＦＩは１０．９であり、１１２５０９の飽和濃度におけるシグナルよりも高かった（図１Ｃ）；これにより、９１Ｒ  ｍＡｂのより高いＣＣＲ９親和性および／またはよりアクセス可能なエピトープの認識が示された。９１Ｒはまた、正常細胞上の内因性ヒトＣＣＲ９を認識した。９１Ｒは、Ｔ細胞の成熟のすべての段階における胸腺細胞を染色し、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ細胞に対する結合が最大であった（図１Ｄ）。加えて、９１Ｒによって、末梢血リンパ球の２〜３％（主にＣＤ３＋集団）が染色された（図１Ｅ）。
【０３１１】
ｈＣＣＲ９−およびｐＣＩｎｅｏ−ＨＥＫ２９３トランスフェクタント（モックトランスフェクト−およびｈＣＣＲ９−ＨＥＫ２９３；図１Ｇ）の膜抽出物を使用してウエスタンブロットにおいて、９１Ｒの特異性をさらに評価した。ｈＣＣＲ９トランスフェクタント由来のサンプルにおいて、９１Ｒは、ｈＣＣＲ９の推定分子量（３６９アミノ酸；推定ＭＷ４２，０１６Ｄａ）に一致する４３ｋＤａのバンドを特異的に認識した。同様に、ＭＯＬＴ−４細胞サンプルにおいて、４７ｋＤａのバンドが検出されたが、Ｊｕｒｋａｔ細胞サンプルにおいては検出されなかった。ＨＥＫ２９３細胞およびＭＯＬＴ−４細胞におけるｈＣＣＲ９バンドの見掛けの分子量の違いは、グリコシル化の違いに起因し得る（図１Ｇ）。
【０３１２】
実施例２
ｈＣＣＲ９  Ｎ末端ドメインは、９１Ｒ  ｍＡｂのエピトープ認識に必要である
ＣＣＲ９は、７個の膜貫通ドメイン、細胞外Ｎ末端ドメイン（Ｎｔ）、３個の細胞内ドメイン、３個の細胞外ドメインおよび細胞内Ｃ末端ドメインから構成される（図２Ａ）。ヒトＣＣＲ９およびマウスＣＣＲ９は、８６％のアミノ酸配列同一性を示し、３１個の残基が異なる。９１Ｒによって認識されるｈＣＣＲ９ドメインをマッピングするために、ｈＣＣＲ９  Ｎｔをマウス配列（ｍＮｔ／ｈＣＣＲ９）によって置換した発現ベクター（図２Ａ）を作製し、ＨＥＫ２９３細胞において発現させた。フローサイトメトリー分析により、Ｋ６２９抗マウスＣＣＲ９  Ａｂはこのキメラ受容体を認識したのに対して、９１Ｒは認識しなかったことが示されたが（図２Ａ）、これは、ｈＣＣＲ９  Ｎｔドメインが９１Ｒのエピトープ認識に必要であったことを示している。
【０３１３】
ｈＣＣＲ９  Ｎｔドメインは、Ａｓｎ３２において推定Ｎ−グリコシル化部位を有するので、それがグリコシドエピトープまたはペプチド骨格を認識したかを確認するために、９１Ｒの認識部位を試験した。ＭＯＬＴ−４細胞溶解物およびｈＣＣＲ９−ＫＥＫ２９３細胞溶解物をＰＮＧａｓｅによって処理し、続いて、電気泳動を行い、９１Ｒを用いてウエスタンブロットを行った。未処理のＭＯＬＴ−４細胞抽出物は、４７ｋＤａの主要なタンパク質バンドおよび４３ｋＤａの副次的なバンドを示したのに対して、ＰＮＧａｓｅ処理した溶解物においては、３９ｋＤａの単一バンドが出現した（図２Ｃ）。ＣＣＲ９トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞抽出物において、９１Ｒは、未処理の溶解物およびＰＮＧａｓｅ処理した溶解物において、それぞれ４３および３９ｋＤａのバンドを検出した。この結果は、ｈＣＣＲ９がＮ−グリコシル化タンパク質であること、およびグリコシル部分が、９１Ｒによって認識されるエピトープの一部ではなく、９１Ｒによって認識されるエピトープをマスクするものでもないことを裏付けており、これは、このｍＡｂがｈＣＣＲ９ペプチド主鎖を特異的に認識することを示唆している。
【０３１４】
実施例３
ＣＣＲ９リガンドＣＣＬ２５は、ＭＯＬＴ−４細胞に対する９１Ｒの結合を部分的に遮断する
ＣＣＬ２５が、９１ＲによるＣＣＲ９認識に対して影響を与えるかを研究するために、受容体のインターナリゼーションを阻害するためのアジ化ナトリウムの存在下において、ＭＯＬＴ−４細胞を単独で、またはｈＣＣＬ２５と共にプレインキュベートし（４０分間、４℃）、続いて、９１Ｒと共にインキュベートし、フローサイトメトリー分析を行った。ＣＣＬ２５は、９１Ｒの結合を部分的に阻害した（図３Ａ）。対照のケモカインＣＸＣＬ１２は、ｍＡｂの結合に対して影響を与えなかったので（図３Ｂ）、この効果は特異的であったが、これは、ＣＣＲ９に対するＣＣＬ２５および９１Ｒの結合部位が部分的に重複しているか、またはごく接近していることを示唆している。
【０３１５】
実施例４
９１Ｒ  ｍＡｂは、異種移植片におけるヒト腫瘍のインビボ成長を阻害する
免疫不全マウスに移植したＭＯＬＴ−４細胞は、腫瘍として成長する。２つのアプローチを使用して、このモデルにおける９１Ｒの抗腫瘍能を評価した。第１の実験デザインにおいて、ＭＯＬＴ−４細胞を２つのマウス群両方の背側脇腹に皮下接種した（０日目）；次いで、ＭＯＬＴ−４細胞を移植した翌日から開始して、９１Ｒまたはアイソタイプ適合ｍＡｂ（Ｐ−０２０、ＩｇＧ２ｂ）をそれらに週４回腹腔内注射した（図４Ａ）。腫瘍が発達し、そのサイズを、マウスを屠殺した５６日目まで定期的に測定した。９１Ｒ処理したマウスにおいては、有意に小さい腫瘍が３９日目に既に出現していた（ｐ＝；図４Ｂ）。５６日目に、各マウス群の腫瘍を摘出し、計量した；９１Ｒ処理したマウスにおいては、対照と比較して、各群の腫瘍重量の合計として測定した全腫瘍量の計算が８４±１８％減少していた（マウス１匹当たりの腫瘍量６３．３±３０．３ｍｇ対３９７±６５ｍｇ；ｐ＝０．０００９；図４Ｃ）。９１Ｒ処理したマウス由来の個々の最大腫瘍は、対照マウス由来のいずれの腫瘍よりも小さかった（図４Ｄ）；すべての対照マウスは腫瘍を発達させたのに対して、９１Ｒ処理した２匹のマウスは腫瘍がなかった（ｎ＝マウス６匹／群）。
【０３１６】
より限定的な条件下における９１Ｒ  ｍＡｂの腫瘍成長阻害能を試験するために、ＭＯＬＴ−４細胞を移植した７日後に、処理を開始した。４つのｍＡｂ用量を上記のように１週間間隔で投与し（図４Ｅ）、腫瘍サイズを、マウスを屠殺した６９日目まで測定した。４８日目までに、２つのマウス群間の腫瘍サイズの差は明らかであり（ｐ＝０．０１２；図４Ｆ）、腫瘍量のデータにより、９１Ｒ処理したマウスにおいては、対照処理したマウスと比較して、６４±２９％減少していたことが示された（１６３±５６ｍｇ対４５１±１１７ｍｇ；ｐ＝０．０３９；図４Ｇ）。これらの実験においては、ＭＯＬＴ−４細胞を一方の脇腹にのみ注射した；２匹の対照マウスおよび９１Ｒ処理した４匹のマウスは腫瘍がなく、９１Ｒ処理したマウス由来の最大腫瘍のサイズは、対照マウス由来の最小腫瘍と同様であった（図４Ｈ）。
【０３１７】
直接的なキャリパー測定が不可能である場合、初期段階において腫瘍成長を評価するために、ルシフェラーゼを発現するＭＯＬＴ−４細胞（ＭＯＬＴ−４−ｌｕｃ）をＲａｇ２−／−マウスの背側脇腹に注射した。抗体の投与回数を減少させる効果を決定するために、１日目（１００μｇ／マウス）および６日目（５０μｇ／マウス）に、９１Ｒおよび対照抗体も投与した（図５Ａ）。発光イメージングによって移植腫瘍をモニタリングし（図５Ｂ）、ｄ６２にマウスを屠殺した。発光分析により、２日目から腫瘍成長が示され、これは、９１Ｒ処理したマウスにおいて１２日目から阻害されたことが示された（ｐ＝０．０３２；図５Ｂ、Ｃ）。９１Ｒ処理は、対照と比べて８５±１１％の総腫瘍量減少をもたらした（図５Ｄ）。重量および相対発光によって決定したところ、９１Ｒ処理した７匹のマウスのうちの３匹は腫瘍がなく、残りの４匹のマウス由来の腫瘍は対照よりも小さかった（２２３±１０３ｍｇ対１，４７８±２６２ｍｇ；ｐ＜０．０００１；図５Ｅ）。
【０３１８】
これらの結果は、ＭＯＬＴ−４マウスモデルにおける９１Ｒの抗腫瘍効果を示している。
【０３１９】
実施例５
９１Ｒ処理した腫瘍は、壊死およびアポトーシスの増加、ならびに血管新生および細胞増殖の減少を示す
ＭＯＬＴ−４腫瘍に対する９１Ｒ処理の効果を組織化学分析によって調べた。剖検で採取した腫瘍異種移植片由来の切片をヘマトキシリン／エオシン染色し、各腫瘍切片について、総面積に対する壊死領域の割合を計算した；壊死領域は、細胞がない領域であって、紫色の核が高密度に蓄積した領域によって囲まれる領域と定義した（図６Ａ）。壊死領域の程度に基づいて、腫瘍を３つのカテゴリーに分類した：低（＜１％）、中（１−３０％）および高（＞３０％）（図６Ｂ）。９１Ｒ処理したマウスにおいてのみ、高い壊死レベルが検出された（腫瘍の４０％）；中級レベルは、９１Ｒ処理したマウスの場合には２０％であり、対照マウスの場合には５０％であった。各抗体処理の頻度分布の差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１；図６Ｂ）。
【０３２０】
ＴＵＮＥＬアッセイを使用して、アポトーシス（これは、細胞クリアランスに先立って、壊死無細胞領域につながり得る）の程度を決定した。対照と比較して、９１Ｒ処理した腫瘍は、アポトーシス細胞密度の有意な増加を示した（１．９３倍；ｐ＜０．０００１；図６Ｃ、Ｄ左）。
【０３２１】
パラフィン包埋腫瘍切片における増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を標識することによって、細胞増殖を定量した；９１Ｒ処理した腫瘍は、対照腫瘍と比較して、増殖細胞の割合の有意な減少を示した（４０％；ｐ＜０．０００１；図６Ｃ、Ｄ中央）。
【０３２２】
腫瘍成長はまた、腫瘍内血管新生の程度に関連している。内皮マーカーＣＤ３１の免疫組織化学的検出による腫瘍血管新生の評価により、９１Ｒ処理した腫瘍においては、対照腫瘍と比較して、微小血管密度が減少していることが示された（５０．７％；ｐ＜０．０００１；図６Ｃ、Ｄ右）。
【０３２３】
これらのデータは、９１Ｒが、アポトーシス細胞死および壊死レベルを増加させ、細胞増殖および腫瘍内微小血管密度を減少させることによって、腫瘍成長を妨げることを示している。
【０３２４】
実施例６
９１Ｒ  ｍＡｂは、補体依存性細胞傷害を媒介する
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、治療抗体による腫瘍細胞排除の主なインビボ機構の１つであり、これにより、補体成分Ｃ１ｑが抗体オプソニン化細胞（古典経路）に動員され、その特異的溶解を促進する。ＭＯＬＴ−４白血病細胞の溶解を誘導する９１Ｒのインビトロ能力を、補体結合によって試験した。９１Ｒ、１１２５０９または適切なアイソタイプ適合ｍＡｂと共にＭＯＬＴ−４細胞をプレインキュベートし、その後、仔ウサギ補体を追加した（１時間、３７℃）。７−ＡＡＤの取り込みのフローサイトメトリー分析によって、特異的細胞死を評価した。
【０３２５】
９１Ｒは、１１２５０９ｍＡｂ（１８±２％；ｐ＝０．０３；図７Ａ）よりも高いレベルにおいて、ＭＯＬＴ−４細胞の補体特異的溶解を促進した（４９±２％；ｐ＜０．０００１；図７Ａ）。
【０３２６】
９１Ｒの使用条件を最適化するために、ｍＡｂ濃度、補体濃度および曝露時間を評価した。用量反応実験により、Ｓ字状の反応が示され、０．４μｇ／ｍｌ以上の濃度において検出可能であり（１８．４±３．２％）、４μｇ／ｍｌ  ｍＡｂにおいて３０分間にわたって４０％の細胞溶解を超えていた（図７Ｂ）。２５％補体において、４０μｇ／ｍｌ  ９１Ｒと共に１時間インキュベートすることにより、約５０％のＭＯＬＴ−４細胞溶解がもたらされた；より長いインキュベーション（５時間）は、溶解を７１．７±４．４に増加させた（図７Ｃ）。より高い補体濃度は、溶解を７７．３±２．３の最大値に高めた（１時間、７５％補体）（図７Ｄ）。これらの結果は、ＣＤＣが、マウスにおけるＭＯＬＴ−４腫瘍異種移植片を減少させるために９１Ｒが使用する機構の１つであることを示唆している。
【０３２７】
実施例７
９２Ｒ  ｍＡｂは、ヒトケモカイン受容体ＣＣＲ９を認識し、この受容体に対する９１Ｒ  ｍＡｂの結合と競合する
真核生物発現ベクターに挿入された全長ｈＣＣＲ９コード配列によって免疫した後に、マウス抗ｈＣＣＲ９  ｍＡｂ  ９２Ｒを作製した。最初に、ｈＣＣＲ９または空ベクターを安定発現するＨＥＫ２９３細胞に対するフローサイトメトリーによって、特異性を評価した。ヒトおよびマウスＣＣＲ９は８６％の配列同一性を共有するが、９２Ｒ  ｍＡｂは、ヒトＣＣＲ９を発現する細胞のみを認識した。９２Ｒは、ｈＣＣＲ９と３０〜３６％の同一性を示すｈＣＣＲ４、ｈＣＣＲ５、ｈＣＣＲ６またはｈＣＣＲ８ケモカイン受容体を発現する安定ＨＥＫ２９３トランスフェクタントと交差反応せず、これは、９２Ｒの特異性を実証している。さらに、９２Ｒは、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４細胞株上の内因性ヒトＣＣＲ９を認識したが、陰性対照のＪｕｒｋａｔ細胞を染色しなかった（図８Ａ）（Ｚａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０：１２４１−５６）。加えて、前記ｍＡｂ  ９１Ｒと共にプレインキュベートしたＭＯＬＴ−４細胞のフローサイトメトリー分析により、この抗体は、ＭＯＬＴ−４細胞に対する結合についてｍＡｂ  ９２Ｒと競合することが示された（図８Ａ）。
【０３２８】
ＣＣＲ９は、７個の膜貫通ドメイン、細胞外Ｎ末端ドメイン（Ｎｔ）、３個の細胞内ドメイン、３個の細胞外ドメインおよび細胞内Ｃ末端ドメインから構成される（図２Ａ）。ヒトＣＣＲ９およびマウスＣＣＲ９は、８６％のアミノ酸配列同一性を示し、３１個の残基が異なる。抗原としてｈＣＣＲ９のアミノ酸２〜２２に対応する合成ペプチドを使用したＥＬＩＳＡ分析の結果により、９２Ｒ  ｍＡｂによって認識されるＣＣＲ９エピトープは、Ｎｔドメインに位置することが示された。これらのアッセイを使用して、ｍＡｂ  ９１Ｒおよび９２Ｒは両方とも、ｈＣＣＲ９アミノ酸２〜２２を含むこの合成ペプチドに対する結合について互いに競合することも示された（図８Ｃ）。
【０３２９】
実施例８
９１Ｒ  ｍＡｂ、９２Ｒ  ｍＡｂは、３Ｃ３  ｍＡｂと構造的に異なる
９１Ｒ  ｍＡｂおよび９２Ｒ  ｍＡｂが、現状技術（国際公開第００／５３６３５号）において説明されている３Ｃ３抗ｈＣＣＲ９  ｍＡｂと構造的に異なっていたかを評価するために、それらのＣＤＲを配列決定した。３Ｃ３  ｍＡｂの６つのＣＤＲの配列は、配列番号：１３（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ−Ｈ２）、配列番号：１５（ＣＤＲ−Ｈ３）、配列番号：１６（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号：９（ＣＤＲ−Ｌ２）、配列番号：１７（ＣＤＲ−Ｌ３）として同定されている。図９に示されているアライメントは、９１Ｒ  ｍＡｂおよび９２Ｒ  ｍＡｂの重鎖ＣＤＲならびにＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３がいずれも３Ｃ３  ｍＡｂの対応するＣＤＲと同一ではなかったことを実証している。実際、９２Ｒ  ｍＡｂおよび３Ｃ３  ｍＡｂのＣＤＲ−Ｌ２のみが同じ配列（配列番号：９）を共有していた。加えて、９１Ｒ  ｍＡｂまたは９２Ｒ  ｍＡｂおよび３Ｃ３  ｍＡｂのそれぞれのＣＤＲ間の配列同一性の割合を計算した（表１）。
【表１】
0006550385.tif 000002
【０３３０】
実施例９
９１Ｒ  ｍＡｂおよび９２Ｒ  ｍＡｂは、３Ｃ３  ｍＡｂによって認識されるものと異なるｈＣＣＲ９のエピトープを認識する
９１Ｒ  ｍＡｂによるｈＣＣＲ９認識のパターンを、３Ｃ３  ｍＡｂのものと比較した。抗体は両方とも、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４細胞株上の内因性ヒトＣＣＲ９を認識し、陰性対照Ｊｕｒｋａｔ細胞を染色しなかった一方（図１０Ａ）、９１Ｒ  ｍＡｂおよび３Ｃ３  ｍＡｂは、ｈＣＣＲ９トランスフェクトＨＥＫ−２９３の異なる認識パターンを有する（図１０Ｂ）。特に、３Ｃ３  ｍＡｂは、モックトランスフェクト細胞に対する非特異的結合が９１Ｒ  ｍＡｂよりも高い。ｈＣＣＲ９由来の合成ペプチドを使用してＥＬＩＳＡによって、この差をさらに分析した。図１１に示されている結果により、９１Ｒ  ｍＡｂは、ｈＣＣＲ９のアミノ酸２〜２２（配列番号：１１）に対応するペプチドを認識し、ｈＣＣＲ９のアミノ酸１３〜３０（配列番号：１２）に対応するペプチドに対する無視可能な結合を示したのに対して、３Ｃ３  ｍＡｂは、これらのペプチドのいずれにも結合しないことが明らかになった。
【０３３１】
ＭＯＬＴ４細胞における９１Ｒ  ｍＡｂ、９２Ｒ  ｍＡｂおよび３Ｃ３  ｍＡｂを使用した競合結合アッセイにより、９１Ｒ  ｍＡｂおよび９２Ｒ  ｍＡｂは、ＭＯＬＴ４細胞に対する結合について互いに競合するのに対して、３Ｃ３  ｍＡｂはそれ自体としか競合しないことが示された。
【０３３２】
実施例１０
９１Ｒ  ｍＡｂおよび３Ｃ３  ｍＡｂは、ＭＯＬＴ４細胞に対して異なる機能を示す
国際公開第００／５３６３５号の文書には、３Ｃ３  ｍＡｂは、ＣＣＲ９リガンドＣＣＬ２５によって誘導されるＭＯＬＴ４細胞の遊走を遮断することが記載されている。９１Ｒ  ｍＡｂと３Ｃ３  ｍＡｂとの間の機能的差異を調査するために、このアッセイを再現した。図１３に示されている結果により、３Ｃ３  ｍＡｂは、ＣＣＬ２５によって誘導されるＭＯＬＴ４細胞の遊走を遮断するのに対して、９１Ｒ  ｍＡｂは遮断しないことが明らかになった。
【図１ＡＢ】
0006550385.tif 000003
【図１ＣＤ】
0006550385.tif 000004
【図１ＥＦ】
0006550385.tif 000005
【図２】
0006550385.tif 000006
【図３】
0006550385.tif 000007
【図４ＡＢＣＤ】
0006550385.tif 000008
【図４ＥＦＧＨ】
0006550385.tif 000009
【図５ＡＢＣ】
0006550385.tif 000010
【図５ＤＥ】
0006550385.tif 000011
【図６ＡＢ】
0006550385.tif 000012
【図６Ｃ】
0006550385.tif 000013
【図６Ｄ】
0006550385.tif 000014
【図７ＡＢ】
0006550385.tif 000015
【図７ＣＤ】
0006550385.tif 000016
【図８ＡＢ】
0006550385.tif 000017
【図８Ｃ】
0006550385.tif 000018
【図９】
0006550385.tif 000019
【図１０】
0006550385.tif 000020
【図１１】
0006550385.tif 000021
【図１２】
0006550385.tif 000022
【図１３】
0006550385.tif 000023
【配列表】
0006550385000001.app