(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＤ６５をコードする遺伝子およびＩＬ−１０をコードする遺伝子を含む、疼痛を軽減または処置する医薬組成物。
【請求項２】
ＧＡＤ６５をコードする遺伝子を動作可能に含む第１のベクター、およびＩＬ−１０をコードする遺伝子を動作可能に含む第２のベクターを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＧＡＤ６５をコードする遺伝子を含む第１のベクター、およびＩＬ−１０をコードする遺伝子を含む第２のベクターを、１：１〜１：５０の、単位体積当たりのウイルス力価に基づく混合比で含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群から選択される、少なくとも１つのウイルスベクターである、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
ＧＡＤ６５が、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ＧＡＤ６５をコードする遺伝子が、配列番号２または配列番号３の塩基配列からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ＩＬ−１０が、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ＩＬ−１０をコードする遺伝子が、配列番号７、配列番号８または配列番号１０の塩基配列からなる、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
疼痛が、侵害受容性疼痛、心因性疼痛、炎症性疼痛、または病的疼痛である、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
疼痛が、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛または片頭痛である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬組成物が、生理学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
医薬組成物が注射薬である、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛を軽減または処置する組成物であって、グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を含む、組成物；ならびに該組成物を用いることによって、疼痛を軽減または処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際疼痛学会(International Association for the Study of Pain)で使用される用語「疼痛」は、「実際の、もしくは潜在的な組織損傷、またはそれに付随する不快感および精神的な体験」と定義されている。疼痛は、損傷発生から損傷治癒の間、損傷した身体の一部を保護し、ヒトが将来、類似の経験を避ける動機を与える。ほとんどの疼痛は、刺激の原因が除去されると徐々に軽減するが、損傷部位が完全に治癒し、刺激が消失したにもかかわらず、疼痛が持続する場合があり、または疼痛は、刺激、損傷もしくは疾患が生じていない状態において、発生する場合がある。
【０００３】
神経障害性疼痛は、神経、脊髄または脳の異常によって誘導される、非悪性の慢性疼痛の一種であり、人口の１％以上が患っていると考えられている。神経障害性疼痛の最も一般的な原因は、外傷、代謝障害および虚血性障害などであり、これらは病的な神経インパルスを、脊髄を介して脳に伝達し、疼痛の発生をもたらす。神経障害性疼痛は、影響を与える位置に依存して、末梢神経障害性疼痛および中枢神経障害性疼痛に分類できる。
【０００４】
このような神経障害性疼痛が長期間持続する場合、身体的苦痛および精神的苦痛をもたらし得、したがって患者の生活の質が低下する可能性がある。それ故、疼痛軽減の積極的な処置を実行すべきである。現在、疼痛自体が疾患として認識されており、疼痛に対する関心が広がっているため、鎮痛剤への需要が将来的に着実に増加することが予想される。主にアセチルサリチル酸、イブプロフェン、およびアセトアミノフェンなどの鎮痛剤が、現在の疼痛処置に広く用いられている。主成分がアセチルサリチル酸であるアスピリンを、鎮痛の目的で使用する場合、少なくとも５００ｍｇの高投与量を投与すべきである。しかしながら、アスピリンは、非ステロイド性抗炎症鎮痛剤（ＮＳＡＩＤ）であり、胃粘膜を保護する役割を果たす、プロスタグランジンの産生を促進する酵素（ＣＯＸ−１）をブロックすることによって、胃粘膜の産生を妨害するため、胃は胃酸によって容易に損傷し得、胃腸出血が容易に起こり得る。さらに、アスピリンは血栓形成を防ぐため、出血が起こり得る。イブプロフェンもまた、非ステロイド性抗炎症鎮痛成分であり、したがって同様に、胃の障害が起こり得る。主成分がアセトアミノフェンである鎮痛剤の場合（タイレノールなど）、アセトアミノフェンは主に肝臓内で代謝されるため、肝臓が損傷し得る。したがって、最大投与量などを低下させる安全性の問題がある。さらに、上述の鎮痛剤の長期使用は、これらが初期段階で有効な場合でさえ、耐性および効力の減少を導くことが多く、具体的には神経障害性疼痛の場合、非ステロイド性抗炎症薬は、各患者における最大投与量においてさえ有効でないため、短期間での高投与量の投与が処方される。それ故、副作用がなく、低投与量で優れた鎮痛効力を示す、神経障害性疼痛の新規な鎮痛剤の開発が、緊急に必要とされている。
【０００５】
現在、数種の新規物質が、神経障害性疼痛の鎮痛剤として開発中である。最近、ナトリウムチャネル遮断薬が開発されたが、これらは主に小分子の形状であり、特定のアイソフォームに対する選択性が低い。さらにこれらは、心毒性、運動障害などの副作用を示し、したがって将来的にさらなる研究が必要である。遺伝子治療薬に関しては、Periphagen Holdings Inc.が、オピオイドペプチドであるエンケファリンをコードする遺伝子を、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）遺伝子担体に導入した治療薬を開発している。しかしながら、臨床試験において、鎮痛効力が減少する問題が発見され、したがってその進行は第２相試験で停止した。ＨＳＶは、皮下投与された場合でさえ、薬剤を末梢神経に送達するという利点を有するが、実際には遺伝子送達の効率は劣っており、オピオイドペプチドであるエンケファリンのみで疼痛を抑制するのは困難であることが想定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の例は、疼痛を軽減または処置する組成物に関し、該組成物は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードする遺伝子、および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を含む。
【０００７】
本発明のさらなる例は、疼痛を軽減または処置する方法を提供し、本方法は、ＧＡＤをコードする遺伝子、および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、疼痛を軽減または処置する医薬組成物であって、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードする遺伝子および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を含む医薬組成物、ならびに疼痛を軽減または処置する方法であって、該医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の医薬組成物は、ごく少量の遺伝子送達で鎮痛効果を示すことができ、疼痛を軽減する効力は、単独投与と比較して、より少ない量の遺伝子送達でさえ観察できる。ＧＡＤ遺伝子産物であるＧＡＢＡは、疼痛のシグナル伝達を遮断する効力を有するが、過量のＧＡＢＡは、そう痒、めまい、眠気などの症状、および心拍速度または呼吸速度の増加などの副作用を生じ得る。ＩＬ−１０は、抗炎症効果を示すサイトカインとして公知であるが、高投与量を全身に用いた場合に、ＲＢＣレベルの減少などの副作用が観察された。一方、本発明の医薬組成物は、ＧＡＤおよびＩＬ−１０の組合せの同時投与を用いることによって、単独投与と比較して、より少ない投与量で、優れた鎮痛活性を示し、したがって、低い投与量の投与によって、従来の副作用および毒性を低下させる、相乗効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、組換えアデノ随伴ウイルスの産生に使用する、プラスミドｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５のベクターマップを示す。
【図２】図２は、組換えアデノ随伴ウイルスの産生に使用する、プラスミドｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０のベクターマップを示す。
【図３】図３は、組換えアデノ随伴ウイルスの産生に使用する、プラスミドｐＡＡＶ−ｒＩＬ−４のベクターマップを示す。
【００１１】
【図４】図４は、ウエスタンブロットによって、各タンパク質の発現レベルを確認した図であり、ＧＡＤ６５、ＩＬ−１０およびＩＬ−４遺伝子をそれぞれ導入したアデノ随伴ウイルスを調製し、次いでヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞を該ウイルスで処理し、細胞または培地を４８時間後に回収した。
【００１２】
【図５】図５は、組換えアデノ随伴ウイルスＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５による、ＧＡＢＡ発現を示し、これはＥＬＩＳＡで測定した、培地中のＧＡＢＡレベルを示す図であり、ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞をＡＡＢ−ＧＡＤ６５で処理し、培地を４８時間後に回収した。各実験群において、２つの同一の試料を別々に調製し、バーは各試料の値を示す。
【００１３】
【図６】図６は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５とＡＡＶ−ＩＬ−１０の同時投与の効力を、ガバペンチン投与と比較した結果を示し、これは、市場で神経障害性疼痛鎮痛薬として用いられるガバペンチンと比較した、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５とＡＡＶ−ＩＬ−１０の同時投与の相乗効果における差異を確認するグラフである。
【００１４】
【図７】図７は、その組合せの組成比に依存した、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５とＡＡＶ−ＩＬ−１０の効力を示す。特にこれは、１：１、１：５、１：３０のＡＡＶ−ＧＡＤとＡＡＶ−ＩＬ−１０との組合せの組成比での、動物行動分析における相乗効果を示すグラフである。
【００１５】
【図８】図８は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５とＡＡＶ−ＩＬ−１０を、経椎間孔硬膜外注射(transforaminal epidural injection)によって、１：１０および１：３０で同時投与した際の、相乗効果を示すグラフである。
【００１６】
【図９】図９は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０の効力を、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−４の効力と比較した結果を示し、これは、ＩＬ−１０およびＩＬ−４を、ＧＡＤ６５とそれぞれ組み合わせて使用した際の、動物行動分析における相乗効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明を実行するのに最良の形態
以下で、本発明を詳細に記述する。
本発明のある実施例において、ＧＡＤをコードする遺伝子および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を、担体に含まれた形態で提供し、該担体は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター（プラスミドまたはリポソームなど）を含む。
【００１８】
ＧＡＤをコードする遺伝子は、第１のベクターに動作可能に含まれ得、抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子は、第２のベクターに動作可能に含まれ得る。
【００１９】
ウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスおよびポックスウイルスからなる群から選択される、少なくとも１つであり得る。
【００２０】
本発明における、ＧＡＤをコードする遺伝子を含む担体（例えば、第１のベクター）、および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を含む担体（例えば、第２のベクター）は、１：１〜１：１００、１：１〜１：８０、１：１〜１：６０、１：１〜１：４０、１：１〜１：２０、１：１〜１：１０、１：３〜１：１００、１：３〜１：８０、１：３〜１：６０、１：３〜１：４０、１：３〜１：２０、または１：３〜１：１０、より好ましくは１：１〜１：５０、最も好ましくは１：５〜１：３０の、単位体積当たりの、ウイルス力価に基づく混合比を有し得る。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、ごく少量の遺伝子または遺伝子を含む担体で、鎮痛効果を示すことができる。本発明の組成物は、ＧＡＤをコードする遺伝子を含むベクター、および神経組織における抗炎症作用の遺伝子を含むベクターからなり、疼痛軽減または疼痛処置の効力を、異なる鎮痛機構を有する物質を同時投与することによって、単独投与よりも少ない量で達成できる。したがって、本発明の組成物は、少量の遺伝子または遺伝子を含む担体を使用するため、毒性を低下させる一方で、優位な鎮痛効力の相乗作用を示す。
【００２２】
本発明の例において、第１のベクターおよび第２のベクターは、アデノ随伴ウイルスであり得る。アデノ随伴ウイルスは、特定の血清型に限定されないが、好ましくは、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ５のいずれかであり得る。
【００２３】
本発明におけるＧＡＤは、グルタミン酸を脱炭酸し、ＧＡＢＡ（ガンマ−アミノ酪酸）を生成する酵素である。本発明に適用できるＧＡＤをコードする遺伝子は、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７のうち１つであり得、これらは２つのアイソフォームである。ＧＡＤ６５は、ヒトもしくはラットのタンパク質またはそれをコードする遺伝子であり得、それらの具体例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００８１８の配列番号１のアミノ酸配列からなり得、配列番号２または配列番号３の塩基配列からなり得る。ＧＡＤ６７は、ヒトもしくはラットのタンパク質またはそれをコードする遺伝子であり得、それらの具体例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００８１７の配列番号４のアミノ酸配列からなり得、配列番号５の塩基配列からなり得る。
【００２４】
本発明の医薬組成物において、抗炎症性サイトカインはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）であり得、相乗的な疼痛軽減の効力は、ＩＬ−１０およびＧＡＤ６５の同時投与によって示される。
【００２５】
ＩＬ−１０は、抗炎症性サイトカインの一種であり、サイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）としても知られている。ＩＬ−１０は、クラスＩＩサイトカインに属し、１７８アミノ酸長の２つのサブユニットからなるホモ二量体である。ＩＬ−１０は、免疫応答におけるＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の活性を阻害する機能を果たし、ＩＬ−１０受容体と複合体を形成することによって、シグナル伝達に関与する。ＩＬ−１０は、ヒトまたはラットのタンパク質またはそれをコードする遺伝子であり得、それらの具体例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１２８５４の配列番号６またはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００５７２の配列番号９のアミノ酸配列からなり得、配列番号７、配列番号８または配列番号１０の塩基配列からなり得る。
【００２６】
本発明のＧＡＤをコードする遺伝子および／またはＩＬ−１０をコードする遺伝子の塩基配列は、その変異体を含み、変異体は、ラットまたはヒトにおけるコドン最適化によって改変された塩基配列であり得る。具体的には、少なくとも６０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含み、「配列相同性％」は、２つの最適に配置された配列および比較領域を比較することによって同定され、比較領域における配列の一部は、２つの配列の最適な配置に関して、基準配列（付加または欠失（すなわちギャップ）を含まない）と比較して、付加または欠失を含み得る。
【００２７】
本発明はまた、疼痛を軽減および／または処置する方法を提供し、この方法は、治療上有効な量の医薬組成物を、疼痛の軽減および／または処置を必要とする患者に投与することを含む。該方法はさらに、投与の工程の前に、患者を、疼痛の軽減および／または処置を必要とする患者として決定することを含み得る。用語「治療上有効な量」は、所望の効力、疼痛の軽減および／または治療効果を達成するための、活性勾配(active gradient)の量に依存し得る。
【００２８】
本発明における疼痛は、侵害受容性疼痛、心因性疼痛、組織損傷および免疫細胞浸潤に関連する炎症性疼痛、神経系への損傷またはその異常機能によって誘導される病状である病的疼痛（線維筋痛症、過敏性腸症候群、緊張性頭痛などの機能障害性疼痛）などを含み得る。また、疼痛は、頚部痛、中背部痛、下背部痛または尾骨痛などの、解剖学的に区別される背部痛を含み得る。さらに、疼痛は、神経障害性疼痛、片頭痛などの疼痛を含み得る。神経障害性疼痛は、体性感覚系に影響を与える損傷または疾患に起因し得る。神経障害性疼痛は、感覚異常と呼ばれる知覚異常、および痛覚が無痛性の刺激にさえ誘発される異痛症に関連し得る。また、神経障害性疼痛は、持続性因子および／または間欠性（発作性）因子であり得る。後者は、比喩的な意味で電気ショックに関連付けられる。一般的な特徴は、熱感または冷感、ピリピリとしたしびれ、しびれ感およびそう痒を含む。
【００２９】
対照的に、侵害受容性疼痛は、「痛み」として発現することが多い。さらに、片頭痛は、多数の自律神経系症状に関連する慢性障害であり、通常、重篤な強度の頭痛を引き起こす。これらの片頭痛の正確な機構は未だ明らかでない。基礎理論は、大脳皮質の興奮性の増加、および脳幹の三叉神経核における疼痛神経細胞(pain nerve cell)の異常制御に関する。
【００３０】
具体例として、疼痛は、神経障害性疼痛、がん性疼痛、術後疼痛、三叉神経痛、特発性疼痛、糖尿病性神経障害性疼痛、片頭痛などからなる群から選択される、少なくとも１つであり得る。別の具体例として、疼痛は、腰痛に関連する筋けいれんでない場合がある。
【００３１】
好ましくは、本発明の組成物を、神経障害性疼痛または慢性がん性疼痛の軽減または処置に使用してもよい。用語「軽減または処置する」は、本発明の組成物を投与することによって、疼痛症状を緩和または改善する、任意の作用を指す。
【００３２】
本発明のさらなる例は、疼痛を軽減または処置する方法に関し、該方法は、ＧＡＤをコードする遺伝子および抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子を、それを必要とする対象に投与することを含む。対象は、ヒトを含む哺乳類、またはヒトを含む哺乳類から単離した細胞および／または組織であり得る。また、対象は非ヒト動物であってもよく、用語「非ヒト動物」は、哺乳類および非哺乳類などの脊椎動物（例えば、ヒトを除く霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）を含む。
【００３３】
本発明の医薬組成物の治療上有効な量および投与経路は、患者の状態および所望の効力などを考慮して、当業者によって適宜調製され得る。例えば、本発明における組成物は、注射の形式で提供され得、例えば、神経注射、皮下注射、筋肉内注射、または遺伝子銃注射(gene gun injection)を含み得る。
【００３４】
本発明の様式
以下で、本発明を実施例によって詳細に説明するが、以下の実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明をさらに説明することを意図している。
【実施例】
【００３５】
＜実施例１＞組換えアデノ随伴ウイルスの調製および性質分析
本発明に必要なアデノ随伴ウイルスを調製し、ＡＡＶヘルパーフリーシステム(Agilent, USA)に基づいて、作成した。
【００３６】
Ａ．ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５の調製
図１のｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５を調製するため、ｐＪＤＫ−ｒＧＡＤ６５(Lee B et al., Gene Ther, 12: 1215-1222 (2005))のＣＭＶプロモーター領域をＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ(Promega, USA)に導入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶを調製した。ＣＭＶプロモーターの増幅に使用したプライマー配列は以下である。
Ｆ−ＪＤＫ（配列番号１６）：５’−ＴＴＣＧＧＣＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’
Ｒ−ＪＤＫ（配列番号１７）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧ−３’
【００３７】
ＧＡＤ６５遺伝子を、配列番号１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０００８１８）を有し、配列番号３の塩基配列(Bioneer, Korea)を合成するヒトＧＡＤ６５配列に基づいて、ヒトに適合するように、コドン最適化によって調製した。ｐＧＥＭ−Ｔに導入されたｈＧＡＤ６５遺伝子をＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理し、１．７ＫｂのＤＮＡフラグメントを得、これを、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶをＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理することによって得た、３．７ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５を完成させた。
【００３８】
ＳＶ４０ｐＡを、ｐＣＩ(Invitrogen, USA)を鋳型として用いてＰＣＲを行うことによって増幅し、次いでＣｌａＩおよびＳａｌＩで処理し、２２２ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。上記フラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５をＣｌａＩおよびＳａｌＩで切断することによって調製した、５．４ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、最終的にｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡを調製した。ＳＶ４０ｐＡの増幅に使用したプライマー配列は以下である。
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１８）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１９）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧ−３’
【００３９】
ｐＡＡＶ−ＭＣＳ(Agilent, USA)におけるアンピシリン耐性遺伝子を、アデノ随伴ウイルスベクターの調製において、カナマイシン耐性遺伝子に置換した。カナマイシン耐性遺伝子を、ｐＥＴ−２８（ａ）(Novagen, USA)を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、増幅した８１６ｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を、ｐＧＥＭ−Ｔと連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｋａｎｒを調製した。カナマイシン耐性遺伝子の増幅に使用したプライマー配列は以下である。
Ｆ−Ｋａｎ（配列番号２０）：５’−ＡＧＧＣＧＣＣＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡ−３’
Ｒ−Ｋａｎ（配列番号２１）：５’−ＴＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’
【００４０】
カナマイシン耐性遺伝子の導入において、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶ部位を、変異誘発によって、ｐＡＡＶ−ＭＣＳにおけるアンピシリン耐性遺伝子のそれぞれ前部および後部に作成し、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶで処理し、次いで上記で調製したｐＧＥＭ−Ｔ−ＫａｎｒをＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶで切断することによって得た、ＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ−Ｋａｎｒを調製した。
【００４１】
調製したｐＡＡＶ−ＭＣＳ−Ｋａｎｒを、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡをＥａｇＩおよびＰｖｕＩで切断することによって得た、２．７ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐｓｓＡＡＶ−ＧＡＤ６５を調製した。
【００４２】
ＧＡＤ６５発現カセットをｐＶＡＸ１(Invitrogen, USA)に導入するため、ＢａｍＨＩ部位を、変異誘発によってｂＧＨｐＡの後部に作成し、次いでＭｌｕＩおよびＮｈｅＩで切断し、ＤＮＡフラグメントを調製した。ＬＩＴＲおよびＣＭＶプロモーター領域を、ｐｓｓＡＡＶ−ＧＡＤ６５を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ(Promega, USA)にクローン化し、次いでＡｓｃＩおよびＮｈｅＩで切断し、上記で調製したｐＶＡＸ１ベクターに連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶを調製した。ＬＩＴＲおよびＣＭＶプロモーター領域の増幅に使用したプライマー配列は以下である。
Ｆ−ＩＴＲ（配列番号２２）：５’−ＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣ−３’
Ｒ−ＪＤＫ（配列番号１７）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧ−３’
【００４３】
ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶを、ＮｏｔＩおよびＮｈｅＩで切断することによって、ＤＮＡフラグメントとして調製し、ｐｓｓＡＡＶ−ＧＡＤ６５をＥａｇｌおよびＮｈｅｌで切断することによって調製した、ＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡを調製した。
【００４４】
ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡを、ＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、次いでｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ−ＳＶ４０ｐＡ−ＲＩＴＲ（ｐｓｓＡＡＶ−ＧＡＤ６５を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙにクローン化した）をＨｐａＩおよびＢａｍＨＩで処理することによって得た、ＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＶＡＸ１−ＬＩＴＲ−ＣＭＶ−ｈＧＡＤ６５−ＳＶ４０ｐＡ−ＲＩＴＲ（以下、「ｐＡＡＶ−ＧＡＤ６５」と略す）を完成させた。ＳＶ４０ｐＡおよびＲＩＴＲ領域の増幅に用いたプライマー配列は以下である。
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１８）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＩＴＲ（配列番号２３）：５’−ＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧ−３’
ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５のベクターマップを、図１に示す。
【００４５】
Ｂ．ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０の調製
ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０を、ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５と類似の方法で調製した。ラットＩＬ−１０遺伝子を、配列番号６のアミノ酸配列を有し、配列番号８の塩基配列(Bioneer, Korea)を有する遺伝子を合成するラット由来の塩基配列（ＮＣＢＩ ＮＭ＿０１２８５４）に基づいて、ラットに適合するように、コドン最適化によって調製した。ｒＩＬ−１０遺伝子を、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙに導入されたラットＩＬ−１０遺伝子を鋳型として用いてＰＣＲで増幅し、次いでＮｈｅＩおよびＳａｌＩで処理し、０．５ＫｂのＤＮＡフラグメントを得、その後、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶをＮｈｅＩおよびＳａｌＩで切断することによって得た、３．７ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０を調製した。ｒＩＬ１０の増幅に用いたプライマー配列は以下である。
Ｆ−ｒＩＬ−１０（配列番号２４）：５’−ＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴ−３’
Ｒ−ｒＩＬ−１０（配列番号２５）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣ−３’
【００４６】
ＳＶ４０ｐＡを、ｐＣＩを鋳型として用いてＰＣＲを行うことで増幅し、その後ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで処理し、２２２ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。上記フラグメントを、上記で調製したｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０をＣｌａＩおよびＳａｌＩで切断することによって調製した、４．２ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡを調製した。ＳＶ４０ｐＡの増幅に使用したプライマー配列は以下である。
Ｆ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１８）：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’
Ｒ−ＳＶ４０ｐＡ（配列番号１９）：５’−ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧ−３’
【００４７】
ｐＧＥＭ−Ｔ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡをＥａｇＩで処理することによって、１．６ＫｂのＤＮＡフラグメントを得、次いでｐＡＡＶ−ＭＣＳ−ＫａｎｒをＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで処理することによって調製した、ＤＮＡフラグメントと連結し、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−１０−ＳＶ４０ｐＡ（以下、「ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０」と略す）を調製した。ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０のベクターマップを、図２に示す。
【００４８】
Ｃ．ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−４の調製
ラットＩＬ−４遺伝子を、配列番号１１のアミノ酸配列を有し、配列番号１３の塩基配列(Bioneer, Korea)を有する遺伝子を合成するラット由来の塩基配列（ＮＣＢＩ ＮＭ＿２０１２７０）に基づいて、ラットに適合するように、コドン最適化によって調製した。ｐＧＥＭ−Ｂ１(Bioneer, Korea)に導入されたｒＩＬ−４遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで処理し、０．５ＫｂのＤＮＡフラグメントを得た。上記フラグメントを、ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５をＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで処理することによって調製した、３ＫｂのＤＮＡフラグメントと連結し、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＭＶ−ｒＩＬ−４−ＳＶ４０ｐＡ（以下、「ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−４」と略す）を調製した。ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−４のベクターマップを図３に示す。
【００４９】
Ｄ．組換えアデノ随伴ウイルスの性質分析
上記で調製した３種のプラスミド（ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ｒＩＬ−４）をそれぞれ、ＰＥＩ(Polysciences, USA)を用いて、ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞に、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣと共に、遺伝子導入した。本明細書において、ＡＡＶ血清型５のカプシド遺伝子を導入したｐＲＣ５を、ｈＧＡＤ６５に使用し、ＡＡＶ血清型１のカプシド遺伝子を導入したｐＲＣ１を、ｒＩＬ−１０およびｒＩＬ−４に使用した。遺伝子導入した細胞を、３７℃のインキュベーター内で培養し、４８時間後に回収し、３サイクルの凍結および解凍を行い、未精製の各ウイルスを得た。
【００５０】
細胞に送達した、組換えアデノ随伴ウイルスのタンパク質発現を確認するため、ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞を、未精製の各ウイルスＡＡＶ５−ｈＧＡＤ６５、ＡＡＶ１−ｒＩＬ−１０およびＡＡＶ１−ｒＩＬ−４で処理し、タンパク質発現をウエスタンブロットで確認した。具体的には、８ｘ１０５個の２９３Ｔ細胞を、Ｔ２５フラスコに分取し、翌日に各フラスコを７００μＬの未精製のウイルスで処理し、その後３７℃のインキュベーター内で培養した。４８時間後に、細胞および培地を別々に回収し、細胞を可溶化剤で溶解し、培地をアミコン(Merck Millipore, Germany)で濃縮した。調製した試料を、ＧＡＤ６５(Cell signaling, USA)、ＩＬ−１０(Santa Cruz, USA)およびＩＬ−４(Santa Cruz, USA)に対する抗体でそれぞれ処理し、ウエスタンブロットを行った。結果を図４に示す。
【００５１】
図４は、ＡＡＶ５−ｈＧＡＤ６５、ＡＡＶ１−ｒＩＬ−１０またはＡＡＶ１−ｒＩＬ−４で処理した、ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞株の細胞溶解液のウエスタンブロット解析を行ったことによる、各タンパク質の発現を示す図である。標的タンパク質の発現を全ての場合において確認したことによって、実験で使用した組換えアデノ随伴ウイルスの構造および性質に問題がないことが確認された。
【００５２】
ＧＡＢＡが、ＡＡ５−ｈＧＡＤ６５によって生成されることを確認するため、ＡＡＶ５−ＧＡＤ６５で処理した細胞の培地を、ウエスタンブロットにおける試料調製の条件と同じ条件で回収し、ＧＡＢＡ ＥＬＩＳＡ(LDN, Netherland)解析を行った。結果を図５に示す。各実験群において、２つの同一の試料を別々に調製し、バーは各試料の値を示す。結果として、ＧＡＢＡは、ＡＡＶ５−ｈＧＡＤ６５ウイルスによって細胞に導入されたＧＡＤ６５により、培地に分泌されたことが確認された。
【００５３】
Ｅ．組換えアデノ随伴ウイルスの調製
組換えアデノ随伴ウイルスを、動物効果実験において、KRcrogen(Korea)によって調製および精製し、調製方法は以下の通りである。
【００５４】
上記で調製した３種のプラスミド（ｐＡＡＶ−ｈＧＡＤ６５、ｐＡＡＶ−ｒＩＬ−１０およびｐＡＡＶ−ｒＩＬ−４）をそれぞれ、リン酸カルシウム法を用いて、ヒト胎児由来腎臓細胞株である２９３Ｔ細胞に、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＲＣと共に、遺伝子導入した。本明細書において、ＡＡＶ血清型５のカプシド遺伝子を導入したｐＲＣ５を、ｈＧＡＤ６５に使用し、ＡＡＶ血清型１のカプシド遺伝子を導入したｐＲＣ１を、ｒＩＬ−１０およびｒＩＬ−４に使用した。遺伝子導入した細胞を、３７℃のインキュベーター内で培養し、４８時間後に回収した。
【００５５】
次いで、ウイルスを含むバンドのみを単離し、セシウム濃度勾配に依存する高速遠心分離を介して精製し、ＡＡＶ５−ｈＧＡＤ６５、ＡＡＶ１−ｒＩＬ−１０およびＡＡＶ１−ｒＩＬ−４を得た。生成したウイルスの力価を、製造者によって確立されたｑＰＣＲ法を用いて測定した。
【００５６】
＜実施例２＞ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＡＤ６５の鎮痛効力試験
Ａ．投与試料の調製
動物投与の３０分前に、−８０℃で保存した組換えアデノ随伴ウイルスを、室温で１分以内に解凍し、ボルテックスでよく混合した。クーマシーブルー色素溶液を、１０ｍｇのクーマシーブルーを１ｍＬのＰＢＳ中でよく混合し、次いでシリンジフィルターで濾過することによって調製した。５．４ｘ１０５ＶＧ／μＬのＡＡＶ−ＧＡＤ６５ １μＬ、１．８ｘ１０７ＶＧ／μＬのＡＡＶ−ＩＬ−１０ １μＬ、および０．１％クーマシーブルー色素 １μＬを、各動物が合計で３μＬを受ける計算の下で、混合した。試料を必要な量の２倍調製し、３μＬの試料を各動物に投与した。
【００５７】
対照群として、ガバペンチンを、投与の１時間前に動物の飲料水に混合し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。
【００５８】
Ｂ．神経障害性疼痛動物モデルの調製および試料投与
１８０〜２００ｇのオスのＳＤラットを吸入麻酔で麻酔し、次いでふくらはぎの上部を切開し、総腓骨神経および脛骨神経の末端を共に結び、結び目を０．５〜１ｃｍ間隔で、７−０縫合(7-0 suture)で作成した。結び目間の２つの神経束の領域をはさみで切断し、切開部位を縫合した。２週間後、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を行い、疼痛誘導を確認し、次いで試験物質を投与した(C.J. Woolf, Pain 87, 2000)。
【００５９】
試験物質を、後根神経節（ＤＲＧ）に投与した。疼痛動物モデルの吸入麻酔後、Ｌ３からＬ５までの腰椎におけるラットの背部を直線的に切開し、椎骨を露出させ、次いで脊髄投射の一種である横突起を、露出部の側部において露出させ、ＤＲＧを覆うＬ４突起を、固定状態において、ＤＲＧを損傷しないように、実体ズーム顕微鏡下で骨鉗子によって注意深く分離した。斜線状に伸びるＤＲＧを米粒のように露出させるように、ＤＲＧ周囲の領域を操作した。
【００６０】
ハミルトンシリンジをポリエチレンカテーテルに接続し、３μＬの試験物質を正確に収集した。次いでシリンジを、投与用の１ｍＬシリンジに交換した。ラットを小動物定位固定装置に置き、マイクロニードルがＬ４ ＤＲＧを正確に穿刺したことをｓｕｒｇｉｏｓｃｏｐｅ下で確認しながら、試料を注射した。本明細書において、色素を含む試料がＤＲＧ外に漏れず、ＤＲＧ内部にうまく送達されたことを確認した。試料全体がＤＲＧに送達されたことを確認した後、シリンジをＤＲＧから離し、縫合し、動物を回収した。
ガバペンチンを、３ｍｇ／ｋｇで経口投与した。
【００６１】
Ｃ．ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた、鎮痛効力の観察
１９９２年にＤｉｘｏｎによって確立された、周知の方法である５０％昇降閾値法(50% up & down threshold method)を用いた。この方法は、Ｎ値がそれぞれ０．４、０．６、１、２、４、６、８および１５ｇであった全８種のフィラメントを用いて、疼痛応答の所定のパターンによって閾値を計算する。疼痛発生領域を、疼痛が発生する、最も外側のつま先から足底の踵までの位置を変化させて、探索した。
【００６２】
ラットは、疼痛が発生すると、突然足底を持ち上げ、足底を縮ませ、またはなめる。したがって、疼痛発生領域が見つかると、周辺領域を次の段階のフィラメントで５回穿刺し、３回以上の応答があった場合、これを疼痛応答と見なし、ラットを次の段階のフィラメントで観察した。全段階において、パターンを記録した。疼痛パターンを、S.R. Chaplan (Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods, 1994)によって確立された、パターンの表に基づいて記録し、これを用いて閾値を計算した。動物群の行動分析を、４〜６週間、盲検法で行い、少なくとも３人で観察し、記録したパターンの結果を統計処理し、疼痛の傾向を分析した。
【００６３】
疼痛動物モデルに試料を投与した、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた疼痛観察の結果を、図６に示す。図６は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０の同時投与と、ガバペンチン投与の効力を比較した結果を示す。ＧＡＤ６５およびＩＬ−１０を同時投与した場合、未処理の対照群（負の対照）と比較して、統計的に有意な疼痛軽減効果が観察され、この効果はガバペンチンよりも高いことがわかった。
【００６４】
＜実施例３＞ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＡＤ６５の疼痛効力試験
Ａ．投与試料の調製
投与試料の調製において、実施例１で調製し、凍結状態で保存した、ｒＡＡＶ５−ＧＡＤ６５およびｒＡＡＶ１−ｒＩＬ−１０を解凍し、試料を、実施例２における投与試料の調製方法と実質的に同じ方法で調製した。具体的には、単独投与物質ＡＡＶ−ＧＡＤ６５またはＡＡＶ−ｒＩＬ−１０、ならびに同時投与物質ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ｒＩＬ−１０を、表１に示すように、１：１、１：５または１：３０のウイルス力価に基づく混合比で、ＰＢＳ中に希釈し、１μＬの０．１％クーマシーブルー色素を、各動物が３μＬを受ける計算の下で、各試料に添加した。試料を全個体群において必要な量の２倍調製し、３μＬの試料を各動物に投与した。
【表１】
0006621916.tif 000002
【００６５】
Ｂ．ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた、鎮痛効力の観察
試料を実施例２と同様の方法で調製した疼痛動物モデルに投与し、疼痛をｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いて観察した。結果を図７に示す。
【００６６】
図７は、その組成比に依存した、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０の効力を示す。特に、実験で鎮痛効力を示さなかった、微量のＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ｒＩＬ−１０と、動物行動分析において相乗的な効力を示した、１：１（実験例１）、１：５（実験例２）および１：３０（実験例３）の混合組成比の、ＡＡＶ−ｒＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＡＤを比較した。結果として、本発明におけるＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ｒＩＬ−１０の同時投与組成物は、ＡＡＶ−ｒＩＬ−１０のＡＡＶ−ＧＡＤに対する混合組成比が増加するにつれて増加するパターンで、疼痛処置効力を示した。
【００６７】
＜実施例４＞経椎間孔硬膜外注射を用いた、ＡＡＶ−ＩＬ−１０およびＡＡＶ−ＧＡＤ６５の鎮痛効力試験
Ａ．投与試料の調製
動物投与実験の３０分前に、−８０℃に保持していた試薬を、室温で１分以内に解凍し、ボルテックスでよく混合した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０をＰＢＳ中に希釈し、表２に示すウイルス力価を得た。５μＬの試料を各動物に投与するため、２種のウイルス希釈溶液を半分ずつ混合し、必要とする体積の１．５倍の体積を得た。次いで５μＬの試料を、各動物に投与した。
【表２】
0006621916.tif 000003
【００６８】
Ｂ．神経障害性疼痛モデルの調製および試料投与
神経障害性疼痛動物モデルを、実験例２に記述される方法と同様の方法で調製し、次いで試験物質を投与した。
【００６９】
試験物質を、経椎間孔硬膜外注射法によって、後根神経節（ＤＲＧ）に隣接する位置に投与した。神経障害性疼痛動物モデルの吸入麻酔後、Ｌ３からＬ５までの腰椎におけるラットの背部を直線的に切開し、椎骨を露出させ、次いで脊髄投射の一種であるＬ４横突起を、露出部の側部において露出させた。ラットを、その側面が上から見え、Ｌ４椎間孔が見えるように、横向きに置いた。
【００７０】
カテーテルに接続したマイクロニードルを、調製した試料中に入れた。ハミルトンシリンジを、カテーテルの反対側に接続し、５μＬの標線に達するまで引き、試料をカテーテルに注入した。ハミルトンシリンジをカテーテルから取り外した後、針の先端から１ｃｍの部分を、ハルステッド・モスキート(Halsted-Mosquito)で掴んだ。Ｌ４の脊椎を鉗子で掴み、上向きに引っ張り、ハルステッド・モスキートストレートで固定した針の先端部を、Ｌ４椎間孔付近に置いた。針の先端を、安全な孔である椎間孔に挿入し、針が椎間孔内部の屈曲部に到達するまで前進させ、掴んでいた針を離した。針が固定されたことを確認した後、１ｍＬシリンジを、針を反対側に接続したポリエチレンカテーテルに接続した。ピストンを穏やかに押し、希釈した投与物質を、ラットのＤＲＧ周辺領域にゆっくりと投与し、次いで縫合し、投与手順を完了した。実施例２に記述される方法と同様の方法で、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた、疼痛の結果を、物質の投与の４週間後に観察した。結果を図８に示す。
【００７１】
図８は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０の混合物が、経椎間孔硬膜外注射法による投与においてさえ、効力を示すことを示す。さらに、動物行動分析における相乗的な効力を、１：１０（実験例１）および１：３０（実験例２）のＡＡＶ−ＧＡＤ６５とＡＡＶ−ＩＬ−１０との混合組成比において、確認した。
【００７２】
＜実施例５＞ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−１０と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ＩＬ−４との、効力の比較
疼痛動物モデルを実施例２と実質的に同じ方法で調製し、投与試料の調製方法も同様であった。実施例１に記述されるＡＡＶ−ｒＩＬ−４を解凍し、以下の動物実験において使用するために調製した。
【００７３】
動物のＤＧＲ投与実験の３０分前に、−８０℃で保存していた試薬を、室温で１分以内に解凍し、ボルテックスでよく混合した。１０ｍｇのクーマシーブルーを、１ｍＬのＰＢＳ中によく混合し、次いでシリンジフィルターで濾過した色素を調製した。ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ｒＩＬ−４をＰＢＳ中に希釈し、表３に示すウイルス力価に基づく混合比を得、１μＬの０．１％クーマシーブルー色素を、各動物が３μＬを受ける計算の下で、各試料に添加した。試料を全個体群において必要な量の２倍調製し、３μＬの試料を各動物に投与した。
【表３】
0006621916.tif 000004
【００７４】
ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験を用いた、疼痛の結果を観察した。結果を図９に示す。図９は、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ｒＩＬ−１０と、ＡＡＶ−ＧＡＤ６５およびＡＡＶ−ｒＩＬ−４の効力を比較した結果を示し、これは、抗炎症効果を有するサイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−４を、それぞれＧＡＤ６５と組み合わせて用いた場合に、動物行動分析において、比較的に現れる相乗的な効力を示す。図９に示されるように、疼痛処置の効力は、ＧＡＤ６５、ＩＬ−１０またはＩＬ−４を単独で投与した場合には、わずかであり、または観察されず、ＧＡＤ６５とＩＬ−４を同時投与した場合には、ＧＡＤ６５またはＩＬ−４を単独で投与した場合と比較して、有意な鎮痛効力は観察されなかった。一方、ＧＡＤ６５およびＩＬ−１０を同時投与した場合、他の比較例よりも統計的に有意に高い鎮痛効力が確認された。特に、相乗的な疼痛軽減効果が観察され、これはＧＡＤ６５およびＩＬ−４を同時投与した場合には示されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006621916.tif 000012
【図９】
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【配列表】
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