(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被検動物に対してエタノール投与後、活動期の被検動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする工程、ついで
（Ｂ）前記エタノール投与後、活動期の被検動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程、及び
（Ｃ）活動期開始からの被検動物の行動量及び／又は自発運動量を測定する工程
を含有することを特徴とする二日酔いの程度を測定する方法。
【請求項２】
（Ａ）被検動物に対してエタノール投与後、活動期の被検動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする工程、ついで
（Ｂ）前記エタノール投与後、活動期の被検動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程
を含有することを特徴とする被検動物の二日酔いを誘発する方法。
【請求項３】
前記被検動物が、げっ歯類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（Ｂ）及び／又は（Ｃ）における行動量及び／又は自発運動量が、赤外線センサーを用いて測定した行動量及び／又は回転車を用いて測定した自発運動量であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（Ａ）において、エタノールを特定の時間に１回又は２回以上投与することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（Ａ）において、投与するエタノールの濃度が１〜１００％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１及び３〜６のいずれか一項に記載の方法を含有することを特徴とする二日酔い症状抑制効果の測定方法であり、被検動物として、エタノール投与前又は投与と同時又は投与後に二日酔い抑制剤を投与した動物と該剤非投与の動物とを使用し、両者間で、工程（Ｃ）で測定される活動期開始からの被検動物の行動量及び／又は自発運動量を比較する、方法。
【請求項８】
請求項１及び３〜６のいずれか一項に記載の方法を含有することを特徴とする二日酔い抑制剤のスクリーニング方法であり、種類の異なる任意の食品、医薬品、化合物もしくは組成物を投与した被検動物を使用し、両者間で、工程（Ｃ）で測定される活動期開始からの被検動物の行動量及び／又は自発運動量を比較する、方法。
【請求項９】
請求項１及び３〜６のいずれか一項に記載の方法を含有することを特徴とする二日酔いしにくい酒の選別方法であり、エタノールとして投与する種類の異なるアルコール飲料を使用し、前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含有する方法を実施する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二日酔いの程度を測定する方法、被検動物の二日酔いを誘発する方法、二日酔い症状抑制効果の測定方法、二日酔い抑制剤のスクリーニング方法、並びに二日酔いしにくい酒の選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲酒による弊害である二日酔いの不快な症状を予防又は軽減する方法として、アルコール代謝促進剤等の二日酔い抑制剤の研究がなされてきた。
しかしながら、二日酔い抑制剤の効果を評価するための試験方法として、二日酔い症状の予防又は軽減効果を定量的に測定できる方法や、被検動物の二日酔いを誘発する方法は、これまでに十分に確立されていない。
【０００３】
特許文献１には、酒酔い又は二日酔い防止又は軽減用組成物の効能評価方法として、ＳＤラットに該組成物とエタノールを投与してから５〜１０分後の自発運動状態を目視で確認することによって「酒酔い」を評価する方法、ヒトに該組成物を摂取後又は未摂取後に飲酒した際の自覚症状について回答してもらうことによって「二日酔い」を評価する方法が開示されている。しかしながら、これらの評価は、評価を行う者の主観に基づいたものであるため客観的な評価ではなく、客観的で定量的な評価方法が求められている。
【０００４】
また、特許文献２には、「二日酔い」を含む飲酒による不快症状の抑制及び防止効果をうたう剤が開示されており、該剤の効能評価方法として、ＩＣＲマウスにエタノールを経口投与してから３０分〜２４０分後の直線歩行距離（斜め４５度に設置した棒上を歩行させ１０分間に歩いた距離）を測定する方法が開示されている。しかしながら、この評価方法は、試験者が意図的に動物を「棒上」に乗せる系であるため、動物の「自発」的な活動を評価しているものではない。また、この評価方法は、エタノールを投与してから３０分〜２４０分後に評価していること、さらに、斜めに設置された棒上を歩行する際のふらつきを見ていることから、「酔い」の評価であり「二日酔い」とは言いきれないと考えられる。
【０００５】
さらに、非特許文献１には、スイス系マウスにエタノールを腹腔内投与してから６時間後にオープンフィールドテスト、タイトロープテスト、フットプリンティングパターン、ハンギングワイヤーテスト、Ｔ字型迷路、Ｈｏｌｅ−ｂｏａｒｄ試験で「二日酔い」を評価する方法が開示されている。しかしながら、この方法は、試験者の熟練を要するため、簡便な方法とは言えず、また試験者が意図的に動物を行動させる系であるため、動物の「日常」的な活動を評価しているものではない。
【０００６】
非特許文献２にはマウスのエタノール経口摂取に伴う「酔い」の評価方法として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにエタノールを試験開始１時間前、又は２時間前と１時間前に経口投与後、高架式十字迷路試験を行う方法、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにエタノールを試験開始直前の１回、又は試験開始１時間前と試験開始直前の２回経口投与後、赤外線センサーを用いた自発運動量を１２時間又は４８時間測定する方法が開示されている。しかしながら、これらの方法は、エタノール投与後すぐに測定しているため単なる「酔い」の評価であると考えられ、「二日酔い」のみの評価ではなく、「二日酔い」の評価方法としては十分なものではないと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１１−００１３４８号公報
【特許文献２】特開２００３−１３７７８８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Behavioural Brain Research 247,165-173(2013)
【非特許文献２】The Japanese Journal of Animal Psychology, 58, 1,1-13(2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記現状に鑑み、二日酔いの程度を定量的（客観的）に測定する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、被検動物の二日酔いを誘発する方法、二日酔い抑制剤の力価を測定する方法、二日酔い抑制剤のスクリーニング方法、並びに、二日酔いしにくい酒の選別方法を提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、（Ａ）被検動物に対してエタノール投与後、活動期の被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする工程、ついで（Ｂ）前記エタノール投与後、活動期の被験動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程、及び（Ｃ）活動期開始からの被験動物の行動量及び／又は自発運動量を測定する工程を含有する測定方法を用いると、二日酔いの程度を定量的（客観的）に測定できることを見出した。
本発明者らは、上記以外にも下記するように種々の思いがけない新知見を得て、さらに鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の二日酔いの程度を測定する方法等に関する。
［１］（Ａ）被検動物に対してエタノール投与後、活動期の被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする工程、ついで
（Ｂ）前記エタノール投与後、活動期の被験動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程、及び
（Ｃ）活動期開始からの被験動物の行動量及び／又は自発運動量を測定する工程
を含有することを特徴とする二日酔いの程度を測定する方法。
［２］（Ａ）被検動物に対してエタノール投与後、活動期の被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする工程、ついで
（Ｂ）前記エタノール投与後、活動期の被験動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程
を含有することを特徴とする被検動物の二日酔いを誘発する方法。
［３］前記被験動物が、げっ歯類であることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記工程（Ｂ）及び（Ｃ）における行動量及び／又は自発運動量が、赤外線センサーを用いて測定した行動量及び／又は回転車を用いて測定した自発運動量であることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記工程（Ａ）において、エタノールを特定の時間に１回又は２回以上投与することを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記工程（Ａ）において、投与するエタノールの濃度が１〜１００％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法を含有することを特徴とする二日酔い症状抑制効果の測定方法。
［８］前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法を含有することを特徴とする二日酔い抑制剤のスクリーニング方法。
［９］前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法を含有することを特徴とする二日酔いしにくい酒の選別方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、二日酔いの程度を定量的（客観的）に測定することができ、二日酔い抑制剤の力価を測定することができる。また、本発明によれば、酔いではなく二日酔い症状抑制効果を測定することができ、二日酔い抑制剤のスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明によれば、被検動物が完全に又は部分的に「酔い」から分離された、又は「酔い」とは異なる「二日酔い」を誘発することができる。
さらに、本発明によれば、二日酔いしにくい酒を選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例１のエタノール経口投与における、マウス血中エタノール量の経時変化である。
【図２】試験例２のエタノール経口投与における、ラット血中エタノール量の経時変化である。
【図３】実施例１のエタノール１回投与試験における、飼育１３日目のスケジュールである。
【図４】実施例２のエタノール２回投与試験（１週間間隔投与）における、マウスの試験開始から試験終了（１日目から２１日目）までのスケジュールである。
【図５】実施例３のエタノール２回投与試験（４時間間隔投与）における、飼育１３日目のスケジュールである。
【図６】実施例３のエタノール２回投与試験（４時間間隔投与）における、飼育１２日目の赤外線センサーを用いて測定した行動量の経時変化のデータである。
【図７】実施例３のエタノール２回投与試験（４時間間隔投与）における、飼育１２日目の回転車を用いて測定した自発運動量の経時変化のデータである。
【図８】実施例３のエタノール２回投与試験（４時間間隔投与）の、エタノールの２回目投与量が２．５ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．の場合における、飼育１３日目の赤外線センサーを用いて測定した行動量の経時変化のデータである。
【図９】実施例３のエタノール２回投与試験（４時間間隔投与）の、エタノールの２回目投与量が２．５ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．の場合における、飼育１３日目の回転車を用いて測定した自発運動量の経時変化のデータである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の二日酔いの程度を測定する方法は、（Ａ）被検動物に対してエタノール投与後、活動期の被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする工程、ついで（Ｂ）前記エタノール投与後、活動期の被験動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程、及び（Ｃ）活動期開始からの被験動物の行動量及び／又は自発運動量を測定する工程を必須の構成要件とすることを特徴とする。
本発明の測定方法は、通常は、前記（Ａ）から（Ｃ）の順序に従って行われ、該（Ａ）〜（Ｃ）の工程以外の工程を含んでも良い。
【００１５】
本発明において、「二日酔い」とは、被検動物がアルコール摂取後に、血中アルコール濃度が実質的にゼロになった状態で、かつアルコール摂取による行動への影響が生じている状態をいう。
【００１６】
二日酔いの程度を測定する方法
工程（Ａ）
本発明において使用される被検動物としては、特に限定されないが、例えば、げっ歯類等が挙げられ、好ましくは、近交系又はミュータント系又はハイブリッド系又はクローズドコロニー又は糖尿病モデル又は免疫不全モデルマウス（ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃＡ、ＢＡＬＢ／ｃＢ、ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ/ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ／ｃｄ、Ｃ５７Ｌ、Ｃ５８、ＤＢＡ、ＫＫ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＦＶＢ／Ｎ、１２９＋Ｔｅｒ／Ｓｖ、Ｃ５７ＢＬ／６−ＦｖＳ、ＤＤＤ−ＦｖＳ、ＣＤＦ１、ＢＤＦ１、Ｂ６Ｃ３Ｆ２、ＣＤ２Ｆ１、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、ｄｄ、ＩＣＲ、ＣＦＷ、ＣＦ＃１、スイスマウス、ｋｋ/Ｔａ、ＫＫ/ＡｙＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／、ＧＫ、ＳＤＴ、ＮＯＤ／Ｓｈｉ、ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｍｕ/ｍｕ、Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｍｕ／ｍｕ、Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ、ＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄ、ＡＬＹ／ＮｓｃＪｃｌ−ａｌｙ/ａｌｙ）、近交系又はクローズドコロニー又は糖尿病モデルラット（ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆ３４４、ＬＥＷ、Ｍ５２０、ＳＨＲ、ＷＡＧ、ＳＤ、Ｗｉｓｔｅｒ、Ｌｏｎｇ―Ｅｖａｎｓ、Ｄａｎｒｙｕ、ＧＫ，ＳＤＴ）等であり、より好ましくは、近交系マウス（Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃＡ、ＢＡＬＢ／ｃＢ、ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ/ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ／ｃｄ、Ｃ５７Ｌ、Ｃ５８、ＤＢＡ、ＫＫ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＦＶＢ／Ｎ、１２９＋Ｔｅｒ／Ｓｖ）、近交系ラット（ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆ３４４、ＬＥＷ、Ｍ５２０、ＳＨＲ、ＷＡＧ）等であり、さらに好ましくは、マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ）である。
【００１７】
本発明において、「活動期」とは、生物が起床してから就寝するまでの日常的な活動を行う時間帯のことであり、例えば、夜行性動物の場合は暗期の期間中のことをいう。
【００１８】
本発明において、「暗期」とは、通常は、照明のない環境のことをいい、夜行性動物の活動期にあたる。「明期」とは、通常は、照明のある環境のことをいい、夜行性動物の休眠期にあたる。暗期に該当する時間及び明期に該当する時間は、本発明の測定方法を実施する設備に応じて、適宜変更することができる。例えば、被検動物としてマウスを使用する場合の第一の実施態様として、暗期を１９時〜７時の期間とし、明期を７時〜１９時の期間とすることができるし、第二の実施態様として、暗期を７時〜１９時の期間とし、明期を１９時〜７時の期間とすることもできる。なお、「夜行性動物」とは、主に夜間に採食・生殖などの活動をする動物のこと、又は夜間あるいは明暗サイクルの暗期に活動性が高まる動物のことをいい、例えば、げっ歯類全般、コウモリ、フクロウ等である。
【００１９】
本発明において使用されるエタノールは、特に限定されず、市販品を使用することができるし、市販品を常法により精製したものを使用することもできる。エタノールは、単独で使用してもよいし、エタノールと水の混合物（水溶液）、エタノールを含有する飲料等を使用してもよい。これらの水溶液及び飲料は、従来公知の方法を用いて調整したものを使用することができ、エタノール以外の物質を含有してもよい。また、エタノールを含有する飲料（エタノール含有飲料）は、アルコール飲料であってもよい。
【００２０】
前記アルコール飲料としては、特に限定されないが、例えば、ワイン、ビール、日本酒、ウイスキー、ブランデー、焼酎、ジン、ラム、ウォッカ、テキーラ等が挙げられる。
【００２１】
前記エタノール水溶液及びエタノール含有飲料におけるエタノールの濃度は、特に限定されないが、該水溶液又は飲料全量に対して、通常は、約１〜１００％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは約３％〜５０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは、約１０〜４０％（ｗ／ｖ）である。
【００２２】
本発明において、エタノールを被検動物に投与する方法は、特に限定されないが、例えば、被検動物の餌又は水にエタノールを含有させて被検動物に摂取させる方法、人為的に投与する方法等が挙げられる。
エタノールの投与量は、特に限定されないが、例えば、１回の投与当たり、通常は、約０．５〜５０ｇ/ｋｇ  ｂ.ｗ.、好ましくは、約２〜３０ｇ/ｋｇ  ｂ.ｗ.となるように、被検動物に投与する。
【００２３】
餌又は水にエタノールを含有させて被検動物に摂取させる方法としては、例えば、エタノールを含有する餌又は水を、被検動物に一定時間自由摂取させる方法を用いることができる。該餌又は水を摂取させる時間としては、特に限定されないが、活動期の被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする必要があり、該餌又は水のエタノール濃度によって摂取終了時刻を決定する。
【００２４】
エタノールを人為的に投与する方法としては、特に限定されないが、好ましくは、胃内経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、経腸投与等であり、より好ましくは腸からエタノールを吸収する胃内経口投与、経腸投与等であり、さらに好ましくは、胃内経口投与である。
【００２５】
また、エタノールを投与するタイミングは、特に限定されないが、特定の時間に投与することが好ましい。該特定の時間としては、特に限定されないが、活動期の被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする必要があり、例えばエタノール３ｇ/ｋｇ  ｂ.ｗ.を経口投与する場合は、被検動物の活動期から４時間前、８時間前等が好ましい。
さらに、エタノールの投与回数は、特に限定されず、餌又は水のエタノール濃度によって１回又は２回以上投与することができ、例えばエタノール３ｇ/ｋｇ  ｂ.ｗ.を経口投与する場合は、好ましくは、２回である。
【００２６】
本発明において、二日酔い抑制剤を被検動物に摂取させてもよい。
本発明において、二日酔い抑制剤を被検動物に摂取させるタイミングは、特に限定されないが、該剤の作用機序によって、エタノール投与前又は投与と同時又は投与後に摂取させることができる。例えば、工程（Ａ）において、エタノール投与前に二日酔い抑制剤を被検動物に摂取させてもよい。該摂取方法は特に限定されないが、例えば、被検動物の餌又は水に二日酔い抑制剤を含有させて被検動物に摂取させる方法、人為的に投与する方法等が挙げられる。
二日酔い抑制剤の摂取量は、特に限定されず、該剤の種類等に応じて適宜変更することができる。
【００２７】
餌又は水に二日酔い抑制剤を含有させて該剤を被検動物に摂取させる方法としては、例えば、二日酔い抑制剤を含有する餌又は水を、被検動物に一定時間自由摂取させる方法を用いることができる。
【００２８】
被検動物に二日酔い抑制剤を人為的に投与する方法としては、特に限定されないが、好ましくは、胃内経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、経腸投与等である。
【００２９】
本発明において、被検動物に摂取させる二日酔い抑制剤は、特に限定されないが、例えば、アルコール代謝促進剤又はアセトアルデヒド分解促進剤又は二日酔い抑制成分をメチルセルロース水溶液、水、餌等に溶解あるいは分散させたもの等が好ましい。これらの溶解、分散方法は、常法を用いることができる。また、二日酔い抑制剤としては、例えば、特開２０１２−３１０８０号公報に記載の二日酔いの症状の回復剤等を使用することができる。
【００３０】
前記二日酔い抑制成分としては、特に限定されないが、二日酔い抑制成分として一般的な任意の食品、医薬品、化合物もしくは組成物等であり、例えば、ウコンエキス等が挙げられる。
【００３１】
エタノール摂取後に血中アルコール濃度が実質的にゼロになった状態の被験動物において、エタノール摂取による行動への影響が生じる場合は、単なる「酔い」ではなく「二日酔い」を示す。尚、被験動物の血中アルコール濃度の測定方法は、特に限定されず、従来公知の方法を使用することができ、後述の実施例に記載の方法を用いることができる。
すなわち、本発明は、前記エタノール投与後、活動期の被験動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させて被検動物の二日酔い状態を誘発する工程（Ｂ）と、活動期開始からの被験動物の行動量及び／又は自発運動量を測定する工程（Ｃ）の前に、活動期の被験動物の血中アルコール濃度が実質的にゼロになっていることを確認する。
【００３２】
被験動物の血中アルコール濃度は、動物の種類や餌及び水の摂取状況（飽食又は絶食等）、アルコールの投与量及び濃度等によって決まる。被験動物の血中アルコール濃度を実質的にゼロにする方法としては、例えば、マウスに約１０〜４０％（ｗ／ｖ）エタノール３ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．を最後に投与してから活動期開始まで、好ましくは約４時間以上、より好ましくは約６時間以上の時間をあけることにより、実質的にゼロにすることができる。
【００３３】
工程（Ｂ）
本発明の測定方法は、前記工程（Ａ）についで、活動期の被験動物の行動量及び／又は自発運動量を実質的に低下させることにより、被験動物の二日酔い状態を誘発する工程（Ｂ）を含有する。該行動量及び／又は自発運動量の測定方法は、後述の工程（Ｃ）に記載の方法を用いることができる。
工程（Ｂ）において、活動期の被検動物の行動量及び／又は自発運動量の低下度合は、特に限定されないが、具体的には、二日酔い抑制剤を摂取していない被検動物において、エタノール投与前日に対するエタノール投与当日の赤外線センサーを用いた行動量が、好ましくは、約０〜９０％、より好ましくは、約２０〜９０％、さらに好ましくは、約２０〜７０％となった状態、及び／又は、エタノール投与前日に対するエタノール投与当日の回転車を用いた自発運動量が、好ましくは、約０〜９０％、より好ましくは、約１０〜９０％、さらに好ましくは、約１０〜７０％となった状態をいう。
【００３４】
工程（Ｃ）
本発明の測定方法は、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）に加えて、活動期開始からの被験動物の行動量及び／又は自発運動量を測定する工程（Ｃ）を含有する。
本発明において、被検動物の行動量及び／又は自発運動量は、赤外線センサーを用いて測定した行動量及び／又は回転車を用いて測定した自発運動量が好ましい。
【００３５】
前記赤外線センサーを用いて測定した行動量は、後述の実施例に記載のように、赤外線センサーを用いたカウント数により求めることができる。
また、前記回転車を用いて測定した自発運動量は、後述の実施例に記載のように、回転車を用いた回転数（カウント数）により求めることができる。
【００３６】
工程（Ｃ）において行動量及び／又は自発運動量を測定する時間は、特に限定されないが、被験動物の活動期開始からの一定時間が好ましく、例えば、げっ歯類等の夜行性動物においては、暗期開始後すぐに行動量及び自発運動量が増加することから、暗期開始から３又は４時間がより好ましい。
【００３７】
前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を実施する前日（すなわち、被検動物にエタノールを摂取させる前日）の被検動物の行動量及び／又は自発運動量を、前記工程（Ｃ）において行動量及び／又は自発運動量を測定する時間と同じ時間に測定しておき、該前日の被検動物の行動量及び／又は自発運動量と、該工程（Ｃ）において測定した行動量及び／又は自発運動量とを比較することにより、二日酔いの程度を測定することができる。
【００３８】
被検動物の二日酔いを誘発する方法
前記工程（Ａ）においてエタノールを投与された後、血中アルコール濃度が実質的にゼロとなり、さらに前記工程（Ｂ）において行動量及び／又は自発運動量が実質的に低下した被検動物は、二日酔い状態である。すなわち、本発明は、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、被検動物の二日酔いを誘発する方法も含む。本発明の被検動物の二日酔いを誘発する方法において、工程（Ａ）及び（Ｂ）の態様は、上述した本発明の二日酔いの程度を測定する方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）の態様と同一である。
【００３９】
二日酔い症状抑制効果の測定方法、二日酔い抑制剤のスクリーニング方法
上述した本発明の二日酔いの程度を測定する方法において、被検動物として、エタノール投与前又は投与と同時又は投与後に二日酔い抑制剤を投与した動物と該剤非投与の動物とを使用し、両者間で、工程（Ｃ）で測定される活動期開始からの被験動物の行動量及び／又は自発運動量を比較することによって、二日酔い抑制剤の二日酔い症状抑制効果を測定して評価することができる。また、種類の異なる二日酔い抑制剤を投与した被検動物を使用することにより、強い該剤を選別することができる。また、種類の異なる任意の食品、医薬品、化合物もしくは組成物等などを投与した被検動物を使用することにより、二日酔い抑制剤のスクリーニングを行うこともできる。二日酔い抑制剤非投与の被検動物には、比較対象とする二日酔い抑制剤投与の被検動物に該剤を投与するタイミングと同じタイミングに、溶媒（分散媒）のみを投与すればよい。該溶媒としては、比較対象とする二日酔い抑制剤作製に使用された溶媒と同じものが好ましい。
【００４０】
また、二日酔い抑制剤の投与は、上記段落［００２６］〜［００３０］に記載した態様と同様の態様が好ましい。
【００４１】
二日酔いしにくい酒の選別方法
本発明は、前記工程（Ａ）においてエタノールとして投与する種類の異なるアルコール飲料（酒）を使用し、前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含有する方法を実施することにより、酒の種類による二日酔いの程度を測定することができ、二日酔いしにくい酒を選別することができる。
【実施例】
【００４２】
本発明を以下の実施例及び比較例によって具体的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００４３】
＜赤外線センサーを用いた行動量の測定＞
赤外線センサーを用いた行動量測定装置（室町機械社製、スーパーメックスＰＹＳ−００１）下にマウスを設置し、該装置を用いて、該装置が有するレンズによってマウスの体温（遠赤外線）を感知して１時間毎の回数をカウントし、そのカウント数を行動量とした。また、測定した行動量を１時間単位で積算した値を、積算行動量とした。
【００４４】
＜回転車を用いた自発運動量の測定＞
回転車（マウス回転式運動量測定装置、室町機械社製、イグルー・ファストトラックＦＴ−７１３）をマウスの飼育環境内に設置し、マウスが回転車を回す１時間毎の回数をカウントし、そのカウント数を自発運動量とした。また、測定した自発運動量を１時間単位で積算した値を、積算自発運動量とした。
【００４５】
＜血中アルコール濃度の測定＞
被験動物から採血し、血中アルコール濃度の測定にはＦ−キットエタノール、（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社製、１７６２９０）を使用した。
【００４６】
＜エタノール経口投与マウスの血中エタノール消失時間＞
（試験例１）
マウス飼育条件として、マウスの飼育室内を１２時間の明暗サイクル（明期：７:００〜１９：００）に設定した。
ＩＣＲマウスに３０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液を３ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.又は４０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液を４ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.となるように経口投与した。エタノール投与前（０時間目）及び、エタノール投与後０．５、２、４、６時間目の血中エタノール量を測定した。測定結果を図１に示す。図１は、Ｎ＝４の、Ｍｅａｎ±ＳＤ（平均値±標準偏差）の値を示す。
図１の結果から、３０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をマウスに３ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.投与する際は約４時間で、また４０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をマウスに４ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.投与する際は約６時間で、血中エタノール濃度が実質的にゼロになる。
すなわち、３０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をマウスに３ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.投与する際は、好ましくは、マウスの活動期（１９：００〜７：００）に血中エタノール濃度が実質的にゼロになるように、該活動期の４時間前に投与し、さらに好ましくは、暗期開始時に血中エタノール濃度が実質的にゼロになるように、暗期開始の４時間前に投与する。また、４０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をマウスに４ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.投与する際は、好ましくは、マウスの該活動期の６時間前に投与し、さらに好ましくは、暗期開始の６時間前に投与する。
【００４７】
＜エタノール経口投与ラットの血中エタノール消失時間＞
（試験例２）
ＳＤラットに４０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液を２ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.となるように経口投与した。エタノール投与前（０時間目）及び、エタノール投与後１、２、３、４時間目の血中エタノール量を測定した。
測定結果を図２に示す。図２は、Ｎ＝５の、Ｍｅａｎ±ＳＤ（平均値±標準偏差）の値を示す。
図２の結果から、４０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をラットに２ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.投与する際は約４時間で、血中エタノール濃度が実質的にゼロになる。
すなわち、４０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をラットに２ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.投与する際は、好ましくは、ラットの活動期（１９：００〜７：００）に血中エタノール濃度が実質的にゼロになるように、該活動期の４時間前に投与し、さらに好ましくは、暗期開始時に血中エタノール濃度が実質的にゼロになるように、暗期開始の４時間前に投与する。
【００４８】
＜測定に使用するマウスの選択＞
（試験例３）
下記種類のマウスを、回転車の入ったプラスチックケージにいれ１４日間飼育した。飼育開始から１２日目までは、マウスに餌及び水を自由摂取させた。飼育１３日目に下記スケジュールに沿って処置した。
試験動物：マウス（近交系：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Ｂ６Ｎ）、ＢＡＬＢ／ｃＡ（ＢＡＬＢ／ｃ）、Ｃ３Ｈ/ＨｅＮ（Ｃ３Ｈ）、クローズドコロニー：ＩＣＲ）を用いた。
スケジュール：１２：３０から１５：００までマウスを絶食及び絶水させ、１５：００に３０％（ｗ／ｖ）エタノール水溶液をマウスに３ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.となるように経口投与した。
飼育１２、１３、１４日目の行動量及び自発運動量を測定した。
【００４９】
飼育１２日目（エタノール投与前日）の、暗期開始から３時間（１９：００〜２２：００）の積算行動量及び積算自発運動量の結果を表１に示す。  表１の結果から、Ｂ６Ｎ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈの近交系マウスがＣＶが少なく、本発明の方法に適している。
【００５０】
【表１】
0006486022.tif 000002
【００５１】
また、飼育１３日目（エタノール投与当日）の、暗期開始から３時間（１９：００〜２２：００）の積算行動量及び積算自発運動量について、上記表１の１２日目の積算行動量、積算自発運動量に対する該１３日目の積算行動量、積算自発運動量の割合（％）を算出した値を表２に示す。表１及び表２において、Ｍｅａｎとは平均値を示し、ＳＤとは標準偏差を示し、ＣＶとは変動係数を示し、Ａ．Ｕ．とは任意単位を示す。
表２の結果から、Ｂ６Ｎマウスの行動量と自発運動量が最も低下しており、ばらつきも少ないため、本発明の方法に使用するマウスとしてＢ６Ｎマウスが最適である。
【００５２】
【表２】
0006486022.tif 000003
【００５３】
（実施例１：１回投与）
Ｂ６Ｎマウスを３日間金網ケージで馴化させた後、回転車の入ったプラスチックケージに移して１４日間飼育した。飼育１３日目に下記スケジュールに沿って処置した。図３に、本実施例１の飼育１３日目のスケジュールを示す。図３において「測定」とは、行動量及び／又は自発運動量の測定を示す。
スケジュール：１２：３０から１５：００までマウスを絶食及び絶水させ、１４：３０に、二日酔い抑制成分としてウコンエキスを２０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．になるように経口投与した。尚、投与液は０．２％（ｗ／ｖ）ウコンエキス分散液を使用した。対照群のマウスには、溶媒（０．５ｗ／ｖ％  メチルセルロース４００溶液）のみを経口投与した。暗期開始の４時間前である１５：００に、１５％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を、マウスに３ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．となるように経口投与した。飼育１２日目と１３日目の行動量及び自発運動量を測定した。
【００５４】
（実施例２：２回投与、１週間間隔）
実施例１と同様にしてＢ６Ｎマウスを１４日間飼育した後、さらにそのまま１週間飼育した。飼育１３日目及び２０日目に下記スケジュールに沿って処置した。飼育１３日目及び２０日目以外は、マウスに餌及び水を自由摂取させた。図４に、本実施例２のマウスのスケジュールを示す。図４において「測定」とは、行動量及び／又は自発運動量の測定を示す。
スケジュール：飼育１３日目の１２：３０から１５：３０までマウスを絶食及び絶水させ、１５：００に、二日酔い抑制成分としてウコンエキスを２０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．になるように経口投与した。尚、投与液は０．２％（ｗ／ｖ）ウコンエキス分散液を使用した。対照群のマウスには、溶媒（０．５ｗ／ｖ％  メチルセルロース４００溶液）のみを経口投与した。その後、１５：３０に、３０％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を、マウスに２ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．となるように経口投与した（１回目投与）。
さらに、飼育２０日目の１２：３０から１６：００までマウスを絶食及び絶水させ、１５：３０に、二日酔い抑制成分としてウコンエキスを２０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．になるように経口投与した。尚、投与液は０．２％（ｗ／ｖ）ウコンエキス分散液を使用した。対照群のマウスには、溶媒のみを経口投与した。１６：００に、３０％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を、マウスに３ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．となるように経口投与した（２回目投与）。飼育１２日目と１３日目の行動量及び自発運動量及び、１９日目と２０日目の行動量及び自発運動量を測定した。
【００５５】
（実施例３：２回投与、４時間間隔）
実施例１と同様にしてＢ６Ｎマウスを１４日間飼育した。飼育１３日目に下記スケジュールに沿って処置した。図５に、本実施例３の飼育１３日目のスケジュールを示す。図５において「測定」とは、行動量及び／又は自発運動量の測定を示す。
スケジュール：８：３０から１１：００まで絶水、及び１５：００まで絶食させ、１０：３０に、ウコンエキスを２０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．になるように経口投与した。尚、投与液は０．２％（ｗ／ｖ）ウコンエキス分散液を使用した。対照群のマウスには、溶媒のみを経口投与した。１１：００に（１回目投与）と１５：００（２回目投与）に、１５％（ｗ／ｖ）エタノール溶液を、マウスに２．５ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．、あるいは３ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．となるように経口投与した。飼育１２日目と１３日目の行動量及び自発運動量を測定した。
【００５６】
上記実施例１〜３について、暗期開始から３時間（１９：００〜２２：００）の積算行動量及び積算自発運動量について、エタノール投与前日に対するエタノール投与当日の積算行動量、積算自発運動量の割合（％）を算出した値及び、ウコンエキス投与群（ウコンエキス有り）と対照群（ウコンエキス無し）の比較をｔ検定で行った結果を表３及び表４に示す。
尚、実施例１及び３については、エタノール投与前日として１２日目の値を、エタノール投与当日として１３日目の値を使用し、実施例２については、エタノール投与前日として飼育１９日目の値を、エタノール投与当日として飼育２０日目の値を使用した。また、表３及び表４において、Ｐ値とは、有意確率を示す。
【００５７】
【表３】
0006486022.tif 000004
【００５８】
【表４】
0006486022.tif 000005
【００５９】
表３及び表４の結果から明らかなように、エタノール投与前日に比べて投与当日の積算行動量及び積算自発運動量が低下していたことから、エタノール投与によってマウスの行動量及び／又は自発運動量が実質的に低下したことがわかる。該行動量及び自発運動量は、２回投与のうち４時間間隔の投与（実施例３）によってさらに低下していた。また、試験例１の結果から、マウスにエタノール３ｇ／ｋｇ  ｂ.ｗ.を投与すると約４時間で血中エタノール濃度が実質的にゼロになることから、実施例３の暗期開始時点において血中エタノール量が実質的にゼロなっていることがわかる。従って、本発明の方法は、被検動物の二日酔いを誘発することができる。
【００６０】
また、表３及び表４において、ウコンエキス有りの場合と無しの場合とを比較することにより、エタノール投与前日に対する投与当日の積算行動量及び積算自発運動量の低下は、ウコンエキスの投与により抑制されることがわかった。従って、本発明の方法は、二日酔いの程度を測定することができ、二日酔い症状抑制効果を測定することができる。また、本発明の方法は、種類の異なる二日酔い抑制剤を投与した被検動物を使用することにより、強い該剤を選別することができ、また、種類の異なる任意の食品、医薬品、化合物もしくは組成物等などを投与した被検動物を使用することにより、二日酔い抑制剤のスクリーニングを行うこともできる。
【００６１】
特に、実施例３の２回投与（４時間間隔）のうち、エタノールの２回目投与量が２．５ｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．の場合に、積算行動量及び積算自発運動量が、ウコンエキス無しに比べて、ウコンエキス有りで有意に高値を示しており、本発明の方法として適している。
また、当該条件における行動量及び自発運動量の経時変化を図６〜９に示す。図６〜９の値は、Ｎ＝７の、Ｍｅａｎ（平均値）の値を示す。図６及び７は、飼育１２日目の行動量及び自発運動量の経時変化を示し、図８及び９は、飼育１３日目の行動量及び自発運動量の経時変化をそれぞれ示す。これらの結果からも、図６及び図８の行動量、及び／又は図７及び図９の自発運動量を比較することにより、二日酔い抑制剤の効果を測定することができる。
【００６２】
さらに、表３及び表４の結果から、二日酔い抑制剤の評価は、ウコンエキス無し（二日酔い抑制剤非投与）のエタノール投与前日に対するエタノール投与当日の積算行動量及び自発運動量の割合（％）が、積算行動量で２５〜６２％、積算自発運動量で１３〜３３％の範囲で、特に好適に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の方法は、被検動物の二日酔いを誘発することができ、二日酔いの程度を定量的（客観的）に測定することができ、二日酔い抑制剤の力価を測定することができる。また、本発明の方法は、二日酔い抑制剤のスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の方法は、二日酔いしにくい酒を選別することができる。
【図１】
0006486022.tif 000006
【図２】
0006486022.tif 000007
【図３】
0006486022.tif 000008
【図４】
0006486022.tif 000009
【図５】
0006486022.tif 000010
【図６】
0006486022.tif 000011
【図７】
0006486022.tif 000012
【図８】
0006486022.tif 000013
【図９】
0006486022.tif 000014