(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質抗原をコードする第１の核酸配列；
ＵＬ１２８またはそのオルソログをコードする第２の核酸配列；および
ＵＬ１３１またはそのオルソログをコードする第３の核酸配列
を含む、ヒトまたは動物のサイトメガロウイルスベクターであって、
活性なＵＬ１３０タンパク質を発現しない、前記ベクター。
【請求項２】
異種タンパク質抗原をコードする第１の核酸配列；
ＵＬ１３０またはそのオルソログをコードする第２の核酸配列；および
ＵＬ１３１またはそのオルソログをコードする第３の核酸配列
を含む、ヒトまたは動物のサイトメガロウイルスベクターであって、
活性なＵＬ１２８タンパク質を発現しない、前記ベクター。
【請求項３】
点変異、フレームシフト変異、またはＵＬ１２８もしくはＵＬ１３０の全てもしくは全て未満の欠失から選択される、ＵＬ１２８またはＵＬ１３０における変異を含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
第４の核酸配列をさらに含み、前記第４の核酸配列がＵＬ１２８またはＵＬ１３０の発現を阻害するアンチセンス配列またはＲＮＡｉ配列を含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項５】
異種抗原が病原体特異的抗原を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
病原体特異的抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来する、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
被験体において異種抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する医薬組成物であって、
第１の異種抗原をコードする第１の核酸配列および活性なＵＬ１３１タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む、有効量の第１のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターを含み、
ここで、第１のＣＭＶベクターが活性なＵＬ１２８タンパク質をコードしないか、活性なＵＬ１３０タンパク質をコードせず、そして異種抗原に対する少なくとも１０％の前記ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＭＨＣクラスＩＩによって提示されたエピトープに指向する、医薬組成物。
【請求項８】
第１のＣＭＶベクターが活性なＵＬ１２８タンパク質をコードせず、且つ活性なＵＬ１３０タンパク質をコードしない、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記応答が少なくとも５０％のクラスＩＩ拘束性ＣＤ８＋エピトープを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
第１の異種抗原が病原体特異的抗原を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
病原体特異的抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
被験体が事前にＣＭＶに暴露されている、請求項７〜１１のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
被験体がヒトまたは非ヒト霊長類である、請求項７〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または経口投与のための、請求項７〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
第２の異種抗原をコードする第３の核酸配列を含む第２のＣＭＶベクターをさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
第２のＣＭＶベクターが、活性なＵＬ１２８タンパク質および活性なＵＬ１３０タンパク質をコードする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
第１の異種抗原および前記第２の異種抗原が同一の抗原である、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
被験者において異種タンパク質抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するために使用される、請求項７〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
被験者が事前にＣＭＶに暴露されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
被験体がヒトまたは非ヒト霊長類である、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
被験者において異種タンパク質抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するために使用される医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項２２】
被験者が事前にＣＭＶに暴露されている、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
被験体がヒトまたは非ヒト霊長類である、請求項２１または２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の承認
本発明を、国立衛生研究所によって拠出された助成金番号ＰＯ１  ＡＩ０９４４１７の合衆国政府の支援を得て実施した。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質（ＭＨＣ−Ｉ）および精巧な細胞内ペプチドのサンプリングおよび輸送システムによって、選択され、細胞表面に輸送された病原体由来短鎖ペプチドのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介認識によって細胞内病原体を検出する（非特許文献１；本明細書中で参考として援用される）。病原体がＣＤ８＋Ｔ細胞認識に適切な長さの何千もの異なるペプチドを潜在的に生成し得るにもかかわらず、タンパク質プロセシング、ペプチド輸送、利用可能なＭＨＣ−Ｉ異形への結合、およびＴＣＲレパートリーマッチングの必要性、ならびにあまり理解されていない免疫調節機構により、これらの候補のうちで抗病原体エフェクターおよびメモリー応答を含むＣＤ８＋Ｔ細胞の標的としての機能を実際に果たすペプチドエピトープは相対的に少数まで絞られる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。過程の複雑さにもかかわらず、ＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子を共有する個体によって開始される病原体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、いわゆる免疫優性エピトープの重複セットを認識する傾向がある（非特許文献２；非特許文献３、非特許文献５；本明細書中で参考として援用される）。病原体の大部分について、かかる免疫優性エピトープをターゲティングするＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、病原体感染細胞を認識して、有効な抗病原体エフェクターおよびメモリー応答を開始することができる。しかし、これはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびそのサル対応物ＳＩＶのような効率的な免疫回避能力を有する因子に当てはまらない。これらのウイルスの多数の複製により、高速変異および機能適応性を組み合わせて、ほとんどのＣＤ８＋Ｔ細胞応答から逃避することが可能である（非特許文献６、本明細書中で参考として援用される）。実際に、これらのウイルスが感染した大部分の被験体におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、保存された機能的に極めて重要なウイルス配列を含むエピトープをターゲティングできず、ウイルス複製を有効に調節しない（非特許文献７；本明細書中で参考として援用される）。これらのウイルスに対するワクチン接種は感染後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の規模を著しく増大させることができる一方で、これらのより大きな応答は非ワクチン接種被験体の感染と同一の免疫優性エピトープを多数ターゲティングし、したがって、依然として免疫エスケープが起こる（非特許文献６；非特許文献８；非特許文献９；その全てが本明細書中で参考として援用される）。ＡＩＤＳワクチン分野において（認識幅の増大または保存配列に対する応答の着目のいずれかによって）多様なＭＨＣ−Ｉハプロタイプにわたって「脆弱な」エピトープをターゲティングするＨＩＶ／ＳＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができるストラテジーを開発する努力がなされているにもかかわらず、この努力は、これまでのところ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫優性ヒエラルキーを実質的に改変することができるストラテジーを得るに至っておらず、大部分の個体において防御ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を確立するという目的に到達もしていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｎｅｅｆｊｉｅｓ  ＭＬら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１，８２３（２０１１）
【非特許文献２】Ｙｅｗｄｅｌｌ  ＪＷら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，５３３（２００６）
【非特許文献３】Ｉｒｖｉｎｅ  Ｋら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，１３５（２００６）
【非特許文献４】Ａｓｓａｒｓｓｏｎ  Ｅら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，７８９０（２００７）
【非特許文献５】Ｇｏｕｌｄｅｒ  ＰＪ  ａｎｄ  Ｗａｔｋｉｎｓ  ＤＩ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，６１９（２００８）
【非特許文献６】Ｐｉｃｋｅｒ  ＬＪら，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ６３，９５（２０１２）
【非特許文献７】ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  ＡＪら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，１１（２０１０）
【非特許文献８】Ｂａｒｏｕｃｈ  ＤＨら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，７３６７（２００３）
【非特許文献９】Ｍｕｄｄ  ＰＡら，Ｎａｔｕｒｅ  ４９１，１２９（２０１２）
【発明の概要】
【０００４】
効率的な免疫回避に必要なウイルス増幅の前に、ＨＩＶ感染を阻止すると考えられるＨＩＶ特異的エフェクターメモリーＴ細胞応答を生成および維持するための持続性ベクターとして、ＨＩＶタンパク質を発現する組み換えサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を使用したＨＩＶ／ＡＩＤＳワクチンストラテジーが開発されている（Ｐｉｃｋｅｒ，２０１２前出）。このアプローチは感染を防止するようにデザインされていなかったが、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの動物モデルにおいて非常に成功し、高病原性ＳＩＶでチャレンジしたＣＭＶ／ＳＩＶベクターをワクチン接種したアカゲザル（ＲＭ）の約５０％が即時で厳密な耐久性のあるウイルス制御を示すことが証明された（Ｈａｎｓｅｎ，２０１１  以下）。
【０００５】
これらの一連の研究中に、ＣＭＶ／ＳＩＶベクターが、十分に特徴づけられたＭａｍｕ−Ａ１＊００１：０１（Ａ＊０１）ＭＨＣ−Ｉタンパク質によって提示されたＳＩＶペプチドに対して、典型的な免疫優性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発しないことが認められ、ＣＭＶベクターがこれらの有効な応答によってターゲティングされた新規のＴ細胞エピトープを誘導すること、およびこれらの新規の応答がワクチン有効性に寄与することが示唆された。
【０００６】
異種抗原（サイトメガロウイルスベクターによって発現されたウイルスおよび細菌の異種抗原など）が、全ての他の公知のベクターによって誘導されたＴ細胞免疫優性プロフィールと基本的に異なるＴ細胞免疫優性プロフィールを誘導することを、本明細書中に開示する。ＳＩＶ抗原を保有するアカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）を感染させたアカゲザル（ＲＭ）をヒトＣＭＶの動物モデルとして使用することにより、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発されたＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋応答が他のワクチンによるかＳＩＶ感染の際に誘発されたｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の範囲が３倍であることを示す。他のワクチンと比較して、ＣＭＶ誘発Ｔ細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣ（ＭＨＣ−ＩＩ）によって提示されたエピトープを高率で含む全く異なるエピトープをターゲティングすることをさらに示す。かかる応答は、任意の他の感染性因子またはワクチンに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答で認められることはあっても稀である。免疫優性プロフィールがＣＭＶの遺伝的調節下にあることをさらに開示する。具体的には、ＣＭＶ遺伝子であるＵＬ１２８およびＵＬ１３０がこの応答の誘導を防止することを証明する。ＵＬ１２８およびＵＬ１３０がＣＭＶベクター中に存在する場合、Ｔ細胞応答は制限されたエピトープセットに集中するのに対して、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞はＵＬ１２８またはＵＬ１３０のいずれかを欠くベクターによって誘導される。これらの所見により、ワクチンベクターが異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープパターンを認識するように遺伝子操作する能力が最初に認められた。
【０００７】
異種タンパク質抗原、活性なＵＬ１３１タンパク質（またはそのオルソログ）、活性なＵＬ１２８タンパク質（またはそのオルソログ）を含むが、活性なＵＬ１３０タンパク質を欠くＣＭＶベクターを本明細書中に開示する。異種タンパク質抗原、活性なＵＬ１３１タンパク質（またはそのオルソログ）、活性なＵＬ１３０タンパク質（またはそのオルソログ）を含むが、活性なＵＬ１２８タンパク質を欠くＣＭＶベクターも本明細書中に開示する。
【０００８】
被験体において異種抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する方法も本明細書中に開示する。本方法は、有効量のＣＭＶベクターを被験体に投与する工程を含む。ＣＭＶベクターは、異種抗原を有し、活性なＵＬ１３１タンパク質を有するが、活性なＵＬ１２８タンパク質を持たないか活性なＵＬ１３０タンパク質を持たないこと、または活性なＵＬ１２８を持たず、且つ活性なＵＬ１３０タンパク質を持たないことによって特徴づけられる。応答は、少なくとも１０％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩＩによって提示されたエピトープに指向することによって特徴づけられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本明細書中に含まれるいくつかのグラフおよびプロットについて、色を用いて理解を深めることができるが、特許出願公開では色は利用できない。出願人は、全ての最初に開示した画像およびグラフが（カラーであるかどうかと無関係に）最初の開示の一部であると見なし、今後の手続きにおいて本明細書中に記載の図面のカラーグラフおよびプロットに対する権利を留保する。
【図１Ａ】図１Ａは、示した通りに処置したＲＭにおけるペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答のエピトープマップである。ＳＩＶｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（ｎ＝１４）でワクチン接種したアカゲザル（ＲＭ）における１２５の連続する１５ｍｅｒ  ｇａｇペプチド（各連続ペプチド間で１１アミノ酸の重複）の認識を検出するためのフローサイトメトリー細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用してエピトープマッピングした。これらの実験で使用したＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターは、遺伝子欠失のためにＵＬ１２８およびＵＬ１３０のＲｈＣＭＶホモログを発現しない６８．１株に由来した。細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（＊）は、非ＢＡＣ由来ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ（Ｌ）（＊＊）でインタクトなＵＬ３６の機能的ホモログをさらに欠く。さらに、エレクトロポレーションを行ったＤＮＡ／ｇａｇ＋ＩＬ−１２ベクター（ｎ＝４）、Ａｄ５／ｇａｇベクター（ｎ＝３）、およびＭＶＡ／ｇａｇベクター（ｎ＝３）をワクチン接種したか、ＳＩＶ（ｎ＝５；血漿ウイルス量５０，０００コピー／ｍｌ未満）を感染させたＲＭを分析した。  バックグラウンドを超えるＣＤ８＋Ｔ細胞応答が得られたペプチドをカラーボックスによって示し、各ＲＭにおけるこれらの陽性応答の総数およびこれらの反応性ペプチド内に潜在的に含まれる独立したエピトープの最小数を右側に示す（後者は、単一のエピトープを隣接する１５ｍｅｒ中に示すことができるという事実を考慮した計算を使用する）。被験体あたりの陽性ペプチド数および異なるエピトープの最小数の両方は、両側ウィルコクソン順位和検定を使用して、他の群を統合したＲＭよりＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭにおいて有意に高い（ｐ＜．０００１）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、各セットが６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞によってターゲティングされた２つの選択した１５ｍｅｒペプチドのコアＣＤ８＋エピトープの決定をまとめたペプチドのリストおよび２つの棒グラフからなる２セットである。これらのエピトープを、ペプチドリスト中に示した短縮ペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答のフローサイトメトリーＩＣＳ分析によって決定した。図は、以下の短縮ペプチドセットを使用して認められた２つの応答パターンの代表例を示す：タイプ１（赤色）（ピーク応答性の急激な消失および９ｍｅｒコアエピトープ）およびタイプ２（青色）（ピーク応答性の漸減および１２ｍｅｒコアエピトープ）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ｂに示す１５ｍｅｒ由来のコアペプチドと比較した親１５ｍｅｒペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答頻度を示す７つのプロットセットである。応答を、各応答について９匹のＲＭにおけるフローサイトメトリーＩＣＳによって比較した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、選択されたＳＩＶｇａｇコアエピトープ（青色および赤色）および選択されたさらなるＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒ（灰色）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す２つの棒グラフセットである。ＣＤ８＋応答を、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０が欠損した６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターでワクチン接種した４２匹のＲＭにおけるフローサイトメトリーＩＣＳによって評価した。ＣＭＶワクチン接種ＲＭを左側のパネルに、４０匹のＳＩＶ感染ＲＭを右側のパネルに、これらのペプチドに対する検出可能な応答を有する各カテゴリーにおけるＲＭの比率として示す。
【図２Ａ】図２Ａは、示したペプチド（Ｇａｇ２１１−２２２、Ｇａｇ２７６−２８４、Ｇａｇ２９０−３０１、Ｇａｇ４８２−４９０、Ｇａｇ４９５−５０６についてはｎ＝８；Ｇａｇ４１−５２、Ｇａｇ２５９−２６７についてはｎ＝５）を使用した６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭ由来のＰＢＭＣの刺激の結果を示す棒グラフである。細胞を、無関係のアイソタイプコントロールｍＡｂ（ＩｇＧ１−クローンＸ４０＋ＩｇＧ２ａ−クローンＸ３９；各１０μｇ）、抗ＭＨＣ−ＩｍＡｂ（ｗ６−３２；１０μｇ）、抗ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂ（Ｇ４６−６；１０μｇ）、またはＣＬＩＰペプチド（ＭＨＣ−ＩＩ関連インバリアント鎖、アミノ酸８９〜１００；２μｇ）の存在下にて、示したＳＩＶｇａｇコアエピトープ（前に図１Ｂに示すコアエピトープの長さによってタイプ１対タイプ２に分類）で刺激した。応答頻度を、アイソタイプコントロール処置培養物中の応答頻度に対して正規化し、各処置についてのこれらの正規化応答頻度の平均＋ＳＥＭを示す。タイプ１に分類された３エピトープに対する応答のみが抗ＭＨＣ−ＩｍＡｂを使用して遮断され、クラス２として分類された４エピトープのみが抗ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂおよびＣＬＩＰペプチドを使用して遮断されたことに留意のこと。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｘ軸上に示すように免疫したＲＭに起因する、示したタイプ（ＭＨＣ−Ｉ遮断、ＭＨＣ−ＩＩ遮断、または不確定）のＲＭあたりのＳＩＶｇａｇエピトープ数のプロットである。図２Ａに記載のＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒペプチド応答を、ＭＨＣ−Ｉ（ｍＡｂ  ｗ６−３２）遮断対ＭＨＣ−ＩＩ（ｍＡｂ  Ｇ４６−６）遮断に供し、ＭＨＣ−Ｉ遮断、ＭＨＣ−ＩＩ遮断、または不確定に分類した。各ＲＭについて、ワクチンタイプによって分類した各カテゴリー中の平均ペプチド特異的応答数を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、応答がＭＨＣ−Ｉ遮断またはＭＨＣ−ＩＩ遮断によって阻害されるかどうかにしたがって配置された６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞応答のエピトープマップである。ＭＨＣ−Ｉ（赤色ボックス）遮断対ＭＨＣ−ＩＩ（青色ボックス）遮断（オープンボックスは不確定を示す）に対する１１匹の６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭにおける各ＳＩＶｇａｇペプチド応答の感受性を示し、ＭＨＣ−Ｉ関連カテゴリーおよびＭＨＣ−ＩＩ関連カテゴリー中の独立エピトープの最小数を右側に示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭ（Ｒｈ２２０３４）由来のＰＢＭＣのＦＡＣＳプロットセットである。異なるＭＨＣ対立遺伝子によって提示される同一ペプチド（「スーパートープ」）を認識するＴ細胞を誘導するＣＭＶベクターを、ＳＩＶｇａｇペプチドパルス（および洗浄）ＲＭ３細胞（ＭＨＣ−ＩＩヌル親細胞株）対単一のＭａｍｕＤＲ分子を発現するＲＭ３トランスフェクタントとインキュベートし、次いで、ＩＦＮ−γ産生および／またはＴＮＦ−α産生（応答頻度を各象限中に示す）の誘導を検出するためのフローサイトメトリーＩＣＳを使用してペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞認識について評価した。試験したＭａｍｕＤＲ分子は、Ｒｈ２２０３４によって発現される４種（ＤＲＢ１＊０３０９、ＤＲＢ１＊０４０６、ＤＲＢ５＊０３０１、およびＤＲＢ＊ｗ２０１）および発現されない１種（ＤＲＢ＊ｗ４：０１）を含んでいた。試験したＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒペプチドは、このＲＭにおいて、ＭＨＣ−Ｉ遮断され、したがって、ネガティブコントロールとして使用したＧａｇ２７３−２８７（１５ｍｅｒ  番号６９）を除き、公知のＭＨＣ−ＩＩ遮断ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対応していた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、自己Ｂリンパ芽球様細胞、ＭＨＣ−ＩＩヌル親細胞、および単一のＭＨＣ−ＩＩトランスフェクタントによるＲｈ２２０３４およびＲｈ２１８３６由来のＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＧａｇ１４１−１５５（１５ｍｅｒ  番号３６）の提示の（図３Ａに）類似の分析のＦＡＣＳプロットセットであり、これらの２匹のＲＭによって相互発現されたＭａｍｕ−ＤＲＢ対立遺伝子（発現した対立遺伝子を赤色で示し、非発現性対立遺伝子を黒色で示す）に対応している。
【図４Ａ】図４Ａは、試験あたり２μｇの標準ペプチド濃度から開始した４つのコア（最適）ＳＩＶｇａｇペプチド（２つがそれぞれＭＨＣ−Ｉ拘束およびＭＨＣ−ＩＩ拘束）の連続希釈倍率の常用対数を示すプロットである。ペプチドを使用して６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭ（ｎ＝５）由来のＰＢＭＣを刺激し、各ペプチド希釈物に対する応答を、フローサイトメトリーＩＣＳによって決定した。各希釈度の対応するＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ陽性）の頻度を、標準ペプチド濃度での応答に正規化した。図は、各エピトープについての正規化応答の平均＋ＳＥＭを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、総ＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒ混合物および４つのコア（最適）ＳＩＶｇａｇスーパートープペプチド（２つがそれぞれＭＨＣ−Ｉ拘束およびＭＨＣ−ＩＩ拘束）に対する、末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示すプロットである。６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種（平均＋ＳＥＭ；ｎ＝２４）後のフローサイトメトリーＩＣＳによって応答を定量して、ＭＨＣ−Ｉ拘束対ＭＨＣ−ＩＩ拘束のスーパートープ応答誘導の相対動態を証明した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、２種のＭＨＣ−Ｉ拘束コア（最適）ＳＩＶｇａｇスーパートープペプチドに対する、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す棒グラフである。６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターワクチン接種ＲＭ（平均＋ＳＥＭ；ｎ＝４）の剖検で示された組織由来の、単核球調製物におけるフローサイトメトリーＩＣＳによって応答を定量した。
【図４Ｄ】図４Ｄは、２種のＭＨＣ−ＩＩ拘束コア（最適）ＳＩＶｇａｇスーパートープペプチドに対する、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す棒グラフである。６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターワクチン接種ＲＭ（平均＋ＳＥＭ；ｎ＝４）の剖検で示された組織由来の、単核球調製物におけるフローサイトメトリーＩＣＳによって応答を定量した。
【図４Ｅ】図４Ｅは、６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭ（ｎ＝１４）由来のＰＢＭＣのＣＤ８＋Ｔ細胞応答の棒グラフである。細胞を、示した総ＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒ混合物またはＭＨＣ−Ｉ拘束対ＭＨＣ−ＩＩ拘束のコア（最適）ＳＩＶｇａｇスーパートープペプチドで刺激し、対応する細胞（ＴＮＦ−αおよび／またはＩＦＮ−γ陽性）上でのＣＤ２８対ＣＣＲ７の発現を、フローサイトメトリーＩＣＳによって決定し、それにより、示したＴＣＭ／ＴＥＭ１／ＴＥＭ２表現型を示す対応細胞の平均（±ＳＥＭ）比率が示された。
【図４Ｆ】図４Ｆは、６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭ（ｎ＝１４）由来のＰＢＭＣのＣＤ８＋Ｔ細胞応答の棒グラフである。細胞を、示した総ＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒ混合物またはＭＨＣ−Ｉ拘束対ＭＨＣ−ＩＩ拘束のコア（最適）ＳＩＶｇａｇスーパートープペプチド（対ペプチドなし）で刺激し、示したサイトカインを産生するか、脱顆粒（ＣＤ１０７外在化）を示すＣＤ８＋メモリー区画内の細胞の頻度を決定した。図は、バックグラウンド減算後のこれらの応答頻度の平均（±ＳＥＭ）を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、アイソタイプコントロール対遮断抗ＭＨＣ−ＩｍＡｂ対遮断抗ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂの存在下でのＲｈＣＭＶ  ＩＥ１タンパク質を含む連続１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸重複）に対する、ワクチン接種していない天然にＲｈＣＭＶ感染させたＲＭ（コロニー流行株）応答対６８．１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターワクチン接種ＲＭ応答由来のＰＢＭＣにおける、ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリープロフィールセットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗ＭＨＣ−ＩｍＡｂ対抗ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂを用いた遮断に対する天然にＲｈＣＭＶ感染させたＲＭまたは６８．１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターワクチン接種ＲＭ（ｎ＝４／群）由来のＩＥ１特異的ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の感受性を比較した棒グラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、天然にＲｈＣＭＶ感染させたＲＭおよび６８．１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターワクチン接種ＲＭ（各ｎ＝４）におけるＲｈＣＭＶ  ＩＥ１に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答のエピトープマップである。応答をエピトープマッピングして１３７の連続する１５ｍｅｒ  ＩＥ１ペプチドの認識を決定し、次いで、各応答のＭＨＣ関連をＭＨＣ−Ｉ遮断対ＭＨＣ−ＩＩ遮断によって分類した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、全ＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒ混合物（それぞれ５つのユニバーサルＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター関連スーパートープ）および２つのＭａｍｕＡ＊０１＋ＲＭ（示した基準ＳＩＶｇａｇエピトープはそれぞれこの対立遺伝子によって制限される）に対する血中のピーク急性期ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す棒グラフセットである。６８．１株ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターをワクチン接種した６匹のＲＭにおける応答を示し、前記ベクターは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１３０−１２８遺伝子のＲｈＣＭＶオルソログ（Ｒｈ１５７．４および１５７．５）の発現が修復されていた（修復されたＲｈＣＭＶ／ｇａｇは、Ｌｉｌｊａ  ＡＥ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ  Ｔ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，１９９５０−１９９５５（２００８）（本明細書中で参考として援用される）に記載のようにＲｈＣＭＶ−６８−１．２に由来していた）。
【図５Ｅ】図５Ｅは、抗ＭＨＣ−ＩｍＡｂ対抗ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂでの遮断に対する元の６８．１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター対Ｒｈ１５７．４−．５（ＵＬ１２８−１３０）修復ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターでワクチン接種したＲＭ（ｎ＝６／群）由来のＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の感受性の比較である。
【図５Ｆ】図５Ｆは、Ｒｈ１５７．４−．５（ＵＬ１３０−１２８）修復ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターをワクチン接種した３匹のＲＭにおけるＳＩＶｇａｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の比較である。応答をエピトープマッピングし、次いで、各応答のＭＨＣ関連を、ＭＨＣ−Ｉ遮断対ＭＨＣ−ＩＩ遮断によって分類した。ＭＨＣ−ＩＩ遮断応答は検出されなかった。
【図６】図６は、ＵＬ１２８を欠くが活性なＵＬ１３０およびＵＬ１３１を有するベクター（左）；ＵＬ１３０を欠くが活性なＵＬ１２８およびＵＬ１３１を有するベクター（中央）；および活性なＵＬ１２８および活性なＵＬ１３０を有するが活性なＵＬ１３１を欠くベクター（右）でワクチン接種した２匹のＲＭについてのメモリーＴ細胞サブセット中での、ＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答パーセントを示す３つのプロットセットである。ＵＬ１３１を欠くがＵＬ１２８およびＵＬ１３０を有するベクターは、いかなるＣＤ８＋免疫応答も得られなかった（図６、右）。
【図７】図７は、ＵＬ１２８を欠く（しかし活性なＵＬ１３０およびＵＬ１３１を有する）ＲｈＣＭＶｇａｇベクターまたはＵＬ１３０を欠く（しかし活性なＵＬ１２８およびＵＬ１３１を有する）ＲｈＣＭＶｇａｇベクターでワクチン接種した２匹のＲＭ由来のＰＢＭＣ中のＳＩＶｇａｇのアミノ末端部分に対応する、約２５の重複１５ｍｅｒセット内の個別のペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す上記図１Ａ、２Ｃ、および５Ｃに類似の２つのエピトープマップセットである。ペプチドがＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩによって提示されたかどうかを決定するために、ＭＨＣ−Ｉ特異的抗体またはＭＨＣ−ＩＩ特異的抗体の存在下でＴ細胞を刺激した。ＭＨＣ−Ｉ特異的抗体またはＭＨＣ−ＩＩ特異的抗体によって阻害されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、それぞれ赤色および青色で示す。これらの結果は、ＵＬ１２８またはＵＬ１３０のいずれかを欠くベクターが、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することを示す。
【図８】図８は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原であるＡｇ８５ＢおよびＥＳＡＴ−６を含むΔＵＬ１２８−ＵＬ１３０（６８−１）ＲｈＣＭＶベクターで免疫した３匹のＲＭ由来のＰＢＭＣ中のＡｇ８５Ｂに対応する７５の重複１５ｍｅｒペプチドおよびＥＳＡＴ−６に対応する２２の重複１５ｍｅｒのセット内の個別のペプチドに対する、ＭＨＣ−Ｉ遮断抗体またはＭＨＣ−ＩＩ遮断抗体の存在下でのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す２つのエピトープマップセットである。結果は、ＲｈＣＭＶベクターが細菌抗原に対してＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができることを示す。
【図９】図９は、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠くＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（６８−１）および活性なＵＬ１２８およびＵＬ１３０を含む修復ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター（６８−１．２）での連続接種により、異種抗原（ＳＩＶｇａｇ）のエピトープ範囲が増大することを証明している。上のパネルは、以前に（１年前未満）ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ（６８−１）をワクチン接種し、１日目にＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ（６８−１）をワクチン接種し、次いで、２３７日目にＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ（６８−１．２）をワクチン接種した２匹のＲＭのＴ細胞メモリープール中に存在する、ＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、経過時間を示す。ＳＩＶｇａｇ特異的応答を、重複１５ｍｅｒペプチドのプール（緑色ライン）または個別のペプチド（赤色ライン）を使用したＩＣＳのフローサイトメトリーによって測定した。ＳＩＶｇａｇに対する総ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が６８−１由来ベクターおよび６８−１．２由来ベクターの両方での再ワクチン接種の際に増大したのに対して、個別のペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答が６８−１．２由来ベクターによって強化されず、これは、総応答の増加が新規のＳＩＶｇａｇペプチドに対する６８−１．２ベクター誘発Ｔ細胞に起因することを示していたことに留意のこと。この結論は、下のパネル中に示す結果によって支持される。ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ（６８−１）での第１のワクチン接種後、ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ（６８−１）での再ワクチン接種後、およびＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇ（６８−１．２）でのワクチン接種後のいずれかでＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇを接種した２匹の各ＲＭ由来のＴ細胞によって認識されるＳＩＶｇａｇ配列に沿った個別の１５ｍｅｒペプチドの位置を示す。各ワクチン接種は、以前の免疫応答を維持しながらＴ細胞をさらに誘発して新規のエピトープを認識した：６８−１由来ベクターでの再ワクチン接種後にＴ細胞によって認識される新規のエピトープを青色で示すのに対して、６８−１．２由来ベクターでのワクチン接種後に認識される新規のエピトープを緑色で示す。これらのＴ細胞応答が付加的であるので、１２５のうちの５２および４５の重複ペプチドに対するＴ細胞応答を連続ワクチン接種の際に測定し、したがって、単一ワクチン接種と比較してＴ細胞によるＳＩＶｇａｇ由来ペプチドの範囲がほぼ倍になった。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
生物に反復して感染させることができるヒトまたは動物のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターを本明細書中に開示する。ＣＭＶベクターは、異種タンパク質抗原をコードする核酸配列および活性なＵＬ１３１タンパク質をコードする核酸配列を含む。１つの例では、ＣＭＶベクターは、活性なＵＬ１２８タンパク質を発現するが活性なＵＬ１３０タンパク質を発現しない核酸配列を含む。別の例では、ＣＭＶベクターは、活性なＵＬ１３０タンパク質をコードするが、活性なＵＬ１２８タンパク質を発現しない。
【００１１】
いくつかの例では、ベクターは、動物ＣＭＶ中のＵＬ１２８もしくはＵＬ１３０またはそのオルソロガス遺伝子をコードする核酸配列の有害変異の存在によって、活性なＵＬ１２８タンパク質またはＵＬ１３０タンパク質を発現しない。変異は、活性なＵＬ１２８タンパク質またはＵＬ１３０タンパク質の発現を欠如させる任意の有害変異であり得る。かかる変異には、点変異、フレームシフト変異、タンパク質をコードする全配列未満の欠失（短縮変異）、またはタンパク質をコードする全核酸配列の欠失、または任意の他の変異が含まれ得る。
【００１２】
さらなる例では、ベクターは、ＵＬ１２８タンパク質またはＵＬ１３０タンパク質の発現を阻害するアンチセンスまたはＲＮＡｉ配列（ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含むベクター中の核酸配列の存在に起因して、活性なＵＬ１２８タンパク質またはＵＬ１３０タンパク質を発現しない。
【００１３】
被験体における異種抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成方法も本明細書中に開示する。本方法は、有効量のＣＭＶベクターを被験体に投与する工程を含む。ＣＭＶベクターは、異種抗原をコードする核酸配列および活性なＵＬ１３１タンパク質をコードする核酸配列を有することを特徴とする。ＣＭＶベクターは、さらに、活性なＵＬ１２８タンパク質または活性なＵＬ１３０タンパク質をコードしないか、活性なＵＬ１２８タンパク質および活性なＵＬ１３０タンパク質のいずれもコードしないことによって特徴づけられる。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、さらに、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたエピトープに指向する少なくとも１０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を有することによって特徴づけられる。さらなる例では、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または６０％を超えるＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されたエピトープに指向する。
【００１４】
さらなる例では、本方法は、有効量の第２のＣＭＶベクター（この第２のＣＭＶベクターは異種抗原をコードする核酸配列を含む）を被験体に投与する工程を含む。この第２のベクターは、任意のＣＭＶベクター（活性なＵＬ１２８タンパク質および活性なＵＬ１３０タンパク質を有するＣＭＶベクターが含まれる）であり得る。第２のＣＭＶベクターは、異なる免疫応答を得るための当該分野で公知のさらなる欠失（ＵＳ１１欠失または任意の他の欠失など）を含むことができる。第２の異種抗原は、任意の異種抗原（第１のＣＭＶベクター中の異種抗原と同一の異種抗原が含まれる）であり得る。第２のＣＭＶベクターを、第１のＣＭＶベクターの投与に対して任意の時間（第１のＣＭＶベクターの投与前、同時、または投与後が含まれる）に投与することができる。これは、第１のベクターの投与前または投与後から数カ月、数日、数時間、数分、または数秒での第２のベクターの投与を含む。
【００１５】
ヒトまたは動物のＣＭＶベクターは、発現ベクターとして使用する場合、ヒトなどの選択された被験体において本質的に非病原性であるか、選択された被験体において非病原性になるように改変されている。例えば、複製欠損アデノウイルスおよびアルファウイルスは周知であり、遺伝子送達ベクターとして使用することができる。
【００１６】
異種抗原は、ＣＭＶに由来しない任意のタンパク質またはそのフラグメント（癌抗原、病原体特異的抗原、モデル抗原（リゾチームまたはオボアルブミンなど）、または任意の他の抗原が含まれる）であり得る。
【００１７】
病原体特異的抗原は、任意のヒトまたは動物の病原体に由来し得る。病原体はウイルス病原体であってよく、抗原はウイルス病原体由来タンパク質であってよい。ウイルスには、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、単純ヘルペスウイルスタイプ１、単純ヘルペスウイルスタイプ２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、カポジ肉腫ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルスタイプ８、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、ヒトボカウイルス、およびパルボウイルスＢ１９が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
病原体は細菌病原体であってよく、抗原は細菌病原体由来のタンパク質であってよい。病原性細菌には、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
病原体は寄生虫であってよく、抗原は寄生虫病原体に由来するタンパク質であってよい。寄生虫は、原生動物または疾患（アカントアメーバ、バベシア症、バランチジウム症、ブラストシスチス症、コクシジウム亜綱、二核アメーバ症、アメーバ症、ジアルジア、イソスポーラ症、リーシュマニア症、原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）、マラリア、リノスポリジウム症、トキソプラズマ症−寄生性肺炎、トリコモナス症、眠り病、およびシャーガス病などであるが、これらに限定されない）を引き起こす原生動物であり得る。寄生虫は蠕虫類または蠕虫または蠕虫類に原因する疾患（鉤虫症／鉤虫、アニサキス症、回虫−寄生性肺炎、回虫−ベイリスアスカリス症、条虫−条虫症、肝吸虫症、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ  ｒｅｎａｌｉｓ感染、裂頭条虫症−条虫、ギニア虫−メジナ虫症、エキノコックス症−条虫、蟯虫−蟯虫症、肝吸虫−肝蛭症、肥大吸虫症−腸管寄生吸虫、顎口虫症、模様条虫症、ロア糸状虫フィラリア症、カラバル腫脹、マンソネラ症、フィラリア症、メタゴニムス症−腸管寄生吸虫、河川盲目症、中国肝吸虫、肺吸虫症、肺吸虫、住血吸虫症−ビルハルジア属、ビルハルツ住血吸虫症または巻貝熱（全タイプ）、腸住血吸虫症、尿路住血吸虫症、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍによる住血吸虫症、アジア腸住血吸虫症、孤虫症、糞線虫症−寄生肺炎、無鉤条虫、有鉤条虫、トキソカラ症、旋毛虫症、水泳性痒疹、鞭虫、およびリンパ性フィラリア性象皮症などであるが、これらに限定されない）であってよい。寄生虫は、生物または生物に原因する疾患（寄生蠕虫、ハルザン症候群、ハエ幼虫症、スナノミ、ヒトヒフバエ、およびカンジルーなどであるが、これらに限定されない）であってよい。寄生虫は、外寄生生物または外寄生生物に原因する疾患（トコジラミ、アタマジラミ−シラミ寄生症、コロモジラミ−シラミ寄生症、ケジラミ−シラミ寄生症、ニキビダニ属−毛嚢虫症、疥癬、スクリューワーム、およびコクリオミイヤ属などであるが、これらに限定されない）であってよい。
【００２０】
抗原は、癌由来のタンパク質であってよい。癌には、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄白血病；副腎皮質癌；ＡＩＤＳ関連癌；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫（小児期の小脳癌または大脳癌）；基底細胞癌；胆管癌（肝外）；膀胱癌；骨の癌（骨肉腫／悪性線維性組織球腫）；脳幹部神経膠腫；脳腫瘍；脳腫瘍（小脳星状細胞腫）；脳腫瘍（大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫）；脳腫瘍（上衣腫）；脳腫瘍（髄芽腫）；脳腫瘍（テント上原始神経外胚葉腫瘍）；脳腫瘍（視覚路および視床下部の膠腫）；乳癌；気管支腺腫／カルチノイド；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍（小児期）；カルチノイド腫瘍（消化管）；原発巣不明の癌腫；中枢神経系リンパ腫（原発性）；小脳星状細胞腫（小児期）；大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫（小児期）；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣腫；食道癌；ユーイング腫瘍ファミリーにおけるユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍（小児期）；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼球の癌（眼球内黒色腫）；眼球の癌（網膜芽細胞腫）；胆嚢癌；胃がん（胃癌）；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞腫瘍：頭蓋外、性腺外、または卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；脳幹神経膠腫；神経膠腫（小児大脳星状細胞腫）；神経膠腫（小児期の視覚路および視床下部）；胃カルチノイド；毛様細胞白血病；頭頸部癌；心臓癌；肝細胞（肝）癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部および視覚路の神経膠腫（小児期）；眼球内黒色腫；島細胞癌（膵内分泌部）；カポジ肉腫；腎臓癌（腎臓細胞癌）；喉頭癌；白血病；白血病（急性リンパ芽球性（急性リンパ球性白血病とも呼ばれる））；白血病（急性骨髄性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる））；白血病（慢性リンパ球性（慢性リンパ球性白血病とも呼ばれる））；白血病（慢性骨髄性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる））；白血病（毛様細胞性）；口唇および口腔の癌；肝臓癌（原発性）；肺癌（非小細胞）；肺癌（小細胞）；リンパ腫；リンパ腫（ＡＩＤＳ関連）；リンパ腫（バーキット）；リンパ腫（皮膚Ｔ細胞）；リンパ腫（ホジキン）；リンパ腫（非ホジキン（ホジキンリンパ腫を除く全リンパ腫の古い分類））；リンパ腫（原発性中枢神経系）；マーカスホイットル（致死性疾患）；マクログロブリン血症（ワルデンシュトレーム）；骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽腫（小児期）；黒色腫；黒色腫（眼内（眼球））；メルケル細胞癌；中皮腫（成人悪性）；中皮腫（小児期）；原発巣不明の転移性頸部扁平上皮癌；口腔の癌；多発性内分泌腫瘍症候群（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉症；骨髄異形成症候群；骨髄異形成疾患／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病（慢性）；骨髄性白血病（成人急性）；骨髄性白血病（小児急性）；骨髄腫（多発性）（骨髄の癌）；骨髄増殖性障害（慢性）；鼻腔および副鼻腔の癌；鼻咽腔癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；口腔がん；口腔咽頭癌；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌（被蓋上皮−間質性腫瘍）；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；膵臓癌（島細胞）；副鼻腔および鼻腔の癌；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；クロム親和性細胞腫；松果体星状細胞腫；松果体胚細胞腫；松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍（小児期）；下垂体腺腫；形質細胞新形成／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞癌（腎臓癌）；腎盂および尿管の移行細胞癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫（小児期）；唾液腺癌；肉腫（ユーイング腫瘍ファミリー）；肉腫（カポジ）；肉腫（軟部組織）；肉腫（子宮）；セザリー症候群；皮膚癌（非黒色腫）；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌腫（メルケル細胞）；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌（皮膚癌（非黒色腫）を参照のこと）；原発巣不明の扁平上皮頸部癌（転移性）；胃癌；テント上原始神経外胚葉腫瘍（小児期）；Ｔ細胞リンパ腫（皮膚）（菌状息肉症およびセザリー症候群）；睾丸癌；咽頭癌；胸腺腫（小児期）；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺癌（小児期）；腎盂および尿管の移行細胞癌；絨毛性腫瘍（妊娠性）；原発部位不明の癌腫（成人）；原発部位不明の癌（小児期）；尿管および腎盂（移行細胞癌）；尿道癌；子宮癌（子宮内膜）；子宮肉腫；膣癌；視覚路および視床下部の膠腫（小児期）；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍（腎臓癌）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中に記載のＣＭＶベクターにより、組換えヒトまたは動物ＣＭＶを含む異種ＤＮＡのクローニングまたは発現のためのベクターが得られる。異種ＤＮＡは、目的のエピトープ、生物学的応答モジュレーター、成長因子、認識配列、治療遺伝子、または融合タンパク質を含む発現産物をコードすることができる。
【００２２】
本明細書中に開示のＣＭＶベクターを、組換えＣＭＶウイルスまたはベクターおよび薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物として使用することができる。組換えＣＭＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含む免疫学的組成物は、免疫学的応答（局所または全身）を誘発する。応答は、防御的であり得るが、その必要はない。組換えＣＭＶウイルスまたはベクター（またはその発現産物）を含む免疫原性組成物は、同様に、防御的であり得るが、その必要はない局所または全身の免疫学的応答を誘発する。ワクチン組成物は、局所または全身の防御応答を誘発する。したがって、用語「免疫学的組成物」および「免疫原性組成物」には「ワクチン組成物」が含まれる（前者の２つの用語が防御的組成物であり得る場合）。
【００２３】
本明細書中に開示のＣＭＶベクターにより、被験体において免疫学的応答を誘導する方法であって、組換えＣＭＶウイルスまたはベクターおよび薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法が得られる。本明細書の目的のために、用語「被験体」には全ての動物（非ヒト霊長類およびヒトが含まれる）が含まれ、一方、「動物」にはヒト以外の全ての脊椎動物種が含まれ、「脊椎動物」には全ての脊椎動物（動物（「動物」を本明細書中で使用する場合）およびヒトが含まれる）が含まれる。勿論、「動物」のサブセットは「哺乳動物」であり、本明細書の目的のために、ヒト以外の全ての哺乳動物が含まれる。
【００２４】
本明細書中に開示のＣＭＶベクターを、組換えＣＭＶウイルスまたはベクターおよび薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む治療組成物中で使用することができる。治療組成物は、本発明の遺伝子療法および免疫療法における実施形態（例えば、宿主に組成物を投与する工程を含む遺伝情報を必要とする動物またはヒトに遺伝情報を伝達する方法）で有用であり、したがって、本発明は、遺伝情報の伝達方法を含む。
【００２５】
本明細書中に開示のＣＭＶベクターを、タンパク質または遺伝子産物または発現産物を発現する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞を本発明の組換えＣＭＶウイルスまたはベクターで感染またはトランスフェクトする工程、および、任意選択的に、細胞から前記タンパク質、遺伝子産物、発現産物、またはＤＮＡを抽出、精製、または単離する工程を含む、方法で使用することができる。さらに、本発明は、異種ＤＮＡ配列をクローニングまたは複製する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて細胞を本発明の組換えＣＭＶウイルスまたはベクターで感染またはトランスフェクトする工程、および、任意選択的に、細胞または子孫ウイルスから前記ＤＮＡを抽出、精製、または単離する工程を含む、方法を提供する。
【００２６】
本明細書中に開示のＣＭＶベクターを、異種抗原をコードする配列を含むＤＮＡをＣＭＶゲノムの非必須領域に挿入することによって調製することができる。本方法は、ＣＭＶゲノム由来の１つ以上の領域を欠失する工程をさらに含むことができる。本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを含むことができる。したがって、本方法は、ＣＭＶゲノムの一部と相同なＤＮＡ配列に隣接する異種ＤＮＡを含むドナーＤＮＡの存在下で細胞適合培地中にて細胞をＣＭＶ  ＤＮＡでトランスフェクトし、それにより、異種ＤＮＡがＣＭＶゲノムに導入される工程、および、任意選択的に、次いでｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによって改変されたＣＭＶを回収する工程を含むことができる。本方法はまた、ＣＭＶ  ＤＮＡを切断して切断ＣＭＶ  ＤＮＡを得る工程、異種ＤＮＡを切断されたＣＭＶ  ＤＮＡにライゲートしてハイブリッドＣＭＶ−異種ＤＮＡを得る工程、細胞をハイブリッドＣＭＶ−異種ＤＮＡでトランスフェクトする工程、および、任意選択的に、異種ＤＮＡの存在によって改変されたＣＭＶを回収する工程を含むことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを包含するので、本方法により、ＣＭＶとは無関係のポリペプチドをコードするＣＭＶ中に天然に存在しないドナーＤＮＡを含むプラスミドも得られ、前記ドナーＤＮＡは、ＣＭＶ  ＤＮＡのセグメント内に存在し、そうでなければ、ＣＭＶの非必須領域由来のＤＮＡがドナーＤＮＡに隣接するようにＣＭＶゲノムの非必須領域と同一線上に存在するであろう。異種ＤＮＡをＣＭＶに挿入して前記ＤＮＡが安定に組み込まれる任意の配置で組換えＣＭＶを生成し、必要に応じて、発現させることができる。
【００２７】
組換えＣＭＶベクター中の異種抗原をコードするＤＮＡは、プロモーターを含むこともできる。プロモーターは、ヘルペスウイルスなどの任意の供給源に由来し得る（ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）、アカゲザルＣＭＶ（ＲｈＣＭＶ）、マウス、または他のＣＭＶプロモーターなどの内因性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが含まれる）。プロモーターはまた、ＥＦ１αプロモーターなどの非ウイルスプロモーターであり得る。プロモーターは、ウイルスによって提供されたトランス活性化タンパク質を使用してトランス活性化される領域および短縮転写活性プロモーターが由来する全長プロモーターの最小プロモーター領域を含む短縮転写活性プロモーターであり得る。本明細書の目的のために、プロモーターは、最小プロモーターに対応するＤＮＡ配列および上流調節配列の会合物から構成される。最小プロモーターは、ＣＡＰ部位＋ＴＡＴＡボックス（基本的レベルの転写のための最小配列；無制御レベルの転写）から構成され、「上流調節配列」は、上流エレメントおよびエンハンサー配列から構成される。さらに、用語「短縮された」は、全長プロモーターが完全な状態で存在しないこと（すなわち、全長プロモーターのいくつかの部分が除去されていること）を示す。さらに、短縮プロモーターは、ＭＣＭＶまたはＨＣＭＶ（例えば、ＨＣＭＶ−ＩＥまたはＭＣＭＶ−ＩＥ）などのヘルペスウイルスに由来し得る。
【００２８】
前述のプロモーターのように、本発明のプロモーターは、ヘルペスウイルス（例えば、ＭＣＭＶ−ＩＥプロモーターまたはＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターなどのＭＣＭＶまたはＨＣＭＶ）であってよく、塩基対に基づいて、全長プロモーターの４０％まで、さらに９０％までサイズを小さくすることができる。プロモーターはまた、改変非ウイルスプロモーターであり得る。
【００２９】
短縮転写活性プロモーターを含む組換えウイルスまたはプラスミドに挿入することができる発現カセットも開示する。発現カセットは、さらに、機能的な短縮ポリアデニル化シグナル（例えば、短縮されているが、依然として機能的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）を含むことができる。本来はより大きなシグナルであることを考慮すると、短縮ポリアデニル化シグナルが機能的であり、且つ短縮ポリアデニル化シグナルがＣＭＶなどの組換えウイルスのインサートサイズ制限の問題に対応することは実際に驚くべきことである。発現カセットは挿入されるウイルスまたは系に関して異種のＤＮＡを含むこともでき、このＤＮＡは本明細書中に記載の異種ＤＮＡであり得る。
【００３０】
より特異的態様では、本発明は、ＣＭＶ、ウイルスプロモーターまたは非ウイルスプロモーターを含む組換え体、およびこれら由来の短縮プロモーターを含む。本発明は、さらに、本発明の組成物および／または組換え体によって誘発される抗体およびかかる抗体の使用を包含する。抗体、抗体を誘発する生成物（目的のエピトープ）、または前記抗体由来のモノクローナル抗体を、結合アッセイ、結合試験、または結合キットで使用して抗原または抗体の有無を決定することができる。
【００３１】
本発明で使用される隣接ＤＮＡは、挿入部位または挿入部位に隣接するゲノム部分（ここで、「隣接する」には、連続した配列（例えば、コドン）およびその前に介在挿入部位が存在する配列（例えば、コドン）が含まれる）に由来し得る。
【００３２】
ワクチン組成物または免疫学的組成物で用いる抗原に関しては、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ２４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８２（例えば、ワクチンの定義（ワクチン処方で使用される抗原のリストについて；かかる抗原または抗原由来の目的のエピトープを、本発明において、本発明の組換えウイルスの発現産物としてか、本発明の組換えウイルスまたは本発明の組換えウイルスに由来する発現産物を含む多価組成物中のいずれかで使用することができる）も参照のこと。
【００３３】
異種抗原に関して、当業者は、異種抗原およびそのコードＤＮＡを、過度に実験することなく、アミノ酸およびペプチドまたはポリペプチドの対応するＤＮＡ配列の知識ならびに特定のアミノ酸の性質（例えば、サイズ、電荷など）およびコドンディクショナリーから選択することができる。
【００３４】
配列に関して、ＤＮＡ配列は、少なくとも抗体応答またはＴ細胞応答、特にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じる抗原の領域をコードすることが好ましい。Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープを決定するための１つの方法は、エピトープマッピングを含む。異種抗原のオーバーラッピングペプチドを、オリゴ−ペプチド合成によって生成する。次いで、個別のペプチドを、未変性タンパク質によって誘発される抗体に結合するか、Ｔ細胞活性化またはＢ細胞活性化を誘導する能力について試験する。Ｔ細胞がＭＨＣ分子と複合体化した短い直鎖ペプチドを認識するので、このアプローチは、Ｔ細胞エピトープのマッピングで特に有用であった。
【００３５】
異種抗原に対する免疫応答は、一般に、以下のように生成される：タンパク質がより小さなペプチドに切断され、別の細胞表面上に存在する「主要組織適合性遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）」と呼ばれる複合体中に提示される場合に限り、Ｔ細胞はタンパク質を認識する。ＭＨＣ複合体には２つのクラス（クラスＩおよびクラスＩＩ）が存在し、各クラスは多数の異なる対立遺伝子で構成されている。異なる種および個別の被験体は異なるＭＨＣ複合体対立遺伝子タイプを有し、これらのタイプを、異なるＨＬＡタイプを有するという。
【００３６】
異種抗原をコードする配列を含むＤＮＡ自体がＣＭＶベクター中での発現の駆動のためのプロモーターを含むことができるか、ＤＮＡを異種抗原のコードＤＮＡに制限することができることに留意する。この構築物を、内因性ＣＭＶプロモーターに関して、前記構築物が前記プロモーターに作動可能に連結され、それにより、発現されるように配置することができる。さらに、発現を増幅または増加させるために、異種抗原をコードする複数のＤＮＡコピーまたは強力プロモーターもしくは初期プロモーターまたは初期プロモーターもしくは後期プロモーター、あるいはその組み合わせを使用することができる。したがって、異種抗原をコードするＤＮＡをＣＭＶ内因性プロモーターに関して適切に配置することができるか、これらのプロモーターを、異種抗原をコードするＤＮＡと共に別の位置に挿入されるように移動させることができる。１つを超える異種抗原をコードする核酸を、ＣＭＶベクター中にパッケージングすることができる。
【００３７】
開示のＣＭＶベクターを含む薬学的組成物および他の組成物をさらに開示する。かかる薬学的組成物および他の組成物を、当該分野で公知の任意の投与手順で使用されるように処方することができる。かかる薬学的組成物は、非経口経路（皮内、筋肉内、皮下、または静脈内など）を介することができる。投与はまた、粘膜経路（例えば、経口、鼻腔、生殖器など）を介し得る。
【００３８】
開示の薬学的組成物を、薬学分野の当業者に周知の標準的な技術にしたがって調製することができる。かかる組成物を、特定の患者の種族または種、年齢、性別、体重、および容態、ならびに投与経路などの要因を考慮して、医学分野の当業者に周知の投薬量および技術によって投与することができる。組成物を、単独で投与することができるか、他のＣＭＶベクターまたは他の免疫学的組成物、抗原性組成物、ワクチン組成物、もしくは治療組成物を用いて同時または連続的に投与することができる。かかる他の組成物は、精製された未変性の抗原もしくはエピトープまたは組換えＣＭＶもしくは他のベクター系による発現由来の抗原もしくはエピトープを含むことができ、この組成物を、前述の要因を考慮して投与する。
【００３９】
本発明の組成物の例には、開口部（例えば、経口、鼻腔、肛門、生殖器（例えば、膣など））への投与のための液体調製物（懸濁液、シロップ、またはエリキシルなど）および非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内への投与（例えば、注射による投与）のための調製物（滅菌懸濁液または乳濁液など）が含まれる。かかる組成物では、組換え体は、適切なキャリア、希釈剤、または賦形剤（滅菌水、生理食塩水、またはグルコースなど）との混合物で存在し得る。
【００４０】
抗原性組成物、免疫原性組成物、またはワクチン組成物は、典型的には、アジュバントおよび所望の応答が誘発される量のＣＭＶベクターまたは発現産物を含むことができる。ヒトへの適用において、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）は典型的なアジュバントである。研究および動物に適用するために使用されるサポニンおよびその精製成分であるＱｕｉｌＡ、フロイント完全アジュバントおよび他のアジュバントは、ヒトワクチンでの使用可能性を制限する毒性を有する。ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、リン脂質抱合体などの化学的に定義された調製物（Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）に記載のものなど）、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９−１７４４（１９９２）に記載のプロテオリポソーム内へのタンパク質のカプセル化、およびＮｏｖａｓｏｍｅ脂質小胞などの脂質小胞中へのタンパク質のカプセル化（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，Ｎ．Ｈ．）も使用することができる。
【００４１】
組成物を、非経口（すなわち、筋肉内、皮内、または皮下）投与または開口部投与（例えば、舌下（例えば、経口）、胃内、粘膜（口腔内、肛門内、および膣内への投与などが含まれる）による免疫のための単回投薬形態にパッケージングすることができる。また、有効な投薬量および投与経路を、組成物の性質、発現産物の性質、組換えＣＭＶを直接使用する場合の発現レベル、および公知の要因（宿主の種族または種、年齢、性別、体重、容態、および性質など）、ならびにＬＤ５０および公知であり且つ過度の実験を必要としない他のスクリーニング手順によって決定する。発現産物の投薬量は、数μｇから数百μｇまでの範囲であり得る（例えば、５〜５００μｇ）。ＣＭＶベクターを、これらの投薬量レベルで発現させるのに適切な任意の量で投与することができる。制限されない例では、ＣＭＶベクターを少なくとも１０２ｐｆｕの量で投与することができる、したがって、ＣＭＶベクターを少なくともこの量で投与することができるか、約１０２ｐｆｕ〜約１０７ｐｆｕの範囲で投与することができる。他の適切なキャリアまたは希釈剤は、防腐剤と含むか含まない水または緩衝化生理食塩水であり得る。ＣＭＶベクターを投与時の再懸濁のために凍結乾燥させることができるか、溶液の形態であり得る。
【００４２】
キャリアはまた、ポリマー遅延放出系であり得る。合成ポリマーは、制御放出する組成物の処方で特に有用である。これの初期の例は、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｍ．Ｄｏｎｂｒｏｗ（Ｅｄ）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．１２５−１４８で報告されたいわゆるナノ粒子を形成するための直径が１ミクロン未満の球体へのメチルメタクリラートの重合であった。
【００４３】
マイクロカプセル化は、制御放出を得るためにマイクロカプセル化した医薬品の注射に適用されている。マイクロカプセル化のための特定のポリマーの選択に多数の要因が寄与する。ポリマー合成およびマイクロカプセル化過程の再現性、マイクロカプセル化の材料および過程の費用、毒性プロフィール、ポリマーの変動する放出動態および物理化学的適合性の要件、ならびに抗原は全て、考慮しなければならない要因である。有用なポリマーの例は、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタン、ポリオルソエステル、およびポリアミド、特に生分解性のものである。
【００４４】
医薬品、より最近では抗原のためのキャリアは、ポリ（ｄ，１−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）が頻繁に選択される。これは、浸食性縫合糸、骨板、および他の一過性プロテーゼにおける医学的使用歴が長く、いかなる毒性も示していない生分解性ポリエステルである。広範な種々の医薬品（ペプチドおよび抗原が含まれる）が、ＰＬＧＡマイクロカプセルに処方されている。抗原の制御放出のためのＰＬＧＡの適応に関して多数のデータが蓄積されており、例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９８９，１４６：５９−６６によって概説されている。直径１〜１０ミクロンのＰＬＧＡミクロスフィアへの抗原の捕捉は、経口投与した場合に顕著なアジュバント効果を有することが示されている。ＰＬＧＡマイクロカプセル化過程は、油中水型乳濁液の相分離を使用する。目的の化合物を水溶液として調製し、ＰＬＧＡを塩化メチレンおよび酢酸エチルなどの適切な有機溶媒に溶解する。これら２つの不混和性溶液を、高速攪拌によって同時乳化する。次いで、ポリマーのための非溶媒を添加し、それにより、水滴の周囲にポリマーが沈殿して初期のマイクロカプセルが形成される。マイクロカプセルを回収し、一連の薬剤（ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ゼラチン、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース）のうちの１つを用いて安定化させ、真空乾燥または溶媒抽出のいずれかによって溶媒を除去する。
【００４５】
ＨＣＭＶプロモーターに関しては、米国特許第５，１６８，０６２号および同第５，３８５，８３９号を参照する。細胞からの発現のためのプラスミドＤＮＡでの細胞のトランスフェクションに関しては、Ｆｅｌｇｎｅｒら，（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１を参照する。さらに、種々の感染症に対する簡潔且つ有効なワクチン接種法としてのプラスミドＤＮＡの直接注射に関しては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５−４９，１９９３を参照する。したがって、ベクターＤＮＡの直接注射によってベクターを使用することができることは本発明の範囲内である。
【００４６】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「アミノ酸配列」を、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーをいうために本明細書中で互換的に使用する。ポリマーは、直鎖または分岐鎖であってよく、改変アミノ酸またはアミノ酸アナログを含むことができ、アミノ酸以外の化学的部分を挿入することができる。これらの用語はまた、天然または介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変（標識成分または生体活性成分との抱合など）によって改変されたアミノ酸ポリマーを含む。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「抗原」または「免疫原」を、被験体において免疫応答を誘導することができる物質、典型的にはタンパク質をいうために互換的に使用する。この用語はまた、一旦被験体に投与した場合に（直接かタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはベクターを被験体に投与することによる）そのタンパク質に対して体液性および／または細胞性の免疫応答を惹起することができるという意味において免疫学的に活性なタンパク質をいう。
【００４８】
タンパク質およびタンパク質をコードする核酸が本明細書中に例示および記載の正確な配列と異なり得ると理解すべきである。したがって、本発明は、配列が本発明の方法にしたがって機能する限り、示した配列の欠失、付加、短縮、および置換を含む。これに関して、置換は、一般に、事実上保存的であろう（すなわち、アミノ酸ファミリー内で起こる置換）。例えば、アミノ酸は、一般に、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として分類される。ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、またはその逆；アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換またはその逆；トレオニンのセリンとの単独置換またはその逆；またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと合理的に予測可能である。したがって、例示および記載の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を保有するタンパク質は、本発明の範囲内である。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、用語「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列（伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または合成核酸が含まれるが、これらに限定されない）をいう。核酸は、一本鎖であり得るか、部分的または完全に二本鎖（二重鎖）であり得る。二重鎖核酸は、ホモ二重鎖またはヘテロ二重鎖であり得る。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「導入遺伝子」を、本発明のタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列に由来し得る「組換え」ヌクレオチド配列をいうために使用することができる。用語「組換え」は、「人によって」操作されており、天然では生じないか、別のヌクレオチド配列に連結しているか、天然では異なる配置で認められるヌクレオチド配列を意味する。「人によって」操作されたとは、装置、コドン最適化、制限酵素の使用などが含まれるいくつかの人為的手段によって操作されたことを意味すると理解される。異種抗原をコードするＣＭＶベクターは、定義によれば組換えＣＭＶベクターである。
【００５１】
ヌクレオチド配列をコドン最適化することができる、例えば、コドンを、ヒト細胞での使用のために最適化することができる。例えば、任意のウイルス配列または細菌配列をそのようにして変更することができる。多くのウイルス（ＨＩＶおよび他のレンチウイルスが含まれる）は多数の稀なコドンを使用し、Ａｎｄｒｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４９７−１５０３，１９９８に記載のように、所望の被験体で一般的に使用されるコドンに対応するようにこれらのコドンを変更することにより、異種抗原の発現を増強することができる。
【００５２】
ＣＭＶベクターおよびこのベクター中に含まれる糖タンパク質の機能的におよび／または抗原的に等価なバリアントおよび誘導体をコードするヌクレオチド配列を意図する。これらの機能的に等価なバリアント、誘導体、およびフラグメントは、抗原活性を保持する能力を示す。例えば、コードされたアミノ酸配列を変化させないＤＮＡ配列の変化、ならびにアミノ酸残基の保存的な置換、１つまたは少数のアミノ酸の欠失または付加、およびアミノ酸残基のアミノ酸アナログとの置換をもたらす変化は、コードされたポリペプチドの性質に有意に影響を及ぼさない変化である。保存的アミノ酸置換は、グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン／メチオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン／トリプトファンである。１つの実施形態では、バリアントは、目的の抗原、エピトープ、免疫原、ペプチド、またはポリペプチドと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同または同一である。
【００５３】
配列の同一性または相同性を、配列ギャップを最小にしながら重複および同一性を最大にするように整列させた時に配列を比較することによって決定する。特に、配列同一性を、いくつかの数学アルゴリズムのうちのいずれかを使用して決定することができる。２配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３；９０：５８７３−５８７７で認められるように修正したＫａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０；８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。
【００５４】
配列比較のために使用される数学アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ＆Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ  １９８８；４：１１−１７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムを、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。アミノ酸配列比較用のＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。局所配列同一性およびアラインメントの領域を同定するためのさらに別の有用なアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４−２４４８に記載のＦＡＳＴＡアルゴリズムである。
【００５５】
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＢＬＡＳＴ）バージョン２．０ソフトウェアが本発明での使用に有利である。いくつかのＵＮＩＸプラットフォームのためのＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン２．０実行プログラムを、ｆｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓからダウンロードすることができる。このプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づき、これはさらにパブリックドメインＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴバージョン１．４に基づく（Ａｌｔｓｃｈｕｌ＆Ｇｉｓｈ，１９９６，Ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９０；２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ＆Ｓｔａｔｅｓ，１９９３；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２；Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７；その全てが本明細書中で参考として援用される）。
【００５６】
種々の本発明の組換えヌクレオチド配列および抗体および／または抗原を、標準的な組換えＤＮＡおよびクローニング技術を使用して作製する。かかる技術は当業者に周知である。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を参照のこと。
【００５７】
本発明のヌクレオチド配列を、「ベクター」に挿入することができる。用語「ベクター」は、当業者によって広く使用され、理解されており、本明細書中で使用する場合、用語「ベクター」を、当業者が理解する意味と一致する意味で使用する。例えば、用語「ベクター」は、ある環境から別の環境への核酸分子の移行が可能であるか容易にするビヒクルまたは核酸分子の操作が可能であるか容易にするビヒクルをいうために当業者によって一般的に使用される。
【００５８】
本発明のウイルスを発現させる任意のベクターを、本発明にしたがって使用することができる。一定の実施形態では、本発明のウイルスを、コードされたＨＩＶ−抗原および／または抗体を産生するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞発現系を使用するなど）でおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた培養細胞中で使用することができ、次いで、タンパク様ワクチンの産生などの種々の適用のために使用することができる。かかる適用のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／または培養細胞中でウイルスを発現可能な任意のベクターを使用することができる。
【００５９】
発現させるべき本発明の異種抗原のために、異種抗原のタンパク質コード配列を、タンパク質の転写および翻訳を指示する制御配列または核酸調節配列に「作動可能に連結」すべきである。本明細書中で使用する場合、コード配列および核酸調節配列またはプロモーターは、これらが核酸調節配列の影響下または調節下でコード配列を発現または転写および／または翻訳するような方法で共有結合的に連結する場合、「作動可能に連結された」という。「核酸調節配列」は、任意の核酸エレメント（プロモーター、エンハンサー、ＩＲＥＳ、イントロン、および作動可能に連結された核酸配列またはコード配列の発現を指示する本明細書中に記載の他のエレメントなどであるが、これらに限定されない）であり得る。用語「プロモーター」を、本明細書中で、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位周囲にクラスター化し、本発明のタンパク質コード配列に作動可能に連結された場合にコードされたタンパク質を発現させる転写調節モジュール群をいうために使用されるであろう。本発明の導入遺伝子の発現は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にあってよく、いくつかの特定の外部刺激（テトラサイクリンなどの抗生物質、エクジソンなどのホルモン、または重金属などであるが、これらに限定されない）に暴露された場合のみ転写を開始する。プロモーターはまた、特定の細胞型、組織、または器官に特異的であり得る。多数の適切なプロモーターおよびエンハンサーは当該分野で公知であり、任意のかかる適切なプロモーターまたはエンハンサーを、本発明の導入遺伝子の発現のために使用することができる。例えば、適切なプロモーターおよび／またはエンハンサーを、真核生物プロモーターデータベース（ＥＰＤＢ）から選択することができる。
【００６０】
本発明は、外来エピトープを発現する組換えウイルスベクターに関する。有利には、エピトープはＨＩＶエピトープである。有利な実施形態では、ＨＩＶエピトープは、本発明のタンパク質フラグメントであるが、本発明は、さらなるＨＩＶ抗原、エピトープ、または免疫原を含むことができる。有利には、ＨＩＶエピトープは、以下の米国特許のＨＩＶ抗原が含まれるが、これらに限定されないＨＩＶ抗原である：米国特許第７，３４１，７３１号；同第７，３３５，３６４号；同第７，３２９，８０７号；同第７，３２３，５５３号；同第７，３２０，８５９号；同第７，３１１，９２０号；同第７，３０６，７９８号；同第７，２８５，６４６号；同第７，２８５，２８９号；同第７，２８５，２７１号；同第７，２８２，３６４号；同第７，２７３，６９５号；同第７，２７０，９９７号；同第７，２６２，２７０号；同第７，２４４，８１９号；同第７，２４４，５７５号；同第７，２３２，５６７号；同第７，２３２，５６６号；同第７，２２３，８４４号；同第７，２２３，７３９号；同第７，２２３，５３４号；同第７，２２３，３６８号；同第７，２２０，５５４号；同第７，２１４，５３０号；同第７，２１１，６５９号；同第７，２１１，４３２号；同第７，２０５，１５９号；同第７，１９８，９３４号；同第７，１９５，７６８号；同第７，１９２，５５５号；同第７，１８９，８２６号；同第７，１８９，５２２号；同第７，１８６，５０７号；同第７，１７９，６４５号；同第７，１７５，８４３号；同第７，１７２，７６１号；同第７，１６９，５５０号；同第７，１５７，０８３号；同第７，１５３，５０９号；同第７，１４７，８６２号；同第７，１４１，５５０号；同第７，１２９，２１９号；同第７，１２２，１８８号；同第７，１１８，８５９号；同第７，１１８，８５５号；同第７，１１８，７５１号；同第７，１１８，７４２号；同第７，１０５，６５５号；同第７，１０１，５５２号；同第７，０９７，９７１号；同第７，０９７，８４２号；同第７，０９４，４０５号；同第７，０９１，０４９号；同第７，０９０，６４８号；同第７，０８７，３７７号；同第７，０８３，７８７号；同第７，０７０，７８７号；同第７，０７０，７８１号；同第７，０６０，２７３号；同第７，０５６，５２１号；同第７，０５６，５１９号；同第７，０４９，１３６号；同第７，０４８，９２９号；同第７，０３３，５９３号；同第７，０３０，０９４号；同第７，０２２，３２６号；同第７，００９，０３７号；同第７，００８，６２２号；同第７，００１，７５９号；同第６，９９７，８６３号；同第６，９９５，００８号；同第６，９７９，５３５号；同第６，９７４，５７４号；同第６，９７２，１２６号；同第６，９６９，６０９号；同第６，９６４，７６９号；同第６，９６４，７６２号；同第６，９５８，１５８号；同第６，９５６，０５９号；同第６，９５３，６８９号；同第６，９５１，６４８号；同第６，９４６，０７５号；同第６，９２７，０３１号；同第６，９１９，３１９号；同第６，９１９，３１８号；同第６，９１９，０７７号；同第６，９１３，７５２号；同第６，９１１，３１５号；同第６，９０８，６１７号；同第６，９０８，６１２号；同第６，９０２，７４３号；同第６，９００，０１０号；同第６，８９３，８６９号；同第６，８８４，７８５号；同第６，８８４，４３５号；同第６，８７５，４３５号；同第６，８６７，００５号；同第６，８６１，２３４号；同第６，８５５，５３９号；同第６，８４１，３８１号；同第６，８４１，３４５号；同第６，８３８，４７７号；同第６，８２１，９５５号；同第６，８１８，３９２号；同第６，８１８，２２２号；同第６，８１５，２１７号；同第６，８１５，２０１号；同第６，８１２，０２６号；同第６，８１２，０２５号；同第６，８１２，０２４号；同第６，８０８，９２３号；同第６，８０６，０５５号；同第６，８０３，２３１号；同第６，８００，６１３号；同第６，８００，２８８号；同第６，７９７，８１１号；同第６，７８０，９６７号；同第６，７８０，５９８号；同第６，７７３，９２０号；同第６，７６４，６８２号；同第６，７６１，８９３号；同第６，７５３，０１５号；同第６，７５０，００５号；同第６，７３７，２３９号；同第６，７３７，０６７号；同第６，７３０，３０４号；同第６，７２０，３１０号；同第６，７１６，８２３号；同第６，７１３，３０１号；同第６，７１３，０７０号；同第６，７０６，８５９号；同第６，６９９，７２２号；同第６，６９９，６５６号；同第６，６９６，２９１号；同第６，６９２，７４５号；同第６，６７０，１８１号；同第６，６７０，１１５号；同第６，６６４，４０６号；同第６，６５７，０５５号；同第６，６５７，０５０号；同第６，６５６，４７１号；同第６，６５３，０６６号；同第６，６４９，４０９号；同第６，６４９，３７２号；同第６，６４５，７３２号；同第６，６４１，８１６号；同第６，６３５，４６９号；同第６，６１３，５３０号；同第６，６０５，４２７号；同第６，６０２，７０９号；同第６，６０２，７０５号；同第６，６００，０２３号；同第６，５９６，４７７号；同第６，５９６，１７２号；同第６，５９３，１０３号；同第６，５９３，０７９号；同第６，５７９，６７３号；同第６，５７６，７５８号；同第６，５７３，２４５号；同第６，５７３，０４０号；同第６，５６９，４１８号；同第６，５６９，３４０号；同第６，５６２，８００号；同第６，５５８，９６１号；同第６，５５１，８２８号；同第６，５５１，８２４号；同第６，５４８，２７５号；同第６，５４４，７８０号；同第６，５４４，７５２号；同第６，５４４，７２８号；同第６，５３４，４８２号；同第６，５３４，３１２号；同第６，５３４，０６４号；同第６，５３１，５７２号；同第６，５３１，３１３号；同第６，５２５，１７９号；同第６，５２５，０２８号；同第６，５２４，５８２号；同第６，５２１，４４９号；同第６，５１８，０３０号；同第６，５１８，０１５号；同第６，５１４，６９１号；同第６，５１４，５０３号；同第６，５１１，８４５号；同第６，５１１，８１２号；同第６，５１１，８０１号；同第６，５０９，３１３号；同第６，５０６，３８４号；同第６，５０３，８８２号；同第６，４９５，６７６号；同第６，４９５，５２６号；同第６，４９５，３４７号；同第６，４９２，１２３号；同第６，４８９，１３１号；同第６，４８９，１２９号；同第６，４８２，６１４号；同第６，４７９，２８６号；同第６，４７９，２８４号；同第６，４６５，６３４号；同第６，４６１，６１５号；同第６，４５８，５６０号；同第６，４５８，５２７号；同第６，４５８，３７０号；同第６，４５１，６０１号；同第６，４５１，５９２号；同第６，４５１，３２３号；同第６，４３６，４０７号；同第６，４３２，６３３号；同第６，４２８，９７０号；同第６，４２８，９５２号；同第６，４２８，７９０号；同第６，４２０，１３９号；同第６，４１６，９９７号；同第６，４１０，３１８号；同第６，４１０，０２８号；同第６，４１０，０１４号；同第６，４０７，２２１号；同第６，４０６，７１０号；同第６，４０３，０９２号；同第６，３９９，２９５号；同第６，３９２，０１３号；同第６，３９１，６５７号；同第６，３８４，１９８号；同第６，３８０，１７０号；同第６，３７６，１７０号；同第６，３７２，４２６号；同第６，３６５，１８７号；同第６，３５８，７３９号；同第６，３５５，２４８号；同第６，３５５，２４７号；同第６，３４８，４５０号；同第６，３４２，３７２号；同第６，３４２，２２８号；同第６，３３８，９５２号；同第６，３３７，１７９号；同第６，３３５，１８３号；同第６，３３５，０１７号；同第６，３３１，４０４号；同第６，３２９，２０２号；同第６，３２９，１７３号；同第６，３２８，９７６号；同第６，３２２，９６４号；同第６，３１９，６６６号；同第６，３１９，６６５号；同第６，３１９，５００号；同第６，３１９，４９４号；同第６，３１６，２０５号；同第６，３１６，００３号；同第６，３０９，６３３号；同第６，３０６，６２５号；同第６，２９６，８０７号；同第６，２９４，３２２号；同第６，２９１，２３９号；同第６，２９１，１５７号；同第６，２８７，５６８号；同第６，２８４，４５６号；同第６，２８４，１９４号；同第６，２７４，３３７号；同第６，２７０，９５６号；同第６，２７０，７６９号；同第６，２６８，４８４号；同第６，２６５，５６２号；同第６，２６５，１４９号；同第６，２６２，０２９号；同第６，２６１，７６２号；同第６，２６１，５７１号；同第６，２６１，５６９号；同第６，２５８，５９９号；同第６，２５８，３５８号；同第６，２４８，３３２号；同第６，２４５，３３１号；同第６，２４２，４６１号；同第６，２４１，９８６号；同第６，２３５，５２６号；同第６，２３５，４６６号；同第６，２３２，１２０号；同第６，２２８，３６１号；同第６，２２１，５７９号；同第６，２１４，８６２号；同第６，２１４，８０４号；同第６，２１０，９６３号；同第６，２１０，８７３号；同第６，２０７，１８５号；同第６，２０３，９７４号；同第６，１９７，７５５号；同第６，１９７，５３１号；同第６，１９７，４９６号；同第６，１９４，１４２号；同第６，１９０，８７１号；同第６，１９０，６６６号；同第６，１６８，９２３号；同第６，１５６，３０２号；同第６，１５３，４０８号；同第６，１５３，３９３号；同第６，１５３，３９２号；同第６，１５３，３７８号；同第６，１５３，３７７号；同第６，１４６，６３５号；同第６，１４６，６１４号；同第６，１４３，８７６号；同第６，１４０，０５９号；同第６，１４０，０４３号；同第６，１３９，７４６号；同第６，１３２，９９２号；同第６，１２４，３０６号；同第６，１２４，１３２号；同第６，１２１，００６号；同第６，１２０，９９０号；同第６，１１４，５０７号；同第６，１１４，１４３号；同第６，１１０，４６６号；同第６，１０７，０２０号；同第６，１０３，５２１号；同第６，１００，２３４号；同第６，０９９，８４８号；同第６，０９９，８４７号；同第６，０９６，２９１号；同第６，０９３，４０５号；同第６，０９０，３９２号；同第６，０８７，４７６号；同第６，０８３，９０３号；同第６，０８０，８４６号；同第６，０８０，７２５号；同第６，０７４，６５０号；同第６，０７４，６４６号；同第６，０７０，１２６号；同第６，０６３，９０５号；同第６，０６３，５６４号；同第６，０６０，２５６号；同第６，０６０，０６４号；同第６，０４８，５３０号；同第６，０４５，７８８号；同第６，０４３，３４７号；同第６，０４３，２４８号；同第６，０４２，８３１号；同第６，０３７，１６５号；同第６，０３３，６７２号；同第６，０３０，７７２号；同第６，０３０，７７０号；同第６，０３０，６１８号；同第６，０２５，１４１号；同第６，０２５，１２５号；同第６，０２０，４６８号；同第６，０１９，９７９号；同第６，０１７，５４３号；同第６，０１７，５３７号；同第６，０１５，６９４号；同第６，０１５，６６１号；同第６，０１３，４８４号；同第６，０１３，４３２号；同第６，００７，８３８号；同第６，００４，８１１号；同第６，００４，８０７号；同第６，００４，７６３号；同第５，９９８，１３２号；同第５，９９３，８１９号；同第５，９８９，８０６号；同第５，９８５，９２６号；同第５，９８５，６４１号；同第５，９８５，５４５号；同第５，９８１，５３７号；同第５，９８１，５０５号；同第５，９８１，１７０号；同第５，９７６，５５１号；同第５，９７２，３３９号；同第５，９６５，３７１号；同第５，９６２，４２８号；同第５，９６２，３１８号；同第５，９６１，９７９号；同第５，９６１，９７０号；同第５，９５８，７６５号；同第５，９５８，４２２号；同第５，９５５，６４７号；同第５，９５５，３４２号；同第５，９５１，９８６号；同第５，９５１，９７５号；同第５，９４２，２３７号；同第５，９３９，２７７号；同第５，９３９，０７４号；同第５
，９３５，５８０号；同第５，９２８，９３０号；同第５，９２８，９１３号；同第５，９２８，６４４号；同第５，９２８，６４２号；同第５，９２５，５１３号；同第５，９２２，５５０号；同第５，９２２，３２５号；同第５，９１９，４５８号；同第５，９１６，８０６号；同第５，９１６，５６３号；同第５，９１４，３９５号；同第５，９１４，１０９号；同第５，９１２，３３８号；同第５，９１２，１７６号；同第５，９１２，１７０号；同第５，９０６，９３６号；同第５，８９５，６５０号；同第５，８９１，６２３号；同第５，８８８，７２６号；同第５，８８５，５８０号；同第５，８８５，５７８号；同第５，８７９，６８５号；同第５，８７６，７３１号；同第５，８７６，７１６号；同第５，８７４，２２６号；同第５，８７２，０１２号；同第５，８７１，７４７号；同第５，８６９，０５８号；同第５，８６６，６９４号；同第５，８６６，３４１号；同第５，８６６，３２０号；同第５，８６６，３１９号；同第５，８６６，１３７号；同第５，８６１，２９０号；同第５，８５８，７４０号；同第５，８５８，６４７号；同第５，８５８，６４６号；同第５，８５８，３６９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，８５８，３６６号；同第５，８５６，１８５号；同第５，８５４，４００号；同第５，８５３，７３６号；同第５，８５３，７２５号；同第５，８５３，７２４号；同第５，８５２，１８６号；同第５，８５１，８２９号；同第５，８５１，５２９号；同第５，８４９，４７５号；同第５，８４９，２８８号；同第５，８４３，７２８号；同第５，８４３，７２３号；同第５，８４３，６４０号；同第５，８４３，６３５号；同第５，８４０，４８０号；同第５，８３７，５１０号；同第５，８３７，２５０号；同第５，８３７，２４２号；同第５，８３４，５９９号；同第５，８３４，４４１号；同第５，８３４，４２９号；同第５，８３４，２５６号；同第５，８３０，８７６号；同第５，８３０，６４１号；同第５，８３０，４７５号；同第５，８３０，４５８号；同第５，８３０，４５７号；同第５，８２７，７４９号；同第５，８２７，７２３号；同第５，８２４，４９７号；同第５，８２４，３０４号；同第５，８２１，０４７号；同第５，８１７，７６７号；同第５，８１７，７５４号；同第５，８１７，６３７号；同第５，８１７，４７０号；同第５，８１７，３１８号；同第５，８１４，４８２号；同第５，８０７，７０７号；同第５，８０４，６０４号；同第５，８０４，３７１号；同第５，８００，８２２号；同第５，７９５，９５５号；同第５，７９５，７４３号；同第５，７９５，５７２号；同第５，７８９，３８８号；同第５，７８０，２７９号；同第５，７８０，０３８号；同第５，７７６，７０３号；同第５，７７３，２６０号；同第５，７７０，５７２号；同第５，７６６，８４４号；同第５，７６６，８４２号；同第５，７６６，６２５号；同第５，７６３，５７４号；同第５，７６３，１９０号；同第５，７６２，９６５号；同第５，７５９，７６９号；同第５，７５６，６６６号；同第５，７５３，２５８号；同第５，７５０，３７３号；同第５，７４７，６４１号；同第５，７４７，５２６号；同第５，７４７，０２８号；同第５，７３６，３２０号；同第５，７３６，１４６号；同第５，７３３，７６０号；同第５，７３１，１８９号；同第５，７２８，３８５号；同第５，７２１，０９５号；同第５，７１６，８２６号；同第５，７１６，６３７号；同第５，７１６，６１３号；同第５，７１４，３７４号；同第５，７０９，８７９号；同第５，７０９，８６０号；同第５，７０９，８４３号；同第５，７０５，３３１号；同第５，７０３，０５７号；同第５，７０２，７０７号；同第５，６９８，１７８号；同第５，６８８，９１４号；同第５，６８６，０７８号；同第５，６８１，８３１号；同第５，６７９，７８４号；同第５，６７４，９８４号；同第５，６７２，４７２号；同第５，６６７，９６４号；同第５，６６７，７８３号；同第５，６６５，５３６号；同第５，６６５，３５５号；同第５，６６０，９９０号；同第５，６５８，７４５号；同第５，６５８，５６９号；同第５，６４３，７５６号；同第５，６４１，６２４号；同第５，６３９，８５４号；同第５，６３９，５９８号；同第５，６３７，６７７号；同第５，６３７，４５５号；同第５，６３３，２３４号；同第５，６２９，１５３号；同第５，６２７，０２５号；同第５，６２２，７０５号；同第５，６１４，４１３号；同第５，６１０，０３５号；同第５，６０７，８３１号；同第５，６０６，０２６号；同第５，６０１，８１９号；同第５，５９７，６８８号；同第５，５９３，９７２号；同第５，５９１，８２９号；同第５，５９１，８２３号；同第５，５８９，４６６号；同第５，５８７，２８５号；同第５，５８５，２５４号；同第５，５８５，２５０号；同第５，５８０，７７３号；同第５，５８０，７３９号；同第５，５８０，５６３号；同第５，５７３，９１６号；同第５，５７１，６６７号；同第５，５６９，４６８号；同第５，５５８，８６５号；同第５，５５６，７４５号；同第５，５５０，０５２号；同第５，５４３，３２８号；同第５，５４１，１００号；同第５，５４１，０５７号；同第５，５３４，４０６号；同第５，５２９，７６５号；同第５，５２３，２３２号；同第５，５１６，８９５号；同第５，５１４，５４１号；同第５，５１０，２６４号；同第５，５００，１６１号；同第５，４８０，９６７号；同第５，４８０，９６６号；同第５，４７０，７０１号；同第５，４６８，６０６号；同第５，４６２，８５２号；同第５，４５９，１２７号；同第５，４４９，６０１号；同第５，４４７，８３８号；同第５，４４７，８３７号；同第５，４３９，８０９号；同第５，４３９，７９２号；同第５，４１８，１３６号；同第５，３９９，５０１号；同第５，３９７，６９５号；同第５，３９１，４７９号；同第５，３８４，２４０号；同第５，３７４，５１９号；同第５，３７４，５１８号；同第５，３７４，５１６号；同第５，３６４，９３３号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３５６，７７２号；同第５，３５４，６５４号；同第５，３４４，７５５号；同第５，３３５，６７３号；同第５，３３２，５６７号；同第５，３２０，９４０号；同第５，３１７，００９号；同第５，３１２，９０２号；同第５，３０４，４６６号；同第５，２９６，３４７号；同第５，２８６，８５２号；同第５，２６８，２６５号；同第５，２６４，３５６号；同第５，２６４，３４２号；同第５，２６０，３０８号；同第５，２５６，７６７号；同第５，２５６，５６１号；同第５，２５２，５５６号；同第５，２３０，９９８号；同第５，２３０，８８７号；同第５，２２７，１５９号；同第５，２２５，３４７号；同第５，２２１，６１０号；同第５，２１７，８６１号；同第５，２０８，３２１号；同第５，２０６，１３６号；同第５，１９８，３４６号；同第５，１８５，１４７号；同第５，１７８，８６５号；同第５，１７３，４００号；同第５，１７３，３９９号；同第５，１６６，０５０号；同第５，１５６，９５１号；同第５，１３５，８６４号；同第５，１２２，４４６号；同第５，１２０，６６２号；同第５，１０３，８３６号；同第５，１００，７７７号；同第５，１００，６６２号；同第５，０９３，２３０号；同第５，０７７，２８４号；同第５，０７０，０１０号；同第５，０６８，１７４号；同第５，０６６，７８２号；同第５，０５５，３９１号；同第５，０４３，２６２号；同第５，０３９，６０４号；同第５，０３９，５２２号；同第５，０３０，７１８号；同第５，０３０，５５５号；同第５，０３０，４４９号；同第５，０１９，３８７号；同第５，０１３，５５６号；同第５，００８，１８３号；同第５，００４，６９７号；同第４，９９７，７７２号；同第４，９８３，５２９号；同第４，９８３，３８７号；同第４，９６５，０６９号；同第４，９４５，０８２号；同第４，９２１，７８７号；同第４，９１８，１６６号；同第４，９００，５４８号；同第４，８８８，２９０号；同第４，８８６，７４２号；同第４，８８５，２３５号；同第４，８７０，００３号；同第４，８６９，９０３号；同第４，８６１，７０７号；同第４，８５３，３２６号；同第４，８３９，２８８号；同第４，８３３，０７２号；および同第４，７９５，７３９号。
【００６１】
別の実施形態では、ＨＩＶまたはその免疫原性フラグメントを、ＨＩＶエピトープとして利用することができる。例えば、米国特許第７，３９３，９４９号、同第７，３７４，８７７号、同第７，３０６，９０１号、同第７，３０３，７５４号、同第７，１７３，０１４号、同第７，１２２，１８０号、同第７，０７８，５１６号、同第７，０２２，８１４号、同第６，９７４，８６６号、同第６，９５８，２１１号、同第６，９４９，３３７号、同第６，９４６，２５４号、同第６，８９６，９００号、同第６，８８７，９７７号、同第６，８７０，０４５号、同第６，８０３，１８７号、同第６，７９４，１２９号、同第６，７７３，９１５号、同第６，７６８，００４号、同第６，７０６，２６８号、同第６，６９６，２９１号、同第６，６９２，９５５号、同第６，６５６，７０６号、同第６，６４９，４０９号、同第６，６２７，４４２号、同第６，６１０，４７６号、同第６，６０２，７０５号、同第６，５８２，９２０号、同第６，５５７，２９６号、同第６，５３１，５８７号、同第６，５３１，１３７号、同第６，５００，６２３号、同第６，４４８，０７８号、同第６，４２９，３０６号、同第６，４２０，５４５号、同第６，４１０，０１３号、同第６，４０７，０７７号、同第６，３９５，８９１号、同第６，３５５，７８９号、同第６，３３５，１５８号、同第６，３２３，１８５号、同第６，３１６，１８３号、同第６，３０３，２９３号、同第６，３００，０５６号、同第６，２７７，５６１号、同第６，２７０，９７５号、同第６，２６１，５６４号、同第６，２２５，０４５号、同第６，２２２，０２４号、同第６，１９４，３９１号、同第６，１９４，１４２号、同第６，１６２，６３１号、同第６，１１４，１６７号、同第６，１１４，１０９号、同第６，０９０，３９２号、同第６，０６０，５８７号、同第６，０５７，１０２号、同第６，０５４，５６５号、同第６，０４３，０８１号、同第６，０３７，１６５号、同第６，０３４，２３３号、同第６，０３３，９０２号、同第６，０３０，７６９号、同第６，０２０，１２３号、同第６，０１５，６６１号、同第６，０１０，８９５号、同第６，００１，５５５号、同第５，９８５，６６１号、同第５，９８０，９００号、同第５，９７２，５９６号、同第５，９３９，５３８号、同第５，９１２，３３８号、同第５，８６９，３３９号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６６，６９４号、同第５，８６６，３２０号、同第５，８６６，１３７号、同第５，８６４，０２７号、同第５，８６１，２４２号、同第５，８５８，７８５号、同第５，８５８，６５１号、同第５，８４９，４７５号、同第５，８４３，６３８号、同第５，８４０，４８０号、同第５，８２１，０４６号、同第５，８０１，０５６号、同第５，７８６，１７７号、同第５，７８６，１４５号、同第５，７７３，２４７号、同第５，７７０，７０３号、同第５，７５６，６７４号、同第５，７４１，７０６号、同第５，７０５，６１２号、同第５，６９３，７５２号、同第５，６８８，６３７号、同第５，６８８，５１１号、同第５，６８４，１４７号、同第５，６６５，５７７号、同第５，５８５，２６３号、同第５，５７８，７１５号、同第５，５７１，７１２号、同第５，５６７，６０３号、同第５，５５４，５２８号、同第５，５４５，７２６号、同第５，５２７，８９５号、同第５，５２７，８９４号、同第５，２２３，４２３号、同第５，２０４，２５９号、同第５，１４４，０１９号、同第５，０５１，４９６号、および同第４，９４２，１２２号のＨＩＶヌクレオチドは、本発明に有用である。
【００６２】
ＨＩＶ抗体によって認識される任意のエピトープを、本発明で使用することができる。例えば、米国特許第６，９４９，３３７号、同第６，９００，０１０号、同第６，８２１，７４４号、同第６，７６８，００４号、同第６，６１３，７４３号、同第６，５３４，３１２号、同第６，５１１，８３０号、同第６，４８９，１３１号、同第６，２４２，１９７号、同第６，１１４，１４３号、同第６，０７４，６４６号、同第６，０６３，５６４号、同第６，０６０，２５４号、同第５，９１９，４５７号、同第５，９１６，８０６号、同第５，８７１，７３２号、同第５，８２４，３０４号、同第５，７７３，２４７号、同第５，７３６，３２０号、同第５，６３７，４５５号、同第５，５８７，２８５号、同第５，５１４，５４１号、同第５，３１７，００９号、同第４，９８３，５２９号、同第４，８８６，７４２号、同第４，８７０，００３号、および同第４，７９５，７３９号の抗ＨＩＶ抗体は、本発明に有用である。さらに、米国特許第７，０７４，５５６号、同第７，０７４，５５４号、同第７，０７０，７８７号、同第７，０６０，２７３号、同第７，０４５，１３０号、同第７，０３３，５９３号、再発行特許第３９，０５７号、同第７，００８，６２２号、同第６，９８４，７２１号、同第６，９７２，１２６号、同第６，９４９，３３７号、同第６，９４６，４６５号、同第６，９１９，０７７号、同第６，９１６，４７５号、同第６，９１１，３１５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，９００，０１０号、同第６，８２５，２１７号、同第６，８２４，９７５号、同第６，８１８，３９２号、同第６，８１５，２０１号、同第６，８１２，０２６号、同第６，８１２，０２４号、同第６，７９７，８１１号、同第６，７６８，００４号、同第６，７０３，０１９号、同第６，６８９，１１８号、同第６，６５７，０５０号、同第６，６０８，１７９号、同第６，６００，０２３号、同第６，５９６，４９７号、同第６，５８９，７４８号、同第６，５６９，１４３号、同第６，５４８，２７５号、同第６，５２５，１７９号、同第６，５２４，５８２号、同第６，５０６，３８４号、同第６，４９８，００６号、同第６，４８９，１３１号、同第６，４６５，１７３号、同第６，４６１，６１２号、同第６，４５８，９３３号、同第６，４３２，６３３号、同第６，４１０，３１８号、同第６，４０６，７０１号、同第６，３９５，２７５号、同第６，３９１，６５７号、同第６，３９１，６３５号、同第６，３８４，１９８号、同第６，３７６，１７０号、同第６，３７２，２１７号、同第６，３４４，５４５号、同第６，３３７，１８１号、同第６，３２９，２０２号、同第６，３１９，６６５号、同第６，３１９，５００号、同第６，３１６，００３号、同第６，３１２，９３１号、同第６，３０９，８８０号、同第６，２９６，８０７号、同第６，２９１，２３９号、同第６，２６１，５５８号、同第６，２４８，５１４号、同第６，２４５，３３１号、同第６，２４２，１９７号、同第６，２４１，９８６号、同第６，２２８，３６１号、同第６，２２１，５８０号、同第６，１９０，８７１号、同第６，１７７，２５３号、同第６，１４６，６３５号、同第６，１４６，６２７号、同第６，１４６，６１４号、同第６，１４３，８７６号、同第６，１３２，９９２号、同第６，１２４，１３２号、再発行特許第３６，８６６号、同第６，１１４，１４３号、同第６，１０３，２３８号、同第６，０６０，２５４号、同第６，０３９，６８４号、同第６，０３０，７７２号、同第６，０２０，４６８号、同第６，０１３，４８４号、同第６，００８，０４４号、同第５，９９８，１３２号、同第５，９９４，５１５号、同第５，９９３，８１２号、同第５，９８５，５４５号、同第５，９８１，２７８号、同第５，９５８，７６５号、同第５，９３９，２７７号、同第５，９２８，９３０号、同第５，９２２，３２５号、同第５，９１９，４５７号、同第５，９１６，８０６号、同第５，９１４，１０９号、同第５，９１１，９８９号、同第５，９０６，９３６号、同第５，８８９，１５８号、同第５，８７６，７１６号、同第５，８７４，２２６号、同第５，８７２，０１２号、同第５，８７１，７３２号、同第５，８６６，６９４号、同第５，８５４，４００号、同第５，８４９，５８３号、同第５，８４９，２８８号、同第５，８４０，４８０号、同第５，８４０，３０５号、同第５，８３４，５９９号、同第５，８３１，０３４号、同第５，８２７，７２３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，８１７，７６７号、同第５，８１７，４５８号、同第５，８０４，４４０号、同第５，７９５，５７２号、同第５，７８３，６７０号、同第５，７７６，７０３号、同第５，７７３，２２５号、同第５，７６６，９４４号、同第５，７５３，５０３号、同第５，７５０，３７３号、同第５，７４７，６４１号、同第５，７３６，３４１号、同第５，７３１，１８９号、同第５，７０７，８１４号、同第５，７０２，７０７号、同第５，６９８，１７８号、同第５，６９５，９２７号、同第５，６６５，５３６号、同第５，６５８，７４５号、同第５，６５２，１３８号、同第５，６４５，８３６号、同第５，６３５，３４５号、同第５，６１８，９２２号、同第５，６１０，０３５号、同第５，６０７，８４７号、同第５，６０４，０９２号、同第５，６０１，８１９号、同第５，５９７，８９６号、同第５，５９７，６８８号、同第５，５９１，８２９号、同第５，５５８，８６５号、同第５，５１４，５４１号、同第５，５１０，２６４号、同第５，４７８，７５３号、同第５，３７４，５１８号、同第５，３７４，５１６号、同第５，３４４，７５５号、同第５，３３２，５６７号、同第５，３００，４３３号、同第５，２９６，３４７号、同第５，２８６，８５２号、同第５，２６４，２２１号、同第５，２６０，３０８号、同第５，２５６，５６１号、同第５，２５４，４５７号、同第５，２３０，９９８号、同第５，２２７，１５９号、同第５，２２３，４０８号、同第５，２１７，８９５号、同第５，１８０，６６０号、同第５，１７３，３９９号、同第５，１６９，７５２号、同第５，１６６，０５０号、同第５，１５６，９５１号、同第５，１４０，１０５号、同第５，１３５，８６４号、同第５，１２０，６４０号、同第５，１０８，９０４号、同第５，１０４，７９０号、同第５，０４９，３８９号、同第５，０３０，７１８号、同第５，０３０，５５５号、同第５，００４，６９７号、同第４，９８３，５２９号、同第４，８８８，２９０号、同第４，８８６，７４２号、および同第４，８５３，３２６号のモノクローナル抗ＨＩＶ抗体も本発明に有用である。
【００６３】
１つの例では、エピトープはＳＩＶエピトープである。当業者は、本明細書中でＨＩＶに関するものはいずれもＳＩＶに適用されると理解する。有利な実施形態では、ＳＩＶエピトープは、本発明のタンパク質フラグメントであるが、本発明は、さらなるＳＩＶ抗原、エピトープ、または免疫原を含むことができる。有利には、ＳＩＶエピトープは、以下のＳＩＶ抗原が含まれるが、これらに限定されないＳＩＶ抗原である：米国特許第７，８９２，７２９号；同第７，８８６，９６２号；同第７，８７９，９１４号；同第７，８２９，２８７号；同第７，７９４，９９８号；同第７，７６７，４５５号；同第７，７５９，４７７号；同第７，７５８，８６９号；同第７，７５４，４２０号；同第７，７４９，９７３号；同第７，７４８，６１８号；同第７，７３２，１２４号；同第７，７０９，６０６号；同第７，７００，３４２号；同第７，７００，２７３号；同第７，６２５，９１７号；同第７，６２２，１２４号；同第７，６１１，７２１号；同第７，６０８，４２２号；同第７，６０１，５１８号；同第７，５８５，６７５号；同第７，５３４，６０３号；同第７，５１１，１１７号；同第７，５０８，７８１号；同第７，５０７，４１７号；同第７，４７９，４９７号；同第７，４６４，３５２号；同第７，４５７，９７３号；同第７，４４２，５５１号；同第７，４３９，０５２号；同第７，４１９，８２９号；同第７，４０７，６６３号；同第７，３７８，５１５号；同第７，３６４，７６０号；同第７，３１２，０６５号；同第７，２６１，８７６号；同第７，２２０，５５４号；同第７，２１１，２４０号；同第７，１９８，９３５号；同第７，１６９，３９４号；同第７，０９８，２０１号；同第７，０７８，５１６号；同第７，０７０，９９３号；同第７，０４８，９２９号；同第７，０３４，０１０号；再発行特許第３９，０５７号；同第７，０２２，８１４号；同第７，０１８，６３８号；同第６，９５５，９１９号；同第６，９３３，３７７号；同第６，９０８，６１７号；同第６，９０２，９２９号；同第６，８４６，４７７号；同第６，８１８，４４２号；同第６，８０３，２３１号；同第６，８００，２８１号；同第６，７９７，８１１号；同第６，７９０，６５７号；同第６，７１２，６１２号；同第６，７０６，７２９号；同第６，７０３，３９４号；同第６，６８２，９０７号；同第６，６５６，７０６号；同第６，６４５，９５６号；同第６，６３５，４７２号；同第６，５９６，５３９号；同第６，５８９，７６３号；同第６，５６２，５７１号；同第６，５５５，５２３号；同第６，５５５，３４２号；同第６，５４１，００９号；同第６，５３１，５７４号；同第６，５３１，１２３号；同第６，５０３，７１３号；同第６，４７９，２８１号；同第６，４７５，７１８号；同第６，４６９，０８３号；同第６，４６８，５３９号；同第６，４５５，２６５号；同第６，４４８，３９０号；同第６，４４０，７３０号；同第６，４２３，５４４号；同第６，３６５，１５０号；同第６，３６２，０００号；同第６，３２６，００７号；同第６，３２２，９６９号；同第６，２９１，６６４号；同第６，２７７，６０１号；同第６，２６１，５７１号；同第６，２５５，３１２号；同第６，２０７，４５５号；同第６，１９４，１４２号；同第６，１１７，６５６号；同第６，１１１，０８７号；同第６，１０７，０２０号；同第６，０８０，８４６号；同第６，０６０，０６４号；同第６，０４６，２２８号；同第６，０４３，０８１号；同第６，０２７，７３１号；同第６，０２０，１２３号；同第６，０１７，５３６号；同第６，００４，７８１号；同第５，９９４，５１５号；同第５，９８１，２５９号；同第５，９６１，９７６号；同第５，９５０，１７６号；同第５，９２９，２２２号；同第５，９２８，９１３号；同第５，９１２，１７６号；同第５，８８８，７２６号；同第５，８６１，２４３号；同第５，８６１，１６１号；同第５，８５８，３６６号；同第５，８３０，４７５号；同第５，８１７，３１６号；同第５，８０４，１９６号；同第５，７８６，１７７号；同第５，７５９，７６８号；同第５，７４７，３２４号；同第５，７０５，５２２号；同第５，７０５，３３１号；同第５，６９８，４４６号；同第５，６８８，９１４号；同第５，６８８，６３７号；同第５，６５４，１９５号；同第５，６５０，２６９号；同第５，６３１，１５４号；同第５，５８２，９６７号；同第５，５５２，２６９号；同第５，５１２，２８１号；同第５，５０８，１６６号；同第５，４７０，５７２号；同第５，３１２，９０２号；同第５，３１０，６５１号；同第５，２６８，２６５号；同第５，２５４，４５７号；同第５，２１２，０８４号；同第５，０８７，６３１号；および同第４，９７８，６８７号。
【００６４】
本発明で使用されるベクターを、典型的には、適切な遺伝子調節領域（プロモーターまたはエンハンサーなど）を含み、且つ本発明の抗原を発現することができるように選択すべきである。
【００６５】
例えば、ＨＩＶ−１抗原に対する免疫応答および／またはＨＩＶ−１に対する防御免疫を得るために本発明の抗原を被験体中にてｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることを目的とする場合、被験体での発現に適切であり、且つｉｎ  ｖｉｖｏでの使用が安全な発現ベクターを選択すべきである。例えば、幾つかの実施形態では、本発明のＨＩＶ−１免疫原性組成物およびワクチンの前臨床試験などのために実験動物において本発明の抗体および／または抗原を発現させることが望ましいかもしれない。他の実施形態では、本発明の免疫原性組成物およびワクチンの臨床試験および実際の臨床などでの使用のためにヒト被験体中で本発明の抗原を発現させることが望ましいであろう。かかる使用に適切な任意のベクターを使用することができ、適切なベクターを選択することは十分に当業者の能力の範囲内である。いくつかの実施形態では、これらのｉｎ  ｖｉｖｏ適用のために使用されるベクターを、ベクターが被験体中で増幅するのを防止するために弱毒化することが好ましいかもしれない。例えば、プラスミドベクターを使用する場合、好ましくは、プラスミドベクターは、被験体中でのｉｎ  ｖｉｖｏ使用の安全性を向上させるために被験体中で機能する複製起点を欠くであろう。ウイルスベクターを使用する場合、好ましくは、ウイルスベクターは、この場合もまた、被験体中でのｉｎ  ｖｉｖｏ使用の安全性を向上させるために被験体中で弱毒化されるか、複製が欠損されている。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態では、ウイルスベクターを使用する。有利には、ベクターは、少なくとも糖タンパク質ＵＬ１２８を欠くＣＭＶベクターまたは少なくとも糖タンパク質ＵＬ１３０を欠くＣＭＶベクターである。各ＣＭＶベクターはまた、糖タンパク質ＵＬ１３１を発現する。
【００６７】
例えば、ＣＤ８＋免疫応答（被験体中でＭＨＣクラスＩＩによって提示されるエピトープに指向する異種抗原に対する高比率のＣＤ８＋Ｔ細胞応答によって特徴づけられる免疫応答が含まれる）が含まれる免疫原性応答を生じさせることを目的とする場合、開示のＣＭＶベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＲｈＣＭＶを使用した免疫原性組成物およびワクチンの前臨床試験のためにアカゲザルなどの実験動物において開示のＣＭＶベクターを使用することが望ましいかもしれない。他の実施形態では、ＨＣＭＶを使用した免疫原性組成物の臨床試験および実際の臨床での使用などのためにヒト被験体中で開示のＣＭＶベクターを使用することが望ましいであろう。
【００６８】
かかるｉｎ  ｖｉｖｏ適用のために、開示のＣＭＶベクターを、薬学的に許容され得るキャリアをさらに含む免疫原性組成物の成分として投与する。本発明の免疫原性組成物は、異種抗原（病原体特異的抗原が含まれる）に対する免疫応答を刺激するのに有用であり、ＡＩＤＳの防止、改善、または処置のためのＨＩＶ−１に対する防止用または治療用のワクチンの１つ以上の成分として使用することができる。本発明の核酸およびベクターは、遺伝子ワクチン（すなわち、本発明の抗原をコードする核酸をヒトなどの被験体に送達し、その後に免疫応答を誘発するために前記抗原が被験体中で発現されるようにするためのワクチン）を提供するのに特に有用である。
【００６９】
本発明の組成物は、注射用の懸濁液、溶液、噴霧、凍結乾燥粉末、シロップ、およびエリキシルなどであり得る。任意の適切な形態の組成物を使用することができる。かかる組成物を調製するために、所望の純度の本発明の核酸またはベクターを、１つ以上の薬学的に許容され得るキャリアおよび／または賦形剤と混合する。キャリアおよび賦形剤は、組成物の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならない。許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、またはその組み合わせ、緩衝液（リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる）；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（登録商標）プルロニックス（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
免疫原性組成物または免疫学的組成物を、水中油滴型エマルションの形態で処方することもできる。水中油滴型エマルションは、例えば、軽流動パラフィンオイル（欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ）型）；イソプレノイドオイル（スクアラン、スクアレン、エイコサン（商標）、またはテトラテトラコンタンなど）；アルケン（例えば、イソブテンまたはデセン）のオリゴマー化に起因するオイル；直鎖アルキル基（植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリラート／カプラート）、グリセリルトリ（カプリラート／カプラート）、またはプロピレングリコールジオレアートなど）を含む酸またはアルコールのエステル；分岐脂肪酸またはアルコールのエステル（例えば、イソステアリン酸エステル）に基づき得る。オイルを乳化剤と組わせて使用してエマルションを形成することが有利である。乳化剤は、非イオン性界面活性剤（ソルビタン、マンニド（例えば、無水マンニトールオレアート）、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、またはヒドロキシステアリン酸（任意選択的にエトキシル化されている）のエステル、およびポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック（プルロニック（登録商標）生成物（例えば、Ｌ１２１）など）など）であり得る。アジュバントは、乳化剤、ミセル形成剤、およびオイルの混合物であってよく、商標名プロバックス（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で市販されている。
【００７１】
本発明の免疫原性組成物は、ワクチンの有効性を増大させるためのさらなる物質（湿潤剤または乳化剤、緩衝剤、またはアジュバントなど）を含むことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，（ｅｄ．）１９８０）。
【００７２】
アジュバントを含むこともできる。アジュバントには、無機酸の塩（例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ（ＳＯ４）２、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、またはカーボン）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むか含まないポリヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．ら，（２００２）Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．７１（３）：５３８−４４；Ａｈｍａｄ−Ｎｅｊａｄ，Ｐ．ら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（７）：１９５８−６８に記載のものなど）；ポリＩＣ酸またはポリＡＵ酸、ＣｐＧを含むか含まないポリアルギニン（当該分野でＩＣ３１としても公知；Ｓｃｈｅｌｌａｃｋ，Ｃ．ら（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｌｉｎｇｎａｕ，Ｋ．ら（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（２９−３０）：３４９８−５０８を参照のこと）、ジュババックス（登録商標）（米国特許第６，６９３，０８６号）、一定の天然物質（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワックスＤ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、またはＢｒｕｃｅｌｌａ属のメンバーで見出される物質）、フラジェリン（Ｔｏｌｌ様受容体５リガンド；ＭｃＳｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（７）：３９１４−９を参照のこと）、サポニン（ＱＳ２１、ＱＳ１７、およびＱＳ７など）（米国特許第５，０５７，５４０号；同第５，６５０，３９８号；同第６，５２４，５８４号；同第６，６４５，４９５号）、モノホスホリルリピドＡ、特に、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）、イミキモド（当該分野でＩＱＭとしても公知であり、アルダラ（登録商標）として市販されている；米国特許第４，６８９，３３８号；同第５，２３８，９４４号；Ｚｕｂｅｒ，Ａ．Ｋ．ら（２００４）２２（１３−１４）：１７９１−８）、およびＣＣＲ５インヒビターＣＭＰＤ１６７（Ｖｅａｚｅｙ，Ｒ．Ｓ．ら（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：１５５１−１５６２を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）は、一般に、０．０５〜０．１％リン酸緩衝生理食塩水溶液として使用されている。特にＤＮＡワクチンと共に使用することができる他のアジュバントは、コレラ毒素、特にＣＴＡ１−ＤＤ／ＩＳＣＯＭ（Ｍｏｗａｔ，Ａ．Ｍ．ら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（６）：３３９８−４０５を参照のこと）、ポリホスファゼン（Ａｌｌｃｏｃｋ，Ｈ．Ｒ．（１９９８）Ａｐｐ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．１２（１０−１１）：６５９−６６６；Ｐａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．ら（１９９５）Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４７３−９３）、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＧＦ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γなどであるが、これらに限定されない）（Ｂｏｙｅｒら，（２００２���Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２１：１３７−１４２；ＷＯ０１／０９５９１９）、免疫調節タンパク質（ＣＤ４０Ｌ（ＡＤＸ４０；例えば、ＷＯ０３／０６３８９９号を参照のこと）、およびナチュラルキラー細胞のＣＤ１ａリガンド（ＣＲＯＮＹまたはα−ガラクトシルセラミドとしても公知；Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｄ．ら，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（３）：２０４６−２０５５を参照のこと）など）、免疫賦活性融合タンパク質（免疫グロブリンのＦｃフラグメントに融合したＩＬ−２（Ｂａｒｏｕｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：４８６−４９２，２０００）など）および共刺激分子Ｂ７．１およびＢ７．２（Ｂｏｙｅｒ）であり、これら全てをタンパク質として、ＤＮＡの形態で、本発明の抗原をコードするウイルスベクターと同一のウイルスベクター中、または個別の発現ベクターに投与することができる。あるいは、本発明のワクチンを準備し、いかなるアジュバントも用いずに投与することができる。
【００７３】
免疫原性組成物を、適切且つ制御された速度で所望の作用部位および放出部位にＣＭＶベクターが導入されるようにデザインすることができる。制御放出処方物の調製方法は、当該分野で公知である。例えば、制御放出調製物を、免疫原および／または免疫原性組成物を複合体化するか吸収するためにポリマーを使用することによって産生することができる。制御放出処方物を、所望の制御放出特性または放出プロフィールが得られることが公知の適切な高分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセタート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）を使用して調製することができる。制御放出調製物による作用持続時間を調節するための別の可能な方法は、有効成分をポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、これらの酸のコポリマー、またはエチレンビニルアセタートコポリマーなど）の粒子中に組み込むことである。あるいは、これらの有効成分をポリマー粒子中に組み込む代わりに、これらの材料を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製したマイクロカプセル内（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリラート）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルション中に補足することが可能である。かかる技術は、Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｌｅｒら，（ｅｄｓ．），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，１９７８およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【００７４】
免疫原性組成物中のＣＭＶベクターの適切な投薬量を、当業者は容易に決定することができる。例えば、ＣＭＶベクターの投薬量は、投与経路および被験体のサイズに応じて変化し得る。適切な用量を、当業者は、例えば、従来の免疫学的技術を使用して被験体（実験動物など）の免疫応答を測定し、必要に応じて投薬量を調整することによって決定することができる。かかる被験体の免疫応答の測定技術には、クロム放出アッセイ、四量体結合アッセイ、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、細胞内サイトカインアッセイ、および他の免疫学的検出アッセイ（例えば、テキスト「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅに詳述）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
免疫原性組成物を、任意の適切な送達方法（筋肉内、静脈内、皮内、粘膜、およ局所への送達が含まれるが、これらに限定されない）を使用して投与することができる。かかる技術は当業者に周知である。送達方法のさらなる具体例は、筋肉内注射、皮内注射、および皮下注射である。しかし、送達は、注射方法に制限される必要はない。
【００７６】
動物（ヒトが含まれる）のための免疫スケジュール（またはレジメン）は周知であり、特定の被験体および免疫原性組成物について容易に決定することができる。それ故、免疫原を、１回以上被験体に投与することができる。好ましくは、免疫原性組成物の個別の投与の時間間隔を設定する。この間隔は被験体毎に変化するが、典型的には、１０日間〜数週間の範囲であり、しばしば、２、４、６、または８週間である。ヒトについて、間隔は、典型的には、２〜６週間である。本発明の特定の有利な実施形態では、間隔はより長く、有利には、約１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、３２週間、３４週間、３６週間、３８週間、４０週間、４２週間、４４週間、４６週間、４８週間、５０週間、５２週間、５４週間、５６週間、５８週間、６０週間、６２週間、６４週間、６６週間、６８週間、または７０週間である。
【００７７】
免疫レジメンは、典型的には、免疫原性組成物を１〜６回投与するが、１回または２回または４回ほどの低頻度であり得る。免疫応答の誘導方法はまた、免疫原とのアジュバントの投与を含むことができる。いくつかの例では、年１回、年２回、または他の長期の間隔（５〜１０年）の追加免疫で最初の免疫プロトコールを補足することができる。
【００７８】
本発明の方法はまた、種々のプライムブーストレジメン、例えば、ＤＮＡプライム−アデノウイルスブーストレジメンを含む。これらの方法では、１回以上のプライミング免疫後に、１回以上の追加免疫を行う。実際の免疫原性組成物は、各免疫および免疫原性組成物のタイプ（例えば、タンパク質または発現ベクターを含む）、経路について同一でも異なっていてもよく、免疫原の処方も異なり得る。例えば、発現ベクターをプライミングおよび追加免疫工程のために使用する場合、発現ベクターは同一または異なるタイプ（例えば、ＤＮＡまたは細菌またはウイルスの発現ベクター）のいずれかであり得る。１つの有用なプライム−追加免疫レジメンは、４週間間隔で２回のプライミング免疫を行い、その後に最後のプライミング免疫から４週間後および８週間後に２回の追加免疫を行う。プライミングおよび追加免疫レジメンを得るために本発明のＤＮＡ、細菌およびウイルスの発現ベクターを使用した並べ替えおよび組み合わせがいくつか存在することも当業者に容易に明らかなはずである。ウイルスベクターがＵＳ２−１１またはＵＳ２−１１領域中にコードされたいくつかの遺伝子を発現する事象では、ウイルスベクターを繰り返し使用することができる一方で、異なる病原体由来の異なる抗原を発現することができる。
【００７９】
特定の実施形態は、被験体に免疫原性組成物を１回以上投与することによる被験体における病原体に対する免疫応答の誘導方法であって、ここで、エピトープが被験体における特異的免疫応答を誘導するのに十分なレベルで発現する、方法を提供する。かかる免疫を、所望の免疫レジメンにしたがって、少なくとも２、４、または６週間（またはそれを超える）間隔で複数回繰り返すことができる。
【００８０】
本発明の免疫原性組成物を、単独で投与することができるか、他の抗原（例えば、「他の」免疫学的組成物、抗原性組成物、ワクチン組成物、または治療組成物）と共に同時投与するか連続的に投与することができ、それにより、本発明の多価組成物または「カクテル」組成物または組み合わせ組成物およびこれらの組成物の使用方法を得ることができる。また、成分および投与様式（連続投与または同時投与）、ならびに投薬量を、特定の被験体の年齢、性別、体重、種、および容態、ならびに投与経路などの要因を考慮して決定することができる。
【００８１】
組み合わせて使用する場合、他の抗原を、全免疫レジメンの一部として（例えば、プライムブーストレジメンまたは他の免疫プロトコールの一部として）同時または異なる時間に投与することができる。
【００８２】
本発明およびその利点を詳述してきたが、添付の特許請求の範囲で定義の本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中で種々の変更、代替、および変化を行うことができると理解すべきである。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、開示の方法を例示する。本開示を考慮して、当業者は、過度の実験を行うこと無くこれらの実施例の変形および開示の方法の他の例が可能であることを認識するであろう。
【００８４】
実施例１−ＵＬ１２８およびＵＬ１３０が欠失したＲｈＣＭＶベクターでの免疫により、ＳＩＶ抗原に対する広範な種々のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープによって特徴づけられる免疫応答が得られる
活性なＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠くが（ΔＵＬ１２８−１３０）、活性なＵＬ１３１を含むＲｈＣＭＶ６８−１株（Ｈａｎｓｅｎ，ＳＧら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，６６２０（２００３）；本明細書中で参考として援用される）由来のＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発されたＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のエピトープターゲティングプロフィールを、より一般的なベクターおよびＳＩＶ自体によって誘発されるプロフィールと比較した。フローサイトメトリー細胞内サイトカイン染色を使用して、全ＳＩＶｇａｇタンパク質を対象とする１２５の連続する１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸の重複）の各々に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を個別に定量した。全部で２９頭のアカゲザル（ＲＭ）を使用した：１４頭にΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターでワクチン接種した。４頭にエレクトロポレーションを行ったＤＮＡ／ｇａｇ＋インターロイキン（ＩＬ）−１２をワクチン接種した。３頭にアデノウイルス（Ａｄ）５／ｇａｇをワクチン接種し、別の３頭にワクシニアウイルス（ＭＶＡ）／ｇａｇをワクチン接種した。別の５頭に、自然発生的なウイルス制御を有するＳＩＶ（ＳＩＶｍａｃ２３９）を予め感染させた。
【００８５】
ΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターワクチン接種ＲＭ由来の末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞は、試験した１２５の１５ｍｅｒ  ＳＩＶｇａｇペプチドのうちの平均４６に対して応答した。これは、平均約３５の異なるエピトープに対応していた（図１Ａ）。対照的に、ＳＩＶ感染コントローラーならびにエレクトロポレーションを行ったＤＮＡ／ｇａｇ＋ＩＬ−１２、Ａｄ５／ｇａｇ、およびＭＶＡ／ｇａｇをワクチン接種したＲＭは平均１０〜１９ペプチドと応答し、これは平均９〜１５の異なるエピトープに対応していた。ΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターワクチン接種ＲＭにおける応答幅は非常に大きく、１４頭の研究した非近交系動物のほとんど、さらには全てにおいて多数のＳＩＶｇａｇ１５ｍｅｒペプチドがＣＤ８＋Ｔ細胞によってターゲティングされた（図１Ａ）。
【００８６】
この所見が単一の共通のエピトープ（「スーパートープ」）の偶然の認識または単純なＴ細胞認識「ホットスポット」（複数が重複するが、異なるエピトープ）を反映するかどうかを決定するために、一連の短縮ペプチドに対する応答を分析した。これらの短縮ペプチドは、応答あたり３頭のＲＭで認識された１５ｍｅｒのうちの７つに対応していた。次いで、これらのペプチドを使用して各ＲＭ中のコアエピトープを同定した（図１Ｂ）。
【００８７】
短縮ペプチドを使用して以下の２つの異なる応答パターンが認められた：本明細書中でタイプ１と呼ばれる第１の応答パターンタイプを、応答頻度が重要なアミノ残基の喪失と共に急激に低下するパターンと定義する。これらの短縮により、典型的には、９ｍｅｒコアエピトープ（例えば、Ｇａｇ２５９−２６７、Ｇａｇ２７６−２８４、およびＧａｇ４８２−４９０）が得られた。本明細書中でタイプ２と呼ばれる第２の応答タイプを、最適な配列の短縮につれて応答頻度が段階的に低下するパターンと定義する。これらの短縮により、典型的には、１２ｍｅｒコアエピトープ（Ｇａｇ４１−５２、Ｇａｇ２１１−２２２、Ｇａｇ２９０−３０１、Ｇａｇ４９５−５０６）が得られた。これらの短縮応答パターンおよびコアペプチドは、各応答について研究した全てのＲＭで同一であり、いかなる場合でも、コアペプチドは、親１５ｍｅｒより優れた刺激（より高い応答頻度）を示した（図１Ｃ）。
【００８８】
まとめると、これらのデータは、ΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターワクチン接種ＲＭにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞によってターゲティングされた多数のＳＩＶｇａｇエピトープが異種ＭＨＣハプロタイプを介して一般的またはさらに普遍的に認識される特異的決定基であることを強く示唆する。実際に、それぞれ、これらの短縮１５ｍｅｒ（タイプ１および２短縮パターンの両方が含まれる）のうちの５つのコア（最適）ペプチドに対する検出可能なＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、４２頭のＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種非近交系ＲＭの１００％で認められ、６つの他のペプチド（２つの最適ペプチドおよび４つの１５ｍｅｒ）に対する応答は６０％を超えるＲＭで見出された（図１Ｄ）。顕著には、これらのエピトープは、従来のＳＩＶ感染ＲＭにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞によって稀に認識された。したがって、ＳＩＶｇａｇに対するΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター誘発ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、従来のように感染されたＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の約３倍の範囲であり、広く認識される「スーパートープ」の頻繁なターゲティングによって固有に特徴づけられる。
【００８９】
実施例２−タイプ１ＣＤ８＋応答はＭＨＣ−Ｉ拘束性であり、タイプ２ＣＤ８＋応答はＭＨＣ−ＩＩ拘束性である
ＭＨＣ−Ｉ拘束性エピトープは、典型的には８〜１０アミノ酸長であり、上記のタイプ１短縮パターンと一致する「末端閉鎖」ＭＨＣ−１結合溝（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧら，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１，２１３（１９９３）；本明細書中で参考として援用される）の特性に適合するように結合ポケット（アンカー残基）に会合する位置特異的アミノ酸を有する。対照的に、タイプ２短縮パターンは、ＭＨＣＩＩ拘束性エピトープにより典型的である（典型的にはより長く、通常１２ｍｅｒコアを超え、特異的アンカー残基を欠き、長さの不均一性により耐性を示す（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ  Ｓら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０，３３６３（１９９８）およびＣｈｅｌｖａｎａｙａｇａｍ  Ｇ，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５８，６１（１９９７）；その両方が本明細書中で参考として援用される）。これは、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターワクチン接種ＲＭにおけるタイプ２  ＳＩＶｇａｇエピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＨＣ−ＩＩ拘束性であり得ることを示唆していた。これに関して、クラスＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は明らかに普通ではないが、かかる応答は、マウス（Ｍｉｚｕｏｃｈｉ  Ｔら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８，４３７（１９８８）；Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３，４４９６（１９９４）；Ｍａｔｅｃｈａｋ  ＥＯら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４，３３７（１９９６）；Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ  ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ  Ｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７，５００（１９９７）；Ｔｙｚｎｉｋ  ＡＪら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９，５５９（２００４）；Ｐｅａｒｃｅ  ＥＬら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３，２４９４（２００４）；その全てが本明細書中で参考として援用される）およびヒト（Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ＭＨら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，６８０６（２００１）；Ｒｉｓｔ  Ｍら，Ｂｌｏｏｄ  １１４，２２４４（２００９）；Ｈｉｒｏｓａｗａ  Ｔら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  １０２，１２８１（２０１１）；その全てが本明細書中で参考として援用される）の両方で以前に報告されており、有意義なＴＣＲシグナル伝達にはそれぞれのＭＨＣ−ＩＩまたはＭＨＣ−Ｉとの特異的なＣＤ４またはＣＤ８共受容体会合が必要ないということが証明されている（Ｖｉｏｌａ  Ａら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６，１７７５（１９９７）およびＬｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１，２５０７（１９９１）；その両方が本明細書中で参考として援用される）。
【００９０】
ΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶｇａｇがｇａｇに対するＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発したかどうかを調査するために、ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩならびにインバリアント鎖由来のＭＨＣ−ＩＩ特異的結合ペプチドＣＬＩＰ（Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８１，６７７（１９９５）；本明細書中で参考として援用される）に特異的な「遮断」モノクローナル抗体（ｍＡｂ）がΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶｇａｇで免疫したＲＭにおけるタイプ１およびタイプ２エピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を遮断する能力を評価した（図２Ａ）。これらの試薬による５つの普遍的スーパートープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の阻害は、タイプ１対２短縮パターンに正確に対応し、３つのタイプ２エピトープ（Ｇａｇ２１１−２２２、Ｇａｇ２９０−３０１、Ｇａｇ４９５−５０６）のＴ細胞認識は抗ＭＨＣ−ＩＩおよびＣＬＩＰによって遮断されるが抗ＭＨＣ−Ｉによって遮断されず、２つのタイプ１エピトープ（Ｇａｇ２７６−２８４、Ｇａｇ４８２−４９０）のＴ細胞認識については逆であった。
【００９１】
ＭＨＣ−Ｉ遮断対ＭＨＣ−ＩＩ遮断に関して図２Ａにマッピングしたエピトープ特異的応答（図２Ｂ、図２Ｃ）。予想通り、ＳＩＶ感染ＲＭおよび従来のワクチンを接種したＲＭにおける全ＣＤ８＋Ｔ細胞応答はＭＨＣ−Ｉをターゲティングする試薬によってのみ遮断されたのに対して、ΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶワクチン接種ＲＭでは、ターゲティングされた１５ｍｅｒの大部分（６１％）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答はＭＨＣ−ＩＩインヒビターによって特異的に遮断され、のこりの少数（３６％）はＭＨＣ−ＩｍＡｂによってのみ遮断された（約３％の応答は不確定であった）。
【００９２】
ＭＨＣ−ＩＩ遮断ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＭＨＣ−ＩＩ拘束性（問題となるエピトープがＭＨＣ−ＩＩと関連して認識されると定義される）であることを確認し、ＭＨＣ異種ＲＭを介したこれらの応答の不規則性の根拠を調査するために、単一のアカゲザルＭＨＣ−ＩＩ異形を発現する細胞株を構築した。選択したＭＨＣ−ＩＩ対立遺伝子は、特徴づけられたＳＩＶｇａｇエピトープ認識プロフィールを有する４頭のＲｈＣＭＶ／ｇａｇワクチン接種ＲＭによって発現された。フローサイトメトリーＩＣＳアッセイは、個別のペプチドでのＭＨＣ−ＩＩ異形トランスファクタントのパルシングによって、遮断実験によってＭＨＣ−ＩＩ関連と分類された応答のみの頑強なＣＤ８＋Ｔ細胞刺激が得られたが親ＭＨＣ−ＩＩ陰性細胞株では得られず（図３Ａ）、これらの応答を抗ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂおよびＣＬＩＰペプチドを使用して遮断することができたが、抗ＭＨＣ−ＩｍＡｂでは遮断できなったことを示した。重要なことに、個別のＭＨＣ−ＩＩ異形は複数のペプチドを提示し、個別のペプチドは複数のＭＨＣ−ＩＩ異形によって頻繁に提示された（図３Ａ）。個別の異形が複数のｇａｇペプチドを提示する能力は、これらのＭＨＣ−ＩＩ拘束性応答の範囲を説明するのに役立つ。複数のＭＨＣ−ＩＩ異形が多数の個別のペプチドを提示する能力は、ＭＨＣ異種ＲＭを介したＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクター誘発ＣＤ８＋Ｔ細胞によるこれらのペプチドの共通の認識（例えば、そのスーパートープ特性）が少なくとも１つの各応答に有効なＭＨＣ−ＩＩ異形を発現する全てのＲＭによって説明される可能性が高いことを示唆している。
【００９３】
ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答について以前に報告されているように（Ｃｏｒｒａｄｉｎ  Ｃ  ａｎｄ  Ｌａｎｚａｖｅｃｃｉａ  Ａ，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，１３９（１９９１）；本明細書中で参考として援用される）、ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発されたＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はＴ細胞ドナーによって発現されないペプチド結合ＭＨＣ−ＩＩ異形との関連でその特異的ペプチドエピトープに応答することができ（図３Ａおよび３Ｂ）、このことは、これらのＴ細胞のＴＣＲが結合したペプチドのみまたはＭＨＣ−ＩＩ分子上の非多型構造との組み合わせを認識することを示す。
【００９４】
実施例３−ΔＵＬ１２８−１３０ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター誘発ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の表現型および機能
ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターワクチン接種によって生成および維持されたＳＩＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の通常でないエピトープ特異性は、これらの応答を支配する特に非従来型のＭＨＣ−ＩＩ拘束性集団の機能的潜在性に関する問題を提起する。第１に、これに関して、最適なペプチド（タイプ１およびタイプ２の両方）に対する応答を１０００００倍超の希釈倍率のペプチド濃度で証明することができるので（図４Ａ）、これらのスーパートープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、標準的なＩＣＳアッセイで使用した高ペプチド濃度の人為的結果ではない。第２に、タイプ１およびタイプ２スーパートープ特異的応答はワクチン接種直後に惹起され（図４Ｂ）、ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターワクチン接種ＲＭについて前に報告したパターンで（Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，５２３（２０１１）；本明細書中で参考として援用される）全身に協調的に分布している（図４Ｃおよび４Ｄ）。第３に、ＲｈＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター誘発ＳＩＶ特異的Ｔ細胞について以前に報告されるように（Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５，２９３（２００９）；本明細書中で参考として援用される）、タイプ１およびタイプ２スーパートープ特異的Ｔ細胞の両方は、エフェクターメモリーＴ細胞分化を示す同一の表現型（ＣＣＲ７−、ＣＤ２８−）およびこのエフェクター−メモリー表現型と一致する同一の多機能プロフィール（高いＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、およびＭＩＰ−１αの産生、高ＣＤ１０７内在化（脱顆粒）、および低ＩＬ−２産生）を示す（図４Ｅおよび４Ｆ）。エフェクターメモリー分化がＡｇ駆動であると考えられるので、これらのデータは、ワクチン接種したＲＭでは、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞がタイプ１およびタイプ２のエピトープに等価にｉｎ  ｖｉｖｏ曝露されると示唆される。
【００９５】
実施例４−ＵＬ１２８およびＵＬ１３０はＣＭＶ誘発ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のターゲティングを調節する
この通常でないＣＤ８＋免疫応答に関連し、前記応答を潜在的に担う候補ＣＭＶ遺伝子を同定するために、内因性ＣＭＶ最初期（ＩＥ）タンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答も非従来型のエピトープ（特に、ＭＨＣ−ＩＩによって拘束されるスーパートープ）をターゲティングするかどうかを最初に問うた。これを、野生型ＲｈＣＭＶ（コロニー流行株）で天然に感染させたＲＭおよび例示的なΔＵＬ１２８−１３０欠損６８．１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクターをワクチン接種したＲＭの評価によって決定した。驚くほどのことではないが、ΔＵＬ１２８−１３０ベクターをワクチン接種したＲＭは、同一ＲＭにおいてＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答と同一のターゲティング特性を有するＩＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が証明された：３０超の異なるＩＥエピトープ／ＲＭ（抗ＭＨＣ−ＩＩで遮断されたエピトープ特異的応答の大部分および抗ＭＨＣ−Ｉで遮断された少数の部分が含まれる）。
【００９６】
しかし、著しく対照的に、天然にＲｈＣＭＶ感染させたＲＭにおけるＩＥ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答ははるかに狭くターゲティングされ（約８エピトープ／ＲＭ）、ＭＨＣ−ＩＩ拘束性やエピトープ不規則性の証拠はなく（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ）、従来の免疫優性ヒエラルキーと一致した。これらの所見は、従来になくターゲティングされたＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が（これらの応答についての相当数の分析にもかかわらず）天然に暴露されたＣＭＶ＋ＲＭおよびヒトにおいて報告されていなかった理由を説明する可能性が高く、より重要には、従来になくターゲティングされたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成を担う機構におけるΔＵＬ１２８−１３０欠損株６８．１ベースのＲｈＣＭＶベクターとΔＵＬ１２８−１３０含有野生型ＲｈＣＭＶとの間の遺伝的相違を含意する。
【００９７】
プライミング中のＣＤ８＋Ｔ細胞のターゲティングにおけるこれらの遺伝子の役割を評価するために、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０のオルソログの発現を再確立するＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターを生成した（Ｌｉｌｊａ  ＡＥら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，１９９５０（２００８）。次いで、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０のオルソログ発現のこの「修復」によってベクター誘発ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のエピトープターゲティングプロフィールが変化したかどうかを問うた。実際に、いかなる前に定義したＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩスーパートープの認識を含まなかったＵＬ１２８およびＵＬ１３０修復ＲｈＣＭＶ／ｇａｇベクターによって誘発されたＳＩＶｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、非修復６８．１株ベクター（ＵＬ１２８−ＵＬ１３０オルソログ発現を欠く）によって誘発された応答よりもはるかに狭くターゲティングされ、この応答は完全にＭＨＣ−Ｉに関連していた（図５Ｄ、５Ｅ、および５Ｆ）。
【００９８】
実施例５−ＵＬ１２８またはＵＬ１３０を単一欠失したＣＭＶベクターはクラスＩＩ拘束によって特徴づけられるＣＤ８応答を示し、ＵＬ１３１を単一欠失したＣＭＶベクターは重複感染が不可能である
ＲｈＣＭＶ６８．１株を、ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター構築におけるその使用前に線維芽細胞培養において複数回継代し、この株はＵＬ１３０遺伝子の一部および全ＵＬ１２８遺伝子を欠失することが元の野生分離株と異なる（Ｇｉｌｌら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４７，２０８（２０１３）；本明細書中で参考として援用される）。ＵＬ１２８およびＵＬ１３０の遺伝子は、５’−ＵＬ１３１−ＵＬ１３０−ＵＬ１２８−３’の順序でＵＬ１３１と共に単一のｍＲＮＡ上にコードされる（Ｌｉｌｊａ  ＡＥら，２００８  前出）。３つ全ての遺伝子がこの単一の「多シストロン性」ｍＲＮＡによってコードされ、且つこのｍＲＮＡの全３’末端が６８−１中で欠如しているので、以前にはＨａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，１２３７８７４  ｄｏｉ，２４  Ｍａｙ  ２０１３（本明細書中で参考として援用される）において、６８．１の欠如によりＨＣＭＶ  ＵＬ１２８、１３０、および１３１遺伝子の３つ全ての活性ＲｈＣＭＶオルソログ（Ｒｈ１５７．６、１５７．４、および１５７．５）を発現できると考えられていた。ＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングの調整におけるＵＬ１２８、ＵＬ１３０、およびＵＬ１３１の個別の機能を決定するために、本発明者らは、これらの各遺伝子を個別に欠くＲｈＣＭＶ／ＳＩＶｇａｇベクターを生成した。ＵＬ１２８−１３０「修復」ＲｈＣＭＶ−６８−１．２ウイルス（Ｌｉｌｊａら  ２００８  前出）を本発明者らの出発点として使用して、本発明者らは、ΔＵＬ１２８ＲｈＣＭＶ／ｇａｇ、ΔＵＬ１３０／ＲｈＣＭＶｇａｇ、およびΔＵＬ１３１／ＲｈＣＭＶｇａｇを生成し、これらの各構築物を予めＲｈＣＭＶを天然に感染させた２頭のＲＭに接種した。図６に示すように、ＵＬ１２８を欠くがＵＬ１３０およびＵＬ１３１を含むＲｈＣＭＶは、両動物においてＳＩＶｇａｇに対するＴ細胞応答を誘導した。同様に、ＵＬ１３０を欠くがＵＬ１３１およびＵＬ１２８を含むＲｈＣＭＶは、両動物においてＳＩＶｇａｇに対するＴ細胞応答を誘導した。対照的に、ＵＬ１３１を欠くがＵＬ１３０およびＵＬ１２８のインタクトな遺伝子を含むＲｈＣＭＶは、ＣＭＶ陽性動物において免疫応答を誘導することができなかった。これらのデータは、機能的ＵＬ１３１遺伝子にはＣＭＶ陽性動物の重複感染が必要であることを示唆している。ＲｈＣＭＶ６８−１が重複感染可能であるので、この結果はまた、多シストロン性ｍＲＮＡの一部の欠失にもかかわらずＲｈＣＭＶ６８−１が機能的ＵＬ１３１を含み、ＲｈＣＭＶ６８−１がΔＵＬ１２８−１３０ベクターであることと一致していることを証明している。ＵＬ１３０またはＵＬ１２８が単一欠失したベクターがＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発するかどうかをさらに決定するために、本発明者らは、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ−遮断抗体の存在下でのＳＩＶｇａｇのアミノ末端部分に対応する２５の重複１５ｍｅｒペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答をモニタリングした。図７に示すように、個別のペプチドに対するＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方が認められた。これらの結果は、ＵＬ１２８またはＵＬ１３０のいずれかを欠くがＵＬ１３１を含む単一欠失ベクターが非従来型のＴ細胞応答を誘導することができることを証明している。
【００９９】
実施例６−Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原を含むΔＵＬ１２８−１３０が欠損したＣＭＶベクターはクラスＩＩ制限によって特徴づけられるＣＤ８応答を示す
上記実施例では、本発明者らは、ＵＬ１２８および／またはＵＬ１３０を欠くベクターがＣＭＶ−ＩＥタンパク質またはＳＩＶｇａｇタンパク質などのウイルス抗原に対してより一般的に認められるＭＨＣ−ＩよりもむしろＭＨＣ−ＩＩに拘束される非従来型のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することを証明した。ΔＵＬ１２８−１３０ベクターが細菌抗原に対してＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することもできるかどうかを決定するために、本発明者らは２つのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質をΔＵＬ１２８−１３０ベクターに挿入した。得られたベクターＲｈＣＭＶ／ＴＢは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの５０ｋＤａ融合タンパク質ＥＳＡＴ６および抗原８５Ｂをコードする（Ｄｅｒｒｉｃｋ  ＳＣら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３、７８０−７８８（２００４）；本明細書中で参考として援用される）。ＥＳＡＴ６は初期分泌タンパク質であるのに対して、抗原８５Ｂは結合し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって発現される最も豊富なタンパク質である（Ｂｒａｎｄｔ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７，３５２７（１９９６）本明細書中で参考として援用される）。３頭のＲＭにＲｈＣＭＶ６８−１由来ベクターＲｈＣＭＶ／ＴＢを接種し、個別のペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩを遮断する抗体の存在下でモニタリングした。図８に示すように、ワクチン接種した各動物は両方の抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じ、ＣＤ８＋Ｔ細胞によってはＭＨＣ−Ｉによって拘束されたものもあれば、他のＭＨＣ−ＩＩによって拘束されたものもあった。したがって、これらのデータは、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠くＣＭＶベクターによるＭＨＣ−ＩＩ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する能力がウイルス抗原に制限されず、他の異種抗原（細菌抗原が含まれる）に拡大することができることを証明している。
【０１００】
実施例７  ＵＬ１２８−１３０欠失ベクターおよびＵＬ１２８−１３０含有ベクターの連続接種が異種抗原のエピトープ範囲を増大させる
上記の実施例では、本発明者らは、ＵＬ１２８−１３０を欠くベクターがＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ拘束性のＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を誘導するのに対して、ＵＬ１２８−１３０インタクトなベクターがＭＨＣ−Ｉ拘束性ＣＤ８＋Ｔ細胞のみを誘導することを証明した。同一抗原を保有するがＵＬ１２８およびＵＬ１３０の存在に関して異なるベクターによる連続接種が異種抗原のエピトープ範囲を増大させるかどうかを決定するために、本発明者らは、ΔＵＬ１２８−１３０（６８−１）を予めワクチン接種した２頭のＲＭに別のラウンドのΔＵＬ１２８−１３０（６８−１）を接種後、ＵＬ１２８−１３０「修復」（６８−１．２）ＲｈＣＭＶベクターを連続的に接種した。全ベクターがＳＩＶｇａｇを発現した。ＳＩＶｇａｇに対する全ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ΔＵＬ１２８−１３０（６８−１由来）ベクターおよびＵＬ１２８−１３０修復（６８−１．２由来）ベクターの両方の再ワクチン接種によって追加免疫した一方で、６８−１／ＳＩＶｇａｇベクターでの以前のワクチン接種に起因する各動物中に存在する個別のペプチドに対する応答を、６８−１／ＳＩＶｇａｇベクターによって追加免疫したが、６８−１．２／ＳＩＶｇａｇベクターによって追加免疫しなかった（図９、上のパネル）。個別のペプチドがＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩのいずれかによって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されたので、これらのデータは、ＵＬ１２８およびＵＬ１３０を欠くベクターによって誘導されるエピトープ範囲がＭＨＣ−Ｉ拘束性Ｔ細胞についてさえインタクトなＵＬ１２８およびＵＬ１３０を含むベクターのエプトープ範囲と重複しないことを証明している。この結果は、同一抗原を保有するＵＬ１２８／１３０欠失ベクターおよびＵＬ１２８−１３０インタクトベクターでの同一個体の連続ワクチン接種が単一ベクターを用いた接種と比較して遥かに広い範囲のＴ細胞応答を誘導することをさらに示唆していた。この結論は、個別のＳＩＶｇａｇエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答が６８−１／ｇａｇでの単一のワクチン接種、６８−１／ｇａｇでの再ワクチン接種、および６８−１．２／ｇａｇでのワクチン接種後に２頭のＲＭにおいてモニタリングされた場合に支持された。図９の下のパネルに示すように、同一タイプのベクターでの再ワクチン接種およびそのＵＬ１２８−１３０組成が異なるベクターでのワクチン接種の両方により、以前のワクチン接種由来のＴ細胞応答を維持しながらさらなるＳＩＶｇａｇエピトープを認識する新規のＴ細胞が誘導された。各コアエピトープが９−１２アミノ酸長であり、且つＳＩＶｇａｇが５１０のアミノ酸をコードすることを考慮して、これらの動物における連続ワクチン接種ストラテジーによって誘導された４５−５２エピトープは、全ＳＩＶｇａｇポリペプチド配列の約９０％を対象とする。本発明者らが知る限り、このエピトープ範囲レベルは任意の他のベクター系を使用して以前には認められなかった。
【０１０１】
実施例８−材料と方法
動物：全部で１６５頭の目的に合うように交配された遺伝子背景がインドの雄または雌の若年アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）を本研究で使用した（６８−１株ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター（野生型または遺伝子改変型、単独またはその後に従来のワクチンまたはウイルス抑制ＳＩＶ感染で異種プライミングを行った）でワクチン接種した１１０頭のマカク、ＳＩＶ感染のみの４７頭のマカク（ＳＩＶｍａｃ２３９またはＳＩＶｍａｃ２５１）、およびＲｈＣＭＶのコロニー流行株で天然に感染した８頭の非ワクチン接種マカクが含まれる）。ＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針の基準下で、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認された全てのマカクを使用した。これらの実験で使用したマカクは、オナガザル（ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｉｃｉｎｅ）ヘルペスウイルス１、Ｄ型サルレトロウイルス、およびサルＴリンパ球向性ウイルスタイプ１を持たなかった。Ｍａｍｕ−Ａ＊０１、Ｍａｍｕ−Ａ＊０２、Ｍａｍｕ−Ｂ＊０８、およびＭａｍｕ−Ｂ＊１７対立遺伝子のＭＨＣ−Ｉ遺伝子型同定を、Ｌｏｆｆｒｅｄｏ  ＪＴら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１、８８２７（２００７）（本明細書中で参考として援用される）に記載の配列特異的プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行った。選択したマカクに対して大規模シーケンシングによってＤＲＢ−遺伝子型同定を行った。簡潔に述べれば、Ｍａｍｕ−ＤＲＢ領域のアンプリコンを、高信頼性Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢｉｏｌａｂｓ）およびユニバーサルＭＨＣ−ＤＲＢ特異的プライマーの対（５’−ＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ−ＭＩＤ−ＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣ−配列番号１；５’−ＣＴＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ−ＭＩＤ−ＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＴ−配列番号２）を用い、以下の熱サイクル条件を使用したＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅によって作製した：９８℃で３分間、（９８℃で５秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で２０秒間）を２５サイクル、および７２℃で５分間。一次ｃＤＮＡ−ＰＣＲ産物を、ＡＭｐｕｒｅＸＰ磁性ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して精製した。Ｌｉｂ−Ａキット（Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したエマルションＰＣＲ、ビーズ精製、およびＲｏｃｈｅ／４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ装置を使用したピロシーケンシング手順を、製造者の説明書通りに行った。配列アセンブリのためのＧｅｎｅｉｏｕｓ−Ｐｒｏ（登録商標）バイオインフォマティクスソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ．）と併せてＬａｂｋｅｙデータベースを使用してデータを分析した。免疫学的アッセイのための単核球調製物を、記載のように（Ｐｉｔｃｈｅｒ  ＣＪら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８，２９（２００２）およびＶｅａｚｅｙ  ＲＳら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，４２７（１９９８）；その両方が本明細書中で参考として援用される）血液、骨髄、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、リンパ節、脾臓、肝��、骨髄、および腸粘膜から得た。精製ＣＤ８＋Ｔ細胞（純度９０％超）を、ＣＤ８マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから得た。ＳＩＶ＋マカクの血漿ウイルス量を、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（６０）によって決定した。ＳＩＶ＋マカクは、血漿ウイルス量が２．０×１０４コピー／ｍｌ未満である場合にＳＩＶコントローラーと見し、血漿ウイルス量が３．０×１０３コピー／ｍｌ未満である場合にｅｌｉｔｅコントローラーと見なした。
【０１０２】
ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶベクター：６８−１株由来ＲｈＣＭＶ／ＳＩＶの構築、特徴付け、および投与は、Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，５２３（２０１１）；Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５，２９３（２００９）およびＨａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８，１０２（２０１０）（その全てが本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。本研究で使用した全ての組換えウイルスは、組織培養物中でのｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによるＲｈＣＭＶ−ＥＧＦＰ中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＳＩＶｇａｇ発現カセットとの置換によって生成したＲｈＣＭＶ（ｇａｇＬ）を除き、ＲｈＣＭＶ６８−１ＢＡＣ株から誘導した。ＲｈＣＭＶ６８−１について記載のように（Ｍａｌｏｕｌｉ  Ｄら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６，８９５９（２０１２）およびＨａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，６６２０（２００３）；その両方が本明細書中で参考として援用される）、ＢＡＣ由来構築物と同様に、ＲｈＣＭＶｇａｇＬはインタクトな読み取り枠（ＯＲＦ）、Ｒｈ６１／Ｒｈ６０（ＵＬ３６）を含む。組織培養への適応の結果として、ＢＡＣおよび非ＢＡＣのＲｈＣＭＶ６８−１構築物の両方は、ＯＲＦ１５７．５およびＯＲＦ  Ｒｈ１５７．４のほとんどが欠失している（これらは、ＨＣＭＶ  ＵＬ１２８およびＵＬ１３０のホモログをそれぞれコードする）（Ｏｘｆｏｒｄ  ＫＬら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７３，１８１（２００８）；本明細書中で参考として援用される）。低継代数のＲｈＣＭＶでは、これら２つのＯＲＦは、Ｒｈ１５７．６（ＵＬ１３１）を含む同一の多シストロン性ｍＲＮＡから翻訳される（Ｌｉｌｊａ  ＡＥら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５，１９９５０（２００８）；本明細書中で参考として援用される）。
【０１０３】
修復ＵＬ１２８−ＵＬ１３０を発現するベクターを生成するために、ＳＩＶｇａｇ発現カセットを、ＲｈＣＭＶ６８−１．２（Ｒｈ６１／Ｒｈ６０（ＵＬ３６）、Ｒｈ１５７．４（ＵＬ１３０）、およびＲｈ１５７．５（ＵＬ１２８）が修復された組換えウイルス）のＲｈ２１１に挿入した。ΔＲｈ１８２−１８９ＲｈＣＭＶ／ｇａｇは、Ｈａｎｓｅｎら  ２０１０前出に記載されている。同様に、Ｒｈ１８２−１８９をコードするゲノム領域（Ｍａｌｏｕｌｉら  ２０１２前出におけるＢＡＣゲノムアノテーションを使用した塩基対１９３，１６１〜１９９，８２３）のＥＦ１αＳＩＶｒｅｖ／ｔａｔ／ｎｅｆまたはｇＨＳＩＶ／ｅｎｖ発現カセットとの置換によってΔＲｈ１８２−１８９ＲｈＣＭＶ／ｒｔｎおよび／ｅｎｖを構築した。部分欠失変異体ΔＲｈ１８２−１８５ＲｈＣＭＶ／ｇａｇおよび／ｒｔｎを、塩基対１９３，１６１および１９６，３０５をＳＩＶｇａｇまたはＳＩＶｒｅｖ／ｔａｔ／ｎｅｆのための発現カセットと置換することによって生成した。部分欠失変異体ΔＲｈ１８６−１８９ＲｈＣＭＶ／ｇａｇおよびｒｔｎを、塩基対１９６，５９３〜１９９，８２３をＳＩＶｇａｇまたはＳＩＶｒｅｖ／ｔａｔ／ｎｅｆ発現カセットと置換することによって構築した。Ｒｈ１８９（ＵＳ１１）のみを欠く組換えＲｈＣＭＶを生成するために、本発明者らは、Ｒｈ１８９コード領域をＲｈＣＭＶｒｔｎ中のＳＩＶｇａｇのコード領域と置換した。したがって、このベクターは、Ｒｈ１８９プロモーターの調節下でＳＩＶｇａｇを発現し、ＥＦ１αプロモーターの調節下でＳＩＶｒｔｎ（Ｒｈ２１１に挿入）を発現する（図Ｓ１０）。全ての組換えウイルスを特徴づけ、制限消化によって確認し、その隣接領域を含む抗原インサートの配列を検証した。ＳＩＶ抗原の発現を免疫ブロットによって検証した。さらに、隣接遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲによって検証した。
【０１０４】
他のワクチン：本研究で使用したＡｄ５／ｇａｇベクターの構築、特徴付け、および投与は、（Ｈａｎｓｅｎら  ２０１１  前出）に記載されている。ＭＶＡ／ｇａｇを、ＭＨ５（初期／後期ワクシニアプロモーター）の調節下でコドン最適化された全長ＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇ遺伝子をＭＶＡシャトルベクターｐＬＷ４４に挿入することによって構築して、組換えプラスミドｐＪＶ７を生成した。ｐＬＷ４４内の隣接配列は、相同組換えによるチミジンキナーゼ遺伝子座への組換え構築物の挿入を指示した。ニワトリ胚性線維芽細胞をｐＪＶ７でトランスフェクション後、ＭＶＡ１９７４株を感染させてＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇを発現する組換えウイルスを生成した（ウェスタンブロットによってＳＩＶｇａｇ発現が確認された）。組換えウイルスをプラーク精製し、大量培養で増幅させた。ウイルスストックを２４→４０％スクロース勾配で精製後、３６％スクロースクッションによってペレット化し、次いで、ペレットを１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．０）に懸濁した。ＭＶＡ／ｇａｇワクチン接種のために、マカクに１０８プラーク形成単位のこのベクターを筋肉内注射によって投与した。ＤＮＡ／ｇａｇ＋ＩＬ−１２ワクチンは、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから提供された。簡潔に述べれば、ＳＩＶｇａｇインサート発現がヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって調節されるように、コドン最適化された全長ＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇの５’ハーフおよび３’ハーフをｐＶＡＸ（登録商標）骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。最適化アカゲザルＩＬ−１２アジュバントを、以前に使用したマカクＩＬ−１２の非最適化バージョン（６３）の修正によって構築した。修正には、ｐ３５インサート配列およびｐ４０インサート配列のみのコドンおよびＲＮＡ最適化が含まれ、最適化をＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって実施した。記載のように（Ｌａｄｄｙ  ＤＬら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３、４２６４（２００９）；本明細書中で参考として援用される）、マカクに１ｍｇの２つのＳＩＶｇａｇ構築物および０．５ｍｇのＩＬ−１２構築物を投与し、ＤＮＡを四頭筋に送達後、Ｃｅｌｌｅｃｔｒａ（登録商標）定電流デバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでエレクトロポレーションを行った。
【０１０５】
抗原および抗原提示細胞：ＳＩＶｇａｇ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｔａｔ、ｅｎｖ、およびｐｏｌタンパク質およびＲｈＣＭＶ  ＩＥ−１タンパク質を含む連続１５ｍｅｒペプチド（１１アミノ酸重複）ならびにこれらのタンパク質内の特異的９〜１４ｍｅｒペプチドの合成を、ＳＩＶｍａｃ２３９配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ３３２６２）（Ｋｅｓｔｌｅｒ  Ｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８，１１０９（１９９０）；本明細書中で参考として援用される）または６８−１株ＲｈＣＭＶ  ＩＥ−１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ１８６１９４）（Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，６６２０（２００３）；本明細書中で参考として援用される）を使用して、ＩｎｔａｖｉｓＡＧ（登録商標）によって行った。全ペプチドを、Ｎ末端からの包括的なアミノ酸の位置によって同定する（例えば、Ｇａｇｘｘ−ｙｙ）。連続１５ｍｅｒも、Ｎ末端１５ｍｅｒから開始する１５ｍｅｒの位置によって命名する（例えば、Ｇａｇ１−１５は１５ｍｅｒ  番号１である；Ｇａｇ４−１９は１５ｍｅｒ  番号２である、など）。他で規定しない限り、これらのペプチドを、Ｔ細胞アッセイにおいて２μｇ／ｍｌ（単独または総タンパク質混合物中のいずれにおいても）で使用した。アルドリチオール−２不活化ＳＩＶ（ＡＴ−２−ＳＩＶ；ロットＰ４１４６、ＡＩＤＳおよびがんプログラム、米国国立癌研究所フレデリック支所，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を、記載のように産生した（Ｂｕｓｅｙｎｅ  Ｆら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，３４４（２００１）；本明細書中で参考として援用される）。自己Ｂ−リンパ芽球様細胞株（ＢＬＣＬ）を、アカゲザルＰＢＭＣにヒヒヘルペスウイルスを感染させることによって生成した（Ｖｏｓｓ  Ｇら  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３９，１８５（１９９２）；本明細書中で参考として援用される）。自己ＳＩＶ感染標的細胞を、記載のように（Ｓａｃｈａ  ＪＢら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，２７４６（２００７）；本明細書中で参考として援用される）スクロース精製ＳＩＶｍａｃ２３９での活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞のスピノキュレーション、その後の４日間の培養、その後のＣＤ４マイクロビーズおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）での精製によって産生した。感染細胞調製物は、富化後に９５％超がＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＳＩＶ感染率は５０％超であった。これをエフェクター：標的比８０：１で使用した。単一のＭａｍｕ−ＤＲ異形トランスファクタントを、ｐｃＤＮＣ３．１よりもむしろプラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＭａｍｕ−ＤＲ対立遺伝子を挿入することを除いて記載のように（Ｇｉｒａｌｄｏ−Ｖｅｌａ  ＪＰら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２，８５９（２００８）；本明細書中で参考として援用される）構築した。Ｍａｍｕ−ＤＲＡ＊０１：０５を、ＤＲＢ１＊１０：０７、ＤＲＢ１＊０４：０６、ＤＲＢ１＊０３：０９、ＤＲＢ５＊０３：０１、ＤＲＢ＊ｗ２：０１、およびＤＲＢ＊ｗ２６：０３と対にし、Ｍａｍｕ−ＤＲＡ＊０１：０２１をＤＲＢ＊ｗ４：０１と対にした。ＭＨＣ−ＩＩ拘束アッセイ前に、これらのトランスファクタント由来のｍＲＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用���て抽出し、Ｍａｍｕ−ＤＲＢの高多型性β１領域に及ぶユニバーサルプライマー対（５’−ＧＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣ−３’−配列番号３および５’−ＧＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣ−３’−配列番号４）を使用したＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、その配列を確認した。ＭＨＣ−ＩＩトランスファクタントおよびＢＬＣＬを、目的のＧａｇペプチドで最終濃度５μｇ／ｍｌにて９０分間（３７℃）パルスし、次いで、温ＰＢＳで２回洗浄し、温Ｒ１０で１回洗浄して非結合ペプチドを除去後、エフェクター：標的比１０：１で新たに単離したＰＢＭＣを刺激するために使用した。
【０１０６】
Ｔ細胞アッセイ：ＳＩＶおよびＲｈＣＭＶ特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔの細胞応答を、詳述するように（Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら  ２０１１  前出；Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら  ２００９  前出、およびＨａｎｓｅｎ  ＳＧら，２０１０前出）、フローサイトメトリーＩＣＳによって血液および組織由来の単核球調製物中で測定した。簡潔に述べれば、単核球または単離ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原（ペプチド、ＡＴ−２ＳＩＶ、ペプチドをパルスしたＢＬＣＬまたはＭＨＣ−ＩＩトランスファクタント、またはＳＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞）および共刺激分子ＣＤ２８およびＣＤ４９ｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１時間インキュベートし、その後にブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してさらに８時間インキュベートした。抗原を使用しない共刺激をバックグラウンドコントロールとして準備した。応答とのＭＨＣ関連（ＭＨＣ−Ｉ対ＭＨＣ−ＩＩ）を、単離単核球またはＡＰＣを、ＭＨＣ−ＩｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ；クローンＷ６−３２）対ＭＨＣ−ＩＩｍＡｂ（ＨＬＡ−ＤＲ；クローンＧ４６−６）またはＣＬＩＰペプチド（ＭＨＣ−ＩＩ関連インバリアント鎖、アミノ酸８９〜１００；２μｇ／ｍｌ）の存在下にて室温で１時間プレインキュベート後、ペプチドを添加するかエフェクターおよび標的細胞を組み合わせ、標準的なＩＣＳアッセイでインキュベートすることによって決定した。刺激された細胞を、Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら  ２０１１  前出；Ｈａｎｓｅｎ  ＳＧら  ２００９  前出，およびＨａｎｓｅｎ  ＳＧら，２０１０  前出に記載のように固定し、透過処理し、染色し、ＬＳＲ−ＩＩ装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にてフローサイトメトリー分析を行った。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析を行った。全分析において、小リンパ球の光散乱サインに対するゲーティング後、ＣＤ３＋集団、次いでＣＤ４＋／ＣＤ８−対ＣＤ４−／ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに対して段階的にゲーティングした。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団またはＣＤ８＋Ｔ細胞集団についての抗原特異的応答頻度を、ＣＤ６９およびＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのいずれかまたはその両方の細胞内発現から日常的に決定した（選択実験では、応答を細胞内ＣＤ６９およびＩＬ−２もしくはＭＩＰ−１β産生またはＣＤ１０７外在化のいずれかによっても特徴づけた（１１））。他の選択実験では、（ＣＤ６９＋／ＴＮＦ−α＋および／またはＣＤ６９＋／ＩＦＮ−γ＋）のブールゲートを生成し、ゲーティングした（応答性）ＣＤ８＋Ｔ細胞集団におけるＣＤ２８およびＣＣＲ７の発現を決定した。記載のように（Ｐｉｔｃｈｅｒ  ＣＪら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８，２９（２００２）；本明細書中で参考として援用される）、バックグラウンド減算およびメモリ補正後に応答頻度を報告した。エピトープ逆重畳実験のために、より厳格な応答基準を使用して偽陽性を防止した。これらの研究では、所与の１５ｍｅｒペプチドに対する応答を、少なくとも２つの独立したアッセイにおいてＣＤ６９＋、ＴＮＦ−α＋、およびＩＦＮ−γ＋としてクラスター化した事象頻度が０．０５％以上であり、バックグラウンドが０．０１％未満である場合、陽性と見なした。ＭＨＣ−Ｉ関連対ＭＨＣ−ＩＩ関連としての個別のペプチド応答の分類は、アイソタイプコントロールと比較したＭＨＣ−Ｉ遮断またはＭＨＣ−ＩＩ遮断のいずれかによる応答の９０％超阻害に基づいていた。これらの基準を満たさなかった応答を、不確定と見なした。最小独立エピトープ数を、以下の基準に従った連続１５ｍｅｒペプチドの試験によって同定された陽性応答から推定した：単一陽性ペプチド＝１独立エピトープ；２隣接陽性ペプチド＝１独立エピトープ；３隣接陽性ペプチド＝２独立エピトープ；４隣接陽性ペプチド＝２独立エピトープ；および５隣接陽性ペプチド＝３独立エピトープ。これらの最小数の独立エピトープの推定を、ＭＨＣ関連データの恩恵を受けずに最初に実施したが、その後に同一の基準を用いて修正し、ＭＨＣ−Ｉ遮断応答対ＭＨＣ−ＩＩ遮断応答に独立して適用した。
【０１０７】
統計：独立したサンプルの比較のために、本発明者らは、ウィルコクソン順位和検定としても公知の２変量マン・ホイットニーＵ検定を適用した。固定ｎｕｌｌ仮定値との一標本比較のために（１００％と比較した百分率など）、本発明者らは一標本ウィルコクソン符合付き順位検定を適用した（Ｗｏｌｆｅ  ＤＡ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  Ｍ  Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７３）；本明細書中で参考として援用される）。全検定を、第一種過誤率５％を用いた両側検定として実施した。本発明者らは、全ての統計解析のためにＲ言語を使用した（ｗｗｗ．Ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ（２０１１）；本明細書中で参考として援用される）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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