(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血中HDLコレステロールレベルを増加させるための組成物であり、肝細胞にトランスフェクトしてATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)を発現させる方法における使用のための組成物であって、前記組成物が、活性型のABCA1をコードするプラスミドベクターと、音響化学的に活性なマイクロスフェアとの混合物を、薬学的に許容可能な水性担体中に含み、前記ベクターが、前記活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームと、哺乳動物細胞内で前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列とを含み、前記音響化学的に活性なマイクロスフェアが、タンパク質、脂質またはそれらの組み合わせを含むシェルに封入されたガス気泡を含み、前記マイクロスフェアは超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり前記封入されたガス気泡を放出するものであり、前記方法が以下の工程：
(a) 前記組成物を被験者に静脈内投与する工程；
(b) 前記組成物が肝臓の脈管構造を循環している間に前記被験者の肝臓を超音波イメージングし、これにより肝臓の脈管構造中の前記組成物の前記マイクロスフェアの存在を検出する工程；および
(c) 前記マイクロスフェアが肝臓内に存在する間に、イメージングに必要とされるレベルよりも高い音響エネルギーレベルであって、かつ前記マイクロスフェアを破壊し前記マイクロスフェアから前記ガス気泡を放出させるのに十分なエネルギーレベルで、肝臓に超音波エネルギーのパルスを照射する工程であって、前記超音波エネルギーのパルスおよびそれによるガス気泡の放出が、肝臓内の細胞の有孔性を一時的に増加させ、前記細胞内への前記組成物の前記プラスミドの侵入を容易にする、該工程
を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記マイクロスフェアが、約0.5〜約20マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ガス気泡がフルオロカーボンガスを含む、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
前記シェルがヒト血清アルブミンを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記オープンリーディングフレームが、配列番号2のヌクレオチド配列を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された前記少なくとも1つの配列が、サイトメガロウイルスプロモーターを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記プラスミドが、1ミリリットル当たり約0.5〜約50ミリグラムの範囲の濃度で前記組成物中に存在する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
前記マイクロスフェアが、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの範囲の濃度で前記組成物中に存在する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記水性担体が、生理学的なpHに緩衝化されていてもよい生理食塩水を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
(a)脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、(b)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外の酵素をコードするプラスミド、および(c)脂質代謝または輸送に関与する酵素を標的とするsiRNAをコードするプラスミド、からなる群から選択される少なくとも1つの物質をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
ABCA1をコードするプラスミドが、(a)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外のタンパク質および(b)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAからなる群から選択される少なくとも1つの物質をまたコードする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
血中HDLコレステロールレベルを増加させるための組成物であり、肝細胞にトランスフェクトしてATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)を発現させる方法における使用のための組成物であって、前記組成物が、1ミリリットル当たり約0.5〜約50ミリグラムの、活性型のABCA1をコードするプラスミドベクターと、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの、音響化学的に活性なマイクロスフェアとの混合物を、薬学的に許容可能な水性担体中に含み、前記ベクターが、前記活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームと、哺乳動物細胞内で前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列とを含み、前記音響化学的に活性なマイクロスフェアが、ヒト血清アルブミンを含むシェルに封入されたフルオロカーボンガス気泡を含み、前記マイクロスフェアは超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり前記封入されたガス気泡を放出するものであり、前記方法が以下の工程：
(a) 前記組成物を被験者に静脈内投与する工程；
(b) 前記組成物が肝臓の脈管構造を循環している間に前記被験者の肝臓を超音波イメージングし、これにより肝臓の脈管構造中の前記組成物の前記マイクロスフェアの存在を検出する工程；および
(c) 前記マイクロスフェアが肝臓内に存在する間に、イメージングに必要とされるレベルよりも高い音響エネルギーレベルであって、かつ前記マイクロスフェアを破壊し前記マイクロスフェアから前記ガス気泡を放出させるのに十分なエネルギーレベルで、肝臓に超音波エネルギーのパルスを照射する工程であって、前記超音波エネルギーのパルスおよびそれによるガス気泡の放出が、肝臓内の細胞の有孔性を一時的に増加させ、前記細胞内への前記組成物の前記プラスミドの侵入を容易にする、該工程
を含む、前記組成物。
【請求項１４】
前記活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
前記オープンリーディングフレームが、配列番号2のヌクレオチド配列を有する、請求項13又は14に記載の組成物。
【請求項１６】
前記水性担体が、生理学的なpHに緩衝化されていてもよい生理食塩水を含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１７】
(a)脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、(b)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外の酵素をコードするプラスミド、および(c)脂質代謝または輸送に関与する酵素を標的とするsiRNAをコードするプラスミド、からなる群から選択される少なくとも1つの物質をさらに含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
ABCA1をコードするプラスミドが、(a)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外のタンパク質および(b)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAからなる群から選択される少なくとも1つの物質をまたコードする、請求項13〜17のいずれか1項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、音響化学的に活性なマイクロスフェアおよびATP結合カセットトランスポーターA1をコードするプラスミドを含む組成物ならびにin vivoでATP結合カセットトランスポーターA1の発現を誘導する方法に関する。
【０００２】
配列表の組み込み
本願の生物学的配列情報は、2013年9月10日に作成され、44617バイトのファイルサイズを有し、ファイル名"SG-2-SEQ-4_ST25.txt"を有するASCIIテキストファイル(参照により本願に組み込まれる)に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
高密度リポタンパク質(HDL)は、リポタンパク質の5つの主要なグループの中で最大である。他のリポタンパク質は、キロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)および低密度リポタンパク質(LDL)を含む。HDLおよび他のリポタンパク質は、それらが疎水性であるにもかかわらず、血流中でコレステロールおよび他の脂質(例えばトリグリセリド)を輸送することができる。健常成人においては、血中コレステロールの約30パーセントがHDLによって運ばれる。
【０００４】
ATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)は、新生高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-c)を生成するためのApoA1の最初の脂質化に必要なリン脂質と協力して細胞から過剰なコレステロールを排出する細胞膜内在性タンパク質である。ABCA1欠乏は、大変低い血漿中HDL-c濃度をもたらす。対照的に、ABCA1の過剰発現は、食事性アテローム性動脈硬化症からC57B1/6マウスを保護することが報告されている。肝臓X因子(LXR)によってその調節遺伝子を制御することによるABCA1転写の増強は、HDL生合成の誘導ばかりでなく、望ましくない肝脂肪症を引き起こす、脂肪合成の有害な増加をも引き起こした。
【０００５】
HDL-cは、ABCA1輸送タンパク質によって媒介されるアポリポタンパク質A1(apoA1)の脂質化によって肝臓および腸において生成される。培養細胞、ヒトHDL欠乏症および動物モデルに関する多数の研究によって、ABCA1が血漿中HDL濃度の主要な決定要因であり、強力なアテローム予防因子であることが示された。血漿HDLの生成に関する肝臓中のABCA1の役割は確立されているが、ABCA1生成の刺激が、新生HDLの脂質化および分泌を増強し、それによって血漿中HDL-c濃度の増加が引き起こされるかどうかは不明である。
【０００６】
HDLの代謝は複雑であり、排泄または再使用(コレステロール逆輸送)のために、動脈からのコレステロールの輸送にいくつかの因子が寄与している。コレステロール逆輸送の重要なプレーヤーには、ABCA1、ABCG1、apoA1、apoE、LXR、ニーマン・ピック(Niemann Pick)タンパク質1および2(NPC1およびNPC2)ステロール調節エレメント結合タンパク質(SREBP)、CD36、アシルコレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)およびスカベンジャー受容体A1(SRA1)が含まれる。これらのタンパク質の多くは、血中HDL-c濃度を増加させるための薬剤標的と考えられてきた。しかしながら、これらの各タンパク質のいずれかの正常な活性および発現をターゲッティングするかまたはその活性を増強するかまたは他の方法でそれに干渉する事の効果は予測できない。高コレステロールは、一般に、肝臓におけるコレステロール生成抑制(例えばHMG-CoAレダクターゼ抑制)または脂肪の消化抑制(例えば胆汁酸産生抑制)によっても治療される。
【０００７】
血漿中HDL-c濃度および血漿中LDL-c濃度は、動脈閉塞を起こす全身性アテローム性動脈硬化症の指標としてルーチンに測定される。HDLは、動脈内からコレステロールを除去し、そのコレステロールを排泄または再利用のために肝臓に逆輸送することができる。高濃度のHDL-cを有する個体は、心血管疾患の減少傾向を有する。低いHDL-cコレステロール値(約40mg/dL未満または約1mmol/L未満)は、心疾患のリスク増加に関連している。まれな遺伝性疾患であるタンジール病(別名"家族性α-リポタンパク質欠乏症")の患者では、染色体9q31における変異がABCA1の不活性型をもたらす。不活性なABCA1は、血液中のHDL濃度の極端な低下をもたらす。現在、タンジール病の有効な治療法は無い。
【０００８】
血中HDL-c濃度と心疾患のリスク低下との間ばかりでなく、HDLとタンジール病との間の関連にも正の疫学的相関が認められるため、血中HDL-c濃度を増加させる新規方法が継続的に求められている。本願は、この継続的な要求に対処するものである。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、細胞(例えば肝臓細胞)をトランスフェクトしてABCA1を発現させるのに有用な組成物を提供する。本明細書に記載の組成物は、活性型のABCA1およびその発現のための少なくとも1つのプロモーターをコードするプラスミドDNA構築物と共に音響化学的に活性なマイクロスフェアを含む薬学的に許容される水性担体を含む。音響化学的に活性なマイクロスフェアは、タンパク質含有シェルまたは脂質含有シェル(例えばヒト血清アルブミンシェル)に封入されたガス気泡(例えばオクタフルオロプロパンまたはパーフルオロヘキサンなどのフルオロカーボンガス)を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このマイクロスフェアは、超音波エネルギー(超音波処理)への暴露によって崩壊可能であり、崩壊して封入ガスを放出する。
【００１０】
以下の実施形態は、本明細書に記載の組成物および方法の例示であって、限定するものではない例として提供される。
【００１１】
実施形態1は、細胞をトランスフェクトするのに有用な組成物であって、活性型のATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)をコードするプラスミドベクターおよび音響化学的に活性なマイクロスフェアの混合物を薬学的に許容される水性担体中に含む組成物を含む。このベクターは、活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームおよび哺乳動物細胞内でこのオープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列を含む。音響化学的に活性なマイクロスフェアは、タンパク質、脂質またはそれらの組み合わせを含むシェルに封入されたガス気泡を含み、このマイクロスフェアは超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり、崩壊して封入されたガス気泡を放出する。
【００１２】
実施形態2は、マイクロスフェアが約0.5〜約20マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、実施形態1に記載の組成物を含む。
【００１３】
実施形態3は、ガスがフルオロカーボンガスを含む、実施形態1または実施形態2に記載の組成物を含む。
【００１４】
実施形態4は、シェルがヒト血清アルブミンを含む、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００１５】
実施形態5は、活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００１６】
実施形態6は、オープンリーディングフレームが、配列番号2のヌクレオチド配列を有する、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００１７】
実施形態7は、オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列がサイトメガロウイルスプロモーターを含む、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００１８】
実施形態8は、プラスミドが、約0.5〜約50mg/mLの範囲の濃度で組成物中に存在する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００１９】
実施形態9は、マイクロスフェアが、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの範囲の濃度で組成物中に存在する、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００２０】
実施形態10は、水性担体が、任意に生理学的なpHに緩衝化された生理食塩水を含む、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００２１】
実施形態11は、a)脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、(b)輸送の脂質代謝に関与するABCA1以外のタンパク質をコードするプラスミドおよび(c)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAをコードするプラスミド、からなる群から選択される少なくとも1つの物質をさらに含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００２２】
実施形態12は、ABCA1をコードするプラスミドが、(a)輸送の脂質代謝に関与するABCA1以外のタンパク質および(b)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNA、からなる群から選択される少なくとも1つの物質もまたコードする、実施形態1〜11のいずれか1つに記載の組成物を含む。
【００２３】
実施形態13は、細胞をトランスフェクトするのに有用な組成物であって、約0.5〜約50mg/mLの、活性型のATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)をコードするプラスミドベクターおよび1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの音響化学的に活性なマイクロスフェアの混合物を薬学的に許容される水性担体中に含む組成物において、このベクターが、活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームおよび哺乳動物細胞内でこのオープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列を含み、音響化学的に活性なマイクロスフェアが、ヒト血清アルブミンを含むシェルに封入されたオクタフルオロプロパンガス気泡を含み、このマイクロスフェアが超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり、崩壊して封入されたガス気泡を放出する組成物を含む。
【００２４】
実施形態14は、組織をin vivoでトランスフェクトして組織の細胞内で活性型のABCA1を発現させる方法であって、(a)活性型のATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)をコードするプラスミドベクターおよび音響化学的に活性なマイクロスフェアを、被験者に静脈内共投与する工程であって、このベクターが、活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームおよび哺乳動物細胞内でこのオープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列を含み、音響化学的に活性なマイクロスフェアが、タンパク質、脂質またはそれらの組み合わせを含むシェルに封入されたガス気泡を含み、このマイクロスフェアが超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり、崩壊して封入されたガス気泡を放出するものである、前記工程、(b)組成物のプラスミドおよびマイクロスフェアが組織の脈管構造を循環する間に、トランスフェクトされた被験者の組織を超音波イメージングし、それによって組織の脈管構造中のマイクロスフェアの存在を検出する工程、ならびに(c)マイクロスフェアが組織内に存在する間に、イメージングに必要とされるレベルよりも高い音響エネルギーレベルであって、かつマイクロスフェアを破壊しマイクロスフェアからガス気泡を放出させるのに十分なエネルギーレベルで、組織へ超音波エネルギーのパルスを照射する工程であって、超音波エネルギーのパルスおよびそれによるガス気泡の放出が組織内の細胞の有孔性を一時的に増加させ、細胞内へのプラスミドの侵入を容易にさせてそれらのトランスフェクションを行うものである、前記工程を含む方法を含む。
【００２５】
実施形態15は、マイクロスフェアが、約0.5〜約20マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、実施形態14に記載の方法を含む。
【００２６】
実施形態16は、ガスがフルオロカーボンガスを含む、実施形態14または実施形態15に記載の方法を含む。
【００２７】
実施形態17は、シェルがヒト血清アルブミンを含む、実施形態14〜16のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００２８】
実施形態18は、活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、実施形態14〜17のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００２９】
実施形態19は、オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列がサイトメガロウイルスプロモーターを含む、実施形態14〜18のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３０】
実施形態20は、プラスミドが、水性担体中で約0.5〜約50mg/mLの範囲の濃度で投与される、実施形態14〜19のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３１】
実施形態21は、マイクロスフェアが、水性担体中で1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの範囲の濃度で投与される、実施形態14〜20のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３２】
実施形態22は、プラスミドおよびマイクロスフェアが、1つの水性担体中の混合物として投与される、実施形態14〜21のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３３】
実施形態23は、プラスミドおよびマイクロスフェアが、別々の水性担体中で投与される、実施形態14〜21のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３４】
実施形態24は、プラスミドおよびマイクロスフェアとともに、追加の生物学的活性剤が共投与される、実施形態14〜23のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３５】
実施形態25は、追加の生物学的活性剤が、(a)脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、(b)輸送の脂質代謝に関与するABCA1以外のタンパク質をコードするプラスミドおよび(c)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAをコードするプラスミド、からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含む、実施形態24に記載の方法を含む。
【００３６】
実施形態26は、組織が、肝臓組織、腸実質組織またはそれらの組み合わせを含む、実施形態14〜25のいずれか1つに記載の方法を含む。
【００３７】
実施形態27は、被験者の血液中の高密度リポタンパク質コレステロールを増加させるための(例えばアテローム性動脈硬化症を治療するための)、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の組成物の使用を含む。
【００３８】
実施形態28は、被験者の血液中の高密度リポタンパク質コレステロールを増加させるための(例えばアテローム性動脈硬化症を治療するための)医薬の製造のための、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の組成物の使用を含む。
【００３９】
ラットを用いて行った研究において、ABCA1プラスミドおよびアルブミン封入フルオロカーボンガス(オクタフルオロプロパン)マイクロスフェアを含む水性組成物の末梢静脈(尾静脈)内注入と組み合わせた肝臓のソノポレーションによって、ラットのベースラインHDL-c濃度に対して血漿中HDL-c濃度の有意な増加が引き起こされた。この研究において、ABCA1プラスミドはapoA1プラスミドよりも高い血清中HDL-c濃度を引き起こした。この発見は驚くべきでことであり、かつ新規である。この分野における現行の理解は、HDL-cの肝臓分泌を増加させるのに最も有効な方法はapoA1合成を増加させることである。実際、この研究において、ABCA1プラスミドおよびapoA1プラスミドの両方を用いた処理では、ABCA1だけの注入と比較してあまり変化はなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本実施例で用いたヒトABCA1のアミノ酸配列(配列番号1)を示す図である。
【図２−１】本実施例で用いたヒトABCA1のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す図である。
【図２−２】本実施例で用いたヒトABCA1のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す図である。
【図２−３】本実施例で用いたヒトABCA1のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列(配列番号1)を示す図である。
【図３−１】本実施例で用いたプラスミドのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。
【図３−２】本実施例で用いたプラスミドのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。
【図３−３】本実施例で用いたプラスミドのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。
【図３−４】本実施例で用いたプラスミドのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。
【図３−５】本実施例で用いたプラスミドのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。
【図４】本実施例で用いたABCA1プラスミドの概略図である。
【図５】OPTISONマイクロスフェアおよび、ABCA1、apoA1またはそれらの組み合わせをコードするプラスミドを含む組成物での音響化学治療後のラットにおける血中HDL-cのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
一側面において、本発明は、細胞をトランスフェクトしてABCA1を発現させるのに有用な組成物であって、活性型のABCA1およびその発現のための少なくとも1つのプロモーターをコードするプラスミドDNA構築物と共に音響化学的に活性なマイクロスフェアを含む薬学的に許容される水性担体を含む組成物を提供する。音響化学的に活性なマイクロスフェアは、タンパク質含有または脂質含有シェルに封入されたガス気泡を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このマイクロスフェアは、超音波処理(すなわち超音波音響エネルギーへの暴露)によって崩壊可能であり、封入ガスを放出する。
【００４２】
他の側面において、本発明は、in vivoで細胞内のABCA1発現を誘導する方法および血液中の高密度リポタンパク質コレステロールを増加させる方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載のABCA1プラスミドおよび音響化学的に活性なマイクロスフェアを被験者の静脈内に共投与し、このマイクロスフェアが組織の脈管構造中を循環する時に、被験者の標的組織(例えば肝臓または腸実質組織)を超音波イメージングして検出することを含む。このイメージングは、一般的には、約0.4MI未満のメカニカルインデックス(mechanical index)(MI；最大ピーク負音圧をイメージング周波数の二乗で割ったもので定義される)の外部からの超音波音響エネルギー照射によって行われる。マイクロスフェアが標的組織内で検出される場合は、超音波音響エネルギーパルスは、イメージングに必要なエネルギーレベル(一般的には1MIを超え、好ましくは1.3MIを超え、最大約2MIまで)よりも高い音響エネルギーレベルで、かつマイクロスフェアシェルを破壊し、シェルに封入されたガス気泡を放出するのに十分強い音響エネルギーで組織に照射される。パルスは、好ましくは、約1〜約7MHzの音響周波数で照射される。パルスの音響エネルギーおよび組織内でのガス気泡の放出は、組織の細胞膜の有孔性を一時的に増加させる(本明細書において"ソノポレーション(sonoporation)"と呼ぶプロセス)。
【００４３】
肝臓などの組織のソノポレーションは、超音波イメージングプローブを用いてその組織に超音波音響エネルギーパルスを照射することを含む。主としてマイクロスフェアが(従って共投与されるプラスミドも)存在する時にパルスが照射されるように、組織を超音波イメージングする間にパルスが照射される。パルスは、一般的に、1分間当たり約6〜約8パルスの割合で合計約5〜約20パルス照射される。パルス幅は、一般的には、1パルス当たり約500〜約2000ミリ秒の範囲である。音響エネルギーパルスは、マイクロスフェアを破壊し、封入ガスを放出させる。直接的に照射される音響エネルギーと組み合わせたこの破壊によって、細胞はプラスミドに対してより有孔性となり、それによってプラスミドは細胞に侵入し、それをトランスフェクトすることができる。ひとたびトランスフェクトされれば、細胞はメッセンジャーRNAを介してタンパク質を転写し、活性型のABCA1の合成を引き起こし、それがまた血液中でHDLの生成を促進し、HDC-c濃度を高める。
【００４４】
本明細書において、用語"共投与"およびその文法的変異形は、同じ治療セッション中に同じ個体に2以上の物質を投与することをいう。このような共投与は、物質を別々に投与することを含むこともできるし、同じ組成物中で一緒に投与することを含むこともできる。この共投与は同時であることもできるし、時間が異なることもできる。さらに、共投与部位は、同じ位置であることもできるし、異なる位置であることもできる。
【００４５】
本明細書において、用語"プラスミド"およびその文法的変異形は、細胞内の染色体DNAとは物理的に分離しており、独立して複製することができ、一般に、細菌内で(すなわち、エピソーム内で)小さな(例えば約千〜約百万塩基対の)環状二本鎖DNA分子として見出される小さな環状DNAである。人工のプラスミドは、分子クローニングにおいてベクターとして用いられ、宿主細胞の染色体DNAを変えずに、宿主細胞のエピソーム内で組換えDNA配列の複製を促進するのに役立つ。
【００４６】
本明細書において、用語"エピソームによってトランスフェクトされた"およびその文法的変異形は、不変の染色体DNAを有する細胞であって、エピソームDNAによってコードされるポリペプチドが、外因性DNAのゲノム組み込みなしで標的細胞(例えば肝臓細胞)内で発現される、外因性エピソーム核酸、例えばDNA、siRNA、RNAまたはmRNA(例えばプラスミドまたは他のエピソームベクター)による非挿入型(非組み込み型)トランスフェクションを指す。本明細書において、用語"エピソーム"およびその文法的変異形は、核内で複製され、宿主細胞、例えば肝臓細胞に導入される外因性プラスミドを含むものとする閉環状DNA分子のことをいう。好ましくは、プラスミドは、活性型のABCA1をコードし、ABCA1タンパク質のエピソーム発現を容易にする調節因子(例えばプロモーター)もまたコードする。
【００４７】
本明細書において、用語"活性型のABCA1"およびその文法的変異形は、配列番号1の保存的置換を含み、配列番号1と少なくとも約95パーセントの配列同一性(例えば少なくとも約95、96、97、98または99%の配列同一性)を有し、配列番号1の位置939および1952にリジン残基を保持する、配列番号1のABCA1タンパク質およびその変異形のことをいう。
【００４８】
本明細書に記載された百分率は、文脈によって明らかであるか、あるいは特記しない限り、濃度についていう場合は重量／重量基準(すなわち、"重量百分率"または"重量パーセント")であり、量または項目の可算個についていう場合は数基準である。
【００４９】
本明細書において、"治療上有効な用量"は、肝臓の超音波処理と組み合わせて投与されるとき、プラスミドが組織の細胞をトランスフェクトして核酸を発現し、続いて血液中のHDL-c濃度の増加またはこの治療によって標的とされる他の効果を生じるような量(例えば、約0.5〜約50mg/mLのABCA1プラスミドおよび1ミリリットル当たり約108〜約109のマイクロスフェアを含む単一組成物または共投与組成物の合計約0.5〜約10mL)である。被験者に投与される用量および投与の回数(例えば単回または複数回投与)は、投与経路、患者の状態および特性(性別、年齢、体重、健康状態、サイズ)、症状の程度、併用療法、処理の周波数および所望の効果、組成物中のプラスミド濃度などを含む種々の因子に左右される。
【００５０】
投与量範囲の調節および操作ならびに個体における組成物の治療効果のin vivoおよびin vitroでの測定方法は、医療分野の当業者の能力の範囲内である。好ましい実施形態の一部において、用量は、10分間で組成物約5mLを超えない。超音波造影剤の適切な安全用量によって、本明細書に記載の方法に使用するための有用なガイドラインが規定される。このような安全用量は当該分野で公知であり、超音波造影剤の製造業者による文献に示されている。
【００５１】
本発明の説明との関係において(特に、以下の特許請求の範囲との関係において)、用語"ある(a)"、"ある(an)"および"その(the)"ならびに同様な指示対象の使用は、特記しない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数の両方を含むものと解釈されるべきである。用語"含んでいる(comprising)"、"有している(having)"、"含んでいる(including)"および"含んでいる(containing)"は、別途記載のない限り、オープンエンドな用語と解釈されるべきである(すなわち、"限定するものではないが、〜を含んでいる"を意味している)。本明細書に特記しない限り、本明細書における値の範囲の記載は、単に、それぞれ別の値が個々にその範囲内に入る事をいう簡略的方法として役立つことを意図し、各値は、それぞれが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記述された全ての方法は、本明細書中で他に断らない限り、あるいは文脈に明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施されることができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語(例えば"など")の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図するものであり、他に主張しない限り、本発明の範囲に制限を設けるものではない。この明細書中の言語のいずれも、本発明の実施のために必須なものとして任意の非請求の要素(non-claimed element)を示すものとして解釈されるべきではない。
【００５２】
本明細書に記載の組成物および方法に使用するのに適した音響化学的に活性なマイクロスフェアは、超音波イメージング造影剤として使用することができる任意のタンパク質ベースまたは脂質ベースのガス充填マイクロスフェア(別名"マイクロバブル")を含む。マイクロスフェアは、生理学的に許容されるガス(例えば無毒のガス、例えば窒素、空気、酸素、アルゴンまたはフルオロカーボン、例えばオクタフルオロプロパン(別名"パーフルトレン(perflutren)")またはパーフルオロヘキサンを含む。マイクロスフェアのシェルは、タンパク質(例えばヒト血清アルブミン)、脂質物質(例えばリン脂質、ホスホコリン脂質およびそれらのポリエトキシレート)、またはそれらの組み合わせを含むことができる。脂質ベースマイクロスフェアには、そのシェルにガラクトースを含むことができるものがある。タンパク質含有マイクロスフェアは、比較的少量(例えば約1パーセント未満)の脂肪酸(例えばカプリル酸)、アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体(例えばN-アシルトリプトファン)または他の製剤助剤を含むことができる。マイクロスフェアは、一般的には、約1〜約10マイクロメートル(好ましくは約1〜約5マイクロメートル)の範囲の平均粒径(すなわち有効平均径)を有する。好ましくは、少なくとも約95%のマイクロスフェアが約10マイクロメートル未満の直径を有する。マイクロスフェアは、好ましくは、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの範囲の濃度で組成物中に存在する。本明細書に記載の組成物は、好ましくは、共投与されるプラスミド(単数または複数)の溶液とマイクロスフェア懸濁液(例えば製造業者によって供給された状態での)との単純な混合によって製造される。
【００５３】
組成物中の薬学的に活性な水性担体は水(例えば脱イオンパイロジェンフリー水)を含み、かつ好ましくは1以上の塩(例えば塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど)を含む。いくつかの好ましい実施形態において、水性担体は生理食塩水(約0.9パーセントNaCl)、リン酸緩衝化生理食塩水などを含む。担体は、一般に滅菌され、安全、等張で血液と適合する溶液を提供するために、場合により他の可溶性物質(例えばデキストロース)、防腐剤などを含むことができる。好ましくは、組成物は生理学的なpH(例えば約pH6.4〜7.5)を有する。
【００５４】
本明細書に記載の組成物および方法に有用ないくつかの好ましいマイクロスフェア製剤は、OPTSONブランドマイクロスフェア(GEヘルスケア社から入手できる)、IMAGENTブランドマイクロスフェア(Alliance Pharmaceutical社によって開発された)およびDEFINITYブランドマイクロスフェア(Lantheus Medical Imaging社から入手できる)を含む。好ましくは、組成物は、ヒト血清アルブミンに封入されたオクタフルオロプロパンマイクロスフェア、例えばOPTISONマイクロスフェアを含む。
【００５５】
製造業者によれば、GEヘルスケア社製のOPTISONマイクロスフェア懸濁液は、懸濁液1mL当たり約5x108〜約8x108マイクロスフェアを含む。このマイクロスフェアは、ヒト血清アルブミンのシェルに封入されたパーフルトレン(オクタフルオロプロパン)ガス気泡を含む。このマイクロスフェアは平均粒径約3〜約4.5μmを有し、このマイクロスフェアの約95%が約10μm未満の直径を有する。このマイクロスフェアは、生理食塩水(約0.9重量パーセントNaCl水溶液)に懸濁されている。この組成物はまた、約1パーセント未満のカプリル酸および約1パーセント未満のN-アシルトリプトファンを含むことができる。報告では、OPTISONマイクロスフェア各1ミリリットルは、ヒト血清アルブミン約10mg、パーフルトレン約0.2〜0.3mg、N-アセチルトリプトファン約0.2mgおよびカプリル酸約0.12mgをpH約6.4〜7.4の0.9%水性塩化ナトリウム中に含む。この懸濁液を含むバイアルのヘッドスペースにはパーフルトレンガスが充填されている。この製造業者は、注射速度が1秒あたり約1mLを超えないことを推奨している(最大総量は、どの10分間隔においても約5mLを超えてはならず、最大総量は、どの患者の試験においても約8.7mLを超えてはならない)。
【００５６】
IMAGENTパーフレキサン(perflexane)脂質マイクロスフェア組成物(以前の商品名はIMAVIST)は、Alliance Pharmaceutical社によって開発された注射用懸濁液である。報告では、このマイクロスフェアは、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、ヒドロキシエチルデンプンおよびポロキソマー(poloxomer)(ポリオキシエチレンの2つの親水性鎖に隣接する中央の疎水性ポリオキシプロピレン鎖で構成される非イオン性トリブロック共重合体)を含む脂質ベースシェルに封入されたパーフレキサン(パーフルオロヘキサン)マイクロバブルを含む。このマイクロスフェアはリン酸緩衝化生理食塩水溶液に懸濁されている。
【００５７】
製造業者の情報によれば、注射用懸濁液としてDEFINITYパーフルトレン脂質マイクロスフェアが提供されている。DEFINITY物質は、活性化によってパーフルトレン脂質マイクロスフェアを生じる成分として供給される。この物質は、透明無色で滅菌されたパイロジェンフリーの高張液であって、VIALMIXブランドアクチベーターを活用した活性化によってパーフルトレン脂質マイクロスフェアの均一不透明な乳状の白色注射用懸濁液を生じる液体を含むバイアルで供給される。この活性化DEFINITYマイクロスフェア懸濁液は静脈内注射によって投与される。このパーフルトレン脂質マイクロスフェアは、(R)-ヘキサデカン-1-[(ホスホノオキシ)メチル]-1,2-エタンジイルエステル、モノナトリウム塩(DPPAと略記される);(R)-4-ヒドロキシ-N,N,N-トリメチル10-オキソ-7-[(1-オキソヘキサデシル)オキシ]-3,4,9-トリオキサ-4-ホスファペンタコサン-1-アミニウム-4-オキシド分子内塩(DPPCと略記される);および(R)-α-[6-ヒドロキシ-6-オキシド-9-[(1-オキソヘキサデシル)オキシ]5,7,11-トリオキサ-2-アザ-6-ホスファヘキサコス-1-イル]-ω-メトキシポリ(オキサ-1,2-エタンジイル)、モノナトリウム塩(MPEG5000 DPPEと略記される)からなる外部脂質シェルに封入されたオクタフルオロプロパンで構成される。
【００５８】
DPPAは、分子量670、実験式C35H68O8PNaを有し、以下の構造式を有する。
0006550039.tif 000002
【００５９】
DPPCは、分子量734、実験式C40H80NO8Pを有し、以下の構造式を有する。
0006550039.tif 000003
【００６０】
MPEG5000 DPPEは、実験式C265H527NO123PNaで表されるおよその分子量5750を有し、以下の構造式を有する。
0006550039.tif 000004
【００６１】
報告では、DEFINITY成分バイアルは、VIALMIXの活性化の前に、そのヘッドスペースに6.52mg/mLのオクタフルオロプロパンを含む。報告では、この透明な液体各1mLは、脂質混合物(DPPA 0.045mg、DPPC 0.401mgおよびMPEG5000 DPPE 0.304mgからなる)0.75mg、プロピレングリコール103.5mg、グリセリン126.2mg、リン酸一ナトリウム・一水和物2.34mg、リン酸二ナトリウム・七水和物2.16mg、および塩化ナトリウム4.87mgの水溶液(pH6.2〜6.8)を含む。報告では、バイアルの内容物を活性化した後、乳状白色の懸濁液各1mLは、最大でパーフルトレン脂質マイクロスフェア1.2x1010およびオクタフルオロプロパン約150μm/mL(1.1mg/mL)を含む。このマイクロスフェアの平均粒径は約1.1μm〜3.3μmであり、このマイクロスフェアの98%は10μm未満の直径を有する。
【００６２】
プラスミド設計。一般に、プラスミドは、対象とするコードされる遺伝子(または相補的DNA、RNA、siRNAもしくはmDNA)(オープンリーディングフレームとして存在する)のin vivo転写および翻訳を促進する強力なウイルスプロモーターを含む。イントロンAは、mRNAの安定性を改善し、それによってタンパク質発現を増加させるために含まれることができる。プラスミドはまた、一般的には、ウシ成長ホルモンまたはウサギβ-グロブリンポリアデニル化配列などの強力なポリアデニル化/転写終結シグナルを含むこともできる。
【００６３】
プラスミドは、それによって目的タンパク質が発現される遺伝物質を提供するため、最大限のタンパク質発現のために最適化されたベクター設計が望ましい。例えば、真核細胞によりよく適合させるために、コドン使用頻度を調整することができる。考慮すべきもう一つの因子はプロモーターの選択である。プロモーターの例は、シミアンウイルス40(SV40)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターおよびサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含む。さらに、発現速度は、エンハンサー配列、アデノウイルストリパタイトリーダー(TPL)配列またはポリアデニル化および転写終結配列への改変の組み入れによって改善される場合がある。肝臓細胞のトランスフェクションのベクターとして使用するのに適したエピソームプラスミドベクターの限定するものではない例は、分子遺伝学分野で公知のSV40ベースベクター、EBウイルスベースベクター、乳頭腫ウイルスベースベクター、BKウイルスベースベクターなどを含む。
【００６４】
真核細胞(例えば初代MSC)のトランスフェクションの非組み込み型ベクターとして使用するのに適したエピソームベクターの限定するものではない例は、分子遺伝学分野で公知のシミアンウイルス40ベースベクター、EBウイルスベースベクター、乳頭腫ウイルスベースベクター、BKウイルスベースベクターなどを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、これらのプラスミドおよびマイクロスフェアに加えて追加の生物学的活性剤が共投与される。このような追加の生物学的活性剤は、例えば、脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、輸送の脂質代謝に関与するABCA1以外のタンパク質をコードするプラスミドおよび、脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAをコードするプラスミドを含む。これに加えて、あるいはこれに代えて、活性型のABCA1をコードするプラスミドは、輸送の脂質代謝に関与するABCA1以外のタンパク質または、脂質代謝もしくは輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAをコードすることもできる。
【００６６】
脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物の限定するものではない例は、HMG-CoA阻害薬、例えばスタチン(例えばアトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンおよびそれらの組み合わせ);胆汁酸阻害薬(例えばコレスチラミン、コレスチポル、コレセバラム(colesevalam)およびそれらの組み合わせ);LDL-cを減少させ、HDL-cを増加させることができるフィブリン酸誘導体(例えばクロフィブレート、ゲムフィブロジル、フェノフィブラート)；ならびにナイアシンを含む。
【００６７】
脂質代謝または輸送に関与するタンパク質の例は、例えばABCA1、ABCG1、apoA1、apoA2、apoE、LXR、NPC1、NPC2、SREBP、CD36、ACAT、SRA1およびHMG-CoAを含む。このようなタンパク質を標的化するこのような酵素またはsiRNAは、ABCA1プラスミドと共投与するプラスミドによってコードされることもできるし、ABCA1と同じプラスミドによってコードされることもできる。
【００６８】
薬物または脂質代謝/輸送タンパク質もしくはsiRNAをコードするプラスミドの共投与は、複数の作用部位、複数の代謝標的またはその両方に行うことによって、その患者が患っている特定の状態を治療するために合わせた治療という利点を有することができる。例えば、共投与される物質は、両方の型のコレステロールが推奨される濃度を外れている患者においてHDL-cを増加させ、LDL-cを減少させるように選択されることもできるし、HDL-cを増加させ、総グリセリドを減少させるように選択されることもできる。さらに、例えば、対象とする特定の脂質代謝経路に関与することができる最適の組織を標的とするために、所定の被験者において異なる組織をトランスフェクトすることができる。例えば、あるタンパク質またはsiRNAを発現させるためにある組織をトランスフェクトし、一方でsiRNAの他のタンパク質を発現させるために同じ被験者の異なる組織をトランスフェクトすることもできる。
【００６９】
限定するものではない以下の実施例は、IP-MSCの特定の特徴および側面ならびに本明細書に記載の方法を例示するために提供される。
【実施例】
【００７０】
方法および手順
雄のスプラーグ・ドーリー・ラット(180〜250g)は、Charles River Laboratories(ウィルミントン、マサチューセッツ州)から購入した。すべての動物実験は、AAALAC、USDAおよびOLAWの公認施設において行った。ラットは、滅菌ケージ(Alternative Design Manufacturing & Supply社、シロアムスプリングス、アーカンソー州)内に収容し、標準的な市販飼料(Lab Diet; Purina Mills社、セントルイス、ミズーリ州)および水には自由にアクセスさせた。動物は、12時間／12時間明暗サイクル、調節された温度(おおよそ24℃)および調節された湿度(おおよそ40%)中で飼育した。
【００７１】
ApoA1 DNAプラスミド.
ヒトapoE肝臓制御領域(HCR)、ヒトユビキチンCプロモーターおよび第1イントロンを含む発現ベクターpMIR0125(Mirus Bio社、マディソン、ウィスコンシン州)に804bpのヒトapoA1 PCR cDNA産物をサブクローニングしてapoA1発現プラスミドを構築した。最終構築物、pMIR0332-HCRUbC-h apoA1を配列決定した。得られたクローンは、報告されているヒトapoA1配列と一致した。ABCA1発現ベクターは、Origene社(ABCA1(NM 005502)Human cDNA ORF Clone、カタログ番号RC221861)から購入した。図1は、このベクターのオープンリーディングフレームにコードされるABCA1のアミノ酸配列(配列番号1)を示す。図2は、このベクターのABCA1オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列(配列番号2)を示す。図3は、この全ベクターのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。図4は、ABCA1プラスミドの概略マップを示す。
【００７２】
注入方法
これらのプラスミド(すなわちapoA1プラスミド、ABCA1プラスミドまたはapoA1およびABCA1プラスミドの組み合わせ)と市販の注射用OPTISONマイクロスフェア懸濁液とを混合した。麻酔剤:酸素と1.5〜3.0%イソフルランの吸入ガス混合物。加温用ベッドでラットの体温を37℃に維持した。26GA3/4インチカテーテルを用いて尾静脈注射を行った。混合物:OPTISONマイクロスフェア約1mLと、個々のプラスミドに用いたのと1mL当たり同じ濃度の(1)apoA1DNAプラスミド(1mL中おおよそ8mg)、または(2)ABCA1プラスミド(1mL中おおよそ7.3mg)、または(3)apoA1とABCA1プラスミドの組み合わせと混合した。
【００７３】
プラスミド容量およびDNA濃度。3mL注射シリンジを用いる注射の前に、単独または組み合わせでもすべてのプラスミドをOPTISONマイクロスフェアと約15〜約30秒間混合し、次いで共投与または共注入した。注入は、人の手によって、時間速度約2〜3mL/分で行い、全注入持続期間は約50〜約70秒間であった。
【００７４】
超音波装置、イメージングおよび治療パラメータ
すべての肝臓超音波処理には、3S超音波プローブを備えたVIVID Iブランドイメージングシステム(GE Healthcare Systems社、ミルウォーキー、ウィスコンシン州)を用いた。すべての音響エネルギー設定は、診断用途の概略を述べたFDAガイドライン(ALARA原則)の範囲内であった。肝臓脈管構造および実質内のOPTISON混合物の外観を確かめるために、外部超音波を用いてラット肝臓を継続的に可視化した。イメージングには、低いメカニカルインデックス(MI)超音波音響エネルギー(例えば<0.4MI)を用い、治療には高めのMI(約1.3MI以上)を用いた。外科的に腹部を切除することはこれまでには行わず、肝臓を視覚化するためには外部超音波を用いた。表面の毛を除去するために、腹部の毛を剃った。
【００７５】
超音波パラメータは、"イメージング"のための低メカニカルインデックス(MI<0.4)超音波の継続的暴露と、それに続く治療効果のための2秒間の"パルス"で合計10回の"パルス"からなった。パルスは、超音波パルスの比較的高い(MI>1.3)バーストと定義された。要約していえば、"パルス"長さは約2秒であり、約8秒間のパルス間隔をおいて合計10パルスを照射した。
【００７６】
血液試料
治療前に、各ラットに関してベースライン血清HDL-cを確認するために、6日間にわたって3つの尾静脈血液試料(0.5ml)を採取した。OPTISONマイクロスフェア懸濁液中のプラスミドでの治療後に、血液試料を毎日3日間採取し、次いで3日間の中断をおいて採取した。すべての血液試料は、リチウムヘパリン抗凝固薬を含むガラス試験管内に採取した。HDL値を定量するために、各血清試料を、臨床脂質パネルテストストリップ(clinical lipid panel test strip)(PTS #1710 Lipid Panel Test for CARDIOCHEK PA CHOLESTEROL ANALYZER、Polymer Technology Systems社、インディアナポリス、インディアナ州)を用いて分析した。グラフデータは平均+1SEMで示し、統計的有意性は2標本t検定で決定した。帰無仮説はP<0.05で棄却し、すべての統計解析はMINITAB12(Minitab社、ステートカレッジ、ペンシルベニア州、米国)を用いて行った。
【００７７】
結果
図5は、ベースライン濃度および治療3日後の濃度を含む、治療ラットの血中HDL-c濃度のグラフを示す。本明細書に記載のソノポレーションによるABCA1の選択的肝臓形質導入は、ベースラインHDL-c濃度に対して血中HDL-cを増加させた。肝臓の超音波処理と組み合わせたABCA1プラスミドおよび音響化学的に活性なマイクロスフェア組成物での単一音響化学治療によって、HDL-cの15%の増加が生じた。本研究における驚くべき発見は、同じ超音波処理条件下でのapoA1プラスミドまたはABCA1およびapoA1プラスミドの組み合わせでの治療に対して、ABCA1プラスミド治療がHDL-cの優れた増加をもたらしたことである。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための、本発明者が知っている最良の形態を含めて、本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態の変異形は、前述の説明を読むことによって当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者が必要に応じてこのような変異形を用いると予想する。本発明者はまた、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる方法で本発明を実施することを考慮する。従って、本発明は、適用法が容認する範囲で、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題事項のすべての改変および等価物を含む。さらに、本明細書に特記しない限り、あるいは文脈によって明確に否定されない限り、すべての起こりうるそれらの変形における上記の要素の任意の組み合わせは本発明に含まれる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕細胞にトランスフェクトするのに有用な組成物であって、前記組成物が、活性型のATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)をコードするプラスミドベクターと、音響化学的に活性なマイクロスフェアとの混合物を、薬学的に許容可能な水性担体中に含み、前記ベクターが、前記活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームと、哺乳動物細胞内で前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列とを含み、前記音響化学的に活性なマイクロスフェアが、タンパク質、脂質またはそれらの組み合わせを含むシェルに封入されたガス気泡を含み、前記マイクロスフェアは超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり、崩壊して前記封入されたガス気泡を放出するものである、前記組成物。
〔２〕前記マイクロスフェアが、約0.5〜約20マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、前記〔1〕に記載の組成物。
〔３〕前記ガス気泡がフルオロカーボンガスを含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔４〕前記シェルがヒト血清アルブミンを含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔５〕前記活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、前記〔1〕に記載の組成物。
〔６〕前記オープンリーディングフレームが、配列番号2のヌクレオチド配列を有する、前記〔1〕に記載の組成物。
〔７〕前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された前記少なくとも1つの配列が、サイトメガロウイルスプロモーターを含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔８〕前記プラスミドが、1ミリリットル当たり約0.5〜約50ミリグラムの範囲の濃度で組成物中に存在する、前記〔1〕に記載の組成物。
〔９〕前記マイクロスフェアが、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの範囲の濃度で組成物中に存在する、前記〔1〕に記載の組成物。
〔１０〕前記水性担体が、生理学的なpHに緩衝化されていてもよい生理食塩水を含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔１１〕(a)脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、(b)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外の酵素をコードするプラスミド、および(c)脂質代謝または輸送に関与する酵素を標的とするsiRNAをコードするプラスミド、からなる群から選択される少なくとも1つの物質をさらに含む、前記〔1〕に記載の組成物。
〔１２〕ABCA1をコードするプラスミドが、(a)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外のタンパク質および(b)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAからなる群から選択される少なくとも1つの物質をまたコードする、前記〔1〕に記載の組成物。
〔１３〕細胞にトランスフェクトするのに有用な組成物であって、前記組成物が、1ミリリットル当たり約0.5〜約50ミリグラムの、活性型のATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)をコードするプラスミドベクターと、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの、音響化学的に活性なマイクロスフェアとの混合物を、薬学的に許容可能な水性担体中に含み、前記ベクターが、前記活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームと、哺乳動物細胞内で前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列とを含み、前記音響化学的に活性なマイクロスフェアが、ヒト血清アルブミンを含むシェルに封入されたフルオロカーボンガス気泡を含み、前記マイクロスフェアは超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり、崩壊して前記封入されたガス気泡を放出するものである、前記組成物。
〔１４〕前記活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、前記〔13〕に記載の組成物。
〔１５〕前記オープンリーディングフレームが、配列番号2のヌクレオチド配列を有する、前記〔13〕に記載の組成物。
〔１６〕組織をin vivoでトランスフェクトして前記組織の細胞内で活性型のABCA1を発現させる方法であって、
(a)活性型のATP結合カセットトランスポーターA1(ABCA1)をコードするプラスミドベクターと、音響化学的に活性なマイクロスフェアとを、被験者に静脈内共投与する工程であって、前記ベクターが、前記活性型のABCA1をコードする発現可能なオープンリーディングフレームと、哺乳動物細胞内で前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された少なくとも1つの配列とを含み、前記音響化学的に活性なマイクロスフェアが、タンパク質、脂質またはそれらの組み合わせを含むシェルに封入されたガス気泡を含み、前記マイクロスフェアは超音波音響エネルギーへの暴露によって崩壊可能であり、崩壊して前記封入されたガス気泡を放出するものである、前記工程、
(b)組成物のプラスミドおよびマイクロスフェアが組織の脈管構造を循環する間に、トランスフェクトされた被験者の組織を超音波イメージングし、それによって組織の脈管構造中のマイクロスフェアの存在を検出する工程、ならびに
(c)マイクロスフェアが組織内に存在する間に、イメージングに必要とされるレベルよりも高い音響エネルギーレベルであって、かつマイクロスフェアを破壊しマイクロスフェアからガス気泡を放出させるのに十分なエネルギーレベルで、組織へ超音波エネルギーのパルスを照射する工程であって、超音波エネルギーのパルスおよびそれによるガス気泡の放出は、組織内の細胞の有孔性を一時的に増加させ、細胞内へのプラスミドの侵入を容易にさせるものである、前記工程
を含む前記方法。
〔１７〕前記マイクロスフェアが、約0.5〜約20マイクロメートルの範囲の平均粒径を有する、前記〔16〕に記載の方法。
〔１８〕前記ガス気泡がフルオロカーボンガスを含む、前記〔16〕に記載の方法。
〔１９〕前記シェルがヒト血清アルブミンを含む、前記〔16〕に記載の方法。
〔２０〕前記活性型のABCA1が、配列番号1のアミノ酸配列を有する、前記〔16〕に記載の方法。
〔２１〕前記オープンリーディングフレームの発現を促進するように適合された前記少なくとも1つの配列が、サイトメガロウイルスプロモーターを含む、前記〔16〕に記載の方法。
〔２２〕前記プラスミドが、水性担体中で、1ミリリットル当たり約0.5〜約50ミリグラムの範囲の濃度で投与される、前記〔16〕に記載の方法。
〔２３〕前記マイクロスフェアが、水性担体中で、1ミリリットル当たり約108〜約109マイクロスフェアの範囲の濃度で投与される、前記〔16〕に記載の方法。
〔２４〕前記プラスミドおよび前記マイクロスフェアが、1つの水性担体中の混合物として投与される、前記〔16〕に記載の方法。
〔２５〕前記プラスミドおよび前記マイクロスフェアが、別々の水性担体中で投与される、前記〔16〕に記載の方法。
〔２６〕前記プラスミドおよび前記マイクロスフェアとともに、追加の生物学的活性剤が共投与される、前記〔16〕に記載の方法。
〔２７〕前記追加の生物学的活性剤が、(a)脂質代謝または輸送に関連する状態を治療するための薬物、(b)脂質代謝または輸送に関与するABCA1以外のタンパク質をコードするプラスミド、および(c)脂質代謝または輸送に関与するタンパク質を標的とするsiRNAをコードするプラスミド、からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含む、前記〔26〕に記載の方法。
〔２８〕前記組織が、肝臓組織、腸実質組織またはそれらの組み合わせを含む、前記〔16〕に記載の方法。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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