(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            （Ｉ）
式中、
ｐは１から２６までの範囲の整数であり、
Ａは抗体であり、かつ
−（Ｌ−Ｄ）はリンカー−薬物ユニットであり、
Ｌはリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットであり、
前記抗体は、前記抗体のシステイン残基を介して前記リンカーユニットにコンジュゲートし、
前記リンカーユニットは、
−Ｃ−ＳＡＡｓ−ＡＡｓ−
であり、式中、
Ｃ−が、
【化１】
0006486316.tif 000039
からなる群より選ばれたコンジュゲートユニット（conjugating unit）であり、
式中、Ｒ７は、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｏ）−、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキレン）−、−アリーレン−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−からなる群より選ばれたものであり、かつｒは１から１０までの範囲の整数であり；
−ＳＡＡｓ−が、
【化２】
0006486316.tif 000040
からなる群より選ばれた糖アミノ酸ユニットであり；
−ＡＡｓ−が、式（ＩＩＩ）のペプチドユニットであり：
【化４】
0006486316.tif 000041
式中、ｚは０から１０までの範囲の整数であり、Ｒ１１は、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２または−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２であり、Ｒ１２はＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、フェニルまたはベンジルであり、Ｒ１３は水素、メチル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、または４−ピリジルメチルである。
【請求項２】
前記抗体が全長抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項３】
前記抗体が、キメラ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、マウス抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ラット抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヤギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはウサギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項４】
前記抗体が、腫瘍、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いられる治療用抗体である、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項５】
前記抗体が、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂおよびＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブベドチン（Brentuximab vedotin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ（farletuzumab））、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sｉbrotuzumab）、Ｆ１９、８１Ｃ６、ヒト化抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、エドレコロマブ（Edrecolomab）、Ｖｉｔａｘｉｎ、ヒト化抗CD33 IgG抗体、エプラツズマブ（Epratuzumab）、ヒト化抗HLA-DR抗体、LYM-1モノクローナル抗体、シプリズマブ（siplizumab）、またはＥｐｒａｔｕｚｕｍａｂを含む、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項６】
Ｃ−が、
【化５】
0006486316.tif 000042
からなる群より選ばれたコンジュゲートユニット（conjugating unit）であり、
式中、Ｒ７が、−１，５−ペンチレン−、−１，６−ヘキシレン−、−１，４−シクロヘキシレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−からなる群より選ばれ、かつｒが２〜５までの範囲の整数である、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項７】
−ＡＡｓ−が、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−および−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−からなる群より選ばれたペプチドユニットである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項８】
前記薬物ユニットが、
【化７】
0006486316.tif 000043
からなる群より選ばれた細胞毒性薬であり、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ独立に、水素、アミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、カルボン酸、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、アミノカルボニル、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、１−ピロリジニルカルボニル、１−ピペリジニルカルボニル、１−ピペラジニルカルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、またはフェニルである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項９】
前記薬物ユニットが標的細胞に対して細胞増殖抑制または細胞毒性活性を有する、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１０】
前記薬物ユニットが、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicin）、コルセミド（colcemid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシノイド（maytansinoid）、ネトロプシン（netropsin）、ピューロマイシン（puromycin）、ピロロベンゾジアゼピン（pyrrolobenzodiazepine）、リゾキシン（rhizoxin）、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、およびビンカアルカロイド（vinca alkaloid）からなる群より選ばれた細胞毒性薬である、請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法であって、以下のステップを含む、方法：
抗体と還元剤とを緩衝液中で反応させて第１の溶液を作るステップ；
有機相または水相中でリンカー−薬物ユニットを調製して第２の溶液を作るステップであって、前記  前記リンカーユニットは、グリコペプチドを有し；
前記第１の溶液と前記第２の溶液を混合して混合溶液を作ることによりコンジュゲーションを行うステップであって、前記混合溶液中の有機溶媒の濃度が約０％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である、ステップ；ならびに
前記混合溶液を精製するステップ。
【請求項１２】
前記抗体が、前記抗体のシステイン残基を介して前記リンカーユニットにコンジュゲートする、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１３】
前記抗体が全長抗体または抗体フラグメントである、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１４】
前記抗体が、キメラ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、マウス抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ラット抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヤギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはウサギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントである、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１５】
前記抗体が、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂおよびＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブベドチン（Brentuximab vedotin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ（farletuzumab））、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sibrotuzumab）、Ｆ１９、８１Ｃ６、ヒト化抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、エドレコロマブ（Edrecolomab）、Ｖｉｔａｘｉｎ、ヒト化抗CD33 IgG抗体、エプラツズマブ（Epratuzumab）、ヒト化抗HLA-DR抗体、LYM-1モノクローナル抗体、シプリズマブ（siplizumab）、またはＥｐｒａｔｕｚｕｍａｂを含む、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１６】
前記還元剤および還元条件を、前記抗体中に存在する鎖間ジスルフィド結合のうち少なくとも１つが一対の遊離チオールに変わるように選択する、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１７】
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−アミノエタンチオール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）からなる群より選ばれる、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１８】
前記抗体と前記リンカー−薬物ユニットのモル当量比を、前記抗体-薬物複合体が約３．５〜約５．５の範囲の平均ＤＡＲを有するように選択する、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／２５０１０７号の利益を主張し、その全体が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本技術分野は、抗体−薬物複合体（antibody-drug conjugate,ＡＤＣ）およびそれを形成するための方法に関し、より詳細には、グリコペプチドを含有するリンカー−毒素とコンジュゲートされた抗体を含む抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）およびそれを形成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗体はそれらの対応する抗原について高度の識別能力を有しており、また多くの細胞毒性薬物の分子は、癌細胞を選択的に殺傷することができないため、癌治療に用いることはできない。よって、抗体と毒性の強い薬物（例えば毒素）との結合は、高度選択的および特異的な複合体薬物（conjugated drug）となる。
【０００４】
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体、リンカー、および薬物（例えば毒素）から構成される。しかし、これらの毒素は、高用量での実施が必要であるため、細胞毒性が高い（ＩＣ５０＜１ｎＭ）ように思われる。ＡＤＣに一般的に用いられる毒素の１つは、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦのようなアウリスタチン誘導体である。
【０００５】
ＡＤＣに一般的に用いられるリンカーの１つは、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔである。これら一般的に用いられるリンカーの中で、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより開発されたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢが、最も広く利用されている系である。ＡＤＣの毒素は、リンカーと毒素との間の結合をカテプシンＢで切断することにより遊離される。しかし、リンカー系は難水溶解性である。このことは、ＡＤＣのコンジュゲーションプロセスにおいてリンカー−毒素を溶解するためには、高含有量、２０％の有機溶媒を共溶媒として用いることを要し、これによりコンジュゲーション反応が均一相中で完了できるようになる。
【０００６】
しかしながら、上述した有機溶媒の導入は、抗体の変性または抗体凝集を引き起こす可能性があり、さらにはＡＤＣの収量低下または生成物の不良につながり得る。加えて、有機溶媒の不完全な除去が、最終的なＡＤＣ生成物が品質管理をパスできなくなる原因の１つとなる可能性がある。
【０００７】
よって、新規なＡＤＣ薬物の開発は、人の抗癌医療のニーズを満たすことを手助けする上での課題である。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本開示は、式（Ｉ）の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する:
Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            （Ｉ）
式（Ｉ）中、ｐは１から２６までの範囲の整数であり、Ａは抗体であり、−（Ｌ−Ｄ）はリンカー−薬物ユニットである。Ｌはグリコペプチドを有するリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットである。抗体は、抗体のシステイン残基を介してリンカーユニットにコンジュゲートする。
【０００９】
本開示はまた、上述の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法も提供する。当該方法は、抗体と還元剤とを緩衝液中で反応させて第１の溶液を作るステップ、有機相または水相中でリンカー−薬物ユニットを調製して第２の溶液を作るステップであって、リンカーがグリコペプチドを有する、ステップ、第１の溶液と第２の溶液とを混合して混合溶液を作ることによりコンジュゲーションプロセスを行うステップ、および混合溶液を精製するステップ、を含む。混合溶液中の有機溶媒の濃度は約０％（ｖ／ｖ）〜約２％（ｖ／ｖ）の範囲である。
【００１０】
添付の図面を参照にしながら、下記の実施形態において詳細な説明を行う。
より具体的には、本発明は以下を提供する：
[１]
式（Ｉ）の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            （Ｉ）
式中、
ｐは１から２６までの範囲の整数であり、
Ａは抗体であり、かつ
−（Ｌ−Ｄ）はリンカー−薬物ユニットであり、
Ｌはグリコペプチドを有するリンカーユニットであり、Ｄは薬物ユニットであり、
前記抗体は、前記抗体のシステイン残基を介して前記リンカーユニットにコンジュゲートする；
[２]
前記抗体が全長抗体または抗体フラグメントである、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[３]
前記抗体が、キメラ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、マウス抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ラット抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヤギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはウサギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントである、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[４]
前記抗体が、腫瘍、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いられる治療用抗体である、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[５]
前記抗体が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂおよびＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブベドチン（Brentuximab vedotin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ（farletuzumab））、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sｉbrotuzumab）、Ｆ１９、８１Ｃ６、ヒト化抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、ＯｖａＲｅｘ、Ｐａｎｏｒｅｘ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｖｉｔａｘｉｎ、Ｃａｍｐａｔｈ  Ｉ／Ｈ、Ｓｍａｒｔ  ＭＩ９５、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、Ｓｍａｒｔ  ＩＤ１０、Ｏｎｃｏｌｙｍ、Ａｌｌｏｍｕｎｅ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ、またはＣＥＡｃｉｄｅを含む、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[６]
前記リンカーユニットが
−Ｃ−ＳＡＡｓ−ＡＡｓ−
であり、式中、
Ｃ−が、
【化１】
0006486316.tif 000002
からなる群より選ばれたコンジュゲートユニット（conjugating unit）であり、
式中、Ｒ７は、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｏ）−、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−からなる群より選ばれたものであり、かつｒは１から１０までの範囲の整数であり；
−ＳＡＡｓ−が、式（ＩＩ）：
【化２】
0006486316.tif 000003
の糖アミノ酸ユニットであり、
式中、ｘは１から８までの範囲の整数であり、ｙは１から４までの範囲の整数であり、
【化３】
0006486316.tif 000004
はテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、またはジヒドロピラン環であり、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立に、単結合、メチレン、ヒドロキシメチレン、エチレン、エチリデン、ヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチリデン、ジヒドロキシエチレン、ジヒドロキシエチリデン、ビニレン、ビニリデン、プロピレン、プロピリデン、トリメチレン、ヒドロキシプロピレン、ヒドロキシプロピリデン、ヒドロキシトリメチレン、ジヒドロキシプロピレン、ジヒドロキシプロピリデン、ジヒドロキシトリメチレン、トリヒドロキシプロピレン、トリヒドロキシプロピリデンまたはトリヒドロキシトリメチレンであり、各Ｒ９はそれぞれ独立に、ヒドロキシル、メチル、ヒドロキシメチル、エチル、ヒドロキシエチル、ジヒドロキシエチル、プロピル、ヒドロキシプロピル、ジヒドロキシプロピルもしくはトリヒドロキシプロピルであるか、または同じ環炭素中の任意の２つのＲ９が、それらが結合する炭素と共にカルボニル基を形成するか、または任意の２つのＲ９、Ｒ８および任意の１つのＲ９、もしくはＲ１０および任意の１つのＲ９が、元のテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランもしくはジヒドロピラン環と縮合する第２のテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランもしくはジヒドロピラン環を形成するか、または任意の２つのＲ９、Ｒ８および任意の１つのＲ９、もしくはＲ１０および任意の１つのＲ９がメチレン、エチリデン、１−プロピリデン、２−プロピリデンもしくはベンジリデン基と共に、元のテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランもしくはジヒドロピラン環と縮合する環状アセタールもしくはケタール環（ｋｅｔａｌ  ｒｉｎｇ）を形成し；
−ＡＡｓ−が、式（ＩＩＩ）のペプチドユニットであり：
【化４】
0006486316.tif 000005
式中、ｚは０から１０までの範囲の整数であり、Ｒ１１は、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２または−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２であり、Ｒ１２はＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、フェニルまたはベンジルであり、Ｒ１３は水素、メチル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、または４−ピリジルメチルである、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[７]
Ｃ−が、
【化５】
0006486316.tif 000006
からなる群より選ばれたコンジュゲートユニット（conjugating unit）であり、
式中、Ｒ７が、−１，５−ペンチレン−、−１，６−ヘキシレン−、−１，４−シクロヘキシレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−からなる群より選ばれ、かつｒが２〜５までの範囲の整数である、[６]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[８]
−ＳＡＡｓ−が、
【化６】
0006486316.tif 000007
からなる群より選ばれた糖アミノ酸ユニットである、[６]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[９]
−ＡＡｓ−が、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−および−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−からなる群より選ばれたペプチドユニットである、[６]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[１０]
前記薬物ユニットが、
【化７】
0006486316.tif 000008
からなる群より選ばれた細胞毒性薬であり、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ独立に、水素、アミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、カルボン酸、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、アミノカルボニル、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、１−ピロリジニルカルボニル、１−ピペリジニルカルボニル、１−ピペラジニルカルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、またはフェニルである、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[１１]
前記薬物ユニットが標的細胞に対して細胞増殖抑制または細胞毒性活性を有する、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[１２]
前記薬物ユニットが、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicin）、コルセミド（colcemid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシノイド（maytansinoid）、ネトロプシン（netropsin）、ピューロマイシン（puromycin）、ピロロベンゾジアゼピン（pyrrolobenzodiazepine）、リゾキシン（rhizoxin）、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、およびビンカアルカロイド（vinca alkaloid）からなる群より選ばれた細胞毒性薬である、[１]の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）；
[１３]
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法であって、以下のステップを含む、方法：
抗体と還元剤とを緩衝液中で反応させて第１の溶液を作るステップ；
有機相または水相中でリンカー−薬物ユニットを調製して第２の溶液を作るステップであって、前記リンカーはグリコペプチドを有する、ステップ；
前記第１の溶液と前記第２の溶液を混合して混合溶液を作ることによりコンジュゲーションを行うステップであって、前記混合溶液中の有機溶媒の濃度が約０％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である、ステップ；および
前記混合溶液を精製するステップ；
[１４]
前記抗体が、前記抗体のシステイン残基を介して前記リンカーユニットにコンジュゲートする、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[１５]
前記抗体が全長抗体または抗体フラグメントである、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[１６]
前記抗体が、キメラ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、マウス抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ラット抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヤギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはウサギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントである、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[１７]
前記抗体が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂおよびＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブベドチン（Brentuximab vedotin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ（farletuzumab））、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sibrotuzumab）、Ｆ１９、８１Ｃ６、ヒト化抗ＨＥＲ２  ｍＡｂ、ＯｖａＲｅｘ、Ｐａｎｏｒｅｘ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｖｉｔａｘｉｎ、Ｃａｍｐａｔｈ  Ｉ／Ｈ、Ｓｍａｒｔ  ＭＩ９５、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、Ｓｍａｒｔ  ＩＤ１０、Ｏｎｃｏｌｙｍ、Ａｌｌｏｍｕｎｅ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ、またはＣＥＡｃｉｄｅを含む、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[１８]
前記還元剤および還元条件を、前記抗体中に存在する鎖間ジスルフィド結合のうち少なくとも１つが一対の遊離チオールに変わるように選択する、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[１９]
前記還元剤が、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−アミノエタンチオール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）からなる群より選ばれる、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[２０]
前記抗体と前記リンカー−薬物ユニットのモル当量比を、前記抗体-薬物複合体が約３．５〜約５．５の範囲の平均ＤＡＲを有するように選択する、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法；
[２１]
前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、またはこれらの組み合わせを含む、[１３]の、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明および実施例を読むことにより、本発明をより十分に理解することができる:
【図１】図１は、本開示のある実施形態による抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法を説明するフロー図である。
【図２】図２は、本開示の１実施形態によるＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図３Ａ】図３Ａは、本開示の１実施形態によるＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本開示の１実施形態によるＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図４】図４は、本開示の１実施形態によるＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７のＨＩＣプロファイルを示している。
【図５】図５は、本開示の１実施形態によるＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７のＨＩＣプロファイルを示している。
【図６】図６は、本開示の１実施形態によるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＨＴ−４７のＨＩＣプロファイルを示している。
【図７】図７は、本開示の１実施形態によるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８のＨＩＣプロファイルを示している。
【図８】図８は、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＣＣＨ−０２８のＨＩＣプロファイルを示している。
【図９】図９は、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＣＣＨ−０３５のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１０】図１０は、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＣＣＨ−０４１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１１】図１１は、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＦＣＷ−０１６のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１２】図１２は、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＣＣＨ−０３８のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＷＨＹ−４６のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＷＨＹ−４６のＳＥＣプロファイルを示している。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本開示の１実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１のＳＥＣプロファイルを示している。
【図１５】図１５は、本開示の１実施形態によるＨＬＸ−０７−ＭＨＴ−７１のＨＩＣプロファイルを示している。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本開示の１実施形態によるコンジュゲートしていない抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂのＨＩＣプロファイルである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本開示の１実施形態によるコンジュゲートした抗−ＥｐＣＡＭ−ＭＨＴ−７１のＨＩＣプロファイルである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、本開示のある実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘおよびＥｒｂｉｔｕｘ−ＡＤＣの４０℃における熱ストレス安定性試験の結果を示している。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、本開示のある実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘおよびＥｒｂｉｔｕｘ−ＡＤＣの５０℃における熱ストレス安定性試験の結果を示している。
【図１８】図１８は、本開示のある実施形態による４℃下での液体形態のＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１の貯蔵安定性試験の結果を示している。
【図１９】図１９は、本開示のある実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＡＤＣ、ＡＰＥＡ−ＡＦ、およびＭＭＡＥ注入マウスの腫瘍増殖の変化の結果を示している。
【図２０】図２０は、本開示のある実施形態によるＥｒｂｉｔｕｘ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＡＤＣ、ＡＰＥＡ−ＡＦ、およびＭＭＡＥ注入マウスの体重の変化の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
以下の詳細な説明においては、説明の目的で、開示される実施形態が十分に理解されるように多数の特定の詳細が記載される。しかし、これらの特定の詳細がなくとも、１つまたは複数の実施形態が実施可能であることは明らかであろう。また、図を簡潔とするため、周知の構造および装置は概略的に示される。
【００１３】
本開示は、水溶解度が高まった新規なリンカー−毒素を含むＡＤＣを提供する。ＡＤＣのコンジュゲーションプロセスにおいて、有機溶媒の使用が減り、ひいては回避され、これによりＡＤＣの凝集、および残留した有機溶媒により引き起こされる問題が低減される。故に、ＡＤＣの安定性が改善される。
【００１４】
前述の新規リンカー−毒素は、ペントース（例えばリボース、キシロースまたはアラビノースなど）およびヘキソース（例えばグリコサミンまたはグルコースなど）のような糖類（sugar groups）を、カテプシンＢに認識され得る、Ｖａｌ−ＣｉｔおよびＰｈｅ−Ｃｉｔのようなジペプチドリンカーに導入するように設計されている。換言すると、そのＣ末端にカテプシンＢにより認識されるジペプチドおよびそのＮ末端に高親水性の糖アミノ酸ユニットを有することを特徴とする新規糖アミノ酸含有リンカーを、新規リンカー−毒素が含むことで、当該リンカーまたはリンカー含有物質の水溶解度を改善する。リンカーのＣ末端におけるカルボン酸基およびＮ末端におけるアミノ基はいずれも、スペーサ、リンカー、リガンド、薬物、毒素、イメージング分子（imaging molecule）、抗体、ペプチドまたは送達分子を結合させるための連結点となり得る。
【００１５】
本開示では、数個の抗体と糖アミノ酸含有リンカー−毒素とがコンジュゲートして新規ＡＤＣを形成する。１実施形態において、本出願は、式（Ｉ）の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            （Ｉ）
式（Ｉ）中、Ａは抗体を表す。いくつかの実施形態において、抗体は、全長抗体または抗体フラグメントであってよい。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはマウス抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントであり得る。他の実施形態において、抗体は、ラット抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヤギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはウサギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントなどのような他の種（species）由来の抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体のシステイン残基を介してリンカーユニットにコンジュゲートする。いくつかの実施形態において、抗体は、腫瘍、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いられる治療用抗体であってよい。ある実施形態では、抗体には、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  Ａｂ、ＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブ ベドチン（Brentuximab vedotin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ（farletuzumab））、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ  １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ  ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sibrotuzumab）、Ｆ１９、または８１Ｃ６が含まれ得る。しかしながら、上述の抗体は単に例であり、本発明の範囲が限定されることは意図されていないと理解されるべきである。抗体における鎖間ジスルフィド結合が遊離チオールに還元されてリンカーに結合することのできるものであれば、その抗体は本開示に用いることができる。 
【００１６】
１実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。抗体は、例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学薬品、核酸、またはそのフラグメントを含む特定の抗原決定基に対するものであり得る。ポリクローナル抗体を作製する方法は、従来技術において既知である。目的の抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来技術において既知である任意の技術を用いて作製され得る。これらには、限定はされないが、元はKohlerおよびMilsteinにより記述された（1975, Nature 256, 495-497）ハイブリドーマ技術（hybridoma technique）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al., 1983, Ｉmmunology Today 4:72）、ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が含まれる。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスのものであってよい。本開示で用いるｍＡｂｓを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。
【００１７】
モノクローナル抗体は、例えば、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはキメラ抗体（例えば、ヒト−マウス抗体）であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、従来技術において既知である多数の技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; and Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16）。
【００１８】
抗体はまた二重特異性抗体であってもよい。二重特異性抗体を作製するための方法は従来技術において既知である。従来の全長二重特異性抗体の作製は、２つの免疫グロブリンの重鎖-軽鎖ペアの共発現に基づくものであり、２つの鎖は異なる特異性を有する（例えばMilstein et al., 1983, Nature 305:537-539; 国際特許公開第ＷＯ９３／０８８２９号公報, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659参照）。
【００１９】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を持つ抗体可変領域（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも１部分を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とするのが好ましい。融合の少なくとも１つに、軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする配列を持つ核酸と、必要であれば、免疫グロブリン軽鎖が、別々の発現ベクターに挿入され、かつ適した宿主生物にコトランスフェクト（co-transfected）される。このことは、コンストラクションに用いられる３つのポリペプチド鎖の割合が等しくないことで最適な収量が得られる実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの互いの比率の調整に柔軟性を与える。しかしながら、等しい割合での少なくとも２つのポリぺプチド鎖の発現が高収量につながる場合、または割合が特に重要なものではない場合には、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００２０】
例えば、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖を一方の腕に、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペア（第２の結合特異性を備えている）を他方の腕に有し得る。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することで容易な分離の方法が得られるため、この非対称構造は、望まない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする（国際特許出願号ＷＯ９４／０４６９０号公報、その全体が参照することにより本明細書に援用される）。
【００２１】
二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210; Rodrigues et al., 1993, J. Immunology 151:6954-6961; Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Carter et al., 1995, J. Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16:677-681を参照されたい。このような技術を用いることで、本明細書で定義されるような疾病の治療または予防に使用するために二重特異性抗体を作製することができる。
【００２２】
二重機能抗体（Bifunctional antibody）はまた、欧州特許公開ＥＰＡ  ０  １０５  ３６０号公報にも記載されている。この参照文献に開示されているように、ハイブリッドまたは二重機能性抗体は、生物学的（つまり細胞融合技術）により、または特に架橋剤もしくはジスルフィド架橋形成試薬（disulfide-bridge forming reagent）を用いて化学的に得られ、かつ抗体全体およびそのフラグメントを含み得る。かかるハイブリッド抗体を得るための方法が、例えば、国際特許公開ＷＯ８３／０３６７９号公報、および欧州特許公開ＥＰＡ  ０  ２１７  ５７７号公報に開示されており、両者は参照することにより本明細書に援用される。
【００２３】
抗体はまた、標的抗原（例えば、癌抗原、ウイルス抗原、微生物抗原または細胞もしくはマトリックスに結合したその他の抗体）に免疫特異的に結合する抗体の機能的に活性なフラグメント、誘導体または類似体であってもよい。この点において、「機能的に活性な」とは、フラグメント、誘導体または類似体が、そのフラグメント、誘導体または類似体の由来元の抗体が認識したのと同じ抗原を認識できることを意味する。具体的には、例示的な実施形態において、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、抗原を特異的に認識するＣＤＲ配列に対してＣ末端にあるフレームワークおよびＣＤＲ配列の欠失により高めることができる。どのＣＤＲ配列が抗原に結合するかを判断するのに、従来技術において既知である任意の結合アッセイ法（例えば、ＢＩＡコアアッセイ）により、ＣＤＲ配列を含有する合成ペプチドを、抗原と共に結合アッセイに使用することができる（例えば、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.; Kabat et al., 1980, J. Immunology 125(3):961-969参照）。
【００２４】
他の有用な抗体には、限定はされないが、抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’、Ｆｖフラグメントならびに重鎖および軽鎖ダイマー、または例えばＦｖｓもしくは単鎖抗体（ＳＣＡ）であるその任意の最小フラグメントのような抗体のフラグメントが含まれる（例えば、米国特許第４９４６７７８号; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-54に記載されている）。
【００２５】
ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体であって、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る組換え抗体もまた、利用可能である（例えば、米国特許第４８１６５６７号；および米国特許第４８１６３９７号参照）。ヒト化抗体は、ヒト以外の種に由来する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域と、を有するヒト以外の種に由来する抗体分子である（米国特許第５５８５０８９号参照）。キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、従来技術において既知である組換えＤＮＡ技術により、例えば、国際特許公開第ＷＯ８７／０２６７１号；欧州特許公開第０  １８４  １８７号；欧州特許公開第０  １７１  ４９６号；欧州特許公開第０  １７３  ４９４号；国際特許公開第ＷＯ８６／０１５３３号；米国特許第４８１６５６７号；欧州特許公開第０１２  ０２３号; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; U.S. Pat. No. 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534;および Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060に記載された方法を用い、作製することができる。
【００２６】
完全ヒト抗体を用いることもできる。ヒト抗体は、例えば、内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないがヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて作製され得る。トランスジェニックマウスを、通常の方式により、選択された抗原、例えば、本開示のポリペプチドの全部または一部で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウス内のヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成し（rearrange）、続いてクラススイッチングおよび体細胞突然変異を起こす。よって、かかる技術を用いると、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を作製することができる。ヒト抗体を作製するこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar（1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するこの技術の詳細な議論、ならびにかかる抗体を作製するためのプロトコールについては、例えば、米国特許第５６２５１２６号；５６３３４２５号；５５６９８２５号；５６６１０１６号；および５５４５８０６号を参照されたい。他のヒト抗体は、市販品、例えばＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Freemont, Calif.）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（San Jose, Calif.）から入手可能である。
【００２７】
選択されたエピトープを認識するヒト抗体はまた、「誘導選択（guided selection）」と称される技術を用いても生成され得る。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選別を誘導する（例えば、Jespers et al., 1994, Biotechnology 12:899-903参照）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーなどの従来技術において既知である各種技術を用いても生成され得る（例えば、Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan and Carter, 2002, “The rise of monoclonal antibodies as therapeutics,” in Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu, P. M. and Fick Jr., R. B, eds., Marcel Dekker, New York, N.Y., Chapter 20, pp. 427-469参照）。
【００２８】
他の実施形態において、抗体は、抗体の融合タンパク質またはその機能的に活性なフラグメントである。例えば、抗体は、Ｎ−末端またはＣ−末端いずれかにおける共有結合（例えばペプチド結合）により、抗体ではない別のタンパク質のアミノ酸配列（またはその一部、例えばタンパク質の少なくとも１０、２０もしくは５０アミノ酸部分）と融合され得る。
【００２９】
抗体には類似体および誘導体も含まれ、それらはつまり、共有結合が抗体にその抗原結合免疫特異性（antigen binding immunospecificity）を保持させ得るものであるならば、任意のタイプの分子の共有結合によって修飾される。例えば、それらに限定するものではないが、抗体の誘導体および類似体には、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基（protectin/blocking group）による誘導体化（derivatization）、タンパク質切断（proteolytic cleavage）、細胞性抗体ユニットまたは他のタンパク質との結合などによってさらに修飾されているものが含まれる。多くの化学修飾のいずれかは、限定はされないが、特異的な化学的切断（specific chemical cleavage）、アセチル化、ホルミル化、チュニカマイシン存在下での代謝合成（metabolic synthesis）などが含まれる公知の技術によって実施され得る。加えて、類似体または誘導体は、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含んでいてよい。
【００３０】
抗体は、Ｆｃレセプターと相互作用するアミノ酸残基に修飾（例えば置換、欠失または付加）を有していてよい。詳細には、抗体には、抗ＦｃドメインとＦｃＲｎレセプター間の相互作用に関与すると確認されたアミノ酸残基に修飾を有する抗体が含まれる（例えば、国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１号参照、その全体が参照することにより本明細書に援用される）。標的抗原に免疫特異的な抗体は、市販品もしくはその他のソースから得るか、または例えば化学合成もしくは組換え発現技術のような当業者に知られた任意の方法により作製することが可能である。癌細胞抗原に免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースもしくはそれに類似するデータベース、文献刊行物から、または通常のクローニングおよびシークエンシングにより得ることができる。
【００３１】
癌の治療に用いることのできる抗体の例には、限定はされないが、ヒト化抗ＨＥＲ２  モノクローナル抗体、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；非ホジキンリンパ腫患者の治療に用いるキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；卵巣癌の治療に用いるマウス抗体であるＯｖａＲｅｘ（ＡｌｔａＲｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）；大腸癌の治療に用いるマウスＩｇＧ２ａ抗体であるＰａｎｏｒｅｘ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ，ＮＣ）；頭頸部癌のような上皮成長因子陽性癌（epidermal growth factor positive cancer）の治療に用いる抗−ＥＧＦＲ ＩｇＧキメラ抗体であるＣｅｔｕｘｉｍａｂ  Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）；肉腫の治療に用いるヒト化抗体であるＶｉｔａｘｉｎ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療に用いるヒト化ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ Ｉ／Ｈ（Ｌｅｕｋｏｓｉｔｅ，ＭＡ）;急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いるヒト化抗ＣＤ３３ ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔ  ＭＩ９５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）； 非ホジキンリンパ腫の治療に用いるヒト化抗ＣＤ２２ ＩｇＧ抗体であるＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ）；非ホジキンリンパ腫の治療に用いるヒト化抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体であるＳｍａｒｔ ＩＤ１０（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）;非ホジキンリンパ腫の治療に用いる放射標識マウス抗−ＨＬＡ−Ｄｒ１０抗体であるＯｎｃｏｌｙｍ（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ，  Ｉｎｃ．，ＣＡ）；ホジキン病または非ホジキンリンパ腫の治療に用いるヒト化抗−ＣＤ２  ｍＡｂであるＡｌｌｏｍｕｎｅ（ＢｉｏＴｒａｎｓｐｌａｎｔ，ＣＡ）；肺および大腸癌の治療に用いる抗−ＶＥＧＦヒト化抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）；非ホジキンリンパ腫の治療に用いる抗−ＣＤ２２抗体であるＥｐｒａｔｕｚｕｍａｂ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＮＪ  ａｎｄ  Ａｍｇｅｎ，ＣＡ）；ならびに大腸癌の治療に用いるヒト化抗−ＣＥＡ抗体であるＣＥＡｃｉｄｅ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，ＮＪ）が含まれる。
【００３２】
癌の治療に有用な他の抗体には、限定はされないが、以下の抗原（括弧内に例示の癌が示されている）:ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５−３（癌種（carcinoma））、ＣＡ１９−９（癌種）、Ｌ６（癌種）、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ（癌種）、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ（癌種）、α−フェトプロテイン（癌種）、ＣＡ  ２４２（大腸癌）、胎盤性アルカリフォスファターゼ（placental alkaline phosphatase）（癌種）、前立腺特異的膜抗原（prostate specific membrane antigen）（前立腺癌）、前立腺酸性フォスファターゼ（prostatic acid phosphatase）（前立腺癌）、上皮成長因子（癌種）、ＭＡＧＥ−１（癌種）、ＭＡＧＥ−２（癌種）、ＭＡＧＥ−３（癌種）、ＭＡＧＥ−４（癌種）、抗トランスフェリンレセプター（癌種）、ｐ９７（メラノーマ）、ＭＵＣ１−ＫＬＨ（乳癌）、ＣＥＡ（大腸癌）、ｇｐ１００（メラノーマ）、ＭＡＲＴ１（メラノーマ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（前立腺癌）、ＩＬ−２レセプター（Ｔ細胞白血病およびリンパ種）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ３３（白血病）、ＣＤ２２（リンパ種）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（癌種）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ種）、ムチン（癌種）、Ｐ２１（癌種）、ＭＰＧ（メラノーマ）、およびＮｅｕ癌遺伝子産物（oncogene product）（癌種）に対する抗体が含まれる。いくつかの特定の有用な抗体には、限定はされないが、ＢＲ９６ ｍＡｂ（Trail et al., 1993, Science 261:212-215）、ＢＲ６４（Trail et al., 1997, Cancer Research 57:100-105）、Ｓ２Ｃ６ｍＡｂのようなＣＤ４０抗原に対するｍＡｂｓ（Francisco et al., 2000, Cancer Res. 60:3225-3231）とそのキメラ型およびヒト化変異体、ｃＤ３３抗原に対するｍＡｂｓ；ＥｐｈＡ２抗原に対するｍａｂｓ；１Ｆ６ ｍＡｂおよび２Ｆ２ｍＡｂのようなＣＤ７０抗原に対するｍＡｂｓとそのキメラ型およびヒト化変異体、ＡＣ１０のようなＣＤ３０抗原に対するｍＡｂｓ（Bowen et al., 1993, J. Immunol. 151:5896-5906; Wahl et al., 2002, Cancer Res. 62(13):3736-42）とそのキメラ型およびヒト化変異体が含まれる。その他多くの腫瘍関連抗原に結合するインターナライジング抗体が利用可能であり、かつすでに評価されている（例えばFranke et al., 2000, Cancer Biother. Radiopharm. 15:459 76; Murray, 2000, Semin. Oncol. 27:64 70; Breitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998参照）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患の治療または予防に用いられる公知の抗体が、本開示の組成および方法に基づいて用いられる。自己免疫性抗体の産生を担う細胞の抗原に免疫特異的な抗体は、市販品もしくはその他のソースから得るか、または例えば化学合成もしくは組換え発現技術のような当業者に知られた任意の方法により作製することが可能である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、抗核抗体；抗−ｄｓ  ＤＮＡ；抗−ｓｓ  ＤＮＡ、抗−カルジオリピン抗体ＩｇＭ、ＩｇＧ；抗−リン脂質抗体ＩｇＭ、ＩｇＧ；抗−ＳＭ抗体；抗−ミトコンドリア抗体；甲状腺抗体；ミクロソーム抗体；サイログロブリン抗体；抗−ＳＣＬ７０；抗−Ｊｏ；抗−Ｕ１ ＲＮＰ；抗−Ｌａ／ＳＳＢ；抗−ＳＳＡ；抗−ＳＳＢ；抗−壁細胞（perital cell）抗体；抗−ヒストン；抗−ＲＮＰ；Ｃ  ＡＮＣＡ；Ｐ  ＡＮＣＡ；抗セントロメア；抗フィブリラリン、および抗−ＧＢＭ抗体のような、自己免疫疾患の治療に対して免疫特異的なものである。１実施形態において、抗体は、自己免疫疾患に関連する活性化リンパ球に結合する。
【００３５】
ある実施形態では、抗体は、標的細胞（例えば、活性化リンパ球）で発現するレセプターまたはレセプター複合体に結合することができる。レセプターまたはレセプター複合体には、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、主要組織適合タンパク質（major histocompatibility protein）、レクチンまたは補体制御タンパク質（complement control protein）が含まれ得る。適した免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの限定されない例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ  ４、ＰＤ  １、およびＩＣＯＳである。適したＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバーの限定されない例は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４  １ＢＢ、ＴＮＦ  Ｒ１、ＴＮＦＲ２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテグリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬ  Ｒ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４、およびＡＰＯ３である。適したインテグリンの限定されない例は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、およびＣＤ１０４である。適したレクチンの限定されない例は、Ｃ型、Ｓ型、およびＩ型レクチンである。
【００３６】
別の特定な実施形態において、ウイルスまたは微生物抗原に免疫特異的な有用な抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体であり得る。本明細書で使用される場合に、用語「ウイルス抗原」には、限定されないが、免疫応答を引き出し得る任意のウイルスペプチド、ポリペプチドタンパク質（例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ｎｅｆ、ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、ＨＴＬＶ ｔａｘ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（例えば、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＥ）ならびにＢ型肝炎表面抗原）が含まれる。本明細書で使用される場合に、用語「微生物抗原」には、限定はされないが、免疫応答を引き出し得る任意の微生物ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、単糖類、多糖類または脂質分子（例として、微生物、真菌、病原性原生動物、または酵母ポリペプチド、例えばＬＰＳおよび莢膜多糖類５／８など）が含まれる。
【００３７】
ウイルスまたは微生物抗原に免疫特異的な抗体は、市販品、例えばＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（San Francisco,Calif.）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Temecula,Calif.）、もしくはＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Burlingame,Calif.）から入手するか、または例えば化学合成もしくは組換え発現技術のような当業者に知られた任意の方法により作製することが可能である。ウイルスまたは微生物抗原に免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースもしくはそれに類似するデータベース、文献刊行物から、または通常のクローニングおよびシークエンシングによって得ることができる。
【００３８】
特定の実施形態において、有用な抗体は、本明細書に開示された方法によるウイルスまたは微生物感染の治療または予防に有用なものである。ウイルス感染または微生物感染の治療に有用である利用可能な抗体の例には、限定されないが、ＲＳＶ感染患者の治療に有用なヒト化抗−呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）モノクローナル抗体であるＳＹＮＡＧＩＳ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）；ＨＩＶ感染の治療に有用なＣＤ４融合抗体であるＰＲＯ５４２（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）；Ｂ型肝炎ウイルスの治療に有用なヒト抗体であるＯＳＴＡＶＩＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の治療に有用なヒト化ＩｇＧ１抗体であるＰＲＯＴＯＶＩＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）；および抗−ＬＰＳ抗体が含まれる。
【００３９】
感染症の治療に有用な他の抗体には、限定されないが、細菌（例えば、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、淋菌（Neisseria gonorrheae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、破傷風菌（Clostridium tetani）、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、クレブシエラ肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラオツェーナ（Klebsiella ozaenas）、クレブシエラリノシェレロモーティス（Klebsiella rhinoscleromotis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、コレラ菌（Vibrio colerae）、大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、カンピロバクター（ビブリオ）フィータス（Campylobacter（Vibrio） fetus）、アエロモナスハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、セレウス菌（Bacillus cereus）、エドワードシエラタルダ（Edwardsiella tarda）、エンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレキシネル菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、フランベジアトレポネーマ（Treponema pertenue）、トレポネーマカラテネウム（Treponema carateneum）、ヴァンサンボレリア（Borrelia vincentii）、ボレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、黄疸出血病レプトスピラ（Leptospira icterohemorrhagiae）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ニューモシスチスカリニ（Pneumocystis carinii）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、ブタ流産菌（Brucella suis）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、マイコプラズマ属の種（Mycoplasma spp.）、発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowazeki）、リケッチアツツグムシ（Rickettsia tsutsugumushi）、クラミジア属の種（Chlamydia spp.））;病原菌（例えばコクシジオイデスイミチス（Coccidioides immitis）、アスペルギルスフミガーツフ（Aspergillus fumigatus）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）、ブラストミセスデルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、クリプトコッカスネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマカプスラーツム（Histoplasma capsulatum））;原生動物（赤痢アメーバ（Entomoeba histolytica）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、口腔トリコモナス（Trichomonas tenas）、腸トリコモナス（Trichomonas hominis）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、ガンビアトリパノソーマ（Tryoanosoma gambiense）、ローデシアトリパノソーマ（Trypanosoma rhodesiense）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、ドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）、熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）、ブラジルリーシュマニア（Leishmania braziliensis）、ニューモシスティス性肺炎（Pneumocystis pneumonia）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malaria））;または蠕虫（蟯虫（Enterobius vermicularis）、ヒト鞭虫（Trichuris trichiura）、回虫（Ascaris lumbricoides）、トリヒナ（Trichinella spiralis）、糞線虫（Strongyloides stercoralis）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、および十二指腸虫（hookworms））の病原株に由来する抗原に対する抗体が含まれる。
【００４０】
ウイルス性疾患の治療のための本開示における有用な他の抗体には、限定されないが、限定しない例として：ポックスウイルス科（Poxyiridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、アデノウイルス科（Adenoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、エンテロウイルス科（Enteroviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、パルボウイルス科（Parvoviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、はしか、呼吸器合胞体ウイルス、風疹、アルボウイルス科（Arboviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、非Ａ／非Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス科（Rhinoviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、ロタウイルス科（Rotoviridae）、およびヒト免疫不全ウイルスを含む病原性ウイルスの抗原に対する抗体が含まれる。
【００４１】
抗体はまた、標的細胞または標的細胞群上に存在する抗体であってもよい。例えば、膜貫通ポリペプチドおよび他のマーカーは、１つまたは複数の正常細胞（例えば非癌性細胞）に比べ、１つまたは複数の特定のタイプの標的細胞（例えば癌細胞）の表面で特異的に発現し得る。しばしば、かかるマーカーは、正常細胞の表面におけるそれらに比べ、標的細胞の表面でより多量に発現するか、またはより優れた免疫原性を示す。かかる細胞表面抗原ポリペプチドの同定は、抗体に基づく療法（antibody-based therapy）による破壊（destruction）のための、細胞に特異的にターゲティングする能力を生みだしてきた。よって、いくつかの実施形態では、抗体には、限定はされないが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が含まれる。かかる腫瘍関連抗原は、従来技術において公知であり、かつ従来技術で周知である方法および情報を用いて作製し、抗体の生成に使用することができる。
【００４２】
式（Ｉ）中、−（Ｌ−Ｄ）はリンカー−薬物ユニットであり、このうちＬは、グリコペプチドを有するリンカーユニットを表し、Ｄは薬物ユニットを表す。式（Ｉ）中、ｐは、式（Ｉ）における抗体Ａに存在する鎖間ジスルフィド結合の数に応じた１から２６までの範囲の整数であり得る。１実施形態では、ｐは２から８までの範囲の整数、または整数４であり得る。１実施形態では、ｐは２から１２までの範囲の整数、または整数８であり得る。１実施形態では、ｐは２から２６までの範囲の整数、または整数１２であり得る。１実施形態では、ｐは整数２６であり得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本開示のリンカーユニット（−Ｌ−）は、糖アミノ酸（sugar amino acid）ユニット（−ＳＡＡｓ−）およびペプチドユニット（−ＡＡｓ−）を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドユニットは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、へプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチドであり得る。
【００４４】
他の実施形態において、本開示のリンカーユニット（−Ｌ−）は、式−Ｃ−ＳＡＡｓ−ＡＡｓ−であり得る。式中、Ｃ−は、
【化８】
0006486316.tif 000009
からなる群より選ばれたコンジュゲートユニット（conjugating unit）であり、式中、Ｒ７は、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ−、−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３〜Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−からなる群より選ばれ、ｒは１から１０までの範囲の整数である。
【００４５】
式中、本開示の糖アミノ酸ユニット（−ＳＡＡｓ−）は、式（ＩＩ）によって表される：
【化９】
0006486316.tif 000010
式（ＩＩ）中、ｘは１から８までの範囲の整数であってよく、ｙは１から４までの整数であってよく、
【化１０】
0006486316.tif 000011
はテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランまたはジヒドロピラン環であってよく、Ｒ８およびＲ１０の各々はそれぞれ独立に、単結合、メチレン、ヒドロキシメチレン、エチレン、エチリデン、ヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチリデン、ジヒドロキシエチレン、ジヒドロキシエチリデン、ビニレン、ビニリデン、プロピレン、プロピリデン、トリメチレン、ヒドロキシプロピレン、ヒドロキシプロピリデン、ヒドロキシトリメチレン、ジヒドロキシプロピレン、ジヒドロキシプロピリデン、ジヒドロキシトリメチレン、トリヒドロキシプロピレン、トリヒドロキシプロピリデンまたはトリヒドロキシトリメチレンであってよく、各Ｒ９はそれぞれ独立に、ヒドロキシル、メチル、ヒドロキシメチル、エチル、ヒドロキシエチル、ジヒドロキシエチル、プロピル、ヒドロキシプロピル、ジヒドロキシプロピルもしくはトリヒドロキシプロピルであり得るか、または同じ環炭素中の任意の２つのＲ９が、それらが結合する炭素と共にカルボニル基を形成するか、または任意の２つのＲ９、Ｒ８および任意の１つのＲ９、もしくはＲ１０および任意の１つのＲ９が元のテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランもしくはジヒドロピラン環に縮合する第２のテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランもしくはジヒドロピラン環を形成するか、または任意の２つのＲ９、Ｒ８および任意の１つのＲ９、もしくはＲ１０および任意の１つのＲ９がメチレン、エチリデン、１−プロピリデン、２−プロピリデンもしくはベンジリデン基と共に元のテトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、テトラヒドロピランもしくはジヒドロピラン環に縮合する環状アセタールもしくはケタール環を形成する。
【００４６】
本開示において、上記糖アミノ酸の例には、限定はされないが：
【化１１】
0006486316.tif 000012
0006486316.tif 000013
0006486316.tif 000014
0006486316.tif 000015
が含まれる。
【００４７】
１実施形態では、ペプチドユニット（−ＡＡｓ−）は式（ＩＩＩ）により表される：
【化１２】
0006486316.tif 000016
式（ＩＩＩ）中、ｚは０から１０までの範囲の整数であり、Ｒ１１は、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２または  −（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２であってよく、Ｒ１２は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、フェニルまたはベンジルであってよく、Ｒ１３は、水素、メチル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチルまたは４−ピリジルメチルであり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ペプチドユニット（−ＡＡｓ−）は、１つまたは複数の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼによって酵素的に切断されて薬物ユニット（−Ｄ）を遊離させることができる。
【００４９】
別の実施形態では、Ｃ− は、
【化１３】
0006486316.tif 000017
からなる群より選ばれたコンジュゲートユニット（conjugating unit）であり、式中Ｒ７は、−１，５−ペンチレン−、−１，６−ヘキシレン−、−１，４−シクロヘキシレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−ＣＨ２−からなる群より選ばれ、かつｒは２から５までの範囲の整数である。
【００５０】
さらに別の実施形態では、−ＳＡＡｓ−は、
【化１４】
0006486316.tif 000018
からなる群より選ばれた糖アミノ酸ユニットである。
【００５１】
１実施形態では、ペプチドユニット（−ＡＡｓ−）は、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｒｇ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−および−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−からなる群より選ばれたものであってよい。
【００５２】
しかしながら、上記の構造は単なる例であり、本発明の範囲が限定されることを意図していない、ということが理解されるべきである。
【００５３】
１実施形態において、薬物ユニット（−Ｄ）は、
【化１５】
0006486316.tif 000019
からなる群より選ばれた細胞毒性薬であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素、アミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、メトキシ、エトキシ、カルボン酸、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、１−ピロリジニル、１−ピペリジニル、１−ピペラジニル、アミノカルボニル、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、１−ピロリジニルカルボニル、１−ピペリジニルカルボニル、１−ピペラジニルカルボニル、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、またはフェニルである。
【００５４】
１実施形態において、薬物ユニット（−Ｄ）は、アマニチン（amanitin）、アントラサイクリン（anthracycline）、アウリスタチン（auristatin）、バッカチン（baccatin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルセミド（colcemid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophysin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エキノマイシン（echinomycin）、エリュテロビン（eleutherobin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、レキシトロプシン（lexitropsin）、メイタンシノイド（maytansinoid）、ネトロプシン（netropsin）、ピューロマイシン（puromycin）、ピロロベンゾジアゼピン（pyrrolobenzodiazepine）、リゾキシン（rhizoxin）、タキサン（taxane）、チューブリシン（tubulysin）、およびビンカアルカロイド（vinca alkaloid）からなる群より選ばれた細胞毒性薬である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、薬物ユニット（−Ｄ）は、カリケアマイシン（calicheamicin）、カンプトテシン（camptothecin）、メイタンシノイド（maytansinoid）またはアントラサイクリン（anthracycline）であり得る。いくつかの実施形態では、薬物ユニットは、タキサン（taxane）、トポイソメラーゼ阻害薬（topoisomerase inhibitor）、ビンカアルカロイド（vinca alkaloid）または同種のものであり得る。いくつか代表的な実施形態では、適した細胞毒性薬には、例えばＤＮＡマイナーグルーブバインダー（minor groove binder）（例えば、エンジイン（enediyne）およびレキシトロプシン（lexitropsin）、ＣＢＩ化合物；米国特許第６１３０２３７号も参照）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、タキサン（taxane）（例えば パクリタキセル（paclitaxel）およびドセタキセル（docetaxel））、ピューロマイシン（puromycin）、ならびにビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれる。他の細胞毒性薬には、例えば、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン（topotecan）、ドキソルビシン（doxorubicin）、リゾキシン（rhizoxin）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（cyanomorpholino-doxorubicin）、エキノマイシン（echinomycin）、コンブレタスタチン（combretastatin）、ネトロプシン（netropsin）、エポチロン（epothilone）、エストラムスチン（estramustine）、クリプトフィシン（cryptophysin）、セマドチン（cemadotin）、メイタンシノイド（maytansinoid）、ディスコデルモリド（discodermolide）、エリュテロビン（eleutherobin）またはミトキサントロン（mitoxantrone）が含まれる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、薬物ユニット（−Ｄ）は抗チューブリン剤であり得る。抗チューブリン剤の例には、アウリスタチン（auristatin）、タキサン（taxane）およびビンカアルカロイド（vinca alkaloid）が含まれる。他の抗チューブリン剤には、例えば、バッカチン誘導体（baccatin derivative）、セマドチン（cemadotin）、コルヒチン（colchicine）、コルセミド（colcemid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、クリプトフィシン（cryptophycin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、エリュテロビン（eleutherobin）、エストラムスチン（estramustine）、メイタンシノイド（maytansinoid）、ノコダゾール（nocodazole）またはタキサン類似体（taxane analog）が含まれる。
【００５７】
ある実施形態では、細胞毒性薬は、メイタンシノイド（maytansinoid）または別のグループの抗チューブリン剤であり得る。例えば、特定の実施形態において、メイタンシノイドはメイタンシン（maytansine）またはＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.; Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131も参照）。
【００５８】
ある実施形態では、細胞毒性薬または細胞増殖抑制剤はドラスタチン（dolastatin）であり得る。ある実施形態では、細胞毒性薬または細胞増殖抑制剤はアウリスタチン類（auristatin class）のものである。よって、特定の実施形態において、細胞毒性薬または細胞増殖抑制剤はＭＭＡＥである。
【００５９】
別の実施形態では、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法１００も提供される。図１は、本開示のある実施形態による抗体-薬物複合体（ＡＤＣ）を形成するための方法１００を説明するフロー図である。
【００６０】
先ず、方法１００は、第１の溶液を作ることによりステップ１０２に進む。第１の溶液は、抗体と還元剤を緩衝液中で反応させることにより作る。いくつかの実施形態において、抗体は全長抗体または抗体フラグメントであり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、キメラ抗体もしくその機能的に活性なフラグメント、ヒト化抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヒト抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはマウス抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントであってよい。他の実施形態において、抗体は、ラット抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、ヤギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメント、またはウサギ抗体もしくはその機能的に活性なフラグメントなどのような他の種（species）由来の抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、上述した任意の適した抗体であってよい。ある実施形態では、抗体には、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、ＨＬＸ−０７、ＥＧ１２０１４、抗−ＥｐＣＡＭ  Ａｂ、ＩｇＧ１、リツキシマブ（Rituximab）、イブリツモマブチウキセタン（Ibritumomab tiuxetan）、トシツモマブ（Tositumomab）、ブレンツキシマブ ベドチン（Brentuximab vedotin）、アレムツズマブ（Alemtuzumab）、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ（Adecatumumab）、ラベツズマブ（Labetuzumab）、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ（Pemtumomab）、オレゴボマブ（Oregovomab）、ＣＣ４９（ミンレツモマブ（minretumomab））、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファーレツズマブ（farletuzumab））、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ（Bevacizumab）、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ（Etaracizumab）、ボロシキシマブ（Volociximab）、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、８０６、トラスツズマブ（Trastuzumab）、ペルツズマブ（Pertuzumab）、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ  １０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ  ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（Mapatumumab）（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ（Denosumab）、シブロツヅマブ（Sibrotuzumab）、Ｆ１９、または８１Ｃ６が含まれ得る。他の抗体の説明については関連する段落における記載を参照することができ、よって不要な繰り返しを避けるために再度説明しない。
【００６１】
ステップ１０２において、抗体の初期濃度は２０ｍｇ／ｍＬ未満であり得る。例えば、抗体の初期濃度は約１から約２０ｍｇ／ｍＬの範囲内であり得る。しかし、抗体の初期濃度これらに限定されるものではない。抗体の初期濃度は、必要に応じて、２０ｍｇ／ｍＬより高くてもよい。
【００６２】
１実施形態では、還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−アミノエタンチオール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（２−ＭＥＡ）、およびその他の適した還元剤からなる群より選ばれ得る。１実施形態では、緩衝液は、２５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２５ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）からなるホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８）、２．６７ｍＭのＫＣｌ、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７．９３ｍＭのＮａＣｌ、および８．０６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２ＯからなるＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、または適したｐＨ値の他の緩衝液であってよい。
【００６３】
ステップ１０２において、還元剤と抗体とのモル当量比は、例えば所望の遊離チオールの数、およびＤＡＲ値のような抗体−薬物複合体の所望の特性などの実際のニーズに応じて調整可能である。
【００６４】
理論的に、ＤＡＲ値は、還元後、還元抗体中に生じる遊離チオールの数に相当する。また、還元剤と抗体とのモル当量比は還元剤の還元能力の影響を受け得る。よって、還元剤および還元条件を、抗体中に存在する鎖間ジスルフィド結合が所望の数の遊離チオールに変わるように選択する。
【００６５】
理論的に、１モル当量のＴＣＥＰは、抗体中に２つの遊離チオールを生じさせる。よって、所望の平均ＤＡＲ値３．５〜４．０を得るために、１．７５〜２モル当量のＴＣＥＰを用いて、抗体中に平均数３．５〜４．０の遊離チオールを生じさせることができる。しかしながら、反応に用いるＴＣＥＰの実際のモル当量は、前述の理論値よりも大きいものであり得ること理解されなければならない。
【００６６】
例えば、平均ＤＡＲ値２６を得るために、理論上は、平均数２６の遊離チオールを生成するべくＴＣＥＰと抗体とのモル当量比を１３に調整することができる。しかし、反応に用いるＴＣＥＰの実際のモル当量は、１３モル当量よりも大きいものであり得る。同様に、平均ＤＡＲ値１２を得るために、理論上は、平均数１２の遊離チオールを生成するべくＴＣＥＰと抗体とのモル当量比を約６に調整することができる。しかし、反応に用いるＴＣＥＰの実際のモル当量は、６モル当量よりも大きいものであり得る。
【００６７】
本開示の１実施形態では、平均ＤＡＲ値３．５〜４．０を得るために、抗体中に平均数３．５〜４．０の遊離チオールを生成すべくＴＣＥＰと抗体とのモル当量比を約１．８〜２．８の範囲内に調整することができる。別の実施形態では、平均ＤＡＲ値３．５〜４．０を得るために、ＴＣＥＰと抗体とのモル当量比を２．１〜２．５とすることができる。さらに別の実施形態では、４．０よりも大きい、例えば５．４の平均ＤＡＲ値、を得るために、ＴＣＥＰと抗体とのモル当量比を約３．４とすることができる。
【００６８】
ステップ１０２において、反応は室温（例えば１５〜２５℃）から４０℃で約１〜３時間行うことができる。反応の後、抗体は還元されて遊離チオールが生じる。
【００６９】
次いで、方法１００は、有機相または水相中でリンカー−薬物ユニットを調製して第２の溶液を作ることによりステップ１０４に進み、このうちリンカーはグリコペプチドを有する。１実施形態において、有機相には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、プロピレングリコール（ＰＧ）などが含まれ得る。リンカー−薬物ユニットを調製するために用いる有機溶媒の濃度は、約０％（ｖ／ｖ）から１００％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば０％、１０％（ｖ／ｖ）、２０％、３０％（ｖ／ｖ）、５０％、７５％、または１００％（ｖ／ｖ）であってよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、グリコペプチドには、単糖類、二糖類または多糖類が含まれ得る。いくつかの実施形態において、グリコペプチドを有するリンカー−薬物ユニットは、ＭＨＴ−４７、ＭＨＴ−７１、ＭＨＴ−８１ａ、ＭＨＴ−９３、ＭＨＴ−９８ａ、ＣＣＨ−２８、ＣＣＨ−３５、ＣＣＨ−３８、ＦＣＷ−０１６、ＷＨＹ−４６およびＣＣＨ−４１からなる群より選ばれ得る。いくつかの実施形態において、グリコペプチドを有するリンカー−薬物ユニットは、上述の適したリンカー−毒素のいずれかであってよい。他のリンカー−薬物ユニットの説明については関連する段落における記載を参照することができ、よって不要な繰り返しを避けるために再度ここで説明はしない。
【００７１】
次に方法１００は、第１の溶液と第２の溶液を混合して混合溶液を作ることによりコンジュゲーションプロセスを行うことによって、ステップ１０６に進む。
【００７２】
いくつかの実施形態において、混合溶液中の有機溶媒の濃度は約０％（ｖ／ｖ）から約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。例えば、混合溶液中の有機溶媒の濃度は、０〜２％（ｖ／ｖ）、２〜５％（ｖ／ｖ）、５〜７％（ｖ／ｖ）、７〜１０％（ｖ／ｖ）、１０〜１５％（ｖ／ｖ）、または１５〜２０％（ｖ／ｖ）であってよい。ステップ１０６において、第１の溶液の還元抗体は、有機溶媒を０〜２０％（ｖ／ｖ）含有する共溶媒系中でリンカー−薬物ユニットとコンジュゲートしてＡＤＣを形成する。ステップ１０６において、コンジュゲーションプロセスは、約０．５〜２時間、０〜１０℃で行うことができる。例えば、１実施形態では、コンジュゲーションプロセスは０．５時間４℃で行うことができる。
【００７３】
先行研究では各種ＡＤＣが開発されているが、コンジュゲーションプロセス時に有機溶媒の含有量が高い共溶媒系が必要であるということに留意すべきである。例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより提示されたコンジュゲーションプロセスでは、モノクローナル抗体中の鎖間ジスルフィド結合を還元してチオール基を遊離するために２．７５モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が還元剤として用いられる。しかしながら、還元抗体は、２０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒を含有する共溶媒系中でＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢのマレイミドとコンジュゲートする。この先行研究においては、共溶媒中の有機溶媒の含有量が減少すると、リンカー−毒素が完全に溶解され得ず、均一相中で抗体にコンジュゲートすることができないため、コンジュゲーション効率が低下することになる。
【００７４】
これに対し、本開示は、水溶解度の高い新規なリンカー−毒素を用いてＡＤＣを形成する。リンカーは、糖アミノ酸を有して、リンカーの親水性を高めると共に、最終的なＡＤＣ生成物の安定性を高めるように設計されている。よって、ＡＤＣのコンジュゲーションプロセス時に用いられる有機溶媒の含有量は有効に減少し、かつＡＤＣの高いコンジュゲーション効率が達成される。加えて、減少した有機溶媒の含有量のために、後続の精製および分析がより容易になる。また、改善されたリンカー−毒素の親水性はＡＤＣの凝集をも低減するため、ＡＤＣの安定性が増す。試料の保管および製剤設計に大きなメリットがある。グリコペプチドを有するリンカーユニット含有の抗体-薬物複合体は、グリコペプチドを有さないリンカーユニット含有の抗体-薬物複合体に比べて、安定性が高まる。
【００７５】
２０％の有機溶媒を必要とするＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより開発されたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢに比して、本開示は、糖アミノ酸を有するリンカー−毒素がＡＤＣのコンジュゲーションプロセス時に有機溶媒の使用を大幅に減らすことができる、ということを証明した。また、特定のリンカー−毒素を用いるコンジュゲーションプロセスは、純水相（pure aqueous phase）中で行えるということも証明された。純水相中でコンジュゲートされたＡＤＣは凝集がほとんどない。ＳＥＣで分析したＨＭＷＳは０．１％未満である（以下の実施例２０、２１および図１３Ｂ、１４Ｂを参照）。
【００７６】
さらに、現在のところ、市販のＡＤＣ薬物、Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）およびＡｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）は凍結結晶（frozen crystal）の形態で保存され、かつ復元（reconstitution）後１日以内に使用しなければならない。一方、本開示のＡＤＣは優れた安定性を備え、液体の形態で４か月以上４℃で保存することができる（以下の実施例１９および図１８を参照）。
【００７７】
加えて、本開示では、抗体とリンカー−薬物ユニットとのモル当量比は、抗体−薬物複合体が約３．５から約４．０の範囲内の平均ＤＡＲを有し得るように選択される。ＡＤＣの平均ＤＡＲは実際のニーズに応じて調整可能であることが理解されなければならない。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＤＣの平均ＤＡＲは４．０より大きくてよい。
【００７８】
最後に、方法１００は、混合溶液を精製することによりステップ１０８に進む。いくつかの実施形態において、脱塩カラムまたはタンジェンシャルフローろ過（tangential flow filtration, ＴＦＦ）を用いて混合溶液を精製し、コンジュゲートしていない（unconjugated）リンカー−毒素を除去して、精製ＡＤＣを得ることができる。溶出時に、緩衝液を、ＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ，ｐＨ７．４）のような別の適した緩衝溶液、またはＳＧＮ（２０ｍＭクエン酸ナトリウム，６．３％（ｗ／ｖ）トレハロース，０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０，ｐＨ６．０）のようなその他の配合溶液（formulation solution）に変えることができる。
【００７９】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析によれば、本開示で得られるＡＤＣの平均ＤＡＲ（薬物−抗体比）は約３．５から約４．０であり、かつコンジュゲーション効率は９０％より大きく、例えば９２％、９３％、９４％、９５％または９６％である。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によれば、コンジュゲーションプロセス中に有意な高分子量種（high molecular weight species, ＨＭＷＳ）は生成されない。加えて、本開示で得られるＡＤＣは優れた熱安定性、貯蔵安定性および腫瘍増殖抑制能力を備える。
【００８０】
リンカー−毒素および抗体−薬物複合体を形成するための方法、ならびに抗体-薬物複合体の特性を説明するために、調製例および実施例を以下に記載する。
【実施例】
【００８１】
調製例および実施例
以下の調製例および実施例により本開示が詳細に説明される。それらのうち、ＭＭＡＥ（周知の毒素）およびアウリスタチンＦ（ＡＦ, 周知の毒素）はＣｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから購入した。Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＯＨおよび各種糖アミノ酸は文献に基づいて合成した。上記化合物の構造は、当業者にはよく知られたものであり、簡潔とするためにここでは説明はしない。
【００８２】
リンカー−毒素に用いた略称およびそれらの対応する化学構造が表１に挙げられている。
【００８３】
【表１】
0006486316.tif 000020
0006486316.tif 000021
0006486316.tif 000022
【００８４】
【表２】
0006486316.tif 000023
【００８５】
＜リンカー−毒素＞
調製例１
ＭＨＴ−４７［ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
リンカー−毒素ＭＨＴ−４７を、次のスキームに示される手順に従って合成した。
【００８６】
【化１６】
0006486316.tif 000024
【００８７】
ステップ１
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ（９．１３ｇ，２０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（７５０ｍＬ）およびイソプロパノール（２５０ｍＬ）の混合物中に入れてから、ジペプチドが完全に溶解するまで撹拌した。次いで、ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（７．０９ｇ，３０ｍｍｏｌ）およびＥＥＤＱ（７．４２ｇ，３０ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を室温で３日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去してから、ジエチルエーテル（３００ｍＬ）をその残留物に加えた。その混合物を濾別し、粗生成物をジエチルエーテル（３００ｍＬ）中に再懸濁させた。この手順を３回繰り返した。最後に、収集した固形の生成物を真空下で乾燥し、Ｚ−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを得た（９．５３ｇ，収率７０．６％）。ＰＭＲによりその生成物の特性を決定した。
【００８８】
ステップ２
Ｚ−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（２．０２ｇ，３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５０ｍＬ）およびメタノール（５０ｍＬ）の混合物中に溶解した。触媒量のＰｄ／Ｃ（１０％）を加えた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し終夜撹拌した。触媒をセライトのパッドで濾別し、その濾液を減圧下で蒸発させて、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（１．６１ｇ，９９％）。
【００８９】
ステップ３
Ｎ３−ＳＡＡ１（Ｘ）−ＯＨ（６３３ｍｇ）およびＰｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（１．３３ｇ）が入ったＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，１１０ｍＬ）の溶液に、ＨＢＴＵ（１．１１８ｇ）およびＤＩＰＥＡ（１．０２ｍＬ）を加えた。１７時間後、ＤＣＭを減圧下で除去した。水およびジエチルエーテルを、残っている粗ＤＭＦ溶液に加え、濾過した後にベージュ色の固体を得た。その固体を高濃度クエン酸水溶液で数回洗浄し、大部分のＨＯＢｔおよびＤＭＦを除去した。最後に、Ｎ３−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に５０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ）。アセトニトリルを減圧下で蒸発させ、残りの水溶液を凍結乾燥した。Ｎ３−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＢｏｃおよびＮ３−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃからなる白色の固体を得た（１ｇ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｎ３−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ３８Ｈ５３Ｎ９Ｏ９）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝７８０．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝７８１．８；Ｎ３−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ３５Ｈ４９Ｎ９Ｏ９）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝７４０．８，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝７４１．７。
【００９０】
ステップ４
Ｎ３−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＢｏｃおよびＮ３−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃの混合物（１００ｍｇ）をメタノール（５０ｍＬ）中に溶解した。触媒量のＰｄ／Ｃ（１０％）を加えた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し終夜撹拌した。触媒をセライトのパッドで濾別した後、メタノールを減圧下で除去し、ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＢｏｃおよびＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃからなる白色の固体を得た（７８ｍｇ）。
【００９１】
ステップ５
ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＢｏｃおよびＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（２１０ｍｇ）の入ったＭｅＯＨ（５０ｍＬ）の溶液に、ＭＣ−ＯＰＦＰ（１０３ｍｇ）を加え、続いてＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ）を加えた。１７時間後、その反応混合物を濃縮した。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に５０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０ｘ５００ｍｍ；流速４０ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＢｏｃおよびＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃの溶液を得た。
【００９２】
ステップ６
ＭＣ−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＢｏｃおよびＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃの溶液を濃塩酸（１０ｅｑ．）で処理した。その反応を、加水分解が完了するまで分析ＨＰＬＣで観察した。アセトニトリルを減圧下で除去し、水溶液を凍結乾燥した後に、固体のＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡを得た。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（Ｃ４０Ｈ５４Ｎ８Ｏ１０）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝８０７．４，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝８０９．１。
【００９３】
ステップ７
ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（１１０ｍｇ）をＤＣＭおよびＤＭＦ  の混合物（１０：１，１０ｍＬ）中に溶解してから、アウリスタチンＦ（９３ｍｇ）、ＨＢＴＵ（５５ｍｇ）、およびＤＩＰＥＡ（０．０７７ｍＬ）をそれぞれ加えた。１７時間後、ＤＣＭ、ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡを減圧下で除去した。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に３５％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０ｘ２５０ｍｍ；流速４０ｍＬ／ｍｉｎ）。目的画分（target fraction）中のアセトニトリルを減圧下で除去し、残った水溶液を凍結乾燥して、ＭＨＴ−４７を白色の固体として得た（２０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−４７）（Ｃ８０Ｈ１１９Ｎ１３Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１５３４．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１５３８．０。
【００９４】
調製例２
ＭＨＴ−７１［ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
次のスキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＭＨＴ−７１を合成した。
【００９５】
【化１７】
0006486316.tif 000025
【００９６】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ１（Ｘ）−ＯＨ（２６．１ｍｇ）およびＶａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（８０ｍｇ）の入ったＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，４．４ｍＬ）の溶液に、ＨＢＴＵ（３２．５ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２９ｍＬ）をそれぞれ加えた。１８時間後、溶媒を減圧下で除去し、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に４５％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０ｘ５００ｍｍ；流速６５ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１１ｍｉｎ）。アセトニトリルを除去した後、Ｚ−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦが完全にＺ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦに変わるまで、その水溶液を冷蔵庫に終夜置いた。次いで、その水溶液を凍結乾燥し、Ｚ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（６３ｍｇ，２工程で収率６３％）。
【００９７】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（６３ｍｇ）をメタノール（５ｍＬ）中に溶解し、次にＰｄ／Ｃ触媒を加えた。次いで、その反応混合物に水素バルーンを適用し３時間撹拌した。Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させ、ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（５２．５ｍｇ）。
【００９８】
ステップ３
ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（４０ｍｇ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（１１．６ｍｇ）の入ったメタノール（４ｍＬ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００５６ｍＬ）を加えた。その反応物を終夜撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に３５％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ５００ｍｍ；流速７０ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１８ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−７１）を白色の固体として得た（２７ｍｇ；４７％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−７１）（Ｃ７６Ｈ１２０Ｎ１３Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１４８６．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１４８７．２。
【００９９】
調製例３
ＭＨＴ−８１ａ［ＭＣ−ＳＡＡ６−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
次のスキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＭＨＴ−８１ａを合成した。
【０１００】
【化１８】
0006486316.tif 000026
【０１０１】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ６（Ｘ）−ＯＨ（１００ｍｇ）の入ったジクロロメタン（１０ｍＬ）の溶液に、プロトンスポンジ（６３ｍｇ）およびＨＢＴＵ（１７０ｍｇ）を加えた。次いで、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（１５０ｍｇ）の入ったＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液を加え、終夜静置した。溶媒を除去した後、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に５０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０＊５００ｍｍ；流速７０ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１５ｍｉｎ）、Ｚ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（１２２．１ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｚ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ４０Ｈ５７Ｎ７Ｏ１１）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝８１２．４２，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝８１３．２。
【０１０２】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（５０ｍｇ）をメタノール（２ｍＬ）中に溶解し、次に触媒Ｐｄ／Ｃを加えた。次いで、その反応混合物に水素バルーンを適用し１７時間置いた。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別し、メタノール減圧下で蒸発させて、ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（３７．４ｍｇ）。
【０１０３】
ステップ３
ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（４７ｍｇ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（２８ｍｇ）をＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解した。その反応混合物にＤＩＰＥＡ（０．０１４１ｍＬ）を加えた。５時間後、ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡを減圧下で除去した。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に５０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０＊５００ｍｍ；流速４５〜５０ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１０．８ｍｉｎ）ＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（４２．５ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ４２Ｈ６２Ｎ８Ｏ１２）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝８７１．４６，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝８７１．５。
【０１０４】
ステップ４
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（４２．５ｍｇ）を室温下ＴＦＡ（０．１ｍＬ）で処理した。１７時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、淡黄色の固体であるＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡを得た（４０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（Ｃ３７Ｈ５４Ｎ８Ｏ１０）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝７７１．４０，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝７７１．９。
【０１０５】
ステップ５
ＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（３２ｍｇ）およびアウリスタチンＦ（２７ｍｇ）をＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，１２ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＨＢＴＵ（２０．５ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２２ｍＬ）をそれぞれ加えた。１７時間後、ＤＣＭおよびＤＭＦを減圧下で除去した。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に４０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０＊５００ｍｍ；流速３０ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（１５ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ６（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（Ｃ７７Ｈ１１９Ｎ１３Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１４９８．８９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１５００．７。
【０１０６】
調製例４
ＭＨＴ−９３［ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
次のスキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＭＨＴ−９３を合成した。
【０１０７】
【化１９】
0006486316.tif 000027
【０１０８】
ステップ１
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（２．４６ｇ，５ｍｍｏｌ）およびＺ−ＳＡＡ７−ＯＨ（１．７１ｇ，５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＤＩＰＥＡ（６４６．２ｍｇ，５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１．９０ｇ，５ｍｍｏｌ）をその反応混合物に加えた。その混合物を室温で１６時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。その残留物を、白色の微粉末が形成されるまで、酢酸エチル（２００ｍＬ）と共に数時間撹拌した。その固体生成物を濾別した。その白色粉末を水（２００ｍＬ）中で１５分間煮沸してから、熱いうちに濾過した。その生成物を、温水（５０ｍＬ，２回）で洗浄し、最後に真空下で乾燥してＺ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを得た。
【０１０９】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（２００ｍｇ）をメタノール（５０ｍＬ）中に溶解し、次に触媒Ｐｄ／Ｃを加えた。次いで、その反応物に水素バルーンを適用し１７時間置いた。触媒をセライトのパッドで濾別した。メタノールを減圧下で蒸発させて、ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（１４８ｍｇ）。
【０１１０】
ステップ３
ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（２４０ｍｇ）、ＭＣ−ＯＰＦＰ（１４４ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．０７２ｍＬ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解した。５時間後、ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡを減圧下で除去した。その残留物を、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）中で４５％アセトニトリルと混合してから、遠心分離した。液体部分を除去した後、ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（２００ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ４１Ｈ６２Ｎ８Ｏ１３）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝８７５．４５，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝８７５．８。
【０１１１】
ステップ４
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中のＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（２００ｍｇ）を室温下ＴＦＡ（０．５ｍＬ）で処理した。１７時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、淡黄色の固体ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡを得た（１８０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（Ｃ３６Ｈ５４Ｎ８Ｏ１１）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝７７５．４，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝７７６．０。
【０１１２】
ステップ５
ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（８０ｍｇ）およびアウリスタチンＦ（７７ｍｇ）を、ＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，１６．６ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＨＢＴＵ（６４ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．０６４ｍＬ）をそれぞれ加えた。１７時間後、ＤＣＭおよびＤＭＦを減圧下で除去した。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に４０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０＊２５０ｍｍ；流速２５ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１０．４２ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−９３）を白色の固体として得た（５０．９ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ７−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−９３）（Ｃ７７Ｈ１２０Ｎ１２Ｏ１８）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１５０３．０，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１５０４．１
【０１１３】
調製例５
ＭＨＴ−９８ａ［ＭＣ−ＳＡＡ８−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
次のスキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＭＨＴ−９８ａを合成した。
【０１１４】
【化２０】
0006486316.tif 000028
【０１１５】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ８（Ｘ）−ＯＨ（１００ｍｇ）の入ったＤＣＭ（１０ｍＬ）の溶液に、プロトンスポンジ（６３ｍｇ）およびＨＢＴＵ（１７０ｍｇ）を加えた。次いで、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（１５０ｍｇ）の入ったＤＭＦ（１ｍＬ）の溶液を加え、その反応混合物を終夜置いた。溶媒を除去した後、その残留物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に５５％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０＊５００ｍｍ；流速６０ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１３ｍｉｎ）、Ｚ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（１４４．６ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：Ｚ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ４０Ｈ５７Ｎ７Ｏ１１）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝８１２．４，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝８１３．４。
【０１１６】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（７０ｍｇ）をＭｅＯＨ  （１０ｍＬ）中に溶解し、次に触媒Ｐｄ／Ｃを加えた。次いで、その反応物に水素バルーンを適用し１７時間置いた。次いで、触媒をセライトのパッドで濾過した。その濾液を減圧下で蒸発させ、ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（５４ｍｇ）。
【０１１７】
ステップ３
ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（４４ｍｇ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（２４．２ｍｇ）をＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解してから、ＤＩＰＥＡ（０．０１４１ｍＬ）を加えた。５時間後、ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡを減圧下で除去し、その残留物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に４５％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０＊２５０ｍｍ；流速３５〜４０ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１３ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（４０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（Ｃ４２Ｈ６２Ｎ８Ｏ１２）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝８７１．５，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝８７２．０。
【０１１８】
ステップ４
ＤＣＭ（２ｍＬ）中のＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（４０ｍｇ）を、室温下ＴＦＡ（０．１ｍＬ）で処理した。１７時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、淡黄色の固体であるＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡを得た（４０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（Ｃ３７Ｈ５４Ｎ８Ｏ１０）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝７７１．４，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝７７１．９。
【０１１９】
ステップ５
ＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（２５．６ｍｇ）およびアウリスタチンＦ（２４．５ｍｇ）をＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，５．５ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＨＢＴＵ（２０．５ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２２ｍＬ）をそれぞれ加えた。１７時間後、ＤＣＭおよびＤＭＦを減圧下で除去した。その残留物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に４０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０＊２５０ｍｍ；流速３５〜４０ｍＬ／ｍｉｎ）、化合物ＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−９８ａ）を白色の固体として得た（３．３ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ８（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−９８ａ）（Ｃ７８Ｈ１２０Ｎ１２Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１４９７．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１５００．５。
【０１２０】
調製例６
ＣＣＨ−０２８［ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ］の合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＣＣＨ−０２８を合成した。
【０１２１】
【化２１】
0006486316.tif 000029
【０１２２】
ステップ１
Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＯＨ（３．２４ｇ，７．９３ｍｍｏｌ）をジクロロメタンおよびメタノールの混合物（３：１，８０ｍＬ）中に加えた。ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−Ｂｏｃ（２．８ｇ，９．５２ｍｍｏｌ）を加えた後、カップリング試薬ＥＥＤＱ（２．４７ｇ，９．５２ｍｍｏｌ）を入れた。その混濁液を室温で撹拌した。未溶解のＺ−Ｖａｌ−Ｃｉｔが徐々に見えなくなり、溶液が次第に澄んできた。４８時間後、ＨＰＬＣで調べたときに反応は完全に完了していた。その反応混合物を、厚いペーストが形成されるまで減圧下で蒸発させた。その混合物を濾別し、ｎ−ヘキサン（５０ｍＬ，２回）、水（５０ｍＬ，２回）およびジエチルエーテル（５０ｍＬ，２回）で洗浄した。最後に、その固体生成物を真空下で乾燥してＺ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−Ｂｏｃを茶色の粉末として得た（７５．０ｍｇ，１．４％）。
【０１２３】
ステップ２
Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−Ｂｏｃ（７５．０ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８ｍＬ）中に加えてから、室温下トリフルオロ酢酸（０．０９ｍＬ）で処理した。４時間後、減圧下で溶媒を蒸発させた。その残留物を水（１０ｍＬ）と混合し、凍結乾燥して、Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）を白色粉末として得た（９６．０ｍｇ）。
【０１２４】
ステップ３
アウリスタチンＦ（８０．０ｍｇ，０．１０２ｍｍｏｌ）を少量のＤＭＦ（１ｍＬ）  中に溶解してから、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈した。その溶液を氷浴中に浸漬してから、Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）（７１．４ｍｇ，０．１０２ｍｍｏｌ）  およびＨＡＴＵ（４３．０ｍｇ，０．１１３ｍｍｏｌ）を入れた。ＤＩＰＥＡ（０．０７１ｍＬ）を加えた後、氷浴を取り除いた。その混合物を室温で４時間撹拌した後、減圧下で溶媒を蒸発させ、その残留物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に４３％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０＊２５０ｍｍ；流量２４ｍＬ／ｍｉｎ）、Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦを白色の固体として得た（８２．０ｍｇ，６１％）。
【０１２５】
ステップ４
Ｚ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（８２．０ｍｇ，０．０６２ｍｍｏｌ）を、塩酸（０．２４ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（１０ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，１０ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し終夜撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させた。その残留物を水（１０ｍＬ）と混合し、凍結乾燥して、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦを白色粉末として得た（７２．８ｍｇ，９６％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（Ｃ６１Ｈ９９Ｎ１１Ｏ１２）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１１７８．８，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１１７９．７。
【０１２６】
ステップ５
Ｚ−ＳＡＡ１（Ｘ）−ＯＨ（２２．０ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解した。ＨＡＴＵ（２５．３ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）を加えた後、その反応混合物を氷浴中に浸漬し、続いてＤＩＰＥＡ（０．０３２ｍＬ，０．０６ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、氷浴を取り除き、室温でＶａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（７２．８ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液をその反応混合物に加えた。３時間後、減圧下で溶媒を蒸発させ、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に４５％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流量２４ｍＬ／ｍｉｎ）。アセトニトリルの除去後、その水溶液を室温で終夜置いて、Ｚ−ＳＡＡ１（Ｘ）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦを完全に加水分解させた。次いで、その水溶液を凍結乾燥し、  Ｚ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦを白色の固体として得た（４３．５ｍｇ，２工程で収率４９％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｚ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（Ｃ７９Ｈ１２０Ｎ１２Ｏ１８）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１５２５．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１５２６．８。
【０１２７】
ステップ６
Ｚ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（４３．５ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）を、塩酸（０．０６ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（５ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．７ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し終夜撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させた。その残留物を水（５ｍＬ）と混合し、凍結乾燥してＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦを白色粉末として得た（３８．４ｍｇ，９４％）。
【０１２８】
ステップ７
【０１２９】
ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（１５．０ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（４．５ｍｇ，０．０１２ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００４ｍＬ）を加えた。その混合物を室温で１時間撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に３６％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流量２４ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦを白色の固体として得た（１０．０ｍｇ；６０％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（ＣＯＯＭｅ）−ＡＦ（Ｃ７８Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１９）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１５４４．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１５４５．８。
【０１３０】
調製例７
ＣＣＨ−０３５［ＭＣ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＣＣＨ−０３５を合成した。
【０１３１】
【化２２】
0006486316.tif 000030
【０１３２】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ３（Ｘ）−ＯＨ（１８．２ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）およびＶａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（６０．０ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）の入ったＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，６ｍＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（２２．０ｍｇ，０．０５７２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２７ｍＬ，０．１５６ｍｍｏｌ）をそれぞれ加えた。１８時間後、溶媒を減圧下で除去し、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に４３％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）。アセトニトリルを除去した後、その水溶液を、アセトニド基が完全に除去されるまで、室温下に終夜置いた。その水溶液を凍結乾燥し、Ｚ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（４８．０ｍｇ，２工程で収率６５％）。
【０１３３】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（４８．０ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ）を、塩酸（０．０１４ｍＬ）を含有するエタノール（５ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．７ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し５時間撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させた。その生成物を水（５ｍＬ）と混合し、凍結乾燥し、ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（４２．０ｍｇ，９４％）。
【０１３４】
ステップ３
ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（２０．０ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（６．３ｍｇ，０．０１６５ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．００６ｍＬ）を加えた。その反応物を室温で１時間撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に３６％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（１２．２ｍｇ；５５％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（Ｃ７５Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１４７３．８，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１４７３．６。
【０１３５】
調製例８
ＣＣＨ−０３８［ＭＣ−ＳＡＡ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＣＣＨ−０３８を合成した。
【０１３６】
【化２３】
0006486316.tif 000031
【０１３７】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ４（Ｘ）−ＯＨ（１５．２ｍｇ，０．０４３ｍｍｏｌ）およびＶａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（５０．０ｍｇ，０．０４３ｍｍｏｌ）の入ったＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，６ｍＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１８．１ｍｇ，０．０４７３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２３ｍＬ，０．１２９ｍｍｏｌ）をそれぞれ加えた。１８時間後、溶媒を減圧下で除去し、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に４３％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）。アセトニトリルを除去した後、その水溶液を、アセトニドが完全に除去されるまで、室温下に終夜置いた。その水溶液を凍結乾燥し、Ｚ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（３２．４ｍｇ，２工程で収率５３％）。
【０１３８】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（３２．４ｍｇ，０．０２２９ｍｍｏｌ）を、塩酸（０．０９ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（５ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，４．０ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し５時間撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させた。その生成物を水（５ｍＬ）と混合し、凍結乾燥してＳＡＡ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（３０．０ｍｇ，９８％）。
【０１３９】
ステップ３
ＳＡＡ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（２０．０ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（６．３ｍｇ，０．０１６５ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（４ｍＬ）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．００６ｍＬ）を加えた。その反応物を室温で１時間撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に３６％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（１５．６ｍｇ；７０％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ４−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＣＣＨ−０３８）（Ｃ７５Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１４７３．８，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１４７３．６。
【０１４０】
調製例９
ＣＣＨ−０４１［ＭＣ−ＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＣＣＨ−０４１を合成した。
【０１４１】
【化２４】
0006486316.tif 000032
【０１４２】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ３（Ｘ）−ＯＨ（１４．５ｍｇ，０．０４１ｍｍｏｌ）およびＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（５４．５ｍｇ，０．０４１ｍｍｏｌ）の入ったＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，６ｍＬ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１７．３ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０２ｍＬ，０．１２３ｍｍｏｌ）をそれぞれ加えた。１８時間後、溶媒を減圧下で蒸発させ、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に４１％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）。アセトニトリルを除去した後、その水溶液を、ケタール基が完全に加水分解されるまで、終夜室温下に置いた。その水溶液を凍結乾燥し、Ｚ−ＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（２１．３ｍｇ，２工程で収率３３％）。
【０１４３】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（２１．３ｍｇ，０．０１３５ｍｍｏｌ）を、塩酸（０．０５２ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（５ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，２．５ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し５時間撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させた。その生成物を水（５ｍＬ）と混合し、凍結乾燥してＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（１６．１ｍｇ，８１％）。
【０１４４】
ステップ３
ＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（１６．１ｍｇ，０．０１０９ｍｍｏｌ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（４．５ｍｇ，０．０１２ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００４ｍＬ）を加えた。その反応混合物を室温で１時間撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に３３％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＣＣＨ−０４１）を白色の固体として得た（９．２ｍｇ；  ５２％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ３−ＳＡＡ３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＣＣＨ−０４１）（Ｃ８１Ｈ１２６Ｎ１４Ｏ２１）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１６３３．０，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１６３３．２。
【０１４５】
調製例１０
ＦＣＷ−０１６［ＭＣ−ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＦＣＷ−０１６を合成した。
【０１４６】
【化２５】
0006486316.tif 000033
【０１４７】
ステップ１
ＨＡＴＵ（４０ｍｇ，０．１０６０ｍｍｏｌ）を、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（９９ｍｇ，０．０８８４ｍｍｏｌ）、Ｚ−ＳＡＡ５−ＯＨ（３６ｍｇ，０．１０６０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．０４６ｍＬ，０．２６５１ｍｍｏｌ）が入ったＤＭＦ（２ｍＬ）およびジクロロメタン（２０ｍＬ）の混合物の撹拌溶液に加えた。室温で１２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、その残留物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に４３％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）、Ｚ−ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の粉末として得た（３３ｍｇ，２６％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｚ−ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（Ｃ７５Ｈ１１５Ｎ１１Ｏ１７）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＝７２１．９，  ｆｏｕｎｄ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＝７２３．６。
【０１４８】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（３５．０ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）を、ＨＣｌ（０．０４８ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（８ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，２．６ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し１６時間撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、その濾液を減圧下で蒸発させた。その生成物を水（１０ｍＬ）と混合し、凍結乾燥して、ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（３０．０ｍｇ，９５％）。ＬＣ−ＭＳ：ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（Ｃ６７Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１５）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＝６５４．９，  ｆｏｕｎｄ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＝６５６．６。
【０１４９】
ステップ３
ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（１６．５ｍｇ，０．０１２６ｍｍｏｌ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（５．７ｍｇ，０．０１５１ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．００６６ｍＬ，０．０３７８ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を室温で３時間撹拌してから、減圧下で蒸発させた。その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に３６％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２４ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＦＣＷ−０１６）を白色の固体として得た（１２．０ｍｇ；６３％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ５−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＦＣＷ−０１６）（Ｃ７７Ｈ１２０Ｎ１２Ｏ１８）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＝７５１．４，  ｆｏｕｎｄ  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＝７５３．１。
【０１５０】
調製例１１
ＷＨＹ−４６［ＭＣ−ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
２つの糖ユニットを含有するリンカー−毒素ＷＨＹ−４６を下記スキームに示される手順に従って合成した。
【０１５１】
【化２６】
0006486316.tif 000034
【０１５２】
ステップ１
Ｚ−ＳＡＡ１（Ｘ）−ＯＨ（２８．０ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）中に溶解した。ＨＡＴＵ（２３．４ｍｇ，０．０．０６１ｍｍｏｌ）を加えた後、その反応混合物を氷浴中に浸漬し、続いてＤＩＰＥＡ（７．９ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、氷浴を取り除き、室温でＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（７０．０ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）の入ったＤＭＦ（３ｍＬ）の溶液をその反応混合物に加えた。１時間後、減圧下で溶媒を蒸発させ、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製した（０．１％ＴＦＡを含む水中に３９％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流速２５ｍＬ／ｍｉｎ）。アセトニトリルを除去した後、その水溶液を室温で終夜置き、Ｚ−ＳＡＡ１（Ｘ）−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを完全に加水分解させた。次いで、その水溶液を凍結乾燥し、Ｚ−ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（６４ｍｇ，２工程で収率７８％）。ＬＣ−ＭＳ：Ｚ−ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（Ｃ８１Ｈ１２５Ｎ１３Ｏ２０）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１６０２．０，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１６０１．５。
【０１５３】
ステップ２
Ｚ−ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（６４．０ｍｇ，０．０４２ｍｍｏｌ）を、塩酸（０．１３６ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（２０ｍＬ）中に溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％，６．５ｍｇ）を入れた後、その反応混合物に水素バルーンを適用し終夜撹拌した。触媒Ｐｄ／Ｃをセライトのパッドで濾別してから、濾液を減圧下で蒸発させた。その生成物を水（１０ｍＬ）と混合し、凍結乾燥してＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（６０．０ｍｇ，９７％）。ＬＣ−ＭＳ：ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（Ｃ７３Ｈ１１９Ｎ１３Ｏ１８）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１４６６．９，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１４６７．５。
【０１５４】
ステップ３
ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（３０．０ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（７．４ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）中に溶解した。その反応混合物を氷浴中に浸漬した後、ＭＣ−ＯＰＦＰ（９．０ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、氷浴を取り除き、その混合物を室温で１時間撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させ、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に３３％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム３０ｘ２５０ｍｍ；流量２５ｍＬ／ｍｉｎ）、ＭＣ−ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦを白色の固体として得た（１８．５ｍｇ，５３％）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−ＳＡＡ１−ＳＡＡ１−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＷＨＹ−４６）（Ｃ８３Ｈ１３０Ｎ１４Ｏ２１）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１６６０．０，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１６６０．７。
【０１５５】
比較調製例１２
ＭＨＴ−８７［ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ］の合成
下記スキームに示される手順に従ってリンカー−毒素ＭＨＴ−８７を合成した。
【０１５６】
【化２７】
0006486316.tif 000035
【０１５７】
ステップ１
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（６５ｍｇ）およびＭＣ−ＯＰＦＰ（５０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解してから、ＤＩＰＥＡ（０．０２３ｍＬ）を加えた。５時間後、ＤＭＦおよびＤＩＰＥＡを減圧下で除去した。次いで、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製し（０．１％ＴＦＡを含む水中に５０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム５０ｘ５００ｍｍ；流速８０ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１３．６０ｍｉｎ）、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃを白色の固体として得た（４０ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：８８（Ｃ３４Ｈ５１Ｎ７Ｏ８）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝６８６．４，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝６８７．３。
【０１５８】
ステップ２
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−Ｂｏｃ（４０ｍｇ）を室温下ＴＦＡ（３００Ｌ）で処理した。１７時間後、ＤＣＭおよびＴＦＡを減圧下で除去し、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡを淡黄色の固体として得た（４６ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（Ｃ２９Ｈ４３Ｎ７Ｏ６）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝５８６．３，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝５８６．７。
【０１５９】
ステップ３
ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ（３７ｍｇ）およびアウリスタチンＦ（４７ｍｇ）をＤＣＭおよびＤＭＦの混合物（１０：１，３．７ｍＬ）中に溶解した。次いで、ＨＢＴＵ（３７ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（０．０３７ｍＬ）を加えた。１７時間後、ＤＣＭおよびＤＭＦを減圧下で除去し、その粗生成物を分取ＨＰＬＣで精製して（０．１％ＴＦＡを含む水中に４０％アセトニトリル；ＵＶ２１０ｎｍ；ＯＤＳ−３カラム  ３０＊２５０ｍｍ；流速２５ｍＬ／ｍｉｎ；ＲＴ１４ｍｉｎ）、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−８７）を白色の固体として得た（９ｍｇ）。ＬＣ−ＭＳ：ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＡＰＥＡ−ＡＦ（ＭＨＴ−８７）（Ｃ７０Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１３）  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ［ＭＨ＋］＝１３１２．８，  ｆｏｕｎｄ  ［ＭＨ＋］＝１３１５．２。
【０１６０】
＜抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）＞
＜抗体−リンカー−毒素＞
実施例１
有機溶媒を６．７％含有する共溶媒系中でのＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、１２ｍＬのＥＧ１２０１４（ＥｉｒＧｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．製）（初期濃度：１２．５ｍｇ／ｍＬ）を２６９μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．５モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した３．５５ｍＬの３ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−７１（９．９モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約６．７％）。１．５ｍＬの０．１Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（後述）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（後述）を用い、平均薬物−抗体比（ＤＡＲ）および高分子量種（ＨＭＷＳ）を決定した。
【０１６１】
ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）分析
Ｂｕｔｙｌ  ＮＰＲ（４．６×３５ｍｍ）ＴＯＳＯＨカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣを用い、薬物−抗体比（ＤＡＲ）プロファイルの分析を行った。移動相Ａは２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウムからなり、ｐＨ６．９５、移動相Ｂは２５ｍＭリン酸ナトリウム、２５％イソプロパノールからなり、ｐＨ６．９５のものとした。試料１５μＬを流速０．８ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入しグラジエントモード（gradient mode）下で分離した：０−１００％移動相Ｂ、１２分間。２８０ｎｍでの吸光度を検出した。
【０１６２】
ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）分析
Ｙａｒｒａ  ３μｍ  ＳＥＣ−３０００（３００ｘ７．８ｍｍ）カラムを備えたＷａｔｅｒｓ  ＰＤＡ９９６  ＨＰＬＣを用い、抗体モノマーと凝集生成物（aggregation product）とをサイズによって分けた。移動相は、０．０２０Ｍリン酸カリウム、０．０２５Ｍ塩化カリウム、およびイソプロパノール５％（ｖ／ｖ）からなり、ｐＨ６．９５のものとした。試料３０μＬを流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入し、イソクラティック条件（isocratic condition）下で分離した。２８０ｎｍでの吸光度を検出した。メインピークより前に溶出したすべての種（species）をまとめて、高分子量種（ＨＭＷＳ）とする。
【０１６３】
図２は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。ＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１の平均ＤＡＲは約３．７である。コンジュゲーション効率は約９５％である。
【０１６４】
実施例２
水相中におけるＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．１４ｍＬのＥＧ１２０１４（ＥｉｒＧｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．製）（初期濃度：７．５ｍｇ／ｍＬ）を３．４μＬの５ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．４モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１３．９μＬの５ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−７１（９．９モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。１５μＬの０．２  Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１６５】
図３Ａは、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。ＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１の平均ＤＡＲは約３．９である。コンジュゲーション効率は約９６％である。
【０１６６】
実施例３
水相中におけるＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．１４ｍＬのＥＧ１２０１４（ＥｉｒＧｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．製）（初期濃度：７．５ｍｇ／ｍＬ）を４．８μＬの５ｍＭ  ＴＣＥＰ（３．４モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１３．９μＬの５ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−７１（９．９モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。１５μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１６７】
図３Ｂは、ＡＤＣのＤＡＲが主に４および６に分布していることを示している。ＥＧ１２０１４−ＭＨＴ−７１の平均ＤＡＲは約５．４である。コンジュゲーション効率は約９９％である。
【０１６８】
実施例４
有機溶媒を１６．７％含有する共溶媒系中でのＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．１ｍＬのヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）（初期濃度：２．６ｍｇ／ｍＬ）を１．６μＬの２．５ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．４モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、７５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した２９．０μＬの３６３μＭリンカー−毒素ＭＨＴ−４７（９．９モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１６．７％）。５μＬの０．１Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１６９】
図４は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。ＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７の平均ＤＡＲは約３．７である。コンジュゲーション効率は約９３％である。
【０１７０】
実施例５
有機溶媒を２％含有する共溶媒系中でのＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、６０μＬのヒトＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）（初期濃度：５．７ｍｇ／ｍＬ）を１．２μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．２モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した４．６μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−４７（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約２％）。０．５μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１７１】
図５は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。ＩｇＧ１−ＭＨＴ−４７の平均ＤＡＲは約３．７である。コンジュゲーション効率は約９３％である。
【０１７２】
実施例6
５．５％の有機溶媒を含有する共溶媒系中でのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＨＴ−４７のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．３ｍＬのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）（初期濃度：１０．３ｍｇ／ｍＬ）を５．２μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．５モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した６９．１μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−４７（９．９モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約５．５％）。２０μＬの０．１Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＨＴ−４７を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１７３】
図６は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＨＴ−４７の平均ＤＡＲは約３．７である。コンジュゲーション効率は約９２％である。
【０１７４】
実施例7
水相中におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．２２ｍＬのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｒｏｃｈｅ）（初期濃度：１１．３ｍｇ／ｍＬ）を４．２μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．５モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した５５．４μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＣＣＨ−０３８（９．９モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。２μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１７５】
図７は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８の平均ＤＡＲは約４．０である。コンジュゲーション効率は約９７％である。
【０１７６】
実施例８
有機溶媒を１．６％含有する共溶媒系中でのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０２８のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．６ｍＬの  Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：４．２ｍｇ／ｍＬ）を３．８μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．２モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した３４．２μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＣＣＨ−０２８（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１．６％）。１００μＬの０．１Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０２８を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１７７】
図８は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０２８の平均ＤＡＲは約３．８である。コンジュゲーション効率は約９５％である。
【０１７８】
実施例9
有機溶媒を１．７％含有する共溶媒系中でのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０３５のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．６ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：４．３ｍｇ／ｍＬ）を３．９μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．２モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した３５．２μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＣＣＨ−０３５（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１．７％）。５０μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０３５を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１７９】
図９は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０３５の平均ＤＡＲは約３．６である。コンジュゲーション効率は約９４％である。
【０１８０】
実施例１０
有機溶媒を１．５％含有する共溶媒系中でのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０４１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．８５ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：３．８ｍｇ／ｍＬ）を４．９μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．２モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、３０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した４４．５μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＣＣＨ−０４１（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１．５％）。８０μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０４１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１８１】
図１０は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０４１の平均ＤＡＲは約３．９である。コンジュゲーション効率は約９６％である。
【０１８２】
実施例１１
有機溶媒を１．４％含有する共溶媒系中でのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＦＣＷ−０１６のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．４ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：３．５ｍｇ／ｍＬ）を４．０μＬの５ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．１モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、１００％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で調製した５．７０μＬの１０ｍＭリンカー−毒素ＦＣＷ−０１６（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（混合溶液中の有機溶媒の最終濃度は約１．４％）。１５μＬの０．１Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＦＣＷ−０１６を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１８３】
図１１は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＦＣＷ−０１６の平均ＤＡＲは約４．０である。コンジュゲーション効率は約９６％である。
【０１８４】
実施例１２
水相中におけるＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、２．０ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：４．５ｍｇ／ｍＬ）を１３．６μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．１モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１２３．２μＬの３ｍＭ  リンカー−毒素ＣＣＨ−０３８（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。２０μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１８５】
図１２は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＣＣＨ−０３８の平均ＤＡＲは約３．８である。コンジュゲーション効率は約９５％である。
【０１８６】
実施例１３
水相中におけるＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＷＨＹ−４６のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、２．３ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：４．３ｍｇ／ｍＬ）を１４．５μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．２モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１３１．５μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＷＨＹ−４６（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。２５０μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＷＨＹ−４６を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１８７】
図１３Ａは、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＷＨＹ−４６の平均ＤＡＲは約３．９である。コンジュゲーション効率は約９６％である。図１３Ｂは、ＨＭＷＳが０．１％しか生成されなかったことを示している。
【０１８８】
実施例１４
水相中におけるＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、２３．５ｍＬのＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）（Ｍｅｒｃｋ）（初期濃度：４．７ｍｇ／ｍＬ）を１５９μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．１モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１．５２ｍＬの３ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−７１（６モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。１２７μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＭＨＴ−７１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１８９】
図１４Ａは、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）−ＭＨＴ−７１の平均ＤＡＲは約３．６である。コンジュゲーション効率は約９５％である。図１４Ｂは、有意のＨＭＷＳが生成されなかったことを示している。
【０１９０】
実施例１５
水相中におけるＨＬＸ−０７−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、０．５ｍＬのＨＬＸ−０７（Ｈｅｎｌｉｘ  Ｉｎｃ．製）（初期濃度：４．４ｍｇ／ｍＬ）を３．６μＬの１０ｍＭ  ＴＣＥＰ（２．４モル当量）で、３７℃で２時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１４０μＬの７５５μＭリンカー−毒素ＭＨＴ−７１（７モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で３０分置いた（純水相）。２０μＬの０．１Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いてＨＬＸ−０７−ＭＨＴ−７１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。ＨＩＣおよびＳＥＣを用い、平均ＤＡＲおよびＨＭＷＳを決定した。
【０１９１】
図１５は、ＡＤＣのＤＡＲが主に２および４に分布していることを示している。ＨＬＸ−０７−ＭＨＴ−７１の平均ＤＡＲは約３．８である。コンジュゲーション効率は約９６％である。
【０１９２】
実施例１６
水相中における抗−ＥｐＣＡＭ−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーション
ホウ酸塩緩衝液中、６０μＬの抗−ＥｐＣＡＭ  Ａｂ（ｃｌｏｎｅ  ＥｐＡｂ３−５，  ＩｇＧ２ｂ）（Ｄｒ．Ｈａｎ−Ｃｈｕｎｇ  Ｗｕ’ｓ  ｌａｂ製）（初期濃度：３．９  ｍｇ／ｍＬ）を３．３μＬの５ｍＭ  ＴＣＥＰ（８モル当量）で、３７℃で５時間処理した。次に、ｄｄＨ２Ｏ中で調製した１０．４μＬの３ｍＭリンカー−毒素ＭＨＴ−７１（１５モル当量）を上記抗体溶液に加え、４℃で１時間置いた（純水相）。０．５μＬの０．２Ｍシステインを加えて反応を停止させた。脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＷＣＯ：４０Ｋ）を用いて抗−ＥｐＣＡＭ−ＭＨＴ−７１を精製した。溶出中は、緩衝液をＰＢＳ緩衝液（２．６７ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，１３７．９３ｍＭ  ＮａＣｌ，８．０６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ）に変えた。抗−ＥｐＣＡＭ−ＭＨＴ−７１のコンジュゲーションプロファイルをＨＩＣにより分析した。コンジュゲートしていない（Ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗−ＥｐＣＡＭ  Ａｂのピークが消失したが、これは抗−ＥｐＣＡＭ抗体のすべてがリンカー−毒素ＭＨＴ−７１にコンジュゲートしたことを示している。
【０１９３】
図１６Ａは、コンジュゲートしていない抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂのＨＩＣプロファイルを示し、図１６Ｂは、リンカー−毒素ＭＨＴ−７１とコンジュゲートした抗−ＥｐＣＡＭ  ＡｂのＨＩＣプロファイルを示している。
【０１９４】
＜熱ストレス試験＞
実施例１７
ＰＢＳ中の５００μＬの３ｍｇ／ｍＬ  Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥ（市販のリンカー−毒素ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（Ｌ１−ＭＭＡＥ）；Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−８７、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１、またはＥｒｂｉｔｕｘ−ＷＨＹ−４６を、４０℃の水浴でインキュベートし、０、１および２週目にサンプリングし、ＳＥＣ分析を行った。Ｙａｒｒａ  ３μｍ  ＳＥＣ−３０００（３００ｘ７．８ｍｍ）カラムを備えるＷａｔｅｒｓ  ＰＤＡ  ９９６  ＨＰＬＣを使用し、抗体モノマーと凝集生成物をサイズによって分離した。移動相を、０．０２０Ｍリン酸カリウム、０．０２５Ｍ塩化カリウム、およびイソプロパノール５％（ｖ／ｖ）で構成し、ｐＨ６．９５とした。３０μＬの試料を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入し、イソクラティック条件下で分離した。２８０ｎｍでの吸光度を検出した。メインピークより前に溶出したすべての種（species）を合わせ、高分子量種（ＨＭＷＳ）とする。
【０１９５】
図１７Ａは、そのリンカーが糖アミノ酸ユニットを含むＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１およびＥｒｂｉｔｕｘ−ＷＨＹ−４６が、そのリンカーがいかなる糖アミノ酸ユニットも含まないＥｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥおよびＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−８７に比べ、ＨＭＷＳの割合が低いことを示している。よって、この実験により、糖アミノ酸ユニットを有するリンカーは、親水性を高めるのみならず、ＡＤＣの熱安定性を著しく高めるということが実証された。
【０１９６】
実施例１８
ＰＢＳ中の５００μＬの３ｍｇ／ｍＬＥｒｂｉｔｕｘ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥ（市販のリンカー−毒素ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（Ｌ１−ＭＭＡＥ）；Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−８７、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１、およびＥｒｂｉｔｕｘ−ＷＨＹ−４６を、５０℃の水浴でインキュベートした。次いで、抗体およびＡＤＣを０、４、７、および２４時間の時点でサンプリングし、ＳＥＣ分析を行った。Ｙａｒｒａ  ３μｍ  ＳＥＣ−３０００（３００ｘ７．８ｍｍ）カラムを備えるＷａｔｅｒｓ  ＰＤＡ  ９９６  ＨＰＬＣを使用し、抗体モノマーと凝集生成物をサイズによって分離した。移動相を、０．０２０Ｍリン酸カリウム、０．０２５Ｍ塩化カリウム、およびイソプロパノール５％（ｖ／ｖ）で構成し、ｐＨ６．９５とした。３０μＬの試料を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでカラムに注入し、イソクラティック条件下で分離した。２８０ｎｍでの吸光度を検出した。メインピークより前に溶出したすべての種（species）をまとめて、高分子量種（ＨＭＷＳ）とする。
【０１９７】
図１７Ｂは、そのリンカーが糖アミノ酸ユニットを含むＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１およびＥｒｂｉｔｕｘ−ＷＨＹ−４６が、そのリンカーがいかなる糖アミノ酸ユニットも含まないＥｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥおよびＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−８７に比べ、ＨＭＷＳの割合が低いことを示している。よって、この実験により、糖アミノ酸ユニットを有するリンカーは、その親水性を高めるのみならず、ＡＤＣの熱安定性をも著しく高めるということが実証された。
【０１９８】
＜貯蔵試験＞
実施例１９
水相中でコンジュゲートしたＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１を脱塩カラムで精製した。溶出中は、緩衝液を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、６．３％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、ｐＨ６．０（ＳＧＮ）に変えた。Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１を１００μＬ／チューブずつに分け、４℃で保管して、貯蔵安定性試験を行った。Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１を毎週または隔週サンプリングし、１７週間にわたり抗体濃度、ＨＩＣおよびＳＥＣの分析を行った。
【０１９９】
図１８は、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１の抗体濃度が４か月にわたって有意な変化がなく（＜１０％）、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１の平均ＤＡＲが４か月にわたって有意な変化がなく（＜５％）、かつＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１のＨＭＷＳ生成が４か月後も依然非常に低かった（≦０．２％）ことを示している。
【０２００】
＜力価試験＞
実施例２０
ＥＧＦＲ発現頭頸部癌細胞株ＦａＤｕとＥＧＦＲ非発現頭頸部癌細胞株ＲＰＭＩ２６５０とを、９種類のグリコペプチドリンカーを含有するＡＤＣで処置し、それぞれ異なるＥＧＦＲ発現腫瘍細胞におけるそれらの選択毒性を分析した。
【０２０１】
ＦａＤｕ細胞およびＲＰＭＩ細胞を、２．５×１０３および４×１０３細胞／ウェルの密度でＣｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＢＩＮＤ  ９６ウェルプレート内にそれぞれ播種した。３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした後、古い培地を除き、ＡＤＣ含有培地を、ＦａＤｕ細胞には１０−７から１０−１３  Ｍまでの濃度で、ＲＰＭＩ細胞には１０−６から１０−１２  Ｍまでの濃度で細胞に加えた（対数連続希釈）。次いで、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで１２０時間インキュベートした。１２０時間インキュベートした後、細胞を一度リンスし、ＭＴＴ法で細胞生存率をアッセイした。その古い培地を吸引し、１００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ含有培地を各ウェル中に加えた。４時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬を除去し、その沈殿をＤＭＳＯ中に溶解した。細胞の測光強度（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を吸収波長５７０ｎｍのマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。細胞生存率は次の等式により計算した。
【０２０２】
（数１）
細胞生存率（％）＝（Ｉｎｓ−Ｉｎｂ）／（Ｉｎｃ−Ｉｎｂ）×１００％
この等式中、「Ｉｎｓ」は所定の毒素とインキュベートした細胞の測光強度であり、「Ｉｎｂ」は細胞が播種されていないブランクウェルの強度であり、「Ｉｎｃ」は培地のみでインキュベートした細胞の強度である（陽性対照）。
【０２０３】
各薬物濃度（ｎ＝６）で１２０時間毒素に曝した後のＦａＤｕ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生存率を記録し、Ｏｒｉｇｉｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅのＳｉｇｍｏｉｄａｌ  ｍｏｄｅｌを用い、データをフィットさせてＩＣ５０値を得た。
【０２０４】
表３は、ＥＧＦＲ発現頭頸部癌細胞株ＦａＤｕ細胞における９種類のグリコペプチドリンカーを含有するＡＤＣのＩＣ５０値が、０．５ｎＭよりも著しく低いことを示している。ＦａＤｕ細胞における９種類のグリコペプチドリンカーを含有するＡＤＣの力価は非常に高いものである。Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−９３を除く、他８種類のグリコペプチドリンカーを含有するＡＤＣは、腫瘍細胞での選択毒性が高い。選択毒性は、ＥＧＦＲ発現頭頸部癌細胞株ＦａＤｕ細胞において、ＥＧＦＲ非発現頭頸部癌細胞株ＲＰＭＩ２６５０細胞の２０００倍超である。選択毒性は、市販のリンカー−毒素ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）にコンジュゲートされたＥｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥの選択毒性よりも優れており（約１２４６倍）、かつリンカーがいかなる糖アミノ酸ユニットを含まないＥｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−８７の選択毒性作用（約３６６倍）よりも優れている。
【０２０５】
【表３】
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【０２０６】
＜腫瘍増殖抑制試験＞
実施例２１
１×１０６のＦａＤｕ細胞を０日目にＣ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍のサイズを（長さ×幅×幅×１／２）（ｍｍ３）で計算して記録した。８日目、平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ３となったとき、賦形剤（ＤＰＢＳ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−４７  ５ｍｇ／ｋｇ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１  ５ｍｇ／ｋｇ  、Ｅｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥ（市販のリンカー−毒素ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（Ｌ１−ＭＭＡＥ）；Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）５ｍｇ／ｋｇ、ＡＰＥＡ−ＡＦ（市販のＡＦ；Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）０．１ｍｇ／ｋｇ、ＭＭＡＥ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）０．１ｍｇ／ｋｇを１回静脈注射し（１０ｍＬ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ．注入量）、薬力学実験（pharmacodynamic experiment）を行った（ｎ＝６）。マウスの腫瘍増殖および体重を週に２回ずつ観察した。腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）の計算式は、ＴＧＩ（％）＝［１−（Δ薬物処置群の腫瘍体積／Δ賦形剤群の腫瘍体積］×１００である。実験期間中、腫瘍がマウスの体重の１０％より大きくなるか、腫瘍体積が１５００ｍｍ３より大きくなるか、または他の副作用が同時に起こった場合、人道的配慮より、ＣＯ２を用いてマウスを屠殺した。
【０２０７】
薬物（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＡＤＣ、ＡＰＥＡ−ＡＦ、およびＭＭＡＥ）による処置の８日後、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−４７、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１、およびＥｒｂｉｒｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥ群の腫瘍増殖は著しく抑制された。２９日目、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−４７、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１およびＥｒｂｉｒｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥ群のＴＧＩはそれぞれ１０６±１％、１０６±１％、および１０５±８％であり、一方、Ｅｒｂｉｔｕｘ群のＴＧＩは２７±１４％であった（表４参照）。図１９は、３６日目にＥｒｂｉｔｕｘ−Ｌ１−ＭＭＡＥ群で腫瘍の再発が観察されたことを示している。５４〜６１日目に  Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−４７群で腫瘍の再発が観察された。一方、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＭＨＴ−７１群では１１７日目まで腫瘍の再発は観察されなかった。
【０２０８】
【表４】
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【０２０９】
図２０は、薬物投与（Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｅｒｂｉｔｕｘ−ＡＤＣ、ＡＰＥＡ−ＡＦ、およびＭＭＡＥ）後に体重低下または他の著しく異常な臨床症状が生じなかったことを示している。
【０２１０】
【表５】
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【０２１１】
本開示の実施形態に様々な改変および変更を加え得るということは、当業者には明らかであろう。明細書および実施例は単に例示として見なされるように意図されており、本開示の真の範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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