(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−ケトステロイドの、対応する７−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であって、
該酵素が、配列番号２の位置１７に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
位置１７の変異が、Ｔ１７Ｘ２（式中、Ｘ２はＦ，Ａ，ＩまたはＳである）であり、そして、
該酵素が、配列番号２を有する７β−ＨＳＤＨと比較して以下のａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）から選択される１以上の特性プロファイルを示す、７β−ＨＳＤＨ：
ａ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の酵素的還元における、ＤＨＣＡに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ｂ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたＤＨＣＡの酵素的還元における、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ｃ）低下したＤＨＣＡによる基質阻害；
ｄ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する改変された補因子特異性。
【請求項２】
７−ケトステロイドの、対応する７−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であって、
該酵素が、配列番号２の位置６４に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
位置６４の変異が、変異Ｒ６４Ｘ１（式中、Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＩまたはＹである）であり、そして、
該酵素が、配列番号２を有する７β−ＨＳＤＨと比較して以下の特性プロファイルｂ）ならびに任意に以下のａ）、ｃ）およびｄ）から選択される１以上の特性プロファイルを示す、７β−ＨＳＤＨ：
ｂ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたＤＨＣＡの酵素的還元における、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ａ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の酵素的還元における、ＤＨＣＡに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ｃ）低下したＤＨＣＡによる基質阻害；
ｄ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する改変された補因子特異性。
【請求項３】
７−ケトステロイドの、対応する７−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であって、
該酵素が、配列番号２の位置６４に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
さらに少なくとも１つの変異を配列番号２の位置３６〜４２の配列モチーフＶＭＶＧＲＲＥに、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列モチーフに有し、かつ、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
位置６４の変異が、変異Ｒ６４Ｘ１（式中、Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＩまたはＹである）であり、そして、
該酵素が、配列番号２を有する７β−ＨＳＤＨと比較して以下の特性プロファイルｂ）ならびに任意に以下のａ）、ｃ）およびｄ）から選択される１以上の特性プロファイルを示す、７β−ＨＳＤＨ：
ｂ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたＤＨＣＡの酵素的還元における、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ａ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の酵素的還元における、ＤＨＣＡに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；
ｃ）低下したＤＨＣＡによる基質阻害；
ｄ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する改変された補因子特異性。
【請求項４】
さらに、アミノ酸配列の変異Ｇ３９Ｘ３（式中、Ｘ３はグリシン（Ｇ）以外のアミノ酸残基である）を有する、請求項３に記載の７β−ＨＳＤＨ。
【請求項５】
二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３の中から選択される、請求項３または４に記載の７β−ＨＳＤＨ：
Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮであり；そして、
Ｘ３は、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲである。
【請求項６】
二重の変異体が以下の中から選択される、請求項５に記載の７β−ＨＳＤＨ：
（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｄ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｔ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｌ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｓ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｐ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｖ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｅ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｄ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｔ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｓ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｌ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｐ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｖ）。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の７β−ＨＳＤＨをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項８】
少なくとも１つの調節配列の制御下で、少なくとも１つの請求項７に記載のヌクレオチド配列を含む発現カセット。
【請求項９】
少なくとも１つの請求項８に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つの請求項７に記載のヌクレオチド配列または少なくとも１つの請求項８に記載の発現カセットまたは少なくとも１つの請求項９に記載の発現ベクターを有する、組換え微生物。
【請求項１１】
補因子の再生に適切なヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）およびデヒドロゲナーゼの中から選択される少なくとも１つのさらなる酵素をコードする配列を任意に追加的に有する、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
さらなるＨＳＨＤが３α−ＨＳＤＨから選択され；そして、
デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰＨ再生酵素およびＮＡＤＨ再生酵素の中から選択される、請求項１１に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
ＮＡＤＰＨ再生酵素が、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＰＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）およびＮＡＤＰＨ再生ホスファイトデヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）の中から選択され、
ＮＡＤＨ再生酵素が、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）およびＮＡＤＨ再生ホスファイトデヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）の中から選択される、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
７α−ＨＳＤＨノックアウト株である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
７β−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の７β−ＨＳＤＨの存在下で、または、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の７β−ＨＳＤＨを発現する組換え微生物の存在下で、対応する７−ケトステロイドが還元され、任意に少なくとも１つの形成された還元生成物が反応混合物から単離される方法。
【請求項１６】
７−ケトステロイドが、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）、７−ケト−リトコール酸（７−ケト−ＬＣＡ）、７，１２−ジケト−リトコール酸（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）、および、これらの誘導体の中から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
還元が、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨの存在下で、特にＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨの消費によって行われる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）消費されたＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰＨ再生酵素とのカップリングによって再生され、または、
（ｂ）消費されたＮＡＤＨが、ＮＡＤＨ再生酵素とのカップリングによって再生され、または、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方が実施される、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＮＡＤＰＨ再生酵素が以下から選択される請求項１８に記載の方法：
ａ）ＦＤＨ（少なくともギ酸のＣＯ２への酵素的酸化を触媒するＮＡＤ＋依存性ＦＤＨの変異体を含み、該変異体は非変異の酵素と比較して補因子としてＮＡＤＰ＋を追加的に受け入れる）；および、
ｂ）ＧＤＨ。
【請求項２０】
式（１）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって：
【化１】
0006582040.tif 000033
［式中、Ｒはアルキル、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルを表すか、または、基−ＣＯ２Ｒが酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。Ｒ１とＲ２は互いに独立してアルキル基を表す。］；
ａ）任意に、式（２）のコール酸（ＣＡ）を化学的に酸化して式（３）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）とし；
【化２】
0006582040.tif 000034
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
【化３】
0006582040.tif 000035
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］；
ｂ）少なくとも１つの請求項１〜６のいずれか一項に記載の７β−ＨＳＤＨ変異体の存在下および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下で、ＤＨＣＡを還元して対応する式（５）の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）とし；
【化４】
0006582040.tif 000036
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］；
特に、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下および消費下で、続いて、
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的に還元してＵＤＣＡとし；そして、
ｄ）任意に、さらに反応生成物を精製する、
製造方法。
【請求項２１】
少なくとも工程ｂ）が、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物の存在下で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｂ）が同一または異なる補因子の再生システムと一体である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
式（１）のＵＤＣＡの製造方法であって：
【化５】
0006582040.tif 000037
［式中、Ｒはアルキル、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルを表すか、または、基−ＣＯ２Ｒが、上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］；
ａ）任意に、式（２）のコール酸（ＣＡ）を化学的に酸化して式（３）のＤＨＣＡとし；
【化６】
0006582040.tif 000038
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
【化７】
0006582040.tif 000039
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］；
ｂ）少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下で、ＤＨＣＡを還元して対応する式（５）の１２−ケトＵＤＣＡとし；
【化８】
0006582040.tif 000040
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］；
特に、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下および消費下で、続いて、
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的に還元してＵＤＣＡとし；そして、
ｄ）任意に、さらに反応生成物を精製し；
工程ｂ）の変換が、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組換え微生物の存在下で行われる、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の７−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ変異体、これらの酵素変異体をコードする配列、酵素変異体の調製方法、およびコール酸化合物の酵素的変換、特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造におけるこれらの使用に関する。本発明の対象は、酵素変異体を用いたＵＤＣＡの新規な合成方法および組換え多重改変微生物を用いたＵＤＣＡの製造である。
【背景技術】
【０００２】
胆汁酸は、脂肪、脂肪酸および疎水性ビタミンの消化および吸収に必要な生体分子である。ヒトでは少量しかみられない胆汁酸は、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）である。それは、最近、コレステロール含有胆石の溶解において、重大な治療的重要性を獲得している。この化合物は化学的または酵素的工程によってトン単位で工業的に生産される。ＵＤＣＡを合成するための重要な前駆体は、１２−ケトウルソデオキシコール酸であり、これはウォルフ・キッシュナー還元によってＵＤＣＡに変換することができる。文献に記載されている１２−ケトウルソデオキシコール酸の合成経路は、コール酸（３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸）から始まり、７α−および１２β−ＨＳＤＨによって触媒される２つの酸化段階によって調製され、１つの還元段階で、７β−ＨＳＤＨにより触媒される（非特許文献１；非特許文献２）。さらなる経路は、７−ケトイソ酪酸から開始し、これは７−ケト基を立体選択的に還元することによってＵＤＣＡに変換することができる。この工程もまた、７β−ＨＳＤＨによって触媒される酵素触媒作用により有利に行われる（非特許文献３；非特許文献４）。さらに有利な合成経路は、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）で始まり、これは２回の還元工程によって１２−ケトウルソデオキシコール酸に変換することができる。これらの２つの工程は、２つの立体選択的ＨＳＤＨ（３α−および７β−ＨＳＤＨ）によって触媒できる（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００３】
Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来の酵素は、非常に好適な７β−ＨＳＤＨであることが証明されている。現在、Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来のこの酵素の遺伝子配列は知られているので、最初に、酵素をクローニングした後で組換えにより利用できる。次に、タンパク質工学的方法によってこの酵素の変異体を作製することが可能であり、したがって任意に、より有利な酵素変異体を見出すことが可能である。
【０００４】
とりわけ、胆石疾患の治療のための薬剤として、活性物質のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）およびそのジアステレオマーのケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）が長年にわたり使用されている。２つの化合物は、Ｃ原子７（ＵＤＣＡ：β立体配置、ＣＤＣＡ：α立体配置）上のヒドロキシル基の立体配置のみが異なる。ＵＤＣＡを調製するための様々な工程が先行技術に記載されており、純粋に化学的手段によって、または化学的工程と酵素的工程の手段の組み合わせとして、これらの工程は行われる。出発点はいずれの場合もコール酸（ＣＡ）、またはコール酸から出発して調製されたＣＤＣＡである。
【０００５】
従って、ＵＤＣＡの調製の従来の化学的方法は、以下のように図式的に示される：
【０００６】
【表１】
0006582040.tif 000002
【０００７】
とりわけ重大な欠点は、以下の通りである：化学的酸化は選択的なものではないため、カルボキシル基ならびに３α−および７α−ヒドロキシ基は、エステル化によって保護されなければならない。
【０００８】
酵素１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替的な化学的／酵素的工程は、以下のように示すことができ、例えば出願人のＰＣＴ出願（特許文献１）に記載されている。
【０００９】
【表２】
0006582040.tif 000003
【００１０】
ここで、１２α−ＨＳＤＨはＣＡを選択的に酸化して１２−ケト−ＣＤＣＡとする。従来の化学的方法で必要とされている２つの保護工程は、ここでは省くことができる。
【００１１】
さらに、非特許文献７は、代替的な酵素的／化学的工程を開示し、それは以下のように図式的に示すことができる。
【００１２】
【表３】
0006582040.tif 000004
【００１３】
ＣＡは、最初にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５２８５由来の７α−ＨＳＤＨ酵素（非特許文献８）および１２α−ＨＳＤＨによって酸化され、７，１２−ジケト−ＬＣＡとなる。これらの２つの酵素は、いずれの場合もＮＡＤＨ依存性である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７５５５（ＤＳＭ  ５９９）由来の７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）（非特許文献９）による還元後、１２−ケト−ＵＤＣＡが生成する。ウォルフ・キッシュナー還元により最終製品が得られる。この方法の欠点は、触媒反応の平衡状態のために完全な転化が不可能であり、反応の第１段階で、２つの異なる酵素を使用しなければならず、それにより工程がより高価になることである。補因子の再生のために、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ；ＮＡＤ＋の再生用）およびグルコース脱水素酵素（ＧｌｃＤＨまたはＧＤＨ；ＮＡＤＰＨの再生用）を用いる。その反応に使用される補因子再生の欠点は、生成する副生成物のみを反応混合物から除去することが非常に困難であるため、反応平衡に正の影響を与えることができず、出発物質の不完全な変換をもたらすことである。
【００１４】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６（ＤＳＭ  ３９７９；以前のＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株由来の７β−ＨＳＤＨは、ＨｉｒａｎｏおよびＭａｓｕｄａによって１９８２年に記載されている（非特許文献１０）。その酵素の配列情報は開示されていない。ゲルろ過によって測定された分子量は４５０００Ｄａであった（非特許文献１０の第１０５９頁左欄参照）。さらに、７β−ヒドロキシ基への７−オキソ基の還元は前記酵素については観察されなかった（非特許文献１０の第１０６１頁第１段落の考察参照）。従って、当業者は、非特許文献１０に記載されている酵素は、３，１２−ジケト−７β−ＣＡを得るための、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の７位での還元を触媒することには適していないことを理解する。
【００１５】
出願人の以前の国際特許出願である特許文献２は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６由来の新規７β−ＨＳＤＨを記載しており、とりわけ、それは約２８〜３２ｋＤａの分子量（ＳＤＳゲル電気泳動により測定）、約５３〜６０ｋＤａの分子量（特にＳＤＳを含まない非変性条件下のゲル濾過により測定）および７−ケト−ＬＰＡの７−カルボニル基を立体選択的に還元して７β−７β−ヒドロキシ基とする能力を有している。
【００１６】
さらに、特許文献２はＵＤＣＡの製造方法を提供し、これは図式的に以下のように示すことができる：
【００１７】
【表４】
0006582040.tif 000005
【００１８】
従って、ＣＡは、従来の化学経路を介して簡単な方法で酸化される。ＤＨＣＡは、酵素ペアである７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨによって個々に１つずつまたは１つのポットで還元され、１２−ケト−ＵＤＣＡとなる。ウォルフ・キッシュナー還元と組み合わせることにより、ＣＡから始めてわずか３工程でＵＤＣＡを合成することができる。７β−ＨＳＤＨ酵素は補因子ＮＡＤＰＨに依存するが、３α−ＨＳＤＨ酵素は補因子ＮＡＤＨを必要とする。補因子の再生を単純化することができるので、同じ補因子に依存する酵素ペアまたは延長依存（例えば、補因子ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨへの）を有する酵素ペアの利用が有利であろう。
【００１９】
特許文献３は、Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓの配列のアミノ酸残基３６〜４２の配列領域におけるＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来の新規７β−ＨＳＤＨ変異体およびＵＤＣＡの調製のための生体触媒工程、特に新規の全細胞工程を記載している。
【００２０】
特許文献４は、望ましくない７α−ＨＳＤＨ酵素活性を標的化した方法でスイッチオフすることが可能であるため、ＵＤＣＡの調製に特に適した新規のノックアウト株を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０号
【特許文献２】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６号
【特許文献３】国際公開第２０１２／０８０５０４号
【特許文献４】国際公開第２０１１／１４７９５７号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｂｏｖａｒａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８：３０５−３０８
【非特許文献２】Ｍｏｎｔｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｎｅ−ｐｏｔ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ：Ｓｕｂｔｌｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｒｕｌｅ  ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｒｏｗ．Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３５１：１３０３−１３１１
【非特許文献３】Ｈｉｇａｓｈｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ７−ｋｅｔｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  １４：４１７−４２４
【非特許文献４】Ｌｉｕ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＮＡＤＰＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９０：１２７−１３５
【非特許文献５】Ｃａｒｒｅａ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅａｃｔｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３１−１１３５
【非特許文献６】Ｌｉｕ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｈｙｄｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９７：６３３−６３９
【非特許文献７】Ｍｏｎｔｉ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｅ−Ｐｏｔ  Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １２−Ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｓｕｂｔｌｅ  Ｃｏｆａｃｔｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  Ｒｕｌｅ  ｔｈｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ  ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｒｏｗ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２００９
【非特許文献８】Ｚｈｕ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  −ｋｅｔｏｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ７−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００６．６２（１８）：ｐ．４５３５−４５３９
【非特許文献９】ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｉ．Ａ．  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｒｏａｃｈ，Ｂｉｌｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ７  ａｌｐｈａ−  ａｎｄ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｂｓｏｎｕｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１９８１．６６５（２）：ｐ．２６２−９
【非特許文献１０】Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎ．Ｍａｓｕｄａ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ  ａｎｄ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８２．４３（５）：ｐ．１０５７−６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の課題は、さらに改良された７β−ＨＳＤＨの提供である。特に、３，１２−ジケト−７β−ＣＡを得るために、ＤＨＣＡの７位の立体特異的還元によるＵＤＣＡの酵素または微生物の調製にさらに有利に使用することができる酵素変異体を提供すること、特に、それは、基質および／または補因子の活性が改善され、および／または基質阻害の低減および／または補因子の利用の変化（修飾特異性または依存性の拡大の増加）を有することが意図された。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
驚くべきことに、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属の好気性細菌、特にＣｏｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株由来の７β−ＨＳＤＨの改良された変異体を生成および特徴づけること、ならびに、それらをコール酸化合物の変換、特にＵＤＣＡの生成に使用することにより、上記の問題を解決することができた。
【００２５】
一方、Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ由来のこの酵素の遺伝子配列は既知であるため、第一に、この酵素をクローン化した後に組換え利用できるようにし、第二に、タンパク質工学的方法でこの酵素の変異体の作製し、そこで、より有利な酵素変異体を任意に見出す可能性がある。
【００２６】
構造的および相同性態様に基づき、本発明では補酵素結合または基質認識に関与する配列領域を定義することが試みられている。これは、変異誘発によってこれらの領域のアミノ酸を標的化した方法で改変し、そのような構造改変によって酵素特性を改変する可能性をもたらす。すなわち、Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓの７β−ＨＳＤＨの場合には、「ロスマンフォールド」として知られているものは、約１０〜６４前後のアミノ酸の領域において補酵素結合に関与する。本発明では、今回、特に、酵素がＮＡＤＰＨの代わりにより実用的なＮＡＤＨを受容するように、この補酵素結合領域中のアミノ酸を改変することを試みた。
驚くべきことに、６４位のアミノ酸アルギニンをアスパラギン酸に置換する試みの間に、この７β−ＨＳＤＨ変異体が顕著により高い活性を有することが分かった。このことは、その後も６４位に変異を有する複数の別の変異体が野生型酵素よりも高い活性を示す限りにおいて確認された。さらに、均一に精製した酵素変異体を、対応して精製した実証された野生型酵素と比較すると、驚くべきことに、顕著により高い特異的酵素活性を示した。
【００２７】
特に、その改善された活性は、変異体７β−ＨＳＤＨ−Ｒ６４Ｅ、７β−ＨＳＤＨ−Ｒ６４Ｄおよび７β−ＨＳＤＨ−Ｒ６４Ｄの特異的活性（換言するとタンパク量に基づく活性値）の増加によって明確に確認できる。発現した７β−ＨＳＤＨ−Ｒ６４Ｅは、検討対象である７β−ＨＳＤＨのタンパク質配列の６４位のアルギニン（Ｒ）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されたことを意味する。技術用語７β−ＨＳＤＨ−Ｒ６４Ｄは、同様に「６４位のアルギニンがアスパラギン酸（Ｄ）と置換された」と読まれる。Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓから得ることができる７β−ＨＳＤＨは、野生型酵素と呼ばれる。
【００２８】
さらに、上記課題は、本明細書中に記載する７β−ＨＳＤＨ変異体および３α−ＨＳＤＨによって触媒される２つの還元的部分工程（いずれの配列においても同時または交互に起こる）を経て、ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的変換を含む生体触媒（微生物および／または酵素）工程と、両者の還元的部分工程で消費された補因子を再生するデヒドロゲナーゼを用いることによる補因子再生の提供により解決される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】図１ａは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ７β−ＨＳＤＨ（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【図１ｂ】図１ｂは図１ａのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す
【図１ｃ】図１ｃはＣｏｍｕｎｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示す。
【図１ｄ】図１ｄは図１ｃのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図２ａ】図２ａは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示す；Ｃ末端が、Ｈｉｓ−タグ配列ＬＥＨＨＨＨＨＨにより延長されている。
【図２ｂ】図２ｂは、それに由来する変異体７β−ＨＳＤＨ［Ｒ６４Ｅ］を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、それに由来する変異体７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ］を示す。
【図２ｄ】図２ｄは、それに由来する変異体７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］を示す。
【図３】図３は、グルタミン酸変異体［Ｒ６４Ｅ］の基質ＤＨＣＡ（左図）および補酵素ＮＡＤＰＨ（右図）に対する特異的酵素活性のプロットを示す。
【図４】図４は、セリン変異体の基質ＤＨＣＡ（左図）および補酵素ＮＡＤＰＨ（右図）に対する特異的酵素活性のプロットを示す。
【図５】図５は、７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］変異体（ＬＢ培地中、振とうフラスコ発酵において発現後）のＳＤＳゲルを示す。無細胞粗抽出物および精製後の酵素を用いた。７β−ＨＳＤＨ変異体の大きさは約２９．９ｋＤａである。約１０μｇのタンパク質を用いた。
【図６】図６は、二重変異体［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］の基質ＤＨＣＡ（左図）および補酵素ＮＡＤＰＨ（右図）に対する特異的酵素活性のプロットを示す。
【図７】図７は、本発明におけるいくつかの変異体（逆三角形（▼）：７β−ＨＳＤＨ［Ｒ６４Ｅ］；四角形（■）：７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ］；三角形（▲）：７β−ＨＳＤＨ）［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］と野生型（円形（●））の動力学の比較を示す
【発明を実施するための形態】
【００３０】
特に、本発明は以下の特定の実施形態に関する：
１．  ７−ケトステロイドから対応する７−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元を少なくとも触媒する酵素である７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）であって、
該酵素は、配列番号２の酵素または当該配列を含む酵素［例えば、配列番号３（すなわち、１つのヒスチジンタグまたはヒスチジンアンカー配列によりＮ末端が伸長した配列番号２）を含む酵素］由来であり、
該酵素は、配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）の位置１７および／または６４に、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列位置に変異を有し、かつ、配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９または９９．５％）の配列同一性を有する。
【００３１】
２．  ７−ケトステロイドから対応する７−ヒドロキシステロイドへの立体特異的酵素還元をを少なくとも触媒する酵素である７β−ＨＳＤＨであって、
配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）のアミノ酸配列の変異によって修飾されたアミノ酸配列を有し、
該アミノ酸配列の変異が、（ａ）Ｒ６４Ｘ１および／または（ｂ）Ｔ１７Ｘ２を含む単一または複数の変異の中から選択され、
Ｘ１は、アルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸残基、特にタンパク質原性アミノ酸残基、特に任意の特異的活性を増加させるおよび／または基質阻害を減少させるおよび／または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸であり；そして、
Ｘ２はトレオニン（Ｔ）以外のタンパク質原性アミノ酸残基、特に任意の特異的活性を増加させるおよび／または基質阻害を減少させるおよび／または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸であり；
変異した（すなわち、修飾された）アミノ酸配列が、配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）と８０％以上１００％未満（例えば、８５，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９または９９．５％）、好ましくは少なくとも８５％、特に少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００３２】
３．  配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）の位置３６〜４２、特に位置３９の配列モチーフＶＭＶＧＲＲＥに、または、当該配列に由来するアミノ酸配列の対応する配列モチーフに、少なくとも１つの変異をさらに有し、かつ、配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）と少なくとも８０％（例えば、８５，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９または９９．５％）の配列同一性を有する、実施形態１または２の７β−ＨＳＤＨ。
【００３３】
４．  さらに、アミノ酸配列の変異（ｃ）Ｇ３９Ｘ３を有する、実施形態３の７β−ＨＳＤＨ：
Ｘ３は、グリシン（Ｇ）以外のアミノ酸残基、特にタンパク質原性アミノ酸残基、特に任意の特異的活性を増加させるおよび／または基質阻害を減少させるおよび／または補因子利用もしくは補因子依存性を改変するアミノ酸、特に天然アミノ酸である。
【００３４】
５．  （ａ）単一の変異体Ｒ６４Ｘ１およびＴ１７Ｘ２と（ｂ）二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３から選択される、上記実施形態の１つである７β−ＨＳＤＨ：
Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶであり；
Ｘ２は、Ｆ、Ａ、ＩまたはＳであり；
Ｘ３は、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、特にＳまたはＡである。
【００３５】
適切な単一の変異体の非限定的な例は、下記を含む：
Ｒ６４Ａ、Ｒ６４Ｓ、Ｒ６４Ｄ、Ｒ６４Ｖ、Ｒ６４Ｔ、Ｒ６４Ｐ、Ｒ６４Ｎ、Ｒ６４Ｅ、Ｒ６４Ｑ、Ｒ６４Ｈ、Ｒ６４ＲＬ、Ｒ６４Ｋ、Ｒ６４Ｃ、Ｒ６４Ｇ、Ｒ６４Ｉ、Ｒ６４Ｙ、Ｒ６４ＦおよびＲ６４Ｗ、ならびに、Ｔ１７Ｆ、Ｔ１７Ａ、Ｔ１７Ｉ、Ｔ１７Ｓ。
【００３６】
適切な二重の変異体の非限定的な例は、下記を含む：
（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｄ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｔ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｌ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｓ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｐ）；（Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｖ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｅ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｄ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｔ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｓ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｌ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｐ）；（Ｇ３９Ａ／Ｒ６４Ｖ）。
【００３７】
単一および二重の変異について上述したことは、特に配列番号２および３に適用される。
【００３８】
６．  配列番号２（もしくは、例えば配列番号３）を有する非変異の７β−ＨＳＤＨと比較して、以下の特性または以下の特性プロファイルの少なくとも１つを示す、上記実施形態の１つである７β−ＨＳＤＨ：
ａ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、特にＮＡＤＰＨを用いたデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の酵素的還元における、ＤＨＣＡに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；例えば、補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、特にＮＡＤＰＨの存在下で、非変異の酵素と比較して特異的活性（Ｕ／ｍｇ）が、少なくとも１，５，１０，５０または１００％増加するか、特に少なくとも１倍、特に２〜１００倍または３〜２０倍または５〜１０倍増加している。
ｂ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、特にＮＡＤＰＨを用いたＤＨＣＡの酵素的還元における、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、特にＮＡＤＰＨに対する増加した特異的活性（Ｖｍａｘ［Ｕ／ｍｇ］）；例えば、補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、特にＮＡＤＰＨの存在下で、非変異の酵素と比較して特異的活性（Ｕ／ｍｇ）が、少なくとも１，５または１０％増加するか、特に少なくとも１倍、特に２〜１０倍増加している。
ｃ）低下したＤＨＣＡによる基質阻害、例えば、１ｍＭ以上、例えば１〜２００ｍＭ、２〜１５０ｍＭ、２．５〜１００ｍＭの範囲のＫｉ値；
ｄ）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに対する改変された補因子特異性、例えば広範な特異性、すなわち以前は使用されていない追加の補因子、特にＮＡＤＰＨの使用；
ｅ）これらの特性ａ）〜ｄ）は、個々にまたは任意の組み合わせで存在することができる。
【００３９】
さらに特定の実施形態は、配列番号２もしくは配列番号３または当該配列に由来する配列を有する７β−ＨＳＤＨ変異体であって、野生型配列と少なくとも８０％または少なくとも８５％、特に少なくとも９０％の配列同一性を有し、上記特性ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の少なくとも１つを有する７β−ＨＳＤＨ変異体に関する。
【００４０】
挙げることができる、さらなる例は下記である：
（１）少なくとも上記特性ａ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（２）少なくとも上記特性ｂ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（３）少なくとも上記特性ｃ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（４）少なくとも上記特性ｄ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（５）少なくとも上記特性ａ）とｂ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（６）少なくとも上記特性ａ）とｃ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（７）少なくとも上記特性ａ）とｄ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（８）少なくとも上記特性ｂ）とｃ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（９）少なくとも上記特性ｂ）とｄ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
（１０）少なくとも上記特性ａ）〜ｄ）を有する、単一の変異体Ｒ６４Ｘ１（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、特に好ましくはＥである）が、例として挙げられる。
【００４１】
（１１）少なくとも上記特性ａ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１２）少なくとも上記特性ｂ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１３）少なくとも上記特性ｃ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１４）少なくとも上記特性ｄ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１５）少なくとも上記特性ａ）とｂ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１６）少なくとも上記特性ａ）とｃ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１７）少なくとも上記特性ａ）とｄ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１８）少なくとも上記特性ｂ）とｃ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（１９）少なくとも上記特性ｂ）とｄ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
（２０）少なくとも上記特性ａ）〜ｄ）を有する、単一の変異体Ｔ１７Ｘ２（Ｘ２は、Ｔ以外のアミノ酸残基、特にＦ、Ａ、ＩまたはＳである）が、例として挙げられる。
【００４２】
（２１）少なくとも上記特性ａ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２２）少なくとも上記特性ｂ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２３）少なくとも上記特性ｃ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２４）少なくとも上記特性ｄ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２５）少なくとも上記特性ａ）とｂ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２６）少なくとも上記特性ａ）とｃ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２７）少なくとも上記特性ａ）とｄ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２８）少なくとも上記特性ｂ）とｃ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（２９）少なくとも上記特性ｂ）とｄ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
（３０）少なくとも上記特性ａ）〜ｄ）を有する、二重の変異体Ｒ６４Ｘ１／Ｇ３９Ｘ３（Ｘ１は、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｋ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｉ、Ｙ、ＨまたはＮ、特にＥ、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｓ、ＰまたはＶ、好ましくはＥであり、Ｘ３はＳ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｃ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＲ、好ましくはＳまたはＡである）が、例として挙げられる。
【００４３】
上に列挙した例示的な実施形態（１）〜（３０）は、特に配列番号２または配列番号３の７β−ＨＳＤＨの変異体に関し、さらにそれらは、少なくとも８０％または少なくとも８５％、特に少なくとも９０％の同一性を有する。
【００４４】
７．  上記実施形態の１つである７β−ＨＳＤＨをコードするヌクレオチド配列。
【００４５】
挙げることができる例は、下記核酸配列から選択される核酸配列である：
ａ）ＧＤＨ、実施形態１〜６の１つである７β−ＨＳＤＨおよび任意に３α−ＨＳＤＨを同時にコードする核酸配列；
ｂ）ＧＤＨ、実施形態１〜６の１つである７β−ＨＳＤＨおよび任意に３α−ＨＳＤＨを含む融合タンパク質をコードする核酸配列：
当該コードする配列は、互いに独立して、コンストラクト中に単一または複数（例えば、２，３，４，５または６〜１０コピーのように）存在しうる。したがって、個々の発現産物の活性に存在する差異は、適切なコピー数を選択することによって補うことができる。
【００４６】
８．  少なくとも１つの調節配列の制御下で、少なくとも１つの実施形態７のヌクレオチド配列、および、任意に少なくとも１つ（例えば、１，２または３）のさらなる酵素（ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、特に３α−ＨＳＤＨ、および、例えばＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨ、Ｇ−６−ＰＤＨ、ＰＤＨなどの補因子の再生に適切なデヒドロゲナーゼから選択される酵素）をコードする配列を含む発現カセット。
特に、発現カセットに存在する酵素は、相違するか、好ましくは同一の補因子の対、例えば、補因子の対であるＮＡＤ＋／ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを用いることができる。
【００４７】
９．  少なくとも１つの実施形態８の発現カセットを含む発現ベクター。
【００４８】
１０．  少なくとも１つの実施形態７のヌクレオチド配列または少なくとも１つの発現カセット８または少なくとも１つの実施形態９の発現ベクターを有する組換え微生物。
【００４９】
１１．  補因子の再生に適切なヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（ＨＳＤＨ）およびデヒドロゲナーゼの中から選択される少なくとも１つのさらなる酵素をコードする配列を任意に追加的に有する実施形態１０の組換え微生物。
【００５０】
１２．  さらなるＨＳＨＤが３α−ＨＳＤＨから選択され；そして、デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤＰＨ再生酵素、例えば、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびＮＡＤＰＨ再生ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）またはホスファイトデヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）またはＮＡＤＨ再生酵素、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ再生ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生ホスファイトデヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）およびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の中から選択される、実施形態１１の組換え微生物。
【００５１】
挙げることのできる例は、本発明の７β−ＨＳＤＨ変異体、本明細書に記載のＧＤＨおよび任意に本明細書に記載の３α−ＨＳＤＨを同時に発現することができる組換え微生物である。
【００５２】
７β−ＨＳＤＨ変異体、ＧＤＨまたはその変異体および３α−ＨＳＤＨおよび１つまたは複数の（異なる）発現コンストラクトをコードする配列を有する、実施形態２９〜３３の１つである組換え微生物。したがって、本発明の対象は、単一プラスミド系で改変（例えば、形質転換）された組換え微生物であり、それは７β−ＨＳＤＨ変異体、ＧＤＨまたはその変異体および３α−ＨＳＤＨまたはその変異体をコードする配列を、１つまたは例えば２，３，４，５もしくは６〜１０コピーなどの複数のコピーで有する。したがって、また本発明の対象は、単一プラスミド系で改変（例えば、形質転換）された組換え微生物でもあり、それは７β−ＨＳＤＨまたはその変異体、ＧＤＨまたはその変異体および３α−ＨＳＤＨまたはその変異体をコードする配列を、１つまたは例えば２，３，４，５もしくは６〜１０コピーなどの複数のコピーで有する。しかし、酵素（７β−ＨＳＤＨ、ＧＤＨおよび３α−ＨＳＤＨまたはそれらの変異体）は、互いに両立し得る２または３の別個のプラスミド上に１つ以上のコピーで存在することもできる。単一プラスミド系およびマルチコピープラスミドの調製に適切な塩基性ベクターは、当業者に公知である。単一プラスミド系の例としては、例えばｐＥＴ２１ａを挙げることができ、マルチコピープラスミドの例としては、例えば、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１およびｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１などのＮｏｖａｇｅｎから入手可能なＤｕｅｔベクターを挙げることができる。これらのベクター、他のベクターおよび微生物宿主株とのこれらの適合性は、例えばＮｏｖａｇｅｎの「Ｕｓｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」ＴＢ３４０  Ｒｅｖ．Ｅ０３０５に記載されている。
【００５３】
プラスミド系を作製するための酵素の最適な組み合わせは、本発明の教示を考慮して、当業者は過度の負担なく実施することができる。したがって、例えば当業者は、例えば、それぞれの場合に使用される７β−ＨＳＤＨ酵素の補因子特異性に応じて、上記デヒドロゲナーゼ、特にＧＤＨおよびそれらの各変異体の中から選択される補因子の再生に最も適切な酵素を選ぶことができる。
【００５４】
さらに、２つ以上のプラスミドに変換するために選択した酵素を分配し、この調製したプラスミドを用いて２つ以上の異なる組換え微生物を調製し、これを本発明の生体触媒変換に一緒に用いることができる。本明細書では、プラスミドの調製に使用される各酵素の組み合わせは、特に、相当する補因子の使用の必要性に従う。すなわち、例えば、第１の微生物は、７β−ＨＳＤＨ変異体およびＧＤＨをコードする配列を有するプラスミドで修飾することができる。一方、第２の微生物は、３α−ＨＳＤＨをコードする配列およびＧＤＨをコードする配列を有するプラスミドで修飾することができる。酵素のペアは双方ともに、それらが補因子の同一ペアを再生できるように選択できる。また、両微生物は、本発明の生物触媒変換のために同時に使用することができる。
【００５５】
２つの異なる生体触媒（組換え微生物）の使用は、合成用の全ての酵素が発現する単一の生体触媒の使用に比べて、２つの重要な利点を有することができる：
ａ）両生体触媒は、遺伝的に改変され、互いに別々に最適化することができる。特に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの再生のために最適化された様々な補因子の再生酵素を使用することが可能である。
ｂ）生体触媒について、異なる割合で生体触媒を使用することが可能である。これにより、すべての生体触媒の調製後であっても、生体触媒が作用している間、複数の酵素作用の個々の反応速度に関与することができる。
【００５６】
１３．  ７α−ＨＳＤＨノックアウト株である実施形態１０〜１２の１つである組換え微生物であって、前記株が、例えばＷＯ２０１１／１４７９５７に記載されている組換え微生物。
【００５７】
１４．  ７β−ヒドロキシステロイドの酵素的または微生物的合成方法であって、実施形態１〜６の１つに定義された７β−ＨＳＤＨの存在下で、または、実施形態１０〜１３の１つの７β−ＨＳＤＨを発現する組換え微生物の存在下で、対応する７−ケトステロイドが還元され、任意に、少なくとも１つの形成された還元生成物が反応混合物から単離される方法。
【００５８】
１５．  実施形態１４の方法であって、７−ケトステロイドが、デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）、７−ケト−リトコール酸（７−ケト−ＬＣＡ）、７，１２−ジケト−リトコール酸（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）、および、これらの誘導体、例えば特に、当該酸の塩、アミドまたはアルキルエステルの中から選択される方法。
【００５９】
１６．  還元が、ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨの存在下で特にその消費によって行われる、実施形態１４または１５の方法。
【００６０】
１７．  実施形態１６の方法であって、消費されたＮＡＤＰＨが、ＮＡＤＰＨ再生酵素（特に、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびＮＡＤＰＨ再生ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）およびＮＡＤＰＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の中から選択される）とのカップリングによって再生され、ＮＡＤＰＨ再生酵素が任意に組換え微生物によって発現する；および／または消費されたＮＡＤＨが、ＮＡＤＨ再生酵素（特に、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ再生ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）、ＮＡＤＨ再生アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ＮＡＤＨ再生グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、ＮＡＤＨ再生ホスファイトデヒドロゲナーゼ（ＰｔＤＨ）およびＮＡＤＨ再生グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の中から選択される）とのカップリングによって再生され、ＮＡＤＨ再生酵素が任意に組換え微生物において発現する、方法。
【００６１】
１８．  ＮＡＤＰＨ再生酵素が以下から選択される実施形態１７の方法：
ａ）ＦＤＨ（少なくともギ酸のＣＯ２への酵素的酸化を触媒するＮＡＤ＋依存性ＦＤＨの変異体を含み、該変異体は非変異の酵素と比較して補因子としてＮＡＤＰ＋を追加的に受け入れる）；および、
ｂ）ＧＤＨ。
【００６２】
１９．  式（１）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法：
【００６３】
【化１】
0006582040.tif 000006
【００６４】
［式中、Ｒはアルキル、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルを表すか、または、基−ＣＯ２Ｒが酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。Ｒ１とＲ２は互いに独立してアルキル基を表す。］；
ａ）任意に、式（２）のコール酸（ＣＡ）を化学的に酸化して式（３）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）とする；
【００６５】
【化２】
0006582040.tif 000007
【００６６】
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
【００６７】
【化３】
0006582040.tif 000008
【００６８】
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
【００６９】
ｂ）実施形態１〜６の１つに定義された少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨ変異体（単離酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現する）の存在下および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨ（単離酵素として存在するか、または対応する組換え微生物によって発現する）の存在下でＤＨＣＡを還元し、対応する式（５）の１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）とする；
【００７０】
【化４】
0006582040.tif 000009
【００７１】
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
特に、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下および消費下で、続いて、
【００７２】
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的にＵＤＣＡに還元する；そして、
ｄ）任意に、反応生成物をさらに精製する。
【００７３】
２０．  少なくとも工程ｂ）が、実施形態１０〜１３の１つである組換え微生物の存在下で行われる、実施形態１９の方法。
【００７４】
２１．  工程ｂ）が同一または異なる補因子の再生システムと一体である、実施形態１９または２０の方法。
【００７５】
式（１）のＵＤＣＡの製造方法：
【００７６】
【化５】
0006582040.tif 000010
【００７７】
［式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２、Ｈ、アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋を表し、基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルを表すか、または、基−ＣＯ２Ｒが、上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］；
ａ）任意に、式（２）のコール酸（ＣＡ）を化学的に酸化して式（３）のＤＨＣＡとする；
【００７８】
【化６】
0006582040.tif 000011
【００７９】
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
【００８０】
【化７】
0006582040.tif 000012
【００８１】
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
【００８２】
ｂ）少なくとも１つの７β−ＨＳＤＨの存在下および少なくとも１つの３α−ＨＳＤＨの存在下でＤＨＣＡを還元し、対応する式（５）の１２−ケトＵＤＣＡとする；
【００８３】
【化８】
0006582040.tif 000013
【００８４】
［式中、Ｒは上記の意味を有するか、または、基−ＣＯ２Ｒが上で定義した酸アミド基−ＣＯＮＲ１Ｒ２で置換されている。］
特に、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下および消費下で、続いて、
【００８５】
ｃ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡを化学的にＵＤＣＡに還元する；そして、
ｄ）任意に、反応生成物をさらに精製する。
【００８６】
工程ｂ）の変換を、実施形態１０〜１３の１つの組換え微生物の存在下で、例えば、実施形態１０〜１３の１つである異なる組換え微生物の一種以上の全細胞の存在下で実施する。該微生物は、本明細書中により詳細に記載されているように、変換および補因子の再生に必要な酵素を含む。
【００８７】
本明細書では、プロセス工程ｂ）は、様々な方法で構成することができる。２つの酵素（７β−ＨＳＤＨ変異体および３αＨＳＤＨ）が同時に存在することができる（例えば、単離された２つの酵素または両酵素を発現する１つ以上の対応する組換え微生物とのワントップ反応が存在する）。あるいは、部分的反応は、任意の所望の順序（最初に７β−ＨＳＤＨ変異体-触媒還元、次に３α−ＨＳＤＨ-触媒還元；または最初に３α−ＨＳＤＨ-触媒還元、次に７β−ＨＳＤＨ変異体-触媒還元）で進めることができる。
【００８８】
さらに工程ｂ）は、ＮＡＤＰＨがＮＡＤＰＨ再生ＧＤＨとグルコースの消費によって再生される補因子再生システムと一体化することができる。あるいは、消費されたＮＡＤＨが、ＮＡＤＨ再生ＧＤＨ、ＡＤＨもしくはＦＤＨによって再生される補因子再生系システムと一体化することができる。
【００８９】
２３．  実施形態１４〜２２の１つである方法を実施するためのバイオリアクターであって、特に、酵素７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨおよび／または３α−ＨＳＤＨまたはそれらの変異体；または７β−ＨＳＤＨ、ＧＤＨおよび／または３α−ＨＳＤＨまたはそれらの変異体の少なくとも１つを含むバイオリアクター。
【００９０】
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施形態には限定されない。それどころか、本発明の教示は、過度の負担なしに当業者に本発明のさらなる進展を提供させるものである。すなわち、例えば、当業者は、標的化した方法により、さらなる酵素変異体を生成し、所望の特性プロファイル（改良された補因子依存性および／または安定性、減少した基質阻害性）に対してそれらを選別および最適化することができる。あるいは、さらに好適な野生型酵素（７β−および３α−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨ、ＡＤＨなど）を単離し、本発明に従ってそれらを利用することができる。さらに当業者は、例えば、特に７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨまたはその変異体などの使用するＨＳＤＨの特性プロファイル（特に補因子依存性）によって、補因子再生に使用できる適切なデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、ＦＨＤ、ＡＤＨなど）およびその変異体を選択することができる。また、選択された酵素を１つ以上の発現コンストラクトまたはベクターに分配し、必要に応じて、１つ以上の組換え微生物を作製することができる。これにより全細胞をベースにした最適化された調製方法が可能となる。
【００９１】
本発明のさらなる展開
１．一般的な定義、および使用される略語
別段の定めがない限り、用語「７β−ＨＳＤＨ」は、ＤＨＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）の少なくとも立体特異的および／または位置特異的な還元を触媒して、特にＮＡＤＰＨの化学量論的消費ならびに任意に対応する逆反応を伴って、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたは１２−ケト−ＵＤＣＡを得る脱水素酵素のことである。本明細書では、酵素は、天然の酵素であっても、組換え生産された酵素であってもよい。原則として酵素は、例えばタンパク質の混入物質などの細胞性混入物質との混合物として存在することもあるが、好ましくは純粋な形態で存在する。適切な検出方法は、例えば、下記実験部分に記載されているか、または文献から公知である（例えば、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ７  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ  ａｎｄ  Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓおよびＳ  Ｈｉｒａｎｏ  ａｎｄ  Ｎ  Ｍａｓｕｄａ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８２）。この活性の酵素は、ＥＣ番号１．１．１．２０１に分類される。
【００９２】
別段の定めがない限り、用語「３α−ＨＳＤＨ」は、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたはＤＨＣＡの少なくとも立体特異的および／または位置特異的な還元を触媒して、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的消費ならびに任意に対応する逆反応を伴って、１２−ケト−ＵＤＣＡまたは７，１２−ジケト−３α−ＣＡ（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）とする脱水素酵素のことである。適切な検出方法は、例えば、下記実験部分に記載されているか、または文献から公知である。適切な酵素は、例えばＣｏｍａｎｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（例えば、ＡＴＣＣ１１９９６）から得ることができる。ＮＡＤＰＨ依存性３α−ＨＳＤＨは、例えば、げっ歯類由来のものが公知であり、同様に使用することができる（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ３  ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ／ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｊ  Ｅ  Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｍ  Ｈｕｉｚｉｎｇａ  ａｎｄ  Ｔ  Ｍ  Ｐｅｎｎｉｎｇ，Ｍａｙ  １５，１９９１  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６，８８２０−８８２５）。この活性の酵素は、ＥＣ番号１．１．１．５０に分類される。
【００９３】
別段の定めがない限り、用語「ＧＤＨ」は、β−Ｄ−グルコースの少なくとも酸化を触媒して、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費ならびに任意に対応する逆反応を伴って、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンとする脱水素酵素のことである。適切な酵素は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから得ることができる。この活性の酵素は、ＥＣ番号１．１．１．４７に分類される。
【００９４】
別段の定めがない限り、用語「ＦＤＨ」は、ギ酸（または対応するギ酸塩）の少なくとも酸化を触媒して、ＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋の化学量論的消費ならびに任意に対応する逆反応を伴って、二酸化炭素とする脱水素酵素のことである。適切な検出方法は、例えば、下記実験部分に記載されているか、または文献から公知である。適切な酵素は、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅから得ることができる。この活性を有する酵素は、ＥＣ番号１．２．１．２に分類される。
【００９５】
本発明においては、「純粋な形態」または「純粋な」または「本質的に純粋な」酵素とは、８０より高い純度、好ましくは９０より高い純度を有する酵素、特に、一般的なタンパク質検出法、例えばＢｉｕｒｅｔ法またはＬｏｗｒｙらによって記載されているタンパク質検出法を用いて測定された全タンパク含量に基づいて、９５重量％を超える、特に９９重量％を超える高い純度を有する酵素であると理解される（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）の記載参照）。
【００９６】
「酸化還元等価物」とは、電子供与体および／または電子受容体として用いることができる低分子有機化合物、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋などのニコチンアミド誘導体、ならびに、それらの各々の還元体ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨを意味すると理解される。本発明の明細書では、「酸化還元等価物」および「補因子」は同義語として使用される。したがって、本発明の目的では「補因子」はまた「酸化還元可能な補因子」（すなわち還元形態および酸化形態で存在できる補因子）と置き換えることができる。
【００９７】
「消費された」補因子は、基質の規定された還元または酸化反応の過程で、対応する酸化型または還元型にそれぞれ変換された補因子の還元形態または酸化形態を意味すると理解される。再生とは、反応の間に形成された酸化または還元された補因子を基質の変換に再び利用できるように、その還元または酸化された初期形態にそれぞれ戻すことである。
【００９８】
本発明においては、「補因子の利用の変化」は、参照と比較して定性的または定量的な変化を意味すると理解される。特に「補因子の利用の変化」は、アミノ酸配列の変異を行うことによって観察できる。この変化は、変異していない開始酵素と比較して判別することができる。ここで、特定の補因子に対する活性は、変異を行うことによって増加もしくは減少することもあり、または、完全に抑制されることもある。しかしながら「補因子の利用の変化」には、ひとつの補因子の特異性ではなく、第１の補因子とは異なる少なくとも１つのさらなる第２の補因子が利用できるようになる（すなわち、補因子の利用が拡大する）ような変化も含まれる。しかしながら反対に、最初に存在する２つの異なる補因子を利用する能力は、これらの補因子のうちの１つに対してのみ特異性が増加するように、またはこれらの補因子の１つに対してのみ減少もしくは完全に抑制するように変化することもある。したがって、例えば、補因子ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）に依存する酵素は、補因子の利用の変化により、ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）と補因子ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の両方に依存するか、またはＮＡＤ（ＮＡＤＨ）の最初の依存性をＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）の依存性に完全に変換することができる。逆もまた同様である。
【００９９】
別段の定めがない限り、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ依存性」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ依存性」は、本発明においては広く解釈すべきである。これらの用語は「特異的な」依存性、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨへの排他的な依存性だけでなく、本発明おいて使用される酵素の、両方の補因子、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ、に対する依存性も含む。
【０１００】
同様のことが、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ受容」および／または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ受容」にも適用される。
【０１０１】
別段の定めがない限り、用語「ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ再生」または「ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ再生」は、本発明においては広く解釈すべきである。これらの用語は「特異的」、すなわち消費された補因子ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨの排他的な再生能力だけではなく、両方の補因子、すなわちＮＡＤ＋／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを再生する能力も含む。
【０１０２】
「タンパク質原性」アミノ酸には、特に：（１文字コード）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｐ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨが含まれる。
【０１０３】
本発明においては、「固定化」は、本発明において使用される生体触媒、例えば７β−ＨＳＤＨの固体支持体材料（すなわち、周囲の液体媒体に本質的に不溶性の支持体材料）への共有結合または非共有結合を意味すると理解される。本発明においては、本発明で使用される組換え微生物などの全細胞も、その支持体を用いて固定化することができる。
【０１０４】
「変異していない酵素と比較して減少した基質阻害」とは、変異していない酵素ではみられた特定の基質に対する基質阻害が、もはや観察されない（すなわち本質的に測定することができなくなり、より高い基質濃度でのみ開始する、すなわちＫｉ値が増加する）ことを意味する。
【０１０５】
本発明においては、「コール酸化合物」は、コール酸の炭素骨格、特にステロイド構造を有し、環の７位ならびに任意に３位および／または１２位に、ケトおよび／またはヒドロキシルおよび／またはアシルオキシ基が存在する化合物を意味すると理解される。
【０１０６】
例えば「コール酸化合物」または「ウルソデオキシコール酸化合物」などの特定のタイプの化合物は、特に、元の出発化合物の誘導体（例えば、コール酸またはウルソデオキシコール酸）を意味するとも理解される。
【０１０７】
そのような誘導体には、例えば、化合物のリチウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩；ならびにアンモニウム塩などの「塩」が含まれる。アンモニウム塩には、ＮＨ４＋塩、または、少なくとも１つの水素原子がＣ１−Ｃ６アルキル基で置換しているアンモニウム塩が含まれる。代表的なアルキル基は、特に、Ｃ１−Ｃ４−アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、ならびに１つ以上の分岐鎖を有するそれらの類似体である。
【０１０８】
本発明における化合物「アルキルエステル」は、特に、例えばＣ１−Ｃ６−アルキルエステルなどの低級アルキルエステルである。非限定的な例として挙げられるものは、メチル、エチル、ｎ−もしくはｉ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−もしくはｔｅｒｔ−ブチルエステル、または例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステルなどの長鎖エステル、ならびに１つ以上の分岐鎖を有するそれらの類似体である。
【０１０９】
「アミド」は、特に、本発明における酸とアンモニアまたは第１級もしくは第２級モノアミドとの反応生成物である。このようなアミドは、例えば、モノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６−アルキルモノアミンであり、アルキル基は、互いに独立して、任意に、例えばカルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ基およびスルホネート基によりさらに置換されていてもよい。
【０１１０】
本発明における「アシル基」は、特に、例えばアセチル、プロピオニルおよびブチリルなどの２〜４個の炭素原子を有する非芳香族基、および、任意に置換された単環芳香族環を有する芳香族基であり、適切な置換基は、例えば、ヒドロキシル、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、ニトロ、およびＣ１−Ｃ６−アルキル基、例えば、ベンゾイルまたはトルオイルの中から選択される。
【０１１１】
例えば、コール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸および７−ケト−リトコール酸など本発明おいて適用および／または製造されるヒドロキシステロイド化合物は、本発明において使用でき、立体異性的に純粋な形態でまたは他の立体異性体との混合物で得られる。しかしながら、好ましくは、適用および／または製造された化合物は、本質的に立体異性的に純粋な形態で使用および／または単離される。
【０１１２】
最も重要な化合物の構造式、その化学名および略称を以下の表に示す：
【０１１３】
【表５】
0006582040.tif 000014
【０１１４】
【表６】
0006582040.tif 000015
【０１１５】
【表７】
0006582040.tif 000016
【０１１６】
２．タンパク質
本発明は、具体的に開示された７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨまたは３α−ＨＳＤＨ活性を有するタンパク質もしくは酵素および／またはそれらの変異体には限定されず、それだけではなくそれらの機能的同等物にも及ぶ。
【０１１７】
本発明の目的では、具体的に開示された酵素の「機能的同等物」または類似体は前者とは異なるものであり、そうであっても例えば７βＨＳＤＨ活性などの所望の生物学的活性を保持するポリペプチドである。
【０１１８】
したがって、例えば、「機能的同等物」という用語は、使用される７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨまたは３α−ＨＳＤＨ活性試験において、本明細書で定義されるアミノ酸配列を含む出発酵素に比べて、少なくとも１％の活性、例えば、少なくとも１０％または２０％、例えば、少なくとも５０％または７５％または９０％高いまたは低い活性を有する酵素を意味すると理解される。
【０１１９】
機能的同等物は、好ましくはｐＨ４〜１１の間でさらに安定であり、有利にはｐＨ６〜１０、特に８．５〜９．５の範囲の最適ｐＨを有し、１５℃〜８０℃または２０℃〜７０℃、例えば約４５〜６０℃または約５０〜５５℃の最適温度を有する。
【０１２０】
７β−ＨＳＤＨ活性は、様々な公知の試験を用いて検出できる。これに限定されるものではないが、試験としては、例えば、実験部分で定義される標準化された条件下で使用するＣＡまたはＤＨＣＡなどが参照基質である試験を挙げることができる。
【０１２１】
ＦＤＨ、ＧＤＨまたは３α−ＨＳＤＨ活性を測定するための試験は、それ自体が同様に公知である。
【０１２２】
本発明では、用語「機能的同等物」は、特に、上記生物学的活性の１つを保持すると具体的に挙げられているアミノ酸とは異なる上記アミノ酸配列の少なくとも１つの配列の位置にアミノ酸を有する「変異体」を意味するとも理解される。したがって、「機能的同等物」は、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４または１５のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位などの１つ以上によって得られる変異体を含み、本発明による特性プロファイルを有する変異体をもたらす限り、上記改変は、任意の配列位置で起こりうる。特に、変異体および未修飾のポリペプチドの反応性パターンが定性的に一致する場合、すなわち、例えば、同じ基質が異なる速度で変換される場合にも、機能的同等物は存在する。好適なアミノ酸置換の例を下記表にまとめる：
【０１２３】
【表８】
0006582040.tif 000017
【０１２４】
上記の意味における「機能的同等物」とは、上記ポリペプチドの「前駆体」および該ポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【０１２５】
本明細書では、「前駆体」とは、所望の生物学的活性を有するまたは有さないポリペプチドの天然物または合成前駆体である。
【０１２６】
用語「塩」は、カルボキシル基の塩だけでなく、本発明におけるタンパク質分子のアミノ基の酸付加塩も意味すると理解される。カルボキシル基の塩は、それ自体公知の方法で調製することができ、例えばナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩および亜鉛塩などの無機塩および例えばアミド、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなどの有機塩基が含まれる。酸付加塩、例えば、塩酸または硫酸などの鉱酸との塩ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩も同様に本発明の対象である。
【０１２７】
本発明におけるポリペプチドの「機能的誘導体」は、公知技術を用いて、機能性アミノ酸の側鎖またはそれらのＮ末端またはＣ末端で生成することもできる。そのような誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンとの反応によって得ることができるカルボキシル基のアミド；アシル基との反応により調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；またはアシル基との反応によって調製される遊離のヒドロキシル基を有するＯ−アシル誘導体である。
【０１２８】
当然に、「機能的同等物」は、他の生物由来の利用可能なポリペプチドおよび天然に存在する変異型をも含む。例えば、配列比較を相同配列領域の領域を決定するために使用し、本発明の特定の要件に基づいて同等な酵素を作ることができる。
【０１２９】
「機能的同等物」は、同様に、例えば所望の生物学的機能を有する本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含む。
【０１３０】
「機能的同等物」は、さらに、上記のポリペプチド配列の１つまたはそれから誘導される機能的同等物、およびＮ末端またはＣ末端結合において機能的にそれらと異なる少なくとも１つ以上の他の異種配列（すなわち、融合タンパク質の一部の機能に重要な変異障害が無い）を有する融合タンパク質である。そのような異種配列の非限定的な例は、例えば、シグナルペプチド、例えば「ＬＥＨＨＨＨＨＨ」などのヘキサヒスチジンアンカーを含むペプチドなどのヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【０１３１】
本発明によれば、「機能的同等物」は、具体的に開示されたタンパク質のホモログを含む。これらは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎのアルゴリズムによって計算された具体的に開示されたアミノ酸配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（８），１９８８，２４４４−２４４８）の１つに対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％、例えば、９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の相同性（または同一性）を有する。本発明における相同ポリペプチドの相同性または同一性のパーセンテージは、特に、本明細書で具体的に記載されるアミノ酸配列の１つの全長に基づくアミノ酸残基の同一性のパーセンテージを意味する。
【０１３２】
ＢＬＡＳＴアライメント、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）の使用、または以下に明記されるＣｌｕｓｔａｌ設定を用いることによって、同一性のパーセントデータを決定できる。
【０１３３】
可能なタンパク質グリコシル化の場合、本発明における「機能的同等物」は、脱グリコシル化またはグリコシル化の形態の上記タイプのタンパク質、およびグリコシル化パターンを変化させることによって得られる修飾形態を包含する。
【０１３４】
本発明におけるタンパク質またはポリペプチドの相同体は、変異誘発、例えば点変異、またはタンパク質の伸長もしくは切断によって生成することができる。
【０１３５】
本発明におけるタンパク質の相同体は、例えば、トランケーション変異体などの変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的ライゲーションなどの、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によってタンパク質変異型の多彩なライブラリーを作製することが可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ホモログのライブラリーを生成するために使用できる多くのプロセスが存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で実施でき、その後、その合成遺伝子を適切な発現ベクターに結合してもよい。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的なタンパク質配列の所望のセットをコードする全ての配列を１つの混合物中で提供することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【０１３６】
先行技術では、点変異または切断によって生成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための様々な技術が知られている。これらの技術は、本発明に従った相同体のコンビナトリアル変異誘発によって作成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合させることができる。ハイスループット解析を行った大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も頻繁に使用される技術には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターライブラリーによる適切な細胞の形質転換、および、所望の活性の検出によって、検出された遺伝子産物をコードするベクターの単離が容易になる条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現が含まれる。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増加させる技術である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）を、相同体を同定するためのスクリーニング試験と組み合わせて用いることができる（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１３７】
さらに本発明には、本明細書中で明示的に言及される本出願人のＷＯ２０１１／０６４４０４に記載されるように、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６由来の７β−ＨＳＤＨ野生型の使用が含まれる。
【０１３８】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ３９７９から得られるこの７β−ＨＳＤＨは、特に、例えば、２，３，４，５，６または７個またはその特性のすべてのような以下の特性の少なくとも１つによって特徴付けられる：
ａ）分子量（ＳＤＳゲル電気泳動）：約２８〜３２ｋＤａ、特に約２９〜３１ｋＤａまたは約３０ｋＤａ；
ｂ）分子量（特にＳＤＳを用いない非変性条件下でのゲル濾過）：約５３〜６０ｋＤａ、特に約５５〜５７ｋＤａ、例えば５６．１ｋＤａ。これは、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ３９７９７β−ＨＳＤＨの二量体性であることを確認する；
ｃ）７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシ基への立体選択的還元；
ｄ）ｐＨ８．５〜１０．５の範囲におけるＵＤＣＡの酸化のために最適なｐＨ、特にｐＨ９〜１０；
ｅ）ｐＨ３．５〜６．５の範囲におけるＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元のために最適なｐＨ、特にｐＨ４〜６；
ｆ）そこに記載された基質／補因子の少なくとも１つについて、以下の表からの少なくとも１つの動力学的パラメータ；±２０％の範囲、特に、以下の表に具体的に記載された値を中心に、±１０％、±５％、±３％、±２％または±１％：
【０１３９】
【表９】
0006582040.tif 000018
【０１４０】
ｇ）原核生物であるＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ３９７９の７β−ＨＳＤＨと、モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）およびハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｕｌｕｓ）を含む動物の１１β−ＨＳＤＨサブグループの系統発生的配列相関性。
【０１４１】
例えば、この７β−ＨＳＤＨは、以下の特性または特性の組み合わせを示す：ａ）；ｂ）；ａ）およびｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【０１４２】
このような７β−ＨＳＤＨまたはそれ由来の機能的同等物は、さらに以下によって特徴付けられる：
ａ）対応する７β−ヒドロキシステロイドへの７−ケトステロイドの立体特異的還元；および／または
ｂ）対応する７β−ヒドロキシステロイドを生じるための７位のケト基およびステロイド骨格上の少なくとも１個のさらなるケト基を含むケトステロイドの位置特異的ヒドロキシル化、特に、例えば、ＮＡＤＰＨ依存性である、対応する３，１２−ジケト−７β−コラン酸を生成するための７位のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）の位置特異的ヒドロキシル化。
【０１４３】
特に、このような７β−ＨＳＤＨは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（アクセッション番号：ＺＰ＿０１７７３０６１）のアミノ酸配列、または６５，７０，７５，８０，８５もしくは９０％などの、少なくとも６０％の同一性度を有するそれ由来の配列、例えば、この配列に対して、少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９もしくは９９．５％の同一性を有する配列；以下の特性または特性の組み合わせの１つによって任意にさらに特徴付けられる：ａ）；ｂ）；ａ）およびｂ）；上記定義のａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【０１４４】
３．核酸およびコンストラクト
３．１核酸
本発明の対象は、７β−ＨＳＤＨ、ＦＤＨ、ＧＤＨおよび／または３α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素およびその変異体をコードする核酸配列でもある。
【０１４５】
本発明はまた、本明細書に記載の特定の配列とある程度の相同性を有する核酸に関する。
【０１４６】
２つの核酸の間の「同一性」は、いずれの場合も核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性、特に以下のパラメータ設定を行ったクラスタルの方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９  Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）を適用することによるＩｎｆｏｒｍａｘ（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１ソフトウェアを用いた比較によって計算される同一性を意味すると理解される。
【０１４７】
マルチプル・アラインメント・パラメータ：
ギャップ開始ペナルティ                    １０
ギャップ延長ペナルティ                    １０
ギャップ分離ペナルティ範囲         ８
ギャップ分離ペナルティ                    オフ
アライメント遅延の％同一性         ４０
残基特異的ギャップ                 オフ
親水性残基ギャップ                 オフ
トランジッションウエイト           ０
【０１４８】
ペアワイズアライメントパラメータ：
ＦＡＳＴアルゴリズム                             オン
Ｋ−タプルサイズ                                 １
ギャップペナルティ                               ３
ウィンドウサイズ                                 ５
最適な対角線数                                   ５
【０１４９】
また同一性は、Ｃｈｅｎｎａ，Ｒａｍｕ，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｈｉｄｅａｋｉ，Ｋｏｉｋｅ，Ｔａｄａｓｈｉ，Ｌｏｐｅｚ，Ｒｏｄｒｉｇｏ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔｏｂｙ  Ｊ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄｅｓｍｏｎｄ  Ｇ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｕｌｉｅ  Ｄの方法によって、下記パラメータを用いて決定できる。（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｌｕｓｔａｌ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００，インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃）
【０１５０】
DNAギャップ開始ペナルティ          15.0
DNAギャップ伸長ペナルティ          6.66
DNAマトリックス             同一
プロテインギャップ開始ペナルティ   10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ   0.2
タンパク質マトリックス             Gonnet
タンパク質/ DNA ENDGAP             -1
タンパク質 / DNA GAPDIST           4
【０１５１】
本明細書で言及される全ての核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ配列、例えば、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなど）は、核酸単位から開始する化学合成によって（例えば、二重らせんの個々の重複した相補的核酸単位の断片凝縮などによって）、それ自体公知の方法で、生成することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，第２版，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，８９６〜８９７頁）に従って、公知の方法で化学的に合成することができる。合成オリゴヌクレオチドのアセンブリおよびＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片の補助ならびにライゲーション反応および一般的なクローニング法の補助によるギャップの充填は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１５２】
また本発明の対象は、上記ポリペプチドのいずれかを、例えば、人工ヌクレオチド類似体を用いて作製できるその機能的同等物でコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）でもある。
【０１５３】
本発明は、本発明におけるポリペプチドまたはタンパク質またはその生物学的に活性のある部分をコードする単離された核酸分子、および、例えば本発明に従ってコードする核酸の同定用または増幅用のハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用できる核酸断片の両方に関する。
【０１５４】
本発明における核酸分子は、コードする遺伝子領域の３’および／または５’末端に由来する非翻訳配列をさらに含むことができる。
【０１５５】
さらに本発明は、具体的に記載されたヌクレオチド配列またはその一部に相補的な核酸分子を含む。
【０１５６】
本発明におけるヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび他の組織において相同な配列を同定および／またはクローニングするために使用できるプローブおよびプライマーの生産を可能にする。そのプローブまたはプライマーは、通常、「厳しい」条件下（以下参照）で、少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、例えば、約４０，５０または７５個の本発明における核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【０１５７】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離される。さらに組換え技術によって生産される場合には他の細胞材料または培養液を基本的に含まない場合があり、または化学的に合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を基本的に含まない場合がある。
【０１５８】
本発明における核酸分子は、分子生物学の標準的な技術や本発明により提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、ｃＤＮＡは、具体的に開示された完全配列の１つまたはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、そして標準的なハイブリダイゼーション技術を使用して適切なｃＤＮＡライブラリーから単離できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ、ＥＦ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている）。さらに、開示された配列またはその一部のいずれかを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離できる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けられる。さらに、本発明におけるオリゴヌクレオチドは、標準的な合成方法、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて生産できる。
【０１５９】
本発明における核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体または一部は、例えば、通常のハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ技術を用いて、例えばゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの方法によって、他の細菌から単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準的な条件下で本発明における配列とハイブリダイズする。
【０１６０】
「ハイブリダイズする」とは、標準的な条件下において、ほぼ相補的な配列に結合するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの能力を意味すると理解される。これらの条件下では、非相補的な相手との間の非特異的結合は起こらない。本明細書では、配列は９０〜１００％相補的である。互いに特異的に結合することができる相補的配列の特性は、例えば、ノーザンブロットもしくはサザンブロット技術またはＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合において利用される。
【０１６１】
ハイブリダイゼーションでは、保存領域の短いオリゴヌクレオチドの使用が有利である。しかしながら、ハイブリダイゼーションのために、本発明における核酸の比較的長い断片、または完全な配列を使用することも可能である。使用する核酸（オリゴヌクレオチド、比較的長い断片もしくは完全な配列）に依存して、またはハイブリダイゼーションにどの核酸型（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を使用するかに依存して、これらの標準的な条件は変化する。すなわち、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度よりも約１０℃低い。
【０１６２】
核酸に依存した標準的な条件とは、例えば０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有する水性緩衝液中で４２〜５８℃の温度、また５０％ホルムアミドの存在下で、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中で４２℃の温度を意味すると理解される。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび約２０℃〜４５℃、好ましくは約３０℃〜４５℃の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣおよび約３０℃〜５５℃の温度、好ましくは約４５℃〜５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションについて記載されたこれらの温度は、約１００ヌクレオチドの長さであり、Ｇ＋Ｃ含量が５０％である核酸を例として計算されたホルムアミドの非存在下における融解温度の値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ』，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９」などの遺伝学の専門の教科書に記載されており、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプまたはＧ＋Ｃ含量の関数として、当該技術分野の当業者に周知の式を用いて計算できる。当業者は、下記教科書からハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を得ることができる：Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９８５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ．），１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ．），１９９１，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ。
【０１６３】
「ハイブリダイゼーション」は、特に厳しい条件下で行われうる。このようなハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１−９．５７の頁またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。
【０１６４】
「厳しい」ハイブリダイゼーション条件とは、特に以下の条件であると理解される：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性断片処理済サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で、一晩インキュベート後、６５℃で０．１×ＳＳＣを用いてフィルターを洗浄する工程を行う。
【０１６５】
また本発明の対象は、具体的に開示された誘導体または誘導されうる核酸配列でもある。
【０１６６】
したがって、本発明におけるさらなる核酸配列は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１，７もしくは９（またはアミノ酸配列２〜６，８，１０もしくは１１をコードする核酸配列）に由来し、一つのもしくは数個のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によって異なるが、依然として所望の特性プロファイルを有するポリペプチドをコードする。
【０１６７】
また本発明には「サイレント」変異を含む核酸配列または具体的に言及した配列と比較して、特定の供給源生物または宿主生物のコドン使用頻度に応じて変化する核酸が含まれる。例えば、スプライス変異型またはアレル変異型などのその天然に存在する変異型である。
【０１６８】
別の対象は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、目的のアミノ酸を同じ電荷、同じサイズ、同じ極性および／または同じ溶解性のアミノ酸で置換する）の方法によって得られる配列である。
【０１６９】
本発明の対象はまた配列多型として具体的に開示された核酸に由来する分子でもある。これらの遺伝子多型は、自然変異の結果として集団の個体間に存在しうる。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％に起こる。
【０１７０】
本発明における核酸配列の誘導体で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，７もしくは９の配列（またはアミノ酸配列２〜６，８，１０もしくは１１をコードする核酸配列）を有するものは、例えば、推定されるアミノ酸レベルで、すべての配列領域にわたって、少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、非常に特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアレル変異型を意味する（アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについての上記解説を参照できる）。有利には、その相同性は、配列の部分領域にわたっては、より高くなりうる。
【０１７１】
さらに、また誘導体は本発明における核酸配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，７もしくは９（またはアミノ酸配列２〜６、８，１０もしくは１１をコードする核酸配列）の相同体、例えば、真菌もしくは細菌の相同体、短縮配列、ＤＮＡ配列をコードもしくはコードしない一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡを意味すると理解される。すなわち、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，７もしくは９（またはアミノ酸配列２〜６，８，１０もしくは１１をコードする核酸配列）の相同体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１，７もしくは９（またはアミノ酸配列２〜６，８，１０もしくは１１をコードする核酸配列）の全ＤＮＡ領域にわたって、ＤＮＡレベルで、少なくとも４０％の相同性、好ましくは、少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは、少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１７２】
さらに、誘導体は、例えばプロモーターとの融合物を意味すると理解される。示されたヌクレオチド配列の上流に位置するプロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド置換、少なくとも１つの挿入、逆位および／または欠失によって変更されてもよいが、プロモーターの機能および有効性は不利な影響を受けない。さらに、そのプロモーターの効果は、それらの配列が変更されることによって増大されてもよいし、または、そのプロモーターは、他種生物由来のプロモーターを含む、より活性の高いプロモーターで全体的に置換されてもよい。
【０１７３】
また当業者は、機能的変異体を生成する方法を熟知している。
【０１７４】
使用する技術に応じて、当業者は、遺伝子または非コード核酸領域（例えば、発現調節に重要な領域）に完全にランダムな、または、より特異的な変異を導入すること、遺伝子ライブラリーを続いて作成することができる。この目的に必要な分子生物学的方法は、当業者に公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌにより記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）。
【０１７５】
遺伝子を改変し、それらによりコードされるタンパク質を改変する方法は、例えば下記のように、長きにわたって当業者には熟知されてきた：
−  遺伝子の単一または複数のヌクレオチドを特異的に置換する部位特異的変異（Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（Ｅｄ．）１９９６；Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；
−  任意の所望のアミノ酸のコドンを、遺伝子の任意の所望の位置で、置換または付加できる飽和変異（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏ  ＤＭ，Ｄｏｃｋｔｏｒ  ＣＭ，ＤｉＭａｉｏ  Ｄ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：１５９３；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ  Ｄ，Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ  Ｍ，Ｖａｌｃａｒｅｌ  Ｒ，Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ  ＨＧ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：５４１；Ｂａｒｉｋ  Ｓ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：１）；
−  ヌクレオチド配列が不完全に作用するＤＮＡポリメラーゼによって変異するＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ（エラープローン）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ  ＫＡ、Ｋｕｎｋｅｌ  ＴＡ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７３９）；
−  ヌクレオチド配列の変異割合が、例えば不完全なＤＮＡ修復機構のために増加している変異株の遺伝子の継代（Ｇｒｅｅｎｅｒ  Ａ，Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｍ，Ｊｅｒｐｓｅｔｈ  Ｂ（１９９６）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔａｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎ：Ｔｒｏｗｅｒ  ＭＫ（Ｅｄ．）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）；または、
−  ＤＮＡシャフリング（密接に関係する遺伝子プールが形成されて切断される）およびその断片は、鎖の分離および再アニーリングの繰り返しによって最終的に生成される全長モザイク遺伝子において、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用される（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９；Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７）。
【０１７６】
「定向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」（とりわけ、Ｒｅｅｔｚ  ＭＴ  ａｎｄ  Ｊａｅｇｅｒ  Ｋ−Ｅ（１９９９），Ｔｏｐｉｃｓ  Ｃｕｒｒ  Ｃｈｅｍ  ２００：３１；Ｚｈａｏ  Ｈ，Ｍｏｏｒｅ  ＪＣ，Ｖｏｌｋｏｖ  ＡＡ，Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎ：Ｄｅｍａｉｎ  ＡＬ，Ｄａｖｉｅｓ  ＪＥ（Ｅｄ．）Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに記載されている）として公知のものを採用することで、当業者は、標的化された方法で機能的変異体を大規模にも生産することができる。ここでは、各タンパク質の遺伝子ライブラリーが第１工程で作成され、これらの遺伝子ライブラリーは、例えば、上記で特定された方法を用いて構築できる。遺伝子ライブラリーは適切な方法、例えば、細菌またはファージディスプレイシステムによって発現する。
【０１７７】
所望の特性に広く対応する特性を有する機能的変異体を発現する宿主生物の関連遺伝子は、さらなる変異サイクルを受けることができる。変異および選択またはスクリーニングの工程は、存在する機能的変異体が所望の特性を十分に示すまで反復して繰り返すことができる。この反復方法によって、例えば１〜５個の変異などの限定した数の変異を段階的に生産できる。また関連する酵素特性に対するそれらの影響を評価して選択できる。そして、選択された変異体は、さらなる変異工程を同じ方法で受けることができる。これにより調査する個々の変異体の数を大きく減少できる。
【０１７８】
また本発明の結果は、所望の改良した性質を有するその外の酵素を標的化した方法で生成するために必要である、目的の酵素の構造および配列に関する重要な情報を提供する。特に、「ホットスポット」として知られるもの（すなわち、標的とする変異の導入を経て酵素特性を改良するときに適切となりうる配列部分）を定義できる。
【０１７９】
３．２コンストラクト
さらに本発明の対象は、調節核酸配列の遺伝子調節下において、本発明における少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現コンストラクトである；そして、これらの発現コンストラクトの少なくとも１つを含むベクターである。
【０１８０】
本発明において「発現ユニット」は、本明細書で定義されるプロモーターを含む発現活性を有する核酸を意味すると理解される。それは、発現する核酸または遺伝子に機能的に結合した後に発現（すなわち、前記核酸または前記遺伝子の転写および翻訳）を調節する。このことが、本明細書において発現ユニットが「調節核酸配列」とも呼ばれる理由である。例えばエンハンサーのような、その外の調節因子が、プロモーターに加えて存在できる。
【０１８１】
本発明において「発現カセット」または「発現コンストラクト」は、発現する核酸または発現する遺伝子に機能的に連結した発現ユニットを意味すると理解される。したがって、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現する核酸配列も含む。
【０１８２】
本発明の明細書では、用語「発現」または「過剰発現」は、微生物中の、対応するＤＮＡにコードされる１つまたは複数の酵素の細胞内活性の生成または増加を説明する。そのために、例えば、遺伝子を生物に導入することができ、存在する遺伝子を異なる遺伝子に置換することができ、遺伝子のコピー数を増加させることができ、強力なプロモーターを使用することができ、または、対応する高い活性を有する酵素をコードする遺伝子を使用することができる。また、任意にこれらの方法を組み合わせることができる。
【０１８３】
好ましくは、本発明におけるこのコンストラクトは、上流のプロモーター（すなわち特定のコード配列の５’末端）および下流の終結配列（すなわち３’末端）を含み、任意には、さらに通常の調節因子にコード配列が、いずれの場合にも作動可能に連結している。
【０１８４】
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」は、本発明においては、転写される核酸と機能的に結合して前記核酸の転写を調節する核酸を意味すると理解される。
【０１８５】
本明細書では、「機能的」または「作動可能な」結合とは、例えばプロモーター活性を有する核酸の１つの連鎖配列および転写される核酸配列を意味する。また任意には、例えば核酸の転写を確実にする核酸配列などのさらなる調節因子、および、例えば調節因子のそれぞれが核酸配列の転写において意図されるその機能を果たすことができるようなターミネーターである。化学的な意味における直接結合は、本明細書では必須ではない。例えばエンハンサー配列などの遺伝子調節配列は、さらに除去された位置から、または異なるＤＮＡ分子からでさえ、標的配列上にその機能を発揮できる。好ましい配列は、２つの配列が互いに共有結合するように、転写される核酸配列がプロモーター配列の後（すなわち、その３’末端）に位置するものである。本明細書では、プロモーター配列と組換え発現される核酸配列との間の距離は、２００塩基対未満または１００塩基対未満または５０塩基対未満でありうる。
【０１８６】
プロモーターおよびターミネーターに加えて言及されるさらなる調節因子の例は、標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【０１８７】
本発明における核酸コンストラクトは、特に、ＳＥＱ  ＩＤ：１，７もしくは９の配列（またはアミノ酸配列２〜６，８，１０もしくは１１をコードする核酸配列）またはその誘導体および相同体を含む。さらに、それらから誘導されうる、１つ以上の調節シグナルに作動可能にまたは機能的に結合する、有利には、例えば遺伝子発現を増加させるなどのコントロールのための核酸配列を含む。
【０１８８】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節がさらに実際の構造遺伝子の上流に存在することがあり、任意には、天然の調節がスイッチオフされ、遺伝子発現が増加するような方法で遺伝子的に変化する。しかしながら、核酸コンストラクトは、比較的単純なデザインでも良く（すなわち、コード配列の上流に追加の調節シグナルが挿入されていない）、その調節と共に天然プロモーターは除去されていない。その代わりに、天然調節配列は、もはや調節が起こらずに遺伝子発現が増加するように変異する。
【０１８９】
好ましい核酸コンストラクトは、有利には、プロモーターに機能的に結合し、増加する核酸配列の発現を可能にする上記「エンハンサー」配列の１つ以上も含む。さらなる調節因子またはターミネーターなどのさらなる有利な配列もまた、ＤＮＡ配列の３’末端に挿入できる。本発明における核酸は、１つ以上のコピーのコンストラクト中に存在しうる。このコンストラクトは、コンストラクトを選択する目的で、任意に、抗生物質耐性または栄養要求性補完遺伝子などのさらなるマーカーをさらに含むことができる。
【０１９０】
好適な調節配列の例は、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、λ−ＰＲなどのプロモーターまたはグラム陰性細菌において有利に使用されるλ−ＰＬプロモーターに存在する。他の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターであるａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母または真菌プロモーターであるＡＤＣ１、ＭＦα、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨに存在する。人工プロモーターもまた、調節目的のために使用できる。
【０１９１】
宿主生物における発現という目的のために、有利には、核酸コンストラクトは、遺伝子が宿主中で最適に発現されることを可能にする、例えば、プラスミドまたはファージなどのベクターに挿入される。ベクターは、プラスミドおよびファージに加えて、当業者に公知の他の全てのベクター、すなわち、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、ならびに、トランスポゾン、ＩＳ因子、ファースミド、コスミドおよび線状もしくは環状ＤＮＡを意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物で自律的に複製されるか、または染色体上で複製される。これらのベクターは、本発明のさらなる進展を構成する。
【０１９２】
好適なプラスミドの例は、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１もしくはｐＢｄＣＩ、または、ストレプトミセスのｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２もしくはｐＩＪ３６１、または、バチルスのｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４、または、コリネバクテリウムのｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７、または、真菌のｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２もしくはｐＢＢ１１６、または、酵母の２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、または、植物のＬＧＶ２３，ｐＧＨｌａｃ＋，ｐＢＩＮ１９，ｐＡＫ２００４もしくはｐＤＨ５１に存在する。列挙したプラスミドは、可能性のあるプラスミドのうちの狭い選択肢である。他のプラスミドは、当業者に周知であり、例えば、クローニングベクター（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）という書籍にみることができる。
【０１９３】
ベクターのさらなる実施態様では、本発明の核酸コンストラクトまたは本発明の核酸を含むベクターは、有利には、線状ＤＮＡの形態で微生物に導入され、異種または相同組換えを介して宿主生物のゲノムに組み込ませることができる。この線状ＤＮＡは、プラスミドなどの線状化ベクターを含むか、または本発明の核酸コンストラクトもしくは核酸のみを含むことができる。
【０１９４】
生物において異種遺伝子を最適に発現させるためには、該生物で用いられる特有の「コドン使用」に従って核酸配列を変化させることが有益である。「コドン使用」は、目的の生物の他の公知遺伝子についてのコンピュータ解析を用いて容易に決定することができる。
【０１９５】
本発明における発現カセットは、適切なプロモーターを適切なコードヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルと融合することによって作製される。これには一般的な組換えおよびクローニング技術が使用され、該技術は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されている。
【０１９６】
適切な宿主生物での発現のために、有利には、組換え核酸コンストラクトまたは遺伝子コンストラクトは宿主特異的ベクターに挿入され、宿主内で遺伝子が最適に発現することが可能になる。ベクターは当業者に周知であり、例えば、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｐｏｕｗｅｌｓ  Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）に見出すことができる。
【０１９７】
４．微生物
本明細書では、用語「微生物」は、出発（野生型）微生物もしくは遺伝子組換え微生物または両者を意味すると理解される。
【０１９８】
本発明におけるベクターを用いて、例えば、本発明における少なくとも１つのベクターを用いて形質転換され、本発明のポリペプチドを生産するために使用できる組換え微生物を調製することが可能である。有利には、本発明における上記の組換えコンストラクトを適切な宿主系に導入し、そこで発現させる。これに関連して、例えば、共沈降、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの当業者に熟知された一般的なクローニングおよびトランスフェクション法が、特定の発現系で発現する前記核酸を引き起こすために好適に使用される。好適な系は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。またタンパク質の異種発現のための細菌発現系の概説が、例えば、Ｔｅｒｐｅ，Ｋ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６）７２：２１１−２２２に提供されている。
【０１９９】
本発明の核酸または核酸コンストラクトのための組換え宿主生物は、原則として、全ての原核生物または真核生物である。宿主生物としては、細菌、真菌または酵母のような微生物を用いることが有利である。グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌を用いることが有利であり、好ましくは腸内細菌科、シュードモナス科、リゾビウム科、ストレプトマイセス科もしくはノカルディア科の細菌、特に好ましくはエシェリヒア属、シュードモナス属、ストレプトミセス属、ノカルディア属、バークホルデリア属、サルモネラ属、アグロバクテリウム属、クロストリジウム属もしくはロドコッカス属の細菌である。非常に特に好ましいのは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ属および種である。さらに有利な細菌は、α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリアまたはγ−プロテオバクテリアの群にさらに見出すことができる。
【０２００】
本明細書では、本発明における宿主生物は、好ましくは、本発明で説明された核酸配列、核酸コンストラクトまたはベクターの少なくとも１つを含み、これらは、上で定義した７β−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする。
【０２０１】
宿主生物によっては、本発明の方法で使用される生物は、当業者に公知の方法で増殖または培養される。微生物は原則として、通常は糖の形態の炭素源、通常は酵母抽出物などの有機窒素源の形態の窒素源、または、硫酸アンモニウムなどの塩、鉄、マンガンおよびマグネシウムの塩などの微量元素、および、任意にビタミンを含む液体培地で、０℃〜１００℃の温度、好ましくは、１０℃〜６０℃の温度で、酸素中を通過させて増殖させる。液体培地のｐＨは、一定に保つことができ、すなわち、培養中に調節してもしなくても良い。培養はバッチ式、半バッチ式または連続式で実施できる。栄養素は、発酵の開始時に提供されてもよく、半連続的または連続的に供給されてもよい。
【０２０２】
５．ＵＤＣＡの生産
工程１：ＣＡのＤＨＣＡへの化学変換
ＣＡのヒドロキシル基は、酸性溶液（例えば、Ｈ２ＳＯ４）中のクロム酸またはクロム酸塩を使用して、従来の化学的経路を介してそれ自体が公知の方法でカルボニル基に酸化される。これによりＤＨＣＡが生じる。
【０２０３】
工程２：ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素的または微生物的変換
ＤＨＣＡは、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下で、３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨまたはその変異体によって水溶液中で特異的に還元され、１２−ケト−ＵＤＣＡとなる。補因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、それぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムまたはグルコースからのＡＤＨまたはＦＤＨまたはＧＤＨまたはその変異体によって再生できる。その反応は緩やかな条件下で進行する。例えば、その反応は、ｐＨ＝６〜９、特に約ｐＨ＝８で、約１０〜３０℃、１５〜２５℃または約２３℃で行うことができる。
【０２０４】
微生物変換工程の場合、所望の酵素活性を発現する組換え微生物は、変換される基質（ＤＨＣＡ）の存在下で、適切な液体培地中で、嫌気的または好気的に培養できる。適切な培養条件は、当業者にそれ自体が公知である。それらには、例えば５〜１０もしくは６〜９のｐＨ範囲での、１０〜６０℃もしくは１５〜４５℃もしくは２５〜４０℃の温度範囲、または３７℃での変換が含まれる。適切な培地は、例えば、以下に記載するＬＢおよびＴＢ培地を含む。本明細書では、変換時間は、例えば、バッチ式または連続式で、または任意の他の慣習的なプロセス変法（上記に記載されているように）で行うことができる。本明細書では、変換時間は、例えば、数分から数時間または数日の範囲であってもよく、例えば、１時間から４８時間であってもよい。任意には、酵素活性が連続的に発現しない場合、後者は、例えば標的細胞密度がおよそＯＤ６００＝０．５〜１．０に達した後に、適切な誘導物質を添加することによって開始できる。
【０２０５】
発酵操作に関しては、培地への添加、酵素固定化および有用物質の単離が、さらに可能な微生物生産プロセスの適切な改変もまた、下記「酵素または変異体の生産」に関するセクションに記載されている。
【０２０６】
工程３：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学変換
１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−カルボニル基は、Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｃｈｎｅｒ還元によってそれ自体が公知の方法で除去され、それによって、ＵＤＣＡが１２−ケト−ＵＤＣＡから生成される。この反応では、まず最初に、カルボニルをヒドラジンと反応させて、ヒドラゾンを得る。その後、塩基（例えば、ＫＯＨ）の存在下で、ヒドラゾンを２００℃に加熱する。この工程の間、窒素が取り除かれてＵＤＣＡが生じる。
【０２０７】
６．酵素および変異体の組換え生産
さらに本発明の対象は、本発明におけるポリペプチドまたはその機能的な生物学的に活性のある断片を組換え生産する方法であり、該方法では、ポリペプチド産生微生物を培養し、ポリペプチドの発現を任意に誘導し、ポリペプチドを培養物から単離する。必要に応じて、当該ポリペプチドはこの方法で工業的規模で生産することもできる。
【０２０８】
本発明に従って生産された微生物は、バッチ法、フェドバッチ法または反復フェドバッチ法により連続的または不連続的に増殖させることができる。公知の培養方法の概要はＣｈｍｉｅｌの教科書（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｕｎｉｔｓ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に記載されている。
【０２０９】
使用される培養液は、目的の株の必要性を適切に満たす必要がある。様々な微生物の培養液の説明はマニュアル（“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に記載されている。本発明において使用できるこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０２１０】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。非常に好ましい炭素源の例は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。また糖類は、糖蜜などの複合化合物または糖精製の他の副産物を介して培地に添加することができる。様々な炭素源の混合物を添加することも有利である。別の可能な炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびヤシ油脂などの油および油脂、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸などの脂肪酸、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールなどのアルコール、ならびに、例えば酢酸または乳酸などの有機酸である。
【０２１１】
窒素源は、通常、有機もしくは無機の窒素化合物またはこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例には、アンモニアガス、または、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆ミール、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などが含まれる。窒素源は、単独でまたは混合物として使用できる。
【０２１２】
培地中に存在する無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リンもしくは硫酸塩が含まれる。
【０２１３】
硫黄源としては、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、四チオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物だけでなく、メルカプタンおよびチオールなどの有機硫黄化合物も使用できる。リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用できる。
【０２１４】
溶液中に金属イオンを保持するために、金属イオン封鎖剤を培地に添加してもよい。特に好適な金属イオン封鎖剤には、カテコールもしくはプロトカテキン酸などのジヒドロキシフェノール、または、クエン酸などの有機酸が含まれる。
【０２１５】
通常、本発明において使用する発酵培地には、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンを含むビタミンまたは増殖促進剤などの他の増殖因子も含まれる。増殖因子および塩は、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分から頻繁に得られる。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加してもよい。培地中の化合物の正確な組成は目的とする実験に大きく依存し、個別の場合について個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教科書“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｅｄｓ  Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）５３−７３頁，ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）に記載されている。増殖培地は、Ｓｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）など、商業的供給源から得ることもできる。
【０２１６】
全ての培地成分は、加熱手段（１．５バールおよび１２１℃で２０分間）またはフィルター滅菌のいずれかによって滅菌する。これらの成分は、一緒にまたは必要に応じて別々に滅菌できる。全ての培地成分は、培養の開始時に存在してもよいし、または必要に応じて連続的にまたはバッチ式で添加してもよい。
【０２１７】
培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃であり、また実験中は一定に保つこともできるし、変化させることもできる。培地のｐＨは、５〜８．５、好ましくは約７．０の範囲とするべきである。培養用のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物の添加によって、培養中に調整できる。例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を泡立ちの発生の制御に使用できる。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択的に作用する物質、例えば抗生物質を培地に添加できる。好気的条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば外気を培養物に通す。培養温度は通常２０℃〜４５℃である。所望の生成物が最大限に形成されるまで培養を続ける。この目的は、通常、１０〜１６０時間以内に達成される。
【０２１８】
その後、発酵液をさらに処理する。必要に応じて、例えば、遠心分離、濾過、デカンテーションまたはこれらの方法の組み合わせなどの分離方法によって、バイオマスの全部または一部を発酵液から除去することもできるし、前記発酵液中に完全に残すこともできる。
【０２１９】
ポリペプチドが培地中に分泌されない場合、その細胞を破砕することができ、その生成物を公知のタンパク質単離方法によって溶解物から得ることができる。細胞は、高周波超音波によって、例えば圧力式細胞破砕などの高圧によって、浸透圧によって、界面活性剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーによって、または、上記の方法のいくつかの組み合わせによって、任意に破砕できる。
【０２２０】
ポリペプチドは、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーなどのモレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）などの公知のクロマトグラフィー技術、ならびに、限外ろ過、結晶化、塩析、透析およびネイティブゲル電気泳動などの他の一般的な方法を用いて精製できる。適切な方法は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ］，Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｏｒ  ｉｎ  Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０２２１】
組換タンパク質を単離するために、有利には、特異的ヌクレオチド配列によってｃＤＮＡを伸長し、そして例えば比較的簡単な精製を目的として働く修飾ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することができる。その適切な修飾は、例えばアンカーとして作用する「タグ」として知られるものであり、ヘキサヒスチジンアンカーまたは抗原であることが抗体によって認識できるエピトープとして公知の修飾などである（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されている）。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラムに充填できるポリマーマトリックスなどの固体支持体にタンパク質を付着させるために、または、タンパク質をマイクロタイタープレートもしくは任意の他の支持体に付着させるために働くことができる。
【０２２２】
同時に、これらのアンカーはタンパク質の同定にも使用できる。タンパク質を同定するために、さらに、蛍光色素などの通常のマーカー、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカーまたは放射性マーカーを、単独でまたはタンパク質の誘導体化のためにアンカーと組み合わせて使用できる。
【０２２３】
７．酵素固定化
本明細書に記載の方法において、本発明における酵素は、遊離または固定された形態で使用できる。固定化酵素は、不活性支持体に固定された酵素を意味すると理解される。適切な支持材料およびその上に固定化された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９、ＥＰ−Ａ−１  ０６９  １８３およびＤＥ−ＯＳ  １００１９３７７３、ならびに、それらに引用された文献から公知である。この点において、前記文献の開示は、その全体が参照される。適切な支持材料としては、例えば、粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換物質、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール・ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、ならびに、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリオレフィンが挙げられる。該支持材料は、通常、支持される酵素の調製のために、細かく分割された粒状で使用され、多孔質の形状であることが好ましい。その支持材料の粒径は、通常は５ｍｍ以下であり、特に２ｍｍ以下である（傾斜曲線）。同様に、全細胞の触媒としてのデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定された形態が選択できる。支持材料は、例えば、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素に加えて細胞も、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋できる（ＣＬＥＡへの架橋）。対応するおよびさらなる固定化方法は、例えば、Ｊ．Ｌａｌｏｎｄｅ  ａｎｄ  Ａ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ｉｎ  Ｋ．Ｄｒａｕｚ  ａｎｄ  Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２００２，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，９９１−１０３２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【実施例】
【０２２４】
実験部分：
特に明記しない限り、クローニング工程は、例えば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への転写、ＤＮＡ断片の結合、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖などの本発明の範囲内で実施される。また組換えＤＮＡの配列分析は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ｌｏｃ．ｃｉｔに記載されている。
【０２２５】
Ａ．一般情報
材料：
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＤＳＭ  ３９７９（ＡＴＣＣ  ２５９８６、以前はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓと呼ばれていた）のゲノムＤＮＡは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）から入手した。ＤＨＣＡ、ＵＤＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡは、それ自体は公知な出発化合物であり、文献に記載されている。他のすべての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＦｌｕｋａ（ドイツ）から入手した。すべての制限酵素エンドヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼおよびイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【０２２６】
培地：
ＬＢ培地：培地１リットル当たり、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含む
【０２２７】
ＡＩ培地（自動誘導培地）：培地１リットル当たり、１００ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．０中に、酵母抽出物２４ｇ、カゼイン加水分解物１２ｇ、グリセロール５ｇ、グルコース５０ｇ、ラクトース２０ｇを含む
【０２２８】
配列：
図２は、野生型７β−ＨＳＤＨ酵素および変異体のアミノ酸配列を示す。しかしながら、いずれの場合も全てがＣ末端ヘキサヒスチジンタグに提供される。このようにして、全ての酵素が単離され、特徴付けられた。
【０２２９】
実施例１：組換え７β−ＨＳＤＨの産生
Ａ）プラスミド形質転換：
制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの切断部位を介して、それぞれの７β−ＨＳＤＨ遺伝子をクローニングした市販の発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）を、組換え７β−ＨＳＤＨ酵素（野生型および変異体酵素）の発現のために使用した。発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）は、ＨＳＤＨ遺伝子をクローニングするときに、一連の６個のヒスチジン分子をコードする遺伝子配列をＨＳＤＨ遺伝子に直接付加することを可能にする。発現後、この配列（ヘキサヒスチジンタグまたはＨｉｓタグと呼ばれる）は、ＨＳＤＨタンパク質のＣ末端に現れる。オリジナルの、または、野生型ＨＳＤＨ遺伝子は、細菌Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６に由来し、それぞれの７β−ＨＳＤＨ遺伝子を含むプラスミドは、ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７β−ＨＳＤＨと呼ばれる。ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７β−ＨＳＤＨプラスミドを形質転換するために、５μｌのライゲーション用混合物を１００μｌのコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨ大腸菌細胞に処理し、形質転換をＨａｎａｈａｎによって記載されたように実施した（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３），ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．５５７）。野生型遺伝子を含むプラスミドおよび変異したＨＳＤＨ遺伝子を含むプラスミドを用いて同じ工程を行なった。本明細書中で通常使用されている大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）Δ７α−ＨＳＤＨは、この株の７α−ＨＳＤＨ遺伝子が欠失している点で区別される。この研究に用いた大腸菌株の詳細な特徴を表１にまとめる。
【０２３０】
【表１０】
0006582040.tif 000019
【０２３１】
Ｂ）発現および細胞の増殖：
発現のために、発現コンストラクト（ｐＥＴ２８ａ（＋）＿７β−ＨＳＤＨプラスミド）を含む大腸菌株を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（１リットル当たり、トリプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ）中で２０時間、２５℃で増殖させた。遠心分離（５０００×ｇ、３０分、４℃）により細胞を収集した。
【０２３２】
Ｃ）粗抽出物の回収：
細胞１ｇ（湿潤質量）当たり４ｍｌの緩衝液を添加して、ペレットを破砕用緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁した。Ｓｏｎｏｐｕｌｓ  ＨＤ２０７０ソニケーター（Ｂａｎｄｅｌｉｎ、ベルリン、ドイツ）を使用して、一定冷却下で、細胞を１分間超音波処理（３０Ｗ出力、５０％作動間隔および１分間の中断）により破砕した。この破砕を３回繰り返した。細胞懸濁液を遠心分離（１８０００×ｇ、３０分、４℃）し、上清を無細胞粗抽出物とした。
【０２３３】
Ｄ）酵素の精製：
Ｈｉｓ−タグは、ＨＳＤＨタンパク質の非常に簡単な精製を可能にする。なぜなら、この配列は、例えば「Ｈｉｓ  Ｐｕｒ  Ｎｉ−Ｎｉ」（Ｎｉｍａｇｅｎ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）などの二価のニッケルイオンを充填した特異的なクロマトグラフィー材料である（ＮＴＡ（Ｎｉ−ニトリロトリアセテート）修飾した支持体に高い特異性で結合するからである。この目的のために、無細胞粗抽出物をこの材料を含む滴下カラムにかける。この滴下カラムは、予め破砕緩衝液（３〜５カラム容量）で平衡化させた。３〜５カラム容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で洗浄することによって、弱く結合するタンパク質を除去した。Ｈｉｓ−タグ−７β−ＨＳＤＨタンパク質をイミダゾール含有溶出緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶離した。この工程は室温で行った。存在するイミダゾールは、緩衝液の交換によって除去された。
【０２３４】
タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄによって記載された方法で測定した（ブラッドフォード試薬９００μｌと１００μｌの試料を混合し、暗所で少なくとも１５分間インキュベートし、次いで、ウシ血清アルブミンで確立した較正カラムに対して５９５ｎｍで測定する）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析を行うために、ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【０２３５】
Ｅ）活性測定：
吸光度の低下を３４０ｎｍで３０秒間にわたって測定する分光アッセイを用いて、７β−ＨＳＤＨおよび変異体の活性を測定した。反応溶液は、全量１ｍｌ中に、８７４μｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液（ｐＨ８．０）；１００μｌの１００ｍＭ  ＤＨＣＡ溶液（５０ｍＭのＫＰｉに溶解したＤＨＣＡ（ｐＨ８））；１０μｌの酵素溶液（任意に希釈）；１６．５μｌの１２．５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ溶液（蒸留Ｈ２Ｏに溶解）を含む。以下においては、活性は単位（Ｕ）で特定され、１Ｕは１μＭ  ＮＡＤＰＨ／分の減少に相当する。
【０２３６】
実施例２：アミノ酸配列６４番目における７β−ＨＳＤＨ変異体の生成およびそれらの特性評価
Ａ）プライマー：
下記の変異導入プライマーを使用して、７β−ＨＳＤＨの位置特異的変異導入を実施した（表２参照）。７β−ＨＳＤＨの遺伝子配列に基づいて、プライマーは、所望するアミノ酸を変換するように選択された。変異体を生成するために以下のプライマーペアを使用した：
【０２３７】
【表１１】
0006582040.tif 000020
【０２３８】
Ｂ）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）−ＰＣＲ：
６４位のアミノ酸のアルギニンをアスパラギン酸に置換した最初の変異体が、野生型酵素よりも著しく高い活性を示した後、その位置にさらなるタンパク質を構成するアミノ酸を組み込み、これらの活性に関するこれらの様々な変異体を試験した。目的とするアミノ酸の変換は「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ−ＰＣＲ」法によって達成できる。このために、以下のＰＣＲ反応を行った（反応混合物は表３を参照）：最初に、９５℃で２分間の初期変性工程を行い、その後、２０サイクルの変性（９５℃で３０秒間）、プライマーのハイブリダイゼーション（６０〜６８℃で１分間）および伸長（６８℃で１３分間）を行った。実施された最後の工程は、６８℃で１０分間の最終伸長であり、その後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は４℃に冷却することによって終了した。用いた鋳型は、７β−ＨＳＤＨ（野生型）の遺伝子を有するｐＥＴ２８ａベクターであった。
【０２３９】
【表１２】
0006582040.tif 000021
【０２４０】
標的化した方法でタンパク質配列中のアミノ酸を変換できるように、目的の遺伝子のＤＮＡ配列に位置特異的変異を行った。この目的のために、互いに相補的であり、それらの配列中に所望の変異を含むプライマーを利用する。使用される鋳型は、変異する遺伝子を含むＮ６−アデニン−メチル化二本鎖プラスミドＤＮＡである。Ｎ６−アデニンメチル化プラスミドＤＮＡを、例えば大腸菌ＤＨ５αなどのｄａｍ＋大腸菌株から単離する。
【０２４１】
ポリメラーゼ連鎖反応は上記のように行われる。ここでは、鋳型を相補化するためにプライマーを伸長させて、所望の変異を有し、鎖の切断部位を有するプラスミドを生じる。他のＰＣＲ反応とは異なり、新たに形成されたＤＮＡ分子はＰＣＲ反応の鋳型として作用できないので、ここではＤＮＡの収量の増加は単に直線的である。
【０２４２】
ＰＣＲ反応が完了した後、ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ  ＡＧ、イエナ、ドイツ）を用いて精製し、親のＮ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを、制限酵素ｄｐｎＩを用いて切断した。この酵素の特異性は、Ｎ６−アデニン−メチル化ＤＮＡを非特異的に切断するが、新たに形成された非メチル化ＤＮＡを特異的に切断しないことである。制限酵素切断は、ＰＣＲ反応混合物に１μｌのｄｐｎＩを添加し、その混合物を３７℃で２時間または一晩インキュベートすることによって行った。７．５μｌのこの混合物を１００μｌの化学的なコンピテントＤＨ５α細胞の形質転換に用いた。
【０２４３】
Ｃ）酵素変異体の活性データ：
６４位において変異導入された変異体の活性測定（実施例１参照）を、以下の表４に示すデータで明らかにした。表の第１列の［Ｒ６４Ｅ］は、タンパク質配列の６４位のアルギニン（Ｒ）が、目的の変異体のグルタミン酸（Ｅ）に置換されたことを意味する。各々のアミノ酸は、国際的な１文字コードを用いて略記される。同様に［Ｒ６４Ｄ］は、アスパラギン酸がこの位置に導入されたことを意味する。
【０２４４】
【表１３】
0006582040.tif 000022
【０２４５】
Ｄ）ミカエリス−メンテン動力学
それぞれの位置の最良の変異体を実施例１Ｄのように精製し、基質ＤＨＣＡおよび補酵素ＮＡＤＰＨの動態定数ｖｍａｘおよびＫＭを決定した。図３は動力学の経過を図示し、表５は動力学的定数を示す。
【０２４６】
【表１４】
0006582040.tif 000023
【０２４７】
表５は、最大速度を野生型酵素の約５倍に増加させることが可能であることを明らかにする。ＫＭ値は同じままである。基質阻害はそれほど顕著ではない。
【０２４８】
実施例３：アミノ酸位置３９における７β−ＨＳＤＨ変異体の生成およびそれらの特性評価
Ａ）プライマー：
表６に列挙した変異導入プライマーを、７β−ＨＳＤＨの位置特異的変異導入のために使用した。７β−ＨＳＤＨの遺伝子配列に基づいて、プライマーは、所望するアミノ酸変換をするように選択された。変異体を生成するために、以下のプライマーペアを使用した：
【０２４９】
【表１５】
0006582040.tif 000024
【０２５０】
Ｂ）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）ＰＣＲ：
３９位のセリンのグリシンへの標的変換は、実施例２Ｂに記載のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲを用いて行った。
【０２５１】
Ｃ）酵素変異体の活性値：
３９位のグリシンの代わりにセリンを含む変異体（７β−ＨＳＤＨ［Ｇ３９Ｓ］）の活性測定（実施例１参照）は、７３５Ｕ／ｍｌの容量活性および５２．９Ｕ／ｍｇのタンパク質特異的酵素活性を示し、一方、野生型酵素を比較すると、９６．８Ｕ／ｍｌの容量活性および８．７Ｕ／ｍｇの特異的活性を有していた。
【０２５２】
Ｄ）ミカエリス−メンテン動力学
動力学的パラメーター定数ｖｍａｘおよびＫＭを精製された酵素を用いて決定した。図４は動力学の経過を図示し、表７は動力学定数を示す。
【０２５３】
【表１６】
0006582040.tif 000025
【０２５４】
表７は、野生型に比べて最大反応速度を約６倍増加させることが可能であることを示す。対照的に、ＫＭ値は４倍低下した。６４位の変異体の場合と同様に、基質阻害はそれほど顕著にはならなかったが、無くなることはなかった。
【０２５５】
実施例４：アミノ酸１７位における７β−ＨＳＤＨ変異体の生成およびそれらの特性評価
Ａ）プライマー：
表８に記載した変異導入プライマーを、７β−ＨＳＤＨの位置特異的変異導入のために使用した。変異体を生成するために以下のプライマーペアを使用した：
【０２５６】
【表１７】
0006582040.tif 000026
【０２５７】
Ｂ）ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）ＰＣＲ：
表８に記載されたアミノ酸の１７位のスレオニンの標的変換は、実施例２Ｂに記載のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲにより行った。
【０２５８】
Ｃ）酵素変異体の活性値：
１７位のスレオニン以外のアミノ酸を含む変異体の活性測定値（実施例１参照）を表９にまとめる。
【０２５９】
【表１８】
0006582040.tif 000027
【０２６０】
実施例５：いくつかの位置におけるアミノ酸変換を含む７β−ＨＳＤＨ変異体の生成およびそれらの特性評価
実施例２〜４に記載された個々の変異体の他に、変異を有利に組み合わせることも可能である。例として、位置３９および６４が同時に改変された二重変異体を生成した。ここでは、位置３９における最良のアミノ酸変換（［Ｇ３９Ｓ］）を、位置６４における最良の変換（［Ｒ６４Ｅ］）と組み合わせた。
【０２６１】
Ａ）二重変異体の生成および活性値
二重変異体を得る方法および活性試験は、２Ｂおよび２Ｃに記載された方法に従った。
【０２６２】
野生型酵素の値と比較した二重変異体の活性値を、表１０にまとめる。
【０２６３】
【表１９】
0006582040.tif 000028
【０２６４】
Ｂ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
異種発現の発現性能の評価を可能とするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。二重変異体を例として用いた。図５は、粗細胞抽出物を用いることにより、この変異体が非常に良好な過剰発現を示しているＳＤＳゲルを示す（おおよそで流した広範なバンド）。３０ｋＤａは、細胞内の可溶性タンパク質が二重変異体のみと高度に一致することを裏付ける。またさらに、当該ゲルは、精製された二重変異体の純度を確認する。変異体の分子量は約２９．９ｋＤａである。
【０２６５】
Ｃ）ミカエリス−メンテン動力学
変異体［Ｇ３９Ｓ／Ｒ６４Ｅ］を精製し（項目３参照）、精製された酵素について動力学的パラメーターを測定した。図６に経過を図示し、表１１に動力学定数を示す。
【０２６６】
【表２０】
0006582040.tif 000029
【０２６７】
図６の（基質ＤＨＣＡに関する）経過の図によれば、３９位と６４位の組み合わせの結果は、もはや７β−ＨＳＤＨが基質阻害を示さないこと分かる。さらに、活性を約７倍まで上昇させることが可能であった。
【０２６８】
本発明の実施例の方法によって達成された改良／改変のまとめ：
ｎ．ｄ．＝測定なし
【０２６９】
【表２１】
0006582040.tif 000030
【０２７０】
【表２２】
0006582040.tif 000031
【０２７１】
【表２３】
0006582040.tif 000032
【０２７２】
本明細書中に記載された刊行物の開示は明示的に参照される。
【図１ａ】
0006582040.tif 000041
【図１ｂ】
0006582040.tif 000042
【図１ｃ】
0006582040.tif 000043
【図１ｄ】
0006582040.tif 000044
【図２ａ】
0006582040.tif 000045
【図２ｂ】
0006582040.tif 000046
【図２ｃ】
0006582040.tif 000047
【図２ｄ】
0006582040.tif 000048
【図３】
0006582040.tif 000049
【図４】
0006582040.tif 000050
【図５】
0006582040.tif 000051
【図６】
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【図７】
0006582040.tif 000053
【配列表】
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