(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数個のエピトープを有する長鎖ペプチド抗原を備えたワクチンにおいて、各エピトープ間配列は、４個〜８個の連続するチロシン、４個〜８個の連続するスレオニン、４個〜８個の連続するアラニン、４個〜８個の連続するヒスチジン、４個〜８個の連続するグルタミン及び４個〜８個の連続するアスパラギンからなる群から選択される一つであることを特徴とするワクチンと、デリバリーシステムとして疎水化多糖とを備え、
前記長鎖ペプチド抗原のアミノ酸長が２８個〜４６個であることを特徴とする組合せワクチン。
【請求項２】
前記ワクチンは、抗がんワクチン、抗菌ワクチン及び抗ウイルスワクチンからなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項１に記載の組合せワクチン。
【請求項３】
前記ワクチンは、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチン、樹状細胞ワクチンからなる群から選択される少なくとも一つのものであることを特徴とする請求項１または２に記載の組合せワクチン。
【請求項４】
前記エピトープ間配列は、６個の連続するチロシン、６個の連続するグルタミン及び６個の連続するアスパラギンからなる群から選択される一つであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の組合せワクチン。
【請求項５】
前記ワクチンは、抗がんワクチンであり、かつペプチドワクチンであることを特徴とする請求項１または４に記載の組合せワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示を促進するエピトープ間配列を含むT細胞誘導ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんに対する免疫応答に関する長年の研究の結果、がん宿主の腫瘍拒絶における細胞性免疫の重要性が明らかになった。特に、ＣＤ８＋キラーＴ細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞）は腫瘍を直接破壊する作用を有するエフェクター細胞であること、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞はＣＤ８＋キラーＴ細胞や抗原提示細胞の働きを増強する重要な調節細胞であること、ならびに樹状細胞やマクロファージといったプロフェッショナルな抗原提示細胞はＴ細胞に抗原を提示し刺激すると共に、ＣＤ８０やＣＤ８６などの共刺激分子やサイトカイン等を介してＴ細胞を活性化することが明らかとなり、以下に述べるように、腫瘍に対する細胞性免疫応答を担う各細胞の役割や位置付けが確立された（非特許文献１）。【０００３】
腫瘍細胞由来のタンパクは、抗原提示細胞に貪食されたあと、細胞内のプロテアソームやプロテアーゼ、ペプチダーゼにより種々の長さのペプチドへと切断される。生じたペプチドのうち、８〜１０アミノ酸のペプチドは主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ, ＭＨＣ）クラスＩ分子に抗原エピトープペプチドとして搭載され、抗原提示細胞の表面で提示され得る。ＣＤ８＋キラーＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ, ＴＣＲ）を用いてこのＭＨＣクラスＩ／抗原ペプチド複合体を特異的に認識し活性化する。活性化したＣＤ８＋キラーＴ細胞は、腫瘍細胞上にも存在するＭＨＣクラスＩ／抗原ペプチド複合体を検出し、グランザイムやパーフォリンなどのエフェクター分子を用いて腫瘍細胞を破壊する。
ＣＤ８＋キラーＴ細胞の十分な活性化には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の働きは重要である（非特許文献２）。抗原提示細胞に取り込まれた抗原タンパクは細胞内のプロテアーゼやペプチダーゼにより種々の長さに切断されるが、そのうち１５〜２０アミノ酸の抗原ペプチドはＭＨＣクラスII分子と複合体を形成し抗原提示細胞上で提示され得る。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞はこれを特異的に認識し活性化する。活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、インターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ, ＩＦＮ）‐γやインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ, ＩＬ）‐２等のサイトカインの分泌を介して、ＣＤ８＋キラーＴ細胞の分化や増殖、機能を増強する。またＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ４０リガンド／ＣＤ４０経路を介して抗原提示細胞を活性化する働きも有し、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により活性化された抗原提示細胞はＣＤ８＋キラーＴ細胞に対する刺激能力が向上する（非特許文献３）。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞にはＢ細胞の抗原特異的ＩｇＧ抗体産生を増強する作用もあることは従来から良く知られている。【０００４】
以上のＴ細胞免疫応答の理解に基づき、腫瘍特異的抗原をワクチン抗原として反復投与し、腫瘍特異的なＣＤ８＋キラーT細胞を患者体内に誘導することでがんの増殖や転移、再発を抑えるがんワクチン療法が考案されている。がんワクチンの抗原の形態は合成ペプチドや組換えタンパク、加工した細胞など様々なものが知られている。発明者らはかつて、腫瘍抗原タンパクの組換え全長タンパクを抗原とするがんワクチンを作製した。全長タンパクには、ＣＤ８＋キラーＴ細胞及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が認識する多様な抗原ペプチドが含まれており、両Ｔ細胞を同時に活性化すると期待される。しかしながら、外因性（細胞外）の抗原タンパクではＭＨＣクラスII経路を介したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化は進行しやすいが、ＭＨＣクラスＩ経路を介したＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性化は進行しにくい。これは抗原提示細胞における外因性抗原タンパクの取り込みと抗原プロセシングの機構上の理由による（非特許文献４）。
そこで国内外では、短鎖のペプチド、主としてＣＤ８＋キラーＴ細胞が認識する８〜１０残基のエピトープペプチドを化学合成し、これを抗原とするワクチンを臨床応用する試みが多くなされている。短鎖ペプチド抗原は抗原提示細胞内への取り込みと抗原プロセシングを経ずに細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合するため、Ｔ細胞への提示は起こりやすい。また、短鎖ペプチドは化学合成による製造が可能で、遺伝子組換え生物を用いる必要がある組換えタンパクの製造に比べて簡便であるという利点がある。【０００５】
しかし、短鎖ペプチド抗原が抗原提示細胞内への取り込みと抗原プロセシングを経ずに、細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合することについて、免疫学上の問題が指摘されている（非特許文献５）。外因性の抗原タンパクでは、共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６など）を備えた樹状細胞やマクロファージのようなプロフェッショナルな抗原提示細胞に貪食され、細胞内でプロセシングされ、適切な濃度と共刺激を伴う様式でT細胞に抗原提示される。一方、短鎖ペプチド抗原は細胞表面のＭＨＣ分子に直接結合するため、抗原の取り込み能力（貪食能力）を持たず共刺激分子も発現しない一般の体細胞でも短鎖ペプチド抗原が大量かつ共刺激を欠く不適切な様式で提示され得る。この場合、短鎖ペプチド抗原とＭＨＣの複合体を認識するT細胞は消耗や細胞死を起こしやすくなり、結果として目的抗原に対する免疫寛容を招く可能性がある。
こうした短鎖ペプチドワクチンの課題を鑑み、長鎖の合成ペプチド抗原の有用性が注目されている（非特許文献５）。長鎖ペプチド抗原は、Ｔ細胞の認識エピトープペプチドを少なくとも二つ以上含むような数十残基のポリペプチドである。長鎖ペプチド抗原は短鎖ペプチドと異なり、そのままではＭＨＣ分子に直接結合できない。長鎖ペプチド抗原ではタンパク抗原と同様、樹状細胞やマクロファージといった貪食能を有するプロフェッショナルな抗原提示細胞に取り込まれ、細胞内でプロセシングを経ることで、初めて長鎖ペプチド抗原に含まれるＴ細胞エピトープペプチドがＭＨＣ分子と複合体を形成し、Ｔ細胞に適切な濃度と共刺激を伴う様式で提示される。抗原の貪食能を欠く一般の体細胞では長鎖ペプチド抗原はワクチン抗原として機能しないため、短鎖ペプチドワクチンと異なりＴ細胞への不適切な抗原提示を生じることがない。また、長鎖ペプチド抗原の製造には化学合成法を用いることができるため、短鎖ペプチド抗原と同様に製造が比較的容易であるという長所も持つ。【０００６】
化学合成で製造する長鎖ペプチド抗原は、配列の自由な設計が可能であることも大きな利点である。長鎖ペプチド抗原は２個以上のＴ細胞エピトープを一本のペプチドに含むように設計されるが、それらＴ細胞エピトープは単一のがん抗原タンパク由来でも、複数のがん抗原タンパク由来でもよい。また、それらＴ細胞エピトープは単一のＭＨＣに拘束性でもよく、複数のＭＨＣに拘束性でもよい。ＣＤ８＋キラーＴ細胞が認識するエピトープとＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が認識するエピトープを、長鎖ペプチド抗原が同時に含むように設計することも可能である。長鎖ペプチド抗原は、このように多様なT細胞を誘導できる高性能のワクチン抗原として機能し得る。ただ、長鎖ペプチド抗原に含まれる一連のエピトープがＴ細胞に効率良く提示されるためには、抗原提示反応の機構に基づき、抗原提示細胞内でプロテアソームやプロテアーゼ、ペプチダーゼによって長鎖ペプチド抗原上の各エピトープ間の配列が適切に切断され、ＭＨＣ分子に結合できる長さと配列のエピトープペプチドとして切り出される必要がある。
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が認識するＭＨＣクラスII結合性エピトープペプチドについては、ＭＨＣクラスII分子上のエピトープペプチド結合溝の末端が開放状態にあり、様々な長さのエピトープペプチドがＭＨＣクラスII分子に結合し得る（非特許文献６）。よって、ＭＨＣクラスII結合性エピトープペプチドでは長さの制限は比較的緩やかである。一方、ＣＤ８＋キラーＴ細胞が認識するＭＨＣクラスI結合性エピトープペプチドでは、ＭＨＣクラスI分子上のエピトープペプチド結合溝の末端が閉鎖状態にあり、８〜１０残基と厳密に限定された長さのエピトープペプチドのみがＭＨＣクラスI分子に結合し得る。よって、特にＭＨＣクラスI結合性エピトープペプチドでは、適切な長さのペプチドが抗原提示細胞内で産生されることが肝要である。【０００７】
ＭＨＣ分子に結合するエピトープペプチドの長さと配列は、細胞内のプロテアソームや種々のプロテアーゼ、ペプチダーゼが関わる複雑な切断反応で決定される。ＭＨＣクラスI結合性エピトープペプチドの産生では、細胞質に存在するプロテアソームが初めに抗原タンパクや長鎖ペプチド抗原を大まかに切断する。生じたペプチド断片の末端をその他のプロテアーゼやペプチダーゼが、一定の基質配列特異性に基づいて切断し、適切な長さになるまで削る（トリミング反応）。この過程でペプチド断片のＮ末端をトリムする酵素群は存在するが、Ｃ末端をトリムする酵素は知られておらず、ＭＨＣクラスＩ結合性エピトープペプチドのＣ末端の決定は最初のプロテアソームによる切断反応のみに依拠している（非特許文献７）。しかし、プロテアソームの基質配列特異性は詳細には明らかになっておらず、プロテアソームに切断されやすいペプチド配列を予測するのは困難である。
以上のエピトープ産生機構を鑑みれば、長鎖ペプチド抗原に含まれるエピトープの間の配列が細胞内のプロテアソームやプロテアーゼ、ペプチダーゼによりいかに切断されるかが、その前後のエピトープペプチドの産生を大きく左右し、その結果、長鎖ペプチド抗原を用いるワクチンによるT細胞の誘導を規定する非常に重要な因子になると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｉｂａｓ, Ａ., ｅｔ ａｌ. Ｃｌｉｎ. Ｏｎｃｏｌ. ２００３；２１（１２）：２４１５−２４３２
【非特許文献２】Ｓｈｉｋｕ, Ｈ. Ｉｎｔ. Ｊ. Ｈｅｍａｔｏｌ. ２００３；７７（５）：４３５−８.
【非特許文献３】Ｂｅｈｒｅｎｓ, Ｇ., ｅｔ ａｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ. ２００４；８２（１）：８４−９０
【非特許文献４】Ｓｈｅｎ, Ｌ. ＆ Ｒｏｃｋ, Ｋ. Ｌ. Ｃｕｒｒ. Ｏｐｉｎ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２００６；１８（１）：８５−９１
【非特許文献５】Ｍｅｌｉｅｆ, Ｃ. Ｊ. Ｍ., ＆ ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ, Ｓ. Ｈ. Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ. Ｃａｎｃｅｒ, ２００８；８（５）：３５１−３６０.
【非特許文献６】Ｈｏｌｌａｎｄ, Ｃ. Ｊ., ｅｔ ａｌ. Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２０１３；４：１７２.
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｂｅｒｇ, Ａ. Ｌ., ｅｔ ａｌ. Ｍｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ.  ２００２；３９（３−４）：１４７−６４.
【非特許文献８】Ｍｕｒａｏｋａ, Ｄ., ｅｔ ａｌ. Ｖａｃｃｉｎｅ.  ２０１３；３１：２１１０−２１１８.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ある長鎖ペプチドやタンパクに含まれるＴ細胞エピトープペプチドが効率良く抗原提示されるためには、長鎖ペプチドやタンパクからそのエピトープペプチド配列が細胞内のプロテアソームやプロテアーゼ、ペプチダーゼによって適切に切り出されなければならない。そのためには、エピトープ間の配列がプロテアソームやプロテアーゼ、ペプチダーゼの認識部位をうまく含んでいる必要がある。
従来技術では、どのようなエピトープ間配列がその条件を満たすか、ほとんど検討されていなかった。そのため、エピトープ間配列を未検討のまま設計した長鎖ペプチド抗原を用いるワクチンでは、含まれるエピトープペプチドを認識するＴ細胞の誘導が弱いか、確認できないことがある。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、複数個のエピトープペプチドを含有する長鎖ペプチド抗原において、各エピトープペプチドの抗原提示を有効に達成するエピトープ間配列を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するための発明に係る複数個のエピトープを有する長鎖ペプチド抗原を備えたワクチンにおいて、各エピトープ間配列は、２個〜１０個の連続するチロシン、２個〜１０個の連続するスレオニン、２個〜１０個の連続するアラニン、２個〜１０個の連続するヒスチジン、２個〜１０個の連続するグルタミン及び２個〜１０個の連続するアスパラギンからなる群から選択される一つであることを特徴とし、特にチロシン、グルタミン又はアスパラギンであることが好ましい。このとき、連続するチロシン、連続するスレオニン、連続するヒスチジン、連続するグルタミン又は連続するアスパラギンの個数は、４個〜８個であることが好ましく、更に４個〜６個であることが好ましく、特に６個であることが好ましい。
上記構成を備えることにより、長鎖ペプチド抗原が体内で生体内の酵素によって、各エピトープが抗原提示を行えるように切断されるので、各エピトープが有効に抗原提示能を発揮する。また、連続するチロシンから成るエピトープ間配列を有する長鎖ペプチド抗原を用いたワクチンは、抗原提示細胞への取込みも向上する。
前記ワクチンは、抗がんワクチン（樹状細胞ワクチンを含む）、抗菌ワクチン、及び抗ウイルスワクチンからなる群から選択される一つのものであることが好ましい。
また、前記ワクチンは、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン及びｍＲＮＡワクチン、樹状細胞ワクチンからなる群から選択される少なくとも一つのものであることが好ましい。樹状細胞ワクチンとする場合には、ペプチド抗原またはｍＲＮＡを添加する。
また、前記ワクチンは、ペプチドワクチンである場合はデリバリーシステムとして疎水化多糖、特にコレステロール修飾プルラン（ＣＨＰ）と組み合わせてワクチンとすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ワクチン中の複数個のエピトープが有効に抗原提示を行えるので、高い効果を有するワクチンを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】複数個のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む長鎖ペプチドワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンによる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導に及ぼす影響を調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。各エピトープ間の配列は６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）、プロリン（Ｐ６）またはスレオニン（Ｔ６）のいずれかとした。各長鎖ペプチド抗原をデリバリーシステムの一種であるコレステロール修飾プルラン（ＣＨＰ）と複合体化し、ワクチンとしてマウスに投与した。投与の際、免疫増強剤としてＣｐＧオリゴＤＮＡを同時投与した。最終投与の１週間後に脾臓細胞を回収し、各エピトープ配列に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を細胞内サイトカイン染色法で測定した。
【図２】複数個のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む長鎖ペプチドワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンの治療効果に及ぼす影響を調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。各エピトープ間の配列は６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）またはプロリン（Ｐ６）のいずれかとした。各長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化し、ワクチンとしてマウスに単回投与した。対照として、ｍＥＲＫ２ ９ｍペプチドのみから成る短鎖ペプチドワクチンをフロイント不完全アジュバントと混合して投与した。投与の際、免疫増強剤としてＣｐＧオリゴＤＮＡを同時投与した。投与翌日、腫瘍抗原としてｍＥＲＫ２を発現し、同抗原由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープｍＥＲＫ２ ９ｍを提示するマウス繊維芽肉腫細胞株ＣＭＳ５ａを皮下移植し、その増殖を経時的に記録した。
【図３】複数個のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む長鎖ペプチドワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンによる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導に及ぼす影響を調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＮＭＥを合成した。図１のＭＥＮとは、３種のエピトープの順序が異なる。各エピトープ間の配列は、６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）またはプロリン（Ｐ６）のいずれかとした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを図１と同様にマウスに投与し、各エピトープ配列に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を細胞内サイトカイン染色法で測定した。
【図４】連続するチロシンから成るエピトープ間配列の有用性が、その前後のエピトープ配列に影響されるかを調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮ、ＥＮＭ、ＮＭＥを合成した。ＭＥＮ、ＥＮＭ、ＭＥＮは、３種のエピトープの順序が異なる。各エピトープ間の配列は、６個連続したチロシン（Ｙ６）とした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを図１と同様にマウスに投与し、各エピトープ配列に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を細胞内サイトカイン染色法で測定した。
【図５】エピトープ間配列として天然配列と連続チロシン配列の違いがワクチンによる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及び特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導に及ぼす影響を調べた。ヒトＮＹ‐ＥＳＯ‐１抗原に由来するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＮＹ ｐ８１）及びマウスＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＮＹ ｐ９１）を含む長鎖ペプチド抗原ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）及びＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）を合成した。エピトープ間の配列は、ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）ではＮＹ‐ＥＳＯ‐１の天然アミノ酸配列を保持し、ＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）では６個連続したチロシン（Ｙ６）とした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを図１と同様にマウスに投与し、各エピトープ配列に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を細胞内サイトカイン染色法で測定した。
【図６】連続するチロシンから成るエピトープ間配列について、チロシンの個数とワクチンによる特異的Ｔ細胞誘導の関係を調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。各エピトープ間の配列は、１〜６個の連続したチロシンとした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを図１と同様にマウスに投与し、各エピトープ配列に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を細胞内サイトカイン染色法で測定した。
【図７】連続するチロシンから成るエピトープ間配列について、チロシンの個数とワクチンによる特異的Ｔ細胞誘導の関係を調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。各エピトープ間の配列は、５〜１０個の連続したチロシンとした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを図１と同様にマウスに投与し、各エピトープ配列に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を細胞内サイトカイン染色法で測定した。
【図８】長鎖ペプチドワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンの抗原提示細胞への取込みに及ぼす影響を調べた。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。各エピトープ間の配列は、６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）またはプロリン（Ｐ６）のいずれかとした。蛍光色素ＦＡＭで標識された各長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化し、試験管内でマウス樹状細胞およびマウスマクロファージに投与した。６０分後に各細胞への蛍光取込みについて、樹状細胞では図中のＰ５画分、マクロファージでは図中のＰ６画分としてフローサイトメトリーで測定した。
【図９】長鎖ペプチドワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンの抗原提示細胞への取込みに及ぼす影響を調べた。図８と同様のＦＡＭ標識長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化し、マウスに皮下投与した。１６時間後に投与部位の所属リンパ節より細胞を回収し、樹状細胞およびマウスマクロファージへの蛍光取込みについて、樹状細胞では図中のＰ４画分、マクロファージでは図中のＰ５画分としてフローサイトメトリーで測定した。
【図１０】複数個のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む長鎖ペプチドワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンによる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導に及ぼす影響を調べた。３種のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＮＹ ｐ１５７：ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性、ＭＡ４  ｐ１４３：ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性 ｐ２３５）を含む長鎖ペプチド抗原ＮＭＷを合成した。各エピトープ間の配列は図示したアミノ酸が６個連続したものとした。各長鎖ペプチド抗原をデリバリーシステムの一種であるコレステロール修飾プルラン（ＣＨＰ）と複合体化し、ワクチンとして試験管内で不死化ヒトＢ細胞株（ＬＣＬ）に投与した。これを抗原提示細胞として、ＮＹ  ｐ１５７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローン１Ｇ４細胞と共培養し、抗原提示による１Ｇ４細胞の活性化をＩＦＮ―γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法で測定した。陽性対照にはＮＹ  ｐ１５７短鎖ペプチドを投与したＬＣＬ、陰性対照には抗原未添加のＬＣＬを抗原提示細胞に用いた。
【図１１】複数個のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むＲＮＡワクチンのエピトープ間配列の違いが、ワクチンによる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導に及ぼす影響を調べた。３種のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＮＹ ｐ１５７：ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性、ＭＡ４  ｐ１４３：ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性、ＷＴ１：ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性ｐ２３５）を含む長鎖ペプチド抗原ＮＭＷをコードするｍＲＮＡを合成した。各エピトープ間の配列は図示したアミノ酸が６個連続したものとした。各ｍＲＮＡをワクチンとして、試験管内でＬＣＬに電気穿孔法を用いて導入した。これを抗原提示細胞として、ＮＹ  ｐ１５７に特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞クローン１Ｇ４細胞またはＭＡ４  ｐ１４３に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＲＮＴ００７＃４５細胞と共培養し、抗原提示によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をＩＦＮ―γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法で測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
＜材料及び方法＞
（１）試験動物
ＢＡＬＢ／ｃマウスは６〜１２週齢の雌を日本SLCから購入し、三重大学医学部動物センターにて飼育した。動物実験のプロトコールについては、三重大学医学部の倫理委員会の承認を得た。
【００１４】
（２）ペプチド
合成長鎖ペプチドはＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社から購入した。合成長鎖ペプチドの配列は次の通りであった。
ＭＥＮ（Ｙ６）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１）
ＭＥＮ（Ｇ６）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＧＧＧＧＧＧＱＹＩＨＳＡＮＶＬＧＧＧＧＧＧＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号２）
ＭＥＮ（Ｐ６）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＰＰＰＰＰＰＱＹＩＨＳＡＮＶＬＰＰＰＰＰＰＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号３）
ＭＥＮ（Ｔ６）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＴＴＴＴＴＴＱＹＩＨＳＡＮＶＬＴＴＴＴＴＴＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号４）
ＮＭＥ（Ｙ６）：ＲＧＰＥＳＲＬＬＹＹＹＹＹＹＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号５）
ＮＭＥ（Ｇ６）：ＲＧＰＥＳＲＬＬＧＧＧＧＧＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＧＧＧＧＧＧＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号６）
ＮＭＥ（Ｐ６）：ＲＧＰＥＳＲＬＬＰＰＰＰＰＰＳＮＰＡＲＹＥＦＬＰＰＰＰＰＰＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号７）
ＥＮＭ（Ｙ６）：ＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬＹＹＹＹＹＹＳＮＰＡＲＹＥＦＬ（配列番号８）
ＭＥＮ（Ｙ１）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号９）
ＭＥＮ（Ｙ２）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１０）
【００１５】
ＭＥＮ（Ｙ３）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１１）
ＭＥＮ（Ｙ４）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１２）
ＭＥＮ（Ｙ５）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１３）
ＭＥＮ（Ｙ８）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＹＹＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＹＹＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬL（配列番号１４）
ＭＥＮ（Ｙ１０）：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＱＹＩＨＳＡＮＶＬＹＹＹＹＹＹＹＹＹＹＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１５）
ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）：ＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬＰＶ（配列番号１６）
ＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）：ＧＰＥＳＲＬＬＹＹＹＹＹＹＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ（配列番号１７）
ＮＭＷ（Ａ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＡＡＡＡＡＡＮＹＫＲＣＦＰＶＩＡＡＡＡＡＡＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号１８）
ＮＭＷ（Ｅ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＥＥＥＥＥＥＮＹＫＲＣＦＰＶＩＥＥＥＥＥＥＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号１９）
ＮＭＷ（Ｇ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＧＧＧＧＧＧＮＹＫＲＣＦＰＶＩＧＧＧＧＧＧＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２０）
【００１６】
ＮＭＷ（Ｈ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＨＨＨＨＨＨＮＹＫＲＣＦＰＶＩＨＨＨＨＨＨＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２１）
ＮＭＷ（Ｎ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＮＮＮＮＮＮＮＹＫＲＣＦＰＶＩＮＮＮＮＮＮＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２２）
ＮＭＷ（Ｐ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＰＰＰＰＰＰＮＹＫＲＣＦＰＶＩＰＰＰＰＰＰＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２３）
ＮＭＷ（Ｑ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＱＱＱＱＱＱＮＹＫＲＣＦＰＶＩＱＱＱＱＱＱＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２４）
ＮＭＷ（Ｓ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＳＳＳＳＳＳＮＹＫＲＣＦＰＶＩＳＳＳＳＳＳＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２５）
ＮＭＷ（Ｙ６）：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＹＹＹＹＹＹＮＹＫＲＣＦＰＶＩＹＹＹＹＹＹＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号２６）
合成短鎖ペプチドはシグマジェノシスから購入した。ペプチドのアミノ酸配列は次の通りであった。
ＭＡ ｐ２６５：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ（配列番号２７）
ｍＥＲＫ２ ９ｍ：ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ（配列番号２８）
ＮＹ ｐ８１：ＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号２９）
ＮＹ  ｐ１５７：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号３０）
【００１７】
ＲＮＡワクチンの合成に用いた鋳型ｃＤＮＡはオペロンバイオテクノロジ―株式会社より購入した。ｃＤＮＡの配列は以下の通りであった。
ＮＭＷ（Ｙ６）：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＣＣＣＡＡＴＧＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴ ＣＣＣＣＧＴＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＣＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号３１）
ＮＭＷ（Ｔ６）：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＴＧＣＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＧＡＴＧＴ ＴＴＣＣＣＣＧＴＧＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＴＡＴＡＣＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号３２）
ＮＭＷ（Ｇ６）：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＡＴＧ ＴＴＴＣＣＣＣＧＴＧＡＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号３３）
ＮＭＷ（Ｐ６）：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＧＧＴＧＴ ＴＴＣＣＣＣＧＴＧＡＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＣＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号３４）
【００１８】
（３）その他の試薬
コレステロール修飾プルラン（略称ＣＨＰ）（ＣＨＰ−８０Ｔ）は（株）日油より入手した。ＣｐＧオリゴＤＮＡは北海道システムサイエンスより購入した。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４モノクローナル抗体（クローンＲＭ４‐５）、ＰｅｒＣＰ‐Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体（クローン５３‐６．７）、ＡＰＣ標識抗ＩＦＮ‐γ抗体（クローンＸＭＧ１．２）はｅＢｉｏｓｃｉｅｃｅ又はＢＤバイオサイエンスから購入した。抗ヒトＩＦＮ‐γ抗体、ビオチン化抗ヒトＩＦＮ‐γ抗体はＭａｂｔｅｃｈ社から購入した。
（４）長鎖ペプチド抗原とＣＨＰの複合体の作製
長鎖ペプチドを１０ｍｇ／ｍLの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ＣＨＰは１０ｍｇ／ｍLの濃度で６Ｍ尿素含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。１ｍL（１０ｍｇ）の長鎖ペプチド溶液と２０ｍL（２００ｍｇ）のＣＨＰ溶液を混合し、暗所にて室温で一晩放置した。混合液を透析膜（分子量カット：３,５００，サーモサイエンティフィック社）に移し、透析外液として容積比１００倍以上の０.６Ｍ尿素含有ＰＢＳに対し４℃で２時間から一晩透析した。次いで、透析外液として容積比１００倍以上の０.０６Ｍ尿素含有ＰＢＳに対し４℃で２時間から一晩透析した。再び、透析外液として容積比１００倍以上のＰＢＳに対し４℃で２時間から一晩透析した。透析内液を回収し、孔径０.４５μｍまたは０.２２μｍの濾過滅菌フィルターで濾過後、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定し、長鎖ペプチドの分子吸光係数からその最終濃度を求めた。
【００１９】
（５）マウスへのワクチン投与と脾臓細胞の分離
ＣＨＰ／長鎖ペプチド複合体をワクチンとして、またＣｐＧオリゴＤＮＡを免疫増強剤として同時にマウスに投与した。投与は、マウスの背部皮下に注射して行った。投与量は、ＣＨＰ／長鎖ペプチド複合体は長鎖ペプチドとして投与１回につき０.０５〜０.１ｍｇ相当を投与した。ＣｐＧオリゴＤＮＡは投与１回につき０.０５ｍｇを投与した。最終投与の１週間後に、投与マウスから脾臓細胞を次の要領で分離した。マウスから脾臓を単離し、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し脱血した。スライドガラスを使いて脾臓を磨砕した後、遊離した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に回収した。遠心分離（４００×ｇ、５分、４℃）後に上清を除去し、２ｍLのＡＣＫ溶液を加えて細胞を１分間処理した。１８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、遠心分離（４００×ｇ、５分、４℃）した。上清を除き、細胞を適当な量のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。細胞数を計数した後、１×１０７個／ｍＬの細胞濃度になるように１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した。
【００２０】
（６）マウス脾臓細胞の細胞内サイトカイン染色
２４穴培養プレート（ヌンク）に、マウス脾臓細胞を１ウェルあたり５×１０６個／０．５ ｍＬで添加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用の短鎖ペプチドとしてＮＹ ｐ８１、ＭＡＧＥ ｐ２６５又はｍＥＲＫ２ ９ｍを、あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用にＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）またはＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）を１０ μＭの濃度で添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で６時間培養を行った。その後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて１０倍希釈したＧｏｌｄｉＰｌｕｇ（ＢＤバイオサイエンス）を１ウェル辺り５０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で６時間培養を行った。細胞を回収し、９６ウェル丸底マイクロプレート（ヌンク）に移した。遠心分離（１２００ｒｐｍ, １分, ４℃）して上清を除いた後、１ウェル当たり５０μＬの染色用バッファー（０.５％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ）に懸濁した。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体またはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体を添加し、混合した後、４℃の暗所にて１５分間静置した。２００μＬの染色用バッファーで細胞を２回洗浄した後、１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファー（ＢＤバイオサイエンス）を添加し、穏やかに混合した。室温の暗所にて２０分間静置した後、１００μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤバイオサイエンス）で２回洗浄した。各種の抗サイトカイン抗体を添加した５０μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーを細胞に加えて穏やかに懸濁した後、室温の暗所にて１５分間静置した。１００μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで細胞を２回洗浄した後、染色用バッファー２００μＬに再懸濁を行い、丸底ポリスチレンチューブ（ＢＤバイオサイエンス）へと移した。細胞はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ，ＢＤバイオサイエンス）にて、付属の解析ソフトウェア（ＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて解析した。
【００２１】
（７）マウス腫瘍増殖試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスに３‐メチルコラントレンを投与して誘発した繊維芽肉腫から単離したＣＭＳ５細胞株より得られたサブクローンＣＭＳ５ａ細胞株は、腫瘍抗原として変異ＥＲＫ２（ｍＥＲＫ２）を発現し、ｍＥＲＫ２由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを提示している。Ｔ７５フラスコ（ヌンク）に培養したＣＭＳ５ａ細胞株を０.５％トリプシン含有ＰＢＳを用いて剥離し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に回収した。遠心分離（４００×ｇ, ５分, ４℃）した後に上清を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地にて２回洗浄後、１×１０6個／１００μＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１００μＬ／個体の用量でＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下移植した。ＣＨＰ／長鎖ペプチド複合体と免疫増強剤は、腫瘍移植の７日前に投与した（予防的条件）。腫瘍移植後、経時的に腫瘍の長径と短径を測定し、その積を腫瘍サイズとして記録した。腫瘍増殖試験におけるデータの比較は、マイクロソフトエクセル（マイクロソフト社）を用いてスチューデントｔ検定により行った。
【００２２】
（８）長鎖ペプチド抗原の抗原提示細胞への取込み
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける長鎖ペプチド抗原の抗原提示細胞への取込みは、以下のようにして測定した。蛍光色素で標識した長鎖ペプチドを前述の方法でＣＨＰと複合体化した。正常マウスより分離した脾臓細胞を２４ウェルプレートに１×１０６個／０.５ｍＬ／ウェルで添加した。各々のＣＨＰ/蛍光標識長鎖ペプチド複合体を１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃にて培養した。６０分後に細胞を回収し、抗ＣＤ１１ｃ抗体および抗Ｆ４／８０抗体で染色した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ１１ｃ＋細胞（樹状細胞）とＦ４／８０＋細胞（マクロファージ）への蛍光標識長鎖ペプチド抗原の取込みを観察した。
動物個体における抗原提示細胞への長鎖ペプチド抗原取り込み試験は、次のように行った。長鎖ペプチドを蛍光標識しＣＨＰナノゲルと複合体してＢＡＬＢ／ｃマウスへ皮下投与した。投与１６時間後、リンパ節より細胞を回収し、抗ＣＤ１１ｃ抗体および抗Ｆ４／８０抗体で染色後、ＣＤ１１ｃ＋細胞（樹状細胞）とＦ４／８０＋細胞（マクロファージ）への蛍光標識長鎖ペプチド抗原の取り込みをフローサイトメトリーにより解析した。
【００２３】
（９）不死化Ｂ細胞株（ＬＣＬ）への長鎖ペプチドワクチン投与
凍結保管していたＬＣＬをＲＰＭＩ培地で洗浄し、１.２５×１０６／ｍＬとなるようにＸ−ＶＩＶＯ１５培地に懸濁した。これをポリプロピレンチューブに０.４ｍＬずつ分注し、各チューブに０.１ｍＬのワクチン溶液（ペプチドとして０.１ｍｇ／ｍＬ)を加えた。３７℃, ５％ＣＯ２存在下で２４時間培養し、抗原提示細胞として用いた。
（１０）不死化Ｂ細胞株（ＬＣＬ）へのＲＮＡワクチン投与
（９）と同様に洗浄・懸濁したＬＣＬに対し、ＥＣＭ８３０を用いた電気穿孔法（３００Ｖ, ７００μｓ）によりｍＲＮＡを導入した。３７℃, ５％ＣＯ２存在下で２４時間培養し、抗原提示細胞として用いた。
【００２４】
（１１）ＥＬＩＳＰＯＴ法
ＥＬＩＳＰＯＴ専用の９６ウェルプレート（ミリポア社、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＡ、 ＭＡＨＡＳ４５１０）に適切な濃度に希釈した捕捉用抗ＩＦＮ−γ抗体を７５μＬずつ分注し、４℃で一夜静置した。液を廃棄し、ＲＰＭＩ培地で洗浄した後、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地を１００μＬずつ分注し、３７℃で１時間以上静置した。液を廃棄し、（９）または（１０）で調製したＬＣＬを５×１０４個／１００μＬ／ウェルとなるように調整し、各ウェルに添加した。凍結保管していたＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを解凍・洗浄し、５×１０５／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ培地で調整した後、０.１ｍＬずつを各ウェルに添加した。３７℃, ５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、液を廃棄し、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ―Ｔ）で良く洗浄した。ビオチン標識した検出用ＩＦＮ−γ抗体を適切な濃度に希釈し、０.１ｍＬずつ各ウェルに分注した。４℃で一夜放置した後、ＰＢＳ―Ｔで良く洗浄し、適切な濃度に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを０.１ｍＬずつ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ―Ｔで良く洗浄した。発色液を０.１ｍＬずつ添加し、室温で５分間から３０分間反応させた。スポットの発生が認められたら、水で洗浄して反応停止した。
（１２）長鎖ペプチド抗原をコードするｍＲＮＡの作製
目的の長鎖ペプチド抗原をコードするｃＤＮＡを、合成遺伝子としてオペロンバイオテクノロジー株式会社から購入した。これをｐｃＤＮＡ３.１ベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。ｐｃＤＮＡ３.１に含まれるＴ７プロモーター上のプライミングサイトを利用し、ライフテクノロジー社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔなどを用いて、常法に従いｍＲＮＡを合成した。
【００２５】
＜試験結果＞
複数個のＴ細胞エピトープを含む長鎖ペプチドを抗原とするワクチンにおいて、エピトープ間配列の違いにより、各エピトープによる特異的Ｔ細胞誘導の成否に影響が生じることを図１に示す。ヒト腫瘍抗原のＭＡＧＥ‐Ａ４、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１及びマウス腫瘍抗原の変異ＥＲＫ２（ｍＥＲＫ２）に由来する３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍを含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。３種のエピトープの間の配列は６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）、プロリン（Ｐ６）またはスレオニン（Ｔ６）のいずれかとした。各長鎖ペプチド抗原をデリバリーシステムの一種であるコレステロール修飾プルラン（ＣＨＰ）と複合体化し、ワクチンとしてマウスに投与した。エピトープ間配列にＹ６またはＴ６を採用した長鎖ペプチドワクチンでは、３種の全てのエピトープに対応する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が明確に誘導された。これに対しエピトープ間配列にＧ６またはＰ６を用いたワクチンでは、３種のエピトープに対する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は明らかに弱いものであった。このことから、エピトープ間配列がその前後のエピトープによるＴ細胞誘導に大きく影響すること、エピトープ間配列としては連続したチロシンまたはスレオニンが好ましいことが明らかとなった。
長鎖ペプチド抗原のエピトープ間配列の違いがワクチンによる抗腫瘍効果に及ぼす影響について、マウス腫瘍移植モデルを用いて検討した（図２）。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成し、各エピトープ間の配列は６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）またはプロリン（Ｐ６）のいずれかとした。各長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化し、ワクチンとしてマウスに単回投与した。対照として、ｍＥＲＫ２ ９ｍペプチドのみから成る短鎖ペプチドワクチンを投与した。投与翌日、ｍＥＲＫ２抗原由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープｍＥＲＫ２ ９ｍを提示するマウス繊維芽肉腫細胞株ＣＭＳ５ａを皮下移植し、その増殖を経時的に記録した。長鎖ペプチド抗原ＭＥＮ（Ｙ６）を用いるワクチンでは、腫瘍の増殖が顕著に抑制された（ｐ＜０.０５）。これと比較して、ＭＥＮ（Ｇ６）またはＭＥＮ（Ｐ６）を用いるワクチン、もしくはｍＥＲＫ２ ９ｍ短鎖ペプチドワクチンでは、腫瘍増殖の有意な抑制は認められなかった。図１で認められたエピトープ間配列の違いから生じた特異的ＣＤ８＋キラーT細胞の誘導の差異が、ワクチンによる治療効果に大きな影響を及ぼしたと考えられる。また、最適なエピトープ間配列を採用することによって、長鎖ペプチドワクチンの方が短鎖ペプチドワクチン（ここではｍＥＲＫ２ ９ｍペプチドを抗原としたワクチン）を凌駕する治療効果を発揮することも明らかとなった。
【００２６】
図１の場合とは長鎖ペプチド抗原上のエピトープの順序が異なる、すなわちエピトープ間配列の前後のエピトープ配列が異なるときの連続チロシン配列のエピトープ間配列としての有用性について検討した。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＮＭＥを合成した。ＮＭＥは図１のＭＥＮとは３種のエピトープの順序が異なる。各エピトープ間の配列は、６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）またはプロリン（Ｐ６）のいずれかとした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンをマウスに投与したところ、図１と同様、エピトープ間配列にＹ６を用いたワクチンで３種の全てのエピトープに対応する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が明確に誘導された（図３）。これに対し、Ｇ６またはＰ６を用いたワクチンでは、３種のエピトープのうち１〜２種のエピトープに対する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導が認められなかった。エピトープ間配列の前後のエピトープ配列の影響をさらに調べるため、エピトープ間配列は６個連続したチロシン（Ｙ６）に固定し、３種のエピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）の順序を変えた長鎖ペプチド抗原ＭＥＮ、ＥＮＭ、ＮＭＥを用意した。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンをマウスに投与したところ、いずれの長鎖ペプチド抗原においても３種の全てのエピトープに対応する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が明確に誘導された（図４）。よって、連続したチロシンからなるエピトープ間配列を含む長鎖ペプチド抗原では、エピトープ間配列の前後の配列に関わらず、全てのエピトープに対する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導できることが分かった。
【００２７】
長鎖ペプチドワクチンでは、標的抗原とするタンパクの天然アミノ酸配列をそのまま長鎖ペプチド抗原の配列に用いることが多い。一方、これまでの試験結果から、エピトープ間の配列によってはその前後のエピトープが適切に機能しないことが明らかとなった（図１〜３）。よって、エピトープ間配列が天然アミノ酸配列であっても、その前後のエピトープの働きに好ましくない影響を及ぼすことがあり得ると考えた。そこで、ヒト腫瘍抗原ＮＹ‐ＥＳＯ‐１に由来するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＮＹ ｐ８１又はＮＹ ｐ８２）およびマウスＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＮＹ ｐ９１）を含む長鎖ペプチド抗原ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）およびＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）を合成した。エピトープ間の配列は、ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）ではＮＹ‐ＥＳＯ‐１の天然アミノ酸配列を保持し、ＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）では６個連続したチロシン（Ｙ６）とした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンをマウスに投与したところ、ＮＹ ｐ８１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導はＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）を抗原とするワクチンではほとんど認められなかったが、ＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）を抗原とするワクチンでは顕著であった（図５）。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープとしてＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）はＮＹ ｐ８１（ＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号２９））を含み、ＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）はＮＹ ｐ８２（ＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号３５））を含む点で差異があるが、ＮＹ ｐ８２はＮＹ ｐ８１に比べて免疫原性が乏しいことを確認しており（非特許文献８）、ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）よりＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）が優れていたのはこの差異に依らない。また、ＮＹ ｐ９１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導は、ＥＳＯ１ ＬＰ（天然型）とＥＳＯ１ ＬＰ（Ｙ６）のいずれにおいても明確に認められた。以上より、天然アミノ酸配列由来のエピトープ間配列は機能しないことがあること、連続チロシン配列をエピトープ間配列に選べば、その問題も解決できることが明らかとなった。
【００２８】
連続するチロシンがエピトープ間配列として有用であるとして、その最適な個数について検討した。３種のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ配列（ＭＡ ｐ２６５、ＮＹ ｐ８１、ｍＥＲＫ２ ９ｍ）を含む長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。各エピトープ間の配列は、１〜６個（図６）または５〜１０個（図７）の連続したチロシンとした。各長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを図１と同様にマウスに投与し、誘導される特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を測定した。１〜６個のチロシンを比較した場合（図６）、１番目のエピトープであるＭＡ ｐ２６５と３番目のエピトープであるＮＹ ｐ８１に関しては、エピトープ間配列が６個のチロシン（Ｙ６）の時が特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が最も高く、チロシンの個数が減るに従いＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は弱まる傾向にあった。２番目のエピトープであるｍＥＲＫ２ ９ｍについては、エピトープ間配列が４個のチロシン（Ｙ４）の時が特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が最も高く、チロシンの個数が減るに従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は弱まる傾向にあった。このｍＥＲＫ２ ９ｍではエピトープ間配列が６個のチロシン（Ｙ６）の場合、４個のチロシン（Ｙ４）のときよりは劣るが、ある程度の特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が認められた。以上の３種のエピトープでの結果を鑑み、エピトープ間配列のチロシンの個数としては６個が最も良く、次いで４個が良く、３個以下は好ましくないと考えられた。５〜１０個のチロシンを比較した場合（図７）、１番目のエピトープであるＭＡ ｐ２６５については、エピトープ間配列のチロシンの個数による特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導への明らかな影響は認められなかった。２番目のエピトープであるｍＥＲＫ２ ９ｍについては、エピトープ間配列が６個のチロシン（Ｙ６）の時が特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が最も高く、チロシンの個数がそれ以外の場合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は弱まる傾向にあった。３番目のエピトープであるＮＹ ｐ８１に関しては、エピトープ間配列のチロシンの個数が８個（Ｙ８）の場合を除き、チロシンの個数による特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導への明らかな影響は認められなかった。３種のエピトープでの結果を鑑み、エピトープ間配列のチロシンの個数としては６個が最もよく、それより多くなっても概ね変わらないと考えられた。以上より、エピトープ間配列として連続するチロシンの個数は４個〜８個が好ましく、４個〜６個がより好ましく、６個が特に好ましいことが明らかとなった。
【００２９】
エピトープ間配列の違いがその前後のエピトープによる特異的Ｔ細胞誘導に影響するとして、その機序はエピトープ間配列が抗原提示細胞内のプロテアソームなどにより適切に切断されるか否かによると考えられる（非特許文献７）。その他の機序を探る目的で、エピトープ間配列を６個連続したチロシン（Ｙ６）、グリシン（Ｇ６）またはプロリン（Ｐ６）のいずれかとした長鎖ペプチド抗原ＭＥＮを合成した。蛍光色素ＦＡＭで標識した各長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化し、試験管内で樹状細胞とマクロファージを含むマウス脾臓細胞に投与した。樹状細胞とマクロファージへの蛍光の取込みを測定したところ、エピトープ間配列の違いにより細胞への取込みが異なるという想定外の所見を得た（図８）。すなわち、エピトープ間配列にＹ６を採用した長鎖ペプチド抗原は、Ｇ６やＰ６を用いた場合と比較し、細胞への取込みが樹状細胞とマクロファージのいずれにおいても著しく高かった。同様の所見はマウス個体での試験でも得られた。図８と同様のＦＡＭ標識長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化し、マウスに皮下投与した。投与部位の所属リンパ節に存在する樹状細胞およびマウスマクロファージへの蛍光取込みを測定した。マクロファージでは、エピトープ間配列にＹ６を採用した長鎖ペプチド抗原の取込みが明確に認められた。これに対し、Ｇ６やＰ６を採用した長鎖ペプチド抗原の取込みはほとんど認められなかった。樹状細胞では、いずれの長鎖ペプチド抗原においても取込みが認められなかった。図８の結果と合わせ、連続するチロシンをエピトープ間配列に有する長鎖ペプチド抗原は抗原提示細胞、特にマクロファージへの取込みが改善することが明らかとなった。この現象は、連続するチロシンをエピトープ間配列に有する長鎖ペプチド抗原を用いたワクチンの高い特異的Ｔ細胞誘導能力と、優れたがん治療効果の機序の一つとなっている可能性がある。
【００３０】
複数個のＴ細胞エピトープを含む長鎖ペプチドを抗原とするワクチンにおいて、エピトープ間配列の違いにより、各エピトープによる特異的Ｔ細胞誘導の成否に影響が生じることを、ヒト免疫細胞を用いた試験管内抗原提示反応において検討した（図１０）。ヒト腫瘍抗原のＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、及びＷＴ１に由来する３種のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞認識エピトープ配列ＮＹ ｐ１５７、ＭＡ４ ｐ１４３、ＷＴ１ ｐ２３５を含む長鎖ペプチド抗原ＮＭＷを合成した。３種のエピトープの間の配列はアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）のいずれかが６個連続するものとした。これら以外のアミノ酸から成るエピトープ間配列を含む長鎖ペプチドは、合成が困難であったか、あるいはＣＨＰとの複合体化が困難であった。各長鎖ペプチド抗原をＣＨＰと複合体化したワクチンを投与したヒト不死化Ｂ細胞株（ＬＣＬ）を抗原提示細胞として、ＮＹ  ｐ１５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン１Ｇ４細胞に対する抗原提示活性をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法で評価した。マウスでの検討結果と同様に、エピトープ間配列にＹ６を採用した長鎖ペプチドワクチンでは１Ｇ４細胞の活性化が明確に確認されたが、エピトープ間配列にＧ６またはＰ６を用いたワクチンでは、同細胞の活性化は明確に認められなかった。また、エピトープ間配列にＡ６、Ｎ６、Ｑ６、Ｓ６を用いたワクチンでもＹ６を用いたワクチンと同様に１Ｇ４細胞の活性化が認められ、これらのエピトープ間配列も有用であることが示された。
【００３１】
複数個のＴ細胞エピトープを含む長鎖ペプチド抗原をコードするｍＲＮＡを用いるワクチンにおいて、エピトープ間配列の違いにより、各エピトープによる特異的Ｔ細胞誘導の成否に影響が生じることを、ヒト免疫細胞を用いた試験管内抗原提示反応において検討した（図１１）。ヒト腫瘍抗原のＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、及びＷＴ１に由来する３種のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞認識エピトープ配列ＮＹ ｐ１５７、ＭＡ４ ｐ１４３、ＷＴ１ ｐ２３５を含む長鎖ペプチド抗原ＮＭＷをコードするｍＲＮＡを合成した。３種のエピトープの間の配列はグリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）のいずれかが６個連続するものとした。各ｍＲＮＡを導入したＬＣＬを抗原提示細胞として、ＮＹ  ｐ１５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン１Ｇ４細胞またはＭＡ４  ｐ１４３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＲＮＴ００７＃４５細胞に対する抗原提示活性をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法で評価した。エピトープ間配列にＹ６を採用した長鎖ペプチドをコードするＲＮＡワクチンでは、１Ｇ４細胞およびＲＮＴ００７＃４５の活性化が明確に確認された。このことから、本発明のエピトープ間配列はペプチドワクチンだけでなくＲＮＡワクチンにおいても有用であることが示された。
【００３２】
連続するチロシンまたはスレオニンのエピトープ間配列としての有用性は、以上の長鎖ペプチドワクチンに限らず、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチンまたは樹状細胞ワクチンにも適用できる。
ＤＮＡワクチンは、Ｎ末端にメチオニン１個を有し、複数個のＴ細胞エピトープを連続チロシン配列または連続スレオニン配列で連結した長鎖ペプチド抗原をコードするｃＤＮＡを人工遺伝子合成技術で合成し、哺乳類向け遺伝子発現プラスミドベクターに挿入することで作製できる。長鎖ペプチド抗原のｃＤＮＡは、含めるＴ細胞エピトープの個数により66〜数ｋｂｐの範囲で合成する。プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３やｐＶＡＸなどの哺乳類細胞で動作するプロモーター（ＣＭＶプロモーターなど）およびｍＲＮＡの安定化用のポリＡ（ウシ成長ホルモン由来など）と薬剤耐性遺伝子（カナマイシンなど）を含むものが利用できる。プラスミドには複数個の長鎖ペプチド抗原ｃＤＮＡを搭載してもよく、各抗原ｃＤＮＡはＩＲＥＳ配列などで連結することで同時発現させることができる。同様にして、プラスミドには腫瘍免疫応答を増強するためのアクセサリー遺伝子、例えばＩＦＮ‐γやＩＬ‐１２などのサイトカインや、ＧＩＴＲリガンド‐Ｆｃなどの免疫刺激性分子、ＰＤ‐Ｌ１‐Ｆｃなどの免疫抑制阻害分子も同時に搭載できる。また、搭載する抗原ｃＤＮＡやアクセサリー分子の数と種類が異なる複数のプラスミドＤＮＡを同時に投与してもよい。
【００３３】
得られたＤＮＡワクチンは、１個体あたり１μｇから１ｍｇの用量で、遺伝子銃、無針注射器、エレクトロポレーション法、ＤＮＡタトゥーイング、デリバリーシステム（カチオニックリポソームやポリエチレンイミンなど）、ハイドロダイナミック法、経皮投与法などの投与技術を用いてマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスなど）などの動物やヒトなどの生体の皮下、皮内、静脈内、筋肉内、リンパ節内、皮膚上または腫瘍内に、１〜４週間の間隔で反復投与する。投与の１〜２週間後には、ＤＮＡワクチン上のｃＤＮＡから転写・翻訳された長鎖ペプチド抗原に含まれるＴ細胞エピトープにより誘導された特異的Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色法やＥＬＩＳＰＯＴ法、ＭＨＣテトラマー染色法などの免疫学的技術で検出できる。マウスでの試験では野生型もしくはモデル抗原遺伝子を組み込んだＣＭＳ５ａ繊維芽肉腫、ＣＴ２６大腸がん、４Ｔ１乳がん（以上ＢＡＬＢ／ｃマウス）やＢ１６メラノーマ、ＬＬＣ肺がん（以上Ｃ５７ＢＬ／６マウス）を皮下移植し、その増殖や転移に対するＤＮＡワクチンの抑制効果を観察できる。腫瘍の増殖は腫瘍のサイズを計測してもよいし、ルシフェラーゼ遺伝子などのモニター用遺伝子を組み込んだ腫瘍細胞を用いれば、ＩＶＩＳ（パーキンエルマー社）などのｉｎ ｖｉｖｏイメージング技術で測定できる。転移は、腫瘍を静脈内または皮下投与したときに転移先の肺などに生じる腫瘍結節を解剖後に目視で計数するか、あるいはｉｎ ｖｉｖｏイメージング技術で評価できる。
【００３４】
ＤＮＡワクチンでは、プラスミドベクターでなくウイルスや微生物を用いる生体ベクターを利用してもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが利用できる。微生物ベクターには酵母やリステリア、サルモネラ菌、大腸菌、乳酸菌などが利用できる。これら生体ベクターを用いたDNAワクチンは、マウスなどの試験動物やヒトの静脈内、皮下、皮内、筋肉内、リンパ節内、粘膜上または腫瘍内に投与される。生体ベクターに搭載する遺伝子の構成と評価方法（免疫原性と治療効果）は、前述のプラスミドベクターの例に準じる。
【００３５】
連続するチロシンまたはスレオニンをエピトープ間配列に配したｍＲＮＡワクチンも、ＤＮＡワクチンと同様に実施できる。Ｎ末端にメチオニン１個を有し、複数個のＴ細胞エピトープを連続チロシン配列または連続スレオニン配列で連結した長鎖ペプチド抗原をコードするｃＤＮＡを人工遺伝子合成技術で合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型用のプラスミドＤＮＡに挿入する。ｃＤＮＡは、含めるＴ細胞エピトープの個数により、６６〜数ｋｂｐの範囲で作製する。プラスミドＤＮＡは、ファージＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター（Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターやＳＰ６プロモーターなど）とポリＡおよび薬剤耐性遺伝子（カナマイシンなど）を含むもの、例えばｐＧＥＭやｐｃＤＮＡ３などが利用できる。このプラスミドＤＮＡを鋳型として、市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（ライフテクノロジーズ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔやプロメガ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓなど）を用いてｍＲＮＡを合成する。必要に応じて、ポリＡテーリングキット（ライフテクノロジーズ）などを用いてポリＡをｍＲＮＡに付加する。得られたｍＲＮＡはそのまま、もしくはプロタミンやリポソームなどを用いて安定化したのち、マウスなどの試験動物やヒトの皮下、皮内、筋肉内、リンパ節内または腫瘍内に投与される。ｍＲＮＡワクチンは複数のｍＲＮＡを含有できる。例えば長鎖ペプチド抗原をコードする複数のｍＲＮＡを混合して投与してもよい。また、ＩＦＮ‐γやＩＬ‐１２などのサイトカイン、ＣＤ４０リガンドやＧＩＴＲリガンド‐Ｆｃなどの免疫刺激性分子、ＰＤ‐Ｌ１‐Ｆｃなどの免疫抑制阻害分子といった腫瘍免疫応答を増強するためのアクセサリー分子をコードするｍＲＮＡをｍＲＮＡワクチンと同時に投与してもよい。ｍＲＮＡワクチンの投与条件と評価方法（免疫原性と治療効果）は、前述のＤＮＡワクチンの例に準じる。
【００３６】
樹状細胞ワクチンに用いる樹状細胞は、ヒトでは末梢血単核球から、マウスでは骨髄細胞から、ＧＭ‐ＣＳＦとＩＬ‐４を用いて常法により試験管内で分化誘導できる。これに前述の長鎖ペプチド抗原を添加したもの、もしくは前述の長鎖ペプチド抗原をコードするｍＲＮＡを添加したものをワクチンとする。長鎖ペプチド抗原を用いる場合は、デリバリーシステムとしてＣＨＰを利用することで取込みと発現の効率を高めることができる（図８）。長鎖ペプチド抗原をコードするmRNAを用いる場合は、エレクトロポレーション法により樹状細胞への取込みと発現の効率を高めることができる。このとき、前述のように腫瘍免疫応答を増強するためのアクセサリー分子をコードするｍＲＮＡを同時に添加してもよい。抗原を添加した後の樹状細胞は、ＴＮＦα, ＩＬ‐１β, ＩＬ‐６, Ｆｌｔ３リガンド、ＰＧＥ２、ＣｐＧオリゴＤＮＡ、ポリＩＣ ＲＮＡなどで刺激して成熟化させて用いてもよい。得られた樹状細胞ワクチンは、マウスなどの試験動物やヒトの皮下、皮内、リンパ節内、腫瘍内または静脈内に１０６〜１０８個の用量で投与される。その評価方法（免疫原性と治療効果）は、前述のＤＮＡワクチンの例に準じる。
【００３７】
連続するチロシンまたはスレオニンをエピトープ間配列に採用した長鎖ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ｍＲＮＡワクチン、樹状細胞ワクチンはがん以外の疾患、例えば感染症にも適用できる。感染症の病原体としては、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、成人型Ｔ細胞白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルスなどの病原性ウイルス類や、リケッチア、クラミジア、ファイトプラズマ、コクシエラ、トキソプラズマ、リーシュマニア等の病原性の偏性細胞内寄生性微生物、マラリア原虫、クリプトスポリジウム等の原虫類などを挙げることができる。
【００３８】
例として、Ｃ型肝炎ウイルスに対するワクチンでは、Ｃ型肝炎ウイルス由来タンパク、例えばコアタンパク、ＮＳ３、ＮＳ４で同定されている複数のＴ細胞エピトープを連続するチロシンまたはスレオニンから成るエピトープ間配列で連結した長鎖ペプチド抗原を設計できる。ヒト肝臓組織を移植した免疫不全マウスなどのモデル系を用いれば、この長鎖ペプチド抗原を含むワクチンの投与条件とＣ型肝炎ウイルスの感染に対する治療効果を検討することができる。ヒトヘルペスウイルスに対するワクチンでは、ヒトヘルペスウイルス由来タンパクのＥ６やＥ７に含まれるＴ細胞エピトープを用いて同様に長鎖ペプチド抗原を設計し、Ｅ６又はＥ７を発現する腫瘍を移植したマウスモデルで投与条件と治療効果を検討することができる。病原性微生物に対するワクチン、例えばマラリアに対するワクチンでは、マラリア原虫の成熟体の表面に発現するｍｅｒｏｚｏｉｔｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ３（ＭＳＰ３）やｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＬＵＲＰ）、管内気に発現するｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＬＩＳＰ２）に含まれるＴ細胞エピトープ群を連続チロシン配列または連続スレオニン配列で連結した長鎖ペプチド抗原を設計する。この長鎖ペプチド抗原を含むワクチンを投与したマウスに、１万個のマラリア原虫のスポロゾイトを静脈内投与し、４〜１４日後に末梢血スメアを作製する。ギムザ染色したのち、顕微鏡下で寄生虫血を観察することで、ワクチンの投与条件と治療効果を検討できる。
【００３９】
以上の結果は、長鎖ペプチド抗原に含まれる複数個のエピトープによる特異的Ｔ細胞誘導をエピトープ間配列の違いが大きく左右すること、不適切なエピトープ間配列を用いたがん治療用ワクチンは目的のＴ細胞誘導もがん治療効果も乏しいことを示す一方で、連続したチロシンやスレオニンをエピトープ間配列に用いることで、長鎖ペプチド抗原に含まれる複数個のエピトープによる特異的T細胞誘導を確実に達成し、高い治療効果を発揮するがん治療用ワクチンを実現できることを示している。その際、エピトープ間配列の前後のエピトープ配列は問わないことも明らかにし、エピトープ間配列の適切な長さも規定できた。
本実施形態によれば、がん治療効果が極めて高いがん治療用ワクチンを提供できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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