(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸球体障害の検査のための方法であって、被検者の尿中の脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）を検出する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＦＡＢＰ４を検出する工程は、ＦＡＢＰ４に対する抗体を用いたイムノアッセイによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡ法である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記糸球体障害が、原発性または二次性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
糸球体障害の罹患の有無、罹患可能性、進展または予後を診断するための方法である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
糸球体障害と尿細管障害との差別化のための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により得られた結果が用いられる、方法。
【請求項７】
腎臓機能の予後の診断のための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により得られた結果が用いられる、方法。
【請求項８】
被検者における糸球体障害の進行の判定のための方法であって、被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量を測定する工程を含む、方法。
【請求項９】
ＦＡＢＰ４に対する抗体を含んでなる糸球体障害の検査用キットであって、前記抗体が被検者の尿中のＦＡＢＰ４の検出のために用いられる、検査用キット。
【請求項１０】
糸球体障害の検査用マーカーとしての、被検者の尿中のＦＡＢＰ４の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸球体障害の検査方法等に関する。より詳細には、糸球体障害の検査方法、糸球体障害と尿細管障害の差別化方法および腎臓機能の予後の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸結合タンパク質（Fatty Acid-Binding Protein : FABP）は長鎖脂肪酸やエイコサノイドのような疎水性リガンドと結合する分子量約１４〜１５ｋＤａのタンパク質である（非特許文献１）。これまでに少なくとも９つのＦＡＢＰのアイソフォームが知られており、その中のＦＡＢＰ４は主に脂肪細胞やマクロファージに発現することが知られている（非特許文献１）。また、正常な腎組織では、間質毛細血管および静脈の血管内皮細胞にＦＡＢＰ４の発現が認められることが知られていた（非特許文献２および３）。ＦＡＢＰ４の発現についてはこれまでに十分な検討はされていなかったが、複数の腎疾患患者の腎臓組織から、ＦＡＢＰ４の発現が確認されたことが、本発明者らの一部によって報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
一方で、ＦＡＢＰ４は慢性炎症に関連し、インスリン抵抗性および動脈硬化形成に重要な役割を果たしているＦＡＢＰ４ノックアウトマウスを用いた検討では、ＦＡＢＰ４の欠損によりインスリン感受性になること、動脈硬化が抑制されることが示されている（非特許文献１および５）。また、ＦＡＢＰ４は分泌シグナルペプチドを持たないため、非分泌タンパク質と考えられていたが、最近の研究によりＦＡＢＰ４が脂肪細胞から分泌されることが報告され、その血中濃度がインスリン抵抗性、糖尿病、動脈硬化と関連することが知られている（非特許文献６および７）。
しかしながら、ＦＡＢＰ４が尿中に排泄されることはこれまで知られていなかった。また、これまでに、種々の体液における脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（Ａ−ＦＡＢＰ、ＦＡＢＰ４、Ｐ２）の濃度を測定することにより、代謝性障害を診断等する方法が報告されている。しかしながら、ＦＡＢＰ４が尿中に排泄されることについては言及されておらず、尿中のＦＡＢＰ４排泄量を測定することも記載されていない（特許文献１）。
【０００４】
ところで、腎臓はネフロンと呼ばれる機能単位からなり、ネフロンは血管極と糸球体からなる腎小体と尿細管からなる。腎臓の機能障害としては、糸球体の障害によるものや尿細管の障害によるものなどがある。腎臓機能障害の指標として、β２−マイクログロブリン（β２−ＭＧ）、Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、ＦＡＢＰのアイソフォームの一つである肝臓型Ｌ−ＦＡＢＰ（ＦＡＢＰ１）の尿中排泄量測定による腎間質障害の評価が臨床応用されているが、主に尿細管障害を評価するものであり、糸球体障害を評価できるものではない（非特許文献８）。また、糸球体障害を評価する指標として尿中アルブミン排泄量が用いられているが（非特許文献９）、尿中アルブミンは糸球体の損傷が進まないと検出されない。また逆に、高度に尿中アルブミンが排泄されると二次性に尿細管障害をきたすことが知られている。
【０００５】
このような状況下、糸球体障害の罹患の有無、罹患可能性、進展または予後を早期に診断でき、糸球体障害と尿細管障害を差別化することができる手法、および、将来的な腎臓機能障害の可能性の有無を判断することができる手法が依然として求められているといえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５０１９２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Furuhashi M, Hotamisligil GS., Fatty acid-binding proteins: role in metabolic diseases and potential as drug targets., Nat. Rev. Drug Discov., 7: 489-503, 2008
【非特許文献２】Elmasri H, et al., Fatty acid binding protein 4 is a target of VEGF and a regulator of cell proliferation in endothelial cells, FASEB J., 23: 3865-3873, 2009
【非特許文献３】Elmasri H, et al., Endothelial cell-fatty acid binding protein 4 promotes angiogenesis: role of stem cell factor/c-kit pathway, Angiogenesis, 15: 457-468, 2012
【非特許文献４】第５６回日本腎臓学会学術総会  抄録
【非特許文献５】Furuhashi M, Ishimura S, Ota H, Miura T, Lipid chaperones in metabolic inflammation, Int. J. Inflam., 2011: 642612, 2011
【非特許文献６】Xu A, Wang Y, Xu JY, Stejskal D, Tam S, Zhang J, Wat NM, Wong WK, Lam KS., Adipocyte fatty acid-binding proteinis a plasma biomarker closely associated with obesity and metabolic syndrome., Clin Chem.,: 405-413, 2006
【非特許文献７】Furuhashi M, Saitoh S, Shimamoto K, Miura T. Fatty acid-binding protein 4 (FABP4): pathophysiological insights and potent clinical biomarker of metabolic and cardiovascular diseases. Clin Med Insights Cardiol 8(S3): 23-33, 2014
【非特許文献８】Kamijo-Ikemori A, Sugaya T, Kimura K. Urinary fatty acid binding protein in renal disease. Clin Chim Acta 374: 1-7, 2006
【非特許文献９】Shlipak MG, Day EC. Biomarkers for incident CKD: a new framework for interpreting the literature. Nat Rev Nephrol 9:478-83, 2013
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、糸球体障害を予測・早期診断できる新規な方法を提供することを目的とする。本発明はまた、糸球体障害と尿細管障害を簡易に差別化することができる方法を提供することを目的とする。本発明はまた、将来的な腎臓機能障害の可能性の有無を判断することができる方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは、これまでに得られた、複数の腎臓疾患患者の腎臓組織においてＦＡＢＰ４の発現が認められたという知見に加え、今般、ＦＡＢＰ４が尿中に排泄され、ＦＡＢＰ４の尿中排泄量が尿中アルブミン排泄量と関係していることを見出した。さらに、本発明者らは、尿中ＦＡＢＰ４の検出結果に基づき、糸球体障害の予測・早期診断ができることを見出した。さらに、本発明者らは、尿中ＦＡＢＰ４の検出結果に基づき、糸球体障害と尿細管障害を差別化し、ひいては将来的な腎臓機能障害の可能性の有無を判断ができることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１０】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）被検者の尿中の脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）を検出する工程を含む、糸球体障害の検査方法。
（２）前記ＦＡＢＰ４を検出する工程は、ＦＡＢＰ４に対する抗体を用いたイムノアッセイによって行う、（１）に記載の検査方法。
（３）前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡ法である、（１）または（２）に記載の検査方法。
（４）前記糸球体障害が、原発性または二次性である、（１）〜（３）のいずれかに記載の検査方法。
（５）糸球体障害の罹患の有無、罹患可能性、進展または予後を診断するための検査方法である、（１）〜（４）のいずれかに記載の検査方法。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の検査方法により得られた結果に基づく、糸球体障害と尿細管障害を差別化する方法。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載の検査方法により得られた結果に基づく、腎臓機能の予後の診断方法。
（８）被検者における糸球体障害をモニタリングする方法であって、
被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量を測定し、
該ＦＡＢＰ４の量が経時的に上昇した場合、糸球体障害が進行したものとする、方法。
（９）ＦＡＢＰ４に対する抗体を含んでなる、糸球体障害の検査用キット。
（１０）糸球体障害の検査用マーカーとしての、ＦＡＢＰ４の使用。
【００１１】
本発明によれば、尿中の脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）を検出するという簡便な方法により、原発性または二次性糸球体障害の罹患の有無、罹患可能性、進展または予後を早期に診断できる。さらに、本発明によれば、前記方法により得られた結果に基づき、糸球体障害と尿細管障害を差別化することができ、また、将来的な腎臓機能障害の可能性の有無を判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群におけるＵ−ＦＡＢＰ４排泄量とＵＡＣＲの相関を示すグラフである。
【図２】尿中のＦＡＢＰ４排泄量とｅＧＦＲの変化の関係を示すグラフである。
【発明の具体的説明】
【００１３】
［検査方法］
本発明の検査方法は、被検者の尿中の脂肪酸結合タンパク質４（以下、「ＦＡＢＰ４」ともいう）（ＦＡＢＰ４）を検出する工程を含むことを特徴としている。以下、本発明の検査方法について具体的に説明する。
【００１４】
ＦＡＢＰ４はＡ−ＦＡＢＰやａＰ２とも呼ばれ、インスリン抵抗性、脂質や糖の代謝を調節する因子として知られている。通常、ＦＡＢＰ４は糸球体には発現しない。また、これまでのところ、ＦＡＢＰ４の尿中への排泄についても何らの検討もされていない。本発明の検査方法においては、尿中に排泄されるＦＡＢＰ４（Ｕ−ＦＡＢＰ４）を検出および／または測定する。
【００１５】
本明細書において、「被検者の尿」という場合、被検者から得た（採取した）尿を含むものである。
【００１６】
本発明の検査に用いられる尿は、常法に従って採取したものを用いることができる。濃縮された起床時尿が好ましい。また、採取した尿は、検査時まで−２０℃以下で保存し、凍結・融解を繰り返さないことが好ましい。
【００１７】
本明細書において、尿中の分子を「検出する」という場合、尿中におけるその分子の有無を調べることだけではなく、尿中に含まれるその分子の量を測定することも含む。また、尿の濃度は採取条件（採尿時の体内の水分量等）により変化することから、随時尿において分子を検出・測定する場合、尿中クレアチニンによる補正（クレアチニン補正）を行うことが好ましい。
【００１８】
尿中の検出対象分子（たとえばＦＡＢＰ４）を測定する方法は、液体中の特定のタンパク質を検出、測定するためのあらゆる方法を用いて行うことができ、例えば、イムノアッセイ、凝集法、比濁法、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法等が挙げられるが、これらに限定されない。また、In situ hybridization法のような、主としてDNAやmRNAを検出・測定する方法を用いて、間接的にタンパク質量を検出・測定してもよい。
検出対象分子に対する抗体と、尿サンプル中の検出対象分子との抗原抗体反応を利用して、検出対象分子の量を測定するイムノアッセイは特に簡便で好ましい。
【００１９】
イムノアッセイは、検出可能に標識した検出対象分子に対する抗体、または、検出可能に標識した検出対象分子に対する抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。
ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では１２５Ｉ、１３１Ｉ，３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
また、イムノアッセイでは、検出対象分子に対する抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
【００２０】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便かつ迅速に抗原を測定することができて好ましい。
ＥＬＩＳＡ法には競合法とサンドイッチ法とがある。競合法では、マイクロプレート等の固相担体に検出対象分子に対する抗体を固定し、尿サンプルと酵素標識した検出対象分子を添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。尿サンプル中の検出対象分子が多ければ発色は弱くなり、尿サンプル中の検出対象分子が少なければ発色が強くなるので、検量線を用いて検出対象分子の量を求めることができる。
【００２１】
サンドイッチ法では、固相担体に検出対象分子に対する抗体を固定し、尿サンプルを添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する検出対象分子に対する抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、検出対象分子の量を求めることができる。サンドイッチ法では、固相担体に固定した抗体と尿サンプル中の検出対象分子を反応させた後、非標識抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
【００２２】
本明細書において、「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属製、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基盤、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられる。
【００２３】
酵素標識を検出するための酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、3,3’-diaminobenzidine (DAB)、3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)、o-phenylenediamine (OPD)等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、p-nitrophenylphosphate（ＮＰＰ）等を用いることができる。
【００２４】
また、上記イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、抗体にラテックス粒子を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。
ラテックス粒子に検出対象分子に対する抗体を結合させて尿サンプルに混合すると、検出対象分子が存在すれば、抗体結合ラテックス粒子が凝集する。そこで、サンプルに近赤外光を照射して、吸光度の測定（比濁法）または散乱光の測定（比朧法）により凝集塊を定量し、抗原の濃度を求めることができる。
【００２５】
本明細書において「抗体」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンをいい、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれのサブクラスであってもよい。また、抗原に特異的に結合する限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ等のフラグメントであってもよい。
抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、たとえば、検出対象分子またはその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、検出対象分子またはその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。
【００２６】
ＦＡＢＰ４に対する抗体は、既存の抗体を用いてもよい。抗ＦＡＢＰ４抗体としては、例えば、抗ＦＡＢＰ４抗体（BioVendor社製）、抗ＦＡＢＰ４抗体（Abcam社製）が挙げられる。
【００２７】
また、本発明におけるイムノアッセイは、市販のイムノアッセイキットを用いて行うこともできる。
【００２８】
本明細書において「糸球体障害」は、その最も広い意味で用いられ、その原因を問わず、糸球体が障害を受けた病態をいう。糸球体障害には、糸球体自体の障害に起因する原発性と、他の全身性疾患に起因する二次性がある。
原発性糸球体障害には、病態として、原発性ネフローゼ症候群と、尿中タンパク質量がネフローゼ症候群の診断基準に満たない原発性軽度蛋白尿、原発性糸球体腎炎が含まれる。
二次性糸球体障害には、病態として、二次性ネフローゼ症候群と尿中タンパク質量がネフローゼ症候群の診断基準に満たない二次性軽度蛋白尿、二次性糸球体腎炎が含まれる。
【００２９】
本明細書において「ネフローゼ症候群」は、その最も広い意味で用いられ、蛋白尿（１日当たりの尿中タンパク質量が３．５ｇ以上となる状態が持続する）、低蛋白血症（血清総タンパク質量６．０ｇ／１００ｍｌ以下（低アルブミン血症とする場合は、血清アルブミン量３．０ｇ／１００ｍｌ以下））を呈する限り、その原因を問わず、原発性および二次性ネフローゼ症候群を含む。
【００３０】
原発性糸球体障害としては、たとえば、微小変化群（Minimal change nephrotic syndrome; MCNS）、巣状分節状糸球体硬化症（Focal segmental glomerulosclerosis; FSGS）、膜性腎症（Membranous nephropathy; MN）、膜性増殖性糸球体腎炎（Membranoproliferative glomerulonephritis; MPGN）、急性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症が挙げられる。
二次性糸球体障害としては、例えば、糖尿病に起因する糖尿病性腎症、膠原病に起因するループス腎炎、アミロイドーシスに起因する腎アミロイド症、ＨＩＶ、ＨＢＶ、リーシュマニアなどの感染症に起因する腎症などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において「腎臓機能障害」は、上記の障害およびそれに起因する障害を意味するが、これらに限定されない。また、「腎臓機能の予後」は、将来的に生じる可能性のある「腎臓機能障害」を意味する。
【００３２】
本明細書において「検査」は、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味し、本発明の検査方法は、例えば検査会社等で実施され得る。
検査には、罹患の有無を調べる検査、罹患の可能性を調べる検査、疾患の進展や予後を調べる検査などが含まれるが、これらに限定されない。
なお、本発明に係る検査方法を用いて検査した結果を、診断に用いることも可能である。具体的には、本発明に係る検査方法を用いて検査した結果に基づき、腎臓機能の予後を診断する方法が挙げられる。
【００３３】
本発明の検査方法の一態様は、被検者の尿中の検出対象分子の濃度（排泄量）と、健常者の尿中の検出対象分子の濃度（排泄量）とを比較する工程を含む。健常者の尿と比較して、被検者の尿中の検出対象分子の濃度（排泄量）が有意に高い場合に、該被検者は糸球体障害を来たしているあるいは将来的に来たす可能性が高い。
【００３４】
本発明の検査方法の一態様として、被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量が、健常者の尿中のＦＡＢＰ４の量を参照して予め設定された閾値と比較して高い場合、被検者における糸球体障害が検出されたものと判定する。
【００３５】
本発明における閾値は、人種、年齢などに応じて、あらかじめ設定することができる。さらに、上記閾値は、上述した尿中のＦＡＢＰ４の検出・測定方法により、健常者の尿中のＦＡＢＰ４の量を測定し、その測定値を参照して予め設定することができる。
【００３６】
このように、本発明によれば、尿中のＦＡＢＰ４を糸球体障害のマーカーとして利用することにより、糸球体障害を検出することが可能となる。
【００３７】
本明細書において「被検者」は、糸球体障害を来たしている可能性のある者、または来たす可能性のある者とすることができる。健康診断等において、健常者を被検者としてもよい。また、被検者はヒトに限定されず、他の哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）であってもよい。
【００３８】
［糸球体障害と尿細管障害の差別化方法］
本発明は、被検者の尿中の検出対象分子を検出する工程を含む、糸球体障害と尿細管障害とを差別化する方法を包含する。すなわち、本発明の検査方法により得られた結果に基づく、糸球体障害と尿細管障害との差別化方法を包含する。
本明細書において「差別化」は、本発明の検査方法により得られた結果に基づいて、尿蛋白を有する被検者の尿中に含まれるＦＡＢＰ４の量が健常者の尿中のＦＡＢＰ４の量を参照して予め設定された閾値以上である場合には糸球体障害に罹患していると判断し、閾値未満の場合には尿細管障害に罹患していると判断する。
【００３９】
［腎臓機能の予後の診断方法］
本発明は、被検者の尿中の検出対象分子を検出する工程を含む、腎臓機能の予後の診断方法を包含する。すなわち、本発明の検査方法により得られた結果に基づく、腎臓機能の予後の診断方法を包含する。
本明細書において「診断」は、本発明の検査方法により得られた結果に基づいて、医師が、患者が糸球体障害に罹患しているか、または罹患する可能性があるかを調べる方法、疾患の進展または予後を調べる方法等をいうが、これらに限定されない。
【００４０】
［糸球体障害のモニタリング方法］
本発明は、被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量を測定し、該ＦＡＢＰ４の量を経時的にモニタリングする工程を含む、被検者の糸球体障害をモニタリングする方法を包含する。本発明のモニタリング方法においては、被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量が経時的に上昇した場合、被検者の糸球体障害が進行したものと判断する。本発明の糸球体障害のモニタリング方法の一態様としては、以下のステップを含む方法がある。
第一ステップ：被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量を測定する。
第二ステップ：第一ステップを行った後、連続的または不連続的に経時的に被検者の尿中のＦＡＢＰ４の量を測定する。
第三ステップ：第二ステップでの測定値と第一ステップの測定値の差（（第二ステップの測定値）−（第一ステップの測定値））を算出する。
第四ステップ：第三ステップで算出された差の値が負である場合には糸球体障害が維持または良化しているものと判断し、当該値が正である場合には糸球体障害が悪化しているものと判断する。
また、上記モニタリング方法において、算出された差の値の絶対値が大きい場合には、良化または悪化の程度が大きいと判断し、当該値が小さい場合には良化または悪化の程度が小さいと判断する。
このようなモニタリング方法は、糸球体障害ひいては腎機能障害の進行を正確に把握し、より適切な時期に、より適切な薬剤を投与したり、適切な治療を施したりするのに利用することができる。
【００４１】
［改善方法］
また、本発明の別の態様によれば、上記いずれかに記載の方法において、糸球体障害を有する被検者に、有効量の糸球体障害改善薬を投与する工程をさらに含んでなる、糸球体障害の改善方法が提供される。ここで「改善」には、確立された病態の「治療」の意味を含むだけでなく、想定される悪化に対して事前に備え、疾患の発生を未然に防ぐ「予防」の意味をも含む。
【００４２】
糸球体障害改善薬としては、特に限定されないが、例えば、化学療法剤（ニューキノロン系抗菌剤など）、副腎ステロイド（メチルプレドニドロンなど）、免疫抑制薬（シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡなど）、抗凝固薬（ヘパリン、ワルファリンなど）、抗血小板薬（ジピリダモール、塩酸ジラゼプなど）、繊維素溶解薬（ウロキナーゼなど）、抗炎症薬（インドメタシンをはじめとする非ステロイド性抗炎症薬など）、利尿薬（フロセミドをはじめとするループ治療薬など）または抗高血圧薬が挙げられる。なお、糸球体障害改善薬の有効量および投薬計画は、被検者の性別、年齢、体重、症状等を考慮し、当業者によって適宜決定される。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。
【００４４】
［各種パラメーターの測定］
本発明者らが北海道端野町および壮瞥町の住民を対象に毎年行っている身体測定およびその追跡調査の参加者３９２名を、本実施例の被検者とした。
【００４５】
被検者の臨床学的背景情報を得るために、各被検者について、６〜９時間の夜間絶食後に身体測定を行った。具体的には、血圧については、自動血圧計（HEM-907、オムロン社製）を用いて連続して２回測定し、その平均を本実施例の分析に用いた。また、身長および体重を測定し、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の２乗で除して肥満度指数（ＢＭＩ値）を算出した。身体測定の後、各被検者から末梢静脈血および尿を採取し、本実施例のサンプルとした。採取直後または−８０℃で保存した後の血清、血漿および尿サンプルについて生化学分析を行った。被検者の臨床学的背景の結果を表１に、採取したサンプルの生化学分析の結果を表２に示す。
【００４６】
なお、本実施例において、血清中のＦＡＢＰ４（Ｓ−ＦＡＢＰ４）および尿中のＦＡＢＰ４（Ｕ−ＦＡＢＰ４）の濃度は、市販されているＦＡＢＰ４の酵素免疫測定キット（RD191036200、Biovendor R&D社製）を用いて測定した。また、尿中のＦＡＢＰ１（Ｕ−ＦＡＢＰ１）の濃度は、市販されているＦＡＢＰ１（別名Ｌ−ＦＡＢＰ）の酵素免疫測定キット（CMIC001、CIMIC Co.社製）を用いて測定した。
【００４７】
また、Ｕ−ＦＡＢＰ４およびＵ−ＦＡＢＰ１の排泄量は、尿中クレアチニンレベルにより補正（正規化）された（μｇ／ｇＣｒ）。
絶食時の血漿インスリン濃度は、ラジオイムノアッセイ法により測定された。クレアチニンの濃度、ならびに、総コレステロール、ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドを含む脂質の濃度は、酵素を用いた一般的な方法を用いて決定された。ＬＤＬコレステロール濃度は、Friedewaldの計算式を用いて計算された。ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）の濃度は、ラテックス凝集法を用いて決定され、国際標準値（ＮＧＳＰ値）として表記した。高感度ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）は比濁法を用いて測定された。インスリン抵抗性の指標であるＨＯＭＡ−Ｒは、公知の式：
インスリン(μU/ml)×グルコース(mg/dl) / 405
を用いて計算された。尿中のクレアチニンに対するアルブミンの比（ＵＡＣＲ；ｍｇ／ｇＣｒ）は、微量アルブミン尿のマーカーとして用いられた。推算糸球体ろ過率（ｅＧＦＲ）は、日本人用の方程式：
eGFR(mL/mn/1.73m2)=194×Cr(-1.094)×年齢(-0.287)（男性の場合）
eGFR(mL/mn/1.73m2)=194×Cr(-1.094)×年齢(-0.287)×0.739（女性の場合）
を用いて計算された。１年経過後のｅＧＦＲの減少を評価するために、ある年のｅＧＦＲ値を翌年のｅＧＦＲ値から差し引くことにより、ｅＧＦＲの変化度を計算した。
【００４８】
計算された各ｐは、平均±標準偏差または中央値（四分位数範囲）として表記した。各パラメーターの分布は、Shapiro-Wilk検定により正規性検定され、非正規分布のパラメーターについては対数変換された。二つのグループ間のパラメーターの差異は、対応のないｔ検定により検定された。二つのパラメーターの相関は、Pearsonの相関係数を用いて評価された。三つのグループのデータにおける有意な差異を検出するために、一元配置分散分析およびTukey-Kramer post hoc検定が用いられた。
【００４９】
Ｕ−ＦＡＢＰ４、ＵＡＣＲおよび１年経過後のｅＧＦＲの変化度について、独立した決定因子（説明変数）を特定するために重回帰分析が行なわれた。ｐ値が０．０５未満の場合に統計的に有意とした。
【００５０】
【表１】
0006558729.tif 000002
【００５１】
３９２名の被検者のうち、男性は１６６名、女性は２２６名で、腹囲、ならびに、脂質異常症および脳卒中の有病率に男女差が認められた。また、１２３名の被検者が何の投薬も受けていなかった。
【００５２】
【表２】
0006558729.tif 000003
【００５３】
生化学分析では、総コレステロール値、ＨＤＬコレステロール値、ＬＤＬコレステロール値、グルコース（血糖）値およびクレアチニン値に男女差が認められた。また、血清中のＦＡＢＰ４（Ｓ−ＦＡＢＰ４）濃度は男性と比較して女性において有意に高い値を示した。また、尿中ＦＡＢＰ４（Ｕ−ＦＡＢＰ４）排泄量については、男女による有意な差は認められなかった。さらに、今回の測定では、Ｕ−ＦＡＢＰ４について２３．７％の被検者において検出限界未満であった。
【００５４】
次に、Ｕ−ＦＡＢＰ４について検出限界未満であった被検者（Ｕ−ＦＡＢＰ４検出不可能群）９３名と、検出限界以上であった被検者（Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群）２９９名とについて、各臨床学的指標を比較した。結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
0006558729.tif 000004
【００５６】
Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群においては、検出不可能群に比べて年齢が有意に高かった。
【００５７】
次に、Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群と検出不可能群について、生化学分析を行った。結果を表４に示す。
【００５８】
【表４】
0006558729.tif 000005
【００５９】
Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群においては、検出不可能群に比べてｅＧＦＲが有意に低い値を示した。このことから、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、腎臓機能の低下が示唆された。また、Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群においては、検出不可能群に比べてＳ−ＦＡＢＰ４濃度が有意に高い値を示した。このことから、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が血清中のＦＡＢＰ４濃度を反映していることが示唆された。
さらに、尿検査においては、Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群において、検出不可能群に比べて尿中のクレアチニンに対するアルブミン比（ＵＡＣＲ）が有意に高い値を示した。すなわち、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、より多くのタンパク質が尿中に排泄されることが示された。このことから、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、糸球体の機能の低下が示唆された。
【００６０】
次に、Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群において、尿中のＦＡＢＰ４排泄量と各臨床学的指標との関連について、単純回帰分析およびステップワイズ法を用いた重回帰分析による分析を行った。結果を表５に示す。
【００６１】
【表５】
0006558729.tif 000006
【００６２】
Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群において、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量は、血中インスリン濃度と有意な負の相関を示した。一方、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量は、年齢、収縮期血圧、中性脂肪、ＨｂＡ１ｃ、ＵＡＣＲ、Ｓ−ＦＡＢＰ４およびＵ−ＦＡＢＰ１と有意な正の相関を示した。ステップワイズ法を用いた重回帰分析においては、年齢、Ｓ−ＦＡＢＰ４、ＵＡＣＲおよびＵ−ＦＡＢＰ１でｔ値の絶対値が２を上回り、ｐ値が０．０５を下回った。したがって、これらのパラメーターはＵ−ＦＡＢＰ４排泄量と強い正の相関を有していることが示され、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量の独立した説明変数として採択し得ることが明らかとなった。
また、これに続く重回帰分析により、年齢、Ｓ−ＦＡＢＰ４濃度、ＵＡＣＲおよびＵ−ＦＡＢＰ１排泄量は独立してＵ−ＦＡＢＰ４排泄量に相関しており、４０．２％説明（Ｒ２＝０．４０２）することが示された。特に注目すべき点は、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量が独立してＵＡＣＲと強い正の相関を有していることである。すなわち、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、より多くのタンパク質が尿中に排泄されることが示された。このことから、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、糸球体の機能の低下が強く示唆された。
【００６３】
Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群において、尿中のクレアチニンに対するアルブミン比（ＵＡＣＲ）と各臨床学的指標との関連について、単純回帰分析およびステップワイズ法を用いた重回帰分析を行った。結果を表６に示す。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群において、尿中のクレアチニンに対するアルブミン比（ＵＡＣＲ）は、年齢、収縮期血圧、拡張期血圧、トリグリセリド（中性脂肪）、グルコース（血糖）、ＨｂＡ１ｃ、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ｅＧＦＲ、Ｓ−ＦＡＢＰ４濃度、Ｕ−ＦＡＢＰ１排泄量およびＵ−ＦＡＢＰ４排泄量と有意な正の相関を示した。また、ステップワイズ法を用いた重回帰分析では、収縮期血圧、ＨｂＡ１ｃおよびＵ−ＦＡＢＰ４排泄量でｔ値の絶対値が２を上回り、ｐ値が０．０５を下回った。したがって、これらのパラメーターはＵＡＣＲと強く相関していることが示され、ＵＡＣＲの独立した説明変数として採択し得ることが明らかとなった。しかしながら、Ｕ−ＦＡＢＰ１排泄量は採択されなかった。さらに、採択された収縮期血圧、ＨｂＡ１ｃおよびＵ−ＦＡＢＰ４排泄量のパラメーターがＵＡＣＲを２１．２％説明（Ｒ２＝０．２１２）することが示された。すなわち、収縮期血圧、ＨｂＡ１ｃおよびＵ−ＦＡＢＰ４排泄量が尿中のクレアチニンに対するアルブミン比（ＵＡＣＲ）を反映していることが明らかとなった。
さらに、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量は、年齢、性別、収縮期血圧、ＨｂＡ１ｃ、ｅＧＦＲ、Ｓ−ＦＡＢＰ４およびＵ−ＦＡＢＰ１の影響を補正した後でも、ＵＡＣＲの独立した説明変数であった。特に注目すべき点は、このような補正を行った後でもＵ−ＦＡＢＰ４排泄量はＵＡＣＲの独立した説明変数として採択し得ることである。すなわち、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量はＵＡＣＲと強い正の相関を有していることが示された。このことは、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、より多くのタンパク質が尿中に排泄されることを意味する。したがって、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、糸球体の機能の低下が強く示唆された。
【００６６】
また、Ｕ−ＦＡＢＰ４検出可能群の２９９名について、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量とＵＡＣＲの相関を調べた。結果を図１に示す。
【００６７】
図１の結果からも、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量とＵＡＣＲとが正の相関を有していることが示された。すなわち、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、より多くのタンパク質が尿中に排泄されることを意味する。このことからも、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高い被検者においては、糸球体の機能の低下が強く示唆された。
【００６８】
上記の各結果から、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高いほど、尿中のタンパク質（アルブミン）排泄量が高いことが分かる。すなわち、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高いほど、糸球体障害が生じている可能性が高いことが示唆される。したがって、尿中のＦＡＢＰ４排泄量を検出および／または測定することにより、糸球体障害の罹患の有無および罹患可能性を診断することが可能となる。また同様に、糸球体障害と尿細管障害を差別化することも可能となる。
そして、糸球体の障害は直接的または間接的に腎臓の機能障害と結びつくものであることから、尿中のＦＡＢＰ４を検出および／または測定することにより、腎臓機能障害の罹患の有無および罹患可能性を診断することも可能となる。
【００６９】
［追跡調査］
上記１回目の検査を受けた３９２名の被検者のうち、３２５名について１年後に２回目の検査（再検査）を行った。再検査の被検者を、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量の１回目の検査時の測定値（ベースライン）に応じて、低Ｕ−ＦＡＢＰ４（Ｔ１）、中Ｕ−ＦＡＢＰ４（Ｔ２）および高Ｕ−ＦＡＢＰ４（Ｔ３）の三つの群に分けた。なお、１回目の検査時にＵ−ＦＡＢＰ４が検出されなかった被検者はＴ１に分類した。
【００７０】
各群の構成は次の通りであった。Ｕ−ＦＡＢＰ４については、
低Ｕ−ＦＡＢＰ：Ｔ１＜０．０４（μｇ／ｇＣｒ）  １０８名
中Ｕ−ＦＡＢＰ：０．０４（μｇ／ｇＣｒ）≦Ｔ２＜０．３０（μｇ／ｇＣｒ）  １０８名
高Ｕ−ＦＡＢＰ：Ｔ３≧０．３０（μｇ／ｇＣｒ）  １０９名
であった。
【００７１】
Ｕ−ＦＡＢＰ４の各群におけるｅＧＦＲを測定し、１回目の検査時のｅＧＦＲからの変化を下記の式に基づいて評価した。
（ｅＧＦＲの変化）＝（再検査時のｅＧＦＲ値）−（１回目のｅＧＦＲ値）
結果を図２に示す。
【００７２】
図２に示すように、Ｕ−ＦＡＢＰ４排泄量のベースラインが低い群（Ｔ１）よりも、高い群（Ｔ３）においてｅＧＦＲの低下が有意に大きかった。
【００７３】
１年経過後のｅＧＦＲの変化度とＵ−ＦＡＢＰ４のベースライン排泄量とは負の相関を有していた（ｒ＝−０．１４０、ｐ＝０．０１１）。すなわち、Ｕ−ＦＡＢＰ４のベースライン排泄量が大きいほど、ｅＧＦＲの低下が大きいことが明らかとなった。
【００７４】
この結果から、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高いほど、１年経過後のｅＧＦＲの低下が大きいことが分かる。すなわち、尿中のＦＡＢＰ４排泄量が高いほど、時間の経過とともに糸球体障害が進展し、予後が悪くなることが示唆される。したがって、尿中のＦＡＢＰ４排泄量を検出および／または測定することにより、糸球体障害の進展、およびその予後を診断することが可能となる。そして、糸球体の障害は直接的または間接的に腎臓の機能障害に結びつくものであることから、尿中のＦＡＢＰ４排泄量を検出および／または測定することにより、腎臓機能の予後を診断することも可能となる。
【図１】
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【図２】
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