(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原を発現する膠芽腫細胞を特徴とする神経膠芽腫の検出または観測を補助するための方法であって、
（ｉ）腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、および／または
（ｉｉ）腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチド、
から成る群より選択される１つ以上のパラメータを、患者から単離した生物学的試料中で検出するおよび／またはその量を測定することを含み、
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、
（ａ）前記生物学的試料中の核酸またはペプチドの存在、または
（ｂ）参照レベルと比較したときの前記生物学的試料中の核酸またはペプチドの量の増加量が、神経膠芽腫の指標となる
方法。
【請求項２】
前記検出および／または前記量の測定が、
（ｉ）前記生物学的試料を、検出されるべきおよび／またはその量を測定されるべき前記核酸、または前記ペプチドに特異的に結合する作用物質と接触させること、ならびに
（ｉｉ）前記作用物質と、検出されるべきまたはその量を測定されるべき前記核酸、または前記ペプチドとの複合体の形成を検出することおよび／または前記複合体の量を測定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記核酸に特異的に結合する前記作用物質が、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、および
（ｉｉ）前記ペプチドに特異的に結合する前記作用物質が、前記ペプチドに特異的に結合する抗体を含む、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記作用物質が検出可能な標識をさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、および／または
（ｉｉ）腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチド、
に特異的に結合する作用物質を含む診断試験キットであって、前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、
腫瘍抗原を発現する膠芽腫細胞を特徴とする神経膠芽腫を検出するための診断試験キット。
【請求項６】
前記作用物質が、検出可能な標識をさらに含む、請求項５に記載の診断試験キット。
【請求項７】
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の診断試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患、特に神経膠腫などの中枢神経系の癌疾患の処置および診断に関する。より特定すると、本発明は、癌処置のための新規標的、特に免疫療法のための腫瘍抗原としてそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の最も一般的で致死的な原発性悪性疾患であり、新規症例の年間発生率は約１９０，０００例にのぼる。
【０００３】
ＧＢＭは、星状細胞腫瘍の群に起因し、世界保健機関（ＷＨＯ）によってグレードＩＶ神経膠腫と分類されている、神経上皮組織の腫瘍である。ＷＨＯグレードＩＶの指定は、細胞学的に悪性で、有糸分裂的に活性であり、典型的には急速な術前および術後の疾患増悪ならびに致死的転帰に結びつく壊死傾向を示す新生物に割り当てられる。
【０００４】
ＧＢＭを有する患者に対する現在の標準的なケアには、外科的切除術、それに続く切除腔への放射線療法（ＲＴ）とテモゾロミド（ＴＭＺ）での化学療法の併用およびＴＭＺの数回の補助サイクルによる継続的な処置が含まれる。
【０００５】
外科的切除術単独では約６か月の平均生存期間をもたらす。外科的切除術とＲＴの併用は、平均生存期間を１２．１か月に延長させる。ＴＭＺの追加は平均生存期間を１４．６か月までさらに延長させる。
【０００６】
外科的切除術および化学療法と放射線療法による積極的処置の実証されている効果に比べると、予後は非常に不良のままである。選択的な処置様式として、標的療法、免疫療法および遺伝子療法を含む新規の治療アプローチが開発された。
【０００７】
免疫療法は、癌療法における最も洗練された概念の１つである。中心となる発想は、癌に対抗するために宿主の免疫系の反応性を動員し、回復させることに基づく。いくつかの免疫治療アプローチが臨床の場に導入されて成功をおさめ、腫瘍学における最も有望な治療法として浮上してきた。治療用ワクチンの開発に関する制限因子は、腫瘍関連抗原の同定である。
【０００８】
腫瘍細胞は、生物学的に、それらの起源の非悪性細胞とは実質的に異なる。これらの相違は、腫瘍発生の間に獲得された遺伝子改変によるものであり、中でも特に、癌細胞における定性的または定量的に変化した分子構造体の形成ももたらす。さらに腫瘍細胞はまた、局所サイトカインレベルを調節することによって周囲の間質細胞が癌進行を伝播するように誘導することもでき、これは、これらの遺伝的に未変化の間質細胞中に非癌性組織とは異なる変化した分子構造体を生じさせる。腫瘍を保持する宿主の特異的免疫系によって認識される、この種の腫瘍関連構造体は、腫瘍関連抗原と称される。腫瘍関連抗原の特異的認識は、２つの機能的に相互に連携するユニットである細胞性機構と体液性機構を含む：ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球は、それぞれＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩおよびＩの分子上に提示されるプロセシングされた抗原を認識し、一方Ｂリンパ球は、プロセシングされていない抗原に直接結合する循環抗体分子を産生する。腫瘍関連抗原の潜在的な臨床−治療的重要性は、免疫系による新生細胞上の抗原の認識が細胞傷害性エフェクター機構の開始をもたらし、Ｔヘルパー細胞の存在下で、癌細胞の除去を引き起こすことができるという事実から生じる（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：５２５−３１，ｏｆ  ｔｈｅ  １９９８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の、特異的で信頼できる、感受性の高い診断および治療アプローチのデザインを可能にする、これらの疾患の遺伝子マーカーおよび標的が当分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の治療および診断に関する。特に、本発明は、中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫に関連し、これらの疾患の診断および治療アプローチの標的としての役割を果たすことができる分子構造体の同定に関する。
【００１１】
本発明は、中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の腫瘍組織に特徴的であり、被験体における中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の治療または診断の標的である核酸およびアミノ酸配列の同定に関する。
【００１２】
腫瘍細胞に関連して発現される、本発明に従って同定される核酸は、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む。好ましくは、腫瘍細胞に関連して発現される、本発明に従って同定される核酸は、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むペプチドをコードする。これらの核酸は、本明細書では「腫瘍関連核酸」または単に「腫瘍核酸」とも称される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本明細書では「腫瘍関連抗原」または単に「腫瘍抗原」とも称される、本発明に従って同定される腫瘍核酸によってコードされるペプチドに関する。したがって、本発明に従って同定される腫瘍抗原は、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明に従って同定される腫瘍抗原は、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【００１４】
１つの態様では、本発明は、本明細書で「腫瘍抗原ペプチド」とも称される、本発明に従って同定される腫瘍抗原の配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。好ましくは、本発明の腫瘍抗原ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする細胞に対する細胞応答を刺激することができ、および／またはそれ自体でもしくは免疫原性担体に結合して使用される場合、本発明に従って同定される腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を惹起することができる。好ましい腫瘍抗原ペプチドは、直接またはプロセシング後に、クラスＩ  ＭＨＣ分子と共に提示され得る。好ましくは、本発明による腫瘍抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、本発明による腫瘍抗原ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明に従って同定される腫瘍抗原の前記フラグメントは、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、または前記フラグメントに結合する抗体を惹起することができる免疫原である。好ましくは、本発明による腫瘍抗原ペプチドは、そのようなフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、そのようなフラグメント、すなわち本発明に従って同定される腫瘍抗原由来のＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ提示ペプチドまたは前記フラグメントに結合する抗体を惹起することができる、本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する免疫原を生成するようにプロセシングされる。したがって、本発明による腫瘍抗原ペプチドは、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含有する腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、および好ましくは、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、本発明による腫瘍抗原ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【００１５】
本発明は一般に、腫瘍核酸または腫瘍抗原を標的とすることによる、中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の処置および／または診断を包含する。これらの方法は、そのような腫瘍核酸および／または腫瘍抗原に関連する細胞の選択的検出および／または根絶を提供し、それによりそのような腫瘍核酸および／または腫瘍抗原に関連しない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。したがって、治療または診断のための好ましい疾患は、本発明に従って同定される腫瘍核酸および／または腫瘍抗原の１つ以上が中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫に関連するものである。
【００１６】
本発明の１つの態様は、腫瘍疾患、特に中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の処置のための治療法であって、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現および／または活性の阻害剤の投与を含む治療法に関する。
【００１７】
この態様では、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現および／または活性の阻害剤を含有する医薬組成物に関する。１つの実施形態では、前記阻害剤は、本発明に従って同定される腫瘍核酸に特異的である。別の実施形態では、前記阻害剤は、本発明に従って同定される腫瘍抗原に特異的である。本発明によれば、「発現および／または活性を阻害する」という語句は、発現および／または活性の完全なまたは基本的に完全な阻害ならびに発現および／または活性の低下を包含する。好ましくは、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現の前記阻害は、本発明に従って同定される腫瘍抗原をコードする転写産物、すなわちｍＲＮＡの産生を阻害することもしくは転写産物のレベルを低下させることによって、例えば転写を阻害するもしくは転写産物の分解を誘導することによって、および／または本発明に従って同定される腫瘍抗原の産生を阻害することによって、例えば本発明に従って同定される腫瘍抗原をコードする転写産物の翻訳を阻害することによって起こり得る。
【００１８】
好ましくは、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現および／または活性の前記阻害は、腫瘍細胞増殖を低減し、および／または腫瘍細胞死を誘導し、したがって腫瘍阻害作用または腫瘍破壊作用を及ぼす。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現の阻害剤は、本発明に従って同定される腫瘍核酸に選択的にハイブリダイズし、前記腫瘍核酸に特異的であって、それによりその転写および／または翻訳を阻害する（例えば低減する）阻害性核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはこれらをコードするＤＮＡ）である。
【００２０】
本発明の阻害性核酸は、標的核酸に対してアンチセンス方向の配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。適切な阻害性オリゴヌクレオチドは、長さが、典型的には５から数百ヌクレオチド長、より典型的には約２０〜７０ヌクレオチド長またはそれ未満、さらにより典型的には約１０〜３０ヌクレオチド長にわたる。これらの阻害性オリゴヌクレオチドは、遊離（裸の）核酸としてまたは保護形態で、例えばリポソームに封入して投与し得る。リポソームまたは他の保護形態の使用は、インビボ安定性を高め、したがって標的部位への送達を容易にし得るので、好都合であり得る。
【００２１】
また、標的腫瘍核酸は、対応するｍＲＮＡの切断を標的とするリボザイムを設計するのに使用し得る。同様に、これらのリボザイムは、遊離（裸の）形態でまたは安定性および／もしくは標的化を増強する送達システム、例えばリポソームの使用によって投与し得る。
【００２２】
また、標的腫瘍核酸は、腫瘍核酸の発現を阻害する（例えば低減する）ことができるｓｉＲＮＡを設計するのに使用し得る。ｓｉＲＮＡは、遊離（裸の）形態でまたは安定性および／もしくは標的化を増強する送達システム、例えばリポソームの使用によって投与し得る。これらはまた、これらの前駆体またはこれらをコードするＤＮＡの形態でも投与し得る。
【００２３】
ｓｉＲＮＡは、好ましくはセンスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、ここでセンスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖はＲＮＡ二本鎖を形成し、センスＲＮＡ鎖は、本発明に従って同定される腫瘍核酸、好ましくは標的腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡ中の約１９〜約２５個の連続するヌクレオチドの標的配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明に従って同定される腫瘍抗原の活性の阻害剤は、前記腫瘍抗原に特異的に結合する抗体である。腫瘍抗原への抗体の結合は、例えば結合活性または触媒活性を阻害することによって、腫瘍抗原の機能を妨げることができる。
【００２５】
また、別の態様での本発明は、腫瘍疾患、特に中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の処置のための治療法であって、標的分子、すなわち本発明に従って同定される腫瘍核酸または腫瘍抗原のリガンドの投与を含む治療法に関する。これに関して、これらの標的を発現する細胞、例えば腫瘍細胞を選択的に標的とし、死滅させるために、治療エフェクター部分、例えば放射性標識、細胞毒、細胞毒性酵素等に結合した、標的核酸に選択的にハイブリダイズする核酸を投与し得るか、または標的抗原に特異的に結合する抗体を投与し得る。
【００２６】
この態様では、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍核酸または腫瘍抗原のリガンドを含有する医薬組成物であって、前記リガンドが１つ以上の治療エフェクター部分に結合している医薬組成物に関する。好ましくは、前記リガンドは、前記腫瘍核酸または腫瘍抗原に特異的である。１つの実施形態では、腫瘍核酸または腫瘍抗原の前記リガンドは、腫瘍細胞増殖を低減し、および／または腫瘍細胞死を誘導し、したがって腫瘍阻害作用または腫瘍破壊作用を及ぼす。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、腫瘍核酸および腫瘍抗原の同定は、同定された抗原に関連する腫瘍細胞を攻撃し、それにより腫瘍疾患の発症を遅延させるもしくは予防するまたは腫瘍細胞を根絶することに基づく、特異的免疫療法を開発することを可能にする。免疫療法は、腫瘍細胞破壊的免疫応答を惹起するという共通の目標を有する様々な介入処置および技術を包含する。以下で要約するようにこれらの核酸および抗原を利用した様々な臨床アプローチが可能である。癌免疫療法へのアプローチは能動と受動のカテゴリーに分けることができる。能動免疫療法は、腫瘍に対する免疫応答を強化するために抗原またはそのような抗原をコードする核酸での患者の直接免疫を含み得る。受動免疫療法は、抗腫瘍応答を直接媒介することを目的とした免疫試薬の投与を指す。本発明は両方のアプローチを企図する。
【００２８】
この態様では、本発明は、（ｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド、または前記ペプチドの誘導体、（ｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、または前記核酸の誘導体、（ｉｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする宿主細胞、（ｉｖ）本発明に従って同定される腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするウイルス、（ｖ）本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドの誘導体を提示する細胞、（ｖｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体またはＴ細胞受容体、（ｖｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するようにインビトロで感作された免疫反応性細胞、および（ｖｉｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸で形質導入されたエフェクター細胞（または幹細胞）から成る群より選択される１つ以上の作用物質を含有する医薬組成物に関する。
【００２９】
１つの実施形態では、（ｉ）に従うペプチドは、腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、または腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくは腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、前記ペプチドは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応する配列を有するか、またはそのような配列を有するペプチドフラグメントを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、前記ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答を刺激することができ、および／または本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現を特徴とする腫瘍に対する体液性免疫応答を刺激することができる。１つの実施形態では、前記ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【００３０】
１つの実施形態では、（ｉｉ）に従う核酸は、腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドをコードするか、または腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくは腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得るペプチドをコードする。好ましくは、前記ペプチドは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応する配列を有するか、またはそのような配列を有するペプチドフラグメントを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、前記ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答を刺激することができ、および／または本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現を特徴とする腫瘍に対する体液性免疫応答を刺激することができる。１つの実施形態では、前記ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。そのような核酸は、プラスミドまたは発現ベクター中に存在してよく、プロモーターに機能的に連結され得る。
【００３１】
１つの実施形態では、（ｉｉｉ）に従う宿主細胞は、腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドをコードするか、または腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくは腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得るペプチドをコードする。好ましくは、前記ペプチドは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応する配列を有するか、またはそのような配列を有するペプチドフラグメントを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、前記ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答を刺激することができ、および／または本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現を特徴とする腫瘍に対する体液性免疫応答を刺激することができる。１つの実施形態では、前記ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。宿主細胞は組換え細胞であり得、コードされるペプチドまたはそのプロセシング産物を分泌することができ、それを表面上に発現することができ、および好ましくは前記ペプチドまたはそのプロセシング産物に結合して、好ましくは前記ペプチドまたはそのプロセシング産物を細胞表面上に提示するＭＨＣ分子を付加的に発現し得る。１つの実施形態では、宿主細胞はＭＨＣ分子を内因性に発現する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／またはペプチドもしくはそのプロセシング産物を組換えによって発現する。宿主細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００３２】
１つの実施形態では、（ｉｖ）に従うウイルスは、腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドをコードするか、または腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくは腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得るペプチドをコードする。好ましくは、前記ペプチドは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応する配列を有するか、またはそのような配列を有するペプチドフラグメントを生成するようにプロセシングされ得る。好ましくは、前記ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答を刺激することができ、および／または本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現を特徴とする腫瘍に対する体液性免疫応答を刺激することができる。１つの実施形態では、前記ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【００３３】
１つの実施形態では、（ｖ）に従う細胞は、ＭＨＣ分子を内因性に発現する。さらなる実施形態では、細胞は、ＭＨＣ分子および／または本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを組換えによって発現する。好ましくは、細胞は、本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドの誘導体をＭＨＣ分子によってその表面上に提示する。好ましくは、提示されるペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応する配列を有するペプチドである。細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、細胞は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞、単球またはマクロファージである。したがって、好ましい実施形態では、（ｖ）に従う細胞は、クラスＩ  ＭＨＣと共に提示される、本明細書で述べる腫瘍抗原ペプチドを含む抗原提示細胞である。
【００３４】
１つの実施形態では、（ｖｉ）に従う抗体はモノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、または抗体のフラグメントまたは合成抗体である。抗体は、治療エフェクター部分または検出可能な標識に連結され得る。好ましくは、（ｖｉ）に従う抗体またはＴ細胞受容体は、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応するペプチド中の配列に結合する。１つの実施形態では、前記抗体またはＴ細胞受容体は、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含むペプチドに結合する。
【００３５】
好ましくは、（ｖｉｉ）に従う細胞は、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応するペプチド中の配列に結合し、前記フラグメントは、好ましくはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される。１つの実施形態では、（ｖｉｉ）に従う細胞は、（ａ）患者からまたは同じ種の別の個体、特に健常個体、または異なる種の個体のいずれかから得た、免疫反応性細胞を含有する試料を提供する工程、（ｂ）前記試料を、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応するアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドの誘導体を提示する細胞と、前記ペプチドに対するＣＴＬの産生を促進する条件下で接触させる工程、および（ｃ）ＣＴＬを、腫瘍抗原を発現し、好ましくはそれをクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する細胞、例えば腫瘍細胞を溶解するのに適した量で患者に導入する工程を含む方法によって入手し得る。
【００３６】
１つの実施形態では、前記方法は、得られたＣＴＬのＴ細胞受容体をクローニングし、Ｔ細胞受容体をコードする核酸を、前記患者からまたは同じ種の別の個体、特に健常個体、または異なる種の個体のいずれかから得た、ＣＴＬまたは未熟ＣＴＬなどのエフェクター細胞に移入することを含み、前記エフェクター細胞は、したがって所望の特異性を受け取り、患者に導入され得る。（ｖｉｉｉ）に従うエフェクター細胞はこのようにして作製することができる。
【００３７】
上述した作用物質を使用したワクチン接種は、特に腫瘍細胞などの細胞中で発現された場合、本発明に従って同定される腫瘍抗原に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起することができるＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープを提供し得る。あるいはまたは加えて、上述した作用物質を使用したワクチン接種は、特に腫瘍細胞などの細胞中で発現された場合、本発明に従って同定される腫瘍抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起することができるＭＨＣクラスＩ提示エピトープを提供し得る。さらに、上述した作用物質を使用したワクチン接種は、本発明に従って同定される腫瘍抗原に特異的な抗体を惹起し得る。
【００３８】
１つの実施形態では、本発明の医薬組成物は、好ましくは免疫調節剤またはこれをコードする核酸をさらに含有する治療用または予防用抗腫瘍ワクチンである。１つの実施形態では、免疫調節剤は、正の共刺激分子のアゴニスト、例えばＣＴＬの共刺激をもたらすことができるＩｇ融合タンパク質である。別の実施形態では、共刺激剤は、負の共刺激分子のアンタゴニスト、例えばＣＴＬ共刺激の阻害を低減することができる抗体である。好ましい実施形態では、免疫調節剤は抗ＣＴＬＡ４抗体である。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含んでよく、および場合により１つ以上のアジュバント、安定剤等を含んでもよい。
【００４０】
本発明の別の態様は、腫瘍疾患、特に中枢神経系の腫瘍、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の予防的および／または治療的処置のための、本明細書で述べる作用物質および組成物の使用を含む。
【００４１】
１つの態様では、本発明は、腫瘍疾患を有するまたは腫瘍疾患を発症する危険性が高い患者を処置する治療的および予防的方法を提供する。１つの態様では、本発明は腫瘍増殖を阻害するための方法を提供する。１つの態様では、本発明は腫瘍細胞死を誘導するための方法を提供する。
【００４２】
好ましくは、腫瘍疾患は、中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫である。好ましくは、腫瘍疾患は、好ましくは中枢神経系の癌から成る群より選択される癌疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫である。
【００４３】
様々な実施形態によれば、本発明の方法は、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現および／もしくは活性の阻害剤、本発明に従って同定される腫瘍核酸もしくは腫瘍抗原のリガンドならびに／または１つ以上の本明細書で述べる免疫治療薬の投与を含む。１つの実施形態では、前記方法は、本明細書で述べる医薬組成物を患者に投与することおよび好ましくは本明細書で述べる抗腫瘍ワクチンで患者をワクチン接種することを含む。当分野で公知の多種多様なワクチン接種方法のいずれかを本発明に従って使用し得る。本発明の抗腫瘍ワクチンは、好ましくは本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対するＣＴＬ活性を誘導するまたは促進することができる。これらはアジュバントと組み合わせて使用してもよく、アジュバントは、直接またはＡＰＣを介してＴ細胞に作用することによって免疫系の刺激を容易にする。アジュバントには、本明細書で述べる正の免疫調節作用を有する免疫調節物質が含まれる。
【００４４】
様々な実施形態において、本発明の方法は、本発明に従って同定される腫瘍抗原に関連し、および好ましくは本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する腫瘍、特に腫瘍細胞に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答の刺激、本発明に従って同定される腫瘍抗原に関連し、および好ましくは本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する腫瘍、特に腫瘍細胞の増殖の阻害、ならびに／または本発明に従って同定される腫瘍抗原に関連し、および好ましくは本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する腫瘍、特に腫瘍細胞の死滅の誘導を含む。
【００４５】
１つの態様では、本発明は、本明細書で述べる処置の方法における使用のための、本発明に従って同定される腫瘍抗原の発現および／もしくは活性の阻害剤、本発明に従って同定される腫瘍核酸もしくは腫瘍抗原のリガンドならびに／または１つ以上の本明細書で述べる免疫治療薬を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書で述べる処置の方法における使用のための、本明細書で述べる医薬組成物を提供する。
【００４６】
腫瘍核酸または腫瘍抗原を標的とすることに基づく処置、例えば本明細書で述べる免疫療法は、外科的切除術および／または放射線および／または伝統的化学療法と併用することができる。
【００４７】
本発明の別の目的は、腫瘍疾患、特に中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の診断、検出または観測、すなわち退縮、進行、経過および／または発症を判定するための方法を提供することである。好ましくは、前記方法は、標的分子に特異的に結合するモノクローナル抗体および核酸プローブなどのリガンドの使用を含む。適切な標的分子は、（ｉ）本発明に従って同定される腫瘍核酸、（ｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくはそれに由来する腫瘍抗原ペプチド、（ｉｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくはそれに由来する腫瘍抗原ペプチドに対する抗体、（ｉｖ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくはそれに由来する腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞および／または（ｖ）本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドをクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＭＨＣ、好ましくはクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する細胞である。そのような方法は、被験体が腫瘍疾患、特に中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫を有するもしくは腫瘍疾患を発症する危険性がある（危険性が高い）かどうか、または、例えば処置レジメンが有効であるかどうかを検出するために使用し得る。
【００４８】
したがって、本発明は、腫瘍疾患、特に中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の診断、検出または観測のための方法であって、患者から、好ましくは腫瘍疾患を有している、腫瘍疾患を有しているもしくは腫瘍疾患に罹患している疑いがあるまたは腫瘍疾患の潜在的可能性を有する患者から単離した生物学的試料において、（ｉ）本発明に従って同定される腫瘍核酸の核酸配列を含む核酸／本発明に従って同定される腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、（ｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド、（ｉｉｉ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体、（ｉｖ）本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するＴ細胞および／または（ｖ）本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＭＨＣ、好ましくはクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する細胞から成る群より選択される１つ以上のパラメータを検出するおよび／またはその量を測定することを含み、前記腫瘍疾患が、好ましくは中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫である方法に関する。
【００４９】
１つの実施形態では、（ｉ）に従う核酸は、腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくは腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされるペプチドをコードする。
【００５０】
１つの実施形態では（ｉｉ）に従うペプチドは、腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、または腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチド、好ましくは腫瘍抗原特異的ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。
【００５１】
好ましくは、（ｉｖ）に従うＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応するペプチド中の配列を認識する。
【００５２】
１つの実施形態では、（ｖ）に従う細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによってペプチドをその表面に提示する。細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、細胞は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞、単球またはマクロファージである。したがって、好ましい実施形態では、（ｖ）に従う細胞は、クラスＩ  ＭＨＣと共に提示される、本明細書で述べる腫瘍抗原ペプチドを含む抗原提示細胞である。別の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。
【００５３】
１つの実施形態では、（ｉ）に従う核酸または（ｉｉ）に従うペプチドは、細胞、好ましくは腫瘍細胞中でインサイチュにて検出されるまたはその量を測定される。１つの実施形態では、（ｉｉ）に従うペプチドは、細胞の表面で、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩとの複合体中でインサイチュにて検出されるまたはその量を測定される。
【００５４】
好ましくは、本発明の方法を用いて診断、検出または観測される腫瘍疾患は、中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫である。好ましくは、腫瘍疾患は、好ましくは中枢神経系の癌から成る群より選択される癌疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫である。
【００５５】
本発明による腫瘍疾患の診断、検出または観測のための方法の１つの実施形態では、生物学的試料および／または対照／参照試料は、腫瘍疾患による罹患に関して診断、検出または観測されるべき組織または器官に対応する組織または器官に由来する；例えば診断、検出または観測されるべき腫瘍疾患は脳の癌であり、生物学的試料および／または対照／参照試料は脳組織である。
【００５６】
診断、検出または観測のための前記方法は、定量的および／または定性的評価、例えば標的分子の絶対的および／または相対的測定、例えば腫瘍核酸または腫瘍抗原の発現レベルの測定を可能にする。
【００５７】
前記検出および／または量の測定を達成するための手段は、本明細書で説明され、当業者に明らかになる。
【００５８】
好ましくは、本発明の方法における検出および／または量の測定は、（ｉ）生物学的試料を、検出されるべきおよび／またはその量を測定されるべき核酸、ペプチド、抗体、Ｔ細胞または細胞に特異的に結合する作用物質と接触させること、ならびに（ｉｉ）作用物質と、検出されるべきまたはその量を測定されるべき核酸、ペプチド、抗体、Ｔ細胞または細胞との複合体の形成を検出することおよび／または複合体の量を測定することを含む。
【００５９】
典型的には、生物学的試料中の標的分子のレベルを参照レベルと比較し、前記参照レベルからの逸脱は被験体における腫瘍疾患の存在および／または病期を示す。参照レベルは、対照試料（例えば健常組織または健常被験体からの）中で測定されるレベルまたは健常被験体からの平均レベルであり得る。前記参照レベルからの「逸脱」は、何らかの有意の変化、例えば少なくとも１０％、２０％または３０％、好ましくは少なくとも４０％または５０％、さらにはそれ以上の増大または減少を表す。好ましくは、前記生物学的試料中の核酸、ペプチド、抗体、Ｔ細胞および／もしくは細胞の存在または参照試料と比較して増大している生物学的試料中の核酸、ペプチド、抗体、Ｔ細胞および／もしくは細胞の量は、腫瘍疾患の存在を示す。
【００６０】
典型的には、本発明の方法における検出および／または量の測定は、標的分子に特異的に結合する標識リガンド、例えば標的核酸にハイブリダイズする標識核酸プローブおよび／または標的ペプチドに特異的に結合する標識抗体もしくはそのフラグメント／誘導体の使用を含む。
【００６１】
本発明によれば、核酸の検出または核酸の量の測定は、公知の核酸検出方法、例えばハイブリダイゼーションまたは核酸増幅技術を含む方法を用いて実施し得る。１つの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を用いてｍＲＮＡ転写産物を検出するまたはその量を測定する。
【００６２】
そのような核酸検出方法は、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用を含み得る。適切なオリゴヌクレオチドは、典型的には５から数百ヌクレオチド長、より典型的には約２０〜７０ヌクレオチド長またはそれ未満、さらにより典型的には約１０〜３０ヌクレオチド長にわたる。
【００６３】
本発明によれば、ペプチドの検出またはペプチドの量の測定は、前記ペプチドに特異的に結合する抗体を使用した免疫検出を含むがこれに限定されない、多くの方法で実施し得る。好ましくは、抗体は、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応する配列に結合する。
【００６４】
ペプチドを検出するために抗体を使用する方法は周知であり、ＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ等を含む。一般に、そのようなアッセイは、標的ペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを直接使用するか、または間接的に、検出を提供する標識、例えば指示酵素、放射性標識、発蛍光団または常磁性粒子に結合した標的ペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを使用する。
【００６５】
本発明によれば、抗体の検出または抗体の量の測定は、前記抗体に特異的に結合するペプチドを使用して実施し得る。
【００６６】
Ｔ細胞は、患者の末梢血、リンパ節、組織試料、例えば生検および切除術に由来する組織試料、または他の供給源から単離し得る。反応性アッセイは、一次Ｔ細胞または他の適切な誘導体に関して実施し得る。例えば、Ｔ細胞を融合してハイブリドーマを作製し得る。Ｔ細胞応答性を測定するためのアッセイは当分野で公知であり、増殖アッセイおよびサイトカイン放出アッセイを含む。
【００６７】
１つの実施形態では、本発明に従って同定される腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するＴ細胞は、腫瘍抗原応答性ＣＴＬである。
【００６８】
ＣＴＬは、以下の好ましい実施形態を含むがこれらに限定されない、多くの方法で検出し、その量を測定し得る。１つの実施形態では、適切な蛍光腫瘍抗原ペプチド／ＭＨＣ四量体を使用してＣＴＬを直接染色する。別の実施形態では、「ＴＲＡＰ」アッセイ（「タンパク質転移によるＡＰＣのＴ細胞認識」を使用する（例えばＢｅａｄｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２：１２０８（２００６）参照）。別の実施形態では、Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ８：４９８，２００６）によって概説された方法を用いて血液試料中のＴ細胞の検出を実施する。反応性Ｔ細胞を検出するためのアッセイおよび指標は公知であり、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＦＮ−γ細胞内サイトカイン染色の使用を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
Ｔ細胞クローンが特定の抗原性ペプチドに応答するかどうかを測定するための他の様々な方法が当分野において公知である。典型的には、ペプチドをＴ細胞の懸濁液に１〜３日間添加する。Ｔ細胞の応答は、増殖、例えば標識チミジンの取込みによって、またはサイトカイン、例えばＩＬ−２の放出によって測定し得る。放出されたサイトカインの存在を検出するために様々なアッセイが利用可能である。
【００７０】
Ｔ細胞の細胞傷性アッセイは、腫瘍抗原に特異性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を検出するために使用できる。１つの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞を、腫瘍抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ分子と共に提示する標的細胞を死滅させるそれらの能力に関して試験する。腫瘍抗原ペプチドを提示する標的細胞を標識し、患者試料からのＴ細胞の懸濁液に添加し得る。溶解細胞からの標識の放出を定量することによって細胞毒性を測定し得る。自発的放出および総放出についての対照をアッセイに含めてもよい。
【００７１】
ペプチドを提示する細胞は、細胞応答を誘導する、例えばＴ細胞を活性化するその能力を試験することによって、またはそのような細胞に特異性を有するＣＴＬによる細胞の溶解を測定することによって検出し、その量を測定し得る。
【００７２】
検出されるべきおよび／もしくはその量を測定されるべき前記核酸、前記ペプチド、前記抗体、前記Ｔ細胞および／もしくは前記細胞の存在、ならびに／または参照レベルと比較して、例えば腫瘍疾患を有さない患者と比較して増大している前記核酸、前記ペプチド、前記抗体、前記Ｔ細胞および／もしくは前記細胞の量は、前記患者における腫瘍疾患の存在または腫瘍疾患の危険性（すなわち腫瘍疾患を発症する潜在的可能性）を示し得る。
【００７３】
１つの実施形態では、生物学的試料は組織または器官に由来し、前記組織または器官が腫瘍を含まない場合、その細胞は、本発明に従って同定される腫瘍抗原および／または本発明に従って同定される腫瘍核酸を実質的に発現しない。本発明の方法による、患者における腫瘍疾患の存在または腫瘍疾患の危険性の指示は、腫瘍疾患が前記組織もしくは器官中に存在することまたは前記組織もしくは器官に前記腫瘍疾患の危険性があることを示し得る。
【００７４】
本発明による観測の方法は、好ましくは最初の時点での第一試料中および２番目の時点でのさらなる試料中で上記に挙げたパラメータの１つ以上を検出するおよび／またはその量を測定することを含み、２つの試料を比較することによって腫瘍疾患の退縮、進行、経過および／または発症を測定し得る。
【００７５】
患者から以前に採取した生物学的試料と比較して、生物学試料中で減少している前記核酸、前記ペプチド、前記抗体、前記Ｔ細胞および／または前記細胞の量は、前記患者における腫瘍疾患の退縮、良好な経過、例えば処置の成功または発症の危険性の低下を示し得る。
【００７６】
１つの実施形態では、生物学的試料は組織または器官に由来し、前記組織または器官が腫瘍を含まない場合、その細胞は本発明に従って同定される腫瘍抗原および／または本発明に従って同定される腫瘍核酸を実質的に発現しない。１つの実施形態では、腫瘍疾患は前記組織または器官中に存在する。
【００７７】
患者から以前に採取した生物学的試料と比較して、生物学試料中で増大している前記核酸、前記ペプチド、前記抗体、前記Ｔ細胞および／または前記細胞の量は、前記患者における腫瘍疾患の進行、好ましくない経過、例えば処置の不成功、再発または転移挙動、発症または発症の危険性を示し得る。
【００７８】
１つの実施形態では、生物学的試料は組織または器官に由来し、前記組織または器官が腫瘍を含まない場合、その細胞は本発明に従って同定される腫瘍抗原および／または本発明に従って同定される腫瘍核酸を実質的に発現しない。１つの実施形態では、腫瘍疾患は前記組織または器官中に存在する。
【００７９】
特定の態様では、本発明は、腫瘍疾患の検出のため、すなわち腫瘍疾患の位置または部位、例えば特定の組織または器官を決定するための方法に関する。１つの実施形態では、前記方法は、本発明に従って同定される腫瘍抗原に結合する、検出可能な標識に連結された抗体を患者に投与することを含む。抗体はモノクローナル抗体であり得る。さらなる実施形態では、抗体は、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、抗体のフラグメントまたは合成抗体である。
【００８０】
前記患者における組織または器官の標識化は、前記組織または器官における腫瘍疾患の存在または腫瘍疾患の危険性を示し得る。
【００８１】
１つの実施形態では、組織または器官は、組織または器官が腫瘍を含まない場合、その細胞が本発明に従って同定される腫瘍抗原および／または本発明に従って同定される腫瘍核酸を実質的に発現しない組織または器官である。
【００８２】
本発明の方法を使用する、上述した腫瘍疾患の陽性診断は、本明細書で述べる処置の方法に適する腫瘍疾患を示し得る。
【００８３】
本発明のさらなる目的は、本発明の診断、検出または観測のための方法において有用な診断試験キットに関する。１つの実施形態においてこれらのキットは、上記で定義した標的分子に特異的に結合するリガンドおよび、場合により、検出可能な標識、例えば指示酵素、放射性標識、発蛍光団または常磁性粒子を含む。特定の実施形態では、リガンドは、上述した標的核酸分子に特異的な核酸プライマーもしくはプローブ、または上述した標的ペプチドに特異的な抗体もしくはその誘導体を含む。キットは、情報を提供するパンフレット、例えば本明細書で開示する方法を実施するために試薬をどのように使用するかを知らせるパンフレットを含み得る。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドの誘導体に関する。１つの実施形態では、前記ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【００８５】
さらなる態様では、本発明は、腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含有する前記ペプチドをコードする核酸を含む組換え核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する。
【００８６】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含む宿主細胞に関する。好ましくは、そのような宿主細胞は、コードされるペプチドを発現する。
【００８７】
宿主細胞は組換え細胞であり得、コードされるペプチドを分泌することができ、それを表面上に発現することができ、および好ましくは前記ペプチドまたはそのプロセシング産物に結合するＭＨＣ分子を付加的に発現し得る。１つの実施形態では、宿主細胞はＭＨＣ分子を内因性に発現する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ＭＨＣ分子および／またはペプチドもしくはそのプロセシング産物を組換えによって発現する。宿主細胞は、好ましくは非増殖性である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。
【００８８】
さらなる態様では、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド、または前記ペプチドの誘導体に結合する作用物質に関する。好ましい実施形態では、前記作用物質は、タンパク質またはペプチド、特に抗体、Ｔ細胞受容体またはＭＨＣ分子である。さらなる実施形態では、抗体は、モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、コンビナトリアル技術によって作製される抗体、抗体のフラグメントまたは合成抗体である。
【００８９】
本発明はさらに、本発明に従って同定される腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドの誘導体に結合する本発明の作用物質と、治療エフェクター部分または検出可能標識とのコンジュゲートに関する。
【００９０】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは例示のためにのみ使用されるものであり、限定を意図されない。図面の説明および実施例により、同様に本発明に包含されるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】種々の腫瘍組織におけるＣＯＬ２０Ａ１の発現  ＣＯＬ２０Ａ１の発現を、示されている腫瘍組織においてプライマー６３０３（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣ）および６３０４（５’−ＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて分析し、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）をハウスキーピング遺伝子として使用して相対発現を計算した。脳腫瘍は神経膠芽腫を指し、ＴＮＢＣはトリプルネガティブ乳癌を指す。
【図２】神経膠芽腫組織におけるＣＯＬ２０Ａ１の発現  ＣＯＬ２０Ａ１発現を、７１の神経膠芽腫組織においてプライマー６３０３（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣ）および６３０４（５’−ＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて分析し、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）をハウスキーピング遺伝子として使用して相対発現を計算した。
【図３】正常組織におけるＣＯＬ２０Ａ１の発現  発現の高さを多くの個別発現レベルに関してカラーコード化している（図面の上部のカラーコード参照）。
【図４Ａ】ＣＯＬ２０Ａ１の他のタンパク質との相同性  ＣＯＬ２０Ａ１の他のコラーゲンタンパク質との相同性を、ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓを参照として使用してＢｌａｓｔｐによって評価した。
【図４Ｂ】ＣＯＬ２０Ａ１の他のタンパク質との相同性  ＣＯＬ２０Ａ１のＣＯＬ１４Ａ１との相同性。ＣＯＬ２０Ａ１のＣＯＬ１４Ａ１との相同性をＢｌａｓｔｐによって評価し、これは、同一の連続するタンパク質配列を示さなかった。
【図５】ＣＯＬ２０Ａ１の予測上のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｔ細胞エピトープ  ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを用いてＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  Ｔ細胞エピトープを予測し、２０より高いスコアを有する、ＣＯＬ２０Ａ１にユニークなＴＣＲエピトープだけを示している。
【図６】ＣＯＬ２０Ａ１  ｍＲＮＡはヒト細胞から翻訳され得る  ＨＥＫ−２９３  Ｔ細胞を、ＣＯＬ２０Ａ１をコードする配列を含むベクター（レーン１）またはベクター単独（レーン２）でトランスフェクトした。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書で述べる特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および学術用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００９３】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらを任意の方法および任意の数で組み合わせて付加的な実施形態を創製し得ることが理解されるべきである。様々に説明される実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に説明される実施形態だけに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に説明される実施形態を、多くの開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を裏付け、包含することが理解されるべきである。さらに、本出願で述べるすべての要素の任意の順序および組合せが、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されると見なされるべきである。
【００９４】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｅｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００９５】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当該分野の文献中で説明される化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）。
【００９６】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除も意味しないことが理解され、ただし一部の実施形態では、そのような他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群が排除され得る、すなわち主題は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含に存する。本発明を説明することに関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中の数値の範囲の列挙は、単にその範囲内に属する各々別々の数値を個別に言及することの簡略化された方法であることが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の数値は、本明細書で個別に列挙されているがごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書で述べるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限りまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に必須の特許請求されない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００９７】
いくつかの資料が本明細書の本文全体にわたって引用される。上記または下記で、本明細書において引用される資料の各々は（すべての特許、特許出願、学術出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明を理由にそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００９８】
本発明の一部の態様は、以下のように要約できる能動または受動免疫治療アプローチを用いて、本発明に従って同定される腫瘍核酸および腫瘍抗原を利用した腫瘍疾患、特に癌疾患、特に中枢神経系の腫瘍または癌疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫の免疫療法を想定する：
免疫療法
Ｉ．能動免疫療法（「癌ワクチン」）
以下による免疫：
ｉ）抗原またはペプチド（天然または修飾）
ｉｉ）抗原またはペプチドをコードする核酸
ｉｉｉ）抗原またはペプチドをコードする組換え細胞
ｉｖ）抗原またはペプチドをコードする組換えウイルス
ｖ）抗原もしくはペプチド（天然もしくは修飾）でパルスしたまたは抗原もしくはペプチドをコードする核酸でトランスフェクトした抗原提示細胞
ＩＩ．受動免疫療法（「養子免疫療法」）
ｖｉ）抗原を認識する抗体またはＴ細胞受容体の移入
ｖｉｉ）インビトロで抗原に感作した細胞（バルクまたはクローン化集団）の導入
ｖｉｉｉ）抗原を認識し、好ましくは腫瘍特異的クラスＩ  ＭＨＣ提示ペプチドに応答性であるＴ細胞受容体をコードする核酸で形質導入したエフェクター細胞（または幹細胞）の移入
【００９９】
この数年、腫瘍免疫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の役割が注目を集めてきた。腫瘍特異的ＣＤ８＋ＣＴＬは、動物モデルにおいてインビボで腫瘍細胞を直接溶解し、腫瘍塊を根絶できることが示されている。しかし、ＣＤ４＋Ｔ細胞も重要な役割を果たすと考えられ、最適な癌ワクチンはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の関与を必要とすると考えられる。
【０１００】
無傷または実質的に無傷の腫瘍抗原での免疫は、クラスＩおよびクラスＩＩの両方のエピトープに対して同時に免疫するという潜在的利点を有するが、大量の腫瘍抗原を精製するには多大の労力と時間が必要である。腫瘍抗原内のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩペプチドの同定は、高レベルの純粋な合成ペプチドで免疫することを可能にする。ペプチドアプローチはまた、どのエピトープを用いるかを選択することによってＭＨＣクラスＩ型およびクラスＩＩ型応答（または混合型）のいずれかを選択できるという利点も有する。ペプチドでの免疫はまた、異なるサブセットのＴ細胞を刺激するためにサブドミナントおよび／または潜在性エピトープを選択できる（抗原プロセシングの必要性を回避し得るまたは「トリミング」の役割に低減し得るため）ことも意味する。またペプチドを、その免疫原性を高めるように修飾し得る（例えばそのＨＬＡクラスＩまたはＩＩアンカー部位において）。
【０１０１】
本発明は、腫瘍特異的クラスＩ  ＭＨＣ提示ペプチドおよびそれらを使用する方法、ならびに腫瘍特異的クラスＩ  ＭＨＣ提示ペプチドに応答性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびそれらを使用する方法に関する。
【０１０２】
１つの態様では、本発明は、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答を刺激することができる抗腫瘍ワクチンを提供する。本発明の抗腫瘍ワクチンは、好ましくは腫瘍抗原ペプチドまたは腫瘍抗原ペプチド核酸を含有する。
【０１０３】
本発明はまた、本発明に従って同定される腫瘍抗原の１つ以上またはそれに由来する１つ以上の腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸の使用を包含する。そのようにコードされる抗原またはペプチドは、治療用または予防用抗腫瘍ワクチンとして有効であると予想される。例えば、これらの核酸の特定の企図される適用は、そのような抗原に対するＣＴＬ応答などの細胞応答および／または体液性免疫応答の誘導を含む。
【０１０４】
プラスミドＤＮＡでの免疫は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗体から成る抗原特異的免疫応答を惹起することができる。ＤＮＡは、遺伝子銃法の免疫によって投与することができる。遺伝子銃免疫では、プラスミドＤＮＡを金粒子に被覆し、続いてＤＮＡ被覆粒子を高圧のヘリウム駆動遺伝子銃によって皮膚内に送達し得る。
【０１０５】
分子生物学における進歩は、本明細書で述べる腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする組換えウイルスを構築することを可能にした。現在までにいくつかの組換えウイルスワクチンが使用されている。
【０１０６】
いくつかのウイルスベクターは、悪性疾患の免疫療法を増強する潜在的可能性に関して有望な結果を示している。複製可能ウイルスおよび複製能力のないウイルスを使用することができ、後者の群が好ましい。ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルスおよびニューカッスル病ウイルスは、本発明に従って有用な好ましいウイルスの例である。
【０１０７】
樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）においては、ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドもしくは腫瘍溶解物のいずれかをロードする、または腫瘍抗原をコードするアデノウイルスを用いた形質導入などによって核酸を形質導入することができる。
【０１０８】
好ましい実施形態では、本発明の抗腫瘍ワクチンは、腫瘍抗原ペプチドをロードしたＡＰＣを含有する。これに関して、プロトコルは、人為的に腫瘍抗原ペプチドを提示するように操作されたＤＣのインビトロ培養／分化に基づき得る。遺伝的に操作されたＤＣの作製は、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸をＤＣに導入することを含み得る。ｍＲＮＡでのＤＣのトランスフェクションは、強力な抗腫瘍免疫を刺激する有望な抗原ロード技術である。
【０１０９】
樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織中で捕捉された抗原を、ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩの両抗原提示経路を介してＴ細胞に提示する白血球集団である。ＤＣが免疫応答の強力な誘導物質であり、これらの細胞の活性化が抗腫瘍免疫の誘導に必須の工程であることは周知である。ＤＣの成熟は、そのような抗原提示ＤＣがＴ細胞のプライミングをもたらすＤＣ活性化状態と称され、一方未熟ＤＣによるその提示は寛容を生じさせる。ＤＣ成熟は、主として固有の受容体によって検出される細菌特徴を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、内毒素等）、プロ炎症性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０ＬによるＤＣ表面でのＣＤ４０の連結、およびストレスによる細胞死を起こしている細胞から放出される物質によって引き起こされる。ＤＣは、骨髄細胞を顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子αなどのサイトカインと共にインビトロで培養することによって誘導できる。
【０１１０】
本発明のさらに別の実施形態は、上記で定義した標的抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。そのようなモノクローナル抗体は、従来の方法によって作製することができ、限定されることなく、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖ、ならびにＦａｂおよびＦａｂ’フラグメントなどの抗原結合抗体フラグメントを含む、そのフラグメントまたは誘導体を包含する。モノクローナル抗体の調製の方法は当分野で公知である。一般に、モノクローナル抗体の調製は、適切な宿主を対象抗原で免疫し、免疫細胞を宿主から単離して、そのような免疫細胞を用いてモノクローナル抗体を単離し、そのような抗原のいずれかに特異的に結合するモノクローナル抗体に関してスクリーニングすることを含む。抗体フラグメントは、公知の方法、例えばモノクローナル抗体の酵素的切断によって調製し得る。
【０１１１】
これらのモノクローナル抗体およびフラグメントは、受動抗腫瘍免疫療法のために有用であるか、または標的化細胞毒性、すなわち腫瘍細胞の死滅を提供するために治療エフェクター部分、例えば放射性標識、細胞毒、治療用酵素、アポトーシスを誘導する作用物質等に結合し得る。本発明の１つの実施形態では、そのような抗体またはフラグメントを、標識または非標識形態にて、単独でまたは他の治療薬、例えば癌治療に適したシスプラチン、メトトレキサート、アドリアマイシン等のような化学療法剤と共に投与する。
【０１１２】
受動抗腫瘍免疫療法のために使用される場合、抗体は治療エフェクター部分に結合されてもよくまたは結合されなくてもよい。好ましくは、本明細書で述べる抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、同型接着および／または食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導することによって細胞の死滅を媒介する。本明細書で述べる抗体は、好ましくは免疫系の成分と、好ましくはＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して相互作用する。しかし、本発明の抗体はまた、単に細胞表面の腫瘍抗原と結合することによって、したがって、例えば細胞の増殖をブロックすることによって作用を及ぼし得る。
【０１１３】
ＡＤＣＣは、本明細書で述べるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表し、これは、好ましくは標的細胞が抗体によって印付けられることを必要とする。
【０１１４】
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体のＦｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に係合したときに起こる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定の細胞集団は、定められたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導する機構と見なすことができ、前記機構はまた、抗原提示および腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導ももたらす。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボでの誘導は、腫瘍に対するＴ細胞応答および宿主由来の抗体応答をもたらす。
【０１１５】
ＣＤＣは、抗体によって指令され得るもう１つの細胞死滅方法である。ＩｇＭは、補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路を介してＣＤＣを指令するのに非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接した多数のＣ１ｑ結合部位の暴露を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくは、これらの暴露されたＣ１ｑ結合部位は、それまでの低親和性Ｃ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティのものへと変換し、これが、一連の他の補体タンパク質を含む事象のカスケードを引き起こし、エフェクター細胞化学走性／活性化物質Ｃ３ａおよびＣ５ａのタンパク質分解性放出をもたらす。好ましくは、補体カスケードは、細胞内および細胞外への水と溶質の自由な通過を促進し、アポトーシスをもたらし得る細胞膜の孔を作り出す、膜傷害性複合体の形成で終了する。
【０１１６】
腫瘍抗原を認識することができる免疫細胞（場合により遺伝的に修飾された）での受動免疫療法は、選択された患者において癌の退縮を媒介するのに有効である。これらの技術は、腫瘍反応性Ｔ細胞のクローン化またはポリクローナル培養物のエクスビボでの再活性化および増殖に基づき得る。培養後、Ｔ細胞をＩＬ−２と共に患者に再注入し得る。ヒトリンパ球を、抗原提示細胞上に提示される腫瘍抗原ペプチドにインビトロで感作するインビトロ技術が開発されている。反復インビトロ刺激によって、ヒト腫瘍抗原を認識する大きな能力を備えた細胞を誘導することができる。これらの細胞の養子移入は、従来通りに増殖させた細胞よりもインビボで腫瘍退縮を媒介するのに有効であり得る。
【０１１７】
１つの実施形態では、自己細胞傷害性リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球を、癌を有する患者から入手し得る。リンパ球を培養下で増殖させ、腫瘍抗原応答性ＣＴＬを、単独でまたは少なくとも１つの免疫調節剤と組み合わせて、好ましくは付加的にサイトカインと組み合わせて、ＭＨＣクラスＩと共に提示される腫瘍抗原ペプチドの存在下で培養することによって増殖させ得る。腫瘍抗原応答性ＣＴＬを、次に、患者における腫瘍を低減するまたは排除するのに有効な量で患者に注入して戻す。
【０１１８】
既存の応答が不十分である場合は、リンパ球を採取する前に抗腫瘍ペプチドワクチンで患者を予備刺激することができる。養子移入したＣＴＬは、低用量から中用量のＩＬ−２注入によって最も良好に生存すると予想される。
【０１１９】
「腫瘍抗原応答性ＣＴＬ」とは、例えば腫瘍細胞の表面に、クラスＩ  ＭＨＣと共に提示される、前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドに対して応答性であるＣＤ８＋Ｔ細胞を意味する。
【０１２０】
本発明によれば、ＣＴＬ応答性は、持続的カルシウム流入、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節、ならびに標的細胞を発現する腫瘍抗原の特異的細胞溶解性死滅を含み得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポーターを使用して測定し得る。
【０１２１】
「腫瘍抗原ペプチド」または「腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチド」とは、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントまたはペプチドのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含むオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。好ましくは、腫瘍抗原ペプチドは、本明細書で同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対する細胞応答、好ましくは腫瘍抗原応答性ＣＴＬを刺激することができ、ならびに／またはそれ自体でもしくは免疫原性担体に結合して使用された場合、本発明に従って同定される腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を惹起することができる。本発明による腫瘍抗原ペプチドは、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列のフラグメントの配列に実質的に対応する配列を含むペプチドであるか、または前記ペプチドの誘導体である。１つの実施形態では、前記ペプチドは、配列表の配列番号：５〜６２から成る群より選択されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。腫瘍抗原ペプチドは任意の長さであってよい。
【０１２２】
腫瘍抗原ペプチドが直接、すなわちプロセシングされずに、特に切断されずに提示される場合、腫瘍抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、直接提示される腫瘍抗原ペプチドの配列は、本発明に従って同定される腫瘍抗原のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。腫瘍抗原ペプチドがプロセシング後に、特に切断後に提示される場合、プロセシングによって生成されるペプチドは、ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合するのに適した長さを有し、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。好ましくは、プロセシング後に提示されるペプチドの配列は、本発明に従って同定される腫瘍抗原のアミノ酸配列に由来する、すなわちその配列は本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である。したがって、１つの実施形態において本発明による腫瘍抗原ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である、７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長の配列を含み、腫瘍抗原ペプチドのプロセシング後に提示ペプチドを形成する。しかし、腫瘍抗原ペプチドはまた、上記で述べた配列よりもさらに長い、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメントに実質的に対応し、好ましくは完全に同一である配列を含み得る。１つの実施形態では、腫瘍抗原ペプチドは、本発明に従って同定される腫瘍抗原の配列全体を含み得る。
【０１２３】
好ましくは、腫瘍抗原ペプチドは、直接またはプロセシング後に、クラスＩ  ＭＨＣ分子と共に提示され得、そのように提示された場合、腫瘍抗原応答性ＣＴＬを刺激することができる。クラスＩ  ＭＨＣによって提示されるペプチドの配列に実質的に対応するアミノ酸配列を有するペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣによって提示されるペプチドのＴＣＲ認識のためまたはＭＨＣへのペプチドの結合のために必須ではない１つ以上の残基において異なり得る。そのような実質的に対応するペプチドも、腫瘍抗原応答性ＣＴＬを刺激することができる。ＴＣＲ認識に影響を及ぼさないが、ＭＨＣへの結合の安定性を改善する残基において提示ペプチドと異なるアミノ酸配列を有するペプチドは、腫瘍抗原ペプチドの免疫原性を改善することができ、本明細書では「最適化ペプチド」と称され得る。これらの残基のいずれがＭＨＣまたはＴＣＲのどちらかへの結合に影響を及ぼす可能性がより高いと考えられるかについての既存の知識を利用して、実質的に対応するペプチドの設計への合理的なアプローチを用いることができる。生じた機能性のペプチドは、腫瘍抗原ペプチドとして企図される。
【０１２４】
本発明によれば、「免疫反応性細胞」という用語は、適切な刺激によって免疫細胞（例えばＢ細胞、ヘルパーＴ細胞またはＣＴＬ（細胞溶解性Ｔ細胞）など）へと成熟することができる細胞を意味する。免疫反応性細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未熟および成熟Ｔ細胞ならびに未熟および成熟Ｂ細胞を含む。腫瘍抗原を認識する細胞溶解性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の産生を所望する場合は、免疫反応性細胞を、細胞溶解性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の産生、分化および／または選択を促進する条件下で腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを提示する細胞（例えば腫瘍抗原を発現する細胞）と接触させる。抗原に暴露された場合のＴ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、免疫系のクローン選択に類似する。
【０１２５】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を包含する。
【０１２６】
「腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする細胞」または「腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する細胞」または同様の表現は、腫瘍細胞または、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して、その細胞が発現する腫瘍抗原を提示するもしくは、例えば腫瘍抗原のプロセシングによって、前記腫瘍抗原に由来するフラグメントを提示する抗原提示細胞などの細胞を意味する。同様に、「腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍」という用語は、腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする細胞を含む腫瘍を表す。
【０１２７】
「提示される、本発明に従って同定される腫瘍抗原のフラグメント」または同様の表現は、フラグメントが、例えば抗原提示細胞に直接添加された場合、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ、好ましくはＭＨＣクラスＩによって提示され得ることを意味する。１つの実施形態では、フラグメントは、本発明に従って同定される腫瘍抗原を発現する細胞、例えば腫瘍細胞によって天然に提示されるフラグメントである。
【０１２８】
「腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識する細胞」または「腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識する免疫反応性細胞」または同様の表現は、特にＭＨＣ分子に関連して、例えば抗原提示細胞または腫瘍細胞の表面上に提示された場合、前記腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドをある程度の特異性で認識することができる細胞を意味する。好ましくは、前記認識は、腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識する細胞が応答性であることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介性細胞溶解による、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわち腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする細胞の除去を含み得る。腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識し、応答性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「腫瘍抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。細胞がＢ細胞である場合、そのような免疫応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【０１２９】
「腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体」とは、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合、前記腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドをある程度の特異性で認識することができるＴ細胞受容体を意味する。好ましくは、前記認識は、上記で概説したように腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドを認識するＴ細胞受容体を担持する細胞が応答性であることを可能にする。
【０１３０】
「腫瘍抗原に対する細胞応答」は、腫瘍抗原をクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする細胞に対する細胞応答を包含することが意図されている。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働く、Ｔ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、腫瘍細胞を死滅させ、より多くの腫瘍細胞の産生を阻止する。両方の免疫応答が必要であると考えられるが、癌を制御するためにはＣＴＬ応答がより重要であると考えられる。
【０１３１】
いくつかの治療方法は、疾患細胞、例えば腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示する癌細胞の溶解を生じさせる、患者の免疫系の反応に基づく。これに関連して、例えば腫瘍抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体に特異的な自己細胞傷害性Ｔリンパ球を、腫瘍疾患を有する患者に投与し得る。インビトロでのそのような細胞傷害性Ｔリンパ球の産生は公知である。Ｔ細胞を分化させる方法の一例は、国際公開第ＷＯ−Ａ−９６３３２６５号に見出される。一般に、血液細胞などの細胞を含有する試料を患者から採取し、その細胞を、前記複合体を提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば樹状細胞）の増殖を生じさせることができる細胞と接触させる。標的細胞は、ＣＯＳ細胞などのトランスフェクト細胞であり得る。これらのトランスフェクト細胞は、所望の複合体をそれらの表面に提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球と接触した場合、後者の増殖を刺激する。その後、クローン増殖させた自己細胞傷害性Ｔリンパ球を患者に投与する。
【０１３２】
細胞傷害性Ｔリンパ球を選択する別の方法では、細胞傷害性Ｔリンパ球の特異的クローンを得るためにＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の蛍光四量体を使用する（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４−９６，１９９６；Ｄｕｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６，１９９８）。
【０１３３】
さらに、所望の複合体を提示する細胞（例えば樹状細胞）は、高い親和性で特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の増殖を生じさせ得る健常個体または別の種（例えばマウス）の細胞傷害性Ｔリンパ球と組み合わせ得る。これらの増殖した特異的Ｔリンパ球の高親和性Ｔ細胞受容体をクローニングし、場合により種々の程度にヒト化して、このようにして得られたＴ細胞受容体を、次に、例えばレトロウイルスベクターを使用して、遺伝子導入によって患者のＴ細胞に形質導入し得る。その後、これらの遺伝的に改変されたＴリンパ球を使用して養子移入を実施し得る（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９６２−７０，２００１；Ｋｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９５７−６１，２００１）。
【０１３４】
細胞傷害性Ｔリンパ球はまた、それ自体公知の方法でインビボにて生成し得る。１つの方法は、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体を発現する非増殖性細胞を使用する。本明細書で使用する細胞は、通常複合体を発現する細胞、例えば照射された腫瘍細胞または複合体の提示に必要な一方もしくは両方の遺伝子（すなわち抗原性ペプチドと提示ＭＨＣ分子）をトランスフェクトした細胞である。別の好ましい形態は、例えばリポソーム移入によってまたは電気穿孔法によって細胞に導入し得る組換えＲＮＡの形態での腫瘍抗原の導入である。生じた細胞は、対象とする複合体を提示し、自己細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識され、その後自己細胞傷害性Ｔリンパ球が増殖する。
【０１３５】
同様の作用は、抗原提示細胞への組込みをインビボで可能にするために、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをアジュバントと組み合わせることによって達成できる。腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドは、タンパク質として、ＤＮＡ（例えばベクター内の）としてまたはＲＮＡとして存在し得る。腫瘍抗原は、ＭＨＣ分子のペプチドパートナーを生成するようにプロセシングされ得るが、そのフラグメントは、さらなるプロセシングを必要とせずに提示され得る。後者は、特にこれらがＭＨＣ分子に結合できる場合に当てはまる。完全な抗原がインビボで樹状細胞によってプロセシングされる投与形態が好ましく、というのはこれが、有効な免疫応答に必要とされるヘルパーＴ細胞応答も生じさせ得るからである（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．７４：７５−９，２０００；Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２，１９９８）。一般に、例えば皮内注射によって、有効量の腫瘍抗原を患者に投与することが可能である。しかし、注射はまた、リンパ節内にも実施し得る（Ｍａｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：３２９９−３０３，２００１）。
【０１３６】
本発明によれば、参照試料または参照生物などの「参照品」は、試験試料または試験生物、すなわち患者から本発明の方法において得られた結果を相互に関連付け、比較するのに使用し得る。典型的には、参照生物は健常生物、特に腫瘍疾患に罹患していない生物である。
【０１３７】
「参照値」または「参照レベル」は、十分に大きな数の参照品を測定することによって参照品から経験的に決定することができる。好ましくは、参照値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも５０、または好ましくは少なくとも１００の参照品を測定することによって決定される。
【０１３８】
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」は、抗体などの作用物質が、それが特異的であるエピトープなどの標的に対して、別の標的への結合と比較してより強く結合することを意味する。ある作用物質は、第一の標的に対して、第二の標的に対する解離定数（ＫＤ）より低い解離定数で結合する場合、第二標的と比較して第一標的により強く結合する。好ましくは、作用物質が特異的に結合する標的に対する解離定数（ＫＤ）は、その作用物質が特異的に結合しない標的に対する解離定数（ＫＤ）よりも１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍または１０１０倍以上低い。
【０１３９】
「ＣＯＬ２０Ａ１」という用語は、コラーゲン遺伝子、好ましくはヒトコラーゲン遺伝子に関する。好ましくは、「ＣＯＬ２０Ａ１」という用語は、好ましくは配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む、好ましくは前記核酸配列または前記変異体から成る核酸、およびこの核酸によってコードされるタンパク質、好ましくは配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくは前記アミノ酸配列または前記変異体から成るタンパク質に関する。
【０１４０】
本発明によれば、腫瘍核酸または腫瘍抗原は、前記腫瘍核酸または腫瘍抗原が細胞または腫瘍に空間的に連結されている場合、特に前記腫瘍核酸または腫瘍抗原が細胞または腫瘍中に存在する場合、前記細胞または腫瘍と結合している。前記腫瘍核酸または腫瘍抗原は、前記細胞または腫瘍によって発現され得る。前記細胞は、腫瘍細胞または間質細胞などの腫瘍細胞と結合している細胞であり得る。
【０１４１】
本発明によれば、核酸は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。核酸は、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産されたおよび化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖としておよび直鎖状または共有結合閉環状分子として存在し得る。
【０１４２】
「本発明に従って同定される腫瘍核酸」および「本発明に従って同定される腫瘍抗原をコードする核酸」という用語は、同様の意味を有する。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを包含する。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加を包含し得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非標準ヌクレオチド、例えば天然には存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドも含み得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
【０１４４】
本明細書で核酸の検出または核酸の量の測定に言及する場合、実際に検出されるべきまたは実際にその量を測定されるべきである核酸は、好ましくはｍＲＮＡである。しかし、これは、ｍＲＮＡが間接的に検出されるまたはｍＲＮＡの量が間接的に測定される実施形態を包含し得ることが理解されるべきである。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに形質転換し、そのｃＤＮＡを検出してもよく、またはその量を測定してもよい。ｍＲＮＡは、本明細書ではｃＤＮＡの等価物と見なされる。当業者は、ｃＤＮＡ配列がｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書では同じ目的に、例えば検出されるべき核酸にハイブリダイズするプローブの作製に使用できることを理解する。したがって、本明細書で配列表に示す配列に言及する場合、これは、前記配列のＲＮＡ等価物も包含するものとする。
【０１４５】
本発明に従って述べる核酸は、好ましく単離されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、インビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動による分離によって、精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に使用可能な核酸である。
【０１４６】
例えば核酸およびアミノ酸配列に関して「変異体」という用語は、本発明によれば、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、立体配座変異体、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを包含する。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列の変化に関するが、その重要性は不明確であることが多い。完全な遺伝子配列決定は、しばしば所与の遺伝子について多数の対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。
【０１４７】
核酸分子に関して、「変異体」という用語は縮重核酸配列を包含し、本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列が参照核酸とは異なる核酸である。
【０１４８】
さらに、本発明による特定核酸配列の「変異体」は、単一または複数の、例えば少なくとも２、少なくとも４または少なくとも６、好ましくは３まで、４まで、５まで、６まで、１０まで、１５までまたは２０までのヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含む核酸配列を包含する。
【０１４９】
好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は参照核酸配列の全長に対して与えられる。
【０１５０】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換であるアミノ酸のパーセントを示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列の間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドのパーセントを示す。
【０１５１】
「同一性パーセント」という用語は、最良のアラインメント後に得られた、比較する２つの配列の間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセントを表すことが意図されており、このパーセントは純粋に統計的であって、２つの配列の間の相違は、ランダムにおよびそれらの全長にわたって分布する。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列比較は、従来、これらの配列を最適に整列した後に比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業による以外に、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって生成し得る。
【０１５２】
同一性パーセントは、比較する２つの配列の間で同一の位置の数を決定し、これら２つの配列間の同一性パーセントを得るためにこの数を比較する位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって計算される。
【０１５３】
核酸は、この核酸ともう１つ別の核酸の２つの配列が互いに相補的である場合、前記別の核酸に「ハイブリダイズすることができる」または「ハイブリダイズする」。核酸は、この核酸ともう１つ別の核酸の２つの配列が互いと安定な二本鎖を形成することができる場合、前記別の核酸に「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを許容する条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを転写した膜を、例えば２×ＳＳＣ中で室温にて、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で６８℃までの温度にて洗浄する。
【０１５４】
相補性パーセントは、第二の核酸配列と水素結合（例えばワトソン−クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子内の連続する残基のパーセントを示す（例えば１０個のうち５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が第二核酸配列内の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。
【０１５５】
「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖鎖上またはリン酸塩上での核酸の任意の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語はまた、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸を包含する。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。
【０１５６】
腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸は、本発明によれば、単独でまたは他の核酸、特に異種核酸と組み合わせて存在し得る。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸は、前記腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドを発現する。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に関して同種または異種であってよい発現制御配列または調節配列に機能的に連結されている。コード配列と調節配列は、それらが、前記コード配列の発現または転写が前記調節配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合で連結されている場合、互いに「機能的に」連結されている。コード配列が機能的タンパク質に翻訳される場合、調節配列が前記コード配列に機能的に連結されていれば、前記調節配列の誘導は、コード配列内にフレームシフトを引き起こすことなくまたは前記コード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。
【０１５７】
「発現制御配列」または「調節配列」という用語は、本発明によれば、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。調節配列の正確な構造は、種または細胞型によって異なり得るが、一般にはそれぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。より具体的には、５’非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。
【０１５８】
本発明によれば、核酸はさらに、前記核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの宿主細胞からの分泌を制御するペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在し得る。本発明によれば、核酸はまた、コードされるタンパク質またはペプチドが宿主細胞の細胞膜上に固定されるまたは前記細胞の特定小器官に分画されることを生じさせるペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在し得る。同様に、レポーター遺伝子または任意の「タグ」である核酸との組合せが可能である。
【０１５９】
好ましい実施形態では、組換え核酸分子は、本発明によれば、核酸、例えば本発明に従って同定される腫瘍抗原をコードする核酸の発現を制御する、適切な場合にはプロモーターを有する、ベクターである。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、核酸が、例えば原核細胞および／または真核細胞に導入され、および適切な場合は、ゲノムに組み込まれることを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。この種のベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。中間ビヒクルは、例えば電気穿孔法、パーティクルガン法、リポソーム投与、アグロバクテリアを用いた導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスを介した挿入における使用に適合させ得る。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。
【０１６０】
本発明に従って同定される腫瘍抗原をコードする核酸は、宿主細胞のトランスフェクションに使用し得る。本明細書における核酸は、組換えＤＮＡおよびＲＮＡの両方を意味する。組換えＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって作製し得る。さらに、適用の前に配列の安定化、キャップ形成およびポリアデニル化によって修飾してもよい。
【０１６１】
本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外来性核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。哺乳動物細胞、例えばヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長動物からの細胞が特に好ましい。細胞は様々な組織型に由来してよく、一次細胞および細胞株を含み得る。具体的な例は、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄の幹細胞および胚性幹細胞を含む。さらなる実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は、単一コピーまたは２以上のコピーの形態で宿主細胞内に存在してよく、１つの実施形態では、宿主細胞において発現される。
【０１６２】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。この用語は核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性にまたは安定に実施され得る。哺乳動物細胞における好ましい発現系は、Ｇ４１８に対する耐性を付与する遺伝子などの選択マーカー（したがって安定にトランスフェクトされた細胞株を選択することを可能にする）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー−プロモーター配列を含有する、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．３およびｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。
【０１６３】
ＭＨＣ分子が腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドを提示する本発明の場合、発現ベクターは、前記ＭＨＣ分子をコードする核酸配列も含み得る。ＭＨＣ分子をコードする核酸配列は、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸と同じ発現ベクター上に存在してもよく、または２つの核酸が異なる発現ベクター上に存在してもよい。後者の場合、２つの発現ベクターを細胞に共トランスフェクトし得る。宿主細胞が腫瘍抗原もしくは腫瘍抗原ペプチドまたはＭＨＣ分子のいずれも発現しない場合、それぞれをコードする２つの核酸を同じ発現ベクターまたは異なる発現ベクターで細胞にトランスフェクトし得る。細胞が既にＭＨＣ分子を発現する場合は、腫瘍抗原または腫瘍抗原ペプチドをコードする核酸配列だけを細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１６４】
「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」は、核酸の発現を調節する、特に低減するために使用し得る。「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」という用語は、本発明によれば、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであって、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたは前記遺伝子のｍＲＮＡに生理的条件下でハイブリダイズし、それにより前記遺伝子の転写および／または前記ｍＲＮＡの翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。本発明によれば、「アンチセンス分子」はまた、その天然プロモーターに対して逆方向に核酸またはその一部を含む構築物も包含する。核酸またはその一部のアンチセンス転写産物は、天然に存在するｍＲＮＡと二本鎖を形成することができ、したがってｍＲＮＡの蓄積または翻訳を妨げ得る。別の可能性は、核酸を不活性化するためのリボザイムの使用である。
【０１６５】
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端または５’上流部位、例えば翻訳開始部位、転写開始部位もしくはプロモーター部位とハイブリダイズする。さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’非翻訳領域またはｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズする。
【０１６６】
１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの組合せから成り、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端がホスホジエステル結合によって互いに連結されている。これらのオリゴヌクレオチドは、従来の方法で合成され得るかまたは組換えによって生産され得る。
【０１６７】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは「修飾」オリゴヌクレオチドである。本明細書では、オリゴヌクレオチドを、例えばその安定性または治療効果を高めるために、その標的に結合する能力を損なわずに非常に異なる方法で修飾し得る。本発明によれば、「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、（ｉ）そのヌクレオチドの少なくとも２個が合成ヌクレオシド間結合（すなわちホスホジエステル結合ではないヌクレオシド間結合）によって互いに連結されている、および／または（ｉｉ）通常は核酸内で認められない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合で連結されている、オリゴヌクレオチドを意味する。好ましい合成ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【０１６８】
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、共有結合で修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドも包含する。「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば３’位のヒドロキシル基および５’位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合した糖残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−アルキル化リボース残基またはリボースの代わりにアラビノースなどの別の糖を含有し得る。
【０１６９】
オリゴヌクレオチドに関して上記で述べたすべての実施形態はポリヌクレオチドにも適用し得ることが理解されるべきである。
【０１７０】
本明細書で使用される「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子または分解されるべきｍＲＮＡを同定するために使用される、好ましくは１０ヌクレオチド長より大きい、より好ましくは１５ヌクレオチド長より大きい、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長の単離されたＲＮＡ分子を意味する。１９〜２５ヌクレオチドの範囲がｓｉＲＮＡの最も好ましい大きさである。
【０１７１】
本発明によるｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡまたは組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／もしくは改変によって天然に生じるＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含み得る。そのような改変は、ｓｉＲＮＡの末端またはｓｉＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド物質の付加；ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾（例えば２’置換リボヌクレオチドの使用もしくは糖−リン酸骨格への修飾）；またはデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡ中の１つ以上のヌクレオチドの置換を包含し得る。さらに、ｓｉＲＮＡは、修飾オリゴヌクレオチドに関して上述したようにその安定性を高めるために、特に１つ以上のホスホロチオエート結合を導入することによって修飾し得る。
【０１７２】
ｓｉＲＮＡの一方の鎖または両方の鎖は３’突出部も含み得る。本明細書で使用される場合、「３’突出部」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から伸びる少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。したがって１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを包含する）長、好ましくは１〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜約４ヌクレオチド長、特に好ましくは約２〜約４ヌクレオチド長の少なくとも１つの３’突出部を含む。ｓｉＲＮＡ分子の両方の鎖が３’突出部を含む実施形態では、突出部の長さは各々の鎖について同じであってもよくまたは異なってもよい。最も好ましい実施形態では、３’突出部はｓｉＲＮＡの両方の鎖上に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、本発明のｓｉＲＮＡの各々の鎖は、ジデオキシチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’突出部を含み得る。
【０１７３】
ｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３’突出部を分解に対して安定化することもできる。１つの実施形態では、プリンヌクレオチド、例えばアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドを含めることによって突出部を安定化する。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば２’−デオキシチミジンによる３’突出部内のウリジンヌクレオチドの置換は耐容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を及ぼさない。特に、２’−デオキシチミジン内に２’−ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地中での３’突出部のヌクレアーゼ耐性を有意に増強する。
【０１７４】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、または２つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域によって共有結合で連結されている単一分子を含み得る。すなわち、センス領域とアンチセンス領域はリンカー分子を介して共有結合で連結され得る。リンカー分子は、ポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、後者のタイプのｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は、「ダイサー」タンパク質（またはその等価物）によって細胞内で切断され、２つの個別の塩基対合ＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、「標的ｍＲＮＡ」は、下方調節の標的であるＲＮＡ分子を指す。
【０１７６】
ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＲＮＡの発現は、最初の転写ヌクレオチドがプリンである場合にのみ効率的であると考えられるので、標的とする部位を変化させずにｐｏｌ  ＩＩＩ発現ベクターからｓｉＲＮＡを発現させることができる。
【０１７７】
本発明によるｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（「標的配列」）のいずれかにおける約１９〜２５個の連続するヌクレオチドの任意のストレッチを標的とすることができる。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択するための技術は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１０月１１日に改訂された、Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ”に示されている。“Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ”は、ワールドワイドウェブ上のＤｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡによって運営されているウェブサイトで入手可能であり、ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのウェブサイトにアクセスして、「ｓｉＲＮＡ」のキーワードで検索することによって見出すことができる。したがって、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ内の約１９〜約２５ヌクレオチドの任意の連続するストレッチと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【０１７８】
一般に、標的ｍＲＮＡ上の標的配列は、好ましくは開始コドンから５０〜１００ヌクレオチド下流（すなわち、３’方向）から始まる、標的ｍＲＮＡに対応する所与のｃＤＮＡ配列から選択できる。標的配列は、しかし、５’もしくは３’非翻訳領域、または開始コドンの近傍の領域に位置し得る。
【０１７９】
ｓｉＲＮＡは、当業者の公知の多くの技術を用いて入手できる。例えば、ｓｉＲＮＡは、化学合成することができるかまたは当分野で公知の方法を用いて、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載されているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）インビトロ系を用いて組換え生産することができる。
【０１８０】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する１個のＲＮＡ分子として合成することができる。
【０１８１】
あるいは、ｓｉＲＮＡはまた、任意の適切なプロモーターを使用して組換え環状または直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。そのような実施形態は、本明細書でｓｉＲＮＡの投与または医薬組成物へのｓｉＲＮＡの組込みに言及する場合に、本発明に従って包含される。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現するための適切なプロモーターは、例えばＵ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。
【０１８２】
他の適切なプロモーターの選択は当分野の技術範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的プロモーターまたは調節可能なプロモーターも含むことができる。
【０１８３】
組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、培養細胞発現系から標準的な技術によって単離され得るか、または細胞内で発現され得る。ｓｉＲＮＡをインビボで細胞に送達するための組換えプラスミドの使用を以下でより詳細に論じる。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する１個のＲＮＡ分子として組換えプラスミドから発現され得る。
【０１８４】
ｓｉＲＮＡを発現するのに適したプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入する方法、および対象とする細胞に組換えプラスミドを送達する方法は、当分野の技術範囲内である。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡはまた、インビボで組換えウイルスベクターから細胞内で発現され得る。組換えウイルスベクターは、ｓｉＲＮＡをコードする配列およびｓｉＲＮＡ配列を発現するための任意の適切なプロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｓｉＲＮＡの発現のための誘導的プロモーターまたは調節可能なプロモーターも含み得る。ｓｉＲＮＡは、２個の別々の相補的なＲＮＡ分子として、または２つの相補的な領域を有する１個のＲＮＡ分子として組換えウイルスベクターから発現され得る。
【０１８６】
「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合で連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０個まで、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では交換可能に使用される。
【０１８７】
好ましくは、本発明に従って述べるタンパク質およびペプチドは単離されている。「単離されたタンパク質」または「単離されたペプチド」という用語は、タンパク質またはペプチドがその天然環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質またはペプチドは、基本的に精製された状態であり得る。「基本的に精製された」という用語は、タンパク質またはペプチドが、自然界でまたはインビボで結合している他の物質を基本的に含まないことを意味する。
【０１８８】
そのようなタンパク質およびペプチドは、例えば抗体の作製において、および免疫学的アッセイもしくは診断アッセイにおいて、または治療薬として使用し得る。本発明に従って述べるタンパク質およびペプチドは、組織または細胞ホモジネートなどの生物学的試料から単離することができ、また、多くの原核生物または真核生物発現系においても組換え発現され得る。
【０１８９】
本発明のために、タンパク質もしくはペプチドまたはアミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を包含する。
【０１９０】
アミノ酸挿入変異体は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端融合ならびに特定のアミノ酸配列における単一アミノ酸または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合は、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列内の特定の部位に挿入されるが、生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。
【０１９１】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【０１９２】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質またはペプチドの間で保存されていないアミノ酸配列内の位置に修飾が存在することおよび／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。
【０１９３】
好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似の荷電または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は一般に４つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることもある。
【０１９４】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性の程度、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約２００または２５０アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
【０１９５】
本明細書で述べるペプチドおよびアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術を用いて、例えば固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４）および類似の方法によってまたは組換えＤＮＡ操作によって容易に作製し得る。置換、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを作製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）の中で詳細に説明されている。
【０１９６】
本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質およびペプチドの修飾形態である。そのような修飾は、任意の化学修飾を包含し、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子、例えば炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドの単一または複数の置換、欠失および／または付加を含む。「誘導体」という用語はまた、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能性の化学的等価物に及ぶ。好ましくは、修飾ペプチドは増大した安定性および／または増大した免疫原性を有する。
【０１９７】
本発明によれば、核酸もしくはアミノ酸配列の変異体、実質的に対応するアミノ酸配列またはペプチドのフラグメントもしくは誘導体は、好ましくは、それぞれ、それが由来する核酸もしくはアミノ酸配列、アミノ酸配列またはペプチドの機能的特性を有する。そのような機能的特性は、抗体との相互作用、他のペプチドまたはタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合および酵素活性を含む。１つの実施形態では、核酸もしくはアミノ酸配列の変異体、実質的に対応するアミノ酸配列またはペプチドのフラグメントもしくは誘導体は、それぞれ、それが由来する核酸もしくはアミノ酸配列、アミノ酸配列またはペプチドと免疫学的に等価である。１つの実施形態では、機能的特性は免疫学的特性である。特定の特性は、ＭＨＣ分子と複合体を形成し、適切な場合、好ましくは細胞傷害性細胞またはヘルパーＴ細胞を刺激することによって、免疫応答を生じさせる能力である。腫瘍抗原のフラグメントは、好ましくは腫瘍抗原の少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個または少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含む。腫瘍抗原のフラグメントは、好ましくは腫瘍抗原の８個まで、特に１０個まで、１２個まで、１５個まで、２０個まで、３０個までまたは５５個までの連続するアミノ酸の配列を含む。腫瘍抗原のフラグメントは、好ましくは、ＭＨＣ分子と共に提示され得、そのように提示された場合、細胞応答を刺激することができる腫瘍抗原の一部である。
【０１９８】
腫瘍抗原の好ましいフラグメントは、インビボでの細胞傷害性Ｔリンパ球の刺激に適するが、エクスビボでの治療的養子移入のための、増殖され、刺激されたＴリンパ球の生産にも適する。
【０１９９】
標的タンパク質に特異的に結合する特異的抗体を含有する抗血清は、様々な標準的工程によって調製できる；例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ  ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２および“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ”ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＩＳＢＮ  ０８７９６９５４４７参照。それにより、複合体膜タンパク質をそれらの天然形態で認識するアフィンおよび特異的抗体を作製することも可能である（Ａｚｏｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２９：３５−４８，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８９９−１９０４，１９８９；Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４：１０７−１１６，２０００）。これは、治療的に使用される予定の抗体の作製のために特に適切であるが、多くの診断適用にも適切である。これに関して、全タンパク質、細胞外部分配列ならびに生理的に折りたたまれた形態で標的分子を発現する細胞で免疫することが可能である。
【０２００】
モノクローナル抗体は、伝統的にハイブリドーマ技術を用いて作製される（技術的詳細に関しては：“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”ｂｙ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｄｅａｎ  ＩＳＢＮ  ０−１９−９６３７２２−９；“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，ＩＳＢＮ：０８７９６９３１４２；“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ”ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７参照）。
【０２０１】
抗体分子の小さな部分であるパラトープだけが、抗体のそのエピトープへの結合に関与することは公知である（Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６），Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ参照）。ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと称される、ｐＦｃ’領域が酵素的に除去されたまたはｐＦｃ’領域なしで生成された抗体は、完全な抗体の両方の抗原結合部位を担持する。同様に、Ｆａｂフラグメントと称される、Ｆｃ領域が酵素的に除去されたまたは前記Ｆｃ領域なしで生成された抗体は、無傷抗体分子の一方の抗原結合部位を担持する。さらに、Ｆａｂフラグメントは、共有結合で連結された抗体の軽鎖および、Ｆｄと称される、前記抗体の重鎖の一部から成る。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要決定基であり（１つのＦｄフラグメントは、抗体の特異性を変化させずに１０までの異なる軽鎖と結合できる）、Ｆｄフラグメントは、単離された場合、エピトープに結合する能力を保持する。
【０２０２】
抗体の抗原結合部分内に位置するのは、抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）およびパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）である。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の両方のＦｄフラグメントが、各々の場合に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によって分けられた４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含む。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、さらにより詳細には重鎖のＣＤＲ３領域が抗体特異性に大きく関与する。
【０２０３】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を、もとの抗体のエピトープに対する特異性を保持しつつ、同じかまたは異なる特異性を有する抗体の類似領域によって置換できることは公知である。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合で連結して機能的抗体を生成する、「ヒト化」抗体の開発を可能にした。
【０２０４】
別の例として、国際公開第ＷＯ９２／０４３８１号は、マウスＦＲ領域の少なくとも一部がヒト起源のＦＲ領域で置換されたヒト化マウスＲＳＶ抗体の生産と使用を述べている。抗原結合能力を有する無傷抗体のフラグメントを含む、この種の抗体は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
【０２０５】
本発明によれば、「抗体」という用語は、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラ抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体、ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同なヒトまたは非ヒト配列で置換されているキメラＦｄフラグメント抗体も包含する。「抗体」という用語はまた、「一本鎖」抗体も含む。
【０２０６】
腫瘍抗原に特異的に結合する非抗体タンパク質およびペプチドは、本発明に従って使用された場合、抗体を置換し得る。この種の結合物質は、例えば溶液中で固定化形態にてまたはファージディスプレイライブラリとして簡単に作製され得る縮重ペプチドライブラリによって提供され得る。同様に１個以上のアミノ酸を有するペプチドのコンビナトリアルライブラリを作製することが可能である。ペプトイドおよび非ペプチド合成残基のライブラリも作製し得る。
【０２０７】
抗体は、腫瘍抗原を発現する細胞および組織を提示するための治療標識にも連結し得る。抗体はまた、治療エフェクター部分にも連結し得る。
【０２０８】
検出可能標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第一もしくは第二の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するように第二標識と相互作用する、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって移動度、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす、または（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原もしくはイオン錯体形成を提供する、ように機能する任意の標識を包含する。蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定な同位体標識、同重体標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンなどの有機低分子、受容体のリガンドまたは細胞接着タンパク質もしくはレクチンなどの結合分子、結合物質の使用によって検出できる核酸および／またはアミノ酸残基を含む標識配列等のような構造体は、標識として適切である。検出可能標識は、非限定的に、硫酸バリウム、イオセタム酸、イオパノ酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、ならびにフッ素−１８および炭素−１１などの陽電子放射体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１などのγ放射体、フッ素およびガドリニウムなどの核磁気共鳴用の核種を含む放射性診断物質を包含する。
【０２０９】
本発明によれば、「治療エフェクター分子」という用語は、治療作用を及ぼし得る任意の分子を意味する。本発明によれば、治療エフェクター分子は、好ましくは１つ以上の腫瘍抗原を発現する細胞へと選択的に誘導され、抗癌剤、放射性ヨウ素標識化合物、毒素、細胞増殖抑制性または細胞溶解性薬剤等を包含する。抗癌剤は、例えばアミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン（ｃｙｔａｒａｂｉｄｉｎｅ）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロンα、ロムスチン、メルカプトプリン、メソトレキサート、ミトタン、塩酸プロカルバジン、チオグアニン、硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチンを含む。他の抗癌剤は、例えばＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，特にＣｈａｐｔｅｒ  ５２（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）に記載されている。毒素は、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質などのタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素であり得る。毒素残基はまた、コバルト−６０などの高エネルギー放出放射性核種であり得る。
【０２１０】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩを包含し、すべての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにそれらを提示することにより、正常免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞の間のシグナル伝達に関与する。ＭＨＣ分子は、細胞内プロセシング区画においてペプチドに結合し、Ｔ細胞による認識のためにこれらのペプチドを抗原提示細胞の表面に提示する。ＨＬＡとも称されるヒトＭＨＣ領域は、第６番染色体上に位置し、クラスＩおよびクラスＩＩ領域を含む。本発明のすべての態様の１つの好ましい実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０２１１】
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」は、参照試料（例えばｓｉＲＮＡで処理していない試料）と比較してレベル、例えばタンパク質またはｍＲＮＡのレベルの全体的な低下、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的低下を生じさせる能力を意味する。ＲＮＡまたはタンパク質発現のこの低減または阻害は、標的ｍＲＮＡ切断または分解を介して起こり得る。タンパク質発現または核酸発現に関するアッセイは当分野で公知であり、例えば、タンパク質発現についてはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析、ＲＮＡについてはノーザンブロット法またはＲＮアーゼプロテクションアッセイを含む。
【０２１２】
本発明によれば、「患者」という用語は、ヒト、非ヒト霊長動物または別の動物、特に哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはマウスおよびラットなどのげっ歯動物を意味する。特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【０２１３】
本発明によれば、「増大している」または「増大している量」という用語は、好ましくは少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の増大を指す。物質の量も、試験試料では検出可能であるが参照試料中には存在しないまたは検出不能である場合、参照試料と比較して生物学的試料などの試験試料中で増大している。
【０２１４】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、細胞の異常増殖によって形成される腫脹または病変（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな増殖を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性であり得る明確な組織塊を形成する。
【０２１５】
好ましくは、本発明による腫瘍疾患は、癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、腫瘍疾患もしくは癌疾患は、本発明に従って同定される腫瘍核酸および／もしくは腫瘍抗原が発現されるもしくは異常発現される細胞を特徴とし、ならびに／または腫瘍細胞もしくは癌細胞は、本発明に従って同定される腫瘍核酸および／もしくは腫瘍抗原の発現もしくは異常発現を特徴とする。好ましくは、腫瘍疾患、癌疾患、腫瘍細胞または癌細胞は、本発明に従って同定される腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする。
【０２１６】
「異常発現」は、本発明によれば、健常個体における状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増大していることを意味する。発現の増大は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはさらにそれ以上の増加を指す。１つの実施形態では、発現は疾患組織においてのみ認められ、健常組織での発現は抑制されている。
【０２１７】
本発明による「腫瘍」という用語は、中枢神経系の腫瘍疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫を含む。本発明による「癌」という用語は、中枢神経系の癌疾患、例えば神経膠腫、特に神経膠芽腫を含む。
【０２１８】
「神経膠腫」という用語は、脳または脊椎で発生する腫瘍の種類に関する。これは、神経膠細胞から生じるため、神経膠腫と呼ばれる。神経膠腫の最も一般的な部位は脳である。神経膠腫は、すべての脳および中枢神経系腫瘍の約３０％ならびにすべての悪性脳腫瘍の８０％を占める。
【０２１９】
神経膠腫は、組織学的特徴を共有する細胞の特定の種類に従って命名されるが、必ずしもそれらを起源とするわけではない。神経膠腫の主な種類には、脳室上衣細胞腫（脳室上衣細胞）、星状細胞腫（星状細胞）（多形性神経膠芽腫は悪性星状細胞腫であり、成人において最も一般的な原発性脳腫瘍である）、乏突起神経膠腫（乏突起神経膠細胞）、脳幹神経膠腫（脳幹において発症する）、視神経神経膠腫（視神経内または視神経の周囲で発症する）、および混合性神経膠腫（例えば乏突起星状細胞腫、異なる種類の神経膠からの細胞を含む）が含まれる。
【０２２０】
脳神経膠腫の処置は、その位置、細胞型および悪性度に依存する。しばしば、処置は、手術、放射線療法および化学療法を用いた併用アプローチである。脊髄腫瘍は手術と放射線によって処置することができる。テモゾロミドは、脳−血液関門を有効に越えることができる化学療法剤であり、現在は悪性度の高い腫瘍の治療において使用されている。神経膠腫はまれにしか治癒可能ではない。高悪性度の神経膠腫を有する患者の予後は一般に不良であり、高齢患者に関しては特に不良である。多形性神経膠芽腫は、診断後の平均生存期間が１２か月未満であるが、これは、より最近の処置で１４か月まで延長されている。
【０２２１】
グレードＩＶ星状細胞腫としても知られる、「多形性神経膠芽腫」（ＧＢＭ）、ＷＨＯ分類名「神経膠芽腫」という用語は、神経膠細胞を含む、ヒトにおける最も一般的で最も攻撃的な悪性原発性脳腫瘍であり、すべての機能性組織脳腫瘍症例の５２％およびすべての頭蓋内腫瘍の２０％を占める。ＧＢＭは２つの変形：巨細胞神経膠芽腫および神経膠肉腫を示す。
【０２２２】
処置は、化学療法、放射線および手術を含み得る。標準治療の放射線およびテモゾロミドでの化学療法による平均生存期間は１５か月間である。処置なしでの平均生存期間は４か月半である。手術が依然として標準治療である。
【０２２３】
「転移」とは、癌細胞の、その最初の部位から身体の別の部分への拡大を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および脈管に入るための内皮基底膜の貫入、そして次に、血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍、すなわち続発性腫瘍または転移性腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移は、しばしば原発性腫瘍が除去された後でも起こり、これは、腫瘍細胞または腫瘍成分が残存し、転移能を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関連する「遠隔転移」に関する。
【０２２４】
続発性または転移性腫瘍の細胞は、最初の腫瘍における細胞に類似する。これは、例えば卵巣癌が肝臓に転移した場合、続発性腫瘍は異常な肝細胞ではなく異常卵巣細胞で構成されることを意味する。肝臓における腫瘍は、その結果、肝臓癌ではなく転移性卵巣癌と呼ばれる。
【０２２５】
再燃または再発は、ある人が過去に罹患した状態に再び罹患する場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患したことがあり、前記疾患の処置を受けて成功したが、再び前記疾患を発症した場合、前記の新たに発症した疾患は再燃または再発と見なされ得る。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再燃または再発は、最初の腫瘍疾患の部位でも起こり得るが、必ずしも最初の部位で起こるとは限らない。したがって、例えば、患者が卵巣腫瘍に罹患し、処置を受けて成功したことがある場合、再燃または再発は、卵巣腫瘍の発生または卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生であり得る。腫瘍の再燃または再発は、腫瘍が最初の腫瘍の部位とは異なる部位でならびに最初の腫瘍の部位で発生する状況も包含する。好ましくは、患者が処置を受けた最初の腫瘍は原発性腫瘍であり、最初の腫瘍の部位とは異なる部位の腫瘍は続発性または転移性腫瘍である。
【０２２６】
本発明によれば、生物学的試料は、体液を含む組織試料および／または細胞試料であってよく、パンチ生検を含む組織生検、および血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便または他の体液を採取することなどの従来の方法で入手し得る。１つの実施形態では、生物学的試料は、癌に罹患している疑いがある組織から得た試料である。１つの実施形態では、生物学的試料は、腫瘍試料、例えば腫瘍から得た、腫瘍細胞を含有する試料である。本発明によれば、「生物学的試料」という用語は、加工された生物学的試料、例えば生物学的試料の画分または単離物、例えば核酸およびペプチド／タンパク質単離物も包含する。
【０２２７】
本発明に従って述べる医薬組成物および処置の方法は、本明細書で述べる疾患を治療的に処置するまたは予防する免疫またはワクチン接種のためにも使用し得る。本発明によれば、「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、好ましくは抗原に対する免疫応答の増大または活性化に関する。癌への免疫効果を試験するために動物モデルを使用することが可能である。例えば、ヒト癌細胞をマウスに導入して、腫瘍を生じさせ得る。癌細胞への効果（例えば腫瘍サイズの縮小）を、動物に投与した作用物質による免疫の有効性の尺度として測定し得る。
【０２２８】
免疫またはワクチン接種のための組成物の一部として、好ましくは本明細書で述べる１つ以上の作用物質を、免疫応答を誘導するためまたは免疫応答を増大させるために１つ以上のアジュバントと共に投与する。アジュバントは免疫応答を増強する物質である。アジュバントは、抗原貯蔵所を提供し（細胞外にまたはマクロファージ中に）、マクロファージを活性化するおよび／または特定のリンパ球を刺激することによって免疫応答を増強し得る。アジュバントは公知であり、非限定的に、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ，ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、サポニン、例えばＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；国際公開第ＷＯ９６／３３７３９号）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６，１９９７）、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−９，１９９５参照）ならびに生分解性油から調製される様々な油中水型エマルション、例えばスクアレンおよび／またはトコフェロールを包含する。好ましくは、本発明によれば、ペプチドをＤＱＳ２１／ＭＰＬとの混合物中で投与する。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比率は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、特に約１：１である。ヒトへの投与のためには、ワクチン製剤は、典型的には約１μｇ〜約１００μｇの範囲内のＤＱＳ２１およびＭＰＬを含有する。
【０２２９】
患者の免疫応答を刺激する他の物質も投与し得る。例えば、リンパ球へのサイトカインの調節特性により、ワクチン接種においてサイトカインを使用することが可能である。そのようなサイトカインには、例えば、ワクチンの防御作用を高めることが示されたインターロイキン１２（ＩＬ−１２）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１４３２−１４３４，１９９５参照）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８が含まれる。
【０２３０】
免疫応答を増強し、それゆえワクチン接種において使用し得る多くの化合物が存在する。前記化合物には、Ｂ７−１およびＢ７−２（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）などのタンパク質または核酸の形態で提供される共刺激分子が含まれる。
【０２３１】
ペプチドは、それ自体公知の方法で投与し得る。１つの実施形態では、核酸をエクスビボ法によって、すなわち患者から細胞を取り出し、核酸を組み込むために前記細胞を遺伝的に修飾して、改変した細胞を患者に再導入することによって投与する。これは一般に、遺伝子の機能的コピーをインビトロで患者の細胞に導入することおよび遺伝的に改変した細胞を患者に再導入することを含む。遺伝子の機能的コピーは、遺伝的に改変した細胞において遺伝子が発現されることを可能にする調節エレメントの機能的制御下にある。トランスフェクションおよび形質導入の方法は当業者に公知である。
【０２３２】
本発明はまた、例えばウイルスおよび標的制御リポソームなどのベクターを使用することによってインビボで核酸を投与することも提供する。
【０２３３】
好ましい実施形態では、核酸を投与するためのウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子から成る群より選択される。アデノウイルスおよびレトロウイルスが特に好ましい。レトロウイルスは、典型的には複製欠損である（すなわち感染性粒子を生成することができない）。
【０２３４】
インビトロまたはインビボで核酸を細胞に導入する方法には、核酸のリン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと結合した核酸のトランスフェクション、対象とする核酸を担持する上記ウイルスでのトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクション等が含まれる。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に向かわせることが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、結合した標的制御分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの分子を核酸担体に組み込み得るまたは核酸担体に結合し得る。好ましい抗体は、腫瘍抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームを介した核酸の投与を所望する場合は、標的の制御および／または取込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質には、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、インターナライズされるタンパク質に対する抗体、細胞内部位を指向するタンパク質等が含まれる。
【０２３５】
本発明の治療的に活性な化合物は、注射または注入を含む、任意の従来経路によって投与し得る。投与は、例えば経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下的または経皮的に実施し得る。好ましくは、抗体は肺エアロゾルとして治療的に投与される。アンチセンス核酸は、好ましくは徐放性静脈内投与によって投与される。
【０２３６】
本発明の組成物は有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の進行の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の処置における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。本発明によれば、癌の診断または処置は、既に形成されたまたは今後形成される癌転移の診断または処置も含み得る。本発明によれば、「処置」という用語は、治療的処置および予防的処置、すなわち予防を含む。
【０２３７】
本発明の組成物の有効量は、処置される状態、疾患の重症度、患者の年齢、生理的状態、体格および体重を含む患者の個体別パラメータ、処置の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路および同様の因子に依存する。したがって、投与される本発明の組成物の用量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者における反応が初期用量で不十分である場合は、より高用量（または異なる、より限局された投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
【０２３８】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応または所望の効果を生じさせる治療活性物質の有効量を含有する。
【０２３９】
一般に、１ｎｇ〜１ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇのペプチドの用量を製剤し、投与する。核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の投与を所望する場合は、１ｎｇ〜０．１ｍｇの用量を製剤し、投与し得る。
【０２４０】
本発明の医薬組成物は、一般に医薬的に適合性の量でおよび医薬的に適合性の製剤中で投与される。「医薬的に適合性」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質を指す。この種の製剤は、通常、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、アジュバントなどの補足的免疫増強物質、例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＲＮＡならびに、適切な場合は、他の治療活性化合物を含有し得る。薬剤中で使用される場合、塩は医薬的に適合性であるべきである。しかし、医薬的に適合性ではない塩も、医薬的に適合性の塩を調製するために使用してもよく、本発明に包含される。この種の薬理的および医薬的に適合性の塩には、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものが含まれる。医薬的に適合性の塩はまた、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩として、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩としても調製され得る。
【０２４１】
本発明の医薬組成物は、医薬的に適合性の担体を含有し得る。「担体」という用語は、適用を容易にするために活性成分に組み合わせる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「医薬的に適合性の担体」という用語は、患者への投与に適する、１つ以上の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤または被包物質を包含する。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望の医薬効果を実質的に損なう相互作用が生じない成分である。
【０２４２】
本発明の医薬組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸などの適切な緩衝物質を含有し得る。
【０２４３】
医薬組成物は、適切な場合は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適切な防腐剤も含有し得る。
【０２４４】
医薬組成物は、通常、均一剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。本発明の医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルの形態またはエマルションの形態であり得る。
【０２４５】
非経口投与に適する組成物は、通常、好ましくは受容者の血液と等張である、活性化合物の滅菌水性または非水性製剤を含む。適合性の担体および溶媒の例は、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常は滅菌固定油が溶液または懸濁液媒質として使用される。
以下、参考形態の例を付記する。
１．  腫瘍抗原の発現および／または活性の阻害剤を含有する医薬組成物であって、
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２に記載の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
２．  （ｉ）腫瘍抗原の発現の前記阻害剤が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸に選択的にハイブリダイズする阻害性核酸であり、前記阻害性核酸が、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはこれらをコードするＤＮＡから成る群より選択される、または（ｉｉ）腫瘍抗原の活性の前記阻害剤が、前記腫瘍抗原に特異的に結合する抗体である、１．に記載の医薬組成物。
３．  腫瘍抗原のリガンドまたは腫瘍抗原をコードする核酸のリガンドを含有する医薬組成物であって、
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、および
腫瘍抗原の前記リガンドまたは腫瘍抗原をコードする核酸のリガンドが１つ以上の治療エフェクター部分に結合しており、前記治療エフェクター分子が、好ましくは放射性標識、細胞毒または細胞毒性酵素である、医薬組成物。
４．  腫瘍抗原の前記リガンドが、前記腫瘍抗原に特異的に結合する抗体を含む、または
腫瘍抗原をコードする核酸の前記リガンドが、前記核酸に選択的にハイブリダイズする核酸である、３．に記載の医薬組成物。
５．  （ｉ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド、または前記ペプチドの誘導体、
（ｉｉ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、または前記核酸の誘導体、
（ｉｉｉ）腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする宿主細胞、
（ｉｖ）腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドをコードするウイルス、
（ｖ）腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドの誘導体を提示する細胞、
（ｖｉ）腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体またはＴ細胞受容体、
（ｖｉｉ）腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するようにインビトロで感作された免疫反応性細胞、および
（ｖｉｉｉ）腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するＴ細胞受容体をコードする核酸で形質導入されたエフェクター細胞または幹細胞
から成る群より選択される１つ以上の作用物質を含有する医薬組成物であって、
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、および
前記腫瘍抗原ペプチドが、前記腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
６．  前記ペプチドが、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドであるか、またはＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ提示ペプチドを生成するようにプロセシングされ得る、５．に記載の医薬組成物。
７．  前記宿主細胞が、前記コードされたペプチドまたはそのプロセシング産物に結合するＭＨＣ分子を発現する、５．に記載の医薬組成物。
８．  前記抗体が、モノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、または抗体のフラグメントまたは合成抗体である、５．に記載の医薬組成物。
９．  治療用または予防用腫瘍ワクチンの形態である、５．から８．のいずれか一つに記載の医薬組成物。
１０．  腫瘍疾患を処置するまたは予防するのに使用するための、１．から９．のいずれか一つに記載の医薬組成物。
１１．  腫瘍疾患を有するまたは腫瘍疾患を発症するリスクがある患者を処置する方法であって、１．から１０．のいずれか一つに記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含み、前記投与することが、好ましくは配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む腫瘍抗原をクラスＩ  ＭＨＣと共に提示することを特徴とする腫瘍に対するＣＴＬ活性を誘導するまたは促進する、方法。
１２．  腫瘍疾患の診断、検出または観測のための方法であって、
（ｉ）腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉｉ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体、
（ｉｖ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するＴ細胞、および／または
（ｖ）腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを提示する細胞
から成る群より選択される１つ以上のパラメータを、患者から単離した生物学的試料中で検出するおよび／またはその量を測定することを含み、
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、および
前記腫瘍抗原ペプチドが、前記腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む、方法。
１３．  前記生物学的試料が組織または器官に由来しており、前記組織または器官が腫瘍を含まない場合、その細胞は、前記腫瘍抗原および／または前記腫瘍抗原をコードする核酸を実質的に発現しない、１２．に記載の方法。
１４．  前記検出および／または前記量の測定が、
（ｉ）前記生物学的試料を、検出されるべきおよび／またはその量を測定されるべき前記核酸、前記ペプチド、前記抗体、前記Ｔ細胞または前記細胞に特異的に結合する作用物質と接触させること、ならびに
（ｉｉ）前記作用物質と、検出されるべきまたはその量を測定されるべき前記核酸、前記ペプチド、前記抗体、前記Ｔ細胞または前記細胞との複合体の形成を検出することおよび／または前記複合体の量を測定すること
を含む、１２．または１３．に記載の方法。
１５．  （ｉ）前記核酸に特異的に結合する前記作用物質が、前記核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、
（ｉｉ）前記ペプチドに特異的に結合する前記作用物質が、前記ペプチドに特異的に結合する抗体を含む、
（ｉｉｉ）前記抗体に特異的に結合する前記作用物質が、前記抗体に特異的に結合するペプチドを含む、または
（ｉｖ）前記Ｔ細胞に特異的に結合する前記作用物質が、ＭＨＣ分子と前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドとの複合体を提示する細胞を含む、１４．に記載の方法。
１６．  前記作用物質が検出可能な標識をさらに含む、１４．または１５．に記載の方法。
１７．  （ｉ）腫瘍抗原のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸、
（ｉｉ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチド、
（ｉｉｉ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する抗体、
（ｉｖ）腫瘍抗原もしくは前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを認識するＴ細胞、および／または
（ｖ）腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを提示する細胞
に特異的に結合する作用物質を含む診断試験キットであって、前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、および
前記腫瘍抗原ペプチドが、前記腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、
前記作用物質が、好ましくは検出可能な標識をさらに含む、診断試験キット。
１８．  腫瘍抗原または前記腫瘍抗原に由来する腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する作用物質であって、
前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：１もしくは２の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む核酸によってコードされるアミノ酸配列を含み、および
前記腫瘍抗原ペプチドが、前記腫瘍抗原のフラグメントのアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含み、
前記作用物質が、好ましくは抗体、より好ましくはモノクローナル、キメラ、ヒトもしくはヒト化抗体、抗体のフラグメントまたは合成抗体である、作用物質。
１９．  １８．に記載の作用物質と治療エフェクター部分または検出可能標識とのコンジュゲート。
２０．  前記腫瘍抗原が、配列表の配列番号：３もしくは４のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、
１．から１０．のいずれか一つに記載の医薬組成物、１１．から１６．のいずれか一つに記載の方法、１７．に記載の診断試験キット、１８．に記載の作用物質、または１９．に記載のコンジュゲート。
２１．  前記腫瘍疾患が中枢神経系の腫瘍疾患である、
１０．もしくは２０に記載の医薬組成物、または１１．から１６および２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．  前記腫瘍疾患が神経膠腫、特に神経膠芽腫である、
１０．２０もしくは２１に記載の医薬組成物、または１１．から１６、２０および２１のいずれか一つに記載の方法。
【実施例】
【０２４６】
本明細書で使用される技術および方法は、本発明において説明されるかまたはそれ自体公知の方法でおよび、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されているように実施される。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、特に指示されない限り製造者の情報に従って実施される。
【０２４７】
実施例１：ＣＯＬ２０Ａ１は神経膠芽腫の高度に特異的なバイオマーカーである
【０２４８】
神経膠芽腫に対するＣＯＬ２０Ａ１の特異性を検証するため、脂質に富む組織用の抽出キットを使用してＲＮＡを正常組織または神経膠芽腫試料から抽出した。ｃＤＮＡ合成を、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびランダム６量体／オリゴｄＴプライマーを用いて実施した。ＣＯＬ２０Ａ１発現を、プライマー６３０３（５’−ＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣ）および６３０４（５’−ＴＧＧＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＧＴＣＡＴ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて分析し、ＨＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）をハウスキーピング遺伝子として使用して相対発現を計算した。
【０２４９】
この方法を、１３の異なる腫瘍実体におけるＣＯＬ２０Ａ１の発現の分析のために使用する（図１）。神経膠芽腫（図１では脳腫瘍として表示）だけがＣＯＬ２０Ａ１の強い発現を示し、他のすべての腫瘍実体は、精巣癌の少数の試料を除き、ＣＯＬ２０Ａ１の発現を全く示さないかまたは非常に低い発現しか示さない。図２に示すように、転写産物であるＣＯＬ２０Ａ１（ＮＭ＿０２０８８２．２、ＮＰ＿０６５９３３．２）は、４００００のカットオフ値を使用した場合は分析した神経膠芽腫の５０％において高発現され、多くのＧＢＭ患者がＣＯＬ２０Ａ１を標的とする処置から恩恵を受けることを示唆する。転写産物の腫瘍特異性を、正常組織の大きなセット（ｎ＝６５）において前記ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルによって分析した。ＣＯＬ２０Ａ１は一部の成人の脳領域および脊髄において弱く発現される（図３）。これに対し、ワクチン接種および他の免疫療法アプローチの一般に認められている標的であるＥＲＢＢ２は、一部の脳領域を含む、いくつかの正常組織で高発現（４００００より大きい相対発現）を示す（図３）。
【０２５０】
実施例２：低い相同性は他のコラーゲンファミリー成員の予想される交差反応性を制限する
【０２５１】
ヒトＣＯＬ２０Ａ１オープンリーディングフレームは、１３６ｋＤａの予測分子量を有する１２８４アミノ酸のタンパク質をコードする。２２アミノ酸のシグナル配列が予測される。ＣＯＬ２０Ａ１の他のコラーゲンタンパク質との相同性をＢｌａｓｔによって評価し、他のコラーゲンとの全体的な相同性が低く、最も高いアラインメントスコアはコラーゲンα−１（ＸＩＶ）（ＣＯＬ１４Ａ１）およびコラーゲンα−１（ＸＩＩ）（ＣＯＬ１２Ａ１）で認められることを示した（図４Ａ）。重要な点として、ＣＯＬ１４Ａ１に関して図４Ｂに示すように、ＣＯＬ２０Ａ１と他のコラーゲンとの間で同一である長いストレッチのアミノ酸は存在せず、それゆえＣＯＬ２０Ａ１が特異的標的化および分子の検出のために使用できることを示唆する（図４Ｂ）。
【０２５２】
実施例３：ＣＯＬ２０Ａ１特異的配列は予測Ｔ細胞エピトープを含む
【０２５３】
ＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＣＯＬ２０Ａ１の標的化能力を調べるため、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベースを用いて配列上に存在するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１エピトープを予測した。ＣＯＬ２０Ａ１にユニークな５８のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１エピトープが検出され（図５）、ＣＯＬ２０Ａ１がＴ細胞に基づく治療法に使用できることを示唆した。
【０２５４】
実施例４：ＣＯＬ２０Ａ１  ｍＲＮＡはヒト細胞から翻訳され得る
【０２５５】
ＣＯＬ２０Ａ１をコードする組換え配列をＨＥＫ−２９３  Ｔ細胞にトランスフェクトし、細胞溶解物を、市販のＣＯＬ２０Ａ１特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてウェスタンブロット法によって分析した。予想されたＣＯＬ２０Ａ１サイズのバンドは、トランスフェクト細胞において検出できるが、モックトランスフェクト細胞では検出できず、ＣＯＬ２０Ａ１  ｍＲＮＡがヒト細胞において安定なタンパク質に翻訳され得ることを示す（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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