(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤、及び（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬を含む、
吸入投与に適した、呼吸器障害の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤（ａ）が、９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オンである請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
ムスカリン受容体拮抗薬（ｂ）が、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム又はオキシトロピウムである請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ムスカリン受容体拮抗薬（ｂ）が、アトロピン又はグリコピロレートである請求項１〜３の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
固定された組み合わせである請求項１〜４の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の組成物、及び１以上の医薬上許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、呼吸器障害の治療のための医薬組成物。
【請求項７】
乾燥粉末インヘラー（ＤＰＩ）又は定量インヘラー（ＭＤＩ）により投与するための請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
呼吸器障害の治療のための医薬製剤であって、
（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤を含む製剤、及び（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬を含む製剤、を含むキットの形態である、医薬製剤。
【請求項９】
呼吸器障害の治療のための医薬製剤であって、
活性成分として、（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及び（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬を含み、（ａ）及び（ｂ）を、同時に、別々に或いは連続的に投与するための、医薬製剤。
【請求項１０】
呼吸器障害の治療のための医薬製剤であって、
活性成分として（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤を含み、及び
（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬と組合せて使用するための、医薬製剤。
【請求項１１】
呼吸器障害の治療のための医薬製剤であって、
活性成分として（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬を含み、及び
（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤と組合せて使用するための、医薬製剤。
【請求項１２】
呼吸器障害が、喘息、アレルギー性喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ステロイド抵抗性喘息、重症喘息、小児喘息、嚢胞性線維症、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）又は間質性肺疾患である請求項８〜１１の何れか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
呼吸器障害が、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である請求項８〜１２の何れか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
喘息、アレルギー性喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ステロイド抵抗性喘息、重症喘息、小児喘息、嚢胞性線維症、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）又は間質性肺疾患である、呼吸器障害の治療において、（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬と組み合わせて同時に、別々に或いは連続的に使用するための医薬の製造における、（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤の使用。
【請求項１５】
喘息、アレルギー性喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ステロイド抵抗性喘息、重症喘息、小児喘息、嚢胞性線維症、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）又は間質性肺疾患である、呼吸器障害の治療において、（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤と組み合わせて同時に、別々に或いは連続的に使用するための医薬の製造における、（ｂ）アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウム、オキシトロピウム、クリジニウム又はメペンゾレートであるムスカリン受容体拮抗薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願番号６１／７９９，１７７の優先権を主張し、参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、呼吸器障害及び炎症性障害の治療において驚くべき治療効果を有する薬剤の新規の組み合わせに関する。
【背景技術】
【０００３】
喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸器疾患を治療するための多くの異なる治療手段が存在する。例えば、コルチコステロイド、β２−アドレナリン受容体作動薬、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）４阻害剤、ＰＤＥ３阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗薬、上皮成長因子受容体（ｅｇｆｒ）キナーゼ阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ＮＫ１作動薬及びムスカリン受容体拮抗薬が、全て、呼吸器疾患の治療に使用するために知られている。
【０００４】
ＲＰＬ５５４（９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン）は、二重ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤であり、ＷＯ００／５８３０８に記載されている。複合ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤として、ＲＰＬ５５４は、抗炎症活性及び気管支拡張活性の両方を有し、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸器障害の治療に有用である。
【０００５】
呼吸器疾患の治療の組み合わせにおいて、異なる分類の呼吸器系薬剤を用いてもよいことが知られている。しかしながら、このような組み合わせ物の成分の間には相乗的相互作用が、ほとんど観察されない。
【発明の概要】
【０００６】
ＲＰＬ５５４に、ムスカリン受容体拮抗薬の活性を増強する能力があるということは本発明の驚くべき知見である。従って、ＲＰＬ５５４及びムスカリン受容体拮抗薬は、組み合わせた場合、相乗的に相互作用し、向上された治療効果を提供する。
【０００７】
薬剤間の真の相乗的相互作用はまれである。相乗的相互作用の存在は、例えば、ベーレンバウム法、ブリスインディペンデンス（ＢＩ）基準、及び／又は湾曲アイソボールを介するロエベアディティビティ（ＬＡ）モデルにより決定することができる（Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，１９７７；Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｇｒａｂｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｔａｌｌａｒｉｄａ，２００４；Ｔａｌｌａｒｉｄａ，２００６；Ｇｏｌｄｏｎｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，２００７；Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ａｎｄ  Ｒａｆｆａ，２０１０を参照）。
【０００８】
組み合わせ相乗作用は、ベーレンバウム法に従って、まずはじめに、各薬剤の低用量及び高用量を特定するために、単独治療としての各構成薬剤に対する用量反応曲線を決定することにより検出される。次いで、低用量の各薬剤の組み合わせ効果を測定する。低用量の各薬剤の組み合わせが、単独治療としての単独でのどんな高用量よりも大きな応答をする場合、２つの薬剤間に真の相乗作用が存在する。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、ＲＰＬ５５４をムスカリン受容体拮抗薬と組み合わせる場合に、ベーレンバウム法に従う真の相乗効果が生じることを見出した。低用量の各構成薬剤を用いる一方で得られる増強された治療効果は、臨床状況において非常に望ましいことであり、例えば、患者が経験する副作用が抑えられる。
【００１０】
従って、本発明は、（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤、及び（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬を含む組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、本発明による組成物及び１以上の医薬上許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、治療を必要とする対象における（ｉ）急性又は慢性の血管又は気管支の閉塞或いは（ｉｉ）急性又は慢性の炎症に基づく疾患又は状態の治療方法であって、（ａ）本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤、及び（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、本明細書で定義された疾患又は状態の治療において、同時に、別々に或いは連続的に使用するための、（ａ）本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及び（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬を含む製品を提供する。
【００１４】
また、本発明は、本明細書で定義された疾患又は状態の治療において、（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬と組み合わせて同時に、別々に或いは連続的に使用するための医薬の製造における（ａ）本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤の使用を提供する。
【００１５】
また、本発明は、本明細書で定義された疾患又は状態の治療において、（ａ）本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤と組み合わせて同時に、別々に或いは連続的に使用するための医薬の製造における（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬の使用を提供する。
【００１６】
また、本発明は、本明細書で定義された疾患又は状態の治療に用いるための医薬の製造における（ａ）本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及び（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬の使用を提供する。
【００１７】
また、本発明は、本明細書で定義された疾患又は状態の治療に用いるための本発明の組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、ムスカリン受容体拮抗薬と組み合わせて、本明細書で定義された疾患又は状態の治療において使用するための本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤を提供する。
【００１９】
また、本発明は、本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤と組み合わせて、本明細書で定義された疾患又は状態の治療において使用するためのムスカリン受容体拮抗薬を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＲＰＬ５５４での５０分間のインキュベーション後のＥＦＳに対するヒト単離気管支標本の収縮阻害を示す線グラフ。示された点は、ｎ＝５の異なる対象のサンプルで行った実験によるものであり、それらは、平均±ＳＥＭとして示される；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ対照。
【図２】アセチルコリンによる準最大収縮に対するＲＰＬ５５４及びアトロピンのヒト気管支弛緩。示された点は、ｎ＝５の異なる対象のサンプルで行った実験によるものであり、それらは、平均±ＳＥＭとして示される；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓアトロピン。
【図３】受動感作ヒト単離気管支におけるヒスタミンの収縮効果に対するＲＰＬ５５４の用量増加効果。示された点はｎ＝５の異なる対象のサンプルで行った実験によるものであり、それらは平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ受動感作対照。
【図４】アトロピンとＲＰＬ５５４の間の低濃度相互作用（１０ｎＭ及び１００ｎＭ）。データは、ｎ＝５の異なる対象のサンプルで行った実験によるものであり、それらは平均±ＳＥＭとして示される。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】ＲＰＬ５５４とアトロピンの組み合わせについてのＢＩ薬剤相互作用モデルの応答表面分析から得られる相互作用表面。横軸は化合物濃度を示し、縦軸はΔＥ（弛緩，％）を示す。０平面はＢＩ相互作用を示し、０平面を超える体積は相乗（正ΔＥ）相互作用を示す。相互作用の大きさは、直接ΔＥに関係しており、３Ｄプロットにおける異なる明暗は、相乗作用の異なるパーセンタイルバンド（１０％）を示す。それぞれ点の交差は、異なる対象（ｎ＝５）のサンプルについて行った実験平均を示す。
【図６】アトロピン（オープンカラム；アトロピン，ｎＭ）、ＲＰＬ５５４（閉鎖カラム；ｎＭ）に対する弛緩反応、各用量の組み合わせの相加反応（点描カラム；相加的）及び各用量の組み合わせで観察される弛緩反応（暗点描カラム；組み合わせ１：１））を示す棒グラフ。各作動薬の濃度をＸ軸上に示す。各棒は平均を示し、縦線は標準偏差（Ｎ＝５）を示す。相加反応の場合、ＳＤは、Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ａｎｄ  Ｒａｆｆａ（２０１０）の方法を用いて評価された。＊Ｐ＜０．０５（調整）１サンプルのｔ検定を用いる相加反応と比較。
【図７】ＲＰＬ５５４単独静脈内（ｉｖ．）投与（●）又は２μｇ／ｋｇアトロピンとの組み合わせ投与（▲）による気道閉塞（ボンベシンの静脈内（ｉｖ．）投与（２μｇ／ｍｌ；５ｍｌ／ｈｒ）によって誘導されるもの）の減少。
【図８】ＲＰＬ５５４単独静脈内（ｉｖ．）投与（●）又は２μｇ／ｋｇアトロピンとの組み合わせ投与（▲）による平均動脈血圧の減少。
【図９】アトロピンの静脈内（ｉｖ．）投与による気道閉塞（ボンベシンの静脈内（ｉｖ．）投与（２μｇ／ｍｌ；５ｍｌ／ｈｒ）によって誘導されるもの）の減少。
【図１０】アトロピンの静脈内（ｉｖ．）投与による平均動脈血圧の減少。
【図１１】異なる電気的フィールド刺激（ＥＦＳ）周波数でのグリコピロニウムに対する気管支緊張の濃度反応曲線（ＣＲＣ）。
【図１２】異なるグリコピロニウム濃度でのグリコピロニウムに対する気管支緊張の周波数反応曲線並びに曲線下面積（ＡＵＣ）プロット。
【図１３】異なる電気的フィールド刺激（ＥＦＳ）周波数でのＲＰＬ５５４に対する気管支緊張の濃度反応曲線（ＣＲＣ）。
【図１４】異なる濃度でのＲＰＬ５５４に対する気管支緊張の周波数反応曲線。
【図１５】（Ａ）３Ｈｚ、（Ｂ）１０Ｈｚ及び（Ｃ）２５ＨｚのＥＦＳでのＲＰＬ５５４、グリコピロニウム、及びＲＰＬ５５４とグリコピロニウムの組み合わせに対するヒト単離気管支の収縮反応、並びにそれぞれの周波数でのＡＵＣ比較（Ｄ）。
【図１６】ＲＰＬ５５４、グリコピロニウムに対する弛緩反応、ＲＰＬ５５４とグリコピロニウムの組み合わせに対する期待反応、及びＲＰＬ５５４とグリコピロニウムの組み合わせに対する観察反応。
【図１７】準最大収縮カルバコール（ＣＣｈ）誘導でのヒト単離気管支に対するＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムの濃度反応曲線。
【図１８】ヒト小気管支（＜１ｍｍ直径）に対するＲＰＬ５５４とグリコピロニウムの組み合わせにより誘導される期待弛緩反応及び観察弛緩反応。
【図１９】ＲＰＬ５５４とグリコピロニウムの組み合わせにより誘導される観察弛緩反応及び期待弛緩反応の間のデルタ効果。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
以下の略記が本明細書中で使用される:
ＲＰＬ５５４：９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン；ＡＮＯＶＡ：分散分析；ＢＩ：ブリスインディペンデンス；ＣＯＸ：シクロオキシゲナーゼ；ＥＣ３０：最大効果の３０％をもたらすために必要な濃度；ＥＣ５０：最大効果の５０％をもたらすために必要な濃度；ＥＣ７０：最大効果の７０％をもたらすために必要な濃度；ＥＦＳ：電気的フィールド刺激；Ｅｍａｘ：最大効果；ＫＨ：クレブス−ヘンゼライト緩衝液；ＬＡ：ロエベアディティビティ；及びＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ。
【００２２】
用語「医薬上許容される」とは、生物学的或いはその他の望ましくないものではない物質を言う。例えば、用語「医薬上許容される担体」とは、望ましくない生物学的作用をもたらすことなく或いは有害な方法で組成物の他の成分と相互作用することなく、組成物に組み込み、対象／患者に投与することができる物質を言う。このような医薬上許容される物質は、通常、毒物試験及び製造試験の必要な基準に適合したものであり、それらには、米国食品医薬品局により適切な不活性成分として特定された物質が含まれる。
【００２３】
用語「医薬上許容される酸付加塩」とは、生物学的或いはその他の望ましくないものではない医薬上の酸付加塩を言う。このような医薬上許容される酸付加塩は、当業者によく知られている。
【００２４】
用語「治療有効量」は、治療を必要とする対象に投与する場合に、治療を果たすために十分な量を意味する。特に、「有効」量は、所望の結果を得るために必要な量であり、「治療有効」量は、所望の治療効果を得るために必要な量である。例えば、ムスカリン受容体を拮抗することに関しては、「有効量」は、ムスカリン受容体拮抗量である。同様に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療するための治療有効量は、所望の治療結果（疾患の予防、改善、抑制又は緩和であってもよい）を達成し得る量である。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「治療すること」又は「治療」とは、哺乳動物（特にヒト）のような対象における疾患又は医学的状態（例えばＣＯＰＤ）を治療すること或いはその治療を意味し、（ａ）疾患又は医学的状態を発生から予防すること（即ち、対象の予防的治療）；（ｂ）疾患又は医学的状態を改善すること（即ち、対象における疾患又は医学的状態を排除すること或いは退行をもたらすこと）；（ｃ）疾患又は医学的状態を抑制すること（即ち、対象における疾患又は医学的状態の発症を遅らせる或いは抑止すること）；又は（ｄ）対象における疾患又は医学的状態の症状を緩和することを含む。例えば、用語「ＣＯＰＤを治療すること」には、ＣＯＰＤを発生から予防すること、ＣＯＰＤを改善すること、ＣＯＰＤを抑制すること、及びＣＯＰＤの症状を緩和することが含まれる。用語「対象」には、治療又は疾患予防を必要とする、特定の疾患又は医学的状態の疾患予防又は治療のために現在治療されているヒトのような動物、並びに本発明の組成物をアッセイで評価する又は使用する試験対象（例えば動物モデル）が含まれることを意図している。
【００２６】
ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤
本発明で用いられるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤は、９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン（ＲＰＬ５５４としても知られる）又はその医薬上許容される酸付加塩である。
【００２７】
通常、ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤は、９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オンである。したがって、９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オンの遊離塩基が好ましい。
【００２８】
ムスカリン受容体拮抗薬
ムスカリン受容体拮抗薬（ＭＲＡ）は、ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性を阻害する化合物である。当業者は、所定の化合物がムスカリン性アセチルコリン受容体の活性を阻害するかどうかを、当業者に周知のアッセイを用いるという困難を伴わずに決定することができる。
【００２９】
ＲＰＬ５５４には２つの構造的に異なるムスカリン受容体拮抗薬（即ち、アトロピン及びグリコピロニウム）の活性を増強する能力があるということが本発明の知見である。２つの構造的に異なるムスカリン受容体拮抗薬でのこの知見に基づけば、ＲＰＬ５５４で観察された相乗的な相互作用はそれらの化合物の特定の構造に起因するのではなく、ムスカリン受容体拮抗薬としてのそれらの化合物の活性に起因して生じるということになる。従って、ＲＰＬ５５４との相乗的な相互作用は、ムスカリン受容体拮抗活性を伴う全ての化合物で期待できるということになる。
【００３０】
通常、ムスカリン受容体拮抗薬は、アトロピン、メチルアトロピン、ホマトロピン、ヒヨスチアミン、スコポラミン、イプラトロピウム、オキシトロピウム、チオトロピウム、メタンテリン、プロパンテリン、アニソトロピン、クリジニウム、コピロレート（ロビナール）、イソプロパミド、メペンゾレート、トリジヘキセチル、ヘキソシクリウム、シクロペントラート、トロピカミド、トリヘキシフェニジル、ピレンゼピン、テレンゼピン、ＡＦ−ＤＸ１１６及びメトクトラミン等である。例えば、ムスカリン受容体拮抗薬は、アトロピン、硫酸アトロピン、アトロピンオキシド、硝酸メチルアトロピン、臭化水素酸ホマトロピン、臭化水素酸ヒヨスチアミン（ｄ、ｌ）、臭化水素酸スコポラミン、イプラトロピウムブロミド、オキシトロピウムブロミド、チオトロピウムブロミド、メタンテリン、プロパンテリンブロミド、アニソトロピンメチルブロミド、クリジニウムブロミド、コピロレート（ロビナール）、イソプロパミドヨージド、メペンゾレートブロミド、トリジヘキセチルクロリド（Ｐａｔｈｉｌｏｎｅ）、メチル硫酸ヘキソシクリウム、塩酸シクロペントラート、トロピカミド、塩酸トリヘキシフェニジル、ピレンゼピン、テレンゼピン、ＡＦ−ＤＸ１１６及びメトクトラミン等である。他の代表的なムスカリン受容体拮抗薬の例としては、アクリジニウム（例えばアクリジニウムブロミド）及びウメクリジニウム（例えば、ウメクリジニウムブロミド）が挙げられる。
【００３１】
通常、ムスカリン受容体拮抗薬は、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート（グリコピロニウム）、イプラトロピウム、チオトロピウム、オキシトロピウム、ピレンゼピン、テレンゼピン、アクリジニウム又はウメクリジニウムである。好ましくは、ムスカリン受容体拮抗薬は、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート（グリコピロニウム）、イプラトロピウムブロミド、チオトロピウムブロミド、オキシトロピウムブロミド、ピレンゼピン、テレンゼピン、アクリジニウム又はウメクリジニウムであってもよい。別の方法としては、ムスカリン受容体拮抗薬は、アトロピン、ヒヨスチン、グリコピロレート、イプラトロピウムブロミド、チオトロピウムブロミド、オキシトロピウムブロミド、ピレンゼピン又はテレンゼピンであってもよい。
【００３２】
より好ましくは、ムスカリン受容体拮抗薬は、アトロピン、イプラトロピウムブロミド又はチオトロピウムブロミドである。
【００３３】
最も好ましくは、ムスカリン受容体作動薬は、アトロピン又はグリコピロニウムである。
【００３４】
ムスカリン受容体拮抗薬は、そのラセミ化合物、そのエナンチオマー、そのジアステレオマー及びその混合物の形態であってもよく、その医薬上許容される酸付加塩であってもよい。ムスカリン受容体拮抗薬の付加塩形成に適切な酸の典型的な例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸及びトリフルオロ酢酸である。さらに、前述の塩の混合物を使用し得る。
【００３５】
組成物、組み合わせ、医薬組成物及び製剤
本発明の組成物は、（ａ）９，１０−ジメトキシ−２−（２，４，６−トリメチルフェニルイミノ）−３−（Ｎ−カルバモイル−２−アミノエチル）−３，４，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピリミド［６，１−ａ］イソキノリン−４−オン又はその医薬上許容される酸付加塩であるＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及び（ｂ）ムスカリン受容体拮抗薬を含む。
【００３６】
通常、本発明の組成物は固定された組み合わせ物である。固定された組み合わせ物において、ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及びムスカリン受容体拮抗薬は、同じ組成物中に存在する。固定された組み合わせ物は、ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及びムスカリン受容体拮抗薬の同時投与のために使用することができる。通常、固定された組み合わせ物は、乾燥粉末組成物（好ましくは乾燥粉末インヘラーからの送達に適したもの）、ネブライザーからの送達に適した溶液、或いは加圧定量インヘラーからの送達に適した溶液又は懸濁液である。
【００３７】
したがって、例えば、固定された組み合わせ物は、好ましくは、ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及びムスカリン受容体拮抗薬の両方を含む乾燥粉末組成物である。別の方法として、固定された組み合わせ物は、ネブライザーからの送達に適切なＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及びムスカリン受容体拮抗薬の両方を含む溶液（通常は水溶液）であってもよい。別の方法としては、固定された組み合わせ物は、加圧定量インヘラーからの送達に適したＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及びムスカリン受容体拮抗薬の両方を含む溶液又は懸濁液であってもよい。
【００３８】
固定された組み合わせ物において通常２成分が混合される。
【００３９】
別の方法としては、本発明の組成物は固定されない組み合わせ物であってもよい。固定されない組み合わせ物において、活性成分（ａ）及び（ｂ）は、同時に、実質的に同時に、別々に或いは連続的に投与するために、通常互いに分離され、１ユニットにパッケージ化される。
【００４０】
通常、組成物は、ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及びムスカリン受容体拮抗薬に加えて１以上の医薬上許容される担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含む医薬組成物である。組成物は、必要に応じて他の治療剤及び／又は製剤化剤を含んでいてもよい。他の治療剤の好ましい例は、β２−アドレナリン受容体作動薬である。β２−アドレナリン受容体作動薬の例は、サルブタモール、アルブテロール、ビトルテロール、フェノテロール、ホルモテロール、インダカテロール、イソエタリン、レバルブテロール、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルメファモール、サルメテロール及びテルブタリンである。β２−アドレナリン受容体作動薬の好ましい例は、サルブタモール、サルメテロール、ホルモテロール、アルブテロール及びピルブテロールである。
【００４１】
本発明の組成物は、通常医薬組成物の形態で対象に投与される。このような医薬組成物は、吸入、経口、経鼻、局所（経皮を含む）及び非経口投与形態（これらに限定されるものではない）を含む任意の許容される投与経路により対象に投与されてもよい。吸入投与が好ましい。さらに、本発明の組成物は、例えば、経口的に、１日複数回投与、１日単回投与又は１週単回投与で投与されてもよい。特定の投与形態に適した本発明の組成物で使用される活性剤の任意の形態（即ち、遊離塩基、医薬上許容される塩、溶媒和物等）が、本明細書で説明された医薬組成物で用いることができると理解されるであろう。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、通常治療有効量の活性剤を含む。しかしながら、医薬組成物が治療有効量を超えて（即ち、バルク組成物）、或いは治療有効量未満（即ち、複数回投与により治療有効量を達成するように設計された個々の単位用量）を含んでいてもよいということが当業者に認識され得るであろう。１つの実施形態では、組成物は、その製剤自体、投与経路、投薬回数などに応じた実際の量で、約０．０１〜９５重量％（約０．０１〜３０重量％、例えば約０．０１〜１０重量％など）の活性剤を含むであろう。他の実施形態では、吸入に適した組成物は、例えば、約０．０１〜３０重量％の活性剤を含むが、他の実施形態では、約０．０１〜１０重量％の活性剤を含む。
【００４３】
任意の従来の担体又は賦形剤が、本発明の医薬組成物で使用することができる。特定の担体若しくは賦形剤又は担体若しくは賦形剤の組み合わせの選択は、特定の対象を治療するために用いる投与形態或いは医学的状態又は病態のタイプに依存するであろう。この点において、特定の投与形態のための適切な組成物の調製については、製薬分野における当業者がその範囲内で精通している。さらに、このような組成物で使用される担体又は賦形剤は市販されている。さらなる例として、従来の製剤技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに記載されている：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（２０００）；及びＨ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９９）。
【００４４】
医薬上許容される担体になり得る代表的な物質の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ラクトース、グルコース及びスクロースのような糖類；トウモロコシデンプン及びバレイショデンプンのようなデンプン類；微結晶性セルロースのようなセルロース、並びにナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテートのようなその誘導体；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター及び坐剤ワックスのような賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油のような油類；プロピレングリコールのようなグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールのようなポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルのようなエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；クロロフルオロ炭素及びヒドロフルオロ炭素のような圧縮噴霧ガス；及び医薬組成物に使用されるその他の非毒性の互換性のある物質。医薬組成物は、通常、活性剤／活性成分を、医薬上許容される担体及び１以上の任意の成分と十分且つ緊密に混合或いは配合することにより調製される。次いで、得られた均一配合混合物は、従来の手順及び設備を用いて、錠剤、カプセル剤、丸剤、キャニスタ、カートリッジ、ディスペンサー等に成形或いは充填され得る。
【００４５】
通常、医薬組成物は吸入投与に適している。医薬組成物は、乾燥粉末インヘラー（ＤＰＩ）又は定量インヘラー（ＭＤＩ）により投与するためのものであってもよい。
【００４６】
吸入投与のための適切な組成物は、通常、エアロゾル又は粉末（例えば乾燥粉末組成物）の形態のものであり得る。このような組成物は、一般的に、ネブライザーインヘラー、乾燥粉末インヘラー又は定量インヘラーのような周知の送達装置を用いて投与される。それらの例を以下に記載する。
【００４７】
別の方法では、活性剤／活性成分を含む組成物を、ネブライザーインヘラーを用いて吸入投与してもよい。このようなネブライザー装置は、通常、組成物をミストとしてスプレーして対象の気道に送らせる高速空気流を生み出す。従って、ネブライザーインヘラーで使用するために処方される場合、活性剤／活性成分を、通常適切な担体に溶解して溶液を形成する。別の方法では、活性剤／活性成分を、微粒子化し、適切な担体と組み合わせ、呼吸に適するサイズに微粒子化された粒子の懸濁液を形成し得る。ここで微粒子化は、通常、粒子の少なくとも約９０パーセントが約１０μｍ未満の質量中央径を有する粒子にすることと定義される。用語「質量中央径」とは、半分の質量の粒子がより大きな直径の粒子に含まれ、半分がより小さい直径の粒子に含まれるような直径を意味する。
【００４８】
適切なネブライザー装置としては、ＲｅｓｐｉｍａｔＲＴＭ Ｓｏｆｔ ＭｉｓｔＴＭ Ｉｎｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＡＥＲｘＲＴＭ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．）及びＰＡＲＩ ＬＣ Ｐｌｕｓ Ｒｅｕｓａｂｌｅ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ｐａｒｉ ＧｍｂＨ）が挙げられる。ネブライザーインヘラーにおいて使用される代表的な組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬのＲＰＬ５５４を含む等張の水溶液を含む。１つの実施形態では、このような溶液は約３．５〜６のｐＨを有する。
【００４９】
別の方法としては、活性剤／活性成分を含む組成物を、乾燥粉末インヘラー（ＤＰＩ）を用いて吸入投与してもよい。このようなＤＰＩは、通常、吸気時に対象の気流中に分散される自由流動性粉末として活性剤を投与する。自由流動性粉末を達成するために、活性剤／活性成分を、通常、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸、ポリラクチド−コ−グリコライド及びそれらの組み合わせのような適切な賦形剤を用いて製剤化する。通常、活性剤/活性成分は、微粒子化され、賦形剤と組み合わされ、吸入に適した配合を形成する。従って、本発明の一実施形態では、活性剤／活性成分は、微粒子化された形態である。例えば、ＤＰＩにおいて用いられる代表的な組成物は、約１μｍ及び約１００μｍの間の粒径を有する乾燥ラクトース（例、乾燥製粉化ラクトース）、及び活性剤の微粒子化された粒子を含む。このような乾燥粉末製剤は、例えば、ラクトースを活性剤と組み合わせ、次いで成分を乾燥配合することにより調製することができる。別の方法としては、活性剤は、必要に応じて、賦形剤を伴わずに製剤化することができる。次いで、組成物は通常ＤＰＩに充填され、或いはＤＰＩと共に使用するための吸入カートリッジ又はカプセルに充填される。ＤＰＩは、当業者に周知であり、そのような多くの装置が市販されており、代表的な装置としては、ＡｅｒｏｌｉｚｅｒＲＴＭ（ノバルティス）、ＡｉｒｍａｘＴＭ（ＩＶＡＸ）、ＣｌｉｃｋＨａｌｅｒＲＴＭ（Ｉｎｎｏｖａｔａ  Ｂｉｏｍｅｄ）、ＤｉｓｋｈａｌｅｒＲＴＭ（グラクソスミスクライン）、ＤｉｓｋｕｓＲＴＭ又はＡｃｃｕｈａｌｅｒ（グラクソスミスクライン）、ＥａｓｙｈａｌｅｒＲＴＭ（オリオンファーマ）、ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ（アベンティス）、ＦｌｏｗＣａｐｓＲＴＭ（Ｈｏｖｉｏｎｅ）、ＨａｎｄｉｈａｌｅｒＲＴＭ（ベーリンガーインゲルハイム）、ＰｕｌｖｉｎａｌＲＴＭ（チエジ）、ＲｏｔａｈａｌｅｒＲＴＭ（グラクソスミスクライン）、ＳｋｙｅＨａｌｅｒＴＭ又はＣｅｒｔｉｈａｌｅｒＴＭ（ＳｋｙｅＰｈａｒｍａ）、Ｔｗｉｓｔｈａｌｅｒ（シェリングプラウ）、ＴｕｒｂｕｈａｌｅｒＲＴＭ（アストラゼネカ）、ＵｌｔｒａｈａｌｅｒＲＴＭ（アベンティス）等が挙げられる。
【００５０】
別の方法としては、活性剤を含む組成物を、定量インヘラー（ＭＤＩ）を用いて吸入投与してもよい。このようなＭＤＩは、通常、圧縮噴霧ガスを用いて一定量の活性剤を放出する。従って、定量製剤は、通常、クロロフルオロ炭素（例えばＣＣｌ３Ｆ）又はヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）（例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ａ）及び１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ２２７））のような液化噴霧剤中の活性剤の溶液又は懸濁液を含む。しかし、オゾン層に影響を与えるクロロフルオロ炭素についての懸念によりＨＦＡ類が一般的に好ましい。ＨＦＡ製剤のさらなる任意の成分としては、エタノール又はペンタンのような共溶媒、及びソルビタントリオレエート、オレイン酸、レシチン及びグリセリンのような界面活性剤が挙げられる。例えば、Ｐｕｒｅｗａｌらの米国特許第５，２２５，１８３号、ＥＰ０７１７９８７Ａ２（ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチュアリング社）及びＷＯ９２／２２２８６（ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクチュアリング社）を参照。ＭＤＩで使用するための代表的な組成物は、約０．０１〜５重量％の活性剤；約０〜２０重量％のエタノール；及び約０〜５重量％の界面活性剤を含み；残りはＨＦＡ噴霧剤である。このような組成物は、通常、活性剤、エタノール（存在する場合）及び界面活性剤（存在する場合）を含む適切な容器に、冷却又は加圧ヒドロフルオロアルカンを加えることによって調製される。懸濁液を調製するために、活性剤を微粒子化し、次いで噴霧剤と組み合わせる。次いで製剤をＭＤＩの一部を形成するエアロゾルキャニスタに充填する。ＭＤＩ類は、当業者に周知であり、このような多くの装置が市販されており、代表的な装置としては、ＡｅｒｏＢｉｄ  Ｉｎｈａｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ａｔｒｏｖｅｎｔ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（ベーリンガーインゲルハイム）、ＦｌｏｖｅｎｔＲＴＭ（グラクソスミスクライン）、Ｍａｘａｉｒ  Ｉｎｈａｌｅｒ（３Ｍ）、ＰｒｏｖｅｎｔｉｌＲＴＭ  Ｉｎｈａｌｅｒ（シェリング）、ＳｅｒｅｖｅｎｔＲＴＭ  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  Ａｅｒｏｓｏｌ（グラクソスミスクライン）等が挙げられる。別の方法として、懸濁液製剤は、微粒子化された活性剤の粒子上に界面活性剤のコーティングをスプレー乾燥して調製することができる。例えば、ＷＯ９９／５３９０１（グラクソグループリミテッド）及びＷＯ００／６１１０８（グラクソグループリミテッド）を参照。
【００５１】
呼吸に適する粒子の調製プロセス、及び吸入投与に適した製剤及び装置のさらなる例は、Ｂｒｉｇｇｎｅｒらの米国特許第５，８７４，０６３号；Ｔｒｏｆａｓｔの米国特許第５，９８３，９５６；Ｊａｋｕｐｏｖｉｃらの米国特許第６，２２１，３９８号；Ｇａｏらの米国特許第６，２６８，５３３号；Ｂｉｓｒａｔらの米国特許第６，４７５，５２４号；及びＣｏｏｐｅｒの米国特許第６，６１３，３０７号に開示されている。
【００５２】
別の方法では、医薬組成物は経口投与に適していてもよい。経口投与に適切な組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、カシェ剤、糖衣錠剤、散剤、顆粒剤；水性又は非水性液体の液剤又は懸濁剤；水中油又は油中水液体乳剤；エリキシル剤又はシロップ剤等の形態であってもよい；それぞれ所定量の活性剤を含む。
【００５３】
固体剤形（即ち、カプセル剤、錠剤、丸剤等）での経口投与を意図している場合、組成物は、通常、活性剤及びクエン酸ナトリウム又は二リン酸カルシウムのような１以上の医薬上許容される担体を含み得る。また、固体剤形は：デンプン、微結晶性セルロース、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又はけい酸のような充填剤又は増量剤；カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアのような結合剤；グリセロールのような湿潤剤；寒天、炭酸カルシウム、バレイショ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート及び／又は炭酸ナトリウムのような崩壊剤；パラフィンのような溶解遅延剤；第４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；セチルアルコール及び／又はモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；カオリン及び／又はベントナイト粘土のような吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及び／又はそれらの混合物のような滑沢剤；着色剤；及び緩衝剤を含んでいてもよい。
【００５４】
また、剥離剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味料、香味剤及び芳香剤、保存剤並びに酸化防止剤が、医薬組成物に存在してもよい。錠剤、カプセル剤、丸剤等のための代表的なコーティング剤としては、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸メタクリル酸エステルコポリマー、セルロースアセテートトリメリタート、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート等のような腸溶コーティングに使用されるものが挙げられる。医薬上許容される酸化防止剤の例としては：アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、プロピルガレート、アルファ−トコフェロール等のような脂溶性酸化防止剤；及びクエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤が挙げられる。
【００５５】
組成物は、例えば、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはその他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はマイクロスフェアを用いて活性剤の徐放又は制御放出を提供するよう製剤化してもよい。さらに、本発明の医薬組成物は乳白剤を含んでいてもよく、活性剤のみを放出するように、或いはそれを胃腸管の特定の部位で優先的に放出するように、必要に応じて遅延形態で製剤化されていてもよい。使用することができる包埋成分の例としては、ポリマー物質及びワックスが挙げられる。また、活性剤は、必要に応じて１以上の上記の賦形剤で、マイクロカプセル化された形態であってもよい。経口投与に適した液体剤形としては、例として、医薬上許容される乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤及びエリキシル剤が挙げられる。液体剤形は、通常、活性剤、並びに例えば、水又はその他の溶媒のような不活性な希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾアート、プロピレングリコール、１，３−ブチルエングリコール、油類（例、綿実油、ピーナッツ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル類及びそれらの混合物のような可溶化剤及び乳化剤を含む。懸濁剤は、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにそれらの混合物のような懸濁化剤を含んでいてもよい。
【００５６】
経口投与が意図される場合、本発明の医薬組成物は、単位剤形にパッケージ化されていてもよい。用語「単位剤形」とは、対象への投与に適した物理的に分離した単位、即ち、単独で或いは１以上のさらなる単位との組み合わせで所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性剤を含む各単位を言う。例えば、このような単位剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤等であり得る。
【００５７】
また、本発明の組成物は、非経口投与することもできる（例、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射又は腹腔内注射による）。このような投与に関して、活性剤は、滅菌溶液、懸濁液又は乳状液中で提供される。このような製剤を調整するための代表的な溶媒としては、水、食塩水、プロピレングリコールのような低分子量アルコール、ポリエチレングリコール、油類、ゼラチン、オレイン酸エチルのような脂肪酸エステル類等が挙げられる。代表的な非経口製剤は、活性剤のｐＨ４〜７の滅菌水溶液である。非経口製剤は、１以上の可溶化剤、安定剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含んでいてもよい。これらの製剤は、注射可能な滅菌媒体、滅菌剤、ろ過、照射又は熱の使用により滅菌してもよい。
【００５８】
また、本発明の組成物は、既知の経皮送達系及び賦形剤を用いて経皮投与してもよい。例えば、活性剤を、プロピレングリコール、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、アザシクロアルカン−２−オン等のような透過促進剤と混合して、パッチ又は同様の送達系に組み込んでもよい。必要に応じて、ゲル化剤、乳化剤及び緩衝剤などのさらなる賦形剤を、そのような経皮組成物中に用いてもよい。
【００５９】
ＲＰＬ５５４を二次的薬剤と組み合わせることによって、ある場合では、二つの組成物を投与することにより、ある場合では、活性剤及び二次的薬剤を含む単一組成物を投与することにより、二重治療（即ち、ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害活性及び二次的薬剤（ムスカリン受容体拮抗薬）に関連した活性）が達成され得る。併用療法において、投与されるＲＰＬ５５４の量並びに二次的薬剤の量は、通常単剤療法で投与される量より少なくてもよい。
【００６０】
ＲＰＬ５５４を、第二の活性剤（ムスカリン受容体拮抗薬）と物理的に混合して両方の薬剤を含む組成物を形成してもよく、或いは各薬剤が、同時又は順次対象に投与される分離された異なる組成物として存在してもよい。例えば、ＲＰＬ５５４は、従来の手順及び設備を用いて第二の活性剤と組み合わせて、ＲＰＬ５５４及び第二の活性剤を含む活性剤の組み合わせを形成することができる。さらに、活性剤は、医薬上許容される担体と組み合わせて、ＲＰＬ５５４、第二の活性剤及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物を形成してもよい。本実施形態において、組成物の成分は、通常、混合され又は配合されて、物理的な混合物を形成する。次いで、物理的な混合物は、本明細書に記載の何れかの経路を用いて治療有効量投与される。
【００６１】
別の方法としては、活性剤は、対象に投与する前に分離された異なる状態のままであってもよい。本実施形態において、投与前に薬剤を物理的に互いに混合せずに、別々の組成物として同時に又は別々の時間に投与される。このような組成物は、別々にパッケージ化することができ、或いはキットとしてまとめてパッケージ化してもよい。別々の時間に投与される場合、二次的薬剤は、通常、ＲＰＬ５５４の投与後２４時間以内に投与され得る。他の実施形態において、この時間的な関係は、ＰＬ５５４の投与後１２時間未満、８時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、１時間未満、３０分未満、１０分未満、１分未満、又はＲＰＬ５５４の投与直後である。また、これは、連続投与としても言及される。したがって、ＲＰＬ５５４は、それぞれ活性剤のために分離された区画を用いる吸入送達装置（例、ブリスターパック）を用いて、他の活性剤と同時に又は連続的に、吸入投与することができる。ここで、連続的とは、ＲＰＬ５５４の投与直後又はある所定の時間後（例、一時間後又は三時間後）に投与することを意味し得る。別の方法として、組み合わせを、分離された送達装置、即ち、各薬剤につき１つの送達装置を用いて投与してもよい。さらに、薬剤は異なる投与経路（即ち、一方を吸入投与し、他方を経口投与）で送達することができる。
【００６２】
通常、キットは、本発明の方法を行うために十分な量で、ＲＰＬ５５４を含む第一の剤形及び本明細書に記載の１以上の二次的薬剤を含む少なくとも一つのさらなる剤形を含む。第一の剤形及び第二（又は第三等）剤形は、共に、対象における疾患又は医学的状態の治療又は予防のための治療有効量の活性剤を含む。二次的薬剤は、含まれる場合、治療有効量存在し、即ち、通常、ＲＰＬ５５４と共投与される場合、治療上の有益な効果を生み出す量で投与される。二次的薬剤は、医薬上許容される酸付加塩、溶媒和物、光学的に純粋な立体異性体等の形態であり得る。したがって、以下に列挙される二次的薬剤は、そのような全ての形態を含むことを意図しており、市販のものであるか、或いは従来の手順及び試薬を用いて調製することができる。二次的薬剤の適切な投与量は、通常、約０．０５μｇ／日ないし約５００ｍｇ／日の範囲内である。
【００６３】
（疾患及び条件）
（ａ）本明細書で定義されたＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤及び（ｂ）本明細書で定義されたムスカリン受容体拮抗薬の組み合わせは、治療を必要とする対象における（ｉ）急性又は慢性の血管又は気管支の閉塞或いは（ｉｉ）急性又は慢性の炎症に基づく疾患又は状態を治療するために有用である。
【００６４】
通常、疾患又は状態は：
１．気道：気管支喘息、アレルギー性喘息、内在性喘息、外因性喘息、運動誘発性喘息、薬物誘発性喘息（アスピリン誘発性喘息及びＮＳＡＩＤ誘発性喘息を含む）及び粉じん誘発性喘息（断続的なもの及び持続性のもの両方及び全ての重症度のもの及び気道過敏反応性の他の原因のもの）を含む喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；伝染性気管支炎及び好酸球性気管支炎を含む気管支炎；肺気腫；気管支拡張症；嚢胞性線維症；サルコイドーシス；農夫肺及び関連疾患；過敏性肺炎；原因不明線維性肺胞炎、特発性間質性肺炎、抗腫瘍治療に合併する線維症、及び結核及びアスペルギルス症及びその他の真菌感染を含む慢性感染を含む肺線維症；肺移植合併症；肺脈管構造の血管炎性障害及び血栓性障害、及び肺高血圧症；気道の炎症性状態及び分泌状態と関連する慢性咳、及び医原性咳の治療を含む鎮咳作用；薬物性鼻炎及び血管運動性鼻炎を含む急性鼻炎及び慢性鼻炎；神経性鼻炎（花粉症）を含む通年性及び季節性アレルギー性鼻炎；鼻のポリープ症；一般的な風邪、並びに呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、コロナウイルス（ＳＡＲＳを含む）及びアデノウイルスによる感染を含む急性ウイルス感染を含む気道の閉塞性疾患；
【００６５】
２．骨及び関節：原発性及び続発性両方の骨関節炎／骨関節症（例えば先天性股関節形成不全）に関連する或いはそれを含む関節炎；頚部脊椎炎及び腰部脊椎炎、並びに背下部痛及び頚部痛；関節リウマチ及びスチル病；強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎及び未分化脊椎関節症（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｐｏｎｄａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）を含む血清陰性脊椎関節症；敗血性関節炎、並びにポット病及びポンセ症候群を含む結核のようなその他の感染関連関節症及び骨障害；尿酸痛風、ピロリン酸カルシウム沈着症及びカルシウムアパタイト関連腱、滑液嚢炎症及び滑膜炎症を含む急性及び慢性結晶誘発滑膜炎；ベーチェット病；原発性及び続発性シェーグレン症候群；全身性硬化症及び限局性強皮症；全身性エリテマトーデス、混合性結合組織病及び未分化結合組織疾患；皮膚筋炎及び多発性筋炎を含む炎症性ミオパシー；リウマチ性多発筋痛；全ての関節分布の特発性炎症性関節炎疹及びその関連症候群を含む若年性関節炎並びにリウマチ熱及びその全身性合併症；巨細胞動脈炎、高安動脈炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎、顕微鏡的多発性血管炎及びウイルス感染、過敏症反応、クリオグロブリン及びパラタンパク質に関連する血管炎を含む血管炎；背下部痛；家族性地中海熱、マックル・ウェルズ症候群及び家族性ハイバーニアンフィーバー（Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｈｉｂｅｒｎｉａｎ  Ｆｅｖｅｒ）、菊池病；薬物誘発性関節痛、腱炎及びミオパシー；
【００６６】
３．傷害［例えばスポーツ外傷］又は疾患による筋骨格障害の疼痛及び結合組織再構築：関節炎（例えば関節リウマチ、骨関節炎、痛風又は結晶性関節症）、その他の関節疾患（例えば椎間板変性又は顎関節変性）、骨再構築疾患（例えば骨粗鬆症、ページェット病又は骨壊死）、多発性軟骨炎、強皮症、混合結合組織病、脊椎関節症又は歯周病（例えば歯周炎）；
【００６７】
４．皮膚：乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎又はその他の湿疹性皮膚疾患、及び遅延型過敏症反応；植物及び光皮膚炎；脂漏性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、扁平苔癬、萎縮性硬化性苔癬、壊疽性膿皮症、皮膚サルコイド、円板状エリテマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡、表皮水疱症、蕁麻疹、血管浮腫、血管炎、毒性紅斑、皮膚好酸球増加症、円形脱毛症、男性型脱毛症、スウィート症候群、ウェーバー・クリスチャン症候群、多形性紅斑；感染性及び非感染性両方の蜂巣炎；脂肪織炎；皮膚リンパ腫、非黒色腫皮膚癌及び他の異形成病変；固定薬疹を含む薬物誘発性障害；
【００６８】
５．眼：眼瞼炎；通年性及び春期型アレルギー性結膜炎を含む結膜炎；虹彩炎；前部及び後部ブドウ膜炎；脈絡膜炎；自己免疫；網膜に影響する変性又は炎症性障害；交感性眼炎を含む眼炎；サルコイドーシス；ウイルス性、真菌性及び細菌性のものを含む感染；
【００６９】
６．胃腸管：舌炎、歯肉炎、歯周炎；逆流性のものを含む食道炎；好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む大腸炎、直腸炎、肛門掻痒症；小児脂肪便症、過敏性大腸症候群、及び消化管の遠隔部位で発現する食物関連アレルギー（例えば偏頭痛、鼻炎又は湿疹）；
【００７０】
７．腹部：自己免疫性、アルコール性及びウイルス性のものを含む肝炎；肝臓の線維症及び肝硬変；胆嚢炎；急性及び慢性両方の膵炎；
【００７１】
８．泌尿生殖器：間質性及び糸球体腎炎を含む腎炎；ネフローゼ症候群；急性及び慢性（間質性）膀胱炎及びハンナー潰瘍を含む膀胱炎；急性及び慢性尿道炎、前立腺炎、精巣上体炎、卵巣炎及び卵管炎；外陰部腟炎；ペーロニー病；勃起不全（男女両方）；
【００７２】
９．同種異系移植片拒絶：急性の及び慢性の、例えば、腎臓、心臓、肝臓、肺、骨髄、皮膚又は角膜の移植後又は輸血後のもの；又は慢性移植片対宿主病；
【００７３】
１０．ＣＮＳ：アルツハイマー病及びＣＪＤ及びｎｖＣＪＤを含むその他の認知症性疾患；アミロイドーシス；多発性硬化症及びその他の脱髄症候群；大脳アテローム性動脈硬化症及び血管炎；側頭動脈炎；重症筋無力症；内臓痛、頭痛、偏頭痛、三叉神経痛、非定型顔面痛、関節痛及び骨痛、癌及び腫瘍侵襲由来の疼痛、糖尿病性、ヘルペス後及びＨＩＶ関連ニューロパチーを含む神経因性疼痛症候群を含む急性疼痛及び慢性疼痛（急性、断続性又は持続性のもの、中枢起源或いは末梢起源）；神経サルコイドーシス；悪性、伝染性又は自己免疫性プロセスの中枢神経及び末梢神経系合併症；
【００７４】
１１．橋本甲状腺炎、グレイブス病、アジソン病、糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、好酸球性筋膜炎、高ＩｇＥ症候群、抗リン脂質症候群を含むその他の自己免疫障害及びアレルギー性障害；
【００７５】
１２．炎症性又は免疫学的要素を伴うその他の障害；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ハンセン病、セザリー症候群及び腫瘍随伴症候群を含む；
【００７６】
１３．心血管：冠血管及び末梢循環に影響するアテローム性動脈硬化症；心膜炎；心筋サルコイドを含む、心筋炎、炎症性心筋症及び自己免疫心筋症；虚血再灌流傷害；感染性のもの（例えば梅毒）を含む、心内膜炎、弁膜炎及び大動脈炎；血管炎；静脈炎などの近位及び末梢静脈の障害並びに深部静脈血栓症及び静脈瘤合併症などの血栓症；
【００７７】
１４．腫瘍学：前立腺、乳房、肺、卵巣、膵臓、腸及び結腸、胃、皮膚及び脳の腫瘍、並びに骨髄に影響する悪性腫瘍（白血病を含む）及びホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫のようなリンパ増殖系に影響する悪性腫瘍を含む一般的な癌の治療；転移性疾患及び腫瘍再発、並びに腫瘍随伴症候群の予防及び治療を含む；並びに
【００７８】
１５．胃腸管：小児脂肪便症、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎、顕微鏡的大腸炎、非定型大腸炎、過敏性腸障害、過敏性大腸症候群、非炎症性下痢、消化管の遠隔部位で発現する食物関連アレルギー、例えば、偏頭痛、鼻炎及び湿疹
から選ばれる。
【００７９】
好ましくは、疾患又は状態が、喘息、アレルギー性喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支炎、肺気腫、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ステロイド耐性喘息、重症喘息、小児喘息、嚢胞性線維症、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、間質性肺疾患、皮膚障害、アトピー性皮膚炎、乾癬、眼炎症、脳虚血又は自己免疫疾患である。
【００８０】
より好ましくは、疾患又は状態が、喘息又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。
【００８１】
治療される対象は、通常ヒトである。
【００８２】
通常、活性成分（ａ）及び（ｂ）は、同時投与される。好ましくは、活性成分（ａ）及び（ｂ）が、単一剤形に含まれる。
【００８３】
別の方法としては、活性成分（ａ）及び（ｂ）を、別々に投与してもよい。活性成分（ａ）及び（ｂ）の投与の間に時間遅延があってもよい。
【００８４】
活性成分（ａ）及び（ｂ）を、吸入投与してもよい。活性成分（ａ）及び（ｂ）を、エアロゾルで投与してもよい。
【００８５】
１回の投与につき投与される活性剤の量、又は１日あたりの投与される総量は、予め決定されていてもよく、或いは患者状態の特徴及び重症度、治療される状態、患者の年齢、体重及び全身の健康、患者の活性剤に対する耐性、投与経路、薬理学的考慮事項（例えば、活性剤の活性、効能、薬物動態プロファイル及び毒物学プロファイル）、並びに投与される任意の二次的薬剤等を含む非常に多くの要素を考慮することにより、患者ごとに決定されてもよい。疾患又は医学的状態（例えばＣＯＰＤ）に罹患している患者の治療は、予め決定された用量又は治療する医師により決定される用量で開始することができ、疾患又は医学的状態の症状の予防、改善、抑制或いは緩和に必要な期間続けられるであろう。このような治療を受けている患者は、通常、日常的にモニタリングされ、治療有効性を決定され得る。例えば、ＣＯＰＤの治療において、自発呼気量（１秒間で測定されるもの）における大幅な改善を、治療有効性の決定のために用いてもよい。本明細書に記載の他の疾患及び状態についての同様の指標は、当業者に周知であり、治療する医師が容易に利用可能である。医師による継続的なモニタリングは、活性剤の最適量が、いつ如何なる時にでも投与され、さらには治療期間の決定を容易にすることを保証するであろう。これは、二次的薬剤も投与する場合、それらの選択、用量及び治療期間も調整が要求される可能性があるため、特に有用である。このように、治療レジメン及び投薬スケジュールを、所望の有効性を示す最小量の活性剤を投与し、さらに、疾患又は医学的状態をうまく治療するために必要である限り投与し続けるように、治療過程全体にわたって調整することができる。従って、一実施形態では、本発明の組成物は、ヒト及びそれらの伴侶動物（例、イヌ、ネコ等）を含む哺乳動物における平滑筋障害を治療するために有用である。このような平滑筋障害としては、例えば、過活動膀胱、慢性閉塞性肺疾患及び過敏性大腸症候群が挙げられる。通常、平滑筋障害又はムスカリン受容体により媒介される他の障害の治療のための適切な投与量は、約０．１４μｇ／ｋｇ／日〜約７ｍｇ／ｋｇ／日（約０．１５μｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日を含む）の活性剤の範囲であり得る。平均７０ｋｇのヒトでは、投与量は活性剤約１０μｇ／日〜約５００ｍｇ／日である。
【００８６】
通常、本発明の組成物は、治療有効量の組成物を患者に投与することによって、ヒトを含む哺乳動物におけるＣＯＰＤ又は喘息のような肺障害又は呼吸器障害の治療に有用である。一般的に、肺障害の治療にための投与量は、約１０〜１５００μｇ／日の範囲であり得る。用語「ＣＯＰＤ」は、慢性閉塞性気管支炎及び肺気腫を含むさまざまな呼吸器の状態を包含することは当業者に理解される（例えば、Ｂａｒｎｅｓ（２０００）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：２６９−７８及びそこで引用された文献で教示されているもの）。
【００８７】
吸入投与される場合、本発明の組成物は、通常、気管支拡張を引き起こす効果を有する。従って、その方法形態の別のものにおいて、本発明は、気管支拡張を引き起こす量の本発明の組成物を患者に投与することを含む、患者において気管支拡張を引き起こす方法に関する。一般的に、気管支拡張を引き起こす治療有効量は、約１０〜１５００μｇ／日の範囲であり得る。
【００８８】
別の方法としては、本発明の組成物は、過活動膀胱の治療に用いてもよい。過活動膀胱の治療に用いる場合、代表的な投与量は、約１．０〜５００ｍｇ／日の範囲内である。別の方法としては、本発明の組成物は、過敏性大腸症候群の治療に用いてもよい。過敏性大腸症候群の治療に用いる場合、本発明の組成物は、通常、経口投与又は経直腸投与され得る、代表的な投与量は、約１．０〜５００ｍｇ／日の範囲内である。
【００８９】
ＲＰＬ５５４は血圧又は心拍数に対してムスカリン受容体拮抗薬（例えばアトロピン）と有害に相互作用しないということが、安全性試験による本発明の知見である。同様に、ムスカリン受容体拮抗薬（例えばアトロピン）の心血管への作用は、ＲＰＬ５５４により影響されない。
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【００９０】
実施例１
物質及び方法
組織の調製
肉眼的に正常な肺の領域を、肺癌の肺葉切除術を受けた慢性気道疾患の病歴がない対象２４人（男性１１人及び女性１３人、６０．１±１．６歳）から切除した未関与領域から採取した。
【００９１】
気道を、すぐに、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤インドメタシン（５．０μＭ）を含む酸素化クレブスヘンゼライト緩衝液（ＫＨ）（ｍＭ：ＮａＣｌ  １１９．０，ＫＣｌ  ５．４，ＣａＣｌ２  ２．５，ＫＨ２ＰＯ４  １．２，ＭｇＳＯ４  １．２，ＮａＨＣＯ３  ２５．０，グルコース  １１．７；ｐＨ  ７．４）に入れ、「レジーナエレナ国立がん研究所」又は「サンタンドレア病院」から４℃で「トルヴェルガータ大学」（イタリアのローマ）の外科及び医薬院の呼吸器研究所に運んだ。対象はいずれもテオフィリン、β２−作動薬又はグルココルチコステロイドで慢性的に治療されていなかった。手術の日に測定された血清ＩｇＥレベルは、正常の範囲内だった。手術前の肺機能パラメーターは、一般的に正常であり、呼吸器感染症の徴候は見られなかった。
【００９２】
実験室において、気道を結合組織及び肺胞組織から切り取った。次いで、区気管支を摘出し、冷蔵温度でＫＨ緩衝液中にて終夜保存した。翌朝、気管支を環状（ｎ＝１２０；厚さ：１〜２ｍｍ；直径：５〜７ｍｍ）に切断し、ＫＨ緩衝液（３７℃）を含む４４００の４室の１０ｍｌ摘出アイソレーテッドオーガニバス（ウゴバジレ、イタリアのヴァレーゼ県）に移し、９５：５％のＯ２／ＣＯ２の混合気体で継続的に通気した。
【００９３】
薬剤の調製
以下の薬剤を用いた：アセチルコリン、ヒスタミン、アトロピン、パパベリン及びインドメタシン。全ての物質をシグマアルドリッチ（米国セントルイス）から入手した。薬剤を、インドメタシン及びキニーネを除いて蒸留水に溶解し、インドメタシン及びキニーネをエタノールに溶解し、次いでＫＨ緩衝液に希釈した。エタノールの最大量（０．０２％）は、摘出組織の反応に影響を与えなかった（Ｆｒｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｈａｔａｋｅ  ａｎｄ  Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ，２０００）。ＲＰＬ５５４は、ヴェローナファーマＰＬＣ（英国ロンドン）により親切に提供された。化合物は使用するまで小さなアリコート中にて−８０℃で保存した。
【００９４】
張力測定
ヒト気管支を、インドメタシン（５．０μＭ）を伴う薬用のＫＨ緩衝液（３７℃）を含む臓器浴に入れ、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でバブリングし、静止張力（０．５〜１．０ｇ）下で懸濁した。気管支リングを、オーガニバス（一方のフックが静止ロッドに糸で取り付けられており、他方のフックが強縮力変位変換器に糸で結びつけられたもの）内のフックに取り付けた。気道は、薬用のＫＨ緩衝液を１０分ごとに繰り返し取り替え、９０分間平衡化させた。強縮張力の変化を、トランスデューサー（Ｆｏｒｔ１０ＷＰＩ、バジーレ、インスツルメント、イタリア）を用いて測定し、組織応答性をアセチルコリン（１００μＭ）により評価した；応答がプラトーに達した時、環状物を三回洗浄し、４５分間平衡化させた。
【００９５】
試験設計
電気的フィールド刺激に対するＲＰＬ５５４の影響
それぞれオーガニバスに、電気的フィールド刺激（ＥＦＳ）のために組織を並列に配置（１０ｍｍ離して）した２つの白金板電極（１ｃｍ２）を取り付けた。実験を、連続の１０Ｈｚ ＥＦＳ（定電流１０Ｖで二相パルス，０．５ｍｓ，１０ｓ）（３１６５多重パルスブースター（ウゴバジレ、イタリアのヴァレーゼ県）にて、最初の１時間は５分ごとに、次の５時間は３０分間隔で１パルス）を用いて行った（Ｂｉｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。連続ＥＦＳ開始後、電気的フィールド刺激（ＥＦＳ）に対する収縮反応の最大阻害に到達するまで、ＲＰＬ５５４（１０又は１００μＭ）を用いて、組織をインキュベートした。次いで薬剤を用いるインキュベーションを終結させ、組織を３０分間繰り返して洗浄し、次いで５時間後まで３０分毎に１回薬剤投与した。
【００９６】
受動的な感作気管支に対するＲＰＬ５５４の弛緩効果
ヒトの摘出気管支リングを、他に記載されているように１０％ｖｏｌ−１感作血清の非存在下（非感作対照リング）又は存在下（感作リング）で、ＫＨ緩衝液を含む管において終夜室温で回転させた（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｂｅ，１９９８）。悪化状態のアトピー性喘息に罹患している対象（総ＩｇＥ＞２５０Ｕ ｍｌ−１、一般的なエアロアレルゲンに対して特異的な）から、血清の寄付のための署名された同意書が提供された。血清を全血の遠心分離により調製し、血清試料を、必要となるまで２００ｍｌのアリコート内にて−８０℃で凍結した。
【００９７】
翌朝、付着している肺胞及び結合組織の除去後、気管支リングを、ＫＨ緩衝液（３７℃）を含むオーガニバスに移し、継続的に９５％Ｏ２／５％ＣＯ２のガスを供給した。組織を、ＲＰＬ５５４（１、１０及び１００μＭ）で３０分間プレインキュベートし、次いで（洗浄することなく）、ＲＰＬ５５４の存在下でヒスタミン（１０ｎＭ〜１ｍＭ）に対する濃度反応曲線を構築した。
【００９８】
ＲＰＬ５５４とムスカリン受容体拮抗薬の相乗効果
ＲＰＬ５５４のムスカリン受容体拮抗薬との組み合わせにより誘導される期待相乗的弛緩を試験するために、気管支リングを、最大効果の７０％をもたらすために必要とする濃度（ＥＣ７０）にてアセチルコリンで収縮させ、１５分間安定化期間とした。次いで、濃度反応曲線を、個々の化合物ＲＰＬ５５４及びムスカリン受容体拮抗薬単独で試験するために構築し；他の場所に記載されているようにアイソボールグラフを得るためにＲＰＬ５５４をムスカリン受容体拮抗薬と組み合わせて投与した（Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔａｌｌａｒｉｄａ，２００１；Ｇｏｌｄｏｎｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，２００７；Ｂｏｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｅｅ，２０１０）。
【００９９】
連続的な濃度の間には２０分の間隔を、次の濃度の投与前に、安定した水準の弛緩を達成するために用いた。実験終了時に、パパベリン（５００μＭ）を、加えて組織を完全に弛緩し、各組織の弛緩を比較するための基準を得た。
【０１００】
結果の分析
ＥＦＳ試験の分析
ＥＦＳにより誘導される気管支収縮張力は、対照気管支のパーセンテージとして測定した。多項式曲線を、他の場所に記載されているように非線形回帰を用いる生物学的データのモデルを適合させることにより構築した（Ｍｏｔｕｌｓｋｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，２００４）。最大効果（Ｅｍａｘ）は、ＥＦＳ刺激により誘導される最小収縮力として特定され、オフセット（ｔ１／２，分）は、最大弛緩の半分を誘発する時間を示す。分離されたオーガニバス系に固定された３つの気管支の各リングについて、１つは、他の場所に記載されているように時間対照として用いられた（Ｍｅｒｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１０１】
濃度反応試験の分析
Ｓ字状モデルに適合する適切な曲線は、効果（Ｅ）、Ｅｍａｘ及び最大効果の５０％をもたらすために必要とする濃度（ＥＣ５０）を計算するために用いられる。使用される方程式は、Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／｛１＋１０＾［（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊Ｈｉｌｌ勾配］｝として表されるｌｏｇ［作動薬］ｖｓ．応答（複合法面）であった（Ｍｏｔｕｌｓｋｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ，２００４；Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。Ｅ／Ｅｍａｘは、収縮薬剤によって誘発されるＥｍａｘのパーセンテージとして表され；ＥＣ５０値は、統計分析のためのｐＤ２に変換され（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、弛緩反応は、弛緩を誘導するパパベリン（５００μＭ）のパーセンテージとして表わされた。
【０１０２】
相乗作用試験の分析
ＲＰＬ５５４とムスカリン受容体拮抗薬との間のポテンシャル相乗作用の分析を、ベーレンバウム方法、ブリスインディペンデンス（ＢＩ）基準及び湾曲したアイソボールを介するロエベアディティビティ（ＬＡ）モデルを適用することによって測定した（Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，１９７７；Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｇｒａｂｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｔａｌｌａｒｉｄａ，２００４；Ｔａｌｌａｒｉｄａ，２００６；Ｇｏｌｄｏｎｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，２００７；Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ａｎｄ  Ｒａｆｆａ，２０１０）。
【０１０３】
ベーレンバウム法を適用するために、ＥＣ５０値についての相互作用インディックスを評価し、その結果、相互作用インディックスが＜１の場合は、効果が相乗的であると考えられ；相互作用インディックスが＞１の場合は、効果が拮抗しており、相互作用インディックスが＝０の場合は、効果が相加的である考えられた（Ｇｏｌｄｏｎｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，２００７；Ｌｅｅ，２０１０）。
【０１０４】
２つの薬剤についてのＢＩ理論は、以下の方程式により表される：Ｅ（ｘ，ｙ）＝Ｅｘ＋Ｅｙ−（Ｅｘ＊Ｅｙ）（式中、Ｅは分画の効果であり、ｘ及びｙは組み合わせ実験における２化合物の濃度である。）。組み合わせ効果が上記の方程式からの期待値より高い場合、相互作用が相乗的であると考えられ、当該効果が低い場合は、相互作用は拮抗している。そうでなければ効果は相加的であり、相互作用が存在しない（Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍｅｌｅｔｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｏｕｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｍ，２００６；Ｇｏｌｄｏｎｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，２００７；Ｂｏｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｅｅ，２０１０）。本試験において、ＢＩ方程式は、Ｘ＝ＲＰＬ５５４及びＹ＝ムスカリン受容体拮抗薬により特徴づけられた。
【０１０５】
各肺の気管支からのアトロピン及びＲＰＬ５５４に対する対照濃度反応曲線を、４つのパラメーターのロジスティックな方程式に適合させ、Ｅｍａｘ、勾配（ｎＨ）及び有効性（ＥＣ５０）のパラメーター推定値を計算した。以下のパラメーターは、Ｅｍａｘ及びｎＨ（平均±ＳＤ）及びＥＣ５０（幾何平均，９５％ＣＩ）を推定する。アトロピンについては（それぞれ６６±１４，０．９１２±０．４８８，１．１８１（０．１３４−１０．４）μＭ，ｎ＝５）及びＲＰＬ５５４については（それぞれ１００±０，２．２７１±０．７１３，２１．２（１１．５−３９．１）μＭ，ｎ＝５）。次いで上記を用いて、各薬剤組み合わせペアに対する相加反応を計算し、相乗作用を評価する（Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ａｎｄ  Ｒａｆｆａ  ２０１０）（Ｇｒａｂｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｔａｌｌａｒｉｄａ  ２００４）。投与当量の概念を用いて、関係ａ／Ａ＋ｂ／Ｂ＝１を、ｂ＋ｂｅｑ（ａ）＝Ｂ（ここで、ｂｅｑはａの投与当量）として再定式化し、２つの個々の濃度反応曲線ＥＡ＝ｆ（Ａ）及びＥＢ＝ｆ（Ｂ）を同等とすることにより、ｂｅｑ（ａ）について解いた。次いで、Ｂに対する各投与の組み合わせの相加反応（Ｅａｂ）を、ＢをＥＢ＝ｆ（Ｂ）に挿入することにより計算した。組み合わせの投与量に対して観察された弛緩反応と相加反応との差を計算し、１標本ｔ検定を用いて多重比較について分析し、確率を、ボンフェローニ補正を用いて多重比較のために調整した。例示のために、１：１投与の組み合わせを相乗作用について分析した。
【０１０６】
統計分析
全ての値を、それぞれの治療群についての平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性を、必要によりスチューデントｔ検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価し、統計的有意性のレベルをＰ＜０．０５として定義した（Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，１９９５）。全てのデータ分析を、コンピューターソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ，米国カリフォルニア州サンディエゴ；Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ，米国ワシントン州レドモンド）を用いて行った。
【０１０７】
アトロピン（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４の相乗効果
アトロピンと組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４により誘導される相乗的弛緩を試験するために、気管支リングを、最大効果の７０％をもたらすために必要とする濃度（ＥＣ７０）で、アセチルコリンで収縮させ、１５分間安定化期間とした。次いで、他のところに記載されているように、濃度反応曲線を構築し、個々の化合物ＲＰＬ５５４又はアトロピン単独で或いはアトロピンと組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４（１０：１〜１：１００の範囲のアトロピン：ＲＰＬ５５４）を試験して、アイソボールグラフを作成した（Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔａｌｌａｒｉｄａ，２００１；Ｇｏｌｄｏｎｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，２００７；Ｂｏｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｅｅ，２０１０）。
【０１０８】
連続的な濃度の間に２０分の間隔を、次の濃度の投与前に、安定した水準の弛緩を達成するために用いた。実験終了時に、パパベリン（５００μＭ）を、加えて組織を完全に弛緩し、各組織の弛緩を比較するための基準を得た。
【０１０９】
結果
気管支リングのベースラインの特徴
湿重量に関して実験で用いられるヒト単離気管支リングのベースラインの特徴（２２０．５±１６．５ｍｇ）、アセチルコリン（１００μＭ）により誘導される収縮（４４０±９５ｍｇ）、及び薬剤で治療する前のＥＦＳ（１０Ｈｚ）により誘導される収縮（４４５±９８ｍｇ）の間に有意差（Ｐ＞０．０５）はなかった。
【０１１０】
予備実験において、それに続く実験のために、アセチルコリン（１ｎＭ〜１ｍＭ）に対する濃度反応曲線を構築して、準最大反応（最大反応のおよそ７０％；１２５０±１９０ｍｇ；ｎ＝５）を確立した。
【０１１１】
単離ヒト気道の気管支緊張に対するＲＰＬ５５４の影響
ＲＰＬ５５４は、当該薬剤の暴露後少なくとも５時間維持するヒト気管支の組織のＥＦＳにより誘導される収縮反応を阻害した（図１）。ＲＰＬ５５４は１００μＭの最大濃度でこれらの収縮反応を消滅させた（Ｅｍａｘ９１．３３±３．３７％；Ｔ１／２  ２３．７±１２．３分）。
【０１１２】
ＲＰＬ５５４は、アセチルコリンで予め収縮させたヒト単離気管支組織の濃度依存性弛緩をもたらした。ＲＰＬ５５４は、気管支弛緩に関して、アトロピンに比べてあまり強力ではなかった（Ｐ＜０．０５）。しかし、アトロピンとは対照的に、ＲＰＬ５５４は組織を完全に弛緩した（Ｐ＜０．００１）。それぞれの肺の気管支のアトロピン及びＲＰＬ５５４に対する対照濃度反応曲線を、４つのパラメーターのロジスティック方程式にあてはめて、Ｅｍａｘ、勾配（ｎＨ）及び有効性（ＥＣ５０）のパラメーター推定値を計算した。以下のパラメーターは、Ｅｍａｘ及びｎＨ（平均±ＳＤ）及びＥＣ５０（幾何平均，９５％ＣＩ）を推定する。アトロピンについては（それぞれ６６±１４，０．９１２±０．４８８，１．１８１（０．１３４−１０．４）μＭ，ｎ＝５）及びＲＰＬ５５４については（それぞれ１００±０，２．２７１±０．７１３，２１．２（１１．５−３９．１）μＭ，ｎ＝５）（図２）。
【０１１３】
気管支の受動感作は、非感作組織と比較してヒスタミンの収縮効果を高めた。受動感作気管支において、ＲＰＬ５５４は、１及び１０μＭで、未治療組織と比較して、有意にヒスタミンに対する濃度反応曲線を左側にシフトさせた（Ｐ＜０．００１）。ＲＰＬ５５４は、１００μＭで、ヒスタミンにより誘導される収縮を完全に消滅させた（図３，表１）。
【０１１４】
表１：受動感作気管支におけるヒスタミンにより誘導される収縮に対するＲＰＬ５５４の効果。示されたデータは、ｎ＝５の異なる対象のサンプルで行った実験によるものであり、それらは平均±ＳＥＭとして示される。＊＊＊Ｐ＜０．００１対受動感作対照。
【０１１５】
【表１】
0006560986.tif 000002
【０１１６】
ヒト気管支緊張に対するＲＰＬ５５４とアトロピンの相乗的な弛緩効果
ＲＰＬ５５４とアトロピンの相互作用は、１ｎＭ〜１０μＭの濃度範囲にわたりＲＰＬ５５４の有意な相乗効果を生み出した（１ｎＭ：Ｐ＜０．０５；１０ｎＭ及び１μＭ：Ｐ＜０．０１；１００ｎＭ及び１０μＭ：Ｐ＜０．００１）。最大相乗作用は、１μＭ  ＲＰＬ５５４及び１０ｎＭアトロピンの交差濃度で見られた（ＢＩデルタ効果：０．５４±０．０９）。ＲＰＬ５５４及びアトロピンの低濃度は、所定の各薬剤単独で誘導する効果の合計と比較して、〜４．８５倍まで気管支リングの弛緩を増大することにより相乗的に相互作用した（１０ｎＭ，Ｐ＜０．０５及び１００ｎＭ，Ｐ＜０．０１）（図４）。
【０１１７】
アセチルコリンで予め収縮させたヒト気管支緊張に対するＲＰＬ５５４とアトロピンの等モル会合（１：１）の結果は、弛緩薬有効性の増強に基づき、統計的に有意なＢＩ相互作用を示した（Ｐ＜０．０１）（表２）。
【０１１８】
【表２】
0006560986.tif 000003
【０１１９】
表２：アセチルコリンにより誘導される準最大収縮に対するＲＰＬ５５４とアトロピン（１：１等モル）の弛緩相乗効果。示されたデータは、ｎ＝５の異なる対象のサンプルで行った実験によるものであり、それらは平均±ＳＥＭとして示される。＊＊Ｐ＜０．０１ゼロ相互作用仮説デルタ効果について（観察値対期待値）。
【０１２０】
さらに、ベーレンバウム分析は、ＲＰＬ５５４とアトロピンが、１ｎＭ〜１０μＭの濃度範囲にわたりＲＰＬ５５４についての相乗的な相互作用を誘発するということ（相互作用インディックス：０．０９±０．０７）、並びにＲＰＬ５５４が、２．９１±０．４４対数のアトロピンに対する弛緩濃度反応曲線の左側へのシフトを有意に誘発すること（Ｐ＜０．０５）を証明した。相乗作用の証拠を示すアトロピンとＲＰＬ５５４の１：１の投与組み合わせに対する観察弛緩反応及び相加的弛緩反応の間には統計的な有意差が存在する（図６）。
【０１２１】
最後に、ＢＩ法を用いる３Ｄ表面分析により、アトロピンがＲＰＬ５５４と一緒に投与された場合に、全ての濃度にわたって拡張された有意に大きく且つ幅広い相乗的な相互作用を誘導するということが証明された（図５）。
【０１２２】
ＲＰＬ５５４によるＰＤＥ３／ＰＤＥ４の選択的阻害が、ヒト単離気道において気管支緊張の弛緩を誘導することが証明された。これは、以前にモルモット単離気管で報告された結果を拡張し且つ支持する（Ｂｏｓｗｅｌｌ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）。ヒト気道における当該化合物の作用の持続時間を確認したところ、当該阻害効果は、薬剤暴露終了後５時間持続した。さらに、ＲＰＬ５５４は、ヒスタミン又はアセチルコリンの何れかで収縮させた気道を弛緩する作用を示した。さらに、ＲＰＬ５５４を用いた組織の先のインキュベーションは、受動的な感作気管支において外因的に投与されたヒスタミンの収縮作用に対して、組織の有意な保護をもたらした。さらに、ムスカリン受容体拮抗薬（アトロピン）に関連するＰＤＥ３／４の阻害は、ＡＳＭの弛緩に対する相乗効果を証明した。これらの結果は、ＲＰＬ５５４が、ヒト気管支の組織における収縮剤に対して良好な機能的拮抗薬であり、ムスカリン受容体拮抗薬と組み合わせられた場合に、さらなる相乗的な気管支拡張をもたらす能力を有し得るということを示す。
【０１２３】
ＲＰＬ５５４は、他のＰＤＥ４阻害剤と比べて、かなり長い期間のＥＦＳ誘導収縮反応に対する作用を有する、ＥＦＳにより誘導される収縮反応の濃度及び時間依存阻害をもたらした（Ｓｐｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｏｓｗｅｌｌ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）。
【０１２４】
ＲＰＬ５５４は、ヒスタミンで収縮させた受動感作のヒト気管支において、収縮反応を阻害する場合に特に効果的であった。さまざまな選択的なＰＤＥ３及びＰＤＥ４阻害剤が、感作モルモットにおける抗原により誘導される急性気管支痙攣を有意に減衰させることが報告されている（Ｂｏｓｗｅｌｌ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ）。
【０１２５】
また、ＲＰＬ５５４は、受動感作気管支におけるヒスタミンに対する最大応答の顕著な減少を誘導した。
【０１２６】
本発明の組み合わせの安全性試験
本試験は、ＲＰＬ５５４がムスカリン性拮抗薬（アトロピン）と心血管系の相互作用を有するかどうかを決定するために行われた。β２作動薬（サルブタモール）が完全性を期すために含まれていた。ＲＰＬ５５４は、可能な抗炎症作用を伴う吸入気管支拡張薬として、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び喘息の治療のために開発された二重ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤である。静脈内ボーラス注射で与えられるＲＰＬ５５４、サルブタモール及びアトロピンに対する心血管応答は、血圧及び心拍数のピーク注射後変化として測定される心血管応答として評価した。本試験のデザインは、交互（例、ＲＰＬ５５４続いてサルブタモール及びその逆）に５分間隔のペアとして所定の薬剤を用いるブラインド且つランダムなものであった。本試験のために選択された投与量は、心血管系への影響、及びおそらく吸入で用いられるものよりもはるかに高い血漿濃度をもたらした。代わりに上記の治療条件下での可能な相互作用について試験することを選択した。
【０１２７】
まとめ
本試験では、単独で及び組み合わせた場合の静脈内に投与されたＲＰＬ５５４、サルブタモール及びアトロピンの効果を、麻酔下のラットにおける血圧及び心拍数に関して無作為な計画に従って試験した。平均血圧（ＭＢＰ）の１５〜３０ｍｍＨｇの増加及び心拍数（ＨＲ）の１分毎３０〜６０拍の増加を生み出す投与量を、ＲＰＬ５５４及びサルブタモールについての初期用量応答の試験で選択した。血圧又は心拍数に対してあまり影響しないアトロピンについては、最大投与量がさらなる試験のために選択された。その後、選択された投与量を、５分ごとの投与ペアで試験した。試験のデータにより、麻酔下ラットにおけるＭＢＰ又はＨＲへの影響に関してＲＰＬ５５４とサルブタモールとの間或いはＲＰＬ５５４とアトロピンとの間に心血管面で相互作用がないことが示唆される。厳密に可能な相互作用を試験するために、本試験のために選択された投与量及び投与経路は、通常の治療の投与量では見られない心血管の影響をもたらした。さらに、ボーラス静脈内経路は、おそらく、吸入により与えられる少ない治療投与量では見られないものよりもはるかに高い血漿濃度をもたらした。本試験の目的は、上記の治療条件下での可能性のある相互作用に挑戦するために上記の標準的な状態を用いることであった。
【０１２８】
プロトコル
本試験は、チャールズリバーの体重量２００〜２５０ｇｒｍｓのスプラーグドーリー雄ラットで行った。ラットは、実験室に送られた後、１〜３時間食料や水を与えられなかった。実験のための動物を、腹腔（ｉ．ｐ．）経路により１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、チオブタバルビタールで麻酔した。追加麻酔は必要なく、実験期間の終わりには各ラットを屠殺した。試験は、２部：（Ｉ）初期用量決定試験及び（ＩＩ）相互作用試験を有する。試験された薬剤は：ＲＰＬ５５４（Ｒ）、サルブタモール（Ｓ）、アトロピン（Ａ）であり、全て食塩水に溶解した。
【０１２９】
（Ｉ）初期用量決定試験
初期用量決定試験は以下の通り行った: ３種の薬剤の静脈内ボーラス用量の累積用量反応曲線は、完全な試験のための３種の薬剤のそれぞれの適切な用量を決定するためになされた。平均血圧（ＭＢＰ）の１５〜３０ｍｍＨｇの増加及び心拍数（ＨＲ）の１分あたり３０〜６０拍の増加をもたらすＲＰＬ５５４又はサルブタモールの投与量は、本初期用量応答試験から選択された。アトロピンは、心血管の影響を抑えられ、それゆえ、顕著なムスカリン受容体阻害の文献的証拠が存在する高用量が選択された。用量決定試験は、３種の薬剤それぞれの累積用量が用量倍増基準で与えらた４匹のラットを加えた。薬剤のそれぞれの投与は、異なる薬剤間の１時間で５分ごと、静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射として行われた。注射順序は：動物１−Ｓ，Ｒ，Ａ；動物２−Ｒ，Ａ，Ｓ；動物３−Ａ，Ｓ，Ｒ及び動物４−Ｒ，Ａ，Ｓであった。上記に示した通り、過正常として選択される投与量及び注射経路並びに上記の投与量は、吸入による場合に得られる効果を生み出す。
【０１３０】
本試験からそれに続く相互作用試験にために以下の投与量が選択された:
Ｒ＝８μｇ／ｋｇ−８μｇ／ｍＬ（０．９％食塩水中）
Ｓ＝２μｇ／ｋｇ−２μｇ／ｍＬ（０．９％食塩水中）
Ａ＝３２μｇ／ｋｇ−３２μｇ／ｍＬ（０．９％食塩水中）
【０１３１】
（ＩＩ）相互作用試験
本試験において、全ての薬剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射により頸静脈カニューレを介して体積１ｍＬ／ｋｇを単回投与量として与えられた。本試験のデザインは、合計１２匹の動物でそれぞれ４匹の動物を含む３ラインとしてブラインド且つランダムなものとした。
【０１３２】
薬剤のペアは、各ラインが以下のように注射した４匹のラットを含むラインデザインによるラインを用いてランダム化ブラインドに基づき個々の動物に与えられた：Ｒ１Ｓ２，Ｓ１Ｒ２，Ｒ１Ａ２及びＡ１Ｒ２（ランダムな順序で、１は与えられる第一の薬剤を示し、２は第一の薬剤の５分後に与えられる第二の薬剤を示す。）。合計３つのラインが試験され、これにより合計１２匹のラットが用いられ、動物を取り換える必要はなかった。本研究は暫定的な分析が目的であるため、１２匹の動物の後に停止し、さらなる試験が正当かどうかを決定し、もし正当であれば、さらなるライン及び／又は投与量の調整が必要とされた（アダプティブデザイン）。
【０１３３】
血圧は、出力をＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＰｏｗｅｒＬａｂ  ２６Ｔで処理する変換機を用いて頸動脈から測定した。心拍数は、ＥＣＧ及び血圧トレースから心拍ごとに計算した。分析はＬａｂＣｈａｒｔ６による。測定は、ＬａｂＣｈａｒｔ６の関数を用いて行った。
【０１３４】
全ての薬剤の効果は、薬剤の各注射に対するピーク応答の時点で測定した。サルブタモールを用いたピーク応答までの時間は、血圧についてはおよそ２０秒、心拍数については６０秒であった。ＲＰＬ５５４に関しては、対応する時間が、血圧については６０〜８０秒、心拍数については２〜４．５分であった。アトロピンに関しては、血圧及び心拍数共に４分であった。
【０１３５】
データは、ｍｍＨｇで収縮期血圧、拡張期血圧及び計算平均血圧として記録し、心拍数は拍／分として記録した。記録された値は、２つの対照値による血圧及び心拍数での薬物誘発性変化を提供するために処理された。これらの一方を１回目の注射前及び２回目の注射前（２回目）とした。また、計算された変化を、これらの二つの対照値に標準化し、対照値からの下落は陰性値又は対照値からの増加は陽性値として何れかで示した。
【０１３６】
結果
一次薬力学
表３．麻酔下のラットにおける対照（Δ）平均動脈血圧及び平均心拍数からの変化に対するＲＰＬ５５４、サルブタモール及びアトロピン（単独及び他の薬剤の後）の効果（各平均値についてｎ＝３）
【０１３７】
【表３】
0006560986.tif 000004
【０１３８】
薬剤は、５分間隔のペアで静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射として与えられた。Δ値は事前の薬剤の値からのピーク効果の差であり、事前の薬剤の値に対する変化又は変化率として示される。
【０１３９】
＊＝予めの薬剤治療を伴わない場合の薬剤に対する対照応答
【０１４０】
測定された一次薬力学的変数は、計算された平均血圧及び心拍数と共に収縮期血圧及び拡張期血圧であった。見られた変化の概要を上記表３に示す。 
【０１４１】
全ての場合に見られるように、試験された投与量で、ＲＰＬ５５４は、収縮期圧、拡張期圧又は平均圧が実際の変化として示されるか、或いは事前の薬剤の値について標準化されるかどうかにかかわず、血圧の低下をもたらした。サルブタモール又はアトロピンの事前の投与前或いは投与後に測定した場合、ＲＰＬ５５４注射に対する血圧の変化は、表３に見られるように、変化が事前の薬剤からの変化として示されるか、或いは割合として標準化されるかどうかで異なりはなかった。
【０１４２】
心拍数応答は、同様に、他の薬剤の事前投与によっては影響しなかった。しかし、第一の薬剤投与５分後の第二の薬剤投与が、対象の薬剤に依存する様式で事前の薬剤の値を変化させた。
【０１４３】
二次薬力学及び安全性薬理学
二次薬力学変数は：ＥＣＧ、呼吸数及び不整脈であった。ＥＣＧ又は呼吸数で有意な変化は見られず、不整脈は見られなかった。
【０１４４】
薬力学的薬剤相互作用
３種の薬剤間の可能な心血管相互作用が、本試験の主な目的であった。表３に示されるように或いは実験記録の検査でみられるように、薬剤間の大きな相互作用は見られなかった。
【０１４５】
実施例２
アトロピン（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４のインビボ相乗効果
本実施例は、ＲＰＬ５５４がアトロピンと組み合わせ投与される場合のボンベシンにより誘導される気管支収縮を元に戻す能力及び潜在的な相乗効果を検討する。
【０１４６】
モルモットは、麻酔をかけられ、人工呼吸された。ボンベシン（２μｇ／ｍｌ；５ｍｌ／時間）の静脈内投与により気道閉塞を誘導した。様々な投与量のＲＰＬ５５４を単独で或いは準最大投与量のアトロピン（２μｇ／ｋｇ）と組み合わせて静脈内（ｉｖ．）投与により気管支拡張を誘導した。投与量は、アトロピンに対する用量反応曲線を生成することにより、気道閉塞のおよそ２０％の減少をもたらす投与量を選択する以下の試験を選択した。全肺抵抗（ＲＬ）及び平均動脈血圧を測定した。データは、気道閉塞又は血圧の％減少として示される。
【０１４７】
ＲＰＬ５５４は、１０〜８０μｇ／ｋｇでモルモットの気道の投与量依存性弛緩をもたらした。２μｇ／ｋｇアトロピン（気道閉塞の２２．３＋４．９％減少をもたらした投与量）との組み合わせにおいて、準最大投与量のＲＰＬ５５４（２０μｇ／ｋｇ）は、当該投与量のＲＰＬ５５４を単独投与した場合に比べてより大きな気道の弛緩をもたらした（表４）。２０μｇ／ｋｇのＲＰＬ５５４の静脈内（ｉｖ．）投与（どちらかと同時投与した場合のポテンシャルではない）は、平均動脈血圧の低下をもたらした（対照：３７．３＋６．７％，＋２μｇ／ｋｇアトロピン：３５．３＋４．３％）。結果は図７〜１０に示される。
【０１４８】
【表４】
0006560986.tif 000005
【０１４９】
結果は、ＲＰＬ５５４が、ムスカリン受容体拮抗薬アトロピンと組み合わされた場合に、気管支拡張薬としての相乗的な活性を有する効果的な気管支拡張薬であるが、血圧に対しては薬剤分類と相互作用しないというさらなる証拠を提供する。
【０１５０】
実施例３
ヒト単離気管支に対するグリコピロニウムブロミド（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されたＲＰＬ５５４の相乗効果
ヒト単離気管支におけるＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムの長時間持続相互作用を検討した。
【０１５１】
方法
６人の患者からの気管支リングを、０．５〜１．０ｇの張力下、Ｏ２／ＣＯ２（９５／５％）で通気されたクレブスヘンゼライト溶液（３７℃）でインキュベートした。ＲＰＬ５５４及びグリコピロニウム（単独で或いは組み合わせで）の作用期間（３０％最大弛緩，ＥＣ３０）を、３、１０又は２５Ｈｚの電気的フィールド刺激（ＥＦＳ）で収縮した組織で試験した。気管支緊張を、パパベリン（Ｅｍａｘ）に対する最大反応の％として示した。収縮反応の曲線下面積（ＡＵＣ）を評価した。薬剤混合物の効果を、ブリスインディペンデンス理論で分析した。値（ｎ＝３）は、平均±ＳＥＭである。
【０１５２】
結果
単独投与されたＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムは、それぞれ１６０±２０分及び５０±１０分で最大弛緩を誘導した。効果は４時間検出可能であった。最大の相乗的弛緩相互作用は、休薬期間の間で〜２時間であった（７１．４±５．１％）。薬剤の組み合わせは、６時間に弛緩効果を延長し、ＥＦＳ媒介収縮反応の減少はまだ４１．２±８．５％であった。観察されたＡＵＣ（４４．９±３．１％）は、試験の６時間の間（Ｐ＜０．００１）、期待されたもの（６５．８±３．３％）よりも有意に低く、３ＨｚのＥＦＳに対する主な有用性を伴っていた（−３５．８±２．５％，Ｐ＜０．００１）。結果は図１１〜１６に示される。
【０１５３】
結論
低濃度のＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムは、ヒト単離気管支においてＥＦＳにより誘導される収縮性緊張を相乗的に阻害し、弛緩効果を６時間延長した。
【０１５４】
実施例４
ヒト末梢気道に対するグリコピロニウムブロミド（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されたＲＰＬ５５４の相乗効果
ヒト単離細気管支におけるＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムの間の相互作用を検討した。
【０１５５】
方法
６人の患者の精密カット肺切片（ＰＣＬＳ）を、Ｏ２／ＣＯ２（９５：５％）で通気したクレブスヘンゼライト溶液（３７℃）でインキュベートした。単独投与及び等効果濃度で組み合わせ投与されたＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムに対する濃度応答を、カルバコール（ＣＣｈ）により誘導される準最大収縮（７０％最大，ＥＣ７０）で評価した。細気管支（＜１ｍｍ直径）の弛緩を、パパベリンにより誘導される最大応答（内腔面積増大）（Ｅｍａｘ）の％として示し、ＩＣ５０（ｐＤ２）の負の対数として有効性を示した。薬剤混合効果をブリスインディペンデンス理論で分析した。値（ｎ＝３）は平均±ＳＥＭである。
【０１５６】
結果
グリコピロニウムは、ＲＰＬ５５４と比べてより強力な細気管支の濃度依存性弛緩を誘導した（ｐＤ２：グリコピロニウム９．２±０．４，ＲＰＬ５５４  ６．０±０．１，Ｐ＜０．００１）。両者は、ＣＣｈ誘導収縮を消滅させた。低濃度ないし中濃度のグリコピロニウム及びＲＰＬ５５４（グリコピロニウム０．０５ｎＭ〜０．１４ｎＭ，ＲＰＬ５５４  ０．３２μＭ〜０．５４μＭ）は、末梢気道に対して相乗的な弛緩反応を有し、期待反応より＋２１．１±４．０％まで弛緩を増強した（Ｐ＜０．０５）。低濃度（ＥＣ３０）のグリコピロニウムとＲＰＬ５５４は、期待反応（５１．０±５．４％）に比べて６９．１±２．４％の有意（Ｐ＜０．０５）な内腔面積増強を誘導した。結果を図１７〜１９に示す。
【０１５７】
結論
ＲＰＬ５５４及びグリコピロニウムは、主に低濃度ないし中濃度で細気管支の内腔面積増大に対する相乗的な相互作用を有する。
【０１５８】
実施例５
チオトロピウムブロミド（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４の相乗効果
ＲＰＬ５５４及びアトロピンの組み合わせ相乗効果を評価するために実施例１の方法を、ムスカリン受容体拮抗薬チオトロピウムブロミドについて繰り返す。ＲＰＬ５５４単独、チオトロピウムブロミド単独、及びチオトロピウムブロミドと組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４を試験するために、濃度反応曲線を構成する。ベーレンバウム法及びブリスインディペンデンス基準を、チオトロピウムブロミド及びＲＰＬ５５４の間の相乗的な作用を評価するために用いる。相乗効果がＲＰＬ５５４及びチオトロピウムブロミドの組み合わせで観察される。
【０１５９】
実施例６
オキシトロピウムブロミド（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４の相乗効果
ＲＰＬ５５４及びアトロピンの組み合わせの相乗効果を評価するために実施例１の方法を、ムスカリン受容体拮抗薬オキシトロピウムブロミドについて繰り返した。ＲＰＬ５５４単独、オキシトロピウムブロミド単独、及びオキシトロピウムブロミドと組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４を試験するために、濃度反応曲線を構成する。ベーレンバウム法及びブリスインディペンデンス基準を、オキシトロピウムブロミド及びＲＰＬ５５４の間の相乗的な作用を評価するために用いる。相乗効果が、ＲＰＬ５５４及びオキシトロピウムブロミドの組み合わせで観察される。
【０１６０】
実施例７
アクリジニウム（ムスカリン受容体拮抗薬）と組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４の相乗効果
ＲＰＬ５５４及びアトロピンの組み合わせ相乗効果を評価するために実施例１の方法を、ムスカリン受容体拮抗薬アクリジニウムについて繰り返した。ＲＰＬ５５４単独、アクリジニウム単独、及びアクリジニウムと組み合わせ投与されるＲＰＬ５５４を試験するために、濃度反応曲線を構築する。ベーレンバウム法及びブリスインディペンデンス基準を、アクリジニウム及びＲＰＬ５５４の間の相乗的な作用を評価するために用いた。相乗効果が、ＲＰＬ５５４及びアクリジニウムの組み合わせで観察される。
【０１６１】
製剤例１−ＤＰＩによる投与
ＲＰＬ５５４組み合わせ物（０．２ｍｇ）を微粒子化し、次いでラクトース（２５ｍｇ）と配合する。次いでこの配合混合物を、ゼラチン吸入カートリッジに充填する。カートリッジの内容物を例えばＤＰＩを用いて投与する。
【０１６２】
微粒子化ＲＰＬ５５４組み合わせ物（１００ｍｇ）を、粉砕ラクトース（２５ｇ）（例えば、粒子の約８５％以下が約６０μｍないし約９０μｍのＭＭＤを有し、粒子の１５％以上が１５μｍ未満のＭＭＤを有するラクトース）と配合する。次いで、配合混合物を、投与量あたり約１０〜５００μｇのＲＰＬ５５４を提供するのに十分な量で剥離可能なブリスターパックの個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ＤＰＩを用いて投与する。
【０１６３】
或いは、微粒子化ＲＰＬ５５４組み合わせ物（１ｇ）を、粉砕ラクトース（２００ｇ）と配合し、化合物の粉砕ラクトースに対する１：２００の重量比を有するバルク組成物を形成する。配合組成物を、投与量あたり約１０〜５００μｇのＲＰＬ５５４を送達することができるＤＰＩに詰める。
【０１６４】
或いは、微粒子化ＲＰＬ５５４（１００ｍｇ）及び微粒子化ムスカリン受容体拮抗薬（５００ｍｇ）を、粉砕ラクトース（３０ｇ）と配合する。次いで、配合混合物を、投与量あたり約１０μｇないし約５００μｇのＲＰＬ５５４を供給するのに十分な量で剥離可能なブリスターパックの個々のブリスターに充填する。ブリスターの内容物を、ＤＰＩを用いて投与する。
【０１６５】
製剤例２−ＭＤＩで用いられる組成物
微粒子化ＲＰＬ５５４組み合わせ物（１０ｇ）を、レシチン（０．２ｇ）を脱塩水（２００ｍＬ）に溶解することにより得られる溶液に分散した。得られた懸濁液をスプレー乾燥し、次いで微粒子化して、約１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子を含む微粒子化組成物を形成する。次いで、微粒子化組成物を、ＭＤＩで投与する場合に投与量あたり約１０μｇないし約５００μｇのＲＰＬ５５４を提供するのに十分な量で加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含むＭＤＩカートリッジに充填する。
【０１６６】
或いは、５重量％ＲＰＬ５５４組み合わせ物、０．５重量％レシチン及び０．５重量％トレハロースを含む懸濁液を、１００ｍＬ脱塩水に溶解した０．５ｇのトレハロース及び０．５ｇのレシチンから形成されるコロイド溶液に１０μｍ未満の平均サイズで微粒子化粒子として５ｇのＲＰＬ５５４組み合わせ物を分散させることにより調製する。懸濁液をスプレー乾燥し、得られた物質を１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子に微粒子化する。粒子を、加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンと共にキャニスタに充填する。
【０１６７】
製剤例３−ネブライザーインヘラーで用いられる組成物
ＲＰＬ５５４組み合わせ物（２５ｍｇ）を、クエン酸緩衝（ｐＨ５）等張食塩水（１２５ｍＬ）に溶解する。混合物を攪拌し、化合物が溶解するまで超音波処理する。溶液のｐＨを確認し、必要に応じて１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をゆっくり加えることによりｐＨ５に調整する。溶液を、ネブライザー装置を用いて投与し、投与量あたり約１０μｇないし約５００μｇのＲＰＬ５５４組み合わせ物を供給する。
【０１６８】
製剤例４−経口投与のための硬質ゼラチンカプセル
ＲＰＬ５５４組み合わせ物（５０ｇ）、スプレー乾燥ラクトース（４４０ｇ）及びステアリン酸マグネシウム（１０ｇ）を十分に配合する。次いで得られた組成物を、硬質ゼラチンカプセルに充填する（カプセルあたり５００ｍｇの組成物）。
【０１６９】
製剤例５−経口投与のための懸濁液
以下の成分を混合して、１０ｍＬの懸濁液あたり１００ｍｇの化合物を含む懸濁液を形成する：
【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
製剤例５−注射投与のための注射可能な製剤
ＲＰＬ５５４組み合わせ物（０．２ｇ）を、０．４Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（２．０ｍＬ）と配合する。得られた溶液のｐＨを、必要に応じて０．５Ｎ塩酸水又は０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４に調整し、次いで、十分な注射用水を加えて２０ｍＬの総体積を得る。次いで混合物を滅菌フィルター（０．２２ミクロン）でろ過し、注射投与に適した滅菌溶液を得る。
【０１７２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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