(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、
上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含み、
上記哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の培養細胞であり、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、方法：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものである、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備え、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、キット：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞であって、
上記哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の培養細胞であり、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、哺乳動物細胞：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載の哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、複製開始領域（ＩＲ；Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎ）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ；Ｍａｔｒｉｘ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ）とを具備するベクター（「ＩＲ／ＭＡＲベクター」または「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」と呼ぶ）を細胞（例えば、ＣＯＬＯ  ３２０、または、ＨｅＬａ）に導入し、ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子を利用して安定な形質転換体を選択することによって、（ｉ）発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（換言すれば、目的遺伝子）の細胞内コピー数を増幅できること、および、（ｉｉ）目的遺伝子を、ＩＲ／ＭＡＲベクターに対して同一の遺伝子構築物（シス）として細胞へ導入した場合であっても、ＩＲ／ＭＡＲベクターに対して別の遺伝子構築物（トランス）として細胞へ導入した場合であっても、目的遺伝子の細胞内コピー数を増幅できること、を見出した。そして、本発明者は、上記ＩＲ／ＭＡＲベクターを用いて目的遺伝子を高度に増幅する系（「高度遺伝子増幅系」または「ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅系」と呼ぶ）を完成させるに至った（例えば、特許文献１および２、並びに、非特許文献１および２参照）。ここで、高度遺伝子増幅系（ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅系）を用いた遺伝子増幅法を、「ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法」と呼ぶ。
【０００３】
ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって遺伝子増幅を行った場合、増幅した領域には、目的遺伝子の単純反復配列が形成される。一般的に、反復配列は、頻繁にＲｅｐｅａｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ（ＲＩＧＳ）と呼ばれる現象によって、ヘテロクロマチン化が起こり、転写抑制されることが知られている。また反復配列はＲＮＡｉ系を高効率的に活性化し、ＤＮＡのメチル化を誘導することも知られている。このため、ＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法によって増幅した遺伝子は、コピー数とその発現量とが必ずしも比例しない場合があった（例えば、非特許文献３参照）。現在、このような転写抑制を解除する方法の開発が進められつつある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日）
【特許文献２】特開２００４−３３７０６６号公報（公開日：平成１６（２００４）年１２月２日）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Noriaki Shimizu et. al., Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification, Cancer Research, Vol.61, No.19, p6987-6990, (2001)
【非特許文献２】Noriaki Shimizu et. al., Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflict between replication and transcription, Cancer Research, Vol.63, No.17, p5281-5290, (2003)
【非特許文献３】Shimizu, N. et. al., Interconversion of intra- and extra-chromosomal sites of gene amplification by modulation of gene expression and DNA methylation, Journal of cellular biochemistry, 102, p515-529, (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の転写抑制を解除する方法では、目的遺伝子が転写・翻訳されて最終的に生じる目的タンパク質の発現量が十分とはいえず、更なる改善の余地があった。
【０００７】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを１つではなく複数含む長いリピート配列によって遺伝子の転写・翻訳に適した環境を生み出し、当該環境の中に目的遺伝子を配置することによって（換言すれば、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの長いリピート配列中に少数の目的遺伝子を配置することによって）、目的遺伝子の転写・翻訳を促進し、目的タンパク質の発現量を上げることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
＜１＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、上記課題を解決するために、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含むことを特徴としている。
【００１０】
＜２＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００１１】
＜３＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００１２】
＜４＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであることが好ましい：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００１３】
＜５＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものであることが好ましい。
【００１４】
＜６＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものであることが好ましい。
【００１５】
＜７＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００１６】
＜８＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法では、上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものであることが好ましい。
【００１７】
＜９＞本発明の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットは、上記課題を解決するために、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備えることを特徴としている。
【００１８】
＜１０＞本発明の哺乳動物細胞は、上記課題を解決するために、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなるものであることを特徴としている。
【００１９】
＜１１＞本発明の目的タンパク質を生産する方法は、上記課題を解決するために、本発明の哺乳動物細胞を用いることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、細胞に導入された目的遺伝子１コピーあたりの目的タンパク質の発現量を上げることができるという効果を奏する。
【００２１】
本発明は、細胞あたりの目的タンパク質の発現量を上げることができるという効果を奏する。
【００２２】
本発明は、目的タンパク質を大量に生産するシステムを樹立することができるという効果を奏する。
【００２３】
本発明は、特に限定されるものではないが培養細胞等を用いたEx vivoの系において好ましく実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】（ａ）は、実施例に用いた直列反復配列および逆位反復配列の電気泳動の結果を示す写真であり、（ｂ）は、実施例に用いた直列反復配列および逆位反復配列の構造を示す図である。
【図２】実施例に用いた発現ベクターの構造を示す図である。
【図３】実施例における、ＦＩＳＨ法による形質転換体の染色像を示す写真である。
【図４】（ａ）および（ｂ）は、実施例における、ＦＩＳＨ法による形質転換体の染色パターンの形成頻度を示すグラフである。
【図５】（ａ）および（ｂ）は、実施例における細胞内の目的タンパク質の発現量を示すグラフである。
【図６】（ａ）および（ｂ）は、実施例における細胞内のリピート配列および発現ベクターのコピー数の測定結果を示すグラフである。
【図７】（ａ）および（ｂ）は、実施例における１コピーの遺伝子あたりのタンパク質の発現量を示すグラフである。
【図８】（ａ）および（ｂ）は、実施例における、ＦＩＳＨ法によるリピート配列および発現ベクターの染色像を示す写真である。
【図９】（ａ）および（ｂ）は、実施例における、Ｂ−３−３１が目的タンパク質の発現に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）および（ｂ）は、実施例における、Ｂ−３−３１の直列反復配列および逆位反復配列が目的タンパク質の発現に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１１】（ａ）および（ｂ）は、Ｂ−３−３１の直列反復配列および逆位反復配列が目的タンパク質の発現に及ぼす効果を示すグラフである。
【図１２】モデル化された本発明のメカニズムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００２６】
〔１．本発明のメカニズム（モデル）〕
本発明のリピート配列が、目的遺伝子１コピーあたりの発現を高めるメカニズムのモデルとして、以下のモデルが考えられ得る（図１２を参照）。
【００２７】
〔１−１．直列反復配列の場合〕
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの長いリピート配列と、目的遺伝子を具備する発現ベクターとを同時に細胞に導入すると、当該長いリピート配列の中に、少数の発現ベクターが「埋もれた」状態になる。
【００２８】
本発明のリピート配列は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含んでいるので、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを１つしか含まない場合と比較して、目的遺伝子の発現に適した環境を生み出すことができる。
【００２９】
本発明では、遺伝子発現に適した環境を人工的に形成し、当該環境の中に目的遺伝子を配置することによって、目的遺伝子１コピーあたりの目的タンパク質の発現量を高めることができる。
【００３０】
〔１−２．逆位反復配列の場合〕
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を用いる場合、染色体に組み込まれた逆位反復配列および発現ベクターは、十字架（cruciform）構造を作り、当該十字架構造がＨｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｖａｓｅにより開裂することで、発現ベクター等が染色体外に切り出される。
【００３１】
切り出された分子は、複製されると環状分子となり、当該環状分子の中に目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドや、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列が含まれていることにより、環状分子が、ある程度の期間染色体外で維持される。このような染色体外の環境は、サイレンシングが生じ難く、目的遺伝子に由来する目的タンパク質の発現を高めることができる。
【００３２】
本発明では、遺伝子発現に適した環境（換言すれば、サイレンシングが生じ難い環境）を人工的に形成し、当該環境の中に目的遺伝子を配置することによって、目的遺伝子１コピーあたりの目的タンパク質の発現量を高めることができる。
【００３３】
〔２．哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法である。
【００３４】
以下に、リピート配列、発現ベクター、および、リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する工程、の各々について説明する。
【００３５】
〔２−１．リピート配列〕
本実施の形態の方法に用いられるリピート配列は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチド（以下、「発現促進ポリヌクレオチド」と呼ぶ。）を複数含むものである。これによって、細胞内に、目的遺伝子の発現に適した環境を人工的に生み出すことができる。なお、発現促進ポリヌクレオチドの具体的な構成は特に限定されず、適宜、所望のポリヌクレオチドを用いることができる（例えば、（ｉ）Haiqing Fu et. al., Preventing gene silencing with human replicators, NATURE BIOTECHNOLOGY, Vol.24, No.5, p572-576, (May 2006)、（ｉｉ）Carl L Schildkraut et. al., Replicators lessen transcriptional silencing, NATURE BIOTECHNOLOGY, Vol.24, No.5, p523-524, (May 2006)、（ｉｉｉ）Liang Huang et. al., Prevention of Transcriptional Silencing by a Replicator-Binding Complex Consisting of SWI/SNF, MeCP1, and hnRNP C1/C2, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Vol.31, No.16, p3472-3484, (Aug. 2011)参照）。
【００３６】
リピート配列の大きさは、特に限定されないが、好ましくは５００〜５０，０００ｂｐであり、より好ましくは１，０００〜５０，０００ｂｐであり、より好ましくは２，０００〜１００，０００ｂｐであり、最も好ましくは５，０００〜１００，０００ｂｐである。
【００３７】
リピート配列に含まれる発現促進ポリヌクレオチドの数は、２個以上であればよく、特に限定されない。例えば、リピート配列に含まれる発現促進ポリヌクレオチドの数は、周囲の染色体環境から独立して発現促進環境を創成するという観点からは、好ましくは２〜５個、更に好ましくは５〜１０個、最も好ましくは１０〜５０個である。
【００３８】
リピート配列に含まれる複数の発現促進ポリヌクレオチドは、互いが直接結合していてもよいし、他の構成（例えば、ヌクレオチド、または、ポリヌクレオチド）を介して、互いが間接的に結合していてもよい。例えば、制限酵素認識部位を介して、上記複数のポリヌクレオチド同士が結合していてもよい。
【００３９】
リピート配列は、発現促進ポリヌクレオチドの直列反復配列（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）を含むものであってもよいし、発現促進ポリヌクレオチドの逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）を含むものであってもよい。つまり、リピート配列は、連続して連結されている複数の発現促進ポリヌクレオチドが同方向になるように連結されているポリヌクレオチド（直列反復配列）を含むものであってもよいし、連続して配置されている複数の発現促進ポリヌクレオチドが逆方向になるように連結されているポリヌクレオチド（逆位反復配列）を含むものであってもよい。
【００４０】
一例として、各々「ＡＴＧ」の塩基配列を有する、２つの発現促進ポリヌクレオチドについて考える。
【００４１】
第１の発現促進ポリヌクレオチドの「Ｇ」に第２の発現促進ポリヌクレオチドの「Ａ」が結合している場合、第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとは、直列反復配列を形成していることになる。つまり、この場合、第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとは、同方向になるように連結されている。
【００４２】
一方、第１の発現促進ポリヌクレオチドの「Ｇ」に第２の発現促進ポリヌクレオチドの「Ｇ」が結合している場合、または、第１の発現促進ポリヌクレオチドの「Ａ」に第２の発現促進ポリヌクレオチドの「Ａ」が結合している場合、第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとは、逆位反復配列を形成していることになる。つまり、この場合、第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとは、逆方向になるように連結されている。
【００４３】
リピート配列が、「発現促進ポリヌクレオチドの直列反復配列を含むもの」である場合、当該発現促進ポリヌクレオチドの全てが同方向になるように連結されている必要はない。
【００４４】
例えば、連続した２つの発現促進ポリヌクレオチドを、１つの反復ユニットと定義する。リピート配列を形成する全ての反復ユニットのうち、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の反復ユニットにおいて、当該反復ユニットを形成する第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとが直列反復配列を形成している場合、当該リピート配列を「発現促進ポリヌクレオチドの直列反復配列を含むもの」と規定し得る。
【００４５】
また、リピート配列を形成する全ての反復ユニットのうち、５０％未満、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、最も好ましくは０％の反復ユニットにおいて、当該反復ユニットを形成する第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとが逆位反復配列を形成している場合、当該リピート配列を「発現促進ポリヌクレオチドの直列反復配列を含むもの」と規定し得る。
【００４６】
リピート配列が、「発現促進ポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むもの」である場合、当該ポリヌクレオチドの全てが逆方向になるように連結されている必要はない。
【００４７】
上記と同様に、連続した２つの発現促進ポリヌクレオチドを、１つの反復ユニットと定義する。リピート配列を形成する全ての反復ユニットのうち、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の反復ユニットにおいて、当該反復ユニットを形成する第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとが逆位反復配列を形成している場合、当該リピート配列を「発現促進ポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むもの」と規定し得る。
【００４８】
また、リピート配列を形成する全ての反復ユニットのうち、５０％未満、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、最も好ましくは０％の反復ユニットにおいて、当該反復ユニットを形成する第１の発現促進ポリヌクレオチドと第２の発現促進ポリヌクレオチドとが直列反復配列を形成している場合、当該リピート配列を「発現促進ポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むもの」と規定し得る。
【００４９】
リピート配列が、発現促進ポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものである場合、当該リピート配列は、染色体内に安定に組み込まれる傾向を示す。一方、リピート配列が、発現促進ポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものである場合、当該リピート配列は、染色体から切り出されて、染色体外に存在する傾向を示す。
【００５０】
発現促進ポリヌクレオチドの具体的構成は、特に限定されず、目的遺伝子の発現を高めることができるものであればよい。なお、所望のポリヌクレオチドが目的遺伝子の発現を高めるものであるか否かは、以下の方法にて確認することができる。まず、所望のポリヌクレオチドをＰＣＲや化学合成等公知の手段を用いて取得する。次いで、ＩＲ／ＭＡＲベクター、目的遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ遺伝子（Enhanced Green Fluorescent Protein遺伝子））および所望のポリヌクレオチドを、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４）に導入した場合の目的遺伝子の発現量１と、所望のポリヌクレオチドを導入せず、ＩＲ／ＭＡＲベクター、および目的遺伝子のみを哺乳動物細胞に導入した場合の目的遺伝子の発現量２と、を比較し、発現量２よりも発現量１が上回っていた場合に、当該ポリヌクレオチドは目的遺伝子の発現を高めるもの（換言すれば、発現促進ポリヌクレオチド）であると判断することができる。
【００５１】
発現促進ポリヌクレオチドの例として、以下のポリヌクレオチド（Ａ）およびポリヌクレオチド（Ｂ）を挙げることができる：
（Ａ）哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド、
（Ｂ）ヒトの第２番染色体短腕１６．１の遺伝子密度の低い領域に由来する３，２７１（ｂｐ）のヒトゲノム断片（以下、「Ｂ−３−３１」とも呼ぶ）。
【００５２】
以下に、ポリヌクレオチド（Ａ）およびポリヌクレオチド（Ｂ）について、更に詳細に説明する。
【００５３】
ポリヌクレオチド（Ａ）
ポリヌクレオチド（Ａ）は、ＩＲの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチド（Ａ）は、ＩＲをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００５４】
ＩＲとしては、特に限定されず、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域を挙げることができる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242（1990）」に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409（1988）」に記載されている。β−グロビン遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009（1998）」に記載されている。
【００５５】
より具体的に、ポリヌクレオチド（Ａ）は、下記（ｅ）〜（ｈ）の何れかのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または、下記（ｅ）〜（ｈ）の何れかのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであってもよい、：
（ｅ）配列番号１０または１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１０または１１に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
（ｇ）配列番号１０または１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号１０または１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の相同性を有し、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００５６】
ポリヌクレオチド（Ｂ）
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、ヒトの第２番染色体短腕１６．１の遺伝子密度の低い領域に由来する３，２７１（ｂｐ）のヒトゲノム断片である。
【００５７】
ポリヌクレオチド（Ｂ）は、下記（ａ）〜（ｄ）の何れかのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、または、下記（ａ）〜（ｄ）の何れかのポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであってもよい：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと９０％以上、９５％以上、９７％以上または９９％以上の相同性を有し、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００５８】
上述したポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）において、「１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド」（換言すれば、変異ポリヌクレオチド）とは、例えば３０個以下、好ましくは２５個以下、より好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドを意図する。
【００５９】
上述したポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）において、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
【００６０】
上述したポリヌクレオチド（Ａ）および（Ｂ）において、「相同性」は、周知の方法に基づいて確認することができる。具体的に、配列番号９、１０または１１に示されている塩基配列を、クエリーとしてＢＬＡＳＴＮ  ２．２．１などの相同検索プログラムを実行し、ＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどのデータベースに対して相同検索を行うことで得られた塩基配列からなるポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド（Ａ）または（Ｂ）として利用することが可能である。
【００６１】
〔２−２．発現ベクター〕
本実施の形態の方法に用いられる発現ベクターは、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを具備するものである。
【００６２】
ＭＡＲは、特に限定されず、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域を挙げることができる。なお、Ｉｇκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば「Tsutsui, K. et. al., J. Biol. Chem. Vol.268, p12886-12894（1993）」に記載されている。ＳＶ４０初期領域の核マトリックス結合領域については、例えば「Pommier, Y. et. al., J. Virol., Vol.64, p419-423（1990）」に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば「Shimizu N. et al., Cancer Res. Vol.61, p6987-6990（2001）」に記載されている。
【００６３】
本実施の形態の方法に用いられる発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）をコードするポリヌクレオチドを具備するものであってもよい。当該構成であれば、より効率よく遺伝子増幅し、より発現が高まることが期待できるという利点があり、より好ましい。
【００６４】
ＩＲとしては、特に限定されず、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域を挙げることができる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242（1990）」に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409（1988）」に記載されている。β−グロビン遺伝子座の複製開始領域については、例えば「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009（1998）」に記載されている。
【００６５】
発現ベクターは、核マトリックス結合領域および複製開始領域の他に、目的に応じて、大腸菌内でクローニングを行なうために必要な配列、薬剤耐性遺伝子（例えば、ブラストサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、等）、または、選択マーカーとして利用可能な蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ遺伝子等）を具備していてもよい。
【００６６】
一方、「目的遺伝子」とは、発現させるべきタンパク質（換言すれば、目的タンパク質）をコードするポリヌクレオチドのことである。よって、目的遺伝子は、特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。当該ポリヌクレオチドは、その塩基配列情報を元に、公知の技術（例えば、ＰＣＲ法、化学合成法）を用いて取得すればよい。
【００６７】
目的遺伝子は、発現制御が可能なようにプロモーターに連結されていることが好ましい。上記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞内で機能するものであれば特に限定されない。例えば、転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が制御されて活性化または不活性化されるプロモーター（換言すれば、転写活性調節型プロモーター）であってもよいし、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。
【００６８】
転写活性調節型プロモーターは、特に限定されず、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品を利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、ＳＲａｌｐｈａプロモーター（ＳＲαプロモーター）、ＬＴＲプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター等が利用可能である。
【００６９】
目的遺伝子には、その他、ターミネーター等目的遺伝子の発現に必要なポリヌクレオチド、制限酵素認識部位、薬剤耐性遺伝子等のクローニングに必要なポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００７０】
〔２−３．リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する工程〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する工程（換言すれば、導入工程）を含んでいる。
【００７１】
哺乳動物細胞としては、特に限定されず、各種哺乳動物由来の細胞（例えば、各種哺乳動物由来の培養細胞）が用いられ得る。例えば、チャイニーズハムスター由来のＣＨＯや、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ＣＨＯとしては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１、ＲＩＫＥＮ  ＲＣＢ０２８５、ＲＩＫＥＮ  ＲＣＢ０４０３等）や、ＣＨＯ  ＤＧ４４が挙げられる。ＣＨＯは、現在、医薬等の有用タンパク質の実生産に用いられており、安全性が確認されている細胞であり、本発明の方法が適用される哺乳動物細胞としては好ましい。
【００７２】
遺伝子増幅効率が高いという点では、無限増殖能を有する腫瘍細胞が好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ（入手先：例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２．２、ＲＩＫＥＮ  ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ  ＲＣＢ０１９１等）、ヒト大腸がんＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ（入手先：例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２０）、ヒト大腸がんＣＯＬＯ  ３２０ＨＳＲ（入手先：例えば、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２０．１）、ＮＳ０（入手先：例えば、ＲＩＫＥＮ  ＲＣＢ０２１３）等が挙げられる。なおヒト大腸がんＣＯＬＯ  ３２０ＤＭについては、「Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」を参照のこと。
【００７３】
リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する方法は、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等の公知の方法を利用可能である。またその詳細な条件については、導入される哺乳動物や、各エレメント等に応じて適宜最適な条件を検討の上、採用すればよい。
【００７４】
〔２−４．その他の工程〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、導入工程の他に、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程（換言すれば、選抜工程）や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞（換言すれば、形質転換細胞）を培養する工程（換言すれば、培養工程）を含んでいてもよい。また、培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する工程（換言すれば、精製工程）を含んでいてもよい。つまり、本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法をも包含する。
【００７５】
選抜工程は、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程である。より詳細に、選抜工程は、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞と、リピート配列と発現ベクターとが導入されていない哺乳動物細胞と、が混在した細胞集団の中から、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を選抜する工程である。選抜工程によって、目的タンパク質を高発現し得る哺乳動物細胞を選抜することができる。
【００７６】
選抜工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、発現ベクターに薬剤耐性遺伝子が含まれている場合、その薬剤耐性を利用して所望の細胞を選抜すればよい。また、ＰＣＲ法やサザンブロット法によって、細胞に含まれる目的遺伝子等のポリヌクレオチドを検出することによっても選抜工程を行い得る。薬剤耐性、ＰＣＲ法、サザンブロット法を利用した選抜の具体的な方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が適宜利用され得る。
【００７７】
培養工程は、選抜工程によって既に選抜された哺乳動物細胞を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的タンパク質を哺乳動物細胞において高発現させることができる。培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。
【００７８】
精製工程は、培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する工程である。精製工程におけるタンパク質の具体的な精製方法としては、例えば、哺乳動物細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）等の緩衝溶液に懸濁した後、ホモジェナイザーまたは超音波等で細胞を破砕し、当該懸濁液を遠心分離に供した後、上清を回収すればよい。上記緩衝溶液には、目的タンパク質の可溶化を促進するための界面活性剤や、目的タンパク質の立体構造を安定化するための還元剤、目的タンパク質の分解を防止するためのプロテアーゼインヒビターを適宜添加してもよい。
【００７９】
上記界面活性剤としては、CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propanesulfonate]、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｎｉｋｋｏｌ、ｎ−オクチルグリコシド等を利用することができる。また、上記還元剤としては、ＤＴＴ（dithiothreitol）、ＤＥＴ（dithioerythritol）等を利用することができる。上記プロテアーゼインヒビターとしては、アプロチニンや、ロイペプチンを利用することができる。
【００８０】
上記上清から、目的タンパク質をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製することができる。また、精製された目的タンパク質を含む溶液を適当な緩衝液に対して透析することで、目的タンパク質を含む溶液から不要な塩を除去してもよい。精製工程は、目的タンパク質の分解を抑えるために低温条件下で行われることが好ましい。特に４℃以下の低温条件下で精製工程が行われることが好ましい。なお、精製工程の具体的な方法は、この限りではなく、公知の方法を適宜利用し得る。
【００８１】
〔３．哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキット〕
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットは、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備えている。
【００８２】
リピート配列については、〔２−１．リピート配列〕の欄にて説明したリピート配列を用いればよい。発現ベクターについては、〔２−２．発現ベクター〕の欄にて説明した発現ベクターから、目的遺伝子を除いた発現ベクターを用いればよい。つまり、本実施の形態のキットの利用者は、所望の目的遺伝子を発現ベクターに挿入した後、当該発現ベクターを用いることになる。それ故に、キットに含まれる発現ベクターには、予め目的遺伝子が具備されている必要はない。
【００８３】
本実施の形態のキットに用いるリピート配列および発現ベクターの構成については既に説明したので、以下では、その概略のみを説明する。
【００８４】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００８５】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００８６】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであることが好ましい：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００８７】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものであることが好ましい。
【００８８】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものであることが好ましい。
【００８９】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００９０】
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットでは、上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものであることが好ましい。
【００９１】
本発明のキットには、形質転換に必要な機器や試薬、宿主となる哺乳動物細胞、その他取扱説明書などがさらに含まれていてもよい。
【００９２】
〔３．哺乳動物細胞〕
本実施の形態の哺乳動物細胞は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞である。
【００９３】
本実施の形態の哺乳動物細胞に用いる細胞については、〔２−３．リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する工程〕の欄に用いた細胞を用いればよい。
【００９４】
リピート配列については、〔２−１．リピート配列〕の欄にて説明したリピート配列を用いればよい。発現ベクターについては、〔２−２．発現ベクター〕の欄にて説明した発現ベクターを用いればよい。本実施の形態の哺乳動物に用いるリピート配列および発現ベクターの構成については既に説明したので、以下では、その概略のみを説明する。
【００９５】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００９６】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【００９７】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであることが好ましい：
（ａ）配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号９に示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
【００９８】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものであることが好ましい。
【００９９】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものであることが好ましい。
【０１００】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであることが好ましい。
【０１０１】
本実施の形態の哺乳動物細胞では、上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものであることが好ましい。
【実施例】
【０１０２】
＜１．リピート配列、および、発現ベクターの作製＞
Ｇ５またはＧ５／ＡＲ１の各々の直列反復配列（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔ）または逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ）を含むリピート配列を作製した。以下に、作製方法を説明する。
【０１０３】
鋳型としてｐＧ５（図２参照）を用い、プライマーとして以下の表１に示すプライマーを用い、酵素としてＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによって、Ｇ５（ＤＮＡ断片の長さ：９９８ｂｐ、配列番号１０）およびＧ５／ＡＲ１（ＤＮＡ断片の長さ：１，３４９ｂｐ、配列番号１１）を増幅した。なお、表１において、「Ｇ５  Ｄｉｒ．」、「Ｇ５  Ｉｎｖ．」、「Ｇ５ＡＲ１  Ｄｉｒ．」および「Ｇ５ＡＲ１  Ｉｎｖ．」の各々は、Ｇ５の直列反復配列、Ｇ５の逆位反復配列、Ｇ５／ＡＲ１の直列反復配列、および、Ｇ５／ＡＲ１の逆位反復配列の作製に用いられたプライマーセットを示している。
【０１０４】
直列反復配列を作製する場合には、プライマーの５’末端に、Ｔｙｐｅ  Ｉの制限酵素であるＲｓｒ  ＩＩの認識配列を付加した。一方、逆位反復配列を作製する場合には、一方のプライマーに、Ｔｙｅ  ＩＩの制限酵素であるＭｒｕ  Ｉの認識配列を付加し、もう一方のプライマーに、Ｔｙｅ  ＩＩの制限酵素であるＳａｌ  Ｉの認識配列を付加した。
【０１０５】
ＰＣＲの増副産物は、５’末端および３’末端に上述した制限酵素の認識配列を有している。ＰＣＲの増幅産物を上記制限酵素によって完全に消化し、消化によって生じた短い断片をＮｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（Ｔａｋａｒａ）を用いて除去した。得られたＰＣＲの増幅産物を、ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてライゲーションした。ライゲーション産物の代表的な電気泳動の像を図１（ａ）に示す。また、図１（ｂ）に、Ｇ５およびＧ５／ＡＲ１の各々について、直列反復配列および逆位反復配列の構造の概略を示す。また、図１（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールとして、λファージ由来のＤＮＡ（ＤＮＡ断片の長さ：９７２ｂｐ、配列番号１２）の直列反復配列および逆位反復配列も作製した。
【０１０６】
【表１】
0006544565.tif 000002
【０１０７】
周知の手法にしたがって、実施例に用いるベクターを作製した。図２に、各ベクターの構造を示す。
【０１０８】
ｐＫＶは、目的遺伝子であるｄ２ＥＧＦＰが挿入されたプラスミドであるである。
【０１０９】
ｐＫＶ−ＡＲ１は、目的遺伝子であるｄ２ＥＧＦＰと、ＭＡＲ（具体的にはＡＲ１、配列番号１３）と、が挿入されたプラスミドであるである。
【０１１０】
ｐＧ５は、ＩＲ（具体的にはＧ５、配列番号１０）と、ＭＡＲ（具体的にはＡＲ１、配列番号１３）と、が挿入されたプラスミドであるである。
【０１１１】
ｐΔＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰは、目的遺伝子であるｄ２ＥＧＦＰと、ＭＡＲ（具体的にはＡＲ１、配列番号１３）と、ＩＲ（具体的にはヒトｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子座由来の複製開始領域）と、が挿入されたプラスミドであるである。
【０１１２】
ｐΔＢＭ  ＡＲ１  ＭｙｃＬＨ  Ｄ１  ＲｓｒＩＩは、目的遺伝子であるＭｙｃと、ＭＡＲ（具体的にはＡＲ１、配列番号１３）と、ＩＲ（具体的にはＤ１、配列番号１４）と、が挿入されたプラスミドであるである。
【０１１３】
＜２．細胞内に導入された発現ベクターの状態に関する試験＞
ｐＫＶ−ＡＲ１を、（ｉ）単独で（−）、（ｉｉ）Ｇ５の直列反復配列と共に（Ｄｉｉｒ.）、（ｉｉｉ）Ｇ５の逆位反復配列と共に（Ｉｎｖ．）、（ｉｖ）ｐＧ５と共に、ヒト大腸癌細胞であるＣＯＬＯ  ３２０ＤＭに導入した。
【０１１４】
薬剤選択によって、安定な形質転換体を取得した。当該形質転換体内のプラスミドの塩基配列を、ＦＩＳＨ法により蛍光（緑色）で検出し、当該形質転換体内の核のＤＮＡを、対比染色（赤色）で検出した。
【０１１５】
図３に、形質転換体の代表的な写真を示す。
【０１１６】
プラスミドの塩基配列が核内における微小な点状の染色像として検出された場合、当該点状の染色像を、Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｔｉｎｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＥＴＥ）と称する。このような命名は、Harada et al.,（2009）J. Biol. Chem.に従った命名である。
【０１１７】
ＥＴＥを、更に、１つの核内での点状の染色像が少ない場合（ＥＴＥ＋）と、１つの核内での点状の染色像が多い場合（ＥＴＥ＋＋）とに大別した。
【０１１８】
一方、点状の染色像がＥＴＥよりも大きい場合は、当該染色像をＤＭ（Double Minutes）と判断した。核内に１個の大きな染色像が見られる場合は、当該染色像をＨＳＲ（Homogenous Staining Region）と判断した。
【０１１９】
５００個以上の核を顕微鏡で観察し、上述した染色像の形成頻度を算出した。
【０１２０】
図４（ａ）は、染色体外のＥＴＥまたはＤＭの形成頻度を示すグラフであり、図４（ｂ）は、ＨＳＲの形成頻度を示すグラフである。
【０１２１】
図４（ａ）から、ｐＫＶ−ＡＲ１およびＧ５の逆位反復配列の両方が導入された細胞では、染色体外の構造体が形成され易くなることが示唆された。染色体外の構造体の形成頻度は、通常のＩＲ／ＭＡＲ法（具体的に、ｐＧ５、ｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰの場合）に比べて高かった。
【０１２２】
図４（ｂ）から、Ｇ５の直列反復配列を用いた方が、Ｇ５の逆位反復配列を用いた場合よりも、高い頻度でＨＳＲが形成されることが示唆された。
【０１２３】
＜３．細胞内における目的タンパク質の発現に関する試験＞
図５（ａ）および図５（ｂ）に示すリピート配列と発現ベクターとの様々な組み合わせを、２種類の細胞（ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、または、ＣＨＯ  ＤＧ４４）に導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換体における目的タンパク質（具体的には、ｄ２ＥＧＦＰ）の発現をフローサイトメーターで測定し、当該発現を任意の単位で数値化してグラフにまとめた。試験結果を図５（ａ）および図５（ｂ）に示す。
【０１２４】
図５（ａ）および図５（ｂ）から明らかなように、λファージ由来のＤＮＡをｐＫＶ−ＡＲ１と同時に細胞へ導入した場合の目的タンパク質の発現量は、ｐＫＶ−ＡＲ１を単独で細胞へ導入した場合の目的タンパク質の発現量と比べて大きな違いはなかった。一方、ｐＫＶ−ＡＲ１をＧ５の単量体（ｍｏｎｏ）と共に細胞へ導入すると、目的タンパク質の発現量が高くなり、ｐＫＶ−ＡＲ１をＧ５の直列反復配列（Ｄｉｉｒ.）またはＧ５の逆位反復配列（Ｉｎｖ．）と共に細胞へ導入すると、目的タンパク質の発現量が著しく高くなった。
【０１２５】
ｐＫＶ−ＡＲ１をＧ５の直列反復配列（Ｄｉｉｒ.）またはＧ５の逆位反復配列（Ｉｎｖ．）と共に細胞へ導入したときの目的タンパク質の発現量は、従来のＩＲ／ＭＡＲ遺伝子増幅法による発現量（ｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰ（ｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰと、図２のｐΔＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰとは、同じ））よりも高かった。同様の結果が、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭおよびＣＨＯ  ＤＧ４４の両方の細胞にて得られた。
【０１２６】
＜４．細胞内における発現ベクターのコピー数に関する試験＞
図６（ａ）および図６（ｂ）に示すリピート配列と発現ベクターとの様々な組み合わせを、２種類の細胞（ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、または、ＣＨＯ  ＤＧ４４）に導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換細胞内の発現ベクターのコピー数をリアルタイムＰＣＲで定量した。より具体的に、発現ベクター内のＳＲａｌｆａプロモーターのコピー数、および、発現ベクターと共に細胞へ導入したＧ５またはλファージ由来のＤＮＡのコピー数、をリアルタイムＰＣＲにて定量した。試験結果を図６（ａ）および図６（ｂ）に示す。
【０１２７】
ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭの場合、コントロールとして細胞に導入したｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰ（換言すれば、ＩＲ／ＭＡＲプラスミド）のコピー数が１，０００コピー程度にまで上昇していた。
【０１２８】
ｐＧ５は、複製開始領域（ＩＲ）であるＧ５と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）であるＡＲ１とを両方とも具備しているため、Ｇ５と発現ベクターは、共に１，０００コピー近くにまで増幅した。
【０１２９】
ｐＧ５とｐＫＶ−ＡＲ１とを共に細胞へ導入した場合は、ｐＧ５とｐＫＶ−ＡＲ１とが共にバランス良く増幅した。Ｇ５の単量体とｐＫＶ−ＡＲ１とを共に細胞へ導入した場合も、Ｇ５とｐＫＶ−ＡＲ１とが共にバランス良く増幅した。
【０１３０】
一方、ｐＫＶ−ＡＲ１をＧ５の直列反復配列（Ｄｉｉｒ.）またはＧ５の逆位反復配列（Ｉｎｖ．）と共に細胞へ導入すると、発現ベクターのコピー数が比較的少ない一方で、Ｇ５のコピー数が極めて多かった。すなわち、少数の発現ベクターが、多数のＧ５と一緒に細胞内で増幅されていた。この現象は、λファージ由来のＤＮＡを用いた場合には観察されなかったので、ＩＲに依存した現象であることが明らかになった。
【０１３１】
同様な結果が、ＣＨＯ  ＤＧ４４についても得られた。ＣＨＯ  ＤＧ４４の場合、測定されたコピー数を標準化するために用いたハムスターＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅用プライマーの増幅効率が悪かった。それ故に、細胞あたりのコピー数は、相対値としては正確性が高いが、絶対値としては正確性が劣り、コピー数（絶対値）が１以下になっている。また、Ｇ５の直列反復配列（Ｄｉｉｒ.）を用いた場合には、Ｇ５の増幅の程度が高いが、Ｇ５の逆位反復配列（Ｉｎｖ．）を用いた場合には、Ｇ５の増幅の程度が低い。この現象は、逆位反復配列の細胞内における不安定性で説明され得る（上述した〔１．本発明のメカニズム（モデル）〕の欄参照）。
【０１３２】
図６のグラフの数値によって図５のグラフの数値を除算することで、１コピーの遺伝子あたりのタンパク質の発現量を求めた。試験結果を図７に示す。図７に示すように、Ｇ５の直列反復配列または逆位反復配列を用いることによって、１コピーの遺伝子あたりのタンパク質の発現量が極めて高くなることが明らかになった。Ｇ５の直列反復配列または逆位反復配列を用いた場合、通常のＩＲ／ＭＡＲプラスミドを用いた場合（ｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰ）や、ｐＫＶ−ＡＲ１とｐＧ５とを共に細胞へ導入する、通常のＩＲ／ＭＡＲ法を採用した場合に比べて、１コピーの遺伝子あたりのタンパク質の発現量が、２桁以上も大きくなった。
【０１３３】
このような効果は、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭでは、逆位反復配列を用いた場合の方が直列反復配列を用いた場合よりも強く、一方、ＣＨＯ  ＤＧ４４では、直列反復配列を用いた場合の方が逆位反復配列を用いた場合よりも強かった。このことは、ＣＨＯ  ＤＧ４４では、逆位反復配列を用いた場合にコピー数が多くならなかったことに起因している可能性が高い。
【０１３４】
＜５．リピート配列および発現ベクターの状態に関する試験＞
ＦＩＳＨ法により、発現ベクターの増幅状況を検討した。
【０１３５】
Ｇ５の直列反復配列とｐＫＶ−ＡＲ１とを共に細胞へ導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換体について、分裂中期染色体標本（metaphase spread）を調製し、当該分裂中期染色体標本に、Ｇ５を検出するプローブと、ｐＫＶ−ＡＲ１を検出するプローブとを同時にハイブリダイズさせ、異なる蛍光色にて、Ｇ５とｐＫＶ−ＡＲ１とを同時に検出した。試験結果を図８に示す。
【０１３６】
図８（ａ）に示すように、Ｇ５とｐＫＶ−ＡＲ１とは、同じＤＭ上で同時に増幅していることが明らかになった。注目されることに、Ｇ５のシグナルの方が、ｐＫＶ−ＡＲ１のシグナルよりも圧倒的に強かった。
【０１３７】
更に、上記形質転換体について、間期核からクロマチンファイバーを取り出し、当該クロマチンファイバーに対して、Ｇ５を検出するプローブと、ｐＫＶ−ＡＲ１を検出するプローブとを同時にハイブリダイズさせ、異なる蛍光色にて、Ｇ５とｐＫＶ−ＡＲ１とを同時に検出した。なお、クロマチンファイバーを用いる検出法は、分裂中期染色体標本を用いる検出法に比べて、はるかに分解能が高い検出法である。
【０１３８】
図８（ｂ）に示すように、Ｇ５のリピート配列（図８（ｂ）の上側の写真参照）の中に、略等しい間隔をおいてｐＫＶ−ＡＲ１（図８（ｂ）の下側の写真参照）が検出された。このことは、目的遺伝子を具備するｐＫＶ−ＡＲ１が、細胞内でＧ５のリピート配列と一体化し、一体化されたものを増幅単位として、ｐＫＶ−ＡＲ１が増幅されていることを強く示唆している。
【０１３９】
＜６．Ｂ−３−３１に関する試験−１＞
目的遺伝子（ｄ２ＥＧＦＰ）、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド（ＡＲ１、配列番号１３）、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）、および、ヒトの第２番染色体短腕１６．１の遺伝子密度の低い領域に由来する３，２７１（ｂｐ）のヒトゲノム断片（Ｂ−３−３１）（配列番号９）を具備する発現ベクター（Ｖｅｃ１）を作製した。
【０１４０】
また、コントロールとして、上述した発現ベクター（Ｖｅｃ１）からヒトゲノム断片（Ｂ−３−３１）を除去した発現ベクター（Ｖｅｃ２）を作製した。
【０１４１】
各発現ベクターを細胞に導入した。当該細胞をフローサイトメーターに供し、ｄ２ＥＧＦＰの発現データと、細胞数のデータとを取得した。図９に試験結果を示す。
【０１４２】
図９（ａ）および図９（ｂ）は基本的に同じ図面であり、図９（ａ）では、「Ｖｅｃ２」のデータを紙面手前に示し、図９（ｂ）では、「Ｖｅｃ１」のデータを紙面手前に示している。なお、図９（ａ）および図９（ｂ）では、ｄ２ＥＧＦＰの発現量を横軸に、細胞数を縦軸にプロットしている。
【０１４３】
図９（ａ）および図９（ｂ）に示すように、Ｖｅｃ１を用いると、Ｖｅｃ２を用いた場合と比較して、蛍光強度が強い（換言すれば、ｄ２ＥＧＦＰの発現量が多い）細胞の数が増加した。つまり、Ｂ−３−３１が、増幅された発現ベクターからの目的タンパク質の発現量を増加させていることが明らかになった。
【０１４４】
＜７．Ｂ−３−３１に関する試験−２＞
＜１−１．リピートの作製＞にて説明した方法と同様の方法にて、Ｂ−３−３１の直列反復配列および逆位反復配列を作製した。
【０１４５】
当該直列反復配列または逆位反復配列と、ｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰとを、共に細胞（ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、または、ＣＨＯ  ＤＧ４４）に導入した（図１０および１１にて、Ｃａｓｅ１にて示す）。また、コントロールとして、ｐＤＢＭ  ｄ２ＥＧＦＰのみを細胞（ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、または、ＣＨＯ  ＤＧ４４）に導入した（図１０および１１にて、Ｃａｓｅ２にて示す）。
【０１４６】
これらの細胞をフローサイトメーターに供し、ｄ２ＥＧＦＰの発現データと、細胞数のデータとを取得した。図１０および１１に試験結果を示す。なお、図１０および図１１では、ｄ２ＥＧＦＰの発現量を横軸に、細胞数を縦軸にプロットしている。
【０１４７】
図１０（ａ）は、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭにＢ−３−３１の直列反復配列を導入した場合の試験結果を示している。図１０（ａ）の左右の図は、基本的に同じ図面であり、左の図では、「Ｃａｓｅ２」のデータを紙面手前に示し、右の図では、「Ｃａｓｅ１」のデータを紙面手前に示している。
【０１４８】
図１０（ｂ）は、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭにＢ−３−３１の逆位反復配列を導入した場合の試験結果を示している。図１０（ｂ）の左右の図は、基本的に同じ図面であり、左の図では、「Ｃａｓｅ２」のデータを紙面手前に示し、右の図では、「Ｃａｓｅ１」のデータを紙面手前に示している。
【０１４９】
図１１（ａ）は、ＣＨＯ  ＤＧ４４にＢ−３−３１の直列反復配列を導入した場合の試験結果を示している。図１１（ａ）の左右の図は、基本的に同じ図面であり、左の図では、「Ｃａｓｅ２」のデータを紙面手前に示し、右の図では、「Ｃａｓｅ１」のデータを紙面手前に示している。
【０１５０】
図１１（ｂ）は、ＣＨＯ  ＤＧ４４にＢ−３−３１の逆位反復配列を導入した場合の試験結果を示している。図１１（ｂ）の左右の図は、基本的に同じ図面であり、左の図では、「Ｃａｓｅ２」のデータを紙面手前に示し、右の図では、「Ｃａｓｅ１」のデータを紙面手前に示している。
【０１５１】
図１０および図１１に示すように、Ｃａｓｅ１の場合には、Ｃａｓｅ２の場合と比較して、蛍光強度が強い（換言すれば、ｄ２ＥＧＦＰの発現量が多い）細胞の数が増加した。つまり、Ｂ−３−３１の直列反復配列および逆位反復配列は、共に、目的タンパク質（ｄ２ＥＧＦＰ）の発現を高めた。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明は、所望のタンパク質（例えば、有用タンパク質）を大量に生産する産業、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等の種々広範な産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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