(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料から核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスであって、
前記乾燥固体マトリックスは、乾燥形態で第１族又は第２族の金属カチオンを含む金属チオシアン酸塩と、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である還元剤と、緩衝液とを含むｐＨ域が４〜７．４の組成物を含む固体マトリックスであり、該固体マトリックスが、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維又はそれらの組合せを含む多孔質マトリックスである、乾燥固体マトリックス。
【請求項２】
第１族又は第２族の金属カチオンが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋及びＢａ２＋からなる群から選択される、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項３】
固体マトリックスに存在する組成物が、ＵＶ保護剤、ラジカル捕捉剤、キレート剤又はそれらの組合せをさらに含む、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項４】
乾燥固体マトリックスに導入された組成物がさらにＲＮアーゼ阻害剤を含む、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項５】
乾燥固体マトリックスにより、周囲条件下で乾燥形態の核酸の長期保存が可能となる、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項６】
核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組合せである、請求項５記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項７】
核酸がＲＮＡである、請求項６記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項８】
多孔質マトリックスがセルロース紙である、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項９】
金属チオシアン酸塩が、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸亜鉛及びその組合せからなる群から選択される、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項１０】
緩衝液が、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液からなる群から選択される、請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項１１】
ＵＶ保護剤又はラジカル捕捉剤が、ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、トルヒドロキノン（ＴＨＱ）及びアスコルビン酸からなる群から選択される、請求項３記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項１２】
ＲＮアーゼ阻害剤が、バナジルリボヌクレオシド錯体（ＶＲＣ）又はヌクレオチドアナログである、請求項４記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項１３】
固体マトリックスが多孔質セルロース系マトリックスであり、
ａ）金属チオシアン酸塩が第１族又は第２族の金属カチオンで構成され、
ｂ）還元剤がＴＣＥＰであり、
ｃ）緩衝液がＭＯＰＳである、
請求項１記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項１４】
ラジカル捕捉剤をさらに含んでいて、ラジカル捕捉剤がＭＥＨＱ又はＴＨＱを含む、請求項１３記載の乾燥固体マトリックス。
【請求項１５】
生体試料から核酸を抽出し、保存する方法であって、
ａ）第１族又は第２族の金属カチオンを含む金属チオシアン酸塩と、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である還元剤と、緩衝液とを含むｐＨ域が４〜７．４である組成物を、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維又はそれらの組合せを含む多孔質マトリックスである乾燥固体マトリックスに導入して、生体試料から核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスを供給すること、
ｂ）乾燥固体マトリックスに組成物に導入した後に固体マトリックスを乾燥すること、
ｃ）核酸を収集するために乾燥固体マトリックスに試料を適用すること、
ｄ）核酸を含む固体マトリックスを乾燥すること、及び
ｅ）周囲条件下で乾燥状態の固体マトリックスで核酸を保存すること
を含む、方法。
【請求項１６】
金属カチオンが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋及びＢａ２＋からなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
固体マトリックスから核酸を回収することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
生体試料が、血液、血清、組織、唾液、鼻の粘液又は細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
生体試料が、精製核酸試料又は組織培養細胞調製物である、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
生体試料からの核酸の精製は、核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスに試料を適用する前に不必要である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
当該方法によって周囲条件下で乾燥形態のＲＮＡの長期保存が可能となる、請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
水溶液、緩衝液又は有機溶液でマトリックスを再水和することにより、乾燥固体マトリックスから核酸を回収し、核酸をさらなる分析に供する、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
電気溶出により乾燥固体マトリックスから核酸を回収する、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、乾燥固体基材及び乾燥形態の生体試料から、核酸、特にＲＮＡを周囲抽出、安定化及び保存するために乾燥固体基材を使用する方法に関する。乾燥固体基材から核酸を抽出、収集、保存及び回収する方法も記載する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡは、化学物質の自己加水分解及び酵素媒介分解の双方の結果として、安定化するのが最も困難な生体分子のうちの１つである。従って、生体試料に由来するＲＮＡの抽出及び保存は、ＲＮＡの抽出及び回収に使用する緩衝液、ｐＨ、温度、特に、丈夫なリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）の遍在性などの多くの環境因子の影響を受けやすいが、これらに限定されない。その結果、精製及び未精製の双方の状態のＲＮＡは、加水分解及び酵素的分解を防ぎ、かつＲＮＡ試料の完全性を保存するために、通常−８０℃での保存を必要とする。−８０℃での試料の保冷又は冷凍に関するコスト及び空間要求を避けるため、周囲条件下でＲＮＡを抽出、収集及び保存する能力が経済的に望まれている。
【０００３】
液体状で周囲条件下でＲＮＡを保存するための現在の方法論は、例えば、界面活性剤、カオトロピック化合物、還元剤、遷移金属、有機溶媒、キレート剤、プロテアーゼ、ＲＮアーゼペプチド阻害剤及び抗ＲＮアーゼ抗体を使用したＲＮアーゼの非活性化に注目してきた。トランスエステル化及び自己加水分解を防ぐために、ＲＮＡを化学的に修飾するというさらなる試みが行われている。しかし、最も入手しやすいＲＮＡ保存物は、室温で数日間又は数週間、液体状のＲＮＡしか保存できない。乾燥形態のＲＮＡの収集及び保存を成功させる現在の技術では、通常、ＲＮＡが、保存される前に、生体物質（例えば、血液、血清、組織、唾液などなどの生体試料）からまず「予備精製」され濃縮されることが必要となる。
【０００４】
乾燥形態のＲＮＡを保存する現在の技術はさらに乾燥設備を必要とする。従って、これらの方法は、著しい試料の加工なしでは試料（例えば、生体試料）からＲＮＡを直接収集できない。
【０００５】
従って、１つの工程で試料（例えば、生体試料）からのＲＮＡの抽出、安定化及び保管／保存をまとめて行える組成物及び方法が望まれており、当該技術分野で必要とされている。このような組成物及び方法により、周囲条件下でのＲＮＡの長期保存が可能になり、インタクトなＲＮＡがさらなる分析のために回収できるようになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第２０１２／００５２５７２号明細書
【発明の概要】
【０００７】
本明細書において下記で定義する生体試料のような試料から核酸を抽出及び保存するための固体マトリックスであって、タンパク質変性剤、還元剤、緩衝液及び必要に応じてラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤を含有する組成物が乾燥形態の固体マトリックスに存在する、固体マトリックスが記載されている。一実施形態では、本願の乾燥固体マトリックスにより、周囲条件下で乾燥形態の核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を含む生体試料の長期保存が可能となる。本発明のさらなる態様では、試料から核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を周囲抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスには、チオシアン酸塩、還元剤、緩衝液及び必要に応じて乾燥形態の固体マトリックスに存在するラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤が含まれる。別の実施形態では、試料から核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスには、１種以上の金属チオシアン酸塩（１種以上の金属チオシアン酸塩は、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）ではない）、還元剤、緩衝液及び必要に応じてラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤が含まれる。
【０００８】
乾燥固体マトリックスに周囲状態で保存した核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、収集した核酸試料のさらなる分析に適したインタクトな形態の固体マトリックスから核酸を解放する工程を行ってもよい。生体試料から核酸を抽出及び保存するために本発明の固体マトリックスを使用する方法も提供される。
【０００９】
化学的に修飾した多孔質膜のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むことでより一層理解され、図面全体にわたり、同じ符号は同じ部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】異なる組成物の固体マトリックスに培養細胞をスポットした後、電気溶出によりセルロースから回収した核酸の代表的な電気泳動図を表す。高分子量ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ  ｒＲＮＡバンドを示す。Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いてＤＮＡ及びＲＮＡをさらに定量化する。パネルＡにおいて各ゲルレーンの上から下に垂線を引き、Ｐｌｏｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅ機能を用いて線の距離（ｃｍ）の関数としてピクセル強度（濃淡値任意単位）をプロットした。ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ  ｒＲＮＡに対応するピークをボックス内に示す。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図２】表示した各組成物の２８ｓ  ｒＲＮＡ及び１８ｓ  ｒＲＮＡについての濃淡値任意単位として示すゲルピクセル強度を表す。セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で１０日間保管した。１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率をグラフの各棒の上に記載する。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図３】表示した各組成物の２８ｓ  ｒＲＮＡ及び１８ｓ  ｒＲＮＡについてのゲルピクセル強度を表す。セルロース基材は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で１３日間保管した。各実験条件の１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率をグラフの各棒の上に表示する。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図４】表示した各組成物の２８ｓ  ｒＲＮＡ及び１８ｓ  ｒＲＮＡについてのゲルピクセル強度を表す。セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で１０日間保管した。各実験条件の１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率をグラフの各棒の上に表示する。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図５】表示した各組成物の２８ｓ  ｒＲＮＡ及び１８ｓ  ｒＲＮＡのバンドについてのゲルピクセル強度を表す。セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で３０日間保管した。各実験条件の１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率をグラフの各棒の上に表示する。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図６】記載した各条件で、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐを用いてＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザで求めた、セルロース基材上の乾燥血斑から測定したＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を表す。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図７】日光によるセルロース基材の損傷からのｍＲＮＡの保護を証明する。グラフの各棒は、図で示した組成物を含むＵＶ処理試料とＵＶ未処理試料の間のｑＲＴ−ＰＣＲサイクル閾値の差異を表す。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図８】４週間にわたる異なる温度で異なる緩衝液の存在下でのセルロースベース紙に対するＴＣＥＰの活性を表す。その他の詳細については実施例の項に記載する。
【図９】化学的含浸セルロース基材にスポットした培養ヒト細胞のＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を表す。試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザでのＲＮＡ分析前の少なくとも１週間は周囲温度で保存した。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【図１０】化学的含浸セルロース基材上の乾燥血斑のＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を表す。乾燥血斑は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザでのＲＮＡ分析前の１９日間、周囲温度で保存した。その他の実験の詳細については下記の実施例の項に記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
試料（例えば、生体試料）から核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組み合わせ）を周囲抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスであって、タンパク質変性剤、還元剤、緩衝液及び必要に応じてラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤を含む組成物が乾燥状態の固体マトリックスに導入される、乾燥固体マトリックスが本明細書に記載されている。本明細書に記載のさらなる実施形態では、周囲条件下で核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組み合わせ）を抽出及び乾燥保存するための固体基材には、１種以上のチオシアン酸塩（１種以上のチオシアン酸塩は、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）ではない）、還元剤、緩衝液及び乾燥形態の固体マトリックスに必要に応じて存在するラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤が含まれる。上記の組成物の「組み込み」には、下記の「浸漬」法が含まれるが、これに限定されない。当業者であれば、乾燥固体マトリックスへの組成物の組み込みを行うために多くのそのような方法が存在することを理解するであろう。乾燥固体マトリックスに組成物に導入した後、任意の適切な方法に従って固体マトリックスを乾燥する。
【００１２】
本発明の組成物により、周囲保存条件下で試料からの核酸の長期乾燥保存が可能となる。この知見は、周囲条件下で不安定であることが広く知られているＲＮＡに関して特に重要である。本明細書で使用される用語「固体マトリックス」には、セルロースベースの物、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維又はそれらのあらゆる組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本願の固体マトリックスは多孔質でもよい。特定の実施形態では、固体マトリックスは、９０３、３１−ＥＴＦ、ＦＴＡ（商標）又はＦＴＡ（商標）ＥｌｕｔｅなどのＷｈａｔｍａｎ（商標）製の多孔質セルロース紙である。膜、紙、セルロース紙、固体マトリックス及び基材という用語は、本開示全体にわたり交換可能に使用され得る。当業者であれば、これらが当該技術分野で使用され、同じ種類の組成物を意味することを直ぐに認識するであろう。
【００１３】
用語「抽出」は、試料、より詳細には生体試料から核酸を分離及び単離する任意の方法を意味する。ＲＮＡ及びＤＮＡなどの核酸は、例えば、空気中の蒸発性試料の細胞溶解の間又は試料と接触すると細胞溶解及び核酸の解放が生じる化学的修飾固体マトリックス（例えば、ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅセルロース紙）中の化合物の存在により解放可能である。当業者であれば、核酸を安定化及び保存するために固体マトリックスに核酸を捕捉できるように、試料（例えば、未精製の生体試料）から核酸、特にＲＮＡを抽出する任意の方法が本開示の組成物及び方法に使用され得ることを理解するであろう。試料からの核酸を抽出する方法の上記の実施例は、例示目的のみに提供される。用語「保存（ｓｔｏｒａｇｅ）」又は「保存（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」は、さらなる分析に適した形態の抽出核酸の維持に関して本明細書に交換可能に使用され得る。
【００１４】
核酸、特にＲＮＡの分野の当業者は、従来から、（１）ｍＲＮＡターゲットの定量ＲＴ−ＰＣＲ増幅、（２）Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザでのＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）分析及び（３）全細胞ＲＮＡの大半を占める２８ｓ：１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の比率に基づき、ＲＮＡの安定性及び品質を評価してきた。高品質の細胞ＲＮＡは、一般に、１より大きい２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡ比率と１０に近いＲＩＮスコアを示す。実際、所望のＲＩＮスコアは一般に５より大きい。さらに、高品質の細胞ＲＮＡは、低存在率のｍＲＮＡと大きな（例えば、１ｋＢ超）ｍＲＮＡの双方の効率的な増幅を支持する。便宜上、ｒＲＮＡシグナル強度及び２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡ比率は、ゲル電気泳動によって高いＲＮＡ保存性を有する試料を迅速にスクリーニングし特定するために使用することが多い。
【００１５】
本明細書で定義するように、「生体試料」には、ヒトなどの任意の生物から得られた血液、血清、組織、鼻の粘液及び唾液が含まれるが、これらに限定されない。生体試料は、自己診断検査（例えば、血糖モニタリング）を受ける個体により又は訓練を受けた医療専門家により、例えば、針を用いて血液を吸引するか、患者の皮膚の病変などの特定の部位を傷つけるか綿棒で擦過（ｓｗａｂ）するかなどの様々な技術によって得ることができる。種々の生体試料を収集する方法が当該技術分野においてよく知られている。用語「試料」には、上記で定義される生体試料だけでなく、例えば、組織培養細胞及び精製核酸も含まれる。
【００１６】
タンパク質変性剤、還元剤及び緩衝液を含む組成物は、本開示の乾燥固体マトリックスに存在する。組成物は、１種以上の上記各成分を含んでもよい。組成物は、必要に応じてさらに、紫外線（ＵＶ）阻害剤（以下、「ＵＶ保護剤」ともいう。）、ラジカル捕捉剤、ＲＮアーゼ阻害剤、キレート剤又はそれらの任意の組合せを含んでもよい。当業者であれば、多くのタンパク質変性剤が当該技術分野において知られており、本明細書に記載した組成物及び方法で使用するために経験的に選択され得ることを理解するであろう。特定のタンパク質変性剤に限定することなく、タンパク質変性剤の例として、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、アルギニン、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）、尿素又はそれらの任意の組合せが挙げられる。タンパク質変性剤の例の式を以下に示す：
【００１７】
【化１】
0006544860.tif 000002
式中、Ｒはそれぞれ独立して、水素、ヘテロ原子含有基又は炭化水素基からなる群から選択されるメンバーであり得る。
【００１８】
ヘテロ原子含有基は、窒素、酸素、硫黄、リン、シリコン及びホウ素から選択されるメンバーを含む基である。反応性官能基を用いてグアニジン含有化合物を結合することが目的である。ヘテロ原子を保有する典型的な反応性基として、エポキシ、アクリラート、マレイミド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、アジド、シアン酸エステル、イソシアナート、ハロゲン化アリール、アルデヒド、アミン、オキシム、チオール、アルコール、酸、アジリジン、アゾ、イソチオシアナート、無水物、混合無水物、ラクトン、スルトン及びケトンが挙げられる。
【００１９】
炭化水素基は炭素と水素の双方を含有する基であるが、親水性を高めるためにヘテロ原子を含有してもよい。反応性官能基を用いてグアニジン含有化合物を結合することが目的である。炭化水素を保有する典型的な反応性基として、アリル、スチリル、ビニル及びアルキンが挙げられる。ヘテロ原子含有炭化水素基として、２−オキシスチリル、３−オキシスチリル又は４−オキシスチリル、アミノアリル、オキシアリル、オキシビニル、アミノビニルが挙げられる。
【００２０】
Ｘは、１個以上の形式負電荷を含む基である、アニオンである。メンバーは、塩化物イオン、チオシアン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、臭化物イオン、亜塩素酸イオン、塩素酸イオン、チオ硫酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、酢酸イオン、蟻酸イオン、リン酸水素イオン、二水素リン酸イオンからなる群から選択される。１種以上のアニオンを併用してもよく、形式電荷のレベル（二価、一価、三価）が異なるアニオンを組み合わせて使用してもよいと考えられる。アニオンの分子量は１０〜１００，０００まで様々であり得る。
【００２１】
用語「還元剤」は、別の化学種に電子を供給する化学種を意味する。さらに、様々な還元剤が当該技術分野において知られており、下記及び特許請求の範囲に例示のリストは、本開示の組成物及び方法に使用できる還元剤を限定するものではない。還元剤の例として、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、並びにこれらの関連した塩（例えば、ＴＣＥＰ塩酸塩）が挙げられる。さらに、これら又は他の還元剤を併用して本発明を実施してもよい。特定の実施形態では、還元剤はＴＣＥＰである。特定の実施形態では、ＴＣＥＰは、その塩酸塩であるＴＣＥＰ−ＨＣｌとして添加できる。
【００２２】
本明細書に使用される「緩衝液」として、例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）緩衝液、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、クエン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液及びリン酸緩衝液が挙げられる。可能な緩衝液の本リストは単に例示目的である。当業者であれば、本明細書に開示の組成物及び方法で使用するために選択された緩衝液のｐＨが適切であることを認識するであろう。緩衝液のｐＨは通常３〜８の範囲である。
【００２３】
上述するように、固体マトリックスに存在する組成物は必要に応じてＵＶ保護剤又はラジカル捕捉剤を含んでもよい。本発明のある態様では、ＵＶ保護剤又はラジカル捕捉剤は、核酸を抽出及び保存するための乾燥固体マトリックスに導入された組成物に必要とされる。特定のＵＶ保護剤に限定することなく、保護剤の例として、例えば、ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、トルヒドロキノン（ＴＨＱ）及びアスコルビン酸又はビタミンＣが挙げられる。ある態様では、ラジカル捕捉剤はＭＥＨＱ又はＴＨＱである。用語「ＵＶ保護剤」又は「ラジカル捕捉剤」は、さらなる分析のために未修飾状態の抽出核酸の保持に関して交換可能に本明細書に使用され得る。固体マトリックス中の組成物はまた、バナジルリボヌクレオシド錯体（ＶＲＣ）又は市販のＲＮアーゼ阻害剤（例えば、ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（商標））のいずれかのようなＲＮアーゼ阻害剤を含んでもよい。他のＲＮアーゼ阻害剤の例は、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３００：８１−８６に記載されており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００２４】
本明細書に記載の組成物を用いる方法がさらに提供される。一実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はその組み合わせ）を抽出し、保存する方法は、ａ）１種以上のタンパク質変性剤、１種以上の還元剤、生物学的緩衝液及び必要に応じてラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤を含む組成物が、乾燥形態の固体マトリックスに導入された固体マトリックスを提供する工程、ｂ）固体マトリックスに試料（例えば、生体試料）を適用し、核酸を抽出する工程、ｃ）固体マトリックスを乾燥する工程及びｄ）周囲条件下で乾燥状態の固体マトリックスで核酸を保存する工程を含む。方法のある態様では、固体マトリックスは、市販の９０３、３１−ＥＴＦ又はＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（商標）などの多孔質のセルロースベース紙である。本方法の性能により、周囲温度下で、乾燥形態（例えば、固体マトリックス上）の核酸、特にＲＮＡ（保存するには不安定な生体分子であることが広く知られている）の保存が可能となる。この方法で利用する試料として、ヒトなどの任意の生物から得られた血液、血清、組織、鼻の粘液及び唾液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
上述の方法は、必要に応じて、さらなる分析のために固体マトリックスから核酸を回収する工程を含んでもよい。例えば、核酸は、上記で定義したような、水溶液、緩衝溶液又は有機溶液で固体マトリックス（例えば、セルロース紙）を再水和することにより回収できる。あるいは、核酸は、電気溶出によって固体マトリックスから回収できる。当業者であれば、固体マトリックスから核酸を回収できる任意の方法を用いて開示の方法を実施し得ることを理解するであろう。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、試料から核酸を抽出し、保存する方法は、ａ）１種以上の金属チオシアン酸塩（１種以上のチオシアン酸塩は、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）ではない）、１種以上の還元剤、緩衝液及び必要に応じてラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤を含む組成物を固体マトリックスに導入し、固体マトリックスを乾燥する、乾燥固体マトリックスを提供する工程、ｂ）固体マトリックスに試料（例えば、生体試料）を適用し、核酸を抽出する工程、ｃ）固体マトリックスを乾燥する工程及びｄ）周囲条件下で乾燥状態の固体マトリックスで核酸を保存する工程を含む。本発明の別の実施形態は、ａ）１種以上のチオシアン酸塩、１種以上の還元剤、緩衝液及び必要に応じてラジカル捕捉剤又はＲＮアーゼ阻害剤を含む組成物（組成物はチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）を含有しない）を固体マトリックスに導入し、固体マトリックスを乾燥する、乾燥固体マトリックスを提供する工程、ｂ）固体マトリックスに試料（例えば、生体試料）を適用し、核酸を抽出する工程、ｃ）固体マトリックスを乾燥する工程及びｄ）周囲条件下で乾燥状態の固体マトリックスで核酸を保存する工程を含む、試料から核酸を抽出し、保存する方法である。ある態様では、金属チオシアン酸塩は、第１族又は第２族の金属カチオンを含み、金属チオシアン酸塩として、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸バリウム及びチオシアン酸亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
方法のある態様では、固体マトリックスは、市販の９０３、３１−ＥＴＦ又はＦＴＡ  Ｅｌｕｔｅ（商標）などの多孔質のセルロースベース紙である。本方法の性能により、周囲温度下で、乾燥形態（例えば、固体マトリックス上）の核酸、特にＲＮＡ（保存するには不安定な生体分子であることが広く知られている）の保存が可能となる。この方法で利用する試料として、ヒトなどの任意の生物から得られた血液、血清、組織、鼻の粘液及び唾液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
用語「核酸」は、あらゆる形態のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）、並びに組換ＲＮＡ分子及び組換ＤＮＡ分子又はヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡ若しくはＲＮＡのアナログを意味する。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。鎖にはコード鎖又は非コード鎖があり得る。天然のＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の核酸のフラグメントは、本発明に包含され、開示の組成物及び方法を用いて回収され得る。「フラグメント」は、核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）の一部を意味する。
【００２９】
下記の実施例は、例示として提供するものであり、限定を目的としていない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：一般的なＲＮＡ分析
培養したヒトリンパ球細胞株（すなわち、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を、全細胞ＲＮＡ源として利用した。細胞は、表示の試薬を含浸させた７ｍｍのセルロースディスク上で乾燥し、デシケーターキャビネットに室温で１０日間保存し、標準プロトコールに従って細胞核酸を電気溶出した。簡潔に言えば、２ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含むヌクレアーゼフリー水（１５μＬ）でディスクを再水和して余分なタンパク質を除去し、約３０分間乾燥した。パンチ片を、１％Ｔｒｉｓホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲルの各ウェルに入れ、ホルムアミド（Ａｍｂｉｏｎ）を含む１×Ｇｅｌ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩに懸濁させた。細胞核酸を１１０ボルトで１〜２時間電気泳動にかけ、ＲＮＡ及びＤＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で後染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。セルロースからの電気溶出中及びその後の細胞ＲＮＡの完全性を保存するために、全て装置及び表面をＲＮＡＺａｐ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｄｄｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び筋肉由来の精製ヒト全ＲＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）などの内標準をアガロースゲルに含有させて、ＲＮアーゼの混入を観察し、コントロールｒＲＮＡバンドを特定する。
【００３１】
電気泳動図は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてデジタルで定量化した。簡潔に言えば、各ゲルレーンの上から下に垂線を引き、Ｐｌｏｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅ機能を用いて線の距離（ｃｍ）の関数としてピクセル強度（濃淡値任意単位）をプロットした。ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ  ｒＲＮＡに対応するピークを特定し、２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡの比率の計算に用いた。
【００３２】
図１は、電気溶出を用いてセルロースから回収した核酸の代表的な電気泳動図を表す。高分子量ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ  ｒＲＮＡバンドを示す。
【００３３】
図１は、さらに、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いたＤＮＡ及びＲＮＡの定量化を提供する。パネルＡにおいて各レーンの上から下に垂線を引き、Ｐｌｏｔ  Ｐｒｏｆｉｌｅ機能を用いて線の距離（ｃｍ）の関数としてピクセル強度（濃淡値任意単位）をプロットした。ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ  ｒＲＮＡに対応するピークは「ボックスで囲む」。
【００３４】
実施例２：ＲＮＡの抽出及び保存に好適な条件の経験的判定
本実施例の主な目的は、セルロース紙でのＲＮＡの保存に対する各単一要素の効果及び試験要素（例えば、キレート剤、緩衝液、ｐＨ、タンパク質変性剤、還元剤及びペプチドＲＮアーゼ阻害剤）の組み合わせの効果を評価することであった。本実施例のさらなる態様は、タンパク質変性剤の効果を高める可能性のある還元剤（ＤＴＴ）の存在を評価することであった。
【００３５】
また、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、全細胞ＲＮＡ源として利用し、セルロース紙試料に細胞を直接適用し、風乾し、典型的なエンドユーザアプリケーションを模倣した。全細胞ＲＮＡは、実施例１で上述したプロトコールに従い、１％のアガロースゲルへの電気溶出により回収し、既知の基準に基づいて、２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡの量を分析した。図２のグラフの各棒の下に列挙した成分を含む試料を、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で１０日間保管した。
【００３６】
実施例２の結果を図２に示す。各棒の上の数字は１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率に対応する。１より大きい２８ｓ：１８ｓ比率は一般にインタクトなＲＮＡを示す。例えば、ＲＮアーゼを不活性化する還元剤（ＤＴＴ）又はＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎを含まない試料又はアルカリ性ｐＨを有する試料など、いくつかの組成物はｒＲＮＡを安定化できなかった。ＧＩＴＣ、ＤＴＴ及び中性緩衝液を含む試料は、他のあらゆる供試試薬の組み合わせより優れた性能を示した。
【００３７】
実施例３：ＲＮＡの抽出及び保存に好適な条件の継続的経験的判定
ＲＮＡを保存するための重要な成分を実施例２で特定した後、実施例３は、ＲＮＡ保存能力に対するＤＴＴ及びＳＤＳの単一の効果又は組み合わせの効果及び実施例２で好適なＲＮＡ安定性を示したＧＩＴＣ／ＤＴＴの組み合わせの性能に対するラジカル捕捉剤及びキレート剤の効果を研究するよう設計した。
【００３８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をセルロース紙試料に直接適用し、風乾し、典型的なエンドユーザアプリケーションを模倣した。全細胞ＲＮＡは、実施例１で上述したプロトコールに従い、１％のアガロースゲルへの電気溶出により回収し、既知の基準に基づいて、２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡの量を分析した。
【００３９】
セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で１３日間保管した。各棒の上の数字は１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率に対応する。１より大きい２８ｓ：１８ｓ比率は一般にインタクトなＲＮＡを示す。実施例３の結果を図３に示す。ＧＩＴＣ／ＤＴＴの組み合わせは一般にＳＤＳ／ＤＴＴ組み合わせより良好なＲＮＡ安定性を示した。キレート剤（ＥＤＴＡ）とのいずれかの組み合わせを添加すると、ＲＮＡの品質が比較的低くなった。
【００４０】
実施例４：ＲＮＡの抽出及び保存に好適な条件の継続的経験的判定
ＲＮＡを保存するための他の重要な成分を実施例３で特定した後、実施例４は、安定性に優れ、臭いの少ない代替の還元剤（ＴＣＥＰ）がＤＴＴの代わりに使用できるかどうかを調べるよう設計した。本実施例に導入した別の要素は、低分子のＲＮアーゼ阻害剤であるバナジルリボヌクレオシド錯体（ＶＲＣ）であった。これらの代用を、ｒＲＮＡを安定化する能力について比較し、評価した。
【００４１】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をセルロース紙試料に直接適用し、風乾し、典型的なエンドユーザアプリケーションを模倣した。全細胞ＲＮＡは、実施例１で上述したプロトコールに従い、１％のアガロースゲルへの電気溶出により回収し、既知の基準に基づいて、２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡの量を分析した。セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で１０日間保管した。各棒の上の数字は１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率に対応する。１より大きい２８ｓ：１８ｓ比率は一般にインタクトなＲＮＡを示す。実施例４の結果を図４に示す。ＴＣＥＰとＤＴＴは、複数の基材組成物中でＲＮＡを安定化するために交換可能に使用できる。
【００４２】
実施例５：セルロースでＲＮＡを保存するための選択組成物の長期性能
実施例５は、選択組成物を室温で３０日間保存した後の選択組成物の長期性能を評価するよう設計した。Ｊｕｒｋａｔ細胞をセルロース紙試料に直接適用し、風乾し、典型的なエンドユーザアプリケーションを模倣した。全細胞ＲＮＡは、実施例１で上述したプロトコールに従い、１％のアガロースゲルへの電気溶出により回収し、既知の基準に基づいて、２８ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡの量を分析した。セルロース試料は、分析前にデシケーターキャビネット内に室温で３０日間保管した。各棒の上の数字は１８ｓ  ｒＲＮＡに対する２８ｓ  ｒＲＮＡの比率に対応する。１より大きい２８ｓ：１８ｓ比率は一般にインタクトなＲＮＡを示す。実施例５の結果を図５に示す。
【００４３】
実施例６：乾燥血斑中のＲＮＡの安定性の分析
実施例６は、様々な緩衝液条件で新鮮な全血により選択ＲＮＡ安定化紙組成物（ＧＩＴＣ／ＴＣＥＰ／ＭＥＨＱ）の性能を評価するように設計した。約５０μＬのラット全血を被験体の尾静脈から採取し、表示の緩衝液成分で調製したＦＴＡ紙又はＲＮＡ安定化紙にスポットした。カードを乾燥し、周囲温度であるが、調整した湿度（相対湿度約２０％）で５〜２２日間保存した。ＲＮＡは、７ｍｍの中央パンチ片から溶解緩衝液に抽出し、当該技術分野において公知のプロトコールに従い、シリカ膜スピンカラムを通して精製した。精製及び溶出の後、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザでＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を測定した。従来、ＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロアレイの応用などの下流の定量分析には、ＲＩＮ＞５が好適であるが、ＲＩＮ＞６が最も好適である。実施例６の結果を図６に示す。全ての試験緩衝液組成物のうちこの選択紙組成物（ＧＩＴＣ／ＴＣＥＰ／ＭＥＨＱ）からの全体的なＲＮＡの品質がＦＴＡ紙の性能を超えていた。
【００４４】
実施例７：ＲＮＡ安定性に対するＵＶ保護の影響
実施例７は、選択乾燥マトリックス（ＧＩＴＣ／ＴＣＥＰ／Ｔｒｉｓ）に存在するＵＶ阻害剤及びラジカル捕捉剤によるｍＲＮＡ保護を調べるよう設計した。ＤＮＡフリー全Ｊｕｒｋａｔ  ＲＮＡ（１μｇ）を、表示の成分を含有するＲＮＡ安定化紙に二反復でスポットした。各カードを分割し、半分を３５℃で２０時間暗所で保存し、残りは、日光の全エネルギースペクトル（全エネルギー２１．７ｋＪ／ｍ2）を再現するためのＱ−ＳＵＮ  Ｘｅ−１Ｘｅｎｏｎ試験機で２０時間（３５℃、０．３Ｗ／ｃｍ2、３４０ｎｍ）処理した。各試料から１．２ｍｍのパンチ片を採取し、逆転写酵素反応に直接供し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その後、ｃＤＮＡライブラリーは、ｑＰＣＲにより、ＨＰＲＴ１及びクラスリンｍＲＮＡに特異的なプライマーに対するプローブとした。ＵＶに暴露した試料のサイクル閾値（ＣT）を、暗所で保存した未処理のメイトペアのＣTから差し引いた。実施例７の結果を図７に示す。ビタミンＣは、図ではアスコルビン酸の同義語として使用する。
【００４５】
実施例８：周囲条件下の紙での還元剤の安定性
Ｗｈａｔｍａｎ（商標）製の３１ＥＴＦセルロースベース紙を、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＧＩＴＣの存在下で、高濃度のＴＣＥＰ又はＤＴＴに浸した。セルロースベース紙は、湿度を調節せずに室温で保存した。５日目、１９日目及び１０５日目、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（「ＤＴＮＢ」）を各紙試料に置いた。活性還元剤の存在下で、黄色への急な変色が確認された。周囲条件下で保存してから１０５日目までは、あらゆる濃度のＴＣＥＰ溶液でコーティングされたセルロース紙はまだ活性があり、白から黄色まで紙の色の明らかな変化によって示されるようにＤＴＮＢを還元できた。ＤＴＴに浸した紙試料はＤＴＮＢを還元でなかったため、紙の色は白のままであった。これらの図は白黒では意味を成さないため、本明細書に含まれていないが、検査官の要請で提供可能である。ＤＴＮＢの還元に関する化学反応は、Ｃｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５１９５−１５２０３に提供されている。
【００４６】
実施例９：還元剤の劣化の定性分析
３１−ＥＴＦセルロース紙試料は、異なる濃度の還元剤ＴＣＥＰ又はＤＴＴと共に、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＧＩＴＣを含有していた。紙試料を、次の異なる条件下で保存した：１）２１℃、相対湿度１０％；２）２１℃、相対湿度８０％；及び３）４１℃、相対湿度１０％。
【００４７】
０日目、１日目、６日目及び２５日目、各条件下のセルロース紙の試料（１０ｍｇ）をＤＴＮＢ溶液に入れ、軽く振り、カラー画像を撮影した。１日目、各環境条件下のＴＣＥＰ試料は全て、ＤＴＮＢ溶液の色を黄色に変えることができ、還元剤としてまだ機能することを示した。一方、ＤＴＴは、２１℃かつ相対湿度１０％でさえ、ＤＴＮＢの存在下で試料を黄色にできなかった。２５日目、２１℃かつ相対湿度１０％で保存したＴＣＥＰ紙は機能的な還元活性を示し続けた。しかしながら、湿度又は温度のいずれかが増加すると、還元剤としてのＴＣＥＰの活性が著しく減少するため、温度及び湿度の双方が還元剤としてのＴＣＥＰ機能の関連因子であることが分かった。
【００４８】
実施例１０：セルロースベース紙に対するＴＣＥＰ活性の定性分析
異なる緩衝液（Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；ＭＥＳ、ｐＨ６．２；及びＭＯＰＳ、ｐＨ７．０）中のＧＩＴＣ及びＭＥＨＱをさらに含むＴＣＥＰ組成物及び緩衝液を含まないコントロール試料を調製した。その後、セルロースベース紙をそれぞれ別の上記溶液でコーティングし、エアブローによりオーブン内で５０℃で迅速に乾燥し、湿度を低く維持するためにアルミホイル袋に乾燥剤で密閉し、その後、４℃、室温又は４１℃で保存した。
【００４９】
図に示した週（０週、１週及び４週）に、ＤＴＮＢ比色アッセイを用いてＴＣＥＰ活性を分析し、アッセイでは、３．６ｍｍの紙パンチ片それぞれにＤＴＮＢを加え、３０分間撹拌し、その後、４１２ｎｍで液体の吸収度を測定した。
【００５０】
全ての試料は４℃で安定しており、１か月で活性が約１００％であった。室温で１か月後、ＴＣＥＰ活性は、利用した緩衝液によってばらつきが生じた（例えば、ＭＯＰＳ（１００％）＞緩衝液なし（９０％）＞ＭＥＳ（８６％）＞Ｔｒｉｓ（８１％））。４１℃で１か月後、さらにＴＣＥＰ活性のばらつきが確認された（例えば、ＭＯＰＳ（６７％）＞ＭＥＳ（６３％）＞Ｔｒｉｓ（４８％）＞緩衝液なし（３９％））。全体として、セルロースに対するＴＣＥＰの還元力は、試験環境条件下においてＭＯＰＳ緩衝液の存在下で最も高かった。
【００５１】
実施例１１：丈夫な基材の調製、周囲温度で乾燥保存及びＲＮＡ抽出及び分析の条件
培養ヒトリンパ球細胞株、より詳細には、Ｊｕｒｋａｔ細胞株を利用し、全細胞ＲＮＡの試料を得た。下記の表に示す試薬を所定濃度で含浸させた７ｍｍのセルロースディスクに細胞をスポットした。下記試薬を含有するディスクは、表１に列挙した量の試薬を含有する浸漬溶液のペトリ皿にＷｈａｔｍａｎ（商標）３１−ＥＴＦ紙を置くことにより、複数（ｉｎ2中約４枚）のセルロース紙（Ｗｈａｔｍａｎ（商標）３１−ＥＴＦ紙）を飽和させる「浸漬」プロトコールによって調製した。浸漬溶液は、浸漬溶液においてこれらの各試薬が所望の濃度となるように、表示のチオシアン酸塩（例えば、ＮａＳＣＮ、ＫＳＣＮ、ＮＨ4ＳＣＮ、Ｃａ（ＳＣＮ）2、Ｍｇ（ＳＣＮ）2、Ｂａ（ＳＣＮ）2、Ｃｏ（ＳＣＮ）2、Ｚｎ（ＳＣＮ）2又はＮａＣｌＯ4）ＭＯＰＳ、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ及びＭＥＨＱ又はＴＨＱに脱イオン水を加えることにより調製した。浸漬溶液をボルテックスで撹拌して固体試薬を完全に溶解し、各最終浸漬溶液のｐＨを当該技術分野において公知の方法に従って測定した。
【００５２】
【表１】
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セルロース紙を飽和させてから、余分な溶液をニップローラーで取り除き、Ｎ２気流下で紙を５０℃で乾燥した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（例えば、全細胞ＲＮＡ源）を、表１に記載の試薬の組み合わせを含む乾燥紙基材に適用した。上記表の試薬と共に、Ｊｕｒｋａｔ細胞由来の全細胞ＲＮＡを含むセルロース基材を乾燥し、相対湿度（ＲＨ）を約２０％に維持したデシケーターキャビネット内で、室温で７〜１７日間保管した。
【００５３】
細胞ＲＮＡを各セルロース試料から抽出し、標準プロトコールに従って測定した。簡潔に言えば、セルロース試料を４ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（１５μＬ）で再水和し、細胞ＲＮＡをセルロースマトリックスから溶解緩衝液に抽出し、当該技術分野において公知のプロトコールに従い、シリカ膜スピンカラムで精製した。精製及びヌクレアーゼフリー水への溶出後、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザでＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を測定した。従来、ＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロアレイの応用などの下流の定量分析には、ＲＩＮ＞５が好適であると考えられ、ＲＩＮ＞６が最も好適であると考えられる。
【００５４】
実施例１１の結果を図９に示す。周囲温度で細胞ＲＮＡを抽出し安定させるには、ＮａＳＣＮが直接ＧｕＳＣＮの代わりに使用できることが確認された。ＧｕＳＣＮの場合とは異なり、本現象は、セルロース紙（ｐＨ４又はｐＨ７）に含浸させるために使用する最終溶液のｐＨとは無関係である。ＧｕＳＣＮは中性のｐＨで弱塩基として働くグアニジンカチオンを含むため、ＧｕＳＣＮがｐＨ７でＲＮＡのアルカリ加水分解を誘発し得ることが想定される。高いＲＮＡ安定性は、金属カチオン又はアンモニウムカチオンを含む関連チオシアン酸塩にも確認されたが、核酸を抽出するために一般的に使用される過塩素酸塩では確認されなかった。これらの関連無機塩のうち、第１族又は第２族の金属カチオン（例えば、Ｎａ+、Ｋ+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｂａ2+）とのチオシアン酸塩は、ＲＮＡの安定化に最も有効であることが分かった（ＲＩＮ＞５）。当業者であれば、金属カチオン、特に二価カチオンが、ＲＮアーゼ酵素及び触媒ＲＮＡ（例えば、リボザイム）の刺激補助因子であることを理解するであろう。従って、Ｍｇ2+又はＣａ2+系のチオシアン酸塩のＲＮＡ保存への応用性は、当業者でさえ予想しなかったであろう。
【００５５】
実施例１２：乾燥血斑のＲＮＡ安定性の分析
実施例１２は、全血由来の全細胞ＲＮＡを安定化するために３種の異なる無機塩の性能を評価するように設計した。約５０μＬのラット全血を被験体の尾静脈から採取し、乾燥形態で還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）及び酸化防止剤（例えば、ＴＨＱ）と組み合わせて等モル濃度で表示の塩を含む化学的処理紙にスポットした。化学的に処理した乾燥セルロース紙を本質的に実施例１１に上述するように調製した。化学的に含浸したセルロース紙の血斑を乾燥し、相対湿度約２０％の調整湿度かつ周囲温度で１９日間保存した。７ｍｍの中央パンチ片から溶解緩衝液にＲＮＡを抽出し、当該技術分野において公知のプロトコールに従い、シリカ膜スピンカラムを通して精製した。精製及び溶出の後、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏ  ＬａｂＣｈｉｐを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザで、各試料のＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を測定した。また、ＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロアレイの応用などの下流の定量分析には、ＲＩＮ＞５が好適であると考えられ、ＲＩＮ＞６が最も好適であると考えられる。
【００５６】
実施例１２の結果を図１０に示す。実施例１１におけるセルロース紙基材に含浸させた表示のチオシアン酸塩は、周囲温度でラット血液からのＲＮＡを抽出し安定させるのに本質的に同等の効果を示した。これらの結果に基づいて、当業者であれば、開示の方法の実施にはいずれの関連チオシアン酸塩も使用できることを理解するであろう。
【００５７】
全ての刊行物、特許公報及び特許は、各個別の刊行物又は特許が具体的かつ個別に参照により導入されることが示されるのと同様に、本明細書に参照により導入される。単数形で記載したものであっても、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数のものを含むものとする。明細書及び特許請求の範囲を通じて、本明細書に使用される概略を表す言葉（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ）は、関連する基本的な機能を変えることなく許容範囲内で変化できる任意の量的表現を修飾するために適用され得る。従って、「約」などの用語により修飾される値は、特定の厳密な値に限定されるものではない。場合によっては、概略を表す言葉は、値を測定する機器の精度に相当することがある。必要に応じて範囲が与えられ、それらの範囲は間の部分範囲を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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