(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液又は血漿のサンプルの凝固を測定するための試験マイクロチップであって、
前記血液又は血漿のサンプルのための入口であって、前記入口は、数十ミクロンから数ミリメートルの長さを有する１つ以上のマイクロチャネルと連通し、各マイクロチャネルは１つ以上の試験チャンバーを有し、各マイクロチャネルは数ナノリットルから数ミリリットルの規定された容積を有する、入口と、
前記１つ以上のマイクロチャネルであって、各マイクロチャネルが、陰イオンにより帯電した少なくとも１つの表面を含み、前記表面は、前記血液又は血漿のサンプルが前記１つ以上のマイクロチャネル又は試験チャンバーに入るときに前記血液又は血漿のサンプルの凝固を活性化させ、前記陰イオンにより帯電した表面は凝固を引き起こす化学薬品を含まない、マイクロチャネルと、
を備え、
前記試験チャンバーは、前記試験チャンバーの中の測定される前記血液又は血漿のインピーダンス、又は光学特性を変化させる材質から形成され、
前記試験マイクロチップはリーダーに挿入可能であり、
前記リーダーは、
凝固時間を測定するための、前記試験チャンバーの中の前記血液又は血漿のサンプルの、インピーダンス、又は光学特性の変化を測定する検出器と、
前記試験チャンバーの温度を調節する温度制御器と、
を備え、
前記検出器は、前記血液又は血漿のサンプルの活性化の時間から、凝固を示す、前記試験チャンバーの中のインピーダンス、又は光学特性の変化の時間までで決定される測定された凝固時間を出力するように構成されている、
試験マイクロチップ。
【請求項２】
前記試験マイクロチップは、凝固を計測するための単一のマイクロチャネルを備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項３】
前記試験マイクロチップは、シリコンウエハーの異方性ウェットエッチング、及びこれに続く熱酸化、透明な低熱膨張ホウケイ酸ガラスウエハーの異方性ウェットエッチング、ステンシルによるウエハーへの金属薄膜のスパッター堆積、シリコン及び透明な低熱膨張ホウケイ酸ガラスウエハー又はゲルマニウム若しくはガリウムウエハーの陽極接合、そしてこれに続くウエハーの方形切断による単一チップの分割によって製造される、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項４】
前記リーダーの前記検出器は、前記試験マイクロチップの前記試験チャンバーの中での光学的変化を測定するためにＩＲ−ＬＥＤ、及びフォトダイオードを備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項５】
前記試験マイクロチップは、電極又はパターン化金属シート又は膜を備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項６】
抵抗、容量、又はインピーダンスを直接測定するのに用いられる電極を備える、請求項５に記載の試験マイクロチップ。
【請求項７】
前記マイクロチップは、抵抗加熱要素に製造されている、金属パターンを施されたドープ半導体基板を備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項８】
個人からの血液又は血漿のサンプルの中の凝固を測定するマイクロアッセイ装置であって、装置は試験マイクロチップを備え、
前記試験マイクロチップは、
前記血液又は血漿のサンプルのための入口であって、前記入口は、数十ミクロンから数ミリメートルの長さを有する１つ以上のマイクロチャネルと連通し、各マイクロチャネルは１つ以上の試験チャンバーを有し、各マイクロチャネルは数ナノリットルから数ミリリットルの規定された容積を有する、入口と、
前記１つ以上のマイクロチャネルであって、各マイクロチャネルが、陰イオンに帯電した少なくとも１つの表面を含み、前記表面は、前記血液又は血漿のサンプルが前記１つ以上のマイクロチャネル又は試験チャンバーへ入るときに前記血液又は血漿のサンプルの凝固を活性化させ、前記陰イオンに帯電した表面は凝固を引き起こす化学薬品を含まない、マイクロチャネルと、
前記試験チャンバーの中の前記血液又は血漿のインピーダンス、又は光学特性を変化させる材料から形成された前記試験チャンバーと、
を備え、
前記試験マイクロチップはリーダーに挿入され、
前記リーダーは、
凝固時間を測定するための、前記試験チャンバーの中の前記血液又は血漿のサンプルのインピーダンス、又は光学特性の変化を測定する検出器と、
前記試験チャンバーの温度を調節する温度制御器と、
を備え、
前記検出器は、前記サンプルの活性化の時間から、凝固を示す、前記試験チャンバーの中のインピーダンス、又は光学特性の変化の時間までで決定される測定された凝固時間を出力するように構成されている、
マイクロアッセイ装置。
【請求項９】
前記リーダーからの前記出力が、モニター、ディスプレイ、又は情報記憶装置と通信する、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
試験マイクロチップ及びリーダーを用いて凝固時間を測定するための方法であって、
前記試験マイクロチップは、
血液又は血漿の入口であって、前記入口は、数十ミクロンから数ミリメートルの長さを有する１つ以上のマイクロチャネルと連通し、各マイクロチャネルは１つ以上の試験チャンバーを有し、各マイクロチャネルは数ナノリットルから数ミリメートルの規定された容積を有する、入口と、
前記１つ以上のマイクロチャネルであって、各マイクロチャネルが、陰イオンに帯電した少なくとも１つの表面を含み、前記表面は、前記血液又は血漿のサンプルが前記１つ以上のマイクロチャネル又は試験チャンバーに入ると前記血液又は血漿のサンプルの凝固を活性化させ、前記陰イオンに帯電した表面は凝固を引き起こす化学薬品を含まない、マイクロチャネルと、
を備え、
前記試験チャンバーは、前記試験チャンバーの中で測定される前記血液又は血漿のサンプルのインピーダンス、又は光学特性を変化させる材料から形成され、
前記リーダーは、
凝固時間を測定するための、前記試験チャンバーの中の前記血液又は血漿のサンプルのインピーダンス、又は光学特性の変化を測定する検出器と、
前記試験チャンバーの温度を調節する温度制御器と、
を備え、
前記検出器は、前記血液又は血漿のサンプルの活性化の時間から、凝固を示す、前記試験チャンバーの中のインピーダンス、又は光学特性の前記変化の時間までで決定される測定された凝固時間を出力するように構成され、
血液又は血漿のサンプルにおける凝固を測定するリーダーに挿入された前記試験マイクロチップに血液又は血漿のサンプルを導入するステップと、
前記検出器が前記試験チャンバーの中の前記血液又は血漿のサンプルのインピーダンス、又は光学特性の変化を測定するステップと、
前記検出器が、凝固時間を出力するステップと、
を備える、方法。
【請求項１１】
前記凝固時間を記録するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、血液が抗凝固処理された個人から得られる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗凝固剤の種類が未知である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
血液が、血液に影響を与える抗凝固剤で抗凝固処理されているため、凝血時間を、活性化部分トロンポプラスチン時間（ａＰＰＴ）で測定することができない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルを通過する伝達はピーク凝固時間までの時間を測定することにより測定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定は１１５０ｎｍと１７００ｎｍの間の波長の光を用いて行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記測定は１３００ｎｍの波長の光を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記温度制御は、凝固時間の計測のために、前記サンプルを体温に加熱する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記帯電した表面は、ガラス又は酸化シリカである、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項２０】
抵抗加熱構造を備える請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項２１】
前記試験チャンバーの各々の容積は、１マイクロリットルと１０マイクロリットルの間である、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項２２】
複数のマイクロチャネルと試験チャンバーを備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項２３】
インピーダンス、抵抗、又はキャパシタンスの測定のための電極を備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項２４】
前記試験マイクロチップは使い捨てである、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項２５】
前記リーダーは、前記挿入された試験マイクロチップの中の前記試験チャンバーの温度を制御する一体化されたヒーターを備える、請求項８に記載のマイクロアッセイ装置。
【請求項２６】
試験マイクロチップとの電気的、光学的、又は流体的なインターフェイスを備える、請求項８に記載のマイクロアッセイ装置。
【請求項２７】
前記挿入された試験マイクロチップの前記試験チャンバーの中の光学特性の変化を検出するように配置された赤外光源及び赤外検出器を備える、請求項８に記載のマイクロアッセイ装置。
【請求項２８】
凝固はリーダーによって、抵抗の変化によって前記試験マイクロチップの前記試験チャンバーを通る変化から測定される、請求項８に記載のマイクロアッセイ装置。
【請求項２９】
凝固はリーダーによって、音響トランスデューサーを用いて測定される、請求項８に記載のマイクロアッセイ装置。
【請求項３０】
温度制御要素をさらに備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項３１】
外部のリーダー又はモニターに対して、インピーダンス、又は光学特性の変化結果を伝達する電気的手段をさらに備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項３２】
リーダー部間に挿入され又は挟まれた、パターン化金属シート又は膜の一体化によって実現される電極及び導線を備える、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【請求項３３】
半導体材料をさらに備え、前記半導体材料は電極として働き、検体の抵抗、容量、インピーダンスなどの電気的特性を直接的に測定するのに用いることが可能である、請求項１に記載の試験マイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、２０１４年９月９日出願の米国仮特許出願第６２／０４８，１８３号の利益を請求し、その優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、通常の健康な患者、凝固障害患者、抗凝固療法患者、及び抗凝固回復患者の全体的な凝固の状態を測定するために使用することができるポイントオブケア・マイクロ流体チップベースの一般的な凝固アッセイの装置及びリーダーに関する。
【背景技術】
【０００３】
凝固（凝血）は、血液が液体からゲルに変化するプロセスである。凝固により、場合によっては止血が起こり、損傷した血管からの血液の流出が停止し、続いて修復される。凝固の機序は、血小板の活性化、付着、及び凝集と共にフィブリノゲンのフィブリンへの変換を伴い、フィブリノゲンは、堆積されて強力なネットワークに成長する。凝固の障害は、出血又は閉塞性凝血（血栓形成）をもたらし得る病状である。
【０００４】
凝固は、血管の傷害がその血管の内壁の内皮を損傷するとすぐに始まる。内皮の下の空間への血液の曝露により、２種類のプロセス：血小板の変化、及び内皮下組織因子の血漿因子ＶＩＩへの曝露が始まり、この曝露により、最終的にフィブリンが形成される。血小板は、傷害部位に血栓を即座に形成し；これは一次止血と呼ばれる。同時に二次止血が起こり：因子ＶＩＩの次のさらなる凝固因子又は凝血因子が、複雑なカスケードに応答してフィブリン鎖を形成し、このフィブリン鎖が血小板血栓を強化する。
【０００５】
二次止血の凝固カスケードは、フィブリンの形成をもたらす２つの経路を有する。これらは、接触活性化経路（内因性経路とも呼ばれる）及び組織因子経路（外因性経路とも呼ばれる）である。凝固カスケードは、つなげられて共通の経路を形成する、等しく重要な２つの経路からなると以前から考えられていた。現在は、血液凝固の開始のための一次経路は、組織因子経路であることが分かっている。経路は一連の反応であり、これらの反応では、セリンプロテアーゼのチモーゲン（不活性酵素前駆体）及びその糖タンパク質補助因子が活性化されて活性成分となり、そしてこれらの活性成分が、カスケードにおける次の反応を触媒し、最終的に架橋結合フィブリンが生成される。凝固因子は、一般的にはローマ数字で示され、活性型を示すために小文字の「ａ」が付け加えられる。
【０００６】
凝固因子は、一般的には、下流のタンパク質の切断によって機能するセリンプロテアーゼである。いくつか例外も存在する。例えば、ＦＶＩＩＩ及びＦＶは、糖タンパク質であり、因子ＸＩＩＩはトランスグルタミナーゼである。凝固因子は、不活性チモーゲンとして循環する。凝固カスケードは、従来３つの経路に分類される。組織因子及び接触活性化経路は共に、因子Ｘ、トロンビン、及びフィブリンの「最終的な共通経路」を活性化する。
【０００７】
組織因子経路（外因性）
組織因子経路の主な役割は、「トロンビンバースト」を生じさせることであり、このトロンビンバーストは、フィードバック活性化の役割の点で凝固カスケードの最も重要な構成要素であるトロンビンが急激に放出されるプロセスである。ＦＶＩＩａは、その他の活性化凝固因子よりも多い量で循環する。このプロセスは、以下のステップを含む。
【０００８】
血管が損傷すると、ＦＶＩＩが、循環を離れて、組織因子保持細胞（間質線維芽細胞及び白血球）で発現される組織因子（ＴＦ）に接触し、活性化複合体（ＴＦ−ＦＶＩＩａ）を形成する。
【０００９】
ＴＦ−ＦＶＩＩａは、ＦＩＸ及びＦＸを活性化する。
【００１０】
ＦＶＩＩは、それ自体が、トロンビン、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ、及びＦＸａによって活性化される。
【００１１】
ＴＦ−ＦＶＩＩａによる（ＦＸａを形成する）ＦＸの活性化は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）によってほぼ即座に阻害される。
【００１２】
ＦＸａ及びその補助因子ＦＶａは、プロトロンビナーゼ複合体を形成し、この複合体は、プロトロンビンを活性化してトロンビンにする。
【００１３】
次いで、トロンビンは、ＦＶ及びＦＶＩＩＩ（ＦＸＩを活性化し、そしてこのＦＸＩがＦＩＸを活性化する）を含む凝固カスケードの他の構成要素を活性化し、そしてｖＷＦに結合したＦＶＩＩＩを活性化して、このＦＶＩＩＩを遊離させる。
【００１４】
ＦＶＩＩＩａは、ＦＩＸａの補助因子であり、この補助因子と共に「ｔｅｎａｓｅ」複合体を形成し、このｔｅｎａｓｅ複合体がＦＸを活性化し；従ってサイクルが続く（「ｔｅｎａｓｅ」は、「ｔｅｎ」と酵素に使用される接尾辞「−ａｓｅ」の縮約形である）。
【００１５】
接触活性化経路（内因性）
接触活性化経路は、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン、及びＦＸＩＩ（ハーゲマン因子）によるコラーゲン上の一次複合体の形成で始まる。プレカリクレインは、カリクレインに変換され、そしてＦＸＩＩはＦＸＩＩａになる。ＦＸＩＩａは、ＦＸＩをＦＸＩａに変換する。因子ＸＩａは、ＦＩＸを活性化し、このＦＩＸは、その補助因子ＦＶＩＩＩａと共に、ｔｅｎａｓｅ複合体を形成し、この複合体はＦＸを活性化してＦＸａにする。血栓形成の開始時に接触活性化経路が有する小さな役割は、ＦＸＩＩ、ＨＭＷＫ、及びプレカリクレインが重度に欠損した患者が出血障害を有していないという事実によって説明することができる。むしろ、接触活性化システムは、より炎症に関与しているようである。
【００１６】
凝固アッセイ
血栓ベース試験、発色若しくは色アッセイ、直接化学測定、及びＥＬＩＳＡを含むいくつかの技術が凝固試験に使用される。これらの技術のうち、血栓ベース及び発色アッセイが最もよく使用される。凝血アッセイは、凝固機能の全体的な評価を提供するが、発色試験は、特定の因子のレベル又は機能を測定するように設計されている。
【００１７】
血栓ベースアッセイは、多くの場合、出血異常の疑いのある患者の評価に使用され、抗凝固療法を監視する。これらの試験の殆どは、クエン酸血漿を使用し、このクエン酸血漿は、調製に数十分を必要とし、典型的には、病院で結果を受け取るまでに数時間から数日かかる。殆どの凝血アッセイの終点は、フィブリン血栓の形成である。
【００１８】
プロトロンビン時間（ＰＴ）は、組織因子（組換え起源であるか、又は脳、肺、若しくは胎盤の抽出物に由来し得る）を含むトロンボプラスチン試薬及びカルシウムを血漿に添加し、そして凝血時間を測定することによって行われる。ＰＴは、試薬及び凝固計によって異なるが、典型的には、１０〜１４秒の範囲である。ＰＴは、因子ＶＩＩ、Ｘ、及びＶ、プロトロンビン、又はフィブリノゲンの欠乏、並びにこれらの因子に対する抗体によって長くなる。この試験はまた、高用量のヘパリンを含むフィブリノゲンからフィブリンへの反応の阻害剤及びフィブリン分解産物の存在で、患者で異常となる。典型的には、ＰＴ試薬は、過剰なリン脂質を含むため、非特異的阻害剤（即ち、ループス性抗凝固因子）が陰イオンリン脂質と反応し、凝血時間を延ばさない。ＰＴは、ワルファリン療法を監視するために最も頻繁に使用されている。ＰＴ測定値は、装置間又はセンター間で比較困難であり、殆どのワルファリン療法を行う診療所は、診療所自体で正常な患者の範囲を確立し、このような正常な患者の範囲は、他で利用できるものではなく、使用される特定のアッセイに存在するその試薬に極めて特異的である。
【００１９】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイは、まず、表面活性剤（例えば、カオリン、セライト、エラグ酸、又はシリカ）及び希釈リン脂質（例えば、セファリン）をクエン酸血漿に添加することによって行われる。ポイントオブケアでは、ａＰＴＴは、典型的には同様の化学活性剤を用いて全血で測定することもできる。このアッセイにおけるリン脂質は、組織因子が存在しないため、部分トロンボプラスチンと呼ばれる。接触因子（因子ＸＩＩ、因子ＸＩ、プレカリクレイン、及び高分子量キニノーゲン）の最適活性化を可能にするためのインキュベーション後、カルシウムを添加し、そして凝血時間を測定する。ａＰＴＴ測定値は、装置間又は病院間で比較困難であり、殆どの臨床検査室は、臨床検査室自体で正常な患者の範囲を確立し、このような正常な患者の範囲は、他で利用できるものではなく、使用される特定のアッセイに存在するその試薬に極めて特異的である。
【００２０】
凝血時間は、使用される試薬及び凝固計によって異なるが、ａＰＴＴは、典型的には２２〜４０秒の範囲である。ａＰＴＴは、接触因子；因子ＩＸ、ＶＩＩＩ、Ｘ、又はＶ；プロトロンビン；又はフィブリノゲンの欠乏で長くなることがある。特定の因子阻害剤及び非特異的阻害剤も、ａＰＴＴを長くすることがある。フィブリン分解産物及び抗凝固剤（例えば、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤、又はワルファリン）もａＰＴＴを長くするが、ａＰＴＴは、ＰＴよりもワルファリンに対して感度が低い。
【００２１】
トロンビン凝血時間（ＴＣＴ）は、過剰なトロンビンを血漿に添加することによって行われる。ＴＣＴは、フィブリノゲンのレベルが低い又は異常フィブリノゲン血症の患者、及びフィブリン分解産物レベルが上昇した患者で長くなる。これらの異常は、播種性血管内凝固症候群でよく見られる。ＴＣＴはまた、ヘパリン及び直接トロンビン阻害剤によっても長くなる。
【００２２】
活性化凝血時間（ＡＣＴ）は、高用量ヘパリン療法又はビバリルジンでの治療を監視するために使用されるポイントオブケアの全血凝血試験である。これらの設定に必要なヘパリン又はビバリルジンの用量は、ａＰＴＴで測定できる範囲を超えている。典型的には、全血は、凝固活性剤（例えば、セライト、カオリン、又はガラス粒子）及び磁気撹拌バーを含む管又はカートリッジに収集され、血液が凝固するのにかかった時間が測定される。ＡＣＴの基準値は、７０〜１８０秒の範囲である。抗凝固の望ましい範囲は、使用される指示及び試験方法によって決まる。ＡＣＴは、他の凝固試験との相関性が低い。
【００２３】
エカリン凝血時間（ＥＣＴ）では、カーペットバイパー（Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ）からの毒液を使用して、プロトロンビンをメイゾトロンビン、即ち直接トロンビン阻害剤による阻害の影響を受けるプロトロンビン中間体に変換する。ＥＣＴは、凝固障害の状態を検出するためには使用することができず、治療薬の監視にのみ有用である。このアッセイは、立体障害が、ヘパリン−抗トロンビン複合体がメイゾトロンビンを阻害するのを防止するため、ヘパリンによる影響を受けない。エカリンはまた、ワルファリン処置患者の血漿中に見られる非カルボキシル化プロトロンビンを活性化するため、直接トロンビン阻害剤のレベルを、同時のワルファリン処置でもアッセイすることができる。ＥＣＴは、前臨床研究に使用されているが、この試験は、まだ標準化されておらず、広く使用されていない。
【００２４】
抗因子Ｘａアッセイを使用して、ヘパリン及び低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）のレベルを測定する。これらは、発色団が結合された因子Ｘａ基質を使用する発色アッセイである。因子Ｘａは、発色基質を切断し、分光光度計で検出することができる着色化合物を放出し、この着色化合物は、存在する因子Ｘａの量に正比例する。既知の量の因子Ｘａが、ヘパリン（又はＬＭＷＨ）を含む血漿に添加されると、ヘパリンが、抗トロンビンによる因子Ｘａの阻害を促進し、基質の切断に利用可能な因子Ｘａが減少する。この結果を、既知の量のヘパリンで形成される標準曲線に関連付けることにより、本発明者らは、血漿中のヘパリンの濃度を計算することができる。抗Ｘａアッセイの使用には、適切な較正器を使用するために患者がどの抗凝固剤を摂取するべきか、及び抗ＩＩａ抗凝固療法を監視するためのどの抗凝固剤を使用できないかの知識が必要である。
【００２５】
臨床用の抗凝固薬としては、ワルファリン、ヘパリン（非分画ヘパリン及びＬＭＷＨ）、及び直接トロンビン阻害剤（ビバリルジン、ヒルジン、及びアルガトロバン）が挙げられる。
【００２６】
ワルファリンは、静脈血栓塞栓症の一次及び二次予防に；心房細動又は人工心臓弁の患者の心原性塞栓事象の予防に；脳卒中、再発性梗塞、又は急性心筋梗塞患者の心血管系死の予防に；及び高リスク男性の急性心筋梗塞の一次予防に有効である。代謝における遺伝的変異並びに環境因子、例えば、投薬、食事、及び併発疾患を反映する、ワルファリンに対する抗凝固反応における変動性のため、治療範囲内の国際標準比（ＩＮＲ）を維持するために定期的な凝固の監視及び用量の調整が必要である。ヘパリンは、抗トロンビンを活性化すると共に、トロンビン及び因子Ｘａを不活性化するその能力を促進する間接的な抗凝固剤である。トロンビン阻害を触媒するために、ヘパリンは、高親和性五糖配列を介して抗トロンビンに結合し、かつトロンビンにも結合する。対照的に、因子Ｘａ阻害を促進するためには、ヘパリンは、その五糖配列を介して抗トロンビンに結合するだけでよい。１８未満のサッカリド単位を含むヘパリン分子はトロンビンと抗トロンビンの両方に結合するには短すぎ、従って、トロンビン阻害を触媒することができない。しかしながら、これらの短いヘパリン断片は、五糖配列を含む場合は、因子Ｘａ阻害を触媒することができる。ヘパリンに対する抗凝固反応は、内皮細胞、単球、及び血漿タンパク質への変動非特異的結合のために予測不可能である。この変動抗凝固剤反応のために、凝固の監視は、ヘパリンが予防量を超えて投与される場合は日常的に行われる。ａＰＴＴは、ヘパリンを監視するために最もよく使用される試験である。残念なことに、ａＰＴＴ試薬は、ヘパリンに対するその反応性が様々であり、そしてａＰＴＴの治療範囲は、試薬の感度及び試験に使用される凝固計によって異なる。ａＰＴＴは、ＰＴよりも標準化することが困難であることが立証され、対照値の１．５〜２．５倍の一般的に引用される治療範囲は、多くの場合、治療量以下のヘパリン用量の系統的投与となる。有効性及び安全性（出血に対する）を予測するａＰＴＴ治療範囲の概念を支持する証拠はやや希薄である。約２５％の患者が、治療ａＰＴＴを得るために３５０００Ｕ／ｄを超えるヘパリンの用量を必要とし、これは、ヘパリン耐性と呼ばれる。これらの患者の殆どは、抗Ｘａアッセイで測定されたときに治療ヘパリンレベルを有し、２つの試験間の相違は、ａＰＴＴを短くする、高濃度の凝固促進剤、例えば、フィブリノゲン及び因子ＶＩＩＩの結果である。ａＰＴＴ反応は、治療範囲内のヘパリンレベルでは線形であるが、ａＰＴＴは、より高いヘパリン用量では測定不可能となる。従って、経皮冠動脈インターベンション又は大動脈冠動脈バイパス手術を受けている患者では、抗凝固のレベルの監視のために、全体的な抗凝固の感度の低い試験、例えば、ＡＣＴが使用される。
【００２７】
ＬＭＷＨは、化学的又は酵素的解重合によって非分画ヘパリンから得られる。ＬＭＷＨは、殆どの病状で徐々にヘパリンに取って代わる。ＬＭＷＨは、典型的には、予防目的で与えられる場合は固定用量で投与される、又は治療のために与えられる場合は体重に合わせた用量で投与される。抗因子ＸａレベルによってＬＭＷＨの監視における潜在的な危険には、市販の抗Ｘａ発色アッセイ間での不十分な比較可能性、様々なＬＭＷＨ製剤間での抗Ｘａの抗ＩＩａに対する比率のばらつき、及び投薬に関する血液サンプリングのタイミングの重要性が含まれる。ａＰＴＴは、高用量のＬＭＷＨで延び得るが、このアッセイは、監視のためには使用されない。これまでの臨床的に利用可能なポイントオブケア・アッセイは、ＬＭＷＨが投与された何百万もの患者の監視には一切利用できない。
【００２８】
直接トロンビン阻害剤は、トロンビンに直接結合して、トロンビンとその基質との相互作用を阻害する。３つの非経口直接トロンビン阻害剤は、北米では限定された病状に対して認可されている。ヒルジン及びアルガトロバンは、ヘパリン起因性血小板減少症の患者の治療に認可されているが、ビバリルジンは、経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）を受けた患者におけるヘパリンの代用品として認可されている。ヒルジン及びアルガトロバンは、日常的な監視を必要とする。ＴＣＴは、この目的のために使用される少量のヒルジン及びアルガトロバンでは感度が高過ぎる。ＡＣＴは、インターベンションの設定で必要な高用量の直接トロンビン阻害剤を監視するために使用されているが、高濃度では最適な線形応答を提供しない。ａＰＴＴは、治療の監視に推奨されるが；それぞれの直接トロンビン阻害剤は、それ自体の用量反応を有し、薬物レベルに対する試験の感度は、ａＰＴＴ試薬間で異なる。ヒルジン療法が、ａＰＴＴで監視される場合、用量は、対照の１．５〜２．５倍のａＰＴＴが維持されるように調整されるが、アルガトロバンでは、標的ａＰＴＴは、対照の１．５〜３倍である（しかしながら、１００秒を超えない）。ａＰＴＴは、この試験が薬物濃度の上昇で反応が低下するため、心肺バイパス手術において高用量の直接トロンビン阻害剤を必要とする患者では有用性が低いようである。ＥＣＴは、低濃度及び高濃度の両方の直接トロンビン阻害剤で有用であるようであり、ａＰＴＴほど妨害物質による影響を受けない。しかしながら、上記のように、ＥＣＴは、日常的に利用可能ではない。ＩＮＲの様々な薬物濃度に対する反応性は、アッセイ試薬及び直接トロンビン阻害剤の種類によって異なる。この特性が、ヘパリン起因性血小板減少症患者のアルガトロバンからビタミンＫ拮抗薬への移行を困難にする。
【００２９】
前述から明らかなように、凝血及び凝血の阻害は、複雑なプロセスである。抗凝固剤の種類は、誤った凝血アッセイを用いて決定すると、誤解を与え、危険な結果を招く恐れがある。これは、抗凝固療法を受けた患者が、その患者が摂取している薬剤及び治療されている状態についての情報なしで緊急治療室に運び込まれたときに、悲惨な状況をもたらす可能性がある。時には、持続的な出血を引き起こしている抗凝固剤又は障害を決定するためのさらなる診断を待つことが不可能である。凝血用の迅速かつ正確な一般的な試験、特にポイントオブケア（「ＰＯＣ」）試験の必要性は周知であるが；選択肢は、極めて限定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
従って、本発明の目的は、凝血用の迅速かつ正確な一般的な試験を提供することにある。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、凝血用のポイントオブケア試験を提供することにある。
【００３２】
本発明のなおさらなる目的は、正確、再現可能、操作が容易、そして極少量のサンプルしか必要としない試験を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
マイクロ流体チップベースのアッセイ装置が、分析物（特に、全血又は全血誘導体）の物理特性を測定するために開発された。この技術を利用して、全血又は全血誘導体の凝血時間を測定する、凝血／凝固の反応速度論に対する抗凝固薬の影響を決定する、及び抗凝固拮抗剤の影響を評価することができる。これらの技術をさらに使用して、抗凝固薬及び／又はそれらの拮抗剤の用量を最適化することができる。このアッセイは、抗凝固剤の存在に依存しない。なぜなら、凝血が、装置内の血液サンプルのガラス（又は他の負に帯電した材料、例えば、酸化ケイ素）表面への曝露によって活性化され、これにより、内因性の経路が活性化され、活性化材料表面全体にせん断流を当てることによってさらに加速することができるからである。化学活性剤の非存在及び高度に制御された再現性のある微小環境により、ポイントオブケアの一般的凝血アッセイが得られる。
【００３４】
サンプルは、マイクロ流体システム内で取り扱われる。試験チャンバーに導入されるサンプルの量は、ナノリットル、マイクロリットル、又はミリリットル範囲（最も好ましくは１〜１０マイクロリットル）である。サンプルは、血液サンプル又は個人から（例えば、指腹での採血から）直接収集ウェルに導入される。一実施形態では、サンプル、例えば、血液又は血漿が採取され、シリンジによって無添加の頂部が赤色の管又は毛細管に収集された直後に加熱されたマイクロ装置に移される。好ましくは２連でのサンプル中での凝血が、血液又は血漿の装置内のガラス表面への曝露によって開始され、このサンプルが、凝血の分析用の手段に曝露される。次いで、血液サンプルは、収集ウェルから毛管作用により受動的に又はポンプで試験チャンバーに引き込まれ、これにより、せん断が生じ、血液サンプルが活性化材料表面に曝露されると共に、形状的に制御された量の血液サンプルが試験チャンバー内に送達される。マイクロ流体システムは、一体化電極、ヒーター構造、又はセンサー若しくはアクチュエーターの他の部分と一緒に、使い捨てとなるように設計されている。マイクロ流体システムは、分析器具の一部である再利用可能な分析ハウジング（本明細書では「リーダー」と呼ばれる）内に導入され、このハウジングが、マイクロ流体システムを接続し、かつ凝血の測定のため、並びに測定の時間及び特徴の外部リーダー、モニター、又はレコーダーへの送信のための流体界面、電気的界面、光学的界面、及び熱界面を提供する。
【００３５】
凝血は、粘度、光透過率、電気インピーダンス、及び／又は圧力の変化によって評価される。好ましい実施形態では、凝血は、一体化電極による血液インピーダンスの測定、及び／又は赤外線（ＩＲ）ＬＥＤ及びフォトダイオードを用いる光透過率の測定のそれぞれによって検出される。一体化熱抵抗ヒーター／クーラー構造、例えば、固体ヒートポンプ又はＰｅｌｔｉｅｒクーラーは、血液サンプルを規定温度、最も好ましくは約３７℃（体温）に維持し、測定の再現性及び適合性を保障する。フィブリノゲンはフィブリンに変換すると、ＩＲ吸光度が、測定可能な様式でピークに達するまで増加する。全血の凝血時間の決定は、ＩＲ吸光度のピーク又はほぼピークで行われる。測定の完了後、血液サンプルを含むマイクロ流体チップは、リーダーから取り外されて廃棄される。
【００３６】
凝血の発生は、電気インピーダンスを測定することによって監視することができる。フィブリンの発生は、電気インピーダンスが測定可能な様式でピークに達するまで電気インピーダンスを増加させる。電気インピーダンスのピーク又はほぼピークで、全血凝血時間の決定が行われる。全血凝血時間は、比較の基準として単独又は同時に測定されるＩＲ吸光度及び電気インピーダンスによって測定することができる。電気インピーダンス及びＩＲ吸光度曲線は、本質的に一致し、独立した測定方式による承認を提供する。
【００３７】
マイクロ流体システムは、マイクロ技術の利用、及びシリコン、ガラス、又は他の適切な材料から形成されたウエハーの加工及び接着によって製造される。マイクロ流体システムはまた、代替の手段によって、例えば、ソフトリソグラフィー技術の利用によって、又はマイクロ流体システムを形成するために単独で又はマイクロパターン化チップと共に使用することができるリーダー部（例えば、プラスチック又は異なる適切な、実質的にＩＲ不透明な材料から形成される）の形成によって製造することもできる。マイクロ流体システムは、典型的には、入口、出口、及びチャネルを介して接続された１つ以上のチャンバーからなり、このチャネルは、長さが数十マイクロメートルからミリメートルの範囲で、高さ及び深さが数十マイクロメートルから数百マイクロメートルの範囲である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、凝固カスケードの模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、血液が１つのチャンバーにピペットで移され、続いてチップがパッケージング内に挿入されるマイクロ流体装置の一実施形態の断面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、血液をチャンバー側を通って導入することができるマイクロ流体装置の一実施形態の断面図であり；血糖測定と同様に「シッパー」がリーダーから突き出ている。
【図３Ａ】図３Ａは、開型の２つのサンプルチャンバー装置の図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、閉型の２つのサンプルチャンバー装置の図である。
【図４Ａ−４Ｈ】図４Ａ〜図４Ｈは、チャンバー、接続チャネル、電気接触パッド、及びサーミスターを示すチャンバーの図である。
【図５】図５は、閉型リーダーの底部の上方からの斜視図である。
【図６】図６は、閉型リーダーの底部の側方からの断面図である。
【図７】図７は、所定の位置にあるサンプルアッセイ装置を示す、閉型リーダーの上部の斜視断面図である。
【図８】図８は、閉型リーダーの底部の上方からの斜視断面図である。
【図９Ａ】図９Ａは、開型リーダーの底部の上方からの斜視断面図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、開型リーダーの底部の側方からの斜視断面図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、開型リーダーの上部の側方及び下方からの斜視断面図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、開型リーダーの上部の側方及び下方からの斜視断面図である。
【図１１】図１１は、一度しか使用できない使い捨てアッセイチャンバー、リーダー、並びにコンピュータープロセッサ及びモニターとの接続部を含むボックスを示す、システムの模式図である。
【図１２Ａ−１２Ｆ】図１２Ａ〜図１２Ｆは、抗凝固剤を含まない対照、３００ｎｇのエドキサバン抗凝固剤／１ｍｌの血液、及び３００ｎｇのエドキサバン及びシラパランタグ（ＰＥＲ９７７；抗凝固拮抗剤）／１ｍｌの血液のそれぞれでの経過時間（分）に対するインピーダンス（１２Ａ、１２Ｃ、及び１２Ｅ）及び赤外線送信（１２Ｂ、１２Ｄ、１２Ｆ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ｉ．定義
マイクロ流体工学
マイクロ流体工学は、工学、物理学、化学、生化学、マイクロ／ナノ技術、及び生物工学から引き出された極めて学際的な分野である。フェムトリットルからミリリットルの範囲の少量の流体は、典型的には、マイクロ流体システムで取り扱われる。マイクロ流体システムの製造方法では、典型的には、液体をマイクロ流体システム内で効果的に移送し、操作し、そして分析することができるように、センサー及び／又はアクチュエーターの一体化が可能である。マイクロ流体システムとその環境との間の界面で、移送、操作、及び分析のための外部機構の実施が可能である。
【００４０】
マイクロ／ナノ技術
典型的には、マイクロ／ナノ技術が使用されて、マイクロ流体システムを含むマイクロシステムが製造される。マイクロ／ナノ技術は、典型的には、マイクロメートル又はナノメートル範囲の寸法の構造の製造を可能にする。このような技術は、元々は集積電子回路の製造のために開発されたシリコンウエハー処理技術に基づき得る。
【００４１】
毛管現象
液体サンプルをマイクロ流体システムにロードする便利な方法は、毛管現象によるものである。サンプル収集ポートをサンプルで濡らすと、このサンプルが、毛管力によってマイクロ流体システムの細い親水性チャネル及びチャンバー内に効果的に引き込まれる。
【００４２】
抗凝固剤
抗凝固剤は、血液が凝固する能力を妨げる物質である。治療薬として投与されると、抗凝固剤は、例えば、潜在的に健康及び／若しくは生命を脅かす塞栓若しくは血栓の発生を低減又は防止するのに役立ち得る。
【００４３】
抗凝固剤拮抗薬
抗凝固剤拮抗薬は、抗凝固剤の効果を部分的に又は完全に拮抗するために治療薬として投与することができる。血液の凝固する能力の回復により、人命を救助することができる。例えば、抗凝固剤を摂取していて重度の外傷を受けている患者を、血液凝固能力の回復及び過剰な失血の防止のために拮抗薬で処置することができる。
【００４４】
「開型」及び「閉型」装置
「開型」装置は、血液の内部チャンバー内への直接のアクセスを可能にする、このチャンバーから外部に延びたチャネルを有する。「閉型」装置は、外部チャネルを備えず、チャンバー内での凝血の評価に利用されるセンサー、電極、ＬＥＤ、及び他の要素に関連した小さい孔を除いて、外部に対して密閉される前に充填される。「開型」のマイクロ流体システムは、チップを最初に、そのパッケージングの中に挿入して加熱することができてなお、アクセス可能（開）であり得るように設計されている。チップが、そのパッケージング内に既に存在する状態で、サイドポートを濡らすことによってサンプルをシステムにロードすることができる。サンプルは、毛管力によってチップ内に引き込まれていく。
【００４５】
「閉型」のマイクロ流体システムは、そのパッケージング内に入れられると、使用者がアクセスすることができない。チップをそのパッケージング内に入れる前に、裏側のサイドポートの１つを湿らす又はピペット操作によってサンプルをシステムの中にロードしなければならない。
【００４６】
ＩＩ．装置
マイクロ流体チップ及びそのリーダーの実施形態が図２〜図１０に示されており、システムは、図１１に示されている両方の部分を含む。図２Ａ及び図２Ｂに示されているように、マイクロ流体チップ１０は、シリコンウエハーの異方性ウェットエッチング、及びこれに続く熱酸化、ＰＹＲＥＸ（登録商標）（透明な低熱膨張ホウケイ酸ガラス）ウエハーの異方性ウェットエッチング、ステンシルによる両方のウエハーへの金属薄膜のスパッター堆積、シリコン及びＰＹＲＥＸ（登録商標）ウエハーの陽極接合、そしてこれに続くウエハーの方形切断による単一チップの分割によって製造される。
【００４７】
マイクロ流体チップは、マイクロ流体構造を製造するのに適した任意の方法、及び血液凝固カスケードを活性化するのに適した任意の負に帯電した材料を用いる代替の手段によって製造することができる。
【００４８】
チャンバー１２ａ及び１２ｂ並びにこれらのチャンバーを接続しているチャネル１４の断面寸法及び形状を変更することができ、かつチャンバーの数を変更することができる。表面と体積の比は、全体として凝血時間に影響を及ぼす。チャンバーへのアクセスは、チャンバー装置の密閉の前は直接的である（「閉型」、図２Ｂ）、又はマイクロチャンバーの外部からのアクセスを可能にするサイドチャネル１６を介してである。
【００４９】
図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、チップは：
・（チャンバー１２ａ及び１２ｂの下面にある）裏側の抵抗又は電気ヒーター構造による加熱
・上面（外部）サーミスター１８による加熱制御のための温度測定
・空気圧測定による凝血の検出
・埋め込まれた電極２０ａ及び接触パッド２０ｂによる血液サンプル中のインピーダンスの測定による凝血の検出
・光学測定による凝血の検出、を可能にするように設計されている。
【００５０】
図４Ａ〜図４Ｈに示されているように、抵抗構造２２は、シリコンウエハー２４の背面（抵抗加熱構造３２を形成するため、図４Ｇ、図４Ｈ）、シリコンウエハーの前面２６（各チャンバーの床に、インピーダンス測定のための電極２０ａ、２０ｂ及びサーミスター１８のそれぞれを形成するため）、及びＰＹＲＥＸ（登録商標）ウエハーの前面（チャンバー１２ａ、１２ｂの一方又は両方の上部にサーミスター１８を形成するため）に堆積される。ヒーター及びサーミスターは、「チップ」の外部にすることができ、かつリーダー構造に一体化することができる。内部にチップが配置されるキャビティの壁が、チップよりも著しく重い質量であり、熱伝導性が高く、そしてほぼ完全な雰囲気を形成する場合は、このキャビティは、「黒体」に近く、このチップは、キャビティと熱平衡にならなければならない。チップが、キャビティと接触している又は近接している場合は、平衡時間定数は非常に短くなり得る。これは、開発中のパイロメータ測定によって確認することができる。これは、システムの使い捨て部分の複雑さ及びコストを軽減するはずである。接続チャネル１４及び入口ポート３６は、水酸化カリウム（ＫＯＨ）を用いてシリコンウエハー２６にエッチングすることができる。
【００５１】
図２Ｂ、図３Ｂの装置（「閉型装置」と呼ばれる）は、シリコン部３０を通ってエッチングされた２つの入口ポート２８ａ、２８ｂを有する。サンプルを、装置１０を密閉されたパッケージングの中に挿入する前にポート２８ａ、２８ｂの一方の中にピペッティングすることができる。図２ａ、図３ｂの装置は、シリコン部を通ってエッチングされた１つの入口ポート２８ｂ、及びＰＹＲＥＸ（登録商標）にエッチングされたチャネルとして実現された１つの横向き入口ポート１６（「開型装置」と呼ばれる）を有する。シリコン基板の場合は、表面波形構造を、十分に理解された微細加工技術によってマイクロ流体設計に直接一体化することができる。開型装置チップ（図２Ａ、図３Ａ）をまず、横向きポートを備える縁がリーダーから突き出るように、密閉パッケージング及び／又はリーダーに挿入することができる。次いで、横向きポート１６を濡らすことにより、サンプルが毛管現象によってチャンバー１２ａ内に引き込まれる。
【００５２】
組み合わせヒーター／クーラー制御システム及びサーミスターは、「チップ」の外部とすることができ、かつリーダー構造に一体化することができる。内部にチップが配置されるキャビティの壁が、チップよりも著しく重い質量であり、熱伝導性が高く、そしてほぼ完全な雰囲気を形成する場合は、このキャビティは、「黒体」に近く、このチップは、キャビティと熱平衡にならなければならない。チップが、キャビティと接触している又は近接している場合は、平衡時間定数は非常に短くなり得る。これは、開発中のパイロメータ測定によって確認することができる。これは、システムの使い捨て部分の複雑さ及び（願わくは）コストを軽減するであろう。
【００５３】
図５〜図１０に示されているチップパッケージ又は「リーダー」は、チップとの電気的界面、光学的界面、及び流体界面を提供する。リーダーは、底部（図５、図６、図９Ａ、図９Ｂ）及び上部（図７、図８、図１０Ａ、図１０Ｂ）からなり、これらの部分は、高精度３次元印刷、成形、機械加工、又は他の製造プロセスによって製造される。両方の部分は、互いに接合され、孔５６に適合する金属ダウエルピンをロックすることによって互いに押圧される。リーダーは、表示手段、情報の保存、及び通信機能を備えることができる。
【００５４】
図５及び図６は、２つの異なる角度からの閉型装置チップのリーダー底部５０を示している。リーダー内の凹部５４に配置されたチャネル５２ａ、５２ｂはそれぞれ、チャンバー２及び１をチップ入口ポートに接続している。リーダーの一側において、ソレノイド弁（不図示）を、リーダーの底部にねじ込まれた掛かりの付いた管状コネクタとリーダーチャネルとの間の接続を制御するために、チャネル端部５８でリーダーに取り付けることができる。反対側において、圧力センサ（不図示）を、リーダーチャネル及びチップ入口ポートに加えられる圧力を監視するために、孔６０でリーダーに取り付けることができる。各入口ポート６２ａ、６２ｂは、孔７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、及び７０ｄに固定されたそれ自体のソレノイド弁／圧力センサーによって制御／監視される。リーダー底部は、マイクロ流体チップのための凹部５４を備える。小さい垂直孔６４ａ、６４ｂは、ポゴピンを保持してチップの底部のヒーター構造を接触させる。リーダー部の中心の孔６６は、光路６８に沿って通る金属缶リーダー内にＩＲ  ＬＥＤチップを保持する。
【００５５】
ＩＲ構成要素は、「ｃｈｉｐｓｔｒａｔｅ」型に成形する又は一体化することができる。
【００５６】
単一点光学測定として示されているが、多点光学測定を使用することもできる。
【００５７】
図７及び図８は、２つの異なる角度からの閉型装置チップのリーダー上部８０を示している。中心にある大きい（例えば、５ｍｍの）孔８２は、光を孔８６に誘導する金属缶リーダー内にＩＲフォトダイオードチップ（不図示）を保持する。３つの小さい（例えば、１ｍｍ未満の）垂直孔８４は、両方のチャンバーでインピーダンス測定を行うことができるよう、インピーダンス測定用の３つの電極（両方のチャンバー用の１つの共通接地電極及び各チャンバーの１つ対電極）が接触するように３つのポゴピン（不図示）を保持している。２つの他の垂直孔８８は、チップ上部のサーミスターが接触するようにポゴピンを保持している。これらの装置の他の実施形態は、既知であり、同じ機能のために容易に利用可能である。ＩＲ  ＬＥＤ及びフォトダイオードは、１つのチャンバーの直径１ｍｍの中心領域を調べるように配置される。
【００５８】
チップリーダー自体は、図１１に示されているように、自動測定を行うために必要な電子回路、弁、及びポンプを含むプロジェクトボックス１００のカバーに取り付けられている。プロジェクトボックス１００は、ＰＣ１０２に接続され、測定は、ＬａｂＶｉｅｗプログラム及びプロセッサー１１０によって制御され、結果がモニター１０４に示される。
【００５９】
図９Ａ及び図９Ｂは、２つの異なる角度からの開型装置チップのリーダー底部１２０を示している。ダウエルピン孔１２２が、装置の固定に使用されている。リーダー内のチャネル１２４は、チャンバー２及び１をそれぞれ、チップ入口ポートに接続している。リーダーの一側において、ソレノイド弁（不図示）を、リーダーの底部にねじ込まれた掛かりの付いた管状コネクタとリーダーチャネルとの間の接続を制御するために、チャネル端部でリーダーに取り付けることができる。反対側において、圧力センサ（不図示）を、リーダーチャネル及びチップ入口ポートに加えられる圧力を監視するために、孔１２６ａ、１２６ｂでリーダーに取り付けることができる。各入口ポートは、孔に固定されたそれ自体のソレノイド弁／圧力センサーによって制御／監視される。リーダー底部は、マイクロ流体チップのための凹部１２８を備える。リーダー部の中心の孔１３０は、金属缶リーダー内にＩＲ  ＬＥＤチップを保持する。
【００６０】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、２つの異なる角度からの開型装置チップのリーダー上部１４０を示している。中心にある大きい（例えば、５ｍｍの）孔１４２は、光を孔１４４に誘導する金属缶リーダー内にＩＲフォトダイオードチップ（不図示）を保持する。３つの小さい（例えば、１ｍｍ未満の）垂直孔１４６は、両方のチャンバーでインピーダンス測定を行うことができるよう、インピーダンス測定用の３つの電極（両方のチャンバー用の１つの共通接地電極及び各チャンバーの１つ対電極）が接触するように３つのポゴピン（不図示）を保持している。２つの他の垂直孔１４８は、チップ上部のサーミスターが接触するようにポゴピンを保持している。ＩＲ  ＬＥＤ及びフォトダイオードは、１つのチャンバーの直径１ｍｍの中心領域を調べるように配置される。
【００６１】
１つのビームを用いた両方のチャンバーの監視について説明したが、別個のビームを用いて両方のチャンバーを調べることも可能である。１つのビームは、単に例示目的で示されている。
【００６２】
チップリーダーは、図１１に示されているように、ねじ孔１５０を用いて上記のようにプロジェクトボックスのカバープレートに取り付けられている。
【００６３】
Ａ．血液凝固の活性化のための表面
マイクロ流体システムは、導入される血液又は血漿サンプルが、ＰＹＲＥＸ（登録商標）などの材料又は熱酸化ケイ素、例えば、非晶質ＳｉＯ２、酸化ケイ素、及び窒化ケイ素からなるガラス表面、マイクロ流体チップの上部、及び／又はマイクロ流体チップの底部の表面に接触するように製造される。ガラスは、追加の化学的又は生物学的試薬を使用することなく凝固カスケードを活性化するのに役立つ。活性化は、サンプルのガラス表面との単なる接触によって、又はマイクロ流体システム内のガラス表面に沿ったサンプルの活発な運動（例えば、外部から加えられる空気圧パルスによる）によって行われる。
【００６４】
マイクロ流体システムは、導入される血液又は血漿サンプルが、追加の化学的又は生物学的試薬を使用することなく凝固カスケードを活性化するのに役立つガラス表面（又は他の負に帯電した表面）に接触するように製造される。ガラス表面は、マイクロ流体システムの製造のために、ガラスウエハー及び酸化ケイ素ウエハーそれぞれの使用によって形成される。別法では、ガラス表面は、マイクロ流体システムを形成するリーダー部に一体化されるガラスチップの使用によって、マイクロ流体システムの内面に堆積されるガラスによって（例えば、スピンオンガラス製品の使用によって）、又はマイクロ流体システム内のガラス表面への小さい物体（例えば、ガラスマイクロビーズ）の一体化によって実現することができる。加えて、ガラス表面は、ケイ素表面の酸化によって導入することができる。
【００６５】
Ｂ．堆積金属薄膜の電気特性
堆積金属薄膜は、クロム接着層（約２０ｎｍの厚み）及び金の上層（インピーダンス測定用の内部電極では約５０ｎｍの厚み、サーミスターでは１００ｎｍの厚み、そしてヒーター構造では１５０ｎｍの厚み）から形成することができる。プラスチックリーダー内のばね荷重ポゴピンを使用して、マイクロ流体チップ上の全ての薄膜電極への電気接触を実現した。約２ｍｍの長さ及び約１ｍｍの幅を有する金属膜試験構造のいずれかの端部に接合された２つのピン間の典型的な抵抗は、ピンがヒーター構造の金属膜に接触している場合は１．８Ω、サーミスターの金属膜に接触している場合は２．７Ω、そしてインピーダンス測定用の内部電極の金属膜に接触している場合は２２Ωである。内部電極ピン間の著しく高い抵抗は、より薄い金属層による可能性が高く、約３００℃での陽極接合中の接点劣化も考えられる。陽極接合の後に、ヒーター構造及びサーミスターが堆積される。
【００６６】
堆積金属薄膜の抵抗の温度係数の測定では、インピーダンス測定用の開回路電極の代わりに抵抗器／サーミスター構造を有するチップを使用した。チップを、そのリーダー内に挿入して、オーブン内で加熱した。ヒーター、サーミスター、及び内部電極抵抗器の電気抵抗を、異なる温度で測定し、抵抗の温度係数αを計算した：
・ヒーター薄膜：        α＝０．００１６Ｋ−１
・サーミスター薄膜：    α＝０．００１１５Ｋ−１
・内部電極薄膜：        α＝０．０００１０８Ｋ−１
【００６７】
Ｃ．サンプルの配置のための内部電極
インピーダンス測定とは別に、一体化電極を使用して、マイクロ流体システム内の分析物、例えば、フィブリンの存在を検出すること、及び／又は、例えば外部から加えられる空気圧パルスによる分析物の移動を追跡することもできる。このような検出及び追跡を使用して、分析物がマイクロ流体システムに添加されてから分析手順を開始し、マイクロ流体システム内の特定の位置に分析物を配置し、そして分析物を画定された位置間で前後に繰り返し移動させることができる。
【００６８】
２つのチャンバー及び２つの電極を参照して例示されたが、多数の電極を使用して、凝血の測定部位又は凝血が測定されるチャンバーの前、例えば入口に近い点で、多数のチャンバーの充填を確認することができる。
【００６９】
ガラス表面に沿った全血又は血漿の移動を繰り返し行って、血液の活性化を高める、血液凝固を加速する、かつ／又は測定時間を短縮することができる。
【００７０】
Ｄ．フィルター構造の一体化
血漿のみが分析チャンバーに到達するように、機械フィルター構造をマイクロ流体チップに一体化することができる。フィルターは、シリコン又はガラスにエッチングされたマイクロピラーのアレイ又はマイクロチャネルとして実現することができる。このようにして、（抗凝固剤、例えば、クエン酸ナトリウム又はＥＤＴＡを用いずに）血漿をｉｎ  ｓｉｔｕで得て、分析中に赤血球の干渉を受けることなく、全血と同様に非常に迅速に試験することができる。マイクロピラーアレイは、利用可能なチャネル断面積の過剰な部分が「詰まる」可能性を最小限にすると共に赤血球の通過を妨げるように、オフセットパターンに配置することができる。
【００７１】
Ｅ．凝血の検出のための手段
血液凝固の時間を決定するために様々な様式を利用することができる。
【００７２】
粘度
血液の粘度は、凝血時間を明らかにするための評価基準として役立ち得る。２つの一般原理を利用して、粘度の直接的又は間接的な評価基準を得ることができる。サンプルを、既知の形状のチャネル内を移動させることができる。粘度は、「長い」チャネルへの進入率を光学的に追跡することによって、又は多数のビーム「チェックポイント」をイメージングすることによって、又は多数の電極インピーダンスセンサによって電気的に測定することができる。粘度は、例えば、特定の時間間隔内にサンプルがチャネル内を移動した距離、特定の時間間隔内に移動したサンプルの量、又は特定の時間間隔内の駆動力の変化の測定によって間接的に測定することができる（例えば、サンプルが、加圧された一定量の閉じ込められた空気によって移動される場合は、空気圧の変化が、サンプルの体積変位の間接的な評価基準として役立ち得る）。別法では、物体は、例えば、静電気力又は磁力によって駆動され、血液サンプル中を移動することができる。物体の移動の追跡により、サンプルの粘度の間接的な評価基準を得ることができる。
【００７３】
分析物の粘度は、加圧された一定量の閉じ込められた空気によるマイクロ流体システム内の分析物の移動によって検出することができる。空気は、例えば、マイクロ流体システムに接続された電気空気ポンプによって加圧することができる。加圧空気は、マイクロ流体システムに接続されたソレノイド弁の閉鎖によって閉じ込めることができる。チップの１つの入口ポートにおける閉じ込められた空気の減圧は、分析物の移動を示唆する。マイクロ流体システムの形状及び加えられる圧力の大きさの情報により、分析物の粘度の計算及び粘度の変化（例えば、血液の場合には凝血による粘度の上昇）の検出が可能となる。
【００７４】
粘度の監視による凝血の検出では、（Ｏリングシールを用いて気密／液密された）リーダーの流体ポートに接続されたチップ上の入口と出口の差圧を測定する。
【００７５】
分析物の粘度は、加圧された一定量の閉じ込められた空気によるマイクロ流体システム内の分析物の移動によって検出することができる。空気は、例えば、マイクロ流体システムに接続された電気空気ポンプによって加圧することができる。加圧空気は、マイクロ流体システムに接続されたソレノイド弁の閉鎖によって閉じ込めることができる。チップの１つの入口ポートにおける閉じ込められた空気の減圧は、分析物の移動を示唆する。マイクロ流体システムの形状及び加えられる圧力の大きさの情報により、分析物の粘度の計算及び粘度の変化（例えば、血液の場合には凝血による粘度の上昇）の検出が可能となる。
【００７６】
インピーダンス
サンプルの凝血は、電流又は電圧が印加されたときのその電気インピーダンス又はその複合抵抗に関連し得る。電気インピーダンスは、サンプルのオーム抵抗及び容量性成分から生じる。電気インピーダンスは、例えば、マイクロ流体チップに直接的に一体化される、又は他の部分と共にマイクロ流体システムを形成するリーダーに一体化される電極によって測定することができる。電極は、部分的にサンプルに直接接触しても良いし、又は（ナノメートルから数百マイクロメートルの範囲の厚みの）薄い絶縁体のみによってサンプルから分離しても良い。
【００７７】
電極及び導線は、マイクロ流体システムを形成する基板に堆積されたパターン化金属薄膜として形成することができる。電極及び導線は、リーダー部間に挿入されて挟まれたパターン化金属シート又は膜の一体化によっても実現することができる。マイクロ流体チップの製造に半導体ウエハーが使用される場合は、半導体材料自体は、拡散、注入、エッチング、微細機械加工、又は集積回路若しくは他のマイクロ装置の生産に使用される技術と同様の適切な技術の任意の組み合わせによって製造される一体化電極を含み得る。この一体化電極を使用して、分析物の電気特性（例えば、抵抗、容量、インピーダンス）を直接測定することができる。適切な電子回路を使用して、分析物の変化（及び電気特性における関連した変化）を測定可能な電圧、電流、周波数、又は他の適切なパラメーターに変換することもできる。部品は、３次元印刷による製造中に挿入しても良いし、又は直接一体化しても良い。例えば、抵抗式加熱要素は、半導体基板のドープチャネルによって（例えば、イオンビーム注入によって）製造され得る。
【００７８】
インピーダンスの監視による凝血の検出は、チップをリーダーに挿入し、金パッド（チップ上の電極に接続された）とリーダー内のポゴピンとを接触させることによって達成され、このリーダーからの電気信号が、例えば、ＬＣＲメーター、又はその他の適切な測定システムによって読み取られる。
【００７９】
インピーダンスの測定による凝血の検出では、サンプルがチップにロードされ、このチップが、そのリーダー内に挿入され、ポゴピンが、ケルビンクリップのリード線によってＱｕａｄＴｅｃｈ  １９２０  ＬＣＲメーターに接続された内部インピーダンス電極に接続される。血液サンプルの複合インピーダンスの大きさ及び位相を１５秒間隔で記録した。１００Ｈｚ、１ｋＨｚ、１０ｋＨｚ、及び１００ｋＨｚでの測定は、大きさ又は位相のいずれか又は両方の特徴的なピーク又はプラトーを示した。ピーク又はプラトーは、凝血時間の評価基準を示した。
【００８０】
図３Ａ及び図３Ｂを参照すると、インピーダンス測定では、外部ＬＣＲメーターは、チャンバー１２ａの両側にある２つの電極２０ｂ、２０ａ間にＡＣ電圧（２０ｍＶ  ＲＭＳ）を印加して、これらの電極間の電流を測定する。次いで、インピーダンスの大きさ及び位相を計算し、そして凝血を計算する。
【００８１】
光学特性
サンプルの光学特性は、凝血事象に関連し得る。波長が５００ｎｍ〜１０，０００ｎｍ（好ましくは１，３００ｎｍ）の範囲の光を使用して、マイクロ流体及びチップリーダーを通るサンプルを照射することができる。以下のパラメーターを使用して、凝血を追跡することができる：送信される光、反射される光、及び散乱される光。コヒーレント光源が使用される場合は、偏光を追加のパラメーターとして使用することができる。
【００８２】
ＩＲ送信による凝血の検出は、チップをリーダーに挿入して、そのチップの厚みを通る（ガラス、流体充填チャンバー、及び下層のシリコンを通る）赤外線送信を測定することによって行われる。これは、チップの上のＩＲ源（ＬＥＤ）及びすぐ下の整合されたフォトダイオード検出器の配置によって達成される。
【００８３】
光学的な凝血の検出では、ＩＲ  ＬＥＤ及びフォトダイオードを、上記のようにそれらのリーダー部に挿入する。血液サンプルをピペットでチップの中に移し、このチップをリーダーの中に入れる。サンプルを、１，３００ｎｍのＩＲ光で連続照射する。典型的には１００ミリ秒の時間間隔で、フォトダイオードの光電流によって引き起こされる１ＭΩの抵抗の前後の電圧降下を記録した。典型的には数ボルトの電圧を測定した。サンプルの凝血により、送信される光及び光電流が時間と共に変化した。送信される光度曲線の特徴的なピークは、凝血時間の評価基準を示した。
【００８４】
連続的な照射測定は、単純な例示として示されている。より高度な測定技術を使用することができる。例えば、ＩＲエミッターが、５０％持続時間、１ｋＨｚの繰り返し率で照射され、そして同期検出器を使用して光検出器の出力が処理され、これに１秒の積分期間が続く場合は、上記の例における信号対ノイズ比を３０倍も改善することができる。加えて、活性信号の処理により、大幅に小さい信号の処理、光検出器の相対的に低いインピーダンス終端部の許容、固有のノイズの低減、及びドリフトのキャンセルが可能になる。周囲の電気ノイズ感度は、実質的に低減することができる。
【００８５】
音響特性
サンプルを通る又はサンプルの表面に沿った音の伝播の測定は、凝血のさらなる評価基準として役立ち得る。外部超音波トランスデューサーを使用して、超音波がサンプル中を移動する時間を測定することができる。加えて、表面音波装置を使用して、サンプルの音響特性を測定して凝血を検出することができる。
【００８６】
ＩＩＩ．装置の製造方法
標準的なプロセス、例えば、フォトリソグラフィーに加えて、特殊な技術、例えば、陽極接合、又はシリコンウエハーの水酸化カリウム異方性ウェットエッチングを利用してマイクロシステムを形成することができる。標準的な紫外線リソグラフィーとは別に、技術、例えば、直接レーザー書き込みマイクロアブレーション若しくはエロージョン、電子ビームリソグラフィー、又は集束イオンビームミリングを使用して、マイクロメートルサイズ若しくはナノメートルサイズの構造を画定することができる。ソフトリソグラフィーは、マイクロ流体システムを製造するための関連方法であり、かつ、例えば、標準的なフォトリソグラフィー技術によるマイクロ構造又はマイクロパターンの形成、及びこれに続く成形／鋳造プロセスでのこれらのパターンの使用に基づいている。エラストマー材料、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が、典型的には、ソフトリソグラフィーによるマイクロ流体システムの形成に使用される。ソフトリソグラフィーによって形成される構造化膜を、互いに又はその他の構造化若しくは非構造化基板に取り付けて複合マイクロ流体システムを形成することができる。さらに、他の技術、例えば、ドリル加工、ミリング、成型、又は３次元印刷を、単独で又は他のマイクロ／ナノ技術と組み合わせて使用してマイクロシステムを製造することができる。
【００８７】
ＩＶ．サンプルの採取
採血
殆どの場合、検査される個人は、恐らく抗凝固剤での処置について知らない状態で診療所又は病院を訪れる。血液は、シリンジ、ランセット（ｌａｎｃｅｌｅｔ）の使用によって、又は血液を含むラインから直接得ることができる。凝血がガラス型表面を用いて活性化される代替の凝血経路の使用により、血液は、抗凝固剤、例えば、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、因子ＩＩａ阻害剤、因子Ｘａ阻害剤、及び血液凝固を阻害する他の因子又は血液凝固を低下させる因子を含み得る。
【００８８】
ワルファリン及び関連した４−ヒドロキシクマリン含有分子は、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ、いくつかの血液凝固タンパク質、主にプロトロンビン及び因子ＶＩＩのカルボキシル化に関与した後に酸化ビタミンＫ１をその還元型に再生する酵素を阻害することによって血液凝固を軽減する。ワルファリンは、ビタミンＫ１の作用に拮抗しないが、ビタミンＫ１の再生に拮抗し、活性ビタミンＫを枯渇させる。従って、薬理作用は、新鮮なビタミンＫによって常に拮抗され得る。投与されても、これらの薬物は、迅速には血液の凝固を抑制しない。代わりに、これらの効果の開始には、残存活性凝固因子が代謝中で自然に消失するまでに約１日を必要とし、ワルファリンの単回投与の作用期間は、２〜５日間である。ワルファリンの投与が中止される又はビタミンＫ１が投与されたときのワルファリンの効果の拮抗には、同様の時間が必要である。
【００８９】
ヘパリンは、肝臓及び血液凝固を阻害する他の組織で産生される化合物である。硫黄含有多糖は、血栓症の処理で抗凝固剤として使用される。低分子量ヘパリン、より高度に処理された生成物は、ａＰＴＴ抗凝固パラメーター（より予測可能な血漿レベルを有する）により監視を必要とせず、かつ副作用が少ないため有用である。しかしながら、出血の緊急事態では、ＬＭＷＨを監視する能力は、ポイントオブケア・アッセイがＬＭＷＨ抗凝固監視では臨床的に許容されていないため、臨床的要求を全く満たさない。
【００９０】
薬物、例えば、リバーロキシバン、アピキサバン、及びエドキサバンは、因子Ｘａを直接阻害することによって作用する（抗トロンビン活性化によって作用するヘパリン及びフォンダパリヌクスとは異なる）。
【００９１】
別のタイプの抗凝固剤は、直接トロンビン阻害剤である。このクラスの現在のメンバーとしては、二価薬物ヒルジン、レピルジン、及びビバリルジン；並びに一価薬物アルガトロバン及びダビガトランが挙げられる。
【００９２】
サンプルは、血液又は血漿として試験することができる。血漿は、濾過又は遠心分離によって調製することができる。加えて、例えば、二重深さチップ又はチャネル内ビーズパッキングを用いたチャネル内へのガラスビーズの導入によって、１つ以上のマイクロ流体チャネルに追加のガラス表面積を加えることができる。
【００９３】
他の生物学的サンプル
装置は、ガラスへの曝露で活性化される他のタイプのサンプルで使用することができる。
【００９４】
Ｖ．使用方法
サンプルを採集して、装置に導入する。凝血を決定する方法は、サンプルが装置に配置されると開始される。結果が、典型的にはプールされた血漿又はプールされた血液からの凝固抑制サンプルの標準的な結果と比較される、又は個人に抗凝固剤が投与される場合には処置の開始時の凝血時間を参照することにより比較される、又は抗凝固剤を中和してより正常な血液凝固を回復させる治療と比較される。
【００９５】
以下の非限定の実施例を参照することにより、本発明をさらに理解されるであろう。
【実施例】
【００９６】
実施例１．チップ上での加熱の実証
チップを使用して、一体化ヒーター（又は一体化ヒーター／クーラー；好ましくは、固体ヒートポンプ又は「Ｐｅｌｔｉｅｒクーラー」）構造の効果を実証した。１２Ｖ  ＤＣ電圧を、マイクロ流体チップのシリコン部の背面のヒーター抵抗に印加した。サーミスターの抵抗を、ヒーター電圧の印加の前及び加熱中に、各チャンバー内（前面のシリコン表面にある内部サーミスター）及び各チャンバーの上部（ＰＹＲＥＸ（登録商標）の上部にある外部サーミスター）で測定した。加熱による局所温度の上昇を、既に報告されているように、測定した抵抗及び抵抗の温度係数を用いて計算した。室温は、約２７℃であった。制限されていない加熱の約２分後の平均局所温度の上昇は以下の通りであった：
・外部サーミスター：    ΔＴ＝２０．３Ｋ
・内部サーミスター：    ΔＴ＝２３．８Ｋ。
【００９７】
実施例２：血液凝固の測定
材料及び方法
血液を、市販の穿刺装置を用いて患者から採取した。１０μＬの血液を得て、ピペットでエッペンドルフ管に移した。生理食塩水を緩衝液として使用した。血液サンプルを、エッペンドルフ管内での上下に５回のピペット操作により以下の試薬の１つと混合した：
・１μＬの緩衝液（偽薬対照と呼ばれる）、
・３００ｎｇ／ｍＬの濃度の抗凝固剤エドキサバンを含む１μＬの緩衝液、
・共に３００ｎｇ／ｍＬの濃度の抗凝固剤エドキサバン及び抗凝固拮抗薬ＰＥＲ９７７を含む１μＬの緩衝液。
【００９８】
エドキサバンは、市販の抗凝固剤である。ＰＥＲ９７７（シラパランタグ）は、エドキサバンの効果を拮抗するように設計された治験薬である。混合の直後に、２．５μＬの各血液サンプルを、ピペットで閉型装置チップに移した。チップをそのリーダーに挿入し、そしてＩＲ光及びインピーダンスの両方の測定値を室温（約２７℃）で迅速に記録した。血液サンプルの加熱は省いた。
【００９９】
結果を、ＩＲ及び粘度インピーダンスの両方によって得た。
【０１００】
結果
図１２Ａ〜図１２Ｆから明らかなように、ＩＲ測定値（図１２Ｂ、図１２Ｄ、及び図１２Ｆ）及びインピーダンス測定値（図１２Ａ、図１２Ｃ、及び図１２Ｅ）は互いに非常に相関している。両方の測定値は、偽薬対照に対して、サンプルの凝血時間を示唆する約２分の特徴的なピークを示している。抗凝固剤エドキサバンの添加により、このピークが約４分シフトする。ピークに加えて、エドキサバン曲線は、約１２分の特徴的な極小を示している。エドキサバンを含む血液サンプルへの抗凝固拮抗剤ＰＥＲ９７７の添加により、各曲線のピークが２分戻り、約１２分の極小の発生を抑制する。これらの測定値は、エドキサバンの凝固遅延効果及びＰＥＲ９７７の追加投与によるこの効果の拮抗を示唆している。
【０１０１】
装置、システム、及びこれらの使用方法の修正及びバリエーションは、前述の詳細な説明から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲内になるものとする。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ−Ｈ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１２Ｄ−Ｆ】
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