(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0006483096.tif 000024
（式中、
ＸはＳまたは結合であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、炭素数３〜１２の単糖または二糖、Ｏ、Ｓ、ＣＨ３Ｓ−またはＮで置換されていてもよい炭素数１〜５のモノカルボン酸またはジカルボン酸、炭素数１〜５のチオカルボン酸、窒素に結合している側鎖が炭素数１〜５のアルキルである炭素数１〜５の第一級または第二級アミド、スレオニン、セリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メルカプトコハク酸塩、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、および亜硫酸塩からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）で表される化合物。
【請求項２】
Ｘが結合であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記式：
【化２】
0006483096.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、スレオニン、セリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メルカプトコハク酸塩、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、および亜硫酸塩からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドである）であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
リガンドがスレオニンであることを特徴とする、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
化合物が薬学的に許容される塩の形態であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物を含有することを特徴とする薬学組成物。
【請求項７】
哺乳動物におけるシアン化物中毒治療用医薬製造のための、請求項１〜５のいずれか一項で定義される化合物または請求項６で定義される組成物の使用。
【請求項８】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
下記式：
【化３】
0006483096.tif 000026
（式中、
ＸはＳまたは結合であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、炭素数３〜１２の単糖または二糖、Ｏ、Ｓ、ＣＨ３Ｓ−またはＮで置換されていてもよい炭素数１〜５のモノカルボン酸またはジカルボン酸、炭素数１〜５のチオカルボン酸、窒素に結合している側鎖が炭素数１〜５のアルキルである炭素数１〜５の第一級または第二級アミド、スレオニン、セリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メルカプトコハク酸塩、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、および亜硫酸塩からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）で表される化合物を含有することを特徴とする薬学組成物。
【請求項１０】
Ｘが結合であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は共通して、スレオニン、セリン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メルカプトコハク酸塩、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、および亜硫酸塩からなる群から選択される１つのリガンドであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
リガンドがスレオニンであることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
化合物が薬学的に許容される塩の形態であることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
化合物が、ナトリウム、カリウム、Ｒ４Ｎ（Ｒは水素）、グルコサミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、トロメタミン（ＴＲＩＳ）、およびＮ−メチルアミノエタノールからなる群から選択されるカチオンを有する塩の形態であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
さらに硫黄源を含有することを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
硫黄源が、硫黄、チオ硫酸塩、硫化アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリチオスレイトール、グルタチオン、およびジベンジルトリスルフィド（ＤＴＳ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
硫黄源が、チオ硫酸ナトリウムおよびチオ硫酸カリウムからなる群から選択される塩であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
哺乳動物におけるシアン化物中毒治療用医薬製造のための、請求項９〜１７のいずれか一項で定義される組成物の使用。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モリブデン化合物含有組成物、新規モリブデン化合物、キットおよびその製造方法に関する。本発明は特に、哺乳動物、特にヒトのシアン化物中毒の治療に使用するためのモリブデン化合物を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
偶然または故意の暴露によるシアン化物中毒を効率的に集団治療することは、公衆衛生上極めて重要である。シアン化物中毒は急激であり、治療の選択肢も限られていることから、生存率は低い。
【０００３】
シアン化物は、燻蒸、電気めっき、採鉱などの工業的分野で使用されている。自殺や殺人、戦争に使用されることもよく知られており、ビル火災における有毒物質としても認識が高まってきている。シアン化物は含窒素ポリマーの燃焼により生成するが、含窒素ポリマーは、木材などの天然材料と比べて急速に一酸化炭素とシアン化物とを放出する（Alarie, Y., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 25, 325-347 (1985)参照）。したがって、シアン化物は、無制御なビル火災全般における、一般市民の吸入傷害に共通する原因であると考えられている（Anderson, R. A. and Harland, W. A., Med. Sci. Law 22, 35-40 (1982); and Ballantyne, B. In Clinical and Experimental Toxicology of Cyanides (B.  Ballantyne and T. Marrs, Eds.), pp. 248-291 (1974); and in Clark, C. J., Campbell, D., and Reid, W. H., Lancet 1, 1332-1335. and same authors in Hum. Toxicol. 6, 139-145 (1981); and in Silverman, S. H., Purdue, G. F., Hunt, J. L., and Bost, R. O., J. Trauma 28, 171-176 (1988)参照）。
【０００４】
世界保健機関（ＷＨＯ）などいくつかの国際組織は、シアン化物を、ヒトの健康や環境に影響を及ぼす恐れのある優先化学物質に指定している。
【０００５】
シアン化物は、ロダネーゼ酵素の活性部位に存在するシステイン２４７により肝臓で自然に代謝される。ロダネーゼはスルファンプールからの硫黄供給により活性化されてシステインパーチオール（−ＳＳＨ）を形成し、これがシアン化物と瞬時に反応して無毒のチオシアン酸塩を形成する。シアン化物への高暴露の場合、シアン化物を代謝するための自然基質は急速に枯渇する。シアン化物は、チトクロームｃオキシダーゼの特異的阻害剤であり、組織中毒性低酸素症を引き起こし、嫌気的細胞による乳酸アシドーシスにつながる（Steven J. Baskin, and Thomas G. Brewer, “Cyanide Poisoning,” “Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare, ” (Frederick R. Sidell, COL Ernest T. Takafuji, and COL David R. Franz, Eds.) and “Textbook of Military Medicine: Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare”, (BG Russ Zajtchuk and COL Ronald F. Bellamy, Eds.), Office of the Surgeon General, Walter Reed Army Medical Center, Washington, D.C. (1997)参照）。
【０００６】
シアン化物の致死血中濃度は、暴露の程度と血中酸素量に依存することが明らかになっている。例えば、高濃度の一酸化炭素を同時に吸入することにより酸素が欠乏すると、ＬＴ５０は１０倍に上昇する（Alarie, Y., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 25, 325-347 (1985)参照）。
【０００７】
シアン化物の致死量は１．０〜６．０ｍｇ／ｌ（４０〜２００μＭ）という広い範囲にありうる。毒性量のシアン化物の半減期は、暴露直後に救急車内で行われた血液検査によれば１時間とされており（S. W. Borron, B. Megarbane., F.J. Baud., Case 6-2004: Severe Burns from a Nightclub Fire. New England Journal of Medicine 2004, 2314参照）、致命的でないケースの研究では、３時間という半減期が得られている（Barillo, D. J., J. Burn Care Rehabil., 15, 46-57 (1994); Kratz, A., Ferraro, M., Sluss, P., Lewandowski, K. B., Laboratory Reference Values. N. Engl. J. Med., 351, 1548-1563 (2004)参照）。より低い濃度の吸入による暴露または経口摂取の場合、残存時間は約３０分である（参照）。人体からのシアン化物の生物学的解毒は、多様な副次的経路を通じて行われる（Keilin, D., Proc R Soc Lond [Biol] 106:418-444 (1930); Isom, G. E. and Way J. L., Toxicol. Appl. Pharmacol. 74:57-62 (1984)参照）。
【０００８】
ロダネーゼ酵素によるシアン化物の自然解毒速度は、測定により０．０１７ｍｇ／ｋｇ・分とされている（McNamara, B. P., Estimation of the toxicity of hydrocyanid acid vapors in man. (Edgewood Arsenal Technical Report No. EB-TR-76023, Army Department (1976))参照）。シアン化物中毒は急速に進行するため、暴露直後に処置を行うことが理想的である。解毒剤や治療薬は、酸素やチオ硫酸塩とともに投与されることが多い。
【０００９】
シアン化物中毒を治療するための従来のアプローチは、以下のグループに分類できる。
【００１０】
メトヘモグロビン誘導物質
このグループには亜硝酸アミル、亜硝酸ナトリウム、およびＤＭＡＰすなわち４−ジメチルアミノフェノールが含まれる。亜硝酸塩類はヘモグロビンを酸化してメトヘモグロビンとする。メトヘモグロビンは、酸素に対するよりもシアン化物に対して高い親和性を有する。メトヘモグロビンはシアン化物とのキレートを形成し、酸素運搬能を失ってシアノメトヘモグロビンとなり、低血圧を引き起こすことが知られている（Hall and Kulig 1989参照）。一酸化炭素の吸入によって生成するカルボキシヘモグロビンが酸素を奪うため、シアン化物中毒を治療する目的でメトヘモグロビンを形成する薬剤を使用することは、被害者の致死率を上昇させることが明らかになっている（Moore, S. J., Norris, J. C., Walsh, D. A., Hume, A. S., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 242(1), 70-74, (1987)参照）。ＤＭＡＰすなわち４−ジメチルアミノフェノールは、酸素欠乏症や無酸素症を招く危険性が著しく高いことから、重症シアン化物中毒にのみ用いられ（Baskin and Brewer参照）、火災の被害者の処置には適さない。亜硝酸塩類とチオ硫酸塩との組み合わせは、米国で最もよく用いられてきた治療薬である。
【００１１】
キレート剤
このグループにはビタミンＢ１２誘導体およびＥＤＴＡが含まれる。ヒドロキソコバラミン（ビタミンＢ１２）は目立った副作用のないシアン化物キレート剤である。ヒドロキソコバラミンは、２００６年１２月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によってＣｙａｎｏｋｉｔ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓａｎｔｅ  ｓ．ａ．ｓ．）における使用が承認された。治療に必要な用量は患者１人あたり５〜２０ｇである。有害事象としては、皮膚がピンクから赤へ変色したり、尿が赤くなったりすることが報告されているが、これらは数日で回復する（S. W. Borron, F. J. Baud, B. Megarbane, C. Bismuth, Am. J. Emer. Med., 25, 551-558, (2007)参照）。この化合物は無毒であり、ヨーロッパで広く用いられている。欠点としては、有効期間が短いこと、光に敏感であること、また高価であることが挙げられる。この化合物は集団治療には適さない。エデト酸ジコバルト（コバルトＥＤＴＡまたはＫｅｌｏｃｙａｎｏｒ）は、亜硝酸ナトリウムとチオ硫酸ナトリウムの併用よりも効果的であるが、シアン化物非存在下のコバルトには強い毒性があるため、シアン化物中毒であるという確証がなければ、コバルトＥＤＴＡなどを用いた治療は行わない。コビナミドについては、臨床試験に向けた研究が進められている（Brenner, M., Kim, J. G., Lee, J., Mahon, S. B., Lemor, D., Ahdout, R., Boss, G. R., Blackledge, W., Jann, L., Nagasawa, H. T., Toxicol Appl Pharmacol, 248:269-276 (2010)参照）。コビナミドは高溶解性のビタミンＢ１２前駆体であり、Ｃｙａｎｏｋｉｔ（登録商標）よりも効果が高く、シアン化物と化学量論的に反応する。
【００１２】
他の治療薬
このグループには、チオ硫酸塩およびメルカプトピルビン酸塩プロドラッグが含まれる。チオ硫酸塩は長く適応外であったが、現在はＦＤＡの認可の過程にある。チオ硫酸塩は、シアノメトヘモグロビンから徐々に放出されるシアン化物と反応し、チオシアン酸塩を形成する。チオ硫酸塩を用いた治療においては、大量を静脈内に投与することが必要であり（Ivankovich, A. D., Braverman, B., Kanuru, R. P., Heyman, H. J., and Paulissian, R., Anesthesiology, 52, 210-216 (1980)参照）、約１２ｇ／１０分が現在の標準である。また、チオ硫酸塩は火災の被害者の酸素運搬能に影響を与えないことから、チオシアン酸塩形成を促進する他の治療薬と併用されることが一般的である。チオ硫酸塩とシアン化物との反応速度は非常に遅く、チオ硫酸塩単独では救命に及ばない。メルカプトピルビン酸塩プロドラッグ（スルファンゲン）は最近開発された薬剤であり、安全かつ中程度の有効性を有するとされている。静脈内に投与されると、β−メルカプトピルビン酸サルファトランスフェラーゼの働きにより活性薬物に変換される。幾分不安定であることが欠点である（Brenner, M., Kim, J. G., Mahon, S. B., Lee, J., Kreuter, K. A., Blackledge, W., Mukai, D., Patterson, S., Mohammad, O., Sharma, V. S., Boss, G., Ann. Emerg. Med., 55:32-362 (2009)）。
【００１３】
当技術分野において公知の上記治療薬には、大量投与が必要、毒性リスクがある、またはＩＶ投与が必要という共通点がある。
【００１４】
したがって、煙吸入や産業事故による複数の被害者の治療に適した、無毒の化合物を少量投与するだけで済む、新規なシアン化物中毒治療薬が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって本発明の目的は、シアン化物中毒の治療に使用するための新規な化合物、組成物、およびキットを提供することであり、無毒の化合物を少量投与するだけで、上記した先行技術の問題を解決することである。
【００１６】
すなわち、本発明の一態様は、下記式の新規モリブデン化合物：
【化１】
0006483096.tif 000002
に関し、特に、哺乳動物、好ましくはヒトのシアン化物中毒治療におけるその使用に関する。
【００１７】
本発明の別の一態様は、哺乳動物におけるシアン化物中毒の治療に使用するための、下記式のモリブデン化合物：
【化２】
0006483096.tif 000003
（式中、
ＸはＳまたは結合であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、炭素数３〜１２の単糖または二糖、天然アミノ酸、炭素数１〜５のアルキルで置換された第一級、第二級または第三級アミン、Ｏ、Ｓ、ＣＨ３Ｓ−またはＮで置換されていてもよい炭素数１〜５のモノカルボン酸またはジカルボン酸、炭素数１〜５のチオカルボン酸またはジカルボン酸、窒素に結合している側鎖が炭素数１〜５のアルキルである炭素数１〜５の第一級、第二級または第三級アミド、ＥＤＴＡなどの錯化剤、シアン化物、チオシアン酸塩（ＳＣＮ−）、亜硫酸塩、ジスルフィドまたはテトラスルフィドからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）
を含有する組成物に関する。
【００１８】
さらなる一態様において本発明は、シアン化物中毒の治療に使用するための、本発明の化合物または組成物を含むキットを提供する。
【００１９】
本発明のさらにまた別の一態様は、本発明の新規モリブデン化合物の製造方法であって、
１）下記式を有するモリブデン化合物：
【化３】
0006483096.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、炭素数３〜１２の単糖または二糖、天然アミノ酸、炭素数１〜５のアルキルで置換された第一級、第二級または第三級アミン、Ｏ、Ｓ、ＣＨ３Ｓ−またはＮで置換されていてもよい炭素数１〜５のモノカルボン酸またはジカルボン酸、炭素数１〜５のチオカルボン酸、窒素に結合している側鎖が炭素数１〜５のアルキルである炭素数１〜５の第一級、第二級または第三級アミド、ＥＤＴＡなどの錯化剤、シアン化物、チオシアン酸塩（ＳＣＮ−）、亜硫酸塩またはテトラスルフィドからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）
を不活性雰囲気下の不活性溶媒中に懸濁すること；
２）不活性雰囲気下の乾燥不活性溶媒中、塩基の存在下でチオ二酢酸を添加し、反応混合物を撹拌すること；
３）溶媒を蒸発させて沈殿物を生じさせること；
４）沈殿物をエタノールおよびエーテルで洗浄し、
任意に再結晶化を行うこと；ならびに
５）下記式を有する新規モリブデン化合物を得ること
【化４】
0006483096.tif 000005
を含む製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（Ａ）はシアン化物からチオシアン酸塩への変換を示す図である。チオ硫酸塩とシアン化物との比を３種類設定し、変換を時間の関数として示している。（Ｂ）は図１（Ａ）の２０分のデータについて、反応収率を比の関数として示している。このデータの収集に使用した触媒は、化合物［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］である。この化合物はシアン化物と瞬時に反応し、チオシアン酸塩を形成する。溶液中のほとんどすべてのシアン化物がチオシアン酸塩となっていることが理解できる（計８３％）。
【図２】チオシアン酸塩反応の収率を、チオ硫酸塩とシアン化物との比の関数として示す図である。線は説明のために引いたものである。データは反応の２０分後に収集した。チオ硫酸塩単独の場合およびシアン化物単独の場合を除いて、触媒量はいずれの実験においても１０ｍｏｌ％［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］である。チオ硫酸塩濃度はチオシアン酸塩生成量に影響するため、化学量論量よりも多くのチオ硫酸塩を使用することは有利である。３〜１０倍という過剰量を用いると、チオシアン酸塩の形成は漸増する。しかし、最大の効果が、触媒であるモリブデン化合物との触媒反応に関連することは明らかである。したがって、触媒を用いた反応と比較して、触媒を用いなければ、シアン化物とチオ硫酸塩との反応において、相当量のチオシアン酸塩は２０分では生成しない。
【図３】新たに単離したラット肝細胞におけるＡＴＰ活性に及ぼすシアン化カリウムの影響を示す図であり、ＡＴＰ活性は生存率と相関するものである。予想通り、ＫＣＮ濃度が高い場合、％生存率は時間とともに低下する。曲線は、チオ硫酸塩と試験化合物とを用いた実験におけるＫＣＮの適切な濃度を決定するために使用した。５ｍＭおよび１０ｍＭでは２時間後の生存率が極めて低く、濃度２ｍＭでは、時間の経過とともに生存率が急激に低下する。
【図４】新たに単離したラット肝細胞における、ＡＴＰ活性に及ぼす（Ｅｔ４Ｎ）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ８］の影響を示す図であり、ＡＴＰ活性は生存率と相関する。モリブデン硫黄化合物のヒトにおける耐容性は良好であるが、ここに示すように、適切な塩を選択することは重要である。この化合物は低濃度での耐容性は非常に良いが、濃度０．５ｍＭでは生存率の急速な低下が観測される。この挙動は、高濃度においてアルキルアンモニウム塩の影響がより大きいことによる。
【図５】新たに単離したラット肝細胞における、ＡＴＰ活性に及ぼす（Ｅｔ４Ｎ）［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ５Ｈ１１ＮＯ２Ｓ）］の影響を示す図であり、ＡＴＰ活性は生存率と相関する。これはアルキルアンモニウム錯体の別データである。高濃度における耐容性の低下が、錯体のメチオニンリガンド（天然アミノ酸）よりも主としてアルキルアンモニウム塩に起因することが再確認される。
【図６】新たに単離したラット肝細胞における、ＡＴＰ活性に及ぼすＫ２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］の影響を示す図であり、ＡＴＰ活性は生存率と相関する。チオ二酢酸錯体のカリウム塩は、試験濃度にかかわらず、極めて良好な耐容性を示している。時点ごとのデータのエラーバーが大きくなっているが、これは、実験間の細胞密度のばらつきによる（実験プロトコル参照）。
【図７】毒性と有効性の試験から得られたデータを示す図である。最上段が、陽性対照すなわち正常増殖細胞であり、これを１００％としている。次が、「解毒剤」と呼ばれるモリブデン硫黄化合物すなわちＫ２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］である。生存率が９５％を超えることから、無毒であることがわかる。次はシアン化物であり、約５０％の細胞が生存するように濃度を調節した。チオ硫酸塩単独では、解毒剤よりも安全性が低いように見受けられる。チオ硫酸塩とシアン化物と化合物とを併用すると、シアン化物単独や対照化合物ＣｏＣｌ２と比較して、約８４％という優れた生存率が明確に示された。
【００２１】
したがって、本化合物は無毒であると結論づけられた。モリブデン化合物は、単独ではシアン化物と化学量論的に反応するに過ぎず、極めて有効とまでは言えないが、チオ硫酸塩と併用すると、安全かつ迅速な投与のための優れた代替治療薬となる。
【００２２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
先に述べたように、上記の公知の治療薬には、大量投与が必要、毒性リスクがある、またはＩＶ投与が必要という共通点がある。煙吸入や産業事故による複数の被害者の治療に適した、無毒の化合物を少量投与するだけで済む、新規なシアン化物中毒治療薬が必要とされていることは明らかである。理想的な投与方法は筋肉内（ＩＭ）投与であり、これは、多数の人々への投与や自己投与が容易であることによる。
【００２４】
そこで本発明者らは、どのようにして短時間で多数の受傷者に解毒剤を投与するかを考慮しつつシアン化物中毒治療薬の開発を行った。すなわち、触媒を利用するアプローチが筋肉内投与に最も有利であると考え、特に硫黄供与体を用いたモリブデン硫黄活性部位による触媒的シアン化物解毒の研究を行った（スキーム１）。
【００２５】
すなわち、本発明者らは、下記スキーム１に示す触媒反応に基づく方法を開発した。
【化５】
0006483096.tif 000006
【００２６】
したがって本発明の目的は、シアン化物中毒の治療に使用するための組成物およびモリブデン化合物であって、耐容性の良好な化合物を最小量使用することにより、酸素輸送を損なうことなく潜在毒性を最小にする組成物およびモリブデン化合物を提供することである。本発明の一態様において、前記シアン化物解毒治療薬は、２つの成分、すなわちＭｏ−Ｓ化合物と、チオ硫酸塩などの硫黄源とを含む。チオ硫酸塩は長年にわたって臨床的には「適応外」であったが、２０１２年にシアン化物中毒治療薬としてＦＤＡに認可申請されている。
【００２７】
前記触媒系は、（１）モリブデン錯体とシアン化物との反応によるチオシアン酸塩とモリブデンスルフィドの形成、および（２）モリブデンスルフィドとチオ硫酸塩などの硫黄源との反応、の２つの反応式で表すことができる。正味の反応は、シアン化物とチオ硫酸塩との反応によるチオシアン酸塩と亜硫酸塩の形成である。
【００２８】
本発明者らは好適な硫黄架橋モリブデン二量体化合物に注目した。理論に拘束されるものではないが、「硫黄架橋」は、硫黄原子の転移を促進し、分子配列をゆがめることなく新しいリガンドを受容することのできる空の配位部位を形成することが知られていることから、興味深い。本発明のモリブデン化合物は、一般式：（カチオン）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ２（Ｓ２）（リガンド）］を有しうる。ジスルフィドリガンドは触媒反応の活性部位であり、一方第２のモリブデンは多様なリガンドを受容して、単座、二座または三座配位になりうる。モリブデン錯体化合物の例として、スキーム２の左に示す（Ｅｔ４Ｎ）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ８］（１）や、右に示す［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］（２）がある。
【化６】
0006483096.tif 000007
【００２９】
シアン化物とチオ硫酸塩とを、両者の比を変えて、１０％ｍｏｌの錯体（２）の存在下で反応させたところ、チオ硫酸塩濃度が高いほど、チオシアン酸塩の反応収率は増加した。図２に、チオ硫酸塩とシアン化物の異なる４つの比における結果を示す。また、錯体（２）を使用せずに異なる２つの比において同じ反応を行った場合の反応収率（黒四角）も示した。
【００３０】
スルフィド錯体の反応速度の決定には、様々な濃度におけるシアン化物と（２）との反応から測定した初期速度を利用することを試みた。本発明者らは、これらの反応において、チオシアン酸塩が錯体（２）の濃度に関して化学量論的に生成することを発見した。本発明者らは、全シアン化物量の減少はチオシアン酸塩の形成によるものであり、チオ硫酸塩を用いなければ化学量論量のチオシアン酸塩のみが得られることを、別途確認した。したがって、スルフィドおよびチオシアン酸塩の形成は、この系で観察される触媒的チオシアン酸塩形成における迅速な反応であると思われる。
【００３１】
触媒として錯体（２）を用いた、チオ硫酸塩とシアン化物との比に関する試験（図２参照）から、チオ硫酸塩の濃度がチオシアン酸塩の生成量に影響し、化学量論量を超えるチオ硫酸塩を使用すると有利であることが明らかになった。しかし最も顕著な効果は、明らかに、モリブデン化合物の触媒効果に関連している。
【００３２】
有効性と安全性に関する複合的な試験から、使用したモリブデン化合物の毒性は極めて低く、事実上無毒であることがはっきりと示された。モリブデン化合物は、単独ではシアン化物と化学量論的に反応するに過ぎず、極めて有効とまでは言えないが、チオ硫酸塩との併用においては、安全かつ迅速な投与のための優れた代替治療薬となる（図７参照）。
【００３３】
シアン化物は、金属と結合する際には強力な供与分子であるため、弱い供与体リガンドと置換可能であり、金属錯体のリガンド交換反応において、エチレンジアミン（ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）などの二座の中性リガンドとも置換しうる。用いられているリガンドのいくつかはシアン化物の高濃度条件下においてシアン化物に置き換わり、その結果、触媒は、該リガンドを２〜３個のシアン化物リガンドに交換することによって、また残りのシアン化物をチオシアン酸塩へと触媒的に変換することによってシアン化物を除去するという、二重の機能を果たすと考えられる。本発明者らは、図１Ｂにおいて、触媒を用いたこの反応によって３つのＤＭＦリガンドと２つのシアン化物リガンドとが交換され、触媒の働きによって８３％のシアン化物が溶液から除去されことを示した。残りの１７％（±測定誤差）は、モリブデンに結合したシアン化物であることが確認された。過剰のシアン化物を［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］と反応させ、生成物をＥｔ４Ｎ＋塩として沈殿させることにより、二量体である（Ｅｔ４Ｎ）４［Ｍｏ４Ｏ４Ｓ４（ＣＮ）４］の結晶を単離した。触媒条件で生成するスルフィド部分（別のリガンドとの錯体、Coucouvanis and Lane, 1991）が、高い濃度で強制的な析出を行う条件下で二量体を形成することは公知である。シアン化物にはこのような性質があるため、触媒的反応のみで不斉錯体を単離することはできない。
【００３４】
したがって、未反応のコントロールとの比較において、無毒の化合物は何ら影響を示さないであろう。ＣｏＣｌ２の場合からわかるように、有毒化合物を用いると、ＡＴＰ活性はシアン化物の場合よりも弱くなる。本発明の化合物には毒性がなく、チオ硫酸塩との併用において優れた生存率が達成される。同じ化合物をマウスに投与し、段階的用量増加試験を行った。マウスにおけるこの化合物の安全用量は５０ｍｇ／ｋｇであることが見出された。比較してみると、イブプロフェンの子供に対する安全用量は１０ｍｇ／ｋｇである（ｄｒｕｇｓ．ｃｏｍ）。
【００３５】
毒性および薬学的許容性は、モリブデン化合物のリガンドに依存する。そこで本発明者らは、哺乳動物、特にヒトのシアン化物中毒の治療における使用に特に適した低毒性リガンドを有するモリブデン化合物を調製した。
【００３６】
従来のシアン化物中毒治療薬および最新の治療薬（新規治療薬または臨床試験段階の治療薬）について、上記の背景技術において検討した。通常のシアン化物中毒治療薬はいずれも、上記したように、投与に手間がかかったり訓練を要したり、被害者に危険性をもたらしたり、さらには非常に高額であるという理由で、急性中毒や多人数の集団の治療には適していない。
【００３７】
臨床的に、救急車内で十分なシアン化物治療を施すことができ、現場で集団の治療を行うための例えばエピペンや類似の器具の形態をした緊急対応キットが利用できれば、煙を吸入した患者や産業事故による受傷者を迅速かつ安全に治療する新しい可能性が開かれるであろう。エピペンは、先端にバネ式の針を有する器具であり（滅菌フィルムで覆われている場合もある）、針を患者の皮膚に刺すことにより、薬剤を皮下または筋肉内に投与できる。現在のほとんどの救急処置室には、シアン化物中毒患者１人を治療するための静脈内投与用キットが、最大１つ備えられているに過ぎない。
【００３８】
本発明者らは、シアン化物中毒の治療に使用するためのモリブデン化合物ならびにこのようなモリブデン化合物を含有する組成物およびキットを開発した。該化合物はシアン化物の存在下でチオシアン酸塩を触媒的に形成するため、必要とされる化合物は少量で済む（最小限の毒性）。特別な訓練の必要なく、ＩＭ投与により複数の被害者を迅速に治療することができる。この治療薬は小分子のモリブデン硫黄化合物であり、チオ硫酸塩とともに投与され、酸素輸送を損なうことなく作用する。予備試験のデータによると、シアン化物の８３％が２０分でチオシアン酸塩として溶液から除去された。シアン化物中毒による死亡は、毒物の吸入濃度にもよるが、１時間以内に起こると推定される。シアン化物濃度が８３％下がれば、致死的毒性は低レベルの毒性に変わる。
【００３９】
新規モリブデン化合物、およびシアン化物中毒を治療するためのその使用
したがって、第１の態様において、本発明は下記式の新規モリブデン化合物を提供する。
【化７】
0006483096.tif 000008
【００４０】
本発明の新規モリブデン化合物は、任意の適切な塩の形態であってよい。該塩は、任意の薬学的に許容される塩であってよく、そのような塩であることが好ましい。
【００４１】
一実施形態において、本発明の新規化合物は塩として提供され、そのカチオンはナトリウム、カリウム、Ｒ４Ｎ（Ｒは水素、メチル、エチル、プロピルまたはブチルから選択される）、メグルミン、グルコサミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、トロメタミン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−メチルアミノエタノールおよびＮ，Ｎ−ジメチルアミノエタノールからなる群から選択される。
【００４２】
別の一実施形態において、本発明の新規モリブデン化合物は、哺乳動物のシアン化物中毒の治療における、前記新規化合物および薬学的に許容されるその任意の塩の使用を提供する。一実施形態において、哺乳動物は飼育動物である。別の実施形態において、哺乳動物は家畜である。特定の一実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４３】
シアン化物中毒の治療に使用するためのモリブデン含有組成物
本発明はまた、シアン化物中毒の治療に使用するためのモリブデン化合物を含有する組成物に関する。
【００４４】
すなわち、本発明はその一態様において、哺乳動物におけるシアン化物中毒の治療に使用するための、下記式のモリブデン化合物：
【化８】
0006483096.tif 000009
（式中、
ＸはＳまたは結合であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、炭素数３〜１２の単糖または二糖、天然アミノ酸、炭素数１〜５のアルキルで置換された第一級、第二級または第三級アミン、Ｏ、Ｓ、ＣＨ３Ｓ−またはＮで置換されていてもよい炭素数１〜５のモノカルボン酸またはジカルボン酸、炭素数１〜５のチオカルボン酸、窒素に結合している側鎖が炭素数１〜５のアルキルである炭素数１〜５の第一級、第二級または第三級アミド、ＥＤＴＡなどの錯化剤、シアン化物、チオシアン酸塩（ＳＣＮ−）、亜硫酸塩、ジスルフィドまたはテトラスルフィドからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）
を含有する組成物を提供する。
【００４５】
特定の一実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるシアン化物中毒の治療に使用するための、下記式を有するモリブデン化合物：
【化９】
0006483096.tif 000010
（式中、ＸはＳまたは結合であり；
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、メチオニン、システイン、スレオニン、セリン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メチルスルフェニルコハク酸塩、メルカプトコハク酸塩、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、ジスルフィドもしくはテトラスルフィド、酢酸塩、チオ二酢酸、アンモニウムまたはジエチルアミンからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）
を含有する組成物を提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態において、前記組成物はモリブデン化合物を含有し、Ｘは結合である。別の一実施形態において、ＸはＳである。
【００４７】
さらにまた別の一態様において、本発明は、哺乳動物におけるシアン化物中毒の治療に使用するための、下記式を有するモリブデン化合物：
【化１０】
0006483096.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、メチオニン、システイン、スレオニン、セリン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メチルスルフェニルコハク酸塩、メルカプトコハク酸塩、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、ジスルフィドもしくはテトラスルフィド、酢酸塩、チオ二酢酸、アンモニウムまたはジエチルアミンからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）
を含有する組成物を提供する。
【００４８】
さらなる一実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるシアン化物中毒の治療に使用するための、下記式を有するモリブデン化合物：
【化１１】
0006483096.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は共通して、メチオニン、システイン、スレオニン、セリン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メチルスルフェニルコハク酸塩、メルカプトコハク酸塩、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、ジスルフィドもしくはテトラスルフィド、酢酸塩、チオ二酢酸、アンモニウムまたはジエチルアミンからなる群から選択されるリガンドの１つであり、Ｒ３）
を含有する組成物を提供する。
【００４９】
本組成物は、静脈内投与または筋肉内投与に適した、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００５０】
したがって、一態様において、本発明の組成物は、ナトリウム、カリウム、Ｒ４Ｎ（Ｒは水素、メチル、エチル、プロピルまたはブチルのいずれかである）、メグルミン、グルコサミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、トロメタミン（ＴＲＩＳ）、Ｎ−メチルアミノエタノールまたはＮ，Ｎ−ジメチルアミノエタノールからなる群から選択されるカチオンを有する塩の形態である。
【００５１】
本発明において、用語「アミノ酸」または天然アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン、グルタミンおよびオルニチンなどの、一般的な、もしくは天然由来の任意のアミノ酸、またはその誘導体を意味する。
【００５２】
本発明のモリブデン化合物を含有する前記組成物は、シアン化物中毒の化学量論的治療またはシアン化物中毒の触媒的治療に用いることができる。シアン化物中毒の化学量論的治療において、前記モリブデン化合物は、体内に存在するシアン化物と化学量論的に反応して、チオシアン酸塩を形成する。シアン化物中毒の触媒的治療において、前記モリブデン化合物は、硫黄供与体を利用するシアン化物からチオシアン酸塩（ＳＣＮ−）への変換を触媒する。
【００５３】
したがって、一態様において、本発明の組成物は、前記モリブデン化合物が、体重１ｋｇあたり０．５〜５０ｍｇ、例えば１〜５０ｍｇ、２〜５０ｍｇ、３〜５０ｍｇ、４〜５０ｍｇ、５〜５０ｍｇ、７．５〜５０ｍｇ、１０〜５０ｍｇ、１５〜５０ｍｇ、２０〜５０ｍｇ、２５〜５０ｍｇまたは体重１ｋｇあたり１〜４５ｍｇ、２〜４０ｍｇ、３〜３５ｍｇ、４〜３０ｍｇ、５〜２５ｍｇ、１０〜２０ｍｇ、１５〜２０ｍｇの用量で投与されるように提供される。
【００５４】
上記のように、本発明の組成物はさらに硫黄源を含有してもよく、この場合、前記モリブデン化合物は、チオシアン酸塩（ＳＣＮ−）を形成するための、硫黄源からシアン化物への硫黄の転移を促進する触媒として機能する。
【００５５】
したがって、別の一態様において、本発明は、上記のモリブデン化合物に加えて硫黄源を含有する組成物を提供する。さらなる一実施形態において、硫黄源は、硫黄、チオ硫酸塩、硫化アンモニウム、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリチオスレイトール、グルタチオンまたはジベンジルトリスルフィド（ＤＴＳ）からなる群から選択される。
【００５６】
特定の一実施形態において、硫黄源は、チオ硫酸ナトリウムまたはチオ硫酸カリウムからなる群から選択される塩である。
【００５７】
したがって、さらなる一態様において、本発明は、体重１ｋｇあたり０．２５〜２５ｍｇの用量のモリブデン化合物が、体重１ｋｇあたり１０〜２５０ｍｇの用量の硫黄源とともに投与されるような組成物を提供する。一実施形態において、前記モリブデン化合物は、体重１ｋｇあたり１〜２０ｍｇ、例えば２〜１５ｍｇ、３〜１０ｍｇ、４〜１０ｍｇ、５〜１０ｍｇの用量で投与され、前記硫黄源は、体重１ｋｇあたり２０〜２２５ｍｇ、例えば３０〜１７５ｍｇ、４０〜１５０ｍｇ、５０〜１２５ｍｇ、７５〜１００ｍｇの用量で投与される。
【００５８】
本発明の組成物は、投与前に溶解する固形物の形態で調製することができる。あるいは、本発明の組成物は、溶液または懸濁液として調製される。
【００５９】
さらに、本発明の組成物は、静脈内投与、経鼻投与、腹腔内投与または筋肉内投与してもよい。
【００６０】
本発明の組成物は、哺乳動物におけるシアン化物中毒の治療に好適であり、哺乳動物には飼育動物、家畜、特にヒトが含まれる。
【００６１】
さらに、本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、ビヒクルまたは薬学的に許容される別のアジュバントをさらに含有してもよい。
【００６２】
また、本発明の組成物は、薬学的に活性な１種以上のさらなる物質を含有してもよい。
【００６３】
シアン化物中毒の治療に使用するためのキット
上記のように、臨床的に、救急車内で十分なシアン化物治療を施すことができ、現場で集団の治療を行うための例えばエピペンや類似の器具の形態をした緊急対応キットが利用できれば、煙を吸入した患者や産業事故による受傷者を迅速かつ安全に治療する可能性が開かれるであろう。
【００６４】
したがって、別の一態様において、本発明は、シアン化物中毒の治療に使用するための、本発明の化合物または組成物を含むキットを提供する。
【００６５】
さらなる一実施形態において、前記キットは、エピペンの形態または類似の形態にある、すなわちエピペンまたは類似の器具であり、該器具は先端にバネ式の針を有し（滅菌フィルムで覆われている場合もある）、針を患者の皮膚に刺すことにより、薬剤を皮下または筋肉内に投与できる。
【００６６】
シアン化物中毒を治療する方法
さらに本発明は、飼育動物、家畜、特にヒトなどの哺乳動物におけるシアン化物中毒を治療する方法であって、治療有効量の本発明のモリブデン化合物、上記のモリブデン化合物を含有する組成物または上記のキットを投与することを含む方法を提供する。
【００６７】
本発明のモリブデン化合物を投与することを含むシアン化物中毒の治療法は、シアン化物中毒の化学量論的治療またはシアン化物中毒の触媒的治療であってよい。シアン化物中毒の化学量論的治療において、モリブデン化合物は、体内に存在するシアン化物と化学量論的に反応して、チオシアン酸塩を形成する。シアン化物中毒の触媒的治療において、モリブデン化合物は、硫黄供与体を利用するシアン化物からチオシアン酸塩（ＳＣＮ−）への変換を触媒する。
【００６８】
モリブデン化合物の製造方法
本発明はまた、本発明の新規モリブデン化合物の製造方法を提供する。
【００６９】
すなわち、さらにまた別の一態様において、本発明は下記式を有するモリブデン化合物の製造のための方法であって、
【化１２】
0006483096.tif 000013
１）下記式を有するモリブデン化合物：
【化１３】
0006483096.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立してまたは共通して、炭素数３〜１２の単糖または二糖、天然アミノ酸、炭素数１〜５のアルキルで置換された第一級、第二級または第三級アミン、Ｏ、Ｓ、ＣＨ３Ｓ−またはＮで置換されていてもよい炭素数１〜５のモノカルボン酸またはジカルボン酸、炭素数１〜５のチオカルボン酸、窒素に結合する側鎖が炭素数１〜５のアルキルである炭素数１〜５の第一級、第二級または第三級アミド、ＥＤＴＡなどの錯化剤、シアン化物、チオシアン酸塩（ＳＣＮ−）、亜硫酸塩またはテトラスルフィドからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３は電子対であってもよい）
を不活性雰囲気下の不活性溶媒中に懸濁すること；
２）不活性雰囲気下の乾燥不活性溶媒中、塩基の存在下で２，２’−チオ二酢酸を添加し、反応混合物を撹拌すること；
３）溶媒を蒸発させて沈殿物を生じさせること；
４）沈殿物をエタノールおよびエーテルで洗浄し、
任意に再結晶化を行うこと；ならびに
５）下記式を有する新規モリブデン化合物を得ること
【化１４】
0006483096.tif 000015
を含む方法を提供する。
【００７０】
上記方法は、ステップ１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立してまたは共通して、メチオニン、システイン、スレオニン、セリン、グルタミン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メチルスルフェニルコハク酸塩、メルカプトコハク酸塩、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、シアン化物、チオシアン酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩またはテトラスルフィド、アンモニウムまたはジエチルアミンからなる群から選択される１つまたは複数のリガンドであり、Ｒ３が電子対である条件下で行われてもよい。
【００７１】
本発明の方法は、ステップ２）において、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＣｓＯＨ、ｔＢｕＯＫ、ｔＢｕＯＮａ、ＮａＯＭｅ、ＫＯＭｅ、ｉＰｒＯＮａ、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、Ｅｔ４ＮＯＨおよびＢｕ４ＮＯＨからなる群から選択される塩基を用いて行われてもよい。
【００７２】
さらに、ステップ１）および２）における不活性溶媒は、アセトニトリル、水、ＤＭＦ、アセトン、ＴＨＦ、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ジオキサン、ＤＭＥ（ジメトキシケトン）、グリコール、ＭＥＫ（メチルエチルケトン）およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい。また、ステップ１）および２）における不活性雰囲気は、アルゴンまたは窒素であってよい。
【００７３】
本発明の方法のステップ２）における反応混合物は、０℃と使用する溶媒の沸点との間の温度、例えば０℃〜５０℃、１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃の温度において、１０分〜２時間、好ましくは３０〜６０分間、例えば３０分間または４５分間、撹拌してもよい。
【００７４】
本発明の方法の特定の一実施形態において、ステップ１）の出発化合物のＲ１、Ｒ２およびＲ３は共通してＤＭＦである。
【００７５】
上記の方法は一般に、本発明のモリブデン化合物の製造に適用できる。これは、例えばＲ１、Ｒ２およびＲ３が共通してＤＭＦである上記の出発化合物またはその他の任意適切な出発化合物をステップ１）で用い、前記方法のステップ２）において２，２’−チオ二酢酸の代わりに、最終生成物においてＲ１、Ｒ２およびＲ３として結合するリガンド分子を用いる合成例からも明らかである。
【００７６】
すなわち、さらなる一実施形態において、本発明の方法は、下記式を有するモリブデン化合物：
【化１５】
0006483096.tif 000016
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は共通して、システイン、メチオニン、セリン、またはスレオニンからなる群から選択される）の製造であって、上記方法のステップ２）において２，２’−チオ二酢酸代わりにシステイン、メチオニン、セリンまたはスレオニンを用い、１）の出発化合物が［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］であってもよい製造に用いることができる。
【００７７】
本発明の別の一態様によれば、メタセシス反応を行うと、前記錯体の別の有機溶解塩が生成しうる。例えば、Ｐｈ４Ｐ＋塩が生成することがある。
【００７８】
本発明の態様のうち１つにおいて記載された実施形態や特徴は、本発明の別の態様にも適用されることに留意されたい。
【００７９】
本明細書に引用した特許文献および非特許文献はいずれも、参照により本明細書に援用される。
【００８０】
本発明を、限定を目的としない以下の実施例においてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００８１】
合成例１および２は、特に明記しない限り窒素雰囲気下またはアルゴン雰囲気下で行った。錯体（Ｅｔ４Ｎ）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ８］は、文献（Coucouvanis and Toupadakis 1988）の記載に従って合成した。（Ｅｔ４Ｎ）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ８］から、錯体［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］を文献（Coucouvanis and Lane 1991）の記載に従って合成し、下記の一般的な方法による、一連の新規錯体の合成における出発原料として用いた。
【００８２】
合成例に使用する塩基は、水酸化物（ナトリウム、カリウム、セシウム）、ｔＢｕＯＫ、ｔＢｕＯＮａ、メトキシド（ＮａＯＭｅ、ＫＯＭｅ、ｉＰｒＯＮａ）、炭酸塩（Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３）、有機水酸化物（Ｅｔ４ＮＯＨ、Ｂｕ４ＮＯＨ）などである。したがってカウンターカチオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｅｔ４Ｎ＋、Ｂｕ４Ｎ＋である。溶媒は、リガンドやカウンターカチオンに応じて、アセトニトリル、水またはＤＭＦが用いられる。
【００８３】
実施例１
方法Ａ：［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］２−カリウム塩の合成
［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］（０．５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、蒸留し、脱ガスしたＤＭＦ４０ｍｌに懸濁した。この溶液に、アルゴン雰囲気下、２，２’−チオ二酢酸（０．１３ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）とｔＢｕＯＫ（０．２ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）との混合物の乾燥メタノール溶液を加えた。生成した溶液を３０分間撹拌した後、減圧下で溶媒を除去し、暗赤色の固形物をエタノールおよびエーテルで洗浄した。残渣を乾燥ＤＭＦ５０ｍｌに再度溶解し、ろ過した後、イソプロパノールを用いて沈殿させた。暗赤色の固形物をろ過により単離し、減圧下で乾燥させた。収量０．２７ｇ（６０％）。
【００８４】
方法Ｂ：［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］２−ナトリウム塩の合成
（Ｅｔ４Ｎ）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ８］（０．５ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４０ｍｌに溶解した。この溶液に、ヨウ素（０．１７ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ２５ｍｌ中に溶解させて得た溶液を加えた。ヨウ素添加終了後、炭酸ナトリウム（０．１４ｇ、１．３４ｍｍｏｌ）と２，２’−チオ二酢酸（０．１０ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）との混合物をメタノール１２ｍｌに溶解させた溶液を加えた。混合溶液を２時間撹拌し、ろ過した後、減圧下で溶媒を除去した。得られた固形物をアルコールで洗浄した後、乾燥ＤＭＦ３０ｍｌに再度溶解し、ろ過した後、エーテルを用いて沈殿させた。暗赤色の固形物をろ過により単離し、減圧下で乾燥させた。収量０．１９ｇ（５０％）。
【００８５】
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ｎ（ＣＯ２−）１６５８（ｖｓ）、ν（Ｍｏ＝Ｏ）；９２７（ｓ）、ｎ（Ｓ２２−）５２１（ｍ）、ｎ（Ｍｏ−Ｓｂ）４６２（ｗ）．
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄｍｓｏ−ｄ６）：３．５（ｂｒｏａｄ）．
ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ；ｅ、Ｍ−１ｃｍ−１：３１２（１３１７０）、４６４（１８００）．
【００８６】
式（ｃａｔ）ｍ［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｌ）ｎ］の化合物を同様の方法で合成した。式中、Ｌは単座、二座または三座配位リガンドであり、したがってｎは１、２または３となる。カチオンの数ｍは、Ｌまたはｎ・Ｌによって生じる全電荷に依存する。例えば、以下の化合物は、方法Ａにより調製してもよく、２，２’−チオ二酢酸は適切な量のＬで置換されている。
【００８７】
Ｌ＝メチオニン；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ν（ＣＯ２−）１６４９（ｖｓ）、ν（Ｍｏ＝Ｏ）；９２４（ｓ）、ν（Ｓ２２−）５１９（ｍ）、ν（Ｍｏ−Ｓｂ）４６５（ｗ）．
Ｌ＝セリン；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ν（ＣＯ２−）１６２９（ｖｓ）、ν（Ｍｏ＝Ｏ）；９３７（ｓ）、ν（Ｓ２２−）５１０（ｍ）、ν（Ｍｏ−Ｓｂ）４６３（ｗ）．
Ｌ＝スレオニン；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ν（ＣＯ２−）１６４９（ｖｓ）、ν（Ｍｏ＝Ｏ）；９３３（ｓ）、ν（Ｓ２２−）５１４（ｍ）、ν（Ｍｏ−Ｓｂ）４６５（ｗ）．
【００８８】
空気中で安定な合成経路
空気中で安定な合成経路を、溶媒として水を用いて確立した。
【００８９】
一般的手順：
［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］（０．５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を水（２０ｍｌ）に懸濁する。ロイシン（０．１２ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）とＮａ２ＣＯ３・１０Ｈ２Ｏ（０．１２ｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）とを１０ｍｌの水中で混合する。すべてが溶解し発泡が止まった後、溶液を上記の［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ＤＭＦ）３］懸濁液に滴下する。懸濁物は溶解し、透明な赤色溶液となる。これを乾固し、赤色固形物を吸引ろ過により回収し、アセトンおよびエーテルで洗浄する。化合物を風乾、凍結乾燥して、０．４１ｇの赤色固形物を得る（９０％）。
Ｌ＝ロイシン；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ν（ＣＯ２−）１６２１（ｖｓ）、１３８６（ｍｓ）、ν（Ｍ＝Ｏ）９４８（ｓ）、９３０（ｓ）、ν（Ｓ２２−）５２１（ｗ）、ν（Ｓ２−）ｂ４８１（ｗ）
Ｌ＝システイン；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ν（ＣＯ２−）１６３６（ｖｓ）、１３７１（ｍｓ）、ν（Ｍ＝Ｏ）９４５（ｓ）、９２９（ｓ）、ν（Ｓ２２−）５２６（ｗ）、ν（Ｓ２−）ｂ４６６（ｗ）
Ｌ＝シュウ酸塩；ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ）：ν（ＣＯ２−）１５９４（ｖｓ）、１３７１（ｍｓ）、ν（Ｍ＝Ｏ）９４４（ｓ）、９２６（ｓ）、ν（Ｓ２２−）５２１（ｗ）、ν（Ｓ２−）ｂ４６４（ｗ）
【００９０】
実施例２
［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ２（ＮＣＳ）４］２−テトラエチルアンモニウム塩の合成
（Ｅｔ４Ｎ）２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ８］（０．５ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）とＫＳＣＮ（０．２５ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を空気中で６０ｍｌのＤＭＦに懸濁した。この溶液に、ヨウ素（０．３４ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３０ｍｌ中に溶解させて得た溶液を加えた。ヨウ素添加終了後、混合溶液を２時間撹拌し、ろ過した後、生成物をエタノールの添加により沈殿させた。得られた固形物をろ過により単離し、減圧下で乾燥させた。アセトニトリル／エタノールから再結晶して、生成物を赤色微結晶性固形物として得た。収量０．４５ｇ（８０％）。
【００９１】
ＦＴ−ＩＲ（ＫＢｒ、ｃｍ−１：ν（ＮＣＳ−）２０８３、（ｖｓ）、ν（Ｍｏ＝Ｏ）９４９；ν（Ｍｏ−Ｓｂ）４７２．ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ；ｅ、Ｍ−１ｃｍ−１：３０８（１２３００）、３５０（ｓｈ）．ＭＳ−ＥＳＩ：ｍ／ｚ；［Ｍ２−＋Ｅｔ４Ｎ＋］−：７０９．５５、［Ｍ＋−（Ｅｔ４Ｎ＋＋ＳＣＮ−）］−；６５０．８２
【００９２】
実施例３
シアン化物とチオ硫酸塩との反応における、触媒としての本発明のモリブデン化合物のインビトロ試験
触媒活性試験：
被験化合物をベロナール緩衝液に溶解して、濃度１ｍＭの溶液とした。ベロナール緩衝液（ｐＨ７．４）はストック溶液として調製したものである。チオ硫酸塩溶液は、１８ＭΩ・ｃｍのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて使用前に調製した。まず、チオ硫酸塩を前記化合物溶液に添加し、次いでシアン化物を添加することにより、反応を行った。反応は、密閉した試験管中、２５℃で行った。反応時間は、シアン化物を添加してからの時間を記録した。一定の時間間隔で、試料のサンプリングを行った。シアン化物以外の全成分を含む試料を、ブランクとして用いた。生成したチオシアン酸塩の定量は、ＦｅＳＣＮ２＋検量線を用い、４４７ｎｍでの吸収を測定する比色分析により行った。シアン化物の全濃度を反応開始時と終了時に測定し、シアン化物が実験中に気化していないことを確認した。分析のための試料のサンプリングと調製はドラフトチャンバー内で行った。
【００９３】
ｐＨ９．２での反応を、炭酸塩緩衝液を用いて同様に行った。溶液中に存在するチオ硫酸塩とシアン化物との比がチオシアン酸塩の形成速度に及ぼす影響について、適切な試薬濃度において同様に試験した。実践上の理由から触媒濃度はいずれの試験においても１０％（ｍｏｌ）に保ち、シアン化物濃度とチオ硫酸塩濃度とを変化させた。シアン化物とチオ硫酸塩との反応性のみによる試験は、触媒を使用しないこと以外は同様に行った。溶液のイオン強度を計算すると約０．２Ｍであった。
【００９４】
化学量論的活性試験：
被験化合物をベロナール緩衝液に溶解して、濃度１ｍＭの溶液とした。ベロナール緩衝液（ｐＨ７．４）はストック溶液として調製したものである。シアン化物溶液を前記化合物溶液に加えた。反応は、密閉した試験管中、２５℃で行った。反応時間は、シアン化物を添加してからの時間を記録した。シアン化物以外の全成分を含む試料を、ブランクとして用いた。一定の時間間隔で、試料のサンプリングを行った。生成したチオシアン酸塩の定量は、ＦｅＳＣＮ２＋検量線を用いた比色分析により行った。シアン化物の全濃度を反応開始時と終了時に測定し、シアン化物が実験中に気化していないことを確認した。分析のための試料のサンプリングと調製はドラフトチャンバー内で行った。ｐＨ９．２での反応を、炭酸塩緩衝液を用いて同様に行った。
【００９５】
シアン化物の定量
ＡＳＴＭ２０３６（方法Ｄ）に記載の比色分析法を用いて、水溶液中のシアン化物濃度を定量した。この方法を用いて、種々の化合物とシアン化物との反応性試験を実施した。被験モリブデン化合物は、４５０ｎｍを超える波長に吸収を有さない。この化合物を用いて調製した試料は５８２ｎｍに吸収を有するため、存在する他の着色物質を妨害することはない。色は数時間安定しており、溶液の分析は発色後３０分以内に行った。シアン化カリウム０．６５１ｇを正確に量り、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解することにより、検量線を作成した。希釈を行い、０．２ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度範囲の標準液を得た。
【００９６】
結果を図１Ａ、１Ｂおよび２に示す。異なる２種のｐＨ値に緩衝化したシアン化物とモデル錯体の、化学量論的反応の結果を表１に示す。
【表１】
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【００９７】
化学量論的活性試験：
表２に記載した本発明の錯体は、ｐＨ７．４のベロナール緩衝液中で１当量のシアン化物と反応し、１時間後に１当量のチオシアン酸塩を形成した。生成したチオシアン酸塩を、検量線を用いてＦｅＳＣＮ２＋として定量した。比較のための錯体（表２のエントリー２）についても測定を行ったが、この錯体は利用可能な硫黄を有さないため、チオシアン酸塩を形成しないと考えられた。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
実施例４
本発明のモリブデン化合物の毒性と有効性の試験
肝細胞モデル
シアン化物に対して頑健であることから肝細胞を選択した。肝細胞はロダネーゼを含有するため、適切なコントロールを用いて、細胞中のロダネーゼの自然活性によるバックグラウンドを評価した。有効性試験では、コントロールプロトコルを用いて硫黄供与体の能力を評価し、以下について、初代肝細胞中のＡＴＰレベルを測定した。
・チオ硫酸塩およびシアン化物
・モリブデン硫黄化合物
・モリブデン硫黄化合物およびシアン化物
・モリブデン硫黄化合物、チオ硫酸塩およびシアン化物
【０１００】
ロダネーゼに関して無毒な化合物は、ロダネーゼコントロールやチオ硫酸塩コントロールとの比較において何ら影響を示さないか、あるいはシアン化物への暴露後、チオ硫酸塩コントロールと比較して硫黄転移が向上して、ＡＴＰ活性が回復することとなる。このモデルでは、シアン化物単独の実験（バックグラウンド）との比較において細胞生存率が向上することで、有効性が定性的に観測される。濃度は、５０％細胞死を目安に設定し、実験条件下で細胞死の上昇または低下が観測できるようにした。
【０１０１】
実験手順
シアン化物解毒剤のインビトロ評価のために、ラット肝細胞を確立された手法で単離し、文献記載の方法で単層として培養した（S. J. Gee, C.E. Green, and C. A. Tyson. Cyanide-induced cytotoxicity to isolated hepatocytes. Toxic. In Vitro, 4, 37-45 (1990)）。このモデルを使用した試験は、ＡＴＰの低下を指標として、公知のシアン化物解毒剤の有効性を再現性よく示す。
【０１０２】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから肝細胞を単離し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの９６ウェルＢｉｏＣｏａｔコラーゲンＩプレート上に播種した（１０，０００細胞／ウェル）。細胞を約２時間かけて付着させた後、培地を交換して死細胞および付着していない細胞を除去した。細胞を２００ｍｌの培地中、３７℃の空気：ＣＯ２（９５：５）雰囲気下で一晩インキュベートし、ＡＴＰ活性を回復、安定化させた。１００ｍｌの培地中、細胞を１ｍＭ  ＫＣＮとともに１０分間プレインキュベートした後、異なる３種の濃度の試験化合物（５０ｍｌ）および最終濃度５ｍＭのチオ硫酸ナトリウム（５０ｍｌ）を添加し、２００ｍｌのインキュベーション容量とした。
【０１０３】
試験物質とチオ硫酸塩の添加から０．５時間、１時間および２時間が経過した後（時間ごとに別のインキュベーションプレートを使用した）、各ウェルから培地を除去し、代わりにキシレノールブルー染料を含有する２００ｍｌの氷冷１％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて、ＡＴＰの溶解および抽出を行った。溶解物中に存在するＡＴＰを、ＥＮＬＩＴＥＮ  ＡＴＰアッセイのルシフェリン／ルシフェラーゼ反応を用いて測定した。公知の研究によると、解毒剤添加の６０分後に、優れた感度で用量依存性の解毒効果が得られるとされている（C. E. Green, S. E. LeValley, and C. A. Tyson. Comparison of amphetamine metabolism using isolated hepatocytes from five species including humans. J. Pharmacol. Exp. Therap. 237, 931-936 (1986)参照）。
【０１０４】
実験は少なくとも３回繰り返し、各データポイントで標準誤差を求めた。
【０１０５】
安全性試験の結果を図３、４、５および６に示す。
【０１０６】
安全性と有効性の複合的な試験結果を表３にまとめ、図７に図示した。
【０１０７】
【表３】
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＊）インキュベーション条件：１０，０００細胞／ウェル、１ｍＭ  シアン化カリウム、５ｍＭ  チオ硫酸ナトリウム、０．１５ｍＭ  Ｋ２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］（解毒剤）または０．１５ｍＭ  ＣｏＣｌ２、３７℃で１時間。細胞は、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの肝細胞から新たに単離した。
【０１０８】
シアン化物に暴露された細胞のＡＴＰ活性は約５５％に低下することがわかる。チオ硫酸塩は、シアン化物に暴露された細胞のＡＴＰ活性を６３％まで回復する解毒作用があった。シアン化物に暴露された細胞（約５５％）と比較してＫ２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］単独ではＡＴＰ活性の有意な上昇はなかったが（約５６％）、チオ硫酸塩とＫ２［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（Ｃ４Ｈ４Ｏ４Ｓ）］（解毒剤）の存在により、シアン化物に暴露された細胞のＡＴＰ活性は約８４％に回復する。しかし、チオ硫酸塩の有無にかかわらず、０．１５ｍＭのＣｏＣｌ２の、シアン化物に暴露された細胞に対する有意な解毒作用は、１時間では認められない（対照化合物）。さらに、０．１５ｍＭの解毒剤は、シアン化物に暴露されていない細胞のＡＴＰレベルに有意な影響は与えない（約９５％）。
【０１０９】
実施例５
化合物のインビトロ試験
本発明の化合物のインビトロ試験を異なる３種のがん細胞株で行い、該化合物の毒性を評価した。感受性が高く、最も高い潜在毒性を示すことが明らかになっているがん細胞株を選択した。選択した細胞株は、ＭＣＦ−４５（乳がん）、ＰＴ４５（膵臓がん）およびＨＴ２９（大腸がん）である。公知の化合物を対照化合物として用いた。表４に得られたデータを示す。
【０１１０】
インビトロ毒性試験を行った化合物は以下の通りである。シスプラチンを対照化合物として用いた。
【化１６】
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【０１１１】
最も毒性の高い化合物（エントリー１）の毒性はシスプラチンの１／８０であり、試験したうち最も毒性の低い化合物（エントリー７）の毒性は１／８００である。この結果から、これらの化合物は細胞に対して無毒であることがわかる。
【０１１２】
表は、異なる３種の細胞株を７２時間処理した後、ＭＴＴ（テトラゾリウム染色）法により分析した結果得られた、錯体１〜７のＩＣ５０値（μＭ）を示す。表中の各測定値は、４回の平均値である。エントリー８は、対照化合物シスプラチンである。
【表４】
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【０１１３】
手順：
使用したがん細胞株：ＰＴ４５（膵臓がん）、ＭＣＦ−７（乳がん）およびＨＴ２９（大腸がん）。
【０１１４】
細胞分割：
各細胞種を３７℃の培地中、１０％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した（１０％ウシ胎仔血清中、［＋］４．５ｇ／ＬＤ−グルコース、［＋］Ｌ−グルタミン、［−］ピルビン酸塩）。培地を除去し、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。２ｍｌのトリプシンＥＤＴＡ溶液を各ペトリ皿に加え、表面から細胞が遊離するまでインキュベートした。８ｍｌのＤＭＥＭを各プレートに加えてよく混合し、遠沈管に移した。細胞懸濁液を遠心分離後、培地を除去し、１０ｍｌの新たな培地を各遠沈管に加えた。得られたペレットを新たな培地中でボルテックスした。得られた細胞懸濁液の細胞数を、Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＴＣ１０（登録商標）全自動セルカウンターを用いて計測した。この方法により、７．６×１０５細胞／ｍｌ〜８．６×１０５細胞／ｍｌが得られた。細胞懸濁液の一部をさらに希釈してインキュベートし、増殖させて後の使用に備えた。
【０１１５】
細胞の播種：
各細胞株のストック液を用意した。希釈を行い、１００μｌの培地に約６０００個の細胞が含まれるようにした。実験には、９６ウェルプレートを使用した。各細胞株のストック液１００μｌを連続した４列（連続した８行）に加え、常法に従って８回希釈した。このようにして必要数のプレートを準備し、２４時間インキュベートした。
【０１１６】
化合物による細胞の処理：
異なる３種の細胞株に対する７種の化合物の毒性を試験した。各化合物を水またはＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭ溶液とした。これらのストック液をさらに希釈して、化合物ごとに濃度の異なる８種のストック液を調製した。各化合物につき３枚のプレートの処理を行った。細胞を化合物で処理した後、プレートを２４時間、４８時間および７２時間インキュベートした。各プレートの処理については、正確に記録するよう注意を払った。
【０１１７】
ＭＴＴアッセイ：
各化合物について、２４時間、４８時間および７２時間における細胞生存率をＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＴＴ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加えた後、さらに２時間インキュベートした。培地を除去し、２００μｌのＤＭＳＯを各ウェルに加えた。各ウェルの吸収を５５０ｎｍで測定し（バックグラウンドは６２０ｎｍ）、これを用いて各化合物のＩＣ５０値を計算した。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて算出した。
【０１１８】
実施例６
化合物の溶解度測定
異なる５種の化合物について溶解度を測定し、水溶解度を評価した。溶解度は、化合物の飽和溶液を準備し、１ａ．ｕ．以下の吸収となるように上清試料を希釈し、あらかじめ求めたモル吸光係数に基づいて濃度を計算することにより決定した。さらに化合物の分子量を乗じることにより、濃度をｇ／ｌの単位に変換した。
【０１１９】
化合物の目標溶解度は２５〜５０ｇ／ｌである。これは容量０．３ｍｌのエピペンによる触媒的治療に好適な濃度であり、この濃度の触媒により、シアン化物は推定致死濃度の１／１０となる。
【０１２０】
典型的手順：
最初に、Ｎａ［Ｍｏ２Ｏ２Ｓ４（ｍｅｔ）］の溶解度を、化合物合成中の経験に基づき推定した。濃度が正確に０．２ｍＭとなるよう調製した溶液のモル吸光係数を求めた。次いで１０ｍｌの水を用いて飽和水溶液を調製し、終夜撹拌した。不溶の化合物を遠心分離した後、透明な上清から０．１ｍｌを取り、吸収が１．０ａ．ｕ．以下となるよう、メスフラスコを用いて５０ｍｌまたは１００ｍｌに希釈した。この溶液の吸収を３０３ｎｍで測定した。先に求めたモル吸光係数を基に濃度をｍｏｌ／ｌの単位で計算し、分子量を乗じることによりｇ／ｌの単位に変換した。
【０１２１】
測定した錯体の水溶解度を示す。
【表５】
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【０１２２】
実施例７
マウスにおける毒性試験
３種の化合物の毒性を、マウスを用いて調べた。表６においてエントリー１、２および７として示す化合物（化合物１、２および７）を選択した。その理由は、最初の２つは生物学的反応を示す可能性が最も高く、３つめの化合物は細胞での毒性試験を基にすれば化合物１の用量の１０倍を投与しうるからである。化合物１は十分な溶解度を有さず、目標とするモル濃度に達しないため、化合物２も使用した。化合物１と２は、最大溶解度における単回投与では生物学的反応が認められなかった。
マウスにおける毒性試験。最大溶解度濃度での化合物の緩衝液溶液を単回投与した。用量は７．５μｌ／ｋｇ、１群あたり３匹のマウスを使用した。濃度は、マウスの血液量を２ｍｌであると仮定して計算した。
【表６】
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【０１２３】
これらの研究から、インビトロパネル試験で最大の毒性を示した化合物の単回投与では、いずれの化合物もマウスに無毒であることがわかる。また、濃度の計算値（推定値）から、最も溶解性の低い化合物であっても、シアン化物の触媒的除去の目的に生物学的に適した濃度範囲内であることがわかる。
【０１２４】
手順：試験のために、Ｃ５７ｂｌ／６雄性８週齢マウスを１群あたり３匹選んだ。これらのマウスを収容し、実験前の１週間観察した。被験化合物のストック液は、表４に示した濃度となるよう、ｄＰＢＳ緩衝液を用いて試験当日に調製した。用量は７．５ｍｌ／ｋｇとした。溶液の濃度は、吸光度測定により確認した。各マウスの体重を測定し、体重に基づいてストック液の総注射量を計算した。例えば、体重２０．２ｇのマウスには１５１．２μｌのストック液を注射した。注射直後の４時間および翌日に観察を行った。体重も同様に調べた。体重の変化や生物学的反応は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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