(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を個々のコンパートメントに隔離するステップ；
ｂ）細胞を溶解し、ｍＲＮＡ捕捉剤でｍＲＮＡ転写物を収集するステップ；
ｃ）ｍＲＮＡ捕捉剤を用いてｍＲＮＡをコンパートメントから単離するステップ；
ｄ）逆転写を行い、次いで捕捉されたｍＲＮＡにＰＣＲ増幅を行うステップ；そして、
ｅ）単一細胞から増幅された、少なくとも２つの異なったｃＤＮＡ産物を配列決定するステップ、
を含む、方法であって、前記少なくとも２つの異なったｃＤＮＡが、対ＴＣＲ配列又は対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、
前記ｍＲＮＡ捕捉剤がビーズであり、
前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記ｍＲＮＡ転写物が、前記隔離された単一細胞が対象の抗原に結合する抗体を分泌する場合にのみ前記ビーズにより捕捉される、方法。
【請求項２】
前記細胞がＢ細胞であり、対象の抗原に結合する抗体について複数の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得するための方法として更に定義された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビーズが磁性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビーズがｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記個々のコンパートメントがゲル中のウェル、マイクロタイタープレート中のウェル又はエマルジョン中の微小胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記個々のコンパートメントが５ｎＬ未満の体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）の前に、前記ウェルが透析膜で覆われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）及び（ｂ）が
同時に行われるか、又は
単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１０，０００の各々の細胞から配列を取得すること、または少なくとも５，０００の各々の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）が、
少なくとも２の転写産物を単一のＤＮＡ分子に連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってｃＤＮＡを連結することを含むか、
重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まないか、
ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを単一分子中で連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを連結することを含むか、
重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡが別箇の分子であるか、
組み換えを行うことによってｃＤＮＡを連結することを含むか、又は
同一ビーズに共有結合的に連結された２又はそれ以上の転写産物の配列決定を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＶＨ及びＶＬ配列が異なった分子の配列決定によって得られる、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、Ｂ細胞及びＴ細胞からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
多数の個々の微小胞を有するエマルジョンを含む組成物であって、微小胞が、（ａ）逆転写反応を開始することができる固定されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、及び（ｂ）個々の細胞を含み、前記個々の細胞が、個々の細胞からｍＲＮＡ転写産物を放出するために崩壊されており、前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記オリゴヌクレオチドが、前記個々の細胞が前記対象の抗原に結合する抗体を分泌する場合にのみ前記ビーズに固定される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、その全体の内容が本明細書に参照によって組み込まれている２０１２年６月１５日に出願された米国仮出願番号６１／６６０，３７０号の優先権を主張する。
本発明は、一般的には分子生物学及び免疫学の分野に関する。より具体的には、発明は、免疫細胞受容体及び抗体をコードするｃＤＮＡハイスループット単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイスループットで個々の細胞から２又はそれ以上の転写産物の発現を同定する必要性がある。特に、多数のバイオテクノロジー及び医薬適用については、患者で又は研究室動物で発現された免疫受容体の完全なレパートリーを正確に決定するために、ハイスループットで、個々の細胞由来の適応性のある免疫受容体を含む２つの鎖をコードする遺伝子対を同定し、配列決定することが重要である。Ｂ及びＴリンパ球によって発現された免疫受容体は、それぞれ、ＶＨ及びＶＬ抗体遺伝子、及びＴＣＲ  α／β又はγ／δ鎖遺伝子によってコードされている。ヒトは、表面マーカー（ＣＤタンパク質）及び転写因子（例えば、Ｔｒｅｇ  Ｔリンパ球サブセット中のＦｏｘＰ３）の発現に基づいて異なったサブセットに分類される多くの何万又は何百万の異なったＢ及びＴリンパ球を有する。ハイスループットＤＮＡ配列決定技術は、ＶＨもしくはＶＬ鎖、又は、特定の疾患状態に関連するリンパ球サブセット中のＴＣＲ  α及びβのレパートリーを決定するために、あるいは、より一般的には、適応性のある免疫系の機能を研究するために使用されてきた（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。免疫学の研究者は、一刻も早く、複数の転写産物のハイスループット分析の特に大きな必要性を有する。
【０００３】
免疫レパートリーの配列決定のための現在利用できる方法は、対象の細胞集団、例えば、記憶Ｂ細胞又は骨髄由来の血漿細胞、からのｍＲＮＡの単離、次いでバルクでＲＴ−ＰＣＲを行って、ハイスループットＤＮＡ配列決定のためのｃＤＮＡを合成することを含む（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。しかしながら、重及び軽抗体鎖（又はα及びβ  Ｔ−細胞受容体）は別々のｍＲＮＡ鎖でコードされ、別々に配列決定されなければならない。したがって、これらの利用できる方法は、重及び軽鎖免疫レパートリー全体をそれぞれ明らかにするための可能性を有するが、重及び軽鎖対をハイスループットで解決できていない。重及び軽鎖対データを収集するための単一細胞レベルでの複数転写産物分析なしには、両鎖を含む完全な適応性のある免疫受容体は、更なる研究のために配列決定又は再構成できず、また発現することができない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗｕ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｅｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，  １５９３−１６０２  （２０１１）．
【非特許文献２】Ｒｅｄｄｙ，  Ｓ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｂｙ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｇｅｎｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，  ９６５−Ｕ９２０  （２０１０）．
【非特許文献３】Ｋｒａｕｓｅ，  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ｂｙ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｒａｃｌｏｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｃｌｏｎａｌ  Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８７，  ３７０４−３７１１  （２０１１）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施態様では、本発明は、ａ）単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を個々のコンパートメントに隔離するステップ；ｂ）細胞を溶解し、ｍＲＮＡ捕捉剤でｍＲＮＡ転写物を収集するステップ；ｃ）ｍＲＮＡ捕捉剤を用いてｍＲＮＡをコンパートメントから単離するステップ；ｄ）逆転写を行い、次いで捕捉されたｍＲＮＡにＰＣＲ増幅を行うステップ；そして、ｅ）単一細胞から増幅された、少なくとも２つの異なったｃＤＮＡ産物を配列決定するステップ、を含む、方法を提供する。ある態様では、細胞は、Ｂ細胞（例えば、血漿細胞又は記憶Ｂ細胞）、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及び癌細胞であり得る。
【０００６】
したがって、具体的な実施態様では、本発明は、多数の対抗原受容体配列を取得する方法であって、以下：（ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一哺乳動物細胞を単離するステップ；（ｂ）細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；（ｃ）単一細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；（ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして、（ｅ）配列決定に基づいて、多数の単一細胞について、複数のｍＲＮＡ転写産物（例えば、対抗原受容体配列）を同定するステップ、を含む、方法を提供する。例えば、ある態様では、複数の、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得する方法であって、以下：（ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一Ｂ細胞を単離するステップ；（ｂ）Ｂ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；（ｃ）単一Ｂ細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；（ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして、（ｅ）複数の単一Ｂ細胞について、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定するステップ、を含む、方法を提供する。更なる態様では、複数の、対Ｔ細胞受容体配列を取得する方法であって、以下のステップ：（ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一Ｔ細胞を単離するステップ；（ｂ）Ｔ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；（ｃ）単一Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；（ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして、（ｅ）配列決定に基づいて、複数の単一Ｔ細胞について、対Ｔ細胞受容体配列を同定するステップ、を含む、方法を提供する。
【０００７】
更なる態様では、本方法は、少なくとも１０，０００、１００，０００又は１，０００，０００の個々の細胞（例えば、約１００，０００及び１千万又は１億の個々の細胞）から配列を取得することを含む。従って、ある態様では、本方法は、少なくとも５，０００、１０，０００又は１００，０００の個々の対抗体ＶＨ及びＶＬ配列（例えば、約１０，０００から１００，０００、又は百万、もしくは１千万までの個々の対配列）を取得することを含む。ある態様では、対配列、例えばＶＨ及びＶＬ配列は、単一分子中でｃＤＮＡを連結するために、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってｃＤＮＡ（例えば、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡ）を連結することを含み得る。別の態様では、実施態様の方法は、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まない。例えば、２（又はそれ以上）のｃＤＮＡ配列は、異なった分子を配列決定することによって、例えば、別箇の異なったＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡ分子を配列決定することによって、得られる。
【０００８】
１つの態様では、本方法は、確率解析をも用いる天然で対となった転写産物を決定することを更に含んでよい。この態様では、対転写産物を同定することは、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含んでよい。例えば、確率解析は、図９のステップを実行することを含んでよい。具体的態様では、本方法は、対抗体ＶＨ及びＶＬ配列を同定することを含んでよい。ある態様では、確率解析は、ＣＤＲ−Ｈ３及び／又はＣＤＲ−Ｌ３配列に基づいてよい。場合によっては、対抗体ＶＨ及びＶＬ配列を同定することは、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含んでよい。更なる態様では、確率解析は、図９のステップを実行することを含んでよい。
【０００９】
本発明の実施態様のある態様は、ｍＲＮＡ捕捉剤に関する。例えば、ｍＲＮＡ捕捉剤は、固定されたオリゴヌクレオチド又はデキストラン及びアガロース等のポリマーネットワークを含む、ビーズ等の固体支持体であり得る。１つの態様では、ビーズは、シリカビーズ及び磁性ビーズである。ｍＲＮＡ捕捉剤は、ｍＲＮＡをハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのポリ（Ｔ）及び／又は対象の転写産物に特異的なプライマーを含んでよい。ある態様では、実施態様のビーズは、単離されるべき個々の細胞よりも小さい（例えばＢ細胞）。
【００１０】
態様によっては、実施態様の個々のコンパートメントは、ゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルでよい。１つの態様では、個々のコンパートメントは、５ｎＬ未満の体積を有し得る。態様によっては、ウェルは、細胞の溶解前又はＲＴ−ＰＣＲの実施の前に透過膜で覆うことができる。なお更なる態様では、個々のコンパートメントは、エマルジョン中の微小胞であり得る。
【００１１】
更なる態様では、単一細胞（及びｍＲＮＡ捕捉剤）を隔離し、細胞を溶解すること（ステップ（ａ）及び（ｂ））は、同時に実施してよい。従って、態様によっては、本方法は、単一細胞を単離し、ｍＲＮＡ捕捉剤をエマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解溶液の存在下で加えることを含んでよい。
【００１２】
更なる態様では、実施態様の方法は、単一ＤＮＡ分子に少なくとも２の転写産物を連結するために、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を実行することによってｃＤＮＡを連結することを含んでよい（例えばステップ（ｅ））。他の態様では、ステップ（ｅ）は、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まなくてよい。ある態様では、ステップ（ｅ）は、組換えを行うことによってｃＤＮＡを連結することを含んでよい。
【００１３】
なお更なる態様では、単一細胞を隔離することは、細胞の大部分が（ｍＲＮＡ捕捉剤、例えばビーズと共に）単一細胞として捕捉されるように、多数のマイクロウェルを含む装置に細胞を導入することを含んでよい。更なる態様では、本方法は、同一ビーズに共有結合的に連結された２以上の転写産物の配列決定を含んでよい。
【００１４】
従って、実施態様によっては、細胞がＢ細胞である、多数の対抗体ＶＨ及びＶＬ配列を取得するための方法を提供する。１つの態様では、本方法は、対象の抗原に結合する抗体のための対抗体ＶＨ及びＶＬ配列を取得するための方法である。ある態様では、ビーズは対象の抗原に複合化され、オリゴヌクレオチドは対象の抗原に結合する抗体の存在下でビーズに専ら複合化され得る。例えば、ビーズは、対象の抗原でコートすることができ、ｍＲＮＡ捕捉剤（例えば、オリゴ−Ｔ）は抗原に結合する抗体の存在下でのみビーズと会合し得る（例えば、図１０参照）。例えば、ｍＲＮＡ捕捉剤はプロテイン−Ａと会合されるか、あるいは、存在するならば抗体に結合するように官能基化され得る。
【００１５】
実施態様のある態様は、対象から試料（例えば、実施態様の方法での使用のための細胞を含む試料）を取得することに関してよい。試料は、対象から直接に取得されるか、又は第三者から得られる。試料は、血清、粘膜（例えば、唾液）、リンパ液、尿、大便及び固体組織試料を含むがこれらに限定されない。同様に、実施態様のある態様は、生物的流体、及びそれからの抗体及び／又は核酸に関する。例えば、生物流体は、血液（例えば、血清）、脳脊髄液、滑液、母親の母乳、臍帯血、腹水、粘膜分泌物、涙、鼻分泌物、唾液、乳、又は性尿器分泌物であり得る。ある態様では、実施態様に従う使用のための細胞は、哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット又はサルの細胞である。好ましい態様では、細胞はヒト細胞である。
【００１６】
態様によっては、実施態様で使用するための細胞は、Ｂ細胞、例えば骨髄等の選択された臓器由来のＢ細胞である。例えば、Ｂ細胞は成熟Ｂ細胞、例えば骨髄プラズマ細胞、脾臓プラズマ細胞又はリンパ節プラズマ細胞、又は末梢血もしくはリンパ器官由来の細胞、でよい。ある態様では、Ｂ細胞は、細胞表面マーカー（例えば、Ｂｌｉｍｐ−１、ＣＤ１３８、ＣＸＣＲ４又はＣＤ４５）の差次的発現に基づいて選択されるか、又は濃縮される。場合によっては、抗体の選択された種類の配列、例えばＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ又はＩｇＡ配列が得られる。
【００１７】
更なる態様では、実施態様の方法は、（例えば、細胞試料を取得する前に）対象を免疫化することを含んでよい。本方法は、リンパ器官組織の単離を更に含んでよい。リンパ器官組織単離は、免疫後の少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日、あるいは免疫後の任意の中間的範囲でよい。本方法は、好ましくはリンパ器官組織からＢ細胞を分離せずに、リンパ器官組織の核酸集団を取得することを更に含んでよい。リンパ器官組織は、一次的、二次的又は三次的なリンパ器官組織、例えば骨髄、脾臓又はリンパ節であり得る。対象は、任意の動物、例えば哺乳動物、魚、両生類、又は鳥であり得る。哺乳動物はヒト、マウス、霊長類、ウサギ、ヒツジ、又はブタであり得る。
【００１８】
核酸配列（例えば、Ｂ細胞又はリンパ器官組織中の）を決定するために、ハイスループットＤＮＡ配列決定法を含む当該分野で知られている任意の核酸配列決定法が使用できる。ハイスループット法の非限定的な例は、合成による配列決定による（例えば、４５４シークエンシング）、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、単一分子ＤＮＡ配列決定、多重ポロニー配列決定、ナノポア配列決定、又はこれらの組合せを含む。
【００１９】
更なる実施態様では、本発明は、以下：（ａ）環状流動油相内に配置された水性流体相出口；及び（ｂ）水性流体相であって、水性相流体が細胞懸濁液を含み、油相内に分散され、細胞の水性懸濁液を含む低サイズ分散度を有する乳化液滴をもたらす、水性流体相を含む、装置を提供する。１つの態様では、水性流体相出口はニードルである。更なる態様では、水性流体相出口はガラス管である。ある態様では、油相はガラス管又はポリマーチューブを流れる。ある態様では、水性相はポリマーチューブを流れる。なお更なる態様では、細胞濃度、水性流体相流速、及び油相流速は、各々の液滴が単一細胞を含む液滴の形成を可能にする。ある態様では、細胞は、以下：Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞及び癌細胞からなる群より選択される。ある態様では、水性流体相は、核酸捕捉逆転写試薬用のビーズ、ポリメラーゼ連鎖反応試薬、及び／又はそれらの組み合わせを含む。
【００２０】
更なる実施態様では、本発明は、（ａ）ビーズ；（ｂ）ｍＲＮＡに結合することができるオリゴヌクレオチド；及び（ｃ）対象の転写産物に特異的な２又はそれ以上のプライマー、を含む組成物を提供する。
【００２１】
なお更なる実施態様では、本発明は、多数の個々の微小胞を有するエマルジョンを含む組成物であって、微小胞が、逆転写を刺激するための固定されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、及び個々のＢ細胞を含み、ｍＲＮＡ転写産物を放出するために崩壊されている、組成物を提供する。
【００２２】
ある態様では、本発明は、（ａ）遺伝子標的のセットに特異的である２又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの５’領域に共通配列を加えるステップ；（ｂ）共通配列を刺激することによって遺伝子標的のセットの核酸増幅を行うステップ；そして、（ｃ）固定されたオリゴヌクレオチドが核酸増幅を刺激するように、表面上に固定された共通配列をふくむオリゴヌクレオチドを核酸増幅に含み、増幅された配列の表面捕捉をもたらすステップ、を含む方法を提供する。
【００２３】
本明細書で使用される“ａ”又は“ａｎ”は１又はそれ以上を意味し得る。本特許請求の範囲で使用される用語“ａ”又は“ａｎ”は、用語「含むこと」と一緒に使用される時には、１又は複数を意味し得る。
【００２４】
本特許請求の範囲で使用される用語「又は」の使用は、本開示が代替物及び「及び／又は」のみを意味する定義を支持しているが、代替物のみを言うように明確に指摘されていない場合、又はその代替物が互いに排他的でない場合には、「及び／又は」を意味するために使用される。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味し得る。
【００２５】
本願に渡って、用語「約」は、ある値が、装置もしくは値を決定するために採用される方法についての固有の誤差変動、又は、試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２６】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、ご承知のように、本発明の趣旨及び範囲内での様々な変更及び修飾は詳細な説明から当業者に明らかになるので、この詳細な説明及び具体例は、本発明の好ましい実施態様を示すと同時に、例証のみの方法で提供される。
【００２７】
以下の図面は、本願の一部を形成し、本発明のある態様を更に証明するために含まれる。本発明は、本明細書に記載の具体的態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１又はそれ以上を参照することによってより理解されよう。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
以下：
ａ）単一細胞及びｍＲＮＡ捕捉剤を個々のコンパートメントに隔離するステップ；
ｂ）細胞を溶解し、ｍＲＮＡ捕捉剤でｍＲＮＡ転写物を収集するステップ；
ｃ）ｍＲＮＡ捕捉剤を用いてｍＲＮＡをコンパートメントから単離するステップ；
ｄ）逆転写を行い、次いで捕捉されたｍＲＮＡにＰＣＲ増幅を行うステップ；そして、
ｅ）単一細胞から増幅された、少なくとも２つの異なったｃＤＮＡ産物を配列決定するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記細胞がＢ細胞である、複数の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得するための方法として更に定義された、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｍＲＮＡ捕捉剤がビーズである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ビーズが磁性である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ビーズがｍＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記オリゴヌクレオチドが対象の転写産物に特異的なポリ（Ｔ）及びプライマーの少なくとも１つを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
対象の抗原に結合する抗体について対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得するための方法として更に定義された、項目２に記載の方法。
（項目８）
前記ビーズが対象の抗原に複合化され、前記オリゴヌクレオチドが対象の抗原に結合する抗体の存在下でビーズに専ら複合化される、項目３に記載の方法。
（項目９）
前記個々のコンパートメントがゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記個々のコンパートメントが５ｎＬ未満の体積を有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｃ）の前に、前記ウェルが透析膜で覆われる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記個々のコンパートメントがエマルジョン中の微小胞である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に行われる、項目１に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、単一細胞及びオリゴヌクレオチドを単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
少なくとも１０，０００の各々の細胞から配列を取得することを含む、項目２に記載の方法。
（項目１６）
少なくとも５，０００の各々の対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得することを含む、項目２に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｅ）が、少なくとも２の転写産物を単一のＤＮＡ分子に連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってｃＤＮＡを連結することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ステップ（ｅ）が重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まない、項目１に記載の方法。
（項目１９）
ステップ（ｅ）が、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを単一分子中で連結するために、重複伸長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによってＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡを連結することを含む、項目２に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ｅ）が、重複延長逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡが別箇の分子である、項目２に記載の方法。
（項目２１）
前記ＶＨ及びＶＬ配列が異なった分子の配列決定によって得られる、項目２に記載の方法。
（項目２２）
前記対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定することが、配列の確率解析を行うことを更に含む、項目２に記載の方法。
（項目２３）
前記確率解析がＣＤＲ−Ｈ３又はＣＤＲ−Ｌ３配列に基づく、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定することが、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記確率解析が図９のステップを行うことを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
ステップ（ｅ）が組み換えを行うことによってｃＤＮＡを連結することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞及び癌細胞からなる群より選ばれる、項目１に記載の方法。
（項目２８）
単一細胞を隔離することが、細胞の大多数が単一細胞として捕捉されるように多数のマイクロウェルを含む装置に細胞を導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
ステップ（ｅ）が同一ビーズに共有結合的に連結された２又はそれ以上の転写産物の配列決定を含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が哺乳動物細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
確率解析を用いて天然に対になった転写産物を決定することを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記対転写産物を同定することが、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記確率解析が図９のステップを行うことを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
ａ）環状流動油相内に配置された水性流体相出口；及び
ｂ）水性流体相であって、水性相流体が細胞懸濁液を含み、油相内に分散され、細胞の水性懸濁液を含む低サイズ分散度を有する乳化液滴をもたらす、水性流体相
を含む、装置。
（項目３５）
前記水性流体相出口がニードルである、項目３４に記載の装置。
（項目３６）
前記水性流体相出口がガラス管である、項目３４に記載の装置。
（項目３７）
前記油相がガラス管を流れる、項目３４に記載の装置。
（項目３８）
前記油相がポリマーチューブを流れる、項目３４に記載の装置。
（項目３９）
前記水性相がポリマーチューブを流れる、項目３４に記載の装置。
（項目４０）
細胞濃度、水性流体相流速、及び油相流速が液滴形成を可能にし、各々の液滴が単一細胞を含む、項目３４に記載の装置。
（項目４１）
前記細胞がＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、及び癌細胞からなる群より選ばれる、項目３４に記載の装置。
（項目４２）
前記水性流体相が核酸捕捉のためのビーズを含む、項目３４に記載の装置。
（項目４３）
前記水性流体相が、逆転写酵素試薬、ポリメラーゼ連鎖反応試薬、及びそれらの組み合わせを含む、項目３４に記載の装置。
（項目４４）
多数の個々の微小胞を有するエマルジョンを含む組成物であって、微小胞が、逆転写を刺激するための固定されたオリゴヌクレオチドを有するビーズ、及び個々のＢ細胞を含み、個々のＢ細胞からｍＲＮＡ転写産物を放出するために崩壊されている、組成物。
（項目４５）
ａ）遺伝子標的のセットに特異的である２又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの５’領域に共通配列を加えるステップ；
ｂ）共通配列を刺激することによって遺伝子標的のセットの核酸増幅を行うステップ；そして、
ｃ）固定されたオリゴヌクレオチドが核酸増幅を刺激するように、表面上に固定された共通配列を含むオリゴヌクレオチドを核酸増幅に含み、増幅された配列の表面捕捉をもたらすステップ、
を含む、方法。
（項目４６）
多数の対抗原受容体配列を取得する方法であって、以下：
ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一哺乳動物細胞を単離するステップ；
ｂ）細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；
ｃ）単一細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；
ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして
ｅ）配列決定に基づいて、多数の単一細胞について、複数のｍＲＮＡ転写産物を同定するステップ、
を含む、方法。
（項目４７）
複数の、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得する方法として更に定義された、項目４６に記載の方法であって、以下：
ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一Ｂ細胞を単離するステップ；
ｂ）Ｂ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；
ｃ）単一Ｂ細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；
ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして
ｅ）配列決定に基づいて、複数の単一Ｂ細胞について、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を同定するステップ、
を含む、方法。
（項目４８）
複数の、対Ｔ細胞受容体配列を取得する方法として更に定義された、項目４６に記載の方法であって、以下のステップ：
ａ）逆転写の刺激のための固定されたオリゴヌクレオチドを有する個々のコンパートメント中の単一Ｔ細胞を単離するステップ；
ｂ）Ｔ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡ転写産物を固定されたオリゴヌクレオチドと会合させるステップ；
ｃ）単一Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ転写産物に相当するｃＤＮＡを取得するために、逆転写を行い、次いでＰＣＲ増幅を行うステップ；
ｄ）ｃＤＮＡを配列決定するステップ；そして
ｅ）配列決定に基づいて、複数の単一Ｔ細胞について、対Ｔ細胞受容体配列を同定するステップ、
を含む、方法。
（項目４９）
対象の抗原に結合する抗体について、対抗体ＶＨ配列及びＶＬ配列を取得する方法として更に定義された、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記オリゴヌクレオチドが、対象の抗原に結合する抗体の存在下でのみ、固定されたオリゴヌクレオチドである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記個々のコンパートメントがゲル又はマイクロタイタープレート中のウェルである、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
ステップ（ｂ）の前に、前記ウェルが透析膜で覆われている、項目４６に記載の方法。
（項目５３）
前記ウェルがエマルジョン中の微小胞である、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記オリゴヌクレオチドがビーズ上に固定されている、項目４６に記載の方法。
（項目５５）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が同時に行われる、項目４６に記載の方法。
（項目５６）
ステップ（ａ）及び（ｂ）が、単一細胞及びビーズ上に固定されたオリゴヌクレオチドを単離して、エマルジョン中の個々の微小胞に細胞溶解液の存在下で加えることを含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
ステップ（ｃ）が、単一分子中で対抗原受容体ｃＤＮＡと連結するために、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって対抗原受容体ｃＤＮＡを連結することを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５８）
ステップ（ｃ）が、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の使用を含まず、対抗原受容体配列ｃＤＮＡが別個の分子である、項目４６に記載の方法。
（項目５９）
対抗原受容体配列を同定するステップ（ｅ）が、配列の確率解析を行うことを含む、項目４６に記載の方法。
（項目６０）
対抗原受容体配列が対ＶＨ配列及びＶＬ配列であり、確率解析がＣＤＲ−Ｈ３又はＣＤＲ−Ｌ３配列に基づく、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記対抗原受容体配列を同定することが、生の配列決定の読み数（ｒａｗ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄ  ｃｏｕｎｔｓ）を比較することを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記確率解析が図９のステップを行うことを含む、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
少なくとも１０，０００の個々の細胞から配列を取得することを含む、項目４６に記載の方法。
（項目６４）
ステップ（ｃ）の前に、固定されたｍＲＮＡ転写物を単離することを更に含む、項目４６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、個々のシールされたウェルに分離された細胞を示す。ウェル内の小さな丸い物体はビーズである。この画像は、透析膜によって取得される。ウェル径は約５６μｍである。
【図２】図２は、以下を示す、左：溶解直前の単離された単一細胞；中央：溶解のプロセスにある細胞；及び、右：経時的顕微鏡検査法を用いる溶解直後のマイクロウェル。ウェル径は約５６μｍである。
【図３】図３は、連結したＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。文字は、定常、可変、連結、及び多様性領域のおおよその位置を示し、一方、番号は、相補性決定領域のおおよその位置を示す。
【図４】図４は、連鎖（重複伸長）ＲＴ−ＰＣＲプロセスの概要を示す。ａ）第１鎖ｃＤＮＡにアニールする５’相補性重／軽重複領域を有するＶ−領域プライマー。ｂ）第２鎖ｃＤＮＡは、５’から３’への伸長によって形成される；重複領域はすべてのｃＤＮＡに組み込まれる。ｃ）変性後に、５’から３’への伸長によって完全な８５０ｂｐ産物を生成するためにアニールする第１鎖センスを有する重及び軽鎖。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は、最終連結コンストラクトの外側近くに位置し、このことは、２ｘ２５０ペアエンド・イルミナ・シークエンシング（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によるＣＤＲ３解析を可能にする。
【図５】図５は、フローフォーカッシングによって形成された液滴中に生きたままカプセル化されたＭＯＰＣ−２１細胞を示す。フローフォーカッシング装置への２つの入口流は、ＭＯＰＣ−２１細胞のＰＢＳ（１００，０００細胞／ｍＬ、細胞流）、０．４％トリパンブルーのＰＢＳ（色素流）、及びエマルジョン液滴形成のポイント直前に一緒に混合された細胞流及び色素流、の等価部からなった。ＭＯＰＣ−２１細胞は、トリパンブルーを除くように示され、これは、エマルジョン液滴内の単一細胞の生存カプセル化を証明した。
【図６】図６は、Ｂ細胞集団由来の天然抗体ＶＨ及びＶＬ  ｍＲＮＡの配列決定に対して適用された複数の転写産物用のハイスループット配列決定技術の概略を示す。ｉ）Ｂ細胞集団は所望の表現型に分類される（例えば、ｍＢＣ、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢＣ、ナイーブＢ細胞）。ｉｉ）単一細胞は、マイクロウェルアレイに無作為に沈ませる（ｓｅｔｔｌｅ）ことによって単離され；ポリ（ｄＴ）マイクロビーズもウェルに加えられる。ｉｉｉ）ウェルは透析膜でシールされ、細胞を溶解し、ＶＨ及びＶＬ  ｍＲＮＡをポリ（ｄＴ）ビーズにアニールするために溶解バッファで平衡化される（斑点は溶解された細胞を表し、丸は磁性ビーズを表し、黒線はｍＲＮＡ鎖を表す）。ｉｖ）ビーズは、約８５０塩基対のＶＨ：ＶＬ  ｃＤＮＡ産物を作製するためのｃＤＮＡ合成及び連鎖ＰＣＲのために、回収、乳化される。ｖ）ＮｅｘｔＧｅｎ配列決定は、連結された鎖を配列決定するために行われる。ｖｉ）生物情報学的処理は対になったＶＨ：ＶＬレパートリーを解析するために使用される。
【図７】図７は、ハイスループット配列決定用のオリゴ固定化磁性ビーズ上の重及び軽鎖ＤＮＡに増幅を示す。ａ）ビーズは３つの固定されたオリゴヌクレオチド：ｍＲＮＡ捕捉のためのポリ（Ｔ）、重鎖増幅のためのＡＨＸ８９、及び軽鎖増幅のためのＢＲＨ０６、の混合物を示す。ｂ）逆転写は、固定されたポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドにアニールした捕捉ｍＲＮＡ（灰色の破線によって示される）から開始される。具体的に設計された免疫グロブリン定常領域逆転写プライマーは、５’末端でのＡＨＸ８９（重鎖用）又はＢＲＨ０６（軽鎖用）のいずれかを有する。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応はエマルジョン液滴内で起こる。ｃ）Ｖ領域フォワードプライマーは、ピロシーケンスを開始するために使用されることになる、５’末端での＜Ｆ３＞配列（重鎖用）又は＜Ｆ５＞配列（軽鎖用）のいずれかを有する。ｃＤＮＡ鎖は黒線として表示される。
【図８】図８は、ノズル／キャリア流装置の略図を示す。ガラスキャピラリー管は、ニードル出口を囲む外側油相キャリア流（矢印）を供給する。ニードルは、細胞を含む水性相を注入し、単分散液滴は環状油相流動からの剪断力によって作製される。
【図９】図９は、ＶＨ及びＶＬ配列のペアリングのための一般的な決定ツリーアルゴリズムを示す。
【図１０】図１０は、特定の抗原用の高親和性抗体をコードする単離された単一細胞由来のｍＲＮＡ捕捉の概略及び例示的プロセスを示す。（ａ）抗体分泌Ｂ細胞（上部左）は、固定された抗原を有するビーズを含むコンパートメントに単離される。Ｂ細胞が抗原用の高親和性抗体をコードする場合には、分泌抗体（灰色）はビーズによって捕捉される。（ｂ）任意の非結合細胞−分泌抗体は洗浄され、連結されたポリ（ｄＴ）ｓｓＤＮＡ（黒色の鎖）を有する抗−ＩｇＧ抗体（白色）はコンパートメントに添加される。抗−ＩｇＧ：ポリ（ｄＴ）（又は他のｍＲＮＡ捕捉部分）コンストラクトは、捕捉された抗体を含むビーズ上に固定される。ポリ（ｄＴ）ｓｓＤＮＡは、所望の抗原に対する高親和性抗体を分泌する細胞と、専ら共局在化される。（ｃ）コンパートメントはシールされ、細胞は溶解される。高親和性抗体を分泌した細胞から放出されたｍＲＮＡ鎖（小円）は、ポリ（ｄＴ）：抗体：ビーズコンストラクト上でポリ（ｄＴ）へのハイブリダイゼーションによって捕捉される。次に、ビーズは、単一細胞ｍＲＮＡ転写産物解析のために回収することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、一般的に、ハイスループット法での単一細胞に発現された２又はそれ以上の遺伝子を配列決定することを含む。より具体的には、本開示は、免疫受容体を含むポリペプチド鎖対（例えば、抗体ＶＨ及びＶＬ配列）を決定するために単一細胞に共発現された転写産物の対をハイスループット配列決定するための方法を提供する。
【００３０】
本開示の方法は、個々の生物又は集団における免疫受容体及び抗体のレパートリーを決定させる。具体的には、本開示の方法は、免疫受容体を作製するポリペプチド鎖対を決定する点で助けとなるかもしれない。Ｂ細胞及びＴ細胞は各々、免疫受容体を発現する；Ｂ細胞は免疫グロブリンを発現し、Ｔ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。両タイプの免疫受容体は、２つのポリペプチド鎖からなる。免疫グロブリンは、可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖からなる。ＴＣＲは、２つの種類がある：１つは、α及びβ鎖からなり、１つは、γ及びδ鎖からなる。免疫受容体におけるポリペプチドの各々は、定常領域及び可変領域を有する。可変領域は、組換え、及びＢ又はＴ細胞の染色体上の遺伝子断片の末端結合（ｅｎｄ−ｊｏｉｎｔ）再配列によって生じる。Ｂ細胞において、可変領域の更なる多様化は、体細胞超変異によって起こる。従って、免疫系は受容体の大きなレパートリーを有し、リンパ球によって発現された任意の所定の受容体対は、別箇の特有の転写産物の対によってコードされる。対における２つの転写産物の配列を知ることのみによって、受容体を全体的に研究することができる。単一細胞に発現された免疫受容体鎖対の配列を知ることも、また、所定の個々の細胞又は細胞集団の免疫レパートリーを確認する点で必須である。
【００３１】
単一細胞中の複数の転写産物、例えば適用可能な免疫受容体を含む２つの転写産物、を分析するために現在利用できる方法は、低スループット並びに非常に高い器械及び試薬コストによって限定される。多くの細胞がどのようにして対象の転写産物セット群を発現するかを迅速に分析するための、あるいは、より具体的には、非常に高いスループット（１０，０００細胞超／ラン）での天然型リンパ球受容体鎖を配列決定するための技術は現在のところ存在しない。本開示は、当該分野の現在の状況よりも２〜３桁高いオーダーのスループットを用いて、単一細胞レベルで同時に複数の転写産物を配列決定するための新技術を提供することによってこれらの欠陥を修正することを目的とする。
【００３２】
本開示の方法の１つの利点は、方法が、当該技術分野の現在の水準よりも数桁のオーダー大きいハイスループットをもたらすことである。加えて、本開示は、競合技術よりも速く、相当の低コストでのハイスループット方式での大細胞集団の２つの転写産物を連結する能力を可能にする。
【００３３】
ある実施態様では、本開示は、オリゴヌクレオチドに複合化されたビーズを有するコンパートメント中の単一細胞を分離し；細胞を溶解し；細胞から放出されたｍＲＮＡ転写産物をオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ；単一細胞由来の少なくとも２つの転写産物からのＤＮＡを共有結合的に連結するために重複伸長逆転写産物ポリメラーゼ連鎖反応を実施し；及び、連結されたＤＮＡを配列決定すること、を含む方法を提供する。ある実施態様では、細胞は哺乳動物細胞であり得る。ある実施態様では、細胞はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞又は癌細胞であり得る。
【００３４】
他の実施態様では、本開示は、オリゴヌクレオチドに複合化されたビーズを有するコンパートメント中の単一細胞を分離し；細胞を溶解し、細胞から放出されたｍＲＮＡ転写産物をオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ；単一細胞由来の少なくとも２つの転写産物からの少なくとも２つのｃＤＮＡを形成するために重複伸長逆転写産物ポリメラーゼ連鎖反応を実施し；及び、ビーズに結合されたｃＤＮＡを配列決定すること、を含む方法を提供する。
【００３５】
別の実施態様では、本開示は、細胞を、細胞の直径よりも小さな直径を有するビーズと混合し、ビーズはオリゴヌクレオチドに複合化される；５ｎＬ未満の体積を有するコンパートメント内の細胞及びビーズを隔離し；細胞を溶解し、及びｍＲＮＡ転写産物をビーズと会合させ；ビーズ及びコンパートメントからの会合されたｍＲＮＡを単離し；逆転写、次いでビーズ会合ｍＲＮＡ上でのＰＣＲ増幅を行い；各々のビーズと会合されたｃＤＮＡを同定するために各々のビーズからのＤＮＡ産物を配列決定すること、を含む方法を提供する。
【００３６】
他の実施態様では、本開示は、環状流動油相内に配置された水性流体相出口を含む装置であって、水性相流体が細胞懸濁液を含み、油相内に分散され、細胞の水性懸濁液を含む低サイズ分散度を有する乳化液滴をもたらす、装置を提供する。
【００３７】
他の実施態様では、本開示は、ビーズ、ｍＲＮＡに結合することができるオリゴヌクレオチド、及び対象の転写産物に特異的な２又はそれ以上、を含む組成物を提供する。
【００３８】
ある実施態様では、本開示はまた、整列したマイクロウェルのアレイを含む装置であって、各々が単一リンパ球細胞を収容するように設計された寸法を有する装置を提供する。１つの実施態様では、マイクロウェルは、１２５ｐＬの総体積に対して、径５６μｍ、深さ５０μｍの環状ウェルでよい。かかるマイクロウェルは、非常に広範なウェルサイズ、形状及び寸法が単一細胞収容のために使用できるが、通常、２０〜３，０００ｐＬの体積に及ぶ。ある実施態様では、マイクロウェルはナノウェルでよい。ある実施態様では、本装置は、チップでよい。本発明の開示の装置は、１つのチップにおいて、数万の単一細胞の直接的な捕捉を、それ自身のマイクロウェル中の各細胞について可能にする。ある実施態様では、チップは顕微鏡スライドの大きさでよい。１つの実施態様では、マイクロウェルチップは、単一細胞を、それ自身の個々のマイクロウェル中で捕捉するために使用できる（図６）。マイクロチップは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作られる；しかしながら、当該分野で知られている他の好適な物質、例えばポリアクリルアミド、シリコン及びエッチングしたガラスも、マイクロチップをつくるために使用できる。
【００３９】
オリゴヌクレオチドと複合化された数個のビーズ又は他の粒子は、本開示の方法に従って単一細胞を有するマイクロウェル中で捕捉されてもよい。ある実施態様では、ビーズ表面上に固定されたオリゴヌクレオチドを含んでよい。他の実施態様では、ビーズは磁性でよい。他の実施態様では、ビーズは１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドでコートされてよい。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドはポリ（Ｔ）、重鎖増幅に特異的な配列、及び／又は軽鎖増幅に特異的な配列を含んでよい。マイクロウェル中の細胞及びビーズを維持すると同時に、溶解試薬がマイクロウェルに透析されるように、透析膜はマイクロウェルを覆う。溶解試薬は、ビーズを有するマイクロウェルに細胞のｍＲＮＡ転写産物を放出させる。オリゴヌクレオチドがポリ（Ｔ）である実施態様では、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡテイルが、ビーズ上のポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドによって捕捉される。従って、各々のビーズは、単一細胞由来のｍＲＮＡ分子でコートされる。ビーズは次いで回収され、洗浄され、重複伸長（ＯＥ）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用試薬を有する溶液中に再懸濁される。この反応混合物は、共有結合的に連結された、対象の２つの転写産物のｃＤＮＡを含む単一ＰＣＲ産物を一緒につくるように設計されたプライマーを含む。熱循環前に、試薬溶液／ビーズ懸濁液は、１以下のビーズ／液滴をつくるために油相で乳化される。ＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲの連結されたｃＤＮＡ産物は、対象の連結転写産物を増幅するネステッドＰＣＲ用の鋳型として回収、使用される。ネステッドＰＣＲの精製産物は次に配列決定され、対情報が解析される（図６）。他の実施態様では、制限及びライゲーションが、対象の複数転写産物のｃＤＮＡを連結するために使用できる。他の実施態様では、組換えが対象の複数転写産物のｃＤＮＡを連結するために使用できる。
【００４０】
本開示はまた、ビーズ上の単一細胞由来のｍＲＮＡを捕捉し、ｃＤＮＡ合成を行い、単一分子をつくるために単一細胞由来の２又はそれ以上の所望のｃＤＮＡ配列を連結し、最後に、ハイスループット（Ｎｅｘｔ−ｇｅｎ）シークエンシングによって連結された転写産物の配列を明らかにする、方法を提供する。本開示によれば、生物学的アッセイでのスループットを増加させる１つの方法は、多数の３−次元並列化マイクロリアクタをつくるエマルジョンを使用することである。分子生物学におけるエマルジョンプロトコルは、通常、１０９〜１０１１液滴／ｍＬ（ｐＬ未満の体積）を与える。単一細胞ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのエマルジョン型方法は、幅広い受容を見出し、エマルジョンＰＣＲは多くのＮｅｘｔＧｅｎ配列決定プロトコルで見出された力強くかつ信頼性のある手段である。しかしながら、液滴内の細胞溶解物が逆転写酵素反応を阻害するので、エマルジョン液滴中の非常に高いハイスループットＲＴ−ＰＣＲは未だ実行されていない。ＲＴ−ＰＣＲの細胞溶解物阻害は、好適な体積に希釈することによって軽減することができる。
【００４１】
別の実施態様では、細胞は、核酸捕捉用ビーズを含むエマルジョン液滴中で溶解される。ある実施態様では、ビーズはオリゴヌクレオチドで複合化され得る。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドはポリ（Ｔ）でよい。他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは対象の転写産物に特異的なプライマーでよい。ある実施態様では、ビーズは磁性でよい。細胞とビーズの両方の懸濁液を有する水性溶液は、油相の高速流に水性細胞／ビーズ懸濁液を注入することによって油相に乳化される。水性懸濁液が流に注入されて低分散度の液滴サイズを有するエマルジョンをつくるので、移動油相によって作製された剪断力は液滴をつくる。各々の細胞は、オリゴヌクレオチドで複合化された数個のビーズと共にそれ自体の液滴中にある。液滴の大きさの均一性は、個々の液滴が１超の細胞を含まないことを確実にするのに役立つ。次いで、細胞は熱的に溶解され、混合物は冷却されて、ビーズにｍＲＮＡを捕捉させる。エマルジョンは破壊され、ビーズは回収される。ビーズは、対象の転写産物のｃＤＮＡを一緒に連結するためにＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲエマルジョン用溶液中に再懸濁される。連結された転写産物のネステッドＰＣＲ及び配列決定は本開示に従って行われる。ある実施態様では、細胞の水性懸濁液は、逆転写試薬を含む。ある別の実施態様では、細胞の水性懸濁液は、ポリメラーゼ連鎖反応及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応試薬の少なくとも１つを含む。他の実施態様では、制限及びライゲーションが、対象の複数転写産物のｃＤＮＡを連結するために使用され得る。他の実施態様では、組換えが、対象の複数転写産物のｃＤＮＡを連結するために使用され得る。
【００４２】
別の実施態様では、個々の細胞及びＲＴ−ＰＣＲ試薬を含むエマルジョン液滴は、高速流油相への注入によって形成される。次に、これらの液滴で直接に熱循環が行われる。ある実施態様では、対象の複数転写産物のｃＤＮＡを連結するために、重複伸長逆転写ポリメラーゼ連鎖反応が使用され得る。
【００４３】
他の実施態様では、単一細胞由来の対象のｃＤＮＡは、以下に記載のビーズにＲＴ−ＰＣＲによって結合され、ビーズ上の転写産物はハイスループット配列決定を用いて直接的に配列決定される。官能基化オリゴヌクレオチドプライマーの３種の等量混合物は、官能基化ビーズに複合化され得る。オリゴヌクレオチドの１つは、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルを捕捉するためのポリ（Ｔ）でよい。他の２つのオリゴヌクレオチドは、対象の転写産物を増幅するための特定のプライマーでよい。この方法で調製されたビーズは、水溶液中で細胞と混合され、各細胞が過剰のビーズと共にそれ自身の液滴中にあるように細胞／ビーズ懸濁液は乳化される。ある実施態様では、平均５５個のビーズが各液滴中に含まれ得る。細胞は熱的に溶解され、ビーズ上のポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡと結合する。エマルジョンは崩壊され、ビーズは回収、洗浄され、そして、転写産物がビーズに結合されるような方法で、対象の転写産物の増幅をもたらすことになるＲＴ−ＰＣＲ用の試薬及びプライマーを有する溶液中に再懸濁される。ビーズ懸濁液は乳化され、ＲＴ−ＰＣＲが行われる。ビーズは回収され、ハイスループット配列決定に供される。ハイスループット配列決定は、少なくとも２種の異なったプライマーであって、各開始プライマーは対象の転写産物に特異的であるプライマーを用いて複数の配列読みを開始することによってビーズに結合された２つの転写産物を直接、配列決定する。この２つの転写産物はハイスループット配列決定グリッド中でビーズ配置によって対にされ、単一細胞から一緒に発現される配列を露呈する。配列決定は、例えば、アプライドバイオシステムズのＳＯＬｉＤプラットフォーム、ライフテクノロジーズのＰｒｏｔｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、又はイルミナのＨｉＳｅｑシークエンシング・プラットフォームで実施される。
【００４４】
ＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー設計は、所定の細胞によって発現される対象のどの転写産物が互いに連結されるかを決定する。例えば、ある実施態様では、ＶＨ及びＶＬ鎖転写産物由来の各々のｃＤＮＡを共有結合的に一緒に連結させるプライマーが設計できる。連結されたｃＤＮＡの配列決定は、単一細胞によって発現されたＶＨ及びＶＬ配列対を明らかにする。他の実施態様では、個々の細胞で発現されたＴＣＲ対の配列が確認できるように、又は、細胞集団が対象の任意の２つの遺伝子を共発現するか否かを決定することができるように、プライマーセットは設計することもできる。
【００４５】
プライマー有効性の僅かな相違はＰＣＲの指数性によって大きな産物不均衡をつくるので、バイアスは、複数の増幅プライマーを使用するＰＣＲ反応での重要な問題であり得る。プライマーバイアスを軽減する１つの方法は、多重プライマーセットでは通常可能でない、同一プライマーを有する複数の遺伝子を増幅することである。対象の複数の特有プライマーの５’末端に共通の増幅領域を含めることによって、共通の増幅領域は、第１の重複事象中に全てのＰＣＲ産物の５’末端に加えられる。最初の重複事象の後に、共通領域でのみ刺激することによって増幅が達成されて、プライマーバイアスを減少させ、そして最終的なＰＣＲ産物分配を、最初の鋳型分配の代表を維持させる。
【００４６】
かかる共通領域は様々な方法で開発できる。１つの明らかな適用は、核酸増幅の大部分が減少した増幅バイアス用の共通配列によって起こるように、高濃度での共有増幅プライマー及び低濃度での（５’共有領域を有する）特有プライマーを加えることである。もう１つの適用は、増幅産物の表面型捕捉、例えば、エマルジョンＰＣＲ中にマイクロビーズ上でＰＣＲ産物を捕捉することである。共通配列オリゴヌクレオチドがビーズ表面上に固定される場合には、対象のＰＣＲ産物は、増幅中にビーズに共有結合的に連結されることになる。この方法では、幅広い多様な転写産物セットは、単一の固定されたオリゴヌクレオチド配列を用いて表面上に捕捉することができる。
【００４７】
例えば、２つの異なった共通領域は、等価な濃度でビーズ表面上に固定することができる（例えば、重鎖については１つの共通配列、及び軽鎖については異なった共通配列）。ＰＣＲ増幅後に、ビーズは、約５０％重鎖増幅産物、及び５０％軽鎖増幅産物でコートされるだろう。ビーズ表面上の重鎖と軽鎖提示とのこのバランスは、ビーズがハイスループット配列決定に供される時に重鎖及び軽鎖からの十分なシグナルを確実にするように働く。
【００４８】
従って、ある実施態様では、本開示は、遺伝子標的のセットに特異的な２又はそれ以上のオリゴヌクレオチドの５’領域に共通配列を加え；そして、共通配列を刺激することによって、遺伝子標的のセットの核酸増幅を実施すること、を含む方法を提供する。ある実施態様では、共通配列ｎは表面に固定される。他の実施態様では、共通配列は増幅産物を捕捉するために使用され得る。
【００４９】
本発明の開示の方法は、単一細胞から発現された複数の転写産物に関する情報を取得させる。ある実施態様では、確率的解析は、非天然対読み数又は頻度を超える読み数又は頻度を有する天然対を同定するために使用することができる。情報は、例えば、癌細胞の異なった集団における遺伝子共発現パターンを研究する際に、使用することができる。ある実施態様では、本開示の方法を用いて得られた発現情報に基づいて、治療法が目的に合わせられる。他の実施態様は新しいリンパ球受容体の発見に焦点を当てることができる。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。技術の説明に続く実施例中で開示された本技術は、本願発明者によって本発明を実施する際によく機能するように開発され、したがってその実施に好ましい型を構成すると考えることができるということが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は本開示を踏まえると、多くの変更が開示されて、さらに本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様の又は類似の結果を得る特定の実施形態中でなされてもよいということを、理解するべきである。
【００５１】
実施例１−高密度マイクロウェルプレートの作製
マイクロピラーの格子（直径５６μｍ、高さ５０μｍ）を、ＳＵ−８フォトレジスト（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてフォトリソグラフィーでシリカウェーハ上に型押しし、シリカウェーハを、標準的な顕微鏡スライドの寸法であってチップ毎におよそ１７０，０００ウェルを含有する、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップ（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）を印刷する型として使用する。マイクロピラーの寸法は、幅約５μｍ〜約３００μｍ及び高さ約５μｍ〜約３００μｍの範囲であり得る。成型したＰＤＭＳチップを、酸素プラズマ容器内で５分間シラン処理して、親水性表面を生成した。その後ＰＤＭＳチップを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で３０分間遮断し、脱イオン水及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、細胞播種の準備をした。
【００５２】
実施例２−ハイスループット法において単一細胞由来の２つの転写物を結合する方法
ハイスループット法において単一細胞由来の２つ以上の転写物を物理的に結合する工程は、実施例１の密閉したＰＤＭＳマイクロウェル装置を使用して、単一細胞を別々のウェル中に閉じ込める。細胞溶解もまた発生し、ｍＲＮＡ捕捉のためのポリ（Ｔ）磁性ミクロンサイズビーズもまた、マイクロウェル中に導入する。一度細胞及びビーズを装填すると、装置を透析膜で密封し、溶菌液を導入する。続いて、ビーズを回収し、重複伸長（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＯＥ）ＲＴ−ＰＣＲのための試薬、プライマー及びポリメラーゼ酵素を有する溶液中に再懸濁し、各ビーズが単一エマルジョン滴中に被包されるように、その後溶液を乳化する。エマルジョン熱循環に供して、２つの転写物（例えば、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ）を物理的に結合し、そして結合した生成物を循環後のエマルジョンから回収する。ネステッドＰＣＲ増幅を実施し、その後Ｉｌｌｕｍｉｎａ又は適切な長さのリードを産生して転写物対合情報（図６）を明確に解釈することができる他のＮｅｘｔＧｅｎ配列決定技術を用いて得られたＤＮＡを、配列決定する。
【００５３】
上に概略した方法を使用して、マウスハイブリドーマ細胞株ＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５を含む混合物中で免疫グロブリン可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖を結合した。これらの細胞株の各々により発現されるＶＨ及びＶＬ配列は既知であり、したがってこれらの実験は方法確認のために役立つ。ＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５細胞からそれぞれ５ｍＬを、継代の２日後の培養物（細胞はＦａｌｃｏｎベント式Ｔ−２５培養フラスコ中で生育した、ＲＰＭＩ−１６４０中１０ｍＬ容積、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ）から別々に取り除き、１５ｍＬ管中に設置した。＞９８％の生存率を有する１５０，０００個の生存細胞／ｍＬの細胞密度を、血球計数器及びトリパンブルー排除によって測定して、決定した。リボヌクレアーゼＡを３０μｇ／ｍＬの濃度で各々の管に加え、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を完全培地で３回、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。洗浄を、吸引及び再懸濁の後に、室温にて５分間、２５０ｇでの遠心分離により達成した。細胞濃度を血球計数器で再度計数し、ＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５細胞を混合して、ＰＢＳ中の総濃度３５，０００細胞／ｍＬを有し、１７，５００  ＭＯＰＣ−２１細胞／ｍＬ及び１７，５００  ＭＯＰＣ−３１５細胞／ｍＬからなる細胞懸濁液を形成した。
【００５４】
５００μＬのＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５細胞混合物を、ＢＳＡでインキュベートして非特異的吸着を阻止しているＰＤＭＳマイクロウェル装置に加えた。総細胞数１７，５００個を各チップに加えた。４つのチップを同時に使用し（総細胞数７０，０００個が４つのＰＤＭＳチップ全てに分配された）、重力により５分間に渡って穏やかに撹拌することで、細胞をウェル中に定着させた。各ＰＤＭＳチップがおよそ１２０，０００ウェルを含有し、細胞負荷効率がおよそ７０％と見積もられた場合、１０ウェルのうちおよそ１つは単離細胞を含有する。ウェル毎の２つの細胞発生率は、ポアソン統計で正確に見積もることができ、これらの条件下において、細胞を含有する＞９５％のウェルが単一細胞を含有する細胞を含有する。
【００５５】
その後マイクロウェル装置の表面をＰＢＳで洗浄して吸着されなかった細胞をチップ表面から除去し、２５μＬのポリ（Ｔ）磁性ビーズ（ｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ、直径２．８μｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を５０μＬのＰＢＳ中で再懸濁し、各マイクロウェル装置表面に、ウェル毎に５５個のポリ（Ｔ）ビーズの平均で塗布した。磁性ビーズを重力によってウェル中に定着させた後、ＰＢＳ中ですすいだＢＳＡ遮断透析膜（１２，０００〜１４，０００個のＭＷＣＯ再生セルロース、折り径２５ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各チップ表面上に塗布した。ＰＢＳを、２００μＬピペットを用いてチップ及び膜表面から除去した。その後、１０００μＬピペット先端のテーパーエンドを切断して、膜をＰＤＭＳチップに押しつけ、ＰＤＭＳマイクロウェル装置とマイクロウェル並びに捕捉された細胞及びビーズ（図１）を内部に密閉した透析膜との間から過剰ＰＢＳを除去する、膜を横切り引っ張られた平らなシリンダーを形成した。
【００５６】
細胞溶解及びマイクロウェル中に捕捉されたポリ（Ｔ）磁性ビーズとのｍＲＮＡ結合を、透析により達成した。５００μＬの細胞溶解溶液（０．１％デオキシコール酸ナトリウム及び１０ｍＭリボヌクレオシドバナジル錯体を有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液中５００ｍＭ  ＬｉＣｌ（ｐＨ７．５））を透析膜に塗布し、室温で試薬をマイクロウェル中に透析した場合に溶解が発生した。細胞溶解は、経時的顕微鏡検査法（図２）により決定した場合＜５分で十分に完了した。
【００５７】
ＰＤＭＳマイクロウェルチップを２０分間室温でペトリ皿の内側にて維持し、その後４℃の低温室にさらに１０分間置いた。透析膜をピンセットで除去して処分し、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ磁石をＰＤＭＳマイクロウェル装置の下に設置してマイクロウェル中の磁性ビーズを保持した。その後磁石を、そのうち１つが２ｍＬの冷たいｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌｙｓｉｓ／結合緩衝液（１００ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＬｉＤＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ）を含有する４つの細区画を有する、別のペトリ皿の下に設置した。４つのＰＤＭＳマイクロウェル装置を順番に反転し、２ｍＬの溶液中に再懸濁して、磁石がマイクロウェルの外側のビーズをｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液中に引きつけるようにした。その後磁性ビーズを２ｍＬのｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌｙｓｉｓ／結合緩衝液中で再懸濁し、溶液を２つのＥｐｐｅｎｄｆｏｒｆ管中に分割し、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ磁気ラックに設置した。ビーズは再懸濁せず、管毎に１ｍＬの洗浄緩衝液１（１００ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４℃）を用いて、１回洗浄した。その直後、ビーズを再懸濁し、洗浄緩衝液１中にて再度洗浄した。その直後、ビーズを洗浄緩衝液２（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ）中で再懸濁し、磁気ラックに設置した。最後にビーズを、０．０５ｗｔ％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＢＳＡ、５０ｍｇ／ｍＬ）及び表１に列挙されるプライマー濃度を含有する、２．８５ｍＬの冷たいＲＴ−ＰＣＲ混合物（Ｑｕａｎｔａ  ＯｎｅＳｔｅｐ  Ｆａｓｔ、ＶＷＲ）中で再懸濁した。増幅は、ＣＬｒｅｖ及びＣＨｒｅｖ特異的プライマーの５’末端の逆相補体にアニールする、２つの通常のプライマー（ＣＨｒｅｖ−ＡＨＸ８９及びＣＬｒｅｖ−ＢＲＨ０６）を高い濃度で用いて達成した。Ｖ領域プライマーはまた、５’末端にリンカー配列を含有して、ＶＨ−ＶＬ結合に影響する。２５μＬの冷たいＲＴ−ＰＣＲ混合物を、ビーズを有さない循環又は非テンプレート対照としての乳化のために予め準備した。ポリ（Ｔ）磁性ビーズを含有する冷たいＲＴ−ＰＣＲ混合物を滴加して、９ｍＬの冷却された油相（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．による４．５％Ｓｐａｎ−８０、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｖ／ｖ％油相試薬を有する分子生物学グレードミネラルオイル）を有するＩｋａ分散管（ＤＴ−２０、ＶＷＲ）を撹拌し、混合物を５分間低速で撹拌した。得られたエマルジョンを、ウェル毎に１００μＬのエマルジョンで９６ウェルＰＣＲプレートに加え、熱サイクラーに設置した。ＲＴステップを、以下の条件下において実施した：５５℃で３０分、続いて９５℃で２分。その後、ＰＣＲ増幅を以下の条件下において実施した：９４℃で３０秒間の変性、５７℃で１分間のアニール、及び７２℃で３分間の伸長を３回；その後、９４℃で３０秒間の変性、５９℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で３分間の伸長を２７回；その後、７２℃で７分間の最終伸長ステップ。図３は、最終結合生成物の図表を示す。
【００５８】
表１：ＭＯＰＣ−２１／ＭＯＰＣ−３１５エマルジョン結合ＲＴ−ＰＣＲのプライマー
【表１】
0006558830.tif 000002
【００５９】
熱循環に続いて、エマルジョンを集め、３つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分割し、室温で１０分間、１６，０００ｇで遠心分離した。ミネラルオイル上方相を処分し、１．５ｍＬのジエチルエーテルを加えて、残った油相を抽出し、エマルジョンを破壊した。上方のエーテル層を除去し、さらに２回のエーテル抽出を実施した。その後、エーテル層を処分し、残ったエーテル溶媒を室温で２５分間、ＳｐｅｅｄＶａｃ中で除去した。残った水相をＤＮＡ結合緩衝液中で５：１に希釈し、その後３部に分割し、３つのシリカスピンカラム（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を通過させて、ＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡ生成物を捕捉した。各カラムを３００μＬの洗浄緩衝液（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）中で洗浄した後、ｃＤＮＡを各カラム中に２０μＬで溶離し、ネステッドＰＣＲ反応を、テンプレートとして溶離した４μＬのｃＤＮＡを用いる２００μＬの総容積中で実施した（Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを有するＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  ＰＣＲ緩衝液、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。９４℃で２分の変性ステップの後、循環を、９４℃で３０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニール、７２℃で２０秒間の伸長で、３０回実施した。４００ｎＭの各ネステッドプライマー（表２）を使用して、およそ８００ｂｐの結合生成物を生成した、結合した重鎖及び軽鎖を増幅した。
【００６０】
表２：ＭＯＰＣ−２１／ＭＯＰＣ−３１５ネステッドＰＣＲのプライマー
【表２】
0006558830.tif 000003
【００６１】
ネステッドＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上で電気泳動させ、８００ｂｐ帯を切除し、アガロース溶解緩衝液中で１０分間、５０℃で溶解し、その後製造者（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．）による指示書に従ってシリカスピンカラム上に捕捉し、そこから溶離して、精製したネステッドＰＣＲ生成物を得た。精製ｃＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ配列決定プラットフォームを有する塩基対対末端（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）リードに供した。結合転写物の同定に適したリードを提供することができる他のＮｅｘｔＧｅｎ配列決定技術（例えば、Ｒｏｃｈｅｄ  ４５４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ他）はまた、この目的に使用することもできる。（図３）。ＨｉＳｅｑデータ出力を、ＳＨｏｒｔ  Ｒｅａｄ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐａｃｋａｇｅソフトウェア（ＳＨＲｉＭＰ）を用いて既知のＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５配列に位置づけ、既知の転写物配列に対して＞９０％の同一性を有する上質なリードのために選別した。この方法において、およそ１８，０００個の結合重鎖及び軽鎖配列を得た（表３）。
【００６２】
表３：配列決定したＶＨ−ＶＬ対の生リード数
【表３】
0006558830.tif 000004
【００６３】
正確な転写物対合を、生ＤＮＡ配列決定データの対合の歪度からさらに判定した。例えば免疫グロブリン重鎖Ｈｉ及び軽鎖Ｌｊといった、対合歪度ｓの尺度である、全体の重鎖又は軽鎖マップ頻度ｆＨｉ及びｆＬｊを有する所与の２つの転写物はいずれも、以下のように算出する：
【００６４】
【数１】
0006558830.tif 000005
【００６５】
計算値ｓは、特定のＶＨと対になるＶＬ頻度と、配列セット全体のＶＬ頻度とを比較する。ｓ＞１の値は、ランダム対合と対応する上の頻度で重−軽対が観測されることを示す。自然対合は、ｓ（表４）の最大値を有する移行から推定した。配列決定した重−軽対に対する、およそ１８，０００個の配列決定したＶＨ−ＶＬ結合対から算出された対合歪度であるｓを、表４に示す。自然重−軽対合を、各重鎖に対するｓの最大値から予想し、緑色で強調する。この表は、細胞の不均一混合物から自然重−軽鎖対合を分離するための、本方法の能力を示す。
【００６６】
表４：算出対合歪度
【表４】
0006558830.tif 000006
【００６７】
実施例３−５つの細胞株の規定混合物を用いるハイスループット転写物対合分析
５つの不死化Ｂ細胞株を異なる比率で混合し、ＯＥ−ＰＣＲにより生成された結合生成物の対合効果を試験するのに使用した。この実験で使用した５つのＢ細胞株は以下の通りである：ＭＯＰＣ−２１、ＭＯＰＣ−３１５、ＩＭ−９、ＡＲＨ−７７、及びＤＢ（表５を参照）。ＤＢは非常に低レベルのＶＨ及びＶＬ転写物を発現し、負の対照として使用された。
【００６８】
全ての細胞株はＡＴＣＣから得られ、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（実施例２を参照）で補われたＲＰＭＩ−１６４０で培養した。３０分ＲＮＡｓｅ処理及びその後の洗浄に続き、細胞を、チップ毎の総細胞数１７，５００個の密度で実施例２によるポリ（Ｔ）磁性ビーズと共にマイクロウェル中へ播種した。ウェルを透析膜で密封し、細胞を溶解し、ビーズ（実施例２）にアニールさせた。その後、ビーズを回収し、ＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲ混合中で再懸濁し、エマルジョン（実施例２）中に設置した。使用したＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲプライマー濃度を表６に示し、熱循環条件を表７に示す。
【００６９】
表５：５つの細胞株の概要
【表５】
0006558830.tif 000007
【００７０】
表６：細胞株の混合のＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲプライマー
【表６】
0006558830.tif 000008
【００７１】
表７：ＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲ熱循環条件
【表７】
0006558830.tif 000009
【００７２】
エマルジョンＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲ生成物をジエチルエーテル抽出によって回収し、続いてネステッドＰＣＲにおいてテンプレートとして使用するために、以下の条件下においてシリカスピンカラム（実施例２）上で捕捉し、そこから溶離した：９４℃で２分間の初回変性、９４℃で３０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニール、７２℃で２０秒間の伸長を、４０回の通算サイクル。ネステッドプライマー配列及び濃度を、表２及び表８にて報告する。
【００７３】
表８：およそ８００ｂｐの結合生成物を生成するネステッドＰＣＲプライマー
【表８】
0006558830.tif 000010
【００７４】
ネステッドＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上で電気泳動させ、６５０〜１０００ｂｐの領域を切除し、シリカスピンカラム（実施例２）で精製した。回収したｃＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  １００ｂｐ対末端配列決定に供した。ＨｉＳｅｑデータを、５つのクローン全てに重鎖及び軽鎖配列を含有する参照ファイルに位置づけ、データ選別して、実施例２にあるような、参照配列に＞９０％一致する対末端リードを得た。自然対合を対合データの歪度を調べることで同定した。全体の重鎖又は軽鎖マップ頻度ｆＨｉ及びｆＬｊを有する、所与の免疫グロブリン重鎖Ｈｉ及び軽鎖Ｌｊのいずれについても、対合歪度の尺度であるｓを以下の通り算出した：
【００７５】
【数２】
0006558830.tif 000011
【００７６】
計算値ｓは、特定のＶＨと対になるＶＬ頻度と、配列セット全体のＶＬ頻度とを比較する。ｓ＞１の値は、ランダム対合と対応する上の頻度で重−軽対が観測されることを示す。自然対合は、各重鎖の最大値ｓを有する全体から推定する。表９は、配列決定した重−軽対に対する、およそ６６，０００個の配列決定したＶＨ−ＶＬ結合対から算出された、同定された自然対合及び対合歪度であるｓを示す。自然重−軽対を、各重鎖に対するｓの最大値から予想し、緑色で強調する。表９は、ハイスループットを用いて細胞の不均一混合物から自然重−軽鎖対合を分離するための、本方法の能力を示す。
【００７７】
表９：自然重−軽鎖対合の分解
【表９】
0006558830.tif 000012
【００７８】
実施例４−高密度マイクロウェルプレート中に捕捉された単一Ｂ細胞由来の２つの転写物を結合する方法
Ｂ細胞の集合を、実施例１に記載の通りに作製したＰＤＭＳマイクロウェルプレート中に重力によって定着させる。この実施例において、各ＰＤＭＳスライドは、少なくとも９５％の確立でポアソン統計に基づきウェル毎に細胞が１つだけ存在している、同時に加工された４つのスライドが６８，０００個のリンパ球に≧１：１０の細胞／ウェル占有率で適応するように、１．７×１０５ウェルを含有する。直径２．８μｍのポリ（ｄＴ）磁性ビーズを平均５５個のビーズ／ウェルでマイクロウェル中に沈着し、スライドを透析膜で覆う。続いて、＜１分以内の完全細胞溶解の結果として生じる１％ドデシル硫酸リチウムを含有する膜で覆われたスライドを、最適化細胞溶解溶液でインキュベートする。ｍＲＮＡは、重複伸長（ＯＥ）ＲＴ−ＰＣＲに対して、試薬、プライマー、逆転写酵素、及びポリメラーゼ酵素により溶液中で集められ、洗浄され、最懸濁されたポリ（ｄＴ）磁性ビーズにアニールする。この方法において、ビーズは油エマルジョン中に水を含む液滴中に単離される。エマルジョンを熱循環に供して、２つの転写物（例えば、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ）を物理的に結合し、結合生成物を循環の後のエマルジョンから回収する。ネステッドＰＣＲ増幅を実施し、その後得られたＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ又は適切な長さのリードを産生して転写物対合情報を明確に解釈することができるあらゆる他のＮｅｘｔＧｅｎ配列決定技術を用いて配列決定する。工程の概要を図６に示す。
【００７９】
上に概説した方法を使用して、ヒト初代細胞の混合物中における免疫グロブリン可変重（ＶＨ）及び可変軽（ＶＬ）鎖を結合した。
【００８０】
健康な３０歳の男性を２０１０〜２０１１  三価ＦｌｕＶｉｒｉｎインフルエンザワクチン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）でワクチン接種し、インフォームド・コンセントが得られた後、血液をワクチン接種から１４日後に採取した。ＰＢＭＣを単離し、凍結保存のためにＤＭＳＯ／１０％ＦＣＳ中で再懸濁した。凍結したＰＢＭＣを解凍し、細胞懸濁液をＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中で抗ヒトＣＤ１９（ＨＩＢ１９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＣＤ２７（Ｏ３２３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ３（７Ｄ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて染色した。ＣＤ１９＋ＣＤ３−ＣＤ２７＋ＣＤ３８ｉｎｔ記憶Ｂ細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ選別システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて選別した。細胞を、後のハイスループットＶＨ：ＶＬ対合のためにＤＭＳＯ／１０％ＦＣＳ中にて、又はリボヌクレアーゼＩｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）及び単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ分析のためのｐＨ８．０の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含む９６ウェルプレート中に選別される単一細胞中にて、のいずれかで凍結保存した。ｃＤＮＡを、プライマーセット及び前述のＰＣＲ条件を用いる免疫グロブリン可変遺伝子の増幅の前に、Ｍａｘｉｍａ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて単一選別（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｏｒｔｅｄ）細胞から合成した（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。可変遺伝子を、ＩＭＧＴサーチエンジン（Ｂｒｏｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を用いてインハウス分析ソフトウェアで判定した。
【００８１】
ハイスループットＶＨ：ＶＬ対合のために凍結された記憶Ｂ細胞を解凍し、２５０ｇで１０分間の遠心分離により回収した。細胞を、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×可欠アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウム及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補われた２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁し、３７℃で１３時間、９６ウェルプレート中でインキュベートした。回収した細胞を２５０ｇで１０分間再び遠心分離し、４００μｌのＰＢＳ中で再懸濁し、６μｌを血球計数器による細胞計数のために取り除いた。およそ８，８００個の細胞を凍結した貯蔵物から回収した。その後記憶Ｂ細胞を約８８０個のＩＭ−９細胞（ＡＴＣＣ数ＣＣＬ−１５９）で内部対照としてスパイクした。細胞を２つのＰＤＭＳマイクロウェルスライド（３４０，０００ウェル）上で再懸濁し、重力により５分に渡って穏やかに撹拌することで、ウェル中に定着させた。細胞播種工程は、細胞播種の前後両方の播種緩衝液中で細胞濃度を測定することにより９０％の効率となるように計算されており、したがって、８，０００個の初代細胞をこの実験で分析した。ウェル状態毎に単一及び多細胞中で単離された細胞の画分を、以下のポアソン統計：
【００８２】
【数３】
0006558830.tif 000013
【００８３】
を用いて算出し、式中、ｋは単一マイクロウェル中の細胞数と等しく、μはウェル毎の細胞の平均数であり、したがってこの実験で使用した１：３９の細胞：ウェル比率は、１細胞／ウェルの占有率で沈着した細胞の９８．７％と対応する。２５μｌのポリ（ｄＴ）磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ）を５０μｌのＰＢＳ中で再懸濁し、各ＰＤＭＳスライド表面（ウェル毎に平均５５個のポリ（ｄＴ）ビーズ）上に分配した。磁性ビーズを重力により約５分間ウェル中に定着させ、その後ＰＢＳ中ですすがれていたＢＳＡ遮断透析膜（１２，０００〜１４，０００個のＭＷＣＯ再生セルロース、２５ｍｍの折り径、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、マイクロウェルを密閉し、細胞及びビーズを内部に捕捉した（図１）各スライド表面上に塗布した。過剰ＰＢＳを、２００μＬのピペットを用いてスライド及び膜表面から除去した。５００μＬの細胞溶解溶液（１％ドデシル硫酸リチウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５ｍＭ  ＤＴＴを有する１００ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中の５００ｍＭ  ＬｉＣｌ）を２０分間室温で透析膜に塗布した。経時的顕微鏡検査法は、全ての細胞が１分以内で十分に溶解することを明らかにした（図２）。続いて、スライドを４℃で１０分間インキュベートし、その際Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ磁石をＰＤＭＳマイクロウェル装置の下に設置して、透析膜をピンセットで除去し、処分したマイクロウェル中に磁性ビーズを保持した。ＰＤＭＳスライドを２ｍＬの冷たい溶菌液を含有するペトリ皿中で素早く反転し、磁石をペトリ皿の下に貼って、ビーズをマイクロウェルの外側へ出した。続いて、最懸濁したビーズを含有する溶菌液の１ｍＬのアリコットをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に設置し、ビーズをＤｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｓ磁気ラック上でペレット化し、再懸濁せずに管あたり１ｍＬ毎に洗浄緩衝液１（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４℃）を用いて１回洗浄した。ビーズを洗浄緩衝液１中で再懸濁し、ペレット化し、洗浄緩衝液２（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ）で再懸濁し、再びペレット化した。最後にビーズを、０．０５ｗｔ％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＢＳＡ、５０ｍｇ／ｍＬ）及びＶＨ−ＶＬ結合増幅（図４並びに表６及び１０）のためのプライマーセットを含有する、２．８５ｍＬの冷たいＲＴ−ＰＣＲ混合物（Ｑｕａｎｔａ  ＯｎｅＳｔｅｐ  Ｆａｓｔ、ＶＷＲ）中で懸濁した。ポリ（ｄＴ）磁性ビーズを含む懸濁液を滴加して、９ｍＬの冷却した油相（４．５％Ｓｐａｎ−８０、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する分子生物学グレードミネラルオイル、ｖ／ｖ％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を含有するＩＫＡ分散管（ＤＴ−２０、ＶＷＲ）を撹拌し、混合物を５分間低速で撹拌した。得られたエマルジョンを、ウェル毎に１００μＬのエマルジョンを有する９６ウェルＰＣＲプレートに加え、熱サイクラーに設置した。ＲＴステップを以下の条件下において実施した：５５℃で３０分、続いて９４℃で２分。ＰＣＲ増幅を以下の条件で実施した：９４℃で���０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長を４回；９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長を４回；９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長を２２回；その後、７２℃で７分間の最終伸長ステップ。熱循環の後、エマルジョンを視覚的に検査して、エマルジョン安定性の重要な指標であるバルク水相の非存在を確かめた。次の視覚確認では、エマルジョンを集め、室温で１０分間、１６，０００ｇで遠心分離し、ミネラルオイル上方相を処分し、１．５ｍＬのジエチルエーテルを加えて残った油相を抽出し、エマルジョンを破壊した。上方のエーテル層を処分し、さらに２回のエーテル抽出を実施し、残ったエーテルをＳｐｅｅｄＶａｃ中で２５分間、室温で除去した。水相をＤＮＡ結合緩衝液中で５：１に希釈し、シリカスピンカラム（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州アーバイン）を通過させて、ｃＤＮＡ生成物を捕捉した。カラムを３００μＬの洗浄緩衝液（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ）で洗浄し、ｃＤＮＡを４０μＬのヌクレアーゼを含まない水中に溶離した。最後に、ネステッドＰＣＲ増幅を、４００ｎＭのプライマー（表８及び表１１）を有する、４μＬの溶離したｃＤＮＡをテンプレートとして用いる総容積２００μＬ中で、以下の条件下において実施した（Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを有するＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  ＰＣＲ緩衝液、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）：９４℃で２分間の初回変性、９４℃で３０秒間の変性を３９回、６２℃で３０秒間のアニール、７２℃で２０秒間の伸長、７２℃で７分間の最終伸長。およそ８５０ｂｐの結合生成物（図３）をアガロースゲル電気泳動により抽出し、２×２５０の対末端ＭｉＳｅｑ  ＮｅｘｔＧｅｎプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて配列決定した。
【００８４】
表１０：ヒトＶＨ−ＶＬ結合ＲＴ−ＰＣＲ増幅のプライマーセット
【表１０】
0006558830.tif 000014
【００８５】
表１１：ヒトＶＨ−ＶＬネステッドＰＣＲ増幅のプライマーセット
【表１１】
0006558830.tif 000015
【００８６】
生物情報学的分析に関して、生２×２５０  ＭｉＳｅｑデータを、５０％のヌクレオチドを２０超える最小Ｐｈｒｅｄ品質スコアについて選別して、ＣＤＲ３含有領域（およそＨＣ  ｎｔ  ６５〜１１５又はＬＣ  ｎｔ  ５５〜１００）中の高いリードの質を確認した。配列データを、生殖系列Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子（Ｂｒｏｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）へ位置づけるためにＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）に供した。配列データをインフレームＶ（Ｄ）Ｊ接合部について選別し、増殖性ＶＨ及びＶκ，λ配列をＩｌｌｕｍｉｎａリードＩＤによって対にした。ＣＤＲ−Ｈ３ヌクレオチド配列を抽出し、末端のギャップは無視しながら９６％ｎｔの同一性にクラスター化して、データセット中における独特なＣＤＲ−Ｈ３の一覧表を作成した。９６％ｎｔの同一性カットオフは、スパイクされた対照クローン中のクラスター配列決定エラーに対する最適なカットオフであることを発見した；独特なＣＤＲ−Ｈ３配列の数及び、したがって報告された独特なＶ遺伝子の数は、試料（表１２）から回収されたクラスターの数について言及する。各ＣＤＲ−Ｈ３クラスターに対する最高リード数のＣＤＲ−Ｌ３を同属対として割り当て、回収したＶＨ：ＶＬ対の一覧表を作成した。９４２：１の観測した正確な比率は、ＩＭ−９スパイク対照細胞株中における正確な重−軽鎖対合の保存を示した（表１２）。
【００８７】
表１２：実施例４の重要な実験の統計
【表１２】
0006558830.tif 000016
【００８８】
このハイスループットアプローチを用いて同定されたＶＨ：ＶＬ対合を、樹立単一細胞選別方法（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｗｒａｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を用いて同定したものと比較した；この分析は二重盲検法にて行った。末梢性ＣＤ１９＋ＣＤ３−ＣＤ２７＋ＣＤ３８ｉｎｔ記憶Ｂ細胞を、２０１０〜２０１１  三価ＦｌｕＶｉｒｉｎインフルエンザワクチン（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）によりワクチン接種の１４日後である健康なボランティアから単離した。ｓｃＲＴ−ＰＣＲ分析に関して、１６８個の単一Ｂ細胞を４つの９６ウェルプレート中に分別し、１６８のＲＴ及び５０４ネステッドＰＣＲ反応を個々に実施して、ＶＨ及びＶＬ（κ及びλ）遺伝子を別々に増幅した。ＤＮＡ生成物をゲル電気泳動によって分離し、配列決定して、その内５０個は独特である合計５１個のＶＨ：ＶＬ対を産生した。合計２４０個の独特なＣＤＲ−Ｈ３：ＣＤＲ−Ｌ３対を回収した。ハイスループット対合セット中で検出された４つのＣＤＲ−Ｈ３配列もまた、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ分析において観測された。盲検分析は、２つのアプローチにより単離したＣＤＲ−Ｈ３：ＣＤＲ−Ｌ３対は、完全に一致していたことを明らかにした（ＤｅＫｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。樹立単一細胞ＲＴ−ＰＣＲ配列決定方法と、ハイスループット配列決定方法との間の一致は、本開示中に記載の方法に従って回収されたＶＨ：ＶＬ配列中において高い正確性を示した。
【００８９】
実施例５−ハイスループットＶＨ：ＶＬ対合に続く高親和性抗体の単離
この実施例は、追加抗原免疫に続く、ヒト末梢性Ｂ細胞からの高親和性抗破傷風抗体の単離について記載する。１人の女性ドナーを、Ｃｈａｒｉｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔｓｍｅｄｉｚｉｎ  Ｂｅｒｌｉｎによるインフォームド・コンセントが得られた後に、ＴＴ／ジフテリアトキソイド（ＴＤ、２０  Ｉ．Ｅ．ＴＴ及び２  Ｉ．Ｅ．ジフテリアトキソイド、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐｅ＆Ｄｏｈｍｅ  ＧｍｂＨ、ライメン、ドイツ）に対して追加抗原免疫化（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）した（試料は匿名でコード化され、病院の倫理承認委員会により認められた研究の番号第ＥＡ１／１７８／１１、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ａｔ  Ａｕｓｔｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ＢｏａｒｄのＩＲＢ番号第２０１１−１１−００９５号）。ＴＴ免疫化の７日後に、ＥＤＴＡ血液を採取し、ＰＢＭＣを記載の通り（Ｍｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）に密度勾配分離によって単離した。ＰＢＭＣをＰＢＳ／ＢＳＡ中において、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ１４−ＰａｃＢ（それぞれクローンＵＣＨＴ１及びＭ５Ｅ２、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＢＤ）、ＣＤ１９−ＰＥＣｙ７（クローンＳＪ２５Ｃ１、ＢＤ）、ＣＤ２７−Ｃｙ５（クローン２Ｅ４、Ｒｅｎｅ  ｖａｎ  Ｌｉｅｒによる高品質な種、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｒｈｅｕｍａｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ（ＤＲＦＺ）で標識、Ｂｅｒｌｉｎ）、ＣＤ２０−ＰａｃＯ（クローンＨＩ４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩｇＤ−ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（クローンＬ２７、ＢＤ）、ＣＤ３８−ＰＥ（クローンＨＩＴ２、ＢＤ）及びＴＴ−Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ＤＲＦＺで標識）により４℃で１５分間染色した。細胞を洗浄し、第２の染色を抗Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−ＦＩＴＣ（Ｒｏｃｈｅ、ＤＲＦＺで標識）により実施し、選別の前にＤＡＰＩを加えた。ＣＤ１９＋ＣＤ３−ＣＤ１４―ＣＤ３８＋＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ２０−ＴＴ＋形質芽細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ選別システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。選別した細胞の一部を洗浄し、ＤＭＳＯ／１０％ＦＣＳ中でハイスループットＶＨ：ＶＬ対合のために凍結保存した。
【００９０】
およそ２，０００個の凍結ＴＴ＋形質芽細胞を含有する１つのバイアルを解凍し、２５０ｘｇで１０分間の遠心分離によって回収した；細胞のおよそ２０〜３０％が生存可能であると予測される（Ｋｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。細胞を１０％ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×可欠アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウム及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）で補われた３００μＬのＲＰＭＩ−１６４０中で再懸濁し、３７℃で１３時間、９６ウェルプレート中でインキュベートした。回収した細胞を再び、２５０ｘｇで１０分間遠心分離し、４００μＬのＰＢＳ中で再懸濁し、６μＬを血球計数器による細胞計数のために採取した。細胞をおよそ３０個のＡＲＨ−７７細胞で内部対照（ＡＴＣＣ数ＣＲＬ−１６２１）としてスパイクし、ＶＨ：ＶＬ転写物を、ＩｇＭプライマーを除去して３８回ネステッドＰＣＲを用いる実施例４に記載の通り結合した；得られた生成物を２×２５０のＭｉＳｅｑ配列決定に供した。ＶＨ及びＶＬ鎖もまた個々に増幅して、抗体発現に対する完全ＶＨ及びＶＬ配列を得た。ネステッドＰＣＲ生成物を１：９で希釈し、０．５μＬをテンプレートとしてＰＣＲ反応中で、以下の条件にて使用した：４００ｎＭのプライマー（表８、表１１及び表１３）、９４℃で２分間の初回変性、９４℃で３０秒間の変性を１２回、６２℃で３０秒間のアニール及び７２℃で１５秒間の伸長、７２℃で７分間の最終伸長。得られた約４５０ｂｐのＶＨ又は約４００ｂｐのＶＬ生成物をアガロースゲル電気泳動により精製し、２×２５０のＭｉＳｅｑ配列決定に供した。配列データを上に記載の通りに加工した；さらなる１０個のＶＨ−ＶＬ対を、ＴＴ＋形質芽細胞対合から抗体発現及び試験のために選択した。これらの１０個の遺伝子の完全抗体配列決定に関して、５’Ｖ遺伝子ＦＲ１−ＣＤＲ２及び３’ＣＤＲ２−ＦＲ４を含有する２×２５０ｂｐリードをＩｌｌｕｍｉｎａリードＩＤによって対にし、コンセンサス配列を、目的の正確なＣＤＲ３を含有するリードから作成した。その後、抗体遺伝子をヒトＩｇＧ発現ベクターｐＭＡＺ−ＶＨ及びｐＭＡＺ−ＶＬ中にそれぞれクローン化した（Ｍａｚｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。環状化した連結生成物の各々４０μｇを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、ニューヨーク州）中に同時形質移入した。培地を形質移入の６日後に遠心分離によって収集し、ＩｇＧをタンパク質Ａアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）クロマトグラフィーカラムによって精製した。
【００９１】
表１３：ＶＨ及びＶＬ分離増幅プライマーのリンカー
【表１３】
0006558830.tif 000017
【００９２】
抗原親和性を、抗原の段階希釈中に異なる濃度のＩｇＧを用いる、ＰＢＳ中の１％ミルクの存在下において１００ｎＭ〜０．０５ｎＭの範囲である競合的ＥＬＩＳＡ（Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）によって判定した。プレートを４℃で一晩、１０μｇ／ｍＬのＴＴによりｐＨ９．６で５０ｍＭの炭酸塩緩衝液中でコーティングし、ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を有するＰＢＳ）中で３回洗浄し、２％ミルクによりＰＢＳ中において、２時間室温で遮断した。ＴＴ抗原を有するＩｇＧの事前に平衡化した試料を遮断したＥＬＩＳＡプレートに加え、１時間室温でインキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５０μｌの抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰ二次抗体（１：５，０００、２％ミルク含有ＰＢＳ）で約２分間、２５℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後５０μｌのＵｌｔｒａ  ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）を各ウェルに加え、２５℃で５分間インキュベートした。反応を等容積の１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて止め、吸光度を４５０ｎｍで読み取った（ＢｉｏＴｅｋ、バーモント州ウィヌースキー）。各競合的ＥＬＩＳＡ複写物を、４パラメーターロジスティック（４ＰＬ）方程式を用いて、分析した各ＩｇＧに関する２〜３つの複写物の標準偏差として表されるエラーと一致させた。１０個の抗体全てがＴＴに対して特異性を示し、ＴＴを高い親和性（０．１ｎＭ≦ＫＤ≦１８ｎＭ；表１４）で結合した（ＤｅＫｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。回収した抗ＴＴ抗体の高親和性は、ヒト細胞ドナーからの抗体発見に関する本開示における、ハイスループットＶＨ：ＶＬ配列決定方法の適用を示す。
【００９３】
表１４：ＶＨ：ＶＬ対のハイスループット配列決定により単離されたＩｇＧの破傷風トキソイド結合親和性。親和性を競合ＥＬＩＳＡ希釈曲線から算出する。
【表１４】
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【００９４】
実施例６−相互対合一致を介するＶＨ：ＶＬ配列の生物情報学的同定
実施例４及び実施例５は、ハイスループット配列決定からの正確なＶＨ：ＶＬ配列対の同定を開示し、それにより所与のＶＨ配列に対する最高リード数ＶＬ配列は、個々のＢ細胞によりコード化された天然の同属ＶＨ：ＶＬ対を明らかにした。代わりに、この実施例は、ＶＨ及びＶＬ配列の両方のコンセンサス対合を介する、ハイスループットＶＨ：ＶＬ単位複製配列データにおける正確なＶＨ：ＶＬ対を同定する方法について記載する。
【００９５】
生データ対合を収集し、各ＶＨ配列の最高頻度ＶＬをファイル１中で表にした。ＶＬ毎の最高ＶＨをファイル２中で別々に表にした。多くの計算手法を、作表ステップを完遂するために使用することができる；例えばＢａｓｈ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）シェル中の「ｇｒｅｐ−ｍ  １  ＣＤＲ３  ｆｉｌｅｎａｍｅ」は、下降リード数により指定された配列を含有するように事前に選別されている、生対合データを含有するファイル（ｆｉｌｅｎａｍｅ）から、ＣＤＲ−Ｈ３又はＣＤＲ−Ｌ３配列（ＣＤＲ３）のトップクラスの同族対を選択することができる。データ作表に対する他の解法として、配列及び配列リード数を収集するためのハッシュの使用（例えば、Ｐｅｒｌコンピューター言語）、又は配列及びリード数を収集するための辞書の使用（例えば、Ｐｙｔｈｏｎ）又は他のデータ記憶構造（例えば、連合記憶又は連想配列）が挙げられる。ファイル１及びファイル２を比較し、どちらのファイルにも現れるＶＨ：ＶＬ対のいずれも「一致」を示し、そこで対は、所与のＶＬに対するトップクラスのＶＨと一致した所与のＶＨに対するトップクラスのＶＬにより記述された。多くの計算手法を、ファイル比較を完遂するために使用することができる；ファイル比較に対する１つの解法は、文書全体と一致する所望のフィールドを含む行が標準出力で印刷されるＢａｓｈ／Ｌｉｎｕｘ（登録商標）中で「結合」コマンドを使用する。本実施例に記載のアルゴリズムは、両方の正確なＶＨ：ＶＬ対の同定、及び配列エラーを含有するＶＨ：ＶＬ対がしばしば相互一致基準により除外されることが原因の少数の配列エラーの減少に効果的であった。対合に使用されるアルゴリズムの一般的な決定樹を、図９に示す。
【００９６】
実施例７−増殖記憶Ｂ細胞のＶＨ：ＶＬ対合
記憶Ｂ細胞を単離し、インビトロで増殖し、増殖細胞の２つのアリコットをハイスループット対合のために加工した。インビトロクローン増殖は同じＶＨ：ＶＬ対を含有する細胞の複数の複製に結果としてなり、したがって同じＢ細胞試料由来の別々のアリコット中の同じＶＨ：ＶＬ対を配列決定する確率を上昇させる。
【００９７】
ＰＢＭＣを提供されたヒト血液から単離し、ＣＤ２０−ＦＩＴＣ（クローン２Ｈ７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（ＨＩＴ３ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州サンディエゴ、ＵＳＡ）、ＣＤ１９−ｖ４５０（ＨＩＢ１９、ＢＤ）、及びＣＤ２７−ＡＰＣ（Ｍ−Ｔ２７１、ＢＤ）で染色した。ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋記憶Ｂ細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体（５Ｃ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、１μｇ／ｍＬのｃＰｇ  ＯＤＮ  ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ、ＵＳＡ）、１００単位／ｍＬのＩＬ−４、１００単位／ｍＬのＩＬ−１０、及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）と共に、１０％ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×可欠アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウム及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる）で補われた４日間ＲＰＭＩ−１６４０の存在下でインキュベートした。９１，０００個の増殖Ｂ細胞を１２チップ上に播種し、９０％の推定ウェル播種効率比の後に、およそ４１，０００個の増殖Ｂ細胞を、実施例４に記載の方法に従って群（１：２５細胞：ウェル比率）毎に分析した。生物情報学的分析を実施例６に記載の通りに実施した。≧１のリードを有する１，０３３個のＣＤＲ−Ｈ３配列を両方の群で配列決定し、９７２／１，０３３個は、９４．０９％の一致画分を産生する一致ＣＤＲ−Ｌ３対を示した。対合正確性について、ＡＰは、２つの独立した以下の群のＣＤＲ−Ｌ３一致画分である、ｆ一致から見積もることができ：
【００９８】
【数４】
0006558830.tif 000019
【００９９】
【数５】
0006558830.tif 000020
【０１００】
これらは９７．０％の全体の正確性を産生した。ポアソン分布によるウェル毎の単一細胞の比率からの正確性の理論的限界（この実施例にて使用した１：２５細胞：ウェル比率に対して９８％）は、ＶＨ：ＶＬ対合の実験的に判定された正確性と非常に近い関係にあった。
【０１０１】
実施例８−ＶＨ：ＶＬ対合に対するリーダーペプチドプライマーの使用
この実施例において、抗体ｃＤＮＡのリーダーペプチド領域とアニールするプライマー（ＶＨ及びＶＬ領域のフレームワーク１に特異的なプライマーとは対照的、実施例４に記載）を使用して、抗体ＶＨ：ＶＬ対を配列決定した。記憶Ｂ細胞を提供ヒトＰＢＭＣから単離し、細胞を２つの群に分割した：群１は２９，０００個の細胞からなり、これを直ちに分析し（合計５１０，０００個のウェルを使用、１：１６細胞：ウェル比率）、一方で群２を実施例７に記載の通りに伸長し、２８，０００個の細胞をインビトロ増殖の後に分析した（合計６８０，０００個のウェルを使用、１：２４細胞：ウェル比率）。どちらの実験も、表１５に示されるリーダーペプチド重複伸長プライマー、及び下記の条件下におけるエマルジョン結合ＲＴ−ＰＣＲ循環を用いる実施例７の通りに実施した：５５℃で３０分間、続いて９４℃で２分間；９４℃で３０秒間の変性、５４℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長を４回；９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長を２９回；その後、７２℃で７分間の最終伸長ステップ。さらなるバーコード領域もまた、個々の結合イベントの多配列リードを同定するのに使用したＶＬ結合プライマー（１６Ｎ領域）に含まれる（表１５）。ネステッドＰＣＲを、各群につき２５のＰＣＲ周期を伴う実施例５の通りに実施した。
【０１０２】
表１５：抗体ｍＲＮＡのリーダーペプチド領域を標的化する重複伸長ＲＴ−ＰＣＲプライマー標的指向
【表１５】
0006558830.tif 000021
【０１０３】
ネステッドＰＣＲ生成物のハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ  ２×２５０ｂｐ配列決定の後、両方のリーダーペプチド群において≧２のリードで観測された２３／２３  ＣＤＲ−Ｈ３は、一致するＣＤＲ−Ｌ３を示した。この実施例は、本開示の方法を用いて、種々のプライマーセットは配列多重転写物を配列決定するのに使用することができることを示す。
【０１０４】
実施例９−ノズル及び環状キャリア流を用いる低分散度、単一細胞油中水液滴形成
この実施例において、不死化Ｂ細胞株ＭＯＰＣ−２１を、ＰＢＳ中の細胞の混合物及び細胞生存率可視化のためのトリパンブルー染色からなる調節された大きさのエマルジョン滴中で生存可能にカプセル化した。この実施例は、調整された大きさ分布のエマルジョン滴中、さらに、液滴形成に先んじて直ちに混合する２つの異なる水流からなっている液滴中への単一細胞の単離を示す（図７）。
【０１０５】
ＭＯＰＣ−２１細胞をＰＢＳの５００，０００細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。同軸乳化装置を、１９ゲージ皮下管留置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）中に２６ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ネバダ州リノ、米国）を挿入することで作製し、針先が皮下管留置の末端で流されるように、針を調節した。同心針を、針の出口がノズル開口部からおよそ２ｍＭであるような１４０μｍの開口部を有する、３／８インチのＯＤガラス管（Ｗａｌｅ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、ペンシルバニア州ヘラータウン、米国）中に設置した。ＰＢＳ／細胞水溶液を５００μＬ／分の速度で針を通じて注射し、一方でＰＢＳ／０．４％トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス、米国）を１９ゲージの皮下管留置を通じて注射し、油相（４．５％Ｓｐａｎ−８０、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する分子生物学グレードミネラルオイル、ｖ／ｖ％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を、３ｍＬ／分の速度でガラス管中を通過させた。油相中で懸濁した液滴を２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に集めた。シリンジポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｅｇａｔｏ  ２００、マサチューセッツ州ホリストン、米国）を使用して水溶液の流速を制御し、ギアポンプ（Ｍ−５０、Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、テキサス州ヒューストン、米国）を使用して油の流速を制御し、得られたエマルジョンを光学顕微鏡で分析した。およそ８５μｍの平均直径を有する液滴を生成し、トリパンブルーの排除によって測定したような高い生存率を示す単一細胞を、カプセル化した（図５）。
【０１０６】
実施例１０−エマルジョン滴中におけるカプセル化を介したＢ細胞中の多重転写物の配列決定
この実施例において、細胞溶解及びポリ（Ｔ）ビーズへのｍＲＮＡアニールは、実施例９に概説した方法を用いて、生成したエマルジョン中で達成した。記憶Ｂ細胞の集合を単離し、細胞を実施例７に記載の通りに増殖した。記憶Ｂ細胞をＰＢＳ中で１００ｋ／ｍＬの濃度で再懸濁し、実施例８のエマルジョン発生装置の２６ゲージの針の最内側を、５００μＬ／分の速度で通過させた。４５０μＬのポリ（ｄＴ）磁性ビーズ（直径１．０μｍ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ、米国）を磁石でペレット化し、５ｍＬの細胞溶解／結合緩衝液（ｐＨ７．５の１００ｍＭ  ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸リチウム、５ｍＭ  ＤＴＴ）中で再懸濁し、得られた混合物を５００μＬ／分の速度で１９ゲージ皮下管留置中を通過させ、一方で油相（４．５％Ｓｐａｎ−８０、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する分子生物学グレードミネラルオイル、ｖ／ｖ％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を、３ｍＬ／分の速度でガラス管の最外側を通過させて、単一細胞を含有する直径およそ８５μｍの水滴からなるエマルジョンを生成した。エマルジョン流を２ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に集めて、液滴が、エマルジョン滴内でカプセル化されたポリ（ｄＴ）磁性ビーズ上でｍＲＮＡを捕捉させるために生成された際に、洗浄剤によって細胞を溶解した。
【０１０７】
各２ｍＬのエマルジョン管を、最低１０分間氷の上に設置する前に、室温で３分間保持した。その後、管を１６，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離し、上方のミネラルオイル層を除去し、処分した。２００μＬの冷たいジエチルエーテルを加えて、エマルジョンを化学的に破壊し、管を１６，０００×ｇで２．５分間遠心分離して、磁性ビーズをペレット化した。磁性ビーズをピペットから取り除き、ペレット化し、２ｍＬの溶解／結合緩衝液（ｐＨ７．５の１００ｍＭ  ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＬｉＤＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ）中で再懸濁した。その後ビーズを洗浄し、実施例８に記載のようなＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲ混合物中で再懸濁した。リーダーペプチドプライマーを使用し、プライマー濃度を表１５に示した。ＯＥ  ＲＴ−ＰＣＲ混合物ビーズ懸濁液を乳化し、熱循環させ、ｃＤＮＡを抽出し、ネステッドＰＣＲを実施した（実施例８を参照のこと）。ネステッドＰＣＲ生成物を電気泳動させて結合転写物を精製し、その後それを上の実施例８に記載の通りに配列決定した。
【０１０８】
ネステッドＰＣＲ生成物のハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ  ２×２５０ｂｐ配列決定の後、≧２のリードを有する１４，１２１個のＶＨ：ＶＬ対を、実施例６に記載のアルゴリズムに従って回収した（群１において７，３６７個のＶＨ：ＶＬ対、及び群２において６，７５４対）。３，９３５個のＣＤＲ−Ｈ３を、両方の群において≧２のリードで観測した。両方の群で観測された３，８９９／３，９３５個のＣＤＲ−Ｈ３は、実施例７に概説した式に従って９９．５％の全体の正確性を示す、一致ＣＤＲ−Ｌ３を示した。本実施例は、エマルジョン滴中で単離した単一細胞からのｍＲＮＡ捕捉を介した多重転写物の配列決定を示す。
【０１０９】
実施例１１−単一細胞由来の重及び軽鎖ｃＤＮＡの並列配列決定
先の実施例は、ｍＲＮＡを捕捉するための磁性ビーズの使用及び単一単位複製配列を作成するための、単一細胞（例えば、ＶＨ及びＶＬ  ｃＤＮＡ）由来の所望のｃＤＮＡｓの共有結合を示す。したがって作成した単一ＶＨ−ＶＬ単位複製配列をハイスループットＤＮＡ配列決定によって配列決定して、天然に対合したＶＨ及びＶＬ配列のレパートリーを明らかにした。
【０１１０】
本実施例において、ビーズ上で捕捉したｃＤＮＡを、結合せずに（すなわち、結合ＶＨ−ＶＬ単位複製配列を作成せずに）直接配列決定した。この方法において、単一細胞由来の所望の転写物の同一性を、重複伸長ＰＣＲの必要なしに明らかにした。始めに、各磁性ビーズ上の固定化オリゴヌクレオチドが以下の割合であるように、３つの５’−アミン機能化プライマー（表１７）の同等の混合物を機能化磁性ビーズに複合した：ｍＲＮＡ捕捉に対し１／３個のポリ（Ｔ）、所望の転写物１（例えば、表１のＡＨＸ８９プライマー）に特異的な１／３個のプライマー、及び所望の転写物２（表１７）に特異的な１／３個のプライマー。これらのプライマー複合体磁性ビーズ二重の目的を果たした：第１に、上の溶解において、実施例４〜６にある通り、捕捉したポリ（Ｔ）プライマーが個々の細胞から重及び軽鎖ｍＲＮＡを捕捉した；第２に、エマルジョンＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＡＨＸ８９及びＢＲＨ０６プライマーが重及び軽鎖ｃＤＮＡのビーズ表面での増幅を引き起こした。ＲＴ−ＰＣＲの後、磁性ビーズを配列決定テンプレートとしてハイスループット配列決定のために使用した。工程を図７に概説する。
【０１１１】
３つの５’−アミンオリゴヌクレオチド（表１６）の同等の混合物を固定化して、製造者による指示書（Ｄｙｎａｌ  ＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄビーズ、直径１．０μｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）に従って磁性ビーズを機能化した。その後、ＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５不死化細胞の混合物を洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００，０００細胞／ｍＬで懸濁した。１．２×１０８機能化磁性ビーズを、実施例１０に概説した通りに細胞溶解／ｍＲＮＡ結合溶液のｍＬ毎に加えた。細胞／ビーズ懸濁液を実施例１０の通りに乳化し、細胞を溶解し、ｍＲＮＡをビーズにアニールした。その後、ビーズをエマルジョンの破壊により回収し、実施例１０にある通りに洗浄し、エマルジョンＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＴ−ＰＣＲプライマー濃度を表１７に示す。循環条件は以下の通りであった：５５℃で３０分間、続いて９４℃で２分間；９４℃で３０秒間の変性、５７℃で１分間のアニール、７２℃で２分間の伸長を４回；９４℃で３０秒間の変性、５９℃で３０秒間のアニール、７２℃で２分間の伸長を２９回；その後、７２℃で７分間の最終伸長ステップ。
【０１１２】
表１６：磁性ビーズ表面に複合したプライマー
【表１６】
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【０１１３】
表１７：ＭＯＰＣ−２１／ＭＯＰＣ−３１５  ＲＴ−ＰＣＲ混合中のプライマー
【表１７】
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【０１１４】
エマルジョンＲＴ−ＰＣＲの後、エマルジョンをＳＯＬｉＤ遺伝子配列決定する製造者による指示書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってｎ−ブタノールで破壊し、磁性ビーズをＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定プラットフォーム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の直接のテンプレートとして供した。配列決定を最初に＜Ｆ３＞重鎖プライマーで開始して重鎖ｃＤＮＡ配列を集め、続いて＜Ｆ５＞軽鎖プライマーで配列決定して軽鎖ｃＤＮＡ配列を集めた。重及び軽鎖配列をＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定プラットフォーム上の位置によって一致させて、天然の重−軽鎖対合を得た。
【０１１５】
実施例１２−細胞コード化高親和性抗体由来の対合ＶＨ：ＶＬ転写物の配列決定
先の実施例は、様々な細胞集団からの配列決定多重転写物に関する種々の技術の使用について詳述した。本実施例は、抗原依存ポリ（ｄＴ）捕捉及び後のＶＨ：ＶＬ配列決定を用いる目的の特定の抗原に特異的な高親和性抗体をコード化する細胞のみに由来する、天然に対合したＶＨ：ＶＬ抗体配列ハイスループット配列決定の方法について記載する。
【０１１６】
抗原被覆磁性ビーズを、製造者による手引きに従って、カルボン酸機能化磁性ビーズ（直径１μｍのＤｙｎａｌ  ＭｙＯｎｅ  ＣＯＯＨビーズ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のために、共有結合遊離ワクチングレード（ｖａｃｃｉｎｅ−ｇｒａｄｅ）の破傷風トキソイド（ＴＴ）（１ｍＭオリゴヌクレオチド、４０ｎＭ  ＴＴ、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、コペンハーゲン、デンマーク）により調製した。
【０１１７】
ＰＢＭＣを、破傷風トキソイド（ＴＴ）／ジフテリアトキソイド追加ワクチン接種（ＴＤ；２０  Ｉ．Ｅ．ＴＴ及び２  Ｉ．Ｅ．ジフテリアトキソイド、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ＭＳＤ  ＧｍｂＨ、ライメン、ドイツ）の投与の１４日後に提供された血液から集め、実施例７にある通りに、標識抗体染色及びＦＡＣＳ選別を介して選別した。記憶Ｂ細胞を、実施例４に記載の通り無菌ＰＤＭＳスライドに抗原被覆ビーズ（およそ４０ビーズ／ウェル）と共に播種し、細胞を透析膜を用いてウェル中に密閉し、以下の記憶Ｂ細胞刺激培地中に４日間、ＰＤＭＳマイクロウェルスライド内で培養した：１０μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ４０抗体（５Ｃ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４、及び５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−５（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ニュージャージー州、米国）と共に、１０％免疫グロブリン枯渇ＦＢＳ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×可欠アミノ酸、１×ピルビン酸ナトリウム及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）で補われたＲＰＭＩ−１６４０。この間、細胞を刺激して抗体（Ｔａｕｂｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を分泌させ、ＴＴに特異的なあらゆる分泌抗体は、固定化された抗原を含有する磁性マイクロビーズに結合した。
【０１１８】
５’ストレプトアビジン標識ポリ（ｄＴ）２５オリゴヌクレオチド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）の溶液を、ヤギ抗ヒトＩｇＧビオチン複合体（Ｂ１１４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｒｉｃｈ、米国）と等モル比で混合した。ストレプトアビジン及びビオチンは溶液中で会合して、ｍＲＮＡ捕捉のために連結ポリ（ｄＴ）２５オリゴヌクレオチドを有する抗ＩｇＧ抗体を形成した。培養中で４日後、封印を解き、スライド表面を優しく４００μＬのＰＢＳで３回洗浄して、ウェル中の細胞及びビーズを妨害することなく分泌抗体を洗い流した。過剰ＰＢＳを除去し、１０ｎＭの抗ＩｇＧ抗体／ポリ（ｄＴ）２５複合物を含有する３５０μＬのＲＰＭＩ−１６４０培養液をマイクロウェルスライド表面に加え、スライドを室温で４５分間インキュベートした。４５分間のインキュベーションの過程に渡り、４日の分泌段階に続いて抗ＴＴ抗体によって被覆されたあらゆる抗原標識マイクロビーズ（すなわち、ＴＴに特異的な抗体をコード化した分泌細胞と、ウェル中に共存した抗原標識マイクロビーズ）は、ｍＲＮＡ捕捉のためのポリ（ｄＴ）２５で装飾された。続いて、スライドを優しく４００ｕＬのＰＢＳで３回洗浄して過剰抗体／オリゴヌクレオチド複合物を除去し、マイクロウェルを透析膜で密閉し、細胞を溶解し、ビーズを磁石で回収し、エマルジョン結合ＲＴ−ＰＣＲを、実施例３において新規に記載された通りに実施したが、０．１％ドデシル硫酸リチウムを、１％ドデシル硫酸リチウムの代わりに細胞溶解緩衝液中で使用したことは除外した。ネステッドＰＣＲを実施し、結合転写物を、実施例５に新規に記載された通りにロングリードのＮｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ配列決定プラットフォームを用いて配列決定した。
【０１１９】
ポリ（ｄＴ）２５配列を含有する結合ＩｇＧ免疫グロブリンを有する抗原標識ビーズのみが、細胞溶解後のｍＲＮＡ捕捉に必要であるため、本方法において概説した工程は高親和性抗原特異的ＶＨ：ＶＬ対に対する配列セットを強化した。したがって、この実施例で概説した方法は、免疫グロブリンの表面発現の必要がない単一の実験における、多数の抗原特異的ＶＨ：ＶＬ対の配列決定に関するハイスループットＶＨ：ＶＬ対合技術の適用を示す。
【０１２０】
実施例１３−低分散度液滴エマルジョンを用いる単一細胞乳化におけるＲＴ−ＰＣＲ
実施例６の通り、エマルジョンを、ノズルの外から高速で動く環状の油相中に水流を注入することで形成した。キャリア流によって発生した剪断力は、厳重に調節された大きさ分布で液滴形成を引き起こし、ノズル／キャリア流法は、液滴の大きさの幅によって引き起こされるエマルジョン滴毎の多細胞の発生率を減少させる、単分散液滴の大きさのエマルジョンを形成した。この実施例において、２つの不死化細胞株（ＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５）混合物を使用して、中間細胞溶解又はｍＲＮＡ捕捉ステップなしにおよそ容積４ｎＬのエマルジョン滴中で直接、細胞のカプセル化及び結合ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【０１２１】
ＲＮＡｓｅ処理及び洗浄済みＭＯＰＣ−２１及びＭＯＰＣ−３１５細胞（実施例２の通り）の同等の混合物を５０，０００総細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳにて再懸濁し、一方で、０．１％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＢＳＡ、５０ｍｇ／ｍＬ）、４％ＳｕｐｅｒＡｓｅ  Ｉｎ  ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、及び０．１％ＮＰ−４０洗剤を有する２倍濃縮ＲＴ−ＰＣＲ混合物（Ｑｕａｎｔａ  ＯｎｅＳｔｅｐ  Ｆａｓｔ  ｑＲＴ−ＰＣＲ）からなる別の水相を調製した。乳化装置を実施例１０にある通りに作製した。全ての針及び針供給管を１％ＢＳＡ中で３０分間予め遮断し、ＰＢＳですすぎ、両方の水相を５００μＬ／分で、ＰＢＳ中の細胞を内側の針（２６ゲージ）を通じて輸送し、一方でＲＴ−ＰＣＲ混合物及び洗剤を外側の針（１９ゲージ）を通じて輸送した。油キャリア位相（４．５％Ｓｐａｎ−８０、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を有する分子生物学グレードミネラルオイル、ｖ／ｖ％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．による油相試薬）を外側のガラス管中を３ｍＬ／分の速度で流し、試料を実施例１０にある通りに集めた。２ｍＬのＮＰ−４０希釈剤と混合した２ｍＬの細胞／ＲＴ−ＰＣＲ混合物の全てを分析したおよそ１００，０００個の細胞のために乳化した。ＲＴ−ＰＣＲ混合物に対するプライマー濃度を、実施例１１において使用していたものと同じ熱循環条件下で表１に示す。
【０１２２】
その後、ＲＴ−ＰＣＲに対する細胞エマルジョンを９６ウェルプレート中に設置し、熱循環し、ｃＤＮＡを抽出し、ネステッドＰＣＲ反応を実施した（実施例４を参照のこと）。ネステッドＰＣＲプライマーを表２に示し、ＰＣＲのための熱循環条件は以下の通りである：９４℃で２分間の変性ステップ、続いて９４℃で３０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニール、７２℃で２０秒間の伸長の熱循環を、３０回。ネステッドＰＣＲ生成物を電気泳動して結合ＶＨ−ＶＬ  ｃＤＮＡを精製し、これをＮｅｘｔＧｅｎ配列決定のテンプレートとして供した。
【０１２３】
したがって、本発明は、その中で固有のものと同様に言及した目標及び利点に到達するためによく適応されている。本発明は、本明細書の教示の利益を有する当業者には明らかな、異なるが同等の方法で修正及び実施されてもよいため、上に開示した特定の実施形態は例証のみである。さらに、以下の特許請求の範囲に記載される以外に、一切の限定は本明細書に示される構造の詳細又は設計を限定するように意図されない。それゆえ、上に記載の特定の例証的な実施形態は変更又は修正されてもよく、全てのそのような変化は本発明の範囲及び趣旨の内であると考えられることが、明らかである。組成及び方法は種々の構成要素又はステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ことに関して記載されているが、一方で組成及び方法はまた、種々の構成要素又はステップを「から本質的になる」又は「からなる」であり得る。上に開示された全ての数及び範囲は、ある程度変化してもよい。下限及び上限を有する数値の範囲が開示される際はいつでも、その範囲に含まれるあらゆる数及びあらゆる含まれる範囲を、特に開示する。特に、本明細書にて開示される（「約ａから約ｂ」、又は同じく、「およそａ〜ｂ」、又は同じく「およそａ〜ｂ」の形態の）値のあらゆる範囲は、値の広い範囲に包含される全ての数及び範囲を意味すると理解されたい。また、特許請求の範囲中の用語は、特許権所有者によって明確に及び明らかに規定されないかぎり、それらの単純な、通常の意味を有する。さらに、特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、それが紹介する１つ以上の要素を意味すると、本明細書では定義する。本明細書及び１つ以上の特許又は参照によって本明細書に組み込まれ得る他の書類において、単語又は用語の使用に何らかの矛盾がある場合、この明細書と一致する定義が適用されるべきである。
***
【０１２４】
本明細書において開示される及び主張される全ての方法は、過度の試験を行うことなく、本明細書の開示に照らして、実行されることができる。本発明の組成及び方法は好ましい実施形態の観点から記載されているが、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法に対して、及び本明細書に記載の方法のステップ中又はステップの配列中において、変更が適用され得ることは、当業者に明らかであろう。さらに具体的には、化学的及び生理学的の両方で関係するある薬剤は、本明細書に記載の薬剤と置換えてもよく、同じ又は同様の結果が得られ得ることが明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような同様の置換え及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の趣旨、範囲、及び概念の内であると見なされる。
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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