(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への結合性が低下した組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって：
抗原認識ドメイン；
配列番号２０のアミノ酸配列を含むスペーサードメイン；
膜貫通ドメイン；
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖シグナル伝達ドメインである細胞内シグナル伝達ドメイン；及び
ＣＤ２８、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ｐ５６ｌｃｋ、又は２Ｂ４に由来する１以上の共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン、
を含んでなる、前記組換えキメラ抗原受容体。
【請求項２】
抗原認識ドメインがｓｃＦｖである、請求項１の組換えキメラ抗原受容体。
【請求項３】
抗原認識ドメインが、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥＧＦＲ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）、葉酸受容体−α、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ガングリオシド２（ＧＤ２）、ガングリオシド３（ＧＤ３）、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＩＬ−１３受容体α２、ＫＤＲ、κ−軽鎖、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ−Ａ１）、メソセリン、マウスＣＭＶ感染細胞、ムチン−１（ＭＵＣ１）、ムチン−１６（ＭＵＣ１６）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ｍＡｂ  ＩｇＥの標的となるＴＡＡ、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、チロシナーゼ、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体から成る群より選択されるがん関連抗原を標的とする、請求項１又は２の組換えキメラ抗原受容体。
【請求項４】
ＣＡＲが、ウイルスベクターに挿入された核酸配列によってコードされる、請求項１〜３のいずれかの組換えキメラ抗原受容体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むＣＡＲ遺伝子が含まれる発現カセットを含んでなるウイルスベクターによって形質導入されたヒト免疫細胞の単離集団であって、ＣＡＲ遺伝子を発現する、前記ヒト免疫細胞の単離集団。
【請求項６】
被験者においてがんを治療する方法に使用するための、ＣＡＲ遺伝子で形質導入されたヒト免疫細胞の単離集団であって、ＣＡＲ遺伝子は：
がんに特異的ながん関連抗原を標的とする抗原認識ドメイン；
配列番号２０のアミノ酸配列を含むスペーサードメイン；
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ζ鎖シグナル伝達ドメインである細胞内シグナル伝達ドメイン；及び
ＣＤ２８、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、４−１ＢＢ、ｐ５６ｌｃｋ、又は２Ｂ４に由来する１以上の共刺激細胞内シグナル伝達ドメイン、
をコードするヌクレオチド配列を含む、前記ヒト免疫細胞の単離集団。
【請求項７】
ＦｃＲへの結合低下性が、非改変免疫グロブリンＦｃ領域に由来するスペーサードメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＣＡＲ遺伝子で形質導入されたヒト免疫細胞と比べて、ヒト免疫細胞の改善された存続をもたらす、請求項６に記載のヒト免疫細胞の単離集団。
【請求項８】
該方法が、ＣＡＲ遺伝子で形質導入されたヒト免疫細胞の集団を、幹細胞移植、放射線療法、外科的切除、化学療法剤、免疫療法剤、標的療法剤、又はこれらの組合せから選択される１以上の抗がん療法と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項６又は７に記載のヒト免疫細胞の単離集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
[0001]  本願は、図面を含めてその全体が本明細書に援用される、米国仮特許出願番号６１／９２６，８８１（２０１４年１月１３日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府利益の陳述
[0002]  本発明は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された認可番号Ｐ５０  ＣＡ１０７３９９及びＰ０１  ＣＡ０３０２０６の下での政府支援でなされたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞を使用する養子免疫療法は、これらの細胞が抗原発現性の腫瘍細胞をヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に無関係なやり方で直接認識して殺傷することができるので、有望ながん治療法である。しかしながら、標的の腫瘍関連抗原の慎重な選択に加えて、この療法アプローチは、ＣＡＲの最適な分子デザインにきわめて依存している。
【０００４】
[0004]  ＣＤ３ζに融合した細胞質共刺激（例えばＣＤ２８又は４−１ＢＢ）ドメインを介して細胞内シグナルを産生するＴＡＡ特異的ｓｃＦｖを含有するＣＡＲについては、様々な系において有意な抗腫瘍効能を発揮することが示されている（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１３；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２０１１；Ｇｒｕｐｐら、２０１３；Ｋａｌｏｓら、２０１１；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、２０１２）が、宿主による免疫学的拒絶及びクリアランスは、依然として有効ながん治療への課題となっている。
【０００５】
[0005]  治療細胞のＦｃＲ介在性クリアランスを防ぐために、ＣＡＲデザインにおいていくつかの改変が用いられてきた。例えば、ＣＤ８α又はＣＤ２８に由来するもののように、Ｉｇ  Ｆｃドメインを起源としないヒンジ／スペーサー配列が使用される場合がある（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、２００７；Ｋａｌｏｓら、２０１１；Ｉｍａｉら、２００４；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、２００９）。これらのスペーサー配列は、ＦｃＲ結合性を軽減し得るが、それらの長さは、ＣＡＲ  Ｔ細胞に、ある種の抗原を標的にするときに、最適な効能を付与しない。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して５Ｔ４、ＮＣＡＭ、及びＭＵＣ１を標的とする場合には、最適な効能のために、より長い（即ち、ＣＤ８α又はＣＤ２８に由来するものより長い）リンカー領域が必要とされた（Ｗｉｌｋｉｅら、２００８；Ｇｕｅｓｔら、２００５）。したがって、がん細胞を殺傷するその効力を維持する一方で、上記の課題に対処するＣＡＲをデザインすることが望ましいであろう。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]  いくつかの態様によれば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）への結合性が低下した組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。このようなＣＡＲには、限定されるものではないが、抗原認識ドメイン、ＦｃＲへの結合性低下をもたらす１以上の変異をそのＣＨ２領域に有する改変免疫グロブリンＦｃ領域に由来するスペーサードメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインが含まれ得る。
【０００７】
[0007]  別の態様では、ＣＡＲ遺伝子が含まれる発現カセットを含んでなるウイルスベクターによって形質導入されたヒト免疫細胞の集団が提供される。いくつかの側面では、このＣＡＲ遺伝子は、抗原認識ドメイン、ＦｃＲへの結合性低下をもたらす１以上の変異をそのＣＨ２領域に有する改変免疫グロブリンＦｃ領域に由来するスペーサードメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでヒト免疫細胞の集団は、ＣＡＲ遺伝子を発現する。
【０００８】
[0008]  別の態様では、被験者のがんを治療する方法が提供される。このような方法には、ＣＡＲ遺伝子で形質導入されたヒト免疫細胞の集団を該被験者へ投与することが含まれる。いくつかの側面では、ＣＡＲ遺伝子は、がんに特異的ながん関連抗原を標的とする抗原認識ドメイン、ＦｃＲへの結合性低下をもたらす１以上の変異をそのＣＨ２領域に有する改変免疫グロブリンＦｃ領域に由来するスペーサードメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
[0009]  ＦｃＲへの結合性が減少又は損なわれたスペーサードメインを有するＣＡＲ（本明細書に記載するもののような）をデザインすることは、ＦｃＲ発現細胞が、ＣＡＲ発現免疫療法細胞を生体内で認識して破壊するか又は意図せずに活性化することを妨げるのに役立つ。したがって、そのようなＣＡＲは、患者へ治療利益を提供するように意図された細胞の免疫学的拒絶及びクリアランスを妨げるのに役立つのである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0010]  図１は、１つの態様にしたがって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞がＮＳＧマウスに効率的には生着しないことを示す。図１ａは、生着試験用にＴ細胞を遺伝子改変するために使用したＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ（上）及びＥＧＦＲｔ（下）発現構築体の概略図を示す。ＣＤ１９特異的ＣＤ２８共刺激ＣＡＲ（ＣＤ１９Ｒ）、自己分解型Ｔ２Ａ、ｈｕＥＧＦＲｔ、及び薬剤耐性ＤＨＦＲＦＳ及びＩＭＰＤＨ２ＩＹ遺伝子の配列部分を、伸長因子１プロモーター配列（ＥＦ−１ｐ）、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）、及び３ヌクレオチド終止コドンと一緒に示す。図１ｂは、生着試験のためにＮＳＧマウスへ投与されたＴ細胞のフローサイトメトリー分析である。ＴＣＭ由来細胞を、形質導入していない（Ｎｏｎ−Ｔｘｄ）か、又は（Ａ）に記載のＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ（ＣＤ１９Ｒ）若しくはＥＧＦＲｔ／ＤＨＦＲＦＳ／ＩＭＰＤＨ２ＩＹ（ＥＧＦＲｔ）構築体を含有するレンチウイルスベクターで形質導入し、ＥＧＦＲｔ発現について免疫磁気的に選択した。次いで、これらの細胞を試験管内で１９日間増殖させて、表面表現型を分析した。陰性対照染色に基づいて創出した４分割を使用し、ＥＧＦＲｔに特異的な抗体と対比してＣＤ４（上）又はＣＤ８（下）に特異的な抗体で染色した細胞の％をそれぞれのヒストグラムに示す。図１ｃでは、（Ｂ）に記載のようなＴＣＭ由来細胞１０７個を、照射したＮＳ０−ＩＬ１５サポートとともにＮＳＧマウスに静脈内投与した。７日目と１４日目に、各群（ｎ＝３〜５匹のマウス）より採取した末梢血白血球を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４５及びビオチン化セツキシマブで染色し、続いてＰＥ結合ストレプトアビジンで染色した。陰性対照染色に基づいて創出した４分割を使用し、リンパ球をゲーティングしたｈｕＣＤ４５＋細胞及びｈｕＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の％をそれぞれのヒストグラムに示す。データは、多数のドナーからのＴＣＭ由来細胞で実施した４回の異なる実験を代表するものである。
【図２】[0011]  図２は、１つの態様にしたがって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞が可溶性ＦｃγＲ１に結合することを例証する。図１に記載したのと同じＴ細胞を、指定滴定量のビオチン化可溶性ヒトＦｃγ受容体１で染色し、続いてＰＥ結合ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ、灰色のヒストグラム）で染色した。ＣＤ１９Ｒ発現細胞について、それぞれのヒストグラムに、ＳＡ−ＰＥ単独で染色した１％以下の細胞（黒線）を検出するように設定したＭ１ゲートに基づいて、免疫応答性細胞の％を示す。
【図３】[0012]  図３は、１つの態様にしたがって、変異ＩｇＧ４スペーサーが、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＣＤ１９特異的エフェクター機能に影響を及ぼさないことを示す。図３ａは、親ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９Ｒ）、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２部分に２つの点変異Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを含有するＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ））、及びＣＨ２ドメイン全体が除去された短鎖型ＩｇＧ４スペーサーを含有するＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δ）の概略図を示す。ＦＭＣ６３  ｍＡｂに由来するリガンド結合性ｓｃＦｖドメイン、ｈｕＣＤ２８に由来する膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにｈｕＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインも示す。図３ｂでは、親ＣＤ１９Ｒ、ＥＧＦＲｔマーカー単独、アミノ酸２３５又はアミノ酸２９７に単一ＩｇＧ４点変異を有するＣＤ１９Ｒ（ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）又はＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ））、二重変異型ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）、あるいはＣＨ２欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δのいずれかを発現する、ＴＣＭ由来のＥＧＦＲｔに富んだ増殖細胞について、導入遺伝子の発現を分析した。それぞれのヒストグラムに、ＳＡ−ＰＥ単独で染色した１％以下の細胞（黒線）を検出するように設定したＭ１ゲートに基づいて、Ｆｃ含有ＣＡＲ（上）又はＥＧＦＲｔ（下）に特異的な抗体で染色した細胞の％を示す。図３ｃでは、図３ｂに使用したのと同じ細胞を、５１Ｃｒ標識ＣＤ１９＋  ＬＣＬ標的又はＳｕｐＢ１５標的に対する４時間クロム放出アッセイにおいて、エフェクターとして使用した。ＣＤ３アゴニストのＯＫＴ３を発現するＬＣＬ細胞（ＬＣＬ−ＯＫＴ３）及びＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞を、それぞれ陽性対照標的及び陰性対照標的として使用した。３重にしたウェルの指定Ｅ：Ｔ比における平均クロム放出％±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図４】[0013]  図４は、１つの態様にしたがって、変異ＩｇＧ４スペーサーを有するＣＡＲが、阻害されたＦｃγＲ結合性を発揮することを示す。ＥＧＦＲｔマーカー単独、親ＣＤ１９Ｒ、単一点変異型のＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）又はＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）、二重点変異型ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）、あるいはＣＨ２欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δのいずれかを発現する、ＴＣＭ由来のＥＧＦＲｔに富んだ増殖細胞株を、以下のビオチン化試薬：抗Ｆｃ抗体（ＣＡＲ検出用）、セツキシマブ（ＥＧＦＲｔ検出用）、又は指定のヒト（Ｈｕ）若しくはマウス（Ｍｕ）可溶性Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ１、Ｒ２ａ、又はＲ２ｂ）で染色し、続いてＰＥ結合ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ、灰色のヒストグラム）で染色した。それぞれのヒストグラムに、ＳＡ−ＰＥ単独で染色した１％以下の細胞（黒線）を検出するように設定したＭ１ゲートに基づいて、免疫応答性細胞の％を示す。
【図５】[0014]  図５は、１つの態様にしたがって、変異ＩｇＧ４スペーサーを有するＣＡＲを発現するＴ細胞が、増強された生体内生着を発揮することを示す。０日目に、親ＣＤ１９Ｒ、ＥＧＦＲｔマーカー単独、単一点変異型のＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）又はＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）、二重点変異型ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）、あるいはＣＨ２欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δのいずれかを発現する、ＴＣＭ由来のＥＧＦＲｔに富んだ１０７個の細胞（表現型については図３ｂを参照）を、照射したＮＳ０−ＩＬ１５サポートとともにＮＳＧマウスへ静脈内注入した。７日目と１４日目に、各群（ｎ＝５匹のマウス）より採取した末梢血白血球を、ＰｅｒＣＰ結合抗ヒトＣＤ４５及びビオチン化セツキシマブで染色し、続いてＰＥ結合ストレプトアビジンで染色した。図５ａには、生存リンパ球をゲーティングした集団におけるＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の平均％±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す（＊：ｐ＜０．０３４、対応の無いスチューデントｔ検定を用いてＣＤ１９Ｒ発現細胞を投与したマウスと比較した場合）。図５ｂは、対照染色に基づいて創出した４分割で表した代表的なヒストグラム（即ち、各群５匹のマウスのうち中央値の３匹）を示す。それぞれのヒストグラムに、ｈｕＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の％を示す。
【図６】[0015]  図６は、いくつかの態様にしたがって、変異ＩｇＧ４スペーサーを有するＣＡＲを発現するＴＣＭ由来細胞が、増強された治療効果を発揮することを示す。０日目に１．５×１０６個のｆｆＬｕｃ＋  ＬＣＬ細胞をＮＳＧマウスに静脈内投与し、３日目に、ＥＧＦＲｔマーカー単独、親ＣＤ１９Ｒ、二重点変異型ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）、又はＣＨ２欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δのいずれかを発現する５×１０６個のＣＡＲ＋  ＴＣＭ由来細胞（合計１０７個の細胞）をＮＳＧマウスに静脈内注入した。次いで、ＬＣＬ腫瘍増殖をＸｅｎｏｇｅｎ社のイメージングによってモニターした。図６ａは、入力したＴＣＭ由来細胞（ビーズ刺激及びレンチウイルス導入後２３日目に使用）のＣＡＲプロファイルを表すフローサイトメトリー分析を示す。それぞれのヒストグラムに、ＳＡ−ＰＥ単独で染色した１％以下の細胞（黒線）を検出するように設定したＭ１ゲートに基づいて、免疫応答性細胞の％を示す。図６ｂは、各群（ｎ＝６）について、ルシフェラーゼ活性の平均フラックスレベル（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す。図６ｃは、２１日目のＮＳＧマウスの代表的な生物発光画像を各群について示す。図６ｄは、２１日目にて末梢血生存リンパ球をゲーティングした集団におけるＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の平均％（＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を示す（＊：ｐ＜０．０３５、対応の無いスチューデントｔ検定を用いてＣＤ１９Ｒ発現細胞を投与したマウスと比較した場合）。図６ｅは、各群についてカプラン・マイヤーの生存分析を示す。ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して、生存率の群間統計解析を実施した（＊：ｐ＝０．０００９、親ＣＤ１９Ｒを発現するＴ細胞を受容したマウスと比較した場合）。
【図７】[0016]  図７は、１つの態様にしたがって、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）を発現する大半のＴ細胞が増強された治療効果を発揮することを示す。０日目に、１．５×１０６個のｆｆＬｕｃ＋  ＬＣＬ細胞をＮＳＧマウスに静脈内投与し、２日目に、親ＣＤ１９Ｒ又は二重点変異型ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）のいずれかを発現する５×１０６個のＣＡＲ＋  Ｔ細胞をＮＳＧマウスに静脈内注入した。次いで、ＬＣＬ腫瘍増殖をＸｅｎｏｇｅｎ社のイメージングによってモニターした。図７ａは、入力したＴ細胞（ビーズ刺激及びレンチウイルス導入後２１日目に使用）のＣＡＲ（上段）、ＥＧＦＲｔ対ＣＤ３（中段）、及びＣＤ４対ＣＤ８（下段）プロファイルのフローサイトメトリー分析を示す。それぞれのヒストグラムに、ヒストグラムサブトラクションによって（上段）、又はモック形質導入細胞の染色及びアイソタイプ対照染色にしたがって描いた４分割に基づいて（中段、下段）決定した免疫応答性細胞の％を表す。図７ｂは、２日目、１１日目、及び２３日目のＮＳＧマウスの代表的な生物発光画像を各群について示す。図７ｃは、各群（ｎ＝３）について、ルシフェラーゼ活性の平均フラックスレベル（±Ｓ．Ｅ．）を示す。図７ｄは、各群についてカプラン・マイヤーの生存分析を示す。ログランク（マンテル・コックス）検定を使用して、生存率の群間統計解析を実施した（＊：ｐ＝０．０２９５、親ＣＤ１９Ｒを発現するＴ細胞を受容したマウスと比較した場合）。
【図８】[0017]  図８は、いくつかの態様にしたがって、変異ＩｇＧ４スペーサーを有するＣＡＲを発現する非濃縮ＴＣＭ由来細胞が増強された生体内生着を発揮することを示す。０日目に、ＥＧＦＲｔマーカー単独、親ＣＤ１９Ｒ、又は二重点変異型ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）のいずれかを発現する１０７個のＴＣＭ細胞を、照射したＮＳ０−ＩＬ１５サポートとともにＮＳＧマウスに静脈内注入した。７日目と１４日目に、各群（ｎ＝４〜６匹のマウス）より採取した末梢血白血球を、ＰｅｒＣＰ結合抗ヒトＣＤ４５及びビオチン化セツキシマブで染色し、続いてＰＥ結合ストレプトアビジンで染色した。図８Ａは、入力したＴＣＭ由来細胞（ビーズ刺激及びレンチウイルス導入後２６日目に使用）のＣＡＲプロファイルを表すフローサイトメトリー分析を示す。それぞれのヒストグラムに、ＳＡ−ＰＥ単独で染色した１％の細胞（黒線）を検出するように設定したＭ１ゲートに基づいて、Ｆｃ含有ＣＡＲ（上段）又はＥＧＦＲｔ（下段）に特異的な抗体で染色した細胞の％を示す。図８Ｂは、生存リンパ球をゲーティングした集団におけるＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の平均％±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を示す（＊：ｐ＝０．００４、及び＊＊：ｐ＝０．０５７、対応の無いスチューデントｔ検定を使用して、親ＣＤ１９Ｒ又はＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）を発現するＴＣＭ由来細胞を注入したマウスを比較した場合）。図８Ｃは、対照染色に基づいて創出した４分割で表した代表的なヒストグラム（即ち、各群４〜６匹のマウスのうち中央値の２匹）を示す。それぞれのヒストグラムにｈｕＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0018]  以下の実施例は、本発明の様々な態様を例解するためのものである。したがって、考察される具体的な態様を本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変更態様、及び修飾態様を作製し得ることが明らかであって、そのような均等態様も本発明に含まれるべきであることが理解される。さらに、本開示において引用されるすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体を本明細書に援用する。
【００１２】
キメラ抗原受容体
[0019]  本明細書に記載される態様によれば、がん関連抗原を標的とする組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれらの使用の方法が提供される。下記の態様によって記載されるように、ＣＡＲには、限定されるものではないが、抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び細胞内共刺激ドメインのうち１以上を含めた、一連のタンパク質又はペプチドのドメインが含まれ得る。
【００１３】
[0020]  いくつかの態様では、ＣＡＲをコードする遺伝子が提供され、ここで該遺伝子には、本明細書に記載されるＣＡＲのタンパク質又はペプチドのドメインに対応するアミノ酸配列をコードする一連の領域が含まれる、ヌクレオチド又は核酸の配列が含まれる。遺伝暗号の縮重性が知られているので、本明細書に開示されるどのアミノ酸配列も、前記配列中の各アミノ酸に対応するすべての縮重した核酸コドンを暗に示している。従って、ＣＡＲとそれらのドメインについて記載する態様は、遺伝子によってコードされるアミノ酸配列としてだけでなく、核酸配列を含んでなる前記遺伝子としても提供され得ると理解される。
【００１４】
[0021]  １つの態様では、ＣＡＲには、限定されるものではないが、抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、場合により少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び場合により少なくとも１つの細胞内共刺激ドメインが含まれ得る。
【００１５】
[0022]  他の態様では、ＣＡＲには、限定されるものではないが、抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインが含まれ得る。
【００１６】
[0023]  他の態様では、ＣＡＲには、限定されるものではないが、抗原結合性ドメイン、スペーサードメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内共刺激ドメインが含まれ得る。
【００１７】
[0024]  抗原結合性ドメイン
[0025]  ＣＡＲ抗原結合性ドメインには、ペプチド又はポリペプチドとして発現される場合に、がん関連抗原のエピトープに結合するヌクレオチド配列が含まれ得る。いくつかの態様では、がん関連抗原は、がん細胞（例えば、腫瘍細胞、新生物細胞、悪性腫瘍細胞、又は他のあらゆるがん性細胞）によって発現又は過剰発現されるどの抗原であってもよく、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、ガングリオシド、プロテオグリカン、又はこれらのあらゆる組合せ又は複合体であり得る。いくつかの側面では、がん関連抗原は、がん又は腫瘍細胞上でのみ発現され得る腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）であって、一方他の側面では、がん関連抗原は、腫瘍細胞上でも正常細胞上でも発現され得る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。他の側面では、がん関連抗原は、変異した発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の産物、又は別の変異遺伝子の産物（例えば、過剰発現又は異常発現された細胞タンパク質、発がんウイルスによって産生された腫瘍抗原、腫瘍胎児抗原、改変された細胞表面糖脂質又は糖タンパク質、又は細胞種特異的な分化抗原）であり得る。
【００１８】
[0026]  本明細書に記載される態様によれば、本明細書に記載されるＣＡＲ抗原結合性ドメインの標的となり得るがん関連抗原には、限定されるものではないが、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡ−１２５炭酸脱水酵素９（ＣＡ９）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦｒｖＩＩＩ、上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥＧＦＲ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＦＢＰ、胎児型アセチルコリン受容体（ＡｃｈＲ）、葉酸受容体−α、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ガングリオシド２（ＧＤ２）、ガングリオシド３（ＧＤ３）、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＩＬ−１３受容体α２、ＫＤＲ、ｋ−軽鎖、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ−Ａ１）、メソセリン、マウスＣＭＶ感染細胞、ムチン−１（ＭＵＣ１）、ムチン−１６（ＭＵＣ１６）、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ｍＡｂ  ＩｇＥの標的となるＴＡＡ、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、チロシナーゼ、及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体が含まれる。いくつかの態様では、本明細書に記載されるＣＡＲの一部である抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９又はＣＤ１２３を標的とする。
【００１９】
[0027]  抗原結合性ドメインは、がんに関連した抗原を標的にする、どの標的指向部分でもよい。いくつかの態様では、抗原結合性ドメインは、抗体又は抗体の機能的断片である。抗体とは、抗原又はエピトープに特異的に結合するか、又はそれらと免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を意味しており、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のみでなく、限定されるものではないが、抗原結合性（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含めた機能性の抗体断片が含まれる。「抗体又はその機能性断片」という用語には、遺伝子工学的に、又は他のやり方で改変された、細胞内抗体、ペプチ体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロ結合抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）のような、免疫グロブリンの諸形態も含まれる。他に述べなければ、「抗体」という用語には、その機能性抗体断片が含まれると理解されるべきである。１つの態様では、抗原結合性ドメインは、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）を有するｓｃＦｖである。他の態様において、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９又はＣＤ１２３を標的とするｓｃＦｖである。そのような態様において、ＣＤ１９を標的にするｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列を有し得る：
【００２０】
【化１】
0006560235.tif 000002
【００２１】
[0028]  そして、ＣＤ１２３を標的にするｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列の１つを有し得る：
【００２２】
【化２】
0006560235.tif 000003
【００２３】
[0029]  スペーサードメイン
[0030]  スペーサードメイン（「ヒンジ領域」又は「スペーサー／ヒンジ領域」とも呼ばれる）は、免疫グロブリンＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２  Ｆｃ領域、ＩｇＧ３  Ｆｃ領域、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩｇＭ  Ｆｃ領域、又はＩｇＡ  Ｆｃ領域の少なくとも一部に由来しても含まれてもよい。ある態様において、スペーサードメインには、そのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの内部に存する、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＡの免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部が含まれる。いくつかの態様において、スペーサードメインには、対応する免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部も含まれ得る。いくつかの態様において、スペーサードメインは、改変免疫グロブリンＦｃ領域、例えば、改変ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、改変ＩｇＧ２  Ｆｃ領域、改変ＩｇＧ３  Ｆｃ領域、改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域、改変ＩｇＥ  Ｆｃ領域、改変ＩｇＭ  Ｆｃ領域、又は改変ＩｇＡ  Ｆｃ領域の少なくとも一部に由来するか又は含まれる。改変免疫グロブリンＦｃ領域は、スペーサードメインのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合性低下を引き起こす、１以上のアミノ酸置換、改変、又は欠失をもたらす１以上の変異（例えば点変異、挿入、欠失、重複）を有し得る。いくつかの側面において、改変免疫グロブリンＦｃ領域は、スペーサードメインの１以上のＦｃＲ（限定されないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ１、ＦｃγＲ２Ｂ２、ＦｃγＲ３Ａ、ＦｃγＲ３Ｂ、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲ２、ＦｃαＲＩ、Ｆｃα／μＲ、又はＦｃＲｎが含まれる）への結合性低下を引き起こす、１以上のアミノ酸置換、改変、又は欠失をもたらす１以上の変異を伴って設計され得る。
【００２４】
[0031]  Ｆｃ  ＣＨ２ドメイン内のいくつかのアミノ酸配列は、抗体−ＦｃＲ相互作用に関与するものとして同定されてきた（Ｓｔｒｏｈｌ、２００９）。ＦｃγＲＩのようなＦｃＲは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とマクロファージが含まれる免疫細胞上に位置する統合膜タンパク質であって、これらの免疫細胞は、このＦｃ標的指向能力を使用して、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）や食作用のような様々な免疫機能を行うのである。
【００２５】
[0032]  このスペーサードメインによる、ＦｃＲへの結合の減損は、ＦｃＲ発現細胞がＣＡＲ発現性の免疫療法細胞を生体内で認識して破壊する、又は意図せずに活性化することを妨げて、それによって、患者へ治療利益を提供するように意図された細胞の免疫学的拒絶及びクリアランスを妨げるのに役立ち、本明細書に記載される変異はまた、ＣＡＲの標的外の効果を抑えて、それによってその特異性と効力を高めるのに貢献する。
【００２６】
[0033]  「アミノ酸改変」又は「アミノ酸置換」又は「置換」は、本明細書に使用されるように、タンパク質又はペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。本明細書に使用される「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを意味する。例えば、置換Ｓ２２８Ｐは、２２８位にあるセリンをプロリンに置き換えた、変異体のタンパク質又はペプチドを意味する。
【００２７】
[0034]  アミノ酸置換は、タンパク質又はペプチドをコードする核酸配列中の特別なコドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンへ変更するような変異によって行うことができる。このような変異は、一般的には、可能な限り少ないヌクレオチド変化を加えることによって行われる。この種の置換変異は、生じるタンパク質中のアミノ酸を非保存的なやり方で（即ち、特別な大きさ又は特徴を有するアミノ酸のグループ（grouping）に属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）、又は保存的なやり方で（即ち、特別な大きさ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸へコドンを変化させることによって）変化させるように行うことができる。このような保存的な変化は、一般に、生じるタンパク質の構造と機能において、非保存的な変化ほどの変化をもたらさない。
【００２８】
[0035]  以下は、アミノ酸の様々な群分けの例である：
[0036]  非極性Ｒ基があるアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
【００２９】
[0037]  非荷電・極性Ｒ基があるアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
[0038]  荷電・極性Ｒ基があるアミノ酸（ｐＨ６．０で負電荷）：アスパラギン酸、グルタミン酸。
【００３０】
[0039]  塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正電荷）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）．
[0040]  別のグループは、フェニル基のあるアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンであり得る。
【００３１】
[0041]  別の群分けは、下記に示すように、分子量（即ち、Ｒ基の大きさ）に従ってよい：
【００３２】
【化３】
0006560235.tif 000004
【００３３】
[0042]  ある態様において、スペーサードメインは、非改変ヒンジに存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１以上のアミノ酸残基が含まれる、改変ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する。１以上の置換アミノ酸残基は、限定されないが、位置：２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９、又はこれらの組合せにある１以上のアミノ酸残基より選択される。
【００３４】
[0043]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、限定されないが、以下のアミノ酸残基置換の１以上が含まれる、改変ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又はこれらの組合せ。
【００３５】
[0044]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、そのＣＨ２−ＣＨ３領域に対してなされる１以上の改変を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域に由来し、ここでその非改変ＩｇＧ  ＣＨ２−ＣＨ３領域は、以下のアミノ酸配列の１つに対応する：
【００３６】
【化４】
0006560235.tif 000005
【００３７】
[0045]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、そのヒンジ領域へなされた１以上の改変を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域に由来し、ここでその非改変ＩｇＧヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列の１つに対応する：
【００３８】
【化５】
0006560235.tif 000006
【００３９】
[0046]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、以下のアミノ酸配列を有するＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する：
【００４０】
【化６】
0006560235.tif 000007
【００４１】
[0047]  ある態様において、スペーサードメインは、非改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１以上のアミノ酸残基が含まれる改変ＩｇＧ４  Ｆｃに由来する。この１以上の置換アミノ酸残基は、限定されないが、位置：２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９、３９６、又はこれらの組合せにある１以上のアミノ酸残基より選択される。
【００４２】
[0048]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、限定されないが、以下のアミノ酸残基置換の１以上が含まれる、改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ、又はこれらの組合せ。ここでは、非改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域中のアミノ酸が、指定の位置で、上記に同定されたアミノ酸で置換される。
【００４３】
[0049]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、限定されないが、以下のアミノ酸残基置換の２以上（即ち、「二重変異」）、３以上（即ち、「三重変異」）、４以上、５以上、又は５より多くが含まれる改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ、又はこれらの組合せ。ここでは、非改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域中のアミノ酸が、指定の位置で、上記に同定されたアミノ酸で置換される。
【００４４】
[0050]  いくつかの態様において、スペーサードメインは、限定されないが、２２８位でのセリン（Ｓ）に代わるプロリン（Ｐ）の置換（Ｓ２２８Ｐ）、２３５位でのグルタミン酸（Ｅ）に代わるロイシン（Ｌ）の置換（Ｌ２３５Ｅ）、２９７位でのグルタミン（Ｑ）に代わるアスパラギン（Ｎ）の置換（Ｎ２９７Ｑ）、又はこれらの組合せが含まれる、改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する。ある態様では、改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域が、以下のアミノ酸配列に示されるように、単一の変異を有する（変異は、太字で下線を施す）：
【００４５】
【化７】
0006560235.tif 000008
【００４６】
[0051]  他の態様において、スペーサードメインは、Ｌ２３５Ｅ置換とＮ２９７Ｑ置換（「ＥＱ」）が含まれるように二重変異した改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する。別の態様において、改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換、Ｌ２３５Ｅ置換、及びＮ２９７Ｑ置換（「Ｓ２２８Ｐ＋Ｌ２３５Ｅ＋Ｎ２９７Ｑ」）が含まれるように三重変異している。ある態様では、改変ＩｇＧ４  Ｆｃ及び／又はヒンジ領域に、以下より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれ得る（変異は、太字で下線を施す）：
【００４７】
【化８】
0006560235.tif 000009
【００４８】
[0052]  ある態様において、スペーサードメインは、そのＣＨ２ドメインの全部又は一部の１以上の欠失が含まれる改変免疫グロブリンＦｃ領域に由来する。１つの態様において、スペーサードメインは、そのＣＨ２ドメインの全部又は一部の１以上の欠失（「ｃｈ２Δ」）が含まれる改変ＩｇＧ４  Ｆｃ領域に由来する。このような態様の１つの側面において、スペーサードメインには、以下のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれ得る：
【００４９】
【化９】
0006560235.tif 000010
【００５０】
［００５３］  いくつかの態様において、スペーサードメインは、免疫グロブリンＦｃ領域を、ＣＤ８ａのヒンジ領域のように、ＦｃＲへ結合する能力を有さないスペーサーに置換するように改変することができる。あるいは、ヒンジのＦｃスペーサー領域を欠失させてよい。そのような置換は、Ｆｃ結合性を低下させるか又は消失させるだろう。
【００５１】
［００５４］  「位（置）」という用語は、本明細書に使用されるように、タンパク質の配列中の場所である。位置は、連続的に番号付けしても、確立された形式、例えば、カバット（Ｋａｂａｔ）位置又はＥＵ位置、又はＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って番号付けてもよい。本明細書で考察するすべての位置では、番号付けがＥＵインデックス又はＥＵ番号付けスキームに従う（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ「免疫学的に興味深いタンパク質の配列」，第５版、アメリカ公衆衛生局、国立衛生研究所、ベセスダ、全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔと同様のＥＵインデックス、又はＥＵ番号付けスキームは、ＥＵ抗体の番号付けを意味する（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５）。カバット位置は、当該技術分野でもよく知られているが、ある位置について、ＥＵ位置と異なる場合がある。例えば、上記に記載したＳ２２８Ｐ置換とＬ２３５Ｅ置換は、ＥＵ位置を参照とする。しかしながら、これらの置換は、カバット位置の２４１（Ｓ２４１Ｐ）と２４８（Ｌ２４８Ｅ）にも対応し得る。
【００５２】
膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメイン
［００５５］  細胞内シグナル伝達ドメインには、どの好適なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合シグナル伝達ドメイン又はその一部分も含まれ得る。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３複合体に由来する。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ鎖シグナル伝達ドメインである。ある態様では、ζ鎖シグナル伝達ドメインに、以下のようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれ得る：
【００５３】
【化１０】
0006560235.tif 000011
【００５４】
［００５６］  細胞内シグナル伝達ドメインは、限定されないが、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＯＸ−４０共刺激ドメイン、ＣＤ２７共刺激ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、ＤＡＰ１０共刺激ドメイン、誘導性共刺激（ＩＣＯＳ）ドメイン、又は２Ｂ４共刺激ドメインが含まれるどの好適な共刺激ドメインとも会合し得る。本明細書に記載される態様によれば、ＣＡＲには、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが含まれ得る。１つの側面において、ＣＡＲは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを有するか、又はそれには、上記に記載したもののような、２以上の共刺激シグナル伝達ドメインが含まれ得る。別の側面において、共刺激ドメインは、上記に記載したもののような単一の共刺激ドメインから構成されても、またあるいは、２以上の共刺激ドメインの２以上の部分から構成されてもよい。あるいは、いくつかの態様において、ＣＡＲには、共刺激シグナル伝達ドメインが含まれない。１つの態様において、ＣＡＲには、ＣＤ２８共刺激ドメインである共刺激シグナル伝達ドメインが含まれる。この態様では、そのような改変ＣＤ２８共刺激ドメインが、限定されないが、ロイシン−ロイシン（ＬＬ）からグリシン−グリシン（ＧＧ）への置換が含まれる、１以上のアミノ酸置換又は改変を有し得る。ある態様では、改変共刺激シグナル伝達ドメイン領域に、以下より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれ得る：
【００５５】
【化１１】
0006560235.tif 000012
【００５６】
[0057]  単数又は複数のシグナル伝達ドメインには、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３膜貫通ドメイン、又は当該技術分野で知られた他のあらゆる好適な膜貫通ドメインより選択される膜貫通ドメインが含まれ得る。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。ある態様では、改変共刺激シグナル伝達ドメイン領域に、以下より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれ得る：
【００５７】
【化１２】
0006560235.tif 000013
【００５８】
ＣＡＲ遺伝子の発現とＴ細胞の形質導入
[0058]  いくつかの態様において、ＣＡＲ遺伝子は、発現カセットの一部である。いくつかの態様において、発現カセットには、ＣＡＲ遺伝子に加えて、アクセサリー遺伝子も含まれ得る。Ｔ細胞によって発現されるとき、アクセサリー遺伝子は、形質導入されたＴ細胞の選択マーカー、生体内追跡マーカー、又は形質導入されたＴ細胞の自殺遺伝子として役立つ場合がある。
【００５９】
[0059]  いくつかの態様において、アクセサリー遺伝子は、末端切断されたＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｔ）である。ＥＧＦＲｔは、非免疫原性の選択ツール（例、ＥＧＦＲｔ含有構築体でレンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞の濃縮用の抗ビオチンミクロビーズと組み合わせてビオチン化セツキシマブを使用する、免疫磁気的選択）、追跡マーカー（例、Ｔ細胞生着を追跡するためのフローサイトメトリー分析）、及び自殺遺伝子（例えば、セツキシマブ／Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）介在性の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路による）として使用し得る。本明細書に記載される態様に従って使用し得る末端切断ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）遺伝子の例が国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５３２９に記載されていて、その主題は、本明細書において完全に説明されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。他の態様において、アクセサリー遺伝子は、末端切断ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）である。
【００６０】
[0060]  別の態様において、アクセサリー遺伝子は、誘導性自殺遺伝子である。自殺遺伝子とは、その遺伝子がその中で発現される細胞が、所望される時間でのプログラム化細胞死又は抗体介在性クリアランスを受けることを引き起こす組換え遺伝子である。１つの態様では、アクセサリー遺伝子として使用され得る誘導性自殺遺伝子が誘導性カスパーゼ９遺伝子である（Ｓｔｒａａｔｈｏｆら（２００５）．Ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ「Ｔ細胞療法の安全弁である、誘導性カスパーゼ９」，Ｂｌｏｏｄ．Ｊｕｎｅ  １；１０５（１１）：４２４７−４２５４を参照のこと。その主題は、本明細書において完全に説明されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６１】
[0061]  いくつかの態様において、上記に記載のＣＡＲ遺伝子が含まれる発現カセットは、標的細胞の形質導入又はトランスフェクションによる、送達用のベクターへ挿入され得る。例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター、又はプラスミドといった、どの好適なベクターも使用し得る。いくつかの態様において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ関連ウイルスベクターより選択されるウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、健常な免疫細胞（例、Ｔ細胞）の集団に形質導入することができる。成功裡に形質導入されたか又はトランスフェクトされた標的細胞は、発現カセットの一部である１以上の遺伝子を発現する。
【００６２】
[0062]  このように、Ｔ細胞のような免疫細胞の１以上の集団を、上記に記載したもののようなＣＡＲ遺伝子で形質導入することができる。形質導入されるＴ細胞は、ドナーに由来しても、がんを有してそのがんの治療が必要である被験者に由来してもよい。いくつかの態様において、形質導入されたＴ細胞は、がんの治療のための養子免疫療法の治療に使用される。いくつかの態様において、形質導入されたＴ細胞は、配列番号２４〜配列番号２７より選択されるアミノ酸配列（太字／下線の残基は、置換を示す）をコードするＣＡＲ遺伝子を発現する：
【００６３】
【化１３−１】
0006560235.tif 000014
【００６４】
【化１３−２】
0006560235.tif 000015
【００６５】
【化１３−３】
0006560235.tif 000016
【００６６】
【化１３−４】
0006560235.tif 000017
【００６７】
[0063]  さらに、このＴ細胞の１以上の集団は、被験者への投与のための送達用の医薬的に許容される組成物の一部であり得る。ＣＡＲ形質導入されたＴ細胞に加えて、医薬的に有効な組成物には、１以上の医薬的に有効な担体が含まれ得る。本明細書に使用される「医薬的に許容される担体」は、目的の治療薬を身体のある組織、臓器、又は部分から身体の別の組織、臓器、又は部分へ運ぶか又は運搬するのに関与する、医薬的に許容される材料、組成物、又は運搬体（vehicle）を意味する。そのような担体は、例えば、液体、固体、又は半固体の充填剤、溶剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、アジュバント、結合剤、緩衝剤、溶解補助剤、溶剤、被包化材料、金属封鎖剤、分散剤、保存剤、滑沢剤、崩壊剤、濃化剤、乳化剤、抗微生物剤、抗酸化剤、安定化剤、着色剤、又はこれらの組合せを含み得る。
【００６８】
[0064]  担体の各成分は、それが組成物の他の成分と適合可能でなければならず、そしてそれが遭遇し得る身体のどの組織、臓器、又は部分との接触にも適していなければならない、つまりそれが毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又はその治療利益より過度に重大になる他のあらゆる合併症のリスクを持ち込んではならないという点で、「医薬的に許容される」。
【００６９】
[0065]  医薬的に許容される担体として役立つことができる材料の諸例には、（１）乳糖、ブドウ糖、及びショ糖のような糖類；（２）トウモロコシデンプンとジャガイモデンプンのようなデンプン類；（３）セルロースと、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及びセルロースアセテートのようなその誘導体；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブリノゲン、ラミニン、デコリン、ヒアルロナン、アルギン酸塩、及びキトサンのような天然ポリマー；（７）タルク；（８）ココア脂と坐薬ワックスのような賦形剤；（９）落花生油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油のような油剤；（１０）プロピレングリコールのようなグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールのようなポリオール類；（１２）トリメチレンカーボネート、オレイン酸エチル、及びラウリン酸エチルのようなエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムと水酸化アルミニウムのような緩衝剤；（１５）アルギン酸（又はアルギン酸塩）；（１６）発熱性物質除去水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコールとプロパンアルコールのようなアルコール；（２０）リン酸緩衝液；（２１）ポリ乳酸、ポリグリコール酸のような熱可塑性物質；（２２）ポリカプロラクトンのようなポリエステル類；（２３）自己集合性ペプチド；及び（２４）アセトンのような、医薬製剤において利用される他の無害な適合可能物質が含まれる。
【００７０】
[0066]  医薬組成物は、ｐＨ調整剤と緩衝剤、毒性調整剤、等のように、生理学的条件に近づけるのに必要とされるような、医薬的に許容される補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、等）を含有してよい。
【００７１】
[0067]  １つの態様において、医薬的に許容される担体は、水性の担体、例えば、緩衝化生理食塩水、等である。ある態様において、医薬的に許容される担体は、極性溶媒、例えば、アセトンとアルコールである。
【００７２】
[0068]  上記製剤中のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の濃度は、広く変動し得て、選択される特別な投与形式と生体系のニーズに従って、主に流体の容量、粘度、臓器サイズ、体重、等に基づいて選択されるものである。
【００７３】
[0069]  ある態様では、がん又は腫瘍細胞を標的として殺傷するための方法に使用される、本明細書に記載される細胞のような、ＣＡＲ遺伝子で形質導入されたＴ細胞（即ち、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞）の集団を細胞培養において増殖させることができる。この態様のある側面では、該方法を試験管内で又は研究現場で使用して、がんの原因における特別ながん関連抗原の役割を検討する、又は新しいＣＡＲ構築体の標的指向能力について評価することができる。
【００７４】
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を用いたがんの治療
[0070]  いくつかの態様によれば、上記に記載したもののような、ＣＡＲ遺伝子とＣＡＲ遺伝子で形質導入されるＴ細胞の集団を、被験者においてがんを治療する方法において使用し得る。そのような方法には、少なくとも１つのＣＡＲ遺伝子で形質導入されたＴ細胞の少なくとも１つの集団の治療有効量を該被験者へ投与する工程が含まれ得る。上記の態様において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の集団は、上記に記載したもののような、１以上のＣＡＲ遺伝子を発現する。ある態様において、このＴ細胞は、本明細書に記載されるような、ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）又はＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）構築体のような単一変異遺伝子構築体、本明細書に記載されるような、Ｌ２３５ＥとＮ２９７Ｑの両方の変異を有する二重変異遺伝子構築体（例、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ））、又は本明細書に記載されるような、欠失遺伝子構築体（例、ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δ）で形質導入されてそれを発現する。そのような細胞が養子免疫療法治療による投与されると、この形質導入されたＴ細胞は、がん関連抗原を発現する細胞（即ち、がん細胞）に生体内で（in vivo）特異的に標的指向してこれを溶解し、それによってがん細胞を消失させるその治療効果を送達する。
【００７５】
[0071]  形質導入Ｔ細胞の集団を使用して治療し得るがんには、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系がん、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫と悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系がん、頚部がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖障害、結腸がん、結直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胎児性腫瘍、中枢神経系がん、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、骨の悪性線維性組織球腫と骨肉腫、胆嚢がん、胃部（胃）がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）−軟部肉腫を参照のこと、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポシ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、舌及び口腔がん、肝臓がん（原発性）、非浸潤性小葉がん（ＬＣＩＳ）、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫と骨肉腫、髄芽腫、髄上皮腫、メラノーマ、メルケル細胞がん、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子が関与する原発不明正中線がんを伴う転移性頚部扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔（Oral）がん、口腔（Oral Cavity）がん、中咽頭がん、骨肉腫と骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中間型松果腺実質腫瘍、松果体芽腫とテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠期乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん（腎盂及び尿管）、移行細胞がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部肉腫、扁平細胞がん、頚部扁平上皮がん、胃部（胃）がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫と胸腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行細胞がん、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が含まれ得る。
【００７６】
[0072]  本明細書に記載される方法に従って使用し得る単数又は複数のＣＡＲ遺伝子で形質導入された細胞の単数又は複数の集団は、単独で、又は医薬組成物の一部として、どの好適な投与経路によっても投与し得る。投与経路は、当該技術分野で知られたどの投与経路にも言及し得て、限定されないが、頭蓋内、非経口、又は経皮が含まれる。「非経口」は、一般に、眼窩内注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、髄腔内、胸骨内、鞘内、腫瘍内、子宮内、静脈内、くも膜下、皮膜下、皮下、経粘膜、又は経気管の注射が含まれる、注射に関連した投与経路を意味する。ある態様では、形質導入Ｔ細胞が静脈内又は髄腔内に投与される。
【００７７】
[0073]  本明細書に使用される「有効量」という用語は、所望される効果を産生する薬剤、化合物、治療薬、又は療法の量を意味する。例えば、細胞の集団を有効量の薬剤、化合物、治療薬、又は療法と接触させて、その効果を試験管内で（例、細胞培養）研究するか又は所望の治療効果を生体外（ex vivo）又は試験管内で産生することができる。有効量の薬剤、化合物、治療薬、又は療法を使用して、標的状態を予防するか又は治療すること、その状態に関連した症状を緩和すること、又は所望される生理学的効果を産生することといった治療効果を被験者において産生することができる。そのような事例において、化合物の有効量は、「治療有効量」、「治療有効濃度」、又は「治療有効用量」である。正確な有効量又は治療有効量は、所与の被験者又は細胞集団において、治療の効力に関して最も有効な結果を生じる組成物の量である。この量は、限定されないが、化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学特性、及びバイオアベイラビリティが含まれる）、被験者（年齢、性別、疾患の種類及び段階、一般健康状態、所与の投与量への反応性、及び薬物療法の種類が含まれる）又は細胞の生理学的状態、製剤中の単数又は複数の医薬的に許容される担体の性質、及び投与の経路が含まれる多様な要因に依存して変動するものである。さらに、有効量又は治療有効量は、該化合物が単独で投与されるか、又は別の化合物、薬物、療法、又は他の治療法又はモダリティと組み合わせて投与されるかに依存して変動する場合がある。臨床及び薬理学の技術分野の当業者は、定型的な実験によって、即ち、化合物の投与に対する細胞又は被験者の応答をモニターして、それに従って投与量を調整することによって、有効量又は治療有効量を決定することができよう。追加のガイダンスについては、本明細書において完全に説明されるかのように参照により本明細書に組み込まれる、「レミントン：調剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２１版、フィラデルフィア科学大学（ＵＳＩＰ）、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ、ペンシルヴェニア州フィラデルフィア（２００５）を参照のこと。本明細書に記載される態様に従って所望の効果を産生するのに有効な量又は療法的に有効な量で使用し得る薬剤、化合物、治療薬、又は療法には、限定されないが、ＣＡＲ遺伝子、ＣＡＲ遺伝子が含まれる発現カセット、ＣＡＲ遺伝子が含まれる発現カセットをＴ細胞のような標的細胞へ送達するベクター、及びＣＡＲ遺伝子で形質導入されるＴ細胞の集団が含まれ得る。
【００７８】
[0074]  ある状態を「治療すること」又はある状態の「治療」という用語は、該状態を予防すること、該状態の発症又は発現速度を遅らせること、該状態を発現するリスクを低下させること、該状態に関連した症状の発現を予防するか又は遅らせること、該状態に関連した症状を低下させるか又は終了させること、該状態の完全又は部分寛解をもたらすこと、又はこれらの組合せに言及し得る。治療は、ある状態の予防又は防止治療を意味する場合もある。
【００７９】
[0075]  本明細書に使用される「被験者」という用語は、霊長動物（特に、高等霊長動物）、ヒツジ、イヌ、齧歯動物（例、マウス又はラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、及びウシのようなすべての哺乳動物が含まれる、ヒト又は動物を意味する。いくつかの態様において、被験者は、ヒトである。
【００８０】
[0076]  ある態様において、がんを治療する方法には、第一のＣＡＲ遺伝子で形質導入されたＴ細胞の第一集団の治療有効量を、第二のＣＡＲ遺伝子で形質導入されたＴ細胞の第二集団の治療有効量と組み合わせて投与する工程が含まれ得る。
【００８１】
[0077]  他の態様では、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を１以上の追加の抗がん療法と組み合わせて投与することができる。「組合せにおいて」又は「〜と組み合わせて」は、本明細書に使用されるように、同じ被験者において同じがんを治療するクールにおいて、２種以上の薬剤、薬物、治療薬、手技、治療レジメン、治療モダリティ、又はこれらの組合せをいかなる順序でも使用することを意味する。これには、同時投与だけでなく、数日まで離れた、時間的に隔てられた順序で投与することも含まれる。このような組合せ治療には、あらゆる１種以上の薬剤、薬物、治療薬、手技、治療レジメン、及び治療モダリティの単回以上の投与も含まれ得る。さらに、２種以上の薬剤、薬物、治療薬、手技、治療レジメン、治療モダリティ、又はこれらの組合せの投与は、同じ投与経路によっても、異なる投与経路によってもよい。
【００８２】
[0078]  本明細書に記載される方法に従って使用され得る追加の抗がん療法には、１以上の抗がん手技、治療モダリティ、抗がん治療薬、又はこれらの組合せが含まれ得る。いくつかの態様において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、限定されないが、幹細胞移植（例、骨髄移植、又は同種幹細胞、自家幹細胞を使用する末梢血幹細胞移植；又は骨髄非破壊的移植）、放射線療法、又は外科的切除が含まれる、１以上の抗がん手技又は治療モダリティと組み合わせて投与し得る。他の態様において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、限定されないが、化学療法剤と他の抗がん薬、免疫療法剤、標的療法剤、又はこれらの組合せが含まれる、がんを治療するために使用し得る１以上の抗がん治療薬又は薬物と組み合わせて投与することができる。
【００８３】
[0079]  本明細書に記載される態様に従ってＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と組み合わせて投与し得る化学療法剤と他の抗がん薬には、限定されないが、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、三酸化ヒ素、アントラサイクリン抗生物質とその医薬的に許容される塩（例、塩酸ドキソルビシン、塩酸ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン）、アルキル化剤（例、シクロホスファミド、ラロムスチン）、代謝拮抗剤と類似体（シタラビン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート）、脱メチル化剤（例、デシタビン、５−アザシチジン）、核酸合成阻害剤（例、ヒドロキシ尿素）、トポイソメラーゼ阻害剤（例、エトポシド）、ビンカアルカロイド（例、硫酸ビンクリスチン）、又はこれらの組合せ（例、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、塩酸ダウノルビシン、及びエトポシドの組合せが含まれる組合せ治療薬である、「ＡＤＥ」）が含まれる。
【００８４】
[0080]  本明細書に記載される態様に従ってＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と組み合わせて投与し得る免疫療法剤には、限定されないが、免疫調節剤（例、ＳＴＡＴ３阻害剤、レナリドミド）と治療用モノクローナル抗体が含まれる。治療用モノクローナル抗体は、１以上の追加のがん関連抗原を標的とするように設計され得る。
【００８５】
[0081]  本明細書に記載される態様に従ってＣＡＲ形質導入Ｔ細胞と組み合わせて投与し得る標的療法剤には、限定されないが、チロシンキナーゼ阻害剤（イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、スニチニブ）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例、チピファルニブ）、ＦＬＴ阻害剤、及びｃ−Ｋｉｔ（又はＣＤ１１７）阻害剤（イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ）が含まれる。
【００８６】
[0082]  以下の実施例は、本発明の様々な態様を例解するために企図されている。従って、考察される具体的な態様を本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。例えば、下記の実施例がＣＤ１９を標的とするＣＡＲについての態様に関するとしても、ＣＡＲは、どの抗原でも標的とするように産生し得ると理解される。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、改変物、及び修飾物を作製し得ることが明らかであろうし、そのような均等態様も本発明に含まれるべきであると理解される。さらに、本開示において引用されるすべての参考文献は、本明細書において完全に説明されるかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８７】
実施例１：  ＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー領域に変異を取り込んだキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＦｃ受容体介在性の認識及びクリアランスを回避し、改善されたＴ細胞の存続及び抗腫瘍効果をもたらす。
【００８８】
[0083]  細胞性のＦｃＲ介在性相互作用が、養子移入されたＣＡＲ発現Ｔ細胞の免疫学的拒絶及びクリアランスに、又はその意図しない活性化にさえ役割を果たすかどうかを判定するために、そのＩｇＧ４  ＦｃスペーサーのＣＨ２領域内の１カ所又は２カ所で変異している（Ｌ２３５Ｅ及び／又はＮ２９７Ｑ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（本明細書において、ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）、ＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）、又はＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）と称する）、並びにそのＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー内にＣＨ２欠失を有するＣＤ１９特異的ＣＡＲ（本明細書において、ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δと称する）をＴ細胞に移入した。次いで、これらの変異ＣＡＲを発現するＴ細胞を、変異していないＣＡＲ（ＣＤ１９Ｒ）を発現するＴ細胞、又は追跡マーカーとして短鎖型ＥＧＦＲ分子（ＥＧＦＲｔ）のみを発現するＴ細胞（Ｗａｎｇら、２０１１）と、試験管内ＦｃγＲ結合性及びＣＡＲ介在性細胞溶解活性、並びに生体内生着及び治療効果について比較した。結果は、細胞性ＦｃγＲ相互作用の消失により、養子移入されたＣＡＲ発現Ｔ細胞の存続及び抗腫瘍反応が改善されることの証拠を提供する。
【００８９】
材料及び方法
[0084]  ＤＮＡ構築体及びレンチウイルスベクター。ＣＤ１９Ｒ２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルス構築体は、ａ）ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３  ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ遺伝子断片、ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、キメラ受容体の発現及び機能を高めるｇｇ変異を含有する共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及び細胞質シグナル伝達ドメイン（Ｎｇｕｙｅｎら、２００３）、及びＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメイン（Ｋｏｗｏｌｉｋら、２００６）から成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列；ｂ）リボソームスキップＴ２Ａ配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋら、２００４）、並びにｃ）短鎖型ＥＧＦＲ配列（Ｗａｎｇら、２０１１ａ）を含有する。ＥＧＦＲｔ−Ｔ２Ａ−ＤＨＦＲＦＳ−Ｔ２Ａ−ＩＭＰＤＨ２ＩＹ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、既に報告されているようにして（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａら、２０１３）作製した。ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター、ＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター、及びＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクターは、Ｇｅｎｅａｒｔで合成してＮｈｅＩ／ＲｓｒＩＩで消化し、同様に消化したＣＤ１９Ｒ２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７と連結されている、コドンを最適化したＣＤ１９Ｒ２８Ｚ＿ｐＧプラスミドの、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いた部位特異的突然変異誘発により作製した。ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δ２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクターは、Ｇｅｎｅａｒｔで合成してＮｈｅＩ／ＲｓｒＩＩで消化し、同様に消化したＣＤ１９Ｒ２８Ｚ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７と連結されている、コドンを最適化したＣＤ１９Ｒ−ＨＬ−ＣＨ３（ＣＯ）＿ｐＭＫ−ＲＱプラスミドより作製した。
【００９０】
[0085]  細胞株及び維持管理。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、シティオブホープ国立医療センター（ＣＯＨＮＭＣ）でアフェレーシスを受けた健常ドナーの残留血液成分を含有する廃棄キットより入手したヘパリン添加末梢血から、記載されているように（Ｗａｎｇ、２０１１ｂ）して単離した。これは特定されない廃棄血液材料であったため、ＣＯＨＮＭＣ内部審査委員会（ＩＲＢプロトコール＃０９０２５）及びＣＯＨＮＭＣヒト被験者保護事務局の承認により、インフォームドコンセントは免除された。次いで、既に記載されているようにして（Ｗａｎｇら、２０１２）、ＴＣＭ単離（ＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡ枯渇、続いてＣＤ６２Ｌ選択を用いる）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体ビーズ刺激、及びレンチウイルス介在性形質導入を行った。いくつかの事例では、既に記載されているように（Ｗａｎｇら、２０１１ａ）、形質導入Ｔ細胞をＥＧＦＲｔ発現について免疫磁気的に濃縮した。
【００９１】
[0086]  ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽細胞株（ＬＣＬ）及びＯＫＴ３を発現するＬＣＬ（ＬＣＬ−ＯＫＴ３）（Ｗａｎｇら、２０１１ｂ）又はｆｆＬｕｃ＋  ＬＣＬ細胞を、１０％加熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ハイクローン、ユタ州ローガン）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州サンタアナ）中で培養した。ｆｆＬｕｃ＋  ＬＣＬは、５００μＬの培地中５μｇ／ｍＬのポリブレン存在下で、レンチウイルスベクターｅＧＦＰ−ｆｆｌｕｃ＿ｅｐＨＩＶ７をＭＯＩ  ２０にて形質導入し、その後ＧＦＰ＋細胞の分取によって精製することにより作製した。
【００９２】
[0087]  ヒト恒常性ＩＬ−１５サイトカイン（ＮＳ０−ＩＬ１５）を分泌するマウス骨髄腫細胞を、既に記載されているようにして（Ｗａｎｇら、２０１１ｂ）作製した。
[0088]  ＳｕｐＢ１５及びＫ５６２白血病細胞株（ＡＴＣＣ）は、対応するＡＴＣＣ推奨培地において増殖させた。
【００９３】
[0089]  抗体及びフローサイトメトリー。蛍光色素結合アイソタイプ対照、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５、及びストレプトアビジンは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンホセ）より入手した。ビオチン化抗Ｆｃは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ペンシルヴァニア州ウェストグローブ）より購入した。ビオチン化セツキシマブの作製については、既に報告されている（Ｗａｎｇら、２０１１ａ）。ビオチン化ｈｕＦｃγＲ１、ｍｕＦｃγＲ１、ｈｕＦｃγＲ２ａ、ｈｕＦｃγＲ２ｂ、及びｍｕＦｃγＲ２ｂは、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（北京、中華人民共和国）より入手した。免疫蛍光細胞％はＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析し、分析領域中の細胞％はＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖ３（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州）を用いて算出した。
【００９４】
[0090]  生体内Ｔ細胞生着及び療法。すべてのマウス実験は、ＣＯＨＮＭＣ研究所の動物実験委員会によって承認された。生着試験のために、６〜１０週齢のＮＯＤ／Ｓｃｉｄ  ＩＬ−２ＲγＣｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに、１０７個の指定のＴＣＭ由来細胞を０日目に静脈内注射し、ヒトＩＬ−１５を生体内で全身供給するために、２×１０７個の照射ＮＳ０−ＩＬ１５を週３回腹腔内注射した。後眼窩出血より末梢血を採取し、赤血球を溶解させて、細胞懸濁液をフローサイトメトリーによって分析した。療法的試験のために、６〜８週齢のＮＳＧマウスに、１．５×１０６個のｆｆＬｕｃ＋  ＬＣＬ細胞を０日目に静脈内投与し、次いで５×１０６個の指定のＣＡＲ＋  ＴＣＭ由来細胞を３日目に静脈内投与した。既に記載されているようにして（Ｋａｈｌｏｎら、２００４）、Ｘｅｎｏｇｅｎ社のイメージングによってルシフェラーゼ活性を測定した。
【００９５】
[0091]  クロム放出アッセイ。４時間の５１Ｃｒ放出アッセイを、指定のエフェクター／標的細胞比を用いて、既に記載されているようにして（Ｓｔａｓｔｎｙら、２００７）実施した。
【００９６】
結果
[0092]  ＣＤ１９Ｒ＋  Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスに生着することができない。Ｔ細胞亜集団としてのセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、養子移入後に優れた生着可能性を有しており、したがって治療効果を有するものとして特徴付けられている（Ｗａｎｇら、２０１１ｂ）。さらなる証拠は、ＮＳＧマウスを用いた生体内異種移植片モデルにおいて、ＴＣＭ由来細胞上でのＣＡＲ発現が、生体内での存続減少と相関するように見えることを示している。本明細書に記載の試験が示すように、非形質導入ＴＣＭ由来細胞の生着を、（ｉ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＤ１９Ｒ）及び追跡マーカーとして短鎖型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）の両方を発現するようにレンチウイルスで形質導入したＴＣＭ由来細胞、並びに（ｉｉ）ＥＧＦＲｔ追跡マーカーのみを細胞表面上に発現するようにレンチウイルスで形質導入したＴＣＭ由来細胞の生着と比較する実験において、この存続減少を示した（図１）。細胞をマウスに静脈内投与した後７日目と１４日目に採取した末梢血を見ると、抗ヒトＣＤ４５  ｍＡでの染色は、非形質導入ＴＣＭ由来細胞の検出を可能にした（図１ｃ）。しかしながら、遺伝子改変細胞を検出するためにＥＧＦＲｔ追跡マーカーについて同時染色すると、入力した細胞の形質導入及び／又はＥＧＦＲｔ発現（図１ｂ、７８〜７９％陽性）のレベルが同様であるにもかかわらず、ＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ＋  ＴＣＭを受けたマウスの末梢血では、ＥＧＦＲｔ＋  ＴＣＭを受けたものと比較して、細胞の生着が有意に少ないことが明らかであった（図１ｃ、ｐ＜０．０００１、対応の無いスチューデントｔ検定を使用して、７日目又は１４日目に各群のＣＤ４５／ＥＧＦＲｔ＋細胞の％を比較した場合）。ＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ＋  ＴＣＭ処理マウスについて検出されたＴ細胞は低レベルであったが、存続Ｔ細胞はすべて７日目及び１４日目においてＣＡＲ陰性であった。この生体内での存続減少は、ＥＧＦＲｔ導入遺伝子ではなくＣＡＲ導入遺伝子を発現するように形質導入した細胞に特異的であるため、Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入に関連するものではない。さらに、これらＮＳＧマウスにおけるＣＤ１９抗原の欠如、及び抗原特異性の異なるＣＡＲを発現するＴ細胞において同様の現象が見られている（データ示さず）という事実は、末梢血における生着／存続の欠如が抗原に異存しないことを示唆している。
【００９７】
[0093]  ＨｕＦｃγＲは、ＣＤ１９Ｒ＋  Ｔ細胞に結合する。ＣＤ１９Ｒ構築体には、マウスモノクローナル抗体ＦＭＣ６３に由来するＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃリンカー、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが含まれる。ＣＡＲ構築体にはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域の一部が含まれるため、ＥＧＦＲｔ＋細胞ではなく、ＣＤ１９Ｒ／ＥＧＦＲｔ＋細胞を選択的にクリアにする、ＦｃＲ介在性の自然免疫応答の傾向について検討した。実際、可溶性ヒトＦｃγＲ１を用いた結合性アッセイは、形質導入しなかったか又はＥＧＦＲｔのみを発現するＴＣＭ由来細胞とは対照的に、ＣＤ１９Ｒを発現するＴＣＭ由来細胞が、より高い希釈率で漸減し得る、ＦｃγＲ１分子の結合性を発揮することを明らかにした（図２）。注目すべきことに、ＮＳＧマウスは、免疫不全だが、ＦｃＲを発現する好中球及び単球を依然として有することが知られているため（Ｉｓｈｉｋａｗａら、２００５；Ｉｔｏら、２００２）、先の生着試験において観測されたＣＡＲ＋  Ｔ細胞の存続欠如について有望な論拠を提供する。
【００９８】
[0094]  ＣＤ１９Ｒ変異体の作製。ＣＡＲ発現ＴＣＭ集団に対するＦｃＲ介在性の潜在的効果の意義についてさらに試験するために、ＦｃＲ結合性に関与し得るＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン内のアミノ酸で、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを変異させた−Ｌ２３５Ｅ及び／又はＮ２９７Ｑ（図３ａ）。ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインの欠失（即ち、アミノ酸残基２３５及び２９７を含有するドメインの欠失）を有するＣＤ１９特異的ＣＡＲも作製した（図３ａ）。得られた単一変異体ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）及びＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）、二重変異体ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）（Ｌ２３５Ｅ変異及びＮ２９７Ｑ変異を有する）、並びに欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δの配列は、別々のレンチウイルス構築体に導入され、非変異ＣＤ１９Ｒについて図１ａに記載したのと同様のデザインでＴ２Ａリボソームスキップ配列を用いて、単一の転写産物からそれぞれＥＧＦＲｔと協調的に発現された。レンチウイルス形質導入、ＥＧＦＲｔ発現細胞の免疫磁気的濃縮、及び単回の迅速増殖の後で、ＴＣＭ由来細胞株のそれぞれは、予測される導入遺伝子について９２〜９９％陽性であり（図３ｂ）、変異がＣＡＲ発現に悪影響を及ぼさないことを実証した。さらに、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイでは、これら変異体のいずれも、これらＴＣＭ由来細胞のＣＤ１９特異的な細胞溶解能力を変化させなかった（図３ｃ）。
【００９９】
[0095]  変異ＩｇＧ４スペーサーを有するＣＡＲへのｈｕＦｃγＲ結合性は低下する。ＦｃＲ結合性に影響を及ぼす、ＣＡＲ中の異なる変異／欠失の効力を判定するために、様々なヒト及びマウスのビオチン化可溶性ＦｃγＲ及びＰＥ−ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施し、異なる細胞集団に対するＦｃγＲの結合を検出した。非変異ＣＤ１９Ｒを発現するＴ細胞は、ヒトのＦｃγＲ１、ＦｃγＲ２ａ、及びＦｃγＲ２ｂ、並びにマウスのＦｃγＲ１及びＦｃγＲ２ｂと結合した（図４）。対照的に、ＥＧＦＲｔのみを発現するＴ細胞はこれらＦｃγＲと結合せず、そしてＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）、ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）、又はＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）の変異体、あるいはＣＤ１９Ｒｃｈ２Δ欠失のいずれかを発現するＴ細胞は、いずれもこれらＦｃγＲへの結合が有意に低下した。
【０１００】
[0096]  ＣＤ１９Ｒ変異体を有するＴ細胞は、改善された生体内生着及び存続を発揮する。ＦｃγＲ結合を妨げることに役立つＣＤ１９Ｒの変異又は欠失が養子移入時の生体内存続の増加へ転化されるかどうかを判定するために、親ＣＤ１９Ｒ、ＥＧＦＲｔマーカー単独、ＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）、ＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）、又はＣＤ１９Ｒｃｈ２Δのいずれかを発現する１０７個の細胞をＮＳＧマウスに静脈内注入した。１週間後及び２週間後に、末梢血をＣＤ４５＋ＥＧＦＲｔ＋細胞生着についてアッセイした（図５）。生着したＥＧＦＲｔ＋細胞は、Ｔ細胞が単一変異型のＣＤ１９Ｒ（Ｌ２３５Ｅ）又はＣＤ１９Ｒ（Ｎ２９７Ｑ）を発現する場合に検出することができた。さらに、二重点変異ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）又はＣＨ２欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δの発現は、これらのマウス群において観察されるＣＤ４５／ＥＧＦＲｔ＋細胞のレベルがＥＧＦＲｔ単独を発現する場合に見られるレベルと同様であったため、Ｔ細胞の生着を救済していた。このような遺伝子改変細胞の生着及び存続の救済は、養子移入の前にＥＧＦＲｔ濃縮しなかったＴＣＭ由来細胞を使用しても観察された（図８）。
【０１０１】
[0097]  ＣＤ１９Ｒ変異体を有するＴ細胞は改善された治療効果を発揮する。この生着試験の知見に基づいて、ＴＣＭ由来細胞の抗腫瘍効力に対するＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）又はＣＤ１９Ｒｃｈ２Δの効果を比較した。ＬＣＬは、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現して生体内腫瘍増殖の生物発光モニタリングを可能にするように形質導入された、ＣＤ１９発現腫瘍細胞株である。ｆｆＬｕｃ＋  ＬＣＬをＮＳＧマウスに静脈内投与した後３日目に、このマウスを、対照としてのＰＢＳ、あるいは非変異ＣＤ１９Ｒ、ＥＧＦＲｔマーカー単独、二重点変異ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）、又はＣＨ２欠失ＣＤ１９Ｒｃｈ２Δのいずれかを発現する５×１０６個のＴ細胞のいずれかで頸静脈処置した。ＴＣＭ由来細胞上でのＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）又はＣＤ１９Ｒｃｈ２Δの発現は、有意な腫瘍増殖制御をもたらした（図６）。この効力は、２１日目の末梢血における遺伝子改変細胞の存在／存続と相関した（図６ｄ）。実際、ＰＢＳ、ＣＤ１９Ｒ、及びＥＧＦＲｔの対照群は、２１日目に安楽死させなければならなかったが、ＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）群及びＣＤ１９Ｒｃｈ２Δ群のマウスは、いずれも１００日過ぎて生存していた（図６ｅ）。これらの生着及び効力試験は、Ｔ細胞のＴＣＭ亜群に焦点を当てたが、これらの知見は、ＦｃＲ相互作用を消失させるためのＩｇＧ４変異の正の恩恵は、遺伝子操作されたＴ細胞集団に依存しないことを示唆している。実際、ＴＣＭ由来細胞株に代えて、ＰＢＭＣ由来Ｔ細胞全体でＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）を発現させても、改善された抗腫瘍効力及び長期の生存をもたらした（ｐ＝０．０２９５）（図７）。
【０１０２】
考察
[0098]  臨床的には、養子Ｔ細胞戦略の生体内治療効果は、養子移入時の生着及び存続と直接相関がある（Ｈｅｓｌｏｐら、２００３；Ｂｒｅｎｎｅｒ＆Ｈｅｓｌｏｐ、２０１０）。細胞移入前の宿主のリンパ球枯渇（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２００５）、細胞移入後のサイトカインサポート（ごく最近では、Ｏｖｅｒｗｉｊｋ＆Ｓｃｈｌｕｎｓ、２００９に概説されている）、及び移入に最適なＴ細胞集団の使用（Ｂｅｒｇｅｒら、２００８；Ｈｉｎｒｉｃｈｓら、２０１１；Ｙａｎｇら、２０１３；Ｇａｔｔｉｎｏｎｉら、２０１１；Ｃｉｅｒｉら、２０１３）を含めた様々なアプローチが移入Ｔ細胞の存続を改善することが示唆されている。上記試験は、治療細胞の生着及び存続を管理する上でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のデザインが重要な役割果たすさらなる証拠を提供する。これまで、ＣＡＲデザインは、第二及び第三世代のＣＡＲに共刺激シグナル伝達ドメインを含めることによって、治療細胞の生着及び存続に利するために活用されてきた（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉら、２０１０を参照のこと）。しかしながら、上記データがまた示唆するように、リガンド結合ドメインをＣＡＲのシグナル伝達ドメインに連結させるために使用される配列（スペーサー、ヒンジ、及び／又はリンカーとして知られる）は、マウス悪性疾患モデルにおける生体内治療結果にとって重要であることがこれまで正しく評価されていない。具体的には、Ｉｇ  Ｆｃスペーサーの使用により、ＮＳＧマウスモデルにおいてＣＡＲ発現細胞の生着及び／又は存続をＦｃγＲ結合性と相関するやり方で潜在的に阻害できることが見出された。したがって、ＣＡＲ  Ｆｃドメイン内の関連配列の点変異又は欠失によりＦｃγＲ結合を妨げると、養子移入された細胞の生体内存続を、ＣＡＲを発現しない細胞のそれまで回復させることができる。このように、スペーサーを最適化したＣＡＲによって介在される生体内存続の増加により、マウスモデルにおいて、有意に改善されたＣＡＲ指向性の抗腫瘍療法へ転換できる。
【０１０３】
[0099]  養子移入されたＴ細胞の免疫学的クリアランスは新たな課題ではない。例えば、ＨｙＴＫ及びＮｅｏＲ選択遺伝子に対する細胞性免疫拒絶反応は、ＣＡＲと協調的に発現されることが示されている（Ｂｅｒｇｅｒら、２００６；Ｊｅｎｓｅｎら、２０１０）。しかしながら、上記試験は、生体内Ｔ細胞存続及び抗腫瘍効力に関し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞に対するＦｃＲ介在性反応の重要性を強調するものである。その結果として、本試験は、この種の免疫原性を回避するための「解決策」があること、即ち、ＦｃγＲ認識を妨げるためのＣＡＲデザインにおける変異の導入についても示している。
【０１０４】
[00100]  これらの結果に基づけば、本明細書に記載の変異は、ヒトに当てはめることができ、したがって、ＩｇＧスペーサー含有ＣＡＲを発現するＴ細胞のヒトにおける存続及び治療効果を高めるはずである。ＣＡＲ  Ｔ細胞生着及び生体内抗腫瘍効力におけるどんな不一致も、マウスＮＳＧモデル系の性質によって影響を受ける可能性がある。ヒトＩｇＧ４は、マウスＦｃＲに効率的に結合して、強力な抗体依存性の細胞介在性細胞傷害を介在することが示されている（Ｉｓａａｃｓら、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、１９８８）。対照的に、ヒトＦｃＲは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３に対して最も強い親和性を有しており、ＩｇＧ４に対する親和性は低い（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ＆Ｃａｖａｃｉｎｉ、２０１０；Ｎｉｒｕｌａら、２０１１）。加えて、ＮＳＧマウスに血清抗体が不足していると、その自然免疫細胞によって発現されるＦｃＲが占有していないため、ＣＡＲ内のＩｇＧ−Ｆｃスペーサーに結合する可能性がより大きい。低グロブリン血症の症例を除けば、免疫応答力のあるヒトは、約１０ｍｇ／ｍＬの高い血清ＩｇＧレベルを有し（Ｓｔｏｏｐら、１９６９）、これがＩｇＧ含有ＣＡＲの認識に対して潜在的に競合する可能性がある。実際、いくつかの研究グループがＩｇＧ−Ｆｃ含有ＣＡＲ  Ｔ細胞をヒトに投与しており、いくつかの症例では、低レベルのＣＡＲ  Ｔ細胞が、投与後６週まで（Ｓａｖｏｌｄｏら、２０１１）、さらには１年まで（Ｔｉｌｌら、２０１２）、定量的ＰＣＲによって検出可能であった。本明細書に記載される変異の導入は、ヒトにおけるこのＣＡＲ  Ｔ細胞の存続をさらに改善する可能性があるだろう。
【０１０５】
[00101]  まとめると、本明細書に報告した試験は、Ｉｇ  Ｆｃスペーサーの成分を含有するＣＡＲは、生体内での細胞のＦｃＲ介在性認識を妨げる改変を導入する必要があるという証拠を提供している。そのような改変は、本明細書に記載のＣＤ１９Ｒ（ＥＱ）構築体及びＣＤ１９Ｒｃｈ２Δ構築体に見られるような、アミノ酸配列を変化させる点変異、又は配列欠失を包含し得る。そのような改変は、ＣＡＲ発現性免疫療法細胞の産物を生体内で認識するＦｃＲ発現細胞の能力を妨げるだけでなく、この免疫療法戦略の様々な望ましくない副作用の原因となり得る、形質移入Ｔ細胞及び／又は宿主免疫応答の意図しない活性化をも妨げる可能性がある（Ｈｏｍｂａｃｈら、２０１０）。
【０１０６】
参考文献
以下に列挙する参考文献、特許、及び公開特許出願、並びに上記明細書に引用したすべての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体を本明細書に援用する。
【０１０７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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