(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルミの枝をアルコールを用いて抽出し，クルミの枝のアルコール抽出物を得る抽出工程を含む，抗肥満剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の抗肥満剤の製造方法であって，前記抗肥満剤は，中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加防止剤である，抗肥満剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の抗肥満剤の製造方法であって，前記抗肥満剤は，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合を阻害することにより抗肥満効果を発揮する抗肥満剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載の抗肥満剤の製造方法であって，前記抗肥満剤は，シノビオリンによるＰＧＣ−１βのユビキチン化を阻害することにより抗肥満効果を発揮する抗肥満剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載の抗肥満剤の製造方法であって，
前記抽出工程は，
クルミの枝１重量部に対して，４重量部以上３０重量部以下の濃度が２０重量％〜６０重量％のアルコールを混合し，加熱還流を少なくとも１度行い第１の還流液を得る第１の加熱還流工程と，
第１の加熱還流工程で得られた第１の還流液をろ過して第１のろ液及び第１の残渣を得る第１のろ過工程と，
第１のろ過工程で得られた残渣１重量部に対して，２重量部以上２０重量部以下の濃度が２０重量％〜６０重量％のアルコールを混合し，加熱還流を少なくとも１度行い第２の還流液を得る第２の加熱還流工程と，
第２の加熱還流工程で得られた第２の還流液をろ過して第２のろ液を得る第２のろ過工程と，
第１のろ液と第２のろ液とを混合し，糖度が５％以上４０％以下となるまで濃縮し第１の濃縮液を得るための第１の濃縮工程と，
第１の濃縮工程で和えられた第１の濃縮液を乾燥させ，乾燥エキスを得る乾燥工程と，
を含む，
抗肥満剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，クルミの抽出物を含む抗肥満剤に関する。本発明は，特に中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加を防止することにより，肥満を予防又は防止するための抗肥満剤に関する。この抗肥満剤は，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合を阻害するほか，シノビオリンによるＰＧＣ−１βのユビキチン化を阻害することにより，上記の作用効果を奏するものと考えられる。
【背景技術】
【０００２】
特開２００８−１８４３８３号公報（特許文献１）には，クルミ由来のポリフェノールを含む高脂血症又は脂肪肝の治療又は防止剤が開示されている。この文献には，クルミの種皮から抽出したポリフェノール成分が，高脂血症又は脂肪肝の治療に有効であることが開示されている。【０００３】
肥満とは，脂肪組織が体に過剰に蓄積した状態のことであり，糖尿病，循環器系疾患，うつ病などの様々な健康上のリスクを高める原因となる（非特許文献１参照）。この問題は，現代社会において非常に大きな経済的及び社会的損失を生じさせる。脂肪細胞代謝の分子メカニズムは広範囲に研究されている（非特許文献２及び３参照）。【０００４】
また，近年ロコモティブシンドローム（運動器症候群）に罹患する患者が増加しつつある。ロコモティブシンドロームに罹患した患者は，運動器に障害をきたすため，寝たきり状態を含め介護が必要な状態となる場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１８４３８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗｉｃｋｅｌｇｒｅｎ，  Ｉ．  (１９９８)．  Ｏｂｅｓｉｔｙ：  ｈｏｗ  ｂｉｇ  ａ  ｐｒｏｂｌｅｍ？  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，  １３６４−１３６７．
【非特許文献２】Ｌｅｆｔｅｒｏｖａ，  Ｍ．Ｉ．，  ａｎｄ  Ｌａｚａｒ，  Ｍ．Ａ．  (２００９)．  Ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０，  １０７−１１４．
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎ，  Ｅ．Ｄ．，  ａｎｄ  ＭａｃＤｏｕｇａｌｄ，  Ｏ．Ａ．  (２００６)．  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７，  ８８５−８９６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のとおり，肥満を予防又は治療するための抗肥満剤が望まれる。【０００８】
また，ロコモティブシンドロームを予防又は治療するためのロコモティブシンドロームの予防又は治療剤が望まれる。【０００９】
一方，特許文献１には，クルミの種皮から抽出した成分が，高脂血症又は脂肪肝の治療に有効であることが開示されているものの，肥満の予防又は治療に有効であることは示されていない。【００１０】
そこで，本発明は，抗肥満剤を提供することを目的とする。特に，本発明は，中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加を防止することにより，肥満を予防又は防止するための抗肥満剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題は，以下の発明により解決される。
本発明の第１の側面は，クルミの枝，殻又は葉の抽出物を有効成分として含む抗肥満剤に関する。【００１２】
クルミの枝，殻又は葉の抽出物は，クルミの枝，殻又は葉のアルコール抽出物であることが好ましく，特に好ましいものは，クルミの枝のアルコール抽出物である。【００１３】
この抗肥満剤は，中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加防止剤であることが好ましい。【００１４】
クルミの枝，殻又は葉の抽出物は，たとえば，クルミの枝，殻又は葉１重量部に対して，４重量部以上３０重量部以下の濃度が２０重量％〜６０重量％のアルコールを混合し，加熱還流を少なくとも１度行い第１の還流液を得る第１の加熱還流工程と，
第１の加熱還流工程で得られた第１の還流液をろ過して第１のろ液及び第１の残渣を得る第１のろ過工程と，
第１のろ過工程で得られた残渣１重量部に対して，２重量部以上２０重量部以下の濃度が２０重量％〜６０重量％のアルコールを混合し，加熱還流を少なくとも１度行い第２の還流液を得る第２の加熱還流工程と，
第２の加熱還流工程で得られた第２の還流液をろ過して第２のろ液を得る第２のろ過工程と，
第１のろ液と第２のろ液とを混合し，糖度が５％以上４０％以下となるまで濃縮し第１の濃縮液を得るための第１の濃縮工程と，
第１の濃縮工程で和えられた第１の濃縮液を乾燥させ，乾燥エキスを得る乾燥工程と，
を含む工程により製造された物である。【００１５】
本発明の第２の側面は，クルミの枝，殻又は葉の抽出物を有効成分として含む，ロコモティブシンドロームの予防剤又は治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１６】
実施例において実証されたとおり，クルミの抽出物（特に枝や殻の抽出物）は，中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加を有意に防止する。このことは，クルミの抽出物が抗肥満剤として有効であることを示す。【００１７】
すなわち，本発明によれば，クルミの枝，殻又は葉の抽出物を有効成分として含む抗肥満剤を提供できる。特に，本発明によれば，中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加を防止することにより，肥満を予防又は防止するための抗肥満剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は，クルミエキスの性状を示す図面に替わる写真である。
【図２】図２は，クルミ抽出物によるシノビオリンとＰＧＣ−１βとの結合阻害効果を示す試験結果であるウェスタンブロットを示す図面に替わる写真である。
【図３】図３は，インビトロユビキチン化アッセイの結果であるウェスタンブロットを示す図面に替わる写真である。
【図４】図４は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による体重変化への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図５】図５は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による食物摂取量への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図６】図６は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による体重変化への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図７】図７は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による食物摂取量への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図８】図８は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による精巣上体脂肪重量変化への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による血液成分の変化への影響（ＧＯＴ，ＧＰＴ，ＡＬＰ）を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による血液成分の変化への影響（ＴＰ，ＡＬＢ，ＢＵＮ，ＵＡ）を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による血液成分の変化への影響（ＴＣ，ＴＧ）を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による血液成分の変化への影響（Ｎａ，Ｋ，Ｃｌ，Ｃａ，Ｆｅ，Ｐ）を示す図面に替わるグラフである。
【図９Ｅ】図９Ｅは，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による血液成分の変化への影響（Ａｍｙ，ＣＰＫ，ＧＬＵ）を示す図面に替わるグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは，関節リウマチ患者由来の滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ株，Ｍ００２４株）に対するクルミ抽出物による細胞増殖への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは，関節リウマチ患者由来の滑膜細胞（Ｍ００１９株，Ｍ００２７株）に対するクルミ抽出物による細胞増殖への影響を示す図面に替わるグラフである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは，関節リウマチ患者由来の滑膜細胞 (Ｍ００２４ 株，Ｍ００１７株)に対するクルミの葉抽出物及びクルミ枝熱水抽出物による細胞増殖への影響を示す図面に替わるグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００２０】
本発明の第１の側面は，クルミの枝，殻又は葉クルミの枝，殻又は葉の抽出物を有効成分として含む抗肥満剤に関する。本発明は，特に中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加を防止することにより，肥満を予防又は防止するための抗肥満剤に関する。本発明の好ましい例は，シノビオリンとＰＧＣ−１βの結合を阻害することによる抗肥満剤や，シノビオリンによるＰＧＣ−１βのユビキチン化を阻害することによる，抗肥満剤に関する。
【００２１】
クルミ（胡桃）は，公知の樹木である。クルミの種類は特に限定されない。好ましいクルミは，オニグルミ，ヒメグルミ，シナノグルミ及びクルミ科黄杞である。クルミ科黄杞（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔｉａ  ｃｈｒｙｓｏｌｅｐｉｓ）は，中国南部の山中に自生するクルミ科の常緑高木である。
【００２２】
クルミの枝は，クルミの枝部分の樹皮，クルミの枝から樹皮をはいだ部分，及びクルミの幹の樹皮のいずれをも含む。これらのうちで，クルミの枝として好ましい部分は，クルミの枝部分の樹皮である。本発明において用いられるクルミの枝は，その太さが１ｍｍ以上１０ｃｍ以下であることが好ましい。枝の太さとは，枝の断面のうち最も直線長さが長い部分を意味する。枝の太さが，０．２ｃｍ以上３ｃｍ以下のものであってもよい。
【００２３】
クルミの枝は，生木をそのまま用いてもよいし，乾燥したものを用いてもよい。また，クルミの枝は，粉砕（細かく裁断）したものを用いてもよいし，粉状にしたものを用いてもよい。
【００２４】
クルミの枝は，一般に，タンニン，５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（ユグロン），１，４，５−トリヒドロキシナフタレン（ヒドロユグロン），ユグランジン，カロテン，イノシトール，ピロガロール，ビタミンＣ及びこれらの誘導体を含む物質を含む。
【００２５】
クルミの殻は，果肉を取り除いた種子からさらに仁を取り除いた部分である。
【００２６】
クルミの枝，殻又は葉の抽出物は，クルミの枝，殻又は葉を抽出原料として用いて，冷水，温水，熱水等の水；有機溶媒；又は水と有機溶媒の混合液を抽出溶媒として抽出することにより取得することができる。この抽出に使用される有機溶媒の例は，メタノール，エタノール，プロパノール，イソプロパノール，ブタノール等の炭素数１〜５の低級アルコール，プロピレングリコール，１，３−ブチレングリコール，アセトン，酢酸メチル，酢酸エチル，クロロホルム，トルエン，ペンタン，ヘキサン，シクロヘキサン，ヘプタン等の単独或いは２種以上の組み合わせである。抽出溶媒の好ましい例は，水，炭素数１〜５の低級アルコール，該アルコールと水の混合液，及びプロピレングリコールと水の混合液である。クルミの枝の抽出物は，クルミの枝のアルコール抽出物であることが好ましい。クルミの枝，殻又は葉をアルコールで抽出する場合，アルコールの濃度は，２０重量％以上６０重量％以下が好ましく，２５重量％以上３５重量％以下でもよい。
【００２７】
クルミの枝の抽出物の抽出方法は，特に制限されず，冷浸法，温浸法，パーコーレーション法，その他植物抽出物の製造において一般的に用いられている方法等を広く使用できる。
【００２８】
クルミの抽出物は，例えば，特許第４１６７８４９号，特許第５３１９５２２号，特表２０１２−５３３５９７号公報，特開２００５−２８９９９９号公報に開示されており，本発明は，これらの文献に開示された方法を適宜用いて，クルミの枝の抽出物を得てもよい。
【００２９】
クルミの抽出物の好ましい製造方法は，以下のとおりである。もちろん，クルミの抽出物を製造するに当たり，適宜条件を調整したり，任意の工程を追加しても構わない。
クルミの枝，殻又は葉１重量部に対して，４重量部以上３０重量部以下の濃度が２０重量％〜６０重量％のアルコールを混合し，加熱還流を少なくとも１度行い第１の還流液を得る（第１の加熱還流工程）。アルコールの濃度は，２０重量％以上６０重量％以下が好ましく，２５重量％以上３５重量％以下でもよい。クルミの枝，殻又は葉１重量部に対して，アルコール溶液の重量は，５重量部以上２０重量部以下でもよい。クルミの枝，殻又は葉は，できる限り細かく裁断等されていることが好ましい。加熱還流は，公知の還流装置を適宜用いて行うことができる。
【００３０】
第１の加熱還流工程で得られた第１の還流液をろ過して第１のろ液及び第１の残渣を得る（第１のろ過工程）。第１のろ過工程におけるろ過方法は，公知のろ過方法を適宜採用できる。
【００３１】
第１のろ過工程で得られた残渣１重量部に対して，２重量部以上２０重量部以下の濃度が２０重量％〜６０重量％のアルコールを混合し，加熱還流を少なくとも１度行い第２の還流液を得る（第２の加熱還流工程）。アルコールの濃度は，２０重量％以上６０重量％以下が好ましく，２５重量％以上３５重量％以下でもよい。クルミの枝，殻又は葉１重量部に対して，アルコール溶液の重量は，４重量部以上１５重量部以下でもよい。
【００３２】
第２の加熱還流工程で得られた第２の還流液をろ過して第２のろ液を得る（第２のろ過工程）。
【００３３】
第１のろ液と第２のろ液とを混合し，糖度が５％以上４０％以下となるまで濃縮することで第１の濃縮液を得る（第１の濃縮工程）。液体の濃縮方法は，公知である。最も簡単な濃縮方法は，混合液を加熱し，蒸発により水分量を減らす方法である。
【００３４】
第１の濃縮工程で得られた第１の濃縮液を乾燥させ，乾燥エキスを得る（乾燥工程）。乾燥方法も公知の乾燥方法を適宜採用できる。乾燥工程の例は，噴霧乾燥である。
【００３５】
本発明の抗肥満剤は，医薬であってもよいし，いわゆるサプリメント（栄養補助食品）であってもよい。また，本発明の抗肥満剤は，機能性食品や機能性食品の成分であってもよいし，例えば調味料などの食品添加物であってもよい。本発明の抗肥満剤は，対象となる部分に塗布することで，部分痩せを目指す化粧料であってもよい。
【００３６】
本発明の抗肥満剤は，中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重の増加防止剤であることが好ましい。中性脂肪量又はコレステロール量の増加防止剤は，投与されることにより血中の中性脂肪量又はコレステロール量が増加する事態を効果的に防止できる剤である。脂肪量の増加防止剤は，投与されることにより特定部位の脂肪量を減少させるか，脂肪が増加することを防止できる剤である。体重の増加防止剤は，投与されることにより対象の体重が増加することを防止できる剤である。
【００３７】
本発明は，対象（例えば，ヒト又はヒト以外の哺乳類）にクルミの枝，殻又は葉の抽出物を投与し，対象がクルミの枝，殻又は葉の抽出物を摂取することにより，対象の肥満を防止する方法をも提供する。また本発明は，同様の工程を含む，対象の中性脂肪量，コレステロール量，脂肪量又は体重が増加することを防止する方法をも提供する。
【００３８】
本発明のクルミの枝，殻又は葉の抽出物は，実施例により実証されたとおり，関節リウマチの治療にも有効である。よって，本発明は，クルミの枝，殻又は葉の抽出物を有効成分として含む，関節リウマチの治療剤又は予防剤としても有効である。また，本発明は，関節リウマチに罹患し，抗肥満剤の摂取を希望する対象に対して特に有効である。
【００３９】
関節リウマチは，ロコモティブシンドロームの一因である。ロコモティブシンドロームは，運動器自体の疾患と，加齢による運動器機能不全によるものに大別される。ロコモティブシンドロームのうち，運動器自体の疾患には，変形性関節症，骨粗しょう症，これらに伴う円背，易骨折性，変形性脊椎症，及び脊柱管狭窄症があげられる。また，関節リウマチにより，痛み、関節可動域制限、筋力低下、麻痺、骨折、及び痙性が惹き起こされ，これに伴って起こるバランス能力、体力、移動能力の低下もロコモティブシンドロームの例である。また，加齢により身体能力が衰えることによって起こる，筋力低下、持久力低下、反応時間延長、運動速度の低下、巧緻性低下、深部感覚低下、及びバランス能力低下もロコモティブシンドロームの例である。本発明のクルミの枝，殻又は葉の抽出物は，ロコモティブシンドロームの予防や治療に有効である。この有効成分は，第１の側面において説明したものを適宜採用すればよい。以下，本発明のクルミの枝，殻又は葉の抽出物を含む医薬を，本発明の剤ともよぶ。
【００４０】
本発明の剤は，生理学的に許容される担体，賦形剤，あるいは希釈剤等と混合し，医薬組成物として経口，あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては，顆粒剤，散剤，錠剤，カプセル剤，溶剤，乳剤，あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては，注射剤，点滴剤，外用薬剤，あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には，皮下注射剤，筋肉注射剤，あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には，経鼻投与剤，吸入剤（噴霧剤），あるいは軟膏剤等を示すことができる。肺線維症の予防・治療に使用する場合の剤形としては、副作用が少なく、肺特異的に作用することができる点で、吸入剤（噴霧剤）が好ましい。主成分である本発明の剤を含むように，上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００４１】
例えば，経口投与用の錠剤は，本発明の剤に賦形剤，崩壊剤，結合剤，および滑沢剤等を加えて混合し，圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には，乳糖，デンプン，あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては，炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には，アラビアゴム，カルボキシメチルセルロース，あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては，タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００４２】
また注射剤は，主成分である本発明の剤を適当な分散剤とともに溶解，分散媒に溶解，あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により，水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには，蒸留水，生理食塩水，あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では，各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき，必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には，塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に，塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００４３】
また，本発明の剤を固形，液状，あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形，あるいは液状の組成物については，先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は，適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には，水，エチルアルコール，あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には，一般にベントナイト，ポリビニルアルコール，アクリル酸，メタクリル酸，あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には，塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また，担体としてカカオ脂のような油性基材，あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより，座剤とすることもできる。
【００４４】
本発明の剤は，安全とされている投与量の範囲内において，ヒトを含む哺乳動物に対して，必要量（有効量）が投与される。本発明の剤の投与量は，剤型の種類，投与方法，患者の年齢や体重，患者の症状等を考慮して，最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。クルミの枝の抽出物の濃度や投与量は，対象の年齢や用途，投与方法に応じて適宜調整すればよい。たとえば，本発明の剤が経口投与される場合，クルミの枝の抽出物は，０．０１重量％以上１０重量％以下含まれていればよい。また，クルミの枝の抽出物は，たとえば，１回あたり１μｇ以上１０ｇ以下投与されればよい。好ましいクルミの枝の抽出物の量は，５μｇ以上５ｇ以下である。
【実施例】
【００４５】
［製造例１］
クルミエキス（クルミ殻抽出物，クルミ枝抽出物及びクルミ葉抽出物を総称してクルミエキスと呼ぶ）を以下の手順を用いて調整した。２００ｋｇのクルミ殻またはクルミ枝を，１０倍量の３０％アルコール（２０００リットル）と混合し，加熱還流による抽出操作を２時間行った。クルミ殻は，仁（食用部分）を包む堅い核の部分を用い，クルミ枝は，クルミの枝部分の樹皮及び樹皮をはいだ部分を用いた。混合液から植物残渣を除くために，３０メッシュを用いて濾し，次いで１５０メッシュで濾し，抽出液Ａを得た。メッシュ上の植物残渣を，８倍量の３０％アルコール（１６００リットル）と混合し，加熱還流により再度の抽出操作を１時間行った。反応終了後，混合液から植物残渣を除くために，３０メッシュを用いて濾し，次いで１５０メッシュで濾し，抽出液Ｂを得た。【００４６】
抽出液Ａと抽出液Ｂを合わせ，糖度（Ｂｒｉｘ値）が１０−２０％になるまで濃縮温度６０℃以下にて一次濃縮を行った。次に，得られた一時濃縮液を，糖度（Ｂｒｉｘ値）が２５−３５％になるまで濃縮温度６０℃以下にて二次濃縮を行った。得られた二次濃縮液を殺菌するために，９０℃で１時間の殺菌工程を２回行った。【００４７】
次に，殺菌した濃縮液を噴霧乾燥することで，乾燥エキスを得た。噴霧乾燥工程は，入り口温度が１４０−２３０℃，出口温度が８０−１００℃の条件で行った。得られた乾燥エキスを６０メッシュで篩過し，得られた篩過品２０ｋｇ（収率：約７％）をクルミエキスとした。【００４８】
［製造例２］
製造例１において，抽出溶媒を３０％アルコールから６０％アルコールに代えた以外は製造例１と同様にして，クルミエキスを製造した。【００４９】
［製造例３］
製造例１において，抽出溶媒を３０％アルコールから８０％アルコールに代えた以外は製造例１と同様にして，クルミエキスを製造した。【００５０】
前記製造例１及び３で製造したクルミエキスの性状を図１に示す。本クルミエキスは、図１に示すようにパウダーであり、パウダーとしては、８０％アルコールで抽出したものよりも３０％アルコールで抽出したものの方が取り扱いやすい。【００５１】
［試験例１］
クルミ抽出物によるシノビオリンとＰＧＣ−１βとの結合の阻害活性を調べるため，ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイを行った。なお，本実施例における蛋白質としては，０．４μｇのＭＢＰ−ＰＧＣ−１β−Ｈｉｓ（ＭＢＰ融合ＰＧＣ−１β），及び２μｇのＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ（膜貫通ドメインを欠失したＧＳＴ融合シノビオリン、特開２００８−７４７５３号公報参照）を用いた。０．４ μｇのＭＢＰ−ＰＧＣ−１β  Ｈｉｓと２μｇのＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭとを，バッファ（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０；１００ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，０．１％ＮＰ−４０，１ｍＭ ＤＴＴ，５％グリセロール，及びプロテアーゼ阻害剤を含む）内で１２時間結合させ，抗ＧＳＴ抗体でシノビオリンを検出した。その結果を図２に示す。図２は，クルミ抽出物によるシノビオリンとＰＧＣ−１βとの結合阻害効果を示すウェスタンブロットである。図２中，殻３０，殻６０及び殻８０は，それぞれ製造例１，製造例２及び製造例３で製造されたクルミ殻抽出物を示し，枝３０，枝６０，及び枝８０は，それぞれ製造例１，製造例２及び製造例３で製造されたクルミ枝抽出物を示し，３４９は，５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（シノビオリン阻害剤、陽性対照）を示す。【００５２】
図２から，クルミ殻抽出物，クルミ枝抽出物及びクルミ葉抽出物が，シノビオリンとＰＧＣ−１βとの結合阻害活性を有することが示された。【００５３】
［試験例２：被検物質のユビキチン化抑制］
クルミ抽出物による，シノビオリンによるＰＧＣ−１βのユビキチン化阻害活性の濃度依存性を検討するため，インビトロでのユビキチン化アッセイを行った。本実施例における蛋白質として，ＧＳＴ−β５（ＰＧＣ−１β），及びＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ΔＴＭ−Ｈｉｓを用いた。その結果を図３に示す。図３は，クルミ抽出物によるＰＧＣ−１βのユビキチン化阻害活性の濃度依存性を示すウェスタンブロットである。図３中，３４８は，５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン（シノビオリン阻害剤、陽性対照）を示す。【００５４】
図３から，クルミ殻抽出物，クルミ枝抽出物及びクルミ葉抽出物のいずれもＰＧＣ−１βのユビキチン化阻害活性が高いことがわかる。【００５５】
［試験例３：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗肥満作用の検証］
野生型マウスを用いてクルミ抽出物の投与がマウスの体重減少を誘導するか否かを検証した。滅菌ミリＱで５０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したクルミ抽出物（殻３０）およびクルミ抽出物（枝３０）を，それぞれ１ｇ／ｋｇの用量で，生後７〜８週間後の野生型マウスに経口投与し，毎日マウスの体重を測定した。隔日週３回の頻度で計２５回の投与を行った。対照区として，野生型マウスに上記と同様にして溶媒を投与した。その結果を図３に示す。図４は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による体重変化への影響を示すグラフである。図４からクルミ抽出物を投与したマウスは，対照と比較して，体重が減少していることが確認された。【００５６】
［試験例４：クルミ抽出物投与による食物摂取量への影響］
クルミ抽出物を投与したマウスにおける体重の減少が食物摂取量の減少によるものか否かを調べるため，試験例３の施行にあわせ，マウスの食物摂取量を測定した。その結果を図５に示す。図５は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による食物摂取量への影響を示すグラフである。図５から，クルミ抽出物を投与したマウスは対照と比較して，食物摂取量に差はないことが分かった。すなわち，体重の減少は食物摂取量の減少によるものではないことが示された。【００５７】
［試験例５：ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗肥満作用の検証）
野生型マウスを用いて，恒常的に高脂肪食を摂取させる条件下でのクルミ抽出物の投与がマウスの体重減少を誘導するかを検証した。
ＤＭＳＯ及びコーン油で５０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したクルミ抽出物（殻３０）およびクルミ抽出物（枝３０）を，それぞれ５０ｍｇ／ｋｇの用量で，生後７〜８週間後の野生型マウスに経口投与し，毎日マウスの体重を測定した。隔日週３回の頻度で計３１回の投与を行った。対照区として，野生型マウスに上記と同様にして溶媒を投与した。その結果を図６に示す。図６は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による体重変化への影響を示すグラフである。図６からクルミ抽出物を投与したマウスは，投与開始から１０日前後で比較例のマウスに比べて体重増加が見られるもののその後に体重差が大きくならないことから，クルミ抽出物は，油脂を接種することに対する肥満防止効果があることが示された。【００５８】
［試験例６：クルミ抽出物投与による食物摂取量への影響］
クルミ抽出物を投与したマウスにおける体重の増加と食物摂取量の関係を調べるため，試験例５を施行した際のマウスの食物摂取量を測定した。その結果を図７に示す。図７は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による食物摂取量への影響を示すグラフである。図７から，殻３０群では，対照マウスと比較して食物摂取量が変わらないことがわかる。一方，図７から，枝３０群では，対象マウスと比較すると食物摂取量が多いことがわかる。図６及び図７をあわせて考えると，枝３０群は食物摂取量が対象マウスに比べて多いにもかかわらず，体重の増加が抑制されていることがわかる。【００５９】
［試験例７：ｉｎ  ｖｉｖｏにおける精巣上体脂肪重量変化の検証）
野生型マウスを用いてクルミ抽出物の投与がマウスの精巣上体脂肪重量の減少を誘導するか否かを検証した。
試験例５と同様に，ＤＭＳＯ及びコーン油で５０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したクルミ抽出物（殻３０）およびクルミ抽出物（枝３０）を，それぞれ５０ｍｇ／ｋgの用量で，生後７〜８週間後の野生型マウスに経口投与した。隔日週３回の頻度で計３１回の投与を行った。対照区として，野生型マウスに上記と同様にして溶媒を投与した。試験開始後７１日目のマウスを解剖し，精巣上体脂肪重量を測定した。その結果を図８に示す。図８は，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による精巣上体脂肪重量変化への影響を示すグラフである。グラフは，７１日目のマウスの体重１００ｇあたりの精巣上体脂肪重量を示す。
図８からクルミ抽出物（枝３０）を投与したマウス群では，対照区として溶媒のみを投与したマウス群と比較して，精巣上体脂肪重量が減少していることが確認された。すなわち，クルミ抽出物（枝３０）には，精巣上体脂肪重量の増加を阻害する効果があることが示された。【００６０】
［試験例８：血液成分の変化の検証］
野生型マウスを用いてクルミ抽出物の投与がマウスの血液成分の変化を誘導するか否かを検証した。
具体的には，試験例７の施行の際に，試験開始後７１日目のマウスより採血し，血清中の成分（ＧＯＴ，ＡＬＰ，ＧＰＴ，ＴＰ，ＢＵＮ，ＡＬＢ，ＵＡ，ＴＣ，ＴＧ，Nａ，Ｃａ，Ｋ，Ｆｅ，Ｃｌ，Ｐ，Ａｍｙ，ＧＬＵ，ＣＰＫ）の濃度を調べた。その結果を図９Ａ〜図９Ｄに示す。図９Ａ〜図９Ｄは，野生型マウスにおけるクルミ抽出物による血液成分の変化への影響を示す図面に替わるグラフである。図９Ａは，血中のＧＯＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ），ＧＰＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ），及びＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）量を示す。図９Ｂは，血中のＴＰ（総タンパク），ＡＬＢ（アルブミン），ＢＵＮ（尿素窒素），ＵＡ（尿酸）量を示す。図９Ｃは，血中のＴＣ（総コレステロール値），及びＴＧ（中性脂肪量：トリグリセリド量）を示す。図９Ｄは，血中のＮａ，Ｋ，Ｃｌ，Ｃａ，Ｆｅ，及びＰ量を示す。図９Ｅは，血中のＡｍｙ（アミラーゼ），ＣＰＫ（クレアチンホスフォキナーゼ），及びＧＬＵ（グルコース）量を示す。【００６１】
図９Ｃから，特に枝３０群では，総コレステロール値や中性脂肪量が軽減したことが示された。これは，枝３０群の食物摂取量が対照に比べて多いことを考えると，枝３０が総コレステロール値や中性脂肪量を軽減する効能があることを示す。【００６２】
［比較例１］
上記と同様に複数種類の濃度のアルコールを用いて，クルミの果実及びクルミの種皮の抽出物を得た。クルミの果実の抽出物及びクルミの種皮の抽出物を用いた以外は，試験例５から試験例８と同様に実験を行った。この結果，クルミの果実の抽出物及びクルミの種皮の抽出物に比べてクルミの枝の抽出物は，総コレステロール値，中性脂肪量，脂肪量及び体重の増加に関して顕著な効果があることわかった。【００６３】
［試験例９：クルミ抽出物の滑膜細胞の増殖抑制効果］
関節リウマチ患者由来の滑膜細胞の増殖に対する効果を次の方法により検討した。滑膜細胞を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０３／ｗｅｌｌで播種し、６〜２４時間後に２０μｇ／ｍｌになるようクルミ抽出液もしくはＤＭＳＯを添加した。４日後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  （Ｄｏｊｉｎｄｏ） を用いて細胞の増殖を測定した。結果を図１０Ａ〜図１０Ｃに示す。縦軸は、ＤＭＳＯを添加した滑膜細胞の増殖を１とした場合における相対値を示している。図からクルミ抽出物は滑膜細胞の増殖をコントロールと比較して６０〜８０％に抑制したことが分かった。さらに滑膜細胞に３、１０、３０，及び１００μｇ／ｍｌのクルミ抽出物を添加し濃度依存性を検討した。図１０Ａ〜図１０Ｃに示すように、クルミ抽出液は濃度依存的に滑膜細胞増殖を抑制することが示された。【００６４】
［試験例１０：クルミ抽出物の関節リウマチへの治療効果］
Ｋｕｚｕｎａらの方法［ケミカル アンド ファーマシューティカル ブリタン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．），２３，１１８４−１１９１（１９７５）］を参考に、アジュバント関節炎ラットを用いて，クルミ抽出物の関節リウマチの治療効果を検討する。アジュバントとしてはディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍの乾燥死菌を流動パラフィンに１％の濃度で懸濁したものを用いる。そして，雄性フィッシャーラットの右後肢足蹠皮下に５０μｌのアジュバンドを注入することによって関節炎を惹起する。３週間後、アジュバントを注入していない左後肢（非炎症足）を５回伸展させ、５回啼鳴反応を示すラットのみをその後の試験に使用する。様々なアルコール濃度で抽出したクルミ抽出物（枝又は殻の抽出物）を，経口投与，局所への注射による投与を行う。その結果，クルミ抽出液が，関節リウマチへの治療効果があることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は医薬産業，食品産業，及び化粧品製造業において利用されうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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