(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、
免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、
前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含み；並びに
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、
抗体。
【請求項２】
百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、
免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、
前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；並びに
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む、
抗体。
【請求項３】
抗体は、３ｎＭ以下のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
抗体は、１２ｎＭ以下のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項の免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項７】
１つ又は複数の請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１又は３に記載のヒト化１Ｂ７抗体及び請求項２又は４に記載のヒト化１１Ｅ６抗体を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、又はリポソームとして製剤化される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口、鼻腔内、肺、皮内、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内送達のために処方される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
百日咳菌に感染した患者を治療するための、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１又は３に記載のヒト化１Ｂ７抗体の有効量及び請求項２又は４に記載のヒト化１１Ｅ６抗体の有効量を含み、前記ヒト化１Ｂ７抗体と前記ヒト化１１Ｅ６抗体とが百日咳菌に感染した患者に共投与される、百日咳菌に感染した患者を治療するための医薬組成物。
【請求項１３】
ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体が、患者に同時に投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ヒト化１Ｂ７抗体が、ヒト化１１Ｅ６抗体を患者に投与する前に、前記患者に投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ヒト化１Ｂ７抗体が、ヒト化１１Ｅ６抗体を患者に投与した後に、前記患者に投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月３１日に出願された米国仮出願第６１／９７３，１４１号及び２０１４年９月５日に出願された米国仮出願第６２／０４６，４０３号の利益を主張するものであり、それらのそれぞれの内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩファイルとして提出された「配列表」、表、又はコンピュータープログラムリスト別表の参照。
２０１５年３月３１日に、２６，４５２バイト、マシンフォーマットＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ  Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムで作成された、ファイルＴ９３３３−５２２００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ＴＸＴに書かれた配列リストは、参照により本明細書に組込まれる。
【０００３】
本発明は、部分的に、百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化抗体及び治療薬としてのその使用に関する。具体的には、本発明は、部分的に、百日咳毒素タンパク質と結合するマウス抗体１Ｂ７及び１１Ｅ６に由来するヒト化抗体に関する。
【背景技術】
【０００４】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））は、上気道に感染して制御不能な激しい咳を引起すグラム陰性細菌である。世界保健機関によると、百日咳菌菌感染症は、主に若いワクチン未接種の幼児の中で、毎年世界中で推定３００，０００人の死亡の原因となっている。百日咳の幼児は、小児集中治療室での入院を必要とすることが多く、その治療は頻繁に機械的な換気を伴う。成人の百日咳は一般的に「１００日の咳」と呼ばれる慢性の咳を引起す。百日咳の発生率は、ワクチン未接種及びまだ完全にワクチン接種されていない幼児を含むワクチン接種下の個人、その免疫が時間の経過とともに弱まった個人、並びに無症状保菌者の暴露によって増加している。
【０００５】
米全国の最近のニュースレポートは、１９９０年代に導入された百日咳ワクチンは、長期的な保護を提供しないことを示している。百日咳のための承認された治療法はない。抗生物質の治療は、その治療は気道から百日咳菌菌を排除することができるが、百日咳毒素タンパク質を中和しないので、百日咳の進行に大きな影響を有さない。従って、百日咳に対してより効果的な治療法が必要とされている。
【０００６】
さらに、発展途上国では、既存の百日咳ワクチン（欠陥があるが）の入手は、一貫性がなく、困難であることが多い。
【０００７】
天然に存在する抗体は、４つのポリペプチド鎖を含有する多量体タンパク質である。ポリペプチド鎖の２つは重鎖（Ｈ鎖）と呼ばれ、ポリペプチド鎖の２つは軽鎖（Ｌ鎖）と呼ばれる。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。免疫グロブリン重鎖は鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。軽鎖は１つの可変領域（ＶＬ）と１つの定常領域（ＣＬ）からなる。重鎖は１つ可変領域（ＶＨ）と少なくとも３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。可変領域は抗体の特異性を決定する。各可変領域は、４つの相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）によって隣接された相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる３つの超可変領域を備える。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲは、抗体の結合特異性に寄与する。天然に存在する抗体は、ヒト化抗体などの、改変抗体のための出発材料として使用されてきた。
【０００８】
百日咳毒素タンパク質と結合する抗体が開発されているが、患者におけるこれらの抗体の有効性は最小限か又は不明のいずれかである。治療薬として使用されるためには、有効性の増大及び副作用の減少を備えた、百日咳毒素タンパク質に対する改良された抗体の必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
従って、様々な態様において、本発明は、百日咳毒素タンパク質と結合し、及び／又はそれを中和する１つ又は複数のヒト化抗体、並びに百日咳の治療又は予防におけるその使用に関する。
【００１０】
一態様では、本発明は百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体に関する。ヒト化１Ｂ７抗体は免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。様々な実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、を含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体に関する。ヒト化１１Ｅ６抗体は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、並びに配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、を含む。
【００１２】
様々な実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体は改善された特性を示す。一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、約３ｎＭ、又は約２ｎＭ、又は約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭ未満のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する。別の実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、約１２ｎＭ、又は約１０ｎＭ、又は約８ｎＭ、又は約６ｎＭ、約４ｎＭ、又は約２ｎＭ、又は約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭ未満のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する。
【００１３】
様々な実施形態では、本発明は、ヒト化１Ｂ７及び１１Ｅ６抗体を製造するための核酸、発現ベクター、宿主細胞、並びに方法も提供する。本発明は、ヒト化１Ｂ７及び／又は１１Ｅ６抗体を含む医薬組成物も提供する。
【００１４】
一態様では、本発明の方法は、患者にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又はその抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を投与することを含む、百日咳菌を有する患者を治療することを含む。一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体は、患者に共投与されて相乗効果を生み出す。別の実施形態では、本方法は、抗菌剤と一緒に、ヒト化１Ｂ７抗体及び／又はヒト化１１Ｅ６抗体を患者に投与することを含む。さらなる実施形態では、本発明の方法は、対象にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又はその抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を投与することによって、対象の百日咳菌感染を予防することに関する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、まだワクチン接種されていない乳児を含む患者にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又はその抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を予防的に投与することにより、百日咳の発症を防止することを含む。
【００１６】
一実施形態では、本発明の方法は、患者の白血球数を低減することを含む。別の実施形態では、本発明の方法は、患者の咳の持続時間及び／又は頻度を低減すること含む。さらなる実施形態では、本発明の方法は、患者の鼻咽頭及び肺における百日咳菌のレベルを低減することを含む。別の実施形態では、本発明の方法は百日咳毒素タンパク質を中和する。
【００１７】
別の態様では、本発明の方法は、患者にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又はその抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を投与することを含む、パラ百日咳菌を有する患者を治療することを含む。別の態様では、本発明の方法は、対象にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又はその抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を投与することによって、対象のパラ百日咳菌感染を防止することに関する。
【００１８】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】還元及び非還元条件下でのヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図３】還元及び非還元条件下でのヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す。
【図４】ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図５】左から右へ、ヒト化ｈｕ１Ｂ７Ａ抗体（３番目の線）、ｈｕ１１Ｅ６Ａ（最初の線）、及び２つの抗体の混合物（２番目の線）のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。結果はｍＬ対ｍＡｕで測定され、すべての線は予想分子量（ＭＷ、垂直黒線）との比較である。
【図６Ａ−６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体、マウスｍ１１Ｅ６抗体、及びマウスｍ１Ｂ７抗体の、温度（℃）対蛍光としてプロットされた熱変性を示す。図６Ａは、ｈｕ１１Ｅ６抗体（ｈｕ１１Ｅ６−１５ｘ）の熱変性を示す。一番上の線は、１０ｕＭのｈｕ１１Ｅ６−１５ｘに対応し、２番目の線は２０ｕＭのｈｕ１１Ｅ６−１５ｘに対応し、下から２番目の線は５ｕＭのｈｕ１１Ｅ６−１５ｘに対応し、及び一番下の線は、ＰＢＳに対応する。図６Ｂは、ｈｕ１Ｂ７抗体の熱変性を示す。一番上の線は、２０ｕＭのｈｕ１Ｂ７に対応し、２番目の線は１０ｕＭのｈｕ１Ｂ７に対応し、下から２番目の線は５ｕＭのｈｕ１Ｂ７に対応し、及び一番下の線はＰＢＳに対応する。図６Ｃはｍ１１Ｅ６抗体の熱変性を示す。一番上の線は３ｕＭのｍ１１Ｅ６に対応し、２番目の線は１．５ｕＭのｍ１１Ｅ６に対応し、下から２番目の線は０．７５ｕＭのｍ１１Ｅ６に対応し、及び一番下の線はＰＢＳに対応する。図６Ｄは、ｍ１Ｂ７抗体の熱変性を示す。一番上の線は３ｕＭのｍ１Ｂ７に対応し、２番目の線は１．５ｕＭのｍ１Ｂ７に対応し、下から２番目の線は０．７５ｕＭのｍ１Ｂ７に対応し、及び一番下の線はＰＢＳに対応する。
【図７】ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体対マウスｍ１Ｂ７及びｍ１１Ｅ６抗体のＰＴｘ結合親和性を比較した百日咳毒素（ＰＴｘ）ＥＬＩＳＡアッセイ結果を示す。結果は、抗体濃度（ｎＭ）対正規化吸光度として示されている。
【図８】２つの異なる実験室で製造されたヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体のＰＴｘ結合親和性を決定する競合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。結果はＰＴｘ濃度対吸光度として示されている。
【図９】ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の百日咳毒素タンパク質を中和する能力を測定するＣＨＯ細胞インビトロ保護アッセイの結果を示す。モル比（モルｍＡｂ／モルＰＴｘ）で示された結果。
【図１０】ＰＴｘ毒素ＥＬＩＳＡアッセイの結果をヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の混合物のＥＣ５０（μｇ／ｍＬ）の値とともに示す。抗体を混合し、４℃で１分、１時間、及び２２時間保存した。結果は、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）対正規化吸光度として示されている。
【図１１】ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体、並びにヒト化ｈｕ１Ｂ７及びヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体の混合物の排出（β）半減期（Ｔ１／２β）を示す。すべての半減期は、マウスで決定された。
【図１２】ヒト化ｈｕ１Ｂ７Ａ抗体の活性に対する熱処理の効果を決定するＰＴｘ毒素ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。具体的には、５０μｇ／ｍＬの抗体をＰＢＳ中で氷上で、５０℃で、又は７０℃で３０分間インキュベートし、１分間、氷上でクエンチした。結果は、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）対吸光度として測定される。
【図１３】ヒト化ｈｕ１１Ｅ６Ａ抗体の活性に対する熱処理の効果を決定するＰＴｘ毒素ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。具体的には、５０μｇ／ｍＬの抗体をＰＢＳ中で氷上で、５０℃で、又は７０℃で３０分間インキュベートし、１分間、氷上でクエンチした。結果は、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）対吸光度として測定される。
【図１４】ヒト化ｈｕ１Ｂ７Ａ 抗体、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６Ａ 抗体及びそれら２つの混合物のＰＴｘ毒素ＥＬＩＳＡアッセイの結果をＥＣ５０（μｇ／ｍＬ）の値とともに示す。結果は、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）対正規化吸光度として示されている。
【図１５】百日咳菌菌のＤ４２０株に感染したマウスの処置におけるヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体の有効性（重量増加％によって測定される）を示す。マウスを、ＰＢＳ、Ｐ−ＩＶＩＧ、マウスｍ１Ｂ７抗体、ｃｈ１Ｂ７抗体、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体、マウスｍ１１Ｅ６抗体、ｃｈ１１Ｅ６抗体、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体、又はヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の混合物のいずれかで処置し、それらの体重を、感染後１０日目に測定した。未感染ナイーブマウスを、ベースライン対照とした。
【図１６Ａ−１６Ｂ】百日咳菌のＤ４２０株に感染したマウスの処置におけるヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体の有効性（５０μＬの血液あたりの白血球数によって測定される）を示す。マウスを、ＰＢＳ、Ｐ−ＩＶＩＧ、マウスｍ１Ｂ７抗体、ｃｈ１Ｂ７抗体、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体、マウスｍ１１Ｅ６抗体、ｃｈ１１Ｅ６抗体、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体、又はヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の混合物のいずれかで処置し、それらの血液の白血球数を、感染後３日目及び１０日目に評価した。未感染ナイーブマウスを、ベースライン対照とした。
【図１７】百日咳菌によるマウスの肺のコロニー形成の低減におけるヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体の有効性を示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ及び１８Ｂは、百日咳菌に感染したヒヒに対するヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体の混合物の処置効果を示す。具体的には、白血球数と咳数を評価した。
【図１９】ヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体で処置した百日咳菌に感染したヒヒの肺からの病理切片を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａ及び２０Ｂは、百日咳菌に感染したヒヒに対するヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体の混合物の処置効果を示す。具体的には、白血球数及び鼻洗浄液の細菌数を評価した。
【図２１Ａ−２１Ｂ】図２１Ａ及び２１Ｂは、それぞれ、２匹の百日咳菌に感染したヒヒ（すなわち、ヒヒ１２９１３番及び１５９１３番）におけるヒト化１１Ｅ６及び１Ｂ７抗体の抗体血清濃度と抗体半減期を示す。図２１ＡのＹ軸上に示されるタイミングは、図２０Ａ及び図２０Ｂに示されているものと同様である（すなわち時間＝０で感染、３日目で処置）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、改善された生物学的活性を呈するヒト化１Ｂ７及び１１Ｅ６抗体の発見に、一部基づいている。百日咳毒素タンパク質に対するこれらの抗体の結合及び／又は中和活性のために、それらは百日咳菌に感染した患者を治療するのに有用である。開示される抗体は、患者における最小限の副作用をもたらしつつ、高い特異性で百日咳毒素タンパク質を標的とするように操作されている。さらに、開示された抗体は、安定性の増加と長いインビボ半減期を示す。本発明の様々な特長及び態様は、以下でより詳細に考察される。
【００２１】
本明細書で使用される場合、別様に示されない限り、「抗体」という用語は、改変され、操作され、もしくは化学的にコンジュゲートされているか、又はヒト抗体である無傷の抗体又は抗原結合断片を含む、無傷の抗体（例えば、無傷のモノクローナル抗体）又は抗体の抗原結合断片（例えば、モノクローナル抗体の抗原結合断片）を意味する。改変又は操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性）である。抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニボディ及び二重特異性抗体が含まれる。毒素部分にコンジュゲートした抗体は、化学的にコンジュゲートした抗体の例である。
【００２２】
百日咳毒素タンパク質と結合する抗体
一態様では、本発明は、百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体に関する。様々な実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト抗体への類似性を高めるように改変された非ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト、例えばマウス、の抗体（ラット、ハムスター又は他の非ヒト種でもあり得る「ドナー抗体」）由来の少なくとも１つのＣＤＲ（又はその機能的断片）が、ヒト抗体（「アクセプター抗体」）上にグラフトされている、遺伝的に、操作された抗体である。いくつかの実施形態では、複数のマウスＣＤＲがグラフトされている（例えば、全ての６つマウスＣＤＲがグラフトされている）。アクセプター体抗体の配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列（又はその断片）、ヒト抗体配列のコンセンサス配列（又はその断片）、又は生殖系列領域配列（又はその断片）であることができる。従って、いくつかの実施形態では、ヒト化抗体はドナー抗体由来の１つ又は複数のＣＤＲ及び可変領域フレームワーク（ＦＲ）を有する抗体であり得る。ＦＲは、ヒト抗体内で定常領域の一部を形成し得る。
【００２３】
さらに、高い結合親和性を保持するために、ヒトアクセプター配列中のアミノ酸は、例えば：（１）アミノ酸がＣＤＲ内にある場合；（２）アミノ酸が、ヒトフレームワーク領域内にある場合（例えば、アミノ酸がＣＤＲの１つに直接隣接している場合）、ドナー配列由来の対応するアミノ酸で置き換えることができる。参照により本明細書に組込まれる、ヒト化抗体の構築のための詳細な手順を提供する米国特許第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号参照。実際、例えば、ヒトフレームワーク領域における残基のこの選択は、ヒト化抗体の望ましさに対して重要であることが多い。ヒト化抗体は、マウス抗体由来のすべての６つのＣＤＲ（例えば、Ｋａｂａｔによって定義されるが、Ｃｈｏｔｈｉａによって定義される超可変ループＨ１を含むことも多い）を組込むことが多いが、それらは、より少ないマウスＣＤＲ及び／又は完全なマウスＣＤＲ配列より少ないもの（例えばＣＤＲの機能的断片）を用いても製造され得る。
【００２４】
様々な実施形態では、ヒト化軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域（例えば、ヒトカッパ又はラムダ軽鎖）に融合される。様々な実施形態では、ヒト化重鎖可変領域は、それぞれの様々なアロタイプ及びアイソタイプを含む重鎖定常領域に融合される。例えば、重鎖定常領域は、任意の免疫グロブリンタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ）から誘導され得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧが使用される。ＩｇＧについては、定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４からもたらされ得る。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１が使用される。さらに、選択することができるそれぞれのＩｇＧの多くのアイソタイプが存在し、いくつかは天然に存在し、いくつかは、天然に存在するアイソタイプの誘導体である。選択されるＩｇＧのタイプは、抗体のエフェクター機能（例えばオプソニン食作用、補体結合、など）を決定するであろう。
【００２５】
一態様では、本発明は、百日咳毒素タンパク質と結合し、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むヒト化１Ｂ７抗体に関する。免疫グロブリン重鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
【化１】
0006588922.tif 000002
免疫グロブリン軽鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
【化２】
0006588922.tif 000003
【００２６】
開示される１Ｂ７重鎖の任意の１つを、開示される１Ｂ７軽鎖の任意のものと対にすることができる。例示として、以下の対を、本発明の組成物及び方法の抗体に組込むことができる：配列番号１／配列番号７；配列番号１／配列番号８；配列番号１／配列番号９；配列番号１／配列番号１０；配列番号１／配列番号１１；配列番号１／配列番号１２；配列番号２／配列番号７；配列番号２／配列番号８；配列番号２／配列番号９；配列番号２／配列番号１０；配列番号２／配列番号１１；配列番号２／配列番号１２；配列番号３／配列番号７；配列番号３／配列番号８；配列番号３／配列番号９；配列番号３／配列番号１０；配列番号３／配列番号１１；配列番号３／配列番号１２；配列番号４／配列番号７；配列番号４／配列番号８；配列番号４／配列番号９；配列番号４／配列番号１０；配列番号４／配列番号１１；配列番号４／配列番号１２；配列番号５／配列番号７；配列番号５／配列番号８；配列番号５／配列番号９；配列番号５／配列番号１０；配列番号５／配列番号１１；配列番号５／配列番号１２；配列番号６／配列番号７；配列番号６／配列番号８；配列番号６／配列番号９；配列番号６／配列番号１０；配列番号６／配列番号１１；及び配列番号６／配列番号１２。
【００２７】
一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００２９】
一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３０】
一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３１】
一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３２】
他の実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、全可変領域、相補性決定領域、又はフレームワーク領域の配列の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６に、少なくとも約５０％の同一性、約５１％の同一性、約５２％の同一性、約５３％の同一性、約５４％の同一性、約５５％の同一性、約５６％の同一性、約５７％の同一性、約５８％の同一性、約５９％の同一性、約６０％の同一性、約６１％の同一性、約６２％の同一性、約６３％の同一性、約６４％の同一性、約６５％の同一性、約６６％の同一性、約６７％の同一性、約６８％の同一性、約６９％の同一性、約７０％の同一性、約７１％の同一性、約７２％の同一性、約７３％の同一性、約７４％の同一性、約７５％の同一性、約７６％の同一性、約７７％の同一性、約７８％の同一性、約７９％の同一性、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８４％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約８９％の同一性、又は約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
【００３３】
他の実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、全可変領域、相補性決定領域、又はフレームワーク領域の配列の配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、もしくは配列番号１２に、少なくとも約５０％の同一性、約５１％の同一性、約５２％の同一性、約５３％の同一性、約５４％の同一性、約５５％の同一性、約５６％の同一性、約５７％の同一性、約５８％の同一性、約５９％の同一性、約６０％の同一性、約６１％の同一性、約６２％の同一性、約６３％の同一性、約６４％の同一性、約６５％の同一性、約６６％の同一性、約６７％の同一性、約６８％の同一性、約６９％の同一性、約７０％の同一性、約７１％の同一性、約７２％の同一性、約７３％の同一性、約７４％の同一性、約７５％の同一性、約７６％の同一性、約７７％の同一性、約７８％の同一性、約７９％の同一性、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８４％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約８９％の同一性、又は約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３４】
一態様では、本発明は、百日咳毒素タンパク質と結合し、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むヒト化１１Ｅ６抗体に関する。免疫グロブリン重鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
【化３】
0006588922.tif 000004
免疫グロブリン軽鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
【化４】
0006588922.tif 000005
【００３５】
開示された１１Ｅ６重鎖の任意の１つを、開示された１１Ｅ６軽鎖の任意のものと対にすることができる。例示により、以下の対を、本発明の組成物及び方法の抗体に組込むことができる：配列番号１３／配列番号１９；配列番号１３／配列番号２０；配列番号１３／配列番号２１；配列番号１３／配列番号２２；配列番号１３／配列番号２３；配列番号１３／配列番号２４；配列番号１４／配列番号１９；配列番号１４／配列番号２０；配列番号１４／配列番号２１；配列番号１４／配列番号２２；配列番号１４／配列番号２３；配列番号１４／配列番号２４；配列番号１５／配列番号１９；配列番号１５／配列番号２０；配列番号１５／配列番号２１；配列番号１５／配列番号２２；配列番号１５／配列番号２３；配列番号１５／配列番号２４；配列番号１６／配列番号１９；配列番号１６／配列番号２０；配列番号１６／配列番号２１；配列番号１６／配列番号２２；配列番号１６／配列番号２３；配列番号１６／配列番号２４；配列番号１７／配列番号１９；配列番号１７／配列番号２０；配列番号１７／配列番号２１；配列番号１７／配列番号２２；配列番号１７／配列番号２３；配列番号１７／配列番号２４；配列番号１８／配列番号１９；配列番号１８／配列番号２０；配列番号１８／配列番号２１；配列番号１８／配列番号２２；配列番号１８／配列番号２３；及び配列番号１８／配列番号２４。
【００３６】
一実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３７】
一実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３８】
一実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００３９】
一実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００４０】
一実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００４１】
他の実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、全体可変領域、相補性決定領域、又はフレームワーク領域の配列の配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、もしくは配列番号１８に、少なくとも約５０％の同一性、約５１％の同一性、約５２％の同一性、約５３％の同一性、約５４％の同一性、約５５％の同一性、約５６％の同一性、約５７％の同一性、約５８％の同一性、約５９％の同一性、約６０％の同一性、約６１％の同一性、約６２％の同一性、約６３％の同一性、約６４％の同一性、約６５％の同一性、約６６％の同一性、約６７％の同一性、約６８％の同一性、約６９％の同一性、約７０％の同一性、約７１％の同一性、約７２％の同一性、約７３％の同一性、約７４％の同一性、約７５％の同一性、約７６％の同一性、約７７％の同一性、約７８％の同一性、約７９％の同一性、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８４％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約８９％の同一性、又は約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
【００４２】
他の実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は、全体可変領域、相補性決定領域、又はフレームワーク領域の配列の配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に、少なくとも約５０％の同一性、約５１％の同一性、約５２％の同一性、約５３％の同一性、約５４％の同一性、約５５％の同一性、約５６％の同一性、約５７％の同一性、約５８％の同一性、約５９％の同一性、約６０％の同一性、約６１％の同一性、約６２％の同一性、約６３％の同一性、約６４％の同一性、約６５％の同一性、約６６％の同一性、約６７％の同一性、約６８％の同一性、約６９％の同一性、約７０％の同一性、約７１％の同一性、約７２％の同一性、約７３％の同一性、約７４％の同一性、約７５％の同一性、約７６％の同一性、約７７％の同一性、約７８％の同一性、約７９％の同一性、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８４％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約８９％の同一性、又は約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
【００４３】
相同性又は同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの市販のコンピューターソフトウエアを使用して、当業者の技能の範囲内にある、様々な方法で決定することができる。プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．ＭＯＬ．ＥＶＯＬ．３６，２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．２５，３３８９−３４０２、参照により組込まれている）によって使用されるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）は、配列類似性検索用に調整される。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチは、最初にクエリ配列とデータベース配列の間の類似のセグメントを検討し、次いで、特定された全ての一致の統計的有意性を評価し、最終的に予め選択された閾値の有意性を満す一致のみを要約することである。配列データベースの類似性検索における基本的問題の議論については、参照により完全に組込まれているＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ６，１１９−１２９参照。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。ヒストグラム（ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）、記述（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）、アラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、期待値（ｅｘｐｅｃｔ）（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性閾値）、カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）、マトリクス（ｍａｔｒｉｘ）及びフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）の検索パラメーターは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９、参照により完全に組込まれている）。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは以下のように調整され得る：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ってすべてのｗｉｎｋ．ｓｕｐ．ｔｈ位置に単語ヒットを生成）；及びｇａｐｗ＝１６（ギャップアライメントが生成されているウィンドウ幅を設定）。等価のＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；及びｇａｐｗ＝３２であってもよい。検索はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＡＳＴ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｐｔｉｏｎパラメーターを使用しても行うことができる（例えば：−Ｇ、ギャップをオープンするコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドに対して５／タンパク質に対して１１；−Ｅ、ギャップを拡張するコスト［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドに対して２／タンパク質に対して１；−ｑ、ヌクレオチド不一致に対するペナルティー［整数］：デフォルト＝−３；−ｒ、ヌクレオチド一致に対する報酬［整数］：デフォルト＝１；−ｅ、ｅｘｐｅｃｔ値［実数］：デフォルト＝１０；−Ｗ、ワードサイズ［整数］：デフォルト＝ヌクレオチドに対して１１／ｍｅｇａｂｌａｓｔに対して２８／タンパク質に対して３；−ｙ、ｂｌａｓｔ拡張のためのビットのＤｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）：デフォルト＝ｂｌａｓｔｎに対して２０／他に対して７；−Ｘ、ギャップアラインメント用のＸｄｒｏｐｏｆｆ値（ビット）：デフォルト＝すべてのプログラム  に対して１５、ｂｌａｓｔｎには適用されない：及び、−Ｚ、（ビット単位）ギャップアラインメントの最終Ｘｄｒｏｐｏｆｆ値（ビット）：ｂｌａｓｔｎに対して５０、他に対して２５）。ペアワイズのタンパク質アラインメントのためのＣｌｕｓｔａｌＷも使用することができる（デフォルトパラメータとしては、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス及びギャップオープニングペナルティー＝１０及びギャップ拡張ペナルティー＝０．１を含み得る）。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティー）及びＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティー）を使用し、タンパク質比較における等価の設定はＧＡＰ＝８及びＬＥＮ＝２である。
【００４４】
上記の実施形態のそれぞれでは、免疫グロブリンの重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列は、配列番号１〜２４に対してアミノ酸の改変（例えば、アミノ酸置換、欠失、又は挿入）を含み得ることが、本明細書において企図されている。例えば、免疫グロブリンの重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列は、配列番号１〜２４に対して置換、欠失、又は挿入から独立して選択される約１〜約５０の変異、約１〜約４０の変異、約１〜約３５の変異、約１〜約３０の変異、約１〜約２５の変異、約１〜約２０の変異、約１〜約１５の変異、約１〜約１０の変異、を含み得る。様々な実施形態では、免疫グロブリンの重鎖可変領域配列及び／又は軽鎖可変領域配列は、配列番号１〜２４に対して、約１の変異、約２の変異、約３の変異、約４の変異、約５の変異、約６の変異、約７の変異、約８の変異、約９の変異、約１０の変異、約１１の変異、約１２の変異、約１３の変異、約１４の変異、約１５の変異、約１６の変異、約１７の変異、約１８の変異、約１９の変異、約２０の変異、約２１の変異、約２２の変異、約２３の変異、約２４の変異、約２５の変異、約２６の変異、約２７の変異、約２８の変異、約２９の変異、約３０の変異、約３１の変異、約３２の変異、役３３変異、約３４の変異、約３５の変異、約３６の変異、約３７の変異、約３８の変異、約３９の変異、約４０の変異、約４１の変異、約４２の変異、約４３の変異、約４４の変異、約４５の変異、約４６の変異、約４７の変異、約４８の変異、約４９の変異、又は約５０の変異、を有する。組込まれ得る例示的なアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択される極性の及び正に荷電した親水性残基、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される極性の及び中性の荷電親水性残基、アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）から選択される極性の及び負に荷電した親水性残基、又は、ヒスチジン（Ｈ）を含む芳香族の、極性の及び正に帯電した親水性の残基、を含み得る親水性アミノ酸残基；グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）もしくはバリン（Ｖ）から選択される疎水性、脂肪族アミノ酸、又はフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、もしくはチロシン（Ｙ）から選択される疎水性、芳香族アミノ酸、を含み得る疎水性アミノ酸残基、を含む。
【００４５】
特定のエピトープと結合する抗体の能力は、平衡解離定数（ＫＤ）によって記述することができる。ある特定の実施形態では、本発明は、約２０ｎｍ以下、又は約１５ｎＭ以下、又は約１０ｎＭ以下、又は約５ｎＭ以下のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体を提供する。一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、約５ｎｍ以下、又は約３ｎｍ以下のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する。例示的な実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、１．５ｎＭ程度、約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭのＫＤで、百日咳毒素タンパク質と結合する。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本発明は、約２０、約１９、又は約１８、又は約１７、又は約１６、又は約１５ｎＭ以下のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体を提供する。一実施形態では、ヒト化１１Ｅ６抗体は１２ｎＭ以下のＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する。例示的な実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体は、約１５ｎｍ、約１４．５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３．５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１．５ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約９．５ｎＭ、約９ｎＭ、約８．５ｎＭ、約８ｎＭ、約７．５ｎＭ、約７ｎｍ、約６．５ｎＭ、約６ｎｍ、約５．５ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎｍ、約２．５ｎＭ、約２ｎｍ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭのＫＤで百日咳毒素タンパク質と結合する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体は、百日咳毒素タンパク質と結合することができる抗体と競合する。ヒト化抗体が百日咳毒素タンパク質と結合することについて抗体（競合抗体）と競合する場合、本発明のヒト化抗体は、競合抗体の結合を測定可能な程度に（完全に又は部分的に）阻害する。結合の阻害は、当該技術分野で公知の任意の方法によって測定され得る。一般に、抗原に対する競合抗体の結合が、ヒト化抗体の存在下で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％だけ減少している場合、ヒト化抗体は競合抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる（例えば、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５８（１０）：３３６９−３３７４によって記載されているマウス１Ｂ７もしくは１１Ｅ６抗体又はＭａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許Ｎｏ．８，６５３，２４３によって記載されているヒト化１Ｂ７抗体、これらは参照によりその全体が本明細書に組込まれる）。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５８（１０）：３３６９−３３７４によって記載されているマウス１Ｂ７又は１１Ｅ６抗体と競合的に百日咳毒素タンパク質と結合する。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、マウス１Ｂ７又は１１Ｅ６抗体の結合を（完全に又は部分的に）阻害する。いくつかのさらなる実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約１００％だけ競合アッセイにおける、マウス１Ｂ７又は１１Ｅ６抗体の結合を減少させる。
【００４８】
実施例に示される実施形態は、１つは重鎖から及び１つは軽鎖からの、可変領域の対、完全長抗体鎖の対、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域の対を含むが、当業者は、代替的な実施形態は、単一の重鎖可変領域又は単一の軽鎖可変領域、単一の完全長抗体鎖、又は重鎖又は軽鎖のいずれかの１つの抗体鎖からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域を含み得ることを認識するであろう。
【００４９】
抗体の産生
本発明の抗体を産生するための方法が、本明細書に記載される。例えば、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ分子は、本明細書に提供される配列情報を使用して化学的に合成することができる。合成ＤＮＡ分子は、所望の抗体をコードする遺伝子発現構築物を生成するために、例えば、定常領域コード配列、及び発現制御配列を含む、他の適切なヌクレオチド配列、に連結することができる。あるいは、本明細書で提供される配列は、合成核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション技術又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によりハイブリドーマからクローニングすることができる。
【００５０】
核酸をコードする所望の抗体は、発現ベクターに組込む（結合する）することができ、トランスフェクション、形質転換、又は形質導入技術によって宿主細胞に導入され得る。例えば、所望の抗体をコードする核酸は、レトロウイルス形質導入によって宿主細胞に導入され得る。例示的な宿主細胞は、大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、及び別にＩｇＧタンパク質を産生しない、骨髄腫細胞である。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞が免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖可変領域をコードする遺伝子を発現することを可能にする条件下で増殖させることができる。
【００５１】
特定の発現及び精製条件は、使用する発現系に依存して変化する。例えば、遺伝子は、大腸菌において発現される場合、それは、最初に、例えば、Ｔｒｐ又はＴａｃなどの適切な細菌プロモーター、及び原核生物のシグナル配列の下流に、操作された遺伝子を配置することによって、発現ベクターにクローニングされる。発現され分泌されたタンパク質は、屈折体又は包含体内に蓄積し、フレンチプレス又は超音波処理による細胞の破壊後に採取することができる。次いで、屈折体は可溶化され、タンパク質は、当該技術分野で公知の方法によって、リフォールディング及び切断される。
【００５２】
操作された遺伝子が真核生物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞において発現される場合、それは、まず、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ＩｇＧ増強剤、各種イントロンを含有する発現ベクター中に挿入される。この発現ベクターは、任意選択で定常領域の全部又は一部をコードする配列を含有し、重鎖又は軽鎖の全体、又は一部が発現されることを可能にする。遺伝子構築物は、トランスフェクション、形質転換、又は形質導入技術を使用して、真核生物の宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、ＶＬ又はＶＨ断片、ＶＬ−ＶＨヘテロ二量体、ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ一本鎖ポリペプチド、完全な重鎖又は軽免疫グロブリン鎖、又はそれらの一部を発現し、それらのそれぞれは別の機能を有する部分に取付けることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、重鎖（例えば、重鎖可変領域）又は軽鎖（例えば、軽鎖可変領域）の全体又は一部を発現するポリペプチドを発現する単一ベクターでトランスフェクトされる。他の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）重鎖可変領域を含むポリペプチド及び軽鎖可変領域を含むポリペプチド、又は（ｂ）免疫グロブリン重鎖全体及び全体の免疫グロブリン軽鎖全体、をコードする単一のベクターでトランスフェクトされる。さらに他の実施形態では、宿主細胞は、複数の発現ベクター（例えば、重鎖もしくは重鎖可変領域の全体又は一部を含むポリペプチドを発現する１つの発現ベクター、及び軽鎖もしくは軽鎖可変領域の全体又は一部を含むポリペプチドを発現する別の発現ベクター）と共トランスフェクトされる。
【００５３】
免疫グロブリン重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドは、ポリペプチドの発現を許容する条件下で、そのような可変領域をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させることによって産生することができる。発現後、ポリペプチドを採取し、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの親和性標識及びヒスチジン標識など、当該技術分野で周知の技術を使用して、又はクロマトグラフィーによって（非限定の例として、サイズ、電荷、及び／又は特異的結合に基づいて）精製することができる。
【００５４】
百日咳毒素タンパク質と結合するモノクローナル抗体、又は、抗体の抗原結合断片は、以下でトランスフェクト、形質転換又は形質導入された宿主細胞を増殖させることにより産生することができる：（ａ）完全又は部分的免疫グロブリン重鎖をコードする発現ベクター、及び完全又は部分的免疫グロブリン軽鎖をコードする別個の発現ベクター；又は（ｂ）両方の鎖の発現を許容する条件下で、両方の鎖（例えば、完全又は部分的重い鎖及び軽鎖）をコードする単一の発現ベクター。無傷の抗体（又は抗体結合断片）を採取し、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などの親和性標識及びヒスチジン標識など、当該技術分野で周知の技術を使用して、又はクロマトグラフィーによって精製することができる。単一の発現ベクターから、又は２つの別々の発現ベクターから重鎖及び軽鎖を発現させることは、当業者の技能の範囲内である。
【００５５】
抗体の修飾
当該技術分野で公知の抗体及び抗体断片の抗原性を低減又は排除するための標準的な方法がある。抗体がヒトに投与される場合、その抗体は、ヒトにおける抗原性を低減又は排除するために、「ヒト化」であることが好ましい。ヒト化抗体は、それが由来する非ヒト化マウス抗体と少なくとも同じか又は実質的に同じ抗原に対する親和性を有することが企図されている。
【００５６】
しかし、ヒト化アプローチは当該技術分野で公知であるが、そのようなヒト化アプローチは、親和性の減少によって阻害される（例えば、元のマウス抗体に対して）ことが多いことに留意されたい。これは、理論に束縛されることを望まずに、ＣＤＲがヒトフレームワークによって作用可能な構成を維持していないという事実に起因し得る。この場合、ヒトフレームワーク配列に少数の変化がなされる。これらの個々のアミノ酸の変化は、抗体がヒト抗体に類似し続けるようにヒト抗体の構造から著しい逸脱をすることなく、親和性を向上させる。そのようにして、抗体は、免疫応答を誘導することなく、ヒトにおける治療目的として使用することができる。変化に対するアミノ酸の選択及び行われるべき特定の変化は、本発明の一部である。
【００５７】
一ヒト化アプローチでは、マウス免疫グロブリン定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域に置き換えられている、キメラタンパク質が生成される。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，ＰＲＯＣ．ＮＡＴ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．８１：６８５１−６８５５，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，ＮＡＴＵＲＥ  ３１２：６０４−６０８；米国特許Ｎｏ．６，８９３，６２５（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；５，５００，３６２（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）；及び４，８１６，５６７（Ｃａｂｉｌｌｙ）参照。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号１、又は配列番号７、又は配列番号１３、又は配列番号１９の任意の１つがヒト定常領域と対にされる可変領域であり得る。
【００５８】
ＣＤＲグラフトとして知られるアプローチでは、軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲが別の種からのフレームワークにグラフトされている。例えば、抗原結合に関与するマウスＣＤＲ及び非ＣＤＲ残基を、ヒト配列にグラフトすることができる。結合部位の構造の維持に関与する残基及びＶＬ：ＶＨコンタクトの維持に関与する残基もグラフトされ得る。ＣＤＲグラフトは、米国特許第７，０２２，５００号（Ｑｕｅｅｎ）；第６，９８２，３２１号（Ｗｉｎｔｅｒ）；第６，１８０，３７０号（Ｑｕｅｅｎ）；第６，０５４，２９７号（Ｃａｒｔｅｒ）；第５，６９３，７６２号（Ｑｕｅｅｎ）；第５，８５９，２０５号（Ａｄａｉｒ）；第５，６９３，７６１豪（Ｑｕｅｅｎ）；第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）；第５，５８５，０８９号（Ｑｕｅｅｎ）；第５，５３０，１０１号（Ｑｕｅｅｎ）；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＮＡＴＵＲＥ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＮＡＴＵＲＥ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＳＣＩＥＮＣＥ  ２３９：１５３４−１５３６；及びＷｉｎｔｅｒ（１９９８）ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴ  ４３０：９２−９４に記載されている。
【００５９】
短縮型ＣＤＲのグラフトと呼ばれるアプローチでは、Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９：１３３−１３９によって定義された短縮型ＣＤＲ、及び抗原結合に関与する非ＣＤＲ残基が、ヒト配列に移植される。結合部位の構造の維持に関与する残基及びＶＬ：ＶＨコンタクトの維持に関与する残基もグラフトされ得る。
【００６０】
免疫原性を低減するための他の方法は、「ＳＤＲ移植」、「ベニア化」及び「フランケンシュタイン化」（Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎｉｎｇ）を含む。例えば、Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ９：１３３−１３９，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＭＯＬ  ＩＭＭＵＮＯＬ  ２９：１１４１−１１４６，及びＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  ＭＯＬ  ＩＭＭＵＮＯＬ  ２８：４８９−４９８、参照。ＳＤＲ移植アプローチでは、抗原結合に関与する残基（すなわち、特異性決定残基又はＳＤＲ）がヒト配列に移植される。結合部位の構造の維持に関与する残基及びＶＬ：ＶＨコンタクトの維持に関与する及び残基も移植され得る。ベニア化アプローチでは、マウス抗体における表面接近可能なアミノ酸残基がヒト抗体において同じ位置により頻繁に見出されるアミノ酸残基によって置換される。例えば、溶媒に露出しているフレームワーク残基がヒト配列からのそれらの同族体で置換される。抗原結合に関与するＣＤＲ及び非ＣＤＲ残基は保存される。フランケンシュタイン化アプローチでは、ＣＤＲは、最も類似したヒトフレームワーク領域から構成される複合配列に移植される。結合部位の構造の維持に関与する残基及びＶＬ：ＶＨコンタクトの維持に関与する残基も移植され得る。
【００６１】
上記のアプローチの任意のものを含む任意の適切なアプローチを、抗体のヒト免疫原性を低減又は排除するために使用することができる。
【００６２】
さらに、マウスにおいて完全にヒトの抗体を生成することが可能ある。任意の非ヒト配列を欠く完全にヒトのモノクローナル抗体は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ  ３６８：８５６−８５９，１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  １４：８４５−８５１，１９９６；及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  １５：１４６−１５６，１９９７において参照された技術によってヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２９６：５７−８６，２０００；及びＫｒｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４  ２００１）において参照された技術によってファージディスプレイライブラリーから調製して最適化することができる。
【００６３】
抗体は、治療薬として使用するためのものである場合、標準のインビトロ結合化学を使用して、小分子又は放射性核種などのエフェクター剤にコンジュゲートすることができる。エフェクター剤がポリペプチドである場合、抗体は、エフェクターに化学的にコンジュゲートされるか又は融合タンパク質としてエフェクターに結合され得る。融合タンパク質の構築は、当業者の技能の範囲内である。
【００６４】
抗体の使用方法
一態様では、本発明の方法は、（例えば、有効量の）ヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくは（例えば、有効量の）ヒト化１１Ｅ６抗体、又は抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、百日咳菌を有する患者を治療することを含む。
【００６５】
別の態様では、本発明の方法は、（例えば、有効量の）ヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくは（例えば、有効量の）ヒト化１１Ｅ６抗体、又は抗体もしくは抗体（複数）を含む医薬組成物を患者に投与することを含む、百日咳菌の感染を予防することを含み、いくつかの実施形態では、患者は百日咳菌感染の危険性がある（例えば、患者は、ワクチン接種前の幼児であり及び／又は患者は百日咳毒素にさらされたことがある）。
【００６６】
白血球増加又は白血球数の上昇は、百日咳菌感染症の特徴である。一実施形態では、本発明の方法は、患者における白血球数の低減を含む。一実施形態では、本発明の方法は、白血球増加の消散の加速をもたらす。別の実施形態では、本発明の方法は、感染の過程の間の最大白血球数の減少をもたらす。
【００６７】
様々な実施形態では、本発明の方法は、患者における百日咳の改善をもたらす。一実施形態では、患者の咳症状が改善される。例えば、本方法は、患者の咳の頻度又は咳（又は咳発作）の数を減少させる。様々な実施形態では、本方法は、咳又は咳発作の数を、１時間あたり少なくとも約１回、１時間あたり少なくとも約２回、１時間あたり少なくとも約３回、１時間あたり少なくとも約４回、１時間あたり少なくとも約５回、１時間あたり少なくとも約６回、１時間あたり少なくとも約７回、１時間あたり少なくとも約８回、１時間あたり少なくとも約９回、１時間あたり少なくとも約１０回、１時間あたり少なくとも約１５回、１時間あたり少なくとも約２０回、１時間あたり少なくとも約２５回、１時間あたり少なくとも約３０回、１時間あたり少なくとも約３５回、１時間あたり少なくとも約４０回、１時間あたり少なくとも約４５回、１時間あたり少なくとも約５０回、１時間あたり少なくとも約５５回、１時間あたり少なくとも約６０回、１時間あたり少なくとも約６５回、１時間あたり少なくとも約７０回、１時間あたり少なくとも約７５回、１時間あたり少なくとも約８０回、１時間あたり少なくとも約８５回、１時間あたり少なくとも約９０回、１時間あたり少なくとも約９５回、又は１時間あたり少なくとも約１００回だけ、減少させる。別の実施例では、本方法は、患者の咳の持続時間を減少させる。例えば、本方法は、少なくとも約３ヶ月、約２カ月、約１ヶ月、約４週間、約３週間、約２週間、約１週間、約５日、約４日、約３日、約２日、又は約１日だけ、感染の過程における咳の持続時間を減少させる。さらなる実施形態では、患者において、咳の数は、減少している。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の方法は、患者の鼻咽頭における百日咳菌のレベルを低減する。さらなる実施形態では、本発明の方法は、患者の肺における百日咳菌のレベル（例えば、細菌の肺コロニー化）を低減する。例えば、本方法は、鼻咽頭及び／又は肺における百日咳菌のレベルを、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、又は約５％だけ低減する。
【００６９】
一実施形態では、本発明の方法は、百日咳毒素タンパク質の中和（阻害又は拮抗）をもたらす。例えば、本発明の抗体は、百日咳毒素タンパク質の１つ又は複数の生物学的活性を部分的に又は完全に阻害するように、百日咳毒素タンパク質に結合することができる。中和する抗体が阻害又はブロックし得る百日咳毒素タンパク質の生物活性には、百日咳毒素タンパク質が細胞受容体と結合する能力がある。百日咳毒素タンパク質の受容体結合領域は、それぞれサブユニットＳ２、サブユニットＳ３、サブユニットＳ４及びサブユニットＳ５、と呼ばれる４つのポリペプチドサブユニットからなる。百日咳毒素タンパク質のサブユニットＳ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５によって結合される細胞受容体の例は、フェツイン、ハプトブロビン（ｈａｐｔｏｂｌｏｂｉｎ）、及びトランスフェリンなどのＮ結合型シアロ糖タンパク質ファミリーのメンバーである。例示的な実施形態では、本発明のヒト化抗体は、百日咳毒素タンパク質が細胞受容体へ結合するのを阻止する。別の実施形態では、本発明のヒト化抗体は、毒素が細胞の細胞質ゾルに到達しないように、百日咳毒素の細胞内移動のステップを変更する。本発明の抗体によって阻害され得る百日咳毒素タンパク質の別の重要な活性は、Ｇタンパク質に対するＡＤＰリボシラーゼとしての百日咳毒素タンパク質の酵素活性である。百日咳毒素タンパク質にＡＤＰリボシラーゼとして酵素活性を付与するサブユニットは、サブユニットＳ１である。いくつかの実施形態では、百日咳毒素タンパク質は百日咳ホロ毒素である。百日咳毒素タンパク質として本明細書で言及される百日咳ホロ毒素は、すべての５つの百日咳毒素タンパク質のサブユニットを含む。他の実施形態では、百日咳毒素タンパク質は短縮百日咳毒素タンパク質である。本明細書で言及される短縮百日咳タンパク質は、百日咳毒素タンパク質のサブユニット（すなわち、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４及びＳ５）のうちの少なくとも１つを含む。様々な形態の百日咳毒素タンパク質は、例えば、米国特許Ｎｏ．８，６５３，２４３に記載されており、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【００７０】
様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、百日咳の感染の任意の段階の治療又は予防に有用である。例えば、百日咳の潜伏期間は４〜２１日の範囲で、一般的に７〜１０日であり、まれに、４２日にも長くなり得る。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、感染が発生するのをより困難にすることによって、潜伏期間の長さを増加させる。疾患の臨床経過は、３つの段階に分けられる。第一段階であるカタル期は、一般的な風邪に類似の、鼻風邪、くしゃみ、微熱、及び軽度の時折の咳の潜行性の発症によって特徴付けられる。咳は徐々にひどくなって、１〜２週間後に、第２段階、すなわち発作段階が始まる。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、カタル期の長さを低減し、任意選択で、発作段階に進むことを防ぐ。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、鼻風邪、くしゃみ、微熱、及び咳のうちの１つ又は複数を治療する。百日咳の診断が通常疑われるのは、この発作段階である。特徴的に、患者は、気管気管支樹から厚い粘液の排出の困難性に明らかに起因する、急激な咳の突発、すなわち発作を有する。発作の終りには、長い吸気努力が通常、特徴的な甲高い叫び声を伴う。そのような発作の間、患者はチアノーゼになり得る。子供や若い幼児は、特に、非常に病的でひどく苦しんでいるように見える。嘔吐と疲労が一般的に発作に続く。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、発作の量及び／又は頻度を低減する。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、患者がチアノーゼになることを防止する。発作性発作は、２４時間あたり１５発作の平均で、夜に、より頻繁に発生する。この段階の最初の１週間又は２週間の間に、発作は、頻度を増し、２〜３週間同じレベルに留まり、次いで徐々に減少する。発作段階は、通常、１〜６週間続くが、最大１０週間持続し得る。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、この段階の長さを減少させる。回復期では、回復は緩やかである。咳は発作性が少なくなり、２〜３週間で消える。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、この段階の開始を促進し及び／又はその期間を減少させる。さらに、様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、その後の呼吸器感染症で発生する可能性があり発作の再発を防止又は低減する。様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、二次細菌性肺炎、発作や脳症などの神経学的合併症、低酸素症、中耳炎、脱水、気胸、鼻出血、硬膜下血腫、ヘルニア、脱出直腸、不眠、尿失禁、肺炎、及び肋骨骨折の１つ又は複数の発症を防止するか又は低減する。さらに、いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、細気管支炎の壊死、（例えば、百日咳菌からの）肺炎、肺水腫、肺高血圧症、及び死を低減又は予防する。
【００７１】
一実施形態では、本発明の方法は、患者へのヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体の共投与を含む。いくつかの実施形態において、共投与は、相乗効果を生み出す。ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体の共投与は、同時又は順次であってもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体は対象に同時に投与される。本明細書で使用される場合、「同時に」という用語は、ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体が、３０分を超えない、２０分を超えない、１０分を超えない、５分を超えない、又は１分を超えないなどの、約６０分を超えない時間間隔で投与されることを意味する。ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体の投与は、単一製剤（例えば、ヒト化１Ｂ７抗体及びヒト化１１Ｅ６抗体を含む製剤）又は別個の製剤（例えば、ヒト化１Ｂ７抗体を含む第１の製剤及びヒト化１１Ｅ６抗体を含む第２の製剤）の同時投与によることができる。
【００７３】
それらの投与のタイミングが、ヒト化１Ｂ７抗体と１１Ｅ６抗体の薬理活性が時間的に重複し、それによって併用治療効果を発揮するようなものである場合、共投与は、治療薬が同時に投与されることを必要としない。例えば、ヒト化１Ｂ７抗体とヒト化１１Ｅ６抗体は、順次投与され得る。本明細書で使用される場合、「順次」という用語は、ヒト化１Ｂ７抗体とヒト化１１Ｅ６抗体が、約６０分を超える時間間隔で投与されることを意味する。例えば、ヒト化１Ｂ７抗体とヒト化１１Ｅ６抗体の連続投与の間の時間は、約６０分超、約２時間超、約５時間超、約１０時間超、約１日超、約２日超、約３日超、又は約１週間超離れる。最適な投与時間は、投与されるヒト化１Ｂ７抗体とヒト化１１Ｅ６抗体の、代謝、排泄の速度、及び／又は薬力学的活性に依存するであろう。
【００７４】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、投与後少なくとも約３０、もしくは約３５、もしくは約４０、もしくは約４５、もしくは約５０、もしくは約５５、もしくは約６０、もしくは約６５、もしくは約７０、もしくは約７５、もしくは約８０時間、又は少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、もしくは約２５日、の血清濃度（例えば、ベータ半減期）のピークを有する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、長引いた半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、約２００、もしくは約２２５、もしくは約２５０、もしくは約２７５、もしくは約３００時間、又は、例えば約１もしくは約２週間、又は約３週間、約４週間、又は約５週間の、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、約３０日、約３１日、約３２日、約３３日、約３４日、又は約３５日、のインビボ半減期を有する。
【００７５】
従って、いくつかの実施形態では、患者は、治療法の一部として、本発明の抗体の最初の投与（例えば、注入又は筋肉内（ＩＭ）注射）を受け、血清濃度のピーク又は本発明の抗体のインビボ半減期の後にさらなる投与（例えば、注入又は筋肉内注射）を受けることができる（例えばさらなる投与の用量は最初の投与と同じであってもよく、又はより低く、例えば維持投与量であってもよい。）。いくつかの実施形態では、さらなる投与は、最初の投与から約１日、又は最初の投与から約１週間である。いくつかの実施形態では、本方法は、１週間あたり（又は約５、又は６、又は７、又は１０日毎に）、約１〜３（例えば、約１、約２、又は約３）用量（例えば、ＩＶ用量又はＩＭ用量）の本発明の抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、約５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ、約２５μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約７５μｇ／ｍＬ、又は約１００μｇ／ｍＬ、又は約１２５μｇ／ｍＬ、又は約１５０μｇ／ｍＬ、又は約１７５μｇ／ｍＬ、又は約２００μｇ／ｍＬ、又は約２２５μｇ／ｍＬ、又は約２５０μｇ／ｍＬ、又は約３００μｇ／ｍＬの血清の抗体レベルの治療域を維持する。いくつかの実施形態では、本方法は、低頻度の投与及び／又はより低い用量（例えばより低い及びより少ない頻度の投与を可能にするより長い半減期）を可能にする。
【００７６】
ヒト化１Ｂ７抗体又はヒト化１１Ｅ６抗体のいずれかが最初に投与され得る。例えば、ヒト化１Ｂ７抗体は、ヒト化１１Ｅ６抗体が投与された時間後に対象に投与され得る。この場合、ヒト化１１Ｅ６抗体の約５０％（例えば、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、又は約５％）が代謝又は排泄される時間の前、又はヒト化１１Ｅ６抗体が、その薬力学的活性の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％に達する時間の前に、ヒト化１Ｂ７抗体を投与するのが一般には望ましい。別の例では、ヒト化１Ｂ７抗体は、ヒト化１１Ｅ６抗体の投与前に対象に投与され得る。この場合、ヒト化１Ｂ７抗体の約５０％（例えば、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、又は約５％）が代謝又は排泄される時間の前、又は投与されたヒト化１Ｂ７抗体が、その薬力学的活性の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％に達する時間の前に、ヒト化１１Ｅ６抗体を投与するのが一般には望ましい。
【００７７】
共投与は、治療薬が、同じ投与経路によって患者に投与されることも必要としない。むしろ、それぞれの治療薬は、任意の適切な経路によって、例えば、非経口又は非非経口で、投与され得る。一実施形態では、治療薬は、対象に経口投与され得る。別の実施形態では、治療剤は、例えば、とりわけ、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下及び関節内注射及び注入を含み、非経口的に投与され得る。一実施形態では、治療剤は、対象への筋肉内注射によって投与され得る。
【００７８】
別の実施形態では、本方法は、抗菌剤と一緒に、患者にヒト化１Ｂ７抗体及び／又は１１Ｅ６抗体を投与することを含む。抗菌剤と一緒のヒト化１Ｂ７抗体及び／又は１１Ｅ６抗体の共投与は相乗効果を生み出すことを企図している。本発明に使用され得る例示的な抗菌剤としては、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ロキシスロマイシン、ケトライド（例えば、テリスロマイシン）アンピシリン、アモキシシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン）、及びセファロスポリンが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、抗菌剤はエリスロマイシンである。
【００７９】
様々な実施形態では、本発明の方法は、ヒト患者を治療する。一実施形態では、ヒト患者は幼児である。一実施形態では、ヒト患者は、新生児である。別の実施形態では、ヒト患者は、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、１週齢未満、６日齢未満、５日齢未満、４日齢未満、３日齢未満、２日齢未満、又は１日齢未満の新生児である。いくつかの実施形態では、ヒトは、１月齢、２月齢、３月齢、４月齢、５月齢、又は６月齢である。いくつかの実施形態では、ヒトは、約６〜約１８月齢、約１８〜約３６月齢、約１〜約５年齢、約５〜約１０年齢、約１０〜約１５年齢、約１５〜約２０年齢、約２０〜約２５年齢、約２５〜約３０年齢、約３０〜約３５年齢、約３５〜約４０年齢、約４０〜約４５年齢、約４５〜約５０年齢、約５０〜約５５年齢、約５５〜約６０年齢、約６０〜約６５年齢、約６５〜約７０年齢、約７０〜約７５年齢、約７５〜約８０年齢、約８０〜約８５年齢、約８５〜約９０年齢、約９０〜約９５年齢又は約９５〜約１００年齢の範囲の齢を有する。
【００８０】
さらなる態様では、本発明の方法は、対象にヒト化１Ｂ７抗体及び／又はヒト化１１Ｅ６抗体を投与することを含んで、以前に細菌にさらされた対象における百日咳菌の感染を防ぐ。様々な実施形態では、本方法は、細菌にさらされた対象に百日咳菌感染症の予防において効果的な予防的治療を提供する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）は、以前に細菌に対してワクチンを接種されていない対象における予防的用途に利用される。一実施形態では、本発明の抗体は、対象が百日咳ワクチン接種を受ける前に予防的処置として対象に投与される。様々な実施形態では、本発明の抗体は、１年齢未満、１１月齢未満、１０月齢未満、９月齢未満、８月齢未満、７月齢未満、６月齢未満、５月齢未満、４月齢未満、３月齢未満、２月齢未満、１月齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、１週齢未満、６日齢未満、５日齢未満、４日齢未満、３日齢未満、２日齢未満、又は１日齢未満である対象の予防的治療に利用される。従って、いくつかの実施形態では、本方法は、幼児患者における出生とワクチン接種の間の時間を埋めることを含む。
【００８２】
様々な実施形態では、本発明の方法は、以前に細菌に対してワクチンを接種した対象における百日咳菌感染を治療又は防止する。一実施形態では、対象は、ＤｔａＰ（例えば、ＩＮＦＡＮＲＩＸ（主に百日咳毒素（ＰＴ）及びＦＨＡである３つの抗原を有する）、ＴＲＩＰＥＤＩＡ（等量で、２つの成分、ＦＨＡ及びＰＴを含有する）及びＤＡＰＴＡＣＥＬ（５つの成分、ＰＴ、ＦＨＡ、ペルタクチン、並びに線毛タイプ２及び３を含有する）でワクチン接種した幼児又は子供である。別の実施形態では、対象は、百日咳ワクチン補助剤Ｔｄａｐ（例えばＩＮＦＡＮＲＩＸに比較して少ない量の３つの百日咳抗原（ＰＴ、ＦＨＡ及びペルタクチン）を有するＢＯＯＳＴＲＩＸ）及びＡＤＡＣＥＬ（ＤＡＰＴＡＣＥＬと同じ５つの成分を有するが少ない量のＰＴを有する）でワクチン接種した成人である。他の実施形態では、本発明の患者は、以下の百日咳混合ワクチンのいずれかを受けていても受けていなくてもよい：ＰＥＤＩＡＲＩＸ、ＰＥＮＴＡＣＥＬ、又はＫＩＮＲＩＸ。
【００８３】
本発明のヒト化抗体は、さらにＤｔａＰ又はＴｄａｐなどの予防接種のためのアジュバントとして機能し得ることが企図されている。さらに、様々な実施形態では、本発明の方法は、以前に細菌に対してワクチンを接種されていない対象において、百日咳菌感染を治療又は防止する。
【００８４】
様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ）による治療を補足するか又はそれに取って代る。
【００８５】
様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法は、非限定的な例として、ペルタクチン陰性百日咳を含む、それらの病因としての様々な株を有する百日咳感染症を治療することができる。
【００８６】
さらに、パラ百日咳菌は密接に関連した百日咳菌である。両方の細菌は、ヒトにおける百日咳の流行に関連付けられ、類似した毒性因子を生成する。百日咳菌とパラ百日咳菌の重感染は珍しいことではない。従って、本発明の一態様では、本発明の方法は、患者にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又は抗体又は抗体（複数）を含む医薬組成物を投与することを含む、パラ百日咳菌を有する患者を治療することを含む。本発明の別の態様では、本発明の方法は、対象にヒト化１Ｂ７抗体及び／もしくはヒト化１１Ｅ６抗体、又は抗体又は抗体（複数）を含む医薬組成物を投与することを含む、以前に細菌にさらされた対象におけるパラ百日咳菌感染を防止する。
【００８７】
様々な実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体及び／又はヒト化１１Ｅ６抗体が感染後約３ヶ月で患者に投与される場合、本発明の方法は、百日咳菌の感染及び／又はパラ百日咳菌の感染を治療するのに有効である。他の実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体及び／又はヒト化１１Ｅ６抗体が感染後約２ヶ月、約１ヶ月、約４週間、約３週間、約２週間、約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日、又は約１日で患者に投与される場合、本発明の方法は、百日咳菌の感染及び／又はパラ百日咳菌の感染を治療するのに有効である。一実施形態では、ヒト化１Ｂ７抗体及び／又はヒト化１１Ｅ６抗体は感染の日に患者に投与される。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける、疾患の治療を意味する。様々な実施形態では、これは以下を含む：（a）疾患の阻害、すなわち、その進行の阻止及び／又は（b）疾患の軽減、すなわち、疾患病態の軽減を引起すこと。
【００８９】
医薬組成物及び投与
本発明の医薬組成物は、治療的又は予防的処置のために投与され得る。そのような用途に対しては、抗体は、好ましくは、薬学的に許容される担体と組み合わされる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、合理的な利益／リスク比に相応する、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題もしくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した緩衝液、担体、賦形剤を意味する。担体は、製剤の他の成分と適合性があり、レシピエントに有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体には、薬学的投与と適合性である緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野で公知である。
【００９０】
本明細書に開示されるような抗体を含有する医薬組成物は、単位剤形で提示することができ、任意の適切な方法によって調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方されるべきである。投与経路の例としては、経口、鼻腔内、肺、静脈内（ＩＶ）、皮内、吸入、経皮、局所、粘膜、皮下、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内、及び直腸内投与が挙げられる。一実施形態では、本発明の抗体の投与経路は、ＩＶ注入である。別の実施形態では、本発明の抗体の投与経路は、ＩＭ注射である。
【００９１】
有用な製剤は、薬学分野で周知の方法により調製され得る。例えば、本発明の医薬組成物は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、又はリポソームとして製剤化され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）参照。
【００９２】
非経口投与に適した製剤成分には、注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝液；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性の調整のための薬剤、が含まれる。
【００９３】
静脈内投与については、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。
【００９４】
単独で又は他の適切な成分と組合せて本明細書で提供される組成物は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤（即ち、「噴霧」）にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴射剤中に入れることができる。
【００９５】
医薬製剤は、好ましくは無菌である。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は凍結乾燥及び再構成の前又は後に行うことができる。
【００９６】
医薬調製物は、単位剤形であるのが好ましい。そのような形態において、調製物は、適切な量の活性成分を含有する単位用量に細分される。単位剤形は、パッケージ製剤であることができ、このパッケージは、パケット錠剤、カプセル剤、及びバイアル又はアンプル中の粉末などの、個別の分量の調製剤を含有する。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ剤自体であることができ、又はそれは、適切な数のこれらの任意のもののパッケージ化形態であることができる。組成物は、他の適合性の治療剤を含有することもできる。例えば、組成物はさらに、本明細書に記載の抗菌剤を含んでもよい。
【００９７】
併用投与は、別々の製剤又は単一の医薬製剤、及びいずれかの順序での順次投与を使用して、共投与を企図しており、ここで、好ましくは、両方の（又は全ての）活性剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間がある。一実施形態では、本発明の医薬組成物はヒト化１Ｂ７抗体の製剤を含む。別の実施形態では、本発明の医薬組成物はヒト化１１Ｅ６抗体の製剤を含む。さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒト化１Ｂ７抗体とヒト化１１Ｅ６抗体の両方の共製剤化を含む。
【００９８】
本発明に従って投与される抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）の実際の用量は、例えば、特定の剤形及び投与の様式に応じて変化することが理解されるであろう。抗体の作用を変更し得る多くの要因（例えば、体重、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、対象の病態、薬剤の併用、遺伝的素因及び反応感度）が当業者によって考慮され得る。投与は、最大の許容される用量内で、連続的又は１つもしくは複数の別個の用量で実施され得る。所与の一連の条件に対する最適な投与速度は、従来の用量投与試験を使用して当業者により確認され得る。
【００９９】
抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）の個々の用量は、例えば、単位剤形あたり約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約９００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約７００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約６００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約４００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約３００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約９０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約８０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約７０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約３０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約３ｍｇ、約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、約５ｍｇ〜約８０ｍｇ、を含有する単位剤形で投与され得る。例えば、単位剤形は、それらの間のすべての値と範囲を含んで、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１，０００ｍｇ、であり得る。
【０１００】
一実施形態では、抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）は、毎日約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約９５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約９００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約８５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約７００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約６５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約６００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約５５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約４５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約４００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約３５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約３００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約２００ｍｇ、毎日約０．０１ｍｇ〜約１５０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約９５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約９０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約８５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約８０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約７５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約７０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約６５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約６０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約５５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約４５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約３５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約３０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約１５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約５ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約３ｍｇ、毎日約０．１ｍｇ〜約１ｍｇ、又は毎日約５ｍｇ〜約８０ｍｇ、の量で投与される。様々な実施形態では、抗体は、それらの間のすべての値と範囲を含んで、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１，０００ｍｇ、の一日用量で投与される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）の適切な用量は対象の体重の約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、又は約１００ｍｇ／ｋｇ体重であって、それらの間のすべての値と範囲を含む。他の実施形態では、抗体の適切な用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、その間の全ての値及び範囲を含む。
【０１０２】
本発明のある特定の実施形態によれば、抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）は、例えば、１日１回超、１日あたり約１回、約１日おきに、約３日毎に、約１週間に１回、約２週間に１回、約毎月１回、約２カ月に１回、約３ヶ月に１回、約６ヶ月に一回、又は約毎年１回、投与され得る。
【０１０３】
抗体は、複数回投与され得る。単回投与間の間隔は、毎週、毎月又は毎年であり得る。対象における抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、間隔は不規則でもあり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、持続放出製剤として投与され得、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。
【０１０４】
いくつかの方法では、本発明の抗体は、１〜１０００μｇ／ｍｌの、またいくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿又は血清の抗体濃度を達成する用量で投与される。例えば、本発明の抗体は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、１〜９００μｇ／ｍｌ、１〜８００μｇ／ｍｌ、１〜７００μｇ／ｍｌ、１〜６００μｇ／ｍｌ、１〜５００μｇ／ｍｌ、１〜４００μｇ／ｍｌ、１〜３００μｇ／ｍｌ、１〜２００μｇ／ｍｌ、１〜１００μｇ／ｍｌ、１０〜５００μｇ／ｍｌ、１０〜４００μｇ／ｍｌ、１０〜３００μｇ／ｍｌ、１０〜２００μｇ／ｍｌ、１０〜１００μｇ／ｍｌ、１００〜４００μｇ／ｍｌ、１００〜３００μｇ／ｍｌ、又は１００〜２００μｇ／ｍｌの、それらの間のすべての値と範囲を含む血漿又は血清レベルを達成する用量で投与され得る。例えば、本発明の抗体は、約１μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約８５μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約９５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１１５μｇ／ｍｌ、約１２０ｍｇμｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１３０μｇ／ｍｌ、約１３５μｇ／ｍｌ、約１４０μｇ／ｍｌ、約１４５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１５５μｇ／ｍｌ、約１６０μｇ／ｍｌ、約１６５μｇ／ｍｌ、約１７０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約１８０μｇ／ｍｌ、約１８５μｇ／ｍｌ、約１９０μｇ／ｍｌ、約１９５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２０５μｇ／ｍｌ、約２１０μｇ／ｍｌ、約２１５μｇ／ｍｌ、約２２０ｍｇμｇ／ｍｌ、約２２５μｇ／ｍｌ、約２３０μｇ／ｍｌ、約２３５μｇ／ｍｌ、約２４０μｇ／ｍｌ、約２４５μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約２５５μｇ／ｍｌ、約２６０μｇ／ｍｌ、約２６５μｇ／ｍｌ、約２７０μｇ／ｍｌ、約２７５μｇ／ｍｌ、約２８０μｇ／ｍｌ、約２８５μｇ／ｍｌ、約２９０μｇ／ｍｌ、約２９５μｇ／ｍｌ、又は約３００μｇ／ｍｌの血漿又は血清レベルを達成する用量で投与され得る。
【０１０５】
いくつかの方法では、本発明の抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）は、少なくとも約１ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約２ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約３ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約４ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約６ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約７ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約８ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約９ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約１０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約１５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約２０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約２５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約３０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約３５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約４０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約４５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約５０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約５５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約６０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約６５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約７０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約７５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約８０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約８５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約９０ＥＵ／ｕｇ、少なくとも約９５ＥＵ／ｕｇ、少なくとも又は約１００ＥＵ／ｕｇの効力を達成する。いくつかの方法では、本発明の抗体（例えば、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体及び／又はｈｕ１１Ｅ６抗体）は、少なくとも約１ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約２ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約３ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約４ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約６ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約７ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約８ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約９ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約１０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約１５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約２０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約２５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約３０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約３５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約４０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約４５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約５０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約５５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約６０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約６５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約７０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約７５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約８０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約８５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約９０ＥＵ／ｍｌ、少なくとも約９５ＥＵ／ｍｌ、少なくとも又は約１００ＥＵ／ｍｌの効力を達成する。ＥＵは、ＷＨＯポリクローナル血清標準で定義されている等価単位を表す。様々な実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、程度約３週間、約４週間、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１２ヶ月後に効力を維持することができる。
【０１０６】
用量及び頻度は、投与経路、投与量、治療されている疾患、及び患者における抗体の半減期などの要因によって変化する。投与の用量及び頻度は、処置が予防的又は治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用では、比較的低用量が長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与される。治療的適用では、疾患の進行が低下又は終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高用量が必要とされることがある。その後、患者は予防的投与計画を投与され得る。例示的な投与頻度は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、週に１回、２週間毎に１回である。いくつかの実施形態では、投与は２週間毎に１回である。  
【０１０７】
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤（例えば様々な併用薬剤あり又はなしのヒト化抗体）の投与を簡素化し得るキットも提供する。本発明の例示的なキットは、単位剤形の本明細書に記載の任意の組成物を含む。一実施形態では、単位剤形は、本明細書に記載の任意の薬剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する、滅菌し得る充填済みシリンジなどの容器である。キットはさらに、本明細書に記載の任意の薬剤の使用を指示するラベル又は印刷された説明書を含むことができる。キットは、開瞼器、局所麻酔薬、及び投与場所の洗浄剤を含むこともできる。キットはさらに、本明細書に記載１つ又は複数の追加の薬剤を含むこともできる。一実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物及び別の組成物は、本明細書に記載のものなどの、有効量の別の組成物を含有する容器を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、キットは、単位剤形の充填済みシリンジ（例えば、注射器ペン）を含む。様々な実施形態では、キットは、例えばフィールドで、例えば第三世界で、従来の医療センターから離れて使用するのに適している。
【実施例】
【０１０９】
以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲又は内容を何ら限定することを意図するものではない。
【０１１０】
実施例１  ヒト化１１Ｅ６重鎖及び軽鎖可変領域のスクリーニング並びに評価
キメラ１１Ｅ６重鎖をコードする発現プラスミド構築物を作製した。構築物は、マウス可変領域、続いてヒト定常領域を有する抗体をコードした。具体的には、構築物は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に融合された配列番号１３をコードした。同様に、キメラ１１Ｅ６軽鎖をコードする発現プラスミド構築物を作製した。構築物は、ヒトカッパ軽鎖定常領域に融合された配列番号１９をコードした。この２つの発現構築物は、ＣＨＯ細胞における発現及びそれからの分泌のためのプロモーター、５’非翻訳配列、並びに異種シグナルペプチドもコードした。
【０１１１】
キメラ１１Ｅ６重鎖をコードする発現プラスミド構築物を作製した。構築物は、マウス可変領域、続いてヒト定常領域を有する抗体をコードした。具体的には、構築物は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に融合された配列番号１３をコードした。同様に、キメラ１１Ｅ６軽鎖をコードする発現プラスミド構築物を作製した。構築物は、ヒトカッパ軽鎖定常領域に融合された配列番号１９をコードした。この２つの発現構築物は、ＣＨＯ細胞における発現及びそれからの分泌のためのプロモーター、５’非翻訳配列、並びに異種シグナルペプチドもコードした。
【０１１２】
類似の方法では、ヒト化１１Ｅ６重鎖をコードする４つの発現プラスミドが配列番号１４、１５、１７、及び１８を利用して構築された。これらは、それぞれ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、及びＨ４と命名された。ヒト化１１Ｅ６軽鎖をコードする３つの発現プラスミドが配列番号２０、２１、及び２３を利用して構築された。これらは、それぞれ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３と命名された。
【０１１３】
重鎖及び軽鎖キメラ発現プラスミドは、ＣＨＯ細胞に共トランスフェクトされ、次いで、組織培養培地に二価キメラ抗体を分泌した。同様に、ヒト化重鎖及び軽鎖構築物のすべての１２の組合せが、ＣＨＯ細胞に共トランスフェクトされた。具体的には、Ｈ１はＬ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４と共トランスフェクトされ；Ｈ２は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４と共トランスフェクトされ；及びＨ３は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４と共トランスフェクトされた。培地を各トランスフェクションから採取し、試料中の抗体のレベルを定量し、百日咳毒素への結合をＥＬＩＳＡにより決定した。キメラ構築物両方及び全ての１２のヒト化の組合せにより、百日咳毒素と特異的に結合する抗体を得た。Ｌ２及びＬ３との組合せでのＨ１及びＨ４が最も高いＥＬＩＳＡシグナルを生成した。Ｈ４及びＬ３の組合せを、さらなる評価のために選択した。
【０１１４】
親マウス抗体、キメラ抗体、Ｈ４／Ｌ３抗体の解離定数（Ｋｄ）を、百日咳毒素結合競合アッセイを用いて決定した。このアッセイでは、漸増する濃度の百日咳毒素が、一定量の抗体にさらされる。次いで、残りの非結合抗体の量を、ＥＬＩＳＡによって定量する。３つの抗体の解離定数は、ほぼ同一であった。
【０１１５】
従って、１１Ｅ６抗体は、親マウス抗体と比較して親和性を何ら損なうことなくヒト化された。
【０１１６】
実施例２  ヒト化１Ｂ７重鎖及び軽鎖可変領域のスクリーニング並びに評価
同じ評価を、１Ｂ７キメラ配列並びにヒト化１Ｂ７重鎖及び軽鎖の２０の組合で実施した。１Ｂ７キメラ重鎖及び軽鎖、配列番号１及び７をそれぞれコードする発現プラスミドを生成した。配列番号２、３、５、及び６をコードする４つの１Ｂ７ヒト化重鎖の発現プラスミドを調製し、それぞれＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４と命名した。配列番号８、９、１１、１２、及び１０をコードする５つの１Ｂ７ヒト化軽鎖の発現プラスミドを調製し、それぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、及びＬ５と命名した。各発現プラスミドに対して、プロモーター、５’非翻訳領域、シグナルペプチド、及び定常領域（ＩｇＧ１及びカッパ）は、実施例１で１１Ｅ６構築物に対して使用したのと同じであった。
【０１１７】
キメラ重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドは、キメラ１Ｂ７抗体を生成するために、ＣＨＯ細胞に共トランスフェクトされた。ヒト化１Ｂ７の重鎖と軽鎖の組合せに対するプラスミドも２０の異なるヒト化１Ｂ７抗体を産生するためにＣＨＯ細胞に共トランスフェクトされた。次いで、抗体は、実施例１において１１Ｅ６でなされたように、百日咳毒素結合ＥＬＩＳＡによって評価された。Ｌ３とＬ４と組合せたＨ１とＨ２が最も高いＥＬＩＳＡシグナルを生成した。Ｈ２／Ｌ３は、さらなる開発のために選択された組み合わせであった。百日咳毒素競合アッセイでは、親マウス１Ｂ７抗体とＨ２／Ｌ３ヒト化１Ｂ７抗体の解離定数はそれぞれ０．１５と０．１６ｎＭであった。
【０１１８】
従って、１Ｂ７抗体は、親マウス抗体と比較して親和性を何ら損わずにヒト化された。
【０１１９】
実施例３：百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化抗体の構築
上記の、実施例１及び２で特定された２つのヒト化抗体をＣＨＯ細胞中で産生した。具体的には、各抗体に対して、重鎖をコードする１つと軽鎖をコードする２つ目の、２つのレトロウイルスベクターを調製した。各抗体に対して、レトロウイルスベクターの対を、繰返し形質導入して、ＣＨＯ細胞の非クローンプールを遺伝的に修飾するのに使用した。次いで、組換えＣＨＯ細胞を、振とうフラスコ中で２週間増殖させた。各抗体は、プロテインＡカラムを介して、ＣＨＯ細胞組織培養培地から精製した。ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分析した（図１及び３参照）。さらに、ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体並びにそれら２つの抗体の混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーによっても分析した（図２、４、及び５参照）。具体的には、ＰＢＳ中の５００μＬの抗体（１００μｇ／ｍＬ）を４℃で２４時間インキュベートし、試料はＰＢＳ緩衝液でＳ２００カラム上で実行した。
【０１２０】
ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して分析した（図１及び３参照）。さらに、ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体並びにそれら２つの抗体の混合物を、サイズ排除クロマトグラフィーによっても分析した（図２、４、及び５参照）。具体的には、ＰＢＳ中の５００μＬの抗体（１００μｇ／ｍＬ）を４℃で２４時間インキュベートし、サンプルはＰＢＳ緩衝液でＳ２００カラム上で実行した。
【０１２１】
ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体に対して、以下の結果が得られた：濃度：５．７８ｍｇ／ｍｌ（１．６４（ｍｇ／ｍｌ）−１のＡ２８０吸光係数を使用して）；０．２５ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシン（０．０４ＥＵ／ｍｇ未満）；及び、０．２ＣＦＵ／ｍＬ未満のバイオバーデン（合格）。
【０１２２】
ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体に対して以下の結果が得られた：濃度：５．６２ｍｇ／ｍｌ（１．５６（ｍｇ／ｍｌ）−１のＡ２８０吸光係数を使用して）；０．２５ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシン（０．０４ＥＵ／ｍｇ未満）；及び、０．２ＣＦＵ／ｍＬ未満のバイオバーデン（合格）。
【０１２３】
図５に示されるように、抗体調製物は、明らかな凝集を示さなかった。
【０１２４】
実施例４：ヒト化抗体の製造
ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の大規模製造を行った。具体的には、ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体を、レトロウイルス形質導入技術を使用してＣＨＯ細胞中で発現させ、続いてモノクローナル抗体精製プロセスを行った。各抗体を製造するためのクローン及びバックアップクローンを特定した。発現について各クローンを特徴付けし、得られた抗体の質を確認した。上流工程は、ｈｕ１Ｂ７抗体の産生のために１００Ｌに拡大し、ｈｕ１１Ｅ６抗体の産生のために２５０Ｌに拡大した。上流工程は、無血清の、化学的に定義された、並びに市販の細胞培養培地及びフィードを利用した。下流の工程は、連続クロマトグラフィーによる３段階精製（すなわち、プロテインＡ、陰イオン交換、及び陽イオン交換）を利用した。製造工程は、洗浄剤ベースのウイルス不活性化ステップ及び１０ｍｇ／ｍＬでのＰＢＳ製剤緩衝液（ｐＨ７．０）中へのタンジェント流ろ過も含んだ。２つの抗体の調製物は０．２ｕｍのフィルターを通して滅菌し、バルクは高密度ポリエチレンボトルに充填した。精製された調製物は、−３５℃未満で長期保存した。ヒト化ｈｕ１Ｂ７とｈｕ１１Ｅ６抗体の収量は、それぞれ、４７と７０グラムであった。この収量は、標準的なプラスミドトランスフェクション法によって生成されたＣＨＯ細胞の製造ラインに比べて、一桁超高いものである。
【０１２５】
製造された抗体のバッチ分析及び安定性試験のために、生物分析アッセイのパネルを行った。これらの方法には、Ａ２８０吸収読取、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＩＥＦ、及びＥＬＩＳＡ活性アッセイなどの製品関連試験、並びに宿主細胞ＤＮＡ及びタンパク質、エンドトキシン、バイオバーデン、及びマイコプラズマの分析などの工程関連試験が含まれた。外観、オスモル濃度、及びｐＨも測定した。両方のモノクローナル抗体は、これらのアッセイにおいて優れた特性を示した。
【０１２６】
例５：ヒト化抗体の特徴づけ
図６Ａ〜６Ｄに示されるように、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６及びｈｕ１Ｂ７抗体並びにそれらのマウス対応物の安定性を評価するために、熱安定性アッセイを使用した。
【０１２７】
ヒト化ｈｕ１１Ｅ６及びｈｕ１Ｂ７抗体の百日咳毒素タンパク質と結合する能力を決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った（図７参照）。具体的には、コーティングのために百日咳毒素タンパク質を使用し、一方抗マウスＨＲＰ又は抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを２次抗体として使用した。アッセイのための基質としてＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を使用した。以下のＥＣ５０（ｎＭ）データを得た：
ｍ１Ｂ７：０．１９±０．０１；
ｈｕ１Ｂ７Ａ：０．２３±０．０４；
ｍ１１Ｅ６：２．７±０．７；及び
ｈｕ１１Ｅ６Ａ  １．３±０．２。
示されているように、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６及びｈｕ１Ｂ７抗体は、マウス抗体と同等以上の、百日咳毒素タンパク質に対する高い親和性を呈した。
【０１２８】
図８はヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の結合親和性を決定する競合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。解離定数を、受託機関（ＣＲＯ）で生成されたものと比較して、学術研究室で生成された抗体調製物に対してアッセイした。ＥＬＩＳＡについて、コーティングのために百日咳毒素タンパク質を使用し、一方抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを２次抗体として使用した。基質としてＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を使用した。
【０１２９】
以下のＫｄ（ｎＭ）データが得られた
研究室  ｈｕ１Ｂ７Ａ＝１．７±０．２；
ＣＲＯ  ｈｕ１Ｂ７Ａ  ２．６±０．１；
研究室  ｈｕ１１Ｅ６Ａ  １０．７±０．３；及び
ＣＲＯ  ｈｕ１１Ｅ６Ａ  １１．３±０．４。
【０１３０】
ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅによっても測定し、表１に示されるように、以下のＫｄデータが得られた。
【表１】
0006588922.tif 000006
【０１３１】
ヒト化ｈｕ１Ｂ７とｈｕ１１Ｅ６抗体の中和活性を比較するために、ＣＨＯ細胞インビトロ保護アッセイを実施した。アッセイは、２つの異なる技術により行った（図９参照）。具体的には、このアッセイは、抗体の百日咳毒素タンパク質を中和する能力を測定した。図９に示されるように、ヒト化とマウス抗体は、百日咳毒素タンパク質の中和において同等であった。
【０１３２】
ヒト化１１Ｅ６と１Ｂ７抗体の混合物を、抗体を混合して４℃で１分、１時間、及び２２時間保存することにより、調製した。百日咳毒素タンパク質に対する該混合物の結合親和性を、前述のようにＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した（図１０参照）。以下のＥＣ５０（ｎＭ）データが得られた：
１分＝０．１２±０．０２；
１時間＝０．１０±０．０１；及び
２２時間＝０．１７±０．０７。
ＥＣ５０データによって証明されるように、混合物としての保存時にヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体とヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体の間に、百日咳毒素タンパク質に対する結合親和性を妨害する明らかな有害な相互作用はなかった。
【０１３３】
以下の表２は、マウスｍ１Ｂ７抗体と比較したヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体の薬物動態（ＰＫ）分析を要約する。
【表２】
0006588922.tif 000007
ＰＫ分析から、５ｕｇのマウスｍ１Ｂ７抗体は百日咳菌に感染したマウスを完全に保護し、約２１０時間の排出半減期を有することが決定された。それと比較して、２０ｕｇのヒト化ｈｕ１Ｂ７は、約８９時間の排出半減期（図１１参照）を有し、７日目まで同様の血中濃度を有した。従って、２０ｕｇの用量のヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体は、５ｕｇ用量のマウスｍ１Ｂ７抗体と同様に、感染したマウスを保護することが期待された。さらに、図１０に示されるように、ヒト化１１Ｅ６抗体は約１２８時間の排出半減期を有したが、２つの抗体の混合物は約７６時間の排出半減期を有した。
【０１３４】
百日咳毒素タンパク質に対するヒト化ｈｕ１Ｂ７Ａ及びｈｕ１１Ｅ６Ａ抗体の結合親和性に熱が影響を与るかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した（図１２及び１３参照）。前述のようにＥＬＩＳＡアッセイを行った。特に、５０μｇ／ｍＬの抗体を氷上で、５０℃で、又は７０℃で３０分、ＰＢＳ中でインキュベートし、氷上で１分間クエンチした。図１２に示されるように、ヒト化ｈｕ１Ｂ７Ａ抗体は安定のままであり、５０℃又は７０°Ｃで３０分加熱後に不可逆的にアンフォールディングしなかった。図１３に示されるように、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６Ａ抗体は５０℃で３０分加熱後に安定であったが、７０℃で加熱した後不可逆的にアンフォールディングした。
【０１３５】
２つの抗体の混合物と比較して、個々のヒト化ｈｕ１Ｂ７Ａ又はｈｕ１１Ｅ６Ａ抗体の結合親和性を比較するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した（図１４参照）。前述のようにＥＬＩＳＡアッセイを行った。以下のＥＣ５０（ｎＭ）データが得られた：
ｈｕ１Ｂ７Ａ：０．０９±０．０１；
ｈｕ１１Ｅ６Ａ：０．６１±０．０７；及び
ｈｕ１Ｂ７Ａとｈｕ１１Ｅ６Ａの混合物：０．２９±０．０７。
【０１３６】
実施例６：マウスの百日咳菌感染症の処置におけるヒト化抗体の評価
百日咳菌感染症の処置におけるヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の有効性をマウスモデルにおいて評価した。
【０１３７】
具体的には、百日咳菌のＤ４２０株に感染したマウスを、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体、及び２つの抗体の混合物で処置した。感染したマウスは、その後、それらの体重及び白血球数を分析した。図１５示されるように、別々に、又は組合せでの各ヒト化抗体による処置は、ＰＢＳで又はマウスｍ１Ｂ７抗体で治療されたものよりも感染したマウスにおいて大きな体重増加を可能にした。図１６Ａ〜１６Ｂは、ヒト化抗体による処置が、感染後３及び１０日後の感染したマウスの白血球数も優位に低減したことを示す。
【０１３８】
細菌性肺コロニー形成に対する抗体治療の効果も評価した。具体的には、マウスを、ＰＢＳ、Ｐ−ＩＶＩＧ、ヒト化ｈｕ１Ｂ７抗体、ヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体、又は２つの抗体の混合物のいずれかで処置した。細菌性肺コロニー形成を感染後１０日で評価した。未感染ナイーブマウスをベースライン対照とした。感染したマウスを感染後１０日目にＣＯ２吸入によって安楽死させ、気道を、４０ｕｇ／ｍｌのセファレキシンを含む１０％ヒツジの血液（止血剤資源）を補充したリーガンロウ寒天上の連続プレーティングによる計数のために摘出した。コロニーを３７℃で５日後に計数した。図１７に示されるように、抗体で処置したマウスは、未治療対照（ＰＢＳ）又はＰ−ＩＶＩＧ治療動物と比較して、細菌性コロニー形成の有意な低下を示した。ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６単独で治療した動物に対してはＰ＜０．０５（＊）、並びにｈｕ１Ｂ７と１１Ｅ６の併用で治療した動物に対してはＰ＜０．０１（＊＊）。
【０１３９】
まとめると、これらのデータは、百日咳菌感染症の治療におけるヒト化ｈｕ１１Ｅ６及びｈｕ１Ｂ７抗体のインビボ有効性を支持する。
【０１４０】
実施例７：ヒヒの百日咳菌感染症の処置におけるヒト化抗体の評価
百日咳菌感染症の処置におけるヒト化ｈｕ１Ｂ７及びｈｕ１１Ｅ６抗体の有効性をヒヒモデルにおいて評価した。
【０１４１】
具体的には、重量で約２〜３ｋｇの離乳（６〜９月齢）の雄と雌のヒヒ（ａｎｕｂｕｓヒヒ、オリーブヒヒ）を百日咳菌のＤ４２０株の鼻腔内投与によって感染させ、ヒト化ｈｕ１Ｂ７及びヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体により静脈内処置した。感染ヒヒは、病気の臨床兆候（例えば、咳、体重及び体温）、白血球数、及び／又は百日咳菌の鼻腔保菌について分析した。
【０１４２】
百日咳菌感染については、百日咳菌の菌株、Ｄ４２０、を１０９〜１０１０ｃｆｕ／ｍｌでＰＢＳに懸濁した。１ｍｌをヒヒ気管の上部に気管内チューブを介して送達した。０．５ｍｌを、各鼻孔の奥に鼻腔内カテーテルを介して送達した。ヒヒを、３分間座位に配置した。瀉血については、５ｍｌ未満の血液を蝶カテーテルで静脈穿刺を介して採取し、白血球測定用チューブと血清分離用チューブに等分した。試験を通じて、ヒヒは、抗体点滴、百日咳菌感染、採血、鼻咽頭洗浄液、及び臨床観察などの活動のために、ケタミンの筋肉内注射で麻酔した。麻酔の使用を最小限に抑えるために、可能な限りこれらの活動を組合せた。
【０１４３】
２つの試験を実施した。１つの試験では、３匹のヒヒを、それぞれ百日咳菌の６ｘ１０９ＣＦＵで感染させた。３日後、２匹の動物をヒト化ｈｕ１Ｂ７とヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体の両方で処置し、第３の動物は未処置のままであった。感染後３週間で、未治療の動物は瀕死状態となり、安楽死させた。他の２匹の処置された動物も安楽死させた。肺切片の組織学的評価を行った。第２の試験では、４匹のヒヒを百日咳菌の４ｘ１０９ＣＦＵで感染させ、３日後に、２匹の動物をヒト化ｈｕ１Ｂ７とヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体の両方で処置し、２匹の動物は未処置のままであった。抗体を静脈内注射を介して投与し、２０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれを使用した。
【０１４４】
図１８Ａに示されるように、未処置の動物は、ＵＬあたり４０，０００細胞を超えてピークに達する白血球増加を進行させた。この動物では、上昇した白血球数が持続した。感染後３週間で、動物は急に瀕死状態になり、安楽死させた。対照的に、処置された動物の白血球数は抗体投与後２日以内に減少し始めた。計数が落下し続け、１週間以内にほぼ正常であった。これらの動物は健康なままであり、未処置動物と並行して殺処分した。咳の数は同様のパターンを示した（図１８Ｂ）。対照動物は、３日目から試験終了まで咳の急速な増加を示し、５日で時間あたり５０を超える咳でピークに達した。対照的に、２匹の処置動物は３日目（治療）まで咳の増加を示し、これは４日目までに急速にゼロに減少した。
【０１４５】
感染したヒヒの肺を病理組織学的検査で評価した（図１９）。剖検で、未処置の動物は、連結右肺を有することが示された。この肺の組織病理は、深刻な亜急性から慢性の膿瘍形成を有するびまん性間質性肺炎、及び中程度の間質性線維症を示した。左肺は、はるかに少ない瘢痕を有するより中程度の間質性肺炎及び膿瘍形成の証拠がないことを明らかにした。膿瘍形成の部分を有する中程度の慢性多発性組織化胸膜炎も存在した。対照的に、剖検時に、２匹の処置動物の肺は肉眼的に正常であった。１匹の処置動物の右肺から組織病理学の切片は、非常に軽度の間質性線維症の証拠を有する非常に軽度の慢性間質性肺炎を明らかにした。左肺は、外観は基本的に正常であった。他の処置動物では、左右の肺は基本的に正常な外観を有し、唯一の知見は軽度から中等度の気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）のリンパ過形成であった。従って、未処置動物は重度の肺炎の変化を示したが、処置動物の肺は正常であるか又は非常に軽度の肺炎を示した。
【０１４６】
感染したヒヒの白血球数と鼻の細菌数を評価した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。未処置の動物は、１ｕＬあたり４０，０００細胞よりずっと高くピークに達する白血球増加を進行させた。これらの動物では、上昇した白血球数が持続し、２０日目までに正常化されなかった。対照的に、２匹の処置動物は、３日目の抗体治療時に白血球数の増加を示したが、白血球数は、未処置動物で観察されたレベルに到達せず、２０日目までに、両方の処置動物の白血球数は正常レベルに戻った。同様に、鼻洗浄液中の百日咳菌細菌細胞数は、３日目（処置）で同様の細菌量を示した。抗体治療に続いて、鼻の中の細菌数は、抗体併用処置した動物に対しては急速な低下を示したが、２匹の対照動物の鼻の中の細菌レベルは、１８日目まで１０３ｃｆｕよりずっと高いままであった。
【０１４７】
ヒト化ｈｕ１Ｂ７とヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体の血清濃度と半減期も測定した。２０ｍｇ／ｋｇの各抗体の静脈内投与後のヒヒ血清中のヒト化１Ｂ７及び１１Ｅ６抗体の量を測定するために、様々な時点で血液サンプルを採取し、血清を単離し、実施例４で前述したように血清サンプルを抗百日咳毒素（ＰＴｘ）ＥＬＩＳＡにおいて使用した。具体的には、百日咳毒素タンパク質をコーティングのために使用し、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを２次抗体として使用した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）をアッセイのための基質として使用した。２匹の処置されたヒヒをこの分析に使用した（すなわち、ヒヒ＃１２９１３及び１５９１３）。図２１Ａは以下の式によって計算されたヒト化ｈｕ１Ｂ７及びヒト化ｈｕ１１Ｅ６抗体の抗体血清濃度を示す：
血清濃度＝ａｅ−αｔ＋ｂｅ−βｔ。
図２１Ｂは、ヒト化抗体の抗体半減期を示す。
【０１４８】
要約すると、両方のヒト化抗体は、単独又は併用のいずれでも、マウス百日咳モデルにおける体重減少、白血球増加症、及び肺細菌負荷を軽減した。さらに、ヒヒモデルでは、抗体の併用は、両方の処置された動物において疾患の経過を逆転させ、正常又はほぼ正常な肺の組織学的検査結果を伴って急速に回復することを可能にした。これらのデータは、百日咳の小児における罹患率、長期の後遺症、及び死亡率を減少させる手段としての本発明のヒト化抗体の臨床応用を支持する。
【０１４９】
実施例８：新生児へのヒト化ｈｕ１Ｂ７とヒト化抗体の予防的投与
ヒト化ｈｕ１Ｂ７とｈｕ１１Ｅ６抗体は、受動免疫を介し百日咳に対する予防的治療を提供するために、新生児へ筋肉内注射を介して投与される。人生の最初の４ヶ月間の百日咳は、死亡又は長期的な後遺症を伴う深刻な病気に対する最も高いリスクの前兆となるので、出生時の処置は、子供をこの高リスク期間中及び／又は彼らが標準的な百日咳ワクチン接種を受けることができる年齢に達するまで、保護することができる。これは、百日咳に罹患するリスクが高く、この疾患で毎年１６０，０００〜３００，０００人の子供が死亡し、新生児は出生時に一度医師に診察をしてもらうのみである発展途上国で特に重要であり得る。
【０１５０】
ヒト化ｈｕ１Ｂ７とｈｕ１１Ｅ６抗体の混合物（別名ＳＹＮ−００５）は、その血漿半減期及び効力に起因して、少なくとも４ヶ月の予防を提供することが期待される。
【０１５１】
ＳＹＮ−００５の半減期は、新生児への予防的治療として投与される他の抗体に関して入手可能なデータと一緒にヒヒ研究から得られた薬物動態（ＰＫ）データに基づいて算定される。具体的には、ＳＹＮ−００５は、１１日の、ヒヒにおけるベータ半減期を有することが示された。
【０１５２】
ＳＹＮ−００５の効力を、ワクチンの有効性を予測するために通常使われる世界保健機関（ＷＨＯ）のポリクローナル血清標準に対して評価した。ＷＨＯの効力は等価単位（ＥＵ）で定量化され、５ＥＵ／ｍｌがヒトにおける保護レベルとみなされる。Ｓｔｏｒｓａｅｔｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｖａｃｃｉｎｅ，１６（２０）：１９０７−１６を参照のこと。具体的には、ＳＹＮ−００５の効力は２ＥＵ／ｕｇであると決定された。さらに、ＣＨＯ細胞機能アッセイにおいて、ＳＹＮ−００５のＥＵはＷＨＯポリクローナル標準のＥＵよりも約７倍強力であることが示された。特に、ＳＹＮ−００５における２つのヒト化抗体は百日咳毒素を中和することが可能であったが、ポリクローナル設定におけるＰＴｘ結合抗体の多くは、百日咳毒素の機能を阻害しなかった。
【０１５３】
従って、ＳＹＮ−００５混合物の保護血漿レベルは５ＥＵ／ｍｌ超であると期待される。具体的には、ＳＹＮ−００５の４０ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与量は、１ヶ月で１００〜１３０ｕｇ／ｍｌ及び４ヶ月で５μｇ／ｍｌの血清レベルを提供することが期待される。ＳＹＮ−００５は２ＥＵ／ｕｇの効力を有するので、５ｕＧ／ｍｌの血清レベルは、予防的処置のためのＷＨＯの標準で必要とされるレベルの２倍の、１０ＥＵ／ｍｌに相当する。さらに、ＳＹＮ−００５の１ＥＵはＷＨＯポリクローナル標準の１ＥＵより７倍強力であるという観察は、４ヶ月の継続的な予防を確実にするための追加マージンを提供する。
【０１５４】
要するに、これらのデータは、ＳＹＮ−００５の単回投与は、少なくとも４ヶ月間、百日咳から新生児を保護するのに必要な閾値を超える血漿レベルを維持することを示唆する。
【０１５５】
参照による組込み
本明細書に参照される特許文献及び科学論文のそれぞれの全体の開示は、すべての目的のために参照により組込まれる。
【０１５６】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本発明が先行発明という理由でそのような刊行物に先行する権利がない承認として解釈されるべきではない。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、すべての見出しは、単に構成のためのものであり、いかなる方法においても本開示を限定するものではない。任意の個々の節の内容は、すべてのセクションに等しく適用され得る。
【０１５８】
均等物
本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなくすべての点で例示的であるとみなされるべきである。
【０１５９】
実施形態
実施形態
実施形態１．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【０１６０】
実施形態２．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、以下から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；並びに（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域。
【０１６１】
実施形態３．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【０１６２】
実施形態４．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、以下から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体：（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；並びに（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域。
【０１６３】
実施形態５．前記抗体は、３ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、実施形態１又は２に記載の抗体。
【０１６４】
実施形態６．前記抗体は、１２ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、実施形態３又は４に記載の抗体。
【０１６５】
実施形態７．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、前記抗体は３ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、抗体。
【０１６６】
実施形態８．前記ＫＤは約３ｎＭ、又は約２ｎＭ、又は約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭである、実施形態７に記載の抗体。
【０１６７】
実施形態９．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、前記抗体は１２ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、抗体。
【０１６８】
実施形態１０．前記ＫＤは約１２ｎＭ、又は約１０ｎＭ、又は約８ｎＭ、又は約６ｎＭ、約４ｎＭ、又は約２ｎＭ、又は約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭである、実施形態９に記載の抗体。
【０１６９】
実施形態１１．実施形態１〜１０のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【０１７０】
実施形態１２．実施形態１〜１０のいずれか１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【０１７１】
実施形態１３．実施形態１１に記載の前記核酸を含有する発現ベクター。
【０１７２】
実施形態１４．実施形態１２に記載の前記核酸を含有する発現ベクター。
【０１７３】
実施形態１５．実施形態１１に記載の前記核酸をさらに含む、実施形態１４に記載の発現ベクター。
【０１７４】
実施形態１６．実施形態１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１７５】
実施形態１７．実施形態１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１７６】
実施形態１８．実施形態１５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０１７７】
実施形態１９．実施形態１３に記載の前記発現ベクターをさらに含む、実施形態１７に記載の宿主細胞。
【０１７８】
実施形態２０．免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを産生する方法であって、以下を含む方法：（ａ）前記宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現するような条件下で、実施形態１６又は１７に記載の前記宿主細胞を増殖させること；及び（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること。
【０１７９】
実施形態２１．百日咳毒素タンパク質と結合する抗体を産生する方法であって、前記方法は以下を含む方法：（ａ）前記宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で、実施形態１８又は１９に記載の前記宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体を産生すること；及び（ｂ）前記抗体を精製すること
【０１８０】
実施形態２２．１つ又は複数の実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０１８１】
実施形態２３．実施形態１、２、５、７、又は８のいずれか１つに記載のヒト化１Ｂ７抗体及び実施形態３、４、６、９、又は１０のいずれか１つに記載のヒト化１１Ｅ６抗体を含む、実施形態２２に記載の医薬組成物。
【０１８２】
実施形態２４．前記組成物は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、又はリポソームとして製剤化される、実施形態２３に記載の医薬組成物。
【０１８３】
実施形態２５．前記組成物は、経口、鼻腔内、肺、皮内、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内送達のために処方される、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１８４】
実施形態２６．百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の前記抗体又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物を投与することを含む方法。
【０１８５】
実施形態２７．百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、実施形態１、２、５、７、又は８のいずれか１つに記載の前記ヒト化１Ｂ７抗体の有効量及び実施形態３、４、６、９又は１０のいずれか１つに記載の前記ヒト化１１Ｅ６抗体の有効量を、共投与することを含む方法。
【０１８６】
実施形態２８．前記ヒト化１Ｂ７抗体及び前記ヒト化１１Ｅ６抗体は、前記患者に同時に投与される、実施形態２７に記載の方法。
【０１８７】
実施形態２９．前記ヒト化１Ｂ７抗体は、前記ヒト化１１Ｅ６抗体を前記患者に投与する前に、前記患者に投与される、実施形態２７に記載の方法。
【０１８８】
実施形態３０．前記ヒト化１Ｂ７抗体は、前記ヒト化１１Ｅ６抗体を前記患者に投与した後に、前記患者に投与される、実施形態２７に記載の方法。
【０１８９】
実施形態３１．前記ヒト化１Ｂ７抗体と前記ヒト化１１Ｅ６抗体の共投与は相乗効果を生み出す、実施形態２７に記載の方法。
【０１９０】
実施形態３２．百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、少なくとも１つの実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物、及び抗菌剤を共投与することを含む方法。
【０１９１】
実施形態３３．前記抗菌剤は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ロキシスロマイシン、ケトライド、アンピシリン、アモキシシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、フルオロキノロン、及びセファロスポリンから選択される、実施形態３３に記載の方法。
【０１９２】
実施形態３４．前記患者はヒトである、実施形態２６〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
実施形態３５．前記ヒトは幼児である、実施形態３４に記載の方法。
【０１９４】
実施形態３６．百日咳菌に以前にさらされた対象の百日咳菌感染を予防する方法であって、前記対象に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の前記抗体の有効量又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法。
【０１９５】
実施形態３７．前記方法は白血球数の低減を含む、実施形態２６〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
実施形態３８．前記方法は、咳の持続時間及び／又は頻度の低減を含む、実施形態２６〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
実施形態３９．前記方法は、鼻咽頭及び／又は肺における百日咳菌レベルの低減を含む、実施形態２６〜３８のいずれか1つに記載の方法。
【０１９８】
実施形態４０．前記百日咳毒素タンパク質は中和される、実施形態２６〜３９のいずれか1項に記載の方法。
【０１９９】
実施形態４１．前記百日咳毒素タンパク質は細胞受容体への結合を防止される、実施形態４０に記載の方法。
【０２００】
実施形態４２．前記百日咳毒素タンパク質は細胞サイトゾルに到達するのを防止される、実施形態４０に記載の方法。
【０２０１】
実施形態４３．パラ百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の前記抗体の有効量又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法。
【０２０２】
実施形態４４．パラ百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、実施形態１、２、５、７、又は８のいずれか１つに記載の前記ヒト化１Ｂ７抗体の有効量及び実施形態３、４、６、９又は１０のいずれか１つに記載の前記ヒト化１１Ｅ６抗体の有効量を、共投与することを含む方法。
【０２０３】
実施形態４５．百日咳菌に以前にさらされた対象のパラ百日咳菌感染を予防する方法であって、前記対象に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の前記抗体の有効量又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法。
【０２０４】
Ｐ１  実施形態
実施形態１．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、及び配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【０２０５】
実施形態２．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、以下から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；並びに（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域。
【０２０６】
実施形態３．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、前記免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【０２０７】
実施形態４．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、以下から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体：（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域；並びに（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域。
【０２０８】
実施形態５．前記抗体は、３ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、実施形態１又は２に記載の抗体。
【０２０９】
実施形態６．前記抗体は、１２ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、実施形態３又は４に記載の抗体。
【０２１０】
実施形態７．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１Ｂ７抗体であって、前記抗体は３ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、抗体。
【０２１１】
実施形態８．前記ＫＤは約３ｎＭ、又は約２ｎＭ、又は約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭである、実施形態６に記載の抗体。
【０２１２】
実施形態９．百日咳毒素タンパク質と結合するヒト化１１Ｅ６抗体であって、前記抗体は１２ｎＭ以下のＫＤで前記百日咳毒素タンパク質と結合する、抗体。
【０２１３】
実施形態１０．前記ＫＤは約１２ｎＭ、又は約１０ｎＭ、又は約８ｎＭ、又は約６ｎＭ、約４ｎＭ、又は約２ｎＭ、又は約１ｎＭ、又は約０．５ｎＭである、実施形態９に記載の抗体。
【０２１４】
実施形態１１．実施形態１〜１０のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【０２１５】
実施形態１２．実施形態１〜１０のいずれか１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【０２１６】
実施形態１３．実施形態１１に記載の前記核酸を含有する発現ベクター。
【０２１７】
実施形態１４．実施形態１２に記載の前記核酸を含有する発現ベクター。
【０２１８】
実施形態１５．実施形態１１に記載の前記核酸をさらに含む、実施形態１４に記載の発現ベクター。
【０２１９】
実施形態１６．実施形態１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０２２０】
実施形態１７．実施形態１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０２２１】
実施形態１８．実施形態１５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【０２２２】
実施形態１９．実施形態１３に記載の前記発現ベクターをさらに含む、実施形態１７に記載の宿主細胞。
【０２２３】
実施形態２０．免疫グロブリン重鎖可変領域又は免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを産生する方法であって、以下を含む方法：（ａ）前記宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを発現するような条件下で、実施形態１６又は１７に記載の前記宿主細胞を増殖させること；及び（ｂ）前記免疫グロブリン重鎖可変領域又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む前記ポリペプチドを精製すること。
【０２２４】
実施形態２１．百日咳毒素タンパク質と結合する抗体を産生する方法であって、前記方法は以下を含む方法：（ａ）前記宿主細胞が前記免疫グロブリン重鎖可変領域及び／又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現するような条件下で、実施形態１８又は１９に記載の前記宿主細胞を増殖させ、それによって前記抗体を産生すること；及び（ｂ）前記抗体を精製すること
【０２２５】
実施形態２２．１つ又は複数の実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【０２２６】
実施形態２３．実施形態１、２、５、７、又は８のいずれか１つに記載のヒト化１Ｂ７抗体及び実施形態３、４、６、９、又は１０のいずれか１つに記載のヒト化１１Ｅ６抗体を含む、実施形態２２に記載の医薬組成物。
【０２２７】
実施形態２４．前記組成物は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、又はリポソームとして製剤化される、実施形態２３に記載の医薬組成物。
【０２２８】
実施形態２５．前記組成物は、経口、鼻腔内、肺、皮内、経皮、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内送達のために処方される、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０２２９】
実施形態２６．百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の前記抗体又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物を投与することを含む方法。
【０２３０】
実施形態２７．百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、実施形態１、２、５、７、又は８のいずれか１つに記載の前記ヒト化１Ｂ７抗体の有効量及び実施形態３、４、６、９又は１０のいずれか１つに記載の前記ヒト化１１Ｅ６抗体の有効量を、共投与することを含む方法。
【０２３１】
実施形態２８．前記ヒト化１Ｂ７抗体及び前記ヒト化１１Ｅ６抗体は、前記患者に同時に投与される、実施形態２７に記載の方法。
【０２３２】
実施形態２９．前記ヒト化１Ｂ７抗体は、前記ヒト化１１Ｅ６抗体を前記患者に投与する前に、前記患者に投与される、実施形態２７に記載の方法。
【０２３３】
実施形態３０．前記ヒト化１Ｂ７抗体は、前記ヒト化１１Ｅ６抗体を前記患者に投与した後に、前記患者に投与される、実施形態２７に記載の方法。
【０２３４】
実施形態３１．前記ヒト化１Ｂ７抗体と前記ヒト化１１Ｅ６抗体の共投与は相乗効果を生み出す、実施形態２７に記載の方法。
【０２３５】
実施形態３２．百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、少なくとも１つの実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物、及び抗菌剤を共投与することを含む方法。
【０２３６】
実施形態３３．前記抗菌剤は、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ロキシスロマイシン、ケトライド、アンピシリン、アモキシシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、フルオロキノロン、及びセファロスポリンから選択される、実施形態３３に記載の方法。
【０２３７】
実施形態３４．前記患者はヒトである、実施形態２６〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
実施形態３５．前記ヒトは幼児である、実施形態３４に記載の方法。
【０２３９】
実施形態３６．百日咳菌に以前にさらされた対象の百日咳菌感染を予防する方法であって、前記対象に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の前記抗体の有効量又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法。
【０２４０】
実施形態３７．前記方法は白血球数の低減を含む、実施形態２６〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
実施形態３８．前記方法は、咳の持続時間及び／又は頻度の低減を含む、実施形態２６〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
実施形態３９．前記方法は、鼻咽頭及び／又は肺における百日咳菌レベルの低減を含む、実施形態２６〜３８のいずれか1つに記載の方法。
【０２４３】
実施形態４０．前記百日咳毒素タンパク質は中和される、実施形態２６〜３９のいずれか1項に記載の方法。
【０２４４】
実施形態４１．前記百日咳毒素タンパク質は細胞受容体への結合を防止される、実施形態４０に記載の方法。
【０２４５】
実施形態４２．前記百日咳毒素タンパク質は細胞サイトゾルに到達するのを防止される、実施形態４０に記載の方法。
【０２４６】
実施形態４３．パラ百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の前記抗体の有効量又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法。
【０２４７】
実施形態４４．パラ百日咳菌に感染した患者を治療する方法であって、前記患者に、実施形態１、２、５、７、又は８のいずれか１つに記載の前記ヒト化１Ｂ７抗体の有効量及び実施形態３、４、６、９又は１０のいずれか１つに記載の前記ヒト化１１Ｅ６抗体の有効量を、共投与することを含む方法。
【０２４８】
実施形態４５．百日咳菌に以前にさらされた対象のパラ百日咳菌感染を予防する方法であって、前記対象に、実施形態１〜１０のいずれかに記載の前記抗体の有効量又は実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の前記医薬組成物の有効量を、投与することを含む方法。
【０２４９】
実施形態４６．本明細書に開示の組成物。
【０２５０】
実施形態４７．本明細書に記載の以下の１つ又は複数の任意の組成物の使用：百日咳の治療及び百日咳の治療のための医薬の製造。
【図１】
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【図２】
0006588922.tif 000009
【図３】
0006588922.tif 000010
【図４】
0006588922.tif 000011
【図５】
0006588922.tif 000012
【図６Ａ−６Ｄ】
0006588922.tif 000013
【図７】
0006588922.tif 000014
【図８】
0006588922.tif 000015
【図９】
0006588922.tif 000016
【図１０】
0006588922.tif 000017
【図１１】
0006588922.tif 000018
【図１２】
0006588922.tif 000019
【図１３】
0006588922.tif 000020
【図１４】
0006588922.tif 000021
【図１５】
0006588922.tif 000022
【図１６Ａ−１６Ｂ】
0006588922.tif 000023
【図１７】
0006588922.tif 000024
【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ−２０Ｂ】
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【図２１Ａ−２１Ｂ】
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【配列表】
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