(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が膠芽腫を患っている可能性を試験する方法であって、
（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
（２）工程（１）の測定結果を、ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いという基準と比較する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（２）において、ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いという基準と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者が、膠芽腫が疑われている者である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
被験者が、膠芽腫が疑われていない者である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
血液サンプルが血清サンプルである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ネスチン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＥＬＩＳＡ法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経膠腫（glioma）は脳に発生する悪性腫瘍の一つであり、全頭蓋内腫瘍の約２５％を占めている。
神経膠腫には多様な種類が存在するが、世界保健機関（ＷＨＯ）による分類が世界的に用いられている（非特許文献１）。ＷＨＯ分類は悪性度に基づいており、各神経膠腫がグレード１（悪性度が最も低い）〜グレード４（悪性度が最も高い）に分類されている。そして、各神経膠腫の治療方針も、このグレードに基づいて定められている。
膠芽腫（glioblastoma）は、ＷＨＯ分類でグレード４に分類される神経膠腫の一つである。膠芽腫は進行が早いため、膠芽腫であることを正確に判定し、膠芽腫に適した治療を開始することが患者の予後にとって重要である。【０００３】
膠芽腫の確定診断は、ＣＴやＭＲＩにより膠芽腫が疑われている被験者から採取した脳組織を病理医が顕微鏡で観察（病理組織検査）することにより行われている。その際、診断の精度を高めるための補助的手段として、採取した脳組織中の細胞をネスチン（nestin）で染色することが行われている。具体的には、神経膠腫組織細胞のネスチン染色性と神経膠腫の悪性度とが相関していることに基づき、免疫組織化学染色法を用いた脳組織細胞のネスチン染色結果を、膠芽腫の診断で補助的に使用している（非特許文献２）。
尚、ネスチンが血液等の細胞外に存在することは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Acta Neuropathol (2007) 114:97-109
【非特許文献２】Brain Tumor Pathol (2012) 29:160-167
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、被験者から採取した脳組織細胞をネスチン染色する方法は、複雑な免疫組織化学染色操作を必要とするため、結果を得るまでに時間がかかる。更に、この方法では、膠芽腫とは異なる疾患である転移性脳腫瘍や悪性リンパ腫との鑑別が困難であることが少なくない。
また、脳組織の採取は、被験者に対する侵襲性が大きく、危険性も少なくないため、通常の健康診断において膠芽腫の検査は行われていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、被験者に対する侵襲性や危険性が低く、簡便、迅速かつ正確に膠芽腫の発症を予測できる手段について鋭意検討したところ、被験者の血液中のネスチン濃度が膠芽腫の発症と関連していることを見いだした。本発明は、この知見に基づいてなされたものである。【０００７】
すなわち、本発明は、下記１〜１１に関するものである。
１.被験者における膠芽腫の発症を予測する方法であって、
（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
を含むことを特徴とする方法。
２.工程（２）において、ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する、前記１に記載の方法。
３.被験者が、膠芽腫が疑われている者である、前記１又は２に記載の方法。
４.被験者が、膠芽腫が疑われていない者である、前記１〜３のいずれかに記載の方法。
５.血液サンプルが血清サンプルである、前記１〜４のいずれかに記載の方法。
６.ネスチン濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
７.ＥＬＩＳＡ法がサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、前記６に記載の方法。
８.膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキット。
９.膠芽腫の発症を予測するためのキットであって、
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
ネスチン濃度が１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキット。
１０.ネスチン濃度を測定する試薬がネスチン抗体を含む、前記８又は９に記載のキット。
１１.ネスチン濃度を測定する試薬がＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬を更に含む、前記１０に記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、後述する実施例で示されるように、被験者に対する侵襲性や危険性が低い手段により入手可能な血液を用いて膠芽腫の発症を簡便、迅速かつ正確に予測することができる。したがって、本発明を用いることにより、他の検査（例えば、ＣＴやＭＲＩ等）により膠芽腫が疑われている被験者に対しては迅速かつ正確な膠芽腫の診断が可能になる。
更に、本発明を用いることにより、通常の健康診断の際に膠芽腫の検査を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は実施例１の結果である。図１は、膠芽腫患者（グループ４）、グレート４以外の神経膠腫患者（グループ２及び３）、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者（グループ５）及び健常者（グループ０）に由来する血清サンプル中のネスチン濃度を示す図である。
【図２】図２は実施例２の結果である。図２は、膠芽腫患者（グループ４）、グレート４以外の神経膠腫患者（グループ２及び３）、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者（グループ５）及び健常者（グループ０）に由来する血清サンプル中のネスチン濃度を示す図である。
【図３】図３は、実施例２のグループ０（健常者）とグループ４（膠芽腫）のデータを用いて作成した、血清ネスチン濃度に関するROC曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の、被験者における膠芽腫の発症を予測する方法は、下記の工程：
（１）被験者由来の血液サンプル中のネスチン濃度を測定する工程、及び、
（２）ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する工程
を含んでいる。
【００１１】
工程（１）
膠芽腫（glioblastoma）は、神経膠細胞から発生する神経膠腫である。ＷＨＯ分類では、グレード４に分類されている悪性度の高い神経膠腫である。膠芽腫は、４５〜６５歳の男性の大脳半球で多く発生することや、症状として頭痛、痙攣、性格変化、認知症や運動麻痺などがあることや、悪性度が高いため症状の進行が早いことが知られている。
被験者は、膠芽腫を発症する可能性のあるあらゆる動物が含むが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはヒトである。
被験者は、公知の膠芽腫の検査手段（例えば、ＣＴやＭＲＩ等）により膠芽腫が疑われている者であってもよく、膠芽腫が疑われていない者（例えば、通常の健康診断を受ける者）であってもよい。
また、被験者の性別や年齢は問わない。
【００１２】
被験者由来の血液サンプルの調製は、当該技術分野で一般的に用いられている手法を特に制限なく用いて行うことができる。
血液サンプルは、被験者から採取した血液をそのまま使用してもよいが、被験者から採取した血液を加工したもの（例えば、血清や血漿等）を使用することが好ましい。ネスチン濃度をより正確かつ迅速に測定できる点で、血清サンプルを用いることが好ましい。
血清サンプルの調製は、当該技術分野で一般的に用いられている手法を特に制限なく用いて行うことができる。例えば、被験者から血液（例えば静脈血）を採取し、これを室温下で静置（例えば３０分間）した後、遠心分離（例えば３５００ｒｐｍで１０分間）することで調製することができる。調製した血清サンプルは、本発明の方法に使用するまで凍結保存（例えば−８０℃）してもよい。
【００１３】
ネスチン（nestin）は、IV型中間系フィラメントに分類される公知の細胞骨格タンパク質である。また、ネスチンは、未分化の神経幹細胞では特異的に発現しているが、ニューロン（neuron）や星状膠細胞（astrocyte）へ分化すると発現が消失することが知られている。
血液サンプル中のネスチン濃度の測定は、当該技術分野で一般的に用いられているネスチン測定方法、検出方法や定量方法を特に制限なく用いて行うことができる。具体例としては、ネスチン特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay、酵素結合免疫吸着検定法）があり、これはネスチンに対する特異性が高くかつ定量性に優れている。
したがって、工程（１）は、当該技術分野で公知の血中ネスチン濃度測定手段、例えばネスチン抗体を含むネスチン検出キット、好ましくはネスチン用ＥＬＩＳＡキットを用いて実施することができる。
【００１４】
工程（１）に好適なＥＬＩＳＡ法としては、サンドイッチ法、直接吸着法が挙げられる。ネスチンに対する特異性が高い点でサンドイッチＥＬＩＳＡ法が好ましい。
例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法は下記の工程で行うことができる。
１．ネスチン抗体（捕獲抗体）を固相に吸着させる。
２．固相をブロッキングする。
３．ネスチンを含む血液サンプルを固相へ添加して、捕獲抗体とネスチンとのコンジュゲートを形成させる。
４．ビオチン標識されたネスチンに対する抗体（一次抗体）を固相へ添加して、捕獲抗体とネスチンと一次抗体とのコンジュゲートを形成させる。
５．アビジン標識された酵素を添加して、捕獲抗体とネスチンと一次抗体と酵素とのコンジュゲートを形成させる。
６．酵素基質を添加して、酵素反応生成物を検出する。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる一次抗体は、捕獲抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識するネスチンに対する抗体である。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いてネスチンを測定するキットは市販されており（例えば、商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan））、これらの市販品を特に制限なく工程（１）に用いることができる。
【００１５】
工程（２）
工程（２）では、工程（１）で測定された血液サンプル中のネスチン濃度に基づいて、被験者が膠芽腫を患っている可能性を予測する。具体的には、血液サンプル中のネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測する。
「１．００ｎｇ／ｍｌ以上」の値を用いると、膠芽腫と健常者とを識別することに加えて、更に膠芽腫と他の悪性腫瘍とを識別することができる。
【００１６】
本発明にしたがい得られた予測結果は、下記の様に利用することができる。
本発明を、ＣＴやＭＲＩにより膠芽腫が疑われている被験者に対して実施した場合、本発明により得られた予測結果を他の膠芽腫の診断基準（病理組織検査結果等）と組み合わせることにより、より迅速かつ正確な確定診断を行うことができる。また、被験者の健康状態等により脳組織の採取が困難な場合には、本発明による予測結果をより有効に活用することができる。
本発明を、膠芽腫が疑われていない者（例えば、通常の健康診断を受ける者）に対して実施した場合、本発明にしたがって得られた予測結果を用いて、膠芽腫に関する二次検査（精密検査）の要否を判定することができる。したがって、被験者に対する侵襲性及び危険性が低い血液サンプルを用い、かつ、簡便な手段で実施できる本発明を用いることで、従来は行われていなかった膠芽腫の検査を通常の健康診断における検査項目とすることができる。
【００１７】
更に本発明は、上述の膠芽腫の予測方法を行うためのキットに関する。具体的には、本発明の膠芽腫の発症を予測するためのキットは、
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬、及び、
ネスチン濃度が０．６３ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．００ｎｇ／ｍｌ以上である場合、被験者が膠芽腫を患っている可能性が高いと予測することを記載した説明書
を含むことを特徴とするキットである。
血液サンプル中のネスチン濃度を測定する試薬は、血液中のネスチンを検出し、定量するために当該技術分野で一般的に用いられているものを特に制限なく用いて行うことができる。具体例としては、ネスチン特異的抗体が挙げられる。
本発明のキットは、好ましくは、前述のＥＬＩＳＡ法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いるものである。この場合、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ法で用いられる試薬（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いられる固相ブロッキング剤、ネスチン抗体（捕獲抗体）、一次抗体、酵素や酵素基質等）を含むことができる。
【００１８】
次に、実施例により本発明の効果を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１
膠芽腫患者、グレート４以外の神経膠腫患者、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者及び健常者に由来する血液サンプル中のネスチン濃度を測定し、比較した。
（１）被験者
被験者を下記のグループに分類した。
グループ０
健常者ボランティア：１２名
グループ２
びまん性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：２名
グループ３
退形成性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：２名
退形成性乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：３名
グループ４
膠芽腫（ＷＨＯ分類でグレード４の神経膠腫）：６名
グループ５
転移性脳腫瘍（神経膠腫ではない疾患）：２名
悪性リンパ腫（神経膠腫ではない疾患）：１名
グループ０以外の各被験者は、2013年5月〜2013年12月の間に東京女子医大脳神経外科で開頭腫瘍摘出術又は生検術を受け、採取された脳組織の病理検査より各疾患に対する診断が確定した者であった。【００２０】
（２）血液サンプルの調製
各被験者から静脈血を採取し、室温下で３０分間静置した後、遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）することによって血清サンプルを調製した。調製した血清サンプルは、ネスチン濃度を測定するまで凍結保存（−８０℃）した。【００２１】
（３）ネスチン濃度の測定
凍結保存した血清サンプルを４℃で解凍した。次いで、市販のネスチン測定キット（商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan）を用い、キット添付のプロトコルに従いサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、血清サンプル中のネスチン濃度を測定した。
測定結果を図１に示す。【００２２】
各グループの血清ネスチン濃度の平均値は以下の通りであった。
0006613526.tif 000002
【００２３】
各グループ間の血清ネスチン濃度をStudent-t testを用いて統計学的に評価した。結果を以下に示す。
Student-t testでのペアごとの比較
0006613526.tif 000003
【００２４】
この統計学的評価結果は、グループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度が、他のグループの血清ネスチン濃度に対して有意差（p<0.05）があることを示している。【００２５】
上記の結果より、グループ４（膠芽腫）の血清サンプル中のネスチン濃度の平均値０．９９７６ｎｇ／ｍｌよりも大きい血清ネスチン濃度値「１．００ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と他の悪性腫瘍及び健常者とを識別することができることが理解される。【００２６】
実施例２
膠芽腫患者、グレート４以外の神経膠腫患者、神経膠腫以外の悪性腫瘍患者及び健常者に由来する血液サンプル中のネスチン濃度を測定し、比較した。
（１）被験者
被験者を下記のグループに分類した。
グループ０
健常者ボランティア：２７名
グループ２
びまん性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：１名
乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：１名
乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード２の神経膠腫）：３名
グループ３
退形成性星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：１名
退形成性乏突起膠星細胞腫（ＷＨＯ分類でグレード３の神経膠腫）：２名
グループ４
膠芽腫（ＷＨＯ分類でグレード４の神経膠腫）：２８名
グループ５
悪性リンパ腫（神経膠腫ではない疾患）：４名
グループ０以外の各被験者は、2013年5月〜2014年6月の間に東京女子医大脳神経外科で開頭腫瘍摘出術又は生検術を受け、採取された脳組織の病理検査より各疾患に対する診断が確定した者であった。【００２７】
（２）血液サンプルの調製
各被験者から静脈血を採取し、室温下で３０分間静置した後、遠心分離（３５００ｒｐｍで１０分間）することによって血清サンプルを調製した。調製した血清サンプルは、ネスチン濃度を測定するまで凍結保存（−８０℃）した。【００２８】
（３）ネスチン濃度の測定
凍結保存した血清サンプルを４℃で解凍した。次いで、市販のネスチン測定キット（商品名：SEA500Hu（Uscn Life Science Inc. Wuhan）を用い、キット添付のプロトコルに従いサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、血清サンプル中のネスチン濃度を測定した。
測定結果を図２に示す。【００２９】
各グループの血清ネスチン濃度の平均値は以下の通りであった。
0006613526.tif 000004
【００３０】
各グループ間の血清ネスチン濃度をStudent-t testを用いて統計学的に評価した。結果を以下に示す。
Student-t testでのペアごとの比較
0006613526.tif 000005
※片側検定では、p値は上記p値の半分の値になるので、4-0比較では、図２に示すとおりp=0.0045となった。【００３１】
この統計学的評価結果は、グループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度が、他のグループの血清ネスチン濃度に対して有意差（p<0.05）があることを示している。【００３２】
上記の結果より、血清ネスチン濃度値「１．００ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と他の悪性腫瘍及び健常者とを識別することができることが理解される。【００３３】
次に、グループ０（健常者）とグループ４（膠芽腫）の血清ネスチン濃度のデータを用いてROC曲線を作成した（図３）。ROC曲線は検査の信頼度を示す。ROC曲線において、Y軸の「感度（陽性率）」は、膠芽腫に罹患している集団に対して検査を行ったとき陽性（異常値）を示す割合を示し、X軸の「1-特異度（偽陽性率）」は、膠芽腫でない健常者（陰性）を陽性として検出してしまう割合を示す。したがって、ある検査法のROC曲線の曲線下面積（AUC）が1に近いほど、当該検査法の信頼性は高くなる。実施例２のROC曲線のAUCは０．８５であった。この結果より、血清ネスチン濃度を指標とする本発明は、膠芽腫の発症予測に関して信頼性の高い方法であることが理解される。
更に、統計ソフトJMP Pro11を用いてカットオフ値（膠芽腫発症予測において陽性と陰性とを分ける値）を算出したところ、カットオフ値となる血清ネスチン濃度は０．６３ｎｇ／ｍｌであった。この結果より、血清ネスチン濃度値「０．６３ｎｇ／ｍｌ」を指標として、膠芽腫と健常者とを識別することができることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、膠芽腫の発症を予測することができる。したがって、本発明は、膠芽腫の診断に利用することができる。
【図１】
0006613526.tif 000006
【図２】
0006613526.tif 000007
【図３】
0006613526.tif 000008