(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)シャペロン介在性オートファジー(CMA)ターゲティングシグナルドメイン;
(b)神経変性疾患、脊髄損傷、脳卒中、脳外傷、アルコール依存症、及びアルコール離脱からなる群から選択される疾患の発病に関与する標的の細胞質タンパク質に選択的に結合するタンパク質結合ドメイン;
及び
(c)細胞膜透過ドメイン:
を含むペプチドであって、前記CMAターゲティングシグナルドメインが、KFERQKILDQRFFEのアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
細胞膜透過ドメインのアミノ酸配列が:
HIV-1 Tatタンパク質のタンパク質形質導入ドメイン, GRKKRRQRRRPPQ;
Antp (Drosophila アンテナぺディア-(アミノ酸 43-58)), RQIKWFQNRRMKWKK;
Buforin II, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK;
hClock-(アミノ酸 35-47) (ヒトClockタンパク質 DNA結合ペプチド), KRVSRNKSEKKRR;
MAP (モデル両親媒性ペプチド), KLALKLALKALKAALKLA;
K-FGF, AAVALLPAVLLALLAP;
Ku70に由来したペプチドであって、VPMLKE、VPMLK、PMLKE又はPMLKを含む群から選択されたペプチドを含むペプチド;
プリオン, Mouse Prpe(アミノ酸 1-28), MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP;
pVEC, LLIILRRRIRKQAHAHSK;
Pep-I, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV;
SynBl, RGGRLSYSRRRFSTSTGR;
トランスポータン, GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;
トランスポータン-l0, AGYLLGKINLKALAALAKKIL;
CADY, Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-システアミド;
Pep-7, SDLWEMMMVSLACQY;
HN-l, TSPLNIHNGQKL;
VT5, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD;
又は
pISL, RVIRVWFQNKRCKDKK
と少なくとも90%、95%又は99%の同一性を有することを特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが配列番号4のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項４】
ペプチドが配列番号4に対して少なくとも90%、95%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項５】
標的タンパク質が、細胞内の内在性のタンパク質であることを特徴とし、及びペプチドが、内在性標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させる目的のものであることを特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項６】
標的タンパク質が、細胞質タンパク質キナーゼであることを特徴とする、請求項１のペプチド。
【請求項７】
細胞質タンパク質キナーゼが、活性型であることを特徴とする、請求項６のペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、動物への全身投与を目的とするものであることを特徴とする、請求項５のペプチド。
【請求項９】
動物において、内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるための薬剤の製造における、請求項５記載のペプチドの使用。
【請求項１０】
動物において、内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させることにおける使用のための、請求項５記載のペプチド。
【請求項１１】
動物の疾患を治療するため、前記動物における内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるための、薬剤の製造における請求項５記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
動物の疾患を治療するため、前記動物における内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させることにおける使用のための、請求項５記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１のペプチド及び医薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬的に活性のある剤と共投与されることを特徴とする、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
(a)シャペロン介在性オートファジー(CMA)ターゲティングシグナルドメイン;
(b)標的タンパク質に選択的に結合するタンパク質結合ドメイン;
及び
(c)細胞膜形質導入ドメイン;
を含むペプチドを含む組成物であって、前記CMAターゲティングシグナルドメインが、KFERQKILDQRFFEのアミノ酸配列を含み、それを必要とする動物において、内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるための組成物。
【請求項１６】
標的タンパク質が、細胞質タンパク質キナーゼであることを特徴とする、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
細胞質タンパク質キナーゼが、活性型であることを特徴とする、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
細胞質タンパク質キナーゼが、細胞死関連タンパク質キナーゼ１(DAPK1)であることを特徴とする、請求項１６の組成物。
【請求項１９】
DAPK1が活性型であることを特徴とする、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
(a)シャペロン介在性オートファジー(CMA)ターゲティングシグナルドメイン;(b)標的タンパク質に選択的に結合するタンパク質結合ドメイン;及び(c)細胞膜形質導入ドメイン:を含むペプチドであって、前記CMAターゲティングシグナルドメインが、KFERQKILDQRFFEのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、動物における標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるための組成物。
【請求項２１】
標的タンパク質の細胞内発現レベルの減少が、可逆的であることを特徴とする、請求項２０の組成物。
【請求項２２】
(a)シャペロン介在性オートファジー(CMA)ターゲティングシグナルドメイン;(b)内在性の標的タンパク質に選択的に結合するタンパク質結合ドメイン;及び(c)細胞膜形質導入ドメイン:を含むペプチドであって、前記CMAターゲティングシグナルドメインが、KFERQKILDQRFFEのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、動物の病態を治療するための組成物であって、ペプチドが内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させることを特徴とする、組成物。
【請求項２３】
病態が神経変性疾患であることを特徴とする、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
神経変性疾患がアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病又はハンチントン病であることを特徴とする、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
病態が脊髄損傷、脳卒中、脳外傷、アルコール依存症又はアルコール離脱であることを特徴とする、請求項２２の組成物。
【請求項２６】
病態が細胞死に関連する疾患であることを特徴とする、請求項２２の組成物。
【請求項２７】
ペプチドが、シャペロン介在性オートファジー(CMA)分解を用いた、α-シヌクレインの細胞内発現レベルを減少させるためのものであることを特徴とする、
(a)CMAターゲティングシグナルドメイン;
(b)α-シヌクレインに選択的に結合するβ-シヌクレイン(βsyn36)のアミノ酸配列;
及び
(c)細胞膜透過ドメイン:
を含むペプチドであって、前記CMAターゲティングシグナルドメインが、KFERQKILDQRFFEのアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２８】
パーキンソン病の治療において使用するための、請求項２７のペプチド。
【請求項２９】
細胞の細胞質において、ペプチドが可溶型であることを特徴とする、請求項１のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、分子細胞生物学分野に属し、細胞でのタンパク質発現の調節に用いられ得る組換え核酸とタンパク質のコンストラクトに関する。特に、本発明の態様は、分解のため標的タンパク質をリソソームに誘導するコンストラクトを用いた内在性の細胞タンパク質のペプチドに仲介されたノックダウンに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
内在性タンパク質の発現レベルを変化させるための迅速かつ可逆的な方法は、複雑な生物学的システムを研究するための不可欠なツールとなるだけでなく、多くの疾患の治療のための新しい治療法の開発を潜在的に駆り立て得る。DNA又はmRNAを標的とすることによって、タンパク質の発現と機能を操作する技術は強力なツールであると判明しているが、しかし特異性、スピード、可逆性、及び同調性の欠失といった問題にしばしば悩まされる1。その上、人間の疾患の治療でのそれらの治療上の使用は効率的な全身の送達システムの欠失よって妨害される場合がある2。
【０００３】
DNAとmRANを基にしたタンパク質の操作の欠点を解決するため2、目的のタンパク質のレベルを減少させる、細胞内タンパク質分解系を利用する試みが行われている3-6。これらの提案されたシステムの多くは、特定の細胞内タンパク質の分解系を経由した、タンパク質のターゲティングと分解を促進するために、タンパク質の遺伝的な操作を必要とする1。
【０００４】
細胞膜透過ドメイン（cell membrane penetrating domains）(CMPDs)(細胞透過ペプチド（cell-penetrating peptides）(CPPs)又はタンパク質形質導入ドメイン(protein transduction domain)(PTDs)ともよばれる)は、HIV-1ウイルス由来のTat タンパク質や、Drosophila melanogasterのアンテナペディアホメオドメイン(Antennapedia homeodomain)のような、細胞膜を横切った移行を仲介するタンパク質のドメインである38,39,40。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
一態様において、本発明は内在性のリソソーム依存の自食作用系、すなわちシャペロン介在性オートファジー(chaperone-mediated autophagy)(CMA)（図１a）を利用することによって、非遺伝的に修飾された、ネイティブタンパク質の迅速かつ可逆的なノックダウンを引き起こすことができる、ペプチドを基にした系に関する。CMAは、分子ごとを基礎とする、基質タンパク質の選択的な取込みを起こす自食作用の型である。この特異性は、いくつかの例が、ペンタペプチドモチーフKFERQに関する場合のある、CMAターゲティングシグナル(CMA-targeting signal)(CTS)によって実現されている。CTSはCMAの誘発に必要であり、そして今までCMAのすべての基質タンパク質で見つかっている。標的とされたタンパク質の分解を目的とし、CMAを利用するため、本発明のペプチドは、標的タンパク質を特異的に認識し結合できる、タンパク質結合ドメイン(protein binding domain)を含むが、これは分解のためにリソソームの内部に、ペプチド−タンパク質複合体を送達することができる、CTSが融合されている。本発明の前記ペプチドは、細胞膜を横切ってペプチドを送達することができる、細胞膜透過ドメイン(cell membrane penetrating domain)(CMPD)をさらに含んでいてもよい（実施例を図１に示した）。CMPDは、HIV-1 Tatタンパク質、GRKKRRQRRRPPQ; Drosophila melanogasterアンテナペディアドメイン（Antennapedia domain） Antp (アミノ酸 43-58), RQIKWFQNRRMKWKK; Buforin II, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK; hClock-(アミノ酸 35-47) (ヒトClockタンパク質DNA結合ペプチド), KRVSRNKSEKKRR; MAP (モデル両親媒性ペプチド(model amphipathic peptide)), KLALKLALKALKAALKLA; K-FGF, AAVALLPAVLLALLAP; Ku70に由来したペプチドであって、VPMLKE、VPMLK、PMLKE又はPMLKを含む群から選択されたペプチドを含むペプチド; プリオン, Mouse Prpe (アミノ酸 1-28), MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP; pVEC, LLIILRRRIRKQAHAHSK; Pep-I, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; SynBl, RGGRLSYSRRRFSTSTGR; トランスポータン(Transportan), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; トランスポータン-10, AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY, Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-システアミド(cysteamide); Pep-7, SDLWEMMMVSLACQY; HN-l, TSPLNIHNGQKL; VT5, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD; pISL, RVIRVWFQNKRCKDKK又は他の知られた任意のCMPDのタンパク質形質導入ドメインであり得る。
【０００６】
このように、本発明の一態様は、タンパク質結合ドメインが、細胞内の環境におけるノックダウンターゲティングペプチドと、内在性のタンパク質との接触が、内在性のタンパク質のリソソーム分解を引き起こすように、内在性のタンパク質に対して、選択的に結合することができるポリペプチド配列であることを特徴とする、前記タンパク質結合ドメイン(PBD)と融合されたCMAターゲティングシグナル(CTS)を含む、ノックダウンターゲティングペプチド組成物が提供される。前記ターゲティングペプチド組成物は、細胞膜透過ドメイン(CPMD)をさらに含んでいてもよい。前記CPMDはHIV-1 Tatタンパク質, GRKKRRQRRRPPQ; Drosophila melanogaster アンテナペディアドメイン Antp (アミノ酸 43-58), RQIKWFQNRRMKWKK; Buforin II, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK; hClock-(アミノ酸 35-47) (ヒトClockタンパク質DNA結合ペプチド), KRVSRNKSEKKRR; MAP (モデル両親媒性ペプチド), KLALKLALKALKAALKLA; K-FGF, AAVALLPAVLLALLAP; Ku70に由来したペプチドであって、VPMLKE、VPMLK、PMLKE又はPMLKを含む群から選択されたペプチドを含むペプチド;プリオン, Mouse Prpe (アミノ酸 1-28), MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP; pVEC, LLIILRRRIRKQAHAHSK; Pep-I, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; SynBl, RGGRLSYSRRRFSTSTGR;トランスポータン, GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; トランスポータン-l0, AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY, Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-システアミド; Pep-7, SDLWEMMMVSLACQY; HN-l, TSPLNIHNGQKL; VT5, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD; pISL, RVIRVWFQNKRCKDKK、又は他の知られた、任意のCMPDのタンパク質形質導入ドメインであり得る。
【０００７】
従って、本発明はCMAターゲティングシグナルドメイン(targeting signal domain)、標的タンパク質に選択的に結合するタンパク質結合ドメイン、及び細胞膜透過ドメインを含むペプチドを提供する。本発明の一態様において、標的タンパク質は内在性の標的タンパク質である。別の態様において、ペプチドは内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるため、動物に全身的に投与される。
【０００８】
本発明の別の態様において、in vitro又はin vivoでの、細胞内の標的タンパク質の発現レベルを減少させるための方法（それを必要とする動物において）が提供される。In vitroで用いられる際には、方法は標的タンパク質と、CTSドメインと標的タンパク質に選択的に結合するPBDを含むペプチドとの共発現を含む。In vivoでの方法は、本明細書に記述された、CTSドメイン、標的タンパク質に選択的に結合するPDB、及び細胞膜透過ドメインを含むペプチドの、それを必要とする動物に対する投与を含む。
【０００９】
またin vitro又はin vivoでの、標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるためのCTSドメイン、標的タンパク質に選択的に結合するPBD、及び細胞膜透過ドメインを含むペプチドの使用が提供される。また標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるための、薬剤の製造における、本明細書に記述されたペプチドの使用が提供される。別の態様において、in vitro又はinvivoでの標的タンパク質の発現レベルを減少させることにおいて使用するための本明細で記述されたペプチドが提供される。
【００１０】
本発明の別の態様において、特定の内在性のタンパク質の細胞内発現を、ノックダウンすることが望まれる疾患の治療方法、すなわちタンパク質結合ドメイン(PBD)が、内在性のタンパク質に選択的に結合する能力のあるポリペプチドの配列であることを特徴とする、ノックダウンターゲティングペプチドが、前記タンパク質結合ドメインに融合された、CMA-ターゲティングシグナル(CMA-targeting signal)(CTS)を含むことを特徴する、そのような疾患を有する、又は有すると疑われる被験体に、前記ノックダウンペプチドの治療有効量を投与することを含む方法が提供される。前記ノックダウンターゲティングペプチドは、細胞膜を横切ってペプチドを送達することができる細胞膜透過ドメイン(CMPD)をさらに含んでいてもよい。前記CMPDはHIV-1 Tatタンパク質, GRKKRRQRRRPPQ; Drosophila melanogaster アンテナペディアドメインAntp (アミノ酸 43-58), RQIKWFQNRRMKWKK; Buforin II, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK; hClock-(アミノ酸 35-47) (ヒトClockタンパク質DNA結合ペプチド), KRVSRNKSEKKRR; MAP (モデル両親媒性ペプチド), KLALKLALKALKAALKLA; K-FGF, AAVALLPAVLLALLAP; Ku70に由来したペプチドであって、VPMLKE、VPMLK、PMLKE又はPMLKを含む群から選択されたペプチドを含むペプチド; プリオン, Mouse Prpe (アミノ酸 1-28), MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP; pVEC, LLIILRRRIRKQAHAHSK; Pep-I, KETWWETWWTEWSQPKKKRKV; SynBl, RGGRLSYSRRRFSTSTGR; トランスポータン, GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL; トランスポータン-l0, AGYLLGKINLKALAALAKKIL; CADY, Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-システアミド; Pep-7, SDLWEMMMVSLACQY; HN-l, TSPLNIHNGQKL; VT5, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD; pISL, RVIRVWFQNKRCKDKK;、又は他の知られた任意のCMPDのタンパク質形質導入ドメインであり得る。
【００１１】
別の態様において、動物の疾患を治療するため動物の内在性の標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させることを目的として、CTSドメイン、内在性の標的タンパク質に選択的に結合するPBD、及び細胞膜透過ドメインを含むペプチドの使用が提供される。動物の疾患を治療するため、内在性の標的タンパク質の、細胞内発現レベルを減少させるための薬剤の製造において、本明細書に記述されたペプチドの使用も提供される。別の態様において、動物の疾患を治療するため内在性の標的タンパク質の、細胞内発現レベルを減少させることにおいて使用するための本明細書に記述されたペプチドが提供される。
【００１２】
内在性タンパク質をノックダウンすることが望まれる疾患の代替の治療法を研究するため、in vivo又はin vitroでの調査用途（すなわち非臨床的な）の目的で、本明細書に記述された化合物は使用される場合がある。その上、これらの単離されたポリペプチドは、リソソームでの分解のメカニズム、単離されたポリペプチドをコードしている核酸、培養で維持される細胞、及び／又は動物モデルを調査するためのin vitro 又はin vivoの研究のため、個々に又はキットの部品として使用される場合がある。
【００１３】
内在性の標的タンパク質は、結合パートナーを持つ、又は結合ドメイン配列が知られた、若しくは入手することができる内在性の任意のネイティブタンパク質を含み得る。例えば、標的タンパク質は、α-シヌクレイン(α-synuclein)、シナプス後肥厚タンパク質95(Post Synaptic Density 95)(PSD95)、細胞死関連タンパク質キナーゼ1(death-associated protein kinase 1)(DAPK1)、又はペプチド結合ドメインが同定された、若しくは同定できる任意の細胞質タンパク質キナーゼ(cytosolic protein kinase)であり得る。
【００１４】
本発明は、従って、α-シヌクレイン(これはパーキンソン病のような神経変性のシヌクレイン症と関係したタンパク質である)をターゲティング及びノックダウンすることができる、新規のノックダウンターゲティングペプチド組成物に関する。１つの態様において、配列番号１に相当な類似性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、配列番号1に対して相当な類似性を有する単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があることを特徴とし、及び単離されたポリペプチドが、α-シヌクレインの分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号1のうちいずれかに対して少なくとも90%の同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があることを特徴とし、及び単離されたポリペプチドがα-シヌクレインの分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号1のうちいずれかに対して少なくとも95%の同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、配列番号1のうちいずれかを含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１５】
単離されたポリペプチドは、α-シヌクレインの分解又はノックダウンを引き起こす場合がある。前記単離されたポリペプチドはその上、前記単離されたポリペプチドに結合した送達及びターゲティング部分を含み得る。前記送達及びターゲティング部分はリガンド、タンパク質形質導入ドメイン、又は抗体の１つ以上から選択されてもよい。前記タンパク質形質導入ドメインはHIV-1 Tatタンパク質の細胞膜形質導入ドメインを含んでいてもよい。一態様において、配列番号2に対して相当な類似性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があることを特徴とし、及び単離されたポリペプチドが、α-シヌクレインの分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号2のうちいずれかに対して少なくとも90%の同一性を有する単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があることを特徴とし、及び単離されたポリペプチドが、α-シヌクレインの分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号2のうちいずれかに対して少なくとも95%の同一性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、配列番号2のいずれかを含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１６】
本発明の別の態様において、α-シヌクレインのレベルを減少させることが望まれる疾患を有し、又は有することが疑われる被験体の治療の方法、すなわち被験体にα-シヌクレインを標的とするノックダウンターゲティングペプチドの、治療有効量を投与することを含む方法が提供される。前記ペプチドは、α-シヌクレインの分解又はノックダウンを引き起こすことができる。前記ペプチドはその上、前記単離されたポリペプチドに結合した、送達及びターゲティング部分を含む場合がある。前記ノックダウンターゲティングペプチドは、配列番号1又は2に対して相当な類似性を有する場合がある。前記ノックダウンターゲティングペプチドは、配列番号1又は2に対して90%、95%、99%又は100%の同一性を有する場合がある。前記疾患はパーキンソン病であり得る。
【００１７】
本発明はまた、細胞質タンパク質キナーゼを選択的にターゲティング及びノックダウンできる能力のある、新規のノックダウンターゲティングペプチド組成物に関する。特定の実施形態において、本発明は活性化された細胞質タンパク質キナーゼの選択的なノックダウンに関する。例えば、前記タンパク質キナーゼは細胞死関連タンパク質キナーゼ1(DAPK1)であり得る。DAPK1はカルシウム−カルモジュリン制御性タンパク質キナーゼであり、不活性時にはN-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA)受容体のNR2Bサブユニットとは結合しない。DAPK1は多くの細胞型にある細胞死促進タンパク質キナーゼであり、興奮毒性／虚血性神経損傷又は酸化ストレスのような病態下での細胞死に必要とされることが、知られている。これらの過程は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)(ALS)のような様々な神経変性疾患、及び脳卒中のような他の状態と関係していることが知られている。一態様において、配列番号3に対して相当な類似性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があることを特徴とし、及び単離されたポリペプチドがDAPK1の分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号3のうちいずれかに対して少なくとも90%の同一性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があることを特徴とし、及び単離されたポリペプチドが、DAPK1の分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号3のうちいずれかに対して少なくとも95%の同一性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、配列番号3のうちいずれかを含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１８】
単離されたポリペプチドは、DAPK1の分解又はノックダウンを引き起こす場合がある。前記単離されたポリペプチドはその上、前記単離されたポリペプチドに結合された送達及びターゲティング部分を含む場合がある。前記送達及びターゲティング部分は、リガンド、タンパク質形質導入ドメイン、又は抗体の１つ以上から選択されてもよい。前記タンパク質形質導入ドメインは、HIV-1 Tatタンパク質の細胞膜形質導入ドメインであり得る。一態様において、配列番号4に対して相当な類似性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があること特徴とし、及び単離されたポリペプチドがDAPK1の分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号4のうちいずれかに対して少なくとも90%の同一性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、同一性が配列の全長にわたって計算される場合があること特徴とし、及び単離されたポリペプチドがDAPK1の分解を引き起こすことを特徴とする、配列番号4のうちいずれかに対して少なくとも95%の同一性を有する、単離されたポリペプチドが提供される。別の態様において、配列番号4のうちいずれかを含む単離されたポリペプチドが提供される。
【００１９】
本発明の別の態様において、DAPK1のレベルを減少させることが望まれる疾患を有する、又は有すると疑われる被験体を治療する方法、すなわちDAPK1を標的とするノックダウンターゲティングペプチドの治療有効量を、前記被験体に投与することを含む方法が提供される。前記ペプチドはDAPK1の分解又はノックダウンを引き起こす場合がある。前記ポリペプチドはその上、前記単離されたポリペプチドに結合された送達及びターゲティング部分を含む場合がある。前記ノックダウンターゲティングペプチドは、配列番号3又は4に対して相当な類似性を有する場合がある。前記ノックダウンターゲティングペプチドは配列番号3又は4に対して90%、95%、99%又は100%の同一性を有する場合がある。前記疾患は酸化ストレス又は興奮毒性ストレスに関連する場合がある。前記疾患は神経変性疾患であり得る。前記疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、ALS又は脳卒中であり得る。
【００２０】
本発明の別の態様において、動物において標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させることを特徴とする方法であって、それを必要とする動物の病態を治療する方法、すなわちCTSドメイン、標的タンパク質に選択的に結合するPBD、及び細胞膜透過ドメインを含むペプチドの治療有効量を、前記動物に投与することを含む方法が提供される。前記病態は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、又はハンチントン病といった中枢神経系の神経変性疾患であり得る。前記病態は、また脊髄損傷、脳卒中、脳外傷、アルコール依存症又はアルコール離脱であり得る。
【００２１】
別の態様において、本明細書に記述されたポリペプチドをエンコードする一連のヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２２】
別の態様において、本明細書に記述されたようなポリペプチドを含む組成物及び担体が提供される。前記担体は、医薬的に許容できる担体であり得る。従って、本明細書中、本明細書に記述されたペプチド及び医薬的に許容できる担体、希釈液、又は賦形剤を含む医薬組成物も提供される。
【００２３】
別の態様において、本明細書に記述された医薬組成物及び他の医薬的に活性のある剤の共投与を含む疾患の治療の方法が提供される。
【００２４】
別の態様において、本明細書に記述されたような単離されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。別の態様において、本明細書に記述されたようなベクターを含む細胞が提供される。別の態様において、ポリヌクレオチドが発現制御配列に操作可能に結合される得ることを特徴とする、本明細書に記述されたようなポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。
【００２５】
別の態様において、細胞を細胞死及び／又はアポトーシスから保護する方法が提供されるが、前記方法は、本明細書に記述されたような単離されたポリペプチドを前記細胞に送達することを含む。
【００２６】
別の態様において、細胞を細胞死及び／又はアポトーシスから保護する方法が提供されるが、前記方法は:(a)本明細書に記述されたようなベクターを前記細胞に送達すること、;及び(b)前記ベクターにより送達されたポリヌクレオチドを発現させること、を含む。
【００２７】
別の態様において、ポリペプチドの発現方法が提供されるが、前記方法は:(a)本明細書で記述されたようなベクターを前記細胞に送達すること;及び(b)前記ベクターにより送達されたポリヌクレオチドの発現を可能にしている状況下に細胞を維持すること、を含む。
【００２８】
ベクターを細胞に送達することは、in vivoにおいて行ってもよい。ベクターを細胞に送達することは、ex vivoにおいて行ってもよい。ベクターを細胞に送達することは、in vitroにおいて行ってもよい。
【００２９】
別の態様において、プロテアソームターゲティングペプチド(proteasome-targeting peptide)が、プロテアソーム分解を用いて標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるためのものであることを特徴とする、プロテアソームターゲティングシグナルドメイン(proteasome-targeting signal domain)、標的タンパク質に選択的に結合するタンパク質結合ドメイン、及び細胞膜透過ドメインを含むプロテアソームターゲティングペプチドが提供される。
【００３０】
別の態様において、CTSドメインを含むペプチド及び本明細書に記述された、プロテアソームを標的とするペプチドとの共投与を含む、標的タンパク質の細胞内発現レベルを減少させるための方法が提供される。
【００３１】
本発明の他の態様及び特徴は、以下の付随的な図と併せて、本発明の特定の実施形態の記述の検討に際して、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の代表的な実施形態に従って、ペプチドに誘導されたリソソームタンパク質分解による内在性の目的のタンパク質の迅速かつ可逆的なノックダウンをするための方法。(a)ターゲティングペプチドにより仲介されるタンパク質分解の略図。投与に続いて、ターゲティングペプチドは自身の細胞膜透過ドメイン(CMPD)を通じて細胞に入り、自身のタンパク質結合ドメイン(PBD)を通じて標的タンパク質に結合し、そして自身のシャペロン介在性オートファジーターゲティングシグナル(CTS)を通じて、ペプチド−タンパク質複合体が分解のためリソソームに行くのに付き添う。(b-d)CTSは標識化GFPタンパク質を分解のためリソソームに誘導するのに十分である。(b)CTS-GFP及びmCTS-GFPコンストラクトの直線的な略図。CTS-GFPをＣ末端でCTSのアミノ酸配列をGFPに結合することにより構築した。mCTS-GFPはCTS-GFPの２つのグルタミン酸残基（Ｑ、赤色で強調）をアラニン（Ａ、赤色で強調）に変異することで構築し、CTS(mCTS)を機能的に無機能にした。(c)野生型GFP(WT-GFP；上)又はCMAで標識したGFP(CTS-GFP；下)のどちらかを遺伝子導入したCOS7細胞における、GFPとリソソームのマーカーであるlamp1との共局在の代表的な共焦点画像。WT-GFPではなく、CTS-GFPはリソソーム区画に誘導された。スケールバー：20μM。(d)WT-GFP、mCTS-GFP、又はCTS-GFPをそれぞれ遺伝子導入後24時間でのCOS7細胞における、WT-GFPと比較したCTS-GFPとmCTS-GFPのレベルの定量化。WT-GFP又はCTS-GFPを遺伝子導入した細胞は、何も処理しなかった（無処理）か、又は血清枯渇(+SD; n=5; CMA活性を増強するため)、マクロオートファジー阻害剤(+3-MA; 10mM; n=5)、プロテアソーム阻害剤(+MG132; 5μM; n=6)、又はリソソーム阻害剤塩化アンモニウム(+NH4Cl; 20mM; n=6)若しくはペプスタチンA(pepstatin A) (+PepA; 10μM; n=5)処理をした。上のパネルは細胞溶解物のGFPに対する代表的な免疫ブロットである。β-アクチンに対するリプロービングメンブレンをローディングコントロールに使用した。下のパネルのバーはWT-GFPに対して基準化した相対的なタンパク質の発現レベルを示す（任意に１と設定；白色バー）。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 対WT-GFP (白色バー); Δp<0.05, ΔΔp<0.01, ΔΔΔp<0.001 無処理のCTS-GFPレベルと比較 (灰色バー)。バーは平均値± 平均値の標準誤差を示す。
【図２】CTSを含むペプチドは、ペプチド−タンパク質相互作用を通じた、CMAに仲介されたリソソーム分解のために自身の結合パートナーを標的にできる。(a-c)ターゲティングペプチドに誘導されたリソソームタンパク質分解によるα-シヌクレインの用量依存的ノックダウン。FLAG-βsyn36及びFLAG-βsyn36-CTSペプチドコンストラクトの略図はbに示した。β-シヌクレイン(β-synuclein)の36-45アミノ酸配列は、恒常的にα-シヌクレインに結合し、ターゲティングペプチドのα-シヌクレインへの結合ドメインを形成する。α-シヌクレインをFLAG-βsyn36-CTS(b)又はFLAG-βsyn36(c)のいずれかと、HEK細胞において様々な割合で共発現させ、そして遺伝子導入後48時間でα-シヌクレインに対する免疫ブロットを行った。上の棒グラフは、α-シヌクレイン単独(割合0:1、白色バー)と比較したα-シヌクレインの発現レベルを定量化及び、下に示した代表的な免疫ブロットから、βsyn36(c; n=4)ではなく、βsyn36-CTS(b; n=8)ペプチドとα-シヌクレインの共発現は、用量依存的態様で、HEK細胞において恒常的にα-シヌクレインを減少させることが明らかになった。FLAG-βsyn36-CTSに誘発されたα-シヌクレインの減少は、リソソーム阻害剤NH4Clで妨げられた(b; 20mM; n=7)。(d-h)不活性型ではなく、活性型DAPK1のターゲティングペプチドによる用量依存的ノックダウンは、リソソーム分解を誘導した。抗HA抗体はHA-NR2Bct-CTS及びHA-NR2Bct-CTSmを検出するために用い、一方抗FLAG抗体はwtDAPK及びcDAPKを検出するために用いた。(d)代表的なDAPK1ターゲティングペプチドのHA-NR2Bct-CTS、及びその無機能なCTS(CTSm)コントロールペプチドのHA-NR2Bct-CTSmの簡単なイラスト。HA-NR2Bct-CTSのDAPK1に結合するドメインは、不活性型DAPK1ではなく、活性型DAPK1にのみ特異的に結合することができる、NMDA受容体のNR2Bサブユニットのカルボキシ末端領域の1242-1342の残基間のアミノ酸配列を含む。Flagで標識をした野生型(不活性化)DAPK1(wtDAPK1)又は恒常的に活性のあるDAPK1の変異体(cDAPK1)を、HEK細胞において様々な割合でHA-NR2Bct-CTS又はHA-NR2Bct-CTSmのいずれかと共発現させ、そして24時間後に共免疫沈降及び／又は免疫ブロットを行った。相互の共免疫沈降とそれに続く免疫ブロットにより、NR2BctはwtDAPK1ではなく、特異的にcDAPK1と相互作用することが明らかとなった。(e) HA-NR2Bct-CTSは特異的かつ用量依存的にwtDAPK1(g; n=3)ではなく、cDAPK1(f; n=4)のレベルを減少させる。HA-NR2Bct-CTSにより仲介されたcDAPK1のノックダウンは、NH4Clを用いたリソソーム阻害(20mM; n=4; ΔΔΔp<0.001, HA-NR2Bct-CTS:cDAPK1=8:1群と比較)及びCMAターゲティングシグナルの変異的な不活性化(h; HA-NR2Bct-CTSm; n=8)により有意に妨げられる。pcDNA3.0ベクター(0:1,白色バー)と共遺伝子導入したα-シヌクレイン(b-c)、cDAPK1又はwtDAPK1(e-g)のレベル(0:1,白色バー)はコントロール値を示し、任意に１と設定。β-アクチンに対するメンブレンプロービングはローディングコントロールとして用いた。*p<0.05 **p<0.01 ***<0.001, コントロールと比較。バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。
【図３】培養皮質神経細胞における、細胞膜透過性のCMAターゲティングペプチド組換え体によるネイティブDAPK1の可逆的、並びに用量及び活性依存的ノックダウン。(a)NMDA処理(50μM; 30分間)はDAPK1を活性化し、そして自身のNMDA受容体との結合を誘発した。上のパネルにおいて、リン酸化DAPK1(pDAPK1)と総DAPK1(DAPK1)に対する一連の免疫ブロットにより、DAPK1のリン酸化レベルの時間依存的減少により実証されたように、NMDA刺激はDAPK1を活性化することが明らかとなった。下のパネル：抗NR2B抗体を用いたDAPK1の共免疫沈降と、それに続くDAPK1(DAPK1)及びNR2Bサブユニット(NR2B)に対する一連の免疫ブロットは、NMDA刺激に続いて誘発されたDAPK1とNR2Bの間の結合を示した。(b)E.coli発現系を用いた膜透過性のTATNR2Bct-CTS及びTAT-NR2Bctペプチド組換え体(下のパネルに模式的に示した)の設計と作製。ペプチドの純度は、SDS-PAGEでクーマシーブルー染色により可視化した(上のパネル１)。(c-f)TAT-NR2Bctではなく、TAT-NR2Bct-CTSは、NMDA活性化依存的態様により、DAPK1をリソソーム分解に誘導させることで、DAPK1のレベルを低下させる。すべてのグラフにおいて、DAPK1の相対的なレベルは、無処理のナイーブの群（白色バー、任意に１と設定）におけるDAPK1のレベルに対して基準化し、そしてナイーブ（白色バー,*）又はNMDAで処理をした群（灰色バー, Δ）と比較した。β-アクチンに対するリプロービングメンブレンをローディングコントロールとして用いた。(c)TAT-NR2Bct(n=6)ではなく、TAT-NR2Bct-CTS(n=9)はNMDA刺激により活性化されたDAPK1をノックダウンし、このノックダウンは、リソソーム阻害剤NH4Cl(20mM; n=5)存在下で阻害された。NMDA刺激の前及び最中に(50μM; 30分間)、200μM、60分間で、ペプチドを神経細胞にバス投与し、次いでNMDA及びペプチド洗浄後２時間でDAPK1のレベルを測定した。TAT-NR2Bct-CTSに仲介されたDAPK1ノックダウンは、用量依存的(d; n=4)及び時間依存的(e; n=6)である。(f)DAPK1のノックダウンはTAT-NR2Bct-CTSの存在下において持続的である。DAPK1のレベルをNMDA及びペプチド洗浄後７時間で測定した。His-TAT-NR2Bct-CTSの単独の前処理(sing.; 200μM,30分間NMDA刺激の前及び最中60分間)は一時的なDAPK1の減少を引き起こし、 7時間以内に処理前のレベルに戻った(n=4; p=0.888 NMDAで処理をした群と比較 (灰色バー))。しかしながら、NMDA洗浄後のペプチドの追加投入は、持続的なDAPK1の減少を引き起こし、少なくとも７時間は減少したままだった(n=4; ΔΔp=0.002,NMDAで処理した群と比較)。
【図４】培養神経細胞において、短い合成NR2B-CTSペプチドの細胞内送達は活性のあるネイティブDAPK1を特異的にノックダウンする。(a)合成ペプチドのNR2B-CTS,TAT-NR2B及びTAT-NR2B-CTSの簡単なイラスト。(b-e)皮質神経細胞に送達された際、NR2B-CTSはNMDA刺激依存的態様により、特異的にネイティブDAPK1のレベルを減少させる。細胞膜透過性のペプチド複合体を形成するため、NR2B-CTSを細胞内送達担体ペプチドPep-1とともに1:4の割合で30分間混合し、次いで前記複合体をNMDA処理(50μM; 30分間)の前及び最中に、60分間神経細胞へバス投与した。それぞれの棒グラフにおいて、DAPK1のレベルを免疫ブロットの定量化により測定し、そして対応する代表的な免疫ブロットをバーの下に示した。バーは無処理ナイーブの群（白色バー,任意に１と設定）に対して基準化された相対的なDAPK1のレベルを表し、ナイーブ(白色バー,*）又はNMDAで処理をした群(灰色バー,Δ)の両方と比較した。β-アクチンに対するメンブレンプロービングはローディングコントロールとして用いた。培養皮質神経細胞において、NMDA処理の後にNR2B-CTSにPep-1を加えたもの(Pep-1単独ではない)は、用量(b; n=5)及び時間依存的(c; n=4)に内在性DAPK1のレベルを減少させた。前記減少はNMDA刺激を必要とし(b)、そしてNH4Clを用いたリソソーム機能の阻害(d; NH4Cl 20mM; n=8; p=0.118 NMDAで処理した群との比較)によりレスキューされた。(e)CTS欠失コントロールTAT-NR2B (25μM; n=4; p=0.223 NMDAで処理した群との比較)ではなく、合成細胞透過ペプチドTAT-NR2B-CTS(25μM; n=6; p=0.001, NMDAで処理した群との比較)は、ネイティブDAPK1を減少させ、そしてこの減少はリソソーム阻害剤NH4Cl(20mM; n=5; p=0.302,NMDAで処理した群との比較)の存在により妨げられた。
【図５】TAT-NR2Bct-CTSペプチドはH2O2により活性化されたネイティブDAPK1をノックダウンし、H2O2により誘発される神経毒性から神経細胞を保護する。(a)リン酸化されたDAPK1(pDAPK1)に対する免疫ブロットにより、H2O2処理(300μM; 30分間; n=4)によるネイティブDAPK1の時間依存的活性化（リン酸化の減少）が明らかとなった。(b)DAPK1ブロットにより、TAT-NR2Bct(n=7; 89.13±10.78%; p=0.311 コントロールと比較)ではなく、100μMでのH2O2処理の前及び最中60分間のTAT-NR2Bct-CTS(36.54±7.1%, n=8; p=0.001,コントロールと比較)のバス投与は、２時間でDAPK1のレベルの有意な減少を引き起こし、そしてこれはリソソーム阻害剤NH4Cl(20mM; n=8; p=0.003,コントロールと比較; 及び p=0.106, H2O2群と比較)により有意に妨げられることを示した。バーは無処理のナイーブ群(白色バー,任意に１と設定)に対するDAPK1のレベルを表し、そしてナイーブ群（白色バー,*）又はH2O2で処理された群(灰色バー、Δ)と比較した。β-アクチンに対するメンブレンリプロービングはローディングコントロールとして用いた。(c)LDH細胞死アッセイ(LDH cell death assay)によりH2O2処理(300μM; 30分間)は、処理後12時間(n=4; 2.38±2.70; p=0.001,コントロールと比較)で神経細胞死の有意な増加を引き起こしたが、H2O2分解酵素であるカタラーゼ(n=4; 1.17±1.76; p=0.001, H2O2群と比較)の追加により、レスキューできることが明らかとなった。このH2O2により誘発される神経毒性は、TAT-NR2Bct (50μM; n=3; 2.63±17.85; p=0.105 H2O2群と比較)やNMDA受容体アンタゴニストであるAPV(50μM; n=4; 2.16±13.8; p=0.169 H2O2群と比較)ではなく、TAT-NR2Bct-CTS(50μM; 前に60分間投与し、実験を通じて維持した。; n=3; 1.56±0.08; p=0.001, H2O2群と比較)を用いた神経細胞の処理により有意に減少した。*Δ p<0.05, **,ΔΔ p<0.01 及び ***, ΔΔΔp<0.001; バーは相対的な平均値± 平均値の標準誤差を表す。ナイーブの無処理コントロールに対して基準化（白色バー、任意に１と設定）。
【図６】CTS-GFPを一過性で遺伝子導入したCOS7細胞において、CTS-GFP は時間依存的態様により分解されるが、一方内在性のCMAの基質GAPDHは安定したままである。バーは12時間WT-GFP群（白色バー）に対して基準化されたタンパク質レベルを表し、12時間WT-GFP群(白色バー, *)又は12時間CTS-GFP群(灰色バー, Δ)と比較した。 *,Δp<0.05, **,ΔΔp<0.01 及び ***, ΔΔΔp<0.001, バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。
【図７】TAT-NR2BCTMにより誘発されるDAPK1の分解は、神経細胞の培養では、様々な細胞内画分でのDAPK1の発現レベルを減少させる。(a)様々な細胞内画分の免疫ブロットにより、NMDA処理(50μM, 30分間)は、核画分(核;左のパネル)から、細胞質（細胞質:中央のパネル）及びミトコンドリア画分(ミトコンドリア;右のパネル)までのDAPK1の時間依存的な移行を引き起こすことが示されている。β-アクチンをローディングコントロールとして用いた。LB1、HSP90及びVDACをそれぞれ核、細胞質、及びミトコンドリア画分のローディングコントロールとして用いた。NMDAで処理した後、2時間で核におけるDAPK1レベルは有意に減少した(左; n=4; p<0.001, F(5,18)=12.349)が、これは最長8時間続いた。逆に、細胞質(中央; n=4; p=0.034, F(5,18)=3.112)では、4時間でDAPK1レベルは有意に増加し、そして8時間でベースラインまで戻ったが、一方ミトコンドリア(右; n=5; p=0.020, F(5,20)=3.499)では、DAPK1はNMDA洗浄後速やかに増加したが、NMDAを洗浄後最長で6時間続いた。(b)TAT-NR2BCTM(25μM, 1時間 NMDA処理の前及び最中)のバス投与は、核(左, n=4, p<0.001, F(2,9)=19.139)、細胞質(中央, n=4, p=0.006, F(2,8)=10.417)及びミトコンドリア(右, n=4, p<0.001, F(2,9)=18.597)の細胞内画分において、NMDA処理及び洗浄後2時間でナイーブコントロール及びNMDAで処理をした群（灰色バー）と比較してDAPK1を有意に減少させた。テューキー ポストホック(Tukey post-hoc)を用いた一元配置分散分析法(One way ANOVA)が使われた. * コントロールと比較, Δ NMDAで処理した群と比較(灰色バー)。 *,Δ p<0.05, **, ΔΔp<0.01; ***, ΔΔΔp<0.001 バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を示す。ナイーブの無処理コントロールに対して基準化（任意に１と設定）。
【図８】Lamp21のsiRNA誘導のノックダウンはTAT-NR2BCTMにより誘発されたDAPK1分解を減少させる。(a及びb)siRNA処理後３日の、Lamp2aの、siRNA(60pmol)誘導のノックダウンを示すLamp2aに対する免疫ブロット。LDHアッセイにより測定された細胞毒性は見られない。(b)ポジティブコントロールはLDHアッセイ前に、トリトンX-100により細胞を溶解することより入手した。n=3, 一元配置分散分析法, p=0.024, F(3,8)=5.474. Scrb-siRNA: スクランブルされたsiRNA, Lamp2a-siRNA: Lamp2aを標的とするsiRNA. (c) siRNAにより仲介されたLamp2aノックダウンを用いたCMAの特異的な遮断による、TAT-NR2BCTMにより誘導されたDAPK1のノックダウンの阻害を示す、一連の免疫ブロット。siRNA処理後３日目に、NMDA (50μM; 30分間)の前及び最中１時間に、細胞をTAT-NR2BCTM(25μM)中でインキュベートした。ペプチド及びNMDAの洗浄後２時間で細胞を回収した。β-アクチンをローディングコントロールに用いた。Lamp2aノックダウン: n=7, 一元配置分散分析法 p<0.001, F(3,24)=13.455; DAPK1ノックダウン: n=7, テューキー ポストホックを用いたクラスカル・ウォリス 順位に関する一元配置分散分析(Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks), p=0.002, H(3)=15.047; *ナイーブコントロールとの比較, ΔNMDAで処理された群（灰色バー）との比較 *,Δ p<0.05, **p<0.01 及び ***p<0.001;バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。ナイーブの無処理コントロールに対して基準化（任意に１と設定）。
【図９】培養神経細胞における、ターゲットペプチドに仲介されたα-シヌクレインとPSD95それぞれの分解(a)上:合成の、細胞を透過するα-シヌクレインのターゲティングペプチドであるTAT-βsyn-CTM、及びそのコントロールTAT-βsynの模式的図。中央:免疫ブロットにより、CTMを欠失しているコントロールペプチドTAT-βsyn(25μM; n=5)ではなく、TAT-βsyn-CTM(25μM; n=5)は、4時間で無処理のコントロールタンパク質PSD-95のレベルに影響を与えることなく、標的とされた内在性のα-シヌクレインを特異的に減少させることが実証された(一元配置分散分析 テューキー ポストホック, p<0.001, F(3,16)=12.435)(下)。この減少はリソソーム阻害剤NH4Cl (20mM; n=5)の存在下で妨げられた。(b)上:PSD-95ターゲティングペプチドTAT-NR2B9c-CTM及びコントロールTAT-NR2B9cの模式図、中央: Tat-NR2B9c(25μM; n=4)ではなく、TAT-NR2B9c-CTM (25μM; n=4)は効果的に内在性のPSD95を分解したが(一元配置分散分析 テューキー ポストホック, p<0.001, F(3,12)=18.154)、非標的のタンパク質α-シヌクレインを乱すことはなかった(下)。NH4ClはPSD95分解をレスキューした。β-アクチンに対するメンブレンリプロービングを、更なる特異性及びローディングコントロールとして用いた。 *p<0.05, **,ΔΔp<0.01 及び ***p<0.001; バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。 ナイーブの無処理コントロールに対して基準化（任意に１と設定）。
【図１０】マクロオートファジー阻害剤3-メチルアデニン(3-methyladenine)(3-MA)は、ターゲティングペプチドに仲介された減少をレスキューできないことを示す免疫ブロット。(a)α-シヌクレインのターゲティングペプチドであるTAT-βsyn-CTM(25μM)は、3-MA(10mM)の存在下で、ネイティブα-シヌクレイン を有意に減少させた。α-シヌクレインの基礎レベルは、3-MAの追加による有意でない増加の傾向を示した(N=5, p<0.001, F(3,16)=47.013)。(b)3-MAは、基礎レベル及びターゲティングペプチドTAT-NR2BCTMによる、DAPK1のNMDA活性化に依存したノックダウンのどちらも変化させなかった(n=4, p<0.001, F(3,12)=21.675)。(c)同様に、3-MAは、基礎レベル及びTAT-NR2B9cにより減少したPSD95のレベルの、どちらも影響を与えなかった(n=4, p<0.001, F(3,12)=14.836)。β-アクチンはローディングコントロールとして用いた。テューキー ポストホックを用いた一元配置分散分析 * p<0.05, **p<0.01 及び ***p<0.001; バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。ナイーブの無処理コントロールに対して基準化（任意に１と設定）。
【図１１】ターゲティングペプチドは、処理後24時間で有意な細胞毒性を示さない。皮質神経細胞は25μMの組換え(左, n=4, p=0.005 H(3)=12.706)又は合成(右, n=4, p<0.001, H(7)=28.074)ペプチドにより処理し、24時間後、細胞死を乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイにより評価した。ポジティブコントロールのため、製造説明書のとおり細胞をトリトン-X 100で溶解した。クラスカル・ウォリス 順位に関する一元配置分散分析を分析に用いた。 *p<0.05. バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。ナイーブの無処理コントロールに対して基準化（任意に１と設定）。 それぞれの群でN=4
【図１２】ラットの中大脳動脈閉塞術のin vivo局所的虚血モデルにおいて、TAT-NR2BCTMの全身投与は、虚血脳領域において特異的にDAPK1をノックダウンし、そして虚血性神経障害を減少させる。(a)１時間の一過性のMCAOを施したラットにおける、免疫ブロットのための組織回収の予定及びDAPK1分解の免疫組織化学分析を含む、実験プロトコールを示す模式図。(b)MCAO負荷は脳の同側における傷害・梗塞領域を確かに誘発することを示す、一連の水平の脳切片の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)(TTC)染色の画像。(c)免疫ブロットのために取り除かれた脳の領域を示す、TTCで染色された代表的な脳の切片における黒色波線。(d)DAPK1に対する免疫ブロットは、コントロールのTAT-NR2B (10mg/kg, i.v.; n=3; 両側検定のスチューデントのt検定(two-tailed student’s t-test), t(4)=0.739, p=0.501)ではなく、TAT-NR2BCTM (10mg/kg, i.v.; n=3; 両側検定のスチューデントのt検定, t(4)=14.459, p<0.001)の全身投与後の、反対側（コントロール）ではなく、梗塞側(MCAO)から回収した組織における、DAPK1のみの特異的ノックダウンを実証する。β-アクチンに対するメンブレンリプローブを、ローディングコントロールとして用いた。 ***p<0.001; バーは相対的な平均値 ± 平均値の標準誤差を表す。 非梗塞のコントロール側に対して基準化(任意に１と設定)。 (e)生理食塩水(上パネル)及びTAT-NR2Bで処理した (中央パネル)コントロールとの比較により、脳のMCAO側において、TAT-NR2BCTM処理(下パネル)はDAPK1のレベル(右;緑)及び梗塞領域(左;ピンク)を選択的に減少させることを示す、ラットの、隣接する脳の切片のヘマトキシリン・エオジン染色(Hematoxylin & Eosin)(H&E染色;ピンク;左のパネル)及び免疫組織化学的なDAPK1の染色(DAPK1に対するIHC;緑;右のパネル)の代表的な画像。注意:梗塞の脳領域に対応する領域において、TAT-NR2BCTM単独でDAPK1を減少させる。前記効果的なDAPK1のノックダウンは脳傷害の劇的な減少と関係している。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
「ノックダウン」という語は本明細書で用いられる場合、細胞におけるタンパク質の発現レベルの減少をさすために用いられる。従って、「ノックダウン」は、「タンパク質のレベルの減少(reduction of the levels of the protein)」、「タンパク質の発現レベルの減少(reduction in the expression level of a protein)」、「タンパク質の細胞内発現レベルの減少(reduction of the intracellular expression level of a protein)」という言い回し又はこれらの言い回しの任意のバリエーションと同じ意味で使われ得る。
【００３４】
本明細書で使われる「同一性」という語は、２つのペプチド間、又は２つの核酸分子間における配列の同一性の評価基準をさす。同一性は、比較の目的のため整列される場合があるお互いの配列における位置の比較により、決定されてもよい。仮に２つのアミノ酸又は核酸の配列が少なくとも約80%の配列同一性、又は少なくとも約81%の配列同一性、又は少なくとも約82%の配列同一性、又は少なくとも約83%の配列同一性、又は少なくとも約84%の配列同一性、又は少なくとも約85%の配列同一性、又は少なくとも約86%の配列同一性、又は少なくとも約87%の配列同一性、又は少なくとも約88%の配列同一性、又は少なくとも約89%の配列同一性、又は少なくとも約90%の配列同一性を共有していたら、それらは実質的に同一であると考えられる。あるいは、仮に２つのアミノ酸又は核酸の配列が少なくとも約91%の配列同一性、又は少なくとも約92%の配列同一性、又は少なくとも約93%の配列同一性、又は少なくとも約94%の配列同一性、又は少なくとも約95%の配列同一性、又は少なくとも約96%の配列同一性、又は少なくとも約97%の配列同一性、又は少なくとも約98%の配列同一性、又は少なくとも約99%の配列同一性を共有していたら、それらは実質的に同一であると考えられる。
【００３５】
配列同一性は、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410で最初に記述された、現在使われるBLASTアルゴリズムにより決定されてもよい。前記BLASTアルゴリズムは発表された初期設定で使用してもよい。比較された配列においてある場所が同じ塩基又はアミノ酸で占拠されるとき、その分子はその場所において同一性を共有すると考えられる。配列間の同一性の程度は、配列により共有される一致している場所の数及び配列間の重複の程度の関数である。その上、配列番号1-4との同一性の程度について考慮したとき、アミノ酸の同等な数がそれぞれ配列番号1-4と比較されることが意図される。配列番号1-4との同一性の程度を決定する際、追加の配列（すなわちそれぞれ配列番号1-4の20,10又は15アミノ酸に対応するもの以外）が考慮されることは意図されない。所定の配列の配列同一性は参照配列（すなわち配列番号1-4）の全長に渡って計算される場合がある。
【００３６】
特定の実施形態において、配列番号1-4に対して相当に類似するアミノ酸構成を有する単離されたポリペプチド構成が提供される。その点で、同等の領域(すなわち、それぞれ〜20 又は 10 又は 15 アミノ酸)が比較されるとき、相当の類似性は配列同一性の程度を包含することを意味する。その上、相当な類似性は、本明細書に記述された細胞保護活性又は他の活性が維持されることを前提とする、保存された置換及び修飾アミノ酸を包含することを意味する。
【００３７】
本明細書で用いられる場合に、「ペプチド」又は「ポリペプチド」は区別しないで用いられることができ、そしてペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により共有結合的に繋がれた、少なくとも２つのアミノ酸残基で構成された化合物を一般的にはさす。しかしながら、特定の配列番号への言及で具体的に用いられたときは、ポリペプチドが配列番号1若しくは2によって表されたα-シヌクレイン、又は配列番号3若しくは4によって表されたDAPK1のアミノ酸配列を含み、細胞保護活性を持つことを特徴とすることを意味する。修飾されたペプチド結合は、例えば、半減期を増加させるような、ペプチドに対して付加的な望ましい特性を提供する場合があるペプチド同配体（修飾されたペプチド結合）を含み得る。ペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含み得る。本明細書で記述されるペプチド又はポリペプチドを含む前記アミノ酸群はまた、翻訳後プロセシングといった自然の過程か、又は当技術分野において周知である化学修飾技術のいずれかによって修飾されてもよい。修飾はペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシル末端を含むペプチド内部のどこで存在してもよい。同じタイプの修飾が既定のペプチドにおける様々な部位において、同じ又は異なった程度で存在し得ることが分かっている。
【００３８】
アミノ酸はアミン基、カルボン酸基、及び異なったアミノ酸間で異なる側鎖を含む分子である。１つのアミノ酸は自身の自然の形であってもよいし、又合成のアミノ酸であってもよい。アミノ酸は例えば、極性、非極性、酸性、塩基性、芳香族性、又は中性として記述される場合がある。極性アミノ酸は、生物学的な又は中性に近いpHで水素結合により水と相互作用できるアミノ酸である。アミノ酸の極性は、生物学的な又は中性に近いpHにおける水素結合の程度の指標である。極性アミノ酸の例としては、セリン、プロリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、チロシン、及びグルタミン酸が挙げられる。非極性アミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが挙げられる。酸性アミノ酸は、中性のpHで正味の負電荷を持つ。酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸をが挙げられる。塩基性アミノ酸は中性のpHで正味の正電荷を持つ。塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。芳香族アミノ酸は一般的に非極性であり、疎水性相互作用に関与することができる。芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンが挙げられる。チロシンは芳香族側鎖のヒドロキシル基を通じて水素結合に関与することもできる。中性の脂肪族アミノ酸は一般的に非極性及び疎水性である。中性アミノ酸の例としてはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びメチオニンが挙げられる。１つのアミノ酸は複数の分類カテゴリーにより記述される場合がある。共通の分類カテゴリーを共有するアミノ酸は、ペプチド内でお互いに代用可能である場合がある。次の表Ａに従って、アミノ酸残基は一般的にアミノ酸の慣用名に対応する１文字又は３文字命名によって表現される場合がある。本明細書に記述されたペプチドを含むアミノ酸は、L-又はD-立体配置になることが理解されるであろう。本明細書で記述されたアミノ酸は、生物学的活性に有害な影響を与えることなく、ペプチドの循環半減期を変えることができるメチル化、アミド化、アセチル化、又は他の化学基による置換によって修飾される場合がある。加えて、ジスルフィド結合は、本発明のペプチドにおいて、存在又は非存在であってもよい。自然において非標準のアミノ酸も生じてもよいし、そして遺伝的にコードされているか、又はされていなくてもよい。遺伝的にコードされた非標準のアミノ酸の例としては、セレノシステイン（しばしばいくつかのタンパク質の中にUGAコドンで取り込まれるが、これは通常ストップコドンであり得る）、又はピロリジン（しばしばいくつかのタンパク質の中にUGAコドンで取り込まれるが、これは通常ストップコドンであり得る）が挙げられる。いくつかの遺伝的にコードされていない非標準アミノ酸は、例えばペプチドにすでに取り込まれた標準アミノ酸の修飾の場合、又は代謝中間体、又は前駆体がある。非標準アミノ酸の例としては、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、6-N-メチルリジン、γカルボキシグルタミン酸、デスモシン、セレノシステイン、オルニチン、シトルリ��、ランチオニン、1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸、γアミノ酪酸、カルニチン、サルコシン、又はN-ホルミルメチオニンが挙げられる。標準及び非標準アミノ酸の合成変異体もまた知られており、化学的に誘導されたアミノ酸、同定又は追跡のために標識されたアミノ酸、様々なα炭素上の側鎖を持つアミノ酸を含み得る。当技術分野においてこれらの側鎖の例が知られており、 脂肪族、単一環芳香族、多環芳香族、ヘテロ環の、ヘテロ核の、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カルボキサミド、カルボキシルエステル(carboxyl ester)、グアニジン、アミジン、ヒドロキシル、アルコキシ、メルカプト-、アルキルメルカプト-、又は他のヘテロ原子を含む側鎖を含み得る。他の合成アミノ酸は、αアミノ酸、βアミノ酸のような非αアミノ酸、デスカルボキシ(des-carboxy)又はデスアミノ酸(des-amino acids)を含み得る。アミノ酸の合成変異体は、当技術分野において一般的に知られた方法を使って合成されてもよいし、又は商業的な供給者、例えばRSP Amino Acids LLC (Shirley, MA)から購入されてもよい。
【００３９】
本明細書に記述されたペプチド又はポリペプチドの中のそれぞれのアミノ酸の態様は、置換されてもよいことが当業者によって認識されるであろう。アミノ酸配列同一性はBLAST(basic local alignment search tool)2.0アルゴリズムを利用したBLASTP又はTBLASTNプログラムの使用により計算されてもよい。アミノ酸配列の類似性又は同一性を計算するための技術は当業者に周知であり、前記BLASTアルゴニズムの使用は ALTSCHUL et al. 1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410 及び ALTSCHUL et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記述されている。
【００４０】
その上、ある置換は活性の保持をよりもたらしそうなことは、当業者によって認識される。例えば、例として、極性、非極性、酸性、塩基性、芳香族性、又は中性としてアミノ酸は記述される場合がある。極性アミノ酸は生物学的又は中性に近いpHにおいて水素結合により水と相互作用することができるアミノ酸である。アミノ酸の極性は、生物学的又は中性に近いpHにおいて水素結合の程度の指標となる。極性アミノ酸の例としては、セリン、プロリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、チロシン、及びグルタミン酸が挙げられる。非極性アミノ酸の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが挙げられる。酸性アミノ酸は、中性のpHで正味の負の電荷を持つ。酸性アミノ酸の例としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。塩基性アミノ酸は、中性のpHで正味の正の電荷を持つ。塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。
【００４１】
芳香族アミノ酸は一般的に非極性であり、そして疎水性相互作用に関与することができる。芳香族アミノ酸の例としては、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。チロシンは芳香族側鎖のヒドロキシル基を通じて水素結合にも関与できる。中性の脂肪族アミノ酸は、一般的に非極性及び疎水性である。中性アミノ酸の例としてはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンが挙げられる。１つのアミノ酸は複数の分類カテゴリーにより記述される場合がある。共通の分類カテゴリーを共有するアミノ酸はペプチド内でお互いに代用可能である場合がある。
【００４２】
ペプチド又はポリペプチドを記述するために使われる命名法は、それぞれののアミノ酸残基に対して、アミノ基が左に存在し、カルボキシ基が右に存在する慣習的実務に従ってもよい。本発明の選ばれた特定の実施形態を表す配列において、特段の定めがない限り、アミノ、及びカルボキシ末端基は、特に示してないないが、生理学的pH値での前提とした形で存在すると理解されるであろう。アミノ酸構造式において、表Ａに従って、それぞれの残基は、一般的にアミノ酸の名前に対応する１文字又は３文字の略称によって表現される場合がある。
【００４３】
【表１】
0006550333.tif 000002
【００４４】
ペプチドは当業者にとって周知の様々な慣習的な方法により修飾される場合がある。修飾の例は以下を含む。エステル、アミド若しくは置換アミノ基を提供するため、ペプチドの末端アミノ基及び／又はカルボキシ基及び／又はアミノ酸側鎖はアルキル化、アミド化又はアシル化により修飾され得る。ヘテロ原子は脂肪族修飾基を含み得る。これは慣用的な化学合成手法を使って行われる。他の修飾はそれぞれグルタミル及びアスパルチル残基に対応するグルタミル及びアスパラギニル残基の脱アミノ化;プロリン及びリジンの水酸化;セリン又はスレオニンのヒドロキシル基のリン酸化;並びにリジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化を含む(例えばT. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co. San Francisco, Calif., 1983を参照されたい)。
【００４５】
本明細書で使用する場合、単離された物質がそれ自身操作又は加工され得るように、「単離された」は、例えばin vivoで別の方法で結合されるような、生物学的成分のような他の成分から離れて実質的に単離又は精製された（ポリヌクレオチド又はポリペプチド又はペプチドといった）物質を包含することを意味する。従って「単離された」という語は、当技術分野において知られた精製方法により精製された物質、及び宿主内で組換え発現により作製した物質、及び化学的に合成される物質を含む。いくつかの実施形態において、それが自然界でそれに付随する物質構成物から、それが試料中の総関連物質の少なくとも60重量%、より一般的には75重量%、又は90重量%以上であるように分離されるとき、化合物は「単離される」。従って、例えば化学的に合成された、又は組換え技術により作製されたポリペプチドは、一般的には自然界ではそれに結合した構成物からは実質的に遊離している。ポリヌクレオチドは、本発明のDNAの由来である天然に存在する生物のゲノムにおいて、通常は接触している（すなわち共有結合的に結合した）コーディング配列に直ちに接触しないときに、実質的に純粋であり得る。単離された化合物は、例えば、自然の資源からの抽出、ポリペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現により、又は化学的合成により得ることができる。純度はカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動又はHPLCのような、適切な任意の方法を使って測定できる。
【００４６】
片方又は両方、しかし通常は片方のペプチド末端は、親油性基、すなわち通常脂肪族又はアラルキル基で置換される場合があるが、ヘテロ原子を含んでもよい。鎖は飽和でも不飽和でもよい。便利なことに、商業的に入手可能なカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸及びミリスチルアルコール、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸及びステアリルアミン、オレイン酸、リノール酸、ドコサヘキサエン酸などといった、脂肪族脂肪酸、アルコール、及びアミンは使われてもよい（例えば米国特許第6,225,444号を参照されたい)。望ましくは分岐していない、長さで14-22の間の炭素原子の自然に生じる脂肪酸である。他の親油性分子はコレステロールのようなグリセリル脂質(glyceryl lipids)及びステロール(sterols)を含む。支持体へのオリゴペプチドの結合部位によっては、親油性基は、慣用的な方法に従って、しばしば支持体上での合成の間中、オリゴペプチド上の適切な官能基と反応させられてもよい。ペプチド及び薬剤の宿主への投与のための他の治療剤と共に、オリゴペプチドがリポソームの内腔に取り込まれ得る場合に、脂質結合は役に立つ。
【００４７】
目的とする使用に依存して、特に哺乳類の宿主に対する投与は、被験ペプチドも、担体分子への取込み、ペプチドの生物学的利用率の変化、半減期の拡大又は短縮、様々な組織又は血流への分配のコントロール、血液成分への結合の減少又は増強などを目的として、他の化合物への連結により修飾され得る。前記の例は例として機能し、これに限定されない。
【００４８】
ペプチドは、複数の方法で作成され得る。ペプチドの化学的合成は当技術分野で周知である。固相合成は一般的に使用され、例えばApplied Biosystems社、Foster City、Calif、 Beckman製の自動化合成機など、様々な商業的な合成装置が入手可能である。特に大きなスケールの産生の場合に、液相合成の方法もまた使われる場合がある。
【００４９】
ペプチドはまた、塩の形としても存在でき、一般的に医薬的に許容できる塩の形で存在できる。これらとしては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンなどの無機塩が挙げられる。ペプチドの様々な有機酸塩は、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸などを含むものからも作られる場合があるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書に記述されたような代表的な単離されたポリペプチドは、標的タンパク質のリソソーム分解を引き起こすことができる。前記ポリペプチドは分解又はノックダウンされることが望まれる標的の内在性のタンパク質に結合するための特異的なタンパク質結合ドメインを含み、タンパク質結合ドメインはシャペロン介在性オートファジー(CMA)ターゲティングシグナル(CTS)と融合される。CTSはCMAを誘導するために必要であり、現在すべてのCMAの基質タンパク質において発見されている。多くのCTSの例が当技術分野において知られており、これらは一般的に生物化学的にペンタペプチドモチーフ(pentapeptide motif)KFERQと関連している7。配列番号1-4に記述された本発明のペプチドはKFERQ モチーフを含む特定のCTSを含むが、しかしながらCTSの他の例が当技術分野において知られており(例えば、Kaushik, S and Cuervo, A.M. Trends in Cell Biology 22(8), 407-17)、このように本発明のペプチドは、タンパク質結合ドメインに連結された代替のCTSドメインを含むことがあり、このようなCTSドメインの同定と置換は当業者の能力の範囲内である。本発明の範囲はこのように代替のCTSドメインを含むこれらのペプチドも包含するであろう。本明細書で用いらる場合に、CMA-ターゲティングシグナル(CTS)とCMA-ターゲティングモチーフ(CTM)は前述のCTS’に言及するために互換的に用いられる。
【００５１】
本発明の代表的なペプチドはまた標的タンパク質が位置している細胞の細胞質に運ばれると、可溶型(soluble form)として存在し得る。
【００５２】
従って、細胞膜を横切る、代表的なポリペプチドの運搬において補助するため、単離されたペプチドはさらには、単離されたポリぺプチドに結合した送達及びターゲティング部分を含み得る。必要に応じて、送達及びターゲティング部分はリガンド、タンパク質形質導入ドメイン、又は抗体:のうちの１つ以上から選ばれる場合がある。必要に応じて、タンパク質形質導入ドメインはHIV-1のTatタンパク質の細胞膜形質導入ドメインであってもよい。前記HIV-1のTatタンパク質は本明細書で記述したような単離されたポリペプチドとの融合タンパク質を形成してもよい(例えば、配列番号2及び4)。
【００５３】
本明細書に記載されたポリペプチド又はペプチドといった生理活性分子の合理的で効率的な態様での１つ以上の細胞への送達は、単に細胞に対するむき出しのペプチドの「投入」、又は被験者又は被験者に対するむき出しのペプチドの投与を超えるものが必要である場合がある。薬理学的有効量のように、有効量を提供できるような、細胞への適した態様における生理活性分子の送達やターゲティングを可能とする剤は当技術分野で知られており、例えばDietz et al. (2004). Mol Cell. Neurosci 27: 85-131に記述されている。本明細書に記載されたペプチド又はポリペプチドはそのような細胞膜透過ドメイン(CPMD)に結合される場合がある。本明細書で用いられる場合、細胞膜透過ドメイン(CPMD)という語は、本明細書で記載されたペプチド又はポリペプチドの標的とする細胞若しくは組織、又は標的細胞内若しくは標的組織の細胞内への送達及び／又はターゲティングを補助する任意の部分を包含することを意味する。その上、本明細書に記述されたペプチド又はポリペプチドの生物学的効率促進によって、細胞膜透過ドメイン(CPMD)は、送達及び／又はターゲティングを補助できる。
【００５４】
細胞膜透過ドメイン(CPMD)の例としては、リポソーム、脂質粒子、抗体、受容体リガンド、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)及びウイルスベクターが挙げられ得る。例えば、脳への送達が望まれる場合に、本明細書に記載された単離されたペプチド又はポリペプチドは、脳内皮細胞受容体(brain endothelial cell receptors)に結合する抗体に結合することができ、受容体又は結合したリガンドのエンドサイトーシス／トランスサイトーシスが生じる(例えば、米国特許第7,744,879号)。ペプチド又はポリペプチドは例えばHIVのTATタンパク質(トランス活性化、転写活性化因子タンパク質)(trans-activating transcriptional activator protein)のようなPTDにも結合することができ、エンドサイトーシスを通じてペプチドが細胞膜を横断することが可能となる。
【００５５】
PTDの例としては、アンテナペディアホメオドメイン(Perez et al. (1992) J. Cell Sci 102: 717-722)、トランスポータン(Pooga et al. (1998) FASEB J 12: 67-77)、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン(translocation domains) (Stenmark et al. (1991) J Cell Biol 113:1025-1032)及び(Wiedlocha et al. (1994) Cell 76: 1039-1051)、並びにHIV-TAT(Demarchi et al. (1996) J Virol. 70: 4427-4437)が挙げられるが、これに限定されない。これらのタンパク質形質導入ドメインの他の例又は関連した詳細はDietz,(上記)及びそこで引用された参考文献に記述されている。その上全身送達の間のペプチド分解を減少させるため、ペプチドは修飾されたPEGを用いて小さなミセル又はリポソームに結合されたり、C末端アミド化又はN末端アセチル化のような末端修飾される場合がある。加えて、送達部分は、CTS及びPBDを含むペプチドへの融合を要しないペプチド担体、例えば短い両親媒性のペプチド担体であるPep-1、であり得る。
【００５６】
リガンドは、選択的な結合又は他の基質に対する特異的な親和性を有することにより、送達及びターゲティング部分として機能できる。リガンドは、特異的な結合本体又は結合パートナー、又は受容体によって認識され、結合される場合がある。ターゲティングに適したリガンドの例は、とりわけ、抗原、不完全抗原、ビオチン、ビオチン誘導体、レクチン、ガラクトサミン及びフコシルアミン(fucosylamine)部分、受容体、基質、補酵素及び補助因子から選ばれる場合がある。
【００５７】
送達及びターゲティング部分の他の種類は、抗体であり、抗体は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、並びにそれらのFab画分、断片及びそれらの誘導体を含むすべての抗体のクラスを含むと定義される。他の送達及びターゲティング部分としては、酵素、特にノイラミニダーゼのような細胞表面酵素、血漿タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、ケイロン、キャビタンド、サイログロブリン、内因子、グロブリン、キレート剤、界面活性物質、有機金属基質、ブドウ球菌プロテインA、プロテインG、チトクロム、レクチン、特定のレジン、及び有機ポリマーが挙げられ得る。
【００５８】
送達及びターゲティング部分としてはまた、本明細書に記述されたペプチド又はポリペプチドによって標的とされるために、細胞又は組織の表面に対して親和性を持つ任意のタンパク質、タンパク質断片、又はポリペプチドのような様々な基質が挙げられる。これらのタンパク質は、当技術分野において知られている組換えDNA、遺伝子及び分子工学の技術を通じで作製される場合がある。例えば、配列番号2及び4は、HIVのTATタンパク質に結合された配列番号1及び3の単離されたポリペプチドを示す。特に役立つのは、本明細書で記述されたペプチド又はポリペプチドの、標的細胞の内部への移行を促進するための適した任意の膜移行タンパク質(例えば、本明細書に記述されたPTD)であろう。
【００５９】
特定の実施形態において、in vivoでのペプチドの特定の組織への送達を補助するため、ペプチドはさらにホーミングペプチドモチーフ(homing peptide motif)を含んでいてもよい。このようなホーミングペプチドとしては、例えば(AHNP: FCDGFYACYKDV; DV1: lgaswhrpdkcclgyqkrplp; DV3: lgaswhrpdk; PEGA: CPGPEGAGC; 及び CREKAのような)CMPDsに結合したホーミングペプチド及び(TCP-1: CTPSPFSHC; HAP-1: SFHQFARATLAS; HAP-2: HIQLSPFQSWR; PYEE, LKKP, EPKK* and ELK*K* (K* = N-アルキル グリシン リジン様ペプトイド); F3: CKDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK; Pep42: CTVALPGGYVRVC; CAP: DWRVIIPPRPSA; RGD-4C: CDCRGDCFC; iRGD: CRGDK/RGPD/EC; cRGD: cRGDf(NMeV);及びNGRのような)自身に細胞透過特性を持つホーミングペプチド(例えばSvensen et al., Trends in Pharmacological Sciences, 33(4): 186-192, 2012を参照されたい)が挙げられる。
【００６０】
本明細書に記述されたように、本発明の代表的なペプチドは特定の標的タンパク質又は目的のタンパク質に対して特異性を有するタンパク質結合ドメインを含む。このような標的タンパク質は結合パートナーを持つ、若しくは結合ドメイン配列が知られた、又は入手することができる、内在性の、任意のネイティブタンパク質であり得る。前記結合パートナー又は結合ドメイン配列は、ペプチドのタンパク質結合ドメインの設計に用いられることができる。酵母ツーハイブリッド法(例えば: Protein Kinase C Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume 233, 2003, pp 327-343, Detection of Protein Kinase-Binding Partners by the Yeast Two-Hybrid Analysis, Chang and Cartwright)、共免疫沈降法、in vitro結合アッセイ、タンパク質架橋、青色未変性ゲル電気泳動法(blue native gel electrophoresis)のような当技術分野において知られた通例の方法は、目的の特定の標的タンパク質のための、潜在的な結合ドメイン配列を同定するために使われることができる。代表的な標的タンパク質は、α-シヌクレイン、シナプス後肥厚タンパク質95(PSD 95)、細胞死関連タンパク質キナーゼ1 (DAPK1)、及び同定されたペプチド結合ドメインを持つ他のタンパク質キナーゼ（例えば、Bogoyevitch  et al., Biochimica et Biophysica Acta 1754: 79-99, 2005に記述されたタンパク質キナーゼ)である。
【００６１】
代表的なペプチドのタンパク質結合ドメインは、ペプチドを目的のタンパク質に誘導する。下記に例述されたように、代表的なペプチドにおいて、このようなタンパク質結合ドメインは標的タンパク質に対して特異的であり、標的とされないタンパク質には影響を及ぼさないため、代表的なペプチドの信頼性と特異性を実証している。従って、本発明の代表的なペプチドは、自身の標的タンパク質に対して特異的であり、そのため標的化された薬剤送達のメカニズムを提供する。下記に例述されたように、本発明のペプチドは条件的であり、非活性型よりはむしろ活性型となっている目的のタンパク質のみを標的とするよう設計されており、そのため代表的なペプチドの特異性が増加する。非疾患型(non-diseased form)（例えば、非活性型）よりはむしろ、疾患型(diseased form)（例えば、活性型）におけるタンパク質を標的とする能力は、代表的なペプチドの治療応用に役立つ。
【００６２】
治療応用において、本明細書に記述された組成物は、１つ以上の疾患、例えば細胞死及び／又はアポトーシスに関連する疾患の症状に苦しんでいる被験者に対して、投与されることができる。治癒をするため、若しくは少なくとも部分的に、疾患及び／又はその合併症を防ぎ、又は抑止し、又はそれらに関連する症状の緩和を助けるのに十分な量で、本明細書に記載された組成物は被験者に投与されることができる。従って、本明細書に記述された代表的なペプチド及び組成物は治療を目的として、又は疾患のリスクを減少させ、又は疾患の症状を減少させるための予防薬として使用される場合がある。治療、治癒又は予防的な処置を成し遂げるのに十分な量は、「治療有効量(therapeutically effective dose)」又は「治療有効投与量(therapeutically effective amount)」として定義される。この使用のために有効な量は疾患の重症度、目的（治療、治癒、予防薬、症状の緩和など）とされた使用及び被験者の健康の全身状態に依存するであろう。被験者により必要とされ、かつ許容される用量及び頻度に応じて、組成物は、単回投与又は複数回投与で投与され得る。被験者における効果的な治療（例えば、少なくとも１つ以上の症状を改善させるため）のために、組成物は一般的に本明細書に記述された活性ペプチド又はポリペプチドの十分な量を提供するであろう。
【００６３】
本明細書に記述されたペプチド又はポリペプチドの濃度は広く変動し、選択された投与の特定の態様及び被験者の要求に従って、液量、粘性、体重などにより第１に選択され得る。しかしながら、濃度は典型的には、約0.1又は1 mg/kg/日から約50 mg/kg/日又は時折それ以上の範囲にわたる用量を提供するため選ばれる。典型的な用量は、約3 mg/kg/日 から約3.5 mg/kg/日まで、好ましくは約3.5 mg/kg/日から約7.2 mg/kg/日まで、さらに好ましくは約7.2 mg/kg/日から約11.0 mg/kg/日まで、最も好ましくは約11.0 mg/kg/日から約15.0 mg/kg/日までの範囲にわたる。特定の好適な実施形態において、投与量は約10 mg/kg/日から約50 mg/kg/日までの範囲にわたる。特定の実施形態において、１日に二度経口で与えられる用量は、約20mgから約50mgまでの範囲に渡ることもあり得る。そのような用量は、特定の被験者又は被験者の群において、治療上の投与計画を最適化するために変えることができることは、認容されるであろう。
【００６４】
従って、本発明の代表的なペプチドは、治療上の使用のため処方されてもよい。本発明の特定の代表的な実施形態は、本発明の代表的なペプチド及び医薬的に許容できる担体、希釈液又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、周知で容易に入手可能な組成物を使った公知の方法により調製されることができる。
【００６５】
特定の実施形態において、本明細書で記述されたペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物は、慣習的に非毒性の医薬的に許容できる担体、補助剤及び溶媒を含む単位処方量において、経口で(例えば、錠剤又はカプセル剤を通じて口腔又は舌下で、を含む）、局所的に、非経口で、鼻腔内に、又は吸引若しくは噴霧による、投与のために処方されてもよい。本明細書で用いられる場合、非経口のという語は、皮下注射、腹腔内注射、又は皮内の、関節内の、静脈内の、筋肉内の、血管内の、胸骨内の、髄腔内の注射、又は脳髄液注入技術(cerebrospinal fluid infusion techniques )のような注入技術を含む。代表的なペプチドは、例えば、シロップ、エリキシル剤、錠剤、トローチ剤、薬用キャンディー、硬又は軟カプセル剤、丸剤、油性若しくは水性の懸濁剤、分散性の散剤若しくは粒剤、乳剤、注射剤又は液剤として製剤化されてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、本明細書で記述されたペプチド又はポリペプチドは、肌に貼られるために活性剤が一般的にペプチド又はポリペプチドの送達装置として機能する積層構造の中に含まていることを特徴とする、慣用的な経皮ドラッグデリバリーシステム、すなわち経皮の「パッチ」を使い、肌を通じて送達されることもできる。そのような構造において、組成物は一般的には、層又は上部の支持層の下にある「貯蔵層」の中に含まれる。この文脈における「貯蔵層」という語は、究極的に肌の表面への送達のため利用可能である「活性成分」の量について言及していることが、理解されるであろう。従って、例えば、前記「貯蔵層」はパッチの支持層上の接着剤又は当業者に知られた様々な異なった任意のマトリックス製剤中の活性成分を含み得る。前記パッチは一つの貯蔵層を含んでもよく、又は複数の貯蔵層を含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本明細書で記述された代表的なペプチド又はポリペプチドは経口で投与されることができる。代表的なペプチドの経口投与は、保護的な賦形剤の使用を含み得る。これは一般的には、ポリペプチドを、ポリペプチドに酸性や酵素性の加水分解に対する抵抗性を与えるための組成物と複合体化すること、又はポリペプチドをリポソームのような適切な抵抗性担体に詰め込むことのいずれかによって達成される。経口送達のためポリペプチドを保護する方法は当技術分野において周知である。
【００６８】
経口投与は固形又は液体単位剤形のいずれかであり得る。液体単位剤形は医薬組成物の製造のための技術分野で知られた方法に従い調製されることができ、そしてこのような組成物は、医薬的に上品で美味な調剤を提供するために甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤から成る群から選ばれる１つ以上の剤を含んでいてもよい。エリキシル剤は砂糖及びサッカリンのような適した甘味剤並びに芳香族の香味剤を含む、含水アルコール（例えばエタノール）溶媒を用いることで調整される。懸濁剤は、アカシア、トラガント、メチルセルロースなどのような懸濁剤の援助により水性溶媒とともに調整されることができる。
【００６９】
錠剤のような固形製剤は、錠剤の製造に適した、毒性のない、医薬的に許容できる賦形剤を含む混合剤中に代表的なペプチドを含む。これらの賦形剤には、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム若しくはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤: 造粒及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸: 結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン若しくはアカシア、及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくは滑石、並びに第二リン酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム・マグネシウム、硫酸カルシウム,デンプン、ラクトース、メチルセルロース、及び機能的に類似した物質のような、他の慣習的な含有物が含まれ得る。錠剤は無コートでも、又は消化管での崩壊及び吸収を遅らせるために既知の技術によってコートされてもよく、それによってより長い期間に渡った継続した作用を提供する。例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンのような時間を遅らせる物質が採用される場合がある。
【００７０】
経口での使用のための製剤は代表的なペプチドが不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、若しくはカオリンとともに混合されることを特徴とする、硬ゼラチンカプセル剤としても、又は、代表的なペプチドが水若しくは、油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン若しくはオリーブ油とともに混合されることを特徴とする、軟ゼラチンカプセル剤として提供されてもよい。軟ゼラチンカプセル剤は、許容できる植物油,軽流動ワセリン(light liquid petrolatum)又は他の不活性油による、化合物のスラリーの機械封入により調製される。
【００７１】
水性懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤を含む混合物の中に代表的なペプチドを含む。このような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント ゴム、及びアカシア ゴムのような懸濁剤であり、: 分散又は湿潤剤は、自然に存在するリン脂質、例えば、レシチン、又はステアリン酸ポリオキシエチレン(polyoxyethylene stearate)などの脂肪酸を含むアルキレンオキシドの縮合物、又はヘプタ−デカエチルエンオキセタノール(hepta-decaethyleneoxycetanol)などの長鎖脂肪族アルコールを含むエチレンオキシドの縮合物、又はポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような、脂肪酸由来の部分エステル及びヘキシトールを含むエチレンオキシドの縮合物、又はポリエチレンソルビタンモノオレエートのような脂肪酸由来の部分エステル及びヘキシトール無水物を含むエチレンオキシドの縮合物であり得る。水性懸濁剤は、例えばエチル又はn-プロピル-p-ヒドロキシ安息香酸エステルなどの１つ以上の保存剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、又はショ糖若しくサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含んでいてもよい。
【００７２】
油性懸濁剤は、植物油、例えばピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、若しくはココナッツ油、又は流動パラフィンといった鉱物油中で、代表的なペプチドを懸濁することにより製剤化される場合がある。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコール、を含み得る。前に示したような甘味剤及び香味剤は、美味な経口の製剤を提供するために加えられることができる。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加により保存され得る。
【００７３】
水を加えることによる水性懸濁剤の調製に適した分散性の粉末及び顆粒は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の保存剤との混合物内に代表的なペプチドを提供する。適した分散又は湿潤剤若しくは懸濁剤は、すでに上記されたものによりに例示される。付加的な賦形剤、例えば甘味剤、香味剤及び着色剤、もまた存在してよい。
【００７４】
医薬組成物は水中油型乳剤の形態でも存在し得る。油相は、植物油、例えばオリーブ油、若しくはピーナッツ油、又は鉱物油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物であり得る。適した乳化剤は、自然に存在するゴム、例えばアカシア ゴム、若しくはトラガント ゴム、自然に存在するリン脂質、例えば大豆、レシチン、及びエステル若しくは脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステル、無水物、例えばソルビタンオレイン酸モノエステル、又はエチレンオキシド、例えばポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステル、を含んだ前記部分エステルの縮合物を含み得る。前記乳剤はまた甘味剤及び香味剤を含み得る。
【００７５】
医薬組成物は無菌で注射可能な水性又は油性懸濁剤の形で存在し得る。この懸濁剤は、前に説明された適した分散又は湿潤剤若しくは懸濁剤を使用する既知の技術に従って処方されることができる。前記無菌で注射可能な製剤は、また、例えば1,3-ブタンジオール溶液のような、無毒な親らしく(parentally)許容できる希釈剤又は溶媒中の無菌で注射可能な溶液又は懸濁剤であり得る。利用できる許容できる溶媒及び溶剤の中には、水、リンゲル液及び生理食塩水がある。加えて、無菌の固定油は慣用的に溶剤又は懸濁化剤として利用される。この目的のため、合成のモノ、又はジグリセリドを含めて任意の無菌の固定油が、利用され得る。加えて、オレイン酸のような脂肪酸の、注射剤の調製における使用が見いだされる。局部麻酔薬、保存剤及び緩衝剤のような補助剤もまた、注射可能な溶液又は懸濁液中に含まれ得る。
【００７６】
他の医薬組成物及び医薬組成分を調製する方法は、当技術分野において知られ、そして例えば「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」 (以前は「Remingtons Pharmaceutical Sciences」); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000)中において記載されている。
【００７７】
付加的な薬理学的な活性剤は、例えば本明細書で記述された代表的なペプチド又はポリペプチドなどの一次活性剤と共に送達される場合がある。代表的なペプチド又はポリペプチドは、同様の又は補足的な(complimentary)活性を有する二次化合物を送達することにより、標的細胞又は組織での治療学的な効果を増強するため、他の医薬的に活性のある剤と共投与されてもよい。一つの実施形態において、そのような剤には脳卒中又は虚血性損傷及び／又はその合併症リスクを減少させる剤があるが、これに限定されない。このような剤としては、抗凝固剤(例えば、アセノクマロール、クマテトラリル、ジクマロール、エチルビスクムアセテート、フェンプロクモン、ワルファリン、クロリンジオン、ジフェナジオン、フェニンジオン、チオクロマロール、ベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリナックス、ダナパロイド、スロデキシド、デルマタン硫酸、アピキサバン、ベトリキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバーロキサバン、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、メラガトラン、キシメラガトラン、REG1、デフィブロチド、ラマトロバン、アンチトロンビンIII及びドロトレコギンアルファ)、抗血小板剤(例えば,アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、クロピドグレル、プラスグレル、チクロピジン、チカグレロル、ベラプロスト、プロスタサイクリン、イロプロスト、トレプロスチニル、アセチルサリチル酸／アスピリン、アロキシプリン、カルバサラートカルシウム、インドブフェン、トリフルサル、ジピリダモール、ピコタミド、テルトロバン、シロスタゾール、ジピリダモール、トリフルサル、クロリクロメン、ジタゾール)、及び血栓溶解性・線維素溶解性剤(例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tissue plasminogen activator)(tPA)又はアルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、ウロキナーゼ、サルプラーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、アンクロッド、フィブリノリジン及びブリナーゼのような組織プラスミノーゲンアクチベーター組換え体(recombinant tissue plasminogen activator)(rtPA))、若しくは同様の剤、又は他の神経保護剤との組み合わせを含むが、これに限定されない。
【００７８】
それらの目的とされた利用に依存して、哺乳類の宿主に対する投与のため、被験ペプチドは、また、担体分子への取込み、ペプチドの生物学的利用能の変化、半減期の拡大若しくは短縮、様々な組織若しくは血流への分配のコントロール、又は血液成分への結合の減少若しくは増強などを目的として、他の化合物への連結により修飾され得る。明らかに、前記の例は例として機能し、これに限定されない。
【００７９】
単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で記述されたような単離されたポリペプチドをコードする、ヌクレオチドの配列を含む場合がある。本明細書で記述された組成物は、本明細書で記述されたようなポリペプチド及び担体を含む場合がある。必要に応じて、前記担体は、医薬的に許容できる担体である場合がある。
【００８０】
ベクターは、本明細書で記述されたような単離されたポリヌクレオチドを含む場合がある。細胞には、本明細書で記述されたようなベクターを含む場合がある。その上、本明細書で記述されたポリヌクレオチドを含む細胞は、発現制御配列に操作可能に連結されたポリヌクレオチドを有する場合がある。
【００８１】
リソソーム分解のため、内在のタンパク質を標的とする方法は、本明細書で記述されている。前記方法は本明細書で記述されたような、単離されたペプチドの細胞への送達を含み得る。このような送達はポリペプチドの標的内在タンパク質への結合を引き起こすことができ、次いで結合されたタンパク質をそれが分解されるリソソームへ運搬させることができる。方法は、(a)本明細書で記述されたベクターを細胞へ送達すること; 及び(b)ベクターにより送達されたポリヌクレオチドを発現させること:を含んでいてもよい。方法は、(a)本明細書で記述されたベクターを細胞へ送達すること;及び(b)細胞をベクターによって運ばれたポリヌクレオチドの発現を許容する状況下に維持すること:を含んでいてもよい。必要に応じて、方法はin vivoの状況下において、ベクターを細胞に送達することを含んでもよい。必要に応じて、方法はex vivoの状況下において、ベクターを細胞に送達することを含んでもよい。必要に応じて、方法はin vitroの状況下において、ベクターを細胞に送達することを含んでもよい。
【００８２】
本発明の特定の実施形態は細胞においてin vitroで、及びin vivoでネイティブタンパク質の発現を阻害又は減少させるための本明細書で記述された代表的なペプチドの使用に関する。本発明の特定の実施形態はさらに細胞においてin vitroで、及びin vivoでネイティブ内在性タンパク質の発現を阻害又は減少させるための本明細書で記述された代表的なペプチドの使用に関する。
【００８３】
本発明の他の代表的な実施形態は、疾患を治療するための本明細書で記述された代表的なペプチドの使用に関する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「興奮毒性のストレス」は、脳卒中及び他の神経変性疾患などの疾患の重要な要素である。興奮毒性ストレスの毒作用は、急性又は遅延型の細胞死のどちらも引き起こすメカニズムを通じて発揮され得、その場合には、NMDA受容体及びAMAP受容体のような興奮性神経伝達物質グルタミン酸の受容体(グルタミン酸受容体)が過剰活性化される、との証明がある。これらの受容体に結合するNMDA及びカイニン酸、並びに病理学的に高レベルのグルタミン酸のような興奮毒は、高レベルのカルシウムイオン(Ca2+)が細胞内に侵入することを許すことで、興奮毒性を引き起こすことができる。細胞内へのCa2+の流入はホスホリパーゼ、エンドヌクレアーゼ、及びカルパインのようなプロテアーゼを含む多くの酵素を活性化することができる。これらの酵素は、細胞骨格、細胞膜及びDNAのような細胞構造を損傷する能力がある。興奮毒性は、脊髄損傷、脳卒中、脳外傷、アルコール依存症又はアルコール離脱、並びに多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、及びハンチントン病といった中枢神経系(CNS)の神経変性疾患に関与し得る。
【００８５】
従って、本発明の特定の実施形態では、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、及びハンチントン病を含む中枢神経系(CNS)の神経変性疾患のような病態を治療するため、又は脊髄損傷、脳卒中、脳外傷、アルコール依存症及びアルコール離脱を治療するため、本明細書で記述されたペプチドの治療用途が期待される。
【００８６】
従って本発明の代表的な実施形態は、細胞死及び／又はアポトーシスと関係した疾患を治療する方法にも関する。前記方法は、それを必要としている被験体に対して、:本明細書で記述されたポリペプチド又は本明細書で記述された医薬組成物の生物学的有効量を投与することを含み得る。生物学的有効量は、細胞死及び／又はアポトーシスを防ぐのに十分な量であり得る。細胞死及び／又はアポトーシスに関連した前記の疾患は、以下のものから選ばれ得るが、これに限定されない。：筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、前頭側頭認知症、脳卒中、多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄損傷、脳外傷、アルコール依存症又はアルコール離脱から選ばれるが、これに限定されない。
【実施例】
【００８７】
実施例
材料及び方法
【００８８】
通常の抗体及び試薬
抗GFP抗体(Clontech, 632381)、抗α-シヌクレイン抗体(BD Transduction Laboratories, 610786)、モノクローナル抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich, F1804-200UG)、抗DAPK1抗体(Sigma, D1319-200UL)、モノクローナル抗リン酸化DAPK1抗体(pSer308, Sigma, D4941)、抗NR2B抗体(研究室で作成)、抗HA抗体(Roche applied science, 11867431001)、抗lamp1抗体(Abcam, ab13523)、抗GAPDH抗体(Abcam, ab9485)、抗アクチン抗体(Abcam, ab8227)、抗lamp2a抗体(Abcam, ab18528)、抗Labmin B1抗体(Abcam, ab16048)、抗HSP90抗体(BD Transduction Laboratories, 610418)、抗VDAC1(Porin)抗体(MitoSciences,MSA03)。抗体は、それらの意図する目的（免疫ブロット、免疫細胞化学、免疫組織化学及び共免疫沈降）のために、メーカーの製品説明書及び／又は研究室の方法に従って、検証された。塩化アンモニウム(Sigma, A0171)、3-メチルアデニン(Sigma, M9281)、MG132(Sigma, C2211)、ペプスタチンA (Sigma)、N-メチル-D-アルパラギン酸(NMDA, Tocris Asc-052)、H2O2(Sigma, 7722-84-1)、カタラーゼ(Sigma, C1345)、(2R)-amino-5-phosphonopentanoic acid(APV, Ascent Scientific, Asc-003)。TAT-NR2B-CTS及びTAT-NR2BはGL Biochem及びUBC内のBrain Research Centerペプチド合成施設により合成された。 
【００８９】
プラスミド構築
CTS-GFPはCTSコード配列を含むBamHI断片をpEGFP-N2ベクター(Clontech #6081-1)に導入することで構築した。CTSコード配列は特注設計のオリゴヌクレオチド(Integrated DNA Technologies)のアニーリングにより調製した。mCTS-GFPはCTS-GFPプラスミドに対する１点変異を行うことにより構築した。FLAG-βsyn36はオリゴヌクレオチドのアニーリング及びHindIII及びNotI制限酵素部位(HindIII, Fermentas, FD0504; NotI Fermentas , FD0594)を使ったpcDNA3.0への挿入により構築した。FLAG-βsyn36-CTSはFLAG-βsyn36を鋳型として用い、CTSコード配列を逆方向プライマーに加えたPCRにより構築した。FLAG-cDAPK1はWT-DAPK1(789-936bp)から自己阻害ドメインを欠失することにより調製した。NR2Bct(1242-1342aa)はNR2B発現ベクターを用いたPCRにより調製した。NR2Bct-CTS断片は、EcoRI及びBglII制限酵素部位(EcoRI, Fermentas, FD0274; BglII, Fermentas, FD0084)を用いたNR2Bct断片のCTS-GFPへの挿入により入手し、次いでPCRにより断片にNcoI及びEcoRIを導入した(NcoI, Fermentas, FD0574)。His-TAT-NR2Bct-CTSはNcoI 及び EcoRI制限酵素部位を用いたNR2Bct-CTSのpTAT/pTAT-HAプラスミドへのクローニングにより構築した(S. Dowdy, Washington University, St. Louis, MOのすばらしい贈り物による31)。His-TAT-NR2BctはCTS配列中の最初のアミノ酸をストップコドンにする変異により構築した。HA-NR2Bct-CTSはTAT-NR2Bct-CTSを鋳型とし、どちらにもBamHI部位を有する順方向及び逆方向プライマーと共にPCRを用いることにより構築し、次いでBamHI(Fermntas, FERFD0054)を用いてpcDNA3.0に挿入した。HA-NR2Bct-CTSmは点変異により構築した。
【００９０】
Hisペプチドの精製
His-TAT-NR2Bct及びHis-TAT-NR2Bct-CTSプラスミドはBL21に形質転換し、アンピシリン耐性培養皿に蒔き、そして37℃で一晩インキュベートした。それぞれのプラスミド由来の単一コロニーをLB(Amp+)で再懸濁し、OD600が0.5に達するまで37℃でインキュベートした。IPTG(1mM)を加えること及び5時間のインキュベートで発現を誘発した。遠心分離及び培養液を廃棄することで次いでペレットを回収した。ペレットを超音波処理及び遠心分離し、精製した。Hisペプチドはメーカーのプロトコール(Thermo Scientific, 88223)に従い精製した。簡潔には、Ni-NTA樹脂カラムを平衡にし、次いで調製したペプチド抽出物をカラムに加えた。カラムを洗浄し、次いで溶出緩衝液を用いて溶出した。精製したペプチドは次いでクーマシー染色を用いて純度をモニターし、そしてペプチド濃度を280nmにおける吸光度により測定した。
【００９１】
細胞培養、遺伝子導入及び処理
HEK293細胞及びCOS7細胞を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen, 12483020)を補充したDMEM(Sigma, D6429-24X500ML)中で培養した。細胞は6ウェルプレート中に80%コンフルエンスまで増殖させ、メーカーのプロトコールに従って、リポフェクタミン2000(Invitrogen, 11668019)を用いて一過性の遺伝子導入をした。細胞を37℃で24時間又は48時間遺伝子導入し、その後生化学的分析のために回収した。TAT又はHis-TATペプチドを含む実験においては、特段の定めのない限り、ペプチドをNMDA刺激の１時間前に添加した。
【００９２】
皮質神経細胞の一次培養
ラット皮質神経細胞の解離培養は、以前説明したとおり35、受精後18日で安楽死させた母親から回収したSprague Dawley系のラットの胎仔から調製した。簡潔には、海馬及び大脳皮質を胎仔から抽出し、0.25%トリプシン-EDTA中で30分インキュベートした。消化された組織を粉砕により解離し、ポリ-D-リジンでコートした(Sigma, P7280)プレート上に蒔いた。プレーティング培地はB27(Invitrogen, 17504044)、グルタミン酸(Sigma, G8415)及びGlutaMax (Invitrogen, 35050-061)を補充したNeurobasal培地(Invitrogen, 21103-049)から成っていた。２日後、培地の2/3を、Neurobasal培地B27及びGlutaMaxから成る新鮮なNeurobasalフィーディング培地で置換した。培養は加湿された5% CO2雰囲気中で37℃に維持した。成熟神経細胞(in vitroで14-18日(DIV))を実験に用いた。
【００９３】
免疫ブロット
免疫ブロットアッセイは以前説明したとおり36行なった。簡潔には、150 mM NaCl、50 mM トリスpH7.4、0.1% SDS、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、1 mM EDTA、1 mM Na3VO4、及びタンパク質分解酵素阻害剤混合液(Thermo Fisher, PI78442) で構成される溶解緩衝液を用いて、タンパク質を神経細胞から抽出した。試料を10% SDS-PAGEゲルで分離し、フッ化ポリビニリデン(PVDF)メンブレンに転写し、そしてそれぞれの抗体を用いて免疫ブロットした。ブロットは化学発光検出試薬キット(Fisher, 32106)で増強し、Bio-Rad imager and Quantity One softwareを用いて可視化した。それぞれのバンドからのシグナルの強度をBio-Rad Image Lab softwareを用いて定量化し、同じメンブレン及び実験からのそれらのコントロールと比較してバンドを分析した。
【００９４】
共免疫沈降
共免疫沈降(Co-IP)アッセイは、以前の説明37をわずかに変更して行った。皮質神経細胞培養物は氷冷したSDAのない溶解緩衝液中で溶解した。抽出物(0.5mg)は10μlタンパク質Aセファロースビーズ(GE Life Sciences, 17-0780-01)を用いて１時間事前除去し、次いで非特異的なIgG (4μg)、ポリクローナルの抗NR2B抗体(ラボ, 4μg)と共に4℃で一晩インキュベートし、その後3時間4℃で60ulのプロテインAセファロースビーズ(Sigma)を添加した。試料は溶解緩衝液で２回洗浄し、無菌のPBSで２回洗浄し、SDS試料緩衝液で変性させた。SDS-PAGE及び免疫ブロットは上記したとおに、引き続き行った。
【００９５】
免疫細胞化学
免疫細胞化学は以前説明したとおり37行った。COS細胞を氷冷したPBSで洗浄し、次いで事前に温めた4% PFA/PBS溶液中で、37℃,60分間で固定し、0.1%トリトンX-100中で5分間透過処理し、PBS中で、5%ウシ胎仔血清(FBS)を用いて30分間37℃でブロックしたが、それぞれのステップ間では大規模にPBSで洗浄した。一次抗体を3%FBS中で希釈した。細胞は抗lamp1a抗体(1:50)と共に24-48時間4℃でインキュベートし、次いでPBSで6×2分間洗浄した。二次抗体Alexa555を3% FBS/PBSで1:1000に希釈し、30分間37℃でインキュベートし、次いで大規模に洗浄した。ProLong Gold medium (Invitrogen, P36930)中でスライドにマウントする前に、核をDAPI(1:5000, 10分間 室温)で染色した。取込み画像は共焦点顕微鏡(Leica DMIRE2 & CTRMIC)から入手した。それぞれの画像をシグナル：ノイズの割合が最大になるように調整した。
【００９６】
細胞分画
細胞質／核分画は培養皮質神経細胞(6.0*106細胞/100分間 ディッシュ)で行った。簡潔には、細胞を氷冷したPBSで洗浄し、30分間溶解緩衝液中で揺り動かした。次いで細胞を回収し、粗い細胞質及び核画分を入手するために遠心分離をした。上清を回収し、精製細胞質画分を得るためにさらに遠心分離をした。元のペレットは核溶解物を得るため洗浄し、ボルテックスした。ミトコンドリア分画はPierce Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells (Thermo Scientific, 89874)のユーザーガイドの記載により行った。精製度はLB1(核のみ)、HSP90 (細胞質のみ)、及びVDAC1(ミトコンドリアのみ)の存在について免疫ブロットにより評価した。
【００９７】
神経細胞死の評価
一次神経細胞培養物の細胞毒性の障害は、以前記述したとおり38培地へ放出されたLDHを測定することで評価した。皮質神経細胞は、His-TAT-NR2Bct-CTS、コントロールペプチドのHis-TAT-NR2Bct(50μM, 1時間 前処理及び実験の間中)、APV(1mM, 30分間 前処理及び実験の間中)又はカタラーゼ(100U, 15 分間前処理及び実験の間中)の存在及び非存在下において、H2O2で誘導された興奮毒性 (300 μMで30分間)にさらし、培地をLHD酵素活性のため刺激後12時間で回収した。ペプチド毒性は神経細胞を24時間、25μM合成ペプチド又は200μM組換えペプチドで処理することにより評価した。培地をLDHアッセイのため回収した。ポジティブコントロールを、培地回収の前に細胞を100% Trixton X-100で溶解することで入手した。培地中のLDHの量は、メーカーの説明に従って、LDH細胞毒性検出キット(Sigma, TOX7)を用いて定量した。490 nmでの吸光度はマイクロプレート読み取り装置(μQuant, Bio-TEK instruments)を用いて定量したが、この際バックグランドでの読み取りを差し引くことで調整した。
【００９８】
中大脳動脈閉塞術(MCAO)
全ての動物実験は動物ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア動物実験委員会の承認されたプロトコールに従って行った。大人の無処理の雄Sprague-Dawley系のラット(300-350g, Charles River)を12時間:12時間明暗周期下で集団収容(3-4動物/ケージ)し、手術前はラットのペレット食及び水を自由にとれるようにした。縫合・挿入方法を用いた可逆的なMCAOは以前説明したとおり37行った。簡潔には、右中大脳動脈を閉塞するまで、先端を鈍らせたナイロン縫合糸を、麻酔をかけたラットの右外頚動脈を通じて進入させ、右内頚動脈まで進めた。60分間の閉塞後、閉塞除去を促進するためラットを再び麻酔した。外科手術を通して、加温パッドを用いて体温を36.5から37.5℃の間に維持した。ペプチド(10 mg/kg)又はビヒクルコントロール(生理食塩水; 1 ml/kg)を頸静脈経由で注入した。次いでラットを縫合し、組織採取まで回復させた。
【００９９】
免疫組織化学
ラットを麻酔し、２重にろ過した生理食塩水及び4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含むPBSで灌流した。脳を回収し、4% PFAで浸し、その後30%ショ糖/PBSで低温保護をした。脳が沈んだ後、ドライアイスで急速冷凍し、その後-80℃で一晩凍らせた。次いでクリオスタットを用いて、それを30μmスライスし、0.1M PB(第二りん酸ナトリウム及び第一りん酸ナトリウム)中で保存した。染色の前に、切片を0.1M PB で3x10分間洗浄し、透過処理及び1%BSA及び0.2% トリトンX-100を含む0.1M PBで30分間ブロックし、抗DAPK1抗体(1:100)を用いて4℃で３日間染色をした。その後それらを洗浄し、Alexa 488 (1:1000)を用いて4℃で一晩染色し、次いで洗浄及びマウントした。
【０１００】
ヘマトキシリン・エオシン染色(H&E染色)
染色前に、切片をスライドグラス上にマウント及び乾燥した。切片は光を遠ざけて15分間ヘマトキシリン溶液 (Sigma, MHS1-100ML)中に浸し、その後5分間水道水で青色付をした。次いでスライドを0.5%エオシンY(Sigma, E4009-5G)で後染色し、エオシンの筋がつくのが止まるまでddH2O中に浸した。次いでEtOH (50%, 70%, 95% 及び 100%)で脱水し、キシレンで２回透徹した。Permount (Fischer Scientific, SP15-500)をカバーグラスとして用いた。
【０１０１】
統計分析
データは平均値±平均値の標準誤差として表した。定量化は少なくとも３つの独立した実験を用いて行った。統計学的有意性は* 又は Δを P < 0.05、 ** 又はΔΔをP < 0.01、***又はΔΔΔをp<0.001として定義した。ANOVA (フィッシャーLSD法)を別段の定めがない限り用いた。一元配置分散分析法(FフィッシャーLSD法)を特段の定めがない限り用い、ANOVA分析を行う前に、データを正規性(シャピロ-ウィルク検定、検定力 0.05)、及び等分散(検定力 0.05)について検定した。
【０１０２】
結果/考察
図1aで図示したように、我々は細胞膜透過ドメイン(CMPD)、標的タンパク質に対する特異性を持つタンパク質結合ドメイン(PBD)、及びCMAターゲティングシグナル(CTS)又はCMAターゲティングモチーフ(CTM)を含むターゲティングペプチドを設計した。本明細書で用いられたように、代表的なペプチドにおける「CTS」及び「CTM」は互換的に用いられる。本発明のターゲティングペプチド(図1aに図示)はin vitro又はin vivoにおける細胞環境に対して投与され、前記ターゲティングペプチドは自身のCMPDを経由して細胞に侵入するが、そこでPBDを経由して自身の標的タンパク質と安定した複合体を形成し、そして自身のCTSと細胞質のヒートショックシャペロン(heat shock chaperone)(hsc)70及び様々なコシャペロン(co-chaperones)8との間の相互作用を通じ、CMAで仲介されるタンパク質分解を経由した急速なノックダウンのため、標的タンパク質をリソソーム区画へ送達する。
【０１０３】
分解のためのリソソームへのタンパク質のCTSターゲティング
HEK細胞を用いて、我々は、CTSのアミノ末端に緑色蛍光タンパク質(GFP)を融合することで(CTS-GFP)、CTSは効率的にCTSを含むタンパク質を分解のためリソソームへ誘導できることを示した。ターゲティングの効率を向上させるため、我々は同時に、３つの異なるCMA基質タンパク質―Rnase A(KFERQ)9、hsc70(QKILD)10及びヘモグロビン(QRFFE)11から同定した３つの異なるCMAターゲティングシグナルをGFPで標識をした(図1b)。次いで我々は、コントロールとしてCTSで非標識の野生型GFPコンストラクト(WT-GFP)と共に、CTS-GFPコンストラクトをHEK又はCOS-7細胞に一過的に発現させた。図1cに示したように、共免疫蛍光の染色により、WT-GFPは核を含む細胞の区画のほとんどで散在的に発現していたが、CTS-GFPは主にリソソーム区画に誘導されていたことが明らかとなったが、これはリソソームのマーカータンパク質lamp1aとの広い範囲の共局在により証明された。CTS-GFPをリソソーム分解に誘導するCTSの能力と一致して、免疫ブロット分析によりCTS-GFPタンパク質レベルは時間依存的な態様により減少したことが明らかになり、遺伝子導入後24時間でWT-GFPのレベルは47.97% ±5.66% (平均値±平均値の標準誤差)減少した(補足図1)。
【０１０４】
様々な一連の証明により、CTS-GFPレベルの減少は、リソソームへのターゲティング及び分解の増加の結果であることが示されている。第１に、CTS-GFPレベルの減少は、リソソーム分解阻害剤である塩化アンモニウム12(NH4Cl; 20mM; 82.65%±6.28%; n=6; p=0.001 無処理CTS-GFP群と比較)、又は２つの一次リソソームプロテアーゼ、カテプシンA及びE13,14の阻害剤であるペプスタチンA (Pep A)、 (Pep A; 10μM; 106.98%±6.68%; n=5; p=0.001, 無処理CTS-GFP群と比較)で処理することで完全に妨げられた(図1d)。対照的に、3-メチルアデニン(3-MA; 10mM)によるマクロオートファジーの阻害、又はMG132 (MG132; 5μM)によるプロテアソーム分解の阻害などといった、他のタンパク質分解系の阻害はCTS-GFPレベルの減少を妨げなかった(3-MA 及び MG132群ではそれぞれ、野生型GFPレベルが51.61%±6.09% 及び 42.55%±3.78%に減少; それぞれの群でn=6 ; 3-MA 及び MG132に対してそれぞれp=0.610 及び p=0.213 , 無処理のCTS-GFP群と比較) (図1d)。第２に、CMAは培地において血清の除去により誘発される飢餓のようなストレスの状況下で活性化又は増強され得る15。確かに、血清欠乏(serum deprivation)(SD)はCTS-GFPレベルの更なる減少を引き起こした(SD; WT-GFPレベルの23.95%±5.94% ; n=5; p=0.0001 WT-GFPと比較)(図1d)。第３に、CMA基質タンパク質のCTSにおけるグルタミン残基(Q)の変異は、変異タンパク質のリソソーム膜への結合を障害し、それによってリソソーム内腔へのターゲティング及びCMAを通じた分解を減少させる16。一貫して、CTS-GFPのCTS内において2Qをアラニン(2A)にする変異(mCTS-GFP)はmCTS-GFPレベルの減少を妨げることを我々は発見した(図1d; mCTS-GFP; WT-GFPの94.87%±7.82%; n=9; p=0.990, WT-GFPと比較)。この結果は、CTSで標識されたGFPを特異的にリソソーム分解に誘導するという、CTSの必然的な役割を確証させた。最後に、CTS-GFPの過剰発現は、内在性のCMA基質グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)の安定性を有意に変化させなかった17(図6)が、これは遺伝子導入をした細胞内において広くCMA活性を増加させる代わりに、CTS-GFP中のCTSは唯一特異的にCTSで標識したGFPのリソソーム分解を増加させることを示唆している。統合すると、これらの実験は、非CMA基質タンパク質に対するCTSの付加は、特異的にタンパク質をCMA経路による分解に向かわせるのに十分であることを示す。
【０１０５】
CTS及びDAPK1に対する特異性を有する結合ドメインを含むペプチドを用いた、リソソームへのDAPK1の間接的なターゲティング
リソソーム分解のためにCTSで融合したタンパク質のターゲティングにおけるCTSの能力と特異性が確証されたので、我々はCTS及び標的タンパク質への結合ドメインから構成される短いペプチドを用いて、非CMAタンパク質基質がCMAを介したリソソーム分解のために間接的に標識されることの実証を進めた。
【０１０６】
細胞死関連タンパク質キナーゼ1(DAPK1)は、カルシウム・カルモジュリン制御性タンパク質キナーゼであり、通常は脳内で不活性である。不活性時は、DAPK1はN-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体NR2Bのサブユニットと相互作用しない20。しかしながら、NMDAによる興奮毒性刺激又は脳虚血のような特定の病態下では20、DAPK1は活性化され、自身とNR2BサブユニットのC末端(CT)の1292-1304残基(NR2Bct1292-1304)との相互作用により、NMDA受容体複合体に取り込まれ得る20。NR2BはDAPK1の不活性型ではなく、活性型にのみ結合できるので、NR2BのDAPK1結合配列及びCTSを含むペプチドは、CMAを介したリソソーム分解のためDAPK1の活性型（不活性型ではない）を条件的に標的とできることを我々は示した。HAタグを有する２つのNR2Bカルボキシルコンストラクト、DAPK1に対する結合に必要な100アミノ酸配列、及び機能のある(HA-NR2Bct-CTS)又は無機能の変異したCTS(HA-NR2Bct-CTSm)のいずれかを含む、NR2BのCT断片(NR2Bct1242-1342)を設計した(図2d)。
【０１０７】
HEK細胞において、HA-NR2Bct-CTSm(リソソーム系では分解できない)が、NR2Bctと活性DAPK1の間の相互作用を経由して、十分かつ特異的にDAPK1の活性型と結合できることを実証するため、FlagタグをしたDAPK1の恒s常的活性型(cDAPK1)21又は野生型DAPK1(wtDAPK1)のどちらかと共に前記ペプチドを共発現させた。抗Flag又はHA抗体のいずれかを用いた相互の共免疫沈降実験を行った。図2eに示したように、共免疫沈降実験は、wtDAPK1ではなく、HA-NR2Bct-CTSmとcDAPK1の相互作用を明らかにしたが、これはNR2BとDAPK1の結合は条件的に後者の活性に依存するという以前の結果20を確証している。
【０１０８】
wtDAPK1ではなく、NR2BcとcDAPK1との間の特異的な相互作用と一致して、遺伝子導入後24時間において、様々な割合におけるHA-NR2Bct-CTSの共発現は、用量依存的な態様でcDAPK1のレベルを効果的に減少させた(図2f)。1:2の遺伝子導入の割合において、cDAPK1のレベルは、cDAPK1単独を遺伝子導入したものから29.18±1.91%減少した(n=4; p=0.021 単独で発現されたcDAPK1のレベルと比較(0:1, 白色バー))が、一方8:1では、cDAPK1のレベルは92.85%±2.30%減少した(n=4; p=0.001, 単独で発現されたcDAPK1のレベルと比較(0:1, 白色バー))。対照的に、HA-NR2Bct-CTSのwtDAPK1との共発現は、もっとも高い割合(8:1)においてでさえ、wtDAPK1の発現レベルに有意に影響を与えなかったが(図 2g; n=3; p=0.933)、これはペプチドのDAPK1と相互作用をする能力は、ペプチドに誘発されたcDAPK1の減少に必要とされることを強く示唆している。HA-NR2Bct-CTS-で誘発されたcDAPK1の減少は増加したリソソーム分解によって仲介されることが、それがリソソーム阻害剤NH4Cl(図 2f; n=4 )又はペプチド内のCTSの変異(図2h; HA-NR2Bct-CTSm; n=8)により有意に妨げられたことから、明らかとなった。まとめると、これらのデータはcDAPK1の特異的な減少は増加したリソソーム分解によるものであり、そしてこれはペプチド-タンパク質の相互作用及びペプチドの機能的なCTS両方に依存することを示唆している。
【０１０９】
従って、本発明の代表的な実施形態は、リソソーム分解のため効率的にタンパク質を標的とすることができるタンパク質結合ペプチドを有するCTSを用いた非CMA基質タンパク質、すなわちDAPK1、の間接的な標識であり、従ってこれは細胞内のタンパク質の発現レベルを急速に減少させるための新規の方法を表している。
【０１１０】
一次神経細胞培養における標的とされたペプチドに仲介された内在性のDAPK1レベル減少
培養された皮質神経細胞は、一次細胞でin situにおいて、内在性のタンパク質であるDAPK1の発現レベルを効率的に減少するという、本発明のペプチドに仲介されたシステムの代表的な実施形態の使用を説明するのに用いた。
【０１１１】
我々は以前報告したように20、実験状況下で、培養した皮質神経細胞においてNR2Bは、不活性化ではなく、活性化したDAPK1と相互作用できることを初めて示した。我々は、培養した皮質神経細胞において、以前記載したとおり20、神経細胞を50μM NMDAで30分間処理することにより、DAPK1を活性化した。図3aで免疫ブロットにより示したとおり、DAPK1のリン酸化型のレベルの減少により証明された20ように、NMDA処理はDAPK1の有意な活性化を引き起こした。加えて、NMDA処理後の、DAPK1の総量が顕著に減少し、これは以前の報告22と一致する。細胞内レベルにおいて、DAPK1のNMDA刺激は、ミトコンドリアと細胞質におけるDAPK1のレベルの増加、及び核におけるレベルの減少を引き起こした(図7a)。共免疫沈降実験によりさらに、基礎条件下でNR2BとDAPK1の間の明らかな結合はないが、NMDA処理は前記２つのタンパク質の間の複合体形成を引き起こすことが明らかとなった(図3b)。従ってこれらの結果は、以前の研究20と同様であるが、培養された皮質神経細胞において、NMDA受容体の活性化はDAPK1を活性化するだけでなく、NR2Bを含むNMDA受容体へ活性型DAPK1を組み込むことを実証した。
【０１１２】
この活性に依存したNR2BとDAPK1の間の結合を前提として、次いで我々は上記で記述したNR2Bct-CTSペプチドはNMDA刺激(興奮毒性)に依存した態様において、DAPK1の細胞内発現レベルを減少させるのに用いられ得ることを示した。我々は、細胞膜透過配列TATと共に（コンストラクトに細胞膜透過能を与えるため）、NR2Bct-CTS又はCTSを有しないNR2Bctを細菌発現ベクターにサブクローンし、次いでそれらをHisで標識した組換えペプチド(TAT-NR2Bct-CTS及びTAT-NR2Bct;図3b)として発現及び精製した。図3cに示したとおり、TAT-NR2Bct-CTS(200μM; 90分間; n=4; p=0.47)のバス投与は、自身のDAPK1の基礎レベルにおいて観察可能な効果を及ぼさなかった。しかしながら、MNDA、TAT-NR2Bct-CTS(200μM; 60分間 30分間のNMDA処理の前及び途中)を共投与した場合、NMDA洗浄後2時間でDAPK1のレベルが57.50%±6.70%減少した(n=9; p=0.007, TAT-NR2Bct-CTSの非存在下でNMDA処理をした群と比較; 図3c)。対照的に、コントロールペプチドであるTAT-NR2Bct(すなわち、CTSがない)とNMDAの同用量の共投与は、NMDA処理単独と比較して何ら注目すべきDAPK1の減少を生じなかった(n=6; p=0.897 NMDA単独処理した群と比較; 図3c)。TAT-NR2Bct-CTSで仲介されたDAPK1発現レベルの減少は、リソソーム阻害剤NH4Clによりレスキューされた(n=5; p=0.118 NMDA処理群と比較)。これらの結果は、観察されたDAPK1の減少はリソソーム分解により仲介され、そしてそれはNR2Bctと活性化DAPK1との特異的な相互作用及びターゲティングペプチド中にCTSの存在を必要とすることを強く示唆している。
【０１１３】
下記のとおり、本発明の代表的な実施形態は活性型DAPK1 TAT-NR2Bct-CTSの用量依存的及び時間依存的な条件付ノックダウンである。図3dで示したとおり、NMDA刺激直後に、TAT-NR2Bct-CTSの25μMから200μMまでの増加は、用量依存的DAPK1の分解を引き起こした。その上、TAT-NR2Bct-CTS (200μM; 60分間 NMDA刺激の前及び最中30分間)の単一用量は、DAPK1レベルの時間依存的減少を引き起こし、2時間までに有意になり(n=6; p=0.018 0時間の群と比較)、4時間で最大となった(n=6; p=0.018 0時間の群と比較)、そしてその後処理後7時間以内に、徐々にベースラインレベルまで戻った(図3e)。しかしながら、NMDA洗浄後速やかにHis-TAT-NR2Bctの２回目の投与することにより、DAPK1分解が観察期間の7時間まで維持できた(図3f; n=4; p=0.002 NMDAで処理した群と比較)。前記可逆性及びDAPK1レベルの減少の時間依存性は、前記減少は毒性により誘発された細胞死のような非特異的な細胞の過程によるものではなく、それはTAT-NR2Bct-CTSに仲介された標的タンパク質の迅速かつ可逆的な分解の結果であるという前記仮説を強く支持する。示したように、前記減少の程度及び時間経過もペプチド投与の濃度及び／又は時間を変化させることにより容易に制御され得る。
【０１１４】
上記実験は、効率的かつ条件的に細胞のネイティブDAPK1の活性型をノックダウンするという組換えペプチドTAT-NR2Bct-CTS能力を実証しているにも関わらず、求められた質及び量において、そのような組換えタンパク質を発現及び精製するための分子生物学的装置の必要性は、その広範な使用を制限する場合がある。加えて、NR2BのC末端内の100アミノ酸は、細胞から速やかに排除するためそれを不安定にしている複数のタンパク質分解部位36を含み、生物学的利用率を低下させ、非特異的な効果の確率を上げている。NR2Bにより活性化されたDAPK1への結合はNR2B1292-1340の18アミノ酸残基の短い区間のみを必要とするため20、我々は最小の28アミノ酸DAPK1分解ターゲティングペプチドであるNR2B-CTSを設計及び合成したが、これはNR2B(NR2B1292-1340)のDAPK1結合配列及びCTSを含む(図4a）。短い合成細胞膜透過ペプチドTAT-NR2B-CTS及びそのコントロールTAT-NR2B(CTS配列を欠如している)を作製するため、TAT細胞透過配列はNR2B-CTSのN末端に直接加えられた(図4a)。図4eに示したとおり、NMDA処理(n=6; p=0.001 NMDAで処理した群と比較)に続くTAT-NR2B-CTS(25μM; NMDA投与の前及び最中)のバス投与は、DAPK1の有意な減少を引き起こすが、一方TAT-NR2BコントロールペプチドはDAPK1レベルに影響を与えなかった(n=5; p=0.223 NMDAで処理をした群と比較)。さらに、TAT-NR2B-CTSに誘発されたDAPK1の減少は、NH4Clの投与によりレスキューされた(n=5; p=0.302 NMDAで処理をした群と比較)(図4e)。さらなる分析は、TAT-NR2B-CTSは核、細胞質及びミトコンドリアの画分でのDAPK1のレベルを減少させることを示した(図7b)。siRNAで仲介されたLamp2a、これはCMA機構の重要な構成要素だが、のノックダウンは、有意にDAPK1ノックダウンをレスキューしたが(図8)、これはリソソーム依存的分解による仲介をさらに支持している。このように、合成ペプチドNR2B-CTS、これはTAT細胞透過配列を用いて神経細胞内に送達されるが、CMA経由で活性型DAPK1のタンパク質レベルを迅速かつ可逆的に減少させるのに十分である。
【０１１５】
我々はさらに、この標的とされたノックダウン方法をより一般的にするため、他の細胞膜透過ペプチドはTATを置換できることを示した。例えば、我々は小さなペプチドNR2B-CTS(図4a)を、短い細胞内送達担体ペプチドPep-1を1:4の割合で用いて、細胞内画分に送達した23,24。NR2B-CTS:Pep-1複合体はNMDA刺激の前及び途中で１時間投与され、次いでNMDAと共に洗浄した。図4bで示したとおり、NMDA洗浄後2時間で、内在性のDAPK1のレベルはNR2B-CTS濃度依存的態様で有意に減少したが、10μM、25μM及び50μMでそれぞれ33.60±14.48%、43.65±2.05%及び63.88± 6.18%減少した。組換えペプチドTAT-NR2Bct-CTSでも同様に、Pep-1により送達されたNR2B-CTSはコントロールの非NMDA処理した神経細胞では、DAPK1レベルに影響を及ぼさなかった(図4b)。活性化されたDAPK1の減少は、NR2B-CTS及びPep-1単独の投与どちらによっても生じなかったが(図4b; n=4;それぞれNMDAで処理した群と比較してそれぞれ p=0.941 及び p=0.981)、このことは、担体Pep-1はDAPK1分解の原因ではなく、NR2B-CTSペプチドを神経細胞の細胞内区画に送達するのに必要であることを示唆している。組換えTAT-NR2B-CTSも同様に、Pep-1で送達されたNR2B-CTSは迅速かつ可逆的な活性化したDAPK1レベルの減少を引き起こした。このように、DAPK1の減少はNMDA及びペプチドの洗浄後１時間以内に現れ(n=3; 58.27±5.48%減少)、2時間で最大レベルに到達し(n=3; 78.79±1.15%減少)、そして次の４時間以上で徐々に回復した(図4c)。その上、NR2B-CTSで仲介された減少はNH4Clの投与により完全にレスキューされたが、これによりタンパク質レベルの減少は増加したリソソーム依存的分解の結果であるという我々の仮説をさらに支持している(図4d)。
【０１１６】
従って、本発明の代表的な実施形態は、用量、時間及び条件依存的態様で、１次神経細胞の培養物における内在性の結合パートナーDAPK1を迅速かつ可逆的に分解するための、NR2B-CTS分解ペプチド(His標識組換え体ペプチド、又はPep-1又はTATで仲介された合成ペプチド)の使用である。
【０１１７】
in vitro及びin situにおける内在性のα-シヌクレイン及びPSD95レベルの標的とされたペプチドに仲介された減少
我々は、本発明の標的とされたペプチドに仲介されたDAPK1分解系の成功の確認に続き、２つの別のタンパク質α-シヌクレイン及びシナプス後肥厚タンパク質95(PSD95)のリソソームターゲティング及び分解を仲介する、CTSを含むペプチドの能力を例証することで、我々の方法の一般化可能性を示した。
【０１１８】
α-シヌクレインは、これはパーキンソン病のような神経変性のシヌクレイン症に関連したタンパク質であるが18、β-シヌクレインの短いアミノ酸区間(アミノ酸36-45間)(βsyn36)と強く相互作用することが最近発見された19。従って、本発明の代表的な実施形態は、リソソーム分解のためα-シヌクレインを標的とできることを我々が示したβ-シヌクレイン(βsyn36)のα-シヌクレイン結合ドメイン及びCTS (FLAG-βsyn36-CTS)両方を含む短いペプチドである。対照的に、CTSではなくβsyn36を含むペプチド(FLAG-βsyn36)は、α-シヌクレインと相互作用する能力を持っているが、リソソーム分解のためのそれのターゲティングに不十分であった(図2a)。我々は、HEK細胞への共遺伝子導入後の48時間で、FLAG-βsyn36-CTSの共発現は、用量依存的態様でα-シヌクレインのレベルを有意に減少させることを示した(図2b; それぞれ1:1, 2:1, 4:1, 8:1でのFLAG-βsyn36-CTS:α-シヌクレインの共発現の割合に対して、α-シヌクレインは、コントロールα-シヌクレインレベルに対して32.40%±7.14%, 42.89%±11.34%, 46.49%±5.72% 及び 52.18%±6.61%減少。; n=8)。それとは逆に、FLAG-βsyn36の共遺伝子導入はα-シヌクレインの発現レベルに有意に影響を及ぼさなかった(図2c; n=4)。FLAG-βsyn36-CTSペプチドで誘発されたα-シヌクレインの減少はリソソーム阻害剤NH4Cl(20mM 2時間)の追加により完全にレスキューされたが、これは前記減少が増加したリソソーム依存的タンパク質分解の結果であることを示している(図2b)。
【０１１９】
我々は、一次培養神経細胞において、内在性のα-シヌクレインを標的とするため、βsyn36及びCMAターゲティングシグナル又はCMAターゲティングモチーフ(CTM)を含むターゲティングペプチド(TAT-βsyn-CTM;図9a,上)を更に設計した。コントロールTAT-βsynではなく、TAT-βsyn-CTMは分解のためα-シヌクレインをリソソームに誘導するのに十分であった。特に、一次培養神経細胞において、バス投与されたとき、コントロールTAT-βsyn (25μM; n=5)ではなく、TAT-βsyn-CTM (25μM; n=5; p<0.001)はネイティブα-シヌクレインを有意に分解した(図9a,中央パネル)。加えて、TAT-βsyn-CTMのバス投与は、目的とされていない標的PSD95に影響を及ぼすことなく、ネイティブα-シヌクレイン、目的とする標的であるが、を分解した(図9a,下パネル)。α-シヌクレインレベルの減少は、リソソーム阻害剤NH4Clの同時処理によりレスキューされたが(図9a,中央)、しかし3-メチルアデニンを用いたマクロオートファジーの阻害によってはされなかった(図10a)が、これはタンパク質レベルの減少は増加したリソソーム依存的分解の結果であることをさらに実証している。
【０１２０】
PSD95はグルタミン酸作動性シナプスに集中した膜結合性のグアニル酸キナーゼ(MAGUK)であり、そしてシナプスの安定性及び可塑性に関与している。PSD95はNMDAR周辺にシグナル伝達タンパク質の特異的集合を集めるための足場として働き、NR2BサブユニットC末端31(NR2B9c)の９アミノ酸と結合する。従って我々はPSD-95ターゲティングペプチドTAT-NR2B9c-CTMを合成した(図9b,上)。コントロールTAT-NR2B9cではなく、TAT-NR2B9c-CTMは分解のためPSD95をリソソームに誘導するのに十分であった。特に、コントロールTAT-NR2B9c(25μM; n=4)ではなく、TAT-NR2B9c-CTM (25μM; n=4; p<0.01)は、リソソーム依存的態様で、有意にPSD95レベルを減少させたが、α-シヌクレインレベルは減少させなかった(図9b)。PSD95レベルの減少は、リソソーム阻害剤NH4Clとの同時処理によりレスキューされたが(図9b,下)、しかし3-メチルアデニン(3-MA; 10mM)によるマクロオートファジーの阻害よってはレスキューされなかったが(図10c)、これはタンパク質レベルの減少は増加したリソソーム依存的分解の結果であることをさらに実証している。重要なことに、βsyn及びNR2B9cペプチドは、投与24時間後でさえも、使用された濃度においては、明らかな毒性を全く示さなかった(図11)。
【０１２１】
従って、本発明のターゲティングペプチドに仲介された分解は、全部ではないが、ほとんどのネイティブ細胞質タンパク質をin situで分解するために一般化されることができ、そしてタンパク質結合ドメインを含むターゲティングペプチドは目的の標的とされたタンパク質に対して特異的である。
【０１２２】
in vitro及びin vivoにおけるターゲティングペプチドにより仲介されるDAPK1分解の神経保護作用
従って、上記の結果は、目的のタンパク質に対する特異的なタンパク質結合ドメイン及びCTSを含むターゲティングペプチドは、目的のタンパク質の分解を引き起こすことができること、及びこの系は様々なネイティブタンパク質の分解に用いることができることを実証している。下記のように、このペプチドに仲介されたネイティブタンパク質レベルの減少は生理的に及び／又は病理学的に関する表現型である。
【０１２３】
上記で説明したとおり、DAPK1は多くの細胞種で細胞死を促進するタンパク質キナーゼであり、そして興奮毒性／虚血性の神経細胞障害20又は酸化ストレス25のような病態下での細胞死に必要であることが知られている。従って、代表的な実施形態は、神経細胞において活性化したDAPK1のレベルを急速に減少させることにより、神経細胞を様々な有害な障害から保護を目的とした、上記の膜透過性のDAPK1ノックダウンペプチドである。NMDAで誘導された興奮毒性神経細胞損傷はDAPK1を必要とするので、それは、CTSを持たない膜透過性NR2BペプチドによるキナーゼのNMDARからの分離により妨げることができる20,26。従って、DAPK1-NR2BRタンパク質相互作用の遮断の効果とDAPK1ノックダウンの効果とを区別することは難しくなる場合がある。この複雑な事態を避けるため、非NMDA受容体依存的酸化ストレスにより誘発される神経細胞死を用いた、TAT-NR2Bct-CTSによるDAPK1ノックダウンの神経保護的効果を我々は実証したが、それはアルツハイマー病(AD)及び筋萎縮性側索硬化症(ALS)25などの多種多様のヒトの神経変性状態に関与している過程である。酸化ストレスは過剰な活性酸素種(ROS)生産及びその後の神経細胞死を誘発することができるフリーラジカルに対する細胞の過剰な直接の曝露の結果である。過酸化水素(H2O2)はROSの強力な発生装置であり27、細胞のH2O2への曝露はDAPK1を活性化することができ、結果として細胞死を引き起こす28。図5aで示したとおり、DAPK1の減少されたリン酸化レベルにより実証されたように、培養皮質神経細胞のH2O2への曝露(300μM; 30分間)は有意にDAPK1を活性化した。NMDAとは対照的に、H2O2は総DAPK1に有意に影響を及ぼさなかった(n=8; p=0.125 コントロールと比較)。これら神経細胞をTAT-NR2Bctではなく、TAT-NR2Bct-CTSでの前処理すると、H2O2で処理をした神経細胞において、DAPK1のレベルの60%超の減少を引き起こした(36.54±7.1%; n=8; p=0.001 コントロールと比較)(図5b)。特異的なリソソーム分解の結果と一致して、TAT-NR2Bct-CTSにより誘導されたDAPK1の減少は、NH4Clにより有意に阻害された(n=8; p=0.005 TAT-NR2Bct-CTS群と比較)(図5b)。図5cで示したとおり、H202障害後12時間に行ったLDH(乳酸脱水素酵素)に基づく細胞死アッセイにより、H2O2曝露は神経細胞死を有意に増加させ(n=4; 2.38±2.70; p=0.001コントロールと比較)、そしてこの神経細胞損傷は、H202の分解を触媒するカタラーゼにより減少させられた29(n=4; 1.17±1.76; p=0.001 H202群と比較)。H2O2で誘発された神経毒性は、神経細胞をTAT-NR2Bct-CTS (50μM; H202洗浄の前、間及び後の連続して60分間; n=3; 1.56±0.08; p=0.001 H2O2群と比較)を用いて処理することにより有意に減少した。それとは逆に、コントロールペプチドTAT-NR2Bctを用いた同様の処理は、保護を示さなかった(n=3; 2.63±17.85; p=0.105 H202群と比較)。その上、選択的なNMDARアンタゴニスト(2R)-アミノ-5-ホスホノ吉草酸(APV)はH2O2で誘発された神経毒性から保護しないことより(n=4; 2.16±13.8; p=0.169 H202群と比較)、TAT-NR2Bct-CTSでみられた神経保護的効果は、ペプチドによるDAPK1のNMDARからの分裂によるものではない。従って、TAT-NR2B-CTSはDAPK1の分解を経由して神経細胞を酸化ストレス傷害から保護する。
【０１２４】
TAT-NR2BCTMの全身投与はDAPK1をノックダウンすることができ、それによって、in vivoで確かにDAPK1を活性化することが以前示された20、特徴がはっきりした局所虚血のラットモデル(中大脳動脈閉塞術; MCAO)を用いることにより、in vivoで虚血性傷害からの神経保護を引き起こすことを我々はさらに示した。ウエスタンブロット及び免疫細胞化学療法を両方用いてDAPK1のノックダウン効率を測定するために、我々は相対的に軽症(60分間 片側の閉塞)の虚血性傷害を用いた。図12aに示したとおり、60分間のMCAOを受けたラットに、再灌流後１時間で、生理食塩水、TAT-NR2BCTM、又はTAT-NR2Bのいずれかを静脈内に注入(injected intravenously)(i.v.)した。生理食塩水で処理したラットからの水平の脳切片の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド(TTC)染色により、片側のMCAOは確かに同側の線条体の大部分において、虚血性の脳障害を誘発することが明らかになった(図12b)。DAPK1はMCAOに誘発された虚血性刺激により活性化され、そしてDAPK1のTAT-NR2BCMTノックダウンはDAPK1活性化依存的であるので、虚血性傷害により影響を受けたほとんどの領域において、DAPK1は最大に活性化され、かつ分解されるであろうと我々は考えた。図12cで示したとおり、TAT-NR2BCTM による虚血性で誘発されたDAPK1のノックダウンを測定するため、我々は線条体及び近傍の皮質のMCAOで負荷をかけられた側、並びに反対側から組織を切除し、DAPK1レベルについて免疫ブロットした。TATNR2B(10mg/kg, i.v.)は虚血性の又は反対側どちらの脳組織においても、DAPK1のレベルに明らかな変化を引き起こさなかったが、一方TAT-NR2BCTM(10mg/kg; i.v.)は脳の虚血性の側においてのみDAPK1レベルの有意な減少を引き起こしたが、DAPK1のレベルは反対側と比べ43.3%減少した(図6d; p<0.001, n=3; 両側検定のスチューデントのt検定)。回収した組織がいくつかの非閉塞領域を含むことを前提として(図12c)、ターゲティングペプチドに仲介されたDAPK1レベルの減少の実際の効率はさらに高くなると期待されるであろう。
【０１２５】
より直接的な態様で領域特異的DAPK1の分解をさらに評価するために、我々は水平方向の脳切片においてDAPK1を探るため免疫組織化学を用いた(図12e,右)。期待されたとおり、隣接切片のヘマトキシリンン・エオシン(H&E)染色により視覚化されたように(図12e,左)、DAPK1ノックダウンは脳卒中で損傷した領域に特異的であり、このことはTAT-NR2BCTMはDAPK1の活性（不活性ではなく）型を特異的にノックダウンできることを実証しているin vitroでの結果をさらに裏付けている。以前報告されたように20、DAPK1をNR2BRシグナル伝達複合体から脱共役することで、TAT-NR2Bはまた虚血性の損傷を部分的に減少させるにも関わらず、TAT-NR2BCTMの神経保護的効果がなおさら顕著に表れた(図12e,左)。
【０１２６】
組み合わさって、上記のデータはin vivoでの前記ターゲティングペプチドを基にしたタンパク質ノックダウン戦略の可能性のための構想の実証証拠を提供する。その上、前記データは、領域及び／又は疾患特異的な内在性のタンパク質のノックダウンを達成するという方法の有用性を説明するが、これはターゲティングぺプチド及びそのタンパク質基質との間の自然な相互作用の性質に依存している。最後に、ターゲティングペプチドの全身的な投与に続いて効率的なタンパク質ノックダウンが起こったことを前提として、ターゲティングペプチドは臨床に関連した治療の設計への使用に適している場合があることを前記データは示唆する。
【０１２７】
考察
上記の実験及び結果において、新規のターゲティングペプチドを基にした方法は、細胞内のネイティブタンパク質の発現レベルを減少させることを実証した。この方法は、頑強な、可逆的な、用量及び時間依存的な、及び条件的なネイティブタンパク質の分解を提供する。小さな(19kDa, α-シヌクレイン)、及び大きな(160kDa, DAPK1)両方の細胞質タンパク質、及びシナプスの足場となるタンパク質PSD95の効率的なノックダウンは、このターゲティングペプチドを基にした方法の可能性及び多用途性をさらに実証しており、結合パートナー及び結合ドメイン配列が知られた、又は入手され得る複数の異なった内在性の細胞質タンパク質の発現レベルを効率的に調整するのに使用することについての構想の実証証拠を提供する。例えば、この方法は異なる細胞質タンパク質キナーゼの発現レベルを調整することにおいて、特に多用途である場合がある。
【０１２８】
CMPDのようなTAT形質導入ドメインを用いた我々の構想の実証実験は、in vitroでの一次細胞培養においてバス投与され、又はin vivoで無処理の動物に末梢的に与えれらた場合に、ターゲティングペプチドが容易に細胞膜を横切ることができることを実証しており、ウイルス感染の必要性を取り除いている。確かに、我々及び我々以外の者が、TATは、in vitro及びin vivo両方で高い効率的な態様により、生理活性積荷を血液脳関門及び細胞膜を横切って細胞内部に送達することができることを以前示している30,31,32。しかしながら、前記結果により実証されたように、CMPDはTATに限られることはない。Pep-1もまたターゲティングペプチドを効率的に送達することができるので、TATは代替の細胞透過ペプチド(CPP)により置換されてもよいことは明らかである。これは、CPP及び積荷の間の共有結合が望まれない場合に、特に役に立つ。タンパク質のレベルを調整するため小さな化学物資を使用する以前の方法と比較すると3,34,35、ペプチドは、小分子阻害剤を受け入れられる結合部位が見つけられていないタンパク質を標的とするために、より容易に設計される場合がある41。
【０１２９】
目的の内在性タンパク質のレベルを減少させるための本明細書で記述された方法の有効性は、本研究に使われたCMAターゲティングシグナル(CTS)が、それが直接標的タンパク質と融合された場合だけでなく、CTSを含むタンパク質結合ペプチドを経由して標的タンパク質と間接的に結合された場合でも、CMAで仲介されたリソソーム分解のため非CMA基質タンパク質を標的とすることができることを強く支持している証拠も提供する。上記の結果は、標的タンパク質に対する特異的なタンパク質結合ドメインを含むターゲティングペプチドは、自身の目的とされた標的タンパク質に対して特異的であり、非特異的な効果を持たないことをさらに実証している。重要なことに、TAT-NR2B-CTSは不活性型ではなく、DAPK1の活性型に対して特異的であったが、これはDNA又はmRNAターゲティングのいずれによっても達成できない。その上、標的タンパク質に分解に対する感受性を与えるために遺伝的に修飾する必要がない。本発明の方法により、in situでのネイティブタンパク質の研究に対して事前の修飾をなくすことができ、これにより遺伝的な標的タンパク質の操作から潜在的な人為産物が生じることを防がれる。
【０１３０】
従って、ネイティブタンパク質の発現レベルを減少させるための本明細書で記述された本方法は、生物医学的な研究において特に有用で効果的な研究ツールである場合があり、そしてその多用途性、タンパク質レベルに対する速やかな影響並びにその可逆性及び用量依存性を前提とする臨床応用のために容易に使われる。特に、ペプチドは多様な方法を通じて作製されてもよい。cDNAプラスミドの遺伝子導入に伴って過剰発現させたり、一般的な細菌の発現システムを用いた組換えタンパク質として発現及び精製されたり、短い合成ペプチドとして商業的に合成されてもよい。従って、ほとんどの何らかの生物学的な研究室、洗練された分子細胞学的設備を有しない研究室でさえも、広く利用されることができる多用途なシステムである。その上、前記方法は迅速であり、その結果タンパク質レベルの減少は処理後１時間の速さで達成される。このような速さは、DNA又はmRNAレベルのどちらにおいても、以前記述されたタンパク質操作のいずれでも達成されない。従って前記方法は、これらのより遅いDNA又はmRNAに基づく、タンパク質ノックダウンとしばしば関係した埋め合わせを伴った数少ない決着策を与えることが期待される。その上、可逆性及び用量依性は、ペプチド投与の用量及び／又は時間を変化させることで、タンパク質ノックダウンのレベル及び持続時間が容易に制御される得ることを意味しており、従って生理的プロセスにおいて、及び疾患の発病において、タンパク質の機能を明らかにするという目的を持った生物医学的研究において、ノックダウンを役立つ効果的な研究ツールとしている。この方法は、以前の方法を超えてはるかに直ちにトランスレーショナルでもある。多くの以前記述されたタンパク質のノックダウン方法は、しばしばウイルス感染（多くの場合において）を用いて、標的とした細胞に事前に遺伝的に修飾したcDNAの発現を必要と1し、従ってヒトの被験者における治療上の使用のために直ちに実用的ではない。しかし、我々の方法におけるTAT細胞膜透過ドメイン又はPep-1はターゲティングペプチドを多くの薬の送達経路の下、様々な器官で細胞内に容易に送達可能とするが、この経路はもっとも一般的に使われる静脈内の投与を含み30,31,32、従って、人の疾患、特に発症が少なくとも一部は特定のタンパク質の過剰発現、及び／又は変異に起因した機能獲得によって引き起こされる疾患の治療に役立つ。我々のMCAO、局所虚血の一般的なモデル、を用いた構想の実証実験は、ターゲティングペプチドは脳において、死を誘発するDAPK1のノックダウンをすることができるが、しかしこれは損傷を受けた部位において特異的であり、非虚血領域においてDAPK1は無傷のままであることを示す。このような疾患に関連した、領域特異的なノックダウンを達成するための能力は、従って通常の遺伝的なDAPK1の除去に対する望まない影響を減少させる。
【０１３１】
我々のCTSを含むペプチド戦略の本質的な限界は、CMA機構及びリソソームの安定性に関連したタンパク質(Hsc70及びlamp-2のような)を操作するために、又はCMAを阻害し得るタンパク質のためには役にたたない場合があることである8。しかしながら、これらのタンパク質は、同様のターゲティングペプチド戦略を用いた他の細胞内タンパク質分解系（プロテアソームのような）を利用することで、急速にノックダウンされる場合がある。この目的を達成するために、強いプロテアソームターゲティングシグナルを基礎とした短いアミノ酸が最近記述された3。その上、本明細書で記述された方法はプロテアソームの代わりにエンドソーム−リソソーム系を用いているため、この方法は他のタンパク質ノックダウン方法を補完するために使用されてもよい。例えば、CTSを含むペプチド及びプロテアソームターゲティングシグナルを含むペプチドの組み合わせは、特定のタンパク質のノックダウン効率を劇的に増強する場合がある。その上、細胞がストレス下にある病態下及び／又はプロテアソームが阻害される病態下においても、本方法は特に強力であり得る。
【０１３２】
この明細書中で参照されたすべての特許、特許出願、出版物及びデータベースエントリーの開示は、個々の前記特許、特許出願、出版物及びデータベースエントリーが、それぞれ、参照によって組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度まで、参照によりその全体が本明細書中に具体的に組み込まれる。
【０１３３】
本発明は特定の実施形態を参照して記述されているが、本発明の範囲から逸脱することのないその様々な改変は当業者に対して明らかであろう。当業者にとって明らかであろうすべてのこのような改変は、以降の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１３４】
配列表 
配列番号１ (TAT PTDを有さない、α-シヌクレインをターゲティングする対象のノックダウンペプチド。CMAターゲティングシグナル(CTS)に下線が引かれている。): GVLYVGSKTRKFERQKILDQRFFE
配列番号２ (TAT PTD（イタリック）を有する、α-シヌクレインをターゲティングする対象のノックダウンペプチド。CMAターゲティングシグナル(CTS)に下線が引かれている。): 
0006550333.tif 000003
配列番号３ (TAT PTDを有さない、DAPK1をターゲティングする対象のノックダウンペプチド。CMAターゲティングシグナル(CTS)に下線が引かれている。): KKNRNKLRRQHSYKFERQKILDQRFFE
配列番号４ (TAT PTD（イタリック）を有する、DAPK1をターゲティングする対象のノックダウンペプチド。CMAターゲティングシグナル(CTS)に下線が引かれている。): 
0006550333.tif 000004
【０１３５】
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【図１】
0006550333.tif 000005
【図２】
0006550333.tif 000006
【図３】
0006550333.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
0006550333.tif 000010
【図７（ａ）】
0006550333.tif 000011
【図７（ｂ）】
0006550333.tif 000012
【図８】
0006550333.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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