(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸の切断方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドをミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用させ、当該二本鎖核酸の両鎖をＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチ塩基対部位で認識して切断することを特徴とする、方法：
（ｉ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）を含む組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｃ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
核酸の増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）請求項２に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び（ｂ）工程（ａ）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程。
【請求項４】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチド：
（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、４７番目と７６番目のアミノ酸残基を除く１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における４７番目のセリンと７６番目のアスパラギンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｃ）を含む組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｃ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、４７番目と７６番目のアミノ酸残基を除く１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における４７番目のセリンと７６番目のアスパラギンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
核酸の増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）請求項５に記載の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び（ｂ）工程（ａ）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程。
【請求項７】
核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む方法：
（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチド；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｄ）請求項１記載の方法で使用するポリペプチド及び/又は請求項４記載のポリペプチド。
【請求項８】
標的核酸を優先的に増幅する方法であって、当該標的核酸と１個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列の核酸の増幅を請求項７記載の方法で抑制することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法であって、さらに耐熱性菌由来のＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＣＮＡ）あるいはそのホモログの存在下で標的核酸の増幅を実施することを特徴する方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法で使用するポリペプチド及び/又は請求項４記載のポリペプチドを用いた標的核酸の変異検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖核酸中のミスマッチ塩基対を認識して切断する耐熱性の新規ミスマッチエンドヌクレアーゼ、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物、及びミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の変異解析方法の発展は目覚ましく、農作物の改良や有用微生物の分離、作製ばかりではなく、人の遺伝子診断等に利用されるようになってきており、一般生活上にも大きな恩恵を与えている。【０００３】
これらの変異の解析法はゲノム配列を直接解析する方法が主流であるが、他にミスマッチ塩基対を認識する酵素群を利用する方法が行われてきた。変異型と野生型のＤＮＡを対合させて形成されたミスマッチ塩基対に対して、ミスマッチ塩基対に特異的結合能力のある因子を結合させて検出する解析方法がその一つであり、代表的な例としては大腸菌のＭｕｔＳ、ＭｕｔＴ、ＭｕｔＬ複合体を利用した変異部位の検索が挙げられる（特許文献１）。【０００４】
また、ミスマッチ部位を特異的に切断するミスマッチエンドヌクレアーゼを利用する方法も行われている。この場合は、ミスマッチエンドヌクレアーゼを利用し、ミスマッチ塩基対付近で切断されたＤＮＡ断片を解析することで、変異の有無やその位置を検出する。
代表的な例としては、セロリ由来のＣｅｌＩ遺伝子産物を利用する方法が知られており（特許文献２）、実際に変異塩基の解析に利用されている。しかし、この酵素は耐熱性を持たず、ＰＣＲ法など高温の反応過程を含む手法には直接使用できない。このため、変異塩基の検出を行う際にも、増幅、ミスマッチ形成、ミスマッチ切断、検出の４ステップが必要となる。【０００５】
最近、耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼが開発され、その利用が期待されている。当該ミスマッチエンドヌクレアーゼは、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｔのミスマッチ部位を認識しその周辺でＤＮＡの両鎖を切断することを特徴とする。（特許文献３）【０００６】
また、変異解析にも大きな影響を与えている生物工学的技術としては、核酸増幅技術が挙げられる。
この核酸増幅技術の中で代表的な技術であるポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等の幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。ＰＣＲ法は、変異型遺伝子の検出や、ＤＮＡのメチル化の解析にも応用されている。
また、等温核酸増幅方法のＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法などは、特別な機器を必要としないことから、より安価な核酸検出法として使用されている。
さらに近年になり行われるようになったゲノム全体の構造解析においては、特に希少な試料からの解析を行う上で、全ゲノム増幅法は重要な技術である。【０００７】
これらの核酸増幅法の問題点として、一定確率で間違った塩基の取り込みを起こすことがあげられる。ポリメラーゼの改良などを通して、この確率は低減されてきたものの、依然精密な解析の際には障害となっている。【０００８】
また、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーの構築などにおいて、核酸増幅法では含有率の高いＤＮＡ分子が優先的に増幅され、多様な種類のＤＮＡの解析やスクリーニングの障害となることがある。【０００９】
その問題を解決するため、自己ハイブリダイゼーションを利用した正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）により含有率の高いＤＮＡの比率の低減が行われている（非特許文献１）。またＰＣＲ法と自己ハイブリダイザーションを組み合わせたＳＳＨ−ＰＣＲ法も使用されている（非特許文献２）が、含有率の高いＤＮＡと相同性を持つＤＮＡも取り除かれる危険性も存在している。【００１０】
さらに、核酸増幅法によるＤＮＡの検出においては、検出対象のＤＮＡの増幅と、検出対象でないＤＮＡの増幅とが競合する場合がある。すなわち、検出対象以外のＤＮＡも同時に増幅され、対象のＤＮＡの検出が困難な場合である。サイクリングプローブやＴａｑＭａｎプローブ等のプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによって検出対象のＤＮＡの増幅のみを検出して上記の問題を解消できることもあるが、検出対象でないＤＮＡが検出対象のＤＮＡに対して大過剰に存在する場合には、多数の類似ＤＮＡの存在による偽陽性反応のため、検出対象のＤＮＡの正確な検出は困難となる。【００１１】
このような問題は、例えば正常対立遺伝子の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出（血中循環腫瘍ＤＮＡの検出等）、エピジェネティックアッセイでの少数のメチル化あるいは非メチル化対立遺伝子の検出、母親の血液中に循環する少量の胎児ＤＮＡ配列の検出等の実施において起こり得る。【００１２】
上記の問題を解決するために、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＥＭＳ  ＰＣＲ）と呼ばれる方法が開発された（非特許文献３）。この方法は、耐熱性の制限酵素を利用し、例えば鋳型が正常型の塩基配列を持つ場合のみにこの制限酵素による切断が起こるように設計したプライマーを用いて、変異型の塩基配列を持つＤＮＡのみを選択的に検出する方法である。しかしながら、検出しようとするＤＮＡによっては、ＲＥＭＳ  ＰＣＲによる選択的検出に適した認識配列を持つ耐熱性の制限酵素が存在しない場合もあり、汎用性に欠ける。【００１３】
以上のように、核酸増幅方法を伴う変異検出方法においては、検出対象でないＤＮＡが検出対象のＤＮＡに対して大過剰に存在する場合でも、多数の類似ＤＮＡの存在による偽陽性反応を回避する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５９２２５３９号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／０６２９７４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００４年２月、第３２巻、３号、ｅ３７
【非特許文献２】”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｌｓ、２００９年、第４９６巻、ｐ．２２３−２４３
【非特許文献３】”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、１９９８年８月、第１５３巻、２号、ｐ．３７３−３７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、新規ミスマッチエンドヌクレアーゼ、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物、及びミスマッチエンドヌクレアーゼの用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記の事情を鑑みて鋭意努力した結果、複製機構の１因子と考えられていたＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｉ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のポリペプチドが耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼの酵素活性を持つことを見出した。以降、当該酵素活性を有するポリペプチドをＴＫＯ  ＮｕｃＳと称す。【００１８】
また、この耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼを基にして、天然型と異なる塩基特異性を向上させた変異型ミスマッチエンドヌクレアーゼの創製に成功し、当該変異型ミスマッチエンドヌクレアーゼ及び／又は天然型ミスマッチエンドヌクレアーゼを単独あるいは組み合わせて使用することで、特定のミスマッチ塩基対以外の切断が抑えられ、より特異的な増幅抑制が可能であることを見出し、本発明を完成させた。【００１９】
すなわち、本発明の第１の発明は、二本鎖核酸の切断方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチドをミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に作用させ、当該二本鎖核酸の両鎖をＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチ塩基対部位で認識して切断することを特徴とする、方法：
（ｉ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、に関する。【００２０】
本発明の第２の発明は、下記（ａ）〜（ｃ）を含む組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｃ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列において１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、に関する。【００２１】
本発明の第３の発明は、核酸の増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）本発明の第２の発明の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程、に関する。【００２２】
本発明の第４の発明は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択されるポリペプチド：（Ａ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（Ｂ）前記（Ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、４７番目及び７６番目のアミノ酸残基を除く１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（Ｃ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における４７番目のセリン及び７６番目のアスパラギンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、に関する。【００２３】
本発明の第５の発明は、下記（ａ）〜（ｃ）を含む組成物：
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｃ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択された少なくとも一種のポリペプチド：
（ｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｉ）前記（ｉ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、４７番目及び７６番目のアミノ酸残基を除く１ないしは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列における４７番目のセリン及び７６番目のアスパラギンに対応するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、に関する。【００２４】
本発明の第６の発明は、核酸の増幅方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）本発明の第５の発明の組成物と鋳型になる核酸分子を含む組成物を調製する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）により得られた組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程、に関する。【００２５】
本発明の第７の発明は、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法であって、下記の（ａ）〜（ｄ）の存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む方法：
（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸またはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチド；
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｃ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；及び
（ｄ）本発明の第１の発明で使用するポリペプチド及び／又は第４の発明のポリペプチド、に関する。
本発明の第７の発明の方法において、使用するミスマッチエンドヌクレアーゼは、本発明の第１の発明で使用するポリペプチド又は第４の発明のポリペプチドと同等のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する別の耐熱性菌由来のものと置き換えてもよい。【００２６】
本発明の第８の発明は、標的核酸を優先的に増幅する方法であって、当該標的核酸と１個もしくは数個の塩基が異なる塩基配列の核酸の増幅を本発明の第７の発明の方法で抑制することを特徴とする方法、に関する。
本発明の第８の発明の方法において、さらに耐熱性菌由来のＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＣＮＡ）あるいはそのホモログの存在下で増幅してもよい。【００２７】
本発明の第９の発明は、本発明の第１の発明で使用するポリペプチド及び／又は第４の発明のポリペプチドを用いた標的核酸の変異検出方法、に関する。当該方法において、使用するミスマッチエンドヌクレアーゼは、本発明の第１の発明で使用するポリペプチド又は第４の発明のポリペプチドと同等のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有する別の耐熱性菌由来のものと置き換えてもよい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、生物工学上利用価値の高いミスマッチ認識配列が異なるミスマッチエンドヌクレアーゼ、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む組成物、及びミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼの精製結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。
【図２】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性測定で用いた基質ＤＮＡ一覧である。
【図３】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのミスマッチＤＮＡ切断活性を示すＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ結果とグラフである。
【図４】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのミスマッチＤＮＡ切断反応に対するｐＨの影響を示すグラフである。
【図５】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのミスマッチＤＮＡ切断反応に対する塩化ナトリウム、塩化カリウム、及びグルタミン酸カリウムの影響を示すグラフである。
【図６】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのミスマッチＤＮＡ切断反応に対する塩化マグネシウムの影響を示すグラフである。
【図７】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのミスマッチＤＮＡ切断反応に対する塩化マンガンの影響を示すグラフである。
【図８】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのミスマッチＤＮＡ切断反応温度の影響を示すグラフである。
【図９】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼの様々なミスマッチＤＮＡに対する切断活性を示すグラフである。
【図１０】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合活性測定で用いたプローブＤＮＡの一覧である。
【図１１】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合活性測定を示すＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果である。
【図１２】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼの耐熱性を示すグラフである。
【図１３】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのＴＫＯ由来ＰＣＮＡ１存在下ミスマッチＤＮＡ切断活性を示すＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ結果とグラフである。
【図１４】本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼのＡ−ＡミスマッチＤＮＡに対する切断活性を示すＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００３１】
本発明において「ミスマッチ」とは、二本鎖核酸中に存在するワトソン−クリック塩基対とは異なる塩基の対合、すなわちＧ（グアニン塩基）−Ｃ（シトシン塩基）、Ａ（アデニン塩基）−Ｔ（チミン塩基）またはＵ（ウラシル塩基）の塩基対結合以外の組み合わせの塩基結合を示す。
【００３２】
（１）本発明の耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ及びその変異体
本明細書において、「ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド(ミスマッチエンドヌクレアーゼと記載することがある)」とは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を有するヌクレアーゼのことをいう。前記のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性は、ミスマッチ塩基対を形成するヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性の他、ミスマッチ塩基対から１〜５塩基対、好ましくは１〜３塩基対離れたヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合を切断する活性を包含する。本発明においてミスマッチエンドヌクレアーゼは、特定のミスマッチ塩基対を特異的に認識して二本鎖核酸を切断する活性を有するものが好ましく、例えば、少なくともＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼが挙げられる。前記エンドヌクレアーゼは、Ｇ−Ｇミスマッチのみ、Ｇ−Ｔミスマッチのみ、あるいはＴ−Ｔミスマッチのみを認識・切断するものであってもよい。またＧ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ｔミスマッチ及びＴ−Ｔミスマッチのうちいずれか２つのミスマッチを認識・切断するものであってもよい。さらにＧ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ｔミスマッチ及びＴ−Ｔミスマッチのすべてを認識・切断するものであってもよい。
【００３３】
また本発明においてさらに別のミスマッチエンドヌクレアーゼが例示される。例えば、少なくともＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼが挙げられる。前記エンドヌクレアーゼは、Ａ−Ａミスマッチのみ、Ａ−Ｃミスマッチのみ、あるいはＣ−Ｃミスマッチのみを認識・切断するものであってもよい。またＡ−Ａミスマッチ、Ａ−Ｃミスマッチ及びＣ−Ｃミスマッチのうちいずれか2つのミスマッチを認識・切断するもので合ってもよい。さらにＡ−Ａミスマッチ、Ａ−Ｃミスマッチ及びＣ−Ｃミスマッチのすべてを認識・切断するものであってもよい。
【００３４】
これらの耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性の他に、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖核酸と二本鎖核酸のジャンクション部分、ダブルフラップ構造、レプリケーションフォーク構造、Ｄ−ループ構造、及び／又はニックが入ったホリデイジャンクション構造を認識して核酸を切断する活性を有していても良い。また、本明細書において耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼは、４０℃以上、好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは６０℃以上の温度において二本鎖核酸中のミスマッチ部位を切断する活性を示すヌクレアーゼが好ましい。
【００３５】
本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用される耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（あるいはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。本発明者らは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のポリペプチド（配列表の配列番号１）が耐熱性のＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼであることを見出した。さらには、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログ、例えば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個、例えば、１ないし１５個、好ましくは１ないし９個、さらに好ましくは１ないし５個、さらに好ましくは１ないし３個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドも、本発明における耐熱性のＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼとして好適である。さらに例えば、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有する前記エンドヌクレアーゼが好適に使用できる。
【００３６】
さらに本発明者らは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、４７番目のセリン残基及び７６番目のアスパラギン残基が他のアミノ酸残基、好ましくは４７番目がアラニンに、７６番目がアラニンに置換されてなるアミノ酸配列を有する変異型ポリペプチドが、Ａ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを特異的に認識する耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼであることを見出した。従って、こうして作成された配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのホモログは、本発明の一態様である。配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログとしては、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において、４７番目及び７６番目のアミノ酸残基を除く１ないしは数個、例えば、１ないし１５個、好ましくは１ないし９個、さらに好ましくは１ないし５個、さらに好ましくは１ないし３個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Ａ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列における４７番目のアラニン残基及び７６番目のアラニン残基が他のアミノ酸残基に置換されてなるポリペプチドであって、Ａ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドのアミノ酸配列において、４７番目及び７６番目のアミノ酸残基を除く１ないしは数個、例えば、１ないし１５個、好ましくは１ないし９個、さらに好ましくは１ないし５個、さらに好ましくは１ないし３個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Ａ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、かつ配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列における４７番目のアラニン残基に対応するアミノ酸残基がセリン以外のアミノ酸残基で、かつ７６番目のアラニン残基に対応するアミノ酸残基がアスパラギン以外のアミノ酸残基であり、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。さらに例えば、配列表の配列番号４記載の塩基配列を有する前記エンドヌクレアーゼが好適に使用できる。これらのミスマッチエンドヌクレアーゼは、後述する種々の用途、例えば特異的ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡを排除しその他のＤＮＡを増幅、検出する方法に好適である。
【００３７】
本発明において、当該ミスマッチエンドヌクレアーゼの活性は、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を基質として測定することができる。具体的には、ミスマッチ塩基対を含有する二本鎖核酸を調製した後、ミスマッチエンドヌクレアーゼに対して過剰量の当該二本鎖核酸をミスマッチエンドヌクレアーゼと反応させ、単位時間当たりの切断核酸量を測定することで活性測定が実施される。切断された二本鎖核酸は、電気泳動などにより切断を受けなかった核酸と分離して定量することが可能である。切断を受けた場合にのみ蛍光強度の増加が検出できるように蛍光物質と消光物質とで二重に標識した二本鎖核酸を使用すれば、反応溶液中の蛍光強度を適当な時間ごとに測定することにより活性を簡便に測定することができる。また、基質となる二本鎖核酸の中のミスマッチ塩基対の塩基を変えることで、特定のミスマッチ塩基対に対する切断活性を調べることも可能である。
【００３８】
（２）本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた二本鎖核酸の切断方法
本発明の二本鎖核酸の切断方法は、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸に配列表の配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのホモログを作用させることで行われる。配列表の配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログとしては、本発明を特に限定するものではないが、配列表の配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個、例えば、１ないし１５個、好ましくは１ないし９個、さらに好ましくは１ないし５個、さらに好ましくは１ないし３個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び配列表の配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが例示される。例えば、上記「（１）本発明の耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼ及びその変異体」のセクションで例示された配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのホモログが挙げられる。
【００３９】
また、本発明の二本鎖核酸の切断方法は、耐熱性菌由来のＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＣＮＡ）の存在下に行ってもよい。特に限定はされないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、並びにＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰＣＮＡやそれらのホモログを使用することができる。ＰＣＮＡの共存下でミスマッチを有する二本鎖核酸の切断を行うことにより、切断の効率が向上する。
【００４０】
本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるミスマッチ塩基対は、二本鎖核酸の内部（通常の塩基対合を行う２個の塩基対の間）に存在するものであれば二本鎖核酸中に１つのミスマッチ塩基対が存在するものに限定されることはなく、ミスマッチ塩基対が間隔をおいて複数個存在するものであってもよいし、２以上の連続するミスマッチ塩基対が存在していてもよい。本発明の二本鎖核酸の切断方法におけるミスマッチ塩基対としては、好ましくは二本鎖核酸の内部に存在する１又は８以下の連続するミスマッチ塩基対、より好ましくは１又は４以下の連続するミスマッチ塩基対、さらにより好ましくは２つの連続するミスマッチ塩基対又は１つのミスマッチ塩基対が例示される。本発明の二本鎖核酸の切断方法において、二本鎖核酸中に複数のミスマッチ塩基対が存在する場合は、該複数のミスマッチ塩基対は、同種のミスマッチ塩基対であってもよいし、または異なる種類のミスマッチ塩基対であってもよい。
【００４１】
当該ミスマッチエンドヌクレアーゼのターゲットとなるミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸としては、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡやその断片などの生物試料由来の核酸、及び合成核酸等が例示される。また、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸は、複数の生物試料由来の混合物又は生物試料由来の核酸と合成核酸との混合物を融解、再アニーリングさせて生成された核酸混合物であってもよい。例えば、変異を有する核酸と野生型の核酸を混合し、融解、再アニーリングした場合、ミスマッチ塩基対が形成され、この部位でミスマッチエンドヌクレアーゼの切断を受ける。こうして生じたミスマッチエンドヌクレアーゼによる切断後の核酸断片の大きさを観察することで、変異の有無、位置を検証できる。
【００４２】
（３）本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた核酸の増幅方法
本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを利用することにより、ＰＣＲ法などの核酸増幅法の反応液にこのミスマッチエンドヌクレアーゼを添加するだけの一段階の反応で変異解析を行うことが可能である。ＰＣＲ法においては、そのサイクル数がある閾値を超えると、反応産物が増加しなくなることが知られている。添加されているｄＮＴＰの枯渇や、プライマーと反応産物のアニーリングの競合がその主な原因であるが、この時には反応産物同士のアニーリングが起こっており、変異を有する鋳型と野生型の鋳型が混在していれば、これらから増幅した反応産物同士のアニーリングにより変異部位にミスマッチ塩基対が生じることになる。したがって、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼの共存下でのＰＣＲを通常よりも増加させたサイクル数で実施することだけで、変異解析が可能になる。すなわち、本発明は、配列表の配列番号１及び／又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを二本鎖核酸に作用させることを含む、変異解析方法を提供する。
【００４３】
また、核酸増幅反応の過程でも本発明の二本鎖核酸の切断方法を実施することができる。核酸増幅の反応液に本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを添加することで、増幅過程の誤ったヌクレオチドの取り込みで生じたミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸が切断される。この結果、反応開始前の鋳型核酸とは異なる配列の核酸の増幅が抑制される。こうして、エラー率の低減した核酸増幅が可能になる。すなわち、本発明は、配列表の配列番号１及び／又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを用いてミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を切断する工程を含む、核酸増幅方法を提供する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、及び配列表の配列番号１及び／又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを含む組成物と、鋳型となる核酸分子とを含む組成物を調製する工程、及び得られたこの組成物を適切な条件下で反応させ、核酸増幅を行う工程を含む核酸の増幅方法も、本発明の一態様である。
【００４４】
上記の核酸の増幅法としては、本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡを増幅する方法が例示される。ＤＮＡを増幅する方法としては、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、及びＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅法が挙げられる。
【００４５】
本発明の核酸の増幅方法においては、耐熱性菌由来のＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＣＮＡ）を組み合わせることができる。特に限定はされないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、並びにＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰＣＮＡやそれらのホモログを使用することができる。ＰＣＮＡの共存下でミスマッチを有する二本鎖核酸の切断を行うことにより、切断の効率が向上する。
【００４６】
（４）本発明の組成物
本発明の組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、及び配列表の配列番号１及び／又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログを含み、核酸の増幅方法に用いられる。本発明の核酸の増幅方法で用いる組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、及び配列表の配列番号１及び／又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのホモログ以外に、さらに反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、及びインターカレーティング色素から選択される少なくとも１種を含んでもよい。また、上記の組成物を核酸増幅反応に使用する場合、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいても良い。本発明に使用される反応緩衝剤としては、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ等のグッドバッファーやリン酸ナトリウムバッファー等のリン酸バッファーが挙げられる。特に限定はないが、ｐＨ６〜１１のリン酸ナトリウムバッファーあるいはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が好ましい。また、２価の金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、及びコバルトイオンが挙げられる。２価の金属イオンは、塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。特に限定はされないが例えばマグネシウムイオンは終濃度で０．５〜５０ｍＭの範囲、マンガンイオンは終濃度で０．５〜１５ｍＭの範囲である。ここで、終濃度とは、核酸増幅反応に供する反応液中の濃度を意味する（以下、同じ）。また、本発明の組成物においては、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ）、界面活性剤、無機塩を含んでいてもよい。特に限定はされないが例えばＢＳＡは終濃度で０〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲である。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及びＮＰ−４０が挙げられる。特に限定はされないが例えば界面活性剤は終濃度で０〜０．２％の範囲である。無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、グルタミン酸カリウム、及び硫酸アンモニウムが挙げられる。特に限定はされないが例えば塩化ナトリウムは終濃度で０〜０．３Ｍの範囲、塩化カリウムは終濃度で０〜０．２Ｍの範囲、グルタミン酸カリウムは終濃度で０〜０．６Ｍの範囲、硫酸アンモニウムは終濃度で０〜０．０５Ｍの範囲である。さらに、耐熱性菌由来のＰＣＮＡを含んでいてもよい。特に限定はされないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、並びにＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰＣＮＡが好適である。
【００４７】
上記の核酸増幅反応用の組成物中のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度は、適宜各々の反応系でＤＮＡの増幅反応を阻害しない濃度やミスマッチ塩基対の切断に有効な濃度を検定して決定すればよい。
【００４８】
上記の核酸増幅反応用の組成物に使用される少なくとも１対のプライマーとしては、各種の核酸増幅法に適した２個以上のプライマーが選択される。これらは、所望の増幅が生じるものであればＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されている所謂キメラプライマーであっても良い。また、公知の核酸アナログを含むプライマーや検出などを目的とした蛍光色素などにより標識されたプライマーであってもよい。
【００４９】
（５）本発明の特定配列核酸の増幅抑制方法及び変異検出方法
さらに、本発明者らは、本発明の基質特異性の異なるミスマッチエンドヌクレアーゼと適切に設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチドとを利用して、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制可能であることを見出した。従って、（ａ）前記特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）少なくとも一対のプライマー、及び（ｄ）少なくとも一種類のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの存在下で核酸増幅反応を行う工程を含む、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法も、本発明の一態様である。また、この方法を使用して標的核酸の塩基配列と１個もしくは数個の塩基が異なる特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制することによって、標的核酸を優先的に増幅する方法も本発明の一態様である。
【００５０】
上記の（ａ）のオリゴデオキシリボヌクレオチドは、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであれば特に限定はなく、ＤＮＡの一部がＲＮＡに置換されている所謂キメラオリゴデオキシリボヌクレオチドであっても良い。また、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’端は、このオリゴデオキシリボヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を抑制するための修飾を施されていてもよい。たとえば、アミノ化などの修飾が例示される。また、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、このオリゴデオキシリボヌクレオチドが結合する核酸がミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの切断を受ける限りにおいて、ホスホロチオエート化やその他の修飾によりデオキシリボヌクレアーゼからの切断から保護されていてもよい。さらに、検出などを目的とした蛍光色素や消光物質などにより標識されていてもよい。
【００５１】
上記オリゴデオキシリボヌクレオチドの鎖長は、実施される反応の条件の下で前記特定の塩基配列を有する核酸とこのオリゴデオキシリボヌクレオチドとがハイブリダイズできるように、適宜決定できる。また、特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際にミスマッチを生じる位置は、このオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端、３’末端の両方から少なくとも３ヌクレオチド以上離れていることが望ましい。
【００５２】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法には、ミスマッチ部位を特異的に切断する活性を有する本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを使用することができる。例えば、核酸増幅法として高温での反応を包含するＰＣＲ法のような方法で、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合には、ミスマッチエンドヌクレアーゼも耐熱性を有するものを使用することが好ましい。本発明を特に限定するものではないが、このような場合には、前記の耐熱性のＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ、すなわち、（ｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個、例えば、１ないし１５個、好ましくは１ないし９個、さらに好ましくは１ないし５個、さらに好ましくは１ないし３個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、（ｉｉｉ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び／又はＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ、すなわち、（ｉｖ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｖ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列において１ないしは数個、例えば、１ないし１５個、好ましくは１ないし９個、さらに好ましくは１ないし５個、さらに好ましくは１ないし３個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されてなるアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、（ｖｉ）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつＡ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを認識して切断するエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを使用することが好適である。
【００５３】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法には、特定のミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸のみを特異的に切断する活性を有するミスマッチエンヌクレアーゼを使用することがさらに好ましい。この場合、増幅抑制する塩基配列を１種類に限定することが可能である。例えば、配列表の配列番号１又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドあるいはそのホモログを用いた場合、Ｇ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチあるいは、Ａ−Ａ、Ａ−ＣあるいはＣ−Ｃミスマッチを含む二本鎖核酸を認識して切断するため、これら特定のミスマッチ以外のミスマッチ塩基対を含む二本鎖核酸は切断されず、増幅抑制を受けることがない。従って、特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法に好適である。これらのミスマッチエンドヌクレアーゼは、増幅を抑制したい塩基配列に応じて、単独あるいは組み合わせて使用してもよい。
【００５４】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの濃度は、適宜各々の反応系でＤＮＡの増幅反応を阻害しない濃度やミスマッチ塩基対の切断に有効な濃度を検定して決定すればよい。（ａ）のオリゴデオキシリボヌクレオチドの濃度は、鋳型量や目的ＤＮＡの増幅効率を勘案して、使用濃度を最適化し、決定すればよい。例えば増幅反応に使用されるプライマーの濃度の０．１倍〜１０倍の濃度で実施可能である。
【００５５】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法は、任意の核酸増幅法において実施することができる。本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡを増幅する方法に特に好適である。たとえばＰＣＲ法、ＭＤＡ法、及びＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅法等で本発明を実施することができる。
【００５６】
本発明の、核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法は、任意の核酸を対象として実施することができる。ＤＮＡを増幅対象とする場合には、人工的に作製されたＤＮＡ混合物、環境由来試料や生物由来の試料、又はその試料より調製されたＤＮＡ混合物中に存在するＤＮＡが例示される。本発明を特に限定するものではないが、生物由来の試料としては、ヒト等の哺乳類由来の試料が例示される。また、本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡ混合物としては、断片化されたゲノムＤＮＡ混合物、ｍＲＮＡより逆転写反応により生じたｃＤＮＡ混合物、複数のＰＣＲ産物の混合物などが例示される。増幅が抑制される特定の塩基配列を有するＤＮＡとしては、分離されずにのこるｒＲＮＡ由来の逆転写産物や、プライマー同士の対合により生じる低分子ＤＮＡなどが例示される。後に機能的スクリーニングを行う遺伝子ライブラリーを増幅する場合には、陽性を示す既知の遺伝子の配列を持つＤＮＡの増幅を抑制することで、より効率的に未知遺伝子を探索できるライブラリーの作製も可能になる。
【００５７】
本発明の、標的核酸を優先的に増幅する方法においては、更に増幅された標的核酸を検出する工程を含んでいても良い。本明細書においては、本発明のこの態様のことを「本発明の検出方法」と記載することがある。例えば、ＤＮＡを検出対象とする本発明の検出方法によれば、検出対象でないＤＮＡ（特定の塩基配列を有するＤＮＡ）が検出対象のＤＮＡ（標的ＤＮＡ）に対して大過剰に存在する場合においても、本発明の核酸増幅反応において特定の塩基配列を有する核酸の増幅を抑制する方法における（ａ）のオリゴデオキシリボヌクレオチドと（ｄ）のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとにより検出対象でないＤＮＡを鋳型としたＤＮＡの増幅が抑制されるため、検出対象のＤＮＡの検出を行うことが可能となる。
【００５８】
さらに、本発明の検出方法は、例えば変異の存在が知られている遺伝子に対応する核酸について、野生型と変異型とを区別して検出することを可能にする。特定の塩基配列を有する核酸として、野生型の塩基配列を含有するＤＮＡを設定して本発明の検出方法を実施することにより、大過剰の正常対立遺伝子（すなわち野生型の塩基配列を有するＤＮＡ）の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出が可能となる。例えば血中循環腫瘍ＤＮＡの検出や母親の血液中に含有されている少量の胎児ＤＮＡ配列の検出に本発明の方法は有用である。したがって、本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた変異検出方法もまた、本発明の一態様である。当該変異としては、微小欠失及び点突然変異が例示される。なお、点突然変異によって生じた多型は一塩基多型（ＳＮＰｓ）と呼ばれる。本明細書においては、ＳＮＰｓのうち変異型の塩基配列を有するＤＮＡのことを、一塩基多型変異を有するＤＮＡと記載することがある。
【００５９】
本発明を特に限定するものではないが、本発明の検出方法が利用できる核酸としては、腫瘍マーカーとして利用される一塩基多型変異、癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異、及び細胞の癌化との相関が知られている一塩基多型変異からなる群より選択された少なくとも１つの一塩基多型変異を含む核酸が好ましい。ＳＮＰｓには、腫瘍細胞に高頻度で認められるものや、癌治療用薬剤による治療効果や発癌との相関が知られているものがある。このようなＳＮＰｓとしては、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｂ−ｒａｆ遺伝子、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子のＳＮＰｓが例示される。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、肺腺癌、甲状腺癌等において高頻度で認められる。Ｂ−ｒａｆ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、肺腺癌等において高頻度で認められる。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は、様々な固形腫瘍において高頻度で認められる。ゲフィチニブやエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤による癌の治療は、癌組織のＥＧＦＲ遺伝子が特定の一塩基多型変異を有する場合に有効である可能性が高いことが知られている。一方、癌組織のＫ−ｒａｓ遺伝子が一塩基多型変異を有する場合には、ＥＧＦＲ阻害剤への抵抗性を示す可能性が高いことが知られている。
【００６０】
本発明のミスマッチエンドヌクレアーゼは、変異検出方法に利用することができる。本発明の検出方法は、例えば、生物由来試料から抽出したメチル化ＤＮＡを含む組成物を亜硫酸水素塩処理した後に得られたＤＮＡを材料として実施してもよい。本発明の検出方法によれば、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出を行うことができる。
【００６１】
前記の亜硫酸水素塩による処理として、メチル化ＤＮＡの検出に用いられる公知の亜硫酸水素塩法（バイサルファイト法）が利用できる。当該処理により非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変化しない。さらに、このバイサルファイト処理済みの反応液をＰＣＲ法で増幅すると、ウラシルはチミンに変換され、メチル化シトシンはシトシンとなる。つまり特定の部位での大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出は、それぞれ大過剰のチミンの中のシトシンの存在、または大過剰のシトシンの中のチミンの存在を検証することに他ならない。ここで大過剰に存在するチミンあるいはシトシンを含有するＤＮＡからの増幅を抑制できれば、少数のメチル化対立遺伝子あるいは非メチル化対立遺伝子の存在はたやすく検証することができる。
【００６２】
本発明の検出方法における標的核酸を検出する工程には、電気泳動、塩基配列解析、サイクリングプローブやＴａｑＭａｎプローブ等のプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを利用することができる。これらの検定方法は一般的な手法をそのまま用いることが可能である。特にＨＲＭ（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ）解析法を用いた場合、目的ＤＮＡの増幅と検出を１段階で行うことができ、迅速かつ簡便な目的ＤＮＡの検証が可能になる。
【００６３】
本発明の特定配列核酸の増幅抑制方法及び変異検出方法においては、耐熱性菌由来のＰＣＮＡを組み合わせることができる。特に限定はされないが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、並びにＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属由来のＰＣＮＡやそのホモログを使用することができる。
【００６４】
さらに、（ａ）特定の塩基配列を有する核酸とハイブリダイズさせた際に１個もしくは数個のミスマッチを生じるように設計されたオリゴデオキシリボヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）少なくとも一対のプライマー、及び（ｄ）少なくとも一種類のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを含む核酸増幅反応用組成物もまた、本発明の一態様である。上記組成物は、さらに、反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、及びインターカレーティング色素から選択される少なくとも１種を含んでもよい。上記の組成物を核酸増幅反応に使用する場合、上記の組成物は、さらに核酸増幅反応の鋳型となる核酸を含んでいても良い。上記組成物は、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ）、界面活性剤、無機塩を含んでいてもよい。さらに、耐熱性菌由来のＰＣＮＡを含んでいてもよい。
【実施例】
【００６５】
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００６６】
調製例１  ゲノムＤＮＡの調製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株（ＪＣＭ  １２３８０Ｔ、以下ＴＫＯと称す）は、京都大学工学研究科の跡見晴幸教授より分与された。本株を以下の方法で培養した。即ち、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）５ｇを加えたａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｓｅａｗａｔｅｒ（以下、ＡＳＷと称す）−ＹＴ培地（０．８×ＡＳＷ、５ｇ／Ｌ濃度のＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製）、５ｇ／Ｌ濃度のＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎ（ベクトンディッキンソン社製）、０．１％  ｒｅｓａｚｕｒｉｎ（ナカライテスク社製））１Ｌに培地が無色になるまで硫化ナトリウムを添加した。その後、前記ＫＯＤ１株を植菌し、８５℃で１６時間嫌気培養した後、集菌し以降の実験に用いた。なお、ＡＳＷ−ＹＴ培地中に含まれる０．８×ＡＳＷの組成は、１６ｇ／Ｌ濃度のＮａＣｌ、２．４ｇ／Ｌ濃度のＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、４．８ｇ／Ｌ濃度のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ濃度の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１６ｇ／Ｌ濃度のＮａＨＣＯ３、０．２４ｇ／Ｌ濃度のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ濃度のＫＣｌ、０．３３６ｇ／Ｌ濃度のＫＨ２ＰＯ４、０．０４ｇ／Ｌ濃度のＮａＢｒ、０．０１６ｇ／Ｌ濃度のＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．００８ｇ／Ｌ濃度のＦｅ（ＮＨ４）ｃｉｔｒａｔｅである。前記の培養で得た約２ｇの菌体を緩衝液Ｌ（１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）１００ｍｌに懸濁し、１０％ＳＤＳを１ｍｌ加えた。この菌体懸濁液を撹拌した後、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のプロテイナーゼＫ（タカラバイオ社製）を１ｍｌ加えて、５５℃で６０分静置した。プロテイナーゼＫ処理後の菌体懸濁液に順次フェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を施した後、得られた水層にエタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。
回収したＤＮＡを１００ｍｌのＴＥ液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、０．７５ｍｇのＲＮａｓｅＡ（ナカライテスク社製）を加えて３７℃で６０分反応させた。その後反応液にフェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を順次施して得られた水層より、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。最終的に７．５ｍｇのＤＮＡが得られた。【００６７】
実施例１  ＴＫＯ  ＮｕｃＳの調製
（１）ＴＫＯ  ＮｕｃＳの発現用プラスミドの作製
配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、すなわちＴＫＯ  ｎｕｃＳ遺伝子のクローニングは以下の方法で行なった。まず、調製例１で調製したＴＫＯゲノムＤＮＡ  １００ｎｇを鋳型にして、配列表の配列番号５記載の塩基配列を有するＴＫ１８９８−Ｆおよび配列表の配列番号６記載の塩基配列を有するＴＫ１８９８−Ｒをプライマーに用いてＰＣＲを行った。なお、ＴＫ１８９８−Ｆは制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を有し、ＴＫ１８９８−Ｒは制限酵素ＮｏｔＩの認識配列を有する。反応液組成は、各プライマー濃度は０．５μＭ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ＵのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて５０μＬの反応容量である。ＰＣＲ条件は、９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １分を１サイクルとする３０サイクル反応で行った。【００６８】
反応液をアガロース電気泳動し、ＴＫＯ  ｎｕｃＳ遺伝子に相当する約８００ｂｐのバンドを切り出し、ここから常法でＤＮＡを精製した。このＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ（いずれもタカラバイオ社製）で消化し、再度アガロース電気泳動とゲルからのＤＮＡ断片精製を行った。このＤＮＡ断片をあらかじめＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）と混合し、ライゲーション反応の後、ＪＭ１０９大腸菌に導入して作製した形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天培地上で培養した。その後生じたコロニーをアンピシリン含有ＬＢ培地で培養して得られた菌体より、ＰｕｒｅＬｉｎｋＲ  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ライフテクノロジーズ社製）を用いてプラスミドを精製した。このプラスミドの挿入断片の塩基配列を常法により解読し、正しくＴＫＯ  ｎｕｃＳ遺伝子がクローニングされていることを確認した。このＴＫＯ  ｎｕｃＳ遺伝子含有プラスミドをｐＥＴ２１ａ−ＴｋｏＮｕｃＳと命名した。【００６９】
（２）ＴＫＯ  ＮｕｃＳの発現
ＴＫＯ  ＮｕｃＳの発現プラスミドであるｐＥＴ２１ａ−ＴｋｏＮｕｃＳは、前記実施例１（１）で作製されたものを用いた。組換えタンパク質の産生には、ノバジェン社の大腸菌組換えタンパク質発現システム（ｐＥＴ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用した。まず、ｐＥＴ２１ａ−ＴｋｏＮｕｃＳを用いて大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ株（アジレント・テクノロジー社製）を説明書記載の方法で形質転換した。形質転換された菌体は、５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌで飽和するまで培養した。こうして得られた培養液を、５０μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリン及び３４μｇ／ｍＬ濃度のクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１ＬにＯＤ６００が０．０１になるように植菌し、ＯＤ６００が０．４になるまで３７℃で振とう培養した後、ＩＰＴＧを添加する（終濃度１ｍＭ）ことで目的タンパク質の産生誘導を行った。ＩＰＴＧ添加後、２５℃で１６時間振とう培養して得た培養液を遠心分離（５,０００×ｇ  １０分間、４℃）して菌体を回収した。【００７０】
回収した菌体を０．５Ｍ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む溶液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）２５ｍｌに懸濁し、氷上で超音波破砕（１０秒間  ｏｎ／１０秒間  ｏｆｆで計１０分間）を行った。この超音波破砕液を遠心分離（２４，０００×ｇ、１０分間、４℃）して得た上清に熱処理（８０℃、３０分間）を行い、ついで遠心（２４，０００×ｇ、１０分間、４℃）を行うことにより、熱変性した大腸菌由来のタンパク質を除去した。【００７１】
（３）ＴＫＯ  ＮｕｃＳの精製
前記（２）で取得した熱処理、遠心分離後の上清に含まれるＴＫＯ  ＮｕｃＳタンパク質を精製するために、まず終濃度０．１５％のポリエチレンイミンをこの上清に添加して混入している核酸を不溶化した。遠心（２４，０００×ｇ、１０分間、４℃）により核酸を除去し、上清を得た。この上清に対して、８０％飽和になるように（ＮＨ４）２ＳＯ４を加え、４℃で一晩撹拌し、目的タンパク質を塩析した。この溶液を遠心分離し（２４，０００×ｇ、１０分間、４℃）、得られた沈殿を１．５Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む溶液Ａ２０ｍｌに溶解させ、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥヘルスケア社製）を用い、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーカラム  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ  ５ｍｌ（ＧＥヘルスケア社製）に供した。１．５Ｍから０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度勾配によりタンパク質を溶出し、１．４〜０．７３Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４に相当する溶出画分を集めた。この画分を、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む溶液Ａで一晩透析した。透析後の溶液を遠心分離（２３，７０８×ｇ、１０分間、４℃）して得られた上清をアフィニティークロマトグラフィーカラムＨｉｓＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥヘルスケア社製）に供した。０．３Ｍから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配によりタンパク質を溶出し、０．５８〜０．８Ｍ  塩化ナトリウムに相当する溶出画分を集めた。この画分を０．３５Ｍ  塩化ナトリウムを含む溶液Ａで一晩透析した。透析後の溶液を遠心分離（２４，０００×ｇ、１０分間、４℃）して得られた上清を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ  １ｍｌ（ＧＥヘルスケア社製）に供した。０．３５Ｍから１Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配によりタンパク質を溶出し、溶出画分を最終精製画分とした。この最終精製産物について１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認した。その結果を図１に示す。精製タンパク質の濃度はＰｒｏｔＰａｒａｍ  ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）で得られたモル吸光係数ε２８０＝１２９５０Ｍ−１ｃｍ−１を用い、精製タンパク質の２８０ｎｍにおける吸光度から算出した。【００７２】
実施例２  ＴＫＯ  ＮｕｃＳの酵素学的性質
（１）ミスマッチＤＮＡ切断反応用基質の調製
ＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチ切断活性について実験を行った。本実施例で用いたオリゴヌクレオチドとそれらの塩基配列は配列表の配列番号７〜１６に示す。なお、配列表の配列番号７〜９は、５’末端にＣｙ５蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドである。【００７３】
図２に示したように、配列表の配列番号７〜１６に記載のオリゴヌクレオチドを組み合わせることで４５ｂｐのミスマッチを含まない二本鎖ＤＮＡ（ａｌｌ  ｍａｔｃｈ  ｄｓＤＮＡ）と、それぞれが１か所のミスマッチを含む８種類の二本鎖ＤＮＡ基質（アデニンとアデニンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ａ  ｄｓＤＮＡ）、アデニンとシトシンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ）、アデニンとグアニンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ａ−Ｇ  ｄｓＤＮＡ）、グアニンとチミンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ｇ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ）、グアニンとグアニンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ｇ−Ｇ  ｄｓＤＮＡ）、チミンとシトシンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ｔ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ）、チミンとチミンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ｔ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ）、シトシンとシトシンのミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ（Ｃ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ））を調製した。Ｃｙ５で蛍光標識されたオリゴヌクレオチドと非標識のオリゴヌクレオチドを１対１．６の比で含むアニール溶液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）５０μｌ中で前述のミスマッチオリゴヌクレオチドをアニールさせて、５０ｎＭの濃度で蛍光標識されたＤＮＡを含む基質溶液を調製した。アニール条件は９８℃  ５分間、８０℃  ３０秒間、８０℃から６０℃になるまで３０分間、６０℃で３０秒間、６０℃から４０℃になるまで３０分間、２５℃で３０秒間の条件で行った。また、二価金属イオンを含まない基質ＤＮＡ溶液は、上記の標識及び非標識オリゴヌクレオチドの組み合せ、アニール条件でアニール溶液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４）５０μｌ中でオリゴヌクレオチドのアニーリングを行い、５０ｎＭの濃度の蛍光標識されたＤＮＡ基質溶液を調製した。【００７４】
（２）ミスマッチＤＮＡ切断活性測定
反応溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡ）２０μｌ中で各濃度のＴＫＯ  ＮｕｃＳ（単量体として０、１、２、５、１０、２０、５０及び１００ｎＭ）と５ｎＭの基質（Ｇ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ）を５５℃、５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μｌを加え反応を停止させた。反応停止後、反応液に５ｍｇ／ｍＬ濃度のプロテイナーゼＫを０．５μｌ加え、３０分間処理することでタンパク質の分解を行った。プロテイナーゼＫ処理後の反応液に、ゲルローディングバッファー（１５％Ｆｉｃｏｌｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、０．１％ＯｒａｎｇｅＧ）  ４μｌを加え、この溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルに供し、１×ＴＢＥ中、２５ｍＡで３０分間の電気泳動を行った。その結果を図３−Ａに示す。図３−Ａにおいてレーン１〜８は、それぞれＴＫＯ  ＮｕｃＳの０〜１００ｎＭに相当する。さらに、電気泳動後のゲルについて、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋  ｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて反応生成物の検出を行い、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬで切断されたオリゴヌクレオチドに相当するバンドの定量を行った。その結果を図３−Ｂに示す。図３−Ｂにおいて縦軸は、切断効率（％）であり、横軸はＴＫＯ  ＮｕｃＳの濃度である。【００７５】
（３）ＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応における至適ｐＨの検討
ＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応における至適ｐＨの検討は、以下のようにして行った。即ち、２０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）、２０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ緩衝液（ｐＨ４．０及び、ｐＨ５．０）、２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０及びｐＨ１０．０）、２０ｍＭ  ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１１．０）、２０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１２．０）の各緩衝液及び０．１Ｍ  ＮａＯＨの溶液（ｐＨ１３．０）に、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡになるように添加したものに、さらにＴＫＯ  ＮｕｃＳ  ２ｎＭと、図２に示したＧ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ  （配列表の配列番号８記載の塩基配列を有するＣｙ５−４５−ｍｉｓｍａｔｃｈ  オリゴヌクレオチドと配列表の配列番号１０記載の塩基配列を有するｔｅｍｐ４５−ｎｏｒｍａｌ  オリゴヌクレオチドからなる２本鎖ＤＮＡ）５ｎＭを添加して５５℃で５分間インキュベートした。インキュベート後、反応液をプロテイナーゼＫ処理し、その後電気泳動に供し切断活性を測定した。その結果を図４に示す。即ち、図４は、反応至適ｐＨを示す図であり、縦軸は相対活性を示し、横軸はｐＨを示す。【００７６】
（４）塩の種類と濃度がＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応に与える影響
塩の種類と濃度がＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応に与える影響を検討した。まず、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡに対して、０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、６００、８００及び１０００ｍＭのＮａＣｌ、ＫＣｌあるいはＫ−Ｇｌｕ（グルタミン酸カリウム）を含む反応液を調製し、そこにＴＫＯ  ＮｕｃＳ  ２ｎＭとＧ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ  ５ｎＭを添加して５５℃で５分間インキュベートさせた。インキュベート後、反応液をプロテイナーゼＫ処理し、その後電気泳動に供し切断活性を測定した。その結果を図５に示す。即ち、図５（Ａ）は、塩化ナトリウム濃度の影響を示す図であり、縦軸は相対活性を示し、横軸は塩濃度を示し、図５（Ｂ）は、塩化カリウム濃度の影響を示す図であり、縦軸は相対活性を示し、横軸は塩濃度を示し、図５（Ｃ）は、グルタミン酸カリウム濃度の影響を示す図であり、縦軸は相対活性を示し、横軸は塩濃度を示す。【００７７】
（５）二価金属イオンがＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応に与える影響
二価金属イオンがＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応に与える影響を検討した。反応液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡに対して、０、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００及び２００ｍＭのＭｇＣｌ２、あるいは０、０．５、１、２、５、１０及び２０ｍＭのＭｎＣｌ２を含む反応液を調製し、そこにＴＫＯ  ＮｕｃＳ  ２ｎＭとＧ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ  ５ｎＭを添加して５５℃で５分間インキュベートさせた。インキュベート後、反応液をプロテイナーゼＫ処理し、その後電気泳動に供し切断活性を測定した。その結果を図６、および図７に示す。即ち、図６は、塩化マグネシウム濃度の影響を示す図であり、縦軸は相対活性を示し、（Ａ）の横軸は０〜２００ｍＭの濃度を示し、（Ｂ）の横軸は０〜２０ｍＭ濃度を示す。同様に図７は、塩化マンガンの影響を示す図であり、縦軸は相対活性を示し、横軸は塩化マンガン濃度を示す。【００７８】
（６）ＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応における至適温度の検討
ＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応における至適温度の検討は以下のようにして行った。即ち、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡを含む反応液を調製し、そこにＴＫＯ  ＮｕｃＳ  ２ｎＭとＧ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ  ５ｎＭを添加して３０℃から９５℃の反応温度で５分間インキュベートさせた。インキュベート後、反応液をプロテイナーゼＫ処理し、その後電気泳動に供し切断活性を測定した。その結果を図８に示す。即ち、図８は、至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性を示し、横軸は反応温度を示す。【００７９】
実施例３  ＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチ切断活性の確認
（１）様々なミスマッチＤＮＡに対する切断活性
実施例２（１）でアニールして作製した４５ｂｐのミスマッチを含まない二本鎖ＤＮＡ（ａｌｌ  ｍａｔｃｈ  ｄｓＤＮＡ）と、それぞれが１か所のミスマッチを含む８種類の二本鎖ＤＮＡ基質を用いて、ＴＫＯ  ＮｕｃＳの様々なミスマッチＤＮＡに対する切断活性を検討した。即ち、反応溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡ）２０μｌ中で各濃度のＴＫＯ  ＮｕｃＳ（単量体として０、１、２、５、１０、２０、５０及び１００ｎＭ）と５ｎＭの基質（ａｌｌ  ｍａｔｃｈ  ｄｓＤＮＡ、Ａ−Ａ  ｄｓＤＮＡ、Ａ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ、Ａ−Ｇ  ｄｓＤＮＡ、Ｇ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ、Ｇ−Ｇ  ｄｓＤＮＡ、Ｔ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ、Ｔ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ、及びＣ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ）を５５℃、５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μｌを加え反応を停止させた。反応停止後、反応液に５ｍｇ／ｍＬ濃度のプロテイナーゼＫを０．５μｌ加え、３０分間処理することでタンパク質の分解を行った。プロテイナーゼＫ処理後の反応液にゲルローディングバッファー  ４μｌを加え、この溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルに供し、１×ＴＢＥ中、２５ｍＡで３０分間の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルについて、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋  ｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて反応生成物の検出を行い、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬで切断されたオリゴヌクレオチドに相当するバンドの定量を行った。その結果を図９に示す。図９において縦軸は、切断効率（％）であり、横軸はＴＫＯ  ＮｕｃＳの濃度である。それぞれのミスマッチ基質の切断効率を凡例に示すような異なるマーカーで表しグラフで示した。図９から、ＴＫＯ  ＮｕｃＳは、Ｇ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ、Ｇ−Ｇ  ｄｓＤＮＡ、Ｔ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ、Ｔ−Ｃ  ｄｓＤＮＡ及びＡ−Ｇ  ｄｓＤＮＡを切断することが確認できた。【００８０】
（２）ＴＫＯ  ＮｕｃＳのＤＮＡ結合活性の測定
ＴＫＯ  ＮｕｃＳのＤＮＡ結合活性について検討した。まず基質特異性を調べるため、結合溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）２０μｌ中で各濃度のＴＫＯ  ＮｕｃＳ（単量体として０、１、２、５、１０及び２０ｎＭ）と配列表の配列番号１７記載の塩基配列を有し、その５’末端にＣｙ５蛍光標識を有するＣｙ５−１５ｂｉｎｄｉｎｇオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号１８〜２６に記載の塩基配列を有する各１５ｂｉｎｄｉｎｇオリゴヌクレオチドを図１０に示した組み合わせで調製したプローブＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ（Ｃｙ５−１５ｂｉｎｄｉｎｇ）、ａｌｌ  ｍａｔｃｈ（１５ｂｐ）  ｄｓＤＮＡ、Ａ−Ａ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ａ−Ｃ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ａ−Ｇ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ｇ−Ｔ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ｇ−Ｇ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ｔ−Ｃ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ｔ−Ｔ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ及びＣ−Ｃ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ）の５ｎＭを３７℃で５分間保温した。保温終了後の反応液にゲルローディングバッファー４μｌを加え、この溶液を８％ポリアクリルアミドゲルに供し、０．５×ＴＢＥ中、２５ｍＡで３０分間の電気泳動を行った。電気泳動後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋  ｉｍａｇｅｒを用いて結合活性の検出を行った。その結果を図１１に示す。図１１においてレーン1〜６及びレーン７〜１２は、それぞれＴＫＯ  ＮｕｃＳの０〜２０ｎＭに相当する。図１１から、ＴＫＯ  ＮｕｃＳは、Ｇ−Ｔ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ、Ｇ−Ｇ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡ及びＴ−Ｔ（１５ｂｐ）ｄｓＤＮＡに結合することが確認できた。【００８１】
（３）ＴＫＯ  ＮｕｃＳの耐熱性検討
耐熱性の検討は、以下のようにして行った。即ち、実施例３（２）の記載に従って、単量体として２ｎＭ  ＴＫＯ  ＮｕｃＳを含み、かつ基質を含まない反応液  １８μｌを調製した。この反応液を各温度（５０、６０、７０、８０、８５、９０及び９５℃）で３０分間処理した後に５ｎＭの基質（Ｇ−ＴミスマッチｄｓＤＮＡ）を加え、５５℃、５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μｌを加え反応を停止させた。反応停止後、反応液に５ｍｇ／ｍＬ濃度のプロテイナーゼＫ  ０．５μｌを加え、３０分間処理することでタンパク質の分解を行った。プロテイナーゼＫ処理後の反応液にゲルローディングバッファー４μｌを加え、この溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルに供し、１×ＴＢＥ中、２５ｍＡで３０分間の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルについてＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋  ｉｍａｇｅｒを用いて反応生成物の検出を行い、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬで切断されたオリゴヌクレオチドに相当するバンドの定量を行った。その結果を図１２に示す。即ち、図１２は、耐熱性を示す図であり、縦軸は残存活性を示し、横軸は処理温度を示す。図１２から、ＴＫＯ  ＮｕｃＳは、８０℃で３０分間処理しても約８０％のミスマッチ切断活性が残っていることが確認できた。【００８２】
実施例４  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｉ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来ＰＣＮＡ１によるＴＫＯ  ＮｕｃＳの切断活性の促進
Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＰＣＮＡ１（Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ、２０１２年、第１７巻、１１号、ｐ．９２３−９３７、以下ＴＫＯ  ＰＣＮＡと称す）によるＴＫＯ  ＮｕｃＳのミスマッチＤＮＡ切断反応への影響を検討した。即ち、塩化ナトリウム４００ｍＭを含む切断反応溶液Ｃの２０μｌ中で、二量体として２．５ｎＭの野生型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ、５ｎＭの基質ＤＮＡ（Ｇ−Ｔ  ｄｓＤＮＡ）、及び各濃度のＴＫＯ  ＰＣＮＡ（三量体として０、５、１０、２５、５０、１２５、２５０、５００、及び１２５０ｎＭ）を５５℃で５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μｌを加えて反応を停止させた。反応停止後、反応液に５ｍｇ／ｍＬ濃度のプロテイナーゼＫ  １μｌ及び１０％ＳＤＳ  １μｌを加え、５０℃で１時間反応させることでタンパク質の分解を行った。
プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ処理後の反応液にゲルローディングバッファーを４．５μｌ加え、この溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルに供し、１×ＴＢＥ中、２５ｍＡで２０分間の電気泳動を行った。
【００８３】
電気泳動後のゲルについてＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ＋  ｉｍａｇｅｒを用いて反応生成物の検出を行い、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬで切断されたオリゴヌクレオチドに相当するバンドの定量を行った。その結果を図１３に示す。図１３中、（Ａ）は、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ写真を示す。また、（Ｂ）は、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬで基質と切断産物のバンド強度を定量化したものであり、縦軸は相対活性を示し、ＰＣＮＡを含まないときの活性を１とした時の様々な濃度のＰＣＮＡ添加後の相対活性である。図１３に示すように、反応阻害が起こる４００ｍＭ  ＮａＣｌ存在下でも、ＴＫＯ  ＰＣＮＡが存在すると、ミスマッチ切断活性が促進されることが確認できた。【００８４】
実施例５  変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳの調製
（１）変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳの発現用プラスミドの作製
ＴＫＯ  ＮｕｃＳの各種部位特異的変異体発現用のプラスミドを構築するため、配列表の配列番号２７〜３０記載の塩基配列を有するプライマーを作製した。次に、変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ産生用プラスミドを構築するため、ＰＣＲを利用した変異導入法を用いた。【００８５】
４７番目の残基への変異導入及び７６番目の残基への変異導入のため、以下の方法を２回繰り返した。２つの１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社製）、０．２ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  マグネシウムイオン、０．０２Ｕ／μＬのＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏを含む２５μｌの反応溶液中に、鋳型として１回目はＴＫＯ  ＮｕｃＳ発現プラスミド（ｐＥＴ２１ａ−ＴｋｏＮｕｃＳ）２５ｎｇを、続いて２回目は１回目に作製したプラスミド２５ｎｇを用い、１回目にはそれぞれ７．５ｐｍｏｌの配列番号２７及び２８のプライマーを、２回目にはそれぞれ７．５ｐｍｏｌの配列番号２９及び３０のプライマーを加えた。反応条件は、９８℃  １分の後、９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ５分を１サイクルとする１４サイクル反応、６８℃  ５分、２５℃  ５秒で行った。【００８６】
ＰＣＲ後、溶液に２０Ｕ／μｌのＤｐｎＩ（タカラバイオ社製）を０．５μｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＤｐｎＩ処理後の反応溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この菌体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地２５ｍｌで振とう培養した後、プラスミド抽出をＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）  ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて行った。抽出したプラスミドのＴＫＯ  ＮｕｃＳがコードされている塩基配列を常法で解読し、変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳタンパク質産生用プラスミドが調製できたことを確認した。作製したプラスミドはｐＥＴ２１ａ−ＴｋｏＮｕｃＳ＿Ｓ４７Ａ／Ｎ７６Ａ  と名付けた。また、変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ  Ｓ４７Ａ／Ｎ７６Ａの発現・精製は、実施例１（２）及び（３）記載の方法で行った。【００８７】
実施例６  変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ  Ｓ４７Ａ／Ｎ７６ＡのミスマッチＤＮＡ切断活性
変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ  Ｓ４７Ａ／Ｎ７６ＡのミスマッチＤＮＡ切断活性を解析した。即ち、反応溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬ濃度のＢＳＡ）２０μｌ中で５ｎＭの基質（Ａ−Ａ  ｄｓＤＮＡ）とそれぞれ野生型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ及び変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ  Ｓ４７Ａ／Ｎ７６Ａを二量体として５０ｎＭ添加し、５５℃、５分間反応させた。その後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １μｌを加え反応を停止させた。反応停止後、反応液に５ｍｇ／ｍＬ濃度のプロテイナーゼＫを０．５μｌ加え、３０分間処理することでタンパク質の分解を行った。プロテイナーゼＫ処理後の反応液にゲルローディングバッファー  ４μｌを加え、この溶液を１０％ポリアクリルアミドゲルに供し、１×ＴＢＥ中、２５ｍＡで３０分間の電気泳動を行った。【００８８】
その結果を図１４に示す。図１４においてレーン１〜３は、それぞれＴＫＯ  ＮｕｃＳタンパク質を含まない反応液、野生型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ、及び変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ  Ｓ４７Ａ／Ｎ７６Ａに相当する。その結果、変異型ＴＫＯ  ＮｕｃＳ  Ｓ４７Ａ／Ｎ７６Ａが、Ａ−Ａミスマッチを認識し切断することが確認できた。このことから、Ｇ−Ｇ、Ｇ−ＴあるいはＴ−Ｔミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼと少なくともＡ−Ａミスマッチを認識して切断するミスマッチエンドヌクレアーゼの両方を作製することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農学等の幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
SEQ ID NO: 1: amino acid sequence of wild type endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis 
SEQ ID NO: 2: nucleotide sequence of wild type endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis 
SEQ ID NO: 3: amino acid sequence of mutant endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis 
SEQ ID NO: 4: nucleotide sequence of mutant endonuclease NucS from Thermococcus kodakarensis
SEQ ID NO: 5: TK1898-F primer
SEQ ID NO: 6: TK1898-R primer
SEQ ID NO: 7: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-45-nondamaged. "5'-end is labeled with Cy5"
SEQ ID NO: 8: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-45-mismatch. "5'-end is labeled with Cy5"
SEQ ID NO: 9: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-temp45. "5'-end is labeled with Cy5"
SEQ ID NO: 10: Substrate for TKO NucS, named as temp45-normal.
SEQ ID NO: 11: Substrate for TKO NucS, named as temp45-21A.
SEQ ID NO: 12: Substrate for TKO NucS, named as temp45-21C.
SEQ ID NO: 13: Substrate for TKO NucS, named as temp45-21G.
SEQ ID NO: 14: Substrate for TKO NucS, named as 45-mismatch25C.
SEQ ID NO: 15: Substrate for TKO NucS, named as 45-mismatch25T.
SEQ ID NO: 16: Substrate for TKO NucS, named as nondamaged-22C.
SEQ ID NO: 17: Substrate for TKO NucS, named as Cy5-15binding. "5'-end is labeled with Cy5"
SEQ ID NO: 18: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_AT.
SEQ ID NO: 19: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_AA.
SEQ ID NO: 20: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CA.
SEQ ID NO: 21: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GA.
SEQ ID NO: 22: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GT.
SEQ ID NO: 23: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_GG.
SEQ ID NO: 24: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CT.
SEQ ID NO: 25: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_TT.
SEQ ID NO: 26: Substrate for TKO NucS, named as 15binding_CC.
SEQ ID NO: 27: A47-F primer
SEQ ID NO: 28: A47-R primer
SEQ ID NO: 29: A76-F primer
SEQ ID NO: 30: A76-R primer
【図１】
0006550649.tif 000002
【図２】
0006550649.tif 000003
【図３】
0006550649.tif 000004
【図４】
0006550649.tif 000005
【図５】
0006550649.tif 000006
【図６】
0006550649.tif 000007
【図７】
0006550649.tif 000008
【図８】
0006550649.tif 000009
【図９】
0006550649.tif 000010
【図１０】
0006550649.tif 000011
【図１１】
0006550649.tif 000012
【図１２】
0006550649.tif 000013
【図１３】
0006550649.tif 000014
【図１４】
0006550649.tif 000015
【配列表】
0006550649000001.app