(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び／又は該アプタマーを安定化する塩基配列の設計方法であって、
一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含むDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換することを含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成され、
前記塩基類似体が、Ds（7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine）、Pn(2-nitropyrrole-1-yl）、Pa（2-formyl-1H-pyrrole-1-yl）、P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one）、Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone）、5SICS（6-methylisoquinoline-1(2H)-thione）、NaM（3-methoxynaphthalen-2-yl）、及びMMO2（2-methoxy-4-methylphenyl）からなる群から選択される、前記設計方法。
【請求項２】
前記DNAアプタマーが、一以上の塩基類似体及び／又は修飾塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩基類似体が、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ミニヘアピンを構成するステム構造以外のステム構造中のGC対を増加させることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
GC対を増加させたステム構造を除く前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記DNAアプタマーの一方の末端に、請求項１に規定されるミニヘアピン構造を付加することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法に従ってDNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び
設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程
を含む、標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法。
【請求項９】
配列番号6及び8〜11のいずれかに示される塩基配列からなる、IFN-γ用DNAアプタマー。
【請求項１０】
配列番号19〜22のいずれかに示される塩基配列からなる、VEGF用DNAアプタマー。
【請求項１１】
配列番号14〜16のいずれかに示される塩基配列からなる、vWF用DNAアプタマー。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAアプタマーの標的分子結合能を強化及び／又はDNAアプタマーを安定化する塩基配列の設計方法並びに該性質を有するDNAアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、siRNA、核酸アプタマー及びデコイ核酸のような機能性核酸が医薬又は診断薬として注目され、その医療応用に向けて様々な核酸医薬品等の研究及び開発が世界各国で進められている。【０００３】
しかし、核酸は、通常、生体内でヌクレアーゼ等の核酸分解酵素により分解され易いという問題がある。生体内での核酸の安定化は、核酸医薬品の薬理効果を効率的に、かつ継続的に作用させる上で不可欠な課題となっている。【０００４】
核酸アプタマーの核酸分解酵素に対する安定性を向上させるためには、核酸分子のバックボーンとなる糖やリン酸部分への化学修飾を施す手法が一般的である（非特許文献1及び2、並びに特許文献1）。しかし、これらの修飾は、核酸の高次構造や物性にも影響も及ぼす可能性があり、標的分子との結合能の低下や生体内での毒性が高まるのみならず、製造コストも増加する可能性がある等の問題を有している。したがって、化学修飾による核酸アプタマーの医薬に向けての実用化には、修飾可能な部位を修飾して網羅的にスクリーニングし、それぞれ解析しなければならないのが現状である。また、このような化学修飾によって、標的分子への結合能を向上させることは一般的には困難であり、報告例もほとんどない。【０００５】
したがって、核酸アプタマーの安定性を高め、さらには標的分子への結合能を向上させるための簡便かつ低コストな方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許出願公開第1931694号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Peng, C.G., Masad, J., Damha, M.J., G-quadruplex induced stabilization by 2′-deoxy-2′-fluoro-D-arabinonucleic acids (2′F-ANA), 2007, Nucl. Acids Res., 35, pp. 4977-4988.
【非特許文献２】Wang, R.E., Wu, H., Niu, Y., Cai, J., Improving the stability of aptamers by chemical modification., 2011, Curr. Med. Chem., pp.4126-4138.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、DNAアプタマーの安定性及び／又は標的分子結合能を高めるための簡便かつ低コストな方法、並びに該方法により得られるDNAアプタマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者は、DNAアプタマーの内部のヘアピン構造をミニヘアピン構造と呼ばれる構造に置換すること、さらに任意にDNAアプタマーのステム構造のA-T塩基対をG-C塩基対に置換することにより、既存のDNAアプタマーの安定性及び／又は標的分子結合能を高めることができることを見出し、本願発明を完成させた。【００１０】
したがって、本願発明は以下の態様を包含する。
（１）既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び／又は該アプタマーを安定化する塩基配列の設計方法であって、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含むDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換することを含み、前記ミニヘアピン構造が、5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、前記設計方法。
（２）前記DNAアプタマーが、一以上の塩基類似体及び／又は修飾塩基を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記塩基類似体が、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylである、（２）に記載の方法。
（４）ミニヘアピンを構成するステム構造以外のステム構造中のGC対を増加させることを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることを含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記DNAアプタマーの一方の末端に、（１）に規定されるミニヘアピン構造を付加することを含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法に従ってDNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程を含む、標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法。
（８）DNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程を含む製造法によって得られる標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーであって、前記設計工程が、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含むDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換することを含み、前記ミニヘアピン構造が、5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、前記DNAアプタマー。
（９）一以上の塩基類似体及び／又は修飾塩基を含む、（８）に記載のDNAアプタマー。
（１０）前記塩基類似体が、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylである、（９）に記載のDNAアプタマー。
（１１）前記設計工程が、ミニヘアピンを構成するステム構造以外のステム構造中のGC対を増加させることを含む、（８）〜（１０）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１２）前記一以上のステム構造の一つがDNAアプタマーの末端を構成する場合に、前記設計工程が、該DNAアプタマーの末端においてGC対を1対〜5対増加させることを含む、（８）〜（１１）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１３）前記設計工程が、前記DNAアプタマーの一方の末端に、（８）に規定されるミニヘアピン構造を付加することを含む、（８）〜（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１４）一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有するDNAアプタマーであって、該DNAアプタマーの非末端部に存在し、一組のステム構造及びループ構造で構成される一以上のヘアピン構造が、5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、（B）gna又はgnna（ここで、各nは、独立に、g、t、a若しくはc、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、かつ第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、前記DNAアプタマー。
（１５）前記一以上のステム構造における総GC含量が75%以上である、（１４）に記載のDNAアプタマー。
（１６）（１４）に規定されるヘアピン構造を一方の末端にさらに含む、（１４）又は（１５）に記載のDNAアプタマー。
（１７）配列番号6及び8〜11のいずれかに示される塩基配列からなる、IFN-γ用DNAアプタマー。
（１８）配列番号19〜22のいずれかに示される塩基配列からなる、VEGF用DNAアプタマー。
（１９）配列番号14〜16のいずれかに示される塩基配列からなる、vWF用DNAアプタマー。
（２０）（８）〜（１９）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。【００１１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-045266号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、低コストで、かつ簡便な調製方法により、DNAアプタマーに安定性を付与し、生体内での高い安定性を確保させ、及び／又は標的分子結合能を高めることができる。それによって、前記DNAアプタマーが、長期間にわたり継続的にその薬理効果を発揮することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、本発明の第1工程の一例を示す。（A）は、ヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換する例を、（B）は、ステム構造に一つのバルジ構造を含むヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換する例を、（C）は、ステム構造に一つのインターナルループ構造を含むヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換する例を示す。図中、101はステム構造を、102はループ構造を、103はヘアピン構造を、104は第1核酸領域を、105は第2核酸領域を、106は第3核酸領域を、107はミニヘアピン構造を、108はバルジ構造を、109はインターナルループ構造を示す。
【図２】図2は、本発明の第2工程の一例を示す。（A）は、バルジ構造を構成する塩基と同数の塩基を他方の鎖に付加する例を、（B）は、バルジ構造を構成する塩基よりも少ない数の塩基を他方の鎖に付加する例を示す。図中、SはG又はCを、S'はSの相補的塩基を示す。
【図３】図3は、本発明の第2工程の一例であり、バルジ構造中のA又はTをG又はCに置換し、その後置換した塩基の相補的塩基を付加する例を示す。図中、WはA又はTを、SはG又はCを、S'はSの相補的塩基を示す。
【図４】図4は、本発明の第2工程の一例を示す。（A）は、インターナルループを構成する塩基の全てをGC対に置換する例を、（B）は、一部の塩基を置換する場合であってインターナルループ構造の末端を置換する例を、（C）は、一部の塩基を置換する場合であってインターナルループ構造の内部を置換する例を示す。図中、NはA、T、G、又はCを、SはG又はCを、S'はSの相補的塩基を示す。
【図５】図5は、本発明の第2工程の一例を示す。インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において異なる場合であって、双方の鎖から同数ずつGC対へ置換する数を増やした場合に、最終的に一方の鎖にバルジ構造が生ずることを示す。図中、NはA、T、G、又はCを、SはG又はCを、S'はSの相補的塩基を示す。
【図６】図6は、実施例で調製した、各IFN-γ用アプタマーの配列と二次構造を示す図である。人工塩基Dsの位置は、丸枠で示す。オリジナルのAptamer 49に対して、ヘアピンをミニヘアピンに置換した部位、及びミニヘアピンを付加した部位は、矢頭を付した四角枠で示す。A-T塩基対からG-C塩基対への置換部位は、四角枠で示す。
【図７】図7は、各IFN-γ用アプタマーの、Aptamer49に対する競合試験の結果を示す図である。上段には、P-標識Aptamer49と共に加えた各種アプタマーと、IFN-γの添加の有無（-：添加なし；＋：添加有）を示す。中段には、P-標識Aptamer49とIFN-γの複合体、及び遊離のP-標識Aptamer49のバンドを示す。下段には、ゲルシフト率、ゲルシフト率から算出したAptamer49のIFN-γへの結合の各アプタマーによる阻害率、及びAptamer49自身の競合阻害能と比較することにより算出した相対結合率を示す。
【図８】図8は、各IFN-γ用アプタマーのヒトIFN-γへの結合を、表面プラズモン共鳴によって測定した結果を示す図である。横軸は時間（秒）を、縦軸は共鳴単位（resonance unit:RU）を示し、図中の数値は算出されたKd値を示す。
【図９】図9は、ヒト血清中での各IFN-γ用アプタマーの安定性を、ゲル電気泳動により確認した結果を示す図である。未分解のアプタマーのバンドの位置を黒三角で示す。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、72時間後に電気泳動した際の、未分解のアプタマーのバンドから、それぞれの時間における残存DNAを100分率で算出した。
【図１０】図10は、各IFN-γ用アプタマーのTm値の測定結果を示す図である。（A）では、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度を示す。（B）では、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度の一次導関数を示す。
【図１１】図11は、各IFN-γ用アプタマーのIFN-γ刺激応答抑制効果を、培養細胞を用いてFACSにより測定した結果を示す図である。（A）は、IFNγ刺激により、IFN-γ受容体を介してSTAT１がリン酸化されることを示す模式図である。（B）は、リン酸化STAT抗体を用いたFACS解析の結果を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。未刺激の細胞を灰色で塗りつぶした領域で示す。抗リン酸化STAT-1抗体溶液による処理を施していない未刺激の細胞は線で示す。（C）は、リン酸化STAT抗体を用いたIFN-γで処理された細胞のFACS解析を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。未刺激の細胞は灰色で塗りつぶした領域、IFN-γで刺激した細胞は線で示す。
【図１２】図12は、各IFN-γ用アプタマーのIFN-γ刺激応答抑制効果を、培養細胞を用いてFACSにより測定した結果を示す図である。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。上段パネルはAptamer 49の抑制効果を、下段パネルはAptamer 58の抑制効果を、それぞれ示す。
【図１３】図13は、各IFN-γ用アプタマーのIFN-γ刺激応答抑制効果を、培養細胞を用いてFACSにより測定した結果を示す図である。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。
【図１４】図14は、実施例で調製した、天然塩基のみからなる各IFN-γ用アプタマーの配列と二次構造を示す図である。人工塩基Dsの位置は、丸枠で示す。オリジナルのAptamer49に対して、ヘアピンをミニヘアピンに置換した部位、及びミニヘアピンを付加した部位は、矢頭を付した四角枠で示す。人工塩基DsからAへの置換部位、及びA-T塩基対からG-C塩基対への置換部位は、小さな四角枠で示す。
【図１５】図15は、Aptamer49に対する競合試験の結果を示す図である。上段には、P-標識Aptamer49と共に加えた各種アプタマーと、IFN-γの添加の有無（-：添加なし；＋：添加有）を示す。中段には、P-標識Aptamer49とIFN-γの複合体、及び遊離のP-標識Aptamer49のバンドを示す。下段には、ゲルシフト率、ゲルシフト率から算出したAptamer49のIFN-γへの結合の各アプタマーによる阻害率、及びAptamer49自身の競合阻害能と比較することにより算出した相対結合率を示す。
【図１６】図16は、天然塩基のみからなる各IFN-γ用アプタマーのTm値の測定結果を示す図である。（A）のグラフでは、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度を示す。（B）のグラフでは、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度の一次導関数を示す。
【図１７】図17は、実施例で調製した、各vWF A1ドメイン用アプタマーの配列と二次構造を示す図である。オリジナルのARC1172(wt)に対して、ヘアピンをミニヘアピンに置換する際に置換した部位、及びミニヘアピンを付加した部位は、矢頭を付した四角枠で示す。末端に付加したinverted dTの位置は、丸枠で示す。
【図１８】図18は、各vWF A1ドメイン用アプタマーの、ARC1172(wt)に対する競合試験の結果を示す図である。上段には、P-標識ARC1172(wt)と共に加えた各種アプタマーと、vWF A1の添加の有無（-：添加なし；＋：添加有）を示す。中段には、P-標識ARC1172(wt)とvWF A1の複合体、及び遊離のP-標識ARC1172(wt)のバンドを示す。下段には、ゲルシフト率、ゲルシフト率から算出したARC1172(wt)のvWF A1ドメインへの結合の各アプタマーによる阻害率、及びARC1172(wt)自身の競合阻害能と比較することにより算出した相対結合率を示す。
【図１９】図19は、ヒト血清中での各vWF A1ドメイン用アプタマーの安定性を、ゲル電気泳動により確認した結果を示す図である。未分解のアプタマーのバンドの位置を黒三角で示す。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、72時間後に電気泳動した際の、未分解のアプタマーのバンドから、それぞれの時間における残存DNAを100分率で算出した。
【図２０】図20は、各vWF A1ドメイン用アプタマーのTm値の測定結果を示す図である。（A）のグラフでは、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度を示す。（B）のグラフでは、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度の一次導関数を示す。
【図２１】図21は、実施例で調製した、各VEGF165用アプタマーの配列と二次構造を示す。人工塩基Dsの位置は丸枠で、オリジナルのAptamer47に対して、G-C塩基対を追加した部位、また、A-T塩基対からG-C塩基対への置換部位は、小さな四角枠で示す。ミニヘアピン配列は、矢頭を付した四角枠で示す。
【図２２】図22は、各VEGF165用アプタマーのAptamer47に対する競合試験の結果を示す図である。上段には、P-標識Aptamer47と共に加えた各種アプタマーと、VEGF165の添加の有無（-：添加なし；＋：添加有）を示す。中段には、P-標識Aptamer47とVEGF165の複合体、及び遊離のP-標識Aptamer47のバンドを示す。下段には、ゲルシフト率、ゲルシフト率から算出したAptamer47のVEGF165への結合の各アプタマーによる阻害率、及びAptamer47自身の競合阻害能と比較することにより算出した相対結合率を示す。
【図２３】図23は、ヒト血清中での各VEGF165用アプタマーの安定性を、ゲル電気泳動により確認した結果を示す図である。未分解のアプタマーのバンドの位置を黒三角で示す。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、72時間後に電気泳動した際の、未分解のアプタマーのバンドから、それぞれの時間における残存DNAを100分率で算出した。
【図２４】図24は、各VEGF165用アプタマーのTm値の測定結果を示す図である。（A）のグラフでは、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度を示す。（B）のグラフ、横軸は温度、縦軸は標準化吸光度の一次導関数を示す。（C）のグラフは、（A）のグラフの50℃までの部分を拡大したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．定義
本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
【００１５】
本明細書において「核酸」又は「核酸分子」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。
【００１６】
本明細書において「天然型ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドであって、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然型塩基を有するデオキシリボヌクレオチドから構成されるDNA、及びアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの天然型塩基を有するリボヌクレオチドから構成されるRNA、又はそれらの組み合わせが挙げられる。天然型ヌクレオチドのみで構成される核酸（分子）を、本明細書では天然型核酸（分子）とする。
【００１７】
本明細書において「非天然型ヌクレオチド」とは、その塩基が人工塩基で構成されている自然界に存在しないヌクレオチドをいう。本発明における非天然型ヌクレオチドを構成するリン酸基及び糖は、天然型ヌクレオチドのリン酸基及び糖と構造的に同一である。
【００１８】
本明細書において「塩基類似体」又は「人工塩基」とは、天然型ヌクレオチドを構成する天然型塩基に類似の性質を有する人工的に構築された化学物質であって、天然型塩基と同様に、人工塩基対合を形成することのできる相手となる塩基類似体（本明細書では、以降「相補的人工塩基」とする）を有する。本明細書において「人工塩基対合」とは、天然型塩基のアデニンとチミン、アデニンとウラシル、又はグアニンとシトシンのように、一対の相補的人工塩基が互いに形成する塩基対合をいう。人工塩基対合は、天然型塩基間の塩基対合に見られる水素結合を介した化学的結合、人工塩基間の分子構造に基づく嵌合を介した物理的結合、及び疎水性相互作用を介したスタッキング効果を含む。
【００１９】
人工塩基が有する「天然型塩基に類似の性質」には、人工塩基対合による相補性によって核酸の複製又は転写（逆転写を含む）が可能な性質を含む。人工塩基は、天然型塩基と同様に、人工塩基対合において排他的選択性を有する。したがって、基質ヌクレオチドに一対の相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが存在すれば、非天然型ヌクレオチドを含む核酸分子であっても、人工塩基間の相補性によって、天然型ヌクレオチドと同様に正確な複製や転写ができる。それ故、非天然型ヌクレオチドを含みながら、PCR等の核酸増幅法によるDNA分子の増幅等が可能となる。
【００２０】
上記人工塩基の具体例として、Ds（7-(2-thienyl)imidazo[4,5-b]pyridine；本明細書では「Ds」とする）、Pn(2-nitropyrrole-1-yl；本明細書では「Pn」とする）、Pa（2-formyl-1H-pyrrole-1-yl；本明細書では「Pa」とする）、P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one；本明細書では「P」とする）、Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone；本明細書では「Z」とする）、5SICS（6-methylisoquinoline-1(2H)-thione；本明細書では「5SICS」とする）、NaM（3-methoxynaphthalen-2-yl；本明細書では「NaM」とする）、及びMMO2（2-methoxy-4-methylphenyl；本明細書では「MMO2」とする）が挙げられる。これらの人工塩基において、Dsの相補的人工塩基には、Pn、及びPaが挙げられる。Pの相補的人工塩基には、Zが挙げられる。5SICSの相補的人工塩基には、NaM、及びMMO2が挙げられる。
【００２１】
なお、人工塩基は、複製や転写の際、相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが基質に含まれない場合には、相補的人工塩基と構造的に及び／又は性質的に近い天然型塩基と代替的に塩基対合することができる。この場合、鋳型となった核酸分子における非天然型ヌクレオチドは、複製又は転写後に天然型ヌクレオチドに置換されることとなる。例えば、Dsの場合、A又はTに置換されることが知られている。
【００２２】
本明細書において、「修飾塩基」とは、人工的に化学修飾された塩基を意味する。修飾塩基として、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル、5-(3-インドール-2-エチル)ウラシル、5-(4-ヒドロキシフェニル-2-エチル)ウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。
【００２３】
本明細書において、「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的分子と強固、かつ特異的に結合し、標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。したがって、核酸アプタマーは、標的分子の機能阻害剤となり得る。本明細書において「標的分子の機能阻害」とは、標的分子が有する触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能のような生物学的機能を阻害又は抑制することをいう。
【００２４】
核酸アプタマーは、一般に、RNAのみで構成されるRNAアプタマーとDNAのみで構成されるDNAアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は、DNAである。
【００２５】
本明細書において「標的分子」とは、DNAアプタマーの結合対象となり得る物質をいう。標的分子の種類は、DNAアプタマーが結合し得る生体物質であれば、特に制限はしない。例えば、ペプチド（オリゴペプチド、又はポリペプチド）、核酸、脂質、糖（糖鎖を含む）、低分子化合物が挙げられる。好ましくはペプチド、より好ましくはポリペプチド、すなわちタンパク質である。また、天然由来の物質、化学合成物質、遺伝子組換え物質、細胞、ウイルス等いずれであってもよい。
２．DNAアプタマーの設計方法
第1の実施形態において、本発明は、既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び／又は該アプタマーを安定化する塩基配列の設計方法に関する。本発明は、特にDNAアプタマーの二次構造レベルの情報に基づいて、結合能の強化及び／又は安定化を可能にする方法に関する。本発明に従う塩基配列の設計方法は、必須の工程として、第1工程を含む。また、本発明に従う塩基配列の設計方法は、第2工程、第3工程、及び第4工程、の1つ以上を任意の工程として含む。これらの任意の工程が含まれる場合、各工程の順序は制限しない。ただし、第3工程及び第4工程の両方が含まれる場合には、第4工程は第3工程の後に行われる。本発明の塩基配列の設計方法を構成する各工程を、以下に説明する。
２−１．第1工程
本明細書において、「第1工程」とは、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含む既存のDNAアプタマーにおいて、一組のステム構造及びループ構造で構成されるヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換する工程である。
【００２６】
本明細書において、「ステム構造」とは、構成塩基の一部、好ましくは連続する2以上、例えば3以上、4以上、又は5以上の塩基が互いに完全に又は部分的に塩基対合することによって形成される二本鎖構造を意味する。本明細書において、「完全に」塩基対合するとは、DNAアプタマーの塩基配列間において、連続する2以上、例えば3以上、4以上、又は5以上の塩基の全てが対応する塩基と塩基対合していることを意味する。また、「部分的に」塩基対合するとは、完全に塩基対合するステム構造の塩基配列間に、1又は2以上、例えば3以上、4以上、又は5以上の塩基対合を形成していない塩基を含むことを意味する。したがって、この場合、ステム構造の内部に、一以上のインターナルループ構造及び／又は一以上のバルジ構造が形成される。本明細書において、「インターナルループ構造」とは、ステム構造を形成する二本鎖双方の対応する位置に、塩基対を形成しない一以上の塩基が存在する場合に生じるステム構造内のループ構造を指す。本明細書において、「バルジ構造」とは、ステム構造を形成する二本鎖の対応する位置において一方のみに、塩基対を形成しない一以上の塩基が存在する場合に生じるステム構造内の突出構造を指す。
【００２７】
本明細書において、「ループ構造」とは、ステム構造を構成する二本鎖間に位置し、ステム構造の形成によって生じる、塩基対合しない核酸内部のループ状の構造を意味する。
【００２８】
本明細書において、「ヘアピン構造」又は「ステムループ構造」は、一つのステム構造及び一つのループ構造（一組のステム構造及びループ構造）からなる構造を意味する。
【００２９】
本明細書において、「ミニヘアピン構造」は、第１核酸領域、第2核酸領域、及び第3核酸領域の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5’末端側から3’末端側に向かって順番に連結された構造を有する。
【００３０】
「第1核酸領域」とは、2〜5個の任意のヌクレオチドからなる核酸領域である。前記ヌクレオチドは、グアニン（g）、アデニン（a）、シトシン（c）又はチミン（t）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチドをいう。本核酸領域の塩基は、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、gc含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がg及び／又はcで構成されていることがもっとも好ましい。
【００３１】
「第2核酸領域」とは、5'‐gna‐3’又は5'‐gnna‐3’の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各nは、独立に、天然型塩基（g、a、t、若しくはc）、前記塩基類似体又は修飾塩基のいずれかからなる。
【００３２】
「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム部分を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ部分をそれぞれ構成し、全体として、例えば、配列番号1、2、23、又は24の塩基配列を有する7〜14個のヌクレオチドからなるミニヘアピン型DNAが形成される。
【００３３】
第1工程の対象DNAアプタマーは、一以上のステム構造及び一以上のループ構造を含む既存のDNAアプタマーである。本明細書において、「既存のDNAアプタマー」は、公知のDNAアプタマー、並びに当該分野で公知の方法により得られるDNAアプタマーであって、その塩基配列が明らかとなっているもの、又はその塩基配列を明らかとすることができるものを意味する。DNAアプタマーを作製する場合、例えば、公知のSELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を応用した改変SELEX法を用いて試験管内選別により作製することができる。SELEX法とは、ランダム配列領域とその両末端にプライマー結合領域を有する核酸分子で構成されるプールから標的分子に結合した核酸分子を選択し、回収後に増幅した後、次のラウンドの核酸プールにするという一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対してより結合力の強い核酸を選択する方法である。改変型SELEX法とは、従来のSELEX法のステップに加えて、核酸プールと標的分子との混合によって得られる複合体を固相担体に固定化するステップを含むものである。改変型SELEX法の詳細についてはWO2013/073602を参照されたい。このような方法によって最終的に得られたDNA分子をDNAアプタマーとして利用することができる。
【００３４】
DNAアプタマーにおいて、ステム構造及びループ構造を構成する塩基配列は、その塩基配列に基づいて二次構造予測を行うことにより、当業者であれば容易に特定できる。核酸の塩基配列に基づく二次構造の予測については、例えばZuker M., “Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction”, Nucleic Acids Res. 2003, 31 , pp. 3406-3415を参照されたい。
【００３５】
あるいは、DNAアプタマーの塩基配列に変異を導入したライブラリ（Doped library）を作成し、これを用いてSELEX法を行い、標的に結合する配列を網羅的に解析し、塩基対が保存されている部位を知ることにより、二次構造を推定することが出来る（例えば、Kimoto M., et al., “Generation of high-affinity DNA aptamer using an expanded genetic alphabet” Nat. Biotechnol., 2013, 31, pp. 453-457を参照されたい）。また、既存のDNAアプタマーでは、それらのX線結晶構造解析やNMRによる構造情報を利用して、DNAアプタマーの二次構造を推定することもできる。
【００３６】
既存のDNAアプタマーの塩基長は、特に限定はしない。DNAアプタマーがその標的結合能を発揮し得る範囲で適宜定めればよい。
【００３７】
既存のDNAアプタマーは、一以上の塩基類似体及び／又は修飾塩基を含んでよい。本発明のDNAアプタマーにおける塩基類似体及び／又は修飾塩基の含有率は、その核酸アプタマーを構成する全ヌクレオチド数の20％以下、好ましくは15％以下、より好ましくは10％以下であればよい。
【００３８】
本工程において置換されるヘアピン構造は、置換後のミニヘアピン構造と同程度の大きさであることが好ましい。ここで、「同程度の大きさ」とは、置換されるヘアピン構造と、置換後のミニヘアピン構造のヌクレオチド長の差が、好ましくは5以下、例えば4以下、3以下、2以下、若しくは1以下、又は、置換されるヘアピン構造と、置換後のミニヘアピン構造のヌクレオチド長が同一であることを意味する。上記の通り、ミニヘアピン構造は7〜14塩基からなるため、置換されるヘアピン構造は、例えば7〜19塩基からなることが好ましい。
【００３９】
本工程において置換されるヘアピン構造を構成するステム構造は、一〜三個のインターナルループ構造及び／又は一〜三個のバルジ構造を有してよい。ここで、ステム構造中のインターナルループ構造を構成する塩基の数は、双方の鎖を合わせて、例えば10個以下、好ましくは6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個である。また、ステム構造中のバルジ構造を構成する塩基の数は、例えば10個以下、好ましくは6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個以下、又は1個である。
【００４０】
本工程の例として、インターナルループ構造及びバルジ構造を含まないステム構造、一つのインターナルループ構造を含むステム構造、並びに一つのバルジ構造を含むステム構造、を含むヘアピン構造のミニヘアピン構造への置換を、図1（A）〜（C）にそれぞれ示す。
【００４１】
ヘアピン構造のミニヘアピン構造への置換は、ヘアピン構造を構成する塩基配列の一部を変更することにより行ってもよいし、ヘアピン構造を構成する塩基配列の全部を変更することにより行ってもよい。
【００４２】
既存のDNAアプタマーに二以上のヘアピン構造が存在する場合には、二以上のヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換してもよく、例えば全てのヘアピン構造を置換することができる。
【００４３】
本工程において置換されるヘアピン構造は、DNAアプタマーの標的分子への結合に関与していない、又は標的分子への結合に対する寄与度が低いヘアピン構造であることが好ましい。DNAアプタマーの標的分子への結合に関与していない、又は標的分子への結合に対する寄与度が低いヘアピン構造は、例えばDNAアプタマーと標的分子との複合体のX線結晶構造解析やNMR分析を行うことにより、当業者であれば容易に特定することができる。また、DNAアプタマーを改変型SELEX法などのスクリーニング方法により得た場合には、選抜されたDNAアプタマー間で保存されている配列から、標的分子への結合に関与していない、又は標的分子への結合に対する寄与度が低いヘアピン構造を推測することもできる。例えば、DNAアプタマーの塩基配列に変異を導入したライブラリ（Doped library）を作成し、これを用いてSELEX法を行い、標的に結合する配列を網羅的に解析し、塩基対が保存されている部位を知ることにより、標的分子への結合に関与していない、又は標的分子への結合に対する寄与度が低いヘアピン構造を推測することができる。
２−２．第2工程
本明細書において、「第2工程」とは、既存のDNAアプタマーがステム構造を二つ以上有する場合に、一以上のステム構造中のGC対を増加させる工程である。本工程は、ステム構造中の一以上のAT対をGC対に置換すること、及び／又はステム構造中にGC対を追加することにより行うことができる。第2の工程の対象ステム構造の部位は、ミニヘアピン構造を構成するステム構造でない限り、特に制限しない。増加させるGC対の数は、例えば10対以下、好ましくは5対以下、4対以下、3対以下、2対以下、又は1対である。例えば、置換の場合、ステム構造中の全てのAT対をGC対に置換してもよいし、ステム構造中のAT対を、例えば10対以下、好ましくは5対以下、4対以下、3対以下、2対以下、又は1対、GC対に置換してもよい。同様に、ステム構造中にGC対を追加する場合には、ステム構造中にGC対を、例えば10対以下、好ましくは5対以下、4対以下、3対以下、2対以下、又は1対、付加してもよい。GC対を付加する部位は、ステム構造の末端でもよいし、ステム構造の内部であってもよい。
【００４４】
ステム構造中の一以上のAT対をGC対に置換すること、及び／又はステム構造中にGC対を追加することに加えて、又は代えて、DNAアプタマーがステム構造中にバルジ構造又はインターナルループ構造を含む場合には、バルジ構造又はインターナルループ構造を構成する塩基に対して置換及び／又は付加を行うことによりステム構造中のGC対を増加させてもよい。（i）バルジ構造がG又はCの塩基を含む場合、（ii）バルジ構造がA又はTの塩基を含む場合、（iii）インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において等しい場合、及び（iv）インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において異なる場合の4つの場合に分けて、以下説明する。
（i）バルジ構造がG又はCの塩基を含む場合
この場合には、バルジ構造を構成する塩基に対して塩基対合を形成するように、他方の鎖にG又はCを付加することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。バルジ構造を構成する塩基と同数の塩基を他方の鎖に付加してもよく、この場合、塩基の付加後、ステム構造を構成する塩基対は完全に対合し、バルジ構造はなくなる。バルジ構造を構成する塩基よりも少ない数の塩基を他方の鎖に付加してもよく、この場合、塩基の付加後、ステム構造を構成する塩基対は部分的に塩基対合し、バルジ構造が残る。G又はCの付加数は、バルジ構造を構成する塩基の数より少ない限り特に限定しないが、例えば10以下、好ましくは5以下、4以下、3以下、2以下、又は1以下である。
【００４５】
バルジ構造を構成する塩基と同数の塩基を他方の鎖に付加する場合、及びバルジ構造を構成する塩基よりも少ない数の塩基を他方の鎖に付加する場合の一例を、それぞれ図2（A）及び（B）に示す。
（ii）バルジ構造がA又はTの塩基を含む場合
この場合には、バルジ構造を構成するA又はTをG又はCに置換した後に、この塩基に対して塩基対合を形成するように、他方の鎖にG又はCを付加することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。バルジ構造を構成するA又はTをG又はCに置換した後に、上記（i）に従ってG又はCを付加する。バルジ構造を構成する全てのA又はTの塩基に対して置換・付加を行ってもよいし、一部のA又はTの塩基に対して置換・付加を行ってもよい。
【００４６】
本工程の一例を、図3に示す。
（iii）インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において等しい場合
この場合には、ステム構造中に存在するのインターナルループを構成している塩基を、双方の鎖から同数、例えばそれぞれ10塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、又は1塩基ずつ、GC対に置換することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。インターナルループを構成する塩基の全てをGC対に置換してもよいし、一部の塩基をGC対に置換してもよい。一部の塩基を置換する場合には、インターナルループ構造の末端、すなわちインターナルループがステム構造と接している部分においてGC対への置換を行うことが好ましい。インターナルループ構造の内部、すなわちインターナルループがステム構造と接していない部分においてGC対へ置換を行う場合には、ステム構造内に、さらにバルジ構造及び／又はインターナルループ構造が形成され得る。この場合、新たに形成されたバルジ構造及び／又はインターナルループ構造に対して、（i）〜（iv）に従って置換及び／又は付加を行うことによりさらにステム構造中のGC対を増加させてもよい。
【００４７】
インターナルループを構成する塩基の全てをGC対に置換する場合、一部の塩基を置換する場合であってインターナルループ構造の末端を置換する場合、及び一部の塩基を置換する場合であってインターナルループ構造の内部を置換する場合の一例を、それぞれ図4（A）〜（C）に示す。
（iv）インターナルループ構造を形成するヌクレオチドの数が、一方の鎖ともう一方の鎖において異なる場合
（iii）の場合と同様に、ステム構造中に存在する塩基対合を形成していない塩基を、双方の鎖から同数、例えばそれぞれ10塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、又は1塩基ずつ、GC対に置換することにより、ステム構造中のGC対を増加させることができる。置換を行う部位については、（iii）の場合と同様であるため記載を省略する。ただし、（iv）の場合、塩基対合を形成していない塩基を、双方の鎖から同数ずつGC対へ置換する数を増やすと、最終的に一方の鎖にバルジ構造が生じる。この場合、形成された構造に対して、上記（i）又は（ii）にしたがって、置換及び／又は付加を行うことによりさらにステム構造中のGC対を増加させてもよい。
【００４８】
本工程の一例を、図5に示す。
２−３．第3工程
本明細書において、「第3工程」とは、DNAアプタマーの少なくとも一方の末端がステム構造を構成している場合に、DNAアプタマーの末端においてGC対を増加させる工程である。GC対の付加数は、DNAアプタマーの標的分子への結合性が低下しない限り制限しないが、例えば5対以下、好ましくは3対以下、2対以下、又は1対である。
【００４９】
本工程は、5'末端及び3'末端に、GC対、すなわちG及びC、又はC及びGをそれぞれ付加することによって行うことができる。また、本工程は、DNAアプタマーの末端を構成するステム構造を形成する一方の鎖の末端が突出しており、突出末端がG又はCの塩基を含む場合には、この突出末端を構成する塩基に対して塩基対合を形成するように他方の鎖にG又はCを付加することにより行うことができる。また、DNAアプタマーの末端を構成するステム構造を形成する一方の鎖の末端が突出しており、突出末端がA又はTの塩基を含む場合には、この塩基をG又はCに置換した後に、この突出末端を構成する塩基に対して塩基対合を形成するように他方の鎖にG又はCを付加することにより行うことができる。
２−４．第4工程
本明細書において、「第4工程」とは、DNAアプタマーの一方の末端に、ミニヘアピン構造を付加する工程である。5'末端及び3'末端のどちらの末端にミニヘアピン構造を付加するかは特に制限はないが、3'末端にミニヘアピン構造を付加することが好ましい。
２−５．効果
本発明の塩基配列の設計方法によれば、既存のDNAアプタマーの標的分子結合能を強化、及び／又は該アプタマーを安定化することが可能となる。
【００５０】
本明細書において、「標的分子結合能」とは、標的分子に対する結合能力を意味する。標的分子に対する結合能力を強化することによって、DNAアプタマーの標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を向上させ得る。
【００５１】
本明細書において、「安定化」とは、熱に対する安定性の増加及び／又は核酸分解酵素に対する安定性の増加を意味する。熱に対する安定性及び核酸分解酵素に対する安定性を高めることで、生体内での安定性を高めることが可能となる。
３．標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法
第2の実施形態において、本発明は、第1の実施形態に記載の塩基配列の設計方法に基づいてDNAアプタマーの塩基配列を設計する工程、及び設計された塩基配列に基づきDNAアプタマーを生産する工程を含む、標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマーの製造方法に関する。設計工程は第1の実施形態に記載の通りであるからここでは記載を省略する。
【００５２】
本明細書において、「標的分子結合能強化安定化型DNAアプタマー」とは、第1の実施形態に記載の塩基配列の設計方法に用いた既存のDNAアプタマーに対して、標的分子結合能が強化及び／又は安定化されたDNAアプタマーを意味する。
【００５３】
DNAアプタマーを生産する工程は、特に限定しない。本分野で公知の方法を用いればよい。例えば、本発明のDNAアプタマーは、上記の通り設計したDNAアプタマーの配列に基づいて公知の固相合成法に従って化学合成することができる。核酸の化学合成法については、例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Section 3を参照されたい。また、このような化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ株式会社、Life Technologies Corporation、Sigma-Aldrich Corporation等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。設計したDNAアプタマーの配列に基づいて幾つかの断片を合成した後に、分子内アニールやリガーゼによるライゲーション等によって断片を連結することによりDNAアプタマーを作製してもよい。
【００５４】
化学合成後の本発明のDNAアプタマーは、使用前に当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、HPLC法等が挙げられる。
４．DNAアプタマー
第3の実施形態において、本発明は、一以上のステム構造及びループ構造を有するDNAアプタマーであって、該DNAアプタマーの非末端部に存在するヘアピン構造が、ミニヘアピン構造であるDNAアプタマーに関する。本発明のDNAアプタマーは、第2の実施形態に記載の製造方法によって得てもよい。
【００５５】
本明細書において、「非末端部」は、DNAアプタマーの5'末端及び3'末端以外の場所であれば、特に制限しない。例えば、DNAアプタマーの非末端部は、DNAの末端部分から好ましくは2塩基以上、例えば3塩基、4塩基、若しくは5塩基以上離れた部位である。
【００５６】
本発明のDNAアプタマーは、非末端部のミニヘアピン構造以外に、ミニヘアピン構造を末端部にさらに含んでもよい。どちらの末端にミニヘアピン構造を含むかは特に制限ないが、特に3'末端にミニヘアピン構造を含むことが好ましい。また、本発明のDNAアプタマーは、ミニヘアピン構造以外に、さらに一以上のステム構造及び／又は一以上のループ構造を有してよい。この場合、DNAアプタマーのステム構造は、その内部に一以上の塩基のミスマッチ部位、又は一以上のバルジ構造を有していてもよい。
【００５７】
本発明のDNAアプタマーの塩基長は、特に限定はしない。DNAアプタマーがその機能を発揮し得る範囲で適宜定めればよい。
【００５８】
本発明のDNAアプタマーは、一以上の塩基類似体及び／又は修飾塩基を含んでよい。本発明のDNAアプタマーにおける塩基類似体及び／又は修飾塩基の含有率は、その核酸アプタマーを構成する全ヌクレオチド数の20％以下、好ましくは15％以下、より好ましくは10％以下であればよい。
【００５９】
本発明のDNAアプタマーは、一以上、例えば一つ、二つ、三つ、又は全てのステム構造におけるGC含量が高いことが好ましい。GC含量は、DNAアプタマーに含まれるステム構造を形成する塩基対中のGC対の割合を意味し、本発明のDNAアプタマーの一以上、例えば一つ、二つ、三つ、又は全てのステム構造におけるGC含量は、例えば50%以上、75%以上、又は90％以上である。一以上、例えば一つ、二つ、三つ、又は全てのステム構造における全ての塩基対がGC対であってもよい。本発明のDNAアプタマーの末端がステム構造である場合、末端部の塩基対はGC対であることが好ましい。
５．IFN-γ用DNAアプタマー
本発明の第4の実施形態は、インターフェロン-γ（本明細書では、「IFN-γ」と略称する）用DNAアプタマーである。本発明のIFN-γ用DNAアプタマーは、上記第3の実施形態で記載したDNAアプタマーの構成を有する。
【００６０】
本発明のIFN-γ用DNAアプタマーは、IFN-γを標的物質として強固かつ特異的に結合し、IFN-γの有する細胞傷害性T細胞誘導活性を抑制する一本鎖DNA分子で構成されるDNAアプタマー（以下、「IFN-γ用DNAアプタマー」とする）である。本発明のIFN-γ用DNAアプタマーの標的分子となるIFN-γが由来する生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトのIFN-γが挙げられる。
【００６１】
本発明のIFN-γ用DNAアプタマーは、配列番号6及び8〜11のいずれかに示される塩基配列からなる。特に、本発明のIFN-γ用DNAアプタマーは、配列番号8又は9に示される塩基配列からなる。
６．VEGF用DNAアプタマー
本発明の第5の実施形態は、血管内皮細胞増殖因子（Vascular Endothelial Growth Factor：本明細書では、「VEGF」と略称する）用DNAアプタマーである。
【００６２】
VEGFは、血管新生促進因子として機能する増殖因子であって、加齢黄斑変性（age-related macular degeneration：AMD）の原因因子の１つとして知られている。
【００６３】
加齢黄斑変性は、成人において視機能の低下や中途失明等の深刻な症状をもたらす進行性網膜疾患で、網膜における血管新生の進行に伴い病態が悪化し、重症化することが判明している（Martin A. et al., 2003, Medicinal Research Reviews, Vol. 23, No. 2: 117-145；Ferris III, F.L. et al., 1984, Archives of Ophthalmology, Vol. 102, Issue 11: 1640-1642）。
【００６４】
本発明のVEGF用DNAアプタマーは、VEGFを標的物質として強固かつ特異的に結合し、VEGFの有する血管新生機能を抑制する一本鎖DNA分子で構成されるDNAアプタマー（以下、「VEGF用DNAアプタマー」とする）である。本発明のVEGF用DNAアプタマーの標的分子となるVEGFが由来する生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトのVEGFが挙げられる。
【００６５】
本発明のVEGF用DNAアプタマーは、配列番号19〜22のいずれかに示される塩基配列からなる。特に、本発明のVEGF用DNAアプタマーは、配列番号20又は22に示される塩基配列からなる。
７．vWF用DNAアプタマー
本発明の第6の実施形態は、ヴォン・ヴィレブランド因子（von Willebrand factor：本明細書では、「vWF」と略称する）用DNAアプタマー、特にvWFのA1ドメイン用DNAアプタマーである。
【００６６】
本発明のvWF用DNAアプタマーは、vWF、特にvWFのA1ドメインを標的物質として強固かつ特異的に結合する一本鎖DNA分子で構成されるDNAアプタマー（以下、「vWF用DNAアプタマー」とする）である。本発明のvWF用DNAアプタマーの標的分子となるvWFが由来する生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトのvWFが挙げられる。
【００６７】
本発明のvWF、特にvWFのA1ドメイン用DNAアプタマーは、配列番号14〜16のいずれかに示される塩基配列からなる。特に、本発明のvWF特にvWFのA1ドメイン用DNAアプタマーは、配列番号16に示される塩基配列からなる。
８．医薬組成物
本発明の第7の実施形態は、医薬組成物である。
８−１．構成
本発明の医薬組成物は、前記実施形態3〜6のいずれかに記載のDNAアプタマーを有効成分として少なくとも一つ含有する。また、本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、前記標的物質機能抑制剤の効果を維持するために、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤又は界面活性剤が挙げられる。
【００６８】
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、或いはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００７０】
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
【００７１】
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【００７２】
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【００７３】
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７４】
このような担体は、必要に応じて適宜使用すればよい。本発明の薬物組成物は、上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤（例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等）、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【００７５】
「界面活性剤」としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する。
【００７６】
本実施形態の医薬組成物は、一医薬組成物中に上記担体を一以上包含することが可能である。
【００７７】
さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、抗生物質を所定量含有していてもよい。
【００７８】
本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。通常は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。
【００７９】
例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
【００８０】
非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は、組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物も、それぞれの投与方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例えば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、例えば、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることができる。
【００８１】
薬物を植物に投与する場合には、薬剤組成物の剤形は、液体、固体（半固体を含む）又はその組み合わせが挙げられる。溶液剤、油性分散液剤、エマルション剤、懸濁製剤、粉剤、散剤、ペースト剤、ゲル剤、ペレット剤、錠剤及び粒剤とすることができる。
【００８２】
なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
８−２．製造方法
本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
【００８３】
例えば、注射剤の場合には、第3〜6の実施形態いずれかのDNAアプタマーを製薬上許容可能な溶媒に溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
【００８４】
「薬学的に許容可能な溶媒」としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
８−３．投与方法
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患等の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のDNAアプタマーを十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のDNAアプタマーを全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
【００８７】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。有効成分であるDNAアプタマーが標的物質に結合してその機能を抑制することができれば、いずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経肺、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。前述のように血流を介して本発明の医薬組成物を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性も比較的低いからである。
９．標的物質検出方法
本発明の第8の実施形態は、前記実施形態3〜6のいずれかに記載のDNAアプタマーを用いた標的物質の検出方法である。
９−１．構成
第3〜6の実施形態いずれかに記載のDNAアプタマーは、その標的物質と極めて強固に、かつ特異的に結合し得るため、DNAアプタマーのその性質を利用して試料中に存在する標的物質を検出することができる。
【００８８】
第3〜6の実施形態いずれかに記載のDNAアプタマーと標的物質間の結合を利用した方法であれば、検出方法自体は公知の検出方法を用いればよい。例えば、SPR法、水晶振動子マイクロバランス法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
【００８９】
SPR（表面プラズモン共鳴）は、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。SPR法は、この現象を利用した測定方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、予め第3〜6の実施形態いずれかのDNAアプタマーを金属薄膜表面上に固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させ、当該DNAアプタマーと標的物質との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することにより試料中の標的物質を検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。
【００９０】
QCM（水晶振動子マイクロバランス：Quartz Crystal Microbalance）法は、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用した方法である。この方法を用いたQCMセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえることができる。本発明においては、電極表面に、前記SPR法と同様に予めDNAアプタマーを固定化しておき、試料を電極表面に接触させることによって、DNAアプタマーと標的物質との結合により生じる水共振周波数の変化量から試料中の標的物質を定量的に検出することができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、Christopher J., et al.(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169を参照すればよい。
【００９１】
比濁法は、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料中に第3〜6の実施形態いずれかのDNAアプタマーを添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中の標的物質を定量的に検出することができる。
【００９２】
また、標的物質に対する抗体と併用することにより標的物質を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体に第3〜6の実施形態いずれかのDNAアプタマーを固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在する標的物質と前記DNAアプタマーとを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗標的物質抗体を加えて標的物質に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗標的物質抗体を検出することにより、試料中の標的物質を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
【実施例】
【００９３】
［実施例1：ミニヘアピン配列を含むDNAアプタマーの調製］
ミニヘアピン構造（GCGNNACGC（配列番号23）又はGCGNAGC（配列番号24）（N=A、T、G、C）等の配列からなる短いDNA断片）の導入、及びステム配列中のA-T塩基対のG-C塩基対への置換によるDNAアプタマーの安定性への効果を調べるために、まずヒトIFN-γ用DNAアプタマーについて、各種核酸断片を設計して調製した。本実施例において調製したアプタマーの配列とその二次構造は図6に示した。【００９４】
Aptamer 49（配列番号4）は、発明者らによって見出された、既報のIFN-γ結合DNAアプタマーである。Aptamer 49A（配列番号5）は、Aptamer 49の人工塩基Dsを天然型塩基Aに置換したものである。Aptamer 58（配列番号6）は、Aptamer 49の3’末端に、ミニヘアピン構造 (CGCGAAGCG(配列番号1)の配列からなる短いDNA断片) を結合したものである。Aptamer 57mh（配列番号9）はAptamer 58の配列内部のヘアピンをミニヘアピン構造(CGCGAAGCG(配列番号1)の配列からなる短いDNA断片)に置換したものである。Aptamer 58GC (配列番号7)及びAptamer 57GCmh(配列番号8)は、Aptamer 58及びAptamer 57mhのステム構造中の2か所のA-T塩基対をG-C塩基対へ置換したものである。【００９５】
Aptamer 49、及びAptamer 58、Aptamer 58GC、Aptamer 57mh、Aptamer 57 GCmh、Aptamer 49Aは、それぞれ図中に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製し、その後、変性アクリルアミドゲルにて精製した。それぞれの核酸断片はリン酸緩衝液（pH7.4）にて、95℃で3分加熱後、室温で10分間静置することで徐冷し、氷上で5分間静置することで再構築させ調製した。
［実施例2：各種IFN-γ用アプタマーのヒトIFN-γに対する結合活性解析］
実施例1で調製した各種核酸のヒトIFN-γへの結合を調べるために、人工塩基Dsを含むAptamer 49を用いた競合実験を行った。20μLの反応液（1×PBS、0.005% Nonidet P-40）中で、［γ-32P］ATPにより標識したAptamer 49 (最終濃度200nM)、実施例1で調製したアプタマー（最終濃度200nM）、及びヒトIFN-γ（最終濃度200nM、Peprotech社）が含まれるように調製し、37℃で30分間インキュベートした。その後、ブロモフェノールブルーを含む25％グリセロールを終濃度5％グリセロールとなるように加え、10％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってヒトIFN-γに結合した標識化Aptamer 49と遊離状態の標識化Aptamer 49とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーFLA-7000（富士フィルム）によって可視化して、放射活性を測定した。ゲルシフト率、阻害率、相対結合率は、以下の通り算出した。ゲルシフト率は、複合体の放射活性を、遊離および複合体の放射活性の総和で割った数値の百分率として算出した。阻害率は、各競合アプタマー存在下でのゲルシフト率を競合アプタマー非存在下でのゲルシフト率で割った値の百分率を100から引いた値として算出した。相対結合率は、各アプタマーの阻害率をAptamer 49の阻害率で割ることにより算出した。【００９６】
さらに、実施例1で調製した配列の中から3つのアプタマー（Aptamer 49、Aptamer 58、Aptamer 57GCmh）をピックアップし、GEヘルスケア社のBIAcoreT200を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）の測定により、ヒトIFN-γへの結合能を解析した。【００９７】
まず、各種配列で構造の末端がビオチン化された核酸断片を化学合成し、その後、各核酸断片を実施例1と同様に変性アクリルアミドゲルにて精製し、リン酸緩衝液（pH7．4）中にて、95℃で加熱後25℃まで徐冷することで再構築させ調製した。SPRのセンサーチップにはストレプトアビジンがコートされたSAチップ（GEヘルスケア）を用い、以下の方法によりDNA断片をチップへ不可逆的に固定化後、ヒトIFN-γへの結合を解析した。なお、SPRは、ランニングバッファーを用いて(1×PBS、+50mM NaCl（最終NaCl濃度205mM）、0.05% Nonidet P-40)、設定温度 25℃で測定した。各DNA断片のセンサーチップへの固定化は、25nMとなるようにPBS溶液で希釈したDNA溶液をフォールディング処理（95℃、3分間加熱変性後、25℃まで徐冷）し、ランニングバッファーにより0.5nMに希釈した後、最終濃度0.05％となるようにNonidet P-40を加え、このDNA溶液を流速5μL/minで40μL（8分間相当）インジェクションすることにより行った。また、固定化後、流速20μL/minで、50mM NaOH溶液をインジェクション（5μL、5回）することにより、SAチップに非特異的に吸着されているDNA断片を洗浄した。固定化されたDNA断片とヒトIFN-γとの相互作用検出は、1.25nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM、30nM及び50nMのヒトIFN-γ溶液（ランニングバッファーで希釈）をKinetic Injectionモードによってインジェクションすることでモニターした。測定条件は流速100μL/min、タンパク質インジェクション時間は150秒である。チップの再生（結合タンパク質の解離及びDNAのリフォールディング）は50mM NaOHの溶液を5μL（15秒相当）インジェクション後、10分間ランニングバッファーを流すことで行った。各DNA断片のセンサーグラムは、センサーチップに対するバルク効果や非特異的吸着によるレスポンス値を差し引くために、DNAを固定化していないセルをリファレンスのセルとして、そのレスポンス値を各DNA断片のセンサーグラムから差し引いた。
＜結果＞
各種アプタマー変異体のAptamer 49に対する結合阻害比率を図7に示した。コントロールとなるAptamer 49の結合阻害比率を1.00とした場合、ミニヘアピン構造を含むアプタマー変異体の相対結合率はそれぞれ、0.05（Aptamer 49A）、1.29（Aptamer 58）、0.26（Aptamer 58GC）、1.53（Aptamer 57GCmh）、1.40（Aptamer 57mh）であった。コントロールとなるAptamer 49と比べ、ミニヘアピンを含むAptamer 58、Aptamer 57mh、及びAptamer 57GCmhは有意に結合力が高いことがわかった。なかでも3'末端にミニヘアピンを付加し、内部のヘアピン部分をミニヘアピンに置換し、さらにステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換したAptamer 57GCmhは特に結合力が高かった。【００９８】
また、SPR測定の結果を図8に示す。各オリゴのKD値は、46pM(Aptamer 49)、38pM(Aptamer 58)、33pM(Aptamer 57GCmh)であった。この結果は、ミニヘアピンDNAを3’末端に付加し、さらに内部のヘアピンをミニヘアピンDNAに置換し、さらにステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換することで、結合力を向上させることができることを示している。
［実施例3：各種IFN-γ用アプタマーの核酸分解酵素などに対する安定性解析］
＜方法＞
血清中に含まれる核酸分解酵素は核酸の生物学的応用において問題となるDNA分解の主な原因の一つであるため、ミニヘアピン構造を含むDNAアプタマーのヒト血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。【００９９】
各種DNAアプタマー（Aptamer 49、Aptamer 58、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmh、最終濃度  2μM）を、ヒト血清濃度が96％となるように混合し、37℃でインキュベートした。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、72時間後に混合溶液から10μLを分取し、110μLの1×TBE、10M Urea溶液と混合して分解反応を止めた。反応後のサンプルを変性15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBR GOLDで染色することで1本鎖核酸を検出した。ヒト血清中の核酸分解酵素による分解産物のバンドパターンをバイオイメージャー  LAS-4000（富士フィルム）で解析し、未分解のアプタマーに相当するバンドの濃さから、残存DNA量を推定した。
＜結果＞
結果を図9に示す。コントロールのDNAアプタマー（Aptamer 49）は、ヒト血清存在下6時間後で全長産物に相当するバンドは55％まで分解された。そして、24時間後には全長産物に相当するバンドは14％まで分解されて、さらに72時間後には9％まで分解された。一方、ミニヘアピンDNAを含むDNAアプタマー（Aptamer 58、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmh）はヒト血清存在下72時間後でもまだ全量のうちの30％以上が全長産物の状態で保持されていることがバンドパターンから確認できた。なかでも、3’末端にミニヘアピンを付加し、内部のヘアピン部分をミニヘアピンDNAに置換し、さらにステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換したAptamer 57GCmhは、ヒト血清存在下72時間後でも80％以上が全長を維持しており、ミニヘアピンDNAの付加等によりヒト血清中に含まれる核酸分解酵素などに対する安定性が顕著に上昇することがわかった。
［実施例4：各種IFN-γ用アプタマーの熱安定性解析］
＜方法＞
各種DNAアプタマー（Aptamer 49、Aptamer 49A、Aptamer 58、Aptamer 58GC、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmh、最終濃度2μM）の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化（0.5℃/min）におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
＜結果＞
結果を図10に示す。コントロールのDNAアプタマー（Aptamer 49）のTm値は、37.8℃であったのに対して、人工塩基を含まないDNAアプタマー（Aptamer 49A）のTm値は、33.4℃であった。ミニヘアピン構造を含むDsアプタマー変異体のTm値はそれぞれ、43.9℃（Aptamer 58）、72.0℃（Aptamer 58GC）、51.1℃（Aptamer 57mh）、64.2℃（Aptamer 57GCmh）であった。ミニヘアピンDNAをDNAアプタマーに付加することでTm値が顕著に上昇しており、熱安定性が向上していることがわかった。また、ステム配列中のA-T塩基対をG-C塩基対に置換することでさらにTm値が上昇することがわかった。
［実施例5：各種Dsアプタマー培養細胞でのIFN-γ刺激応答抑制効果の解析］
本実施例では、調製した各種のDNAアプタマーの存在下で、IFN-γ刺激応答によるSTAT−1のリン酸化の程度を解析することにより、IFN-γとIFN-γ受容体との相互作用に対する、各種アプタマーの阻害効果を調べた。
＜方法＞
1）細胞培養
MDA-MB-231細胞の培養は、10％ウシ胎児血清（FBS、Atlanta Biologicals社）を含むDMEM培地（Dulbecco’s Minimal Essential Medium、Corning cellgro社）に、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）とL-glutamineの100倍溶液（Gibco社）を添加したものを用いて行った。
2)IFN-γによる刺激処理
IFN-γによる刺激の前処理として、106 /mLのMDA-MB-231細胞を含む10％FBS含有DMEM培地をポリスチレン製のラウンドチューブ（Falcon社）に入れて、37度で15分間インキュベートした。その後、1200gで5分間遠心することで細胞を回収した後、リコンビナントタンパク質のヒトIFN-γ（Peprotech社）を2 ng/mL含むDMEM培地に再懸濁し、37度で10分間インキュベートして、IFN-γによる刺激を行った。その後、遠心して細胞を回収した後、PBSで一回洗浄することで刺激を終結し、FACS解析用の細胞とした。
3)アプタマー存在下でのIFN-γによる刺激処理
上記2)同様、刺激の前処理として、106 /mLのMDA-MB-231細胞を含む10％FBS含有DMEM培地をポリスチレン製のラウンドチューブ（Falcon社）に入れて、37度で15分間インキュベートした。その後、1200gで5分間遠心することで細胞を回収した後、アプタマーを含む血清含有培地で細胞を再懸濁して一晩室温又は37℃でインキュベートした後、翌朝IFNγを添加して、37度で10分間インキュベートすることで刺激を行った。その後、遠心して細胞を回収した後、PBSで一回洗浄することで刺激を終結し、FACS解析用の細胞とした。
4）FACS解析用の細胞の調製
IFN-γによる刺激処理を行い、PBSで洗浄した上述の細胞を、1mLの2％パラホルムアルデヒド溶液（Electron Microscopy Science社）に懸濁し、10分間室温でインキュベートした後に、遠心により細胞を回収した。回収した細胞は、冷却した90％メタノール、1 mlに再懸濁し、4度遮光条件下で、30分間から60分間、もしくは一晩インキュベートした。遠心して回収した細胞は、0.5 mLのFACS解析用緩衝液（1×PBS pH 7.4、0.1％のアジ化ナトリウム及び0.1％のBSAを含む）で2回洗浄した後、7.5μLの抗リン酸化STAT-1抗体溶液（BD Phosflow PE mouse anti-Stat-1 pY701）を含む0.1mLのFACS解析用緩衝液中にて、4度遮光条件下30分間から60分間インキュベートし、0.5 mLのFACS解析用緩衝液で2回洗浄した。洗浄後の細胞を0.5mLのFACS解析用緩衝液に懸濁した後、フローサイトメトリーで解析した。
＜結果＞
MDA-MB-231細胞に2ng/mLの濃度で37℃、10分間IFN-γを反応させ、抗リン酸化STAT-1抗体を用いてFACS解析したところ、IFN-γによる刺激応答によって抗リン酸化STAT-1抗体による蛍光強度の明らかな増加を確認した（図11）。【０１００】
次に、Aptamer 49、及び3'末端にミニヘアピンDNAを付加したAptamer58を用いて、室温もしくは37℃の反応温度、100ng/mLの核酸濃度でMDA-MB-231細胞に添加し、一晩インキュベートした後、10分間IFN-γを反応させ、抗リン酸化STAT-1抗体を用いてFACS解析した。室温においてはAptamer 49、Aptamer 58共にSTAT1のリン酸化が阻害されていることが確認された（図12A）。これによって、ミニヘアピンDNAを3'末端に付加しても、アプタマーのIFN-γ刺激阻害活性が維持されることが明らかとなった。また、37℃において、Aptamer49は、培地中に含まれる核酸分解酵素等によって分解されてしまい、IFN-γ刺激阻害効果が消失してしまっていたが、Aptamer 58はIFN-γ刺激阻害効果が維持されていることがわかった（図12B）。これによって、ミニヘアピンDNA付加によって、培地中の血清に含まれる核酸分解酵素に対する安定性が顕著に向上していることが確認された。【０１０１】
次に、各種DNAアプタマー（Aptamer 49、Aptamer 49A、Aptamer 58、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmh）、及びコントロールとして既存のIFN-γに対するDNAアプタマー（Aptamer 26）を用いて、IFN-γ刺激阻害効果を調べた。100-200ng/mLの濃度で種々のアプタマーを添加し、37℃、一晩の反応を行った後、抗リン酸化STAT-1抗体を用いてFACS解析した。コントロールのAptamer 26、及びミニヘアピンDNAを付加していないAptamer 49、Aptamer 49Aは、IFN-γ刺激阻害効果がほとんど見られないのに対して、ミニヘアピンDNAを付加したAptamer 58、Aptamer 57mh、Aptamer 57GCmhは、IFN-γ刺激阻害効果を示していることが確認された。特に、ミニヘアピンDNAを3'末端に付加し、内部のヘアピン部分を置換したAptamer 57mh、Aptamer 57GCmhは、IFN-γ刺激阻害効果が顕著に維持されており、ミニヘアピンDNA付加によって明らかに安定性が向上していることが判明した（図13）。
［実施例6：天然塩基からなるIFN-γ用アプタマーのヒトIFN-γに対する結合活性解析］
本実施例では、人工塩基を含まない天然塩基のみで構成されるDNAアプタマーに対してもミニヘアピンDNAの付加及びステム構造へのGC対の付加によって結合活性が向上するかどうかを調べた。
＜方法＞
図14に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製した。【０１０２】
上記の通り、Aptamer 49（配列番号4）は、発明者らによって見出された、既報のIFN-γ結合DNAアプタマーであり、Aptamer 49A（配列番号5）は、Aptamer 49の人工塩基Dsを天然型塩基Aに置換したものである。Aptamer 57Amh（配列番号11）はAptamer 49Aの3’末端にミニヘアピン構造を結合し、配列内部のヘアピンをミニヘアピン構造(CGCGAAGCG(配列番号1)の配列からなる短いDNA断片)に置換したものである。Aptamer 57AGCmh（配列番号10）はAptamer 57Amhのステム構造中の2か所のA-T塩基対をG-C塩基対へ置換したものである。【０１０３】
以上の塩基配列からなる核酸を、実施例1と同様に化学合成し、精製し、再構築させて各種DNAアプタマーを調製した。【０１０４】
調製した各種核酸のヒトIFN-γへの結合を調べるために、人工塩基Dsを含む野生型アプタマーであるAptamer 49用いた競合実験を行った。20μLの反応液（1×PBS、0.005% Nonidet P-40）中で、［γ-32P］ATPにより標識したAptamer 49 (最終濃度20nM)、1000倍量の非標識核酸（Aptamer 49A、Aptamer 57AGCmh、Aptamer 57Amh）（最終濃度20μM）、及びヒトIFN-γ（20nM、Peprotech社）を混合し、37℃で30分間インキュベートした。その後、ブロモフェノールブルーを含む25％グリセロールを終濃度5％グリセロールとなるように加え、10％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてヒトIFN-γに結合した標識化Aptamer49と遊離状態の標識化Aptamer 49とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーFLA-7000によって可視化して、放射活性を測定した。ゲルシフト率、阻害率、相対結合率は、実施例2に従って算出した。
＜結果＞
各種アプタマー変異体のAptamer 49に対する結合阻害比率は図15に示した。コントロールとなるAptamer 49Aの結合阻害比率を1.00とした場合、ミニヘアピン構造を含むアプタマー変異体の結合阻害比率（相対結合率）はそれぞれ、3.00（Aptamer 57AGCmh）、3.09（Aptamer 57Amh）であった。コントロールとなるAptamer49Aと比べ、ミニヘアピンを含むAptamer 57AGCmh 、Aptamer 57Amhは有意に結合力が向上していることがわかった。
［実施例7：天然塩基からなるIFN-γ用アプタマーの熱安定性解析］
＜方法＞
各種天然塩基DNAアプタマー（Aptamer 49A、Aptamer 57Amh、Aptamer 57AGCmh、最終濃度2 μM）の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化（0.5℃/min）におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
＜結果＞
結果を図16に示す。コントロールのDNAアプタマー（Aptamer 49A）のTm値は、33.4℃であったのに対して、ミニヘアピン構造を含む天然塩基からなるアプタマー変異体のTm値はそれぞれ、45.4℃（Aptamer 57Amh）、61.6℃（Aptamer 57AGCmh）であった。ミニヘアピンDNAをDNAアプタマーに付加することでTm値が顕著に上昇しており、熱安定性が向上していることがわかった。この結果により、ミニヘアピン付加及びGC付加は、人工塩基Dsの有無に関係無くDNAアプタマーの熱安定性を向上させるものであることがわかった。
［実施例8：vWF用アプタマーのvWF A1ドメインに対する結合活性解析］
IFN-γ以外のタンパクに対するDNAアプタマーに対してもミニヘアピンDNAを付加することで結合活性が向上するかどうかを調べた。
＜方法＞
図17に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製した。【０１０５】
ARC1172(wt)（配列番号12）は、公知のvWF A1ドメイン結合DNAアプタマーである。ARC1172(wt)-iT（配列番号13）は、ARC1172(wt)に対し、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加を行ったものである。ARC1172-F（配列番号14）は、配列内部のヘアピンをミニヘアピン構造(GCCGAAGGC (配列番号2)の配列からなる短いDNA断片)に置換したものである。ARC1172-F-iT（配列番号15）は、ARC1172-Fに対し、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加を行ったものである。ARC1172-G（配列番号16）は、ARC1172-Fの3’末端にミニヘアピン構造(CGCGAAGCG(配列番号1)の配列からなる短いDNA断片)を結合したものである。【０１０６】
以上の塩基配列からなる核酸を、実施例1と同様に化学合成し、精製し、再構築させて各種DNAアプタマーを調製した。【０１０７】
調製した各種核酸のvWF A1ドメインへの結合を調べるために、vWF A1ドメインに結合するアプタマーとして報告されているARC1172に対して、各種変異体核酸を用いた競合実験を行った。20μLの反応液（1×PBS、0.1mg/mL BSA）中で、［γ-32P］ATPにより標識したARC1172 (最終濃度100nM)、非標識核酸（ARC1172(wt)、ARC1172(wt)-iT、ARC1172-F、ARC1172-F-iT、ARC1172-G）（最終濃度100nM）、及びvWF A1ドメイン（100nM、U-ProteinExpress社）を混合し、37℃で30分間インキュベートした。その後、ブロモフェノールブルーを含む25％グリセロールを終濃度5％グリセロールとなるように加え、10％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてvWF A1ドメインに結合した標識化ARC1172(wt)と遊離状態の標識化ARC1172とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーFLA-7000によって可視化して、放射活性を測定した。ゲルシフト率、阻害率、相対結合率は、実施例2に従って算出した。
＜結果＞
各種アプタマー変異体の標識化ARC1172(wt)に対する結合阻害比率は図18に示した。コントロールとなる非標識化ARC1172(wt)の結合阻害比率を1.00とした場合、3'末端inverted dT付加、及びミニヘアピンDNA付加アプタマー変異体の結合阻害比率(相対結合率)はそれぞれ、1.12（ARC1172(wt)-iT）、1.37（ARC1172-F）、1.43（ARC1172-F-iT）、1.61（ARC1172-G）であった。コントロールとなるARC1172と比べ、ヘアピン構造をミニヘアピン構造に置換し、さらにミニヘアピンDNAを3’末端に付加したARC1172-Gが最も結合活性が向上していることがわかった。この結果から、天然塩基から構成される従来のDNAアプタマーに対して、ミニヘアピンDNAを付加することで結合力を向上させることができることがわかった。
［実施例9：vWF用アプタマーの核酸分解酵素などに対する安定性解析］
本実施例では、天然塩基のみからなるDNAアプタマーに対して、ミニヘアピンDNAを付加したDNAアプタマーのヒト血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。また、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加と比較検討した。
＜方法＞
ミニヘアピンDNAを含むDNAアプタマーと含まないDNAアプタマー（ARC1172(wt)、ARC1172(wt)-iT、ARC1172-F、ARC1172-F-iT、ARC1172-G、最終濃度2 μM）を、ヒト血清濃度が96％となるように混合し、この溶液を37℃でインキュベートした。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、72時間後に混合溶液から10μLを分取し、110μLの1×TBE、10M Urea溶液と混合して分解反応を止めた。反応後のサンプルを変性15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBR GOLDで染めることで1本鎖核酸を検出した。ヒト血清中の核酸分解酵素による分解産物のバンドパターンをバイオイメージャー  LAS-4000（富士フィルム）で解析し、未分解のアプタマーに相当するバンドの濃さから、残存DNA量を推定した。
＜結果＞
結果を図19に示す。コントロールのDNAアプタマー（ARC1172(wt)）は、ヒト血清存在下24時間後では全長産物に相当するバンドは38％まで分解された。そして、72時間後には全長産物に相当するバンドは19％まで分解された。また、従来の核酸安定化技術であるinverted dT付加したDNAアプタマー（ARC1172(wt)-iT）は、ARC1172(wt)と比較すると、ヒト血清中における核酸分解酵素に対する安定性は向上しているものの、ヒト血清存在下24時間後では全長産物に相当するバンドは47％まで分解され、72時間後には全長産物に相当するバンドは27％まで分解された。一方、ミニヘアピンDNAを3'末端及び内部に付与したDNAアプタマー（ARC1172-G）はヒト血清存在下24時間後で70％、72時間後でもまだ全量のうちの42％が全長産物の状態で保持されていることがバンドパターンから確認できた。これにより、ミニヘアピンDNAの付加によりヒト血清中に含まれる核酸分解酵素などに対する安定性が顕著に上昇することがわかった。また、3'末端へのミニヘアピンDNA付加によるヒト血清中に含まれる核酸分解酵素などに対する安定性向上効果は、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加よりも高いことが分かった。
［実施例10：vWF用アプタマーの熱安定性解析］
＜方法＞
各種DNAアプタマー（ARC1172(wt)、ARC1172(wt)-iT、ARC1172-F、ARC1172-F-iT、ARC1172-G、最終濃度2 μM）の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化（0.5℃/min）におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
＜結果＞
結果を図20に示す。コントロールのDNAアプタマー（ARC1172(wt)）のTm値は、63．8℃であったのに対して、従来の核酸安定化技術である3'末端へのinverted dT付加を行ったDNAアプタマー（ARC1172(wt)-iT）のTm値は63.2℃であった。ミニヘアピン構造を含むDsアプタマー変異体のTm値はそれぞれ、64.3℃（ARC1172-F）、64.4℃（ARC1172-F-iT）、61.9℃（ARC1172-G）であった。ミニヘアピンDNAをDNAアプタマーに付加することでTm値には大きな変化はみられず、ミニヘアピンDNA付加による熱安定性の大きな減少はないことがわかった。
［実施例11：VEGF用アプタマーのデザインと調製］
ミニヘアピン構造及びGC対の付加等のVEGF結合DNAアプタマーの特性に与える影響を調べるため、図21に示す各種Anti-VEGF165 DNA aptamer変異体をデザインして、調製した。【０１０８】
Aptamer 47（配列番号17）は、発明者らによって見出された、既報のVEGF結合DNAアプタマーである。Aptamer 47A（配列番号18）は、Aptamer 47の人工塩基Dsを天然型塩基Aに置換したものである。Aptamer 49（配列番号19）は、Aptamer 47の末端側のステム構造にG-C塩基対を一つ伸ばした変異体である。Aptamer 58mh（配列番号20）は、さらにAptamer 49の3’末端に、ミニヘアピン構造 (CGCGAAGCG(配列番号1)の配列からなる短いDNA断片) を結合したものである。Aptamer 49GC (配列番号21)及びAptamer 58GCmh(配列番号22)は、Aptamer 49及びAptamer 58mhのステム構造中の2か所のA-T塩基対をG-C塩基対へ置換したものである。【０１０９】
各種変異体は、化学合成後、実施例1と同様にポリアクリルアミド電気泳動により精製し、リン酸緩衝液（pH7.4）中にて、95℃で加熱後室温まで徐冷して再構築した後に、以下の実施例において使用した。
［実施例12：VEGF用アプタマーのターゲットタンパク質への結合活性解析］
＜方法＞
実施例11で調製した各種アプタマーのヒト由来VEGF165タンパク質への結合活性を比較するために、競合実験による結合活性解析を行った。スケールは20μLで行い、0.005%のNonidetP-40を含むリン酸緩衝液（pH 7.4）中で、［γ−32P］ATPにより標識したAptamer 47 (最終濃度100nM)、非標識の各種改変体（最終濃度100nM）、VEGF165タンパク質（ぺプロテック、最終濃度100nM）を混合し、37℃で30分間インキュベートした。その後、5μlの25%グリセロールを添加してすぐ、10％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてVEGF165 タンパク質に結合した標識Aptamer 47と遊離したAptamer 47とを分離し、ゲルを乾燥させ、バイオイメージアナライザーによって可視化し、放射活性を測定した。ゲルシフト率、阻害率、相対結合率は、実施例2に従って算出した。
＜結果＞
結果を、図22に示した。図22に示したとおり、Aptamer 47をAに置換したアプタマー(Aptamer 47A)は、結合阻害を全く示さなかったのに対し、Aptamer 47のステム領域を一塩基対伸ばしたAptamer 49は相対結合率が1.53となり、有意に結合力が向上していることがわかった。Aptamer 49のステム領域中のA-T塩基対を2か所G-C塩基対に置換したAptamer 49GCは相対結合率が1.50であった。一方、ミニヘアピンを含むAptamer 58mh、 Aptamer 58GCmhについては、それぞれ相対結合率が1.58、1.59となり、Aptamer 49と同様にAptamer 47よりも結合力が向上していることを確認できた。
［実施例13：VEGF用アプタマーのヒト血清中での安定性解析］
＜方法＞
本実施例では、実施例11で調製したDNAアプタマーの各種変異体を用いて、ヒト血清中での安定性を調べた。【０１１０】
ミニヘアピン構造を含むアプタマー（Aptamer 58mh, Aptamer 58GCmh）と含まないアプタマー（Aptamer 47、Aptamer 49、Aptamer 49GC）最終濃度2μMと、ヒト血清（ミリポア社）最終濃度96%を混合し、この溶液を37℃でインキュベートした。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後に混合溶液から10μLを分取し、110μLの10M尿素/1×TBEを混合して、分解反応を止めた。反応後のサンプルを、7M尿素を含む変性15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBR GOLDで染色することでDNA断片を検出した。DNAのバンドパターンをバイオイメージャーLAS4000（富士フィルム）で解析し、未分解のアプタマーに相当するバンドの濃さから、残存DNA量を推定した。
＜結果＞
結果を図23に示す。ミニヘアピン構造を含まないアプタマー（Aptamer 47、Aptamer 49、Aptamer 49GC）は、24時間後ですでに全長産物に相当するバンドは50％以下であったのに対し、ミニヘアピン構造を含むアプタマー（Aptamer 58mh, Aptamer 58GCmh）は72時間後でも、全長産物に相当するバンドが、50％以上が保持されていた。この結果より、ミニヘアピン構造がアプタマーのヒト血清中の核酸分解酵素による分解に対して安定化することがわかった。
［実施例14：VEGF用アプタマーの溶液中での熱安定性解析］
＜方法＞
各種変異体（Aptamer 47, Aptamer 47A, Aptamer 49, Aptamer 58mh, Aptamer 49GC, Aptamer 58GCmh、最終濃度2μM、リン酸緩衝液pH 7.4中）の熱安定性を、Tm値の測定により検討した。温度上昇変化（0.5℃/min）におけるDNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV−2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
＜結果＞
結果を図24に示す。コントロールのDNAアプタマー（Aptamer 47）のTm値は、69.5℃であったのに対して、G-C塩基対の置換がない各種変異体のTm値は、60.0℃（Aptamer 47A）、67.7℃（Aptamer 49）、65.6℃（Aptamer 58mh）であり、ミニヘアピン構造及びG-C塩基対の付加でTm値自身には大きな変化はみられなかった。G-C塩基対置換したAptamer 49GC, Aptamer 58GCmhについては、融解曲線が2段階になり、それぞれのTm値はAptamer 49GCでは、54.6℃と78.7℃、Aptamer 58GCmhでは62.6℃と80.8℃であった。さらに詳細に、G-C塩基対延長、置換及びミニヘアピン構造付加による影響を調べるために、図24の下段に、50度までの融解曲線を拡大して表示した。吸光度の変化は、G-C塩基対延長(Aptamer 49)、ミニヘアピン構造付加(Aptamer 58mh)により抑えられ、構造が安定化されていること、さらにはG-C塩基対置換(Aptamer 49GC、Aptamer 58GCmh)によりさらに安定化されていることが確認できた。【０１１１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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