(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤の混合物を含む、個体間の血漿内Ａβ(amyloid beta)濃度の標準偏差又は同一個体から採取された複数サンプルの血漿内Ａβ濃度の標準偏差減少用の血漿前処理組成物。
【請求項２】
ＴＣＥＰを追加で含む請求項１に記載の血漿前処理組成物。
【請求項３】
１）被験者及び健常者から分離した血漿サンプルに請求項１に記載の血漿前処理組成物を加えた後血漿内Ａβ４２濃度を検出して、
２）前記検出された被験者の血漿内Ａβ４２濃度が健常者の血漿内Ａβ４２平均濃度値と比較して、８．０％を超えて減少した場合、６５％以上の特異度(specificity)をもってＭＣＩ患者であることを示す、認知機能異常を診断するための方法。
【請求項４】
前記２）で検出された被験者の血漿内Ａβ４２濃度が健常者の血漿内Ａβ４２平均濃度値と比較して、８．０％〜１１．０％減少した場合、６５％以上の特異度及び７５％以上の敏感度(sensitivity)をもってＭＣＩ患者であることを示す、請求項３に記載の認知機能異常を診断するための方法。
【請求項５】
１）被験者及び健常者から分離した血漿サンプルに請求項１に記載の血漿前処理組成物を加えた後血漿内Ａβ４２濃度を検出して、
２）前記検出された被験者の血漿内Ａβ４２濃度が健常者の血漿内Ａβ４２平均濃度値と比較して、９．０％超えて減少した場合、７０％以上の特異度をもってＡＤ患者であることを示す、認知機能異常を診断するための方法。
【請求項６】
前記２）で検出された被験者の血漿内Ａβ４２濃度が健常者の血漿内Ａβ４２平均濃度値と比較して、９．０％〜２１．０％減少した場合、７０％以上の特異度及び８０％以上の敏感度をもってＡＤ患者であることを示す、請求項５に記載の認知機能異常を診断するための方法。
【請求項７】
１）被験者及び健常者から分離した血漿サンプルに請求項１に記載の血漿前処理組成物を加えた後血漿内Ａβ４２濃度を検出して、
２）前記検出された被験者血漿内Ａβ４２濃度が健常者の血漿内Ａβ４２平均濃度値と比較して、８．５％を超えて減少した場合、６５％以上の特異度をもってＣＩ（ＭＣＩ及びＡＤ）患者であることを示す、認知機能異常を診断するための方法。
【請求項８】
前記２）で検出された被験者の血漿内Ａβ４２濃度が健常者の血漿内Ａβ４２平均濃度値と比較して、８．５％〜１０．０％減少した場合、６５％以上の特異度及び７５％以上の敏感度をもってＣＩ（ＭＣＩ及びＡＤ）患者であることを示す、請求項７に記載の認知機能異常を診断するための方法。
【請求項９】
１）被験者及び健常者から分離した血漿サンプルに請求項１に記載の前処理組成物を加えた後血漿内Ａβ４０濃度を検出して、
２）被験者から分離した血液サンプルからヘモグロビン（Ｈｂ）濃度を検出して、
３）前記１）の血漿内Ａβ４０濃度、前記２）のヘモグロビン濃度、及びＭＭＳＥスコア（Ｚ）を下記の数式１及び数式２に適用してｐ値を収得して、
【数１】
0006621485.tif 000017
（ｐｉ：確率、β０：定数、β１：ＭＰＰ−Ａβ４０の係数、β２：ＭＭＳＥ（Ｚ）スコアの係数、β３：ヘモグロビンの係数、ｘ１：ＭＰＰ−Ａβ４０値、ｘ２：ＭＭＳＥ（Ｚ）スコア値及びｘ３：ヘモグロビン数値）
【数２】
0006621485.tif 000018
４）前記３）のｐ値が、ＰＥＴ陰性である個体群の平均ｐ値と比較して１９０．０％以上増加した場合、８５％以上の特異度で脳にＡβが蓄積されたと予測する、脳の病理学的なＡβ蓄積の有無を診断する方法。
【請求項１０】
前記３）のp値が、ＰＥＴ陰性である個体群の平均p値と比較して１９０．０％〜２３０．０％増加した場合、８５％以上の特異度及び７５％以上の敏感度で脳にＡβが蓄積されたと予測する、請求項９に記載の脳の病理学的なＡβ蓄積の有無を診断する方法。
【請求項１１】
１）被験者から分離した血漿サンプルに請求項１に記載の前処理組成物を加えた後血漿内Ａβ４０濃度を検出して；
２）被験者から分離した血漿サンプルに請求項２に記載の前処理組成物を加えた後血漿内Ａβ４０の濃度を検出して；及び
３）前記１）のＡβ４０濃度と比較して前記２）のＡβ４０の濃度が８．０ｐｇ／ｍｌを超えて増加する場合、６５％以上の特異度及び８０％以上の敏感度で脳にＡβが蓄積されたと予測する、脳のＡβ蓄積の有無を診断する方法。
【請求項１２】
１）請求項１に記載の血漿前処理組成物で処理した被験者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ濃度値、被験者から分離した血液サンプル内ヘモグロビン濃度値、及び被験者のＭＭＳＥ（Ｚ）測定値を入力する情報入力部と、
２）前記血漿前処理組成物で処理した健常者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ平均濃度値、ＰＥＴ陰性である対照群の平均p値が格納されたデータベース部と、
３）前記情報入力部で入力した情報をデータベースに格納された値と比較分析して、下記の数式１のロジステック回帰分析及び下記の数式２の演算を行う情報処理部と、
【数３】
0006621485.tif 000019
（ｐｉ：確率、β０：定数、β１：ＭＰＰ−Ａβ４０の係数、β２：ＭＭＳＥ（Ｚ）スコアの係数、β３：ヘモグロビンの係数、ｘ１：ＭＰＰ−Ａβ４０値、ｘ２：ＭＭＳＥ（Ｚ）スコア値及びｘ３：ヘモグロビン数値）
【数４】
0006621485.tif 000020
４）前記情報処理部から演算された結果を出力する情報出力部とで構成された、臨床学的及び病理学的アルツハイマー病予測及び診断システム。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物を含む血液収集装置。
【請求項１４】
血液凝固防止剤を追加で含む、請求項１３に記載の血液収集装置。
【請求項１５】
被験者の血液から分離した血漿を収集して保管する、請求項１に記載の組成物を含む血漿収集装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿にプロテアーゼ抑制剤とホスファターゼ抑制剤の混合物（Mixture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors、ＭＰＰ）及び／またはＴＣＥＰを含む血漿前処理組成物を処理した後血漿内Ａβ濃度を定量することによって臨床学的認知能力低下及び病理学的Ａβ蓄積の有無を診断してアルツハイマー病への進行をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶力低下とその他の認知機能低下などの特徴が現れる神経衰退性病で（非特許文献１）、認知症の最も重要な原因である。記憶力、思考力が急激に低下する退行性脳疾患である認知症は代表的な老人性疾患であり、脳機能が徐々に衰退して記憶、思考及び日常生活能力及び行動に問題が生じる疾病で、脳内に毒性のアミロイドベータ（Amyloid beta, Aβ, Abeta）が蓄積されることを特徴とする。脳の中に蓄積されたＡβは、脳細胞の損傷及び死滅を起こして脳の様々な機能に問題をもたらす。国内の場合、６５歳以上の老人人口中の約９．５％である２９万人程度が老人性認知症で苦しんでいて、この中で７３％である１８万人はしばしば町中を徘徊するなど、重症患者に区分される。これは、今後人口の高齢化が加速化するにつれ認知症患者は持続的に増加して、２０２０年には現在より２．４倍にまで増加した７０万人に達すると予想される。認知症は、類型別にはアルツハイマー病が５１％、血管性認知症が３４％で８５％を占めており、その他に感染性疾患、代謝性疾患などによる認知症が１５％を占める。アルツハイマー病と血管性認知症は、全認知症原因疾患の大部分を占める最も一般的な原因である。しかし、死亡前の正確な鑑別診断が備えられておらず、その診断の信頼度に多くの議論が続いている。特に国内の場合は、死亡後にも死に対する東洋的な考え方により脳組織を得ることが困難で病理学的最終診断を求めることはほぼ不可能であることが現状である。アルツハイマー病の臨床的診断は、病歴（history taking）と神経心理学的検査に主に依存して、副次的な検査で磁気共鳴画像（ＭＲＩ）やＰＥＴといった画像検査を実施する。ＰｉＢ−ＰＥＴ(Pittsburgh compound B-positron emission tomography)は、脳の画像撮影により脳内のＡβ蓄積レベルを確認できる方法としてＡＤ及びＭＣＩ（Mild Cognitive Impairment: 軽度認知障害）診断に利用されているが、高価である。
【０００３】
脳において、アミロイドベータタンパク質（Ａβ）凝集体、特にＡβ４０（Ａβ１−４０）及びＡβ４２（Ａβ１−４２）の蓄積は、アルツハイマー病（ＡＤ）と関連し、これらのタンパク質凝集体はアルツハイマー病に対する標準マーカーとして考えられている。しかし、ＡＤに対する唯一に確実なテストは、死後脳サンプルから線維性Ａβ凝集体のプラークを免疫組織化学的に染色することである。現在、ＡＤに対する事前診断テストとしてＦＤＡに認定されたものはないが、Ａβ４２に対する抗体または蛍光で標識されたＡβ４２を使用するシーディドマルチマー化(seeded multimerization)方法が知られている。これは健常な対照群被験者から採取した脳脊髄液（ＣＳＦ）と比較して、アルツハイマー病にかかった患者から収得した脳脊髄液でＡβオリゴマー種が増加したレベルで確認された研究に基づいて(非特許文献２)、アルツハイマー病患者の脳脊髄液においてベータアミロイドを測定する。
【０００４】
血液内において、Ａβは単量体ではなく線維形態で凝集していて、血液内に存在する様々なタンパク質は、Ａβ濃度に対する正確な測定を妨げる。代表的に、血液内タンパク質の多くの部分を構成するヒト血清アルブミン（Human Serum Albumin，ＨＳＡ）は、血液内に存在するＡβに結合してこれらと共に３次構造を成す。その結果、Ａβがアルブミン内に隠れるようになると、これのエピトープが表面に露出されず、これにより抗−Ａβ抗体に結合しない可能性が高くなる。さらに、血液内には、様々なプロテアーゼが存在して、これらのプロテアーゼがタンパク質を切断して安定したタンパク質の濃度維持を妨げる。
【０００５】
これまで血液内Ａβ濃度を正確に測定する方法に対する研究がそれほど多く進行されず、現状はアルツハイマー病の早期検出のためのより迅速かつ効率的な診断方法、及び潜在的治療法を評価しようとする更なる生体マーカーが求められている。特に、アルツハイマー病と軽度認知障害（ＭＣＩ）を血液から簡単に区別できる診断方法は現在存在していない実情である。
一方、特許文献１は、生体から分離した細胞、または組織に存在するアミロイドベータプラーク(plaque)に特異的な二光子蛍光プローブを利用してこれを画像化することについて記述されている。また、特許文献２は、クルクミン誘導体またはこれの薬学的に許容される塩を含むベータアミロイド凝集物関連疾患診断用組成物について記述されている。しかし、血漿を前処理して血漿内Ａβを定量してこれによりＭＣＩ及びＡＤを診断及び予測する方法に対する記述は全くないのが実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−１４９３９３５号
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−１４７８６０９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mckhann etal.,Neurology 34;939(1984)
【非特許文献２】Georganopoulouet al.PNAS,2005,102,2273;Pitschke et al.,Nature Medicine,1998,、4(7)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、血液（血漿）にプロテアーゼ抑制剤とホスファターゼ抑制剤の混合物（ＭＰＰ）を処理して血漿内Ａβ４２及び／またはＡβ４０を安定化させた後、これ（ら）の濃度の測定することによって、臨床学的認知能力（または、認知機能）低下及び脳での病理学的Ａβ蓄積の有無を診断及び予測する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記方法で測定された血漿内Ａβ４２及び／またはＡβ４０の濃度から、アルツハイマー病の発病を診断及び予測する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記方法で測定された血漿内Ａβ４２及び／またはＡβ４０の濃度から、臨床学的認知能力低下の有無及び脳での病理学的Ａβ蓄積の有無を予測及び診断して、これにより脳ＰＥＴ撮影の有無を決める一連の診断システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的の達成のために、本発明は、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤の混合物を含み、血漿内Ａβ(amyloid beta)の濃度（分布）標準偏差を減少させる、血漿前処理組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記血漿前処理組成物で処理した血漿で、Ａβの濃度及び濃度変化を検出してこれを健常者の血漿内Ａβ平均濃度値と比較して、認知機能異常を診断及び予測する方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記血漿前処理組成物で処理した血漿でＡβの濃度を測定して、脳の中での病理学的Ａβ蓄積の有無を予測及び診断する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記血漿前処理組成物で処理した被験者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ濃度値、被験者から分離した血液サンプル内ヘモグロビン濃度値、及び被験者のＭＭＳＥスコア（ｚ）測定値を入力する情報入力部と、前記血漿前処理組成物で処理した健常者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ平均濃度値が格納されたデータベース部と、前記情報入力部で入力した情報をデータベース部に格納された値と比較分析してロジステック回帰分析を行う情報処理部と、前記情報処理部から演算された結果を出力する情報出力部とで構成された、臨床学的及び病理学的アルツハイマー病予測及び診断システムを提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、血漿にＭＰＰを処理するか、ＭＰＰを処理した後還元剤であるＴＣＥＰを追加で処理した後、血漿内Ａβの濃度を定量して、これを健常者でのＡβ濃度値と比較することによって、臨床学的認知機能異常であるＭＣＩ及びＡＤを診断及び予測することができる。また、前記定量された血漿内Ａβ濃度から脳の中での病理学的Ａβ蓄積の有無を確認してＡＤへの進行を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】インビトロで製作されたＡβの量を測定した図であり、Ａは実験室で製作したＡβの単量体及び線維形態の比較した図であり、Ｂは同じ濃度の単量体及び線維形態のＡβを定量したグラフである。
【図２】血漿内Ａβ検出値に対するＭＰＰの処理効果を示すものである。
【図３】ＭＰＰを処理した血漿内Ａβ４２及びＡβ４０の濃度とＭＭＳＥスコア（Ｚ）を確認して、［Ａβの濃度］と［健常者とＭＣＩ］、［健常者とＡＤ］及び［健常者とＣＩ（ＭＣＩ及びＡＤ）］の相関を検証したものである。
【図４】臨床的認知機能異常と判別された患者から収得した血漿サンプルにＭＰＰを処理した後Ａβ４２及びＡβ４０濃度を検出して、これをＰＥＴ撮影結果と比較して、脳Ａβプラークとの相関を確認したものである。
【図５】ＭＰＰ処理した血漿内Ａβ４０濃度または他の因子（ＭＭＳＥ  ｚ−スコア及び血液内ヘモグロビンの濃度）とＰｉＢ−ＰＥＴスキャン陽性または、陰性（脳の中へのＡβ蓄積の有無）結果の相関を検証したものである。
【図６】ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４２またはＡβ４０の任意のｃｕｔ−ｏｆｆ値による臨床的認知能力診断及び病理学的な脳の中でのＡβ蓄積（プラーク）を判別するのを図式化したものである。
【図７】ＭＰＰ処理に後続してＴＣＥＰを追加で処理した後、インビトロ状態（Ａ）のＡβ濃度変化及び血漿内（Ｂ）Ａβの濃度変化を確認したものである。
【図８】健常群のＭＰＰ処理された血漿にＴＣＥＰを処理することによって増加したＡβの濃度によるＰＥＴ陽性及びＰＥＴ陰性を区別するｃｕｔ−ｏｆｆ値を求めたものである。
【図９】本発明の血漿前処理組成物及び血液凝固防止剤を含む血液収集装置の例を示した図である。
【図１０】被験者の血液から分離した血漿を保管する本発明の血漿収集装置の例を示した図である。
【図１１】被験者の血液から分離した血漿を本発明の血漿前処理組成物を含む血漿収集装置に収集する例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を詳細に説明する。但し、本発明は様々な形態に変更または変形されて実現できて、ここで説明する実現例に限定されない。
【００１６】
本発明で使用された用語「検出」または「測定」とは、検出または測定された対象の濃度を定量することを意味する。
【００１７】
本発明で使用された用語「Ａβ４０」は、「Ａβ１−４０」とも表記されることができる。
【００１８】
本発明で使用された用語「Ａβ４２」は、「Ａβ１−４２」とも表記されることができる。
【００１９】
本発明で使用された用語「健常群」は「健常者」と混用されることができる。
【００２０】
本発明で使用された用語「血漿前処理組成物（ＭＰＰ）」とは、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤を混合した混合物(Mixture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors)であり、ＴＣＥＰを追加で含むことができる。ＴＣＥＰは総体積に対して３ｍＭの濃度になるよう追加することができる。プロテアーゼ抑制剤は、ＰＭＳＦ(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluoride)のように一般的に使用することができるプロテアーゼ抑制剤を１種以上使用でき、２種以上の場合、プロテアーゼ抑制剤カクテル（protease inhibitor cocktail，ＰＩＣ）と呼ばれることができる。本発明でＭＰＰは、血漿内タンパク質（ら）の安全性を高めて、これによりＡβの濃度が安定的に測定される。
【００２１】
一側面で、本発明は、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤の混合物を含み、血漿内Ａβ濃度の標準偏差を減少させる、血漿前処理組成物に関する。一実現例で、前記血漿前処理組成物は、前記プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤を１：１（ｖ／ｖ）で含む。また、ＭＰＰは、プロテアーゼ抑制剤カクテル（Protease inhibitor cocktail，ＰＩＣ）：ＰＭＳＦ（Serineprotease inhibitor）：ホスファターゼ抑制剤カクテルＩ：ホスファターゼ抑制剤カクテルＩＩを１：１：１：１（ｖ／ｖ）で混合したものであってもよい。また、一実現例で、前記前処理組成物は、ＴＣＥＰを追加で含むことができる。
【００２２】
一側面で、本発明は、被験者及び健常者から収得した血漿サンプルを本発明の前処理組成物で処理した後、血漿内Ａβ４２の濃度を定量して；被験者血漿サンプルから定量したＡβ４２の濃度を健常者血漿サンプルからのＡβ４２の平均濃度値と比較することを含み、認知機能異常を予測及び診断する方法を提供する。一実現例で、前記認知機能異常は、ＭＣＩ（軽度認知障害）またはＡＤ（アルツハイマー病）であり得る。一実現例で、被験者の血漿内Ａβ４２の濃度が健常者の平均Ａβ４２濃度と比較して８．０％超えて減少した場合、６５％以上の特異度でＭＣＩ患者であると予測することができる。他の一実現例で、被験者の血漿内Ａβ４２の濃度が健常者の平均Ａβ４２濃度と比較して８．０〜１１．０％減少した場合、６５％以上の特異度及び７５％以上の敏感度でＭＣＩ患者であると予測することができる。他の一実現例で、被験者の血漿内Ａβ４２の濃度が健常者の平均Ａβ４２濃度と比較して９．０％超えて減少した場合、７０％以上の特異度でＡＤ患者であると予測することができる。さらに他の一実現例で、被験者の血漿内Ａβ４２の濃度が健常者の平均Ａβ４２濃度と比較して９．０〜２１．０％減少した場合、７０％以上の特異度及び８０％以上の敏感度でＡＤ患者であると予測することができる。さらに他の一実現例で、被験者の血漿内Ａβ４２の濃度が健常者の平均Ａβ４２濃度と比較して８．５％超えて減少した場合、６５％以上の特異度でＣＩ（ＭＣＩ及びＡＤ）患者であると予測することができる。さらに他の一実現例で、被験者の血漿内Ａβ４２の濃度が健常者の平均Ａβ４２濃度と比較して８．５〜１０．０％減少した場合、６５％以上の特異度及び７５％以上の敏感度でＣＩ（ＭＣＩ及びＡＤ）患者であると予測することができる。このように、本発明の認知機能異常を診断する方法により、臨床学的に認知能力に異常があるか否かを判別することができる。
【００２３】
他の一側面で、本発明は、被験者から分離した血漿サンプルを本発明の前処理組成物で処理した後、血漿内Ａβ４０の濃度を定量して、被験者から分離した血液サンプルでヘモグロビン濃度を検出して、前記血漿内Ａβ４０の濃度、前記血液内ヘモグロビンの濃度及びＭＭＳＥスコア（Ｚ）を下記の数式１のロジステック回帰分析及び数式２に適用してｐ値を導き出して、及び前記導き出したｐ値をＰＥＴ陰性である対照群の平均p値と比較することを含み、脳の中での病理学的Ａβ蓄積の有無を診断する方法に関する。
【００２４】
【数１】
0006621485.tif 000002
【００２５】
【数２】
0006621485.tif 000003
【００２６】
一実現例で、被験者から導き出したｐ値がＰＥＴ陰性である対照群の平均ｐ値と比較して１９０．０％以上増加する場合、８５％以上の特異度で脳の中にＡβが蓄積されたことと予測することができる。本発明で脳の中Ａβ蓄積の有無は窮極的にＰｉＢ−ＰＥＴ(Pittsburgh compound B-positron emission tomography)撮影によって確認した。一実現例で、被験者から導き出したｐ値がＰＥＴ陰性である対照群平均p値と比較して１９０．０〜２３０．０％増加する場合、８５％以上の特異度及び７５％以上の敏感度で脳にＡβが蓄積されたことと予測することができる。本発明で脳の中にＡβが蓄積されたことは、ＰｉＢ−ＰＥＴ陽性（ＰｉＢ−ＰＥＴ（＋））と表した。
【００２７】
一側面で、本発明は１）被験者から分離した血漿サンプルをプロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤を混合した前処理組成物で処理した後、血漿内Ａβ４０の濃度を定量して、２）被験者から分離した血漿サンプルをプロテアーゼ抑制剤、ホスファターゼ抑制剤及びＴＣＥＰを混合した前処理組成物で処理した後、血漿内Ａβ４０の濃度を定量して、及び３）前記１）で定量したＡβ４０の濃度より前記２）で定量したＡβ４０の濃度が８．０ｐｇ／ｍｌ超えて増加すると６５％以上の特異度及び８０％以上の敏感度で脳の中に病理学的にＡβが蓄積されたと判断する脳の中Ａβ蓄積の有無を診断する方法に関する。特定の増加したＡβ４０の濃度、例えば、９．２４ｐｇ／ｍｌ増加は、約７０％の特異度及び約８７％の敏感度で脳の中Ａβ蓄積の有無を診断することができる。このように増加した血漿内Ａβ４０の濃度を有する被験者は、認知機能上では正常でも今後ＡＤに進行される確率が高いと予測することができる。
【００２８】
本発明で使用されたＴＣＥＰは、血漿内でアルブミンなどのタンパク質と結合したＡβを分離できて、血漿内Ａβの検出をさらに正確にすることができる。また、本発明の一実施例で、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤だけ混合したＭＰＰを処理した血漿と比べてＴＣＥＰを共に含んだＭＰＰを処理した場合で健常者の血漿内Ａβ４０濃度が増加して、本発明の方法により、病理学的に脳にＡβが蓄積されたか否かを判別することができる。
【００２９】
一側面で、本発明は、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤の混合物処理後定量した血漿内Ａβ４２またはＡβ４０の濃度で認知機能異常及び脳のＡβ蓄積の有無を同時に判別する方法に関する。
【００３０】
本発明の一実施例で、Ａβの定量（検出または測定）は、Ｂｉｏｐｌｅｘ法により測定したもので、他の方法であるＥＬＩＳＡ(Enzyme-linked immunosorbent assay)と比較して敏感度と特異度が顕著に優秀である。
【００３１】
一側面で、本発明は、被験者及び健常者から各々分離した血漿サンプルにプロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤の混合物を処理した後、被験者及び健常者の血漿サンプル内Ａβ４０及び／またはＡβ４２の濃度を各々比較して臨床学的に認知機能異常の可否を判断して、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤の混合物を処理した血漿内Ａβ４０の濃度値、被験者から分離した血液サンプル内ヘモグロビン濃度値及びＭＭＳＥ（Ｚ）スコアを前記数式１のロジステック回帰分析及び前記数式２に適用して得たp値をＰＥＴ陰性である対照群の平均p値と比較して脳のＡβ蓄積の可否を判断することを含む、アルツハイマー病の発病の可能性を予測及び／またはモニタリングする方法を提供する。
【００３２】
一側面で、本発明は、ＭＣＩ（軽度認知障害）でＡＤ（アルツハイマー病）への進行経過をモニタリングするのに必要な情報を提供する方法に関する。本発明の方法により健常者とＭＣＩ及びＡＤを区別して、ＰｉＢ−ＰＥＴ陽性群と陰性群を区別することによって、単に臨床学的認知能力低下の進行を診断するだけでなく、実際の病理学的進行の可否も診断することができる。
【００３３】
一側面で、本発明は、本発明の血漿前処理組成物で処理した被験者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ４０またはＡβ４２濃度値、被験者から分離した血液サンプル内ヘモグロビン濃度値、及びＭＭＳＥスコア（ｚ）測定値を入力する情報入力部と、前記血漿前処理組成物で処理した健常者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ平均濃度値、ＰＥＴ陰性群の平均ｐ値が格納されたデータベース部と、前記情報入力部で入力した情報をデータベース部に格納された値と比較分析して、前記数式１のロジステック回帰分析及び前記数式２の演算を行う情報処理部と、前記情報処理部から演算された結果を出力する情報出力部とで構成された、臨床学的及び病理学的アルツハイマー病予測及び診断システムを提供する。一実現例で、１）被験者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ４０濃度を情報入力部に入力する段階と、２）前記情報入力部に入力された被験者から分離した血漿サンプルで検出したＡβ４０濃度が前記データベースに格納された健常者の平均Ａβ４０濃度と比較して８．５％を超えて減少した場合、前記被験者から分離した血液サンプル内ヘモグロビン濃度、及び前記ＭＭＳＥ（Ｚ）測定値を情報入力部に追加で入力する段階と、３）前記情報処理部に対して、前記段階１）及び段階２）の入力された情報及びデータベースに格納された情報を利用した前記数式１のロジステック回帰分析及び数式２の演算を行ってＰ値を導き出すように命令を下す段階とともに、４）ロジステック回帰分析の結果、被験者から導き出したｐ値がデータベース部のＰＥＴ陰性である対照群の平均ｐ値と比較して１９０．０％以上増加する場合、臨床学的に認知機能異常であり、かつ、病理学的に脳の中にＡβが蓄積されたことと予測する、臨床学的及び病理学的アルツハイマー病予測及び診断システムを提供する。
【００３４】
他の一側面で、本発明は、本発明の血漿前処理組成物を含む血液収集装置を提供する（図９参照）。一実現例で、前記血液収集装置は、血液凝固防止剤を追加で含む血液収集装置、例えば、血液収集チューブ、エッペンドルフチューブまたはキットであってもよく、前記血液凝固剤は、血液が凝固するのを防止する薬品が使用されてもよく、ＥＤＴＡであってもよい。
【００３５】
他の一側面で、本発明は、本発明の血漿前処理組成物を含む血漿収集装置を提供する（図１０参照）。一実現例で、前記血漿収集装置に血液収集装置に被験者の全血のうち血漿だけを分離して収集して保管することができる（図１１参照）。一実現例で、本発明の血漿前処理組成物は、凍結乾燥されて装置に含まれ、血液（全血）約８．５ｍｌまたは血漿３〜４ｍｌ当たり血漿前処理組成物が約３４０ｕｌ含まれることができる。血漿前処理組成物は、プロテアーゼ抑制剤及びホスファターゼ抑制剤を含むことができ、例えば、ＡＥＢＳＦ  ２６ｍＭ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ  ２０ｕＭ、Ｂｅｓｔａｔｉｎ  １ｍＭ、Ｅ−６４  ０．３５ｍＭ、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）０．５ｍＭ、ペプスタチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａ０．３７５ｍＭ、（−）−ｐ−ブロモテトラミソルシュウ酸塩（Bromotetramisole oxalate）０．６２５ｍＭ、カンタリジン（Ｃａｎｔｈａｒｉｄｉｎ）１２５ｕＭ、マイクロシスチン(Microcystin)ＬＲ １２５ｎＭ、イミダゾール(Imidazole)５０ｍＭ、フッ化ナトリウム(Sodium Fluoride)２５ｍＭ、モリブデン酸ナトリウム(SodiumMolybdate)２８．７５ｍＭ、オルトバナジウム酸ナトリウム(Sodium orthovanadate)２５ｍＭ、酒石酸ナトリウム二水和物(Sodium Tartrate Dihydrate)１００ｍＭ及びＰＭＳＦ(phenylmethanesulfonylfluoride)２５ｍＭを含むことができる。本発明の血液収集装置は、血液または血漿収集後２〜８℃で保管されることができる。
【００３６】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するだけで本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、通常の技術分野で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【実施例】
【００３７】
＜実施例１凝集によるＡβ検出量確認＞
インビトロで単量体形態(monomer form)または凝集した線維形態(fibrillar form)で製作されたＡβの検出量を確認するために、Ａβタンパク質をアメリカンペプチド（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入して、メーカーの指示に従って準備した。具体的に、Ａβ単量体はＡβペプチドをＤＭＳＯに溶かした後、Ｓｐｅｅｄｖａｃ（Thermo savant社）で凍結乾燥して製造して、線維形態Ａβは、単量体Ａβを常温で２４時間インキュベーションして製造した。プロテアーゼ抑制剤カクテル（Protease inhibitor cocktail，ＰＩＣ）、セリンプロテアーゼ抑制剤（Serine protease inhibitor，ＰＭＳＦ）及びヒト血清アルブミン（humanserum albumin，ＨＳＡ）は、Sigma Aldrich（ＣＡ，ＵＳＡ）で、ホスファターゼ抑制剤カクテル(Phospatase inhibitor cocktail)Ｉ（Ｌｏｔ♯Ｄ１１５１）及びＩＩ（Ｌｏｔ♯Ｃ１３４６）は、A.G.Scientific,Incから各々購入した。準備した同じ濃度の単量体形態及び線維形態のＡβをＢｉｏｐｌｅｘ(Fujirebio Europe N.V.(旧innogenetics)社)のinno-bia plasmaAβforms kitを活用して実験した後、Ｂｉｏ−ｒａｄ社のＢｉｏ−ｐｌｅｘ２００で定量した。その結果、単量体形態のＡβよりも線維形態のＡβが本来製作された濃度よりも顕著に少なく検出された（図１）。これにより、単量体形態のＡβの検出がさらに正確であることが分かった。
＜実施例２ＭＰＰ処理した血漿内Ａβ濃度に応じた臨床学的認知能力区別＞
＜２−１ＭＰＰ処理による血漿内Ａβ４２及びＡβ４０検出値の標準偏差確認＞
【００３８】
血漿内Ａβ４２及びＡβ４０濃度を同時に確認するために、ＩＮＮＯ−ＢＩＡ  ｐｌａｓｍａ  Ａβｆｏｒｍｓキット(Innogenetics,Gent,Belgium)を使用して、血漿内Ａβレベルは、Ｘ−ｍａｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(Bioplex 200 systems;Bio-rad社,Hercules,CA,USA)で測定した。実験に利用した血漿は、下記の表１の個体から得られた。血液サンプルは、Ｋ２  ＥＤＴＡチューブ(BD Vacutainer Systems,Plymouth,UK)に収得され、常温で３０分間安定化された後、７００×ｇで５分間常温で遠心分離して上澄み液である血漿サンプルを得た。試料の純度を高めるために、収得した血漿を同じ条件で追加遠心分離して純粋な血漿を得た後、これを分注して−８０℃で保管した。血漿前処理組成物であるＭＰＰはプロテアーゼ抑制剤カクテル：Ｐ.ＭＳＦ(Serine protease inhibitor)：ホスファターゼ抑制剤カクテルＩ：ホスファターゼ抑制剤カクテルＩＩを１：１：１：１（ｖ／ｖ）で混合して、すなわち、プロテアーゼ抑制剤とホスファターゼ抑制剤を１：１（ｖ／ｖ）で混合して製造した。ＭＰＰ処理による血漿内Ａβ濃度を確認するために、前記ＭＰＰを血漿希釈液(plasma diluent)バッファーに１／２５で希釈し、前記希釈された溶液で再び血漿を１／３で希釈（ＭＰＰが添加された血漿希釈液：ヒト血漿サンプル＝２：１）した後、３０分間インキュベーションした。その後ｂｉｏｐｌｅｘで定量して、ＭＰＰを処理する前の定量値と比較してＭＰＰ処理による血漿内Ａβ４２及びＡβ４０濃度の標準偏差値を求めた（図２）。
【００３９】
【表１】
0006621485.tif 000004
ＣＮ：認知正常個体(cognitivelynormal)；
ＭＣＩ：軽度認知障害個体；
ＡＤ：アルツハイマー病患者；
ＭＭＳＥ  ｚ−ｓｃｏｒｅ：年齢、性別及び教育を考慮した改正済みの簡易精神状態評価(Mini-Mental State Examination)；
ＣＤＲ：認知症尺度検査(Clinical Dementia Rating)；
ＳＤ：標準偏差；
ＮＡ：Non-available；及び
ｎ：個体数
【００４０】
その結果、患者（被験者）の表現型に関係なく全個体でＭＰＰ処理によってＡβ濃度の標準偏差値が減少し、ＭＰＰを処理した健常者、ＭＣＩ患者及びＡＤ患者の血漿内のＡβ４２及びＡβ４０標準偏差が減少して、患者個体間Ａβ４２及びＡβ４０の濃度分布幅が減少することが分かった（図２）。すなわち、ＭＰＰ処理によって血漿内Ａβ４２及びＡβ４０値のノイズが除去されて測定値の再現性及び信頼性が増大することが分かり、特にＡβ４０でより安定された。
＜２−２臨床学的認知能力診断結果とＭＰＰ処理による血漿内Ａβ濃度の関連性確認＞
【００４１】
前記実施例＜２−１＞で検出したＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４２及びＡβ４０値を確認して、統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５(GraphPad Software,Sandiego,CA,USA)及びＭｅｄＣａｌｃ(MedCalcSoftware,Ostend,Belgium)ソフトを利用して行った。すべてのデータは、平均の標準誤差(mean±standarderror of the mean,SEM)で表した。また、単一スチューデントt-検定(unparied Student’s t-test)を利用して血漿内Ａβ濃度とＰｉＢ−ＰＥＴ陽性または陰性群と比較した。ＡＮＯＶＡ分析後GraphPad Prism 5でTurky’s多重比較検定を行った。診断テストの性能を評価するために、ＭｅｄＣａｌｃを利用してＲＯＣ(Receiver Operating Characteristic)カーブ分析による回帰分析(stepwise logistic regression)を行った。血漿内Ａβ濃度データを利用してＲＯＣカーブを描いてＡＵＣ(Area under the curve)をＷｉｌｃｏｘｏｎ統計を利用して測定した。
【００４２】
ＭＰＰ処理前後の血漿内Ａβ４２の濃度をＲＯＣ(ReceiverOperating Characteristic)カーブ分析による回帰分析(stepwise logisticregression)した結果、ＭＰＰ処理によって健常群（ＣＮ）  ｖｓ ＭＣＩ、健常群  ｖｓ ＡＤ及び健常群  ｖｓ ＣＩ(cognitive impariment patients-MCI及びAD)いずれにおいてもＡＵＣ値が顕著に増加して、ＭＰＰ処理後健常群  ｖｓＭＣＩでＡＵＣは７７．７％、敏感度（疾病にかかった個体を疾病にかかったと判別する程度）は、８７．５％及び特異度（疾病にかからなかった個体を疾病にかからなかったと判別する程度）は、６９．６％と示され、健常群  ｖｓＡＤではＡＵＣは８６．７％、敏感度は９０．０％及び特異度は７８．３％と示され、健常群  ｖｓ ＣＩでＡＵＣは８２．７％、敏感度は８３．３％及び特異度は７８．３％と示され、血漿内Ａβ４２が臨床学的認知能力程度を診断するためのバイオマーカーとして活用される可能性が増加したことを確認した。さらに、これにより、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４２の濃度が５０．２４ｐｇ／ｍｌ以下であるとＭＣＩ患者であり、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４２の濃度が４９．９０ｐｇ／ｍｌ以下であるとＡＤ患者であり、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４２の濃度が４９．９０ｐｇ／ｍｌ以下であるとＭＣＩ及びＡＤ患者であることを予測することができる（表２及び図３）。
【００４３】
【表２】
0006621485.tif 000005
ＡＵＣ：カーブの下の面積；及び
ＣＩ：認知障害個体（すなわち、ＭＣＩ及びＡＤ）
＜２−２−１健常群  ＶＳ  ＭＣＩ区別＞
【００４４】
前記実施例＜２−２＞の分析結果に基づいて求めたｃｕｔ−ｏｆｆ値を境界にして、敏感度(sensitivity)及び特異度(specificity)が１５％以内に変わるｃｕｔ  ｏｆｆ値区間（橙色及び赤色数値）で捉えると、下記の表3および表4(表4は、カットオフ区間を拡大したものである)のように表すことができる。すなわち、健常群のＭＰＰ−Ａβ４２濃度平均値は５５．１ｐｇ／ｍｌで、診断の信頼性が保障されるｃｕｔ  ｏｆｆ区間は４９．２〜５０．２４ｐｇ／ｍｌと示され、健常群の平均数値に比べて８．９〜１０．７％以上減少時にＭＣＩであると診断することができる。例えば、健常群の平均ＭＰＰ−Ａβ４２濃度よりも８．９％未満に減少した場合には、ＭＣＩであると診断できないが、１０．７％を超えて減少した場合にはＭＣＩであると診断できることがわかる。但し、ＭＣＩと診断するには健常群の平均濃度に比べて減少した割合が８．９〜１０．７％になってこそＭＣＩと診断できる信頼性があることを意味する。
【００４５】
【表３】
0006621485.tif 000006
【００４６】
【表４】
0006621485.tif 000007
＜２−２−２健常群  ＶＳ  ＡＤ区別＞
【００４７】
前記実施例＜２−２＞の分析結果に基づいて求めたｃｕｔ−ｏｆｆ値を境界にして、敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が１５％以内に変わるｃｕｔ  ｏｆｆ値区間で捉えると、 下記の表5および表６（表６は、カットオフ区間を拡大したものである)のように表すことができる、健常群のＭＰＰ−Ａβ４２濃度平均値は、５５．１ｐｇ／ｍｌで、診断の信頼性が保障されるｃｕｔ  ｏｆｆ区間は４４．９〜４９．９ｐｇ／ｍｌと示され、健常群の平均数値に比べて９．５〜２０．１％以上減少時ＡＤであると診断することができる。例えば、健常群の平均ＭＰＰ−Ａβ４２濃度より９．５％未満に減少した場合には、ＡＤであると診断できないが、２０．１％以上に減少した場合にはＡＤであると診断できることがわかる。ただし、ＡＤと診断するには健常群の平均濃度に比べて減少した割合が９．５〜２０．１％になってこそＡＤと診断できる信頼性があることを意味する。
【００４８】
【表５】
0006621485.tif 000008
【００４９】
【表６】
0006621485.tif 000009
＜２−２−３健常群  ＶＳ  ＣＩ（ＭＣＩ＋ＡＤ）区別＞
【００５０】
前記実施例＜２−２＞の分析結果に基づいて求めたｃｕｔ−ｏｆｆ値を境界にして、敏感度及び特異度が１５％以内に変わるｃｕｔ  ｏｆｆ値区間で捉えると、 下記の表7および表8(表8は、カットオフ区間を拡大したものである)のように表すことができる、健常群のＭＰＰ−Ａβ４２濃度平均値は、５５．１ｐｇ／ｍｌで、診断の信頼性が保障されるｃｕｔ  ｏｆｆ区間は４４．９〜５０．２４ｐｇ／ｍｌと示され、健常群の平均数値に比べて８．９〜９．５％以上減少時ＣＩであると診断することができる。例えば、健常群の平均ＭＰＰ−Ａβ４２濃度より８．９％未満に減少した場合にはＣＩであると診断できないが、９．５％以上に減少した場合にはＣＩであると診断できることがわかる。ただし、ＣＩと診断するには健常群の平均濃度に比べて減少した割合が８．９〜９．５％になってこそＣＩと診断できる信頼性があることを意味する。
【００５１】
【表７】
0006621485.tif 000010
【００５２】
【表８】
0006621485.tif 000011
＜実施例３ＭＰＰ処理した血漿内Ａβ濃度に応じた病理学的Ａβ蓄積判別＞
＜３−１ＭＰＰ処理した血漿内Ａβ４２及びＡβ４０濃度と脳Ａβプラークとの相関＞
【００５３】
同様にＭＰＰを処理した後血漿内のＡβ濃度を測定して、大脳皮質全般でのＳＵＶＲ(Standardized Uptake Value Ratio)値とＭＰＰ処理後Ａβ濃度との関連性を確認した。具体的に、統計分析は前記実施例＜３−１＞のように行っており、従属変数（ＰｉＢ−ＰＥＴ陽性またはＰｉＢ−ＰＥＴ陰性）と独立変数（ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ濃度）との間の関係を測定するためにロジステック回帰分析を行った。
【００５４】
その結果、大脳皮質全般(Global cortical)のＳＵＶＲ(Standardized Uptake Value Ratio)は、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０と逆相関を示し（ｐ＝０．０４３２）、ＰＣ−ＰＲＣ、外側頭頂葉(lateral parietal)及び側方側頭部(lateral temporal)ＲＯＩ（各々ｐ＝０．０４５３、０．０３４７及び０．０２２６）は、総個体でのＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０に反比例した（図４）。
＜３−２ＰｉＢ−ＰＥＴデータとＭＰＰ処理した血漿内Ａβ濃度の関連性確認＞
【００５５】
本発明で測定した血漿内Ａβ４０濃度により、脳に存在するＡβプラークを確認したＰｉＢ−ＰＥＴ(Pittsburgh compound B- positron emission tomography)陽性または陰性を区別できるか否かを検証した。具体的に、ＰＥＴ陽性（患者）群及びＰＥＴ陰性（患者）群のＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０の濃度を単一t−検定で比較して前記実施例＜３−１＞同様ＲＯＣカーブを図示した。また、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０の濃度及びＭＭＳＥ（Ｚ）スコア結果、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０濃度及び血液(whole blood)内ヘモグロビン濃度（Ｈｂ）、ＭＭＳＥ（Ｚ）スコア結果及び血液内ヘモグロビン濃度、及びＡβ４０の濃度、ＭＭＳＥ（Ｚ）スコア結果及び血液内ヘモグロビン濃度を各々下記の数式１を利用してロジステック回帰分析を行って、これから導き出したｐｉ値を数式２を利用してｐ値を求めた。また、p値によりＲＯＣカーブを描いてこれからｃｕｔ−ｏｆｆ値(criterion)を導き出した。
【００５６】
【数３】
0006621485.tif 000012
【００５７】
【数４】
0006621485.tif 000013
【００５８】
その結果、血漿内Ａβ４０、Ａβ４０＋ＭＭＳＥ（Ｚ）、及びＡβ４０＋ＭＭＳＥ（Ｚ）＋ＨｂのＡＵＣ値がＭＰＰ処理によって増加して、ＭＰＰ処理によって血漿内Ａβ４０がＰＥＴ陽性及び陰性を診断するためのバイオマーカーとして活用される可能性が増加したことを確認することができ、これらの中Ａβ４０＋ＭＭＳＥ（Ｚ）＋Ｈｂモデルが最も大きい活用度を示した（表６及び図５）。また、ロジステック回帰分析して得られたｃｕｔ−ｏｆｆ値(Criterion値)によりＰｉＢ−ＰＥＴ陽性  ｖｓ  ＰｉＢ−ＰＥＴ陰性を区別する可能性があることを確認した（表９）。これにより、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０の濃度が１７６．５０ｐｇ／ｍｌ以下であるか、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０の濃度、ＭＭＳＥ（Ｚ）スコア及び血液内ヘモグロビン濃度をロジステック回帰分析して得たp値が０．５９を超えると、ＰＥＴ陽性であることを予測することができる（表9）。
【００５９】
【表９】
0006621485.tif 000014
＜３−２−１ＰＥＴ陽性  ＶＳ  ＰＥＴ陰性区別＞
【００６０】
健常群の平均ｐ値は、前記数式１にβ０：定数＝−１５．８３４５、β１：ＭＰＰ−Ａβ４０の係数＝−０．０６２３４０、β２：ＭＭＳＥ（Ｚ）スコアの係数＝−１．３０８７２、β３：ヘモグロビンの係数＝１．８５８８６、ＰＥＴ陰性群の平均ＭＰＰ−Ａβ４０値：ｘ１＝１７５．９５、ＰＥＴ陰性群の平均ＭＭＳＥ（Ｚ）スコア値：ｘ２＝０．２０９８８及びＰＥＴ陰性群の平均ヘモグロビン値：ｘ３＝１３．５１１５を代入して求めたｌｎ（１／１−p）値が−１．５１１９１０２６４であるから、これを数式２により、ＰＥＴ陰性である個体の平均、すなわち、ＰＥＴ陰性である健常群の平均ｐ値である０．１８を求めた。ｃｕｔ−ｏｆｆ値を境界にして、敏感度及び特異度が５％以内に変わるｃｕｔ  ｏｆｆ値区間で捉えると、下記の表１０および表１１（表１１は、カットオフ区間を拡大したものである）のように表すことができる。
【００６１】
すなわち、診断の信頼性が保障されるｃｕｔ  ｏｆｆ区間は０．５３〜０．５９であり、これはＰＥＴ陰性群の平均p値に比べて１９４．７％〜２２４．５％増加した値である。したがって、ＰＥＴ陰性群の平均p値に比べて１９４．７％〜２２４．５％より大きく増加するとＰＥＴ陽性であると診断することができる。例えば、１９４．７％より小さい％に増加した場合にはＰＥＴ陽性であると診断できないが、２２４．５％より高い％に増加した時にはＰＥＴ陽性であると診断することができる。すなわち、ＰＥＴ陽性と診断するにはＰＥＴ陰性群の平均p値対比増加率が１９４．７％〜２２４．５％になってこそＰＥＴ陽性と診断できる信頼性があることを意味する。
【００６２】
【表１０】
0006621485.tif 000015
【００６３】
【表１１】
0006621485.tif 000016
【００６４】
前記結果により、ＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４２またはＡβ４０濃度に応じて臨床学的に認知能力による患者分類（健常者、ＭＣＩ及びＡＤ）と病理学的に脳のＡβの蓄積の有無（ＰＥＴ陽性及びＰＥＴ陰性）を判別できることがわかる（図６）。
＜実施例４ＴＣＥＰを追加で含むＭＰＰ処理による血漿でのＡβ検出確認＞
＜４−１ＴＣＥＰを追加で含むＭＰＰ処理を通したＡβ定量＞
【００６５】
前記＜実施例１＞と同様にインビトロ状態のＡβにプロテアーゼ、ホスファターゼ及び還元剤であるＴＣＥＰ(tris(2-carboxyethyl)phosphine)(Sigma Aldrich,CA,USA)を含むＭＰＰを各々３ｍＭ処理した後常温で３０分間インキュベーションとＡβ４２及びＡβ４０を定量した。
【００６６】
その結果、インビトロ状態でヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を処理したＡβ４２及びＡβ４０にＴＣＥＰを処理時Ａβの濃度が増加して、これは血漿内存在するアルブミンの３次構造を破壊して、これに結合及び凝集しているＡβを解いて測定可能なＡβの量を増加させたと判断される（図７Ａ）。また、実際の血漿内でもＴＣＥＰを処理するようになった時Ａβ４０の濃度が増加して、これはアルブミンの構造を解くことによってＡβ４０の濃度が増加したと判断される（図７Ｂ）。さらに、たとえ実際のヒトの血漿でＡβ４２の濃度に対して効果がなかったが、これは人体他人工的な実験と体内に実際に存在する血漿を利用した実験での差であると判断される。
＜４−２ＴＣＥＰ追加処理によるＡβ濃度増加量とＰＩＢ−ＰＥＴイメージデータとの相関分析＞
【００６７】
健常群内でのＰＥＴ陽性群及びＰＥＴ陰性群を区別するために、プロテアーゼ、ホスファターゼ及びＴＣＥＰを含むＭＰＰを処理した血漿内のＡβ４０濃度を定量した後、ＴＣＥＰを除いたプロテアーゼ及びホスファターゼを含むＭＰＰを処理した血漿内Ａβ４０の濃度を差し引いた値を求めてＰｉＢ−ＰＥＴスキャンデータと比較した。
【００６８】
その結果、プロテアーゼ及びホスファターゼだけ含むＭＰＰ処理後血漿内Ａβ４０濃度よりＴＣＥＰを含むＭＰＰを処理することによって健常群である個体の血漿内Ａβ４０の濃度が、ＰＥＴ陰性及びＰＥＴ陽性である実験群で顕著に増加することが分かった。また、健常群内のＰＥＴ陽性である個体群でＴＣＥＰによる血漿内Ａβ増加量が顕著であった。この時、ｃｕｔ  ｏｆｆ（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）値は＞９．２４であり、これにより、プロテアーゼ及びホスファターゼだけ含むＭＰＰ処理によるＡβ濃度よりＴＣＥＰを含むＭＰＰ処理によって増加したＡβ濃度が９．２４ｐｇ／ｍｌより大きいと、ＰＥＴ陽性群である個体である確率が高いことが分かり、敏感度と特異度は各々８７．５０％及び７０．５９％であった（図８）。
【００６９】
ＰｉＢ−ＰＥＴ陽性群でのＡβ４０に対するＴＣＥＰ効果は、ＰｉＢ−ＰＥＴ陰性群に比べて高かった（＊＊p＜０.０１）。これにより、以後ＡＤへの転換確率が相対的に高い健常群内でのＰＥＴ陽性及びＰＥＴ陰性の識別が可能であることが分かった。これは健常群内で脳のＡβプラーク（ｐｌａｑｕｅ）が多い場合、ＴＣＥＰを処理した血液に、それがより反映されることを示唆する。すなわち、患者の脳画像を高価な費用をかけて撮像しなくても血液により容易に健常群内でＰＥＴ陽性及び陰性を区別する可能性を提示する。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、臨床で認知症患者の診断に有用に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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