(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．９６７２の受入番号で寄託され、ミルベマイシン(milbemycin)を産生する能力を有することを特徴とする、ストレプトマイセス  ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)ＨＳ７５２３。
【請求項２】
ミルベマイシンの製造のための、請求項１に記載のストレプトマイセスＨＳ７５２３の使用。
【請求項３】
同化炭素源と同化窒素源とを含む栄養培地にてストレプトマイセスＨＳ７５２３を好気性発酵させる工程を含むことを特徴とする、ミルベマイシンの発酵方法。
【請求項４】
上記同化炭素源が、澱粉、デキストリン、グルコース、工業糖蜜、グリセロール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、キシラン、マンニトールおよびソルビトールのうちの１つ、またはこれらの物質の組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記同化窒素源が、酵母エキス、パン種、牛肉エキス、トリプトン、ペプトン、脱脂粉乳、全脂粉乳、大豆ケーキ粉末、綿実ケーキ粉末、ピーナッツケーキ粉末、グルテン粉末、コーンパルプ乾燥粉末、糠、尿素およびアンモニウム塩のうちの１つ、またはこれらの物質の組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記栄養培地が、２〜１０ｇ／Ｌの酵母エキス、酵母エキスペーストまたはペプトン、２０〜２００ｇ／Ｌのスクロースまたは糖蜜、２〜１１ｇ／Ｌの脱脂粉乳またはコーンパルプ、２〜１１ｇ／Ｌの大豆ケーキ粉末、５〜１５ｇ／Ｌの綿実ケーキ粉末またはグルテン粉末、０．５〜１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．０５〜０．１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００５〜０．０２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４、１〜５ｇ／ＬのＣａＣＯ３、０．０１〜０．０５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４および０．１〜０．５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４を含むことを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記発酵の温度が、２０〜４０℃であり、上記栄養培地のｐＨが、６．０〜８．０であり、上記発酵の時間が、３００〜３６０時間であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
上記発酵の温度が、２５〜３５℃であり、上記栄養培地のｐＨが、７．０であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記発酵の時の溶存酸素が、３５％以上であることを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記発酵の時の通気量が、０．５〜１．０ｖｖｍであることを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しいストレプトマイセス(Streptomyces)およびストレプトマイセスの発酵培養によってミルベマイシン(milbemycin)Ａ３を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミルベマイシンは、微生物源からの天然産物であり、これは、農薬として用いることができ、また、現代の世界で最も良好なダニ駆除剤の一つであることを示すデータがある。米国環境保護機関(Environmental Protection Agency)は、これを、危険性の低い農薬であると確認し、オランダは、これを、「ＧＮＯ」（作物の生産における天然産物）として承認している。これは、生態系に優しい農薬に属しており、有機農業の病虫害の総合的な防止に応用可能であり、発達した国家において、好評な殺虫剤およびダニ駆除剤となってきている。
【０００３】
ミルベマイシンは、試験用の虫として二斑クモダニを用いて、日本の三共製薬による微生物の発酵液からスクリーニングされた、殺虫活性を有する代謝産物である（ＵＳ３，９５０，３６０）。大量の基礎研究を経て、１９８３年に、ダニ駆除剤として、ミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４の成分の混合物（Ａ３：Ａ４＝３：７）が用いられた。ミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４の構造を式Ｉに示す。１９９０年に、日本で、茶および茄子に対するダニ駆除剤として、１％のミルベマイシン乳剤(milbeknock)が用いられた。１％のミルベマイシン乳剤はまた、１９９３年に、日本で、梨、桃、西瓜、苺、茄子および花卉に対する農薬として登録された。現在、ミルベマイシンは、日本や、ヨーロッパの多くの国、米国などの多くの国で登録されており、安全で環境に優しい殺虫剤およびダニ駆除剤として、米国環境保護機関によって使用が推奨されている。
【０００４】
ミルベマイシンを含む発酵液は、複雑な組成を有しており、分離が困難であるので、ミルベマイシンは通常、ミルベマイシンＡ３成分およびミルベマイシンＡ４成分の混合物として報告され、単独成分の製造と使用はめったに報告されない。この主要な原因は、Ａ３およびＡ４の類似の比率を有する液からＡ３およびＡ４の単独成分を分離することが困難であることであり、このことが、最終的な生産量に影響を及ぼす。Ａ３の場合、液中のＡ３の含量は３０％より小さい。Ａ３の単独成分を得るために、多くのＡ４が消失してしまう。Ａ３またはＡ４の単独成分を生産することを実現することは、ミルベマイシンの単独成分の、他の領域での応用をさらに容易化することができる。単独成分を得るための最も効率的な方法は、単独成分を産生する新しい菌種を獲得することである。
【０００５】
【化１】
0006550144.tif 000002
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、ミルベマイシンＡ３の単位生産量を増加させることができる微生物菌種を提供することであり、本発明は、発酵液中のミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７０％を超える百分率を占め、ミルベマイシンＡ３の単位生産量が３０００ｕｇ／ｍｌを超える量に到達することができ、不純物含量が低いことを特徴としている。
【０００７】
本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３の微生物菌種は、２０１４年９月１６日、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター(China General Microbiological Culture Collection Center)（住所：Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No.1 Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing）に、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．９６７２の寄託番号で寄託され、Streptomyces hygroscopicusとして分類・命名され、登記され、生存が証明された。
【０００８】
本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３の主要な生物学特性は以下の通りである：コロニーが、ＩＳＰ１、ＩＳＰ２、ＩＳＰ３培地上では白色で、円形であり、中間に少し突起があり、皺が多く、中型サイズの直径（約６ｍｍほど）であり、胞子は少なく、基質菌糸が発達しており、菌糸が培地と緊密に結合していて引き起こしが容易でなく、ＩＳＰ１およびＩＳＰ２培地上では色素が産生されず、ＩＳＰ３培地上ではベージュ褐色の色素が産生される。
【０００９】
本発明は、ストレプトマイセスＨＳ７５２３の形態学的特性および分子レベルの特性を述べる。公知のミルベマイシン産生菌を形態学および分子レベルで比較することによって、ストレプトマイセスＨＳ７５２３はStreptomyces hygroscopicusに属することが確認された。ストレプトマイセスＨＳ７５２３は、Streptomyces sp.  ＮＲＲＬ  ５７３９  １６ｓ  ｒＲＮＡと９９％の相同性を有し、Streptomyces bingchenggensis  ＢＣＷ−１と９９％の相同性を有する。ストレプトマイセスＨＳ７５２３菌株と、他のミルベマイシン産生菌の間の、形態学上の最大の相違点は、Streptomyces sp.  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．  ７６７７などの他の菌種のコロニーが、産生プレート上のコロニー表面に金色の涙を分泌し、色素が産生されるが、ストレプトマイセスＨＳ７５２３は、同じ培地上で、灰色がかった白色であり、表面に涙を有さず、色素が産生されないことである（図２参照）。
【００１０】
本発明はまた、ストレプトマイセスＨＳ７５２３（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．９６７２）を用いることによって、ミルベマイシンを製造する方法を提供する。この方法は、同化炭素源と同化窒素源とを含む栄養培地にてストレプトマイセスＨＳ７５２３（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．９６７２）を好気性発酵させる工程を含む。
【００１１】
好ましい実施形態では、好ましくは、上記炭素源が、澱粉、デキストリン、グルコース、工業糖蜜、グリセロール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、キシラン、マンニトールおよびソルビトールのうちの１つ、またはこれらの物質の組み合わせから選択される。
【００１２】
好ましい実施形態では、好ましくは、上記窒素源が、酵母エキス、パン種、牛肉エキス、トリプトン、ペプトン、脱脂粉乳、全脂粉乳、大豆ケーキ粉末、綿実ケーキ粉末、ピーナッツケーキ粉末、グルテン粉末、コーンパルプ乾燥粉末、糠、尿素およびアンモニウム塩のうちの１つ、またはこれらの物質の組み合わせから選択される。
【００１３】
好ましい実施形態では、上記栄養培地が、２〜１２ｇ／Ｌの酵母エキス、酵母エキスペーストまたはペプトン、２０〜２００ｇ／Ｌのスクロースまたは糖蜜、２〜１１ｇ／Ｌの脱脂粉乳またはコーンパルプ、２〜１１ｇ／Ｌの大豆ケーキ粉末、５〜１５ｇ／Ｌの綿実ケーキ粉末またはグルテン粉末、０．５〜１ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、０．０５〜０．１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００５〜０．０２ｇ／ＬのＺｎＳＯ４、１〜５ｇ／ＬのＣａＣＯ３、０．０１〜０．０５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４および／または０．１〜０．５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４を含む。
【００１４】
好ましい実施形態では、発酵培養の温度が、２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３５℃であり、培地のｐＨが、６．０〜８．０、好ましくは約７．０であり、発酵の時間が、３００〜３６０時間であり、溶存酸素が、３５％以上であり、通気量が、０．５〜１．０ｖｖｍである。
【００１５】
発酵方式は、液中発酵である。
【００１６】
ミルベマイシンは、以下の方法によって測定可能である：
０．５ｍｌの発酵液に４．５ｍｌの７５％エタノールを加える。得られた混合物を均質に混合し、１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。上澄み液を取って試料を注入する。
ＨＰＬＣカラム：Ｚｏｒｂｅｘ  ＲＸ−Ｃ８、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ
ＵＶ吸収波長：２４０ｎｍ
温度制御：２２℃
ＨＰＬＣ流動相条件：表９に示す。
注入量：１０μｌ。
【００１７】
本発明で採用されるミルベマイシン産生菌は、ストレプトマイセスＨＳ７５２３（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．９６７２）、または、ストレプトマイセスＨＳ７５２３（ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．９６７２）の自然突然変異体または通常の突然変異誘発によって得られた突然変異体である。
【００１８】
本発明の主要な有利な点は以下の通りである。
【００１９】
（１）本発明は、新しいミルベマイシン産生菌であるストレプトマイセスＨＳ７５２３およびそれを用いてミルベマイシンを製造する方法を提供する。本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３は、発酵液中のミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７０％を超える百分率を占め、ミルベマイシンＡ３の単位生産量が３０００ｕｇ／ｍｌを超える量に到達することができ、不純物含量が低いことを特徴としている。
【００２０】
（２）本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３は、発酵法によって発酵生成物中のミルベマイシンＡ３の比率を改善するので、ミルベマイシンＡ３の単独成分の製造の困難さが軽減され、これは、製造コストを下げてミルベマイシンＡ３の単独成分の応用範囲を広げるのに有利である。
【００２１】
（３）ミルベマイシンＡ３の発酵単位が改善される。原始菌であるStreptomyces milbemycinicus  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７の力価と比べて、本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３によって製造されるミルベマイシンＡ３の力価は、大幅に増加しており、これは産業的生産に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３の選択育成ダイヤグラムである。
【図２】本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３菌株のコロニー形態とStreptomyces milbemycinicus  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７のコロニー形態との比較であり、Ａは、Streptomyces milbemycinicus  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７のコロニー形態であり、Ｂは、本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３のコロニー形態である。
【図３】ミルベマイシンＡ３の標準品およびミルベマイシンＡ４の標準品のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】実施例５の発酵液中でのＨＰＬＣクロマトグラムである。ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７２％を占める。
【図５】実施例６の５０Ｌの発酵槽中でのミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４の製造における本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３の発酵曲線である。
【図６】実施例６の条件下での本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３により産生されたミルベマイシンＡ３のＨＰＬＣクロマトグラムである。ミルベマイシンＡ４の含量は１２４６ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量は３０５０ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７１％を占める。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例で用いられる実験方法は、特に記載のない限り、すべて、従来の方法である。
【００２４】
以下の実施例で用いられる材料、試薬等は、特に記載のない限り、すべて、商業的に入手可能である。
【００２５】
以下の具体的な実施形態を参照して本発明を説明する。以下の実施例は、本発明を説明することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００２６】
ミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４の標準品の製造は、米国特許ＵＳ３，９５０，３６０の実施例１に記載されている。
スクロースは、Guangxi Dongmen Nanhua Sugar Industry Co., Ltd.の製品である。
酵母エキスは、Zhejiang Dongcheng Pharmaceutical Co., Ltd.の製品である。
酵母エキスペーストは、Hefei Laisi Biological Engineering Co., Ltd.の製品である。
ペプトンは、Huzhou Confluence Biological science and technology Co., Ltd.の製品である。
糖蜜は、Guangdong Jiangmen Biological science and technology Co., Ltd.の製品である。
脱脂粉乳は、Hulunbeier Sanyuan Milk Co.,Ltd.の製品である。
コーンパルプは、Shandong Shouguang Juneng Golden Corn Co., Ltd.の製品である。
大豆ケーキ粉末は、Ningbo Beilun Jiangnan Oil Co., Ltd.の製品である。
綿実ケーキ粉末は、Beijing Kang Mingwei Medium Technology Co., Ltd.の製品である。
グルテン粉末は、Beijing Kang Mingwei Medium Technology Co., Ltd.の製品である。
【００２７】
〔実施例１：  菌株の源〕
本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３は、ミルベマイシン産生菌であるStreptomyces milbemycinicus  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７（中国特許ＣＮ１０３７８９３３９Ａ参照）に基づいて、（ＮＴＧ、ＥＭＳ、ＵＶ等の突然変異誘発手段を含む）多数回の突然変異誘発および選択育成によって得られた、高比率のミルベマイシンＡ３を有する菌種である。原始菌種と比べて、菌種の外観が大きく変化し、形態学的突然変異体に属する。
【００２８】
２８℃で１０〜１２日間、Streptomyces milbemycinicus  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７をＩＳＰ３斜面培地上で培養した。次に、接種シャベルでの無菌条件で、菌糸を研磨口管中で研磨し、その後、無菌水に懸濁させ、菌懸濁液を得た。ＮＴＧ（ニトロソグアニジン）、ＥＭＳ（エチルメタンスルフォン酸エステル）、ＵＶ（紫外線）を用いて、菌懸濁液を突然変異誘発に付した。具体的な方法は以下の通りである。
【００２９】
ＮＴＧ結晶を１０ｍｇ取り、無菌Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに溶解させ、その後、トランスファーピペットを用いて菌懸濁液１ｍｌを加えた。その後、得られた混合物を、２８℃の培地に置き、回転または往復式の振盪機にて３０分間振盪した。適度に希釈した後、処理した混合物をＩＳＰ３プレートに塗布した。突然変異誘発処理に付さなかった菌懸濁液も適度に希釈し、対照としてＩＳＰ３プレートに塗布した。２８℃で１０日間培養した後、コロニーの数をチェックし、致死率を計算した。
【００３０】
１０−１または１０−２の単独細胞菌懸濁液５ｍｌ〜１０ｍｌを、留め具の付いたプレート（直径９ｃｍ）に徐々に加えた。その後、プレートをＵＶ誘導箱内に置き、磁力攪拌機の上に置いた。その後、蓋を開け、撹拌しながら、３０ｃｍの距離で数分間（通常２〜５分間）、プレートにＵＶ１５Ｗを照射した。照射後、プレートを黒い布で包み、その後、生理食塩水（０．９塩化ナトリウム溶液）で１０−２〜１０−７倍に希釈し、希釈液をＩＳＰ３プレートにそれぞれ塗布し、突然変異誘発グループを得た。
【００３１】
ＥＭＳを１ｍｌ取り、無水エタノール２ｍｌに溶解させ、０．１モル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２２ｍｌをさらに加えた。１０−１または１０−２の単独細胞菌懸濁液５ｍｌを、留め具の付いたプレートに徐々に加えた。その後、４．０％ＥＭＳ溶液の５ｍｌをプレート中に加え、ＥＭＳの最終濃度は２．０％であった。その後、プレートを磁力攪拌機の上に置いて２０〜６０分間撹拌した。反応を止めるために、突然変異誘発プレート中に５％チオ硫酸ナトリウムを１０ｍｌ加えた。その後、得られた混合物を今度は生理食塩水で１０−２〜１０−７倍に希釈し、希釈液をＩＳＰ３プレートにそれぞれ塗布し、突然変異誘発グループを得た。
【００３２】
多数回の上記の単独または組み合わせた突然変異誘発の後、１０，０００株以上の単独コロニーが選択されて振盪フラスコ発酵に付された。ミルベマイシンの生産量はＨＰＬＣで測定される。図１に示すように、多数回の突然変異誘発によって、突然変異体のStreptomyces hygroscopicusＨＳ７５２３を選出した。
【００３３】
〔実施例２：  ストレプトマイセスＨＳ５２３の培養特性〕
以下の実験は、「Streptomyces鑑定マニュアル」、「actinomyceteの分類と鑑定」および「一般細菌系統鑑定マニュアル」を参照して行った。
【００３４】
２８℃で、７〜１０日間、１０種類の培地、すなわち、ＩＳＰ１、ＩＳＰ２、ＩＳＰ３、ＩＳＰ４、ＩＳＰ５、Gause氏Ｎｏ．１、リンゴ酸カルシウム、栄養寒天、ＹＭＳおよびCzapek氏にて培養した後、菌糸の色と色素を観察した（培養特性を表１に示した）。
【００３５】
【表１】
0006550144.tif 000003
【００３６】
注：表１中、「/」は色素が産生されなかったことを表す。
【００３７】
〔実施例３：  ストレプトマイセスＨＳ７５２３の生理学および生化学試験〕
以下の実験は、「Streptomyces鑑定マニュアル」、「actinomyceteの分類と鑑定」および「一般細菌系統鑑定マニュアル」を参照して行った。温度試験以外は、培養はすべて、２８℃で、７〜１０日間行った。
【００３８】
（１）炭素源の利用：基礎培地としてＩＳＰ９を採用し、種々の炭素源の最終濃度はすべて１．０％であった。結果を表２に示した。
【００３９】
（２）無機窒素源の利用：基礎培地としてＩＳＰ９を採用し、ＫＮＯ３および（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度はどちらも０．１％であった。結果を表２に示した。
【００４０】
（３）分解試験およびＮａＣｌ耐性試験（結果を表７に示した）は、基礎培地としてＧＹＥＡ（ｐＨ６．８）を採用した。種々の分解生成物の濃度を表３に示した。結果を表３に示した。
【００４１】
（４）酸化酵素およびカタラーゼ試験（結果を表４に示した）、ｐＨ試験（結果を表５に示した）および温度試験（結果を表６に示した）は、すべて、ＹＭＳ培地を採用した。
【００４２】
【表２】
0006550144.tif 000004
【００４３】
【表３】
0006550144.tif 000005
【００４４】
【表４】
0006550144.tif 000006
【００４５】
【表５】
0006550144.tif 000007
【００４６】
【表６】
0006550144.tif 000008
【００４７】
【表７】
0006550144.tif 000009
【００４８】
注：表２〜表７において、０：増殖なし、１：増殖が弱い、２：増殖可能で少量の胞子あり、３：良好な増殖で、多数の胞子あり、４：最高の増殖で、豊富に胞子あり、＋：陽性、−：陰性である。
【００４９】
〔実施例４：  １６Ｓ  ｒＤＮＡのシーケンス分析および公知のミルベマイシン産生菌との比較〕
ＩＳＰ２上で良好に増殖した本発明の菌糸を収集し、ガラスビーズを含んだＴＳＢ液体培地に接種し、２８℃でインキュベーターに置き、２５０ｒ／分で２〜４日間振盪培養した。その後、遠心分離で菌糸を収集し、無菌水で２回洗浄し、４℃で保存して使用に備えた。
【００５０】
（１）菌糸を１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
【００５１】
（２）最終濃度が３〜４ｍｇ／ｍｌになるまで、リゾチーム溶液（菌糸体積：リゾチーム溶液＝１：５〜１０）を加え、その後、３７℃で１〜３時間水浴に置いた。
【００５２】
（３）５０〜１００ｕｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫおよび１％ＳＤＳを加え、その後、３７℃で０．５〜３時間水浴に置いた。
【００５３】
（４）等体積の中性フェノール／クロロホルムを加え、３０秒間振盪し、その後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００５４】
（５）上澄み液に１／１０体積の３ＭのＮａＡｃ溶液と、等体積のイソプロパノールとを加え、均質に混合し、５分間室温に置き、その後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００５５】
（６）沈殿物を７０％エタノール２回洗浄し、乾燥後、ＴＥ／ＲＮａｓｅに溶解させた。
【００５６】
（７）抽出したゲノムをテンプレートとして用い、その後、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。
【００５７】
フォワードプライマー２７Ｆは、５’−ＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）であり、
リバースプライマー１４９５Ｒは、５’−ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）である。
【００５８】
反応は、ＰＣＲ増幅器上で行った。工程は以下の通りである：９５℃で５分間、前変性させ、９４℃で４５秒間の変性と５５℃で４５秒間のアニーリングと７２℃で９０秒間の延伸とのサイクルを３０回行い、その後、７２℃で１０分間延伸した。反応系は以下の通りである：
脱イオン水                  １４．２５μＬ
１０×ＰＣＲバッファー      ２．０μＬ
ｄＮＴＰ混合物              ０．５μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ          ０．２５μＬ
プライマー１（２７Ｆ）      １．０μＬ
プライマー２（１４９５Ｒ）  １．０μＬ
ＤＮＡテンプレート          １．０μＬ（濃度に基づいて定量した）。
【００５９】
ＰＣＲ生成物を０．８％寒天ゲル電気泳動で測定した。明瞭なバンドの生成物を選択して精製した。増幅された生成物をゲル電気泳動で回収し、Ｔベクターに連結してシークエンシングした。菌種の１６Ｓ  ｒＤＮＡの一次構造が得られた。結果は、Genebankのデータベース(blast)の類似性検索を行うことによって、ストレプトマイセスＨＳ７５２３が、Streptomyces sp.  ＮＲＲＬ  ５７３９  １６ｓ  ｒＲＮＡと９９％の相同性を有すること、および、Streptomyces bingchenggensisＢＣＷ−１と９９．５％の相同性を有することを示した。
【００６０】
【表８】
0006550144.tif 000010
【００６１】
〔ストレプトマイセスＨＳ７５２３と、公知のミルベマイシン産生菌との比較〕
ＵＳ３９５０３６０によって報告されているように、ミルベマイシン産生菌であるStreptomyces  ＮＲＲＬ  ＮＯ．５７３９については、ＩＳＰ２培地上のその空中の菌糸は灰色で、背面は黄褐色であり、コロニー表面には多くの黄色い涙があり、黄色の色素が産生され、ＩＳＰ４培地上のその空中の菌糸は灰色で、背面は黄土（カーキ）色であり、コロニー表面にはやはり多くの黄色い涙があり、明るいオリーブ緑色の色素が産生され、アラビノースとキシロースとが利用可能であった。一方、本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３については、ＩＳＰ２培地上のその空中の菌糸は白色で、背面はベージュ色であり、コロニー表面に涙は無く、色素は産生されず、ＩＳＰ４培地上のその空中の菌糸は白色で、背面は象牙色であり、コロニー表面に涙は無く、色素は産生されず、アラビノースとキシロースとは利用不可能であった。
【００６２】
ＣＮ１０１１００６５１Ａによって報告されているように、ミルベマイシン産生菌である、Gause氏Ｎｏ．１ 培地上のStreptomyces bingchengsis sp.nov  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７３４のコロニーの表面は灰色（黒色の吸水斑があった）で、コロニーの背面は黄灰色で、黄褐色の色素が産生された。一方、Gause氏Ｎｏ．１ 培地上の本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３のコロニーの表面は、中央部は白色で、周囲部はテレグレイ４であり、コロニーの背面はテレグレイ４で、色素は産生されなかった。
【００６３】
要約すれば、本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３は、Streptomyces属に属するが、公知のミルベマイシン産生菌であるStreptomyces  ＮＲＲＬ  ＮＯ．５７３９およびStreptomyces bingchengsis sp.nov  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７３４とは異なっている。ストレプトマイセスＨＳ７５２３は新しい菌種である。
【００６４】
本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３菌株のコロニーの形態と、Streptomyces milbemycinicus  ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．  ７６７７との比較図を図２に示す。
【００６５】
〔実施例５：  ミルベマイシンＡ３の製造〕
〔（１）  斜面上の菌糸の製造および培養〕
斜面胞子培地の処方（ｇ／Ｌ）：酵母エキス２、麦芽エキス２、スクロース８、脱脂粉乳１、寒天２０であり、消毒前のｐＨ７．０〜７．２、試験管３０×２００ｍｍ、充填体積２０ｍＬであり、１２１℃で２０分間滅菌した後、培地を５０〜６０℃に冷却し、斜面を形成した。その後、斜面に菌糸リングを接種した。２８±１℃の温度で１０日間培養した後、菌糸が成熟した。
【００６６】
〔（２）  種培地の製造および培養〕
種培地の処方（ｇ／Ｌ）：酵母エキス５、ペプトン５、スクロース２０、脱脂粉乳２、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５であり、消毒前のｐＨは７．０〜７．２であった。振盪フラスコの充填体積は２５０ｍＬであり、三角フラスコは３０ｍＬであった。種培地を１２１℃で２０分間滅菌した。菌の接種量は１０５〜１０６ｃ．ｆ．ｕ．／ｍＬであり、培養温度は２８±１℃であり、振盪機内にて４８時間、２５０ｒｐｍで振盪培養した。
【００６７】
〔（３）  ミルベマイシンＡ３発酵培地の製造および培養〕
発酵培地の処方（ｇ／Ｌ）：酵母エキス５、スクロース１２０、脱脂粉乳１０、大豆ケーキ粉末１０、綿実ケーキ粉末１４、Ｋ２ＨＰＯ４  １、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１、ＺｎＳＯ４  ０．０２、ＣａＣＯ３  ５、ＣｕＳＯ４  ０．０５、Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．５であった。振盪フラスコの充填体積は２５０ｍＬであり、三角フラスコは３０ｍＬであった。発酵培地を１２１℃で２０分間滅菌した。その後、１０％（体積百分率）の接種量で種培地を接種し、振盪機内にて温度２８±１℃、２５０ｒｐｍで１４日間振盪培養し、発酵後、発酵液をＨＰＬＣで測定した。
【００６８】
ミルベマイシンのＨＰＬＣ測定方法は以下の通りである：
０．５ｍｌの発酵培地に４．５ｍｌの７５％エタノールを加える。得られた混合物を均質に混合し、１５分間３０００ｒｐｍで遠心分離する。上澄み液を取って試料を注入する。
ＨＰＬＣカラム：Ｚｏｒｂｅｘ  ＲＸ−Ｃ８、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ
ＵＶ吸収波長：２４０ｎｍ
温度制御：２２℃
ＨＰＬＣ流動相条件は以下の通りであった。
【００６９】
【表９】
0006550144.tif 000011
【００７０】
注入量：１０μｌ。
【００７１】
同様の条件下での、ミルベマイシンＡ３の標準品およびミルベマイシンＡ４の標準品のＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示した（以下の実施例の発酵液のＨＰＬＣ測定は、すべて、ミルベマイシンＡ３の標準品およびミルベマイシンＡ４の標準品のＨＰＬＣ測定ステップを含んでいた）。
【００７２】
発酵液中でのＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示した。
【００７３】
同様の条件下での、目的産物のＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間をミルベマイシンＡ３の標準品およびミルベマイシンＡ４の標準品のＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間と比較することにより、発酵液の目的産物が、ミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４であることが確定された（以下の実施例の発酵液のＨＰＬＣクロマトグラムの比較によって、目的産物がミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４であることが確定された）。
【００７４】
発酵液中のミルベマイシンＡ４の含量は１２０６ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量は３１００ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７２％を占めた。
【００７５】
〔実施例６：  ミルベマイシンＡ３の製造〕
〔（１）  種タンクでの種培地の製造〕
種培地１０Ｌ（種培地の処方については実施例５を参照。同時に、泡を消す薬剤として０．２５％の消泡剤を添加した）を、１５Ｌの種タンクに投入した。１２１℃で３０分間、蒸気滅菌を行った。冷却後、２００ｍｌの振盪フラスコ種培地をその中に接種し、その後、温度２８±１℃、撹拌速度１５０ｒｐｍで、通気量１ｖｖｍにて、４８時間培養した。
【００７６】
〔（２）  発酵槽培地の製造および培養〕
発酵培地の処方は実施例５と同様であり、ただし、泡を消す薬剤として０．２５％の消泡剤の添加を要した。発酵槽の体積は５０Ｌであり、供給材料の体積は３５Ｌであった。消毒前の発酵培地のｐＨは７．２〜７．６であった。１２１℃で２５分間、蒸気滅菌を行った。冷却後、その中に約３．５Ｌの種タンク培地を接種し、温度２８±１℃で発酵させ、最低１５０ｒｐｍの撹拌速度で撹拌し、溶存酸素は３５％以上であった。通気量は０．６ｖｖｍであり、１４日間発酵培養し、その後、発酵槽を解放した。発酵後、実施例５に示すように発酵液をＨＰＬＣで測定した。発酵液においては、ミルベマイシンＡ４の含量は１２４６ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量は３０５０ｍｇ／Ｌであると測定され、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７１％を占めた。
【００７７】
発酵槽中でのミルベマイシンＡ３およびミルベマイシンＡ４の発酵曲線を図５に示した。
【００７８】
発酵液中でのミルベマイシンＡ３（Ｆ０７５−Ａ３）のＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示した。
【００７９】
〔実施例７：  ミルベマイシンＡ３の製造〕
〔（１）  種タンクでの種培地の製造〕
種培地８Ｔ（種培地の処方については実施例５を参照。同時に、泡を消す薬剤として０．２５％の消泡剤を添加した）を、１５Ｔの種タンクに投入した。１２１℃で３５分間、蒸気滅菌を行った。消毒後、培地の体積は１０Ｔであった。冷却後、２Ｌの振盪フラスコ種培地をその中に接種し、その後、温度２８±１℃、撹拌速度１００ｒｐｍで、通気量０．８ｖｖｍにて、４８時間培養した。
【００８０】
〔（２）  発酵槽培地の製造および培養〕
発酵培地の処方は実施例５と同様であり、ただし、泡を消す薬剤として０．２５％の消泡剤の添加を要した。発酵槽は７０Ｔであり、供給材料の体積は５５Ｔであった。消毒前のｐＨは７．２〜７．６であった。１２１℃で３５分間、蒸気滅菌を行った。冷却後、約６Ｔの種タンク培地をその中に接種し、温度２８±１℃で発酵させ、最低５０ｒｐｍの撹拌速度で撹拌し、溶存酸素は３５％以上であった。通気量は０．５ｖｖｍであり、１４日間発酵培養し、その後、発酵槽を解放した。発酵後、実施例５に示すように発酵液をＨＰＬＣで測定した。ミルベマイシンＡ４の含量は１４１３ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量は３３００ｍｇ／Ｌであると測定され、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７０％を占めた。
【００８１】
〔実施例８：  ミルベマイシンＡ３の製造〕
種培地の処方（ｇ／Ｌ）：酵母エキス５、ペプトン５、スクロース４０、脱脂粉乳２、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５であり、消毒前のｐＨは７．０〜７．４であった。振盪フラスコの充填体積は２５０ｍＬであり、三角フラスコは２５ｍＬであった。種培地を１２１℃で２０分間滅菌した。実施例５の斜面から１×２ｃｍの面積を有する菌塊片を掘り出して種瓶に接種し、２８±１℃で４５時間培養した。上記種培地の２．５ｍＬを発酵培地に接種した（ｇ／Ｌ）：酵母エキスペースト１０、糖蜜２００、脱脂粉乳１１、豆ケーキ粉末１１、綿実ケーキ粉末１１、Ｋ２ＨＰＯ４  １、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１、ＺｎＳＯ４  ０．０２、ＣａＣＯ３  ５、ＣｕＳＯ４  ０．０５、Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．５であった。振盪フラスコの充填体積は２５０ｍＬであり、三角フラスコは３０ｍＬであった。１２１℃で２０分間滅菌した。得られた混合物を、振盪機内にて温度２８±１℃、２５０ｒｐｍで１４日間振盪培養した。発酵後、実施例５に示すように発酵液をＨＰＬＣで測定した。発酵液中のミルベマイシンＡ４の含量は１０５４ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量は３０００ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７４％を占めた。
【００８２】
〔実施例９：  ミルベマイシンＡ３の製造〕
実施例８に沿って種培地を製造および培養し、その後、種培地の２．５ｍＬを発酵培地に接種した（ｇ／Ｌ）：ペプトン１０、スクロース１４０、コーンパルプ１０、大豆ケーキ粉末１０、グルテン粉末１５、Ｋ２ＨＰＯ４  １、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１、ＺｎＳＯ４  ０．０２、ＣａＣＯ３  ５、ＣｕＳＯ４  ０．０５、Ｎａ２ＭｏＯ４  ０．５であった。振盪フラスコの充填体積は２５０ｍＬであり、三角フラスコは３０ｍＬであった。１２１℃で２０分間滅菌した。得られた混合物を、振盪機内にて温度２８±１℃、２５０ｒｐｍで１４日間振盪培養した。発酵後、実施例５に示すように発酵液をＨＰＬＣで測定した。発酵液中のミルベマイシンＡ４の含量は１１４６ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量は３１００ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７３％を占めた。
【００８３】
〔比較例１：  ミルベマイシン産生についての、本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３と原始菌ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７との比較実験〕
（１）斜面、種、発酵培地、および培養条件は実施例５のものと同じであった。原始菌ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．７６７７を用いて、５組の平行発酵を行った。発酵後、実施例５に示すように発酵液をＨＰＬＣで測定した。ミルベマイシンＡ４の平均含量は７４８ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の平均含量は２５１ｍｇ／Ｌであると測定され、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の２５％を占めた。
【００８４】
（２）斜面、種、発酵培地、および培養条件は実施例５のものと同じであった。本発明のストレプトマイセスＨＳ７５２３を用いて、５組の平行発酵を行った。発酵後、発酵液をＨＰＬＣで測定した。ミルベマイシンＡ４の平均含量は１１１４ｍｇ／Ｌであり、ミルベマイシンＡ３の平均含量は３０１２ｍｇ／Ｌであると測定され、ミルベマイシンＡ３の含量が、Ａ３およびＡ４の総含量の７３％を占めた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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