(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法による核酸増幅の検査方法であって、
検出対象の試料と、
前記検出対象の試料のＤＮＡにおける第一の増幅対象領域を増幅するための第一のプライマーセットと、
同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを備えた第二のプライマーセットと、
内部標準用のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、前記第二のプライマーセットにより増幅される第二の増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列と相補的な塩基配列、もしくは、前記第二の増幅対象領域を増幅可能な前記同一の塩基配列と相同性を有する塩基配列と相補的な塩基配列、を挿入して得られた人工合成ＤＮＡと、を用いて、
前記第一のプライマーセットによって、前記第一の増幅対象領域における核酸を増幅させると共に、
前記第二のプライマーセットによって、前記第二の増幅対象領域における核酸を増幅させ、当該第二の増幅対象領域における核酸の増幅産物の有無にもとづいて、核酸増幅の成否を判定する
ことを特徴とする核酸増幅の検査方法。
【請求項２】
前記第二のプライマーセットとして、前記第一のプライマーセットにおけるいずれか一方のプライマーの塩基配列と、それぞれ同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを用いる
ことを特徴とする請求項１記載の核酸増幅の検査方法。
【請求項３】
同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを備えたプライマーセットと、
内部標準用のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、前記プライマーセットにより増幅される増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列と相補的な塩基配列、もしくは、前記増幅対象領域を増幅可能な前記同一の塩基配列と相同性を有する塩基配列と相補的な塩基配列、を挿入して得られた人工合成ＤＮＡと、を含むことを特徴とする核酸増幅の検査キット。
【請求項４】
前記同一の塩基配列が、検出対象の試料のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅するためのプライマーセットのいずれか一方の塩基配列と同一の塩基配列、もしくは、前記増幅対象領域を増幅可能な前記プライマーセットのいずれか一方の塩基配列と相同性を有する塩基配列、であることを特徴とする請求項３記載の核酸増幅の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の種類等を遺伝子配列にもとづき特定する遺伝子検査技術に関し、特に核酸増幅反応における非特異的な増幅を低減して、検査精度を高める核酸増幅方法、核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品検査や環境検査等において、食品や環境に存在する微生物などの生物の種類等を遺伝子配列にもとづき特定するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などの核酸増幅法を用いて、標的とする遺伝子におけるＤＮＡを増幅し、その増幅産物を検出して、生物の種類等を特定することが行われている。
ＰＣＲ法では、２種類の異なるプライマー、すなわちフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットが使用され、これらを起点として核酸合成酵素により塩基が繋ぎ合わされて、プライマーセットに特有の大きさの増幅産物が生成される。そして、増幅産物の大きさを電気泳動法などによって測定することにより、その増幅産物に対応する生物の種類等が特定される。
【０００３】
ところで、複数の増幅対象領域（増幅の標的とする遺伝子領域）を一つの反応液で同時に増幅させる場合、その増幅対象領域を増幅するために用いる複数種類のプライマーセットを反応液に添加する必要がある。しかしながら、核酸増幅反応においてプライマーの種類数が増加すると、非特異的な増幅産物の生じる可能性が高くなり、検査を正確に行えないケースが増加するという問題があった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−７５０５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、核酸増幅反応において非特異的な増幅産物が生じる可能性を低減する手法について鋭意研究し、１種類のみのプライマーを用いて、ＰＣＲを実現可能にすることに想到した。すなわち、従来のように、フォワードプライマーとリバースプライマーとして、２種類の異なる塩基配列からなるものを用いるのではなく、同一の塩基配列からなるものを用いてＰＣＲを行う方法について研究し、１種類のみのプライマーを用いてＰＣＲを行うことに成功した。これにより、ＰＣＲに用いるプライマーの種類数を低減することができ、非特異的な増幅産物が生じる可能性を低減することが可能となった。
【０００６】
ここで、フォワードプライマーとリバースプライマーとして同一の塩基配列からなるものを用いて増幅対象領域を増幅可能にするためには、標的とする遺伝子の二本鎖のそれぞれに、増幅対象領域を隔てて当該同一の塩基配列に対して相補的な塩基配列が存在している必要がある。しかしながら、検出対象生物の遺伝子において、このような塩基配列を見いだすことは、容易ではなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、このような構成を備えた人工合成ＤＮＡを製造した。そして、この人工合成ＤＮＡを試料として、１種類のみのプライマー（以下、人工合成ＤＮＡ検出用プライマー）を用いてＰＣＲを実行することにより、対象とする増幅産物を得ることに成功した。
【０００８】
また、このような人工合成ＤＮＡと人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを、試料検出のためのＰＣＲを行うに際して内部標準として利用することで、使用するプライマーの種類数を減らしつつ、ＰＣＲ自体が成功したか否かを確認可能にすることに成功した。
このようにＰＣＲ自体が成功したか否かを確認可能にすることで、陰性の結果がでた場合に、それがＰＣＲの失敗によるものではなく、試料が存在しなかったことによるものであることを確認することが可能となった。
【０００９】
また、人工合成ＤＮＡ検出用プライマーとして、試料を検出するためのプライマー（以下、試料検出用プライマー）セットの一方と同一の塩基配列からなるものを用いると共に、人工合成ＤＮＡとして、二本鎖のそれぞれに、増幅対象領域を隔てて人工合成ＤＮＡ検出用プライマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列を挿入したものを製造することもできる。
このような人工合成ＤＮＡと人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを内部標準として利用すれば、ＰＣＲに用いるプライマーの種類数をさらに減らしてＰＣＲ自体が成功したか否かを確認でき、非特異的な増幅産物が生じる可能性を一層低減することが可能となる。
【００１０】
ここで、特許文献１には、単一蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた核酸の検出法が開示されている。しかしながら、この文献には、フォワードプライマーとリバースプライマーとして、同一の塩基配列からなるものを用いてＰＣＲを行うことについては、記載も示唆もされていない。その他に、本発明と同一又は近い技術が開示された先行文献は、見あたらなかった。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、核酸増幅反応において、増幅対象領域を１種類のみのプライマーを用いて増幅することで、非特異的な増幅産物が生じる可能性を低減することが可能な核酸増幅方法、核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明の核酸増幅の成否判定方法は、ＰＣＲ法による核酸増幅の検査方法であって、検出対象の試料と、前記検出対象の試料のＤＮＡにおける第一の増幅対象領域を増幅するための第一のプライマーセットと、同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを備えた第二のプライマーセットと、内部標準用のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、前記第二のプライマーセットにより増幅される第二の増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列と相補的な塩基配列、もしくは、前記第二の増幅対象領域を増幅可能な前記同一の塩基配列と相同性を有する塩基配列と相補的な塩基配列、を挿入して得られた人工合成ＤＮＡと、を用いて、前記第一のプライマーセットによって、前記第一の増幅対象領域における核酸を増幅させると共に、前記第二のプライマーセットによって、前記第二の増幅対象領域における核酸を増幅させ、当該第二の増幅対象領域における核酸の増幅産物の有無にもとづいて、核酸増幅の成否を判定する方法としてある。
【００１４】
さらに、本発明の核酸増幅の検査キットは、同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを備えたプライマーセットと、内部標準用のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、前記プライマーセットにより増幅される増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列と相補的な塩基配列、もしくは、前記増幅対象領域を増幅可能な前記同一の塩基配列と相同性を有する塩基配列と相補的な塩基配列、を挿入して得られた人工合成ＤＮＡと、を含む構成としてある。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、核酸増幅反応において、増幅対象領域を１種類のみのプライマーを用いて増幅することで、非特異的な増幅産物が生じる可能性を低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試料のＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡのそれぞれの増幅反応の結果と、ＰＣＲの成否及び試料の存否との関係を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る核酸増幅方法、核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットの実施例で用いられた人工合成ＤＮＡ、人工合成ＤＮＡ検出用プライマー、及び試料検出用プライマーの塩基配列を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る核酸増幅方法の実施例１における人工合成ＤＮＡの増幅産物の検出結果を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットの実施例２における試料のＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡの増幅産物の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態に係る核酸増幅方法、核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットについて、詳細に説明する。
本実施形態に係る核酸増幅方法は、ＰＣＲ法による核酸増幅方法であって、プライマーセットとして同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを用いると共に、核酸増幅対象の試料として、試料のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、プライマーセットの増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列もしくは前記増幅対象領域を増幅可能な相同性を有する塩基配列が存在するものを用いて、１種類のプライマーで増幅対象領域における核酸を増幅させることを特徴とする。
本明細書及び図面において、塩基配列は、５’末端から３’末端方向に把握するものとする。
【００１８】
ＰＣＲ法では、検出対象の試料のＤＮＡと、そのＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるための２種類のプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）からなるプライマーセットと、核酸合成酵素と、核酸合成基質（Ｇ，Ｃ，Ａ，Ｔ）等を含むＰＣＲ反応液を用いて、核酸の増幅が行われる。
このようなフォワードプライマーとリバースプライマーとしては、検出対象の試料のＤＮＡにおける増幅対象領域を特異的に増幅可能なものが設計されるため、通常は互いに異なる塩基配列からなり、一般にＰＣＲには検出対象の試料ごとに２種類のプライマーが必要であると考えられている。
【００１９】
一方、ＰＣＲにおいて使用するプライマーの種類が増えるほど、非特異的な増幅が生じるリスクが高くなることから、本発明者らは、そのリスクを低減するために、これまでの常識に反する同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを用いることを案出した。また、このような１種類のプライマーを用いてＰＣＲを実行可能にするため、あるＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、増幅対象領域を隔ててその１種類のプライマーの塩基配列に対して相補的な塩基配列を挿入して、人工合成ＤＮＡを製造した。そして、この１種類のみのプライマーを用いて、人工合成ＤＮＡの増幅対象領域における核酸を増幅させることに成功した。
【００２０】
さらに、このような人工合成ＤＮＡと人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを、試料を検出するにあたってのＰＣＲの成否を確認するための内部標準として利用することが好ましい。
すなわち、本実施形態に係る核酸増幅の成否判定方法は、ＰＣＲ法による核酸増幅の検査方法であって、検出対象の試料と、検出対象の試料のＤＮＡにおける第一の増幅対象領域を増幅するための第一のプライマーセットと、同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを備えた第二のプライマーセットと、内部標準用のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、第二のプライマーセットにより増幅される第二の増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列もしくは前記第二の増幅対象領域を増幅可能な相同性を有する塩基配列を挿入して得られた人工合成ＤＮＡとを用いて、第一のプライマーセットによって、第一の増幅対象領域における核酸を増幅させると共に、第二のプライマーセットによって、第二の増幅対象領域における核酸を増幅させ、当該第二の増幅対象領域における核酸の増幅産物の有無にもとづいて、核酸増幅の成否を判定することを特徴とする。
【００２１】
ここで、図１を参照して、試料のＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡの増幅反応の結果と、ＰＣＲの成否及び試料の存否との関係について説明する。
同図の左側には、試料のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるための２種類のプライマーからなる試料検出用プライマーと、人工合成ＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅させるための１種類のプライマーからなる人工合成ＤＮＡ検出用プライマーとを含むＰＣＲ反応液を用いて、それぞれの増幅対象領域を１つのＰＣＲ反応液で同時に増幅させる場合の増幅反応の結果を示している。
【００２２】
図１に示すように、増幅反応の結果には、（１）試料のＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡの両方の増幅産物が得られる場合と、（２）試料のＤＮＡの増幅産物が得られ、人工合成ＤＮＡの増幅産物が得られない場合と、（３）試料のＤＮＡの増幅産物が得られず、人工合成ＤＮＡの増幅産物が得られる場合と、（４）試料のＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡの両方の増幅産物が得られない場合の４通りのパターンが存在する。
【００２３】
（１）の場合は、試料のＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡの両方の増幅産物が得られていることから、ＰＣＲが成功したことが確認できると共に、ＰＣＲ反応液中に試料が存在していることが確認できる。
【００２４】
（２）の場合は、試料のＤＮＡの増幅産物が得られていることから、ＰＣＲが成功したことが確認できる。また、ＰＣＲ反応液中に試料が存在していることが確認できる。人工合成ＤＮＡの増幅産物は得られていないが、これは、例えばＰＣＲ反応液に人工合成ＤＮＡ又は人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを入れ忘れた場合など、生じる可能性が小さいケースである。
【００２５】
（３）の場合は、人工合成ＤＮＡの増幅産物が得られていることから、ＰＣＲが成功したことが確認できる。また、試料のＤＮＡの増幅産物が得られていないことから、ＰＣＲ反応液中に試料が存在していないことが確認できる。これにより、試料のＤＮＡの増幅産物が得られていない理由が、ＰＣＲの失敗にもとづく偽陰性反応によるものではなく、ＰＣＲ反応液中に試料が存在していないことによるものであることを確認することが可能となる。
【００２６】
（４）の場合は、試料のＤＮＡと人工合成ＤＮＡの両方の増幅産物が得られていないことから、ＰＣＲが失敗した可能性の高いことが推定される。したがって、ＰＣＲ反応液中における試料の存否は不明であり、再度試験を行う必要があることを確認できる。
【００２７】
本実施形態に係る核酸増幅の成否判定方法によれば、このように人工合成ＤＮＡと人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを内部標準として用いて、ＰＣＲの成否を確認することができる。このため、非特異的な増幅産物が生じる可能性を低減しつつ、ＰＣＲの成否を確認でき、ＰＣＲの検査精度を向上させることが可能になっている。
【００２８】
また、本実施形態に係る核酸増幅の検査キットは、同一の塩基配列からなるフォワードプライマーとリバースプライマーを備えたプライマーセットと、内部標準用のＤＮＡの二本鎖のそれぞれに、プライマーセットにより増幅される増幅対象領域を隔てて前記同一の塩基配列もしくは前記増幅対象領域を増幅可能な相同性を有する塩基配列を挿入して得られた人工合成ＤＮＡとを含むことを特徴とする。
すなわち、このような核酸増幅の検査キットを用いることによって、非特異的な増幅産物が生じる可能性を低減しつつ、ＰＣＲの成否を確認可能なＰＣＲ反応液を作成することが可能となる。
【００２９】
本実施形態に係る核酸増幅方法、核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットを用いるにあたり、試料からＤＮＡを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。
まず、検出対象の微生物などが培養された培養液等を回収し、遠心分離を行う。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿にリゾチーム溶液を加えて、溶菌処理を行う。さらに、カラム精製を行って、ＤＮＡ抽出液を得ることができる。そして、このＤＮＡ抽出液を、ＰＣＲで使用する試料とすることができる。
【００３０】
ＰＣＲ反応液としては、試料のＤＮＡ、プライマーセット、核酸合成基質、核酸合成酵素、緩衝液、及び残りの成分として水を含むものなどを好適に使用することができる。
ＰＣＲ反応を行う装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
【００３１】
ＰＣＲの反応条件としては、例えば以下の通りに行うことができる。
（ａ）９４℃  ２分、（ｂ）９４℃（ＤＮＡ変性工程）  ３０秒、（ｃ）６３℃（アニーリング工程）  ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程）  ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル）、（ｅ）７２℃  ３分
【００３２】
また、本実施形態及び後述する実施例において、人工合成ＤＮＡ及び各プライマーは、それぞれの塩基配列そのものに限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
【００３３】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、各塩基配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、各塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００３４】
以上説明した通り、本実施形態に係る核酸増幅方法、核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットによれば、増幅対象の試料のＤＮＡと１種類のみのプライマーを用いてＰＣＲを実行して、増幅産物を得ることができる。
また、このようにして増幅可能な人工合成ＤＮＡと人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを内部標準として利用することで、試料検出のためのＰＣＲを行うに際し、使用するプライマーの種類数を少なくしつつ、ＰＣＲ自体が成功したか否かを確認することが可能になる。
【００３５】
さらに、人工合成ＤＮＡ検出用プライマーとして、試料検出用プライマーセットの一方と同一の塩基配列からなるものを用いることも好ましい。このような人工合成ＤＮＡ検出用プライマーとこれにより増幅可能な人工合成ＤＮＡを内部標準とすることによって、ＰＣＲに用いるプライマーの種類数を減らすことができ、非特異的な増幅産物が生じる可能性を一層低減することが可能である。
【実施例】
【００３６】
（試験１）
本実施形態の核酸増幅方法を用いて、１種類のみのプライマーを用いて、増幅対象の試料のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅できるかを確認するための検証試験を行った。
増幅対象の試料のＤＮＡとしては、図２の配列番号１に示す塩基配列及びその相補配列からなる二本鎖の人工合成ＤＮＡを、１０＾７ｃｏｐｙ／μｌで使用した。また、その増幅対象領域を増幅するためのプライマーとして、図２の配列番号２に示す塩基配列からなる人工合成ＤＮＡ検出用プライマーを使用した。これらは、ライフテクノロジージャパン株式会社より合成した。
【００３７】
ＰＣＲ反応液としては、以下の組成のものを使用した。人工合成ＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡ検出用プライマー以外は、タカラバイオ株式会社製である。なお、以下の組成において、人工合成ＤＮＡ検出用プライマー以外のプライマーは、試験２のためのものであるが、試験１のＰＣＲ反応液でもこれらを含むものを使用した。
【００３８】
・緩衝液  10×Ex  Taq  buffer(20mM  Mg  2＋  plus)  5.0μl
・核酸合成基質  dNTP  Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)  4.0μl
・16SrRNA検出用フォワードプライマー(10μM)  1.25μl
・16SrRNA検出用リバースプライマー  (10μM)  1.5μl
・rpo検出用フォワードプライマー(10μM)  0.2μl
・rpo検出用リバースプライマー  (10μM)  0.3μl
・人工合成ＤＮＡ検出用プライマー  (10μM)  0.4μl
・核酸合成酵素  EX  Taq  Hot  Start  Version  (5U/μl)  0.25μl
・人工合成ＤＮＡ  2.5μl
・滅菌水  34.6μl
（全量  50μl）
【００３９】
ＰＣＲ法による核酸の増幅には、ｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社製）を使用した。また、ＰＣＲの反応条件は、実施形態で説明したものと同一の次の条件で行った。
（ａ）９４℃  ２分
（ｂ）９４℃  ３０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（ｃ）６３℃  ３０秒（アニーリング工程）
（ｄ）７２℃  ６０秒（ＤＮＡ合成工程）
（ｅ）７２℃  ３分
（ｂ）〜（ｄ）を３５サイクル
【００４０】
次に、ＰＣＲ法による増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認した。電気泳動は、ＭｕｌｔｉＮＡ（Ｒ）(株式会社島津製作所製)を用いて行った。その結果を図３に示す。
同図において、人工合成ＤＮＡの増幅産物を示す５７８ｂｐ付近にバンドが示された。
したがって、本実施形態の核酸増幅方法を用いて、１種類のみのプライマーを用いて、増幅対象の試料のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅できることが確認された。
【００４１】
（試験２）
本実施形態の核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットを用いて、検出対象の試料のＤＮＡと人工合成ＤＮＡにおける各増幅対象領域を一つの反応液を用いて同時に増幅させ、その増幅産物の有無を確認するための検証試験を行った。
【００４２】
人工合成ＤＮＡとしては、試験１と同じものを１０＾４ｃｏｐｙ／μｌで使用した。また、人工合成ＤＮＡ検出用プライマーも試験１と同じものを使用した。
検出対象の試料としては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）  ＮＢＲＣ１５８９１を、１０ｎｇ／μｌ（菌数換算で１０＾８〜１０＾９程度）で使用した。
【００４３】
試料からのＤＮＡの抽出は、次のようにして行った。
まず、５０００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。
【００４４】
検出対象の試料のＤＮＡにおける増幅対象領域を増幅するためのプライマーとしては、図２の配列番号３〜６に示す塩基配列からなるものを使用した。配列番号３と４のプライマーは、それぞれ１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーであり、配列番号５と６のプライマーは、それぞれＲＮＡポリメラーゼ（ｒｐｏ）遺伝子領域を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーである。
【００４５】
ＰＣＲ反応液としては、以下の組成のものを使用した。人工合成ＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡ検出用プライマー以外は、タカラバイオ株式会社製である。
・緩衝液  10×Ex  Taq  buffer(20mM  Mg  2＋  plus)  5.0μl
・核酸合成基質  dNTP  Mixture(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)  4.0μl
・16SrRNA検出用フォワードプライマー(10μM)  1.25μl
・16SrRNA検出用リバースプライマー  (10μM)  1.5μl
・rpo検出用フォワードプライマー(10μM)  0.2μl
・rpo検出用リバースプライマー  (10μM)  0.3μl
・人工合成ＤＮＡ検出用プライマー  (10μM)  0.4μl
・核酸合成酵素  EX  Taq  Hot  Start  Version  (5U/μl)  0.25μl
・人工合成ＤＮＡ  2.5μl
・検出対象の試料のＤＮＡ  2.5μl
・滅菌水  32.1μl
（全量  50μl）
【００４６】
ＰＣＲ法による核酸の増幅は、試験１と同様に行った。また、ＰＣＲ法による増幅産物を、試験１と同様にアガロースゲル電気泳動により泳動させ、人工合成ＤＮＡ及び検出対象の試料のＤＮＡのそれぞれについて、正しい増幅産物が得られているかを確認した。その結果を図４に示す。
【００４７】
図４において、人工合成ＤＮＡの増幅産物を示す５７８ｂｐ付近にバンドが示されると共に、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の増幅産物を示す５０５ｂｐ付近にバンドが示され、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍのｒｐｏ遺伝子領域の増幅産物を示す２６６ｂｐ付近にバンドが示された。
したがって、本実施形態の核酸増幅の成否判定方法、及び核酸増幅の検査キットを用いて、検出対象の試料のＤＮＡと人工合成ＤＮＡにおける各増幅対象領域を同時に増幅させて、増幅産物が得られることが確認された。
【００４８】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、人工合成ＤＮＡ及び人工合成ＤＮＡ検出用プライマーの塩基配列は、これらに限定されず、１種類のみのプライマーを用いて増幅対象領域を増幅できるものであれば良い。また、検出対象の試料として、複数種類の生物のＤＮＡを用いるなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、内部標準を使用してＰＣＲを行う場合などに、好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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