(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれの変異標的配列について、１／１０３〜１／１０５の密接に関連した野生型標的配列のコピーに対する変異標的配列のコピーの比率で、多量のコピーの密接に関連した野生型標的配列を含む混合物において、１以上の希少な変異標的配列のそれぞれの少なくとも１０コピーを検出するための増幅・検出方法であって、
（ａ）混合物について、プライマー依存性増幅反応のプライマーアニーリング、プライマー伸長、およびらせん変性の熱サイクルを繰り返し行い、
前記混合物が、前記変異標的配列及びそれと密接に関連した野生型標的配列の両方、ＤＮＡポリメラーゼ、増幅に必要な他の試薬、およびそれぞれの変異標的配列についての複数部位プライマーを含むプライマー対を含み、
前記複数部位プライマーが、５’から３’方向に、以下の３つの隣接するＤＮＡ配列：前記変異標的配列およびそれと密接に関連した野生型標的配列と、プライマーアニーリングの間ハイブリダイズするアンカー配列；
前記変異標的配列およびそれと密接に関連した野生型標的配列のいずれともプライマーアニーリングの間ハイブリダイズしないブリッジ配列；および
５〜８のヌクレオチド長であり、前記変異標的配列と完全に相補的であり、その野生型配列と１もしくは２ヌクレオチドだけミスマッチであるフット配列；を含み、
（ｉ）  前記プライマーのブリッジ配列とプライマーアニーリングの間ハイブリダイズしない介在配列が前記変異標的配列および野生型標的配列にあり、前記プライマーの前記アンカー配列および前記フット配列が前記変異標的配列またはそれと密接に関連した野生型標的配列のいずれかとハイブリダイズすると、前記ブリッジ配列および前記介在配列がともにハイブリッド中に２８〜５２のヌクレオチドの外周を有するバブルを形成し、前記ブリッジ配列および前記介在配列が少なくとも８ヌクレオチド長であり、
（ｉｉ）  前記１以上の希少な変異標的配列の１０６コピー、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、増幅バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、増幅バッファー、ＳＹＢＲグリーン検出試薬および前記複数部位プライマーを含むプライマー対を含む混合物の増幅の閾値サイクル（ＣＴ）が、前記複数部位プライマーの代わりに前記アンカーのみからなるプライマーを用いた同じ増幅反応のＣＴと比較して、少なくとも２サイクルの遅れによって証明されるように、変異標的配列の複数部位プライマーの伸長による合成の開始が非効率であり、
（ｉｉｉ）  前記ブリッジ配列および前記フット配列はともに、前記変異標的配列およびそれと密接に関連した野生型標的配列以外の前記混合物における配列をプライムせず、ならびに
（ｉｖ）  複数部位プライマー／野生型標的配列ハイブリッドについて熱サイクルを行う間に伸長される可能性は、複数部位プライマー／変異標的配列ハイブリッドについて熱サイクルを行う間に伸長される可能性よりも、少なくとも１３．３サイクルのΔＣＴで証明されるように、少なくとも１０，０００倍低い；ならびに、
（ｂ）増幅された生成物を二重ストランドＤＮＡ結合染料により検出すること、またはそれぞれの複数部位プライマーについて前記プライマーの前記増幅された生成物とのハイブリダイゼーションを信号で伝える蛍光性ハイブリダイゼーションプローブ、またはそれぞれの複数部位プライマーについて前記プライマーの増幅された生成物に組み込まれた場合もしくはハイブリダイズした場合にのみ蛍光を発する前記プライマーの５’−末端で消光され蛍光標識されたオリゴヌクレオチドヘアピン構造、を検出することを含む、増幅・検出方法。
【請求項２】
それぞれの複数部位プライマーの前記フット配列がその野生型標的配列とミスマッチであるのは、前記プライマーの３’ヌクレオチドと３’末端から２番目のヌクレオチドとのいずれか、またはその両方においてである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の特徴の１つ以上を有する、請求項１または２に記載の方法：
前記少なくともひとつの変異標的配列が、ｃＤＮＡである；
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、検出がリアルタイム検出である。
【請求項４】
前記少なくとも１つの複数部位プライマーのそれぞれについて、前記ＣＴの遅れが少なくとも５サイクルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ反応は、複数部位プライマーが過剰なプライマーである非対称増幅方法である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記変異標的配列が、ひとつの変異標的配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
以下の特徴の１つ以上を有する、請求項６に記載の方法：
前記変異標的配列についての前記複数部位プライマーが有する前記フット配列が、６〜７のヌクレオチド長である；
前記バブルの外周が、２８〜４４のヌクレオチド長である；
増幅された生成物の検出がＳＹＢＲ（登録商標）グリーンまたは他の二重ストランドＤＮＡ結合染料を検出試薬として用いるものであり、且つ前記増幅反応が対称ＰＣＲ反応である。
【請求項８】
前記希少な変異標的配列が、均一な配列を共有しておらずゲノム内の異なる位置に位置している少なくとも２つの変異標的配列を含み、
それぞれの変異標的配列について複数部位プライマーおよびリバースプライマーがあり、ならびに、
それぞれの複数部位プライマーから増幅された生成物が、その増幅された生成物のストランドのいずれかの特異的な配列にハイブリダイズすると信号を送る特異的に着色された二重標識蛍光プローブによって別々に検出される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＣＲ反応が、非対称ＰＣＲ反応である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
初期混合物が１０６コピーのそれぞれの変異標的配列を含むアッセイの前記閾値サイクル（ＣＴ）が、初期混合物が１０６コピーのそれと密接に関連した野生型標的配列を含むアッセイの前記ＣＴより、少なくとも１８サイクル早い、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくともひとつの変異標的配列が、同じコドンでの１または２の単一ヌクレオチド多型によって相互に異なる少なくとも２つの変異標的配列を含み、
前記少なくとも２つの変異配列のそれぞれについての複数部位フォワードプライマー、および共通のリバースプライマーがあり、
前記プライマー依存性増幅反応は前記共通のリバースプライマーが各複数部位プライマーに対して過剰である非対称増幅方法であり、
それぞれの複数部位プライマーはクロスハイブリダイゼーションを抑制させるのに十分に明確な異なるブリッジ配列を有し、
それぞれの複数部位プライマーが前記目的とする標的にハイブリダイズするときに形成される前記バブルが、２８〜４４のヌクレオチドの長さであり、且つ前記介在配列よりも前記ブリッジ配列が長いことで非対称であり、ならびに、
それぞれの複数部位プライマーから増幅された生成物が別々に検出される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の特徴の１つ以上を有する、請求項１１に記載の方法：
それぞれの前記複数部位プライマーの前記ブリッジ配列が、少なくとも１８ヌクレオチド長である；および
それぞれの複数部位プライマーから増幅された生成物の検出が、その増幅された生成物のいずれかのストランドに結合すると信号を送る特異的に着色された二重標識蛍光プローブによってされる。
【請求項１３】
それぞれの複数部位プライマーが、５’後尾部として単位複製配列のキャプチャーまたは単位複製配列の検出のための機能性部位を含み、前記機能性部位は前記変異標的配列または前記野生型標的配列のいずれともハイブリダイズしない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の増幅および検出を実施するための試薬を含み、前記試薬は、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の、前記デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、前記増幅バッファー、前記ＤＮＡポリメラーゼおよび各変異標的配列に関して前記複数部位プライマーを含むプライマー対を含む、試薬キット。
【請求項１５】
以下の１つ以上を含む、請求項１４に記載のキット：
（Ａ）  少なくとも２つの複数部位プライマー、およびその増幅された生成物のいずれかのストランドに結合すると信号を送るそれぞれの複数部位プライマーの増幅された生成物についての特異的な二重標識蛍光プローブ；ならびに、
（Ｂ）  同じコドンでの１または２の単一ヌクレオチド多型によって相互に異なる少なくとも２つの変異標的配列の、それぞれについての複数部位プライマー、および前記複数部位プライマーについての共通のリバースプライマー、ただし、前記プライマー依存性増幅反応は前記共通のリバースプライマーが各複数部位プライマーに対して過剰である非対称増幅方法であり、それぞれの複数部位プライマーはクロスハイブリダイゼーションを抑制させるのに十分に明確な異なるブリッジ配列を有し、ならびに、それぞれの複数部位プライマーがその目的とする標的配列にハイブリダイズするときに形成される前記バブルが、２８〜４４のヌクレオチドの長さであり、且つ前記介在配列よりも前記ブリッジ配列が長いことで非対称である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２０１３年２月７日に出願された米国仮出願番号６１／７６２１１７の優先権を主張する。この出願の内容は、参照により全体に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、本発明は、プライマー依存性増幅反応、特にＰＣＲのようなＤＮＡ増幅反応、プライマー、反応混合物、ならびにそのような反応およびそれに適用する分析における試薬キットに関する。
【０００３】
発明の背景
プライマー依存性増幅反応、これは増幅生成物（「単位複製配列」）の検出も含みうるが、「特異性」を必要とする。すなわち、核酸らせん構造における目的とする場所へのプライマーのアニーリングおよび目的とする標的配列のみに結合したプライマーの伸長である。従来、特異性は、増幅反応条件下において、主にプライマーアニーリング工程の間、核酸ストランド内でプライマーがただひとつの場所に進むことができるように、十分な長さのプライマーを作ることにより得られる。
【０００４】
ある増幅反応では、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のような対立遺伝子多型間または対立遺伝子多型内で識別することが目的とされる。これを行うひとつの方法としては、すべての変異型を増幅し、それらの間またはそれら内で対立遺伝子特異性ハイブリダイゼーションプローブにより識別することである。このようなアプローチにおいて、プライマー増幅は、すべての変異型に対して等しく相補的に行われ、対立遺伝子多型間または対立遺伝子多型内で変化する配列を含む地域を増幅することができ、プローブは増幅された生成物または配列の中に存在する対立遺伝子を識別する。例えば、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：４９−５３を参照。検討対象の配列が他の対立遺伝子と混ざって存在しているＳＮＰのような対立遺伝子（例えば、野生型（ＷＴ）変異）である場合、プローブを用いて区別しようとすると、希少な（rare）対立遺伝子の増幅を圧倒する一般的な対立遺伝子の増幅の傾向により、約３％（代替の対立遺伝子（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ａｌｌｅｌｅ）の１，０００，０００分子の存在下で約３０，０００以上の標的対立遺伝子分子）という実用上の検出限界が存在する。
【０００５】
対立遺伝子間または対立遺伝子中で識別するための他の方法としては、検討対象の配列に選択的なプライマーを用いることである。このようなアプローチにおいては、プライマーは、対立遺伝子間または対立遺伝子中で変化する配列に相補的となり、増幅生成物は、標識されたプライマー、ＤＮＡ結合染料、または標識されたプローブとしていずれか検出されうる（このような場合、プローブはすべての対立遺伝子の単位複製配列に共通した配列を検出する）。特異性の高いプライマーは、一般的に１５−３０のヌクレオチド長を有する。このような従来のプライマーは、他の対立遺伝子と比較してひとつの対立遺伝子に対する非常に限られた選択性を有する。プライマーを短くすることは、その選択性を改善することであることが知られている。しかしながら、この改善は、特異性を犠牲とするものであり、短いプライマーは一般的なアニーリング温度でそれらの標的配列と安定なハイブリッドを形成しにくいために、プライマーを短くすることは、対立遺伝子の混合物の分析において価値が限られている。
【０００６】
プライマーの他の修飾は、特異性を保持しながらそれらの選択性を改善するために開発されてきた。そのようなアプローチのひとつとしてＡＲＭＳ（対立遺伝子特異的増幅変異検出システム）（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）がある。ＡＲＭＳプライマーは、検討対象の配列変異（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）に相補的であり、他の対立遺伝子または対立遺伝子にはミスマッチな３’−末端ヌクレオチドを有する。Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６；  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５１  ：２５１−２６２を参照。ＡＲＭＳは、あるＤＮＡポリメラーゼの反応しにくい性質（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｎａｔｕｒｅ）、すなわち、そのようなミスマッチを有するプライマー−標的ハイブリッドが伸長しない傾向に依存している。ＡＲＭＳは接合性（ホモ接合性ＷＴ、ヘテロ接合性またはホモ接合性変異（ＭＵＴ））を測定するのに有効であることが示されているが、他の用途における実用上の検出限界は約１％（代替の対立遺伝子（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ａｌｌｅｌｅ）の１，０００，０００分子の存在下で約１０，０００以上の標的対立遺伝子分子）である。
【０００７】
他のアプローチは、その選択性を増加させるために、プライマーをヘアピン構造に作製することである。Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐａｔｅｎｔ  ＥＰ  １  １８５  ５４６  （２００８）（当該文献は、検討対象の配列に相補的であり、他の対立遺伝子または対立遺伝子にはミスマッチなヘアピン構造のループを作製することを開示している）；およびＨａｚｂｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｌａｎｄ  （２００４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２：  １２３６−１２４２（当該文献は、ＡＲＭＳのように、検討対象の配列変化に相補的であり、他の対立遺伝子または対立遺伝子にはミスマッチなヘアピン構造プライマーの３’アームの末端ヌクレオチドを作製することを開示している）を参照。これらの修飾は、実用的な検出限界が約１％（代替の対立遺伝子（alternate allele）の１，０００，０００分子の存在下で約１０，０００以上の標的対立遺伝子分子以上）である。
【０００８】
韓国ソウルのＳｅｅｇｅｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅのＪｏｎｇ−Ｙｏｏｎ  Ｃｈｕｎおよび彼の同僚が、「ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ）」と称されるプライマーの型を考案した。Ｃｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５  （６）  ｅ４０；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １４９：７６−８４；  Ｈｏｒｉｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４９：４６−５２；  ＷＯ  ２００６／０９５９８１  Ａ１；  および  ＷＯ  ２００７／０９７５８２  Ａ１を参照。ＤＰＯプライマーは、３つのセグメントからなる；例えば、２０−２５のヌクレオチド長のような、長い５’高温セグメント、５つのデオキシリボイノシン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｉｎｏｓｉｎｅｓ）である中央分離セグメント、および目的とする標的細胞と相補的であり他の標的配列とはミスマッチである、通常８−１２のヌクレオチド長の３’プライミングセグメント。標的配列は、すべての３つのセグメントと相補的であるが、３’セグメントのＴｍは、その長さがより短いために５’セグメントのＴｍよりも低く、分離セグメントは５つのデオキシリボイノシンにより最も低いＴｍを有する。ＤＰＯプライマーは、５’セグメントおよび３’セグメントの両方が標的ストランドにハイブリダイズする場合に限り、増幅が生じるように設計されている。Ｃｈｕｎ等（２００７）によれば、分離セグメントは５つのデオキシリボイノシンとするために選択される。なぜなら、３−４および６−８デオキシリボイノシンは良好な結果が得られないためである；３’セグメントはＧＣ含量が４０−８０％となるように配置され、５’セグメントは、３’−ＲＡＣＥ増幅に用いるために、そのＴｍがアニーリング温度を超えて十分に上昇する長さに提供される（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３５（６）  ｅ４０  ａｔ  ｐａｇｅ  ２）。Ｃｈｕｎ等は、ＤＰＯプライマーの２つの対を用いて、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子におけるＳＮＰ（Ｇ→Ａ変異）の遺伝子型決定（ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性またはホモ接合性変異）の成功を報告している。４つのＤＰＯプライマーのうち、ひとつは３’セグメント１２−ヌクレオチド長を有し、完全に両方の対立遺伝子に相補的である；ひとつは、３’セグメント９−ヌクレオチド長を有し、完全に両方の対立遺伝子に相補的である；および２つは、中間、すなわち、３’末端から４番目のヌクレオチド位置に位置した可変ヌクレオチド（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とともに、３’セグメント８−ヌクレオチド長を有する。遺伝子型決定はゲル電気泳動により実施された。
【０００９】
非常に多量の（ａｂｕｎｄａｎｔ）第２の対立遺伝子の存在下において、非常に希少な（ｒａｒｅ）第１の対立遺伝子を検出することが望まれている状況がある。これは、「感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）」と称されている。言い換えると、プライマーは、「特異性」（ゲノムにおいて正しい位置に行く）であり、「選択的」（多量の野生型または標的配列に類似の他の配列を拒絶する）である必要があるだけでなく、高く選択的である必要がある。すなわち、多量の野生型または他の多量の第２の配列の存在下において、非常に希少な変異または他の希少な第１の配列を検出するのに十分な感受性である必要がある。Ｍａｋａｒｏｖ  ａｎｄ  Ｃｈｕｐｒｅｔａ  国際特許出願  ＷＯ  ２０１２／１１２５８２  Ａ２  段落［０００４］を参照。
【００１０】
特異性および選択性を維持しながら感受性を改善するために、Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｍａｋａｒｏｖおよび彼の同僚等は、Ｓｗｉｆｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  Ｍｉｃｈｉｇａｎ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）において、ｍｙＴＭ（登録商標）プライマーとして商品化されている「不連続ヌクレオチド（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）［「プライマー」］設計」（ＷＯ  ２０１２／１１２５８２  Ａ２  段落［００５１］）が開示されている。このようなプライマーは、２つのオリゴヌクレオチドからなる従来の長いプライマー（ｌｏｎｇ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ）としてみなされ、８−ヌクレオチド３’プライミング配列を作製することができ；５’末端および他のオリゴヌクレオチドの３’末端に相補的な後尾部（ｔａｉｌｓ）を添加して、高温ステム（ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｅｍ）を形成する。ステムを通して、２つのオリゴヌクレオチドが非共有で結合し、標的配列と配列して安定な３方向の接合点（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成する。８−ヌクレオチド３’末端を有するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｉｇｈｔ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ３’  ｅｎｄ）は、「プライマー」と称され、他のオリゴヌクレオチドは、「定着剤」（ｆｉｘｅｒ）と称される。定着剤の機能は、特異性を提供する、すなわち、ゲノム中の目的とする場所にプライマーを結合することである。それは適切な長さであり、一般的には約３０ヌクレオチド長である。後尾部の機能は、増幅条件下でふたつのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることであり、よって後尾部もまた、適切な長さで、２０−２５のヌクレオチド長のステムを形成する。８−ヌクレオチド３’領域の機能は、選択的にプライムすることである。不連続なハイブリダイゼーションは、この領域が８塩基と同じくらい小さい場合であってもプライマーオリゴヌクレオチドの［プライミング］領域間の結合を実質的に安定化し、よって、ＰＣＲの効率が増加した（ＷＯ  ２０１２／１１２５８２  Ａ２）。さらなる改善が、ＷＯ  ２０１２／１１２５８２  Ａ２の実施例９−１１に開示されている。野生型標的にミスマッチなヌクレオチドが、ＡＲＭＳのように、３’−末端ヌクレオチドに作製され；第３のオリゴヌクレオチド、５’−末端ヌクレオチドがプライマーの３’−末端ヌクレオチドと重複し、野生型標的と相補的であるブロッキングヌクレオチド（「ブロッカー」）が増幅領域に含まれ；プライマーの３’−末端ヌクレオチドがｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（「ＬＮＡ」）で作製される。Ｋ−ｒａｓおよびＢ−ｒａｆ遺伝子中の単一ヌクレオチド多型の検出については、１４，０００の野生型における１つの変異の検出感度（約０．０１％）が開示された。
【００１１】
検出するための能力、および好ましくは希少な第１の標的配列の数を定量するための能力、例えば、第１の標的配列とは異なる非常に多数の第２の標的配列（単一ヌクレオチドと同じくらい小ささの、例えば、野生型配列）の存在下における変異標的配列の数を定量するための能力を有する単一オリゴヌクレオチドプライマーへの需要がある。
【発明の概要】
【００１２】
発明の要約
本発明は、特には、単一ヌクレオチド置換（ときには単一ヌクレオチド多型（略してＳＮＰ）とも称される）によって異なる、目的とする希少な標的（例えば、変異ＤＮＡ標的）および密接に関連した配列（例えば、野生型ＤＮＡ標的）間を識別することができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を含むプライマー依存性の核酸増幅方法についての複数部位プライマーを含む。
【００１３】
本発明は、プライマー依存性の核酸増幅方法、例えば、本発明による複数部位プライマーが利用され、密接に関連した配列が多量に存在する群においてひとつ以上の希少な標的配列が選択的に増幅できるＰＣＲ方法が含まれる。このような目的とする標的配列は、例えば、悪性細胞において、そうでない場合は、正常細胞中に見られる野生型が多量に存在する群において見られる配列のような、希少な変異配列でありうる。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用するＰＣＲ法のような方法において、目的とする標的および関連した配列は、検体において発生するＤＮＡ配列、またはそれらは検体において発生するＲＮＡ配列（ｍＲＮＡ配列など）からの逆転写によって作製されたｃＤＮＡ配列である。逆転写は後の増幅と同様の反応混合物において実施されてもよく、または、増幅の前に別途実施されてもよい。複数部位プライマーは、逆転写反応のプライマーとして用いられうる。本発明は、また、増幅された生成物、または「単位複製配列」の検出を含む増幅方法および検出方法を含む。実施例を含む以下に続く記述は、ＤＮＡ標的から始まるＰＣＲ増幅反応に関連して、複数部位プライマーを説明する。他のプライマー依存性の核酸増幅方法に関連して、これらの技術の複数部位プライマーへの適用方法は当業者であれば理解されうるだろう。
【００１４】
本発明は、このような増幅方法および検出方法を含む、このような増幅方法を実施するための試薬を含む試薬キットをさらに含む。
【００１５】
本発明は、特に、分子診断という主要な目的に取り組んでおり、これは、非常に多量の正常細胞を含む臨床検体において、極端に希少ながん細胞（識別体細胞変異（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）の理由により）を検出するための精度が高く、特異の手段を見つけるためであり、定量的にそれらの個体数（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を決定することができるためである。これらには、以下に含むことをすることができるという多くの利点がある：
１．治療後（白血病患者の骨髄移植後のような）のがん細胞の存在および個体数を検出する能力。本発明を利用することにより、薬剤の投与を中断できるかどうかを医者が決定することが可能になるだろう。本発明により、薬剤の治療なしで、体で対処されうる最少の残存疾患のレベルを決定するために臨床研究を実施することが可能となるだろう。さらには、治療後に、その後適当な手段によって治療されうる高いレベルの状況を検出するために、患者はゆっくりと時間をかけて監視されることができる。
【００１６】
２．手術の間に採取された生検中の希少ながん細胞を迅速に検出および定量する能力（小さすぎて病理学者が顕微鏡で見ることができないレベル）。本発明を利用することにより、外科医が、手術の程度を合理的に決定することができ、病気でない組織を除去せずに済むであろう。
【００１７】
３．血液中を循環する希少ながん細胞の破壊の自然過程によって血漿中に放出されたＤＮＡ分子内の極めて重要な変異を検出する能力。本発明を利用することにより、代謝する能力を得ている細胞である腫瘍の早期の検出が可能となり、医者が早期に介入する機会を提供するであろう。
【００１８】
４．遺伝的形質により、生命を脅かす腫瘍が彼らの生存期間の間に発生しうる（多くの乳がんのように）ことを示唆されている患者を監視する能力。本発明を利用することにより、定期的な監視が可能となり、主要な体細胞変異が生じた場合に決定することができるだろう。それにより、治療介入が病気の非常に早期の段階で提供されうる。
【００１９】
当業者であれば、本発明の他の適用について思いつくであろう。 
【００２０】
「希少な」（ｒａｒｅ）および「多量の」（ａｂｕｎｄａｎｔ）とは、少なくとも１／１０３〜１／１０７の範囲である（すなわち、１，０００に１つ、１０，０００に１つ、１００，０００に１つ、１，０００，０００に１つ、または１００，０００，０００に１つ）、密接に関連した配列に対する目的とする標的配列の比率を意味する。「密接に関連した」とは、１、２、または多くても２〜３ヌクレオチドによって目的とする標的配列とは異なる配列を意味する。単一ヌクレオチドによって特定の位置で野生型配列とは異なる変異標的配列は、一般的に単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である、または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有すると称される。
【００２１】
本発明による方法は、サンプル中または目的とするものではない密接に関連した標的配列（例えば、野生型ＤＮＡ標的配列）を多量に含む反応混合物中にめったに生じることのない、少なくともひとつの目的とする標的配列（例えば、変異ＤＮＡ標的配列）のためのプライマー依存性核酸増幅を含む。これらの方法は、それぞれ希少な標的について本発明の複数部位プライマーを含む反応混合物を利用する。プライマーの３つの部分は、お互いに協力して、極めて選択的な増幅を産生する。図１は、本発明によるプライマーの略図である。図１は、２つの図を含む：上の図は、少量でありうるその目的とする標的１０１に関して、ＰＣＲサイクルのアニーリング工程の間に生じるような、ハイブリダイゼーション条件下での複数部位プライマー１０３を示し；および下の図は、密接に関連した配列（本明細書中、目的とするものではない、またはミスマッチな標的１０２と称する）に関する同じプライマーを示す。目的とする標的１０１および目的とするものではない標的１０２は、目的とする標的１０１が１以上のヌクレオチド「ｘ」、好ましくはミスマッチな標的１０２中の対応するヌクレオチド（ここでは「ｙ」と称する）とは異なる単一ヌクレオチドを有すること以外は、同様のヌクレオチド配列を有する。例えば、目的とするものではない標的配列１０２は、野生型ヒトＤＮＡ配列であってもよく、および目的とする標的配列１０１はＳＮＰを含む変異がん細胞配列であってもよい。上部の図は、目的とする標的ストランド１０１とハイブリダイズされたプライマー１０３を示す。５’から３’方向において、プライマーはアンカー配列１０４、ブリッジ配列１０５、およびフット配列１０６を含む。プライマー１０３は、任意で、付与された機能性を与えるための５’後尾部（ｔａｉｌ）１０７を含んでいてもよい。また、任意で、ブロッキンググループ１０８を含む。増幅の開始時のプライマーアニーリングの間、アンカー配列およびその結合部位との間（相補的なヌクレオチドの対で示されている）を短い垂直線によって一般的に示されているように、アンカー配列１０４は目的とする標的１０１とハイブリダイズする。ブリッジ配列１０５は、配列１０９で標的１０１とミスマッチであり（相補的でない）、これは「介在配列」と称し、デュープレックス構造中に「バブル」（bubble）を発生する。フット配列１０６は目的とする標的１０１とハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼによって複製の準備（prime）をする。下の図は、目的とするものではない、ミスマッチな標的１０２とハイブリダイズする同じプライマー１０３を示す。上述のように、ミスマッチな標的１０２は、反対のプライマーフット１０６の配列における少なくともひとつのヌクレオチド変化（ｘからｙ）によって目的とする標的１０１とは異なる。増幅の開始時のプライマーアニーリングの間、アンカー配列１０４は、示されているように、アンカー配列の結合部位において、目的とするものではない標的１０２とハイブリダイズする。また、ブリッジ配列１０５は、介在配列１０９とはミスマッチである。しかしながら、フット配列１０６は、標的１０２とはハイブリダイズせず、標的１０２は複製が準備されない。
【００２２】
図１による理想的な増幅反応において、目的とする標的１０１は、少量であっても、通常、複製され、目的とするものではない標的１０２は、多量であっても、決して複製されない。しかしながら、プライミングは、統計上の事柄である。例えば、プライマーは、ある頻度で、最適なおよびミスマッチな（ｐｅｒｆｅｃｔ  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）標的に進行したり停止したりする（ｇｏ  ｏｎ  ａｎｄ  ｏｆｆ）。結果として、最適な標的は必ずしも複製されるとも限らず、ミスマッチな標的はときどき複製される。このようにして希少な標的を選択的に増幅して検出することは、最適な標的が複製される頻度と、ミスマッチな標的が複製される頻度との両方に依存する。本発明で用いられる複数部位プライマーは、増幅および検出分析を含む実際の増幅反応において非常に高い選択性を達成するために、お互いに協力をしあう３つの連続した配列（アンカー配列、ブリッジ配列およびフット配列）を有する。アンカー配列は、プライマーと標的配列とをハイブリダイズさせる役割を有する。これは、これまでのプライマーのハイブリダイゼーションとは異なることがない効率的な方法において、目的とする標的および目的とするものではないミスマッチな標的と同様である（または、ほぼ同様である）。以下により詳細に記述したブリッジおよびフット配列は、協力してプライマーに特異性、すなわち、ミスマッチな標的と比較して目的とする標的に選択性を付与する。我々は、ブリッジおよびフット配列が協力して、起こりそうというよりはむしろ起こりそうもない目的とする標的の複製をする場合、高い程度の選択性が達成されることを発見した。さらに、我々は、迅速に効率的に複製が可能であるブリッジ配列を作製する。ブリッジ配列は、好ましくはＤＮＡ配列である。達成された結果としては、通常はいったん開始すると進行するが、開始時に遅れる、目的とする標的配列の増幅である；これに対し、目的とするものではないミスマッチな標的配列の増幅は、通常はいったん開始すると進行するが、有意にもっと遅れる。適合の配列に対してミスマッチな配列の増大した遅れは、プライマーによって達成された選択性における改善である。このように改善された選択性が達成され、ＤＮＡポリメラーゼによって複製される目的とするものではない標的配列の可能性は、複製される目的とする標的配列の可能性よりも少なくとも１，０００倍低く、好ましくは１０，０００倍低く、より好ましくは１００，０００倍低い。
【００２３】
図１を参照すると、プライマーは、増幅反応のプライマーアニーリング温度を含むプライマーアニーリング工程の間、プライマーと目的とする標的と密接に関連した標的配列との結合部位でハイブリダイズするアンカー配列１０４を含む。これに関して、アンカー配列は、従来のプライマーのようであり、従来のプライマーのように機能する。これは、標的および密接に関連した配列に完全に相補的であってもよく、または１以上のミスマッチなヌクレオチドを含んでいてもよい。用いられる増幅反応において、通常、少なくともアニーリング温度以上の融点Ｔｍを有し、ハイブリダイゼーションを増進する。大部分の実施例において、アンカー配列のＴｍは、プライマーアニーリング温度以上の３℃から１０℃の間である。ブロッキンググループによって抑制されない限り、本発明の複数部位プライマーのアンカー配列のすべてまたは一部はＤＮＡポリメラーゼによって複製される。指数関数的増幅は、高い通常のＰＣＲ効率で迅速に進行するため、複製された部分において非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、および非天然ヌクレオチド間結合の含有（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）は、ＤＮＡポリメラーゼによる迅速で効率的な複製が許容する種類および個数に制限されている。我々は、アンカー配列はＤＮＡ配列であることを好む。
【００２４】
アンカー配列１０４は典型的には、１５−４０のヌクレオチド長、好ましくは１５−３０のヌクレオチド長、より好ましくは２０−３０のヌクレオチド長のプローブ標的ハイブリッド（ｐｒｏｂｅ−ｔａｒｇｅｔ  ｈｙｂｒｉｄ）を形成する。より短いアンカー配列は、上述したように、プライマーアニーリングの間にそれらの標的配列とさらにハイブリダイズしなければならず、これはしばしば、それらのＴｍが少なくとも５０℃（例えば、６６−７２℃）でなければならないことを意味する。これは、標的と完全に相補的であってもよく、または１以上のミスマッチなものであってもよい；例えば、ある人は、アンカーに対して変わりやすい配列の標的を探索しており、ある人は、標的のあらゆる型の配列に完全に相補的でなく、プライマーアニーリングの間にすべての変異とハイブリダイズするコンセンサス配列であるアンカー配列１０４を選択してもよい。我々は、一般的なＰＣＲプライマーに典型的であるように、通常１５−３０塩基対の範囲で、アンカー−配列／標的ハイブリッドを形成するＤＮＡアンカー配列を好む。我々は、ＤＮＡであり、完全に標的配列に相補的である２４のヌクレオチド長のアンカー配列を下記実施例で実証する。複数部位プライマーは、その標的配列以外（すなわち、目的とする標的配列および目的とするものではない不適合の標的配列）の反応混合物において配列をプライムしない。従来のプライマーがその機能を達成するために設計されるべきであるのに対して、検体に存在するかまたは存在するかもしれない他の配列と識別するのにフット配列が助力するため、アンカー配列に対する要求はそれほど厳しくない。
【００２５】
図１を参照すると、プライマーは、ヌクレオチド（ＳＮＰヌクレオチド）または場合によっては、目的とするものではないミスマッチな標的配列とは異なる２つのヌクレオチドを含む範囲で、目的とする標的配列と相補的であるフット配列１０６を含む。フット配列は、目的とする標的配列と完全に相補的であってもよく、または１つの、または場合によっては、目的とする標的配列および目的とするものではないミスマッチな標的配列のどちらともミスマッチな２つのヌクレオチドさえ含んでいてもよい。フット配列１０６は、通常、少なくとも１以上のヌクレオチドにより、ミスマッチな標的配列よりも目的とする標的配列とより相補的である。フット配列は、増幅の間、複製される。指数関数的増幅は、高い通常のＰＣＲ効率で迅速に進行するため、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、および非天然ヌクレオチド間結合の含有は、ＤＮＡポリメラーゼによる迅速で効率的な複製を許容する種類および個数に制限される。我々は、フット配列がＤＮＡ配列であることを好む。単位複製配列の次の指数関数的増幅は、高い通常のＰＣＲ効率で迅速に進行することが望ましいため、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、および非天然ヌクレオチド間結合のフット配列の含有は、ＤＮＡポリメラーゼによる迅速で効率的な複製を許容する種類および個数に制限される。好ましい実施形態において、フット配列は目的とする標的配列と完全に相補的であるＤＮＡ配列であり、目的とするものではない標的配列のヌクレオチドとミスマッチな単一ヌクレオチドを含む。
【００２６】
フット配列１０６は、例えば、５−８塩基対の範囲で、好ましくは６−８塩基対の範囲で、少なくとも５のヌクレオチド長で、例えば、６−７塩基対の範囲で、より好ましくは７ヌクレオチド長以下で、目的とする標的配列とハイブリッドを形成する。アンカー配列が目的とする標的配列とハイブリダイズすると、フット配列にとって１つのみの結合部位が存在する。フット配列が短縮されると、特にフット配列がたった５ヌクレオチドに短縮されると、他の可能性のある結合部位を有することができる機会が増加することとなり、このことはプライマー設計の際に考慮すべき事柄である。一方、実施例で実証するように、目的とするものではない標的に対してミスマッチなヌクレオチドは、フット１０６のあらゆるヌクレオチド位置で生じてもよく、我々は、ＡＲＭＳプライマーのように、ミスマッチなヌクレオチドが、３’ヌクレオチドであること（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：２５０３−２５１６；  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ５１  ：２５１−２６２）、またはフットの３’末端からの１つのヌクレオチド（ｏｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ３’  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｏｔ）（これは我々がしばしば「３’末端から２番目のヌクレオチド（３’ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」と称するものである）に存在することのいずれかを好む。
【００２７】
また図１を参照すると、プライマーは、複数部位プライマーの標的分子へのアニーリングの間、介在配列１０９とハイブリダイズできないように選択されるブリッジ配列１０５を含む。ブリッジ配列、またはブロッキンググループを含む場合、それらの３’位置はＤＮＡポリメラーゼにより複製される。単位複製配列の指数関数的増幅は、高い通常のＰＣＲ効率で迅速に進行することが望ましいため、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、および非天然ヌクレオチド間結合のブリッジ配列の複製された部分の含有は、ＤＮＡポリメラーゼによる迅速で効率的な複製を許容する種類および個数に制限される。ＤＮＡであるブリッジ配列が好ましい。
【００２８】
標的におけるブリッジ配列１０５およびその向かい合った介在配列１０９は、プライマー／目的とする標的ハイブリッドにおいてバブルを形成する。バブルの外周は、ブリッジ配列１０５の長さに介在配列１０９の長さを加算し、さらに４（アンカー−配列ハイブリッドからの対のヌクレオチド、フット−配列ハイブリッドからの対のヌクレオチド）を加算するものである。ブリッジおよび介在配列は、等しい長さではない必要がある；どちらかが他方より短い。ある実施形態においては、介在配列の長さはゼロである。好ましい実施形態において、少なくとも６のヌクレオチド長である。より好ましい実施形態では、ブリッジおよび介在配列の長さの合計は少なくとも２４ヌクレオチドであり、我々は、介在配列が少なくとも８ヌクレオチドの長さを有することが望ましく、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドである。ブリッジ配列は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきである。ある好ましい実施形態では、長さの等しいブリッジおよび介在配列である。バブルの外周は、１６ヌクレオチドと同じくらい短くてもよく、５２ヌクレオチドと同じくらいの長さであってもよく、例えば、１６−５２ヌクレオチド、２０−５２ヌクレオチド、または２８−４４ヌクレオチドである。
【００２９】
複数部位プライマーの設計のための一般的な検討としては、バブルの外周が増加することおよびフットが短くなることにより、目的とする標的の増幅に遅れが拡大する。例えば、強度がそれぞれのＰＣＲサイクルの間に存在する単位複製配列の数を反映する、挿入している染料ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの蛍光強度を観測することにより、目的とする標的配列の特定数で開始する反応において、所定の検出可能な単位複製配列の数を合成するのに必要なＰＣＲサイクルの数（その反応における閾値サイクル、ＣＴ）が測定されうる。これは、ＤＮＡポリメラーゼが複数部位プライマー／目的とする標的ハイブリッドを伸長する可能性に対する、ＤＮＡポリメラーゼが複数部位プライマー／目的とするものではない−標的ハイブリッドを伸長する可能性の違いを測定する方法も提供する。もし指数関数的な倍加（exponential doubling）により増幅が進行するならば、１０サイクルでのＣＴ差は、複数部位プライマー／目的とするものではない−標的ハイブリッドの伸長の可能性が、複数部位プライマー／目的とする標的ハイブリッドの伸長の可能性より１，０００倍低いことを示す；１３．３サイクルでのＣＴ差は、その可能性が１０，０００倍低いことを示す；１６．６サイクルでのＣＴ差は、その可能性が１００，０００倍低いことを示す；および２０サイクルでのＣＴ差は、その可能性が１，０００，０００倍低いことを示す。
【００３０】
複数部位プライマーを用いる本発明による分析において、ミスマッチな標的配列で観測されるより高い閾値サイクルおよび目的とする標的配列の、同じ数で、例えば１０６コピーの複製で観測されるより低い閾値サイクルの間の差は、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料を反応混合物へ添加することにより達成されるそれぞれのＰＣＲサイクルでの蛍光強度の測定からΔＣＴにおいて反映されるように、少なくとも１０サイクル、好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、さらに好ましくは少なくとも１７サイクル、さらにより好ましくは少なくとも１８サイクル、もっとも好ましくは２０サイクル以上である。本発明による複数部位プライマーが、十分に設計された従来のＰＣＲプライマーに取って代わる増幅反応において、目的とする標的配列を用いて達成される閾値サイクルの遅れ（ｄｅｌａｙ）（ΔＣＴ）が存在する。遅れの量は、比較された従来のプライマーがどれほどよく設計されているかに依存するが、典型的には、複数部位プライマーのアンカー配列のみからなる従来のプライマーと比較すると、遅れは少なくとも２増幅サイクルであり、しばしば、少なくとも３サイクルであり、ときには、少なくとも８サイクルであり、または１０サイクルでさえある。
【００３１】
本発明による方法の好ましい実施形態は、希少な標的配列の増幅から生成物を検出することを含む。増幅された生成物の検出は、続く増幅とは別に、例えば、ゲル電気泳動により、実施されてもよい。好ましい実施形態において、検出試薬は、検出が「リアルタイム」、すなわち増幅の経過の間、何度も実施される、または「終点（end point）」、すなわち増幅反応の終了した後に実施されるであってもよい場合に、好ましくは反応容器を開放することなく均一検出により、増幅反応混合物中に含まれる。検出試薬はＤＮＡ結合染料、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、増幅された生成物を産生するよう信号を送る二重標識蛍光プローブ、例えば、分子標識プローブ、および染料からの発光により刺激される結合染料と蛍光プローブとの組み合わせを含む。さらに、本明細書で述べたように、プライマー自身は、プライマーが単位複製配列に組み込まれた場合、または代わりとして、プライマーが相補的な単位複製配列に結合した場合にのみ蛍光を発する蛍光標識を含む。 
【００３２】
本発明は、少なくとも１つの標的配列を増幅するための反応混合物を含む。反応混合物は、それぞれの目的とする標的配列のための対のプライマーを含み、それぞれの対におけるひとつのプライマーは、本明細書で述べたように、複数部位プライマーである。反応混合物はまた、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、増幅バッファー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む標的を増幅するための試薬を含む。本発明による分析方法において好ましい反応混合物は、また、検出試薬、すなわち、ＤＮＡ結合染料、ハイブリダイゼーションプローブ（または両方）、またはそれぞれの複数部位プライマーの５’機能性後尾部（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔａｉｌ）を含む。開始検体がＲＮＡを含む場合、増幅反応混合物は、また、逆転写酵素および逆転写用のプライマーを含む。
【００３３】
本発明は、また、１以上の目的とする標的配列における上述した増幅反応ならびに増幅および検出反応を実施するためのキットである生成物を含む。キットは、本発明による反応混合物を作製するために必要なオリゴヌクレオチドおよび試薬を含む。ＲＮＡである検体を開始するためのキットは逆転写のための試薬を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明の１以上の詳細な実施形態は後述の説明に記述されている。本発明の他の特徴、目的、効果は説明および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、その目的とする標的配列とハイブリダイズした、および１以上のヌクレオチド置換によって目的とする標的配列とは異なるミスマッチな配列とハイブリダイズした本発明で用いられる複数部位プライマーの概略図である。
【図２】図２は、本発明の複数部位プライマーの最初の複製、および次の２サイクルにおける得られた単位複製配列の次の複製の、増幅サイクルの概略図である。
【図３】図３は、ＤＮＡポリメラーゼによる複製を停止するブロッキンググループの配置の位置を示す本発明による複数部位プライマーの概略図である。
【図４】図４は、任意の５’機能性部位のいくつかの例の概略図である。
【図５】図５は、従来の直線状プライマー（ｌｉｎｅａｒ  ｐｒｉｍｅｒ）で、プライマーが結合する配列の中央に位置する単一ヌクレオチドでお互いに異なる、１，０００，０００の目的とする標的配列または１，０００，０００の目的とするものでないミスマッチな標的配列のどちらかで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図６】図６は、ＡＲＭＳプライマーで、１，０００，０００の目的とする標的配列または１，０００，０００の単一ヌクレオチドによって異なる目的とするものでないミスマッチな標的配列のどちらかで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す。ここで、プライマーにおける「ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」（これは目的とする標的配列において相当するヌクレオチドに相補的であり、目的とするものではない標的配列において相当するヌクレオチドとは相補的でない）が、プライマーの３’末端ヌクレオチドである；およびこの図は、問題となるヌクレオチドが、プライマーの３’末端の最後から２番目のヌクレオチド（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である同様のプライマーで得られた結果も示す。
【図７】図７は、１，０００，０００のプライマーの目的とする標的配列の分子または１，０００，０００のプライマーの目的とするものでないミスマッチな標的配列（フット配列の最後から２番目の位置（ｔｈｅ  ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）であるｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを有した複数部位プライマー）のどちらかを含む反応において本発明による複数部位プライマーで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図８】図８は、それぞれが１，０００，０００の目的とするものでない標的配列および：０；１０；１００；１，０００；１０，０００；１００，０００；または１，０００，０００の目的とする標的配列のいずれかを含む一連の反応で、本発明による複数部位プライマーで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図９】図９は、目的とする標的の数の対数に対して、図８で示されたそれぞれの反応で観測された閾値サイクル間の逆の直線関係を示すグラフであり、図の点線は、目的とする標的配列を含んでいない１，０００，０００の目的とするものではない標的配列を含んだ反応で得られた閾値サイクルを示す。
【図１０】図１０は、フットが、６、７、または８のいずれかのヌクレオチド長（ｉｎｔｅｒｒｏｇｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはそれぞれのフット配列の最後から２番目の位置に位置している）である以外は同一の３つの複数部位プライマーを用いている、図８および図９で示した実施例で用いた同じ希釈系で得られた結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ブリッジ配列が、標的分子における同一の長さの介在配列と異なる外周のバブルを形成する３つの複数部位プライマーを用いている、図８、図９および図１０で示した実施例で用いた同じ希釈系で得られた結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明による他の同一の複数部位プライマーで、１，０００，０００の目的とする標的配列または１，０００，０００の目的とするものではない標的配列（単一ヌクレオチド多型により目的とする標的配列と異なっている）のどちらかで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す一連のグラフである。ここで、プライマーのフットにおけるｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（これは目的とする標的配列において相当するヌクレオチドに相補的であり、目的とするものではない標的配列において相当するヌクレオチドとは相補的でない）がプライマーの３’末端に対して異なる位置に位置している。
【図１３】図１３は、本発明による複数部位プライマーで、１，０００，０００の目的とする標的配列または１，０００，０００の単一ヌクレオチドにより異なる目的とするものではない標的配列のどちらかで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す一連のグラフである。ここで、目的とする標的配列のブリッジ配列の長さと介在配列の長さとの合計が一定であるが（すなわち、バブルの外周が同じであるが）、標的分子のブリッジ配列および介在配列により形成されたバブルの対称性（それらの配列の長さに対する）は変えられている。
【図１４】図１４は、観測された閾値サイクルと、１，０００，０００の野生型ヒトＢ−ｒａｆ標的配列、および１０；１００；１，０００；１０，０００；１００，０００；または１，０００，０００のいずれかのＶ６００Ｅ変異のヒトＢ−ｒａｆ標的配列をそれぞれ含む一連の反応におけるＶ６００Ｅ変異のヒトＢ−ｒａｆ標的配列の数の対数との間の逆の直線関係を示すグラフである。
【図１５】図１５は、観測された閾値サイクルと、培養された正常ヒト細胞から分離されたゲノムＤＮＡに存在する１０，０００野生型標的配列およびＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する培養されたヒトがん細胞から分離されたゲノムＤＮＡに存在する１０；３０；１００；３００；１，０００；３，０００；または１０，０００のいずれかの変異標的配列をそれぞれ含んだ一連の反応に存在する変異標的配列の数の対数との間の逆の直線関係を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５分光蛍光熱サイクラー（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）の代わりに、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７７００分光蛍光熱サイクラーを用いて実験を実施した以外は、図９で示した結果と同様の実験である実験の結果を示す。
【図１７】図１７は、パネルＡ；１，０００，０００のプライマーの目的とする標的配列の分子または１，０００，０００のプライマーの目的とするものではない標的配列（フット配列の最後から２番目の位置でｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを有した複数部位プライマー）の分子のどちらかを含む反応における本発明による複数部位プライマーで得られたリアルタイム蛍光の結果、およびパネルＢ；３’最後から２番目のヌクレオチドおよび３’−末端ヌクレオチドがないプライマーの不完全なバージョンで得られたリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図１８】図１８は、２つの密接に関連した目的とする標的配列の多重反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において用いられてもよい本発明による２つの複数部位プライマーの概略図である。
【図１９】図１９は、２つの密接に関連した目的とする標的配列の多重反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において用いられてもよい２つの複数部位プライマーおよび２つの分子標識プローブの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
本発明は、少なくとも一部、プライマー依存性増幅反応における複数部位プライマーの特異な設計に基づいている。したがって、本発明は、複数部位プライマーの設計および特性を開示する。それらは原検体（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｓａｍｐｌｅ）に存在する鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とハイブリダイズされる場合に並外れた選択性を示す。この並外れた選択性により、我々は、本発明の複数部位プライマーを「超選択性」プライマーと称する。
【００３７】
重大なことに、変異鋳型においていったん合成が開示されると、得られる単位複製配列は、高い効率で指数関数的に増幅され、リアルタイムデータは、原検体に存在する多量の変異鋳型を査定する従来の方法を提供する。後述の実験は、変異および野生型間の相違が単一ヌクレオチド多型のみであった場合であっても、野生型配列の１，０００，０００の分子を含む検体において変異配列の１０の分子が確実に検出されうるわずかな程度まで、超選択性プライマーが野生型配列の合成を抑制するのに十分に識別力があることを実証している。
【００３８】
１．プライマー依存性増幅反応
本発明の方法で用いられるプライマー依存性増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、対称または非対称のいずれかの、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、切断酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ストランド−転移増幅（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、およびローリングサイクル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）を含むあらゆる好適な指数関数的な増幅方法であってもよい。非対称ＰＣＲ増幅法（例えば、非対称ＰＣＲ）においては、１つのプライマー（制限プライマー（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ））が、増幅の終了の前に使い果たされうる制限量（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）で存在しており、これが使い果たされた後に、残っているプライマー（過剰プライマー（ｅｘｃｅｓｓ  ｐｒｉｍｅｒ））を用いた直線状増幅が生じる。本発明で用いられる非対称ＰＣＲ方法は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲである（例えば、欧州特許ＥＰ１，４６８，１１４；およびＰｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２：８６０９−８６１４）を参照）。非対称増幅方法が用いられる場合、複数部位プライマーは、過剰なプライマーであることが好ましい。好ましい方法は、また、デジタルＰＣＲを含み（例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｚｌｅｒ  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：９２３６−９２４１を参照）、これは大量の野生型分子が存在する反応に存在する単一の変異鋳型分子から多くの単位複製配列を検出するために好ましい。
【００３９】
増幅反応がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例としては、ＮＡＳＢＡ）を利用する場合、増幅反応は定温である。増幅した生成物の繰り返される一連の合成を「サイクル」と称するが、それらは熱サイクルではない。そのような増幅において、本発明による複数部位プライマーによって開始される「目的とする標的配列」および「目的とするものでない標的配列」は、ＤＮＡポリメラーゼおよび複数部位プライマーが存在している原検体および増幅反応混合物に生じるＲＮＡ配列である。
【００４０】
増幅反応がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例としては、ＰＣＲ）を利用する場合、原検体は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のいずれかを含んでいてもよい。そのような増幅において、本発明による複数部位プライマーによって開始される「目的とする標的配列」および「目的とするものでない標的配列」は、ＤＮＡポリメラーゼおよび複数部位プライマーが存在している原検体に生じるか、または原検体に生じる逆転写ＲＮＡにより作製されるかのいずれかのＤＮＡ配列である。複数部位プライマーが逆転写に用いられる場合、「目的とする標的配列」および「目的とするものではない標的配列」はｃＤＮＡだけでなくＲＮＡでもある。離れた外部のプライマーが逆転写に用いられる場合、「目的とする標的配列」および「目的とするものではない標的配列」はｃＤＮＡである。いずれかの場合において、「目的とする標的配列」および「目的とするものではない標的配列」は、ＤＮＡポリメラーゼおよび複数部位プライマーを有する増幅反応混合物に存在する核酸配列である。プライマー依存性増幅反応は、プライマーアニーリング、プライマー伸長、およびらせん変性（らせん融解）の繰り返される熱サイクルを含む。プライマーアニーリングは、プライマー伸長温度以下の温度で実施されてもよく（例えば、３温度ＰＣＲ（ｔｈｒｅｅ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ＰＣＲ））、またはプライマーアニーリングおよびプライマー伸長は同じ温度で実施されてもよい（例えば、２温度ＰＣＲ（ｔｗｏ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ＰＣＲ））。反応の全体の熱プロファイルは、特異のサイクルの繰り返しを含んでいてもよく、または温度／回数は１以上のサイクルの間に変動してもよい。例えば、いったん増幅が開始し複数部位プライマーのプライミング配列が伸ばされると、より長いプライマーに適したより高いアニーリング温度は増幅反応を終了するために用いられてもよい。
【００４１】
本発明による分析方法は、増幅された標的配列の検出を含む。本発明による方法は、特有の検出スキームに限られていない。検出は、ゲル電気泳動によるような下記の増幅で実施されてもよい。代わりとして、均一な検出は、（リアルタイム）の間または増幅反応の終わり（終点）に、増幅の間存在する試薬を用いて、単一チューブ内でまたは他の反応容器で実施されてもよい。代わりとして、マイクロ流体を用いて、増幅した生成物を１以上の固定化キャプチャープローブのような検出試薬または絶縁試薬（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）と接触するチャンバーに移動させることも可能である。検出試薬は、例えばＳＹＢＲ（登録商標）グリーンのような二重ストランドＤＮＡ結合染料、および例えば、分子標識プローブもしくはＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅ（登録商標）プローブのような例えばハイブリダイゼーションを合図する蛍光性でまたは発光性の標識ハイブリダイゼーションプローブ、または例えば５’−ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））プローブのような増幅の間に切断されるプローブを含む。
【００４２】
２．複数部位プライマー
上述したように、本発明の方法は、それぞれの希少な標的細胞について複数部位プライマーを含む。複数部位プライマーでの増幅は、プライマー１０３および目的とする標的配列１０１（図１）として図２に例示した。まず、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）として示されるプライマー１０３は、標的配列１０１をアニールして、ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型としてストランド１０１を用いて伸長され、伸長生成物２０１を生成する。中央の略図を参照すると、次の増幅サイクルにおいて、ストランド２０２（プライマー１０３および伸長生成物２０１を含む）は、従来のプライマー２０３であるリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）の鋳型になる。リバースプライマー２０３はアニールして、鋳型としてのストランド２０２を用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、伸長生成物２０４を生成する。伸長生成物２０４は、プライマー１０３と完全に相補的な配列を含む。伸長生成物２０４は、ストランド１０１に関係なく、そのような完全に相補的な配列を含む。すなわち、プライマー１０３が早いサイクルにおいて伸長された場合（上の略図）、得られるストランド２０２（中央の略図）は常にプライマー１０３の完全な相補物を含む。次の増幅サイクルにおいて（下の図）、ストランド２０５は、リバースプライマー２０３および伸長生成物２０４を含むが、プライマー１０３の完全な相補物を含む；プライマー１０３は、ストランド２０５に結合し、ＤＮＡポリメラーゼより伸長され、伸長生成物２０６を生成する。そのように、図２は、複数部位プライマーがアニールして伸長され、単位複製配列２０２を生成するときはいつでも、目的とする標的配列１０１だけでなく、ミスマッチな標的配列１０２に適用する。
【００４３】
前項において示したように、図２は、リバースプライマー２０３の伸長の間のプライマー１０３全体の複製を示す。これは、次のサイクルのための長いプライミング領域、すなわち、アンカー配列１０４、ブリッジ配列１０５およびフット配列１０６に相補的な配列を形成する。ある実施形態においては、そのような長さのプライミング領域を有する増幅の残りの部分とともに進行するのは望ましくないかもしれない。図３は、後のサイクルでプライミング領域を短縮するためのブロッキンググループを有する複数部位プライマーの使用を例示する。ブロッキンググループは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を停止することが知られている。ブロッキンググループは、例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）であってもよい。特に、ブリッジ配列１０５が長い場合、図３の上の略図に示されるように、ブリッジ配列１０５のブロッキンググループ１０８を配置するのが好ましい。後の増幅サイクルにおけるプライミング領域は、フット１０６のヌクレオチドに、ブロッキンググループ１０８の３’に位置するブリッジ１０５のヌクレオチドを足したものからなる。代わりとして、図３の下の略図に示されるように、アンカー配列１０４のブロッキンググループ１０８Ａを配置するのも好ましい。このような実施形態において、増幅の後のサイクルのプライミング領域は、フット１０６のヌクレオチド、ブリッジ１０５のヌクレオチド、さらにブロッキンググループ１０８Ａの３’に位置するアンカー１０４のヌクレオチドを含む。
【００４４】
上述のように、本発明での使用のための複数部位プライマーは、機能性部位、アンカー配列１０４に結合している５’後尾部を含む。本発明は、そのようなグループが実施する機能に関して、またはそれらの構造に関して制限されない。いくつかの機能性部位の例としては、図４に例示されている。それぞれの図はアンカー配列１０４およびアンカー配列の５’末端に位置する異なる機能性グループを有する複数部位プライマー１０３を示す。機能性グループ４０１は、単に、キャプチャープローブへのハイブリダイゼーションまたは標識プローブへのハイブリダイゼーションに用いられうるオリゴヌクレオチド後尾部である。後尾部４０１は、図示されているように、プライマー１０３内のアンカー配列と相補的でない。後尾部４０１を含むプライマーのブロッキンググループ１０８Ｂの存在のために、ＤＮＡポリメラーゼは後尾部４０１を複製せず、後尾部４０１は常に、一重ストランド（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ）であり、相補的な単位複製配列が一重ストランドかまたは二重ストランドかに関わらず、キャプチャープローブまたは標識プローブに結合するのに有効である。オリゴヌクレオチド４０１は、得られる単位複製配列をキャプチャープローブのアレイ上の特定の位置に、または分布式アレイの異なる要素に結合したキャプチャープローブに固定化するための「郵便番号（ｚｉｐ  ｃｏｄｅ）」として役立つ。他の機能性部位は、リンカー４０３を経由してアンカー配列１０４に結合したビオチングループ４０２を含む。プライマーのブロッキンググループ１０８Ｂの存在のために、ＤＮＡポリメラーゼはリンカー４０３を複製せず、リンカー４０３は、常に一重ストランドである。ビオチングループ４０２により、プライマーから合成された単位複製配列に付加的な機能を習得できるようにする。例えば、ビオチングループは、単位複製配列が、常磁性粒子のように、結合基を経由して固体表面に固定化されたストレプトアビジンタンパク質によって強く捕捉されることを許容する。他の機能性部位は、消光分子４０７（好ましくは、ＤａｂｃｙｌまたはＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ２のような非蛍光消光分子）および相互作用する蛍光部位４０８（好ましくは蛍光色素分子）で標識された一重ストランドループ４０５および二重ストランドステム４０６を含むステムおよびループ構造を有するヘアピン構造のオリゴヌクレオチド４０４である。リバースプライマー２０３（図２）の伸長は、蛍光部位４０８から消光分子４０７を分離して、標識ヘアピン構造４０４を通して継続し、それにより、蛍光のシグナルを発生する。Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：２５１６−２５２１を参照。プライマー１０３の標識ヘアピン構造４０４の含有は、増幅を示す蛍光のシグナルを導く。さらに他の機能性部位は、オリゴヌクレオチド配列４１４およびブロッキンググループ１０８Ｂを経由してアンカー配列１０４に結合した分子標識プローブ４０９である。この機能性部位は、スコーピオン（登録商標）プライマーという付加的な機能を有する。すなわち、コピー２０１が生成されたときにプライマー１０３の下流で、つながれた分子プローブが標的ストランド（目的とする標的配列およびミスマッチな標的配列の両方）とハイブリダイズすることを可能にする機能を有する。分子標識プローブ４０９は、相互作用する消光分子４１２および蛍光部位４１３に共有結合的に結合したループ４０１およびステム４１１を含み、これにより、伸長生成物２０１へのプローブ４０９のハイブリダイゼーションが、ステム４１１を中断し、増幅を示す蛍光シグナルを発生することができるようにされている。ヘアピン構造４０４と異なり、この場合はプライマー１０３がブロッキンググループ１０８Ｂを含んでいるためヘアピン構造４０９は複製されない。図４の下部の図は、分子標識のステム４１７の５’−末端配列がブリッジ配列１０５の部分と相補的であり、ループがアンカー配列１０４を含んでいるヘアピン構造４０４の変異を示す。結果として、相補的な単位複製配列ストランドへのハイブリダイゼーションにおいて、得られるハイブリッドの剛性は蛍光部位４１６から相互作用する消光分子４１５を分離して、それにより、増幅を示す蛍光を発生する。
【００４５】
複数部位プライマーは、その標的配列（すなわち、目的とする標的配列および目的とするものではないミスマッチな標的配列）以外の反応混合物において、配列をプライムしない。ブリッジ配列の３’部位およびフット配列は、そのような不適切な配列のためのプライマーとしての役割を果たす配列をともに形成しない。
【００４６】
本発明の方法で用いられる複数部位プライマーは、図１に関連して、以下のように機能する。合成の１回目の段階では、例えば、第１ＰＣＲサイクルにおいて、高温変性工程が続くかもしれないが、アンカー配列１０４は、目的とする標的１０１および目的とするものではないミスマッチな標的１０２の両方の標的配列とハイブリダイズする。ブリッジ配列１０５は、標的配列とハイブリダイズしない。フット配列１０６は、好ましくは、目的とする標的配列１０１とハイブリダイズするが、ある程度は、目的とするものではないミスマッチな標的１０２ともハイブリダイズする。ハイブリッドは、ある頻度で形成し、分離する。また、ある頻度で、ＤＮＡポリメラーゼは形成されたハイブリッドと結合し、プライマーの伸長を開始する。目的とする標的配列１０１に関して、複数部位プライマーおよび目的とする標的配列１０１の１０６コピーの複製を用いて（目的とするものではない標的配列１０２の複製の有無に関わらず）、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン検出でのＰＣＲ増幅および検出分析と、対応する従来のプライマー（複数部位プライマーのアンカー配列と同様である）を用いて同様の分析との間で比較を行った場合、我々が少なくとも２サイクルでのＰＣＲ閾値サイクルＣＴでの遅れとして測定しているが、ハイブリッド形成の結合した頻度（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）およびポリメラーゼ結合／伸長は、目的とする標的配列１０１の非効率的な複製という結果になる。複数部位プライマーおよびミスマッチな標的配列１０２の１０６コピーの複製を用いたＣＴと、複数部位プライマーおよび目的とする標的配列１０１の１０６コピーの複製を用いたＣＴとの間のそのような分析において（目的とするものではない標的配列１０２の複製の有無に関わらず）、違い（ΔＣＴ）を測定したが、目的とするものではないミスマッチな標的配列１０２に関して、ハイブリッド形成の結合した頻度およびポリメラーゼ結合／伸長は、極端に非効率な複製という結果になる。複数部位プライマーによって引き起こされる目的とする標的配列の遅れは、少なくとも２ＰＣＲサイクルであり、より大きくてもよく、例えば、４サイクルまたは５−１０サイクルであってもよい。目的とするものではないミスマッチな標的および目的とする標的の間の違い（ΔＣＴ）は、少なくとも１０ＰＣＲサイクルであり、好ましくはそれ以上である。付加的なサイクルを通して増幅が進行すると、目的とする標的配列が複製され、最終的には、ミスマッチな標的でも起こるだろう。両方の標的から合成された複製は複数部位プライマーを含み、よって識別されるだろう。
【００４７】
複数部位プライマーが増幅前に試験される検体に存在する標的核酸分子上で単位複製配列の合成を開始した後、その開始が１回目のサイクルまたは後のサイクルで生じるかどうかに関わらず、得られる単位複製配列は、単位複数配列に関して、従来のプライマーとして作用する複数部位プライマーを用いて、続くサイクルにおいて、迅速に、通常の高い効率で、指数関数的に増幅される。例えば、単位複数配列の複製について、複数部位プライマーは、２０−５０のヌクレオチド長である従来のＰＣＲプライマーと同様の方式で作用する。これは、フットは、いったん増幅が開始するとプライマーとして作用することを意味する。ひとつの可能性としては、全体（または少なくとも、４０１、４０３および４０９のようなブロッキンググループに対して５’に位置した機能性部位を除く全体）が複製され、単位複製配列の複製においてプライマーとして作用することである。
【００４８】
複数部位プライマーにおいてブロッキンググループを有するそれらの実施形態では、ブロッキンググループの目的は、プライマーの５’末端のいくつかの部分の複製を抑制することである。ブロッキンググループは、当業者には公知である。ブロッキンググループは、例えば、ヘキサエチレングリコールまたは窒素塩基がない脱塩基ヌクレオチドであってよい。ブロッキンググループは、機能性部位４０１、４０３、または４０９に関してのブロッキンググループ１０８Ｂの配置のように、機能性部位の複製を抑制するためにアンカー配列の５’末端に配置されてもよい；または、ブロッキンググループ１０８の配置のように、アンカー配列１０４内のあらゆる位置に配置されてもよい；鋳型分子が単位複製配列の場合、複製された短縮された配列とちょうど同じくらいの長さが、効率的なプライマーとして作用できるほどに十分長い。例示すると、複数部位プライマーが６のヌクレオチド長のフット配列を有し、それは３５ヌクレオチドが複製されることを要求していると仮定する。ブリッジ配列１０５は２４ヌクレオチド長である場合、アンカー配列の５ヌクレオチドは、所望のプライマー長を達成するためにブロッキンググループの下流（すなわち、３’）であるべきである。
【００４９】
３．命名法
後述の実施例において、本発明の複数部位プライマーの数を言及するために２つの命名法を用いている。
【００５０】
ひとつめの命名法において、複数部位プライマーは、以下のような形式で称される；例えば「２４−１４−５：１：１」プライマー、これは、２４ヌクレオチド長のアンカー配列、１４ヌクレオチド長のブリッジ配列、および７ヌクレオチド長のフット配列（フットの５’末端から、変異（ＭＵＴ）および野生型（ＷＴ）標的の両方に相補的な５ヌクレオチド、ＷＴ標的の相当するヌクレオチドには相補的でなく、ＭＵＴの相当するヌクレオチドには相補的であるひとつのｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、および最後に、両方の標的に相補的なひとつのヌクレオチドを含む）を称する。ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはプライマーの３’末端内（ｉｎｂｏａｒｄ）のひとつのヌクレオチドに配置され、このヌクレオチドを「３’最後から２番目の位置」（３’−ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に配置されると称する。
【００５１】
ブリッジ配列を、アンカーの結合配列およびフットの結合配列の間にある標的配列の領域（これを我々は「介在配列」と称する）と比較すると、いくつかの下記実施例の介在配列は、他においては（実施例８のように）、介在配列およびブリッジ配列は異なる長さを有しているのに対して、１４ヌクレオチド長であり、ブリッジ配列の長さと同じであることが分かる。介在配列の長さを特定するために、２番目の命名法がときに用いられる。この場合、「２４−１８／１０−５：１：１」複数部位プライマーは、その５’アンカー配列が２４ヌクレオチド長であり、そのブリッジ配列が１８ヌクレオチド長であって１０のヌクレオチド長である鋳型の介在配列の反対で生じ、その３’−フット配列が７ヌクレオチド長であって変異型および野生型鋳型の両方に十分に相補的である５’セグメントからなり、その後に変異鋳型の相当するヌクレオチドにのみ相補的であるｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅが続き、その後に変異および野生型鋳型の両方の相当するヌクレオチドに相補的である３’ヌクレオチドが続くことを意味する。
【００５２】
ブリッジ配列の配列は、プライマーアニーリングの間、ブリッジ配列と介在配列とのハイブリダイゼーションを抑制するために、介在配列に相補的でないようにして選択される。お互いのアニーリングの代わりに、アンカー配列およびフット配列が鋳型にハイブリダイズすると、ブリッジ配列および介在配列は、単一ストランドの「バブル」を形成する。我々は、ときに、ブリッジ配列と介在配列の組み合わせを、バブルと称する。例えば、２４−１４／１４−５：１：１の記号表示は、「１４／１４バブル」を意味する。
【００５３】
「バブルの外周」とは、ブリッジ配列のヌクレオチドの数と、介在配列のヌクレオチドの数と、アンカー配列の３’ヌクレオチドおよびその相補物（complement）と、フット配列の５’−末端ヌクレオチドおよびその相補物と、を足した合計として定義する。結果的には、２４−１４／１４−５：１：１複数部位プライマー（１４／１４バブル）の鋳型分子への結合により形成されたバブルの外周は、１４＋１４＋２＋２であり、３２ヌクレオチド長である。下記のリストは、下記実施例で用いられたいくつかのプライマーについて、この２番目のフォーマットを用いて記載する。
【００５４】
【化１】
0006544861.tif 000002
【００５５】
それぞれの超選択性プライマー内のブリッジ配列は下線を引き、そのフット配列のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは太字で下線を引いて示す。プライマーは、比較例でのそれらの使用を反映するグループとして配列させる。
【００５６】
４．使用
本発明は特定の目的とする標的、特定の増幅方法、または特定の機器に限定されない。比較目的として、我々は実施例１−８において、同じ目的とする標的、ＥＧＦＲ変異のＬ８５８Ｒ、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン検出を用いてプラスミドＤＮＡで開始する均一ＰＣＲ分析を用いて、および同じ熱サイクラーＢｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５分光蛍光熱サイクラーを用いて、いくつかの系の実験を提示している。我々は、実施例で報告されたものと一致した結果を与えた他の分析を行っている。このような分析は、ヒトＥＧＦＲ変異Ｔ７９０ＭおよびヒトＢ−ｒａｆ変異Ｖ６００Ｅを含む他の目的とする標的を利用し；ゲノムＤＮＡを利用し；分子標識プローブを用いた検出を含み；異なるＰＣＲパラメーターを利用し；および異なる機器ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００分光蛍光熱サイクラーを利用している。
【００５７】
実施例１は、完全にマッチした目的とする標的配列を増幅するために、また、プライマーが結合する配列の中央付近に配置された単一ヌクレオチド多型によって異なる目的とするものではないミスマッチな標的配列を増幅するために、２１ヌクレオチド長の従来のＰＣＲフォワードプライマーが使用されたコントロールアッセイである（ここで、他の実施例のように、従来のＰＣＲリバースプライマーも使用された）。最初の増幅反応混合物中の、顕著にそれらの蛍光を増加するための方式で二重ストランドの単位複製配列と結合するＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの含有によって二重ストランドの増幅生成物（または二重ストランドの「単位複製配列」）の均一な検出が可能となった。結果として、それぞれのＰＣＲ増幅サイクルの鎖延長ステージの終わりに測定されたＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの蛍光強度は、存在する単位複製配列の数の正確な指針を提供する。図５に提示したリアルターム動力学的蛍光曲線（蛍光強度対増幅サイクル数）は、１０１２の単位複製配列のオーダーで十分な二重ストランド生成物が生産され、１０６の鋳型で開始するＰＣＲ分析に典型的であるだいたい２０ＰＣＲサイクルが実施される時点で、バックグラウンドよりも大きく（ａｂｏｖｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）検出可能なシグナルを与える（閾値サイクル、「ＣＴ」と略される）ことを示す。図５は、また、フォワードプライマーが目的とするものではないミスマッチな標的に対して目的とする標的を選択する選択性をほとんど有していないことを示している。すなわち、ミスマッチな配列で開始する場合、閾値サイクル（ＣＴ）の顕著な遅れはない。熱動力学的に、ミスマッチなハイブリッドの安定性に比べて、完全に相補的なハイブリッドの安定性にほとんど違いはない（わずかながら起こりそうなミスマッチなプライマー−標的ハイブリッドの形成から作製される単位複製配列の出現において実質的に観測できる遅れはないという結果に終わる）。
【００５８】
実施例２には２つの追加的なコントロールが記載されており、ミスマッチな標的における置換されたヌクレオチドは、最初に、公知のＡＲＭＳ技術の従来のフォワードプライマーの３’末端ヌクレオチドで、次に、従来のフォワードプライマーの３’末端ヌクレオチドから１つのヌクレオチド内（ｉｎｂｏａｒｄ）で、置換される。我々は、単一ヌクレオチド多型が存在しうるまたは欠如しうる標的のヌクレオチドと反対であるプライマー配列内のヌクレオチドの位置を、「ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」と称することがある。これらのコントロールについてのリアルタイム動力学的曲線は図６に示されており、２０サイクル付近に残されたＣＴが目的とする標的とともに示されており、目的とする標的にとって増幅反応は、実施例１で報告されている増幅と同じくらい高い効率であることを示している。しかしながら、ミスマッチな標的とともに、ＣＴは、数サイクルによって遅延する。図６、フット配列の３’−末端でｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅと一緒であるプライマーの場合は、遅れ（１１サイクル）はだいたい１０サイクルであり、これは完全にマッチする目的とする標的に１０００倍（２１０は１，０２４）有利な選択性を示している。フット配列の３’末端の最後から２番目の位置であるｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの場合は、ＣＴはいくらか少なく、訳８サイクルである。実施例１および２を比較すると、目的とする標的の増幅の効率はプライマーの３’末端で、またはその付近でｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅが配置することによって減っておらず、単一ヌクレオチドによって異なる目的とするものではない標的に対する目的とする標的の選択性は改善されたことがわかる。我々は、ケト−エノール互変異性のために、標的配列の非相補的なヌクレオチドを有するミスマッチなｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅのいくつかの塩基対は頻繁に生じるため、選択性は制限されていると理解している。そのため、いくつかの好ましくない伸長が起こり、そのため単位複製配列が生成する可能性は、形成されるハイブリッドの可能性と得られるハイブリッドが伸長されうる構造を形成する可能性との乗算（ｔｉｍｅｓ）の積（ｐｒｏｄｕｃｔ）である。
【００５９】
実施例３は、本発明による複数部位プライマーでの同じ実験を示す。我々は、ここで用いられたプライマーを２４−１４−５：１：１と表記する。最初の数字、２４はアンカー配列のヌクレオチド長である。二番目の数字、１４は、ブリッジ配列のヌクレオチド長である（この実験において、本明細書で述べられた他の実験のように、明確に他を示す場合を除いて、標的の介在配列はブリッジ配列と同じ長さである）。最後の３つの数字、５：１：１は、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの５’であるヌクレオチドの数、次に、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの数（それは本明細書中、すべての実験において１である）、および最後はｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの３’であるヌクレオチドの数を与える、フット配列を言い表す。よって、この場合、フット配列は、最後から２番目のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを有する７ヌクレオチド長であった。これらのリアルタイム分析の結果、それぞれの熱サイクルの成立の後に存在する単位複製配列の数（それぞれのサイクルの鎖延長段階の終わりに決定される）を測定するためにＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度を活用することとして、図７に示されている。図５と図７とを比較すると、目的とする完全にマッチする標的を有するＣＴは、この場合は約３サイクル遅延されていることがわかる。目的とするものではない（フットのｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅに相補的でない単一ヌクレオチド多型を含む）標的を有するＣＴはさらにより遅延され、目的とする標的および目的とするものではない標的の間で約１９サイクルのΔＣＴを与える。これは、選択性が約５００，０００倍（２１９は５２４，２８８である）の差である。
【００６０】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、我々は、以下が真実であると信じる；
Ａ．たとえフット配列がアンカーハイブリッドによる鋳型につながれているとしても、フットはとても小さいので、そのような大きなバブル（鋳型のプライマーのブリッジ配列および介在配列を含む）によってアンカーハイブリッドから分離されており、アニーリング温度は、短いフット配列にとってはとても高いため、いつなんどきでも（ＰＣＲ分析のアニーリング工程の平衡状態）で、テストされる検体に存在する鋳型分子のきわめて小さい部分のみがフットといつなんどきでも、ハイブリダイゼーションすることができる。
【００６１】
Ｂ．さらに、フットおよび標的の間で形成するハイブリッドは相対的に弱く、そのためそれらが存続する間の平均時間（ｍｅａｎ  ｔｉｍｅ）はとても短い（おそらく１００マイクロ秒）。
【００６２】
Ｃ．所定の任意の時点で存在するハイブリッドの減少した可能性、および得られる弱いハイブリッドの減少した平均存続時間の両方の結果として、ハイブリッド（完全に相補的なハイブリッドであっても）とＤＮＡポリメラーゼとの間で安定な（伸長可能な）複合体が形成される可能性は極めて低い。
【００６３】
Ｄ．これは完全に相補的な（「変異」）標的から作られる単位複数配列の出現における約１０サイクルの遅れとして好ましい複数部位プライマー設計を用いて実施されるＰＣＲ分析で見られ（すなわち、約２０のＣＴに代えて、従来の直線状プライマーが１０６の完全な相補的標的とともに用いられるときに生じるように）、Ｃｔは約３０である。ＣＴ値の１０熱サイクルの増加は、ＤＮＡポリメラーゼおよび完全に相補的なフットハイブリッド間の安定な複合体の形成の可能性が、従来の直線状プライマーが同じ反応条件下で用いられた場合よりも１／１，０００より少ない可能性であることを示す。
【００６４】
Ｅ．それらの同じＰＣＲ条件下で、同じ好ましい複数部位プライマー設計を利用すると、ミスマッチな（「野生型」）標的で得られたＣＴ値は完全に相補的な標的で生じるＣＴ値よりも約２０サイクル遅く生じる。よって、複数部位プライマーの変わりに従来の直線状プライマーが用いられた同じ条件下で生じるだろうＣＴ値と比べると、これらのミスマッチな標的からの単位複製配列の出現に約３０サイクルの遅れがある。したがって、ＤＮＡポリメラーゼ分子およびミスマッチなフット標的配列と結合したフット配列を含むハイブリッド間の安定な複合体を形成する可能性は、非常に低い。ＣＴ値のこの３０サイクルの増加は、ＤＮＡポリメラーゼ分子およびミスマッチなフットハイブリッド間の安定な複合体を形成する可能性は、従来の直線状プライマーが同じ反応条件下で利用された場合よりも１／１，０００，０００，０００の低い可能性である。
【００６５】
Ｆ．目的とするものではない標的配列およびＤＮＡポリメラーゼ間の伸長可能な複合体を形成するこの劇的に低い可能性は、次の識別要素の生成物である：（ｉ）ミスマッチなハイブリッドのより低い安定性は（完全に相補的なハイブリッドの安定性と比べて）、いつなんどきであっても存在するミスマッチなハイブリッドの断片が明確に減少する（いつなんどきも存在することのできる完全に相補的なハイブリッドの断片に比べて）；および（ｉｉ）ミスマッチなハイブリッドのより低い安定性は、ハイブリッド平均持続時間がより短いという結果になり、よって、安定化した複合体を形成するハイブリッドを形成するためのＤＮＡポリメラーゼ分子の能力が明確に減少する。
【００６６】
実施例４は、実施例３の分析とともに示し、目的とするものではない標的配列の１０６コピーの複製のみを含む検体と、目的とするものでない標的配列の１０６コピーの複製の存在下の目的とする標的配列の１０またはそれ以上の複製を含む検体とで得られた異なった結果が容易に識別できる。希釈系において得られたリアルタイムＰＣＲの結果は（目的とするものではない標的配列の１０６コピーの複製を含む反応混合物の目的とする標的配列の１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１コピーの複製）、図８に提示しており、それらの結果より決定されたＣＴは図９に提示されており、それらは目的とする標的配列の開始する複製の数の対数に対してプロットされている。それらの図を参照すると、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの蛍光のＣＴは、目的とする標的の濃度の１０００倍の減少ごとに約１０サイクル遅れており、その上、目的とする標的配列の１０コピーの複製および目的とするものではない標的配列の１０６コピーの複製を有する検体は、目的とする標的配列の１０コピーの複製を有さず、および目的とするものではない標的配列の１０６コピーの複製を有する検体とは識別されることがわかる；すなわち、野生型配列に相当する１００，０００コピーの複製群におけるひとつの変異配列の検出は、可能である。さらに、開始する反応混合物における変異複製の数の対数に相当する閾値サイクルとともに分析は定量的である。
【００６７】
これらの結果は本発明による選択的プライマーの使用の以下の態様を確かにする：
Ａ．いったん複数部位プライマーがＰＣＲ分析のアニーリング段階の間でＤＮＡポリメラーゼと結合するハイブリッドを形成すると、その安定化したハイブリッドはＰＣＲ分析の伸長段階の間に伸長され、得られる単位複数配列は高い効率で複製される（標準的な直線状プライマーを用いて実施された反応を経由するように）。これは、もともと検体に存在する変異鋳型の数の１，０００のファクターによる減少は約１０熱サイクルによる単位複製配列のかなりの数の出現における遅れという結果になるという事実を理解されうる（例えば、図８および図９に示された結果の実験において、１００，０００の変異鋳型を有する検体のＣＴ値は約２７であり、１００の変異鋳型を有する検体のＣＴ値は約３７である）。熱サイクルごとに単位複製配列の数が効率的に２倍存在する場合、その後１０サイクル後、単位複数配列の１，０２４倍であるべきである（すなわち、２１０）。これらの結果は、テストされる検体に存在する変異鋳型から生成した単位複製配列がその後に効率的に増幅されることを確かにしている。
【００６８】
Ｂ．複数部位プライマーが生成物の単位複製配列（プラスの単位複製配列ストランド）が５’末端にいったん組み込まれると、合成の次のサイクルで生成した相補的な単位複製配列（マイナスの単位複製配列ストランド）がその３’末端に複数部位プライマーの全体の配列に完全に相補的である配列を有するため、効率的な単位複製配列の増幅が生じる。結果として、単位複製配列に関連して（元の鋳型分子とは対照的に）、複数部位プライマーは、単位複製配列のさらなる増幅についてそれらは従来の直線状プライマーであるようにふるまう。
【００６９】
Ｃ．テストされる検体に存在する完全に相補的な変異鋳型からの単位複製配列の並外れた選択的生成によって（テストされる検体に存在するミスマッチな野生型鋳型からの単位複製配列の生成に比べて）、いったん単位複製配列が合成されるとプライマーによる単位複製配列の効率的な増幅と組み合わせて、得られるリアルタイムデータを、テストされる検体に存在する変異鋳型分子の数を定量的に測定するのに用いることが可能である。
【００７０】
異なる数の変異鋳型分子を含む検体から得られたＣＴ値に反映されるように、テストされる検体に存在する標的分子の数の対数および単位複製配列の所定の数で合成されるために行われる熱サイクルの数の間には逆の直線関係（ＰＣＲ分析のような指数関数的増幅反応における）がある。Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｌｉｚａｒｄｉ  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：４０１−４０２を参照。ＣＴ値対それぞれのテストされる検体に存在する目的とする（変異）鋳型分子の数の対数のプロットの直線性は、結果が図９に示されている実験の例に関して、野生型鋳型から生成する顕著な単位複製配列はないことを示している（それぞれの検体に存在する１，０００，０００の野生型鋳型分子を通してさえも）。野生型鋳型から生成する多くの単位複製配列があると、わずかな変異鋳型のみを含む検体についてのＣＴ値は、低くなるだろう（すなわち、結果は、多量の目的とするものではない標的分子から合成された望まない単位複製配列の出現は、非常に希少な目的とする標的分子からの単位複製配列の出現を覆い隠すであろうために、直線を形成しない）。
【００７１】
実施例５で報告されたように、我々は、３つのプローブ系：２４−１４−４：１：１、２４−１４−５：１：１および２４−１４−６：１：１での実施例４の分析を用いた増幅反応で、複数部位プライマーのフットの長さの効果を検討した。アンカー配列の長さは２４ヌクレオチドで維持した。ブリッジ配列の長さは１４ヌクレオチドで維持し、標的配列間の同じ単一ヌクレオチドの相違を維持し、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの位置はフットの３’末端の最後から２番目の位置で維持した。フット配列の長さは、４から５、６へとｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの位置のヌクレオチド５’の数を変化することで、６ヌクレオチドから７ヌクレオチド、８ヌクレオチドへと変化させた。得られたＣＴ値を表１に要約し、目的とする標的配列の開始複製数の対数に対して、図１０にプロットした。直線１００１（フット長６）、１００２（フット長７）および１００３（フット長８）はデータに適合している。なお、図９について上記に報告されているように、３つすべてのプライマーは、定量的な結果を提供していることが分かる。また、フィットライン（ｆｉｔｔｅｄ  ｌｉｎｅｓ）１００１、１００２および１００３は同等に近く（ｃｌｏｓｅ  ｔｏ  ｐａｒａｌｌｅｌ）、ＣＴおよび３つのすべてのフット長の開始複製数の対数の間の同一の定量的関係を示すことがわかる。図１０は、フットの長さを短くすることによりＣＴが遅延することを示しているが、図１０に見られるように、フットの長さを短くすることも、目的とする標的配列の１０６〜１０１コピーの複製からのデータのより良い直線フィットを提供する（すなわち、フット長が短いほど、テストされる検体の多量の目的とするものではない標的分子から合成された単位複製配列は、同じ検体中に存在する希少な目的とする標的配列分子から合成された単位複製配列を覆い隠すであろうことが起こりにくい）。
【００７２】
実施例６で報告したように、我々はまた、３つのプライマーの系：２４−１０−５：１：１、２４−１４−５：１：１、および２４−１８−５：１：１の実施例４の分析を用いて、複数部位プライマーのブリッジ配列ならびに目的とする、および目的とするものではない標的配列の介在配列から形成されたバブルの外周の増幅に対する効果を検討した。我々は、２４ヌクレオチドでアンカー配列の長さを維持し；５：１：１でフット配列を維持し、ブリッジ配列の長さを１０から１４〜１８ヌクレオチドに変化させて、標的内の介在配列が、そのプライマーのブリッジと同じ長さになるように、各複数部位プライマーのためのアンカーの配列を選択した。その結果、３つのプライマーのそれぞれによって形成される（ヌクレオチドで表される）のバブルの外周は、そのフット配列が標的（アンカーハイブリッドとフットハイブリッドにより寄与された４つのヌクレオチドを含む）とハイブリダイズしたときには、それぞれ２４、３２および４０であった。得られたＣＴ値を表２に要約し、図１１に目的とする標的配列の開始複製数の対数に対してプロットした。直線１１０１（バブル外周２４）、１１０２（バブル外周３２）および１１０３（バブル外周４０）がデータに適合している。なお、図９および図１０として上記に報告されているように、３つすべてのプライマーは、定量的な結果を提供していることが分かる。また、フィットライン１１０１、１１０２および１１０３は、平行に近く、ＣＴと３つすべてのバブル外周についての開始複製数の対数との間には同一の定量的関係が存在していることがわかる。図１１はまた、バブルの外周の増加はＣＴを遅延することを示しているが、図１１のように、バブルの外周を増加させることは、目的とする標的配列の１０６〜１０１コピーの複製でデータのより良好な直線フィットを与える（すなわち、バブルが大きいほど、テストされる検体中の多量の目的とするものではない標的分子から合成された単位複製配列は、同じ検体中に存在する希少な目的とする標的分子から合成された単位複製配列を不明瞭にすることが起こりにくい）。
【００７３】
これらの実験的観察は、より短いフットの長さ、および／または、より大きなバブルにより、ハイブリッド形成がかなり起こりにくいことを引き起こし、より短いフットの長さ、および／または、より大きなバブルにより、ＣＴ対目的とする標的分子の数の対数のプロットの改善された直線性によって証明されるミスマッチな野生型鋳型に対して高い選択性をもたらすことを論証している。これがそうである理由を理解するために、我々は、ＰＣＲ分析のアニーリング段階の間に存在する平衡状態の下でフットハイブリッド形成の熱力学を調査した。これが私たちの理解である：
Ａ．我々のＰＣＲアッセイに存在する複数部位プライマーは非常に高い濃度で存在する（各反応で合成することができる約１０単位複製配列に組み込まれるように利用可能である十分な複数部位プライマーが必要であるように）。したがって、これらのＰＣＲアッセイのアニーリング段階で存在する平衡状態下で、実質上あらゆる鋳型分子は、迅速に複数部位プライマーのアンカー配列に結合される。さらに、アンカー配列が長いので（例えば、２４ヌクレオチド）、アンカー配列と鋳型分子との間の結合は非常に強力で、長時間、平均で、持続する（おそらくは、分で測定される）。平衡状態で、これらの固定された複合体の非常に小さな部分で、短いフット配列は、鋳型分子とハイブリダイズする。任意のある瞬間に、フット配列にハイブリダイズされていない固定された複合体の濃度は、「［Ａ］」であり、フット配列にハイブリダイズされた固定された複合体の濃度は、「［Ｂ］」である。これらの２つの状態の相互関係を表す一般的平衡定数（「ｋ」）は以下で表される：
【００７４】
【数１】
0006544861.tif 000003
【００７５】
熱力学的に、平衡状態でハイブリッドを形成する確率は、両方のハイブリッド強度（エンタルピー）、２つの配列が相互作用をしてハイブリッドを形成することができるようになる確率を決定する物理的な関係（エントロピー）に依存する。平衡定数は、そのフット配列がハイブリダイズされたフット配列とハイブリダイズしていない、固定化された複合体の変換の際に生じるエンタルピーの変化（ΔＨ）、および、そのフット配列がハイブリダイズされたフット配列とハイブリダイズしていない、固定化された複合体の変換の際に生じるエントロピーの変化（ΔＳ）から決定され、以下の一般式により決定される：
【００７６】
【数２】
0006544861.tif 000004
【００７７】
ここで、Ｒは熱力学的気体定数、Ｔはケルビン温度、およびｌｎ（ｋ）は平衡定数の自然対数である。この方程式を変形して、ｋを表すと：
【００７８】
【数３】
0006544861.tif 000005
【００７９】
ここで、Ｅ＝２．７１８２８である。全く同じ反応において、ハイブリダイズしたフット配列を有する複合体の割合（θ）は次式によって表される：θ＝［Ｂ］／（［Ａ］＋［Ｂ］）。しかしながら、（複数部位プライマーを用いる反応の場合のように）、［Ｂ］が非常に小さくなるにつれて、θが０に近づき、次のようにθの方程式を表すことができる：
【００８０】
【数４】
0006544861.tif 000006
【００８１】
方程式４でθを表す式は方程式１におけるｋを表わす方程式と実質的に同じであるため、我々は、一般的な熱力学的パラメーター、ΔΗおよびΔＳに対して、ハイブリダイズしたフットを有するプライマー−鋳型複合体の非常に低量の関係式（θ）を得るために、方程式３でｋに対してθを以下のように置き換えることができる：
【００８２】
【数５】
0006544861.tif 000007
【００８３】
ＰＣＲ条件の下で起こる、核酸ハイブリダイゼーション反応のために、量（ΔΗ−ＴΔＳ）は正の値であり、よってｅは、θに小数値を与えるため、負の数まで上昇される。（ΔΗ−ＴΔＳ）の値が小さいほど、分数θは小さくなる。また、ＰＣＲ反応のアニーリング段階の間、Ｔは一定である。したがって、θは、複数部位プライマーの設計の変化の結果として変更されているかを理解するために、我々は、複数部位プライマーが目的とするものではない標的にハイブリダイズされる場合に比べて、目的とする標的にハイブリダイズされる場合のその設計時の効果を理解するために、それぞれのプライマー設計のためのΔΗおよびΔＳの値の大きさを考慮する必要がある。
【００８４】
Ｂ．エントロピーは分子複合体を形成することができる立体構造的に異なる状態の数の尺度である。よって、固定化された複合体のフットがその標的にハイブリダイズしたとき、複合体を形成することができる位相的に異なる状態の数が、高い数字から低い数字に移る。よって、フットハイブリッドを形成する際のエントロピーの変化（ΔＳ）は、負の値を有する。
【００８５】
Ｃ．エンタルピーは、分子複合体の安定性の尺度であり、複合体を含有する溶液中に存在するエネルギーの量で表す。核酸ハイブリッドを解離するために高温が必要とされるため、複合体がバラバラにされ、熱エネルギーが複合体の形成の際に放出されたとき、熱エネルギーを加える。したがって、フットハイブリッド形成時のエンタルピーの変化（ΔΗ）は、負の値を有する。
【００８６】
Ｄ．複数部位プライマーがＰＣＲアッセイで使用される場合、ハイブリダイズしたフット配列を有する複合体の割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ）（θ）は、式５で十分に表される。フットの長さを変化させた、またはバブルの外周を変化させた上述の実験において、唯一の変数はΔΗとΔＳである。フットハイブリッドの形成のために、ΔΗおよびΔＳは負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）であり、ギブス自由エネルギー（ΔＧ）として知られる量（ΔΗ−ＴΔＳ）は正である。その結果、量ＴΔＳは、ΔＨよりも大きな負である。フット配列を有する複合体の割合（θ）を計算するという点で、ΔＨの負の大きさが小さいほど、θは小さくなるだろう。同様に、ΔＳの負の大きさが大きいほど、θは小さくなるだろう。
【００８７】
Ｅ．フットハイブリッドを有する複合体の割合（θ）における異なるフット長の効果を決定するためには、何よりも等しく、ΔＨが負でなくなるにつれて、フットハイブリッドの長さがより短くなることを実現することが必要である。その結果、フットハイブリッドの長さが短いほど、いつなんどきも、フットハイブリッドを有するプライマー−標的複合体の割合が低くなる。
【００８８】
Ｆ．同様に、フットハイブリッドを有する複合体の割合（θ）における異なるバブルの外周の効果を決定するためには、何よりも等しく、ΔＳが負でなくなるにつれて、バブルの外周がより大きくなることを実現することが必要である。その結果、バブルの外周が大きいほど、いつなんどきも、フットハイブリッドを有するプライマー−標的複合体の割合が低くなる。
【００８９】
Ｇ．これらの実現を考えて、複数部位プライマーにおけるフット配列の設計がどのように完全に相補的な標的配列（目的とする標的配列）とミスマッチな標的配列（目的とするものではない標的配列）との間を識別するのに貢献するのか見てみよう。例えば、図８および図９に結果を示した実験で用いた複数部位プライマーは、異なる長さのフットを有していた（「１：１：６」または「５：１：１」、または「４：１：１」）。それらの名称は、それぞれのフット全長が、プライマーの３’末端の最後から２番目の位置に位置するｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを有してそれぞれ８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、または６ヌクレオチドであった（すなわち、目的とする標的配列の対応するヌクレオチドに相補的であるか、目的とするものではない標的配列の対応するヌクレオチドに相補的でないかのいずれかである）ことを示す。
【００９０】
Ｈ．我々が最後から２番目の位置にキーヌクレオチドを配置する理由は、単離された塩基対は、ＰＣＲアッセイのアニーリング温度（約６０℃）で安定であることが極めて起こりにくいため、我々は、最後から２番目の塩基対は、（ミスマッチであるため）形成できない、末端塩基対もまた、形成できない（フットの３’ヌクレオチドが標的の対応するヌクレオチドに相補的であっても）ということを信じているからである。よって、与えられたフット配列について、ミスマッチなハイブリッドは、完全に相補的なハイブリッドよりも２つの塩基対分短くなるだろう。
【００９１】
Ｉ．これは、（概念的に）意味することです；ポイントを説明するために、それらが定数であるため温度（Ｔ）＝１と仮定し、気体定数（Ｒ）＝１と仮定します。完全に相補的な６：１：１フットとのハイブリッドの形成のためのΔＨ値は−１６であり、短いミスマッチな６：１：１フットとのハイブリッド形成のためのΔΗ値は−１２である。それでは、バブルの円周によって決定されたこれらのハイブリッドの両方のためのΔＳ値が−２０であることを想像してみよう。したがって、完全に相補的なハイブリッドのためのΔＧ値が（２０−１６として計算）４であり、ミスマッチなハイブリッドのためのΔＧ値は、（２０−１２として計算）８である。方程式５にこれらの値を差し込むと、目的とする標的と形成されるハイブリッドのためのθの概念値（θｍ）はｅ−４に等しく、その値は０．０１８３である。比較すると、目的とするものではない標的と形成されるハイブリッドのためのθの概念値（θｗ）は、値０．０００３３５であるｅ−８と等しい。この概念的な例では、完全に相補的なハイブリッドの存在量は、ミスマッチなハイブリッドの存在量よりも５４．６倍大きい。この計算は、本発明による複数部位プライマーの使用が、存在する目的とする標的と形成されるフットハイブリッドの確率に比べて（任意の時点で）、目的とするものではない標的と形成されるフットハイブリッドの確立が（任意の時点で）はるかに低い確率となることを示しているが、この差は、目的とする標的から合成された単位複製配列のＣＴに比べて、目的とするものではない標的から合成された単位複製配列のＣＴにおける大きな遅延となるが、θｍとθｗの実際の値はこの概念的な例とは異なるであろう。
【００９２】
Ｊ．今度は５：１：１フットを有する複数部位プライマーの同様な概念的な計算を行う。この場合、５：１：１フットとの完全に相補的なハイブリッドの形成のためのΔΗ値は−１４であり、４：１：１フットとミスマッチなハイブリッドの形成のためのΔΗ値は−１０である；得られるΔＧ値（同じサイズのバブル、ΔＳ＝−２０として）は以下の通りである：完全に相補的なハイブリッドのΔＧ値は６（２０−１４＝６として計算）であり、ミスマッチなハイブリッドのΔＧ値は１０（２０−１０＝１０として計算）である。これらの値を方程式５に挿入すると、目的とする標的と形成されるハイブリッドのθの概念値（θｍ）は０．００２４８の値で、ｅ−６と等しい。比較すると、目的とするものではない標的と形成されるハイブリッドのθの概念値（θｗ）は０．００００４５４の値で、ｅ−１０と等しい。驚いたことに、この概念的な例において、完全に相補的なハイブリッドの確立は、ミスマッチなハイブリッドの確立よりも５４．６倍大きい。
【００９３】
Ｋ．今度は４：１：１フットを有する複数部位プライマーの同様な概念的な計算を行う。この場合、４：１：１フットとの完全に相補的なハイブリッドの形成のためのΔΗ値は−１２であり、４：１：１フットとミスマッチなハイブリッドの形成のためのΔΗ値は−８である；得られるΔＧ値（同じサイズのバブル、ΔＳ＝−２０として）は以下の通りである：完全に相補的なハイブリッドのΔＧ値は８（２０−１２＝８として計算）であり、ミスマッチなハイブリッドのΔＧ値は１２（２０−８＝１２として計算）である。これらの値を方程式５に挿入すると、目的とする標的と形成されるハイブリッドのθの概念値（θｍ）は０．０００３３５の値で、ｅ−８と等しい。比較すると、目的とするものではない標的と形成されるハイブリッドのθの概念値（θｗ）は０．０００００６１４の値で、ｅ−１２と等しい。また、さらに驚いたことに、この概念的な例において、完全に相補的なハイブリッドの確立は、ミスマッチなハイブリッドの確立よりも５４．６倍大きい。よって、我々は、たとえより短いフットが低い値のθという結果になったとしても、またより短いフットが増加したＣＴ値という結果になったとしても、厳密な熱力学的観点から、より短いフット配列によって目的とする標的配列および目的とするものではない標的配列の間の識別の強化につながることに信じる理由はないと推論する。
【００９４】
Ｌ．さらに、たとえバブルの外周の増加がθの値を低下したとしても、起こりにくいハイブリッドの形成を行うとしても、バブルの外周が増加することは、目的とするものではないハイブリッドから形成されたフットハイブリッドと比べて、目的とする標的から形成されたフットハイブリッドの平衡の比率を変化させないことは明らかである。
【００９５】
Ｍ．典型的な熱力学的分析の観点では、どのような複数部位プライマーであったとしても、フットハイブリッドを形成する分子複合体の割合が極度に低い場合においては、目的とする標的と形成されるフットハイブリッドの割合（θｍ）の比率は、目的とするものではない標的と形成されるフットハイブリッドの比率（θｗ）に比べて、バブルの外周の増加によっては影響されず（これはΔＳを変える）、フットの長さの減少によっても影響されない（これはΔＨを変える）ことを示されることができ、むしろこれらの変化は、比率（θｍ／θｗ）を変えないがθｗおよびθｍの両方の値を減少させ、これはエンタルピーにおける差（ΔＨｍ−ΔＨｗ）の関数である。結果として、古典的な熱力学的視点から、目的とするものではないハイブリッドと比べて相対的に多量な目的とするハイブリッドに影響するただひとつのことは、それらのエンタルピー値における相違であり、この相違は形成された塩基対の数における相違の結果であり、これは、たとえどんなフットの長さであったとしても同じである。比率（θｍ／θｗ）を示す熱力学的方程式は以下である：
【００９６】
【数６】
0006544861.tif 000008
【００９７】
図１０および図１１に示した実験結果は、バブルの外周を増加させ、フットの長さを減少させることが、本発明による複数部位プライマーの選択性を顕著に増加させることを証明している；すなわち、複数部位プライマーの設計におけるこれらの変更は、多量のフットハイブリッドを減少させるけれども、識別比率（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ  ｒａｔｉｏ）（θｍ／θｗ）を顕著に増加するが、これは、この識別比率における増加は１０６目的とする標的分子で得られたＣＴおよび１０６の目的とするものではない標的分子で得られたＣＴの間のＣＴ値における相違（ΔＣＴ）の増加によって証明されるためである。これらの観察は、本発明による複数部位プライマーの並外れた選択性のために付加的である（おそらく非熱力学的な理由で）ことを意味している。
【００９８】
本発明による複数部位プライマーがＰＣＲ増幅分析のアニーリング段階の平衡条件下で、任意の瞬間に存在するフット標的の比率を減少させるために設計された場合に生じる強化された選択性についての説明は、ＡＲＭＳの識別結果にある。なぜなら、ＤＮＡポリメラーゼ分子がプライマーの３’−末端ヌクレオチドを含む塩基対を有していないハイブリッドを拒絶する程度が、それらのプライマーがどれほど多量であったとしても同じであるからである。それでも、希少なフットハイブリッドを形成するようにプライマーが設計された場合に追加的な識別メカニズムが並外れた選択性を可能にすることは実験的な結果から明らかである。
【００９９】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、我々は、フットの長さを減少させ、バブルの外周を増加させることが選択性を向上させると考えている理由は、ここにある。説明としては、ＰＣＲアッセイのアニーリング段階の間に存在する比較的高い温度で、非常に短いフットハイブリッドのみがそれらが解離する前の非常に短い時間存在する（おそらく、数十または数百マイクロ秒で測定される）という我々の予期しない認識にある。さらに、ハイブリッドが短いほど、バブルの外周が大きいほど、そのハイブリッドが存在する間の平均時間がより短くなる。我々は、特定のタイプのハイブリッドの平均持続時間が短くなるほど、ＤＮＡポリメラーゼ分子にとって、それらのハイブリッドのひとつと出会い、それにより鎖延長を受けることのできるそのハイブリッドとの安定な複合体が形成することがより起こりにくくなると推測する。ここで重要な点は、ハイブリッドがＤＮＡポリメラーゼ分子と安定化複合体を形成するかどうかはそのハイブリッドの平均持続時間の関数であるということである。我々は、プライマーのフットの長さが減少し、バブルの外周が増加する場合、特定の複数部位プライマーで形成された完全に相補的なハイブリッドの平均持続時間の比率は、同じタイプの複数部位プライマーで形成されたミスマッチな（より短い）ハイブリッドの平均持続時間に比べて、より大きいと信じている。よって、より厳しい複数部位プライマー設計（より短いフット、より長いバブル）により、ＤＮＡポリメラーゼ分子との安定化ハイブリッドを非常に形成しにくい、より短い生きたハイブリッドを産生する。結果として、より短いフットハイブリッドは、多量でないだけでなく、それらはＤＮＡポリメラーゼ分子との安定化ハイブリッドを形成する低められた機会を有し、この追加の識別性質は複数部位プライマーの並外れた選択性の主要因である。
【０１００】
実施例７に報告されているように、我々はまた、本発明による複数部位プライマーのフット配列におけるinterrogating nucleotideの位置を変化させた場合の効果を調べた。我々は、６つのプライマーのシリーズを利用した；２４−１４−６：１：０、２４−１４−５：１：１、２４−１４−４：１：２、２４−１４−３：１：３、２４−１４−２：１：４、および２４−１４−１：１：５。我々は、アンカー配列の長さ、ブリッジ配列の長さ、およびフット配列の長さ（７ヌクレオチド）を維持して、フット配列内の（interrogating nucleotideの位置だけを変化させた。目的とする標的（変異）の１０６コピーの複製および目的とするものではない標的（野生型）の１０６コピーの複製を有するそれぞれのプライマーから得られたリアルタイム蛍光結果は、図２に示し、計算されたＣＴ値を表３に要約した。結果は、interrogating nucleotideの位置がフットの３’末端に近づくにつれて、目的とする標的配列と目的とするものではない標的配列との間の区別（ΔＣＴ）のウィンドウが次第に増加することを示している。これらの結果は、interrogating nucleotideのための好ましい位置はフットの３’末端（ＡＲＭＳ識別を可能にする）、およびフットの３’の最後から二番目のヌクレオチドである（１つの塩基対の形成を抑制するというよりむしろ、形成を抑制するための２つの塩基対をもたらす）。
【０１０１】
実施例８で報告したように、我々はまた、本発明による複数部位プライマーのブリッジ配列と、目的とするおよび目的とするものではない標的配列中の介在配列との間に形成されたバブルの形状を調べた。我々は、これら２つの配列の相対的な長さを選択することで、「バブルの形状」を変更した。アッセイを実施するときに、我々は、２４ヌクレオチド長のアンカー配列を有し、５：１：１フット配列を有するプライマーのシリーズを使用した。我々は、３２ヌクレオチドでバブル外周を維持し、（鋳型分子へのハイブリダイゼーションの際に、」介在配列が所望の長さとなるように、アンカーの配列を変更することによって）ブリッジ配列の長さおよび介在配列の長さを変化させた。対称的なバブル、すなわち、１４ヌクレオチド長のブリッジ配列を有するプライマーおよび１４ヌクレオチド長になる介在配列を引き起こすアンカー配列（１４／１４バブル）を形成する複数部位プライマーをテストすることに加えて、我々は、相対的に長いブリッジ配列を有する非対称なバブル（１８／１０バブルおよび１６／１２バブル）、および相対的に短いブリッジ配列を有する非対称なバブル（１２／１６バブルおよび１０／１８バブル）を産生する複数部位プライマーをテストした。目的とする標的（変異）の１０６コピーの複製および目的とするものではない標的（野生型）の１０６コピーの複製を有するこれらのプライマーから得られたリアルタイム蛍光結果は、図１３に示し、計算されたＣＴ値を表４に要約した。結果は、目的とする標的配列と目的とするものではない標的配列との間の区別（ΔＣＴ）のウィンドウが、対称な１４／１４バブルで、とても穏やかでありながら最も大きいことを示す。結果として、我々の最も好ましいバブルは対称である。
【０１０２】
実施例９は、異なる標的であるＢ−ｒａｆ変異Ｖ６００Ｅ（ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒの代わりに）およびその変異における２４−１４−５：１：１複数部位プライマーについて実施例４のアッセイ方法を利用している実験を報告している。図１４は、ＣＴ対目的とする標的鋳型の開始数の対数のグラフである。図１４からわかるように、このアッセイは、１０６のＷＴ鋳型を含む検体および１０６のＷＴ鋳型の存在下で１０６のＭＵＴ鋳型を含む検体の間の２３．１サイクルのΔＣＴを提供したもので、これは実施例４で達成した対応するΔＣＴよりもさらに大きい。
【０１０３】
実施例１０では、ＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍならび野生型標的鋳型の１０，０００までのコピーを有するゲノムＤＮＡおよび２４−１４−４：１：１複数部位プライマーを用いるＰＣＲ増幅を利用する、他のバリエーションを報告している。図１５は、ＣＴ対目的とする標的変異鋳型の開始数の対数のグラフである。図１５からわかるように、このアッセイは、１０４のＷＴ鋳型を含む検体および１０４のＷＴ鋳型の存在下で１０４のＭＵＴ鋳型を含む検体の間の１２．６サイクルのΔＣＴを提供したものである。
【０１０４】
実施例１１は、鋳型が消化されていないこと以外は、異なる分光蛍光サーマルサイクラー、ＡＢＩＰＲＩＳＭ  ７７００、同じ２４−１４−５：１：１複数部位プライマー、およびプラスミドＤＮＡを用いて、実施例４におけるＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒのためのアッセイと同様のアッセイを報告している。図１６は、ＣＴ対目的とする標的鋳型の開始数の対数のグラフである。図１６からわかるように、このアッセイは、１０６のＷＴ鋳型を含む検体および１０６のＷＴ鋳型の存在下で１０６のＭＵＴ鋳型を含む検体の間の１６．４サイクルのΔＣＴを提供したものである。
【０１０５】
図１７は、実施例１２で記載した実験の結果を示す。実験は、本明細書に記載の複数部位の選択性を決定する際の酵素（ＡＲＭＳ型）検討事項（ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ）に比べて、熱力学的検討事項の相対的な寄与を示すために設計された。我々がしたことは、２４−１４−５：１：１プライマーを用いるだけでなく、３’−最後から２番目のヌクレオチドと末端ヌクレオチドとを省略した不完全な２４−１４−５：０：０プライマーを用いて、実施例３のアッセイを繰り返したことである。よって、後者のプライマーのフット配列は目的とする標的配列および目的とするものではない標的配列の両方に完全相補的であった。図１７、パネルＡは、２つのタイプの鋳型間で識別するために、熱力学的だけでなくＡＲＭＳでも行われているように、フット／標的ハイブリッドが３’末端で不安定化されている２４−１４−５：１：１複数部位プライマーを有する１，０００，０００の目的とするものではない標的配列の増幅に対して１，０００，０００の目的とする標的配列の増幅を比較する。プライマーのＣＴ値は、目的とする標的配列については２３．１であり（曲線１７０１）、目的とするものではない標的配列については４０．７（曲線１７０２）であり、１７．６サイクルのΔＣＴを与えた。
【０１０６】
図１７、パネルＢは、フット／標的ハイブリッドが３’末端で不安定化されてない２４−１４−５：０：０複数部位プライマーを有する１，０００，０００の目的とするものではない標的配列の増幅に対して１，０００，０００の目的とする標的配列の増幅を比較する。プライマー２４−１４−５：０：０のＣＴ値は、目的とする標的配列については３９．７であり、目的とするものではない標的配列については３９．４であり、−０．３サイクルのΔＣＴを与えた。
【０１０７】
不完全なプライマー２４−１４−５：０：０と同様に、複数部位プライマー２４−１４−５：１：１は、野生型鋳型内の同じ５ヌクレオチドとフットハイブリッドを形成する（曲線１７０２）。これは、このプライマーのｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは単一ヌクレオチド多型に相補的でなく、フット配列の最後から２番目の位置で得られるミスマッチな塩基対は、このプライマーのフット配列の隣接の３’−末端ヌクレオチドが、解離した塩基対を形成することを抑制するためである。しかしながら、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：０：０によって形成されたハイブリッドおよび野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：１：１によって形成されたハイブリッドの間には相違があり、その相違は、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：１：１によって形成されたハイブリッドにおけるフット配列は、３’−最後から２番目のミスマッチによって引き起こされた２つの突き出した（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）ヌクレオチドを有し、それゆえに、ＤＮＡポリメラーゼによるＡＲＭＳ型識別を受ける。これに対して、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：０：０によって形成されたハイブリッドにおける不完全なフット配列は、突き出された３’−末端塩基対を有しておらず、よって、ＤＮＡポリメラーゼによるＡＲＭＳ型識別を受けない。もしＡＲＭＳ型識別が本発明による複数部位プライマーが利用される際の選択性において重要な役割を担う場合、我々は、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：０：０を伴う反応のＣＴ値（曲線１７０４）は、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：１：１を伴う反応のＣＴ値（曲線１７０２）よりも低いであろうことを予測していた。これはＡＲＭＳ型識別は、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：０：０を伴う反応におけて役割を担うことができないが、野生型鋳型とプライマー２４−１４−５：１：１を伴う反応における識別役割を担うことができるためである。これらの結果は、本発明による複数部位プライマーが利用された場合（おそらく、これらの高い選択的核酸増幅プライマーによって形成されたフットハイブリッドの極度に短い平均持続時間の結果として）、ＡＲＭＳ型識別の役割がなく、または顕著に減少したことを示している。
【０１０８】
本発明によるアッセイは、複数の可能な希少な標的のうちのひとつが存在する場合、あらゆる希少な標的の存在を探索するスクリーニングアッセイを含んでいてもよい。このようなアッセイについて、複数部位プライマーは、それぞれの可能な希少な標的について用いられるが、検出はどの標的が存在するかを同定することを必要としない。よって、無差別に信号を送る二重標識ハイブリダイゼーションプローブでありうるように、無差別に信号を送るプライマー上の５’機能性配列でありうるように、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン染料は検出試薬として用いられることができる。本発明による複数部位プライマーを採用するアッセイは、１つの標的または複数の標的が存在することを特定する必要がある単一の反応管、反応ウェル、または他の反応容器に、２以上の希少な標的配列の定量を同時に含んでいてもよい、増幅および検出を含む。単一の反応管内での、均一な配列を有しておらず、ゲノム内の異なる位置に位置している２以上の希少な標的配列の増幅および検出（例えば、異なる遺伝子に位置する希少な単一ヌクレオチド多型の同時検出）は、複数部位プライマーから下流の増幅された生成物のストランドのいずれかの特異的な配列にハイブリダイズする分子標識プローブ、ＲｅｓｏｎＳｅｎｓｅプローブ、または５’−ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴａｑＭａｎ）プローブのような、それぞれ異なる目的とする標的配列について、特定の、特異的に着色された、ハイブリダイゼーションプローブを含んでいてもよい。これは、浮遊性検出器（ｆｒｅｅ−ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）プローブだけでなく、図４の分子標識プローブ４０９のような繋がれたプローブにも適用する。代わりとして、それぞれ異なる標的配列のための複数部位プライマーは、図４のヘアピン構造４０４のような、標識ヘアピン構造を含んでいてもよい。図４を参照すると、２以上の異なる複数部位プライマー１０３、異なる希少な標的配列のためのそれぞれ特定のプライマー、および特異的に着色された蛍光標識４０８、４１３、または４１６を有するそれぞれ標識されたプライマーは、個々の検体に存在するそれぞれの目的とする標的配列を識別および定量するのに同時に用いられうる。
【０１０９】
５．多重アッセイ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙｓ）
本発明の超選択性プライマーの特に魅力的な特性は、同じ臨床検体内で異なる希少な変異配列の存在量を同時に測定する多重アッセイにおけるそれらの潜在的使用である。これらのアッセイの結果は、それぞれ個々のための治療を調整するための患者特有の情報を提供することができる。魅力的な多重ラベリング戦略は、その実現に基づいており、これは、ブリッジ配列と目的とする標的配列との間に関係がないため、分析設計者が多重アッセイにおいて同時に存在する異なる超選択性プライマーそれぞれのために、明確に異なるブリッジ配列を自由に選択するためである。各プライマーの全配列は、プライマーがその変異標的に結合した際に生成される単位複製配列の不可欠な部分となるので、ブリッジセグメントの独特の核酸配列は、それが生成された場所から変異標的を識別する単位複製配列内の「シリアルナンバー」として機能することができる。
【０１１０】
これらの特定のブリッジ配列は比較的長くすることができ（例えば、それらの特異性を確保するために２０ヌクレオチド長）、プライマーは、鋳型内に相対的に短い介在配列を形成するように設計することができる。臨床検体に存在する異なる変異標的配列を同時に検出および定量をするために、特定の分子標識プローブのセット（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４，  ３０３−３０８，  Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９８）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １６，  ４９−５３，およびＢｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  ６１７１−６１７６）が、リアルタイムな遺伝子増幅反応において、超選択プライマーのひとつの独特のブリッジ配列の相補体についてそれぞれ特有に、異なる色のフルオロフォアで標識されたものとして含まれうる。
【０１１１】
これらの反応において、超選択性フォワードプライマーの濃度が制限されるべきこと、および直線状の（ｌｉｎｅａｒ）リバースプライマーは過剰に存在すべきことが好ましく、よって、反応が対称的でなく、豊富ではない相補的な単位複製配列から顕著な競争がない状態で、分子標識が過剰に合成されたすべての単位複製配列と可視的に結合できることを保証する（Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０２，  ８６０９−８６１４）。特定の変異型を検出するために設計された超選択性プライマーが、野生型標的配列に対して識別するのと同様にして、隣接のまたは代替の変異に対して識別するため、これらの多重分析は、同じコドン内で生じる異なる変異型を識別さえできる。
【０１１２】
別の多重化戦略は、図１８に示されており、これは密接に関連する目的とする標的配列のための多重化反応において用いられてもよい、本発明による２つの複数部位プライマーの模式図である。
【０１１３】
多重アッセイにおいて目的とする標的配列間のまたは目的とする標的配列の中の配列均一性がある場合、独特の配列は、それぞれ異なる目的とする標的配列、独特のブリッジ配列を利用することによって、導入することができる。図２に関連して上述したように、リバースプライマーは、全フォワード（複数部位）プライマーを、リバース生成物ストランド内で複製し、よって、増幅の続くサイクルにおいて、全複数部位プライマー（アンカー配列、ブリッジ配列、およびフット配列）はリバースプライマーの伸長によって作られた生成物と相補的である。多重アッセイにおいて、複製された一つの複数部位プライマー、「正しい」プライマーのみがハイブリダイズし、そのリバース生成物ストランドを準備することが重要である。よって、十分に明確な「正しい」複数部位プライマーのブリッジ配列を作製し、他の複数部位プライマーがそのリバース生成物ストランドにプライムする（いわゆる「クロスハイブリダイゼーション」）ことを抑制させるべきであることに留意すべきである。ブリッジ配列の相補体に対して標的にされている特定の、特異的に着色されたハイブリダイゼーションプローブ、浮遊性またはプライマーに繋がれたハイブリダイゼーションプローブは、ひとつの目的とする標的のみの増幅の信号を送り、複数部位プライマー自身へのハイブリダイズによって誤った信号を送らないだろう。同様に、特異的に着色されたヘアピン構造の後尾部（図４のヘアピン構造４０５）を有する「正しい」複数部位プライマーのみがリバース生成物ストランドとハイブリダイズして、信号を送る。
【０１１４】
ほとんど同一である（１または２つの単一ヌクレオチド多型のみによってお互いが異なっている）、およびゲノム内で互いに非常に近くで生じる（例えば、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の医学的に重要な変異鋳型、これは、異なる単一ヌクレオチド多型がコドン１２内で生じることができるものであり、遺伝子のコードされたタンパク質という点において異なるアミノ酸の同一性をそれぞれ特定する）異なる希少な標的配列の発生を識別し定量化するために、２以上の複数部位プライマーは図１８または図１９に描かれた構造を有するものを利用することができる。図１８から始めると、上部構造１０３Ａは、フット配列１０６Ａが特定の目的とする希少な標的配列と完全に相補的である複数部位プライマーを示し、相補的なヌクレオチド「ｇ」（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に相当する標的配列という点でヌクレオチドを含む。下部構造１０３Ｂは、フット配列１０６Ｂが、フット１０６Ｂのための標的の変異型であり、フット１０６Ａのための目的とする標的配列のゲノム内の位置に（または非常に近くに）位置している、異なる特定の希少な目的とする標的配列と完全に相補的である複数部位プライマーを示す。フット配列１０６Ｂにおいて、ヌクレオチド「ｈ」は、フット１０６Ｂの目的とする標的配列内の対応するヌクレオチドに完全に相補的であるｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅである。同じ反応におけるそれらの希少な標的配列のそれぞれの存在量を同時に識別すること、または識別および定量化を可能にするために、プライマー１０３Ａは、特異的な構造４０４Ａに結合されることができ、プライマー１０３Ｂの構造４０４Ｂにおいて、配列４０５Ｂおよび４０６Ｂならびに蛍光色素分子標識４０８Ｂとは配列４０５Ａおよび４０６Ｂならびに蛍光色素分子標識４０８Ａで異なっている。類似の目的とする希少な標的配列を同時に（または非常に類似の位置で）識別および定量化するためにプライマー１０３Ａおよび１０３Ｂのような２以上の複数部位プライマーが同時に用いられる場合、それらのそれぞれのアンカー配列が同一で、または非常に類似であるケースがしばしばある（識別された変異配列が生じる場所に近い所望の位置でプライマーが結合することを引き起こすために）。しかしながら、本発明の複数部位プライマーのブリッジ配列とその目的とする標的配列との間には関連がないため、プライマー１０３Ａのブリッジ配列１０５Ａは、そのヌクレオチド配列がプライマー１０３Ｂのブリッジ配列１０５Ｂとは異なるように選択されうる。これは、本発明の２以上の複数部位プライマーが、お互いに対立遺伝子であり、ゲノム内で同じ位置に（または非常に類似した位置に）位置する希少な目的とする標的配列を識別および定量化するために同時に用いることができる方法である。
【０１１５】
リバースプライマー２０３の伸長（図２）は、標識構造４０４Ａおよび４０４Ｂを通じて継続し、消光分子４０７が蛍光色素分子ラベル４０８Ａおよび４０８Ｂからそれぞれ分離する。結果として、それらの鎖延長サイクルの終わりにそれらの蛍光強度がリアルタイムで測定されている場合（ＰＣＲ増幅反応におけるような、単位複製配列が二重ストランドになる増幅反応において）、それらが単位複数配列に導入されたときに、プライマー１０３Ａおよび１０３Ｂは、それらの特異的な識別色でそれぞれ蛍光を発する。代わりとして、合成が同じプライマーの導入によって開始された単位複製配列ストランド２０４（図２）の３’末端でその十分に相補的な配列に結合する各プライマー（１０３Ａまたは１０３Ｂ）の結果として、それらの消光分子グループ４０７はそれらの蛍光色素分子標識（４０８Ａまたは４０８Ｂ）から分離されるため、それらの蛍光強度が増幅反応のアニーリング段階の終わりに測定されるときに、プライマー１０３Ａおよび１０３Ｂは、それぞれ、それらの特異的な識別色で蛍光を発する。
【０１１６】
図１９は、識別ヘアピン構造後尾部というよりはむしろ浮遊性分子標識プローブを利用する同じようなアッセイについてのプライマーおよびプローブについて記載する。図１９において、複数部位プライマー１９０３Ａは、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ「ｒ」を含む特定の第１の目的とする希少な標的配列に完全に相補的であるフット配列１９０６Ａを有する。複数部位プライマー１９０３Ｂは、フット配列１９０６Ａのための標的の変異型であり、フット１９０６Ａの目的とする標的配列のゲノム内の位置に（または非常に近い位置に）位置する、異なる特定の第２の目的とする希少な標的配列に完全に相補的であるフット配列１９０６Ｂを有する。フット配列１９０６Ｂにおいて、ヌクレオチド「ｓ」はｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅである。
【０１１７】
この実施形態において、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ「ｒ」は第２の希少な標的配列または野生型配列のどちらかに相補的でない。また、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ「ｓ」は第１の希少な標的配列または野生型配列のどちらかに相補的でない。クロスハイブリダイゼーションを抑制するだけでなく、同じ反応における２つの希少な標的配列の増幅生成物と識別することを可能にするために、ブリッジ１９０５Ａの配列はブリッジ１９０５Ｂの配列と全く相違して作られる。分子標識プローブ１９０７Ａは、ループ１９０８Ａ、ステム１９０９Ａおよび消光分子１９１１Ａから構成されており、ブリッジ配列１９０５Ａの相補体について特定なループを有する。分子標識プローブ１９０７Ｂは、ループ１９０８Ｂ、ステム１９０９Ｂおよび蛍光色素分子１９１０Ｂから構成されており、ブリッジ配列１９０５Ｂの相補体について特定なループを有する。蛍光色素分子１９１１Ａおよび１９１１Ｂは異なる色である。プローブ１９０７Ａおよび１９０７Ｂによる検出はリアルタイムまたは終点でありうる。  異なる目的とする希少な対立遺伝子標的配列から生成された異なる単位複製配列で作られるための同時リアルタイム測定を可能にする重要な特徴は、本発明の複数部位プライマーがそれらの識別ヘアピン構造後尾部（例えば、４０４Ａおよび４０４Ｂ用）において、およびそれらのブリッジ配列（例えば１０５Ａおよび１０５Ｂ）において、全く異なる配列を有するように設計することができることである。従って、各タイプのプライマーのみが、合成がプライマーの同じタイプによって開始された単位複製配列に結合することを保証するようにアニーリング条件を調整することができる。さらに、プライマーの特定のタイプが非同族単位複製配列に結合した場合、そのプライマーの末端にシグナル伝達のヘアピン型構造は、単位複製配列の３’末端で配列に相補的ではないであろうし、よって、蛍光が生じないであろう。単に反応において同時に存在するであろうそれぞれの複数部位プライマーのための異なるブリッジ配列を利用するための代替として、異なるアンカー配列は、ひとつを短くすることにより、または配列に沿ってそれをスライドすることにより利用されうる。代わりに、ブリッジ配列のための異なる長さ（例えば、１０５Ａおよび１０５Ｂ）により、それぞれのプライマーの選択性を顕著に変えることをせずに、異なるアンカー配列（例えば、１０４Ａおよび１０４Ｂ）の使用が可能となるだろう。これは、プライマー１０３Ｂおよびプライマー１０３Ｂのためのプライミング配列を含む非同族単位複製配列の間のミスマッチなハイブリッドの形成の可能性を低めるだけでなく、プライマー１０３Ａおよびプライマー１０３Ｂのためのプライミング配列を含む非同族単位複製配列の間のミスマッチなハイブリッドの形成の可能性を低めるだろう。
【０１１８】
６．複数部位プライマーの設計のための付加的な検討事項
本発明による複数部位プライマーの設計は、直接的である。我々は、機器がそれらの検出および蛍光の定時において特に変化するように、設計が特定の機器における特定の増幅プロトコルのためであることを推奨する。好適な手順は、設計を選択することである。（アンカー長、ブリッジ長およびフット長、３’−末端ヌクレオチドまたはフットの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドに位置するｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅとともに）。そして、ブリッジ配列長およびフット配列長を単に変化することにより、わずかな試験において、目的とする標的を含む検体および目的とするものではない標的配列を含む検体の間の所望の大きなΔＣＴを達成するためえのプライマー設計が最適化できる。これは、目的とする標的配列を増幅するためには非効率なプライマーを作ることを伴う。設計のための検討事項としては、実施例に関連して上述した。特に、フット配列を短くすること、およびブリッジ配列および標的の介在配列により形成されるバブルのサイズを増加させることは、目的とする標的でＣＴの遅れを増加し、目的とする標的を含む検体および目的とするものではない標的を含む検体の間のΔＣＴを増加する。
【０１１９】
本発明の複数部位プライマーを設計する際の追加的な検討事項がある。プライマーは、検体に存在する、または存在するかもしれない他の配列を準備してはならない。それを抑制するための従来のコンピューター法がよく知られており、容易に利用できる。
【０１２０】
ａ．アンカー配列
アンカー配列は通常（必ずしもではないが）、鋳型配列に完全に相補的で、それは通常、フット配列の５’末端から約１４ヌクレオチドに位置され、通常、１５−４０、１５−３０または２０から３０（２０から２４のような）ヌクレオチド長でありうる。その長さは、それが鋳型と形成するハイブリッドの融点が、例えばいくつかの実施例における６６℃から７２℃のような好適な範囲となるように選択される。
【０１２１】
特定の多型に対して識別するように設計された複数部位プライマーのアンカー配列が、その標的配列は、ゲノムの他の場所に存在するため、十分に特定でないと判明した場合、この問題は同じ多型に対して識別するが、相補的な標的ストランドに結合する複数部位プライマーを設計することによって解決されるかもしれない。
【０１２２】
ｂ．ブリッジ配列
ブリッジ配列に関して、我々は、点検を行うこと、および必要であれば、その配列が標的と低いＴｍハイブリッドを形成することができる場合に生じるかもしれない一時的なハイブリダイゼーション事象を取り除くことを推奨する。それにより、その効果的な長さが減少する。また、ブリッジの効果は、異なるヌクレオチド配列がいくぶん異なる硬さを有するように、ブリッジ配列の硬さを調節することで変更されうる。Ｇｏｄｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  ８５：２４００−２４０３を参照。
【０１２３】
一例では、ブリッジ配列は、長さが少なくとも約６（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０）ヌクレオチドでありうる。そのヌクレオチド配列が、アニーリング条件下で、以下を保証するために選択されうる；（ｉ）鋳型ストランド（フット標的配列およびアンカー標的配列の間に位置する）の相当する「介在配列」にハイブリダイズしない；（ｉｉ）ヒトゲノム中の任意の配列にハイブリダイズしない；（ｉｉｉ）効果的にその長さを短くするであろうアッセイ条件下で任意の二次構造を形成しない；および（ｉｖ）相補的な鋳型ストランドの合成を準備するために用いられた従来のリバースプライマーにハイブリダイズしない。さらに、鋳型ストランドの介在配列が、その長さを効果的に短くするアッセイ条件下で二次構造を形成した場合、ブリッジ配列の長さが増加されうり、介在配列の長さは相当する数のヌクレオチドによって減少されうる（同じ数のヌクレオチドによりフット標的配列に近いアンカー標的配列を選択することにより達成される）。
【０１２４】
ブリッジ配列が相対的に短いまたは相対的に長いように選択されうるという実現、およびプローブ設計者がブリッジセグメントのためのあらゆる任意の配列を選択できるという実現は、本発明の超選択性プライマーの設計における多くの機能的な可能性を広げる。
【０１２５】
例えば、鋳型において自然に発生する推定の介在配列の配列は、アッセイ条件下で二次構造を形成するようである場合、プライマーはプライマー−鋳型ハイブリッドにおいて相対的に小さな介在配列を作成するように設計され、それにより二次構造の形成を破壊し、プライマーのブリッジ配列は相対的により長い長さであるように選択され、それによりアッセイの選択性を保護する（表４に示された結果を参照）。さらに、プライマー機能は、介在配列およびブリッジ配列のフレキシビリティにおける相違を考慮するブリッジのための配列を選択することにより微調整されうる。
【０１２６】
さらに、超選択プライマーのための適切なブリッジ配列の選択は明らかに、プライマーダイマーのような偽の単位複製配列の発生を抑制することができる。従来の直線状プライマーの設計とは異なり（配列は、それが結合する鋳型によって決定される）、任意の配列は、ブリッジセグメントのために使用される。我々は、ブリッジ配列を選択するために以下のことを注意する：二次構造を形成しない（ｉ）二次構造を形成しない；（ｉｉ）鋳型の配列、ゲノムＤＮＡの配列、および従来のリバースプライマーの配列とは無関係である；さらに（ｉｉｉ）全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）のプライマーに組み込まれると、プライマーは自己ハイブリダイゼーションができない。
【０１２７】
ｃ．ブリッジ配列および介在配列によって形成されたバブルの役割
上述の許容範囲内において、元の鋳型分子と超選択性プライマーのハイブリダイゼーションによって形成されたバブルの外周が大きくなるほど、野生型単位複製配列合成の抑制は変異単位複製配列合成の抑制に対してより大きくなる（例えば、図１１を参照）。熱力学的観点から、より大きなバブルは、野生型ハイブリッドおよび変異ハイブリッドの両方の平衡存在量を減少させるべきであり、それらの相対的存在量を変化させるべきではない。しかしながら、動力学的観点から、フットハイブリッドを標的ハイブリッドに連結するバブルに作用する力を考慮することが適当である。なぜなら、バブルは反応混合物における水分子のランダムなブラウン運動を受けるためである。これは、フットハイブリッドを引き離す可能性を有する力を作る。バブルの外周が大きくなるほど、この潜在的な破壊力が大きくなる。さらに、ミスマッチな野生型ハイブリッドは、完全に相補的な変異ハイブリッドよりも弱いが、より引き離されやすい。
【０１２８】
したがって、ミスマッチな野生型ハイブリッドは、それらのより低い安定性のためにより短い時間で存在するだけでなく、それらは、より容易にバブルに作用するランダムな力によって引き離される。したがって、我々は超選択的プライマーの並外れた選択性は、ハイブリッドの安定性に影響を与える熱力学的要因と、得られるハイブリッドの平均持続時間に影響する動力学的要因との両方から生じると考えている。
【０１２９】
ｄ．フット配列
フット配列は、プライマーの３’末端に位置している；それは、例えば、単一ヌクレオチド多型が配置され、それが通常７ヌクレオチド長であるような、目的とする標的配列およびそれに密接に関連した目的とするものではない標的配列の間で少なくともひとつのヌクレオチド鎖がある鋳型ストランドの領域に相補的である。フット配列の「ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ」は、フット配列の３’末端の最後から２番目の位置、またはフット配列の３’末端に配置されてもよい。フット配列の長さは、選択性を改善するために変化されうる。フット配列は、特に高いＧ−Ｃ含量を有する場合、より短くされうる（６または５ヌクレオチド長）。ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅが野生型鋳型ストランドとＧ：Ｔ塩基対を形成する場合、相補的な鋳型ストランドが結合できるようにプライマーを設計することが望ましい。
【０１３０】
フット配列が標的配列にハイブリダイズした場合、およびハイブリッドがバラバラになる前にＤＮＡポリメラーゼがハイブリッドと機能性複合体を形成することができる場合、フット配列の伸長は、単位複製配列を産生するためにＤＮＡポリメラーゼによって触媒されうる。例えば６または７ヌクレオチド長の短いフット配列は通常、テストされる検体内（例えばヒト細胞からのゲノムＤＮＡ内）に存在するかもしれない核酸内の多くの異なる位置で生じる配列に相補的であるように短いことが好ましいだろう。しかしながら、フット配列はかなり短く、結果として、ＰＣＲアッセイで用いられた条件のような増幅で用いられた条件下で、非常に低い融点Ｔｍを有する。プライマーのアンカー配列が、所望の標的配列から離れたごくわずかなヌクレオチドであるテストされる核酸内の位置と第１のハイブリダイズをしない場合、フット配列は、テストされる核酸検体において完全に相補的な配列とハイブリッドを形成しないだろう。
【０１３１】
本明細書の方法で開示された方法でいったん設計されると、アッセイ条件下でそれらが内部ヘアピン構造またはセルフダイマーを形成しにくくなることを確保するために、およびそれらが従来のリバースプライマーを用いてヘテロダイマーを形成しないことを確保するために、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒコンピュータープログラム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，アイオワ州）のような任意の適切なコンピュータプログラムを用いて、プライマー配列は調べられうる。
【０１３２】
７．キット
本発明はさらに、増幅および検出方法を含む、上述の増幅方法を実施するための試薬を含む試薬キットを含む。そのためには、本明細書に開示される方法のための１以上の反応成分は、標的核酸の検出に使用するためのキットの形態で供給されうる。そのようなキットでは、１つ以上の反応成分の適切な量は、１つ以上の容器内に提供されるか、または基板上に保持される（例えば、静電的相互作用または共有結合によって）。
【０１３３】
本明細書に記載のキットは、上述の１以上のプライマーを含む。キットは、本発明の１以上のプライマーを含む１以上の容器を含むことができる。キットは、単一の容器中に単一のプライマーを含むことができ、同じプライマーを含む複数の容器、本発明の２以上の異なるプライマーを含む単一の容器、または異なるプライマーを含むもしくは２以上のプライマーの混合物含む複数の容器であってもよい。プライマーおよび容器のあらゆる組み合わせと順序とは、本発明のキットに包含される。
【０１３４】
キットはまた、上記の方法を実施するための追加の材料を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明のプライマーを使用する方法を実施するための試薬、材料の一部またはすべてを含む。キットは、このように、本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うための試薬のいくつかまたはすべてを含んでもよい。キットの構成要素の一部または全ては、本発明のプライマーを含む容器とは別の容器で提供されうる。キットの追加の成分の例としては、限定されるものではないが、１以上の異なるポリメラーゼ、コントロール核酸に対して、または標的核酸に対して特異的である１以上のプライマー、コントロール核酸に対して、または標的核酸に対して特異的である１以上のプローブ、重合反応のための緩衝液（ＩＸまたは濃縮形態）、および重合生成物を検出するための１以上の染料または蛍光分子が挙げられる。キットは、以下の構成要素の１以上を含むことができる：担体、停止剤、修飾剤または消化剤、浸透圧調節物質、および検出プローブを検出するための装置。
【０１３５】
増幅および／または検出工程において使用される反応成分は、様々な形態で提供されてもよい。例えば、成分（例えば、酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中でまたは凍結乾燥もしくは凍結乾燥粉末、ペレット、またはビーズとして、懸濁させることができます。後者の場合、成分は、再構成されたときに、アッセイで使用するための成分の完全な混合物を形成する。
【０１３６】
キットまたはシステムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、本明細書に記載の成分の任意の組み合わせを含むことができ、成分を使用するために具体的な形態で記録された機器を含んでもよい。いくつかの用途では、１つ以上の反応成分は、個々の、典型的には使い捨てのチューブまたは同等の容器に、予め測定された単回使用量で提供されてもよい。このような構成により、標的核酸の存在についてテストされる検体は、個々のチューブに添加され、増幅は直接行われる。キットで提供される成分の量は、任意の適切な量とすることができ、製品を対象とするターゲット市場に依存してもよい。適切な量を決定するための一般的なガイドラインは、例えば、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１  ；および  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ２００３の中に見出すことができる。
【０１３７】
本発明のキットは、本発明の方法を実施するのに有用な、任意の数の追加の試薬または物質を含むことができる。このような物質としては、これらに限定されないが：細胞溶解用の試薬（緩衝液を含む）、二価カチオンキレート試薬または不要なヌクレアーゼを阻害し、プライマー、ポリメラーゼおよび反応の他の構成要素が適切に機能していることを確保するための使用におけるＤＮＡ制御する他の試薬、ＤＮＡ断片化試薬（緩衝液を含む）、増幅反応試薬（緩衝液を含む）、および洗浄溶液。本発明のキットは、任意の温度で提供されうる。例えば、液体中にそのタンパク質成分または複合体を含むキットの保存のために、それらは、０℃以下、好ましくは−２０℃以下で、またはそうでなければ凍結状態で、提供され、維持されることが好ましい。
【０１３８】
成分が供給された容器としては、例えば、供給された形状を保持することが可能な任意の従来の容器とすることができ、例えば、マイクロチューブ、アンプル、ボトル、または流体装置、カートリッジ、ラテラルフロー、もしくは他の類似の装置などのような一体の試験装置などがある。キットは、標的核酸の増幅または検出に使用するための標識または非標識の核酸プローブのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットはさらに、本明細書に記載される方法のいずれかの成分を使用するための説明書を含むことができ、例えば、核酸抽出および／または精製することなく粗の基質を使用する方法などがある。
【０１３９】
キットはまた、容器または容器の組み合わせを保持するためのパッケージング材料を含むことができる。そのようなキットおよびシステムのための典型的な包装材料は、例えば、あらゆる種々の形状で（例えば、バイアル、マイクロタイタープレート、マイクロアレイなどの中で）反応成分または検出プローブを保持する固体基質（例えば、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子等）を含む。
【０１４０】
８．追加の定義
本明細書で使用する場合、用語「標的核酸」または「標的配列」とは、標的核酸配列を含有する核酸を意味する。標的核酸は、核酸一重ストランドまたは二重ストランドであってよく、そして多くの場合、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの組合せの誘導体である。「標的核酸配列」、「標的配列」、または「標的領域」は、一重ストランド核酸の核酸配列のすべてまたは一部を含む特定の配列を意味する。標的配列は、核酸一重ストランドまたは二重ストランド核酸の任意の形態であってもよい、核酸鋳型内にあってもよい。鋳型は、精製もしくは単離された核酸であってもよいし、または精製されていないもしくは単離されていない核酸であってもよい。
【０１４１】
本明細書において用いられているように、用語「増幅」およびその変異は、少なくともいくらかの部分のポリヌクレオチドの多重複製または相補体を生産するためのあらゆる工程を含み、このポリヌクレオチドは、典型的には、「鋳型」と呼ばれている。鋳型ポリヌクレオチドは、一重ストランドまたは二重ストランドでありうる。与えられた鋳型の増幅は、ポリヌクレオチドの増幅生成物群の生成という結果になり、まとめて「単位複製配列」と称される。単位複製配列のポリヌクレオチドは、一重ストランドまたは二重ストランド、または両方の混合物でありうる。典型的には、鋳型は、標的配列を含み、そして得られた単位複製配列は実質的に同一または標的配列と実質的に相補的であるいずれかの配列を有するポリヌクレオチドを含むだろう。いくつかの実施形態では、特定の単位複製配列のポリヌクレオチドは、互いに、実質的に同一、または実質的に相補的である；代わりに、いくつかの実施形態では、与えられた単位複製配列内のポリヌクレオチドは互いに変化するヌクレオチド配列を有することができる。増幅は、線形または指数関数的に進行することができ、２以上の増幅生成物を形成するために、与えられた鋳型の繰り返しの連続した複製を含むことができる。いくつかの典型的な増幅反応は、鋳型に基づく核酸合成の連続した繰り返しのサイクルを含み、少なくともいくらかの鋳型のヌクレオチド配列を含む多量の娘ヌクレオチド（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の形成という結果となり、鋳型と少なくともある程度のヌクレオチド配列の同一性（または相補性）を共有する。いくつかの実施形態では、増幅の「サイクル」と称されうる核酸合成の各例は、遊離３’末端を作成することを含み（例えば、二重ストランドＤＮＡの一方の鎖をニッキングすることにより）、それによって、プライマーおよびプライマー伸長段階を生成する；任意に、追加の変性工程は、鋳型が部分的または完全に変性されていることを含みうる。いくつかの実施形態では、１ラウンド（ｏｎｅ  ｒｏｕｎｄ）の増幅は、与えられた数の増幅の単一サイクルの繰り返しを含む。例えば、増幅のラウンドは５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上の特定のサイクルの繰り返しを含みうる。例示的な一実施形態では、増幅は、特定のポリヌクレオチド鋳型が、核酸合成の２つの連続サイクルを受ける。合成は、鋳型依存性核酸合成を含みうる。
【０１４２】
用語「プライマー」または「プライマーオリゴヌクレオチド」は、鋳型核酸にハイブリダイズして、核酸合成のための鋳型核酸の組成物による伸長ヌクレオチドを導入する開始点として作用することができる核酸のストランドまたはオリゴヌクレオチドを意味する。「伸長ヌクレオチド」は、増幅の間に伸長生成物に組み込まれることのできるあらゆるヌクレオチドを意味し、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体であり、それはラベルを含んでいてもよい。
【０１４３】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」または「アニール」は、２つの連続したストランドが水素結合によって連結された安定な二重ストランド構造または領域（しばしば「ハイブリッド」と称される）を形成するために、並列または好ましくは逆平行配向で、特定されたハイブリダイゼーション条件（例えば、厳しいハイブリダイゼーション条件）下で、完全にまたは部分的に相補的な核酸ストランドが一体となる能力を意味する。水素結合は、典型的には、アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）の間に形成するが、他の塩基対を形成してもよい（例えば、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｈ，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  １１ｔｈ  ｅｄ．，  １９９２）。
【０１４４】
用語「厳しいハイブリダイゼーション条件」または「厳しい条件」は、プローブまたはオリゴマーが、他の配列ではなく、その目的とする標的核酸配列に特異的にハイブリダイズする条件を意味する。厳しい条件は、よく知られている要因、例えば、ＧＣ含量と配列長さに依存して変化してもよく、分子生物学の当業者に知られている一般的な方法を用いて経験的に予測してまたは決定してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｈ，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｈ．  １１，  ｐｐ．  １１．４７−１１．５７，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．））。
【０１４５】
本明細書に開示されているように、数値の範囲の数が提供される。それぞれの介在する数値は、文章で明確にそうでないと示さない限りは、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限および下限の間に、明確に開示されていると理解される。その記載された範囲内の任意の記載された数値または介在する数値と、その記載された範囲内の他の記載されたまたは介在する数値との間のそれぞれのより小さい範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して含まれてもよいし、または範囲から除外され、どちらかの、どちらでもない、または両方の制限がより小さい範囲に含まれている各範囲が、本発明に包含され、その記載された範囲内で、特に除外された制限を受ける。記載された範囲が制限の１つもしくは両方、またはそれらの包含された制限のどちらかもしくは両方を除外する範囲を含むことは本発明に含まれる。
【０１４６】
「約」という用語は、一般的に、示された数のプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％から１１％の範囲を示してもよいし、「約１」は、０．９〜１．１を意味してもよい。「約」の他の意味は、文脈から明らかであり、四捨五入をしてもよく、例えば、「約１」も、０．５から１．４であってもよい。
【実施例】
【０１４７】
実施例１：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒおよび従来の直線状プライマー
２つのＰＣＲ増幅および検出アッセイは、鋳型として、ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒを含むプラスミドＤＮＡまたは単一ヌクレオチド多型によって互いに異なっている、対応する野生型配列を含むプラスミドＤＮＡのいずれかを用いて行った。従来のフォワードおよびリバースプライマーは、４９ヌクレオチド長の二重ストランド増幅生成物を生成するために使用された。フォワードプライマー（ＦＰ）は、プライマー配列の中央付近にｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを含む従来のプライマーであった。リバースプライマー（ＲＰ）は、両方の標的配列に完全に相補的である従来のプライマーであった。次のようにプライマー配列および変異対立遺伝子（ＭＵＴ）を有する目的とする標的配列は、以下の通りである：
【０１４８】
【化２】
0006544861.tif 000009
【０１４９】
フォワードプライマー配列において、野生型鋳型にはミスマッチであるが、変異標的鋳型に相補的であるヌクレオチドは、太字で、下線付き、およびより大きく示した。変異標的配列において、フォワードプライマーのための結合部位には下線を引き、リバースプライマーの配列は下線を引いてある。また、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには太字で、下線を引き、より大きく示した。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、変異対立遺伝子に結合されたフォワードプライマーの算出されたＴｍは６７．５℃であり、リバースプライマーの算出されたＴｍは６４．０℃である。
【０１５０】
プラスミドをｐＧＥＭ−１１Ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異または対応するＥＧＦＲ野生型配列のいずれかを含有する１１５塩基対のＥＧＦＲ遺伝子断片を挿入することによって調製した。変異および野生型プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化させた。消化混合物は、１０単位Ｍｓｅ  Ｉと、５ｍＭ  ＫＡｃ、２ｍＭのトリスのＡｃ（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＭｇＡｃ、１％ウシ血清アルブミン、および１００μΜジチオトレイトールを含む２０μＬ量における変異または野生型ゲノムＤＮＡの４μｇとを含有していた。反応は、３７℃で１２０分間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間インキュベートし、酵素を不活性化した。
【０１５１】
５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ（ライフ  テクノロジーズ）、２５０μΜのそれぞれの４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、６０ｎＭの各プライマー、および１ｘＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（ライフ  テクノロジーズ）を含む３０μＬ量で、ＰＣＲ増幅を行った。このシリーズでは、反応混合物は、変異鋳型（ＭＵＴ）の１０６のコピーまたは野生型鋳型（ＷＴ）の１０６コピーのいずれかを含有していた。増幅は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社ＩＱ５分光蛍光サーマルサイクラー中で０．２ｍＬのポリプロピレンＰＣＲチューブ（白）を用いて行った。サーマルサイクリングプロファイルは、９５℃で１０分で行い、続いて、９４℃１５秒間、６０℃１５秒間、および７２℃２０秒間の６０サイクルを行った。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、各鎖伸長段階（７２℃）の終了時に測定した。
【０１５２】
リアルタイム蛍光の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図５に示されている。曲線５０１は、１０６のＭＵＴ鋳型を含む反応であり、曲線５０２は１０６のＷＴ鋳型を含む反応である。分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。これらの値は２０．０（曲線５０１）および１９．７（曲線５０２）であった。左上角のグラフは、中間にｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（円）を有する従来のフォワードプライマー（直線）の模式図である。
【０１５３】
実施例２：ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒおよび３’末端Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを有する従来の直線状プライマー
ＰＣＲ増幅および検出アッセイは、実施例１に記載の変異型（ＭＵＴ）および野生型（ＷＴ）鋳型を用いて行った。この実験においては、フォワードプライマーは、変異鋳型に完全に相補的であるプライマーだが、ＷＴ鋳型にミスマッチな３’末端を有する、すなわちプライミング配列の３’末端にＩｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを有する「ＡＲＭＳプライマー」である。我々は、実施例１と同じリバースプライマーを用いた。プライマー配列および変異対立遺伝子（ＭＵＴ）を有する目的とする標的配列は、以下のとおりである：
【０１５４】
【化３】
0006544861.tif 000010
【０１５５】
フォワードプライマー配列においては、変異標的鋳型に相補的だが野生型鋳型にミスマッチなヌクレオチドは、下線を引いた、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーの結合部位には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。また、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには下線を引き、より大きな、太字にする。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、変異対立遺伝子に結合されたフォワードプライマーの算出されたＴｍは６０．７℃であり、リバースプライマーの算出されたＴｍは６４．０℃である。
【０１５６】
実施例１で記載したように、ＰＣＲ増幅を実施した。リアルタイム蛍光強度の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図６、パネルＡに示されている。図６、パネルＡは、曲線６０１は、１０６のＭＵＴ鋳型で開始する反応であり、曲線６０２は、１０６のＷＴ鋳型で開始する反応である。分析機器は、自動的に各曲線の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。これらの値は、１９．４（曲線６０１）および３０．４（曲線６０２）であり、１．１サイクルのΔＣＴとなった。グラフの左上角は、
プライマーの３’末端に位置したｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（円）を有する従来のフォワードプライマー（直線）の概略図である。
【０１５７】
上述の実験は、その３’末端の最後から２番目の位置でのｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅを保有するフォワードプライマーを用いて繰り返した（プライマーの３’末端にＧを追加し、プライマー長さを維持するために５’末端のＣを除去した）。得られたリバースプライマーの配列は以下の通りである：
【０１５８】
【化４】
0006544861.tif 000011
【０１５９】
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラム、および上述の同じ反応条件を用いて、変異対立遺伝子に結合されたフォワードプライマーのＴｍの計算値は６１．９℃であった。
【０１６０】
リアルタイム蛍光の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図６、パネルＢに示されている。図６、パネルＢにおいて、曲線６０３は、１０６のＭＵＴ鋳型で開始する反応であり、曲線６０４は１０６のＷＴ鋳型で開始する反応である。機械で算出されたＣＴ値は１９．１（曲線６０３）および２７．８（曲線６０４）であり、８．８サイクルのΔＣＴとなった。グラフの左上角は、プライマーの３’末端の最後から２番目の位置に位置したｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（円）を有する従来のフォワードプライマー（直線）の概略図である。
【０１６１】
実施例３：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒおよび２４−１４−５：１：１複数部位プライマー（リアルタイムデータ）
２つのＰＣＲ増幅および検出アッセイは、実施例１に記載の変異体（ＭＵＴ）および野生型（ＷＴ）鋳型を用いて実施された。この実験では、フォワードプライマー（ＦＰ）は、本発明による複数部位プライマーである。我々は、実施例１と同様のリバースプライマーを使用した。
【０１６２】
我々の命名法では、この実施例で使用される複数部位プライマーは２４−１４−５：１：１プライマーと称され、２４ヌクレオチド長であるアンカー配列、１４ヌクレオチドの長であるブリッジ配列、および７ヌクレオチド長であるフット配列を意味する（フットの５’末端から、ＭＵＴおよびＷＴ標的の両方に相補的な５ヌクレオチド、ターゲットに相補的な５ヌクレオチド、ＷＴ標的の対応するヌクレオチドに相補的でないがＭＵＴ標的の対応するヌクレオチドに相補的であるひとつのｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、最後に、両方の標的に相補的であるひとつのヌクレオチドを含む）。ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅはプライマーの３’末端内のひとつのヌクレオチドに位置しているため、我々は、このヌクレオチドを「３’−最後から２番目の位置」に位置すると称している。アンカーの結合配列とフットの結合配列との間に存在する標的配列の領域のブリッジ配列（我々は「介在配列」と称している）を比較すると、この実施例における介在配列は、１４ヌクレオチド長であり、ブリッジ配列と同じ長さであることがわかる。プライマーアニーリングの間、ブリッジ配列と介在配列とのハイブリダイゼーションを抑制するために、ブリッジ配列の配列は介在配列に相補的でないように選択される。お互いにアニーリングする代わりに、アンカー配列およびフット配列の両方が鋳型にハイブリダイズされた際にブリッジ配列および介在配列は、一重ストランドの「バブル」を形成する。「バブルの外周」がブリッジ配列のヌクレオチドの数と、介在配列のヌクレオチドの数と、アンカー配列の３’ヌクレオチドおよびその相補体と、フット配列の５’末端ヌクレオチドおよびその相補体とを加えた合計であると定義される。したがって、この実施例における複数部位プライマーとこの実施例で用いられた鋳型分子との結合によって形成されたバブルの外周は、１４＋１４＋２＋２であり、３２ヌクレオチド長に等しい。
【０１６３】
プライマー配列および変異対立遺伝子（ＭＵＴ）を有する目的とする標的配列は以下の通りである：
【０１６４】
【化５】
0006544861.tif 000012
【０１６５】
複数部位フォワードプライマー配列においては、ブリッジ配列には下線を引き、フット配列のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅには下線を引き、より大きな、太字とする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーおよびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれているまた、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには下線を引き、より大きな、太字にする。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、アンカー配列と鋳型と結合のＴｍは６６．９℃であり、全複数部位プライマーと得られる相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃である。
【０１６６】
ＰＣＲ増幅は実施例１に記載のように実施された。リアルタイム蛍光の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図７に示されている。図７において、曲線７０１は、１０６のＭＵＴ鋳型で開始する反応であり、曲線７０２は１０６のＷＴ鋳型で開始する反応である。分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。これらの値は、２２．９（曲線７０１）および４１．１（曲線７０２）であり、１８．２サイクルのΔＣＴとなった。左上角のグラフは、プライマーの３’末端の最後から２番目の位置に位置したｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（円）を有する複数部位プライマー（ブリッジ配列は半円）の概略図である。
【０１６７】
実施例４：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒおよび２４−１４−５：１：１複数部位プライマー（選択的増幅）
一連のＰＣＲ増幅および検出アッセイは、実施例３で記載された同様の複数部位プライマー、リバースプライマー、目的とする標的（ＭＵＴ）、および目的とするものではない標的（ＷＴ）を用いて実施された。増幅は実施例３と同様に実施された。完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図８に示されている。図８において、曲線８０１は、１０６のＷＴ鋳型で開始する反応であり、曲線８０２−８０７は、１０６ＷＴ鋳型を含む各反応に１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、または１０１のＭＵＴ鋳型のいずれかを加える希釈系である。分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。これらの値は４１．１（曲線８０１）、２３．３（曲線８０２）、２６．８（曲線８０３）、３０．５（曲線８０４）、３３．８（曲線８０５）、３７．０（曲線８０６）、および３９．２（曲線８０７）であった。左上角のグラフは、プライマーの３’末端の最後から２番目の位置に位置したｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（円）を有する複数部位プライマー（ブリッジ配列は半円）の概略図である。
【０１６８】
図９は、その反応に存在するＭＵＴ鋳型の数の対数の関数として、ＭＵＴ鋳型を含む各反応で観測されたＣＴ値のグラフ（図８の８０７を通じて、曲線８０２から得られた）である。直線９０１は、データ点の線形相関フィット（ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆｉｔ）である。破線９０２は、ＭＵＴ鋳型のない１０６のＷＴ鋳型で開始する増幅のＣＴ値を識別する。
【０１６９】
実施例５：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒおよび複数部位プライマーフット長の低減効果
実施例４に記載した実験を、７ヌクレオチド長であるフット配列を有する同じ２４−１４−５：１：１のプライマー（配列番号６）を用いて；追加のプライマーのうちのひとつのフット配列を１ヌクレオチド長にし（２４−１４−６：１：１）、および他の追加のプライマーのフット配列を１ヌクレオチド分短くした（２４−１４−４：１：１）こと以外は、同様の設計の２つの追加的な複数部位プライマーを用いて、繰り返した。それらすべてのケースにおいて、アンカー配列は２４ヌクレオチド長であり、ブリッジ配列は１４ヌクレオチド長であり、および標的の介在配列は１４ヌクレオチド長であり、すべてのケースにおいて３２ヌクレオチドのバブル外周を形成した。さらに、３つすべてのケースにおいて、プライマーのフットにおいて、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、３’−最後から２番目の位置に位置した。プライマー配列およびそれらの目的とする標的配列（ＭＵＴ）は、以下の通りである：
【０１７０】
【化６】
0006544861.tif 000013
【０１７１】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーおよびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。また、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには下線を引き、より大きな、太字にする。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、２４−１４−４：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６８．１℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは８０．３℃であり；２４−１４−５：１：１アンカー配列と鋳型の結合のＴｍは、６６．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃であり；および、２４−１４−６：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは６８．１℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複数配列との結合のＴｍは７９．４℃である。
【０１７２】
３つの複数部位プライマーの設計のそれぞれにおいて、一連のＰＣＲ増幅および検出アッセイは、それぞれ、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２または１０１コピーの複製のＭＵＴ鋳型を加えた１０６のＷＴ鋳型で始まる希釈系列を用いて、実施例４に記載のように実施した。分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。各反応のリアルタイムデータ（図示せず）から算出したＣＴ値は、ＭＵＴ鋳型なしで１０６のＷＴ鋳型で開始された反応について算出されたＣＴ値とともに、表１に列挙されている。
【０１７３】
【表１】
0006544861.tif 000014
【０１７４】
図１０は、それぞれの反応に存在するＭＵＴ鋳型の数の対数の関数として（同じプライマーを含む反応の各セットの）観察されたＣＴ値を示す一連のグラフである。直線１００１は、６ヌクレオチド長のフット配列（４：１：１）を有するプライマーのＣＴ値への線形相関フィットであり；直線１００２は、７ヌクレオチド長のフット配列（５：１：１）を有するプライマーのＣＴ値への線形相関フィットであり；および直線１００３は、７ヌクレオチド長のフット配列（６：１：１）を有するプライマーのＣＴ値への線形相関曲線フィットである。２４−１４−６：１：１プライマーを用いるとき、より低い存在量のＭＵＴ鋳型検体が、予測より多少早く発生したＣＴ値を提供し、検体内の多量のＷＴ鋳型から生成される少しの不明瞭な単位複製配列の存在を示す。
【０１７５】
これらの結果は、２４−１４−５：１：１プライマーのようなより短いフット配列を有する複数の部位プライマーの使用がこの問題を低減し、２４−１４−４：１：１プライマーのようなもっとも短いフット配列を有するプライマーの使用が、実質的にこの問題を排除することを証明しており、これにより、１，０００，０００の目的とするものではない鋳型分子の存在下で、わずか１０のような少ない量の目的とする鋳型分子の検出および定量が可能となる。
【０１７６】
実施例６：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒおよび複数部位プライマーバブル外周を増加させる効果
実施例４に記載の実験を、１４ヌクレオチド長であるその鋳型とハイブリダイズすると介在配列を形成する１４ヌクレオチド長であるブリッジ配列を有する同じ２４−１４−５：１：１のプライマー（配列番号６）を用いて；追加のプライマーのうちのひとつのブリッジ配列を１８ヌクレオチド長にし（２４−１８−５：１：１）、および他の追加のプライマーのブリッジ配列を１０ヌクレオチド長にした（２４−１０−５：１：１）こと以外は、同様の設計の２つの追加的な複数部位プライマーを用いて、繰り返した。それらすべての３つのケースにおいて、アンカー配列は２４ヌクレオチド長であり、フット配列は５：１：１であり、およびアンカー配列は、プライマーがその鋳型に結合した際に生成する介在配列がプライマーのブリッジ配列と同じ長さになるように選択した。結果として、この３つの複数部位プライマーが形成したバブルの外周は、それぞれ２４、３２、および４０ヌクレオチド長だった。さらに、これらすべての３つのケースにおいて、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、プライマーのフットの３’−最後から２番目の位置に位置した。プライマー配列およびそれらの目的とする標的配列（ＭＵＴ）は、以下の通りである：
【０１７７】
【化７】
0006544861.tif 000015
【０１７８】
複数部位フォワードプライマー配列においては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは、下線を引いた、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーおよびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。また、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには下線を引き、より大きな、太字にする。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、２４−１０−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．３℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７８．０℃であり；２４−１４−５：１：１アンカー配列と鋳型の結合のＴｍは、６６．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃であり；および、２４−１８−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは６７．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複数配列との結合のＴｍは７９．３℃である。
【０１７９】
３つの複数部位プライマー設計のそれぞれにおいて、一連のＰＣＲ増幅および検出アッセイは、それぞれ、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２または１０１コピーの複製のＭＵＴ鋳型を加えた１０６のＷＴ鋳型で始まる希釈系列を用いて、実施例４に記載のように実施した。分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。各反応のリアルタイムデータ（図示せず）から算出したＣＴ値は、ＭＵＴ鋳型なしで１０６のＷＴ鋳型で開始された反応について算出されたＣＴ値とともに、表２に列挙されている。
【０１８０】
【表２】
0006544861.tif 000016
【０１８１】
図１１は、それぞれの反応に存在するＭＵＴ鋳型の数の対数の関数として（同じプライマーを含む反応の各セットの）観察されたＣＴ値を示す一連のグラフである。直線１１０１は、２４ヌクレオチド長の外周を有するバブルを形成するプライマーのＣＴ値への線形相関フィット（ｌｉｎｅａｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｆｉｔ）であり；直線１１０２は、３２ヌクレオチド長の外周を有するバブルを形成するプライマーのＣＴ値への線形相関フィットであり；および直線１１０３は、４０ヌクレオチド長の外周を有するバブルを形成するプライマーのＣＴ値への線形相関フィットである。より長いフット配列を有するプライマーで発生するのと同様に、相対的に小さいバブルを形成する２４−１０−５：１：１プライマーを用いるとき、より低い存在量のＭＵＴ鋳型検体が、予測より多少早く発生したＣＴ値を提供し、検体内の多量のＷＴ鋳型から生成される少しの不明瞭な単位複製配列の存在を示す。
【０１８２】
これらの結果は、２４−１４−５：１：１プライマーのようなより大きなバブルを形成する複数の部位プライマーの使用がこの問題を低減し、２４−１８−５：１：１プライマーのようなもっとも大きなバブルを形成するプライマーの使用が、実質的にこの問題を排除することを証明しており、これにより１，０００，０００の目的とするものではない鋳型分子の存在下で、わずか１０のような少ない量の目的とする鋳型分子の検出および定量が可能となる。
【０１８３】
実施例７：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒおよび複数部位プライマーのフット配列内のＩｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの位置を変化させる効果
実施例３に記載した実験を、ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅがプライマーの３’末端の最後から２番目の位置に位置する７ヌクレオチド長であるフット配列を含む同じ２４−１４−５：１：１のプライマー（配列番号６）を用いて、また、フット配列を有するｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの位置を変えたこと以外は、同様の設計の５つの追加的な複数部位プライマーを用いて、繰り返した。それらすべての６つのケースにおいて、アンカー配列は２４ヌクレオチド長であり、ブリッジ配列は１４ヌクレオチド長であり、およびフット配列は７ヌクレオチド長であった。プライマー配列および目的とする標的配列（ＭＵＴ）は、以下の通りである：
【０１８４】
【化８−１】
0006544861.tif 000017
【０１８５】
【化８−２】
0006544861.tif 000018
【０１８６】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のinterrogating nucleotideは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーおよびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。また、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには下線を引き、より大きな、太字にする。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）；２４−１４−６：１：０アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６７．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．０℃であり；２４−１４−５：１：０アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃であり；２４−１４−４：１：２アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６８．１℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは８０．０℃であり；２４−１４−３：１：３アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６７．０℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７８．９℃であり；２４−１４−２：１：４アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６５．６℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７８．２℃であり；２４−１４−１：１：５アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．６℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７８．１℃である。
【０１８７】
ＰＣＲ増幅は実施例１に記載のように実施された。リアルタイム蛍光の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図１２の６パネルに示されている。図７において、それぞれのパネルは、用いられた複数部位プライマーを識別する。それぞれのパネルにおいて、奇数の番号の曲線は、１０６のＭＵＴ鋳型を含んで開始する検体で得られた結果であり、偶数の番号の曲線は、１０６のＷＴ鋳型を含む検体で得られた結果である。表３に、それぞれのプライマーを有する標的の両方について、機械で算出されたＣＴ値を示し、その差（ΔＣＴ）も示した。
【０１８８】
【表３】
0006544861.tif 000019
【０１８９】
実施例８：ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒと複数部位プライマーのバブル対称性を変化させる影響
実施例３に記載した実験を、鋳型から１４ヌクレオチド長のブリッジ配列および１４ヌクレオチド長の介在配列を含む対称性のバブルを形成する同じ２４−１４−５：１：１のプライマー（配列番号６）を用いて繰り返した；実験は、また、変異標的（配列番号２）を有する異なる非対称性バブルを形成する４つの追加の複数部位プライマーを用いた。「非対称性バブル」とは、我々は、異なる長さを有する鋳型のブリッジ配列および介在配列によって形成されるバブルを意味する。この実験において、比較されたすべての複数部位プライマーは、２４ヌクレオチド長のアンカー配列、５：１：１フット配列、および異なる長さのブリッジ配列（１８，１６，１４，１２、または１０ヌクレオチド長）を有していた。それぞれの複数部位プライマーにおいて、アンカー配列の識別は、ブリッジ配列の長さに、介在配列の長さ（アンカー配列およびフット配列の両方が鋳型に結合することによって形成される）を加えた合計が２８に等しくなるよう選択された。結果として、これら５つの複数部位プライマーのそれぞれによって形成されたバブルの外周は常に同じであった。実験の補助は、非対称性バブルの形成がプライマーの選択性に影響を与えるかどうかについて決定するためである。プライマー配列および目的とする標的配列（ＭＵＴ）は以下の通りである：
【０１９０】
【化９−１】
0006544861.tif 000020
【０１９１】
【化９−２】
0006544861.tif 000021
【０１９２】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のinterrogating nucleotideは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーおよびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。また、変異標的配列において、変異体に特異的なヌクレオチドには下線を引き、より大きな、太字にする。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）；２４−１８／１０−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．３℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．１℃であり；２４−１６／１２−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６７．０℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７８．５℃であり；２４−１４／１４−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃であり；２４−１２／１６−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．３℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．５℃であり；および、２４−１０／１８−５：１：１アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６７．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．３℃である。
【０１９３】
ＰＣＲ増幅は実施例１に記載のように実施された。リアルタイム蛍光の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、図１３の５パネルに示されている。図１３において、それぞれのパネルは、ブリッジ配列の長さと介在配列の長さによって形成されうるバブルを識別する（例えば、「１８／１０バブル」は、１０ヌクレオチド長である標的を有する介在配列を形成するフォワードプライマー２４−１８／１０−５：１：１の使用を示す）。それぞれのパネルにおいて、奇数の番号の曲線は、１０６のＭＵＴ鋳型を含んで開始する検体で得られた結果であり、偶数の番号の曲線は、１０６のＷＴ鋳型を含む検体で得られた結果である。表４に、それぞれのプライマーを有する標的の両方について、機械で算出されたＣＴ値を示し、その差（ΔＣＴ）も示した。
【０１９４】
【表４】
0006544861.tif 000022
【０１９５】
実施例９：Ｂ−ｒａｆ変異Ｖ６００Ｅ
我々は、単一ヌクレオチド多型であるＢ−ｒａｆ変異Ｖ６００Ｅを標的とする本発明による複数部位プライマーを用いて、実施例４の方法を用いた。比較のために、我々は、２４−１４−５：１：１プライマー設計を利用した。プライマー配列および目的とする標的配列（ＭＵＴ）は以下の通りである：
【０１９６】
【化１０】
0006544861.tif 000023
【０１９７】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーおよびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６３．５℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７１．１℃であり、リバースプライマーの結合の算出されたＴｍは５６．１℃である。
【０１９８】
プラスミドを、Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異またはＢ−ｒａｆ野生型配列のいずれかを含有した１１６ｂｐ  ＥＧＦＲ遺伝子断片に相当するｐＧＥＭ−１１Ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、合成オリゴヌクレオチドを挿入することによって調製した。変異および野生型プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＭｓｅ  Ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化させた。消化混合物は、１０単位Ｍｓｅ  Ｉと、５ｍＭ  ＫＡｃ、２ｍＭのトリスのＡｃ（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＭｇＡｃ、１％ウシ血清アルブミン、および１００μΜジチオトレイトールを含む２０μＬ量における変異または野生型ゲノムＤＮＡの４μｇとを含有していた。反応は、３７℃で１２０分間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間インキュベートし、酵素を不活性化した。
【０１９９】
５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ、２５０μΜのそれぞれの４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、６０ｎＭの各プライマー、および１ｘＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを含む３０μＬ量で、ＰＣＲ増幅を行った。増幅は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社ＩＱ５分光蛍光サーマルサイクラー中で０．２ｍＬのポリプロピレンＰＣＲチューブ（白）を用いて行った。サーマルサイクリングプロファイルは、９５℃で１０分で行い、続いて、９４℃１５秒間、６０℃２０秒間、および７２℃２０秒間の６０サイクルを行った。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、各鎖伸長段階（７２℃）の終了時に測定した。
【０２００】
ＰＣＲ増幅および検出アッセイは、それぞれ、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、または１０１コピーのＭＵＴ鋳型を加えた１０６のＷＴ鋳型を含む希釈系列を用いて実施された。我々はまた、１０６のＷＴ鋳型のみを含む検体も含有していた。リアルタイム蛍光データ（図示せず）から、分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。Ｂ−ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ変異体の希釈系列の場合、それらの値は、２７．７（１０６のＭＵＴ鋳型）、３１．１（１０５のＭＵＴ鋳型）、３４．１（１０４のＭＵＴ鋳型）、３７．６（１０３  ＭＵＴ鋳型）、４３．０（１０２のＭＵＴ鋳型）、４６．９（１０１のＭＵＴ鋳型）、および５０．８（１０６のＷＴ鋳型、ＭＵＴ鋳型を含まず）であった。図１４は、反応中に存在するＭＵＴ鋳型の数の対数の関数として、ＭＵＴ鋳型を含有した各反応について観察されたＣＴ値のグラフである。直線１４０１は、データポイントへの線形相関フィットである。破線１４０２は、ＭＵＴ鋳型なしで１０６のＷＴ鋳型で開始された増幅のＣＴ値を識別する。
【０２０１】
実施例１０：ヒトゲノムＤＮＡにおけるＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍ
一連のＰＣＲ増幅および検出アッセイを、ＥＧＦＲ変異Ｔ７９０Ｍ（ＥＦＧＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を含む細胞株Ｈ１９７５から単離された）およびＥＧＦＲ遺伝子中の単一ヌクレオチドにより異なっている対応する野生型配列を含むヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから得られたヒトゲノムＤＮＡから単離された）を含むヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて行った。フォワードプライマーは、本発明による２４−１４−４：１：１複数部位プライマーであった。リバースプライマーは、従来の直線状プライマーであった。プライマー配列およびそれらの目的とする標的配列（ＭＵＴ）は、以下の通りである：
【０２０２】
【化１１】
0006544861.tif 000024
【０２０３】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーの結合配列およびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、７２．５℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７３．９℃であり、リバースプライマーの結合の算出されたＴｍは６８．２℃である。
【０２０４】
変異および野生型ヒトゲノムＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＭｓｅ  Ｉで消化された。消化混合物は、１０単位Ｍｓｅ  Ｉと、５ｍＭ  ＫＡｃ、２ｍＭのトリスのＡｃ（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＭｇＡｃ、１％ウシ血清アルブミン、および１００μΜジチオトレイトールを含む２０μＬ量における変異または野生型ゲノムＤＮＡの４μｇとを含有していた。反応は、３７℃で１２０分間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間インキュベートし、酵素を不活性化した。
【０２０５】
５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０単位のＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ、２５０μΜのそれぞれの４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、６０ｎＭの各プライマー、および１ｘＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを含む２０μＬ量で、ＰＣＲ増幅を行った。増幅は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社ＩＱ５分光蛍光サーマルサイクラー中で０．２ｍＬのポリプロピレンＰＣＲチューブ（白）を用いて行った。サーマルサイクリングプロファイルは、９５℃で１０分で行い、続いて、９４℃１５秒間、５５℃１５秒間、および７２℃２０秒間の６０サイクルを行った。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、各鎖伸長段階（７２℃）の終了時に測定した。
【０２０６】
ＰＣＲ増幅および検出アッセイは、それぞれ、１０，０００；３，０００；１，０００；３００；１００；３０；または１０コピーの複製のＭＵＴ鋳型を加えた１０，０００のＷＴ鋳型を含む希釈系列を用いて実施された。我々はまた、１０，０００のＷＴ鋳型のみを含む検体も含有していた。リアルタイム蛍光データ（図示せず）から、分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。このＴ７９０Ｍの希釈系列の場合、それらの値は、２９．２（１０，０００のＭＵＴ鋳型）、３１．１（３，０００のＭＵＴ鋳型）、３２．７（１，０００のＭＵＴ鋳型）、３５．５（３００のＭＵＴ鋳型）、３８．２（１００のＭＵＴ鋳型）、３８．８（３０のＭＵＴ鋳型）、４０．７（１０のＭＵＴ鋳型）、および４２．８（１０，０００のＷＴ鋳型でＭＵＴ鋳型を含まず）であった。図１５は、反応中に存在するＭＵＴ鋳型の数の対数の関数として、ＭＵＴ鋳型を含有した各反応について観察されたＣＴ値を示すグラフである。直線１５０１は、データポイントへの線形相関フィットである。破線１５０２は、ＭＵＴ鋳型なしで１０，０００のＷＴ鋳型で開始された増幅のＣＴ値を識別する。
【０２０７】
実施例１１：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７７００分光蛍光サーマルサイクラーで定量されたＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒ
実施例４で報告されたアッセイと同様の実験を、異なる熱サイクル装置、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＲＩＳＭ  ７７００サーマルサイクラーを利用して、ＥＧＦＲ遺伝子における変異Ｌ８５８Ｒの増幅および検出を実施した。一連のＰＣＲ増幅および検出アッセイは、ＥＧＦＲ変異Ｌ８５８Ｒを含むプラスミドＤＮＡおよび単一ヌクレオチドにより異なっている対応する野生型配列を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として用いて実施した。実施例４で使用した鋳型とは対照的に、この実験では、鋳型は、制限エンドヌクレアーゼで消化されなかった。実施例３に記載したように、増幅は同じ複数部位フォワードプライマーおよび従来のリバースプライマーを用いて実施された。プライマー配列および目的とする標的配列（ＭＵＴ）は次の通りである：
【０２０８】
【化１２】
0006544861.tif 000025
【０２０９】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のinterrogating nucleotideは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーの結合配列およびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、アンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．９℃であり、全複数部位プライマーと得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃であり、リバースプライマーの結合の算出されたＴｍは６８．２℃である。
【０２１０】
５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２．０単位のＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮＡポリメラーゼ、２５０μΜのそれぞれの４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、６０ｎＭの各プライマー、および１ｘＳＹＢＲ（登録商標）グリーンを含む４０μＬ量で、ＰＣＲ増幅を行った。増幅は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＲＩＳＭ  ７７００分光蛍光サーマルサイクラー中で０．２ｍＬのポリプロピレンＰＣＲチューブ（透明）を用いて行った。サーマルサイクリングプロファイルは、９５℃で１０分で行い、続いて、９４℃１５秒間、６０℃２０秒間、および７２℃２０秒間の５５サイクルを行った。ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、各鎖伸長段階（７２℃）の終了時に測定した。
【０２１１】
ＰＣＲ増幅および検出アッセイは、それぞれ、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、または１０１コピーのＭＵＴ鋳型を加えた１０６のＷＴ鋳型を含む希釈系列を用いて実施された。我々はまた、１０６のＷＴ鋳型のみを含む検体も含有していた。リアルタイム蛍光データ（図示せず）から、分析機器は、自動的に各反応の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。それらの値は、２１．２（１０６のＭＵＴ鋳型）、２４．９（１０５のＭＵＴ鋳型）、２８．３（１０４のＭＵＴ鋳型）、３２．２（１０３  ＭＵＴ鋳型）、３６．０（１０２のＭＵＴ鋳型）、３７．６（１０１のＭＵＴ鋳型）、および５３８．７（１０６のＷＴ鋳型、ＭＵＴ鋳型を含まず）であった。図１６は、反応中に存在するＭＵＴ鋳型の数の対数の関数として、ＭＵＴ鋳型を含有した各反応について観察されたＣＴ値のグラフである。直線１６０１は、データポイントへの線形相関フィットである。破線１６０２は、ＭＵＴ鋳型なしで１０６のＷＴ鋳型で開始された増幅のＣＴ値である。
【０２１２】
実施例１２：複数部位プライマーがＰＣＲアッセイに利用されるときのＡＲＭＳ識別の役割  本発明による複数部位プライマーの機能を検討するために、実施例３に記載の２４−１４−５：１：１プライマーを有するだけでなく、同じアンカー配列、同じブリッジ配列およびフット配列の同じ５つの５’ヌクレオチドを有するプライマーである不完全な２４−１４−５：０：０プライマーも有する、実施例３に記載の実験を繰り返した。これは、フット配列の最後の２つの３’ヌクレオチドを欠いていた。したがって、そのフット配列は目的とする変異標的および目的とするものではない野生型標的の両方に完全に相補的である。これら２つの複数部位プライマーのそれぞれを利用する反応についてのプライマー配列および目的とする標的配列（ＭＵＴ）は、以下の通りである：
【０２１３】
【化１３】
0006544861.tif 000026
【０２１４】
複数部位フォワードプライマーにおいては、ブリッジ配列は下線を引き、フット配列中のｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは下線を引き、より大きな、太字にする。変異標的配列において、フォワードプライマーのアンカーの結合配列およびフォワードプライマーのフットの結合配列には下線が引かれ、リバースプライマーの配列は下線が引かれている。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を算出するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（パラメータを指定：［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）、両方のプライマーのアンカー配列と鋳型との結合のＴｍは、６６．９℃であり、プライマー２４−１４−５：１：１と得られた相補的な単位複製配列との結合のＴｍは７９．９℃であり、プライマー２４−１４−５：０：０と得られた相補的な単位複数配列との結合のＴｍは、７９．０℃である。
【０２１５】
ＰＣＲ増幅は実施例３に記載のように実施された。リアルタイム蛍光の結果、すなわち、完了した増幅サイクルの数の関数としてＳＹＢＲ（登録商標）グリーン蛍光強度は、各反応について記録された。図１７、パネルＡには、プライマー２４−１４−５：１：１を含む反応で得られた結果を示しており、曲線１７０１は、１０６のＭＵＴ鋳型を含む反応であり、曲線１７０２は１０６のＷＴ鋳型を含む反応であり；および図１７、パネルＢは、プライマー２４−１４−５：０：０を含む反応で得られた結果を示しており、曲線１７０３は、１０６のＭＵＴ鋳型を含む反応であり、曲線１７０４は１０６のＷＴ鋳型を含む反応である。分析機器は、自動的に各曲線の閾値サイクル（ＣＴ）を算出する。プライマー２４−１４−５：１：１のＣＴ値は、２３．１（曲線１７０１）および４０．７（曲線１７０２）であり、１７．６サイクルのΔＣＴとなった。プライマー２４−１４−５：０：０のＣＴ値は、３９．７（曲線１７０３）および３９．４（曲線１７０４）であり、０．３サイクルのΔＣＴとなった（これら２つの反応は実質的に同一の結果を与えたことを示している）。
【０２１６】
好ましい実施形態の前述の例および説明は、特許請求によって定義される本発明を限定するものではなく、例示として解釈されるべきである。容易に理解されるように、上述の多くの変形および特徴の組合せは、特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく利用することができる。このような変形は本発明の範囲からの逸脱とみなされず、全てのそのような変形は、添付の特許請求の範囲内に含まれると意図される。本明細書で引用した全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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