(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ポリペプチドに組み立てられた以下の(a)、(b)及び(c)の断片:
(a)2つの領域を含むか又はそれらからなるデングウイルス(DENV)血清型1(DENV1)の非構造(NS)NS3タンパク質の2つの断片であって、第1の領域が配列番号6に規定のアミノ酸配列を有し、第2の領域が配列番号9に規定のアミノ酸配列を有する、2つの断片、
(b)配列番号12に規定のアミノ酸配列を有する、DENV1のNS4bタンパク質の断片、
(c)配列番号15に規定のアミノ酸配列を有する、DENV1のNS5タンパク質の断片
を含むか又はそれらからなり、(a)、(b)及び(c)の断片がこの順番で直接的又は間接的に融合している、600未満のアミノ酸残基を有するキメラポリエピトープ:
又はそのポリエピトープ変異体であって、前記ポリエピトープ変異体が、融合断片(a)、(b)及び(c)からなる融合ポリペプチドの配列とその全長にわたり90%超の同一性を有するアミノ酸配列を有するキメラポリエピトープからなり、前記融合ポリペプチドからアミノ酸残基の変異により該キメラポリエピトープが誘導される、キメラポリエピトープ。
【請求項２】
配列番号3、配列番号146、配列番号147及び配列番号148からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項３】
DENV1、DENV2、DENV3及びDENV4に対するヒト白血球抗原(HLA)制限CD8+及び/又はCD4+T細胞応答を誘発する、請求項1又は2に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープをコードする単離又は精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号1又は配列番号2からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項4又は5に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドであるベクター。
【請求項７】
(i)MVウイルスの全長RNAゲノムをコードするcDNA、及び(ii)任意選択で追加転写ユニット(ATU)中、MVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間又はMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間にインサートとして配置されている、請求項4又は5に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドである組換え麻疹ウイルス(MV)ゲノムベクターであって、ここで(i)及び(ii)の配列がプラスミド中で組み換えられる場合、rule of sixに一緒に従う、組換え麻疹ウイルスゲノムベクター。
【請求項８】
(a)MVウイルスの全長RNAゲノムをコードするcDNA、及び(b)DENV1の膜タンパク質の膜貫通ドメイン(ectoM)に融合した、4種のDENV血清型のエンベロープドメインIII(EDIII)ポリペプチドの融合体から構成されるDENV抗原をコードするポリヌクレオチド、及び(c)請求項4又は5に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドである組換えMVゲノムベクターであって、
-  ポリヌクレオチド(b)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されており、且つポリヌクレオチド(c)がMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間のインサートとして配置されているか、又は
-  ポリヌクレオチド(b)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されており、且つポリヌクレオチド(c)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されているか、又は
-  ポリヌクレオチド(b)がMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間のインサートとして配置されており、且つポリヌクレオチド(c)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されており、
ここで(a)、(b)及び(c)の配列がプラスミド中で組み換えられる場合、rule of sixに一緒に従う、組換えMVゲノムベクター。
【請求項９】
弱毒化生シュワルツウイルス又は弱毒化生モラテンウイルスの全長RNAゲノムをコードするcDNAを含む、請求項7又は8に記載の組換えMVゲノムベクター。
【請求項１０】
請求項4又は5に記載のポリヌクレオチド、請求項6に記載のベクター、又は請求項7から9のいずれか一項に記載の組換えMVゲノムベクターで遺伝的に形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
HEK-293-T7-MV細胞株である、請求項10に記載の細胞。
【請求項１２】
T7 RNAポリメラーゼ並びにMVのN、P及びLタンパク質を発現し、請求項6に記載のベクターをコードする核酸又は請求項7から9のいずれか一項に記載の組換えMVゲノムベクターをコードする核酸を更に発現するヘルパー細胞株からレスキューされる、組換え麻疹ウイルス(MV)粒子。
【請求項１３】
(a)DENV1のectoMに融合した、4種のDENV血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成されるDENV抗原、及び(b)請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープを含み、任意選択でアクセサリーアジュバントを含まない、免疫原性組成物。
【請求項１４】
請求項12に記載の組換えMV粒子を含み、任意選択でアクセサリーアジュバントを含まない、免疫原性組成物。
【請求項１５】
皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、筋肉内(i.m.)注射、腹腔内(i.p.)注射又は静脈内(i.v.)注射などの非経口経路による投与のために製剤化されている、請求項13又は14に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
単回又は多回投与で投与される、請求項13から15のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ヒト対象においてデングウイルス感染症を予防及び/又は処置するための、請求項13から16のいずれか一項に記載の免疫原性組成物であって、薬学的に許容される媒体及び/又はアジュバントと混合されている、免疫原性組成物。
【請求項１８】
抗デングウイルスワクチンを調製するための組換えMV粒子を産生するための方法であって、
a)T7 RNAポリメラーゼ並びにMVのN、P及びLタンパク質を発現するヘルパー細胞株中に、請求項7から9のいずれか一項に記載の組換えMVゲノムベクターをトランスフェクトする工程、
b)前記ヘルパー細胞株を、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープと、任意選択で、DENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原を含むポリペプチドとを発現する組換えMV粒子の複製及び産生を維持する能力がある細胞上に移す工程、及び
c)工程b)で産生された組換えMV粒子を回収する工程
を含むか又はそれからなる、方法。
【請求項１９】
工程b)における前記能力がある細胞が、ベロ(アフリカミドリザルの腎臓)細胞、CEF(ニワトリ胚線維芽)細胞又はMRC5細胞である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記DENV抗原が、配列番号145の配列を有する、請求項8に記載の組換えMVゲノムベクター、又は請求項13に記載の免疫原性組成物、又は請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
プライムブースト投与レジメンで投与される、請求項16に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非構造タンパク質断片から構成されるデングウイルスのキメラポリエピトープ及びデングウイルス感染症に対する免疫原性組成物におけるその使用に関する。本発明は、前記キメラポリエピトープを発現するベクター、特に組換え麻疹ウイルス(またMVとも示す)粒子からなるベクターを産生するための、手段、特にポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び方法を提供する。本発明はまた、デングウイルス感染症を予防及び/又は処置するための、組換えMV粒子の、特に組成物の又はワクチンの形態下での使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
デングウイルス(DENV)は、エンベロープ型、プラス鎖RNAウイルスのフラビウイルス科(Flaviviridae)に属し、ネッタイシマカ(Aedes mosquito)により伝播される。DNEV感染症は、毎年約3億9000万の感染を生じる最も重要な節足動物媒介性ウイルス疾患であり、この疾患はデング熱(DF)を引き起こし、更に症例の1〜5%において、血液量減少性ショックに至る血管漏出を特徴とするデング出血熱(DHF)及びデングショック症候群(DSS)を引き起こす[世界保健機関(WHO)2009年出版、WHO/HTM/NTD/DEN/2009. 第1版; Bhatt Sら、Nature 2013、496(7446): 504〜507頁]。200万件を超える重症のデング疾患症例及び20,000件を超える死亡が毎年発生していると推定される[Gubler DJ、The American journal of tropical medicine and hygiene 2012、86(5): 743〜744頁]。
【０００３】
アミノ酸レベルで67〜75%同一な主たる4種のDENV血清型(DENV1〜4と示す)が存在する。ウイルスRNAゲノムは、ウイルスプロテアーゼ及び宿主プロテアーゼにより3種の構造タンパク質[キャプシド(c)、プレメンブレン(prM)、及びエンベロープ(E)]及び7種の非構造(NS)タンパク質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)に切断される単一のポリタンパク質として翻訳される。4種のデングウイルス血清型について参照ゲノムの完全ヌクレオチド配列は、それぞれ、受託番号NC_001477.1、NC_001474.2、NC_001475.2及びNC_002640.1でGenbankデータベースからアクセスできる。感染の過程では、Eタンパク質は細胞受容体と相互作用し、受容体介在性エンドサイトーシスを介してウイルス取り込みが生じる[Heinz FXら、Archives of virology Supplementum 1994、9: 339〜348頁; Mukhopadhyay Sら、Nat Rev Microbiol 2005、3(1): 13〜22頁]。Eタンパク質は、フラビウイルス間で構造的に保存されており、3つのドメインからなる(EDI、EDII及びEDIII)[Rey FAら、Nature 1995、375(6529): 291〜298頁]。特に、EDIIIドメインは、最も強力な中和抗体及び血清型特異的抗体を誘導する[Beltramello Mら、Cell host & microbe 2010、8(3): 271〜283頁; Shrestha Bら、PLoS Pathog 2010、6(4): e1000823; Sukupolvi-Petty Sら、J Virol 2010、84(18): 9227〜9239頁; Wahala WMら、PLoS Pathog 2010、6(3): e1000821; de Alwis Rら、PLoS neglected tropical diseases 2011、5(6): e1188; Yauch LEら、Advances in virus research 2014、88: 315〜372頁]。
【０００４】
膜タンパク質のエクトドメイン(ectoM)に融合した4種のDENV血清型に由来する4種のエンベロープドメインIII(EDIII)から構成される単一の最小4価DENV抗原がこれまでに説明されている[Brandlerら、PLoS 2007、1(3)、e96; Brandlerら、Vaccine、2010、28、6730〜6739頁]。弱毒化生MVワクチンに由来する複製ウイルスベクターで発現させたとき、この抗原はデングウイルスの4種の血清型に対する中和抗体を誘導した(Brandlerら、Vaccine、2010、28、6730〜6739頁)。しかし、DENV感染の非ヒト霊長類モデルで評価したところ、4価EDIII-ectoM抗原を発現する組換えMVベクターは、部分的な防御しか提供しなかった。この観察により、完全な防御を提供するためのさらなるDENV抗原が見出されていないことが示された。
【０００５】
NSタンパク質は、ウイルス複製及びアセンブリに関与するが、成熟したウイルス粒子には通常取り込まれない。驚くべきことに、1つのDENV血清型による一次感染は、同一血清型による再感染に対して持続的防御免疫を誘導するが、この感染は、他の血清型による感染に対して防御を示さないことに加え、二次感染時により重症の疾患を発症させるリスクも高め、この現象は、非中和抗体又は下位の中和抗体に起因し、抗体依存性感染増強(ADE)と呼ばれている[Halstead SBら、Nature 1977、265(5596): 739〜741頁; Dejnirattisai WらScience 2010、328(5979): 745〜748頁]。ADE仮説を裏付けるものとして、一次感染に続いて産生される血清型交差反応性抗体のレベルが低いことにより、骨髄系細胞上のFeγ受容体(FcγR)に結合するDENV抗体複合体の形成を通して二次感染が増強される得ることが提唱された。このプロセスにより、ウイルス負荷がより高まり、そして血管透過性の原因である炎症メディエーターの産生がより高まることになる[Halstead SBら、Nature 1977、265(5596): 739〜741頁; Morens DMら、Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 1994、19(3): 500〜512頁; Halstead SBら、Advances in virus research 2003、60: 421〜467頁]。
【０００６】
機構的に、ADEは、刺激に基づいて多量のサイトカイン(TNF-α及びIL-6)及びケモカイン(MIP-1α)を産生する単球、マクロファージ及び樹状細胞(DC)により発現するFcγRIIa受容体の活性化に決定的に依存していることが示された[Wong KLら、PLoS ONE 2012、7(5): e36435; Boonnak Kら、J Immunol 2013、190(11): 5659〜5665頁; Guilliams Mら、Nat Rev Immunol 2014、14(2): 94〜108頁]。ADEにおけるウイルス負荷の上昇は、ヒトの一次単球上の白血球Ig様受容体B1(LILR-B1)への免疫複合体の結合(ウイルスと下位の中和抗体の間の)の結果であり、このことにより活性化されたFcγRIIaにより媒介される初期の抗ウイルス応答が阻害されることも示された[Chan KRら、Proc Natl Acad Sci USA 2014、111(7): 2722〜2727頁]。
【０００７】
したがって、DENV特異的抗体応答の特質に依存して、適応性免疫は、感染に対する防御又は感染及び疾患進行の増強のいずれかを誘導する可能性がある。
【０００８】
B細胞の様に、二次感染の過程におけるウイルス特異的T細胞の病因的役割も示唆された。「抗原原罪」と呼ばれる仮説により、一次感染後、二次感染の血清型に対して低い結合活性を有する交差反応性メモリーT細胞が、特異的T細胞応答を抑制したりマスクしたりすることにより、感染した標的細胞の殺滅を非効率化すると仮定された[Mongkolsapaya JらNat Med 2003、9 (7). -921〜927頁]。このような交差反応性CD8+T細胞は、二次感染の際に異なる血清型に刺激されると、交差反応性エピトープ又は改変されたペプチドリガンドに対するそれらの応答において定量的及び定性的な相違も示した[Bashyam HSら、J Immunol 2006、76(5): 2817〜2824頁]。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2004/001051
【特許文献２】WO2004/000876
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】世界保健機関(WHO)2009年出版、WHO/HTM/NTD/DEN/2009. 第1版
【非特許文献２】Bhatt Sら、Nature 2013、496(7446): 504〜507頁
【非特許文献３】Gubler DJ、The American journal of tropical medicine and hygiene 2012、86(5): 743〜744頁
【非特許文献４】Heinz FXら、Archives of virology Supplementum 1994、9: 339〜348頁
【非特許文献５】Mukhopadhyay Sら、Nat Rev Microbiol 2005、3(1): 13〜22頁
【非特許文献６】Rey FAら、Nature 1995、375(6529): 291〜298頁
【非特許文献７】Beltramello Mら、Cell host & microbe 2010、8(3): 271〜283頁
【非特許文献８】Shrestha Bら、PLoS Pathog 2010、6(4): e1000823
【非特許文献９】Sukupolvi-Petty Sら、J Virol 2010、84(18): 9227〜9239頁
【非特許文献１０】Wahala WMら、PLoS Pathog 2010、6(3): e1000821
【非特許文献１１】de Alwis Rら、PLoS neglected tropical diseases 2011、5(6): e1188
【非特許文献１２】Yauch LEら、Advances in virus research 2014、88: 315〜372頁
【非特許文献１３】Brandlerら、PLoS 2007、1(3)、e96
【非特許文献１４】Brandlerら、Vaccine、2010、28、6730〜6739頁
【非特許文献１５】Halstead SBら、Nature 1977、265(5596): 739〜741頁
【非特許文献１６】Dejnirattisai WらScience 2010、328(5979): 745〜748頁
【非特許文献１７】Morens DMら、Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America 1994、19(3): 500〜512頁
【非特許文献１８】Halstead SBら、Advances in virus research 2003、60: 421〜467頁
【非特許文献１９】Wong KLら、PLoS ONE 2012、7(5): e36435
【非特許文献２０】Boonnak Kら、J Immunol 2013、190(11): 5659〜5665頁
【非特許文献２１】Guilliams Mら、Nat Rev Immunol 2014、14(2): 94〜108頁
【非特許文献２２】Chan KRら、Proc Natl Acad Sci USA 2014、111(7): 2722〜2727頁
【非特許文献２３】Mongkolsapaya JらNat Med 2003、9 (7). -921〜927頁
【非特許文献２４】Bashyam HSら、J Immunol 2006、76(5): 2817〜2824頁
【非特許文献２５】Simmons CPら、J Virol 2005、79(9): 5665〜5675頁
【非特許文献２６】Yauch LEらJ Immunol 2009、182(8): 4865〜4873頁
【非特許文献２７】Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22): E2046〜2053頁
【非特許文献２８】B. Rivino Lら、J Virol 2013、87(5): 2693〜2706頁
【非特許文献２９】PDB ID 2VBC、J Virol. 2008年1月; 82(1): 173〜183頁
【非特許文献３０】PDB ID 2J7W、J Virol. 2007年5月; 81(9): 4753〜65頁
【非特許文献３１】Yauch LEら、J Immunol 2009、182(8): 4865〜4873頁
【非特許文献３２】Imrie Aら、J Virol 2007、81 (18): 10081〜10091頁
【非特許文献３３】Lund Oら、PLoS ONE 2011、6(10): e26494
【非特許文献３４】Weiskopf Dら、J Immunol 2011、187(8): 4268〜4279頁
【非特許文献３５】Boucherma Rら、J Immunol 2013、191(2): 583〜593頁
【非特許文献３６】Nascimento EJら、PLoS neglected tropical diseases 2013、7(10): e2497
【非特許文献３７】Rivino Lら、J Virol 2013、87(5): 2693〜2706頁
【非特許文献３８】Rivino Lら、J Immunol 2013、191 (8): 4010〜4019頁
【非特許文献３９】Immune Epitope Database (IEDB)
【非特許文献４０】Cole C、Barber JD & Barton GJ. Nucleic Acids Res. 2008. 35 (suppl. 2) W197〜W201
【非特許文献４１】GOR secondary structure prediction method version IV、Methods in Enzymology 1996 R.F. Doolittle編、vol 266、540〜553頁、Gamier J、Gibrat J-F、Robson B
【非特許文献４２】Edgar RC、Nucleic Acids Res 2004、32(5): 1792〜1797頁
【非特許文献４３】Parks、C. L.ら、2001、J Virol、75(2): 910〜920頁
【非特許文献４４】Schwarz、A. J.、1962、Am J Dis Child、103、386〜389頁
【非特許文献４５】Hilleman、M.、2002、Vaccine、20: 651〜665頁
【非特許文献４６】Calain、P.らJ Virol.、1993、67: 4822〜4830頁
【非特許文献４７】Lamb、R. A.らIn Fields Virology、第4版、1305〜1340頁
【非特許文献４８】Schneider、H.らVirology、1997、227: 314〜322頁
【非特許文献４９】Combredet、C.ら、2003、J Virol、77(21): 11546〜11554頁
【非特許文献５０】Guerboisら、Virology、2009、388(1): 191〜203頁
【非特許文献５１】Zemmour Jら、J Immunol 1992、148(6): 1941〜1948頁
【非特許文献５２】Ewen CLら、2006、J Immunol Methods、308(1〜2): 156〜166頁
【非特許文献５３】Kalia Vら、2010、Adv Exp Med Biol、684: 79〜95頁
【非特許文献５４】Zanetti Mら2010、Adv Exp Med Biol、684: 108〜125頁
【非特許文献５５】Marcet-Palacios Mら、2011、PLoS Pathog、7(12): e1002447
【非特許文献５６】Clemente T.ら、2013、Methods、61(2): 105〜109頁
【非特許文献５７】Legrand Nら、2011、Proc Natl Acad Sci U S A、108(32): 13224〜13229頁
【非特許文献５８】Garcia Sら、2012、Immunol Lett、146(1〜2): 1〜7頁
【非特許文献５９】Serra-Hassoun Mら、2014、J Immunol、193(3): 1504〜1511頁
【非特許文献６０】Pascolo Sら、1997、J Exp Med、185(12): 2043〜2051頁
【非特許文献６１】Despresら、J. Virol.、1998、72(1)、823〜829頁
【非特許文献６２】SirivichayakulらVirol. J. 2014、11〜48頁
【非特許文献６３】Stebbingsら、PLoS-One、2012、7(11)、e50397
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、そのような研究にもかかわらず、DENV特異的T細胞の病因的役割の直接的な実証は未だになく、最近の報告でも、二次感染過程におけるデング出血熱の発病における交差反応性CD8+T細胞についての原因となる役割は裏付けられなかった。実際、二次感染を経験している成人での研究から、T細胞応答の大きさ及び特異性と臨床的な疾患の程度との間にいかなる相関関係も解明されず[Simmons CPら、J Virol 2005、79(9): 5665〜5675頁]、更に一次DENV感染の過程におけるCD8+T細胞の重要な防御的役割がマウスモデルにおいて確認もされた[Yauch LEらJ Immunol 2009、182(8): 4865〜4873頁]。より驚くべきことに、高流行地からのドナーにおけるHLA制限T細胞応答の詳細な分析は、DENV感染過程におけるCD8+T細胞の防御的役割を更に強化する[Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22): E2046〜2053頁]。血清型特異応答は、一次感染の顕著な特徴であるが、血清型特異的応答間又は保存応答間でCD8+T細胞における結合活性又は機能性の差異を生じさせることなく、二次感染に続く保存エピトープに対する応答へのシフトが存在すると思われる。また、弱いT細胞応答と罹病性との間に有意な相関関係が確立された[Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22): E2046〜2053頁]。まとめると、これらの研究により、デングウイルス感染症において疾患進行に対するCD8+T細胞の有益な効果に注目が集まっている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】DENV1の非構造タンパク質NS3、NS4a、NS4b及びNS5の免疫原性並びにDENVの血清型内及び血清型間アミノ酸配列の保存を示す図である。A. Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22): E2046〜2053頁; B. Rivino Lら、J Virol 2013、87(5): 2693〜2706頁.
【図２】NS DENV1のポリエピトープが結合したポリエピトープ抗原(配列番号3)のアミノ酸配列及び二次構造を示す図である。以下に示す配列中のアミノ酸位置に関する記述は、二次構造のタイプを示しており、ここでアミノ酸は、NS4Bに対して予測された、又はNS3及びNS5に関して公開された結晶学的研究に記載された[それぞれ、PDB ID 2VBC、J Virol. 2008年1月; 82(1): 173〜183頁及びPDB ID 2J7W、J Virol. 2007年5月; 81(9): 4753〜65頁]、対応する全長タンパク質に含まれる。具体的には、アルファ-ヘリックスは、次のアミノ酸のセグメント: 35〜45; 57〜66; 94〜103; 123〜138; 181〜185; 189〜198; 232〜241; 247〜254; 307〜318; 342〜360; 371〜372; 374〜375; 396〜398; 406〜419; 455〜460; 468〜473; 480〜489; 500〜517で観察される。ベータ鎖は、次のアミノ酸のセグメント: 20〜23; 50〜54; 72〜74; 112〜116; 142〜146; 164〜168; 276〜277; 280〜281; 283〜285; 291〜293; 366〜370; 376〜380; 436〜442; 452〜453で観察される。ベンドは、次のアミノ酸のセグメント: 16; 55〜56; 70; 80; 86〜87; 89〜93; 105; 111; 117; 122; 140; 148〜49; 156〜157; 161〜162; 173〜174; 178〜179; 221; 243; 260〜261; 287〜288; 297〜298; 305〜306; 433〜35; 449〜450; 479; 492; 519〜520で観察される。ターンは、次のアミノ酸のセグメント: 17〜18; 27〜29; 32〜34; 46〜47; 67〜69; 77〜78; 118〜119; 139; 151〜152; 186〜187; 199〜200; 204〜205; 223〜226; 230〜231; 242; 255〜257; 264〜267; 278〜279; 304; 319; 329〜332; 420〜423; 428〜429; 474; 490〜491; 518; 528〜538で観察される。更に、3/10ヘリックスは、次のアミノ酸のセグメント: 213〜218; 271〜273; 301〜303; 462〜466で観察され、βブリッジはアミノ酸188及び300で観察される。保存アミノ酸を有する位置(4種の血清型を包含する2033配列の代表的パネルの99.9%超に見いだされる)はダークグレーで強調されている。
【図３】DENV2-NS、DENV3-NS及びDENV4-NSポリエピトープ(それぞれ、配列番号146、147及び148)のアミノ酸コンセンサス配列を示す図である。
【図４】DENV1-NS、DENV2-NS、DENV3-NS及びDENV4-NSのコンセンサスポリエピトープ(それぞれ、配列番号3、146、147及び148)のアミノ酸配列を比較するアライメントを示す図である。
【図５】DENV1-NSポリエピトープをコードするポリヌクレオチドの天然ヌクレオチド配列の図である(配列番号1)。
【図６】DENV1-NSポリエピトープをコードするポリヌクレオチドの最適化ヌクレオチド配列の図である(ヒトコドン最適化、麻疹最適化)(配列番号2)。
【図７】DENV抗原を発現する組換えMVベクターを示す略図である。NSポリエピトープの合成配列をDENV EDIII 4価抗原と組み合わせて又は組み合わせずにMVベクターのATU位置2又は3に挿入した。MV遺伝子は次のとおりである: 核タンパク質(N)、リンタンパク質及びV/Cアクセサリータンパク質(PVC)、マトリックス(M)、融合(F)、ヘマグルチニン(H)並びにポリメラーゼ(L)。T7 RNAポリメラーゼプロモター(T7)、T7 RNAポリメラーゼターミネーター(T7t)、デルタ型肝炎ウイルスリボザイム(δ)、ハンマーヘッドリボザイム(hh)。MVDVax9において、ATU位置2に挿入された結合抗原は、様々な成分を隔離するために挿入されたフューリン部位(配列番号152に規定のアミノ酸配列RRDKRを有する)を有する分泌型NSポリエピトープ配列に融合された分泌型DENV EDIII 4価タンパク質から構成される。MVDVax11において、逆に、NSポリエピトープ合成配列は分泌型ではなく(ペプチドリーダー配列ではない)、3'において搬出型DENV EDIII 4価タンパク質(ペプチドリーダー配列から開始される)に融合している。
【図８】MV-DENV組換えウイルスにより感染させたベロ細胞の細胞溶解液又はpcDNA3-NSプラスミドでトランスフェクションしたHEK293細胞の細胞溶解液におけるDENV NSポリエピトープ抗原(上)及びDENV EDIII 4価抗原(下)の発現のウエスタンブロットによる検出を示す図である。DENVタンパク質は特異的Mabでプローブした。
【図９】CD46-IFNARマウスにおいてELISPOTアッセイに使用したDENV NSポリエピトープペプチドを示す図である。配列1〜36は、DENV NSポリエピトープ抗原全体をカバーする、5つのアミノ酸が重複する15-merペプチドである。ペプチド37〜41は、CD46-IFNARマウスにおいて発現したH2-Db及びH2-KbT細胞受容体に結合するそれらの能力について、予測アルゴリズム使用して同定された。これらのペプチドは配列番号98〜138に規定のアミノ酸配列を有する。
【図１０】MV-DENVベクターで免疫したCD46-IFNARマウスにおけるT細胞応答のELISPOT定量化を示す図である。マウス6匹の群をMVDVax10、MVDVax8又は空のMVで免疫した。ELISPOTSは、単回免疫化して7日後に採取した脾臓細胞において定量された。DENV NSペプチド、MV及び陽性対照のコンカナバリンAに対する応答が示されている。
【図１１】MV-DENVベクターで免疫したCD46-IFNARマウスにおけるT細胞応答のELISPOT定量化を示す図である。NSポリエピトープ抗原をカバーする様々なペプチドプール又は個々のペプチドに対する応答が示されている。
【図１２】個々のペプチド又はプールに対する応答を累計する、MV-DEBNVベクターで免疫したCD46-IFNARマウスにおけるELISPOT応答を示す図である。
【図１３】H-2クラスIヌル/HLAクラスIトランスジェニックマウスにおいてCD8+T細胞応答を誘発するための手順及びELISPOTアッセイによるIFN-γ応答の定量化を示す図である。
【図１４】DENV1-NSポリエピトープ構築物(配列番号3)の免疫原性エピトープの同定及びHLA制限を示す図である。
【図１５Ａ】HLA-A2、A24、B7及びB35トランスジェニックマウスにおけるT細胞応答の、ELISPOTアッセイによる定量化を示す図である。3つの独立した実験が実施され、それにおいて、合計で10匹及び4匹のHLA-A*02: 01トランスジェニックマウスが、それぞれDENV1-NSポリエピトープ構築物(配列番号3)及び対照プラスミドを受け、合計で8匹及び4匹のHLA-A*24: 02トランスジェニックマウスが、それぞれDENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受け、合計で5匹及び4匹のHLA-B*07: 02が、それぞれDENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受け、合計で5匹及び3匹のHLA-B*35: 01トランスジェニックマウスが、それぞれDENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受けた。全ての動物は皮内注射(100μgのDENV1-NSポリエピトープ構築物、又は100μgのpcDNA3.1対照プラスミド)により、続いてin vivoエレクトロポレーションにより免疫した。2回の免疫化を3週間隔で実施し、脾臓細胞を第2の注射後10日目にELISPOTによりIFN-γ分泌について試験した。個々のマウスを、2μg/mlにて様々なペプチドと並行して及び最終濃度5μg/mlにてコンカナバリンA(ConA)で試験した。
【図１５Ｂ】HLA-A2、A24、B7及びB35トランスジェニックマウスにおけるT細胞応答の、ELISPOTアッセイによる定量化を示す図である。合計で10匹及び4匹のHLA-A*02: 01トランスジェニックマウスが、それぞれ、DENV1-NSポリエピトープ構築物(配列番号3)及び対照プラスミドを受けるように、合計で8匹及び4匹のHLA-A*24: 02トランスジェニックマウスが、それぞれ、DENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受けるように、合計で5匹及び4匹のHLA-B*07: 02トランスジェニックマウスが、それぞれ、DENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受けるように、並びに合計で5匹及び3匹のHLA-B*35: 01トランスジェニックマウスが、それぞれ、DENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受けるように、3つの独立した実験を実施した。全ての動物は皮内注射(100μgのDENV1-NSポリエピトープ構築物、又は100μgのpcDNA3.1対照プラスミド)により、続いてin vivoエレクトロポレーションにより免疫した。2回の免疫化を3週間隔で実施し、脾臓細胞を第2の注射後10日目にELISPOTによりIFN-γ分泌について試験した。個々のマウスを、2μg/mlにて様々なペプチドと並行して及び最終濃度5μg/mlにてコンカナバリンA(ConA)で試験した。
【図１６Ａ】個々のペプチドに対する応答を累積するINF-γELISPOT応答を示す図である。これらのアッセイで、使用したペプチドは以下のとおりであった。HLA-A24トランスジェニックマウスについては、P17、P32及びP33ペプチド(それぞれ、配列番号39、33及び47に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドHBSP A2-2(配列番号150に規定のアミノ酸配列TLCIPHVAVを有する)を対照として使用した。HLA-A2トランスジェニックマウスについては、P30、P53及びP56ペプチド(それぞれ、配列番号18、51及び55に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドHBSP A2-2を対照として使用した。HLA-B7トランスジェニックマウスについては、P15、P30及びP36ペプチド(それぞれ、配列番号68、18及び21に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドSv B7-3(配列番号151に規定のアミノ酸配列SPFLPLLPIを有する)を対照として使用した。HLA-B35トランスジェニックマウスについては、P49、P50及びP51ペプチド(それぞれ、配列番号28、32及び45に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドSv B7-3を対照として使用した。
【図１６Ｂ】個々のペプチドに対する応答を累積するグランザイムB(GrB)ELISPOT応答を示す図である。これらのアッセイで、使用したペプチドは以下のとおりであった。HLA-A24トランスジェニックマウスについては、P17、P32及びP33ペプチド(それぞれ、配列番号39、33及び47に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドHBSP A2-2(配列番号150に規定のアミノ酸配列TLCIPHVAVを有する)を対照として使用した。HLA-A2トランスジェニックマウスについては、P30、P53及びP56ペプチド(それぞれ、配列番号18、51及び55に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドHBSP A2-2を対照として使用した。HLA-B7トランスジェニックマウスについては、P15、P30及びP36ペプチド(それぞれ、配列番号68、18及び21に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドSv B7-3(配列番号151に規定のアミノ酸配列SPFLPLLPIを有する)を対照として使用した。HLA-B35トランスジェニックマウスについては、P49、P50及びP51ペプチド(それぞれ、配列番号28、32及び45に規定のアミノ酸配列を有する)を同族として使用し、ペプチドSv B7-3を対照として使用した。
【図１７】DENV1-NSポリエピトープ構築物(配列番号3)又は対照プラスミドで免疫した動物由来のT細胞のin vivo細胞障害性活性を示す図である。HLA-24マウスについては、高染色標的細胞はP17、P32及びP33同族ペプチド(それぞれ、配列番号39、33及び47に規定のアミノ酸配列を有する)の混合物でパルスしたが、一方、低染色対照細胞はパルスしなかった。HLA-A2マウスについては、高染色標的細胞はP30、P53及びP56同族ペプチド(それぞれ、配列番号18、51及び55に規定のアミノ酸配列を有する)の混合物でパルスしたが、一方、低染色対照細胞はHBSP A2-2対照ペプチドでパルスしなかった。HLA-B35マウスについては、高染色標的細胞はP49、P50及びP51同族ペプチド(それぞれ、配列番号28、32及び45に規定のアミノ酸配列を有する)の混合物でパルスしたが、一方、低染色対照細胞はパルスしなかった。
【００１３】
本発明者らは、カンボジアのコホートからの無症候性か又は症候性のいずれかの感染ドナーに由来する末梢血単核球(PBMC)で異なって発現された転写物を分析し、症候性ドナーと比較して、デング熱(DF)又はデング出血熱(DHF)に罹患した無症候性個体において過剰発現した、CD8+T細胞活性化に対応する有意な数の遺伝子を観察した。重症のデング症例で観察される強い炎症反応と一致して、TH17と関連した転写物の数が多いこと及び好中球活性化も、DHF及びデングショック症候群(DSS)に罹患したこのような症候性患者に由来するPBMCにおいて観察された。まとめると、これらの観察により、抗DENV免疫性における、CD8+T細胞へのHLAにリンクした防御的役割が強く裏付けられる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、DENVに対するCD8+T細胞免疫性を誘導することが可能な抗原を設計した。最も重要なことは、この抗原はDENVゲノムの全長、又はDENV NSタンパク質の全長に比べてサイズが小さいことであり、その結果、この抗原は、例えば弱毒化生MVワクチンに由来する複製ウイルスベクターなどの任意のワクチンベクターに挿入することができる。更に、この設計は、免疫系の曝露を弱免疫原性エピトープに限定して、免疫応答の拡散又は希薄化を予防するという概念を用いて、高抗原性エピトープに富むDENV抗原を提供することを目標とする。このような抗原はDENVのNSタンパク質に由来するポリエピトープ領域から構成される。蓄積された抗DENV T細胞エピトープの分布及び強度を使用して[Simmons CPら、J Virol 2005、79(9): 5665〜5675頁; Yauch LEら、J Immunol 2009、182(8): 4865〜4873頁; Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22): E2046〜2053頁; Imrie Aら、J Virol 2007、81 (18): 10081〜10091頁; Lund Oら、PLoS ONE 2011、6(10): e26494; Weiskopf Dら、J Immunol 2011、187(8): 4268〜4279頁; Boucherma Rら、J Immunol 2013、191(2): 583〜593頁; Nascimento EJら、PLoS neglected tropical diseases 2013、7(10): e2497; Rivino Lら、J Virol 2013、87(5): 2693〜2706頁; Rivino Lら、J Immunol 2013、191 (8): 4010〜4019頁; Immune Epitope Database (IEDB)]、本発明者らは、合計539個のアミノ酸として: NS3中2領域(それぞれ、185個及び134個のアミノ酸): NS4b中1領域(86個のアミノ酸)及びNS5中1領域(135個のアミノ酸)、CD8エピトープに富んだ4領域を選択した(図1)。これら4領域の境界は、NS3及びNS5関する結晶学データを使用して(それぞれ、PDB ID 2VBC及びPDB ID 2J7W)、及びNS4BについてはJPRED[Cole C、Barber JD & Barton GJ. Nucleic Acids Res. 2008. 35 (suppl. 2) W197〜W201]又はGOR IV(GOR secondary structure prediction method version IV、Methods in Enzymology 1996 R.F. Doolittle編、vol 266、540〜553頁、Gamier J、Gibrat J-F、Robson B)などの予測ツールを使用して、それぞれのポリタンパク質の二次構造及びアミノ酸配列特性に基づいて選択した(図2)。特に、設計ではα-ヘリックス又はβ鎖などの二次構造要素の破壊を注意深く回避した(図2)。MUSCLE 3.7[Edgar RC、Nucleic Acids Res 2004、32(5): 1792〜1797頁]を使用して、アミノ酸配列に応じて手動調節によって、合計で2033の全長デングゲノム配列(血清型1については865、血清型2については678、血清型3については427、及び血清型4については63)のアライメントをとった。配列類似性は、核酸レベル及びアミノ酸レベルで血清型内及び血清型間で評価した。対象とする連結領域の分析により、全体としてゲノムに比較して、サブタイプ間比較についても含めて、強い血清型内保存、及び概してより高度な配列同一性が明らかとなった(図1及び図2)。DENVの4種の血清型の遺伝的多様性に基づいて、更に、T細胞エピトープは、異なる血清型間で保存されているか、又は血清型特異的ではあるがなお交差反応性CD8+T細胞応答を誘導する能力を有するかのいずれかであるという概念を用いて、DENV1の流行株に基づいたプロトタイプコンセンサス配列、DENV1 NS T細胞ポリエピトープを選択した(図1及び図2)。
【００１５】
4種の血清型と最も高い平均遺伝的同一性を示したことから(血清型1に対して99.48%、血清型2に対して83.48%、血清型3に対して89.39%、血清型4に対して76.96%)、血清型1のコンセンサス配列を選択した。
【００１６】
平均遺伝的同一性は、各血清型について、血清型の各配列に対するペアでパーセント配列同一性(NSポリエピトープを構成する並べられた全ての位置数に対する同一な位置数の割合)として評価し、平均値を報告した。この与えられたパーセンテージは、NS3、NS4B及びNS5の選択された断片の連鎖にのみに対応している。
【００１７】
したがって、本発明は、融合ポリペプチドに組み立てられた以下の(a)、(b)及び(c)の断片:
(a)2つの領域を含むか又はそれらからなるデングウイルス(DENV)血清型1(DENV1)の非構造(NS)NS3タンパク質の2つの断片であって、第1の領域が配列番号6に規定のアミノ酸配列を有し、第2の領域が配列番号9に規定のアミノ酸配列を有する、2つの断片、
(b)配列番号12に規定のアミノ酸配列を有する、DENV1のNS4bタンパク質の断片、
(c)配列番号15に規定のアミノ酸配列を有する、DENV1のNS5タンパク質の断片
を含むか又はそれらからなり、(a)、(b)及び(c)の断片がこの順番で直接的又は間接的に融合している、600未満のアミノ酸残基を有するキメラポリエピトープ:
又はそのポリエピトープ変異体であって、該キメラポリエピトープは、(i)DENV NS断片のアセンブリを融合ポリペプチドの形態で含むか又はそれからなり、ここでそれら断片の配列が、DENV2、DENV3若しくはDENV4血清型であるウイルスのNSタンパク質の相応するNS3、NS4b及びNS5配列と、(a)、(b)及び(c)に記載のNS3 DENV1、NS4b DENV1、NS5 DENV1断片をアラインすることにより得られるか、又は(ii)融合断片(a)、(b)及び(c)からなる融合ポリペプチド(これからアミノ酸残基の変異により該キメラポリエピトープが誘導される)の配列とその全長にわたり、75%超の同一性、特に80%超又は85%超又は90%超の同一性を有するアミノ酸配列を有するキメラポリエピトープからなる、キメラポリエピトープに関する。
【００１８】
特定の一実施形態では、本発明は、600未満のアミノ酸残基のサイズを有し、特に539アミノ酸残基の鎖からなり、並びに以下(a)、(b)及び(c)とされ、且つ任意のDENVゲノムのいくつかの非構造(NS)タンパク質から得られるか又はそれらを代表する断片の融合体を含むか又はそれからなるキメラポリエピトープに関し、すなわち断片は:
(a)DENV1のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_059433.1)中の1645〜1829及び1959〜2092のアミノ酸、又はDENV2のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_056776.2)中の1645〜1828及び1958〜2091のアミノ酸、又はDENV3のポリタンパク質配列(Genbank受託番号YP_001621843.1)中の1643〜1827及び1957〜2090のアミノ酸、又はDENV4のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_073286.1)中の1644〜1827及び1957〜2090のアミノ酸からなるNS3タンパク質、
(b)DENV1のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_059433.1)中の2262〜2347のアミノ酸、又はDENV2のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_056776.2)中の2260〜2345のアミノ酸、又はDENV3のポリタンパク質配列(Genbank受託番号YP_001621843.1)中の2260〜2344のアミノ酸、又はDENV4のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_073286.1)中の2259〜2341のアミノ酸からなるNS4bタンパク質、並びに
(c)DENV1のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_059433.1)中の2766〜2899のアミノ酸、又はDENV2(Genbank受託番号NP_056776.2)のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_056776.2)中の2765〜2898のアミノ酸、又はDENV3のポリタンパク質配列(Genbank受託番号YP_001621843.1)中の2763〜2896のアミノ酸、又はDENV4のポリタンパク質配列(Genbank受託番号NP_073286.1)中の2761〜2894のアミノ酸からなるNS5タンパク質からなり、
ここで、(a)、(b)及び(c)の各断片は、免疫応答、とりわけ全てのDENV血清型に対するT細胞の免疫応答を誘発するのに適した複数のエピトープを含むが、前記ポリエピトープは、前記断片、特に特異的デングウイルス血清型に由来する複数の前記断片の直接的又は間接的融合から生じる。
【００１９】
特定の一実施形態では、本発明は、539個のアミノ酸のサイズを有し、並びに以下(a)、(b)及び(c)とされ、且つ任意のDENVゲノムのいくつかの非構造(NS)タンパク質から得られるか又はそれらを代表する断片の融合体を含むか又はそれからなるキメラポリエピトープに関し、すなわち断片は:
(a)DENV1のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001477.1)中の5027〜5581及び5969〜6370のヌクレオチド、又はDENV2のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001474.2)中の5026〜5580及び5968〜6369のヌクレオチド、又はDENV3のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001475.2)中の5021〜5575及び5963〜6364のヌクレオチド、又はDENV4のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_002640.1)中の5028〜5582及び5970〜6371のヌクレオチドにコードされるNS3タンパク質、
(b)DENV1のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001477.1)中の6878〜7135のヌクレオチド、又はDENV2のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001474.2)中の6874〜7131のヌクレオチド、又はDENV3のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001475.2)中の6872〜7126のヌクレオチド、又はDENV4のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_002640.1)中の6876〜7124のヌクレオチドにコードされるNS4bタンパク質、並びに
(c)DENV1のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001477.1)中の8390〜8791のヌクレオチド、又はDENV2のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001474.2)中の8389〜8790のヌクレオチド、又はDENV3のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_001475.2)中の8381〜8782のヌクレオチド、又はDENV4のヌクレオチド配列(Genbank受託番号NC_002640.1)中の8382〜8783のヌクレオチドにコードされるNS5タンパク質からなり、
ここで、(a)、(b)及び(c)の各翻訳断片は、免疫応答、とりわけ全てのDENV血清型に対するT細胞の免疫応答を誘発するのに適した複数のエピトープを含むが、前記ポリエピトープは、前記断片、特に特異的デングウイルス血清型に由来する複数の前記断片の直接的又は間接的融合から生じる。
【００２０】
本明細書で定義される、用語「ポリエピトープ」とは、DENV1 NS3、NS4b及びNS5タンパク質中に同定された、有利には少なくとも3つの、特に少なくとも5つの、好ましくは10を超える又は13を超えるエピトープを、特に図1に提供されたDENV1 NS3、NS4b及びNS5コンセンサス配列のT細胞エピトープ有するポリペプチドを指す。本発明の範囲内のエピトープは、直線的又は立体配置的のいずれか、好ましくは直線的であるとともに、細胞性免疫応答、とりわけ、DENVに対するT細胞免疫応答及び特にDENV1、DENV2、DENV3、DENV4のいずれか1つに対する又は複数に対する、特にDENV血清型全てに対するT細胞免疫応答の誘導に関与する任意のペプチド又はポリペプチドである。したがって、本明細書に記載のエピトープは、宿主においてAPC(抗原提示細胞)により処理されるエピトープ、とりわけ、クラスI MHC(主要組織適合遺伝子複合体)分子との結合で認識されるTエピトープ、例えば標的細胞がCD8+Tリンパ球であるエピトープ、又はクラスII MHC分子との結合で認識されるTエピトープ、例えば標的細胞がCD4+Tリンパ球であるエピトープを含む。
【００２１】
用語「キメラポリエピトープ」とは、NS3、NS4b及びNS5タンパク質の内から選択される異なるDENV NSタンパク質の下位部分を、例えば、本明細書に規定の、第1のDENV NSタンパク質に由来するポリエピトープ及び第2のDENV NSタンパク質に由来するポリエピトープ含む任意のポリエピトープポリペプチドを意味する。ポリエピトープはまた、同一なDENV NSタンパク質からの異なるポリエピトープに由来する下位部分を、又は異なるDENV NSタンパク質からの同一なポリエピトープに由来する下位部分を含む場合でも、キメラポリエピトープであるとみなされる。本発明のキメラポリエピトープには、ポリエピトープ変異体が含まれる。したがって、それぞれの定義又は本明細書で開示の実施形態は、技術的に無関係でない限り変異ポリエピトープに適用される。
【００２２】
本発明の特定の一実施形態では、キメラポリエピトープには、ヒト白血球抗原(HLA)制限エピトープが含まれる。表現「HLA制限」とは、このタイプのHLA分子に対する親和性を有する特定のエピトープに対する能力を指す。本発明において使用するHLA分子は、クラスI分子(HLA-A、B又はCと示される)又はクラスII分子(DP、DQ又はDRと示される)のいずれかを包含する。
【００２３】
本発明の別の特定の実施形態では、キメラポリエピトープは、DENV1、DENV2、DENV3及びDENV4に対するヒト白血球抗原(HLA)制限CD8+T細胞応答及び/又はCD4+T細胞応答を誘発する。DENV CD8T細胞エピトープの非網羅的なリストをTable 1(表1)に示す。
【００２４】
【表１Ａ】
0006486973.tif 000002
【００２５】
【表１Ｂ】
0006486973.tif 000003
【００２６】
【表１Ｃ】
0006486973.tif 000004
【００２７】
【表１Ｄ】
0006486973.tif 000005
【００２８】
本発明の別の特定の実施形態では、キメラポリエピトープは、DENV1、DENV2、DENV3及びDENV4に対するヒト白血球抗原(HLA)制限CD4+T細胞応答を誘発する。DENV CD4T細胞エピトープの非網羅的なリストをTable 2(表2)に示す。
【００２９】
【表２】
0006486973.tif 000006
【００３０】
特定の一実施形態では、NSキメラポリエピトープ配列は、HLA-A*02: 01、HLA-A*24: 02、HLA-B*07: 02又はHLA-B*35: 01などのHLA制限によりマウスにおいて抗原性応答を誘発することが示された。
【００３１】
特定の一実施形態では、本発明は、そのサイズが539個のアミノ酸で、
(a)それぞれ、配列番号6、配列番号9に規定のアミノ酸配列を有する、デングウイルス(DENV)血清型1(DENV1)の非構造(NS)NS3タンパク質の2つの断片、
(b)配列番号12に規定のアミノ酸配列を含む、DENV1のNS4bタンパク質の断片、
(c)配列番号15に規定のアミノ酸配列を含む、DENV1のNS5タンパク質の断片を含むか又はそれらからなるキメラポリエピトープに関し、
ここで、各NS断片(a)、(b)及び(c)が、好ましくはこの順番で、ポリエピトープにおいて別のNS断片(a)、(b)及び(c)と直接的又は間接的に融合している。
【００３２】
DENV1、DENV2、DENV3及びDENV4のポリタンパク質のヌクレオチド配列は、それぞれ、Genbank受託番号NP_059433.1、NP_056776.2、YP_001621843.1及びNP_073286.1からアクセスできる。
【００３３】
それぞれ、配列番号146,147及び148の、本発明の変異ポリエピトープであるDENV2-NSポリエピトープ、DENV3-NSポリエピトープ及びDENV4-NSポリエピトープのアミノ酸配列が図3に開示されている。本発明者らは、DENV1-NSポリエピトープ、DENV2-NSポリエピトープ、DENV3-NSポリエピトープ及びDENV4-NSポリエピトープの配列中の保存アミノ酸残基を示すアライメントを実施した(図4)。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態では、キメラポリエピトープは、本明細書で開示の少なくともP30、P451、P36、P453、P49、P50、P32、P17、P21、P51、P33、P56及びP15エピトープを含む。特に、P30、P451及びP56エピトープはHLA-A*02: 01で制限され、P17、P32及びP33エピトープはHLA-A*24: 02で制限され、P15、P30及びP36エピトープはHLA-B*07: 02で制限され、P21、P49、P50、P51及びP453エピトープはHLA-B*35: 01で制限される。キメラポリエピトープは、少なくとも既存のHLAの数に等しいいくつかのさらなるエピトープを含有することが予想され、例がTable 1(表1)及びTable 2(表2)に提供されている。
【００３５】
本発明のエピトープは、本発明の枠内で、DENV1に対して決定したコンセンサスNSにおいて1つ又は複数のアミノ酸により異なるか又は違うアミノ酸配列を有していてもよい。或いは又は更に、本発明のポリエピトープの2つのエピトープは、1つのNS断片中に重複する配列を有していてもよく、したがって一部のアミノ酸を共有していてもよい。
【００３６】
本発明のキメラポリエピトープは、化学的に合成してもよいし、又は細胞系でポリエピトープをコードする核酸分子の発現後にin vitro(無細胞系)又はin vivoのいずれかで産生してもよい。
【００３７】
本明細書で定義される、用語「断片」とは、NSタンパク質(すなわち、NS3、NS4b又はNS5タンパク質)の一部又は部分、特に86から185までのアミノ酸を有する部分を指す。本発明の断片に相応する、任意のデングウイルス分離株の任意の配列又は配列の組合せ[Genbank(NP_059433.1)に寄託されたDENV1参照配列上の又はその配列番号に関連して開示された、ヌクレオチド及びアミノ酸ナンバリングを使用して同定された、NSタンパク質における位置で区切られた]は、それが由来するNSタンパク質よりも、長さの点で短い。
【００３８】
本発明の特定の一実施形態によれば、1つのNS断片が、別のNS断片と「直接的に」融合している、すなわち、NS断片の3'末端は第2の断片(など)の5'末端に直接的にリンクし、これは、NS3、NS4b及びNS5の内で選択される同一なNSタンパク質からの及び/又は異なるNSタンパク質からの、特にDENV1のNSコンセンサス配列に由来する、連続するNS断片から構成されるキメラポリエピトープに相応する。代替の一実施形態によれば、断片の融合は「間接的」であり、したがって非NSアミノ酸残基セグメント、すなわち、検討中の断片の配列を提供するNSタンパク質上で読み取りをしないアミノ酸残基セグメントの存在を含む。
【００３９】
本明細書で定義される、用語「領域」とは、本明細書に規定のNSタンパク質の隣接アミノ酸鎖を指し、少なくとも86個のアミノ酸を有する。NSタンパク質の断片は、NS3断片に関する限りでは複数の領域を含んでもよく、それらからなっていてもよい。
【００４０】
本明細書で使用する、2つの比較されるヌクレオチド配列間又はそれぞれの2つアミノ酸配列間の用語「同一性のパーセンテージ」とは、最良のアライメントの後に得られる、比較される2つの配列間の同一ヌクレオチド又は同一アミノ酸のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは単に統計的なものであり、2つの配列間の差異はランダムに、それらの全長にわたって分布している。用語「最良のアライメント」又は「最適のアライメント」とは、同一性のパーセンテージが最も高いアライメントを意味する。2つの核酸配列間又は2つのアミノ酸配列間の配列の比較は、従来どおりに、それらを最適な方法でアラインした後にこれらの配列を比較することによって実施され、前記比較は、配列類似性を有する局所的な領域を同定し且つ比較する比較セグメント又は比較ウィンドウを使用して実施される。比較のための最適な配列アライメントは、手動又は、Smith及びWaterman(1981)の局所的相同性アルゴリズムを使用して、Neddleman及びWunsch(1970)の局所的相同性アルゴリズムを使用して、Pearson及びLipman(1988)の配列類似性検索方法を使用して、又はこれらのアルゴリズムを用いるソフトウェア(Wisconsin Genetics Software PackageのGAP、BESTFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA及びTFASTA、Genetics Computer Group、575 Science Dr, Madison、Wl)を使用して、実施することができる。最適なアライメントを得るために、BLOSUM 62マトリックスとともに、BLASTプログラムを使用することができる。PAM又はPAM250マトリックスを使用することも可能である。MUSCLE 3.7[Edgar RC、Nucleic Acids Res 2004、32(5): 1792〜1797頁]を使用して、アミノ酸配列に応じて手動調節によって、合計で2033の全長デングゲノム配列(血清型1については865、血清型2については678、血清型3については427、及び血清型4については63)のアライメントをとった。
【００４１】
2つの核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、最適な方法でアラインしたこれらの2つの配列を比較することにより決定される。同一性のパーセンテージは、2つの配列間でヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較された全位置数で割り、得られた結果に100を掛けて、これらの2つの配列間の同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【００４２】
本発明の特定の一実施形態では、DENV1のNS3の第1の領域は配列番号6に規定のアミノ酸配列を有し、DENV1のNS3の第2の領域は配列番号9に規定のアミノ酸配列を有し、DENV1のNS4b断片は配列番号12に規定のアミノ酸配列を有し、及びDENV1のNS5断片は配列番号15に規定のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
本発明の別の特定の実施形態では、DENV1のNS3の第1の領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列及び最適化配列は、それぞれ、配列番号4及び5に規定され、DENV1のNS3の第2の領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列及び最適化配列は、それぞれ、配列番号7及び8に規定され、DENV1のNS4b断片をコードするポリヌクレオチドの天然配列及び最適化配列は、それぞれ、配列番号10及び11に規定され、DENV1のNS5断片をコードするポリヌクレオチドの天然配列及び最適化配列は、それぞれ、配列番号13及び14に規定されている。
【００４４】
用語「変異体」は、本明細書で開示の、DENV血清型2、3又は4のウイルスのNS3、NS4b及びNS5タンパク質の他の断片のアセンブリを包含する。
【００４５】
本発明の好ましい一実施形態では、キメラポリエピトープは、配列番号3、146、147及び148からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか又はそれからなる。
【００４６】
本発明はまた、本発明のキメラポリエピトープと、以降4価EDIII/ectoMと称される異なる免疫原性ポリペプチドとの結合体にも関する。本発明の特定の一実施形態では、前記異なる免疫原性ポリペプチド(4価EDIII/ectoM)は、DENV1のectoMに融合した、4種のDENV血清型を代表するEDIIIポリペプチドの融合体から構成されるキメラDENV抗原からなり、配列番号145に開示されるアミノ酸配列を有し、配列番号144を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【００４７】
ポリペプチドの前記結合体は、本明細書に開示のベクターに由来する、前記キメラポリエピトープ及び異なる免疫原性ポリペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現の結果として達成することができる。また、前記結合体は、前記キメラポリエピトープ及び異なる免疫原性ポリペプチドを包含するアミノ酸構築物から得ることもできる。
【００４８】
本発明はまた、ウイルス粒子にも、特に本発明のキメラポリペプチド又は4価EDIII/ectoMポリペプチドと結合した前記キメラポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルス(MV)粒子にも関する。
【００４９】
本発明はまた、本発明のキメラポリエピトープを発現する組換え麻疹ウイルス(MV)粒子及び4価EDIII/ectoM免疫原性ポリペプチドを任意選択で発現する組換え麻疹ウイルス(MV)粒子を含むか又はそれからなるベクターにも関する。
【００５０】
このように産生した組換えウイルス粒子、特に麻疹ウイルス粒子により、単独で使用したときDENV抗原により誘発される免疫応答が、特にそれを必要とする宿主へのこの粒子の投与に続いて誘発される免疫原性T細胞応答に影響を与えることで、増強されることが証明された。
【００５１】
ウイルス粒子を、特に本明細書に開示のいわゆる4価EDIII/ectoMポリペプチドと結合した本発明のキメラポリエピトープを発現するMV粒子を調製するために、前記ポリエピトープ及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがウイルスのゲノム、とりわけ麻疹ウイルスのゲノムを包含するポリヌクレオチドに組み換えられる。
【００５２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、組換えMVゲノムは、弱毒化生シュワルツウイルス又は弱毒化生モラテンウイルスの全長RNAゲノムをコードするcDNAとして提供される。
【００５３】
弱毒化生MV株とは、選択された細胞上で連続的に継代され、好ましくは、IFNα/β応答とともに初代細胞などの他の細胞に適合する株を指し、すなわち病原性の復帰もせず、宿主染色体、特にヒト宿主染色体に統合もしないであろう安定したゲノムを保有する、ワクチン株の調製に適した種子株を産生するためのCEF細胞に適合している。本発明の特定の一実施形態では、弱毒化生MVは、CEF細胞などの初代細胞上で選択されたものである。
【００５４】
本明細書で定義される場合、表現「弱毒化生シュワルツウイルス又は弱毒化生モラテンウイルス」は、宿主、とりわけヒトに投与された場合に感染性の特性及び免疫原性並びに場合によりアジュバント活性を維持しつつも、同一宿主、とりわけヒトにおいて非病原性であるか又は決定された親株よりも弱い病原性を有する株に由来するシュワルツウイルス又はモラテンウイルスを指す。具体的には、シュワルツ株やモラテン株は、Rouvax(登録商標)ワクチン(Aventis社)由来である。シュワルツ株はモラテン株と配列の完全な同一性を有することが実証されてきた[Parks、C. L.ら、2001、J Virol、75(2): 910〜920頁; Schwarz、A. J.、1962、Am J Dis Child、103、386〜389頁]。シュワルツ/モラテン株は、長期的な細胞性及び液性免疫応答を誘導し、重要な遺伝的安定性を提示するので、病原型への復帰がこれまで観察されなかったことから、現在広く使用されている(Hilleman、M.、2002、Vaccine、20: 651〜665頁)。
【００５５】
麻疹ウイルゲノムは、当分野においてとりわけWO2004/001051及びWO2004/000876において開示されている全長MVゲノムをコードするcDNA分子の調製の結果として得られる。前記cDNA分子は、2002年6月12日にCNCMによりNo.I-2889で寄託されたpTM-MVSchwと称されるプラスミドにおいてインサートとして包含された(Institut Pasteur-Paris-France)。ゲノムをコードするMV cDNAの配列は、本発明のキメラポリエピトープ及び異なるいわゆる4価EDIII/ectoMポリペプチドを用いて調製した構築物を説明する図に示されている。MV配列の位置が前記図中に開示されている。
【００５６】
本発明のキメラポリエピトープを発現させるために、及び異なるいわゆる4価EDIII/ectoMポリペプチドを任意選択で発現させるために、全長MVゲノムをコードする前記cDNA分子を、本発明のキメラポリエピトープをコードするDNA分子で及び任意選択で、本明細書で開示のいわゆる4価EDIII/ectoMポリペプチドをコードするDNA分子において、当業者に周知の方法及びプロトコルを使用して、組み換える。前記ポリペプチドをコードするDNA分子を当業者により公知の技法に従って調製する。
【００５７】
特定の一実施形態では、本発明のキメラポリエピトープに対応するDNA分子は、化学合成で作製することができる。好ましくは、この配列は、哺乳類細胞での発現のためコドン最適化されており、好ましくはその長さは、ヌクレオチドの総数は6の倍数であることを要求する「rule of six」を満たすが、このルールはMVゲノムからの、MVタンパク質の適切な発現に影響を与えることが公知である(Calain、P.らJ Virol.、1993、67: 4822〜4830頁)。
【００５８】
特定の一実施形態では、全長MVゲノムをコードするcDNAに挿入された全ての核酸構築物、特にキメラポリエピトープのコード配列及びいわゆる4価EDIII/ectoMポリペプチドのコード配列は、6の倍数であるヌクレオチド数を有する。
【００５９】
したがって、本発明は、本発明のキメラポリエピトープをコードする単離又は精製されたポリヌクレオチドに関するが、rule of sixに従う合計ヌクレオチド数を有することが好ましい。このポリヌクレオチドは具体的にはDNA又はcDNAである。特定の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドのNS断片をコードする配列のMV編集配列及びポリアデニル化様配列を変異させる(Lamb、R. A.らIn Fields Virology、第4版、1305〜1340頁; Schneider、H.らVirology、1997、227: 314〜322頁)。また、哺乳類発現プラスミド例えばpcDNA3へのpUCなどのプラスミドへの、又はMVベクターへのその将来のクローニングを可能とするために、本発明のキメラポリエピトープをコードするDNAの端部に、BgIII、Apal、BsiWI及びBssHIIなどの制限部位の配列を配置した。
【００６０】
したがって、本発明は、それぞれ、配列番号1及び配列番号2として開示の配列である、DENV1のキメラポリエピトープをコードする天然ヌクレオチド配列及びコドン最適化ヌクレオチド配列に特に関する(図5及び図6)。DENV1のキメラポリエピトープのアミノ酸配列は配列番号3として開示の配列である。
【００６１】
本発明はまた、DENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原をコードするポリヌクレオチドを更に含む核酸構築物における、本発明のキメラポリエピトープをコードする単離又は精製されたポリヌクレオチドに関し、この場合、得られるポリヌクレオチドはrule of sixに従う合計ヌクレオチド数を有することが好ましい。特定の一実施形態では、このポリヌクレオチドは配列番号144の配列を有する。そのような構築物は、本発明のキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドから上流にDENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原をコードするポリヌクレオチドを特に含むことができる。
【００６２】
本発明はまた、本発明のキメラポリエピトープをコードする本明細書で開示のポリヌクレオチド含み、且つ全長MVゲノムをコードするcDNA分子で組み換えられた、DENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原をコードするポリヌクレオチドを任意選択で含む核酸分子にも関する。
【００６３】
本明細書で定義する、用語「単離又は精製された」は、その自然な状態からヒトによって変えられた分子を意味し、すなわち、その分子が自然界に存在する場合、それがその元の環境から変化されたか且つ/又は引き出された、分子を意味する。例として、天然で発現する、生物の生物環境中に自然に存在し且つ見いだされるポリヌクレオチド、それは本文脈上では、「単離」されていない。しかし、その自然環境からから分離されたか及び/又はクローニング、増幅及び/又は化学合成によって得られた、同一のポリヌクレオチドは、本発明では「単離された」とみなされる。更に、形質転換、遺伝操作により、又はその他組換え法によって生物に導入されたポリヌクレオチドは、それが前記生物内に存在していても、「単離されて」いる。
【００６４】
本出願で使用される用語「コードする」は、核酸分子が転写プロモーターを含む発現制御配列下に位置しているとき、転写され、及び適切な場合には、選択された細胞又は細胞株に産物の発現のために翻訳される前記核酸分子の機能と定義される。したがって、本発明に記載の「をコードするポリヌクレオチド」とは、アミノ酸配列に翻訳される配列を有する核酸に限定されるか、又は代替的に特定の場合、発現制御配列も含まれる。
【００６５】
本発明はベクターにも関する。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、1種又は複数の細胞型を形質導入/トランスフェクションするために設計されたポリヌクレオチド構築体を指す。ベクターは、たとえば、挿入したポリヌクレオチドの単離、継代及び複製向けに設計された「クローニングベクター」(インサートと称される)、宿主細胞内でのポリヌクレオチド分子の発現、とりわけ宿主細胞におけるインサートの発現向けに設計された「発現ベクター」、又は組換えウイルス粒子若しくはウイルス様粒子を産生するように設計された「ウイルスベクター」、或いは二種類以上のベクターの属性を含む「シャトルベクター」としてよい。
【００６６】
細胞の形質導入に又はトランスフェクションに適したいくつかのベクターは、特に細胞及び細菌の安定なトランスフェクションに適したいくつかのベクターは、そのような細胞株を構築する方法と同様に、一般に入手可能である(例えばプラスミド、ウイルス)。本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれをも含むベクターの任意の種を包含することが理解されよう。
【００６７】
したがって、本発明は、ベクター、特に発現ベクターに関し、これは、本明細書に規定の1又は複数の核酸分子をポリヌクレオチドインサートとして含むプラスミドとすることができる。特定の一実施形態では、プラスミドは、インサートとして、本明細書に規定の本発明のキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドを含み、且つDENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原をコードするポリヌクレオチドを任意選択で含む。
【００６８】
特定の一実施形態では、本発明は、(i)麻疹(MV)ウイルスの全長RNAゲノムをコードするcDNA、(ii)このcDNAがそれにより組み換えられている、本明細書に規定の本発明のキメラポリエピトープをコードする、本発明に記載のポリヌクレオチドを含み、(iii)本明細書に規定の、DENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原をコードするポリヌクレオチドを任意選択で含む、プラスミド(麻疹ゲノムベクターと称される)に関する。特定の一実施形態では、(i)、(ii)及び任意選択で(iii)の配列が、MVゲノムベクターに存在するとき、それらはrule of sixに一緒に従う。
【００６９】
特定の一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、MVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間の、又はMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間の別個のインサートとして配置されている。任意選択で前記インサートは、構築物MVDVax6において説明されているATU2又はATU3の配列を有するATUなどの、追加転写ユニット(ATU)中に位置する。MVの抗ゲノム性RNAに由来する、cDNA内のATUの位置は前記cDNAに沿って変化させることができる。
【００７０】
特定の一実施形態では、本発明は、(i)MVウイルスの全長RNAゲノムコードするcDNA、及び(ii)任意選択で追加転写ユニット(ATU)中、MVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間又はMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間にインサートとして配置されている、本発明に記載のキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである組換え麻疹(MV)ゲノムベクターであって、ここで(i)及び(ii)の配列がプラスミド中で組み換えられる場合、rule of sixに一緒に従う、組換え麻疹(MV)ゲノムベクターに関する。
【００７１】
本発明はまた、(a)MVウイルスの全長RNAゲノムコードするcDNA、(b)DENV1の膜タンパク質のエクトドメイン(ectoM)に融合した、4種のDENV血清型のエンベロープドメインIII(EDIII)ポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原、特に配列番号145の配列を有するDENV抗原をコードするポリヌクレオチド、及び(c)本発明に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドである組換えMVゲノムベクターであって、
-  ポリヌクレオチド(b)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されており、且つポリヌクレオチド(c)がMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間のインサートとして配置されているか、又は
-  ポリヌクレオチド(b)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されており、且つポリヌクレオチド(c)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されているか、又は
-  ポリヌクレオチド(b)がMVゲノムのH遺伝子とL遺伝子との間のインサートとして配置されており、且つポリヌクレオチド(c)がMVゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間のインサートとして配置されており、
ここで(a)、(b)及び(c)の配列がプラスミド中で組み換えられる場合、rule of sixに一緒に従う、組換えMVゲノムベクターにも関する。
【００７２】
特定の一実施形態では、(a)、(b)及び(c)の配列がプラスミド中で組み換えられる場合、それらはrule of sixに一緒に従う。
【００７３】
双方のポリヌクレオチドを含む本発明の特定のベクターのヌクレオチド配列は、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143及び配列番号149として開示の配列である。
【００７４】
本発明はまた、本発明のキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドで遺伝的に形質転換された、及び本発明に記載の4価EDIII/ectoMをコードするポリヌクレオチド、特にDENV1の膜タンパク質のエクトドメイン(ectoM)に融合した、4種のDENV血清型のエンベロープドメインIII(EDIII)ポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原をコードするポリヌクレオチドで任意選択で遺伝的に形質転換された、宿主細胞にも関する。特定の宿主細胞はしたがって、本発明のゲノムベクターで、特に本発明の組換えMVゲノムベクターで遺伝的に形質転換することができる。
【００７５】
本発明の宿主細胞は、当業者に周知の方法により、すなわち化学的トランスフェクション(リン酸カルシウム、リポフェクタミン)、脂質をベースとした技法(リポソーム)、エレクトロポレーション、フォトポレーション、ウイルスベクターの使用等々により、本発明のゲノムベクターでトランスフェクトされている。
【００７６】
特定の一実施形態では、相同な細胞配列での組換えによるか又は細胞ゲノムにおける挿入のいずれかによる細胞ゲノムにおいてポリヌクレオチドの組込みを可能とする方法で、細胞が本発明のポリヌクレオチドで形質転換されるか又はそれで導入されている。トランスフェクション、感染又は導入はex vivoで、すなわち生物の外側の人工的環境で行うことができる。
【００７７】
本明細書で使用する場合、用語「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、又は「感染された」とは、本発明のベクターを含む細胞(一過性発現)を指し、一方、用語「遺伝的に形質転換された」とは、そのゲノムが、本発明のポリヌクレオチドによって決定的に改変されている細胞(永続的発現)を指す。
【００７８】
前記一時的に又は安定的に形質転換された細胞は、任意の原核(細菌)細胞又は真核(酵母、昆虫又は哺乳類とりわけヒトを含む動物)細胞とすることができる。一実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。特定の一実施形態では、本発明の細胞は単離されたヒト細胞であり、「単離される」とはその自然環境の外部を意味する。
【００７９】
本発明の特定の一実施形態では、細胞はHEK-293-T7-MV細胞株である。
【００８０】
より好ましくは、本発明を実施するのに適した感染性組換えMVゲノムベクターは、
プラスミドpTM-MVSchwにクローンした、MVシュワルツ株のcDNAを使用して産生されるが、このプラスミドは2002年6月12日に番号1-2889でCNCMのInstitut Pasteur(パリ、フランス)により寄託され、その配列はCombredet[Combredet、C.ら、2003、J Virol、77(21): 11546〜11554頁]により記載され、且つWO2004/000876に開示もされている。プラスミドpTM-MVSchwは、Bluescriptプラスミドから得られたが、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの制御下に置かれた、シュワルツ株の全長MV (+) RNA鎖をコードするポリヌクレオチドを含むとともに、18967個のヌクレオチドを有する。他のMV株からのcDNAは、弱毒化生MVのウイルス粒子から精製した核酸から開始して同様に得ることができる。したがって、本発明の組換えMVゲノムベクターは、配列番号139により説明されているpTM-MVDVax6、配列番号140により説明されているpTM-MVDVax7、配列番号141により説明されているpTM-MVDVax8、配列番号142により説明されているpTM-MVDVax9、配列番号143により説明されているpTM-MVDVax10又は配列番号149により説明されているpTM-MVDVax11である。
【００８１】
このように規定された組換えMVゲノムを含むプラスミド(ゲノムベクター)は組換え麻疹ウイルス粒子を調製するためのレスキュー系での使用に適している。
【００８２】
組換えMVウイルスのレスキューは前に記載したように[Combredetら、J Virol.、2003、77(21): 11546〜11554頁]、特に安定なHEK293-T7-MVヘルパー細胞を使用して行うことができる(WO2004/000876)。
【００８３】
実現すべき且つ本発明の組換えMV粒子のアセンブリを可能とする、組換えMV粒子のレスキューのために、T7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼ及びMVのN、P及びLタンパク質を発現し、且つ本発明に記載のMVゲノムベクターで遺伝的に形質転換されている、ヘルパー細胞(宿主細胞)を使用する。ヘルパー細胞によるMVタンパク質の発現は、トランス相補性プラスミドなどの、これはT7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼ及びMVのN、P及びLタンパク質を発現する、さらなるベクターでヘルパー細胞を遺伝的に形質転換することにより得ることができる。
【００８４】
本発明の特定の一実施形態では、ヘルパー細胞株は、2006年6月14日にCollection Nationale de Culture de Micro-organismes(CNCM)に番号I-3618により寄託された293-T7-NP細胞株、又は2006年8月4日にCNCMに番号I-3662により寄託された293-nlsT7-NP MV細胞株である。
【００８５】
本発明はまた、組換えMV粒子にも関し、これはT7 RNAポリメラーゼ並びにMVのN、P及びLタンパク質を発現するヘルパー細胞株からレスキューされるとともに、本発明のベクターをコードする核酸又は本発明の組換えMVゲノムベクターをコードする核酸を更に発現する。
【００８６】
さらなる一態様では、本発明は、(a)DENV1のectoMに融合した、4種のDENV血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成されるDENV抗原、特に配列番号145の配列を有するDENV抗原、及び(b)本発明に記載のキメラポリエピトープを含み、任意選択でアクセサリーアジュバントを含まない、免疫原性組成物に関する。
【００８７】
本発明はまた、本発明に記載の組換えMV粒子を含み、任意選択でアクセサリーアジュバントを含まない、免疫原性組成物にも関する。興味深いことに、本発明の組換えMV粒子は、宿主において投与すると、デングウイルス感染症に対して又はMV感染症及びデングウイルス感染症の双方に対して、液性及び/又は細胞性免疫応答を誘発することができる。特定の一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、免疫応答、特にDENV1、DENV2、DENV3及びDENV4に対するT細胞免疫応答を誘発し、したがって、これらDENV1〜4血清型いずれかのウイルスによる感染に対して防御応答を誘発することができる。
【００８８】
本発明の特定の一実施形態によれば、免疫原性組成物は、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、筋肉内(i.m.)注射、腹腔内(i.p.)注射又は静脈内(i.v.)注射などの非経口経路による投与のために製剤化されている。
【００８９】
本発明の特定の別の実施形態によれば、免疫原性組成物は単回又は多回投与で、特にプライムブースト投与レジメンで投与される。
【００９０】
特定の一実施形態では、免疫原性組成物はアクセサリーアジュバントを含まない。
【００９１】
投与する量(用量)は、患者の状態、個々の免疫系の状態、投与経路及び宿主のサイズを含めて、処置する対象に依存する。適切な用量は、103TCID50から107TCID50の範囲で、状況に応じて当業者が改変できる。
【００９２】
本発明はまた、(a)DENV1のectoMに融合した、4種のDENV血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成されるDENV抗原、特に配列番号145の配列を有するDENV抗原、及び(b)本発明に記載のキメラポリエピトープを含み、任意選択でアクセサリーアジュバントを含まない、ワクチン組成物にも関する。
【００９３】
本発明はまた、本発明に記載の組換えMV粒子を含み、任意選択でアクセサリーアジュバントを含まない、ワクチン組成物にも関する。
【００９４】
本発明はまた、ヒト対象においてデングウイルス感染症を予防及び/又は処置する方法であって、本発明に記載の組換えMV粒子の薬学的有効量又は本発明に記載の免疫原性組成物の薬学的有効量を投与する工程を含み、ここで前記粒子又は組成物が、薬学的に許容される媒体及び/又はアジュバントと混合物されている、方法にも関する。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」とは、それによりデングウイルス感染症を遮断する又は遅らせる方法を指す。
【００９６】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」とは、それによりデングウイルス感染症の症状が軽減するか、すなわち宿主におけるデングウイルス感染症の減少若しくは患者の臨床状態の改善、又は完全に取り除かれる方法を指す。
【００９７】
本明細書で定義される、薬学的に許容される媒体には、キメラポリエピトープ、ポリヌクレオチド、ベクター、特に本発明に記載の組換えMV粒子ベクターの製剤を可能とする、組成物内の任意の物質が包含される。媒体は、生理学的に許容される任意の物質又は物質の組合せであり、すなわち、宿主、とりわけヒトと接触する組成物中でのその使用に適したものであり、従って非毒性である。このような媒体の例としては、リン酸緩衝生理食塩水、蒸留水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤滅菌溶液などである。
【００９８】
本明細書で定義される、アジュバントには、例えば、リポソーム、油相、例えば、通常水性相を伴ったエマルジョンの形で用いられるフロイント型アジュバントがあげられ、或いは水に不溶性の無機塩、例えば、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド状水酸化鉄、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムを含めることができる。
【００９９】
本発明はまた、抗デングウイルスワクチンを調製するための組換えMV粒子を産生するための方法であって、
a)T7 RNAポリメラーゼ並びにMVのN、P及びLタンパク質を発現するヘルパー細胞株中に、本発明に記載の組換えMVゲノムベクターをトランスフェクトする工程、
b)前記ヘルパー細胞株を、本発明に記載のキメラポリエピトープと、任意選択で、DENV1のectoMに融合した、4種の血清型のEDIIIポリペプチドの融合体から構成される4価DENV抗原、特に配列番号145の配列を有するDENV抗原を含むポリペプチドとを発現する組換えMV粒子の複製及び産生を維持する能力がある細胞上に移す工程、及び
c)工程b)で産生された組換えMV粒子を回収する工程
を含むか又はそれらの工程からなる、方法にも関する。
【０１００】
本発明の好ましい一実施形態では、工程b)における能力がある細胞は、ベロ(アフリカミドリザル腎臓)細胞、CEF(ニワトリ胚線維芽)細胞又はMRC5細胞である。
【実施例】
【０１０１】
細胞培養
ベロ細胞は熱失活させたウシ胎児血清5%(FCS、Invitrogen社 Frederick、MD)で補ったDMEM Glutamax(Gibco-BRL社)中で維持した。ウイルスレスキューに使用した安定なHEK293-T7-MVヘルパー細胞(WO2004/000876)は10%FCSで補ったDEME中で成長させた。
【０１０２】
組換えMVベクターの構築及びレスキュー
プラスミドpTM-MVSchwについては、シュワルツMVワクチン株の抗ゲノムに相応する感染性MV cDNAを含有するが、先に記載した[Combredetら、J Virol.、2003, 77(21): 11546〜11554頁]。DENV1からの非構造タンパク質のポリエピトープ構築物をコードする合成cDNAを、先に記載の4価EDIII抗原と組み合わせて又は組み合わせずにBsiWI/BssHII-消化pTM-MVSchwベクターに様々な位置で挿入した[Brandlerら、PLoS 2007、1(3)、e96; Brandlerら、Vaccine, 2010、28、6730〜6739頁](図7)。組換えウイルスのレスキューは、先に記載のように[Combredetら、J Virol.、2003、77(21): 11546〜11554頁]安定なHEK293-T7-MVヘルパー細胞を使用して行った(WO2004/000876)。組換えウイルスはベロ細胞上で成長させ、ウイルス力価はベロ細胞上で終点希釈アッセイにより決定した。
【０１０３】
ウエスタンブロット
MVベクター又はpcDNA3発現プラスミドによるDENV抗原の発現を明示するため、MV-DENVで感染させたベロ細胞からの溶解物又はpcDNA3-NSプラスミドでトランスフェクトしたHEK293細胞からの溶解物をSDS-PAGEで分画し、セルロース膜(Amersham Pharmacia Biotech社)に転写し、抗EDIII DENV1 mAb 4E11又は抗NS3抗体でプローブした。ヤギ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(Amersham社)を二次抗体として使用した。ペルオキシダーゼ活性は、増強化学蛍光検出キット(Pierce社)で可視化した。この分析により、MVベクターがEDIII 4価抗原及びNSポリエピトープ抗原の双方を発現していることが示された。同様に、pcDNA3-NSプラスミドは、高レベルのNSポリエピトープ抗原を発現した(図8)。
【０１０４】
マウス実験及び細胞性免疫応答
IFNα/β受容体欠失及びヒトMV受容体(hCD46+/-IFNα/β-/-又はCD46-IFNAR)を発現するマウスを先に記載のように作出し[Combredetら、J Virol.、2003、77(21): 11546〜11554頁]、Institut Pasteur動物施設にて病原体フリーの条件下で収容した。実験はInstitut PasteurにてOffice of Laboratory Animal Careの指針に従って実施した。6週齢のCD46-IFNARマウス6匹の群にMV-DENVベクター105TCID50又は空のMVの単回投与を腹腔内(ip)経路で接種した。マウスは免疫化後7日目に安楽死させ、脾臓を採取した。抽出直後の脾臓細胞をDENVペプチド(2μg/ml)又はMV(MOI 1)で18時の間特異的に刺激した。細胞はまた、陽性対照としてコンカナバリンA(5μg/ml、Sigma社)及び陰性対照としてRPMI-IL-2(10U/ml)でも刺激した。刺激するとIFN-γを分泌するそれらの細胞の能力は、先に記載のELISPOTアッセイにより試験した[Guerboisら、Virology、2009、388(1): 191〜203頁]。
【０１０５】
ペプチド
NSポリエピトープ配列全体をカバーする36の重複ペプチド(5個のアミノ酸が重複する9〜15個のアミノ酸)の系列を合成した(図9)。CD46-IFNARマウスにおいて発現したH2-Db T細胞受容体及びH2-Kb T細胞受容体に結合可能な5つの特異的ペプチドも、予測アルゴリズムを使用して同定された(図9)。これらのペプチドを、プールするか又は個々のペプチドとしてのいずれかでELISPOT実験で使用して、免疫CD46-IFNARマウスからの脾臓細胞におけるT細胞応答を再刺激した。
【０１０６】
CD46-IFNARマウスにおける免疫原性
MV-DENVでの免疫化により誘発される細胞性免疫応答(CMI)は、単回免疫化を行って7日後に採取した脾臓細胞に関するIFN-γELISPOTアッセイを使用して評価した。DENV NSペプチド又はMVによるex vivo刺激の後、有意な数のDENV-特異的IFN-γ分泌細胞(400〜800のスポット形成細胞/106脾臓細胞)がMV-DENV免疫マウスに検出され(図10、図11、図12)、これは類似の刺激条件におけるMV特異的応答の1/3であった(1500のスポット形成細胞/106脾臓細胞)。MV-DENVで免疫したほとんどのマウス(5/6)はDENVに対して有意なCMI応答を有し、本実験モデルにおける単回MV-DENV免疫化により、1週間以内に抗DENV細胞性免疫をプライミング可能であることが実証された。
【０１０７】
ヒト化マウスにおける免疫原性。
CMVプロモーター下でDENV1 NSポリエピトープ配列を発現するpcDNA3プラスミドを、HLA-A*02-01、HLA-A*24: 02、HLA-B*07: 02及びHLA-B*35: 01単鎖形質転移/H-2 Class Iヌルマウスにおいてエレクトロポレーションにより注入し、脾臓細胞のINF-γ応答を、個々のペプチドに対するELISPOTアッセイにより定量した(図13)。
【０１０８】
事前にDENVに曝露したヒトドナーにおいてHLA制限T細胞応答を誘発すると記載されている潜在的47のエピトープの内、13のエピトープが免疫マウスにおいて同定された: HLA-A*02: 01、HLA-B*07: 02及びHLA-B*35: 01で制限された、NS3の第1のドメイン中4つ、HLA-A*24: 02及びHLA-B*35: 01で制限された、NS3の第2のドメイン中4つ、HLA-A*24: 02及びHLA-B*35: 01で制限された、NS4bにおいて3つ、並びにHLA-A*02: 01及びHLA-B*07: 02で制限されたNS5において2つである(図14)。
【０１０９】
異なるトランスジェニックマウスにおいて誘発されたT細胞応答を比較すると、高流行地からのヒトドナーのこの対立遺伝子と関連した応答頻度が高く及び応答の大きさが大きいことに一致して、HLA-B*35: 01マウスにおいて応答の大きさのより大きいペプチドの数がより多いことが明らかとなった[Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22): E2046〜2053頁](図15)。
【０１１０】
興味深いことに、そして異なる血清型から選択される保存抗原領域に一致して(図1及び図14)、ポリエピトープ構築物中に存在する抗原エピトープのアミノ酸配列は、特にHLA結合に関与する2つのアンカー残基に対して、他のデング血清型の内に保存されていた[Table 3(表3)]。このことにより、DENV1をベースとした建築物により誘導されたCD8+ T細胞は、DENV2、3及び4に由来するペプチドも認識することができることが示唆された。このようなT細胞交差反応活性は、単一HLA対立遺伝子を発現するヒトEBV形質転換B細胞株C1Rを使用して確認することができ[Zemmour Jら、J Immunol 1992、148(6): 1941〜1948頁]、そして同族ペプチドでパルスさせるか、又はDENV1、2、3及び4で感染させることができる。
【０１１１】
【表３Ａ】
0006486973.tif 000007
【０１１２】
【表３Ｂ】
0006486973.tif 000008
【０１１３】
【表３Ｃ】
0006486973.tif 000009
【０１１４】
DENV1-NSポリエピトープ構築物(配列番号3)によるDNA免疫化後に誘導されるin vitro及びin vivo免疫防御の証拠
A.HLAクラスIトランスジェニックマウスにおけるDENV-特異的細胞障害性T細胞の誘導
防御免疫応答におけるCD8 T細胞の役割を調査するために、4群のH-2クラスIヌル/HLAクラスIトランスジェニックマウス(HLA-A*02: 01、HLA-A*24: 02、HLA-B*07: 02及びHLA-B*35: 01)にDNA免疫法によりワクチン接種をした。7匹のトランスジェニック動物から構成されている各群において、5匹及び2匹のマウスが、それぞれ、DENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドを受けた。全ての動物を皮内注射(100μgのDENV1-NSポリエピトーププラスミド又は対照プラスミド)、続いてin vivoエレクトロポレーションにより免疫した。2回の免疫化を3週間隔で実施し、脾臓細胞を第2の注射後10日目にELISPOTアッセイによりin vitro及びin vivo細胞障害性活性並びにIFN-γ分泌について試験した。
【０１１５】
1-  in vitroでのDENV特異的細胞障害性T細胞応答の評価
HLAクラスIトランスジェニック動物の各群において、DENV1-NSポリエピトープ構築物及び対照プラスミドをそれぞれ受けた3匹及び1匹のマウスを、それらの抗原特異的細胞障害性T細胞応答について試験した。T細胞応答の定量化は、グランザイムB(GrB)ELISPOTアッセイを使用して得た。このアッセイにより単一細胞レベルで細胞障害性メディエーターグランザイムBの放出を測定するが、この放出は標的細胞を溶解するT細胞の能力と強く相関すること[Ewen CLら、2006、J Immunol Methods、308(1〜2): 156〜166頁; Kalia Vら、2010、Adv Exp Med Biol、684: 79〜95頁; Zanetti Mら2010、Adv Exp Med Biol、684: 108〜125頁]及びウイルス産生を阻害すること[Marcet-Palacios Mら、2011、PLoS Pathog、7(12): e1002447]が示された。このアッセイにおいて、同族ペプチド又は無関係ペプチドによるin vitro刺激に対してグランザイムBを放出する脾臓細胞の頻度を、IFN-γを分泌する細胞の頻度と並行して測定した。結果は、対照pcDNA3.1プラスミドで免疫した動物と比較して、DENV1-NSポリエピトープ構築物で免疫したマウスにおいて有意なINF-γ及びGrB応答を示した(図16A及び図16B)。INF-γ応答とGrB放出との間に相関関係もあり、INF-γ及びGrB双方について最も大きい応答は、HLA-A24マウスについてはペプチドP32に対して、HLA-A2マウスについてはP56に対して、HLA-B7マウスについてはP15に対して、及びHLA-B35マウスについてはP49、P50及びP51に対して得られた。
【０１１６】
2-  in vivoでのDENV特異的細胞障害性T細胞の評価
in vivo細胞障害性のアッセイを先に記載のように実施した[Clemente T.ら、2013、Methods、61(2): 105〜109頁]。要約すると、DENV1-NSポリエピトープ構築物又は対照プラスミドで免疫したマウスに、ペプチドを負荷させ且つ蛍光染料(Cell trace violet)で標識した同系細胞で養子移入を行った。それぞれ、特異的ペプチド及び対照ペプチドでパルスされた、107の高蛍光染色細胞及び107の低蛍光染色細胞の混合物を、レシピエント動物に静脈内注射した。注射して18時間後に、レシピエントマウスの脾臓細胞をフローサイトメトリーで分析し、Cell trace高ドナー細胞(特異的ペプチド混合物でパルスした細胞)とCell trace低ドナー細胞(パルスされなかったか又は対照ペプチドでパルスされた)との間の比を決定した。同数の高染色細胞及び低染色細胞をレシピエントマウスに注射した場合、免疫マウスにおける特異的死滅活性は特異的ペプチドの混合物で負荷させた高染色細胞のより低い画分にもたらされた(図17)。特異的溶解のパーセンテージは式:
【０１１７】
【数１】
0006486973.tif 000010
【０１１８】
を使用して決定した。
【０１１９】
B.ヒト化マウスにおける防御免疫応答の誘導
タイプI IFNが十分なマウスはDENV感染症に耐性があるので、DENVでの攻撃に対するワクチン誘導の防御免疫応答は、タイプI欠損マウスおいて、又はヒト造血幹細胞が生着した無リンパ球マウスにおいてのみ考慮することができる。HLA制限応答によりヒト骨髄コンパートメント及びリンパ球コンパートメントで再構成したヒト化マウスの新世代に関する近年の発展に即して[Legrand Nら、2011、Proc Natl Acad Sci U S A、108(32): 13224〜13229頁; Garcia Sら、2012、Immunol Lett、146(1〜2): 1〜7頁; Serra-Hassoun Mら、2014、J Immunol、193(3): 1504〜1511頁]、
本発明者らは、ヒトSIRPアルファに対してトランスジェニックしたRAG-/-γc-/-マウスを使用するが、このマウスでは、マウスMHCクラスI分子及びクラスII分子が、それぞれ、ヒトHLA-A2分子及びDR1分子で置き換えられた(CH1-2hSa)。
【０１２０】
第1のセッティングでは、HLA-A2分子は、HHDの立体配置で存在することになる(H2Dbのマウスα3ドメインにリンクした、HLA-A2のヒトα1ドメイン及びα2ドメインとともに)[Pascolo Sら、1997、J Exp Med、185(12): 2043〜2051頁]。CH1-2hSa HHDマウスは現在市販されている。ヒト造血臍帯血前駆体が生着して3か月後、全てのヒトサブセットが宿主において再構成したとき、マウスをデングウイルスでまず感染させて、ヒト樹状細胞コンパートメントでのin vivoウイルス複製を確認することになる。要約すると、3匹のマウスの2群それぞれにDENV1株KDH0026A(ヒト臨床分離株に由来する)の105又は106PFUを静脈注射することになる。ウイルス力価は定量的逆転写(qRT)-PCRにてモニターされる。
【０１２１】
第2のセッティングでは、HLA-A2分子はクラスI分子の全ヒトHHHバージョンからなるであろう。このような新しいCH1-2hSa HHH宿主は、現在開発中であるが、ヒトCD8/TCR分子のMHCペプチド複合体への結合を改良し、DENV特異的CD8 T細胞の更に効率的な刺激が可能となるはずである。図13に記載のように、6匹のヒト化CH1-2hSa HHHマウス2群のそれぞれをDENV1-NSポリエピトーププラスミド構築物及び対照プラスミド構築物で免疫することになる。6匹の再構成マウスの各群内で、防御は、マウス3匹の各群内でのDENV1株KDH0026Aの105又は106PFUを静脈注射後2、4及び7日目に感染動物の血液中においてqRT-PCRにてウイルスmRNAを定量化することで評価することになる。
【０１２２】
C.CD46-IFNARマウスにおけるMVDVaxの防御有効性
本発明者らは、DENV1の膜タンパク質のエクトドメイン(ectoM)に融合した、4種のDENV血清型のエンベロープドメインIII(EDIII)の融合体から構成される4価DENV抗原を発現し、並びに本発明のDENV1 NS抗原を同時に発現する組換えMVDVaxベクターの、CD46-IFNARマウスにおける防御有効性を評価した(図7に記載)。先に記載のように、CD46-IFNARマウスを作出し[Combredet、C.ら、2003、J Virol、77(21): 11546〜11554頁]、Institut Pasteur動物施設にて病原体フリーの条件下で収容した。実験はInstitut PasteurにてOffice of Laboratory Animal Careの指針に従って実施した。6週齢のCD46-IFNARマウス6匹の群をMV-DENVベクター105TCID50又は空のMVを腹腔内(ip)経路で接種した。同一用量の第2の投与をプライミングを行って1月後に実施した。抗MV抗体及び抗DENV抗体の存在を分析するため、血液を規則的に眼窩周囲経路により採取した。最後の免疫後2か月後に、全ての動物を、ベロ細胞上で成長させたマウス神経適応DENV1ハワイ株の105TCID50の腹腔内注射による実験的攻撃に供した[Despresら、J. Virol.、1998、72(1)、823〜829頁]。攻撃後、1、2、3、5、7日目に血液を眼窩周辺経路にて採取し、動物は続く15日間、臨床徴候について及び体重について追跡調査した。DENV1ゲノムウイルス負荷を、下に記載のワンステップqRT-PCRによりマウス血清において決定した。血清は56℃で30分間熱不活性化し、抗MV抗体の存在は、ELISA(Trinity Biotech社)を使用して検出した。HRPコンジュゲート抗マウス免疫グロブリン(Jackson Immuno Research社)を二次抗体として使用した。抗DENV抗体は先に記載のように[Brandlerら、Vaccine、2010、28、6730〜6739頁]、大腸菌(E.coli)中で産生したか又はin vitroで合成したDENV1、DENV2、DENV3、及びDENV4からの組換えEDIIIタンパク質で被覆した96-ウエルプレートを使用するELIZAにて検出した。HRPコンジュゲート抗マウス免疫グロブリンを二次抗体として使用した。プールされた血清の終点力価を、陰性対照として利用するMVを接種されたマウスからの血清の吸光度の2倍を与える最終希釈の逆数として算出した。
【０１２３】
D.非ヒト霊長類におけるMVDVaxの防御有効性
本発明者らは、非ヒト霊長類(NHP)において、組換えMVDVaxベクターの防御有効性を評価する。
【０１２４】
実験を次のように実施する:
ウイルス。攻撃ウイルス: DENV1ジャマイカ株CVI 1636 3Pを、1977年に単離、2/3 MP/3P C6/36HT 2Pベロ細胞の培養上清で継代培養する。DENV1株KDH0026Aを、C6/36細胞培養上清で継代培養する。DENV2 DJ.M.O.1.7.12を、C6/36細胞培養上清で継代培養する。DENV4ドミニカ814669株を、1981年に単離、4P C6/36 HT 2Pベロ細胞の培養上清で継代培養する。これらのウイルスを中和化試験に使用する。組換えMVDVaxワクチンウイルスを先に記載のように(Brandlerら、Vaccine、2010、28、6730〜6739頁)調製し、ウイルス力価をベロ細胞上で終点限界希釈アッセイにて決定する。
【０１２５】
動物。モーリシャス由来マカクザル[cynomolgus macaques(Macaca fascicularis)]をCEAのBSL-3動物診療施設に収容する。イル-ド-フランス地域圏(lle-de-France region)倫理委員会は欧州指令2010-63-UEに従って実施される実験方法を承認するであろう。動物は若い雌雄の成体(0.8〜1kg)である。ワクチン候補の免疫原性を評価するため、12匹の動物を、105TCID50のMVDVaxワクチンウイルスを含有する200μL用量でひと月おいて2回皮下接種し、6か月後に106TCID50のMVDVaxの第3の用量で増強する。同様に、8匹の対照動物が空のMVSchwワクチン(105TCID50を含有する200μL)の2回の投与及び6か月後106TCID50の第3の用量を受ける。最後に免疫化して5か月後、動物を2群に分け、PBS 200μLに懸濁させた野生型DENV1又は野生型DENV4の1.0×104pfuの静脈内接種による攻撃に供する。サルは、ウイルス血症、臨床徴候、細胞性応答及び抗体応答についてモニターする。末梢血単核球(PBMC)をPercoll密度勾配遠心分離(Sigma-Aldrich社)にて単離する。血清及び血漿を採取し、後の分析のため-20℃にて保存する。
【０１２６】
液性応答。抗DENV及び抗MV抗体を、先に記載の(Brandlerら、Vaccine、2010、28、6730〜6739頁)酸素結合免疫測定法(ELIZA)を使用して熱不活性化血清において検出する。吸光度(OD)が対照動物からの血清のODの2倍であるとき、血清は陽性であるとみなされる。
【０１２７】
DENV中和試験。抗DENV中和抗体を、先に記載のように[Brandlerら、PLoS 2007、1(3)、e96]ベロ細胞中でフォーカス減少中和試験(PRNT)を使用して検出する。要約すると、抗DENV中和抗体を、ベロ適合DENV1ハワイ株(WHOレファレンス株、Genbank受託番号AF226687)、DENV2ジャマイカ株N.1409、DENV3株PaH881/88タイ、又はDENV4株63632/76ビルマの50FFUを使用してベロ細胞上で検出する。終点力価は、FFU数を少なくとも50%減少させる最も高い血清希釈として算出する。中和抗体力価もCenter for Vaccine Development (CVD、Mahidol University、タイ)にて試験する。CVDにて実施される試験では、サル腎臓由来LLC-MK2細胞及び次のDENVを使用し: DENV1(16007)、DENV2(16681)、DENV3(16562)及びDENV4(1036)、そしてPRNT力価は、先に記載のように(SirivichayakulらVirol. J. 2014、11〜48頁)プラークカウントにおける50%低減 (PRNT50)に基づいて算出する。
【０１２８】
細胞性免疫応答。細胞性応答を、先に記載のように[Stebbingsら、PLoS-One、2012、7(11)、e50397]、MVDVaxのDENV1-NSインサートをカバーする合成ペプチドプールによる、抹消血からのリンパ球の刺激の後、Elispotアッセイにより及び多機能フローサイトメトリーにより検出する。細胞は、共刺激性抗体の抗CD28及び抗CD49d(Biolegend社)1μg/mlの存在下で、合成15-mer(11のaaにより重複している)ペプチドプール(BEI、http: //www.beiresources.org)の1μg/mlで又は弱毒化生の空のMVの104TCID50/106細胞で3回繰り返しで刺激する。陰性対照をペプチド無しの同容量のDMSO(0.15%v/v)とともにインキュベートし、陽性対照をStaphylococcal Enterotoxin B(Sigma-Aldrich社)の1μg/mlとともにインキュベートする。
【０１２９】
DENVウイルスRNAの定量化及びDENV力価測定。血清(25μL)は0.5mlのDulbeccoの修正Eagle培地(DMEM)/5%ウシ胎児血清(FCS)中に希釈する。ウイルスRNAを抽出し(QIAamp viral RNA extraction kit、Qiagen社)、ハイフィデリティ酵素(Roche社、Mannheim、ドイツ)を使用して、ワンステップDENV qRT-PCRにて分析する。DENV RNAのリアルタイムqRT-PCRを、RealArtTM WNV LC real-time PCRキット(Qiagen社)で実施する。ウイルス力価測定については、試料を250μLの培地中に希釈し、系列希釈の感染性をDMEM Glutamax/2%FCS[0.8%の最終(質量/容量)カルボキシメチルセルロースを含有する]で重畳されたベロ細胞上でアッセイする。インキュベートして4日後、細胞を固定し、先に記載の[Brandlerら、PLoS 2007、1(3)、e96]免疫フォーカスアッセイにてプラークを可視化する。
【０１３０】
【表４Ａ】
0006486973.tif 000011
【０１３１】
【表４Ｂ】
0006486973.tif 000012
【図１】
0006486973.tif 000013
【図２】
0006486973.tif 000014
【図３】
0006486973.tif 000015
【図４】
0006486973.tif 000016
【図５】
0006486973.tif 000017
【図６】
0006486973.tif 000018
【図７】
0006486973.tif 000019
【図８】
0006486973.tif 000020
【図９】
0006486973.tif 000021
【図１０】
0006486973.tif 000022
【図１１】
0006486973.tif 000023
【図１２】
0006486973.tif 000024
【図１３】
0006486973.tif 000025
【図１４】
0006486973.tif 000026
【図１５Ａ】
0006486973.tif 000027
【図１５Ｂ】
0006486973.tif 000028
【図１６Ａ】
0006486973.tif 000029
【図１６Ｂ】
0006486973.tif 000030
【図１７】
0006486973.tif 000031
【配列表】
0006486973000001.app