(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの式（ＩＶ）：
−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ    （ＩＶ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、細胞毒であり、
Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース部分であり、
Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸部分である］
部分を含む、少なくとも１つのグリカンを含む結合性ポリペプチド。
【請求項２】
グリカンは二分岐グリカンである、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項３】
二分岐グリカンは、フコシル化されており、または非フコシル化である、請求項２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項４】
グリカンは、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含む、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項５】
グリカンは、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含む、請求項３に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項６】
グリカンは、結合性ポリペプチドに対してＮ結合している、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項７】
結合性ポリペプチドはＦｃドメインを含む、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項８】
グリカンは、ＥＵナンバリングによるＦｃドメインのアミノ酸２９７位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している、請求項７に記載の結合性ポリ
ペプチド。
【請求項９】
グリカンは、ＥＵナンバリングによるＦｃドメインのアミノ酸２９８位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している、請求項７に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１０】
Ｆｃドメインはヒトである、請求項７に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１１】
結合性ポリペプチドはＣＨ１ドメインを含む、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１２】
グリカンは、ＫａｂａｔナンバリングによるＣＨ１ドメインのアミノ酸１１４位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している、請求項１１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１３】
細胞毒が以下に示される表１に列挙した細胞毒からなる群から選択される、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【表１】
0006588422.tif 000038
【表２】
0006588422.tif 000039
【請求項１４】
接続部分は、ｐＨ感受性のリンカー、ジスルフィドリンカー、酵素感受性のリンカー、または他の切断可能なリンカー部分を含む、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１５】
接続部分は、以下：
【化１】
0006588422.tif 000040
【化２】
0006588422.tif 000041
（ここで、Ｒ1〜Ｒ5は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル部分またはアリール部分からなる群から選択される）
からなる群から選択されるリンカー部分を含む、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１６】
抗体またはイムノアドヘシンである、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載の結合性ポリペプチド、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物。
【請求項１８】
細胞毒の、結合性ポリペプチドに対する比率は４未満である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
細胞毒の、結合性ポリペプチドに対する比率は約２である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の結合性ポリペプチドを作製する方法であって、式（Ｉ）：
ＮＨ2−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ （Ｉ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、細胞毒である］
のエフェクター部分を、酸化されたグリカンを含む結合性ポリペプチドと反応させることを含む、前記方法。
【請求項２１】
酸化されたグリカンを含む結合性ポリペプチドは、グリカンを含む結合性ポリペプチドを、穏やかな酸化剤と反応させることによって産生される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
穏やかな酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１ｍＭ未満の過ヨウ素酸ナトリウムを用いる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
穏やかな酸化剤はガラクトースオキシダーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
グリカンを含む結合性ポリペプチドは、１つまたは２つの末端シアル酸残基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
末端シアル酸残基は、結合性ポリペプチドを、シアリルトランスフェラーゼ、またはシアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組合せで処理することにより導入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）抗体または抗線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）抗体を含む、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項２８】
グリカンが、二分岐グリカン、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含むグリカン、および結合性ポリペプチドに対してＮ結合しているグリカンの一つか、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項２９】
少なくとも１つの式（ＩＶ）：
−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ    （ＩＶ）
［式中、
Ａ）Ｑは、Ｏであり、
Ｂ）ＣＯＮは、Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣであり
（ここで、
ｉ．Ｃｙｓは、システインアミド由来の構成成分であり、
ｉｉ．ＭＣは、マレイミド由来の構成成分であり、
ｉｉｉ．ＶＣは、シトルリンにカップリングするバリン由来の構成成分であり、
ｉｖ．ＰＡＢＣは、４−アミノベンジルカーバメート由来の構成成分である）、
Ｃ）Ｘは、ＭＭＡＥであり、
Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース部分であり、
Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸部分である］
部分を含む、少なくとも１つのグリカンを含む、結合性ポリペプチド。
【請求項３０】
少なくとも１つの式（ＩＶ）：
−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ    （ＩＶ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、診断用または治療用のエフェクター部分であり、
Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース部分であり、
Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸部分である］
部分を含む、少なくとも１つのグリカンを含む結合性ポリペプチドであって、
グリカンが、二分岐グリカン、および結合性ポリペプチドに対してＮ結合しているグリカンの一つか、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、前記結合性ポリペプチド。
【請求項３１】
少なくとも１つの式（ＩＶ）：
−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ    （ＩＶ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、診断用または治療用のエフェクター部分であり、
Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース部分であり、
Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸部分である］
部分を含む、少なくとも１つのグリカンを含む結合性ポリペプチドであって、
抗ＨＥＲ２抗体または抗ＦＡＰ抗体を含む、前記結合性ポリペプチド。
【請求項３２】
少なくとも１つの式（ＩＶ）：
−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ    （ＩＶ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、リンカー部分であり、
Ｃ）Ｘは、細胞毒、検出剤および標的化部分からなる群から選択されるエフェクター部分であり、
Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース部分であり、
Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸部分である］
部分を含む、少なくとも１つのグリカンを含む、結合性ポリペプチド。
【請求項３３】
以下の条件：ａ）グリカンは二分岐グリカンである；ｂ）二分岐グリカンは、フコシル化されており、または非フコシル化である；ｃ）グリカンは、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含む；ｄ）グリカンは、結合性ポリペプチドに対してＮ結合している；ｅ）結合性ポリペプチドは、Ｆｃドメインを含む；ｆ）結合性ポリペプチドは、ヒトＦｃドメインを含む；ｇ）シアル酸部分は、修飾前にシアル酸部分を有しない部分に存在する；ｈ）結合性ポリペプチドは、抗体またはイムノアドヘシンである；およびｉ）結合性ポリペプチドは、ＩｇＧ抗体である；の一つまたはそれ以上を満たす、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項３４】
結合性ポリペプチドはＦｃドメインを含み、グリカンは、ＥＵナンバリングによるＦｃドメインのアミノ酸２９７位、またはＦｃドメインのアミノ酸２９８位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項３５】
結合性ポリペプチドはＣＨ１ドメインを含み、グリカンは、ＫａｂａｔナンバリングによるＣＨ１ドメインのアミノ酸１１４位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項３６】
細胞毒が以下に示される表２に列挙した細胞毒からなる群から選択される、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【表３】
0006588422.tif 000042
【表４】
0006588422.tif 000043
【請求項３７】
以下の条件：ａ）リンカー部分は、ｐＨ感受性のリンカー、ジスルフィドリンカー、酵素感受性のリンカー、または他の切断可能なリンカー部分を含む；ｂ）リンカー部分は、以下；
【化３】
0006588422.tif 000044
【化４】
0006588422.tif 000045
（ここで、Ｒ1〜Ｒ5は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル部分またはアリール部分からなる群から選択される）
からなる群から選択される；の一つまたはそれ以上を満たす、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項３８】
請求項３２に記載の結合性ポリペプチド、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物。
【請求項３９】
細胞毒の、結合性ポリペプチドに対する比率は４未満または約２である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項３２に記載の結合性ポリペプチドを作製する方法であって、式（Ｉ）：
ＮＨ2−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ （Ｉ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、リンカー部分であり、
Ｃ）Ｘは、細胞毒、検出剤および標的化部分からなる群から選択されるエフェクター部分である］
のエフェクター部分を、酸化されたシアル酸部分を含むグリカンを含む結合性ポリペプチドと反応させることを含む、前記方法。
【請求項４１】
シアル酸部分を含むグリカンを含む結合性ポリペプチドを酸化剤と反応させることをさらに含み、酸化剤は、穏やかな酸化剤である過ヨウ素酸ナトリウムまたはガラクトースオキシダーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１ｍＭ未満の過ヨウ素酸ナトリウムを用いる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
グリカンを含む結合性ポリペプチドは、１つまたは２つの末端シアル酸部分を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
グリカンを含む結合性ポリペプチドを、シアリルトランスフェラーゼ、またはシアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組合せで処理して、一つまたは２つの末端シアル酸部分を導入することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）または線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を結合する、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項４６】
Ａ）Ｑは、Ｏであり、Ｂ）ＣＯＮは、Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣであり（ここで、ｉ．Ｃｙｓは、システインアミド由来の構成成分であり、ｉｉ．ＭＣは、マレイミド由来の構成成分であり、ｉｉｉ．ＶＣは、シトルリンにカップリングするバリン由来の構成成分であり、ｉｖ．ＰＡＢＣは、４−アミノベンジルカーバメート由来の構成成分である）、Ｃ）Ｘは、ＭＭＡＥであり、Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース部分であり、Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸部分である、請求項３２に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項４７】
グリカンは、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含む、請求項３０に記載の結合性ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１〜１６および２７〜３７のいずれか１項に記載の結合性ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５０】
請求項４８に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１１日出願の「糖類工学による部位特異的抗体薬物コンジュゲーション」という表題の米国仮特許出願第６１／７７６，７２４号；２０１３年３月１１日出願の「高グリコシル化結合性ポリペプチド」という表題の米国仮特許出願第６１／７７６，７１０号、および２０１３年３月１１日出願の「変更されたグリコシル化および低減されたエフェクター機能を有するＦｃ含有ポリペプチド」という表題の米国仮特許出願第６１／７７６，７１５号の優先権を主張するものである。前述の出願の内容は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
癌の処置は人類にとって依然として意義深い挑戦である。現在の標準的な治療法は、外科手術、照射、および化学療法を含めて多くの患者の命を救ってきたが、より有効な治療法、特に、より有効性が高く、治療ウインドウの大きな標的特異的治療法が大いに必要とされている。これら標的特異的治療法の１つは抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用するものであり、ＡＤＣでは、抗原特異的な抗体が、腫瘍部位に対して非特異的な化学療法薬を標的にする。これら分子は、臨床設定において、有効性および良好な安全性プロファイルを有することが示されている。しかし、このような治療法の開発は、抗体自体および連結の安定性を含めた多くの要因のため困難であり得、腫瘍特異性に対して重大な影響があり得、そのため有効性は低下する。ＡＤＣは非特異的な結合性が高く、循環中の安定性が低いため、腫瘍に到達する前に正常な組織によって除去される。さらに、薬物のローディングが高い重大な亜集団を有するＡＤＣは、マクロファージによって排除される凝集物を産生し得、そのため半減期は短くなる。よって、決定的なプロセスの制御および改善、ならびに、生成物の凝集およびＩｇＧからの非特異的な毒性などの複雑化の防止がますます必要とされる。
【０００３】
現在の方法によって産生されるＡＤＣは有効であるが、用いられるコンジュゲーションの化学反応の結果にはしばしば異種性の混合物があるため、このような治療法の開発は困難であり得る。例えば、抗体のリジン残基に対する薬物のコンジュゲーションは、コンジュゲーションに利用できる抗体中に多くのリジン残基が存在する（およそ３０個）という事実により複雑になっている。薬物対抗体比（ＤＡＲ）の最適数は非常に低いため（例えば、およそ４：１）、リジンのコンジュゲーションは、非常に不均一なプロファイルをしばしば産生する。さらに、多くのリジンが、ＣＤＲ領域の決定的な抗原結合部位に位置し、薬物コンジュゲーションは抗体の親和性の低下をもたらし得る。一方、チオール媒介性のコンジュゲーションは、ヒンジのジスルフィド結合に関与する８個のシステインを主に標的にするが、様々な調製物の中で、８個のシステインのうちどの４個が一貫してコンジュゲートするかを予想し、同定するのは依然として難しい。より最近では、遊離のシステイン残基を遺伝子操作することで、チオールベースの化学反応での部位特異的コンジュゲーションが可能になっているが、このような連結はしばしば、極めて変わりやすい安定性を表し、薬物−リンカーは、アルブミンおよび他のチオール含有血清分子と交換反応をうける。したがって、規定されたコンジュゲーション部位および安定な連結を有するＡＤＣを産生する、部位特異的コンジュゲーション戦略は、薬物のコンジュゲーションを保証し、抗体の構造または機能に対する有害効果を最小にする上で、極めて有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、結合性ポリペプチド（例えば、抗体）、およびそれとエフェクター部分のコンジュゲート（例えば、薬物コンジュゲート）を提供する。所定の実施形態において、コンジュゲートは、結合性ポリペプチドの天然の、または改変されたグリカン内に、部位特異的に改変された薬物−グリカン連結を含む。本開示は、このような抗原結合性ポリペプチドを作製するための、抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞も提供する。本明細書で開示される抗原結合性ポリペプチドを用いて疾患を処置する方法も提供する。
【０００５】
所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、エフェクター部分（例えば、薬物部分）を、安定な（例えば、オキシム）連結によってカップリングすることにより得ることができる。この戦略により、ｉｎ  ｖｉｖｏの安定性が増強し、凝集の低減した、高度に規定された生成物が提供される。他の実施形態において、さらなる部位選択性および均一性を提供するために、エフェクター部分のコンジュゲート（例えば、薬物コンジュゲート）が、ＩｇＧグリカンの末端糖残基（例えば、末端シアル酸またはガラクトース残基）へのカップリングにより形成され得る。末端糖残基は、穏やかな酸化（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでの）によって反応性アルデヒド形態に容易に変換され得る。酸化された糖残基を、次いで、アルデヒド反応性アミノオキシ薬物−リンカーにコンジュゲートして、タンパク質−薬物コンジュゲート（例えば、ＡＤＣ）の安定かつ均一な集団を提供することができる。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも１つの式（ＩＶ）：
−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ
式（ＩＶ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、エフェクター部分（例えば、薬物部分または標的化部分）であり、
Ｄ）Ｇａｌは、ガラクトース由来の構成成分であり、
Ｅ）Ｓｉａは、シアル酸由来の構成成分であり、
Ｓｉａは、存在または非存在である］
部分を含む、少なくとも１つの修飾グリカンを含む結合性ポリペプチドを提供する。
【０００７】
一実施形態において、修飾グリカンは、二分岐グリカンである。別の一実施形態において、二分岐グリカンは、フコシル化されており、または非フコシル化である。別の一実施形態において、修飾グリカンは、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含み、Ｓｉａは２つの部分のうち１つのみに存在する。別の一実施形態において、修飾グリカンは、少なくとも２つの式（ＩＶ）部分を含み、Ｓｉａは２つの部分の両方に存在する。別の一実施形態において、修飾グリカンは、結合性ポリペプチドに対してＮ結合している。
【０００８】
別の一実施形態において、結合性ポリペプチドはＦｃドメインを含む。別の一実施形態において、修飾グリカンは、ＥＵナンバリングによるＦｃドメインのアミノ酸２９７位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している。別の一実施形態において、修飾グリカンは、ＥＵナンバリングによるＦｃドメインのアミノ酸２９８位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している。別の一実施形態において、Ｆｃドメインはヒトである。
【０００９】
別の一実施形態において、結合性ポリペプチドはＣＨ１ドメインを含む。一実施形態において、修飾グリカンは、ＫａｂａｔのナンバリングによるＣＨ１ドメインのアミノ酸１１４位のアスパラギン残基を介して結合性ポリペプチドに対してＮ結合している。一実施形態において、結合性ポリペプチドは抗体またはイムノアドヘシンである。
【００１０】
一実施形態において、エフェクター部分は細胞毒である。別の一実施形態において、細胞毒は、表１に列挙する細胞毒からなる群から選択される。別の一実施形態において、エフェクター部分は検出剤である。所定の実施形態において、エフェクター部分は標的化部分である。一実施形態において、標的化部分は炭水化物または糖ペプチドである。別の一実施形態において、標的化部分はグリカンである。
【００１１】
別の一実施形態において、接続部分は、ｐＨ感受性のリンカー、ジスルフィドリンカー、酵素感受性のリンカー、または他の切断可能なリンカー部分を含む。別の一実施形態において、接続部分は、表２または１４に示すリンカー部分の群から選択されるリンカー部分を含む。
【００１２】
他の態様において、本発明は、本発明の結合性ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を提供する。一実施形態において、治療用または診断用のエフェクター部分の、結合性ポリペプチドに対する比率は４未満である。別の一実施形態において、治療用または診断用のエフェクター部分の、結合性ポリペプチドに対する比率は約２である。
【００１３】
別の態様において、本発明は、有効量の本発明の組成物を投与することを含む、それを必要とする患者を処置する方法を提供する。
【００１４】
別の一態様において、本発明は、本発明の結合性ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドもしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１５】
さらに他の態様において、本発明は、本発明の結合性ポリペプチドを作製する方法であって、式（Ｉ）：
ＮＨ２−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ
式（Ｉ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、エフェクター部分である］
のエフェクター部分を、酸化されたグリカンを含む変更された結合性ポリペプチドと反応させることを含む方法を提供する。
【００１６】
一実施形態において、変更された結合性ポリペプチドは、グリカンを含む結合性ポリペプチドを、穏やかな酸化剤と反応させることによって産生される、酸化されたグリカンを含む。所定の実施形態において、穏やかな酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウムである。所定の実施形態において、１ｍＭ未満の過ヨウ素酸ナトリウムが用いられる。一実施形態において、酸化剤は、ガラクトースオキシダーゼである。別の一実施形態において、グリカンを含む結合性ポリペプチドは、１つまたは２つの末端シアル酸残基を含む。別の一実施形態において、末端シアル酸残基は、結合性ポリペプチドを、シアリルトランスフェラーゼ、またはシアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組合せで処理することにより導入される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】毒素部分が、抗体のグリカンの酸化されたシアル酸残基にオキシム結合を用いて連結されている、抗体薬物コンジュゲートの合成を示す模式図である。
【図２】グリコシル化変異体の発現および精製を示す、クーマシーブルー染色したゲルを示す図である。
【図３】αβＴＣＲ  ＨＥＢＥ１  ＩｇＧ抗体の変異体の、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８およびＦ１５８）に対する結合を評価するのに用いた、表面プラズモン共鳴実験の結果を示す図である。
【図４】αβＴＣＲ  ＨＥＢＥ１  ＩｇＧ抗体の変異体の、組換えヒトＦｃγＲＩに対する結合を評価するのに用いた、表面プラズモン共鳴実験の結果を示す図である。
【図５】変異抗αβＴＣＲ抗体の存在下の、ＴＮＦａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｙ、およびＩＬ１０に対するＰＢＭＣからのサイトカイン放出のプロファイルを示す図である（２日目）。
【図６】変異抗αβＴＣＲ抗体の存在下の、ＩＬ６、ＩＬ４、およびＩＬ２に対するＰＢＭＣからのサイトカイン放出のプロファイルを示す図である（２日目）。
【図７】変異抗αβＴＣＲ抗体の存在下の、ＴＮＦａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｙ、およびＩＬ１０に対するＰＢＭＣからのサイトカイン放出のプロファイルを示す図である（４日目）。
【図８】変異抗αβＴＣＲ抗体の存在下の、ＩＬ６、ＩＬ４、およびＩＬ２に対するＰＢＭＣからのサイトカイン放出のプロファイルを示す図である（４日目）。
【図９】ウエスタンブロットおよび表面プラズモン共鳴による、２Ｃ３変異体の発現レベルを調査する実験の結果を示す図である。
【図１０】ＰＮＧａｓｅＦ処理前および処理後の２Ｃ３変異体のグリコシル化を調査する実験の結果を示す図である。
【図１１】細胞培養物から単離した２Ｃ３変異体に対するグリコシル化部位を調査するＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果を示す図である。
【図１２】修飾抗ＣＤ５２の、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８）に対する結合を評価するのに用いた表面プラズモン共鳴実験の結果を示す図である。ＦｃドメインにＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異を含む抗ＣＤ５２を用いて、修飾分子のエフェクター機能を評価した。ＣＤ５２ペプチドに対する結合（Ａ）、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合（Ｖ１５８、Ｂ）、およびマウスＦｃＲｎに対する対照の結合（Ｃ）。
【図１３】２Ｃ３変異体のＦｃ結合特性を調査する表面プラズモン共鳴実験の結果を示す図である。
【図１４】修飾抗ＣＤ５２の、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖａｌ１５８）（上記の通り）およびＦｃγＲＩＩＩａ（Ｐｈｅ１５８）両方に対する結合を調査する表面プラズモン共鳴実験の結果を示す図である。ＦｃドメインにＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異を含む抗ＣＤ５２抗体を用いて、修飾分子のＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖａｌ１５８、図１４Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩａ（Ｐｈｅ５８、図１４Ｂ）に対する結合のエフェクター機能を評価した。
【図１５】Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体およびＷＴ２Ｃ３対照（Ａ）におけるＣ１ｑ結合の分析、ならびにウェルの等価なコーティングを確認するＥｌｉｚａ分析の結果を示す図である。
【図１６】ＣＤ−５２ペプチド７４１に対する２Ｃ３変異体の結合動力学を測定するプラズモン共鳴実験の結果を示す図である。
【図１７】ＷＴ抗ＣＤ−５２  ２Ｃ３およびＡ１１４Ｎ高グリコシル化変異体の抗原結合親和性を比較するプラズモン共鳴実験の結果を示す図である。
【図１８−１】２Ｃ３変異体のグリカン含量を決定するための等電点電気泳動および質量分析による電荷の特徴付け実験の結果を示す図である。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１８−３】図１８−２の続き。
【図１９】ＷＴ抗ＣＤ−５２  ２Ｃ３および変異体の抗原結合親和性を比較する、濃度（Ｏｃｔｅｔ）およびプラズモン共鳴実験の結果を示す図である。
【図２０】抗ＴＥＭ１  Ａ１１４Ｎ変異体のさらなるグリコシル化を実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果を示す図である。
【図２１】Ａ１１４Ｎ抗Ｈｅｒ２変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図２２】アミノオキシ連結によるＰＥＧの２Ｃ３  Ａ１１４Ｎ変異体へのコンジュゲーションを実証するＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果を示す図である。
【図２３】抗ＴＥＭ１  Ａ１１４Ｎ高グリコシル化変異体のグリカン含量を決定するためのＬＣ−ＭＳ実験の結果を示す図である。
【図２４】野生型ＨＥＲ２抗体およびＡ１１４Ｎ抗Ｈｅｒ２高グリコシル化変異体のグリカン含量を決定するためのＬＣ−ＭＳ実験の結果を示す図である。
【図２５Ａ】本発明の方法による抗体の部位特異的コンジュゲーションを行うための例示的な方法を示す図である。
【図２５Ｂ】本発明の方法による抗体の部位特異的コンジュゲーションを行うための例示的な方法を示す図である。
【図２５Ｃ】本発明の方法による抗体の部位特異的コンジュゲーションを行うための例示的な方法を示す図である。
【図２６】本発明の例示的なエフェクター部分である、アミノオキシ−Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥおよびアミノオキシ−Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０の合成を示す図である。
【図２７】シアリル化した（ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ＨＥＲ２抗体に対する特徴付け情報を示す図である。
【図２８】酸化されたシアリル化した抗ＨＥＲ２抗体に対する特徴付け情報を示す図である。
【図２９】３つの異なるシアリル化した抗体で調製した複合糖質（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の、２つの異なるアミノオキシ基との疎水性相互作用クロマトグラフを示す図である。
【図３０】ＧＡＭ（＋）化学反応を用いて調製した、抗Ｈｅｒ２  Ａ１１４グリコシル化変異体のＡＯ−ＭＭＡＥとのコンジュゲートのＨＩＣクロマトグラフを示す図である。
【図３１】抗ＨＥＲ２の複合糖質およびチオールコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏの効力の比較を示す図である。
【図３２】抗ＦＡＰ  Ｂ１１の複合糖質およびチオールコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏの効力の比較を示す図である。
【図３３】Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞異種移植片モデルにおける抗ＨＥＲ２の複合糖質およびチオールコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏの効力の比較を示す図である。
【図３４】Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異を含む変異体の抗αβＴＣＲ抗体のグリカン含量を決定するためのＬＣ−ＭＳ実験の結果を示す図である。
【図３５】野生型の抗αβＴＣＲ抗体、およびＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異を含む変異抗αβＴＣＲ抗体の相対的な熱安定性を決定するための円二色性実験の結果を示す図である。
【図３６】Ａ１１４Ｎ高グリコシル化変異およびＡＯ−ＭＭＡＥを保有する抗ＨＥＲ抗体と調製したＡＤＣに対する細胞増殖アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、結合性ポリペプチド（例えば、抗体）、およびそれとエフェクター部分のコンジュゲート（例えば、薬物コンジュゲート）を提供する。所定の実施形態において、コンジュゲートは、ＩｇＧ分子などの抗原結合性ポリペプチドの、天然の、または改変されたグリカン内に、部位特異的に改変された薬物−グリカン連結を含む。本開示は、このような抗原結合性ポリペプチドを作製するための、抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞も提供する。本明細書で開示される抗原結合性ポリペプチドを用いて疾患を処置する方法も提供する。
【００１９】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる「結合性ポリペプチド」または「結合性ポリペプチド」という用語は、対象の標的抗原（例えば、ヒト抗原）に対する選択的な結合を担う少なくとも１つの結合部位を含むポリペプチド（例えば、抗体）を意味する。例示的な結合部位には、抗体可変ドメイン、受容体のリガンド結合部位、またはリガンドの受容体結合部位が含まれる。ある態様において、本発明の結合性ポリペプチドは、複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの）結合部位を含む。
【００２０】
本明細書で用いられる「天然の残基」という用語は、結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはそのフラグメント）の特定のアミノ酸位置に天然に生じ、人の手によって修飾、導入、または変更されていないアミノ酸残基を意味する。本明細書で用いられる「変更された結合性ポリペプチド」または「変更された結合性ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つの非天然の変異させたアミノ酸残基を含む結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはそのフラグメント）を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる「特異的に結合する」という用語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、最大で約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する能力、および／または非特異的な抗原に対する親和性より少なくとも２倍より高い親和性で抗原に結合する能力を意味する。
【００２２】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、対象の抗原に対して重要な既知の特異的免疫反応活性を有する集合体（例えば、インタクトな抗体分子、抗体フラグメント、またはこれらのバリアント）を意味する。抗体および免疫グロブリンは、鎖間共有結合を有する、または有さない軽鎖および重鎖を含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。
【００２３】
下記でより詳しく論じる通り、「抗体」という総称は、生化学的に区別することができる５つの別個のクラスの抗体を含む。５つのクラスの抗体はいずれも明確に本開示の範囲内であるが、以下の議論は、概ねＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に対するものである。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは、分子量およそ２３０００ダルトンの２本の同一の軽鎖、および分子量５３０００〜７００００の２本の同一の重鎖を含む。４本の鎖はジスルフィド結合で「Ｙ」型に連結されており、軽鎖は、「Ｙ」の開口部から始まり可変領域に続く部分で重鎖と繋がっている。
【００２４】
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖のクラスはカッパまたはラムダの軽鎖のいずれかと結合し得る。一般的に、軽鎖および重鎖は相互に共有結合しており、２本の重鎖の「尾」の位置は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって産生される場合は共有結合でのジスルフィド連結または非共有結合での連結によって相互に結合している。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ型のフォーク状の終端のＮ末端から各鎖の底部のＣ末端方向に配列される。当業者であれば、重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）と分類され、この中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることを理解されよう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンアイソタイプのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は十分に特徴付けられており、機能的な特化をもたらすことが知られている。当業者であれば、これらのクラスおよびアイソタイプ各々の修飾型は、本開示を考慮すれば容易に認識することが可能なことから、これらも本開示の範囲内である。
【００２５】
軽鎖および重鎖はいずれも、構造的に相同な領域と機能的に相同な領域とに分割される。「領域」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体の鎖の一要素または一部分を意味し、定常領域または可変領域、および前記領域のさらに別個の一要素または一部分を含む。例えば、軽鎖可変領域は、本明細書で規定される「フレームワーク領域」または「ＦＲ」中に点在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
【００２６】
免疫グロブリン重鎖または軽鎖の領域は、「定常」（Ｃ）領域または「可変」（Ｖ）領域と定義される場合があり、「定常領域」の場合は、多様なクラスメンバーの領域内の配列の変化が相対的にないことに基づき、または「可変領域」の場合は、多様なクラスメンバーの領域内で重大な変化があることに基づきそのように定義される。「定常領域」および「可変領域」という用語は、機能的に用いられる場合もある。この点で、免疫グロブリンまたは抗体の可変領域が、抗原の認識および特異性を決定することが理解されよう。反対に、免疫グロブリンまたは抗体の定常領域は、例えば、分泌、経胎盤移行性、Ｆｃ受容体の結合性、補体の結合性などの重要なエフェクター機能を付与する。免疫グロブリンの多様なクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元配置がよく知られている。
【００２７】
免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常領域および可変領域は、ドメインに折りたたまれる。「ドメイン」という用語は、βプリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合などによって安定化されたペプチドループを含む（例えば、３個から４個のペプチドループを含む）、重鎖または軽鎖の球状の領域を意味する。免疫グロブリン軽鎖上の定常領域ドメインは、それぞれ同じ意味で「軽鎖定常領域ドメイン」、「ＣＬ領域」、または「ＣＬドメイン」と呼ばれる。重鎖上の定常ドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメイン）は、それぞれ同じ意味で「重鎖定常領域ドメイン」、「ＣＨ」領域ドメイン、または「ＣＨドメイン」と呼ばれる。軽鎖上の可変ドメインは、それぞれ同じ意味で「軽鎖可変領域ドメイン」、「ＶＬ領域ドメイン」、または「ＶＬドメイン」と呼ばれる。重鎖上の可変ドメインは、それぞれ同じ意味で「重鎖可変領域ドメイン」、「ＶＨ領域ドメイン」、または「ＶＨドメイン」と呼ばれる。
【００２８】
慣例により、可変定常領域ドメインのナンバリングは、可変定常領域ドメインが免疫グロブリンまたは抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるに従って増大する。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖それぞれのＮ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域であるが、実際には重鎖および軽鎖のカルボキシ末端はそれぞれＣＨ３およびＣＬドメインに含まれる。したがって、免疫グロブリンの軽鎖ドメインは、ＶＬ−ＣＬの配置で並べられ、重鎖ドメインはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の配置で並べられる。
【００２９】
ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬドメインにおけるアミノ酸位置などの重鎖定常領域におけるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリングしてもよい（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、アメリカ合衆国保健福祉省、第５版、１９９１年を参照されたい）。あるいは、抗体のアミノ酸位置は、ＥＵインデックスナンバリングシステムに従ってナンバリングしてもよい（Ｋａｂａｔら、同書を参照されたい）。
【００３０】
本明細書で用いられる「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＶＬドメイン」という用語は、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインを含む。
【００３１】
本明細書で用いられる「ＣＨ１ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムの約１１４〜２２３位（ＥＵ１１８〜２１５位）にわたる免疫グロブリン重鎖の第１の（アミノ末端の一番端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、免疫グロブリン重鎖のＶＨドメインとヒンジ領域のアミノ末端とに接しており、Ｆｃ領域の一部を形成しない。
【００３２】
本明細書で用いられる「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに繋げる重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５個の残基を含み、柔軟であることから、２つのＮ末端抗原結合性領域を独立して動かすことができる。ヒンジ領域は、上部、中央、および下部のヒンジドメインである３つの個々のドメインに細分することができる（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、１６１巻、４０８３頁）。
【００３３】
本明細書で用いられる「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムにおいて約２４４〜３６０位（ＥＵ２３１〜３４０位）にわたる重鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと緊密に対形成しないという点で独特である。それとは異なり、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ結合型分岐状炭水化物鎖が介在する。一実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。
【００３４】
本明細書で用いられる「ＣＨ３ドメイン」という用語は、ＣＨ２ドメインのＮ末端からおよそ１１０残基にわたる、例えばＫａｂａｔのナンバリングシステムの約３６１〜４７６位（ＥＵ３４１〜４４５位）にわたる重鎖免疫グロブリン分子の一部分を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、いくつかの免疫グロブリンでは、ＣＨ３ドメインからさらなるドメインが伸長して分子のＣ末端部分（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのｅ鎖におけるＣＨ４ドメイン）を形成する場合もある。一実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、ＩｇＧ１分子（例えば、ヒトＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【００３５】
本明細書で用いられる「ＣＬドメイン」という用語は、例えばＫａｂａｔの約１０７Ａ〜２１６位にわたる免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインはＶＬドメインに隣接する。一実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、カッパ軽鎖（例えば、ヒトカッパ軽鎖）に由来するＣＬドメインを含む。
【００３６】
本明細書で用いられる「Ｆｃ領域」という用語は、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として、ＩｇＧの残基２１６）のすぐ上流のヒンジ領域に始まり、抗体のＣ末端で終わる、重鎖定常領域部分と規定される。したがって、完全なＦｃ領域は、少なくとも、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
【００３７】
本明細書で用いられる「天然のＦｃ」という用語は、単量体の形態かまたは多量体の形態かに関わらず、抗体の消化によって得られた、または他の手段によって生成させた非抗原結合性フラグメントの配列を含む分子を意味し、ヒンジ領域を含み得る。天然のＦｃのオリジナルの免疫グロブリンの起源はヒト起源であるのが好ましく、あらゆる免疫グロブリンであってよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然のＦｃ分子は、共有結合性（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合性の会合によって二量体または多量体の形態に連結できる単量体ポリペプチドで構成される。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて１から４までの範囲である。天然のＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって得られた、ジスルフィド結合した二量体である。本明細書で用いられる「天然のＦｃ」という用語は、単量体、二量体、および多量体の形態に対する総称である。
【００３８】
本明細書で用いられる「Ｆｃバリアント」という用語は、天然のＦｃから改変されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む、分子または配列を意味する。例示的なＦｃバリアント、およびこれらのサルベージ受容体との相互作用は、当技術分野において知られている。このように、「Ｆｃバリアント」という用語は、非ヒトの天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含み得る。さらに、天然のＦｃは、本発明の抗体様の結合性ポリペプチドに必要とされない、構造上の特徴または生物学的活性を提供するため除去することができる領域を含む。このように、「Ｆｃバリアント」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択される宿主細胞との不適合性、（３）選択される宿主細胞で発現される時のＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体に対する結合、または（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼし、または関与する、１つもしくはそれ以上の天然のＦｃ部位もしくは残基が欠失した、または１つもしくはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が修飾された分子または配列を含む。
【００３９】
本明細書で用いられる「Ｆｃドメイン」という用語は、天然のＦｃおよびＦｃバリアント、ならびに上記で規定された配列を包含する。Ｆｃバリアントおよび天然のＦｃ分子と共に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全体の抗体から消化により得られたかまたは他の手段によって生成したかに関わらず、単量体または多量体の形態の分子を含む。
【００４０】
上記で指摘した通り、抗体は、抗体の可変領域により、抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができるようになる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインが組み合わさって、３次元の抗原結合部位を規定する可変領域（Ｆｖ）が形成される。抗体のこの４次構造が、Ｙの各腕の終端に存在する抗原結合部位を形成する。より詳しく述べると、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖の可変領域の各々の上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。本明細書で用いられる「抗原結合部位」という用語は、抗原（例えば、細胞表面または可溶性抗原）に特異的に結合する（と免疫反応する）部位を含む。抗原結合部位は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域を含み、これら可変領域によって形成される結合部位が抗体の特異性を決定する。抗原結合部位は、抗体ごとに変動する可変領域によって形成される。本開示の変更された抗体は少なくとも１つの抗原結合部位を含む。
【００４１】
所定の実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、結合性ポリペプチドと選択された抗原との会合をもたらす、少なくとも２つの抗原結合性ドメインを含む。抗原結合性ドメインは、必ずしも同じ免疫グロブリン分子由来でなくてもよい。この点において、可変領域は、体液性応答を開始し、所望の抗原に対する免疫グロブリンを産生するように誘発され得るあらゆるタイプの動物由来であってもよい。したがって、結合性ポリペプチドの可変領域は、例えば、哺乳動物起源であってよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル、マカクなど）、オオカミ、またはラクダ（例えば、ラクダ、ラマ、および関連の種由来）であってよい。
【００４２】
天然に存在する抗体では、各単量体の抗体上に存在する６個のＣＤＲは、抗体が水性環境中でその３次元立体構造を呈すると抗原結合部位が形成されるように特異的に配置されたアミノ酸の短い非隣接配列である。重鎖および軽鎖可変領域の残りは、アミノ酸配列における分子間可変性をあまり示さず、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は、概ねβシート立体配置をとり、ＣＤＲは、βシート構造に接続するか、場合によりβシート構造の一部を形成するループを形成する。このように、これらのフレームワーク領域は、鎖間の、非共有結合性の相互作用によって６個のＣＤＲを正確な位置に配置させる骨格を形成するように作用する。位置付けされたＣＤＲによって形成される抗原結合性ドメインは、免疫反応性の抗原上のエピトープに相補的である表面を規定する。この相補的な表面により、抗体の、免疫反応性の抗原エピトープに対する非共有結合が促進される。
【００４３】
本発明の例示的な結合性ポリペプチドは、抗体バリアントを含む。本明細書で用いられる「抗体バリアント」という用語は、天然に存在しないように変更された、合成された、改変された形態の抗体、例えば、少なくとも２つの重鎖の一部分を含むが、２つの完全な重鎖は含まない抗体（例えば、ドメイン欠失抗体またはミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ））、２つ以上の異なる抗原または単一の抗原上の異なるエピトープに結合するように変更された多特異的な形態の抗体（例えば、二重特異性、三重特異性など）、ｓｃＦｖ分子に繋がっている重鎖分子などを含む。さらに、「抗体バリアント」という用語は、多価の形態の抗体（例えば、３価、４価など）、同じ抗原の３つ、４つ、またはそれより多くのコピーに結合する抗体を含む。
【００４４】
本明細書で用いられる「結合価」という用語は、ポリペプチドにおける潜在的な標的結合部位の数を意味する。各標的結合部位は、１個の標的分子または標的分子上の特定の部位に特異的に結合する。ポリペプチドが１つより多くの標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は、同じまたは異なる分子に特異的に結合し得る（例えば、異なるリガンドもしくは異なる抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに結合し得る）。対象の結合性ポリペプチドが、ヒト抗原分子に特異的な結合部位を少なくとも１つ有するのが好ましい。
【００４５】
「特異性」という用語は、所与の標的抗原（例えば、ヒト標的抗原）と特異的に結合する（例えば、免疫反応する）能力を意味する。結合性ポリペプチドは単一特異性であり、標的に特異的に結合する１つまたはそれ以上の結合部位を含んでいてもよく、またはポリペプチドは多特異性であり、同じもしくは異なる標的に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含んでいてもよい。所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、同じ標的の２つの異なる（例えば、重複しない）部分に特異的である。所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、１つより多くの標的に特異的である。腫瘍細胞上で発現される抗原に結合する抗原結合部位を含む例示的な結合性ポリペプチド（例えば、抗体）が当技術分野において知られており、このような抗体からの１つまたはそれ以上のＣＤＲが、本発明の抗体に含まれていてもよい。
【００４６】
「連結部分」という用語は、本明細書で開示される結合性ポリペプチドにエフェクター部分を連結させることができる部分を含む。連結部分が切断できるように（例えば、酵素により切断できるように、もしくはｐＨ感受性となるように）、または切断できないように、連結部分を選択してもよい。例示的な連結部分を、本明細書の表２に記載する。
【００４７】
本明細書で用いられる「エフェクター部分」という用語は、生物学的活性または他の機能的活性を有する作用剤（例えば、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、糖ペプチド、薬物部分、およびこれらのフラグメント）を含む。例えば、結合性ポリペプチドにコンジュゲートしたエフェクター部分を含む修飾結合性ポリペプチドは、コンジュゲートしていない抗体に比べて少なくとも１つのさらなる機能または性質を有する。例えば、細胞毒性剤（例えば、エフェクター部分）の、結合性ポリペプチドへのコンジュゲーションは、第２の機能として（すなわち、抗原結合性に加えて）、薬物細胞毒性を有する結合性ポリペプチドの形成をもたらす。別の一例では、第２の結合性ポリペプチドの、結合性ポリペプチドへのコンジュゲーションは、さらなる結合特性を付与し得る。所定の実施形態において、エフェクター部分が遺伝的にコードされる治療用または診断用のタンパク質または核酸である場合、エフェクター部分は、当技術分野においてよく知られている、ペプチド合成法または組換えＤＮＡ法のいずれかによって合成し、または発現させることができる。別の一態様において、エフェクター部分が非遺伝的にコードされるペプチド、または薬物部分である場合、エフェクター部分は、人工的に合成されてもよいし、または天然の供給源から精製されてもよい。本明細書で用いられる「薬物部分」という用語は、抗炎症剤、抗癌剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤など）、および麻酔性の治療剤を含む。さらなる一実施形態において、薬物部分は、抗癌剤または細胞毒性剤である。適用可能な薬物部分はまた、プロドラッグを含み得る。例示的なエフェクター部分を、本明細書の表１に記載する。
【００４８】
所定の実施形態において、「エフェクター部分」は「標的化部分」を含む。本明細書で用いられる「標的化部分」の語は、標的分子に結合するエフェクター部分を意味する。標的化部分は、制限なく、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（例えば、グリカン）、およびこれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、糖ペプチド、および糖脂質）を含むことができる。
【００４９】
本明細書で用いられる「プロドラッグ」という用語は、親の薬物に比べて活性が低く、反応性が低く、または副作用を起こしにくく、酵素的に活性化することができ、またはそれ以外の方法でｉｎ  ｖｉｖｏでより活性な形態に変換することができる、薬学上活性な薬剤の前駆体または誘導体の形態を意味する。本開示の組成物で適用可能なプロドラッグとしては、これらに限定されないが、より活性な細胞毒性の遊離の薬物に変換することができる、ホスフェート含有プロドラッグ、アミノ酸含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されているフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、または場合により置換されているフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。当業者であれば、本開示の修飾結合性ポリペプチドを調製する目的で、この化合物の反応をより便利にするために、所望の薬物部分またはそのプロドラッグに化学修飾を行うことができる。薬物部分には、本明細書に記載する薬物部分の誘導体、薬学的に許容される塩、エステル、アミド、およびエーテルも含まれる。誘導体は、特定の薬物の所望の治療活性を改善できるかまたは著しく低減させない、本明細書で特定された薬物に対する修飾を含む。
【００５０】
本明細書で用いられる「抗癌剤」という用語は、新生物細胞または腫瘍細胞の成長および／または増殖に有害であり、悪性疾患を低減し、阻害し、または破壊するように作用し得る薬剤を含む。このような薬剤の例としては、これらに限定されないが、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、細胞毒性ヌクレオシド、チューブリン結合剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、細胞毒性剤などが挙げられる。細胞毒性剤には、トマイマイシン誘導体、メイタンシン誘導体、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｅ）誘導体、アントラサイクリン誘導体、ビスホスホネート誘導体、レプトマイシン誘導体、ストレプトニグリン誘導体、アウリスタチン誘導体、およびデュオカルマイシン誘導体が含まれる。免疫反応性の細胞または悪性細胞の成長を遅延させ、または遅くするように作用するあらゆる薬剤が本開示の範囲内である。
【００５１】
本明細書で用いられる「抗原」または「標的抗原」という用語は、結合性ポリペプチドの結合部位によって結合することが可能な分子または分子の一部を意味する。標的抗原は１つまたはそれ以上のエピトープを有し得る。
【００５２】
ＩＩ．結合性ポリペプチド
一態様において、本開示は、グリコシル化されたドメイン、例えば、グリコシル化された定常ドメインを含む、結合性ポリペプチド（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体バリアント、および融合タンパク質）を提供する。本明細書に開示する結合性ポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化部位を有するドメインを含むあらゆる結合性ポリペプチドを包含する。所定の実施形態において、結合性ポリペプチドは、抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体である。あらゆる源または種からのあらゆる抗体を、本明細書に開示する結合性ポリペプチドにおいて用いることができる。適切な抗体には、制限なく、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体が含まれる。
【００５３】
所定の実施形態において、グリコシル化ドメインはＦｃドメインである。所定の実施形態において、グリコシル化ドメインは、Ｎ２９７の天然のグリコシル化ドメインである。
【００５４】
他の実施形態において、グリコシル化ドメインは、改変されたグリコシル化ドメインである。Ｆｃドメインにおける例示的な改変されたグリコシル化ドメインは、ＥＵナンバリングによるアミノ酸２９８位にアスパラギン残基；およびＥＵナンバリングによるアミノ酸３００位にセリンまたはスレオニン残基を含む。
【００５５】
本明細書で開示される結合性ポリペプチドにおいては、あらゆる免疫グロブリンのクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）ならびに種からのＦｃドメインを用いることができる。異なる種またはＩｇクラスからのＦｃドメインの一部を含むキメラのＦｃドメインも用いることができる。所定の実施形態において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの場合、野生型アミノ酸のＫａｂａｔの２９８位のアスパラギンへの変異、およびＫａｂａｔの３００位のセリンまたはスレオニンへの変異により、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス部位（すなわち、Ｘがプロリン以外のあらゆるアミノ酸である、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓシークオン）の形成がもたらされる。しかし、他の種および／またはＩｇクラスもしくはアイソタイプのＦｃドメインの場合、当業者であれば、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓシークオンを再び作製するためにプロリン残基が存在する場合、ＦｃドメインのＫａｂａｔの２９９位を変異させることが必要な場合があることを理解されよう。
【００５６】
他の実施形態において、本開示は、Ｎ結合型グリコシル化部位を有する少なくとも１つのＣＨ１ドメインを含む、結合性ポリペプチド（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体バリアント、および融合タンパク質）を提供する。このような例示的な結合性ポリペプチドは、例えば、Ｋａｂａｔのナンバリングによる１１４位に改変されたグリコシル化部位を含むことができる。
【００５７】
あらゆる免疫グロブリンのクラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）ならびに種からのＣＨ１ドメインを、本明細書に開示する結合性ポリペプチドにおいて用いることができる。異なる種またはＩｇのクラスからのＣＨ１ドメインのポーションを含むキメラのＣＨ１ドメインも用いることができる。所定の実施形態において、ＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインである。ヒトＩｇＧ１ドメインの場合、１１４位の野生型アミノ酸のアスパラギンへの変異により、Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス部位（すなわち、Ｘがプロリン以外のあらゆるアミノ酸である、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓシークオン）の形成がもたらされる。しかし、他の種および／またはＩｇクラスもしくはアイソタイプの他のＣＨ１ドメインの場合、当業者であれば、ＣＨ１ドメインの１１５位および／または１１６位を変異させて、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓシークオンを作製することが必要であり得ることを理解されよう。
【００５８】
所定の実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、抗体の抗原結合性フラグメントを含み得る。「抗原結合性フラグメント」という用語は、抗原に結合するか、または抗原結合（すなわち、特異的結合）に関してインタクトな抗体と（すなわち、抗原結合性フラグメントが誘導されたインタクトな抗体と）競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを意味する。抗原結合性フラグメントは、当技術分野においてよく知られている組換え法または生化学的方法によって生成できる。例示的な抗原結合性フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）２を含む。好ましい実施形態において、本開示の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの改変されたグリコシル化部位を含む変更された抗原結合性フラグメントである。例示の一実施形態において、本開示の変更された抗原結合性フラグメントは、上記に記載した変更されたＶＨドメインを含む。別の例示的な一実施形態において、本開示の変更された抗原結合性フラグメントは、上記に記載する変更されたＣＨ１ドメインを含む。
【００５９】
例示的な実施形態において、結合性ポリペプチドは、単鎖可変領域配列（ＳｃＦｖ）を含む。単鎖可変領域の配列は、柔軟なリンカーによってＶＨドメインに連結しているＶＬドメインなど、１つまたはそれ以上の抗原結合部位を有する単一のポリペプチドを含む。ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬの配置またはＶＬ−リンカー−ＶＨの配置で構築できる。抗原結合部位を構成するＶＬドメインとＶＨドメインとを連結する柔軟なヒンジは、好ましくはアミノ酸残基約１０個から約５０個を含む。接続ペプチドは当技術分野において知られている。本発明の結合性ポリペプチドは、少なくとも１個のｓｃＦｖおよび／または少なくとも１個の定常領域を含み得る。一実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔの１１４位にアスパラギン残基を含むＣＨ１ドメイン）、ならびに／またはＣＨ２ドメイン（例えば、ＥＵ２９８位にアスパラギン残基、およびＥＵ３００位にセリンもしくはスレオニン残基を含むＣＨ２ドメイン）を含む抗体またはフラグメントに連結または融合した少なくとも１つのｓｃＦｖを含み得る。
【００６０】
ある例示的な実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、ＳｃＦｖ分子（例えば、変更されたＳｃＦｖ分子）を有する抗体をコードするＤＮＡ配列を融合することにより作製される、多価（例えば、４価）抗体である。例えば、一実施形態において、これらの配列は、ＳｃＦｖ分子（例えば、変更されたＳｃＦｖ分子）がそのＮ末端またはＣ末端で柔軟なリンカー（例えば、ｇｌｙ／ｓｅｒリンカー）によって抗体のＦｃフラグメントに連結するように組み合わされている。別の一実施形態において、本開示の４価抗体は、ＳｃＦｖ分子を、ＣＨ１ドメイン（例えば、Ｋａｂａｔの１１４位にアスパラギン残基を含むＣＨ１ドメイン）に融合した接続ペプチドに融合させてＳｃＦｖ−Ｆａｂの４価分子を構築することにより作製することができる。
【００６１】
別の一実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは変更されたミニボディである。本開示の変更されたミニボディは、ＣＨ３ドメインまたはその一部に接続ペプチドによって融合した、各々がＳｃＦｖ分子（例えば、上記に記載した変更されたＶＨドメインを含む変更されたＳｃＦｖ分子）を含む２本のポリペプチド鎖を構成する二量体分子である。ミニボディは、ＳｃＦｖ構成成分を構築し、当技術分野で説明されている方法を用いてペプチド−ＣＨ３構成成分を接続することにより作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ９４／０９８１７Ａｌを参照されたい）。別の一実施形態において、４価のミニボディを構築することができる。４価のミニボディは、２個のＳｃＦｖ分子を柔軟なリンカーを用いて連結する以外は、ミニボディと同じ方法で構築することができる。連結されたｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ構築物は、次いで、ＣＨ３ドメインに繋げられる。
【００６２】
別の一実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、各々がｓｃＦｖ分子に類似のポリペプチドを有するが、同じポリペプチド鎖上のＶＬおよびＶＨドメインが相互作用することができないように、両方の可変ドメインを接続する短い（１０個未満、好ましくは１〜５個の）アミノ酸残基のリンカーを通常有する、二量体の、４価の分子である。代わりに、１つのポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメインと（それぞれ）相互作用する（例えば、ＷＯ０２／０２７８１を参照されたい）。本開示の二重特異性抗体は、ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ分子を含む。
【００６３】
他の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、同じポリペプチド鎖上に連続して１つまたはそれ以上の可変ドメインを含む多重特異的または多価の抗体、例えば、タンデム型可変ドメイン（ＴＶＤ）ポリペプチドを含む。例示的なＴＶＤポリペプチドは、米国特許第５，９８９，８３０号に記載されている「ダブルヘッド」または「デュアルＦｖ」の立体配置を含む。デュアルＦｖ立体配置では、２つの異なる抗体の可変ドメインが、２つの別々の鎖（重鎖１本および軽鎖１本）上でタンデム型の配置で発現され、この場合、１本のポリペプチド鎖に、ＶＨドメインがペプチドリンカーで隔てられて連続２つ存在し（ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２）、他のポリペプチド鎖はペプチドリンカーによって連続して接続された相補的なＶＬドメインからなる（ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２）。交差したダブルヘッドの立体配置では、２つの異なる抗体の可変ドメインが、タンデム型の配置で２つの別々のポリペプチド鎖（重鎖１本および軽鎖１本）上に発現され、この場合、１本のポリペプチド鎖は、２つのＶＨドメインがペプチドリンカーで隔てられたて連続して存在し（ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２）、他のポリペプチド鎖は、逆の配置でペプチドリンカーによって連続して接続された相補的なＶＬドメインからなる（ＶＬ２−リンカー−ＶＬ１）。「デュアル−Ｆｖ」のフォーマットに基づいたさらなる抗体バリアントは、デュアル−可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ−ＩｇＧ）二重特異的抗体（米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）およびＴＢＴ１フォーマット（ＵＳ２０１０／０２２６９２３Ａ１を参照されたい）を含む。定常ドメインをデュアル−Ｆｖのそれぞれの鎖に（ＣＨ１−Ｆｃを重鎖に、カッパまたはラムダ定常ドメインを軽鎖に）付加することにより、さらなる修飾をまったく必要とせずに機能的な二重特異的抗体がもたらされる（すなわち、安定性を増強するための定常ドメインが明確に付加される）。
【００６４】
別の例示的な一実施形態において、結合性ポリペプチドは、「ダブルヘッド」の立体配置（その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、ＵＳ２０１２０２５１５４１Ａ１を参照されたい）に基づく、交差した二重可変ドメインＩｇＧ（ＣＯＤＶ−ＩｇＧ）を有する二重特異的抗体を含む。ＣＯＤＶ−ＩｇＧ抗体バリアントは、連続してＣＬドメインに接続しているＶＬドメイン（ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ）を有する１本のポリペプチド鎖、および連続して反対の配向においてＣＨ１ドメインに接続している相補的なＶＨドメイン（ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１）を有する第２のポリペプチド鎖を有し、ポリペプチド鎖は交差した軽鎖−重鎖対を形成する。所定の実施形態において、第２のポリペプチドはＦｃドメインにさらに接続していてもよい（ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１−Ｆｃ）。所定の実施形態において、リンカーＬ３は、リンカーＬ１の少なくとも２倍の長さであり、かつ／またはリンカーＬ４はリンカーＬ２の少なくとも２倍の長さである。例えば、Ｌ１およびＬ２はアミノ酸残基の長さ１〜３個であってよく、Ｌ３はアミノ酸残基の長さ２から６個であってよく、Ｌ４はアミノ酸残基の長さ４から７個であってよい。適切なリンカーの例は、単一のグリシン（Ｇｌｙ）残基、ジグリシンペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、トリペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、グリシン残基４個のペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、グリシン残基５個のペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、グリシン残基６個のペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、グリシン残基７個のペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、グリシン残基８個のペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を含む。ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、およびペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒなどの他の組合せのアミノ酸残基を用いてもよい。
【００６５】
所定の実施形態において、結合性ポリペプチドは、抗体定常領域に融合した非抗体結合領域（例えば、受容体、リガンド、または細胞接着分子）を含む、イムノアドヘシン分子を含む（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、８巻（２）、１０４〜１１５号を参照されたい）。
【００６６】
所定の実施形態において、結合性ポリペプチドは免疫グロブリン様ドメインを含む。適切な免疫グロブリン様ドメインとしては、これらに限定されないが、フィブロネクチンドメイン（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｋｏｉｄｅら（２００７年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３５２巻、９５〜１０９頁、ＤＡＲＰｉｎ（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｓｔｕｍｐｐら（２００８年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、１３巻（１５〜１６）、６９５〜７０１頁を参照されたい）、プロテインＡのＺドメイン（その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｎｙｇｒｅｎら（２００８年）、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７５巻（１１）、２６６８〜７６頁を参照されたい）、リポカリン（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｓｋｅｒｒａら（２００８年）、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７５巻（１１）、２６７７〜８３頁を参照されたい）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎｓ）（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら（２００７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３７２巻（１）、１７２〜８５頁を参照されたい）アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎｓ）（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋら（２００８年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３８３巻（５）、１０５８〜６８頁を参照されたい）、アヴィマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら（２００５年）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻（１２）、１５５６〜６１頁を参照されたい）、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒｓ）（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら（２００７年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２８２巻（５）、３１９６〜３２０４頁を参照されたい）、およびクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインペプチド（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｎｉｘｏｎら（２００６年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ、９巻（２）、２６１〜８頁を参照されたい）が挙げられる。
【００６７】
ＩＩＩ．Ｎ結合型グリカン
所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、結合性ポリペプチドのポリペプチドバックボーンにおけるグリコシル化部位に、アスパラギン残基を介して「Ｎ−連結」している、Ｎ結合型グリカンを使用する。グリコシル化部位は天然でも、または改変されたグリコシル化部位でもよい。さらに、またはあるいは、グリカンは、天然のグリカンでも、または非天然の連結を含む改変されたグリカンでもよい。
【００６８】
所定の例示的な実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、抗体Ｆｃドメインの天然のグリコシル化部位を含む。この天然のグリコシル化部位は、ＥＵナンバリングによるＦｃドメインの２９７位に野生型のアスパラギン残基を含む（Ｎ２９７）。この位置にある天然のＮ結合型グリカンは、一般的にβ−グリコシルアミド連結によってＮ２９７側鎖の窒素基に連結している。しかし、技術分野で認められている、他の適切な連結も用いることができる。他の例示的な実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の改変されたグリコシル化部位を含む。このような改変されたグリコシル化部位は、結合性ポリペプチドのポリペプチドバックボーンに１つまたはそれ以上の野生型アミノ酸の、細胞のグリコシル化酵素によってＮ−グリコシル化することができるアスパラギン残基での置換を含む。本発明の、例示的な改変されたグリコシル化部位は、Ｆｃドメインのアミノ酸２９８位（２９８Ｎ）またはＣＨ１ドメインのアミノ酸１１４位（１１４Ｎ）のアスパラギン変異の導入を含む。
【００６９】
あらゆるタイプの天然に存在する、または合成の（すなわち、非天然の）Ｎ結合型グリカンが、本発明の結合性ポリペプチドのグリコシル化部位に連結することができる。所定の実施形態において、グリカンは糖（例えば、オリゴ糖の末端に位置する糖残基）を含み、糖は、酸化されて（例えば、過ヨウ素酸処理またはガラクトースオキシダーゼによって）、エフェクター部分（例えば、反応性アルデヒド基）に対するコンジュゲーションに適する基を生成することができる。適切な酸化可能な糖としては、これらに限定されないが、ガラクトースおよびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸）が挙げられる。所定の実施形態において、グリカンは二分岐グリカンである。所定の実施形態において、グリカンは天然に存在する哺乳動物の糖型である。
【００７０】
グリコシル化は、当技術分野において知られているあらゆる手段によって達成できる。所定の実施形態において、グリコシル化は、Ｎ結合型グリコシル化が可能である細胞中で結合性ポリペプチドを発現させることによって達成される。あらゆる天然の、または改変された細胞（例えば、原核もしくは真核）を用いることができる。一般的に、グリコシル化を達成するには哺乳動物細胞が用いられる。哺乳動物細胞で生成したＮ−グリカンは通常、複合型、高マノース型、ハイブリッド型Ｎ−グリカンと呼ばれる（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ  Ｋ、Ｔａｙｌｏｒ  ＭＥ（２００６年）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版を参照されたい）。これらの複合型Ｎ−グリカンは、内部コア構造であるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に連結したシアリルラクトースアミン配列を典型的に有する、２個から６個の外部分岐を有する構造を有する。複合型Ｎ−グリカンは、オリゴ糖で終わり、ＧｌｃＮＡｃとガラクトース（Ｇａｌ）残基とが交互になった、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の分岐を有しており、例えば、ＮｅｕＮＡｃ−；ＮｅｕＡｃα２，６  ＧａｌＮＡｃα１−；ＮｅｕＡｃα２，３  Ｇａｌβ１，３  ＧａｌＮＡｃα１−；およびＮｅｕＡｃα２，３／６  Ｇａｌβ１，４  ＧｌｃＮＡｃβ１などが挙げられる。さらに、硫酸エステルがガラクトース、ＧａｌＮＡｃ、およびＧｌｃＮＡｃ残基上に存在していてもよい。ＮｅｕＡｃは、Ｏ−アセチル化されていてもよいし、またはＮｅｕＧｌで置き換えられてもよい（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）。複合型Ｎ−グリカンには、バイセクト型ＧｌｃＮＡｃおよびコアのフコース（Ｆｕｃ）の鎖間置換があってもよい。
【００７１】
さらに、またはあるいは、グリコシル化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで酵素的手段によって達成または修飾することができる。例えば、１つまたはそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼを用いて、特定の糖残基を、結合性ポリペプチドの天然の、または改変されたＮ−グリカンに付加してもよく、１つまたはそれ以上のグリコシダーゼを用いて不要の糖をＮ結合型グリカンから除去してもよい。このような酵素的手段は当技術分野においてよく知られている（例えば、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ２００７／００５７８６を参照されたい）
【００７２】
ＩＶ．免疫学的エフェクター機能およびＦｃ修飾
所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を媒介する抗体定常領域（例えば、ＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域）を含み得る。例えば、Ｃ１複合体は抗体定常領域に結合すると、補体系を活性化し得る。補体システムの活性化はオプソニン作用、および細胞の病原体の溶解において重要である。補体システムの活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫の過敏性にも関与し得る。さらに、抗体は、多様な細胞上の受容体にＦｃ領域によって結合する（抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位は細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する）。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）など、様々なクラスの抗体に特異的な数々のＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、抗体がコーティングする粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体がコーティングする標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存的細胞媒介性細胞毒性すなわちＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤移行、および免疫グロブリン生成の制御など、数々の重要かつ多種多様な生物学的応答が誘発される。好ましい実施形態において、本発明の結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメント）は、Ｆｃ−ガンマ受容体に結合する。代替の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、１つまたはそれ以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ活性）を欠く定常領域を含み得、かつ／またはＦｃγ受容体に結合することができない。
【００７３】
本発明の所定の実施形態は、免疫原性がおよそ同じである未変更の全抗体と比べた場合に、エフェクター機能の低減もしくは増強、非共有結合で二量体化する能力、腫瘍の部位に局在する能力の増大、血清半減期の低減、または血清半減期の増大など、所望の生化学的特徴をもたらすために、１つまたはそれ以上の定常領域ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸が欠失し、または別の方法で変更された抗体を含む。例えば、本明細書に記載する診断方法および処置方法で用いるためのある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似のポリペプチド鎖を含むが、１つまたはそれ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部が欠失したドメイン欠失抗体である。例えば、ある種の抗体では、修飾抗体の定常領域の１個のドメイン全体が欠失し、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または部分が欠失している。
【００７４】
他の所定の実施形態において、結合性ポリペプチドは、様々な抗体のアイソタイプに由来する定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の２つ以上からの定常領域）を含む。他の実施形態において、結合性ポリペプチドは、キメラのヒンジ（すなわち、様々な抗体のアイソタイプのヒンジドメインに由来するヒンジ部分を含むヒンジ、例えば、ＩｇＧ４分子からの上部ヒンジドメインおよびＩｇＧ１中央ヒンジドメイン）を含む。一実施形態において、結合性ポリペプチドは、分子のコアヒンジ領域に、ヒトＩｇＧ４分子からのＦｃ領域またはその一部、およびＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異（ＥＵナンバリング）を含む。
【００７５】
所定の実施形態において、Ｆｃ部分を、当技術分野において知られている技術を用いて、エフェクター機能を増大または低減するように変異させてもよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活化（点変異または他の手段によって）により、循環性の修飾抗体のＦｃ受容体結合を低減することができ、それによって腫瘍の局在化が増大する。他の場合では、本発明と一致する定常領域の修飾は補体の結合を緩和するため、血清半減期およびコンジュゲートした細胞毒の非特異的な会合が低減される。定常領域のさらに他の修飾を用いてジスルフィド連結またはオリゴ糖部分を修飾してもよく、これらの修飾は抗原の特異性または柔軟性を増大することで局在化を増強させる。得られた生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、および修飾の他の生化学的効果、例えば、腫瘍の局在化、体内分布、および血清半減期は、過度の実験をせずに、よく知られている免疫学的技術を用いて、容易に測定および定量され得る。
【００７６】
所定の実施形態において、本発明の抗体において用いられるＦｃドメインはＦｃバリアントである。本明細書で用いられる「Ｆｃバリアント」という用語は、それに前記Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃドメインに比べて、少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＦｃドメインを意味する。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃバリアントは、前記Ｆｃドメインに比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【００７７】
Ｆｃバリアントのアミノ酸置換（複数可）は、Ｆｃドメイン内のあらゆる位置（すなわち、あらゆるＥＵ規則のアミノ酸位置）に位置していてよい。一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ヒンジドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置の置換を含む。別の一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置の置換を含む。別の一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置の置換を含む。別の一実施形態において、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置の置換を含む。
【００７８】
本発明の結合性ポリペプチドは、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合における改善（例えば、低減もしくは増強）をもたらすことが知られている、あらゆる技術分野で認められているＦｃバリアントを用いることができる。前記Ｆｃバリアントは、例えば、その各々が全体、参照によって本明細書に組み入れられる、国際ＰＣＴ公開ＷＯ８８／０７０８９Ａ１、ＷＯ９６／１４３３９Ａ１、ＷＯ９８／０５７８７Ａ１、ＷＯ９８／２３２８９Ａ１、ＷＯ９９／５１６４２Ａ１、ＷＯ９９／５８５７２Ａ１、ＷＯ００／０９５６０Ａ２、ＷＯ００／３２７６７Ａ１、ＷＯ００／４２０７２Ａ２、ＷＯ０２／４４２１５Ａ２、ＷＯ０２／０６０９１９Ａ２、ＷＯ０３／０７４５６９Ａ２、ＷＯ０４／０１６７５０Ａ２、ＷＯ０４／０２９２０７Ａ２、ＷＯ０４／０３５７５２Ａ２、ＷＯ０４／０６３３５１Ａ２、ＷＯ０４／０７４４５５Ａ２、ＷＯ０４／０９９２４９Ａ２、ＷＯ０５／０４０２１７Ａ２、ＷＯ０５／０７０９６３Ａ１、ＷＯ０５／０７７９８１Ａ２、ＷＯ０５／０９２９２５Ａ２、ＷＯ０５／１２３７８０Ａ２、ＷＯ０６／０１９４４７Ａ１、ＷＯ０６／０４７３５０Ａ２，およびＷＯ０６／０８５９６７Ａ２、または米国特許第５，６４８，２６０号、第５，７３９，２７７号、第５，８３４，２５０号、第５，８６９，０４６号、第６，０９６，８７１号、第６，１２１，０２２号、第６，１９４，５５１号、第６，２４２，１９５号、第６，２７７，３７５号、第６，５２８，６２４号、第６，５３８，１２４号、第６，７３７，０５６号、第６，８２１，５０５号、第６，９９８，２５３号、および第７，０８３，７８４号に開示されたアミノ酸置換のいずれか１つを含んでいてもよい。例示的な一実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、ＥＵ２６８位にアミノ酸置換を含むＦｃバリアント（例えば、Ｈ２６８ＤまたはＨ２６８Ｅ）を含み得る。別の例示的な一実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、アミノ酸置換を、ＥＵ２３９位（例えば、Ｓ２３９ＤもしくはＳ２３９Ｅ）および／またはＥＵ３３２位（例えば、Ｉ３３２ＤもしくはＩ３３２Ｑ）に含んでいてもよい。
【００７９】
所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、抗体の抗原非依存的エフェクター機能、特に結合性ポリペプチドの循環半減期を変更するアミノ酸置換を含む、Ｆｃバリアントを含み得る。このような結合性ポリペプチドは、これらの置換のない結合性ポリペプチドに比べた場合、増大または低減されたＦｃＲｎに対する結合のいずれかを示すことから、それぞれ増大または低減した血清中の半減期を有する。ＦｃＲｎに対して改善された親和性を有するＦｃバリアントの血清半減期はより長いと予測され、このような分子は、慢性疾患または障害の処置など、投与する抗体の半減期が長いことが望ましい、哺乳動物を処置する方法において有利に適用される。これとは対照的に、ＦｃＲｎ結合親和性が低減されたＦｃバリアントの半減期はより短いと予想され、このような分子はまた、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏの診断画像法、または初発の抗体が循環中に長期間存在する場合に毒性の副作用がある状況など、循環時間の短縮が有利であり得る場合の哺乳動物への投与などに有用である。低減したＦｃＲｎ結合親和性を有するＦｃバリアントはまた、胎盤を移行する可能性が低く、したがって妊婦の疾患または障害を処置するのにも有用である。さらに、低減したＦｃＲｎ結合親和性が望ましいことがある他の適用には、脳、腎臓、および／または肝臓に局在化された適用が含まれる。例示的な一実施形態において、本発明の変更された結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメント）は、脈管構造から腎糸球体の上皮を横切った輸送の低下を示す。別の一実施形態において、本発明の変更された結合性ポリペプチド（例えば、抗体およびその抗原結合性フラグメント）は、脈管の間隙中へ、脳から血液脳関門（ＢＢＢ）を横切った輸送の低減を示す。一実施形態において、変更されたＦｃＲｎ結合を有する抗体は、Ｆｃドメインの「ＦｃＲｎ結合性ループ」内に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するＦｃドメインを含む。ＦｃＲｎ結合性ループは、アミノ酸残基２８０〜２９９（ＥＵナンバリングによる）からなる。ＦｃＲｎ結合活性を変更する例示的なアミノ酸置換は、参照によって全体が本明細書に組み入れられる、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０４７３２７に開示されている。例示的な所定の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメント）は、１つまたはそれ以上の以下の置換：Ｖ２８４Ｅ、Ｈ２８５Ｅ、Ｎ２８６Ｄ、Ｋ２９０Ｅ、およびＳ３０４Ｄ（ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む。さらに他の例示的な実施形態において、本発明の結合性分子は、二重変異Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆを有するヒトＦｃドメインを含む（例えば、米国特許第８，１６３，８８１号を参照されたい）。
【００８０】
他の実施形態において、本明細書に記載する診断方法および処置方法で用いるための結合性ポリペプチドは、グリコシル化が低減または排除されるように変更された、定常領域、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を有する。例えば、本発明の結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメント）はまた、抗体Ｆｃのグリコシル化を変更するアミノ酸置換を含むＦｃバリアントも含み得る。例えば、前記Ｆｃバリアントのグリコシル化は低減されていてもよい（例えば、ＮまたはＯ結合型グリコシル化）。例示的な実施形態において、Ｆｃバリアントは、アミノ酸２９７位（ＥＵナンバリング）に通常見出されるＮ結合型グリカンのグリコシル化の低減を含む。別の一実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＮＸＴまたはＮＸＳを含むＮ結合型グリコシル化モチーフなど、グリコシル化モチーフ付近またはモチーフ内にアミノ酸置換を有する。特定の一実施形態において、抗体は、アミノ酸２２８位または２９９位（ＥＵナンバリング）に、アミノ酸置換を有するＦｃバリアントを含む。より特定の実施形態において、抗体は、Ｓ２２８ＰおよびＴ２９９Ａ変異（ＥＵナンバリング）を含むＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含む。
【００８１】
グリコシル化の低減または変更を付与する例示的なアミノ酸置換は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／０１８５７２号に開示されている。好ましい実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドはグリコシル化を排除するように修飾される。このような結合性ポリペプチドは、「アグリ（ａｇｌｙ）」結合性ポリペプチド（例えば、「アグリ」抗体）と呼ぶことができる。理論に拘泥するわけではないが、「アグリ」結合性ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで改善された安全性および安定性のプロファイルを有し得ると考えられている。アグリ結合性ポリペプチドは、そのあらゆるアイソタイプまたはサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものであってよい。所定の実施形態において、アグリ結合性ポリペプチドは、Ｆｃ−エフェクター機能を欠くＩｇＧ４抗体の非グリコシル化のＦｃ領域を含み、そのため、ＩＬ−６を発現する正常な重要な器官に対するＦｃ媒介性毒性の可能性が排除される。さらに他の実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドは、変更されたグリカンを含む。例えば、抗体は、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７のＮ−グリカン上に少数のフコース残基を有し得る、すなわち、非フコシル化である（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。非フコシル化により、ＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩ結合性は増大し、ＡＤＣＣを潜在的に増大する。抗ＩＬ−６のｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３のｓｃＦｖを含むダイアボディは、ＡＤＣＣによるＩＬ−６発現性細胞の死滅を誘発することが示されている。したがって、一実施形態において、非フコシル化された抗ＩＬ−６抗体を用いて、ＩＬ−６発現性細胞を標的にし、死滅させる。別の一実施形態において、結合性ポリペプチドは、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７のＮ−グリカン上に、変更された数のシアル酸残基を有し得る。「アグリ」抗体または変更されたグリカンを有する抗体を作製するのに、技術分野で認められた多数の方法を利用できる。例えば、修飾グリコシル化経路（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ欠失）を有する、遺伝子改変した宿主細胞（例えば、修飾された酵母菌、例えば、ピキア（Ｐｉｃｃｈｉａ）またはＣＨＯ細胞）を用いてこのような抗体を生成することができる。
【００８２】
Ｖ．エフェクター部分
所定の実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、エフェクター部分（例えば、薬物部分および標的化部分）を含む。一般的に、これらのエフェクター部分は、結合性ポリペプチド上のＮ結合型グリカンに（直接、またはリンカー部分を介してのいずれかで）コンジュゲートする（例えば、Ｎ結合型グリカンがＣＨ２ドメインのＮ２９８（ＥＵナンバリング）および／またはＣＨ１ドメインのＮ１１４（Ｋａｂａｔナンバリング）に連結している）。所定の実施形態において、結合性ポリペプチドは、Ｋａｂａｔ１１４位にグリカンを有するＣＨ１ドメインを２個含む全長抗体であり、この場合、グリカンは両方とも、１つまたはそれ以上のエフェクター部分にコンジュゲートしている。
【００８３】
あらゆるエフェクター部分を、本明細書で開示される結合性ポリペプチドに付加することができる。エフェクター部分は、結合性ポリペプチドの固有の活性を大幅に変更することなく、変更された抗体またはそのフラグメントに非天然の機能を加えるのが好ましい。エフェクター部分は、例えば、これらに限定されないが、治療剤または診断剤であってよい。本開示の修飾結合性ポリペプチド（例えば、抗体）は、１つまたはそれ以上のエフェクター部分を含んでいてもよく、これらは同じでもよいし、または異なっていてもよい。
【００８４】
一実施形態において、エフェクター部分は、式（Ｉ）：
Ｈ２Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ
式（Ｉ）
であってよく、
式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、エフェクター部分（例えば本明細書で規定される治療剤または診断剤）である。
【００８５】
接続部分は、治療剤をＨ２Ｎ−Ｑ−に接続する。接続部分は、例えば、アルキレニル構成成分、ポリエチレングリコール構成成分、ポリ（グリシン）構成成分、ポリ（オキサゾリン）構成成分、カルボニル構成成分、システインアミド由来の構成成分、シトルリンにカップリングするバリン由来の構成成分、および４−アミノベンジルカーバメート由来の構成成分、またはこれらのあらゆる組合せなど、当業者に知られているあらゆる適切な構成成分を少なくとも１つ含んでいてもよい。
【００８６】
別の一実施形態において、式（Ｉ）のエフェクター部分は、式（Ｉａ）：
Ｈ２Ｎ−Ｑ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｚ−Ｘ
式（Ｉａ）
であってよく、
式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）Ｚは、−Ｃｙｓ−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆであり、
式中、
ｉ．Ｃｙｓは、システインアミド由来の構成成分であり、
ｉｉ．ＭＣは、マレイミド由来の構成成分であり、
ｉｉｉ．ＶＣは、シトルリンにカップリングするバリン由来の構成成分であり、
ｉｖ．ＰＡＢＣは、４−アミノベンジルカーバメート由来の構成成分であり、
ｖ．Ｘは、エフェクター部分（例えば本明細書で規定される治療剤または診断剤）であり、
ｖｉ．ａは、０または１であり、
ｖｉｉ．ｂは、０または１であり、
ｖｉｉｉ．ｃは、０または１であり、
ｉｘ．ｆは、０または１である。
【００８７】
「システインアミド由来の構成成分」は、Ｈ２Ｎ−Ｑ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−への付着点である。一実施形態において、「システインアミド由来の構成成分」は、構造：
【化１】
0006588422.tif 000002
を有するエフェクター部分の１つまたはそれ以上の部分を指す場合がある。
【００８８】
一実施形態において、エフェクター部分の「Ｃｙｓ」構成成分は、このような部分を１つ含んでいてもよい。例えば、以下の構造は、このような部分を１つ有するエフェクター部分を示す（式中、「Ｃｙｓ」構成成分を点線のボックスで示す）：
【化２】
0006588422.tif 000003
【００８９】
別の一実施形態において、エフェクター部分の「Ｃｙｓ」構成成分は、このような部分を２つ以上含んでいてもよい。例えば、以下の部分はこのような部分を２つ含む。
【化３】
0006588422.tif 000004
【００９０】
構造からわかるように、「Ｃｙｓ」構成成分は、−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆ−Ｘ基を保有する。
【００９１】
一実施形態において、「マレイミド由来の構成成分」という表現は、構造：
【化４】
0006588422.tif 000005
を有するエフェクター部分のあらゆる部分を指す場合があり、式中、ｄは２から５の整数である。エフェクター部分におけるあらゆるＣｙｓ−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆ−Ｘ基に含まれるＭＣ構成成分の数は、下付き
数字「ａ」によって示され、０または１であり得る。一実施形態において、ａは１である。別の一実施形態において、ｂは０である。
【００９２】
一実施形態において、「Ｃｙｓ」構成成分は、以下の構造における点線ボックスで示す通り、「Ｃｙｓ」構成成分中の硫黄原子を介して「ＭＣ」構成成分に接続していてよい：
【化５】
0006588422.tif 000006
【００９３】
一実施形態において、「シトルリンとカップリングするバリン由来の構成成分」という表現は、以下の構造を有するエフェクター部分のあらゆる部分を指す場合がある：
【化６】
0006588422.tif 000007
【００９４】
エフェクター部分におけるあらゆるＣｙｓ−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆ−Ｘ基に含まれるＶＣ構成成分の数は、下付き文字「ｂ」で示され、０または１であってよい。一実施形態において、ｂは１である。別の一実施形態において、ｂは０である。
【００９５】
一実施形態において、「４−アミノベンジルカーバメート由来の構成成分」という表現は、以下の構造を有するエフェクター部分のあらゆる部分を指す場合がある：
【化７】
0006588422.tif 000008
【００９６】
エフェクター部分におけるあらゆるＣｙｓ−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆ−Ｘ基に含まれるＰＡＢＣ構成成分の数は、下付き文字「ｃ」によって示され、０または１であってよい。一実施形態において、ｃは１である。別の一実施形態において、ｃは０である。
【００９７】
一実施形態において、「Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４」は以下の構造を指す：
【化８】
0006588422.tif 000009
【００９８】
エフェクター部分におけるあらゆるＣｙｓ−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆ−Ｘ基に含まれるＣ１６Ｈ３２Ｏ８の単位の数は、下付き文字「ｆ」によって示される。一実施形態において、ｆは１である。別の一実施形態において、ｆは０である。
【００９９】
一実施形態において、ａは１であり、ｂは１であり、ｃは１であり、ｆは０である。
【０１００】
ａ）治療用エフェクター部分
所定の実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、治療剤、例えば、薬物部分（もしくはそのプロドラッグ）、または放射標識した化合物を含むエフェクター部分にコンジュゲートしている。一実施形態において、治療剤は細胞毒である。例示的な細胞毒性治療剤を、本明細書の表１に記載する。
【０１０１】
【表１】
0006588422.tif 000010
【０１０２】
【表２】
0006588422.tif 000011
【０１０３】
さらなる例示的な薬物部分は、抗炎症剤、抗癌剤、抗感染剤（例えば、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤など）、および麻酔性の治療剤を含む。さらなる一実施形態において、薬物部分は抗癌剤である。例示的な抗癌剤は、これらに限定されないが、細胞分裂阻害剤、酵素阻害剤、遺伝子調節剤（ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、細胞毒性ヌクレオシド、チューブリン結合薬またはチューブリン阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ホルモンおよびホルモンアンタゴニスト、血管新生阻害剤などを含む。例示的な細胞分裂阻害性の抗癌剤は、アルキル化剤、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬物（例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、シクロスポリンＡ、クロロキン、メトプテリン、ミトラマイシン、ポルフィロマイシン、ストレプトニグリン、ポルフィロマイシン、アントラセンジオン、およびアジリジン）を含む。他の細胞分裂阻害性の抗癌剤は、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、メトトレキセートおよびジクロロメトトレキセート、３−アミノ−１，２，４−ベンゾトリアジン１，４−ジオキシド、アミノプテリン、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル、ガンシクロビル、ヒドロキシ尿素、アクチノマイシンＤ、およびマイトマイシンＣ）、ＤＮＡインターカレーターまたは架橋剤（例えば、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シス−ジアミン白金（ＩＩ）ジクロリド（シスプラチン）、メルファラン、ミトキサントロン、およびオキサリプラチン）、ならびにＤＮＡ−ＲＮＡ転写調節剤（例えば、アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ホモハリングトニン、およびイダルビシン）を含む。本開示で適用可能な他の例示的な細胞分裂阻害剤は、アンサマイシンベンゾキノン、キノノイド誘導体（例えば、キノロン、ゲニステイン、バクタサイクリン（ｂａｃｔａｃｙｃｌｉｎ））、ブスルファン、イホスファミド、メクロレタミン、トリアジクオン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、カルバジルキノン、インドロキノンＥＯ９、ジアジリジニル−ベンゾキノンメチルＤＺＱ、トリエチレンホスホラミド、およびニトロソ尿素化合物（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）を含む。
【０１０４】
例示的な細胞毒性ヌクレオシド抗癌剤は、それだけには限定されないが、例えば、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、フトラフール、および６−メルカプトプリンを含む。例示的な抗癌性のチューブリン結合薬は、それだけには限定されないが、タキソイド（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、タキサン）、ノコダゾール、リゾキシン、ドラスタチン（例えば、ドラスタチン−１０、−１１、または−１５）、コルヒチンおよびコルヒチノイド（例えば、ＺＤ６１２６）、コンブレタスタチン（例えば、コンブレタスタチンＡ−４、ＡＶＥ−６０３２、ならびにビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン（ナベルビン））を含む。例示的な抗癌ホルモンおよびホルモンアンタゴニストは、それだけには限定されないが、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、ヒドロキシプロゲステロンまたはメドロプロゲステロン）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（例えば、テストステロン）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド）、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、アピゲニン、ブレフェルジンＡ、シメチジン、ジクロロメチレン−ジホスホン酸、ロイプロリド（ロイプロレリン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ピフィスリンａ、ラパマイシン、性ホルモン結合性グロブリン、およびタプシガルジンを含む。例示的な抗癌性の抗血管新生化合物は、それだけには限定されないが、アンジオスタチンＫ１〜３、ＤＬ−ａ−ジフルオロメチル−オルニチン、エンドスタチン、フマギリン、ゲニステイン、ミノサイクリン、スタウロスポリン、および（±）−サリドマイドを含む。
【０１０５】
例示的な抗癌性の酵素阻害剤は、それだけには限定されないが、Ｓ（±）−カンプトテシン、クルクミン、（−）−デグエリン、５，６−ジクロロベンズイミダゾール１−β−Ｄリボフラノシド、エトポシド、フォルメスタン、フォストリエシン、ヒスピジン、２−イミノ−１−イミダゾリジン酢酸（シクロクレアチン）、メビノリン、トリコスタチンＡ、チロホスチンＡＧ３４、およびチロホスチンＡＧ８７９を含む。
【０１０６】
例示的な抗癌性の遺伝子調節剤は、それだけには限定されないが、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−アザシチジン、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、４−ヒドロキシタモキシフェン、メラトニン、ミフェプリストーン、ラロキシフェン、トランス−レチナール（ビタミンＡアルデヒド）、レチノイン酸、ビタミンＡ酸、９−シス−レチノイン酸、１３−シス−レチノイン酸、レチノール（ビタミンＡ）、タモキシフェン、およびトログリタゾンを含む。
【０１０７】
他の好ましいクラスの抗癌剤は、それだけには限定されないが、例えば、プテリジンファミリーの薬物、ジイン、およびポドフィロトキシンを含む。これらのクラスの特に有用な種類は、例えば、メトプテリン、ポドフィロトキシン、またはポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシドまたはエトポシドホスフェート、リューロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、リューロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）などを含む。
【０１０８】
本明細書の教示で適用可能なさらに他の抗癌剤は、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥおよびモノメチルアウリスタチンＥ）、ゲルダナマイシン、カリケアマイシン、グラミシジンＤ、メイタンシノイド（例えば、メイタンシン）、ネオカルチノスタチン、トポテカン、タキサン、サイトカラシンＢ、エチジウムブロミド、エメチン、テニポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびこれらの類似体またはホモログを含む。
【０１０９】
本明細書の教示で適用可能ななお他の抗癌剤は、トマイマイシン誘導体、メイタンシン誘導体、クリプトフィシン誘導体、アントラサイクリン誘導体、ビスホスホネート誘導体、レプトマイシン誘導体、ストレプトニグリン誘導体、アウリスタチン誘導体、およびデュオカルマイシン誘導体を含む。
【０１１０】
薬物部分として用いることができる別の一クラスの適用可能な抗癌剤は、腫瘍または免疫反応性の細胞を効果的に標的とすることができる放射線増感性の薬物である。このような薬物部分は、電離放射線に対する感受性を増強することによって放射線治療の効能を増大する。理論に限定されるつもりはないが、放射線増感性の薬物部分で修飾され、腫瘍細胞に内在化した抗体は、放射線増感薬を核のより近くに送達することから、そこで放射線増感が最大になると予想される。放射線増感薬部分を失った抗体は血液から速やかに除去され、残った放射線増感薬は標的の腫瘍に局在化し、正常組織への取り込みは最小化される。血液から除去された後、腫瘍に局所的にあてられる体外照射、腫瘍への放射能の直接的な埋め込み、または同じ修飾抗体での放射免疫療法によって補助的な放射線治療を施すことができる。
【０１１１】
一実施形態において、治療剤は放射性核種または高エネルギー電離放射線を持った放射標識を含み、高エネルギー電離放射線は核のＤＮＡで複数の鎖切断を引き起こすことができ、細胞死をもたらす。例示的な高エネルギーの放射性核種は、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、および１８８Ｒｅを含む。これらの同位元素は、軌道の長さの短い、高エネルギーのα粒子またはβ粒子を生成するのが典型的である。このような放射性核種は、極めて近位にある細胞、例えばコンジュゲートが付着しているかまたは侵入した新生物細胞を死滅させる。これらは非局在化細胞にはほとんどまたはまったく効果がなく、本質的に非免疫原性である。あるいは、高エネルギーの同位体は、ホウ素中性子捕捉療法の場合のように、その他の点では安定な同位体の熱放射によって産生され得る（Ｇｕａｎら、ＰＮＡＳ、９５巻、１３２０６〜１０頁、１９９８年）。
【０１１２】
一実施形態において、治療剤は、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、およびＰＥＧ８−Ｄｏ１１０から選択される。
【０１１３】
例示的な治療用エフェクター部分は、以下の構造を含む：
【化９】
0006588422.tif 000012
【０１１４】
一実施形態において、エフェクター部分は以下から選択される：
【化１０】
0006588422.tif 000013
【０１１５】
所定の実施形態において、エフェクター部分は１つより多くの治療剤を含む。これらの複数の治療剤は同じでもよいし、または異なっていてもよい。
【０１１６】
ｂ）診断用エフェクター部分
所定の実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドは、診断剤を含むエフェクター部分にコンジュゲートしている。一実施形態において、診断剤は、ビオチン、フルオロフォア、発色団、スピン共鳴プローブ、または放射標識などの検出可能な小分子標識である。例示的なフルオロフォアは、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、および他の発酵分子（例えば、ルミナール）を含む。フルオロフォアは、基質と結合すると構造的な変化を受ける、修飾結合性ポリペプチドにおける１つまたはそれ以上の残基に接近して位置する場合に、その蛍光が変化するように、環境的に感受性であってもよい（例えば、ダンシルプローブ）。例示的な放射標識は、１つまたはそれ以上の低感受性の核を有する原子（１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなど）を含む小分子を含む。放射性核種が、投与とイメージング部位への局在化との間の経過時間後の活性または検出を可能にするのに適した半減期を有するガンマ、光子、またはポジトロン放出性の放射性核種であるのが好ましい。
【０１１７】
一実施形態において、診断剤はポリペプチドである。例示的な診断用ポリペプチドは、生成物（すなわち、ルシフェラーゼなどのレポータータンパク質）としてフルオロフォアまたは発色団を形成する基質を切断する能力など、蛍光発生活性または色素産生活性を有する酵素を含む。他の診断用タンパク質は、固有の蛍光発生活性または色素産生活性（例えば、生物発光性の海洋生物からの緑色、赤色、および黄色の蛍光の生物発光のエクオリンタンパク質）を有し得、または１つもしくはそれ以上の低エネルギーの放射性核（１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなど）を含むタンパク質を含み得る。
【０１１８】
本開示と組み合わせた放射標識したコンジュゲートの使用に関して、本開示の結合性ポリペプチドを直接標識してもよく（例えば、ヨウ素化によって）、またはキレート化剤の使用によって間接的に標識してもよい。本明細書で用いられる「間接的な標識化」および「間接的な標識化のアプローチ」という表現は両方とも、キレート化剤が結合性ポリペプチドに共有結合で付着し、少なくとも１つの放射性核種がキレート化剤と会合していることを意味する。このようなキレート化剤は、ポリペプチドおよび放射性同位元素の両方に結合することから、典型的には二官能性キレート化剤と呼ばれる。例示的なキレート化剤は、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート化剤は、Ｐ−ＤＯＴＡおよびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接的な標識化に特に好ましい放射性核種は、１１１Ｉｎおよび９０Ｙを含む。ほとんどのイメージング試験では５ｍＣｉの１１１Ｉｎ標識化抗体が利用される、というのはこの線量は安全であり、低線量に比べてイメージング効率が増大しており、最適なイメージングが抗体投与３日後から６日後に生じるからである。例えば、Ｍｕｒｒａｙ、（１９８５年）、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．、２６巻、３３２８頁、およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏら（１９８５年）、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．、２６巻、６７頁を参照されたい。直接標識化に特に好ましい放射性核種は、１３１Ｉである。当業者であれば、非放射性コンジュゲートは、コンジュゲートさせるために選択した薬剤に応じて組み立てることができることを理解されよう。
【０１１９】
所定の実施形態において、診断用エフェクター部分はＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブである。ＦＲＥＴは、癌の診断などの多様な診断応用に用いられている。ＦＲＥＴプローブは、ＦＲＥＴプローブのドナーとアクセプター部分とを接続する切断可能なリンカー（酵素感受性またはｐＨリンカー）を含んでいてもよく、切断により、増強された蛍光（近赤外線を含む）がもたらされる（例えば、Ａ．Ｃｏｂｏｓ−Ｃｏｒｒｅａら、Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＦＲＥＴ  ｐｒｏｂｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｓ  ＭＭＰ１２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２００９年）、５巻（９）、６２８〜６３頁、Ｓ．Ｇｅｈｒｉｇら、Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｅｌａｓｔａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ  （２０１２年）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、５１巻、６２５８〜６２６１頁を参照されたい）。
【０１２０】
一実施形態において、エフェクター部分は以下から選択される：
【化１１】
0006588422.tif 000014
【０１２１】
ｃ）官能基化されたエフェクター部分
所定の実施形態において、エフェクター部分自体の他にさらなる基が含まれるように、本発明のエフェクター部分を官能基化してもよい。例えば、エフェクター部分は、特定の条件下でエフェクター部分を結合性ポリペプチドから放出する、切断可能なリンカーを含んでいてもよい。例示的な実施形態において、エフェクター部分は、細胞の酵素によって切断され、かつ／またはｐＨ感受性であるリンカーを含んでいてもよい。さらに、またはあるいは、エフェクター部分は、細胞中に取り込まれると細胞内グルタチオンによって切断されるジスルフィド結合を含んでいてもよい。例示的なジスルフィドおよびｐＨ感受性のリンカーを以下に示す：
【化１２】
0006588422.tif 000015
【０１２２】
さらに他の実施形態において、エフェクター部分は、ポリ（グリシン）、ポリ（オキサゾリン）、またはＰＥＧ部分など、親水性および生体適合性の部分を含んでいてもよい。例示的な構造（「Ｙ」）を以下に提供する：
【化１３】
0006588422.tif 000016
【０１２３】
所定の実施形態において、エフェクター部分は、安定なオキシム結合によって結合性ポリペプチドに対するコンジュゲーションを促進するアミノオキシ基を含む。アミノオキシ基を含めた例示的なエフェクター部分を、本明細書の表２に記載する。
【０１２４】
【表３】
0006588422.tif 000017
【０１２５】
【表４】
0006588422.tif 000018
【０１２６】
他の実施形態において、エフェクター部分は、安定なヒドラゾン結合によって結合性ポリペプチドに対するコンジュゲーションを促進するための、ヒドラジドおよび／またはＮ−アルキル化ヒドラジン基を含む。アミノオキシ基を含む例示的なエフェクター部分を、本明細書の表１４に記載する。
【０１２７】
【表５】
0006588422.tif 000019
【０１２８】
ｄ）標的化部分
所定の実施形態において、エフェクター部分は、１つまたはそれ以上の標的分子に特異的に結合する標的化部分を含む。制限なく、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（例えば、グリカン）、およびこれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、糖ペプチド、および糖脂質）を含めた、あらゆるタイプの標的化部分を用いることができる。所定の実施形態において、標的化部分は、炭水化物または糖ペプチドである。所定の実施形態において、標的化部分はグリカンである。標的化部分は、天然または非天然に存在する分子であってよい。
【０１２９】
ＶＩ．エフェクター部分の結合性ポリペプチドに対するコンジュゲーション
所定の実施形態において、エフェクター部分は、変更された結合性ポリペプチド（例えば、抗体のＣＨ１ドメインのＮ１１４が改変されたグリカンである、または抗体ＦドメインのＮ２９７が天然のグリカンである）の酸化されたグリカン（例えば、酸化されたＮ結合型グリカン）に、（直接、またはリンカー部分を介してのいずれかで）コンジュゲートする。「酸化されたグリカン」という用語は、グリカン上のアルコール置換基が酸化されておりカルボニル置換基になっていることを意味する。カルボニル置換基は適切な窒素求核試薬と反応して、炭素−窒素二重結合を形成することができる。例えば、カルボニル基がアミノオキシ基またはヒドラジン基と反応すると、それぞれオキシムまたはヒドラジンが形成される。一実施形態において、カルボニル置換基はアルデヒドである。適切な酸化されたグリカンには、酸化されたガラクトースおよび酸化されたシアル酸が含まれる。
【０１３０】
一実施形態において、式（ＩＩ）の修飾ポリペプチドは式（ＩＩ）：
Ａｂ（Ｇａｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ）ｘ（Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｏ）Ｈ）ｙ
式（ＩＩ）
で示すことができ、
式中、
Ａ）Ａｂは、抗体、または本明細書で規定される他の結合性ポリペプチドであり、
Ｂ）Ｇａｌは、ガラクトース由来の構成成分であり、
Ｃ）Ｓｉａは、シアル酸由来の構成成分であり、
Ｄ）ｘは、０から５であり、
Ｅ）ｙは、０から５であり、
ｘおよびｙの少なくとも１つは０ではない。
【０１３１】
当技術分野で認められているあらゆる化学反応を用いて、エフェクター部分（例えば、リンカー部分を含むエフェクター部分）をグリカンにコンジュゲートすることができる（例えば、その全文が本明細書に組み入れられる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）を参照されたい）。所定の実施形態において、グリカンの糖残基（例えば、シアル酸またはガラクトース残基）を最初に酸化して（例えば、シアル酸の過ヨウ素酸ナトリウム処理またはガラクトースのガラクトースオキシダーゼ処理を用いて）反応性アルデヒド基を産生する。このアルデヒド基を、アミノオキシ基またはヒドラジン基のエフェクター部分と反応させて、それぞれオキシムまたはヒドラゾンリンカーを形成させる。この一般的な反応スキームを用いた例示的な方法を、実施例１０から１５に記載する。
【０１３２】
所定の実施形態において、結合性ポリペプチドの天然の、または改変されたグリカンを、最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリコシルトランスフェラーゼ酵素と前処理して、適切な反応性を有する末端の糖残基をもたらす。例えば、シアリル化は、最初にガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａｌＴ）の組合せを用いて達成してもよい。所定の実施形態において、ガラクトースを欠く（Ｇ０ＦもしくはＧ０）、またはガラクトースを１つだけ含む（Ｇ１ＦもしくはＧ１）二分岐グリカンを、コンジュゲーションに適した高次のガラクトシル化またはシアリル化された構造（Ｇ１Ｆ、Ｇ１、Ｇ２Ｆ、Ｇ２、Ｇ１Ｓ１Ｆ、Ｇ１Ｓ１、Ｇ２Ｓ１Ｆ、Ｇ２Ｓ１、Ｇ２Ｓ２Ｆ、もしくはＧ２Ｓ２）に変換してもよい。
【０１３３】
シアリル化した複合糖質を生成するための例示的な一コンジュゲートスキームを、図２５Ｃに示す。シアル酸残基を酵素的に、および部位特異的に、抗体のグリカン（例えば、Ａｓｎ−２９７が天然のグリカン）に、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳｉａｌＴ）の組合せを用いて導入する。導入したシアル酸残基を、低濃度の過ヨウ素酸ナトリウムで引き続き酸化させて、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（例えば、オキシム結合したＡＤＣ）を産生するための薬物−リンカー（例えば、アミノオキシ薬物リンカー）と適切な反応性を有する反応性シアル酸を得る。グリカンの数およびシアル残基の数をｉｎ  ｖｉｔｒｏの再構築で制御することにより、当業者であればＡＤＣの薬物−抗体比（ＤＡＲ）にわたって正確な制御をすることができる。例えば、およそ１個のシアル酸を、各重鎖における単一の二分岐グリカン（Ａ１Ｆ）上に付加する場合、ＤＡＲが２である抗体または結合性ポリペプチドを均一に得ることができる。
【０１３４】
ＶＩＩ．修飾結合性ポリペプチド
所定の実施形態において、本発明は、変更された結合性ポリペプチド（例えば、抗体ＣＨ１ドメインのＮ１１４が改変されたグリカンまたは抗体ＦドメインのＮ２９７が天然のグリカン）の酸化されたグリカン（例えば、酸化されたＮ結合型グリカン）にエフェクター部分を（直接的、またはリンカー部分によってのいずれかで）コンジュゲートしてなる生成物である、修飾ポリペプチドを提供する。
【０１３５】
一実施形態において、結合性ポリペプチドは式（ＩＩＩ）：
Ａｂ（Ｇａｌ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ）ｘ（Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ）ｙ
式（ＩＩＩ）
で示すことができ、
式中、
Ａ）Ａｂは、本明細書で規定される抗体であり、
Ｂ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｃ）ＣＯＮは、本明細書で規定される接続部分であり、
Ｄ）Ｘは、本明細書で規定される治療剤または診断剤であり、
Ｅ）Ｇａｌは、ガラクトース由来の構成成分であり、
Ｆ）Ｓｉａは、シアル酸由来の構成成分であり、
Ｇ）ｘは、０から５であり、
Ｈ）ｙは、０から５であり、
ｘおよびｙの少なくとも１つは０ではない。
【０１３６】
一実施形態において、結合性ポリペプチドは式（ＩＩＩ）：
Ａｂ（Ｇａｌ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｚ−Ｘ）ｘ（Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｚ−Ｘ）ｙ
式（ＩＩＩａ）
で示すことができ、
式中、
Ａ）Ａｂは、抗体であり、
Ｂ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｃ）Ｚは、Ｃｙｓ−（ＭＣ）ａ−（ＶＣ）ｂ−（ＰＡＢＣ）ｃ−（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ８Ｃ２Ｈ４）ｆ−であり、
式中、
ｉ．Ｃｙｓは、システインアミド由来の構成成分であり、
ｉｉ．ＭＣは、マレイミド由来の構成成分であり、
ｉｉｉ．ＶＣは、シトルリンとカップリングしたバリン由来の構成成分であり、
ｉｖ．ＰＡＢＣは、４−アミノベンジルカーバメート由来の構成成分であり、
ｖ．Ｘは、エフェクター部分（例えば本明細書で規定される治療剤または診断剤）であり、
ｖｉ．ａは、０または１であり、
ｖｉｉ．ｂは、０または１であり、
ｖｉｉｉ．ｃは、０または１であり、
ｉｘ．ｆは、０または１であり、
Ｄ）Ｘは、本明細書で規定される治療剤であり、
Ｅ）Ｇａｌは、ガラクトース由来の構成成分であり、
Ｆ）Ｓｉａは、シアル酸由来の構成成分であり、
Ｇ）ｘは、０から５であり、
Ｈ）ｙは、０から５であり、
ｘおよびｙの少なくとも１つは０ではない。
【０１３７】
式（ＩＩＩ）は、抗体、Ｇａｌ置換基、およびＧａｌ−Ｓｉａ置換基が鎖状に接続されていることを示そうとするものではないことを理解されたい。そうではなく、このような置換基が存在する場合、抗体は、各置換基に直接接続している。例えば、ｘが１であり、ｙが２である式（ＩＩＩ）の結合性ポリペプチドは、以下に示す配置を有し得る：
【化１４】
0006588422.tif 000020
【０１３８】
式（ＩＩＩ）におけるＣＯＮ置換基およびその中の構成成分は、エフェクター部分について式（Ｉ）に関して記載した通りである。
【０１３９】
一実施形態において、ＱはＮＨである。別の一実施形態において、ＱはＯである。
【０１４０】
一実施形態において、ｘは０である。
【０１４１】
式（ＩＩＩ）の抗体Ａｂは、本明細書に記載されるあらゆる適切な抗体であってよい。
【０１４２】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）の結合性ポリペプチドを調製するための方法を提供し、方法は式（Ｉ）：
ＮＨ２−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ
式（Ｉ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、エフェクター部分（例えば本明細書で規定される治療剤または診断剤）である］
のエフェクター部分を、式（ＩＩ）：
Ａｂ（ＯＸＧ）ｒ
式（ＩＩ）
［式中、
Ａ）ＯＸＧは、酸化されたグリカンであり、
Ｂ）ｒは、０から４から選択される］
の修飾抗体と反応させることを含む。
【０１４３】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）の結合性ポリペプチドを調製するための方法を提供し、方法は、式（Ｉ）：
ＮＨ２−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ
式（Ｉ）
［式中、
Ａ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｂ）ＣＯＮは、接続部分であり、
Ｃ）Ｘは、エフェクター部分（例えば本明細書で規定される治療剤または診断剤）である］
のエフェクター部分を、式（ＩＩａ）：
Ａｂ（Ｇａｌ−Ｃ（Ｏ）Ｈ）ｘ（Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｏ）Ｈ）ｙ
式（ＩＩａ）、
［式中、
Ａ）Ａｂは、本明細書に記載する抗体であり、
Ｂ）Ｇａｌは、ガラクトース由来の構成成分であり、
Ｃ）Ｓｉａは、シアル酸由来の構成成分であり、
Ｄ）ｘは、０から５であり、
Ｅ）ｙは、０から５であり、
ｘおよびｙの少なくとも１つは０ではない］
の修飾抗体と反応させることを含む。
【０１４４】
ＶＩＩ．修飾抗体で処置する方法
一態様において、本発明は、本明細書で開示される結合性ポリペプチドの有効量を投与することを含む、それを必要とする患者を処置または診断する方法を提供する。本開示の好ましい実施形態は、そのような処置を必要とする哺乳動物の対象における、新生物性の障害などの障害を診断および／または処置するためのキットおよび方法を提供する。対象がヒトであるのが好ましい。
【０１４５】
本開示の結合性ポリペプチドは、数々の様々な適用において有用である。例えば、一実施形態において、対象の結合性ポリペプチドは、結合性ポリペプチドの結合性ドメインに結合することにより認識されるエピトープを保有する細胞を低減または除去するのに有用である。別の一実施形態において、対象の結合性ポリペプチドは、循環中の可溶性抗原の濃度を低減または除去するのに効果的である。一実施形態において、結合性ポリペプチドは、腫瘍のサイズを低減し、腫瘍の成長を阻害し、かつ／または担癌動物の生存時間を延長し得る。したがって、本開示は、ヒトまたは動物に、効果的な、非毒性の量の修飾抗体を投与することにより、このようなヒトまたは他の動物における腫瘍を処置する方法にも関する。当業者であれば、慣例的な実験によって、悪性腫瘍を処置する目的で、修飾結合性ポリペプチドの効果的な非毒性の量がどのくらいであるのかを決定することができる。例えば、修飾抗体またはそのフラグメントの治療有効量は、疾患段階（例えば、ステージＩ対ステージＩＶ）、年齢、性別、医学上の合併症（例えば、免疫抑制性の状態または疾患）、および対象の体重、ならびに修飾抗体が対象において所望の反応を誘発する能力などの要因に従って変更してもよい。最適な治療応答がもたらされるように、投与量レジメンを調節してもよい。例えば、いくつかの分割された投与量を毎日投与してもよく、または治療的状況の要求に応じて投与量を比例的に低減してもよい。
【０１４６】
一般的に、本開示で提供される組成物は、修飾抗体による癌性細胞の標的化を可能にする抗原マーカーを含む、あらゆる新生物を予防的または治療的に処置するのに用いることができる。
【０１４７】
ＶＩＩＩ．修飾抗体またはそのフラグメントを投与する方法
本開示の結合性ポリペプチドを調製し、対象に投与する方法は、当業者にはよく知られており、または当業者によって容易に決定される。本開示の結合性ポリペプチドを投与する経路は、経口、非経口、吸入によって、または局所的であってよい。本明細書で用いられる非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、または膣内投与を含む。静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内の形態の非経口投与が、一般的に好ましい。これらの投与形態は全て、本開示の範囲内にあることが明らかに企図され、投与のための形態は注射用の、特に静脈内または動脈内の注射または点滴用の溶液である。通常、注射に適する医薬組成物は、バッファー（例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、またはクエン酸バッファー）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、場合により安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含んでいてもよい。しかし、本明細書の教示で適用可能な他の方法では、修飾抗体を、有害な細胞の集団の部位に直接送達し、それによって罹患している組織の治療剤への暴露を増大することができる。
【０１４８】
一実施形態において、投与する結合性ポリペプチドは、式（ＩＩＩ）：
Ａｂ（Ｇａｌ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ）ｘ（Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｃ（Ｈ）＝Ｎ−Ｑ−ＣＯＮ−Ｘ）ｙ
式（ＩＩＩ）
の結合性ポリペプチドであり、
式中、
Ａ）Ａｂは、本明細書で規定される抗体であり、
Ｂ）Ｑは、ＮＨまたはＯであり、
Ｃ）ＣＯＮは、本明細書で規定される接続部分であり、
Ｄ）Ｘは、エフェクター部分（例えば本明細書で規定される治療剤または診断剤）であり、
Ｅ）Ｇａｌは、ガラクトース由来の構成成分であり、
Ｆ）Ｓｉａは、シアル酸由来の構成成分であり、
Ｇ）ｘは、０から５であり、
Ｈ）ｙは、０から５であり、
ｘおよびｙの少なくとも１つは０ではない。
【０１４９】
非経口投与のための調製物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性の担体は、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば、食塩水および緩衝化媒体を含む。本開示の組成物および方法において、薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸バッファー、または０．８％食塩水が挙げられる。他の一般定な非経口のビヒクルは、リン酸ナトリウム溶液、デキストロース加リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補充液、電解質補充液、例えば、デキストロース加リンゲル液をベースとしたものなどを含む。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在してもよい。より具体的には、注射用の使用に適する医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性である場合）、または無菌の注射用溶液または分散液を即時に調製するための分散剤および無菌の粉末を含む。このような場合には、組成物は無菌でなければならず、シリンジ操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が容易になる程度に流動性を有していなければならない。組成物は製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていることが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要とされる粒子サイズを維持することにより、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
【０１５０】
微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの多様な抗菌剤および抗真菌剤によって達成できる。多くの場合、組成物中に、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むのが好ましい。注射用組成物の長時間の吸収は、組成物中に、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含有させることによって達成できる。
【０１５１】
いずれの場合においても、無菌の注射用溶液は、有効化合物（例えば、修飾結合性ポリペプチドを単独で、または他の活性物質と併用して）を、適宜、本明細書に列挙する成分の１つまたは組合せを含む必要量の好適な溶媒中に入れ、その後濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、有効化合物を無菌のビヒクル中に入れることによって調製され、無菌のビヒクルは、基本的な分散媒体、および上記に列挙したものから必要とされる他の成分を含む。無菌の注射用溶液を調製するための無菌の粉末の場合は、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、その場合、有効成分に加えてあらゆるさらなる所望の成分を含む予め滅菌濾過した溶液から、それらの粉末を得る。注射用の調製物は、当技術分野で知られている方法に従って処理加工され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、またはバイアルなどの容器中に充填され、無菌的な条件下で密封される。さらに、調製物は、各々が参照によって本明細書に組み入れられる、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３７およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３８に記載されているものなどのキットの形態で包装し、販売してもよい。このような製造品は、関連の組成物が、自己免疫性または新生物性の障害に罹患しているか、またはその素因を有する対象を処置するのに有用であることを示すラベルまたは添付文書を有するのが好ましい。
【０１５２】
上記に記載した状態を処置するための本開示の組成物の有効投与量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与する他の薬物療法、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含めた多くの様々な要因に応じて変更される。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非ヒトの哺乳動物も処置することができる。処置投与量は、安全性および効能を最適化するために当業者に知られている慣例的な方法を用いて決定できる。
【０１５３】
結合性ポリペプチドでの受動免疫では、投与量は、例えば、宿主の体重の約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１から５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、ｌｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であってよい。例えば、投与量は１ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであってよい。上記の範囲内の中間値の投与量も、本開示の範囲内であるものとする。対象に、このような投与量を毎日、１日おきに、毎週、または経験的な分析によって決定されるあらゆる他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な一処置は、少なくとも６か月などの長期間にわたる、複数回用量での投与を伴う。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間ごとに１回、または１か月に１回、または３か月から６か月ごとに１回の投与を伴う。例示的な投与量スケジュールは、毎日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法では、結合特異性の異なる２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与されるが、この場合、投与される各抗体の投与量は示された範囲内である。
【０１５４】
本開示の結合性ポリペプチドは、複数の機会に投与することができる。１回の投与間の間隔は、週単位、月単位、または年単位であってよい。間隔は、修飾結合性ポリペプチドまたは抗原の患者における血中レベルの測定で示されるように、不規則であってもよい。いくつかの方法では、投与量を調節することにより、修飾結合性ポリペプチドの血漿濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成し、いくつかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌを達成する。あるいは、結合性ポリペプチドを徐放製剤として投与してもよく、その場合、それほど頻繁に投与しなくてもよい。抗体に対して、投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変更される。一般的に、ヒト化抗体は最長の半減期を示し、その後にキメラ抗体および非ヒト抗体が続く。
【０１５５】
投与の投与量および頻度を、処置が予防的であるか、または治療的であるかに応じて変更してもよい。予防的適用では、本発明の抗体またはそのカクテルを含む組成物をまだ疾患状態ではない患者に投与することで、患者の抵抗性を増強してもよい。このような量は、「予防有効投与量」と定義される。この使用において、正確な量は、やはり患者の健康状態および全身の免疫性に依存するが、一般的に１投与量あたり０．１から２５ｍｇ、特に１投与量あたり０．５から２．５ｍｇの範囲である。相対的に低い投与量を、相対的に低頻度の間隔で長期間にわたって投与する。患者の中には、残りの生涯ずっと処置を受け続ける者もいる。治療的適用では、比較的短い間隔の比較的高投与量（例えば、１投与量あたり抗体約１から４００ｍｇ／ｋｇ、ラジオイムノコンジュゲートの場合は５から２５ｍｇの投与量がより一般的に用いられ、細胞毒−薬物修飾抗体の場合はより多くの投与量が用いられる）が、疾患の進行が遅くなるか、または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで必要となる場合がある。その後、患者に予防的レジメンを投与してもよい。
【０１５６】
本開示の結合性ポリペプチドは、場合により、処置（例えば、予防的または治療的）を必要とする障害または状態を処置するのに有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。本開示の９０Ｙで標識した修飾抗体の効果的な単一処置投与量（すなわち、治療有効量）は、約５から約７５ｍＣｉの間、より好ましくは約１０から約４０ｍＣｉの間の範囲である。１３１Ｉ修飾抗体の効果的な処置１回分の骨髄除去以外の場合の投与量は、約５から約７０ｍＣｉの間、より好ましくは約５から約４０ｍＣｉの間の範囲である。１３１Ｉ標識した抗体の有効な処置１回分の除去のための投与量（すなわち、自家骨髄移植を必要とする場合がある）は、約３０から約６００ｍＣｉの間、より好ましくは約５０から約５００ｍＣｉ未満の間の範囲である。キメラ抗体と組み合わせると、ヨウ素−１３１Ｉ修飾キメラ抗体の効果的な処置１回分の骨髄除去以外の場合の投与量は、約５から約４０ｍＣｉの間、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満の範囲である。例えば、１１１Ｉｎ標識に対する画像化判定基準は、約５ｍＣｉ未満であるのが典型的である。
【０１５７】
結合性ポリペプチドはすぐ上で説明した通りに投与できるが、他の実施形態では、結合性ポリペプチドを他の点では健康な患者に第一線の治療として投与してもよいことを強調しなければならない。このような実施形態において、結合性ポリペプチドは、正常もしくは平均的な赤色骨髄蓄積量を有する患者に、および／または経験したことがなく、今も経験していない患者に投与してもよい。本明細書で用いられる、補助療法と協同して、または組み合わされてなされる修飾抗体またはそのフラグメントの投与は、治療法および開示する抗体の、逐次の、同時の、所定期間にわたる、随伴的な、または同時期の投与または適用を意味する。当業者であれば、併用の治療レジメンの多様な成分の投与または適用は、処置の全体的な有効性を増強するように時期を選ぶことができることを理解されよう。例えば、化学療法薬を、標準的なよく知られている処置経過で投与した後、数週間以内に本開示のラジオイムノコンジュゲートを投与してもよい。反対に、結合性ポリペプチドに関連する細胞毒を静脈内投与した後、腫瘍に局所的にあてられる体外照射を行ってもよい。さらに他の実施形態において、１回の受診で、修飾結合性ポリペプチドを、１種またはそれ以上の選択された化学療法薬と同時に投与してもよい。当業者（例えば、経験のある腫瘍専門医）であれば、選択される補助療法および本明細書の教示に基づいて過度の実験を行わずに、効果的な併用治療レジメンを識別することが容易にできる。
【０１５８】
この点では、結合性ポリペプチドと化学療法薬との併用を、患者に治療的利点をもたらすあらゆる順序で、あらゆる時間枠内で投与することができることが理解されよう。すなわち、化学療法薬および結合性ポリペプチドは、あらゆる順序で、または同時に投与することができる。選択された実施形態において、本開示の結合性ポリペプチドを、以前に化学療法を受けたことがある患者に投与する。さらに他の実施形態において、結合性ポリペプチドと化学療法処置とを、実質的に同時に、または並行して投与する。例えば、患者に結合性ポリペプチドを投与する一方で、化学療法の経過を経験させてもよい。好ましい実施形態において、全ての化学療法の薬剤または処置の１年以内に修飾抗体を投与する。他の好ましい実施形態において、全ての化学療法の薬剤または処置の１０、８、６、４、または２か月以内に、結合性ポリペプチドを投与する。なお他の好ましい実施形態において、全ての化学療法の薬剤または処置の４、３、２、または１週以内に、結合性ポリペプチドを投与する。さらに他の実施形態において、選択された化学療法の薬剤または処置の５、４、３、２、または１日以内に、結合性ポリペプチドを投与する。２種の薬剤または処置を、数時間または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）患者に投与してもよいことがさらに理解されよう。
【０１５９】
本開示の結合性ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで新生物細胞の成長を排除し、低減し、阻害し、または制御するあらゆる化学療法の薬剤または（複数の）薬剤と協同して、または併用して（例えば、併用の治療レジメンを提供するために）用いることができることがさらに理解されよう。本開示で適用可能な例示的な化学療法薬は、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキセート、ならびにプレドニゾンを含む。４つの薬物の併用であるＭＯＰＰ（メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジン、およびプレドニゾン）は、多様なタイプのリンパ腫を処置するのに非常に効果的であり、本発明の好ましい実施形態を含むものである。ＭＯＰＰ抵抗性の患者では、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）、ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰプラスＡＢＶＤ、ＭＯＰＰプラスＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびビンブラスチン）、またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）の併用を用いることができる。Ａｒｎｏｌｄ  Ｓ．ＦｒｅｅｄｍａｎおよびＬｅｅ  Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ、Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、ＨＡＲＲＩＳＯＮ’Ｓ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ、１７７４〜１７８８頁（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編集、１３版、１９９４年）、ならびにＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら（１９９７年）、ならびに標準的な投薬および計画に対して本明細書に引用する参考文献。これらの治療法をそのままで、または特定の患者に対して適宜変更して、本明細書に記載する本開示の１つまたはそれ以上の結合性ポリペプチドと併用して用いることができる。
【０１６０】
本開示の状況で有用であるさらなるレジメンは、シクロホスファミドもしくはクロラムブシルなどの単一のアルキル化剤、またはＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰプラスプロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰプラスメトトレキセート、ブレオマイシン、およびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、およびロイコボリン、プラス標準のＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキセート、およびロイコボリン）、ならびにＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定投与量のプレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）などの併用の使用を含む。当業者であれば、これらの各レジメンに対する標準の投与量および計画を容易に決定することができる。ＣＨＯＰはまた、ブレオマイシン、メトトレキセート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド、およびエトポシドと併用されている。他の適用可能な化学療法薬としては、これらに限定されないが、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコホルマイシン、およびフルダラビンが挙げられる。
【０１６１】
寛解または再発を達成することができない、中等度および高悪性度のＮＨＬを有する患者には、サルベージ治療を用いる。サルベージ治療は、単独でまたは併用で投与されるシトシンアラビノシド、カルボプラチン、シスプラチン、エトポシド、およびイホスファミドなどの薬物を用いる。再発の、または進行が早い形態のある種の新生物性の障害では、以下のプロトコールをしばしば用いる：各々よく知られている投薬速度およびスケジュールでの、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキセート、およびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキセート、およびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高投与量シタラビン、およびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、ならびにＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン、およびプレドニゾン）。
【０１６２】
本開示の修飾抗体と併用して用いる化学療法薬の量は、対象によって変更させてもよく、当技術分野において知られているものに従って投与することができる。例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ、Ｃｈａｂｎｅｒら、Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、ＧＯＯＤＭＡＮ＆ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、１２３３〜１２８７頁（Ｊｏｅｌ  Ｇ．  Ｈａｒｄｍａｎら編集、９版、１９９６年）を参照されたい。
【０１６３】
先に論じた通り、本開示の結合性ポリペプチド、免疫反応性のフラグメント、またはその組換え体を、哺乳動物の障害をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するための薬学的有効量で投与してもよい。この点において、本開示の結合性ポリペプチドは、活性物質の投与を容易にし、その安定性が促進されるように調合される。
【０１６４】
本開示による医薬組成物が、薬学的に許容される、非毒性の、無菌の担体、例えば、生理学的食塩水、非毒性のバッファー、保存剤などを含むのが好ましい。本出願の目的では、治療剤にコンジュゲートした、またはコンジュゲートしていない、改変された結合性ポリペプチド、免疫反応性フラグメント、またはその組換え体の薬学的有効量は、抗原に対する効果的な結合を達成するのに十分な量、および利点を達成するのに、例えば、疾患もしくは障害の症状を軽減するのに、または物質もしくは細胞を検出するのに十分な量を意味するとされる。腫瘍細胞の場合、修飾結合性ポリペプチドが、新生物上または免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用し、これら細胞の死滅の増大をもたらすことができるのが好ましい。もちろん、薬学的有効量の修飾結合性ポリペプチドを提供するために、本開示の医薬組成物を単一または複数の投与量で投与してもよい。
【０１６５】
本発明の範囲を維持する上で、本開示の結合性ポリペプチドを、前述の処置方法に従って、治療効果または予防効果をもたらすのに十分な量において、ヒトまたは他の動物に投与してもよい。本開示の結合性ポリペプチドを、本開示の抗体を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と、既知の技術に従って組み合わせることによって調製される従来の剤形において、このようなヒトまたは他の動物に投与することができる。当業者であれば、薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、組み合わせようとする有効成分の量、投与経路、および他のよく知られている変数によって決まることが認識されよう。当業者であれば、本開示に記載された結合性ポリペプチドの１つまたはそれ以上の種を含むカクテルが特に効果的であることが証明され得ることをさらに理解されよう。
【０１６６】
ＩＸ．結合性ポリペプチドの発現
一態様において、本発明は、本明細書で開示される結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドを発現することを含む結合性ポリペプチドを作製する方法も提供する。
【０１６７】
本明細書で開示される結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望する量の請求する抗体、またはそのフラグメントを生成するのに用いることができる宿主細胞中に導入するための発現ベクターに挿入されるのが典型的である。したがって、ある態様において、本発明は、本明細書で開示されるポリヌクレオチド、ならびにこれらのベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む発現ベクターを提供する。
【０１６８】
本明細書において、「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書および特許請求の範囲のために、細胞における所望の遺伝子中に導入し、発現させるためのビヒクルとして本発明に従って用いられるベクターを意味するものとして用いられる。当業者に知られている通り、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般的に、本発明で適用可能なベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを促進するのに好適な制限部位、真核細胞または原核細胞中に侵入し、かつ／または中で複製する能力を含む。
【０１６９】
多数の発現ベクター系を本発明の目的に用いることができる。例えば、１クラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他者は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニック系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡを自身の染色体に取り込む細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞を選択できるようにする１種またはそれ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性の宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質耐性）、または銅などの重金属に対する耐性を付与するものでもよい。選択マーカーの遺伝子は、発現させようとするＤＮＡ配列に直接連結させてもよいし、または同時形質転換によって同じ細胞中に導入してもよい。ｍＲＮＡの最適な合成には、さらなる要素も必要とされ得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含んでいてもよい。特に好ましい実施形態において、上記に論じた通り、クローニングした可変領域の遺伝子を合成的に重鎖および軽鎖の定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と一緒に発現ベクター中に挿入する。
【０１７０】
他の好ましい実施形態において、本発明の結合性ポリペプチドを、ポリシストロニック性の構築物を用いて発現させてもよい。このような発現系において、抗体の重鎖および軽鎖などの対象の複数の遺伝子産物を、単一のポリシストロニック性の構築物から生成してもよい。これらの系は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、宿主の真核細胞中で比較的高レベルの本発明のポリペプチドを提供するのに有利である。適用可能なＩＲＥＳ配列は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている。当業者であれば、このような発現系を用いて、本出願に開示するポリペプチドの全範囲を効果的に生成し得ることを理解されよう。
【０１７１】
より一般的には、抗体をコードするベクターもしくはＤＮＡ配列、またはそれらのフラグメントを調製した後は、発現ベクターを好適な宿主細胞中に導入してもよい。すなわち、宿主細胞を形質転換してもよい。プラスミドの宿主細胞中への導入は、当業者にはよく知られている多様な技術によって遂行することができる。このような技術としては、これらに限定されないが、トランスフェクション（電気泳動および電気穿孔を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈降、被覆されているＤＮＡでの細胞融合、マイクロインジェクション、ならびにインタクトなウイルスでの感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、２４章．２、４７０〜４７２頁、Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編集（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．、１９８８年）を参照されたい。電気穿孔により宿主中にプラスミドを導入することが最も好ましい。形質転換した細胞を、軽鎖および重鎖の生成に好適な条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成に対してアッセイする。例示的なアッセイ技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。
【０１７２】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、広義に用いられ、遺伝子型を変更して結果的にレシピエント細胞における変化をもたらす、レシピエント宿主細胞中へのＤＮＡ導入を意味する。
【０１７３】
それと同じ方針で、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された、少なくとも１つの異種性の遺伝子をコードするベクターで形質転換された細胞を意味する。組換え宿主からポリペプチドを単離するためのプロセスの記載において、「細胞」および「細胞培養物」という用語はそれぞれ同じ意味で用いられており、別段の明らかな特定がなければ、抗体の源を意味する。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全細胞を遠心沈殿したものからの回収、または培地および懸濁した細胞の両方を含む細胞培養物からの回収のいずれかを意味し得る。
【０１７４】
一実施形態において、抗体の発現に用いる宿主細胞系は哺乳動物起源であり、当業者であれば、その中で発現させようとする所望の遺伝子産物に最適な特定の宿主細胞系を決定することができる。例示的な宿主細胞系としては、これらに限定されないが、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌（ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ細胞）、２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。一実施形態において、細胞系は、そこから発現される抗体の、変更されたグリコシル化、例えば、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）をもたらす（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ）またはＦＵＴ８−ノックアウトＣＨＯ細胞系（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ．ＲＴＭ．細胞）（Ｂｉｏｗａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．））。一実施形態において、ＮＳ０細胞を用いることができる。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は、典型的には、商業的なサービス、アメリカ培養細胞系統保存機関、または出版されている文献から入手できる。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生成をスケールアップして、大量の所望のペプチドを得ることもできる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養するための技術は、当技術分野において知られており、エアリフトリアクター中、または連続撹拌リアクター中などの均一な懸濁培養物、または中空ファイバー中、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジ上などに固定化もしくは捕捉された細胞培養物を含む。必要であれば、かつ／または所望により、ポリペプチドの溶液を、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、および／または（免疫）アフィニティクロマトグラフィーなど慣例的なクロマトグラフィー法によって精製することができる。
【０１７６】
本発明の結合性ポリペプチドをコードする遺伝子は、細菌または酵母菌または植物細胞などの非哺乳動物細胞においても発現させることができる。この点では、細菌など、多様な単細胞の非哺乳動物の微生物、すなわち、培養物または発酵中で増殖させることができるものも形質転換することができることが理解されよう。細菌は形質転換を受けやすく、腸内細菌科の種類、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の系統、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の種類を含む。細菌中で発現させる場合は、ポリペプチドは封入体の一部となっている場合があることがさらに理解されよう。ポリペプチドを単離し、精製し、次いで機能的分子に組み立てなければならない。
【０１７７】
原核生物の他に、真核生物の微生物も用いることができる。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち一般的なパン酵母が、真核生物の微生物の中で最も一般的に用いられるが、数々の他の系統も一般に利用できる。出芽酵母における発現には、プラスミドＹＲｐ７、例えば（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻、３９頁（１９７９年）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７巻、１４１頁（１９７９年）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１０巻、１５７頁（１９８０年））が一般的に用いられる。このプラスミドはすでにＴＲＰ１遺伝子を含んでおり、ＴＲＰ１遺伝子はトリプトファン中で増殖する能力がない酵母菌の変異株に対する選択マーカー、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５巻、１２頁（１９７７年））を提供する。酵母菌宿主細胞のゲノムの特徴としてｔｒｐ１の破壊が存在することで、トリプトファンの非存在下の増殖による形質転換を検出するのに効果的な環境がもたらされる。
【実施例】
【０１７８】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、以下の実施例をさらなる限定と解釈してはならない。本出願を通して引用される配列リスト、図、ならびに全ての参考文献、特許、および公開されている特許出願の内容は、参照によって本明細書に特に組み入れられるものとする。
【実施例１】
【０１７９】
２Ｃ３抗ＣＤ−５２高グリコシル化抗体の変異体のデザイン、調製、および特徴付け
ＦｃγＲとの相互作用を変更することにより抗体のエフェクター機能を調節するために嵩高な基を相互作用界面（例えば、抗体の薬物動態を調節するためのＦｃＲｎ結合部位）に付加する目的で、またはエフェクター部分（これらに限定されないが、薬物、毒素、細胞毒性剤、および放射性核種を含む）のコンジュゲーションのための新規な架橋部位のサブシーケンスの化学修飾を導入するために、複数の高グリコシル化変異を、抗ＣＤ−５２抗体である２Ｃ３の重鎖にデザインした。高グリコシル化された２Ｃ３変異体を、表３に記載する。
【０１８０】
【表６】
0006588422.tif 000021
【０１８１】
１Ａ．２Ｃ３抗ＣＤ−５２抗体の高グリコシル化変異体の作製
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づいてデザインしたＡ１１４Ｎ変異を、変異原性ＰＣＲ（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲ）によって、２Ｃ３のＣＨ１ドメイン中に導入した。全長の抗体を作製するために、ＶＨドメインプラス変異させたＡ１１４Ｎ残基を、ライゲーション非依存的クローニング（ＬＩＣ）によって、抗体ＣＨドメイン１〜３をコードするｐＥＮＴＲ−ＬＩＣ−ＩｇＧ１ベクター中に挿入した。他の全ての変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）で部位特異的変異誘発によってｐＥＮＴＲ−ＬＩＣ−ＩｇＧ１上に導入した。ＷＴ２Ｃ３のＶＨを、変異させたベクター中にＬＩＣによってクローニングした。全長の変異体をｐＣＥＰ４（−Ｅ＋Ｉ）Ｄｅｓｔ発現ベクター中にＧａｔｅｗａｙクローニングによってクローニングした。Ｆｃの変異を、ＥＵナンバリングシステムに基づいてデザインした。ＤＮＡシーケンシングによって変異を確認した。ＷＴ２Ｃ３の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列、ならびに変異させた２Ｃ３重鎖のアミノ酸配列を表４に記載する。変異させたアミノ酸を灰色で強調し、変異によって作製したコンセンサスグリコシル化標的部位に下線を付す。
【０１８２】
【表７】
0006588422.tif 000022
【０１８３】
【表８】
0006588422.tif 000023
【０１８４】
変異体およびＷＴの対照を、６ウェルプレートのフォーマットでＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトした。図９に示す通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析したところ、発現レベルはおよそ０．１μｇ／ｍｌであることが見出された。さらに馴化培地中の変異体の発現もＢｉａｃｏｒｅ上でのプロテインＡの捕獲によって測定した。固定化したプロテインＡ中に注入して６分後の解離応答を用いて濃度を決定した。培地中９０μｇ／ｍＬから１．５ｎｇ／ｍＬまで段階希釈した、ＣＨＯが生成するＷＴ２Ｃ３を標準曲線として用いた。濃度を、４−パラメータの適合を用いて検量線によっておよそ０．２μｇ／ｍＬまで算出した。図９に示す通り、相対的な発現レベルは低く、ウエスタンブロットの結果と概ね一致した。
【０１８５】
１Ｂ．高グリコシル化の検証
さらなるグリコシル化部位が変異によって導入されたか否かを決定するために、２Ｃ３変異体および野生型のタンパク質を、普遍的な脱グリコシル化酵素であるＰＮＧａｓｅＦで処理し、タンパク質の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析した。図１０に示す通り、Ａ１１４Ｎ変異体だけに見かけの分子量の増大があり、さらなるＮ結合型炭水化物の存在が指摘された。
【０１８６】
小規模の抗体調製物を生成して、グリコシル化部位の導入をさらに検証するための２Ｃ３変異体を精製した。図１１に示す通り、Ａ１１４Ｎ変異体だけに、さらなるグリコシル化部位の導入があったことが確認された。
【０１８７】
１Ｃ．２Ｃ３抗ＣＤ−５２変異体の結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、精製したタンパク質の結合特性を比較した。マウス、およびＳＥＣにより精製したヒトＦｃＲｎ−ＨＰＣ４を、アミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化した。各抗体を２００、５０、および１０ｎＭに希釈し、固定化したＦｃ受容体上に注入した。Ｃａｍｐａｔｈ、ＣＨＯが生成したＷＴの２Ｃ３、およびＤＥＰＣ処理したＣａｍｐａｔｈを、陽性対照および陰性対照として含めた。図１３に示す通り、Ｙ４３６変異体は、ヒトＦｃＲｎに対する結合に約２倍の低減を示した。興味深いことに、この変異体の、マウスＦｃＲｎに対する結合は影響を受けなかった。他の２Ｃ３変異体はどれも、ヒトまたはマウスのＦｃＲｎ結合に対して際立った効果がまったくなかった。
【０１８８】
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、精製したタンパク質の抗原結合特性を、ＣＤ−５２ペプチドである７４１のＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイを用いて比較した。ＣＤ−５２ペプチドである７４１、および対象のペプチドである７７７をＣＭ５チップに固定化した。抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ中６０から０．２ｎＭまで２倍段階希釈し、３分間２回ずつ注入し、その後流速５０μＬ／分のバッファー中で５分解離させた。ＧＬＤ５２ロット１７２００−０８４を対照として含めた。表面を、４０ｍＭ  ＨＣｌの１パルスで再生した。１：１の結合モデルを用いて、７．５から０．２ｎＭの曲線に適合させた。図１６に示す通り、Ａ１１４Ｎ変異体のＣＤ−５２結合親和性はわずかに低く、ＮＧＴ変異体の親和性は、このアッセイにおける残りの変異体よりもわずかに高かった。ＣＤ−５２ペプチドである７４１のＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイを、より大スケールの調製物（ｐｒｅｐ）から精製したタンパク質で繰り返した。図１７に示す通り、Ａ１１４Ｎ変異体は、ＷＴの２Ｃ３に匹敵するＣＤ−５２ペプチド結合性を示した。
【０１８９】
１Ｄ．Ａ１１４Ｎ変異体の電荷の特徴付け
等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行って、２Ｃ３変異体の電荷を特徴付けた。精製したタンパク質を、固定化したｐＨ勾配（ｐＨ３〜１０）のアクリルアミド（ＩＰＧ）ゲル上を流した。図１８Ａに示す通り、Ａ１１４Ｎはより陰性の電荷を有することが見出され、シアル酸残基によるものと思われる。インタクトのＭＳデータにより、シアル酸がＡ１１４Ｎ変異体上にある複雑な構造が確認された。これとは対照的に、ＷＴの２Ｃ３は、優勢なグリコシル化種としてＧ０ＦおよびＧ１Ｆを有することが示された（それぞれ図１８Ｃおよび１８Ｄ）。
【実施例２】
【０１９０】
いくつかの抗体のバックボーンにおける高グリコシル化変異体の調製
２Ｃ３抗ＣＤ−５２抗体の他に、Ａ１１４Ｎ変異を他の抗体バックボーンのいくつかに施し、固有の高グリコシル化部位が非関連の重鎖可変ドメイン配列中に導入され得ることを確認した。高グリコシル化の抗−ＴＥＭ１、抗ＦＡＰ、および抗Ｈｅｒ２変異体を、表５に記載する。
【０１９１】
【表９】
0006588422.tif 000024
【０１９２】
２Ａ．抗ＴＥＭ１および抗ＦＡＰ抗体の高グリコシル化変異体の作製
Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに基づいて命名したＡ１１４Ｎ変異を、抗ＴＥＭ１および抗ＦＡＰのＣＨ１ドメイン中に変異原性ＰＣＲによって導入した。全長の抗体を作製するために、変異させたＶＨプラス残基１１４を、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）によって、抗体のＣＨドメイン１〜３をコードするｐＥＮＴＲ−ＬＩＣ−ＩｇＧ１ベクター中に挿入した。全長の変異体を、次いで、ｐＣＥＰ４（−Ｅ＋Ｉ）Ｄｅｓｔ発現ベクター中に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングによってクローニングした。ＤＮＡシーケンシングによって変異を確認した。抗ＴＥＭ１野生型のアミノ酸配列、ならびに変異させた重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を表６に記載する。変異させたアミノ酸を灰色で強調し、変異によって作製されたコンセンサスのグリコシル化標的部位に下線を付す。
【０１９３】
【表１０】
0006588422.tif 000025
【０１９４】
変異体および野生型の対照を、トリプルフラスコのフォーマットでＨＥＫ２９８−ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトし、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）上で精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計上Ａ２８０で分析したところ、抗ＦＡＰのＡ１１４Ｎおよび抗ＦＡＰのＡ１１４Ｃの発現は、それぞれ約３μｇ／ｍｌおよび約１μｇ／ｍｌであった。抗ＴＥＭ１のＡ１１４Ｎの発現は約０．０４μｇ／ｍｌであった。
【０１９５】
２Ｂ．高グリコシル化の検証
さらなるグリコシル化部位がＡ１１４Ｎ変異体に導入されたことを確認するために、Ａ１１４Ｎ変異体から精製したタンパク質を、野生型の対照のタンパク質と一緒に、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。さらなる１つのグリコシル化部位により、重鎖の分子量に２０００〜３０００ダルトンが加えられる。図２０に示す通り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、抗ＦＡＰ、および抗ＴＥＭ１のＡ１１４Ｎ変異体の重鎖のバンドの見かけの分子量が増大し、さらなるグリコシル化部位が両方の抗体に上首尾に導入されたことと一致したことが指摘される。
【０１９６】
２Ｃ．抗Ｈｅｒ２抗体の高グリコシル化変異体の作製
Ｈｅｒ−２のＡ１１４Ｎ、Ｈｅｒ−２のＡ１１４Ｎ／ＮＮＡＳ、およびＷＴのＨｅｒ−２抗体を、ライゲーション非依存的クローニングによって作製した。ハーセプチンのＶＨドメインを合成し、ＷＴの、またはＡ１１４Ｎ変異を有するいずれかの、２セットのＬＩＣ適合性のプライマーでＰＣＲ増幅した。全長の抗体を得るために、増幅したＶＨ挿入断片（ＷＴまたはＡ１１４Ｎ）を、ＣＨ１〜３ドメイン、ｐＥＮＴＲ−ＬＩＣ−ＩｇＧ１のＷＴ、およびｐＥＮＴＲ−ＬＩＣ−ＩｇＧ１のＮＮＡＳをコードする、２つのｐＥＮＴＲベクター中にクローニングし、ｐＥＮＴＲ上のエントリークローンとして、３つの全長の変異体（Ａ１１４Ｎ、ＮＮＡＳ、Ａ１１４Ｎ／ＮＮＡＳ）およびＷＴ対照がもたらされた。これらの変異体を、ｐＣＥＰ４（−Ｅ＋Ｉ）Ｄｅｓｔ発現ベクター中にＧａｔｅｗａｙクローニングによってクローニングした。ＤＮＡシーケンシングによって変異を確認した。抗Ｈｅｒ−２の野生型のアミノ酸配列、ならびに変異させた重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、表７に記載する。変異させたアミノ酸を灰色で強調し、変異によって作製したコンセンサスグリコシル化標的部位に下線を付す。
【０１９７】
【表１１】
0006588422.tif 000026
【０１９８】
【表１２】
0006588422.tif 000027
【０１９９】
２Ｄ．Ａ１１４Ｎの抗Ｈｅｒ２抗体の高グリコシル化変異体の発現
Ａ１１４Ｎの抗Ｈｅｒ２および野生型の構築物を、リポフェクタミン−２０００（試薬対ＤＮＡ比２．５：１）およびＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＨＰ（試薬対ＤＮＡ比３：１）で、１２個のトリプルフラスコ中のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトした。３日目の馴化培地（ＣＭ）からアリコートをＯｃｔｅｔで測定したところ、タンパク質の発現は、リポフェクタミン２０００およびＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＨＰの両方に対して６個のフラスコにわたり一定であることが示された。表８に示す通り、全体のトランスフェクト効率はＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＨＰで３０％高かった。３日目に回収した馴化培地を、両方のトランスフェクト条件ごとに一緒にプールし、プロテインＡカラムによって精製した。Ｏｃｔｅｔで測定することにより、血清含有疑似培地中の抗体は１．８μｇ／ｍｌであり、これに対して無血清疑似培地中では０μｇ／ｍｌであることが示された。
【０２００】
【表１３】
0006588422.tif 000028
【０２０１】
６日目からの馴化培地を回収し、トランスフェクト条件ごとに別々に精製した。両方の溶離液を別々にＰＢＳ、ｐＨ７．２にバッファー交換し、Ａｍｉｃｏｎ−４（カットオフ５０ｋＤ）カラムを用いておよそ１５倍濃縮した。６日目のＣＭは、３日目のＣＭに比べて高い発現レベルを示した。表８に示す通り、合計３ｍｇのハーセプチンＡ１１４Ｎ  １５．５９ｍｇ／ｍｌ（リポフェクタミントランスフェクションから）および６ｍｇのハーセプチンＡ１１４Ｎ  １６．８６ｍｇ／ｍｌ（ＸｔｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＨＰトランスフェクションから）を、抗体−薬物コンジュゲーションなど、さらなる下流の適用のために、６日目の馴化培地から生成した。
【０２０２】
２Ｅ．Ａ１１４Ｎ抗Ｈｅｒ２変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＩＣ分析
コンジュゲート前、精製したＡ１１４Ｎハーセプチンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって特徴付けた。図２１に示す通り、精製したＡ１１４Ｎハーセプチンの質は、さらに下流で適用するのに適すると決定された。
【０２０３】
２Ｆ．改変されたグリコシル化に対するコンジュゲーション
以下のことが実証された：ａ）グリコシル化部位が、抗ＴＥＭ１上のＫａｂａｔ１１４位の部位に導入された、ｂ）Ａ１１４Ｎ変異体は、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより重鎖上に高グリコシル化を有していた、ならびにｃ）Ａ１１４高グリコシル化変異体は、インタクトＬＣ／ＭＳにより、ＳＡＭおよびＧＡＭコンジュゲーションに理想的な末端のシアル酸およびガラクトースを含む複雑な炭水化物構造を有していた。改変されたグリコシル化部位がコンジュゲーションに適することを確認するために、抗ＴＥＭ１  Ａ１１４Ｎを、アミノオキシ化学反応によって５ｋＤａのＰＥＧとコンジュゲートさせた。図２２に示す通り、ＰＥＧを、アミノオキシ連結によって抗ＴＥＭ１  Ａ１１４Ｎに上首尾にコンジュゲートさせた。この変異体をまた、抗ＦＡＰおよび抗ＣＤ−５２の２Ｃ３バックボーン上で上首尾に調製した（示さず）。これらのデータは、Ｎ１１４のグリコシル化部位は、エフェクター部分のコンジュゲーションに有用であることを実証するものである。
【実施例３】
【０２０４】
Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００ＳのＦｃ変異体の産生
新たなグリコシル化部位を天然に存在するＡｓｎ２９７部位の隣であるＥＵのＳｅｒ２９８位に導入した、改変されたＦｃバリアントをデザインし、産生した。Ａｓｎ２９７のグリコシル化は、維持し、または変異によって除去するいずれかであった。変異および所望のグリコシル化の結果を、表９に記載する。
【０２０５】
【表１４】
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【０２０６】
３Ａ．Ｈ６６αβ−ＴＣＲ抗体の変更されたグリコシル化バリアントの作製
ｐＥＮＴＲ＿ＬＩＣ＿ＩｇＧ１テンプレートを用いてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅにより、αβＴ細胞受容体抗体クローン＃６６の重鎖上に変異を行った。ＨＥＢＥ１  Δａｂ  ＩｇＧ１  ＃６６のＶＨドメインをＬＩＣプライマーで増幅した後、変異型または野生型のｐＥＮＴＲ＿ＬＩＣ＿ＩｇＧ１中にＬＩＣによってクローニングして、全長の変異体または野生型の抗体を作製した。サブクローニングを、ＤｒａＩＩＩ／ＸｈｏＩ二重消化物で検証し、およそ１２５０ｂｐサイズのインサートを上首尾なクローンにおいて生成した。次いで、これらの全長の変異体を発現ベクターであるｐＣＥＰ４（−Ｅ＋Ｉ）Ｄｅｓｔ中に、Ｇａｔｅｗａｙクローニングによってクローニングした。ＤＮＡシーケンシングによって変異を確認した。ＷＴのＨ６６抗−αβＴＣＲ重鎖および軽鎖のアミノ酸配列、ならびに変異させたＨ６６の重鎖のアミノ酸配列を表１０に記載する。変異させたアミノ酸を灰色で強調し、変異によって作製したコンセンサスグリコシル化標的部位に下線を付す。
【０２０７】
【表１５】
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【０２０８】
【表１６】
0006588422.tif 000031
【０２０９】
変異体、野生型、ならびに非グリコシル化対照２種（ＨＥＢＥ１  Ａｇｌｙ  ＩｇＧ４およびｐＣＥＰ４中ＨＥＢＥ１  Δａｂ  ＩｇＧ１）の構築物を、発現用にトリプルフラスコ中、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトした。タンパク質を、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（ＧＥ）１ｍｌで、馴化培地（ＣＭ）１６０ｍｌから、マルチチャンネル蠕動ポンプを用いて精製した。得られた各上清の５マイクログラムを４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ還元性および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した（図２を参照されたい）。非グリコシル化変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｔ２９９Ａ、およびＡｇｌｙ対照）の重鎖はより遠くに遊走し（矢印）、これらの抗体におけるグリカンの喪失と一致する。しかし、改変されたグリコシル化抗体（ＮＳＹ、ＳＴＹ、ＳＹ、Δａｂ、およびｗｔ対照、矢印）の重鎖は、野生型対照に同様に遊走した。この結果は、ＥＵ２９８位の改変されたグリコシル化部位の存在に一致した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により、全ての変異体が単量体として発現されることが指摘された。
【０２１０】
３Ｂ．ＬＣ−ＭＳによるグリコシル化分析
改変されたＨ６６  ＩｇＧ１のＦｃバリアントを、３７℃で３０分間、２０ｍＭＤＴＴで部分的に還元した。次いで、試料を、ＱＳＴＡＲｑｑ  ＴＯＦハイブリッドシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とカップリングさせたＡｇｉｌｅｎｔ１１００キャピラリーＨＰＬＣシステム上、キャピラリーＬＣ／ＭＳによって分析した。ベースライン補正をしたベイズ理論によるタンパク質の再構成、およびＡｎａｌｙｓｔ  ＱＳ１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｓｏｙｓｔｅｍ）におけるコンピュータモデリングをデータ解析に用いた。Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００ＳのＨ６６抗体変異体では、１個のグリコシル化部位がアミノ酸２９８に観察され、二分岐および三分岐の複合型グリカンが、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、およびＧ２Ｆに並ぶ主な種として検出された（図３４を参照されたい）。この変更されたグリコシル化のプロファイルは、野生型のＮ２９７のグリコシル化部位の代わりに、移行したＮ２９８のグリコシル化と一致する。
【０２１１】
３Ｃ．Ｂｉａｃｏｒｅを用いたヒトＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩに対するαβＴＣＲ抗体変異体の結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ１５８およびＦ１５８）ならびにＦｃγＲＩに対する結合を評価した。ＣＭ５チップの４つのフローセル全てを、Ｂｉａｃｏｒｅによって提供される標準的なアミンカップリング手順によって、抗ＨＰＣ４抗体で固定化した。抗ＨＰＣ４抗体を、カップリング反応用に１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０中５０μｇ／ｍＬに希釈し、５μＬ／分で２５分間注入した。抗体およそ１２０００ＲＵをチップ表面に固定化した。組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８およびＦｃγＲＩＩＩａ−Ｆ１５８を、結合バッファー（１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＨＢＳ−Ｐ）中０．６μｇ／ｍＬに希釈し、それぞれフローセル２および４に５μＬ／分で３分間注入して、抗ＨＰＣ４チップ上３００〜４００ＲＵ受容体を捕獲した。低バインダー間を区別するために、このアッセイで通常用いるより３倍多いｒｈＦｃγＲＩＩＩａを抗ＨＰＣ４表面上に捕獲した。フローセル１および３を基準対照として用いた。各抗体を結合バッファー中２００ｎＭに希釈し、４つのフローセル全ての上に４分間注入し、引き続きバッファー中５分間解離させた。表面を、ＨＢＳ−ＥＰバッファー中１０ｍＭ  ＥＤＴＡで、２０μＬ／分で３分間再生した。これらの実験の結果を図３に示す。
【０２１２】
Ｂｉａｃｏｒｅをここでも用いて、ＦｃγＲＩ結合を比較した。抗テトラＨｉｓ抗体を、Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムを用いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０にバッファー交換し、アミノカップリング用に酢酸バッファー中２５μｇ／ｍＬに希釈した。ＣＭ５チップのフローセル２個を、５μＬ／分で２０分間注入した後、およそ９０００ＲＵの抗テトラＨｉｓ抗体で固定化した。試料を弱い結合と比べるために、先の実験における通り、１０倍多いＦｃγＲＩを抗テトラＨｉｓ表面に捕獲した。組換えヒトＦｃγＲＩを、ＨＢＳ−ＥＰ結合バッファー中１０μｇ／ｍＬ希釈し、フローセル２に５μＬ／分で１分間注入して、抗テトラＨｉｓチップにおよそ１０００ＲＵの受容体を捕獲した。１００ｎＭの単一濃度の抗体を、捕獲した受容体および対照の表面上に、３０μＬ／分で３分間注入した。引き続き、解離を３分間モニタリングした。次いで、１０ｍＭグリシンｐＨ２．５を２０μＬ／分で３０秒間２回注入して表面を再生した。これらの実験の結果を図４に示す。
【０２１３】
これらの結果は、糖が改変された変異体のＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩに対する結合における著しい低減を実証するものである。特にＨ６６のＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓの、両受容体に対する結合は、ほとんど完全に破壊されていた。さらに詳しく分析するために、この変異体を選択した。
【０２１４】
３Ｄ．円偏光二色性を用いた安定性の特徴付け
Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ抗体の変異体の安定性を、２１６ｎｍおよび２２２ｎｍのＣＤシグナルを、抗体のアンフォールディング（変性）をもたらす温度の上昇としてモニタリングする、遠ＵＶのＣＤ熱融解実験によってモニタリングした。
【０２１５】
温度を、熱電性のペルティエ（ＪａｓｃｏモデルＡＷＣ１００）によって制御し、２５〜８９℃から１℃／分の速度で上昇させた。光路長が１０ｍｍである石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ，Ｉｎｃ）におけるＰＢＳバッファー中およそ０．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、ＣＤスペクトルをＪａｓｃｏ８１５分光光度計上で収集した。スキャン速度は５０ｎｍ／分であり、データのピッチ（ｐｉｔｃｈ）は０．５ｎｍであった。感度設定を中程度にし、バンド幅２．５ｎｍを用いた。データ間隔０．５ｎｍ、温度間隔１℃でＣＤシグナルおよびＨＴ電位を２１０〜２６０ｎｍから回収し、各試料に対して４回の重複するスキャンを行った。結果は、デルタＡＢのＨ６６およびＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００ＳのＨ６６変異体の両方とも類似の熱挙動を示し、分解に対しておよそ同じ開始温度（６３℃周辺）を有することを実証するものであり（図３５）、これらは匹敵する安定性を有することがさらに示唆される。
【実施例４】
【０２１６】
Ｆｃ改変変異体の機能分析
Ｆｃ改変された変異体を、ＰＢＭＣ増殖アッセイおよびサイトカイン放出アッセイによって評価した。ＰＢＭＣ増殖アッセイでは、ヒトＰＢＭＣを増大濃度の治療用抗体と７２時間培養し、３Ｈ−チミジンを加え、１８時間後に細胞を収集した。Ｔ細胞枯渇／サイトカイン放出アッセイでは、ヒトＰＢＭＣを増大濃度の治療用抗体と培養し、細胞数および生存性について７日目まで毎日分析した（Ｖｉ−Ｃｅｌｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。細胞上清も回収し、−２０℃で貯蔵し、８個の構成成分を持つ（８区画の）サイトカインパネル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分析した。
【０２１７】
正常ドナーのＰＢＭＣを解凍し、以下の条件下で処理した（全て補体を含む培地中）：未処理；ＢＭＡ０３１、ｍｏＩｇＧ２ｂ  １０μｇ／ｍｌ；ＯＫＴ３、ｍｏＩｇＧ２ａ  １０μｇ／ｍｌ；Ｈ６６、ｈｕＩｇＧ１デルタＡＢ  １０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および０．１μｇ／ｍｌ；Ｈ６６、ｈｕＩｇＧ１  Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ  １０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および０．１μｇ／ｍｌ。
【０２１８】
サイトカインを２日目（Ｄ２）および４日目（Ｄ４）にＢｉｏＰｌｅｘ分析用に収集した（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ）。Ｄ４に、細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびａｂＴＣＲ発現用に染色した。
【０２１９】
図５〜８に示す結果は、Ｈ６６のＳ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓは、行った細胞ベースのアッセイ全てにおいてＨ６６のデルタＡＢと同様の挙動をし、ＣＤ２５発現によるＴ細胞の最小の活性化、ａｂＴＣＲに対する結合（デルタＡＢにわずかに異なる動力学で）、ならびにＤ２およびＤ４両方の時間点でのサイトカインの最小の放出を示すことを実証するものである。Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ変異体は、このように、デルタＡＢ変異と同じくらい効果的にエフェクター機能を排除した。
【実施例５】
【０２２０】
改変Ｆｃバリアントの抗ＣＤ５２抗体のバックボーンにおける調製および特徴付け
Ｈ６６抗αβＴＣＲ抗体の他に、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異も、抗ＣＤ５２抗体のバックボーン（クローン２Ｃ３）において改変した。次いで、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００ＳのＨ６６抗αＴＣＲ抗体に見られる、観察されたエフェクター機能の調節は別の抗体のバックボーンと一致するか否かを決定するために、この変異体を試験した。
【０２２１】
５Ａ．２Ｃ３抗ＣＤ５２抗体が変更するグリコシル化バリアントの作製
最初に、ｐＥＮＴＲ＿ＬＩＣ＿ＩｇＧ１を用いたクイックチェンジ変異誘発によってＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓの２Ｃ３バリアントＤＮＡを調製し、ＷＴの２Ｃ３  ＶＨを、変異したベクター中にＬＩＣによってクローニングした。全長の変異体を、ｐＣＥＰ４（−Ｅ＋Ｉ）Ｄｅｓｔ発現ベクター中に、Ｇａｔｅｗａｙ技術を用いてクローニングした。引き続き、ＤＮＡシーケンシングによって変異を確認し、配列は表１１に記載するものであった。次いで、変異体を、６ウェルプレートのフォーマットでＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中にトランスフェクトし、タンパク質を馴化培地から精製した。抗−ＣＤ５２の２Ｃ３野生型抗体を、対照として並行して生成した。発現レベルは、ＳＤ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を用いて０．１μｇ／ｍＬであることが見出された（図９Ａ）。ニートの馴化培地中の変異体の発現も、Ｂｉａｃｏｒｅ上プロテインＡの捕獲によって測定した。濃度を、固定化したプロテインＡを６分間注入した後の解離応答を用いて決定した。ＣＨＯが生成したＷＴ２Ｃ３を、培地中９０μｇ／ｍＬから１．５ｎｇ／ｍＬに段階希釈し、標準曲線として用いた。４パラメータの適合を用いた検量線により、濃度はおよそ０．２μｇ／ｍＬ以内と算出された。相対的な発現レベルは低く、ウエスタンブロットデータと概ね一致する（図９Ｂ）。
【０２２２】
【表１７】
0006588422.tif 000032
【０２２３】
５Ｂ．ＰＮＧａｓｅＦを用いたグリコシル化分析
変異によって導入されるさらなるグリコシル化部位を評価するために、濃縮したＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体をＰＮＧａｓｅＦで脱グリコシル化した。それによれば、分子量の見かけの変化がまったく実証されなかったことから、さらなる炭水化物が存在しなかったことが指摘された（図１０）。さらなる特徴付け用にこれらの変異体を精製するために、小規模の調製を行い、結果によりＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体上にさらなる炭水化物が存在しなかったことが再確認された（図１１）。
【０２２４】
５Ｃ．Ｂｉａｃｏｒｅを用いた２Ｃ３抗ＣＤ−５２抗体変異体のヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する結合特性
Ｂｉａｃｏｒｅをやはり用いて、抗原結合性、ＦｃγＲＩＩＩ、および精製した抗体の結合特性を特徴付けた（図１２、１３、および１４を参照されたい）。Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓの２Ｃ３バリアントはＣＤ５２ペプチドに強固に結合し、結合性のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は野生型対照と識別できず、この変異は抗原結合性に影響を及ぼさないことが実証された（図１２Ａ）。
【０２２５】
Ｆｃのエフェクター機能に対してアッセイするために、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（Ｖａｌ１５８）を結合試験で用いた。変異体および野生型の対照の抗体を２００ｎＭに希釈し、ＨＰＣ４−タグが捕獲したＦｃγＲＩＩＩａに注入した。ＦｃγＲＩＩＩ結合はＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体に対してほとんど検出不可能であり、これによりこのバリアントによるエフェクター機能の喪失が指摘された（図１２Ｂおよび図１４Ａ）。Ｆｃのエフェクター機能に対してさらにアッセイするために、ＦｃγＲＩＩＩ受容体（Ｐｈｅ１５８）を結合試験においてやはり用いた。変異体および野生型の対照の抗体を２００ｎＭに希釈し、ＨＰＣ４−タグが捕獲したＦｃγＲＩＩＩａに注入した。ＦｃγＲＩＩＩの結合は、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体に対してほとんど検出不可能であり、これによりＰｈｅ１５８バリアントでのエフェクター機能の喪失が指摘された（図１４Ｂ）。最後に、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、精製したタンパク質のＦｃＲｎ結合特性を比較した。マウス、およびＳＥＣ精製したヒトＦｃＲｎ−ＨＰＣ４をＣＭ５チップに、アミンカップリングによって固定化した。各抗体を２００、５０、および１０ｎＭに希釈し、受容体上に注入した。Ｃａｍｐａｔｈ、ＣＨＯが生成するＷＴ２Ｃ３、およびＤＥＰＣ処理したＣａｍｐａｔｈが、陽性対照および陰性対照として含まれた。これらのデータは、変異体は、ヒトおよびマウス両方のＦｃＲｎ受容体に、野生型抗体の対照と同じ親和性で結合し、循環半減期または他の薬物動態学的特性に変更のある可能性がないことを示すものである（図１２Ｃ、図１３Ａ、およびＢを参照されたい）。したがって、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異は、ヒトＦｃγ受容体の関与などによって、望ましくないＦｃエフェクター機能を低減または排除するために、一般的に抗体に適用できる。
【実施例６】
【０２２６】
Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体における循環性免疫複合体の検出
循環性免疫複合体の検出をまた、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体およびＷＴの対照に対してＣ１ｑ結合アッセイを用いて調査した。高結合性のＣｏｓｔａｒ９６ウェルプレートを、コーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＣＨＯ３、ｐＨ９．２）中１０〜０．００１μｇ／ｍｌの範囲の濃度の２倍段階希釈した２Ｃ３Ａｂ１００μｌと、４℃で一夜コーティングした。ＥＬＩＳＡ分析により、Ｃ１ｑの結合は、ＷＴに比べてＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体では低減したことが示された（図１５Ａ）。抗ＦａｂＡｂのコーティングした２Ｃ３Ａｂに対する結合により、ウェルの等しいコーティングが確認された（図１５Ｂ）。
【実施例７】
【０２２７】
等電点電気泳動を用いたＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体の分離および分析
ｐＨ３〜１０の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを流して、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体を特徴付けた。Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓはより陰性の電荷を有することが見出され、したがって、シアル酸分子である可能性が高い（図１８Ａ）。Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体およびＷＴの２Ｃ３の両方とも、インタクトＭＳによって、優勢なグリコシル化種としてＧ０ＦおよびＧ１Ｆを有することが示された（それぞれ図１８ＢおよびＤ）。
【実施例８】
【０２２８】
Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓの抗原結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、小スケール（図１６）および大スケール（図１７）の発現の両方から調製および精製した、ＷＴ抗ＣＤ−５２の２Ｃ３ＡｂおよびＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体の抗原結合親和性を比較した。ＣＤ５２ペプチドである７４１および対照のペプチドである７７７で固定化したＣＭ５チップを入手した。抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ中６０から０．２ｎＭに２倍段階希釈し、次いで、チップ表面にわたって３分間注入し、引き続き流速５０μｌ／分のバッファー中で５分間解離させた。次いで、表面を４０ｍＭ  ＨＣｌのパルスで再生した。これらの分析を２回ずつ行い、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体およびＷＴの２Ｃ３抗体は匹敵するＣＤ５２ペプチド結合性を示すことが実証された。
【０２２９】
小規模のトランスフェクションの間に作製された抗体をスクリーニングするために、培地のスクリーニングプラットホームをデザインして、精製前の機能的結合特性を試験した。これらの試験を、Ｏｃｔｅｔ（図１９Ａ）を用いて行って濃度を決定し、プロテインＡバイオセンサーおよびＧＬＤ５２標準曲線を用いた。試料を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いたＣＤ５２結合の比較用にＨＢＳ−Ｅｐ中７．５および２ｎＭに希釈した（図１９Ｂ）。ペプチド結合アッセイの結果により、Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異体およびＷＴ２Ｃ３抗体の両方とも匹敵するＣＤ５２ペプチド結合性を有することが示された。さらに、これらの分析により、ＯｃｔｅｔおよびＢｉａｃｏｒｅは、小規模のトランスフェクションから抗体による抗原結合性を予測するのに十分に働くことが実証された。
【実施例９】
【０２３０】
さらなる抗体のバックボーンにおけるＳ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ、Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ、およびＳ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓが変更するグリコシル化変異体の調製
抗αβ−ＴＣＲ抗体および２Ｃ３抗Ｃｄ−５２抗体の他に、Ｓ２９８／Ｙ３００Ｓ、Ｓ２９８Ｎ／Ｔ２９９Ａ／Ｙ３００Ｓ、およびＮ２９７Ｑ／Ｓ２９８Ｎ／Ｙ３００Ｓ変異を他の抗体のバックボーンで改変して、さらなるタンデム型のグリコシル化部位が非関連の重鎖可変ドメイン配列中に導入され得ることを確認した。交互にグリコシル化されている抗ＣＤ−５２の１２Ｇ６および抗Ｈｅｒ２変異体を、表１２および１３に記載する。
【０２３１】
【表１８】
0006588422.tif 000033
【０２３２】
【表１９】
0006588422.tif 000034
【０２３３】
【表２０】
0006588422.tif 000035
【実施例１０】
【０２３４】
反応性グリカン部分を含む変更された抗体の産生
誘導体化したエフェクター部分と反応することができるグリカン部分を含む抗体を産生するために、抗ＨＥＲ抗体を最初に、グリコシルトランスフェラーゼおよび関連の糖ヌクレオチドドナーを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでグリコシル化した。例えば、シアル酸残基を導入するために、Ｋａｎｅｋｏらの方法に従って、ドナー抗体を最初にβ−ガラクトシルトランスフェラーゼでガラクトシル化し、引き続きα２，６−シアリルトランスフェラーゼでシアリル化した（Ｋａｎｅｋｏ，Ｙ．、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．、およびＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２００６年）、Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  Ｆｃ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１３巻、６７０〜３頁）。反応は、β−ガラクトシルトランスフェラーゼ（５０ｍＵ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）およびα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（５μｇ／ｍｇ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）を、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含む５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）中ドナーの糖ヌクレオチド基質であるＵＤＰ−ガラクトース（１０ｍＭ）およびＣＭＰ−シアル酸と用いてワンポットの合成工程において行った。５ｍｇ／ｍｌ抗ＨＥＲ２抗体を含む反応混合物を、３７℃で４８時間インキュベートした。シアリル化を、ＰＮＧａｓｅＦで抗体から放出された過剰メチル化されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析、ＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣを用いたシアル酸含量分析、およびα２，６−シアル酸に特異的なレクチンであるＳＮＡでのレクチンブロッティングを用いて検証した。
【０２３５】
シアリル化した抗ＨＥＲ２抗体のＰＮＧａｓｅＦ処理により放出されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、天然のグリカンは、少量のジシアリル化種と共に、主にモノシアリル化された二分岐構造であるＡ１Ｆ（図２７Ａ）で完全に再建されたことが指摘された。抗体を大量のα２，６−シアリルトランスフェラーゼで処理すると、Ａ１Ｆの糖型のより均一な集団が生成され、酵素活性またはグリカン局在化のいずれかにより完全なシアリル化が妨げられ得ることが示唆された。シアル酸含量は抗体１モルあたりおよそ２ｍｏｌであると決定され、これは主な糖型種としてのＡ１Ｆグリカンと一致する（図２７Ｂ）。α２，６連結したシアル酸に特異的なセイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）のアグルチニンであるＳＡＮレクチンでのレクチンブロッティングにより、シアル酸がα２，６結合の立体配置で存在することが確認された（図２７Ｃ）。
【０２３６】
結論として、天然のタンパク質であるグリカンはある程度不均質であるが、ガラクトシルおよびシアリルトランスフェラーゼによる再建により、モノシアリル化されているが完全にガラクトシル化されている二分岐グリカンを有するほぼ均一な抗体が得られる（Ａ１Ｆ）。分岐した各グリカン上の２つのガラクトースアクセプターに導入されたシアル酸がほぼ１つだけであったことは、グリカンは抗体中に埋まっていることが多いために１つのガラクトースにしか接近できないことが原因か、またはグリカンのタンパク質表面との非共有結合での相互作用が原因である可能性がある。
【実施例１１】
【０２３７】
反応性グリカン部分を含む変更された抗体の酸化
シアリル化を検証した後、シアリル化された抗ＨＥＲ２抗体の、多様な濃度の過ヨウ素酸（０．２５から２ｍＭ）での製造工程中の酸化を調査した。シアリル化した抗体を最初に、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）にバッファー交換し、引き続きＰＢＳバッファーとバッファー交換した。次いで、緩衝化した抗体混合物を、ＰＢＳバッファーで予め平衡にしたプロテインＡセファロースカラムに適用した。カラムを、１５カラム容積のＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１５カラム容積のＰＢＳ、および３０カラム容積のＰＢＳで洗浄した後、次いでこれを２５ｍＭクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ２．９）で溶出した。溶出液を、二塩基性リン酸バッファーで直ちに中和し、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａを用いて抗体を濃縮した。精製後、シアリル化した抗ＨＥＲ２抗体を、次いで、氷上の暗所で３０分間、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）中の過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で酸化し、氷上の３％グリセリンで１５分間、反応をクエンチした。生成物を脱塩し、５０ｋＤａのＡｍｉｃｏｎ上５ラウンドの限外濾過によって１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）に交換した。図２８Ａは、多様な量の過ヨウ素酸塩で決定した、シアリル化した抗体のシアル酸含量の分析を示す。シアル酸残基の完全な酸化が、０．５ｍＭより高い過ヨウ素酸塩濃度で達成された。実際、導入されたシアル酸を完全に酸化するには、０．５ｍＭ程に低い過ヨウ素酸塩濃度で十分である。したがって、濃度１ｍＭの過ヨウ素酸塩が、薬物コンジュゲート用のシアリル化された抗体の酸化用に選ばれた。
【０２３８】
酸化は抗体の完全性に対して有害作用があり得る。例えば、ＦｃＲｎ結合部位近くのＦｃのＣＨ３領域に位置するＭｅｔ−２５２およびＭｅｔ−４２８を含むメチオニン残基の酸化は、抗体の血清半減期の延長に決定的であるＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすことが知られている（Ｗａｎｇ，Ｗ．ら（２０１１年）Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、４８巻、８６０〜６頁）。したがって、ＦｃＲｎの相互作用に決定的であるメチオニン残基（例えば、Ｍｅｔ−２５２）に対する過ヨウ素酸塩酸化の潜在的な副作用を調べるために、シアリル化した抗体の酸化状態を、トリプシンペプチド消化のＬＣ／ＭＳ分析によって決定した。分析により、Ｍｅｔ−２５２のおよそ３０％の酸化、および１ｍＭ過ヨウ素酸塩でシアリル化したトラスツマブを処理した後のＭｅｔ−４２８の＜１０％の酸化が明らかになった。この程度のメチオニン酸化のＦｃＲｎ結合に対する影響を決定するために、各抗体に対するＦｃＲｎ結合の動力学を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いて評価した。この分析により、酸化の状態はＦｃＲｎ結合の少量の喪失に相関することが明らかになった（マウスおよびヒトＦｃＲｎに対して１２％および２６％の減少、それぞれ図２８Ｂおよび２８Ｃを参照されたい）。とりわけ、各抗体上に単一のインタクトなＦｃＲｎ部位があれば機能性およびＰＫの利点をもたらすのに十分であるため、ヒトＦｃＲｎに対するＫａにおけるおよそ２５％の減少は、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける血漿半減期に対して効果がないことが報告されている（Ｗａｎｇら、同上）。
【０２３９】
要約すると、これらのデータは、過ヨウ素酸塩に感受性であるシアル酸残基をシアリルトランスフェラーゼ処理によって導入すると、非常に低濃度の過ヨウ素酸塩が使用できるようになり、抗体−ＦｃＲｎ相互作用に対して最小の副作用、および凝集によって評価される抗体の統一性（≦１％）がもたらされることを指摘するものである。このように、本発明の方法によるシアリル化した抗体を用いることで、用いようとする酸化条件のより広いウインドウがもたらされ、血清半減期に対する効果なしに活性な複合糖質を再現可能に産生できるようになる。
【０２４０】
高グリコシル化抗体変異体におけるガラクトースも、ガラクトースオキシダーゼを用いて特異的に酸化して、コンジュゲーションのためのアルデヒド基を産生することができる。このアプローチを確認するために、Ａ１１４Ｎ抗ＴＥＭ１抗体を１３〜２０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで、ＰＢＳ中２０ｍＵ／ｍｇシアリダーゼで３７℃で６時間処理した。脱シアリル化した生成物を、次いで、ガラクトースオキシダーゼ（「ＧＡＯ」）で酸化し、最初にタンパク質１ｍｇあたり５μｇのＧＡＯを３７℃で一夜、引き続きタンパク質１ｍｇあたり２μｇのＧＡＯを加え、さらなる５時間インキュベートした。酢酸ナトリウムを加えてｐＨを５．６に調節し（０．１ｖ／ｖ、ｐＨ５．６）、ＤＭＳＯを加えて最終反応濃度１６％を達成し、コンジュゲーションの前に加えた。高グリコシル化変異体であるＡ１１４Ｎ抗ＨＥＲ抗体（１５ｍｇ／ｍｌ）をシアリダーゼ（２０ｍＵ／ｍｇ）で同様に脱シアリル化し、３７℃で一夜、単一の反応において、タンパク質１ｍｇあたり５μｇのＧＡＯで酸化した。
【実施例１２】
【０２４１】
反応性エフェクター部分の合成
本発明のアルデヒドで誘導体化した抗体の糖型とのコンジュゲーションを促進するために、候補の薬物エフェクター部分（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびドラスタチン１０（Ｄｏｌ１０））を、アルデヒドと特異的に反応性である官能基（例えば、アミノオキシ−ｃｙｓ）を含むように、アミノオキシシスタミド（ａｍｉｎｏｏｘｙ−ｃｙｓｔａｍｉｄｅ）で誘導体化した。
【０２４２】
簡潔に述べると、出発材料としてアミノオキシ−シスタミドを産生するために、Ｓ−トリチル−Ｌ−システインアミド（３６２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、ｔ−ＢＯＣ−アミノオキシ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（２８９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液３ｍＬに加えた。反応は、ＨＰＬＣ分析から明らかである通り、３時間後に完了した。引き続き、反応混合物をジクロロメタン３０ｍｌで希釈し、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（２×２０ｍＬ）、水（２×２０ｍＬ）、およびブライン（２×２０ｍＬ）で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して乾燥させた。この乾燥した残渣にＴＦＡ３ｍＬを加え、引き続きトリエチルシラン１５０μＬを加えた。得られた溶液を、ｔ−ブチルメチルエーテルから沈殿させ、このプロセスを３回繰り返した。濾過後、残渣を減圧下で乾燥させてオフホワイト色の固体２０５ｍｇを得た（収率６７％）。化合物をさらに精製せずに次の工程に用いた。
【０２４３】
アミノオキシ誘導体化したＭＭＡＥ（アミノオキシ−Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）を産生するために、ＤＭＦ３ｍＬ中アミノオキシシスタミド３０．１ｍｇ（０．０９８ｍｍｏｌ、２当量）を、ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（０．０４９ｍｍｏｌ）６４．６ｍｇ、およびトリエチルアミン１００μＬと合わせた。得られた反応混合物を室温で１５分間撹拌したが、ＨＰＬＣ分析によるとその時間までに反応は完了する。化合物を分取ＨＰＬＣによって精製し、オフホワイト色の固体の所望の生成物４５ｍｇ（６２％）を得た。逆相ＨＰＬＣ分析により、化合物の純度は＞９６％であることが示唆された。ＥＳＩ:Ｃ７３Ｈ１１６Ｎ１４Ｏ１８Ｓ（ＭＨ）＋の計算値１５０９．８５０１；実測値、ｍ／ｚ  １５０９．８４６９。
【０２４４】
アミノオキシ誘導体化したＤｏｌ１０（アミノオキシ−Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０）を産生するために、アミノオキシシスタミド７．４ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ、３当量）、ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０  １２ｍｇ（０．００８ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン３０μＬを、ＤＭＦ  ３ｍＬ中で合わせた。反応は、ＨＰＬＣ分析によると１５分以内に完了した。分取ＨＰＬＣの精製により、オフホワイト色の固体の所望の生成物６．２ｍｇ（４６％）がもたらされた。逆相ＨＰＬＣ分析により、化合物の純度は＞９６％であることが示唆された。ＥＳＩ:Ｃ８０Ｈ１２４Ｎ１６Ｏ１９Ｓ２（ＭＨ）＋の計算値１６７８．０６６４；実測値、ｍ／ｚ  １６７８．０６１３。
【実施例１３】
【０２４５】
反応性エフェクター部分のシアル酸媒介性（ＳＡＭ）コンジュゲーション
脱塩後、実施例１１の薬物−リンカーを、７５％ＤＭＳＯ（０．１６７ｖ／ｖ）中濃度２５ｍＭの実施例１０の、酸化し、シアリル化した抗体と合わせて、薬物−リンカー対抗体のモル比２４：１、最終抗体濃度５ｍｇ／ｍｌを達成した。混合物を室温で一夜インキュベートした。非組み入れの薬物−リンカーおよびあらゆる遊離の薬物を、ＢｉｏＢｅａｄｓを用いて捕集した。生成物を、ＰＤ−１０カラムを用いてヒスチジン−Ｔｗｅｅｎバッファーにバッファー交換し、滅菌濾過した。内毒素のレベルを決定し、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に０．１ＥＵ／ｍｇ未満のＡＤＣを達成した。
【０２４６】
図２９Ａ〜Ｃは、ＡＯ−ＭＭＡＥにグリココンジュゲートした、様々にシアリル化した抗体（実施例１１の抗ＦＡＰのＢ１１およびＧ１１、ならびに抗ＨＥＲ２抗体）の疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）を示す。シアリル化したＨＥＲ２抗体も、薬物−リンカーであるＡＯ−Ｃｙｓ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０とコンジュゲートさせた（図２９Ｄ）。この分析により、抗体１個あたり主に１個から２個の薬物コンジュゲートが存在し、薬物対抗体比（ＤＡＲ）は１．３〜１．９の範囲であることが明らかになった。Ｄｏ１１０複合糖質（図２９Ｄ）の、ＭＭＡＥ複合糖質（図２９Ｃ）と比べた保持時間の延長は、Ｄｏ１１０の疎水性が大きいことによるものと思われる。
【０２４７】
３０ｍｇのスケールで２つの異なる薬物−リンカー（ＡＯ−ＭＭＡＥまたはＡＯ−ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０）とコンジュゲートした抗ＨＥＲ抗体で、ＬＣ−ＭＳ分析も行った。この分析により、コンジュゲート後のＤＡＲ値は１．７および１．５で似通っていることが示され、これはＨＩＣ分析に匹敵する。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、これらのコンジュゲート中、非常に低レベルの（１％）凝集物が示された。
【実施例１４】
【０２４８】
反応性エフェクター部分のガラクトース媒介性（ＧＡＭ）コンジュゲート
実施例１１に記載した、Ａ１１４Ｎ抗ＴＥＭ１高グリコシル化変異抗体上、ガラクトースオキシダーゼで産生されたガラクトースアルデヒドを、２５℃で一夜インキュベートすることによって抗体を上回って２４モル過剰のアミノオキシ−ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ薬物−リンカーとコンジュゲートさせ、ＤＡＲ１．７２のＡＤＣコンジュゲートを得た。実施例１１に記載した通りに調製したガラクトースオキシダーゼ処理した抗ＨＥＲ抗体に対して、１０分の１の反応容積の１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６を加えてｐＨを５．６に調節し、ＤＭＳＯを加えて最終濃度を１４％とした後、アミノオキシＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ薬物リンカー２４当量を加えた。反応を室温で一夜インキュベートした。遊離の薬物および薬物−リンカーをＢｉｏｂｅａｄｓで捕集し、生成物バッファーをＳＥＣにより交換した（収率６５％）。生成物コンジュゲートをＨＩＣにより分析した。図３０に示す通り、ＡＯ−ＭＭＡＥは分子のおよそ６０％とコンジュゲートしていた。
【実施例１５】
【０２４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＤＣ細胞増殖アッセイ
本発明の抗ＨＥＲおよび抗ＦＡＰの複合糖質分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性をまた、チオール連結によって同じドナー抗体のヒンジ領域システインに連結している同じ薬物部分を含む対応するチオールコンジュゲートと比べた。チオールコンジュゲートは、複合糖質よりおよそ２倍数の、抗体１個あたりの薬物（ＤＡＲ）を含んでいた。チオールベースのコンジュゲーションを、Ｓｔｅｆａｎｏらによって記載されている通りに行った（出版物、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１３年）。次いで、Ｈｅｒ２＋ＳＫ−ＢＲ−３およびＨｅｒ２−ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系を用いて、各ＡＤＣの相対的効能を評価した。この分析の結果を、以下の表１５に表す。
【０２５０】
【表２１】
0006588422.tif 000036
【０２５１】
図３１は、抗ＨＥＲ複合糖質およびその対応物であるチオールコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏの効力の比較を示す。細胞生存性を、コンジュゲートをＨｅｒ２抗原発現性（ＳＫ−ＢＲ−３）細胞（図３１ＡおよびＣ）、または非発現性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞（図３１およびＤ）に７２時間暴露した後に決定した。ＡＤＣは、グリカンに連結している（「グリコ」）ＭＭＡＥもしくはＰＥＧ８−Ｄｏ１１９のいずれか、または従来の化学反応によってヒンジ領域のシステイン（「チオール」）を含んでいた。図３１ＡおよびＣに示す通り、複合糖質に比べてチオールコンジュゲートに対して、およそ２倍低いＥＣ５０が観察され、これは後者よりも前者ではＤＡＲが２倍高かったことに一致する。最高１００μｇ／ｍｌのあらゆる抗体を有するＨｅｒ２細胞系に毒性は観察されなかった。
【０２５２】
同様の傾向が、結腸癌、膵臓癌、および乳癌を含めた上皮癌における反応性間質線維芽細胞によって高度に発現される、腫瘍抗原（ＦＡＰ）に対する抗体で調製したＡＤＣに対する細胞増殖にも観察された（Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．（２００９年）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔａｒｇｅｔｓ．、Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、９巻、９８２〜１００４頁）。これらのコンジュゲートは、アミノオキシＭＭＡＥ薬物−リンカーまたはマレイミドＭＭＡＥ薬物−リンカーのいずれかを、グリカンまたはチオール基にコンジュゲートさせることによってやはり調製される。これらのコンジュゲートの細胞増殖アッセイにより、チオールコンジュゲートのＥＣ５０は、ヒトＦＡＰをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対して、図３２に示す通りＦＡＰ発現を欠く同じ細胞よりもおよそ１００倍高い効力を有し、図３２は、抗ＦＡＰのＢ１１複合糖質対チオールコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｔｒｏの効力の比較を示すものである。細胞生存性を、ＦＡＰ抗原あり、またはなしでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するコンジュゲートに暴露した後に決定した。ＡＤＣは、グリカンに結合したＭＭＡＥ（「グリコ」）、または従来の化学成分によってヒンジ領域のシステインに結合したＭＭＡＥ（「チオール」）を含んでいた。複合糖質に比べてチオールに対するおよそ２倍低いＥＣ５０は、抗体１個あたり送達される薬物の相対的な量と一致し、抗原発現性ＣＨＯ細胞における標的結合性および内部移行に対する同様の効率が想定される。並行して、先に記載した通り、ＤＡＲ１．５を有する抗ＦＡＰ（Ｂ１１）ＡＤＣの複合糖質をアッセイし、チオールコンジュゲートに比べておよそ２倍高いＥＣ５０が示された（ＤＡＲ３．３）。
【０２５３】
図３６に示す通り、ＳＫ−ＢＲ−３発現性細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対してアッセイした場合、同様の傾向が、実施例１４に記載したＡ１１４Ｎ高グリコシル化変異およびＡＯ−ＭＭＡＥを保有する抗ＨＥＲ抗体で調製したＡＤＣに対する細胞増殖アッセイにおいて観察された。Ａ１１４Ｎ複合糖質は、非発現性の系統全体でＨｅｒ２発現性細胞系に対して増強された細胞毒性を明らかに示す。同じ抗体で調製したＳｉａｌＴ複合糖質に比べた相対的な毒性は、この調製物の薬物含有量（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ）がより低いことに一致する。
【０２５４】
細胞増殖アッセイをまた、実施例１４に記載した通りに調製したＡ１１４Ｎ高グリコシル化変異およびＡＯ−ＭＭＡＥを保有する抗ＴＥＭ１抗体で調製したＡＤＣに対して行った。非発現性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１系に比べて、ＴＥＭ１発現細胞系であるＳＪＳＡ−１およびＡ６７３に、高い毒性が観察された。同じ抗体を有する従来のチオールコンジュゲートに比べた毒性のレベルは、この調製物の薬物含有量（ＤＡＲ）と合致した。
【０２５５】
【表２２】
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【０２５６】
要約すると、切断可能なリンカーを有するグリカンによる薬物の部位特異的コンジュゲーションにより、様々な抗体および様々な薬物−リンカーを用いて実証される通り、毒性のあるＡＤＣおよび従来のチオールベースのコンジュゲートに匹敵するｉｎ  ｖｉｔｒｏの効能が生成される。さらに、過ヨウ素酸塩２ｍＭ未満では、薬物コンジュゲートのレベルはシアル酸の低下に相関する。シアル酸の酸化型への完全な変換から予想される通り、過ヨウ素酸塩の濃度を２ｍＭより高く増大させても利点はほとんどもたらされない。しかし、全ての条件下で、抗体１個あたりの薬物の数は、シアル酸含量よりわずかに少なく、酸化されたシアル酸のいくらかは、埋められていることにより、または他の点で薬物−リンカーのバルクに生じる立体障害によりのいずれかで、同様にカップリングに利用可能ではない可能性があることが指摘される。
【実施例１６】
【０２５７】
抗体薬物コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏでの特徴付け
抗ＨＥＲ複合糖質の効能をまた、Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞異種移植片モードで評価し、およそ２倍高いＤＡＲを有するチオールコンジュゲートの比較対照（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）と比較した。Ｂｅｉｇｅ／ＳＣＩＤマウスにＳＫ−ＯＶ−３  Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞を埋め込み、およそ１５０ｍｍ３の腫瘍を確立させた後、処置を開始した。３または１０ｍｇ／ｋｇ投与量のＡＤＣを、３８、４５、５２、および５９日目に尾静脈から注射した。１群あたりマウスはおよそ１０匹であった。異なる群のマウスの腫瘍体積を測定し、これらの生存を記録した。生存曲線を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法に基づきプロットした。
【０２５８】
図３３は、Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞異種移植片モデルにおける抗ＨＥＲ複合糖質およびチオールコンジュゲートの、ｉｎ  ｖｉｖｏの効能の比較を示す。ＳＫ−ＯＶ−３  Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞を埋め込んだＢｅｉｇｅ／ＳＣＩＤマウスに、およそ２倍高いＤＡＲを含む複合糖質またはチオールコンジュゲートの比較対照を含む、ＭＭＡＥ（図３３ＡおよびＢ）ならびにＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０（図３３ＣおよびＤ）を投与した。ＭＭＡＥコンジュゲートの腫瘍成長の動力学を図３３Ａに示す。この場合、複合糖質は、ネイキッドの抗体単独（黒色）よりも有意に高いが、およそ２倍高いＤＡＲ（緑色）を有するチオールコンジュゲートの比較対照より低い効能を示した。ＭＭＡＥ複合糖質は有意な腫瘍の後退、および腫瘍の成長におけるおよそ２０日の遅延を示し（図３３Ａ）、第１の投与量からの生存時間におけるおよそ２倍の増大を示した（図３３Ｂ）。チオールＭＭＡＥコンジュゲートは、同じ投与量のＡＤＣ（１０ｍｇ／ｋｇ）でほとんど完全な腫瘍の抑制を示した。
【０２５９】
ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０複合糖質（「グリコＤｏｌ１０」）およびおよそ２倍高いＤＡＲを有するチオールコンジュゲートの比較対照（「チオールＤｏｌ１０」）のｉｎ  ｖｉｖｏの効能も、同じＨｅｒ２＋腫瘍細胞異種移植片モデルにおいて決定した。コンジュゲートは両方とも、先に記載したＭＭＡＥコンジュゲートよりも低い効能を示した。しかし、１０ｍｇ／ｋｇのアミノオキシ−ＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０複合糖質（「グリコＤｏｌ１０」）は、腫瘍の増殖において１５日の遅れを示し（図３３Ｃ）、第１の投与後の生存時間におけるおよそ２０日（１．７倍）の増大を示した（図３３Ｄ）。チオールコンジュゲートは同じ投与量ではより有効であり、生存におけるおよそ２倍の増大を示した。低投与量では（３ｍｇ／ｋｇ）、チオールコンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇの複合糖質よりも低い効能を示した。この投与量は１ｋｇあたりのＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０薬物８０μｍｏｌの投与量に相当し、それに対して複合糖質では１ｋｇあたりのＰＥＧ８−Ｄｏｌ１０薬物１１０μｍｏｌの投与量である。
【０２６０】
これらのデータは、抗体のグリカンのシアル酸上への、薬物の部位特異的コンジュゲーションにより、チオールベースの化学反応によって産生されるＡＤＣに匹敵する効力の分子が得られることを実証するものである。ｉｎ  ｖｉｖｏの効能が幾分低いのは、各抗体に結合した抗原が内部移行することにより、各抗体によって腫瘍細胞中に運ばれる薬物の数が少ないことに由来する可能性がある。本発明者らは、これらの複合糖質を、ＤＡＲが同じであるチオールコンジュゲートと比較していないが、投与した薬物が匹敵するレベルであることを示す２つのＡＤＣの様々な投与量に観察された効能は、複合糖質がそのチオールの対応物に匹敵する内在性の効能を有することを示し、この部位のコンジュゲーションに有害効果がないことを指摘するものである。さらに、わずかに２８％多い薬物を導入するＤｏｌ１０複合糖質の１０ｍｇ／ｋｇ投与量により、チオールコンジュゲート（３ｍｇ／ｋｇ）を上回る生存における２倍の増大がもたらされ、これらのコンジュゲートは同じＤＡＲでさえも優れた効能をもたらし得ることが示唆される。天然のグリカンのシアル酸の組み入れに明らかな制限がある場合、分岐した薬物リンカーの使用またはさらなるグリコシル化部位の導入を含めた数々の異なる戦略によって、および同じ方法を用いて、より高い薬物含有量が達成され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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