(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質を含む、虚血心の治療を必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を治療するための、医薬組成物。
【請求項２】
少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
虚血心の治療が、心臓組織を再生及び/又は保護することを含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、ヒドロゲル中に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、エレクトロスピニングされた(electro-spun)三次元足場中に含まれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分化可能細胞と共に存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、それを必要とする被験体の虚血心に注射するための注射可能形態で提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、組換え生産されたタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ナイドジェン-1が、心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤として使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
分化した心筋細胞のin vitro生産方法であって、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分化可能細胞が、分化した心筋細胞を得るために、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質である又はそれをコードする少なくとも1つの生体分子と共に培養され、ここで、ナイドジェン-1は、分化可能細胞を分化した心筋細胞へ分化させるために使用され、且つ、前記方法におけるナイドジェン-1の使用はコラーゲンを含まない、前記方法。
【請求項１１】
分化可能細胞が、ナイドジェン-1で被覆されたプレート上で培養される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を治療する方法に使用するための、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質、前記グリコシル化タンパク質を含む医薬組成物、及び分化した心筋細胞のin vitro生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、組織の損傷又は機能障害をもたらし得る血液供給の制限である。心血管疾患による、特に心筋梗塞による心筋の虚血は、現代医学によって取り組まれなければならない主要な問題である。心不全は、先進工業国における死亡原因の第1位である。虚血に起因する大量の細胞損失の後、心筋組織は内在の再生能力を欠くため、心筋梗塞は、典型的には、線維性瘢痕形成及び永久的心機能障害をもたらす。心筋梗塞を生き延びた被験体では、心臓コラーゲン蓄積が生じ、硬直したコラーゲンリッチな瘢痕組織が形成され、それは、残存する心筋の肥大及び左心室の病的変形をもたらし、最終的に心不全をもたらし得る。
【０００３】
EP 1 730 265 A2は、生物分解性ゲル系マトリックス、少なくとも1つの活性薬剤、及び心臓組織に分化することができる幹細胞を含む組成物を開示する。
【０００４】
EP 1 856 246 A2は、脱細胞化組織由来の細胞外マトリックス、並びにその生成及び使用方法を開示する。脱細胞化マトリックスを生成する方法は、(a)組織を洗浄及び高張性緩衝液に供するステップ、(b)組織を、トリプシンなどの酵素を用いた酵素的タンパク質分解に供するステップ、及び(c)全ての細胞成分を、トリトンX-100及び水酸化アンモニウムを含む界面活性剤溶液を用いて組織から除去するステップを含む。
【０００５】
EP 2 349 292 A2は、心臓組織由来の脱細胞化細胞外マトリックスを含む組成物を開示する。
【０００６】
Seif-Naraghiら(Sci Transl Med, 2013, 5 (173), 173)は、心筋梗塞を治療するための注射可能細胞外マトリックスヒドロゲルの安全性及び有効性を開示する。
【０００７】
Sreejitら(Stem Cell Reviews and Reports, 2013, 9 (2), 158-171)は、成人の骨髄由来幹細胞を用いた、足場ベースの心臓再生のための生体材料としての天然の細胞外マトリックスを開示する。
【０００８】
Higuchiら(J Biosci Bioeng, 2013, 115(3), 320-5)は、心臓細胞外マトリックスが、マウス胚性幹細胞の心筋細胞分化を補助することを開示する。
【０００９】
Hindererら(Biomaterials, 2012, 33(21), 5259-66)は、組織工学気管のための繊維性デコリンマトリックスのエンジニアリングを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】EP 1 730 265 A2
【特許文献２】EP 1 856 246 A2
【特許文献３】EP 2 349 292 A2
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Seif-Naraghiら、Sci Transl Med, 2013, 5 (173), 173
【非特許文献２】Sreejitら、Stem Cell Reviews and Reports, 2013, 9 (2), 158-171
【非特許文献３】Higuchiら、J Biosci Bioeng, 2013, 115(3), 320-5
【非特許文献４】Hindererら、Biomaterials, 2012, 33(21), 5259-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、特に虚血心臓組織の、損傷の再生の程度及び質を改善するための戦略を開発するために、様々なアプローチが提供されている。しかし、開示された方法のいずれも満足のいく結果を提供しない。したがって、虚血心臓組織を再生するための改善された手段及び方法に対する満たされていない要求が依然としてある。
【００１３】
本発明の根底にある技術的課題は、特に、上に特定した欠点を克服すること、好ましくは、幹細胞、好ましくは多能性(pluripotent)幹細胞、心臓幹細胞及び/又は心臓前駆細胞の、分化した心筋細胞への分化を改善する成分、好ましくは医薬組成物を提供することであり、このことは、前記成分、好ましくは前記医薬組成物が無い場合よりも多数の細胞が心臓系統へ分化すべきであることを意味する。特に、提供される成分及び/又は医薬組成物の使用によって、虚血に罹患した又は罹患している動物又はヒト被験体の心臓組織は、前記成分及び/又は医薬組成物で治療されない動物又はヒト被験体の心臓組織と比較して、優れて再生又は保護されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記技術的課題は、独立請求項の教示によって解決されている。
本発明はまた、以下に関する。
[項目１]
それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を治療する方法に使用するための、細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質であって、該細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質は、ナイドジェン-1(nidogen-1)である、グリコシル化タンパク質。
[項目２]
ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質を含む、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を治療する方法に使用するための、医薬組成物。
[項目３]
少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む、項目２に記載の医薬組成物。
[項目４]
虚血心の治療が、心臓組織を再生及び/又は保護することを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のグリコシル化タンパク質又は医薬組成物。
[項目５]
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、ヒドロゲル中に含まれる、項目２〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項目６]
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、エレクトロスピニングされた(electro-spun)三次元足場中に含まれる、項目２〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項目７]
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分化可能細胞と共に存在する、項目２〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
[項目８]
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、それを必要とする被験体の虚血心に注射するための注射可能形態で提供される、項目１〜７のいずれか一項に記載のグリコシル化タンパク質又は医薬組成物。
[項目９]
細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質が、組換え生産されたタンパク質である、項目１〜８のいずれか一項に記載のグリコシル化タンパク質又は医薬組成物。
[項目１０]
ナイドジェン-1が、心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤として使用される、項目１〜９のいずれか一項に記載のグリコシル化タンパク質又は医薬組成物。
[項目１１]
分化した心筋細胞のin vitro生産方法であって、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分化可能細胞が、分化した心筋細胞を得るために、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質である又はそれをコードする少なくとも1つの生体分子と共に培養される、方法。
[項目１２]
分化可能細胞が、ナイドジェン-1で被覆されたプレート上で培養される、項目１１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、ヒト胚性幹細胞株H9に由来するスピン胚様体(spin embryoid body)のための改変された心臓分化プロトコールを示す(使用されている略語は以下の実施例1及び2で説明される)。
【図２】図2は、サルコメアミオシン(MF20抗体)に対する細胞内フローサイトメトリー分析を示す、n=5; 図2A: 非染色対照; 図2B: 10日目の拍動していない増殖した細胞; 図2C: 10日目の拍動している胚様体; 図2D:（B）、（C）及び（E）のためのサンプルを、プレートから切断した; 図2E: サルコメアミオシン(MF20)及び心臓トロポニンTで染色した10日目の拍動している胚様体の免疫蛍光画像。PE-テキサスレッド-Aは、スルホローダミン101酸クロリドとも呼ばれるテキサスレッドの、R-フィコエリスリンとのコンジュゲートである。図2で使用される略語「EB」は、胚様体を意味する。
【図３】図3は、リアルタイムPCR分析の結果を示す; (A): 転写因子Tbx5、心臓トロポニンT及び心筋ミオシンMYH6に焦点を合わせた、心臓分化の10日目での拍動している胚様体(EB)及び拍動していない細胞のリアルタイムPCR分析の結果; (B): 心臓分化中のナイドジェン-1の遺伝子発現。
【図４】図4は、細胞外マトリックスタンパク質のデコリン、ナイドジェン-1、フィブロネクチン、ペリオスチン、コラーゲンI、コラーゲンIV及びラミニンに焦点を合わせた、心臓分化の10日目での拍動している胚様体の免疫蛍光画像のグレー値強度(GVI)の比較を示す。
【図５−１】図5は、心臓分化の10日目での拍動している胚様体の免疫蛍光画像を示す。蛍光染色した(図5中の灰色)細胞外マトリックスタンパク質デコリン、ナイドジェン-1、フィブロネクチン、ペリオスチン、ラミニン、コラーゲンI及びコラーゲンIVを、免疫蛍光顕微鏡のチャンネルの1つを用いて画像取得した。これもサンプル中に存在するサルコメアミオシンを有する分化した心筋細胞は、可視化されていない。蛍光染色した(図5中の灰色)細胞外マトリックスタンパク質は、分化した心筋細胞の近くに見出された。
【図５−２】図5-1の続きである。
【図５−３】図5-2の続きである。
【図６】図6は、対照被覆(0.1重量％のゼラチンのみ)と比較した、0.1重量％のゼラチン＋50μg/mlのナイドジェン-1での被覆上の心血管分化の10日目での、CTNT陽性細胞の割合の有意な増加を示す。n=3、p<0.05。
【図７】図7は、心筋梗塞(MI)に罹患し、前記心筋梗塞に罹患した直後にナイドジェン-1で処置されたマウス(「ナイドジェン-1」)、及び心筋梗塞に罹患し、ナイドジェン-1で処置されないマウス(「対照」)の駆出率(EF)の割合を示す。駆出率の割合は、心筋梗塞の2週及び4週後の対照群において、心筋梗塞の2日後の時点と比べて有意に減少する。ナイドジェン-1処置群(ナイドジェン-1の投与)では、これは当てはまらない。ナイドジェン-1処置群と対照群の間の駆出率の差は、心筋梗塞の2週後の時点で有意である。同じことが、心筋梗塞の4週後の時点についても当てはまる。
【図８】図8は、心筋梗塞及び再灌流(MI/R)事象後にナイドジェン-1注射又は対照注射を受けたマウス心臓のパラフィン包埋組織切片の明視野像(ラッセル-モバットペンタクローム染色)及び免疫蛍光(IF)画像を示す。白い長方形は、右側に画像におけるより詳細が示されている部分を示す。図8A、8B及び8Cは、対照注射を受けたマウス心臓のラッセル-モバットペンタクローム染色を示す。図8D、8E及び8Fは、ナイドジェン-1注射を受けたマウス心臓のラッセル-モバットペンタクローム染色を示す。図8G、8H及び8Iは、対照注射を受けたマウス心臓のcTnTの免疫蛍光染色(薄い灰色)及び細胞核(DAPI、濃い灰色)を示す。図8J、8K及び8Lは、ナイドジェン-1注射を受けたマウス心臓のcTnTの免疫蛍光染色(薄い灰色)及び細胞核(DAPI、濃い灰色)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の関連で、用語「細胞」は、当技術分野におけるその最も広い意味で理解され、かつ、多細胞生物の組織の構成単位であり、外部から隔離する膜構造に囲まれており、自己複製能力を有しており、遺伝情報及びその発現機構を有している生体(living body)を指す。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞又は人工的に改変された細胞、例えば融合細胞及び遺伝的に改変された細胞であってよい。
【００１７】
本発明の関連で、用語「幹細胞」は、少なくとも1つのタイプのより特殊化した細胞を生じることができる細胞を指す。幹細胞は、自己再生能力、すなわち、未分化状態を維持したまま細胞分裂の多数のサイクルを通過する能力を有し、かつ、特殊化した細胞型に分化する能力を有する。通常、幹細胞は損傷組織を再生することができる。
【００１８】
幹細胞は、本明細書において、好ましくは、多能性(pluripotent)細胞若しくは前駆(progenitor)細胞、又はそれらの混合物である。多能性細胞は、好ましくは、誘導多能性幹細胞若しくは胚性幹細胞、又はそれらの混合物である。前駆細胞は、好ましくは、複能性(multipotent)細胞である。複能性細胞は、好ましくは、心臓前駆細胞、組織幹細胞、間葉幹細胞である。複能性幹細胞は、心臓、血液循環又は他の組織に由来し得る。幹細胞は、本明細書において、好ましくは、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、又は組織特異的幹細胞とも呼ばれる組織幹細胞、、成体幹細胞又は体性幹細胞である。
【００１９】
本発明の関連で、「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」は、三胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる細胞、例えば、全能性(totipotent)幹細胞又は誘導多能性幹細胞の直接の子孫である。したがって、用語「多能性幹細胞」はまた、誘導多能性幹細胞を含む。
【００２０】
iPS細胞又はiPSCと一般に略記される「誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)」は、再プログラム化因子と称される特定の遺伝子を挿入する又は他の再プログラム化法を使用することによって、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞、又は最終分化細胞、例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などから人為的に調製された多能性幹細胞の一種を指す。
【００２１】
本発明の関連で、「胚性幹細胞」は、自己再生し、成熟した動物又はヒトに存在する細胞型の多く又は全てを生成する能力を有する、哺乳動物の胚又は胚盤胞に由来する細胞である。胚性幹細胞は、多能性幹細胞である。規定された条件の下では、胚性幹細胞は、無限に自分自身を増殖させることができる。多能性(pluripotency)は、成体に見られる「成体幹細胞」から胚性幹細胞を区別する。胚性幹細胞は、体内の全ての細胞型を生成することができるが、成体幹細胞は、複能性であり、限られた数の細胞型のみを生成することができる。
【００２２】
体性幹細胞としても知られている「成体幹細胞」は、多能性ではなく、発達後の全身に見られる非最終分化細胞であり、細胞分裂によって増殖し、死にかけている細胞を補充し、損傷組織を再生する。それらは、成体の動物及びヒトの体だけでなく幼体に見出され得る。成体幹細胞は、無期限に分裂又は自己再生し、かつそれらが由来する臓器の全ての細胞型を生成することができ、潜在的には数個の細胞から臓器全体を再生することができる。成体幹細胞は、自己再生及び複能性の特性を有する。「複能性(multipotency)」とは、いくつかの異なる細胞型の前駆細胞を生成する能力を有することを意味する。
【００２３】
胚性幹細胞とは異なり、「心臓幹細胞」は、限定された分化潜在力を有する。心臓幹細胞は、組織特異的幹前駆細胞、好ましくは、成体哺乳動物の心臓内の組織特異的前駆細胞である。
【００２４】
「前駆細胞(progenitor cell)」は、いくつかの異なる細胞型に分化する能力を有するが、任意の細胞型に分化する能力を有さない細胞である。これらの細胞は、複能性、二能性(bipotent)、又は単能性(unipotent)であることが知られている。幹細胞と前駆細胞の最も重要な違いは、幹細胞は無限に複製することができ、一方、前駆細胞は限られた回数だけ分裂できることである。前駆細胞は、幹細胞と比較して、細胞分化のより後期にある。したがって、細胞を分化させる過程において、前駆細胞は、幹細胞と完全に分化した細胞との間に存在する。
【００２５】
本発明の関連で、心臓筋細胞(cardiac muscle cell)とも呼ばれる「心筋細胞(cardiomyocyte)」は、心筋を構成する筋細胞である。各心筋細胞は、筋細胞の収縮単位であるサルコメアの長い鎖である筋原線維を含有する。心筋細胞は、骨格筋細胞におけるものと同様の横紋を示す。倍数性及び多核細胞化は、哺乳動物の心筋細胞の特徴である。用語「心筋細胞」は、成熟心筋細胞、並びに、形態、特徴的タンパク質マーカー発現、in vitro及びin vivo機能的アッセイによって決定されるように心筋細胞の全ての特徴を有する、成熟しかつ完全に機能的な心筋細胞、好ましくは完全に機能的な心筋細胞の全てではないがいくつかの特徴を示す、心筋様細胞を含む。
【００２６】
用語「胚様体」は、以下に実施例1に記載されるように、又は単層凝集多能性幹細胞の一部をそれらが接着することができない基板に添加することによって、好ましくは生産することができる、分化及び未分化細胞の凝集体として理解される。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「担体」は、化合物が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。薬学的に許容される担体は、好ましくは、水、油及びヒドロゲルなどの無菌の液体である。水又は水溶液食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射可能溶液のための担体として好ましくは使用される。最も好ましくは、ヒドロゲルは、特に注射可能媒体のための担体として使用される。
【００２８】
本発明の関連で、「治療上有効量で」という用語は、幹細胞、好ましくは多能性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から好ましくは選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞の少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、好ましくは少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、好ましくは少なくとも99％、好ましくは100％が、心筋細胞に分化することを意味する。特に医薬組成物中の、グリコシル化タンパク質の添加の無い同じ条件下で分化する、分化可能な、好ましくは未分化の細胞と比較して、少なくとも1.1倍、好ましくは少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.3倍、好ましくは少なくとも1.4倍、好ましくは少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍多くの、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞が心筋細胞に分化することを達成するために、好ましくは、少なくとも1つのグリコシル化タンパク質が、治療上有効量でそれを必要とするヒト又は動物被験体に投与される。
【００２９】
特定のタンパク質を「コードする」「生体分子」とは、本発明の関連では、適切な調節配列下に置かれた場合、in vitro又はin vivoで転写され、場合により、遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳もされる核酸分子である。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、又はRNA形態で存在し得る。DNA形態で存在する場合、核酸分子は、センス鎖である一本鎖であっても、又は二本鎖であってもよい。コード領域の境界は、5'(アミノ)末端で開始コドンによって、及び3'(カルボキシ)末端で翻訳停止コドンによって決定される。
【００３０】
用語「組換えDNA分子」は、本発明の関連では、分子生物学的技術によって一緒に結合されるDNAのセグメントからなるDNA分子と理解される。
【００３１】
用語「組換え生産されたタンパク質」は、組換えDNA分子から発現されるタンパク質として本発明の関連において理解される。組換えDNA(rDNA)分子は、分子生物学的技術によって一緒に結合されたDNAのセグメントからなるDNA配列である。
【００３２】
本発明の関連で、用語「in vitro」は、人工的な環境として、及び人工的な環境内で起こる過程又は反応として理解される。in vitro環境は、好ましくは、試験管及び細胞培養を含むことができる。
【００３３】
用語「細胞外マトリックス」は、動物又はヒトの組織における細胞間に見出され、組織における構造要素として機能する、タンパク質リッチな物質を意味する。それは、典型的には、細胞によって分泌された多糖類及びタンパク質の複雑な混合物を含む。使用される細胞外マトリックスは、種々の方法で単離され、処理され得る。細胞外マトリックス材料(ECM)は、好ましくは、細胞若しくは幹細胞に由来するか、又は小腸粘膜下組織、胃粘膜下組織、膀胱粘膜下組織、組織粘膜、硬膜、肝臓基底膜、心筋、心膜、若しくは他の組織から単離される。単離及び処理後に、それは、一般的に、細胞外マトリックス又はECM材料と称される。
【００３４】
用語「医薬組成物」は、動物又はヒトにおいて、好ましくは温血哺乳動物において、好ましくはヒトにおいていくつかの治療的及び/又は有益な効果をもたらす、好ましくは局所的又は全身的な効果(1つ又は複数)をもたらす製剤と理解される。
【００３５】
本発明の関連で、用語「それを必要とする被験体」は、虚血、好ましくは心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、冠動脈疾患、糖尿病性心臓病、血栓性脳卒中又は塞栓性脳卒中のうちの1つ以上に罹患した又はに罹患している任意の動物又はヒト被験体と理解される。動物又はヒト被験体は、好ましくは、温血哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３６】
用語「投与」は、医薬組成物又は活性薬剤製剤が、治療部位へ機能的薬剤又は製剤又は組成物を送達するのに適切な任意の方法によって、治療部位、例えば損傷組織に提供されることを意味する。送達方法は、好ましくは、治療部位における直接注射、経皮送達及び局所適用である。
【００３７】
本発明の関連で、用語「治療」及び「治療すること」は、所望の薬学的及び/又は生理学的効果を得ることを意味する。好ましくは、この効果は、部分的又は完全に虚血を治癒する観点で治療的である。用語「治療」は、本明細書で使用する場合、ヒト又は動物、好ましくは哺乳動物、特に脊椎動物、より好ましくはヒトにおける、虚血、並びに/又は虚血によって引き起こされる心臓欠陥及び/若しくは心機能障害に罹患している心臓組織の任意の治療に及び、そして少なくとも部分的に心臓又は心臓組織の機能障害を再生及び/又は修復することを含む。
【００３８】
心虚血とも呼ばれる用語「虚血」は、本発明の関連で、心臓組織における不十分な酸素につながる不十分な灌流に起因する、酸素の供給と需要の間の不均衡がある場合に生じる、酸素の供給及び/又は代謝産物の供給の欠乏を被っている心臓組織において生じ得る状態と理解される。また、例えばバイパス手術の間の、血流の遮断などの医療介入は、虚血を導き得る。心虚血は、無症候性虚血から安定又は不安定狭心症から心筋梗塞(AMI又は「心臓発作」)まで、幅広い状態を含む。
【００３９】
本発明の関連で、薬剤の添加の無い同じ条件下で分化する同じ分化可能な、好ましくは未分化の細胞と比較して、該薬剤の添加により、統計学的に有意に多い量の未分化細胞が心筋細胞に分化する場合、薬剤は、「心臓誘導的(cardioinductive)」に作用する。
【００４０】
本発明の関連で、「統計学的に有意な」とは、分散分析(ANOVA)に続くフィッシャーの最小有意差(LSD)検定を行うことにより、0.05未満のp値が得られることを意味する。図面では、統計学的有意性は、1つ(*)又は2つ(**)の星印で示される。
【００４１】
薬剤の添加の無い同じ条件下で、好ましくは実施例5にしたがって、分化する同じ分化可能な、好ましくは未分化の細胞と比較して、該薬剤の添加により、少なくとも10％多くの、好ましくは少なくとも20％多くの、好ましくは少なくとも30％多くの、好ましくは少なくとも40％多くの、好ましくは少なくとも50％多くの、好ましくは少なくとも60％多くの、好ましくは少なくとも70％多くの、好ましくは少なくとも80％多くの、好ましくは少なくとも90％多くの、好ましくは少なくとも100％多くの、好ましくは少なくとも150％多くの、好ましくは少なくとも200％多くの、好ましくは少なくとも300％多くの分化可能な、好ましくは未分化の細胞が、心筋細胞に分化する場合、薬剤は心臓誘導剤(cardioinductive agent)として好ましくは作用する。
【００４２】
本発明の関連で、薬剤の添加により、統計学的に有意に多くの量の細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞が、少なくとも20分〜60分、好ましくは20分〜60分、好ましくは20分の酸素欠乏を生き延びる場合、薬剤は、「心臓保護的」に作用する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、薬剤の添加の無い同じ条件にさらされた同じ細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞と比較して、酸素欠乏の完了直後に該薬剤を添加し、続いて、空気で充満したインキュベーターに37℃で2日間細胞をさらすことによって、50％以上の細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞が20分の酸素欠乏をin vitroで生き延びる場合、薬剤は心臓保護剤である。
【００４４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、薬剤の添加の無い同じ条件にさらされた同じ細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞と比較して、酸素欠乏の完了直後に該薬剤を添加し、続いて、空気で充満したインキュベーターに37℃で2日間細胞をさらすことによって、40％以上の細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞が30分の酸素欠乏をin vitroで生き延びる場合、薬剤は心臓保護剤である。
【００４５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、薬剤の添加の無い同じ条件にさらされた同じ細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞と比較して、酸素欠乏の完了直後に該薬剤を添加し、続いて、空気で充満したインキュベーターに37℃で2日間細胞をさらすことによって、30％以上の細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞が45分の酸素欠乏をin vitroで生き延びる場合、薬剤は心臓保護剤である。
【００４６】
本発明のさらに好ましい実施形態では、薬剤の添加の無い同じ条件にさらされた同じ細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞と比較して、酸素欠乏の完了直後に該薬剤を添加し、続いて、空気で充満したインキュベーターに37℃で2日間細胞をさらすことによって、20％以上の細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞が60分の酸素欠乏をin vitroで生き延びる場合、薬剤は心臓保護剤である。
【００４７】
用語「駆出率」は、拡張末期容積で割った1回拍出量(stroke volume)である、各心拍で排出される拡張末期容積の割合と理解される。拡張末期容積は、心筋の収縮の直前における心室内の血液量である。1回拍出量は、拡張末期容積と収縮末期容積との間の差である。収縮末期容積は、心筋の収縮の終わりに心室に残った血液量である。
【００４８】
本発明において、ナイドジェン-1は、虚血心を治療する方法に使用される細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質である。エンタクチンとも呼ばれる「ナイドジェン-1(nidogen-1)」は、他の成分、例えばIV型コラーゲン、プロテオグリカン、例えばヘパラン硫酸及びグリコサミノグリカン、ラミニン及びフィブロネクチンと共に、基底膜の成分である、硫酸化多ドメイン糖タンパク質である。ナイドジェン-1は、カルシウムイオンと結合し、ナイドジェン-1のこのカルシウム結合活性は、マトリックス会合過程において役割を果たし得る。その主要な機能は、基底膜の会合であると思われる。ナイドジェン-1は、好ましくは哺乳動物ナイドジェン-1、好ましくはヒト又はヒト化ナイドジェン-1である。
【００４９】
本発明の技術的課題は、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を治療する方法に使用するための、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質によって特に解決され、ここで、細胞外マトリックス、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質はナイドジェン-1である。
【００５０】
驚くべきことに、細胞外マトリックスタンパク質ナイドジェン-1は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞の心血管分化において重要な役割を果たすことが見出されている。該タンパク質は、幹細胞、好ましくは多能性幹細胞及び/又は前駆細胞の心血管系統への分化を達成するために使用することができる。したがって、該タンパク質は心臓誘導的である。
【００５１】
したがって、細胞外マトリックスタンパク質ナイドジェン-1を用いることによって、心筋細胞の生成につながる、幹細胞及び/又は前駆細胞の分化のための条件及び環境が虚血心に提供される。
【００５２】
ナイドジェン-1は、心臓誘導剤として、好ましくは、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞を、心筋細胞に分化させる薬剤として、好ましくは使用される。
【００５３】
幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞を分化させた場合、好ましくは、心血管分化の少なくとも5日、好ましくは少なくとも又はちょうど10日の期間の後に、ナイドジェン-1を使用せずに分化させた細胞の対照サンプルと比較して、ナイドジェン-1の使用によって、CTNT(心臓トロポニンT)陽性細胞の割合は有意に増加する。この効果は、in vitroで少なくとも存在する。ナイドジェン-1の注射は、in vivoマウスモデルにおいて、心臓発作後の同じ時に、好ましくは心臓発作の少なくとも2又は4週後に、ナイドジェン-1で処置されていない対照マウスモデルと比較して、駆出率の改善をさらに導く。
【００５４】
したがって、心臓発作に罹患した直後にナイドジェン-1で処置されていない心臓の駆出率と比較して、好ましくは、少なくとも2日、好ましくは少なくとも2週、好ましくは少なくとも4週の期間にわたって、ナイドジェン-1の添加によって、駆出率は実質的に改善し、すなわち増加し、又は等しいままでいる。したがって、ナイドジェン-1は、心臓保護剤として好ましくは作用する。
【００５５】
本発明の関連で、ナイドジェン-1は、好ましくはナイドジェン-1を接触させる細胞に応じて、心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤として好ましくは作用する。分化可能な、好ましくは未分化の細胞をナイドジェン-1と接触させる場合、ナイドジェン-1は心臓誘導剤として好ましくは作用する。分化した細胞、好ましくは心臓細胞、好ましくは心筋細胞をナイドジェン-1と接触させる場合、ナイドジェン-1は心臓保護剤として好ましくは作用する。両方の細胞型、すなわち分化可能な細胞及び分化した細胞をナイドジェン-1と接触させる場合、ナイドジェン-1は心臓誘導剤及び心臓保護剤として好ましくは作用する。
【００５６】
心臓トロポニンTは、心筋細胞の特異的マーカーである。したがって、ナイドジェン-1の使用によって、心臓トロポニンT及び心筋細胞の割合はまた、ナイドジェン-1を使用せずに分化させた細胞の対照サンプルと比較して、好ましくは有意に増加する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質は、組換え生産されたタンパク質、好ましくは組換え生産されたヒトタンパク質である。組換え生産によって、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質は、再現可能かつ制御された方法で生産することができ、規定された濃度で、それを必要とする被験体に投与することができる。
【００５８】
ヒトタンパク質ナイドジェン-1の組換え生産は、宿主細胞株、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞株(CHO宿主細胞株)で好ましくは起こる。CHO宿主細胞株は、高い安全性レベルのために、タンパク質治療薬の組換え生産のために食品医薬品局(FDA)によって承認されている。臨床研究のために、組換え生産された、好ましくはヒトの、タンパク質の生産は、適正製造基準(GMP)の条件にさらに適合させることができる。
【００５９】
本発明に係るグリコシル化タンパク質及び/又は医薬組成物は、好ましくは混入物がなく、好ましくは、それを必要とする被験体に伝達し得る、ウイルス、プリオン、及び他のまだ知られていないリスクがなく、特にウイルス及びプリオンがない。
【００６０】
好ましくは、ナイドジェン-1は、本発明に係る方法に使用される唯一のタンパク質である。この好ましい実施形態では、ナイドジェン-1はまた、医薬組成物中に存在する唯一のタンパク質である。
【００６１】
好ましくは、ナイドジェン-1は、本発明に係る方法に使用される唯一のグリコシル化タンパク質である。この好ましい実施形態では、ナイドジェン-1はまた、医薬組成物中に存在する唯一のグリコシル化タンパク質である。
【００６２】
好ましくは、ナイドジェン-1は、本発明に係る方法に使用される唯一の細胞外マトリックス成分である。この好ましい実施形態では、ナイドジェン-1はまた、医薬組成物中に存在する唯一の細胞外マトリックス成分である。
【００６３】
好ましくは、ナイドジェン-1は、本発明に係る方法に使用される基底膜の唯一の成分である。この好ましい実施形態では、ナイドジェン-1はまた、医薬組成物中に存在する基底膜の唯一の成分である。
【００６４】
好ましくは、ナイドジェン-1は、本発明に係る方法に使用される細胞外マトリックス足場の唯一の構造タンパク質である。この好ましい実施形態では、ナイドジェン-1はまた、医薬組成物中に存在する細胞外マトリックス足場の唯一の構造タンパク質である。細胞外マトリックス足場の構造タンパク質は、好ましくは、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲン及びフィブリリンである。
【００６５】
好ましくは、ナイドジェン-1は、本発明に係る方法に使用される細胞外マトリックス足場の唯一の機能的タンパク質である。この好ましい実施形態では、ナイドジェン-1はまた、医薬組成物中に存在する細胞外マトリックス足場の唯一の機能的タンパク質である。
【００６６】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、好ましくはデコリンを含まない。この好ましい実施形態では、医薬組成物も、デコリンを含まない。
【００６７】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、好ましくはコラーゲンを含まない。この好ましい実施形態では、医薬組成物も、コラーゲンを含まない。
【００６８】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、好ましくはデコリン及びコラーゲンを含まない。この好ましい実施形態では、医薬組成物も、デコリン及びコラーゲンを含まない。
【００６９】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、好ましくはラミニン、コラーゲンIV、及びヘパラン硫酸を含まない。この好ましい実施形態では、医薬組成物も、ラミニン、コラーゲンIV、及びヘパラン硫酸を含まない。
【００７０】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、好ましくはラミニン、コラーゲンIV、及びヘパラン硫酸を含まない。この好ましい実施形態では、医薬組成物も、ラミニン、コラーゲンIV、及びヘパラン硫酸を含まない。
【００７１】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、好ましくは、コラーゲンI及びIII、エラスチン、ラミニン、細胞質ドメイン-44（CD44）、ヒアルロナン、シンデカン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、フィブロネクチン(Fn)、テネイシン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸B、インテグリン、デコリン、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFベータ)を含まない。この好ましい実施形態では、医薬組成物も、コラーゲンI及びIII、エラスチン、ラミニン、細胞質ドメイン-44（CD44）、ヒアルロナン、シンデカン、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、PDGF、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、フィブロネクチン(Fn)、テネイシン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸B、インテグリン、デコリン、及びトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFベータ)を含まない。
【００７２】
好ましくは心臓誘導剤及び/又は心臓保護剤としての、本発明に係る方法におけるナイドジェン-1の使用は、以下からなる群から選択される少なくとも1つの成分を好ましくは含まない: コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン(GAG)鎖、さらなる糖タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞表面結合タンパク質、細胞接着分子(CAM)、血管新生増殖因子、内皮リガンド(endothelial ligand)、マトリカイン(matrikine)、マトリックスメタロプロテアーゼ、カドヘリン、免疫グロブリン、線維コラーゲン、非線維性コラーゲン、基底膜コラーゲン、マルチプレキシン(multiplexin)、小ロイシンリッチプロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン(keratocan)、ルミカン、エピフィカン(epiphycan)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、パールカン(perlecan)、アグリン(agrin)、テスチカン(testican)、シンデカン、グリピカン、セルグリシン(serglycin)、セレクチン、レクチカン(lectican)、アグリカン、バーシカン、ニューロカン(nuerocan)、ブレビカン、細胞質ドメイン-44(CD-44)、マクロファージ刺激因子、アミロイド前駆体タンパク質、ヘパリン、コンドロイチン硫酸C、コンドロイチン硫酸B(デルマタン硫酸)、コンドロイチン硫酸A、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、フィブロネクチン(Fn)、テネイシン、エラスチン、フィブリリン、ラミニン、フィブリンI、フィブリンII、インテグリン、膜貫通分子、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF-アルファ)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-ベータ)、線維芽細胞増殖因子-2(FGF-2)(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)とも呼ばれる)、トロンボスポンジン、オステオポンチン、アンジオテンシン変換酵素(ACE)、及び血管上皮増殖因子(VEGF)。
【００７３】
この好ましい実施形態では、医薬組成物も、以下からなる群から選択される少なくとも1つの成分を含まない: コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン(GAG)鎖、さらなる糖タンパク質、増殖因子、サイトカイン、細胞表面結合タンパク質、細胞接着分子(CAM)、血管新生増殖因子、内皮リガンド(endothelial ligand)、マトリカイン(matrikine)、マトリックスメタロプロテアーゼ、カドヘリン、免疫グロブリン、線維コラーゲン、非線維性コラーゲン、基底膜コラーゲン、マルチプレキシン(multiplexin)、小ロイシンリッチプロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、ケラトカン(keratocan)、ルミカン、エピフィカン(epiphycan)、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、パールカン(perlecan)、アグリン(agrin)、テスチカン(testican)、シンデカン、グリピカン、セルグリシン(serglycin)、セレクチン、レクチカン(lectican)、アグリカン、バーシカン、ニューロカン(nuerocan)、ブレビカン、細胞質ドメイン-44(CD-44)、マクロファージ刺激因子、アミロイド前駆体タンパク質、ヘパリン、コンドロイチン硫酸C、コンドロイチン硫酸B(デルマタン硫酸)、コンドロイチン硫酸A、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、フィブロネクチン(Fn)、テネイシン、エラスチン、フィブリリン、ラミニン、フィブリンI、フィブリンII、インテグリン、膜貫通分子、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF-アルファ)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF-ベータ)、線維芽細胞増殖因子-2(FGF-2)(塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)とも呼ばれる)、トロンボスポンジン、オステオポンチン、アンジオテンシン変換酵素(ACE)、及び血管上皮増殖因子(VEGF)。
【００７４】
特に、組換え生産されたヒトタンパク質が使用される場合、それは、有害な免疫反応をもたらす、ヒト免疫系による異物として認識されない。同じ特定の動物に投与される場合、特定の動物の組換え生産されたタンパク質に同じことが当てはまる。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物及び/又はグリコシル化タンパク質は、損傷した心臓組織だけでなく、その隣接領域にも投与され、好ましくは注射される。
【００７６】
好ましくは、医薬組成物又はグリコシル化タンパク質ナイドジェン-1は、虚血に罹患した心臓組織に、好ましくは単独で、投与される。好ましくは、ナイドジェン-1又は医薬組成物は、虚血に罹患した心臓組織の隣接領域に、好ましくは単独で、投与される。好ましくは、ナイドジェン-1又は医薬組成物は、虚血に罹患した組織の梗塞境界領域に、好ましくは単独で、投与される。好ましくは、医薬組成物又はグリコシル化タンパク質ナイドジェン-1は、虚血に罹患した心臓組織又は虚血に罹患した組織の梗塞境界領域に、好ましくは単独で、投与される。梗塞境界領域は、虚血に罹患した心臓組織の周囲の領域として好ましくは定義される。梗塞境界領域は、最大で1cmで、好ましくは最大で0.5cm、好ましくは最大で1mmの幅を好ましくは有する。梗塞境界領域は、少なくとも1μm、好ましくは少なくとも50μm、好ましくは少なくとも100μmの幅を好ましくは有する。梗塞境界領域は、1μm〜1cm、好ましくは50μm〜0.5cmの幅を好ましくは有する。
【００７７】
虚血に罹患した心臓組織の表面とも呼ばれる、無傷の組織から虚血に罹患した組織を分離する心臓梗塞組織界面の接平面からの、梗塞境界組織へのナイドジェン-1投与の局所位置の垂直距離は、最大で1mm、好ましくは最大で0.5mm、好ましくは最大で100μm、好ましくは最大で50μm、好ましくは最大で10μm、好ましくは最大で1μmであることが好ましい。
【００７８】
本発明の技術的課題はまた、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックス、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質を含む、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を処置する方法に使用するための医薬組成物によって特に解決される。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態では、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質は、治療上有効量で使用及び/又は投与される。本発明は、好ましい実施形態では、少なくとも1つの薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明に係る医薬組成物に関する。
【００８０】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係るグリコシル化タンパク質又は本発明に係る医薬組成物に関し、ここで、虚血心の治療は、心臓組織を再生及び/又は保護することを含む。
【００８１】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、二次元又は三次元足場中に含まれる。三次元足場は、好ましくは、メッシュ、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされた(electro-spun)、バイオプリンティングされた(bioprinted)若しくはバイオスプレーされた(biosprayed)三次元足場又はネイティブ組織足場である。
【００８２】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、ヒドロゲル中に含まれる。
【００８３】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、エレクトロスピニングされた三次元足場中に含まれる。
【００８４】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分化可能な、好ましくは未分化の細胞と共に存在する。
【００８５】
本発明の技術的課題は、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心の治療のための、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質の使用によって特に解決される。
【００８６】
したがって、本発明はまた、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心の治療のための医薬組成物の調製のための、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの上に特定されたグリコシル化タンパク質の使用に関する。
【００８７】
本発明の技術的課題はまた、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質を含む、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心を治療するための医薬組成物の使用によって特に解決される。
【００８８】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る使用に関し、ここで、虚血心の治療は、心臓組織を再生することを含む。
【００８９】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る使用に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、二次元又は三次元足場中で、それを必要とする被験体に投与される。三次元足場は、好ましくは、メッシュ、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされた、バイオプリンティングされた若しくはバイオスプレーされた三次元足場又はネイティブ組織足場、好ましくはヒドロゲル及び/又はエレクトロスピニングされた三次元足場である。
【００９０】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る使用に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの1つのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞と共に、それを必要とする被験体に投与される。
【００９１】
好ましい実施形態では、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの1つのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、それを必要とする被験体の虚血心に注射するための注射可能形態で提供される。
【００９２】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る使用に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの1つのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、それを必要とする被験体の虚血心における注射によって投与される。
【００９３】
本発明は、好ましい実施形態では、本発明に係る使用に関し、ここで、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、組換え生産されたタンパク質である。
【００９４】
本発明の技術的課題はまた、分化した心筋細胞のin vitro生産方法であって、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞が、分化した心筋細胞を得るために、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質である又はそれをコードする少なくとも1つの生体分子と共に培養される、方法によって特に解決される。細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質をコードする生体分子は、該生体分子をグリコシル化タンパク質ナイドジェン-1に翻訳する宿主細胞中に好ましくは存在する。
【００９５】
好ましくは、分化可能細胞は、ナイドジェン-1で被覆されたプレート上で培養される。好ましくは、プレートは、好ましくは1〜500μg/ml、好ましくは20〜200μg/ml、好ましくは50μg/mlのナイドジェン-1を含む、0.05〜5重量％、好ましくは0.09〜2重量％、好ましくは0.1重量％のゼラチン溶液で被覆される。ゼラチン溶液のための溶媒として、水及び/又はリン酸緩衝生理食塩水が、好ましくは単独で、使用される。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態では、心臓幹細胞は、心臓成体幹細胞である。
【００９７】
本発明の技術的課題はまた、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質を投与することによる、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心の治療方法によって特に解決される。
【００９８】
本発明の技術的課題はまた、ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの少なくとも1つのグリコシル化タンパク質を含む医薬組成物を投与することによる、それを必要とするヒト又は動物被験体の虚血心の治療方法によって特に解決される。
【００９９】
好ましくは、虚血心の治療は、心臓組織を再生及び/又は保護することを含む。
【０１００】
細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの、好ましくは組換え生産された、タンパク質、すなわちナイドジェン-1は、それを必要とする被験体の虚血心への好ましくは注射によって、二次元若しくは三次元足場と共に又はその中で、それを必要とする被験体に好ましくは投与される。三次元足場は、好ましくは、メッシュ、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされた、バイオプリンティングされた若しくはバイオスプレーされた三次元足場又はネイティブ組織足場、好ましくはヒドロゲル又はエレクトロスピニングされた三次元足場である。
【０１０１】
より好ましくは、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの少なくとも1つのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞と共に、それを必要とする被験体に投与される。
【０１０２】
最も好ましくは、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスの少なくとも1つのタンパク質、すなわちナイドジェン-1は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞と共に、二次元若しくは三次元足場、好ましくはメッシュ、ヒドロゲル、エレクトロスピニングされた、バイオプリンティングされた若しくはバイオスプレーされた三次元足場又はネイティブ組織足場、好ましくはヒドロゲル又はエレクトロスピニングされた三次元足場中に含まれる。
【０１０３】
本発明の技術的課題はまた、(a)ナイドジェン-1である、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質、及び(b)幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞、を含むキットによって特に解決される。好ましくは、キットは、細胞外マトリックス、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスをさらに含む。好ましくは、(a)及び(b)を含むキットは、二次元又は三次元足場をさらに含む。
【０１０４】
心臓が虚血に罹患した又は罹患している、本発明に係る、それを必要とする動物又はヒト被験体の虚血心を治療する方法において、細胞外マトリックスの、好ましくは哺乳動物細胞外マトリックスのグリコシル化タンパク質、すなわちナイドジェン-1は、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から特に選択される、幹細胞及び/又は前駆細胞を、分化した、好ましくは完全に分化した、心筋細胞へ分化させるために使用される。
【０１０５】
好ましい実施形態では、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から好ましくは選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞、好ましくは心臓幹細胞及び/又は心臓前駆細胞は、好ましくは懸濁液中で又は二次元若しくは三次元足場中で、凝集体の形態で、それを必要とするヒト又は動物被験体に投与される。これらの凝集体は、胚性幹細胞の場合、「胚様体」と呼ばれる。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態では、グリコシル化タンパク質ナイドジェン-1は、虚血に罹患している間又は虚血に罹患した後に、それを必要とするヒト又は動物被験体に投与される。「罹患した後」という用語は、グリコシル化タンパク質、すなわちナイドジェン-1が、ヒト又は動物被験体における心臓の虚血の開始の1時間〜15年、好ましくは1時間〜6ヶ月、好ましくは1分〜6週、好ましくは1分〜1日、好ましくは1分〜6時間、好ましくは1分〜10分、好ましくは1分〜5分、好ましくは1分〜2時間、好ましくは1分〜4時間、好ましくは1分〜3時間、好ましくは5分〜4時間、好ましくは10分〜4時間、好ましくは15分〜4時間、好ましくは2〜6週後に投与されることを好ましくは意味する。
【０１０７】
好ましくは、ナイドジェン-1は、1mLの投与体積当たり20〜100μg、好ましくは1mLの投与体積当たり30〜70μg、好ましくは1mLの投与体積当たり50μgの濃度で投与される。
【０１０８】
好ましくは、1回の投与内でヒト被験体に投与されるナイドジェン-1の量は、1μg〜1mg、好ましくは2μg〜200μg、好ましくは2μg〜100μg、好ましくは20μg〜50μgののナイドジェン-1である。
【０１０９】
本発明の好ましい実施形態では、幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、心臓幹細胞、心臓前駆細胞、複能性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から好ましくは選択される、分化可能な、好ましくは未分化の細胞は、グリコシル化タンパク質ナイドジェン-1を含む二次元又は三次元足場中に埋め込まれながら投与される。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態では、グリコシル化タンパク質及び/又は医薬組成物は、末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血組織又は虚血後組織、特に、左心室、右心室、冠動脈、心筋組織、虚血組織又は虚血後組織への直接の注射によって、それを必要とする被験体に投与される。
【０１１１】
さらなる好ましい実施形態は、従属請求項の内容である。
【０１１２】
本発明は、以下に図面及び実施例により例示される。
【実施例】
【０１１３】
1. 胚様体の生成
hESC(H9)(Thomson, J.A., et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998. 282(5391): p. 1145〜1147)を、MEF(マウス胎児線維芽細胞)細胞(Millopore (#PMEF-CFL))に対する現在のプロトコール(WiCell Research Institute, Inc.)にしたがって培養した(図1も参照のこと)。単一細胞懸濁液のために、H9細胞コロニーを、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄し、TrypLE Select (Invitrogen, life technologies)とともに37℃で5分間インキュベートし、1mlピペットで再懸濁し、細胞ストレーナー(40μm、BD Falcon)を通過させた。細胞懸濁液を比1:1でPBSと混合し、遠心分離した(5分、1000 rpm)。細胞ペレットを、10ng/mlのBMP4(骨形成タンパク質4)及び10ng/mlのRho結合キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632(Sigma、St. Louis、MO)を有するmTeSR1培養培地(STEMCELL Technologies, Inc.、Vancouver、Canada)中に再懸濁し、細胞600000個/mlの懸濁液を作製した。細胞30000個(50μlの細胞懸濁液)を、円錐状ウェルを有する96ウェルプレート(96ウェルマイクロプレート、未処理、円錐底、Fisher Scientific)にウェル毎に分注した。96ウェルプレート中の細胞懸濁液を5分間1000rpmで遠心分離し、プレートを細胞培養インキュベーター中で一晩インキュベートした。
【０１１４】
2. 改変された心臓分化プロトコール
心臓分化のために、本発明者らは、Yang(Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature, 2008. 453(7194): p. 524〜528)及びWillemsら(Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res, 2011. 109(4): p. 360〜364)に記載された分化プロトコールの改変を使用した。分化の1日目に、一晩のインキュベーション後に、細胞凝集によってEB(胚様体)が形成し、EBを超低接着6ウェルプレート(Corning incorporated、New York、製品#3471)に1mlピペットで慎重に移した。1つの6ウェルは、3mlの、StemPro 34(Life technologies、Carlsbad、California、U.S.)＋3ng/mlのアクチビンA＋5ng/mlのbFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)＋10ng/mlのBMP4(ステージ1培地)中に最大200個のEBを保持することができる。同じ培地の変更を、分化の2又は3日目に要する。浮遊しているEBを、2mlの、ステージ1培地＋5μMのIWR-1(4-(1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロ-1,3-ジオキソ-4,7-メタノ-2H-イソインドール-2-イル)-N-8-キノリニル-ベンズアミド; 150ng/mlのDKK-1の代替として)を用いて、4日目に、0.1％ゼラチン被覆6ウェルに移した。EBを、翌日までプレートを動かさずにインキュベートした。5日目に、EBのほとんどはディッシュに接着しており、細胞がそれらから増殖していた。5日目から10日目に、接着したEBを、StemPro 34＋5ng/mlのVEGF(血管内皮増殖因子)＋10ng/mlのbFGF＋5μMのIWR-1からなるステージ2培地中で分化させた。同じ培地の変更を、分化の8日目に要した。接着したEBは、7又は8日目に拍動を開始し、10日目にさらなる分析のために回収した。
【０１１５】
3. 分析
分化状態を特定するために、フローサイトメトリー分析をサルコメアミオシン(MF20抗体)について行い、免疫蛍光染色を心臓トロポニンT(cTnT)及びサルコメアミオシンについて行った。加えて、リアルタイムPCRを、転写因子TbX5、cTnT及び心筋ミオシン(MYH6)のα重鎖の発現をモニターするために利用した。分化過程中の心臓特異的細胞外マトリックスの発現を、リアルタイムPCR及び免疫蛍光によって分析した。
【０１１６】
4. 結果
改変された細胞培養プロトコールを用いることによって、フローサイトメトリー分析(図2)及びリアルタイムPCR分析(図3a)、並びに免疫蛍光染色(図2e)によって特定されるように、多数の細胞が心臓系統に分化した。自発的に拍動している胚様体(85％+/-17.6％)の頑強かつ再現可能な生成が観察された。加えて、リアルタイムPCRは、心臓分化中のデコリン及びナイドジェン-1発現の有意な増加を有する、細胞外マトリックスタンパク質のステージ特異的及び培養条件特異的な発現を明らかにした(図3b及び3c)。分化の10日目における拍動している胚様体の免疫蛍光画像(図5参照)の半定量分析は、拍動している胚様体中のコラーゲンIV及びラミニンと比較して、デコリン及びナイドジェン-1、並びにフィブロネクチンの有意に高い量を明らかにした(図4及び表1)。
【０１１７】
表1は、図5の画像の正規化されたグレー値強度を示す。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
5. in vitro試験
ナイドジェン-1の心臓誘導効果のin vitro試験のために、細胞培養ディッシュを、0.1重量％のゼラチン(対照として)又は0.1重量％のゼラチン＋50μg/mlのヒトナイドジェン-1で被覆した。ヒトナイドジェン-1は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で組換え生産された。ヒト胚性幹細胞株H9から出発し、図1のプロトコールに記載されているように、心血管分化を行った。分化の4日目に、被覆培養ディッシュにEBを移した。心血管分化の効率の分析を、心筋細胞マーカーCTNT(心臓トロポニンT)についての蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析で行った。この分析の結果を図6に示す。
【０１２０】
図6は、対照被覆(0.1重量％のゼラチンのみ)と比較した、0.1重量％のゼラチン＋50μg/mlのナイドジェン-1での被覆上の心血管分化の10日目での、CTNT陽性細胞の割合の有意な増加を示す。n(ラン数)=3、p<0.05。
【０１２１】
6. in vivo試験
さらなるin vivo実験では、マウス心筋梗塞(MI)モデルを使用した。制御された梗塞事象(MI/R手順)の後、各マウスに、梗塞境界領域とも呼ばれる梗塞の境界域に50μg/mlのナイドジェン-1有り又は無しの不活性ヒドロゲル及びリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の混合物50μlを注射した。心エコー検査は、ナイドジェン-1処置を受けたマウスが、処置の2及び4週後の対照マウス(ナイドジェン-1注射無し)と比較して、駆出率(EF; 心臓機能のための重要なパラメーター)の有意な増加を示したことを明らかにした(図7も参照のこと)。
【０１２２】
7. マウス心臓の組織学的H＆E及びラッセル-モバットペンタクローム染色並びに免疫蛍光染色の結果
心筋細胞マーカータンパク質cTnTの組織学的染色（ラッセル-モバットペンタクローム)及び免疫蛍光(IF)染色を、MI/R(「心筋虚血/梗塞及び再灌流」)及び梗塞域周囲への50μg/mlのナイドジェン-1の注射又は対照注射の4週後のマウス心臓の同等の切片に対して行った(図8)。ナイドジェン-1又は対照注射による質的な差を、行った染色法の全てにおいて見ることができる。
【０１２３】
ラッセル-モバットペンタクローム染色を、梗塞及びナイドジェン-1を用いたその後の注射若しくは対照注射の、心臓組織のECMに対する影響を可視化するために実施した。この染色は、ECMリッチな梗塞域(薄い灰色)と、無傷の心筋を有する周囲の組織(濃い灰色)とを明確に区別する。ラッセル-モバットペンタクローム染色の薄い灰色は、梗塞域におけるプロテオグリカン、及びコラーゲンリッチなECM沈着を示す。ラッセル-モバットペンタクローム染色は、対照心臓(図8A、8B、8C)と比較して、ナイドジェン-1注射を受けた心臓(図8D、8E、8F)におけるより小さい梗塞域によって示されるように、より低い程度の病的リモデリングを特定する。コラーゲン沈着の空間的蓄積を対照心臓において見ることができるのに対し、ナイドジェン-1で処置した心臓におけるコラーゲン沈着は、より均等に分布しているように見える。
【０１２４】
心筋細胞マーカータンパク質cTnTのIF染色(薄い灰色)は、梗塞域と、cTnT陽性心筋細胞を有する非梗塞周囲心臓組織との明確な差異を示す。H＆E及びラッセル-モバットペンタクローム染色の結果にしたがって、cTnTのIF染色の定性分析は、対照処置(図8G、8H、8I)と比較して、ナイドジェン-1で処置したマウス心臓(図8J、8K、8L)における機能的な収縮性の心筋細胞を欠く、より小さな領域を特定する。
【０１２５】
したがって、これらの組織学的染色法の定性分析は、対照心臓と比較して、ナイドジェン-1処置が、心臓の形態のより良い保存及び保護を可能にすることを明らかにした。さらに、病的リモデリングの程度は、対照注射と比較して、ナイドジェン-1注射を受けた心臓においてより低い。
【０１２６】
8. in vivoマウスMI/R及びECM注射
UCLAにおける心筋梗塞のマウスモデルを、MI後のナイドジェン-1による心筋注射の効果を特定するために使用した。動物のケア及び手術は、プロトコール2011-042及び2013-057の下で、University of California、Los Angeles Animal Research Committeeにしたがって行った。8週齢の雌のC57BL/6Jマウス、株DLAMb6を、2.0％イソフルラン(Butler Schein、UK)を用いて麻酔し、加熱された手術用ボード上に配置し、フルニキシン(フルニキシンメグルミン、Schering-Plough Animal Health、USA)2.5mg/kgを皮下投与した。解剖顕微鏡下で、正中頸部切開を行い、PE-90プラスチックカテーテル(Stoelting社、USA)を挿管するための気管を露出させた。225〜250μlの換気量(tide volume)及び130ストローク/分の呼吸数を用いて酸素を供給するHarvardミニベント(Harvard Apparatus、Germany)にカテーテルを接続した。手術レベルの麻酔を、1〜1.5％のイソフルランでその後維持した。側方切開を第四肋間腔において行った。心臓を露出させ、左冠動脈を9-0ナイロン縫合糸(Ethicon、USA)を用いて起点から2mmで壁内で結紮した。閉塞のより簡単かつ安全な除去を可能にしながら、冠動脈を閉塞するために、縫合糸をプラスチックチューブ(PE-10)の小片の周りに結びつけた。この閉塞は45分間生じた。この時間の間、無菌雰囲気を維持するために、湿ったガーゼパッドを切開の上に配置した。左冠動脈によってもはや血液が供給されない心筋の局所的蒼白によって虚血を確認した。PE-10チューブ上の結び目を切断することにより再灌流させ、以前の蒼白領域における充血の出現によって再灌流を確認することができた。再灌流に起因して、梗塞領域は通常のピンクがかった赤色に変化した。このMI/R手順を10匹のマウスに行った。
【０１２７】
出血がないことを確認した後、動物は、心筋梗塞の境界域に注射を受けた。以下のセクション9に記載のように、ヒドロゲル及びECM注射を調製した。対照群の5匹の動物に、動物1匹あたり合計50μlのHyStem(登録商標)ヒドロゲル(Glycosan BioSystems、USA)＋PBSを注射した。ナイドジェン-1処置群では、5匹の動物は、動物1匹あたりそれぞれ合計50μlのHyStem(登録商標)ヒドロゲル＋PBS＋50μg/mlのナイドジェン-1の注射を受けた。各マウスについて、50μlの総注射体積を、LV心筋梗塞境界域の5部位における10μlの注射に分けた。
【０１２８】
マウス胸部を2層に閉じた。肋骨(内層)を断続パターンで6-0被覆ビクリル縫合糸(Ethicon、USA)を用いて閉じた。皮膚を表皮下で6-0ナイロン又は絹縫合糸(Covidien、UK)を用いて閉じた。麻酔を停止し、マウスを数分間回復させ、その後、気管内チューブを除去した。痛みの緩和のために、マウスは手術後にバナミン(2.5mg/kg)の腹腔内注射を受けた。
【０１２９】
9. MI/R後注射のためのヒドロゲル及びECMの調製
ヒドロゲル＋ECM注射のための全ての手順は無菌条件下で行った。ヒドロゲルは、2つの成分HyStem(登録商標)及びExtralink(Glycosan BioSystems、USA)からなり、凍結乾燥された固体を製造業者の指示にしたがってDG(脱気、脱イオン)水中に溶解し、HyStemとExtralinkを1:4の体積比で混合することによって調製された。これらの2成分を混合すると、HyStem(登録商標)ヒドロゲルのゲル化が20分以内に起こった。各マウスについて、合計50μlのHyStem(登録商標)ヒドロゲル＋PBS±ECMタンパク質を要した。したがって、調製チューブ又はシリンジ中の可能性のある残留のため、マウス1匹あたり70μlを調製した。注射可能混合物70μlに対して、8.4μlがHyStem及びExtralink混合物からなった。対照群では、残りの61.6μlは滅菌PBSであった。ナイドジェン-1処置群では、ナイドジェン-1を、50μg/mlのナイドジェン-1の総濃度のために適切に添加した。
【０１３０】
10. 心エコー検査及びVevo負荷(strain)分析
意識的(conscious)心エコー検査を、4つの異なる時点で行った。ベースラインの心エコー検査の測定を、MI/R手順の前に、各マウスに行った。図7に示すように、連続的な性質で、さらなる心エコー検査の測定を、心臓機能、特に駆出率を追跡するために、MI/R及び心筋注射手順の2日及び2週及び4週後に行った。
【０１３１】
心エコー画像化のために、高周波超音波イメージングシステムVevo 2100(VisualSonics、Canada)を、MS400トランスデューサー18-38 MHzを用いて、in vivoで非侵襲的に顕微画像化する意識のあるマウスに適用した。麻酔は心拍に影響を与え、これにより、実験結果に影響を与え得るため、心エコー検査を、意識のあるマウスに行った。心筋性能を、Vevo LABソフトウェアを用いて評価し、これは、局所的及び全体的な壁運動の追跡を可能にし、負荷の定量化を提供する。
【０１３２】
意識的心エコー検査の前に、除毛クリーム(Nair、Church & Dwight、USA)を3〜5分使用してマウス胸部から毛を除去した。動物をプラットホーム上に拘束し、苦痛を最小にするために迅速に心エコー検査を行った。また、動物が苦痛の徴候を示した場合、動物を拘束から解放した。行ったプロトコールは、Chancellor's Animal Research Committee(ARC-OARO)で承認された。マウスは、4週の心エコー検査後に屠殺し、その心臓を組織学的調査のために外植した。
【図１】
0006486354.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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