(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造（Ｉ）のリンカー−薬物化合物であって、
【化１１９】
0006621919.tif 000219
式中、
Ｘが、
【化１３６】
0006621919.tif 000220
【化１３７】
0006621919.tif 000221
【化１３８】
0006621919.tif 000222
からなる群から選択される脱離基であり、
前記脱離基Ｘ及び硫黄原子Ｓが、ジスルフィド結合を介して結合し、
Ｒ１及びＲ２が独立して、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ３から選択されるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、４〜６員環もしくは酸素ヘテロ原子を含む４〜６員環を形成し、
Ｓｐが、スペーサーであり、ｎが、０または１であり、及び
Ｄが、マイタンシン、オーリスタチン、ドラスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）単量体または以下の構造：
【化１３９】
0006621919.tif 000223
（ｎは０または１である）を有する二量体、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）単量体または二量体、およびＣＢＩ−ＰＢＤ二量体から選択される薬物部分である、前記リンカー−薬物化合物。
【請求項２】
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が−ＣＨ２ＣＨ３であるか；または（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロブチル、シクロペンチル、テトラヒドロフラン、シクロヘキシル、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、請求項１に記載のリンカー−薬物化合物。
【請求項３】
構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物であって、
【化１２６】
0006621919.tif 000224
式中、
担体が、システイン硫黄原子ＳＡを含み、
ｐが、１、２、３、４、５、６、７、または８であり、
Ｒ１及びＲ２が独立して、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ３から選択されるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、４〜６員環もしくは酸素ヘテロ原子を含む４〜６員環を形成し、
Ｓｐが、スペーサーであり、ｎが、０または１であり、
Ｄが、マイタンシン、オーリスタチン、ドラスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）単量体または以下の構造：
【化１４０】
0006621919.tif 000225
（ｎは０または１である）を有する二量体、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）単量体または二量体、およびＣＢＩ−ＰＢＤ二量体から選択される薬物部分である、前記ジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２が、−ＣＨ２ＣＨ３であるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項５】
前記担体が、（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原２）、（４）ＭＵＣ１６（０７７２Ｐ、ＣＡ１２５）、（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、（６）Ｎａｐｉ２ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、（８）ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子）、（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）もしくはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ７３７９２）、（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、（１７）ＨＥＲ２、（１８）ＮＣＡ、（１９）ＭＤＰ、（２０）ＩＬ２０Ｒα、（２１）Ｂｒｅｖｉｃａｎ、（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、（２３）ＡＳＬＧ６５９、（２４）ＰＳＣＡ、（２５）ＧＥＤＡ、（２６）−ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３）、（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）、（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ）、（２９’ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１）、（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開閉型イオンチャネル５）、（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、（３５）ＦｃＲＨ５（ＩＲＴＡ２、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）、（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグ���カン）、（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン−１）、（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ−１）、（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２（アフリカツメガエル）、ＳＨＩＳＡ２）、（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、（５２）ＣＤ３３、ならびに（５３）ＣＬＬ−１から選択される１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体である、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項６】
前記抗体が、システイン操作された抗体である、請求項５に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項７】
前記システイン操作された抗体が、ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ、ＨＣ  Ａ１１８Ｃ、ＬＣ  Ｓ１２１Ｃ、またはＬＣ  Ｖ２０５Ｃをリンカーコンジュゲートの部位として含む、請求項６に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項８】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３３、抗Ｎａｐｉ２ｂ、及び抗ＣＬＬ−１から選択される、請求項５に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項９】
ｐが、１、２、３、または４である、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項１０】
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物の混合物を含み、前記抗体−薬物コンジュゲート化合物の混合物中の１抗体当たりの平均薬物負荷が、約２〜約５である、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項１１】
前記担体が、タンパク質である、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項１２】
前記タンパク質が、アルブミンである、請求項１１に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項１３】
前記担体が、ペプチドである、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドが、細胞透過性ペプチドアンテナペディアホメオドメイン、Ｔａｔ  ＨＩＶタンパク質、及び操作されたカチオン性ペプチドから選択される、請求項１３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項１５】
構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物を調製する方法であって、
【化１２８】
0006621919.tif 000226
前記方法が、
（Ａ）
（ｉ）水を含む、溶媒系、
（ｉｉ）リンカー硫黄原子に結合して、前記ジスルフィド結合を形成することができる硫黄原子ＳＡを有するスルフヒドリル部分を有する少なくとも１つのシステインを含む、担体、及び
（ｉｉｉ）構造（Ｉ）の化学量論過剰のリンカー−薬物コンジュゲート化合物であって、
【化１２９】
0006621919.tif 000227
式中、
Ｘが、
【化１４１】
0006621919.tif 000228
【化１４２】
0006621919.tif 000229
【化１４３】
0006621919.tif 000230
からなる群から選択される脱離基であり、
前記脱離基及び前記リンカーが、ジスルフィド結合を介して結合し、
Ｒ１及びＲ２が独立して、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ３から選択されるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、４〜６員環もしくは酸素ヘテロ原子を含む４〜６員環を形成し、
Ｓｐが、スペーサーであり、ｎが、０または１であり、
Ｄが、マイタンシン、オーリスタチン、ドラスタチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）単量体または以下の構造：
【化１４４】
0006621919.tif 000231
（ｎは０または１である）を有する二量体、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）単量体または二量体、およびＣＢＩ−ＰＢＤ二量体から選択される薬物部分である、リンカー−薬物コンジュゲート化合物を含む、反応混合物を形成することと、
（Ｂ）前記反応混合物を反応させて、構造（ＩＩ）の前記ジスルフィドコンジュゲート化合物を含む生成混合物を形成することであって、式中、ｐが、１、２、３、４、５、６、７、または８であり、前記生成混合物中の複数の形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物のｐの平均値が、約１〜約５、約１．５〜約３、約１．５〜約２．５、約１．７〜約２．３、約１．８〜約２．２、または約２である、形成することと、を含む、前記方法。
【請求項１６】
（ｉ）Ｒ１及びＲ２が、−ＣＨ２ＣＨ３であるか；または（ｉｉ）Ｒ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
治療有効量の化学療法剤を更に含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
癌を治療するための、請求項１７または請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、化学療法剤と組み合わせて前記患者に投与されることを特徴とする、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
哺乳動物における癌の治療のための医薬品の製造における、請求項３〜１４のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物の使用。
【請求項２２】
癌の治療において使用するための、請求項３〜１４のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物を含む薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１７または請求項１８に記載の薬学的組成物と、容器と、前記薬学的組成物が癌の治療に使用され得ることを示す添付文書またはラベルと、を含む、製造品。
【請求項２４】
Ｘが、
【化１４５】
0006621919.tif 000232
からなる群から選択される、請求項１に記載のリンカー−薬物化合物。
【請求項２５】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ−ＣＨ３である、請求項１に記載のリンカー−薬物化合物。
【請求項２６】
Ｒ１およびＲ２が、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、オキセタン、テトラヒドロフラン及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、請求項１に記載のリンカー−薬物化合物。
【請求項２７】
ｎが０である、請求項１に記載のリンカー−薬物化合物。
【請求項２８】
ｎが１であり、Ｓｐ−Ｄが、構造：
【化１４６】
0006621919.tif 000233
であり、波線が、前記スペーサーの前記リンカーカルボニル炭素原子への結合点を示し、そしてＲ３０がＨおよび−ＣＨ３から選択される、請求項１に記載のリンカー−薬物化合物。
【請求項２９】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ−ＣＨ３である、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項３０】
Ｒ１およびＲ２が、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、オキセタン、テトラヒドロフラン及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項３１】
ｎが０である、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【請求項３２】
ｎが１であり、Ｓｐ−Ｄが、構造：
【化１４７】
0006621919.tif 000234
であり、波線が、前記スペーサーの前記リンカーカルボニル炭素原子への結合点を示し、そしてＲ３０がＨおよび−ＣＨ３から選択される、請求項３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１５／０９２０８４号の優先利益を主張する。
【０００２】
本開示の分野は一般に、選択的担体、束縛リンカー、及び薬物部分を含むコンジュゲートを調製する方法に関し、リンカーは、ジスルフィド結合によって選択的担体にコンジュゲートされる。
【背景技術】
【０００３】
選択的担体−リンカー−薬物構造（例えば、抗体−薬物コンジュゲート、つまりＡＤＣ）を含むコンジュゲートは、標的細胞に対する選択性の理想的な特性と細胞傷害性薬物とを組み合わせるため、それらは、魅力的な選択的化学療法分子である。選択的担体としては、タンパク質、ペプチド、及び抗体が挙げられる。強力な細胞傷害性薬物を標的細胞に指向することによって、非標的化細胞に対する影響を最小化しながら、標的細胞中で所望される治療効果を増強することができる。所与の標的細胞の選択的担体−リンカー−薬物コンジュゲート開発の成功は、他の要素の中でも、担体選択の最適化、血流中のリンカーの安定性、有効量の薬物の放出のために十分な細胞内のリンカーの犠牲、細胞傷害性薬物の効力、及び抗体に対するリンカー−薬物コンジュゲーションの様式に依存する。より具体的には、効果的な担体薬物コンジュゲートは、以下、（ｉ）抗体が標的に対する十分な特異性を保持し、薬物有効性が維持される、担体薬物コンジュゲート形成方法、（ｉｉ）血液中の薬物放出を制限するのに十分な、担体薬物コンジュゲート安定性、（ｉｉｉ）治療的細胞内担体薬物コンジュゲート濃度を達成するのに十分な、細胞膜輸送効率（エンドサイトーシス）、（ｉｖ）治療薬物濃度を達成するのに十分な、担体薬物コンジュゲートからの十分な細胞内薬物放出、及び（ｖ）ナノモルまたはナノモル以下の量での薬物細胞傷害性のうちの少なくとも１つ以上を特徴とする。
【０００４】
問題となるのは、効果的な血流安定性及び担体薬物コンジュゲートからの効果的な細胞内薬物放出が、典型的には当技術分野において既知である選択的担体薬物コンジュゲートに関連付けられ、反比例するため、血液安定性を呈するコンジュゲートもまた、不良な細胞内薬物放出も呈することである。
【０００５】
したがって、血流中で安定しており、効果的な細胞内薬物放出を提供する、効果的な選択的担体−リンカー−薬物コンジュゲートに対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示は、構造（Ｉ）のリンカー−薬物コンジュゲート化合物に関する。
【化１】
0006621919.tif 000002
Ｘは、脱離基である。脱離基Ｘ及び硫黄原子Ｓは、ジスルフィド結合を介して結合する。Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、任意で酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環を形成しする。Ｓｐは、任意の犠牲スペーサーであり、ｎは、０または１であり、Ｄは、薬物部分である。
【０００７】
いくつかの他の実施形態において、本開示は、構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物に関する。
【化２】
0006621919.tif 000003
担体は、システイン硫黄原子ＳＡを含む。ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８である。Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、任意で酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環を形成しする。Ｓｐは、任意のスペーサーであり、ｎは、０または１であり、Ｄは、薬物部分である。
【０００８】
いくつかの他の実施形態において、本開示は、構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物を調製する方法に関する。
【化３】
0006621919.tif 000004
【０００９】
本方法は、（ｉ）水を含む、溶媒系、（ｉｉ）リンカー硫黄原子に結合して、ジスルフィド結合を形成することができる硫黄原子ＳＡを有するスルフヒドリル部分を有する少なくとも１つのシステインを含む、担体、及び（ｉｉｉ）構造（Ｉ）の化学量論過剰のリンカー−薬物コンジュゲート化合物を含む反応混合物を形成することを含む。
【化４】
0006621919.tif 000005
【００１０】
Ｘは、脱離基であり、脱離基及びリンカーは、ジスルフィド結合を介して結合し、各Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、任意で酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環を形成し、Ｓｐは、任意のスペーサーであり、ｎは、０または１であり、Ｄは、薬物部分である。反応混合物を反応させて、構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物を含む生成混合物が形成され、式中、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり、生成混合物中の複数の形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物のｐの平均値は、約１〜約５、約１．５〜約３、約１．５〜約２．５、約１．７〜約２．３、約１．８〜約２．２、または約２である。
【００１１】
いくつかの他の実施形態において、本開示は、本明細書で他に記載されるジスルフィドコンジュゲート化合物と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。いくつかの他の態様において、本開示は、患者に薬学的組成物を投与することを含む、癌を治療する方法に関する。
【００１２】
いくつかの他の実施形態において、本開示は、癌の治療のための方法において使用するための、本明細書で他に記載される抗体−薬物コンジュゲート化合物に関する。
【００１３】
いくつかの他の実施形態において、本開示は、本明細書で他に記載される抗体−薬物コンジュゲート化合物を作製する方法であって、抗体を、本明細書で他に記載される式（Ｉ）のリンカー−薬物化合物と反応させることを含む、方法に関する。
【００１４】
いくつかの他の実施形態において、本開示は、本明細書で他に記載される薬学的組成物と、容器と、薬学的組成物が癌の治療に使用され得ることを示す添付文書またはラベルとを含む製造品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のハーセプチン４Ｄ５  ＨＣ  Ａ１１８Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−薬物コンジュゲートを含む反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例４で更に考察されるように）脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子はシクロプロピルで束縛され、薬物はピロロベンゾジアゼピンであった。
【図２】抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のハーセプチン４Ｄ５  ＨＣ  Ａ１１８Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−薬物コンジュゲートを含む反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例４で更に考察されるように）脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子はシクロブチルで束縛され、薬物はピロロベンゾジアゼピンであった。
【図３】図３Ａは、抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−薬物コンジュゲートを含む反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基はメチルスルホン酸であった。（以下の実施例５で更に考察されるように）図３Ａはリンカー１の結果を描写し、図３Ｂはリンカー２の結果を描写する。    図３Ｂは、抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−薬物コンジュゲートを含む反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基はメチルスルホン酸であった。（以下の実施例５で更に考察されるように）図３Ａはリンカー１の結果を描写し、図３Ｂはリンカー２の結果を描写する。
【図４】図４Ａは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図４Ａ〜４Ｄは、（以下の実施例６で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図４Ｂは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図４Ａ〜４Ｄは、（以下の実施例６で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図４Ｃは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図４Ａ〜４Ｄは、（以下の実施例６で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図４Ｄは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図４Ａ〜４Ｄは、（以下の実施例６で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
【図５】図５Ａは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は３，５−ジニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図５Ａ〜５Ｄは、（以下の実施例７で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図５Ｂは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は３，５−ジニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図５Ａ〜５Ｄは、（以下の実施例７で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図５Ｃは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は３，５−ジニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図５Ａ〜５Ｄは、（以下の実施例７で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図５Ｄは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は３，５−ジニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図５Ａ〜５Ｄは、（以下の実施例７で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
【図６】図６Ａは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化５】
0006621919.tif 000006
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図６Ａ〜６Ｄは、（以下の実施例８で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
図６Ｂは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化６】
0006621919.tif 000007
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図６Ａ〜６Ｄは、（以下の実施例８で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
図６Ｃは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化７】
0006621919.tif 000008
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図６Ａ〜６Ｄは、（以下の実施例８で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
図６Ｄは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化８】
0006621919.tif 000009
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図６Ａ〜６Ｄは、（以下の実施例８で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
【図７】図７Ａは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化９】
0006621919.tif 000010
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図７Ａ〜７Ｄは、（以下の実施例９で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
図７Ｂは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化１０】
0006621919.tif 000011
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図７Ａ〜７Ｄは、（以下の実施例９で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
図７Ｃは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化１１】
0006621919.tif 000012
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図７Ａ〜７Ｄは、（以下の実施例９で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
図７Ｄは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は
【化１２】
0006621919.tif 000013
であり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。図７Ａ〜７Ｄは、（以下の実施例９で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
【図８】図８Ａは、ｐＨ８．５で形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を異なる脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例１０で更に考察されるように）脱離基は以下の通りであり、
【化１３】
0006621919.tif 000014
各リンカーの硫黄原子を有する炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。
図８Ｂは、ｐＨ８．５で形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を異なる脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例１０で更に考察されるように）脱離基は以下の通りであり、
【化１４】
0006621919.tif 000015
各リンカーの硫黄原子を有する炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。
図８Ｃは、ｐＨ８．５で形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を異なる脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例１０で更に考察されるように）脱離基は以下の通りであり、
【化１５】
0006621919.tif 000016
各リンカーの硫黄原子を有する炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。
図８Ｄは、ｐＨ８．５で形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を異なる脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例１０で更に考察されるように）脱離基は以下の通りであり、
【化１６】
0006621919.tif 000017
各リンカーの硫黄原子を有する炭素原子は２つのメチル基で束縛されていた。
【図９】図９Ａは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、ＡＤＣを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛され、薬物はマイタンシノイドであった。図９Ａ〜９Ｄは、（以下の実施例１１で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図９Ｂは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、ＡＤＣを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛され、薬物はマイタンシノイドであった。図９Ａ〜９Ｄは、（以下の実施例１１で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図９Ｃは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、ＡＤＣを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛され、薬物はマイタンシノイドであった。図９Ａ〜９Ｄは、（以下の実施例１１で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。    図９Ｄは、様々なｐＨで形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上のＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−薬物構成成分と反応させることによって形成される、ＡＤＣを含む、４つの反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、脱離基は５−ニトロピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子は２つのメチル基で束縛され、薬物はマイタンシノイドであった。図９Ａ〜９Ｄは、（以下の実施例１１で更に考察されるように）それぞれｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中で形成される、抗体−リンカー−プローブコンジュゲートのＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩ結果を描写する。
【図１０】図１０Ａは、それぞれｐＨ５及びｐＨ８で形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上の抗ＨＥＲ２  ４Ｄ５  ＨＣ  Ａ１１８Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例１３で更に考察されるように）脱離基はピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子はメチル基で束縛されていた。    図１０Ｂは、それぞれｐＨ５及びｐＨ８で形成され、かつ抗体がジスルフィド結合によってリンカーに結合しており、１つ以上の抗ＨＥＲ２  ４Ｄ５  ＨＣ  Ａ１１８Ｃ抗体システインチオール基を脱離基−Ｓ−リンカー−プローブ構成成分と反応させることによって形成される、抗体−プローブコンジュゲートを含む、反応生成混合物の面積パーセントによる純度を描写する、ＬＣ／ＭＳ  ＥＳＩスキャンであり、（以下の実施例１３で更に考察されるように）脱離基はピリジンであり、硫黄原子を有するリンカー炭素原子はメチル基で束縛されていた。
【図１１Ａ】「１９−１」、「１９−２」、「２０−１」、「２０−２」、「２１−１」、及び「２１−２」と指定される化合物の細胞生存率％対対数濃度［μＭ］を描写する。化合物１９−１は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物１９−２は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物２０−１は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２０−２は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２１−１は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。化合物２１−２は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
【図１１Ｂ】「１９−１」、「１９−２」、「２０−１」、「２０−２」、「２１−１」、及び「２１−２」と指定される化合物の細胞生存率％対対数濃度［μＭ］を描写する。化合物１９−１は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物１９−２は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物２０−１は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２０−２は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２１−１は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。化合物２１−２は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
【図１１Ｃ】「１９−１」、「１９−２」、「２０−１」、「２０−２」、「２１−１」、及び「２１−２」と指定される化合物の細胞生存率％対対数濃度［μＭ］を描写する。化合物１９−１は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物１９−２は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物２０−１は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２０−２は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２１−１は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。化合物２１−２は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
【図１１Ｄ】「１９−１」、「１９−２」、「２０−１」、「２０−２」、「２１−１」、及び「２１−２」と指定される化合物の細胞生存率％対対数濃度［μＭ］を描写する。化合物１９−１は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物１９−２は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物２０−１は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２０−２は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２１−１は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。化合物２１−２は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
【図１１Ｅ】「１９−１」、「１９−２」、「２０−１」、「２０−２」、「２１−１」、及び「２１−２」と指定される化合物の細胞生存率％対対数濃度［μＭ］を描写する。化合物１９−１は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物１９−２は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物２０−１は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２０−２は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２１−１は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。化合物２１−２は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
【図１１Ｆ】「１９−１」、「１９−２」、「２０−１」、「２０−２」、「２１−１」、及び「２１−２」と指定される化合物の細胞生存率％対対数濃度［μＭ］を描写する。化合物１９−１は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物１９−２は、メチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ａ及び１１Ｂ）。化合物２０−１は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２０−２は、シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。化合物２１−１は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＣＤ２２  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。化合物２１−２は、シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを含む、ＰＢＤ二量体抗ＮａＰｉ  ＡＤＣであり、ＣＤ２２発現ＢＪＡＢ及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞株に対して評価された（図１１Ｅ及び１１Ｆ）。
【図１２Ａ】経時的なジスルフィド切断及び犠牲生成物の相対存在量を描写する。薬物類似体１（メチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において「１」と指定されるＰＢＤ二量体）、薬物類似体２（シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において「２」と指定されるＰＢＤ二量体）、ならびに薬物類似体１１（シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において「１１」と指定されるＰＢＤ二量体）のインキュベーションから、ＬＣ／ＭＳによって生成物を監視した。インキュベーションは、０．２ｍＭのシステイン（図Ａ１、Ａ２、及びＡ３）、０．０３ｍＭのシステイン（図Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）、４ｍＭのグルタチオン（図Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）、ならびに０．０３ｍＭのグルタチオン（図Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃で行った。図Ａ１〜Ｄ３において、ＰＢＤ二量体負荷量は「８」と指定する。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物３ａ及び３ｂ（それぞれ「３ａ」及び「３ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物３ａ）及びグルタチオン（化合物３ｂ）にコンジュゲートされる（メチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ４において、化合物４ａ及び４ｂ（それぞれ「４ａ」及び「４ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物４ａ）及びグルタチオン（化合物４ｂ）にコンジュゲートされる（シクロプロピル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体２を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１２ａ及び１２ｂ（それぞれ「１２ａ」及び「１２ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物１２ａ）及びグルタチオン（化合物１２ｂ）（シクロブチル）にコンジュゲートされる（シクロブチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１１を指す。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物６（「６」と指定される）は、化合物３ａ及び３ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において、化合物７（「７」と指定される）は、化合物４ａ及び４ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１３（「１３」と指定される）は、化合物１２ａ及び１２ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。
【図１２Ｂ】経時的なジスルフィド切断及び犠牲生成物の相対存在量を描写する。薬物類似体１（メチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において「１」と指定されるＰＢＤ二量体）、薬物類似体２（シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において「２」と指定されるＰＢＤ二量体）、ならびに薬物類似体１１（シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において「１１」と指定されるＰＢＤ二量体）のインキュベーションから、ＬＣ／ＭＳによって生成物を監視した。インキュベーションは、０．２ｍＭのシステイン（図Ａ１、Ａ２、及びＡ３）、０．０３ｍＭのシステイン（図Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）、４ｍＭのグルタチオン（図Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）、ならびに０．０３ｍＭのグルタチオン（図Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃で行った。図Ａ１〜Ｄ３において、ＰＢＤ二量体負荷量は「８」と指定する。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物３ａ及び３ｂ（それぞれ「３ａ」及び「３ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物３ａ）及びグルタチオン（化合物３ｂ）にコンジュゲートされる（メチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ４において、化合物４ａ及び４ｂ（それぞれ「４ａ」及び「４ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物４ａ）及びグルタチオン（化合物４ｂ）にコンジュゲートされる（シクロプロピル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体２を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１２ａ及び１２ｂ（それぞれ「１２ａ」及び「１２ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物１２ａ）及びグルタチオン（化合物１２ｂ）（シクロブチル）にコンジュゲートされる（シクロブチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１１を指す。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物６（「６」と指定される）は、化合物３ａ及び３ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において、化合物７（「７」と指定される）は、化合物４ａ及び４ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１３（「１３」と指定される）は、化合物１２ａ及び１２ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。
【図１２Ｃ】経時的なジスルフィド切断及び犠牲生成物の相対存在量を描写する。薬物類似体１（メチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において「１」と指定されるＰＢＤ二量体）、薬物類似体２（シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において「２」と指定されるＰＢＤ二量体）、ならびに薬物類似体１１（シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において「１１」と指定されるＰＢＤ二量体）のインキュベーションから、ＬＣ／ＭＳによって生成物を監視した。インキュベーションは、０．２ｍＭのシステイン（図Ａ１、Ａ２、及びＡ３）、０．０３ｍＭのシステイン（図Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）、４ｍＭのグルタチオン（図Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）、ならびに０．０３ｍＭのグルタチオン（図Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃で行った。図Ａ１〜Ｄ３において、ＰＢＤ二量体負荷量は「８」と指定する。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物３ａ及び３ｂ（それぞれ「３ａ」及び「３ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物３ａ）及びグルタチオン（化合物３ｂ）にコンジュゲートされる（メチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ４において、化合物４ａ及び４ｂ（それぞれ「４ａ」及び「４ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物４ａ）及びグルタチオン（化合物４ｂ）にコンジュゲートされる（シクロプロピル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体２を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１２ａ及び１２ｂ（それぞれ「１２ａ」及び「１２ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物１２ａ）及びグルタチオン（化合物１２ｂ）（シクロブチル）にコンジュゲートされる（シクロブチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１１を指す。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物６（「６」と指定される）は、化合物３ａ及び３ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において、化合物７（「７」と指定される）は、化合物４ａ及び４ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１３（「１３」と指定される）は、化合物１２ａ及び１２ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。
【図１２Ｄ】経時的なジスルフィド切断及び犠牲生成物の相対存在量を描写する。薬物類似体１（メチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において「１」と指定されるＰＢＤ二量体）、薬物類似体２（シクロプロピル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において「２」と指定されるＰＢＤ二量体）、ならびに薬物類似体１１（シクロブチル−束縛ジスルフィドリンカーを有し、図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において「１１」と指定されるＰＢＤ二量体）のインキュベーションから、ＬＣ／ＭＳによって生成物を監視した。インキュベーションは、０．２ｍＭのシステイン（図Ａ１、Ａ２、及びＡ３）、０．０３ｍＭのシステイン（図Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）、４ｍＭのグルタチオン（図Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）、ならびに０．０３ｍＭのグルタチオン（図Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃で行った。図Ａ１〜Ｄ３において、ＰＢＤ二量体負荷量は「８」と指定する。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物３ａ及び３ｂ（それぞれ「３ａ」及び「３ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物３ａ）及びグルタチオン（化合物３ｂ）にコンジュゲートされる（メチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ４において、化合物４ａ及び４ｂ（それぞれ「４ａ」及び「４ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物４ａ）及びグルタチオン（化合物４ｂ）にコンジュゲートされる（シクロプロピル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体２を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１２ａ及び１２ｂ（それぞれ「１２ａ」及び「１２ｂ」と指定される）は、ジスルフィド結合を介してシステイン（化合物１２ａ）及びグルタチオン（化合物１２ｂ）（シクロブチル）にコンジュゲートされる（シクロブチル−束縛ジスルフィドを有する）薬物類似体１１を指す。図Ａ１、Ｂ１、Ｃ１、及びＤ１において、化合物６（「６」と指定される）は、化合物３ａ及び３ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ２、Ｂ２、Ｃ２、及びＤ２において、化合物７（「７」と指定される）は、化合物４ａ及び４ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。図Ａ３、Ｂ３、Ｃ３、及びＤ３において、化合物１３（「１３」と指定される）は、化合物１２ａ及び１２ｂのジスルフィド還元／犠牲生成物を指す。
【図１３】ヒトＢ細胞リンパ腫ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２異種移植片を有するマウスにおける、「１−１」、「２−１」、「３−１」、「２−２」、及び「３−２」と指定される化合物の、平均腫瘍体積（ｍｍ３）での抗腫瘍効果対ジスルフィド連結ＰＢＤ  ＡＤＣの用量後期間（日）を描写する。化合物１−１は、ジスルフィドリンカーがメチル部分で束縛されている抗ＣＤ２２  ＰＢＤ二量体ＡＤＣであった。化合物２−１は、ジスルフィドリンカーがシクロプロピル部分で束縛されている抗ＣＤ２２  ＰＢＤ二量体ＡＤＣであった。化合物３−１は、ジスルフィドリンカーがシクロブチル部分で束縛されている抗ＣＤ２２  ＰＢＤ二量体ＡＤＣであった。化合物２−２は、ジスルフィドリンカーがシクロプロピル部分で束縛されている非標的対照抗ＮａＰｉ  ＰＢＤ二量体ＡＤＣであった。化合物３−２は、ジスルフィドリンカーがシクロブチル部分で束縛されている非標的対照抗ＮａＰｉ  ＰＢＤ二量体ＡＤＣであった。
【図１４】図１３の化合物１−１、２−１、３−１、２−２、及び３−２の平均体重変化％対期間（日）でのマウスの許容性を描写する。
【図１５】正規化した平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）％対用量後期間（日）に関する、図１３及び１４の化合物１−１、２−１、及び３−１のインビボ安定性を描写する。
【図１６Ａ】緩衝液（１６Ａ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（１６Ｂ）中、３７℃で１時間インキュベートした、シクロプロピルチオール化合物７（Ｎ１０位に構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（シクロプロピル）−ＳＨのシクロプロピルチオール部分を有するＰＢＤ）のＤＮＡ結合潜在性を描写する。図１６Ｃ及び１６Ｄは、緩衝液（図１６Ｃ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（図１６Ｄ）中、３７℃で１時間インキュベートした、ＰＢＤ二量体８のＤＮＡ結合潜在性を描写する。
【図１６Ｂ】緩衝液（１６Ａ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（１６Ｂ）中、３７℃で１時間インキュベートした、シクロプロピルチオール化合物７（Ｎ１０位に構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（シクロプロピル）−ＳＨのシクロプロピルチオール部分を有するＰＢＤ）のＤＮＡ結合潜在性を描写する。図１６Ｃ及び１６Ｄは、緩衝液（図１６Ｃ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（図１６Ｄ）中、３７℃で１時間インキュベートした、ＰＢＤ二量体８のＤＮＡ結合潜在性を描写する。
【図１６Ｃ】緩衝液（１６Ａ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（１６Ｂ）中、３７℃で１時間インキュベートした、シクロプロピルチオール化合物７（Ｎ１０位に構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（シクロプロピル）−ＳＨのシクロプロピルチオール部分を有するＰＢＤ）のＤＮＡ結合潜在性を描写する。図１６Ｃ及び１６Ｄは、緩衝液（図１６Ｃ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（図１６Ｄ）中、３７℃で１時間インキュベートした、ＰＢＤ二量体８のＤＮＡ結合潜在性を描写する。
【図１６Ｄ】緩衝液（１６Ａ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（１６Ｂ）中、３７℃で１時間インキュベートした、シクロプロピルチオール化合物７（Ｎ１０位に構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（シクロプロピル）−ＳＨのシクロプロピルチオール部分を有するＰＢＤ）のＤＮＡ結合潜在性を描写する。図１６Ｃ及び１６Ｄは、緩衝液（図１６Ｃ）または１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡ（図１６Ｄ）中、３７℃で１時間インキュベートした、ＰＢＤ二量体８のＤＮＡ結合潜在性を描写する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
これより本発明の特定の実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の構造及び式に例示されている。本発明は、列挙される実施形態と併せて説明される一方で、それらは、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、全ての代替形、修正形、及び同等物を網羅することが意図されており、それらは、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る。
【００１７】
当業者であれば、本発明の実施に使用することができる、本明細書に記載されるものに類似または同等である多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されるものではない。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本開示は一般に、改善された血流安定性及び細胞内薬物放出を有するコンジュゲートの調製を可能にする、ジスルフィドコンジュゲートを調製する方法及びジスルフィドコンジュゲート自体を対象とする。より具体的には、本開示は、選択的担体−Ｓ−Ｓ−束縛リンカー−薬物コンジュゲートを含むそのようなジスルフィドコンジュゲート；水を含むか、または主に水を含む溶媒と、少なくとも１つのシステインスルフヒドリル部分を有する選択的担体と、脱離基−Ｓ−Ｓ−束縛リンカー−薬物化合物とを含む反応混合物を形成することを含む、調製方法を対象とする。反応混合物を反応させて、構造（ＩＩ）の選択的担体−Ｓ−Ｓ−束縛リンカー−薬物コンジュゲートを含む反応生成混合物が形成される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本開示は一般に、一般構造（Ｉ）のリンカー−薬物コンジュゲート、つまり、構造、脱離基−Ｓ−Ｓ−束縛リンカー−薬物を有するコンジュゲートを更に対象とする。本開示の脱離基は、水を含むか、または主に水を含む溶媒系中の選択的担体のシステインチオールへの束縛リンカー−薬物のバイオコンジュゲーションを可能にするのに十分な反応性を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示は一般に、一般構造、選択的担体−Ｓ−Ｓ−束縛リンカー−薬物（すなわち、構造（ＩＩ））を有するジスルフィドコンジュゲートを更に対象とする。コンジュゲートは、血流中の安定性を提供し、効果的な細胞内薬物放出もまた提供する。
【００２１】
他の実施形態は、本開示のジスルフィドコンジュゲートを含む薬学的組成物、ジスルフィドコンジュゲートを含む薬学的組成物を投与することによって癌を治療する方法、癌の治療のための医薬品の製造におけるジスルフィドコンジュゲートの使用、癌の治療のための方法において使用するための本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物、本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物を作製する方法であって、担体を本開示のリンカー−薬物化合物と反応させることを含む、方法、及び癌の治療において使用するためのパッケージ化された本開示のジスルフィドコンジュゲート薬学的組成物を対象とする。
【００２２】
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有し、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、及びＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋと一貫している。
【００２３】
「リンカー」（Ｌ）は、１つ以上の薬物部分（Ｄ）を抗体（Ａｂ）などの担体に連結して、一般式、
担体−［Ｌ−Ｄ］ｐ
（式中、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８であり得る）の担体−リンカー−薬物コンジュゲートを形成するために使用することができる、二機能性または多機能性部分である。いくつかの実施形態において、担体−Ｄコンジュゲートは、薬物に及び担体に共有結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して、調製することができる。例えば、いくつかの実施形態において、システイン操作された抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカーの反応性官能基または薬物−リンカー中間体と結合を形成して、ＡＤＣを作製することができる。一態様において、リンカーは、抗体上に存在する遊離システインと反応して、共有ジスルフィド結合を形成することができる官能性を有する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５（４）：７６５−７７３の７６６頁のコンジュゲーション方法、及びその中の実施例を参照されたい）。リンカーは、ジスルフィド基と薬物部分との間に１つ以上の「スペーサー」単位を含んでもよい。代表的なスペーサー構成成分としては、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」または「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、及びｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢＣ」）が挙げられる。様々なリンカー構成成分が当技術分野において既知である。いくつかの態様において、スペーサーは犠牲性であってもよい。
【００２４】
「犠牲」とは、酵素（例えば、プロテアーゼ）、グルタチオン、及び／またはｐＨ変化などによって、インビトロ及び／またはインビボで切断可能であるリンカーまたはスペーサーなどの部分を指す。
【００２５】
「束縛リンカー」とは、ジスルフィド結合を形成することができる硫黄を有する炭素原子を有するリンカーを指し、炭素原子は、Ｈ以外の少なくとも１つの置換基で置換され、より具体的には、本明細書の以下で更に詳述されるように、ヒドロカルビルまたは置換ヒドロカルビル部分で置換される。
【００２６】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む当技術分野において既知である一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例示的かつ代表的実施形態が当技術分野において既知であり、これらのいずれも、本発明の目的のために使用することができる。
【００２７】
反応性を測定するための一例示的な方法は、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」が、非標識抗原の一連の滴定の存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートに結合している抗原を捕捉することによってＦａｂの抗原に対する溶液結合親和性を測定する、以下のアッセイによって説明される、対象となる抗体のＦａｂバージョン及びその抗原によって実行される、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定され得るものである（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１）。アッセイの条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中２重量体積％のウシ血清アルブミンで２〜５時間室温（約２３℃）で遮断し得る。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、対象となるＦａｂの段階希釈液と混合し得る（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫している）。その後、対象となるＦａｂを一晩インキュベートし得るが、インキュベーションをより長い期間（例えば、６５時間）継続して、平衡に到達することを確実にし得る。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移動し得る。その後、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ−２０でプレートを８回洗浄し得る。プレートが乾燥したとき、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し得、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数し得る。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択し得る。別の実施形態に従うと、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定され得る。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し得る。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で、抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）になるまで希釈してから、５ｕｌ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成し得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断し得る。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、２５ｕｌ／分の流量、２５℃で注入し得る。会合速度（ｋｏｎ）及び解離��度（ｋｏｆｆ）を、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算し得る。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算し得る。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、結合速度は、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌レッドキュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定することができる。
【００２８】
「結合速度」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」はまた、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を２５℃で使用する、上述のものと同一の表面プラズモン共鳴技術によっても決定することができる。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し得る。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で、抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）になるまで希釈してから、５ｕｌ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成し得る。１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断した後。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、約２５ｕｌ／分の流量、２５℃で注入し得る。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算し得る。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算し得る。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照されたい。しかしながら、上記表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、結合速度は、好ましくは、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定され得る。いくつかの態様において、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」が、非標識抗原の一連の滴定の存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートに結合している抗原を捕捉することによってＦａｂの抗原に対する溶液結合親和性を測定する以下のアッセイによって説明される、抗体のＦａｂバージョン及び抗原分子によって実行される、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定され得るものである（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１）。アッセイの条件を確立するために、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中２重量体積％のウシ血清アルブミンで２〜５時間室温（約２３℃）で遮断し得る。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、対象となるＦａｂの段階希釈液と混合し得る（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫している）。その後、対象となるＦａｂを一晩インキュベートし得るが、インキュベーションをより長い期間（例えば、６５時間）継続して、平衡に到達することを確実にし得る。その後、室温での１時間のインキュベーションのために混合物を捕捉プレートに移動し得る。その後、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％のＴｗｅｅｎ−２０でプレートを８回洗浄し得る。プレートが乾燥したとき、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し得、Ｔｏｐｃｏｕｎｔガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数し得る。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択し得る。別の実施形態に従うと、ＫｄまたはＫｄ値は、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定され得る。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し得る。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で、抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）になるまで希釈してから、５ｕｌ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成し得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断し得る。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、約２５ｕｌ／分の流量、２５℃で注入し得る。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算し得る。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算し得る。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、結合速度は、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌レッドキュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定することができる。
【００２９】
「結合速度」または「会合の速度」または「会合速度」または「ｋｏｎ」は、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を２５℃で使用する上述の表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定され得る。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し得る。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で、抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）になるまで希釈してから、５ｕｌ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成し得る。１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断した後。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、約２５ｕｌ／分の流量、２５℃で注入し得る。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算し得る。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算し得る。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９３：８６５−８８１を参照されたい。しかしながら、上記表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を超える場合、結合速度は、好ましくは、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定され得る。
【００３０】
「担体」、「選択的担体」、及び「細胞標的化部分」とは、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン、成長因子、小分子、及びタンパク質などの生物学的担体を指す。いくつかの実施形態において、担体は、抗原を発現する標的に対する結合親和性を有する。
【００３１】
「を主に含む」とは、引用に基づいて、例えば、非限定的に、重量％、体積％、重量体積％、モル％、または当量％などに基づいて、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の参照構成成分を指す。「から本質的になる」は一般に、特徴、組成、または方法を引用される要素及び／またはステップに限定するが、引用される特徴、組成、または方法の機能、組成、及び／または特徴に実質的に影響を与えない追加の要素及び／またはステップの可能性は除外しない。
【００３２】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望される生物活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に網羅する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであり得るか、または他の種に由来するものであり得る。抗体は、特定の抗原を認識し、それに結合することができる、免疫系によって生成されるタンパク質である。（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は一般に、複数の抗体のＣＤＲによって認識されるエピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、１つの抗原は、２つ以上の対応する抗体を有し得る。抗体としては、全長免疫グロブリン分子、または全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、対象となる標的抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子が挙げられ、そのような標的としては、癌細胞、または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスのものであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。しかしながら、一態様において、免疫グロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギ起源のものである。
【００３３】
「抗体断片」は、全長抗体の一部分、一般にはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖抗体；ミニボディ（Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−３２３）、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、及び癌細胞抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原に免疫特異的に結合する、本明細書に記載されるもののうちのいずれかのエピトープ結合断片、一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００３４】
本明細書に使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する変異の可能性は除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向されている。更に、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成され得るという点で、有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、または組み換えＤＮＡ法（例えば、ＵＳ４８１６５６７、ＵＳ５８０７７１５を参照されたい）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００３５】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片を具体的に含み、これは、それらが所望される生物活性を呈する限りにおいてである（ＵＳ４８１６５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。本明細書において対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が挙げられる。
【００３６】
本明細書における「インタクト抗体」とは、ＶＬ及びＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異形であり得る。インタクト抗体は、１つ以上の「エフェクター機能」を有し得、この機能は、抗体のＦｃ定常領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異形のＦｃ領域）に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、ならびにＢ細胞受容体及びＢＣＲなどの細胞表面受容体の下方制御が挙げられる。
【００３７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクト抗体は、異なる「クラス」に割り当てられ得る。インタクト免疫グロブリン抗体には、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。Ｉｇ形態は、ヒンジ修飾形態または無ヒンジ形態を含む（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３−４０９０、Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６−７２５６、ＵＳ２００５／００４８５７２、ＵＳ２００４／０２２９３１０）。
【００３８】
「システイン操作された抗体」または「システイン操作された抗体変異形」は、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている抗体である。本開示に従うと、システイン操作された抗体のチオール基（複数可）は、小分子にコンジュゲートされて、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体薬物コンジュゲートを形成し得る。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を薬物部分にコンジュゲートして、本明細書に更に記載されるように、免疫コンジュゲートを作製することができる。例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、軽鎖内の非システイン天然残基のシステインへの単一の変異（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従うＧ６４Ｃ、Ｋ１４９Ｃ、Ｓ１２１Ｃ、またはＲ１４２Ｃ）または重鎖内のもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けに従うＤ１０１ＣまたはＶ１８４ＣまたはＴ２０５Ｃ）を有する抗体であり得る。特定の例において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、重鎖内または軽鎖内に単一のシステイン変異を有し、そのため各全長抗体（すなわち、２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体）は、２つの操作されたシステイン残基を有することになる。システイン操作された抗体及び調製方法は、ＵＳ２０１２／０１２１６１５Ａ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって開示される。
【００３９】
「癌」、及び「癌性」という用語は、典型的には未制御の細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理的病態を指すか、または説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、ならびに白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性骨髄増殖性障害、血小板性白血病、前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ｐｒｅ−Ｂ−ＡＬＬ）、前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ｐｒｅＴ−ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、肥満細胞疾患、肥満細胞性白血病、肥満細胞肉腫、骨髄性肉腫、リンパ性白血病、及び未分化白血病が挙げられる。いくつかの実施形態において、癌は、骨髄性白血病である。いくつかの実施形態において、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００４０】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００４１】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５つの主要なクラスの抗体、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４２】
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因し得る生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００４３】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、必要な投与量で必要な期間にわたって所望される治療的または予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【００４４】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位を指す。いくつかの実施形態において、抗体が結合する抗原分子上の特定の部位は、ヒドロキシルラジカルフットプリント法によって決定される。
【００４５】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異形のＦｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書において別段明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００４６】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）において以下の配列、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で現れる。
【００４７】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように、本明細書において互換的に使用される。
【００４８】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらは、初代形質転換細胞及び継代数に関わらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、変異を含有し得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【００４９】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００５０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。一般に、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３におけるような下位群である。一実施形態において、ＶＬについて、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記）におけるような下位群カッパＩである。一実施形態において、ＶＨについて、下位群は、Ｋａｂａｔら（上記）におけるような下位群ＩＩＩである。
【００５１】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００５２】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、類似した構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７）を参照されたい）。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入されている宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結している核酸の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変的である、かつ／または構造的に画定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、このうち３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最も高く、かつ／または抗原認識に関与する。代表的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において生じる。（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。代表的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、及びＨ３の９５〜１０２において生じる。（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。ＶＨ内のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に収容される。代表的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、及びＨ３の９５〜１０２に生じる。（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）。別段示されない限り、可変ドメイン（例えば、ＦＲ残基）内のＨＶＲ残基及び他の残基は、本明細書においてＫａｂａｔら（上記）に従って番号付けされる。
【００５５】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。
【００５６】
「単離抗体」は、その天然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００５７】
「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てられ得る。
【００５８】
「添付文書」という用語は、そのような治療製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはその使用に関する警告を含有する、治療製品の市販パッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。
【００５９】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一の候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当技術分野の技術範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）にユーザ文書とともに申請されており、これは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【００６０】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、またはそれを含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される。分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によって、そのプログラムのＡ及びＢの整列における完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢへのアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡへのアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解されるだろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００６１】
「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒であるいかなる追加の構成成分も含有しない調製物を指す。
【００６２】
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置及び予防的または防止的処置の両方を指し、その目的は、所望されない生理的変化または障害、例えば、癌の発症または伝播を予防または緩徐化（緩和）することである。本開示の目的では、有益または所望される臨床結果としては、検出可能であるか検出不能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の緩和または緩解、及び（部分的であるか完全であるかに関わらず）寛解が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていなかった場合に予測される生存と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。治療を必要とする者としては、病態もしくは障害を既に有する者、及び病態もしくは障害を有する傾向にあるもの、または病態もしくは障害を予防する必要がある者が挙げられる。
【００６４】
「治療有効量」という用語は、哺乳動物において疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量を指す。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞の数の低減、腫瘍サイズの縮小、癌細胞の末梢器官への浸潤の阻害（すなわち、ある程度の緩徐化及び好ましくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の緩徐化及び好ましくは停止）、腫瘍成長のある程度の阻害、及び／または癌に関連する症状のうちの１つ以上のある程度の緩和を行うことができる。薬物が既存の癌細胞の成長の予防及び／またはそれらの殺滅を行うことができる限り、この薬物は細胞増殖抑制性かつ／または細胞傷害性であり得る。癌療法について、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）の評価及び／または応答率（ＲＲ）の決定によって、測定することができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「脱離基」という用語は、本明細書に記載されるそれらの基に関与する化学反応の経過において、抗体Ｃｙｓ残基上で硫黄原子によって置き換えられる（または「脱離する」）部分を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ヒドロカルビル」という用語は、専ら水素及び水素の元素のみからなる有機化合物またはラジカルを説明する。これらの部分としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリール部分が挙げられるが、これらに限定されない。これらの部分はまた、アルカリル、アルケンアリール、及びアルキンアリールなどの他の脂肪族もしくは環状炭化水素基で置換された、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアリール部分も含む。別段示されない限り、これらの部分は、好ましくは、１〜２０個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、または１〜６個の炭素原子を含む。
【００６７】
別段示されない限り、本明細書に記載されるアルキル基は、好ましくは、主鎖に１〜８個の炭素原子を含有する低級アルキルである。それらは、直鎖もしくは分岐鎖、または環状であり得、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、アリール、ベンジル、ヘキシルなどを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
別段示されない限り、本明細書に記載されるアルキニル基は、好ましくは、主鎖に２〜８個の炭素原子及び最大２０個の炭素原子を含有する低級アルキニルである。それらは、直鎖または分岐鎖であり得、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル、ヘキシニルなどを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される場合、単独での、または別の基の一部としての「アリール」という用語は、任意で置換された同素環芳香族基、好ましくは環部分内に５〜２０個の炭素、５〜１０個の炭素、または５〜６個の炭素を含有する単環式基または二環式基（フェニル、ビフェニル、ナフチル、置換フェニル、置換ビフェニル、または置換ナフチルを含むが、これらに限定されない）を表す。アリール部分は任意で、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される１個以上のヘテロ原子を含み得る。そのようなヘテロ芳香族は、環内に１個または２個の窒素原子、１個または２個の硫黄原子、１個または２個の酸素原子、及びこれらの組み合わせを含んでもよく、各ヘテロ原子は、炭素を通して分子の残りに結合する。非限定的な代表的な基としては、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、チオペン（ｔｈｉｏｐｅｎｅ）、チオピリリウム（ｔｈｉｏｐｙｒｒｉｌｉｕｍ）、ピラチアジン、インドール、プリン、ベンゾイミダゾール、キノロン、フェノチアジンが挙げられる。非限定的な代表的な置換基としては、以下の基、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アルキル、アルコキシ、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケンオキシ、アリール、アリールオキシ、アミノ、アミド、アセタール、カルバミル、カルボシクロ、シアノ、エステル、エーテル、ハロゲン、ヘテロシクロ、ヒドロキシ、ケト、ケタール、ホスホ、ニトロ、及びチオのうちの１つ以上が挙げられる。
【００７０】
本明細書に記載される「置換」部分は、炭素以外の少なくとも１つの原子で置換されるヒドロカルビル、アルキル、及びアリールなどの部分であり、炭素鎖原子がヘテロ原子（窒素、酸素、ケイ素、亜リン酸、ホウ素、硫黄、またはハロゲン原子など）で置換される部分を含む。これらの置換基としては、ハロゲン、ヘテロシクロ、アルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ、ケト、アシル、アシルオキシ、ニトロ、三級アミノ、アミド、ニトロ、シアノ、チオ、スルフィネート、スルホンアミド、ケタール、アセタール、エステル、エーテルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
「炭素環」、「環状炭素」、及び「シクロアルキル」という用語は、単環式環として３〜１２個の炭素原子（Ｃ３−１２）または二環式環として７〜１２個の炭素原子を有する一価の非芳香族の飽和環または部分的不飽和環を指す。７〜１２個の原子を有する二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系として配置することができ、９もしくは１０個の環原子を有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として、またはビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、及びビシクロ［３．２．２］ノナンなどの架橋系として配置することができる。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキシ−１−エニル、１−シクロヘキシ−２−エニル、１−シクロヘキシ−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、及びシクロドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書で使用される場合、単独での、または別の基の一部としての「ハロゲン」という用語は、塩素、臭素、フッ素、及びヨウ素を指す。
【００７３】
束縛リンカー
本開示の束縛リンカーは一般に、以下の構造（式中、Ｓ原子を有する炭素原子は置換されるため、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも１つは水素ではない）に一致する。
【化１７】
0006621919.tif 000018
いくつかの態様において、硫黄原子の波線の結合は、チオール脱離基への結合点を示す。いくつかの他の態様において、硫黄原子の波線の結合は、担体システイン硫黄原子への結合点を示す。いずれのそのような態様においても、カルボニル部分を有する炭素原子の結合点は、薬物への、またはスペーサー−薬物への直接的または間接的結合点を示す。いくつかの態様において、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得る。いくつかの特定のそのような態様において、Ｒ１及びＲ２は独立して、Ｈ、−ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈである。いくつかの他の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合している炭素原子とともに、任意で酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環を形成する。いくつかの特定のそのような態様において、Ｒ１及びＲ２は、それらが結合している炭素原子とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、テトラヒドロフラン、シクロヘキシル、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する。
【００７４】
束縛リンカーの例は以下の通りであり、硫黄原子の波線は本明細書で他に定義される脱離基への結合点を指し、カルボニル部分の波線は薬物を含む部分への結合点を指す。
【化１８−１】
0006621919.tif 000019
【化１８−２】
0006621919.tif 000020
【００７５】
本開示に従い、現在までの実験的証拠に基づいて、本開示のコンジュゲートの束縛連結基構成成分は、細胞内犠牲性であることが発見されている。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、細胞内放出機構は、リンカー犠牲及び薬物放出がグルタチオンによって媒介される、以下の機構に従って進行すると考えられている。
【化１９】
0006621919.tif 000021
【００７６】
現在までの実験的証拠に基づいて、本開示のコンジュゲートの束縛リンカー構成成分のうちの特定のものが、束縛連結基を含まないコンジュゲートと比較して、薬物安定性及び放出を改善し、改善された血流安定性及び細胞内薬物放出（犠牲）を提供すると考えられている。現在までの実験的証拠に更に基づいて、かついかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本明細書で他に記載される本開示の脱離基は、束縛炭素に結合している硫黄原子とシステインチオールとの反応を指向し、それにより改善された特異性及び反応性を提供するように機能するため、本明細書に更に記載されるように、水を含むか、主に水を含むか、または水から本質的になる溶媒系中で担体−リンカーコンジュゲーションが実行され得ると考えられる。更に、現在までの実験的証拠に基づいて、かついかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本明細書で他に記載される本開示の脱離基は、抗体上の他の部位に対して特定の部位に位置するＣｙｓ残基によって優先的に置き換えられることができ、抗体への部位特異的複数薬物コンジュゲーションを可能にすると考えられる。
【００７７】
脱離基
本開示のいくつかの態様において、脱離基は、以下から好適に選択され得る。
【化２０】
0006621919.tif 000022
そのような態様において、波線は、脱離基の束縛リンカーＳ原子への結合点を示し、それによりジスルフィド結合を形成する。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５は独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、但し、Ｘ１〜Ｘ５のうちの少なくとも１つがＮであることを条件とし、破線は、任意の二重結合を表し、Ａは、６員環を表す。Ｙ１、Ｙ２Ｙ３、及びＹ４は独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、但し、Ｙ１〜Ｙ４のうちの少なくとも１つがＮであることを条件とし、破線は、任意の二重結合を表し、Ｂは、５員環を表す。Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６は独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、但し、Ｚ１及びＺ２のうちの少なくとも１つがＮであることを条件とし、破線は、任意の二重結合を表し、Ｅは、６員環を表し、Ｄは、縮合５員環を表す。各Ｒ３は独立して、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒ５、−ＯＲ５’、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）（Ｒ５）、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＮ、及び−Ｂｒから選択される。各Ｒ５は独立して、Ｈ、任意で置換されたＣ１−６ヒドロカルビル、任意で置換されたＣ５−６炭素環、及び任意で置換されたＣ５−６複素環から選択される。Ｒ５’は、Ｃ１−４アルキルである。ｑは、０、１、２、または３である。脱離基１、脱離基２、脱離基３、及び／または脱離基４の環構造内の各炭素原子は、Ｒ５で置換される。脱離基１、脱離基２、脱離基３、及び／または脱離基４の環構造内の各窒素原子は、任意でＲ５で置換されて、三級アミンまたは四級アミンを形成する。
【００７８】
いくつかの特定のそのような態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５は独立して、ＣまたはＮであり、Ｘ１〜Ｘ５のうちの２つ以下は、Ｎであり、環Ａは、不飽和である。他の特定の態様において、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４は独立して、ＣまたはＮであり、Ｂ環は、不飽和である。更に他の特定の態様において、Ｚ１は、Ｎであり、Ｚ２は、Ｎ、Ｓ、及びＯから選択され、Ｚ３〜Ｚ６は、Ｃ及びＮから選択され、Ｚ３〜Ｚ６のうちの２つ以下は、Ｎであり、環Ｅは、不飽和である。更に他の特定の態様において、各Ｒ３は独立して、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｈ３ＣＳ（Ｏ）（Ｏ）−、及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。
【００７９】
本開示の脱離基のいくつかの例を、以下に例示する。
【化２１−１】
0006621919.tif 000023
【化２１−２】
0006621919.tif 000024
【化２１−３】
0006621919.tif 000025
【００８０】
現在までの実験的証拠に基づいて、かついかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、本開示の脱離基は、本開示の脱離基−リンカー−薬物コンジュゲート及び担体−脱離基コンジュゲートにおける構成成分として存在するとき、改善された脱離基置き換えを提供すると考えられる。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、電子不足脱離基はコンジュゲーション位置選択性を改善し、より低いｐＫａ値を有する脱離基はより効果的に置き換えられると考えられている。いくつかの態様において、ｐＫａは、約−４〜約１２または約２〜約１２である。改善された脱離基置き換えは、転じて、水性反応系中ならびに温度及びｐＨの穏やかな反応条件下、ジスルフィド結合による、高選択性及び収率での本開示のリンカーへの担体システインチオールの直接的コンジュゲーションを可能にする。そのような穏やかな反応条件は、典型的には不安定な生物学的担体の選択性及び標的化特徴を維持するために必要とされる。
【００８１】
活性化束縛リンカー
本開示のいくつかの実施形態は、構造（Ｉ）の活性化束縛リンカーを対象とし、
【化２２】
0006621919.tif 000026
式中、Ｘ、Ｒ１、及びＲ２は、本明細書で他に定義される通りであり、ｎは、０または１であり、Ｓｐは、スペーサーである。いくつかの態様において、ｎが１であるとき、スペーサーは、以下の構造のｐ−アミノベンジルオキシカルボニルを含んでもよく、式中、波線は、束縛リンカーカルボニル炭素原子への結合点を示し、Ｒ３０は、Ｈ、任意で置換されたＣ１−６ヒドロカルビル、任意で置換されたＣ５−６炭素環、及び任意で置換されたＣ５−６複素環、
【化２３】
0006621919.tif 000027
から選択される。
いくつかの特定の態様において、Ｒ３０は、Ｈである。
【００８２】
ｎが０であるとき、本明細書で他に記載されるように、束縛リンカーカルボニル炭素原子と薬物部分との間の結合は、好適にエーテルであっても、非環式もしくは環式アミン薬物原子から形成される三級アミンであってもよい。ｎが１であるとき、スペーサーカルボニル炭素原子の薬物部分への結合は、本明細書で他に記載されるように、好適に脂肪族（非環式）一級アミン薬物原子から形成される二級アミンであっても、好適に脂肪族二級アミン薬物原子から形成される三級アミンであっても、または好適に環状アミン薬物原子から形成される三級アミンであってもよい。
【００８３】
いくつかの態様において、薬物へのコンジュゲーションに好適な活性化束縛連結基は、以下の反応スキーム（１）に従って好適に調製することができ、
【化２４】
0006621919.tif 000028
式中、Ｘ、Ｒ１、及びＲ２は、本明細書で他に記載される通りであり、Ｘは、ジスルフィド結合によってリンカーに結合する。
【００８４】
第１のステップにおいて、化学量論過剰の塩化スルフリルを、乾燥溶媒中、脱離基Ｘの撹拌懸濁液または溶液に添加する。反応生成物は、例えば溶媒蒸発などによって、任意で単離してもよい。脱離基反応生成物を、乾燥溶媒中、リンカー前駆体溶液と組み合わせ、撹拌しながら反応させて、活性化リンカー中間体を含む反応生成混合物を形成する。当業者であれば、好適な溶媒及び反応条件を導出することができる。溶媒の一例はジクロロメタン（「ＤＣＭ」）であり、脱離基濃度は約０．１〜約１モル／Ｌであり得、リンカー基濃度は約０．１〜約１モル／Ｌであり得、各反応の温度は約−１０℃〜約３０℃であり得、各反応は不活性雰囲気下で行われ得る。いくつかの態様において、各反応を約−１０℃〜約５℃で開始し、その後、室温まで温め、反応を完了するのに十分な時間にわたって維持する。反応完了は、当業者にとって既知であるＬＣ／ＭＳなどの分析的方法によって決定することができる。活性化リンカー中間体は、当技術分野において既知の方法によって反応生成混合物から単離することができる。例えば、反応生成混合物中の沈殿物は、当業者にとって既知である濾過または遠心分離などの固体−液体法によって除去することができる。その後、活性化リンカー中間体は、溶媒蒸発によって濾液から単離することができる。単離された活性化リンカー中間体は、任意で精製されてもよい。例えば、単離された活性化リンカー中間体は、（１）塩基性化水によって処理されても、（２）溶媒（例えば、ＤＣＭ）中に抽出されても、（３）水及び／またはブラインで洗浄されても、（４）（例えば、ＭｇＳＯ４で）乾燥されても、（５）濾過され、溶媒除去（例えば、蒸発）によって固体として単離されても、ならびに任意で、（６）当技術分野において既知である逆相高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはフラッシュクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法によって精製されてもよい。
【００８５】
第２のステップにおいて、当量過剰のトリホスゲン（またはジホスゲンもしくはホスゲン）を、乾燥溶媒（例えば、ＤＣＭ）中、活性化リンカー中間体の撹拌溶液に添加し、不活性雰囲気下で完了まで反応させて、活性化リンカーを形成する。活性化リンカー中間体濃度は、約０．０５〜約０．５モル／Ｌであり得る。活性化リンカーは、溶媒除去によって固体として単離されても、本明細書で他に記載される薬物に直接コンジュゲートされてもよい。
【００８６】
担体
本開示の担体は、少なくとも１つのシステインスルフヒドリル部分を含む任意の細胞標的化生物学的化合物である。細胞標的化化合物としては、抗体、ペプチド、及びポリペプチド、ホルモン、成長因子、及びタンパク質が挙げられる。
【００８７】
癌細胞などの特定の種類の細胞は、周辺組織と比較して特有である表面分子（抗原）を発現する。これらの表面分子に結合する細胞標的化部分は、本明細書で他に記載される薬物の、特に標的細胞への標的化された送達を可能にする。例えばかつ非限定的に、細胞標的化部分は、肺、乳房、脳、前立腺、脾臓、膵臓、子宮頸部、卵巣、頭頸部、食道、肝臓、皮膚、腎臓、白血病、骨、精巣、結腸、または膀胱細胞に結合し、それによって内部移行され得る。
【００８８】
腫瘍関連抗原
本開示のいくつかの特定の態様において、標的細胞は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する癌細胞である。腫瘍関連抗原は、当技術分野において既知であり、当技術分野において周知の方法及び情報を使用して抗体を生成するのに使用するために調製され得る。癌の診断及び治療のための有効な細胞標的を発見するための試みにおいて、研究者らは、１つ以上の正常な非癌性細胞（複数可）と比較して、１つ以上の特定の種類（複数可）の癌細胞の表面上に特異的に発現する膜貫通ポリペプチドまたは他の様式で腫瘍に関連するポリペプチドを特定しようとした。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上と比較して、癌細胞の表面上でより豊富に発現する。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの特定により、抗体に基づく治療法によって癌細胞を破壊のために特異的に標的化する能力が生じた。
【００８９】
腫瘍関連抗原ＴＡＡの例としては、本明細書に列挙されるＴＡＡ（１）〜（５３）が挙げられるが、これらに限定されない。便宜上、これらの抗原（全て当技術分野において既知である）に関する情報を本明細書に列挙し、この情報は、名称、別称、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主な参考文献（複数可）に続き、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質配列を特定する慣例を含む。ＴＡＡ（１）〜（５３）に対応する核酸及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて入手可能である。抗体によって標的化される腫瘍関連抗原としては、引用される参考文献において特定されている配列と比較して、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有する全てのアミノ酸配列変異形及びアイソフォーム、または引用される参考文献中に見出される配列を有するＴＡＡと実質的に同一の生物学的特性もしくは特徴を呈するものが挙げられる。例えば、変異形配列を有するＴＡＡは一般に、列挙されている対応する配列を有するＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される参考文献中の配列及び開示は、参照により明示的に組み込まれる。
【００９０】
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４（５１５５）：１０１−１０４（１９９４）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４（１１）：１３７７−１３８２（１９９７））、ＷＯ２００４０６３３６２（請求項２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３１３４７９０−Ａ１（３８〜３９頁）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、２９６頁）、ＷＯ２００３０５５４４３（９１〜９２頁）、ＷＯ２００２９９１２２（実施例２、５２８〜５３０頁）、ＷＯ２００３０２９４２１（請求項６）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図１１２）、ＷＯ２００２９８３５８（請求項１、１８３頁）、ＷＯ２００２５４９４０（１００〜１０１頁）、ＷＯ２００２５９３７７（３４９〜３５０頁）、ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７、３７６頁）、ＷＯ２００１４８２０４（実施例、図４）ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質受容体ＩＢ型／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１−相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８；ＮＰ＿００１１９４．１；ＡＹ０６５９９４。
【００９１】
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５（２），２８３−２８８（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ３９５（６６９９）：２８８−２９１（１９９８）、Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１６）：１１２６７−１１２７３）、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＷＯ２００２９９０７４（請求項１９、１２７〜１２９頁）、ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７、２２２、３９３頁）、ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０、２９３頁）、ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３、９３〜９５頁）、ＷＯ２０００１４２２８（請求項５、１３３〜１３６頁）、ＵＳ２００３２２４４５４（図３）、ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２、１５０頁）、ＮＰ＿００３４７７溶質担体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体、ｙ＋システム）、メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３−ホモサピエンス、相互参照：ＭＩＭ：６００１８２；ＮＰ＿００３４７７．３；ＮＭ＿０１５９２３；ＮＭ＿００３４８６＿１。
【００９２】
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（１５），５８５７−５８６０（２００１）、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２５）：１４５２３−１４５２８）、ＷＯ２００４０６５５７７（請求項６）、ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｌ）、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３１５７０８９（実施例５）、ＵＳ２００３１８５８３０（実施例５）、ＵＳ２００３０６４３９７（図２）、ＷＯ２００２８９７４７（実施例５、６１８〜６１９頁）、ＷＯ２００３０２２９９５（実施例９、図１３Ａ、実施例５３、１７３頁、実施例２、図２Ａ）、ＮＰ＿０３６５８１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原、相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５；ＮＰ＿０３６５８１．１；ＮＭ＿０１２４４９＿１。
【００９３】
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２９）：２７３７１−２７３７５（２００１））、ＷＯ２００４０４５５５３（請求項１４）、ＷＯ２００２９２８３６（請求項６、図１２）、ＷＯ２００２８３８６６（請求項１５、１１６〜１２１頁）、ＵＳ２００３１２４１４０（実施例１６）、ＵＳ７９８９５９。相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７；ＡＡＫ７４１２０．３；ＡＦ３６１４８６＿１。
【００９４】
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２），８０５−８０８（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２０）：１１５３１−１１５３６（１９９９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（１）：１３６−１４０（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３７）：２１９８４−２１９９０（１９９５））、ＷＯ２００３１０１２８３（請求項１４）、（ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、２８７〜２８８頁）、ＷＯ２００２１０１０７５（請求項４、３０８〜３０９頁）、ＷＯ２００２７１９２８（３２０〜３２１頁）、ＷＯ９４１０３１２（５２〜５７頁）、相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１；ＮＰ＿００５８１４．２；ＮＭ＿００５８２３＿１。
【００９５】
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２２）：１９６６５−１９６７２（２００２）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６２（２）：２８１−２８４（１９９９）、Ｆｅｉｌｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８（３）：５７８−５８２）、ＷＯ２００４０２２７７８（請求項２）、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、３２６頁）、ＥＰ８７５５６９（請求項１、１７〜１９頁）、ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、３２９頁）、ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）、ＷＯ２００１７５１７７（請求項２４、１３９〜１４０頁）、相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７；ＮＰ＿００６４１５．１；ＮＭ＿００６４２４＿１。
【００９６】
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）Ｎａｇａｓｅ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．７（２）：１４３−１５０）、ＷＯ２００４０００９９７（請求項１）、ＷＯ２００３００３９８４（請求項１）、ＷＯ２００２０６３３９（請求項１、５０頁）、ＷＯ２００１８８１３３（請求項１、４１〜４３、４８〜５８頁）、ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）、ＷＯ２００３１０１４００（請求項１１）、受託：Ｑ９Ｐ２８３；ＥＭＢＬ；ＡＢ０４０８７８；ＢＡＡ９５９６９．１．Ｇｅｎｅｗ；ＨＧＮＣ：１０７３７。
【００９７】
（８）ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２５４６−２５５３、ＵＳ２００３１２９１９２（請求項２）、ＵＳ２００４０４４１８０（請求項１２）、ＵＳ２００４０４４１７９（請求項１１）、ＵＳ２００３０９６９６１（請求項１１）、ＵＳ２００３２３２０５６（実施例５）、ＷＯ２００３１０５７５８（請求項１２）、ＵＳ２００３２０６９１８（実施例５）、ＥＰ１３４７０４６（請求項１）、ＷＯ２００３０２５１４８（請求項２０）、相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８；ＡＡＱ８８９９１．１；ＡＹ３５８６２８＿１。
【００９８】
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）、Ｎａｋａｍｕｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７，３４−３９，１９９１、Ｏｇａｗａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，２４８−２５５，１９９１、Ａｒａｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｐｎ．Ｃｉｒｃ．Ｊ．５６，１３０３−１３０７，１９９２、Ａｒａｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３４６３−３４７０，１９９３、Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ａ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，６５６−６６３，１９９１、Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ  Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３８７３−３８７９，１９９３；Ｈａｅｎｄｌｅｒ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０，ｓ１−Ｓ４，１９９２、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ２２８，４３−４９，１９９９、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８２，３１１６−３１２３，１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１５８９−２１５９６，１９９７、Ｖｅｒｈｅｉｊ  Ｊ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１０８，２２３−２２５，２００２、Ｈｏｆｓｔｒａ  Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５，１８０−１８５，１９９７、Ｐｕｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｅ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ７９，１２５７−１２６６，１９９４、Ａｔｔｉｅ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４，２４０７−２４０９，１９９５、Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：３５１−３５４，１９９６、Ａｍｉｅｌ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５，３５５−３５７，１９９６、Ｈｏｆｓｔｒａ  Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２，４４５−４４７，１９９６、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３，１４５−１４８，１９９８、Ｆｕｃｈｓ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７，１１５−１２４，２００１、Ｐｉｎｇａｕｌｔ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１１，１９８−２０６、ＷＯ２００４０４５５１６（請求項１）、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０４００００（請求項１５１）、ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２６１０８７（図１）、ＷＯ２００３０１６４９４（図６）、ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２、１４４頁）、ＷＯ２００１９８３５１（請求項１、１２４〜１２５頁）、ＥＰ５２２８６８（請求項８、図２）、ＷＯ２００１７７１７２（請求項１、２９７〜２９９頁）、ＵＳ２００３１０９６７６、ＵＳ６５１８４０���（図３）、ＵＳ５７７３２２３（請求項１ａ、３１〜３４欄）、ＷＯ２００４００１００４。
【００９９】
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）、ＷＯ２００３１０４２７５（請求項１）、ＷＯ２００４０４６３４２（実施例２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００３０８３０７４（請求項１４、６１頁）、ＷＯ２００３０１８６２１（請求項１）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９３）、ＷＯ２００１６６６８９（実施例６）、相互参照：ＬｏｃｕｓＩＤ：５４８９４；ＮＰ＿０６０２３３．２；ＮＭ＿０１７７６３＿１。
【０１００】
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２（１１）：１５７３−１５８２（２００２））、ＷＯ２００３０８７３０６、ＵＳ２００３０６４３９７（請求項１、図１）、ＷＯ２００２７２５９６（請求項１３、５４〜５５頁）、ＷＯ２００１７２９６２（請求項１、図４Ｂ）、ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１１）、ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１６）、ＵＳ２００４００５５９８（請求項２２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３０６０６１２（請求項１２、図１０）、ＷＯ２００２２６８２２（請求項２３、図２）、ＷＯ２００２１６４２９（請求項１２、図１０）、相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８；ＡＡＮ０４０８０．１；ＡＦ４５５１３８＿１。
【０１０１】
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）Ｘｕ，Ｘ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１９）：１０６９２−１０６９７（２００１）、Ｃｅｌｌ１０９（３）：３９７−４０７（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３３）：３０８１３−３０８２０（２００３））、ＵＳ２００３１４３５５７（請求項４）、ＷＯ２０００４０６１４（請求項１４、１００〜１０３頁）、ＷＯ２００２１０３８２（請求項１、図９Ａ）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７、３９１頁）、ＵＳ２００３２１９８０６（請求項４）、ＷＯ２００１６２７９４（請求項１４、図１Ａ〜Ｄ）、相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６；ＮＰ＿０６０１０６．２；ＮＭ＿０１７６３６＿１。
【０１０２】
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．８（７）：１９８７−１９９１（１９８９）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９（３）：５５５−５６５（１９９１））、ＵＳ２００３２２４４１１（請求項１）、ＷＯ２００３０８３０４１（実施例１）、ＷＯ２００３０３４９８４（請求項１２）、ＷＯ２００２８８１７０（請求項２、５２〜５３頁）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図５８）、ＷＯ２００２１６４１３（請求項１、９４〜９５、１０５頁）、ＷＯ２００２２２８０８（請求項２、図１）、ＵＳ５８５４３９９（実施例２、１７〜１８欄）、ＵＳ５７９２６１６（図２）、相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５；ＮＰ＿００３２０３．１；ＮＭ＿００３２１２＿１。
【０１０３】
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）Ｆｕｊｉｓａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（４）：２１１８−２１２５）、Ｗｅｉｓ  Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７，１０４７−１０６６，１９８８、Ｍｏｏｒｅ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，９１９４−９１９８，１９８７、Ｂａｒｅｌ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，１０２５−１０３１，１９９８、Ｗｅｉｓ  Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，５６３９−５６４３，１９８６、Ｓｉｎｈａ  Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，５３１１−５３２０、ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）、ＵＳ２００４００５５３８（実施例１）、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）、ＷＯ９１０２５３６（図９．１〜９．９）、ＷＯ２００４０２０５９５（請求項１）、受託：Ｐ２００２３；Ｑ１３８６６；Ｑ１４２１２；ＥＭＢＬ；Ｍ２６００４；ＡＡＡ３５７８６．１。
【０１０４】
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６２６または１１０３８６７４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）１００（７）：４１２６−４１３１、Ｂｌｏｏｄ（２００２）１００（９）：３０６８−３０７６、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（６）：１６２１−１６２５）、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２、図１４０）、ＷＯ２００３０８７７６８、ＵＳ２００４１０１８７４（請求項１、１０２頁）、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＵＳ２００２１５０５７３（請求項５、１５頁）、ＵＳ５６４４０３３、ＷＯ２００３０４８２０２（請求項１、３０６及び３０９頁）、ＷＯ９９／５５８６５８、ＵＳ６５３４４８２（請求項１３、図１７Ａ／Ｂ）、ＷＯ２０００５５３５１（請求項１１、１１４５〜１１４６頁）、相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５；ＮＰ＿０００６１７．１；ＮＭ＿０００６２６＿１。
【０１０５】
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４、ＡＹ３５８１３０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０（２００３）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ５４（２）：８７−９５（２００２）、Ｂｌｏｏｄ９９（８）：２６６２−２６６９（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１７）：９７７２−９７７７（２００１）、Ｘｕ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０（３）：７６８−７７５、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項５、図１８Ｄ−１〜１８Ｄ−２）、ＷＯ２００３０９７８０３（請求項１２）、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項２５）、相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９；ＮＰ＿１１０３９１．２；ＮＭ＿０３０７６４＿１。
【０１０６】
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０（４７３０）：１１３２−１１３９）、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３１９，２３０−２３４，１９８６、Ｓｅｍｂａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６４９７−６５０１，１９８５、Ｓｗｉｅｒｃｚ  Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６５，８６９−８８０，２００４、Ｋｕｈｎｓ  Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３６４２２−３６４２７，１９９９、Ｃｈｏ  Ｈ．−Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４２１，７５６−７６０，２００３、Ｅｈｓａｎｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１５，４２６−４２９、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｉ）、ＷＯ２００４００９６２２、ＷＯ２００３０８１２１０、ＷＯ２００３０８９９０４（請求項９）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＵＳ２００３１１８５９２、ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）、ＷＯ２００３０５５４３９（請求項２９、図１Ａ〜Ｂ）、ＷＯ２００３０２５２２８（請求項３７、図５Ｃ）、ＷＯ２００２２２６３６（実施例１３、９５〜１０７頁）、ＷＯ２００２１２３４１（請求項６８、図７）、ＷＯ２００２１３８４７（７１〜７４頁）、ＷＯ２００２１４５０３（１１４〜１１７頁）、ＷＯ２００１５３４６３（請求項２、４１〜４６頁）、ＷＯ２００１４１７８７（１５頁）、ＷＯ２０００４４８９９（請求項５２、図７）、ＷＯ２０００２０５７９（請求項３、図２）、ＵＳ５８６９４４５（請求項３、３１〜３８欄）、ＷＯ９６３０５１４（請求項２、５６〜６１頁）、ＥＰ１４３９３９３（請求項７）、ＷＯ２００４０４３３６１（請求項７）、ＷＯ２００４０２２７０９、ＷＯ２００１００２４４（実施例３、図４）、受託：Ｐ０４６２６；ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６７；ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１１７６１；ＡＡＡ３５８０８．１。
【０１０７】
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）；Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３，５９−６６，１９８８、Ｔａｗａｒａｇｉ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５０，８９−９６，１９８８、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１６８９９−１６９０３，２００２、ＷＯ２００４０６３７０９、ＥＰ１４３９３９３（請求項７）、ＷＯ２００４０４４１７８（実施例４）、ＷＯ２００４０３１２３８、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７、４２７頁）、ＷＯ２００２６０３１７（請求項２）、受託：Ｐ４０１９９；Ｑ１４９２０；ＥＭＢＬ；Ｍ２９５４１；ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ；Ｍ１８７２８。
【０１０８】
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６）：１６８９９−１６９０３（２００２））、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３、８５〜８７頁）、ＪＰ０５００３７９０（図６〜８）、ＷＯ９９４６２８４（図９）、相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０；ＡＡＨ１７０２３．１；ＢＣ０１７０２３＿１。
【０１０９】
（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）、Ｃｌａｒｋ  Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３，２２６５−２２７０，２００３、Ｍｕｎｇａｌｌ  Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４２５，８０５−８１１，２００３、Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ１０４，９−１９，２００１、Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３５４５−３５４９，２００１、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４７５１７−４７５２３，２００２、Ｐｌｅｔｎｅｖ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２：１２６１７−１２６２４、Ｓｈｅｉｋｈ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，２００６−２０１０、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＵＳ２００４００５３２０（実施例５）、ＷＯ２００３０２９２６２（７４〜７５頁）、ＷＯ２００３００２７１７（請求項２、６３頁）、ＷＯ２００２２２１５３（４５〜４７頁）、ＵＳ２００２０４２３６６（２０〜２１頁）、ＷＯ２００１４６２６１（５７〜５９頁）、ＷＯ２００１４６２３２（６３〜６５頁）、ＷＯ９８３７１９３（請求項１、５５〜５９頁）、受託：Ｑ９ＵＨＦ４；Ｑ６ＵＷＡ９；Ｑ９６ＳＨ８；ＥＭＢＬ；ＡＦ１８４９７１；ＡＡＦ０１３２０．１。
【０１１０】
（２１）Ｂｒｅｖｉｃａｎ（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）Ｇａｒｙ  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ２５６，１３９−１４７，２０００、Ｃｌａｒｋ  Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３，２２６５−２２７０，２００３、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２、ＵＳ２００３１８６３７２（請求項１１）、ＵＳ２００３１８６３７３（請求項１１）、ＵＳ２００３１１９１３１（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２２（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２６（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１２１（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２９（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１３０（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１２８（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２５（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２０２６３４（請求項１）。
【０１１１】
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）Ｃｈａｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗａｔｔ，Ｖ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６（６），１０５７−１０６１（１９９１）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１０（５）：８９７−９０５（１９９５）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３０９−３４５（１９９８），Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９６：１７７−２４４（２０００））、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２０００５３２１６（請求項１、４１頁）、ＷＯ２００４０６５５７６（請求項１）、ＷＯ２００４０２０５８３（請求項９）、ＷＯ２００３００４５２９（１２８〜１３２頁）、ＷＯ２０００５３２１６（請求項１、４２頁）；相互参照：ＭＩＭ：６００９９７；ＮＰ＿００４４３３．２；ＮＭ＿００４４４２＿１。
【０１１２】
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）ＵＳ２００４０１０１８９９（請求項２）、ＷＯ２００３１０４３９９（請求項１１）、ＷＯ２００４０００２２１（図３）、ＵＳ２００３１６５５０４（請求項１）、ＵＳ２００３１２４１４０（実施例２）、ＵＳ２００３０６５１４３（図６０）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、２９９頁）、ＵＳ２００３０９１５８０（実施例２）、ＷＯ２００２１０１８７（請求項６、図１０）、ＷＯ２００１９４６４１（請求項１２、図７ｂ）、ＷＯ２００２０２６２４（請求項１３、図１Ａ−１Ｂ）、ＵＳ２００２０３４７４９（請求項５４、４５〜４６頁）、ＷＯ２００２０６３１７（実施例２、３２０〜３２１頁、請求項３４、３２１〜３２２頁）、ＷＯ２００２７１９２８（４６８〜４６９頁）、ＷＯ２００２０２５８７（実施例１、図１）、ＷＯ２００１４０２６９（実施例３、１９０〜１９２頁）、ＷＯ２０００３６１０７（実施例２、２０５〜２０７頁）、ＷＯ２００４０５３０７９（請求項１２）、ＷＯ２００３００４９８９（請求項１）、ＷＯ２００２７１９２８（２３３〜２３４、４５２〜４５３頁）、ＷＯ０１１６３１８。
【０１１３】
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）Ｒｅｉｔｅｒ  Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１７３５−１７４０，１９９８、Ｇｕ  Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１９，１２８８−１２９６，２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７５（３）：７８３−７８８、ＷＯ２００４０２２７０９、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＵＳ２００４０１８５５３（請求項１７）、ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）、ＷＯ２００２８１６４６（請求項１、１６４頁）、ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０、２８８頁）、ＷＯ２００１４０３０９（実施例１、図１７）、ＵＳ２００１０５５７５１（実施例１、図１ｂ）、ＷＯ２０００３２７５２（請求項１８、図１）、ＷＯ９８５１８０５（請求項１７、９７頁）、ＷＯ９８５１８２４（請求項１０、９４頁）、ＷＯ９８４０４０３（請求項２、図１Ｂ）、受託：Ｏ４３６５３；ＥＭＢＬ；ＡＦ０４３４９８；ＡＡＣ３９６０７．１。
【０１１４】
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）、ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１−ホモサピエンス種：ホモサピエンス（ヒト）ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）、ＷＯ２００３０００８４２（請求項１）、ＷＯ２００３０２３０１３（実施例３、請求項２０）、ＵＳ２００３１９４７０４（請求項４５）、相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９；ＡＡＰ１４９５４．１；ＡＹ２６０７６３＿１。
【０１１５】
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）、ＢＡＦＦ受容体／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１−ホモサピエンス、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３（５５３７），２１０８−２１１１（２００１）、ＷＯ２００４０５８３０９、ＷＯ２００４０１１６１１、ＷＯ２００３０４５４２２（実施例、３２〜３３頁）、ＷＯ２００３０１４２９４（請求項３５、図６Ｂ）、ＷＯ２００３０３５８４６（請求項７０、６１５〜６１６頁）、ＷＯ２００２９４８５２（１３６〜１３７欄）、ＷＯ２００２３８７６６（請求項３、１３３頁）、ＷＯ２００２２４９０９（実施例３、図３）、相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９；ＮＰ＿４４３１７７．１；ＮＭ＿０５２９４５＿１；ＡＦ１３２６００。
【０１１６】
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、ＢＬ−ＣＡＭ、Ｌｙｂ−８、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＦＬＪ２２８１４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１３７−１４６、ＷＯ２００３０７２０３６（請求項１、図１）、相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６；ＮＰ＿００１７６２．１；ＮＭ＿００１７７１＿１。
【０１１７】
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ；Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合的に相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合体を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質、ｐＩ：４．８４、分子量：２５０２８  ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）、ＷＯ２００３０８８８０８、ＵＳ２００３０２２８３１９、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＵＳ２００２１５０５７３（請求項４、１３〜１４頁）、ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１６）、ＷＯ９２０７５７４（図１）、ＵＳ５６４４０３３；Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５２６−１５３１、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：１６２１−１６２５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ４０（４）：２８７−２９５、Ｐｒｅｕｄ’ｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０（１）：１４１−１４６、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（２）６３３−６３７、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７（１１）：３４５７−３４６４。
【０１１８】
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１；ＣＸＣＬ１３ケモカインによって活性化され、リンパ球遊走及び液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染ならびにおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質結合型受容体）、３７２アミノ酸、ｐＩ：８．５４  分子量：４１９５９  ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）、ＷＯ２００４０４００００、ＷＯ２００４０１５４２６、ＵＳ２００３１０５２９２（実施例２）、ＵＳ６５５５３３９（実施例２）、ＷＯ２００２６１０８７（図１）、ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、２６９頁）、ＷＯ２００１７２８３０（１２〜１３頁）、ＷＯ２０００２２１２９（実施例１、１５２〜１５３頁、実施例２、２５４〜２５６頁）、ＷＯ９９２８４６８（請求項１、３８頁）；ＵＳ５４４００２１（実施例２、４９〜５２欄）、ＷＯ９４２８９３１（５６〜５８頁）、ＷＯ９２１７４９７（請求項７、図５）、Ｄｏｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２７９５−２７９９、Ｂａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０９：７７３−７７９。
【０１１９】
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球にそれらを提示する、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、２７３アミノ酸、ｐＩ：６．５６  分子量：３０８２０  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）、Ｔｏｎｎｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１１）：２８３９−２８４７、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ２９（６）：４１１−４１３、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：４３３−４４１、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ９９：１６８９９−１６９０３、Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８７５９−８７６６、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：１−１３、Ｎａｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ５９：５１２−５１９、ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１５）、ＵＳ６１５３４０８（３５〜３８欄）、ＵＳ５９７６５５１（１６８〜１７０欄）、ＵＳ６０１１１４６（１４５〜１４６欄）、Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３０（１）：６６−６８、Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２６）：１４１１１−１４１１９。
【０１２０】
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開閉型イオンチャネル５、細胞外ＡＴＰによって開閉されるイオンチャネルであり、シナプス伝達及び神経発生に関与し得、不足すると突発性排尿筋不安定の病態生理に寄与し得る）、４２２アミノ酸）、ｐＩ：７．６３、分子量：４７２０６  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）、Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１８（１−２）：１９５−１９９、ＷＯ２００４０４７７４９、ＷＯ２００３０７２０３５（請求項１０）、Ｔｏｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：１６５−１７３、ＷＯ２００２２２６６０（請求項２０）、ＷＯ２００３０９３４４４（請求項１）、ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）、ＷＯ２００３０２９２７７（８２頁）。
【０１２１】
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）タンパク質配列完全ｍａｅａｉｔｙ．．．ｔａｆｒｆｐｄ（１．．３５９、３５９アミノ酸）、ｐＩ：８．６６、分子量：４０２２５  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）、ＷＯ２００４０４２３４６（請求項６５）、ＷＯ２００３０２６４９３（５１〜５２、５７〜５８頁）、ＷＯ２０００７５６５５（１０５〜１０６頁）、Ｖｏｎ  Ｈｏｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４（１２）：４８７０−４８７７、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ９９：１６８９９−１６９０３。
【０１２２】
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質、Ｂ細胞活性化及びアポトーシスを制御し、機能消失は、全身性エリテマトーデスを有する患者における疾患活性の増加に関連付けられている）、６６１アミノ酸、ｐＩ：６．２０、分子量：７４１４７  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）、ＵＳ２００２１９３５６７、ＷＯ９７０７１９８（請求項１１、３９〜４２頁）、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３８（３）：２９９−３０４、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ９２：２８１５−２８２２、ＷＯ２００３０８３０４７、ＷＯ９７４４４５２（請求項８、５７〜６１頁）、ＷＯ２０００１２１３０（２４〜２６頁）。
【０１２３】
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様ドメイン及びＩＴＡＭドメインを含有する免疫グロブリンＦｃドメインの推定上の受容体、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）、４２９アミノ酸、ｐＩ：５．２８、分子量：４６９２５  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１−１ｑ２２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項６、図１８Ｅ−１〜１８Ｅ−２）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ９８（１７）：９７７２−９７７７、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項８）、ＥＰ１３４７０４６（請求項１）、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項７）。
【０１２４】
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２、Ｂ細胞発達及びリンパ腫形成に役割を有する可能性がある推定上の免疫受容体、転座による遺伝子の制御解除がいくつかのＢ細胞悪性腫瘍で生じる）、９７７アミノ酸、ｐＩ：６．８８分子量：１０６４６８  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号、ヒト：ＡＦ３４３６６２、ＡＦ３４３６６３、ＡＦ３４３６６４、ＡＦ３４３６６５、ＡＦ３６９７９４、ＡＦ３９７４５３、ＡＫ０９０４２３、ＡＫ０９０４７５、ＡＬ８３４１８７、ＡＹ３５８０８５、マウス：ＡＫ０８９７５６、ＡＹ１５８０９０、ＡＹ５０６５５８、ＮＰ＿１１２５７１．１。ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９７）、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７（１）：１２４−１２７、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項３、図１８Ｂ−１〜１８Ｂ−２）。
【０１２５】
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２、トモレグリン、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定上の膜貫通プロテオグリカン、成長因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチン関連）、３７４アミノ酸、ＮＣＢＩ受託：ＡＡＤ５５７７６、ＡＡＦ９１３９７、ＡＡＧ４９４５１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０５７２７６、ＮＣＢＩ遺伝子：２３６７１、ＯＭＩＭ：６０５７３４、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｑ９ＵＩＫ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４、ＡＹ３５８９０７、ＣＡＦ８５７２３、ＣＱ７８２４３６、ＷＯ２００４０７４３２０（配列番号８１０）、ＪＰ２００４１１３１５１（配列番号２、４、８）、ＷＯ２００３０４２６６１（配列番号５８０）、ＷＯ２００３００９８１４（配列番号４１１）、ＥＰ１２９５９４４（６９〜７０頁）、ＷＯ２００２３０２６８（３２９頁）、ＷＯ２００１９０３０４（配列番号２７０６）、ＵＳ２００４２４９１３０、ＵＳ２００４０２２７２７、ＷＯ２００４０６３３５５、ＵＳ２００４１９７３２５、ＵＳ２００３２３２３５０、ＵＳ２００４００５５６３、ＵＳ２００３１２４５７９、Ｈｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ６７：１４６−１５２、Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６６：５９３−６０２、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：４９０７−１２、Ｇｌｙｎｎｅ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｏｃｔ１５；９４（２）：１７８−８４。
【０１２６】
（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、ＭＥ２０、ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４、ＢＴ００７２０２、Ｍ３２２９５、Ｍ７７３４８、ＮＭ＿００６９２８、ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６（３３），１３７３１−１３７３６、Ｋｕｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（４），２２９６−２３０６。
【０１２７】
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン−１）、Ｈ７３６５、Ｃ９ｏｒｆ２、Ｃ９ＯＲＦ２、Ｕ１９８７８、Ｘ８３９６１、ＮＭ＿０８０６５５、ＮＭ＿００３６９２、Ｈａｒｍｓ，Ｐ．Ｗ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７（２１），２６２４−２６２９、Ｇｅｒｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２（１８）：２７２３−２７２７。
【０１２８】
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ−１）、Ｕ９５８４７、ＢＣ０１４９６２、ＮＭ＿１４５７９３  ＮＭ＿００５２６４、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９（８），２２６４−２２７７、Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８２（６５８６）：８０−８３。
【０１２９】
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、ＮＰ＿００２３３７．１、ＮＭ＿００２３４６．２、ｄｅ  Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１０３（６），７６８−７７４、Ｚａｍｍｉｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（３）：９４６−９５２。
【０１３０】
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２（アフリカツメガエル）、ＳＨＩＳＡ２）、ＮＰ＿００１００７５３９．１、ＮＭ＿００１００７５３８．１、Ｆｕｒｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０６（２），４８０−４９２、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０。
【０１３１】
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、ＮＰ＿０６７０７９．２、ＮＭ＿０２１２４６．２、Ｍａｌｌｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８０（１）：１１３−１２３、Ｒｉｂａｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１）：２７８−２８７。
【０１３２】
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、ＮＰ＿００３６５８．１、ＮＭ＿００３６６７．２、Ｓａｌａｎｔｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１７０（５）：５３７−５４５、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３７（３）：５２８−５３３。
【０１３３】
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、ＮＰ＿０６６１２４．１、ＮＭ＿０２０９７５．４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１００（１０）：１８９５−１９０１、Ｎａｒｉｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２８（３４）：３０５８−３０６８。
【０１３４】
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、ＮＰ＿０５９９９７．３、ＮＭ＿０１７５２７．３、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７（２４）：１１６０１−１１６１１、ｄｅ  Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１０３（６）：７６８−７７４。
【０１３５】
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、ＮＰ＿００６１３４．１、ＮＭ＿００６１４３．２、Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｄ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０５（１−２）：１６２−１６４、Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９４（３）：３２５−３２９。
【０１３６】
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、ＮＰ＿１１５９４０．２、ＮＭ＿０３２５５１．４、Ｎａｖｅｎｏｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（６）：１３００−１３０６、Ｈａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２９（２）：６１７−６２３。
【０１３７】
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、ＮＰ＿８５９０６９．２、ＮＭ＿１８１７１８．３、Ｇｅｒｈａｒｄ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（１０Ｂ）：２１２１−２１２７。
【０１３８】
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、ＮＰ＿０００３６３．１、ＮＭ＿０００３７２．４、Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１（８）：９２０−９２５、Ｎａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１２５（４）：９０９−９１７。
【０１３９】
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、ＮＰ＿００１１０３３７３．１、ＮＭ＿００１１０９９０３．１、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４０（７０８２）：３４６−３５１。
【０１４０】
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、ＮＰ＿０７８８０７．１、ＮＭ＿０２４５３１．３、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１１）：６７５９−６７６４、Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２０（１−３）：９７−１０１。
【０１４１】
（５２）シアル酸に結合する免疫グロブリン様レクチンファミリーのメンバーであるＣＤ３３は、６７ｋＤａのグリコシル化膜貫通タンパク質である。ＣＤ３３は、委任骨髄単球性前駆細胞及び赤血球前駆細胞に加えて、ほとんどの骨髄性白血病細胞及び単球性白血病細胞上で発現する。それは、最も初期の多能性幹細胞、成熟顆粒球、リンパ球細胞、または非造血細胞上では見られない（Ｓａｂｂａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：７５６−５６、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ６８：１０３０−５）。ＣＤ３３は、その細胞質尾部に２つのチロシン残基を含有し、これらの各々に、多くの阻害性受容体に見られる免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に類似した疎水性残基が続いている。
【０１４２】
（５３）ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）は、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、共通のタンパク質折り畳みを共有し、細胞接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質ターンオーバー、ならびに炎症及び免疫応答における役割などの多様な機能を有する。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、顆粒球及び単球の機能の負の制御因子である。この遺伝子のいくつかの代替的なスプライス転写物変異形が説明されているが、これらの変異形のうちの一部については全長の性質が決定されていない。この遺伝子は、染色体１２ｐ１３上のナチュラルキラー遺伝子複合体領域内の他のＣＴＬ／ＣＴＬＤスーパーファミリーメンバーに緊密に連結している（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ  Ｋ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（５）：５８５−９０、ｖａｎ  Ｒｈｅｎｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ１１０（７）：２６５９−６６、Ｃｈｅｎ  ＣＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ１０７（４）：１４５９−６７、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１５９−６９、Ｂａｋｋｅｒ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（２２）：８４４３−５０、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＡＳ，，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１５）：１４７９２−８０２）。ＣＬＬ−１は、単一のＣ型レクチン様ドメイン（カルシウムまたは糖のいずれにも結合することが予測されていない）、ストーク領域、膜貫通ドメイン、及びＩＴＩＭモチーフを含有する短い細胞質尾部を含む、ＩＩ型膜貫通受容体であることが示されている。
【０１４３】
抗体
本開示の抗体の実施形態のいずれにおいても、抗体は、ヒト化されている。一実施形態において、抗体は、本開示の実施形態のいずれかにおけるようなＨＶＲを含み、ヒトアクセプターフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。特定の実施形態において、ヒトアクセプターフレームワークは、以下の変異のうちのいずれか１つを含む、ヒトＶＬカッパＩコンセンサス（ＶＬＫＩ）フレームワーク及び／またはＶＨフレームワークＶＨ１である。
【０１４４】
別の態様において、抗体は、本明細書に提供される実施形態のいずれかにおけるようなＶＨと、本明細書に提供される実施形態のいずれかにおけるようなＶＬとを含む。
【０１４５】
本開示の更なる一態様において、本明細書の実施形態のいずれかに従う抗体は、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施形態において、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）２断片である。別の実施形態において、抗体は、実質的に全長の抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、または本明細書に定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１４６】
更なる一態様において、本明細書の実施形態のいずれかに従う抗体は、本明細書に記載される特徴のうちのいずれかを、単独で、または組み合わせて組み込むことができる。
【０１４７】
１．抗体親和性
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有し、任意で１０−１３Ｍ以下（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。
【０１４８】
一実施形態において、Ｋｄは、以下のアッセイによって説明されるように、対象となる抗体のＦａｂバージョン及びその抗原によって実行される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の一連の滴定の存在下でＦａｂを最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化し、その後、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートに結合している抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中２重量体積％のウシ血清アルブミンで２〜５時間室温（約２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）中、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、対象となるＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫している）。その後、対象となるＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）継続して、平衡に到達することを確実にしてもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移動する。その後、溶液を除去し、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））でプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥したとき、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを１０分間計数する。２０％以下の最大結合をもたらす各Ｆａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
【０１４９】
別の実施形態に従うと、Ｋｄは、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを有するＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００、ＢＡＩＣＯＲＥ（登録商標）−Ｔ２００、またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を２５℃で使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で、抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）になるまで希釈し、及び／またはＨＢＳ−Ｐ（０．０１ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）で希釈してから、５μｌ／分及び／または３０μｌ／分の流量で注入して、約１０応答単位（ＲＵ）のカップリングされたタンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基を遮断する。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、約２５μｌ／分の流量、２５℃で注入する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。本明細書に記載される表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、結合速度は、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗−抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定することができる。
【０１５０】
２．抗体断片
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに本明細書に記載される他の断片が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、またＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。エピトープ残基に結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６を参照されたい。
【０１５１】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載される。
【０１５２】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。
【０１５３】
抗体断片は、本明細書に記載される、インタクト抗体のタンパク質消化、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって作製することができる。
【０１５４】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類（サルなど）由来の可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。更なる一例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１５５】
特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減するために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、１つ以上の可変ドメインを含み、そのＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはそれらの部分）は非ヒト抗体に由来し、そのＦＲ（またはそれらの部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意でヒト定常領域の少なくとも一部分を含むだろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体内のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来している抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１５６】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説され、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を説明）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を説明）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を説明）、ならびにＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングに対する「誘導選択」アプローチを説明）に更に記載されている。
【０１５７】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、「最良適合」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
４．ヒト抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において既知である様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１５９】
ヒト抗体は、抗原負荷に応答して、インタクトヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように修飾されているトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに統合される、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部分を含有する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を説明）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を説明）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明）、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号（ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を説明）も参照されたい。そのような動物によって生成されたインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって更に修飾されてもよい。
【０１６０】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が説明されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体もまた、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。更なる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を説明）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマを説明）に記載されているものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【０１６１】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。その後、そのような可変ドメインは、所望されるヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術は、本明細書に記載されている。
【０１６２】
５．ライブラリ由来の抗体
本開示の抗体は、コンビナトリアルライブラリを所望される活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望される結合特徴を有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野において既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に更に記載されている。
【０１６３】
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中でランダムに組み換えられ、その後、それらは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載される抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、（例えば、ヒトから）ナイーブレパートリーをクローニングして、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原及びまた自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配置を達成することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリを説明する特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１６４】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１６５】
６．多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体としては、全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなど）、共有結合的または非共有結合的に連結されている抗体断片などが挙げられるが、これらに限定されない。重鎖可変領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖可変領域の少なくとも一部分を更に含むＶＨ／ＶＬ単位はまた、「アーム」または「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、第２のヘミマーとの分子内ジスルフィド結合が形成されるのを可能にするのに十分な重鎖可変領域の部分を含む。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、例えば、相補的ホール変異またはノブ変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異またはホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、本明細書で更に考察される。
【０１６６】
特定の実施形態において、本明細書に提供される多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり得る。「二重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を網羅する。本明細書において、二重特異性抗体はまた、「重複特異性」を有するもの、または「重複特異性である」とも称される場合がある。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。本明細書で使用される場合、「二重パラトピック抗体」という用語は、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインが、同一の抗原分子上の２つの異なるエピトープに結合する二重特異性抗体を指し、それは、２つの異なる抗原分子上のエピトープに結合してもよい。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、二重パラトピック抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、１つかつ同一の抗原分子内の２つのエピトープに結合してもよい（分子内結合）。例えば、二重パラトピック抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、同じ抗体分子上の２つの異なるエピトープに結合してもよい。特定の実施形態において、二重パラトピック抗体が結合する２つの異なるエピトープは、通常１つの単一特異性抗体（例えば、従来の抗体など）または１つの免疫グロブリン単一可変ドメインに同時には結合しないエピトープである。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、二重パラトピック抗体の第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは、２つの別個の抗原分子内に位置するエピトープに結合してもよい（分子間結合）。
【０１６９】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、ならびに「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号）、ＷＯ２００９／０８９００４、ＵＳ２００９／０１８２１２７、ＵＳ２０１１／０２８７００９、Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．（２００５）２６（６）：６４９−６５８、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：１−９を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用される場合、「ノブイントゥホール」または「ＫｎＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で、一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによって、インビトロまたはインビボで一緒に対合することを指向する技術を指す。例えば、ＫｎＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ６：７８１−７８８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＫｎＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖を一緒に対合することが促進される。例えば、それらのＦｃ領域内にＫｎＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含むことができるか、または類似したもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含むことができる。ＫｎＨ技術はまた、２つの異なる受容体の細胞外ドメインを一緒に対合するか、または異なる標的認識配列を含む任意の他のポリペプチド配列（例えば、アフィボディ、ペプチボディ、及び他のＦｃ融合体を含む）を対合するために使用することもできる。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で、隆起（ノブ）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態において、他のポリペプチドは、ホール変異を有する。
【０１７１】
「隆起」とは、第１のポリペプチドの界面から突出し、したがって、隣接界面（すなわち、第２のポリペプチドの界面）の補償空洞内に位置付け可能となり、これにより、例えば、ヘテロ多量体を安定させ、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が好都合になる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、隆起をコードするように改変される。これを達成するために、第１のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解されるだろう。様々なアミノ残基の側鎖体積は、例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９の表１に示される。「隆起」を導入する変異は、「ノブ変異」と称され得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、隆起の形成のための移入残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される、天然に存在するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、移入残基は、トリプトファンまたはチロシンである。いくつかの実施形態において、隆起の形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなどの小さい側鎖体積を有する。
【０１７３】
「空洞」とは、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、したがって、隣接する第１のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように改変される。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解されるだろう。いくつかの実施形態において、空洞の形成のための移入残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される、天然に存在するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、移入残基は、セリン、アラニン、またはトレオニンである。いくつかの実施形態において、空洞の形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きい側鎖体積を有する。「空洞」を導入する変異は、「ホール変異」と称され得る。
【０１７４】
隆起は、空洞内に「位置付け可能」であり、これは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドそれぞれの界面上の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐなどの隆起は、典型的には界面の軸から垂直には延びず、好ましい立体構造を有さず、いくつかの例において、対応する空洞を有する隆起の整列は、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるものなどの３次元構造に基づいて、隆起／空洞の対をモデル化することに依存する。これは、当技術分野において広く受け入れられている技術を使用して達成することができる。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のノブ変異は、Ｔ３６６Ｗである。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ４定常領域内のホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。
【０１７７】
多重特異性抗体はまた、静電式ステアリング効果を操作して、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、ＵＳ４６７６９８０、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して、二重特異性抗体を作製すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して、二重特異性抗体断片を作製すること（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））、ならびに一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４））、ならびに三重特異性抗体を調製すること（例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））によっても作製することができる。
【０１７８】
「オクトパス抗体」または「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた、本明細書に含まれる（ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１、及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１７９】
特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異形が生成され得る。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８０】
特定の実施形態において、本開示は、全てではないが一部のエフェクター機能を有し、それによりインビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途にとって望ましい候補となる、抗体変異形を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃ（ＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃ（ＲＩ、Ｆｃ（ＲＩＩ、及びＦｃ（ＲＩＩＩ。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、ＵＳ５５００３６２（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７））に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または更に、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて、評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実行してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定はまた、当技術分野において既知である��法を使用して実行することもできる（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６））。
【０１８１】
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体としては、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（ＵＳ７３３２５８１）。
【０１８２】
特定の実施形態において、野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９が、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃのプロリン３２９とＦｃｇＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｒｐ１１０との間に形成される、Ｆｃ／Ｆｃγ受容体界面内のプロリンサンドイッチを破壊するのに十分な大きさのアミノ酸残基で置換される（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ４０６，２６７−２７３（２０  Ｊｕｌｙ  ２０００））。更なる一実施形態において、Ｆｃ変異形内の少なくとも１つの更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、またはＰ３３１Ｓであり、更に別の実施形態において、上記の少なくとも１つの更なるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅである（その全体が参照により組み込まれる、ＵＳ８９６９５２６）。
【０１８３】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＦｃ変異形を含み、このポリペプチドは、グリシンで置換されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＰｒｏ３２９を有し、Ｆｃ変異形は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５ＡまたはヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅにおいて少なくとも２つの更なるアミノ酸置換を含み、残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けされる（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，９６９，５２６号）。特定の実施形態において、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａの置換を含むポリペプチドは、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の低減を呈し、野生型ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むポリペプチドによって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％にＡＤＣＣを下方調節し、及び／またはＡＤＣＰを下方調節する（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，９６９，５２６号）。
【０１８４】
特定の一実施形態において、野生型ヒトＦｃポリペプチドのＦｃ変異形を含むポリペプチドは、三重変異、つまり、Ｐｒｏ３２９位におけるアミノ酸置換、Ｌ２３４Ａ変異、及びＬ２３５Ａ変異（Ｐ３２９／ＬＡＬＡ）を含む（その全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，９６９，５２６号）。特定の実施形態において、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換、つまり、Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａを含む。
【０１８５】
ＦｃＲへの結合が改善または減弱された特定の抗体変異形が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい）。
【０１８６】
特定の実施形態において、抗体変異形は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載される、改変された（すなわち、改善もしくは減弱された）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす改変がＦｃ領域内になされる。
【０１８８】
増加した半減期、及び母体ＩｇＧの胎児への移動に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、その中にＦｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異形としては、Ｆｃ領域残基、２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上に置換を有するもの、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１８９】
また、Ｆｃ変異形の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１もまた参照されたい。
【０１９０】
７．システイン操作された抗体変異形
特定の実施形態において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体、例えば、「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の利用しやすい部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を薬物部分にコンジュゲートして、本明細書に更に記載されるように、免疫コンジュゲートを作製することができる。特定の実施形態において、以下の残基、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、軽鎖のＫ１４９（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちのいずれか１つ以上が、システインで置換され得る。システイン操作された抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成することができる。
【０１９１】
いくつかの態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、以下の表Ａに列挙される重鎖及び軽鎖システイン置換のうちの１つを含む。
【表Ａ】
0006621919.tif 000029
【０１９２】
他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表Ｂに列挙される重鎖システイン置換のうちの１つを含む。
【表Ｂ−１】
0006621919.tif 000030
【表Ｂ−２】
0006621919.tif 000031
【０１９３】
いくつかの他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表Ｃに列挙される軽鎖システイン置換のうちの１つを含む。
【表Ｃ】
0006621919.tif 000032
【０１９４】
いくつかの他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表Ｄに列挙される重鎖及び軽鎖システイン置換のうちの１つを含む。
【表Ｄ】
0006621919.tif 000033
【０１９５】
いくつかの他の態様において、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体は、表Ａ〜Ｄのいずれかに列挙される重鎖及び軽鎖システイン置換の対を含む。そのような対の非限定的な例としては、（ｉ）ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ及びＬＣ  Ｓ１２１Ｃ、（ｉｉ）ＨＣ  Ａ１１８Ｃ及びＬＣ  Ｓ１２１Ｃ、ならびに（ｉｉｉ）ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ及びＬＣ  Ｖ２０５Ｃが挙げられる。
【０１９６】
癌の治療における本開示の抗体−薬物コンジュゲートに有用であり得るシステイン操作された抗体としては、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原は、当技術分野において既知であり、当技術分野において周知の方法及び情報を使用して抗体を生成するのに使用するために調製され得る。癌の診断及び治療のための有効な細胞標的を発見するための試みにおいて、研究者らは、１つ以上の正常な非癌性細胞（複数可）と比較して、１つ以上の特定の種類（複数可）の癌細胞の表面上に特異的に発現する膜貫通ポリペプチドまたは他の様式で腫瘍に関連するポリペプチドを特定しようとした。しばしば、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌性細胞の表面上と比較して、癌細胞の表面上でより豊富に発現する。そのような腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの特定により、抗体に基づく治療法によって癌細胞を破壊のために特異的に標的化する能力が生じた。
【０１９７】
腫瘍関連抗原ＴＡＡの例としては、本明細書に列挙されるＴＡＡ（１）〜（５３）が挙げられるが、これらに限定されない。便宜上、これらの抗原（全て当技術分野において既知である）に関する情報を本明細書に列挙し、この情報は、名称、別称、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号及び主な参考文献（複数可）に続き、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質配列を特定する慣例を含む。ＴＡＡ（１）〜（５３）に対応する核酸及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて入手可能である。抗体によって標的化される腫瘍関連抗原としては、引用される参考文献において特定されている配列と比較して、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有する全てのアミノ酸配列変異形及びアイソフォーム、または引用される参考文献中に見出される配列を有するＴＡＡと実質的に同一の生物学的特性もしくは特徴を呈するものが挙げられる。例えば、変異形配列を有するＴＡＡは一般に、列挙されている対応する配列を有するＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される参考文献中の配列及び開示は、参照により明示的に組み込まれる。
【０１９８】
ペプチド及びポリペプチド
本開示のいくつかの実施形態において、担体は、細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）であり得る。ＣＰＰは、腫瘍透過及び内部移行能力を呈する、典型的には３０個未満のアミノ酸からなる小ペプチドである。ＣＰＰ薬物コンジュゲートは、転座及び内部移行が可能であり、したがって、薬物負荷量の送達を提供する。ＣＰＰは、当技術分野において既知であり、例としては、ＨＩＶ−１ウイルス由来のＴａｔタンパク質及びキイロショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメインが挙げられる。ＣＰＰは、操作されたカチオン性ペプチドを更に含み、例えば、ＵＳ２０１５／０２３９９４７、Ｒｅｇｂｅｒｇ，Ｊａｋｏｂ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ２０１２，５，９９１−１００７、Ｍｕｎｙｅｎｄｏ，ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２０１２，２，１８７−２０２、及びＵＳ２００５／０２６０７１５（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。リンカーは、ジスルフィド結合によってＣＰＰシステインスルフヒドリル部分にコンジュゲートされ得る。いくつかのそのような態様において、ＣＰＰは、１当量当たり少なくとも１つのシステイン残基を含む。いくつかの他のそのような態様において、システイン残基は、直鎖ＣＰＰの一端または両端に挿入されてもよい。
【０１９９】
本開示のいくつかの実施形態において、担体は、１当量当たり少なくとも１つのシステインチオール部分を有する細胞標的化ペプチドまたはポリペプチド（「ＣＴＰ」）であり得る。
【０２００】
標的化された細胞株に対する特異性及び親和性を有するＣＴＰは、当技術分野において既知である。例えば、ＭｉｍｏＤＢは、２０，０００個を超えるペプチド配列及び１４００個を超える標的の公的に入手可能なミモトープのデータベースであり、そこでは、ＣＴＰ標的親和性値が具体的に提供される。更に、腫瘍ＨｏＰｅは、標的腫瘍及び親和性を参照する、７００個を超えるペプチド配列のデータベースである。
【０２０１】
本開示のいくつかの実施形態において、ＣＴＰは、当技術分野において既知であるインビボファージディスプレイ技術（バイオパニング）法を使用して特定することができ、この方法では、ペプチドライブラリを１つ以上の癌細胞株に対してスクリーニングして、癌細胞に対する十分な特異性を有する担体としての使用に好適であり得るペプチドを特定することができる。一般に、ファージディスプレイにおいて、対応するコード配列と、ファージ表面タンパク質のうちの１つをコードする遺伝子との融合によって、ランダムペプチドがファージ表面上で発現される。所望されるファージは、単離された器官断片（エキソビボ手順）または培養された細胞（インビトロ手順）などの標的に対するそれらの結合に基づいて選択される。標的化ペプチドの特定はまた、マウスにファージライブラリを注入し、その後、標的化器官から結合したファージを救出することによって達成される、インビボ手順によっても行うことができる。選択されたペプチドは、ディスプレイされたペプチドをコードするゲノムファージ領域を配列決定することによって特定される。選択的ファージホーミングを、脳及び腎臓に（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３８０（１９９６）３６４−３６６）、肺、皮膚、及び膵臓の脈管構造に（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲａｊｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２（１９９８）４３０−４３７）、ならびにいくつかの腫瘍型に（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５（１９９７）５４２−５４６）付与した、単離されたペプチド配列へのインビボ器官スクリーニングの適用に成功し得る。更に、Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，「Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８（１９８５），１３１５−７、Ｓｃｏｔｔ  ＪＫ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ，「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９（１９９０）３８６−３９０、ＭｃＧｕｉｒｅ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ４：４４８０（２０１４）」、Ｔｈｕｎｄｉｍａｄａｔｈｉｌ，Ｊｙｏｔｈｉ「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｖｏｌ．２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ９６７３４７（２０１２）、及びＺｈｉ，ＪＬ  ａｎｄ  Ｃｈｉ，ＨＣ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｖａ���ｃｕｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１２，１０（Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ１）を参照されたい。Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｏｔｔ、ＭｃＧｕｉｒｅ、Ｔｈｕｎｄｉｍａｄａｔｈｉｌ、及びＺｈｉの各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。その後、ディスプレイファージは、１つ以上の対象となる細胞型に対してスクリーニングされ得、その細胞によって発現される抗原と相互作用するファージが、増幅され、単離され得る。その後、標的化ペプチドが、配列決定され、特定され得る。
【０２０２】
本開示のいくつかの態様において、ＣＴＰは、標準的技術を使用して天然源から単離されてもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開出願第２００３／０２３２０１３号を参照されたい）。いくつかの他の態様において、ＣＴＰは、標準的技術を使用して合成されてもよい。例えば、ＣＴＰは、固相合成技術を使用して合成されてもよい（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ＲＢ，「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６３，８５（１４），２１４９−２１５４を参照されたい）。他のペプチド合成技術が、当業者にとって周知である（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．：「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９７６（２ｎｄ  ｅｄ．）、及び「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ１９８５を参照されたい。各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。そのような合成における使用に適切な保護基は、上記の文書に、及びＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出されるだろう。これらの合成方法は、成長するペプチド鎖への、１つ以上のアミノ酸残基または好適な保護アミノ酸残基の逐次付加を伴う。通常、第１のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、好適な、選択的に除去可能な保護基によって保護される。リジン及びシステインなどの反応性側基を含有するアミノ酸には、異なる選択的に除去可能な保護基が利用される。
【０２０３】
任意で、標的化ペプチドの抗原に対する親和性を増加させるために、ペプチドはトリリジンコア上で四量体化されてもよい（ＭｃＧｕｉｒｅ  ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。ＭｃＧｕｉｒｅによって開示されるように、四量体化は、細胞に対する多価の結合を提供することによって、ならびにペプチド結合価及びファージ上にディスプレイされる配向を維持することによって、親和性を増強する。本開示のいくつかの態様において、標的化ペプチド単量体は、テトラシステインコア上でオリゴマー化されてもよい。
【０２０４】
リンカーは、ジスルフィド結合によってＣＴＰシステインスルフヒドリル部分にコンジュゲートされ得る。いくつかのそのような態様において、ＣＴＰは、１当量当たり少なくとも１つのシステイン残基を含む。いくつかの他のそのような態様において、システイン残基は、直鎖ＣＴＰの一端または両端に挿入されてもよい。更に他の態様において、１つ以上のＣＴＰを有するコアが少なくとも１つのシステイン残基を含んでも、少なくとも１つのシステイン残基がそのようなコアに誘導体化されてもよい。
【０２０５】
他の担体
本開示のいくつかの実施形態において、担体は、１当量当たり少なくとも１つのシステインチオール部分を有する成長因子、ホルモン、サイトカイン、またはタンパク質であり得る。
【０２０６】
いくつかのそのような態様において、細胞標的化部分は、成長因子であり得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国公開出願第２０１４／０３４９９４４号を参照されたい）。例えば、形質転換成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子（１−２３）、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）、ヘレグリン、血小板由来成長因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、または低酸素誘導因子が、本開示に従う細胞標的化部分として使用され得る。これらの成長因子は、同族成長因子受容体を発現する細胞に対する構築物の標的化を可能にする。例えば、ＶＥＧＦを使用して、ＦＬＫ−１及び／またはＦｌｔ−１を発現する細胞を標的化することができる。
【０２０７】
本開示の更なる態様において、細胞標的化部分は、ホルモンであり得る（例えば、米国第２０１４／０３４９９４４号を参照されたい）。本開示において使用するためのホルモンのいくつかの例としては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体化ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、ドーパミン、メラトニン、チロキシン、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、アドレナリン、ノルアドレナリン、プロゲステロン、インスリン、グルカゴン、アミリン、エリスロポイチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｔｉｎ）、カルシトリオール、カルシフェロール、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、神経ペプチドＹ、グレリン、ＰＹＹ３−３６、インスリン様成長因子−１、レプチン、トロンボポエチン、アンジオテンシノーゲン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、またはＩＬ−３６が挙げられるが、これらに限定されない。そのような態様において、ホルモンを含む標的化構築物は、示されるホルモンの細胞外受容体を含む細胞集団を標的化する方法を可能にする。
【０２０８】
依然更なるそのような態様において、細胞標的化部分は、顆粒球−結腸刺激因子、マクロファージ−結腸刺激因子、顆粒球−マクロファージ結腸刺激因子、白血病阻害因子、エリスロポエチン、顆粒球マクロファージ結腸刺激因子、オンコスタチンＭ、白血病阻害因子、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＭＩＦ、及びＩＧＩＦなどのサイトカインであり得る（例えば、米国２０１４／０３４９９４４号を参照されたい）。
【０２０９】
本開示の更なる他の態様において、担体は、タンパク質であり得る。そのようなタンパク質の例としては、アルブミン、フィブロネクチン、コラーゲン、アルファ−１−アンチトリプシン、アルファ−２−マクログロブリン、セルロプラスミン、トランスフェリン、ラミニン、トロンボスポンジン、インテグリン、Ｎ−ＣＡＭ、ＰＥＣＡＭ、ＣＤ４４を含むが、これらに限定されない、セレクチン、インテグリン、及びカドヘリンなどの細胞接着タンパク質が挙げられる。（例えば、米国公開出願第２０１０／０１６８０１９号を参照されたい。Ｇｕｍｂｉｎｅｒ，Ｂ  Ｍ（１９９６）．「Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｃｅｌｌ８４（３）：３４５−３５７もまた参照されたい。各参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる）。他の例としては、脂肪酸または他の疎水性リガンドと複合体を形成する脂質結合タンパク質が挙げられ、ミエリン塩基性タンパク質、スペクトリン、リポタンパク質リパーゼ、アポリポタンパク質Ｂ及びＥ、ＬＤＬを含むが、これらに限定されない（例えば、ＵＳ２０１０／０１６８０１９を参照されたい。参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｎｌｏｈｒ，ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｉｐｉｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｇｅｎｅｓ」，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：２７７−３０３（１９９７）もまた、参照されたい）。
【０２１０】
リンカーは、ジスルフィド結合によって成長因子、ホルモン、サイトカイン、またはタンパク質システインスルフヒドリル部分にコンジュゲートされ得る。いくつかのそのような態様において、成長因子、ホルモン、サイトカイン、またはタンパク質は、少なくとも１つのシステイン残基を含む。いくつかの他のそのような態様において、システイン残基は、成長因子、ホルモン、サイトカイン、またはタンパク質の一端もしくは両端内に、またはそこに挿入されてもよい。
【０２１１】
薬物
本開示の様々な態様のいずれにおいても、薬物は一般に、リンカーとコンジュゲートを形成するのに好適な官能基を含む任意の薬物である。そのような連結コンジュゲートの例としては、脂肪族（非環式）アミン、環状アミン、脂肪族アルコール、及び環状アルコールが挙げられる。本明細書で使用される場合、「薬物部分」は、本開示のコンジュゲートの薬物構成物を指す。薬物部分は、リンカーに、または任意でスペーサーに共有結合する。脂肪族アミンは、好適に一級アミンまたは二級アミンであり得る。二級アミンコンジュゲーション部分を有する薬物の一例は、モノメチルオーリスタチンＥ（「ＭＭＡＥ」）である。環状アミンは、不飽和環（例えば、アリール）、部分飽和環、または完全飽和環内に窒素ヘテロ原子を含む。不飽和環内に環状窒素コンジュゲーション部分を有する薬物の一例は、ピロロベンゾジアゼピンである。不飽和環に環状アルコールコンジュゲーション部分を有する薬物の一例は、マイタンシノイドである。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、薬物は、マイタンシノイドである。マイタンシノイドは、マイタンシンの誘導体であり、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカ低木メイテナス・セラタ（ｅａｓｔ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｈｒｕｂ  Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から最初に単離された（米国特許第３８９６１１１号）。その後、特定の微生物もまた、マイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノイドは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号、及び同第４，３７１，５３３号に開示される。この段落に引用される各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
マイタンシノイド薬物部分は、抗体−薬物コンジュゲートにおいて魅力的な薬物部分であるが、これは、それらが、（ｉ）発酵もしくは化学修飾、または発酵生成物の誘導体化により比較的調製しやすく、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーによる抗体へのコンジュゲーションに好適な官能基での誘導体化に対応可能であり、（ｉｉｉ）血漿中で安定しており、かつ（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるためである。
【０２１４】
マイタンシノイド薬物部分としての使用に好適な特定のマイタンシノイドは、当技術分野において既知であり、既知の方法に従って天然源から単離され得るか、または遺伝子操作技術を使用して産生され得る（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ９９：７９６８−７９７３を参照されたい）。マイタンシノイドはまた、既知の方法に従って合成的にも調製され得る。
【０２１５】
代表的なマイタンシノイド薬物部分としては、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４２５６７４６号）（例えば、アンサミトシン（ａｎｓａｍｙｔｏｃｉｎ）Ｐ２の水素化アルミニウムリチウム還元によって調製される）、Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号）（例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓもしくはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓを使用する脱メチル化、またはＬＡＨを使用する脱塩素化によって調製される）、ならびにＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（例えば、塩化アシルを使用するアシル化によって調製される）などの修飾芳香族環を有するものと、芳香族環の他の位置に修飾を有するものとが挙げられるが、これらに限定されない。この段落に引用される各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
代表的なマイタンシノイド薬物部分としては、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４４２４２１９号）（例えば、マイタンシノールのＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製される）、Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（ＵＳ４３３１５９８）、Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアルコキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（例えば、Ｎｏｃａｒｄｉａによって調製される）、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（ＵＳ４３６４８６６）（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるマイタンシノールの転換によって調製される）、Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号）（例えば、Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｌｆｌｏｒａから単離される）、Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４３６２６６３号及び同第４３２２３４８号）（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるマイタンシノールの脱メチル化によって調製される）、ならびに４，５−デオキシ（ＵＳ４３７１５３３）（例えば、マイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される）などの修飾を有するものもまた挙げられる。この段落に引用される各特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
マイタンシノイド化合物上の多くの位置は、結合位置として有用である。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によって形成され得る。いくつかの実施形態において、この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じ得る。いくつかの実施形態において、結合は、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ−３位で形成される。
【０２１８】
本開示の範囲内のマイタンシノイド薬物部分としては、以下の構造を有するものが挙げられ、
【化２５】
0006621919.tif 000034
式中、各Ｒは独立して、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルであり得る。アミド基を硫黄原子に結合させるアルキレン鎖は、メタニル、エタニル、またはプロピルであり得、すなわち、ｍは、１、２、または３である（ＵＳ６３３４１０、ＵＳ５２０８０２０、Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１、及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２１９】
マイタンシノイド薬物部分の全ての立体異性体は、本発明のコンジュゲート、すなわち、キラル炭素におけるＲ及びＳ構成の任意の組み合わせに対して企図される（ＵＳ７２７６４９７、ＵＳ６９１３７４８、ＵＳ６４４１１６３、ＵＳ６３３４１０（ＲＥ３９１５１）、ＵＳ５２０８０２０、Ｗｉｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９：４３９２−４４０８、これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、マイタンシノイド薬物部分は、以下の立体化学を有する。
【化２６】
0006621919.tif 000035
【０２２０】
マイタンシノイド薬物部分の代表的な実施形としては、構造、
【化２７−１】
0006621919.tif 000036
【化２７−２】
0006621919.tif 000037
を有する、ＤＭ１、ＤＭ３、及びＤＭ４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
マイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、その作製方法、及びそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号及び同第５，４１６，０６４号、ＵＳ２００５／０２７６８１２Ａ１、ならびに欧州特許第ＥＰ０  ４２５  ２３５Ｂ１号に開示されており、それらの開示がこれにより参照により本明細書に明示的に組み込まれる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）、及びＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）もまた参照されたい。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、抗体−マイタンシノイドコンジュゲートは、抗体またはマイタンシノイド分子のいずれかの生物活性を著しく減弱させることなく、担体（例えば、抗体）をマイタンシノイド分子に化学的に連結させることによって調製され得る。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい（その開示がこれにより参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、１抗体分子当たり平均３〜４個のマイタンシノイド分子がコンジュゲートされたＡＤＣは、抗体の機能または可溶性に悪影響を与えることなく、標的細胞の細胞傷害性を増強することにおいて有効性を示している。いくつかの例において、毒素／抗体の１つの分子でさえも、裸抗体を使用するより細胞傷害性を増強することが予測される。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、薬物は、ドラスタチン、オーリスタチン、ならびにそれらの類似体及び誘導体である（ＵＳ５６３５４８３、ＵＳ５７８０５８８、ＵＳ５７６７２３７、ＵＳ６１２４４３１）。オーリスタチンは、海生軟体動物化合物ドラスタチン−１０の誘導体である。いかなる特定の理論によっても拘束されることを意図するものではないが、ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂及び細胞分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（ＵＳ５６６３１４９）及び抗菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチン／オーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通して抗体に結合し得る（ＷＯ０２／０８８１７２、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１（７）：７７８−７８４、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０２（４）：１４５８−１４６５）。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２４】
代表的なオーリスタチンの実施形態としては、それらの開示の全体が参照により明示的に組み込まれる、ＵＳ７４９８２９８及びＵＳ７６５９２４１に開示される、Ｎ末端連結されたモノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが挙げられ、
【化２８】
0006621919.tif 000038
式中、ＤＥ及びＤＦの波線は、束縛リンカーへの共有結合部位を示す。独立して、各位置で、Ｒ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環、及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され、Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環、及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され、Ｒ５は、Ｈ及びメチルから選択され、Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）、Ｃ３−Ｃ８複素環、及びＣ１−Ｃ８アルキル−（Ｃ３−Ｃ８複素環）から選択され、各Ｒ８は独立して、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環、及びＯ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）から選択され、Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、Ｒ１０は、アリールまたはＣ３−Ｃ８複素環から選択され、Ｚは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、またはＮＲ１２であり（式中、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ８アルキルである）、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８複素環、−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−Ｒ１４、または−（Ｒ１３Ｏ）ｍ−ＣＨ（Ｒ１５）２から選択され、ｍは、１〜１０００の範囲の整数であり、Ｒ１３は、Ｃ２−Ｃ８アルキルであり、Ｒ１４は、ＨまたはＣ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ１５の各出現は独立して、Ｈ、ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈ、または−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、Ｒ１６の各出現は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨであり、Ｒ１８は、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−アリール、−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８複素環）、及び−Ｃ（Ｒ８）２−Ｃ（Ｒ８）２−（Ｃ３−Ｃ８炭素環）から選択され、ｎは、０〜６の範囲の整数である。任意で、Ｒ４及びＲ５はともに、環状炭素を形成し、式−（ＣＲａＲｂ）ｎ−を有し、式中、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、及びＣ３−Ｃ８炭素環から選択され、ｎは、２、３、４、５、及び６から選択される。
【０２２５】
いくつかの態様において、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ７は独立して、イソプロピルまたはｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ５は、−Ｈまたはメチルである。代表的な一実施形態において、Ｒ３及びＲ４は各々、イソプロピルであり、Ｒ５は、−Ｈであり、Ｒ７は、ｓｅｃ−ブチルである。他の態様において、Ｒ２及びＲ６は各々、メチルであり、Ｒ９は、−Ｈである。他の態様において、Ｒ８の各出現は、−ＯＣＨ３である。他の態様において、Ｒ３及びＲ４は各々、イソプロピルであり、Ｒ２及びＲ６は各々、メチルであり、Ｒ５は、−Ｈであり、Ｒ７は、ｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ８の各出現は、−ＯＣＨ３であり、Ｒ９は、−Ｈである。他の態様において、Ｚは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。他の態様において、Ｒ１０は、アリールである。他の態様において、Ｒ１０は、−フェニルである。他の態様において、Ｚが−Ｏ−であるとき、Ｒ１１は、−Ｈ、メチル、またはｔ−ブチルである。他の態様において、Ｚが−ＮＨであるとき、Ｒ１１は、−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中、Ｒ１５は、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ１６）２であり、Ｒ１６は、−Ｃ１−Ｃ８アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨである。他の態様において、Ｚが−ＮＨであるとき、Ｒ１１は、−ＣＨ（Ｒ１５）２であり、式中、Ｒ１５は、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３Ｈである。
【０２２６】
式ＤＥの代表的なオーリスタチンの一実施形態は、ＭＭＡＥであり、式中、波線は、抗体−薬物コンジュゲート：ＭＭＡＥのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す。
【化２９】
0006621919.tif 000039
【０２２７】
式ＤＦの代表的なオーリスタチンの一実施形態は、ＭＭＡＦであり、式中、波線は、抗体−薬物コンジュゲート：ＭＭＡＦのリンカー（Ｌ）への共有結合を示す。
【化３０】
0006621919.tif 000040
【０２２８】
他の代表的な実施形態としては、ペンタペプチドオーリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニンカルボキシ修飾を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ２００７／００８８４８）及びペンタペプチドオーリスタチン薬物部分のＣ末端にフェニルアラニン側鎖修飾を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ２００７／００８６０３）が挙げられる。この段落に引用される各公報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
典型的には、ペプチド系薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／またはペプチド断片の間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、液相合成法に従って、調製することができる（例えば、Ｅ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌｕｂｋｅ，「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、いくつかの実施形態において、ＵＳ７４９８２９８、ＵＳ５６３５４８３、ＵＳ５７８０５８８、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ１３：２４３−２７７、Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５、Ｐｅｔｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３、及びＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−７８４の方法に従って調製することができる。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、ＭＭＡＥなどの式ＤＥ及びＭＭＡＦなどの式ＤＦのオーリスタチン／ドラスタチン薬物部分、ならびにそれらの薬物−リンカー中間体及び誘導体（ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、及びＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥなど）は、ＵＳ７４９８２９８、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１７：１１４−１２４、及びＤｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８−７８４に記載される方法を使用して調製し、その後、対象となる抗体にコンジュゲートすることができる。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
いくつかの実施形態において、薬物は、カリケアマイシンである。カリケアマイシンファミリーの抗生物質、及びそれらの類似体は、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生成することができる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２、Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５８：２９２５−２９２８）。カリケアマイシンは、細胞内作用部位を有するが、特定の例において、血漿膜を容易には横断しない。したがって、いくつかの実施形態において、抗体媒介性内部移行を通したこれらの薬剤の細胞取り込みによって、それらの細胞傷害性効果を大いに増強することができる。カリケアマイシン薬物部分を有する抗体−薬物コンジュゲートを調製する、非限定的な代表的な方法は、例えば、ＵＳ５７１２３７４、ＵＳ５７１４５８６、ＵＳ５７３９１１６、及びＵＳ５７６７２８５に記載され、これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３２】
いくつかの態様において、薬物部分は、式、
【化３１】
0006621919.tif 000041
を有するカリケアマイシン化合物であり、式中、Ｘは、ＢｒまたはＩであり、Ｌは、リンカーであり、Ｒは、水素、Ｃ１−６アルキル、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ１−６アルキルであり、Ｒａは、水素またはＣ１−６アルキルである。カリケアマイシン化合物上の多くの位置は、結合位置として有用である。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によって形成され得る。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、薬物は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。いくつかの実施形態において、ＰＤＢ二量体は、特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。天然生成物アントラマイシン、ＰＢＤは、１９６５年に最初に報告された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９６５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：５７９３−５７９５、Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９６５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：５７９１−５７９３）。それ以来、三環式ＰＢＤ足場の二量体を含む、いくつかのＰＢＤ（天然に存在するもの及び類似体の両方）が報告されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９４，４３３−４６５（ＵＳ６８８４７９９、ＵＳ７０４９３１１、ＵＳ７０６７５１１、ＵＳ７２６５１０５、ＵＳ７５１１０３２、ＵＳ７５２８１２６、ＵＳ７５５７０９９）。いかなる特定の理論にも拘束されることを意図するものではないが、二量体構造が、Ｂ型ＤＮＡの副溝との等螺旋性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）に適切な三次元形状を付与し、それによって結合部位において滑合がもたらされると考えられている（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）、Ｈｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，（１９８６）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９：２３０−２３７）。Ｃ２アリール置換基を有する二量体ＰＢＤ化合物は、細胞傷害性剤として有用であることが示されている（Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０（１７）：６８４９−６８５８、Ａｎｔｏｎｏｗ（２０１０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５３（７）：２９２７−２９４１、Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１９（２２）：６４６３−６４６６）。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、ＰＢＤ化合物は、それらをＮ１０位において、インビボで除去可能である窒素保護基で保護することによって、プロドラッグとして用いることができる（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／１２５０７及びＷＯ２００５／０２３８１４を参照されたい）。
【０２３５】
ＰＢＤ二量体は、抗体にコンジュゲートされており、結果として生じるＡＤＣは、抗癌特性を有することが示されている（ＵＳ２０１０／０２０３００７）。ＰＢＤ二量体上の非限定的な代表的な結合部位としては、５員のピロロ環、ＰＢＤ単位の間のテザー、及びＮ１０−Ｃ１１イミン基が挙げられる（ＷＯ２００９／０１６５１６、ＵＳ２００９／３０４７１０、ＵＳ２０１０／０４７２５７、ＵＳ２００９／０３６４３１、ＵＳ２０１１／０２５６１５７、ＷＯ２０１１／１３０５９８）。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、リンカーは、Ｂ環のＮ１０イミン、Ｃ環のＣ−２エンド／エキソ位、またはＡ環を連結するテザー単位を含む、ＰＢＤ二量体薬物部分の様々の部位のうちの１つで結合してもよい（以下の構造Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）を参照されたい）。
【０２３７】
非限定的な代表的なＡＤＣのＮ−１０連結ＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ、
【化３２】
0006621919.tif 000042
のもの、ならびにその塩及び溶媒和物であり、式中、波線は、リンカーへの共有結合部位を示し、点線は、Ｃ１とＣ２との間またはＣ２とＣ３との間の任意の二重結合を示し、Ｒ２は独立して、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ、及びＣＯＲから選択され、任意で、ハロ及びジハロから更に選択され（式中、ＲＤは独立して、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、及びハロから選択される）、Ｒ６及びＲ９は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、及びハロから選択され、Ｒ７は独立して、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ、及びハロから選択され、Ｑは独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮＨから選択され、Ｒ１１は、Ｈ、またはＲ、またはＱがＯであるとき、ＳＯ３Ｍ（Ｍは、金属カチオン）のいずれかであり、Ｒ及びＲ’は各々独立して、任意で置換されたＣ１−８アルキル、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−８ヘテロシクリル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から選択され、任意で、基ＮＲＲ’との関連で、Ｒ及びＲ’はそれらが結合している窒素原子とともに、任意で置換された４員、５員、６員、または７員の複素環を形成し、Ｒ１２、Ｒ１６、Ｒ１９、及びＲ１７はそれぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ９、及びＲ７について定義される通りであり、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキレン基（その鎖は、１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ、及び／または芳香族環、例えば、ベンゼンもしくはピリジンによって分断され得、それらの環は、任意で置換されている）であり、Ｘ及びＸ’は独立して、Ｏ、Ｓ、及びＮ（Ｈ）から選択される。
【０２３８】
いくつかの態様において、Ｒ及びＲ’は各々独立して、任意で置換されたＣ１−１２アルキル、Ｃ３−２０複素環、及びＣ５−２０アリール基から選択され、任意で、基ＮＲＲ’との関連で、Ｒ及びＲ’はそれらが結合している窒素原子とともに、任意に置換された４員、５員、６員、または７員の複素環を形成する。いくつかの態様において、Ｒ９及びＲ１９は、Ｈである。いくつかの態様において、Ｒ６及びＲ１６は、Ｈである。いくつかの態様において、Ｒ７は、Ｒ１７は、ともにＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａは、任意で置換されたＣ１−４アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ７Ａは、Ｍｅである。いくつかのそのような態様において、Ｒ７Ａは、Ｃｈ２Ｐｈであり、Ｐｈは、フェニル基である。いくつかの態様において、Ｘは、Ｏである。いくつかの態様において、Ｒ１１は、Ｈである。いくつかの態様において、各単量体単位においてＣ２とＣ３との間に二重結合が存在する。
【０２３９】
いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は独立して、Ｈ及びＲから選択される。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は独立して、Ｒである。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は独立して、任意で置換されたＣ５−２０アリールまたはＣ５−７アリールまたはＣ８−１０アリールである。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は独立して、任意で置換されたフェニル、チエニル、ナプチル（ｎａｐｔｈｙｌ）、ピリジル、キノリニル、またはイソキノリニルである。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は独立して、＝Ｏ、＝ＣＨ２、＝ＣＨ−ＲＤ、及び＝Ｃ（ＲＤ）２から選択される。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は各々、＝ＣＨ２である。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は各々、Ｈである。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は各々、＝Ｏである。いくつかの態様において、Ｒ２及びＲ１２は各々、＝ＣＦ２である。いくつかの態様において、Ｒ２及び／またはＲ１２は独立して、＝Ｃ（ＲＤ）２である。いくつかの態様において、Ｒ２及び／またはＲ１２は独立して、＝ＣＨ−ＲＤである。
【０２４０】
いくつかの態様において、Ｒ２及び／またはＲ１２が＝ＣＨ−ＲＤであるとき、各基は独立して、以下に示される構成のいずれかを有し得る。
【化３３】
0006621919.tif 000043
いくつかのそのような態様において、＝ＣＨ−ＲＤは、構成（Ｉ）にある。いくつかの態様において、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基またはＣ５アルキレン基である。
【０２４１】
いくつかの態様において、代表的なＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ−１の構造を有し、
【化３４】
0006621919.tif 000044
式中、ｎは、０または１である。
【０２４２】
いくつかの態様において、代表的なＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ−２の構造を有し、
【化３５】
0006621919.tif 000045
式中、ｎは、０または１である。
【０２４３】
いくつかの態様において、代表的なＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ−３の構造を有し、
【化３６】
0006621919.tif 000046
式中、ＲＥ及びＲＥ”は各々独立して、ＨまたはＲＤから選択され、ＲＤは上記に定義される通りであり、ｎは、０または１である。いくつかのそのような態様において、ｎは、０である。いくつかの態様において、ｎは、１である。いくつかの態様において、ＲＥ及び／またはＲＥ”は、Ｈである。いくつかの態様において、ＲＥ及びＲＥ”は、Ｈである。いくつかの態様において、ＲＥ及び／またはＲＥ”は、ＲＤであり、ＲＤは、任意で置換されたＣ１−１２アルキルである。いくつかの態様において、ＲＥ及び／またはＲＥ”は、ＲＤであり、ＲＤは、メチルである。
【０２４４】
いくつかの態様において、代表的なＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ−４の構造を有し、
【化３７】
0006621919.tif 000047
式中、Ａｒ１及びＡｒ２は各々独立して、任意で置換されたＣ５−２０アリールであり、Ａｒ１及びＡｒ２は同一であっても異なっていてもよく、ｎは、０または１である。
【０２４５】
いくつかの態様において、代表的なＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ−５の構造を有し、
【化３８】
0006621919.tif 000048
式中、Ａｒ１及びＡｒ２は各々独立して、任意で置換されたＣ５−２０アリールであり、Ａｒ１及びＡｒ２は同一であっても異なっていてもよく、ｎは、０または１である。
【０２４６】
いくつかの態様において、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立して、任意で置換されたフェニル、フラニル、チオフェニル、及びピリジルから選択される。いくつかの態様において、Ａｒ１及びＡｒ２は各々独立して、任意で置換されたフェニルである。いくつかの態様において、Ａｒ１及びＡｒ２は各々独立して、任意で置換されたチエン−２−イルまたはチエン−３−イルである。いくつかの実施形態において、Ａｒ１及びＡｒ２は各々独立して、任意で置換されたキノリニルまたはイソキノリニルである。キノリニルまたはイソキノリニル基は、任意の利用可能な環の位置を通して、ＰＢＤコアに結合されてもよい。例えば、キノリニルは、キノリン−２−イル、キノリン−３−イル、キノリン−４イル、キノリン−５−イル、キノリン−６−イル、キノリン−７−イル、及びキノリン−８−イルであり得る。いくつかの態様において、キノリニルは、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イルから選択される。イソキノリニルは、イソキノリン−１−イル、イソキノリン−３−イル、イソキノリン−４イル、イソキノリン−５−イル、イソキノリン−６−イル、イソキノリン−７−イル、及びイソキノリン−８−イルであり得る。いくつかの実施形態において、イソキノリニルは、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イルから選択される。
【０２４７】
いくつかの態様において、代表的なＡＤＣのＰＢＤ二量体構成成分は、式Ａ−６の構造を有する。
【化３９】
0006621919.tif 000049
【０２４８】
更なる非限定的な代表的なＰＢＤ二量体薬物構成成分は、式Ｂ、
【化４０】
0006621919.tif 000050
のもの、ならびにその塩及び溶媒和物であり、式中、波線は、リンカーへの共有結合部位を示し、波線で例示されるＯＨ部分は、ＳまたはＲ構成を示す。ＲＶ１及びＲＶ２は独立して、Ｈ、メチル、エチル、及びフェニル（このフェニルは、特に４位において、フルオロで任意に置換されてもよい）、Ｃ５−６ヘテロシクリルから選択され、ＲＶ１及びＲＶ２は、同じであっても異なっていてもよい。ｎは、０または１である。
【０２４９】
他の非限定的な代表的なＰＢＤ二量体薬物としては、テザー連結された式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）が挙げられる。
【化４１】
0006621919.tif 000051
式Ｃ（Ｉ）及びＣ（ＩＩ）は、それらのＮ１０−Ｃ１１イミン形態で示される。
【０２５０】
代表的なＰＢＤ薬物部分はまた、以下の表に示される、カルビノールアミン及び保護カルビノールアミン形態も含み、表内に示される形態は、上記に例示される構造Ｃ（ＩＩ）のＰＢＤ内の７員環の一方または両方を指し、
【化４２】
0006621919.tif 000052
式中、Ｘは、ＣＨ２（ｎ＝１〜５）、Ｎ、またはＯであり、Ｚ及びＺ’は独立して、ＯＲ及びＮＲ２から選択され（Ｒは、１〜５個の炭素原子を含有する一級、二級、または三級アルキル鎖である）、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２、及びＲ’２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−２０アリール（置換アリールを含む）、Ｃ５−２０ヘテロアリール基、−ＮＨ２、−ＮＨＭｅ、−ＯＨ、及び−ＳＨから選択され（いくつかの実施形態において、アルキル、アルケニル、及びアルキニル鎖は、最大５個の炭素原子を含む）、Ｒ３及びＲ’３は独立して、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、及びＮＲ２から選択され（Ｒは、１〜５個の炭素原子を含有する一級、二級、または三級アルキル鎖である）、Ｒ４及びＲ’４は独立して、Ｈ、Ｍｅ、及びＯＭｅから選択され、Ｒ５は、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−２０アリール（ハロ、ニトロ、シアノ、アルコキシ、アルキル、ヘテロシクリルで置換されたアリールを含む）、及びＣ５−２０ヘテロアリール基から選択され（いくつかの実施形態において、アルキル、アルケニル、アルキニル鎖は、最大５個の炭素原子を含む）、Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または保護基（アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、または自己犠牲単位を含む部分（バリン−シトルリン−ＰＡＢなど）であり、Ｒ１２は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、または保護基であり、Ｒ１、Ｒ’１、Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ５、もしくはＲ１２のうちの１つの水素、またはＡ環間の−ＯＣＨ２ＣＨ２（Ｘ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ−スペーサーの水素は、ＡＤＣのリンカーに接続される結合で置き換えられる。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＢＤ二量体を含むコンジュゲートは、（本明細書で他に記載される）脱離基を含むリンカー−薬物中間体を、硫黄原子を介して（本明細書で他に記載される）担体ののシステインチオールにコンジュゲートして、ジスルフィド結合を形成することによって作製され得る。更に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＰＢＤ二量体を含むコンジュゲートは、（本明細書で他に記載される）脱離基を含むリンカー−薬物中間体をコンジュゲートすることによって作製され得る。いくつかの特定の態様において、脱離基は、−ＮＯ２で一置換されたピリジル環を含む。いくつかのそのような態様において、−ＮＯ２一置換は、ジスルフィドに対してパラである。いくつかの態様において、ＰＢＤ二量体は、Ｎ１０位を通して接続される。例えば、ＰＢＤ二量体を含む代表的なＡＤＣは、モノメチルエチルピリジルジスルフィド、（以下に示される）Ｎ１０連結ＰＢＤリンカー中間体を、担体（例えば、抗体）にコンジュゲートすることによって作製することができ、
【化４３】
0006621919.tif 000053
式中、Ｘ、Ｒ１、及びＲ２は、本明細書で他に定義される通りである。Ｒ１の非限定的な一例は、ＣＨ３であり、Ｒ２の非限定的な一例は、Ｈであり、Ｘの非限定的な例は、以下、本明細書で他に記載される通りである。
【化４４】
0006621919.tif 000054
【０２５２】
ＰＢＤ二量体及びＰＢＤ二量体を含むＡＤＣは、当技術分野において既知の方法に従って調製することができる。例えば、ＷＯ２００９／０１６５１６、ＵＳ２００９／３０４７１０、ＵＳ２０１０／０４７２５７、ＵＳ２００９／０３６４３１、ＵＳ２０１１／０２５６１５７、ＷＯ２０１１／１３０５９８、ＷＯ２０１３／０５５９８７（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、薬物は、アントラサイクリンである。アントラサイクリンは、細胞傷害性活性を呈する抗生物質化合物である。いかなる特定の理論によっても拘束されることを意図するものではないが、研究は、アントラサイクリンが、１）薬物分子の、細胞のＤＮＡへのインターカレーションによってＤＮＡ依存性核酸合成を阻害すること、２）その後、細胞巨大分子と反応して細胞への損傷を引き起こすフリーラジカルの薬物による産生、及び／または３）薬物分子と細胞膜との相互作用（例えば、Ｃ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｏｆ  Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ  Ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ」ｉｎ  Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｎ．Ｒ．Ｂａｃｈｕｒ，「Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｄａｍａｇｅ」ｉｄ．ａｔ  ｐｐ．９７−１０２）を含むいくつかの異なる機構によって、細胞を殺滅するように動作し得ることを示している。それらは潜在的に細胞傷害性であるため、アントラサイクリンは、白血病、乳癌、肺癌、卵巣腺癌、及び肉腫などの多数の癌の治療に使用されている（例えば、Ｐ．Ｈ−Ｗｉｅｒｎｉｋ，ｉｎ  Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  Ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｐ１１を参照されたい）。
【０２５４】
非限定的な代表的なアントラサイクリンとしては、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノマイシン、ネモルビシン、及びそれらの誘導体が挙げられる。ダウノルビシン及びドキソルビシンの免疫コンジュゲート及びプロドラッグが調製され、研究されている（Ｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３：４７７−５２３、Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１６：３５８−３６２、Ｔｏｒｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１６：７１７−７２１、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：８２９−８３４、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１２：１５２９−１５３２、Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：４３３６−４３４３、ＥＰ０３２８１４７、ＵＳ６６３０５７９）。抗体−薬物コンジュゲートＢＲ９６−ドキソルビシンは、腫瘍関連抗原ルイス−Ｙと特異的に反応し、第Ｉ相及び第ＩＩ相試験において評価されている（Ｓａｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１８：２２８２−２２９２Ａｊａｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒ．６：７８−８１、Ｔｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１７：４７８−４８４）。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
ＰＮＵ−１５９６８２は、ネモルビシンの強力な代謝物（または誘導体）である（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１１（４）：１６０８−１６１７）。ネモルビシンは、ドキソルビシンのグリコシドアミノ上に２−メトキシモルホリノ基を有するドキソルビシンの半合成類似体であり、臨床評価されている（Ｇｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．１７：１３３、Ｒｉｐａｍｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６５：７０３；）、これには、肝細胞癌腫の第ＩＩ／ＩＩＩ相試験が含まれる（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２２，Ａｂｓ１４４８、Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：１ｓｔ  Ｅｄ，Ａｂｓ４６４９、Ｐａｃｃｉａｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２４：１４１１６）。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５６】
ＰＮＵ−１５９６８２を含むアントラサイクリンは、いくつかの結合部位、及び本明細書に記載されるリンカーを含む様々なリンカー（ＵＳ２０１１／００７６２８７、ＷＯ２００９／０９９７４１、ＵＳ２０１０／００３４８３７、及びＷＯ２０１０／００９１２４を参照されたい（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる））を通して抗体にコンジュゲートされ得る。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応によって形成され得る。
【化４５】
0006621919.tif 000055
【０２５７】
いくつかの実施形態において、薬物は、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）である。５−アミノ−１−（クロロメチル）−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（アミノＣＢＩ）クラスのＤＮＡ小溝アルキル化剤は、強力な細胞毒であり（Ａｔｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２：３４００）、癌治療のために設計されたいくつかのクラスのプロドラッグ中のエフェクター単位として利用されている。これらは、抗体コンジュゲート（Ｊｅｆｆｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４８：１３４４）、ニトロベンジルカルバメートに基づく遺伝子療法のためのプロドラッグ（Ｈａｙ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：２４５６）、及び低酸素活性化プロドラッグとしての対応するニトロ−ＣＢＩ誘導体（Ｔｅｒｃｅｌ，ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５０：２６０６−２６０９）を含んでいる。ＣＢＩ及びピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ファルマコフォアは、アルキル鎖によって一緒に連結されている（Ｔｅｒｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４６：２１３２−２１５１）。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
いくつかの態様において、薬物は、１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）二量体（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０２３３５５）である。いくつかのそのような実施形態において、二量体は、ヘテロ二量体であり、その二量体の半分がＣＢＩ部分であり、二量体のもう半分がＰＢＤ部分である。
【０２５９】
いくつかの態様において、ＣＢＩ二量体は、式、
【化４６】
0006621919.tif 000056
を含み、式中、Ｒ４１は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、Ｒ４２は、Ｈ、Ｐ（Ｏ）３Ｈ２、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、またはリンカー（Ｌ）への結合から選択され、Ｒａ及びＲｂは独立して、Ｈ、及び１つ以上のＦで任意で置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択されるか、またはＲａ及びＲｂは、５員もしくは６員のヘテロシクリル基を形成し、Ｔは、Ｃ３−Ｃ１２アルキレン、Ｙ、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）−Ｙ−（Ｃ１−Ｃ６アルキレン）、（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルケニレン）、及び（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）−Ｙ−（Ｃ２−Ｃ６アルキニレン）から選択されるテザー基であり、Ｙは独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲ４１、アリール、及びヘテロアリールから選択され、アルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは独立してかつ任意で、Ｆ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＰ（Ｏ）３Ｈ２、及びＣ１−Ｃ６アルキルで置換され（アルキルは、１つ以上のＦで任意で置換される）、またはアルキレン、アルケニレン、アリール、及びヘテロアリールは独立してかつ任意で、Ｌへの結合で置換される。Ｄ’は、
【化４７】
0006621919.tif 000057
から選択される薬物部分であり、式中、波線は、Ｔへの結合部位を示し、Ｘ１及びＸ２は独立して、Ｏ及びＮＲ４３から選択され（Ｒ４３は、Ｈ、及び１つ以上のＦで任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキルから選択され、Ｒ４４は、Ｈ、ＣＯ２Ｒ、またはリンカー（Ｌ）への結合であり（Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはベンジルである）、及びＲ４５は、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。リンカーへのコンジュゲーションは、ＰＢＤとの関連で、本明細書で他に記載されている。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、薬物は、アマトキシンである。アマトキシンは、８個のアミノ酸で構成される環状ペプチドであり、タマゴテングダケから単離され得るか、または合成的に調製され得る。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それにより患部細胞の転写及びタンパク質生合成も阻害する。細胞内の転写の阻害により、成長及び増殖が停止する。例えば、Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＪＮＣＩ１０４：１−１３（２０１２）、ＷＯ２０１０１１５６２９、ＷＯ２０１２０４１５０４、ＷＯ２０１２１１９７８７、ＷＯ２０１４０４３４０３、ＷＯ２０１４１３５２８２、及びＷＯ２０１２１１９７８７（これらの各々の全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態において、１つ以上のアマトキシン分子は、１つ以上のα−アマニチン分子である。
【０２６１】
本開示の範囲内の他の薬物部分としては、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１０：１０２５−１０２８、Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、ならびにジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定されない、その酵素的活性毒素及び断片が挙げられる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６２】
依然更なる薬物部分としては、シクロプロパンドリン、それらの類似体、それらの誘導体、及び／またはそれらの立体異性体が挙げられる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１２／０１６５２９２を参照されたい）。
【０２６３】
他の薬物部分としては、シクロプロピルベンジンドール（ＣＢＩ）、それらの類似体、それらの誘導体、及び／またはそれらの立体異性体（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，５８５，４９９及びＵＳ５，８４６，５４５を参照されたい）。
【０２６４】
他の薬物部分としては、エリナフィド、それらの類似体、それらの誘導体、及び／またはそれらの立体異性体が挙げられる（例えば、Ｂａｉｌｌｙ，Ｃ；Ｂｒａｎａ，Ｍ．Ｆ．；Ｗａｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２４０，１９５．、Ｂｒａｎａ，Ｍ．Ｆ．；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ，Ｊ．Ｍ．；Ｍｏｒａ，Ｍ．；Ｖｅｇａ，Ｍ．Ｊ．Ｐ；Ｒｏｍｅｒｄａｈｌ，Ｃ．Ｒ．；Ｑｉａｎ，Ｘ．Ｄ．；Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｐ．；Ｅｍｌｉｎｇ，Ｆ．；Ｓｃｈｌｉｃｋ，Ｒ；Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ，Ｇ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１９９３，８，２５７．、Ｂｒａｎａ，Ｍ．Ｆ．；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ，Ｉ  Ｍ．；Ｍｏｒａ，Ｍ．；Ｖｅｇａ，Ｍ．Ｊ．Ｐ；Ｐｅｒｒｏｎ，Ｄ．；Ｃｏｎｌｏｎ，Ｄ．；Ｂｏｕｓｑｕｅｔ，Ｐ．Ｆ．；Ｒｏｍｅｒｄａｈｌ，Ｃ．Ａ．；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１９９６，１１，２９７、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．；Ｐｒａｔｔ，Ｃ．Ｂ．；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｆ．；Ｂｏｗｍａｎ，Ｌ．；Ｚａｍｂｏｎｉ，Ｗ．Ｃ；Ｐａｐｐｏ，Ａ．ＩｎＶｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ１９９８，１６，４５を参照されたい（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【０２６５】
薬物部分はまた、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）も含む。２つ以上の求核基が薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応する場合、結果として生じる生成物は、抗体に結合する１つ以上の薬物部分が分布するＡＤＣ化合物の混合物であることを理解されたい。１抗体当たりの平均薬物数（ＤＡＲ）は、この混合物から、抗体に特異的であり薬物に特異的である重複ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって、計算することができる。個々のＡＤＣ分子は、質量分析法によって混合物中で特定され、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離されてもよい（例えば、ＭｃＤｏｎａｇｈ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｒ．Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ１９（７）：２９９−３０７、Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，」Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ４５，Ｍａｒｃｈ２００４、Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，」Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ４５，Ｍａｒｃｈ２００４を参照されたい）。特定の実施形態において、単一の負荷値を有する同種のＡＤＣが、電気泳動またはクロマトグラフィーによってコンジュゲーション混合物から単離されてもよい。この段落に引用される各参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６６】
リンカー−薬物コンジュゲーション
リンカーの薬物アミンへのコンジュゲーションは、ＷＯ２０１３／０５５９８７、ＷＯ２０１５／０２３３５５、ＷＯ２０１０／００９１２４、及びＷＯ２０１５／０９５２２７（これらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる）の方法に従って好適に行うことができる。いくつかのそのような態様において、本明細書で他に記載される活性化リンカーを薬物の溶液と組み合わせて、リンカー−薬物コンジュゲートを形成する。一般に、１リットル当たり約０．０５〜約１モルの薬物を含む溶液を提供することができる任意の溶媒が好適である。いくつかの態様において、溶媒は、ＤＣＭである。いくつかの他のリンカー−薬物コンジュゲーションの態様において、薬物の溶液、化学量論過剰のトリホスゲン（またはジホスゲンまたはホスゲン）、塩基（例えば、４−ジメチルアミノピリジン）が溶媒（例えば、乾燥ＤＣＭ）中で形成される。（本明細書で他に記載される）アルコール部分を有するリンカー中間体を薬物溶液と組み合わせて、反応混合物を形成し、これを反応が完了するまで撹拌して、リンカー−薬物コンジュゲートを含む生成混合物を形成する。反応混合物は、およその薬物濃度は、好適に、１リットルの薬物当たり約０．００５モル〜１リットル当たり約０．５モルであり、１当量の薬物当たり約２〜約１０当量のリンカー中間体、約０．０２〜約０．５当量の塩基を好適に含み得る。反応の完了後、リンカー−薬物コンジュゲートは溶媒蒸発などによって単離され、抽出、逆相高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、またはフラッシュクロマトグラフィーのうちの１つ以上などの当技術分野において既知の方法によって精製され得る。
【０２６７】
薬物が脂肪族アルコールを含む本開示の態様において、本開示の薬物−リンカーコンジュゲートは、以下の一般構造、
【化４８】
0006621919.tif 000058
のエーテルであり、式中、担体、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＤは、本明細書で他に定義される通りである。
【０２６８】
本開示のいくつかの態様において、束縛連結基−薬物コンジュゲートは更に、以下に例示されるパラ−アミノベンジルアルコールを含むスペーサーを更に含んでもよく、それにより連結基−スペーサー薬物コンジュゲート、
【化４９】
0006621919.tif 000059
を形成し、式中、担体、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３０は、本明細書で他に定義される通りであり、Ｒ２０は、薬物アルキル部分であり、Ｒ２１は任意で、Ｈまたは置換アルキルである。
【０２６９】
ジスルフィドコンジュゲート化合物の調製
いくつかの実施形態において、構造（ＩＩ）、
【化５０】
0006621919.tif 000060
の本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物は、（１）水を含む、溶媒系、（２）スルフヒドリル部分を有する少なくとも１つのシステインを含む、担体源、及び（３）構造（Ｉ）、
【化５１】
0006621919.tif 000061
の化学量論過剰のリンカー−薬物コンジュゲート源を含む反応混合物を形成することによって調製することができる。
担体、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、ＳＡ、Ｓｐ、ｎ、及びＤは、本明細書で他に記載される通りである。反応混合物を反応させて、構造（ＩＩ）（式中、ｐは、１、２、３、４、５、６、７、または８である）のジスルフィドコンジュゲート化合物を含む反応混合物を形成する。混合物中の個々のジスルフィドコンジュゲート化合物は、１〜８のｐ値を有してもよく、そのような混合物中のいくつかの担体分子は、コンジュゲートされていなくてもよいものの（ｐ＝０）、薬物当量対担体当量の比として表される、生成混合物中の複数の形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物の薬物対担体比は、約１〜約５、約１．５〜約３、約１．５〜約２．５、約１．７〜約２．３、約１．８〜約２．２、または約２である。
【０２７０】
そのような実施形態の様々な態様のいずれにおいても、担体源は、水性緩衝液中の溶液中に提供され得る。いくつかのそのような態様において、緩衝液は、好適に、Ｎ−（２−アセトアミド）−アミノエタンスルホン酸（「ＡＣＥＳ」）；酢酸塩；Ｎ−（２−アセトアミド）−イミノ二酢酸（「ＡＤＡ」）；２−アミノエタンスルホン酸、タウリン（「ＡＥＳ」）；２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（「ＡＭＰ」）；２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、アメジオール（Ａｍｍｅｄｉｏｌ）（「ＡＭＰＤ」）；Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＡＭＰＳＯ」）；Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（「ＢＥＳ」）；Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン（「ビシン」）；［ビス−（２−ヒドロキシエチル）−イミノ］−トリス−（ヒドロキシメチルメタン）（「ビス−トリス」）；１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン（「ビス−トリス−プロパン」）；ジメチルアルシン酸（「カコジル酸」）；３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（「ＣＡＰＳＯ」）；シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（「ＣＨＥＳ」）；クエン酸塩；３−［Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＤＩＰＳＯ」）；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ」）；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳＯ」）；２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（「ＭＥＳ」）；３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）；３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳＯ」）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（「ＰＩＰＥＳ」）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」）；コハク酸塩；３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ｝−プロパンスルホン酸（「ＴＡＰＳ」）；３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＴＡＰＳＯ」）；２−アミノエタンスルホン酸、ＡＥＳ（「タウリン」）；トリエタノールアミン（「ＴＥＡ」）；２−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−エタンスルホン酸（「ＴＥＳ」）；Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン（「トリシン」）；トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（「トリス」）であり得る。いくつかのそのような態様において、緩衝液は、コハク酸またはトリスであり得る。緩衝液濃度は、好適に、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、または約１５０ｎＭ（約５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｎＭなど）である。緩衝液中の担体の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ以上であり得る。担体溶液のｐＨは、好適に、約４〜約８、約４〜約６、または約５である。
【０２７１】
そのような実施形態の様々な態様のいずれにおいても、リンカー−薬物コンジュゲート化合物（「活性化リンカー−薬物コンジュゲート」）源は一般に、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、エチレングリコール、及びジクロロメタンから選択される少なくとも１つの極性非プロトン溶媒を含む溶媒中に、活性化束縛リンカー−薬物コンジュゲートを溶解することによって形成され得る。いくつかの態様において、溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び／またはジメチルアセトアミドを含むか、主にそれを含むか、またはそれから本質的になる。
【０２７２】
担体源及び活性化リンカー−薬物コンジュゲート源を好適に混合して、反応混合物を形成し得る。反応混合物中の担体濃度は、好適に、約１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、または約２５ｍｇ／ｍＬ、及びそれらの範囲（約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、または約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬなど）である。活性化リンカー−薬物コンジュゲート対担体の当量比は、好適に、約２：１、約３：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、または約２０：１、及びそれらの範囲（約２：１〜約２０：１、約３：１〜約１５：１、約３：１〜約１０：１、または約５：１〜約１０：１など）である。本開示のいくつかの態様において、反応混合物溶媒系は、主に水を含む。いくつかの他の態様において、反応混合物溶媒系は一般に、少なくとも７５体積％の本明細書で他に記載される緩衝液と、約５体積％、約１０体積％、約１５体積％、約２０体積％、約２５体積％、または約３０体積％、及びそれらの範囲（約５体積％〜約３０体積％、約５体積％〜約２０体積％、約５体積％〜約１５体積％、または約１０体積％など）の本明細書で他に記載される極性非プロトン溶媒とを含み得る。いくつかの他の態様において、反応混合物溶媒系は一般に、少なくとも５０体積％の本明細書で他に記載される緩衝液と、約１０体積％〜約５０体積％（約１０体積％、約２０体積％、約３０体積％、約４０体積％、または５０体積％超など）のプロピレングリコールまたはエチレングリコールとを含み得る。換言すると、反応混合物溶媒系は、約５０体積％、約６０体積％、約７０体積％、７５体積％、約８０体積％、約８５体積％、約９０体積％、または約９５体積％の水から、約９５体積％及びその範囲の水（約５０体積％〜約９５体積％の水、約７５体積％〜約９５体積％の水、約８０体積％〜約９５体積％の水、または約８５体積％〜約９５体積％の水）を含み得る。反応混合物のｐＨは、好適に、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０、及びその範囲（約５．０〜約９．０、約５．０〜約９．０、約６．０〜約９．０、約６．５〜約９．０、または約７．０〜約９．０、または約７．５〜約８．５など）である。
【０２７３】
反応混合物を、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、または約５０℃、及びそれらの範囲（約１０℃〜約５０℃、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、または約２０℃〜約３０℃など）で、約０．５時間、約１時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、または約４８時間、及びそれらの範囲（約０．５時間〜約４８時間または約１時間〜約２４時間など）の間インキュベートして、構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物を含む生成混合物を形成する。
【０２７４】
生成混合物は、ＭＳ／ＬＣによって決定される、少なくとも６０面積％、少なくとも６５面積％、少なくとも７０面積％、少なくとも７５面積％、少なくとも８０面積％、少なくとも８５面積％、または少なくとも９０面積％の担体−リンカー−薬物コンジュゲートを含み得る。生成混合物は、少なくとも１つの脱離基副生成物種を更に含み得る。いくつかの態様において、ＭＳ／ＬＣによって測定される、形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物の面積パーセンテージと比較して、全脱離基副生成物種の面積パーセンテージは、１０面積％未満、５面積％未満、４面積％未満、３面積％未満、２面積％未満、１面積％未満、０．５面積％未満である。抗体担体基の場合、現在までの実験的証拠に基づいて、脱離基副生成物種は、
【化５２】
0006621919.tif 000062
とを含み得、式中、Ｘは、本明細書で他に定義される通りであり、Ｑは、硫黄連結原子を有しないＸ部分を指す。代表的なＸ及び対応するＱを、以下に例示する。
【化５３】
0006621919.tif 000063
【０２７５】
反応混合物は、（ｉ）２つのシステインスルフヒドリル部分の反応によって形成される、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む非コンジュゲート担体単量体種と、（ｉｉ）２つのシステインスルフヒドリル部分の反応によって形成される、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む非コンジュゲート担体二量体種と、（ｉｉｉ）非コンジュゲート担体単量体種と非コンジュゲート担体二量体種との組み合わせとを含む、非コンジュゲート担体化合物を更に含み得る。いくつかの態様において、ＭＳ／ＬＣによって測定される、形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物の面積パーセンテージと比較して、非コンジュゲート担体化合物の合計濃度は、１０面積％未満、５面積％未満、４面積％未満、３面積％未満、２面積％未満、１面積％未満、０．５面積％未満、０．３面積％未満、０．１面積％未満であるか、または検出不能である。
【０２７６】
ジスルフィドコンジュゲート治療方法
本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物は、様々な疾患または障害、例えば、腫瘍抗原の過剰発現を特徴とするものを治療するために使用され得ることが企図される。代表的な病態または過剰増殖性障害としては、良性または悪性の固形腫瘍、ならびに血液疾患（白血病及びリンパ性悪性腫瘍など）である。他のものとしては、神経細胞性、膠細胞性、星状細胞性、視床下部性、腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性、炎症性、血管形成性、及び免疫性（自己免疫性を含む）の障害が挙げられる。
【０２７７】
一態様において、本明細書に提供されるジスルフィドコンジュゲート化合物は、癌細胞の増殖を阻害する方法において使用され、この方法は、抗体または抗体−薬物コンジュゲートの、細胞表面上の腫瘍関連抗原への結合を許容する条件下で、細胞を抗体−薬物コンジュゲートに曝露し、それにより細胞の増殖を阻害することを含む。特定の実施形態において、この方法は、インビトロ方法またはインビボ方法である。更なる実施形態において、細胞は、リンパ球、リンパ芽球、単球、または骨髄単球細胞である。
【０２７８】
インビトロでの細胞増殖の阻害は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されている、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率アッセイを使用してアッセイすることができる。そのアッセイは、代謝的に活性な細胞を示す、存在するＡＴＰの定量に基づいて、培養物中の生存細胞の数を決定する。Ｃｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０：８１−８８、米国特許第６６０２６７７を参照されたい。アッセイは、９６ウェルまたは３８４ウェル形式で行って、自動化高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に対応可能なものとしてもよい。Ｃｒｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ６：３９８−４０４を参照されたい。アッセイ手順は、単一の試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬）を培養細胞に直接添加することを伴う。これにより、細胞溶解及びルシフェラーゼ反応によって産生される発光シグナルの生成がもたらされる。発光シグナルは、培養物中に存在する生存細胞の数に直接比例し、存在するＡＴＰの量に比例する。データは、ルミノメーターまたはＣＣＤカメラ画像化デバイスによって記録することができる。発光出力は、相対発光単位（ＲＬＵ）として表される。
【０２７９】
別の態様において、医薬品として使用するためのジスルフィドコンジュゲート化合物が提供される。更なる態様において、治療方法において使用するためのジスルフィドコンジュゲート化合物が提供される。特定の実施形態において、癌の治療において使用するためのジスルフィドコンジュゲート化合物が提供される。特定の実施形態において、本開示は、個体に有効量のジスルフィドコンジュゲート化合物を投与することを含む、個体を治療する方法において使用するためのジスルフィドコンジュゲート化合物を提供する。
【０２８０】
本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物は、単独で、または治療における他の薬剤と組み合わせてのいずれかで使用することができる。例えば、本開示の抗体または免疫コンジュゲートは、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、アントラサイクリンである。いくつかの実施形態において、アントラサイクリンは、ダウノルビシンまたはイダルビシンである。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、シタラビンである。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、クラドリビンである。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、フルダラビンまたはトポテカンである。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、５−アザシチジンまたはデシタビンである。
【０２８１】
本明細書に記述されるそのような併用治療法は、併用投与（２つ以上の治療薬が同一または別個の製剤に含まれる）及び個別投与を包含し、個別投与の場合、本開示の組成物の投与は、追加の治療剤及び／またはアジュバントの投与前、投与と同時、及び／または投与後に生じ得る。本開示の組成物はまた、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０２８２】
本開示の組成物（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含み、局所治療に所望される場合、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口輸注としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短時間であるか、または慢性的であるかに部分的に応じて、例えば、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈注射または皮下注射などの注射によるものであり得る。単回投与または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない、様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
【０２８３】
本開示の組成物は、良好な医療行為と一致する様式で、製剤化され、投薬され、投与されるだろう。この文脈において考慮する要素としては、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師にとって既知である他の要素が挙げられる。本開示の組成物、必ずしもそうである必要はないが、任意で、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。有効量のそのような他の薬剤は、製剤中に存在する本開示の組成物の量、障害または治療の種類、及び本明細書で考察される他の要素に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同一の投与量及び投与経路で使用されるか、あるいは本明細書に記載される投与量の約１〜９９％、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の投与量及び任意の経路で使用される。
【０２８４】
疾患の予防または治療について、本開示の組成物の適切な投与量（単独で、または１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、組成物の種類、疾患の重症度及び経過、組成物が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の臨床歴、及び組成物に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存するだろう。組成物は、１回で、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるものであれ、連続輸注によるものであれ、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の本開示の組成物が、患者への投与のための初回候補投与量であり得る。１つの典型的な１日投与量は、本明細書に言及される要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。病態に応じて、数日間以上にわたる反復投与では、治療は一般に、疾患症状の所望される抑制が生じるまで持続されるだろう。組成物の１つの代表的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。そのような用量は、断続的に、例えば、毎週または３週間に１回（例えば、患者が約２〜約２０回、または例えば、約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。より高い初回負荷量に続いて、１回以上のより低い用量が投与されてもよい。しかしながら、他の投与量レジメンも有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【０２８５】
標的細胞内でのジスルフィドコンジュゲート化合物からの薬物の細胞内放出は、グルタチオンによるジスルフィド結合の還元的切断と、リンカー犠牲との組み合わせから生じると考えられている。グルタチオン媒介性放出は、酸に不安定なヒドラジンリンカーなどの先行技術において既知である特定のリンカーと比較して、利点を提供する。より具体的には、グルタチオンの血液濃度は、非常に低い（マイクロモル範囲など）ことが知られている一方で、細胞内グルタチオン濃度は、典型的には最大３倍より大きい（ミリモル範囲など）。癌細胞内のグルタチオン濃度は、還元酵素の活性の増加のために、更により大きいと更に考えられる。本開示の特定のコンジュゲートの硫黄原子を有するリンカー炭素原子の立体束縛は、改善された血流安定性及び改善された細胞内放出（犠牲）を提供すると依然更に考えられる。したがって、本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物は、血流中での改善された安定性及び改善された細胞内放出速度を提供すると考えられる。
【０２８６】
製造品
本開示の別の態様において、本明細書に記載される障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上もしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の組成物と組み合わせて、障害の治療、予防、及び／または診断に有効である組成物を保有し、無菌アクセスポート（例えば、容器は、静脈注射用溶液袋または皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであってもよい）を有してもよい。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された病態を治療するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本開示のジスルフィドコンジュゲート化合物を含む組成物をその中に収容した第１の容器と、（ｂ）更なる細胞傷害性剤、またはさもなければ治療剤を含む組成物をその中に収容した第２の容器とを含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物が、特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、または更に、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）の容器を更に備えてもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでもよい。
【実施例】
【０２８７】
以下は、本開示の方法及び組成物の実施例である。本明細書に提供される概要を考慮して、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
【０２８８】
実施例１：一般的なＡＤＣの調製方法
システイン操作された抗体（表Ａ〜Ｄに列挙されるものなど）を、ＤＴＴ（クリーランド試薬、ジチオスレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などの還元剤で処理することによって、本開示のリンカー−薬物中間体とのコンジュゲーションのために反応性にし（Ｇｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ２７３：７３−８０（参照により本明細書に組み込まれる）、Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡを参照されたい）、その後、デヒドロアスコルビン酸などの穏やかな酸化体で鎖間ジスルフィド結合を再形成（再酸化）した。ＣＨＯ細胞内に発現した全長のシステイン操作されたモノクローナル抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．１０５（４）：７４８−７６０（参照により本明細書に組み込まれる）、及びＧｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２６：１４３８−１４４５（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を、例えば、２ｍＭのＥＤＴＡを有する５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中、約５０倍過剰のＤＴＴで、室温で一晩還元し、これにより、システイン及びグルタチオン付加物を除去し、抗体内の鎖間ジスルフィド結合を低減した。付加物の除去を、ＰＬＲＰ−Ｓカラムを使用する逆相液体クロマトグラフィー／質量分析（「ＬＣ／ＭＳ」）によって監視した。還元されたＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を希釈し、少なくとも４体積の１０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）緩衝液に添加することによって酸性にした。あるいは、抗体を希釈し、少なくとも４体積の１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５）に添加し、ｐＨが約５になるまで１０％の酢酸によって滴定することによって酸性にした。ｐＨを下げ、希釈したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、その後、ＨｉＴｒａｐ  Ｓカチオン交換カラムに負荷し、数カラム体積の１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄し、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭの塩化ナトリウムで溶出した。
【０２８９】
再酸化を実行することによって、親Ｍａｂ内に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合を再度確立した。溶出され、還元された上述のＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、１５×デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）で約３時間、またはあるいは、２００ｎＭ〜２ｍＭの水性硫酸銅（ＣｕＳＯ４）で室温で一晩処理した。当技術分野において既知である他の酸化体（すなわち、酸化剤）及び酸化条件を使用してもよい。周囲空気酸化もまた、効果的であり得る。この穏やかな部分的再酸化ステップにより、高い忠実度で鎖内ジスルフィドが効率的に形成された。再酸化は、ＰＬＲＰ−Ｓカラムを使用する逆相ＬＣ／ＭＳによって監視した。再酸化したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を上述のコハク酸緩衝液で希釈して、約ｐＨ５に到達させ、１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５）、１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５）（緩衝液Ａ）中３００ｍＭの塩化ナトリウム（緩衝液Ｂ）の勾配で溶出を実行したことを除いて、上述のようにＳカラムで精製を実行した。２ｍＭの最終濃度になるまで、溶出したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体にＥＤＴＡを添加し、必要に応じて５ｍｇ／ｍＬ超の最終濃度に到達するまで濃縮した。
【０２９０】
コンジュゲーションに好適な、結果として生じるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、アリコートで−２０℃で保管した。６２００シリーズＴＯＦまたはＱＴＯＦ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ／ＭＳで、ＬＣ／ＭＳ分析を実行した。８０℃まで加熱したＰＲＬＰ−Ｓ（登録商標）１０００Ａ、ミクロボアカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で試料のクロマトグラフィーを行った。３０〜４０％のＢの線形勾配（溶媒Ａ：水中０．０５％のＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．０４％のＴＦＡ）を使用し、エレクトロスプレー源を使用して溶出剤を直接イオン化した。データを回収し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアによってデコンボリューションした。ＬＣ／ＭＳ分析前、抗体または薬物コンジュゲート（５０マイクログラム）を、ペプチドＮ−グルコシダーゼＦ（「ＰＮＧａｓｅ  Ｆ」）（２単位／ｍｌ、ＰＲＯｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）で、３７℃で２時間処理して、Ｎ連結炭水化物を除去した。あるいは、抗体または薬物コンジュゲートをＬｙｓＣ（５０ｕｇの抗体またはコンジュゲート当たり０．２５ｕｇ）で、３７Ｃで１５分間部分的に消化させて、ＬＣ／ＭＳによって分析するためのＦａｂ及びＦｃ断片をもたらした。デコンボリューションしたＬＣ／ＭＳスペクトルにおけるピークを割り当て、定量化した。観察された全てのピークと比較して、薬物−コンジュゲートされた抗体に対応するピーク（複数可）の強度の比率を計算することによって、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を計算した。
【０２９１】
１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ中、コンジュゲーションのためのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、１ＭのトリスでｐＨ７．５〜８．５に調整した。約３モル〜２０当量の過剰の、チオール−反応性ピリジルジスルフィド基を有する本開示のリンカー−薬物中間体を、ＤＭＦまたはＤＭＡ中に溶解し、還元、再酸化、及びｐＨ調整した抗体に添加した。反応を室温または３７℃でインキュベートし、反応混合物のＬＣ／ＭＳ分析によって決定される完了まで（１〜約２４時間）監視した。反応の完了時、いくつかの方法のうちの１つまたは任意の組み合わせによってコンジュゲートを精製して、残りの未反応リンカー−薬物中間体及び凝集タンパク質（有意なレベルで存在する場合）を除去し得る。例えば、コンジュゲートを、最終ｐＨが約５．５になるまでヒスチジン−酢酸（ｐＨ５．５）で希釈し、Ａｋｔａ精製システムに接続されたＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＳマキシスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）のいずれかを使用するＳカチオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製し得る。あるいは、コンジュゲートを、Ａｋｔａ精製システムに接続されたＳ２００カラムまたはＺｅｂａスピンカラムを使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し得る。あるいは、透析を使用してもよい。ゲル濾過または透析のいずれかを使用して、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体−薬物コンジュゲートを、２４０ｍＭのスクロースを有する２０ｍＭのＨｉｓ／酢酸（ｐＨ５）中に製剤化した。精製されたコンジュゲートを、遠心分離限外濾過によって濃縮し、無菌条件下で０．２μｍのフィルターを通して濾過し、保管のために凍結する。抗体−薬物コンジュゲートをＢＣＡアッセイによって特性評価して、タンパク質濃度を決定し、凝集分析のために分析的ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）を行い、リジンＣエンドペプチダーゼ（ＬｙｓＣ）での処理後にＬＣ／ＭＳを行って、ＤＡＲを計算した。
【０２９２】
０．７５ｍｌ／分の流量で、０．２５ｍＭの塩化カリウム及び１５％のＩＰＡを有する０．２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．２）中、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ８０２．５カラムを使用して、コンジュゲートに対してサイズ排除クロマトグラフィーを実行した。コンジュゲートの凝集状態を、２８０ｎｍでの溶出ピーク面積吸光度の積分によって決定した。
【０２９３】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＱＴＯＦ６５２０ＥＳＩ機器を使用して、コンジュゲートに対してＬＣ／ＭＳ分析を実行し得る。一例として、抗体−薬物コンジュゲートを、トリス（ｐＨ７．５）中、１：５００ｗ／ｗエンドプロテイナーゼＬｙｓ  Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で３７℃で３０分間処理した。結果として生じる切断断片を、８０℃に加熱した１０００Å（Ａｎｇｓｔｒｏｍ）、８μｍ（ミクロン）ＰＬＲＰ−Ｓ（高度架橋ポリスチレン）カラムに負荷し、３０％のＢ〜４０％のＢまでの勾配で５分間溶出した。移動相Ａは、０．０５％のＴＦＡを有するＨ２Ｏであり、移動相Ｂは、０．０４％のＴＦＡを有するアセトニトリルであった。流量は、０．５ｍｌ／分であった。タンパク質溶出を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度検出によって、エレクトロスプレーイオン化及びＭＳ分析の前に監視した。非コンジュゲートＦｃ断片、残存非コンジュゲートＦａｂ、及び薬物化Ｆａｂのクロマトグラフィー分解が、通常達成された。得られたｍ／ｚスペクトルを、Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してデコンボリューションして、抗体断片の質量を計算した。
【０２９４】
実施例２：ハーセプチンＨＣ  Ａ１１８Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
リンカー及びチオール脱離基を含む様々なプローブ化合物を、ハーセプチンＨＣ  Ａ１１８Ｃとコンジュゲートした。各コンジュゲーションにおいて、溶媒系中５ｍｇ／ｍＬの抗体をプローブ−リンカー−脱離基化合物と１０：１のプローブ化合物対抗体の当量比で接触させた（プローブ−リンカーは、ジスルフィド結合を介して抗体にコンジュゲートされる）。溶媒系は、７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）及び１０体積％のＤＭＦを含んだ。コンジュゲーション反応を、室温で２４時間実行した。反応生成混合物をＬＣ／ＭＳによって分析して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）、抗体−プローブコンジュゲートとの比較での脱離基副生成物の面積パーセント、抗体−プローブコンジュゲートとの比較での非コンジュゲート二量体の面積パーセント、及び抗体−プローブコンジュゲートとの比較での非コンジュゲート単量体の面積パーセントを決定した。
【０２９５】
プローブは、以下の式のものであった（式中、波線はリンカーへの結合点を示す）。
【化５４】
0006621919.tif 000064
【０２９６】
評価したプローブ−リンカー−脱離基化合物としては、
【化５５−１】
0006621919.tif 000065
【化５５−２】
0006621919.tif 000066
が挙げられる。
【０２９７】
結果を以下の表１に報告し、「ＤＡＲ」は薬物−抗体比を指す。
【表１】
0006621919.tif 000067
【０２９８】
実施例３：ハーセプチンＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
実施例２の反応条件下、ジスルフィド結合を介したハーセプチンＫ１４９Ｃへのコンジュゲーションについて、実施例２のプローブ化合物を評価した。反応生成混合物をＬＣ／ＭＳによって評価して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を決定した。結果を以下の表２に報告する。
【表２】
0006621919.tif 000068
【０２９９】
実施例４：ハーセプチンＨＣ  Ａ１１８Ｃ  ＡＤＣ
リンカー及び５−ニトロＰＤＳチオール脱離基を含む様々な薬物化合物を、ジスルフィド結合を介してハーセプチン２  ４Ｄ５  ＨＣ  Ａ１１８Ｃ抗体とコンジュゲートした。各コンジュゲーションにおいて、溶媒系中５ｍｇ／ｍＬの抗体を薬物−リンカー−脱離基化合物と３：１の薬物−リンカー−脱離基化合物対抗体の当量比で接触させた。溶媒系は、７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）を含んだ。コンジュゲーション反応を、室温で３時間実行した。反応生成混合物をＬＣ／ＭＳによって分析して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）、及び抗体−プローブコンジュゲートとの比較での脱離基副生成物の面積パーセントを決定した。
【０３００】
薬物は、以下の式のものであった（式中、波線はリンカーへの結合点を示す）。
【化５６】
0006621919.tif 000069
【０３０１】
評価した薬物−リンカー−脱離基化合物としては、
【化５７−１】
0006621919.tif 000070
【化５７−２】
0006621919.tif 000071
【化５７−３】
0006621919.tif 000072
が挙げられる。
【０３０２】
結果を以下の表３に報告し、シクロプロピル及びシクロブチル脱離基のＬＣ／ＭＳ結果をそれぞれ図１及び２に再現する。
【表３】
0006621919.tif 000073
【０３０３】
実施例５：ＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ  ＡＤＣ
第１の評価において、メチルスルホン酸脱離基（ＭＴＳ）（リンカー１）を含むリンカー−薬物化合物を、ジスルフィド結合を介してＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とコンジュゲートした。第２の評価において、第２の評価において、ＭＴＳ脱離基（リンカー２）を含むリンカー−薬物化合物を抗体とコンジュゲートした。各コンジュゲーションにおいて、溶媒系中５ｍｇ／ｍＬの抗体を薬物−リンカー−脱離基化合物と３：１のプローブ化合物対抗体の当量比で接触させた。溶媒系は、７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）を含んだ。コンジュゲーション反応を、室温で３時間実行した。リンカー１及び２を、以下に例示する。
【化５８−１】
0006621919.tif 000074
【化５８−２】
0006621919.tif 000075
【０３０４】
反応生成混合物をＬＣ／ＭＳによって評価して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を決定した。ＬＣ／ＭＳ結果を図３Ａ及び３Ｂに報告する。リンカー１について、薬物対抗体比は２．０であった。リンカー２について、薬物対抗体比は１．５であった。
【０３０５】
実施例６：異なるｐＨで形成されるＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
以下の緩衝液中、ジスルフィド結合を介したＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とのコンジュゲーションについて、実施例２のジメチル／５−ニトロＰＤＳプローブ−リンカー−脱離基化合物を評価した。（１）１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）、（２）７５ｍＭのビス−トリス（ｐＨ６．３）、（３）７５ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、及び（４）７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）。各評価において、５ｍｇ／ｍＬの抗体をプローブ−リンカー−脱離基と１０：１のプローブ化合物対抗体の当量比で接触させ、室温で一晩反応させた。ＬＣ／ＭＳ結果を図４Ａ〜４Ｄに描写する。ＬＣ／ＭＳ結果は、ｐＨの低下が、ジメチル／ニトロ−ＰＤＳの抗体とのコンジュゲーションを改善しないことを示す。
【０３０６】
実施例７：異なるｐＨで形成されるＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
以下の構造のプローブ−リンカー−ジニトロＰＤＳ脱離基化合物
【化５９】
0006621919.tif 000076
を、実施例６の方法に従って、ｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中、ジスルフィド結合を介したＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とのコンジュゲーションについて評価した。ＬＣ／ＭＳ結果を図５Ａ〜５Ｄに描写する。主要な副生成物は、以下の２種を含むと考えられる。
【化６０】
0006621919.tif 000077
【０３０７】
実施例８：異なるｐＨで形成されるＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
以下の構造のプローブ−リンカー−２−メルカプト−チアゾール脱離基化合物
【化６１】
0006621919.tif 000078
を、実施例６の方法に従って、ｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中、ジスルフィド結合を介したＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とのコンジュゲーションについて評価した。ＬＣ／ＭＳ結果を表４に報告し、図６Ａ〜６Ｄに描写する。
【表４】
0006621919.tif 000079
【０３０８】
ＬＧ副生成物は、主に以下の種を含むと考えられる。
【化６２】
0006621919.tif 000080
【０３０９】
実施例９：異なるｐＨで形成されるＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
以下の構造のプローブ−リンカー−２−メルカプト−オキサゾールＰＤＳ脱離基化合物
【化６３】
0006621919.tif 000081
を、実施例６の方法に従って、ｐＨ５．０、６．３、７．５、及び８．５の緩衝液中、ジスルフィド結合を介したＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とのコンジュゲーションについて評価した。ＬＣ／ＭＳ結果を表５に報告し、図７Ａ〜７Ｄに描写する。
【表５−１】
0006621919.tif 000082
【表５−２】
0006621919.tif 000083
【０３１０】
ＬＧ副生成物は、主に以下の種を含むと考えられ、
【化６４】
0006621919.tif 000084
式中、ＳＮＡｒ種は、主要なＬＧ副生成物ピークである。ＳＮＡｒ種は、主に６．３以下のｐＨで形成されると更に考えられる。
【０３１１】
実施例１０：ｐＨ８．５で形成されるＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体−プローブコンジュゲート
以下の構造のプローブ−リンカー−脱離基化合物
【化６５−１】
0006621919.tif 000085
【化６５−２】
0006621919.tif 000086
を、実験１〜４において、実施例６の方法に従って、７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）緩衝液中、ジスルフィド結合を介したＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とのコンジュゲーションについて評価した。ＬＣ／ＭＳ結果を図８Ａ〜８Ｄに描写し、以下の表６に要約する。
【表６】
0006621919.tif 000087
【０３１２】
実施例１１：異なるｐＨで形成されるＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ  ＡＤＣ
以下の脱離基−リンカー−薬物化合物を、以下の緩衝液中、ＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ抗体とのコンジュゲーションについて評価した。（１）１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）、（２）７５ｍＭのビス−トリス（ｐＨ６．３）、（３）７５ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、及び（４）７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）。各評価において、５ｍｇ／ｍＬの抗体を脱離基−リンカー−薬物化合物と１０：１のプローブ化合物対抗体の当量比で接触させ、室温で一晩反応させた。ＬＣ／ＭＳを図９Ａ〜９Ｄに描写し、これは各コンジュゲーション反応のＤＡＲが０であったことを示す。
【化６６】
0006621919.tif 000088
【０３１３】
実施例１２：ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体薬物及び抗体−プローブコンジュゲート
本明細書に記載されるＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、本明細書に開示される方法によって、本開示の様々な活性化リンカー−プローブコンジュゲートとコンジュゲートした。反応生成混合物を、本明細書に記載される方法によって、ＤＡＲについて評価した。
【０３１４】
第１連の評価において、活性化リンカー−プローブ化合物
【化６７】
0006621919.tif 000089
を、抗体とコンジュゲートした。結果を以下の表７に報告する（式中、波線はジスルフィド部分へのＲの結合点を示す）。
【表７】
0006621919.tif 000090
【０３１５】
第２連の評価において、以下に例示される活性化リンカー−ＭＭＡＥ薬物化合物
【化６８】
0006621919.tif 000091
を、以下の抗体とコンジュゲートした。ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（結果は表８Ａ）、ＨＣ  Ａ１４０Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（結果は表８Ｂ）、ＬＣ  Ｓ１２１Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（結果は表８Ｂ）、ＬＣ  Ｖ２０５Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（結果は表８Ｂ）、及びＨＣ  Ａ１１８Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体（結果は表８Ｂ）。各コンジュゲーション実験を、７５ｍＭのトリス及び１０％のＤＭＦ中、１０×リンカー対薬物比、ｐＨ８．５、及び室温で１５〜１７時間行った。表８Ａ及び８Ｂにおいて、波線は、ジスルフィド部分へのＲの結合点を示す。
【表８Ａ−１】
0006621919.tif 000092
【表８Ａ−２】
0006621919.tif 000093
【表８Ｂ−１】
0006621919.tif 000094
【表８Ｂ−２】
0006621919.tif 000095
【表８Ｂ−３】
0006621919.tif 000096
【表８Ｃ】
0006621919.tif 000097
【０３１６】
第２連の評価において、以下に例示される活性化リンカー−ピロロベンゾジアゼピン二量体化合物
【化６９】
0006621919.tif 000098
を、ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とコンジュゲートした。結果を以下の表９に報告する（式中、波線はジスルフィド部分へのＲの結合点を示す）。
【表９】
0006621919.tif 000099
【０３１７】
実施例１３：活性化ＰＢＤ二量体、活性化ＣＢＩ−ＰＢＤ二量体、及び活性化ＭＭＡＥのＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体薬物コンジュゲーション評価。
以下の活性化薬物化合物の各々を、ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体、ＨＣ  Ａ１４０Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体、ＬＣ  Ｓ１２１Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体、ＬＣ  Ｖ２０５Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体、及びＨＣ  Ａ１１８Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体の各々とコンジュゲートした。
【化７０】
0006621919.tif 000100
【０３１８】
各コンジュゲーション実験を、７５ｍＭのトリス及び１０％のＤＭＦ中、１０×リンカー対薬物比、ｐＨ８．５、及び室温で１５〜１７時間行った。結果を以下の表１０に提示する。
【表１０−１】
0006621919.tif 000101
【表１０−２】
0006621919.tif 000102
【０３１９】
表１０の値はＬＣ  Ｋ１４９Ｃに対して正規化し、各抗体のＬＣ  Ｋ１４９Ｃ結果は１００に対して正規化した。正規化した結果を以下の表１１に報告する。
【表１１】
0006621919.tif 000103
表１０の結果は、所与の脱離基及びＣｙｓ変異部位について、活性化ＣＢＩ−ＰＢＤ二量体のコンジュゲーションよりも大きい活性化ＭＭＡＥのコンジュゲーションは、評価した脱離基の活性化ＰＢＤ二量体のコンジュゲーションよりも大きいことを示す。これらの差異は、ＭＭＡＥ、ＰＢＤ二量体、及びＣＢＩ−ＰＢＤ二量体リンカー−薬物の間の示差的可溶性によるものであり得る。表１１の正規化したデータ結果は、ＤＡＲ傾向が、同一の脱離基を有するＭＭＡＥ、ＣＢＩ−ＰＢＤ二量体、及びＰＢＤ二量体のＣｙｓ変異部位にわたって同等であることを示し、これは、Ｃｙｓ部位選択性が主に脱離基によって支配されることを示唆する。
【０３２０】
実施例１４：ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗ＣＤ２２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃへの及びＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗Ｈｅｒ２  ４Ｄ５  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃへの、活性化薬物のコンジュゲーション評価
実施例１３の方法に従って、実施例１３のＣＢＩ−ＰＢＤ二量体及びＰＢＤ二量体、ならびに以下の活性化ＭＭＡＥ薬物を、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体抗ＣＤ２２ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ及びＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗Ｈｅｒ２  ４Ｄ５  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃの各々とコンジュゲートした。
【化７１】
0006621919.tif 000104
ＤＡＲ結果を以下の表１２に提示する。
【表１２】
0006621919.tif 000105
【０３２１】
実施例１５：マイタンシノイドまたはＭＭＡＥを含むＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体コンジュゲート
以下に描写されるマイタンシノイド及びＭＭＡＥを、様々なリンカー−脱離基化合物を有するＨｅｒ２  ４Ｄ５  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃとコンジュゲートした。
【化７２】
0006621919.tif 000106
【０３２２】
コンジュゲーションを、１０％のＤＭＦ中７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）中、１０×リンカー対薬物化学量論比、室温で１５〜１７時間行った。結果を以下の表１３に報告し、「ＤＡＲ」は薬物対抗体比を指し、「Ｍａｙ」はマイタンシノイド化合物を指し、「ＭＭＡＥ」はオーリスタチン化合物を指す。
【表１３−１】
0006621919.tif 000107
【表１３−２】
0006621919.tif 000108
【０３２３】
実施例１６：活性化リンカーの合成
以下の５−ニトロピリジン−２−チオールでリンカーを活性化した。塩化スルフリル（ＤＣＭ中２．３５ｍＬの１．０Ｍの溶液、２．３５ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（７．５ｍＬ）中、５−ニトロピリジン−２−チオール（３３４ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、アルゴン雰囲気下、０℃（氷／アセトン）で滴加した。反応混合物は黄色の懸濁液から黄色の溶液となり、それを室温まで温め、その後、２時間撹拌してから、溶媒を真空中蒸発によって除去して、黄色固体を得た。固体をＤＣＭ（１５ｍＬ）中に再溶解し、（Ｒ）−２−メルカプトプロパン−１−オール（２１３ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭ溶液（７．５ｍＬ）で、アルゴン雰囲気下、０℃で液滴処理した。反応混合物を室温まで温め、２０時間撹拌し、この時点でＬＣ／ＭＳによる分析は、保持時間１．４１分間（ＥＳ＋）ｍ／ｚ２４７（［Ｍ＋Ｈ］＋．、約１００％の相対強度）での実質的な生成物形成を示した。沈殿物を濾過によって除去し、濾液を真空中で蒸発させて、橙色固体を得、これをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で処理し、水酸化アンモニウム溶液で塩基性化した。混合物をＤＣＭ（３×２５ｍＬ）で抽出し、合わせた抽出物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空中で蒸発させて、粗生成物を得た。フラッシュクロマトグラフィー（１％の増分の勾配溶出：１００％のＤＣＭから９８：２ｖ／ｖのＤＣＭ／ＭｅＯＨ）による精製によって、（Ｒ）−２−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）プロパン−１−オールを油（１１１ｍｇ、２１％の収率）として得た。
【０３２４】
トリホスゲン（４８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を、（Ｒ）−２−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）プロパン−１−オール（１１１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及びピリジン（３４μＬ、３３．５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＣＭの撹拌溶液（５ｍＬ）に添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で４５分間撹拌してから、溶媒を真空下蒸発によって除去して、（Ｒ）−２−（（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファニル）プロピルカルボノクロリデートを黄色フィルムとして得た。
【０３２５】
実施例１７：Ｈｅｒ２モデルにおける腫瘍成長阻害
本発明の２つの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のインビボ有効性を、高発現ＨＥＲ２トランスジェニック外植マウスモデルによって測定した。抗Ｈｅｒ２抗体−薬物コンジュゲートを、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２）の転写制御下、乳腺上皮内でヒトＨＥＲ２遺伝子を過剰発現しているトランスジェニックマウスモデルである、Ｆｏ５モデルで試験した。ＨＥＲ２過剰発現は、乳腺腫瘍の自然発症を引き起こす。これらの樹立動物のうちの１つの乳腺腫瘍（樹立番号５［Ｆｏ５］）を、腫瘍断片（サイズ約２×２ｍｍ）の段階移植によってＦＶＢマウスの後続世代において増殖させた。全ての研究を、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って行った。
【０３２６】
腫瘍を確立し、０日目の単回治療前に（カリパスを使用して測定される）１５０〜２００ｍｍ３の体積まで成長させた。初回腫瘍サイズは、約２００ｍｍ３の体積であった。対象を、１キログラム当たり１ミリグラム（「ｍｐｋ」）のＡＤＣ１、３ｍｐｋのＡＤＣ１、６ｍｐｋのＡＤＣ１、もしくは１ｍｐｋのＡＤＣ２、またはプラセボ緩衝液対照（ビヒクル）で一度静脈内治療し、３週間にわたって監視して、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、式、Ｖ（ｍｍ３）＝０．５Ａ×Ｂ２（式中、Ａ及びＢはそれぞれ、短径及び長径である）に従って、カリパスを使用して測定した。ＡＤＣ１及びＡＤＣ２は以下に例示され、抗体とジスルフィド結合を形成するＳ原子を有するリンカー炭素原子上のメチル置換基に関して異なる。ＡＤＣ１及びＡＤＣ２の両方の抗体は、ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ変異を有するＴＨＩＯＭＡＢ（商標）であった。
【化７３−１】
0006621919.tif 000109
【化７３−２】
0006621919.tif 000110
【０３２７】
結果を以下の表１４に報告する。
【表１４】
0006621919.tif 000111
【０３２８】
実施例１８：活性化束縛ジスルフィドを含むＰＢＤ二量体の調製
本明細書に記載される他の活性化ＰＢＤ二量体を表す一例として、メチル部分で束縛されている活性化ジスルフィドリンカーを含むＰＢＤ二量体化合物１を、以下の全体反応スキーム１に従って合成した。
スキーム１：
【化７４】
0006621919.tif 000112
【０３２９】
トリホスゲン（２４１ｍｇ、０．８１２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を、化合物Ａ１（ＷＯ２０１３０５５９８７に記載される手順に類似した手順を使用して調製、５００ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）及びピリジン（１５３ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に２０℃で滴加した。反応混合物を２０℃で３０分間撹拌し、その後、濃縮した。残渣は、更に精製することなく、次のステップで直接使用した。
【０３３０】
化合物Ａ２（６２７ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を、化合物Ａ３（ＷＯ２０１３０５５９８７に記載されるように調製、１．５０ｇ、１．５７ｍｍｏｌ）及びピリジン（１６１．７９ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ）の溶液に２０℃で滴加した。反応混合物を２０℃で３時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（１．６ｇ、８３％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝１．２２分、ｍ／ｚ＝１２２５．４［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０３３１】
氷ＨＯＡｃ（１５ｍＬ）を、ＴＨＦの混合物中の化合物Ａ４（９００ｍｇ、０．７３４ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（１０ｍＬ／１０ｍＬ）の溶液に２０℃で添加した。反応混合物を２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、水（２×２０ｍＬ）、飽和水溶液ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）、及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を得た。この材料をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１〜５％のＣＨ３ＯＨ）によって精製して、生成物（７００ｍｇ、９６％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．８３分、ｍ／ｚ＝９９７．４［Ｍ＋２３］＋．
【０３３２】
ＤＭＰ（２５５ｍｇ、０．６０１ｍｍｏｌ）を、化合物Ａ５（２００ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）に０℃で添加した。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した後、それをＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＳＯ３（５ｍＬ／５ｍＬ）の飽和溶液で反応停止させ、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＳＯ３（５ｍＬ／５ｍＬ）及びブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、その後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１５：１）によって精製して、生成物（１３０ｍｇ、６５％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．７７分、ｍ／ｚ＝１０１５．４［Ｍ＋２３］＋．
【０３３３】
低温ＴＦＡ（１０ｍＬ）を化合物Ａ６（６５０ｍｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、その後、飽和水溶液ＮａＨＣＯ３（１５０ｍＬ）に０℃で滴加した。結果として生じる混合物をＤＣＭ（４×４０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を得た。この材料を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１５：１）によって精製して、化合物１（３００ｍｇ、５２％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．８７分、ｍ／ｚ＝８７５．５［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．１４（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），５．５２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１３−５．０６（ｍ，４Ｈ），４．５１（ｓ，１Ｈ），４．２３−４．１２（ｍ，４Ｈ），４．０８−３．９０（ｍ，５Ｈ），３．８５−３．７５（ｓ，６Ｈ），３．７５−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．６２−３．５２（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．８８−２．７８（ｍ，２Ｈ），２．６７−２．６３（ｍ，１Ｈ），１．８４−１．５６（ｍ，６Ｈ），１．１９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ）．
【０３３４】
シクロプロピル部分で束縛されている活性化ジスルフィドリンカーを含むＰＢＤ二量体化合物２を、以下の全体反応スキーム２に従って合成した。
スキーム２：
【化７５−１】
0006621919.tif 000113
【化７５−２】
0006621919.tif 000114
【０３３５】
ＴＦＡ（１６．３ｇ、１６７．６ｍｍｏｌ）及びＫＳＣＮ（８．１４ｇ、８３．８ｍｍｏｌ）を、酢酸イソプロピル（１００ｍＬ）中のｓｕ１２１ａｐｈｔｈａｌｅｎｅｆナフタレン−１−アミン（１２．０ｇ、８３．８ｍｍｏｌ）に２０℃で逐次添加した。反応混合物を還流下で一晩撹拌し、その後、室温まで冷却し、濾過した。濾過ケークをＩＰＯＡｃ（１００ｍＬ）で洗浄し、その後、真空下で乾燥させて、化合物２（１２．０ｇ、７１％）を無色個体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．７６（ｓ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９０−７．８５（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．４５（ｍ，４Ｈ），６．９６（ｂｒ，２Ｈ）．関連した調製については、Ｏ．Ｒ．Ｔｈｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００８，７３，３５０８を参照されたい。
【０３３６】
２，４−ジブロモブタノイルクロリド（１３．５ｇ、５１．０７ｍｍｏｌ）を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（８０ｍＬ）及びＤＣＭ（１５０ｍＬ）中の化合物Ａ７（１０．３３ｇ、５１．０７ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で緩徐に添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、その後、１５％のＮａＯＨ水溶液（５０ｍＬ）及びベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（２００ｍｇ）を逐次添加した。室温で一晩撹拌した後、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を添加し、混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残基をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中２０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物Ａ８（９．０ｇ、４４％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９５−７．９２（ｍ，１Ｈ），７．６１−７．５５（ｍ，４Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），１．９０−１．８４（ｍ，２Ｈ），１．４７−１．４１（ｍ，２Ｈ）．
【０３３７】
１５％のＮａＯＨ水溶液（５０ｍＬ）及びＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中の化合物Ａ８（５．０ｇ、１８．６３ｍｍｏｌ）の混合物を、還流下で６時間撹拌した。ＥｔＯＨを真空下で除去し、水層をＥｔＯＡｃ（７０ｍＬ×４）で抽出して、望ましくない副生成物を除去した。ＨＣｌ水溶液を緩徐に添加することによって、水層をｐＨ３に酸性化し、その後、ＥｔＯＡｃ（７０ｍＬ×４）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、その後、ＭｎＯ２（３．２ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）を添加した。
【０３３８】
混合物を室温で０．５時間撹拌し、その後、濾過し、濃縮した。残基をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％のＣＨ３ＯＨ）によって精製して、化合物Ａ９（１．３ｇ、６０％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．９２（ｓ，４Ｈ），１．６２（ｓ，４Ｈ）．
【０３３９】
化合物Ａ９（４００ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を、ＬＡＨ（３８９ｍｇ、１０．２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ懸濁液（１０ｍＬ）に２５℃で添加した。反応混合物を還流下で１時間撹拌し、その後、０℃まで冷却し、２ＮのＨＣｌ水溶液で慎重に反応停止させた。結果として生じる混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（以下を参照されたい）で希釈し、更に精製することなく、次のステップで直接使用した。
【０３４０】
ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（６０ｍＬ／６０ｍＬ）中、粗化合物Ａ１０（３５６ｍｇ、３．４２ｍｍｏｌ）及び１，２−ビス（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファン（２．１２ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で一晩撹拌した。その後、ＭｎＯ２（３．０ｇ、３４．５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で更に０．５時間撹拌した。混合物を濾過し、濾過ケークをＤＣＭ（１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾液及び洗浄物を真空下で濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ中０〜１％のＤＣＭ）によって精製して、所望される生成物を得た。この材料を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１）によって更に精製して、Ａ１１（４００ｍｇ、２回のステップにわたって４６％）を褐色油として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．８０分、ｍ／ｚ＝２５８．８［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．３５（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｓ，１Ｈ），３．４７（ｓ，２Ｈ），１．１５−１．１２（ｍ，２Ｈ），１．０１−０．９８（ｍ，２Ｈ）．
【０３４１】
化合物Ａ１１（８５．０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びピリジン（２５．０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３ｍＬ）を、トリホスゲン（３９．０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３．０ｍＬ）に０℃で滴加した。反応混合物を０℃で１５分間撹拌し、その後、次のステップで直接使用した。
【０３４２】
上記で調製した粗化合物Ａ１２の溶液（９６．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を、化合物Ａ３（２２０．０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びピリジン（２４．０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（６．０ｍＬ）に２６℃で滴加した。反応混合物を２６℃で２時間撹拌すると、ＴＬＣ分析は、所望される生成物（石油エーテル中５０％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．３０）の出現及び出発材料の消費（Ｒｆ＝０．２５）を示した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取ＴＬＣ（石油エーテル中３０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物Ａ１３（１５０ｍｇ、５３％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝１．２５分、ｍ／ｚ＝１２３７．４［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０３４３】
氷ＨＯＡｃ（３．０ｍＬ、５２ｍｍｏｌ）を、Ｈ２Ｏ（２．０ｍＬ）及びＴＨＦ（２．０ｍＬ）中の化合物Ａ１３（１５０．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に２０℃で添加した。反応混合物を２０℃で２４時間撹拌すると、ＴＬＣ分析は、所望される生成物（ＤＣＭ中３．３％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．３０）の出現及び出発材料の消費（Ｒｆ＝０．６５）を示した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、水（２×４ｍＬ）、飽和水溶液ＮａＨＣＯ３（６ｍＬ）、及びブライン（６ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物Ａ１４（７０ｍｇ、５７％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．８７分、ｍ／ｚ＝１００９．４［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０３４４】
デス・マーチンペルヨージナン（８８．０ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）を、化合物Ａ１４（７０．０ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（４．０ｍＬ）に０℃で添加した。反応混合物を２０℃まで温め、２時間撹拌した。その後、ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＳＯ３（３．０ｍＬ／３．０ｍＬ）の飽和溶液を添加し、混合物をＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＳＯ３（３．０ｍＬ／３．０ｍＬ）、ブライン（５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中６．２５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物Ａ１５（４５ｍｇ、６５％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（条件Ｂ、１０−８０ＡＢ、７．０分）：保持時間＝２．７０分、ｍ／ｚ＝８８７．５［Ｍ−１００−１８］＋．
【０３４５】
低温ＴＦＡ（水中９５％、２．０ｍＬ）を化合物Ａ１５（４５ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）に０℃で添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、それを飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４．０ｍＬ）に０℃で滴加した。結果として生じる混合物をＤＣＭ（４×８．０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を得た。この材料を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中６．２５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物２（２２ｍｇ、５５％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．７５分、ｍ／ｚ＝８８７．５［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．１８（ｓ，１Ｈ），８．２２−８．２０（ｍ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｓ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．７６（ｓ，１Ｈ），５．５６（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１９−５．１３（ｍ，４Ｈ），４．４８（ｂｒ，１Ｈ），４．３２−４．２３（ｍ，４Ｈ），４．１６−４．０２（ｍ，５Ｈ），３．９３−３．８６（ｍ，６Ｈ），３．８１−３．７９（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．６８（ｍ，２Ｈ），３．１４−３．０８（ｍ，１Ｈ），２．９５−２．９１（ｍ，２Ｈ），２．２６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），１．９３−１．８９（ｍ，４Ｈ），１．６３−１．５９（ｍ，２Ｈ），１．０６−１．０２（ｍ，２Ｈ），０．９４−０．８４（ｍ，２Ｈ）．
【０３４６】
シクロブチル部分で束縛されている活性化ジスルフィドリンカーを含むＰＢＤ二量体化合物１１を、以下の全体反応スキーム３に従って合成した。
スキーム３：
【化７６】
0006621919.tif 000115
【０３４７】
Ｎ−ブロモスクシンイミド（１７．２ｇ、９６．６ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１．２８ｇ、７．８ｍｍｏｌ）を、エチルシクロブタンカルボキシレート（１０．０ｇ、７８．０ｍｍｏｌ）のＣＣｌ４溶液（１４０ｍＬ）に２５℃で逐次添加した。反応混合物を８０℃まで加熱し、その温度で１６時間維持すると、ＴＬＣ分析は、所望される生成物（石油エーテル中３％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４）が形成されたことを示した。混合物を室温まで冷却し、その後、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ×２）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１〜３％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物Ａ１６（６．４ｇ、４０％）を無色油として得、更に特性評価することなく使用した。
【０３４８】
ＫＳＡｃ（３．８８ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）を、化合物Ａ１６（６．４ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）のアセトン混合物（１００ｍＬ）に２５℃で添加した。反応混合物を８０℃で３０時間撹拌すると、ＴＬＣ分析は、所望される生成物（石油エーテル中１０％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．６）が形成されたことを示した。混合物を室温まで冷却し、その後、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜５％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物Ａ１７（２．５ｇ、４０％）を黄色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．２２−４．１７（ｍ，２Ｈ），２．８９−２．８３（ｍ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．２２−２．０３（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）．
【０３４９】
化合物Ａ１７（２．５ｇ、１２．３６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中ＬＡＨ（１．８８ｇ、４９．４ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で添加した。添加の完了後、混合物を加熱して、８０℃で２時間還流させると、ＴＬＣ分析は、所望される生成物（石油エーテル中１０％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．２）の形成を示した。反応混合物を０℃まで冷却し、ＨＣｌ水溶液（６ｍＬ、２．０Ｍ）を緩徐に添加することによって慎重に反応停止させた。混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（以下を参照されたい）で希釈し、次のステップで直接使用した。
【０３５０】
以前のステップで調製した反応混合物を、ＤＣＭ（６０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（６０ｍＬ）中１，２−ビス（５−ニトロピリジン−２−イル）ジスルファン（７．６７ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）の懸濁液に１５℃で添加した。その後、反応混合物を１５℃で１６時間撹拌すると、ＴＬＣ分析は、所望される生成物（１００％のＤＣＭ、Ｒｆ＝０．３）が形成されたことを示した。ＭｎＯ２（５．０ｇ）を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌し、その後、濾過した。濾液を濃縮して黄色固体を得、これを５０ｍＬのＭｅＯＨで粉砕し、２度目の濾過を行った。濾液をもう一度濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜１％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物Ａ１９（１．４６ｇ、２回のステップにわたって４３％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．７０分、ｍ／ｚ＝２７２．９［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０３５１】
化合物Ａ１９（２００．０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）及びピリジン（５８．０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３．０ｍＬ）を、トリホスゲン（８７．０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２．０ｍＬ）に０℃で滴加した。混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、次のステップで直接使用した。
【０３５２】
上記で調製した化合物Ａ２０（２４５．０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ粗溶液（５．０ｍＬ）を、ＤＣＭ（５．０ｍＬ）中、化合物Ａ３（５００．０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．０６ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に２５℃で滴加した。添加の完了後、混合物を２５℃で２時間撹拌し、その後、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中０〜３３％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物Ａ２１（５１０ｍｇ、７６％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝１．２５分、ｍ／ｚ＝１２７３．７［Ｍ＋Ｎａ］＋．
【０３５３】
氷ＨＯＡｃ（１１．７６ｍＬ、２０５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（８．０ｍＬ）及び水（８．０ｍＬ）中の化合物Ａ２１（５１０．０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）の混合物に２５℃で添加した。反応混合物を２５℃で１６時間撹拌し、その後、ＥｔＯＡｃ（７０ｍＬ）で希釈し、水（２５ｍＬ×３）、飽和水溶液ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ×３）、及びブライン（３０ｍＬ）で逐次洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜５％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物Ａ２２（３５０ｍｇ、８４％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．８６分、ｍ／ｚ＝１０２３．５［Ｍ＋Ｈ］＋．
【０３５４】
デス・マーチンペルヨージナン（１８５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、化合物Ａ２２（１５４．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に０℃で添加した。その後、反応を２５℃で２０時間撹拌し、それをＮａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（１０％、３０ｍＬ）に注ぎ入れ、結果として生じる混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を飽和水溶液ＮａＨＣＯ３（３０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、その後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中６．２５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物Ａ２３（８０ｍｇ、５２％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．８２分、ｍ／ｚ＝１０４１．５［Ｍ＋Ｎａ］＋．
【０３５５】
低温ＴＦＡ（１．９ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）及び水（０．１０ｍＬ）を、化合物Ａ２３（１００．０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）に０℃で逐次添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、ＮａＨＣＯ３の飽和水溶液（１５０ｍＬ）に０℃で滴加した。結果として生じる混合物をＤＣＭ（４０ｍＬ×４）で抽出し、合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗生成物を得た。この材料を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、化合物１１（２０ｍｇ、２３％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（条件Ａ、５−９５ＡＢ、１．５分）：保持時間＝０．７７分、ｍ／ｚ＝９０１．４［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．２１（ｄ，Ｊ＝１．９８Ｈｚ，１Ｈ）８．３６（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ）７．７０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ）７．５６−７．５１（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），５．５９（ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２０（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，２Ｈ），５．１６（ｂｒ．，２Ｈ），４．６４−４．４８（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．２５（ｍ，５Ｈ），４．２１−３．９８（ｍ，６Ｈ），３．９１−３．７３（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｔ，Ｊ＝８．８０Ｈｚ，１Ｈ）３．５０（ｓ，１Ｈ）３．２２−３．０８（ｍ，１Ｈ）２．９９−２．８７（ｍ，２Ｈ）２．７３（ｍ，１Ｈ）２．０４−１．８６（ｍ，８Ｈ）１．３８−１．１５（ｍ，１Ｈ）．
【０３５６】
実施例１９：活性化束縛ジスルフィドを含むＭＭＡＥ化合物の調製
活性化ＭＭＡＥ化合物Ａを、以下の全体反応スキーム１に従って合成した。
スキーム１：
【化７７】
0006621919.tif 000116
【０３５７】
化合物１（６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、ＭＭＡＥ（１１０ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ溶液（３．０ｍＬ）に、ピリジン（１３４ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を２０℃で添加し、混合物をＮ２下、１６℃で１６時間撹拌させた。混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣ（ＦＡ条件）によって精製して、化合物Ａ（９９．７ｍｇ、収率：６４％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ：（１０−８０、ＡＢ、２分）、１．３３１分、ＭＳ＝９３２．５［Ｍ＋２］；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０−７．７６（ｍ，２Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．１８（ｍ，７Ｈ），５．１０（ｓ，１Ｈ），４．５６−４．５１（ｍ，２Ｈ），４．２９−４．１６（ｍ，３Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３７（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２８−３．２３（ｍ，８Ｈ），３．１５（ｓ，３Ｈ），２．８４（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，２Ｈ），２．１８（ｓ，２Ｈ），２．００（ｓ，１Ｈ），１．８１（ｓ，３Ｈ），１．６２−１．５６（ｍ，２Ｈ），１．３４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．０５−１．０１（ｍ，８Ｈ），０．８８−０．８０（ｍ，１８Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、９３０．５０であった。
【０３５８】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｂを、以下の全体反応スキーム２に従って合成した。
スキーム２：
【化７８】
0006621919.tif 000117
【０３５９】
化合物１（３．００ｇ、９．６８ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＭＦ（１：１、１０．０ｍＬ）撹拌溶液に、化合物２（３８０ｍｇ、４．８４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ／ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）を、Ｎ２下、１５℃で５分間かけて滴加した。混合物を、Ｎ２下、１５℃で１６時間撹拌した後、それを濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝３０／１）によって精製して、化合物３（５００ｍｇ、収率：４５％）を得た。
【０３６０】
化合物３（５０．０ｍｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中ＰＮＰ（１３１ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（５６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を１５℃で添加した。混合物を、Ｎ２下、１５℃で１６時間撹拌した。混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝３０／１）によって精製して、化合物４（６０ｍｇ、収率：７４％）を得た。
【０３６１】
化合物４（３０ｍｇ、０．０７５６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＭＭＡＥ（４９ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中ＨＯＢｔ（２．０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、及びピリジン（６０ｍｇ、０．７５６ｍｍｏｌ）を２２℃で添加した。混合物を２０℃で１６時間撹拌し、それを分取ＨＰＬＣ（ＦＡ）によって精製して、化合物Ｂ（６０．０ｍｇ、収率：８０％）を得た。ＬＣＭＳ：（５−９５、ＡＢ、１．５分）、１．００７分、ＭＳ＝９９８．６［Ｍ＋２３］＋；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．２３（ｓ，１Ｈ），８．５３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４４−８．０２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．１８（ｍ，７Ｈ），５．１０（ｓ，１Ｈ），４．７０−４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｓ，１Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｓ，１Ｈ），３．４６（ｓ，１Ｈ），３．４０−３．１８（ｍ，１２Ｈ），２．８４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），２．４１（ｓ，２Ｈ），２．１８（ｓ，２Ｈ），１．８１（ｓ，３Ｈ），１．７４−１．５０（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，１Ｈ），１．０４−０．７８（ｍ，２８Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、９７５．４８であった。
【０３６２】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｃを、以下の全体反応スキーム３に従って合成した。
スキーム３：
【化７９】
0006621919.tif 000118
【０３６３】
化合物１（５０ｍｇ、０．２０３ｍｍｏｌ）及び炭酸ＰＮＰ（１２３ｍｇ、０．４０６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ撹拌溶液（２．０ｍＬ）に、ＤＩＥＡ（７８ｍｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２７℃で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＤＣＭ（５０ｍＬ×２）とＨ２Ｏ（４０ｍＬ）とに分割させた。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、分取ＴＬＣ（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ＝３／１）によって精製して、化合物２（６０ｍｇ、収率：７２％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ：（５−９５、ＡＢ、１．５分）、０．８５７分、ＭＳ＝４１１．８［Ｍ＋１］＋．
【０３６４】
ＭＭＡＥ（３０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）及び化合物２（３４ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ撹拌溶液（２．０ｍＬ）に、ＨＯＢｔ（１．０ｍｇ、０．００４２ｍｍｏｌ）及びピリジン（３３ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２７℃で１２時間撹拌し、分取ＨＰＬＣ（ＦＡ）によって精製して、化合物Ｃ（２３ｍｇ、収率：５５％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δｐｐｍ９．２４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），８．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５３−７．０９（ｍ，５Ｈ），４．７３−４．５６（ｍ，５Ｈ），４．３６−４．１５（ｍ，５Ｈ），３．９２−３．５１（ｍ，１Ｈ），３．４９−３．３７（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｓ，５Ｈ），３．２５−３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０２−２．８６（ｍ，３Ｈ），２．５６−２．３９（ｍ，２Ｈ），２．３２−１．５１（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｄｄ，Ｊ＝６．８，２．８Ｈｚ，４Ｈ），１．２３−１．０９（ｍ，６Ｈ），１．０６−０．７７（ｍ，１９Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、９８９．５０であった。
【０３６５】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｅ、Ｆ、及びＧを、以下の全体反応スキーム４に従って合成した。
スキーム４：
【化８０】
0006621919.tif 000119
【０３６６】
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中、化合物１（５００．０ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）及び炭酸ＰＮＰ（１１６９ｍｇ、３．８４ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＩＥＡ（７４４．７ｍｇ、５．７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、Ｎ２下、１４℃で８時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１００％のＤＣＭ）によって精製して、化合物２（３００ｍｇ、３４％の収率）を黄色油として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８５０分、［Ｍ＋Ｈ］＋４２５．８．
【０３６７】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、化合物２（１００．０ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ）及びピリジン（１８６ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭＭＡＥ（１０７ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（３．１８ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ）精製して、化合物Ｄ（１１０ｍｇ、４６％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８９９分、［Ｍ＋Ｎａ］＋１０２６．３．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．１８（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３２−７．１９（ｍ，４Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．８８（ｓ，１Ｈ），４．７２−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．２５−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１４−３．９４（ｍ，５Ｈ），３．７８（ｄ，Ｊ＝５．６，１Ｈ），３．４４（ｍ，１Ｈ），３．３５−３．３１（ｍ，４Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），３．０４（ｓ，１Ｈ），２．８４−３．００（ｍ，２Ｈ），２．４４−２．３４（ｍ，３Ｈ），２．３４−２．３０（ｍ，１Ｈ），１．８８−２．０５（ｍ，３），１．８４−１．７５（ｍ，３Ｈ），１．３０（ｓ，７Ｈ），１．２０（ｍ，３Ｈ）１．００−０．７５（ｍ，２４Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、１００３．５１であった。
【０３６８】
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中、化合物Ｄ（２０．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、化合物３（１４．９６ｍｇ、０．１０００ｍｍｏｌ）、化合物４（２９．７１ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（７．３ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の混合物を３０℃で８時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣによって精製して、化合物Ｅ（４．１ｍｇ、２０．２％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７５８分、［Ｍ／２＋Ｈ］＋５００．１．
【０３６９】
化合物５（５８．０２ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（５１．９９ｍｇ、０．６００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃で３０分間撹拌した後、それを濾過し、濾液を化合物Ｄ（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物５（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１０．９６ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を３０℃で８時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣによって精製して、化合物Ｆ（４．８ｍｇ、０．００４７ｍｍｏｌ、１５．８％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７６７分、［Ｍ／２＋Ｎａ］＋５２２．１．
化合物６（２５ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（５８．６８ｍｇ、０．６７０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８℃で３０分間撹拌した後、それを濾過し、濾液を化合物Ｄ（３０．０ｍｇ、０．０３００ｍｍｏｌ）、化合物６（５１ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１２．３７ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を４０℃で８時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣによって精製して、化合物Ｇ（９．８ｍｇ、２７％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８４９分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０４３．５．
【０３７０】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｈを、以下の全体反応スキーム５に従って合成した。
スキーム５：
【化８１】
0006621919.tif 000120
【０３７１】
ＤＭＦ（１０．０ｍＬ）中、化合物１（１５０．０ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ）及びピリジン（２７８．９ｍｇ、３．５３ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭＭＡＥ（１６０．５ｍｇ、０．３２０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４．７６ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０℃で８時間撹拌した後、それを真空下で濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中９％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物２（１１０ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、３１．１％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８９７分、［Ｍ＋Ｈ］＋１００４．５．
【０３７２】
化合物３（５１．０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）にＭｎＯ２（５８．６８ｍｇ、０．６７０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１８℃で３０分間撹拌した。混合物を濾過し、濾液に化合物２（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物３（２５．０ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１２．３７ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で８時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（カラム：ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｃ１８  １５０＊３０  ５ｕ、条件：０．２２５％のＦＡ−ＡＣＮ）によって精製して、化合物Ｈ（９．８ｍｇ、０．００９１ｍｍｏｌ、２７％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８４９分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０４３．５．
【０３７３】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｉを、以下の全体反応スキーム６に従って合成した。
スキーム６：
【化８２−１】
0006621919.tif 000121
【化８２−２】
0006621919.tif 000122
【０３７４】
二硫化炭素（１９２ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（４．０ｍＬ）及び水（１．０ｍＬ）中ＫＯＨ（１４１ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応混合物を２０℃で１５分間撹拌した。その後、化合物３（２５０．０ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、マイクロ波照射下、１２０℃で１５分間撹拌し、その後、室温まで冷却した。反応混合物をＨＯＡｃでｐＨ＝５に調整し、その後、溶媒を除去した。固体を水（５．０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、化合物２（２２０ｍｇ、６３．５％）を黒色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０８（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１２−７．０９（ｍ，１Ｈ）．
【０３７５】
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中、化合物２（４５．０ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭｎＯ２（１２９ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１５分間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を次のステップで直接使用した。
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中、化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（４４．０ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及び化合物２（４５．２ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＡＰ（１８．３ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル４５〜７５％／１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３−ＡＣＮ）によって精製して、化合物Ｉ（７．８ｍｇ、２５．８％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７３５分、［Ｍ＋Ｈ］＋９９９．６．
【０３７６】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｊを、以下の全体反応スキーム７に従って合成した。
スキーム７：
【化８３−１】
0006621919.tif 000123
【化８３−２】
0006621919.tif 000124
【０３７７】
二硫化炭素（１９１ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（４．０ｍＬ）及び水（１．０ｍＬ）中ＫＯＨ（１４１ｍｇ、２．５２ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応混合物を２０℃で１５分間撹拌した。その後、化合物３（２５０ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、マイクロ波照射下、１３０℃で１５分間加熱し、室温まで冷却した。反応混合物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、ＨＯＡｃでｐＨ＝５に調整し、０℃まで冷却した。固体を濾過し、減圧下で乾燥させて、化合物２（２３０ｍｇ、６６．４％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．８７−１２．８４（ｍ，２Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）．
【０３７８】
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中、化合物２（４５．０ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭｎＯ２（１２９ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２５℃で１５分間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を次のステップに直接使用した。
【０３７９】
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中、化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（４４．０ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及び化合物２（４５．１６ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＡＰ（１８．２５ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で１５時間混合した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３５〜６５％／０．２２５％のＦＡ−ＡＣＮ）によって精製して、化合物Ｊ（８．８ｍｇ、２９．５％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７１７分、［Ｍ＋Ｈ］＋９９９．５．
【０３８０】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｋを、以下の全体反応スキーム８に従って合成した。
スキーム８：
【化８４−１】
0006621919.tif 000125
【化８４−２】
0006621919.tif 000126
【０３８１】
化合物３（２５０．０ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）に、二硫化炭素（１７４ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で７２時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ（１０．０ｍＬ）で希釈し、ＨＯＡｃでｐＨ＝５．０に調整し、減圧下で濾過して、化合物２（２００ｍｇ、６２．８％）を黄色固体として得、これを次のステップで直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．１８−１３．０７（ｍ，２Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２９（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）．
【０３８２】
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中、化合物２（６０．０ｍｇ、０．３１０ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭｎＯ２（１３４ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１５分間撹拌し、その後、濾過した。濾液を次のステップで直接使用した。
【０３８３】
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中、化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（５８．０ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及び化合物２（５８．３ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＡＰ（１８．２５ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル５０〜８０％／０．２２５％ＦＡ−ＡＣＮ）によって精製して、化合物Ｋ（７．７ｍｇ、０．００７２ｍｍｏｌ、２３．９％の収率）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８６３分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０４３．７．
【０３８４】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｌを、以下の全体反応スキーム９に従って合成した。
スキーム９：
【化８５−１】
0006621919.tif 000127
【化８５−２】
0006621919.tif 000128
【０３８５】
二硫化炭素（２０７．４ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（２．０ｍＬ）及び水（０．５０ｍＬ）中ＫＯＨ（１５３ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応混合物を１２０℃で１５分間撹拌した。その後、化合物３（２５０ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、マイクロ波照射下、１３０℃で１５分間撹拌し、その後、室温まで冷却した。反応混合物をＨ２Ｏ（１０．０ｍＬ）で希釈し、ＨＯＡｃでｐＨ＝５に調整し、０℃まで冷却した。固体を濾過によって回収し、減圧下で乾燥させて、化合物２（２２０ｍｇ、６３．７％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．５０（ｓ，１Ｈ），１３．０１（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｓ，１Ｈ）．
【０３８６】
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中、化合物２（４５．０ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭｎＯ２（１２８．５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２５℃で１５分間撹拌し、濾過した。濾液は、更に精製することなく、次のステップで直接使用した。
【０３８７】
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中、化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（４４．０ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及び化合物２（４５．５ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＡＰ（１８．２６ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で１５時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３０〜６０％／水中０．１％のＮＨ４ＯＨ）によって精製して、化合物Ｌ（９．２ｍｇ、３０．１％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８７３分、［Ｍ＋Ｈ］＋１００１．０．
【０３８８】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｍを、以下の全体反応スキーム１０に従って合成した。
スキーム１０：
【化８６−１】
0006621919.tif 000129
【化８６−２】
0006621919.tif 000130
【０３８９】
ピラジン−２，３−ジアミン（３）（２５０．０ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）及び二硫化炭素（２４２．０ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）に。反応混合物を２５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、濾過して、化合物２（２００ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、５７．９％の収率）を黄色固体として得、これを次のステップで直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３．４５（ｓ，２Ｈ），８．０８（ｓ，２Ｈ）．
【０３９０】
ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中、化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（１０１．９ｍｇ、０．３４０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１２．３５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）の混合物に、化合物２（５１．３ｍｇ、０．３４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で８時間撹拌した後、それを分取ＨＰＬＣ（条件：水（０．２２５％ＦＡ）−ＣＡＮ）によって精製して、化合物Ｍ（６．０ｍｇ、０．００５９ｍｍｏｌ、１７．６％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７８８分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０００．５．
【０３９１】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｎを、以下の全体反応スキーム１１に従って合成した。
スキーム１１：
【化８７−１】
0006621919.tif 000131
【化８７−２】
0006621919.tif 000132
【０３９２】
化合物２（１６．８７ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（２９．３ｍｇ、０．３４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃で３０分間撹拌した後、それを濾過し、濾液に化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１２．３５ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）、及び化合物２（１６．８７ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で８時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ１５０＊２５  ５ｕ、条件：水（０．２２５％のＦＡ）−ＣＡＮ）によって精製して、化合物Ｎ（７．１ｍｇ、２１．６％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．６８３分、［Ｍ＋Ｎａ］＋９７１．０．
【０３９３】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｏを、以下の全体反応スキーム１２に従って合成した。
スキーム１２：
【化８８】
0006621919.tif 000133
【０３９４】
化合物１（８０．０ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４．０ｍＬ）に、化合物２（６０．６４ｍｇ、０．８００ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（１１９．６７ｍｇ、０．８００ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（２９．２ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３８℃で１２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（ＨＣｌ）によって精製して、化合物Ｏ（３１ｍｇ、４１．７％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７０６分、［Ｍ＋Ｈ］＋９２４．５．
【０３９５】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｐを、以下の全体反応スキーム１３に従って合成した。
スキーム１３：
【化８９】
0006621919.tif 000134
【０３９６】
ＥｔＯＨ（４．０ｍＬ）及び水（１．０ｍＬ）中、化合物３（２００．０ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ）及びＫＯＨ（１１０．６ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）に、ＣＳ２（１５０．１ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、マイクロ波照射下、１３０℃で１．０時間撹拌した。混合物を氷水に注ぎ入れ、ＨＯＡｃでｐＨ＝５に調整し、ＤＣＭ（１０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を濃縮して、化合物２（１５０ｍｇ、０．７７２ｍｍｏｌ、５８．８％の収率）を黒色油として得た。
【０３９７】
ＤＭＦ（１０．０ｍＬ）中、化合物２（１００．０ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）及びＭｎＯ２（２５９．５ｍｇ、２．９９ｍｍｏｌ）の混合物を、２６℃で２０分間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を、化合物１（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、及び化合物２（５０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．２４ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）に２６℃で添加した。混合物は２６℃で１２時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル５５〜８５％／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｐ（５．６ｍｇ、２４．１％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８１０分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０４３．６．
【０３９８】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｑを、以下の全体反応スキーム１４に従って合成した。
スキーム１４：
【化９０】
0006621919.tif 000135
【０３９９】
化合物３（３００．０ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１２．０ｍＬ）に、二硫化炭素（３６５ｍｇ、４．８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で２４時間撹拌した後、それを濃縮し、水（１５ｍＬ×２）で洗浄し、固体を回収して、化合物２（１２０ｍｇ、２９．９％の収率）を灰色固体として得、これを次のステップで直接使用した。
【０４００】
化合物３（３００．０ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１２．０ｍＬ）に、二硫化炭素（３６５ｍｇ、４．８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で２４時間撹拌した後、それを濃縮し、水（１５ｍＬ×２）で洗浄し、固体を回収して、化合物２（１２０ｍｇ、２９．９％の収率）を灰色固体として得、これを次のステップで直接使用した。
【０４０１】
化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２（２４．９ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及び化合物２ａ（４９．６４ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）の溶液を２０℃で２．０時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル２０〜５０／水（０．２２５ＦＡ）−ＡＣＮ）によって精製して、化合物Ｑ（２．６ｍｇ、８．６％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７２２分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０１５．５．
【０４０２】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｒを、以下の全体反応スキーム１５に従って合成した。
スキーム１５：
【化９１】
0006621919.tif 000136
【０４０３】
４−メトキシベンジルアミン（３）（６．００ｇ、４３．７４ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１２０ｍＬ）中に溶解した。氷冷却下、トリエチルアミン（７．３２ｍＬ、５２．８１ｍｍｏｌ）及び二硫化炭素（２．９ｍＬ、４７．９１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１時間撹拌した。反応混合物に、ヨードメタン（３．３３ｍＬ、５３．４７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２６℃まで温め、１６時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で希釈し、クエン酸水溶液（６０ｍＬ×２）、飽和Ｎａ２ＣＯ３（６０ｍＬ）、及びブライン（６０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、化合物４（９．００ｇ、９０．５％）を無色油として得た。
【０４０４】
化合物４（１０．００ｇ、４３．９９ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）／水（２０ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（５．０５ｇ、７７．６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を８０℃で１６時間撹拌した。溶液を、真空中で濃縮して、ＥｔＯＨのほとんどを除去した。残りの溶液をＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、１．０ＭのＨＣｌ溶液でｐＨ＝３に調整し、ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜１０％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物５（７．００ｇ、７１．６％）を白色固体として得た。
【０４０５】
化合物５（４４４．０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、アニソール（０．７０ｍＬ、６．４４ｍｍｏｌ）、及びＴＦＡ（３．３ｍＬ、４４．４３ｍｍｏｌ）の溶液を、マイクロ波照射下、１００℃で２時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、結果として生じる沈殿物をＥｔＯＡｃ（４．０ｍＬ）中に再溶解した。溶媒を減圧下で除去して、黄色固体を得、これをＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）及び水（５ｍＬ）中に溶解した。混合物に、ＮａＯＨ（１．１２ｇ、２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌した後、水層を分離させた。濃縮ＨＣｌで、ｐＨを１〜２に調整した。溶液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×２）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮して、１Ｈ−テトラゾール−５−チオール（１８０ｍｇ、８８．２％）を白色固体として得た。
【０４０６】
化合物２（５０．２ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（２１６ｍｇ、２．４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４℃で２０分間撹拌した。その後、混合物を濾過し、濾液を化合物１（５０．０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、化合物２（２６ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１８．３ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（３．０ｍＬ）に添加した。反応溶液を４０℃で１６時間撹拌した。溶液を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル５０〜８０／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｒ（１４．１ｍｇ、２７．７％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．９１６分、［Ｍ＋Ｈ］＋９５０．７．
【０４０７】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｓを、以下の全体反応スキーム１６に従って合成した。
スキーム１６：
【化９２】
0006621919.tif 000137
【０４０８】
化合物３（１００．０ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（３．０ｍＬ）に、二硫化炭素（２．０８９ｇ、２７．４５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で４８時間撹拌した。混合物を濃縮して、粗生成物化合物４（１００ｍｇ、８１．２％）を赤色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．７４（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）．
【０４０９】
ＴＨＦ／ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏの５：３：１混合物（４．５ｍＬ）中、化合物４（８０．０ｍｇ、０．３６０ｍｍｏｌ）の溶液を氷水浴内で０℃まで冷却し、ＬｉＯＨ  Ｈ２Ｏ（７５ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１０℃まで温め、それを１時間撹拌した。それを０℃まで冷却し、Ｈ２Ｏ（３．０ｍＬ）で希釈し、ｐＨをＨＯＡｃで６に調整した。溶媒を濃縮して、化合物２（６８ｍｇ、０．３４７ｍｍｏｌ、９７．２％の収率）を黄色固体として得、これを、更に精製することなく、次のステップで使用した。
【０４１０】
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中、化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ，（５８．３ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、化合物２（２９．３ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（７．３ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の混合物を、３８℃で１２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３５〜６０％／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｓ（９．０ｍｇ、２８．９％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７４６分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０４４．４．ＨＰＬＣ（１０−８０ＡＢ／１５分）：保持時間＝８．５５分。
【０４１１】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｔを、以下の全体反応スキーム１７に従って合成した。
スキーム１７：
【化９３−１】
0006621919.tif 000138
【化９３−２】
0006621919.tif 000139
【０４１２】
塩化チオニル（１００．０ｍＬ、３１．７４ｍｍｏｌ）中４−クロロニコチン酸３（５．００ｇ、３１．７４ｍｍｏｌ）の混合物を、８０℃で１．５時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、残渣をトルエンで希釈し、再度濃縮して、化合物４（５．５０ｇ、９８．５％の収率）を黄色固体として得、次のステップに直接使用した。
【０４１３】
化合物４（５．５０ｍｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ溶液（１５０ｍＬ）に、トリエチルアミン（９．４９ｇ、９３．７５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（１５．６３ｍＬ、３１．２５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（１５．６ｍＬ）を０℃で滴加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜１２％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物５（４．１０ｇ、７１．１％）を褐色油として得た。
【０４１４】
無水ＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中、硫化ナトリウム九水和物（４．９４ｇ、２０．５８ｍｍｏｌ）及び硫黄（６５９ｍｇ、２０．５８ｍｍｏｌ）を８０℃で１５分間撹拌した。混合物が高温の間にそれを濾過し、濾液を化合物５（３．８０ｇ、２０．５８ｍｍｏｌ）に添加した。混合物を、Ｎ２下、８０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、ＭｎＯ２（８．７０ｇ）を添加し、混合物を室温で更に２時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜１５％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物２ａ（１５００ｍｇ、２７．７％）を薄褐色油として得た。ＬＣＭＳ（０−６０ＡＢ／２分）：ＲＴ＝０．９２３分、［Ｍ＋Ｈ］＋３６２．９．
【０４１５】
化合物２ａ（２００．０ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）／水（５．０ｍＬ）溶液に、３−［ビス（２−カルボキシエチル）ホスファニル］プロパン酸（６）（４１４ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を２６℃で１時間撹拌した。溶液をＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ７に調整し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１、３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、化合物２（５０ｍｇ、２４．９％）を粗褐色油として得た。
【０４１６】
化合物１（５０．０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）、化合物２（４５．３８ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）、化合物２ａ（１４４ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１８．２５ｍｇ、０．１５００ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（４．０ｍＬ）を４０℃で１６時間撹拌した。溶液を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル４５〜７５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｔ（３４．１ｍｇ、６５．８％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８７８分、［Ｍ＋Ｈ］＋１０３０．９．
【０４１７】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｕを、以下の全体反応スキーム１８に従って合成した。
スキーム１８：
【化９４】
0006621919.tif 000140
【０４１８】
化合物２（２８．９ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（１０．８ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５℃で３０分間撹拌した後、それを濾過し、濾液に化合物１（２５．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（９．１ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）、及び化合物２（２８．９ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で３時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｃ１８  １５０＊３０  ５ｕ、条件：水（０．２２５％ＦＡ）−ＣＡＮによって精製して、化合物Ｕ（１１．１ｍｇ、４３．５％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８３１分、［Ｍ＋Ｈ］＋９６４．６．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０５（ｍ，１Ｈ），７．８８−７．６０（ｍ，１Ｈ），７．２９−７．２２（ｍ，４Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），５．４０−５．３２（ｍ，１Ｈ），４．４７−４．３９（ｍ，１Ｈ），４．２３−４．０５（ｍ，５Ｈ），３．９８−３．９３（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．５１（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，５Ｈ），３．１６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．１０（ｓ，２Ｈ），３．０３−２．９５（ｍ，２Ｈ），２．８５−２．７９（ｍ，３Ｈ），２．６５（ｓ，１Ｈ），２．３８（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），２．３１−２．２５（ｍ，１Ｈ），１．２１−１．９９（ｍ，３Ｈ），１．７８−１．６９（ｍ，３Ｈ），１．５１−１．４４（ｍ，２Ｈ），１．３３−１．２７（ｍ，７Ｈ），１．０３−０．９５（ｍ，７Ｈ），０．８６−０．７１（ｍ，１９Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、９６３．５３であった。
【０４１９】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｖを、以下の全体反応スキーム１９に従って合成した。
スキーム１９：
【化９５】
0006621919.tif 000141
【０４２０】
化合物２（３６．０ｍｇ、０．２２０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（３．０ｍＬ）に、二酸化マンガン（８６．５７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４℃で０．５時間撹拌した。その後、混合物を濾過し、濾液を化合物１（２０．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、化合物２（１３．０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（７．３ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）に添加した。反応溶液を４０℃で１６時間撹拌した。溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｃ１８  １００＊１９ｍｍ＊５ｕｍ、アセトニトリル４５〜７５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｖ（１．０ｍｇ、０．００１０ｍｍｏｌ、４．８％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．９１０分、［Ｍ＋Ｎａ］＋１０３４．８．
【０４２１】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｗを、以下の全体反応スキーム２０に従って合成した。
スキーム２０：
【化９６】
0006621919.tif 000142
【０４２２】
化合物２（３４ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（４．０ｍＬ）に、二酸化マンガン（１３０ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４℃で０．５時間撹拌した後、それを濾過し、濾液を化合物１（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２（１７ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１０．９５ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応溶液を４０℃で１６時間撹拌した。溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｃ１８  １００＊１９ｍｍ＊５ｕｍ、アセトニトリル４５〜７５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｗ（８．０ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ、２６．４％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．７７０分、［Ｍ＋Ｈ］＋９６３．６．
【０４２３】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｘを、以下の全体反応スキーム２１に従って合成した。
スキーム２１：
【化９７】
0006621919.tif 000143
【０４２４】
化合物１（３００．０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）のＮＭＰ溶液（１０．０ｍＬ）に、ＤＩＥＡ（６７５ｍｇ、５．２３ｍｍｏｌ）、その後、化合物２（４０９ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を２０℃で１６時間撹拌した後、それをＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、ブライン（３０ｍＬ×５）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．６）によって精製して、化合物３（５００ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ、９８．２％の収率）を白色固体として得た。
【０４２５】
化合物１（３００．０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）のＮＭＰ溶液（１０．０ｍＬ）に、ＤＩＥＡ（６７５ｍｇ、５．２３ｍｍｏｌ）に続いて化合物２（４０９ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を２０℃で１６時間撹拌した後、それをＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、ブライン（３０ｍＬ×５）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．６）によって精製して、化合物３（５００ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ、９８．２％の収率）を白色固体として得た。
【０４２６】
ＭｅＯＨ（６．０ｍＬ）／水（３．０ｍＬ）中、化合物４（５００ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）の混合物に、ＮａＯＨ（１９６ｍｇ、４．９０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で２時間撹拌した。溶液を真空中で濃縮して、ＭｅＯＨのほとんどを除去し、水スラリーをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２０ｍＬ×３）で洗浄した。水層をＨＣｌ溶液でｐＨ＝２に調整し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１、３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮して、化合物５（３００ｍｇ、０．８３０ｍｍｏｌ、５０．９％の収率）を褐色固体として得た。ＬＣＭＳ（０−６０ＡＢ／７分）：ＲＴ＝２．６６分、［Ｍ＋Ｈ］＋２７８．９．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８６（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２２（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ）．
【０４２７】
化合物５（３００ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）のＴＦＡ（６．０ｍＬ）／アニソール（１．０ｍＬ）溶液を、４０℃で２４時間撹拌した。溶液を真空中で濃縮して、溶媒を除去し、残渣をＤＣＭ（２０ｍＬ）で洗浄して、化合物６（１００ｍｇ、０．６３２ｍｍｏｌ、５８．７％の収率）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．７７（ｓ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ）．
【０４２８】
化合物６（４８ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、二酸化マンガン（１３０ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４℃で１時間撹拌した後、それを濾過し、濾液を化合物７（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物６（２４ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１８．３ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応溶液を４０℃で２日間撹拌した。溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｃ１８  １５０＊３０ｍｍ＊５ｕｍ、アセトニトリル４２−８８／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物Ｘ（３．８０ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ、１２．７％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８８８分、［Ｍ＋Ｎａ］＋１０２８．８．
【０４２９】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｙを、以下の全体反応スキーム２２に従って合成した。
スキーム２２：
【化９８】
0006621919.tif 000144
【０４３０】
ＮａＯＨ溶液（２．０Ｍ、４．０ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）中、化合物１（３００．０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の水溶液（４．０ｍＬ）を、２０℃で４時間撹拌した。溶液を濃縮ＨＣｌ溶液でｐＨ＝２．０に調整した。形成された沈殿物を濾過によって回収し、真空中で乾燥させて、化合物２（２００ｍｇ、１．２６４ｍｍｏｌ、７２．６％の収率）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．７６（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ）．ＬＣＭＳは、ほとんどの生成物が二量体であることを示した。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８０７分、［Ｍ＋Ｈ］＋１５８．７、二量体：［Ｍ＋１］＋３１４．９．
【０４３１】
化合物２（４７．０ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（４．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（１２９．８５ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４℃で０．５時間撹拌した後、それを濾過し、濾液を化合物３（３０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、化合物２（２３ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１０．９５ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応溶液を４０℃で２日間撹拌し、それを分取ＨＰＬＣによって精製して、化合物Ｙ（４．８ｍｇ、０．００４７ｍｍｏｌ、１５．８％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８８６分、［Ｍ＋Ｎａ］＋１０２８．８．
【０４３２】
活性化ＭＭＡＥ化合物Ｚを、以下の全体反応スキーム２３に従って合成した。
スキーム２３：
【化９９−１】
0006621919.tif 000145
【化９９−２】
0006621919.tif 000146
【０４３３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中、化合物１（５００．０ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７８７．０６ｍｇ、６．０９ｍｍｏｌ）の混合物に、炭酸ＰＮＰ（１２３５．１ｍｇ、４．０６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、Ｎ２下、２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物をシリカ上のクロマトグラフィー（溶媒勾配：石油エーテル中０〜５０％のＥｔＯＡＣ）によって精製して、化合物２（３００ｍｇ、０．５８３４ｍｍｏｌ、２８．７％の収率）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８４５分、［Ｍ＋Ｈ］＋４１１．９．
【０４３４】
ＭＭＡＥ（１００．０ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、化合物２（６８．７６ｍｇ、０．１７０ｍｍｏｌ）、１−ＨＯＢｔ（３．７６ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）、及びピリジン（１１０．１７ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を１５℃で２日間撹拌した。溶液を真空中で濃縮し、残渣を分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物３（１００ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ、７０．３％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．９９６分、［Ｍ＋Ｈ］＋９９０．６．
【０４３５】
化合物４（４７ｍｇ、０．４１０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（１７５．５９ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４℃で１時間撹拌した。その後、混合物濾過し、濾液を化合物３（４０．０ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）、化合物４Ａ（２２ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１４．８ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。反応溶液を４０℃で１６時間撹拌した。溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ１５０＊２０ｍｍ＊５ｕｍ、アセトニトリル３５〜６５／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製した。それを分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって更に精製して、ＧＮＴ＿Ｂ３４３＿８３７−１（２８．２ｍｇ、０．０２８２ｍｍｏｌ、６９．９％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．８６６分、［Ｍ＋Ｈ］＋９４９．５．
【０４３６】
活性化ＭＭＡＥ化合物ＡＡを、以下の全体反応スキーム２４に従って合成した。
スキーム２４：
【化１００】
0006621919.tif 000147
【０４３７】
化合物１（５０．０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及び炭酸ＰＮＰ（９２．６３ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（８．０ｍＬ）に、ＤＩＥＡ（７８．７１ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５℃で３時間攪拌した。混合物を真空中で濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ）によって精製して、化合物２（８０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、９５．８％の収率）を白色固体として得た。
【０４３８】
ＤＭＦ（３．０ｍＬ）中、ＭＭＡＥ（３０．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）及び化合物２（６０．０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の混合物に、ピリジン（３３．０５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．５６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で８時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物３（３５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ、８３．７％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．９９４分、［Ｍ＋Ｈ］＋９９０．５．
【０４３９】
ＤＭＦ（１０．０ｍＬ）中、溶液化合物４（２００．０ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）に、ＭｎＯ２（７５４．９ｍｇ、８．６８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５℃で２時間撹拌した。混合物を濾過し、濃縮して、化合物４Ａ（１５０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、７５．７％の収率）を赤色固体として得た。
【０４４０】
化合物３（４０．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４．０ｍＬ）に、化合物４（４６．５２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、化合物４Ａ（９２．２２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（１４．８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３８℃で１２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル３０〜６０％／水中０．１％のＮＨ４ＨＣＯ３）によって精製して、化合物ＡＡ（２０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、５０．１％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．８７５分、［Ｍ＋Ｈ］＋９４９．５．ＨＰＬＣ（１０−８０ＡＢ／１５分）：保持時間＝４．７９分。
【０４４１】
活性化ＭＭＡＥ化合物ＢＢを、以下の全体反応スキーム２５に従って合成した。
スキーム２５：
【化１０１】
0006621919.tif 000148
【０４４２】
シクロペンタンカルボン酸（８．０ｇ、７０．０９ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（１００ｍＬ）溶液に、Ｂｒ２（１１．２７ｇ、７０．０９ｍｍｏｌ）及びクロロスルホン酸（８．１７ｇ、７０．０９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８５℃で２時間撹拌し、濃縮した。残渣をメタノール（７０ｍＬ）中に溶解し、混合物を７７℃で１２時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル中３％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４）は、ほとんどのＳＴＭの消費及び新たなスポットを示した。混合物を濃縮し、ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で希釈し、水（８０ｍＬ＊３）及びブライン（８０ｍＬ）で洗浄した。有機層を濃縮して、生成物メチル１−ブロモシクロペンタンカルボキシレート（１２．４ｇ、５９．８８３ｍｍｏｌ、８５．４％の収率）を黄色油として得た。
【０４４３】
アセトン（８０．０ｍＬ）中エタンチオ酢酸カリウム（７．２８ｇ、６３．７５ｍｍｏｌ）の混合物に、化合物２（１１．０ｇ、５３．１２ｍｍｏｌ）の水溶液（５０．０ｍＬ）を添加した。反応混合物を８０℃で３時間撹拌した。混合物を濃縮し、ＭＴＢＥ（１５０ｍＬ）で希釈し、水（１５０ｍＬ×３）で洗浄した。合わせた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０〜５％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物３（４．６０ｇ、２２．７４ｍｍｏｌ、４２．８％の収率）を黄色油として得た。
【０４４４】
０℃のＴＨＦ（７０ｍＬ）中ＬＡＨ（４．３２ｇ、１１３．０ｍｍｏｌ）の混合物に、化合物３（４．６０ｇ、２２．７４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）を添加した。添加後、混合物を加熱して、Ｎ２下、８０℃で３時間還流させた。混合物を０℃のＨＣｌ水溶液（２．０Ｍ、２０．０ｍＬ）で反応停止させた。濾過後、濾液を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）中に溶解した。有機層を水（１５０ｍＬ×３）で洗浄し、濃縮して、粗化合物４（２．５ｇ、１８．９１ｍｍｏｌ、８３．１％の収率）を黄色油として得、これを、更に精製することなく、次の反応で直接使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．５１（ｓ，２Ｈ），２．２５（ｓ，１Ｈ），１．９１−１．６７（ｍ，８Ｈ）．
【０４４５】
ヨウ素（２．８７９ｇ、１１．３４ｍｍｏｌ）を、化合物４（５００ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び化合物５（４．３５５ｇ、３７．８２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（３０．０ｍＬ）に緩徐に添加した。混合物を１０℃で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、ＤＣＭ（８０ｍＬ）中に溶解し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（８０ｍＬ×３）で洗浄した。有機層を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＰＥ中２０％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、化合物６（３５０ｍｇ、１．３５５ｍｍｏｌ、３５．８％の収率）を無色油として得た。ＬＣＭＳ（０−６０ＡＢ＿２分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝１．０４３分、［Ｍ＋Ｈ］＋２４５．８．
【０４４６】
ＤＭＦ（１５．０ｍＬ）中、炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（３７２ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．３２０ｍＬ、１．８３ｍｍｏｌ）の混合物に、化合物６（１５０．０ｍｇ、０．６１０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、Ｎ２下、２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ中５０％〜１００％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物７（２００ｍｇ、０．４６８ｍｍｏｌ、７６．５％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７２３分、［Ｍ＋Ｈ］＋４１１．０．
【０４４７】
ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中ＨＯＢｔ（１．６５ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）及びＭＭＡＥ（７８．６ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ）の混合物に、ピリジン（０．１０ｍＬ、１．２２ｍｍｏｌ）及び化合物７（５０．０ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０℃で１８時間撹拌した後、それを真空中で濃縮し、分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル５０〜７５／水中０．２２５％のＦＡ）精製して、化合物ＢＢ（５０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、４１．１％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７９５分、［Ｍ＋Ｈ］＋９８９．４．ＨＰＬＣ（１０−８０ＡＢ／８分）：保持時間＝５．１１分。
【０４４８】
活性化ＭＭＡＥ化合物ＣＣを、以下の全体反応スキーム２６に従って合成した。
スキーム２６：
【化１０２−１】
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【化１０２−２】
0006621919.tif 000150
【０４４９】
ＬＡＨ（１．０２ｍＬ、４２．０５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）に、化合物４（２．００ｇ、１０．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液２０ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。溶液を０℃のＥｔＯＡｃ（６．０ｍＬ）及びＨＣｌ水溶液（２．０Ｍ、８ｍＬ）で反応停止させ、その後、粗混合物を直接使用した。
【０４５０】
化合物５（１．１０ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液に、化合物６（２．２８ｇ、１０．３６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物２０℃で１６時間撹拌した。ＭｎＯ２（１０．０ｇ）を混合物に添加し、室温で２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を真空中で濃縮し、シリカ上のクロマトグラフィー（ＰＥ中０〜５０％のＥｔＯＡＣ）によって精製して、化合物７（３２０ｍｇ、１．４８６ｍｍｏｌ、１４．３％の収率）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／７分）：保持時間＝１．５４６分、［Ｍ＋Ｈ］＋２１５．７．
【０４５１】
化合物７（１００．０ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０．０ｍＬ）に、炭酸ＰＮＰ（２８２ｍｇ、０．９３０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１８０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８℃で１６時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０〜５０％のＥｔＯＡＣ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物８（８５ｍｇ、０．２１７ｍｍｏｌ、４６．７％の収率）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５＿１．５分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝０．７８０分、［Ｍ＋Ｈ］＋３８０．９．
【０４５２】
化合物７（１００．０ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１０．０ｍＬ）に、炭酸ＰＮＰ（２８２ｍｇ、０．９３０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１８０ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８℃で１６時間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０〜５０％のＥｔＯＡＣ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物８（８５ｍｇ、０．２１７ｍｍｏｌ、４６．７％の収率）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５＿１．５分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝０．７８０分、［Ｍ＋Ｈ］＋３８０．９．
【０４５３】
ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中、化合物９（２４．７９ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の混合物に、ＭＭＡＥ（１５．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、ピリジン（１６．５３ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ）、及びＨＯＢｔ（１．４１ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、Ｎ２下、３５℃で１２時間撹拌した。混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｃ１８  ２５０＊２１．２ｍｍ＊４ｕｍ、条件：水（０．０５％のＨＣｌ）−ＡＣＮ）によって精製して、化合物ＣＣ（１０．３ｍｇ、０．０１０１ｍｍｏｌ、４８．６％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５＿１．５分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝０．７０８分、［Ｍ＋Ｈ］＋９７４．０．
【０４５４】
活性化ＭＭＡＥ化合物ＤＤを、以下の全体反応スキーム２７に従って合成した。
スキーム２７：
【化１０３】
0006621919.tif 000151
【０４５５】
２，４−ジクロロ−５−ニトロピリミジン（３）（７．８０ｇ、４０．２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１０．３９ｇ、８０．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２００ｍＬ）に、４−メトキシベンジルアミン（４．９６ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した後、それを濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ中０〜３３．３％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．６）で精製して、化合物４（６．８０ｇ、２３．１ｍｍｏｌ、５７．４％の収率）を黄色油として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ＿１．５分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝０．７８８分、［Ｍ＋Ｈ］＋２９４．９．
【０４５６】
トリエチルアミン（４．５８ｍＬ、３２．６ｍｍｏｌ）、キサントホス（２５１．３３ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（４．４ｍＬ、１０８ｍｍｏｌ）、及び化合物４（３．２０ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（３０ｍＬ）に、酢酸パラジウム（ＩＩ）（９７．５ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、ＣＯ（１５ｐｓｉ）下、７０℃で１６時間撹拌した。混合物を濾過し、濾液を濃縮し、シリカ上のカラムクロマトグラフィー（ＰＥ中２０％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、化合物５（１．７１ｇ、５．８９ｍｍｏｌ、５４．３％の収率）を褐色固体として得た。
【０４５７】
アセトニトリル（６０ｍＬ）及び水（１５ｍＬ）中、硝酸セリウムアンモニウム（９．０９ｇ、１６．５９ｍｍｏｌ）の混合物に、化合物５（１．７０ｇ、５．８６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。水性ＮａＨＣＯ３（８０ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（７０ｍＬ×３）で抽出し、ブラインで洗浄した。有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＰＥ中４０％のＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、化合物６（６１０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、４４．５％の収率）を褐色固体として得た。
【０４５８】
ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中、化合物６（５６０ｍｇ、３．２９ｍｍｏｌ）の混合物に、１０％の炭素上Ｐｄ（５６．４ｍｇ）を添加した。混合物を、Ｈ２（１５ｐｓｉ）下、２０℃で１時間撹拌した後、それを濾過し、濾液を濃縮して、化合物７（３１０ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ、６７．２％の収率）を褐色固体として得た。
【０４５９】
ＥｔＯＨ（８．０ｍＬ）及び水（２．０ｍＬ）中ＫＯＨ（１９２ｍｇ、３．４３ｍｍｏｌ）の混合物に、化合物７（１６０．０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）及び二硫化炭素（２６１ｍｇ、３．４３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、マイクロ波下、１３０℃で１時間撹拌した。混合物を濃縮して、ＥｔＯＨを除去し、ＨＯＡｃでｐＨ＝５に調整した。混合物を濾過し、固体を水（２．０ｍＬ×２）で洗浄して、２を褐色固体（１４０ｍｇ、０．７６８ｍｍｏｌ、６７．３％の収率）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１３．３０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），１２．８１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ），３．３４（ｓ，３Ｈ）．
【０４６０】
化合物２（６０．０ｍｇ、０．３３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、ＭｎＯ２（１４３．２ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５℃で１時間撹拌した後、それを濾過し、濾液を濃縮して、化合物２Ａ（４５．０ｍｇ、０．１２４ｍｍｏｌ、３７．７％の収率）を褐色固体として得、これを、更に精製することなく、次のステップで使用した。ＬＣＭＳ（５−９５＿１．５分）：ＲＴ（２２０／２５４ｎｍ）＝０．６５３分、［Ｍ＋Ｈ］＋３６３．０．
【０４６１】
ＤＭＡＰ（１２．１６ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）に、化合物１（２０．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、２（１８．１４ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）、及び２Ａ（３６．０８ｍｇ、０．１０００ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で１２時間撹拌した後、それを濾過し、濾液を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル４５〜７５％／水中０．２２５％のＦＡ）によって精製して、化合物ＤＤ（５．７ｍｇ、０．００５５ｍｍｏｌ、２７．８％の収率）を灰白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：ＲＴ＝０．９０５分、［Ｍ＋１］＋１０３０．６．
【０４６２】
実施例２０：活性化束縛ジスルフィドを含むマイタンシノイド化合物の調製
活性化マイタンシノイド化合物Ａを、以下の全体反応スキーム１に従って合成した。
スキーム１：
【化１０４】
0006621919.tif 000152
【０４６３】
化合物１（４０．０ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（６．０ｍＬ）／ＭｅＯＨ（３．０ｍＬ）溶液に、化合物２（３１．８１ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２３℃で１８時間撹拌した。その後、追加の化合物２（３１．８１ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を２３℃で１８時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物Ａ（２３ｍｇ、０．０２２４ｍｍｏｌ、４３．７％の収率）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．９７８分、ＭＳ＝［Ｍ−１８＋Ｈ］＋９１６．３；１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．１７−９．１６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５０−８．４７（ｍ，１Ｈ），７．９６−７．９４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．１７（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），６．５４−６．４８（ｍ，３Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），５．５５−５．４８（ｍ，１Ｈ），５．２８−５．２６（ｍ，１Ｈ），４．５１−４．４７（ｍ，１Ｈ），４．０３（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．４６−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．２２−３．１６（ｍ，４Ｈ），２．７７−２．７５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），２．５３−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．４−１．６（ｍ，４Ｈ），１．５５（ｓ，３Ｈ），１．５０−１．０８（ｍ，１８Ｈ），０．７５（ｓ，３Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、９３３．３１であった。
【０４６４】
活性化マイタンシノイド化合物Ｂを、以下の全体反応スキーム２に従って合成した。
スキーム２：
【化１０５】
0006621919.tif 000153
【０４６５】
化合物１（１５．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２．０ｍＬ）に、化合物２（１８．２２ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１８℃で７２時間撹拌した後、それを分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中１０％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物Ｂ（３．０ｍｇ、１７％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．９８２分、［Ｍ−１８＋Ｈ］＋９０２．３．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．２１−９．２０（ｍ，１Ｈ），８．５４−８．５０（ｍ，１Ｈ），８．０−７．９３（ｍ，１Ｈ），７．１９−７．１７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．５６−６．５１（ｍ，３Ｈ），５．９３（ｓ，１Ｈ），５．５７−５．５２（ｍ，１Ｈ），５．３４−５．２９（ｍ，１Ｈ），４．５２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．０７−４．０４（ｍ，１Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．４９−３．４０（ｍ，２Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．１９−３．０８（ｍ，５Ｈ），２．８１−２．７１（ｍ，４Ｈ），２．５０−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．１９−１．７５（ｍ，４Ｈ），１．５９−１．５８（ｍ，３Ｈ）１．４６−１．４０（ｍ，２Ｈ），１．２４−１．１１（ｍ，１２Ｈ），０．７８−０．７７（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，３Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、９１９．２９であった。
【０４６６】
活性化マイタンシノイド化合物Ｃを、以下の全体反応スキーム３に従って合成した。
スキーム３：
【化１０６】
0006621919.tif 000154
【０４６７】
化合物２（６７．２５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５．０ｍＬ）に、化合物１（８０．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４０℃で１時間撹拌した後、それを濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中１５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．５）によって精製して、化合物Ｃ（８０．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．９２９分、［Ｍ−１８＋Ｈ］＋８７４．１．
【０４６８】
活性化マイタンシノイド化合物Ｄを、以下の全体反応スキーム４に従って合成した。
スキーム４：
【化１０７】
0006621919.tif 000155
【０４６９】
化合物１（２０．０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２．０ｍＬ）に、化合物２（２９．８４ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０℃で１時間撹拌した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｃ１８  １５０＊３０  ５ｕ、条件：水（０．２２５％のＦＡ）−ＣＡＮによって精製して、化合物Ｄ（１５．６ｍｇ、６６．６％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７６８分、［Ｍ−１８＋Ｈ］＋８４７．３．１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３３−８．３２（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｓ，２Ｈ），７．０１−６．９８（ｍ，１Ｈ），６．６１−６．７２（ｍ，２Ｈ），６．５０（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｍ，１Ｈ），６．１６（ｓ，１Ｈ），５．５８（ｍ，１Ｈ），５．３３（ｍ，１Ｈ），４．６５−４．７５（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．５１−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．４３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），３．１８（ｂｒ，１Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），２．８８−３．０６（ｍ，４Ｈ），２．６０−２．８３（ｍ，５Ｈ），２．４６−２．５５（ｍ，１Ｈ），２．０４−２．１４（ｍ，１Ｈ），１．３４−１．５２（ｍ，５Ｈ），１．１２−１．２５（ｍ，７Ｈ），０．７２（ｓ，３Ｈ）．ＮＭＲによって決定される分子量は、８４６．２７であった。
【０４７０】
活性化マイタンシノイド化合物Ｅを、以下の全体反応スキーム５に従って合成した。
スキーム５：
【化１０８】
0006621919.tif 000156
【０４７１】
１（１０．０ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２．０ｍＬ）に、化合物２（５．８６ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０℃で２４時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮し、分取ＴＬＣ（ＤＣＭ中５％のＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．４）によって精製して、化合物Ｅ（９．３ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ、７５．１％の収率）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（５−９５ＡＢ／１．５分）：保持時間＝０．７８８分、［Ｍ＋Ｈ］＋８７５．４．
【０４７２】
実施例２１：ジスルフィド連結ＰＢＤ  ＡＤＣのリンカー犠牲及び細胞殺滅活性
メチル置換、シクロプロピル置換、及びシクロブチル置換を有するβ−メルカプトエチル−カルバメートジスルフィドリンカーを含有するＰＢＤ二量体に関連する、インビトロでのリンカー犠牲及び放出パラメータを調査した。関連ＡＤＳの細胞殺滅活性もまた調査した。
【０４７３】
実験の第１相において、システイン及びグルタチオン（チオール濃度は血漿中及び癌細胞内のものを模倣する）とのインキュベーションによる、ジスルフィド切断及び犠牲を、以下のパラ−ニトロ−ピリジルジスルフィド含有リンカー薬物類似体１、２、及び１１を有する非コンジュゲート小分子モデル系を使用して調査した。具体的には、５％のメタノールを含有する１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）中、システイン（３０μＭもしくは２００μＭ）またはグルタチオン（ＧＳＨ、４ｍＭ）とともに、３７℃、１５μＭでインキュベートすることによって、切断及び犠牲をインビトロで評価した。アリコートを指定の時点で取得し、試料を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（１００×２．１、１．９μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、Ｓｃｉｅｘ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００でＬＣ／ＭＳによって分析した。緩衝液Ａ（１０ｍＭの酢酸アンモニウム中０．１％のギ酸）から緩衝液Ｂ（９０％のアセトニトリル中、１０ｍＭの酢酸アンモニウム中０．１％のギ酸）への勾配、０．４ｍＬ／分で、５％のＢ０〜０．５分、５〜２５％のＢ０．５〜８分、２５〜７５％のＢ８〜１３分、及び７５〜９５％のＢ１３〜１３．５分、９５％のＢ１３．５〜１４．５分、９５〜５％のＢ１４．５〜１５分によってカラムを溶出した。これらの条件下、パラ−ニトロピリジルチオールは５．３分で溶出した。全ての生成物（化合物１、２、１１、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、１２ａ、１２ｂ、６、７、１３、及び８）を分離し、陽性ＥＳＩイオン様式のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって特性評価した。全ての分析物は、主要な種としてプロトン化した分子ＭＨ＋を有し、源断片化をほとんど有さなかった。フルスキャン精密質量ピーク面積を使用して、各構成成分の相対存在量を推定し、１、２、及び１１の推定相対フルスキャンピーク面積の消失は、ＭＳまたはＵＶによって、０時間との比較での相対存在量に基づいて推定されたものと一貫した。結果を以下の表１５に報告し、分析結果を以下の表１６に提示し、「Ｃｍｐｄ」は化合物を指し、「ＲＴ」は分での保持時間を指し、「Ｃａｌｃ．Ｍａｓｓ」は質量計算値を指す。経時的なジスルフィド切断及び犠牲生成物の相対存在量を評価し、図１２Ａ１〜Ｄ３に開示し、生成物は、リンカー薬物１、２、及び１１のインキュベーションから、０．２ｍＭのシステイン（図Ａ１、Ａ２、及びＡ３）、０．０３ｍＭのシステイン（図Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）、４ｍＭのグルタチオン（図Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）、ならびに０．０３ｍＭのグルタチオン（図Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の存在下、ｐＨ７．０及び３７℃でＬＣ／ＭＳによって監視する。図１２Ａ１〜Ｄ３において、化合物参照番号１、２、３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、６、７、８、１１、１２ａ、１２ｂ、及び１３は、以下の構造に対応する。
【０４７４】
薬物類似体１、２、及び１１の構造を、以下に描写する。
【化１０９】
0006621919.tif 000157
式中、Ｒ’及びＲ（ＰＢＤ二量体）は、
【化１１０】
0006621919.tif 000158
である。
【０４７５】
化合物３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、１２ａ、及び１２ｂの構造を以下に描写し、式中、Ｒ”は、システインまたはＧＳＨを指す。化合物１とシステインとの間のジスルフィド交換によって、化合物３ａを調製した。化合物１とＧＳＨとの間のジスルフィド交換によって、化合物３ｂを調製した。化合物２とシステインとの間のジスルフィド交換によって、化合物４ａを調製した。化合物２とＧＳＨとの間のジスルフィド交換によって、化合物４ｂを調製した。化合物１１とシステインとの間のジスルフィド交換によって、化合物１２ａを調製した。化合物１１とＧＳＨとの間のジスルフィド交換によって、化合物１２ｂを調製した。
【化１１１】
0006621919.tif 000159
【０４７６】
化合物３ａ及び３ｂのジスルフィド還元／犠牲は、以下の化合物６及びＰＢＤ二量体８を生成すると考えられ、化合物４ａ及び４ｂのジスルフィド還元／犠牲は、以下の化合物７及びＰＢＤ二量体８を生成すると考えられ、化合物１２ａ及び１２ｂのジスルフィド還元／犠牲は、以下の化合物１３及びＰＢＤ二量体８を生成すると考えられる。
【化１１２】
0006621919.tif 000160
【表１５−１】
0006621919.tif 000161
【表１５−２】
0006621919.tif 000162
【表１６−１】
0006621919.tif 000163
【表１６−２】
0006621919.tif 000164
【０４７７】
データは、これらの分子内のパラ−ニトロピリジルジスルフィド部分が、数分間の半減期で急速なジスルフィド切断を受けたことを示す（図１２Ａ１〜Ｄ３、表１５）。ＬＣ／ＭＳ／ＵＶによる分析は、化合物１及び２の還元が異なる生成物をもたらしたことを示し、ＰＢＤ−二量体化合物８は、メチル含有化合物１から主要生成物として得られた一方で、チオール化合物７は、過剰レベルの還元チオールが存在したときに（０．２ｍＭのシステインまたは４ｍＭのＧＳＨ）、シクロプロピル含有化合物２（表１５及び１６ならびに図１２Ａ１、１２Ａ２、１２Ｃ１、及び１２Ｃ２）から形成された。対照的に、比較的低濃度のシステイン（０．０３ｍＭ）を使用した場合（図１２Ｂ１及び１２Ｂ２）、チオール−システイン付加化合物３ａ及び４ａが、還元チオールの消費のため、２４時間のインキュベーションでの主要かつ安定した生成物であった。同様に、化合物１及び２を低濃度のＧＳＨ（０．０３ｍＭ）に同じ時間曝露したとき（図１２Ｄ１及び１２Ｄ２）、チオール−ＧＳＨ付加化合物３ｂ及び４ｂが主要生成物として観察された。これらの切断反応はまた、以下に提案される機構に描写されるパラ−ニトロピリジルチオール化合物５も形成した。０．０３ｍＭのＧＳＨ濃度で同等のｐＫａ値（４．７〜４．８）を有する、パラ−ニトロピリジルチオール化合物５とシクロプロピル含有チオール化合物７との間には、可逆的ジスルフィド交換が観察された（図１２Ｄ２）。（低レベルではあるが）中間体化合物３ａ及び６の観察は、（いかなる特定の機構にも拘束されるものではないが）化合物１からＰＢＤ−二量体化合物８を形成するための、提案される機構と一貫しており、この機構は、（１）化合物３ａを形成するための、２−メルカプトエチル由来のジスルフィド硫黄原子に対するシステイン攻撃、（２）チオレート中間体をもたらすための、結果として生じるチオール−システインジスルフィドのより束縛が弱い硫黄原子に対する第２のシステイン攻撃、及び（３）ＰＢＤ−二量体化合物８を遊離するためのチオレート犠牲、または対応するチオール化合物６を形成するためのプロトンの捕捉（以下に提案される機構を参照されたい）を伴う。化合物１に対する初回システイン攻撃の描写される位置化学は、ジスルフィド電子及び酸性ニトロピリジルチオレートｐＫａ（すなわち、この断片は良好な脱離基である）の両方によって影響されると考えられる（Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｓｕｐｐｌ．Ｓ  Ｃｈｅｍ．ｓｕｌｆｕｒ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔ．ｇｒｏｕｐｓ１９９３，６３３を参照されたい。Ｆｒｅｔｅｒ，Ｒｏｌｆ；Ｐｏｈｌ，Ｅｒｉｃ  Ｒ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊａｎｅｔ  Ｍ．；Ｈｕｐｅ，Ｄ．Ｊ．Ｊ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｈｅｍ１９７９，４４（１１），１７７１もまた参照されたい）。チオール−システインジスルフィド化合物３ａは、細胞内の内部移行及びリソソームタンパク質分解後の、対応するＡＤＣの細胞内異化によって産生される、提案される中間体と同一である（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｈ．Ｋ．；Ｗｉｄｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．；Ｍａｙｏ，Ｍ．Ｆ．；Ｗｈｉｔｅｍａｎ，Ｋ．；Ａｕｄｅｔｔｅ，Ｃ．；Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｄ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ２０１３，２１（１），８４を参照されたい）。
【０４７８】
いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、ＰＢＤ二量体−リンカー犠牲及び放出の１つの機構を、以下に描写する。
【化１１３−１】
0006621919.tif 000165
【化１１３−２】
0006621919.tif 000166
であり、Ｒ”は、システイン（「ａ」と指定される化合物、例えば、３ａ）またはＧＳＨ（「ｂ」と指定される化合物、例えば、３ｂ）である。
【０４７９】
図１２Ａ１及び１２Ｃ１ならびに表１５に示されるように、メチル含有チオール中間体化合物６は、ＬＣ／ＭＳによって、インキュベーションの初期相において低レベルで検出され得るが、ＰＢＤ−二量体化合物８をもたらすために急速に犠牲にされ得る。しかしながら、ジスルフィド化合物２から産生される、対応するシクロプロピル含有チオール化合物７は、認識できるほどには犠牲にならず、安定しているようであった。更に、化合物１を利用する切断実験において、チイラン化合物９がＬＣ／ＭＳを介して検出された一方で、対応するチイラン化合物１０は化合物２を用いる研究からは特定されなかった（上記の提案される機構を参照されたい）。その後、シクロブチル類似体化合物１１を調製した。化合物１１及びそのチオール−システイン付加化合物１２ａの両方は、急速なジスルフィド切断を受け、その後、そのチオレート及びチオール１３の犠牲を効率的に受けて、チイラン化合物１４及びＰＢＤ−二量体化合物８を形成した（図１２Ａ３、１２Ｂ３、及び１２Ｃ３）。低濃度のグルタチオン（０．０３ｍＭ）とのインキュベーションにおいて、化合物１と比較して、より多くの量の出発材料化合物１１が観察されたため、化合物１１中のシクロブチル置換ジスルフィドは、メチル類似体化合物１よりも安定している（図１２Ｄ１及び１２Ｄ３）。全てのインキュベーション条件下で化合物６よりも少ない化合物１３が検出されたため、シクロブチル含有チオール化合物１３の犠牲もまた、メチル含有チオール化合物６よりもわずかに効率的であり得る（表１５）。シクロブチルまたはメチル含有リンカーの効率的犠牲と比較して、シクロプロピルリンカーの非犠牲は、複数の要素によるものであると考えられる。例えば、シクロプロピル環に関連する結合角度は、チオレート化合物９及び１４と比較して、縮合ジ−シクロプロピルチイラン化合物１０において環歪みの増加をもたらし、それにより所望される犠牲反応を妨害すると考えられる（Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｅ．；Ｐｉｉｚｚｉ，Ｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００５，１０５（５），１７３５を参照されたい）。シクロプロピル環はまた、チオレート中間体上で電子効果（ｐ軌道特徴）を発揮することができ、これはその求核性、したがって、その環化能力を低減する。この可能性と一貫して、シクロプロピル含有チオール化合物１５では、シクロブチル含有チオール化合物１６について測定されたものと比較して、著しくより低いｐＫａ値（より産生）が測定された（それぞれ４．８対９．６）。まとめると、これらの結果は、ジスルフィドリンカーに対するわずかな構造的修正が、対応する犠牲及び放出効率における差異をもたらし得ることを実証する。
【０４８０】
関連するＡＤＣの細胞殺滅活性に対する犠牲の効果を評価した。抗ＣＤ２２コンジュゲート（ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−抗ＣＤ２２−ＰＢＤ）１９−１（メチル−）、２０−１（シクロプロピル−）、及び２１−１（シクロブチル−）、ならびに対応する対照コンジュゲート（ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−抗ＮａＰｉ２ｂ−ＰＢＤ）１９−２、２０−２、及び２１−２を、化合物１、２、及び１１から調製した。Ｂ細胞起源の癌でのその高度な発現、及び非Ｂ細胞関連正常細胞での比較的低い蔓延率のために、ＣＤ２２抗原を選択した（Ｐｏｌｓｏｎ，ａ  Ｇ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．；Ｇｒａｙ，ａ  Ｍ．；Ｆｕｊｉ，Ｒ．Ｎ．；Ｐｏｏｎ，Ｋ．ａ；ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｊ．；Ｒａａｂ，Ｈ．；Ｊａｎｕａｒｉｏ，Ｔ．；Ｇｏ，Ｍ．；Ｌａｕ，Ｊ．；Ｙｕ，Ｓ．−Ｆ．；Ｄｕ，Ｃ．；Ｆｕｈ，Ｆ．；Ｔａｎ，Ｃ．；Ｗｕ，Ｙ．；Ｌｉａｎｇ，Ｗ．−Ｃ．；Ｐｒａｂｈｕ，Ｓ．；Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｊ．−Ｐ．；Ｈｏｎｇｏ，Ｊ．；Ｄｅｒｅ，Ｒ．Ｃ．；Ｄｅｎｇ，Ｒ．；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍ．；ｄｅ  Ｔｕｔｅ，Ｒ．；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｆ．；Ｒａｗｓｔｒｏｎ，ａ；Ｊａｃｋ，ａ；Ｅｂｅｎｓ，ａ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ２０１０，２４（９），１５６６を参照されたい）。以下のＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−抗ＣＤ２２−ＰＢＤ及びＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−抗ＮａＰｉ２ｂ−ＰＢＤ  ＡＤＣを調製し、ＰＢＤ−Ｎ１０は、上記で「Ｒ」と指定されるＰＢＤ化合物に対応する。
【化１１４】
0006621919.tif 000167
【０４８１】
ＣＨＯ細胞内で発現される全長のシステイン操作されたモノクローナル抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標））を、５０倍過剰のＤＴＴに室温で一晩曝露して、操作されたシステイン残基と、培養培地に存在するシステインまたはグルタチオンとの間に形成され得るジスルフィド結合を低減した。還元したＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を希釈し、１０ｍＭのコハク酸ナトリウム（ｐＨ５）中、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰカラムに負荷し、コハク酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）で溶出した。小分子還元体が存在しない還元した抗体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中のストックとして以前に溶解していた１５当量のデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）で約３時間処理して、操作されたシステインをコンジュゲーションのために遊離したままにしながら鎖間ジスルフィドを再形成した。コンジュゲート可能な最終ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を、１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）、１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５．０）中３００ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出したことを除いて、還元体の除去に使用したものと同一の様式でＤＨＡＡを除去した。その後、ＥＤＴＡを２ｍＭの最終濃度で最終タンパク質プールに添加した。
【０４８２】
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体のコンジュゲーションのために、抗体をまず、１Ｍのトリス（ｐＨ８．５）でｐＨ８．５にｐＨ調整した。これらの溶液に、反応体積中のＤＭＦの最終量が１０％であるように、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解した、適切な過剰のニトロピリジルジスルフィド（上記に描写される化合物１、２、または１１、約６〜１５モル当量）を添加した。コンジュゲーション反応を室温で一晩進行させた。コンジュゲーション混合物を精製して、標準的カチオン交換（Ｓマキシスピンカラム、Ｐｉｅｒｃｅ）法とゲル濾過（ＺｅｂａスピンカラムまたはＳ２００カラム）法との組み合わせを使用して、非コンジュゲート１、２、または１１、及びコンジュゲーション副生成物を除去した。最終コンジュゲートを、２０ｍＭのヒスチジン−酢酸（ｐＨ５．５）、２４０ｍＭのスクロース、及び０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０の緩衝液中に製剤化した。
【０４８３】
ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体調製（還元／再酸化）及びその後のコンジュゲーション中、及びその後、凝集及び薬物対抗体比（ＤＡＲ）の両方について反応を監視した。凝集測定のために、分析的ＳＥＣ（Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０２．５カラム、０．２Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．２）、０．２５Ｍの塩化カリウム緩衝液）を使用した。ＤＡＲを測定するために、我々は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＴＯＦ質量分光計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する逆相ＬＣＭＳ（ＰＬＲＰ−Ｓカラム、１０００オングストローム、５０ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって、インタクトであるコンジュゲート、またはプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｆａｂドメイン及びＦｃドメインを分離させる）によって部分的に消化されたコンジュゲートのいずれかを分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ取得ソフトウェアによってデータを回収し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ｎｏｖａｔｉａ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を使用してデコンボリューションを実行した。薬物修飾抗体に対応するピークを、薬物を有しない抗体に対応するピークと比較することによって、ＤＡＲ値を計算した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。全てのコンジュゲートは、５％未満の凝集レベル、５％未満の残りの非コンジュゲートリンカー薬物の量、２ｍｇ／ｍＬ超の濃度、及び０．５ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルを有した。様々なコンジュゲートのＤＡＲ値を、以下の表１７に提供する。
【表１７−１】
0006621919.tif 000168
【表１７−２】
0006621919.tif 000169
【０４８４】
ＢＪＡＢ、及びＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、及びＪｕｒｋａｔ２細胞株を４，０００〜７，０００個の細胞／ウェルで播種し、システインを含まないＲＰＭＩ中、または５０μＭの新鮮なシスチンで補助した１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．０１５ｇ／Ｌのメチオニンを含有するＤＭＥＭ＿Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェルＦｌａｔ  Ｃｌｅａｒ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｗｈｉｔｅ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓで、コンフルエンスまで成長させた。１０の濃度（１〜３回の希釈）のＡＤＣコンジュゲート（１９、２０、及び２１）を、４日間インキュベートしてから、ＡＴＰレベルを測定する（細胞数の間接的測定）Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光試薬を使用して細胞生存率を決定した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーで発光強度を測定した。非薬物処理対照に対して正規化することによって相対的細胞生存率を計算し、ＫｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアパッケージを使用してグラフ化した。ＩＣ５０値を濃度として決定して、５０％の最大細胞殺滅（Ｎ＝４）を得た。ＩＣ５０結果を表１８に提示し、細胞生存率結果を図１１Ａ〜１１Ｆに提示する。
【表１８】
0006621919.tif 000170
【０４８５】
メチル含有コンジュゲート１９−１及びシクロブチル含有コンジュゲート２１−１は、２つのＣＤ２２発現細胞株（ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２及びＢＪＡＢ、表１８）において強力な標的依存性細胞殺滅活性を示した。しかしながら、これらの実験において、シクロプロピル含有コンジュゲート２０−１は、１９−１及び２１−１よりも著しく（５０倍超）弱く、また対応する非標的コンジュゲート（２０−２）との効力の差もほぼ呈さなかった。これらの結果は、シクロプロピル含有チオール化合物７がＤＮＡオリゴを効率的にアルキル化することも、犠牲を介してＰＢＤ−二量体化合物８を放出することもできないことを例示する図１１及び表１５に描写される、インビトロデータと一貫した。ＡＤＣ細胞データはまた、コンジュゲート１９−１及び２１−１に関連するインビトロモデル系からの強力なＤＮＡアルキル化剤（ジイミン化合物８）の効率的な放出とも一貫した（表１５ならびに上記の提案される犠牲及び放出機構を参照されたい）。
【０４８６】
実施例２２：ジスルフィド連結ＰＢＤ  ＡＤＣのインビボ腫瘍殺滅活性
構造１−１、２−１、及び３−１（実施例２１において上記に描写される構造１９−１、２０−１、及び２１−１に対応）の抗ＣＤ２２抗体−薬物コンジュゲートＡＤＣの有効性を、ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のマウス異種移植片モデルＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において、１−２、２−２、及び３−２の構造（実施例２２において上記に描写される構造１９−２、２０−２、及び２１−２に対応）の非標的対照抗ＮａＰｉ抗体−薬物コンジュゲートＡＤＣに対して調査した。以下の構造のＰＢＤシクロプロピルチオール化合物７もまた、評価した。
【化１１５】
0006621919.tif 000171
【０４８７】
ギ酸アンモニウム、ギ酸、及び仔ウシＤＮＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。２つの操作されたシステイン残基を有するヒトＣＤ２２及びＮａｐｉ抗体を、以前に記載されるように生成した（Ｂｈａｋｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｐｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。抗ＣＤ２２コンジュゲート（軽鎖−Ｋ１４９Ｃ−抗ＣＤ２２−ＰＢＤ）化合物１−１（メチル−）、化合物２−１（シクロプロピル−）、及び化合物３−１（シクロブチル−）、ならびに対応する対照コンジュゲート（軽鎖−Ｋ１４９Ｃ−抗ＮａＰｉ−ＰＢＤ）化合物１−２、２−２、及び３−２、ＰＢＤ−二量体８、及びシクロプロピルチオール７を調製した。マウス（ＣＢ−１７ＳＣＩＤ、ヌード、Ｂａｌｂ／Ｃ株）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。全ての動物研究は、実験動物の管理及び使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠して実行し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｔ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により承認された。
【０４８８】
皮下異種移植片モデルを確立するために、腫瘍細胞（０．２ｍＬのハンクス平衡塩類溶液中２０００万個の細胞、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を、雌のＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の側腹部に皮下に植え付けた。腫瘍サイズが所望される体積に到達したとき、動物を各８匹のマウスの群に分け、抗Ｎａｐｉ（非標的対照）、ＬＣ−Ｋ１４９Ｃ−抗ＣＤ２２−メチル−ＰＢＤ化合物１−１、シクロプロピル−ＰＢＤ化合物２−１、またはシクロブチル−ＰＢＤ化合物３−１の単回静脈内注入を、０．５または１ｍｇ／ｋｇで尾部静脈を通して受けさせた（研究０日目）。研究を通して、マウスの腫瘍及び体重を１週間に１〜２回測定した。体重減少がそれらの出発体重の２０％を超えたとき、マウスを即座に安楽死させた。腫瘍が３０００ｍｍ３に到達するか、または切迫した潰瘍化の兆候を示す前に、全ての動物を安楽死させた。腫瘍体積を、カリパスを使用して２次元（長さ及び幅）で測定し、その腫瘍体積を、以下の式を使用して計算した。腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝（より大きな測定値×より小さい測定値２）×０．５。
【０４８９】
腫瘍、肝臓、及び血漿を含む選択した組織を、５ｍ／ｋｇの化合物２−１（シクロプロピル−）及び化合物３−１（シクロブチル−）の単回静脈内用量の２４及び９６時間後に回収し、総抗体及び負荷量の曝露評価のために分析するまで−８０Ｃで凍結しておいた。選択した血漿試料を、１ｍ／ｋｇの化合物１−１（メチル−）、化合物２−１（シクロプロピル−）、及び化合物３−１（シクロブチル−）の単回静脈内用量後、１、４、及び７日目に回収し、ＤＡＲ値を分析するまで−８０Ｃで凍結しておいた。
【０４９０】
異種移植片マウスに、単回静脈内５ｍｇ／ｋｇでシクロプロピル含有化合物２−１またはシクロブチル含有化合物３−１を投薬した後、腫瘍及び他の組織中の総ｍＡｂ及び異化産物を特性評価した。血漿、肝臓、及び腫瘍を２４及び９６時間で回収し、対照マウス血漿中でホモジナイズし、有機溶媒で抽出した後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって異化産物について分析した。組織の別の部分を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ緩衝液中でホモジナイズし、親和性−捕捉ＬＣ／ＭＳによって総抗体について分析し、その後、タンパク質Ａ捕捉及びトリプシン消化を行った。
【０４９１】
マウス血漿及び組織中の異化産物の濃度を定量化するために、５０μＬの血漿または約５０ｍｇの組織（肝臓または腫瘍）を、１５０μＬの氷冷ブランクマウス血漿と混合した。試料を、各々予冷ビーズ（１０個のビーズ、−８０℃）による２回の３０秒間サイクルで完全にホモジナイズし、その後、１０ｎＭの内部標準（５８９．２／２６１．０）を含有する４００μＬの氷冷アセトニトリルによって抽出した。６，５００×ｇで１５分間遠心分離した後、１０μＬの上清を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に結合されたＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ６５００質量分光計（ＭＳ）に注入した。ＬＣ条件は、移動相Ａ（０．１％のギ酸）及びＢ（１００％のアセトニトリル）、ならびに０〜０．５分５％のＢ、０．５〜３．５分５〜９０％のＢ、３．５〜４．０分９０％のＢ、４．０〜４．５分９０〜５％のＢ、４．５〜５．０分５％のＢの勾配、０．５ｍＬ／分の流量（３５℃のカラム温度）で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８、１．７μｍ、１００Å、１００×２．１ｍｍを使用する。ＰＢＤ−二量体８、異化産物チオール５、及びＩＳの保持時間はそれぞれ、２．６、３．１、及び２．９分であった。ＭＳの多重反応監視（ＭＲＭ）移行は、ＰＢＤ４（５８５．１／５０４．２）及び異化産物チオール化合物５（７３２．２／５０４．２）であった。化合物依存性ＭＳパラメータは、ＤＰ、ＥＰ、ＣＥ、及びＣＸＰについてそれぞれ、６１、１０、２９〜４１、１４であった。ＭＳ機器依存性パラメータは、ＣＡＤ（−３）、ＣＵＲ（１０）、ＧＳ１（９０）、ＧＳ２（５０）、ＩＳ（５５００）、及びＴＥＭ（５００）であった。定量化のための標準曲線試料は、ＰＢＤ−二量体化合物８及びチオール化合物７についてそれぞれ、０．２４、０．４９、０．９８、１．９６、及び３．９１、ならびに０．２４、０．４９、０．９８、１．９６、及び３．９１、ならびに７．８１ｎＭであった。化合物７及び８の定量化の下限（ＬＬＯＱ）はともに、０．２４ｎＭであった。組織試料のマトリクス効果は、組織をブランクマウス血漿中でホモジナイズすることによって最小化した。
【０４９２】
試料を、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（１００×２．１、１．９μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、Ｓｃｉｅｘ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００でＬＣ／ＭＳによって分析した。カラムを、１０ｍＭのギ酸アンモニウム中０．１％のギ酸から、１０ｍＭのギ酸アンモニウム中０．１％のギ酸を含有するアセトニトリルへの勾配によって溶出した。ＰＢＤ−二量体化合物８をＬＣ／ＭＳによって、Ｍ／Ｚ実測値：５８５．２７０８及び計算値：５８５．２７１１で特定し、Ｃ３３Ｈ３６Ｎ４Ｏ６及び主要断片をＭ／Ｚ：５０４．２１４４、４９２．２１４４、４１１．１５７０、３２７．１７２４、２５９．１０９６、及び２４６．１１３９で特定した。シクロプロピル含有チオール化合物７をＬＣ／ＭＳによって、Ｍ／Ｚ実測値：７３３．２９０１及び計算値：７３３．２９０２で特定し、Ｃ３８Ｈ４４Ｎ４Ｏ９Ｓ及び主要断片をＭ／Ｚ：７１５．２８１４、５８５．２７１６、５３６．２０４０、５０４．２１４０、及び４９２．２１４０で特定した。
【０４９３】
タンパク質Ａ磁気ビーズを使用する親和性捕捉アプローチを使用して、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のマウス組織ホモジネートから、シクロブチル含有化合物２−１またはシクロプロピル含有化合物３−１を濃縮した。結合したＡＤＣを、標準的タンパク質変性、還元、及びアルキル化処理ステップの後、トリプシンで「オンビーズ」タンパク質分解に供した。簡潔には、タンパク質消化によって産生された代替ペプチド（複数可）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定を使用することによって、総抗体濃度の定量化を達成した。内因性マトリクス構成成分からのシクロブチル含有化合物２−１またはシクロプロピル含有化合物３−１の分化を可能にするために特有である、ヒトＦｃ領域から生成された代替ペプチドＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫは、９３８．０／８３６．７のＭＲＭ移行によって定量化した。加えて、ヒトＦｃ領域に特徴的であるいくつかの他のペプチドを、以前に記載されるように立体構造及びトラブルシューティングの目的で監視した（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｔｗｏ  ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ」Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ６：１７８１−９４（２０１４））。
【０４９４】
ＤＡＲを以前に記載されるように決定した（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｓｍａ／ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ４１２：５６−６６（２０１１））。簡潔には、ＡＤＣの静脈内投与後の適切な体積のマウス血漿を、ビオチン化ＣＤ２２標的抗原とともに室温でインキュベートし、これをストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカップリングさせた。ビーズで捕捉されたＡＤＣ分析物を洗浄し、３７℃で一晩脱グリコシル化した。ＡＤＣを、１％のギ酸を有する水中、３０％のアセトニトリルによって溶出し、逆相ＨＰＬＣカラムに結合したＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ５６００質量分光計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）に注入した。流量１５μＬ／での勾配条件を適用した。移動相Ａは、０．１％のギ酸を有する水であり、移動相Ｂは、０．１％のギ酸を有するアセトニトリルであった。陽性飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳスキャンを取得し、処理した。ピークデコンボリューションを実行して、ＤＡＲ０種、ＤＡＲ１種、及びＤＡＲ２種（以下に描写）の分布プロファイルを得、対応するピーク面積を測定した。その後、各時点での各ＤＡＲの相対比率及び平均ＤＡＲ値を計算することができた。
【化１１６】
0006621919.tif 000172
【０４９５】
ＤＮＡ結合アッセイのために、１μＭの化合物７及び８を、０．５ｍＬの１０ｍＭのビス−トリス（ｐＨ７．１）中、１ｍｇ／ｍＬの仔ウシＤＮＡとともに３７℃で１時間インキュベートした。酢酸エチル（１ｍＬ）を使用して、ボルテックス（２０秒間）及び遠心分離（５，０００×ｇで４分間）によって反応混合物を２回抽出した。合わせた有機抽出物を真空下で濃縮し、０．１５ｍＬの１：１の水／メタノール中で再構成してから、ＬＣ／ＭＳに注入した。試料を、陽性ＥＳＩイオン様式で、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム（１００×２．１、１．９μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上、Ｓｃｉｅｘ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００でＬＣ／ＭＳ／ＵＶによって分析した。緩衝液Ａ（０．１％のギ酸）から緩衝液Ｂ（アセトニトリル中０．１％のギ酸）への勾配、０．４ｍＬ／分で、５％のＢ０〜０．５分、５〜２５％のＢ０．５〜８分、２５〜７５％のＢ８〜１３分、及び７５〜９５％のＢ１３〜１３．５分、９５％のＢ１３．５〜１４．５分、９５〜５％のＢ１４．５〜１５分によってカラムを溶出した。
【０４９６】
コンジュゲート１−１（メチル−）、２−１（シクロプロピル−）、及び３−１（シクロブチル−）の有効性を、ＣＤ２２発現ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２異種移植片マウスモデルにおいてインビボで研究した。０．５及び１ｍｇ／ｋｇの両方で１回静脈内に投薬したとき、メチル（１−１）及びシクロブチル（２−１）置換基を有するジスルフィドリンカーを含有するコンジュゲートは、１週目に開始し、３５日間継続する部分的な応答の観察をもって、強い有効性を呈した（図１３）。これらの主体は、全ての治療群において対応する体重減少が５％以内であったため、マウスにおいて耐容性が良かった（図１４）。関連する非標的ＮａＰｉ（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）対照コンジュゲート（３−２及び２−２）は、同一のマウスモデルにおいて最小の有効性を示した。１．０ｍｇ／ｋｇのシクロプロピル含有抗ＣＤ２２コンジュゲート（２−１）の静脈内投与は、ほぼ全く抗腫瘍活性をもたらさず、この群の全ての動物は、ＡＤＣ投薬の２週間以内に、ＮａＰｉ対照群とともに腫瘍成長のために安楽死させた（図１３及び１４）。
【０４９７】
全身薬物動態が、上述の実験においてシクロプロピル含有コンジュゲート２−１が呈する弱い有効性の可能性となり得るかどうかを評価するための研究を行った。この可能性を探索するために、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２異種移植片マウスに、シクロプロピル含有２−１及びシクロブチル含有３−１の両方の５ｍｇ／ｋｇの単回用量を静脈内投与した後、動物の血漿、肝臓、及び腫瘍中の総ｍＡｂ及び異化産物濃度を測定した。組織試料採取を比較的初期の時点（２４及び９６時間）で実行して、十分な腫瘍量が分析のために入手可能であることを確実にした。表１９に示されるように、両方の主体の総抗体の測定された腫瘍及び血漿曝露は、投薬の２４及び９６時間後の両方で類似しており、血漿中の総ｍＡｂ濃度（２１６〜３７０ｎＭ）は腫瘍（１６〜５９ｎＭ）中よりも一層高かった。１ｍｇ／ｋｇの静脈内用量を用いる別個の実験において、血漿試料から決定される２つのコンジュゲートの薬物−抗体比は類似しており、７日間の期間にわたって比較的安定していた（図１５）。結果的に、コンジュゲートされた抗体はまた、マウスにおいて、シクロプロピル含有コンジュゲートとシクロブチル含有コンジュゲートとの間で類似した濃度を有するはずである。これらの結果は、シクロプロピル含有２−１ＡＤＣ及びシクロブチル含有３−１ＡＤＣについて観察された劇的に異なる有効性に関与し得る、ＰＫ及び／またはインビボ安定性に有意な差異が存在しないことを示した。
【表１９】
0006621919.tif 000173
【０４９８】
表１９の結果において、異化産物ＰＢＤ−二量体８及びシクロプロピル−チオール７及びは、ビヒクルを投薬したマウスの組織中では検出されず、ＮＤ＝検出されず、ＮＡ＝該当せず、ＬＬＯＱ＝７及び８についてホモジネート中０．２４４ｎＭであり、腫瘍及び肝臓中の濃度（ｎＭ）は、１ｇ／ｍＬの組織密度の想定に基づいて推定した。
【０４９９】
腫瘍中に存在する関連する異化産物の検査は、共通点のない有効性結果の説明を助けた。シクロブチル含有３−１を用いる実験において、ＰＢＤ−二量体８は、投薬の２４及び９６時間後の両方で、腫瘍（１．０〜２．０ｎＭ）中、顕著な量で検出された（表１９）。ＡＤＣ媒介送達について予測されるように、ＰＢＤ−二量体８の腫瘍濃度は、両方の時点で、血漿及び肝臓中で検出された腫瘍濃度よりも有意に高かった。加えて、ＰＢＤ−二量体８の濃度は、腫瘍中では２４〜９６時間まで維持されるか、またはわずかに増加したが、血漿中では非常に低いレベルまで減少した。対照的に、シクロプロピル含有２−１コンジュゲートを利用した実験において、ＰＢＤ二量体８は、腫瘍または血漿中では認識できるレベルでは検出されなかった。代わりに、測定可能なレベルのチオール含有異化産物７が、腫瘍中（４．３〜７．５ｎＭ）ならびに血漿及び肝臓中（２４時間で０．５〜１．４ｎＭ）で観察され、これは、シクロブチル含有ＡＤＣ３−１に由来するＰＢＤ−二量体８の対応する濃度よりも一層高かった。
【０５００】
異化産物ＰＢＤ−二量体８及びシクロプロピルチオール７のＤＮＡ結合可能性を、インビトロで評価した。図１６Ｄに示されるように、ＤＮＡ溶液中でのＰＢＤ−二量体８の１時間のインキュベーション後、約９４％のＰＢＤ−二量体８が抽出不能（１０％未満の回収率）となった。対照的に、シクロプロピルチオール７は、類似したインキュベーションから定量的に回収された（図１６Ｂ）。これらの結果は、シクロプロピルチオール７がＤＮＡに結合しない一方で、ＰＢＤ−二量体８がＤＮＡに急速に結合することを示唆し、これは、それらの別個の有効性プロファイルを支持する。したがって、７（約２．５〜４倍）と比較して、腫瘍及び肝臓中のより低いＰＢＤ−二量体８濃度は、組織中の効率的なＤＮＡアルキル化によるＰＢＤ−二量体８の消失と一貫している（図１５、シクロプロピルチオール７はＤＮＡには認識できるほどには結合しない）。これらの組織分析結果に基づいて、０．５ｍｇ／ｋｇの３−１（シクロブチル−）の静脈内用量が、マウスにおける線形ＰＫ、取り込み、及び異化を想定して、腫瘍中で０．１０〜０．２０ｎＭの濃度範囲のＰＢＤ−二量体８を生成する（腫瘍中で測定される５％未満の総ｍＡｂを表す）と予測される。そのようなＰＢＤ−二量体８濃度は、標的発現細胞株におけるＰＢＤ−二量体８の高い効力（ＩＣ５０＝約５０ｐＭ）、及びＤＮＡアルキル化による実際の腫瘍内量の過小評価の可能性を考慮すると、シクロブチル含有３−１で実行した対応する有効性実験において観察される強い腫瘍殺滅と一貫している（Ｈａｒｔｌｅｙ，ＪＡ「Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ａｇｅｎｔｓ」Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ２０：７３３−７４４（２０１１））。血漿中及び腫瘍中のシクロプロピル含有２−１及びシクロブチル含有３−１の総抗体の類似した濃度は、インビボでの２つのＡＤＣ間の類似した有効性を予測する。しかしながら、１つの理論の下、かついかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、腫瘍中の薬物異化産物及び関連するＤＮＡ結合特性は、これらの２つのコンジュゲートが呈する有効性の差の説明を助ける。したがって、ＤＮＡ結合／アルキル化及び最終的な有効性に関与する、腫瘍中のＡＤＣによって送達される負荷量の測定は、所与のＡＤＣの有効性を理解する上での一要素である。これらの結果は、腫瘍異化産物分析を使用して、ＡＤＣのインビボ有効性結果を予測することができることを実証する。
【０５０１】
実施例２３：マイタンシノイド及びＭＭＡＥ  ＡＤＣのインビトロ安定性及び細胞殺滅活性
以下の表２０に開示されるように、本明細書で他に記載される方法に従って、以下に示される置換を有する実施例１５に描写される活性化マイタンシノイド及びＭＭＡＥ薬物を、ヒトＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とコンジュゲートした。
【表２０】
0006621919.tif 000174
【０５０２】
ジスルフィド交換によるＤＡＲ消失によって測定される、カニクイザル全血、ヒト全血、マウス全血、ラット全血中のＭａｙ１〜Ｍａｙ３及びＭＭＡＥ１〜ＭＭＡＥ３の２４時間の安定性を決定した。結果を以下の表２１に提示する。
【表２１−１】
0006621919.tif 000175
【表２１−２】
0006621919.tif 000176
【０５０３】
以下の表２２に開示されるように、本明細書で他に記載される方法に従って、以下に示される置換を有する実施例１５に描写される活性化マイタンシノイド及びＭＭＡＥ薬物を、ヒトＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とコンジュゲートした。
【表２２−１】
0006621919.tif 000177
【表２２−２】
0006621919.tif 000178
【０５０４】
ＭＭＡＥ６ＡＤＣを、以下のＭＭＡＥ（式中、ＸはＨであり、ＹはＣＨ３であり、Ｚは表２２に描写されるパラニトロピリジンであった）
【化１１７】
0006621919.tif 000179
及び以下の抗体、抗Ｈｅｒ２  ７Ｃ２  ＬＣ  Ｋ１４９Ｃから調製した。
【０５０５】
ＢＪＡＢ、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、及びＪｕｒｋａｔ細胞に対する、表２２のＡＤＣ化合物Ｍａｙ４〜Ｍａｙ１０及びＭＭＡＥ１〜ＭＭＡＥ４のインビトロＩＣ５０を評価した。細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした（１ｍＬ当たり１００，０００個の細胞）。培地は、システインを含まないＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ＋２０ｍＭのグルタミン＋５０μＭのシステインであった。その後、培地を除去し、異なるＡＤＣ濃度を含有する新鮮な培地で置き換えた。薬物投与の４日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用して細胞生存率を測定した。結果を以下の表２３に提示する。
表２３：ＢＪＡＢ、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、及びＪｕｒｋａｔ細胞に対する、マイタンシノイド及びＭＭＡＥ  ＡＤＣのＩＣ５０
【表２３−１】
0006621919.tif 000180
【表２３−２】
0006621919.tif 000181
【０５０６】
ＳＫ−ＢＲ−３及びＫＰＬ−４細胞に対する、ＡＤＣ化合物ＭＭＡＥ１、ＭＭＡＥ２、ＭＭＡＥ５、及びＭＭＡＥ６のインビトロＩＣ５０を評価した。細胞を、システインを含まないＲＰＭＩ＋１０％のＦＢＳ＋２０ｍＭのグルタミン＋５０μＭのシステイン培地中、９６ウェルプレートにプレーティングし（ＳＫ−ＢＲ−３は１ウェル当たり５０００個の細胞、ＫＰＬ−４は１ｍＬ当たり１５００個の細胞）、一晩接着させた。その後、培地を除去し、異なるＡＤＣ濃度を含有する新鮮な培地で置き換えた。薬物投与の５日後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏを使用して細胞生存率を測定した。結果を以下の表２４に提示する。
【表２４】
0006621919.tif 000182
【０５０７】
実施例２４：ＭＭＡＥ  ＡＤＣ及びマイタンシノイドＡＤＣのインビボ試験
マウス異種移植片ＢＪＡＢ−ルシフェラーゼ腫瘍モデルにおいて、ＭＭＡＥ及びマイタンシノイドＡＤＣをインビボで評価して、有効性及び異化を研究した。
【０５０８】
ＢＪＡＢ−ｌｕｃのマウス異種移植片モデル（ヒトバーキットリンパ腫）において、抗ＣＤ２２抗体−ＭＭＡＥコンジュゲート抗ＣＤ２２抗体−マイタンシノイドコンジュゲート及びの有効性を調査した。ＢＪＡＢ細胞株は、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、亜系ＢＪＡＢ−ｌｕｃは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈでルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するように生成した。
【０５０９】
雌のＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，Ｃａｌｉｆ．）に各々、２０００万個のＢＪＡＢ−ｌｕｃ細胞を側腹部領域に皮下に植え付けた。異種移植片腫瘍が約２００ｍｍ３の腫瘍体積に到達したとき（０日目と称される）、マウスを群にランダム化し、動物にＡＤＣまたはビヒクルの単回静脈内注入を受けさせた。様々な時間でマウスの腫瘍及び体重を測定した。体重減少がそれらの出発体重の２０％を超えたとき、腫瘍が約１５００ｍｍ３に到達するか、または切迫した潰瘍化の兆候を示す前に、マウスを即座に安楽死させた。
【０５１０】
Ｚｈａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ  Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａ  Ｄｉｓｐｏｓ．４４：１５１７−１５２３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２０１６に開示される方法に従って、血漿薬物対抗体比を測定した。一般に、ＡＤＣの静脈内投与後の適切な体積のマウス血漿を、ビオチン化ＣＤ２２標的抗原とともに室温でインキュベートし、これをストレプトアビジン常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にカップリングさせた。ビーズで捕捉されたＡＤＣ分析物を洗浄し、３７℃で一晩脱グリコシル化した。１％のギ酸を含有する水中、３０％のアセトニトリル中の結果として生じる試料を、逆相ＨＰＬＣカラムを使用するＨＰＬＣに結合したＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ５６００質量分光計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）に注入した。化合物を、移動相Ａ（０．１％のギ酸を有する水）及び移動相Ｂ（０．１％のギ酸を有するアセトニトリル）の勾配によって、５ｍＬ／分の流量で溶出した。陽性飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳスキャンを取得し、処理した。ピークデコンボリューションを実行して、ＤＡＲ０種、ＤＡＲ１種、及びＤＡＲ２種の分布プロファイルを得、対応するピーク面積を測定した。その後、各時点での各ＤＡＲの相対比率及び平均ＤＡＲ値を計算した。
【０５１１】
第１の評価において、本明細書で他に記載される方法に従って、以下の表２５に開示されるように、以下に示される置換を有する実施例１５に描写される活性化マイタンシノイド薬物を、ヒトＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とコンジュゲートした。マウスを群にランダム化した。上述のマウスは、０日目に単回静脈内用量のビヒクル、Ｍａｙ１〜４、または対照を受けた。Ｍａｙ１用量は、３．１ｍｇ／ｋｇ（１００μｇ／ｍ２）であり、残りのＡＤＣの用量は、２．８ｍｇ／ｋｇ（１００μｇ／ｍ２）であった。０、４、７、１１、１４、１８、及び２１日目にマウスの腫瘍体積及び体重を測定し、腫瘍体積が約１０００ｍｍ３に到達したときに終了した。１、４、及び７日目にＡＤＣを投薬したマウスの血漿を回収し、ＤＡＲについて評価した。
【表２５−１】
0006621919.tif 000183
【表２５−２】
0006621919.tif 000184
【０５１２】
腫瘍体積結果（ｍｍ３）及び正規化ＤＡＲ結果を以下の表２６に報告する。
【表２６−１】
0006621919.tif 000185
【表２６−２】
0006621919.tif 000186
【０５１３】
第２の評価において、本明細書で他に記載される方法に従って、以下の表２７に開示されるように、以下に示される置換を有する実施例１５に描写される活性化マイタンシノイド薬物を、ヒトＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とコンジュゲートした。マウスを群にランダム化した。上述のマウスは、０日目に単回静脈内用量のビヒクル及びＭａｙ５〜１２を受けた。各ＡＤＣの用量は、５０μｇ／ｍ２であった。０、３、７、１０、１４、１７、及び２１日目にマウスの腫瘍体積及び体重を測定し、腫瘍体積が約１０００ｍｍ３を超えたときに終了した。１、３、及び７日目にＡＤＣを投薬したマウスの血漿を回収し、ＤＡＲについて評価した。
【表２７−１】
0006621919.tif 000187
【表２７−２】
0006621919.tif 000188
【０５１４】
腫瘍体積結果（ｍｍ３）及び正規化ＤＡＲ結果を以下の表２８に報告する。
【表２８−１】
0006621919.tif 000189
【表２８−２】
0006621919.tif 000190
【０５１５】
第３の評価において、本明細書で他に記載される方法に従って、以下及び対応する以下の表２９に描写される活性化ＭＭＡＥ薬物を、ヒトＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体とコンジュゲートした。マウスを群にランダム化した。上述のマウスは、０日目に単回静脈内用量のビヒクル、ＭＭＡＥ１〜４、または対照１もしくは２を受けた。腫瘍有効性研究について、ＭＭＡＥ１の用量は１ｍｇ／ｋｇであり、ＭＭＡＥ２〜４ならびに対照１及び２の用量は２０ｍｇ／ｋｇであった。ＤＡＲ研究について、ＭＭＡＥ１の用量は１ｍｇ／ｋｇであり、ＭＭＡＥ２〜４の用量は２０ｍｇ／ｋｇであった。０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５、及び３２日目にマウスの腫瘍体積及び体重を測定し、腫瘍体積が約１０００ｍｍ３を超えたときに終了した。１、４、及び７日目にＡＤＣを投薬したマウスの血漿を回収し、ＤＡＲについて評価した。
【化１１８】
0006621919.tif 000191
【表２９−１】
0006621919.tif 000192
【表２９−２】
0006621919.tif 000193
【表３０−１】
0006621919.tif 000194
【表３０−２】
0006621919.tif 000195
【０５１６】
実施例２５：活性化ジスルフィド−ＭＭＡＥ分子の、アルブミン及びペネトラチンへのコンジュゲーション
第１の評価において、ＭＭＡＥをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にコンジュゲートした。ヒト血清アルブミンは、単一の遊離内因性システイン残基Ｃｙｓ−３４を有し、それに対してＣｙｓ反応性分子が最終的にコンジュゲートされ得る（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ，２０１５，２６（５），９４１−９４９）。このＣｙｓ残基は、Ｃｙｓまたはグルタチオンとの混合ジスルフィドとして遮断され、これが、この残基に対する他の分子の完全なコンジュゲーションを防ぐ。ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体からのそのような遮断基の除去に類似した様式で、ＨＳＡのＣｙｓ−３４上の遮断基を還元−再酸化手順を通して除去し、タンパク質を１０ｍＭのコハク酸（ｐＨ５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡの緩衝液中に保管した。２．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を１Ｍのトリス（ｐＨ８．５）（７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）の最終緩衝液濃度）と、及びＨＳＡと比較して、１０モル当量のジスルフィドＭＭＡＥ化合物と、室温で約１６時間混合することによって、様々な脱離基を有するジスルフィド−ＭＭＡＥ分子をＨＳＡにコンジュゲートした。コンジュゲート反応をＬＣ／ＭＳによって分析した。反応中に形成される予測ＭＭＡＥ−ＨＳＡコンジュゲートの程度を、ＭＭＡＥ−ＨＳＡコンジュゲートのＭＳピークの存在量を観察された全てのピークの合計存在量で除することによって測定される、「コンジュゲート比」によって表す。コンジュゲート比の理想的な値は、１．０である。結果を以下の表３１に報告する（式中、脱離基の波線はジスルフィド部分への結合点を示し、「ＨＳＡ  ＣＲ」はヒト血清アルブミンコンジュゲート比を指す）。
【０５１７】
第２の評価において、ＭＭＡＥをペネトラチン（ＡｎｔＰ）ペプチドにコンジュゲートした。配列Ｈ２Ｎ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＣ−ＣＯＮＨ２を有し、Ｃ末端に遊離Ｃｙｓチオールを有するＡｎｔＰペプチドを、標準的Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法を介して合成した。このペプチドを、７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．５）及び１０％のＤＭＦで構成される緩衝溶液中、２５ｕＭの濃度で、様々な脱離基（５当量）を有するジスルフィドＭＭＡＥ分子に室温で約１６時間コンジュゲートした。ＭＭＡＥ−ＡｎｔＰコンジュゲートのＵＶピークの積分面積を、全てのピークの合計で除する（「生成物％」）ことによって、反応の程度を測定した。生成物％の理想的な値は、１００％である。結果を以下の表３１に報告する（式中、脱離基の波線はジスルフィド部分への結合点を示し、「ＡｎｔＰ  ％Ｐ」はペネトラチン（ＡｎｔＰ）ペプチド生成物％を指す）。
【表３１−１】
0006621919.tif 000196
【表３１−２】
0006621919.tif 000197
【０５１８】
本開示またはその好ましい実施形態（複数可）の要素を導入するとき、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」という冠詞は、これらの要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（を含む）」、及び「ｈａｖｉｎｇ（を有する）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙される要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【０５１９】
この明細書は、最良の様式を含む本発明を開示し、また任意の当業者による任意のデバイスまたはシステムの作製及び使用、ならびに任意の組み込まれる方法の実行を含む本発明の実施を可能にするために、実施例を使用する。本発明の特許取得の対象となる範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者に想起される他の実施例を含み得る。そのような他の実施例は、それらが特許請求の範囲の文言と異ならない構造的要素を有する場合、またはそれらが特許請求の範囲の文言と実質的な差異を有しない同等の構造的要素を含む場合、特許請求の範囲内であることが意図される。
例えば、本発明の実施形態において、以下の項目が提供される。
（項目１）
構造（Ｉ）のリンカー−薬物化合物であって、
【化１１９】
0006621919.tif 000198
式中、
Ｘが、脱離基であり、
前記脱離基Ｘ及び硫黄原子Ｓが、ジスルフィド結合を介して結合し、
Ｒ１及びＲ２が独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環もしくは４〜６員環を形成し、
Ｓｐが、スペーサーであり、ｎが、０または１であり、及び
Ｄが、薬物部分である、前記リンカー−薬物化合物。
（項目２）
Ｘが、以下、
【化１２０】
0006621919.tif 000199
から選択され、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、Ｘ１〜Ｘ５のうちの少なくとも１つが、Ｎであり、破線が、任意の二重結合を表し、Ａが、６員環を表し、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４が独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、Ｙ１〜Ｙ４のうちの少なくとも１つが、Ｎであり、破線が、任意の二重結合を表し、Ｂが、５員環を表し、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６が独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、Ｚ１及びＺ２のうちの少なくとも１つが、Ｎであり、破線が、任意の二重結合を表し、Ｅが、６員環を表し、Ｄが、縮合５員環を表し、
各Ｒ３が独立して、−Ｃ１−４アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、−ＯＲ５、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＮ、及び−Ｂｒから選択され、
Ｒ５及びＲ６が独立して、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−６ヒドロカルビル、非置換または置換Ｃ５−６炭素環、及び非置換または置換Ｃ５−６複素環から選択され、
Ｒ５’が、Ｃ１−４アルキルであり、
ｑが、０、１、２、または３であり、
脱離基１、脱離基２、脱離基３、及び／または脱離基４の環構造内の各炭素原子が、非置換であるか、またはＲ５で置換され、
脱離基１、脱離基２、脱離基３、及び／または脱離基４の前記環構造内の各窒素原子が、非置換であるか、またはＲ５で置換されて、三級アミンまたは四級アミンを形成し、及び
波線が、前記脱離基の前記硫黄原子Ｓへの結合点を示し、それによりジスルフィド結合を形成する、項目１に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目３）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が独立して、ＣまたはＮであり、Ｘ１〜Ｘ５のうちの２つ以下が、Ｎであり、環Ａが、不飽和であり、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４が独立して、ＣまたはＮであり、環Ｂが、不飽和であり、
Ｚ１が、Ｎであり、Ｚ２が、Ｎ、Ｓ、及びＯから選択され、Ｚ３〜Ｚ６が独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｚ３〜Ｚ６のうちの２つ以下が、Ｎであり、環Ｅが、不飽和であり、及び
各Ｒ３が独立して、−ＣＨ３、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣＨ３、及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２から選択される、項目２に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目４）
Ｘが、
【化１２１−１】
0006621919.tif 000200
【化１２１−２】
0006621919.tif 000201
【化１２１−３】
0006621919.tif 000202
から選択される、項目１〜３のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目５）
Ｒ１及びＲ２が独立して、Ｈ、−ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、テトラヒドロフラン、シクロヘキシル、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、項目１〜４のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目６）
Ｒ１及びＲ２が各々、−ＣＨ３であるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成し、Ｘが、脱離基３及び脱離基４から選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目７）
Ｘが、
【化１２２】
0006621919.tif 000203
から選択される、項目６に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目８）
Ｒ１及びＲ２が各々、−ＣＨ３であり、Ｘが、
【化１２３】
0006621919.tif 000204
である、項目７に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目９）
（ｉ）Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、Ｈであるか、（ｉｉ）Ｒ１が、−ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２が、Ｈであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロブチル環を形成し、Ｘが、脱離基１である、項目１〜５のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１０）
Ｘが、
【化１２４】
0006621919.tif 000205
である、項目９に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１１）
ｎが、０であり、束縛リンカーカルボニル炭素原子と前記薬物部分との間の前記結合が、エーテルであるか、または非環式もしくは環式アミン薬物部分原子から形成される三級アミンである、項目１〜１０のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１２）
ｎが、１であり、Ｓｐ−Ｄが、以下の構造のものであり、
【化１２５】
0006621919.tif 000206
式中、
波線が、前記スペーサーの前記束縛リンカーカルボニル炭素原子への結合点を示し、
Ｒ３０が、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−６ヒドロカルビル、非置換または置換Ｃ５−６炭素環、及び非置換または置換Ｃ５−６複素環から選択され、から選択され、及び
前記Ｓｐカルボニル炭素原子の前記薬物部分への結合が、脂肪族一級アミン薬物部分原子から形成される二級アミンであるか、脂肪族二級アミン薬物部分原子から形成される三級アミンであるか、または非環式もしくは環式アミン薬物部分原子から形成される三級アミンである、項目１〜１０のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１３）
Ｒ３０が、Ｈである、項目１２に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１４）
前記薬物部分が、マイタンシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；オーリスタチン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ドラスタチン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；カリケアマイシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）単量体もしくは二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）単量体もしくは二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ＣＢＩ−ＰＢＤ二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；アマトキシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ゲルダナマイシン、その類似体、その誘導体、その酵素的活性毒素、その酵素的活性断片、及び／またはその立体異性体；シクロプロパンドリン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；シクロプロピルベンジンドール、その類似体、その誘導体，及び／またはその立体異性体；ならびにエリナフィド、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体から選択される、項目１〜１３のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１５）
Ｘが、約−４〜約１２または約２〜約１２のｐＫａを有する、項目１〜１４のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目１６）
構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物であって、
【化１２６】
0006621919.tif 000207
式中、
担体が、システイン硫黄原子ＳＡを含み、
ｐが、１、２、３、４、５、６、７、または８であり、
Ｒ１及びＲ２が独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環もしくは４〜６員環を形成し、
Ｓｐが、スペーサーであり、ｎが、０または１であり、
Ｄが、薬物部分である、前記ジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目１７）
Ｒ１及びＲ２が独立して、Ｈ、−ＣＨ３、及び−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、項目１６に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目１８）
Ｒ１及びＲ２が各々、−ＣＨ３であるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、項目１７に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目１９）
ｎが、０であり、カルボニル炭素原子と前記薬物部分との間の前記結合が、エーテルであるか、または非環式もしくは環式アミン薬物部分原子から形成される三級アミンである、項目１６〜１８のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２０）
ｎが、１であり、Ｓｐ−Ｄが、以下の構造のものであり、
【化１２７】
0006621919.tif 000208
式中、
Ｒ３０が、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−６ヒドロカルビル、非置換または置換Ｃ５−６炭素環、及び非置換または置換Ｃ５−６複素環から選択され、から選択され、
波線が、前記スペーサーの前記カルボニル炭素原子への結合点を示し、及び
前記Ｓｐカルボニル炭素原子の前記薬物部分への結合が、脂肪族一級アミン薬物部分原子から形成される二級アミンであるか、脂肪族二級アミン薬物部分原子から形成される三級アミンであるか、または非環式もしくは環式アミン薬物原子から形成される三級アミンである、項目１６〜１９のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２１）
Ｒ３０が、Ｈである、項目２０に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２２）
前記担体が、１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体である、項目１６〜２１のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２３）
前記抗体が、コンジュゲートのために操作された少なくとも１つのシステインスルフヒドリル部分を含み、前記抗体が、
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原２）、（４）ＭＵＣ１６（０７７２Ｐ、ＣＡ１２５）、（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、（６）Ｎａｐｉ２ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、（８）ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来の成長因子）、（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）もしくはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ７３７９２）、（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、（１７）ＨＥＲ２、（１８）ＮＣＡ、（１９）ＭＤＰ、（２０）ＩＬ２０Ｒα、（２１）Ｂｒｅｖｉｃａｎ、（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、（２３）ＡＳＬＧ６５９、（２４）ＰＳＣＡ、（２５）ＧＥＤＡ、（２６）−ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３）、（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）、（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ）、（２９’ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１）、（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開閉型イオンチャネル５）、（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、（３５）ＦｃＲＨ５（ＩＲＴＡ２、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）、（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、（���７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン−１）、（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−アルファ−１）、（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２（アフリカツメガエル）、ＳＨＩＳＡ２）、（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、（５２）ＣＤ３３、ならびに（５３）ＣＬＬ−１から選択される、項目２２に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２４）
前記抗体が、システイン操作された抗体である、項目２２または２３に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２５）
前記システイン操作された抗体が、ＬＣ  Ｋ１４９Ｃ、ＨＣ  Ａ１１８Ｃ、ＬＣ  Ｓ１２１Ｃ、またはＬＣ  Ｖ２０５Ｃをリンカーコンジュゲートの部位として含む、項目２４に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２６）
前記抗体が、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３３、抗Ｎａｐｉ２ｂ、及び抗ＣＬＬ−１から選択される、項目２２〜２５のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２７）
ｐが、１、２、３、または４である、項目１６〜２６のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２８）
前記抗体−薬物コンジュゲート化合物の混合物を含み、前記抗体−薬物コンジュゲート化合物の混合物中の１抗体当たりの平均薬物負荷が、約２〜約５である、項目１６〜２７のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目２９）
前記担体が、タンパク質である、項目１６〜２１のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目３０）
前記タンパク質が、アルブミンである、項目２９に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目３１）
前記担体が、ペプチドである、項目１６〜２１のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目３２）
前記ペプチドが、細胞透過性ペプチドアンテナペディアホメオドメイン、Ｔａｔ  ＨＩＶタンパク質、及び操作されたカチオン性ペプチドから選択される、項目３１に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目３３）
前記薬物部分が、マイタンシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；オーリスタチン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ドラスタチン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；カリケアマイシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）単量体もしくは二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）単量体もしくは二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ＣＢＩ−ＰＢＤ二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；アマトキシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ゲルダナマイシン、その類似体、その誘導体、その酵素的活性毒素、その酵素的活性断片、及び／またはその立体異性体；シクロプロパンドリン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；シクロプロピルベンジンドール、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ならびにエリナフィド、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体から選択される、項目１６〜３２のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物。
（項目３４）
構造（ＩＩ）のジスルフィドコンジュゲート化合物を調製する方法であって、
【化１２８】
0006621919.tif 000209
前記方法が、
（Ａ）
（ｉ）水を含む、溶媒系、
（ｉｉ）リンカー硫黄原子に結合して、前記ジスルフィド結合を形成することができる硫黄原子ＳＡを有するスルフヒドリル部分を有する少なくとも１つのシステインを含む、担体、及び
（ｉｉｉ）構造（Ｉ）の化学量論過剰のリンカー−薬物コンジュゲート化合物であって、
【化１２９】
0006621919.tif 000210
式中、
Ｘが、脱離基であり、
前記脱離基及び前記リンカーが、ジスルフィド結合を介して結合し、
Ｒ１及びＲ２が独立して、Ｈ及びＣ１−３アルキルから選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであり得るか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、酸素ヘテロ原子を含む３〜６員環もしくは４〜６員環を形成し、
Ｓｐが、スペーサーであり、ｎが、０または１であり、
Ｄが、薬物部分である、リンカー−薬物コンジュゲート化合物を含む、反応混合物を形成することと、
（Ｂ）前記反応混合物を反応させて、構造（ＩＩ）の前記ジスルフィドコンジュゲート化合物を含む生成混合物を形成することであって、式中、ｐが、１、２、３、４、５、６、７、または８であり、前記生成混合物中の複数の形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物のｐの平均値が、約１〜約５、約１．５〜約３、約１．５〜約２．５、約１．７〜約２．３、約１．８〜約２．２、または約２である、形成することと、を含む、前記方法。
（項目３５）
前記生成混合物が、少なくとも１つの脱離基副生成物種を更に含み、ＬＣ／ＭＳによって測定される、形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物の面積パーセンテージと比較して、全脱離基副生成物種の面積パーセンテージが、５面積％未満、４面積％未満、３面積％未満、２面積％未満、１面積％未満、０．５面積％未満である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記生成混合物が、（ｉ）２つのシステインスルフヒドリル部分の反応によって形成される、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む非コンジュゲート担体単量体種と、（ｉｉ）２つのシステインスルフヒドリル部分の反応によって形成される、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む非コンジュゲート担体二量体種と、（ｉｉｉ）非コンジュゲート担体単量体種と非コンジュゲート担体二量体種との組み合わせと、を含む非コンジュゲート担体化合物を更に含み、ＬＣ／ＭＳによって測定される、形成されたジスルフィドコンジュゲート化合物の面積パーセンテージと比較して、非コンジュゲート担体化合物の合計濃度が、５面積％未満、４面積％未満、３面積％未満、２面積％未満、１面積％未満、０．５面積％未満、０．３面積％未満、０．１面積％未満、または検出不能である、項目３４または項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記溶媒系が、生物学的緩衝液を含み、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０のｐＨ、及び約５．０〜約９．０、約５．０〜約９．０、約６．０〜約９．０、約６．５〜約９．０、または約７．０〜約９．０、または約７．５〜約８．５などのその範囲を有する、項目３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記溶媒系が、
アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、エチレングリコール、及びジクロロメタンから選択される、少なくとも１つの極性非プロトン溶媒を更に含み、
前記溶媒系中の前記極性非プロトン溶媒濃度が、約５体積％、約１０体積％、約１５体積％、約２０体積％、約２５体積％、約３０体積％、約４０体積％、または約５０体積％、及び約５体積％〜約５０体積％、約２５体積％〜約５０体積％、約５体積％〜約３０体積％、約５体積％〜約２０体積％、約５体積％〜約１５体積％、または約１０体積％などのその範囲である、項目３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記溶媒系が、
約６．０〜約９．０、約６．０〜約８．５、約７．０〜約８．５、または約７．５〜約８．５のｐＨを有する、５０ｍＭ〜１００ｍＭのトリス、ビス−トリス、またはＨＥＰＥＳから選択される、少なくとも５０体積％または少なくとも７５体積％の生物学的緩衝液と、
約５体積％〜約２５体積％のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドもしくはジメチルアセトアミド、または約１０体積％〜約５０体積％のプロピレングリコールもしくはエチレングリコールと、を含む、項目３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記反応混合物中の前記抗体濃度が、約１ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、または約２５ｍｇ／ｍＬ、及び約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、または約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬなどのその範囲である、項目３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
リンカー−薬物コンジュゲート化合物対前記担体の当量比が、約２：１、約３：１、約５：１、約１０：１、約１５：１、または約２０：１、及び約２：１〜約２０：１、約３：１〜約１５：１、約３：１〜約１０：１、または約５：１〜約１０：１などのその範囲である、項目３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記反応温度が、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、または約５０℃、及び約１０℃〜約５０℃、約１５℃〜約４５℃、約１５℃〜約４０℃、約２０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３５℃、または約２０℃〜約３０℃などのその範囲であり、
前記反応時間が、約０５時間、約１時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、または約４８時間、及び約０．５時間〜約４８時間、または約１時間〜約２４時間などのその範囲である、項目３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
Ｘが、以下、
【化１３０】
0006621919.tif 000211
から選択され、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、Ｘ１〜Ｘ５のうちの少なくとも１つが、Ｎであり、破線が、任意の二重結合を表し、Ａが、６員環を表し、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４が独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、Ｙ１〜Ｙ４のうちの少なくとも１つが、Ｎであり、破線が、任意の二重結合を表し、Ｂが、５員環を表し、
Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、及びＺ６が独立して、Ｃ、Ｎ、Ｓ、またはＯであり、Ｚ１及びＺ２のうちの少なくとも１つが、Ｎであり、破線が、任意の二重結合を表し、Ｅが、６員環を表し、Ｄが、縮合５員環を表し、
各Ｒ３が独立して、−Ｃ１−４アルキル、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｒ５、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）（Ｒ６）、−ＯＲ５、−Ｃｌ、−Ｆ、−ＣＮ、及び−Ｂｒから選択され、
Ｒ５及びＲ６が独立して、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−６ヒドロカルビル、非置換または置換Ｃ５−６炭素環、及び非置換または置換Ｃ５−６複素環から選択され、
Ｒ５’が、Ｃ１−４アルキルであり、
ｑが、０、１、２、または３であり、
脱離基１、脱離基２、脱離基３、及び／または脱離基４の環構造内の各炭素原子が、非置換であるか、またはＲ５で置換され、
脱離基１、脱離基２、脱離基３、及び／または脱離基４の前記環構造内の各窒素原子が、非置換であるか、またはＲ５で置換されて、三級アミンまたは四級アミンを形成し、及び
波線が、前記脱離基の前記硫黄原子Ｓへの結合点を示し、それによりジスルフィド結合を形成する、項目３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、及びＸ５が独立して、ＣまたはＮであり、Ｘ１〜Ｘ５のうちの２つ以下が、Ｎであり、環Ａが、不飽和であり、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４が独立して、ＣまたはＮであり、環Ｂが、不飽和であり、
Ｚ１が、Ｎであり、Ｚ２が、Ｎ、Ｓ、及びＯから選択され、Ｚ３〜Ｚ６が独立して、Ｃ及びＮから選択され、Ｚ３〜Ｚ６のうちの２つ以下が、Ｎであり、環Ｅが、不飽和であり、
各Ｒ３が独立して、−ＣＨ３、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣＨ３、及び−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
Ｘが、以下、
【化１３１−１】
0006621919.tif 000212
【化１３１−２】
0006621919.tif 000213
【化１３１−３】
0006621919.tif 000214
から選択される、項目４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
Ｒ１及びＲ２が独立して、Ｈ、−ＣＨ３及び−ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｒ１及びＲ２のうちの１つのみが、Ｈであるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成する、項目３４〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
Ｒ１及びＲ２が各々、−ＣＨ３であるか、またはＲ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラン、及びテトラヒドロピランから選択される環を形成し、Ｘが、脱離基３及び脱離基４から選択される、項目３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
Ｘが、以下、
【化１３２】
0006621919.tif 000215
から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
Ｒ１及びＲ２が各々、−ＣＨ３であり、Ｘが、
【化１３３】
0006621919.tif 000216
である、項目４８に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目５０）
（ｉ）Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、Ｈであるか、（ｉｉ）Ｒ１が、−ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２が、Ｈであるか、または（ｉｉｉ）Ｒ１及びＲ２が、それらが結合している炭素原子とともに、シクロブチル環を形成し、Ｘが、脱離基１である、項目３４〜４６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
Ｘが、以下、
【化１３４】
0006621919.tif 000217
である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ｎが、０であり、前記束縛リンカーカルボニル炭素原子と前記薬物部分との間の前記結合が、エーテルであるか、または非環式もしくは環式アミン薬物部分原子から形成される三級アミンである、項目３４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
ｎが、１であり、Ｓｐ−Ｄが、以下の構造のものであり、
【化１３５】
0006621919.tif 000218
式中、
Ｒ３０が、Ｈ、非置換または置換Ｃ１−６ヒドロカルビル、非置換または置換Ｃ５−６炭素環、及び非置換または置換Ｃ５−６複素環から選択され、から選択され、
波線が、前記スペーサーの前記束縛リンカーカルボニル炭素原子への結合点を示し、
前記Ｓｐカルボニル炭素原子の前記薬物部分への結合が、脂肪族一級アミン薬物部分原子から形成される二級アミンであるか、脂肪族二級アミン薬物部分原子から形成される三級アミンであるか、または非環式もしくは環式アミン薬物部分原子から形成される三級アミンである、項目３４〜５２のいずれか１項に記載のリンカー−薬物化合物。
（項目５４）
Ｒ３０が、Ｈである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記薬物部分が、マイタンシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；オーリスタチン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ドラスタチン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；カリケアマイシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）単量体もしくは二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；１−（クロロメチル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール（ＣＢＩ）単量体もしくは二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ＣＢＩ−ＰＢＤ二量体、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；アマトキシン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ゲルダナマイシン、その類似体、その誘導体、その酵素的活性毒素、その酵素的活性断片、及び／またはその立体異性体；シクロプロパンドリン、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；シクロプロピルベンジンドール、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体；ならびにエリナフィド、その類似体、その誘導体、及び／またはその立体異性体から選択される、項目３４〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
Ｘが、約−４〜約１２または約２〜約１２のｐＫａを有する、項目３４〜５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
項目１６〜３３のいずれか１項に記載のジスルフィドコンジュゲート化合物と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
（項目５８）
治療有効量の化学療法剤を更に含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
（項目５９）
患者に、項目５７または項目５８に記載の薬学的組成物を投与することを含む、癌を治療する方法。
（項目６０）
前記患者が、前記抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせて、化学療法剤を投与される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
哺乳動物における癌の治療のための医薬品の製造における、項目１６〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物の使用。
（項目６２）
癌の治療のための方法において使用するための、項目１６〜３３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート化合物。
（項目６３）
項目５７または項目５８に記載の薬学的組成物と、容器と、前記薬学的組成物が癌の治療に使用され得ることを示す添付文書またはラベルと、を含む、製造品。
【図１】
0006621919.tif 000235
【図２】
0006621919.tif 000236
【図３】
0006621919.tif 000237
【図４】
0006621919.tif 000238
【図５】
0006621919.tif 000239
【図６】
0006621919.tif 000240
【図７】
0006621919.tif 000241
【図８】
0006621919.tif 000242
【図９】
0006621919.tif 000243
【図１０】
0006621919.tif 000244
【図１１Ａ】
0006621919.tif 000245
【図１１Ｂ】
0006621919.tif 000246
【図１１Ｃ】
0006621919.tif 000247
【図１１Ｄ】
0006621919.tif 000248
【図１１Ｅ】
0006621919.tif 000249
【図１１Ｆ】
0006621919.tif 000250
【図１２Ａ】
0006621919.tif 000251
【図１２Ｂ】
0006621919.tif 000252
【図１２Ｃ】
0006621919.tif 000253
【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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