(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の治療剤の送達に好適なナノ粒子製剤であって：
ナノ粒子が、カチオン性リポソームであり、
該リポソームが、
（ｉ）式：Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜１０であり、ｙは、１〜１０であり、ｚは、１〜１０である）のポリアミン炭化水素付加物を有するコレステロールを含む、カチオン性コレステロール誘導体；
（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含む、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンの飽和中性リン脂質；
（ｉｉｉ）コレステロールまたは、酢酸コレステリル、酪酸コレステリル、吉草酸コレステリル、カプリル酸コレステリル、ドデカン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ヘプタデカン酸コレステリル、ステアリン酸コレステリル、リノール酸コレステリル、リノールエライジン酸コレステリル、パルミチン酸コレステリル、パルミトエライジン酸コレステリル、ミリスチン酸コレステリル、ベヘン酸コレステリル、エルカ酸コレステリル、アラキドン酸コレステリル、１０−ウンデカン酸コレステリル、およびフェニル酢酸コレステリルからなる群から選択される中性コレステロール誘導体；および
（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と少なくとも１００の分子量を有するポリエチレングリコール鎖とを含む、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含み、および
該製剤が、さらに、１〜６個の炭素原子からなる脂肪族のカルボン酸である１つ以上の治療剤を含む、製剤。
【請求項２】
治療剤が、該リポソーム内に封入されている、請求項１に記載のナノ粒子製剤。
【請求項３】
治療剤が、酢酸、プロピオン酸、および酪酸からなる群から選択される、請求項１または２に記載のナノ粒子製剤。
【請求項４】
治療剤が酢酸である、請求項３に記載のナノ粒子製剤。
【請求項５】
ナノ粒子の平均サイズが１〜５００ｎｍの範囲にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤。
【請求項６】
封入されている治療剤の濃度が、０．１〜２０ｍＭの範囲にある、請求項２〜５のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤。
【請求項７】
該リポソームが、
（ｉ）式：Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜４であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜４である）のポリアミン炭化水素付加物を有するコレステロールを含む、カチオン性コレステロール誘導体；
（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含む、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンの飽和中性リン脂質；
（ｉｉｉ）コレステロールまたは、酢酸コレステリル、酪酸コレステリル、吉草酸コレステリル、カプリル酸コレステリル、ドデカン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、およびステアリン酸コレステリルからなる群から選択される中性コレステロール誘導体；および
（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と、分子量が１５００〜２０００のポリエチレングリコール鎖とを含む、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含み、および
治療剤が、酢酸、プロピオン酸および酪酸からなる群から選択され、および、該リポソーム内に封入されている、請求項１、５および６のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤。
【請求項８】
（ｉ）〜（ｉｖ）のモル比が、以下の範囲を満たす、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤；
（ｉ）２０〜４０；
（ｉｉ）２０〜４０；
（ｉｉｉ）２５〜５５；および
（ｉｖ）１〜１０。
【請求項９】
腫瘍標的薬剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤。
【請求項１０】
腫瘍標的薬剤が、哺乳類の非腫瘍組織の細胞における受容体の発現と比較して、腫瘍細胞において過剰発現している受容体のリガンドを含む、請求項９に記載のナノ粒子製剤。
【請求項１１】
腫瘍標的薬剤が、葉酸部分を含み、または腫瘍標的薬剤が、リン脂質−ポリエチレングリコール−葉酸化合物である、請求項１０に記載のナノ粒子製剤。
【請求項１２】
リン脂質−ポリエチレングリコール−葉酸化合物が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−葉酸［ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（２０００）−葉酸］である、請求項１１に記載のナノ粒子製剤。
【請求項１３】
製剤に存在する葉酸部分の量が、全製剤の１〜２ｍｏｌ％である、請求項１１または１２に記載のナノ粒子製剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤、および、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
医薬品を製造するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤、または請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１６】
肥満、心血管系疾患、二型糖尿病、卒中、癲癇または癌を含む代謝調節異常の予防または治療用医薬品の製造のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤、または請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤、または請求項１４に記載の医薬組成物を含有する、肥満、心血管系疾患、二型糖尿病、卒中、癲癇または癌を含む代謝調節異常の予防または治療剤。
【請求項１８】
有機溶媒の（ｉ）〜（ｉｖ）の溶液を用意して、溶媒を蒸発させて（ｉ）〜（ｉｖ）の混合物の薄膜を得ること；
薄膜を１つ以上の治療剤を含む所定の容積の極性溶液で戻すこと；
極性溶液を撹拌することによって、（ｉ）〜（ｉｖ）の混合物と、極性溶液中の１つ以上の治療剤との分散液を形成させること；
任意で、分散液をおよそ７のｐＨに緩衝すること；および
任意で、濾過によって分散液を純化することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のナノ粒子製剤を調製する方法。
【請求項１９】
極性溶液が、音波処理によって撹拌され；
分散液が、透析濾過によって純化され；
分散液を、およそ７のｐＨに緩衝した後、且つ純化する前に、０〜１０℃で低温保温し；および／または
薄膜を戻すために使用する極性溶液中の１つ以上の治療剤の濃度が、１ｍＭ〜１０Ｍの範囲にある、
請求項１８に記載のナノ粒子製剤を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子製剤に関する。特に、それは、代謝疾患および癌疾患の治療のための治療剤の、ナノ粒子によって補助される送達に関するが、それに限られるわけではない。
【背景技術】
【０００２】
細胞の代謝制御不全は、癌を含めて、多くの慢性病の発症において中心的な前提である。近年、小さい分子の使用によって異常な細胞および組織の代謝的再変換（metabolic re-transformation）を達成する代謝工学の可能性に新たな関心が寄せられている。しかしながら、そうした方法によって、代謝的な影響を十分かつ持続的になすことは困難であり得、なぜなら、それは、好適な小さい分子を識別する必要があり、送達の適切なモードを開発する必要があるためである。
【０００３】
代謝工学は、それが細胞の代謝活性のシステマチックな操作および細かい調整を可能にするため、有力かつ効果的なツールを提供する。調節異常状態または癌化状態の代謝を再設計（reengineer）する手段が望ましい。そうした手段が、肥満、癌の範囲、および代謝不安定に関するあらゆる関連する病状の予防または治療において、特定の用途を有し得る。
【０００４】
肥満は、世界的な健康上の懸念事項であり、二型糖尿病、高血圧および心血管系疾患を含み、かつ、多くの癌型の発症の独立危険因子となる多くの合併性に関与している。世界中での肥満率上昇の社会的および経済的負担は、介入的治療の方策に対する差し迫った需要があることを意味する。
【０００５】
特に、肝臓は、身体の代謝を制御するにあたって、根本的な役割をする。広範な疫学の研究により、肥満を引き起こす状態が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、および、最も顕著なことに、たったの４〜８％が５年の生存率を有する最も致死的な癌の１つである肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症に関連しているということが実証された。過度の肝臓のトリグリセリド合成の結果として、過度のカロリー摂取の後に肝臓の機能障害が起こり得、そしてそれが肝実質細胞において脂質の過蓄積につながることが、研究によって示されている。また、こうした脂肪の蓄積が、炎症、ＨＣＣの発症を媒介すると考えられる脂肪性肝炎の進行性の状態を伴う恐れがある。
【０００６】
現在、肥満に対処する最も効果的な治療は、食事の改善および定期的運動に焦点を合わせている。提案される食事パターンは、繊維と、食物の容積あたりの代謝可能なエネルギー含有量を薄める水分との量が多いため、果物、野菜および全粒を含む。エネルギー密度の主要な決定要因である食物繊維の多い食事が、体重の減少、全身脂肪および血糖値を含め、代謝性症候群の症状に有益な効果を有することが、以前の研究によって示されている。食物繊維の摂取が殆どの先進国において有意に減り、主要な食物繊維のタイプが、ナッツ、種子および芋から得られる高発酵性炭水化物から、低発酵性穀物粒繊維に変化したこともまた、概算によって示唆されている。
【０００７】
特に、齧歯動物において発酵性炭水化物の摂取を増やすと、大腸短鎖脂肪酸の産生の増加、体重の減少、およびインスリン感受性の向上につながることが示された。人による多くの試みによっても、発酵性炭水化物が、食欲抑圧および減量を補助し得ることが示唆された。
【０００８】
発酵性炭水化物が媒介する食欲の変化の背後のメカニズムは、大部分が以前として未知であるが、１つの仮説が、短鎖脂肪酸（腸における炭水化物発酵の最終生産物）が食欲抑制ホルモンの血中濃度を上昇させていることを指摘している。しかしながら、ヒトにおいて、発酵性炭水化物の摂取を増やした結果としての食欲の抑圧が、血中食欲抑制ホルモンの増加と関連していることを一貫して実証することは困難であった。
【０００９】
実際、発酵性炭水化物を多く含む食事によって、または、直接な投与（例えば、腹腔内注射）を介して起こる短鎖脂肪酸濃度の長期的な上昇によって得られる食欲抑制効果が、食欲抑制ホルモンの増加の結果だけでなく、中枢神経系への直接的効果であり得ることを、本発明の発明者らは発見した。しかしながら、短鎖脂肪酸を治療に使用することに関連する１つの問題は、それが、結腸細胞および肝臓によって容易に代謝され、非常に低い濃度で末梢循環に到達するという事実に関連する。従って、無毒、かつ、有益な治療効果をもたらすであろう濃度で、そうした化合物を投与することは困難である。
【００１０】
ブチラート等、短鎖脂肪酸は、主に未消化の食物性炭水化物の腸内細菌による発酵によって生産されることが既に知られており、あり得る治療効果を示すことが知られている。例えば、ブチラートは、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害因子として作用することが知られており、従って、多くの腫瘍細胞型において、細胞周期の停止、分化および／またはアポトーシスを強いる能力がある（Chen et al. Curr Cancer Drug Targets, 2003, 3 (3), 219-36）。加えて、それが、結腸癌腫細胞の増殖を低減し、その細胞アポトーシスを誘発することが示され、そのため、代謝症候群の治療における有用性が発見された（Canini et al. World J Gastroenterol 2011, 17 (12), 1519-28）。
【００１１】
しかしながら、特に、ブチラートは、非常に短い半減期を有するため、生体内での使用があまり成功していない。従って、有益な効果を引き出すためには、高い濃度で投与することが必要とされる。従って、以前の研究は、ブチラートを制御した形で送達するための手段を提供することに焦点が置かれた。
【００１２】
例えば、Coradini et al. Cancer Therapy 2004, 2, 201-16は、ヒトの固体腫瘍の治療において、ブチラート等、ＨＤＡＣ阻害因子の好適なキャリアとしてヒアルロナンの使用について記載している。Hamer et al. Aliment Pharmacol Ther 2008, 27, 104-119は、結腸機能におけるブチラートの影響について記載しており、徐放性ｐＨ依存性コーティングでコーティングされた錠剤によるブチラートの送達、ブチラートを生産するプロバイオティクス細菌の消費、ブチラート誘導体（トリブチルティン等）を含むプロドラッグ、および、ブチラートを遠位の腸に送達するための直腸用浣腸の利用についてまとめている。
【００１３】
短鎖脂肪酸を送達するための方策の他の例として、ＷＯ２００６／１２７９７７に記載されているものが挙げられ、これは、プロドラッグ様小分子としての特定の糖−ブチラートハイブリッド分子の使用について詳述している。ＷＯ２００６／０７６３４は、アミノ酸、例えば、セリンへの付着によって短鎖脂肪酸を送達するためのプロドラッグに基づいたアプローチについて記載している。ＷＯ２００６／１２８８８８は、それぞれの短鎖脂肪酸の徐放のための、共有結合で結合したコレステロール−プロピオネート／ブチラート誘導体を含む固体脂質ナノ粒子について記載している。さらに、ＷＯ２００２／０２４１９５は、結腸炎等、胃腸疾患の治療に有用な短鎖脂肪酸をアルコキシ単位として含むキャリアとしてのアルコキシル化アシルグリセリンに関する。しかしながら、これら先行技術の例のいずれも、そのままでは、必要な対象部位へ効果的に放出および分布するべく、そうした治療剤を選択される標的器官に送達することができない。
【００１４】
従って、本発明の目的は、中枢神経系への治療剤の長期の送達を促すのに好適なナノ粒子製剤を提供することである。
【００１５】
本発明の一態様では、１つ以上の治療剤の送達に好適なナノ粒子製剤が提供され、該製剤は、（ｉ）カチオン性コレステロール誘導体、（ｉｉ）中性リン脂質、（ｉｉｉ）コレステロールまたは中性コレステロール誘導体、および（ｉｖ）ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含む。
【００１６】
本発明の脂質ベースのナノ粒子の特定の設計によって、標的器官への治療薬剤の制御された送達が達成され得る。短鎖脂肪酸の場合、これには、肝細胞脂質値におけるプラスの効果、体脂肪停滞の低下、および関連する癌増殖の速度の低下をもたらす可能性がある。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「中性」は、選択されたｐＨで、非荷電または中性の両性イオンの形で存在するものをいう。用語「カチオン性」は、選択されたｐＨで、正に電荷した形で存在するものをいう。好適なｐＨは、例えば、７．４＋／−０．５であり得る。
【００１８】
用語「リン脂質」は、通常、負に荷電したリン酸基を含む親水頭部基と、疎水尾部基とを含む脂質をいう。好適な例として：ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）；ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）；ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）；ホスファチジルセリン（ＰＳ）；ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）；ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）；ホスファチジルイノシトールビスリン酸（ＰＩＰ２）；ホスファチジルイノシトールトリリン酸（ＰＩＰ３）；セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）；セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ−ＰＥ）；およびセラミドホスホリルグリセロールをベースとする脂質が挙げられる。
【００１９】
用語「短鎖脂肪酸」は、直鎖または分鎖であり得る１〜６個の炭素原子からなる脂肪族のカルボン酸をいう。好適な短鎖脂肪酸として：蟻酸；酢酸；プロピオン酸；酪（ブタン）酸；イソ酪（２−メチルブタン）酸；吉草（ペンタン）酸；イソ吉草（３−メチルブタン）；およびカプロン（ヘキサン）酸、ならびにジクロロ酢酸（ＤＣＡ）等、ハロゲン化誘導体を含む類似体が挙げられる。一方、用語「脂肪酸」は、Ｃ７−２４の炭素鎖を含む、直鎖または分鎖、飽和または不飽和カルボン酸またはその誘導体をいう。通常、飽和脂肪酸は、Ｃ１２−２４の炭素鎖を含む。
【００２０】
用語「ナノ粒子」は、それらの輸送および特性について１つの単位として作用する小さい粒子をいい、通常、１〜５００ｎｍ（好ましくは、１〜２５０ｎｍ）の範囲の平均粒子サイズ直径（例えば、光分散技術によって決定される）を示す。用語「超微小粒子」は、用語「ナノ粒子」と同義的に使用され得る。リポソームは、脂質二分子層からなる人工的に調製された小胞とみなされ得る例示的なタイプのナノ粒子である。
【００２１】
用語「ＰＥＧ化」は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖に共有結合で付着しているもの、通常、ポリマーまたは脂質ベースのものをいう。ＰＥＧ鎖は、分子式Ｃ２ｎＨ４ｎ＋２Ｏｎ＋ｉ由来であり、２０，０００ｇ／ｍｏｌｅ未満の分子質量を有する。
【００２２】
製剤は、ナノ粒子によって送達されるべき１つ以上の治療剤をさらに含み得る。ナノ粒子の物理的な性質および組成によって、治療剤は、対象となる解剖学的位置へ送達でき、該位置で、その後、薬剤が放出される。放出は、直接、対象となる細胞または器官の中で、または、最初は周囲組織に、次に、循環系を介して、脳等、身体の他の位置へとなされ得る。
【００２３】
そのような治療剤は、粒子の表面への化学的付着、すなわち、共有結合によって、粒子の物理的構造への取込みによって、または、粒子の内部容積における封入によって、ナノ粒子と結びついてよい。例えば、好ましい実施形態では、ナノ粒子は、カチオン性リポソーム等、リポソームであり、そのため、リポソームは、略球状であり得、１つ以上の脂質二分子層膜を含み得る。本実施形態では、１つ以上の治療剤は、封入されている水容積、またはリポソームの疎水内部構造内に含まれ得る。リポソーム技術をこのような形で使う１つの利点は、治療剤の放出を制御することで、一定の組織、例えば、肝臓を標的とすることが可能であるため、循環する薬剤の量が増え、より長い期間にわたって、より一定にその送達を助けることである。
【００２４】
治療剤がナノ粒子、またはリポソームに封入されているとき、封入されている治療剤の濃度は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは、０．５〜１５ｍＭ、より好ましくは、１〜１０ｍＭの範囲にあり得る。特に好ましい実施形態では、封入されている濃度は、１〜７ｍＭの範囲にある。
【００２５】
本発明の製剤における使用に特に好適な一群の治療剤は、短鎖脂肪酸である。そうした短鎖脂肪酸は、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸および／または吉草酸を含む。短鎖脂肪酸受容体（例えば、ＦＦＡＲ２およびＦＦＡＲ３）は、人体全体で広く見受けられ、従って、糖尿病および肥満、ならびに関連する癌の治療にとって理想的な標的となる。
【００２６】
他の小さい分子の治療と比較して、特に、酢酸、プロピオン酸、および酪酸は、ヒトにおけるそれらの好ましい毒性学的プロファイルにより、治療の観点から好まれる。さらに、酢酸が、本発明のナノ粒子製剤に封入されるというその性向、製剤自体におけるその安定性、ならびに、食欲抑圧、体脂肪停滞、および関連する癌の増殖抑圧に対するその明らかなプラスの効果に関して、特に効果的であることを本発明の発明者らは発見した。生体分布研究により、肝臓、心臓、腎臓およびリポソームの菌組織が、請求される製剤を多く吸収することが示されている。
【００２７】
ナノ粒子のサイズが制限因子となることが発見されていない。しかしながら、実際的な観点から、ナノ粒子の平均サイズ（例えば、光分散技術によって測定される直径）は、１〜５００ｎｍ、好ましくは、１０〜３００ｎｍ、より好ましくは、２０〜２５０ｎｍの範囲にあり得る。より具体的には、そのようなナノ粒子の物理的形成と、それによる治療剤の封入とに関しては、３０〜２００ｎｍ、特に、４０〜１２０ｎｍの平均サイズのナノ粒子が好ましいことが理解されよう。４０〜１２０ｎｍのサイズ範囲のナノ粒子が、より容易に形成され、貯蔵および投与に関して、より高いレベルの安定性を示す。本文で記載される実施例のナノ粒子の平均サイズを、粒子サイズについては動的な光分散原理を、ゼータ電位については電気泳動光散乱法を使って、ゼータサイザーナノＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．ＵＫ）で測定した。
【００２８】
１つ以上の治療剤がナノ粒子に封入されているとき、封入されている薬剤の濃度が０．１〜１００ｍＭ、好ましくは、０．１〜５０ｍＭ、０．１〜２５ｍＭ、または０．５〜１５ｍＭの範囲にあることが有利である。より好ましくは、封入されている薬剤の濃度は、１〜１０ｍＭの範囲にあるが、何故なら、これによって、より安定したナノ粒子を生じ、適切な量の薬剤によって、必要とされる生物学的な効果を引き出すことができるようになるためである。封入されている薬剤の濃度は、核磁気共鳴スペクトル測定法を使って決定され得る。本文に記載する実施例では、５ｍｍのインバースモードＢＢＩプローブを有するＢｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ、ＵＳＡ）において、以下のパラメータで、１ＨＮＭＲスペクトルが得られた：５００．１３ＭＨｚ、スウィープ幅１２ｐｐｍ（６００９Ｈｚ）、データポイント３２ｋ、取得時間２．７２６秒、弛緩遅延３秒（全待ち時間（recycle delay）５．７２６秒）、パルス幅６μｓ（５５度パルスに対応する）、平均６４、および温度２９８Ｋ。ＭｅｓｔＲｅ‐Ｃソフトウェアを使って、得られたスペクトルを分析した。自由誘発減衰（ＦＩＤ）信号を、ノイズを低減するためにアポダイズして、フーリエ変換した。スプライン関数を使ってベースライン補正を実行して、相対的定量のためにピークを統合した。封入されている薬剤の濃度を、１．３ｐｐｍの乳酸の参照ピークに対して決定した。
【００２９】
本発明の製剤は、カチオン性コレステロール誘導体を含む。そうした誘導体は、コレステロールベースの炭化水素骨格を、ポリアミン炭化水素鎖等、極性有機尾部基に結合した頭部基として含み得る。頭部基は、共通のコレステロール構造をベースとする任意の骨格であってよいが、コレステロールは、特に好ましく、３−ヒドロキシル基を介して尾部基に結合され得る。好適な特定のカチオン性コレステロール誘導体としては、４−アザ−Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−１，７−ヘプタンジアミン（ＡＣＨ）、Ｎ１−コレステリルオキシ−カルボニル−３．７−ジアザ−１．９−ノナンジアミン（ＣＤＡＮ）、Ｎ１０−コレステリルオキシカルボニル−４、８、１３−トリアザ−１、１６−ヘキサデカンジアミン（ＣＴＡＨ）、Ｎ１−コレステリルオキシ−カルボニル−４，９−ジアザ−１，１２−ドデカンジアミン（ＣＤＡＤ）、および、Ｎ１５−コレステリルオキシカルボニル−３，７，１２−トリアザ−１，１５−ペンタデカンジアミン（ＣＴＡＰ）が挙げられる。尾部基の構造に移るが、以下の式に基づいたポリアミン付加物が好ましい：Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜１０であり、ｙは、１〜１０であり、ｚは、１〜１０である）。本実施形態では、ｘは、好ましくは、１〜４であり、ｙは、好ましくは、１〜４であり、ｚは、好ましくは、１〜４である。このコレステロールベースのカチオン脂質により、肝細胞へのナノ粒子の吸収が増大すると考えられる。加えて、それは、あらゆる治療剤を封入されたままにするのを助ける。実施形態において、カチオン性コレステロール誘導体は、Ｎ１−コレステリルオキシ−カルボニル−３，７−ジアザ−１，９−ノナンジアミン（ＣＤＡＮ）である。
【００３０】
本発明の製剤はまた、中性リン脂質を含む。製剤に含めるのに好適な中性リン脂質として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等、ホスファチジルエタノールアミン；ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）等、ホスファチジルコリン；ホスファチジルグリセリン；ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）およびジステアロイルホスファチジルグリセリン（ＤＳＰＧ）等、ホスファチジルグリセリン；ジオレオイル−またはジパルミトイルホスファチジルセリン等、ホスファチジルセリン；ならびに、ジホスファチジルグリセリンが挙げられる。中性リン脂質は、飽和中性リン脂質、好ましくは、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン脂質であり得る。中性リン脂質がホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミン脂質であるとき、脂質は、好ましくは、Ｃ７−２４、より好ましくは、Ｃ８−２２、最も好ましくは、Ｃ１０−２０の脂肪酸鎖を含む。特に、Ｃ１０−２０の脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリン脂質が好ましい。そうした脂質の脂肪酸鎖がＣ１０−２０の範囲にあるとき、より安定したナノ粒子が形成されると考えられる。最も好ましくは、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である。
【００３１】
本発明の製剤はまた、コレステロール（ＩＵＰＡＣ名：（３β）−コレスト−５−エン−３−オール）または中性のコレステロール誘導体を含む。中性のコレステロール誘導体は、３−ヒドロキシル基、例えば、エステル結合によって、炭化水素ベースの鎖に共有結合で付着し得るコレステロールベースの炭化水素骨格を含み得る。好適なそのような誘導体としては：酢酸コレステリル；酪酸コレステリル、吉草酸コレステリル；カプリル酸コレステリル；ドデカン酸コレステリル；オレイン酸コレステリル；ヘプタデカン酸コレステリル；ステアリン酸コレステリル；リノール酸コレステリル；リノールエライジン酸コレステリル；パルミチン酸コレステリル；パルミトエライジン酸コレステリル；ミリスチン酸コレステリル；ベヘン酸コレステリル；エルカ酸コレステリル；アラキドン酸コレステリル；１０−ウンデカン酸コレステリル；およびフェニル酢酸コレステリルが挙げられる。この成分が、ナノ粒子に一定レベルの剛性を与え、それによって、ナノ粒子が、関連する治療剤を所望の送達点まで蓄えることができ、該送達時に、ナノ粒子が活性含有物を分散することができると考えられる。コレステロールは、強度と分散との好ましいバランスで、ヒトにおける有益な毒性プロファイルをもたらすため、最も好ましくは、製剤はこの成分を含む。
【００３２】
本発明の製剤はまた、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含む。ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン誘導体は、Ｃ１０−２４、好ましくは、Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖を含み得る。ホスファチジルエタノールアミンの好適な誘導体としては、ジオレオイル ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が挙げられ、ホスファチジルコリンの好適な誘導体としては、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）が挙げられる。最も好ましくは、誘導体は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）またはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。ＰＥＧ成分に関しては、中性のホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン誘導体は、ポリエチレングリコール鎖に共有結合で付着し得、それは、それらの平均分子量を示している。例えば、ｎ＝９のＰＥＧ鎖は、およそ４００ダルトンの平均分子量を有することになり、ＰＥＧ４００と識別されることになる。ＰＥＧ鎖は、５５０〜５０００、好ましくは、１２００〜３０００、いっそうより好ましくは、１５００〜２５００の範囲にあり得る。最も好ましくは、ＰＥＧ鎖は、およそ２０００の平均分子量を有する。
【００３３】
ナノ粒子製剤はまた、蛍光性のリン脂質を可視化ツールとして含み得る。例示的な脂質として、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルフォニル、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（１−ピレンスルフォニル）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（カルボキシフルオレセイン）、１−オレオイル−２−［６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン、２５−｛Ｎ−［（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−メチル］アミノ｝−２７−ノルコレステロール、オレオイル−２−［６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）が挙げられる。好ましい蛍光性の脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）である。
【００３４】
本発明のナノ粒子は、通常、１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下のサイズを有する。慎重にナノ操作することによって、ナノ粒子形成は、それらのサイズが１５０ｎｍ、好ましくは、１００ｎｍ未満で留まるように制御され得る。このサイズ範囲は、腫瘍組織の特徴により、固体腫瘍におけるナノ粒子の蓄積に最適であるとみなされる。腫瘍組織は、enhanced permeation and retention効果（EPR）と呼ばれる、高分子薬剤に対して共通の親和性を有するとみなされており、それによって、高分子薬剤が腫瘍組織に蓄積する。血管新生の増加、不均一かつ破壊的な血管の基礎構造、リンパ排液障害および「漏出性」内皮層等、腫瘍特性は、腫瘍組織内の高分子構造の蓄積に貢献するあらゆる要因であると考えられる。
【００３５】
従って、本発明のさらなる実施形態では、ナノ粒子製剤は、腫瘍標的薬剤をさらに含み得る。腫瘍標的薬剤を含む本発明のナノ粒子は、通常、哺乳類の非腫瘍組織の細胞における前記受容体の発現と比較して腫瘍細胞に過剰発現した受容体のリガンドを含む。
【００３６】
そうした腫瘍標的薬剤の一例は、葉酸部分を含むものである。本発明の好ましい実施例において、腫瘍標的薬剤は、リン脂質−ポリエチレングリコール−葉酸化合物である。より好ましくは、リン脂質−ポリエチレングリコール−葉酸化合物は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−葉酸［ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（２０００）−葉酸］である。
【００３７】
通常、ナノ粒子製剤中に存在する葉酸部分の量は、あらゆる組み込まれた治療剤を除いて、全製剤の１〜２ｍｏｌ％である。ナノ粒子がリポソームであるとき、リポソーム中に存在する葉酸部分の量は、概して、全リポソーム製剤の１〜２ｍｏｌ％である。
【００３８】
腫瘍標的薬剤の例として、葉酸は、そのような標的部分の良い例である；なぜなら、葉酸ベースの標的システムは、治療剤または造影剤を腫瘍に選択的に送達する有効な手段となるためである。進行期における侵襲性または未分化の腫瘍では、葉酸受容体（ＦＲ）密度が上昇していることが知られており、ＦＲを介した薬物送達がもたらす広範なアプローチから、癌治療が恩恵を受け得ることを示している。ＦＲは、脳癌、腎臓癌、肺癌および乳癌等、いくつかの癌型において、また、特に、卵巣癌等、上皮癌腫において、過剰発現する。ＦＲリガンド、葉酸エステル（または葉酸）は、ヌクレオチドの生合成に使われ、かつ、増殖している癌細胞の必要性を満たすべく、高い値で利用されるビタミンである。
【００３９】
数多くの薬物送達に関する尽力に加えて、葉酸を標的とする技術は、治療剤の放射性画像化や、癌細胞、ＭＲＩ造影剤およびガドリニウムリポソームの蛍光画像化への応用が成功した。ナノ粒子、特に、リポソームは、腫瘍における、およそ４０ｋＤａ以上のコロイド状高分子の受動的な蓄積に依存する、広く報告されているenhanced permeation and retention効果（ＥＰＲ）のため、腫瘍組織内で蓄積することができる。ＥＰＲ効果は、異常な腫瘍内皮細胞に起因して起こり、その「漏出性」の結果として、ナノ粒子による腫瘍組織内への浸透が可能になる。腫瘍組織におけるリポソーム蓄積は、リポソームの表面に抱合後（post-conjugated）であるか、または、リポソームの二重層内に組み込まれる脂質に付着している受容体標的部分の使用によって、高めることができる。ＦＲ結合の親和性（Ｋｄ＝１×１−１０Ｍ（１×１０−１０Ｍ））は、そのリガンドである葉酸がそのγ−カルボキシルを介して造影剤または治療部分に抱合しているとき、影響を受けないと見受けられるため、脂質ＰＥＧアンフィフィルの末端につながれている葉酸リガンドによって、ＦＲ標的リポソームシステムの発達が可能になる。
【００４０】
加えて、磁気共鳴画像化および核磁気共鳴画像化を改良するためのさらなる脂質が含まれ得る。例示的な例として、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ビス（ステアリールアミド）（Ｇｄ−ＢＳＡ）；Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ビス（ミリスチルアミド）（ＧｄＤＴＰＡ−ＢＭＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンジエチレン−トリアミンペンタ酢酸：Ｇｄ３＋（ＤＭＰＥＤＴＰＡ：Ｇｄ３＋）；Ｄ３５−１．２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリールアミドメチル−Ｎ"−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカ−１−イル｝−酢酸（Ｇｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＡ）；ガドリニウム（ＩＩＩ）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ１−コレステリルオキシ−３−カルボニル−１，２−ジアミノエタン）アミド（Ｇｄ．ＤＯＴＡ．Ｃｈｏｌ）；ガドリニウム（ＩＩＩ）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ１−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）アミド（Ｇｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＰＥ）およびガドリニウム（ＩＩＩ）ジエチレントリアミン−１，１，４，７，１０−ペンタ（酢酸）−１０−酢酸モノ（Ｎ１−コレステリルオキシ−３−カルボニル−１，２−ジアミノエタン）アミド（Ｇｄ．ＤＴＰＡ．Ｃｈｏｌ）が挙げられる。
【００４１】
成分（ｉ）〜（ｉｖ）に関するモル比について、ナノ粒子製剤の組成は、実施形態においては、以下の範囲を満たし得る：（ｉ）１０〜５０；（ｉｉ）１０〜５０；（ｉｉｉ）２０〜７０；および（ｉｖ）１〜２０。より好ましくは、（ｉ）〜（ｉｖ）のモル比は、以下の範囲を満たす：（ｉ）２０〜４０；（ｉｉ）２０〜４０；（ｉｉｉ）２５〜５５；および（ｉｖ）１〜１０。特に好ましい実施形態では、（ｉ）〜（ｉｖ）のモル比は、以下の範囲を満たす：（ｉ）３０〜３５；（ｉｉ）３０〜３５；（ｉｉｉ）３０〜３５；および（ｉｖ）１〜５。
【００４２】
本発明のナノ粒子製剤は、広範囲の治療剤を送達するために使用される可能性があり、従って、医薬品調製のための広範囲な有用性を有する。特に、肥満または癌の予防または治療において、適切な治療剤と関連して使用するとき、製剤は、有利な有効性を示す。好ましい態様では、ナノ粒子製剤は、肥満または癌の予防または治療において使用するときに効果的な短鎖脂肪酸、最も好ましくは、酢酸を封入するリポソームを含む。請求されるナノ粒子製剤の使用によって軽減され得る特定の形態の癌としては、肝細胞性の癌腫等、肝臓癌、胆管癌、血管内皮腫、結腸癌、腎臓細胞癌腫等、腎臓癌、および尿路上皮細胞癌腫が挙げられる。請求される技術を使って軽減または治療され得る他の病状として、代謝性症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、二型糖尿病、高血圧、心血管系疾患、高コレステロール血症、癲癇および卒中（卒中後の神経の損傷を含む）が挙げられる。
【００４３】
本発明の関連する態様において、本発明のナノ粒子製剤と、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。そのような医薬組成物は、特に、上記の肥満または癌の予防または治療において使用するための医薬品として使用され得る。加えて、医薬組成物は、上記の病状のすべての予防または治療において利用され得る。
【００４４】
本発明の他の態様では、上記に定義したナノ粒子製剤を調製する方法が提供され、該方法は：有機溶媒での（ｉ）〜（ｉｖ）の溶液を準備して、溶媒を蒸発させて（ｉ）〜（ｉｖ）の混合物の薄膜を得ること；任意で１つ以上の治療剤を含む所定の容積の極性溶液で薄膜を戻すこと；極性溶液を撹拌して、（ｉ）〜（ｉｖ）の混合物と、極性溶液中の１つ以上の任意の治療剤との分散液を形成させること；任意で、分散液をおよそ７のｐＨに緩衝すること；および、任意で、濾過によって分散液を純化することを含む。
【００４５】
通常、成分（ｉ）〜（ｉｖ）は、上記に示したそれらの各モル比で組み合わせられる。それらは任意の有機溶媒と組み合わせられ得るが、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、ジメチルホルムアミド、トルエン、アセトン、およびエチル酢酸が好ましい。特に、アセトン、ジクロロメタンまたはクロロホルム等、非プロトン性の有機溶媒が利用され得る。溶解性観点から、クロロホルムが非常に好ましい。
【００４６】
生じた薄膜を水で戻すことは、最初に、任意で１つ以上の治療剤を含む極性溶液で為され得る。極性溶液は、通常、水、エタノール、およびメタノール等、プロトン性溶媒であり、または溶液の極性は、その中で可溶化している極性の化合物の存在により、上昇し得る。例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジンエタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）、酢酸、プロピオン酸、または酪酸等、酸性種を含む水溶液。１つ以上の治療剤が短鎖脂肪酸であるとき、極性溶媒は、好ましくは、１つ以上の短鎖脂肪酸、最も好ましくは、酢酸を含む水溶液である。
【００４７】
薄膜を戻すのに使用する極性溶液中の１つ以上の治療剤の濃度は、好ましくは、１ｍＭ〜１０Ｍ、より好ましくは、５０ｍＭ〜２Ｍ、最も好ましくは、７５ｍＭ〜１．５Ｍの範囲にある。例えば、好ましくは、１つ以上の治療剤の濃度は、およそ１Ｍである。
【００４８】
製剤は、極性溶液中のナノ粒子成分の混ぜ合わせ、振とうまたは超音波処理によって撹拌され得る。現実的な観点から、必要な成分の音波処理が、それが極性溶液中、より均一に分散したナノ粒子の混合物を生じるため、好ましい。例えば、本文の実施例のように、音波処理は、ＭＸＢ Ｓｅｒｉｅｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ水槽（Ｇｒａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を１時間、３０℃の最も高い設定で使って、達成され得る。撹拌および緩衝の後、本文の実施例のように、ナノ粒子混合物は、好ましくは、分子量１００ｋＤのナノ粒子用にサイズ調整したＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ(R)Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓに仕様が定められている通りに正確に適用する）等、膜または動的透析を使って、透析濾過によって純化される。
【００４９】
本発明によるナノ粒子製剤を調剤する方法の好ましい実施形態では、分散液をおよそ７のｐＨに緩衝した後、濾過によって分散液を純化する前に、分散液を０〜１０℃の温度の低温に保つ。このようにして低温保温ステップが用いられるとき、１つ以上の治療剤の封入が、より効果的である。これは、特に、治療薬剤が酢酸の場合である。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態においては、ナノ粒子製剤は、（ｉ）式Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜４であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜４である）のポリアミン付加物を含むカチオン性コレステロール誘導体；（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンの飽和中性リン脂質；（ｉｉｉ）酢酸コレステリル、酪酸コレステリル、吉草酸コレステリル、カプリル酸コレステリル、ドデカン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、およびステアリン酸コレステリルからなる群から選択されるコレステロールまたは中性コレステロール誘導体；ならびに（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と、分子量が１５００〜２０００のＰＥＧ鎖とを含むホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含む、カチオン性リポソームであって、酢酸、プロピオン酸および酪酸からなる群から選択される短鎖脂肪酸が、その中に封入されている。
【００５１】
本発明の他の好ましい実施形態では、ナノ粒子製剤は：（ｉ）式Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜４であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜４である）のポリアミン付加物を含むカチオン性コレステロール誘導体；（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンの飽和中性リン脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と、１５００〜２０００の分子量を有するＰＥＧ鎖とを含む、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含むカチオン性リポソームであって、酢酸、プロピオン酸および酪酸からなる群から選択される短鎖脂肪酸が、その中に封入されており、成分（ｉ）〜（ｉｖ）は、それぞれ、モル比２０〜４０：２０〜４０：２５〜５５：１〜１０で存在する。
【００５２】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子製剤は：（ｉ）式Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜４であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜４である）のポリアミン付加物を含むカチオン性コレステロール誘導体；（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンの飽和中性リン脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と、分子量が１５００〜２０００のＰＥＧ鎖とを含むホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含むカチオン性リポソームであって、酢酸、プロピオン酸および酪酸からなる群から選択される短鎖脂肪酸が、１０〜１０ｍＭの濃度でその中に封入されており、成分（ｉ）〜（ｉｖ）は、それぞれ、２０〜４０：２０〜４０：２５〜５５：１〜１０のモル比で存在し、リポソームの平均粒子サイズは、４０〜１２０ｎｍの範囲にある。
【００５３】
本発明の他の好ましい実施形態では、ナノ粒子製剤は：（ｉ）ＣＤＡＮ；（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンの飽和中性リン脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と、分子量がおよそ２０００のＰＥＧ鎖とを含むホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含むカチオン性リポソームであって、酢酸、プロピオン酸および酪酸からなる群から選択される短鎖脂肪酸が、１０〜１０ｍＭの濃度でその中に封入されている。
【００５４】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、ナノ粒子製剤は：（ｉ）式Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｘＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨ（ＣＨ２）ｚＮＨＣ（Ｏ）−（式中、ｘは、１〜４であり、ｙは、１〜４であり、ｚは、１〜４である）のポリアミン付加物を含むカチオン性コレステロール誘導体；（ｉｉ）Ｃ１０−２０の飽和脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリンの飽和中性リン脂質；（ｉｉｉ）コレステロール；および（ｉｖ）Ｃ１２−２０の飽和脂肪酸鎖と、分子量がおよそ２０００のＰＥＧ鎖とを含むホスファチジルエタノールアミンの飽和脂肪酸ＰＥＧ化中性誘導体を含むカチオン性リポソームであって、酢酸がその中に封入されており、リポソームの平均粒子サイズは、４０〜１２０ｎｍの範囲にある。
【００５５】
ここで、単に例示のために、以下の図を参照して、本発明をより詳細に説明する。本文に示した実施例に関連して、プロピオン酸および酪酸で類似した結果が得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、実施例２の製剤における異なる濃度の酢酸についての、ナノ粒子サイズ分布である。
【図２】図２は、実施例２の製剤における異なる濃度の酢酸についての、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図３】図３は、実施例２の方法によって生産される製剤における異なる量の成分（ｉ）（ＣＤＡＮ）についての、ナノ粒子サイズ分布である。
【図４】図４は、実施例２の方法によって生産される製剤における異なる量の成分（ｉ）（ＣＤＡＮ）についての、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図５】図５は、実施例２の方法によって生産される製剤における異なる量の成分（ｉｉ）（ＤＳＰＣ）についての、ナノ粒子サイズ分布である。
【図６】図６は、実施例２の方法によって生産される製剤における異なる量の成分（ｉｉ）（ＤＳＰＣ）についての、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図７】図７は、実施例２の方法によって生産される製剤においてＤＯＰＥおよびＤＬＰＣが含まれる場合の、異なる性質の成分（ｉｉ）についてのナノ粒子サイズ分布である。
【図８】図８は、実施例２の方法によって生産される製剤においてＤＯＰＥおよびＤＬＰＣが含まれる場合の、異なる性質の成分（ｉｉ）について、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図９】図９は、実施例２の方法によって生産される製剤における異なる量の成分（ｉｉｉ）（コレステロール）についてのナノ粒子サイズ分布である。
【図１０】図１０は、実施例２の方法によって生産される製剤における異なる量の成分（ｉｉｉ）（コレステロール）についての、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図１１】図１１は、実施例２の方法によって生産される製剤におけるＰＥＧ群の分子量に関しての、異なる性質の成分（ｉｖ）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のナノ粒子サイズ分布である。
【図１２】図１２は、実施例２の方法によって生産される製剤におけるＰＥＧ群の分子量に関しての、異なる性質の成分（ｉｖ）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）についての、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図１３】図１３は、実施例２の方法で生産される製剤に関しての、熱安定性に関するナノ粒子サイズ分布である。
【図１４】図１４は、実施例２の方法で生産される製剤に関しての、熱安定性に関する、封入されている酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量である。
【図１５】図１５は、コントロールの異種移植片モデルと、実施例２の製剤で処置したモデルの腫瘍増殖率である。
【図１６】図１６は、高脂肪食の動物の重量増加における、実施例２の製剤の一日２回の腹腔内注入の効果である。
【図１７】図１７は、高脂肪食の動物の全身脂肪症における、実施例２の製剤の一日２回の腹腔内注入の効果である。
【図１８】図１８は、リポソーム抱合の生体分布である。（Ａ）ＬＩＰ−ＦＤＧナノ粒子（１０ＭＢｑの１８Ｆ−ＦＤＧが封入されている）を注射したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、注入の２時間後の代表的なＰＥＴ、ＣＴおよびＰＥＴ／ＣＴ融合画像、（Ｂ）１８Ｆ−ＦＤＧ（コントロール）またはＬＩＰＦＤＧ（ｎ＝４／群）の注入の３０分後に、対象領域（ＲＯＩ）から記録された曲線（ＡＵＣ）データ下の領域。（Ｃ〜Ｇ）は、ＬＩＰ−Ｒｈｄの腹腔内注射の２時間後に回収したＣ５７ＢＬ／６マウスの代表的な組織画像；（Ｃ）肝臓、（Ｄ）心臓、（Ｅ）筋肉、（Ｆ）脾臓および（Ｇ）肺。（Ｈ）ＬＩＰ−ＸＧ−Ｒｈｄの腹腔内注射の２時間後に回収した、異種移植片腫瘍の代表的な組織画像。（Ｉ−Ｋ）は、ＲＯＩにおける、ＬＩＴＡ−ＧｄまたはＬＩＴＡ（コントロール）ナノ粒子（ｎ＝４／群）の腹腔内注射の０時間後、２４時間後、４８時間後に記録したＴｌ値である；（Ｉ）肝臓、（Ｊ）腎臓および（Ｋ）皮下脂肪。結果を平均±ＳＤとして表示する。スチューデントのｔ検定によって分析したデータ；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図１９】図１９は、酢酸封入および定量である。（Ａ）４ｍＭの酢酸溶液、（Ｂ）アルブミンを含む４ｍＭの酢酸溶液、（Ｃ）アルブミンを含むＬＩＴＡ溶液（２ｇ）；（Ｄ）アルブミンを含むＬＩＴＡ溶液（４ｇ）の４．５ｐｐｍ〜−０．５ｐｐｍの１Ｈ ＮＭＲスペクトル。トリメチルシリルプロピオネート（ＴＳＰ）は、０ｐｐｍの基準値を提供する。酢酸のピークは、通常、２．０３ｐｐｍで観察される。（Ｅ）乳酸のない場合と、（Ｆ）乳酸のある場合（５．２ｍｇの乳酸ナトリウム）の、ＬＩＴＡナノ粒子のＮＭＲスペクトルが示されている。リポソーム調製のサイズを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使って測定し、（Ｇ）および（Ｈ）は、それぞれ、コントロール（ＨＥＰＥＳを含む）およびＬＩＴＡ（リポソーム封入酢酸）のサイズ分布を示し、（Ｉ）は、コントロールおよびＬＩＴＡリポソームの平均サイズを示す。
【図２０】図２０は、ミトコンドリアの熱量測定である。ＨＴ−２９細胞を、酢酸（５ｍＭ）で、または酢酸なしで（コントロール）処理し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ａｓｓａｙによってインビトロでＡＴＰ生成を評価した。（Ａ）ＡＴＰ生成；（Ｂ）予備呼吸能；ｎ＝４／群；＊＊＝ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使って分析したデータ；ＯＣＲ：酸素消費速度（ｐＭｏｌｅｓ／ｍｉｎ）。
【図２１】ＨＦＤ食を取らせたマウスにおけるＬＩＴＡナノ粒子の修復効果。マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）をとらせて５週間後、さらに５週間にわたって、３日毎に、リポソーム封入酢酸（ＬＩＴＡ）ナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）のいずれかを注射した。（Ａ）体重の変化（ｇ）；（Ｂ）累積食物摂取（ｇ／ｗｅｅｋ）；（Ｃ）全身脂肪症の変化（％）；（Ｄ）ＩＨＣＬの変化；（Ｅ）血漿脂質および追加の血中ペプチド（グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）、インスリン、トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリグリセリド（ｍｍｏｌ／Ｌ）、レプチン（ｎｇ／ｍｌ）、アディポネクチン（ｎｇ／ｍｌ）、リパーゼ（Ｕ／Ｌ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）（μｍｏｌ/Ｌ））；（Ｆ）炎症マーカー（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−Ιβ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＫＣ／ＧＲＯそれぞれ）の血清中レベル（［血清］（ｐｇ／ｍｌ））；（Ｇ）コントロール群（ＵＣＰ２、ＰＰＡＲα、ＡＣＯＸ１、ＣＰＴＡ１、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２、それぞれ）と比較した、ＬＩＴＡにおける肝臓のｍＲＮＡ値の倍率変化；（Ｈ）（β−アクチンに正規化した）ＨＤＡＣ蛋白質の発現；（Ｉ）（全ヒストンに標準化した）ヒストン残基（ａｃＨ４Ｋ１２、ａｃＨ３Ｋ９およびｍ２Ｈ３Ｋ９それぞれ）の発現。スチューデントのｔ検定または二元配置分散分析（2 way ANOVA）とボンフェローニ事後テストによって分析したデータ；ｎ＝８／群；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２２】ＨＦＤ食をとらせたマウスにおけるＬＩＴＡナノ粒子の修復効果。５週間、マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）をとらせた。次に、さらに５週間にわたって、３日毎に、リポソーム封入酢酸（ＬＩＴＡ）ナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）のいずれかで、長期的な注入を開始した（ｎ＝８／群）。（Ａ）膵臓、腎臓、肝臓、筋肉、ＷＡＴ、ＢＡＴ、皮下（subcutaneous）、後腹膜、精巣上体、腸間膜のそれぞれの器官重量（Ｂ）マイクロアレイデータ（−ｌｏｇ１０（ｐ−値）対ｌｏｇ２倍率変化）；ｎ＝８／群；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。二元配置分散分析とボンフェローニ事後テストとで分析したデータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
【図２３】ＨＦＤ食をとらせたマウスにおけるＬＩＴＡナノ粒子の予防効果。マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）をとらせ、６週間にわたって、３日毎に、リポソーム封入酢酸（ＬＩＴＡ）ナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）のいずれかを注射した。（Ａ）体重（ｇ）、（Ｂ）全身脂肪症（％）、（Ｃ）ＩＨＣＬの全体の変化。摂食または絶食条件での血漿値、（Ｄ）摂食または絶食条件での血清グルコース（ｍｍｏｌ／ｌ）およびインスリン（ｎｇ／ｍｌ）の値（ｎ＝１８／群）、（Ｅ）ＬＤＬ、ＴｒｉＧ、ＨＤＬ、Ｃｈｏｌ、ＦＦＡおよび３０Ｈ−ＢＴＡ、それぞれについての血漿脂質（ｍｍｏｌ／Ｌ）（ｎ＝１２／群）、（Ｆ）コントロール動物（ｎ＝６−８／群）と比較した、皮下および腸間膜（陰影のない円柱はＡＴＧＬで、陰影のついた円柱はＨＳＬ）についての、ＬＩＴＡにおける脂肪組織ｍＲＮＡ発現の倍率変化；（Ｇ）機能（それぞれ、ＶＬＤＬ代謝、ミトコンドリア機能、β酸化、脂肪酸合成、グルコース代謝および炎症）別に分けた遺伝子（それぞれ、Ａｐｏ−Ｂ、Ｍｔｔｐ、ＵＣＰ−２、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、ＰＧＣｌａ、ＡＣＯＸ１、ＣＰＴ１、ＳＲＥＢＰ１、ＡＣＣ、ＦＡＳＮ、ＦＯＸ０１、ＧＬＵＴ２、ＩＲＳ１、ＩＲＳ２、ＴＮＦα、ＩＬ−６）について、コントロール動物（ｎ＝６−８／群）と比較した、ＬＩＴＡにおける肝臓のｍＲＮＡ発現の倍率変化。（Ｈ）肝臓断面のＨ＆Ｅ染色。（Ｉ）ミトコンドリアの周長あたりの稜の数（ｎ＝４／群）。（Ｊ）ミトコンドリア複合体Ｉ〜Ｖの蛋白質発現の倍率変化（ｎ＝５／群）。スチューデントのｔ検定または二元配置分散分析によって、また、多重比較のために適用可能な場合はボンフェローニテストで分析したデータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）；ｎ＝２４／群；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２４】ＨＦＤ食を取らせたマウスにおけるＬＩＴＡナノ粒子の予防効果。マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）をとらせ、６週間にわたって、３日毎に、リポソーム封入酢酸（ＬＩＴＡ）ナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）のいずれかを注射した。（Ａ）平均週次食物摂取（ｇ）、（Ｂ）５週目の始めに、一晩の絶食後、グルコース負荷試験（ＧＴＴ、１分あたりのグルコースｍｍｏｌ／Ｌ）を実施した（ｎ＝１０／群）。（Ｃ）追加の血中ペプチド（アディポネクチン（ｎｇ／ｍｌ）、グレリン（ｎｇ／ｍｌ）およびＧＩＰ（ｎｇ／ｍｌ）（ｎ＝６／群）、レプチン（ｐｇ／ｍｌ）、およびインターロイキン−６（ｐｇ／ｍｌ）（ｎ＝１８／群））、（Ｄ）肝臓機能の３つのマーカーの血清濃度：アラニン トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（すべてＵ／Ｌ）（ｎ＝１２／群）；ｎ＝２４／群；＊＊=ｐ＜０．０１；二元配置分散分析とボンフェローニ事後テストとで分析したデータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
【図２５】ミトコンドリアの形態および酸化的リン酸化における、長期的なＬＩＴＡナノ粒子投与の効果。ＨＦＤをとらせ、６週間にわたって、ＬＩＴＡまたはコントロールナノ粒子のいずれかを注射したマウスのミトコンドリアの形態、（Ａ）ミトコンドリア数を計算するのに使用する１２００倍で得られた代表的な透過電子顕微鏡法画像（ＴＥＭ）、（Ｂ）ミトコンドリアあたりの稜の数を計算するのに使用する４８００倍の代表的なＴＥＭ画像、（Ｃ）画像あたりのミトコンドリアの数、（Ｄ）ミトコンドリアの複合体Ｉ〜Ｖを示すＷＢの代表的な写真；（Ｅ）ＮＦＤ予防調査のコントロールおよびＬＩＴＡを注射したマウスにおける酸化的リン酸化複合体Ｉ、ＩＩＩおよびＶの平均蛍光強度（ＭＦＩ）；ｎ＝１２／群；二元配置分散分析によって分析したデータ。
【図２６】ＮＦＤ食をとらせたマウスにおけるＬＩＴＡナノ粒子の予防効果。マウスに正常な脂肪食（ＮＦＤ）をとらせ、６週間にわたって、３日毎に、リポソーム封入酢酸（ＬＩＴＡ）ナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）のいずれかを注射した。（Ａ）体重（ｇ）、（Ｂ）全身脂肪症、（Ｃ）ＩＨＣＬの全体的な変化。摂食または絶食条件での血漿値（Ｄ）血漿脂質（ｍｍｏｌ／Ｌ）（ｎ＝６／群）、（Ｅ）摂食または絶食条件での血清グルコースおよびインスリンの値（ｎ＝８／群）、（Ｆ）コントロール動物と比較した、ＬＩＴＡにおける脂肪組織ｍＲＮＡ発現の倍率変化（ｎ＝６／群）（Ｇ）コントロール動物（ｎ＝６／群）と比較した、ＬＩＴＡにおける肝臓のｍＲＮＡ発現の倍率変化であって、遺伝子は機能別に分けた。（Ｈ）肝臓断面のＨ＆Ｅ染色。二元配置分散分析によって、また、多重比較のため、ボンフェローニテストで分析したデータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）；ｎ＝２４／群；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２７】ＮＦＤ食をとらせたマウスにおける、ＬＩＴＡナノ粒子の予防効果。マウスに正常な脂肪食（ＮＦＤ）をとらせ、６週間にわたって、３日毎に、ＬＩＴＡナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）のいずれかを注射した。（Ａ）平均週次食物摂取（ｇ）（ｎ＝２４／群）、（Ｂ）５週目の始めの一晩の絶食に続いて、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を実施した（ｎ＝１０／群）。（Ｃ）追加の血中ペプチド（アディポネクチン（ｎｇ／ｍｌ）（ｎ＝６／群）、Ｃ−ペプチド（ｐｇ／ｍｌ）、グレリン（ｐｇ／ｍｌ）、ＧＩＰ（ｐｇ／ｍｌ）、グルカゴン（ｐｇ／ｍｌ）、インスリン（ｐｇ／ｍｌ）、レプチン（ｐｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ−１（ｐｇ／ｍｌ）、レジスチン（ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−６（ｐｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍｌ）（ｎ＝１２／群））、（Ｄ）肝臓機能の３つのマーカーの血清濃度：アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートトランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（すべてＵ／Ｌ）（ｎ＝６／群）。（Ｅ）脂肪組織蓄積の重量（ｎ＝１２／群）。＊＊=ｐ＜０．０１；二元配置分散分析と、ボンフェローニ事後テストとによって分析したデータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
【図２８】ネズミのＨＴ−２９結腸腫瘍における、ＬＩＴＡナノ粒子の効果。マウスにＨＴ−２９結腸癌細胞を接種して、腫瘍が触知可能なのを確認したら、４週間にわたって、３日毎に、ＬＩＴＡナノ粒子またはコントロール（ＨＥＰＥＳ）ナノ粒子のいずれかを注射した。（Ａ）ＬＩＴＡおよびコントロールを注射した動物からの代表的な腫瘍移植片、（Ｂ）腫瘍サイズ（ｍｍ２）、（Ｃ）腫瘍重量（ｍｇ）、（Ｄ）４週間のプロトコルにおける腫瘍容積（ｍｍ３）、（Ｅ）コントロールＨＥＰＥＳリポソームに正規化した、長期的なＬＩＴＡ投与後の異種移植片腫瘍の定量的なｍＲＮＡ変化。スチューデントのｔ検定または二元配置分散分析によって、また、ボンフェローニ事後テストで分析したデータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）；ｎ＝６／群；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２９】コントロール（ＣＯＮ）または実施例２のナノ粒子（ＴＸ）で処置したラットにおける、病変容積のＭＲＩ評価：閉塞の２４時間後（ＩＤ）および１週間後（１ＷＫ）。
【図３０】コントロール（ＣＯＮ）または実施例２のナノ粒子（ＴＸ）のいずれかを受けたラットの（Ａ）移動した距離および（Ｂ）平均速度。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
実施例１−リポソームナノ粒子の調製
有機溶媒（通常、ＣＨＣｌ３）での、Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の適切な容量の保存溶液を、５ｍＬの丸底フラスコ内で、それぞれのモル比３２：３２：３５：１でともに組み合わせて、薄膜を生産した。次に、この薄膜を、所定の容量の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）（４ｍＭ、ＮａＣｌ １３５ｍＭ、ｐＨ６．５）で戻し、超音波処理して脂質分散液を生産し、ｐＨ７に緩衝し、透析濾過によって純化して事前に決定された全脂質濃度のリポソーム懸濁液を得た。
【００５８】
実施例２−短鎖脂肪酸封入リポソームの調製
有機溶媒（通常、ＣＨＣｌ３）での、Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の適切な量の保存溶液を、５ｍＬの丸底フラスコ内で、それぞれのモル比３２：３２：３５：１でともに組み合わせて、薄膜を生産した。次に、この薄膜を、所定の容積の酢酸溶液（１Ｍ、ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ２．０）で戻し、超音波処理して脂質分散液を生産し、ｐＨ７に緩衝し、透析濾過によって純化して事前に決定された全脂質濃度のリポソーム懸濁液を得た。
【００５９】
それぞれ１ｍＬの溶液がおよそ１０１１ナノ粒子／ｍｌを含むように、リポソーム封入酢酸ナノ粒子（「ＬＩＴＡ」とも呼ばれる）を調製した。図１に示すように粒子サイズを決定した。
【００６０】
実施例３−蛍光標識リポソームの調製
有機溶媒（通常、ＣＨＣｌ３）での、Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン（ＣＤＡＮ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルフォニル）（ＤＯＰＥ−ローダミン）、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の適切な量の保存溶液を、５ｍＬの丸底フラスコ内で、それぞれのモル比３２：３２：３４：１：１で、ともに組み合わせて、薄膜を生産した。次に、この薄膜を所定の容積の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（４ｍＭ、ＮａＣｌ １３５ｍＭ、ｐＨ６．５）で戻し、超音波処理して脂質分散液を生産し、ｐＨ７に緩衝し、透析濾過によって純化して、事前に決定された全脂質濃度のリポソーム懸濁液を得た。
【００６１】
蛍光性の標識を含む短鎖脂肪酸封入リポソームを生成するために、実施例２の手順を、実施例３の脂質組成で行った。
【００６２】
実施例４−異なる濃度の酢酸の封入
実施例２のナノ粒子を、異なる濃度の酢酸を使って調製した。用いた酢酸の濃度は、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭおよび１Ｍであった。生産されたナノ粒子の、結果として生じた粒子サイズ分布が、図１に図解されている。調製したら、封入されている酢酸の量を各濃度について定量化し、結果を図２に図解している。これらの数字は、ナノ粒子サイズの範囲がそれに封入されている酢酸濃度の範囲で生じ得ることを示している。
【００６３】
実施例５−異なる脂質組成
封入されている酢酸を含むナノ粒子製剤を実施例２にしたがって調製した。
【００６４】
ａ）ＣＤＡＮの量は、１０％〜３２％および５０％のように異なっていた。ナノ粒子サイズ分布が図３に示されており、ＣＤＡＮの量の増加は、粒子サイズ分布の縮小をもたらすことがわかる。図４は、異なる値のＣＤＡＮで製剤されたナノ粒子における酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量を示し、それぞれが、封入されている酢酸を生じることがわかる。しかしながら、３０％の領域におけるモル比がより効果的であることが判明した。
【００６５】
ｂ）成分（ｉｉ）（ＤＳＰＣ）の量は、１０％〜３２％および５０％のように異なっていた。ナノ粒子サイズ分布が図５に示されており、ＤＳＰＣの量が増えるほど、より広い粒子サイズ分布を生じるが、より小さい絶対的粒子サイズで広がっていることがわかる。図６は、異なる値のＤＳＰＣで調剤したナノ粒子中の酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量を示しており、それぞれが、封入されている酢酸を生じることがわかる。しかしながら、３０％の領域におけるモル比がより効果的であることが判明した。
【００６６】
ｃ）成分（ｉｉ）の性質は、ＤＳＰＣから、ＤＯＰＥとＤＬＰＣとで異なっていた。ナノ粒子サイズ分布が図７に示されており、ＤＯＰＥとＤＬＰＣとの両方が、およそ３０〜１００ｎｍのより広範な粒子サイズ分布を提供することがわかる。図８は、これらの成分で調剤されたナノ粒子中の酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量を示しており、ＤＳＰＣよりも低い値でではあるが、両方のケースで酢酸が封入されていることがわかる。
【００６７】
ｄ）成分（ｉｉｉ）の量を、１％〜１０％で変化させた。ナノ粒子サイズ分布が図９に示されており、１０％のコレステロールが、１％と比較して非常に広範な粒子サイズ分布を提供することがわかる。図１０は、これらの成分で製剤したナノ粒子における酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量を示しており、酢酸が、両方のケースで封入されていることがわかる。
【００６８】
e）成分（ｉｖ）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）の性質は、ＰＥＧ群に関して、分子量が２０００〜５０００のように異なっていた。ナノ粒子サイズ分布が図１１に示されており、分子量が５０００に増えると、２０００の分子量と比較してより小さいナノ粒子の形成を生じることがわかる。図１２は、これらの成分で製剤したナノ粒子中の酢酸の１Ｈ−ＮＭＲ定量を示しており、酢酸は、両方の場合で、同程度に封入されていることがわかる。
【００６９】
実施例６−ナノ粒子製剤および熱安定性の特徴
封入されている酢酸を含むナノ粒子製剤を、実施例２にしたがって調剤し、透析濾過の前後の１８時間にわたって、高温（３５℃）または低温（４℃）の保温という異なる温度条件下で、ナノ粒子の粒子サイズ安定性（すなわち、凝集に対する安定性）を試験した。図１および２（室温で、実施例２にしたがって製剤した１Ｍの酢酸）と比較して、図１３の結果は、適正なタイムスケールにおいて、室温でのナノ粒子の形成が最適であることを示す。加えて、低温の透析濾過（およそ４℃）によってナノ粒子内での経時的な酢酸保持を向上することができることが、図１４の１Ｈ−ＮＭＲ定量によって図解されている。
【００７０】
実施例７−肝臓における生体分布調査
実施例３に記載したように、ナノ粒子を、ローダミン脂質をそこに組み入れて調剤し、次に、マウスに投与した。標準的な用量投与（２００μＬ）の２時間後に、マウスの肝臓において肝臓組織診断を実行した。ナノ粒子の検出をローダミン蛍光によって確認した。ＤＡＰＩ（４'，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を使って、視野の中に、正常な肝細胞の存在を実証した。蛍光フィルタを使って、非特定背景蛍光または他の非特定アッセイアーチファクトを照射した。データは、ナノ粒子が肝臓に集中し、肝細胞への酢酸の機能的送達を媒介することを実証している。特に、カチオン性脂質（例えば、ＣＤＡＮ）が、肝臓への、封入されている酢酸の機能的送達にとって有益であることをデータは示唆している。
【００７１】
実施例８−結腸癌用の生体内異種移植片モデル
Ｔ−２５フラスコ（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）あたり２．５×１０５細胞で所望の細胞株を播種し、５％のＣＯ２を含む３７℃のインキュベータ内で、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を補給したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）で、単層として増殖させた。決して１５回の継代を超えないように、細胞を３〜５日毎に継代した。細胞がおよそ８０％コンフルエントになったら、培地を取り除き、培地の除去によってそれらを回収し、ＰＢＳで洗浄し、続いて、およそ５分間、トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を添加した。培地を取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、無血清ＤＭＥＭで再懸濁し、５分間、１，０００ＲＰＭで遠心分離した。培地を取り除き、細胞を血球計算器で計数した。
【００７２】
結腸癌細胞株ＨＴ−２９を調製し、２５ゲージの針を使って１００μｌの無血清培地中５×１０６細胞をｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右歯面に皮下注射した。腫瘍を有するマウスを群に分け、一回の注入につきおよそ５×１０８リポソームを含む、実施例２のナノ粒子製剤またはコントロールナノ粒子のいずれかを２００μＬ、腹腔内投与を受けさせた（ｎ＝８）。ヌードマウス皮下異種移植片腫瘍の識別には、１４〜２０日必要であった。腫瘍が触知可能になったら、長期的な注入を３日毎に投与して、平行して、キャリパーによって腫瘍を測定して、楕円体形状を仮定して推測した容積を、以下の方程式を使って決定した：容積＝長さ×幅×奥行×π/６。
【００７３】
実施例２のナノ粒子製剤を受けている群が、コントロール群（ｐ＜０．００１）と比較して増殖の有意な減少を示したことを、異種組織片腫瘍モデルの増殖曲線（図１５）が示している。処置群における差は、この新規のナノ粒子が、特に、結腸癌に対する抗腫瘍特性を有するという多大かつ確かな発見をもたらした。
【００７４】
結果を平均（ＳＥＭ）の平均±標準誤差として示し、「ｎ」は、群毎の動物の数または生物学的反復をいう。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）で分析を実施した。データ分析には二元配置分散分析を適用し、統計的有意性を、Ｐ値＜０．０５とした。
【００７５】
実施例９−累積重量増加および全身脂肪症の減少
実施例２の製剤の前臨床の適合性検査（relevance）を１０週間の期間にわたって、生体内モデルを使って実行した。２２℃、湿度７０％、かつ、１２：１２（６．３０ａｍ〜６．３０ｐｍ）の明：暗サイクルで、個別に換気したケージ（ＩＶＣ）内に、マウスをケージ毎４匹に分けた。マウスは自由に水にアクセスでき、５週間目に、ｋｃａｌ摂取で６０％の高脂肪食をとらせ、これは、ＳＳＮＩＦＦ（Ｅｎｇｌａｎｄ、ＵＫ）によって提供されるもので、以下にまとめたものである（表１）。
【００７６】
【表１】
0006483017.tif 000002
【００７７】
マウスは、５週間、高脂肪食を続け、その間、食物摂取および重量増加を少なくとも週３回、モニターした。５週間目に、マウスは、さらに５週間、３日毎に、腹腔内注射によって、実施例２のナノ粒子またはコントロールＨＥＰＥＳを含むナノ粒子の長期的な送達を受けた。注入容積は、２００μＬであり、これは、１回の注入あたりおよそ５×１０８のナノ粒子を含んでいた。ナノ粒子処置の期間、マウスは高脂肪食を続けた。５週目と１０週目とで、全身脂肪症を、１Ｈ ＭＲＳ（磁気共鳴スキャン）によって決定した。これは、高脂肪食を消費しながらもナノ粒子が全身脂肪症に効果があるかどうか生体内で決定するために、スキャンの前後の脂肪含有量について実行した。
【００７８】
スキャンの前に、一晩、１６〜１８時間、動物を絶食させた。スキャンのために、マウスに、２〜３％イソフルラン２／ｍｉｎ酸素で麻酔をかけ、ＲＦコイル内に、肝臓がコイルの中央になるようにうつ伏せに置いて、４．７Ｔ Ｕｎｉｔｙ Ｉｎｏｖａ ＭＲスキャナー（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）でスキャンした。スキャン中、呼吸用パッド（breathing pad）を使用して呼吸速度をモニターし、中心温度を、温風送風機で３７℃に維持した直腸プローブを使用して測定した。
【００７９】
マウス全体の水信号をシミングすることによって磁場均一性を最適化した。マウス腹部にわたって連続した軸方向のスライス一式を設計することによって全体の肝臓被写を得るために、３つの平面スカウト画像を撮った。以下のパラメータで、全身ＭＲＩ（磁気共鳴映像法）を使って設置した体積要素２×２×２ｍｍ３のＰＲＥＳＳシーケンスを使って局所１Ｈ肝臓ＭＲＳを実行した：ＴＲ １０ s、ＴＥ ９ ms、平均６４およびスペクトル幅２０，０００Ｈｚ。全スキャン時間は、動物につきおよそ３０分であった。１Ｈ肝臓ＭＲＳを使ってＩＨＣＬを決定するための統計的分析をＭｅｓｔＲｅ−Ｃソフトウェアを使って実行した。
【００８０】
１０週間の終わりに、図１６に図解されるように、ナノ粒子を投与した群において、コントロール群と比較して、累積重量増加の減少があった。図１７に示されるように、重量の低下に加えて、全身脂肪症の減少もあった。高脂肪食を続けている間であっても、コントロール群に示されるように食事に影響される全身脂肪症の増大をナノ粒子が防いだことをこのデータは結論付けている。減少は、ナノ粒子の治療特性の結果によるものである。
【００８１】
実施例１０−ナノ粒子調製および生体分布
様々な画像化モダリティを利用して、肝臓と悪性組織との両方へのリポソーム性ベクターの受動的な、非標的送達を確認した。リポソーム抱合は、それらに封入されている生産物、または、脂質二分子層に導入された部分によって区別された（表２）。
【００８２】
【表２】
0006483017.tif 000003
【００８３】
表２の説明：（１）ＬＩＰ：１８Ｆ−ＦＤＧ、酢酸およびＨＥＰＥＳの封入に使用する、標準的なリポソーム抱合；（２）ＬＩＰ−ＸＧ：悪性腫瘍の動物モデルにおける腫瘍吸収を増大させるための、より高い割合のＤＳＰＥ ＰＥＧ２０００とのリポソーム抱合；（３）ＬＩＰ−Ｒｈｄ：組織分析に使用される蛍光性の脂質であるローダミン（Ｒｈｄ）を１％含むリポソーム；（４）ＬＩＰ−ＸＧ−Ｒｈｄ：組織分析のために、さらに１％のローダミンを含むＬＩＰ−ＸＧ。（５）ＬＩＰ−Ｇｄ：ＭＲＩ生体分布分析での使用のためのガドリニウム（Ｇｄ）とのリポソーム抱合；ＬＩＰ：リポソーム；ＬＩＴＡ：リポソーム封入酢酸；ＤＳＰＣ：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＣＤＡＮ：Ｎ１−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン；ＤＳＰＥ ＰＥＧ２０００：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００；ＤＯＴＡ：ガドテル酸メグルミン；ＤＯＰＥ−ローダミン：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミン ローダミンＢスルフォニル）；ＤＳＡ：デジタル差引血管造影法。
【００８４】
遊離１８Ｆ−ＦＤＧまたは１８Ｆ−ＦＤＧ封入リポソーム（ＬＩＰ−ＦＤＧ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、短期間の生体分布を評価した。注入の３０分後に得たＬＩＰＦＤＧ群の代表的なＰＥＴ、ＣＴおよびＰＥＴ／ＣＴ融合画像を、図１８Ａに示す。１８ＦＦＤＧのリポソーム送達は、肝臓、腎臓および筋肉を含む全組織において得られた。興味深いことに、１８Ｆ−ＦＤＧ吸収の増加が心臓および筋肉において観察された（図１８Ｂ）。ローダミンとのリポソーム抱合（ＬＩＰ−Ｒｈｄ）の組織特異的な蓄積を、組織診断技術を使って精査した（図１８Ｃ〜Ｇ）。ＬＩＰ−Ｒｈｄの最高濃度は、肝臓および脾臓において観察され、心臓、腎臓、および脳における量は、より少なかった（表３）。
【００８５】
【表３】
0006483017.tif 000004
【００８６】
表３の説明：マウスに、２００μｌのＬＩＰ−Ｒｈｄナノ粒子溶液を腹腔内注入した。器官を回収して、注入の２時間、１６時間、２４時間、４８時間後、ローダミン着色した（ｎ＝３／タイムポイント）；これらのタイムポイントにおけるローダミンの存在（Ｙ）または非存在（−）を示す。
【００８７】
悪性の組織への高度な送達のために調剤されたナノ粒子の異種移植片吸収を、図１８Ｈに示す。磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を使って、脂質膜（ＬＩＰ−Ｇｄ）に埋め込まれた脂質−ガドリニウム複合体で製剤したリポソームの生体分布を追跡することによって、長期のナノ粒子蓄積を評価した。ベースラインスキャンに続いて、ＬＩＰ−Ｇｄまたはコントロールのいずれかの腹腔内注射を受けたマウスを、注入の２４時間と４８時間後、スキャンした。肝臓、腎臓および皮下脂肪のＴｌ変化を、それぞれ、図１８Ｉ〜Ｋに示す。注入の２４時間および４８時間後、有意なＴｌの減少によって示されるように、ナノ粒子は、選択的に肝臓において蓄積した（２４時間：ＬＩＰ−Ｇｄ：４９５．９±３７．４ｍｓｅｃ、コントロール：８０４．１±８１．８ｍｓｅｃ；ｐ＜０．０５；４８時間：ＬＩＴＡ−Ｇｄ：５０３±６６ｍｓｅｃ、コントロール：７３８±８０ｍｓｅｃ；ｐ＜０．０５）。
【００８８】
実施例１１−リポソーム封入酢酸製剤および定量
標的組織における選択的吸収の確認に続いて、酢酸（実施例２の「ＬＩＴＡ」）、またはコントロールとして低イオン強度緩衝剤（ＨＥＰＥＳ）のいずれかでリポソームを封入した。酢酸と結合し、そのＮＭＲ信号を減少するとして知られているアルブミンを含む場合と含まない場合とで、ＬＩＴＡ製剤とリポソームを含まない酢酸溶液とを調製した。アルブミンは、リポソームを含まない溶液中の酢酸のＮＭＲ信号を抑制したが、減少がＬＩＴＡナノ粒子溶液中では観察されず（図１９Ａ〜Ｄ）；酢酸がリポソーム内に無事に封入されたことを示している。リポソーム性酢酸の定量を可能にするために、ＬＩＴＡ製剤を、内部基準として既知の濃度の乳酸と併せてスキャンした。リポソーム性酢酸の濃度を、ｌ００ｕｌあたり２６．４５μｇ（２．２ｍＭ）と計算した（図１９Ｅ〜Ｆ）。一回のＬＩＴＡの注入あたりの酢酸の濃度は、２．６ｍｇ／ｋｇであって、だいたい、ネズミのモデルにおける胃内または経口送達に以前に使用したものよりも低い規模であった。リポソーム製剤のサイズに差異はなかった（ＬＩＴＡ：１０２．３±７．５ｎｍ；コントロール：９５．９±９．０ｎｍ、ｐ＝０．６、図１９Ｇ〜Ｉ）。
【００８９】
実施例１２−ミトコンドリアの呼吸における、酢酸のインビトロ効果
ＬＩＴＡプロトコル（１００μｌの注入あたり２．２ｍＭ）で使用する用量に匹敵する濃度で、酢酸がエネルギー源として使用されたかどうかを決定するために、インビトロでミトコンドリアの呼吸を評価した。酢酸（５ｍＭ）が、有意にＡＴＰ生成を増加させることがわかった（ｐ＜０．０１）（図２０）。
【００９０】
実施例１３−高脂肪食をとらせたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、長期的なＬＩＴＡナノ粒子投与の修復性効果
ＬＩＴＡナノ粒子（実施例２）の代謝可能性を、複数の生体内モデルにおいて評価して、異なる代謝結果を精査した。始めに、５週間、マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）をとらせることによって肥満の原因となる背景を確立した。マウスは、その後、さらなる５週間にわたって、３日毎に、ＬＩＴＡまたはコントロールナノ粒子の腹腔内注射を受けながら、ＨＦＤを維持した。体重の差（図２１Ａ）または累積の食物（図２１Ｂ）を、群の間で観察した。ＨＦＤの最初の５週間後、全身脂肪症およびＩＨＣＬを１Ｈ ＭＲＳによって決定し、この場合も、その後の５週間、長期的な注入を行った。全身脂肪症（ＬＩＴＡ：９．０±１６．７％；コントロール：４０±２１．８％、ｐ＝０．０２）（図２１Ｃ）およびＩＨＣＬ（ＬＩＴＡ：−０．１１±０．０６、コントロール：２．４±０．９、ｐ＜０．０００１）（図１８Ｄ）は、ＬＩＴＡで処置した動物において、有意に減少した。白色脂肪組織（ＷＡＴ）もまた減少した（ＬＩＴＡ：３．４±１．２ｇ、コントロール：４．３±１．２ｇ、ｐ＜０．０１）が、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）値に見られた変化は、それよりも小さかった（図２２Ａ）。血中グルコース、インスリンまたは脂質の変化を観察した（図２１Ｅ）。ＬＩＴＡを注射した動物では、血清ケモカインＫＣ／ＧＲＯの低下（ｐ＜０．０５）が実証され、炎症トーンの減退と、炎症誘発性サイトカイン産生阻害マーカーであるＩＬ−１０の増加（ｐ＜０．０５）とが示された（図２１Ｆ）。肝臓ｍＲＮＡの定量的なＲＴ−ＰＣＲによって、ＬＩＴＡで処置した動物におけるＵＣＰ−２発現の有意な減少が明らかとなった（図２１Ｇ）。ＲＴ−ＰＣＲ肝臓分析によって、ＬＩＴＡ誘発によるＨＤＡＣ１発現の減少が実証され（ｐ＜０．００１）（図２１Ｇ）、ウエスタンブロット分析によって、ＨＤＡＣ２（ｐ＜０．０１）とＨＤＡＣ７（ｐ＜０．００１）との有意な差が示された（図２１Ｈ）。ヒストンリシン蛋白質を全ヒストン蛋白質発現に正規化することによって、ＬＩＴＡ群における残基ａｃＨ４Ｋ１２の減少が明らかとなった（図２１Ｉ）。さらに、マイクロアレイ分析によって、ＨＤＡＣクラス１を含め、代謝関連遺伝子の発現に有意な変化が確認された（図２２Ｂ）。
【００９１】
実施例１４−ＨＦＤをとらせたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、長期的なＬＩＴＡ−ナノ粒子投与の予防効果
第二の食事モデルにおいて、肥満の原因となる食事に関連する結果の発展をＬＩＴＡナノ粒子（実施例２）が妨げる可能性を評価した。ＨＦＤをとらせたマウスは、６週間にわたって、３日毎に、ＬＩＴＡまたはコントロールナノ粒子の腹腔内注射を受けた。体重の差（図２３Ａ）または週次食物摂取（図２４Ａ）を観察した。以前のモデルにしたがって、長期的なＬＩＴＡの処置は、脂肪症の蓄積を有意に低減した（ＬＩＴＡ：２４．１±９．７％；コントロール：３０．８±９．７％、ｐ＝０．０３）（図２３Ｂ）およびＩＨＣＬ（ＬＩＴＡ：−０．０１±０．７、コントロール：０．０３±０．０５、ｐ＝０．０５）（図２３Ｃ）。ＬＩＴＡ注入によって、血清インスリン値が低下し（ＬＩＴＡ：０．６±０．３ｎｇ／ｍｌ、コントロール：１．１±０．７ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）、絶食グルコース（ＬＩＴＡ：８．６±１．８ｍｍｏｌ／Ｌ、コントロール：７．４±１．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐ＝０．０２）が増加した（図２３Ｄ）。グルコース負荷試験（ＧＴＴ）後、ＬＩＴＡを注射したマウスにグルコースクリアランスの減少傾向が見られた（図２４Ｂ）。インスリン感受性の差を、恒常性のモデル評価（ＨＯＭＡ）指数を使って観察した（ＬＩＴＡ：６．１±２．５、コントロール：６．７±２．３、ｐ＝ＮＳ）。この場合も、ＬＩＴＡで処置した動物において血清炎症のマーカーの減少傾向があった（ＴＮＦ−α：ＬＩＴＡ：５．４±３．４ｐｇ／ｍｌ、コントロール：１０．６±８．５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０６；ＩＬ−６：ＬＩＴＡ：１７．４±１７．６ｐｇ／ｍｌ、コントロール：３９．７±３５．５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０６）（図２４Ｃ）。ＬＩＴＡを注射したマウスが、脂肪組織トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）の皮下脂肪組織（ＳＡＴ）ｍＲＮＡ発現の減少（ｐ＜０．０１）を示して（図２３Ｆ）、周辺部の脂質動員の減少を示唆したにも関わらず、血清脂質濃度の差は最小であった（図２３Ｅ）。ＬＩＴＡを注射した動物においては、血清遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が顕著に増加し（ＬＩＴＡ：０．３６±０．０８ｎｍｏｌ／Ｌ、コントロール：０．７５±０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、ｐ＜０．０５）、ケトン、３−ヒドロキシブチラートの血清濃度は、上昇した（ＬＩＴＡ：０．２９±０．１ｎｍｏｌ／Ｌ、コントロール：０．１８±０．０３ｎｍｏｌ／Ｌ、ｐ＜０．０５）（図２３Ｅ）。肝臓の機能を、標準的な肝臓機能テストと、ｍＲＮＡの定量的なＲＴ−ＰＣＲとによって評価した。肝臓機能マーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の血清レベルの低下が、ＬＩＴＡを注射した動物において観察された（ＡＳＴ：ＬＩＴＡ：１０６±２６Ｕ／Ｌ、コントロール：２０１±８７Ｕ／Ｌ、ｐ＝０．０２およびＡＬＰ：ＬＩＴＡ：５７．５±１４Ｕ／Ｌ、コントロール：７６．９±２０Ｕ／Ｌ、ｐ＝０．０２）（図２４Ｄ）。長期的なＬＩＴＡ注入はまた、ステロール調節エレメント結合蛋白質−１（ＳＲＥＢＰ１）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）および脂肪酸シンターゼ遺伝子（ＦＡＳＮ）を含めて、脂肪酸合成（ＦＡＳ）に関与する遺伝子のｍＲＮＡ発現の有意な減少をもたらした（図２３Ｇ）。ＬＩＴＡ投与はまた、β−酸化と、ＶＬＤＬ合成との両方の原因となる遺伝子のｍＲＮＡ発現の有意な減少をもたらした（β−酸化；カルニチン パルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ１）、アシルＣｏＡオキシダーゼ−１（ＡＣＯＸ１）と、ＶＬＤＬ合成；ミクロソームトリグリセリド輸送蛋白質（Ｍｔｔｐ））（図２３Ｇ）。前のＨＦＤモデルにしたがって、ＬＩＴＡを注射したマウスによって、ＵＣＰ−２値の減少が実証された（図２３Ｇ）。さらに、ＬＩＴＡで処置したマウスによって、コントロールで処置したマウスと比較して、肝臓におけるマイクロ空胞形成（microvacuolation）の減少が実証された（図２３Ｈ）。肝臓のミトコンドリアの形態の透過電子顕微鏡法分析によって、ミトコンドリアの数に差がない（図２５Ａ〜Ｃ）がＬＩＴＡを注射したマウスにおける稜／周辺部の長さは増大傾向にあることが明らかとなった（ｐ＝０．０７、図２３Ｉ）。酸化的リン酸化複合体ＩＩＩ（＋６２％）、ＩＶ（＋９１％）およびＶ（＋６９％）の蛋白質発現の有意な増加が、ＬＩＴＡ動物において観察された（図２３Ｊおよび図２５Ｄ）。長期的なＬＩＴＡ注入は、フォークヘッド蛋白質Ｏ１（ＦＯＸＯｌ）ｍＲＮＡの肝臓発現の減少をもたらし（図２３Ｇ）、グルコース新生の減少を示した。さらに、グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）ｍＲＮＡの減少（図２３Ｇ）と、空腹時グルコースの上昇（このとき、食物摂取に違いはない）（図２３Ｄ）とによって示されるように、ＬＩＴＡ投与後のグルコースの肝臓吸収の低下もまた観察された。
【００９２】
実施例１５−正常な脂肪食（ＮＦＤ）をとらせたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、長期的なＬＩＴＡナノ粒子投与の予防効果
次のモデルでは、正常な食事背景におけるＬＩＴＡ送達の効果を評価した。ＮＦＤをとらせたマウスに、６週間にわたって、３日毎に、ＬＩＴＡ（実施例２）またはコントロールナノ粒子の腹腔内注射を受けさせた。体重の差（図２６Ａ）または週次食物摂取（図２７Ａ）を観察した。全身脂肪症の差を観察した（ＬＩＴＡ：３．９±４．４％、コントロール：６．６±９．１％、ｐ＝ＮＳ）（図２６Ｂ）。ＬＩＴＡを注射したマウスに、ＩＨＣＬの有意な減少が見られた（ＬＩＴＡ：−０．０１±０．０８、コントロール：０．０５±０．０５、ｐ＜０．０５）（図２６Ｃ）。摂食もしくは絶食条件でのインスリンもしくはグルコース値に関して（図２６Ｄ）、または長期的な注入の５週間後に実行したＧＴＴ後（図２７Ｂ）、差を記録した。ＨＯＭＡ−ＩＲ指数の有意な減少がＬＩＴＡを注射した動物において記録され、インスリン感受性が改良されたことを示唆している（ＬＩＴＡ：１．９±１．４；コントロール：３．６±１．５、ｐ＝０．０３）。血清炎症のマーカーであるレジスチンおよびＴＮＦ−αが、ＬＩＴＡ注入を受けたマウスにおいて有意に減少した（レジスチン：ＬＩＴＡ：１３．６±１．８ｎｇ／ｍｌ、コントロール：１７．２±４．８ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５；ＴＮＦ−α：ＬＩＴＡ：１４．８±８．５ｐｇ／ｍｌ、コントロール：４６．９±３３．Iｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０１）。トリグリセリドの血清中レベル（ＬＩＴＡ：０．７９±０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ、コントロール：１．０３±０．２２ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐ＝０．０５）（図２６Ｅ）、および、レプチンの血清中レベル（ＬＩＴＡ：１９２１±９３５ｐｇ／ｍｌ、コントロール：２８８９±１２０９ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）（図２７Ｃ）もまた、ＬＩＴＡを注射した動物において有意に減少し、コレステロール、ＨＤＬまたはＬＤＬには違いがなかった（図２６Ｅ）。ＷＡＴおよび腸間膜ＡＴは、ＬＩＴＡ投与後、有意に減少した（ＷＡＴ：ＬＩＴＡ：１．３６±０．２４g、コントロール：１．５±０．１７g、ｐ＜０．０５；腸間膜：ＬＩＴＡ：０．１６±０．０４g、コントロール：０．１９±０．０１g、ｐ＜０．０５）（図２７Ｄ）。精巣上体および皮下の蓄積から単離した含脂肪細胞の、群間の平均数、容積または表面面積を記録した。ＬＩＴＡを注射した動物から単離したＡＴは、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）ｍＲＮＡの発現の減少を実証し（コントロールと比較した倍率変化：０．０５±０．０８、ｐ＜０．００１）（図２６Ｆ）、周辺部の脂質の動員の減少を反映していた。ＨＦＤモデルの予防結果と同様、肝臓ｍＲＮＡ試料の定量的なＲＴ−ＰＣＲによって、ＶＬＤＬ代謝（Ａｐｏ−Ｂ、Ｍｔｔｐ）、β−酸化（ＡＣＯＸ−１、ＣＰＴ−１）、ミトコンドリアの酸化（ＰＰＡＲγ、ＰＧＣ−１）、グルコース代謝（ＧＬＵＴ−２、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２）および炎症（ＴＮＦα）に関与する遺伝子の発現の、ＬＩＴＡ誘発による減少が明らかとなった（図２６Ｇ）。組織試験によって、ＮＦＤをとらせた全マウスについて、正常な肝臓構造が明らかとなり、ＬＩＴＡを注射したマウスは、コントロールよりも少ないマイクロ空胞化を示し（図２６Ｈ）、炎症が減退したことを示した。ミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体の活性���、群間で比較した（図２５Ｅ）。
【００９３】
実施例１６−異種移植片腫瘍転移における、ＬＩＴＡナノ粒子投与の代謝効果
ＬＩＴＡナノ粒子（実施例２）の投与が、腫瘍サイズの有意な減少をもたらした（ＬＩＴＡ：１０７±１１３ｍｍ２、コントロール：２７０±８７ｍｍ２、ｐ＝０．０４）（図２８Ａ〜Ｃ）。腫瘍容積の進行は、ＬＩＴＡを注射した動物において有意に低減した（腫瘍容積（４週目）：ＬＩＴＡ：１２３±１１９ｍｍ３、コントロール：２５４±９３ｍｍ３、ｐ＜０．０５）（図２８Ｄ）。異種移植片ｍＲＮＡの定量的なＲＴ−ＰＣＲによって、ＬＩＴＡを注射した動物において、クラスＩ ＨＤＡＣ；ＨＤＡＣ １（ｐ＜０．０５）、ＨＤＡＣ ２（ｐ＜０．０５）、ＨＤＡＣ ３（ｐ＜０．００１）およびＨＤＡＣ ４（ｐ＜０．０１）の発現の有意な減少が明らかとなった（図２８Ｅ）。加えて、エピジェネティクスのサイレンシングｍＲＮＡの原因となる「silent mating type information regulation homologues」つまりＳｉｒＴ蛋白質の発現もまた、ＬＩＴＡを注射した動物において有意に減少した（ＳｉｒＴｌ、ｐ＜０．０５）（図２８Ｅ）。
【００９４】
実施例１７−卒中のラットＭＣＡＯモデルにおけるナノ粒子の効果
卒中後の脳組織の保護および回復のための実施例２のナノ粒子の潜在的有効性（封入酢酸）について、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）ラットモデルで試験した。
【００９５】
方法
動物：ＳＤラット（Sprague-Dawley rats）（オス、２３０〜２５０ｇ、ｎ＝２０ Ｈａｒｌａｎ社）を取得して、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）の誘発の前５〜７日間、馴化させた。それらを、ランダムに、同様の体量を有する２つの群に割り当てた。
【００９６】
卒中の誘発：ＭＣＡＯの誘発の前に、神経造影を実行した（以下参照）。ＭＣＡＯの誘発のために、イソフルラン２％、酸素−エアー混合物（３０：７０）でラットに麻酔をかけた。総頸動脈を露出するために中心線切開を行い、頚静脈から血液試料を採取し、血漿を得た（以下参照）。シリコンゴムでコーティングされた先端（直径：０．３３ｍｍ、長さ：４〜５ｍｍ）を有する５−０モノフィラメントナイロン縫合糸を、内頚動脈に導入し、中大脳動脈（ＭＣａ）への血流を塞ぐために動脈に沿って２０〜２２ｍｍ前進させた。賦形剤または治療剤（１ｍｌ）の腹腔内（ｉｐ）注入を閉塞において行った。次に、ＭＣＡＯ中、動物を麻酔から回復させた。ＭＣＡＯの９０分後、動物に麻酔をかけ、フィラメントを完全に引っ込めて、ＭＣＡの再灌流を可能にした。あり得る脱水症を和らげるために、生理食塩水（３ｍｌ）を皮下投与した。手術中、加温ブランケットと直腸プローブとを使って、体温を維持した。
【００９７】
２週間の観察期間にわたって、毎日、コントロールナノ粒子（１ｍｌ）または実施例２のナノ粒子（１ｍｌ）のいずれかを動物に腹腔内投与した。体重および神経造影もまた、実験の期間全体にわたって毎日記録した。
【００９８】
処置の評価：閉塞の２４時間後と２週間後、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を行った。線条体の核磁気共鳴スペクトル測定法（ＭＲＳ）もまた、後のタイムポイントで行った（以下参照）。最終のタイムポイントでのＭＲＩおよびＭＲＳの前に、さらにオープンフィールドをラットの自発運動を評価するために行った。
【００９９】
最終のタイムポイントでのＭＲＩおよびＭＲＳの後、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、リン酸で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）、以下参照）で脳を灌流固定した。灌流の後、脳を回収して、その後の低温切開および免疫蛍光検査のために３０％の蔗糖（ＰＢＳ）に漬ける前に、４％のＰＦＡ中で一週間、さらに固定させた。
【０１００】
磁気共鳴法：イソフルラン、酸素−エアー（３０：７０％）混合物でラットに麻酔をかけた。ラットの頭部を内径４３ｍＭの直交容積ＭＲＩコイルの中央に慎重に位置づけて、次に、７Ｔ Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＲスキャナーの磁石ボア内に置いた。閉塞の２４時間後、１週間後、２週間後、ＭＣＡＯ病変のサイズおよび程度を示すために、Ｔ２強調ＭＲＩを行った。Ｔ２強調ＭＲ画像における病変容積は、手作業で分けた。
【０１０１】
行動−神経造影−オープンフィールド：自発運動および不安様行動を評価するために、オープンフィールドテストを行った。白く、特徴のない活動領域において、静かで薄暗い行動観察ルーム（behaviour room）内で行動試験を行った。ラットを活動領域内に個別に置いて、それらの行動を、３０分、活動領域の真上で、天井に位置するビデオカメラで記録した。ラットの全行程および平均速度をＥｔｈｏ Ｖｉｓｉｏｎ ＸＴソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ社、オランダ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ）を使って測定した。記録の最後に、動物は、それらのケージにもどり、それぞれの動物セットの間において、７０％のＩＭＳ溶液で活動領域を完全に清浄した。
【０１０２】
結果
病変容積のＭＲＩ評価：ＭＲＩで評価した病変容積は、コントロールと比較して、閉塞の２４時間後、実施例２のナノ粒子で処置したラットの方が小さかった（９１．３３±２４．６３ｍｍ３対１４３．４±４４．１）。閉塞の１週間後、両方の群において、閉塞の２４時間後よりも病変部は小さくなった（図２９）。
【０１０３】
行動評価−オープンフィールド：実施例２のナノ粒子を与えられたラットは、閉塞にコントロール−ナノ粒子を与えられたラットよりも、より速い速度で（Ｐ＜０．０５）、より長い距離（Ｐ＜０．０５）を移動した（図３０）。
【０１０４】
まとめ
これらの結果は、ナノ粒子封入酢酸が、肥満と癌との両方を示す病原性の識別特性（signatures）の発症を防ぎ、かつ食い止めることができる、強力で多機能な医薬品有効成分（ＡＰＩ）として作用することを示している。組織像および画像化を使った、１８Ｆ−ＦＤＧ、ローダミンおよびガドリニウム抱合リポソームの生体分布の評価によって、ＬＩＴＡナノ粒子が、もともと肝臓親和性（livertropic）であることが確認された。特に、リポソーム膜におけるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル濃度の割合の増加が、腫瘍組織におけるリポソームの選択的蓄積をもたらした。
【０１０５】
調査した全食事モデルにおいて、長期的なＬＩＴＡ投与によって、修復性および予防性ＨＦＤ実例の両方において、肝細胞内脂質（ＩＨＣＬ）および脂肪症が有意に減少した。これらの変化は、食物摂取または体重の減少から独立して起こった。重要なことに、ＬＩＴＡ送達は、単に蓄積を遅らせるばかりか、ＩＨＣＬを積極的に減少させた。肝脂質の蓄積は、次々と肝臓状態を益々衰弱させる上で重要な媒体となり、インスリン抵抗および糖尿病の進行に強く関与している。ＬＩＴＡ誘発によるＩＨＣＬの減少は、ナノ粒子が、ＮＡＦＬＤを防ぐことができるだけでなく、その後の肝細胞性の癌腫（ＨＣＣ）への進行の制御をもし得ることを示している。ＬＩＴＡ注入が、ＨＦＤおよびＮＦＤモデルにおいて、それぞれ、ＦＦＡおよびトリグリセリドの血中値を低下させることがわかった。ＬＩＴＡ投与が、周辺部の脂質動員、肝臓の脂肪産生および脂質吸収に関与する蛋白質の発現を低減することを示すデータによって、堅調なＩＨＣＬの減少のための前向きなメカニズムがもたらされる。肥満およびＩＨＣＬの低下に加えて、肝臓機能の研究によって、さらなる有益な効果が明らかとなった。ＨＦＤおよびＮＦＤモデルの両方に観察されたＵＣＰ−２発現の減少は、ミトコンドリアの膜にわたるプロトン漏出の減少、電気化学的電位の破壊の減少および小器官効率の上昇を反映している。ＨＦＤモデルにおける、周長あたりの稜数の増加、および、ＯＸＰＨＯＳ複合体の蛋白質発現の減少の傾向は、ＡＴＰ生産の増加を示している。さらに、ＬＩＴＡ誘発による血清ＡＳＴおよびＡＬＰの減少は、改良された機能を示している。
【０１０６】
ＬＩＴＡ送達は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびレジスチンの血清濃度の低下傾向と併せて、ＮＦＤおよびＨＦＤモデルの両方において肝臓におけるＴＮＦ−αの発現の減少をもたらした。さらに、ＬＩＴＡ投与を続けたなら、すべての食事実例において観察された脂肪質量およびＩＨＣＬの低下が、さらに長期の炎症トーンの改善に貢献すると期待されよう。ＬＩＴＡ投与後の変化は、全食事モデルにわたって均一ではなく、ＨＦＤ実例に限り、脂肪酸合成、血中ＦＦＡ、インスリン、ならびに炎症および肝臓機能の血清マーカーが減少した。正常な食事条件下での肝臓の酢酸の増加は、長期の絶食中に見られる脂肪酸酸化の上流調節に関連している。肝臓の酢酸の値の上昇を飢餓信号として解釈する補償的恒常性維持機構が、ＮＦＤ背景でのＬＩＴＡ投与に対する消極的代謝反応をもたらしたと考えられる。
【０１０７】
酢酸補給が、肝臓内のアセチル−ＣｏＡの生産の増加をもたらし、それは、ミトコンドリアの吸収後、ＴＣＡサイクルに入って、ＨＦＤモデルにおける細胞培養に観察されたようなＡＴＰ生成を増加させるか、または、予防的ＨＦＤモデルに見られるように、ケトン産生の経路に入り得る。ケトン生成は、肝臓ミトコンドリアでのみ起こるため、ＬＩＴＡ誘発の血清ヒドロキシブチラートの増加は、重要な発見であり、肝臓ミトコンドリアへの酢酸の生体内送達を間接的に確認している。肝臓内のミトコンドリアのアセチル−ＣｏＡ合成酵素（ＡｃｅＣＳ２）の発現が明らかに欠損しているため、ＬＩＴＡナノ粒子からの酢酸が、後にミトコンドリアに入っていく細胞質内酵素（ＡｃｅＣＳl）によって、アセチル−ＣｏＡに変換されると考えられる。しかしながら、データは、逆を示しており、ＮＦＤおよびＨＦＤモデルの両方において、長期的なＬＩＴＡ注入が、β−酸化経路を制御する遺伝子の発現を減少させている。酢酸代謝の方法および速度が、これらの差を説明し得、ボラス注入または経口胃管栄養法後のより即効性のある全身吸収とは対照的に、比較的安定した、主に肝臓への送達が、リポソームのナノ粒子によって提供される。
【０１０８】
それと併せて、ＬＩＴＡ誘発のミトコンドリアのアセチル基−ＣｏＡの蓄積が、β−酸化を阻害し、その後、脂質吸収、脂肪産生および肝臓の吸収を低減するというメカニズムを、結果が支持している。さらに、これらの変化は、酢酸を燃料として利用できるため、グリコールおよびグルコース新生経路を抑制することによってグルコースの使用を損なう代謝信号を生成するという仮説と一致している。炭水化物代謝からの転換が、ＬＩＴＡを注射した動物における呼吸器系の結果を変えると期待し得るが、代謝ケージ分析後、差異は観察されなかった。しかしながら、酢酸が酸化燃料として脂肪に置き換わるため、エネルギー支出が酢酸の注入後維持されると報告するいくつかの刊行物によって、これらの結果は支持される。
【０１０９】
ＳＣＦＡに起因する抗腫瘍形成効果は、細胞の遺伝子発現において主要な役割をなすエピジェネティックなマーカーであるＨＤＡＣ酵素の発現の変化に関連している。癌細胞におけるＳＣＦＡの非効率的な代謝は、細胞核におけるアセチル基−ＣｏＡの蓄積をもたらすと考えられ、細胞核において、それは、細胞増殖、細胞アポトーシス、および分化に関与する遺伝子の発現を変えるＨＤＡＣ阻害因子として機能する。過去の研究では、ＳＣＦＡ、ブチラートの補給によって、結腸癌細胞における変えられた細胞代謝を標的にして破壊することが試みられたが、これらの結果は；ＬＩＴＡの長期的な投与が、腫瘍増殖の有意な減少と、いくつかのクラスのＨＤＡＣにおけるｍＲＮＡ発現の減少をもたらしたという仮説を支持している。従って、ＬＩＴＡ補給が、好気性の糖分解からミトコンドリアのベータ酸化への燃料選択の切り替えを引き起こし、正常な非増殖性状態へと、癌細胞の代謝的リプログラミングをなすことが予測される。ヒストンデアセチラーゼ、ＳｉｒＴｌの発現の減少は、細胞アポトーシスの阻害因子および腫瘍形成の促進因子としてその役割を考えると、留意するべきである。
【０１１０】
全体的に、ＬＩＴＡ投与によって、肥満と癌と両方の動物モデルにおいて、腫瘍増殖の減少と、ＩＨＣＬ、体脂肪、血清インスリン、ＦＦＡおよび炎症トーンの減退を含め、広範囲の代謝性症候群に関連する結果の回復とを含む代謝プロファイルが包括的に改善された。投与はまた、卒中モデルにおいて有益であることもわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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