(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む水溶液を、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体により、フロースルーする精製方法であり、
前記水溶液中の前記凝集体の含有率が３％以下であり、
前記目的タンパク質の単量体と凝集体を前記カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬあたり０．５ｇ以上ロードし、
前記凝集体を５０％以上低減させる、精製方法。
【請求項２】
タンパク質が、前記カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬに対し、１０ｍｇ以上吸着される条件でフロースルー精製を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的タンパク質の単量体を７８％以上回収する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的タンパク質を含む水溶液のｐＨが５以上１０以下である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記目的タンパク質を含む水溶液の電気伝導度が０．１ｍＳ／ｃｍ以上２０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む水溶液がさらに、プロテインＡを含み、前記カチオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルーにより、前記プロテインＡを低減させる、請求項１から５のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項７】
前記カチオン交換クロマトグラフィー担体が、基材と、前記基材に固定された共重合体と、を備える、請求項１から６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項８】
前記共重合体が、共有結合により基材に固定されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記共重合体が、カチオン交換基を有するモノマー単位と、電荷を持たない中性モノマー単位と、を備える、請求項７又は８に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記共重合体において、前記カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合よりも、前記中性モノマー単位の質量割合が高い、請求項９に記載の精製方法。
【請求項１１】
前記共重合体において、カチオン交換基を有するモノマー単位と、非荷電であるモノマー単位と、のモル比において、前記カチオン交換基を有するモノマー単位の方が大きい、請求項７から９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１２】
前記カチオン交換基が、弱カチオン交換基のみからなる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１３】
前記弱カチオン交換基が、カルボン酸基である、請求項１２に記載の精製方法。
【請求項１４】
前記カチオン交換クロマトグラフィー担体が膜状である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１５】
前記目的タンパク質が抗体タンパク質である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１６】
前記抗体タンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬あるいは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
【０００３】
液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
【０００４】
イオン交換クロマトグラフィー工程は、吸着剤表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。吸着剤の形状としては、ビーズや、平膜、中空糸等の膜などが採用されており、これらの基材にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが吸着剤として市販されている。
【０００５】
カチオン交換基を有する吸着剤では、低塩濃度の抗体溶液を吸着材に接触させることにより、抗体を吸着させ、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた生理活性物質を溶出させる精製が一般的に行われており、抗体の単量体と、抗体の２量体等の凝集体と、を分離することがしばしば目的とされている。更に、より良好な方法として、フロースルー精製も提案されている。
【０００６】
フロースルー精製とは、目的物質よりも不純物を選択的に吸着させる精製方法である。そのため、従来の吸着、溶出を利用した方法に比べ、緩衝液（バッファー）の節約や工程の簡略化につながる。
【０００７】
特許文献１には、樹脂上に芳香族と弱カチオン交換基を有する低分子化合物を結合させた、フロースルー精製に用いるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が開示されている。
【０００８】
特許文献２には、強カチオン交換基を有するモノマー単位と、非荷電であるモノマー単位と、の共重合体を担体に固定したカチオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルー精製が開示されており、凝集体を効率的に除去できるとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４７７６６１５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１７１４３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１には、プロテインＡと抗体が凝集した凝集体をフロースルー精製により除去することが開示されているが、抗体同士の凝集体の除去能に関しては開示されていない。また、特許文献１に係るクロマトグラフィー樹脂にかけられる抗体の量は少ない。
【００１１】
特許文献２には、強カチオン交換基を主とするカチオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルーモードでの抗体の凝集体の除去方法が開示されている。しかし、本発明者らは検討の結果、強カチオン交換基を主とするカチオン交換クロマトグラフィー担体では、抗体溶液中の抗体の凝集体の含有率が少なくても、効率的に抗体の凝集体を除去できる抗体溶液の量が増加しないことを見出した。このように、強カチオン交換基を主とするカチオン交換クロマトグラフィー担体は、抗体の凝集体の含有率が少ない抗体溶液であっても抗体溶液の処理量が少なく、抗体の凝集体の含有率が少ない抗体溶液のフロースルー精製には適さない場合があることを本発明者らは見出した。なお、抗体溶液の処理量とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体に導入することができる抗体溶液の全量である。
【００１２】
このように、抗体の凝集体の含有率が少ない抗体溶液から抗体の凝集体を効率よく除去する方法は従来見出されていない。そこで、本発明は、抗体の凝集体の含有率が少ない抗体溶液から効率的に抗体の凝集体を除去する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を有するカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いるフロースルー精製により、抗体の凝集体の含有率が少ない抗体溶液から効率的に抗体の凝集体を除去出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明の形態によれば、目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む水溶液を、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体により、フロースルーする精製方法であり、水溶液中の凝集体の含有率が３％以下であり、目的タンパク質の単量体と凝集体をカチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬあたり０．５ｇ以上ロードし、凝集体を５０％以上低減させる、精製方法が提供される。
【００１５】
上記の精製方法において、タンパク質が、カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬに対し、１０ｍｇ以上吸着される条件でフロースルー精製を行ってもよい。目的タンパク質の単量体を７８％以上回収してもよい。目的タンパク質を含む水溶液のｐＨが５以上１０以下であってもよい。目的タンパク質を含む水溶液の電気伝導度が０．１ｍＳ／ｃｍ以上２０ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む水溶液がさらに、プロテインＡを含み、カチオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルーにより、プロテインＡを低減させてもよい。
【００１６】
上記の精製方法において、カチオン交換クロマトグラフィー担体が、基材と、基材に固定された共重合体と、を備えていてもよい。共重合体が、共有結合により基材に固定されていてもよい。共重合体が、カチオン交換基を有するモノマー単位と、電荷を持たない中性モノマー単位と、を備えていてもよい。共重合体において、カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合よりも、中性モノマー単位の質量割合が高くてもよい。共重合体において、カチオン交換基を有するモノマー単位と、非荷電であるモノマー単位と、のモル比において、カチオン交換基を有するモノマー単位の方が大きくてもよい。カチオン交換基が、弱カチオン交換基のみからなっていてもよい。弱カチオン交換基が、カルボン酸基であってもよい。カチオン交換クロマトグラフィー担体が膜状であってもよい。
【００１７】
上記の精製方法において、目的タンパク質が抗体タンパク質であってもよい。抗体タンパク質が、モノクローナル抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る精製方法によれば、抗体の凝集体の含有率が少ない抗体溶液から効率的に抗体の凝集体を除去することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーにかけた際の吸光度のグラフである。
【図２】図１のグラフの拡大図である。
【図３】実施例１から１０、及び比較例１から６の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下に示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００２１】
実施の形態に係るタンパク質の精製方法は、目的タンパク質の単量体と凝集体とを含む水溶液を、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体により、フロースルーする精製方法であり、水溶液中の凝集体の含有率が３％以下であり、目的タンパク質の単量体と凝集体をカチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬあたり０．５ｇ以上ロードし、目的タンパク質の凝集体を５０％以上低減させる、精製方法である。ここで、凝集体の含有率とは、水溶液中における、抗体の単量体と凝集体の全質量に対する、凝集体の質量の割合をいう。
【００２２】
実施の形態に係る目的タンパク質は、特に限定されないが、抗体タンパク質でありうる。抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。抗体タンパク質は単に抗体とも表記する。
【００２３】
実施の形態に係る抗体タンパク質のクラスアイソタイプ及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスの何れであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１からＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係る抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
【００２４】
さらに、抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係る抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質の何れであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、実施の形態に係る抗体タンパク質としては、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適であるが、これに限定されない。
【００２５】
実施の形態に係る目的タンパク質の凝集体とは、目的タンパク質の単量体が複数凝集して形成されるものである。目的タンパク質の凝集体とは、例えば、目的タンパク質（それ自体は２量体等の会合体であってもよい）の２量体及び３量体等の低次の凝集体、４量体以上の高次の凝集体、及びそれらの混合物の少なくともいずれかを指す。
【００２６】
フロースルーとは、不純物となる凝集体などを吸着除去して、目的タンパク質を透過して回収する精製方法をいう。例えば、抗体タンパク質の単量体が目的物で、抗体タンパク質の凝集体が不純物である場合、抗体タンパク質の単量体は概して吸着剤の表面を流れ、抗体タンパク質の凝集体が概して吸着剤に結合する。この時、抗体タンパク質の単量体は吸着剤に吸着されてもよいが、抗体タンパク質の凝集体がより選択的に吸着剤に吸着されることにより、抗体タンパク質の単量体が精製される。
【００２７】
スルホン酸基等の強カチオン交換基を主とする強カチオン交換体を用いるフロースルー精製による凝集体除去効率は、凝集体の含有率への依存性が小さいため、抗体溶液における凝集体の含有率が多くても、凝集体が効率的に除去できる。しかし、凝集体の含有率の少ない抗体溶液では、効率的に凝集体を除去できる抗体溶液の量は大きく増加しない（国際公開第２０１４／１７１４３７号参照）。一方、本発明の実施の形態における、弱カチオン交換基を備え、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高いカチオン交換クロマトグラフィー担体によるフロースルー精製は、理由は定かではないが、凝集体の含有率への依存性が大きい傾向にあり、凝集体の含有率の少ない抗体溶液であれば、効率的に凝集体を除去できる抗体溶液の量が増加する傾向にある。ここで、抗体溶液の量とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体に導入することができる抗体溶液の全量である。そのため、本発明の実施の形態によるカチオン交換体によるフロースルー精製では、凝集体の含有率が少ないほど、効率的な精製が可能となる。凝集体の含有率が少ないとは、凝集体の含有率が、例えば、３．０％以下、２．９％以下、２．８％以下、２．７％以下、２．６％以下、２．５％以下、２．４％以下、２．３％以下、２．２％以下、２．１％以下、２．０％以下、１．９％以下、１．８％以下、１．７％以下、１．６％以下、１．５％以下、１．４％以下、１．３％以下、１．２％以下、１．１％以下、１．０％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、あるいは０．５％以下等であることをいう。
【００２８】
また、実施の形態で処理可能な抗体溶液に含まれる目的タンパク質の単量体と凝集体の全量、換言すれば、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体にロードすることができる目的タンパク質の単量体と凝集体の全量は、カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬあたり、０．５０ｇ以上であれば特に限定されないが、精製効率の点から好ましい例として、０．６０ｇ以上、０．７０ｇ以上、０．８０ｇ以上、０．９０ｇ以上、１．００ｇ以上、１．０１ｇ以上、１．１０ｇ以上、１．２０ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．４０ｇ以上、１．５０ｇ以上、１．６０ｇ以上、１．７０ｇ以上、１．８０ｇ以上、１．９０ｇ以上、２．００ｇ以上、２．１０ｇ以上、２．２０ｇ以上、２．３０ｇ以上、２．４０ｇ以上、２．５０ｇ以上、２．６０ｇ以上、２．７０ｇ以上、２．８０ｇ以上、２．９０ｇ以上、３．００ｇ以上等が挙げられる。
【００２９】
実施の形態に係る精製方法によれば、目的タンパク質の凝集体が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上低減する。ここで、目的タンパク質の凝集体の低減割合とは、実施の形態に係るフロースルーによる精製前の凝集体の含有率に対する、精製後の凝集体の含有率を、１から引いた値の％表示をいい、以下の算出式で求められる。
低減割合（％）
＝１００−（（精製後の凝集体の含有率／精製前の凝集体の含有率）×１００）
【００３０】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、基材上に、少なくとも１種類の弱カチオン交換基を有する。少なくとも１種類の弱カチオン交換基を有していれば、強カチオン交換基を有していてもよく、あるいは強カチオン交換基を有していなくともよい。弱カチオン交換基としては、例えばカルボン酸基、ホスホン酸基、及びリン酸基等が挙げられ、強カチオン交換基としては、スルホン酸等が挙げられる。
【００３１】
「カチオン交換基密度」とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体１リットル当たりのカチオン交換基のモル数の濃度として一般的に表される、カチオンイオン交換クロマトグラフィー担体におけるカチオン交換基の濃度を意味する。
【００３２】
実施の形態に係るカチオン交換基密度は、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であれば特に限定されないが、タンパク質処理量の観点から、より高い方が好ましい傾向にある。そのようなイオン交換基密度として、例えば５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１７０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２７０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３７０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、３９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、あるいは４００ｍｍｏｌ／Ｌ以上等が挙げられる。
【００３３】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体のカチオン交換基密度を求める方法として、強酸などを用いてカチオン交換基を全てプロトン化した後に、塩基を用いて中和し、逆滴定により測定する方法がある。また、カチオン交換基のカウンターカチオンをリチウムイオンに置換した後に、強酸で処理し、溶出するリチウムの量を測定する方法もある。これらの方法により、カチオン交換基密度が測定できる。ここで、カチオン交換基密度は、高カチオン交換基密度と、弱カチオン交換基密度と、の計である。
【００３４】
強カチオン交換基密度を測定する方法として、例えば、強酸などを用いて強カチオン交換基を全てプロトン化した後に、塩化ナトリウム水溶液を加え、溶出してくる塩化水素を滴定することにより測定する方法がある。
【００３５】
弱カチオン交換基密度は、カチオン交換基密度から、強カチオン交換基密度を差し引くことにより求めることが出来る。
【００３６】
実施の形態に係るフロースルー精製においては、固定相と移動相が平衡にあり、固定相上の目的タンパク質単量体と、移動相に存在するタンパク質凝集体と、が置換することにより、効率的に凝集体が除去できると考えられる。そのため、必ずしも理論に拘束されるものではないが、フロースルー精製の後に、カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬに対して、１０ｍｇ以上のタンパク質が吸着される条件で、実施の形態に係るフロースルー精製が実施されることが好ましい。ここで、フロースルー精製の後にカチオン交換クロマトグラフィー担体に吸着されているタンパク質とは、目的タンパク質の凝集体のみならず、単量体をも含みうる。より好ましい範囲として、２０ｍｇ以上、３０ｍｇ以上、４０ｍｇ以上等が挙げられ、特に好ましい範囲として、５０ｍｇ以上、６０ｍｇ以上、７０ｍｇ以上、８０ｍｇ以上等が挙げられる。カチオン交換クロマトグラフィー担体に吸着されているタンパク質の量は、下記式で表されるように、フロースルー精製した際の、目的タンパク質の単量体と凝集体の回収率（％）から求めることができる。
吸着量＝タンパク質のロード量−タンパク質のロード量×回収率／１００
【００３７】
実施の形態に係る、純度の向上したタンパク質単量体を得る精製方法は、タンパク質の単量体とタンパク質の凝集体とを含む混合溶液から、タンパク質の単量体を精製する精製方法であって、上述したカチオン交換クロマトグラフィー担体に対し、混合溶液を接触させることを含む。実施の形態に係る精製方法によるタンパク質の単量体の回収率は、例えば７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上である。目的タンパク質の単量体の回収率は、下記式に基づいて算出される。なお、下記式において、目的タンパク質を含む水溶液の処理量とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体に導入された目的タンパク質を含む水溶液の全量である。
目的タンパク質の回収率（％）＝（目的タンパク質水溶液の回収量（ｍＬ）×回収水溶液における目的タンパク質単量体の含有量（ｍｇ／ｍＬ））／（目的タンパク質を含む水溶液の処理量（ｍＬ）×処理前の水溶液における目的タンパク質単量体の含有量（ｍｇ／ｍＬ））×１００
【００３８】
目的タンパク質を含む水溶液の溶媒としての緩衝液の水素イオン濃度（ｐＨ）は、処理するタンパク質の等電点や、大きさなどにより異なり、適宜最適条件を検討する必要があるが、弱カチオン交換基の荷電量の観点から、５．０以上が好ましく、より好ましくは６．０以上、さらに好ましくは６．５以上、さらにさらに好ましくは６．６以上、特に好ましくは７．０以上がある。また、タンパク質の安定性の観点から、１０．０以下が好ましく、より好ましくは９．５以下、さらに好ましくは９．０以下、特に好ましくは８．５以下である。
【００３９】
実施の形態に係るクロマトグラフィーの移動相としては、強酸、強アルカリ以外の緩衝液（バッファー）を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは緩衝能を有する水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。塩化ナトリウムや塩化カリウム等の無機塩類は含んでも含まなくてもよく、その塩類の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌ以上８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは、０ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。また、バッファー濃度は１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。ここで、バッファー濃度とは、バッファーの有効成分の濃度のことをいう。例えば、酢酸バッファーであれば、通常酢酸と酢酸ナトリウムから調整されるが、その時の、酢酸と酢酸ナトリウムの合計の濃度である。また、トリスバッファーでは、トリスヒドロキシメチルアミノメタンの濃度のことをいう。酢酸−トリスバッファー等のように表記されるバッファーについては、前者の濃度のことであり、酢酸−トリスでは酢酸の濃度のことであり、トリス−酢酸であればトリスの濃度のことである。
【００４０】
なお、緩衝溶液における無機塩類の濃度が１００ｍｍｏｌ／Ｌより高いと、遮蔽効果が大きくなり、カチオン交換クロマトグラフィー担体が凝集体等の不純物を保持することが困難となる傾向にある。
【００４１】
目的タンパク質を含む水溶液の電気伝導度は、０．１ｍＳ／ｃｍ以上２０ｍＳ／ｃｍ以下、０．３ｍＳ／ｃｍ以上１５ｍＳ／ｃｍ以下、０．５ｍＳ／ｃｍ以上１０ｍＳ／ｃｍ以下、０．７ｍＳ／ｃｍ以上７ｍＳ／ｃｍ以下、０．８ｍＳ／ｃｍ以上５ｍＳ／ｃｍ以下、０．９ｍＳ／ｃｍ以上４．５ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは１．０ｍＳ／ｃｍ以上３．９ｍＳ／ｃｍ以下である。電気伝導度が２０ｍＳ／ｃｍを超えると、遮蔽効果が大きくなり、カチオン交換クロマトグラフィー担体が凝集体等の不純物を保持することが困難となる傾向にある。
【００４２】
また、不純物として凝集体以外にプロテインＡが除去されてもよい。プロテインＡは、プロテインＡをリガンドに有するクロマトグラフィー工程により抗体溶液に混入し得るが、実施の形態では、混入したプロテインＡも効果的に抗体溶液から除去することが可能である。
【００４３】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の基材の形状は特に限定されず、ビーズ状、膜状等が挙げられるが、処理速度の観点から膜状であることが好ましい。
【００４４】
ビーズ状の基材の材料としては、特に限定されないが、ガラス、シリカ、ポリスチレン樹脂、メタクリル樹脂、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋ポリビニルアルコール、及び架橋セルロースなどが使用できる。
【００４５】
膜状の基材の形状としては、平膜状、中空糸状、不織布状、モノリス、キャピラリー、焼結体、円板、及び円筒状等が挙げられる。また、膜状の基材の材料も特に限定されないが、ポリオレフィン系重合体や、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、セルロース等から構成されていることが好ましい。
【００４６】
ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましい。また、ポリアミドとしてとしては、特に限定されないが、ナイロン６（ε−カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ−フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、ｍ−フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。ポリエステルとしては、特に限定されないが、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート等が挙げられる。
【００４７】
本発明の実施の形態に係る基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は特に限定されないが、例えば５ｎｍ以上１００００ｎｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、又は１５０ｎｍ以上である。好適な細孔径は、基材の形態や、表面修飾の方法により異なるが、例えば２００ｎｍ以上４００ｎｍ以下、４００ｎｍ以上６００ｎｍ以下、６００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以上１５００ｎｍ以下、１５００ｎｍ以上２０００ｎｍ以下、２０００ｎｍ以上３０００ｎｍ以下、３０００ｎｍ以上４０００ｎｍ以下、４０００ｎｍ以上５０００ｎｍ以下、５０００ｎｍ以上６０００ｎｍ以下、６０００ｎｍ以上７０００ｎｍ以下、７０００ｎｍ以上８０００ｎｍ以下、８０００ｎｍ以上９０００ｎｍ以下、９０００ｎｍ以上１００００ｎｍ以下等がある。
【００４８】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、例えば、基材に共重合体が固定された構造を有する。
【００４９】
固定とは、共重合体が基材内に保持されていることを意味し、共有結合のように強い結合により保持されていてもよいし、水素結合、イオン結合、疎水性結合、ファンデルワールス力等のように弱い結合であってもよい。また、明確な結合でなく、物理的に基材内に保持されていてもよい。
【００５０】
基材に共有結合により、共重合体を固定する方法として、グラフト重合がある。グラフト重合法としては、放射線グラフト重合法や、表面リビングラジカル重合法が挙げられる。
【００５１】
放射線グラフト重合法で基材表面に共重合体を固定する場合、基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、基材に電離性放射線を照射すると、基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線はコバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【００５２】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ未満では、ラジカルが均一に生成しにくくなる傾向にある。また、照射線量が１０００ｋＧｙを超えると、基材の物理的強度の低下を引き起こす傾向にある。
【００５３】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性化合物と接触させる前照射法と、基材を反応性化合物と接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。
【００５４】
基材に、水素結合等により共重合体を固定する場合、例えばあらかじめ共重合体を合成し、その共重合体を基材にコーティングする方法などがある。そのコーティングの方法として、共重合体を直接塗布する方法や、共重合体を良溶媒に溶解させ、基材に含浸させた後乾燥する方法、また、共重合体を良溶媒に溶解させ、基材に含浸させた後、貧溶媒を添加し、共重合体を析出させる方法等がある、
【００５５】
実施の形態において、共重合体の重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、メタノールやエタノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
【００５６】
共重合体は、その組成に、荷電を持たない中性モノマー単位であって、親水性及び／又は疎水性の化合物であるモノマー単位を１又は複数種類含んでいてもよい。これらの親水性及び／又は疎水性モノマー単位になるモノマーを、カチオン交換基を有するモノマーと共重合させることにより、カチオン交換基同士の距離が離されるため、より選択的に抗体の凝集体を吸着しやすくなると考えられる。
【００５７】
さらに、タンパク質の単量体と、タンパク質の凝集体と、の吸着力の差別化の観点から、共重合体及び共重合体合成時の仕込み時において、中性モノマー単位の質量割合は、カチオン交換を有するモノマー単位の質量割合よりも高いことが好ましく、より好ましくは、２倍以上であり、更に好ましくは３倍以上である。
【００５８】
実施の形態における共重合体における、カチオン交換基を有するモノマー単位の質量、及び中性モノマー単位の質量は、以下のように求めることが出来る。
（カチオン交換基モノマー単位の質量）＝
（カチオン交換基密度×担体体積×カチオン交換基モノマー単位の分子量）
（中性モノマー単位の質量）＝
（カチオン交換担体質量―基材質量―カチオン交換基モノマー単位の質量）
これらの質量比により、カチオン交換基を有するモノマー単位の質量割合、及び中性のモノマー単位の質量割合を求めることができる。
【００５９】
また、別の表現方法として、共重合体及び共重合体合成時の仕込み比率において、中性モノマー単位である、親水性モノマー単位及び／又は疎水性モノマー単位のモル比が、カチオン交換を有するモノマー単位のモル比よりも高いことが好ましく、より好ましくは、２倍以上であり、更に好ましくは３倍以上である。
【００６０】
また、抗体は疎水性相互作用の性質を有するため、膜状基材の疎水性が強いと、疎水性相互作用により、抗体が膜状基材に吸着され、目的の抗体の回収率が低下することがある。この現象に対し、共重合体の重合時に親水性モノマーを導入することにより、抗体が膜状基材へ吸着することを防ぐことが出来る。そのような親水性モノマーとして、アクリルアミド、メタアクリルアミド、並びにジメチルアクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、ジエチルメタクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）メタクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド、及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物が挙げられる。あるいは、上記のような親水性モノマーとして、アクリレート、メタアクリレート、並びに２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルメタクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、４−ヒドロキシブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、及び２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート等の（メタ）アクリレート化合物が挙げられる。
【００６１】
あるいは、共重合体の重合時に疎水性モノマーを導入し、疎水性相互作用を活かすことにより抗体の単量体と、抗体の凝集体と、の吸着選択性を上げることもできる。一般に抗体の凝集体は、抗体の単量体よりも強い疎水性相互作用を示す。適した疎水性モノマーを選択することにより、抗体の単量体と、抗体の凝集体と、の疎水性相互作用の差を顕著にし、高い選択性を実現し得る。そのような疎水性モノマーとして、スチレン類、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類等があるが、力学的強度の観点から、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類が挙げられる。アルキル基に関しては、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基であれば、抗体に対し、実質的に疎水性相互作用を発現しうる。共重合体は、芳香族や複素芳香族を含んでも含まなくてもよいが、含む場合は、疎水性が強すぎることやπ−πスタッキング等により、しばしば共重合体が伸縮し、後述のような立体的な吸着を妨げることがあることから、実施の形態では含まないことが好ましい。
【００６２】
また、共重合体は、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含まず、架橋構造を持たなくてもよい。あるいは、モノマー単位中に重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含み、架橋構造を有していてもよい。しかし、共重合体は、実質的に非架橋構造であることが好ましい。実質的に非架橋とは、架橋構造を有していても、実質的に性能に影響を及ぼさない程度に架橋度の低いことをいう。共重合体が実質的に非架橋であるが、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位の質量割合は、例えば１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下であり、低いほど好ましい。
【００６３】
モノマー中に重合性官能基を２つ以上含むモノマーは、特に限定されないが、重合性官能基としてはオレフィンが挙げられる。そのようなモノマーとして、（メタ）アクリルアミド系モノマーや（メタ）アクリレート系モノマー、又はそれらの官能基が混合したモノマーが挙げられる。（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−プロピレンビスメタクリルアミド、及びＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスメタクリルアミド等が挙げられる。
【００６４】
（メタ）アクリレート系モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、１，３−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，５−ペンタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、１，９−ノナンジオールジアクリレート、１，１０−デカンジオールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ジプロピレングリコールジアクリレート、トリプロピレングリコールジアクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジオールジアクリレート、４、４’−チオジベンゼンチオールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリトリトールテトラアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、１，３−ブタンジオールジメタクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，５−ペンタンジオールジメタクリレート、１，６−ヘキサンジオールジメタクリレート、１，９−ノナンジオールジメタクリレート、１，１０−デカンジオールジメタクリレート、ネオペンチルグリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ジプロピレングリコールジメタクリレート、トリプロピレングリコールジメタクリレート、２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジオールジメタクリレート、４、４’−チオジベンゼンチオールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、及びペンタエリトリトールテトラメタクリレート等が挙げられる。
【００６５】
担体がグラフト重合体である場合、グラフト重合によるグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、基材の密度により、最適値が異なりうる。例えば基材が膜状ポリエチレンの時は、吸着容量の観点から２０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、更に好ましくは３０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、更に好ましくは１００％以下である。グラフト率は以下の式によって表わされる。
ｄｇ（％）＝（ｗ1−ｗ0）／ｗ0×１００
ここで、ｗ0は反応前の基材の重量、ｗ1はグラフト鎖が導入された基材の重量である。
【００６６】
基材が膜状ポリフッ化ビニリデンの時は、ポリフッ化ビニリデンはポリエチレンに比べ、密度が高いため、適したグラフト率がポリエチレンの時と異なる。基材膜がポリフッ化ビニリデンの時は、吸着容量の観点から５％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上、更に好ましくは１５％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは１００％以下、より好ましくは８０％以下、更に好ましくは７０％以下である。
【００６７】
また、カチオン交換基を有する共重合体が基材に固定されていることにより、基材表面上にカチオン交換基が分布している場合に比べ、立体的に吸着することが可能となる。そのため、タンパク質の単量体に比べ、タンパク質の凝集体はより強固に吸着され、タンパク質の単量体を高い純度で得ることが可能となる。したがって、共重合体が、少なくとも弱カチオン交換基を有し、１又は複数種類のカチオン交換基を有していることが好ましい。また、共重合体が架橋構造であると、共重合体の立ち上がりを抑えることにより、通液圧を抑制するといったメリットがあるが、先述の、立体的に吸着することを妨げるため、実質的に非架橋構造であることが望ましい。
【００６８】
また、共重合体において親水性モノマーが少ないと、共重合体が伸縮して立体的な吸着が不可能となるため、立体的な吸着をするには、ある程度以上の含有量が必要である。そのような共重合体中の親水性モノマーの質量割合として、３０％以上が好ましく、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上である。
【００６９】
実施の形態において実施されるカチオン交換クロマトグラフィーによる精製工程に加え、任意の精製工程と組み合わせることにより、精製物の純度をさらに向上しうる。
【００７０】
そのような工程として、例えば、プロテインＡによるアフィニティー精製工程、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製工程、疎水性クロマトグラフィーによる精製工程、ゲル濾過クロマトグラフィーによる工程、デプスフィルターによる精製工程、活性炭による精製工程、ウィルス除去フィルターによるウィルス除去工程等が挙げられる。
【実施例】
【００７１】
以下に、実施の形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。
【００７２】
（実施例１）
実施例１では、放射線グラフト重合法によって、カルボン酸基を有する中空糸状のカチオン交換膜１を合成し、フロースルー精製に用いた。
【００７３】
１）放射線グラフト重合
基材としてポリエチレン多孔質中空糸を用い、放射線グラフト重合によってその表面に２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ブチルメタクリレート及びメタクリル酸をグラフト重合させ、カルボン酸基を有する中空糸状のカチオン交換膜を合成した。以下にその合成方法を具体的に説明する。
【００７４】
２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。
【００７５】
得られた中空糸１本の体積を測定したところ、１．０５ｍＬであった。この中空糸をエタノールにより親水化し、水に置換した。水を除去した後、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加えた。１時間放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を取り出し、純水１０ｍＬを加えた。更に１時間放置した後、純水を回収することにより、膜内に残った水酸化ナトリウムを回収した。回収した水酸化ナトリウム溶液を統合し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸により滴定をおこなったところ、中和に７．９３ｍＬ要した。ブランクが９．７７ｍＬであったことから、水酸化ナトリウムと反応した、膜が有する弱カチオン交換基は１８４ｕｍｏｌであることが分かった。これを測定した中空糸の体積で除すると弱カチオン交換基密度を求めることが出来、カチオン交換基密度は１７５ｍｍｏｌ／Ｌであった。また、カチオン交換基モノマー単位及び中性モノマー単位の質量割合は、それぞれ、０．１０３及び０．８９７であった。
【００７６】
その後、該中空糸をモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、カチオン交換膜１とした。
【００７７】
２）細胞培養液の調整
抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクロナール抗体）を０．１６４ｇ／Ｌ含む培養上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。ろ過は、提供者の取扱い説明書を参考に実施した。
【００７８】
３）プロテインＡカラムによる抗体タンパク質の精製
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅを充填したカラム）に、ろ過した抗体溶液を添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））２０ｍＬを通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を２４０ｍＬ通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。
【００７９】
４）凝集体調整
得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ３に調整し、一時間放置した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の凝集体を含む抗体溶液を調整した。
【００８０】
５）凝集体を含む抗体溶液調整
プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／トリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調整した。
【００８１】
６）凝集体量の測定
得られた抗体溶液１を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＹＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ１．７ｕｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３０℃
システム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｈ  ＣＬＡＳＳ（ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）−アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）
【００８２】
その結果、図１のクロマトチャートが得られ、それを拡大したものが図２である。図２の（１）及び（２）のピークで現れるものは抗体の凝集体であり、（３）で現れるピークは単量体である。
【００８３】
７）フロースルー精製
カチオン交換膜１に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。抗体溶液の組成は、凝集体成分（１）が１．３６％、凝集体成分（２）が１．４７％、単量体が９７．１７％であり、凝集体成分の合計は３％以下であった。加えた抗体溶液の量は３０ｍＬ（５．１３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。カチオン交換膜１にロードされた抗体タンパク質の量は、１５３．９０ｍｇ（３０ｍＬ×５．１３ｍｇ／ｍＬ）であり、膜体積が０．２５ｍＬであるから、抗体タンパク質は、カチオン交換膜１の１ｍＬあたり約６１６ｍｇロードされた。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００８４】
（実施例２）
実施例２では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が１．４３％、凝集体成分（２）が１．５５％、単量体が９７．０２％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は５０ｍＬ（５．０６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００８５】
また、実施例２では、カチオン交換膜１によるフロースルー精製前後のプロテインＡの混入量を測定した。プロテインＡはＴＨＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社のＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＥＬＩＳＡ  を用い、ＵＶ測定により定量した。フロースルー精製前のプロテインＡの量が目的の抗体に対し３．６ｐｐｍであったのに対し、フロースルー精製後は、０．６ｐｐｍであり、プロテインＡが除去されていた。
【００８６】
（実施例３）
実施例３では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が０．６９％、凝集体成分（２）が１．１９％、単量体が９８．１２％である抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は６０ｍＬ（５．３１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で７０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００８７】
（実施例４）
実施例４では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が０．４０％、凝集体成分（２）が１．０２％、単量体が９８．５８％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００８８】
（実施例５）
実施例５では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が０．３８％、凝集体成分（２）が１．０５％、単量体が９８．５７％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は１００ｍＬ（５．１８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で１１０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００８９】
（実施例６）
実施例６では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が０．３４％、凝集体成分（２）が０．６１％、単量体が９９．０５％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は１３０ｍＬ（５．０３ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で１４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００９０】
（実施例７）
実施例７では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が０．２９％、凝集体成分（２）が０．５９％、単量体が９９．１２％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は１５０ｍＬ（５．１７ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で１６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。また、実施例７では、実施例２と同様に、フロースルー精製前後のプロテインＡの混入量を測定した。フロースルー精製前のプロテインＡ量が目的の抗体に対し２．８ｐｐｍであったのに対し、フロースルー精製後は、０．５ｐｐｍであり、プロテインＡが除去されていた。
【００９１】
（実施例８）
実施例８では、以下に説明するカチオン交換膜２を用いた。カチオン交換２は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．８５ｇ、ブチルメタクリレート０．７７ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径２．０ｍｍ、内径１．１ｍｍ、平均孔径０．４５ｕｍのポリフッ化ビニリデン多孔質中空糸５．８０ｇ（１５ｃｍ、３０本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、８．２６ｇ、グラフト率４４％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１９８ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．１１ｍＬ）し、実施例８に係るカチオン交換膜２とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０４及び０．８９６であった。
【００９２】
カチオン交換膜２を用い、凝集体成分（１）が０．６１％、凝集体成分（２）が１．０６％、単量体が９８．３３％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（４．９４ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜２を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００９３】
（実施例９）
実施例９では以下に説明するカチオン交換膜３を用いた。カチオン交換膜３は次のように合成した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート２．５０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート１．３６ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１６ｇ、グラフト率７２％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７６ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例９に係るカチオン交換膜３とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０５及び０．８９５であった。
【００９４】
カチオン交換膜３を用い、凝集体成分（１）が０．５１％、凝集体成分（２）が１．０９％、単量体が９８．４０％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（５．０８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜３を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００９５】
（実施例１０）
実施例１０では以下に説明するカチオン交換膜４を用いた。カチオン交換膜４は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５１ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１７６ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、実施例１０に係るカチオン交換膜３とした。また、カチオン交換基モノマー及び中性モノマーの質量割合は、それぞれ、０．１０５及び０．８９５であった。
【００９６】
カチオン交換膜４を用い、凝集体成分（１）が０．４９％、凝集体成分（２）が１．０７％、単量体が９８．４４％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は８０ｍＬ（５．１２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜４を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で９０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体成分の含有率は減少していた。結果を図３に示す。
【００９７】
（比較例１）
比較例１では、カチオン交換膜１を用い、凝集体成分（１）が２．６９％、凝集体成分（２）が２．１３％、単量体が９５．１８％であって、凝集体の含有率が３％より多い１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は５０ｍＬ（５．１８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体は３８％のみ減少した。結果を図３に示す。
【００９８】
（比較例２）
比較例２では以下に説明するカチオン交換膜５を用いた。カチオン交換膜５は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．６ｇ、ブチルメタクリレート１．２ｇ、グリシジルメタクリレート１．２ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２８０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１６ｇ、グラフト率７２％のカチオン交換膜を得た。
【００９９】
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基を強カチオン交換基であるスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は４０ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例２に係るカチオン交換膜５とした。
【０１００】
カチオン交換膜５を用い、凝集体成分（１）が１．４８％、凝集体成分（２）が１．４２％、単量体が９７．１０％である１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は３０ｍＬ（５．０２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体は４９％のみ減少した。結果を図３に示す。
【０１０１】
（比較例３）
比較例３では以下に説明するカチオン交換膜６を用いた。カチオン交換膜６は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．８８ｇ、メタクリル酸０．１７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１３ｇ、グラフト率７１％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は２６ｍｍｏｌ／Ｌであり、３０ｍｍｏｌ／Ｌより低かった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例３に係るカチオン交換膜６とした。
【０１０２】
カチオン交換膜６を用い、凝集体成分（１）が１．１８％、凝集体成分（２）が１．６３％、単量体が９７．１９％である１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は３０ｍＬ（４．９３ｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬでカチオン交換膜６を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で４０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体は２８％のみ減少した。結果を図３に示す。
【０１０３】
（比較例４）
比較例４では以下に説明するカチオン交換膜７を用いた。カチオン交換膜７は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．６ｇ、ブチルメタクリレート１．８ｇ、グリシジルメタクリレート０．６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２８０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させたポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させたところ、５．１４ｇ、グラフト率７１％のカチオン交換膜を得た。
【０１０４】
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基を強カチオン交換基であるスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。実施例１と同様に測定して、カチオン交換基密度は１８ｍｍｏｌ／Ｌであり、３０ｍｍｏｌ／Ｌより低かった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例４に係るカチオン交換膜７とした。
【０１０５】
カチオン交換膜７を用い、凝集体成分（１）が０．９５％、凝集体成分（２）が１．８１％、単量体が９７．２４％である１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は３０ｍＬ（５．２１ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけたところ、凝集体は７４％減少した。結果を図３に示す。
【０１０６】
（比較例５）
比較例５では、カチオン交換膜７を用い、凝集体成分（１）が０．９７％、凝集体成分（２）が１．９８％、単量体が９７．０５％である１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は５０ｍＬ（４．７８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけた結果を図３に示す。
【０１０７】
（比較例６）
比較例６では、カチオン交換膜７を用い、凝集体成分（１）が０．２９％、凝集体成分（２）が１．１２％、単量体が９８．５９％である１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）の抗体溶液をフロースルー精製した。加えた抗体溶液の量は５０ｍＬ（４．７８ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分、温度は２５℃であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で流れる２５℃の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬでカチオン交換膜７を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で５５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけた結果を図３に示す。
【０１０８】
実施例２と比較例１の結果の比較から、実施例に係るカチオン交換担体を用いて、行主体の含有率が３％よりも多い抗体溶液を処理すると、凝集体除去性能が低下することが分かる。実施例１と比較例２の結果の比較から、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上でも、弱カチオン交換基が無ければ、凝集体除去性能が低いことが分かる。実施例１と比較例３の結果の比較から、弱カチオン交換基を有していても、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより低いと凝集体除去性能が低いことが分かる。
【０１０９】
実施例２は、実施例１とほぼ同程度の凝集体量割合の抗体溶液を、カチオン交換膜１ｍＬあたり１０１２ｍｇ処理したものである。
【０１１０】
比較例４の結果から、カチオン交換膜が強カチオン交換基を備える場合は、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカチオン交換基密度でも、カチオン交換膜１ｍＬあたりの抗体の処理量が６２５ｍｇのように少量であれば、凝集体除去性能が高いことが分かる。しかし、実施例２と、比較例５の結果より、３％以下の凝集体割合の抗体をカチオン交換膜１ｍＬあたり約１０００ｍｇ処理する際には、強カチオン交換基密度３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のカチオン交換担体を用いる（比較例５）より、実施例に係るカチオン交換担体を用いた方が凝集体除去性能が高いことが分かる。
【０１１１】
実施例２ないし７の結果から、実施例に係るカチオン交換担体を用いると、凝集体割合が低い抗体溶液ほど、多量の抗体を処理できることが分かる、一方、比較例５と比較例６の結果から、強カチオン交換基のみを持つカチオン交換担体では、凝集体量が低くても、凝集体除去性能は高くならず、抗体処理量は向上しないことが分かる。
【０１１２】
以上より、弱カチオン交換基を有し、カチオン交換基密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のカチオン交換クロマトグラフィー担体を用い、凝集体量が３％以下といった低含有率の抗体溶液をフロースルー精製することにより、効率的に凝集体が除去できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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