(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-7に対する受容体のα鎖（CD127と称する。）に結合する抗体であって、ヒトCD127陽性細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)である細胞傷害活性を示し、インターロイキン7(IL-7)に対するアンタゴニスト特性を有し、これによって、CD127陽性細胞上のCD127へのIL-7の接近に拮抗し、該抗体の抗原結合部位が、可変重鎖及び可変軽鎖を含み、
該可変重鎖が下記のポリペプチド：
a)(i)配列番号22のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、及び
(ii)配列番号24のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、及び
(iii)配列番号26のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、又は
(iv)配列番号18の位置19から位置141のアミノ酸配列を有するVH
を含み、かつ
該可変軽鎖が下記のポリペプチド：
b)(i)配列番号28のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、及び
(ii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、及び
(iii)配列番号32のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、又は
(iv)配列番号20の位置21から位置133のアミノ酸配列を有するVL
を含む、前記抗体。
【請求項２】
ヒト細胞によって発現されるCD127に対して発生する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記ヒト細胞が、CD127を発現しているヒトT細胞（CD127+細胞）である、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
補体依存性細胞傷害(CDC)を更に示す、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
a) No.I-4532でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-3により産生される抗体、又は
b) No.I-4532でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-3によって発現されたRNA分子から逆転写されたcDNA核酸分子と同一の核酸分子により組み換えられた組換え真核細胞によって発現される抗体であって、ここで、該RNAがa)の抗体をコードするものである該抗体、並びに、
c) a)又はb)の抗体に対して改変された抗体であって、該改変された抗体が、そのアミノ酸配列の全長において、それが改変される抗体と、90％を超える、95％を超える、又は最大99％の同一性を有し、ここで、該抗体が、a)又はb)の抗体に対して、改変されたフレームワーク(FR)及び／又は定常(CH)領域を有する、該抗体
の群において選択される、抗体であって、
IL-7に対する受容体のα鎖（CD127と称する。）に結合し、インターロイキン7(IL-7)に対するアンタゴニスト特性を有し、これによって、CD127陽性細胞上のCD127へのIL-7の接近に拮抗し、かつヒトCD127陽性細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)である細胞傷害活性を示す、前記抗体。
【請求項６】
ヒト化モノクローナル抗体又はキメラモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を示すキメラ抗体であり、その定常(Fc)断片がヒトFc断片である、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
その抗原結合部位が、請求項１に記載の可変重鎖及び可変軽鎖を含み、ヒトFc断片を有し、組換えヒトCD127を発現する標的細胞を用いて評価した場合に少なくとも80％のADCC活性のレベルを示す、請求項７記載のキメラ抗体。
【請求項９】
標準的な定義及び数体系に従って、ヒト抗体において対応する位置を有するヒトアミノ酸残基について、請求項１〜６のいずれか一項記載の抗体の定常領域中に存在するアミノ酸残基で置換されることにより誘導されるヒト化抗体であり、その置換レベルが、該定常領域において1％〜20％の残基である、前記抗体。
【請求項１０】
前記置換レベルが、前記定常領域において1％〜18％の残基である、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体を含むキメラ分子であって、前記モノクローナル抗体が機能的に異なる分子に結合し、該キメラ分子が、融合キメラタンパク質、又は、化学基若しくは分子との共有結合から生じた結合体のいずれかである、前記キメラ分子。
【請求項１２】
前記化学基又は分子が、PEGポリマー又は標識化抗体である、請求項１１記載のキメラ分子。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体を含む組成物若しくは化合物の集合体、又は請求項１１若しくは１２記載のキメラ分子。
【請求項１４】
前記CD127+細胞が、ヒトCD127+細胞である、請求項１３記載の組成物又は化合物の集合体。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体をコードする核酸分子又は一群の核酸分子。
【請求項１６】
下記の群から選択される核酸配列又は一群の核酸配列を含む、請求項１５記載の核酸分子又は一群の核酸分子：
i.配列番号17の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置55から位置423のその断片、又は
ii.配列番号21、配列番号23、及び配列番号25の配列をそれぞれ有する、VHCDR1領域、VHCDR2領域、及びVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、及び
iii.配列番号19の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置61から位置399のその断片、又は
iv.配列番号27、配列番号29、及び配列番号31の配列をそれぞれ有する、VLCDR1領域、VLCDR2領域、及びVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクターであって、請求項１５又は１６記載のポリヌクレオチドを含む、前記ベクター。
【請求項１８】
哺乳動物細胞におけるクローニング及び／又は発現に適したプラスミドである、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１５又は１６記載のポリヌクレオチドにより組み換えられた細胞又は細胞系。
【請求項２０】
哺乳動物細胞若しくは細胞系である、請求項１９記載の細胞又は細胞系。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の抗体又はキメラ分子を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
別の有効成分を更に含む、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ヒト患者に投与する場合、CD127+細胞の生存若しくは増殖を制御するのに適した製剤中に、有効成分として、請求項１〜１２のいずれか一項記載の抗体若しくはキメラ分子、又は請求項２１若しくは２２に記載の医薬組成物を含む、組成物。
【請求項２４】
前記CD127+細胞が、CD8+及びCD4+メモリーT細胞である、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
免疫調節治療効果を有する付加的な化合物を更に含む、請求項２１〜２４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫調節治療効果が、アレルギー又は自己免疫に関与する細胞上で観察される、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
その必要のある患者の併用療法又は追加療法における有効成分として、請求項１〜１２のいずれか一項記載の抗体又はキメラ分子を含む、医薬組成物。
【請求項２８】
臓器若しくは組織移植拒絶の予防、又は自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患の治療、又は癌の治療、又はリンパ腫の治療のためにヒト患者における使用のための、請求項２１若しくは２２記載の医薬組成物、又は請求項２３若しくは２４記載の組成物。
【請求項２９】
前記癌が、CD127+細胞に関連する乳癌である、請求項２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記リンパ腫が、セザールリンパ腫、又はIL7-R/TSLPシグナル伝達経路の獲得型突然変異による急性リンパ芽球性白血病である、請求項２８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン7 (IL-7)の受容体のα鎖に対する抗体に関し、特に、ヒト
細胞上で発現するヒトIL-7の受容体（ヒトIL-7Rα又はIL-7Raとも称する。）に関する。
また、インターロイキン7 (IL-7)の受容体のα鎖はCD127とも称される。
【０００２】
本発明の抗体は、CD127陽性細胞に対して細胞傷害活性を有する。
【０００３】
また、本発明は、ADCC（抗体依存性細胞媒介細胞傷害）、及び、場合により、CDC（補
体依存性細胞傷害）を介して、抗体の細胞傷害作用により、リンパ球の亜集団又は（Tリ
ンパ球、Bリンパ球、NK細胞及び樹状細胞を含む）CD127を発現する他の細胞集団を枯渇さ
せるための、これらの抗体の使用にも関する。したがって、本発明は、支配的免疫寛容状
態(dominant tolerogenic state)に至るヒト患者における免疫応答の改変、又は、これと
は逆に、悪性CD127陽性細胞の破壊とともに、免疫応答のレベルの制御が必要な免疫寛容
の欠如に関与する病態の治療における抗体の使用に関する。よって、本発明は、移植拒絶
、自己免疫疾患、リンパ腫又は癌によって誘発されるものなどの病状が、CD127陽性細胞
と関連している場合、これらの病状に用いるのに適した手段を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ナイーブT細胞は、移植された臓器及び組織の急性拒絶の部分的な原因である。これら
の細胞は、現在の免疫抑制剤（カルシニューリン阻害剤）によって、及び共刺激（抗接着
、CD80/86阻害剤）をブロックするモノクローナル抗体によって制御することができる。
また、メモリーT細胞も移植拒絶の原因である。メモリーT細胞は、後天性免疫の病歴、主
にウイルスに対する前者の反応により蓄積される。メモリーT細胞は、同種抗原との抗ウ
イルス防御の交差反応である、「異種免疫」により、同種抗原によって活性化できること
が示されている（Adamsらの文献： Immunol Rev 2003, 196, 147-60）。ナイーブT細胞と
対照的に、メモリーT細胞は、共刺激シグナルの要件を低減し、急速に活性化するように
プログラムされているので、異種免疫は、免疫寛容誘発に対して強力な障壁を表す。メモ
リーT細胞は、慢性拒絶にも関与し得る。臓器移植及び組織移植における役割の他に、ナ
イーブT細胞及びメモリーT細胞は、同時に、多くの自己免疫疾患の原因でもある。これは
、潰瘍性大腸炎（Shinoharaらの文献：J. Immunol 2011, 186：2623-32）、関節リウマチ
、乾癬又は移植片対宿主病の場合である。
【０００５】
さらに、複数の悪性細胞は、IL-7Rを提示することが示されている。これは、セザール
皮膚リンパ腫（うち60%）又は小児急性リンパ性白血病の場合であり、これらの約15％は
、これらの腫瘍を部分的にIL-7依存性の状態にして、CD127における機能獲得型突然変異
を発現する（Shochatらの文献：J Exp Med. 2011年5月 9;208(5):901-8）。
【０００６】
CD127は、メモリーT細胞及びナイーブT細胞の両方によるものを含む、種々の細胞によ
って発現する。具体的には、CD127は、休止T細胞及びメモリーT細胞を含むエフェクターT
細胞(Teff)によって、並びに未成熟B細胞によって発現するが、特に、休止内在性制御性T
細胞（内在性Treg）によっては発現しない。IL-7Raは、胸腺細胞分化、及びリンパ球のク
ローン性増殖の促進に不可欠である。
【０００７】
移植拒絶におけるIL-7/CD127経路の役割は、共刺激遮断、マウスにおける長期心臓同種
移植生存と関連する場合、抗IL-7 Mabの効果によって示唆されている（Wangらの文献：Am
J Transplant 2006, 6 (12), 2851-60）。また、自己免疫におけるIL-7/CD127経路の役
割も、マウスにおける試験的自己免疫性脳脊髄炎を予防する、ブロッキング抗IL-7RaのMa
bの効果によって示唆されている（Liuらの文献：Nature Medicine 2010, 16 (2), 191-19
8）。
【０００８】
Tリンパ球の枯渇は、同種移植拒絶に対抗するか又は自己免疫に抵抗する自明の免疫抑
制アプローチであった。しかしながら、すべてのT細胞枯渇は、免疫寛容の誘発に有利で
はない場合がある。Treg細胞を改変することなく、T細胞の亜集団又は選択的に活性化さ
せたT細胞の標的化は、前免疫寛容アプローチ(pro-tolerogenic approach)を構成し得た
（Haudebourgらの文献：Transpl Int 2009, 22 (5), 509-18）。このように、CD127は、
かかるモノクローナル抗体が、エフェクターを枯渇させる可能性があるが、制御性リンパ
球を枯渇させる可能性はないため、免疫応答を調節することを目的としたモノクローナル
抗体(Mab)の関心を惹く潜在的治療標的と考えることができる。したがって、これらが、
移植、自己免疫（Michelらの文献：J Clin Invest. 2008 Oct;118(10):3411-9.）、並び
に、IL7-Rに対するIL-7の接近に拮抗し、そのため、T細胞及びB細胞の機能と増殖を制限
することによる悪性腫瘍において効能を示し得ると考えられている。
【０００９】
細胞傷害活性を有するCD127+細胞に対するモノクローナル抗体による治療は、Treg細胞
を維持するか、又はCD127陽性悪性細胞を排除しつつ、ナイーブT細胞及びメモリーT細胞
を排除／中和することによって、その目的を果たすことができた。
【００１０】
これに関連して、IL-7Raに対してアンタゴニスト特性を有したIL-7Raに対するモノクロ
ーナル抗体は、多発性硬化症のような自己免疫疾患を治療する観点から、国際公開公報第
2010/017468号に開示されている。記載されている抗体は、IL-7の受容体に結合するIL-7
のアンタゴニストと考えられており、IL-7とこれらのCD127受容体との相互作用が必要で
あると考えられているTH17及びTH1細胞の増殖及び生存に対して、活性を有すると考えら
れている。
【００１１】
刊行物（Racape M.らの文献：Arch. Immunol. Ther. Exp., 2009, 57, 253-261）にお
いて、筆者らは、移植における潜在的治療標的としての関心対象のIL-7受容体αを分析し
た。種々のT細胞及びIL-7応答性細胞上のIL-7Rαの発現を再検討したところ、筆者らは、
IL-7Rαを発現する標的メモリーT細胞は、マウスにおける同種移植生存を延長できるか否
かについて判断し、標的IL-7又はIL-7RαがTreg細胞を有利に存続させると結論付けてい
る。将来の方向性において、筆者らは、治療的処置においてIL-7又はIL-7Rαのいずれか
を標的にすることにより、CD127を発現する細胞の生存に対して異なる結果がもたらされ
る可能性があり、異なる型のリンパ球減少症が誘発する可能性があることを指摘した。ま
た、ブロッキングするか若しくは中和するか否かによって異なるIL-7Rαに対する抗体、
又は細胞傷害性抗体の影響についての問題は、概念的な観点からももたらされた。しかし
ながら、筆者らは、かかる抗体の入手及び分析、そして、それどころか、仮説の妥当性を
評価するための更なる研究の必要性の表明を示していなかった。
【発明の概要】
【００１２】
急性又は慢性移植拒絶を含む免疫関連疾患、及び一部の乳癌を含む種々の型の癌などの
IL-7/IL-7Rαに関与する他の疾患の利用可能な治療アプローチの欠点を考慮すると、更な
る薬剤候補物質、特に、ヒト患者の免疫活性化を制御する、例えば調節することを目的と
した、より選択的な標的に対し活性のある候補物質が依然として必要とされている。
【００１３】
本発明者らは、前免疫寛容原性制御性T細胞を維持しつつ、侵襲性エフェクター細胞を
枯渇させる能力を有し、かつ、CD127+リンパ腫において悪性細胞を排除する能力を示す抗
体を提供して、この必要性を満たす。概して、本発明者らは、ヒトCD127+細胞、特にヒト
CD127+ T又はB細胞に対して細胞傷害活性を示す抗体を提供する。
【００１４】
また、これに関連して、本発明者らは、標的CD127+細胞に対して細胞傷害作用を発揮し
、物理的にこれらの数を低減する（亜集団の収縮）IL-7Raに対するモノクローナル抗体を
得たので、適切な手段も提供する。特定の実施態様において、本発明者らは、このような
特性と、IL-7/IL7-R相互作用に対するアンタゴニスト活性とを組み合わせた抗体も得た。
したがって、新しい作用機序を有するこれらのMabは、CD127標的化の治療上の利点を評価
する新しい生成物を構成する。
【００１５】
このように、本発明は、IL-7に対する受容体のα鎖（CD127と称する。）、特に、ヒトC
D127陽性細胞によって発現するIL-7受容体のα鎖に結合し、CD127を発現するヒトT細胞（
CD127+細胞）に対して、具体的にはヒトT細胞によって発現するIL-7受容体に対して細胞
傷害活性を示す、抗体又はその機能的断片に関する。
【００１６】
特定の実施態様において、本発明の抗体又はその機能的断片は、IL-7受容体中に存在す
るCD127分子に対するものであり、そのため、ヒト細胞、特に前述の受容体を発現するヒ
トT細胞に対して細胞傷害性である。
【００１７】
本発明の特定の実施態様において、機能的断片の抗体は、TSLPの受容体としてTSLP受容
体（CCRF2；アクセッションナンバーAF338733としても知られている。Reche P.A.らの文
献：J Immunol.167(1), 336-343 (2001)）と組み合わせる場合、同じIL7-Rα鎖を標的と
し、これに結合する（Reche P.A.らの文献、2001）。ヒトTSLP（アクセッションナンバー
AF338732）は、樹状細胞を極性化させ、T細胞及びB細胞の増殖と分化を促進し、かつ、皮
膚疾患及び肺疾患において役割を果たすことが示されている因子である（Ruiらの文献：A
nn N Y Acad. Sci. 2010, 1183: 13-24）。したがって、TSLPは、ヒト及びマウスにおけ
る気道炎症性疾患及びアトピー性皮膚炎を含む種々の病状に関連することが示されている
（Ying S.らの文献：(2008) J Immunol 181:2790-2798；Jariwala SP.らの文献：(2011) 
Clin Exp Allergy 6月14日号）。さらに、TSLPは、腸の免疫及び炎症の調節に関連するこ
とが示されている（Taylor BC.らの文献：(2009) J Exp Med 206: 655-667）。
【００１８】
本発明の抗体の「機能的断片」は、抗体の一部、すなわち、恐らく天然の形態で、ヒト
IL-7のIL-7受容体のα鎖に対して抗原結合能を示す、本発明の抗体の構造の一部に対応す
る分子（抗原結合断片とも称する。）であり、かかる断片は、特に、対応する4本鎖抗体
の抗原結合能と比較して、前述の抗原に対して同じか又は実質的に同じ抗原結合能を示す
。この抗原結合能は、抗体及び考慮される断片の親和性を測定によって決定することがで
きる。
【００１９】
抗体の機能的断片は、抗原認識部位（すなわち、ヒトIL-7のIL-7Ra）を包含し、そのた
め、抗原認識特異性を確定する、CDR（相補性決定領域）と称する超可変領域又はこれら
の部分を含む断片である。4本鎖免疫グロブリンのそれぞれの軽鎖及び重鎖（それぞれ、V
L及びVH）は、3つのCDRを有し、それぞれ、VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3及びVH-CDR1、VH-
CDR2、VH-CDR3と称される。
【００２０】
したがって、本発明は、VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3並びにVH-CDR1、VH-CDR2及びVH-CD
R3若しくはこれらの機能的部分、すなわち、ヒトIL-7のIL-7Raに対して高い親和性を有す
ることが好ましい所望の結合能を示す部分のうちのすべてか又は選択されたものを含むか
又はこれからなる、本発明の抗体の断片に関する。
【００２１】
CDR3領域が、抗原認識の特異性決定因子であると考えられる場合、VH-CDR3及び／又はV
L-CDR3若しくはこれらの機能的部分を含むか又はこれからなる断片が特に好ましい。
【００２２】
当業者は、この点に関して示す、標準数体系を含む、標準数体系定義（Martin, A.C.R.
の文献：(2001)、Duebel, S.及びKontermann, R.編、抗体工学実験室マニュアル(Antibod
y Engineering Lab Manual)中の抗体可変領域のタンパク質配列及び構造分析。(Protein 
Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.)(Springer-Verlag, 
Heidelberg)）を参照することによって、又は、Kabatの数体系（免疫学の関心対象である
タンパク質配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)、第4版、米国保健
社会福祉省, NIH, 1987）を参照することによって、又は、IMGT「collier de perle」ア
ルゴリズム(http://www.imgt.org/IMGTindex/Colliers.html)の適用によって、抗体の種
々の領域／ドメインの位置を決定することができる。この点に関して、本発明の配列の定
義については、領域／ドメインの境界を別の標準体系から変更できることに留意すべきで
ある。したがって、本発明に定義する領域／ドメインは、およそ+/-10%の抗体の可変領域
の全長配列内の関連する配列の長さ又は局在性の変化を示す配列を包含する。
【００２３】
このように、4本鎖免疫グロブリンの構造に基づいて、機能的断片は、利用可能なデー
タベース及び従来技術（Martin A.C.R.らの文献）における抗体の配列と比較して、特に
、これらの配列内の機能的領域の位置を比較することによって定義することができ、フレ
ームワーク及び定常領域の位置が、種々の分類の抗体、特にIgG、具体的には哺乳動物のI
gGを十分に定義していることに留意すべきである。
【００２４】
本発明の特定の実施態様を説明する目的で、前述した抗体のCDRを含んだ可変領域を含
有する抗体の抗原結合断片は、Kabat (NIH 1987), Martin A.C.R.ら及び更にRoitt I.ら
（免疫学の基礎と応用(Fundamental and Applied Immunology) (MEDSI/McGraw-Hill)）を
参照して十分に定義されたFv、dsFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2を包含する。Fv断片は、
疎水性相互作用によってともに結合された抗体のVL及びVH領域からなる。dsFv断片におい
て、VH:VLヘテロ二量体は、ジスルフィド結合によって安定化されている。scFv断片にお
いて、VL及びVH領域は、一本鎖タンパク質を形成する柔軟なペプチドリンカーを介して相
互に接続されている。Fab断片は、抗体のパパイン消化によって得られる単量体の断片で
あり、これらは、ジスルフィド結合を介してともに結合された全L鎖、及びH鎖のVH-CH1断
片を含む。F(ab')2断片は、ヒンジジスルフィド下の抗体のペプシン消化によって生成す
ることができ、これは、2つのFab'断片と、更に免疫グロブリン分子のヒンジ領域の付加
的部分を含む。Fab'断片は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによってF(ab
')2断片から得ることができる。F(ab')2断片は二価であり、すなわち、これらは、天然免
疫グロブリン分子のような2つの抗原結合部位を含み、他方では、Fv（Fabの可変部分を構
成するVH-VL二量体(dimmer)）、dsFv、scFv、Fab及びFab'断片は一価であり、すなわち、
これらは、単一の抗原結合部位を含む。
【００２５】
本発明のこれらの基本的な抗原結合断片をともに組み合わせて、ダイアボディ、トリボ
ディ又はテトラボディなどの多価抗原結合断片を得ることができる。これらの多価抗原結
合断片も本発明の一部である。
【００２６】
本発明の抗体とその断片の標的である、IL-7受容体の鎖としてのCD127を発現するヒト
細胞は、主にTリンパ球であり、より正確には、ナイーブT細胞及びメモリーT細胞を含む
エフェクターTリンパ球の亜集団であるが、制御性T細胞、特に天然休止Tregではない。メ
モリーT細胞は、抗原プライミングにより発生し、二次エフェクター及びメモリー細胞へ
の再活性化及び分化の際にリコール増殖(recall proliferation)を受ける能力を含む、こ
れらの機能的特性によって主に定義される。同様に、（IL7-Rα鎖との結合構造としての
）標的TSLP受容体は、Tヘルパーリンパ球、B細胞及び樹状細胞分化の調節を支配する。
【００２７】
本発明の実施態様によれば、「T細胞に対する細胞傷害活性」又は細胞傷害性を有する
抗体（細胞傷害性抗体）は、これらの細胞を死滅させることによって、エフェクターT細
胞集団の枯渇を生じさせ、その結果、投与されると、これらの細胞の数を減少させる。こ
れとは反対に、これらの抗体は、制御性T細胞の亜集団を改変しないか、又は、相当な程
度まで当該亜集団を改変せず、これによって、Treg細胞がこれらの機能を果たすことがで
きる。
【００２８】
これに関連して、特定の実施態様において、エフェクターT (Teff)細胞に対する制御性
T (Treg)細胞の割合は、本発明の細胞傷害性抗体の投与後に上昇することが観察された。
特定の実施態様において、本発明の細胞傷害性抗体は、前述の割合を約10％以上、上げる
ことができる。特定の実施態様において、Teffに対するTregの割合は約20％である。
【００２９】
本発明の特定の実施態様によれば、細胞傷害性抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性
(ADCC)を示す。
【００３０】
ADCC特性は、実施例に記載されている試験などのADCCアッセイで評価することができる
。抗体がラット抗体である場合、ADCCアッセイで使用するエフェクター細胞は、ラットの
LAK（リンホカイン活性化キラー）細胞である。抗体がヒト化される場合、ADCCアッセイ
は、ヒトLAK細胞上で行うことができる。
【００３１】
本発明の特定の実施態様によれば、本発明の抗体のADCC活性は、少なくとも10 ng/mlの
抗体の濃度により達成される。ADCCは、キメラ抗体を用いて、すなわち、定常断片がヒト
Fc断片である抗体(Fc)を用いてアッセイすることができる。
【００３２】
抗体がその抗原との結合によりADCC活性を有する場合、Fc断片は、このような活性を観
察する際に有用であり得る。
【００３３】
この点に関して、本発明は、特にMD707-3抗体又はMD707-3由来の抗体、具体的には、組
換えヒトCD127を発現する標的細胞を用いて評価した場合に少なくとも80%のレベルのADCC
活性を有した、ヒトFc断片を有するキメラMD707-3抗体を提供する。
【００３４】
別の実施態様によれば、本発明のフレーム内にある細胞傷害性抗体又はその機能的断片
は、インターロイキン7 (IL-7)に対してアンタゴニスト特性を更に有し、これによって、
IL-7がCD127陽性細胞上のCD127に接近すること、すなわち、IL-7がCD127陽性細胞上のCD1
27に結合することに拮抗する。
【００３５】
「アンタゴニスト特性」とは、IL-7Rαを標的とする本発明の抗体又はその機能的断片
が、その結合パートナーIL-7、特にヒトIL-7のために、CD127細胞、特にヒトエフェクタ
ーT細胞、具体的にはヒトメモリーT細胞上に発現したIL-7受容体の接近を防止する効果を
有することを意味する。IL-7の結合への拮抗により、本発明の抗体又はその機能的断片は
、IL-7依存性胸腺T細胞の発生を防止することによってリンパ球減少をもたらす。本発明
の抗体又はその機能的断片のアンタゴニスト特性を測定するための試験は、実施例に記載
されている。
【００３６】
CD127陽性細胞に対する細胞傷害性及びアンタゴニスト特性をともに有する本発明の抗
体は、エフェクターT細胞、特にメモリーT細胞の枯渇に対しこれらの特性の累積効果を発
揮することが可能であり、これによって、強力な枯渇（CD127+細胞のプールの消耗）が可
能になり、また、標的T細胞の数の減少に対応する。
【００３７】
本発明の別の実施態様において、抗体又はその機能的断片は、そのIL-7Rα鎖を介してT
SLP受容体に結合する。その結果、本発明の抗体又は抗体の機能的断片は、T細胞及びB細
胞分化の改善により、TSLP阻害を実行し、特に、一部の自己免疫疾患及び喘息においてみ
られる、いわゆるTH-2分化に影響を与える。
【００３８】
本発明の抗体又はその機能的断片は、ヒトT細胞によって発現するCD127である分子に対
して特に有利に発生し、恐らく、天然ポリペプチド又は組換え分子の形態下で免疫化から
発生する。
【００３９】
免疫化は、下記の実施例に開示されているプロトコールに従って行うことができる。す
なわち、組換えCD127 Fcキメラ（10975-H03H、Sino Biological社(Beijing, China)製）
を使用し、Louvain大学で利用可能なLOU/C IgkIA系統ラットなどのラットを免疫した。ハ
イブリドーマを、先に記載されている手順（Chassouxらの文献、Immunology 1988 65 623
-628）に従い、脾臓単核細胞を、LOUラット免疫細胞腫IR983F、非分泌及びアザグアニン
耐性細胞系と融合させることによって得た。ハイブリドーマを、まず、分泌されたモノク
ローナル抗体が組換えCD127分子に結合する能力に従ってスクリーニングした（CD127 Fc
キメラ；10975-H03H、Sino Biological社(Beijing, China)製）。次いで、ハイブリドー
マを、これらモノクローナル抗体がヒトT細胞によって発現させたCD127に結合する能力に
ついてスクリーニングした。
【００４０】
本発明の特定の実施態様によれば、細胞傷害性抗体又はその機能的断片は、
a) No.I-4531でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-1により産生された抗体若しく
はその機能的断片、又は、
b) a)の抗体をコードするNo.I-4531でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-1におい
て発現させたRNAに対応するcDNAと同一の核酸分子により組み換えられた組換え真核細胞
によって発現する、抗体若しくはその機能的断片、並びに、
c)その可変重鎖(VH)及び／又はその可変軽鎖(VL)において改変されたCDR領域を有する
、特に、場合により、VH若しくはVLのうちのいずれか若しくは両方に少なくとも1つの同
一のCDR3、CDR2及び／又はCDR1領域を保持する、及び／又は改変されたフレームワーク(F
R)及び／又は定常(CH)領域を有する、a)又はb)に対して改変された抗体であって、前述の
改変された抗体が、そのアミノ酸配列の全長において、a)又はb)の抗体と、70%を超える
同一性、特に、75%を超える、80%を超える、85%を超える、90%を超える、95%を超える若
しくは最大99%の同一性を有する、抗体若しくはその機能的断片の群から選択される。
【００４１】
本発明の別の実施態様において、抗体又はその機能的断片は、IL-7に対して細胞傷害性
及びアンタゴニストであり、
a) No.I-4532でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-3、若しくはNo.I-4533でCNCMに
寄託されたハイブリドーマMD707-13により産生された抗体若しくはその機能的断片、又は
、
b) a)の抗体をコードする、No.I-4532でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-3若し
くはNo.I-4533でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-13において発現させたRNAに対応
するcDNAと同一の核酸分子により組み換えられた組換え真核細胞によって発現する抗体若
しくはその機能的断片、並びに、
c)その可変重鎖(VH)及び／又はその可変軽鎖(VL)において改変されたCDR領域を有する
、特に、場合により、VH若しくはVLのうちのいずれか若しくは両方に少なくとも1つの同
一のCDR3、CDR2及び／又はCDR1領域を保持する、及び／又は改変されたフレームワーク(F
R)及び／又は定常(CH)領域を有する、a)又はb)に対して改変された抗体であって、前述の
改変された抗体が、そのアミノ酸配列の全長において、a)又はb)の抗体と、70%を超える
同一性、特に、75%を超える、80%を超える、85%を超える、90%を超える、95%を超える若
しくは最大99%の同一性を有する、抗体若しくはその機能的断片の群から選択される。No.
I-4531、I-4532及びI-4533でのハイブリドーマの寄託は、ブダペスト条約に基づいて、CN
CM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Paris , France)で2011年
9月28日になされた。
【００４２】
本発明に係る「ハイブリドーマ細胞」は、選択された免疫原、及び得られた融合細胞に
不死性を提供することが可能な髄腫細胞である融合パートナーをあらかじめ免疫した動物
由来の抗体産生細胞（B細胞）の融合から発生させた細胞である。髄腫細胞及び抗体産生
細胞（脾細胞などのB細胞）は、同じ由来のものであってもよく、真核細胞、特に、同じ
動物の哺乳動物細胞である。または、これらは異なる由来であってもよく、そのため、ヘ
テロハイブリドーマを発生させ得る。LOUラット免疫細胞腫IR983Fなどの髄腫細胞、非分
泌及びアザグアニン耐性系は、製造したハイブリドーマが所望の特異性のモノクローナル
抗体のみを分泌することを可能にするために、免疫グロブリンを産生することができない
細胞の中から選択される。組換え細胞における発現による抗体の製造のための以下の頁に
記載されているものなどのADCCを促進するのに適した他の細胞を、ラット免疫細胞腫の代
わりに用いてもよい。かかる細胞は、低いフコシル化能を有するか又はこれを有しない細
胞であることが有利である。
【００４３】
本発明を実施するのに適したハイブリドーマの製造は、従来法によって行われる。実施
態様は、特定の開示されている特徴が、融合パートナーとして使用される他の細胞に適応
できる、本出願の実施例に詳細に記載されている。
【００４４】
抗体又はその機能的断片の製造に有用な本発明の具体的なハイブリドーマは、2011年9
月28日にNo.I-4531でCNCMに寄託されたMD707-1、又は2011年9月28日にNo.I-4532でCNCMに
寄託されたMD707-3、又は2011年9月28日にNo.I-4533でCNCMに寄託されたMD707-13である
。
【００４５】
寄託されたハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体の特性に関し、本発明によ
って提供される教示を考慮すると、本発明の抗体を発現するために、当業者は、ハイブリ
ドーマにより分泌され、その結合及び中和特性を有した構造を有する抗体の選択によって
、発現ライブラリ及び発現系などの代替技術を用いることができる。cDNAライブラリは、
本発明のハイブリドーマで発現させたRNA、及び選択して発現させた適切な配列から十分
に製造することができる。
【００４６】
抗体の機能的断片は、特にパパイン若しくはペプシン消化を含む周知の技術に従い酵素
消化を用いて、又はいずれかの適切な切断法を用いて、抗体から出発して得ることができ
る。または、これらは、前述の断片のアミノ酸配列をコードする核酸配列による組換えに
よって改変された宿主細胞において発現させるか、又は合成、特に化学合成することがで
きる。
【００４７】
したがって、改変された抗体を含む本発明の抗体、並びに抗体の機能的断片はまた、例
えばSambrookらの文献（分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning, A La
boratory Manual), 第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N. Y., (1989))、及び最新版）に記載されているような古典的遺伝子工学技術によって
も製造することができる。
【００４８】
本発明によれば、IL-7Raタンパク質への「結合」とは、抗原‐抗体型の相互作用をいい
、そして、抗体又はその機能的断片の「特異的結合」特性とは、抗体又はその機能的断片
が、IL-7Raタンパク質に結合し、さらに、他のタンパク質（例えば、一般的なサイトカイ
ン受容体γ鎖）に対し顕著に弱い親和性により結合するか又は結合しないことを意味する
。結合能は、実施例に開示されている試験に従ってアッセイすることができ、具体的には
、ELISA又はウェスタンブロット分析によってアッセイすることができる。
【００４９】
特定の実施態様において、本発明に係る抗体又はその機能的断片は、次に示すポリペプ
チドのうちの少なくとも1つの抗原結合部位に含まれる。
【００５０】
1) MD707-1
a)可変重鎖において、
(i)配列番号6のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、
(ii)配列番号8のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、
(iii)配列番号10のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号2の位置19から位置141のアミノ酸配列を有するVH、及び／又は、
b)可変軽鎖において、
(i)配列番号12のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、
(ii)配列番号14のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、
(iii)配列番号16のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号4の位置21から位置133のアミノ酸配列を有するVL。
【００５１】
2) MD707-3
a)可変重鎖において、
(i)配列番号22のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、
(ii)配列番号24のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、
(iii)配列番号26のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号18の位置19から位置141のアミノ酸配列を有するVH、及び／又は、
b)可変軽鎖において、
(i)配列番号28のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、
(ii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、
(iii)配列番号32のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号20の位置21から位置133のアミノ酸配列を有するVL。
【００５２】
3) MD707-13
a)可変重鎖において、
(i)配列番号38のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、
(ii)配列番号40のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号34の位置22から位置135のアミノ酸配列を有するVH、及び／又は、
b)可変軽鎖において、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、
(iii)配列番号48のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号36の位置22から位置129のアミノ酸配列を有するVL。
【００５３】
また、本発明は、シグナルペプチドを包含し、配列番号2、配列番号4、配列番号18、配
列番号20、配列番号34及び配列番号36にそれぞれ対応する、VH及びVLポリペプチドの変形
にも関する。
【００５４】
ヒト患者への投与のために本発明の抗体又はその機能的断片を使用することを目的とし
て、特に、前述の抗体に対する受容宿主又は患者の免疫反応を低下させるために、実施例
に示されているものなどの非霊長類抗体である本発明の抗体から、ヒト化モノクローナル
抗体若しくはキメラモノクローナル抗体及び／又は脱免疫抗体を誘導することは有益であ
ると考えられる。これらの変異体抗体の機能的断片は、ヒト化、キメラ又は脱免疫化変異
体としても得ることができる。
【００５５】
ヒト化抗体である抗体又はその機能的断片は、標準的な定義及び数体系に従って、ヒト
抗体において対応する位置を有するヒトアミノ酸残基が、本発明の非ヒト抗体の可変鎖の
定常領域、すなわち、VH及び／又はVLのフレームワーク領域中に存在するアミノ酸残基で
置換されることにより誘導され、その置換レベルは、前述の定常領域、すなわちフレーム
ワークにおいて1%〜20%、特に1％〜18％の残基である。前述の定常領域には、4本鎖抗体
で画定されたFR領域が含まれる。
【００５６】
本発明に係る改変された抗体の特定の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又は脱免疫
抗体を包含する。
【００５７】
特定の改変された抗体は、CDR領域においてアミノ酸残基が修飾され、前述の修飾は、
結果として、非ヒト抗体の可変領域中のT細胞エピトープの喪失により脱免疫化が生じる
。脱免疫化は、抗体可変領域のT細胞エピトープを決定した後に、特に、インシリコ予測
、続いて、機能的T細胞エピトープを排除する抗体の可変鎖配列における点突然変異によ
って行うことができる。本発明の好適な実施態様において、CDR領域、特にCDR3領域の改
変は、例えば、HLAクラスII／ペプチド複合体に対するT細胞受容体の結合親和性を減少さ
せるために、人体への投与の目的で脱免疫化するのに必要な程度まで制限されている。特
定の実施態様において、VH及び／又はVLのCDR3領域は改変されていない。別の実施態様に
おいて、FR領域及び／又はCH領域も改変され、特にヒト化されている。
【００５８】
したがって、本発明のフレームワーク内の抗体は、上に定義された特徴に基づく抗体を
包含し、特に、標準的な定義及び数体系に従って、ヒト抗体において対応する位置を有す
るヒトアミノ酸残基が、本発明の抗体の定常領域中に存在するアミノ酸残基で置換される
ことによって得られるヒト化抗体であり、その置換レベルは、前述のフレームワーク領域
において1%〜20%、特に1％〜18％の残基であり、また、脱免疫化のために、CDR領域のう
ちの一部又はすべてに適切に置換されている。上述したように、ヒト化は、主に、元の抗
体のフレームワーク領域を標的とする。場合によっては、ヒト化は、代替的に又はさらに
、CDR領域、特に、CDR1及び／又はCDR2領域に関するものであってもよい。
【００５９】
ここで、ヒト化は、非ヒト抗体若しくはその断片の配列と最も高い配列同一性を示す、
ヒト生殖系列軽鎖又は重鎖フレームワークを考慮し、対応するヒト残基に適合させるため
に、前述の非ヒト抗体又はその断片において置換された、アミノ酸残基、特に抗体表面で
暴露した残基を選択して、達成することができる。特定の実施態様において、FRLのうち
の一部又はすべて、及び／又はFRHのうちの一部又はすべては、完全にヒトであり、すな
わち、ヒトフレームワーク配列に特有である。別の実施態様において、FR領域のうちの一
部又はすべてにおいて選択された残基は置換されている。
【００６０】
また、抗体をヒト化する方法も、当該技術分野で周知であり、例えば、Routledegeらの
文献（ヒトにおける予防及び治療用途の抗体分子のタンパク質工学(Protein Engineering
of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man) (Ac
ademic Titles, Nottingham, England (1993)), 13-44中の「治療用抗体の再形成(Reshap
ing antibodies for therapy)」）、又はRoguskaらの文献（Protein Engineering, 9(10)
, 895-904, (1996)）によって記載されている。これらの方法も、scFvなどの抗原結合断
片に適用することができる。
【００６１】
一例として、「リサーフェシング(resurfacing)」として知られている方法には、ヒト
の1組の表面残基を有する非ヒト抗体の可変領域のフレームワークにおいて1組の表面残基
を置換することがあるが、CDRグラフト化として知られている方法には、CDRを、非ヒト抗
体からヒト抗体のフレームワーク領域へ転写させることがある。CDRグラフト化は、一般
に、結合親和性を最適化するために、ヒトフレームワークの一部の残基の置換がある、フ
レームワーク最適化によってなされる。
【００６２】
フレームワーク最適化の手段は、近年、コンビナトリアルライブラリを用いることによ
って簡素化されている（Rosokらの文献：J. Biol. Chem. 271, 22611-22618, 1996；Baca
らの文献：J. Biol. Chem. 272, 10678-10684, 1997）。
【００６３】
抗体のヒト化に利用可能な別の近年の戦略は、軽鎖及び重鎖の元の非ヒトCDR3配列のみ
を保持し、他の配列は、ナイーブヒトV遺伝子ライブラリから選択される（Raderらの文献
：Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 95, 8910-8915, 1998）。
【００６４】
本発明の別の実施態様によれば、抗体は改変され、その結果、異なる抗体のアミノ酸残
基のドメイン又は鎖を含むキメラ抗体、具体的には、異なる動物種から得られ、機能的抗
体でともに組み合わされた抗体となる。
【００６５】
本発明のキメラ、ヒト化及び／又は脱免疫抗体は、非改変抗体のように、いずれかの分
類の免疫グロブリンに属し得る。これらは、IgG1、IgG2、lgG3又はIgG4などのIgGクラス
のサブクラスに属していることが好ましい。
【００６６】
抗体の可変領域を、適当なリンカー又は別の抗体の定常領域と組み合わせることによっ
て組換え抗原結合断片又はキメラ抗体を製造するための方法は、当該技術分野において周
知である。
【００６７】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であると考えられ、これらの抗体の組成物が、抗
原結合特異性、したがって可変領域組成の点で、均質で、特に同一であることを意味する
。したがって、抗体は、ハイブリドーマ技術に代わる技術によって得られる場合であって
も、モノクローナルとして適格である。
【００６８】
別の実施態様によれば、本発明は、本明細書に提供される定義のいずれかによる抗体又
はその機能的断片を含むキメラ分子にも関し、前述のモノクローナル抗体又はその機能的
断片は、機能的に異なる分子に結合する。本発明のキメラ分子は、抗体若しくは機能的断
片の安定性及び／又は半減期の改善のために、融合キメラタンパク質、又は、化学基若し
くは生物基(biological group)と又は分子（PEGポリマー若しくは別の保護基、若しくは
インビボにおけるプロテアーゼ切断に対する保護に適した分子など）との共有結合、グラ
フト化、化学結合を含む適切な形態の結合から生じた結合体のいずれかであってもよい。
同様の技術を用いて、特に化学結合又はグラフト化によって、キメラ分子を、生物活性分
子により製造することができ、前述の活性分子は、例えば、毒素、具体的には、シュード
モナス外毒素A（Risbergらの文献：PLoS One. 2011;6(9):e24012）、植物毒素リシンのA
鎖（Van Oosterhoutらの文献：Int J Pharm. 2001年6月19日;221(1-2):175-86.）、又は
サポリン毒素（Flavellらの文献：Br J Haematol. 2006 Jul;134(2):157-70）、特に治療
有効成分、人体の特定の細胞若しくは組織に対する抗体若しくは機能的断片を標的とする
のに適したベクター（特にタンパク質ベクターを含む。）の中から選択されるか、又は、
キメラ分子は、特に抗体の断片が使用される場合、標識若しくはリンカーに結合すること
ができる。
【００６９】
抗体又はその機能的断片のPEG化が、特に治療用途において、宿主への活性物質の送達
条件を改善する場合、PEG化は、特定の関心を惹く態様である。PEG化は、抗体又はその機
能的断片の認識部位との干渉を防止する特異的な部位であり、高分子量PEGにより行うこ
とができる。PEG化は、抗体若しくはその機能的断片の配列中に存在する遊離システイン
残基によってか、又は抗体若しくはその機能的断片のアミノ酸配列中の遊離システイン残
基の添加によって達成することができる。
【００７０】
また、本発明は、本明細書に定義する抗体若しくはその機能的断片を含む組成物であっ
て、抗体若しくはその機能的断片が、抗体若しくはその機能的断片の均質な集団であるか
、又はモノクローナル抗体若しくはその機能的断片である、組成物にも関する。
【００７１】
さらに、本発明は、本明細書に開示されている抗体を含む組成物若しくは化合物の集合
体、又は本発明のキメラ分子にも関し、これは、
a) CD127陽性細胞に対して、特にCD127+ T細胞に対して細胞傷害活性を有し、ヒトIL-7
に対してアンタゴニスト特性も有する抗体、又は、
b) CD127陽性細胞に対して、特にCD127+ T細胞に対して細胞傷害活性を有する抗体若し
くはその機能的断片の集団、及びヒトIL-7に対してアンタゴニスト特性を有する抗体若し
くはその機能的断片の集団であって、これらの抗体の集団が、混合物中で組み合わされる
か、又は分離され、後者の選択では、併用投与若しくは連続投与のために製剤される集団
を含む。
【００７２】
特に本発明の抗体を参照することによってされる定義は、同様に、技術的に明らかに関
連性がない場合を除き、その機能的断片にも適用される。また、これらの定義は、これら
の抗体若しくはその機能的断片を含むか、又は、本出願に開示されているように、これら
の抗体から誘導された分子（特に、キメラ抗体若しくはキメラ分子）又は組成物にも適用
される。さらに、本発明の抗体の機能的断片が、概念又は設計の観点から当該抗体に由来
するが、必ずしも製品のような抗体に頼らずに、種々の技術によって製造できることが明
示されている。
【００７３】
また、本発明は、本明細書で提供される定義のいずれかによる抗体をコードする核酸分
子にも関する。
【００７４】
本発明の抗体又はその機能的断片の製造に適したかかる核酸は、特に、次に示す群から
選択される。
【００７５】
1) MD707-1
i.配列番号1の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置55から位
置423のその断片、
ii.配列番号3の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置61から位
置399のその断片、
iii.配列番号5の配列を有するVHCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
iv.配列番号7の配列を有するVHCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
v.配列番号9の配列を有するVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
vi.配列番号11の配列を有するVLCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
vii.配列番号13の配列を有するVLCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
viii.配列番号15の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド。
【００７６】
2) MD707-3
i.配列番号17の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置55から位
置423のその断片、
ii.配列番号19の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置61から
位置399のその断片、
iii.配列番号21の配列を有するVHCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
iv.配列番号23の配列を有するVHCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
v.配列番号25の配列を有するVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
vi.配列番号27の配列を有するVLCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
vii.配列番号29の配列を有するVLCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
viii.配列番号31の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド。
【００７７】
3) MD707-13
i.配列番号33の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置64から位
置405のその断片、
ii.配列番号35の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置67から
位置387のその断片、
iii.配列番号37の配列を有するVHCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
iv.配列番号39の配列を有するVHCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
v.配列番号41の配列を有するVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
vi.配列番号43の配列を有するVLCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
vii.配列番号45の配列を有するVLCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
viii.配列番号47の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド。
【００７８】
本発明の特定の実施態様によれば、ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3、配列
番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配
列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31
、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番
号45及び／又は配列番号47の配列に対して修飾されたヌクレオチドを有し、
a)それぞれ、配列番号2のアミノ酸配列若しくは位置19から位置141のその断片、配列番
号4のアミノ酸配列若しくは位置21から位置133のその断片、配列番号6、配列番号8、配列
番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18のアミノ酸配列若しくは位置
19から位置141のその断片、配列番号20のアミノ酸配列若しくは位置21から位置133のその
断片、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配
列番号34のアミノ酸配列若しくは位置22から位置135のその断片、配列番号36のアミノ酸
配列若しくは位置22から位置129のその断片、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配
列番号44、配列番号46及び／又は配列番号48のアミノ酸配列を有するポリペプチドのいず
れかをコードし、及び／又は、
b)配列番号1の配列若しくは位置55から位置423のその断片、配列番号3の配列若しくは
位置61から位置399のその断片、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番
号13、配列番号15、配列番号17の配列若しくは位置55から位置423のその断片、配列番号1
9の配列若しくは位置61から位置399のその断片、配列番号21、配列番号23、配列番号25、
配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33の配列若しくは位置64から位置405の
その断片、配列番号35の配列若しくは位置67から位置387のその断片、配列番号37、配列
番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45及び／又は配列番号47の配列を有するポリ
ヌクレオチドのうちの1つと、これらの全長に対して、少なくとも85%、好ましくは少なく
とも90%、より好ましくは少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも98%若しくは少
なくとも99%の同一性を有する。
【００７９】
本発明の別のポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配
列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21
、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番
号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45及び／又は配列番
号47の配列を有するポリヌクレオチド配列の断片であり、それぞれ、配列番号2、配列番
号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列
番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、
配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号
44、配列番号46及び／又は配列番号48のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的断片
をコードする。
【００８０】
本発明のポリヌクレオチドは、特に宿主細胞中での発現のために、配列を最適化するこ
とができる。本分野における最適化技術は、従来技術である。
【００８１】
細胞の産生から本発明の抗体を回収する目的で、ポリヌクレオチドは、抗体鎖をコード
するヌクレオチド配列から上流に、発現された抗体の分泌のためのシグナルペプチドをコ
ードする配列を含み得る。
【００８２】
上述のポリヌクレオチド断片は、少なくとも9つのヌクレオチドの配列を有し、これら
の起源の配列よりも短いことが有利である。
【００８３】
特定の実施態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明に係る抗体若しくはそ
の機能的断片をコードする配列、本明細書に開示されているものと同じものを含むキメラ
分子に加えて、産生細胞で発現させる場合、前述のタンパク質の分泌を可能にするシグナ
ルペプチドをコードする配列を含むことが有利であり得る。また、これらは、前述したタ
ンパク質の検出及び／又は精製を容易にする1以上のマーカーペプチドをコードする1以上
の配列も含み得る。
【００８４】
また、本発明は、本明細書に開示されているポリヌクレオチドのクローニング及び／又
は発現のためのベクターにも関し、特に、哺乳動物細胞におけるクローニング及び／又は
発現に適したプラスミドであり、このプラスミドは、転写及び発現のための調節配列を含
む。
【００８５】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドにより組み換えられた細胞又は細胞系、
特に、哺乳動物又は鳥類細胞若しくは細胞系に関する。例えば、遺伝的に改変されたチャ
イニーズハムスター卵巣細胞は、全フコシル化を減少させる。実際、コアフコシル化を欠
く抗体は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)を有意に高めることを示す（von Horste
nらの文献：Glycobiology. 2010 Dec;20(12):1607-18）。別の例は、低フコシル化特性を
生来有するEB66細胞系である（Olivierらの文献：MAbs. 2010年7月16日;2(4)）。
【００８６】
したがって、本発明は、抗体又はその機能的断片を製造する方法にも関し、この方法は
、
a)動物、特にヒトIL-7受容体のヒトα鎖を有する哺乳動物を免疫した後にハイブリドー
マを得ること、及び、必要に応じて、同じ免疫原により前述の動物を増強させ、免疫化に
応答する動物から脾臓又はリンパ節細胞を回収し、前述の細胞を髄腫細胞と融合させモノ
クローナル抗体を単離することと、
b)抗体の回収が可能な条件下で、EB66鳥類細胞などの低いフコシル化能を提示するか又
はフコシル化能を提示しない細胞の組換え形態において、かかる抗体をコードする遺伝子
を発現させること、
c)ヒトIL-7受容体のα鎖に対して所望の結合親和性を有した抗体を回収することと、を
含む。
【００８７】
本発明の別の目的は、本発明に係る抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子ととも
に医薬用ビヒクルを含む医薬組成物であり、前述の医薬組成物は、必要に応じて、別の有
効成分を更に含む。
【００８８】
また、本発明は、ヒト患者に投与する場合、ヒトCD127陽性細胞の生存若しくは増殖、
具体的にはヒトCD127陽性エフェクター細胞、特にCD127+メモリーT細胞の生存若しくは増
殖、特にCD127+及びCD8+メモリーT細胞、又はCD127+及びCD4+メモリーT細胞を制御するの
に適した製剤中に、有効成分として、本明細書に提供される定義による抗体若しくはその
機能的断片又はキメラ分子、又は医薬組成物を含む、組成物にも関する。
【００８９】
本発明の組成物は、特にアレルギー又は自己免疫に関与する細胞上で免疫調節治療効果
を有する、付加的な化合物を更に含み得る。例示の目的において、関心対象の免疫調節剤
は、抗CD3、抗ICOS若しくは抗CD28抗体又は組換えタンパク質、又はCTLA4Ig若しくは抗CD
40抗体などの補助細胞を標的とする抗体などのT細胞を標的とする他のモノクローナル抗
体である。
【００９０】
また、本発明は、併用して有効成分としてか又はその必要のある患者の追加治療法に使
用される、本明細書に定義するか又は示す抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子に
も関する。
【００９１】
本発明に係る抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子、本明細書に定義する医薬組
成物若しくは組成物は、具体的には、免疫応答、特にメモリーT細胞応答による影響を受
けた病態を治療するためのヒト患者での使用に提案されている。したがって、本発明者ら
は、本発明に係る抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子、本明細書に定義する医薬
組成物若しくは組成物が、臓器若しくは組織移植拒絶の予防、又は自己免疫疾患若しくは
アレルギー性疾患の治療、又はCD127+細胞に関連する乳癌などの癌の治療、又はセザール
リンパ腫などのT細胞皮膚リンパ腫の治療、又はIL7-R/TSLP経路の獲得型突然変異(gain-m
utation)による急性リンパ芽球性白血病の治療に使用することを提案した。また、TSPLR
と相互作用させることによって、本発明の抗体又はその機能的断片は、喘息などのアレル
ギー反応を阻害することもできる。
【００９２】
「治療」又は「治療的処置」とは、投与を行う段階が、IL-7経路に関連する障害、すな
わち、CD127陽性細胞の活性化若しくは増殖に関与する障害に罹患している必要のある動
物又はヒト患者の臨床状態を改善させることを意味する。かかる治療は、IL-7若しくはTS
LP経路に関連した障害、すなわち、CD127陽性細胞の活性化若しくは増殖に関与した障害
に関連する症状を排除又は低下させることにより、動物又はヒト患者の臨床状態を改善さ
せること、及び／又は、好適な実施態様において、健康の回復を目的とする。
【００９３】
本発明の更なる特徴及び特性は、次に示す実施例及び図面から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
図面の説明
【図１】ナイーブT細胞及びメモリーT細胞とMD707の選択的な枯渇。
【００９５】
【図２】5 μg/mlの組換えヒトIL-7受容体でコーティングされたプレート上のラット抗ヒトCD127抗体のELISAプロファイル。
【００９６】
【図３】ヒト末梢血単核細胞(PBMC)、ヒヒPBMC、マカク(macaque)PBMC及びラット脾臓細胞におけるフローサイトメトリにより分析したラット抗ヒトCD127抗体の交差反応性。MFI:蛍光強度中央値。abissa上の座標は、101、102、103、104、105である。
【００９７】
【図４】エフェクター(E)細胞としてのラットリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、及び標的(T)細胞としての51Cr標識ヒトTリンパ球を、種々の比：E:T=30:1（■）、E:T=10:1（▲）、E:T=3:1（●）及びE:T=1:1（◆）で、ともに4時間インキュベーション後のラット抗ヒトCD127抗体の抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)。特異的細胞傷害性の割合を、51Cr放出によって決定した。
【００９８】
【図５】ラット抗ヒトCD127抗体によるIL-7誘導増殖の阻害。ヒトTリンパ球を、100 UI/ml（■）、50 UI/ml（●）又は10 UI/ml（▲）で、OKT3コーティングプレート(1 μg/ml)、可溶性組換えヒトIL-7タンパク質（rhIL-7；Sino Biologicals社(Beijing, China)製；標準10975-H08H）上で3日間、抗体とともにインキュベートした。3H-チミジン（1 μCi/ウェル）を導入することによって、インキュベーションの最後の8時間で増殖を測定した。rhIL-7を含むOKT3コーティングプレート上の抗CD127抗体のない状態でインキュベートしたヒトT細胞の増殖は、約105計数毎分(counts per minutes) (cpm）であった。
【００９９】
【図６】MD707-1 (A)、MD707-3 (B)及びMD707-13 (C)のVH及びVL可変領域のアミノ酸及びヌクレオチド配列。それぞれの可変断片にシグナルペプチドをコードする核酸配列に、下線を付している。MD707-1、MD707-3及びMD707-13のそれぞれのVH及びVLのCDR1、CDR2及びCDR3領域のそれぞれのアミノ酸配列を、配列番号として開示する配列に応じて下線を付している。したがって、これらのCDR配列をコードする核酸配列は、図中の下線を付したアミノ酸配列に沿って配置されている。
【０１００】
【図７】8週齢の雄Balb/cマウスに、21日間、1日おきに、抗IL-7Rα mAb（クローンA7R34）を400 μg腹腔内に(n=5)、又はアイソタイプ対照を同じ計画で(n=5)投与した。マウスを第21日目に屠殺し、血液及び脾臓を、マラッセ(Malassez)装置を備えた従来の顕微鏡による絶対Tリンパ球計数のために採取した。
【０１０１】
【図８】8週齢の雄Balb/cマウスに、21日間、1日おきに、抗IL-7Rα mAb（クローンA7R34）を400 μg腹腔内に(n=5)、又はアイソタイプ対照を同じ計画で(n=5)投与した。マウスを第21日目に屠殺し、腸間膜リンパ節及び脾臓を、フローサイトメトリによるリンパ球表現型決定のために採取した。抗IL-7Rα処置マウスは、リンパ節（12.5％に対して21.4%）又は脾臓（11.6％のCD4+ T細胞に対して20.3）のいずれかにおいて、対照マウスよりも有意に高いCD3+CD4+CD25+FOXP3+制御性T細胞の頻度を有していた(p＜0.01)。
【０１０２】
【図９】7〜9週齢の雄Balb/cマウス(H-2b)を、移植5〜10日前に、腹腔内に250 mg/kgのストレプトゾトシンを投与することによって糖尿病にさせた。それぞれのレシピエントに、7〜9週齢の雄C57BL/6マウス(H-2d)から分離した約500の膵島を移植した。対照群には処置を行わなかった。処置群に、移植21日前から開始し、1日おきに、抗IL-7Rαモノクローナル抗体（クローンA7R34）を400 μg腹腔内に投与し、これを、移植後90日間継続させた。対照マウスの移植生存率の中央値は21日であった（範囲：14〜34日）が、6匹の処置マウス中5匹は、限定のない移植生存（160日超）であった（P=0.0002、ログランク検定）。
【０１０３】
【図１０】非肥満糖尿病(NOD) 6週齢雌マウスを、Charles-River France社から購入し、本発明者らの動物施設で維持した。血糖を、10週齢から毎週測定した。処置群に、8週齢から16週齢まで、8週間、週3回、抗IL-7Rαモノクローナル抗体（クローンA7R34）を400 μg腹腔内に投与した。対照群に、同じ量及び同じ計画でPBSを投与した。52週齢において、対照マウスの5/8 (62.5%)が糖尿病を発症し、処置マウスの1/8が糖尿病であった（p=0.028、ログランク検定）。
【０１０４】
【図１１】ヒトCD127でトランスフェクトさせたマウスBA/F3細胞系に対するキメラクローン3抗ヒトCD127抗体の抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)。エフェクター(E)として使用したヒトNK細胞を、標的(T)細胞として51Cr標識マウスBA/F3 CD127トランスフェクト細胞の種々の比：E:T=3:1（●）、10:1（▲）、又は30:1（■）、及びキメラMD707-3を種々の濃度ととともに4時間インキュベートした。特異的細胞傷害性の割合を、51Cr放出によって決定した。
【０１０５】
【図１２】ヒトT細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)細胞系に対するキメラクローン3抗ヒトCD127抗体の抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)。エフェクター(E)として使用したヒトNK細胞を、標的(T)細胞として2つの異なる51Cr標識T-ALL細胞系の種々の比：E:T=1:1（●）、3:1（▲）、又は10:1（■）、及びキメラMD707-3を種々の濃度とともに4時間インキュベートした。特異的細胞傷害性の割合を、51Cr放出によって決定した。A/標的細胞は、CD127を過剰発現するDND41 T-ALL細胞系であり、B /標的細胞は、低いレベルのCD127を発現するJurkat T-ALL細胞系であった。
【実施例】
【０１０６】
実施例
I) モノクローナル抗体の調製及び特性評価
1. 新規抗ヒトCD127 Mabの調製及び選択
ラットを、組換えhCD127-Ig（免疫グロブリンの定常領域と融合させたhCD127‐Sino Bi
ologicals社(Beijing, China)製；標準10975-H03H）により免疫し、モノクローナル抗体
を、従来法に従って誘導した。免疫化プロトコールは次に示すとおりであった。組換えCD
127 Fcキメラ（10975-H03H、Sino Biologicals社(Beijing, China)製）を使用し、LOU/C 
IgkIA株のラットを免疫した。50 μgのタンパク質を、完全フロイントアジュバント中で
懸濁させ、皮下投与した。20日後、不完全フロイントアジュバント中に懸濁させたタンパ
ク質のリコール注射(recall injection)を行った。別の同様のリコール注射を60日間行い
、ブースト注射(boost injection)を、脾臓細胞回収4日前に、100 μgのタンパク質とと
もに第90日目で行った。
【０１０７】
ハイブリドーマを、先に記載されている手順（Chassouxらの文献：Immunology 1988 65
623-628）に従い、LOUラット免疫細胞腫IR983F、非分泌及びアザグアニン耐性細胞系と
脾臓単核細胞を融合させることによって得た。ハイブリドーマを、まず、組換えCD127分
子に対する分泌されたモノクローナル抗体の結合能に応じてスクリーニングした（CD127 
Fcキメラ；10975-H03H、Sino Biological社(Beijing, China)製）。次いで、ハイブリド
ーマを、ヒトT細胞により発現させたCD127に対するモノクローナル抗体の結合能について
スクリーニングした。
【０１０８】
組換えCD127（Sino Biological社製）の分泌された抗体による認識に基づいて、13のク
ローンを最初に選択し、これらの中から、さらに、ヒトT細胞によって発現するCD127の認
識に基づいて9つのクローンを選択した。
【０１０９】
抗体を作製し、これらのアイソタイプ並びにこれらの親和性を、BIAcore技術を用いた
表面プラズモン共鳴測定により特性評価した（表1）。
【０１１０】
【表１】
0006621778.tif 000002
【０１１１】
ELISAによって評価した抗h-CD127 MabのrCD127認識
組換えhCD127（Sino Biologicals社(Beijing, China)製、標準10975- H08H）を、プラ
スチック上で固定化し、漸増用量のMabを加え、結合を測定した。インキュベーション及
び洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラット免疫グロブリン抗体を加え、従来法により明ら
かにした。結果は、MD707-1、2、3、4、9、13の良好な結合、MD707-5及び12の中程度の結
合、並びにMD707-6の弱い結合が明らかになった。
【０１１２】
抗ヒトCD127 Mabと非ヒト霊長類の交差反応性
表1に示すMabをフローサイトメトリアッセイに使用し、ヒトT細胞と比較した霊長類T細
胞上の結合について検討した。ラット由来のMabがラット分子を認識することは想定され
なかったので、ラットT細胞を負の対照として使用した。データ（図3）は、試験した全Ma
bが、霊長類（カニクイザル(Cynomolgus Macaque)及びヒヒ）T細胞を認識することも示す
。ラットT細胞は陰性であった。
【０１１３】
抗ヒトCD127 Mabの抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)
ADCCとは、標的細胞上に発現するエピトープに対する抗体の結合、並びにその後のFc受
容体（本質的にNK細胞及び活性化リンパ球）を発現するエフェクター免疫細胞のFc依存性
リクルートをいい、主にグランザイム／パーフォリン系機構によって標的細胞の死滅が生
じ、表1に示すMabをADCCアッセイに使用した。ラット由来（Mabがラット脾細胞から得ら
れたため）のリンホカイン活性化キラー細胞(LAK)を、Mabの存在下で、CD127を発現する
標的ヒトT細胞を死滅させるエフェクター細胞として使用した。図4に示すデータは、Mab 
7MD07-1、3、6、9及び13がADCCを誘発することを明らかにした。興味深いことに、親和性
、結合特性及びADCC特性の間に直接の相関関係はなく、このことは、ADCC特性が結合分析
から予測できなかったことを示す。
【０１１４】
抗ヒトCD127 Mabのアンタゴニスト特性
受容体へのリガンドの結合に拮抗する当該受容体に対する所定のMabの能力は、恐らく
、受容体にドッキングさせるのにリガンドにより使用されるエピトープを標的とするMab
の能力によって異なる。また、標的の構造を改変するMabの能力、したがって、受容体の
結合特性を改変するMabの能力によっても異なると考えられた。図5に示すデータは、Mab 
MD707-1、2、3、4、5、12及び13が、IL-7媒介性T細胞の増殖を妨げることができるが、MD
707-6及び9が、限られた範囲でしかIL-7媒介性T細胞の増殖を妨げないことを明らかにし
た。
【０１１５】
抗ヒトCD127 Mabのヌクレオチド及びアミノ酸配列
RACE PCR法を用いて、MD707クローンのVH及びVL領域の配列決定をした。簡潔には、全RNAを抽出し、逆転写し、得られたcDNAを、dATP及びターミナルトランスフェラーゼ酵素を用いて、分子の3'末端でポリアデニル化した。第１の35サイクルのPCR反応を、オリゴdTアンカープライマー及びHerculase酵素（Stratagene社製）を用いて行った。第２の35サイクルのPCRを、入れ子PCRアンカープライマーを用いて行った。次いで、得られたPCR産物を大腸菌でTAクローニングし、アンピシリンにおいて選択した後、得られたコロニーを、制限酵素プロファイリングによってスクリーニングし、挿入されたcDNAの配列決定をした。ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を図6及び配列表に示す。
【０１１６】
2. T細胞の枯渇における代用抗CD127モノクローナル抗体の活性
代用抗ヒトCD127 Mabは、Teff細胞を枯渇させ、Treg/Teff比を増加させる
抗CD127 MabがどのようにT細胞に影響を与えるかについて説明するために、9週齢の雄B
alb/cマウス(H-2b)に、21日間、1日おきに、抗CD127 Mab（マウスCD127に対するクローン
A7R34）を400 μg、腹腔内に投与した。その結果、血液及び脾臓でT細胞の枯渇がみられ
た（図7）（並びに、リンパ節及び胸腺においてもT細胞の枯渇がみられたが、そのデータ
は示さない。）。興味深いことに、残存する細胞において、Treg細胞の比は、通常、約10
％、最大20%上昇し、このことは、Treg細胞に対するTeff細胞の選択的な枯渇を示した（
図8）。
【０１１７】
代用抗ヒトCD127のMabは、膵島移植拒絶を予防する
抗CD127 Mabが同種移植拒絶をどのようにして調節し得るかについて理解するために、7
〜9週齢の雄Balb/cマウス(H-2b)を、C57BL/6マウス(H-2d)から膵島を移植する5〜10日前
に、腹腔内に250 mg/kgのストレプトゾトシンを投与することによって糖尿病にさせた。
対照マウスの移植生存率の中央値は21日であった（範囲：14〜34日）が、6匹の処置マウ
ス中5匹は、限定のない移植生存（160日超）であった（P=0.0002、ログランク検定;図9）
。
【０１１８】
代用抗ヒトCD127 Mabは、NODマウスの糖尿病を予防し、治癒する
抗CD127 Mabが自己免疫疾患をどのようにして調節し得るかについて理解するために、
非肥満糖尿病(NOD) 6週齢雌マウスを、8週齢から16週齢まで、8週間、週3回、400 μgの
抗IL-7Rモノクローナル抗体（クローンA7R34）を腹腔内に投与して処置した。対照群に、
同じ量及び同じ計画でPBSを投与した。図10に示すように、結果は、処置されたマウスの
ほとんどで糖尿病が予防されるが、対照動物の60％超が、最初の26週齢以内に糖尿病を発
症することを実証した。
【０１１９】
II)キメラ抗CD127抗体のADCC活性
MD707-3抗CD127 Mabにより調製されたキメラ抗体を、元のラット抗体のFc断片をヒトFc
断片に置換することによって得た。
【０１２０】
このキメラ抗体において、エフェクター細胞は、AutoMACS 細胞分類器及び磁気ビーズ
（NK単離キット、Miltenyi Biotec社(Bergisch Gladbach ,Germany)製）を使用した負の
選択によって末梢血単核細胞から単離された、新しい初代ヒトNK細胞であった。NK細胞を
、10% FBS（Life Technologies社(Carlsbad, California)製）、100 IU/mlのペニシリン
（Life Technologies社製）、0.1 mg/mlのストレプトマイシン（Life Technologies社製
）、2 mMのL-グルタミン（Life Technologies社製）及び150 IU/mlのヒトIL-2（Roche社(
Basel, Switzerland)製）を添加したRPMI 1640培地（Life Technologies社製）で、37℃
、5％ CO2で一晩、インキュベートした。
【０１２１】
標的細胞を、100 μCi (3.7 MBq)の51Cr（PerkinElmer社製）で、37℃で1時間標識し、
培養培地で3回洗浄した。標的細胞を、室温で15分間、希釈した抗体、又は賦形剤（培養
培地）とともにインキュベートし、10,000細胞を96ウェルU底プレートに置いた。エフェ
クターT細胞を、示されたE:T（エフェクター：標的）の細胞比（200 μlの最終容積）で
加え、37℃で4時間又は18時間、インキュベートした。次いで、上清の全25 μlを回収し
、ガンマカウンター（Packard Instrument社製）で計数した。
【０１２２】
アッセイの結果を図11及び12に開示する。
【表２】
0006621778.tif 000003
0006621778.tif 000004
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
IL-7に対する受容体のα鎖（CD127と称する。）に結合し、ヒトCD127陽性細胞、特にCD
127を発現するヒトT細胞（CD127+細胞）に対して細胞傷害活性を示す、抗体又はその機能
的断片。
（構成２）
インターロイキン7 (IL-7)に対してアンタゴニスト特性を更に有し、これによって、IL
-7がCD127陽性細胞上のCD127に接近することに拮抗する、構成１に記載の抗体又はその
機能的断片。
（構成３）
ヒト細胞、特にヒトT細胞によって発現されるCD127に対して発生する、構成１又は２
に記載の抗体又はその機能的断片。
（構成４）
抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC)、及び、場合により、補体依存性細胞傷害(CDC)
を示す、構成１〜３のうちのいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（構成５）
構成１に記載の抗体又はその機能的断片であって、該抗体又はその機能的断片は、
a) No.I-4531でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-1により産生される抗体若しく
はその機能的断片、又は、
b)該a)の抗体をコードするNo.I-4531でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-1におい
て発現させたRNAに対応するcDNAと同一の核酸分子により組み換えられた組換え真核細胞
によって発現する、抗体若しくはその機能的断片、又は、
c)その可変重鎖(VH)及び／又はその可変軽鎖(VL)において改変されたCDR領域を有する
、特に、場合により、VH若しくはVLのうちのいずれか若しくは両方に少なくとも1つの同
一のCDR3、CDR2及び／又はCDR1領域を保持する、及び／又は改変されたフレームワーク(F
R)及び／又は定常(CH)領域を有する、該a)又はb)に対して改変された抗体であって、該改
変された抗体が、そのアミノ酸配列の全長において、該a)又はb)の抗体と、70%を超える
同一性、特に、75%を超える、80%を超える、85%を超える、90%を超える、95%を超える若
しくは最大99%の同一性を有する、抗体若しくはその機能的断片の群から選択される、
前記抗体又はその機能的断片。
（構成６）
構成２に記載の抗体又はその機能的断片であって、該抗体又はその機能的断片は、
a) No.I-4532でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-3、若しくはNo.I-4533でCNCMに
寄託されたハイブリドーマMD707-13により産生される抗体若しくはその機能的断片、又は
、
b)該a)の抗体をコードする、No.I-4532でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-3若し
くはNo.I-4533でCNCMに寄託されたハイブリドーマMD707-13において発現させたRNAに対応
するcDNAと同一の核酸分子により組み換えられた組換え真核細胞によって発現する、抗体
若しくはその機能的断片、並びに、
c)その可変重鎖(VH)及び／又はその可変軽鎖(VL)において改変されたCDR領域を有する
、特に、場合により、VH若しくはVLのうちのいずれか若しくは両方に少なくとも1つの同
一のCDR3、CDR2及び／又はCDR1領域を保持する、及び／又は改変されたフレームワーク(F
R)及び／又は定常(CH)領域を有する、該a)又はb)に対して改変された抗体であって、該改
変された抗体が、そのアミノ酸配列の全長において、該a)又はb)の抗体と、70%を超える
同一性、特に、75%を超える、80%を超える、85%を超える、90%を超える、95%を超える若
しくは最大99%の同一性を有する、抗体若しくはその機能的断片の群から選択される、
前記抗体又はその機能的断片。
（構成７）
構成１〜７のうちのいずれかに記載の抗体又はその機能的断片であって、その抗原結
合部位が、次に示すポリペプチドのうちの少なくとも1つを含む、前記抗体又はその機能
的断片
1) MD707-1
a)可変重鎖において、
(i)配列番号6のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、
(ii)配列番号8のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、
(iii)配列番号10のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号2の位置19から位置141のアミノ酸配列を有するVH、及び／又は、
b)可変軽鎖において、
(i)配列番号12のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、
(ii)配列番号14のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、
(iii)配列番号16のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号4の位置21から位置133のアミノ酸配列を有するVL、
2) MD707-3
a)可変重鎖において、
(i)配列番号22のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、
(ii)配列番号24のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、
(iii)配列番号26のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号18の位置19から位置141のアミノ酸配列を有するVH、及び／又は、
b)可変軽鎖において、
(i)配列番号28のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、
(ii)配列番号30のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、
(iii)配列番号32のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号20の位置21から位置133のアミノ酸配列を有するVL、
3) MD707-13
a)可変重鎖において、
(i)配列番号38のアミノ酸配列を有するVHCDR 1、
(ii)配列番号40のアミノ酸配列を有するVHCDR 2、
(iii)配列番号42のアミノ酸配列を有するVHCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号34の位置22から位置135のアミノ酸配列を有するVH、及び／又は、
b)可変軽鎖において、
(i)配列番号44のアミノ酸配列を有するVLCDR 1、
(ii)配列番号46のアミノ酸配列を有するVLCDR 2、
(iii)配列番号48のアミノ酸配列を有するVLCDR 3、若しくは、
(iv)配列番号36の位置22から位置129のアミノ酸配列を有するVL。
（構成８）
ヒト化モノクローナル抗体若しくはキメラモノクローナル抗体及び／又は脱免疫抗体で
ある、構成１〜８のうちのいずれかに記載の抗体。
（構成９）
標準的な定義及び数体系に従って、ヒト抗体において対応する位置を有するヒトアミノ
酸残基が、構成１〜８のうちのいずれかに記載の抗体の定常領域中に存在するアミノ酸
残基で置換されることにより誘導されるヒト化抗体であり、その置換レベルが、該定常領
域において1%〜20%、特に1％〜18％の残基である、抗体又はその機能的断片。
（構成１０）
構成１〜９のうちのいずれかに記載の抗体を含むキメラ分子であって、該モノクロー
ナル抗体が機能的に異なる分子に結合し、該キメラ分子が、融合キメラタンパク質、又は
、PEGポリマー若しくは標識化抗体などの、化学基若しくは分子との共有結合から生じた
結合体のいずれかである、前記キメラ分子。
（構成１１）
構成１〜１０のうちのいずれかに記載の抗体を含む組成物若しくは化合物の集合体、
又は構成１１に記載のキメラ分子であって、該組成物若しくは化合物の集合体又はキメ
ラ分子が、
a) CD127+細胞に対して、特にヒトCD127+ T細胞に対して細胞傷害活性を有し、ヒトIL-
7に対してアンタゴニスト特性も有する抗体、又は、
b) CD127+細胞に対して細胞傷害活性を有する抗体若しくはその機能的断片の集団、及
びヒトIL-7に対してアンタゴニスト特性を有する抗体若しくはその機能的断片の集団であ
って、これらの抗体の集団が、抗体の混合物中で組み合わされるか、又は分離され、併用
投与若しくは連続投与のために製剤される集団を含む、
前記組成物若しくは化合物の集合体又はキメラ分子。
（構成１２）
構成１〜９のうちのいずれかに記載の抗体をコードする核酸分子。
（構成１３）
次に示す群から選択される、構成１３に記載の核酸:
1) MD707-1
i.配列番号1の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置55から位
置423のその断片、
ii.配列番号3の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置61から位
置399のその断片、
iii.配列番号5の配列を有するVHCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
iv.配列番号7の配列を有するVHCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
v.配列番号9の配列を有するVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
vi.配列番号11の配列を有するVLCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
vii.配列番号13の配列を有するVLCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
viii.配列番号15の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
2) MD707-3
i.配列番号17の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置55から位
置423のその断片、
ii.配列番号19の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置61から
位置399のその断片、
iii.配列番号21の配列を有するVHCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
iv.配列番号23の配列を有するVHCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
v.配列番号25の配列を有するVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
vi.配列番号27の配列を有するVLCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
vii.配列番号29の配列を有するVLCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
viii.配列番号31の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
3) MD707-13
i.配列番号33の配列を有するVH領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置64から位
置405のその断片、
ii.配列番号35の配列を有するVL領域をコードするポリヌクレオチド、又は位置67から
位置387のその断片、
iii.配列番号37の配列を有するVHCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
iv.配列番号39の配列を有するVHCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
v.配列番号41の配列を有するVHCDR3領域をコードするポリヌクレオチド、
vi.配列番号43の配列を有するVLCDR1領域をコードするポリヌクレオチド、
vii.配列番号45の配列を有するVLCDR2領域をコードするポリヌクレオチド、
viii.配列番号47の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド。
（構成１４）
配列番号47の配列を有するVLCDR3領域をコードするポリヌクレオチド。
（構成１５）
ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号1、配列番号3、配列番号
5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番
号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配
列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45
及び／又は配列番号47の配列に対して修飾されたヌクレオチドを有し、
a)それぞれ、配列番号2のアミノ酸配列若しくは位置19から位置141のその断片、配列番
号4のアミノ酸配列若しくは位置21から位置133のその断片、配列番号6、配列番号8、配列
番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18のアミノ酸配列若しくは位置
19から位置141のその断片、配列番号20のアミノ酸配列若しくは位置21から位置133のその
断片、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配
列番号34のアミノ酸配列若しくは位置22から位置135のその断片、配列番号36のアミノ酸
配列若しくは位置22から位置129のその断片、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配
列番号44、配列番号46及び／又は配列番号48のアミノ酸配列を有するポリペプチドのいず
れかをコードし、及び／又は、
b)配列番号1の配列若しくは位置55から位置423のその断片、配列番号3の配列若しくは
位置61から位置399のその断片、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番
号13、配列番号15、配列番号17の配列若しくは位置55から位置423のその断片、配列番号1
9の配列若しくは位置61から位置399のその断片、配列番号21、配列番号23、配列番号25、
配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33の配列若しくは位置64から位置405の
その断片、配列番号35の配列若しくは位置67から位置387のその断片、配列番号37、配列
番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45及び／又は配列番号47の配列を有するポリ
ヌクレオチドのうちの1つと、これらの全長に対して、少なくとも85%、好ましくは少なく
とも90%、より好ましくは少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも98%若しくは少
なくとも99%の同一性を有するか、又は、
c)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号1
3、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列
番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、
配列番号41、配列番号43、配列番号45及び／又は配列番号47の配列を有するポリヌクレオ
チドの断片であり、それぞれ、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号
10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列
番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、
配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46及び／又は配列番号48の
アミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的断片をコードする、
前記ポリヌクレオチド。
（構成１６）
構成１２〜１４のうちのいずれかに記載のポリヌクレオチドのクローニング及び／又
は発現のためのベクター、特に、哺乳動物細胞におけるクローニング及び／又は発現に適
したプラスミド。
（構成１７）
構成１２〜１４のうちのいずれかに記載のポリヌクレオチドにより組み換えられた細
胞又は細胞系、特に、哺乳動物細胞若しくは細胞系。
（構成１８）
構成１〜１１のうちのいずれかに記載の抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子
とともに医薬用ビヒクルを含み、必要に応じて、別の有効成分を更に含む、医薬組成物。
（構成１９）
ヒト患者に投与する場合、CD127+細胞の生存若しくは増殖、特にCD8+及びCD4+メモリー
T細胞を制御するのに適した製剤中に、有効成分として、構成１〜１１のうちのいずれ
かに記載の抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子、又は構成１９に記載の医薬組
成物を含む、組成物。
（構成２０）
特にアレルギー又は自己免疫に関与する細胞上で免疫調節治療効果を有する、付加的な
化合物を更に含む、構成１７又は１８に記載の組成物。
（構成２１）
併用して有効成分としてか又はその必要のある患者の追加治療法に使用される、構成
１〜１１のうちのいずれかに記載の抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子。
（構成２２）
臓器若しくは組織移植拒絶の予防、又は自己免疫疾患若しくはアレルギー性疾患の治療
、又はCD127+細胞に関連する乳癌などの癌の治療、又はセザールリンパ腫などのリンパ腫
の治療、又はIL7-R/TSLPシグナル伝達経路の獲得型突然変異による急性リンパ芽球性白血
病の治療のためにヒト患者において使用される、構成１〜１１のうちのいずれかに記載
の抗体若しくはその機能的断片又はキメラ分子、構成１７に記載の医薬組成物若しくは
構成１８に記載の組成物。
（構成２３）
構成１〜１０のうちのいずれかに記載の抗体又はその機能的断片を製造する方法であ
って、該方法は、
a)動物、特にヒトIL-7受容体のヒトα鎖を有する哺乳動物を免疫した後にハイブリドー
マを得ること、及び、必要に応じて、同じ免疫原により該動物を増強させ、免疫化に応答
する動物から脾臓又はリンパ節細胞を回収し、該細胞を髄腫細胞と融合させモノクローナ
ル抗体を単離することと、
b)抗体の回収が可能な条件下で、EB66鳥類細胞などの低いフコシル化能を提示するか又
はフコシル化能を提示しない細胞の組換え形態において、該抗体をコードする遺伝子を発
現させることと、
c)該ヒトIL-7受容体のα鎖に対して所望の結合親和性を有する抗体を回収することと、
を含む、
前記方法。
【図１】
0006621778.tif 000005
【図２】
0006621778.tif 000006
【図３Ａ】
0006621778.tif 000007
【図３Ｂ】
0006621778.tif 000008
【図４Ａ】
0006621778.tif 000009
【図４Ｂ】
0006621778.tif 000010
【図５Ａ】
0006621778.tif 000011
【図５Ｂ】
0006621778.tif 000012
【図６Ａ】
0006621778.tif 000013
【図６Ｂ】
0006621778.tif 000014
【図６Ｃ】
0006621778.tif 000015
【図７】
0006621778.tif 000016
【図８】
0006621778.tif 000017
【図９】
0006621778.tif 000018
【図１０】
0006621778.tif 000019
【図１１】
0006621778.tif 000020
【図１２】
0006621778.tif 000021
【配列表】
0006621778000001.app