(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程、
培養した前記形質転換体に、非イオン界面活性剤を濃度０．３％（ｗ／ｖ）以上となるように添加する工程、
培養した形質転換体に、陰イオン界面活性剤を濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）となるように添加する工程、および
前記形質転換体内から前記タンパク質を抽出させる工程を含む、タンパク質の製造方法であって、
前記タンパク質が、ヒトＦｃγＲＩＩＩａであり、
非イオン界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）であり、
陰イオン界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムである、方法。
【請求項２】
培養した形質転換体に、糖質分解酵素を添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養した形質転換体に、核酸分解酵素を添加する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質を発現可能な形質転換体から、前記タンパク質を効率的に抽出可能な試薬、および前記試薬を用いた前記タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する方法として、従来より超音波破砕処理やフレンチプレス処理等の物理的破砕による方法や、市販の抽出試薬を用いた化学的処理による方法が知られている。しかしながら、これらの方法を用いて、前記タンパク質を工業的に抽出しようとすると、物理的破砕による方法では超音波破砕装置やフレンチプレス等の破砕装置の設置に莫大な費用がかかる問題があり、化学的処理による方法では高価な抽出試薬を大量に用いる問題がある。
【０００３】
前記タンパク質を抽出する方法としては、前述した方法以外にも、種々の界面活性剤を用いた方法が知られており、例えば非イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤とを含んだ試薬で抽出する方法（特許文献１）や、陽イオン界面活性剤を含む試薬で抽出する方法（特許文献２）や、非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤とを含む試薬で抽出する方法（特許文献３）が知られている。
【０００４】
前述した抽出方法により得られたタンパク質抽出液は、カラムクロマトグラフィーなどの方法で精製することで、目的とするタンパク質の純度を高める。前記抽出液には細胞破砕物に由来する不溶物を含むため、精製操作を行なう際、それらを遠心やろ過などによりあらかじめ除去する必要がある。しかしながら、抽出効率の高い抽出方法で得られたタンパク質抽出液は、その中に含まれる細胞破砕物の粒子径が細かくなるため、遠心による細胞破砕物の除去が困難となり、遠心後のタンパク質溶液の清澄度が低下する問題や、細胞破砕物による目詰まりでろ過が困難となる問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−０５１９４３号公報
【特許文献２】特開２００６−３２０３１３号公報
【特許文献３】特開２０１３−２５２０９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出する際、細胞破砕物などの不溶物の持ち込みの少ない（清澄度の高い）タンパク質溶液を効率よく調製可能な抽出試薬、および前記試薬を用いた前記タンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、抽出試薬に添加する界面活性剤を最適化することで、形質転換体内から組換えタンパク質を効率よく抽出でき、かつ不溶物の持ち込みの少ない（清澄度の高い）タンパク質溶液が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は以下の発明を包含する：
（Ａ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体内から前記タンパク質を抽出するのに用いる抽出試薬であって、少なくとも終濃度０．３％（ｗ／ｖ）以上の非イオン界面活性剤と終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）の陰イオン界面活性剤とを含む、前記試薬。
【０００９】
（Ｂ）非イオン界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）であり、陰イオン界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムである、請求項１に記載の試薬。
【００１０】
（Ｃ）さらに糖質分解酵素を含む、（Ａ）または（Ｂ）に記載の試薬。
【００１１】
（Ｄ）さらに核酸分解酵素を含む、（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載の試薬。
【００１２】
（Ｅ）タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質である、（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載の試薬。
【００１３】
（Ｆ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養する工程と、培養した前記形質転換体に、少なくとも終濃度０．３％（ｗ／ｖ）以上の非イオン界面活性剤と終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）の陰イオン界面活性剤とを含む抽出試薬を用いて、前記形質転換体内から前記タンパク質を抽出させる工程とを含む、タンパク質の製造方法。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明の抽出試薬は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の細胞壁を溶かすことで、当該形質転換体内に発現した前記タンパク質を機械的な破砕処理をせずに抽出可能な試薬であり、少なくとも非イオン界面活性剤と陰イオン界面活性剤とを含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明の抽出試薬に含まれる非イオン界面活性剤は、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（商品名）、Ｂｒｉｊ  ５８（商品名）、Ｂｒｉｊ  ３５（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商品名）、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミン−Ｎ−オキシド、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド、スクロースモノドデカン酸、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド等があげられる。
【００１７】
本発明の抽出試薬に含まれる陰イオン界面活性剤も、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、コール酸、デオキシコール酸、グリコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸およびそれらの塩等があげられる。
【００１８】
本発明の抽出試薬に含まれる界面活性剤の濃度は、非イオン界面活性剤は終濃度０．３％（ｗ／ｖ）以上であればよく、陰イオン界面活性剤は終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲であればよい。前述した濃度の範囲であれば、細胞破砕物などの培養液中の夾雑物の性質や濃度、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度などを考慮し、界面活性剤の濃度を適宜設定すればよい。
【００１９】
なお本発明の抽出試薬に糖質分解酵素をさらに含むと、形質転換体（大腸菌）の溶菌が促進されるため好ましい。本発明の抽出試薬に含んでもよい糖質分解酵素としては、膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼおよびそれらの塩等があげられる。糖質分解酵素の濃度については、細胞破砕物などの培養液中の夾雑物の性質や濃度などを考慮し、適宜設定すればよい。一例として、糖質分解酵素としてリゾチームを用いる場合は、終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．００１％（ｗ／ｖ）の範囲に設定するとよい。
【００２０】
本発明の抽出試薬には、前述した成分以外の成分を含んでもよく、特にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）等のエンドヌクレアーゼ（核酸分解酵素）をさらに含むと、形質転換体内から、前述した界面活性剤によりタンパク質とともに抽出される、核酸による粘度上昇が抑制できるため好ましい。なお、本発明の抽出試薬に核酸分解酵素をさらに含ませる場合、助剤として２ｍＭ程度の硫酸マグネシウムを含むとよい。
【００２１】
核酸分解酵素以外で、本発明の抽出試薬にさらに含んでもよい成分としては、緩衝液成分、塩類があげられる。緩衝液成分としては、濃度１０ｍＭから１００ｍＭ程度の酢酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、コラミン−ＨＣｌ緩衝液、ＢＥＳ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アセトアミドグリシン緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、グリシンアミド緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液等があげられる。一例として抽出するタンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、濃度２０ｍＭから５０ｍＭ、ｐＨ６．０から８．０のリン酸緩衝液またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液が好ましく、濃度５０ｍＭ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液がもっとも好ましい。塩類としては、終濃度１０ｍＭから１０００ｍＭの硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、塩化物等があげられる。一例として抽出するタンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、終濃度５０ｍＭから８００ｍＭの塩化ナトリウムおよび終濃度５０ｍＭから８００ｍＭの塩化カルシウムが好ましく、終濃度６００ｍＭから７００ｍＭの塩化ナトリウムおよび終濃度４０ｍＭから６０ｍＭの塩化カルシウムがもっとも好ましい。
【００２２】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体から、本発明の抽出試薬を用いて前記形質転換体内から前記抗体結合性タンパク質を抽出する際、前記タンパク質が失活せず、さらに追加で添加する酵素（糖質分解酵素や核酸分解酵素）が活性を示すｐＨ（具体的には、ｐＨ５．０から７．０）条件下で抽出操作を行なうと、タンパク質抽出の効率が向上するため好ましい。一例として抽出する抗体結合性タンパク質がヒトＦｃ結合性タンパク質の場合、ｐＨ５．５からｐＨ６．５の条件下で抽出操作を行なうと好ましい。
【００２３】
本発明の抽出試薬を用いて形質転換体内のタンパク質を抽出した後は、当該技術分野における公知の方法を用いて抽出残渣（細胞破砕物など）を除去する精製操作を行なうことで、純度の高いタンパク質溶液が得られる。前記精製操作の一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、純度の高いタンパク質溶液を調製することができる。
【００２４】
なお液体クロマトグラフィーを用いた精製操作を行なう際、抽出工程で得られたタンパク質溶液の濁度が高い（すなわち清澄度が低い）と、クロマトグラフィーにおけるタンパク質の分離能が悪くなったり、カラム性能の再現性が低下するなどの問題が生じるため、抽出工程で得られたタンパク質溶液の清澄度は高いほど好ましい。そのため、あらかじめ遠心やろ過によりタンパク質溶液の清澄度を高めた上でクロマトグラフィーを用いた精製操作を行なうとよい。遠心によりタンパク質溶液の清澄度を高める方法としては、専用ボトルを用いたバッチ式の遠心や、円筒式型、分離版式型などの連続式の遠心がある。ろ過によりタンパク質溶液の清澄度を高める方法としては、ＭＦ膜（精密ろ過膜）やＵＦ膜（限外ろ過膜）を用いた方法や、ろ過助剤を併用した加圧ろ過による方法があげられる。ろ過に用いる膜の種類（材質、ポアサイズ、分画分子量など）は、不溶物を効率よく除去できるものであれば特に限定はない。
【００２５】
本発明の製造方法で得られたタンパク質の分析方法は、培養液、抽出液等から安定的にかつ効率的に定量できる方法であれば特に限定はなく、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）やウェスタンブロット法などがあげられる。
【００２６】
本発明の抽出試薬を用いて抽出するタンパク質は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られた形質転換体の菌体内に発現するタンパク質であれば特に限定されない。以降、ここでは前記タンパク質の一例である、ヒトＦｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。
【００２７】
本明細書におけるヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）を構成するタンパク質（図１参照）、またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）（図２参照）を構成するタンパク質があげられる。なお必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。本明細書におけるヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号２７に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質や、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。
【００２８】
前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報や特開２０１４−０２７９１６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。
【００２９】
また前記（ｉｖ）の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１４−１６６８８３号）があげられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
また前記（ｉｖ）の別の具体例としては、配列番号２８に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（４１）から（１０４）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１４−２６３４０７号）があげられる。
（４１）配列番号２８の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（４２）配列番号２８の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（４３）配列番号２８の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４４）配列番号２８の６７番目のチロシンがセリンに置換
（４５）配列番号２８の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（４６）配列番号２８の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（４７）配列番号２８の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４８）配列番号２８の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号２８の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（５０）配列番号２８の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（５１）配列番号２８の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（５２）配列番号２８の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（５３）配列番号２８の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（５４）配列番号２８の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（５５）配列番号２８の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（５６）配列番号２８の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（５７）配列番号２８の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
（５８）配列番号２８の３４番目のメチオニンがイソロイシン、リジン、スレオニンのいずれかに置換
（５９）配列番号２８の３７番目のグルタミン酸がグリシンまたはリジンに置換
（６０）配列番号２８の３９番目のロイシンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（６１）配列番号２８の４９番目のグルタミンがプロリンに置換
（６２）配列番号２８の６２番目のリジンがイソロイシンまたはグルタミン酸に置換
（６３）配列番号２８の６４番目のグルタミンがトリプトファンに置換
（６４）配列番号２８の６７番目のチロシンがヒスチジンまたはアスパラギンに置換
（６５）配列番号２８の７０番目のグルタミン酸がグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（６６）配列番号２８の７２番目のアスパラギンがセリンまたはイソロイシンに置換
（６７）配列番号２８の７７番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（６８）配列番号２８の８０番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（６９）配列番号２８の８１番目のセリンがアルギニンに置換
（７０）配列番号２８の８３番目のイソロイシンがロイシンに置換
（７１）配列番号２８の８４番目のセリンがプロリンに置換
（７２）配列番号２８の８５番目のセリンがアスパラギンに置換
（７３）配列番号２８の８７番目のアラニンがスレオニンに置換
（７４）配列番号２８の９０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（７５）配列番号２８の９１番目のフェニルアラニンがアルギニンに置換
（７６）配列番号２８の９３番目のアスパラギン酸がバリンまたはグルタミン酸に置換
（７７）配列番号２８の９４番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（７８）配列番号２８の９７番目のバリンがメチオニンとグルタミン酸に置換
（７９）配列番号２８の９８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換
（８０）配列番号２８の１０２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８１）配列番号２８の１０６番目のグルタミンがロイシンに置換
（８２）配列番号２８の１０９番目のロイシンがグルタミンに置換
（８３）配列番号２８の１１７番目のグルタミンがロイシンに置換
（８４）配列番号２８の１１９番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８５）配列番号２８の１２１番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（８６）配列番号２８の１３０番目のプロリンがロイシンに置換
（８７）配列番号２８の１３５番目のリジンがチロシンに置換
（８８）配列番号２８の１３６番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８９）配列番号２８の１４１番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（９０）配列番号２８の１４６番目のセリンがスレオニンに置換
（９１）配列番号２８の１５４番目のリジンがアルギニンに置換
（９２）配列番号２８の１５９番目のグルタミンがヒスチジンに置換
（９３）配列番号２８の１６３番目のグリシンがバリンに置換
（９４）配列番号２８の１６５番目のリジンがメチオニンに置換
（９５）配列番号２８の１６７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（９６）配列番号２８の１６９番目のヒスチジンがチロシンに置換
（９７）配列番号２８の１７４番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（９８）配列番号２８の１７７番目のリジンがアルギニンに置換
（９９）配列番号２８の１８５番目のセリンがグリシンに置換
（１００）配列番号２８の１９４番目のセリンがアルギニンに置換
（１０１）配列番号２８の１９６番目のアスパラギンがリジンに置換
（１０２）配列番号２８の２０１番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０３）配列番号２８の２０３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはリジンに置換
（１０４）配列番号２８の２０７番目のスレオニンがアラニンに置換
【発明の効果】
【００３０】
本発明の抽出試薬は、少なくとも終濃度０．３％（ｗ／ｖ）以上の非イオン界面活性剤と終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）の陰イオン界面活性剤とを含むことを特徴としている。本発明の抽出試薬により、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体内に発現した前記タンパク質を効率的に抽出することができる。
【００３１】
また本発明の抽出試薬を用いたタンパク質の抽出方法は、物理的破砕による方法や市販の抽出試薬を用いた方法と比較し、安価かつ効率的に前記タンパク質を抽出可能であることから、組換えタンパク質の工業的な製造において有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ヒトＦｃγＲＩの概略図である。
【図２】ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。
【図３】本発明の抽出試薬を用いたとき（実施例２）と、用いなかったとき（比較例１）とで、形質転換体からの組換えＦｃ結合性タンパク質の抽出効率を比較した結果を示す図である。
【実施例】
【００３３】
以下、タンパク質としてヒトＦｃ結合性タンパク質を用いたときの実施例および比較例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１  ヒトＦｃγＲＩＩＩａ発現ベクターの作製
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸配列のうち、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９２番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換したヌクレオチド配列を設計した。設計したヌクレオチド配列を配列番号２に示す。
（２）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチドを作製するために、配列番号３から２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、前記オリゴヌクレオチドを用いて、下記に示す二段階ＰＣＲを行なった。
（２−１）一段階目のＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を１０サイクル繰り返すことでポリヌクレオチドを合成し、これをＦｃＲｐ１とした。なお表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号３から２０に記載の配列からなる１８種類のオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液を意味する。
【００３５】
【表１】
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（２−２）二段階目のＰＣＲは、（２−１）で合成したＦｃＲｐ１を鋳型とし、配列番号２１（５’−ＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣ−３’）および配列番号２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして実施した。具体的には、表２に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を９８℃で５分熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６２℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。
【００３６】
【表２】
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（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３を抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３のうち、ヒトＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２３（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号２４（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００３７】
発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲ３で発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２６に、それぞれ示す。なお配列番号２５において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域）であり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。
【００３８】
実施例２
（１）実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、特開２０１４−２２３０６４号公報にて開示した方法にて発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ３Ｔ８−Ｒ１を作製し、当該発現ベクターを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換して組換え大腸菌を得た。当該組換え大腸菌を特開２０１３−０８５５３１号公報に記載の方法を参考にして培養し、得られた培養液から遠心分離により大腸菌菌体（湿潤菌体）を得た。
（２）（１）で得られた湿潤菌体（２５０ｇ）を１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁させ、均一になるまで室温（２０℃から２５℃）にて撹拌後、ＮａＣｌを終濃度４０ｍＭとなるよう添加し、さらに室温で撹拌した。
（３）（２）で得られた菌体懸濁液に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）水溶液を終濃度０．５（ｗ／ｖ）％となるよう添加した後、さらにリゾチーム塩酸塩を終濃度０．０００５（ｗ／ｖ）％となるように、デオキシコール酸ナトリウム水溶液を終濃度０．００１（ｗ／ｖ）％となるように、それぞれ添加し、室温で撹拌することで、ヒトＦｃ結合性タンパク質を抽出した。
（４）核酸分解酵素（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ、メルク社製）を終濃度２５０ｕｎｉｔ／Ｌとなるよう添加し、助剤として硫酸マグネシウムを終濃度２ｍＭとなるよう添加後、室温で撹拌することで、（３）で添加した界面活性剤により菌体内から抽出される核酸による粘度上昇を抑制した。
（５）一晩抽出操作を行なったのち、（４）の抽出液を遠心分離し（８５００ｒｐｍ、３０分）、上清（無細胞抽出液）を得た。得られた上清の清澄度を６００ｎｍの吸光度から求めたところ、６００ｎｍの吸光度は１．０であった。なお遠心分離前の清澄度（濁度）は６００ｎｍの吸光度で６２．９である。
【００３９】
比較例１
実施例２（３）に記載のヒトＦｃ結合性タンパク質の抽出を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）水溶液を終濃度０．５（ｗ／ｖ）％となるよう菌体懸濁液に添加した後、さらにリゾチーム塩酸塩を終濃度０．００５（ｗ／ｖ）％となるように添加し、室温で撹拌することで、抽出した他は、実施例２と同様の方法でヒトＦｃ結合性タンパク質を含む無細胞抽出液を得た。得られた上清の清澄度を６００ｎｍの吸光度から求めたところ、６００ｎｍの吸光度は１．７と、本発明の抽出試薬で抽出したとき（実施例２）と比較し、清澄度は低下していた。なお遠心分離前の清澄度（濁度）は６００ｎｍの吸光度で３１．９である。
【００４０】
実施例３
実施例２および比較例１で得られた無細胞抽出液に含まれるヒトＦｃ結合性タンパク質の量（すなわち組換え体からのヒトＦｃ結合性タンパク質抽出量）を以下に示したＥＬＩＳＡ法にて、ヒトＦｃ結合性タンパク質以外の夾雑タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて、それぞれ測定した。
（１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定した（４℃で１８時間）。
（２）固定化終了後、洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（商品名）と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄し、０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）によりブロッキングした。
（３）洗浄緩衝液にて洗浄後、調製したタンパク質抽出液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（４）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ａｎｔｉ−ｈＦｃγＲＩＩＩＡ／Ｂ（ＣＤ１６ａ／ｂ）抗体試薬（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を添加した（３０℃で１時間）。
（５）反応終了後、洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＧｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ｈ＋ＩＨＲＰ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（６）３０℃で１時間反応後、洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定し、ヒトＦｃ結合性タンパク質量を求めた。
【００４１】
結果を図３に示す。本発明の抽出試薬を用いたとき（実施例２）のＦｃ結合性タンパク質の抽出量は、界面活性剤として非イオン界面活性剤のみを用いたとき（比較例１）の抽出量の８２％と、大きな低下はみられなかった。このことから、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを大腸菌で形質転換して得られる形質転換体を培養し、当該培養した形質転換体から前記タンパク質を抽出する際に、終濃度０．３％（ｗ／ｖ）以上の非イオン界面活性剤と終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）から０．０１％（ｗ／ｖ）の陰イオン界面活性剤とを含む抽出試薬で抽出することで、抽出量を大きく減らすことなく、清澄度の高い前記タンパク質の抽出液を調製できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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