(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチャンバー本体３００と、前記マイクロチャンバー本体３００の上側面３０３に提供されたマイクロチャンバー本体密閉部５００と、を含み、前記マイクロチャンバー本体密閉部５００には試料注入部８００が形成されており、生物学的物質分析のための特異成分が内蔵できるマイクロチャンバーホール３０１が形成されているマイクロチャンバープレートにおいて、
流動性フィルム２００が、前記マイクロチャンバー本体３００の上側面３０３とマイクロチャンバーホールの側面３０２とに付着され、マイクロチャンバー本体の上側面３０３でマイクロチャンバーホールの側面３０２を経て、マイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５まで延びて円柱型または半球型の光学測定部を形成しており、
ここで、前記流動性フィルム２００は、遠心力による加圧、または真空及び遠心力による加圧によって試料を供給する場合、垂れる現象が発生して、円柱型または半球型の光学測定部を形成して、試料注入部８００から試料が供給されることが可能となり、そして、遠心力による加圧、または真空及び遠心力による加圧を解除する場合に、垂れる現象が緩和されて余分の試料またはマイクロチャンバーホール３０１内に含まれている残存気泡７０１が、試料注入部８００を介してマイクロチャンバーホールの外部に流出することを特徴とする前記マイクロチャンバープレート。
【請求項２】
マイクロチャンバー本体の上側面３０３に流動性フィルム２００を付着させて、ブロー成形した後、マイクロチャンバー本体密閉部５００をマイクロチャンバー本体の上側面３０３に密着させて製造されたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項３】
前記流動性フィルム２００は、加熱、真空もしくは加圧、または加熱、真空及び加圧によってマイクロチャンバー本体３００に付着していることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項４】
流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体３００との間にまたは流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体密閉部５００との間に、密着のための接着フィルム１００が追加的に含まれることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項５】
前記流動性フィルム２００は、光学測定のための透明性を持つことを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項６】
前記流動性フィルム２００は、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、延伸または非延伸されたポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ及びこれらのコポリマー中から選択された材質からなることを特徴とする請求項５に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項７】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００には、各マイクロチャンバーホール３０１当たり一つ以上の試料注入部８００が形成されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項８】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、金属または高分子フィルムからなることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項９】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、気孔の大きさ０．２〜５．０μｍの多孔性膜材質からなることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１０】
前記各試料注入部８００は、各マイクロチャンバーホール全体面積対比０．０５％〜６０％の面積を持つことを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１１】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、流動性フィルム２００に熱融着、レーザ融着及び接合剤コーティングから選択された一つ以上の方法を介して付着していることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１２】
前記マイクロチャンバー本体３００の表面は、ポリエステル系高分子樹脂及びポリエチレン系ホットメルト接着剤の中から選択された一つ以上の物質によってコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロチャンバープレート。
【請求項１３】
（ａ）マイクロチャンバー本体の上側面３０３に流動性フィルム２００を付着させる段階と、
（ｂ）ブロー成形を介して各マイクロチャンバーホールの側面３０２と流動性フィルム２００を付着させると同時にマイクロチャンバーホールの下側面３０５に流動性フィルム２００を円柱型または半球型の形態で形成して、マイクロチャンバーホール３０１を形成する段階と、
（ｃ）マイクロチャンバー本体の上側面３０３の流動性フィルム２００と、試料注入部８００が形成されているマイクロチャンバー本体密閉部５００を融着させる段階と、を含むことを特徴とするマイクロチャンバープレートの製造方法であって、
ここで、前記流動性フィルム２００は、遠心力による加圧、または真空及び遠心力による加圧によって試料を供給する場合、垂れる現象が発生して、円柱型または半球型の光学測定部を形成して、試料注入部８００から試料が供給されることが可能となり、そして、遠心力による加圧、または真空及び遠心力による加圧を解除する場合に、垂れる現象が緩和されて余分の試料またはマイクロチャンバーホール３０１内に含まれている残存気泡７０１が、試料注入部８００を介してマイクロチャンバーホールの外部に流出することを特徴とする前記製造方法。
【請求項１４】
前記（ｂ）段階と（ｃ）段階との間に、（ｂ’）各マイクロチャンバーホール３０１に生物学的物質分析のための特異成分４００を注入する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項１５】
前記（ｂ）段階のブロー成形は、１００〜３００℃の温度で行われることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項１６】
前記（ａ）段階での流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体３００との間にまたは流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体密閉部５００との間に、密着のための接着フィルム１００が追加的に含まれることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項１７】
前記流動性フィルム２００は、光学測定のための透明性を持つことを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項１８】
前記流動性フィルム２００は、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、延伸または非延伸されたポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ及びこれらのコポリマー中から選択された材質からなることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項１９】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００には、各マイクロチャンバーホール３０１当たり一つ以上の試料注入部８００が形成されていることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２０】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、金属または高分子フィルムからなることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２１】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、気孔の大きさ０．２〜５．０μｍの多孔性膜材質からなることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２２】
前記各試料注入部８００は、各マイクロチャンバーホール全体面積対比０．０５％〜６０％の面積を持つことを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２３】
前記（ｃ）段階での前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、流動性フィルム２００に熱融着、超音波融着及び接合剤コーティングから選択された一つ以上の方法を介して付着していることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２４】
前記マイクロチャンバー本体３００の表面は、ポリエステル系高分子樹脂及びポリエチレン系ホットメルト接着剤の中から選択された一つ以上の物質によってコーティングされていることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２５】
前記（ｃ）段階後に、（ｄ）試料７００注入段階及び（ｅ）試料注入部８００密封段階をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【請求項２６】
試料注入部８００の密封は、高分子フィルム、オイル、シリコン、パラフィン及び接着剤からなる群で選択される一つ以上の物質を利用して行われることを特徴とする請求項２５に記載のマイクロチャンバープレートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチャンバープレートに関し、より詳細には流動性フィルムを利用してマイクロチャンバーホールを形成することによって、真空及び／または遠心力を利用して試料を注入する時より円滑に試料供給が可能であるだけでなく、マイクロチャンバーホールに含まれている残存気泡及び余分の試料などが効率よく排出できて、より正確かつ効率的な分析及び反応が可能なマイクロチャンバープレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロチャンバーとは、数マイクロリットル以下の微細な反応が起きる容器であって、シリコンウェハー、ガラス、金属、セラミックまたはプラスチックなどで形成され、前記マイクロチャンバープレートとは、前記マイクロチャンバーが２次元的に配列されてなるプレートであって、一般に一側面は試料が注入されて密封できる構造からなる。
【０００３】
一方、遺伝子の量を測定する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行いながらリアルタイムで遺伝子の量に比例して増加する蛍光値を測定できるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）法が開発された。
【０００４】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法は、ポリメラーゼ連鎖反応を行うにつれポリメラーゼ連鎖反応産物から発生する蛍光値を各サイクル毎に測定して、一定量以上の蛍光値が発生するサイクルを確認することによって、試料の特定遺伝子初期濃度を定量的に分析することができる。
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法は、前記ポリメラーゼ連鎖反応後に電気泳動過程を必要とせず、ポリメラーゼ連鎖反応を行うと同時に反応した産物を定量的に測定して試料内部の各々の特定塩基配列を持つ遺伝子の濃度を１０９以上の範囲で決定できる利点がある（“Ａ−Ｚ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ”  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．Ｂｕｓｔｉｎ  ２００４−２００６  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，“Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ”  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｔｅｖｆｉｋ  Ｄｏｒａｋ  ２００６  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ）。
【０００５】
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法を行うリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器は様々な形態が提案されており、多数の試料を分析できるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器として標準９６ウェル（ｗｅｌｌ）または３８４ウェルプレートを用いて９６個または３８４個の遺伝子を分析できる機器が提案された（Ｒｏｃｈｅ社のＬｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ  ４８０、ＡＢＩ７５００、７９００）。
【０００６】
前記Ｒｏｃｈｅ社のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応機器は、反応試料の量が１０〜５０μＬのもので、比較的大量の試料が必要とされ、多数の遺伝子を分析できない問題点がある。
【０００７】
前記問題点を解決するためにＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を利用して反応試料の量を減らすことによって早期に多くの試料を同時に分析するための様々な方法が提示されて、これによりマイクロチャンバーアレイプレートを利用した方法も提案された。
【０００８】
マイクロチャンバーアレイプレートを用いる方法は、大きく前記マイクロチャンバーに反応試料を注入する段階、マイクロチャンバー間の反応溶液を密封させる段階、反応及び分析段階の３段階で構成でき、第一に個別的に前記マイクロチャンバーに試料溶液を加える方法として、透明な細胞培養用マイクロチャンバープレートに反透過性膜を覆ってマイクロチャンバーを隔離させて各々のマイクロチャンバーに一つの細胞を培養して培養液を除去した後、タックマン（Ｔａｑｍａｎ）反応溶液を加えて蒸発防止のために透明オイルで密封して温度サイクリングをしながらプレートの底で蛍光値を測定するマイクロチャンバーアレイプレートが提案された（ＹＡＳＵＤＡ，Ｋｅｎｊｉ  ＥＰ１，５４１，６７８Ａ１，ＪＰ２００２２４５９００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｈｉｐ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）。前記方式は各々のマイクロチャンバーにそれぞれ異なる溶液をマイクロピペットで吸入して加えなければならないので、時間が多くかかり、特に、１，５３６個以上のマイクロチャンバーに試料を注入するために微細自動分注機を使用しなければならず、各々異なる溶液を加える前に洗浄する過程に多くの時間がかかって、現実的に３８４プレート以上は使用が難しい問題点がある。
【０００９】
第二に、第一の方法を解決するためにシリコンウェハーをフォトリソグラフィと化学エッチング方式でマイクロチャンバーアレイを構成した反応機がＥ．Ｔａｍｉｙａ教授グルプのＨｉｄｅｎｏｒｉ  Ｎａｇａｉ等によって提示された（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１７３，１０４３−１０４７，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  ＰＣＲ）。
【００１０】
前記反応機は、ポリメラーゼ連鎖反応溶液の蒸発を防止するために、顕微鏡スライドカバーグラスを利用したが、前記カバーグラスを覆う時と引き離す時の反応液の交差汚染が誘発されるにつれ撥水性膜をカバーグラスとウェハーとの間に挟んで先に前記カバーグラスを除去した後反応溶液を乾燥させた後に撥水性膜を除去して分析しなければならない煩わしさがあって、リアルタイム遺伝子定量増幅に用いることはできない問題点があった。
【００１１】
第三に、定量増幅問題点を解決するために同研究室でＹ．Ｍａｔｓｕｂａｒａ等は、ウェハー上の窪んだマイクロチャンバーに各々のプライマーをマイクロアレイ装備を利用して加えた後乾燥させたマイクロチャンバーアレイを開発した（７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ５−９，２００３，Ｓｑｕａｗ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）。
【００１２】
前記マイクロチャンバーアレイは、チップの上部にミネラルオイルを加えてマイクロチャンバーを完全に覆った後そこにポリメラーゼ連鎖反応液をナノジェット分注機を利用して反応機のミネラルオイルの上で点滴する方法を用いた。この方法は、１インチ×３インチのシリコンウェハーをフォトリソグラフィと化学エッチング方式で５０ナノリットルの体積（０．６５×０．６５×０．２ｍｍ）を持つ１，２４８個のマイクロチャンバーアレイチップを製造した後、マイクロチャンバーにプライマーとタックマン（Ｔａｑｍａｎ）プローブ溶液をナノリットル分注機で点滴してこれを乾燥させて、全体をミネラルオイルでコーティングして各々のマイクロチャンバーを隔離密封した。
【００１３】
前記三番目の方法を利用して製造されたマイクロチャンバーアレイは、ナノリットル分注機を利用してＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素と試料ＤＮＡの混合液をミネラルオイルの上層部で噴射して各々のマイクロチャンバーに分注することでマイクロチャンバーで各々の反応成分が交差汚染なしにポリメラーゼ連鎖反応を行うことができる長所がある。
【００１４】
しかし、前記方法は溶液を注入する際に別のマイクロアレイ用ナノリットル分注装備が必要で、分注をするための時間が長くかかり、プレート移動時にミネラルオイルの流動で反応液相互間の交差汚染の危険性が高い問題点がある。また、温度サイクリング反応時高温でバブルが発生してオイルと水溶液の疏水性効果によって水溶液が球状になってレンズ効果を起こすにつれ光学測定時励起光と発光が散乱、分散して測定誤差を大きくする問題点がある。
【００１５】
第四に、前記三番目のような化学的なエッチング方式によって製造されたマイクロチャンバーであるが前記三番目の方式よりはるかに多数の反応をさせることができるものとしてｐｉｃｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅが開発された（Ｊｏｈｎ  Ｈ．Ｌｅａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｐｉｃｏ−ｌｉｔｅｒ−ｓｃａｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２００３，２４，３７６９−３７７７）。
【００１６】
前記四番目の方式は３９．５ｐｌの量で３００，０００個の独立的なポリメラーゼ連鎖反応をさせることができる形態があるが、プライマー／プローブを固定化した担体がなければならないので、均一な光学特性が求められるリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応に適用されることはできない。
【００１７】
第五目に、微量試料を反応させるために米国特許第５９４８６７３号には、‘フィルム反応機（またはＤＮＡカード）’という反応機が提示された。
【００１８】
前記フィルム反応機は３層の非常に薄いフィルムとなっており、具体的に、下層フィルムは、反応機の底面を形成して、中層フィルムは、反応機の側面を形成して、上層フィルムは、試料注入口を形成する。
【００１９】
前記フィルム反応機にピペットを介して微量試料溶液を注入した後、反応のためには反応注入口を完全に密封しなければならないが、完全に密封できない場合、ポリメラーゼ連鎖反応時反応溶液が全て蒸発される問題点があって、前記フィルム反応機は、数千個の試料を扱うためには、構造的に複雑になりすぎるため現実的に製造が不可能である。
【００２０】
第六に、標準ＥＬＩＳＡプレートの大きさで１，５３６蛍光分析反応を行うことができる反応プレートがＷＯ０２／４０１５８とＵＳ６，２３２，１１４に開示された。
【００２１】
前記六番目の方法は、プレートに多数の貫通した穴を形成して、蛍光量が少ない透明なフィルムを密着して多数の反応容器を形成して、ここに試料を入れた後、透明フィルムで密封して反応を行う容器を利用する方法である。前記反応プレートは、上面及び下面が透明に形成されて、一側面で励起光を加えて他則で蛍光を測定できる長所がある。
【００２２】
しかし、前記六番目の方法も、多数の遺伝子を分析するためには、各々のマイクロチャンバー毎に各々異なるプライマーとプローブが入るべきであり、多数の試料を分析するプレートは、数千個の異なる溶液を微細なマイクロチャンバーに入れなければならないので、このために従来のナノリットル分注機のような特殊な分注装備が必要で、多くの時間がかかる作業であり、かつ試料注入時不良が発生する問題点をそのままにすることになる。
【００２３】
また、マイクロチャンバー内に溶液を完全に満たすことはできない問題によって、気泡ができて加温される場合、マイクロチャンバーの上部に水蒸気が水滴になって散乱により光学測定を邪魔する問題点もある。
【００２４】
第七に、一側面に試料注入のための多孔性膜が形成されて、他則面に光学測定部が形成されたマイクロチャンバープレートを利用した反応プレートを本発明者等がＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００５６３５）している。
【００２５】
前記七番目の方法は、プレートに多数の貫通した穴を形成して、一側面に蛍光量が少ない透明なフィルムを密着して多数の反応容器を形成して、ここに試料を入れた後、他則面に試料溶液注入が可能な多孔性膜で密封して反応を行う容器を利用する方法である。前記反応プレートは、多孔性膜を介して試料溶液注入後、注入面にミネラルオイルを点滴して密封して、他則面に形成された光学測定部で励起光印可及び測定する方法である。
【００２６】
しかし、前記七番目の方法は、注入部と光学測定部が別に形成されていて構造が複雑で、注入部に形成されたミネラルオイル層が透明になって、底面のしみ具合により測定結果に偏差が生じる問題があり得る。また、反応及び測定のためにミネラルオイル点滴された注入部が下側に向かうことがあるが、この時試料に比べて相対的に密度が低いミネラルオイルがマイクロチャンバー内部に流入して散乱を誘発する問題点もある。
【００２７】
最近、本出願の発明者等によってマイクロチャンバー内部の溶液蒸発を防止して、試料注入を円滑にすることによって、試料注入に要する時間を画期的に短縮できるだけでなく、マイクロチャンバーホール間の溶液が混入されないようにすると同時に試料注入部と光学測定部を一体化して簡単な構造を持ちながらも測定正確度を高めることができる新しい構造のマイクロチャンバープレートが開発された（大韓民国特許公開公報第２０１２−００１０１１８号参照）。
【００２８】
しかし前記方法は、注入のための試料を多孔性膜に直接印可する構造となっており、１）真空による試料注入方法を用いる場合；真空印可時試料の沸きを防止するために遠心力を加えが、この時多孔性膜の気孔からの気体の排出が試料の表面張力と遠心力によって邪魔されることになって、２）遠心力によってマイクロチャンバー内の気体が圧着されて体積が縮小されることによって注入過程中に膜から抜け出ることができるほどの浮力を受けることができず小さい気泡形態で残存して大気圧状態の測定条件で再び膨張して測定を邪魔する問題点がある。
【００２９】
しかし、既存のマイクロチャンバープレートはいずれも各マイクロチャンバーホール内に含まれている残存気泡や余分の試料などが除去されにくく、これにより、依然として測定の正確度が低い短所を有している。
【００３０】
そこで、本発明者等は前記問題点を解決するために鋭意努力した結果、流動性フィルムを利用して、マイクロチャンバーホールを形成する場合、試料注入が完了した後、各マイクロチャンバーホール内に含まれている残存気泡と余分の試料が効率よく排出されて、窮極的に測定の正確度が高まる可能性があることを確認して、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明の目的は、流動性フィルムを利用してマイクロチャンバーホールを形成することによって、真空及び／または遠心力を利用して試料を注入する時より円滑に試料供給が可能となるだけでなく、マイクロチャンバーホールに含まれている残存気泡及び余分の試料などが効率よく排出できて、より正確かつ効率的な分析及び反応が可能なマイクロチャンバープレートを提供することにある。
【００３２】
特に、本発明に係るマイクロチャンバープレートは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定温酵素反応またはＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行うに当たり、各マイクロチャンバーホール内に残存され得る気泡を完ぺきに除去することによって、光学測定時の正確度を画期的に高めることができるだけでなく、各マイクロチャンバーホール内の溶液蒸発を防止して、各マイクロチャンバーホール内への試料注入時間を短縮することによって、溶液注入の容易性を高めることができ、各マイクロチャンバー間の溶液混入を完ぺきに遮断することができる長所がある。
【００３３】
また、本発明の他の目的は、前記マイクロプレートの製造方法及びこれを利用した分析方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】流動性フィルムとマイクロチャンバー本体密閉部が付着されて完成されたマイクロチャンバープレートの斜視図。
【図２】マイクロチャンバー本体に流動性フィルムを密着させた後、試料を注入する方法を示した模式図。（Ａ）マイクロチャンバー本体に流動性フィルムが密着した状態を示した図面。（Ｂ）流動性フィルムが密着したマイクロチャンバー本体に加熱、真空または圧力を加えて円柱型光学測定部を形成して、マイクロチャンバーホールが形成された状態を示した図面。（Ｃ）流動性フィルムが密着したマイクロチャンバー本体に加熱、真空または圧力を加えて半球型光学測定部を形成して、マイクロチャンバーホールが形成された状態を示した図面。（Ｄ）前記マイクロチャンバーホールに特異成分が注入された形態を示した図面。（Ｅ）マイクロチャンバー本体の上側面にマイクロチャンバー本体密閉部が融着された態を示した図面。（Ｆ）真空及び／または遠心力でマイクロチャンバーホール内に試料を注入した状態を示した図面（マイクロチャンバーホール内部に気泡が含まれている）。（Ｇ）真空及び／または遠心力が除去された後、流動性フィルムが収縮してマイクロチャンバーホール内気泡が排出されて除去された状態を示した図面。
【図３】マイクロチャンバープレートに流動性フィルムと接着フィルムを密着させた後、試料を注入する方法を示した模式図。（Ａ）マイクロチャンバー本体に流動性フィルムと接着フィルムが密着した状態を示した図面。（Ｂ）流動性フィルムと接着フィルムが密着されたマイクロチャンバー本体に加熱、真空または圧力を加えて円柱型光学測定部を形成して、マイクロチャンバーホールが形成された状態を示した図面。（Ｃ）流動性フィルムと接着フィルムが密着されたマイクロチャンバー本体に加熱、真空または圧力を加えて半球型光学測定部を形成して、マイクロチャンバー内部に容器を形成した図面。（Ｄ）前記マイクロチャンバーホールに特異成分が注入された形態を示した図面。（Ｅ）マイクロチャンバー本体の上側面にマイクロチャンバー本体密閉部が融着された状態を示した図面。（Ｆ）真空及び／または遠心力でマイクロチャンバーホール内に試料を注入した状態を示した図面（マイクロチャンバーホール内部に気泡が含まれている）。（Ｇ）真空及び／または遠心力が除去された後、流動性フィルムが収縮してマイクロチャンバーホール内気泡が排出されて除去された状態を示した図面。
【図４】製作されたマイクロチャンバープレートを内蔵するポリメラーゼ連鎖反応用チャンバー結合体の斜視図。
【図５】製作されたマイクロチャンバープレートを内蔵するポリメラーゼ連鎖反応用チャンバー結合体を示した形状。
【図６】マイクロチャンバー本体密閉部の試料注入部形状の例示を図示したもの。
【図７】マイクロチャンバーホールに試料注入後気泡が排気された現象を比較して示す図面（写真は、約６０倍拡大して撮影した写真で、中央の黒く見える点等は試料注入部の形状）。（Ａ）既存マイクロチャンバープレートを利用した試料注入時気泡がマイクロチャンバーホール内に形成された写真。（Ｂ）本発明のマイクロチャンバープレートを利用した試料注入時マイクロチャンバーホール内に気泡なしに試料が注入された写真。
【図８】本発明のマイクロチャンバープレートを利用したポリメラーゼ連鎖反応結果増幅現象が現れることを示すグラフ。
【図９】本発明のマイクロチャンバープレートを利用したポリメラーゼ連鎖反応結果に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル確認結果。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００３６】
本発明では、マイクロチャンバー本体３００と、前記マイクロチャンバー本体３００の上側面３０３に提供されたマイクロチャンバー本体密閉部５００と、を含み、生物学的物質分析のための特異成分が内蔵できる単位個数のマイクロチャンバーホール３０１が形成されているマイクロチャンバープレートにおいて、マイクロチャンバー本体の下側面３０４の一部または全部、特にマイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５が流動性フィルム２００で構成されていることを特徴とするマイクロチャンバープレートを提供する。
【００３７】
前記流動性フィルム２００は、マイクロチャンバー本体３００に密着すると同時に透明な光学部を形成して、真空及び／または遠心力などの加圧によって試料を注入する場合、遠心力によって流動性を持つ流動性フィルム２００が遠心力が作用する方向に延びることになり（垂れる現象発生）、真空を加えてマイクロチャンバーホール３０１の内部にある空気を排気させて試料が円滑に流入できるようにして、以後真空及び遠心力が除去されると、流動性フィルム２００が元の形状に戻るが（垂れる現象解消）、この時、各マイクロチャンバーホール３０１内に含まれている残存気泡や余分の試料が一緒に試料注入部８００を介して円滑に排出されることができる。
【００３８】
本発明における「流動性フィルム２００」とは、熱を加えたり、減圧または加圧時柔軟性を持ってその形状が自由に変化できる特徴を持つフィルムを意味する。特に、１０〜１０００Ｇ、好ましくは３００〜７００Ｇ、さらに好ましくは４００〜６００Ｇの遠心力が加えられる時、遠心力が作用する方向に延びる、すなわち垂れる現象が発生し得る特性を持つことが好ましい。
【００３９】
前記流動性フィルム２００は、マイクロチャンバー本体の下側面３０４にだけ形成され、マイクロチャンバー本体の下側面３０４とマイクロチャンバー本体の上側面３０３に共に形成されてもよい。特に、前記流動性フィルム２００は、マイクロチャンバー本体の上側面３０３でマイクロチャンバーホールの側面３０２を経て、マイクロチャンバー本体の下側面３０４の一部または全部、特にマイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５にまで延びて形成されていることが好ましい。前記流動性フィルム２００は、マイクロチャンバーの本体に密着されると同時に透明な光学部とマイクロチャンバーホール３０１を形成する役割をする。
【００４０】
具体的に、前記流動性フィルム２００がマイクロチャンバー本体の下側面３０４にだけ形成される場合、マイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５を含むマイクロチャンバー本体の下側面全部に流動性フィルムが形成され、前記流動性フィルム２００がマイクロチャンバー本体上側面３０３でマイクロチャンバーホールの側面３０２を経て、マイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５まで延びて形成される場合、マイクロチャンバー本体の下側面３０４ではマイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５にだけ流動性フィルムが形成されることが好ましい。
【００４１】
前記マイクロチャンバー本体の下側面３０４に流動性フィルム２００を形成させるためには、マイクロチャンバー本体の下側面３０４に流動性フィルム２００をそのまま密着させてもよいが、マイクロチャンバー本体の上側面３０３に流動性フィルム２００を密着させた後、１００〜３００℃、好ましくは１１０〜２７０℃の温度でブロー成形してマイクロチャンバーホールの側面３０２を経て、マイクロチャンバー本体の下側面３０４の一部または全部、特にマイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５にまで延びて形成されるようにすることが好ましい。また、前記ブロー成形時、加圧及び／または真空を追加的に印可することが好ましい。これを通じて、生物学的物質分析のための特異成分、試料などが注入できる流動性フィルム２００からなる内部空間であるマイクロチャンバーホール３０１が形成される。
【００４２】
本発明において、前記流動性フィルム２００の材質は、光学測定が可能になるように透明性を持つものならいずれも制限なしに使用可能であり、好ましくはポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、延伸または非延伸されたポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡからなる群で選択された一つの高分子物質または２以上の物質が含まれたコポリマーの材質からなってもよい。また、前記流動性フィルム２００の厚さは、２００μｍ以下、特に１００μｍ以下のものが好ましいが、これに限定されない。
【００４３】
本発明において、前記流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体密閉部５００との付着を容易にするために、マイクロチャンバー本体密閉部の表面に接着性物質が塗布されたり、流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体密閉部５００との間に接着性能を持つ接着フィルム１００が追加的に導入されてもよく、また、流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体３００との付着を容易にするために、マイクロチャンバー本体の表面に接着性物質が塗布されて接着性コーティング層６００が形成されたり、流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体３００との間に接着性能を持つ接着フィルム１００が追加的に導入されてもよい。
【００４４】
前記接着フィルム１００と接着性物質は、流動性フィルムのように光学測定部を形成することができるように透明な材質からなることが好ましいが、一部光に不透過性、または選択的透過性を持つ物質が使用されても構わない。好ましい接着性物質は、ポリエチレン系フィルム型ホットメルト接着剤が使用でき、接着性フィルムは一例で、ＺＰＭＡ−ｆｉｌｍ００１（Ｐｉｎｇｈｕ  Ｚｈａｎｐｅｎｇ  Ｈｏｔ  Ｍｅｌｔ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｗｅｂ  ＆  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）等の製品が使用されるが、これに限定されない。
【００４５】
本発明における「生物学的物質分析のための特異成分」とは、特定の生物学的物質、例えばタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの定量または定性分析のための成分であって、プライマー、プローブ、抗体、アプタマー、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合酵素などを意味し、特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定温酵素反応またはＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行うために必要な成分を意味する。特に、「核酸分析のための特異成分」とは、ＤＮＡやＲＮＡなどの定量または定性分析のための成分であって、プライマー、プローブ、抗体、アプタマー、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合酵素などを意味する。
【００４６】
本発明における「試料」とは、製造されるマイクロチャンバープレートにより定量または定性分析のための検体が単独で用いられるか、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行うために必要な成分に検体を追加して用いられてもよい。前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行うために必要な成分は、反応用緩衝溶液、ＭｇＣｌ２、４種のｄＮＴＰ、ＤＮＡまたはＲＮＡ重合酵素などが含まれるが、これに限定されず、通常のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のために必要とする成分が制限されず用いられる。また、前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応のホットスタート反応のために、ピロホスフェート、ピロホスファターゼなどが追加的に含まれてもよい。
【００４７】
本発明において、マイクロチャンバー本体密閉部５００は、金属、高分子フィルム、プラスチック、多孔性膜材質などからなってもよいが、これに限定されず、マイクロチャンバー本体３００または流動性フィルム２００に付着されてマイクロチャンバーホール３０１に生物学的物質分析のための特異成分４００または試料７００が含まれるようにする程度の硬度を持ち、マイクロチャンバーホール３０１に含まれる生物学的物質分析のための特異成分４００または試料７００との反応性がない材質の物質であればいずれも制限せず使用可能である。特に、前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、気孔の大きさ０．２〜５．０μｍの多孔性膜材質からなってもよい。好ましくは、前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、アルミニウム、ステンレススチール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ポリスチレン、ナイロン、ポリウレタンなどのフィルム形態であるか、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ナイロン、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦなどの多孔性膜または金属であってもよい。
【００４８】
前記マイクロ本体密閉部５００は、５〜４００μｍ、好ましくは１０〜２００μｍの厚さを持ってもよく、光学測定効率を上げるために光を反射する質または光が反射できるように表面がコーティングまたは改質されたものが好ましい。
【００４９】
また、前記マイクロ本体密閉部５００は、流動性フィルム２００によるマイクロチャンバー本体３００との融着等によってマイクロチャンバーホール３０１の内部に注入された生物学的物質分析のための特異成分または試料が外部に流出するのを防止する目的で使用される。
【００５０】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００には、各マイクロチャンバーホール３０１当たり一つ以上の試料注入部８００が形成されていることが好ましい。各試料注入部８００は、マイクロチャンバーホール３０１の面積により異なるように形成でき、各マイクロチャンバーホール全体面積（マイクロチャンバー本体密閉部５００と接触している方向への上部の面積）対比０．０５％〜６０％の面積を持つことが好ましいが、これに限定されない。本発明において、前記試料注入部８００は、マイクロチャンバー本体密閉部５００が金属である場合、エッチングで加工可能で、高分子フィルムである場合、パンチングで加工可能であるが、これに限定されない。
【００５１】
前記説明した通り、本発明において前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、流動性フィルム２００の上層部に融着されて、マイクロチャンバー密閉部５００と流動性フィルム２００との間に接着性能を持つ接着フィルム１００が追加的に導入されてもよいが、この時接着フィルムは、熱融着、超音波融着、接合剤コーティングなどの方法で導入されてもよい。加熱による融着の場合、１００〜１７０℃、好ましくは１１０〜１６０℃、さらに好ましくは１２０〜１５０℃の温度で加熱で密着が円滑になるようにする。密着後、真空及び／または遠心力などの加圧による試料７００注入が完了した後、試料注入部８００を高分子フィルム、オイル、シリコン、パラフィン及び接着剤からなる群で選択される一つ以上の物質を利用して密封することができる。
【００５２】
本発明においてマイクロチャンバー本体３００は、金属または高分子材質からなることが好ましく、特にＳＵＳ（Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｓｔｅｅｌ）材質からなることが好ましい。特に、マイクロチャンバー本体３００の表面は、流動性フィルム２００との接着力を増大させて、流動性フィルム２００の離脱を防止して、流動性フィルム２００の側面がマイクロチャンバー本体３００に安着するようにして、遠心力による流動性フィルム２００の垂れが遠心力方向にだけ限定されるようにするために、ポリエステル系高分子樹脂及びポリエチレン系ホットメルト接着剤の中から選択された一つ以上の物質によってコーティングされて、接着性コーティング層６００が形成されていることが好ましい。前記マイクロチャンバー本体の表面のコーティングは、スプレー、ディップ、またはローラーなどの当業界に公知された通常の方法を介して実行可能である。
【００５３】
本発明は他の観点で、前記マイクロチャンバープレートの製造方法を提供する。
本発明に係るマイクロチャンバープレートの製造方法は
（ａ）マイクロチャンバー本体の上側面３０３に流動性フィルム２００を付着させる段階と、
（ｂ）ブロー成形を介して各マイクロチャンバーホールの側面３０２と流動性フィルム２００を付着させると同時にマイクロチャンバーホールの下側面３０５に流動性フィルム２００を形成して、マイクロチャンバーホール３０１を形成する段階と、
（ｃ）マイクロチャンバー本体の上側面３０３の流動性フィルム２００とマイクロチャンバー本体密閉部５００を融着させる段階と、を含むことを特徴とする。
前記マイクロチャンバープレートの製造方法において、マイクロチャンバー本体３００、流動性フィルム２００、マイクロチャンバー本体密閉部５００等は、先述したような技術的特徴を持つ。
【００５４】
前記（ｂ）段階と（ｃ）段階との間に、（ｂ’）各マイクロチャンバーホール３０１に生物学的物質分析のための特異成分４００を注入する段階をさらに含んでもよく、前記（ｂ）段階のブロー成形は、１００〜３００℃、好ましくは１１０℃〜２７０℃の温度で行われてもよい。また、前記（ｂ）段階のブロー成形段階で、真空もしくは加圧、または真空及び加圧を加えて、マイクロチャンバーホールを形成させる段階を追加で含んでもよい。また、前記（ｃ）段階後に、（ｄ）試料７００注入段階及び（ｅ）試料注入部８００密封段階；を追加で含んでもよい。
【００５５】
以下、添付図面を参照して本発明の実施例をより詳細に説明する。但し、実施例を説明するに当たり、本発明が属する技術分野に良く知られていて、本発明と直接的に関連がない技術内容についてはできるだけ説明を省略する。これは、不要な説明を省略することによって、本発明の核心を不明瞭にすることなく追加的に明確に伝達するためである。
【実施例】
【００５６】
≪実施例１．マイクロチャンバープレートの製造≫
１．１  マイクロチャンバー本体３００の準備
マイクロチャンバー本体内部に一定空間、すなわちマイクロチャンバーホール３０１が形成されるように一定の厚さのＳＵＳ（Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｓｔｅｅｌ）をエッチングしてマイクロチャンバー本体３００を準備した。マイクロチャンバー本体３００を形成するＳＵＳ（Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｓｔｅｅｌ）の厚さは１ｍｍで、チャンバーホール３０１は径１．２ｍｍ〜１．９ｍｍであり、各々のチャンバーホール３０１は、２．２５ｍｍ間隔で個別プレート当たり最大７６８個まで形成される。チャンバーホール３０１の径及び各々のチャンバーホール３０１の間の間隔は容易に調節が可能である。
【００５７】
１．２  マイクロチャンバー本体３００と流動性フィルム２００の密着
前記流動性フィルム２００は、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート及びポリカーボネートで選択された一つまたは二以上が組み合わされて使用可能で、成形が可能な透明なフィルムはいずれも使用可能である。以下、キャスト流動性フィルム２００としてポリプロピレン（Ｃａｓｔ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）フィルム（韓国、栗村（ユルチョン）化学ＧＣＰ、６０μｍ）を使用した実施例を挙げて説明する。
【００５８】
マイクロチャンバー本体の上側面３０３に流動性フィルム２００を密着させるために、マイクロチャンバー本体３００に液状ホットメルト（（株）エアロケム、４２７Ｔ）をＭＥＫに３〜５ｖｏｌ％で希釈してスプレーコーティングした。液状ホットメルトは、マイクロチャンバー本体から流動性フィルム２００が離脱しないように、マイクロチャンバー本体３００と流動性フィルムを固定させる役割をする。以後、Ｃａｓｔ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ（ＣＰＰ）フィルム（韓国、栗村（ユルチョン）化学（ＧＣＰ、６０μｍ））と接着フィルム（ＺＰＭＡ−ｆｉｌｍ００１，Ｐｉｎｇｈｕ  Ｚｈａｎｐｅｎｇ  Ｈｏｔ  Ｍｅｌｔ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｗｅｂ  ＆  Ｆｉｌｍ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）をマイクロチャンバーが製造可能な大きさで裁断し、ブロー成形用成形機構物にマイクロチャンバー本体、ＣＰＰフィルム、接着フィルム順に積層した。
【００５９】
本発明の流動性フィルム２００は、前記マイクロチャンバー本体の上側面３０３と各マイクロチャンバーホールの側面３０２に密着されて形成されて、マイクロチャンバー本体の上側面３０３からマイクロチャンバー本体の下側面３０４、特にマイクロチャンバーホール３０１の下側面３０５まで連結されて、各々のマイクロチャンバーホール３０１を連結するように形成されて、各々のマイクロチャンバーホールの内部を保護して、各々のマイクロチャンバーホールを分離させて、マイクロチャンバー本体の上側面３０３でマイクロチャンバー密閉部５００の融着を可能にする役割をする。
【００６０】
前記流動性フィルム２００は、透明なフィルムからなり注入部の背面に位置して光学測定部を形成する。前記流動性フィルム２００をなすフィルムの組み合わせは好ましくは、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、延伸及び無延伸のポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡまたはこれらのコポリマーのうちから選択され、これらのフィルムは、真空及び加圧によってマイクロチャンバー本体３００に密着されると同時に透明な光学測定部を形成することによって、マイクロチャンバーホール３０１を形成することができる。
【００６１】
１．３  流動性フィルムを利用したマイクロチャンバーホールの形成
マイクロチャンバー本体に前記実施例１．２のように流動性フィルム２００を付着させた後、１７０〜２７０℃の温度で加熱しながら、真空（−２０ｋＰａ〜−１００ｋＰａ）または加圧（１〜２ｋｇｆ／ｃｍ２）するブロー成形を介してマイクロチャンバーホールの側面３０２とマイクロチャンバーの下側面３０４に流動性フィルム２００を形成した。この時、真空及び加圧印可時にはリーク（ｌｅａｋ）が発生しないように密閉した。ブロー成形が完了後１時間が経過した時、冷水を利用して成形機構物を冷却させて、成形機構物から流動性フィルムが成形されたマイクロチャンバー本体を分離した。マイクロチャンバー本体に成形された流動性フィルムの余分をマイクロチャンバー本体に合うようにカットした。
【００６２】
１．４  マイクロチャンバーホール３０１の内部への特異成分４００の分注
前記マイクロチャンバー本体に形成された各マイクロチャンバーホール３０１の内部に核酸分析のための特異成分４００を各々分注した。前記特異成分４００は、各々のプライマーまたはプローブを含む。特異成分４００の分注は、専用の試料分注機を利用して行われ、反応のために計算された濃度の試料が各マイクロチャンバーホール３０１当たり１〜２μＬずつ同時に分注された。分注された特異成分４００は、マイクロチャンバーホール３０１からの離脱を防止するために、８０〜９０℃のオーブンで５分間乾燥させた。
【００６３】
１．５  マイクロチャンバー本体３００とマイクロチャンバー本体密閉部５００の融着
前記各々異なる特異成分が内蔵されたマイクロチャンバーホール３０１を含むマイクロチャンバー本体３００に試料注入部８００が形成されたマイクロチャンバー本体密閉部５００を付着した。前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、厚さ１０〜２００μｍのアルミニウム、ステンレススチール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ポリスチレン、ナイロン、ポリウレタンなどのフィルム形態であるか、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ナイロン、ＰＴＦＥ、ＰＶＤＦなどの多孔性膜または金属であってもよい。
【００６４】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００が、金属またはフィルムの形態である場合、前記試料注入部８００は、試料注入のための一つ以上の注入ホールを持ち、注入ホールは、各マイクロチャンバーホール面積の０．０５％〜６０％の面積を持つ点または線からなるが、好ましくは図６のような形状である。
【００６５】
前記フィルム形態のマイクロチャンバー本体密閉部５００の場合、試料７００注入及び注入ホールシール時に一部試料７００が流出しても隣接する他のマイクロチャンバーに試料溶液が混入されるのを防止するために、各々のマイクロチャンバーの間を隔離させるパターンが形成されてもよい。
【００６６】
また、前記マイクロチャンバー本体密閉部５００が、多孔性膜である場合、気孔の大きさが、０．２〜５．０μｍである透明または半透明な高分子性多孔性膜であってもよい。本発明では、厚さ５０μｍのステンレススチールをエッチング加工して２００μｍの試料注入部８００を形成させて使用した。前記マイクロチャンバー本体密閉部５００は、前記マイクロチャンバーに形成された流動性フィルム２００の融着面に融着されてマイクロチャンバーの上部を密閉することによって各々の独立したマイクロチャンバーを形成させる。
【００６７】
前記マイクロチャンバー本体密閉部５００の融着は、前記マイクロチャンバー本体３００に既に密着された流動性フィルム２００の素材及び構成により、前記流動性フィルム２００が１種のフィルムからなる場合、接着剤が塗布されて硬化されたり、前記流動性フィルムが２種以上のフィルムの組み合わせからなる場合には、超音波密着によるか、熱によって加熱圧着されてなってもよい。
【００６８】
前記接着剤は、常温硬化型であっても、熱硬化型、反応硬化型などであってもよく、水によって溶出せず熱に安定すると好ましい。
【００６９】
前記超音波密着や熱による密着の場合、マイクロチャンバー本体３００と密着された流動性フィルム２００の変形がなく、かつ流動性フィルム２００の一部が溶融され得る温度であることが好ましい。本発明の場合、１５０℃で５秒以内で加熱圧着したりロールで圧着してマイクロチャンバー本体密閉部５００を融着した。また、実際に超音波密着の場合、付着面で発生した熱がマイクロチャンバーの内部に伝達されないため、温度と関係なく行うことができる。
【００７０】
好ましくはマイクロチャンバー本体密閉部５００を融着した後、完全な安置のために冷却及び後圧着工程がさらに行われてもよい。
【００７１】
≪実施例２．試料注入部を介した試料の注入≫
マイクロチャンバー本体密閉部５００に形成された試料注入部８００を介して試料を各マイクロチャンバーホール３０１に真空注入する過程を詳細に説明する。この時用いられる試料は、各マイクロチャンバーホール３０１毎に異なってもよく、一部または全部のマイクロチャンバーホールに同じ試料が注入されてもよい。
【００７２】
前記マイクロチャンバーホール３０１の内部に試料７００を注入する際に、真空及び遠心力を利用してマイクロチャンバーホール３０１の内部の空気をまず除去した後、試料７００が接触されるようにしてマイクロチャンバーホール３０１の内部の空気を円滑に除去することができるようにして、これにより試料７００が気泡なしに完全に注入されるようにする。
【００７３】
しかし、マイクロチャンバーホール３０１の内部の空気を除去したとしても長時間真空状態を維持する場合、試料７００の蒸発が発生する可能性があって、十分な真空印可にならない場合には残留する気泡を完全に除去するには限界がある。
【００７４】
したがって本発明では、遠心力によって流動できる流動性フィルム２００を形成して、十分な試料供給を可能にすることによって、試料７００の完ぺきな注入を可能にする。
【００７５】
前記流動性フィルム２００は、遠心力によって垂れが発生する可能性があって、それによって内容積が増加して試料注入部８００から十分な試料７００の供給を可能にして、遠心力解除時垂れが緩和されて余分の試料がマイクロチャンバーホール３０１の外部に再び排出されると同時にマイクロチャンバーホール３０１の内部に残存し得る気泡７０１が試料注入部８００を介してマイクロチャンバーホール３０１の外部に完全に抜け出るようにすることによって、完ぺきな試料注入を可能にする。
【００７６】
本発明では５０Ｇ以下の遠心力で１分３０秒以内に真空を印可した後、真空状態を維持して４５０Ｇ以上で試料７００の注入が行われるようにした。前記遠心力は、前記流動性フィルム２００の垂れが発生し得る十分な遠心力であることが好ましく、本発明では４５０Ｇ以上で十分に流動性フィルム２００の垂れが発生するようにした。
【００７７】
試料注入が完了した後、マイクロチャンバー本体密閉部５００に形成されている試料注入部８００を介した試料７００の流出を防ぐために、試料注入部８００をシールした。好ましくは高分子性フィルム、オイル、シリコン、パラフィン、接着剤などによってシールでき、好ましくは高分子性フィルムを付着して注入部８００をシールした。
【００７８】
本発明では、試料としてＨＢＶ  Ｋｉｔ（（株）バイオニア、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）  ＨＢＶ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ）を利用して、詳しくは９６−ウェルプレート用として供給される乾燥形態の試料にＩＰＣ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）０．５μＬ、ＰＣ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）０．５μＬと蒸溜水（Ｄ．Ｗ）を注入して、全体体積を５０μＬに合わせた後、本発明のマイクロチャンバープレートチャンバーホール内に注入させるために専用注入器を利用して各マイクロチャンバーホールの内部に注入させてマイクロチャンバープレートを完成した。
【００７９】
本実施例で製造されるマイクロチャンバープレートは、製造後ポリメラーゼ連鎖反応が正しく行われるか確認するために製造するもので、実施例１．４に係る特異成分注入段階を省略して試料と共にＩＰＣとＰＣを注入した。この時、使用されたＰＣ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）は、本実験で検体の役割を果たすことになり増幅結果を確認できるものである。
【００８０】
≪実施例３．ポリメラーゼ連鎖反応実行及び定量分析≫
前記実施例２で製造されたマイクロチャンバープレートを利用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行って、その結果から本発明のマイクロチャンバープレートで遺伝子増幅が可能であることを確認した。
【００８１】
本発明に使用される増幅装備は、韓国登録特許１０−１０８９０４５に記述された装置を利用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を進めた。増幅反応条件は以下の表１のとおりである。下反応条件の温度及び時間は、本実施例に限定されず、反応に適合した他の条件に変更可能である。前記条件に従って、２５℃で１分間安定化を経て、９５℃で５分間変性させた後、９５℃で５秒、５５℃で１０秒ずつ５０回繰り返してポリメラーゼ連鎖反応を行って、その結果を図８と図９に示した。図８によると、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクルが進行されるにつれ測定された蛍光値が増加して典型的な増幅曲線を示し、すべてのマイクロチャンバープレートのチャンバーで増幅が起きることを確認することができた。また、図９で増幅された産物を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施して、確認した結果ＰＣ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）増幅位置でバンドを確認することができて正常な増幅が起きたことを確認した（Ｍａｒｋｅｒ：（株）パイオニア、２５／１００ｂｐ  Ｍｉｘｅｄ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ）。このような結果から、本発明のマイクロチャンバープレートで正常な遺伝子増幅が可能であることを確認した。
【００８２】
【表１】
0006483118.tif 000002
【００８３】
≪実施例４．マイクロチャンバープレートの使用≫
図４及び図５を参照して本発明にマイクロチャンバープレートの使用方法を説明する。本発明に係るマイクロチャンバープレートは、マイクロチャンバープレート収容部５０００に受容できる。マイクロチャンバープレート収容部５０００は、平らな板状に形成されることができる。マイクロチャンバープレート収容部５０００は、試料注入用マイクロチャンバープレート４０００を安置させるためのものである。図面符号‘５１００’は、マイクロチャンバープレート収容部５０００が多数個一体で形成されたマイクロチャンバープレート収容部モジュールを示す。一方、マイクロチャンバープレート収容部モジュール５１００の側面には収容部締結突起５２００が突出形成される。図４の図面符号‘３１００’は、マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００が互いに連結されて多数個形成されたマイクロチャンバープレート収容部蓋モジュールを示す。
【００８４】
また、マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００の下側面に容器連通部が形成される。容器連通部は、外力によって広がる切開線３２００であってもよい。前記切開線は、遠心を加えた場合、圧力によって切開線が広がる現象が発生して、注入しようする試料溶液が切開線を通してマイクロチャンバーホールの内部に流入されるようにする。マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００の下側面に外力が作用しない場合、マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００に臨時保存された核酸を含む試料溶液は、切開線３２００を通してマイクロチャンバープレート収容部蓋３０００の外部に流出しなくなる。マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００は、シリコン材質で形成されてもよい。一方、切開線３２００の形状は、「＋」形状、「＜」形状、「＝」形状、「×」形状であってもよい。
【００８５】
前記マイクロチャンバープレート収容部は、締結ケース２０００に締結されてもよい。締結ケース２０００には、上下面を貫くケース貫通孔２２００が形成される。図面符号‘２１００’は、締結ケース２０００が互いに連結されて多数個形成された締結ケースモジュールを示す。一方、締結ケースセット２１００の側面には収容部締結突起５２００が嵌め込まれるケース締結溝２３００が形成される。締結ケース２０００は、マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００の上段を圧着してマイクロチャンバープレート収容部に締結される。締結ケース２０００とマイクロチャンバープレート収容部５０００との締結は、収容部締結突起５２００がケース締結溝２３００に嵌め込まれることによって行われる。締結ケース２０００が、マイクロチャンバープレート収容部５０００に締結されることによって、蓋支持部の下側端が試料注入用マイクロチャンバープレート４０００の上面に密着されて、これによりマイクロチャンバープレート収容部蓋３０００と試料注入用マイクロチャンバープレート４０００の上面の間に試料溶液保存空間が形成される。締結ケース２０００が、マイクロチャンバープレート収容部５１００と締結されることによって、貫通孔の下側端は、試料溶液保存空間に連通されて、ケース貫通孔２２００は、マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００と連通される。
【００８６】
締結ケース２０００にはケース蓋１０００が付着している。ケース蓋１０００には上下面を貫くケース蓋貫通孔１２００が形成される。ケース蓋貫通孔１２００は、ケース蓋１０００が締結ケース２０００に付着された場合、マイクロチャンバープレート収容部蓋３０００の一部は密閉さするように形成される。図面符号‘１１００’は、ケース蓋１０００が互いに連結されて多数個形成されたケース蓋モジュールを示す。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明に係る流動性フィルムを含むマイクロチャンバープレートは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、定温酵素反応またはＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行うに当たり、各マイクロチャンバーホール内に残存され得る残存気泡及び余分の試料を完ぺきに除去することによって、光学測定時の正確度を画期的に高めることができるだけでなく、各マイクロチャンバーホール内の溶液蒸発を防止して、各マイクロチャンバーホール内への試料注入時間を短縮することによって、溶液注入の容易性を高めることができて、各マイクロチャンバー間の溶液混入を完ぺきに遮断することができる長所がある。
【００８８】
さらに、マイクロチャンバーホール３０１に注入される特異成分の種類によって少量の試料を利用した様々な分析が可能で、一つのマイクロチャンバープレートを利用した多数の試料分析が可能である長所がある。
【００８９】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【符号の説明】
【００９０】
１００    接着フィルム
２００    流動性フィルム
３００    マイクロチャンバー本体
３０１    マイクロチャンバーホール
３０２    マイクロチャンバーホールの側面
３０３    マイクロチャンバー本体の上側面
３０４    マイクロチャンバー本体の下側面
３０５    マイクロチャンバーホールの下側面
４００    生物学的物質分析のための特異成分
５００    マイクロチャンバー本体密閉部
６００    接着性コーティング層
７００    試料
７０１    気泡
８００    試料注入部
１０００  ケース蓋
１１００  ケース蓋モジュール
１２００  ケース蓋貫通孔
２０００  締結ケース
２１００  締結ケースモジュール
２２００  締結ケース貫通孔
２３００  締結ケース締結溝
３０００  マイクロチャンバープレート収容部蓋
３１００  マイクロチャンバープレート収容部蓋モジュール
３２００  切開線
４０００  マイクロチャンバープレート
４１００  マイクロチャンバープレートモジュール
５０００  マイクロチャンバープレート収容部
５１００  マイクロチャンバープレート収容部モジュール
５２００  マイクロチャンバープレート収容部締結突起
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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