(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fcドメインを含む二重特異性抗体を、該二重特異性抗体を含む溶液から分離する方法であって、
(a) 該溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる段階であって、該溶液が
(i)該二重特異性抗体の1種もしくは複数種の断片、ここで、1種もしくは複数種の断片はFcドメインを含み；かつ/または
(ii)抗体重鎖のヘテロ二量体またはホモ二量体、単一の抗体軽鎖およびFabまたはscFab断片を有する1種もしくは複数種の二重特異性抗体特有副産物(BASB)、ここで1種もしくは複数種のBASBはFcドメインを含む；
をさらに含み、
(b)該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させる段階、および
(c)塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から該二重特異性抗体を溶出する段階であって、該溶出が
(i)6.5〜8.0のpH、1mM〜20mMのリン酸イオン濃度、0.01mM〜0.5mMのカルシウムイオン濃度、および10mM〜200mMの塩化物イオン濃度を有する溶出緩衝液の出発組成；
(ii)勾配による該出発組成の塩化物イオン濃度の増加；および
(iii) 溶出画分を得ること、ここで、画分は、該二重特異性抗体を含有するが、該1種もしくは複数種の断片のうちの少なくとも1種を含有せず、かつ/または該1種もしくは複数種のBASBのうちの少なくとも1種を含有しない、
を含む、段階
を含む、方法。
【請求項２】
前記溶出緩衝液の出発組成が、6.5〜7.5のpH、10mMのリン酸イオン濃度、0.1mMのカルシウムイオン濃度および50mMの塩化物イオン濃度を有し、かつ、塩化物イオンの濃度の増加が、50mMから500mMまでの勾配における増加である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記勾配が、直線勾配、段階的勾配、または、直線-段階的勾配でのそれらの組み合わせである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液が、抗体Fcドメインに対する特異性、抗体軽鎖のκドメインに対する特異性、および/または抗体軽鎖のλドメインに対する特異性を有するアフィニティクロマトグラフィー媒体の溶出液由来の二重特異性抗体含有画分またはプールされた二重特異性抗体含有画分を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上流または下流のイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含み、該工程が、前記断片、前記BASB、および/または重鎖/軽鎖ポリペプチドの対を含むホモ二量体のうちの少なくとも1種から前記二重特異性抗体を分離する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン交換単位操作がカチオン交換単位操作である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記二重特異性抗体がCrossMab二重特異性抗体であるか、または該二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記二重特異性抗体がknob-in-hole(KiH)二重特異性抗体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記二重特異性抗体がCrossMabおよびKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはAng2およびVEGFに対する特異性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含み、該二重特異性抗体がKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するか、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはTWEAKおよびIL17に対する特異性を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、二重特異性抗体生産に特有の1種または複数種の副産物も含む溶液から二重特異性抗体を分離するためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの使用を含む方法に指向している。二重特異性抗体の生産に特有の副産物(二重特異性抗体特有副産物(bispecific antibody specific byproduct)、「BASB」)は、二重特異性抗体の断片と、該抗体のより重い分子量の変異体とを含み、該断片および/または該変異体はFcドメインを含むが、所望の二重特異性抗体によって示される2つの異なるエピトープおよび/または抗原に対する親和性を示さない。したがって、本発明の方法は、二重特異性抗体の、そのBASBのうちの1種または複数種からの分離を含む。本発明のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、単独で使用してもよいか、あるいは、治療用途および/または診断用途などに必要な二重特異性抗体の任意のレベルの純度を達成するために、当技術分野で公知の標準的な精製工程および単位操作とさらに組み合わせてもよい。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
二重特異性抗体の治療可能性は、長い間認識されてきた。二重特異性抗体は、2つの抗原または2つのエピトープに同時に結合することができるIgG様プラットフォームを提供する。したがって、二重特異性抗体は、少なくとも2つの分子の相互作用および/または該分子を含む少なくとも2つのシステムの相互作用を調節するための有望なツールを提供する。このような調節は、例えば、認識される抗原および/またはエピトープが細胞の表面に発現される場合の、これら2つの細胞の相互作用の調節であってよい。二重特異性抗体の治療的使用の例としては、例えば、細胞シグナル伝達の調節(例えば、所望の表面受容体またはリガンドの相互作用を促進または妨害することによる)および癌治療(例えば、癌細胞に免疫細胞を標的化するのを助ける)が挙げられる。
【０００３】
二重特異性抗体の治療的使用への関心にもかかわらず、それらの商業生産には問題があることが判明している。初期の試みは、各々が単一特異性の二価抗体を発現する2つのハイブリドーマ細胞株の融合に焦点が合わされた(「クアドローマ技術」、例えば、Milstein and Cuello, Nature 305(1983), 537-540（非特許文献1）を参照されたい)。クアドローマは抗体分子を発現したものの、発現された分子が2本の親重鎖と2本の親軽鎖のさまざまな組み合わせを含むことはすぐにわかった。4本全ての親鎖の同時発現は、ほぼ同じ分子の10種の異なる変異体の混合物をもたらし、そこでは10種のうちのたった1種(すなわち、発現された全分子のほんの一部)が、所望の二重特異性を示すために必要な重鎖と軽鎖の適切な対を含んでいた(例えば、Suresh et al., Methods Enzymol. 121(1986), 210-228（非特許文献2）を参照されたい)。そのため、生産上の問題を解消する試みにおいて、代替の二重特異性抗体ベースの構築物、例えば抗体可変ドメインの一本鎖融合体に関心が向けられた。ところが、これらの型の多くは、原型抗体構造と大きく異なっており、不十分な薬物動態学的特性および/またはエフェクター活性の喪失(例えば、Fcドメインが存在しないことによる)といった治療上の欠点を示すことが判明した。さらに、多くの構築物はまた、凝集する傾向、およびリンカー領域などの非ヒトまたは人工のドメインの存在ゆえに免疫原性が増加する可能性を示した。
【０００４】
代替の二重特異性型の制限を考慮しても、かつ生産上の困難性にもかかわらず、原型抗体アーキテクチャ(特に、IgG様アーキテクチャ)を有する二重特異性抗体の関心は依然として残っている。主に、2つの問題がIgG様アーキテクチャを有する所望の二重特異性抗体の生産において生起する。このような分子は2本の異なる重鎖と2本の異なる軽鎖の適切な会合を必要とするので、(1)2本の異なる重鎖のヘテロ二量体化を、ホモ二量体化よりも好ましい反応として誘導すること、および、(2)発現された分子が所望の軽鎖/重鎖相互作用のみを含むように、可能性のある軽鎖/重鎖組み合わせ相互作用間の判別を最適化することが、必要である。これら2つの問題は実際上解決されている。
【０００５】
第一に、2本の異なる重鎖のヘテロ二量体化は、「knobs into holes」手法つまり「KiH」手法の使用により、ホモ二量体化の相互作用と比べて促進されることが示されている。KiH手法では、大きいアミノ酸の側鎖が一方の重鎖のCH3ドメインに導入され、その側鎖が他方の重鎖のCH3ドメインの適切に設計されたキャビティ内に収まる(例えば、Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621（非特許文献3）およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681（非特許文献4）を参照されたい)。したがって、重鎖のヘテロ二量体は、どのホモ二量体よりも安定しており、発現されたポリペプチドのより大きい割合を占める傾向がある。
【０００６】
第二に、所望の軽鎖/重鎖対の会合は、軽鎖と重鎖の間で定常領域をまたは定常領域および可変領域を「交換する」ように、二重特異性抗体の1つのFab(Fab領域)を改変することによって誘導することができる。したがって、改変されたFabドメインでは、重鎖は、例えば、CL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖は、それぞれ、CH1-VLまたはCH1-VHドメインを含みうる。これは、改変された鎖(すなわち、改変された軽鎖または重鎖)の重鎖/軽鎖Fab部と、標準/未改変アームの重鎖/軽鎖Fab部との相互作用を防止する。説明としては、CLドメインを含む、改変アームのFabドメイン中の重鎖は、CLドメインも含む、未改変アーム/Fabドメインの軽鎖とは、優先的に相互作用しない(重鎖/軽鎖の「不適切な」または望ましくない対合を防止する)。「不適切な」軽鎖/重鎖の会合を防止するためのこの技術は「CrossMab」技術と呼ばれており、KiT技術と組み合わせた場合、所望の二重特異性分子の著しく向上した発現をもたらす(例えば、Schaefer et al., PNAS 108(2011), 11187-11192（非特許文献5）を参照されたい)。代替的にまたは追加的に、FabドメインがscFabまたはscFvであり、このシステム内にただ1つの「遊離」軽鎖が残るように、抗体の一方のアームは改変することもできる。
【０００７】
二重特異性抗体の発現における最近の利点にもかかわらず、前記分子の使用は、特にその生産に関連した副産物(二重特異性抗体特有副産物、「BASB」)の形成および所望の分子からのBASB分離に関連した問題のために、制約されたままである。標準抗体の精製に比べて、生産培地からの二重特異性抗体の経済的な精製は、独特な難題を提示する。標準抗体の生産は、同一の重鎖/軽鎖サブユニットの二量体化に依存している。これとは対照的に、二重特異性抗体の生産は、それぞれが異なる重鎖ならびに異なる軽鎖を含む、2つの異なる重鎖/軽鎖サブユニットの二量体化を必要とする。したがって、二重特異性抗体生産は、最大4本のペプチド鎖の適切な相互作用を必要とする。したがって、鎖の誤対合(例えば、同一の重鎖ペプチドのホモ二量体化または不適切な重鎖/軽鎖会合)がしばしば観察され、同様に、異なる抗体鎖のアンバランスな発現のため不完全なタンパク質アセンブリが観察される。通常観察されるBASBには、1/2抗体(単一の重鎖/軽鎖対を含む)および3/4抗体(単一の軽鎖を欠く完全抗体を含む)が含まれる。用いられる二重特異性型に応じて、追加のBASBが観察されるかもしれない。例えば、二重特異性抗体の1つの可変ドメインが一本鎖Fab(scFab)として構築される場合には、5/4抗体副産物(追加の重鎖または軽鎖可変ドメインを含む)が観察されることがある。これに相当する副産物は、標準抗体生産では通常見られない。
【０００８】
さらに、BASBは、それらが最終精製産物中に残存する場合には、特に不利な活性を示し得る。標準抗体に関して、すなわち、単一特異性抗体に関して、上記の副産物は少なくとも1つの機能的な抗原結合部位を含むことが見て取れる。したがって、単一特異性抗体の製剤中のこのような副産物は、おそらく、完全にではないとしても、部分的に治療的に機能しており、そのため、どの精製スキームにおいてもほとんど問題にならない。対照的に、BASBは、二重特異性型に応じて、所望の二重特異性製剤の活性にマイナスの影響を与え得る不純物に相当する。したがって、精製中に所望の分子からそれらを分離することが極めて重要になる。例えば、二重特異性分子の機能性は、単一の分子が2つの異なる抗原への結合活性を示すことによって決まる。ある分子が(上述した1/2または3/4抗体などの場合)ただ1つの標的抗原への結合活性を示す場合、この標的抗原へのその結合は、完全に機能する二重特異性抗体の結合をブロックし、二重特異性分子の所望の活性を潜在的にアンタゴナイズするであろう。少なく見積もっても、二重特異性抗体生産の単一特異性副産物は、分離されない場合は、最終的な二重特異性製剤の有効性を低下させる可能性が高い。さらに、本明細書に記載したBASBの多くは、通常ペプチド-ペプチド相互作用を促進する露出領域を有しており、免疫原性および凝集を示す傾向がある。
【０００９】
残念ながら、ほとんどの商業上の抗体の生産および精製スキームは、不適切であるか、または上述した特有副産物から二重特異性抗体を分離することができない。標準的な抗体精製スキームは、通常、クロマトグラフィーに関する少なくとも2つの異なる様式を含み、すなわち、通常は目的の免疫グロブリンを副産物/不純物から分離するための少なくとも2つのクロマトグラフィーメカニズムを利用する。第1の様式は、通常、精製すべきタンパク質(すなわち、関心対象のタンパク質)と固定化された捕捉試薬との間の特異的相互作用を利用する、親和性ベースのクロマトグラフィーである。親和性試薬は精製スキームの最も高価な部分に相当しうるので、親和性リガンドの使用を減らすこと、および/または特定のスキーム(および親和性試薬)の適用可能性を多くの産物にまたがって最大にすることが望ましい。免疫グロブリンの精製において最も一般的に使用される(かつ広範囲の免疫グロブリンベースの産物に適用できる)親和性リガンドは、Fc結合物質または定常ドメイン結合物質、例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインL、KappaSelect(商標)、およびLambdaFabSelect(商標)である。しかし、これらのFc結合物質または定常ドメイン結合物質の分離活性は、Fcドメイン、κドメイン、および/またはλドメインの存在に基づいており、重要なこととして、これらのドメインは二重特異性抗体およびその特有副産物(すなわち、BASB)によって共有されている。その結果、Fc-または定常ドメイン-親和性リガンドは、単独では、二重特異性抗体をBASBから精製するのに不十分であり、また、追加的な親和性ベースの精製および/または分子特異的(すなわち、抗原特異的)な精製の実施は、おそらく、経済的に法外なスキームにつながるであろう。
【００１０】
さらに、本発明以前の当技術分野での理解に基づくと、商業的な抗体処理スキームで使用される他の一般的な精製工程を追加することもまた、二重特異性抗体をBASBから満足のいくように分離するのに十分とは考えられない。商業的な抗体精製のためにアフィニティクロマトグラフィーと一緒に使用される最も一般的な精製工程は、サイズ、電荷(例えば、等電点または「IEP」)、溶解性、および/または疎水性度の違いに基づいて、関心対象のタンパク質を望ましくない副産物/不純物から分離する、標準的なクロマトグラフ法である。こうした方法として、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーが挙げられる。しかし、標準的なプロトコールを使用する、これらの一般的なクロマトグラフィー工程は、BASBからの二重特異性抗体の分離に適していない。すなわち、サイズ排除クロマトグラフィーは大規模な精製では経済的に実現可能でなく、また、二重特異性抗体とBASBの間のIEPの差は、イオン交換クロマトグラフィーによるそれらの分離には大部分が小さすぎると考えられた。
【００１１】
したがって、抗体を、その生産に特有の副産物(例えば、Fcを含む抗体断片)を含む溶液から分離するための公知の方法は、二重特異性抗体の精製には有効でなく、かつ/または経済的理由(例えば、追加のアフィニティクロマトグラフィー段階の使用)のために望ましくない。よって、(例えば、効率のよいコスト、処理能力、および産物の純度を実証して)診断用および治療用産物を生産するためのバイオテクノロジー産業の要件を満たすことができる、二重特異性抗体を生産溶液(特に、そこに含まれるBASB)から精製するための新規かつ/または改良されたスキームが、必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Milstein and Cuello, Nature 305(1983), 537-540
【非特許文献２】Suresh et al., Methods Enzymol. 121(1986), 210-228
【非特許文献３】Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621
【非特許文献４】Atwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681
【非特許文献５】Schaefer et al., PNAS 108(2011), 11187-11192
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、二重特異性抗体と二重特異性抗体の生産(例えば、組換え生産)に特有の1種または複数種の副産物とを含有する溶液から二重特異性抗体を分離するためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する方法に指向している。二重特異性抗体の生産(例えば、組換え生産)に特有の副産物(本明細書では、二重特異性抗体特有副産物、「BASB」とも呼ばれる)は、所望の二重特異的活性を欠いている、より高いまたはより低い分子量の二重特異性抗体のポリペプチド変異体である。例えば、BASBは、二重特異性抗体によって認識される2つのエピトープまたは抗原の一方のみに対する特異性を示す場合があり、かつ/または二重特異性抗体によって認識されるエピトープまたは抗原の一方もしくは両方に対する親和性の大幅な低下を示す場合がある。典型的なBASBには、以下が含まれる：(i)1/2抗体(単一の重鎖/軽鎖対を有する)および3/4抗体(抗体重鎖のヘテロまたはホモ二量体と単一の抗体軽鎖を有する)を含むがこれらに限定されない、二重特異性抗体の断片(すなわち、より低い分子量のペプチドまたはポリペプチド変異体)；ならびに(ii)5/4抗体(抗体重鎖のヘテロ二量体(そのうちの一方は抗体scFabまたはscFv断片を含む)と2本の抗体軽鎖とを有する)を含むがこれに限定されない、より高い分子量のポリペプチド変異体(例えば、図1を参照されたい)。特に、本発明の方法は、Fcドメインを含む二重特異性抗体の、Fcドメインも含む1種または複数種のBASBからの分離に指向している。
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載されるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法が、生産物供給流中のFcドメインを含む1種または複数種のBASBからFcドメインを含む所望の二重特異性抗体を分離することができることを見出した。したがって、本発明の方法は、標準的な抗体精製スキームと組み合わせるのに特に有用であることができ、該スキームはそうしなければBASBから二重特異性抗体を分離するには不十分な単位操作を含んでいる。本明細書に記載の方法はまた、最終生産物流(二重特異性抗体を含む)を最終的な配合物および/または純度の状態に至らせるために、標準的な抗体精製工程と組み合わせるのに特に有用であり得る。
【００１５】
本発明は、Fcドメインを含む二重特異性抗体を、該二重特異性抗体を含有する溶液から分離する方法に指向しており、本方法は、(a)該溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる段階、(b)該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させる段階、および(c)塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイト媒体から該二重特異性抗体を溶出する段階を含み、該二重特異性抗体を含有する溶液は、(i)該二重特異性抗体の1種もしくは複数種の断片(該断片もまたFcドメインを含む)、および/または(ii)該二重特異性抗体の分子量よりも大きい分子量を有しかつ該二重特異性抗体の2本の重鎖のうちの少なくとも一方を含む、1種もしくは複数種のポリペプチド(該1種もしくは複数種のポリペプチドもまたFcドメインを含む)をさらに含有するかまたは含む。したがって、本発明はまた、二重特異性抗体を含有する溶液からFcドメインを含む二重特異性抗体を分離するためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体の使用を包含し、該使用は、(a)ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体を該溶液と接触させること、(b)該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させること、および(c)塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイト媒体から該二重特異性抗体を溶出することを含み、該二重特異性抗体を含有する溶液は、(i)該二重特異性抗体の1種もしくは複数種の断片(該断片もまたFcドメインを含む)、および/または(ii)該二重特異性抗体の分子量よりも大きい分子量を有しかつ該二重特異性抗体の2本の重鎖のうちの少なくとも一方を含む、1種もしくは複数種のポリペプチド(該1種もしくは複数種のポリペプチドもまたFcドメインを含む)をさらに含有する。
【００１６】
二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとを含有する溶液は、クロマトグラフィー媒体への二重特異性抗体ならびに/または二重特異性抗体および1種もしくは複数種のBASBの結合を可能にする条件下で、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる。好ましくは、二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとの結合に適する条件は、溶液が低い導電率値を有する条件である。本明細書に開示する方法に適した低導電率値を有する溶液は、一般的に、約13mS/cmまたはそれ以下の値を有する。本明細書に開示する方法に適した低導電率値を有する溶液は、さらに、約10.6mS/cmもしくはそれ以下、または約8.5mS/cmもしくはそれ以下の導電率値を有していてよい。低導電率値を有する溶液の非限定的な例としては、約1mM〜約20mMの範囲、好ましくは約10mMのリン酸イオン濃度；約0.001mM〜約0.5mMの範囲、好ましくは約0.1mMのカルシウムイオン濃度；および約10mM〜約200mMの範囲、好ましくは約50mMの塩化物イオン濃度を含む、約6.5〜8.0のpHの緩衝溶液が挙げられる。本発明の方法で使用するための低導電率値を有する溶液は、約6.5〜7.5のpH値、少なくとも10mMのリン酸イオン濃度、少なくとも0.1mMのカルシウムイオン濃度、および約50mM〜約500mMの塩化物イオン濃度を有していてよい。代替的にまたは追加的に、本発明の方法で使用するための低導電率値を有する溶液は、約6.5〜7.5のpH値、約10mMのリン酸イオン濃度、約0.1mMのカルシウムイオン濃度、および約50mM〜約500mMの塩化物イオン濃度を有し得る。溶液中のリン酸イオンは、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の任意の好適なリン酸塩もしくはそれらの組み合わせによって提供される。本明細書に記載の方法に従って溶液中で使用するのに好適なリン酸塩の非限定的な例としては、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、およびK2HPO4が挙げられる。溶液中のカルシウムイオンは、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の任意の好適なカルシウム塩もしくはそれらの組み合わせによって提供される。本明細書に記載の方法に従って溶液中で使用するのに好適なカルシウム塩の非限定的な例としては、CaCl2が挙げられる。溶液中の塩化物イオンは、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の任意の好適な塩化物塩、例えば、カルシウムイオン濃度が本明細書で指定された範囲内に維持されるという条件で、カルシウムイオンを提供するために使用された塩、またはそれらの組み合わせによって提供され得る。本発明の方法に従って溶液中で使用するのに好適な塩化物塩の非限定的な例としては、NaClおよびKClが挙げられる。これらの態様で使用するための塩化物イオンを提供する塩類の典型的な組み合わせは、NaCl、CaCl2、およびKClを含む。好ましい態様では、二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとを、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体へのそれらの初期結合を可能にするのに適した条件で含有する溶液は、(二重特異性抗体および1種または複数種のBASBのほかに)約10mM NaH2PO4、約50mM NaCl、20mM MES、および約0.1mM CaCl2を約6.5〜7.5のpHで含む溶液である。当技術分野で公知のように、この段落で具体的に記載した態様を含めて、結合緩衝液単独(二重特異性抗体も1種または複数種のBASBも含まない)は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体のための平衡化緩衝液として、および/またはクロマトグラフィー工程についての1つもしくは複数のステージで洗浄緩衝液として使用することができる。
【００１７】
二重特異性抗体の溶出は、もっぱら、塩化物イオンの濃度を増加させることによって成し遂げられる。この溶出は、低い出発導電率を有する溶出緩衝液を用いて行われ、その後に塩化物イオンの濃度が着実に高められる。すぐ上に記載した低導電率の結合溶液(すなわち、二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとを、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体へのそれらの結合を可能にする条件で含有する、溶液)を選択するための条件は、本発明の溶出緩衝液(すなわち、低い出発導電率も有する)の出発組成を選択する際にも同様に当てはまる。したがって、溶出緩衝液の出発組成は、すぐ上にまたは本明細書に記載した結合溶液/結合緩衝液の組成と同じであってもまたは異なっていてもよい。特定の態様では、溶出緩衝液の出発組成は、結合溶液/結合緩衝液の組成と同じである。他の態様では、溶出緩衝液の出発組成は、結合溶液/結合緩衝液の組成とは異なる。溶出緩衝液は、好ましくは、リン酸イオンと塩化物イオンの両方を含有する。特定の態様では、溶出緩衝液は、約6.5〜7.5のpHで約10mM NaH2PO4、約50mM NaCl、約20mM MES、および約0.1mM CaCl2の出発組成を有する。
【００１８】
本発明は、クロマトグラフィー媒体から二重特異性抗体を溶出するために、溶出緩衝液中の塩化物イオンの濃度を増加させる段階を含む方法に指向している。塩化物イオンの濃度は、直線勾配、組み込まれた段階勾配(例えば、図6に示される、増加する塩化物イオンの組み込まれた段階勾配を参照)、またはこれら2つの勾配の組み合わせに従って増加させることができる。クロマトグラフィー媒体から二重特異性抗体を溶出するための、および/またはBASBから二重特異性抗体を分離するための(すなわち、一方を該媒体に結合させたままにしながら他方を溶出するための)勾配の最適化は、本明細書に含まれる教示を考慮して、当業者の能力の範囲内である。塩化物イオンの濃度は、溶出緩衝液中で1種または複数種の塩化物塩の濃度を増加させることによって、増加させることができる。塩化物イオンの濃度を増加させるために溶出緩衝液に添加し得る塩化物塩の非限定的な例としては、NaClおよびKClが挙げられる。タンパク質クロマトグラフィーの分野で理解されるように、カルシウムイオンとリン酸イオンの相対濃度は、本発明を実施する過程で1つもしくは複数の溶液からカルシウムとリン酸が沈殿するのを防止するためにモニターまたは評価する必要がある。特定の態様では、溶出緩衝液中の塩化物イオンの濃度は、NaClの濃度を増加させることによって増加される。好ましい態様では、溶出緩衝液の出発塩化物イオン濃度は、約50mMであり(1種または複数種の塩化物塩によって提供され得る)、続いて、溶出の間に、二重特異性抗体を溶出するのに必要な濃度にまで増加させる。当業者であれば、当技術分野で公知の日常的な方法を用いて、また、本明細書に記載の教示および方法に従って、吸着された二重特異性抗体を溶出するのに必要な塩化物イオンの最大濃度を容易に決定することができる。特定の態様では、二重特異性抗体を溶出しかつ/または1種もしくは複数種のBASBから二重特異性抗体を分離するための塩化物イオンの最大濃度は、約200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、または500mMである。本発明の方法に従う典型的な溶出緩衝液は、約6.5〜7.5のpHで約10mM NaH2PO4、約50mM NaCl、約20mM MES、および約0.1mM CaCl2の出発組成を有し、その後、溶出段階の間に、直線勾配、段階的勾配、または直線-段階的勾配によりNaClの濃度を約500mMにまで増加させることによって、塩化物イオンの濃度を増加させる。
【００１９】
二重特異性抗体の溶出は、好ましくは、二重特異性抗体を含むが、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着されたBASBのうちの少なくとも1種を含まない、溶出画分において成し遂げられる。本発明の方法は、特に、二重特異性抗体をその少なくとも1種のBASBから分離することを可能にし、その少なくとも1種のBASBは、1/2抗体、3/4抗体、または5/4抗体である。言い換えると、本発明の方法は、Fcドメインを含む二重特異性抗体を、該二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとを含む溶液から分離することを可能にし、(a)該溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる段階、(b)該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させる段階、および(c)塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイト媒体から該二重特異性抗体を溶出する段階を含み、段階(c)の、該二重特異性抗体を含む溶出画分は、該1種または複数種のBASBのうちの少なくとも1種を含まず、かつ該1種または複数種のBASBは1/2抗体、3/4抗体、または5/4抗体である。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体の性能は、当技術分野で認識されているように、生物学的分子(例えば、二重特異性抗体およびBASB)に関連して変化することがあるので、1種もしくは複数種のBASBからの二重特異性抗体の分離および/または精製に関連して本開示を通して使用される「分離する」という用語ならびに類似の用語および語句は、必ずしも絶対的な表現として解釈されるべきではないことが理解される。むしろ、本明細書で使用する場合、当技術分野での理解に従って、こうした用語は、溶出された二重特異性抗体が分離および/または精製されたと見なすことができるが、1種または複数種のBASBのうちの少なくとも1種由来のわずかな汚染物質(もとはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着されていた)を含んでいてもよいという認識で使用される。したがって、本明細書で使用する場合、本発明の方法から/によって得られた二重特異性抗体の溶液に関して使用される「分離された」、「精製された」、「含有しない」という用語ならびに類似の用語および語句は、二重特異性抗体を含む溶出物中または溶出画分中の1種または複数種のBASBの全量が二重特異性抗体の全量の10％以下であることを意味するために使用される。好ましい態様では、本発明の方法から/によって得られた二重特異性抗体の溶液に関して使用される「分離する」/「分離された」、「精製された」、「含有しない」という用語ならびに類似の用語および語句は、二重特異性抗体を含む溶出物中または溶出画分中の1種または複数種のBASBの全量が二重特異性抗体の全量の5％以下であることを意味するために使用される。他の態様では、溶出された二重特異性抗体は、1種もしくは複数種のBASBのうちの少なくとも1種由来の汚染物質を4％未満、3％未満、2％未満、1％未満含有するか、または汚染物質を含まない。同様に、1種または複数種のBASBならびに溶出物および/もしくは溶出画分に関連して使用される「含まない」という語句および類似の語句は、絶対的な表現として理解されるべきでない。むしろ、当技術分野で理解されるように、こうした語句は、溶出画分が、特有の1種または複数種のBASBを本質的に含まないこと、すなわち、最小限��のBASBを含んでいてもよいことを示している。したがって、本明細書で使用する場合、二重特異性抗体を含みかつ1種または複数種のBASBを含まない溶出物または溶出画分は、二重特異性抗体の全量の5％以下である量の1種または複数種のBASBを含んでいてもよい。この段落および本説明全体を通して使用する場合、1つまたは複数の二重特異性抗体含有画分中の二重特異性抗体の全量と比較した1種または複数種のBASBの全量の相対的割合は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の方法によって決定することができる。非限定的な例では、それは、SDS-PAGE分析、MS分析から、またはBIAcore、OctetもしくはELISAプロトコールに基づく結合解析から、測定または推定された量の比較に基づいて算出することができる。
【００２０】
本発明の方法は、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の任意の二重特異性抗体型にも適用可能である。したがって、二重特異性抗体は、動物供給源由来の抗体(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、類人猿、および/もしくはニワトリ抗体)ならびにキメラ、ヒトおよびヒト化抗体を含むがこれらに限らない、適切な供給源抗体由来の抗体ペプチド鎖(例えば、重鎖および/もしくは軽鎖)もしくはその抗原結合断片を含むことができ；本明細書で定義される適切な動物供給源およびヒト抗体を含むがこれらに限らない、適切な供給源抗体由来の定常ドメイン(例えば、CL、CH1、CH2、およびCH3ドメイン)を有するペプチド鎖(例えば、重鎖および/もしくは軽鎖)を含むことができ；scFv、scFab、Fd、dAb、単一重鎖可変ドメイン、および単一軽鎖可変ドメインを含むがこれらに限らない、抗原結合機能を保持する抗体断片に組換えにより融合されたもしくは化学的にコンジュゲート化された、適切な供給源抗体由来の1つもしくは複数の定常ドメイン(例えば、1つもしくは複数のCL、CH1、CH2、およびCH3ドメイン)を有するペプチド鎖(例えば、重鎖および/もしくは軽鎖)を含むことができ；かつ/またはヒトもしくはヒト化フレームワークドメインを有するペプチド鎖(例えば、重鎖および/もしくは軽鎖)を含むことができる。特定の態様では、本発明に係るFcドメインを含む二重特異性抗体は、「knobs-in-holes」(「KiH」)二重特異性抗体である(すなわち、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載のKiH法に従って設計された2本の重鎖を含む)。KiH手法は他の二重特異性抗体設計の手法と組み合わせてもまたは組み合わせなくてもよい。このような他の二重特異性抗体設計の手法の非限定的な例には、二重特異性抗体の可変ドメインのうちの1つもしくは複数に適用される手法、例えばCrossMabの手法、および/または1つもしくは複数の重鎖定常ドメインへの抗原結合断片(例えば、scFab)の融合が含まれる。本発明はまた、KiHの手法とは無関係に、CrossMabおよび抗原結合断片(例えば、scFab)重鎖融合の手法の使用を包含する。したがって、本発明の二重特異性抗体は、KiH手法、CrossMab手法、および抗原結合断片-重鎖融合手法のうちの1つのみの使用を含んでもよいか、またはこれらの手法の2つ以上の使用を含んでもよい。便宜上、本開示を通して使用する場合、KiH法、CrossMab法、および/または抗原結合断片-重鎖融合法に従って設計された抗体は、それぞれ、「KiH二重特異性抗体」、「CrossMab二重特異性抗体」、および/または「結合断片-重鎖融合抗体」と呼ばれる。本発明の特定の態様では、二重特異性抗体は結合断片-重鎖融合抗体であり、この場合、二重特異性抗体の一方の重鎖は、抗体重鎖のヒンジ-CH2-CH3領域に組換えにより融合されたまたは化学的にコンジュゲート化されたscFabを含む(すなわち、「scFab二重特異性抗体」)。特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、KiH二重特異性抗体、CrossMab二重特異性抗体、scFab二重特異性抗体、KiH-CrossMab二重特異性抗体、またはKiH-scFab二重特異性抗体である。特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、KiH二重特異性抗体、CrossMab二重特異性抗体、scFab二重特異性抗体、KiH-CrossMab二重特異性抗体、またはKiH-scFab二重特異性抗体であり、かつ本発明の方法は二重特異性抗体を1種または複数種のそのBASBから分離する。
【００２１】
本発明は、特定のエピトープまたは抗原に対する特異性を有する二重特異性抗体に限定されるものではなく、二重特異性抗体に広く適用可能であり、特に、Fcドメインを有する二重特異性抗体に適用される。したがって、本発明の抗体は、2つもしくはそれのエピトープ(これらのエピトープは同一のまたは異なる抗原上にある)に対する特異性を有することができ、かつ/または2つもしくはそれの抗原に対する特異性を有することができる。二重特異性抗体が特異性を示すことができる抗原の非限定的な例には、タンパク質およびポリペプチドが含まれる(限定するものではないが、未変性コンホメーションの単離されたタンパク質およびポリペプチド；単離された変性タンパク質およびポリペプチド；細胞の表面上に発現されたタンパク質およびポリペプチド(当技術分野で公知または本明細書に記載の細胞受容体および/または細胞マーカーを含む)；ならびに生物学的流体(例えば、血液、血清、尿、およびそのようなものの分画)中に見出せる可溶性のタンパク質およびポリペプチド、例えば、分泌タンパク質、切断(shed)細胞受容体および切断細胞マーカーが含まれる)。特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、以下のうちの1つまたは複数に対する特異性を有する：EGFR、IGFR、Ang2、VEGF、TWEAK、IL17、CD3、TNF(TNF-α)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、細胞死受容体5(DR5)、CEA、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、葉酸受容体1(FolR1)、潜伏膜タンパク質1/2(LMP 1/2)、または詳細な説明に記載される他の抗原。代替的または追加的態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、以下のうちのいずれか2つに対する特異性を有する：EGFR、IGFR、Ang2、VEGF、TWEAK、IL17、CD3、TNF(TNF-α)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、細胞死受容体5(DR5)、CEA、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、葉酸受容体1(FolR1)、潜伏膜タンパク質1/2(LMP 1/2)、または詳細な説明に記載される他の抗原。さらなる代替的または追加的態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFR、Ang2およびVEGF、またはTWEAKおよびIL17に対する特異性を有する。
【００２２】
特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するKiH-CrossMab二重特異性抗体であり、本発明の方法は、二重特異性抗体を、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液から分離し、少なくとも1種のBASBは1/2抗体であり、かつ分離は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、EGFR-IGFR二重特異性抗体を含むが1/2抗体を含まない溶出画分を得ることである。この態様のある側面では、二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するKiH-CrossMab二重特異性抗体であり、IGFRに特異的な可変ドメインはCrossMab可変ドメインである。この態様の好ましい側面では、二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するKiH-CrossMab二重特異性抗体であり、IGFRに特異的な可変ドメインはCrossMab可変ドメインであり、1種または複数種のBASBは1/2抗体であり、かつ本発明の方法は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、EGFR-IGFR二重特異性抗体を含むが1/2抗体を含まない溶出画分を得ることを含む。
【００２３】
特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、本発明の方法は、この二重特異性抗体を、該抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液から分離し、少なくとも1種のBASBは1/2抗体であり、かつ分離は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、Ang2-VEGF二重特異性抗体を含むが1/2抗体を含まない溶出画分を得ることである。この態様のある側面では、二重特異性抗体は、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、Ang2に特異的な可変ドメインはscFab可変ドメインである。この態様の好ましい側面では、二重特異性抗体は、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、Ang2に特異的な可変ドメインはscFab可変ドメインであり、1種または複数種のBASBは1/2抗体であり、かつ本発明の方法は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、Ang2-VEGF二重特異性抗体を含むが1/2抗体を含まない溶出画分を得る段階を含む。
【００２４】
特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、本発明の方法は、二重特異性抗体を、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液から分離し、少なくとも1種のBASBは1/2抗体であり、かつ分離は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、EGFR-IGFR二重特異性抗体を含むが1/2抗体を含まない溶出画分を得ることである。この態様のある側面では、二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、IGFRに特異的な可変ドメインはscFab可変ドメインである。この態様の好ましい側面では、二重特異性抗体は、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、IGFRに特異的な可変ドメインはscFab可変ドメインであり、1種または複数種のBASBは1/2抗体であり、かつ本発明の方法は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、EGFR-IGFR二重特異性抗体を含むが1/2抗体を含まない溶出画分を得る段階を含む。
【００２５】
特定の態様では、本発明の方法に係る二重特異性抗体は、TWEAKおよびIL17に対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、本発明の方法は、二重特異性抗体を、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液から分離し、少なくとも1種のBASBは5/4抗体であり、かつ分離は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、TWEAK-IL17二重特異性抗体を含むが5/4抗体を含まない溶出画分を得ることである。この態様のある側面では、二重特異性抗体は、TWEAKおよびIL17に対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、TWEAKに特異的な可変ドメインはscFab可変ドメインである。この態様の好ましい側面では、二重特異性抗体は、TWEAKおよびIL17に対する特異性を有するKiH-scFab二重特異性抗体であり、TWEAKに特異的な可変ドメインはscFab可変ドメインであり、1種または複数種のBASBは5/4抗体であり、かつ本発明の方法は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、TWEAK-IL17二重特異性抗体を含むが5/4抗体を含まない溶出画分を得る段階を含む。
【００２６】
特定の態様では、本発明の方法に従う二重特異性抗体は、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するKiH-CrossMab二重特異性抗体であり、本発明の方法は、二重特異性抗体を、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液から分離し、少なくとも1種のBASBは3/4抗体であり、かつ分離は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、Ang2-VEGF二重特異性抗体を含むが3/4抗体を含まない溶出画分を得ることである。この態様のある側面では、二重特異性抗体は、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するKiH-CrossMab二重特異性抗体であり、Ang2に特異的な可変ドメインはCrossMab可変ドメインである。この態様の好ましい側面では、二重特異性抗体は、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するKiH-CrossMab二重特異性抗体であり、Ang2に特異的な可変ドメインはCrossMab可変ドメインであり、1種または複数種のBASBは3/4抗体であり、かつ本発明の方法は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から、Ang2-VEGF二重特異性抗体を含むが3/4抗体を含まない溶出画分を得る段階を含む。
【００２７】
本明細書に開示されるいずれのハイドロキシアパタイト法も、本発明の側面および/または態様として記載されようと、また、好ましいとして記載されようとなかろうと、本明細書に記載のおよび/または当技術分野で公知の上流または下流精製工程と組み合わせることができる。本明細書に開示されるハイドロキシアパタイト法と上流または下流で組み合わせることができる、このような精製工程の例としては、限定するものではないが、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー(アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーを含む)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、他の形態の混合モードクロマトグラフィー、ならびに当技術分野で公知のような種々の濾過法が挙げられる。特定の二重特異性抗体の精製を成し遂げるために、開示された方法と統合させるのに適した条件を開発することは、当業者の能力の範囲内である。非限定的な例では、本明細書に開示されるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法はいずれも、上流のアフィニティクロマトグラフィー法と組み合わせることができ、その際の親和性リガンドは、Fcドメイン、κドメイン、またはλドメインなどの抗体ドメインに対する特異性を有する(例えば、限定するものではないが、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインL、KappaSelect(商標)、およびLambdaFabSelect(商標)(GE Healthcare Life Sciences社, Upsala, SE))。特定の態様では、本発明の方法に従ってハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触される、二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとを含有する溶液は、抗体Fcドメイン、または抗体軽鎖のκもしくはλドメインに対する特異性を有するアフィニティクロマトグラフィー媒体からの溶出液のプールされた抗体含有画分を含む。さらなる非限定的な例では、本発明に係るハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、上流または下流の精製工程、例えば、限定するものではないが、アニオンクロマトグラフィーおよびカチオンクロマトグラフィーと組み合わせることができる。非限定的な例として、本明細書に開示した本発明に係るハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法の任意の方法、側面、態様、またはその他の例は、上流または下流のアニオンもしくはカチオンクロマトグラフィーと組み合わせることができる。本明細書に開示した任意の方法、側面、態様、またはその他の例と組み合わせることができる具体的な例では、本発明に係るハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、上流または下流のカチオンクロマトグラフィーと組み合わせることができ、このカチオンクロマトグラフィーは、1種または複数種の汚染物質、不純物、および/または第2のBASBから二重特異性抗体を分離することができる。本明細書で使用される「汚染物質」、「不純物」という用語および類似の用語は、当技術分野で公知のそれらの標準的な意味を有し、特に、二重特異性抗体を含有する溶液中の望ましくない成分を示す。このような望ましくない成分の非限定的な例には、望ましくないタンパク質(例えば、限定するものではないが、二重特異性抗体の重鎖のホモ二量体)、望ましくない小分子、本明細書に記載されるBASB以外の二重特異性抗体の1つまたは複数の断片、二重特異性抗体の凝集物、および細胞により産生された望ましくないタンパク質/分子(内因性か異種かを問わない)が含まれる。本明細書で使用される「第2のBASB」という用語および類似の用語は、本明細書に開示されるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法によって二重特異性抗体から分離される少なくとも1種のBASBではないBASBを指す。したがって、特定の態様では、本明細書に開示されるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含有する溶液から二重特異性抗体を分離し、分離は、二重特異性抗体を含むが少なくとも1種のBASBを含まない溶出画分中にハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から二重特異性抗体を溶出することであり、かつ方法は、少なくとも1種の汚染物質、不純物、および/または第2のBASBから二重特異性抗体を分離する、少なくとも1つの上流または下流のカチオンクロマトグラフィー法と組み合わされる。本明細書に開示される任意の方法、側面、態様、またはその他の例と組み合わせることができる具体的な例では、本発明によるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、(1)親和性リガンドが、Fcドメイン、κドメイン、またはλドメインなどの抗体ドメインに対する特異性を有する、上流のアフィニティクロマトグラフィー法；および(2)カチオンクロマトグラフィーが、1種または複数種の汚染物質、不純物、および/または第2のBASBから二重特異性抗体を分離する、上流または下流のカチオンクロマトグラフィー法と組み合わせることができる。
【００２８】
定義
一般的に、下記の用語または語句は、要約、説明、実施例、および特許請求の範囲で使用される場合、示された定義を有する。
【００２９】
本明細書で数値に関連して使用される「約」という用語は、その数値の±5％を示す。装置により行われた測定(例えば、pHメーターにより測定されたpH)または当技術分野で公知の標準方法により行われた測定(例えば、HPLC、UV吸収、ELISA、標準キット(例えば比色アッセイ法)により測定された溶液のタンパク質濃度)に関連して使用される場合、「約」は、そのような装置に関して公知の標準誤差内の数値、またはそのような方法についての測定値の1標準偏差内の数値を示す。
【００３０】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、以下を含む：単一のモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体；ならびに脱免疫化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体ならびに/または任意の適切な動物供給源(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、類人猿、および/もしくはニワトリ)に由来する抗体を含む)、イムノコンジュゲート、合成抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、F(ab')2断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、細胞内抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片。特に、本発明は、二重特異性抗体に指向しており、それは、当業者には理解されるように、特定の態様では、少なくとも2つまたはそれ以上の異なる抗体に由来するドメインから構成されると考えられている。したがって、本発明の二重特異性抗体は、2本の異なる重鎖(それぞれが異なる抗体に由来する)と2本の異なる軽鎖(それぞれが異なる抗体に由来する)を含むことができ、かつ/またはそれぞれが2つ以上の異なる抗体由来の断片を含む重鎖と軽鎖を含むことができる。したがって、本発明の二重特異性抗体は、脱免疫化抗体由来、マウス抗体由来、キメラ抗体由来、ヒト化抗体由来、およびヒト抗体由来の重鎖および/または軽鎖、ならびに、脱免疫化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびその断片(例えば、その可変および/または定常ドメイン)由来の重鎖および/または軽鎖の組み合わせを含むことができる。本発明の二重特異性抗体はまた、特に、1つまたは複数の重鎖または軽鎖定常ドメインに連結された、抗体のエピトープ結合断片(例えば、限定するものではないが、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')断片、F(ab')2断片、およびジスルフィド結合Fv(sdFv))、例えば、重鎖CH1/CH2/CH3ドメインに連結されたscFvを含むことができる。好ましい態様では、本発明の二重特異性抗体はFcドメインを含む。当業者には理解されるように、Fcドメインの存在は、二重特異性抗体を、限定するものではないがプロテインA、プロテインG、および/またはプロテインA/GなどのFc結合部分を用いた精製に適する状態にする。当技術分野で十分に認識されているように、重鎖のCH1-ヒンジ-CH2-CH3ドメインの特定の構造およびアミノ酸配列は、免疫グロブリンのタイプおよびサブクラスを決定する。本発明の二重特異性抗体は、いかなる方法でも、特定の重鎖構造またはアミノ酸配列に限定されず；したがって、本発明の二重特異性抗体は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)またはサブクラスのものであり得る。
【００３１】
本明細書で特にクロマトグラフィー工程に関連して使用される「親和性リガンド」とは、部分(例えば、リガンド)上および/または成分上の結合部位との特異的相互作用を介して、該工程の供給流または負荷流に含まれる成分と選択的にまたは優先的に結合する部分を指す。本発明に係る免疫グロブリン親和性リガンドは、免疫グロブリンのFcドメインまたは他の定常ドメイン(例えば、抗体軽鎖のκまたはλドメイン)と選択的にまたは優先的に結合する。したがって、本明細書で使用される「免疫グロブリン親和性リガンド」は、Fcドメイン、κドメイン、および/またはλドメインを有する供給流中または負荷流中の成分と選択的にまたは優先的に結合する。免疫グロブリン親和性リガンドは、一般的に、樹脂支持体などの固相に固定化される。樹脂支持体に結合させることができる本発明に係る免疫グロブリン親和性リガンドの例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：Fc親和性リガンド、例えば限定するものではないがプロテインA、プロテインG、プロテインA/G、およびそれらの類似体；ならびに、KappaSelect(商標)、LambdaFabSelect(商標)(GE Healthcare Life Sciences社, Upsala, SE)、およびそれらの類似体を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの他の定常ドメイン(例えばκドメインおよび/またはλドメイン)に結合する親和性リガンド。固相支持体材料に親和性リガンドを結合させる方法は、精製技術分野で周知である。例えば、Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Ed.), (Irl Pr: 1997); およびAffinity Chromatography, Herbert Schott (Marcel Dekker, New York: 1997)を参照されたい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、ある範囲内のパラメータの定義に関連する「 〜 の」という用語は、その範囲の端点を明確に含む。したがって、そのパラメータが「X〜Y」であると本明細書で定義される場合、そのパラメータは、数値がY未満またはY、すなわちY以下である限り、Xに等しいまたはXより大きい数値を有してもよいことが、明確に意図される。言い換えると、「X〜Yの」という語句によりおよび類似の構成により定義された数値は、数値XおよびYを明確に含むものとする。
【００３３】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は相互に交換可能に使用され、全てのこのような名称には子孫が含まれる。特に、本発明は、細胞、細胞株、および細胞培養物の生産物からの、関心対象の分子、すなわち二重特異性抗体の分離および/または精製を包含する。このような生産物には、一般に、馴化細胞培地ならびに/または溶解してホモジナイズした細胞および細胞培養物(例えば、馴化細胞培地内のホモジナイズした細胞および細胞成分)が含まれる。本発明の方法は、トランスジェニック細胞、細胞株、および細胞培養物からの生産物の処理に特に適しており、トランスジェニック細胞、細胞株、および細胞培養物は関心対象の分子を発現する。
【００３４】
本発明の方法は、関心対象の分子、例えば二重特異性抗体を、該分子を含有する溶液から分離、精製、および/または処理することに関係することが理解される。本発明の方法に係る関心対象の分子を含有する溶液には、クロマトグラフィー工程の供給流または負荷流、例えば、精製スキームの一環として、1つまたは複数のクロマトグラフィー単位操作にアプライされる供給流または負荷流が含まれる。したがって、関心対象の分子を含有する溶液が細胞培養用培地または細胞培養用培地の分画化部分もしくは清澄化部分である場合、そのような培地は(関心対象の分子を含むべく)必然的に馴化細胞培養用培地であることが理解される。したがって、本明細書で使用される「細胞培養液」という用語および類似の用語は、関心対象の分子を含むと予想される生物学的工程またはシステムの任意の溶液を指し、例えば、限定するものではないが、馴化細胞培養上清；清澄化した馴化細胞培養上清；清澄化したホモジナイズ/溶解細胞培養物などを含む。
【００３５】
特定の態様では、細胞培養用培地は、本明細書に開示される方法を実施する前に清澄化および/または滅菌される。本明細書で使用される「清澄化された」および「清澄化」という用語は、濾過滅菌および/または遠心分離を含めて、溶液からの粒子状物質の除去を指す。本明細書で使用される「滅菌された」という用語は、タンパク質を含む溶液に関連して使用されることが理解され；したがって、このような溶液の「滅菌」は、タンパク質の変性および/またはタンパク質の凝集を避けるために、熱によってではなく、好ましくは濾過および/または遠心分離によって行われることが理解される。典型的には、細胞培養用培地に関する「清澄化された」/「滅菌された」溶液とは、約0.45μm以下の細孔サイズ、好ましくは約0.22μm以下の細孔サイズの膜を通して濾過されている溶液である。
【００３６】
本明細書で使用する「クロマトグラフィー媒体」という用語は、当技術分野で周知のように、アプライされた負荷流体の1種または複数種の成分と選択的に結合することが可能な固相材料を指す。本発明は、特に、関心対象の分子、具体的には二重特異性抗体を処理するための、当技術分野で公知のおよび/または本明細書で定義されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体の使用を包含する。本発明の方法はさらに、二重特異性抗体の製造に特有の1種または複数種の副産物、すなわち二重特異性抗体特有副産物(「BASB」)から、関心対象の分子、すなわち二重特異性抗体を分離するための精製スキームの一環として、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーと1つまたは複数のさらなるクロマトグラフィー工程(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)との組み合わせを包含する。本発明の方法に従ってハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーと組み合わせることができるクロマトグラフィー単位操作の例には、限定するものではないが、カチオン交換、アニオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、π-π結合、金属親和性、および/または生体分子による特異的結合(例えば、免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、および酵素を含むアフィニティ樹脂)を介して負荷流体の1種または複数種の成分と選択的に結合する固相(例えば、樹脂)の使用を含むクロマトグラフィー単位操作が含まれる。固相は多孔質粒子、非多孔質粒子、膜、またはモノリスとすることができる。特定の二重特異性抗体の精製を成し遂げるために、これらの追加のクロマトグラフィー単位操作に適切な条件を開発すること、およびそれらを本明細書に開示された発明と統合させることは、当業者の能力の範囲内である。
【００３７】
本明細書で使用する「Fcドメイン」、「Fc領域」という用語および類似の用語は、IgG抗体のC末端領域、特に、IgG重鎖のCH2/CH3ドメインを含む、IgG抗体の重鎖のC末端領域を指す。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに変化し得るが、Fcドメインは、典型的には、IgG重鎖のアミノ酸残基Cys226付近からカルボキシル末端に及ぶと定義される。当技術分野で公知のように、Fc領域は、残りの抗体アーキテクチャとは無関係に、例えば、タンパク質タグとして機能するように第2のタンパク質に連結されて、または典型的にFc領域に関連する機能性(例えば、補体結合活性、FcRn結合など)を第2のタンパク質に付与するために、使用することができる。Fcドメインに連結される(例えば、限定するものではないが、化学的コンジュゲーションおよび組換え融合)、このような第2のタンパク質には、免疫グロブリンの断片が含まれる。当技術分野で認識されているように、このようなFcコンジュゲーションまたは融合を含むタンパク質では、Fc領域は、必ずしも、そのタンパク質鎖または発現されたアミノ酸配列のC末端領域である必要はない。
【００３８】
「副産物」という用語および類似の用語は、関心対象の分子の生産、すなわち二重特異性抗体の生産から特別に生じる、負荷流中または供給流中に存在する好ましくない分子を指し、該分子はクロマトグラフィー/精製工程の間にそこから分離されるべきである。二重特異性抗体特有副産物「BASB」という語句に関して、この用語は、二重特異性抗体の組換え生産に特有である、Fcドメインを含む副産物を指す。したがって、BASBは、Fcドメインを含む、二重特異性抗体の断片であってもよいか、または二重特異性抗体の分子量よりも大きい分子量を有するポリペプチドであってもよく、該ポリペプチドは、二重特異性抗体の2本の重鎖のうちの少なくとも一方を含み、かつFcドメインをさらに含む。発現される所望の二重特異性抗体型に応じて、本発明の方法に従って二重特異性抗体から分離され得る典型的なBASBとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：1/2抗体(1つの抗体軽鎖/重鎖対を含む)、3/4抗体(抗体重鎖のヘテロ二量体またはホモ二量体と単一の抗体軽鎖を含む) 、ならびに5/4抗体(抗体重鎖のヘテロ二量体またはホモ二量体(該重鎖の一方は本明細書で定義されるscFab-重鎖融合体であってももしくは該scFab-重鎖融合体でなくてもよい)、単一の抗体軽鎖、およびFabまたはscFab断片を含む)(図1参照)。
【００３９】
本発明の方法はまた、二重特異性抗体を含有する溶液からのBASB以外の不純物および/または汚染物質の分離を包含する。本明細書で使用される「不純物」、「汚染物質」という用語および類似の用語は、関心対象の分子を含有する負荷物/負荷流体中に存在する、関心対象の分子以外のDNA、RNA、またはタンパク質などの生体高分子を含む、外来または好ましくない分子を指す。不純物としては、例えば、以下が挙げられる：タンパク質変異体(本明細書で具体的に説明したBASB、凝集タンパク質、高分子量種、低分子量の種および断片、ならびに脱アミド化種を含むが、これらに限定されない)；精製される関心対象の分子を分泌する宿主細胞由来の他のタンパク質(宿主細胞タンパク質)；事前の精製段階の間に試料中に浸出する可能性があるアフィニティクロマトグラフィーに使用された吸着剤の一部であるタンパク質(例えば、プロテインA)；内毒素；ならびにウイルス。
[本発明1001]
Fcドメインを含む二重特異性抗体を、該二重特異性抗体を含む溶液から分離する方法であって、
(a) 該溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させる段階、
(b) 該二重特異性抗体を該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に吸着させる段階、および
(c) 塩化物イオンの存在下で該ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体から該二重特異性抗体を溶出する段階
を含み、
該溶液が、該二重特異性抗体の1種もしくは複数種の断片をさらに含み、該1種もしくは複数種の断片がFcドメインを含み、かつ/または
該溶液が、1種もしくは複数種のポリペプチドをさらに含み、該1種もしくは複数種のポリペプチドが、該二重特異性抗体の分子量よりも大きい分子量を有し、かつ該二重特異性抗体の2本の重鎖のうちの少なくとも一方を含み、該1種もしくは複数種のポリペプチドがFcドメインをさらに含む、方法。
[本発明1002]
段階(c)が、溶出画分を得ることを含み、該画分が、前記二重特異性抗体を含有するが、前記1種もしくは複数種の断片のうちの少なくとも1種を含有せず、かつ/または前記1種もしくは複数種のポリペプチドのうちの少なくとも1種を含有しない、本発明1001に記載の方法。
[本発明1003]
前記1種もしくは複数種の断片のうちの少なくとも1種が1/2抗体もしくは3/4抗体であり、かつ/または
前記1種もしくは複数種のポリペプチドのうちの少なくとも1種が5/4抗体である、
本発明1002に記載の方法。
[本発明1004 ]
前記溶出が、6.5〜7.5のpH、約1mM〜約20mMのリン酸イオン濃度、約0.001mM〜約0.5mMのカルシウムイオン濃度、および約10mM〜約200mMの塩化物イオン濃度を有する溶出緩衝液の存在下である、本発明1001〜1003のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1005]
前記溶出が、6.5〜7.5のpH、約10mMのリン酸イオン濃度、約0.1mMのカルシウムイオン濃度を有する溶出緩衝液の存在下であり、かつ塩化物イオンの濃度が、約50mMから約500mMまでの勾配で増加する、本発明1004に記載の方法。
[本発明1006]
前記勾配が、直線勾配、段階的勾配、または、直線-段階的勾配でのそれらの組み合わせである、本発明1005に記載の方法。
[本発明1007]
前記溶液が、抗体Fcドメインに対する特異性、抗体軽鎖のκドメインに対する特異性、および/または抗体軽鎖のλドメインに対する特異性を有するアフィニティクロマトグラフィー媒体の溶出液由来の二重特異性抗体含有画分またはプールされた二重特異性抗体含有画分を含む、本発明1001〜1006のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1008]
上流または下流のイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含み、該工程が、前記断片、前記ポリペプチド、および/または1/2抗体ホモ二量体のうちの少なくとも1種から前記二重特異性抗体を分離する、本発明1001〜1007のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1009]
前記イオン交換単位操作がカチオン交換単位操作である、本発明1008に記載の方法。
[本発明1010]
前記二重特異性抗体がCrossMab二重特異性抗体であるか、または該二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含む、本発明1001〜1009のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1011]
前記二重特異性抗体がknob-in-hole(KiH)二重特異性抗体である、本発明1001〜1010のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1012]
前記二重特異性抗体がCrossMabおよびKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはAng2およびVEGFに対する特異性を有する、本発明1001〜1011のいずれか一項に記載の方法。
[本発明1013]
前記二重特異性抗体の重鎖のうちの一方がscFabを含み、該二重特異性抗体がKiH二重特異性抗体であり、かつ該二重特異性抗体が、Ang2およびVEGFに対する特異性を有するか、EGFRおよびIGFRに対する特異性を有するか、またはTWEAKおよびIL17に対する特異性を有する、本発明1001〜1011のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】プロテインAクロマトグラフィーに続く、KiH-CrossMab抗EGFR/抗IGFR二重特異性抗体の生産培養上清の非還元CE-SDS分析。
【図２】図1で分析された二重特異性抗体組成物のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからの溶出プロファイル(280nmでのUV吸収によってモニターした)。溶出は、斜線で表される溶出緩衝液中のNaClの増加勾配(直線勾配)を用いて成し遂げられた。
【図３】図2の最初の溶出ピーク(左側のグレーのボックス)の非還元CE-SDS分析。
【図４】図2の2番目の溶出ピーク(右側のグレーのボックス)の非還元CE-SDS分析。
【図５】プロテインAクロマトグラフィーに続く、KiH/scFab二重特異性抗体の抗VEGF/抗Ang2の生産培養上清の非還元CE-SDS分析。
【図６】図5で分析された二重特異性抗体組成物のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからの溶出プロファイル(280nmでのUV吸収によってモニターした)。溶出は、段のある斜線で表される溶出緩衝液中のNaClの増加勾配(組み込まれた段を有する直線勾配)を用いて成し遂げられた。
【図７】図6の黒縦線の左側の最初の溶出ピークおよびプール画分の非還元CE-SDS分析。
【図８】図6の2番目の溶出ピーク(図6の黒縦線の右側の最初の溶出ピーク)の非還元CE-SDS分析。
【図９】ハイドロキシアパタイトカラムにロードする前にプロテインAクロマトグラフィーに供した、KiH/CrossMab二重特異性抗体の抗VEGF/抗Ang2の生産培養上清の、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからの溶出プロファイル(280nmでのUV吸収によってモニターした)。溶出は、斜線で表される溶出緩衝液中のNaClの増加勾配(直線勾配)を用いて成し遂げられた。
【図１０】プロテインAクロマトグラフィーに続く、KiH/scFab二重特異性抗体の抗EGFR/抗IGFRの生産培養上清の非還元CE-SDS分析。
【図１１】図10で分析された二重特異性抗体組成物のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからの溶出プロファイル(280nmでのUV吸収によってモニターした)。溶出は、段のある斜線で表される溶出緩衝液中のNaClの増加勾配(組み込まれた段を有する直線勾配)を用いて成し遂げられた。
【図１２】図11の2番目の溶出ピークの非還元CE-SDS分析。
【図１３】プロテインAクロマトグラフィーに続く、KiH/scFab二重特異性抗体の抗IL17/抗TWEAKの生産培養上清の非還元CE-SDS分析。
【図１４】図13で分析された二重特異性抗体組成物のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムからの溶出プロファイル(280nmでのUV吸収によってモニターした)。溶出は、段のある斜線で表される溶出緩衝液中のNaClの増加勾配(組み込まれた段を有する直線勾配)を用いて成し遂げられた。1番目、2番目、および3番目の溶出ピーク中の黒矢印は、その後CE-SDSで分析された画分を示す(図15および16に示され；3番目の矢印で示した画分の分析は図示せず)。
【図１５】図14の最初の溶出ピーク(1番目/最も左側の黒矢印)の非還元CE-SDS分析。
【図１６】図14の2番目の溶出ピーク(2番目/中央の黒矢印)の非還元CE-SDS分析。
【図１７】図13で分析された二重特異性抗体組成物のカチオン交換グラフィーカラムからの溶出プロファイル(280nmでのUV吸収によってモニターした)。溶出は、斜線で表される溶出緩衝液中のNaClの増加勾配(直線勾配)を用いて成し遂げられた。
【図１８】図17の最初の溶出ピークの非還元CE-SDS分析。
【図１９】図17の2番目の溶出ピークの還元CE-SDS分析。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
驚くべきことに、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、二重特異性抗体生産に特有の少なくとも1種の副産物(すなわち、少なくとも1種の二重特異性抗体特有副産物、「BASB」)から二重特異性抗体を分離するために使用できることが判明した。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、タンパク質精製工程において、凝集物、DNA、および内毒素などの不純物から高度の精製をもたらすことが示されているが、ごくわずかに異なるIEPを有する分子を分離することは実証されていない(例えば、Gagnon et al., Hydroxyapatite as a Capture Method for Purification of Monoclonal Antibodies, IBC World Conference and Exposition, San Francisco (2006)を参照されたい)。一般的に、二重特異性抗体およびBASBは、それらのIEP値がせいぜい0.5のpHしか異なっておらず、このことは、本発明および本教示以前には、イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離するにはあまりにも接近しすぎると考えられた。その結果、二重特異性抗体を精製する試みは、一般的に、二重特異的活性を有する分子の精製を確実にするために複数の高価なアフィニティ段階を使用することに依拠している。対照的に、本発明の方法は、二重特異性抗体および少なくとも1種のBASBを分離するための簡略化および/または改良された精製プロトコールを提供する。
【００４２】
本明細書で定義されるBASBは、Fcドメインを含む二重特異性抗体の断片、および/または二重特異性抗体より大きい分子量を有する二重特異性抗体のポリペプチド変異体であり、該ポリペプチド変異体は、二重特異性抗体の2本の重鎖のうちの少なくとも一方を含み、かつFcドメインをさらに含む。BASBの非限定的な例としては、1/2抗体、3/4抗体、および5/4抗体が挙げられる。したがって、開示されたハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、1種または複数種のBASBから二重特異性抗体を分離するのに一般的に不適切または不十分である既存の抗体精製スキームを補完することができる。本明細書に開示されるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、溶液から二重特異性抗体を分離/精製/単離するための任意の工程においても使用することができ、特に、溶液は1種または複数種のBASBを含む。本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含有する溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体および1種もしくは複数種のBASBの吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが1種または複数種のBASBを含有しない溶出画分を得ることを含む。本明細書に記載されるように、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含有する溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体の吸着に続いて、または二重特異性抗体および1種もしくは複数種のBASBの吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが1種または複数種のBASBを含有しない溶出画分を得ることを含み、1種または複数種のBASBは1/2抗体、3/4抗体、または5/4抗体である。特定の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは1/2抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体および1/2抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが1/2抗体を含有しない溶出画分を得ることを含む。関連するまたは代替の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは3/4抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体および3/4抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが3/4抗体を含有しない溶出画分を得ることを含む。さらなる関連するまたは代替の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは5/4抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体および5/4抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが5/4抗体を含有しない溶出画分を得ることを含む。さらなる関連するまたは代替の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは1/2抗体および3/4抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体、1/2抗体、および3/4抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが1/2抗体および3/4抗体の一方または両方を含有しない溶出画分を得ることを含む。さらなる関連するまたは代替の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは1/2抗体および5/4抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体、1/2抗体、および5/4抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが1/2抗体および5/4抗体の一方または両方を含有しない溶出画分を得ることを含む。さらなる関連するまたは代替の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは3/4抗体および5/4抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体、3/4抗体、および5/4抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが3/4抗体および5/4抗体の一方または両方を含有しない溶出画分を得ることを含む。さらなる関連するまたは代替の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1種または複数種(すなわち、少なくとも1種)のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するために使用することができ、1種または複数種のBASBは1/2抗体、3/4抗体、および5/4抗体であり、ハイドロキシアパタイト媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体、1/2抗体、3/4抗体、および5/4抗体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含有するが1/2抗体、3/4抗体、5/4抗体のうちの1つ、2つ、または全部を含有しない溶出画分を得ることを含む。
【００４３】
ハイドロキシアパタイト[HA]は、Ca10(PO4)6(OH)2の構造式を有するリン酸カルシウムの結晶性鉱物である。HA上のタンパク質反応性部位は、正に荷電したカルシウムイオンのペア(Cサイト)、および負に荷電したリン酸基のトリプレット(Pサイト)を含む。Cサイトは、タンパク質のカルボキシルクラスターによるHAカルシウムキレート化を介してタンパク質(二重特異性抗体およびBASBなど)と相互作用する。カルシウムキレート化および配位はカルシウムアフィニティとも呼ばれている。Pサイトは、正に荷電したタンパク質のアミノ酸残基とのホスホリルカチオン交換を介してタンパク質と相互作用する(例えば、US 2012/0077961を参照されたい)。産業上および商業上の設定では、HAは、タンパク質生産の副産物、例えばタンパク質凝集物、宿主細胞タンパク質、および宿主細胞DNAなどから、所望のタンパク質を、リン酸勾配を用いて、またはある状況下では塩化物勾配を用いて、分離する際に最もよく使用されている。しかし、Fc含有副産物の副産物は所望の産物(すなわち、完全抗体)と一緒に溶出すると考えられていたため、HAは、これらの副産物からの完全長抗体(例えば、Fcドメインを含む)の精製については考慮されていない。例えば、リン酸の存在下での塩化ナトリウムの使用は、IgGをHAにあまり強く結合させず、その結果、抗体の溶出だけでなくFc含有汚染物質の溶出ももたらすと以前に考えられていた。対照的に、本発明者らは、驚くべきことにリン酸の存在下での塩化ナトリウムの増加する濃度によって1種または複数種のBASBから二重特異性抗体を分離可能であることを見出した。
【００４４】
種々のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー担体は、市販されており、かつ当技術分野で日常的に使用されており、該担体のいずれも本発明の実施において使用することができる。これらには、セラミックハイドロキシアパタイト、ハイドロキシアパタイトゲル、ハイドロキシアパタイト樹脂、およびハイドロキシアパタイト粉末が含まれるが、これらに限定されない。セラミックハイドロキシアパタイトは、ナノ結晶が粒子に凝集されかつ高温で溶融されてクロマトグラフィーの用途に適した安定なセラミック微小球を形成している、ハイドロキシアパタイトの形態を指す。セラミックハイドロキシアパタイトの市販品の例としては、限定するものではないが、CHTタイプIおよびCHTタイプII(BIORad社, USA)が挙げられる。ハイドロキシアパタイト微小球は、一般に、10、20、40、および80マイクロメートルを含むがこれらに限定されない粒子サイズで入手可能である。ハイドロキシアパタイトゲルは、ゲル担体に埋め込まれた非セラミックハイドロキシアパタイトを含む製品を指す。ハイドロキシアパタイトゲルの非限定的な例は、ULTROGEL(商標)(Pall Corp., USA)であり、これは多孔性のアガロース微小球に埋め込まれた非セラミックハイドロキシアパタイトの微小破砕片(microfragment)を含む。平均粒子サイズを含み、本発明の方法に適している、ハイドロキシアパタイトの形態および/または種類の選択は、当業者の能力の範囲内であり、一般的な知識を用いて成し遂げられ、かつ/または日常の実験により決定される。
【００４５】
クロマトグラフィー法は、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の任意のセットアップに従って実施してもよい。クロマトグラフィー法の非限定的な例には、二重特異性抗体を含む溶液とクロマトグラフィー媒体が混合される、充填床カラム、流動床/膨潤床カラム、および/またはバッチ操作の使用が含まれる。好ましい態様では、カラムが結合-溶出モード/条件で操作される、ハイドロキシアパタイトの充填床カラムを用いて、本発明の方法を実施する。
【００４６】
本発明の方法は、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液(すなわち、「二重特異性抗体溶液」)から二重特異性抗体を分離する。本発明の方法は、精製されていないかもしくは部分精製されておりかつ/または濾過されているかもしくは濾過されていない二重特異性抗体溶液に適用可能である。二重特異性抗体溶液は天然供給源由来、合成供給源由来、または組換え供給源由来であり得る。精製されていない二重特異性抗体溶液は、限定するものではないが、以下を含む当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の任意の供給源に由来することができる：血漿、血清、腹水、乳、植物抽出物、細菌溶解物、酵母溶解物、細胞溶解物、組換え細胞溶解物、および馴化細胞培養用培地。本明細書で使用される「部分精製された溶液」とは、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程、濾過工程、分画工程、沈殿工程、もしくは当技術分野で公知の他の標準的な精製工程、またはこれらの任意の組み合わせによって処理された二重特異性抗体の溶液を含むがこれらに限定されない溶液を指すことができる。本発明は、本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法と、当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の他のクロマトグラフィー工程との組み合わせを包含し、他のクロマトグラフィー工程としては、限定するものではないが、サイズ排除、アフィニティ、アニオン交換、カチオン交換、疎水性相互作用、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、および混合モードクロマトグラフィー、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。
【００４７】
本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、1つまたは複数のアフィニティクロマトグラフィー法と組み合わせることができ、特に、抗体の定常ドメインに対する、例えば、限定するものではないが、抗体のFcドメインおよび/または抗体軽鎖のκもしくはλドメインに対する特異性を有するアフィニティ媒体を使用する(すなわち、それぞれ、Fc結合物質、κ結合物質、および/またはλ結合物質の使用を含む)アフィニティクロマトグラフィー法と組み合わされる。各種溶液から抗体(例えば、二重特異性抗体)を精製するための、定常ドメイン結合物質(例えば、Fc結合物質)に基づくアフィニティクロマトグラフィーは、当技術分野で周知であり、日常的に実施されている。
【００４８】
本明細書で使用される「Fc結合物質」という用語および類似の用語は、抗体(例えば、IgG抗体)のFc領域に結合することが可能な分子を指す。本発明の方法に従って使用され得る一般的なFc結合物質の非限定的な例としては、補体タンパク質、Fc受容体、細菌由来のタンパク質(プロテインAおよび/またはプロテインGなど)、およびこれらの組み合わせが挙げられる。典型的には、Fc結合物質は、重鎖のCH2/CH3領域内で抗体に、例えばIgGに結合する。好ましい態様では、本発明は、Fcドメイン/領域を含む二重特異性抗体を、二重特異性抗体を含有する溶液から分離することに指向している。より好ましい態様では、本発明は、Fcドメイン/領域を含む二重特異性抗体を、二重特異性抗体と少なくとも1種のBASB(必然的に、これもFcドメインを含む)とを含有する溶液から分離することに指向している。したがって、特定の態様では、本発明の方法に従ってハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に接触させる溶液は、Fc結合物質を含むアフィニティカラムから溶出されプールされた二重特異性抗体とBASBとを含有する画分を含む。
【００４９】
本明細書で使用される「抗体軽鎖定常ドメイン結合物質」という用語および類似の用語は、抗体(例えば、IgG抗体)の軽鎖に、特に、抗体軽鎖の定常領域に、例えば、軽鎖κ定常ドメイン/領域または軽鎖λ定常ドメイン/領域に、結合することが可能な分子を指す。本発明の方法に従って使用され得る一般的な抗体軽鎖定常ドメイン結合物質の非限定的な例としては、細菌由来のタンパク質(プロテインLなど)、および軽鎖に対する特異性を有する一本鎖抗体断片(例えば、KappaSelect(商標)およびLambdaFabSelect(商標)(GE Healthcare社, USA)などの市販製品)、ならびにこのような物質の組み合わせが挙げられる。一般的に、プロテインL、κ結合物質、およびλ結合物質は、軽鎖の定常領域内で抗体に、例えばIgGに結合する。特定の態様では、本発明は、抗体軽鎖定常ドメイン/領域を含む二重特異性抗体を、二重特異性抗体を含有する溶液から分離することに指向している。特定の態様では、本発明の方法に従ってハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に接触させる溶液は、抗体軽鎖定常ドメイン結合物質を含有するアフィニティカラムから溶出されプールされた二重特異性抗体含有画分を含む。
【００５０】
ほとんどの商業的精製の用途では、Fc結合物質および/または抗体軽鎖定常ドメイン結合物質(例えば、κ結合物質および/またはλ結合物質)は、カラム充填を可能にしかつ/またはアプライされた溶液からの親和性リガンド-標的分子(例えば、二重特異性抗体および少なくとも1種のBASB)の容易な分離を可能にするために、固相上に固定化される。固相は、例えば、限定するものではないが、ビーズ、アガロースマトリックス、シリカ、およびこれらの混合物を含むことができる。
【００５１】
本発明に係るハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、タンパク質、ペプチド、および/またはポリペプチド(例えば、抗体および二重特異性抗体)を精製するための当技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載の他の公知工程と組み合わせることができる。タンパク質/ペプチド/ポリペプチドの精製工程、特に、商業的な精製工程は、一般に、濾過、沈殿、および/またはクロマトグラフィーのような1つまたは複数の別個の工程/段階/方法を含む精製スキームを用いる。別個の工程/段階/方法は、当技術分野で公知のように、「単位操作」と呼ぶこともでき；したがって、「工程」、「段階」、「方法」、および「単位操作」という用語は、精製段階、例えばクロマトグラフィー法およびクロマトグラフィー単位操作に関連して本明細書で使用される場合、相互に交換可能である。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の精製方法/単位操作と組み合わせることができ、該精製方法/単位操作としては、限定するものではないが以下が挙げられる：微生物由来のタンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィー(例えば、記載したようなプロテインA、プロテインG、プロテインA/G、および/またはプロテインLアフィニティクロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、カチオン交換、アニオン交換、および混合モード交換クロマトグラフィー)、チオフィリック吸着(thiophilic adsorption)(例えば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを使用)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、ブチルセファロース、フェニルセファロース、アザ-アレノフィリック樹脂(aza-arenophilic resin)、またはm-アミノフェニルボロン酸を使用)、金属キレートアフィニティクロマトグラフィー(例えば、Ni(II)-、Zn(II)およびCu(II)-アフィニティ材料を使用)、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに分取電気泳動法(例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など)(Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。当技術分野で周知の精製段階または単位操作の追加の非限定的な例としては、以下が挙げられる：透析、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー(HCIC)、硫酸アンモニウム沈殿、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカッシング、およびゲル濾過。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法、および/または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の他の精製方法/単位操作との組み合わせは、宿主細胞核酸、内毒素、ウイルス、および本明細書で使用されるBASBという用語によって明示的に包含されない他の二重特異性抗体変異体を含むがこれらに限定されない、汚染物質および/または不純物から二重特異性抗体を分離するように十分に適合される。二重特異性抗体の生産由来の汚染物質とみなされるが、本明細書で使用するBASBという用語に包含され得ない二重特異性抗体の変異体の例は、重鎖/軽鎖ポリペプチドの対を含むホモ二量体である。このようなホモ二量体は、二重特異性抗体と同様の分子量およびアーキテクチャ(すなわち、「標準」IgGと同様のアーキテクチャ)を有するが、各可変ドメイ���は同一であり得る。このようなホモ二量体は、本明細書では1/2抗体ホモ二量体と呼ばれる。したがって、本発明によるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法は、単独であろうと当技術分野で公知の1つまたは複数の精製単位操作との組み合わせであろうと、二重特異性抗体と1/2抗体ホモ二量体とを含む溶液から二重特異性抗体を分離することができ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体への二重特異性抗体または二重特異性抗体および1/2抗体ホモ二量体の吸着に続いて、分離は、二重特異性抗体を含むが1/2抗体ホモ二量体を含まない溶出画分を得ることを含む。特定の態様では、本発明の方法は、二重特異性抗体と1/2抗体ホモ二量体とを含む溶液からの二重特異性抗体の分離を包含し、本方法は、本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法とカチオン交換クロマトグラフィー法(ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法の上流であってもまたは下流であってもよい)との組み合わせを含み、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法およびカチオン交換クロマトグラフィー法に続いて、分離は、二重特異性抗体を含むが1/2抗体ホモ二量体を含まない、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法またはカチオン交換クロマトグラフィー法の(それらが実施される順序に応じて)どちらか一方からの溶出画分を得ることを含む。
【００５２】
本明細書に開示されたクロマトグラフィー法は、商業規模での使用に十分に適応している。この方法は、バッチ操作もしくは連続操作でまたは半連続法で、例えば、所望の種を含有する溶液の連続流を基にして、実施され、大規模バッチ全体がこのように(例えば、濾過ステージの間に1回または複数回の任意の洗浄段階を介在させて)濾過されるまで、クロマトグラフィー単位操作を経ることができる。このようにして、連続サイクル工程を実施して、高収量の所望の生産物を、許容される純粋な形態で比較的短時間に得ることができる。
【００５３】
本発明に係る二重特異性抗体は、好ましくは、組換え手段によって生産される。抗体の組換え生産のための日常的な方法は、二重特異性抗体の生産に一般的に適応可能である。このような日常的な方法は最先端の水準で周知であり、原核または真核細胞でのタンパク質発現を含む(例えば、次の総説を参照されたい：Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202 (1999); Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880)。二重特異性抗体の組換え生産は、標準的な抗体の生産に比べて、対処しなければならない追加の懸念材料、特に、2本の異なる重鎖のヘテロ二量体化の促進、ならびに適切な重鎖可変ドメイン-軽鎖可変ドメインの対合の促進に関する懸念をかかえている。しかし、二重特異性抗体の良好な生産、例えば、適切なポリペプチド形成の促進は、最先端を行く最高の技術になっている。例えば、2本の異なる重鎖のヘテロ二量体化は、「knobs into holes」または「KiH」の手法を使用することで促進されることが示されている。KiH手法では、大きいアミノ酸の側鎖が一方の重鎖のCH3ドメインに導入され、その側鎖が他方の重鎖のCH3ドメインの適切に設計されたキャビティ内に収まる(例えば、Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681を参照されたい)。したがって、重鎖のヘテロ二量体は、どのホモ二量体よりも安定しており、発現されたポリペプチドの大きい割合を占める傾向がある。さらに、所望のFabドメインを形成するための所望の軽鎖/重鎖対の会合は、軽鎖と重鎖の間で定常領域をまたは定常領域および可変領域を「交換する」ように、二重特異性抗体(Fab領域)の1つの可変ドメイン(またはFabドメイン内の可変ドメイン-定常領域)を改変することによって誘導することができる。したがって、改変されたFabドメインでは、重鎖は、例えば、CL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖は、それぞれ、CH1-VLまたはCH1-VHドメインを含むであろう。これは、改変されたアームの重鎖/軽鎖と、標準/非改変アームの重鎖/軽鎖との相互作用を防止する。説明として、CLドメインを含む、改変アームのFabドメインの重鎖は、標準アームの軽鎖のCLドメインと相互作用しない(重鎖/軽鎖の「不適切な」対合を防止する)であろう。不適切な軽鎖/重鎖の会合を防止するためのこの技術は「CrossMab」技術と呼ばれており、KiT技術と組み合わせた場合、所望の二重特異性分子の著しく向上した発現をもたらす(例えば、Schaefer et al., PNAS 108(2011), 11187-11192)。代替的にまたは追加的に、抗体の一方のアームは、FabドメインがscFabまたはscFvであり、システム内にただ1つの「遊離」軽鎖を残すように、改変することができる。したがって、本発明は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載のいずれかの手段により生産された二重特異性抗体を包含する。
【００５４】
本発明の方法は、任意の二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液から二重特異性抗体を分離するのに適している。開示された方法に係る二重特異性抗体は、組換え免疫グロブリンであり得る。さらに、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト化免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン、ヒト免疫グロブリン、および/または免疫グロブリンコンジュゲートの断片を含むことができる。本発明の方法により分離および/または精製された二重特異性抗体は、治療用または診断用の二重特異性抗体であってよい。一態様では、二重特異性抗体は治療用の二重特異性抗体である。治療用二重特異性抗体の非限定的な例には、以下のうちの少なくとも1つまたは2つに対する特異性を有する二重特異性抗体が含まれる：EGFR、HER3、HER4、IGFR、Ep-CAM、CEA、TRAIL、TRAIL受容体1、TRAIL受容体2、リンホトキシンβ受容体、CCR4、CD3、CD19、CD20、CD22、CD28、CD33、CD40、CD80、CSF-1R、CTLA-4、細胞死受容体5(DR5)、IL-17、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、葉酸受容体1(FolR1)、ヘプシン、潜伏膜タンパク質1/2(LMP 1/2)、メラノーマ結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(MCSP)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、VEGF受容体1、VEGF受容体2、IGFl-R、TSLP-R、PDGF-R、TIE-I、TIE-2、TNF(TNF-α)、TNF様のアポトーシスの弱い誘導因子(TWEAK)、IL-IR、VEGF、EGF、PDGF、HGF、アンジオポエチン1および/または2(Ang1および/またはAng2)、ならびに本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の腫瘍抗原(例えば、増殖因子受容体および増殖因子)。
【００５５】
二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体と接触させるための準備において、通常は該媒体の化学的環境を平衡化することが必要である。これは、二重特異性抗体の該媒体への結合を可能にするのに適切なpH、導電率、および塩濃度を確立するために、該媒体を平衡化緩衝液と接触させることによって達成される。本発明に係る平衡化緩衝液は、約1mM〜20mMの濃度のリン酸塩、約10mM〜200mMの濃度の塩化物塩、および約0.01mM〜0.5mMの濃度のカルシウム塩を含むことができる。特定の態様では、本発明の方法に係る平衡化緩衝液は、リン酸塩、カルシウム塩、および塩化物塩を含む。本発明の方法に係る平衡化緩衝液は、約10mMの濃度のリン酸塩、約0.1mMの濃度のカルシウム塩、および約50mMの濃度の塩化物塩を含むことができる。本発明の方法に係る平衡化緩衝液は、約10mMの濃度のNaH2PO4、約0.1mMの濃度のCaCl2、および約50mMの濃度のNaClを含むことができる。
【００５６】
平衡化緩衝液はまた任意で、適切なpH制御を付与するための緩衝化合物を含んでもよい。緩衝化合物としては、限定するものではないが、MES、HEPES、BICINE、イミダゾール、およびTrisが挙げられる。非限定的な実施態様では、本発明の方法に係る平衡化緩衝液は、約6.5〜7.5のpHおよび約20mMの濃度のMESの存在下で、約10mMの濃度のリン酸塩、約0.1mMの濃度のカルシウム塩、および約50mMの濃度の塩化物塩を含むことができる。関連するまたは代替の非限定的な実施態様では、本発明の方法に係る平衡化緩衝液は、約6.5〜7.5のpHおよび約20mMの濃度のMESの存在下で、約10mMの濃度のNaH2PO4、約0.1mMの濃度のCaCl2、および約50mMの濃度のNaClを含むことができる。
【００５７】
ハイドロキシアパタイト媒体を平衡化した後、それは二重特異性抗体と少なくとも1種のBASBとを含む溶液に接触させることができる。二重特異性抗体および少なくとも1種のBASBは、一般的に、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体へのそれらの結合を可能にする条件で溶液中に存在する。当技術分野で公知のように、このような溶液は結合緩衝液と呼ぶことができる。結合緩衝液は、本明細書で定義したような平衡化緩衝液と同じ組成または異なる組成を有していてもよい。特定の実施態様では、結合緩衝液は、本明細書で説明した平衡化緩衝液について概説される基準に従って選択される。その結果、非限定的な実施態様では、本発明の方法に係る結合緩衝液は平衡化緩衝液と同じである。非限定的な実施態様では、結合緩衝液は、約6.5〜7.5のpHおよび約20mMの濃度のMESの存在下で、約10mMの濃度のリン酸塩、約0.1mMの濃度のカルシウム塩、および約50mMの濃度の塩化物塩を含むことができる。関連するまたは代替の非限定的な実施態様では、本発明の方法に係る結合緩衝液は、約6.5〜7.5のpHおよび約20mMの濃度のMESの存在下で、約10mMの濃度のNaH2PO4、約0.1mMの濃度のCaCl2、および約50mMの濃度のNaClを含むことができる。結合および溶出クロマトグラフィー法を含む一実施態様では、二重特異性抗体と1種または複数種のBASBとを含む溶液は、ハイドロキシアパタイト媒体を含有するカラムを通って流れ、二重特異性抗体または二重特異性抗体および1種もしくは複数種のBASBがカラムに(すなわち、ハイドロキシアパタイト媒体に)結合する。二重特異性抗体を含む溶液は、その後、通常は平衡化緩衝液および/または結合緩衝液と同じ組成の、洗浄緩衝液で洗浄されてもされなくてもよい。洗浄緩衝液は、使用する場合、カラムから1種または複数種の汚染物質を除去し得る。
【００５８】
少なくとも二重特異性抗体の結合および任意の洗浄に続いて、二重特異性抗体は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー媒体に結合された1種もしくは複数種のBASBを残す条件下で、ならびに/または二重特異性抗体および1種もしくは複数種のBASBが該媒体から別々に溶出する条件下で、該媒体から溶出される。溶出緩衝液は、導電率の値が低くなるような出発組成を有するように選択される。本明細書に開示された方法に適する低導電率値を有する溶液は、一般的に、約13mS/cmまたはそれ以下の値を有する。本明細書に開示された方法に適する低導電率値を有する溶液は、さらに、約10.6mS/cmもしくはそれ以下、または約8.5mS/cmもしくはそれ以下の導電率値を有することができる。低導電率値を有する溶出緩衝液の出発組成の非限定的な例は、6.5〜8.0のpHでの緩衝化合物(結合緩衝液および/または平衡化緩衝液に関連して本明細書で定義される)の存在下で、約1mM〜約20mMの範囲のリン酸イオン濃度、約0.01mM〜約0.5mMの範囲のカルシウム濃度、および約10mM〜約200mMの範囲の塩化物濃度を有する溶液を含む。本発明の方法に係る溶出緩衝液は、約6.5〜7.5のpHでの緩衝化合物(結合緩衝液および/または平衡化緩衝液に関連して本明細書で定義される)の存在下で、約10mMのリン酸イオン濃度、約0.1mMのカルシウム濃度、および約50mMの塩化物濃度を有する出発組成を有することができる。具体的な実施態様では、本発明の方法に係る溶出緩衝液は、6.5〜7.5のpHの20mM MESの存在下で10mM NaH2PO4、0.1mM CaCl2、および50mM NaClの出発組成を有する。本発明の方法は、もっぱら溶出緩衝液中の塩化物イオンの濃度を増加させることによって、ハイドロキシアパタイト媒体から二重特異性抗体を溶出させる。塩化物イオン濃度は、直線勾配、組み込まれた段階勾配(例えば、図6に示される、増加する塩化物イオンの組み込まれた段階勾配を参照)、またはこれら2つの勾配の組み合わせに従って増加させることができる。クロマトグラフィー媒体から二重特異性抗体を溶出するための、および/または1種もしくは複数種のBASBから二重特異性抗体を分離するための(すなわち、一方を該媒体に結合させたままにしながら他方を溶出するための)勾配の最適化は、本明細書に含まれる教示を考慮して、当業者の能力の範囲内である。塩化物イオンの濃度は、1種または複数種の塩化物塩の濃度を増加させることによって、溶出緩衝液中で増加させることができる。塩化物イオンの濃度を増加させるために溶出緩衝液に添加し得る塩化物塩の例としては、NaClおよびKClが挙げられる。特定の実施態様では、溶出緩衝液中の塩化物イオンの濃度は、NaClの濃度を増加させることによって増加される。好ましい態様では、溶出緩衝液の出発塩化物イオン濃度は、約50mMであり(1種または複数種の塩化物塩によって提供され得る)、その後溶出中に、二重特異性抗体を溶出するのに必要な濃度へと増加される。当業者は、当技術分野で公知の常法を用いて、また、本明細書に記載される教示および方法に従って、吸着された二重特異性抗体を溶出するのに必要な塩化物イオンの最大濃度を容易に決定することができる。特定の実施態様では、二重特異性抗体を溶出しかつ/または1種もしくは複数種のBASBから二重特異性抗体を分離するための塩化物イオンの最大濃度は、約200mM、約250mM、約300mM、約350mM、約400mM、または約500mMである。本発明の方法に係る典型的な溶出緩衝液は、約6.5〜7.5のpHで約10mM NaH2PO4、約50mM NaCl、約20mM MES、および約0.1mM CaCl2の出発組成を有し、塩化物イオンの濃度は、その後、溶出段階の間に、直線勾配、段階的勾配、または直線-段階的勾配によりNaClの濃度を約500mMにまで増加させることによって、増加される。
【００５９】
本明細書に記載した全ての特許および刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示唆するものである。本発明のいくつかの形態が例示されているが、それらが、本明細書に記載されかつ示された特定の形態または部品配置に限定されるべきでないことを理解すべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができ、本発明は本明細書に示されて記載されているものに限定されるものではないことが明らかであろう。本明細書に記載の本発明をさらに十分に理解することができるように、以下の非限定的な実施例が示される。
【実施例】
【００６０】
一般的方法
抗体発現
抗体はHEK293細胞(Invitrogen社)において一過的に発現させた。細胞のトランスフェクションは、細胞供給業者の指示に従って、抗体ベクターのMaxiprep(Qiagen社)製品、Opti-MEM I培地(Invitrogen社)、293fectin(Invitrogen社)、および無血清FreeStyle 293発現培地(Invitrogen社)中の1〜2×106個 生細胞/mLの初期細胞密度を使用して行った。振盪フラスコ内または撹拌型発酵槽内で7日間培養した後、抗体含有細胞培養上清を遠心分離により回収し、滅菌フィルター(0.22μm)を通して濾過した。上清は回収後直ちに処理するか、精製まで-80℃で保存した。
【００６１】
プロテインAアフィニティクロマトグラフィー
Fc領域/ドメインを含む分子は、プロテインA-セファロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって、滅菌濾過した培養上清から精製した(MabSelectSure-Sepharose(商標)(GE Healthcare社, スウェーデン))。簡単に説明すると、培養上清をPBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したプロテインAカラムに最初にアプライした。続いて、このカラムを平衡化緩衝液で洗浄し、抗体を25mMクエン酸ナトリウムpH3.0で溶出した。抗体画分をプールし、脱塩カラムを用いた10mM NaH2PO4、50mM NaCl、20mM MES、0.1mM CaCl2、pH6.5〜7.5への緩衝液交換によって、または透析によって、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー用に調製した。
【００６２】
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、MacroPrep CHTタイプIIハイドロキシアパタイト樹脂(BioRad社, USA)を用いて行った。そのハイドロキシアパタイト樹脂を10mM NaH2PO4、50mM NaCl、20mM MES、0.1mM CaCl2、pH6.5〜7.5で平衡化した後、上記のように調製した抗体負荷流体をカラムにアプライした。次いで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、結合された物質を10mM NaH2PO4、500mM NaCl、20mM MES、0.1mM CaCl2、pH6.5〜7.5への直線勾配または組み込まれた段を有する直線勾配で溶出した。溶出液(溶出画分)中のタンパク質濃度は、280nmでの吸光度によりモニターした(本明細書に示されるように、クロマトグラムとして提示される）。
【００６３】
CE-SDS分析
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前後に、二重特異性抗体、二重特異性抗体断片、および/または二重特異性抗体特有副産物の割合の測定を含めて、負荷および/または画分組成(推定分子量を含む)をドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動(CE-SDS)によって分析した。CE-SDSは、マイクロ流体Labchip技術(PerkinElmer社, USA)を用いて、製造業者の説明書に従って行った。簡単に説明すると、5μlの負荷流体(プレ-ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー；すなわち、プロテインAアフィニティカラムから溶出された溶出液(つまり抗体))およびハイドロキシアパタイトカラムからの溶出液を、HT Protein Express試薬キットを製造業者の説明書に従って用いてCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Expressチップを用いてLabChip GXIIシステムで分析した。データは、LabChip GXソフトウェアを用いて解析した。
【００６４】
実施例1：1/2抗体断片および二重特異性CrossMab EGFR-IGFRの分離
方法
抗EGFR/抗IGFR二重特異性抗体は、例えば、Schaefer et al., PNAS USA 108(2011), 11187-11192に記載された、CrossMabおよびknob in hole(KiH)の方法に従って設計した。その二重特異性抗体を発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィーを用いて培養上清から精製し、一般的方法で上述したようにCE-SDSにより分析した。
【００６５】
プロテインAアフィニティ精製に続いて、抗体含有溶液をハイドロキシアパタイトカラムにロードして、上記のように直線塩勾配で溶出した。
【００６６】
結果
プロテインAカラムから溶出された抗体含有画分をプールして、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー用の負荷流体を形成させ、タンパク質組成について分析した。CE-SDS分析により、負荷流体が2つの主要なタンパク質種を含むことが明らかになった。総タンパク質の約43％は約94kDの分子量を有するタンパク質であり、約33％は約160kDの分子量を有するタンパク質であった。これら2つのタンパク質種は、それぞれ1/2抗体断片(すなわち、単一重鎖と単一軽鎖を含む二重特異性抗体の断片)および「完全な」二重特異性抗体として同定された(図1)。
【００６７】
負荷流体は、ハイドロキシアパタイトカラムにアプライし、上記のような図2に斜めの線で表される直線塩勾配を用いて溶出した。図2はまた、280nmでのUV吸収によりモニターされたハイドロキシアパタイトカラムからの溶出プロファイルを示す。1/2抗体種は、より低い塩濃度で、所望の二重特異性抗体の共溶出をほとんど伴わずに、ハイドロキシアパタイトカラムから溶出した。すなわち、図2の左側のグレーのボックスで表されるプール画分中の総タンパク質の約92％は、1/2抗体副産物/汚染物質であり、4％未満が二重特異性抗体であることが判明した(CE-SDSにより測定、図3)。二重特異性抗体は第2のピークとして溶出した。すなわち、図2の右側のグレーのボックスで表されるプール画分中のタンパク質の約80％は、二重特異性抗体であることが判明した(CE-SDSにより測定、図4)。
【００６８】
これらの結果は、本発明の方法が少なくとも1/2抗体副産物/汚染物質からの二重特異性抗体の容易な分離を可能にすることを実証している。
【００６９】
実施例2：1/2抗体断片および二重特異性scFab Ang2-VEGFの分離
方法
実施例2は、以下を除いては実施例1の手法に従う：二重特異性抗体が、CrossMab法ではなくKiH法を用いて設計された抗Ang2/抗VEGF二重特異性抗体であったこと。その代わりに、Ang2特異的可変ドメインはscFabとして設計され、これは、本明細書に、例えば背景技術の項に、記載されるように、種々の軽鎖および重鎖可変ドメインの不適切な対合を防止した。さらに、プロテインA捕捉に続いて、抗体含有溶液は、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
【００７０】
結果
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が3つの主要なタンパク質種を含有することが明らかになった。すなわち、約16％は1/2抗体断片であり、約77％は所望の二重特異性抗体であり、かつ約6％は高分子量の凝集物であった(図5)。
【００７１】
この負荷流体をハイドロキシアパタイトカラムにアプライし、図6に段のある斜線で表される、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いて溶出した。図6はまた、280nmでのUV吸収によりモニターされたハイドロキシアパタイトカラムからの溶出プロファイルを示す。1/2抗体種は、二重特異性抗体よりもかなり低い塩濃度で溶出し、「完全な」二重特異性種およびより大きい凝集物から完全に分離することができた。低塩濃度で溶出するタンパク質種の100％は、1/2抗体断片であることが判明した(図7：図6の太い縦線の左側のプール画分の分析)。その後、塩濃度が増加するにつれて二重特異性抗体および抗体凝集物が別々に溶出した。二重特異性抗体を含むプール画分(図6の黒の実線の右側の最初のピークに相当する)は、約97％純度の二重特異性抗体であることが判明した(図8)。
【００７２】
これらの結果は、本発明の方法が少なくとも1/2抗体副産物/汚染物質ならびに5/4抗体副産物/汚染物質などの抗体凝集物からの二重特異性抗体の容易な分離を可能にすることを実証している。
【００７３】
実施例3：3/4抗体断片および二重特異性CrossMab Ang2-VEGFの分離
方法
実施例2を繰り返したが、CrossMab手法に従って設計した二重特異性Ang2-VEGF抗体を用いた。この場合も、プロテインA捕捉に続いて、抗体含有溶液は、直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
【００７４】
結果
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が、約7.8％の3/4抗体断片(すなわち、1本の軽鎖を欠く二重特異性抗体)および85％の二重特異性抗体を含むことが明らかになった(データは示さず)。
【００７５】
この負荷流体をハイドロキシアパタイトカラムにアプライし、図9に斜線で表される直線塩勾配を用いて溶出した。3/4抗体は、図9のピークの側方の画分中に濃縮された。例えば、画分C4(図9)は95％の二重特異性抗体と1.8％の3/4抗体とを含んでいた。画分D8は78％の二重特異性抗体と9.1％の3/44抗体とを含んでいた。したがって、これらの結果は、本発明の方法が少なくとも3/4抗体副産物/汚染物質からの二重特異性抗体の実質的な分離を可能にすることを実証している。
【００７６】
実施例4：1/2抗体断片および二重特異性scFab EGFR-IGFRの分離
方法
実施例4は、以下を除いては実施例2の手法に従う：二重特異性抗体を抗EGFR/抗IGFR二重特異性抗体としたこと。実施例2と同様に、二重特異性抗体は、CrossMab手法ではなくKiHを用いて設計され、IGFR抗原結合ドメインがscFabであった。抗体含有画分は、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
【００７７】
結果
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、実施例2について観察されたものと同様に、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が3つの主要なタンパク質種を含むことが明らかになった。すなわち、約25％は1/2抗体断片であり、約57％は所望の二重特異性抗体であり、かつ約14％は高分子量の凝集物であった(図10)。
【００７８】
この負荷流体をハイドロキシアパタイトカラムにアプライし、図11に段のある斜線で表される、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いて溶出した。1/2抗体種は低塩濃度で溶出し、二重特異性抗体および抗体凝集物は次第に高くなる濃度で別々に溶出した(図11)。二重特異性抗体の溶出ピーク由来のプール画分は、約97％の二重特異性抗体を含み、1/2抗体断片/副産物または凝集物由来の汚染はほとんどないことが判明した(図12)。したがって、段のある直線塩勾配は、1/2抗体断片/副産物と抗体凝集物の両方からの二重特異性抗体の容易な分離および精製を可能にした。
【００７９】
実施例5：5/4抗体および二重特異性scFab TWEAK-IL17の分離
方法
実施例5は、以下を除いては実施例2および3の手法に従う：二重特異性抗体を抗TWEAK/抗IL17二重特異性抗体としたこと。実施例2および3と同様に、二重特異性抗体は、CrossMab手法ではなくKiHを用いて設計され、TWEAK抗原結合ドメインがscFabであった。抗体含有画分は、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いてハイドロキシアパタイトカラムから溶出させた。
【００８０】
結果
プロテインAアフィニティクロマトグラフィーからプールされた抗体含有画分のCE-SDS分析により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の負荷流体が2つの主要なタンパク質画分を含むことが明らかになった。すなわち、約17％は5/4抗体種(おそらく余分なIL17軽鎖を含む)であったが、約68％は所望の二重特異性抗体の見かけの分子量を有する画分であった(図13)。その後の分析は、二重特異性タンパク質の見かけの分子量を有するタンパク質を含む画分が二重特異性タンパク質と、抗IL17重鎖/軽鎖対のホモ二量体との、すなわち、単一特異性または「標準」抗IL17抗体の等価物との混合物であることを明らかにした(データは示さず；還元条件下で行ったCE-SDSにより確認)。
【００８１】
この負荷流体をハイドロキシアパタイトカラムにアプライし、図14に段のある斜線で表される、組み込まれた段を有する直線塩勾配を用いて溶出した。二重特異性抗体およびホモ二量体は、より低い塩濃度で単一のピークとして共溶出した(図14および図15、最初のピーク参照)。5/4抗体は、より高い塩濃度で別個に溶出した(図14の3番目のピーク参照；4番目のピークはタンパク質凝集物である)。最初の溶出ピーク由来のプール画分は、二重特異性抗体とホモ二量体とのみを含むことが判明し、より高分子量の種由来、例えば5/4抗体由来の汚染は観察されなかった(図15)。同様に、5/4抗体に関係する溶出ピークのプール画分は、このタンパク質種が二重特異性抗体由来またはホモ二量体由来の検出可能な汚染物質なしに溶出することを明らかにした(図16)。したがって、段のある直線塩勾配は、少なくとも5/4抗体および/または関心対象の分子よりもほんのわずかに大きい分子量を有する副産物からの二重特異性抗体の容易な分離および精製を可能にした。
【００８２】
実施例6：ホモ二量体および二重特異性scFab TWEAK-IL17の分離
方法
実施例5は、本発明の方法によるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーが5/4抗体汚染物質から二重特異性抗体を分離することができることを実証したが；二重特異性抗体は、抗IL17重鎖/軽鎖対のホモ二量体(すなわち、「標準」または単一特異性抗IL17抗体に等しい)と共溶出した。ホモ二量体と二重特異性抗体の分離は、直線塩勾配を用いたPorosHS50カチオン交換クロマトグラフィーを使用して調べた。
【００８３】
結果
実施例5について報告したように、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー後の二重特異性scFab TWEAK-IL17の生産からの負荷流体は、3つのタンパク質種：二重特異性抗体、抗IL17ホモ二量体、および5/4抗体を含んでいた。負荷流体をカチオン交換クロマトグラフィーに供して、図17に示すように直線塩勾配を用いて溶出した。負荷流体由来のタンパク質は2つのピークで溶出した(図17)。最初のピークのプール画分のCE-SDS分析により、それらが二重特異性抗体と5/4抗体種とを含むことが明らかになった(実施例5および図18(非還元条件下でのCE-SDS)参照)。2番目のピークのプール画分のCE-SDS分析により、それらがもっぱらIL-17ホモ二量体を含むことが明らかになった(図19参照、還元条件下でのCE-SDS)。したがって、カチオン交換カラムの使用は、ホモ二量体分子からの二重特異性抗体および/または5/4抗体汚染物質種の容易な分離を可能にした。実施例5は、共溶出した二重特異性抗体および5/4抗体汚染物質がその後、本明細書に記載するようなハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて容易に分離できることを示している。実施例5および6の結果の差は、本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法が、当技術分野で公知の従来の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーとは異なる、独特のクロマトグラフィーツールをもたらすというさらなる証拠を提供する。したがって、本明細書に記載のハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを、任意で他のクロマトグラフィー法と組み合わせて、使用することは、二重特異性抗体生産に特有の副産物からの二重特異性抗体の分離を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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