(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＡ及びＢブロックコポリマーを含むコポリマーに基づく組成物であって、
−  Ａブロックが、ポリエステルであり、
−  Ｂブロックが、ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）であり、
−  前記Ｂブロックの重量による分子質量が、６７．５kDa〜１６５kDaであり、そして、
−  エチレンオキシド単位／エステル単位モル比が、０．５〜５である組成物。
【請求項２】
前記Ａ及びＢブロックコポリマーが、ＡＢジブロックコポリマー、並びにＡＢＡ及びＢＡＢトリブロックコポリマー、並びにこれらの混合物から選択される、請求項１記載のコポリマーに基づく組成物。
【請求項３】
前記コポリマー中の前記Ｂブロックの重量による分子質量が、７２〜１３７．５kDa、より好ましくは、８１〜１２６．５kDa、更により好ましくは、９０kDa〜１２１kDaである、請求項１又は２記載のコポリマーに基づく組成物。
【請求項４】
エチレンオキシド単位／エステル単位比が、１〜３である、請求項１〜３のいずれか一項記載のコポリマーに基づく組成物。
【請求項５】
前記Ａブロックが、特に、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、及びポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）から選択されるポリ（乳酸）である、請求項１〜４のいずれか一項記載のコポリマーに基づく組成物。
【請求項６】
ＰＬＬＡが、前記Ａブロックの少なくとも５０重量％、好ましくは、前記Ａブロックの７５重量％〜１００重量％に相当する、請求項５記載のコポリマーに基づく組成物。
【請求項７】
医療用途、好ましくは、子宮内癒着の予防を意図する、請求項１〜６のいずれか一項記載のコポリマーに基づく組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載のコポリマー組成物を形成することによって得られる抗接着材料。
【請求項９】
押出成形、溶媒蒸発、ホットプレス、又は３Ｄ印刷によって形成される、請求項８記載の抗接着材料。
【請求項１０】
水性媒体中で、１〜２０、好ましくは３〜１５、より好ましくは少なくとも４に等しい
膨潤比を有するフィルムの形態である、請求項８又は９記載の抗接着材料。
【請求項１１】
前記コポリマーが、水性媒体中で、２〜２０日間、好ましくは３〜１５日間の滞留時間
後に分解される、請求項８〜１０のいずれか一項記載の抗接着材料。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項記載の抗接着材料を含む、子宮内癒着を予防するための
医療用具。
【請求項１３】
前記抗接着材料が、輪郭にぴったりとくっつき、そして、子宮腔の壁と並置されるよう
に、子宮腔内で展開されることを意図する台形フィルムの形態である、請求項１２記載の
医療用具。
【請求項１４】
前記抗接着材料を子宮腔に挿入するための手段を含む、請求項１２又は１３記載の医療
用具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエステル及びポリオキシエチレンブロックに基づくジブロック及び／又はトリブロックコポリマーの新規組成物、並びに組織接着、そして、より具体的には子宮内の接着又は癒着の予防に特に適した抗接着材料を製造するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
子宮内の癒着又は接着は、最も重篤な場合、アッシャーマン症候群としても知られており、子宮頸部及び／又は子宮の体壁の部分的又は全体的な接着からなる。これらは、慢性腹痛及び月経困難症を伴うことが多く、そして、着床不全に起因する機械的不妊につながることがある。子宮内癒着は、例えば、帝王切開、子宮内膜切除、出産又は流産後の掻爬等、子宮腔において実施される外科手技に起因する場合が最も多いことが今日では認識されている。
【０００３】
一旦診断されると、子宮内癒着は、一般的に、線維性癒着ブリッジ（fibrous synechia bridges）を切開するために子宮腔に導入されるマイクロシザーを使用して、子宮鏡下手術によって処置される。しかし、癒着の再形成率は依然として比較的高く、そして、重篤な癒着の場合、４０％超に達する場合さえある。
【０００４】
現在、癒着の予防については殆ど又は全く進歩していない。解決策は、組織接着を予防するために、リスクのある患者の子宮腔に物理的障壁を配置することに存し得る。しかし、現在までに開発されている製品は、満足のゆくものではない。
【０００５】
したがって、外科手技後に子宮壁に沈着させるヒアルロン酸及び／又はポリエチレングリコールに基づくゲル（Nordic Pharma製のHyalobarrier（登録商標）、Covidien製のSprayShield（登録商標））が開発されている。しかし、特にそのガレヌス性（galenic）ゲル形態が原因で、これら製品は非常に速やかに排出され、そして、子宮内滞留時間が平均して２４時間よりも短い。しかし、癒着は、子宮外傷の発生後１〜８日以内に生じることが知られている。したがって、これらゲルの排出が速すぎると、十分に作用して線維性癒着ブリッジの形成を防ぐことができなくなる。
【０００６】
カルボキシメチルセルロース／グリセロール基材と結合している合成ヒアルロン酸で構成されるフィルムも開発されている（Genzyme製のSeprafilm）。開腹手術における術後接着を予防するためにこの種のフィルムを一般的に用いる場合、子宮内癒着について満足のゆくものではない。実際、前記フィルムの形態及び機械的特性によって、子宮頸部を介して子宮腔にそれを導入するのが困難又は不可能になる。
【０００７】
また、特に腹部における癒着を予防するための抗接着フィルムを形成するために用いられる、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及び分子量６，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づくコポリマーを含む組成物が、米国特許第７，２０２，２８１号から知られている。しかし、子宮内癒着を予防する状況において、このようなフィルムは満足のゆくものではない。
【０００８】
したがって、子宮腔に容易に配置することができ、そして、その物理的及び化学的特性によって、特に子宮腔において外科手技を受けた患者における癒着の形成を予防することが可能になる製品が真に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この状況において、本発明者らは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）等のポリエステルブロック及び高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックに基づくコポリマーを使用することによって、子宮腔内における癒着の形成を予防するために子宮腔において使用するのに特に適している、表面の抗接着、膨潤、及び再吸収の特性を併せ持つ材料を生成できることを見出した。したがって、本発明者らは、「乾燥」形態で子宮頸部を介して容易に配置することができる寸法を有し、そして、一旦子宮腔に入ると、湿潤し、そして、展開して子宮腔の輪郭にぴったりとくっつく、このような材料で作製される医療用具を開発した。実際、本発明に係る材料は、水性媒体中で「乾燥」形態に比べて約１０倍まで体積が増加し得る膨潤比を有する。更に、この材料の崩壊時間は、一般的に、５〜２０日間であり、このことによって、線維性癒着ブリッジの形成を予防するために医療用具の子宮腔における十分な滞留時間を保証するだけではなく、特に次の月経周期中に前記医療用具を確実に自然に排出することも可能になる。
【００１０】
したがって、本発明は、少なくとも１つのコポリマーブロックＡ及びＢを含むコポリマーに基づく組成物であって、
−  Ａブロックが、ポリエステルであり、
−  Ｂブロックが、ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）であり、
−  前記Ｂブロックの重量による分子質量が、５０kDa以上であり、そして、
−  エチレンオキシド単位／エステル単位モル比が、０．５〜５である組成物に関する。
【００１１】
有利には、コポリマー中のＢブロックの分子質量は、約５０kDa〜約３００kDaである。特定の実施態様では、ＰＥＧの分子質量は、約７５kDa〜約１５０kDa、好ましくは、約８０〜約１２５kDa、より好ましくは、約９０〜約１１５kDa、更により好ましくは、約１００kDa〜約１１０kDaである。
【００１２】
好ましくは、本発明に係る組成物は、Ａ及びＢブロックコポリマーのみで構成される。特定の実施態様では、該組成物は、ＡＢＡトリブロックコポリマーを含む。別の実施態様では、該組成物は、ＡＢＡトリブロックコポリマーのみで構成される。
【００１３】
本発明は、また、このようなコポリマーに基づく組成物を形成することによって得られる抗接着材料に関する。本発明に係る材料は、特に組織接着を予防するため、そして、より具体的には、子宮内癒着を予防するための医療用途に特に適している。該材料は、特に、フィルム又はチューブの形態を有していてよい。
【００１４】
本発明は、また、前記抗接着材料を含む子宮内癒着を予防するための医療用具に関する。有利には、該医療用具は、患者の子宮腔に前記材料を導入し、そして、放出することができる、前記材料を挿入するための手段を更に含む。
【００１５】
同様に、本発明は、リスクのある患者における組織接着、特に、子宮内癒着を予防するための、このような組成物、このような材料、及び／又はこのような医療用具の使用に関する。例えば、本発明に係る材料は、帝王切開、妊娠中絶、又は癒着を引き起し得る任意の子宮内外科手技、例えば、特に筋腫摘出術による子宮筋腫の両側切除等を受けたばかりの患者において体系的に使用することができる。
【００１６】
本発明は、また、リスクのある患者において子宮内癒着を予防する方法であって、前記患者の子宮腔に、少なくとも１つのＡ及びＢブロックコポリマーを含むコポリマーに基づく組成物から生成される抗接着材料を導入し、ここで、
−  Ａブロックが、ポリエステルであり、
−  Ｂブロックが、ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）であり、
−  前記Ｂブロックの分子質量が、５０kDa以上であり、そして、
−  エチレンオキシド単位／エステル単位モル比が、０．５〜５である方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、エチレンオキシド／乳酸（ＥＯ／ＬＡ）モル比が３であるＰＬＡ−ＰＥＧ ９５kDa−ＰＬＡトリブロックコポリマー（以後、コポリマーＰ４）を含む本発明に係る材料、及び２つのコントロール（ＴＣＰＳ及びＰＬＡ５０）に対して実施した細胞接着試験中に得られた結果を示す。蛍光値（ＡＵ ６１５nm）は、ｔ＝４５分及びｔ＝３時間においてフィルムに接着している細胞の量を反映している。用いた細胞は、医療用具のインビトロ評価に一般的に用いられるマウス線維芽細胞株（Ｌ９２９）である（図１ａ）。図１ｂは、本発明に係る２つの材料、すなわち、コポリマーＰ４及びＥＯ／ＬＡモル比が１であるＰＬＡ−ＰＥＧ ９５kDa−ＰＬＡトリブロックコポリマー（以後、コポリマーＰ３）、並びに市販の抗接着材料であるSeprafilm、並びに２つのコントロール（ＴＣＰＳ及びＰＬＡ５０）に対して実施した細胞接着試験中に得られた比較結果を示す。蛍光値（ＡＵ ６１５nm）は、ｔ＝４５分、ｔ＝１．５時間、及びｔ＝３時間においてフィルムに接着している細胞の量を反映している。用いた細胞は、ヒト子宮内膜細胞である（図１ｂ）。
【図２】図２は、コポリマーＰ４から生成された本発明に係る材料、及びＥＯ／ＬＡモル比が１であるＰＬＡ−ＰＥＧ ９５kDa−ＰＬＡトリブロックコポリマー（以後、コポリマーＰ３）を含む本発明に係る第２の材料、並びに２つのコントロール（ＴＣＰＳ及びＰＬＡ５０）に対して実施した細胞増殖試験中に得られた結果を示す。蛍光値は、１、２、及び３日目におけるフィルム上で増殖した細胞の量を反映している。用いた細胞は、医療用具のインビトロ評価に一般的に用いられるマウス線維芽細胞株（Ｌ９２９）である。
【図３】図３は、ヒト子宮内膜細胞と直接接触している、コポリマーＰ４に基づく材料、コポリマーＰ３に基づく材料、及び３つのコントロール（ＴＣＰＳ、ポジティブコントロール、及びＰＬＡ５０）に対して実施した細胞毒性試験中に得られた結果を示す。２４時間における吸光度値は、細胞溶解レベルを反映している：細胞毒性試験。コポリマーＰ４及びコポリマーＰ３対ポジティブコントロールＰ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。
【図４】図４（図４ａ、４ｂ、及び４ｃ）は、ホットプレスによって形成されるコポリマーＰ４、コポリマーＰ３に基づく本発明に係る材料、又はＰＬＡ５０の膨潤特性を示す。図４ａは、経時的な前記材料の水取り込み率を示し、図４ｂは、対応する表面積の増加率を示し、そして、図４ｃは、対応する体積の増加率を示す。
【図５】図５は、水に浸漬する前（図５ａ及び５ｂ）及び様々な浸漬時間、ｔ＝２分〜ｔ＝２４時間（図５ｃ〜５ｈ）における、巻き取られたコポリマーＰ４に基づく本発明に係る組成物から生成されたフィルムのストリップの展開能を示す。これら写真によって、フィルムの長さ及び厚みの増加を可視化することができる：５ａ．巻き取られたストリップの全直径（４，７２４μm）、５ｂ．膜の厚み（４６３μm）。５ｃ．ｔ＝０における長さ（４，７８４μm）；５ｄ．ｔ＝２分における長さ（５，６２５μm）；５ｅ．ｔ＝７分における長さ（７，８１８μm）；５ｆ．ｔ＝１５分における長さ（９，６５５μm）；５ｇ．ｔ＝４５分における長さ（１０，４０９μm）；５ｈ．ｔ＝２４時間における長さ（１０，６３４μm）。
【図６】図６は、水で満たされた子宮腔を模倣するモデルに挿入中の、コポリマー組成物Ｐ４から生成された本発明に係るフィルム（Ｐ４フィルム）が挿入されているＩＵＤアプリケータの写真である。
【図７】図７は、ｔ＝０分（図７ａ）、ｔ＝１分（図７ｂ）、ｔ＝３分（図７ｃ）、ｔ＝５分（図７ｄ）、及びｔ＝８分（図７ｅ）における、図６の腔モデルに放出されたＰ４フィルムの展開の進行を示す。
【図８ａ】図８は、機械的に振盪しながら３７℃のＰＢＳに浸漬したときの、コポリマーＰ４フィルム及びコポリマーＰ３フィルムのレオロジー特性を示す。図８ａは、固定周波数（１Hz）変形域を適用するときの、５分間浸漬した後のコポリマーＰ３及びＰ４フィルムの弾性係数Ｇ’及び粘性係数Ｇ’’を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、２日間及び２１日間浸漬した後のコポリマーＰ４及びＰ３についての、（０．０５％変形における）周波数の関数としての弾性係数（Ｇ’）及び粘性係数（Ｇ’’）の変動を示す。
【図８ｃ】図８ｃは、コポリマーＰ４及びＰ３についての、様々なインキュベート時間における弾性係数（Ｇ’）を示す。
【図８ｄ】図８ｄは、剪断速度の関数としての、３０日間インキュベートした後のコポリマーＰ４の応力及び４０日間インキュベートした後のコポリマーＰ３の応力を示す。
【図９】図９は、水性媒体中でインキュベートしたときの、コポリマーＰ４、コポリマーＰ３に基づく本発明に係る材料から生成された２つのフィルム、及びＰＬＡ５０のフィルムの質量減少率を示す。この図は、経時的な前記材料の質量減少の進行を示し、９０日間インキュベートした後にコポリマーＰ３及びＰ４フィルムは完全に可溶化する。
【図１０】図１０は、様々な時点ｔ＝２４時間（図１０ａ）、ｔ＝５日（図１０ｂ）、ｔ＝１２日（図１０ｃ）、ｔ＝２２日（図１０ｄ）、及びｔ＝４０日（図１０ｅ）におけるコポリマーＰ４に基づく本発明に係る材料から生成されたフィルムの水性媒体中における分解、並びにｔ＝２４時間（図１０ａ’）、ｔ＝３０日（図１０ｂ’）、及びｔ＝６０日（図１０ｃ’）におけるコポリマーＰ３に基づく材料の分解を示す。フィルムの写真は、フィルムがほぼ完全に崩壊するまでの、フィルムの崩壊の進行を示す。
【図１１】図１１は、サイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリングした、コポリマーＰ４に基づく本発明に係る材料から生成されたフィルムの水性媒体中における分解を示す。
【図１２】図１２は、様々な時点ｔ＝０（図１２ａ）及びｔ＝２日（図１２ｂ）におけるコポリマーＰ４に基づく本発明に係る材料から生成されたフィルムのインビボにおける分解、並びに様々な時点ｔ＝０（図１２ａ’）、ｔ＝１２時間（図１２ｂ’）、ｔ＝２日（図１２ｃ’）、ｔ＝５日（図１２ｄ’）、及びｔ＝１２日（図１２ｅ’）におけるコポリマーＰ３に基づく本発明に係る材料から生成されたフィルムのインビボにおける分解を示す。
【図１３】図１３は、腹膜と盲腸との間の接着を形成するために、腹膜に傷をつけ、そして、盲腸漿膜を擦過した１２日後のラットの腹腔の状態を示す。図１３ａは、抗接着処置又は剤を適用しなかった手術の１２日後の盲腸及び腹膜の接着を示す（コントロールラット）。図１３ｂは、コポリマーＰ４に基づく本発明に従って生成されたフィルムを適用した手術の１２日後の接着のない腹腔の状態を示す。図１３ｃは、コポリマーＰ３に基づく本発明に従って生成されたフィルムを適用した手術の１２日後の接着のない腹腔の状態を示す。
【図１４】図１４は、膨潤及び展開後にその輪郭にぴったりとくっつくことができるので、ヒト子宮腔において使用するのに特に適している、台形状の本発明に係る抗接着フィルムの概略図である。
【図１５】図１５は、子宮腔に抗接着材料を挿入するための手段を含む、本発明に係る医療用具の実施態様の一例の概略図の長手方向断面である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明者らは、医療分野における使用、特に、子宮内癒着の予防に特に適している機械的特性及び化学的特性を有する、ポリエステルブロック及び高分子量ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）ブロックに基づくブロックコポリマーを含む組成物を開発した。実際、該組成物の膨潤及び展開特性は、抗接着特性及び数日間で分解される特性と合わせて、子宮腔内において一時的に使用して子宮壁の接着を確実に予防することを可能にする。
【００１９】
組成物
本発明は、少なくとも１つのＡ及びＢブロックコポリマー（Ａは、ポリエステルであり、そして、Ｂは、ポリオキシエチレン（ＰＥＧ）である）を含むコポリマーに基づく組成物であって、該コポリマー中のＢブロックの分子質量が５０kDa以上であり、そして、エチレンオキシド単位／エステル単位モル比が０．５〜５である組成物に関する。
【００２０】
本発明の状況において、「ｘ〜ｙ」という表現は、値ｘ及びｙを含むことを意味する。
【００２１】
本発明によれば、「ポリエステル」という用語は、その主鎖の反復単位がエステル官能基を含有し、そして、医療分野で用いることができる任意のポリマーを指す。特に、「ポリエステル」とは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリブチロラクトン（ＰＢＬ）、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、及びこれらのコポリマー等の脂肪族ポリエステルを意味する。
【００２２】
好ましい実施態様では、ポリエステル（Ａブロック）は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、及びこれらのコポリマーから選択される。
【００２３】
好ましくは、前記組成物中に存在するポリエステルは、非架橋形態である。
【００２４】
ポリ（乳酸）は、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、又はポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）であってよい。ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）が有利に用いられる。この場合、ポリマーは、好ましくは少なくとも５０％、特に、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％のＬ−乳酸を含む。実際、Ｄ−乳酸に対するＬ−乳酸の割合を変更することによって、Ａ及びＢブロックコポリマーの分解速度を調整することができる。Ｌ−乳酸のレベルを増加させることによって、該コポリマーの分解速度を減速させることができる。本発明の特定の実施態様では、前記組成物は、Ａブロックとして１００％ ＰＬＬＡを含む。
【００２５】
本発明によれば、用いるＰＥＧは高分子量を有するので、前記コポリマー中のＰＥＧの総分子量は、５０kDa以上である。実際、本発明者らは、ＰＥＧが５０kDa以上、好ましくは７５kDa超、より好ましくは１００kDa以上の分子量を有するコポリマーによって、抗接着フィルム又は膜の形態における医療用途の状況において、特に有利なフィルム形成特性を前記組成物に付与するのが可能になることを見出した。「フィルム形成特性」とは、前記組成物が均質な連続フィルムを形成できることを意味する。より具体的には、これらフィルム形成特性によって、前記組成物が経時的に特に安定かつ均質になり、そして、水性媒体中で良好な性能を有するフィルムが形成される。
【００２６】
本発明の状況において、「分子質量」及び「分子量」という用語は、特に指定しない限り、重量平均分子量（Ｍｗ）を示すために互換的に用いられる。本発明によれば、Ｍｗは、標準レンジのポリ（エチレングリコール）を用いて、分析溶媒としてのジメチルホルムアミド中で実施されるサイズ排除クロマトグラフィーによって求められる。
【００２７】
有利には、コポリマー中のＰＥＧの総分子質量は、約５０〜約３００kDaである。例えば、ＰＥＧブロックは、約５０kDa、７５kDa、１００kDa、１２５kDa、１５０kDa、２００kDa、２２５kDa、２５０kDa、２７５kDa、又は３００kDaの分子質量を有する。特定の実施態様では、用いるＰＥＧブロックは、約７５kDa〜約１５０kDa、好ましくは、約８０〜約１２５kDa、より好ましくは、約９０〜約１１５kDa、更により好ましくは、約１００kDa〜約１１０kDaの分子質量を有する。特定の実施態様では、用いるＰＥＧブロックは、９５〜１０５kDaの分子質量を有する。
【００２８】
本発明によれば、用いるＰＥＧブロックは、有利には、クロロホルム中２５℃で、濃度１g/Lにて、Ubbelohde型毛細管粘度計によって測定したとき、０．０４mg/mL〜０．６mg/mL、好ましくは０．０８mg/mL〜０．５mg/mL、更により好ましくは０．１mg/mL〜０．３mg/mLの固有粘度を有する。
【００２９】
有利には、本発明に係るコポリマーに基づく組成物は、ＡＢジブロック、又はＡＢＡ若しくはＢＡＢトリブロックコポリマー、あるいはこれらの混合物、特に、［ＡＢＡ及びＢＡＢ］、［ＡＢ及びＡＢＡ］、［ＡＢ及びＢＡＢ］、［ＡＢＡ及びＢＡＢ及びＡＢ］を含む。好ましくは、前記組成物は、Ａ及びＢブロックコポリマーのみを含む。特定の実施態様では、本発明に係る組成物は、ＡＢＡ又はＢＡＢトリブロックコポリマーのみ、好ましくは、ＡＢＡトリブロックコポリマーのみを含む。本発明によれば、ＡＢ及び／又はＡＢＡコポリマーの組成物では、各ＰＥＧブロックは、５０kDa以上、有利には、約５０〜約３００kDa、好ましくは、約７５kDa〜約１５０kDa、好ましくは、約８０〜約１２５kDa、より好ましくは、約９０〜約１１５kDa、更により好ましくは、約１００kDa〜約１１０kDa、又は９５〜１０５kDaの分子質量を有するが、ＢＡＢコポリマーを含む組成物では、前記コポリマー中のＰＥＧブロックの分子質量の合計は、５０kDa以上、有利には、約５０〜約３００kDa、好ましくは、約７５kDa〜約１５０kDa、好ましくは、約８０〜約１２５kDa、より好ましくは、約９０〜約１１５kDa、更により好ましくは、約１００kDa〜約１１０kDa、実際には、９５〜１０５kDaである。
【００３０】
本発明の状況において、モル比は、Ａ及びＢブロックの各反復単位のモル比を表す。Ｂブロックは、ＰＥＧであり、反復単位は、エチレンオキシド（「エチレンオキシド単位」又はＥＯ）であるが、一方、Ａブロックの反復単位（「エステル単位」）は、乳酸単位等のカルボン酸である。本発明によれば、前記組成物のコポリマー中のＥＯ／エステル単位モル比は、０．５〜５、好ましくは約１〜３である。該モル比は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ：ＣＨ（ＰＬＡ）：５．１ppm；ＣＨ２（ＰＥＧ）：３．５ppm；ＣＨ３（ＰＬＡ）：１．５ppm コポリマーに特徴的なピークの化学シフトを同定することが可能な、コポリマーの重水素化クロロホルム中のプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルから測定される。コポリマーのＥＯ／エステル単位モル比、特にエチレンオキシド単位／乳酸単位（ＥＯ／ＬＡ）モル比が約１〜３である組成物は、水性媒体中で体積が１０倍まで増加するような膨潤及び展開特性を有し、それによって、これら組成物は、子宮内癒着を予防するための医療用途に特に適したものになる。ＥＯ／ＬＡモル比が約３である組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の水性媒体中において、約５〜２０日以内に分解するＥＯ／ＬＡモル比が約１である組成物よりも短い時間、すなわち、約３〜５日以内に分解される。
【００３１】
本発明の状況において、「約」という用語は、所与の値±１０％を意味する。
【００３２】
本発明によれば、「水性媒体」とは、生物学的流体の浸透圧と同様の浸透圧を有する媒体を指す。代表的な生物学的流体とみなされるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が、水性媒体として一般的に用いられる。
【００３３】
特定の実施態様では、前記組成物は、ＡＢＡトリブロックコポリマーからなり、ここで、Ａブロックは、ＰＤＬＬＡであり、そして、Ｂブロックは、約１００kDaの分子量を有するＰＥＧであり、ＥＯ／ＬＡモル比は、約１に等しい。
【００３４】
別の特定の実施態様では、前記組成物は、ＡＢＡトリブロックコポリマーからなり、ここで、Ａブロックは、ＰＤＬＬＡであり、そして、Ｂブロックは、約１００kDaの分子量を有するＰＥＧであり、ＥＯ／ＬＡモル比は、約３に等しい。
【００３５】
本発明に係る組成物は、当業者に公知の任意のブロックコポリマー合成方法によって得ることができる。例えば、ＡＢＡ型コポリマーは、Ｂブロックの末端からの連鎖重合によって得ることができる。典型的には、オクタン酸スズ等の触媒の存在下でＰＥＧブロックの末端ヒドロキシルによって、単量体となる（primed）ラクチド環を開環することによって重合が行われる。この重合は、溶媒の非存在下又は存在下で行ってよい。ＢＡＢ型コポリマーは、例えば、２つの鎖末端がカルボン酸官能基であるＰＬＡ鎖にメトキシ−ＰＥＧをカップリングすることによって調製することができる。このような「二官能化」ＰＬＡは、例えば、無水コハク酸又は無水アジピン酸でＰＬＡ鎖を処理することによって得られる。
【００３６】
特定の実施態様では、本発明に係る組成物は、Ａ及びＢブロックコポリマーを含み、ここで、Ｂブロック（高分子量ＰＥＧ）は、より低分子量の幾つかのＰＥＧから得られる。例えば、前記組成物は、分解可能な結合によって互いに結合している、より短いＰＥＧブロック（例えば、５〜２５kDa）を用いて生成される１００kDa ＰＥＧを含む。コポリマーの分解中、該１００kDa ＰＥＧブロックは、次いで、５〜２５kDaのサブユニットに分解され、これは、糸球体濾過を通過して、尿に排出され得る。この実施態様は、子宮内癒着以外の組織接着を予防するために本発明に係る組成物を使用することが望ましいときに、特に有利である。
【００３７】
抗接着材料
本発明は、また、上記Ａ及びＢブロックコポリマーに基づく組成物を形成することによって得られる抗接着材料に関する。
【００３８】
該材料の形成は、当業者に公知の任意の手段、特に、押出成形、例えばジクロロメタンを用いる溶媒蒸発、ホットプレス、成形、又は３Ｄ印刷によって行うことができる。
【００３９】
一般的に、得られる材料の厚みは、用いられる組成物の量、及び形成プロセスのために用いられる基材又は成形型の表面積に依存する。
【００４０】
したがって、本発明に係る材料は、フィルム、チューブ、多孔質構造、例えば、ゲル又は多孔質ヒドロゲルの２Ｄ又は３Ｄマトリクス等の形態をとってよい。
【００４１】
「フィルム」とは、本発明に係る組成物のコポリマーが溶解している溶媒を平面上で蒸発させることによって得られる二次元材料を意味する。このようなフィルムの厚みは、有利には、数マイクロメートル〜数百マイクロメートルであり、特に、１０μm〜５００μmである。特定の実施態様では、該フィルムは、約１００μm〜３００μmの厚みを有する。「厚み」とは、形成し、そして、前記コポリマーを溶解させるために供された溶媒を全て蒸発させた後、無水状態で（例えば、光学顕微鏡によって）測定されるという意味で「乾燥」を意味する。
【００４２】
前記フィルムの寸法は、特に、所望の寸法よりも大きい寸法のフィルムを切り取ることによって、必要に応じて調整することができる。
【００４３】
前記フィルムを折り畳んでチューブ又はスリーブを形成してもよく、縫合又は接着によって必要に応じて閉じた状態にしてもよい。また、チューブは、シリンダの周囲で形成することによって又は押出成形によって直接得ることもできる。
【００４４】
本発明の状況において、「チューブ」とは、本発明に係る少なくとも１つのＡ及びＢブロックコポリマーを含むコポリマーフィルムで壁が形成されている中空三次元円筒形物体を指す。好ましくは、このようなチューブの直径は、数百マイクロメートルであり、特に、３００μm〜３，０００μmである。特定の実施態様では、該チューブは、壁厚約３００μm及び直径約９００μmを有する。
【００４５】
特定の実施態様では、前記材料は、前記材料の一部を形成することを意図する基材上で前記組成物を形成することによって得られる。例えば、別のポリマーからなる織布又は編布上で前記組成物を乾燥させて、その全体が混合材料を形成する。
【００４６】
有利には、前記材料は、本発明に係るコポリマーに基づく組成物の成分と、場合により、微量の溶媒とのみを含む。例えば、前記材料は、ＰＬＡ及び高分子量（５０kDa以上）ＰＥＧのコポリマーのみを含む。特定の例では、前記材料は、ＰＬＡ及びＰＥＧのコポリマーのみを含み、該ＰＥＧは、約１００kDaの分子量を有する。
【００４７】
特定の場合では、前記材料は、本発明に係る組成物の成分に加えて、追加の添加剤又は活性成分、例えば、抗接着分子又は抗生物質等の治療分子を含んでいてよい。この添加剤又は活性成分は、例えば、前記材料のポリマーマトリクス中に分散させるために、前記材料の形成前又は形成中に前記コポリマーに基づく組成物に添加してよい。さもなければ、形成プロセス後にこの活性成分を前記材料に含浸させたり、この活性成分で前記材料を覆ったりすることができる。好ましくは、前記活性成分は、水性媒体中に存在するとき、前記材料の外側に向かって拡散することができる。
【００４８】
本発明に係る材料は、組織接着、特に子宮内癒着を予防するための医療用途に特に適する抗接着特性、再吸収特性、及び膨潤特性を有する。
【００４９】
「抗接着特性」とは、本発明に係る材料が、このような特性を有していない材料と比べて、その表面上における細胞増殖及び細胞接着を防ぐか又は少なくとも制限することができることを意味する。抗接着特性は、前記材料の表面上において、前記材料の表面に接着している細胞の量を反映する蛍光を測定することにより、細胞接着速度を経時的に評価することによって測定することができる。同様に、細胞増殖速度も、前記材料の表面上において蛍光を測定することによって評価することができる。
【００５０】
前記材料を形成するために用いられる組成物において高分子量ＰＥＧを使用することによって、癒着、特に子宮内癒着を予防する状況において、特に有利な抗接着特性を前記材料に付与することができる。したがって、ＡＢＡトリブロックコポリマー（Ａは、ＰＤＬＬＡであり、そして、Ｂは、１００，０００ＰＥＧ（すなわち、分子量約１００kDa）であり、そのＥＯ／ＬＡモル比は、約１又は約３である）に基づく組成物を形成することによって得られる材料の細胞接着速度は、最新の接着フィルムで得られる速度よりも２倍遅い。
【００５１】
有利には、本発明に係る材料は、生物学的流体と同一の浸透圧を有する水性媒体中で、約１〜２０、好ましくは約３〜１５の膨潤比を有する。好ましくは、本発明に係る材料は、少なくとも４に等しい膨潤比を有する。膨潤比は、以下の方法で測定される：乾燥材料のストリップを計量した後、振盪しながら３７℃で２４時間生理食塩水媒体（１×ＰＢＳ）に浸漬する。２４時間後、過剰のＰＢＳを吸取紙で除去し、そして、該ストリップを再度計量する。膨潤比は、以下の比に対応する：湿潤材料のストリップの質量／乾燥材料のストリップの質量。前記材料の膨潤比は、その水取り込み率に比例し、これは、比［（湿潤材料のストリップの質量−乾燥材料のストリップの質量）／乾燥材料のストリップの質量］×１００に対応する。
【００５２】
前記材料の膨潤は、表面積及び体積の増加を伴い（「水和」表面積又は体積）、これは、特に子宮腔の輪郭にぴったりとくっつけるために、子宮腔における前記材料の展開を促進するので、子宮内癒着を予防するための医療用途において特に有利である。
【００５３】
表面積の増加は非常に速く、そして、特に、水性媒体中で数分間〜数時間の内に２００〜３００％に達することができる。約３００〜４００％の安定状態は、有利には、水性媒体中で４〜５時間後に観察される。表面積の増加は、前記材料の体積の増加を伴い、これは、生理食塩水溶液中の滞留時間のみを変更することによって、膨潤比の測定中と同条件下で目視測定される。表面積の増加は、比［（浸漬時間ｔ後の「水和」ストリップの表面積−「乾燥」ストリップの表面）／「乾燥」ストリップの表面］×１００に対応する。
【００５４】
本発明に係る材料の特に有利な更なる特徴は、水性媒体中で速やかに分解されず、少なくとも１〜１５日間その完全性を保持しながら、１〜４０日間、好ましくは２〜２０日間、より好ましくは３〜１５日間、子宮腔内で滞留することができる点である。前記材料の分解は、ポリエステルブロックのエステル結合の加水分解の進行と、それに続く、ＰＥＧを含有するブロックの可溶化に起因する。前記材料の機械的特性の喪失は、その分解に直接関連する。該分解は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって、振盪しながら３７℃で生理食塩水媒体（１×ＰＢＳ）に浸漬した後の前記材料のストリップの分子量の減少を経時的に測定することによって評価することができる。また、前記材料の動的粘度の減少を評価することもできる。約３０〜５０％の粘度喪失は、一般的に、振盪しながら３７℃で７日間生理食塩水媒体（１×ＰＢＳ）に浸漬した後に観察され、そして、１５日間後には７０％にまで至る。
【００５５】
本発明に係る材料の機械的特性の変化もインビボで観察される。より正確には、該材料は、数日間でフィルム状態からゲル状態になる。特に、ＡＢＡトリブロックコポリマー（Ａは、ＰＬＡであり、そして、Ｂは、約１００kDaの分子質量を有するＰＥＧである）を用いると、フィルム状態からゲル状態への移行は、ＥＯ／ＬＡ比が３であるとき、２日後に生じ、そして、ＥＯ／ＬＡ比が１であるとき、１２日後に生じる。これら機械的特性の変化は、加水分解に直接関連する。
【００５６】
したがって、本発明に係る組成物は、ポリマーの膨潤比とその分解速度との間の均衡がとれており、それによって、このような組成物から得られる材料が十分な期間、有利には約３〜１５日間子宮腔内に滞留し、その間、前記材料の機械的特性及び物理的完全性が少なくとも部分的に保持されるのを保証することができる。特に、子宮壁の外傷後に前記材料を患者の子宮腔に配置するとき、前記材料の抗接着特性及び「水和」体積は、癒着の形成を防ぐのに十分な時間持続する。子宮腔におけるＰＥＧブロックの可溶化及びポリエステルブロックの加水分解は、進行性であり、そして、一般的に、１０〜１５日後には、特に、一般的に子宮腔内に前記材料を配置した後の月経中に前記材料を排出するのに十分である。
【００５７】
医療用具及び使用
本発明は、また、本発明に係る抗接着材料を含む子宮内癒着を予防するための医療用具に関する。
【００５８】
特定の実施態様では、該医療用具は、ＡＢＡトリブロックコポリマー（Ａは、ＰＤＬＬＡであり、そして、Ｂは、約１００kDaの分子量を有するＰＥＧであり、ＥＯ／ＬＡ比は、約１である）からなる組成物を形成することによって得られるフィルム又はチューブを含む。
【００５９】
別の実施態様では、該医療用具は、ＡＢＡトリブロックコポリマー（Ａは、ＰＤＬＬＡであり、そして、Ｂは、約１００kDaの分子量を有するＰＥＧであり、ＥＯ／ＬＡ比は、約３である）からなる組成物を形成することによって得られるフィルム又はチューブを含む。
【００６０】
有利には、該医療用具は、一旦水和し、そして、膨潤によって展開したら、該医療用具を配置することを意図する子宮腔の内側輪郭に最もぴったりとくっつけるために、三角形又は台形の形状を有する本発明に係る材料のフィルムを含む。
【００６１】
該フィルムは、例えば、約３００〜５００マイクロメートルの乾燥厚みを有し得る。
【００６２】
特定の実施態様では、図１４に示すとおり、フィルム１は、高さｈ約１〜２cm、最大幅Ｌ約１〜１．５cm、及び最小幅ｌ約０．２５〜０．７５cmの台形状を有する。例えば、該台形は、高さ約１．５cm、最大幅Ｌ約１．２５cm、及び最小幅ｌ約０．５cmである。これら寸法は、処置される患者の種類に従って、該患者が初産婦であるか経産婦であるか、該患者の年齢、癒着の発生に関する理由等に従って、特に上記範囲内で、当業者によって容易に調整可能である。
【００６３】
本発明に係る用具は、有利には、子宮腔内に前記材料を挿入し、そして、配置するための手段を含む。
【００６４】
例えば、図１５に示すとおり、本発明に係る用具１０は、中空円筒形挿入器１１を含み、その穴部１２中に倒立台形状のフィルム２を入れる。有利には、挿入器１１の寸法を最大限低減させるために、該フィルムを圧縮形態で穴部１２に入れる。例えば、該フィルムを蛇腹状に折り畳み、そして、穴部１２の内壁によってきつく押さえる。該蛇腹が展開されるのは、子宮腔内に放出されるときだけである。この展開は、ほぼ同時に生じるフィルムの体積増加によって更に促進され、該フィルムのポリマーは、子宮内流体と接触して水によって膨潤する。
【００６５】
医療用具１０は、有利には、挿入器の遠位端１４に対して並進に摺動可能であるように実装されるプランジャ１３を含み、対向する近位端１５は、それによって挿入器１１を子宮腔に導入することを意図する端部である。プランジャ１３は、挿入器１１の穴部１２内部で近位端１５に向かって押されるときに、フィルム２を挿入器１１の外側に向かって並進運動させるシャフト１６からなる。
【００６６】
有利には、プランジャ１３は、シャフト１６の近位端に停止手段１７を含み、該停止手段１７は、フィルム２が挿入器から十分に押し出されたこと及びそれが子宮腔内の所定の位置にあることを用具１０の取り扱い者に知らせるために、挿入器の近位端１５に接している穴部１１の壁に当接するように設計される。次いで、それは、単に外側に向かって引くことによって、挿入手段／挿入器全体を引き抜くのに十分になり、フィルム２は、子宮腔内の所定の位置に残る。
【００６７】
このようなシステムによって、本発明に係る抗接着材料を信頼できる方法で導入し、そして、配置することが可能になる。更に、この圧縮形態によって、膨潤前に前記材料の寸法を更に低減させることが可能になり、これにより、患者の子宮頸部を介する導入が容易になる。
【００６８】
本発明に係る医療用具は、有利には、帝王切開又は腹骨盤腔の任意の他の外科手技を受けたばかりの患者において体系的に用いることができる。抗接着材料の圧縮形態及び小さな寸法のアプリケータの使用によって、これら患者の敏感であることが多い子宮腔内への配置が容易になる。更に、月経周期中に自然に排出されることによって、前記用具を取り出すための医療従事者による更なる手技を患者が回避することが可能になる。
【００６９】
次に、以下の実施例を用いて本発明を説明するが、これは、説明目的で提示されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７０】
１−ＡＢＡトリブロックポリマーの合成
材料
市販のポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＧ）：供給元Aldrich Sigma、ＣＡＳ番号２５３２２−６８−３。重量平均モル質量（Ｍｗ）を求めるために、研究室でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって市販のＰＥＧを分析した。分析は、分析溶媒（ジメチルホルムアミド）中で実施し、そして、Ｍｗは、標準レンジのポリ（エチレングリコール）を介して求めた。
【００７１】
重量平均モル質量（Ｍｗ）は、９５，０００Daであり、そして、その固有粘度は、０．１６mL/mgである。
【００７２】
組成物において用いるラクチドは、Ｄ，Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、又はＤ−ラクチドとＤ−ラクチドとの組み合わせであってよい。合成中に導入されるラクチドの比率は、最終ポリマーの組成において望ましいＬ−又はＤ−ラクチドの割合に依存する。
【００７３】
方法
ＡＢＡトリブロックは、以下のとおり合成される：
【００７４】
ＰＥＧ（Ｍｗ９５，０００）及びラクチドを室温で２４時間真空下にて乾燥させる。ＰＥＧ及びラクチド（ラクチドの量は、Ａブロックの所望の長さに依存する）を、オクタン酸スズの存在下で丸底重合フラスコに導入する。次いで、真空（１０−３bar）及びアルゴン連続サイクルを１０回実施する。次いで、混合物を１４０℃に加熱し、そして、真空及びアルゴンの連続サイクルを１０回繰り返す。該混合物を室温に戻し、次いで、氷浴に入れる。結晶化したら、反応混合物を３０分間動的真空下に置き、次いで、動的真空下で密封する。次いで、該混合物を、機械的に回転させながら１４０℃の加熱チャンバに３日間入れる。該混合物をジクロロメタンに溶解させ、そして、エーテル／エタノール混合物中で沈殿させる。沈殿物を回収し、次いで、真空下で２４時間乾燥させる。
【００７５】
特性評価
このレポートに提示するＡＢＡトリブロックのうちの１つは、ＰＥＧ（Ｍｗ９５，０００Da）及びＤ，Ｌ−ラクチドから得られる。コポリマーＰ４と呼ばれるコポリマーの最終組成をプロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）によって求め、そして、それからＥＯ／ＬＡモル比が３であると推定した。
【００７６】
二次元ＮＭＲ分析（ＤＯＳＹ）は、合成によってＡＢＡトリブロックが生成されたことを示す。
【００７７】
また、その平均モル質量（Ｍｗ）及び分散度（Ｉｐ）を求めるために、前記コポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。
【００７８】
ジメチルホルムアミド等の分析溶媒及び標準レンジのポリ（エチレングリコール）を用いて、Ｍｗ１２３，０００Da及び５に近い分散度が得られる。
【００７９】
更に、熱重量分析（ＴＧＡ）によってコポリマーＰ４の分解温度を求めることが可能になり、該温度は２５６℃である。
【００８０】
２−抗接着材料の形成
以下のとおり、トリブロックコポリマーの組成物から抗接着フィルムを形成する：
【００８１】
Ａ．  溶媒蒸発による：該コポリマーをジクロロメタンに溶解させる（５０mg/mL）。溶液を基材に沈着させ、そして、ジクロロメタンをゆっくり蒸発させてフィルムを形成する。フィルムの厚みは、用いられるコポリマーが溶解している溶液の体積及び基材の表面積に依存する。
【００８２】
Ｂ．  ホットプレスによる：該コポリマーを１０分間かけて１００℃に加熱し、次いで、２枚の加熱板の間に置く。次いで、２枚の板の間に圧力（３，０００psi）を加える。フィルムの厚みは、用いられるコポリマーの量及び基材の表面積に依存する。
【００８３】
Ｃ．  熱溶解積層（ＦＤＭ）技術を用いる三次元印刷による：まず、該コポリマーを押出成形（Ｔ°＝１２０℃）して均質なフィラメントを形成する。次いで、該コポリマーのフィラメントを用いて３Ｄモデル化物体を印刷する。
【００８４】
一般的に、Ｐ３フィルム、Ｐ４フィルム、及びＰＬＡ５０フィルムは、それぞれ、コポリマーＰ３、コポリマーＰ４、及びＰＬＡ５０の組成物から生成されるフィルムを指す。
【００８５】
３−抗接着材料の抗接着特性及び生体適合性の評価
この試験の目的は、抗接着効果及び細胞毒性がないことを示すことである。
【００８６】
細胞培養物において実施される全ての試験について、コポリマーは、組成物として、以下を有する：
−  ＰＥＧ（Ｍｗ９５，０００）及びＤ，Ｌ−ラクチドから得られるＡＢＡトリブロック。最終ＥＯ／ＬＡモル比は、３である（プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）によって決定）。このポリマーは、コポリマー「Ｐ４」と呼ばれる。
コポリマーＰ４のフィルム（以後Ｐ４フィルム）の形成：溶媒蒸発による。厚み３００μm（光学顕微鏡によって得られた測定値）。
−  ＰＥＧ（Ｍｗ９５，０００）及びＤ，Ｌ−ラクチドから得られるＡＢＡトリブロック。最終ＥＯ／ＬＡモル比は、１である（プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）によって決定）。このポリマーは、コポリマー「Ｐ３」と呼ばれる。
コポリマーＰ３のフィルム（以後Ｐ３フィルム）の形成：溶媒蒸発による。厚み３００μm（光学顕微鏡によって得られた測定値）。
【００８７】
用いるコントロールは、以下のコントロールから選択される：
−  ポジティブコントロール：ＴＣＰＳ（ウェル）；
−  ネガティブコントロール：細胞溶解液を添加したＴＣＰＳ（ウェル）。全体が、再現可能な細胞毒性応答を誘導する；
−  ＰＬＡ５０、細胞増殖を促進する生体適合性材料として知られている。評価するＰ４及び／又はＰ３と同一の形成；
−  Seprafilm（Genzyme S.A.S）、ヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロースからなる市販の抗接着バリア。
【００８８】
用いる細胞は、EN ISO 10993-5規格に準拠する医療用具のインビトロ細胞適合性の評価について推奨されているＣＣＬ  １マウス皮膚線維芽細胞株（ＮＣＴＣクローン９２９）、又はヒト子宮内膜細胞培養物である。
【００８９】
全ての試験は、結果の再現性を保証するためにトリプリケートで実施する。
【００９０】
Ａ．  細胞接着試験
PrestoBlue（登録商標）試験は、細胞の代謝活性を測定することによって細胞生存率を評価することを可能にする。試験（スチューデントｔ検定）は、接着細胞を定量するために、材料に細胞を直接接触させた後に実施する。
【００９１】
接着細胞の量に対応する蛍光値は、蛍光分光光度法（λ励起＝５３１nm；λ発光＝６１５nm）によって測定する。
【００９２】
膨潤させるために、まず、用いるＰ４フィルムをpH７．４ ＰＢＳに２４時間浸漬する。
【００９３】
図１ａから分かるとおり、蛍光値は、フィルムに接着している細胞の量を反映する。ＰＬＡ５０フィルム及びＴＣＰＳポジティブコントロールと比べてＰ４フィルムでは細胞接着が著しく減少していることが観察される。
【００９４】
したがって、細胞の１００％がポジティブコントロール（ＴＣＰＳ）に接着すると考えると、４５分間インキュベートした後、細胞の６９％がＰＬＡ５０フィルムに接着し、そして、Ｐ４フィルムに接着するのは細胞のわずか５１％である。この割合は、３時間インキュベートした後も同様である。
【００９５】
図１ｂは、Ｐ４フィルム及びＰ３フィルムにおける細胞接着の減少を確認する。４５分間、１．５時間、及び３時間インキュベートした後、ＴＣＰＳポジティブコントロールと比べてＰ４及びＰ３フィルムではヒト子宮内膜細胞の接着の減少が観察される。また、３時間インキュベートした後、Ｐ４フィルム、Ｐ３フィルム、及びSeprafilm（登録商標）抗接着膜で等価な細胞接着が観察される。
【００９６】
Ｂ．  細胞増殖試験
膨潤させるために、まず、用いるＰ４及びＰ３のフィルムをpH７．４ ＰＢＳに２４時間浸漬する。
【００９７】
この試験は、様々な増殖日数において、ＰＬＡ５０フィルム及びＴＣＰＳと比べてＰ４フィルムでは細胞増殖が顕著に減少することを示す（図２）。実際、Ｐ４フィルムは、１及び２日間の増殖時間について、ＰＬＡ５０及びＴＣＰＳとは著しく異なる蛍光値を有する。
【００９８】
また、細胞増殖は、Ｐ３フィルムにおいても減少し、蛍光値は、様々な時間において、ＴＣＰＳよりも著しく低い。
【００９９】
全ての接着（図１ａ〜１ｂ）及び増殖（図２）の結果は、Ｐ４フィルムが、接着及び細胞増殖を減少させる傾向のある特性を有することを示す。前記材料の抗接着特性及び抗増殖特性は、前記組成物中のポリエチレングリコールの存在に起因する。
【０１００】
Ｃ．  細胞毒性試験
医療用具の生物学的評価に関するEN ISO 10993-5規格によれば、細胞毒性は、定量的評価によって２４時間インキュベートした後に評価することができる：
【０１０１】
−  細胞死パラメータの測定。
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、細胞死が生じるときに媒体に放出される、真核細胞中に存在する酵素である。ＬＤＨ細胞毒性アッセイキットは、細胞の細胞毒性マーカーであるＬＤＨをアッセイするための比色法である。ＬＤＨ活性は、前記材料の存在下でヒト子宮内膜細胞を２４時間インキュベートした後に４９０nmにおいて分光光度法によって測定される。
【０１０２】
膨潤させるために、まず、用いるＰ４、Ｐ３、及びＰＬＡ５０のフィルムをpH７．４ ＰＢＳに２４時間浸漬する。
【０１０３】
図３に示すとおり、Ｐ４、Ｐ３、及びＰＬＡ５０のフィルムは、ポジティブコントロールとネガティブコントロールとの間の吸光度値を有する。
【０１０４】
更に、Ｐ４及びＰ３のフィルムは、ポジティブコントロールとは著しく異なる吸光度値を有し、そして、Ｐ４及びＰ３コポリマー、ＰＬＡ５０、並びにネガティブコントロールは、同じ集団由来である（ｐ値＞０．０５  Ｐ４−Ｐ３対ＰＬＡ５０／ネガティブコントロール）。この情報は全て、Ｐ４及びＰ３フィルムが毒性を有しないことを支持する。
【０１０５】
４−抗接着材料の展開特性の評価
全ての展開試験について、用いる材料は、ホットプレスによって形成されたコポリマー組成物Ｐ４又はコポリマー組成物Ｐ３から得られる。該コポリマーから得られるフィルムは、４００μmの厚みを有する（光学顕微鏡を用いて得られた測定値）。
【０１０６】
溶媒蒸発によって形成されたコポリマー組成物Ｐ４から得られる材料も調製した。得られるフィルムは、３００μmの膜厚を有する（光学顕微鏡を用いて得られた測定値）。
【０１０７】
全ての試験は、結果の再現性を保証するためにトリプリケートで実施する。
【０１０８】
Ａ．  膨潤試験
この試験で用いる抗接着フィルム及びＰＬＡ５０フィルムをストリップに切断し（ｔ０時点で知られた質量）、次いで、振盪しながら生理食塩水媒体（１×ＰＢＳ）中３７℃でインキュベートする。
【０１０９】
該ストリップの質量を様々な時点で計量し、そして、水取り込み率を以下のとおり計算する：
【数１】
0006621821.tif 000002
【０１１０】
Ｐ４フィルムのストリップは、ＰＢＳ中で膨潤し、水取り込み率は、５分間インキュベートした時点で約３００％である（図４ａ）。前記材料内の含水率は、約１０００％の割合に達するまで経時的に増大する。水取り込み率は、インキュベート８日目からインキュベート１４日目まで安定する。次いで、１５日間インキュベートした後、Ｐ４フィルムは崩壊して断片になる。
【０１１１】
Ｐ３フィルムのストリップもＰＢＳ中で膨潤し、水取り込み率は、インキュベート１２日目の時点で、そして、２２日目まで約６００％である。次いで、２５日間ＰＢＳに浸漬した後、コポリマーＰ３フィルムは崩壊する。
【０１１２】
溶媒蒸発によって得られるＰ４フィルムの水取り込み率は、非常に速やかに約９００％まで増大し、次いで、２４時間インキュベートした時点で安定する（図示せず）。
【０１１３】
コポリマーＰ４及びＰ３が水性媒体中で膨潤する能力は、高分子量ＰＥＧの親水性ブロックに起因する。コポリマー組成物におけるＥＯ／ＬＡ比の増大は、水の取り込みの増大につながる。
【０１１４】
Ｂ．  表面積増加試験
以下の試験によって、これら同じ材料の表面積の漸進的変化を決定することが可能になる。
【０１１５】
この試験で用いる抗接着フィルムをストリップに切断し（ｔ０時点で知られた表面積）、次いで、振盪しながら生理食塩水媒体（１×ＰＢＳ）中３７℃でインキュベートする。該ストリップの寸法を様々な時点で測定し、そして、表面積の増加を以下のとおり求める：
【数２】
0006621821.tif 000003
【０１１６】
コポリマーＰ４に基づくストリップの形成に関係なく、該ストリップはＰＢＳ中で膨潤し、そして、５分間インキュベートした時点で表面積は２倍になる。コポリマーＰ３に基づくストリップは、ＰＢＳ中で膨潤し、そして、３０分間インキュベートした時点で表面積は２倍になる（図４ｂ）。
【０１１７】
溶媒蒸発によるＰ４の形成によって、５時間インキュベートした時点で約３００％の表面積増加が可能になり、そして、膜の表面積は、次いで、安定する（図示せず）。
【０１１８】
表面積の増加は、ホットプレスによってＰ４を形成するとき、わずかに異なる。実際、ストリップの表面積は、３時間のインキュベートで２５０％増加し、次いで、安定する。この差は、形成工程中のポリマー鎖の配置によって説明することができる。
【０１１９】
同様に、コポリマーＰ３については、５時間インキュベートした後の表面積の増加は約１５０％であり、そして、表面積は、次いで、安定する。蒸発によって形成されるコポリマーＰ４に基づくストリップの表面積の増加を定規を用いて測定するとき、その「乾燥」寸法（ｔ＝０における）は、高さ０．５cm及び長さ１cmであり、わずか５分間のインキュベート後（ｔ＝５分）に両寸法の急速な増加が観察される：高さ０．８cm及び長さ１．６cm。ｔ＝３０分では、高さ０．９cm及び長さ１．８cmであり、ｔ＝２４時間では、高さ１cm及び長さ２cmに達し、そして、安定する。
【０１２０】
Ｃ．  体積増加試験
以下の試験によって、ホットプレスによって得られるＰ４及びＰ３のフィルムの体積の漸進的変化を決定することが可能になる。
【０１２１】
この試験で用いる抗接着フィルムをストリップに切断し（ｔ０時点で知られた表面積）、次いで、振盪しながら生理食塩水媒体（１×ＰＢＳ）中３７℃でインキュベートする。該ストリップの寸法を様々な時点で測定し、そして、体積の増加を以下のとおり求める：
【数３】
0006621821.tif 000004
【０１２２】
コポリマーＰ３及びコポリマーＰ４のフィルムの体積は、水性媒体中に浸漬している時間中増加する（図４ｃ）。コポリマーＰ３フィルムの体積は、２時間インキュベートした時点で３倍になり、１６日間インキュベートした後体積が１０倍になるまで増加する。コポリマーＰ４フィルムの体積の増加は、コポリマーＰ３フィルムと比べて速く、５日間インキュベートした時点で体積が１０倍に増加する。
【０１２３】
Ｄ．  展開試験
コポリマー組成物Ｐ４から形成される材料の膨潤は、水性媒体中で膜の展開を誘導する。
【０１２４】
Ｐ４フィルムの展開は、以下の実験によって説明することができる（図５ａ〜５ｈ）：
【０１２５】
ホットプレスによって形成されたＰ４フィルムの矩形ストリップ（長さ４cm及び幅２．４cm）を巻き貝状に巻き取り、次いで、水に浸漬する。該ストリップの展開及びその厚みの漸進的変化を光学顕微鏡によって可視化する。
【０１２６】
水に浸漬する前、巻き貝状に巻き取ったら該ストリップの厚み及びその直径を測定する（乾燥寸法）：初期厚み（ｔ０）＝４６３μm；初期直径（ｔ０）＝４，７２４μm。
【０１２７】
展開及び厚みの漸進的変化をｔ＝２４ｈまでモニタリングしたところ、コポリマーの膨潤は、２４時間インキュベートした時点で安定する。
【０１２８】
図５ａ〜５ｈによって、一旦水に浸漬した前記ストリップの展開の進行を可視化することができる。該ストリップは経時的に広がり、水中において最初の２分時点で、占有体積が増加する（ｔ０＝４，７８４μm〜ｔ２分＝５，６２５μm）。前記ストリップは、１５分間浸漬した時点で、全ての利用可能な空間を完全に占有するまで展開する（ｔ１５分＝９，６５５μm）。展開現象は、２４時間で全長が１０，６３４μm（これは、初期長さの２倍超である）に達して、終了する。
【０１２９】
前記ストリップの展開は、水中でコポリマーが膨潤した結果である。膨潤は、経時的な厚みの増加として表され、２４時間における最大厚みは１，３１２μmであり、これは、初期厚みに対して約１８５％の増加を表す。
【０１３０】
前記ストリップの展開現象は、主に、コポリマーが大量の水を吸収する能力に関連する。コポリマーは膨潤し、それによって、展開し、そして、利用可能な空間を占有する力を有する。
【０１３１】
５−展開及び利用可能な空間の占有の評価
コポリマー組成物Ｐ４の溶媒蒸発によってフィルムを調製し、そして、台形に切断し、次いで、ＩＵＤアプリケータに導入した。
【０１３２】
その中で展開させるために、プランジャシステムを用いて、水で満たされた子宮腔を模倣するモデルに該アプリケータから台形フィルムを押し出す（図６）。子宮腔モデルは、ヒト子宮腔の理論的寸法を有する。
【０１３３】
一旦フィルムを腔内に押し出したら、展開し、そして、該腔を完全に覆うのに約１０分間かかる（図７ａ〜７ｅ）。
【０１３４】
６−抗接着材料の分解の評価
組成物Ｐ４又はＰ３からホットプレスによってフィルムに形成された抗接着フィルムのインビトロにおける分解を求めるために、前記フィルムから切り取られた矩形（１．５×１cm）を機械的に撹拌しながら３７℃でＰＢＳに導入する。
【０１３５】
Ｐ４及びＰ３フィルムの機械的特性を、レオロジー測定によって様々なインキュベート時間で評価する。
【０１３６】
図８ａは、固定周波数（１Hz）変形域を適用するときの、５分間浸漬した後のＰ３及びＰ４のフィルムの弾性係数Ｇ’及び粘性係数Ｇ’’を示す。両コポリマーについて、弾性係数は、粘性係数よりも大きく、これは、弾性固体材料に特徴的である。
【０１３７】
図８ｂは、２日間及び２１日間浸漬した後のＰ４及びＰ３のフィルムについての、（０．０５％変形における）周波数の関数としての弾性係数（Ｇ’）及び粘性係数（Ｇ’’）の変動を示す。両コポリマーについて、係数値はインキュベート期間中に減少し、これは、コポリマーの分解に特徴的である。例えば、２Hzの周波数では、Ｇ’（Ｐ３）は、それぞれ、２日及び２１日後、２，００５Paの値から７３９Paになる。機械的特性の喪失は、フィルムの分解に直接関連する。
【０１３８】
図８ｃは、Ｐ４及びＰ３のフィルムについての、様々なインキュベート時間における弾性係数（Ｇ’）を示す。Ｇ’値によって、一次系指数関数速度を示すことが可能になり、Ｐ３フィルムよりもＰ４フィルムの分解速度の方が速い。
【０１３９】
図８ｄは、剪断速度の関数としての、３０日間インキュベートした後のＰ４フィルムの応力及び４０日間インキュベートした後のＰ３フィルムの応力を示す。この図は、前記材料が高度の粘度を有することを示し、Ｐ３については約０．２５、そして、Ｐ４については０．３５の限界応力（□ｃ）を有する。
【０１４０】
インビトロにおける分解は図９によっても説明され、これは、コポリマーＰ３フィルム、Ｐ４フィルム、及びＰＬＡ５０からなるフィルムの経時的な質量減少率を示す。該コポリマーフィルムは、９０日間インキュベートした後に該フィルムが完全に可溶化するまで質量が減少する。
【０１４１】
図１０ａ〜１０ｅは、様々な分解時間におけるＰ４フィルムを説明する。該フィルムは、最初の浸漬日の間は物理的完全性を維持している、すなわち、展性かつ弾性フィルムである。その機械的特性の喪失は、１２日間の浸漬後明らかになり、取り扱い時にフィルムが崩壊する。この観察によって、該フィルムの分解を示すことが可能になる。４０日目に、該フィルムは完全に断片化する。
【０１４２】
次に、図１０ａ’〜１０ｃ’は、様々な分解時間におけるＰ３フィルム（図１０ａ’）のフィルム形成特性を説明する。Ｐ３フィルムは、３０日間の浸漬後には機械的特性を保持しており（図１０ｂ’）、次いで、６０日間の浸漬後に崩壊してゲル片になる（図１０ｃ’）。
【０１４３】
また、コポリマーの分解は、１Ｈ  ＮＭＲ分析によっても示され、これは、ＰＢＳ中で１ヶ月間及び２週間インキュベートした後、乳酸の形成を示す。乳酸の存在は、前記材料内のポリ（乳酸）鎖の加水分解のマーカーである。
【０１４４】
コポリマーＰ４のインビトロにおける分解は、質量（Ｍｗ）減少（図１１）、そして、サイズ排除クロマトグラフィーによって得られる分散度の増加によって示される。Ｍｗは、経時的に減少し、２０日間インキュベートした時点でほぼ５０％減少する。この減少は、ＰＬＡ鎖の加水分解によって説明される。次第により小さなモル質量になるその鎖は、加水分解されて、次いで、オリゴマーの段階に達し、最終的には乳酸のモノマーになる。
【０１４５】
コポリマーＰ４及びコポリマーＰ３のフィルムのインビボにおける分解を求めるために、前記フィルムから切り取られた矩形（４×３．５cm）をラットの盲腸と腹膜との間に導入する。腹膜及び盲腸に傷をつけ、そして、圧定布で擦過して臓器間を接着させ、そして、腹部を閉じる前に擦過された盲腸と腹膜の傷との間に直ちに該コポリマーフィルムを適用する。前記ラットを、外科手技後の様々な時点で安楽死させる。
【０１４６】
図１２ａは、動物に導入する前のコポリマーＰ４フィルムを示す（ｔ＝０）、そして、図１２ｂは、移植の２日後に回収したコポリマーＰ４の残渣を示す。コポリマーＰ４フィルムのゲル粒子への分解は、術後２日の時点で観察され、初期フィルムの大部分は溶解し、そして、体内から排出される。
【０１４７】
図１２ｂ’〜１２ｅ’は、動物の腹腔内における様々な滞留時間後のコポリマーＰ３フィルム（移植前は完全なフィルム：図１２ａ’）を示す。図１２ｂ’及び図１２ｃ’は、それぞれ、動物の体内で１２時間及び２日間滞留した後に回収したＰ３フィルム断片を示す。図１２ｄ’は、５日間滞留した後のフィルムの小片状のＰ３フィルムを示し、そして、図１２ｅ’は、１２日後のゲル粒子状のＰ３フィルムを示し、初期フィルムの大部分は溶解し、そして、腹腔から排出される。
【０１４８】
７−ラット腹膜接着モデルにおけるコポリマーＰ４及びＰ３の抗接着効果の評価
材料及び方法
３４匹のWistar雌を、ケタミン（５０mg/kg）及びキシラジン（５mg/kg）の筋肉注射後に麻酔する。腹部をベタジンで消毒し、そして、局所皮下麻酔を投与した後、腹部を切開する（０．１％ リドカイン）。
【０１４９】
腹部を４cmの長さで正中縦切開し、次いで、腹腔を開く。盲腸漿膜を圧定布で擦過し、そして、それに対向する腹膜パステル（peritoneal pastille）（１cm2）を作製する。コポリマーフィルム及びSeprafilm（登録商標）を盲腸と腹腔との間の側腹部に直接配置し、そして、生理食塩水溶液 １mLを腹腔に滴下注入した後、閉じる。Hyalobarrier（登録商標）については、ゲル（約１mL）を腹膜に滴下注入し、そして、盲腸に外傷を負わせる。コントロール群については、盲腸を擦過し、そして、腹膜パステルを作製した後、そのまま腹部を閉じる（再吸収可能なVicryl 3-0 Ethicon）。外科手技後最初の４８時間以内にブプレノルフィン（０．０２mg/kg）を体系的に注射する。
【０１５０】
効果試験は、５つの群を含む：
Ａ群（ｎ＝６）：コポリマーＰ４フィルムを用いる
Ｂ群（ｎ＝６）：コポリマーＰ３フィルムを用いる
Ｃ群（ｎ＝６）：Seprafilm（登録商標）：品目番号４３０１−０３を用いる
Ｄ群（ｎ＝６）：Hyalobarrier（登録商標）を用いる
Ｅ群（ｎ＝６）：コントロール
【０１５１】
接着スコアは、以下のとおり、接着の拡大、重篤度、及び程度に従って評価する：
１）接着の拡大の評価：
０＝接着なし
１＝外傷を負った表面のうちの２５％未満に関係する接着
２＝外傷を負った表面のうちの２５〜５０％に関係する接着
３＝外傷を負った表面のうちの５０〜７５％に関係する接着
４＝外傷を負った表面のうちの７５〜１００％に関係する接着
２）接着の重篤度の評価：
０＝接着なし
１＝細かい無血管性の接着
２＝不透明な血管新生化接着
３＝盲腸の腹膜壁に対する全体的接着
３）接着の程度の評価：
０＝接着なし
１＝静かに引っ張ることによって組織から分離する接着
２＝中等度に引っ張ることによって組織から分離する接着
３＝開放するためには強く引っ張る必要がある接着、又は臓器の損傷なしに開放することが不可能な接着
スコア：／１０
【０１５２】
盲腸と腹膜との間の接着スコアを評価するために、手術の５日後に各群から３匹のラットを殺処分し、そして、次いで、１２日後に３匹のラットを殺処分する。
【０１５３】
４匹の更なるラットを用いて、初期におけるコポリマーの接着スコア及び挙動を評価する：手術の１２時間後及び２日後にＰ３を評価し、そして、手術の２日後にＰ４を評価する。１匹のラットを用いて、術後Ｄ２に接着の有無を評価する。
【０１５４】
ケタミン麻酔、次いで、致死性のペントバルビタール注射によって動物を殺処分する。
【０１５５】
コポリマーフィルムの形成：
コポリマーフィルムをホットプレスによって形成し、そして、動物を殺処分するときに腹腔内のフィルムをよりよく可視化するために紫色の染色剤で染色する。該コポリマーフィルムは４００μmの厚みを有し、そして、４cm×３．５cm（ｌ×Ｌ）の矩形に切断する。該フィルムをガンマ線によって滅菌し、次いで、手術の日まで冷凍庫内で保管する。該フィルムは、事前に水和する必要もなく、腔内における固定技術も必要ない。
【０１５６】
前記手技の２日後、コントロールラットは接着を示さない。これは、Ｐ４及びＰ３のフィルムを受け入れたラットについても当てはまる。この試験は、術後Ｄ２には接着が存在しないという盲腸／腹膜接着の形成時間についての情報を提供する。Ｐ３フィルムは、Ｄ２において外傷を負った領域に存在する（図１１ｃ’）が、一方、Ｐ４フィルムは、分解して、腔内には小さなゲル粒子しかない（図１１ｂ）。コントロールラットにおける接着の非存在下では、Ｄ２におけるコポリマーの抗接着効果を求めることができない。
【０１５７】
前記外科手技の５日後、各群から３匹のラットを殺処分する。コントロール群では、ラットは、腹膜表面の７５％〜１００％に関係し（拡大＝４）、盲腸が腹膜壁に対して全体的に接着し（重篤度＝３）、そして、臓器の損傷なしに盲腸を開放することが不可能（程度＝３）である重篤な接着（表１）を有する。Seprafilm（登録商標）の適用後、Ｄ５で接着が観察され、平均スコアは７．３３である。Hyalobarrier（登録商標）を受け入れた群では、スコアはゼロである。接着は観察されず、これは、術後Ｄ５においてそれが有効である証拠である。
【０１５８】
コポリマーＰ４フィルムを用いる群では、２匹のラットが接着を有し、第３のラットは無傷の腔を有する。平均スコアは４．６６であり、接着スコアは、コントロール群のスコアよりも明らかに低くとどまる。
【０１５９】
コポリマーＰ３フィルムを用いる群では、接着は観察されず（スコアゼロ）、そして、該フィルムは腔内で小片状である（図１１ｄ’）。
【表１】
0006621821.tif 000005
【０１６０】
次に、前記外科手技の１２日後、各群から３匹の残りのラットを殺処分し、接着スコアを評価する（表２）。コントロール群のＤ１２における接着スコアは高く（スコア８．６）、全てのラットにおいて外傷を負った表面の少なくとも５０％を覆う血管新生化接着を特徴とする。
【０１６１】
Seprafilm（登録商標）の適用後、Ｄ１２で接着が観察され、平均スコアは４．３である。フィルムは極めて脆弱であるので、その配置は簡単ではない。結果を鑑みて、抗接着効果は証明されない。
【０１６２】
Hyalobarrier（登録商標）を受け入れた群では、２匹のラットがコントロール群と同等の接着強度を有し、盲腸と腹膜とが接着し、臓器の損傷なしに盲腸を開放することが不可能である。この群の第３のラットは、無傷の腔を有する。したがって、Hyalobarrier（登録商標）は、短期間（Ｄ０〜Ｄ５）にわたって抗接着の役割を果たし、次いで、特に酵素加水分解によってゲルが分解されるので、１２日間にわたってバリアの役割を果たすことはできない（スコア＝６．６）。
【０１６３】
コポリマーＰ４フィルムを用いる群では、接着スコアは、Ｄ５において観察されるものと同様である。コポリマーＰ４の接着スコア（スコア＝５．３）は、競合製品であるHyalobarrier（登録商標）の接着スコアとSeprafilm（登録商標）の接着スコアとの間である。コポリマーＰ４フィルムは早期に分解するので、該フィルムは、長期にわたって抗接着効果を示すことができない。
【０１６４】
コポリマーＰ３フィルムを用いる群では、接着は観察されず（スコアゼロ）、そして、腹膜は巨視的に治癒している。コポリマーＰ３は、ゲル粒子の形態でみられる（図１１ｔｈ’）。Ｐ３の抗接着効果は明白である。
【表２】
0006621821.tif 000006
【０１６５】
コントロール群では、腹腔に外傷を負わせる外科手技によって、腹膜と傷ついた盲腸との間に重篤な接着が生じる。コポリマーＰ４フィルムを手術後に適用することによって、接着の重篤度を低減することができる。コポリマーＰ３フィルムを適用することによって、接着を完全になくすことができる。
【図１】
0006621821.tif 000007
【図２】
0006621821.tif 000008
【図３】
0006621821.tif 000009
【図４】
0006621821.tif 000010
【図５】
0006621821.tif 000011
【図６】
0006621821.tif 000012
【図７】
0006621821.tif 000013
【図８ａ】
0006621821.tif 000014
【図８ｂ】
0006621821.tif 000015
【図８ｃ】
0006621821.tif 000016
【図８ｄ】
0006621821.tif 000017
【図９】
0006621821.tif 000018
【図１０】
0006621821.tif 000019
【図１１】
0006621821.tif 000020
【図１２】
0006621821.tif 000021
【図１３ａ】
0006621821.tif 000022
【図１３ｂ】
0006621821.tif 000023
【図１３ｃ】
0006621821.tif 000024
【図１４】
0006621821.tif 000025
【図１５】
0006621821.tif 000026