(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）又は（２）の条件で、ナットウキナーゼ及びカラギーナンを含んでなるバイオフィルム分散用溶液。
（１）ナットウキナーゼを０．０００１質量％以上０．０００５質量％以下含有し、かつι-カラギーナンを０．０１質量％以上０．１０質量％以下含有するバイオフィルム分散用溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．０００５質量％含有し、ι-カラギーナンを０．１０質量％含有する分散用溶液を除く。）。
（２）ナットウキナーゼを０．００１質量％以上０．０１０質量％以下含有し、かつκ-カラギーナンを０．５質量％以上１．０質量％以下含有するバイオフィルム分散用溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．００１質量％含有し、κ-カラギーナンを１．０質量％含有する分散溶液を除く。）。
【請求項２】
前記条件（１）において、ナットウキナーゼ及びι−カラギーナンの合計濃度が０．０１０１質量％以上０．１００１質量％以下である、請求項１に記載のバイオフィルム分散用溶液。
【請求項３】
前記条件（２）において、ナットウキナーゼ及びκ−カラギーナンの合計濃度が０．５０１質量％以上１.０１質量％以下である、請求項１に記載のバイオフィルム分散用溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオフィルム分散方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは生物膜又はスライムとも言われ、一般に水系で細菌等の微生物が物質の表面に付着して増殖する際に、微生物細胞が産生する多糖、タンパク質及び核酸等の高分子物質により形成された、微生物を包み込む構造体を指す。
【０００３】
バイオフィルムが形成されると、微生物による種々の問題が発生するため、様々な産業分野で問題となっている。
例えば、食品プラントの配管内にバイオフィルムが形成されると、このバイオフィルムが剥がれ落ちて製品内へ異物として混入したり、微生物に由来する毒素により、食中毒が発生する原因となる場合がある。
また、金属表面へのバイオフィルム形成は金属腐食の原因となり、設備の老朽化が促進される。
医療分野においては、内視鏡等の医療機器の狭い隙間や空孔内に残存した微生物がバイオフィルムを形成すると、院内感染を引き起こすことが知られている。
また、ヒト口腔内においては歯にデンタルプラーク（歯垢）と呼ばれるバイオフィルムが形成されると、齲蝕や歯周病の原因となることが知られている。
【０００４】
バイオフィルムによる様々な問題を防止するためには、微生物、特に細菌に対して殺菌、静菌作用を与えることにより、細菌を増殖させない考え方が一般的に検討されてきた。しかし、バイオフィルムを形成した微生物集合体は、浮遊状態にある微生物と比較して、殺菌剤、静菌剤のような微生物の制御薬剤に耐性を持つことや、薬剤のバイオフィルム内部への浸透が不十分であることが知られている。このため、バイオフィルムによる危害を防止する方法について検討が行われている。
【０００５】
これまでバイオフィルムを除去する技術として、プロテアーゼ類を用いる方法が提案されている（特許文献１及び２参照）。しかし、バイオフィルムの除去性能は未だ満足できるレベルにない。さらに、プロテアーゼは生体に刺激性を有するものも多く、より安全かつ効果的な技術開発が求められている。
一方で、ヒトの口腔内での歯垢の除去や虫歯菌の付着阻害及び脱離のための口腔用組成物に、ナットウエキスやカラギーナンを配合することが知られている（例えば、特許文献３及び４参照）。しかし、ナットウエキスとカラギーナンを併用することによるバイオフィルム分散の相乗効果や、これらの併用によるバイオフィルム分散の相乗効果を示すための各成分の配合量に関しては全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−６７２０号公報
【特許文献２】特開平６−２６２１６５号公報
【特許文献３】特開２０１１−１２６８１９号公報
【特許文献４】特開平５−１３９９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、バイオフィルムを効果的に分散し得るバイオフィルムの分散方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、バイオフィルムを効果的に分散し得るバイオフィルムの除去方法を実現すべく、種々検討を行った。その結果、ナットウキナーゼと、ι-カラギーナン又はκ-カラギーナンを所定量併用することによって、バイオフィルムを効果的に除去し得ることを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成するに至った。
【０００９】
本発明は、下記（１）又は（２）の条件でナットウキナーゼ及びカラギーナンを含んでなるバイオフィルム分散溶液をバイオフィルムに適用する、バイオフィルムの分散方法に関する。
（１）ナットウキナーゼを０．０００１質量％以上０．０００５質量％以下含有し、かつι-カラギーナンを０．０１質量％以上０．１０質量％以下含有するバイオフィルム分散溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．０００５質量％含有し、ι-カラギーナンを０．１０質量％含有する分散溶液を除く）をバイオフィルムに適用する。
（２）ナットウキナーゼを０．００１質量％以上０．０１０質量％以下含有し、かつκ-カラギーナンを０．５質量％以上１．０質量％以下含有するバイオフィルム分散溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．００１質量％含有し、κ-カラギーナンを１．０質量％含有する分散溶液を除く）をバイオフィルムに適用する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオフィルム分散方法によれば、バイオフィルムを効果的に分散することができる。さらに、微生物が関与する様々な分野においてバイオフィルムに起因する危害を防止することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るバイオフィルムの分散方法は、前記（１）又は（２）の条件で、ナットウキナーゼ及びカラギーナンを所定量含むバイオフィルム分散用溶液をバイオフィルムに適用する。これにより、ナットウキナーゼ及びカラギーナンをそれぞれ単独で使用したときのバイオフィルム分散効果の単なる相加的な効果ではなく、バイオフィルムを効果的にかつ相乗的に分散することができる。
【００１２】
ナットウキナーゼは納豆菌により産生されるプロテアーゼであり、例えば特開平６−１５３９７７号公報に記載の方法により製造可能である。また、ナットウキナーゼのアミノ酸配列はNCBI  Accession：AHZ12722.1、Accession：AHW57451.1、Accession：AEV91244.1、Accession：AHY94992.1等として登録されている。さらに、その塩基配列はAccession：KJ174339.1、Accession：KJ174338.1、Accession：KJ495732.1等として登録されている。これらの情報も元に、常法である遺伝子組換え技術を用いてナットウキナーゼを製造することもできる。
本発明で用いるナットウキナーゼとしては特に制限されないが、例えば、和光純薬工業社製のナットウキナーゼなど、市販のものを用いることができる。
【００１３】
カラギーナンは紅藻類から得られる含硫黄多糖類の一種であり、主にD-ガラクトースと硫酸から構成される化合物である。
ι-カラギーナンはEucheuma spinosumから得られるカラギーナンであり、κ-カラギーナンはKappaphycus cottoniiから得られるカラギーナンである。これらのカラギーナンは例えば特開昭５８−９８０４６号公報、特開昭５８−９８０４７号公報に記載の方法により製造することができる。
本発明で用いるι-カラギーナン及びκ-カラギーナンとしては特に制限されないが、例えば、東京化成工業社製のι-カラギーナン及びκ-カラギーナンなど、市販のものを用いることができる。
【００１４】
本発明において、前記ナットウキナーゼ及びカラギーナンを溶媒に溶解又は分散させ、得られた分散溶液をバイオフィルムが付着した対象物に適用して、バイオフィルムの分散を行う。
本発明で用いることができる溶媒としては特に制限はないが、水、エタノール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキサイド等が挙げられる。これらのうち、水及びエタノールが好ましい。
また前記分散溶液は、前記ナットウキナーゼ及びカラギーナンがバイオフィルムに接触する場において溶液状態となる限りにおいて、適用前の剤形が錠剤、顆粒剤、散剤等であっても良い。よって、薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、他の薬効成分等を適宜組み合わせて適宜用いることができる。
【００１５】
本発明で用いる前記分散溶液における前記ナットウキナーゼ及びカラギーナンの含有量は、上記の所定の濃度を達成するように適宜決定できる。
例えばナットウキナーゼとι−カラギーナンの併用の場合、前記分散溶液に含まれる両成分の合計濃度は０．０１０１質量％以上０．１００１質量％以下が好ましく、ナットウキナーゼとκ−カラギーナンの併用の場合、前記分散溶液に含まれる両成分の合計濃度は０．５０１質量％以上１.０１量％以下が好ましい。
【００１６】
本発明で用いるバイオフィルム分散溶液は、前記ナットウキナーゼ及びカラギーナンを所定の濃度となるように溶媒に溶解して調製することができる。
あるいは、前記ナットウキナーゼ及びカラギーナンを高濃度に含む希釈用組成物を調製し、バイオフィルムに適用する前に、ナットウキナーゼ及びカラギーナンが所定の濃度となるよう溶媒で希釈して希釈液を調製し、調製した希釈液を使用することもできる。この場合の各成分の希釈倍率は、好ましくは２質量倍以上、より好ましくは５質量倍以上、さらに好ましくは１０質量倍以上、そして、好ましくは９９質量倍以下、より好ましくは７５質量倍以下、さらに好ましくは５０質量倍以下である。
【００１７】
バイオフィルムの形成に関連し、本発明の方法により分散するバイオフィルムを形成する細菌としては、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、ポルフィロモナス（Porphyromonas）属細菌、エルシニア（Yersinia）属細菌、エシェリキア（Escherichia）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、ヘモフィルス（Haemophilus）属細菌、ヘリコバクター（Helicobacter）属細菌、バシルス（Bacillus）属細菌、ボレリア（Borrelia）属細菌、ナイセリア（Neisseria）属細菌、カンピロバクター（Campylobacter）属細菌、デイノコックス（Deinococcus）属細菌、ミコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌、シゲラ（Shigella）属細菌、エロモナス（Aeromonas）属細菌、エイケネラ（Eikenella）属細菌、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、アクチノマイセス（Actinomyces）属細菌、バクテロイデス（Bacteroides）属細菌、カプノサイトファガ（Capnocytophaga）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、ハロバチルス（Halobacillus）属細菌、フゾバクテリウム（Fusobacterium）属細菌、エルウィニア（Erwinia）属細菌、エルベネラ（Elbenella）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、リステリア（Listeria）属細菌、マンヘイミア（Mannheimia）属細菌、ペプトコッカス（Peptococcus）属細菌、プレボテラ（Prevotella）属細菌、プロテウス（Proteus）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌及びベイロネラ（Veillonella）属細菌などが挙げられる。
より具体的には、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・アルギノリチカス（Vibrio alginolyticus）、シュードモナス・ホスホレウム（Pseudomonas phosphoreum）、ポリフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、大腸菌（Escherichia coli）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgfdorferi）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ペスト菌（Yersinia pestis）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、デイノコックス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、箕田赤痢菌（Shigella flexneri）、シゲラ・ボイデイ（Shigella boydii）、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・クブチリス（Bacillus cubtilis）、エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、チフス菌（Salmonella enterica）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、ヘリコバクター・ヘパティカス（Helicobacter hepaticus）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、スタフィロコッカス・ハエモリティカス（Staphylococcus haemolyticus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ストレプトコッカス・サンギニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、ビブリオ・ブルニフィカス（Vivrio vulnificus）、ビブリオ・ミミクス（Vibrio mimicus）、ビブリオ・アングイラルム（Vibrio anguillarum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）、エルウィニア・カロトバラ（Erwinia carotovara）、ハロバチルス・ハロフィラス（Halabacilus halophilus）、セラチア・ピムチカ（Serratia pymuthica）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・ディスタソニス（Bacteroides distasonis）、リステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、アエロモナス・ハイドロフィリア（Aeromonas hydrophilia）、マンヘイミア・ハエモライティカ（Mannhemia haemolytica）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、カンピロバクター・レクタス（Campylobacter rectus）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、アクチノマイセス・ナエスランディ（Actinomyces naeslundii）、ペプトコッカス・アナエロビウス（Peptococcus anaerobius）、フゾバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、ベイロネラ・パルラ（Veillonella parvula）、カプノサイトファガ・スプティゲナ（Capnocytophaga sputigena）及びプレボテラ・インタメディア（Prevotella intermedia）などが挙げられる。
【００１８】
本発明のバイオフィルム分散方法では、前記分散溶液にバイオフィルムが付着した対象物を浸漬して静置することにより、バイオフィルムを分散させ除去することができる。また、前記分散溶液をバイオフィルムに塗布又は噴霧して静置することにより、バイオフィルムを分散させ除去することができる。
また、バイオフィルムの分散と除去を促進するために、上記のようにバイオフィルムと前記分散溶液とを接触させた後、バイオフィルムが存在する表面をこすり洗いしてもよい。
【００１９】
なお、バイオフィルムと前記分散溶液とを接触させる時間は適宜設定できるが、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上である。
【００２０】
本発明のバイオフィルム分散方法では、ヒト又は非ヒト動物の口腔内に前記分散溶液を適用することで、歯に付着するバイオフィルムを治療的又は非治療的に分散させ除去する態様も包含する。この場合前記分散溶液の適用量はバイオフィルムを分散しうる量であればよく、投与方法、年齢、症状等により適宜決定することができる。例えば、ナットウキナーゼとι−カラギーナンの併用の場合、有効成分の総質量は、通常０．０１〜１ｇ、好ましくは０．１〜１ｇである。ナットウキナーゼとκ−カラギーナンの併用の場合は、通常０．１〜１０ｇ、好ましくは５〜１０ｇである。
なお、前記分散溶液を口腔内に適用する時間は適宜設定できるが、好ましくは３０秒以上、より好ましくは１分以上である。
また本明細書において「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００２１】
本発明は、下記溶液（３）又は（４）を含んでなるバイオフィルム分散溶液も提供する。
（３）ナットウキナーゼを０．０００１質量％以上０．０００５質量％以下含有し、かつι-カラギーナンを０．０１質量％以上０．１０質量％以下含有する溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．０００５質量％含有し、ι-カラギーナンを０．１０質量％含有する溶液を除く）。
（４）ナットウキナーゼを０．００１質量％以上０．０１０質量％以下含有し、かつκ-カラギーナンを０．５質量％以上１．０質量％以下含有する溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．００１質量％含有し、κ-カラギーナンを１．０質量％含有する溶液を除く）。
ここで、前記分散溶液（３）における両成分を合わせた含有量は０．０１質量％以上１質量％以下が好ましく、０．０１質量％以上０．１質量％以下がより好ましい。また、前記分散溶液（４）における両成分を合わせた含有量は０．１質量％以上１質量％以下が好ましく、０．５質量％以上１質量％以下がより好ましい。
【００２２】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のバイオフィルムの分散方法、バイオフィルムの分散組成物、使用並びに方法を開示する。
【００２３】
＜１＞下記（１）又は（２）の条件で、ナットウキナーゼ及びカラギーナンを含んでなるバイオフィルム分散用溶液をバイオフィルムに適用する、バイオフィルムの分散方法。
（１）ナットウキナーゼを０．０００１質量％以上０．０００５質量％以下含有し、かつι-カラギーナンを０．０１質量％以上０．１０質量％以下含有するバイオフィルム分散溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．０００５質量％含有し、ι-カラギーナンを０．１０質量％含有する分散溶液を除く）をバイオフィルムに適用する。
（２）ナットウキナーゼを０．００１質量％以上０．０１０質量％以下含有し、かつκ-カラギーナンを０．５質量％以上１．０質量％以下含有するバイオフィルム分散溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．００１質量％含有し、κ-カラギーナンを１．０質量％含有する分散溶液を除く）をバイオフィルムに適用する。
【００２４】
＜２＞前記条件（１）において、前記分散溶液に含まれるナットウキナーゼ及びι−カラギーナンの合計濃度が０．０１０１質量％以上０．１００１質量％以下である、前記＜１＞項に記載の方法。
＜３＞前記条件（２）において、前記分散溶液に含まれるナットウキナーゼ及びκ−カラギーナンの合計濃度が０．５０１質量％以上１.０１質量％以下である、前記＜１＞項に記載の方法。
＜４＞シュードモナス属細菌、ポルフィロモナス属細菌、エルシニア属細菌、エシェリキア属細菌、サルモネラ属細菌、ヘモフィルス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バシルス属細菌、ボレリア属細菌、ナイセリア属細菌、カンピロバクター属細菌、デイノコックス属細菌、ミコバクテリウム属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、シゲラ属細菌、エロモナス属細菌、エイケネラ属細菌、クロストリジウム属細菌、スタフィロコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、アクチノバチルス属細菌、アクチノマイセス属細菌、バクテロイデス属細菌、カプノサイトファガ属細菌、クレブシエラ属細菌、ハロバチルス属細菌、フゾバクテリウム属細菌、エルウィニア属細菌、エルベネラ属細菌、ラクトバチルス属細菌、リステリア属細菌、マンヘイミア属細菌、ペプトコッカス属細菌、プレボテラ属細菌、プロテウス属細菌、セラチア属細菌及びベイロネラ属細菌からなる群より選ばれる１種又は２種以上の細菌が形成するバイオフィルムを分散させる、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜５＞ビブリオ・ハーベイ、ビブリオ・フィシェリ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオ・アルギノリチカス、シュードモナス・ホスホレウム、ポリフィロモナス・ジンジバリス、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、ネズミチフス菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、枯草菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、髄膜炎菌、淋菌、ペスト菌、カンピロバクター・ジェジュニ、デイノコックス・ラジオデュランス、結核菌、エンテロコッカス・フェカリス、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、黄色ブドウ球菌、箕田赤痢菌、シゲラ・ボイデイ、セレウス菌、バチルス・クブチリス、エロモナス・ハイドロフィラ、チフス菌、エイケネラ・コロデンス、ヘリコバクター・ヘパティカス、ウェルシュ菌、スタフィロコッカス・ハエモリティカス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ストレプトコッカス・サンギニス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・ミティス、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、ビブリオ・ブルニフィカス、ビブリオ・ミミクス、ビブリオ・アングイラルム、ラクトバチルス・ラムノサス、エルウィニア・アミロボラ、エルウィニア・カロトバラ、ハロバチルス・ハロフィラス、セラチア・ピムチカ、セラチア・マルセセンス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ブルガタス、バクテロイデス・ディスタソニス、リステリア・モノサイトジェネス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、クロストリジウム・ディフィシル、アエロモナス・ハイドロフィリア、マンヘイミア・ハエモライティカ、クレブシエラ・ニューモニアエ、バチルス・アンスラシス、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・レクタス、プロテウス・ミラビリス、アクチノマイセス・ナエスランディ、ペプトコッカス・アナエロビウス、フゾバクテリウム・ヌクレアタム、ベイロネラ・パルラ、カプノサイトファガ・スプティゲナ及びプレボテラ・インタメディアからなる群より選ばれる１種又は２種以上の細菌が形成するバイオフィルムを分散させる、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜６＞前記分散溶液にバイオフィルムが付着した対象物を浸漬し、バイオフィルムを分散させる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜７＞前記分散溶液をバイオフィルムに塗布又は噴霧して静置することにより、バイオフィルムを分散させる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜８＞前記分散溶液とバイオフィルムとを接触させた後、バイオフィルムが存在する表面をこすり洗いしてバイオフィルムを分散させる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜９＞ヒトの口腔内に前記分散溶液を適用し、歯に付着するバイオフィルムを分散させる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
【００２５】
＜１０＞下記溶液（３）又は（４）を含んでなる、バイオフィルム分散溶液。
（３）ナットウキナーゼを０．０００１質量％以上０．０００５質量％以下含有し、かつι-カラギーナンを０．０１質量％以上０．１０質量％以下含有するバイオフィルム分散溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．０００５質量％含有し、ι-カラギーナンを０．１０質量％含有する溶液を除く）。
（４）ナットウキナーゼを０．００１質量％以上０．０１０質量％以下含有し、かつκ-カラギーナンを０．５質量％以上１．０質量％以下含有するバイオフィルム分散溶液（ただし、ナットウキナーゼを０．００１質量％含有し、κ-カラギーナンを１．０質量％含有する溶液を除く）。
【００２６】
＜１１＞バイオフィルム分散溶液としての、前記溶液（３）又は（４）の使用。
＜１２＞バイオフィルム分散溶液の製造のための前記溶液（３）又は（４）の使用。
＜１３＞前記溶液（３）又は（４）をバイオフィルム分散溶液として使用する方法。
＜１４＞口腔内のバイオフィルムの除去方法のために用いる、前記溶液（３）又は（４）。
＜１５＞口腔内のバイオフィルムの除去方法のための、前記溶液（３）又は（４）の非治療的な使用。
＜１６＞口腔内のバイオフィルムの除去薬を製造するための、前記溶液（３）又は（４）の使用。
【００２７】
＜１７＞前記溶液（３）に含まれるナットウキナーゼ及びι−カラギーナンの合計濃度が０．０１０１質量％以上０．１００１質量％以下である、前記＜１０＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の溶液、使用又は方法。
＜１８＞前記溶液（４）に含まれるナットウキナーゼ及びκ−カラギーナンの合計濃度が０．５０１質量％以上１.０１質量％以下である、前記＜１０＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載のバイオフィルム分散溶液、使用又は方法。
＜１９＞前記バイオフィルムが、シュードモナス属細菌、ポルフィロモナス属細菌、エルシニア属細菌、エシェリキア属細菌、サルモネラ属細菌、ヘモフィルス属細菌、ヘリコバクター属細菌、バシルス属細菌、ボレリア属細菌、ナイセリア属細菌、カンピロバクター属細菌、デイノコックス属細菌、ミコバクテリウム属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、シゲラ属細菌、エロモナス属細菌、エイケネラ属細菌、クロストリジウム属細菌、スタフィロコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、アクチノバチルス属細菌、アクチノマイセス属細菌、バクテロイデス属細菌、カプノサイトファガ属細菌、クレブシエラ属細菌、ハロバチルス属細菌、フゾバクテリウム属細菌、エルウィニア属細菌、エルベネラ属細菌、ラクトバチルス属細菌、リステリア属細菌、マンヘイミア属細菌、ペプトコッカス属細菌、プレボテラ属細菌、プロテウス属細菌、セラチア属細菌及びベイロネラ属細菌からなる群より選ばれる１種又は２種以上の細菌が形成するバイオフィルムである、前記＜１０＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の溶液、使用又は方法。
＜２０＞前記バイオフィルムが、ビブリオ・ハーベイ、ビブリオ・フィシェリ、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオ・アルギノリチカス、シュードモナス・ホスホレウム、ポリフィロモナス・ジンジバリス、エルシニア・エンテロコリチカ、大腸菌、ネズミチフス菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、枯草菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、髄膜炎菌、淋菌、ペスト菌、カンピロバクター・ジェジュニ、デイノコックス・ラジオデュランス、結核菌、エンテロコッカス・フェカリス、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、黄色ブドウ球菌、箕田赤痢菌、シゲラ・ボイデイ、セレウス菌、バチルス・クブチリス、エロモナス・ハイドロフィラ、チフス菌、エイケネラ・コロデンス、ヘリコバクター・ヘパティカス、ウェルシュ菌、スタフィロコッカス・ハエモリティカス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ストレプトコッカス・サンギニス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・ミティス、アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス、ビブリオ・ブルニフィカス、ビブリオ・ミミクス、ビブリオ・アングイラルム、ラクトバチルス・ラムノサス、エルウィニア・アミロボラ、エルウィニア・カロトバラ、ハロバチルス・ハロフィラス、セラチア・ピムチカ、セラチア・マルセセンス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・ブルガタス、バクテロイデス・ディスタソニス、リステリア・モノサイトジェネス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、クロストリジウム・ディフィシル、アエロモナス・ハイドロフィリア、マンヘイミア・ハエモライティカ、クレブシエラ・ニューモニアエ、バチルス・アンスラシス、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・レクタス、プロテウス・ミラビリス、アクチノマイセス・ナエスランディ、ペプトコッカス・アナエロビウス、フゾバクテリウム・ヌクレアタム、ベイロネラ・パルラ、カプノサイトファガ・スプティゲナ及びプレボテラ・インタメディアからなる群より選ばれる１種又は２種以上の細菌が形成するバイオフィルム、前記＜１０＞〜＜１９＞のいずれか１項に記載の溶液、使用又は方法。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
なお、実施例中の「％」はいずれも「質量％」を表す。
【００２９】
＜供試菌株＞
ストレプトコッカス・ミュータンス（JCM5175）を８ｍｌのBHI培地（ベクトン・ディッキンソン社製）で３７℃、嫌気条件下で１日培養した。得られた培養液をBHI培地で２０倍に希釈後、滅菌した９６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）の各ウェルに希釈溶液を２００μＬずつ分注し、３７℃、嫌気条件下で４８時間培養した。上澄みを廃棄後、各ウェルに２００μＬのＰＢＳを添加し、上澄みを廃棄する操作を３回行い、実験に供した。
【００３０】
＜バイオフィルム分散溶液の調製＞
ナットウキナーゼは、和光純薬工業社より入手したものを使用した。
κ-カラギーナン、及びι-カラギーナンはそれぞれ、東京化成工業社製より入手したものを使用した。
ナットウキナーゼ溶液、κ-カラギーナン溶液、及びι-カラギーナン溶液は、各物質をＢＨＩ培地に溶解して調製した。
【００３１】
＜バイオフィルム分散性能の評価＞
上記方法で調製した、ストレプトコッカス・ミュータンスが４８時間で形成したバイオフィルムの各ウェルに、ＢＨＩ培地に溶解した前記バイオフィルム分散溶液を１００μＬ加え、３７℃、嫌気条件下で１時間培養した。
１時間の培養後、１，０００ｒｐｍで１分間プレートを振盪させ、培養液８０μＬの吸光度を波長６００ｎｍで測定し、バイオフィルム分散性能を評価した。また、同じプレートの異なるウェルに、前記バイオフィルム分散溶液の代わりにＢＨＩ培地のみを加えて同様の操作を行ったものをネガティブコントロールとし、吸光度を測定した。また、バイオフィルム分散溶液自体の吸光度をサンプルブランクとして測定した。
【００３２】
サンプルの吸光度（As）、ネガティブコントロールの吸光度（An）及びサンプルブランクの吸光度（Abs）、及びネガティブコントロールブランクの吸光度（Abn）に基づき、バイオフィルム分散性能を下記の数式（１）に基づいて算出した。
バイオフィルム分散能（OD600値）＝（As−Abs）−（An−Abn）      数式（１）
【００３３】
さらに、上記の数式（１）に基づいて算出した、ナットウキナーゼを単独で作用させた場合のバイオフィルム分散能（Ｂｎ）、ι-カラギーナン又はκ-カラギーナンを単独で作用させた場合のバイオフィルム分散能（Ｂｃ）、ナットウキナーゼ、及びι-カラギーナン又はκ-カラギーナンを併用して作用させた場合のバイオフィルム分散能（Ｂｎｃ）に基づき、バイオフィルムの分散相乗割合を下記の数式（２）に基づいて算出した。
バイオフィルムの分散相乗割合＝Ｂｎｃ／（Ｂｎ＋Ｂｃ）      数式（２）
【００３４】
このようにして行った分散評価結果を下記表１（ナットウキナーゼとι-カラギーナンの分散相乗効果）及び表２（ナットウキナーゼとκ-カラギーナンの分散相乗効果）に示す。
【００３５】
【表１】
0006560891.tif 000002
【００３６】
【表２】
0006560891.tif 000003
【００３７】
表１、２から明らかなように、ナットウキナーゼと、ι-カラギーナン又はκ-カラギーナンを併用し、かつこれらを所定量含む分散溶液を用いた場合に、バイオフィルム分散の相乗効果が認められ、優れたバイオフィルム除去性を示した。