(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機相として１０％〜９０％の脱細胞化生体組織マトリクス材料と、無機相として９０％〜１０％のカルシウム塩とを含み、前記脱細胞化生体組織マトリクス材料が微小繊維形状を有し、前記微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料が１〜２５０マイクロメートルの直径および１００〜４０００マイクロメートルの長さを有することを特徴とする、脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料。
【請求項２】
前記カルシウム塩が、バイオガラス、バイオセラミック、ストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する鉱物またはストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する塩であることを特徴とする、請求項１に記載の脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料。
【請求項３】
分散相としての前記無機相が、連続相としての有機相内に粒子の形態で分散しており、前記無機相は前記有機相内に均一に分散されており、または前記有機相内に特定の勾配で分散されていることを特徴とする、請求項１に記載の脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料。
【請求項４】
３次元多孔質ネットワーク構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料。
【請求項５】
前記脱細胞化生体組織マトリクス材料が哺乳動物の軟組織に由来し、前記哺乳動物の軟組織が、ブタの軟組織、ウシの軟組織および人体の軟組織を含み、前記軟組織は、表皮、真皮、血管、横隔膜、筋腱、靱帯、大腸、小腸および神経組織を含むことを特徴とする、請求項１に記載の脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料。
【請求項６】
前記カルシウム塩が、ヒドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸二水素カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸オクタカルシウム、硫酸カルシウムまたは炭酸カルシウムであることを特徴とする、請求項１に記載の脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨修復のための複合材料を調製する方法であって
以下の工程：
８．１）微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を調製する工程であって、以下の工程：
（ａ）組織原材料を採取し、血液を洗い流し、所望のサイズに切断し、前記材料を２〜１０℃の低温で保存する工程と、
（ｂ）消毒し、滅菌する工程であって、前記組織原材料を消毒剤溶液中で滅菌し、滅菌脱イオン水で十分に洗浄し、次いで滅菌生理食塩水ですすぐ、消毒し、滅菌する工程と、
（ｃ）切断する工程であって、組織粉砕および脱細胞化を容易にするように前記組織原材料を所望のサイズに切断する、切断する工程と、
（ｄ）組織を粉砕する工程であって、消毒した組織原材料を粉砕器によって粉砕し、均質化する、組織を粉砕する工程と、
（ｅ）前記材料を一連の脱細胞化溶液中に浸して、細胞を除去し、残存デオキシリボ核酸をデオキシリボヌクレアーゼ溶液で分解する工程と、
（ｆ）組織マトリクスを洗浄する工程であって、工程（ｅ）における生成物を、０．９％の質量濃度を有する生理食塩水によって洗浄し、工程（ｅ）の処理によって得られた上清を遠心分離プロセスによって除去する、組織マトリクスを洗浄する工程と、
（ｇ）最終的に滅菌する工程であって、工程（ｆ）における生成物を、１０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度にて生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水の溶媒中に分散させ、滅菌し、得られた脱細胞化生体組織マトリクス微小繊維を閉鎖容器内に密閉して保存する、滅菌する工程と
を含む、微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
８．２）バイオセラミック微小粒子を調製する工程であって、以下の工程：
（ｈ）機械的微粉化、高速ボールミルの工程の後に１〜５００マイクロメートルの粒径を有するバイオセラミック微小粒子を得、特定の用途に応じて前記バイオセラミックをふるい分けし、次いでウイルスを不活性化するために高温および高圧下で前記バイオセラミック微小粒子を消毒し、滅菌する工程と、
（ｉ）前記バイオセラミック微小粒子を滅菌生理食塩水と混合し、５００〜１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を有する均質な懸濁液を得るように十分に撹拌し、振動する工程と
を含む、バイオセラミック微小粒子を調製する工程と、
８．３）骨修復のための複合材料を調製する工程であって、以下の工程：
（ｊ）工程８．１）の（ｇ）において得られた前記微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を、工程８．２）の（ｉ）において得られた滅菌粒子バイオセラミックと、請求項１において定義された割合に従って均質に物理的に混合して、流体状態の複合材料の混合物を得る工程と、
（ｋ）工程８．３）の（ｊ）における複合材料の混合物を型に移し、複合材料を充填した型を１〜２４時間、−２０℃〜−１９６℃の温度で置いて、凍結混合物を得る工程と、
（ｌ）工程８．３）の（ｋ）において得られた凍結状態の混合物から溶媒を、１２〜９６時間、−２０℃から１０℃の低温および１０〜２０００ミリトルの真空環境下で除去し、骨修復のための３次元多孔質複合材料を得る工程と、
（ｍ）工程８．３）の（ｌ）において得られた骨修復のための複合材料を最終的に殺菌する工程と
を含む、骨修復のための複合材料を調製する工程と
を含み、
前記骨修復のための複合材料において、前記カルシウム塩がバイオセラミックであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨修復のための複合材料を調製する方法。
【請求項８】
以下の工程：
９．１）請求項７において定義された工程８．１）による微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
９．２）骨修復のための複合材料を調製する工程であって、以下の工程：
（ａ）工程９．１）における前記脱細胞化生体組織マトリクス材料を型に移し、前記材料を充填した型を１〜２４時間、−２０℃〜−１９６℃の温度で置いて、凍結生体組織マトリクス材料を得る工程と、
（ｂ）工程９．２）の（ａ）において得られた凍結状態の生体組織マトリクス材料から溶媒を、１２〜９６時間、−２０℃から１０℃の低温および１０〜２０００ミリトルの真空環境下で除去し、３次元多孔質生体組織マトリクス材料を得る工程と、
（ｃ）工程９．２）の（ｂ）において得られた３次元多孔質生体組織マトリクス材料を、１〜４時間、２０〜３７℃にてカルシウムイオンを含有する溶液中に浸し、次いで生体組織マトリクス材料を取り出し、脱イオン水で３回、各回５分洗浄し、生体組織マトリクス材料を、１〜４時間、２０〜３７℃にてリン酸イオンを含有する溶液中に浸し、次いで生体組織マトリクス材料を取り出し、脱イオン水で３回、各回５分洗浄し、さらなる量のカルシウムイオン対リン酸イオンのモル比は、Ｃａ／Ｐ＝１／１〜２／１であり、上記の工程を５回反復して、骨修復のための３次元多孔質複合材料を得る工程と、
（ｄ）工程９．２）の（ｃ）において得られた骨修復のための複合材料を最終的に滅菌する工程と
を含む、骨修復のための複合材料を調製する工程とを含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨修復のための複合材料を調製する方法。
【請求項９】
前記原材料が哺乳動物の軟組織に由来し、前記哺乳動物の軟組織が、ブタの軟組織、ウシの軟組織および人体の軟組織を含み、前記軟組織は、表皮、真皮、血管、横隔膜、筋腱、靱帯、大腸、小腸および神経組織を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の骨修復のための複合材料を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は材料科学の分野に属し、特に脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料およびそれを調製する方法に関する。複合材料は整形外科および形成外科の分野において広範に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
障害のある骨組織の修復および再構成は、世界中で整形外科医が取り組まなければならない重要な課題である。統計によれば、６００，０００超および１，０００，０００の症例の骨移植手術が２０１３年にそれぞれ中国および米国において実施され、世界中で骨移植代用材料の販売は２０億ＵＳドルを超える。骨移植材料は障害のある骨組織の修復に必要とされる。自家骨組織、すなわち患者独自の身体から採取した健常な骨組織は障害のある骨組織の修復のための将来有望な基準と世界中でみなされている。自家骨は、優れた骨誘導性、骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）、骨原性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）および安全性などの、骨組織を修復するのに必要とされる全ての特性を有する。しかしながら、自家骨の使用に関連する臨床的に避けられない欠点が存在する。骨組織は、自家骨を使用する場合、患者の身体のドナー部位から採取されることを必要とするので、この追加の手術が手術の期間およびコスト、患者の回復時間を増加させる。その一方で、ドナー部位の罹患率および制限された供給が自家骨に関連する他の問題である。加えて、骨移植を必要とする高齢患者の骨組織の質は年齢に伴って減少し、したがって自家骨は恐らく高齢者にとって良好な選択ではない。したがって、自家骨を置換することができる骨再生材料（または骨移植代用材料）の開発が解決されるべき緊急の問題である。
【０００３】
整形外科医によって臨床的に使用される骨移植代用材料には、同種骨、脱灰骨マトリクス、成長因子および合成材料が含まれる。同種骨は他の人々によって提供された骨組織に由来する。それは骨伝導性を有し、比較的適した供給がある。しかしながら、同種骨に関連する欠点には、供与組織の制御できない質、組織拒絶反応、骨癒合にかかる長い時間またはさらに癒着不能、および疾患伝播の危険性が含まれる。脱灰骨マトリクスは同種骨または異種骨（動物骨組織）を脱灰することによって得られる。それは骨伝導性があり、適切な供給がある。脱灰骨マトリクスの臨床的使用に関して比較的十分なデータが存在する。それにも関わらず、脱灰骨マトリクス材料の骨誘導性は非常に制限され、その使用もまた、疾患伝播の危険性を有する。骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）または骨形成タンパク質−７（ＢＭＰ−７またはＯＰ−１）などの骨修復のための成長因子は骨誘導性を有する。しかしながら、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、米国における臨床用途および販売のための成長因子を含む少ない種類の整形外科医療機器、例えば、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ製のＩｎＦｕｓｅ（登録商標）（ＢＭＰ−２を含有する）およびＳｔｒｙｋｅｒ製のＯＰ−１（登録商標）（ＢＭＰ−７を含有する）を唯一承認している。さらに、成長因子自体は骨伝導性を有さず、非常に高価である。その一方で、最近、ますます多くの臨床報告により、成長因子の使用が発癌性の危険があることが明らかにされている。
【０００４】
自家骨、同種骨、脱灰骨マトリクスおよび成長因子の臨床用途に存在する種々の不可避の不都合な点のために、合成材料がますます整形外科医の選択になってきている。整形外科医によって臨床的に使用される合成骨移植材料は合成材料の第１の世代と合成材料の第２の世代に大まかに分類され得る。合成材料の第１の世代および第２の世代は良好な骨伝導性を有し、一般に骨欠損の小領域を修復するための骨充填材料として使用される。合成材料の第１の世代には、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイトなどの種々の種類のセラミック材料、またはセラミック、カルシウムおよびリン酸塩と、天然および合成ポリマーなどの有機材料との複合材料が含まれる。国際市場におけるこのような種類の製品には、ＳｔｒｙｋｅｒのＶｉｔｏｓｓ（登録商標）、ＭｅｄｔｒｏｎｉｃのＭａｓｔｅｒＧｒａｆｔ（登録商標）、ＢｉｏｍｅｔのＰｒｏＯｓｔｅｏｎ（登録商標）、ＤｅＰｕｙのＨｅａｌｏｓ（登録商標）、ＺｉｍｍｅｒのＣｏｐｉＯｓ（登録商標）などが含まれる。このような製品は骨伝導性および骨原性を有さない。合成材料の第２の世代は、バイオガラス、シリコンおよびリン酸塩ならびに同種のものなどの生物活性を有する無機成分を導入することによって新たな骨形成を刺激する制限された機能を示す。国際市場における合成材料の第２の世代には、Ｓｔｒｙｋｅｒ製のＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡ、Ｂａｘｔｅｒ製のＡｃｔｉＦｕｓｅ（登録商標）およびＮｏｖａＢｏｎｅ製のＮｏｖａＢｏｎｅ（登録商標）が含まれる。骨移植代用材料を開発し、市販している国内の製造業者は中国において少数のみである。例えば、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｒｅｂｏｎｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．は、自己硬化リン酸カルシウムから作製されたその人工骨材料を生産している。Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｙｉｅｒｋａｎｇ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒは、Ｔｓｉｎｇｈｕａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって開発されたＲｅＬｉｖｅ（登録商標）ナノ人工骨を市販している。国内の製造業者によって生産された骨移植代用材料は本質的に、国際分類基準によって定義されている合成材料の第１の世代に属する。
【０００５】
骨組織は脊椎動物において石灰化した細胞外マトリクスを形成する唯一の結合組織である。石灰化した細胞外マトリクスは骨格に必要とされる硬度および強度を提供する。骨マトリクスは有機および無機成分の両方からなる。有機成分は骨格の約２０％の湿重量に相当し、無機成分は骨格の約６５％の湿重量に相当する。骨格の有機成分は主にコラーゲンであり、それは有機成分の約９０％に相当し、主にＩ型コラーゲンである。空間的構造に関して、コラーゲンは三重螺旋の特別なより合わさっている構造を示す。互いに独立している３つのコラーゲンペプチド鎖は、グリシンの間に形成される水素結合により三重螺旋のより合わさっている構造を維持する。この構造は安定な構造および優れた強度をコラーゲンに与える。骨格の無機成分は主にヒドロキシアパタイトである。骨組織の構造および性能を模倣するために、科学者はしばしば、科学研究および臨床製品開発における骨修復のための材料として、Ｉ型コラーゲン、セラミック材料、またはそれらの複合材料を使用する。現在の国際的な医療機器市場および臨床において、骨修復のためのほぼ全てのコラーゲン含有材料は化学的に精製されたＩ型コラーゲンを使用している。多くの米国特許、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９などの全ては、主に原材料として化学的に精製されたＩ型コラーゲンを使用する骨修復材料に関する。それらの特許文献から変換された臨床製品には、Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）、Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）およびＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡなどが含まれる。特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４などの多くの同様の国内特許は、化学的に精製されたコラーゲンおよびセラミックの複合材料を報告している。化学的に精製されたコラーゲンの不都合な点は、その抽出プロセスが複雑であり、コラーゲンは、抽出の間、その固有の三重螺旋構造を変性させ、損失し、その元の生物学的機能の損失を生じるということである。加えて、コラーゲンは化学的方法によって生体組織から抽出され、元の生体マトリクスにおける多くの種類の有機成分が最終材料において損失し、コラーゲンは比較的単純な成分を有し、骨修復の間の複雑なシグナル経路のための要件を満たすことができなくなる。一方で、化学的に精製されたコラーゲンが骨修復材料として使用される場合、ホルムアルデヒド、２，３−ジヒドロキシプロパナール、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドなどの、比較的高い毒性を有する化学架橋剤が、コラーゲンの強度および熱安定性を増加させるようにコラーゲン分子を架橋するために必要とされる。しかしながら、材料のインビボ移植の後、ならびにその分解および吸収プロセスの間、低分子架橋剤が化学的に架橋されたコラーゲンから放出され、細胞毒性を生じ、炎症および免疫反応を誘導する。この内在する問題に対処するために、特許文献１５は骨組織操作のための骨格材料を報告しており、その材料は、脱細胞化され、脱脂されたブタの皮膚由来のコラーゲンの天然の３次元ネットワーク構造を得、その上に、コラーゲンを架橋するためのさらなる化学架橋剤を使用することなく、ヒドロキシアパタイト層を配合することによって調製される。骨格材料を生成するこの方法はコラーゲンの３次元ネットワーク構造に基づく。したがって、石灰化がコラーゲンおよびヒドロキシアパタイトの複合材料を生成するためにリン酸カルシウム溶液中で実施される方法において使用されるためだけに制限されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５７７６１９３号
【特許文献２】米国特許第５６８１８７２号
【特許文献３】米国特許第６７６４５１７号
【特許文献４】米国特許第７１８９２６３号
【特許文献５】米国特許第７９９８４９９号
【特許文献６】米国特許第８３０３９６７号
【特許文献７】米国特許第８４６０６８６号
【特許文献８】米国特許第８９６８７９７号
【特許文献９】米国特許第８６１３９３８号
【特許文献１０】中国特許第１３３８３１５号
【特許文献１１】中国特許第１５２６７６５号
【特許文献１２】中国特許第１０２０８５３９２号
【特許文献１３】中国特許第１０３０５５３５２号
【特許文献１４】中国特許第１０３３４１２０６号
【特許文献１５】中国特許第１０１４１７１４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料およびそれを調製する方法を提供することである。本発明によって調製される複合材料は脱細胞化生体組織マトリクスに基づく。生成した生体組織マトリクス材料は有機成分の天然の架橋状態を維持するので、化学架橋剤は必要とされない。本発明に使用される生体組織マトリクス材料は微小繊維形状を有するので、マトリクス材料を、リン酸カルシウムなどの無機材料と物理的に混合することによって、またはバイオミネラリゼーションによって均一に分散された複合材料を調製するために使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は以下の技術的解決策によって達成される。
【０００９】
脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料は、有機相として１０％〜９０％の脱細胞化生体組織マトリクス材料と、無機相として９０％〜１０％のカルシウム塩とを含む。
【００１０】
好ましくは、カルシウム塩は、無機相として、バイオガラス、バイオセラミック、ストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する鉱物またはストロンチウム、亜鉛、マグネシウムもしくはケイ素を含有する塩と置き換えられる。
【００１１】
好ましくは、分散相としての無機相は連続相としての有機相内に粒子の形態で分散しており；無機相は有機相内に均一に分散され得るか、または有機相内に特定の勾配で分散され得る。
【００１２】
好ましくは、脱細胞化生体組織マトリクス材料に基づいた骨修復のための複合材料は３次元多孔質ネットワーク構造を有する。
【００１３】
好ましくは、脱細胞化生体組織マトリクス材料は哺乳動物の軟組織に由来する。哺乳動物の軟組織は、ブタの軟組織、ウシの軟組織および人体の軟組織を含む。軟組織は、表皮、真皮、血管、横隔膜、筋腱、靱帯、大腸、小腸および神経組織を含む。
【００１４】
好ましくは、脱細胞化生体組織マトリクス材料は微小繊維形状を有する。微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料は１〜２５０マイクロメートルの直径および１００〜４０００マイクロメートルの長さを有する。
【００１５】
好ましくは、カルシウム塩は、ヒドロキシアパタイト［Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨ］、α−リン酸三カルシウム［α−Ｃａ３（ＰＯ４）２］、β−リン酸三カルシウム［β−Ｃａ３（ＰＯ４）２］、リン酸水素カルシウム［ＣａＨＰＯ４］、リン酸水素カルシウム二水和物［ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ］、リン酸二水素カルシウム［Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２］、リン酸四カルシウム［Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ］、リン酸オクタカルシウム［Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ］、硫酸カルシウム［ＣａＳＯ４］または炭酸カルシウム［ＣａＣＯ３］である。
【００１６】
骨修復のための複合材料を調製する方法は、
１．１）微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を調製する工程であって、以下の工程：
（ａ）組織原材料を採取し、血液を洗い流し、所望のサイズに切断し、材料を２〜１０℃の低温で保存する工程と、
（ｂ）消毒し、滅菌する工程であって、組織原材料を消毒剤溶液中で滅菌し、滅菌脱イオン水で十分に洗浄し、次いで滅菌生理食塩水ですすぐ、消毒し、滅菌する工程と、
（ｃ）切断する工程であって、組織粉砕および脱細胞化を容易にするように組織原材料を所望のサイズに切断する、切断する工程と、
（ｄ）組織を粉砕する工程であって、消毒した組織原材料を粉砕器によって粉砕し、均質化する、組織を粉砕する工程と、
（ｅ）材料を一連の脱細胞化溶液中に浸して、細胞を除去し、残存デオキシリボ核酸をデオキシリボヌクレアーゼ溶液で分解する工程と、
（ｆ）組織マトリクスを洗浄する工程であって、工程（ｅ）における生成物を、０．９％の質量濃度を有する生理食塩水によって洗浄し、工程（ｅ）の処理によって得られた上清を遠心分離プロセスによって除去する、組織マトリクスを洗浄する工程と、
（ｇ）最終的に滅菌する工程であって、工程（ｆ）における生成物を、１０〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度にて生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水の溶媒中に分散させ、滅菌し、得られた脱細胞化生体組織マトリクス微小繊維を閉鎖容器内に密閉して保存する、滅菌する工程と
を含む、微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
１．２）バイオセラミック微小粒子を調製する工程であって、以下の工程：
（ｈ）機械的微粉化、高速ボールミルの工程の後に１〜５００マイクロメートルの粒径を有するバイオセラミック微小粒子を得、特定の用途に応じてバイオセラミックをふるい分けし、次いでウイルスを不活性化するために高温および高圧下でバイオセラミック微小粒子を消毒し、滅菌する工程と、
（ｉ）バイオセラミック微小粒子を滅菌生理食塩水と混合し、５００〜１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を有する均質な懸濁液を得るように十分に撹拌し、振動する（ｓｈｏｃｋｉｎｇ）工程と
を含む、バイオセラミック微小粒子を調製する工程と、
１．３）骨修復のための複合材料を調製する工程であって、以下の工程：
（ｊ）工程１．１）の（ｇ）において得られた微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を、工程１．２）の（ｉ）において生成した滅菌粒子バイオセラミックと、本発明において定義された割合に従って均質に物理的に混合して、流体状態の複合材料の混合物を得る工程と、
（ｋ）工程１．３）の（ｊ）における複合材料の混合物を型に移し、複合材料を充填した型を１〜２４時間、−２０℃〜−１９６℃の温度で置いて、凍結混合物を得る工程と、
（ｌ）工程１．３）の（ｋ）において得られた凍結状態の混合物から溶媒を、１２〜９６時間、−２０℃から１０℃の低温および１０〜２０００ミリトルの真空環境下で除去し、骨修復のための３次元多孔質複合材料を得る工程と、
（ｍ）工程１．３）の（ｌ）において得られた骨修復のための複合材料を最終的に滅菌する工程と
を含む、骨修復のための複合材料を調製する工程と
を含む。
【００１７】
代替として、骨修復のための複合材料を調製する方法は以下の工程：
２．１）上記の方法の工程１．１）による微小繊維脱細胞化生体組織マトリクス材料を調製する工程と、
２．２）骨修復のための複合材料を調製する工程であって、以下の工程：
（ａ）工程２．１）における脱細胞化生体組織マトリクス材料を型に移し、材料を充填した型を１〜２４時間、−２０℃〜−１９６℃の温度で置いて、凍結生体組織マトリクス材料を得る工程と、
（ｂ）工程２．２）の（ａ）において得られた凍結状態の生体組織マトリクス材料から溶媒を、１２〜９６時間、−２０℃から１０℃の低温および１０〜２０００ミリトルの真空環境下で除去し、３次元多孔質生体組織マトリクス材料を得る工程と、
（ｃ）工程２．２）の（ｂ）において得られた３次元多孔質生体組織マトリクス材料を、１〜４時間、２０〜３７℃にてカルシウムイオンを含有する溶液中に浸し、次いで生体組織マトリクス材料を取り出し、脱イオン水で３回、各回５分洗浄し、生体組織マトリクス材料を、１〜４時間、２０〜３７℃にてリン酸イオンを含有する溶液中に浸し、次いで生体組織マトリクス材料を取り出し、脱イオン水で３回、各回５分洗浄し、さらなる量のカルシウムイオン対リン酸イオンのモル比は、Ｃａ／Ｐ＝１／１〜２／１であり、上記の工程を５回反復して、骨修復のための３次元多孔質複合材料を得る工程と、
（ｄ）工程２．２）の（ｃ）において得られた骨修復のための複合材料を最終的に滅菌する工程と
を含む、骨修復のための複合材料を調製する工程と
を含む。
【００１８】
好ましくは、原材料は哺乳動物の軟組織に由来する。哺乳動物の軟組織は、ブタの軟組織、ウシの軟組織および人体の軟組織を含む。軟組織は、表皮、真皮、血管、横隔膜、筋腱、靱帯、大腸、小腸および神経組織を含む。
【００１９】
本発明の有益な技術的効果は以下の通りである。
【００２０】
本発明によって調製される複合材料は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ製のＨｅａｌｏｓ（登録商標）およびＳｔｒｙｋｅｒ製のＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡなどの、国際的な医療機器市場および臨床用途における典型的な骨修復材料より優れた骨修復機能を示す。現在、臨床における生物学的因子を含む骨修復材料のこれらの種類の全ては、化学的に精製されたＩ型コラーゲンを使用する。この種類のコラーゲンの不都合な点は、その抽出プロセスが複雑であり、コラーゲンが抽出の間に変性し、その最適な生物学的性能を発揮することができない点であり、加えて、その組成は比較的単純であるので、骨修復プロセスの間、複雑なシグナル経路についての要件を満たすことができず、さらに、毒性の化学架橋剤がこのようなコラーゲンの使用の間に必要とされ、これにより移植の間に免疫および炎症反応を容易に誘発し得るという点である。対照的に、その進化した抽出プロセスに起因して本発明によって調製される生体組織マトリクス材料は、組織に存在する未変性のコラーゲンおよび他の細胞外マトリクスを最大限に保持できるので、それは豊富な成分を有し、細胞吸収を良好に促進でき、細胞移動、成長および分化に必要とされる種々のシグナルを提供でき；抽出プロセスがコラーゲン間の結合を破壊しないので、得られたタンパク質は天然架橋状態になり、化学架橋剤は必要とされず、生体組織マトリクス材料の分解が主に細胞によって分泌される種々の酵素により実施される。本発明によって調製される生体組織マトリクス材料のこれらの特性は、純粋なコラーゲン材料と比べて骨修復代用材料としてのその大きな利点および多機能を決定する。
【００２１】
インタクトなタンパク質構造を有するミクロンサイズの生体組織マトリクス材料と、同様にミクロンサイズのバイオセラミックとの複合物は、本発明によって開発された進化した微細加工技術によって実現される。種々の成分が均質に分散し、生体適合性、骨伝導性および骨誘導性が優れている、骨再生のための新たな複合材料が調製される。本発明は、
サイズの差のためにバイオセラミック材料または他のポリマー材料と均質な複合材料を形成することが困難である、基質として大きなサイズのコラーゲンを使用する他の材料が有する技術的欠点を克服する。本発明に記載される骨修復のための複合材料は、その生体組織マトリクス微小繊維を、同様のミクロンサイズの任意のバイオセラミック材料と混合して、種々の成分が均質に分散された複合材料を形成することによって製造され得る。したがって、複合材料は比較的複雑な生物学的石灰化プロセスによって調製されることを必要としないので、工業生産のスケールアップをより容易に達成することができる。
【００２２】
本発明によって調製される骨修復のための複合材料は、さらなる物理的または化学的架橋を有さずに完全な３次元多孔質ネットワーク構造を有し；生体組織マトリクス材料中のタンパク質成分は天然の三重らせん構造を維持し；複合材料は、優れた生体適合性、完全な生体適合性、優れた骨伝導性、良好な骨誘導性および骨原性を有し；一方で、本発明の複合材料は特定の機械的強度および形状記憶機能を有し、生物活性を有する良好な骨充填材料または骨欠損の大部分のための修復材料である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】それぞれ、（Ａ）薄片および細長片形状、（Ｂ）円柱形状、および（Ｃ）円盤形状の微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料である、本発明によって調製された、いくつかの製品の画像である。
【図２】本発明によって調製された、６０％のリン酸水素カルシウム含有量（重量）を有する微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像である。本発明によって調製された複合材料は３次元多孔質構造を有し、リン酸水素カルシウム粒子は微小繊維生体組織マトリクスの連続相内に均一に分散されている。
【図３】本発明によって調製された微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料における（Ａ）カルシウムおよび（Ｂ）リンの元素の走査画像である。
【図４】異なる凍結温度にて本発明によって調製された微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像である。（Ａ）は−１９６℃にて液体窒素中で材料を凍結し、さらに凍結乾燥させることによって得られた微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像である。得られた３次元骨格材料の孔径は、（Ｂ）に示すように−２０℃にて凍結し、さらに凍結乾燥させることによって調製された複合材料の孔径より小さい。
【図５】本発明によって調製された７５％のリン酸水素カルシウム含有量（重量）を有する微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像である。
【図６】微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料をマウスの頭蓋冠欠損内に移植してから６週間後のインプラントの組織染色画像を示す。複合材料は３０％のリン酸水素カルシウム含有量（重量）を有し、移植前の新鮮なマウス骨髄と混合される。（Ａ）はゴールドナー・トリクローム（Ｇｏｌｄｎｅｒ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色であり、（Ｂ）はフォン・コッサ（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色である。
【図７】６０％のリン酸水素カルシウム含有量（重量）を有し、移植前に新鮮なマウス骨髄と混合される微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を使用したマウスの脛骨の重篤なサイズの欠損の修復を示す。（Ａ）は、外科処置後１日目のＸ線画像であり、マウスの脛骨において３．５ミリメートル長の骨欠損を示し、（Ｂ）Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）の移植の１２週後におけるＸ線画像であり、（Ｃ）はＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡ移植の１２週後におけるＸ線画像であり、（Ｄ）は本発明の生体組織マトリクス複合材料の移植の１２週後におけるＸ線画像であり、（Ｅ）はＨｅａｌｏｓ（登録商標）の移植の１２週後におけるフォン・コッサ染色画像であり、（Ｆ）はＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡの移植の１２週後におけるフォン・コッサ染色画像であり、（Ｇ）は本発明の生体組織マトリクス複合材料の移植の１２週後におけるフォン・コッサ染色画像である。
【図８】７５％のリン酸水素カルシウム含有量（重量）を有し、移植前に新鮮なマウス骨髄と混合される微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料を使用したマウスの脛骨の骨非癒合の修復を示す。（Ａ）は、骨非癒合の両端における偽関節が切除され、髄腔が再露出されていることを示すＸ線画像であり、（Ｂ）は、本発明によって調製され、移植前に新鮮なマウス骨髄と混合される複合材料の移植により骨非癒合を修復してから８週後におけるＸ線画像であり、（Ｃ）は、本発明によって調製され、移植前の新鮮なマウス骨髄と混合される複合材料の移植により骨非癒合を修復してから８週後におけるマイクロコンピューターによる断層画像であり、（Ｄ）は、本発明によって調製され、移植前の新鮮なマウス骨髄と混合される複合材料の移植により骨非癒合を修復してから８週後の元の骨非癒合部位における新たに生成された組織のゴールドナー・トリクローム染色画像であり、（Ｅ）は、本発明によって調製され、移植前に新鮮なマウス骨髄と混合される複合材料の移植により骨非癒合を修復してから８週後の元の骨非癒合部位における新たに生成された組織のフォン・コッサ染色画像である。
【実施例】
【００２４】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に記載し、それらは本発明を限定するというより本発明を例示することを意図する。
【００２５】
実施例１：
ブタの表皮を脱細胞化し、ガンマ線照射によって滅菌することによって得られる２４０ｍｇの微小繊維生体組織マトリクス材料を、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した１ｍｌの脱イオン水に加えた。微小繊維生体組織マトリクスをボルテックスミキサーによって水中に均質に分散した。さらに、約２５μｍの粒径を有する３６０ｍｇのリン酸水素カルシウム粉末を、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した１ｍｌの脱イオン水に加えた。リン酸水素カルシウムをボルテックスミキサーによって水中に均質に分散した。次いで微小繊維生体組織マトリクスの１ｍｌ懸濁液をリン酸水素カルシウムの１ｍｌ懸濁液と混合した。微小繊維生体組織マトリクスおよびリン酸水素カルシウムをホモジナイザーによって均質化した（複合材料におけるリン酸水素カルシウムの重量パーセントは６０％である）。均質に混合された微小繊維生体組織マトリクスおよびリン酸水素カルシウムのペーストを成型のために特定の形状を有する型に移し、次いで−２０℃にて２４時間凍結させ、さらに−５０℃にて４８時間凍結乾燥させた。
【００２６】
生成した微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料は、図１（Ａ）、１（Ｂ）および１（Ｃ）に示されるように薄片、細長片、円柱、円盤形状などの種々の形状に作製することができる。生成した微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像を図２に示す。生成した複合材料は、リン酸水素カルシウム粒子が微小繊維生体組織マトリクスの連続相内に均質に分散されている、３次元多孔質構造を有する。図３は、複合材料におけるカルシウムおよびリンの元素の走査画像であり、複合材料におけるリン酸水素カルシウム成分の均質な分散を示す。
【００２７】
実施例２：
ブタの表皮を脱細胞化し、ガンマ線照射によって滅菌することによって得た２４０ｍｇの微小繊維生体組織マトリクス材料を秤量した。０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した１ｍｌの脱イオン水を生体組織マトリクス微小繊維材料に加えた。微小繊維生体組織マトリクスをボルテックスミキサーを使用して水中に均質に分散した。さらに、約２５μｍの粒径を有する１０３ｍｇのリン酸水素カルシウム粉末を秤量し、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した１ｍｌの脱イオン水に加えた。リン酸水素カルシウムをボルテックスミキサーを使用して水中に均質に分散した。次いで微小繊維生体組織マトリクスの１ｍｌ懸濁液をリン酸水素カルシウムの１ｍｌ懸濁液と混合した。微小繊維生体組織マトリクスおよびリン酸水素カルシウムをホモジナイザーによって均質化した（複合材料におけるリン酸水素カルシウムの重量パーセントは３０％である）。均質に混合された微小繊維生体組織マトリクスおよびリン酸水素カルシウムのペーストを成型のために特定の形状を有する型に移し、次いで液体窒素中で２４時間凍結させ、さらに−５０℃にて４８時間凍結乾燥させた。
【００２８】
生成した微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像を図４（Ａ）に示す。生成した複合材料は３次元多孔質構造を有し、その孔径は、−２０℃の条件で凍結し、次いで実施例１における凍結乾燥によって生成される複合材料の孔径より小さい［図４（Ｂ）］。
【００２９】
実施例３：
ブタの表皮を脱細胞化し、ガンマ線照射によって滅菌することによって得られた２４０ｍｇの微小繊維生体組織マトリクス材料を秤量した。０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した１ｍｌの脱イオン水を生体組織マトリクス微小繊維材料に加えた。微小繊維生体組織マトリクスをボルテックスミキサーによって水中に均質に分散した。さらに、約２５μｍの粒径を有する７２０ｍｇのリン酸水素カルシウム粉末を秤量し、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過した１ｍｌの脱イオン水に加えた。リン酸水素カルシウムをボルテックスミキサーによって水中に均質に分散した。次いで微小繊維生体組織マトリクスの１ｍｌ懸濁液をリン酸水素カルシウムの１ｍｌ懸濁液と混合した。微小繊維生体組織マトリクスおよびリン酸水素カルシウムをホモジナイザーによって均質化した（複合材料におけるリン酸水素カルシウムの重量パーセントは７５％である）。均質に混合された微小繊維生体組織マトリクスおよびリン酸水素カルシウムのペーストを成型のために特定の形状を有する型に移し、次いで−２０℃にて２４時間凍結させ、さらに−５０℃にて４８時間凍結乾燥させた。
【００３０】
生成した微小繊維生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム複合材料の走査型電子顕微鏡画像を図５に示す。生成した複合材料は、リン酸水素カルシウム粒子が微小繊維生体組織マトリクスの連続相内に均質に分散されている、３次元多孔質構造を有する。６０％のリン酸水素カルシウム含有量を有する複合材料と比較して、７５％のリン酸水素カルシウム含有量を有する複合材料はリン酸水素カルシウム粒子のより密度が高い分布を有し、その機械的強度および操作性の両方が改善される。
【００３１】
実施例４：
頭蓋冠欠損を、免疫不全マウスを使用して３．５ｍｍの直径を有する頭蓋冠骨の円形部を除去することによって作り出した。実施例２における滅菌生体組織マトリクス複合材料（リン酸水素カルシウム含有量が３０％である）を新たなマウス骨髄で飽和させ、頭蓋冠欠損内に移植した。６週後、マウスを屠殺した。マウス頭蓋冠を除去し、７０％のエタノール溶液中で固定した。移植部位における組織をポリメチルメタクリレート内に埋め込み、次いで切片化した。新たな骨形成および骨塩沈着を、ゴールドナー・トリクローム染色およびフォン・コッサ染色によって観察した。図６（Ａ）におけるゴールドナー・トリクローム染色により、６週後、移植した生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム材料が完全に吸収され、新たに生成した海綿骨と置き換わっていることが示される。活性骨芽細胞が新たな骨を連続して生成し、破骨細胞が骨再建に能動的に関与している。図６（Ｂ）におけるフォン・コッサ染色により、元の骨欠損が、大量の骨塩組織で充填され、ほとんど全ての骨欠損領域が充填されることが示される。
【００３２】
実施例５：
欠損を、免疫不全マウスの脛骨から約３．５ｍｍ長の骨組織の一部を除去することによって作り出した。実施例１における滅菌生体組織マトリクス複合材料（リン酸水素カルシウム含有量は６０％である）を新たなマウス骨髄で飽和させ、骨欠損内に移植した。実験対照として、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ製のＨｅａｌｏｓ（登録商標）およびＳｔｒｙｋｅｒ製のＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡもまた、新たなマウス骨髄で飽和させ、骨欠損内に移植した。６週後、Ｘ線画像により、大量の新たな骨組織が本発明の複合材料を移植したマウスにおいて形成されることが示される。したがって、マウスにその回復を継続させるように外部固定装置が除去された。Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）またはＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡのみを移植したマウスは骨欠損において形成される少量の骨組織を有する。したがって、外部固定装置が骨欠損を固定するために維持された。１２週後、マウスを屠殺した。マウス脛骨を除去し、７０％エタノール溶液中に固定した。移植部位における組織をポリメチルメタクリレートに埋め込み、次いで切片化した。新たな骨形成および骨塩沈着を、ゴールドナー・トリクローム染色およびフォン・コッサ染色によって観察した。図７（Ａ）は外科処置後１日目のＸ線画像であり、マウス脛骨において３．５ｍｍの骨欠損を示す。図７（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）のそれぞれは、Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）、Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡおよび本発明の生体組織マトリクス複合材料を移植してから１２週後のＸ線画像である。Ｘ線画像により、１２週後、Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）のみを移植したマウスは、骨欠損において新たな骨形成が制限され；Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡを移植したマウスは、骨欠損においていくらかの新たな骨が形成されるが、新たに生成した骨組織は骨欠損を修復できず；本発明の生体組織マトリクス複合材料を移植したマウスにおける骨欠損は完全に修復されたことが示される。図７（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）のそれぞれは、Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）、Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡおよび本発明の生体組織マトリクス複合材料を移植してから１２週後のフォン・コッサ染色画像である。フォン・コッサ染色の画像により、Ｈｅａｌｏｓ（登録商標）のみを移植したマウスは骨欠損において新たな骨形成が制限され；Ｖｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡを移植したマウスは、骨欠損においていくらかの新たな骨が形成したが、新たに生成した骨組織は骨欠損を修復できず；本発明の生体組織マトリクス複合材料を移植したマウスにおける骨欠損は完全に修復され、新たに生成した皮質骨は元の骨組織を両端で完全に結合することが示される。移植した生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム材料は完全に吸収された。周囲皮質骨が元の骨欠損において形成した。髄腔における海綿骨は破骨細胞によって吸収される。髄腔の再建が開始した。実験の結果により、本発明に記載される生体組織マトリクス複合材料の骨修復能が、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ製のＨｅａｌｏｓ（登録商標）およびＳｔｒｙｋｅｒ製のＶｉｔｏｓｓ（登録商標）ＢＡの骨修復材料の骨修復能よりはるかに良好であることが示される。本発明に記載される生体組織マトリクス複合���料は、骨組織形成を誘導でき、成長因子および幹細胞を使用せずに複合材料自体および新たな骨髄によって簡単に非常に大きな領域の骨欠損を修復できる。
【００３３】
実施例６：
部分欠損を、免疫不全マウスの脛骨から約３．５ｍｍの長さを有する骨組織の一部を切除することによって作り出した。欠損を外部固定装置で固定し、材料は移植しなかった。次いで外科処置後６週にわたって動物を回復させた。６週後、偽関節がマウス脛骨欠損の両端において形成することが観察され、それは臨床において骨癒着不能として知られている。その後の外科処置をこの時点で実施した。脛骨癒着不能の両端における偽関節を切除して髄腔を露出させた。骨欠損の長さはこの時点で約４ｍｍであった。次いで、実施例３における滅菌生体組織マトリクス複合材料（リン酸水素カルシウム含有量は７５％である）を新たなマウス骨髄で飽和させ、骨欠損に移植した。さらに８週後、マウスを屠殺した。各マウスの脛骨を回収し、７０％エタノール溶液中に固定した。移植部位における組織をポリメチルメタクリレートに埋め込み、次いで切片化した。新たな骨形成および骨塩沈着を、ゴールドナー・トリクローム染色およびフォン・コッサ染色によって観察した。図８（Ａ）は、偽関節を切除し、複合材料を移植した後の骨のＸ線画像であり、マウス脛骨において約４ｍｍの長さを有する骨欠損を示す。図８（Ｂ）は複合材料を移植してから８週後におけるＸ線画像である。図８（Ｃ）は、複合材料を移植してから８週後におけるマイクロコンピューターによる断層画像であり、複合材料を移植してから８週後、元の骨癒着不能の位置において大量の新たな骨形成を示す。図８（Ｄ）におけるゴールドナー・トリクローム染色により、移植した生体組織マトリクス／リン酸水素カルシウム材料が８週後、新たな骨組織の形成と共に徐々に吸収されることが示される。能動的な骨芽細胞は新たな骨を連続的に生成し、破骨細胞が骨の再構成に能動的に関与している。大量の海綿骨が元の骨癒着不能において形成し、軟骨組織の存在が観察され、このことは、骨が軟骨内骨化によって形成できることを示唆している。図８（Ｅ）におけるフォン・コッサ染色により、大量の新たな骨塩組織が元の骨癒着不能において形成することが示される。実験結果により、本発明に記載される生体組織マトリクス複合材料が、成長因子または幹細胞を有さないが、新たな骨髄と混合される場合、骨組織形成を誘導でき、骨癒着不能を修復できることが示される。
【００３４】
本発明におけるいくつかの特定の実施形態のみが上記に例示され、それらは本発明の保護範囲を限定するものとみなされることはできない。本発明の趣旨によってなされる等価の変更または修飾は本発明の保護範囲内であるとみなされるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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