(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでルペオールを添加する工程を含む、線維芽細胞の伸長
促進方法。
【請求項２】
線維芽細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでゴールデンシルク抽出物を添加する工程を含み、
前記ゴールデンシルク抽出物が、ゴールデンシルクから６０℃以上の酸性アルコール溶媒又はアルコールと水との酸性混合溶媒で抽出して得たものである、線維芽細胞の伸長促進方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の再生に関与する線維芽細胞の伸長促進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、火傷等による皮膚損傷の治療に、シート状細胞培養物を適用し、皮膚の再生を行うことが提案されている（特許文献１）。
【０００３】
線維芽細胞は、胎児や新生児の皮膚、特に真皮が創生する段階において、重要な役割を果たすことが知られている。線維芽細胞が、まず大型のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるバーシカンを産生し、これが足場となって、線維芽細胞が産生するコラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン等の成分が真皮の三次元構造を形成するのを補助する（非特許文献１〜２）。
【０００４】
これまでに、皮膚の創傷治癒作用を有する成分として、トリテルペンのひとつであるルペオールが報告されている（特許文献２）。ルペオールが有する作用としては、皮膚の抗老化作用も報告があり、ルペオールやこれを含有する植物抽出物を配合した組成物により、表皮細胞や線維芽細胞の細胞数を増殖させて抗老化効果を得ることが開示されている（特許文献３〜４）。
しかしながら、ルペオールが線維芽細胞の伸長を促進する作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−０１５９６３号公報
【特許文献２】特表２０１３−５１１５６８号公報
【特許文献３】特開平０５−１８６３２６号公報
【特許文献４】特開２００７−５１１４７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ARAKI Eri et al., 日本結合組織学会学術大会抄録集  41巻, 54頁
【非特許文献２】Sorrell JM. et al., Anat. Embryol., 1999, 199 (1) 45-56
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、線維芽細胞の伸長を促進させる方法を提供し、皮膚の効率的な創生・再生に寄与することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまでにシルクの中でも濃黄色の繭色を呈するゴールデンシルクから特定の方法で抽出した抽出物が、線維芽細胞におけるバーシカン産生を促進させることを見出している（特願２０１４−２３１３４０）。上記課題を解決すべくさらに鋭意研究したところ、該抽出物に含まれるバーシカン産生促進に有効な成分が、ルペオールであることを突き止めた。さらに、ルペオールが線維芽細胞のバーシカン産生を促進するのみならず、線維芽細胞の伸長を促進することを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明の第一の態様は、線維芽細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでルペオールを添加
する工程を含む、線維芽細胞の伸長促進方法である。
また、本発明の第二の態様は、線維芽細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでゴールデンシルク抽出
物を添加する工程を含む、線維芽細胞の伸長促進方法である。この態様におけるゴールデンシルク抽出物は、ゴールデンシルクから６０℃以上の酸性アルコール溶媒又はアルコールと水との酸性混合溶媒で抽出して得たものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、線維芽細胞の伸長を促進させる方法が提供される。伸長した線維芽細胞は活動範囲が広がりかつバーシカン産生が促進され、産生したバーシカンは足場となってコラーゲン線維束等が太く強靭になり真皮の三次元構造を形成するのを補助するため、本発明は皮膚の効率的な創生・再生に寄与することができる。
本発明により創生・再生した皮膚は、損傷した皮膚の修復のための移植に供することができる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの種々の試験に供することもでき、例えば、線維芽細
胞を用いる種々のスクリーニング試験や、線維芽細胞培養マトリックスを疑似皮膚として用いる皮膚外用剤等の試験などが挙げられるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における線維芽細胞を示す顕微鏡写真。Ａ：ゴールデンシルク抽出物添加なし、Ｂ：ゴールデンシルク抽出物添加あり。
【図２】ゴールデンシルク抽出物分画とルペオールの1Ｈ−ＮＭＲチャート。
【図３】ゴールデンシルク抽出物分画とルペオールの13Ｃ−ＮＭＲチャート。
【図４】参考試験例２におけるバーシカンの分布を示す顕微鏡写真。Ａ：ゴールデンシルク抽出物添加なし、Ｂ：ゴールデンシルク抽出物添加あり。
【図５】参考試験例３におけるコラーゲン線維束を示す顕微鏡写真。Ａ：ゴールデンシルク抽出物添加なし、Ｂ：ゴールデンシルク抽出物添加あり。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明するが、本発明は具体的な実施態様にのみ限定されないことはいうまでもない。
【００１３】
本発明の第一の態様に係る方法は、線維芽細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでルペオールを添加
する工程を含む。
ルペオールはルパン型トリテルペンである（ＣＡＳ番号：５４５−４７−１、分子量４２６．７２４）。天然には、種々の植物に含まれていることが知られている。
本発明者らは、先にゴールデンシルク抽出物が優れたバーシカン産生促進作用を有することを見出し、その有効成分がルペオールであることを突き止めた。さらに、ルペオールを含有するゴールデンシルク抽出物が線維芽細胞のバーシカン産生を促進するのみならず、線維芽細胞の伸長を促進することも明らかにした。
ルペオールは桑の葉にも含まれていると考えられるが、桑の葉を食べた蚕が作る繭にもルペオールが存在し、繭から抽出することでルペオールを高い純度で得ることができる。特に、ゴールデンシルクと呼ばれる繭から抽出すると、より高い純度のルペオールを得ることができる。
したがって、本発明の第二の態様に係る方法は、線維芽細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでゴー
ルデンシルク抽出物を添加する工程を含む。
【００１４】
本発明に係るルペオールはゴールデンシルク抽出物から精製して用いてもよいし、ゴールデンシルク抽出物として用いてもよい。
ゴールデンシルク抽出物は、エキス状、オイル状、粉末状のいずれであってもよく、溶媒を用いてエキスやオイルとして抽出した抽出液を乾燥させ、粉末状の抽出物としてもよい。
【００１５】
ゴールデンシルク（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｉｌｋ  Ｎｏ．１１）はカイコガ（Ｂｏｎｂｉｘ
ｍｏｒｉ）の繭糸であって、濃黄色を呈する繭糸である。主に、タイ王国  ランプン県
トンフォアチャン地方（Thunghuachang Lamphun Thailand）で生産されている特殊な繭であり、商業的にも入手可能である。
【００１６】
本発明におけるゴールデンシルク抽出物は、任意の製造方法で得ることができるが、ゴールデンシルクを６０℃以上の酸性アルコール溶媒又はアルコールと水との酸性混合溶媒で抽出する工程を含む製造方法で得ることが、ルペオールを多く含みバーシカン産生促進能が高い抽出物を得られるため好ましい。
【００１７】
アルコール溶媒としては、低級アルコールが好ましく、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコールなどが挙げられる。このうち、メタノール、エタノールが好ましく、エタノールが抽出効率の観点からより好ましい。また、アルコールと水との混合溶媒においては、通常アルコールが４０％ｖ／ｖ以上含まれることが好ましく、５０％ｖ／ｖ以上含まれることが抽出効率の観点から特に好ましい。また、上限は特段限定されず、通常９９．９％ｖ／ｖ以下である。
【００１８】
抽出溶媒を酸性とするのはゴールデンシルクを加水分解させるためであり、ｐＨは通常７より小さく、３以下であることが好ましく、２以下であることがより好ましい。ｐＨの下限は特段限定されないが、通常ｐＨ１以上である。
なお、アルカリ性溶媒でもゴールデンシルクを加水分解させることはできるが、アルカリ性溶媒で抽出したゴールデンシルク抽出物は、黄褐色の着色が強く、皮膚外用剤等の組成物に配合する際に好ましくない。一方、酸性溶媒で抽出したゴールデンシルク抽出物は着色が少ない。
抽出溶媒を酸性とするためには、例えば硫酸、塩酸、硝酸などの酸を溶媒中に適量添加することができる。これらのうち、抽出物の着色をより少なくできることから、塩酸が特に好ましい。
【００１９】
抽出は６０℃以上で行い、好ましくは８０℃以上で行う。なお、加温の上限は特段限定されず、圧力を過度に変動させることのない、安全性を確保できる範囲で行えばよい。
また抽出は、抽出温度にもよるが、通常１０分以上行い、３０分以上行うことがより好ましく、１時間以上行うことが更に好ましい。抽出時間の上限は特段限定されないが、通常２０時間以下であり、１０時間以下であることが好ましい。
【００２０】
得られた抽出物は、さらにアルカリにより中和を行うことが好ましい。なお、中和は、ＮａＯＨやＫＯＨなどのアルカリを加えることによりできる。
その他に、適宜澱を析出させて純度を上げたり、濾過ステップを設けて不純物などを除去したりすることもできる。
【００２１】
ゴールデンシルク抽出物からルペオールを得る方法は、定法により行うことができる。
【００２２】
本発明の方法において、線維芽細胞は、任意の生物に由来し得る。例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等が挙げられ、これらのうちヒト由来の線維芽細胞が特に好ましい。
【００２３】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるが、その際、線維芽細胞は通常は液体培
地中にある。液体培地としては、汎用されているものを特に限定されずに用いることができＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７等が挙げられる。
【００２４】
また、本発明において、線維芽細胞の培養は定法に従って行うことができ、培養温度、播種密度等の諸条件は適宜調整してよい。
培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、種々の材質の容器、容器中の固形又は半固形（ゲル等）の表面等を含む。
【００２５】
また、本発明の方法において、通常、ルペオールは液体培地中で線維芽細胞に対して添加され、その添加濃度は、特に限定されないが、培地中の終濃度が好ましくは０．００００１〜０．０５質量％、より好ましくは０．０００１〜０．０５質量％、さらに好ましくは０．００１〜０．０５質量％になるように添加する。
また、本発明の方法において、通常、ゴールデンシルク抽出物は液体培地中で線維芽細胞に対して添加され、その添加濃度は、特に限定されないが、培地中の終濃度が好ましくは０．０００１〜０．５質量％、より好ましくは０．００１〜０．５質量％、さらに好ましくは０．０１〜０．５質量％になるように添加する。
【００２６】
本発明の方法において、ルペオール又はゴールデンシルク抽出物添加後は、線維芽細胞を引き続き定法に従って培養することが好ましく、例えば好ましくは２４時間以上、より好ましくは３日以上、さらに好ましくは５日以上培養を行う。
【００２７】
本発明の方法により、線維芽細胞の伸長が促進される。具体的には、線維芽細胞は突起をもつ細長い扁平な形をした細胞であるところ、伸長促進により特に長軸方向の長さが増加し、線維芽細胞の活動範囲が格段に大きくなる。そうすると線維芽細胞が産生するバーシカンがより細胞外マトリクスに充満し、バーシカンが足場となって補助する真皮の三次元構造形成が促され、その結果皮膚の創生・再生が効率的に行われる。
【実施例】
【００２８】
以下、具体的な実験例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の態様にのみ限定されない。
【００２９】
＜実施例１＞
ＤＭＥＭ培地を入れたコラーゲンゲルにヒト線維芽細胞を１．５×１０4個／ウェルず
つ播種し、ゴールデンシルク抽出物を蒸発残分として１×１０-3質量％の濃度となるように添加して、通常のコラーゲンゲル培養法に従って１０日間培養した。対照として、ゴールデンシルク抽出物を添加しないヒト線維芽細胞も同様に培養した。培養後の細胞を倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒ Ｍ：ＺＥＩＳＳ）で観察した。
結果を図１に示す。対照の線維芽細胞に比べてゴールデンシルク抽出物を添加した線維芽細胞の長さは１．５１３倍であった。細胞の長さの１／２を半径とする球体の体積を細胞が動ける範囲と想定した場合、ゴールデンシルク抽出物の添加により伸長が促進された線維芽細胞の動ける範囲は対照の（１．５１３）3≒３．４６倍も拡大したことになる。
【００３０】
＜参考試験例１＞
ゴールデンシルク（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｉｌｋ  Ｎｏ．１１  タイ王国ランプン県トンフォアチャン地方産）２０ｇを、メタノール４００ｍＬ、水４００ｍＬ及び濃塩酸２ｍＬの混合溶媒に浸漬させ、８０℃で６時間抽出を行った。抽出後、ろ過したろ液を、１ＮのＮａＯＨで中和した。その後、中和した抽出液を５℃で１日以上静置し澱を析出させた。澱をろ別してゴールデンシルク抽出物を得た。
【００３１】
上記ゴールデンシルク抽出物から溶媒を留去したのち、酢酸エチルを加えて液液分配した。酢酸エチル層を乾固後、クロロホルムを溶媒として用いてシリカゲルカラムで精製した。
１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地にヒト繊維芽細胞を７．０×１０5個／ウェルずつ播種し
、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。培養開始２４時間後に培地を除去し、細胞をＰ
ＢＳ（−）で洗浄し、２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地中で各カラム分画を蒸発残分として１×１０-3質量％の濃度となるように添加し、さらに４８時間培養した。培養後にｍＲＮＡを回収して、ＲＴ−ＰＣＲでバーシカンのｍＲＮＡ発現量を測定した。なお、発現量は、内部標準物質を基準に算出した。また、対照として、抽出液の代わりに５０％エタノールを添加した場合について、同様にｍＲＮＡ発現量を測定した。対照に比べてバーシカンのｍＲＮＡ発現量が大きかった分画について1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲを行い、これらが
ルペオール（和光純薬株式会社  試薬）と一致することと（図２〜３）、文献値（EXCLI Journal 2010; 9: 1-10、Research Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.1 (1), 23-27, 2012）と一致することから、ゴールデンシルク抽出物のバーシカン産生促進作用の有効成分はルペオールであると同定した。
【００３２】
＜参考試験例２＞
ＤＭＥＭ培地を入れたコラーゲンゲルにヒト線維芽細胞を１．５×１０4個／ウェルず
つ播種し、ゴールデンシルク抽出物を蒸発残分として１×１０-3質量％の濃度となるように添加して、通常のコラーゲンゲル培養法に従って１０日間培養した。対照として、ゴールデンシルク抽出物を添加しないヒト線維芽細胞も同様に培養した。培養後の細胞を抗バーシカン抗体（Human  versican  Isoform  VO  Antibody：R&D  systems）で染色し、共焦点蛍光顕微鏡（LSM510  Laser  Module：ZEISS）で観察した。
結果を図４に示す。ゴールデンシルク抽出物によって線維芽細胞におけるバーシカン産生が促進され、コラーゲンゲル内にバーシカンが充満したことがわかる。
【００３３】
＜参考試験例３＞
ＤＭＥＭ培地を入れたコラーゲンゲルにヒト線維芽細胞を１×１０6個／ウェルずつ播
種し、ゴールデンシルク抽出物を蒸発残分として１×１０-3質量％の濃度となるように添加して、通常のコラーゲンゲル培養法に従って５日間培養した。対照として、ゴールデンシルク抽出物を添加しないヒト線維芽細胞も同様に培養した。培養後にコラーゲン線維束を走査型電子顕微鏡（VSM−6380LA：日本電子）で観察した。
結果を図５に示す。ゴールデンシルク抽出物を添加した系では、より太いコラーゲン線維束が多数形成されたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、線維芽細胞の伸長を促進させる方法が提供され、これにより皮膚の効率的な創生・再生に寄与することができる。創生・再生した皮膚は、損傷した皮膚の修復のための移植や、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に供し得ため、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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