(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高力価のE型肝炎ウイルス(HEV)を産生する方法であって、
a)約1μg/ml〜約5μg/mlの濃度のポリブレンを含む培地においてインビトロで細胞株を培養する工程であって、前記細胞株が、ATCC番号  HB-8065で寄託されたHepG2又はATCC番号  CRL-10741で寄託されたHepG2/C3Aである、工程、及び
b)細胞株にHEVを感染させる工程
を含む方法。
【請求項２】
HEVの高力価が、約108コピー/ml〜約1010コピー/mlである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
HEVの高力価が、約107コピー/ml〜約1010コピー/mlである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
工程b)のHEV感染細胞株を、約1μg/ml〜約5μg/mlの濃度のポリブレンを含む培養培地において継代する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
培地及び/又は感染細胞において得られるHEVの高力価が、約108コピー/ml〜約1010コピー/mlである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
培地及び/又は感染細胞において得られるHEVの高力価が、約107コピー/ml〜約1010コピー/mlである、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
試料中のHEVの存在及び/又はレベルを特定する方法であって、
a)細胞株及び培養培地を含む混合物に試料を供給する工程であって、前記細胞株が、ATCC番号  HB-8065で寄託されたHepG2又はATCC番号  CRL-10741で寄託されたHepG2/C3Aであり、前記培養培地が約1μg/ml〜約5μg/mlの濃度のポリブレンを含む、工程;
b)試料中にHEVが存在する場合にHEVの増殖を可能にするために、工程a)からの細胞株、培養培地、及び、試料を含む混合物をインキュベートする工程;
c)工程b)の一部分を収集する工程であって、HEVが存在し工程b)の間に増殖した場合、一部分がHEVを含む、工程;並びに
d)収集した一部分中におけるHEVに関連する生物学的物質の存在及び/又はレベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項８】
生物学的物質が、HEVのポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド配列を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
生物学的物質の存在及び/又はレベルを測定する工程が、
a)収集した一部分中にHEVが存在する場合にHEVのポリヌクレオチドを曝露するために、収集した一部分を第一の溶液と混合することによって第一の反応混合物を供給する工程であって、ポリヌクレオチドがHEVのRNAである、工程;
b)HEVのRNAに対して少なくとも部分的に相補的である相補的デオキシリボ核酸(cDNA)を産生するために、第一の反応混合物に第一の試薬を加えることによって第二の反応混合物を供給する工程;
c)1対のポリヌクレオチドのそれぞれに対して少なくとも部分的に相補的であるcDNAの配列を増幅するために、1対のポリヌクレオチドを含む第二の試薬を第二の反応混合物に加えることによって第三の反応混合物を供給する工程;
d)配列を増幅することによって第四の反応混合物を供給する工程; 及び
e)第四の反応混合物中の増幅された配列の濃度を特定する工程
を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
濃度を特定する前記工程が、
a)第四の反応混合物を供給する工程;
b)所定の量のHEVのcDNAを含む1つ又は複数の対照を供給する工程;
c)第四の反応混合物及び1つ又は複数の対照に薬剤を加える工程であって、前記薬剤が、第四の反応混合物中の増幅された配列、及び1つ又は複数の対照中の所定の量のHEVのcDNAに対して少なくとも部分的に特異的である、工程;並びに
d)1つ又は複数の対照に対する、第四の反応混合物中の薬剤によるHEVの認識のレベルを計算する工程
を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記1対のポリヌクレオチドが、
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)
を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
薬剤が、
5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
約1μg/ml〜約5μg/mlの範囲のポリブレン及び細胞株を含む培養培地の使用を含むHEV力価測定アッセイであって、前記細胞株が、ATCC番号  HB-8065で寄託されたHepG2又はATCC番号  CRL-10741で寄託されたHepG2/C3Aである、HEV力価測定アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する優先権及び相互参照
本出願は、2015年7月23日に出願された米国仮出願第62/195,936号に対する優先権の恩典を主張するものであり、なお、当該仮出願は、参照によりその全体が明確に本明細書に組み込まれている。
【０００２】
配列一覧に対する参照
本出願は、電子形式の配列一覧と共に出願される。当該配列一覧は、DURC6_006AUS_SEQLIST.txtの表題のファイルとして提供され、当該ファイルは、1,093バイトのサイズを有し、2016年5月31日に作成され、2016年5月31日に最終修正されている。当該配列一覧の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００３】
分野
本発明は、ウイルス学の分野、より正確には、E型肝炎ウイルス(以下においては、HEV)ストックを生成する方法に関する。具体的には、本発明は、高力価のHEVストックを増殖させる方法及びHEVストックを力価測定する方法について開示する。
【背景技術】
【０００４】
HEV(ヘペウイルス属(genus Hepevirus)、ヘペウイルス科(family Hepeviridae))は、およそ7.2kbの一本鎖のプラス鎖のポリアデニル化RNAゲノムを有する小さな非エンベロープウイルス/疑似エンベロープウイルスである。特定されているHEVには4つの遺伝子型が存在するが、血清型は1つしか存在しない。遺伝子型1及び遺伝子型2は、発展途上国における水媒介性感染症の主な原因であり、主にヒト及び高等霊長類において疾患を引き起こす。感染症は、典型的には、自己回復性かつ急性で、最長で2〜7週間続くが、特に妊娠女性においては致命的な場合もある。遺伝子型3及び遺伝子型4は、工業先進国における地方病性(土着性)感染症に関連する。これら2つの遺伝子型は、主にブタにおいて疾患を引き起こすが、ヒトも、食物又は人獣共通感染症曝露の結果として、偶発的に宿主となり得る。臨床疾患は、典型的には、若年成人において無症候性で穏やかであるが、より年配の男性においては臨床的に表面化し得る。更に、遺伝子型3及び遺伝子型4の感染症は、免疫力の弱った人、例えば、臓器移植患者又はAIDS患者等においては慢性となり得る。
【０００５】
近年、E型肝炎は、輸血伝染性の感染性疾患として分類されている。近年のHEVの世界的な広がりを前提として、血液由来及び血漿由来製品の安全性に関する懸念が高まっている。血液由来及び血漿由来製品のウイルス安全性プロファイルは、それらの製造プロセスにおけるウイルス減少及び/又はクリアランス能を実証するクリアランス試験を実施することによって保証することができる。これらのクリアランス試験の際、既知の量のウイルスが、血液又は血漿製品中間体中に故意に添加され、次いで、当該添加された物質は、製造プロセスのベンチスケールのモデルを使用して処理される。ある工程におけるウイルス減少及び/又はクリアランスは、処理の前後でのウイルスの量を比較することによって特定される。
【０００６】
ウイルスクリアランス試験は、大量の高力価ウイルスを必要とし、HEVのための効率的な細胞培養系の欠如が、HEVに対してそのような試験を実施する能力を妨げてきた。最近、この問題に対処するために、いくつかのHEV細胞培養系が開発された。
【０００７】
遺伝子型3株及び遺伝子型4株は、Okamoto及び同僚によって、A549ヒト肺細胞において増殖し3.9×108コピー/mLのHEV RNA力価に達するように適合された。更に、前記遺伝子型4株は、PLC/PRF/5細胞(ヒトヘパトーマ細胞)においても培養されたが、力価は低かった。
【０００８】
第二の遺伝子型3(Kernow-C1株)は、Emerson及び同僚によって、HepG2/C3Aヒトヘパトーマ細胞において増殖し6継代後に4.61×108ゲノム/mLの力価が得られるように適合された。S17ヒトリボソームタンパク質遺伝子の174リボヌクレオチドを獲得した後に、インビトロでの増殖に対する適合が結果として得られることが、研究によって示された。由来元のウイルス接種物、すなわち慢性的に感染しているHIV-1患者からの糞便懸濁液において、同じ挿入体を有するゲノムが検出されたので、組み換え/挿入事象が自然に生じており、細胞培養のため人工的に生じたのではなかった。PLC/PRF/5及びA549細胞において前記株を増殖させる試みは、成功していないか又は結果として低い力価が得られているが、当該ウイルスは、遺伝子型3のウイルスにとって主要な人獣共通感染症の宿主であるブタ由来の腎臓細胞に感染し複製した。
【０００９】
ヒトヘパトーマ細胞は、増殖させるのが困難であり、細胞付着及び/又は細胞増殖を促進するために、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、及び/又はポリ-L-リシン等のコーティングの使用を含む、特殊な細胞プレート培養法を必要とし得る。更に、これらのコーティングの全てが、全ての細胞タイプにとって良好に機能するわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第20130302790(A1)号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tanakaら、(2007) J Gen Virol 88:903-911
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
いくつかの実施形態において、高力価のE型肝炎ウイルスを産生する方法であって、ある濃度のポリブレンを含む培地においてインビトロで細胞株を培養する工程、及び細胞株をHEVに感染させる工程を含む方法が提供される。当該方法のいくつかの実施形態において、使用される細胞株は、HepG2(ATCC番号  HB-8065)又はHepG2/C3A(ATCC番号  CRL-10741)である。当該方法のいくつかの実施形態において、ポリブレンの濃度は、約1μg/ml〜約5μg/mlである。当該方法のいくつかの実施形態において、高力価は、約108コピー/mL〜約1010コピー/mLである。当該方法のいくつかの実施形態において、高力価は、約107コピー/mL〜約1010コピー/mLである。いくつかの実施形態において、当該方法は更に、ある濃度のポリブレンを培地に加える工程;ポリブレンを含む培地においてHEV感染細胞株を継代する工程;並びに培地及び/又は感染細胞を収集する工程を含む。当該方法のいくつかの実施形態において、ポリブレンの濃度は、約1μg/ml〜約5μg/mlである。当該方法のいくつかの実施形態において、培地及び/又は感染細胞において得られるHEVの高力価は、約108コピー/mL〜約1010コピー/mLである。当該方法のいくつかの実施形態において、培地及び/又は感染細胞において得られるHEVの高力価は、約107コピー/mL〜約1010コピー/mLである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、試料中のHEVの存在及び/又はレベルを特定する方法であって、細胞株及び培養培地を含む混合物に試料を供給する工程であって、前記培養培地がポリブレンを含む、工程;試料中にHEVが存在する場合にHEVの増殖を可能にするために、前工程からの試料を含む混合物をインキュベートする工程;前工程の一部分を収集する工程であって、HEVが存在し前工程の間に増殖した場合、前記一部分がHEVを含む、工程;並びに、収集した一部分中におけるHEVに関連する生物学的物質の存在及び/又はレベルを測定する工程を含む方法が提供される。当該方法のいくつかの実施形態において、細胞株は、HepG2(ATCC番号  HB-8065)及びHepG2/C3A(ATCC番号  CRL-10741)の細胞株からなる群から選択される。当該方法のいくつかの実施形態において、前記生物学的物質は、HEVのポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド配列を含む。当該方法のいくつかの実施形態において、前記測定する工程は、収集した一部分中にHEVが存在する場合にHEVのポリヌクレオチドを曝露するために、収集した一部分を第一の溶液と混合することによって第一の反応混合物を用意する工程であって、ポリヌクレオチドがHEVのRNAである、工程;HEVのRNAに対して少なくとも部分的に相補的である相補的デオキシリボ核酸(cDNA)を産生するために、第一の反応混合物に第一の試薬を加えることによって第二の反応混合物を用意する工程;1対のポリヌクレオチドのそれぞれに対して少なくとも部分的に相補的であるcDNAの配列を増幅するために、1対のポリヌクレオチドを含む第二の試薬を第二の反応混合物に加えることによって第三の反応混合物を用意する工程;当該配列を増幅することによって第四の反応混合物を用意する工程;及び、第四の反応混合物中の増幅された配列の濃度を特定する工程を含む。当該方法のいくつかの実施形態において、前記濃度を特定する工程は、第四の反応混合物を用意する工程;所定の量のHEVのcDNAを含む1つ又は複数の対照を用意する工程;第四の反応混合物及び1つ又は複数の対照に薬剤を加える工程であって、前記薬剤が、第四の反応混合物中の増幅された配列、及び1つ又は複数の対照中の所定の量のHEVのcDNAに対して少なくとも部分的に特異的である、工
程;並びに、1つ又は複数の対照に対する、第四の反応混合物中の薬剤によるHEVの認識のレベルを計算する工程を含む。当該方法のいくつかの実施形態において、前記1対のポリヌクレオチドは、
a)5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)
b)5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)
を含む。
【００１４】
当該方法のいくつかの実施形態において、当該薬剤は、
5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)
を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、約1μg/ml〜約5μg/mlの範囲のポリブレンを含む、高力価HEVを生成するための培養培地を提供する。いくつかの実施形態において、高力価HEVは、約108コピー/mL〜約1010コピー/mLである。いくつかの実施形態において、高力価HEVは、約107コピー/mL〜約1010コピー/mLである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ポリブレンの使用を含むHEV力価測定アッセイを提供する。当該アッセイのいくつかの実施形態において、使用されるポリブレンの濃度は、約1μg/ml〜約5μg/mlの範囲である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】本明細書における本開示のいくつかの実施形態による様々な細胞培養培地によって1日培養したHepG2/C3A細胞を20×倍率で撮影した画像を示す図である。DMEM+10%FBS+非必須アミノ酸、ファンギゾン、HEPES、ゲンタマイシン(NHG)によって培養したHepG2/C3A細胞を示す。
【図１Ｂ】本明細書における本開示のいくつかの実施形態による様々な細胞培養培地によって1日培養したHepG2/C3A細胞を20×倍率で撮影した画像を示す図である。DMEM+10%FBS+NHG+ピルベートで培養したHepG2/C3A細胞を示す。
【図１Ｃ】本明細書における本開示のいくつかの実施形態による様々な細胞培養培地によって1日培養したHepG2/C3A細胞を20×倍率で撮影した画像を示す図である。DMEM+10%FBS+NHG+ピルベート+ポリブレンで培養したHepG2/C3A細胞を示す。
【図２Ａ】3日間培養したHepG2/C3A細胞を10×倍率(左)又は20×倍率(右)で撮影した画像を示す図である。DMEM+10%FBS+NHGで培養したHepG2/C3A細胞を示す。
【図２Ｂ】3日間培養したHepG2/C3A細胞を10×倍率(左)又は20×倍率(右)で撮影した画像を示す図である。DMEM+10%FBS+NHG+ピルベートで培養したHepG2/C3A細胞を示す。
【図２Ｃ】3日間培養したHepG2/C3A細胞を10×倍率(左)又は20×倍率(右)で撮影した画像を示す図である。DMEM+10%FBS+NHG+ピルベート+ポリブレンで培養したHepG2/C3A細胞を示す。
【図３】本明細書における本開示のいくつかの実施形態により、HEV PCRアッセイによって評価した、MPK(ブタ)細胞に対する慢性的に感染させたHepG2(ヒト)細胞でのHEV RNA力価の比較を示す図である。プレート培養表面へのMPK細胞付着は非常に効率的であるため、MPK細胞にはポリブレンを使用しなかった。
【図４】本明細書における本開示のいくつかの実施形態による、HEV PCRアッセイに使用したプライマー及びプローブのヌクレオチド配列及びHEVゲノム上のそれらの位置を示す図である。
【図５】本明細書における本開示のいくつかの実施形態によるHEV PCRアッセイの検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ウイルスクリアランス試験での使用に好適なE型肝炎ウイルス(HEV)の高力価ストックを生成するプロセス及び感染性HEV力価を特定する方法に関する。本発明は、血液由来及び血漿由来製品の製造プロセスのHEVクリアランス能を評価する試験での使用のために、細胞培養物において高力価HEVを増殖させる単純な方法を含む。
【００１９】
前に説明したように、HEVは、Okamoto及び同僚によってPLC/PRF/5ヒトペパトーマ細胞及びA549ヒト肺細胞を用いて、並びにEmerson及び同僚によってHepG2/C3Aヒトヘパトーマ細胞を用いて、細胞培養における増殖に適合させられている。ヒトヘパトーマ細胞は、増殖させるのが困難であり、特殊な細胞プレート培養法を必要とし得る。Emersonの研究室は、細胞播種の前にプレートをラット尾由来コラーゲンIでコーティングしており、Okamotoの研究室は、IWAKIから購入したプレートを使用しており、それらのいくつかはコラーゲンでコーティングされている。Table 1(表1)は、様々な細胞培養系由来のHEV力価を比較しており、細胞プレート培養を増強するために様々な研究室によって使用される方法を列挙している。コラーゲン及び他のコーティング、例えば、フィブロネクチン、ゼラチン、及びポリ-L-リシン等は細胞付着及び/又は細胞増殖を促進し、非常に増殖が困難な細胞であっても、より高い密度に達することができ、それにより、高力価ウイルスが得られる。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞付着及び/又は細胞増殖を促進するためにコラーゲン等のコーティング又は他のコーティングを使用する代わりに、ポリブレン(ヘキサジメトリンブロミド及び1,5-ジメチル-1,5-ジアザウンデカ-メチレンポリメト-ブロミドとしても知られる)の使用を伴うHEVの培養法を提供する。
【００２２】
ポリブレンは、ウイルスと細胞との間の電荷斥力を減らすことによってレトロウイルスの感染効率を高めるために細胞培養物において典型的に使用される安価なカチオン性ポリマーである。プレート培養表面へのヒトヘパトーマ細胞の付着及び細胞へのHEVの付着を促進するために、様々な物質を寄せ集めるポリブレンの能力が、本発明において使用される。ポリブレンは、単に、細胞及びウイルス増殖のために使用される細胞培養培地に加えられる。本発明によって、コラーゲン若しくは他のコーティング剤で予めコーティングされた高価なプレートを購入する必要性、又は細胞播種及びウイルス感染前にコラーゲン若しくは他のコーティング剤でプレートを予めコーティングする必要性が回避される。
【００２３】
HEVは、通常、インビボにおいて低力価に複製するため、インビトロでの増殖は困難である。ウイルスクリアランス試験での使用にとって好適な高力価ストックを得るためにHEVを培養する方法は、以前は利用可能ではなかった。
【００２４】
本明細書において開示される本発明の一態様において、細胞培養物での高力価HEVの増殖は、ポリブレンを補った培地を使用することによって可能である。
【００２５】
ポリブレンは、ウイルスと細胞との間の電荷斥力を減らすことによってレトロウイルス(エンベロープウイルス)の感染効率を高めるために細胞培養において使用される安価なカチオン性ポリマーである。本発明のいくつかの実施形態において、非エンベロープ/疑似エンベロープウイルスであるHEVの細胞への付着を促進するために、ポリブレンが細胞培養培地に加えられる。更に、ポリブレンの存在は、細胞付着及び細胞増殖を向上させ、それにより、感染細胞でのHEVの総産生量を高める。
【００２６】
したがって、第一の実施形態において、本発明は、細胞培養培地へのポリブレンの添加に基づく、インビトロ培養物において高力価HEVを産生する方法に関する。
【００２７】
HEVは、細胞培養物での細胞変性効果(CPE)を生じず、そのため、HEV検出は、PCRに基づく。したがって、いくつかの実施形態において、低濃度でのHEVの検出が、本発明のPCRアッセイによって可能である。当該PCRアッセイは、例えば、精密で正確で信頼できる、HEVに対する感染性アッセイを開発するために使用することができる。
【００２８】
元々は米国国立衛生研究所(NIH)によって開発された当該PCRアッセイを、感度を高めるために改変した。リバースプライマーを変更し、完全に新規のプローブを設計した。本発明のPCRアッセイを使用する方法は、一貫して、ポジティブ又はネガティブとして試料を正しくスコア化しており、力価計算において有用である。したがって、更なる実施形態において、本発明は、ポリブレン又は前記ポリブレンを含む培養培地(好ましくは、細胞培養培地)の使用を含む、PCRベースのHEV力価測定アッセイを開示する。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、ポリブレンを補った培地を使用することによる、細胞培養物での高力価HEVの増殖;及び、感度が高いPCRアッセイによるHEVの検出、を伴うプロセスに関する。
【００３０】
当該プロセスは、HEVに対して特異的であり得るが、ウイルス増殖のための当該方法は、他の非エンベロープウイルスに対しても適用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、Emerson研究室から入手したHEV遺伝子型3株Kernow-C1の6継代によって試験した。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記において言及した高力価HEVを産生する方法が、インビトロ培養物において、好ましくはインビトロの臓器、組織、又は細胞培養物において実施されることが想到される。最も好ましい実施形態において、本発明の高力価HEVを産生する当該方法は、インビトロ細胞培養物において実施される。
【００３２】
本発明の方法において、初代細胞培養系及び樹立細胞培養系の両方を使用することができる。使用される細胞培養系は、任意の有機体由来であり得る。例えば、昆虫細胞又は哺乳動物細胞の使用が想到される。好ましくは、使用される細胞培養系は、ブタ(又はミニブタ)及びヒト由来である。
【００３３】
更に、好ましくは、使用される細胞株は、肝臓又は腎臓由来である。細胞株が由来する前記肝臓又は腎臓は、健康であるか、又は疾患を患っているか、又は悪性腫瘍若しくは良性腫瘍を含み得る。最も好ましい実施形態において、樹立細胞株HepG2(ATCC番号  HB-8065)又はHepG2/C3A(ATCC番号  CRL-10741)が使用される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ポリブレンの濃度は、約1μg/ml〜約5μg/mlの範囲である。いくつかの実施形態において、ポリブレンの濃度は、約1、2、3、4、又は5μg/mlである。好ましい実施形態において、ポリブレンの濃度は、約4μg/mlである。
【００３５】
本発明の方法は、いくつかの実施形態において、約108コピー/mL〜約1010コピー/mLの範囲のHEV力価をもたらした。本発明の方法は、いくつかの実施形態において、約107コピー/mL〜約1010コピー/mLの範囲のHEV力価をもたらした。好ましい実施形態において、本発明の方法は、約109コピー/mLのHEV力価をもたらした。
【００３６】
更なる実施形態において、本発明は、a)ポリブレンを含有する培養培地において細胞をプレート培養する工程、及びb)HEVをインビトロ培養物に感染させる工程を含む、高力価HEVを産生する方法に関する。いくつかの実施形態において、高力価HEVを得るために、当該インビトロ培養物から細胞培養培地を収集した。
【００３７】
上記の工程b)の後、現状技術において公知の任意の手段によって(好ましくは、トリプシン処理によって)、培養された細胞を収集することができ、HEVの含有量について一定分量がアッセイされ得る。HEVの前記含有量は、好ましくはPCRによって、更により好ましくは下記において説明される本発明によるPCRアッセイによって、特定することができる。図5を参照されたい。代替の実施形態において、HEVの含有量は、免疫蛍光(IF)に基づくアッセイによって特定することができる。図5を参照されたい。
【００３８】
更に、前記工程b)の後、現状技術において公知の任意の手段によって(好ましくは、トリプシン処理によって)、培養された細胞を得ることができ、現状技術において公知の任意の方法によって、HEVストックを得ることができる。好ましい実施形態において、HEVストックは、細胞をある回数、好ましくは1回又は2回、凍結-解凍することによって生成される。
【００３９】
生成されたHEVストックは、好ましくは-65℃以下において貯蔵される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、上記において説明される方法は、c)ポリブレンを細胞培養培地に加える工程;及びd)HEVに感染させた細胞を更に継代する工程も含むことが想到される。
【００４１】
工程c)及びd)は、例えば、HEVを産生する細胞の数を増やすため、並びに培養物でのウイルス伝播及び感染を最大化するために、繰り返すことができる。当業者は、工程c)及びd)を繰り返すことができる回数、すなわち、感染した細胞株が許容できる継代の回数を、例えば細胞及びそれらの増殖曲線の外観に基づいて、容易に決定することができる。
【００４２】
各継代の工程d)の後、現状技術において公知の任意の手段によって(好ましくは、トリプシン処理によって)、培養された細胞を得ることができ、一定分量を、HEVの含有量についてアッセイすることができる。HEVの前記含有量は、好ましくはPCRによって、更により好ましくは下記において説明される本発明によるPCRアッセイによって、特定することができる。図5を参照されたい。
【００４３】
更に、各継代の前記工程d)の後、現状技術において公知の任意の手段によって(好ましくは、トリプシン処理によって)、培養された細胞を得ることができ、現状技術において公知の任意の方法によって、HEVストックを得ることができる。好ましい実施形態において、HEVストックは、細胞をある回数、好ましくは1回又は2回、凍結-解凍することによって生成される。生成されたHEVストックは、好ましくは-65℃以下において貯蔵される。
【００４４】
或いは、感染した細胞株によって実施された所望の又は必要な継代回数の後(すなわち、工程c)及びd)が、所望の又は必要な回数繰り返された後)においてのみ、培地を収集することもできる。
【００４５】
HEVに感染した細胞を継代する工程d)は、当業者に公知であるように、現状技術において公知の任意の手段によって細胞を得ることを意味する。細胞を表面(例えば、フラスコ又はプレートの)に付着させて増殖させる場合、当該細胞は、現状技術において公知の任意の手段によって、好ましくはトリプシン処理によって、剥がす必要があり得る。細胞を剥がすために酵素(例えば、トリプシン)が使用される場合、通常、前記酵素は、不活性化する必要がある。通常、現状技術において、前記不活性化は、タンパク質が豊富な溶液、好ましくはFBSを有する細胞培養培地で希釈することによって実施される。
【００４６】
ポリブレン及び、前記試薬を含む培養培地(好ましくは、細胞培養培地)が、インビトロ培養物(好ましくは、インビトロ細胞培養物)でのHEVの効率的な感染及び産生を可能にするという事実を踏まえると、それらは、HEV力価測定アッセイにおいても使用することができる。
【００４７】
したがって、更なる実施形態において、本発明は、ポリブレン又は前記ポリブレンを含む培養培地(好ましくは、細胞培養培地)の使用を含むことを特徴とする、HEV力価測定アッセイを開示する。
【００４８】
当該インビトロ培養物は、好ましくは、インビトロ臓器、組織、又は細胞培養物である。最も好ましい実施形態において、当該インビトロ培養物は、インビトロ細胞培養物である。
【００４９】
初代細胞培養系及び樹立細胞培養系の両方を使用することができる。使用される細胞培養系は、任意の有機体由来であり得る。例えば、昆虫細胞又は哺乳動物細胞の使用が想到される。好ましくは、使用される細胞培養系は、ブタ(又はミニブタ)及びヒト由来である。
【００５０】
更に、好ましくは、使用される細胞株は、肝臓又は腎臓由来である。細胞株が由来する前記肝臓又は腎臓は、健康であるか、又は疾患を患っているか、又は悪性腫瘍若しくは良性腫瘍を含み得る。最も好ましい実施形態において、樹立細胞株HepG2(ATCC番号  HB-8065)又はHepG2/C3A(ATCC番号  CRL-10741)が使用される。
【００５１】
好ましくは、本発明のHEV力価測定アッセイは、ウイルスの存在がウイルス病理学によってではなくポジティブPCRシグナルによって示されることを除いて実施される、当業者が知るような50%組織培養感染量(TCID50)アッセイである。
【００５２】
前記力価測定アッセイでは、HEV試料が力価測定される細胞の培養物において、ポリブレン、又は前記ポリブレンを含む細胞培養培地が使用される。
【００５３】
別の実施形態において、HEVストックにおいてのHEVの検出のための方法が提供される。
【００５４】
前記検出は、現状技術において公知の任意の方法若しくは手段によって実施することができる。それにもかかわらず、好ましい実施形態では、検出はPCRによって実施される。
【００５５】
好ましい実施形態において、HEVの検出に使用されるPCRは、相補的DNA(cDNA)に対するウイルスRNAの逆転写の第一の工程、及び好ましくはダブルクエンチャープローブを使用して実施されるリアルタイムPCRの第二の工程を含む、リアルタイム逆転写PCRである。
【００５６】
最も好ましい実施形態では、第二の工程において、プライマー及びプローブとして以下のオリゴヌクレオチドが使用される(図4):
a)フォワードプライマー:5'-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3'(配列番号1)
b)リバースプライマー:5'-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3'(配列番号2)
c)プローブ:5'-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3'(配列番号3)。
【００５７】
HEV PCRベースの感染性アッセイの性能を評価するための試験からのデータをTable 2(表2)にまとめる。
【００５８】
【表２Ａ】
0006588397.tif 000003
【００５９】
【表２Ｂ】
0006588397.tif 000004
【００６０】
好ましい実施形態において、細胞を96ウェルプレートにおいて力価測定し、磁気バイオクローンビーズ又は磁気ダイナビーズ、より好ましくはダイナビーズを用いて抽出したHEV RNAを使用する。
【００６１】
より良い理解のために、本発明のある特定の実施形態について、一例として提示される付随の図を参照しながら、及び本発明を限定するものではない例示的実施例を参照しながら、より詳細に説明する。
【実施例】
【００６２】
(実施例1)
様々な増殖培地でのHepG2/C3A細胞の細胞増殖パターン
HepG2/C3A(106)細胞を、25cm2フラスコに播種し、以下:
-  DMEM+10%FBS+NHG(非必須アミノ酸、ファンギゾン、HEPES、ゲンタマイシン);
-  DMEM+10%FBS+NHG+1mMピルベート;又は
-  DMEM+10%FBS+NHG+1mMピルベート+4ug/mLポリブレン
の細胞培養培地のうちの1つにおいて培養した。
【００６３】
1日後に20×倍率において撮影した画像を図1に示す。培地DMEM+10%FBS+NHG(A)又はDMEM+10%FBS+NHG+ピルベート(B)において培養したHepG2/C3A細胞は細胞集塊になって増殖したため、これにウイルス(例えば、HEV)を感染させることは非常に困難なはずである。他方において、HepG2/C3A細胞をDMEM+10%FBS+NHG+ピルベート+ポリブレン(C)において培養した場合、細胞は付着し、平坦で均一な単層として増殖したが、これは、ウイルス(例えば、HEV)によって容易に感染するはずである。
【００６４】
3日後に10×倍率及び20×倍率において撮影した画像を図2に示す。1日目の細胞と同様に、DMEM+10%FBS+NHG(A)又はDMEM+10%FBS+NHG+ピルベート(B)において培養したHepG2/C3A細胞は細胞集塊になって増殖したが、DMEM+10%FBS+NHG+ピルベート+ポリブレン(C)において増殖させた細胞は平坦で均一な単層として増殖した。細胞集塊は、ウイルスによる均一な感染を妨げるはずなので、HEV感染の効率は、ポリブレンの存在下で増殖させた細胞の方が高い可能性が最も高いはずである。
【００６５】
(実施例2)
HEV-感染細胞の樹立
感染のために、以下のように細胞培養フラスコに播種した。現状技術において公知のプロトコル又は手順に従って、HepG2又はHepG2/C3A細胞をトリプシン処理した。トリプシンを中和するために、10mLの増殖培地(使用する細胞株の要件に従った基本培地と、約1〜約5μg/mLの濃度のポリブレン)を加え、細胞集塊を破壊するために、当該懸濁液を上下にピペッティングした。次いで、当該細胞を、150cm2フラスコあたり約106個の細胞密度において播種し、37℃のインキュベーターにおいて一晩放置した。
【００６６】
フラスコから培地を除き、0.1〜1.0の感染多重度(MOI)及び5〜10mLの総量においてHEVストック(澄んだ状態にしたウイルス感染細胞溶解物)を加えることによって、細胞にHEVを感染させた。当該細胞を、37℃で少なくとも1時間インキュベートし、その間、細胞が乾燥するのを防ぐため、及び細胞全体に均等にウイルス播種物を分配するために、定期的にフラスコを激しく前後に揺すった。追加の増殖培地(フラスコあたり10〜20mL)を加え、細胞単層がコンフルエントになるまで(およそ1週間)、当該フラスコを37℃に維持した。
【００６７】
(実施例3)
HEV感染細胞の増殖
細胞単層がコンフルエントになった時点で、実施例1に従って150cm2フラスコにおける感染細胞(HepG2又はHepG2/C3A)をトリプシン処理した。複数のフラスコをトリプシン処理する場合、細胞懸濁液を一緒にプールしてから次に進んだ。
【００６８】
PCRによってHEV RNAを分析するために、トリプシン処理した細胞懸濁液を、1mL以上の一定分量採取した。残りの細胞懸濁液は、廃棄するか又は、コンフルエントな単層の1/6の細胞数に等しい密度において他の150cm2フラスコに分けた(1:6分割)。各150cm2フラスコの最終量を20〜25mLにするために増殖培地を加え、細胞がコンフルエントに達するまで当該フラスコをインキュベートした(およそ1週間)。
【００６９】
この手順を、PCR分析のために取り出した1mLの試料中におけるHEV RNAの量が高力価に達するまで、毎週繰り返した。いくつかの実施形態において、高力価は、約108コピー/mL〜約1010コピー/mLの範囲であった。いくつかの実施形態において、高力価は、約107コピー/mL〜約1010コピー/mLの範囲であった。次いで、いくつかのフラスコをトリプシン処理し、HEV感染細胞の連続継代のために分割し、その一方で、残りのフラスコをHEVストックとして処理した。
【００７０】
HEVストックのフラスコは、感染細胞を破壊してウイルスを放出させるために、凍結及び解凍を1〜2回行った。次いで、当該感染した溶解物をプールし、適切な容器に等分し、-65℃以下で貯蔵した。
【００７１】
(実施例4)
HEV PCRベースの感染性アッセイ
96ウェルプレート形式でのHEV力価測定について、この実施例において説明するが、当該アッセイは、他のサイズのマルチウェルプレートに容易に適合させることができる。
【００７２】
HEVストックの連続希釈を作製し、HepG2又はHepG2/C3A細胞を播種したウェルに加えた。1時間以上において37℃でウイルスを吸着させ、増殖培地を加えた。プレートを37℃で2日以上インキュベートした後、ウェルから培地を吸引し、当該細胞を緩衝液(例えば、PBS)によって2回以上洗浄/吸引した。次いで、当該プレートを、PCRのために抽出するか、抽出の準備ができるまで-65℃以下で貯蔵した。
【００７３】
ダイナビーズ(登録商標) mRNA DIRECT(商標)マイクロキット(Life Technologies社)を使用し、製造業者取扱説明書に従って、力価測定プレートの各ウェルの細胞から、ポリアデニル化RNA(例えば、HEV RNA)を抽出した。結果として得られた溶出液(ポリA RNA)は、PCR増幅のために即座に処理するか、又はPCR増幅の準備ができるまで-65℃以下で貯蔵した。
【００７４】
前に説明したようなプライマー及びプローブを使用して試料中のHEV RNAを検出するために、一段階RT-PCRを使用した。各反応に対するアッセイ条件は以下の通りであった:
a)試薬:5.0μlの4×TaqMan(登録商標)Fast Virus 1-Step Master Mix(Life Technologies社)、0.08μLの100mMプライマーF+R、0.04μLの100mMプローブ、0.4μLのSUPERase In(Life Technologies社)、4.4μLの水、及び10μLのテンプレート(合計20μl)、
b)反応:52℃で10分間、95℃で30秒間、及び95℃で15秒間を40サイクル、56℃で45秒間。
【００７５】
AB 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems社、フォスターシティ、CA)及び付属のソフトウェアを製造業者の取扱説明書に従って使用して、PCR及びサイクル閾(Ct)値決定を実施した。
【００７６】
PCRは、定量的又は定性的であった。定量的PCRの場合、NIHから得られたHEV cDNAプラスミドをMluIを用いて線状にし、mMESSAGE mMACHINE(登録商標)キット(Life Technologies社)を使用し転写させて、7-メチルグアノシンキャップ及びポリAテールを有する7.2kbのRNA転写物を生成させた。当該転写物を、Ambion MegaClearキット(Life Technologies社)を用いて精製し、Quant-iT(商標) RiboGreen(登録商標) RNA試薬及びキット(Invitrogen社)により定量し、RNA標準較正曲線を構築するための標準物質として使用した。
【００７７】
標準物質により算出したコピー数の対数に対してCt値をプロットすることによって、AB7500ソフトウェアシステムによってRNA検量線を作成した。
【００７８】
図5(右パネル)は、典型的な検量線を示す。全ての曲線は、反応あたり100〜107コピーの範囲の広いダイナミックレンジを有しており、直線的で、相関係数はr2>0.99であった。増幅のパーセント効率は、%E=[10(-1/傾き)-1]*100として計算した。n=22のHEV qPCR検量線に基づき、HEV定量的PCRの効率は、100.4%であった(データは示されず)。
【００７９】
定性的PCRの場合、ポジティブPCRシグナルの存在に基づいて、ウェルをポジティブ又はネガティブにスコア化した。ウイルス力価は、適切な統計法:Spearman-Karber法、MPN法、又はポアソン法を用いてTCID50/mLとして計算した。
【００８０】
(実施例5)
HEV PCRベースの感染性アッセイの性能評価
HEV感染性アッセイの操作特性を評価するために、アッセイ適性試験を実施した。評価したパラメータは、精度、正確性、直線性、定量及び検出の限界、並びにダイナミックレンジであった。
【００８１】
判定基準は、他のウイルス力価測定アッセイに典型的に使用されるものと同じであった。
【００８２】
結果は、Table 2(表2)にまとめられており、当該アッセイが全ての試験に合格したことを示している。
【００８３】
定義
HepG2:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the American Type Culture Collection)から入手した肝細胞癌細胞(ATCC番号  HB-8065)
MPK:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手したミニブタ腎臓細胞(ATCC番号  CCL-66)
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地
FBS:ウシ胎仔血清
HEPES:N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸
NEAA:非必須アミノ酸
NHG:以下の混合物:非必須アミノ酸、ファンギゾン、HEPES、及びゲンタマイシン
力価測定:予想されるウイルス力価が間に含まれるように試料を連続的に希釈し、TCID50/mLを特定するために、当該希釈した試料をプレートに移すプロセス
力価:溶液中の物質(ウイルス)の濃度又は力価測定によって特定されたそのような物質の強度
SK法:Spearman-Karber法は、比較的高いウイルス濃度の試料においてウイルス力価を計算するための統計法である。この方法は、任意の希釈でのポジティブウェルの割合が>25%の場合に使用される。
MPN法:最確数は、比較的低いウイルス濃度の試料においてウイルス力価を計算するための統計法である。MPN法は、全ての希釈でのポジティブウェルの割合が<25%の場合に使用される。
ポアソン法:ポアソン法は、極めて低いウイルス濃度の試料においてウイルス力価を計算するための統計法である。この方法は、ポジティブウェルが観察されない場合に使用される。
ATCC:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
TCID50:50%組織培養感染量(終末点希釈アッセイ)に対応する。これは、感染させた宿主の50%を殺すために、又はウイルスを接種した組織培養細胞の50%において細胞変性効果を生じさせるために必要なウイルスの量を定量する、感染性ウイルス力価の測定値である。
【００８４】
(参考文献)
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【図１Ａ】
0006588397.tif 000006
【図１Ｂ】
0006588397.tif 000007
【図１Ｃ】
0006588397.tif 000008
【図２Ａ】
0006588397.tif 000009
【図２Ｂ】
0006588397.tif 000010
【図２Ｃ】
0006588397.tif 000011
【図３】
0006588397.tif 000012
【図４】
0006588397.tif 000013
【図５】
0006588397.tif 000014
【配列表】
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