(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞培養プロセスの間の、免疫グロブリンのＦｃ領域を含有し、マンノース−５グリカンを有する組換えタンパク質の作成方法であって、
バイオリアクター中の無血清培地において、組換えタンパク質を発現する哺乳類細胞培養を確立すること、
産生フェーズの間、前記哺乳動物細胞を維持すること、及び
前記細胞培養をモネンシンと接触させること
を含む、方法。
【請求項２】
１日；２日；３日；４日；５日；６日；７日；８日；９日；及び１０日またはそれ以上から成る群から選択される期間にわたって、前記モネンシンが前記細胞培養中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モネンシンが、前記細胞培養の持続期間にわたって前記細胞培養中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記モネンシンが、所定の選択された濃度で前記細胞培養中に存在する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
モネンシンの前記所定の選択された濃度が、０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
モネンシンの前記所定の選択された濃度が、１０ｎＭ〜８００ｎＭの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
モネンシンの前記所定の選択された濃度が、２５ｎＭ〜７５０ｎＭの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
モネンシンの前記所定の選択された濃度が、５０ｎＭ〜５００ｎＭの間である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
モネンシンの前記濃度が、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ；５００ｎＭ；及び７５０ｎＭから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記モネンシンが、２５ｎＭ〜１００ｎＭの間の第１の選択された濃度で前記細胞培養中に存在し、次いで、１００ｎＭ〜５００ｎＭの間の第２のより高い濃度に増大される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１１】
前記モネンシンが、前記第１の濃度で３〜５日間維持され、次いで、前記第２の濃度で１日から培養持続期間にわたって維持される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
モネンシンの前記第２のより高い濃度が、続いて、１日から培養持続期間にわたって２５ｎＭ〜１００ｎＭの間に漸減される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記モネンシンが、前記培養が確立された後３〜１５日目の間に前記細胞培養に加えられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記モネンシンが、前記培養が確立された後３日目、４日目、５日目；６日目；７日目；８日目；９日目；１０日目；１１日目；または１２日目に前記細胞培養に加えられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養が灌流によって維持される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
灌流が、前記細胞培養の１日目または約１日目〜９日目または約９日目に始まる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
灌流が、前記細胞培養の３日目または約３日目〜７日目または約７日目に始まる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
灌流が、細胞が産生フェーズに達したときに始まる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
灌流が交互接線流によって達成される、請求項１５、１６、１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
灌流が、限外濾過膜またはマイクロフィルターを使用する交互接線流によって達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞培養が、流加バッチによって維持される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養が、産生の間に３回供給を受ける、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記培養が、２〜４日目の間の１日に、５〜７日目の間の１日に、及び８〜１０日目の間の１日に供給を受ける、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記培養が、産生の間に４回供給を受ける、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記培養が、２〜４日目の間の１日に、５〜６日目の間の１日に、７〜８日目の間の１日に、及び８〜１０日目の間の１日またはそれ以降の１日に供給を受ける、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
収集ステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ＣＨＯ細胞培養などの哺乳類細胞培養を含めた細胞培養によって産生される組換えタンパク質の１つまたは複数の特性をモジュレートするための化合物及びプロセスに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９８，３１０号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
グリコシル化は哺乳動物細胞における遍在性の翻訳後修飾であり；通常のヒト免疫グロブリンとチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生される治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方とも、糖タンパク質である。ＣＨＯ宿主細胞によって発現されるタンパク質のグリコフォームは、細胞株の生成及びクローン選抜の間に大部分は決定されるが、高マンノースグリコフォーム含量の存在及び／または程度も細胞培養条件に影響を及ぼされ得る（Ｐａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８，２３４８−２３５８）。
【０００４】
治療用ｍＡｂの薬物動態特性とエフェクター機能の両方とも、定常領域のグリコシル化に影響を及ぼされ得る。フコース及びガラクトースなどの末端糖は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１５：２６−３２）に影響を及ぼし得る。高マンノースグリカンは、ある特定のｍＡｂの血清クリアランスを増大させる場合があるので、有効性に影響を及ぼす可能性がある（Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：９４９−５９）。あるいは、高マンノースグリコフォームは、ＦｃγＩＩＩ受容体に対する抗体の親和性を増大させることができるので、ある特定の抗体のＡＤＣＣ活性を増大させる（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＭＡｂｓ  ４：４７５−８７）。したがって、各組換えｍＡｂに関して、ｍＡｂの治療的可能性を最も支持するある特定のグリコシル化プロファイルが維持される必要がある。
【０００５】
細胞培養においてタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量を操作する方法は、培地組成、浸透圧、ｐＨ、温度などの変化を含む（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｐａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｃｈｅｅ  Ｆｕｒｎｇ  Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８９：１６４−１７７；Ａｈｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０１：１２３４−４４）。これらの方法の有効性は、細胞株、分子型及び培地環境に特異的であり、典型的には試行錯誤により得られる。さらに、これらの方法は、抗体生産性、細胞培養の挙動及び他の抗体品質特性を変える傾向もある。
【０００６】
モネンシンは、生体膜に組み込むことでき、それにより、こうした膜を挟むナトリウム−水素勾配を乱すことができる、ナトリウム−水素イオノフォアである。モネンシンは、畜牛業界及び家禽業界で抗生物質として、及び真核生物の培養細胞で細胞内小胞輸送を研究するためのツールとして、広く使用されている。モネンシンの添加は、様々な細胞型からの多くの異なるタンパク質の分泌を阻害することが報告されている（Ｆｕｋａｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）１４：６７３−８４；Ｋｕｈｎ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（１９８６）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：３８１６−２５）。モネンシンはまた、ゴルジのｐＨを中和することによってグリカンプロセシングを阻害し、それにより、様々なグリコシル化酵素の機能に影響を及ぼす（Ｋｕｂｏ，Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｐｉｇｅｏｎ，（１９８３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：３４５−８）。
【０００７】
様々な細胞系で発現する様々な異なるタンパク質に関して、モネンシンの添加が高マンノースグリコフォームの増大につながることが観察されている（Ｍａｃｈａｍｅｒ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ  Ｐ．Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：１２８７−９１；Ｋｏｕｓｏｕｌａｓ，Ｋ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０：５６−６０；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ４４：１００３−１２）。しかし、発表された報告の多くでは、グリカンプロセシングに対するその影響を研究するためにモネンシンの短期適用が使用され；マイクロモル濃度でのモネンシンの長期投与は、細胞に対して毒性がある。さらに、ＣＨＯ産生細胞株によって産生された治療用抗体の高マンノースプロファイルをモジュレートするためのモネンシンの有用性を調べた研究はない。
【０００８】
ＣＨＯ産生の培養能力及び抗体の収率を損なわずに、ｍＡｂにおいて高マンノースグリコフォーム（特にマンノース５）を増大させることができる普遍的メカニズムを特定する必要性が依然としてある。そうした方法は、治療用タンパク質のプロセス開発のためになると思われる。本発明は、治療用タンパク質を発現する細胞をモネンシンと接触させることによって高マンノースグリコフォーム含量を調節する方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０８，２３４８−２３５８
【非特許文献２】ＣＤＣ；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１５：２６−３２
【非特許文献３】Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：９４９−５９
【非特許文献４】Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＭＡｂｓ  ４：４７５−８７
【非特許文献５】Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｐａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ，Ｃｈｅｅ  Ｆｕｒｎｇ  Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８９：１６４−１７７
【非特許文献６】Ａｈｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０１：１２３４−４４
【非特許文献７】Ｆｕｋａｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）１４：６７３−８４
【非特許文献８】Ｋｕｈｎ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（１９８６）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：３８１６−２５
【非特許文献９】Ｋｕｂｏ，Ｒ．Ｔ．ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｐｉｇｅｏｎ，（１９８３）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：３４５−８
【非特許文献１０】Ｍａｃｈａｍｅｒ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ  Ｐ．Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：１２８７−９１
【非特許文献１１】Ｋｏｕｓｏｕｌａｓ，Ｋ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０：５６−６０
【非特許文献１２】Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ４４：１００３−１２
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、哺乳類細胞培養プロセスの間に組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量を調節する方法であって、バイオリアクターにおいて哺乳類細胞培養を確立すること、及び細胞培養をモネンシンと接触させることを含む方法を提供する。任意に、本発明は、細胞培養によって産生された組換えタンパク質を収集するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、細胞培養によって産生された組換えタンパク質は精製され、医薬的に許容可能な製剤に製剤化される。
【００１１】
さらなる実施形態では、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量は、細胞をモネンシンと接触させない培養によって産生されるものと比較して増大する。一実施形態では、高マンノースグリカン種はマンノース５（Ｍａｎ５）である。別の実施形態では、高マンノースグリカン種はマンノース６（Ｍａｎ６）、マンノース７（Ｍａｎ７）、マンノース８（マンノース８ａ及び８ｂ；Ｍａｎ８ａ及び８ｂを含める、またはマンノース９（Ｍａｎ９）である。さらなる実施形態では、高マンノースグリカン種は、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８ａ、Ｍａｎ８ｂ及び／またはＭａｎ９の混合物を含む。
【００１２】
本発明は、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量が１０％未満である、さらなる実施形態を提供する。別の実施形態では、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量は、１０％以上である。さらなる実施形態では、モネンシンと接触させる細胞培養によって産生される組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量は、モネンシンと接触させない細胞培養によって産生されるものよりも、１パーセンテージポイント、２パーセンテージポイント、３パーセンテージポイント、４パーセンテージポイントまたは５パーセンテージポイント大きい。さらに別の実施形態では、モネンシンと接触させる細胞培養によって産生される組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量は、モネンシンと接触させない細胞培養によって産生されるものよりも、６、７、８、９または１０パーセンテージポイント大きい。さらなる実施形態では、モネンシンと接触させる細胞培養によって産生される組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量は、モネンシンと接触させない細胞培養によって産生されるものよりも、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７または４０パーセンテージポイント大きい。さらに別の実施形態では、モネンシンと接触させる細胞培養によって産生される組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量は、モネンシンと接触させない細胞培養によって産生されるものよりも、５０パーセンテージポイント以上（すなわち、６０、７０、８０、９０または１００パーセンテージポイント）大きい。
【００１３】
一実施形態では、モネンシンは、終濃度になるように単回ボーラス投与で細胞培養に加えられる。一実施形態では、培地中のモネンシンの終濃度は０．１ｎＭ〜１０００ｎＭであり；別の実施形態では、濃度は１０ｎＭ〜８００ｎＭであり；別の実施形態では、終濃度は２５ｎＭ〜７５０ｎＭであり；さらに別の実施形態では、終濃度は５０ｎＭ〜５００ｎＭである。本発明のさらなる態様は、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ；５００ｎＭ；または７５０ｎＭの終濃度でモネンシンを細胞培養培地に含めることによって、哺乳類細胞培養プロセスの間に組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量を調節する方法を含む。
【００１４】
本発明の一実施形態は、モネンシンを含むまたはモネンシンが加えられる培地を１〜３日間連続的に細胞に与えることによって、哺乳類細胞培養プロセスの間に組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量を調節する方法を提供する。一実施形態では、モネンシンは、（培地に加えるまたは培地とともに培養に加えることによって）、約１日（２０〜２８時間）；約２日（４０〜５６時間）または約３日（６０〜８４時間）にわたって、細胞培養中に存在する。さらなる実施形態では、モネンシンは、（培地に加えるまたは培地とともに培養に加えることによって）、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日またはそれ以上、細胞培養中に存在する。追加的な実施形態については、モネンシンは、培養プロセスの持続期間全体にわたって細胞培養中に存在する。これらの実施形態では、モネンシンは、本明細書に記載のように、所定の選択された濃度で存在してもよいし、漸増濃度で、または高い濃度に増大されてから最初の濃度もしくは別のより低い濃度に再び低下させられる初期濃度で存在してもよい。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態は、モネンシンを含む培地と細胞を接触させること、及び同時にまたは順次モネンシンを別個に培養に加えることによって、哺乳類細胞培養プロセスの間に組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含量を調節する方法を提供する。追加的な実施形態は、流加バッチ培養におけるモネンシンの使用、及び灌流培養におけるモネンシンの使用を含む。一実施形態では、交互接線流（ＡＴＦ）を使用して培養を灌流する。一実施形態では、モネンシンは、本明細書に記載されるように、選択された期間にわたって選択された濃度で培地中の培養物に加えることによって細胞培養中に存在し、モネンシンの濃度は、供給培地または灌流培地と分離して（しかし任意にこれらの培地とともに）モネンシンを培養物に加えることによって、選択された時点で及び選択された期間にわたって増大させられる。
【００１６】
本発明は、培養が確立された後３〜１５日目の間に細胞培養へモネンシンを加えることをさらに提供する。一実施形態では、モネンシンは、培養が確立された後、３日目、４日目、５日目；６日目；７日目；８日目；９日目；１０日目；１１日目；または１２日目に細胞培養に加えられる。モネンシンは、先に記載したような濃度で（一実施形態では、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭまたは７５０ｎＭの終濃度で）１〜７日の間の期間にわたって維持され、本明細書で言及する方法（すなわち、供給培地中に含めること、供給培地と分離して添加することなど）のうちのいずれかによって添加され得る。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、細胞培養物が収集される前の１〜１５日の間に、細胞培養へモネンシンを加えることを提供する。さらに別の実施形態では、モネンシンは、０日目から収集までの細胞培養の持続期間全体にわたって存在する。一実施形態では、モネンシンは、細胞培養収集の１日前；２日前、３日前；４日前；５日前；６日前；７日前；８日前；９日前；または１０日前に細胞培養に加えられる。モネンシンは、先に記載したような濃度で（一実施形態では、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭまたは７５０ｎＭの終濃度で；別の実施形態では、前述の範囲のうちの１つで）１〜３日の間の期間にわたって維持される。さらなる実施形態では、モネンシンの量は、本明細書に記載のように、定常状態にまたはある濃度であって、そこから次いで低下させられる濃度に、経時的に増大させられる。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、細胞培養へのモネンシンの添加は、培養が確立された後１〜１５日の間または培養が確立された後３〜１５日目の間に始まり、任意に、細胞培養物が収集されるまで続ける。一実施形態では、モネンシンは、培養が確立された後１日目；２日目、３日目；４日目；５日目；６日目；７日目；８日目；９日目；または１０日目に細胞培養に加えられる。さらなる実施形態では、モネンシンは、培養の確立後１１日目、１２日目；１３日目；１４日目；１５日目；１６日目；１７日目；１８日目；１９日目；２０日目；２１日目または２２日目に細胞培養に加えられる。先に記載したように、一実施形態では、モネンシンは、０日目から収集までの細胞培養の持続期間全体にわたって存在する。別の実施形態では、モネンシンは、上記のような濃度で（一実施形態では、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭまたは７５０ｎＭの終濃度で；別の実施形態では、前述の範囲のうちの１つで）１〜３日の間の期間にわたって維持される。さらなる実施形態では、モネンシンの量は、本明細書に記載のように、経時的に定常状態にまたはある濃度であって、そこから次いで低下させられる濃度に増大させられる。
【００１９】
本発明の一実施形態では、モネンシンは、一定の濃度を達成するように細胞培養に加えられ；別の実施形態では、モネンシンの濃度は変化する。一実施形態については、細胞培養におけるモネンシンの濃度は、３〜５日にわたって２５ｎＭで保たれ、次いで１日から培養持続期間にわたって５０ｎＭに、増大（またはランプアップ）され得る。別の実施形態では、細胞培養におけるモネンシンの濃度は、３〜５日にわたって２５ｎＭで保たれ、次いで、３〜５日にわたって５０ｎＭに増大され、次いで、培養持続期間にわたって再度２５ｎＭに漸減される。追加的な実施形態は、モネンシンレベルが増大され、定常に保たれ、任意に低下させられる、より短いまたは長い期間を含み、例えば、１〜２日かけて増大され、１〜２日の期間にわたって定常に保たれ、任意に１〜２日の期間にわたって低下させられる。
【００２０】
本発明は、２５ｎＭ〜１００ｎＭの間から１００ｎＭ〜５００ｎＭの間でモネンシンの濃度を変化させること、及び１日から培養持続期間にわたって第２のより高いモネンシン濃度を維持することをさらに含む。別の実施形態では、方法は、任意に、モネンシンの濃度を２５ｎＭ〜１００ｎＭの間に（１日から培養持続期間にわたって）低減する漸減ステップを含む。各段階の持続期間は、記載のように変化し得、各段階で、３〜５日にわたって選択されたレベルでモネンシンを保つ。ある期間を通してモネンシンの量を徐々に増加させ、モネンシン濃度を保つか徐々に濃度を低下させることなどの他の変動を用いる時に、より長い期間も用いることができる。
【００２１】
一実施形態では、モネンシンは、選択された終濃度（すなわち、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭまたは７５０ｎＭ）で培地（供給培地でもよいし、灌流培地でもよい）に含まれ；別の実施形態では、モネンシンは、培地とともに細胞培養に加えられ、さらに別の実施形態では、モネンシンは、培地と分離して加えられる。モネンシンは、培養において所望の終濃度を達成する及び／または維持するのに十分である割合で、培養に加えられる。一実施形態では、モネンシンは、例えば灌流によって培養に培地が加えられる割合の１／４０〜１／６０の割合で加えられ；別の実施形態では、モネンシンは、培地が加えられる割合の１／５０の割合で加えられる。さらなる実施形態では、当技術分野で既知の計算を使用して、所望の濃度を達成するように割合を変化させる。モネンシンは、培養培地のものの１／１０から培養培地のものの１／１００の割合で加えることができる。
【００２２】
本明細書に記載の本発明の実施形態のうちのいずれかと組み合わせて、必要に応じて、培養容器に消泡剤を加えることができる。あるいはまたはさらに、１Ｍ炭酸ナトリウムまたは別の適切な塩基が、所望の設定値でｐＨを維持するのに使用される。
【００２３】
本明細書に記載のように、本発明の一態様では、灌流によって細胞培養を維持することができる。一実施形態では、灌流は、細胞培養の１日目または約１日目〜９日目または約９日目に始まる。関連する実施形態では、灌流は、細胞培養の３日目または約３日目〜７日目または約７日目に始まる。一実施形態では、灌流は、細胞が産生フェーズに達したときに始まる。本発明のさらなる実施形態では、灌流は、交互接線流によって達成される。関連する実施形態では、灌流は、限外濾過膜またはマイクロフィルターを使用する交互接線流によって達成される。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、連続的な灌流を提供し；さらに別の実施形態では、灌流量は一定である。本発明の一実施形態は、１日あたり１．０作業量以下の量で実施される灌流を提供する。関連する実施形態では、灌流は、細胞培養の間中、産生フェーズの間に１日あたり０．２５作業量から１日あたり１．０作業量に増大する量で実施される。別の関連する実施形態では、灌流は、細胞培養の９〜１１日目に、１日あたり１．０作業量に達する量で実施される。別の関連する実施形態では、灌流は、細胞培養の１０日目に、１日あたり１．０作業量に達する量で実施される。
【００２５】
一実施形態では、細胞培養は、培養の３〜７日目より前に、ボーラス細胞培養培地供給を受ける。
【００２６】
本発明のさらに別の態様では、細胞培養は、流加バッチによって維持される。流加バッチ培養の一実施形態では、培養は、産生の間に３回供給を受ける。さらなる実施形態では、培養は、２〜４日目の間の１日に、５〜７日目の間の１日に及び８〜１０日目の間の１日に供給を受ける。別の実施形態は、培養が産生の間に４回供給を受ける流加バッチ法を提供する。さらに他の実施形態では、培養は、２〜４日目の間の１日に、５〜６日目の間の１日に、７〜８日目の間の１日に及び８〜１０日目の間の１日またはそれ以降の１日に供給を受ける。
【００２７】
本発明の一実施形態では、モネンシンは、供給培地とともに流加バッチ培養に加えられる。したがって、モネンシンは、先に説明した時に、産生プロセスの間に３または４回添加され得る。モネンシンは、培養において特定の濃度を達成するように意図された濃度で培地（すなわち産生培地）に添加され得るか、モネンシンは、供給培地と分離して（しかし、それとともに）培養に添加され得る。別の実施形態では、モネンシンは、培養が供給されていない（すなわち、追加的な供給培地が加えられていない）日（複数可）に、直接的に培養に加えられる。モネンシンの濃度及びモネンシンが培養に存在する時間量は、前述のパラメーターに従って選択される。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、哺乳類細胞培養は、無血清培地中の少なくとも０．５×１０６〜３．０×１０６細胞／ｍＬをバイオリアクターに接種することによって確立される。代替のまたはさらなる実施形態では、哺乳類細胞培養は、無血清培地中の少なくとも０．５×１０６〜１．５×１０６細胞／ｍＬをバイオリアクターに接種することによって確立される。
【００２９】
本発明は、培養の間に温度シフトをさらに含むことができる。一実施形態では、温度シフトは３６℃から３１℃へである。一実施形態では、本発明は３６℃から３３℃への温度シフトをさらに含む。関連する実施形態では、温度シフトは、成長フェーズと産生フェーズの間の移行時に生じる。関連する実施形態では、温度シフトは、産生フェーズの間に生じる。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、Ｌ−アスパラギン飢餓、それに続く、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって、細胞成長停止を誘導することをさらに含む。別の実施形態では、本発明は、５ｍＭ以下のＬ−アスパラギン濃度を有する無血清灌流培地での灌流によって、細胞成長停止を誘導することをさらに含む。関連する実施形態では、無血清灌流培地のＬ−アスパラギン濃度は５ｍＭ以下である。関連する実施形態では、無血清灌流培地のＬ−アスパラギン濃度は４．０ｍＭ以下である。関連する実施形態では、無血清灌流培地のＬ−アスパラギン濃度は３．０ｍＭ以下である。関連する実施形態では、無血清灌流培地のＬ−アスパラギン濃度は２．０ｍＭ以下である。関連する実施形態では、無血清灌流培地のＬ−アスパラギン濃度は１．０ｍＭ以下である。関連する実施形態では、無血清灌流培地のＬ−アスパラギン濃度は０ｍＭである。関連する実施形態では、細胞培養培地のＬ−アスパラギン濃度は、Ｌ−アスパラギン飢餓より前及びその間にモニターされる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、本発明は、産生フェーズの間の圧縮細胞量が３５％以下であることを含む。関連する実施形態では、圧縮細胞量は３５％以下である。関連する実施形態では、圧縮細胞量は３０％以下である。
【００３２】
関連する実施形態では、３５％以下の圧縮細胞量での哺乳類細胞培養の生細胞密度は１０×１０６生細胞／ｍＬ〜８０×１０６生細胞／ｍｌである。別の実施形態では、哺乳類細胞培養の生細胞密度は２０×１０６生細胞／ｍｌ〜３０×１０６生細胞／ｍｌである。
【００３３】
さらに別の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。さらに別の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。さらに別の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。
【００３４】
さらに別の実施形態では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。さらに別の実施形態では、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質またはサイトカインから成る群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】交互接線流（ＡＴＦ）を使用するバイオリアクターにおける細胞培養能力に対するモネンシンの影響を調べたときに得られた結果を示す図である。ＡＴＦリアクターＲａ（灰色の三角形）及びＲｂ（灰色の丸）中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。対照リアクター（黒色の丸）中の細胞は、モネンシンの非存在下で成長させた。生細胞密度を図１に図示する。
【図２】交互接線流（ＡＴＦ）を使用するバイオリアクターにおける細胞培養能力に対するモネンシンの影響を調べたときに得られた結果を示す図である。ＡＴＦリアクターＲａ（灰色の三角形）及びＲｂ（灰色の丸）中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。対照リアクター（黒色の丸）中の細胞は、モネンシンの非存在下で成長させた。図２は生存率解析の結果を示す。
【図３】交互接線流（ＡＴＦ）を使用するバイオリアクターにおける細胞培養能力に対するモネンシンの影響を調べたときに得られた結果を示す図である。ＡＴＦリアクターＲａ（灰色の三角形）及びＲｂ（灰色の丸）中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。対照リアクター（黒色の丸）中の細胞は、モネンシンの非存在下で成長させた。図３では、実験過程の全体を通して毎日モニターした、モネンシンのタンク及び対照のタンクの圧縮細胞量を示す。毎日の使用済み培地試料も、力価解析のために提示した。
【図４】交互接線流（ＡＴＦ）を使用するバイオリアクターにおける細胞培養能力に対するモネンシンの影響を調べたときに得られた結果を示す図である。ＡＴＦリアクターＲａ（灰色の三角形）及びＲｂ（灰色の丸）中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。対照リアクター（黒色の丸）中の細胞は、モネンシンの非存在下で成長させた。圧縮細胞量及び力価値を使用して、図４に示す圧縮細胞調整力価を計算した。
【図５】モネンシンの存在下で、ＡＴＦにおいて産生されたＭＡｂ  Ｅの高マンノースプロファイルを示す図である。図１〜４について記載するように、ＡＴＦリアクターＲａ及びＲｂ中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。毎日の使用済み培地試料を、全高マンノースグリカンの解析のために提示した。使用済み培地試料についての全グリカン解析を図５（Ｒａ−灰色の三角形、Ｒｂ−灰色の丸、対照（モネンシンなし）−黒色の丸）に示す。
【図６】モネンシンの存在下で、ＡＴＦにおいて産生されたＭＡｂ  Ｅの高マンノースプロファイルを示す図である。図１〜４について記載するように、ＡＴＦリアクターＲａ及びＲｂ中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。毎日の使用済み培地試料を、全高マンノースグリカンの解析のために提示した。全高マンノースに加えて、個々のより高い順序のマンノース種を解析し；ＡＴＦ対照（モネンシンなし）リアクター（全高マンノース、黒色の丸；Ｍａｎ５（黒色の菱形）、Ｍａｎ６（黒色の三角形）、Ｍａｎ７（黒色のアステリスク）、Ｍａｎ８（黒色の正方形）、Ｍａｎ９（黒色の線）について図６に結果を示す。
【図７】モネンシンの存在下で、ＡＴＦにおいて産生されたＭＡｂ  Ｅの高マンノースプロファイルを示す図である。図１〜４について記載するように、ＡＴＦリアクターＲａ及びＲｂ中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。毎日の使用済み培地試料を、全高マンノースグリカンの解析のために提示した。モネンシンの存在下で、ＡＴＦにおいて産生されたＭＡｂ  Ｅの高マンノースプロファイルを示す図である。図７はＲａリアクターについての同じ解析を示す。
【図８】モネンシンの存在下で、ＡＴＦにおいて産生されたＭＡｂ  Ｅの高マンノースプロファイルを示す図である。図１〜４について記載するように、ＡＴＦリアクターＲａ及びＲｂ中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。毎日の使用済み培地試料を、全高マンノースグリカンの解析のために提示した。モネンシンの存在下で、ＡＴＦにおいて産生されたＭＡｂ  Ｅの高マンノースプロファイルを示す図である。図８はＲｂリアクターについて示す。
【図９】モネンシンを有するＡＴＦリアクターで産生されたＭＡｂ  Ｅについての、予測高マンノースレベル及び測定高マンノースレベル並びに高マンノース低下の割合を示す図である。ＡＴＦリアクターＲａ及びＲｂ中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。測定高マンノース（黒色のバー）が増大し続けている時点（９〜１１日目）に関して、すべての産生されたＭＡｂ  Ｅ抗体が高マンノースグリカンを含むという仮定に基づいて、Ｒａリアクターについて予測高マンノース値（白色のバー）を計算した。ｍＡｂ  Ｅの高マンノースレベルが低下し始める１３日目以降については、予測高マンノース値は、新しく産生されるどのＭＡｂ  Ｅ抗体も、いかなる高マンノースグリカンも含んでいないと仮定して計算した。
【図１０】モネンシンを有するＡＴＦリアクターで産生されたＭＡｂ  Ｅについての、予測高マンノースレベル及び測定高マンノースレベル並びに高マンノース低下の割合を示す図である。ＡＴＦリアクターＲａ及びＲｂ中のモネンシン濃度を、８日に開始し９日目に終了した約２２時間の過程にわたって、５００ｎＭに保った。測定高マンノース（黒色のバー）が増大し続けている時点（９〜１１日目）に関して、すべての産生されたＭＡｂ  Ｅ抗体が高マンノースグリカンを含むという仮定に基づいて、Ｒｂリアクターについて予測高マンノース値（白色のバー）を計算した。ｍＡｂ  Ｅの高マンノースレベルが低下し始める１３日目以降については、予測高マンノース値は、新しく産生されるどのＭＡｂ  Ｅ抗体も、いかなる高マンノースグリカンも含んでいないと仮定して計算した。
【図１１】モネンシンを有するＡＴＦリアクターで産生されたＭＡｂ  Ｅについての、予測高マンノースレベル及び測定高マンノースレベル並びに高マンノース低下の割合を示す図である。倍数力価増大（黒色のバー）及び倍数高マンノース増大（白色のバー）も、Ｒａに関して、この期間にわたって計算した。
【図１２】モネンシンを有するＡＴＦリアクターで産生されたＭＡｂ  Ｅについての、予測高マンノースレベル及び測定高マンノースレベル並びに高マンノース低下の割合を示す図である。倍数力価増大（黒色のバー）及び倍数高マンノース増大（白色のバー）も、Ｒｂに関して、この期間にわたって計算した。
【図１３】ＡＴＦリアクターＲａにおける計算されたモネンシン濃度を図示する図である。８日目に、モネンシンをリアクターに５００ｎＭでボーラス投与し、この濃度で約２２時間維持した。モネンシン投与終了後のタンク中のモネンシン濃度を、リアクター中の培地灌流量（灰色の丸）に基づいて計算した。高マンノースの全測定パーセントを黒色の丸で示す。
【図１４】ＡＴＦリアクターＲｂにおける計算されたモネンシン濃度を図示する図である。８日目に、モネンシンをリアクターに５００ｎＭでボーラス投与し、この濃度で約２２時間維持した。モネンシン投与終了後のタンク中のモネンシン濃度を、リアクター中の培地灌流量（灰色の丸）に基づいて計算した。高マンノースの全測定パーセントを黒色の丸で示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本出願で使用される専門用語は当技術分野内で標準的なものであるが、特許請求の範囲の意味の明瞭性及び明確性を保証するために、ある特定の用語の定義を本明細書に提供する。単位、接頭辞及び記号は、それらのＳＩ（国際単位系）で承認された形式で示され得る。本明細書に記載される数値範囲は、その範囲を規定する数を含み、規定された範囲内の各整数を含み、その整数を支持する。本明細書に記載の方法及び技法は、一般に、別段指示がない限り、当技術分野で周知の従来の方法に従って、本明細書全体を通して引用され考察される様々な一般的参考文献及びより特定の参考文献に記載されているように実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。
【００３７】
開示する方法は、撹拌タンクリアクター（スピンフィルターを備えていてもよいが、備えている必要はない、従来のバッチ及び流加バッチ細胞培養を含める）、灌流システム（交互接線流（「ＡＴＦ」）培養、アコースティック灌流システム、デプスフィルター灌流システム及び他のシステムを含める）、中空糸バイオリアクター（ＨＦＢ、これは、場合によっては灌流プロセスに用いられ得る）並びに様々な他の細胞培養法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：７５１−６５；Ｋｕｙｓｔｅｒｍａｎｓ  ＆  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ，（２０１１）“Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒｏｍ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：２５−５２，Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ（ｅｄ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；Ｃａｔａｐａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）“Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｌｅ−Ｕｐ”ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｉｂｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）で成長する、接着性培養または懸濁培養に適用可能である。
【００３８】
限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含めた、本出願で引用されるすべての文献または文献の一部は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。本発明の一実施形態に記載されていることは、本発明の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００３９】
定義
本明細書で使用する場合、用語「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、特に指示がない限り、１つまたは複数を意味する。さらに、文脈によって別段必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びにタンパク質化学及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、並びにこれらの技法は、当技術分野で周知且つ一般に使用されるものである。
【００４０】
本開示は、「目的のタンパク質」を発現する細胞培養の特性をモジュレートする方法を提供し；「目的のタンパク質」には、天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質及び改変蛋白質（例えば、天然に存在せず、ヒトによって設計された及び／または作出されたタンパク質）が含まれる。目的のタンパク質は、治療的に関連性のあることが知られているか、そう思われているタンパク質であり得るが、そうである必要はない。目的のタンパク質の特定例としては、（本明細書に記載され、定義されるような）抗原結合タンパク質、ペプチボディ（すなわち、抗体のＦｃドメインなどの他の分子に直接的または間接的に融合したペプチド（複数可）を含む分子（ここでは、ペプチド部分が所望の標的に特異的に結合し；ペプチド（複数可）は、Ｆｃ領域に融合されてもよく、Ｆｃ−ループに挿入されてもよく、または例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０１４０９３４号に記載されている修飾Ｆｃ分子であってもよい））、融合タンパク質（例えば、Ｆｃフラグメントがタンパク質またはペプチドに融合しているＦｃ融合タンパク質）、サイトカイン、成長因子、ホルモン及び他の天然に存在する分泌タンパク質、並びに天然に存在するタンパク質の変異型が挙げられる。
【００４１】
用語「抗原結合タンパク質」は、その最も広い意味において使用され、抗原または標的に結合する部分及び任意に、抗原結合部分が抗原への抗原結合タンパク質の結合を促進するコンフォメーションをとることを可能にするスキャフォールドまたはフレームワーク部分を含むタンパク質を意味する。抗原結合タンパク質の例としては、ヒト抗体、ヒト化抗体；キメラ抗体；組換え抗体；単鎖抗体；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；ＩｇＤ抗体；ＩｇＥ抗体；ＩｇＭ抗体；ＩｇＧ１抗体；ＩｇＧ２抗体；ＩｇＧ３抗体；またはＩｇＧ４抗体、及びそれらのフラグメントが挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替のタンパク質スキャフォールドまたは移植されたＣＤＲもしくはＣＤＲ誘導体を有する人工のスキャフォールドを含むことができる。そうしたスキャフォールドは、限定されないが、例えば抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された変異を含む、抗体由来のスキャフォールド、及び例えば生体適合性ポリマーを含む完全合成のスキャフォールドが挙げられる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５３（１）：１２１−１２９（２００３）；Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４（２００４）を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣物（「ＰＡＭ」）を使用することができ、スキャフォールドとしてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣物に基づくスキャフォールドも使用することができる。
【００４２】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然に存在する免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと規定する。
【００４３】
天然に存在する免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の指定は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，（１９９１）の定義に従って行われ得る。所望により、ＣＤＲはまた、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３、またはＨｏｎｅｇｇｅｒ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０を参照されたい）のものなどの代替の命名スキームに従って再定義され得る。
【００４４】
本開示の文脈において、抗原結合タンパク質は、解離定数（ＫＤ）が≦１０−８Ｍである場合に、その標的抗原に「特異的に結合する」または「選択的に結合する」と言われる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍである場合に「高親和性」で、及びＫＤが≦５ｘ１０−１０Ｍである場合に「非常に高親和性」で、抗原に特異的に結合する。
【００４５】
用語「抗体」は、別段の指定がない限り、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化された及びグリコシル化されていない免疫グロブリンの両方への、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合するそれらの抗原結合領域への言及を含む。さらに、用語「抗体」は、別段の指定がない限り、インタクトな免疫グロブリン、または特異的結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ法により、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成することができ、目的のタンパク質の要素を形成することができる。抗原結合部分としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びポリペプチドに特異的な抗原結合を与えるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
【００４６】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する、二価のフラグメントであり；Ｆｄフラグメントは、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖフラグメントは、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有し；ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメインまたはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合性フラグメントを有する（米国特許第６，８４６，６３４号、第６，６９６，２４５号、米国特許出願公開第０５／０２０２５１２号、第０４／０２０２９９５号、第０４／００３８２９１号、第０４／０００９５０７号、第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）。
【００４７】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬとＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して結合して、連続的なタンパク質鎖を形成する抗体である（ここでは、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体の上に折り畳まれ、一価の抗原結合部位を形成させるのに十分な長さである）（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３を参照されたい）。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ここでは、各ポリペプチド鎖は、リンカー（これは、同じ鎖状で２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるので、各ドメインを別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対合させる）によって結合したＶＨ及びＶＬドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８；及びＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合は、それらの対合によるダイアボディは、２つの同一抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製するのに使用することができる。同様に、トリボディ及びテトラボディは、それぞれ３つ及び４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、３つ及び４つの抗原結合部位（同じでもよいし異なってもよい）を形成する、抗体である。
【００４８】
１つまたは複数のＣＤＲを共有結合的または非共有結合的に分子に組み込んで、その分子を抗原結合タンパク質にすることができる。抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（複数可）を組み込むことができ、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（複数可）を共有結合的に連結することができ、または非共有結合的にＣＤＲ（複数可）組み込むことができる。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００４９】
抗原結合タンパク質は、１つまたは複数の結合部位を有し得る。１つを超える結合部位が存在する場合、結合部位は互いに同一でもよいし、異なっていてもよい。例えば、天然に存在するヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一結合部位を有するが、「二重特異性」または「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００５０】
明瞭にする目的で、及び本明細書に記載のように、抗原結合タンパク質はヒト起源のもの（例えばヒト抗体）であり得るが、そうである必要はなく、ある場合には非ヒトタンパク質、例えばラットまたはマウスのタンパク質を含み、他の場合では、抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質と非ヒトタンパク質のハイブリッド（例えば、ヒト化抗体）を含むことができることに留意されたい。
【００５１】
目的のタンパク質はヒト抗体を含むことができる。用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１つまたは複数の可変領域及び定常領域を有するすべての抗体を含む。一実施形態では、すべての可変ドメイン及び定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。そうした抗体は様々な方法で調製することができ、これには、ヒト重鎖及び／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子組換えされたマウス、例えばＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）、ＵｌｔｉＭａｂ（商標）またはＶｅｌｏｃｉｍｍｕｎｅ（登録商標）系に由来するマウスの目的の抗原での免疫化を介することが含まれる。ファージベースのアプローチも用いることができる。
【００５２】
あるいは、目的のタンパク質は、ヒト化抗体を含むことができる。「ヒト化抗体」は、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及び／または付加によって、非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有し、その結果、ヒト化抗体は、ヒト対象に投与される場合に、免疫応答を誘導する可能性が低く、及び／または非ヒト種抗体と比較して軽度な免疫応答を誘導する。一実施形態では、ヒト化抗体を生成するために、非ヒト種抗体の重鎖及び／または軽鎖のフレームワーク及び定常ドメインにおけるある特定のアミノ酸を変異させる。別の実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメイン（複数可）を非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合する。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号及び第５，８７７，２９３号に見出すことができる。
【００５３】
「Ｆｃ」領域は、この用語が本明細書で使用される場合、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する２つの重鎖フラグメントを含む。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合によって、及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって互いに結合している。抗原結合タンパク質及びＦｃ融合タンパク質を含めた、Ｆｃ領域を含む目的のタンパク質は、本開示の別の態様を形成する。
【００５４】
「ヘミボディー」は、１つの完全な重鎖、１つの完全な軽鎖及び完全な重鎖のＦｃ領域と対合した１つの第２重鎖Ｆｃ領域を含む、免疫学的に機能的な免疫グロブリン構築物である。必ずしも必要ではないが、重鎖Ｆｃ領域と第２の重鎖Ｆｃ領域を結合させるためにリンカーを用いることができる。特定の実施形態では、ヘミボディーは、本明細書に開示される抗原結合タンパク質の一価の形態である。他の実施形態では、１つのＦｃ領域を第２のＦｃ領域と結合させるために、荷電残基の対を用いることができる。本開示の文脈において、ヘミボディーは目的のタンパク質でもよい。
【００５５】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されているか、核酸配列で形質転換することができ、それによって、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、後代が形態または遺伝子構成において元の親細胞と同一であるか否かに関わらず、目的の遺伝子が存在さえすれば、親細胞の後代を含む。細胞培養は、１種または複数の宿主細胞を含むことができる。
【００５６】
用語「ハイブリドーマ」は、不死化細胞と抗体産生細胞の融合により生じる細胞または細胞の後代を意味する。生じたハイブリドーマは抗体を産生する不死化細胞である。ハイブリドーマを作出するのに使用される個々の細胞は、限定されないが、ハムスター、ラット、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ及びヒトを含めた、任意の哺乳類の供給原由来であり得る。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株の間の融合産物であるヘテロハイブリッド骨髄腫融合体の後代が、続いて形質細胞と融合する場合に生じるトリオーマ細胞株も包含する。この用語は、例えばクアドローマなどの、抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むことを意図する（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３を参照されたい）。
【００５７】
用語「培養」及び「細胞培養」は互換的に使用され、細胞集団の生存及び／または成長に適した条件下において、培地中で維持される細胞集団を指す。当業者に明らかであるように、これらの用語は、細胞集団とこの集団が懸濁している培地とを含む組み合わせも指す。
【００５８】
（例えば、目的のタンパク質または目的のポリペプチドとの関連で使用される場合）用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似体または模倣物であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用する。この用語は、例えば、糖タンパク質を形成するために炭水化物残基を付加することによって修飾された、またはリン酸化されたアミノ酸ポリマーも包含することができる。ポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在する、非組換えの細胞によって産生することができ、またはポリペプチド及びタンパク質は、遺伝子操作されたもしくは組換えの細胞によって産生することができる。ポリペプチド及びタンパク質は、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸からの欠失、そうしたアミノ酸への付加及び／もしくはそうしたアミノ酸の置換を有する分子を含むことができる。
【００５９】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、天然に存在するアミノ酸のみを含む分子及び天然に存在しないアミノ酸を含む分子を包含する。天然に存在しないアミノ酸（これは、所望により、本明細書に開示される任意の配列に見られる、天然に存在する任意のアミノ酸を置換することができる）の例としては、以下が挙げられる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の同様のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表示法では、標準的な用法及び慣例に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシル末端方向である。
【００６０】
タンパク質もしくはポリペプチド配列中に挿入することができる、またはタンパク質もしくはポリペプチド配列の野生型残基を置換することができる、天然に存在しないアミノ酸の例の非限定的なリストとしては、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。例としては、以下が挙げられる（Ｌ型またはＤ型；括弧内のように省略される）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎα−メチルホモシトルリン（Ｎα−ＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα−メチルオルニチン（Ｎα−ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα−メチルロイシン（Ｎα−ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎα−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、３−（１−ナフチル）アラニン（１−Ｎａｌ）、３−（２−ナフチル）アラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２−インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩ−Ｐｈｅ）、パラ−アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４−アミノ−Ｐｈｅ）、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（省略形「Ｋ（Ｎε−グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」）、ニトロフェニルアラニン（ニトロｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（アミノｐｈｅまたはアミノ−Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ベンジルｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−カルボキシｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ヒドロキシｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα−メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎ−α−メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα−メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（アセチルａｒｇ）、α，β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、g−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−メチルアルギニン、４−アミノ−Ｏ−フタル酸（４ＡＰＡ）及び他の同様のアミノ酸並びに具体的に列挙されたもののうちのいずれかの誘導体化形態。
【００６１】
「細胞培養」または「培養」は、多細胞生物または組織の外部における細胞の成長及び増殖を意味する。哺乳動物細胞に適切な培養条件は当技術分野で既知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁液でまたは固形基材に付着させながら培養することができる。流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラボトル、振盪フラスコまたは撹拌タンクバイオリアクターを、マイクロキャリアの有無に関わらず、使用することができる。一実施形態では、５００Ｌ〜２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。一実施形態では、１０００Ｌ〜２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。
【００６２】
用語「細胞培養培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）」（「培養培地」、「細胞培養培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）、「組織培養培地」とも呼ばれる）は、細胞、例えば動物または哺乳動物細胞を成長させるために使用され、且つ一般に、以下の少なくとも１つのまたはそれ以上の成分を提供する、任意の栄養液を指す：エネルギー源（通常、グルコースなどの炭水化物の形態）；すべての必須アミノ酸の１つまたは複数、及び一般に２０種の塩基性アミノ酸とシステイン；典型的には低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸；並びに通常マイクロモル濃度範囲の非常に低濃度で典型的には必要とされる微量元素、例えば無機化合物または天然に存在する元素。
【００６３】
培養される細胞の要求に応じて及び／または所望の細胞培養パラメーターに応じて、細胞成長を最適化するために、任意に、さらなる任意の成分で栄養液を補充することができ、さらなる任意の成分は、例えば、ホルモン及び他の成長因子、例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、血清など；塩、例えば、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩並びに緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ；ヌクレオシド及び塩基、例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチン；並びにタンパク質及び組織の加水分解産物、例えば、加水分解した動物タンパク質または植物タンパク質（動物副産物、精製ゼラチンまたは植物材料から得ることができる、ペプトンまたはペプトン混合物）；抗生物質、例えばゲンタマイシン；細胞保護剤または界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８及びＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８とも称される；ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心的な疎水性鎖から構成される、非イオン性のトリブロックコポリマー；ポリアミン、例えば、プトレシン、スペルミジン及びスペルミン（例えば、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ２００８／１５４０１４号を参照されたい）及びピルビン酸（例えば、米国特許第８０５３２３８号を参照されたい）である。
【００６４】
細胞培養培地としては、任意の細胞培養プロセス、例えば、限定されないが、バッチ、拡張バッチ（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｂａｔｃｈ）、流加バッチ及び／または灌流もしくは連続的細胞培養をともなう使用において典型的に用いられる、及び／またはこうした細胞培養プロセスをともなう使用について知られているものが挙げられる。
【００６５】
「基本」（またはバッチ）細胞培養培地は、典型的には細胞培養を開始するのに使用され、細胞培養を支持するのに十分に完全である、細胞培養培地を指す。
【００６６】
「成長」細胞培養培地は、典型的には、指数関数的成長、すなわち「成長フェーズ」の間に細胞培養で使用され、このフェーズの間の細胞培養を支持するのに十分に完全である、細胞培養培地を指す。成長細胞培養培地は、宿主細胞株に組み込まれた選択マーカーに対する抵抗性または生存を付与する選択剤も含むことができる。そうした選択剤としては、限定されないが、ジェネテシン（Ｇ４１１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシミン、メトトレキサート、グルタミン無細胞培地、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンまたはチミジンのみを欠く細胞培養培地が挙げられる。
【００６７】
「産生」細胞培養培地は、典型的には、指数関数的成長が終わり、タンパク質産生が優勢になる移行期、すなわち「移行」及び／または「産物」フェーズ中の細胞培養で使用され、このフェーズ中の所望の細胞密度、生存率及び／または産物力価を維持するのに十分に完全である、細胞培養培地を指す。
【００６８】
「灌流」細胞培養培地は、典型的には、灌流または連続的な培養方法によって維持される細胞培養で使用され、このプロセスの間の細胞培養を支持するのに十分に完全である、細胞培養培地を指す。灌流細胞培養培地配合物は、使用済み培地を除去するのに使用される方法に適応させるために、基本細胞培養培地配合物よりも栄養分があってもよく、またはさらに濃縮されてもよい。灌流細胞培養培地は、成長フェーズ中と産生フェーズ中の両方で使用することができる。
【００６９】
濃縮細胞培養培地は、細胞培養を維持するのに必要な栄養素のいくつかまたはすべてを含むことができ；特に、濃縮培地は、細胞培養の産生フェーズの過程において消費されるとして同定された、またはそのことが知られている栄養素を含むことができる。濃縮培地は、ほぼすべての細胞培養培地配合物に基づき得る。そうした濃縮供給培地は、細胞培養培地の成分のいくつかまたはすべてを、例えば、それらの通常量の約２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、３０×、５０×、１００×、２００×、４００×、６００×、８００×またはさらに約１０００×で含むことができる。
【００７０】
細胞培養培地を調製するのに使用される成分は、粉末培地配合物に完全に製粉されてもよく；必要に応じて細胞培養培地に加えられた液体補充物とともに部分的に製粉されてもよく；または完全な液体形態で細胞培養に加えられてもよい。
【００７１】
細胞培養は、配合するのが困難である可能性があるか、細胞培養で急速に枯渇する特定の栄養素の、独立した濃縮供給物で補充することもできる。そうした栄養素は、アミノ酸、例えばチロシン、システイン及び／またはシスチンでもよい（例えば、ＷＩＰＯ公開第２０１２／１４５６８２号を参照されたい）。一実施形態では、細胞培養中のチロシン濃度が８ｍＭを超えないように、チロシンの濃縮溶液が、チロシンを含む細胞培養培地で成長する細胞培養に独立して供給される。別の実施形態では、チロシン及びシスチンの濃縮溶液が、チロシン、シスチンまたはシステインを欠く細胞培養培地で成長する細胞培養に独立して供給される。独立した供給は、産生フェーズより前にまたは産生フェーズの開始時に始めることができる。独立した供給は、同じまたは異なる日における濃縮供給培地としての細胞培養培地への流加バッチによって達成することができる。独立した供給は、同じまたは異なる日に灌流培地として灌流することもできる。
【００７２】
「無血清」は、動物血清、例えばウシ胎仔血清を含まない細胞培養培地に適用する。規定された培養培地を含めた様々な組織培養培地が市販されており、例えば、以下の細胞培養培地のいずれか１つまたは組み合わせを使用することができる：数ある中で、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地及び無血清培地、例えばＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）。そうした培養培地の無血清バージョンも利用可能である。培養される細胞の要求に応じて及び／または所望の細胞培養パラメーターに応じて、細胞培養培地を追加的なまたは増大した濃度の成分、例えば、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などで補充することができる。用語「バイオリアクター」は、細胞培養の成長に有用な任意の容器を意味する。本開示の細胞培養はバイオリアクター中で成長することができ、バイオリアクターは、バイオリアクター中で成長する細胞によって産生される目的のタンパク質の用途に基づいて選択され得る。バイオリアクターは、細胞の培養に有用でありさえすれば、いかなるサイズのものでもよく；典型的には、バイオリアクターは、その内部で成長する細胞培養の容積に適したサイズに設定される。典型的には、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、２、５、１０、５０、１００、２００、２５０、５００、１，０００、１５００、２０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットルもしくはそれ以上またはその間の任意の容積でもよい。限定されないがｐＨ及び温度を含めた、バイオリアクターの内部条件は、培養期間の間、制御することができる。当業者なら、関連する考慮事項に基づいて、本発明の実施において使用するための適切なバイオリアクターを認識し、且つ選択することができる。
【００７３】
「細胞密度」は、所与の容積の培養培地中の細胞の数を指す。「生細胞密度」は、標準的な生存率アッセイ（トリパンブルー色素排除法など）によって決定される、所与の容積の培養培地中に生きている細胞数を指す。
【００７４】
用語「細胞生存率」は、培養中の細胞が、所与の一連の培養条件下または実験変動下で生存する能力を意味する。この用語は、特定の期間の培養における生細胞及び死細胞の総数に対する、その特定の期間に生きている細胞の割合も指す。
【００７５】
「パーセント圧縮細胞量」（％ＰＣＶ）とも称される「圧縮細胞量」（ＰＣＶ）は、細胞培養の全量に対する、細胞が占める量の比であり、パーセンテージとして表される（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．Ｄｅｃ  ２０：９５（６）：１２２８−３３を参照されたい）。圧縮細胞量は、細胞密度及び細胞径の関数であり；圧縮細胞量の増大は、細胞密度または細胞径のいずれか、または両方の増大から生じ得る。圧縮細胞量は、細胞培養中の固形物含量の尺度である。固形物は、収集及び下流の精製の間に除去される。固形物が多いほど、収集及び下流の精製ステップの間に、所望の産物から固形物質を分離する手間が多くなる。さらに、所望の産物が固形物中にトラップされ、収集プロセスの間に失われる可能性があり、その結果、産物の収量が低下し得る。宿主細胞はサイズが異なり、且つ細胞培養は死細胞及び死にかけている細胞並びに他の細胞残屑も含むので、圧縮細胞量は、細胞培養内の固形物含量を説明するための、細胞密度または生細胞密度よりも正確な方法である。例えば、５０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度を有する２０００Ｌの培養は、細胞サイズに応じて非常に異なる圧縮細胞量を有すると思われる。さらに、細胞の中には、成長停止状態にある場合にサイズが増大するものもあり、そのため、成長停止前と成長停止後の圧縮細胞量は、細胞サイズの増大の結果としてバイオマスが増大することが原因で、異なる可能性がある。
【００７６】
「細胞成長停止」とも称される「成長停止」は、細胞が数を増加させるのを止めるポイントまたは細胞周期がもはや進行しないポイントである。成長停止は、細胞培養の生細胞密度を決定することによりモニターすることができる。成長停止状態の細胞の中には、サイズを増大させることができるが、数を増加させることができないものもあり、そのため、成長停止した培養の圧縮細胞量が増大し得る。成長停止は、細胞が健全性を低下していない状態である場合、成長停止をもたらす状態を回復させることを加えることによって、ある程度回復させることができる。
【００７７】
用語「力価」は、所与の量の培地容積における細胞培養によって産生される目的のポリペプチドまたはタンパク質（これは、目的の天然に存在するタンパク質でもよいし、目的の組換えのタンパク質でもよい）の総量を意味する。力価は、１ミリリットル（または容積の他の尺度）の培地あたりのポリペプチドまたはタンパク質のミリグラムまたはマイクログラムの単位で表すことができる。「累積力価」は、培養の過程において細胞によって産生される力価であり、例えば、毎日の力価を測定し、その値を使用して累積力価を計算することによって、決定することができる。
【００７８】
用語「流加バッチ培養」は、懸濁培養の形態を指し、培養プロセス開始後の１または複数の時点で追加的な成分が培養に与えられる、細胞培養方法を意味する。与えられる成分は、典型的には、培養プロセスの間に枯渇した、細胞のための栄養補充物を含む。さらにまたは代わりに、追加的な成分は補充成分（例えば細胞周期阻害化合物）を含み得る。流加バッチ培養は、典型的にはあるポイントで止められ、培地中の細胞及び／または成分が収集され、任意に精製される。
【００７９】
用語「積算生細胞密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）」または「ＩＶＣＤ」は互換的に使用され、培養が実施された時間量を乗じた、培養過程にわたる生細胞の平均密度を意味する。
【００８０】
「累積生細胞密度」（ＣＶＣＤ）は、２つの時点間の平均生細胞密度（ＶＣＤ）をこれら２つの時点間の時間分で乗じることによって計算される。ＣＶＣＤは、ＶＣＤ対時間をプロットすることによって形成される曲線下面積である。
【００８１】
細胞培養プロセスの説明
組換えタンパク質産生の間、細胞が所望の密度まで成長し、次いで、細胞の生理的状態が、成長停止した高生産性状態（ここでは、より多くの細胞を生成する代わりに、細胞がエネルギー及び基質を使用して、目的の組換えタンパク質を産生する）に転換する、制御された系を有することが望ましい。この目標を達成するための様々な方法があり、そうした方法には、温度シフト及びアミノ酸飢餓、並びに細胞死を引き起こさないで細胞成長を停止させることができる、細胞周期阻害剤または他の分子の使用が含まれる。
【００８２】
組換えタンパク質の産生は、培養プレート、フラスコ、チューブ、バイオリアクターまたは他の適切な容器においてタンパク質を発現する細胞の哺乳動物細胞産生培養を確立することから始める。より小型の産生バイオリアクターが典型的には使用され、一実施形態では、バイオリアクターは５００Ｌ〜２０００Ｌである。別の実施形態では、１０００Ｌ〜２０００Ｌのバイオリアクターが使用される。バイオリアクターに接種する種細胞密度は、産生される組換えタンパク質レベルに正の影響を与え得る。一実施形態では、バイオリアクターに、無血清培地中の少なくとも０．５×１０６〜３．０×１０６生細胞／ｍＬまでを、及びこれを越えるものを接種する。別の実施形態では、接種は１．０×１０６生細胞／ｍｌである。
【００８３】
次いで、哺乳動物細胞は指数関数的成長フェーズを経る。細胞培養は、所望の細胞密度が達成されるまで、補充的供給なしで維持することができる。一実施形態では、細胞培養は、補充的供給の有無にかかわらず３日間まで維持される。別の実施形態では、短時間の成長フェーズなしで産生フェーズを始めるために、所望の細胞密度で培養を接種することができる。本明細書の実施形態のいずれかでは、成長フェーズから産生フェーズへの転換は、前述の方法のうちのいずれかによって始めることもできる。
【００８４】
成長フェーズと産生フェーズの間の移行時及び産生フェーズの間、パーセント圧縮細胞量（％ＰＣＶ）は３５％以下である。産生フェーズの間に維持される所望の圧縮細胞量は３５％以下である。一実施形態では、圧縮細胞量は３０％以下である。別の実施形態では、圧縮細胞量は２０％以下である。さらに別の実施形態では、圧縮細胞量は１５％以下である。さらなる実施形態では、圧縮細胞量は１０％以下である。
【００８５】
成長フェーズと産生フェーズの間の移行時の、及び産生フェーズの間に維持される、所望の生細胞密度は、それぞれプロジェクトに応じて異なり得る。これは、過去のデータの同等の圧縮細胞量に基づいて決定することができる。一実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜８０×１０６生細胞／ｍＬである。一実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜７０×１０６生細胞／ｍｌである。一実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜６０×１０６生細胞／ｍＬである。一実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜５０×１０６生細胞／ｍｌである。一実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜４０×１０６生細胞／ｍＬである。別の実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜３０×１０６生細胞／ｍｌである。別の実施形態では、生細胞密度は少なくとも約１０×１０６生細胞／ｍＬ〜２０×１０６生細胞／ｍｌである。別の実施形態では、生細胞密度は少なくとも約２０×１０６生細胞／ｍＬ〜３０×１０６生細胞／ｍｌである。別の実施形態では、生細胞密度は少なくとも約２０×１０６生細胞／ｍＬ〜少なくとも約２５×１０６生細胞／ｍＬまたは少なくとも約２０×１０６生細胞／ｍＬである。
【００８６】
産生フェーズの間のより低い圧縮細胞量は、より高い細胞密度の灌流培養を妨げる可能性がある、溶存酸素スパージング問題を軽減するのに役立つ。より低い圧縮細胞量はまた、より小型の培地貯蔵容器の使用を可能にするより少ない培地容積を可能にし、且つより遅い流量と組み合わせることができる。より低い圧縮細胞量はまた、より高い細胞バイオマス培養と比較して、収集及び下流の処理に対する影響が少ない。それらすべては、組換えタンパク質治療剤の製造と関係があるコストを低減する。
【００８７】
哺乳類細胞培養によって組換えタンパク質を産生するための商業的なプロセスにおいて、典型的には３つの方法（バッチ培養、流加バッチ培養及び灌流培養）が使用される。バッチ培養は細胞を固定容積の培養培地中で短期間成長させ、続いて完全に収集する、非連続的な方法である。バッチ法を使用して成長させた培養には、最大細胞密度に達するまで細胞密度の増大が起こり、続いて、培地成分が消費され、代謝副産物（乳酸及びアンモニアなど）のレベルが蓄積するにしたがって、生細胞密度の低下が起こる。収集は、典型的には、最大細胞密度（典型的には、培地配合物、細胞株などに応じて５〜１０×１０６細胞／ｍＬ）が達成されるポイントで生じる。バッチプロセスは最も単純な培養法であるが、生細胞密度が栄養素の利用能によって制限され、一旦細胞が最大密度になると、培養は減退し、産生が低下する。老廃物の蓄積及び栄養素の枯渇が急速に培養の減退をもたらすので、産生フェーズを延ばすことができない（典型的には約３〜７日）。
【００８８】
流加バッチ培養は、消費された培地成分を補充するためにボーラスまたは連続的な培地供給を提供することによって、バッチプロセスを改善する。流加バッチ培養は、実施全体を通して追加的な栄養素を受け取るので、これは、バッチ法と比較して、より高い細胞密度（培地配合物、細胞株などに応じて＞１０〜３０×１０６細胞／ｍｌ））及び産物力価の増大を達成する可能性がある。バッチプロセスと異なり、供給ストラテジー及び培地配合物を操作して、所望の細胞密度を達成するための細胞成長期間（成長フェーズ）を、停止したまたは緩徐な細胞成長期間（産生フェーズ）と区別することによって、二相性培養を作出し且つ持続することができる。したがって、流加バッチ培養は、バッチ培養と比較して、より高い産物力価を達成する可能性がある。典型的には、バッチ法は成長フェーズの間に使用され、流加バッチ法は産生フェーズの間に使用されるが、流加バッチ供給ストラテジーは、全プロセスを通して使用することができる。しかし、バッチプロセスと異なり、バイオリアクターの容積が、供給量を制限する制限因子である。さらに、バッチ法と同様に、代謝副産物の蓄積が培養の減退をもたらし、これによって、産生フェーズの持続期間が約１．５〜３週に制限される。流加バッチ培養は非連続的であり、収集は、典型的には、代謝副産物レベルまたは培養物の生存率が所定のレベルに達したときに生じる。供給が生じないバッチ培養と比較して、流加バッチ培養は、より多くの量の組換えタンパク質を産生することができる。例えば、米国特許第５，６７２，５０２号を参照されたい。
【００８９】
灌流法は、新鮮な培地を加え、同時に使用済み培地を除去することによって、バッチ及び流加バッチ法を超える潜在的な改善を提供する。典型的な大規模の商業的な細胞培養ストラテジーは、リアクター容積のほぼ３分の１〜２分の１超がバイオマスである、６０〜９０（＋）×１０６細胞／ｍＬという高細胞密度に達することを目指す。灌流培養を用いて、＞１×１０８細胞／ｍＬという極端な細胞密度が達成されており、さらに高い密度が予測される。典型的な灌流培養は、１日または２日にわたって続くバッチ培養の開始から始め、続いて、新鮮な供給培地を連続的、段階的及び／または断続的に培養に添加し、同時に使用済み培地を除去し、培養の成長及び産生フェーズ全体を通して、細胞及びタンパク質などのさらなる高分子量化合物（フィルター分子量カットオフに基づく）を保持する。様々な方法、例えば沈降、遠心分離または濾過が、細胞密度を維持しながら、使用済み培地を除去するのに使用することができる。１日あたりのわずかな作業量から１日あたりの多くの複数作業量までの灌流流量が報告されている。
【００９０】
灌流プロセスの利点は、産生培養が、バッチまたは流加バッチ培養法よりも長期間維持され得ることである。しかし、培地の調製、使用、貯蔵及び廃棄の増大が、長期灌流培養、特に高細胞密度をともなう長期灌流培養を支持するのに必要であり、これはまた、さらに多くの栄養素を必要とし、このすべてが、バッチ及び流加バッチ法と比較して産生コストをさらに高くする。さらに、より高い細胞密度は、溶存酸素レベルの維持、並びにより多くの発泡及び消泡ストラテジーの変更の必要性をもたらすと思われる、ガス処理の増大をともなう問題（より多くの酸素を補給すること、及びより多くの二酸化炭素を除去することを含める）などの問題を、産生の間に引き起こす可能性があり；並びに、過剰な細胞物質を除去するのに必要とされる努力が産物の喪失をもたらす恐れがある、収集及び下流の処理の間には、細胞量の増大が原因で、力価の増大の利点を打ち消す問題を引き起こす可能性がある。
【００９１】
成長フェーズの間の流加バッチ供給、それに続く産生フェーズの間の連続的な灌流を組み合わせる大規模細胞培養ストラテジーも提供される。この方法は、細胞培養が３５％以下の圧縮細胞量に維持される産生フェーズを標的にする。
【００９２】
一実施形態では、ボーラス供給を用いる流加バッチ培養を使用して、成長フェーズの間、細胞培養を維持する。次いで、産生フェーズの間、灌流供給を使用することができる。一実施形態では、灌流は、細胞が産生フェーズに達したときに始まる。別の実施形態では、灌流は、細胞培養の３日目または約３日目〜９日目または約９日目に始まる。別の実施形態では、灌流は、細胞培養の５日目または約５日目〜７日目または約７日目に始まる。
【００９３】
成長フェーズの間にボーラス供給を使用することにより、細胞が産生フェーズへ移行するのが可能になり、その結果、産生フェーズの開始及び制御手段としての温度シフトへの依存が低くなるが、３６℃から３１℃への温度シフトが、成長フェーズと産生フェーズの間に行われてもよい。一実施形態では、このシフトは３６℃から３３℃へである。別の実施形態では、流加バッチ培養における細胞成長停止の開始は、流加バッチ培養を細胞周期阻害剤に曝露することによって開始することができる。別の実施形態では、流加バッチ培養における細胞成長停止の開始は、細胞周期阻害剤を含む無血清の灌流培地を用いる灌流によって達成することができる。
【００９４】
本明細書に記載のように、無血清培地中の少なくとも０．５×１０６から３．０×１０６生細胞／ｍＬまでを、及びこれを越えるものを、例えば１．０×１０６生細胞／ｍＬを、バイオリアクターに接種することができる。
【００９５】
灌流培養は、細胞培養が新鮮な灌流供給培地を受け取る一方で、同時に使用済み培地を除去する培養である。灌流は、連続的、段階的、断続的またはこれらの任意のいずれかのもしくはすべての組み合わせであり得る。灌流量は、１日あたりの作業量未満から多くの作業量であり得る。細胞は培養中に保持され、除去される使用済み培地は実質的に細胞を含んでいないか、培養よりも著しく少ない細胞しか有さない。細胞培養物によって発現される組換えタンパク質も培養中に保持され得る。灌流は、遠心分離、沈降または濾過を含めたいくつかの手段によって達成することができ、例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８２：７５１−６５を参照されたい。濾過法の１例は交互接線流濾過である。交互接線流は、中空糸フィルターモジュールを通して培地をポンピングすることによって維持される。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号；Ｆｕｒｅｙ（２００２）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．２２（７），６２−６３を参照されたい。
【００９６】
「灌流流量」は、バイオリアクターを通過する（加えられるか除去される）培地の量であり、典型的には、所与の時間内のある部分の作業量または複数の作業量として表される。「作業量」は、細胞培養に使用されるバイオリアクター容積の量を指す。一実施形態では、灌流流量は１日あたり１作業量以下である。灌流供給培地は、灌流量を最小化するために、灌流栄養素濃度を最大にするように配合することができる。
【００９７】
細胞培養の産生フェーズの過程において消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含む濃縮供給培地で、細胞培養を補充することができる。濃縮供給培地は、ほぼすべての細胞培養培地配合物に基づき得る。そうした濃縮供給培地は、細胞培養培地の成分の多くを、それらの通常量の例えば、約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、３０×、５０×、１００×、２００×、４００×、６００×、８００×またはさらに約１０００×で含むことができる。濃縮供給培地は、流加バッチ培養プロセスで使用されることが多い。
【００９８】
本発明による方法は、複数フェーズ培養プロセスにおける組換えタンパク質の産生を改善するために使用することができる。多段階プロセスでは、２つ以上の別々のフェーズで細胞を培養する。例えば、細胞を、細胞成長及び生存率を最大にする環境条件下の１つまたは複数の成長フェーズに最初に培養し、次いで、タンパク質産生を最大にする条件下の産生フェーズに移す。哺乳動物細胞によってタンパク質を産生するための商業的なプロセスでは、一般に、複数の、例えば、最終的な産生培養に先行して異なる培養容器で生じる、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９または１０の成長フェーズが存在する。
【００９９】
成長及び産生フェーズは、１つまたは複数の移行フェーズが先行してもよいし、その移行フェーズによって分離されてもよい。複数フェーズプロセスでは、本発明による方法は、少なくとも、商業的な細胞培養の最終的な産生フェーズの成長及び産生フェーズ中に用いることができるが、先行する成長フェーズで用いることもできる。産生フェーズは、大規模で行うことができる。大規模プロセスは、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルの容積で行うことができる。一実施形態では、産生は、５００Ｌ、１０００Ｌ及び／または２０００Ｌのバイオリアクターで行う。
【０１００】
成長フェーズは、産生フェーズよりも高い温度で生じ得る。例えば、成長フェーズは約３５℃〜約３８℃の第１温度で生じ得、産生フェーズは約２９℃〜約３７℃、任意に約３０℃〜約３６℃または約３０℃〜約３４℃の第２温度で生じ得る。さらに、タンパク質産生の化学的誘導物質、例えば、カフェイン、ブチレート及びヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などを、温度シフトと同時に、温度シフトの前に及び／または温度シフトの後に加えることができる。誘導物質を温度シフトの後に加える場合は、温度シフトから１時間〜５日後、任意に温度シフトから１〜２日後に誘導物質を加えることができる。細胞が所望のタンパク質（複数可）を産生している間、細胞培養を数日間またはさらに数週間維持することがきる。
【０１０１】
当技術分野で既知の解析法のうちのいずれかを使用して、細胞培養由来の試料をモニターし、調べることができる。組換えタンパク質並びに培地の質及び特性を含めた様々なパラメーターを、培養持続期間にわたってモニターすることができる。試料を取得し、連続的なモニタリング、リアルタイムまたはほぼリアルタイムを含めた望ましい頻度で、断続的にモニターすることができる。
【０１０２】
典型的には、最終的な産生培養に先行する細胞培養（Ｎ−ｘ〜Ｎ−１）は、産生バイオリアクター、すなわちＮ−１培養に接種するのに使用される種細胞を生成するために使用される。種細胞密度は、産生される組換えタンパク質レベルに正の影響を与え得る。産物レベルは、播種密度が増大するとともに増大する傾向がある。力価の改善は、より高い播種密度に関係するだけなく、産生状態に置かれる細胞の代謝及び細胞周期の状態の影響を受ける可能性が高い。
【０１０３】
種細胞は、任意の培養法によって生成することができる。そうした方法の１つは、交互接線流濾過を使用する灌流培養である。Ｎ−１バイオリアクターを、交互接線流濾過を使用して実施して、産生バイオリアクターに接種するための高密度な細胞を提供することができる。Ｎ−１段階は、＞９０×１０６細胞／ｍｌの密度に細胞を成長させるのに使用することができる。Ｎ−１バイオリアクターは、ボーラス種培養物を生成するのに使用することができ、または複数の産生バイオリアクターに高種細胞密度で播種するために維持され得る回転種ストック培養物として使用することができる。産生の成長段階の持続期間は、７〜１４日に及んでもよく、産生バイオリアクターの接種前に指数関数的成長に細胞を維持するように設計することができる。灌流量、培地配合物及びタイミングは、細胞を成長させ、その産生を最適化するのに最も貢献する状態でその細胞をバイオリアクターに送るように最適化される。産生バイオリアクターに播種するために、＞１５×１０６細胞／ｍＬの種細胞密度が達成され得る。接種時のより高い種細胞密度によって、所望の産生密度に達するのに必要とされる時間を短くするか、さらには排除することができる。
【０１０４】
本発明は、組換えタンパク質のグリコシル化の存在及び／または量の調節において特定の有用性を見出す。本発明で使用される細胞株（「宿主細胞」とも称される）は、商業的または科学的に興味深いポリペプチドを発現するように遺伝子操作される。細胞株は、典型的には、時間無制限に培養中で維持され得る初代培養から生じる系統に由来する。細胞株の遺伝子操作は、組換えポリヌクレオチド分子で細胞を形質移入、形質転換もしくは形質導入すること、及び／または宿主細胞に所望の組換えポリペプチドを発現させるように、別の方法で（例えば、相同組換え及び遺伝子活性化もしくは組換え細胞と非組換え細胞の融合によって）変化させることを含む。目的のポリペプチドを発現させるように細胞及び／または細胞株を遺伝子操作するための方法及びベクターは当業者に既知であり；例えば、様々な技法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、及び四半期ごとのアップデート）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０，ｐｐ．１５−６９に例示されている。
【０１０５】
動物細胞株は、その前駆体が多細胞動物に由来する細胞に由来する。動物細胞株の１つの種類は哺乳動物細胞株である。培養における成長に適した多種多様の哺乳動物細胞株が、アメリカ培養細胞株保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）及び商業的な販売業者から入手可能である。本業界で一般に使用される細胞株の例としては、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓを含める）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株（例えば、ＮＳＯ、ＮＳ１）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞は、複雑な組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子及び抗体の産生に広く使用されている（Ｂｒａｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｌｏｏｄ  ８８：２００４−２０１２；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６３：６３５２−６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：２３１−２３９；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠乏変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）、ＤＸＢ１１及びＤＧ−４４は、効率的なＤＨＦＲ選択可能且つ増幅可能な遺伝子発現系によって、これらの細胞で高レベルの組換えタンパク質発現が可能になるので、望ましいＣＨＯ宿主細胞株である（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０），Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５：５３７−５６６）。さらに、これらの細胞は、接着培養または懸濁培養として操作するのが容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞及びその中で組換えで発現したタンパク質は、広く特徴づけられており、臨床用商業製造での使用について規制当局によって認可されている。
【０１０６】
目的のタンパク質
本発明の方法は、目的の組換えタンパク質を発現する細胞を培養するのに使用することができる。発現された組換えタンパク質は、培養培地中に分泌され得、その培地から、組換えタンパク質を回収及び／または採取することができる。さらに、このタンパク質を、商業的な販売業者から入手可能な既知のプロセス及び製品を使用して、そのような培養または成分から（例えば培養培地から）精製または部分的に精製することができる。次いで、精製されたタンパク質を「製剤化する」ことができ、これは、最終的な使用者のために、バッファー交換する、滅菌する、バルク包装する及び／または包装することを意味する。医薬組成物に適した製剤としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．１９９５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されているものが挙げられる。
【０１０７】
本発明の方法を用いて産生することができるポリペプチドの例としては、以下のタンパク質のうちの１つの全体または一部と同一であるか、実質的に類似しているアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：５５−６０）、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子に対するリガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許第５８８８１９号）、マスト細胞成長因子、幹細胞成長因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｔｅ）成長及び発生因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノーゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６８２；Ｒｕｅｇｇ  ａｎｄ  Ｐｙｔｅｌａ（１９９５），Ｇｅｎｅ  １６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（α−インターフェロン、γ−インターフェロン及びコンセンサスインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号及び第４，８９７４７１号）を含める）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、白血病抑制因子及びオンコスタチン−Ｍ。本発明の方法に従って産生することができるタンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，全巻（Ａｇｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ，ｅｄｓ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ  ａｎｄ  Ｌｅｉｇｈ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）；及びＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｓ．１  ａｎｄ  ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｔｚｅ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００３）に見出すことができる。
【０１０８】
さらに、本発明の方法は、上記のタンパク質のいずれかに対する受容体、そうした受容体もしくは上記のタンパク質のいずれかに対するアンタゴニスト、及び／またはそうした受容体もしくはアンタゴニストと実質的に類似しているタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むタンパク質を産生するのに有用であると思われる。これらの受容体及びアンタゴニストとしては、以下が挙げられる：腫瘍壊死因子受容体の両方の形態（ＴＮＦＲ、ｐ５５及びｐ７５と称される、米国特許第５，３９５，７６０号及び米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型；ＥＰ特許第０４６０８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号及び米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは阻害剤（米国特許第５，９８１，７１３号、第６，０９６，７２８号及び第５，０７５，２２２号）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（ＥＰ特許第０３６７５６６号及び米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血病抑制因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテゲリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４を含める）並びにデスドメインを含む受容体、例えばＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）。
【０１０９】
本発明を使用して産生することができる他のタンパク質としては、分化抗原（ＣＤタンパク質と称される）もしくはそのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似しているタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部を含むタンパク質が挙げられる。そうした抗原は、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）に開示されている。同様のＣＤタンパク質は、それに続くワークショップに開示されている。そうした抗原の例としては、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０及びそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドなど）が挙げられる。いくつかのＣＤ抗原は、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、このファミリーは、４１ＢＢ及びＯＸ４０も含む。これらのリガンドは、４１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドと同様に、ＴＮＦファミリーのメンバーであることが多い。
【０１１０】
酵素的に活性なタンパク質またはそのリガンドも本発明を使用しても産生することができる。例としては、以下のタンパク質もしくはそれらのリガンドのうちの１つ、またはこれらのうちの一つと実質的に類似しているタンパク質のすべてまたは一部を含むタンパク質が挙げられる：ＴＮＦ−α変換酵素を含めたジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインファミリーメンバー、様々なキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、上記の酵素のいずれかに対するリガンド並びに多数の他の酵素及びそれらのリガンド。
【０１１１】
産生することができる抗体の例としては、限定されないが、上記のタンパク質及び／または以下の抗原（これらに限定されない）を含めたタンパク質のいずれか１つまたは組み合わせを認識するものが挙げられる：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−β及びそれらの類似体（米国特許第５，２７２，０６４号及び第５，１４９，７９２号を参照されたい）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号を参照されたい）ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンγ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ（ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１及びｚＴＮＦ４としても知られる）；Ｄｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５を参照されたい）、補体Ｃ５、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌及び／または膵臓癌の患者の血清中に上昇したレベルで存在する腫瘍関連エピトープ、乳房、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺及び／もしくは腎臓の癌細胞で、並びに／または黒色腫、神経膠腫もしくは神経芽腫の細胞で発現する、癌に関連するエピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、インテグリン（α４β７を含むインテグリンを含める）、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン接着因子、血小板糖タンパク質ｇｐ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心筋ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害剤）、ＭＨＣＩ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）。
【０１１２】
本発明の方法を使用して産生することができる既知の抗体の特定例としては、限定されないが、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリゾマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｏｍａｂ）、ザルツムマブ及びザノリムマブが挙げられる。
【０１１３】
本発明は、例えば上記のタンパク質のいずれかを含む組換え融合タンパク質を産生するのに使用することもできる。例えば、上記のタンパク質のうちの一つと多量体化ドメイン、例えばロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分または実質的に同様のタンパク質とを含む組換え融合タンパク質を、本発明の方法を使用して産生することができる。例えば、ＷＯ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：８０−８３；Ｈａｋａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７：２５５−６４を参照されたい。そのような組換え融合タンパク質には、受容体の一部が抗体のＦｃ部分と融合しているタンパク質、例えばエタネルセプト（ｐ７５  ＴＮＦＲ：Ｆｃ）、アバタセプト及びベラタセプト（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）が特に含まれる。
【０１１４】
本発明は、本発明の個々の態様の一つの例示として意図された、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が制限されるものではなく、機能的に均等な方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【実施例】
【０１１５】
実施例１
非常に低レベルの高マンノースグリカンを示す、抗体（ＭＡｂ  Ａ）産生組換えＣＨＯ細胞株における高マンノースグリカンに対するモネンシンの影響を６日のバッチアッセイで評価した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３ｍｌの最終量で、２４ディープウェルプレート中のバッチ産生培地に２×１０６細胞／ｍｌで接種した。モネンシンの原液（１０００×；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａ）をメタノール中に調製し、アッセイ中に、様々な濃度で、様々な時点で培養に加え（１日目に０．１ｎＭ〜５０ｎＭ及び３日目に１００〜５００ｎＭ）；溶媒対照としてメタノールを加えた。
【０１１６】
細胞培養パラメーターを６日目に解析し、対応する使用済み培地の上清を抗体力価及びグリカン解析について調べて、細胞成長、生存率、組換え抗体の力価及びグリカンプロファイルに対するモネンシンの影響を評価した。細胞密度及び生存率を、ＶｉａＣｏｕｎｔアプリケーションを用いるＧｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって測定した。培養物をスピンダウンし、０．４ミクロンのフィルターで上清を濾過し、力価及びグリカン分布について解析した。
【０１１７】
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０の緩衝液で平衡化したＰＯＲＯＳ  Ａ／２０プロテインＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、濾過した細胞培養上清をロードすることによって、抗体力価を測定した。抗体の溶出は、２２０ｍＭ酢酸、１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．６の緩衝液を用いて、４．０ｍｌ／分の移動相の流速で実施した。溶出された抗体を２８０ｎｍの波長で検出した。参照抗体標準を用いる検量線に基づいて、抗体濃度を決定した。高分子量の測定については、ＡＴＯＬＬカラム（ＡＴＯＬＬ−Ｂｉｏ  Ｉｎｃ  ＵＳＡ，Ｌａｗｒａｎｃｅ，Ｋａｎｓａｓ）によって、使用済み培地の上清から抗体を精製し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して解析した。
【０１１８】
グリカン解析については、プロテインＡ精製された抗体からのペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧＡｓｅ  Ｆ）遊離Ｎ結合型グリカンを２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）で標識し、蛍光検出器とインライン接続されたＨＩＬＩＣ（親水性相互作用液体クロマトグラフィー）で分離した。分離は、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して実施した。ポジティブモードでイオントラップ質量分析計（ＬＴＱ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用するインライン質量分析（ＭＳ）を組み込んで、化学種の質量決定に適応させた。グリカンを注入し、高有機条件のカラムに結合させ、次いで、ギ酸アンモニウム緩衝水液の増加勾配を用いて溶出した。１．７μＭの小粒子カラムフォーマット（Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｇｌｙｃａｎ  Ｃｏｌｕｍｎ、２．１×１００ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、高速の分離時間を達成した。
【０１１９】
表１で示すように、モネンシンは、組換え抗体における高マンノースグリカンの用量依存的増大を引き起こした。Ｍａｎ５が、モネンシン処理の際にアップレギュレートされる主な高マンノース種であったが、より高い順序のマンノース構造体においても、わずかな増大があった。０．１〜１０ｎＭの間のモネンシン濃度では、高マンノースまたは細胞培養パラメーターに対して影響がなかった。高濃度（５０ｎＭ（６日間インキュベートした）及び５００ｎＭ（３日間インキュベートした））では、モネンシンは、細胞成長、生存率及び力価を犠牲にして、高マンノースのより大きな増大を引き起こした。しかし、０日目に２５ｎＭのボーラスとして、または３日目に２００ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのボーラスとして投与した場合、モネンシンは、細胞培養パラメーターに対する負の影響なしで、組換え抗体における全高マンノースグリカンを６〜３０倍の範囲に増大した。溶媒対照として使用したメタノールは、高マンノースグリカンを増大しなかった。
【０１２０】
【表１】
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【０１２１】
収集した試料の生細胞密度（ＶＣＤ）、生存率及び力価測定によって、細胞培養能力を評価した。各バーは、２連の細胞培養試料に対する平均結果を表す。各値は２連の平均である。
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
まとめると、これらの結果によって、モネンシンが、産物の収量に対して負の影響なしで、組換えの治療用抗体において高マンノースグリカンを増大させる可能性があることが示された。
【０１２４】
実施例２
様々な抗体産生細胞株に対するモネンシンの影響を、偽灌流設定において調べた。偽灌流アッセイは、毎日の培地交換を介してバイオリアクターの灌流条件を模倣するように設計されている、小規模なプレートベースのアッセイである。１０日間の偽灌流アッセイのために、様々な産生細胞株の継代培養物を、ウェルあたり３ｍｌの最終量で、２４ディープウェルプレート中の化学的に規定された基本灌流培地に１：５に希釈した。３日目に偽灌流を開始し、この時に、１０００ｒｐｍで５分間細胞をスピンダウンし、各使用済み培養培地の２５％を同等量の新鮮な灌流培地と交換した。その後の培地交換のパーセンテージは、４〜８日に４０％、９日目に５０％とした。解析する前に、交換した上清を４℃で保管した。
【０１２５】
細胞培養パラメーターの解析も３日目に開始し；先に記載したようにＶｉａＣｏｕｎｔ  Ｇｕａｖａアッセイを使用して、生細胞密度及び生存率を解析した。グルコースは、３日目に開始して毎日測定し、１２ｇ／ｌに維持した。保管した上清を、先に記載されているように抗体力価について解析した。６、８及び１０日目からの上清液の試料は、ＨＩＬＩＣ解析によって、グリカンの存在及び種類についても解析した。
【０１２６】
使用した細胞株は、低高マンノースグリカン（ＭＡｂ  Ａ、ＭＡｂ  Ｂ及びＭＡｂ  Ｃ）を有するｍＡｂを産生することが知られている３つの産生細胞株及び高レベルの高マンノースグリカン（ＭＡｂ  Ｄ）を有する産物を一貫して産生する１つの産生細胞株を含んでいた。モネンシンを２５ｎＭの終濃度で３日目に加え、それ以降１セットの２連試料を、２５ｎＭのモネンシンを含む灌流培地で部分的に毎日培地交換をした（以下の表３において「一定モネンシン」と称される；２４−ウェルプレートの列３及び４）。別のセットの２連試料に、漸増用量のモネンシンを有する灌流培地を与えた（以下の表３において「漸増モネンシン」と称される；２４−ウェルプレートの列５及び６）。対照培養に同等量のメタノールを毎日加えた（２４−ウェルプレートの列１及び２）。このスキームを以下に示す：
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
１０日目に、細胞ペレットを冷却ＰＢＳで１回洗浄し、氷上で１０分間、４％パラホルムアルデヒド中に固定した。次いで、冷却ＰＢＳ中で細胞を再び１回洗浄し、以下に記載のように免疫蛍光染色するまで４℃で保管した。
【０１２９】
表３で示すように、６日間のバッチアッセイで得られた結果と同様に、モネンシンは、試験した４つすべての抗体産物について高マンノースグリカンを用量依存的様式で増大したが、アップレギュレーションの規模は、細胞株依存的であった。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
対照試料と比較して、産生アッセイの１０日目に採取した抗体における高マンノースレベルは、モネンシン用量に応じて１．５〜１５倍の範囲の増大を示した。高マンノースグリカンレベルは、２５ｎＭのモネンシンを含む灌流培地との３日目に開始の毎日の部分的な培地交換にかけた培養において経時的に低下したが、すべての時点で対照培養より高かった（表３、「一定モネンシン」と指定された行に示される値）。これは、時間とともに細胞数が増大し、それにより、後期の時点での細胞あたりのモネンシン用量が低減するためと考えられる。
【０１３２】
細胞株の一つについて、産生アッセイ実施の過程にわたって、灌流培地のモネンシン用量を５０ｎＭにランプアップし；残りの細胞株について、灌流培地のモネンシン用量を１００ｎＭにランプアップ（漸増）した。モネンシン濃度を漸増した結果として、これらの細胞株によって産生される抗体における高マンノースレベルは、初期から後期の時点まで一定に保たれた（表３、「漸増モネンシン」と指定された行に示される値）。ＭＡｂ  Ａを発現する細胞株（実施例１で調べたもの）については、以前に細胞培養パラメーターについて悪影響が観察されたので、灌流培地のモネンシン濃度を５０ｎＭを越えて増大させなかった。したがって、及び２５ｎＭ添加条件で観察されたものと同様に、その細胞株で産生される抗体における高マンノースレベルは時間とともに低下した。
【０１３３】
１０日目に採取した精製された抗体試料について、全高マンノース値（全ＨＭの列）及びＭａｎ５からＭａｎ９までの高マンノース種への対応する分布を決定した。表４に示す各値は、２連の平均を表す。
【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
大抵の場合、モネンシンは、高マンノース種のレベルをその相対的分布を変えないで上昇させる（すなわち、モネンシン添加の前に、Ｍａｎ５が主な高マンノース形態であった場合、典型的には、モネンシン投与の後、その優勢な形態にとどまった）。
【０１３６】
この影響に対する唯一の例外は、ＭＡｂ  Ｄを産生する１つの細胞株で見られた。漸増用量のモネンシンは、この細胞株によって産生されるｍＡｂにおいて、Ｍａｎ７及びＭａｎ８（ｂ）高マンノースグリカンを主にアップレギュレートした。この細胞株は、（これらの実験及び過去において）、対照培養条件下でさえも、高レベルの高マンノースグリカンを有するｍＡｂを一貫して産生した。他の試験した細胞株と比較して、この細胞株における、モネンシン存在下での高マンノース種のアップレギュレーションの違いは、これらの細胞における高マンノースプロセシング機構の根本的相違を反映する可能性がある。
【０１３７】
実施例３
モネンシンは、腫大及び断片化したシスターネを特徴とする、ゴルジ構造の全体的な変化を引き起こすことが知られている。ＭＡｂ  Ａを産生する組換え細胞の継代培養物を用いて、様々なゴルジタンパク質に対する５つの異なる市販の抗体のパネルを使用して、モネンシン処理後のＣＨＯ産生細胞株のゴルジ構造体を免疫蛍光顕微鏡観察によって解析した。ゴルジマトリックスタンパク質であるＧＭ１３０に対する抗体のみが、ゴルジ特異的な染色パターンを示した。
【０１３８】
次に、ＭＡｂ  Ａ産生細胞及びＭＡｂ  Ｃ産生細胞の、１０日目の対照及びモネンシン処理偽灌流培養を、ＧＭ１３０抗体を使用して免疫蛍光顕微鏡観察にかけた。パラホルムアルデヒドで固定した細胞ペレットを、ＰＢＳで作製した０．１％トリトンＸ−１００で透過処理した。ペレットをＰＢＳＡ（０．５％ＢＳＡを入れたＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳＡ中に１：５０に希釈したＧＭ１３０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともにインキュベートした。細胞をＰＢＳＡで３回洗浄し、ＰＢＳＡ中に１：１０００に希釈した、Ａｌｅｘａ４８８がコンジュゲートされたマウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）でインキュベートした。ＤＲＡＱ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、核ＤＮＡを可視化した。６３×水浸レンズを有するＺｅｉｓｓ５１０顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して画像を取得し、ＬＳＭ画像ブラウザーソフトウェアを使用して画像を解析した。
【０１３９】
対照とモネンシン処理したＭＡｂ  Ａ産生細胞の間に形態的な違いは観察されなかった。しかし、７〜１０日目の灌流培地において１００ｎＭの最終モネンシン濃度で最高に達する、連続的に増大させた量のモネンシンを含む灌流培地で処理したＭＡｂ  Ｃ産生細胞は、おそらくゴルジストレスを示す、ＧＭ１３０タンパク質の点状の分布を示した。ＧＭ１３０の染色パターンのこの種の変化は、以前に、ＨｅＬａ細胞において、亜ヒ酸塩またはヒートショック誘導性細胞ストレスと関連付けられている（Ｋｏｌｏｂｏｖａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，２００９；３１５（３）５４２−５５）。
【０１４０】
様々な細胞培養パラメーターに対する一定モネンシンレベルまたは漸増モネンシンレベルの影響も調べた。生細胞密度（ＶＣＤ）及び生存率を、３日目に開始して毎日測定した。使用済み培地試料を３〜１０日目に採取し、力価解析にかけた。生細胞密度を使用して累積生細胞密度を計算し、これを累積力価値とともに使用して、特異的生産性（ｑＰ）を計算した。示したどの値も２連の平均である。表５で示すように、ゴルジ形態の明らかな喪失をよそに、これらの細胞において、力価の低下または細胞培養のいかなる他の負の影響もなかった。
【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
偽灌流条件下での細胞培養パラメーターに対するモネンシンの影響は細胞株特異的であり、ＭＡｂ  Ａ細胞が全細胞量蓄積の低下を示し、続いて、ＭＡｂ  Ｄ細胞に対して、それほどはっきりしていないが同様の負の成長の影響を示した。モネンシンは、ＭＡｂ  Ｂ細胞の成長または生存率に影響がなく、ＭＡｂ  Ｃ細胞の累積生細胞密度をわずかに増大し、生存率を改善した。
【０１４３】
モネンシンは、論議されている産生細胞株に応じて、細胞成長及び生存率に対して異なる影響を有する。モネンシンは、ある特定のリンパ腫及び腎臓癌の細胞株において、Ｇ１／ＳまたはＧ２／Ｍ細胞周期の遮断を引き起こし、アポトーシスを誘導することが報告されている。ＣＤＫ２、ＣＤ６、サイクリンＡ及びサイクリンＢ１のようないくつかの細胞周期関連タンパク質のレベルを低下させること、及び細胞周期阻害剤のｐ２１及びｐ２７のレベルを増大させることが示された（Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００３，２２（４）：８５５−６０；Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００３，２３（１）：１９７−２０４；Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００２，１１９（２）：ｐ．４００−７）。これらの細胞周期タンパク質に対するモネンシンの影響は、ｍＡｂ  Ａ及びＭＡｂ  Ｄ細胞の成長及び生存率に対するモネンシンの負の影響を説明することができる。
【０１４４】
一方で、低用量のモネンシンは、細胞内のＮａ＋レベルを増大させることによって細胞培養パラメーターを改善することが報告されており、これは、モネンシン存在下におけるＭＡｂ  Ｃ細胞の改善した細胞培養能力を説明することができる（Ｔｅｎａｇｌｉａ，Ａ．Ｎ．，Ｃ．Ｇ．Ｆｒｙ，ａｎｄ  Ｇ．Ｖａｎ  Ｚａｎｔ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９８５．１３（６）：５１２−５１９）。なぜ異なる産生細胞株がモネンシンに異なって応答するかは分かっておらず、クローン細胞系が由来する細胞の異種性によって部分的に説明することが可能であろう。
【０１４５】
力価及び特異的生産性に対するモネンシンの影響も細胞株特異的であった（図３）。モネンシン存在下において、ＭＡｂ  Ａ細胞は、力価が低下したが、特異的生産性が増大したことを示し、一方ＭＡｂ  Ｃ細胞は、力価が増大したが、特異的生産性がわずかに低下したことを示した。モネンシンは、ＭＡｂ  Ｂ細胞の力価にも特異的生産性にも影響がなく、ＭＡｂ  Ｄ細胞の力価をわずかに低下させたが、特異的生産性に対して影響がなかった。力価及び特異的生産性に対するこの影響は、モネンシンが細胞成長及び生存率に対して有する影響をおそらく反映する。しかし、一般に、モネンシンの使用は、力価または特異的生産性に対する著しい影響なしに、高マンノースグリカンのより大きな増大を促進し、事実上、産生される抗体の高分子量プロファイルの変化はない。
【０１４６】
実施例４
大規模な制御された産生設定で高マンノースレベルをモジュレートするためにモネンシンを使用することの適用性を、交互接線流（ＡＴＦ）バイオリアクターにおいて、ＭＡｂ  Ｅを産生する組換え細胞株を使用して調べた。シードトレイン（ｓｅｅｄ  ｔｒａｉｎ）用に成長培地中で成長するＭＡｂ  Ｅ細胞を使用して、成長培地中の６×１０５細胞／ｍｌでＮ−１バイオリアクターに接種した。次いで、Ｎ−１バイオリアクターからの細胞を使用して、基本灌流培地中の７．５×１０５細胞／ｍｌで３つの２Ｌ産生バイオリアクター（Ｎ）に接種した（対照、Ｒａ及びＲｂバイオリアクターと称される）。
【０１４７】
産生バイオリアクターを、ｐＨ７．００、３６℃、３０％ＤＯ及び４００ｒｐｍの撹拌で、２０日間成長させた。これらの産生タンクを、ＡＴＦシステムを用いて運転し、０．５容積／日の灌流量で３日目に開始して、これを、０．６容積／日、０．８３５２容積／日及び１容積／日へ、それぞれ６、７及び８目日目に増大した。グルコースなしで灌流培地を調製したので、グルコースレベルは、５ｇ／Ｌに別途維持した。
【０１４８】
モネンシン（２５μＭの原液）を単回ボーラス投与として加えて、２つのタンク（Ｒａ及びＲｂ）において５００ｎＭの終濃度を８日目に達成し；第３のタンクは対照タンクとして扱った。その後、灌流培地量の１／５０の割合でおおよそ２２時間にわたってモネンシンを連続的に供給して、タンク中の５００ｎＭ濃度を維持した。１Ｍ炭酸ナトリウムを使用して、所望の設定値でｐＨを維持する間、必要に応じて消泡剤もタンクに加えた。毎日のタンク試料を採取して、様々な細胞培養パラメーターを測定し、力価及び高マンノースを解析した。
【０１４９】
ＡＴＦバイオリアクターから採取した６０マイクログラムの毎日のＭＡｂ  Ｅ試料を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．６中で６０ユニットのＩｄｅＳ酵素（ｆａｂＲＩＣＡＴＯＲ，Ｇｅｎｏｖｉｓ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、３７℃のウォーターバス中で３０分間インキュベートして、Ｆｃ／２及びＦａｂ’２に消化した。次いで、消化した試料を、５０ｍＭ  ＤＴＴを含む４Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３中で還元し、続いて、５５℃のヒートブロック中で１０分間インキュベートして、Ｆｃ／２、ＬＣ及びＦｄに還元した。
【０１５０】
消化及び還元に続いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＭＳによって試料を直ちに解析した。解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＳＴ飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して実施した。消化及び還元した試料を、８０℃で維持した逆相Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨフェニルカラム（１．７ミクロンの粒径、２．１×１５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で分離した。分離用に用いる移動相は、０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）及びアセトニトリル、０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）とした。
【０１５１】
５マイクログラムの各試料を注入し、以下の勾配を用いて、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した：３０％のＢを２．５分間保ち、続いて、３０％〜４５％のＢの勾配を５分の持続時間にわたって保ち、続いて４５％〜１００％のＢの勾配を０．５分にわたって保ち；Ｂを１００％で４分間保ち、続いて、１００％〜３０％のＢの勾配を０．１分にわたって保ち、次いで、３０％のＢを残りの２．９分間保った。ＵＶ溶出も２２０ｎｍの波長でモニターした。質量データをＦＣ／２ピークのＴＩＣから抽出し、続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒデコンボリューションソフトウェアを使用して、抽出したスペクトルのデコンボリューションを行った。デコンヴォルーションしたピークのイオン強度を使用して、グリカン種を定量した。
【０１５２】
図１〜４及び図７で示すように、モネンシンの添加は、細胞成長及び生存率に対してわずかな負の影響があったが、これらの影響は、培養の生産性に対していかなる負の影響も引き起こすほど重大ではなかった。実際に、モネンシン処理したタンクは、対照タンクと比較して、ほんのわずかに改善した力価を示した。重要なことに、モネンシンの添加は、組換え抗体において高マンノースグリカンレベルの９〜１０倍の増大をもたらした（図５〜９）。早期の時点（９日目及び１０日目）で他の高い順序のマンノース種もアップレギュレートされたが、主要な増大はＭａｎ５種で見られた。１１日目以降では、Ｍａｎ５が、タンクに存在する、ほとんど独占的な高マンノース種であり、無視できるほどの量の他の高マンノース種が検出された。
【０１５３】
予測高マンノースレベルと測定高マンノースレベルの比較は、高マンノース含有抗体の発現が１０日目にピークに達し、ピークでは、８９％の産生された抗体が高マンノースグリカンを含んでいたことを示す（図９）。一旦タンク中でモネンシン量がごくわずかになると（灌流培地の流量計算に基づくと、１１日目以降）、高マンノースグリカンを有する抗体のパーセンテージの低下の割合は、力価が増大している割合に比例していた（図１０）。換言すれば、高レベルの高マンノース抗体は、低レベルの高マンノースを含む新しく産生された抗体で希釈された。
【０１５４】
全体的に見て、高マンノースレベルの増大は、流量基準で計算された、タンク中のモネンシンの濃度とかなり相関しており、最大の増大はモネンシン濃度が最も高い９日目及び１０日目に見られ、１１日目以降漸減した（図９〜１２）。連続的な培地灌流プロセスを介してタンクからモネンシンを完全に流し出した後、高マンノースレベルは、初期スパイクの３５〜５０％から収集日の１５〜１７％に至るまで低下した（図１３及び１４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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