(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを製造する方法であって、以下の工程：
（１）オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類を培養して細胞内にトリグリセリドを蓄積させる工程；
（２）培養したオーランチオキトリウム属藻類からトリグリセリド成分を抽出する工程；
（３）抽出したトリグリセリド成分を成分分離して、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド、及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを取得する工程；
を含み、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドが、３つの脂肪酸基の１つ以上が奇数脂肪酸であり、不飽和脂肪酸を含有しない、当該製造方法。
【請求項２】
製造された奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドがペンタデカン酸を含有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
製造された高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドが、３つの脂肪酸基の１つ以上がドコサヘキサエン酸又はドコサペンタエン酸である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記成分分離が、前記抽出したトリグリセリド成分を晶析によって沈降物を形成させることを含み、沈降物部分が奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
オーランチオキトリウム属藻類由来であり、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドであって、３つの脂肪酸基の１つ以上が奇数脂肪酸であり、不飽和脂肪酸を含有しない、トリグリセリド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類を利用して、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを含有するトリグリセリド混合物を製造する方法、当該方法により製造されたトリグリセリド混合物、当該混合物を成分分離してトリグリセリド画分を取得する方法、及び当該方法により製造されたトリグリセリド画分に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類や鳥類の体内の脂肪酸は、炭素数が偶数であるものがほとんどであるが、炭素数が奇数の脂肪酸も僅かに存在する。このような奇数脂肪酸は、発見当初は異常な脂肪酸として毒性があるのではないかと思われていた。１９７５年の奇数脂肪酸に関する総説では、奇数脂肪酸は偶数脂肪酸と同様にβ‐酸化によりエネルギー源となるもので毒性は無い旨、ヒトおよび家畜と家禽の体脂肪、筋肉、臓器、乳および卵に０．１〜数％程度の奇数脂肪酸が含まれており、臓器により組成が異なる旨、奇数脂肪酸は体外から取り込まれたものだけでなく、体内で生合成され得る旨が記載されている（非特許文献１）。更に１９９３年になって、Ａｄａｃｈｉ  らは、ペンタデカノイルモノグリセリドが毛母細胞のＡＴＰレベルを上昇させ、細胞を活性化させることを報告し（非特許文献２）、この知見に基づき育毛剤が開発され、製品化された。
【０００３】
脂肪酸は体内で酸化され、炭素数２個（Ｃ２）のアセチル−ＣｏＡとなってクエン酸サイクル（ＴＣＡサイクル）に入り、補酵素ＮＡＤ  （ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）をＮＡＤＨ２やＦＡＤＨ２に還元し、電子伝達系によりＡＴＰを産生する。ここで、炭素数が偶数の脂肪酸は、全ての炭素鎖がＣ２のアセチル−ＣｏＡに分解されてＴＣＡサイクルに利用されるが、奇数脂肪酸の場合は、分解の最後にＣ３のプロピオニル−ＣｏＡが残る。
【０００４】
プロピオニル−ＣｏＡは、Ｃ４のメチル−マロニル−ＣｏＡに変換され、ビタミンＢ１２を補酵素とする酵素メチルマロニル−ＣｏＡムターゼによって、ＴＣＡサイクルの一員であるスクシニル−ＣｏＡに変換される。ＴＣＡサイクルに導入されたスクシニル−ＣｏＡは、酵素スクシニルＣｏＡ  シンセターゼによってコハク酸になる。この反応で、シグナル伝達物質であるＧＴＰ（グアノシン三リン酸）が生産される。ＴＣＡサイクルにおいて、ＧＴＰが生産されるのはこの反応だけである。なお、ＴＣＡサイクルにおいてＡＴＰは生産されない。
【０００５】
ＧＴＰはＧ−タンパク質と呼ばれる膜タンパク質に結合してシグナルを伝達する。ＧＴＰが結合した活性型Ｇタンパク質は、細胞の様々な生理機能を活性化させる重要な役割を担っている。したがって、奇数脂肪酸は、Ｃ２のアセチル−ＣｏＡから出発するＡＴＰ生産に加えて、Ｃ３のプロピオニル−ＣｏＡから出発する細胞の生理機能活性化にも関与することが示唆される。
【０００６】
ＴＣＡサイクルを構成する分子は他の様々な代謝経路にも関与するものであるため、構成分子のいずれかが不足してＴＣＡサイクルが充分に機能しなくなくなる場合がある。そのような場合、奇数脂肪酸が上記のように分解されて生成されたスクシニル−ＣｏＡがＴＣＡサイクルに補充される（この現象を補充反応（ａｎａｐｌｅｒｏｓｉｓ）と呼ぶ）。また、逆にＴＣＡサイクルの分子が過剰に存在する場合は、いずれかの構成分子を抜き取る反応（ｃａｔａｐｌｅｒｏｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）が生じ、ＴＣＡサイクルが正常に保たれる。奇数脂肪酸は、プロピオニル−ＣｏＡを経由してスクシニル−ＣｏＡを補充することにより、ＴＣＡサイクルを正常に維持する機能を担ってもいるのである（非特許文献３及び４）。
【０００７】
ＴＣＡサイクルが正常に機能し、スクシニル−ＣｏＡの補充が必要でない場合、プロピオニル−ＣｏＡから生成するメチルマロニル−ＣｏＡはスクシニル−ＣｏＡに変換されず、ロイシン、バリン、イソロイシンといったメチル側鎖を有するアミノ酸（ＢＣＡ）の生成に用いられる。これらのＢＣＡは筋肉を構成するアミノ酸であると同時に、激しい運動などでＴＣＡサイクルの分子が不足した場合にスクシニル−ＣｏＡ  を補充する分子でもある（非特許文献５）。激しい運動で血中のＢＣＡが急激に減少するのも、上記の補充反応によりＢＣＡがスクシニル−ＣｏＡの補充に消費されるためであると考えられる。また、運動後に起こる筋肉痛は筋繊維の断裂によるものであるが、ＢＣＡの補充により筋肉痛が緩和されるという研究もある。運動時の血中ＢＣＡ濃度の減少は年齢が高くなるほど大きくなるが、これはＴＣＡサイクルの機能が低下しているためと考えられる。従って、奇数脂肪酸を摂取してＴＣＡサイクルの機能を維持することにより、運動時や運動後の筋肉の損傷により起こる筋肉痛を軽減出来ることが示唆される（非特許文献６〜８）。
【０００８】
以上のように、奇数脂肪酸は細胞の生理機能の改善や健康増進に有益な効果を有することが期待されているため、今後の産業上の需要が増大することが予想される。
【０００９】
奇数脂肪酸は、これまで商業的価値が充分に認識されていなかったため、確立された合成プロセスはこれまで開発されていない。また、上述のように、炭素数が奇数の脂肪酸は動物性脂肪中に僅かしか存在しないため、動物性脂肪からこれを抽出するのは甚だ非効率である。
【００１０】
従って、医薬又は機能性食品としての優秀な潜在的価値が見込まれる奇数脂肪酸を高品質かつ良好な効率で生産する技術を確立することは、将来の奇数脂肪酸の需要増大に備える上で重要である。
【００１１】
一方、高度不飽和脂肪酸、特にＤＨＡ、ＥＰＡに代表されるω‐３高度不飽和脂肪酸は多くの生理活性が報告されており、これらを有効成分として含有する市販製品も数多く存在する。しかしながら、ＤＨＡやＥＰＡは主に魚油から分離されるため、臭気物質とエチルエステル化しており、分子蒸留による濃縮精製を経ても魚臭を完全に除去することが出来ない。そのため、魚油由来のＤＨＡやＥＰＡ製品は、若干残る魚臭が購買者に不快感を与えているとの評価がある。特に欧米圏の購買者に対しては、そのような臭気は重大な忌避の要因となっている。
【００１２】
従って、従来の魚油からの分離に代替する、ＤＨＡやＥＰＡ等のω‐３高度不飽和脂肪酸生産技術を開発することは、それらに対する購買者の忌避を解消し、商業的価値を更に高めることとなるため、極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】：特許第２７６４５７２号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】：生雲  晴久、吉田  実. 家畜・家禽における奇数脂肪酸の分布とその代謝. 日本家禽学会誌  12,(4) 155-166 (1975)
【非特許文献２】：Adachi K, Yokoyama D, Tamai H, Sadai M, and Oba K (1993) Effect of glyceride of pentadecanoic acid on energy  metabolism in hair follicles.  International Journal of Cosmetic Science 15 (3): 125-131.
【非特許文献３】：Kasumov T et al. (2007) Mass isotopomer study of anaplerosis from propionate in the perfused rat heart. Arch Biochem Biophys. 463 (1): 110-117
【非特許文献４】：Owen O, Kalhan S, Hanson R (2002) The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.J.   Biol. Chem. 277 (34):  30409-30412
【非特許文献５】：下村吉治、北浦靖之（2014) 化学と生物  52、No 3. 143-144.
【非特許文献６】：Shimomura  Y. Kobayashi H. Mawatari K, Akita K, Inaguma A, Watanabe S, Bajjoto G, Sato J. (2009）  Effects of squat exercise and branched-chain amino acid supplementation on plasma free amino acid concentrations in young women. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 55, 288-291.
【非特許文献７】：Katsanos C S, Kobayashi H, Sheffield- Moore M, Aarsland A, Wolfe R R (2006) A high proportion of leucine is required for optimal stimulation of the rate of muscle protein synthesis by essential amino  acids in the  elderly. Am J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291, E381-E387.
【非特許文献８】：Minetti GC, Feige GN, et al (2011) Gai2 signaling promotes skeletal muscle hypertrophy, myoblast differentiation, and muscle regeneration. Science Signaling 4 ,ra80
【非特許文献９】：G. Chen. et al. New Biotechnology 27, 382-289 (2010)
【非特許文献１０】：Q. Li et al., J. Agric. Food Chem. 57(10), 4267-4272 (2009)
【非特許文献１１】：K. W. Fan et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 26, 1303-1309 (2010)
【非特許文献１２】：BioScience, Biotechnology, and Biochemistry 75, 2246-2248
【非特許文献１３】：Metz JG, Roessler P, Facciotti D, Levering C, Dittrich F, Lassner M, Valentine R, Lardizabal K, Dommergue F, Yamada A, Yazawa K, Knauf V, Browse J.(2001) Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes. Science 293, 290-293.
【非特許文献１４】：Hayashi M, Yukino T, Watanabe F, Miyamoto E, Nakano Y. (2007) Effrct of vitamin B12-enriched thraustchytrides on the population growth of rotifers. Biosci. Biotechnol. Biochem.71, 222-225.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の状況に鑑み、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを、高効率で生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
近年、微生物の炭素同化を利用した、炭化水素やトリグリセリド等の有用物質の生産技術の開発が盛んに行われている。所望の有用物質を生産する微生物を培養し、その生産物として様々な物質を取得することが出来る当該技術は、生産効率が極めて高く、生産規模を工業レベルに拡大することが比較的容易であることから、工業的利用が有望視されている。
【００１７】
物質生産に利用される微生物の例として、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する藻類が挙げられる。ラビリンチュラ類藻類は様々な炭化水素や油脂を生産するものが報告されており、微生物を利用した物質生産技術の有望な材料として注目されている。例えば物質生産性ラビリンチュラ類藻類として、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）等の高度不飽和脂肪酸を多量に蓄積する性質を有するもの（ＳＲ２１株、特許文献１）や、スクワレンを生産するものが知られている。（非特許文献９〜１１）。
【００１８】
ラビリンチュラ類藻類の中でも、特にオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類は、水中の栄養分を同化して脂質を生産し、細胞内に大量に蓄積する特徴を有する。彼谷らは、スクワレンを生産するオーランチオキトリウム属藻類ｔｓｕｋｕｂａ−３株を同定し、その生産効率が、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）等の従来から産業利用が研究されている炭化水素生産藻類よりも格段に優れていることを見出した（非特許文献１２）。
【００１９】
オーランチキトリウム属藻類は、２つの脂肪酸合成経路を有することが知られている（非特許文献１３）。一方は、飽和脂肪酸を合成する脂肪酸シンターゼ経路であり、他方は、デサチュラーゼの作用を受けずに高度不飽和脂肪酸を合成するポリケチドシンターゼ経路である。これらの両経路を利用して、オーランチキトリウム属藻類は、パルミチン酸（Ｃ１６）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を合成することが出来る（非特許文献１４）。
【００２０】
本発明者らは、オーランチキトリウム属藻類が上記２つの脂肪酸合成経路を用いて、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドをそれぞれ独立に細胞内に大量に蓄積することが出来るという驚異的な知見に基づき、斯かる藻類を大量に培養して脂肪酸を抽出することにより、奇数脂肪酸及び高度不飽和脂肪酸を高効率で生産することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
従って、本願は、以下の発明を提供する。
１．奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを含有するトリグリセリド混合物を製造する方法であって、以下の工程：
（１）オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類を培養して細胞内にトリグリセリドを蓄積させる工程；
（２）培養したオーランチオキトリウム属藻類からトリグリセリド成分を抽出する工程；
（３）抽出したトリグリセリドを精製する工程；
を含む、当該製造方法。
２．製造されたトリグリセリド混合物が、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドとしてペンタデカン酸を含有する、項目１に記載の製造方法。
３．製造されたトリグリセリド混合物が、高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドとしてドコサヘキサエン酸又はドコサペンタエン酸を含有する、項目１又は２のいずれか１項に記載の製造方法。
４．製造されたトリグリセリド混合物中、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドが、高度不飽和脂肪酸を含有せず、かつ、高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドが、奇数脂肪酸を含有しない、項目１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
５．皮膚若しくは皮膚付属器の健康の改善、アレルギー症状の軽減、筋肉痛の軽減、運動機能の向上、組織損傷の治癒、造血作用の改善に用いられる、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造されたトリグリセリド混合物。
６．項目１〜４のいずれか１項に記載の方法により製造されたトリグリセリド混合物を成分分離することにより、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド画分及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド画分を製造する方法。
７．項目６に記載の方法により製造された、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド画分。
８．項目６に記載の方法により製造された、高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド画分。
【発明の効果】
【００２２】
奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを細胞内に大量に蓄積するオーランチオキトリウム属藻類を培養し、蓄積したトリグリセリド混合物を抽出することにより、希少な奇数脂肪酸トリグリセリド及び商業的価値の高い高度不飽和脂肪酸トリグリセリドをそれぞれ独立に高効率で取得することが出来る。斯かる微生物の炭素同化を利用した有用物質の生産技術は、生産効率が極めて高く、生産規模を工業レベルに拡大することが比較的容易であることから、採算性の高い生産プロセスを構成することが出来る。
【００２３】
また、オーランチキトリウム属藻類は、上記のように、奇数脂肪酸トリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸トリグリセリドを別個の経路を用いて合成するため、両トリグリセリドを分離精製することが出来るという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、偶数脂肪酸と奇数脂肪酸のＴＣＡサイクルで代謝されるプロセスの比較を示す。偶数脂肪酸は、全ての炭素鎖がＣ２のアセチル−ＣｏＡに分解されてＴＣＡサイクルに利用されるが、奇数脂肪酸の場合は、分解の最後にＣ３のプロピオニル−ＣｏＡが生成される。
【図２】図２は、本発明の方法により生産されるトリグリセリド混合物中の主要な有効成分である、奇数脂肪酸のペンタデカン酸、並びにω―３高度不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸及びドコサペンタエン酸の構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．藻類
本発明の方法において、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類が用いられる。オーランチオキトリウム属は、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する従属栄養性のヤブレツボカビ目藻類であり、２００７年に本多らによってシゾキトリウムから分離・独立した新属である。当該藻類は、細胞内に多量の脂質を大量に蓄積することを特徴としている。ラビリンチュラ類は、卵菌類に属する原生生物であるが、系統的には褐藻類や珪藻類等の不等毛植物と近縁であり、不等毛植物とともにストラメノパイル系統を構成する。ラビリンチュラ類藻類は、ω-３高度不飽和脂肪酸を多く含有することが知られていた。
【００２６】
本発明の方法に用いるオーランチオキトリウム属藻類として、所望のトリグリセリドを生産する能力の優れた株を用いるのが好ましい。そのような藻類株は、天然に採取及び分離されたものであっても、突然変異誘導及びスクリーニングを経てクローニングされたものであっても、あるいは遺伝子組み換え技術を利用して樹立されたものであってもよい。例えば、オーランチオキトリウムＳｐ．又はオーランチオキトリウムＮＢ６−３株（沖縄、オーピーバイオファクトリー株式会社）は、ビタミンＢ１２欠乏培地で奇数脂肪酸のペンタデカン酸（ＰＤＡ）を含有するトリグリセリドと、高度不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）やドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を含有するトリグリセリドを細胞内に大量に蓄積する性質を有するため、本発明の方法に用いる藻類株、又は改変の出発株として、特に好ましい。
【００２７】
細胞増殖速度と細胞収量が顕著に高い株として単離されたオーランチオキトリウムＮＢ６−３株は、本発明の方法に用いる藻類株として特に好ましい。
【００２８】
２．藻類培養条件
本発明の方法に用いる上記オーランチオキトリウム属藻類の培養は、当該技術分野において確立された方法で行われる。即ち、通常の維持培養は、成分調製した適当な培地に播種し、定法に従い行われる。培地としては、任意の公知のものを使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース等の糖類がある。これらの炭素源を、例えば、培地１リットル当たり２０〜１２０ｇの濃度で使用する。窒素源としては、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素、又は酵母抽出物、コーンスチープリカー、ポリペプトン、ペプトン、トリプトン等の生物由来消化物等がある。また、上記培地は適宜ビタミン類を含むこともできる。上記培地は、適切な塩分濃度の人工海水で調製される。好ましくは、当該培地は、最終的な塩分濃度が海水（塩分濃度３．４％（ｗ／ｖ））の約１０％（ｖ／ｖ）以上、又は約１０％（ｖ／ｖ）〜約１００％（ｖ／ｖ）、例えば塩分濃度が約１．０〜３．０％（ｗ／ｖ）となるように調製される。より好ましくは、当該培地は、最終的な塩分濃度が海水の約２０％（ｖ／ｖ）〜８０％（ｖ／ｖ）、約３０％（ｖ／ｖ）〜７０％（ｖ／ｖ）、約４０％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）、又は約５０％となるように調製される。
【００２９】
本明細書中、「塩分」とは、海水が含有する主要な塩類、即ち塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム及び塩化カリウムの、海水と同一の構成比率の混合物を意味する。他の態様において、「塩分」とは、７５％（ｗ／ｗ）以上の塩化ナトリウムと、塩化ナトリウム以外の１つ以上の上記海水が含有する主要な塩類との混合物、又は塩化ナトリウム単体を意味する。
【００３０】
海水は、人工海水であってもよい。人工海水は、水に溶解させることで海水に近い各種イオン組成を構成することの出来る塩の混合物である。好ましくは、当該人工海水は、海水を模倣するように、適切な比率で塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化カリウム、微量金属、有機物等を含有する。本明細書中、本発明の培地の成分として、人工海水に代えて、海水と等張の水溶液を構成する量の塩化ナトリウムを用いてもよい。あるいは、人工海水に代えて、天然の海水又は海水濃縮物を用いてもよい。
【００３１】
好ましくは、上記培地は、ＧＴＹ培地（人工海水１０−４０ｇ／Ｌ、Ｄ（＋）グルコース２０−１００ｇ／Ｌ、トリプトン１０−６０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５−４０ｇ／Ｌ）である。
【００３２】
上記培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることにより適宜ｐＨを調整できる。培地のｐＨは、ｐＨ２．０〜１１．０、好ましくはｐＨ３．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ４．０〜９．０、より好ましくはｐＨ４．５〜９．０であり、最も好ましくはｐＨ６．５である。
【００３３】
上記培地は、オーランチオキトリウム属藻類の播種前にオートクレーブ、ろ過滅菌や紫外線照射等により殺菌されてもよい。
【００３４】
培養は、培養温度５〜４０℃、好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは１０〜３０℃にて行われる。継代は、通常１〜１０日間、好ましくは３〜７日間置きに行われる。培養は通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で行うことができるが、好ましくは通気攪拌培養又は振とう培養で培養する。
【００３５】
藻類細胞内のトリグリセリド組成は、培養条件に応じて顕著に変動し得る。従って、好ましい態様において、上記培養は、藻類細胞内のトリグリセリド組成の変化を誘導する条件で行われる。当該トリグリセリド組成の変化の誘導は、所望のトリグリセリドを高効率で取得することを目的として実施されてもよい。
【００３６】
細胞培養において、培地中のアミノ酸の含有量を制限することにより、細胞内のトリグリセリドの蓄積量を増大させられることが知られている。斯かる方法を用いると、標準的なアミノ酸含有量の培地を用いた場合と比較して、トリグリセリドを含有する油滴状脂肪の蓄積が顕著に増大する。アミノ酸制限培養の条件は、他の培養条件や藻類の種類、状態等に依存して、当業者による通常の条件検討により設定することが出来る。
【００３７】
３．トリグリセリドの抽出
本発明の方法において、微生物が生産したトリグリセリド混合物は、当業者に既知の方法で抽出及び分析することができる。例えば、上記の通り藻類細胞を培養及び増殖させ、得られた培養液から遠心分離又は濾過等により回収したペレットを、凍結乾燥又は加温による乾燥等により乾燥させる。または、培養後の藻類細胞が懸濁した培地をそのままトリグリセリドの抽出ステップに用いてもよい。
【００３８】
得られた微生物の乾燥体、又は培養物から、有機溶媒を用いて所望のトリグリセリドを含有する脂質を抽出できる。抽出は、異なる有機溶媒を用いて複数回行ってもよい。有機溶媒としては、ｎ-ヘキサン・エタノール混合溶媒、クロロホルム・メタノール混合溶媒、又はエタノール・ジエチルエーテル混合溶媒等の極性溶媒と弱極性溶媒の混合液を用いることができる。得られた抽出液は、当業者に既知の方法で精製される。例えば、シリカゲルや酸性白土を用い、極性脂質を吸着させて精製することができる。また、精製したトリグリセリドを、ＮＭＲ、ＩＲ、ガスクロマトグラフィー、ＧＣ／ＭＳ等により分析する。
【００３９】
４．トリグリセリド及び脂肪酸
本発明の文脈において、「トリグリセリド」とは、ＣＨ２（ＯＯＣＲ１）ＣＨ（ＯＯＣＲ２）ＣＨ２（ＯＯＣＲ３）という一般化学式を有する、３個の脂肪酸残基とグリセロールとのエステルであり、式中、ＯＯＣＲ１、ＯＯＣＲ２、およびＯＯＣＲ３は、各々、エステル結合した脂肪酸残基を表す。本発明において、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドは、ＯＯＣＲ１、ＯＯＣＲ２、およびＯＯＣＲ３の１つ以上が奇数脂肪酸であるトリグリセリドを意味する。また、高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドは、ＯＯＣＲ１、ＯＯＣＲ２、およびＯＯＣＲ３の１つ以上が高度不飽和脂肪酸であるトリグリセリドを意味する。
【００４０】
本発明の文脈において、「脂肪酸」とは直鎖モノカルボン酸を指し、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、長鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸を含む。他に言及の無い限り、脂肪酸は、遊離脂肪酸に加えて金属塩、有機塩基との塩、トリ、ジ、およびモノグリセリドを含む脂肪酸とアルコールのエステルやアミドの形態のものを含む。
【００４１】
本発明の文脈において、「高度不飽和脂肪酸」とは、複数の不飽和結合を有する炭素鎖を有する脂肪酸を意味し、ω−３、ω−６、ω−７、ω−９のいずれの不飽和脂肪酸であってもよい。ω‐3脂肪酸として、α―リノレン酸、ω‐３エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω‐3ドコサペンタエン酸（ω‐３ＤＰＡ）コサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。
【００４２】
本発明の文脈において、「奇数脂肪酸」は、炭素数が奇数の炭素鎖を有する脂肪酸を意味し、Ｃ３プロピオン酸、Ｃ５吉草酸、Ｃ７エナント酸、Ｃ９ペラルゴン酸、Ｃ１１ウンデカン酸、Ｃ１３トリデカン酸、Ｃ１５ペンタデカン酸、Ｃ１７マルガリン酸、Ｃ１９ノナデカン酸、Ｃ２１ヘンイコシル酸、Ｃ２３トリコシル酸が挙げられる。
【００４３】
特に好ましくは、本発明の方法を用いて生産されるトリグリセリド混合物が含有する、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドは、ＯＯＣＲ１、ＯＯＣＲ２、およびＯＯＣＲ３のいずれも高度不飽和脂肪酸でなく、また、高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドは、ＯＯＣＲ１、ＯＯＣＲ２、およびＯＯＣＲ３のいずれも奇数脂肪酸ではない。このように、奇数脂肪酸と高度不飽和脂肪酸が同一のトリグリセリドの枝に共存しないのは、オーランチキトリウム属藻類が、奇数脂肪酸トリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸トリグリセリドを別個の経路を用いて合成するためである。斯かる特徴を有するため、本発明の方法を用いて生産されるトリグリセリド混合物は、後述するように、奇数脂肪酸トリグリセリドと、高度不飽和脂肪酸トリグリセリドとを、分離精製出来るという利点を有する。
【００４４】
本発明の方法を用いて生産されるトリグリセリド混合物は、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドの両方を、顕著な量で含有する。好ましい態様において、当該トリグリセリド混合物は、抽出された混合物の重量に対して、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを、１０％〜９０％、１５％〜８５％、２０％〜８０％、２５％〜７５％、３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、４５％〜５５％含有する。更に好ましい態様において、当該トリグリセリド混合物は、抽出された混合物の重量に対して、高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを、１０％〜９０％、１５％〜８５％、２０％〜８０％、２５％〜７５％、３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、４５％〜５５％含有する。
【００４５】
５．奇数脂肪酸トリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸トリグリセリドの分離精製
本発明の方法により生産されるトリグリセリド混合物は、奇数脂肪酸と高度不飽和脂肪酸が同一のトリグリセリドの枝に共存しないという特徴を有するため、奇数脂肪酸トリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸トリグリセリドを分離精製することが出来る。
【００４６】
トリグリセリドを分離する手法は、当業者に既知の分画手法が採用される。分画するトリグリセリド分子の極性、溶媒への溶解度、融点、比重、分子量等の様々な物理化学的特性を利用して分離精製が行われてもよく、好ましくはカラムクロマトグラフィー技術が用いられる。トリグリセリド分離手段の条件は、トリグリセリド混合物の組成及び分画すべきトリグリセリドの種類に依存して、当業者による通常の条件検討により設定することが出来る。
【００４７】
７．生産物の用途
本発明の方法を用いて生産される、奇数脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリド及び高度不飽和脂肪酸を主要成分として含有するトリグリセリドを含有するトリグリセリド混合物は、様々な生理機能の改善や健康増進に有益な効果を有することが期待される。
【００４８】
ＤＨＡ等のω−３高度不飽和脂肪酸の機能性については研究が進んでおり、不整脈に関連する健康リスクの低下、循環器疾患のリスクの低下、血中トリグリセリドレベルの低下、血液の流動性の改善、脳機能の増強、細胞の酸化的損傷からの保護、炎症性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、神経変性疾患、代謝性症候群に関連する疾患及び癌関連疾患の緩和等の、広範な健康増進効果を有することが知られている。
【００４９】
高度不飽和脂肪酸と比較して、奇数脂肪酸の機能性については研究が進んでいないが、上記のようにＴＣＡサイクルの循環において奇数脂肪酸が重要な役割を果たすことが判明していることから、ＴＣＡサイクルが関与する様々な生理機能に影響することが予想される。例えば、奇数脂肪酸は、皮膚若しくは皮膚付属器の健康の改善、細胞活性化作用、アレルギー症状の軽減、筋肉痛の軽減、運動機能の向上等の機能を有すると推察される。
【実施例】
【００５０】
藻類の培養及び回収
オーランチキトリウムＳｐ．株を、２５０ｍｌのＧＴＹ培地（１％トリプトン、２％グルコース、０．５％酵母エキス、１．０％海水塩）を用いて、５００ｍｌの坂口培養フラスコの中で増殖させた。細胞を一定温度２５℃かつ１００ストローク／分で７２時間培養した。当該培養物を、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、藻体を沈殿物として回収し、これを凍結乾燥させた。
【００５１】
脂質の抽出
上記凍結乾燥させた藻類細胞にｎ−ヘキサン／エタノール混合物（混合比率は試料の水分含量に応じて適宜変化させた。一例として、３：１、ｖ／ｖ。）で黄色の色素が抽出されなくなるまで繰り返し抽出した。当該抽出液をロータリーエバポレーターで減圧乾固し、ｎ−ヘキサン／アセトン（８５：１５，  ｖ／ｖ）に溶解し、これをシリカゲルカラム用試料とした。脂質の収量は、藻体の乾燥重量に対し２０％であった。
【００５２】
脂質の分画
上記シリカゲルカラム用試料を、ｎ−ヘキサンで調整したシリカゲルカラム（充填剤シリカゲル−６０）に添加し、更にカラム床体積の４倍量のｎ−ヘキサン／アセトン（８５：１５，  ｖ／ｖ）またはｎ−ヘキサン／クロロホルム  （１：１，  ｖ／ｖ）を添加することにより、中性脂質を溶出させた。当該溶出液をロータリーエバポレーターで減圧乾固し、  ｎ−ヘキサンに溶解した。
【００５３】
当該中性脂質を溶解したｎ−ヘキサン溶液を、ｎ−ヘキサンで調整したシリカゲルカラム（充填剤シリカゲル−６０）に添加し、更にカラム床体積の２倍量のｎ−ヘキサン／アセトン（９２：８，  ｖ／ｖ）またはｎ−ヘキサン／クロロホルム  （１：１，  ｖ／ｖ）を添加することにより、炭化水素および無極性カロチノイドを溶出させた。更に、カラム床体積の３倍量のｎ−ヘキサン／アセトン（８５：１５，  ｖ／ｖ）またはクロロホルムを添加することにより、トリグリセリドを溶出させた。当該トリグリセリドの収量は、乾燥藻類１０ｇに対し、０．７ｇであった。
【００５４】
本実施例で取得されたトリグリセリドの脂肪酸組成を、表１に示す。Ｃ１３，  Ｃ１５，  Ｃ１７からなる奇数飽和脂肪酸が約３０％、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）が約３５％含まれていた。生物が生産するトリグリセリドの脂肪酸組成は、２位に不飽和脂肪酸、１または３位に飽和脂肪酸が結合していることが定説であり、ＤＨＡを２５％程度含有するトリグリセリドにおいて、飽和脂肪酸だけで構成されているトリグリセリドが全トリグリセリドの５０％に及ぶ例はこれまでにない。しかも、生体由来のトリグリセリドにおいてペンタデカン酸の割合が３０％に達した例は初めてである。従って、本実施例において取得された藻類由来のトリグリセリド混合物は、奇数脂肪酸であるＣ１５のペンタデカン酸と、ω−３高度不飽和脂肪酸であるドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を大量に含有していることが示された。
【表１】
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【００５５】
奇数飽和脂肪酸を主成分とするトリグリセリドの単離
上記トリグリセリド画分を同体積のｎ−ヘキサンに溶解し、４℃に１２時間以上静置すると、白色の沈殿が生成する。上澄み液を濃縮・乾固し、同体積のｎ−ヘキサンに溶解し同様の操作を行うと、再び白色沈殿が生成する。この沈殿は、奇数及び偶数の飽和脂肪酸トリグリセリドだけからなり、不飽和脂肪酸は含まれていなかった。当該トリグリセリド沈殿において奇数脂肪酸トリグリセリドの占める割合は、６６％に達した。一方、溶液部分は、約３６％が奇数飽和脂肪酸であり、４４％がドコサヘキサエン酸とドコサペンタエン酸であった。奇数飽和脂肪酸を主成分とする沈殿画分の収量は、乾燥藻類１０ｇあたり０．４ｇであり、奇数飽和脂肪酸、ドコサヘキサエン酸及びドコサペンタエン酸を主成分とする溶液画分のトリグリセリドの混合物の収量は、乾燥藻類１０ｇあたり、０．３ｇであった。
【００５６】
特筆すべきは、この微生物は奇数飽和脂肪酸を主成分とするトリグリセリドと高度不飽和脂肪酸を主成分とするトリグリセリドが別々に生合成されていることであり、他の生物ではグリセリドの２位に不飽和脂肪酸が主に結合し、１及び３位には飽和脂肪酸が結合している場合が一般的であることから、本トリグリセリドは極めて稀な脂肪酸組成を有している。
ｎ−ヘキサンに代えて、アセトン、ｎ−ペンタン、イソペンタン、シクロヘキサン、ｎ−ヘプタン、イソヘプタン、シクロヘプタン等を用いても同様の結果が得られた。
【表２】
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【００５７】
当該分画によって、元のグリセリド混合物において２９．５％であったペンタデカン酸の割合が４７．４％に濃縮された全飽和脂肪酸からなるトリグリセリドを得ることができる。また、一方では、溶液画分ではドコサヘキサエン酸及びドコサペンタエン酸が４４．１％に濃縮されており、高度不飽和脂肪酸の濃縮も達成されている。
【図１】
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【図２】
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