(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１である、ことを特徴とするサソリ毒耐熱合成ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のサソリ毒耐熱合成ペプチドのてんかん、アルツハイマー病やパーキンソン病の治療薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチド薬物研究分野に属し、特に漢方薬としての東亜サソリのサソリ毒からサソリ毒耐熱ペプチド（ＳＶＨＲＰ）を取得するアミノ酸配列及びその合成製品であるサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）のてんかん、アルツハイマー病とパーキンソン病の治療薬としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）の臨床症状の出現は、中脳黒質内のドーパミン（ＤＡ）ニューロンの損傷により、線条体のＤＡ神経伝達物質のレベルが顕著に低下するのが原因である。ＰＤの酸化ストレス説はＤＡ酸化ストレスに基づいて提出されており、自由基説は中脳黒質緻密部（ＮＣｓ）ＤＡニューロン損傷の重要な機構であり、耐酸化治療は現在公認されている効果的な治療手段である。
【０００３】
漢方薬としての東亜サソリ（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉｉＫａｒｓｃｈ，ＢｍＫ）は、キョクトウサソリとも呼ばれる。現代医学研究によって、サソリ尻尾の嚢腺から作られるサソリ毒（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｖｅｎｏｍ，ＳＶ）には毒素が豊かに含まれているのが証明された。その毒素作用機構に基づいて神経毒素と細胞毒素に分けられ、その中、神経毒素は長鎖サソリ毒（６０−７０個のアミノ酸残基を含む）と短鎖サソリ毒（３０−４０個のアミノ酸残基を含む）に分けられる。長鎖サソリ毒が作用する標的は、主に神経興奮を起こすことが可能な膜上の電圧依頼性ナトリウムイオンチャンネル（Ｖｏｌｔａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎａ＋ｃｈａｎｎｅｌｓ）であり、短鎖サソリ毒はＣａ２＋チャンネル、Ｋ＋チャンネル又はＣｌ−チャンネルに作用することができる。サソリ毒は既に膜イオンチャンネルの持薬と抗毒素の研究に広く用いられている。サソリは中国の伝統的な漢方薬であり、今まで、ＢｍＫサソリ毒から抗癌、アンチパイン、抗てんかん、抗血栓、抗炎症、抗リウマチ、抗菌などの機能を有するサソリ毒が分離純化されている。サソリ毒の毒性は僅かに蛇毒に劣るだけである。特許文献１において、天然薬物としてのサソリの薬用部位である尾部節嚢腺から作られる毒液−サソリ毒が、難治性てんかん（Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ，ＲＥ）に対する有効性及び処理を行った後、安全性を有することが開示された。特許文献２（中国特許出願番号２０１３１０３３０２９０．１）において、ＢｍＫのＳＶから、非耐熱と耐熱の有毒成分を除去することによって、より安全なサソリ毒耐熱ペプチド抽出液を取得できることが開示された。該ポリペプチドは難治性てんかん（Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｅｐｉｌｅｐｓｙ，ＲＥ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ  Ｄｉｓｅaｓｅ，ＡＤ）の予防と治療に用いられ、共同の作用ターゲットを有しており、それぞれの特殊な効果を有する。しかし、サソリ毒耐熱ペプチド抽出液からのペプチド取得率が低く、そのため、化学合成したサソリ毒耐熱ペプチドを取得することは、この創造性研究成果の開発及び産業化生産に転化できるか否かを決定する重要な点である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許出願公開第１３２４６２１号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０４３４１４９５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、化学合成されたサソリ毒耐熱ペプチド及びその用途を提供することを目的とする。本願は、サソリ毒耐熱ペプチドのアミノ酸配列の測定、固相化学合成法による該ペプチドの合成、及びサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の薬力活性と安全性の測定などの内容を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係るサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）のアミノ酸配列は以下のとおりである：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１：（Ｎ端）Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｃ端）。サソリ毒耐熱合成ペプチドは人工合成された活性ポリペプチドであり、１５個のアミノ酸残基を含み、分子量が１５２４Ｄａである。
【０００７】
本発明に係るサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）は、まず従来漢方薬としてのＢｍＫサソリ毒からサソリ毒耐熱ペプチドのアミノ酸配列を取得する。主に以下を含む：動物試験によって試料（ｘｉｅｄｕ  ２００６０１１２−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｍｍａｒｙ）がてんかん、パーキンソン病、老年性認知症に対して顕著の予防と治療の作用を有することを確認し、その後、試料に対してＬａＧＭ複合材料と快速磁気分離を繰り返し行ってから、ナノ逆相クロマトグラフィーエレクトロスプレとイオン化質量分析法（ｎａｎｏＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ）を連用する質量分析法による平行試験を行ってサソリ毒耐熱ペプチドのアミノ酸配列を検定し、最後に固相化学合成法、クロマトグラフィーによる純化及び質量分析法による解析を行うことで、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）を得る。そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示しており、この配列はサソリ毒耐熱ペプチドの薬力活性や安全性及びさまざまな生物活性を保持している。
本発明に係るサソリ毒耐熱合成ペプチドの製造方法は以下のとおりである。
１．サソリ毒耐熱ペプチドのアミノ酸配列の測定
（１）ＢｍＫサソリ毒の凍結乾燥粉末を溶かして遠心し、上清液を取って１００℃の水浴で加熱した後、遠心し、上清液即ちサソリ毒耐熱成分抽出液を取り、順次に分画分子量が５０ｋＤａと３０ｋＤａの濾過膜を用いる遠心式限外濾過管で、サソリ毒耐熱成分抽出液を遠心限外濾過し、上槽液を収集し、サソリ毒耐熱ペプチド抽出液を得る。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ分子ふるいカラム（Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｒａｎｇｅ（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）  Ｍ、１００−７０００Ｄａ）で上記サソリ毒耐熱ペプチド抽出液を粗分離した後（図１をご参照）、得られた試料をＨＰＬＣにより更に細分離する（図２を参照）。クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィーカラムはＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ４．６＊２５０  ５μｍ（ＡｇｉｌｅｎｔＵＳＡ）であり、移動相はＡ液とＢ液を含み、その中、Ａ液は０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水＝２：９８であり、Ｂ液は０．０８％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水＝９８：２であり、順次に０−４０％のＢ液を含む移動相３−６カラム体積、４０−１００％のＢ液を含む移動相０．５−１カラム体積、１００％Ｂ液１−３カラム体積（ＣＶ）を流し、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、紫外線検出器の検出波長は２８０ｎｍ／２５８ｎｍ／２１４ｎｍである。
【０００８】
（２）凍結乾燥したポリペプチド試料を再度Ｎａｎｏ−ＲＰＬＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａに溶解させ、オンラインＮａｎｏ−ＲＰＬＣ液体クロマトグラフィーはＥｋｓｉｇｅｎｔｎａｎｏＬＣ−Ｕ１ｔｒａＴＭ  ２Ｄシステム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）で行い、溶解させた上記試料は２μＬ／ｍｉｎの流速でＣ１８予備カラム（１００μｍ×３ｃｍ、Ｃ１８、３μｍ、１５０Å）に掛け、流速を保持しながら１０ｍｉｎ洗浄し脱塩する。質量スペクトルはＴｒｉｐｌｅＴＯＦ５６００システム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）とナノ噴霧ＩＩＩイオン源（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）を連用したシステムを用い、質量スペクトルより採集した原始ｗｉｆｆグラフファイルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．４．５（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）ソフトウェアでデータ加工処理を行い、サソリ耐熱ペプチド（ＳＶＨＲＰ）を得る。その配列は、配列表ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ．１に示す。
【０００９】
２．固相化学合成法でサソリ毒耐熱合成ペプチドを製造する。
（１）該当ポリペプチドの合成とは、上記サソリ毒耐熱ペプチドのアミノ配列に従い、アミド結合の指向形成方法で目標分子を得るものである。固相合成とは、原料薬の一つのアミノ酸のカルボキシル基を共有結合の形式で固相担体（Ｆｍｏc  樹脂）と連結して、このアミノ酸のアミノ基を合成起点として、隣接するアミノ酸（アミノ基保護）のカルボキシル基とアシル化反応させ、ペプチド結合を形成するものである。その後、この二つのアミノ酸を含んだ樹脂ペプチドのアミノ基を脱保護させた後、次のアミノ酸のカルボキシル基と反応させる。目標ペプチドが得られるまで、この過程を繰り返す。
【００１０】
【化１】
0006483858.tif 000002
【００１１】
（２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による純化：ポリペプチド合成過程において、目標ペプチドの構造に類似するポリペプチド（図６を参照）が生成される。例えばアミノ酸のラセミ化によるジアステレオ異性体、一部のアミノ酸が連結されないことによる欠乏ペプチド、ペプチド連鎖の断裂による断裂ペプチドなどである。クロマトグラフィー条件：クロマトグラフィーカラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−ＳＰ  ４．６ｍｍ＊２５０ｍｍであり、移動相は０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸を含む水で構成される混合液であり、紫外線検出器の検出波長は２１４ｎｍである。
（３）質量スペクトルを用い、合成ポリペプチドの構造解析を行い、検索及び解析を経て、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）のアミノ酸配列を確定し、該当ＳＶＨＲＳＰのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示す。
【発明の効果】
【００１２】
本発明におけるサソリ毒耐熱合成ペプチドにおいて、Ｍｏｒｒｉｓウォーターメイズ実験法を用い、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）がＡＤマウスの学習記憶に与える影響を測定したところ、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）はＡＤマウスの空間学習記憶能力に対して促進作用を有することが証明された。線虫走化性行動実験法によるＡβ神経毒性の測定結果より、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）はニューロンを保護でき、Ａβによる毒性作用に対抗でき、またニューロンのＡβの発現による走化性行動異常を改善させることがわかった。サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）について、難治性てんかんピロカルピンモデルラットに対する予防及び治療作用を観察したところ、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）はリチウム−ピロカルピンてんかんラット慢性モデルのてんかん性発作に対して著しい制御効果を有し、発作回数を著しく低減させた。サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）が初代培養したニューロンのナトリウム電流に対する抑制作用を観察したところ、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）は初代培養した海馬ニューロンのナトリウムチャンネル電流を明らかに抑制することがわかった。また、ＮＭＤＡにより誘導されるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞損傷に対して保護作用を有する。サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）についてＩＩ型星状神経膠細胞に対する影響を観察した結果、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）はＩＩ型星状神経膠細胞が再プログラミング（逆分化）により脳内内在性神経幹細胞になるのを促進することが分かった。細胞内ＲＯＳを測量する方法でＳＶＨＲＳＰの６−ＯＨＤＡによりＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内に生成される活性酸素に対する除去能力を測定したところ、ＳＶＨＲＳＰは明らかに細胞内ＲＯＳを除去でき、ＰＤ酸化的ストレスを抑制することがわかった。サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の薬用安全性と薬用活性の比は２０００／０．０５＝４０，０００倍より大きく、昆明種マウスの腹腔注射投与量が２０００ｍｇ／ｋｇ・ＢＷに達する場合でも、何の毒性反応も認められず、これらの結果は、本願ＳＶＨＲＳＰが新型耐てんかん、アルツハイマー病とパーキンソン病薬物としての応用前景を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サソリ毒耐熱ペプチド抽出液試料のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるグラフである。
【図２】サソリ毒耐熱ペプチド抽出液試料のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるグラフである。
【図３】Ｍｏｒｒｉｓウォーターメイズ実験法において、サソリ毒耐熱合成ペプチドの老人性認知症（ＡＤ）マウスの空間学習記憶能力に対する影響の測定結果である。
【図４】サソリ毒耐熱合成ペプチドが６−ＯＨＤＡＰＤ細胞モデルにおいてＲＯＳの生成を除去することを示すグラフである。
【図５】サソリ毒耐熱合成ペプチドが海馬脳切片の癲癇様放電を抑制することを示すグラフである。
【図６】サソリ毒耐熱合成ペプチドの逆相−高速液体クロマトグラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）結果を示すグラフである。
【図７】サソリ毒耐熱合成ペプチドのＭＳ解析結果を示すグラフである。
【図８】サソリ毒耐熱合成ペプチドのリチウム−ピロカルピンてんかんラットの繰り返し発作に対する抑制作用を示すグラフである。
【図９】サソリ毒耐熱合成ペプチドがＡＤの遺伝子導入カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ) ＣＬ２３５５の走化性行動に与える影響を示すグラフである。
【図１０】サソリ毒耐熱合成ペプチドが初代培養ニューロンにおけるナトリウム電流に対する抑制作用を示すグラフである。
【図１１】サソリ毒耐熱合成ペプチドがＮＭＤＡにより誘導されるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の損傷に対して保護作用を有することを示すグラフである。
【図１２】サソリ毒耐熱合成ペプチドがＩＩ型星状神経膠細胞の脳内内在性神経幹細胞への再プログラミング（逆分化）を促進することを示すグラフである。
【図１３】サソリ毒耐熱合成ペプチドがＯＰＣ細胞の内在性神経幹細胞への分化を促進することを示すグラフである。
【図１４】サソリ毒耐熱合成ペプチドがＮｅｓｔｉｎ蛋白質の表現を向上させるのを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の実施例は、更に本発明の内容を解釈する為のものであり、本発明を限定するものではない。
【００１５】
（実施例１）
サソリ毒耐熱ペプチドのアミノ酸配列の測定：
（１）三次蒸留水で河南宜昌由来のＢｍＫサソリ毒の凍結乾燥粉末を溶解した後、遠心し、上清液、即ちＢｍＫサソリ毒抽出液を得る。カバー付きの耐熱プラスチックチューブに分注し、恒温水浴槽において、１００℃で４ｈ加熱した後取り出し、自然に室温まで冷却させて、遠心分離及び高速遠心分離を行って、上清液、即ちサソリ耐熱成分抽出液を得る。その抽出液を順次に分画分子量が５０ｋＤａと３０ｋＤａの濾過膜を用いる遠心限外濾過管で遠心限外濾過し、上槽液、即ちサソリ毒耐熱ポリペプチド抽出液を得る。これを遠心し、上清液、即ちサソリ毒耐熱成分抽出液を得る。
【００１６】
サソリ毒耐熱ペプチド抽出液をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ分子ふるいカラム（Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｒａｎｇｅ（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｍ、１００−７０００Ｄａ）で粗分離し（図１を参照）、得られた試料をＨＰＬＣで更に細分離する（図２を参照）。クロマトグラフィー条件は以下の通りである。クロマトグラフィーカラムはＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ４．６＊２５０、５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ．ＵＳＡ）であり、移動相はＡ液とＢ液を含み、その中、Ａ液は０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水＝２：９８であり、Ｂ液は０．０８％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水＝９８：２である。０−４０％のＢ液を含む移動相約３−６カラム体積、４０−１００％のＢ液を含む移動相０．５−１カラム体積、１００％のＢ液を含む移動相１−３カラム体積（ＣＶ）を順次に流す。流速は、０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、紫外線検出器の検出波長は２８０ｎｍ／２５８ｎｍ／２１４ｎｍである。上記条件において、分離を行い、サソリ毒耐熱ポリペプチド抽出純化物を得る。
【００１７】
（２）１．５ｍＬのサソリ毒耐熱ポリペプチド抽出純化物を取り、１００００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離した後上清液を取り、上清液：３０ｍｇ／ｍＬのＬａＧＭ複合材料＝５０：１の比率で、３０ｍｇ／ｍＬのＬａＧＭ複合材料を上清液に加え、２分間十分にボルテックスした後１０００ｒ、室温下で１０ｍｉｎ振とうし、１００００ｒで５ｍｉｎ遠心分離して磁気分離を行う。上清液を除去し、沈殿に５００μＬの水を加え、１分間十分にボルテックスした後、室温で５ｍｉｎ振とうし、１００００ｒで５ｍｉｎ遠心分離して磁気分離を行い、上清液を除去する。このステップを２回繰り返す。沈殿に２０μＬの８０％＋１％ＴＦＡ洗浄液を加え、１分間ボルテックスした後、室温で５ｍｉｎ振とうし、１００００ｒで５ｍｉｎ遠心分離して磁気分離を行い、上清液を収集する。このステップを１回繰り返し、冷凍乾燥する。磁性材料を分離した後、冷凍乾燥したポリペプチド試料を再度Ｎａｎｏ−ＲＰＬＣ  ＢｕｆｆｅｒＡに溶解させ、オンラインＮａｎｏ−ＲＰＬＣ液体クロマトグラフィーはＥｋｓｉｇｅｎｔｎａｎｏＬＣ−Ｕ１ｔｒａＴＭ  ２Ｄシステム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）で行い、溶解後の試料は２μＬ／ｍｉｎの流速でＣ１８予備カラム（１００μｍ×３ｃｍ、Ｃ１８、３μｍ、１５０Å）に掛け、流速を保持しながら１０ｍｉｎ洗浄し脱塩する。分析カラムはＣ１８逆相クロマトグラム（７５μｍ×１５ｃｍ  Ｃ１８−３μｍ  １２０Å、ＣｈｒｏｍＸＰＥｋｓｉｇｅｎｔ）であり、７０ｍｉｎ内に、移動相においてのＢ液の濃度が５％から８０％に向上するように制御する。質量スペクトルはＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００システム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）とナノリットル噴霧ＩＩＩイオン源（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）を連用したシステムを採用し、その中、噴霧電圧が２．４ｋＶであり、エアカーテン気圧が３０Ｐｓｉであり、霧化気圧が５Ｐｓｉであり、加熱温度が１５０℃であり、一段ＴＯＦ−ＭＳにおいて、一枚のグラフに対するスキャン時間が２５０ｍｓであり、毎回ＩＤＡ循環において最大で３５個の電荷が２＋乃至８＋で、且つ単秒計数が１００以上の二段グラフを採集し、毎枚の二段グラフの累積時間が８０ｍｓである。毎回循環時間を２．５秒に固定し、衝撃室のエネルギー設定はすべての前駆体イオン衝撃誘導解離（ＣＩＤ）に適応し、動的排除を１１秒に設置する。
【００１８】
（３）データ解析条件
質量スペクトルより採集した原始ｗｉｆｆグラフファイルに対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．４．５（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）ソフトウェアでデータ加工処理と検索分析を行う。データベースはｕｎｉｐｒｏｔベース中のサソリであり、検索方式は徹底分析であり、仮陽性率を１％ＦＤＲに制御する。得られたサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）のアミノ酸配列は、配列表ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示す。検索結果は表１のとおりである。
【００１９】
【表１】
0006483858.tif 000003
【００２０】
サソリ毒耐熱ペプチド（ＳＶＨＲＰ）抽出液はＬａＧＭ複合材料と複数回の快速磁気分離を経た後、冷凍乾燥する。冷凍乾燥したポリペプチド試料を再度Ｎａｎｏ−ＲＰＬＣ  ＢｕｆｆｅｒＡに溶解させ、オンラインＮａｎｏ−ＲＰＬＣ液体クロマトグラフィーはＥｋｓｉｇｅｎｔｎａｎｏＬＣ−Ｕ１ｔｒａＴＭ  ２Ｄシステム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）で行い、流速を保持しながら１０ｍｉｎ洗浄し脱塩する。質量スペクトルはＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００システム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）とナノリットル噴霧ＩＩＩイオン源（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）を連用したシステムを採用し、質量スペクトルが採集した原始ｗｉｆｆグラフファイルに対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．４．５（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）ソフトウェアでデータ加工処理と検索分析を行い、サソリ毒耐熱ポリペプチドのアミノ酸配列を検出する。
【００２１】
（実施例２）
合成サソリ毒耐熱ポリペプチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による純化：
ポリペプチドの合成過程において目標ペプチドの構造に類似する不純ペプチドが生成される可能性があり、例えばアミノ酸のラセミ化によるジアステレオ異性体、一部のアミノ酸が連結されないことによる欠乏ペプチド、ペプチド連鎖の断裂による断裂ペプチドなどが生成される。従ってＲＰ−ＨＰＬＣで純化を行う。
試料純化条件は以下のとおりである：
構造：ＫＥ−１５
番号：０２０００４６
ロット番号：Ｐ１６０４１８−ＣＱ４５５２１６
カラム：４．６ｍｍ＊２５０ｍｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−ＳＰ
溶液Ａ：０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
溶液Ｂ：０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水
傾度：                  Ａ                Ｂ
０．０１ｍｉｎ        １０％            ９０％
２５．００ｍｉｎ      ３５％            ６５％
２５．０１ｍｉｎ      １００％            ０％
３０.００ｍｉｎ        Ｓｔｏｐ
波長：２１４ｎｍ
試料供給体積：１０μＬ
【００２２】
（実施例３）
Ｍｏｒｒｉｓウォーターメイズ実験法でＳＶＨＲＳＰが（ＡＤ）マウスの空間学習記憶能力に与える影響の測定：
モリスウォーターメイズ実験において行動学の変化を検出する。定位・航行実験を５ｄ持続する。毎日４回訓練し、マウスがプラットホーム（プラットホームは第１象限に置く）を探し出す時間、即ち、脱出潜伏期を記録し、且つマウスをプラットホームで２０ｓ停留させる。マウスが６０ｓ内にプラットホームを探し出せない場合、脱出潜伏期を６０ｓと記録する。空間捜索実験は、定位・航行実験の第５ｄにおいての４回訓練後に行う。プラットホームを取り外した後、第３象限の入水点でマウスをプールに入れて、試験を開始する。マウスの目標象限（第１象限）内の水泳距離と水泳時間との百分比を算出し、総時間は６０ｓにする。マウスが隠しプラットホームを通過する回数を測定する。
モリスウォーターメイズ実験からＳＶＨＲＳＰがＡＤマウスの空間学習記憶能力に対して促進作用を有することがわかった。モリスウォーターメイズの隠しプラットホーム獲得実験のテスト日（第５日）において、ＡＤモデル薬物投与組マウスの脱出潜伏期（第５ｄ、１２±２回）が明らかにＡＤモデル組（第５日、２２±２回）の脱出潜伏期＊＊ｐ＜０．０１より短く、その水泳距離はモデル組の第５ｄの５００ｃｍから薬物投与組の３００ｃｍに低下し、プラットホームを通過する回数はモデル組の５回から薬物投与組の８回に向上した。
【００２３】
（実施例４）
線虫走化行動学の実験方法：
同期化した遺伝子組み換え線虫ＣＬ２３５５及びそのコントロール株ＣＬ２１２２に対してそれぞれ異なる濃度のＳＶＨＲＳＰ（２、２０、４０μｇ／ｍＬ）及び等量の三次蒸留水を投与する。虫卵である時から投与し、毎日線虫を新しい薬物含有のＮＧＭ培養皿に移転する。すべての線虫を１６℃で３６時間培養した後、インキュベーターの温度を２３℃に向上し、継続して３６時間培養する。上記線虫を収集し、Ｍ９緩衝液で３回洗浄する。走化実験を行う時に１００ｍｍの大きい培養皿を用いる。固体培地は１．９％の寒天、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＳＯ４、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液を含み、ｐＨは６．０であり、マイクロ波で均一に混合した後、皿に入れて、冷却させる。培養皿の底部に、中心位置を経由するようにマジックペンで二本の互いに垂直する直線を描くことにより、皿全体を均一に四つの象限に分ける。
各組の約６０本の線虫を走化培養皿の中心位置に置いて、１μＬのベンズアルデヒド（濃度が０．１％であり、無水エタノールで希釈する）と１μＬの０．２５Ｍアジ化ナトリウムを１、３象限の中心位置に滴下し、１μＬの無水エタノールと１μＬの０．２５Ｍアジ化ナトリウムを２、４象限に滴下し、その中、該点から中心点までの距離は２センチメートル以上である必要がある。走化培養皿を２３℃のインキュベーターに移動させ、１時間が経過した後、走化指数を計数する。ベンズアルデヒドは高濃度気味を有する化学物質であり、線虫はベンズアルデヒドの気味に吸引されその区域へ移動するはずであり、そこでアジ化ナトリウムに接触すると麻痺して原地に止まる。走化指数の算出方法は、１、３象限（吸引物が所在する象限）に計数する線虫の数から２、４象限での線虫の数を差し引き、得られた数を線虫の総数で割るものである。
サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）は投与量依頼性でＣＬ２３５５のＣＩを向上させることができ、４０μｇ／ｍＬのＳＶＨＲＳＰのニューロンに対する保護作用が最も顕著であり、ほとんど完全にＡβの発現による走化性行動損傷を逆転させた。コントロール組の３９．４５±６．２に比べて、薬物投与組は７±５．６６にまで減少され、ｐ＜０．０１であった。これらの結果は、ＳＶＨＲＳＰは、ニューロンを保護し、Ａβによる毒性作用に対抗し、ニューロンのＡβの発現による走化性行動異常を改善させる作用があることを表明する。結果は、表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
（実施例５）
ＳＶＨＲＳＰが６−ＯＨＤＡによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ酸化ストレスに与える影響：
蛍光プローブＤＣＦＨ−ＤＡによりＲＯＳを検出し、ＳＶＨＲＳＰが６−ＯＨＤＡによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ酸化ストレスに与える影響を観察する。実験は、対照組、ＲＯＳｕｐ陽性対照組、６−ＯＨＤＡモデル組及び異なる濃度（２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ）のＳＶＨＲＳＰ薬物組に分けて行う。指数増殖期にあるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を取り、培地を除き、滅菌ＰＢＳで一回洗浄した後、０．２５％のパンクレアチンを加えて消化し、ピペッチングして細胞を分散させる。細胞計数板で細胞をカウントして、１．５×１０４個／ｍＬになるように調製した後、９６ウエルプレートに巻き込み、細胞がプレートの底に沈んだ後、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れ、２４ｈ培養する。濃度が２０μｇ／ｍＬのＳＶＨＲＳＰ薬物組は、薬物を加えて１ｈ作用させた後、６−ＯＨＤＡを加え、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れて２４ｈ継続して培養する。１：５００の希釈比率でＲＯＳｕｐを培地で希釈して、各ウエルに１００μＬずつ加え、２７分間培養する。１：２０００の希釈比率でＤＣＦＨ−ＤＡを無血清培地で希釈し、最終濃度が５μｍｏｌ／Ｌになるようにする。培地を捨て、各ウエルに５０μＬずつ上記希釈したＤＣＦＨ−ＤＡ溶液を加えて、軽く均一に揺れてから５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに入れ、２０ｍｉｎ培養する。上清液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄し、蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、４８８ｎｍの励起波長、５２５ｎｍの発射波長で蛍光測定を行う。ＯＤ値を測定し、比較する。
【００２６】
細胞内のＲＯＳを測定する方法によってＳＶＨＲＳＰの６−ＯＨＤＡによりＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内に生成される活性酸素に対する除去能力を測定する。ＳＶＨＲＳＰ（２０μｇ／ｍＬ）を加えて１ｈ予め処理し、続いて６−ＯＨＤＡ（１００μＭ）を入れ２４ｈ損傷させた後、蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、４８８ｎｍの励起波長、５２５ｎｍの発射波長で、細胞内のＲＯＳの発現情況を測定する。測定結果により、６−ＯＨＤＡは細胞内のＲＯＳの発現を明らかに向上させ、統計的に有意な差（ｃｏｎｔｒｏｌ  １±０．２ｖｓ６−ＯＨＤＡ３．４±０．４ｐ＜０．０１）を示したが、ＳＶＨＲＳＰを加えた場合、細胞内のＲＯＳが明らかに除去されるのを確認でき、統計的にも有意な差（ｃｏｎｔｒｏｌ  ３．４±０．４ｖｓ１．５±０．４ｐ＜０．０５）があった。
【００２７】
（実施例６）
サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の難治性てんかんピロカルピンモデルラットに対する予防・治療作用：
１）体重１８０ｇの健康なオスＳＤラットを用い、リチウム−ピロカルピンを３００ｍｇ／ｋｇの用量でｉｐより投与して、側頭葉てんかんの発作を誘発する。てんかんが急性に発作した後の１５日目に、てんかんラットをモデル組とモデル薬物投与組にランダムにグルーピングする。てんかんモデル組の動物は生理塩水（ＮＳ）を腹腔内に注射し、１５日間連続する。てんかんモデル薬物投与組のラットは更に３つのモデル薬物投与組にグルーピングし、それぞれＳＶＨＲＰ抽出液を５０μｇ／ｋｇ／ｄの用量でｉｐより投与した組、ＳＶＨＲＳＰを５０μｇ／ｋｇ／ｄの用量でｉｐより投与した組、陽性対照薬物−バルプロ酸ナトリウム投与組である。即ち、ピロカルピンてんかんモデル＋ＮＳ組、リチウム−ピロカルピンてんかんモデル＋ＳＶＨＲＰ組、リチウム−ピロカルピンてんかんモデル＋ＳＶＨＲＳＰ組、リチウム−ピロカルピンてんかんモデル＋バルプロ酸ナトリウム組である。各組において、てんかんレベルを観察して記録し、Ｒａｃｉｎｅ’ｓレベルを評価標準とし、表３に示す。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
結果解析：
（１）ＳＶＨＲＳＰは、リチウム−ピロカルピンてんかんラットの慢性モデルてんかん発作に対して著しい制御効果を有し、発作回数を著しく低減させる。
（２）ＳＶＨＲＳＰがリチウム−ピロカルピンてんかんラット慢性モデルの発作レベル及び発作回数を低下する能力は、いずれも陽性対照組であるバルプロ酸ナトリウムより強い。
【００３０】
【表４】
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【００３１】
（実施例７）
サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の初代培養ニューロンのナトリウム電流に対する抑制作用：
（１）初代培養による海馬ニューロンの培養：
生まれて２４ｈ後のＳＤラットを７５％アルコールで消毒した後、氷上で断頭し、解剖顕微鏡下で解剖し快速に両側の海馬を完全に剥離し、解剖液中に置いて体積が１ｍｍ３の小塊になるように切って、終濃度が０．１２５％のパンクレアチン消化液に入れ、３７℃、１０％ＣＯ２のインキュベーターに入れて３０ｍｉｎ消化させる。消化された組織を取り出して、播種液を入れて、消化を終止し、ピペッチングで懸濁させ、濾過を行うことによって、密度が１×１０５／ｍＬの細胞懸濁液を作り、ポリリシン（０．１ｍｇ／ｍＬ）で事前にコーティングして置いた培養プレートに播種し、３７℃、１０％ＣＯ２のインキュベーターにおいて培養する。第２ｄに播種液を全部培地に切替えて、培養する。培養第４ｄに培地にシタラビン（３μｇ／ｍＬ）を加え、非神経細胞の過度増殖を抑制する。その後３ｄごとに５０％の新鮮な培地を切替える。体外培養により、海馬ニューロンは第９−１２ｄ培養することで、成熟ニューロンになり、本実験においては、培養して第１０ｄ目に得られたニューロンを用いる。
【００３２】
（２）全細胞パッチクランプ記録：
初代培養した海馬ニューロンを１０ｄ培養した後、全細胞パッチクランプ記録を行う。記録用ガラス管微小電極の外径は１．５ｍｍ、内径は０．６−０．８ｍｍ、長さは８ｃｍであり、ＰＰ−８３０型微小電極引張機で両段階垂直引張を行って製作する。引張後の電極直径が約１μｍであり、電極内液を充填した後、電極抵抗が３−５ＭΩである。参照電極はＡｇ−ＡｇＣｌ電極である。全細胞パッチクランプ記録において、電極と細胞膜との間に安定な高抵抗封止を形成した後、快速のコンデンサー補償（Ｃ−ｆａｓｔ）を行い、やや負圧を加えて破膜させ、全細胞構造を形成した後、減速コンデンサー補償（Ｃ−ｓｌｏｗ）を行う。減速コンデンサー補償率は８０％−８５％である。リーク電流法でリーク電流（Ｌｅａｋ  Ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）を差し引く。設定された刺激電圧で電流のアクティブ情況を観察する。全細胞パッチクランプ記録に用いられる機器の設置条件は以下の通りである。ＥＰＣ−１０二重チャンネルパッチクランプ増幅器実験パラメータ、データの採集と刺激の与えは、いずれもＰｕｌｓｅソフトウェアによって制御され、Ｂｅｓｓｅｌフィルター１の周波数は１０ＫＨｚであり、Ｂｅｓｓｅｌフィルター２の周波数は２．９ＫＨｚである。実験過程中に、所用する薬物はいずれもＢＰＳ−８潅流装置により投与され、排出管毎個の直径は０．２ｍｍであり、管口は記録に用いる細胞より約１００μｍ離れる。初代培養したニューロンシステムに対して、パッチクランプを行いナトリウムチャンネル電流を記録する。同じ細胞に対してサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）を加える前後の電流を比較する。
全細胞パッチクランプ記録において、同じ細胞に対してサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）を加える前後の電流を比較する。比較結果により、２μｍ／ｍＬのＳＶＨＲＳＰは初代培養した海馬神経細胞体のナトリウムチャンネル電流を顕著に抑制し、その抑制率は９０％以上に達し（ｎ＝６）（ｐ＜０．０００１）、細胞外液で洗浄した後電流が回復できることが分かった。
【００３３】
（実施例８）
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は人の神経芽腫細胞株由来の細胞株である。ＮＭＤＡモデル：ＮＭＤＡ２０ｍＭ＋Ｇｌｙ１０μＭ。
実験過程：実験前、実験目的に応じてグルーピングする。ＳＨ−ＳＹ５Ｙを９６ウェルのプレートに０．８×１０4／穴になるように巻き込み、２４ｈ培養した後、ＳＶＨＲＳＰとｐｅｐｔｉｄｅを加え２４ｈプレインキュベーションする。その後、グルーピングされた各組において、ＮＭＤＡ２０ｍＭ＋Ｇｌｙ１０μＭを加えて２４ｈ培養した後、ＭＴＴアッセイにより各組細胞の生存率を測定する。測定結果は図１１に示す。測定結果により、ＳＶＨＲＳＰは、ＮＭＤＡによるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞損傷に対して保護作用を有することが判明された。その中、ＳＶＨＲＰ濃度は２μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬであり、ＳＶＨＲＳＰ濃度は２μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬであり、ＮＭＤＡ２０ｍＭ＋Ｇｌｙ１０μＭであり、ｐ＜０．０５（ｎ＝３）である。
【００３４】
（実施例９）
ＩＩ型星状膠細胞は逆分化によって増殖及び分化能力を有する多能性神経幹細胞を形成する。
実験過程：生まれて２４ｈ後のＳＤラットを用い、大脳皮層を無菌分離し、細胞懸濁液を得、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地において、混合膠細胞の初代培養を行う。７−９ｄ培養した後、まずＬ−ロイシンメチル塩酸塩（Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）で１ｈ処理し、新鮮な無菌の細胞培地を切替えて、３７℃の恒温振とう台で１８０ｒ／ｍｉｎの速度で１８時間揺らした後、上清液を２００メッシュの濾過網で濾過し、得られた上清液をポリリシンで予備処理した６ウェルプレートに播種して、相対的に純化されたＯＰＣを得る。細胞をインキュベーターに中で自然沈降させ、２ｈ後に細胞が壁に接着したか否かを観察する。壁に接着した後、上清液を捨ててＩＩ型星状膠細胞誘導液（２０％ＤＭＥＭ）を切替え、４−５ｄ継続して培養して、相対的に純化されたＩＩ型星状膠細胞を得る。
５ｄ後、ＩＩ型星状膠細胞を消化させ超低接着６ウェルプレートに播種し、培地を幹細胞培養培地に切替えて、１２ｄ継続して培養して、幹細胞コロニーを形成させる。この超低接着６ウェルプレート中のコロニーを取って、ポリリシンを処理した細胞クライミングスライドを敷設した２４ウェルプレートに巻き込んで２４ｈ培養した後、細胞クライミングスライドを取出し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、免疫蛍光染色を行う。Ｎｅｓｔｉｎ（ｇｒｅｅｎ）でコロニーが幹細胞であるか否かを確認する。Ｎｅｓｔｉｎは、神経幹細胞の特異性マーカーであり、サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）はＩＩ型星状膠細胞が逆分化して神経幹細胞を形成する過程のマーカーであるＮｅｓｔｉｎに影響する。
【００３５】
（実施例１０）
サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の急性毒性実験：
１）主な観察指標：
ｉ）最大耐性量（Ｍａｘｉｍａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｄｏｓｅ，ＭＴＤ）：即ち最大非致死投与量、受験動物が死に至らない最大の用量を言う。
ｉｉ）最小致死投与量（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｌｅｔｈａｌ  ｄｏｓｅ，ＭＬＤ）：個別の受験動物が死亡し始める用量を言う。
ｉｉｉ）最大無毒性量（最高無毒）：即ち毒性反応が現れない最大の用量（Ｎｏ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｌｅｖｅｌ，ＮＯＡＥＬ）であり、即ち一定の時間内に、動物に損害作用を与えない最大の用量を言う。
ｉｖ）最小毒性量：動物が毒性反応を現す最低用量を言い、毒性反応が現れたばかりの用量、即ち動物が毒性反応を現す最低用量を言う。
２）注：
ｉ）受験動物：昆明種マウス、雌と雄がそれぞれ半分ずつである（健康な成年であり、体重が１９−２０ｇである）。
ｉｉ）受験試薬：ＳＶＨＲＳＰ：
ａ．出所：河南省宜昌ＸＩＮＸＩＮサソリ養殖工場（２０１２−０５−２８）からＢｍＫサソリ毒抽出液を購入する。    
ｂ．Ｌｏｔ  Ｎｏ：Ｐ１６０４１８−ＣＱ４５５２１６。
ｃ．含有量（又は仕様）：１０ｍｇ／１つ。
ｄ．保存条件及び配合方法：−２０℃で長期保存でき、４℃では７−１０ｄで保存でき、使用時に超純水で溶かす。
ｉｉｉ）投与経路：それぞれｉｐで投与する（マウスｉｐ経路投与において、常用する最大容積は０．１−１．０ｍＬ／２０ｇＢＷである）。
投与経路に基づいて当該動物種の最適な投与容量（投与量が異なっても、投与容量は同じにする）を選択することであり、今回実験において、ｉｐ投与経路は、いずれも０．２ｍＬ／２０ｇＢＷにする。
ｉｖ）採用方法の選択
近似致死量法によって、可能な配列表を作成する。
従来サソリ毒耐熱ポリペプチドの昆明種マウスに対する急性毒性試験結果に基づき，サソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の可能な最大耐性量と最小致死量を算出し、複数の投与量を含んだ投与量配列表を設計する。
可能な最大耐性量（Ｍａｘｉｍａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｄｏｓｅ，ＭＴＤ）：７６．８、５１．２、３４．１ｍｇ／ｋｇ。
可能な最小致死量（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｌｅｔｈａｌ  ｄｏｓｅ，ＭＬＤ）：１１５．２、７６．８、５１．２ｍｇ／ｋｇ。
算出した投与量配列表から可能な致死量範囲（１１５．２、７６．８、５１．２、３４．１ｍｇ／ｋｇ）を探し出し、この範囲内にある各投与量を一匹の動物に投与し、最小致死量と最大耐性量を測定した後、両者の間にいる投与量を一匹の動物に投与する。当該投与量で動物が死亡に至らない場合、当該投与量と最小致死量との間の範囲を近似致死量範囲とする。当該投与量で動物が死亡する場合、当該投与量と最大耐性量との間の範囲を近似致死量範囲とする。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
結果：本発明のサソリ毒耐熱合成ペプチド（ＳＶＨＲＳＰ）の薬用安全性と薬の効果活性との比は２０００／０．０５＝４０，０００倍より大きく、昆明種マウスの腹腔注射投与量は２０００ｍｇ／ｋｇ．ＢＷに達する場合にも、何の毒性反応も起こさなかった。最大無毒性反応投与量（最高無毒）、即ち毒性反応が認められない最大投与量に達してない。
【００３８】
（付記）
（付記１）
完全な遺伝子配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１である、ことを特徴とするサソリ毒耐熱合成ペプチド。
【００３９】
（付記２）
ＢｍＫサソリ毒の凍結乾燥粉末を溶かして遠心し、上清液を取り１００℃の水浴で加熱した後、遠心し、上清液を回収してサソリ毒耐熱成分抽出液を得、該サソリ毒耐熱成分抽出液を順次に分画分子量が５０ｋＤａと３０ｋＤａである遠心式限外濾過管において遠心限外濾過を行って上槽液を回収し、サソリ毒耐熱ポリペプチド抽出液を得るステップと、  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ分子ふるいカラム（Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｒａｎｇｅ（ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｍ，１００−７０００Ｄａ）により前記サソリ毒耐熱ポリペプチド抽出液を粗分離した後、得られた試料をＨＰＬＣによりさらに分離し、その中、クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィーカラムはＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８  ４．６＊２５０  ５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＵＳＡ）、移動相はＡ液とＢ液を含み、その中、Ａ液は０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水＝２：９８であり、Ｂ液は０．０８％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水＝９８：２であり、順次に０−４０％のＢ液を含む移動相３−６カラム体積、４０−１００％のＢ液を含む移動相０．５−１カラム体積、１００％Ｂ液１−３カラム体積（ＣＶ）を流し、流速は０．８ｍＬ／ｍｉｎであり、紫外線検出器の検出波長は２８０ｎｍ／２５８ｎｍ／２１４ｎｍであるステップと、
冷凍乾燥したポリペプチド試料をＮａｎｏ−ＲＰＬＣ  ＢｕｆｆｅｒＡに再び溶解させ、オンラインＮａｎｏ−ＲＰＬＣ液体クロマトグラフィーはＥｋｓｉｇｅｎｔｎａｎｏＬＣ−Ｕ１ｔｒａＴＭ  ２Ｄシステム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）で行い、溶解させた前記試料は２μＬ／ｍｉｎの流速でＣ１８予備カラム（１００μｍ×３ｃｍ、Ｃ１８、３μｍ、１５０Å）に掛け、流速を保持しながら１０ｍｉｎ洗浄して脱塩し、質量スペクトルはＴｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ  ５６００システム（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）とナノリットル噴霧ＩＩＩイオン源（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）を連用するシステムを用い、質量スペクトルより採集した原始ｗｉｆｆグラフファイルに対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｉｌｏｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ．４．５（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、ＵＳＡ）ソフトウェアでデータ加工処理を行って、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１であるサソリ毒耐熱合成ペプチドを得るステップと、
固相化学合成法で前記サソリ毒耐熱合成ペプチドを製造するステップと、
前記ポリペプチド合成過程において、目標ペプチドの構造に類似するポリペプチドが生成され、それに対して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により純化を行い、その中、クロマトグラフィー条件は、クロマトグラフィーカラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−ＳＰ  ４．６ｍｍ＊２５０ｍｍであり、移動相は０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸を含む水であり、紫外線検出器の検出波長は２１４ｎｍであるステップと、
質量スペクトルを用い、前記合成ポリペプチドの構造解析を行い、検索及び解析を経て、サソリ毒耐熱合成ペプチドのアミノ酸配列を確定し、そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１であるステップを含む、ことを特徴とするサソリ毒耐熱合成ペプチドの製造方法。
【００４０】
（付記３）
付記１に記載のサソリ毒耐熱合成ペプチドのてんかん、アルツハイマー病やパーキンソン病の治療薬としての用途。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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