(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞。
【請求項２】
前記幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性の表面因子発現特性を有することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
前記幹細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の表面因子発現特性を有することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞。
【請求項４】
前記純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、絨毛膜と脱落膜との間に位置した栄養膜層中、絨毛膜絨毛を除いた組織から由来したことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の幹細胞。
【請求項５】
胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞を有効成分として含む細胞治療剤。
【請求項６】
前記幹細胞は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞、神経細胞、靭帯細胞及び腱細胞からなる群から選択された１種以上に分化されることを特徴とする、請求項５に記載の細胞治療剤。
【請求項７】
前記細胞治療剤は、軟骨損傷、軟骨欠陥、骨欠損、腱・靭帯欠損、または脂肪組織欠損の治療用であることを特徴とする、請求項５または６に記載の細胞治療剤。
【請求項８】
前記軟骨欠陥は、軟骨外傷、軟骨破裂、軟骨軟化、軟骨壊死、骨軟骨炎、軟骨欠損及び骨関節炎からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項７に記載の細胞治療剤。
【請求項９】
胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞を有効成分として含む組織再生用組成物。
【請求項１０】
前記組織は、軟骨、脂肪、骨、神経、靭帯及び腱からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記軟骨は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、繊維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）または弾性軟骨（ｅｌａｓｔｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記軟骨は、関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、耳軟骨、鼻軟骨、肘軟骨、半月状軟骨（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、膝軟骨、肋軟骨、足首軟骨、器官軟骨、喉頭軟骨及び脊椎軟骨で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（絨毛膜絨毛を除いた栄養膜層、ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞及びそれを含む細胞治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の生命工学は、ヒト福祉を最終目標として、食糧、環境、健康問題に新たな解決策の可能性を提示しており、そのうち、幹細胞を用いた技術は、難病治療の新たな地平を開いている。これまでは、ヒトの難病治療のために、臓器移植、遺伝子治療等が提示されていたが、免疫拒否と供給臓器不足、ベクター開発や疾患遺伝子に対する知識不足により、効率的な実用化が微弱であった。そこで、幹細胞への関心が高まり、増殖と分化を通して全ての器官を形成する能力を有する万能幹細胞がほとんどの疾患治療はもちろん、臓器き損を根源的に解決できるものと認識された。また、多くの科学者が、人体のほとんどの臓器再生はもちろん、難病であったパーキンソン病、各種の癌、糖尿病と脊髄損傷等の治療に至るまで幹細胞の適用可能性を多様に提示してきた。
【０００３】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、未分化された細胞であって、自己複製能を有し、かつ二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。幹細胞は、分化能によって、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、全分化能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、多分化能（多能性）幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に分類でき、細胞学的由来によって、胚芽幹細胞と成体幹細胞とに区別できる。胚芽幹細胞は、着床前受精卵や発生中の胎児生殖器組織等に由来するのに対し、成体幹細胞は、成体内で存在する各器官、例えば、骨髄、脳、肝臓、すい臓等に由来する。
【０００４】
胚芽幹細胞は、倫理的に制限があるため、細胞治療剤として用いるための限界があった。これに対し、成体幹細胞は、主に脂肪、臍帯血、骨髄及び胎盤等から採取が可能であり、倫理的な問題がなく、特に、脂肪組織にある脂肪幹細胞と出産時に胎盤に存在する胎盤幹細胞は、安全でありながらも分化能力に優れるため、現代医学で治療が厳しい難治性疾患である糖尿、認知症、退行性関節炎、心筋梗塞、脳梗塞、腎不全等の様々な細胞損傷疾患の症状を改善するのに活用できる。
【０００５】
このうち、胎盤由来幹細胞の場合、出産後に廃棄される胎盤を利用することにより、採取が容易で多量の幹細胞を容易に確保可能な長所がある。脂肪や骨髄由来幹細胞は、分離、抽出されるドナーの年齢や健康状態等に影響を受け、増殖力や分化能等に制限があり、変動性が多いが、胎盤由来幹細胞の場合、成体幹細胞のうち最も早い時期に収得できる幹細胞であって、ドナーの年齢等の変数によって幹細胞能にほとんど影響を受けず、優れた増殖力及び分化能を有する。また、胎盤由来幹細胞は、神経系疾患、肝臓疾患、筋骨格系疾患等、様々な疾患に活用可能な幹細胞群を分離することができる。
【０００６】
上述した長所のため、胎盤由来幹細胞に関する研究が盛んに進んでいる。例えば、大韓民国特許登録第８１８２１４号には、ＮＡＣ（Ｎ−ａｃｒｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）含有培地を利用して羊膜または脱落膜から幹細胞を分離する方法が開示されており、大韓民国特許登録第８７１９８４号には、ｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）含有培地を利用して羊膜、漿膜、基底脱落膜及び胎盤組織から由来した幹細胞を培養する方法が開示されており、大韓民国公開特許第１０−２００７−００５２２０４号には、胎盤栄養膜の胎盤絨毛（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｉ）から幹細胞を分離する方法が開示されている。しかし、今まで胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞についての研究は行われていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明者らは、胎盤由来幹細胞の中でも幹細胞能にさらに優れた幹細胞を見つけるための研究を続けた結果、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（絨毛膜絨毛を除いた栄養膜層、ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞が、従来の胎盤全体由来幹細胞に比べて均質な成長特性、優れた増殖特性及び分化特性を示し、特に、軟骨細胞への分化能に優れて細胞治療剤として有用に利用され得ることを確認することで、本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明の目的は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞を提供することである。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞または前記幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む細胞治療剤及び組織再生用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞を提供する。
【００１１】
また、本発明は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞または前記幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。
【００１２】
また、本発明は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞または前記幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む組織再生用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る純粋栄養膜層（絨毛膜絨毛を除いた栄養膜層、ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞は、従来の胎盤全体から由来した幹細胞に比べて均質な成長特性、優れた増殖特性及び分化特性を示し、特に、軟骨細胞への分化能に優れて軟骨損傷または軟骨欠損等の治療のための細胞治療剤及び組織再生用組成物として有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】胎盤の断面を示す顕微鏡写真であって、上から胎盤の羊膜上皮（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ；ＡＥ）、羊膜（ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；ＡＭ）、絨毛膜（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ；ＣＭ）、純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ；ＣＴ−Ｖ）、絨毛膜絨毛（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｉ；ＣＶ）及び脱落膜（ｄｅｃｉｄｕａ；ＤＣ）が順に積層された形態を示した図である。
【図２】本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の継代培養する前（Ｐ０）と長期間継代培養した後（Ｐ２８）の細胞形態を顕微鏡で観察した写真（×１００）を示した図である。
【図３】胎盤全体由来幹細胞の継代培養する前（Ｐ０）と長期間継代培養した後（Ｐ２９）の細胞形態を顕微鏡で観察した写真（×１００）を示した図である。
【図４】胎盤全体由来幹細胞及び純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の集落形成単位を示した図である。
【図５】胎盤全体由来幹細胞及び純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の集団倍加時間を示した図である。
【図６】本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の表面因子発現特性を確認するためのフローサイトメトリー結果を示した図である。
【図７】胎盤全体由来幹細胞及び純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）または骨細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）への分化程度を観察するための各染色結果を示した図である。
【図８】胎盤全体由来幹細胞及び純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の軟骨細胞への分化程度を観察するために、Ｓａｐａｒｉｎ−Ｏで染色した後、定量化した結果を示した図である。
【図９】胎盤全体由来幹細胞及び純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の軟骨細胞への分化程度を観察するために、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎを用いた免疫組織化学染色を行った後、定量化した結果を示した図である。
【図１０】胎盤全体由来幹細胞及び純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞の脂肪細胞、軟骨細胞または骨細胞への分化程度を比較分析した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
本発明は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞を提供する。
【００１７】
本発明において、「幹細胞」とは、自己複製能を有し、かつ二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。幹細胞は、分化能によって、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、全分化能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、多分化能（多能性）幹細胞（ｍｕｌｔｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）に分類できる。
【００１８】
本発明において、「万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」とは、一つの完全な個体に発生して行くことのできる万能の性質を有する細胞であって、卵子と精子の受精以後８細胞期までの細胞がこのような性質を有し、この細胞を分離して子宮に移植すれば、一つの完全な個体に発生して行くことのできる細胞を意味する。本発明において、「全分化能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」とは、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の様々な細胞と組織に発生できる細胞であって、受精４〜５日後に現れる胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置した内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）に由来し、これを胚芽幹細胞と称し、様々な他の組織細胞に分化するが、新たな生命体を形成することはできない細胞を意味する。本発明において、「多分化能幹細胞」は、幹細胞が含まれている組織及び器官を形成する特異的な細胞にのみ分化できる細胞を意味する。本発明の目的上、前記「幹細胞」は、好ましくは、多分化能幹細胞である。
【００１９】
本発明において、「胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）」とは、妊娠中に胎児のために作られる生体内組織を意味するが、重さ５００〜６００ｇ、直径１５〜２０ｃｍ、厚さ２〜３ｃｍ程度の円盤形態である。胎盤の一方は、母体と当たって、他方は胎児と当たっており、その間で母体の血液と胎児の血管との間に栄養分及び酸素の伝達がなされるようになる。胎盤は、大きく羊膜、絨毛膜、脱落膜の３層に区別でき、より詳細には、羊膜上皮、羊膜、絨毛膜、栄養膜層、脱落膜に区別できる。脱落膜は、受精卵が子宮に着床するために、子宮の上皮細胞が変形されて形成された膜である。胎盤の断面図を、図１に簡略に示している。
【００２０】
本発明において、「純粋栄養膜層」とは、絨毛膜と脱落膜との間に位置した栄養膜層中、絨毛膜絨毛を除いた組織を意味する。
【００２１】
本発明に係る純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、胎盤から分離した純粋栄養膜層組織に酵素溶液を加え、酵素反応を行って得られた細胞を、成長因子を使用せず、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加された培地で培養した後、回収することにより収得され得る。
【００２２】
より具体的には、本発明に係る純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、下記のようなステップを通して収得され得る。
【００２３】
（ａ）胎盤から細部組織である純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ；ＣＴ−Ｖ）を分離するステップ；
（ｂ）前記分離された純粋栄養膜層組織にトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）及びエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）からなる群から選択された１種以上の酵素を処理し、純粋栄養膜層由来の細胞を収得するステップ；及び
（ｃ）前記収得した純粋栄養膜層由来の細胞から幹細胞を選別するステップ。
【００２４】
以下、本発明の純粋栄養膜層から幹細胞の製造方法を各ステップ別に具体的に説明する。
【００２５】
前記（ａ）ステップは、胎盤から細部組織である純粋栄養膜層を分離するステップであって、分離方法は、特にこれに制限されないが、フォーセップス（forceps）、メス等を用いた機械的分離方法、酵素的処理を用いた化学的分離方法等によって行われ得る。また、（ａ）ステップ以後に前記分離された組織を洗浄して胎盤から由来した血液を除去することが好ましく、このとき、洗浄液としてＰＢＳを利用することができ、これに制限されない。
【００２６】
前記（ｂ）ステップは、純粋栄養膜層組織にトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、リパーゼ（ｌｉｐａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）及びエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）からなる群から選択された１種以上の酵素を処理し、純粋栄養膜層由来の細胞を収得するステップである。前記コラゲナーゼは、コラゲナーゼＡ、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ等を含む。前記酵素の反応を終了する方法は、特にこれに制限されないが、ウシ胎児血清を含む培地を追加する方法を用いることが好ましい。
【００２７】
前記（ｃ）ステップは、純粋栄養膜層由来の細胞から幹細胞を選別するステップであって、選別方法は、特にこれに制限されないが、前記（ｂ）ステップを通して収得した純粋栄養膜層由来の細胞を培養容器で培養し、前記培養容器の下部に付着して付着培養される細胞を選別する方法によって行われることが好ましい。このとき、培養時に用いられる培地は、幹細胞の培養に用いられる全ての培地を用いることができ、特にこれに制限されないが、成長因子を含まない血清及び抗生剤を含む培地を用いることが好ましい。
【００２８】
本発明の一実施例によると、前記（ｂ）ステップで収得した細胞をメッシュにろ過して分解されていない組織を除去し、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加された培地を利用して洗浄する。前記洗浄された細胞を、成長因子を含まず、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加された培地で培養し、培養容器の底に付着される中間葉幹細胞を選別する。前記選別された中間葉幹細胞は、外形的には、突起及び長い形態を示し、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）と類似した形態学的特性を示す。
【００２９】
本発明に係る胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、下記のような特徴を示す。
【００３０】
（ａ）線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌ）形状の形態学的特徴；
（ｂ）２５〜３０以上の継代数に達するように長期間の間増殖できる能力；
（ｃ）脂肪細胞、軟骨細胞または骨細胞に分化できる能力；
（ｄ）集落形成能；
（ｅ）ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性の免疫学的特性；及び、
（ｆ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的特性；
本発明に係る純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、下記方法によって互いに異なる種類の細胞に分化でき、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、神経細胞、靭帯細胞または腱細胞（ｔｅｎｏｃｙｔｅ）等、様々な種類の細胞に分化でき、これに制限されない。
【００３１】
本発明において、「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」とは、一般的に比較的単純な系が２つ以上の質的に異なる部分系に分離される現象を意味するが、具体的には、細胞が分裂増殖して成長する間に互いに構造や機能が特殊化する現象、即ち、生物の細胞、組織等がそれぞれに与えられたことを果たすために形態や機能が変わって行く現象を意味する。相対的に、「未分化」とは、上述した分化が生じない、未だ幹細胞としての特徴を含有している状態を意味する。
【００３２】
幹細胞を分化させる方法は、従来、公知になった方法によって行われ得、特に制限されない。例えば、前記幹細胞をデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、インスリン及びＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）を含む培地で培養して脂肪細胞に分化させる方法；前記幹細胞をデキサメタゾン、ＢＭＰ−６（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）及びＬ−プロリン（Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ）を含む培地で培養して軟骨細胞に分化させる方法；前記幹細胞をデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリクロホスフェート（β−ｇｌｙｃｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びアスコルビン酸−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む培地に培養して骨細胞に分化させる方法等を用いることが好ましい。
【００３３】
前記方法で分化された純粋栄養膜層から由来した幹細胞の分化程度を測定する方法は、特にこれに制限されないが、当該分野に公知になった技法であるフローサイトメトリー法、免疫細胞化学的方法、ＰＣＲまたは遺伝子−発現プロファイルを用いて細胞表面標識または形態の変化を測定する方法、光学顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて細胞の形態変化を調査する方法、遺伝子発現プロファイルの変化を測定する方法等を用いることができ、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｏｉｌ−ｒｅｄ  Ｏ染色法、Ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色法、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ免疫組織化学染色法、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）染色法またはＡｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ  Ｓ染色法等を利用することができる。
【００３４】
本発明に係る純粋栄養膜層（絨毛膜絨毛を除いた栄養膜層、ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞は、従来の胎盤全体から由来した幹細胞に比べて均質な成長特性、優れた増殖特性及び分化特性を示し、特に、軟骨細胞への分化能に優れている。
【００３５】
従って、本発明は、胎盤の細部組織である純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞または前記幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。
【００３６】
前記分化した細胞は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞、神経細胞、靭帯細胞、腱細胞等を含み、治療目的に合わせて選択され得る。
【００３７】
本発明の用語「細胞治療剤（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」とは、ヒトから分離、培養及び特殊な操作を通して製造された細胞及び組織で治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品（米国ＦＤＡ規定）であって、細胞あるいは組織の機能を復元させるために、生きている自家、同種、または異種細胞を体外で増殖選別するか、または他の方法で細胞の生物学的特性を変化させる等の一連の行為を通して、このような細胞が疾患の治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品を意味する。
【００３８】
好ましくは、本発明の細胞治療剤は、軟骨損傷、軟骨欠陥、骨欠損、腱・靭帯欠損、または脂肪組織欠損等への治療用として利用され得る。
【００３９】
本発明において、「軟骨欠陥」とは、身体内に含まれる軟骨に損傷、欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）または不足のある場合を包括する意味であって、例えば、軟骨外傷、軟骨破裂、軟骨軟化、軟骨壊死、骨軟骨炎、軟骨欠損または骨関節炎等を含むが、これに制限されない。
【００４０】
本発明の純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、身体の組織または器官が目的とする細胞群集、例えば、幹細胞または分化細胞群集の生着、移植または注入により調整、強化、治療または代替される様々な種類の治療プロトコルに用いられ得る。本発明の純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、存在する組織を代替または強化させ、新しいか、または変化した組織になるようにするか、または生物学的組織あるいは構造と結合させることができる。
【００４１】
また、本発明の純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、関節内に投与することで関節軟骨の病変を治療するか、または腱あるいは靭帯部位に投与することで治療あるいは予防する等の目的で用いられ得る。例えば、本発明の純粋栄養膜層から由来した幹細胞を関節や腱、または靭帯部位に投与することで前記組織の損傷部位に対する回復や調整を図るか、または本発明の純粋栄養膜層から由来した幹細胞から由来した軟骨組織構成物等の幹細胞由来の物質を利用して関節（例えば、膝関節等）の組織を再構成するか、または再生等の方法で治療するのに用いられ得る。
【００４２】
本発明の細胞治療剤の好適な投与量は、個体の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適切に選択され得る。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】
また、本発明は、純粋栄養膜層から由来した幹細胞または前記幹細胞から分化した細胞を有効成分として含む組織再生用組成物を提供する。
【００４４】
前記組織は、特に制限されないが、軟骨、脂肪、骨、神経、靭帯、腱等の組織を含み、好ましくは、軟骨である。
【００４５】
前記軟骨は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、繊維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）または弾性軟骨（ｅｌａｓｔｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ）等を含み、例えば、関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、耳軟骨、鼻軟骨、肘軟骨、半月状軟骨（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、膝軟骨、肋軟骨、足首軟骨、器官軟骨、喉頭軟骨または脊椎軟骨であってよいが、これに制限されない。
【００４６】
以下、下記実施例を通して、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を詳細に説明するためのものであって、本発明の範囲は、これらの実施例により制限されるものではない。
【００４７】
実施例１：胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の収得
胎盤は、サムスンソウル病院臨床試験倫理委員会指針書によってサムスンソウル病院で帝王切開した正常分娩で寄贈に同意した産婦から収集した。胎盤組織は、滅菌された容器に入れて移した。移した胎盤組織から羊膜を剥離した後、絨毛膜（ＣＭ）と脱落膜（ＤＣ）との間に位置した栄養膜層を分離し、前記栄養膜層中、絨毛膜絨毛を除いた純粋栄養膜層（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｌａｙｅｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｖｉｌｌｉ、ＣＴ−Ｖ）を滅菌されたフォーセップス（forceps）とメスを利用して注意深く分離した。胎盤の断面図を図１に示した。
【００４８】
分離された純粋栄養膜層組織を、ＰＢＳを利用して数回洗浄し、血液及び血球細胞を除去した後に組織をできる限り細かく切った後、０．２％コラゲナーゼを添加したＤＭＥＭ培地を加え、３７℃で撹拌機を利用して２〜３時間反応させ、純粋栄養膜層から由来した細胞を収得した。
【００４９】
前記収得した純粋栄養膜層組織から由来した細胞を７０μｍメッシュにろ過して分解されない組織を除去し、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地を加えた後、２５℃、１０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清液を除去して残った沈殿した細胞に成長因子を含まず、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。前記培養物から培養容器の底に付着した細胞を選別し、純粋栄養膜層から由来した幹細胞を収得した。
【００５０】
比較例１：胎盤全体から由来した幹細胞の収得
全体胎盤組織を細切し、ＰＢＳで洗浄して胎盤組織から血液及び血球細胞を除去した。前記洗浄された胎盤組織に０．２％コラゲナーゼを添加したＤＭＥＭ培地を加え、３７℃で撹拌機を利用して反応させ、胎盤細胞を収得した。前記収得した胎盤細胞を７０μｍメッシュにろ過して分解されない組織を除去し、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地を加えた後、２５℃、１０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清液を除去して残った沈殿した細胞に成長因子を含まず、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。前記培養物から培養容器の底に付着した細胞を選別し、胎盤全体（Ｗｈｏｌｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ、Ｐｌａ）由来幹細胞を収得した。
【００５１】
実施例２：胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の継代培養
前記実施例１で収得した胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞をＰＢＳで洗浄した後、成長因子を含まず、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地を２〜３日毎に取り替えながら培養した。前記幹細胞が８０％以上成長した時点でトリプル（ＴｒｙＰＬＥ）を処理して幹細胞を培養容器から分離し、分離された幹細胞を１／４の割合で希釈した後、他の培養容器で培養する方法で継代培養を行った。前記のような継代培養を繰り返して行いながら、それ以上継代培養されない継代数（ｐａｓｓａｇｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を測定し、継代培養する前（Ｐ０）と長期間の間継代培養した後の細胞形態を顕微鏡で観察した。また、前記比較例１で収得した胎盤全体（Ｗｈｏｌｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ、Ｐｌａ）由来幹細胞を利用して、同様の方法で継代培養を行った後、継代培養する前（Ｐ０）と長期間の間継代培養した後の細胞形態を顕微鏡で観察した。これをそれぞれ図２及び図３に示した。
【００５２】
図２に示したように、本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞は、線維芽細胞形状の形態学的特徴を示し、継代数が２８に達するまで優れた増殖能を有しており、長期間培養が可能であることを確認した。
【００５３】
また、図３に示したように、胎盤全体（Ｗｈｏｌｅ  ｐｌａｃｅｎｔａ、Ｐｌａ）由来幹細胞は、継代培養初期から線維芽細胞形状の形態的特性を示し、一つの形態ではなく多数の互いに異なる形態の細胞が混合されていることを確認することができた。即ち、本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞（図２）と比較すると、継代培養前後で純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）から由来した幹細胞は、単一の細胞だけを特異的に維持していたが、胎盤全体から由来した幹細胞は、互いに異なる形態の細胞が混合されていた。
【００５４】
実施例３：胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の集落形成能分析
前記実施例１で収得した胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の集落形成能を確認した。より具体的には、前記実施例１で収得した純粋栄養膜層から由来した幹細胞を前記実施例２の方法で第一の継代培養を行い、前記継代培養が終了する時点で１００ｍｍの皿に５×１０３個ずつ接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、１０日間成長因子を含まず、ウシ胎児血清及び抗生剤が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。前記培養された幹細胞を対象にギムザ染色法（Ｇｉｅｍｓａ  ｓｔａｉｎ）を実施して幹細胞でいくつの集落が形成されるかを計数し、これらの平均値を算出した。また、前記比較例１で収得した胎盤全体由来幹細胞を利用して、同様の方法で集落形成能を測定し、その結果値を１００％として換算した。その結果を図４に示した。
【００５５】
図４に示したように、本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞は、胎盤全体由来幹細胞より集落形成能に優れていることを確認した。
【００５６】
実施例４：胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の集団倍加時間分析
前記実施例１で収得した胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の集団倍加時間を測定した。より具体的には、前記実施例１で収得した純粋栄養膜層から由来した幹細胞を前記実施例２の方法で第一の継代培養を行い、２〜３日間隔で細胞を収得及び継代培養を繰り返した。細胞の収得時は、増加した細胞の数を確認し、継代時は、３×１０５個の細胞を１００ｍｍの皿に培養をした。継代過程中にそれ以上細胞の数が増加しない時点を最終的に増加されない時点に定めた。倍加時間は、Ｐ２からＰ６まで継代培養された細胞数で測定し、下記のように計算した。また、前記比較例１で収得した胎盤全体由来幹細胞を利用して、同様の方法で集団倍加時間を計算した。その結果を図５に示した。
【００５７】
倍加時間＝培養された時間／倍加
倍加＝ｌｏｇ（Ｎ初期細胞数／Ｎ増加した細胞数）／ｌｏｇ２
図５に示したように、本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞は、胎盤全体由来幹細胞より集団倍加時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）が短く、細胞増殖が速いことを確認した。
【００５８】
実施例５：胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の表面マーカー分析
前記実施例１で収得した胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の免疫学的特性を確認するために、下記のような実験を行った。先ず、純粋栄養膜層から由来した幹細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプル処理した後、幹細胞を回収して１０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清液を除去した後、非特異的結合を抑制するために、２％ＦＢＳ及びＰＢＳの混合液を入れて幹細胞を洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清液を除去した後、幹細胞をＰＢＳに浮遊させ、１×１０５ｃｅｌｌずつフローサイトメーター専用の丸底フラスコに分注した。ここに抗体（ＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れて、氷で３０分間インキュベーションした後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。再び上清液を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。前記過程を２回繰り返した。最後に、上清液を除去した後、幹細胞をシングル化し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を利用して免疫学的特性を分析した。また、同様の方法で前記比較例１で収得した胎盤全体由来幹細胞の免疫学的特性を分析した。その結果を表１及び図６に示した。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
表１及び図６に示したように、本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性の標識因子発現特性を示し、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の標識因子発現特性を示すことを確認した。
【００６１】
実施例６：胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の軟骨細胞への分化能確認
前記実施例１で収得した胎盤の細部組織である純粋栄養膜層から由来した幹細胞の軟骨細胞への分化能を確認するために、幹細胞を公知になった軟骨細胞分化誘導培地（０．１μＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、４０μｇ／ｍｌ  Ｌ−プロリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β３、５００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−６、５０ｍｇ／ｍｌ  ＩＴＳ  ｐｒｅｍｉｘが含まれたＤＭＥＭ培地）で３週間培養し、軟骨細胞への分化を誘導した。前記幹細胞の軟骨細胞への分化程度を測定するために、従来、公知になった方法によってＳａｆｒａｎｉｎ−Ｏ染色及びＴｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎを用いた免疫化学染色法を行った。また、同様の方法で前記比較例１で収得した胎盤全体由来幹細胞の軟骨細胞への分化能を測定した。その結果を図７乃至図９に示した。
【００６２】
図７乃至図９に示したように、本発明に係る純粋栄養膜層（ＣＴ−Ｖ）由来幹細胞は、胎盤全体由来幹細胞より均一に軟骨細胞に分化できる優れた軟骨細胞分化能を有していることを確認した。
【００６３】
特に、従来、公知になった方法によって純粋栄養膜層から由来した幹細胞と胎盤全体由来幹細胞の骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞への分化能を比較分析した結果、純粋栄養膜層から由来した幹細胞は、脂肪細胞や骨細胞への分化程度は胎盤全体由来幹細胞と類似しているが、軟骨細胞への分化能に特に優れていた（図１０）。
【００６４】
これを通して、胎盤全体由来幹細胞は、様々な組織から由来した互いに異なる分化パターンを有する幹細胞が混在しており、目的とする細胞治療効果を奏するのに多少不足するが、本発明に係る純粋栄養膜層から由来した幹細胞を利用する場合、均質な特性を有する細胞だけを利用することができ、軟骨細胞への分化能に優れ、軟骨損傷や軟骨再生が必要な疾患の細胞治療剤に適用する場合、優れた効果を示すことを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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