(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒生デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質および１つ以上の構造タンパク質をコードし、かつ第２のデングウイルス由来の１つ以上の構造タンパク質を少なくともコードする核酸配列を含むキメラフラビウイルス構築物を含む核酸分子であって、第２のデングウイルスが、デング−１、デング−３またはデング−４ウイルスから選択され、前記キメラ構築物は、以下のうちの１つ以上の突然変異：
エンベロープ（Ｅ）タンパク質が前記第２のデングウイルスに由来する時、デング−４のＥタンパク質のアミノ酸４１７位と同義のアミノ酸位置における、グルタミン酸から正に荷電した残基へのＥタンパク質の突然変異；
弱毒生デング−２ウイルスのカプシド（Ｃ）タンパク質のアミノ酸１０７位と同義のアミノ酸位置におけるＣタンパク質の突然変異であって、弱毒生デング−２におけるアミノ酸から芳香族アミノ酸残基への突然変異；および
弱毒生デング−２のＮＳ４Ａのアミノ酸１７位と同義のアミノ酸位置における、メチオニンからロイシンへのＮＳ４Ａの突然変異
を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記第２のデングウイルスがデング−４である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
少なくとも第２のデングウイルスにおいて、前記アミノ酸４１７位と同義の位置がグルタミン酸の代わりにリジンである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記アミノ酸１０７位と同義の位置における芳香族アミノ酸がチロシンである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記弱毒生デング−２が５’ＮＣＲの５７位の突然変異、ＮＳ１の５３位の突然変異およびＮＳ３の２５０位の突然変異を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記弱毒生デング−２がＮＳ１の５３位の突然変異およびＮＳ３の２５０位の突然変異を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
弱毒デング−２のアミノ酸１０２〜１０６位が、デング−４ウイルスのこれらの位置における同義のアミノ酸に置換されている、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項８】
第３の異なるフラビウイルス由来の構造タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記第３の異なるフラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、および黄熱ウイルスのうちから選択される、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載の核酸分子を１つ以上と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１１】
追加のデング−デングキメラ構築物をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
二価、三価または四価のデングウイルス組成物の一部を構成している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
他の弱毒生フラビウイルスをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
前記医薬は、対象においてデング−１、デング−２、デング−３およびデング−４のうちの少なくとも１つに対する免疫応答を誘導するためのものである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１０に記載の組成物を１つ以上と、容器とを含むキット。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸分子を含む弱毒生ウイルス。
【請求項１８】
配列番号２２（ＤＥＮＶａｘ４ｅ）、配列番号９（ＤＥＮＶａｘ４ｉ）または配列番号２４（ＤＥＮＶａｘ４ｈ）を含む弱毒生デング−４キメラウイルス。
【請求項１９】
請求項１８に記載の弱毒生デング−４キメラウイルスを１つ以上と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項２０】
対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項１９に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
デング−４が株１０３６に由来する、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記弱毒生デング−２ウイルスが、突然変異したＰＤＫ−５３骨格を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
２種以上のデングウイルス血清型に対する免疫原性組成物の一部を構成している、請求項１７に記載の弱毒生ウイルス。
【請求項２４】
弱毒生デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質および１つ以上の構造タンパク質と、デング−４由来の１つ以上の構造タンパク質とをコードする核酸配列を含むキメラフラビウイルス構築物を含む核酸分子であって、弱毒生デング−２は、
ＮＳ１の５３位の突然変異およびＮＳ３の２５０位の突然変異を含み、前記デング−４由来の１つ以上の構造タンパク質は、
デング−４のエンベロープ（Ｅ）タンパク質のアミノ酸４１７位と同義のアミノ酸位置における、グルタミン酸から正に荷電した残基へのＥタンパク質の突然変異を含む、核酸分子。
【請求項２５】
前記弱毒生デング−２ウイルスが５’ＮＣＲの５７位の突然変異を含む、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
第３の異なるフラビウイルス由来の構造タンパク質をさらに含む、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２７】
前記第３の異なるフラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、および黄熱ウイルスのうちから選択される、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
弱毒生デング−２／４キメラを含む弱毒生デングウイルスを含む四価のデングウイルス組成物であって、
前記弱毒生デング−２／４キメラは、デング−４ウイルスに由来する１つ以上の構造タンパク質を有する弱毒生デング−２ウイルスと、１つ以上の弱毒生フラビウイルスまたは１つ以上のフラビウイルスキメラとを含み、前記弱毒生デング−２／４キメラは以下のうちの１つ以上の突然変異：
エンベロープ（Ｅ）タンパク質がデング−４に由来する時、デング−４のＥタンパク質のアミノ酸４１７位と同義のアミノ酸位置における、グルタミン酸から正に荷電したアミノ酸残基へのＥタンパク質の突然変異；
前記キメラのカプシド（Ｃ）タンパク質のアミノ酸１０７位と同義のアミノ酸位置におけるＣタンパク質の突然変異であって、芳香族アミノ酸残基への突然変異；および
弱毒生デング−２の非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）のアミノ酸１７位と同義のアミノ酸位置におけるＮＳ４Ａの突然変異であって、デング−２／４キメラのデング−２骨格におけるＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸１７位と同義の位置における、メチオニンからロイシンへの突然変異
をさらに含み、前記組成物はデング−１、デング−２、デング−３、およびデング−４の全４種のデングウイルス血清型を含む、組成物。
【請求項２９】
デング−４ウイルスは、デング−２ウイルスよりも少なくとも１ｌｏｇ多い量で前記組成物中に存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
デング−１またはデング−３ウイルスは、デング−２／１およびデング−２／３キメラの少なくとも一方を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物中のデング−１：デング−２：デング−３：デング−４のｌｏｇプラーク形成単位（ｐｆｕ）比が、１：１：１：２、１：２：１：３、１：３：１：４、２：３：３：４、５：４：５：５、４：４：４：５、４：４：５：５、４：４：５：６、または４：３：４：５ｌｏｇ  ｐｆｕである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
デング−２／４キメラのアミノ酸４１７位と同義の位置がグルタミン酸残基の代わりにリジンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
デング−２／４キメラのアミノ酸１０７位と同義の位置における芳香族アミノ酸がチロシンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
デング−２／４キメラのデング−２骨格が５’ＮＣＲの５７位の突然変異、ＮＳ１の５３位の突然変異およびＮＳ３の２５０位の突然変異を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
デング−２／４キメラのデング−２骨格がＮＳ１の５３位の突然変異およびＮＳ３の２５０位の突然変異を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
デング−２／４キメラのアミノ酸１０２〜１０６位が、デング−４ウイルスのこれらの位置における同義のアミノ酸に置換されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
デング−２／４キメラ構築物が、配列番号２２（ＤＥＮＶａｘ４ｅ）、配列番号９（ＤＥＮＶａｘ４ｉ）または配列番号２４（ＤＥＮＶａｘ４ｈ）で表されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３８】
前記１つ以上のフラビウイルスキメラは、デングウイルスと、デングウイルスでない他のフラビウイルスとの組合せを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３９】
前記デングウイルスでない他のフラビウイルスが、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、および黄熱ウイルスのうちから選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記フラビウイルスキメラは、デング−黄熱フラビウイルスキメラを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項４２】
対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬の製造における、請求項４１に記載の組成物の使用。
【請求項４３】
前記組成物が、対象に皮下、筋肉内、皮内、鼻腔内、経口、局所、経皮、非経口、胃腸内、経気管支または経肺胞投与されるように製剤化されている、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の組成物と、適切な容器とを含むキット。
【請求項４５】
前記組成物は、配列番号１５、１７、１９、または２１で表される１つ以上のポリペプチドを含む、請求項２８〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔連邦政府資金による研究〕
本願に開示されるいくつかの実施形態は、アメリカ国立衛生研究所の認可番号Ｒ４３ＡＩ０８４２９１−０１によって一部援助された。米国政府は対象の発明を実施する特定の権利を有し得る。
【０００２】
〔分野〕
本願の実施形態はデング−ウイルス４（ＤＥＮＶ−４）構築物に関する組成物、方法および使用を報告する。いくつかの実施形態は、限定するものではないが、本願に開示のＤＥＮＶ−４ウイルス構築物を単独で、または他の構築物と組み合わせてワクチン組成物中で使用可能な組成物に関する。ある実施形態において、組成物は例えばデング−１（ＤＥＮ−１）ウイルス、デング−２（ＤＥＮ−２）ウイルス、またはデング−３（ＤＥＮ−３）ウイルスとＤＥＮＶ−４ウイルスキメラ構築物とを組み合わせた二価、三価または四価製剤のような、デングウイルスの２種以上の血清型のキメラ構築物を含むことができる。他の実施形態では、本願に開示のＤＥＮＶ−４キメラ構築物（デング−デングキメラ）は他のフラビウイルス構築物と組み合わされてもよい。ある実施形態は、他のデング血清型の成分、例えば構造要素を有するＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含む。他の実施形態は、対象に投与されるとその対象においてＤＥＮＶ−４に対し他の構築物よりも改善された免疫応答を誘導するワクチン組成物におけるＤＥＮＶ−４ウイルスキメラ構築物に関する方法および使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
デングウイルスによる感染は、痛みを伴う発熱を様々な重症度でもたらし得る。今のところ、デングウイルスの５種類の血清型が特定されており、これらはデング−１（ＤＥＮ−１）、デング−２（ＤＥＮ−２）、またはデング−３（ＤＥＮ−３）、デング−４（ＤＥＮ−４）およびデング−５（ＤＥＮ−５）である。デング熱はデングウイルスの感染によって生じる。デングウイルス血清型１〜４は、デング出血熱（ＤＨＦ）およびデングショック症候群（ＤＳＳ）を引き起こすこともある。感染の最も深刻な結果であるＤＨＦおよびＤＳＳは生命に関わることがある。デングウイルスは毎年５千万〜１億症例の消耗性デング熱、５００，０００症例のＤＨＦ／ＤＳＳ、および２０，０００を超える死亡例を引き起こしている。今のところ、デング熱から保護するための有効なワクチンはなく、この疾患に対する薬物療法もない。蚊を駆除する努力も、流行地域でのデングの大流行やこの疾患の更なる地理的拡大を防ぐのに効果を上げていない。推定では、３５億人がデングウイルスの感染に脅かさている。さらに、デングウイルスは、アジア、中央アメリカ、南アメリカ、およびカリブ海のような流行地域への旅行者の発熱の一番の原因である。
【０００４】
全４種のデングウイルス血清型は、世界の熱帯地域および亜熱帯地域の全域に特有であり、世界的に見て人に対して最も脅威的な蚊媒介性ウイルスとなっている。デングウイルスは主にネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）を介してヒトに伝染する。１種のデングウイルス血清型に感染すると、その血清型による再感染から生涯にわたり防御されるが、他の３種のデングウイルス血清型のうちの１つによる二次感染は防御しない。実際、１種のデングウイルス血清型による以前の感染は、異なる血清型に二次感染した時に深刻な疾患（ＤＨＦ／ＤＳＳ）のリスクを高める可能性がある。有効なワクチンを開発することが、この世界的な流行性疾患を予防および抑制するのに重要なアプローチとなる。
【発明の概要】
【０００５】
本願の実施形態は、ＤＥＮＶキメラ構築物、例えばＤＥＮＶ−４の組成物、方法および使用に関する。いくつかの実施形態において、組成物はＤＥＮＶ−４ウイルスキメラ構築物を単独で、または他のデングウイルス血清型構築物と、あるいは同じ血清型または他の血清型の弱毒生デングウイルスと、もしくは標的ウイルス（例えばデングウイルス）に対する免疫応答を誘導可能な他のフラビウイルス構築物と組み合わせて含むことができる。他の実施形態は、ＤＥＮＶ−４の弱毒生ウイルス構築物と、任意選択でＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−３に対する１種以上の弱毒生ウイルス構築物との組成物を含んでもよい。他の実施形態において、対象に導入された時に強力な免疫原性を持つＤＥＮＶ−４弱毒生キメラウイルス構築物を含む免疫原性組成物が提供される。これらの実施形態に従って、これらの弱毒生ウイルス構築物は単独で、または１種以上の他のＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−３構築物と、そしてデングウイルス血清型に対するワクチン製剤を形成するために薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて使用可能である。ある実施形態では、１種以上のデングウイルスに対する一価、二価、三価または四価の薬学的に有効な製剤が形成される。ある実施形態では、免疫原性組成物は、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３デング−デングキメラ構築物のうちの１種以上を、本願に開示のキメラＤＥＮＶ−４構築物と組み合わせて含むことができる。
【０００６】
ある実施形態では、本発明のＤＥＮＶ−４構築物をＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−３のうちの１種以上と組み合わせて含む免疫原性組成物は、単一のワクチン投与で２種以上のデングウイルス血清型に対する同時防御を与えるために使用することができる。他の実施形態において、本願に開示の実施形態のＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３および改変型または突然変異型ＤＥＮＶ−４構築物を含む免疫原性組成物は、各デングウイルス血清型に対して改善された免疫原生応答であって、ＤＥＮＶ−４に対する免疫応答干渉の低減された免疫原生応答を誘導するために対象に投与されてもよい。
【０００７】
ある実施形態では、ＤＥＮＶ−４構築物は、ＤＥＮＶ−４の構造領域または非構造領域に適応的突然変異を有するデング−デングキメラ構築物を含むことができる。他の実施形態において、ＤＥＮＶ−４構築物は別のデングウイルス血清型、すなわちＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２またはＤＥＮ−３の骨格を含んでもよい。さらに他の実施形態において、キメラ構築物は、ＤＥＮ−２の構造領域または非構造領域がＤＥＮＶ−４構造領域またはＤＥＮＶ−４の非構造領域に置換されているＤＥＮ−２骨格を含んでもよい。これらの実施形態に従って、ＤＥＮ−２骨格は任意の弱毒生ＤＥＮ−２ウイルスを含むことができる。他の実施形態において、ＤＥＮ−２骨格は弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスを骨格として含むことができ、ここで、弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫウイルスは、ＤＥＮＶ−４のｐｒＭ（プレメンブレン）およびＥ（エンベロープ）構造タンパク質のうちの１つ以上の構造タンパク質をさらに含む。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは増殖を、またはｉｎ  ｖｉｖｏでは投与時に対象においてＤＥＮＶ−４に対する免疫応答を促進するために、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格は、新規な構築物を形成するＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３の更なる突然変異または突然変異の復帰を含んでもよい。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＤＥＮＶａｘ−４株と名付けられた現在のデングキメラ構築物（配列番号２１）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの製造のため、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＥＮＶ−４に対する免疫応答を誘導する用途の構築物として、両方の目的でウイルスの複製効率を高めるために、ＤＥＮ−２骨格のカプシド／ＰｒＭジャンクションを含むように改変して、遺伝子的にＤＥＮ−２よりもＤＥＮＶ−４により類似するようにした。ＤＥＮ−４の現在の株であるＤＥＮＶａｘ−４は、ＤＥＮ−４ではなくＤＥＮ−２と同一のカプシド／ＰｒＭ配列を有し、恐らくゲノムＲＮＡからの非効率的な転写および翻訳を引き起こし、これは野生型ＤＥＮＶ−４のそれとは異なる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、構造タンパク質遺伝子は、デング−デングキメラを形成するために、別のデングウイルス骨格（例えばデング−２、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３）にＤＥＮＶ−４のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含むことができる。例えばＤＥＮ−４構築物は、ある実施形態ではＤＥＮＶａｘ−４ｅ（カプシド１０７システイン→チロシン；ＤｅｎＶａｘ−４ｂ骨格、カプシド／ｐｒＭジャンクションの改変）、ＤＥＮＶａｘ−４ｆ（ＰＤＫ−５３骨格ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａの突然変異が１６６８１のものに復帰している）またはＤＥＮＶａｘ−４ｈ（エンベロープ４１７Ｇｌｕ→Ｌｙｓ）（例えば図４を参照）と名付けられたこれらの構築物を含んでもよい。ここで、特定の構築物について、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格は（例えば非コード領域（ＮＣＲ）または非構造領域（ＮＳ２等）に）野生型ＤＥＮ−２への１つ以上の復帰変異、および、ＤＥＮＶ−４構造領域（例えばｐｒＭまたはＥ）に１つ以上の突然変異を有し、一方でＤＥＮＶ−４（例えば株１０３６）の１つ以上の構造タンパク質をコードする。本願に開示の改変型ＤＥＮＶ−４構築物は、ＤＥＮＶ−４株１０３６の１つ以上の改変型構造タンパク質を有する改変型弱毒ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格を含んでもよい。いくつかの実施形態において、弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスに存在する１つ以上の突然変異は、野生型核酸に戻されてもよいし（これはサイレント変異であってもよい）、別の核酸であって、その弱毒性または安全性に影響を与えることなく複製能力および免疫原性が高められているが、ＤＥＮ−４ウイルスの増殖および／または複製には影響を与え得る改変型ＤＥＮ−２／ＤＥＮＶ−４構築物を形成する本願の構築物を製造するための別の核酸に戻されてもよい。ある実施形態では、復帰変異は増殖および／または複製の増強をもたらし得る。
【００１０】
他の実施形態において、改変型ＤＥＮＶ−４構築物は、安全性およびウイルスの弱毒性を維持しながら、改善された免疫学的応答を誘導する構築物を形成するために、ＤＥＮＶ−４の１つ以上の構造領域および／または非構造領域に導入された突然変異を含んでもよい。例えば、ＤＥＮ−２／ＤＥＮＶ−４の改変型または突然変異型デング−デングキメラは、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格の１つ以上の非構造領域、例えばＮＳ２Ａ、およびＮＳ４Ａにおける突然変異、および／または５’非コード領域（５’ＮＣＲ）における突然変異を含んでもよい。別の実施形態において、改変型ＤＥＮＶ−４キメラ構築物は、ＰＤＫ−５３のＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａの突然変異（例えば、ＮＳ４ＡのＭ−Ｌ置換）を復帰させることにより、ＤＥＮ−２  １６６８１のＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａを含んでもよい。いくつかの実施形態は、標的構築物のＤＥＮ−２  ＰＫＤ−５３骨格における対応する突然変異を復帰させることによりＤＥＮ−２  １６６８１の５’ＮＣＲ、ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａを有する改変型ＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含む。他の実施形態は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格における対応する突然変異を復帰させることによりＤＥＮ−２  １６６８１の５’ＮＣＲを有する改変型ＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含んでもよい。また、改変型ＤＥＮ−４キメラ構築物はＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格を含み、かつＤＥＮ−４株Ｈ２４１の１つ以上の構造タンパク質をコードしていてもよい。免疫応答を誘導するために、デング−２血清型骨格（例えばＰＤＫ−５３または改変型ＰＤＫ−５３）を含むキメラウイルスの構造領域が、任意のＤＥＮ−４構造タンパク質に置換され得ると考えられる。いくつかの実施形態において、改変型ＤＥＮ−４構築物はＤＥＮ−４構造タンパク質と、骨格としての弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３とを含み、ＤＥＮ−４（例えば株１０３６）の構造領域を改変するために突然変異が導入され得る。
【００１１】
他の実施形態において、突然変異は、そのような突然変異を含む構築物の免疫原性を高めるために、ＤＥＮＶウイルスのカプシド／ｐｒＭジャンクションのアミノ酸配列に導入されてもよい。例えば、ＤＥＮ−４における突然変異は、ＤＥＮ−４のカプシドの１０７位のＣｙｓ−Ｔｙｒ変異であってもよい。他の実施形態において、１０７位のシステインは、疎水性側鎖を有する任意の他の芳香族アミノ酸に変異されてもよいと考えられる（例えばＤＥＮ−４ｅを参照）。キメラ構築物の他のＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３復帰変異はＮＳ２ＡまたはＮＳ４Ａに見られる。さらに他の実施形態は、ＤＥＮ−４構築物であって、ＤＥＮ−２骨格がＰＤＫ−５３（ＭＶＳ、配列番号２１）を含み、ＰＤＫ−５３のカプシド領域のアミノ酸の１０２〜１０７位が相同なＤＥＮ−４の対応するアミノ酸に変換されてＤＥＮＶ−４ｂを形成する（例えば図４を参照）、ＤＥＮ−４構築物を含む。これらの骨格構築物は、カプシド領域のシステインから適所の芳香族アミノ酸（例えばチロシン、トリプトファン等）をさらに含んでもよい。ある実施形態では、この構築物は配列番号２２または配列番号２３で表される。
【００１２】
本願に開示される他のＤＥＮＶ−４構築物は、エンベロープの４１７位にアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、ＤＥＮ−４株１０３６株配列またはその同等株位置であって、そこではＤＥＮ−４構造タンパク質を有するデング−２のＰＤＫ−５３（ＭＶＳ  ＤＥＮ２／４、配列番号２１）骨格が提供される。実施形態は、エンベロープ４１７位を負から正に荷電した側鎖を持つアミノ酸（リジン等）に更に変異させることを含む。任意の荷電側鎖が、ＤＥＮ−４構築物の安全性または弱毒性に影響を与えることなくその免疫原性の増強をもたらすと考えられる。ある実施形態では、この構築物は配列番号２４または配列番号２５で表される。
【００１３】
ある実施形態では、キメラＤＥＮＶ構築物のＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３復帰変異はＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３  ＭＶＳに見られる５’ＮＣ、ＮＳ１およびＮＳ３の突然変異を有し、一方で他の復帰変異または突然変異を有する。これら３つの突然変異は弱毒化に重要な場合があることが実証されている（例えば、対象と比較したプラークサイズの小ささ、増殖速度の低減、力価の低下、温度感受性の上昇および神経毒性の低下）。
【００１４】
他の実施形態において、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ゲノム骨格を使用してＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３のキメラ構築物を形成することができ、ここで、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ゲノムの１つ以上の構造タンパク質遺伝子はＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３の１つ以上の構造タンパク質遺伝子に置換されてもよい。これらの構築物は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格を持つ単一のキメラ内にＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３の両方の組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態において、構造タンパク質はＤＥＮ−１および／またはＤＥＮ−３のＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質またはＥタンパク質とすることができる。ある実施形態では、構造タンパク質遺伝子はＤＥＮ−１またはＤＥＮ−３のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む。これらのハイブリッド／キメラウイルスは、親ＤＥＮ−２の弱毒化表現型を維持しつつ、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮＶ−４の表面抗原を発現する。ある実施形態では、これらの構築物は配列番号１５、ＤＥＮ−２／ＤＥＮ−１および配列番号１９、ＤＥＮ−２／ＤＥＮ−３で表すことができ、これらの構築物は本願に開示される二価、三価または四価の組成物において使用することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本願に開示される構築物は、骨格として弱毒ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスを用いたＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の表面抗原を発現するＤＥＮＶ−４、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−１、およびＤＥＮ−３のキメラ構築物を含んでもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態は、任意のワクチン組成物に使用される改変型または突然変異型ＤＥＮＶ−４構築物を形成するための方法を開示し、ここで、任意のワクチン組成物は、限定するものではないが、ＤＥＮＶ−４構築物のみを有する単一のワクチン組成物、２種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導可能な混合型単一ワクチン組成物、フラビウイルスおよびＤＥＮＶ−４を含む１種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導可能な他のフラビウイルス構築物と組み合わされた本願に開示されるキメラ（および非キメラ）構築物を有する混合型単一ワクチン組成物を含む。
【００１７】
後述の図面は本明細書の一部を構成し、特定の実施形態をさらに明示するために含められている。いくつかの実施形態は、これらの図面のうちの１つ以上を単独で、あるいは提示された特定の実施形態の詳細な説明と併せて参照することにより更に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３の構造遺伝子および非構造遺伝子の代表的略図を示す。
【図１Ｂ】ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格における異なるデングウイルス血清型の構造タンパク質をそれぞれ発現する、本願に開示されるいくつかの実施形態の特定のキメラデングウイルス構築物の例示的な結果を示す。
【図２】本願に開示されるいくつかの実施形態のＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含む特定のワクチンを非ヒト霊長類において分析するための例示的な実験計画を示す表である。
【図３】本願に開示される特定の実施形態のＤＥＮＶ−４キメラウイルス構築物を有するワクチン組成物で免疫した動物モデルによって得られたＤＥＮＶ−４中和抗体力価の生成に関する実験の例示的グラフを示す。
【図４】本願のいくつかの実施形態に開示され、ワクチン製剤に単独でまたは他の弱毒生ウイルス構築物と組み合わせて使用される特定のＤＥＮＶ−４キメラ構築物の略図を示す。
【図５】本願に開示される特定の実施形態のいくつかのＤＥＮＶ−４ウイルス構築物のプラーク表現型、ベロ細胞力価および蚊の成長の分析のいくつかの例示的データを示す表である。
【図６】Ａ〜Ｆは、ＤＥＮＶ−４野生型（Ａ）、ＤＥＮＶａｘ−４（Ｂ）、ＤＥＮＶａｘ−４ｅ（Ｃ）、ＤＥＮＶａｘ−４ｈ（Ｄ）、ＤＥＮＶａｘ−４ｉ（Ｅ）、およびＤＥＮＶａｘ−４ｊ（Ｆ）を含む特定のＤＥＮＶ−４キメラ構築物を用いた例示的実験のイムノフォーカス（プラーク）結果の例示的表現型を提示する写真である。
【図７】哺乳類細胞中で増殖後の様々なＤＥＮＶ−４キメラ構築物の経時的ウイルス力価のグラフであり、「感染後日数」として説明される。
【図８】蚊の細胞中で増殖後の様々なＤＥＮＶ−４キメラ構築物の経時的ウイルス力価のグラフであり、「感染後日数」として説明される。
【図９】動物モデルにおける様々なＤＥＮＶ−４キメラ構築物のＤＥＮＶ−４に対する免疫応答誘導試験に使用される許容可能な動物モデルを表すフローチャートである。
【図１０】様々なＤＥＮＶ−４キメラ構築物を並べたものを示し、共通配列および例示的な突然変異および／または復帰変異を示す。
【図１１】様々なＤＥＮＶ−４キメラ構築物を並べたものを示し、共通配列および例示的な突然変異および／または復帰変異を示す。
【図１２】ＤＥＮ−２ウイルスの弱毒生ウイルス構築物の略図を示す。
【図１３】本願に開示される様々なＤＥＮＶ−４構築物のクローニングの例示的な略図を示す。
【図１４】蚊の細胞における様々なＤＥＮＶ−４構築物の増殖を比較したグラフを表す。
【図１５】本願に開示される様々なＤＥＮＶ−４構築物のマウスにおける免疫原性を比較した例示的なヒストグラムプロットを表す。
【図１６】免疫したマウスをｗｔ−ＤＥＮＶによる攻撃から防御するために、マウスにおいて様々なＤＥＮ−４構築物を用いた有効性を生存率として示す例示的なグラフを表す。
【図１７】フラビウイルスエンベロープタンパク質を並べたものを表す。
【図１８】ＤＥＮＶのタンパク質のオープンリーディングフレームを含むＤＥＮＶウイルスの略図を表す。
【図１９】本願で使用が意図された哺乳類細胞株における様々なＤＥＮ−４構築物の増殖後に達成された力価のグラフを表す。
【図２０】ワクチン接種後の非ヒト霊長類における様々なデング構築物でのワクチン接種後の中和抗体の様々なレベルを、ワクチン接種後日数として表す。
【図２１】ワクチン接種後の非ヒト霊長類における様々なデング構築物でのワクチン接種後の中和抗体の様々なレベルを、ワクチン接種後日数として表す。
【図２２】ワクチン接種後のマウスにおけるデング構築物の様々なレベルを、ワクチン接種後日数として表す。
【図２３】ワクチン接種後のマウスにおけるデング構築物の様々なレベルを、ワクチン接種後日数として表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
〔定義〕
本願で使用する「１つの」は、１つまたは１つを超える事項を意味する場合がある。
本明細書で使用する「対象」は、限定するものではないが、ヒト（例えば成人および子供）、または家畜化あるいは野生の哺乳類、例えばイヌ、ネコ、他の家庭用ペット（例えばハムスター、モルモット、マウス、ラット）、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、プレーリードッグ、野生齧歯類、または動物園動物のような哺乳類を含む場合がある。
【００２０】
本願で使用する用語「キメラ構築物」、「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「フラビウイルスキメラ」および「キメラフラビウイルス」は、デング−２ウイルスのヌクレオチド配列のタンパク質、そしてさらにデング−２ウイルスに由来しないか、異なるデングウイルス血清型または異なるフラビウイルスに由来するヌクレオチド配列を含む構築物を意味することがある。「デングキメラ」は少なくとも２種の異なるデングウイルス血清型を含む。他のデングウイルスまたはフラビウイルスの例には、デング−１ウイルス、デング−３ウイルス、デング−４ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱ウイルスおよびこれらの組合せ由来の配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２１】
本願で使用する「核酸キメラ」は、デング−２ウイルスの核酸配列の一部を含む核酸配列と、さらにデング−２ウイルスの核酸配列と同じ起源のものではない１つ以上のヌクレオチド配列とを含む本願に開示される構築物を意味することがある。それに応じて、本願に開示される全てのキメラフラビウイルス、全てのデングキメラまたはフラビウイルスキメラは核酸キメラの一例として認識され得る。
【００２２】
〔説明〕
以下の節では、様々な実施形態を詳述するために様々な例示的組成物および方法を記載する。様々な実施形態を実施するのに、ここに概説された特定の詳細のすべて、あるいは一部ですら採用する必要はなく、むしろ濃度、時間その他の特定の詳細は日常の実験により変更可能であることは当業者には明らかであろう。いくつかの場合、周知の方法または構成要素はこの説明には含まれていない。
【００２３】
本発明の実施形態によれば、本分野の従来技術に含まれる分子生物学、タンパク質化学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が採用されてもよい。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、サムブルック、フリッチュおよびマニアティス（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ）、分子クローニング：実験室マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、１９８６年を参照されたい。
【００２４】
本願の実施形態は、対象において単独で、または、他のデングウイルス血清型あるいはフラビウイルスに対する免疫応答を誘導するための１つ以上の作用剤と組み合わせて、ＤＥＮ−４に対する改善された免疫応答を誘導するための組成物、方法および使用に関する。これらの実施形態に従って、弱毒生デングウイルスおよびＤＥＮ−４の核酸キメラが形成され、本願に開示される免疫原性組成物において使用される。いくつかの実施形態は、改変型または突然変異型ＤＥＮ−４構築物に関する。いくつかの実施形態は、ＤＥＮ−４キメラ構築物に突然変異および／または復帰変異を導入して、キメラ構築物のアミノ酸配列を改変することに関する。いくつかの実施形態は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格構築物に突然変異および／または復帰変異を導入して、キメラ構築物のアミノ酸配列またはＲＮＡ配列を改変することに関する。ある実施形態では、キメラ構築物のアミノ酸配列を改変するためのＤＥＮ−４キメラ構築物への突然変異および／または復帰変異は、ＤＥＮＶａｘ−４（配列番号２１）と称される既知のキメラ構築物のＣ／ｐｒＭ切断部位の上流の、突然変異誘発を含むがこれに限定されない技術による突然変異を含んでもよい。
【００２５】
本願の実施形態は、ＤＥＮＶ−４ウイルスキメラ構築物の組成物、方法および使用に関する。いくつかの実施形態において、組成物はＤＥＮＶ−４ウイルスキメラ構築物を単独で、または他のデングウイルス血清型構築物と、あるいは同じまたは異なる血清型の弱毒生デングウイルスと、または標的ウイルス（例えばデングウイルスや他のフラビウイルス）に対する免疫応答を誘導可能な他のフラビウイルス構築物と組み合わせて含んでもよい。他の実施形態は、ＤＥＮＶ−４に対する弱毒生ウイルス構築物の組成物と、任意選択で、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−３に対する１つ以上の弱毒生ウイルス構築物とを含んでもよい。さらに他の実施形態では免疫原性組成物が提供され、その免疫原性組成物は、他の既知の構築物と比較して、対象に導入された時の免疫原性が増強されたＤＥＮＶ−４弱毒生キメラウイルス構築物を含む。これらの実施形態に従って、これらの弱毒生ウイルスキメラ構築物は単独で、または１つ以上の他のＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−３構築物（例えば弱毒生ウイルスまたはキメラ）と、および薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて使用して、１種以上のデングウイルス血清型に対するワクチン製剤を形成することができる。ある実施形態では、１種以上のデングウイルスに対する一価、二価、三価または四価の薬学的に有効な製剤が形成される。ある実施形態では、免疫原性組成物は、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３デング−デングキメラ構築物または弱毒生デングウイルスを、本願に開示されるキメラＤＥＮＶ−４構築物と組み合わせて含んでもよい。
【００２６】
ある実施形態では、本発明のＤＥＮＶ−４構築物をＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２およびＤＥＮ−３のうちの１種以上と組み合わせて含む免疫原性組成物は、単一のワクチン投与で２種以上のデングウイルス血清型に対する同時防御を与えるために使用することができる。他の実施形態において、本願に開示の実施形態のＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３および改変型または突然変異型ＤＥＮＶ−４構築物を含む免疫原性組成物は、各デングウイルス血清型に対して改善された免疫原生応答であって、ＤＥＮＶ−４に対する免疫応答干渉の低減された免疫原生応答を誘導するために対象に投与されてもよい。
【００２７】
ある実施形態では、ＤＥＮＶ構築物は、骨格（ＰＤＫ−５３）の構造領域または非構造領域またはＤＥＮ−４の構造領域に適応的突然変異を有するデング−デングキメラ構築物を含んでもよい。他の実施形態において、ＤＥＮＶ−４構築物は、別のデングウイルス血清型であるＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２またはＤＥＮ−３の骨格を含んでもよい。さらに他の実施形態において、キメラ構築物はＤＥＮ−２骨格を含んでもよく、ここで、ＤＥＮ−２構造および／または非構造領域がＤＥＮＶ−４構造領域またはＤＥＮＶ−４の非構造領域に置換される。これらの実施形態に従って、ＤＥＮ−２骨格は、安全性および有効性を維持しながら、ＤＥＮ−２に対する免疫応答を誘導する任意の弱毒生ＤＥＮ−２ウイルスを含むことができる。他の実施形態において、ＤＥＮ−２骨格は弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３（初代イヌ腎細胞（ＰＤＫ）における５３継代）またはＤＥＮ−１６６８１株ウイルス由来のものを骨格として含んでもよく、ここで、弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスは、ＤＥＮＶ−４のｐｒＭ（プレメンブレン）構造タンパク質およびＥ（エンベロープ）構造タンパク質のうちの１つ以上の構造タンパク質をさらに含む。さらに、投与時に対象においてＤＥＮＶ−４に対する免疫応答を促進するために、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格はＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３の更なる突然変異または突然変異の復帰を含んでもよい（例えば図４参照）。
【００２８】
いくつかの実施形態において、構造タンパク質遺伝子は、ＤＥＮＶ−４のｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を別のデングウイルス骨格上に含んでもよく、これはデング−デングキメラを形成する。例えば、ＤＥＮＶ−４構築物は、ある実施形態ではＤＥＮＶａｘ−４ｅ、ＤＥＮＶａｘ−４ｆ、またはＤＥＮＶａｘ−４ｈ（例えば図４参照）と称される構築物を含んでもよく、ここで、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格は（例えば非コード領域（ＮＣＲ）または非構造領域（ＮＳ１等）において）野生型ＤＥＮ−２アミノ酸への１つ以上の復帰変異、およびＤＥＮＶ−４構造領域（例えばｐｒＭまたはＥ）に１つ以上の突然変異を有し、かつＤＥＮＶ−４（例えば株１０３６）の１つ以上の構造タンパク質をコードする。本願に開示される改変型ＤＥＮＶ−４構築物は、ＤＥＮＶ−４株１０３６の１つ以上の改変された構造領域を有する改変型弱毒ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格を含んでもよい。いくつかの実施形態において、弱毒生ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスに存在する１つ以上の突然変異は、対照アミノ酸に、または別のアミノ酸であって、安全性又は弱毒性に影響を与えることなく免疫原性が（配列番号２１のＭＶＳ配列と比較して）高められているが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＥＮ−４ウイルスの増殖および／または複製には影響を与え得る改変型ＤＥＮ−２／ＤＥＮＶ−４キメラ構築物を形成する本願の構築物を製造するための別のアミノ酸に戻されてもよい。ある実施形態では、復帰変異は増殖および／または複製の増強をもたらし得る。
【００２９】
他の実施形態において、改変型ＤＥＮＶ−４構築物は、安全性およびウイルスの弱毒性を維持しながら、改善された免疫学的応答を誘導する構築物を形成するために、ＤＥＮＶ−４の１つ以上の構造領域および／または非構造領域に導入された変異を含んでもよい。例えば、ＤＥＮ−２／ＤＥＮＶ−４の改変型または変異型デング−デングキメラは、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格の１つ以上の非構造領域、例えばＮＳ２Ａ、およびＮＳ４Ａにおける突然変異、および／または５’非コード領域（５’ＮＣＲ）における突然変異を含んでもよい。別の実施形態において、改変型ＤＥＮＶ−４キメラ構築物は、ＰＤＫ−５３のＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａの突然変異（例えば、ＮＳ４ＡのＭ−Ｌ置換）を復帰させることにより、ＤＥＮ−２  １６６８１のＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａを含んでもよい。いくつかの実施形態は、標的構築物のＤＥＮ−２  ＰＫＤ−５３骨格における対応する突然変異を復帰させることによりＤＥＮ−２  １６６８１の５’ＮＣＲ、ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａを有する改変型ＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含む。他の実施形態は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格における対応する突然変異を復帰させることによりＤＥＮ−２  １６６８１の５’ＮＣＲを有する改変型ＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含んでもよい。また、改変型ＤＥＮ−４キメラ構築物はＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格を含み、かつＤＥＮＶ−４株Ｈ２４１の１つ以上の構造タンパク質をコードしていてもよい。
【００３０】
ＤＥＮＶ−４構造タンパク質は、デング−２血清型骨格（例えばＰＤＫ−５３または本願で特定される改変型ＰＤＫ−５３）の構造領域または非構造領域を置換することができると考えられる。いくつかの実施形態において、改変型ＤＥＮＶ−４構築物はＤＥＮ−４構造タンパク質と、骨格としての弱毒生改変型ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３とを含み、ＤＥＮＶ−４（例えば株１０３６）の構造領域を改変するために突然変異が導入され得る。いくつかの実施形態において、突然変異は、そのような突然変異を含む構築物の複製および／または免疫原性を増強するために、ＤＥＮＶ−４のカプシド／ｐｒＭジャンクションのアミノ酸配列に導入されてもよい。例えば、ＤＥＮＶ−４における突然変異は、ＤＥＮＶ−４のカプシドの１０７位のＣ−Ｙ突然変異であってもよい（例えばＤＥＮＶａｘ−４ｅを参照）。これらの実施形態に従って、改変型ＰＤＫ−５３骨格においてシステインを芳香族アミノ酸（例えばチロシン等）に変異させてもよい（ＤＥＮＶ−４ｂ）。他の突然変異は、ＤＥＮＶ−４  １０３６株配列のエンベロープの４１７位（グルタミン酸、Ｅ）または別のＤＥＮＶ−４のそれと同等の位置のアミノ酸置換（例えばＤＥＮＶａｘ−４ｈを参照）を含んでもよく、ここでは陰性アミノ酸が、荷電した側鎖をもつ陽性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン等）に置換される。キメラ構築物の他のＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３復帰変異はＮＳ２Ａ領域またはＮＳ４Ａ領域に見られる。
【００３１】
他の実施形態において、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ゲノム骨格を使用してＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３のキメラデングウイルス構築物を形成することができ、ここで、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ゲノムの１つ以上の構造タンパク質遺伝子または非構造タンパク質遺伝子はＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３の１つ以上の構造タンパク質遺伝子または非構造遺伝子に置換されてもよい。これらの構築物は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格を持つ単一のキメラ内にＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３の両方の構造遺伝子または非構造遺伝子の組合せを含んでもよい。いくつかの実施形態において、構造タンパク質はＤＥＮ−１および／またはＤＥＮ−３のＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質またはＥタンパク質とすることができる。ある実施形態では、構造タンパク質遺伝子はＤＥＮ−１またはＤＥＮ−３あるいはこれらの組合せのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む。これらのハイブリッド／キメラウイルスは、親ＤＥＮ−２の弱毒化表現型を維持しつつ、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３またはＤＥＮＶ−４の表面抗原を発現することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本願に開示される構築物は、骨格として弱毒ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３または弱毒生ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス（あるいは、デング−２血清型ＰＤＫ−５３に見られる任意の突然変異の、その野生型１６６８１ウイルスへの１つ以上の復帰変異を有するデング−２ウイルス）を用いてＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮＶ−４の表面抗原を発現するＤＥＮＶ−４、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−１、およびＤＥＮ−３のキメラ構築物を含むことができる。また、医薬組成物の一部である構築物は、弱毒生ウイルス（例えばＤＥＮ−２、他のフラビウイルス）のような他の作用剤を含んでもよい。さらに、これらの組成物に使用する他の作用剤は、弱毒生ウイルスの劣化を低減させるための、他の薬学的に許容される抗ウイルス剤、アジュバントまたは安定剤を含んでもよい。
【００３３】
本願のいくつかの実施形態は、ＤＥＮＶ−４に対する任意のワクチン組成物に使用される改変型または突然変異型ＤＥＮＶ−４構築物を形成するための方法を開示し、ここで、任意のワクチン組成物は、限定するものではないが、ＤＥＮＶ−４構築物のみを有する単一のワクチン組成物、２種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導可能な単一のワクチン組成物のデングウイルス構築物の混合物、本願に開示されるキメラ（および非キメラ）構築物を、異なるフラビウイルス（例えば黄熱、ウエストナイル、日本脳炎等）に対する免疫応答を誘導可能な他のフラビウイルス構築物ならびにＤＥＮＶ−４を含む１種以上のデングウイルス血清型と組み合わせて有する単一のワクチン組成物中の混合物を含む。
【００３４】
他の実施形態において、本願に開示されるＤＥＮＶ−４構築物と共に使用する他の組合せが考えられる。例えば、ＰＤＫ細胞において１３回継代したデングウイルス血清型１野生型ウイルスはＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスとして指定される。他のワクチン候補は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３、ＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３（例えば、初代ミドリザル腎細胞で３０回継代した後、アカゲザル胎仔肺細胞で３回継代したもの）およびＤＥＮＶ−４  ＰＤＫ−４８である。これら４つの候補ワクチンウイルスはそれぞれ、野生型親ＤＥＮ−１  １６００７、ＤＥＮ−２  １６６８１、ＤＥＮ−３  １６５６２およびＤＥＮＶ−４  １０３６ウイルスの組織培養継代により得られたものである。これらの現存する弱毒生デングウイルスは全て、本願に開示されるＤＥＮＶ−４キメラウイルス構築物と組み合わせて使用することが企図される。
【００３５】
これらの弱毒ウイルスを用いたこれまでのヒトでの治験は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３がヒトで最少の感染用量（５０％最低感染用量が５プラーク形成単位すなわちＰＦＵ）であり、強い免疫原性であり、安全性について懸念がないことを示している。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３およびＤＥＮＶ−４  ＰＤＫ−４８ワクチンウイルス候補のヒトでの５０％最低感染用量は、それぞれ、これよりも高い１０，０００、３５００、および１５０ＰＦＵである。
【００３６】
ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスワクチン候補（以降ＰＤＫ−５３と略す）は弱毒化に関するいくつかの測定可能な生物学的マーカーを有し、これらは温度感受性、小さいプラークサイズ、蚊のＣ６１３６細胞培養における低下した複製、無傷の蚊における低下した複製、乳飲みマウスに対する神経毒性の喪失およびサルにおけるウイルス血症の発生率の低下を含む。候補ＰＤＫ−５３ワクチンの治験では、ヒトでの安全性および免疫原性が実証されている。さらに、ＰＤＫ−５３ワクチンは、ワクチン接種されたヒトにおいてデングウイルス特異的Ｔ細胞記憶応答を誘導する。
【００３７】
ある実施形態では、核酸分子は、弱毒生デング−２ウイルスに由来する非構造タンパク質および少なくとも１つまたは複数の構造タンパク質をコードし、かつ第２のフラビウイルスに由来する１つ以上の構造タンパク質をコードする核酸配列を有するキメラフラビウイルス構築物を含んでもよく、ここで、キメラ構築物は、エンベロープ（Ｅ）タンパク質のアミノ酸の４１７位と同義の位置での突然変異、カプシドタンパク質の１０７位と同義の位置での突然変異、およびＮＳ４Ａのアミノ酸の１７位と同義の位置での突然変異を含む１つ以上の突然変異をさらに含む。他の実施形態において、核酸はエンベロープ（Ｅ）タンパク質のアミノ酸の４１７位と同義の位置において、野生型グルタミン酸からリジンに変わる突然変異をさらに含んでもよい。本願に開示される更に他の核酸分子は、カプシド（Ｃ）タンパク質のアミノ酸の１０７位と同義の位置において、システインからチロシンに変わる突然変異をさらに含んでもよい。他の核酸分子において、ＮＳ４Ａタンパク質のアミノ酸の１７位と同義の位置における突然変異は、メチオニン（例えば野生型配列）をロイシンに変化させる。第２のフラビウイルスはＤＥＮＶ−１、ＤＥＮＶ−３またはＤＥＮＶ−４であってもよいと考えられる。ある実施形態では、核酸分子はＤＥＮＶ−４である第２のフラビウイルスを含んでもよい。他の実施形態において、弱毒生デング−２骨格を有する核酸分子は、５’ＮＣＲの５７位、ｎｓ１の５３位およびｎｓ３の２５０位に突然変異を含む。これらの実施形態によれば、弱毒生デング−２ウイルスは、ｎｓ１の５３位およびｎｓ１の２５０位の突然変異に加え、１つ以上の構造タンパク質のデング−１、３または４置換を含む。ある実施形態では、核酸構築物は、対象においてデング−４ウイルスに対する免疫応答を誘導可能なＤＥＮＶ−４ｅ（配列番号２２）、ＤＥＮＶ−４ｈ（配列番号２４）またはＤＥＮＶ−４ｉ（配列番号９）であってもよい。本願では、デングウイルス血清型４の構造配列はデング−ウイルス１または３を用いて置換可能であり、かつ、構築物に対する免疫応答を増強するために、上記で参照された突然変異をさらに含むことができると考えられる。
【００３８】
いくつかの実施形態は、弱毒生デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質および少なくとも１つまたは複数の構造タンパク質をコードし、かつ第２のフラビウイルス由来の１つ以上の構造タンパク質を少なくともコードする核酸配列を含む、キメラフラビウイルス構築物を有する核酸分子に関し、ここで、弱毒デング−２はｎｓ１の５３位およびｎｓ３の２５０位に突然変異を含むが、ＮＳ２ＡまたはＮＳ４Ａには突然変異を含まない。ある実施形態では、核酸構築物はＤＥＮＶ−４ｆ（配列番号３０）であってもよい。他の実施形態では、６７４位のヌクレオチドを、ＤＥＮＶ−４ｆの野生型ヌクレオチドのＧからＣに変異させてもよい。さらに他の実施形態において、本願のＤＥＮＶ−２／ＤＥＮＶ−４構築物の混合物は、デングウイルス感染に対する免疫原性作用剤として用いられる薬学的に許容される組成物と組み合わされてもよい。
【００３９】
ある実施形態では、ＤＥＮＶ−２／ＤＥＮＶ−４構築物の弱毒デング−２ウイルス骨格は、ＤＥＮＶ−２／ＤＥＮＶ−４構築物における１０２〜１０７位に野生型デング４配列（例えば１０８６）への１つ以上の突然変異／置換をさらに含んでもよい。例えば、デング−４由来の１０２〜１０７位の個々の位置において、ＴＩＴＬＬＣのうちの１つ以上を、それぞれ野生型デング−２ウイルスの同義の位置である１０２〜１０７位のＡＧＭＩＩＭのうちの１つ以上と交換することができる。これらの実施形態に従って、この領域に置換を有するＤＥＮ−２／ＤＥＮ−４構築物は、システインから芳香族アミノ酸（例えばチロシン、トリプトファン等）への突然変異をさらに含んでもよい。
【００４０】
他の実施形態において、本願に開示される任意の免疫原性組成物のＤＥＮＶ−２／ＤＥＮＶ−４構築物はＤＥＮＶ−４ｇ（配列番号２８）またはＤＥＮＶ−４ｊ（配列番号３２）であってもよい。
【００４１】
デング−２ウイルス骨格およびデング−４ウイルスの少なくとも１つの構造タンパク質を有する免疫原性フラビウイルスキメラは、デングウイルスキメラを調製するために使用することができ、デングウイルスまたはフラビウイルスキメラを製造するための方法が記載される。免疫原性フラビウイルスキメラは単独または組合せで、薬学的に許容される担体中で、デングウイルス血清型ＤＥＮＶ−４のような（単独の、またはＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−１との組合せの）１つ以上のデングウイルスまたはフラビウイルス株による感染を最小化、阻害、または個体を感染に対して免疫するための免疫原性組成物として提供される。組み合わされたとき、免疫原性フラビウイルスキメラは、フラビウイルスの２種以上の種又は株による感染に対する同時防御を与える多価ワクチンとして使用され得る。ある実施形態では、複数のフラビウイルスキメラが、既知のデングウイルス血清型に対する二価、三価または四価のワクチンとして有用な免疫原性組成物中で組み合わされるか、または異なるフラビウイルス由来の１つ以上のタンパク質をコードする核酸配列を含ませることによって他の病原性フラビウイルスに対する免疫を与える。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮＶ−４ウイルスの各々についての核酸配列を用いて、生体試料中のデングウイルスを順に検出するために用いられる、例えば、ワクチンの有効性および／またはデングウイルス感染レベルを評価するためのプローブを生成することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本願で提供される非病原性の免疫原性フラビウイルスキメラは、弱毒デング−２ウイルス（例えばＰＤＫ−５３）の非構造タンパク質遺伝子またはその等価物と、対象における免疫原性の誘導の標的となるフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその免疫原性の部分とを含む。例えば、いくつかの実施形態は、ウイルス骨格としての弱毒デング−２ウイルスＰＤＫ−５３ゲノムと、そのＰＤＫ−５３ゲノムのカプシド、プレメンブレン／メンブレン、またはエンベロープ、あるいはこれらの組合せをコードする１つ以上の構造タンパク質遺伝子であって、ＤＥＮＶ−４ウイルスまたは防御対象となる他のウイルス（異なるフラビウイルスや異なるデングウイルス血清型など）に由来する１つ以上の対応する構造タンパク質遺伝子で置換された構造タンパク質遺伝子とを有するキメラに関する。これらの実施形態に従って、ＰＤＫ−５３骨格には、構築物の免疫原性を高めるように更なる突然変異または復帰変異がなされている。さらに、本願に開示される核酸キメラは弱毒デング−２ウイルスの機能的特性を有することができ、かつ非病原性であるが、他のフラビウイルスに加え、ＤＥＮＶ−４の構造遺伝子産物の抗原のエピトープを発現し、かつ免疫原性である（例えば、対象において遺伝子産物に対する免疫応答を誘導する）。突然変異および／または復帰変異は、キメラ構築物の弱毒性および／または安全性に影響を与えない。
【００４３】
別の実施形態において、核酸キメラは、限定するものではないが、弱毒デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、およびデング−４ウイルス単独または別のフラビウイルスとの組合せ由来の構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を有する核酸キメラであってもよい。他の実施形態において、弱毒デング−２ウイルスはワクチン株ＰＤＫ−５３または１６６８１であってもよい。いくつかの実施形態は、デングまたは他のフラビウイルスのＣ、ｐｒＭまたはＥタンパク質のうちの１つ以上の構造タンパク質を含む。構造タンパク質の選択源となるフラビウイルスの例としては、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱ウイルスまたはダニ媒介性脳炎ウイルスと本願に開示されるＤＥＮＶ−４構築物との組合せが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、構造タンパク質はフラビウイルスの近縁種であるＣ型肝炎ウイルスのような非フラビウイルス種から選択されてもよい。
【００４４】
本願に開示される他の態様は、キメラウイルスが例えばＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３にヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでもよいことを含む。これらの変化はＤＥＮＶ−４ウイルスに対する免疫原性応答との干渉を低減することができる。これらの改変は、構造タンパク質および非構造タンパク質において単独でまたは本願に開示される改変例と組み合わせて行うことができる。
【００４５】
本願の実施形態はフラビウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質を含み、これらのタンパク質は完全なタンパク質、そのタンパク質のエピトープ、または例えばその５個以上のアミノ酸残基を含む任意のフラグメントの配列をコードする任意の遺伝子を含む任意のタンパク質とすることができる。
【００４６】
本願に開示される特定の実施形態は、組換え技術を用いて、必要とされる置換を適当な骨格ゲノムに挿入することにより、本発明のキメラウイルスを形成するための方法を提供する。
【００４７】
フラビウイルスキメラ
デングウイルス型１〜４（ＤＥＮ−１からＤＥＮＶ−４）は蚊媒介性フラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは５’−非コード領域（５’−ＮＣ）、それに続くカプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、それに続くプレメンブレン／メンブレンタンパク質（ｐｒＭ）コード領域、それに続くエンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、それに続く非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする領域、そして最後に３’非コード領域（３’ＮＣ）を含む（例えば図１Ａを参照されたい）。ウイルスの構造タンパク質はＣ、ｐｒＭおよびＥであり、非構造タンパク質はＮＳ１〜ＮＳ５である。構造タンパク質および非構造タンパク質は単一のポリタンパク質として翻訳され、細胞性およびウイルス性プロテアーゼによるプロセシングを受ける。
【００４８】
【化１】
0006486827.tif 000002
【００４９】
フラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の１つの種類または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子を、異なる種類または血清型のデングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種のタンパク質遺伝子、例えば構造タンパク質遺伝子と融合させることによって形成された構築物であってもよい。あるいは、本願に開示されるフラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の１つの種類または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子を、他のデングウイルス血清型またはフラビウイルス科の他のウイルスから選択されたポリペプチドまたはタンパク質の合成をもたらす更なるヌクレオチド配列と融合させることによって形成された構築物である。
【００５０】
他の実施形態において、本願で提供する非病原性かつ免疫原性のフラビウイルスキメラは、弱毒デング−２ウイルスまたはその等価物の非構造タンパク質遺伝子と、免疫原性を与えようとするフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその抗原性部分とを含む。
【００５１】
フラビウイルスキメラの構築に用いられる他の適切なフラビウイルスは、野生型病原性ＤＥＮ−１  １６００７、ＤＥＮ−２  １６６８１、ＤＥＮ−３  １６５６２およびＤＥＮＶ−４  １０３６ならびに弱毒ワクチン株ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３、ＤＥＮ−３  ＰＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３およびＤＥＮＶ−４  ＰＤＫ−４８であってもよい。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮＶ−４野生型／弱毒ウイルスペアの間の遺伝子上の差異が、そのウイルスゲノムにコードされるアミノ酸配列の変化とともに考慮される。本願で用いられる任意のＤＥＮＶ−４株は、本願で考慮され、かつ／または開示される構築物の同義突然変異を含む可能性がある。
【００５２】
ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３の配列表は、ゲノムヌクレオチドの５２７０位がＡからＴに変異しており、ポリタンパク質のアミノ酸の１７２５位すなわちＮＳ３タンパク質アミノ酸の２５０位がバリン残基を含むＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｖバリアントに相当する。このヌクレオチド変異のないＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３バリアントであるＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｅは、ＰＤＫ−５３−Ｖとはこの１つの位置のみで異なる。ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｅはヌクレオチドの５２７０位にＡを有し、ポリタンパク質アミノ酸の１７２５位、ＮＳ３タンパク質アミノ酸の２５０位にグルタミン酸を有する。本願の実施形態は、これらの位置に、自然に派生する配列への１つ以上の復帰変異／突然変異を含む改変型ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３を含み得ることが理解される。
【００５３】
ＤＥＮ−３  １６５６２の配列表は、ゲノムヌクレオチドの１５２１位がＴであり、ポリタンパク質のアミノ酸の４７６位すなわちＥタンパク質のアミノ酸の１９６位がロイシンであるバリアントに相当する。第２のバリアントはＤＥＮ−３  １６５６２培養物に存在し、ヌクレオチドの１５２１位にＴを有し、ポリタンパク質のアミノ酸の４７６位すなわちＥタンパク質のアミノ酸の１９６位がセリンを含む。
【００５４】
ＤＥＮＶ−４  ＰＤＫ−４８の配列表は、ゲノムヌクレオチドの：６９５７位がＴかつポリタンパク質のアミノ酸の２２８６位およびＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸の４４位がフェニルアラニンであり、７５４６位がＴかつポリタンパク質のアミノ酸の２３６６位およびＮＳ４Ｂのアミノ酸の２４０位がバリンであり、７６２３位がＴかつポリタンパク質のアミノ酸の２５０８位およびＮＳ５タンパク質のアミノ酸の２１位がチロシンであるバリアントに対応する。
【００５５】
ある実施形態では、キメラの設計はＤＥＮ−２ウイルス特異的感染性クローン骨格および他のフラビウイルスの構造遺伝子（ｐｒＭ−ＥまたはＣ−ｐｒＭ−Ｅ）の挿入に基づいている。デング−２骨格用のＤＥＮ−２、それに従った株由来の構造遺伝子が挿入される。特定の骨格バリアントが次に反映される。キメラの構築に用いた特定のＤＥＮ−２骨格バリアントは、ハイフンの後に続いて置かれた文字によって示される。親１６６８１（Ｐ）、ＰＤＫ−５３−Ｅ（Ｅ）、またはＰＤＫ−５３−Ｖ（Ｖ）；最後の文字は、親（Ｐ）株またはそのワクチン誘導体（Ｖ）由来のＣ−ｐｒＭ−Ｅ構造遺伝子、あるいは親（Ｐ）またはそのワクチン誘導体（Ｖ１）由来のｐｒＭ−Ｅ構造遺伝子を示す。例えば、ＤＥＮ−２／１−ＶＰは、ＮＳ３−２５０にバリンおよび野生型ＤＥＮ−１  １６００７由来のＣ−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含む弱毒ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格を含むキメラを表す；ＤＥＮ−２／１−ＶＶは、デング−１、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３のワクチン株を伴うＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格を表す；ＤＥＮ−２／１−ＶＰ１は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格および野生型ＤＥＮ−１  １６００７由来のｐｒＭ−Ｅ遺伝子を表す；ＤＥＮ−２／３−ＶＰ１は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格および野生型ＤＥＮ−３  １６５６２由来のｐｒＭ−Ｅ遺伝子を表す；ＤＥＮ−２／４ＶＰ１は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格および野生型ＤＥＮＶ−４  １０３６由来のｐｒＭ−Ｅ遺伝子表す；ＤＥＮ−２／ＷＮ−ＰＰ１は、ＤＥＮ−２  １６６８１骨格およびウエストナイルＮＹ９９由来のｐｒＭ−Ｅ遺伝子を表す。本願に開示される他のキメラが同じ方法で表示される。
【００５６】
一実施形態において、本願に開示されるキメラは、ウイルス骨格として弱毒ＤＥＮ−２ウイルスＰＤＫ−５３ゲノムを含み、ＰＤＫ−５３ゲノムのＣ、ｐｒＭおよびＥタンパク質をコードする構造タンパク質遺伝子、またはこれらの組合せが、ＤＥＮＶ−４ウイルス由来の、および任意選択で、防御対象とする別のフラビウイルス（異なるフラビウイルスや異なるデングウイルス株等）由来の対応する構造タンパク質遺伝子で置換される。新たに発見されたフラビウイルスやフラビウイルス病原体もＤＥＮ−２骨格に組み込むことができる。
【００５７】
非構造タンパク質領域において、ＧｌｙからＡｓｐへの（野生型からＰＤＫ−５３への）突然変異が非構造タンパク質ＮＳ１−５３（ゲノムヌクレオチドの２５７９位）で発見された；ＬｅｕからＰｈｅへの（野生型からＰＤＫ−５３への）突然変異が非構造タンパク質ＮＳ２Ａ−１８１（ゲノムヌクレオチドの４０１８位）で発見された；ＧｌｕからＶａｌへの（野生型からＰＤＫ−５３への）突然変異が非構造タンパク質ＮＳ３−２５０（ゲノムヌクレオチドの５２７０位）で発見された；ＧｌｙからＡｌａへの突然変異（野生型からＰＤＫ−５３への）が非構造タンパク質ＮＳ４Ａ−７５（ゲノムヌクレオチドの６５９９位）で発見された。
【００５８】
弱毒ＰＤＫ−５３ウイルス株は、ゲノムｎｔ５２７０に混合遺伝子型を有する。ウイルス集団のかなりの部分（約２９％）が、ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ突然変異ではなく、野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスに存在する非突然変異ＮＳ３−２５０Ｇｌｕをコードしている。どちらの遺伝的バリアントも非病原性であるので、この突然変異は非病原性キメラには必須ではないかもしれない。
【００５９】
以前に、弱毒ＰＤＫ−５３ウイルス株の非病原性が、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列および５’非コード領域における突然変異に起因し得ることが発見された。例えば、ＮＳ１−５３の１つの突然変異、ＮＳ１−５３および５’ＮＣ−５７の２つの突然変異、ＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０の２つの突然変異、ならびにＮＳ１−５３、５’ＮＣ−５７およびＮＳ３−２５０の３つの突然変異はＤＥＮ−２ウイルスの弱毒化をもたらす。したがって、これらの遺伝子座にこのような非保存的アミノ酸置換またはヌクレオチド置換を含む任意のデング−２ウイルスのゲノムを、改変型ＰＤＫ−５３を誘導するためのベース配列として用いることができる。望ましい場合、５’非コード領域のステム／ループ構造のステムにおける別の突然変異が更なる非病原性表現型安定性を提供し得る。この領域への突然変異は、ウイルス複製に重要な潜在的な二次構造を破壊する。ＤＥＮおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスの両方の、この短い（ヌクレオチド残基たった６個分の長さ）のステム構造における１つの突然変異は、ヘアピン構造の形成を妨害する。このステム構造における更なる突然変異は、ウイルスの生存能力を維持しながら、この遺伝子座の復帰変異の可能性を低下させる。
【００６０】
本願に開示される突然変異は、部位特異的突然変異誘発、直接合成、欠失、または当業者に既知の技術を用いた他の方法を含むがこれらに限定されない、本分野で既知の任意の方法により達成することができる。本願に開示され、および本分野で周知の病原性スクリーニングアッセイを使用して病原性および非病原性骨格構造の違いを識別可能であることが、当業者には理解される。
【００６１】
フラビウイルスキメラの構築
本願に開示されるフラビウイルスキメラは、それに対する免疫が望まれるフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子を、ＰＤＫ−５３デングウイルスゲノム骨格にスプライシングすることにより、または本分野で既知の他の方法により、対応するＰＤＫ−５３遺伝子を除去し、それをデング−４ウイルス遺伝子または本分野で既知の他の遺伝子に置換する組換え工学を用いて製造することができる。
【００６２】
別法として、本願に開示される任意の構築物の核酸配列、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子は、任意の既知の核酸合成技術を用いて合成され、適切なベクターに挿入されてもよい。したがって、本願の実施形態の非病原性かつ免疫原性ウイルスは、当業者に既知の組換え工学技術を用いて製造することができる。
【００６３】
標的遺伝子は、単独でまたは別のフラビウイルスと組み合わせて、ＤＥＮＶ−４について関心のあるフラビウイルス構造タンパク質をコードする骨格に挿入されてもよい。挿入するフラビウイルス（例えばデングウイルス）遺伝子は、Ｃタンパク質、ＰｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、デング−２骨格に挿入される配列は、ＰｒＭおよびＥ構造タンパク質の両方をコードしていてもよいし、あるいは１つの構造タンパク質だけをコードしていてもよい。デング−２骨格に挿入される配列は、Ｃ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質の全てまたは１つをコードしていてもよい。
【００６４】
他のフラビウイルスまたはデングウイルス血清型の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む適切なキメラウイルスまたは核酸キメラは、非病原性を示す弱毒化の表現型マーカーについてスクリーニングし、また免疫原性についてスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性を評価することができる。抗原性および免疫原性は、当業者に既知の通常のスクリーニング手順を用いて、フラビウイルス抗体または免疫反応性血清とのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ反応性を用いて評価することができる。
【００６５】
デングウイルスワクチン
ある実施形態では、キメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用な弱毒生ウイルスを提供することができる。いくつかの実施形態は、危険な病原性または致死効果を生じることなくデング−４ウイルスに対し高い免疫原性を示すキメラを含む。
【００６６】
デングウイルスの１つの血清型のみに対してワクチン接種した対象におけるＤＨＦ／ＤＳＳの発症を低減するためには、ウイルスの２種から全４種までの血清型に対する同時免疫を提供する二価、三価または四価のワクチンが必要である。四価ワクチンは弱毒生デング−２（例えばデング−２  ＰＤＫ−５３）と本願に開示されるデング−２／１、デング−２／３、およびデング−２／４新規キメラとを、全４種のデングウイルス血清型に対する多価ワクチンとしての投与に適切な薬学的担体中で組み合わせることにより製造することができる。他の製剤は上記の二価または三価の製剤を含むことができ、これらの製剤は１つ以上の新規なＤＥＮＶ−４キメラ構築物を含む。
【００６７】
本願の特定の実施形態に開示されるキメラウイルスまたは核酸キメラは、病原性または弱毒ＤＥＮ−２ウイルス骨格に野生型または弱毒ウイルスのいずれかの構造遺伝子を含んでもよい。例えば、キメラは野生型ＤＥＮＶ−４  １０３６ウイルスの構造タンパク質遺伝子、およびその候補ワクチン誘導体をいずれのＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３バックグラウンドで発現してもよい。ある実施形態では、本願に開示される薬学的または実験的組成物は、ＤＥＮＶａｘ−４ｅ、ＤＥＮＶａｘ−４ｇ、および／またはＤＥＮＶａｘ−４ｈと称されるものを単独で、または他のフラビウイルス構築物との組合せで有する１つ以上の構築物を含んでもよい。ある例では、これらの構築物は本願に開示される１つ以上のマスターウイルスシード（ＭＶＳ）構築物（例えばＤＥＮ−１／ＤＥＮ−２）と組み合わせて使用することができる。他の実施形態は、本願に開示されるＤＥＮＶ−４構築物を、黄熱骨格またはウエストナイル骨格あるいは他のフラビウイルス骨格上に形成されたもの等の他のフラビウイルスキメラと組み合わせて含んでもよく、これらのフラビウイルスキメラは、対象に導入された時にその対象においてウイルスに対する免疫応答を誘導するデングウイルス血清型とキメラ構築物を形成可能である。
【００６８】
本願に開示されるキメラに用いられるウイルスは、本分野で既知の技術を用いて増殖させることができる。その後、増殖培養物の生存能力および表現型特性を評価するためにウイルスプラーク滴定を実施してプラークを計数する。野生型ウイルスを培養細胞株によって継代し、弱毒候補出発材料を誘導する。
【００６９】
感染性キメラクローンは、入手可能な様々なデング血清型クローンから構築することができる。望ましい場合、ウイルス特異的ｃＤＮＡフラグメントのクローニングを実現することもできる。構造タンパク質遺伝子または非構造タンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントは逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、様々なプライマーとともにデングウイルスＲＮＡから増幅することができる。増幅したフラグメントは、他の中間体クローンの切断部位にクローニングすることができる。中間体キメラデングウイルスクローンはその後シークエンシングされ、挿入されたデングウイルス特異的ｃＤＮＡの正確性が評価されてもよい。
【００７０】
ある実施形態では、デング血清型ウイルスの構造タンパク質または非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することにより構築された完全ゲノム長キメラプラスミドが、当業者に周知の組換え技術を用いて得られる。
【００７１】
ヌクレオチドおよびアミノ酸解析
ある実施形態では、ＰＤＫ−５３は、野生型デング−２ウイルスに対してＥタンパク質にアミノ酸突然変異を含まないが、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮＶ−４弱毒ウイルスはＥタンパク質にアミノ酸突然変異を有し得る。野生型ＤＥＮ−３  １６５６２は、ヌクレオチド１５２１位にＴを含むバリアントの痕跡を含むことが確認されている。これは、ポリタンパク質４７６位、Ｅタンパク質のアミノ酸残基４７６位のロイシンの組み込みを指定する。後の３種のウイルスの各々は、Ｅタンパク質にＧｌｕからＬｙｓへの（親からワクチンへの）突然変異を有し得るが、突然変異はＥタンパク質の異なるアミノ酸残基に位置する。この置換は負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸へのシフトをもたらす。ＤＥＮＶ−４ワクチンウイルスのＥタンパク質におけるＧｌｕからＬｙｓへの置換は、Ｅタンパク質に存在する唯一の突然変異であった。一方、ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３ワクチンウイルスのＥタンパク質は、それぞれ５個および３個のアミノ酸突然変異を有していた。
【００７２】
ある実施形態では、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスにおいてＮＳ１−５３突然変異が生じ、このウイルスの弱毒化表現型に重要である。その理由は、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのＮＳ１−５３−Ｇｌｙは、今日までに配列決定されているダニ媒介性ウイルスを含むほぼすべてのフラビウイルスで保存されているためである。本願に開示されるＤＥＮＶ−４ウイルス構築物は、ＮＳ１タンパク質の２５３位にアミノ酸突然変異を含んでもよい。ＤＥＮＶ−４  ＰＤＫ−４８ウイルスにおけるＧｌｎからＨｉｓへの突然変異であるこの位置は、デングウイルスの全４種の野生血清型ではＧｌｎである。このＧｌｎ残基はフラビウイルス属に属するデングウイルスに特有である。ＮＳ１タンパク質は、フラビウイルスに感染した細胞から分泌される糖タンパク質である。これは感染した細胞の表面に存在し、ＮＳ１特異的抗体は、ウイルスに感染した個体の血清中に存在する。ＮＳ１タンパク質で免疫した、あるいはＮＳ１特異的抗体で受動的に免疫された動物の保護が報告されている。
【００７３】
特定の突然変異が、天然に保存されているＤＥＮ−１、−２、−３および−４弱毒株のＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ４Ａ、およびＮＳ４Ｂタンパク質において発見された。ＤＥＮ−２およびＤＥＮＶ−４ワクチンウイルスのそれぞれＮＳ４Ａ−７５およびＮＳ４Ａ−９５突然変異は、一般にフラビウイルスの間ではなく、デングウイルスの間のアミノ酸保存位置に生じた。
【００７４】
フラビウイルスＮＳ３タンパク質は少なくとも２つの認識された機能を有し、これらはウイルスプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ／ＮＴＰアーゼである。６９８−ａａ長（ＤＥＮ−２ウイルス）のＮＳ３タンパク質はアミノ末端セリンプロテアーゼドメイン（ＮＳ３−５１−Ｈｉｓ、−７５−Ａｓｐ、−１３５−Ｓｅｒ触媒三残基）およびそれに続くＲＮＡヘリカーゼ／ＮＴＰアーゼ機能に関する配列モチーフ（ＮＳ３−１９６−ＧＡＧＫＴ）、−２８４−ＤＥＡＨ、−４５９−ＧＲＩＧＲ（配列番号２６）以前に提示済み）を含む。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、またはＤＥＮ−３ウイルスのＮＳ３タンパク質における突然変異はいずれも、認識されたモチーフには生じない。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスのＮＳ３−５１０のＴｙｒからＰｈｅへの突然変異は保存的突然変異である。野生型ＤＥＮ−２、−３および−４ウイルスはこの位置にＰｈｅを含むため、ＴｙｒからＰｈｅへの突然変異がＤＥＮ−１ウイルスの弱毒化に関与しているとは考えにくい。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスにおけるＮＳ３−１８２のＧｌｕからＬｙｓへの突然変異は、大部分の蚊媒介性フラビウイルスの間でＡｓｐまたはＧｌｕとして保存された位置で生じ、弱毒化に関与している可能性がある。この突然変異は、ＧＡＧＫＴ（配列番号２７）ヘリカーゼモチーフからアミノ酸残基１５個分上流に位置していた。特定のデング−２ウイルスにおいて、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのＮＳ３−２５０−Ｇｌｕは、黄熱ウイルスを除く全ての蚊媒介性フラビウイルスで保存されている。
【００７５】
本願の特定の実施形態に使用する核酸プローブは、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮＶ−４ウイルスをコードする核酸分子またはそれらの相補的配列と選択的にハイブリダイズする。「選択的」とは、他の核酸とハイブリダイズしてデングウイルスの十分な検出を妨げることのない配列を意味する。したがって、ハイブリダイズ核酸の設計において、選択性は試料中に存在する他の成分に依存し得る。ハイブリダイズ核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％相補的である必要がある。本願で核酸を記述するのに用いる場合、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、偶発的にランダムにハイブリダイズする核酸を除外し、したがって「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味を持つ。本願に開示される選択的ハイブリダイズ核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％相補的とすることができ、好ましくは８５％以上である。
【００７６】
コード核酸またはその核酸の相補的（あるいは反対の）ストランドに選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーが企図される。核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、機能的な種−特異的ハイブリダイゼーション能力が維持される限り、核酸に軽微な修飾または置換があっても生じ得る。「プローブ」は、相補的核酸配列と選択的にハイブリダイゼーションさせてそれを検出または増幅するためのプローブまたはプライマーとして使用可能な核酸配列を意味する。このプローブは約５〜１００ヌクレオチドの間で、好ましくは約１０〜５０ヌクレオチド、最も好ましくは約１８〜２４ヌクレオチドの間で長さを変化させることができる。
【００７７】
プライマーとして使用される場合、組成物は、所望の領域を増幅するように標的分子の異なる領域にハイブリダイズする好ましくは少なくとも２つの核酸分子を含む。プローブまたはプライマーの長さに応じて、標的領域は７０％相補性塩基から完全相補性までの間で変動可能であり、ストリンジェントな条件下で依然ハイブリダイズ可能である。例えば、デングウイルスの存在を検出する目的の場合、ハイブリダイズ核酸（プローブまたはプライマー）と、それがハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、少なくとも、核酸とのハイブリダイゼーションを他の有機体から識別するのに十分である。
【００７８】
ＤＥＮＶ−４、ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−１ウイルスをコードする核酸配列をプラスミドのようなベクターに挿入し、生きている生命体の中で組換え発現させて組換えデングウイルスペプチドおよび／またはポリペプチドを産生することができる。
【００７９】
核酸検出方法
本願に開示されるワクチンウイルスの各々を診断する迅速な遺伝子検査が本発明によって提供される。本発明のこの実施形態は、ウイルス血症を発症しワクチン接種されたヒトの血清から単離されたウイルスの分析を促進し、また、候補ワクチンウイルスで免疫した非ヒト霊長類におけるウイルス血症の特性化を促進する。
【００８０】
これらの配列は、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）、ならびに、ｃＤＮＡアンプリコンを増幅するために下記に説明するように設計されたフォワードおよびリバース増幅プライマーを用いてウイルスゲノムＲＮＡテンプレートから増幅されるｃＤＮＡアンプリコンの検出の報告に役立つ診断用ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ含む。特定の例において、増幅プライマーのうち一方は、その増幅プライマーの３’−末端にワクチンウイルス特異的突然変異を含むように設計されたものであり、これは検査をより効果的に、ワクチン株に対しより特異的する。その理由は、標的部位でのプライマーの伸長、ひいては増幅が、ウイルスＲＮＡテンプレートがその特異的突然変異を含むときのみに生じるためである。
【００８１】
臨床検査室で広く使われるようになってきている自動化ＰＣＲに基づく核酸配列検出システムを使用してもよい。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、試料核酸テンプレートからＰＣＲで生成されたアンプリコンの自動化されたリアルタイムの可視化および定量を可能にする非常に特異的かつ感度の高いアッセイである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）は特定の配列の存在または不在を決定することができる。このアッセイでは、フォワードおよびリバースプライマーがそれぞれ標的突然変異部位の上流および下流にアニーリングするように設計される。特異的検出プローブは、いずれの増幅プライマーよりも約１０℃高い融解温度を持つように設計され、ワクチンウイルス特異的ヌクレオチド突然変異またはその相補物（検出されるＲＴ／ＰＣＲアンプリコンのストランドに依存する）を含み、このアッセイの第３のプライマー成分を構成する。キメラ構築物のうちの１つにおける突然変異した位置を特異的に検出するように設計されたプローブは、任意の突然変異を検出するための特異的なヌクレオチド変化を含んでもよい。
【００８２】
診断的遺伝子検査のための１つの方策は分子標識を使用することである。分子標識方策はまた、アンプリコンのＲＴ／ＰＣＲ増幅のためのプライマー、および、プローブ末端にレポーター色素およびクエンチャー色素を含むプローブによるアンプリコン中の特定配列の検出も使用する。このアッセイでは、プローブはステム・ループ構造を形成する。５’−および３’−末端のレポーター色素およびクエンチャー色素は、それぞれ短いステム構造の端部に配置される。これにより、クエンチャー色素がレポーター色素と並列の近位置になる。ステム構造はＲＴ／ＰＣＲアッセイの変性ステップ中に融解する。標的ウイルスＲＮＡが標的配列を含み、フォワードおよびリバース増幅プライマーによって増幅される場合、プローブの開かれたループは、サイクルのアニーリングステップ中に標的配列にハイブリダイズする。プローブがアンプリコンテンプレートのストランドのいずれかにアニーリングした時、クエンチャー色素とレポーター色素とは離され、レポーター色素の蛍光が検出される。これが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイによく似たリアルタイム同定・定量アッセイである。分子標識アッセイは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイで使用されるものとは異なるクエンチャー色素およびレポーター色素を使用する。
【００８３】
医薬製剤
本分野で既知の、ワクチン用の任意の医薬製剤が本願では企図される。ある実施形態では、製剤はＤＥＮＶ−４構築物を単独で、または１つ以上の追加のＤＥＮ血清型（あるいは他のフラビウイルス組成物）を本願に開示されるＤＥＮＶ−４構築物と、デングウイルスの亜型の存在またはその流行地域への所定の曝露に応じて様々な比率で組み合わせて含んでもよい。製剤は、対象のワクチン接種に使用される他の活性作用剤、例えば限定するものではないが、当業者に既知の他の活性または不活性の材料または組成物を含有し得ることが考えられる。ある実施形態では、本願に開示される製剤にはアジュバントが含まれてもよい。
【００８４】
本発明の他の態様は、対象へのデングウイルスに対するワクチンへの免疫応答を改変することを含んでもよい。デングウイルスに対するワクチンは、デングウイルスの血清型、弱毒生デングウイルス、またはそれらのフラグメント（デングウイルス血清型から誘導されあるいは得られるタンパク質や核酸等）の比率を含む組成物を含んでもよい。様々な血清型の比率は同じであってもよいし、必要に応じて、あるいはウイルスへの曝露または可能性のある曝露に応じて、特定の血清型が他よりも多く提示されてもよい。これらの実施形態に従って、任意の血清型１、２、３と本願に開示されるＤＥＮＶ−４構築物との組合せに関し、例えば製剤において提示される血清型の数、所定の応答および所望の効果に応じて、比率は１：２、１：３、１：４、１：１０、１：２０、１：１：１、１：２：２、１：２：１、１：１：１：１、１：２：１：２、１：３：１：３、２：３：３：３、５：４：５：５、４：４：４：５、１：２：２、４：４：５：５、４：４：５：６または任意の比率とすることができる。最後の数字は製剤中のＤＥＮＶ−４構築物の量を表す。各数字は１０のべき乗を表す（６＝１０６ＰＦＵ）。任意のデングウイルス血清型製剤が、それを必要とする対象への投与に使用されるワクチン（例えば弱毒ウイルス等）の生成に使用できると考えられる。
【００８５】
本願の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏの薬剤投与に適した生体適合性の形態の組成物の対象への投与を提供する。「ｉｎ  ｖｉｖｏの薬剤投与に適した生体適合性の形態」とは、活性作用剤（例えば、本願実施形態の薬剤としてのタンパク質、ペプチド、または遺伝子等）が、その活性作用剤の治療効果が毒性作用を上回るように投与される形態を意味する。治療効果をもたらす量の治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間において有効な量と定義される。例えば、ある化合物の治療効果をもたらす量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を生じさせる抗体の能力等の因子によって変動し得る。投薬レジメンは最適な治療的応答をもたらすように調整することができる。
【００８６】
一実施形態において、化合物（例えば、本願実施形態の薬剤としてのタンパク質、ペプチド等）は好都合な方法、例えば皮下、静脈内、皮内、経口投与、吸入、経皮適用、皮内、膣内適用、局所適用、鼻腔内または直腸投与により投与することができる。投与経路に応じて、作用化合物は、酵素、酸およびその化合物を不活性化し得る他の自然条件による分解からその化合物を保護する材料でコーティングされてもよい。一実施形態において、化合物は吸入のように鼻腔内投与されてもよい。
【００８７】
化合物は適切な担体または希釈剤中で対象に投与されても、酵素阻害剤またはリポソームのような適切な担体と共に投与されてもよい。本願で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、生理食塩水や緩衝剤水溶液等の希釈剤を含むように意図されている。化合物の不活性化を防止する材料で化合物をコーティングするか、または化合物をその材料と共に投与することが必要な場合がある。活性作用剤は非経口で、または腹腔内に投与されてもよい。グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中、それらの混合物中、および油中の分散液を調製してもよい。通常の保存条件および使用条件下で、これらの調製物は微生物の成長を防止する保存剤を含んでもよい。
【００８８】
注射用途に適した医薬組成物は、本分野で既知の手段により投与することができる。例えば、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、滅菌注射用溶液または分散液を即席で調製するための滅菌粉末を使用してもよい。いずれの場合でも、組成物は滅菌状態かつ注射容易性を有する程度に流体とすることができる。これは、製造条件および保存条件下で安定である可能性があり、細菌や菌類等の微生物の汚染活動に対して保存され得る。薬学的に許容される担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチンのコーティングを用いることにより、分散液の場合に要求される粒径を維持することにより、および界面活性剤を用いることにより、維持することができる。微生物の防止は、加熱、洗浄剤への作用剤の曝露、放射線照射または様々な抗菌性あるいは抗真菌性物質の添加により達成することができる。
【００８９】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記で列挙した１つ以上の材料と組み合わせて包含させることにより調製することができる。
水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散した有効量の治療用化合物、ペプチド、エピトープコア領域、刺激剤、阻害剤等を含むことができる。本願に開示される化合物及び生物由来物質は、本分野で既知の手段により精製することができる。
【００９０】
処方時、溶液が投薬製剤と適合する方法および治療上有効な量で投与される。製剤は、上述した注射用溶液等の様々な投薬形態で容易に投与される。徐放性カプセル、持続放出性のマイクロ粒子等も採用可能であると考えられる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。
【００９１】
活性治療剤は混合物中に、約１０２〜約５×１０６ＰＦＵの本願で考慮される各構築物を含むように製剤化することができる。単一用量または多用量を、所定の条件について適切なスケジュールで投与してもよい。ある実施形態では、０日目に１箇所の解剖学的または複数箇所の解剖学的位置に、干渉の低減した、または異なるリンパ節の免疫応答を誘導するために、２用量が投与されてもよい。ある実施形態では、一価、二価、三価または四価のデングウイルス構築物の製剤が対象に投与されてもよい。これらの製剤はいずれも、対象に単一用量または多用量として提供される。ある実施形態では、１用量が投与され、その後ある程度経ってから追加免疫が提供されてもよい。
【００９２】
別の実施形態において、鼻用溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入剤が、目的とする化合物の送達に用いられてもよい。他の投与形式に適した更なる製剤には、坐薬およびペッサリーが含まれる。直腸用ペッサリーまたは坐薬が使用されてもよい。一般に、坐薬について、従来の結合剤および担体には、例えばポリアルキレングリコールやトリグリセリドが含まれる。このような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％２％の範囲の活性材料を含む混合物から形成され得る。
【００９３】
α１−アンチトリプシンを含む医薬組成物、その類似体、またはセリンプロテアーゼ活性の阻害剤あるいはその機能的誘導体が個体に、特にヒトに、例えば皮下、筋肉内、鼻腔内、経口、局所、経皮、非経口、胃腸内、経気管支および経肺胞投与されてもよい。
【００９４】
本発明の方法のある実施形態では、対象はヒト等の哺乳類または獣医学の動物および／または家畜動物であってもよい。
本発明の一実施形態では、方法は、デングウイルスのいる国へ旅行の準備をしている対象へのワクチン接種を提供する。他の実施形態では、対象は流行地域の居住者であってもよい。対象は０日目に単回の注射または２回の注射を受けてもよく、任意選択で、３０日未満、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月または１年後に追加免疫してもよいことが企図される。
【００９５】
キット
他の実施形態は、本願に開示される方法（例えば、ワクチンを適用または投与する方法）および組成物と共に使用するキットに関する。いくつかの実施形態は、１種以上のデングウイルスを持っているか、それに曝露されたか、または曝露されたことが疑われる対象の予防または治療に用いられるワクチン組成物を有するキットに関する。ある実施形態では、キットは１種またはそれ以上のデングウイルス血清型の製剤（例えば弱毒ワクチン）を所定の比率で含んでもよい。キットは携帯可能であってもよく、例えば、軍事施設や辺鄙な村のような僻地に輸送されて使用されることができる。他のキットは、１種以上のデングウイルスに曝されたか、もしくはデングウイルスに曝される危険があると疑われる対象を処置するために、保健施設において使用されるものであってもよい。
【００９６】
キットはまた、適切な容器、例えば、バイアル、チューブ、ミニ遠心チューブもしくはマイクロ遠心チューブ、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器を含んでもよい。追加の成分や作用剤が提供される場合、キットはその作用剤や成分を入れる１つ以上の追加の容器を含んでよい。本願のキットはまた、典型的には、作用剤、組成物および任意の他の試薬の容器を商業的販売のために一緒にパッキングした状態で収容するための手段を含む。このような容器は、射出成形プラスチック容器もしくは吹き込み成形プラスチック容器を含んでもよく、その中に所望のバイアルが保持される。任意選択で、免疫原性因子や他の抗ウイルス剤、抗真菌剤または抗菌剤のような１種以上のさらなる作用剤が、記載される組成物のために、例えば、１種以上のさらなる微生物に対するワクチンとして使用する組成物のために、必要とされてもよい。
【００９７】
本発明の実施形態は、以下の非限定的実施例によりさらに例証される。これらは、その範囲に対し限定を加えるものであるとはいかなる場合にも解釈されないものとする。以下の実施例において開示された技術が、本願に開示される実施において十分に機能することが見出されている技術を代表するものであり、よって、その実施の好ましい態様を構成すると考えられることは、当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に鑑みれば、開示されるある種の実施形態では、本願の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であり、依然として同様のまたは類似の結果を得られることを理解するはずである。
【００９８】
実施例
〔実施例１〕
特定の例示的方法において、薬学的に許容される組成物に使用されるＤＥＮＶ−４キメラ構築物が形成される。
【００９９】
図１Ａは、本願に開示されるいくつかの実施形態の、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ゲノム（ＰＣＴ／ＵＳ０１／０５１４２、米国出願第１０／２０４，２５２（それぞれ、参照によりその全体を全目的で本願に援用する）に既に開示されている）と称される例示的なウイルス骨格を示しており、これは改変型ＤＥＮＶ−４構築物の作製に使用することができる（第２世代としても表示される）。図１Ａに示されるように、ＮＳ１−Ｇ５３Ｄ、ＮＳ３−Ｅ２５０Ｖ等の非構造領域における特定のアミノ酸置換突然変異、およびＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ゲノムの５’非コード領域におけるヌクレオチド置換突然変異Ｃ５７Ｔが同定されている。原型のＤＥＮＶ−１、３、および４構築物（第１世代とも表示される）は、ＤＥＮＶ−２骨格のｐｒＭおよびＥのコード配列を、各血清型の構造コード配列に置換することにより作製された（図１Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの複製効率を高め、また宿主において免疫原性を向上させることのできる改変型ＤＥＮＶａｘ−４構築物を作製するために、原型ＤＥＮＶａｘ−４構築物の非コード領域、構造タンパク質コード配列、および／または非構造領域に点突然変異を導入した。例えば、（ＤＥＮＶａｘ−４が現在含有する）デング−２ではなく野生型デング−４を模倣するように、現在のＤＥＮＶａｘ−４  Ｃ／ｐｒＭ切断部位の上流のアミノ酸配列を改変させることができる。
【０１００】
特定の例示的なＤＥＮＶ−４構築物におけるいくつかの追加の改変が表１に提示されている。下記に示されるのは、ＤＥＮＶ−２、ＤＥＮＶ−１および原型ＤＥＮＶａｘ−４の野生型配列と並べた特定の改変型ＤＥＮＶａｘ−４構築物（ＤＥＮＶａｘ−４ｂ、ＤＥＮＶａｘ−４ｃ、およびＤＥＮＶａｘ−４ｄ）に含まれる配列である。これらの配列における選択された変更は太字および下線で示されている。
【０１０１】
【化２】
0006486827.tif 000003
【０１０２】
図４は、原型および改変型ＤＥＮＶ−４構築物の概略的なマップを示す。ＤＥＮＶａｘ−４ｅはＤＥＮＶａｘ−４ｂ配列を骨格に使用して作製され、カプシドタンパク質のアミノ酸１０７位のＣからＹへの変異をさらに含む。ＤＥＮＶａｘ４ｆ、ＤＥＮＶａｘ４ｇおよびＤＥＮＶａｘ４ｊはＤＥＮＶａｘ−４ａ骨格上に構築されたが、図４に示されるようなＰＤＫ−５３配列の弱毒化突然変異の野生型復帰変異を含んでいる。すなわち、ＤＥＮＶａｘ−４ｆは野生型（ＤＥＮ−２  １６６８１）ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａを含み、ＤＥＮＶａｘ−４ｇは野生型５’ＮＣＲ、ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ａを含み、ＤＥＮＶａｘ−４ｊは野生型５’ＮＣＲを含む。ＤＥＮＶａｘ４ｈはＤＥＮＶ４  １０３６配列のエンベロープ４１７にＥからＫへの置換を有する。ＤＥＮＶａｘ４ｉは、ＮＳ４Ａの１７位にメチオニンからロイシンへのアミノ酸置換を有する（ゲノム核酸の６４２４位のＡ→Ｔ、または構築物のアミノ酸２１１０位と同義）。ＤＥＮＶａｘ４ｋは１０３６株の代わりに、ＤＥＮＶ−４  Ｈ２４１株由来のＰｒＭ／Ｅ遺伝子を有する（表１）。ＤＥＮＶａｘ４ｅ、ｈ、およびｉに構築された突然変異は、ベロ細胞での連続継代のＤＥＮＶａｘ４およびＤＥＮＶａｘ−４ｂからの配列データに基づいていた。
【０１０３】
ＤＥＮＶａｘ−４ｂは合計７個のアミノ酸の変更を含み、ＤＥＮＶａｘ−４ｃは合計９個のアミノ酸の変更を含み、ＤＥＮＶａｘ−４ｄは配列のフレームシフトをもたらすアミノ酸の欠失を含む。ＲＮＡを転写し、増幅およびウイルスレスキューのためベロ細胞へのエレクトロポレーションを行った。増殖動態実験において、ＤＥＮＶａｘ４−Ｐ２、ＤＥＮＶａｘ４−Ｐ８およびＤＥＮＶａｘ２−Ｐ２を対照に用い、ＤＥＮＶａｘ−４ｂおよびＤＥＮＶａｘ−４ｃを、ベロ細胞およびＣ７／３６細胞での増殖効率について試験した。ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ２およびＤＥＮＶａｘ−２−Ｐ２は、個々のウイルスプラークをＤＥＮＶａｘに感染したベロ細胞単層から選び取り、その後一つ一つのプラークを可視化するためのニュートラルレッドを含有するアガロースゲルで覆うプロセスであるウイルスプラーク精製によっては、遺伝子型として選択されなかったウイルス試料である。ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ８は、ＤＥＮＶａｘ−４遺伝子型クローンのウイルスストックを得るためにプラーク精製によって選択された。この工程は、復帰した弱毒化突然変異のないマスターシードウイルス（ＭＶＳ）を作製するために行われる。ＤＥＮＶａｘ−４ｃはベロ細胞での増殖後、十分なピーク力価に達せず、ＤＥＮＶａｘ−４およびＤＥＮＶａｘ−４ｂのいずれよりも初期増殖速度が遅かった。ベロ増殖曲線においてＤＥＮＶａｘ−４およびＤＥＮＶａｘ−４ｂのピーク力価の間に有意差はなく、両方とも同程度の初期増殖速度であった。Ｃ６／３６蚊細胞分析では、ＤＥＮＶａｘ−４ｂおよびＤＥＮＶａｘ−４ｃは両方とも野生型ＤＥＮＶ−４よりも有意に低いピーク力価に達し、これらの弱毒化が裏付けられた。
【０１０４】
【表１】
0006486827.tif 000004
【０１０５】
〔実施例２〕
完全長感染性ｃＤＮＡクローンの作製
改変型ＤＥＮＶａｘ−４構築物配列を含む完全長感染性ｃＤＮＡクローンを作製するには、多段階ダイジェスション／ライゲーションスキームを使用可能である。これは下記の工程を有し得る：１）改変型核酸配列または改変型構造タンパク質コード配列を含むＡｇｅＩ／ＭｌｕＩ合成フラグメント（例えば、ｂ、ｃまたはｄ、あるいは上記構築物のうちの任意のもの）をｐＤ２／３−ＰＰ１−５’に挿入してｐＤ２／４ｉ−ｂ、ｃまたはｄを生成する；２）ｐＤＥＮＶａｘ−４完全長ｃＤＮＡクローンをダイジェスションしてＭｌｕＩ／ＮｇｏＭＩＶフラグメントを抽出し、それをｐＤ２／４ｉ−ｂ、ｃまたはｄの対応する位置に挿入してｐＤ２／４ｉ−ｂ、ｃまたはｄを得る；３）ｐＤＥＮＶａｘ−４完全長ｃＤＮＡクローンをダイジェスションしてＮｇｏＭＩＶ／ＸｂａＩフラグメントを抽出し、それをｐＤ２／４ｉ−ｂ、ｃまたはｄの対応する位置に挿入して、改変型配列を含む完全長感染性クローンを作製する。最終的な完全長感染性クローンの配列を配列解析により確認した。
【０１０６】
ウイルスの作製
改変型構築物の各々のｃＤＮＡクローンをゲノムウイルスＲＮＡに転写した。そのＲＮＡをエレクトロポレーションによりベロ細胞に変換した。ＣＰＥをモニタリングしながらウイルスを１２日間増殖させ、回収した。エレクトロポレーション後のこの最初の回収をＰ１（継代（Ｐａｓｓａｇｅ）１）と名付けた。その後の増幅および継代をＰ２、Ｐ３、・・・とした。原型ＤＥＮＶａｘ−４、ならびにＤＥＮＶａｘ−４ｂおよびｃについては僅かなＣＰＥがあったが、ＤＥＮＶａｘ−４ｄでは目立ったＣＰＥが生じなかった。他のウイルスとは異なり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させると、デングウイルスはベロ細胞内で増殖した時にＣＰＥをあまり生じない。ＤＥＮＶａｘ−４ｄウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＰＥを全く生じなかったが、他の株と並行して増幅した。増幅したＰ１ウイルス（例えば、ＤＥＮＶａｘ−４ｂ、ｃ、ｄＰ１）は配列解析および増殖曲線実験を実施するのに十分に高い力価を生成した。ＤＥＮＶａｘ−４ｄには力価がなく、したがってエレクトロポレーション後にウイルスが形成されなかった。
【０１０７】
ＤＥＮＶａｘ−４ｂおよび−４ｃウイルスは完全に配列決定された。ＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ２ウイルスには２つの突然変異があった。ヌクレオチド４１６位は、ＤＥＮＶａｘ−４ｂウイルスのカプシドに作られた改変の位置（Ｃ／ｐｒＭジャンクション付近）であった。これは混合集団であったため、ｎｔ４１６は操作された「Ｇ」ヌクレオチドに代わり「Ａ」ヌクレオチドに戻っており、予測されるアミノ酸であるアルギニンに代わってリジンをもたらした。ＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ２ウイルスに見られた第２の突然変異はヌクレオチド８７６９位にあった。これは、予測されるグルタミンからプロリンへのアミノ酸の変化を引き起こした。この突然変異は感染性クローンのＮＳ５遺伝子領域にあった。ＤＥＮＶａｘ−４ｃ−Ｐ２ウイルスには４つの突然変異があった。混合集団であったＤＥＮＶａｘ−４ｂウイルスとは異なり、これらは全て完全変換であった。ゲノムのカプシド領域におけるヌクレオチド４００位の突然変異は、Ｃ／ｐｒＭジャンクションに作られた改変に影響を与えた。これは、その位置の予測されるアミノ酸をスレオニンに代えてプロリンにした。他の３つの突然変異は非構造遺伝子内にあり、そのうちの２つはアミノ酸の変化を生じ、１つはサイレント変異であった。
【０１０８】
ウイルスの表現型および遺伝的特性評価
ウイルスの表現型の特性評価をベロ細胞およびＣ６／３６（ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ））細胞において行った。図５〜６は、改変型ＤＥＮＶａｘ−４構築物から作製されたウイルスバリアントの例示的な表現型特徴を示す。プラークサイズは重要な弱毒化マーカーであり、ウイルスバリアントの各々について解析された。図５に示すように、ＤＥＮＶａｘ−４ｂウイルスのプラークサイズは直径およそ０．３ｃｍであった。ＤＥＮＶａｘ−４ｃウイルスのプラークサイズは直径約０．１ｃｍであった。ＤＥＮＶａｘ−４ｈウイルスのプラークサイズは直径約０．３ｃｍであった。ＤＥＮＶａｘ−４ｉウイルスのプラークサイズは直径約０．１ｃｍであった。ＤＥＮＶａｘ−４ｃウイルスのプラークサイズは直径約０．２ｃｍであった。各サイズは５〜１０個のプラークの平均値を表す。ｂおよびｃ候補ウイルス、特にＤＥＮＶａｘ−４ｃのプラークは均質ではなかった。いくつかの小さいプラークおよびいくつかの大きいプラークを含むウイスルの混合集団が存在した。これらの小さいおよび大きいプラークの配列のばらつきは、弱毒化およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ適合性をもたらし得る可能なヌクレオチド変化に関して特性評価することができる。必要であれば、これらの突然変異を更なるＤＥＮＶａｘ−４バリアントに作り出してもよい。図６Ａ〜６Ｆは野生型ＤＥＮＶ−４ウイルス（Ａ）およびＤＥＮＶａｘ−４ｂ〜ｆウイルスバリアント（Ｂ〜Ｆ）のそれぞれのイムノフォーカスの例示的な結果を示す。
【０１０９】
いくつかの例示的な方法において、ＤＥＮＶ−４構築物から作製されたウイルスの増殖曲線を測定した。ベロ細胞の単層を０．００１のＭＯＩで様々なＤＥＮＶ−４構築物組成物（例えば、ＤＥＮＶａｘ−４ｂ〜ｊ、およびＤＥＮＶａｘ−４Ｐ１）に感染させた。いくつかの例示的実験では、１３日目まで隔日で試料を採取し、アリコートを滴定した。ＤＥＮＶａｘ−２−Ｐ２ウイルスはより迅速にピーク力価に達した。ＤＥＮＶａｘ−４ｂウイルスはピーク力価および増殖速度において、ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ２およびＰ８ウイルスと同様であった。ＤＥＮＶａｘ−４ｃウイルスは初期は増殖速度が遅かったが、最終的には同様のピーク力価に達した。ＤＥＮＶａｘ−４ｂおよびＤＥＮＶａｘ−４ｃウイルスの効率およびピーク力価は原型ＤＥＮＶａｘ−４と同程度であった。他の例示的な実験では、２日目から１２日目まで隔日で試料を得た。回収した培地を保持し、更なる研究のため、７、９および１１日目に安定化した。２日目から１２日目までの試料をＩＦＡにより滴定した。ＤＥＮＶａｘ−４ｅ〜４ｈウイルスは対照ＤＥＮＶａｘ−４と同様のピーク力価を示した（図７）。
【０１１０】
弱毒化を実証するためには、各ワクチンウイルスの複製効率はＣ６／３６蚊細胞において野生型ウイルスよりも低下されなければならない。この表現型は、自然界において弱毒キメラウイルスが伝染する可能性のないことを確認するためのＤＥＮＶａｘワクチンウイルスの必須の安全性特性である。いくつかの例示的方法では、Ｃ６／３６蚊細胞での増殖はＤＥＮＶａｘ４ｂおよびＤＥＮＶａｘ−４ｃウイルスの増殖特性を野生型デング４ウイルス（株１０３６）と比較するために行われた。他の例示的実験では、ＤＥＮＶａｘ４ｅ〜４ｊと原型ＤＥＮＶａｘ４との間で比較を行った。デュプリケートでフラスコのＣ６／３６細胞を０．００１のＭＯＩで各Ｐ２ウイルス（−ｂ、−ｃ、および野生型）に感染させ、１４日間増殖させた。デング４野生型ウイルス（ＷＴ  Ｄ４  １０３６）は最も効率的に複製し、最高の力価となった。ＤＥＮＶａｘ−４ｂウイルスはＣ６／３６細胞中である程度良く複製し、１４日目までに２．７×１０６ｐｆｕ／ｍＬのピーク力価に達した。ＤＥＮＶａｘ４ｃウイルスは６日目まで増殖が非常に遅く、その後１４日目まで増殖が加速し、２．２×１０４ｐｆｕ／ｍＬのピーク力価に達した。６日目、ＤＥＮＶａｘ−４ｂおよびＤＥＮＶａｘ４ｃは両方とも、Ｃ６／３６細胞中の野生型と比較して増殖が同程度に減衰し、原型ＤＥＮＶａｘ−４と同程度の力価を有した。他の例示的実験では、本願の特定の実施形態のキメラデングウイルスをＣ６／３６蚊細胞内で増殖させた。蚊細胞内でのＤＥＮＶａｘ４ｅ〜４ｊ増殖を対照ＤＥＮＶａｘ４と比較した。デュプリケートでフラスコのＣ６／３６細胞を０．００１のＭＯＩで各Ｐ２ウイルスに感染させ、１２日間増殖させた。２日目から１２日目まで試料を回収した。蚊細胞内での増殖をベロ細胞内での増殖と比較した。７、９および１１日目に培養培地を得て安定化した。２日目から１２日目までの試料をＩＦＡにより滴定し、ウイルス生成について分析した。構築物のウイルス力価および増殖を対照ＤＥＮＶａｘ４と比較した（図８参照）。
【０１１１】
図７〜８は、ベロ細胞（図７）およびＣ６／３６蚊細胞（図８）における様々なＤＥＮＶ４構築物のウイルスの増殖曲線を示す例示的なグラフを表す。本願の特定の実施形態のいくつかの新規なＤＥＮＶａｘ４構築物は、ベロ細胞（図７）において対照ＤＥＮＶａｘ４よりも高い力価を、および蚊細胞（図８）において対照ＤＥＮＶａｘ４よりも低い力価を生成し、動物モデルでの更なる評価が求められた（下記の表２参照）。
【０１１２】
マウスにおけるウイルスバリアントの安全性および有効性
ＤＥＮＶａｘ−４ｂ、ｃまたは他のバリアントウイルスの免疫原性を分析するための研究を行った。表２は例示的な研究計画を示す。１０匹のＡＧ１２９マウスの群に、それぞれ１０４ＰＦＵのＤＥＮＶａｘ−４、および別個のバリアントを（足裏の）皮内へワクチン接種した。対照群には賦形剤溶液のみを注射した。４２日後、これらのマウスに追加免疫用量を与えた。初回接種後４２日目および５６日目に、血清学用の血清試料を採取し、ＰＲＮＴによりセロコンバージョンを分析した。第２世代のＤＥＮＶａｘ−４ｂおよびｃバリアントを免疫原に用いた場合、ＤＥＮＶａｘ−４の免疫原性に有意な改善はなかった。
【０１１３】
【表２】
0006486827.tif 000005
【０１１４】
ＤＥＮＶａｘ−４ｂの免疫原性を更に改変および増幅するために、このウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏでベロ細胞増殖に適応させた。哺乳類細胞培養での適応がウイルスの複製能力を強化し、ひいてはその免疫原性を高めると仮定して、これを１０回の盲継代により行った。この「新しい」第２世代ＤＥＮＶａｘ−４をＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１０（１０継代）と名付けた。
【０１１５】
３種の別個のＤＥＮ４ウイルス、すなわち第１世代、第２世代（４ｂ構築物）および相同野生型ＤＥＮ４  １０３６を含むデングウイルスワクチンの異なる四価製剤を評価するために、別の研究を行った。６匹のマウスの群に、５０μＬ体積中１０４ＰＦＵ  ＤＥＮＶａｘ−１、１０３ＰＦＵ  ＤＥＮＶａｘ−２、１０４ＰＦＵ  ＤＥＮＶａｘ−３および１０５ＰＦＵ  ＤＥＮＶａｘ４（４：３：４：５）を含有する四価ワクチン製剤を皮内注射した。対照マウスには同じ経路で１０５ＰＦＵの第１世代、第２世代または野生型１０３６一価ＤＥＮＶ４を注射した。希釈剤のみを注射したマウスの群を対照に含めた。４２日目に、全マウスに同様のワクチン製剤の追加免疫注射を行った。初回接種後０、２１、４１および５６日目にマウスを出血させ、全４種のＤＥＮＶ血清型に対する中和抗体の存在を判定した。５６日目に、群４、５および６からのマウスをＤＥＮＶ−２（ＮＧＣ株）で攻撃し、生存率を評価した（現在、有効性分析用に使用されるマウス適応性の致死性ＤＥＮＶ４株はない）。表３に示されるように、第１世代および第２世代のＤＥＮＶａｘ−４ワクチンは、単独で投与された時に同程度の免疫原性プロフィールを有する。しかし、これらが四価デングウイルスワクチンとして与えられると、第２世代ＤＥＮＶａｘ−４のみに影響を与える干渉により、ＤＥＮＶ−４に対する免疫応答は弱まる。野生型ＤＥＮＶ４は高度に免疫原性であり、四価デングウイルスワクチンにおいては、これは他の３種のデングウイルスワクチンによって誘導される中和抗体応答を干渉、抑制する。野生型ＤＥＮＶ４、第１世代および第２世代ＤＥＮＶａｘ−４は異種ＤＥＮＶ−２攻撃からの部分的な保護を提供した。
【０１１６】
ＮＨＰにおける第２世代ＤＥＮＶａｘの安全性および有効性
【０１１７】
【表３】
0006486827.tif 000006
【０１１８】
４匹のカニクイザルの群におけるＤＥＮＶａｘの免疫原性を、各四価ＤＥＮＶａｘ製剤（表４および図２）の０．５ｍＬ注入量での皮下注射後に評価した。この研究の目的は、主要な第２世代ＤＥＮＶａｘ−４構築物を第１世代ＤＥＮＶａｘ−４と比較して評価することであった。また、ＤＥＮＶａｘにより誘導されるＤＥＮＶ−４に対する中和抗体応答を改善する様々な方法を検討した。これらは、従来使用されていたＤＥＮＶａｘ−４の用量の１０×を含む製剤（「新製剤」と名付ける）を試験すること、および四価混合物のＤＥＮＶａｘ−２成分を減少させることを含んでいた（このワクチンは４つのワクチンウイルス株の中で最も免疫原性であるため）。様々な投与日を試験し、同日の初回免疫および追加免疫を（０日目）、０日目の初回免疫および６０日目の追加免疫と比較した。血清学用の試料を０、２８、５８、７３、および９０日目に採取した。ＤＥＮＶ−４バリアントウイルスおよび原型に対する中和抗体力価の動態を、一例として図３に示した。同様のレベルが確認された。
【０１１９】
【表４】
0006486827.tif 000007
【０１２０】
ＮＨＰ研究のためのワクチン製剤をバルク調製した。群１に、ｃＧＭＰにより製造され、ヒト治験で現在試験されているワクチンと同一のワクチンを与えた。ワクチンをＮＨＰに与え、その後、逆滴定して実際の用量を決定した。結果を下の表５に示す。
【０１２１】
【表５】
0006486827.tif 000008
【０１２２】
ウイルス血症用の試料を初回投与後−１１日目（ベースライン）、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目、１７日目、２１日目、２８日目、５８日目、６２日目および６６日目に採取した。血清試料からＲＮＡを抽出し、テトラプレックスｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによりウイルス力価を測定した。検出可能なウイルス血症を示した唯一のウイルスはＤＥＮＶａｘ−２であり、これは初回ワクチン接種後２１日目までに消退した。ワクチンの追加免疫用量の投与後に検出されたウイルスはなかった。
【０１２３】
９６ウェルプレートにおいて、ハイスループットＰＲＮＴアッセイを用いて血清を評価した。第１および第２世代ＤＥＮＶａｘ−４の比較（群１対群２の比較）は、これら２つのウイルスの免疫原性における有意差を示さなかった（表６）。
【０１２４】
【表６】
0006486827.tif 000009
【０１２５】
より高用量のＤＥＮＶａｘ−４を評価したところ（群３）、ＤＥＮＶ−４中和抗体応答の動態において有意差が得られることが明らかとなった。２つの異なるワクチン製剤を比較すると、ピーク力価は概ね同程度を維持した（２倍の希釈範囲内）。しかし、免疫がより多い量のＤＥＮＶａｘ−４で行われた場合、ＤＥＮＶ−４のピーク力価が得られた速度は遥かに早かった。さらに、製剤中のＤＥＮＶａｘ−２の量を減少させたところ（群５）、この四価ＤＥＮＶａｘワクチンの血清応答におけるＤＥＮＶ−４の動態またはピーク力価に顕著な差はなかった。
【０１２６】
図９は、本願に開示されるウイルス構築物の安全性および有効性を動物モデルで試験するための１つの例示的な工程のフローチャートを表す。例えば、ワクチンとして用いられる１つ以上のキメラデングウイルスを含む組成物（１つまたは複数）、例えばＤＥＮＶａｘ４ｅ、ＤＥＮＶａｘ４ｆまたはＤＥＮＶａｘ４ｈ、あるいは他のキメラ構築物の組成物、もしくは対象組成物を動物モデル（例えばＡＧ１２９）で試験することができる。動物を０日目に初回免疫し、次に３０日目か、４２日目か、それらより前か、または他の適切な時期に、同じまたは異なるデングウイルスワクチン組成物で追加免疫することができる。その後、動物を１種以上のデングウイルス血清型に曝露することにより攻撃し、攻撃に対する免疫応答の誘導を評価することができる。血液試料を、中和抗体の試験用に例えば０、３０、４１、４８、５２または８４日目または他の適切な日に回収し、ウイルス血症の（または組成物および選択される投与プロトコールに適切とされる）試験用に５日目や４７日目等の他の日に回収することができる。
【０１２７】
ウイルスクローニングおよびＰ１へのレスキュー
プラスミド突然変異誘発を使用して、本願に開示されるワクチン組成物に用いられる新しいＤＥＮＶ−４キメラクローンを作出した。点突然変異をコードするプライマーを合成し、新しい感染性クローン全体を増幅するために使用した。テンプレートをＤｐｎＩによりダイジェスションし、その後のプラスミドをシークエンシングした。ＲＮＡを転写し、ベロ細胞にエレクトロポレーションして継代レベル０（Ｐ０）のウイルスを作製した後、ベロ細胞内での１回継代により増幅した。
【０１２８】
ＤＥＮＶａｘ−４ｂクローンのカプシド／ＰｒＭジャンクションにおける改変は、ＮＨＰ研究においてＤＥＮＶ−４免疫原性の増強を引き起こすようには見えなかった。ＤＥＮＶ−４およびＤＥＮＶａｘ−４ｂの連続盲継代からのシークエンシングデータを用いて、ベロ細胞適応を促進し得る３個の点突然変異を同定した。さらに、いくつかの弱毒化突然変異が野生型配列に復帰し、マウスにおける免疫原性を高めた。図６に示されるように、ＤＥＮＶａｘ−４ｅおよびＤＥＮＶａｘ−４ｈの大きいＩＦＵサイズおよび溶解性表現型は、これらのクローンがマウスにおいて免疫原性の増強を示す可能性があることを示す。新しいＤＥＮＶａｘ−４クローンの各々の増殖動態を分析するための実験を行い、挿入された改変がベロ細胞適応を促進するか否かを調べた。Ａ１２９マウスでの免疫原性を分析する試験も行われる。
【０１２９】
増殖動態
ベロ細胞におけるデングワクチン株の連続継代は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖により適する株を選択するための古典的な方法である。これらの例示的な増殖実験において、ＤＥＮＶａｘ−２（図１）が対照に含められ、これは２日目に最も高い初期力価を示し、続いてＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１０、ＤＥＮＶａｘ−４、およびＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１であった。増殖期間の終わり（１２日目）ではＤＥＮＶａｘ−２が最も高いピーク力価を有し、続いてＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１０、ＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１、およびＤＥＮＶａｘ−４であった。
【０１３０】
配列のアミノ酸変化
ＤＥＮＶａｘ４−Ｐ１０ゲノムシークエンシングは、アミノ酸Ｅ−４１７  Ｅ−Ｋ（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）およびＮＳ４Ａ−１７  Ｍ−Ｌに相当する突然変異を示した。ＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１０シークエンシングは、アミノ酸Ｃ−１０７  Ｃ−Ｙに相当する突然変異を示した。Ｅ−４１７  Ｅ−Ｋ突然変異は、カルボニルヒドロキシル基をアミン基（ＮＨ２）に置換するようにアミノ酸残基を変化させる。しかし、Ｒ基は依然として荷電しており、親水性を維持する。ＮＳ４Ａ−１７  Ｍ−Ｌ突然変異はＲ基からの硫酸基の除去をもたらすが、非極性を維持し、その結果疎水性アミノ酸をもたらす。Ｃ−１０７  Ｃ−Ｙ突然変異はＲ基の劇的な変化をもたらす。システインはジスルフィド結合を形成可能なＳＨ基を持つ。一方、チロシンはヒドロキシル基を持つ炭素ベンゼン環を有する。これはアミノ酸残基を親水性に代えて疎水性にさせ、他のアミノ酸Ｒ基との相互作用に影響を与える。
【０１３１】
図１９は、増殖動態実験におけるＤＥＮＶａｘ−４構築物の力価のグラフである。各試料を採取した日がｘ軸にプロットされ、力価がｙ軸にプロットされている。
ＤＥＮＶａｘでワクチン接種したＮＨＰにおける中和抗体
ある方法において、ＤＥＮＶ−４キメラ構築物ウイルスの評価が、免疫レジメンを試験する大規模な研究により行われた。ＤＥＮＶａｘ−４ａの免疫原性と比較したＤＥＮＶａｘ−４ｂの免疫原性を試験した。０日目に群１および２を２用量でワクチン接種し、追加免疫のワクチン接種は行わなかった。ＤＥＮＶａｘ−４（菱形）もＤＥＮＶａｘ−４ｂ（四角）も全ての用量について同じ力価を用いた。ＤＥＮＶ−４を含む全ての血清型の間で、中和抗体の幾何平均力価（ＧＭＴ）に有意差はみられなかった。これは、四価ＤＥＮＶａｘにおけるＤＥＮＶａｘ−４ｂの使用がＤＥＮＶ−４に対する中和抗体応答に影響を与えるか、またはそれを増強することを示唆している。図２０：群１（ＤＥＮＶａｘ−４、菱形）と２（ＤＥＮＶａｘ−４ｂ、四角）とを比較したＧＭＴ値。ＧＭＴ値は、プラーク減少中和技術からの中和抗体値の測定値である。
【０１３２】
四価ＤＥＮＶａｘ中のＤＥＮＶａｘ−４の用量の増加がＤＥＮＶ−４に対する免疫原性を増強するか否かを確認するため、群１および３における中和抗体応答を比較した。結果は、高用量のＤＥＮＶａｘ−４で免疫した霊長類では、従来の四価ＤＥＮＶａｘで免疫したものと比べて、最初の６０日で検出された一次中和抗体のＧＭＴが増加することを示した。他のＤＥＮＶ血清型の間でＧＭＴに有意差はなかった（図２１）。これは、高用量のＤＥＮＶａｘ−４がＤＥＮＶ−４に対する中和抗体応答を改善することを示唆している。
【０１３３】
免疫原性に対する免疫スケジュールの効果を試験するために、群１（菱形）および４（四角）で中和抗体応答を比較した（図２２）。図２２は中和抗体応答に対するワクチンスケジュールの効果を示すＧＭＴ値を示している。これは、０日目の２用量および追加免疫なしが、０日目の１用量および６０日目の１用量と比べて悪影響とならないことを示している。最後に、ＤＥＮＶａｘ−２の用量の減少がＤＥＮＶａｘ−４の免疫原性に影響を与えるかどうかを調べるために、群４（菱形）および５（四角）からのデータを比較した。結果は、ＤＥＮＶ−４に対するＧＭＴには有意差がないが、ＤＥＮＶ−２に対するＧＭＴは群５で有意に減少したことを示している。これは、ＤＥＮＶａｘ−２により誘導される抗体応答が、ＤＥＮＶａｘ−４により誘導される抗体応答に悪影響を与えないことを示している（図２３）。図２３は、群４（菱形）および５（四角）の全ＤＥＮＶ血清型についてのＧＭＴ値を示す。結果はプラーク減少中和技術を用いて判定した。
【０１３４】
これらの実験の結果は、本願に開示される構築物がＤＥＮＶ−４中和抗体応答を改善することを裏付けている。投与製剤におけるＤＥＮＶａｘ−４の増加は、中和抗体産生量の有意な増加を示さない。ＤＥＮＶａｘ−２の用量は、ＤＥＮＶａｘ−４の中和抗体応答に影響を与えないようにも見える。初回２用量ワクチン接種法と、初回および追加ワクチン接種法との間で、抗体産生量にはほとんどまたは全く差がないかもしれない。ＤＥＮＶａｘ−４に現在用いられている株であるＤＥＮＶ−４  １０３６に対し、十分な中和抗体力価が生成される。成功するＤＥＮＶ−４ワクチンは、ゲノム改変を有する、異なる遺伝子型および異なる表現型の新しく進化した株を含む野生型ＤＥＮＶ−４の多くの株を十分に中和可能である必要がある。
【０１３５】
シークエンシング中、継代１と継代１０の両方の構築物の間で３個の点突然変異が特定された。これらの突然変異は、上述したようにＤＥＮＶａｘ−４ｂのカプシド領域ならびにＤＥＮＶａｘ−４のｐｒＭ遺伝子およびエンベロープ遺伝子に位置していた。構築物へのこれらの突然変異の取り込みは、ウイルスの減衰を低下させることによりベロ細胞内での増殖の促進をもたらす可能性があり、これは免疫原性を高め得る。本願に開示されるように、ＤＥＮＶａｘ−４ｈでは中和抗体力価が２倍増加した。一方、ＤＥＮＶａｘ−４ｅでは中和抗体力価が１．５倍増加した。他の方法では、ＤＥＮＶ−４免疫原性の増強が試験され、他の二価、三価および四価構築物組成物と比較される。
【０１３６】
〔材料と方法〕
細胞培養
ベロ細胞はアフリカミドリザルの腎臓から誘導された哺乳類細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で使用されたベロ細胞株。ベロ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ユタ州ローガン）、２％Ｌ−グルタミン（ハイクローン）、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、ハイクローン）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、メディアテック社（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、バージニア州マナッサス）において３７℃で増殖させた。細胞を継代させるため、トライプルエクスプレス（Ｔｒｙｐｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）溶液（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いてフラスコ表面から細胞を除去した。
【０１３７】
ベロ単層のウイルス感染
ベロ細胞を、感染の約４８時間前に複数のＴ−７５ｃｍ２フラスコに播いた。１０％ＦＢＳ、２％Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭを細胞増殖培地に用いた。細胞がコンフルエントに達したら、ＰＢＳで１：５に希釈された０．２５％トリプシン溶液４ｍＬで１つのフラスコをトリプシン処理した。ＭＯＩを定めるため、細胞を計数した。残りのフラスコのうち２つを、ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ２（第１世代ＤＥＮＶａｘ−４）またはＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ３または他の構築物１ｍＬ中の所定のＭＯＩで感染させ、ＢＡ−１希釈剤（ウシ血清アルブミン、１×Ｍ１９９、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１×Ｌ−グルタミン、７．５％重炭酸ナトリウム、１×Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１×ファンギゾン）で希釈した。細胞単層の乾燥を防ぐために１０分ごとに揺動させながら、ウイルスをベロ細胞に９０分間吸着させた。吸着後、５％ＦＢＳを添加した２０ｍＬのＤＭＥＭを各フラスコに加えた。フラスコを７日間３７℃でインキュベートした。
【０１３８】
ウイルス回収とその後の感染：盲継代
所定期間の経過後、各フラスコでＣＰＥを確認し、ウイルス上清を回収して、−８０℃での保存用に２０％ＦＢＳ中で安定化した。以前に播種したコンフルエントＴ−７５ｃｍ２ベロフラスコを、前述のフラスコからの１ｍＬのウイルス上清で感染させた。ウイルスを、１０分ごとに揺動させながら９０分間吸着させた。ウイルス吸着後、各フラスコに２０ｍＬ  ＤＭＥＭ  ５％ＦＢＳを加えた。新しい未感染の対照フラスコを７日ごとにプレーティングした。以降１０週間、この工程を７日ごとに繰り返して各ウイルスにつき１０の継代を得て、ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ２−Ｐ１〜Ｐ１０またはＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ３−Ｐ１〜Ｐ１０あるいは様々な構築物について指定された他の記号で名称を付けた。
【０１３９】
ウイルスのプラーク滴定
ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ２およびＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ３ならびに他のキメラ構築物からの試料を１、５および１０週目に採取し、力価を測定するためにプラーク滴定した。ウイルス試料を１×１０−１から１×１０−６までＢＡ−１希釈剤で段階的に希釈した。試料はトリプリケートでプラーク滴定し、各希釈物の１００μＬを、ベロ細胞を予め播種した６ウェルプレートに９０分間、８分ごとに揺動させながら吸着させた。吸着後、ウェルを４ｍＬのＢＳＳ／アガー（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、グルコース、ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ）溶液で被覆し、４日間３７℃でインキュベートした。４日目にウェルを２ｍＬのＢＳＳ／アガー／ニュートラルレッド溶液で被覆し、一晩３７℃でインキュベートした。５、６および７日目にプラークを計数した。
【０１４０】
増殖曲線分析
ベロ細胞で増殖曲線を実施することにより、適応した株の増殖動態を分析した。上述したようにベロフラスコを播種した。０日目に、ベロ細胞のコンフルエントなフラスコを計数し、０．００１のＭＯＩでフラスコを感染させるのに必要なウイルスＰＦＵを計算した。フラスコを１ｍＬのＤＥＮＶａｘ−４、ＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１、ＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ１０、またはＤＥＮＶａｘ−２あるいは他のキメラ構築物（例えばＤＥＮＶａｘ−４ｅ、４ｈ等）で感染させた。ウイルスを単層に９０分間、８分ごと揺動させながら吸着させた。吸着後、１％Ｆ−１２７を添加したＦＢＳを含まない１０ｍＬのｃＤＭＥＭを各フラスコに加え、試料を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。２日目および４〜１２日目に各フラスコの上清から試料を回収した。フラスコ内の上清の全量を回収することによりワクチンを採集し、４日目および６〜１２日目に増殖培地を新しいｃＤＭＥＭ−Ｆ１２７に取り換えた。培地の交換の際、フラスコをＰＢＳで３回洗浄した。試料を１×ＦＴＡ（ＦＴＡ：１５％トレハロース、１％Ｆ−１２７、０．１％ヒト血清アルブミン、ＰＢＳ）中で安定化し、上述したようにプラーク滴定を行って力価を測定した。
【０１４１】
ＤＥＮＶａｘ−４およびＤＥＮＶａｘ−４ｂの両方をベロ細胞で１０回盲継代した後、各継代をシークエンシングしてＰ１とＰ１０との間の突然変異を同定した。シークエンシング反応は、ＤＥＮＶａｘ−４−Ｐ２−Ｐ１とＰ１０、およびＤＥＮＶａｘ−４ｂ−Ｐ３−Ｐ１とＰ１０についてＣＤＣで行われた。ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡキットを用いてウイルスストックから単離した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＣＤＣにより以前に設計されたプライマーを使用してＲＮＡをＤＮＡに転写した。プライマーはＤＥＮＶ−２  １６６８１およびＤＥＮＶ−４  １０３６の配列から設計されている。１つの構築物につき約７〜９種類のＰＣＲフラグメントをＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。次に、ＤＮＡフラグメントをベックマン・コールターにより自動シークエンシング反応を用いてシークエンシングし、比較のためにアラインメントした。
【０１４２】
シークエンシング
様々な構築物をベロ細胞で１０回以上継代させた後、各継代をシークエンシングして突然変異を同定した。シークエンシング反応は各試料について実施した。ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡキットを用いてウイルスＲＮＡをウイルスストックから単離した。逆転写ＲＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＣＤＣにより以前に設計されたプライマーを使用してＲＮＡをＤＮＡに転写した。プライマーはＤＥＮＶ−２  １６６８１およびＤＥＮＶ−４  １０３６の配列から設計されている。１つの構築物につき約７〜９種類のＰＣＲフラグメントをＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。次に、ＤＮＡフラグメントをベックマン・コールターにより自動シークエンシング反応を用いてシークエンシングし、比較のためにアラインメントした。
【０１４３】
非ヒト霊長類研究
カニクイザルを異なる試験群に分け、様々なＤＥＮＶ−４構築物を有する四価のＤＥＮＶａｘの用量でワクチン接種した。１つの群につき１つの製剤を試験することができる。製剤１は、ＤＥＮＶａｘ−４第１世代を含む高用量のＤＥＮＶａｘを含むことができ、群１の霊長類は０日目に２用量で初回免疫され、追加免疫を受けない。製剤２はＤＥＮＶａｘ−４構築物を含む高用量のＤＥＮＶａｘを含んだものであり、群２の霊長類は０日目に２用量で初回免疫され、追加免疫を受けないものとすることができる。ワクチンは皮下またはＩＤ、あるいは針を使用するまたは使用しない系とシリンジとを用いる他の方法により投与することができる。血清学について試験する試料は、０、２８、５８、７３、９０、１２８または他の適切な時期に採取することができる。血清中の中和抗体応答はプラーク減少中和技術により測定される。
【０１４４】
プラーク減少中和技術
血清試料における中和抗体産生を試験するために、プラーク減少中和アッセイを使用することができる。単層コンフルエンシーを確実にするため、接種の２日前にベロ６ウェルプレートに播種する。血清試料を９６ウェルプレート中にＢＡ−１希釈剤で２倍ずつ連続希釈し、デングウイルスと共に約２０時間４℃でインキュベートした。インキュベート後、ベロウェルに調製済みウイルス／血清希釈物を接種した。単層の乾燥を防ぐため８分ごとに揺動させながら、試料を９０分間吸着させる。吸着後、ウェルをＢＳＳとアガロースの１：１溶液で被覆し、３７℃で４日間インキュベートする。４日目、細胞を１：１比のニュートラルレッド添加ＢＳＳ溶液とアガロースで被覆することができる。ウェル上の視認できるプラークを、例えば５、６、および７日目に計数する。ＧＭＴ値は、ウイルスの５０％を中和可能な血清の平均希釈率を示す。これは、血清の非存在下で形成されるプラークの数を決定し、（希釈を説明するため）その値を２で割り、血清のどの希釈率が、その量と同じまたはそれ未満のプラーク形成をもたらしたかを注記することにより測定される。
【０１４５】
ＤＥＮＶａｘ−４ｅ（カプシド突然変異）と比較してＤＥＮＶａｘ−４ｈ（エンベロープ突然変異）の高い免疫原性は、ＤＥＮＶａｘ−４エンベロープタンパク質が最適化され得ることを示唆する。エンベロープタンパク質は、中和抗体の生成のためのエピトープを提供し、強力な抗体応答を誘導するエピトープ部位を最適化するように配列を改変することにより、抗体力価が増大し得る。ＤＥＮＶａｘ−４ｈの４１７位におけるエンベロープ突然変異はステム領域の保存された部分にある。ＤＥＮＶ−４は、この位置に他のフラビウイルスとは異なるアミノ酸を有する。ステム領域はＥタンパク質のドメインＩＩＩにあり、ここには最も強力な中和エピトープ部位が存在する。この部位に結合して中和する抗体は、ステム領域がエンドサイトーシス後にエンドソーム膜と融合するのを抑制する。実際、ＤＥＮＶ−１、−２、−３、およびＷＮＶを含むフラビウイルスファミリーの間で４１７位は保存されている。ＥからＫへの復帰変異は、より強い免疫応答を示すように二次構造を変化させ得る。更なる突然変異は、他のフラビウイルスに見られるような保存された荷電アスパラギン酸（Ｄ）に復帰させるものであり得る。
【０１４６】
本発明について上述した内容は、例示および説明の目的で提示されている。上記は本発明を本明細書に開示された形態に限定するようには意図されていない。本発明の説明は、１つ以上の実施形態、特定の変形例および変更例の説明を含んでいるが、他の変形例及び変更例も本願の範囲内であり、例えば、本願の開示を理解した後の当業者の技能および知識の範囲内であり得る。特許請求の範囲に記載されたものについて、代替の、交換可能な、かつ／または同等の構造、機能、範囲または工程をはじめとする代替実施形態を含む権利を、そのような代替の、交換可能な、かつ／または同等の構造、機能、範囲または工程が本願に開示されているか否かに関わらず、許容される程度まで得ることが意図されており、特許性のある発明特定事項を公に捧げる意図はない。
【図１Ａ】
0006486827.tif 000010
【図１Ｂ】
0006486827.tif 000011
【図２】
0006486827.tif 000012
【図３】
0006486827.tif 000013
【図４】
0006486827.tif 000014
【図５】
0006486827.tif 000015
【図６Ａ−６Ｆ】
0006486827.tif 000016
【図７】
0006486827.tif 000017
【図８】
0006486827.tif 000018
【図９】
0006486827.tif 000019
【図１０】
0006486827.tif 000020
【図１１】
0006486827.tif 000021
【図１２】
0006486827.tif 000022
【図１３】
0006486827.tif 000023
【図１４】
0006486827.tif 000024
【図１５】
0006486827.tif 000025
【図１６】
0006486827.tif 000026
【図１７】
0006486827.tif 000027
【図１８】
0006486827.tif 000028
【図１９】
0006486827.tif 000029
【図２０】
0006486827.tif 000030
【図２１】
0006486827.tif 000031
【図２２】
0006486827.tif 000032
【図２３】
0006486827.tif 000033
【配列表】
0006486827000001.app