(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことを特徴とする除草剤耐性タンパク質。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載の除草剤耐性タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、
又は、
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする除草剤耐性遺伝子。
【請求項３】
調節配列と、請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子とを含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項４】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセットを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセットを含むトランスジェニック宿主生物の細胞を取得する工程と、
除草剤耐性タンパク質の発生を許容する条件で前記トランスジェニック宿主生物の細胞を培養する工程と、
前記除草剤耐性タンパク質を回収する工程と、を含むことを特徴とする除草剤耐性タンパク質を発生する方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック宿主生物が、植物、動物、細菌、酵母、バキュロウイルス、線虫又は藻類を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート及びサトウキビからなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の除草剤耐性タンパク質又は請求項３に記載の発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質を、請求項１に記載の除草剤耐性タンパク質又は請求項３に記載の発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質と異なるタンパク質をコーディングする少なくとも１つの第２のヌクレオチド配列と一緒に植物中において発現することを含むことを特徴とする除草剤耐性範囲の拡大方法。
【請求項９】
前記第２のヌクレオチド配列が、グリホサート耐性タンパク質、グルホシネート耐性タンパク質、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクローム類タンパク質又はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコーディングすることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセットで複数の植物細胞を形質転換し、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットの発現を許容する形質転換細胞で成長させ、そして、非形質転換細胞を殺傷する又は非形質転換細胞の成長を抑制する除草剤濃度で前記細胞を培養することを含み、前記除草剤はフェノキシオーキシンであることを特徴とする形質転換した植物細胞の選択方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセット又は請求項４に記載の組換えベクターを含む作物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含み、
前記除草剤がフェノキシオーキシンであることを特徴とする雑草を制御する方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセット又は請求項４に記載の組換えベクターを植物に導入し、導入後の植物に除草剤の障害から保護するのに充分な除草剤耐性タンパク質を発生させることを含み、
前記除草剤がフェノキシオーキシンであることを特徴とする、植物を除草剤による障害から保護する方法。
【請求項１３】
前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート及びサトウキビからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセット又は請求項４に記載の組換えベクターを含むグリホサート耐性植物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含むことを特徴とするグリホサート耐性植物の田畑においてグリホサート耐性雑草を制御する方法。
【請求項１５】
前記除草剤が、フェノキシオーキシン及びグリホサートを少なくとも含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリホサート耐性植物が、単子葉植物又は双子葉植物であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項２に記載の除草剤耐性遺伝子又は請求項３に記載の発現カセット又は請求項４に記載の組換えベクターを植物に導入することを含むことを特徴とする作物に２，４−Ｄ除草剤耐性を付与する方法。
【請求項１８】
前記作物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート及びサトウキビからなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
フェノキシオーキシン類除草剤に耐えるための、除草剤耐性タンパク質の使用であって、
前記除草剤耐性タンパク質は、（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むことを特徴とする、除草剤耐性タンパク質の使用。
【請求項２０】
除草剤耐性範囲の拡大、形質転換した植物細胞の選択、雑草を制御すること、植物をフェノキシオーキシン類除草剤による障害から保護すること、又は、植物にフェノキシオーキシン類除草剤耐性を付与することに使用することを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
除草剤耐性範囲の拡大に使用することは、請求項８又は９に記載の方法を含むことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
形質転換した植物細胞の選択に使用することは、請求項１０に記載の方法を含むことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記雑草を制御する使用が、請求項１１、１４〜１６の何れかに記載の方法を含むことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記植物を除草剤による障害から保護する使用が、請求項１２又は１３に記載の方法を含むことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記植物に除草剤耐性を付与する使用が、請求項１７又は１８に記載の方法を含むことを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途に関し、特に、２，４−Ｄに耐性を有するタンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
雑草は、土壌中の作物と他の目標植物が必要とする価値のある栄養素を高速に消費してしまう。現在、さまざまな除草剤で雑草を制御していて、その中で最も汎用されている除草剤はグリホサートである。例えばコーン、大豆、コットン、ビート、小麦、水稲等のグリホサートに耐性を有する作物が既に開発された。従って、グリホサート耐性作物を栽培する農耕地に、雑草を制御するためにグリホサートを噴射しても、作物を顕著に損害することはない。
【０００３】
グリホサートは、世界的に２０年以上利用されていて、これにより、グリホサートやグリホサート耐性作物技術に過度の依存し、野生雑草種類からグリホサートに対して天然的にトレランスを有する、又はグリホサート対抗活性が既に発展された植物から選択しなければならなくなった。少数の雑草からグリホサートに対する耐性を発展されたことが報道されていて、例えばスイスライグラス、イタリアンライグラス、オヒシバ、ブタクサ、カナデンシス、イェジンハオトン、ヘラオオバコのような広葉雑草とイネ科雑草がある。そして、グリホサート耐性作物が汎用される前、農業問題以外の雑草も盛り上がっていて、これらはグリホサート耐性作物で制御することが難しく、これらの雑草は主に、例えば、アマランサス科、アカザ科、タンポポ科、ツユクサ科のような制御しにくい広葉雑草と一緒に出現する（しかし、これに限定されることはない）。
【０００４】
グリホサート耐性雑草又は制御しにくい雑草種類の地域において、栽培者は、ミキシング又は漏れ雑草を制御可能な他の除草剤を利用することでグリホサートの問題点に対応することができる。多くの場合、広葉雑草を制御する汎用されて有効なミキシングコンパニオンは、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）である。２，４−Ｄは、農業や非作物条件で広葉雑草の制御用として６５年以上利用されていて、依然として世界的に最も汎用されている一つの除草剤である。２，４−Ｄの更なる応用は、双子葉植物（例えば、大豆又はコットン）中の選択性が低い特性の制限を受けているので、２，４−Ｄは、通常敏感性双子葉作物には応用されない（且つ、通常接近しない）。そして、２，４−Ｄは、イネ科作物中の用途が、出現する可能性のある作物損害特性の制限を受けている。２，４−Ｄとグリホサートとを組み合せしたものは、既に不耕起大豆やコットンを栽培する前の強烈な消滅処理に利用されているが、このような双子葉種類が２，４−Ｄに対して敏感であるので、このような消滅処理を栽培する１４〜３０日前に行わなければならない。
【０００５】
ＭＣＰＡ、４−クロロ−２−プロパン酸は、２，４−Ｄプロピオン酸と同様であって、２，４−Ｄはフェノキシ酢酸系除草剤である。２，４−Ｄは、大きな単子葉作物（例えば、コーン、小麦、水稲）から選択的に広葉雑草を制御しつつ目標作物を厳重に損害しない場合に利用される。２，４−Ｄは、合成されたオーキシン誘導体で、その作用は、正常なサイトカイン内安定状態を崩し、均一な成長を阻害することにある。
【０００６】
２，４−Ｄは、異なる植物に異なるレベルの選択性を示している（例えば、双子葉植物の方がイネ科植物より敏感である）。異なる植物による２，４−Ｄに対する代謝の違いが異なるレベルの選択性についての解釈である。通常、植物は２，４−Ｄを徐々に代謝するので、標的部位の異なる活性は植物による２，４−Ｄに対する異なる応答を一層解釈できる。２，４−Ｄの植物代謝は、通常、ヒドロキシル化後にアミノ酸又はグルコースと結合する二段階で代謝を実現する。
【０００７】
時間の経過に伴って、微生物群はすでに、当該特定の外来物を分解するに有効な入れ替えルートを発現し、前記ルートによると、２，４−Ｄが完全に石化される。微生物に除草剤を連続して適用すると、除草剤を炭素源として成長に貢献する（これにより、土壌中で競争優位に立つ）の微生物を選択できる。そこで、現在、２，４−Ｄを短い土壌半減期を有するように調製し、その後の作物に明確な残された問題がない。これにより、２，４−Ｄの除草剤の適用が一層促進された。
【０００８】
２，４−Ｄ分解能力を有する生物としてラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）を研究した。コーディング石化中の一番目の酵素触媒工程の遺伝子はｔｆｄＡである。ＴｆｄＡは、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼによって反応して、２，４−Ｄ酸のジクロロフェノール（ＤＣＰ）への変換を触媒する。ＤＣＰは、２，４−Ｄに比べ除草剤活性を殆ど有していない。ＴｆｄＡはトランスジェニック植物において２，４−Ｄに敏感である双子葉植物（例えば、コットンやタバコ）に２，４−Ｄ耐性を入力する。
【０００９】
環境中で大量の２，４−Ｄを分解できるタンパク質をコーディングするｔｆｄＡ型遺伝子を認定した。多くの同一系植物はｔｆｄＡに類似し（アミノ酸同一性＞８５％）、またｔｆｄＡに類似する酵素活性を有する。しかし、全てのＴａｕＤ等の構造ドメインを有するタンパク質がいずれも２，４−Ｄ分解機能を有するのではなく、大量の同一系植物はｔｆｄＡに比べ明確に低い同一性（２５−５０％）を有するが、αケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼＦｅ＋２ジオキシゲナーゼに関連する特定残基を有する。従って、このような異なるジオキシゲナーゼの基質特異性が何であるかは不明確である。ｔｆｄＡと低相同性（アミノ酸同一性２８％）を有する特定の実例はＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｈｅｒｂｉｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのｒｄｐＡからのものである。当該酵素は、（Ｒ）−２，４−Ｄプロピオン酸（と他の（Ｒ）−フェノプロフェン）及び２，４−Ｄ（フェノキシ酢酸）石化の第１段階に対する触媒することを示した。
【００１０】
グリホサート耐性雑草の出現や２，４−Ｄ除草剤の汎用によって、２，４−Ｄに敏感である目標植物に２，４−Ｄ耐性を入力する必要がある。現在、２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質の植物中の発現レベル及び除草剤のトレランスに関する報道はなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途を提供することをその目的とし、本発明は、新規の２４ＤＴ２２遺伝子を提供することを目的とし、前記２４ＤＴ２２タンパク質は植物において除草剤に対して高いトレランスを有する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を実現するため、本発明は、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
（ｂ）（ａ）中のアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸が置換及び／又は欠失及び／又は追加され、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有する（ａ）から誘導されたタンパク質を含む除草剤耐性タンパク質を提供する。
【００１３】
上記目的を実現するため、本発明は、
（ａ）前記除草剤耐性タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、又は、
（ｂ）厳密条件で（ａ）に限定されたヌクレオチド配列と交雑し、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコーディングするヌクレオチド配列、又は、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列を含む除草剤耐性遺伝子を提供する。
【００１４】
前記厳密条件とは、６×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液中で、６５℃で交雑し、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでそれぞれ膜を１回洗浄することを指す。
【００１５】
上記目的を実現するため、本発明は、有効に接続された調節配列によって調節された前記除草剤耐性遺伝子を含む発現カセットをさらに提供する。
【００１６】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットを含む組換えベクターを提供する。
【００１７】
上記目的を実現するため、本発明は、
前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットを含むトランスジェニック宿主生物の細胞を取得することと、
除草剤耐性タンパク質の発生を許可する条件で前記トランスジェニック宿主生物の細胞を培養することと、
前記除草剤耐性タンパク質を回収することと、を含む除草剤耐性タンパク質を発生する方法を提供する。
【００１８】
さらに、前記トランスジェニック宿主生物は、植物、動物、細菌、酵母、バキュロウイルス、線虫又は藻類を含む。
【００１９】
前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート又はサトウキビであることが好ましい。
【００２０】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性タンパク質又は前記発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質を植物中において少なくとも１種類の前記除草剤耐性タンパク質又は前記発現カセットによりコーディングした除草剤耐性タンパク質と異なる第２種類のヌクレオチドと一緒に発現することを含む除草剤耐性範囲の拡大方法を提供する
さらに、前記第２種類のヌクレオチドは、グリホサート耐性タンパク質、グルホシネート耐性タンパク質、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、チトクローム類タンパク質又はプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコーディングする。
【００２１】
本発明において、２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質の１種類のトランスジェニック植物での発現は、一つ又は複数のグリホサート耐性タンパク質及び／又はグルホシネート耐性タンパク質の発現を伴うことができる。このような１種類以上の除草剤耐性タンパク質による同一のトランスジェニック植物での共通発現は、遺伝子工学によって植物に必要な遺伝子を含有させ発現させることで実現することができる。そして、１種の植物（第１親株）が遺伝子工学操作によって２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質を発現し、第２種の植物（第２親株）が遺伝子工学操作によってグリホサート耐性タンパク質及び／又はグルホシネート耐性タンパク質を発現することができる。第１親株と第２親株の交雑によって第１親株と第２親株の全ての遺伝子を導入した子孫植物を取得する。
【００２２】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットで複数の植物細胞を転化し、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセットの発現を許可する転化細胞で成長させ、そして、未転化の細胞は殺した又は未転化の細胞の成長を抑制した除草剤濃度で前記細胞を培養することを含み、前記除草剤はフェノキシオーキシンである転化した植物細胞の選択方法を提供する。
【００２３】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを含む作物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含む雑草を制御する方法を提供する。
【００２４】
前記除草剤が、フェノキシオーキシンであることが好ましい。
【００２５】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを植物に導入し、導入後の植物に除草剤の障害から保護するに充分な量の除草剤耐性タンパク質を発生させることを含む植物を除草剤による障害から保護する方法を提供する。
【００２６】
前記除草剤が、フェノキシオーキシン又はアリルオキシフェノキシアルカノエートであることが好ましい。前記植物は、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート又はサトウキビであることが好ましい。
【００２７】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを含むグリホサート耐性植物を栽培する田畑に有効量の除草剤を投薬することを含むグリホサート耐性植物の田畑においてグリホサート耐性雑草を制御する方法を提供する。
【００２８】
前記除草剤が、フェノキシオーキシンであることが好ましい。前記グリホサート耐性植物は、単子葉植物又は双子葉植物である。
【００２９】
上記目的を実現するため、本発明は、前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを植物に導入することを含む作物に２，４−Ｄ除草剤耐性を付与する方法を提供する。
【００３０】
前記植物が、大豆、コットン、コーン、水稲、小麦、ビート又はサトウキビであることが好ましい。
【００３１】
上記目的を実現するため、本発明は、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
（ｂ）（ａ）中のアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸が置換及び／又は欠失及び／又は追加され、且つアリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ活性を有する（ａ）から誘導されたタンパク質を含む除草剤耐性タンパク質がフェノキシオーキシン類除草剤に耐える用途を提供する。
【００３２】
前記除草剤耐性遺伝子又は前記発現カセット又は前記組換えベクターを植物に導入することを、本発明においては外因性のＤＮＡを植物細胞に導入することであって、通常の転化方法は、アグロバクテリウムが仲介した転化、微量放射衝撃、直接にＤＮＡをプロトプラストに摂取する方法、電気穿孔法又は珪素ホイスカーの仲介によるＤＮＡ導入方法を含むが、これらに限定されることはない。
【００３３】
本発明の前記２，４−Ｄ耐性遺伝子及びその後の耐性作物は、作物中でグリホサート耐性（又は、高耐性及び遷移した）広葉雑草種類の良好な選択に用いられる。２，４−Ｄは広スペクトルで、安価で強力な広葉除草剤で、双子葉や単子葉において同様に強い作物トレランスを提供すると、栽培者に良好な効果を提供できる。２，４−Ｄ耐性トランスジェニック双子葉植物は、適用時間や使用量でさらに高い柔軟性を有している。２，４−Ｄ除草剤耐性特性の他の用途は、２，４−Ｄのドリフト、揮発、転化（又は他の遠距離の移動現象）、使用ミス、破壊等の正常な敏感性作物に対する損害を予防することである。既に異なるフェノキシオーキシンを組み合せしたさまざまな混合物で異なる地域の特定の雑草スペクトルと環境条件を処理している。植物に２４ＤＴ２２遺伝子を使用すると、一層広スペクトルのフェノキシオーキシン除草剤を保護することができ、柔軟性と制御可能な雑草スペクトルを向上し、市販のフェノキシオーキシン全体のドリフト又は他の遠距離フェノキシ除草剤に対するダメージを防止することができる。
【００３４】
フェノキシオーキシン除草剤は通常、活性酸に調製されるが、一部の商品はさまざまな対応するエステル製剤の一つとして調製され、普通の植物エステラーゼは植物においてこれらのエステルを活性酸に変換するので、これらを植物中の２４ＤＴ２２酵素の基質とみなすことができる。類似するものとして、対応する酸の対応する有機又は無機塩がある。キラルプロピオン酸、プロピオン酸塩又はプロピオン酸エステル除草剤を示す時、異なるＣＡＳ番号であっても光学精製化合物に対応することもあって、これらの除草剤を命名する際にラセミ体（Ｒ、Ｓ）又は光学精製した（Ｒ又はＳ）エナンチオマーが同一である除草剤とみなす。可能な使用量範囲は、作物又は非作物用途において単独処理又は他の除草剤と組み合せであることができる。
【００３５】
現在、２４ＤＴ２２遺伝子が遺伝子改変されて植物を発現した後に植物でのフェノキシオーキシン除草剤の使用を許可する特性を有していることが認定され、前記植物には固有の耐性が存在しなく、又はこれらの除草剤の使用を許可するに不十分である。そして、２４ＤＴ２２遺伝子は、天然耐性が選択性を許可するに不十分である時、植物中でフェノキシオーキシン除草剤に対する保護を提供する。現在、１種類、２種類又は幾つかのフェノキシオーキシン除草剤と組み合せして連続又はミキシングに処理することのできるものは２４ＤＴ２２遺伝子の植物のみである。広スペクトル双子葉雑草の各種フェノキシオーキシン除草剤の使用量範囲は２５〜４０００ｇ  ａｅ／ｈａに制御され、通常は、１００〜２０００ｇ  ａｅ／ｈａである。同一の田畑において（連続又はミキシング組み合せ）これらの異なる化学類別と異なる作用モードと範囲を有する除草剤を組み合せると、殆どの除草剤制御を必要とする潜在的な雑草を制御できる。
【００３６】
グリホサートは、非常に広スペクトルの広葉とイネ科雑草種類を制御できるので汎用されている。しかし、グリホサート耐性作物と非作物にグリホサートを繰り返して使用することで、雑草が天然的に耐性を有する種類又はグリホサート耐性生物型になっている（そして継続されている）。大部分の除草剤耐性管理戦略として、有効使用量のミキシング除草剤コンパニオンを耐性雑草の出現を遅延する方法とし、前記除草剤コンパニオンは同一種に対する制御を提供するが、異なる作用モードを有する。２４ＤＴ２２遺伝子とグリホサート耐性特性（及び／又は他の除草剤耐性特性）を重ねて、同一作物にグリホサートとフェノキシオーキシン（例えば、２，４−Ｄ）を選択的に使用することで、グリホサート耐性作物中のグリホサート耐性雑草種類（１種類又は多様のフェノキシオーキシンにより制御される広葉雑草種類）に対する制御を実現する。これらの除草剤の適用は、作用モードの異なる２種類以上の除草剤のミキシング物で同時に使用したり、連続使用（例えば、栽培前、発芽前又は発芽後）中に単一の除草剤組み合せ物の単独使用（使用する間隔範囲は２時間〜３ヶ月）、又は任意の時間（作物を栽培してから７ヶ月内〜作物を収穫するまで（又は、単一除草剤の場合収穫前の間隔、最も短いのをとる））に、使用可能な化合類別を代表する任意数量の除草剤の組み合せを使用することができる。
【００３７】
広葉雑草を制御するにおいて柔軟性を有することは非常に重要で、即ち、使用時間、単一除草剤の使用量、頑固又は耐性雑草を制御する能力は非常に重要である。作物においてグリホサート耐性遺伝子／２４ＤＴ２２遺伝子と重ね合わされるグリホサートの適用範囲は、２５０〜２５００ｇ  ａｅ／ｈａであることができる。フェノキシオーキシン除草剤（１種類又は多様）は、２５〜４０００ｇ  ａｅ／ｈａであることができる。このような適用の時間の最適な組み合せは、具体的な条件、種類、環境によって決められる。
【００３８】
除草剤製剤（例えば、エステル、酸又は塩レシピー又は可溶性濃縮物、乳剤濃縮物又は可溶性液体）とミキシング添加剤（例えば、アジュバント又は相溶剤）は、所定の除草剤又は１種類又は多様の除草剤の組み合せの雑草制御に明確な影響を与える。任意の上述した除草剤の任意の化学組み合せはいずれも本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
当業者にとって周知な２種類以上の作用モードの組み合せによる、制御を受ける雑草スペクトル及び／又は天然的に耐性を有する種類又は耐性雑草種類における有益な効果は、ヒトによって（トランスジェニック又は非トランスジェニック）作物中でグリホサート耐性作物以外の除草剤耐性の化学物を発生するまで拡張できる。実質上、グリホサート耐性（例えば、耐性植物又は細菌ＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルホシネート耐性（例えば、ＰＡＴ、Ｂａｒ）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）抑制性除草剤耐性（例えば、イミダゾリジノン、スルホニル尿素、トリアゾロ、スルホンアミドアニリン、ピリミジンチオベンゾエート、例えばＡＨＡＳ、Ｃｓｒｌ、ＳｕｒＡ等の他の化学物耐性遺伝子）、ブロモキシニル耐性（例えば、Ｂｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）酵素抑制剤に対する耐性、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）抑制剤に対する耐性、光系ＩＩ抑制性除草剤に対する耐性（例えば、ｐｓｂＡ）、光系Ｉ抑制性除草剤に対する耐性、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）抑制性除草剤に対する耐性（例えば、ＰＰＯ−１）、フェニル除草剤に対する耐性（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素等を単独又は多様を重ね合わせてコーディングすることで、雑草による上述した任意の類別の除草剤耐性の能力を引き続くことを有効に制御又は防止する。
【００４０】
他の除草剤の場合、他の好適なＡＬＳ抑制剤は、トリアゾロスルホンアミドアニリン（クロランスラムアミン、ジクロスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノキススラム）、ピリミジンチオベンゾエート、フルカルバゾンナトリウムを含む。好適なＨＰＰＤ抑制剤は、メソトリオン、イソキサフルトール、スルコトリオンを含む。好適なＰＰＯ抑制剤は、フルミオキサジン、ブタフェナシル、カルフェントラゾンエチル、スルフェントラゾン、ジフェニルエーテル（例えば、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、オキシフルオルフェン）がある。
【００４１】
そして、２４ＤＴ２２遺伝子を単独又は他の除草剤耐性作物の特徴を重ね合わせた後に１種類又は多様の他の輸入（例えば、害虫抵抗性、真菌抵抗又はストレス耐性等）又は輸出（例えば、向上された収量、改善された油量、向上された繊維品質等）特性と重ね合わされる。よって、本発明は、柔軟且つ経済的に任意数量の農学害虫を制御する能力及び作物品質を向上させる完璧な農学解決案を提供する。
【００４２】
本発明の２４ＤＴ２２遺伝子は２，４−Ｄを分解することができ、重要な除草剤耐性作物であって、標記物質特徴可能性を選択する基礎である。
【００４３】
本発明は、トランスジェニック発現を行うことができ、殆どの広葉雑草の除草剤組み合せを制御できる。２４ＤＴ２２遺伝子は、優れた除草剤耐性作物特性として、例えば他の除草剤耐性作物特性（例えば、グリホサート耐性、グルホシネート耐性、ＡＬＳ抑制剤（例えば、イミダゾリジノン類、スルホニル尿素類、トリアゾロピリミジンスルホンアミド類）耐性、ブロモキシニル耐性、ＨＰＰＤ抑制剤耐性、ＰＰＯ抑制剤耐性等）、害虫抵抗性特性（Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｖｉｐ３、他のバチルス・チューリンゲンシスタンパク質又は非バチルス由来の害虫抵抗性タンパク質等）と重ね合わされる。そして、２４ＤＴ２２遺伝子を、標記物を選択する補助選択用の他の遺伝子又は遺伝子群が遺伝子改変した植物の一次転化体とすることができる。
【００４４】
フェノキシアルカノエート基は、安定した酸官能基を除草剤に導入する。酸性基は「酸捕捉」によって師管部活性（除草剤作用に必須な属性である）を入力し、活性目的で新規の除草剤に統合される。２４ＤＴ２２基質である可能性のある市販と実験性除草剤がある。よって、本発明の遺伝子を用いると、他の除草剤の耐性を得ることができる。
【００４５】
本発明の除草剤耐性作物特性を他の除草剤耐性作物特性（グリホサート耐性を含むが、これに限定されることはない）との新規の組み合せに適用することもできる。除草剤（例えば、グリホサート）に対する新しく取得した耐性又は固有の耐性により、これらの特性組み合せによって雑草種類を制御する新しい方法を発生する。よって、除草剤耐性作物特性以外に、本発明の範囲は、除草剤で雑草を制御する新しい方法も含み、それにおいて、トランスジェニック作物中の前記酵素によって前記除草剤に対する耐性を発生する。
【００４６】
本発明は多様の植物に適用でき、例えばシロイヌナズナ、タバコ、大豆、コットン、米、コーン、アブラナに適用できる。本発明はさらに、多様の他の単子葉（例えば、牧草イネ科又は芝草イネ科）と双子葉作物（例えば、アルファルファ、クローバー、高木種類等）にも適用できる。類似して、２，４−Ｄ（又は、他の２４ＤＴ２２基質）は適切な耐性のイネ科作物に最も積極的に適用され、これにより、特性が向上された耐性により、栽培者に最も有効な使用量と一層広い投薬時間でこれらの除草剤を使用しつつ作物ダメージのリスクのない可能性を提供する。
【００４７】
本発明に上述した植物、植物組織又は植物細胞のゲノムとは、植物、植物組織又は植物細胞内のいずれかの遺伝物質を指し、且つ細胞核とプラスチドとミトコンドリアゲノムとを含む。
【００４８】
本発明に記載の「抵抗」は遺伝可能なもので、植物が、除草剤が所定の植物に一般的な除草剤有効処理を行っている状況下成長し繁殖することができる。当業者にとって周知なように、植物が除草剤処理によるダメージ程度が明確であっても、植物は依然として「抵抗」を有するとみなす。本発明において、用語「耐性」は用語「抵抗」よりその範囲が広く、「抵抗」と特定の植物が有する除草剤の誘導に抵抗して各程度のダメージの向上能力を含み、同様な除草剤使用量で、通常、同一の遺伝子型野生型の植物がダメージを受けることになる。
【００４９】
本発明に記載のポリヌクレオチド及び／又はヌクレオチドにより完璧な「遺伝子」を形成し、必要な宿主細胞においてタンパク質又はポリペプチドをコーディングする。当業者は、本発明のポリヌクレオチド及び／又はヌクレオチドを目標宿主中の調節配列により制御することを理解できる。
【００５０】
当業者にとって周知なように、ＤＮＡは典型的に二本鎖形式で存在する。このような配列において、一鎖と他の鎖が相補し、その反対も同じである。ＤＮＡが植物中で複製してＤＮＡの他の相補鎖を発生する。このように、本発明は、配列表に示すポリヌクレオチド及びその相補鎖の使用を含む。本分野でよく使用される「コーディング鎖」とは、アンチセンス鎖と結合する鎖を指す。体内でタンパク質を発現するため、典型的に、ＤＮＡの一鎖を一ｍＲＮＡの相補鎖に転写し、それをモデルとしてタンパク質を翻訳する。ｍＲＮＡは、実際上、ＤＮＡの「アンチセンス」鎖から転写されたものである。「センス」又は「コーディング」鎖は一連のコドン（コドンは、三つのヌクレオチドで、１回で三つを読むと特定のアミノ酸を得ることができる）を有し、それをオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として読み取ることで標的タンパク質又はペプチドを形成する。本発明はさらに、例示したＤＮＡに対応する機能を有するＲＮＡとＰＮＡ（ペプチド核酸）も含む。
【００５１】
本発明において、核酸分子又はその断片は厳密条件で本発明の除草剤耐性遺伝子と交雑する。いずれかの常用の核酸交雑又は増幅方法は、いずれも本発明の除草剤耐性遺伝子の存在を鑑定できる。核酸分子又はその断片は一定の状況で、他の核酸分子と特異性交雑を行うことができる。本発明において、二つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することができることを、当該二つの核酸分子が互いに特異性交雑を行うことができると言う。二つの核酸分子が完全な相補性を示すことを、その中の一つの核酸分子が他の核酸分子の「相補物」であると称す。本発明において、一つの核酸分子の各ヌクレオチドがいずれも他の核酸分子の対応するヌクレオチドと相補すると、当該二つの核酸分子は「完全相補性」を有する。二つの核酸分子が充分な安定性で相互交雑して少なくとも常用の「低度厳密」条件でアニーリングして互いに結合すると、当該二つの核酸分子は「最低程度相補」と呼ばれる。類似して、二つの核酸分子が充分な安定性で相互交雑して常用の「高度厳密」条件でアニーリングして且つ互いに結合すると、当該二つの核酸分子は「相補性」を有する。完全相補性からの遷移は許可し、このような遷移が二つの分子による二本鎖構造の形成を完全に阻止するものでなければよい。一つの核酸分子をプライマー又はプローブとする場合、用いられる特定溶剤と塩濃度で安定した二本鎖構造を形成するように、配列で充分な相補性を有しなければならないわけではない。
【００５２】
本発明において、相同性に基づく配列は１区間の核酸分子で、該核酸分子は高度厳密条件でマッチする他の区間の核酸分子の相補鎖と特異性交雑を発生する。ＤＮＡ交雑を促進するに適切な厳密条件は、例えば、約４５℃条件で、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で処理し、その後、５０℃条件で、２．０×ＳＳＣで洗浄することであって、これらの条件は当業者にとって周知なものである。例えば、洗浄工程での塩濃度として、低度厳密条件の約２．０×ＳＳＣ、５０℃〜高度厳密条件の約０．２×ＳＳＣ、５０℃から選ぶことができる。そして、洗浄工程での温度条件として、低度厳密条件の約２２℃の室温から高度厳密条件の約６５℃まで上昇させることができる。温度条件と塩濃度は変更可能であって、その中の一つを不変に保持し他の一つを変更させることもできる。本発明における厳密条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液において、６５℃で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と特異性交雑を行い、その後２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでそれぞれ膜を１回洗浄することであることが好ましい。
【００５３】
よって、除草剤トレランス活性を有し、厳密条件で本発明の配列１と交雑する配列も本発明に含まれる。これらの配列は本発明の配列と少なくとも、４０％〜５０％相同性、約６０％、６５％又は７０％相同性、ひいては少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は更に大きい配列相同性を有する。
【００５４】
本発明で機能タンパク質を提供する。「機能活性」（又は「活性」）とは、本発明において、本発明の用途のタンパク質／酵素（単独又は他のタンパク質との組み合せで）が除草剤活性を分解又は削減する能力を有することを指す。本発明のタンパク質を発生する植物は「有効量」のタンパク質を発生し、除草剤で植物を処理する時、タンパク質が発現されるレベルが、植物に除草剤（特別な説明がない場合、普通の使用量である）に対する完全又は一部の抵抗又は耐性を付与するに充分である。通常の標的植物を殺す使用量で、正常な田畑使用量と濃度で除草剤を使用することができる。本発明の植物細胞と植物は、除草剤処理による成長抑制又はダメージを受けないように保護される。本発明の転化植物と植物細胞が、２，４−Ｄ除草剤の抵抗又は耐性を有することが好ましく、即ち、転化された植物と植物細胞は有効量の２，４−Ｄ除草剤が存在する雰囲気で成長可能である。
【００５５】
本発明に記載の遺伝子とタンパク質は、特定の例示配列を含む以外、前記特定に例示したタンパク質の除草剤耐性活性の特徴を保存した一部及び／断片（タンパク質全体に比べ内部及び／又は末端が欠失した）、変異体、突然変異体、置換物（アミノ酸を置換するタンパク質）、キメラ、融合タンパク質も含む。前記「変異体」又は「変異」とは、同一のタンパク質をコーディングする又は除草剤耐性活性を有する等価タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列を指す。前記「等価タンパク質」とは、請求項のタンパク質と同一又は基本的に同一の除草剤トレランスの生物活性を有するタンパク質を指す。
【００５６】
本発明に記載のＤＮＡ分子又はタンパク質配列の「断片」又は「切り捨て」とは、かかる原始ＤＮＡ又はタンパク質配列（ヌクレオチド又はアミノ酸）の一部又はその人的改造形式（例えば、植物の発現に適合する配列）を指し、断片に接近し、分子全長に比べ内部及び／又は末端が欠失したものを含み、上述した配列の長さは変更可能であるが、その長さは（コーディング）タンパク質が除草剤耐性タンパク質であるように確保するに充分である。一部の状況において（特に、植物中の発現）、切り捨てタンパク質をコーディングする切り捨て遺伝子を利用することが有利である。好適な切り捨て遺伝子は、通常、タンパク質全体の４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％をコーディングする。
【００５７】
遺伝コドンが冗長性を有するので、多様の異なるＤＮＡ配列は同一のアミノ酸配列をコーディングすることができる。これらの同一又は基本的に同一のタンパク質をコーディングする入れ替え可能なＤＮＡ配列を発生することは当業者の技術レベル内のことである。このような異なるＤＮＡ配列も本発明の範囲に含まれる。前記「基本的に同一の」配列とは、アミノ酸の置換、欠失、追加又は挿入があるが、実質的には除草剤耐性活性に影響を与えていない配列を指し、除草剤耐性活性を保留した断片を含む。
【００５８】
本発明において、アミノ酸配列の置換、欠失又は追加は本分野の常用技術で、このようなアミノ酸が、タンパク質の折りたたみ及び／又は活性の保守に顕著な影響がないアミノ酸置換である小さい特性改変、通常約１〜３０個のアミノ酸の欠失である小さい欠失、例えばアミノ末端から一つのメチオニン残基が延長された小さいアミノ基又はカルボキシル基末端延長、例えば約２０〜２５個の残基長さの小さい接続ペプチドに変化することが好ましい。
【００５９】
保守置換の実例は以下のアミノ酸組内で発生した置換である：アルカリ性アミノ酸（例えば、アルギニン酸、リジン酸、ヒスチジン酸）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミン、アスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小分子アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）。通常、特定活性を変更しないアミノ酸置換は本分野の周知技術で、例えば、Ｎ．  Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｒ．  Ｌ．  Ｈｉｌｌの１９７９年ニューヨーク学術出版社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）が出版した《Ｐｒｏｔｅｉｎ》で記載された。最もよく見られる交換としてＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｕ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕとＡｓｐ／Ｇｌｙ、及びこれらに相反する交換がある。
【００６０】
当業者にとって周知なように、このような置換は分子機能に重要な作用を果たす領域以外で行い、且つ活性ポリペプチドを発生する。本発明のポリペプチドの場合、その活性が不可欠であるので置換されないアミノ酸残基を選択し、本分野で周知な方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発の方法で鑑定することができる（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５を参照）。後方の技術は、分子中の各正帯電した残基に突然変異を導入し、得られた突然変異分子の除草剤耐性活性を検出して、該分子活性にとって重要なアミノ酸残基を確定する。基質−酵素の相互作用部位もその三次元構造を分析して測定することができ、このような三次元構造は、ＮＭＲ分析、結晶学又は光親和性標識等の技術で測定することができる（例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ等の、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ等の、１９９２、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  ２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ等の、１９９２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０９；５９−６４を参照）。
【００６１】
よって、配列２で示されるアミノ酸配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列も本発明に含まれる。これらの配列と本発明配列との類似性／相同性は典型的に６０％を超えていて、７５％を超えることが好ましく、８０％を超えることがさらに好ましく、９０％を超えることが一層好ましく、９５％を超えることもできる。そして、特定の相同性及び／又は類似性範囲に基づいて本発明の好適なポリヌクレオチドとタンパク質を定義することもできる。例えば、本発明に例示した配列と４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性及び／又は類似性を有する。
【００６２】
本発明において、前記調節配列は、プロモーター、輸送ペプチド、ターミネータ、エンハンサー、リーダー配列、イントロン及び他の前記２４ＤＴ２２遺伝子に操作可能に接続される調節配列を含むが、これらに限定されることはない。
【００６３】
前記プロモーターは、植物で発現可能なプロモーターで、前記「植物で発現可能なプロモーター」とは、それに接続されるコーディング配列の植物細胞内での発現を確保するプロモーターを指す。植物で発現可能なプロモーターは、構成的プロモーターである。植物内の構成的発現を指導するプロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓプロモーター、コーンＵｂｉプロモーター、水稲ＧＯＳ２遺伝子のプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されることはない。そして、植物で発現可能なプロモーターは、組織特異性のプロモーターであることもでき、即ち例えばＰＥＰカルボキシル化酵素プロモーターのような、該プロモーターが植物の一部の組織内、例えば緑色組織でコーディング配列の発現レベルが植物の他の組織（通常のＲＮＡ試験によって測定できる）以上であるように指導する。そして、植物で発現可能なプロモーターは創傷誘導性プロモーターであることもできる。創傷誘導性プロモーター又は創傷誘導を指導する発現モードのプロモーターとは、植物が機械的又は昆虫かじりによるダメージを受けた時、プロモーターの調節を受けたコーディング配列の発現が正常な成長条件より明確に向上されたことを指す。創傷誘導性プロモーターとして、ジャガイモとトマトのタンパク質酵素抑制遺伝子（ｐｉｎＩとｐｉｎＩＩ）とコーンタンパク質酵素抑制遺伝子（ＭＰＩ）のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００６４】
前記輸送ペプチド（分泌信号配列又はガイド配列とも呼ばれる）とは、トランスジェニック産物を特定の細胞小器官又は細胞コンパートメントにガイドすることを指し、受容タンパク質にとって、前記輸送ペプチドが非相同性なものであってもよく、例えば、コーディング葉緑体輸送ペプチド配列標的葉緑体を利用したり、又は「ＫＤＥＬ」保留配列標的小胞体を利用したり、又は大麦植物レクチン遺伝子のＣＴＰＰ標的液胞を利用したりする。
【００６５】
前記リーダー配列は、ＥＭＣＶリーダー配列（脳心筋炎ウイルス５’非コーディング領域）のような小ＲＮＡウイルスリーダー配列、ＭＤＭＶ（コーンド萎縮モザイクウイルスウイルス）リーダー配列のようなジャガイモＹウイルス組リーダー配列、ヒト免疫グロブリンタンパク質重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質ｍＲＮＡの不翻訳リーダー配列（ＡＭＶ  ＲＮＡ４）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）リーダー配列を含むが、これらに限定されることはない。
【００６６】
前記エンハンサーは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）エンハンサー、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）エンハンサー、カーネーションエッチドリングウイルス（ＣＥＲＶ）エンハンサー、カッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）エンハンサー、ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）エンハンサー、ケストルムイエローリーフカーリングウイルス（ＣｍＹＬＣＶ）エンハンサー、Ｃｏｔｔｏｎ  ｌｅａｆ  ｃｕｒｌＭｕｌｔａｎウイルス（ＣＬＣｕＭＶ）、ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅウイルス（ＣｏＹＭＶ）、Ｐｅａｎｕｔｃｈｌｏｒｏｔｉｃｓｔｒｅａｋウイルス（ＰＣＬＳＶ）エンハンサーを含むが、これらに限定されることはない。
【００６７】
単子葉植物の適用において、前記イントロンは、コーンｈｓｐ７０イントロン、トウモロコシユビキチンイントロン、Ａｄｈイントロン１、スクロースシンターゼイントロン又は水稲Ａｃｔ１イントロンを含むが、これらに限定されることはない。双子葉植物の適用において、前記イントロンは、ＣＡＴ−１イントロン、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬイントロン、ＰＩＶ２イントロン、「スーパーユビキチン」イントロンを含むが、これらに限定されることはない。
【００６８】
前記ターミネータは、植物で作用を果たすポリアデニルの酸化に適合する信号配列であることができ、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列、タンパク質酵素抑制剤ＩＩ（ｐｉｎＩＩ）遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列、エンドウｓｓＲＵＢＩＳＣＯ  Ｅ９遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列、α−チューブリンタンパク質（α−ｔｕｂｕｌｉｎ）遺伝子に由来するポリアデニル酸化信号配列を含むが、これらに限定されることはない。
【００６９】
本発明において、前記「有効接続」とは核酸配列の連結を指し、前記連結によって一つの配列が対応する配列にとって必要な機能を提供可能である。本発明において、前記「有効接続」は、プロモーターを関心のある配列に接続して、該関心のある配列の転写が該プロモーターに制御されたり調節されることができる。関心のある配列がタンパク質をコーディングし、また該タンパク質の発現を取得しようとする場合、「有効接続」は、プロモーターを前記配列に接続し、接続方式によって取得した転写物が効率的に翻訳されることを表す。プロモーターとコーディング配列の接続が転写物融合であってコーディングしたタンパク質の発現を実現しようとする場合、このような接続を行うことで、得られる転写物中の第１翻訳開始コドンがコーディング配列の開始コドンになる。そして、プロモーターとコーディング配列の接続が翻訳融合であってコーディングしたタンパク質の発現を実現しようとする場合、このような接続を行うことで、５’非翻訳配列に含まれた第１翻訳開始コドンがプロモーターに連結され、接続方式によって得られる翻訳産物と所要のタンパク質をコーディングする翻訳オープンリーディングフレームの関係はリーディングフレームに符合する。「有効接続」可能な核酸配列は、遺伝子発現機能を提供する配列（即ち、例えばプロモーター、５’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コーディング領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位及び／又は転写ターミネータ等の遺伝子発現素子）、ＤＮＡ転移及び／又は整合機能を提供する配列（即ち、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、部位特異性組換え酵素識別部位、整合酵素識別部位）、選択性機能を提供する配列（即ち、抗生物質耐性標記物、生物合成遺伝子）、スコア可能標記物機能を提供する配列、体外又は体内協力配列操作する配列（即ち、ポリリンカー配列、部位特異性組換え配列）、複製機能を提供する配列（即ち、細菌の複製起点、自発的複製配列、セントロメア配列）を含むが、これらに限定されることはない。
【００７０】
本発明によると、植物に新しい除草剤耐性特性を付与し、また、収量を含む表現型に対する不良影響は見られていない。本発明において、植物は、少なくとも１種類の試験対象除草剤２×、３×、４×又は５×普通適用レベルに耐性を有する。これらの耐性レベルの向上は本発明の範囲に含まれる。例えば、本分野で周知の多様な技術に予見可能の最適化を行ったり一層改善させて、所定の遺伝子の発現を増加することができる。
【００７１】
本発明において、前記除草剤耐性タンパク質は２４ＤＴ２２アミノ酸配列であって、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示すとおりである。前記除草剤耐性遺伝子は２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列で、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示すとおりである。前記除草剤耐性遺伝子は植物に用いられて、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列によりコーディングしたタンパク質のコーディング領域を含む以外、例えば輸送ペプチドをコーディングするコーディング領域、選択性標記タンパク質又は害虫抵抗性を付与するタンパク質をコーディングするコーディング領域等の他の素子も含む。
【００７２】
本発明において、２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質は、殆どのフェノキシオーキシン除草剤に対して耐性を有する。本発明中の植物は、そのゲノムに外因性のＤＮＡを含み、前記外因性のＤＮＡは２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含み、有効量の該タンパク質を発現することで、除草剤の脅威から保護される。有効量とは、ダメージのない又はダメージが軽い使用量を指す。同時に、植物は、その形状が正常であって、且つ通常の方法で培養して産物の消費及び／又は成長に利用される。
【００７３】
植物材料における除草剤耐性タンパク質の発現レベルは、本分野で周知の多様な方法で検出することができ、例えば、特異性プライマーを用いて組織内に発生された除草剤耐性タンパク質をコーディングするｍＲＮＡの量を固定したり、又は直接に発生された除草剤耐性タンパク質の量を特異性検出することができる。
【発明の効果】
【００７４】
本発明は、除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途を提供し、以下のメリットを有する：
１、除草剤に対する耐性が強い。本発明の除草剤耐性タンパク質２４ＤＴ２２は除草剤に対する耐性が強く、特に、フェノキシオーキシン除草剤、２，４−Ｄに対する耐性が強い。
【００７５】
２、除草剤に対する耐性が広い。本発明の除草剤耐性タンパク質２４ＤＴ２２タンパク質は、多様なフェノキシオーキシン除草剤に対して高い耐性を示すので、植物に汎用される見込みがある。
【００７６】
以下、図面と実施例によって、本発明の技術案を一層詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔの構築を示すフローチャートである。
【図２】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１の構築を示すフローチャートである。
【図３】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の対照配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１Ｎの構築を示すフローチャートである。
【図４】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途のトランスジェニックシロイヌナズナＴ１植物の除草剤耐性効果を示す図である。
【図５】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途のトランスジェニック大豆Ｔ１植物の除草剤耐性効果を示す図である。
【図６】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４の構築を示すフローチャートである。
【図７】本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の対照配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４Ｎの構築を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、具体的な実施例によって本発明の除草剤耐性タンパク質、そのコーディング遺伝子及び用途の技術案をさらに説明する。
【００７９】
第１実施例、２４ＤＴ２２遺伝子配列の取得と合成
１、２４ＤＴ２２遺伝子配列の取得
２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質のアミノ酸配列（２９２個のアミノ酸）は、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示すとおりである。植物の好みコドンに基づいて、前記２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質に対応するアミノ酸配列（２９２個のアミノ酸）をコーディングするヌクレオチド配列（８７９個のヌクレオチド）を取得し、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示すとおりである。
【００８０】
２、上記２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列の合成
前記２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列（例えば、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示す）を南京金斯瑞生物科学技術有限会社で合成し、合成された前記２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の５’末端にＳｐｅＩ酵素切断部位が接続され、前記２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の３’末端にＫａｓＩ酵素切断部位が接続されている。
【００８１】
第２実施例、シロイヌナズナと大豆組換え発現ベクターの構築
１、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔの構築
合成した２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列をクローンベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ、ＣＡＴ：Ａ３６００）に接続し、その操作工程はＰｒｏｍｅｇａ会社の製品ｐＧＥＭ−Ｔベクターの説明書に従って行い、組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔを得て、その構築フローは図１に示す（ここで、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｆ１はファージｆ１の複製起点を、ＬａｃＺはＬａｃＺ開始コドンを、ＳＰ６はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、Ｔ７はＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼプロモーターを、２４ＤＴ２２は２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を、ＭＣＳは複数のクローン部位をそれぞれ示す）。
【００８２】
その後、組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔをヒートショック法で大腸菌Ｔ１受容性細胞（Ｔｒａｎｓｇｅｎ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ、ＣＡＴ：ＣＤ５０１）に転化し、そのヒートショック条件は、５０μＬ大腸菌Ｔ１受容性細胞、１０μＬプラスミドＤＮＡ（組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔ）で、４２℃で３０秒水浴し、３７℃で１時間振動培養し（回転速度１００ｒｐｍでシェーカーで揺れ動く）、表面にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）とＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）のアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）が塗布されたＬＢ板（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．５まで調節）で一夜成長させた。白色コロニーを選択し、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．５まで調節）で温度３７℃条件で一夜培養した。そのプラスミドをアルカリ抽出し、即ち菌液を回転速度１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心処理し、上清液を除去し、沈殿菌体を１００μＬの氷で予備冷却した溶液Ｉ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、５０ｍＭグルコース、ｐＨ８．０）に懸濁し、その後、２００μＬの新しく調製した溶液ＩＩ（０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））を添加し、チューブを４回倒して混合し、氷の上に３〜５ｍｉｎ放置する。１５０μＬの冷たい溶液ＩＩＩ（３Ｍ  酢酸カリウム、５Ｍ  酢酸）を添加して直ちに充分に混合し、氷の上に５〜１０ｍｉｎ放置する。温度４℃、回転速度１２０００ｒｐｍの条件で５ｍｉｎ遠心処理し、上清液に２倍体積の無水アルコールを添加し、均一に混合した後、室温に５ｍｉｎ放置する。温度４℃、回転速度１２０００ｒｐｍの条件で５ｍｉｎ遠心処理し、上清液を除去し、沈殿物を濃度（Ｖ／Ｖ）が７０％であるアルコールで洗浄して乾燥する。３０μＬのＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍＬ）含有ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加して沈殿物を溶解し、温度３７℃で３０ｍｉｎ水浴し、ＲＮＡを消化する。温度−２０℃に保存する。
【００８３】
抽出したプラスミドをＳｐｅＩとＫａｓＩによる酵素切断鑑定を行った後、陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔに挿入された前記２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列は、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列であって、即ち２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列が正確に挿入された。
【００８４】
２、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有するシロイヌナズナと大豆組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１の構築
制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩとＫａｓＩとでそれぞれ、組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔと発現ベクターＤＢＮＢＣ−０１（ベクター骨格：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡ機構が提供可能である））に酵素切断を行って、切断した２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列断片を発現ベクターＤＢＮＢＣ−０１のＳｐｅＩとＫａｓＩの部位間に挿入し、通常の酵素切断方法でベクターを構築することは当業者にとって周知なものであって、組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１を構築し、その構築フローは図２に示す（Ｋａｎ：カナマイシン遺伝子；ＲＢ：右境界；ＡｔＵｂｉ１０：シロイヌナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ（ユビキチン）１０遺伝子プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；２４ＤＴ２２：２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；Ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ｐｒＣａＭＶ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；ＰＡＴ：グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；ｔＣａＭＶ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；ＬＢ：左境界）。
【００８５】
組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１を、ヒートショック法で大腸菌Ｔ１受容性細胞に転化し、そのヒートショック条件は、５０μＬ大腸菌Ｔ１受容性細胞、１０μＬプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１）であって、４２℃で３０秒水浴する。３７℃で１時間振動培養する（回転速度１００ｒｐｍでシェーカーで揺れ動く）。その後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）含有ＬＢ固定板（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．５まで調節した）上で温度３７℃の条件で１２時間培養し、白色コロニーを選択し、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．５まで調節した）で温度３７℃条件で一夜培養した。そのプラスミドをアルカリ抽出した。抽出したプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩとＫａｓＩで酵素切断して鑑定し、陽性クローンに測定鑑定を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１は、ＳｐｅＩとＫａｓＩ部位間のヌクレオチド配列が配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示すヌクレオチド配列であって、即ち２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列である。
【００８６】
３、対照配列を含有するシロイヌナズナと大豆組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１Ｎの構築
本発明の第２実施例中の１に記載の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔを構築する方法に従って、対照配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）で対照配列を含有する組換えクローンベクターＤＢＮ０１Ｒ−Ｔを構築した。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターＤＢＮ０１Ｒ−Ｔに挿入された対照配列は配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるヌクレオチド配列であって、即ち、対照配列が正確に挿入された。
【００８７】
本発明の第２実施例中の２に記載の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１を構築する方法に従って、対照配列で対照配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１Ｎを構築し、そのベクター構造は図３に示す（ベクター骨格：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡ機構が提供可能である）、Ｋａｎ：カナマイシン遺伝子；ＲＢ：右境界；ＡｔＵｂｉ１０：シロイヌナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ（ユビキチン）１０遺伝子プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；ｍＮ：対照配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；Ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ｐｒＣａＭＶ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；ＰＡＴ：グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；ｔＣａＭＶ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；ＬＢ：左境界）。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１Ｎに挿入された対照配列は配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。
【００８８】
第３実施例、２４ＤＴ２１ヌクレオチド配列に移転したシロイヌナズナ植物の取得
１、組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム
既に正確に構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１とＤＢＮ１００３０１Ｎ（対照配列）を、液体窒素法でアグロバクテリウムＧＶ３１０１に転化し、その転化条件は、１００μＬアグロバクテリウムＧＶ３１０１、３μＬプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）である。液体窒素中に１０分放置し、３７℃温度で１０分水浴する。転化後のアグロバクテリウムＧＶ３１０１をＬＢ試験管に接種し、温度２８℃、回転速度が２００ｒｐｍである条件で２時間培養し、５０ｍｇ／Ｌのリファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）と５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ板に陽性モノクローナルが出るまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ  ＳｍａＩとＰｓｔＩでＤＢＮ１００３０１を酵素切断した後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ  ＳｍａＩと  ＢｇｌＩでＤＢＮ１００３０１Ｎ（対照配列）を酵素切断した後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１とＤＢＮ１００３０１Ｎ（対照配列）の構造は完全に正確であった。
【００８９】
２、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の取得
野生型シロイヌナズナ種子を０．１％（ｗ／ｖ）アガロース溶液に懸濁させる。懸濁した種子を４℃で２日保存して休眠の需要を満たし、種子の同期発芽を保証する。バーミキュライトを馬糞と混合し、湿るまで水で地下灌漑し、土壌混合物を２４時間排出する。前処理後の種子を土壌混合物に植えて、保湿カバーで７日覆う。種子が発芽し、恒温（２２℃）、恒湿（４０〜５０％）、光強度が１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒である長日照条件（１６時間光照射／８時間暗所）で温室で植物を培養した。初期はホーグランド栄養溶液で植物を灌漑し、その後はイオン交換水で灌漑し、土壌の湿りは保持するもののずぶぬれにしない。
【００９０】
花浸漬法でシロイヌナズナを転化する。選択したアグロバクテリウムコロニーで１部又は複数部の１５−３０ｍＬのカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）とリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）含有ＹＥＰ培養液の予備培養物を接種する。２２０ｒｐｍで培養物を２８℃で一定速度で揺れ動きながら１夜孵化する。各予備培養物で２部の５００ｍＬのカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）とリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）含有ＹＥＰ培養液の培養物を接種し、培養物を２８℃で継続して揺れ動きながら１よる孵化する。室温で約８７００×ｇで沈殿細胞に１０分遠心処理し、得られた上清液を除去する。細胞沈殿を５００ｍＬ浸透培地に軽く懸濁し、前記浸透培地は１／２×ＭＳ塩／Ｂ５ビタミン、１０％（ｗ／ｖ）蔗糖、０．０４４μＭベンジルアミノプリン（１０μＬ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ中の原液））と３００μＬ／Ｌ  Ｓｉｌｖｅｔ  Ｌ−７７を含有する。約一ヶ月の植物を培地に１５秒浸漬し、最新の花序を浸漬させる。次に、植物を側面倒して、２４時間覆い（透明又は非透明）、その後水で洗浄して縦方向に置く。２２℃で１６時間光照射／８時間暗所の光周期で植物を培養した。約４週間浸漬した後種子を収穫した。
【００９１】
新しく収穫した（２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列と対照配列）Ｔ１種子を室温で７日乾燥した。種子を２６．５×５１ｃｍ発芽トレイに植えて、各トレイに２００ｍｇＴ１種子（約１００００個の種子）を植えていて、前記種子は予め４０ｍＬ  ０．１％（ｗ／ｖ）アガロース溶液に懸濁して４℃で２日保存して休眠の需要を満たして種子の同期発芽を保証した。
【００９２】
バーミキュライトに馬糞を混合し、湿るまで水で地下灌漑し、重力によって排水した。ピペットで前処理した後の種子（各４０ｍＬ）を土壌混合物に均一に植えて、保湿カバーで４〜５日覆った。発芽後にグルホシネート（共同転化したＰＡＴ遺伝子を選択）を噴射し初期転化体を選択する１日前にカバーを除去する。
【００９３】
７日栽培後（ＤＡＰ）、１１ＤＡＰで再びＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空ノズルで１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴射体積用Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ  ａｉ／Ｌのグルホシネート）の０．２％溶液をＴ１植物（それぞれ、子葉期と２〜４葉期である）に噴射し、毎回２８０ｇ  ａｉ／ｈａ有効量を適用したグルホシネートを提供した。最後に噴射した後、４〜７日後に生存したもの（成長が活躍である植物）を鑑定し、それぞれ馬糞とバーミキュライトからなる７ｃｍｘ７ｃｍの四角形鉢に移植した（鉢ごとに３〜５株）。保湿カバーで移植した植物を３〜４日覆い、２２℃の培養室に放置するか、又は直接に温室に移動する。その後、カバーを除去し、２４ＤＴ２２遺伝子によるフェノキシオーキシン除草剤耐性の能力をテストする前の少なくとも１日前に植物を温室（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、１４時間光照射：１０時間暗所、最小５００μＥ／ｍ２ｓ１天然＋補充光）に移植した。
【００９４】
第４実施例、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の除草剤耐性効果の検出
２４ＤＴ２２遺伝子で第１回のシロイヌナズナ転化を行った。まず、グルホシネート選択方案で、未転化種子背景からＴ１転化体を選択した。約２００００個のＴ１種子を選別し、３１４株Ｔ１陽性形質転換体（ＰＡＴ遺伝子）を鑑定した結果、約１．６％の転化率であった。２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したシロイヌナズナＴ１植物、対照配列に移入したシロイヌナズナＴ１植物、野生型シロイヌナズナ植物（栽培した１８日後）それぞれの２，４−Ｄジメチルアンモニウム塩とＭＣＰＡに対する除草剤耐性効果を検出した。
【００９５】
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したシロイヌナズナＴ１植物、対照配列に移入したシロイヌナズナＴ１植物、野生型シロイヌナズナ植物をそれぞれ、２，４−Ｄジメチルアンモニウム塩（５６０ｇ  ａｅ／ｈａ、１倍田畑濃度）、ＭＣＰＡ（５６０ｇ  ａｅ／ｈａ、１倍田畑濃度）、空白溶剤（水）で噴射した。噴射した７日と１４日後に、植物の耐性状況を統計した：７日後の成長状況が空白溶剤（水）と一致するものを高抵抗植物と、７日後にロゼット葉曲げがあるものを中抵抗植物と、１４日後にも抽出が不可能であるものを低抵抗植物と、１４日後に死亡したものを不抵抗植物とした。各シロイヌナズナＴ１植物が独立して転化したので、所定の使用量で各Ｔ１による応答の明確な差異を予見できる。その結果を表１と図４に示す。
【００９６】
【表１】
0006486505.tif 000002
【００９７】
シロイヌナズナの場合、５６０ｇ  ａｅ／ｈａ  ２，４−ＤとＭＣＰＡは、敏感植物と平均耐性レベルを有する植物とを区別する有効量であった。表１と図４の結果によると、２４ＤＴ２２遺伝子は個別のシロイヌナズナ植物に除草剤耐性を与え（ただ一部の植物が耐性を有する原因は、Ｔ１の植物挿入部位がランダムであるので、耐性遺伝子の発現レベルが異なっていて、耐性レベルの差異を示す）、特に、フェノキシオーキシン除草剤の方が顕著である。野生型シロイヌナズナ植物と対照配列に移入したシロイヌナズナＴ１植物は、いずれもフェノキシオーキシン除草剤耐性を有していない。
【００９８】
第５実施例、トランスジェニック大豆植物の取得及び検証
１、組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム
既に正確に構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１とＤＢＮ１００３０１Ｎ（対照配列）を、液体窒素法でアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ、ＣＡＴ：１８３１３−０１５）に転化し、その転化条件は、１００μＬアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４、３μＬプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）である。液体窒素中に１０分放置し、３７℃温度で１０分水浴した。転化後のアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４をＬＢ試験管に接種し、温度２８℃、回転速度が２００ｒｐｍである条件で２時間培養し、５０ｍｇ／Ｌのリファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）と５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ板に、陽性モノクローナルが成長するまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ  ＳｍａＩとＰｓｔＩでＤＢＮ１００３０１を酵素切断した後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ  ＳｍａＩと  ＢｇｌＩでＤＢＮ１００３０１Ｎ（対照配列）を酵素切断した後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１とＤＢＮ１００３０１Ｎ（対照配列）の構造は完全に正確であった。
【００９９】
２、トランスジェニック大豆植物の取得
通常に利用されるアグロバクテリウム侵入法で、無菌培養した大豆種類中の黄１３の子葉節組織を本実施例中の１に記載のアグロバクテリウムと共同培養し、第２実施例中の２と３で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１００３０１やＤＢＮ１００３０１Ｎ中のＴ−ＤＮＡ（シロイヌナズナＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１０遺伝子のプロモーター配列、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列、対照配列、Ｎｏｓターミネータ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、グルホシネートアセチル転移酵素遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネータを含む）を大豆染色体組に移入し、２４ＤＴ２２と対照ヌクレオチド配列に移入された大豆植物を得て、同時に、野生型大豆植物を対照物とした。
【０１００】
アグロバクテリウムが仲介した大豆の転化について、要約すると、成熟した大豆種子を大豆発芽培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、蔗糖２０ｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）で発芽させ、種子を発芽培地に接種し、以下の条件で培養した：温度が２５±１℃で、光周期（光／暗い）は１６／８ｈである。発芽した４〜６日後に、新緑の子葉節で膨張した大豆無菌苗を取って、子葉節の下方の３〜４ｍｍで胚軸を切って、子葉を縦方向に切断し、頂部芽、側面芽、種子根を除去した。解剖カットの峰で子葉節を傷つけ、アグロバクテリウム懸濁液を傷つけた子葉節組織に接触し、その中、アグロバクテリウムは前記２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を傷つけた子葉節組織に伝達することができ（工程１：侵入工程）、当該工程において、子葉節組織がアグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６６０＝０．５−０．８、侵入培地（ＭＳ塩２．１５ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、蔗糖２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン（ＡＳ）４０ｍｇ／Ｌ、２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）４ｇ／Ｌ、ゼアチン（ＺＴ）２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．３）に浸漬されて接種を開始することが好ましい。子葉節組織をアグロバクテリウムと一定期間（３日）共同培養した（工程２：共同培養工程）。子葉節組織を、侵入工程後に固体培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、蔗糖２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）４ｇ／Ｌ、ゼアチン２ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）で培養した。当該共同培養段階後に、選択的な「回復」工程を行うことが好ましい。「回復」工程において、回復培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）１ｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、ゼアチン（ＺＴ）２ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）には少なくとも１種類の、周知のアグロバクテリウム成長を抑制する抗生物質（セファロスポリン）が存在し、植物転化体の選択剤を添加しない（工程３：回復工程）。子葉節に再生した組織ブロックを、抗生物質はあるが選択剤はない固体培地で培養し、アグロバクテリウムを除去し、侵入細胞に回復期間を提供する。次に、子葉節に再生した組織ブロックを選択剤（グルホシネート）を含有する培地で培養し、成長中の転化カルス組織を選択する（工程４：選択工程）。子葉節に再生した組織ブロックを選択剤のある選別固体培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）１ｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡＰ）１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸１００ｍｇ／Ｌ、グルホシネート６ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）で培養し、転化した細胞を選択的に成長させることが好ましい。その後、転化した細胞を植物に成長させ（工程５：再生工程）、ここで、選択剤を含有する培地で成長した子葉節に再生した組織ブロックを固体培地（Ｂ５分化培地とＢ５発根培地）で培養して植物を再生させることが好ましい。
【０１０１】
選別して得た耐性組織ブロックを前記Ｂ５分化培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）１ｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、ゼアチン（ＺＴ）１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸５０ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸５０ｍｇ／Ｌ、ジベレリン１ｍｇ／Ｌ、オーキシン１ｍｇ／Ｌ、グルホシネート６ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）に転移し、２５℃で培養分化した。分化した苗を前記Ｂ５発根培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、２−モルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）１ｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）１ｍｇ／Ｌ）に転移し、発根培地で、２５℃で約１０ｃｍ高さまで培養し、温室に移動して丈夫になるまで培養した。温室において、毎日２６℃で１６時間培養し、そして２０℃で８時間培養した。
【０１０２】
３、ＴａｑＭａｎでトランスジェニック大豆植物を検証
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入した大豆植物と、対照ヌクレオチド配列に移入した大豆植物の葉をそれぞれ約１００ｍｇとってサンプルとし、ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ＫｉｔでそのゲノムＤＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ方法で、ＰＡＴ遺伝子コピー数を検出して、２４ＤＴ２２遺伝子のコピー数を確定した。同時に、野生型大豆植物を対照物とし、上記方法で検出分析を行った。実験を３回繰り返し、その平均値をとった。
【０１０３】
ＰＡＴ遺伝子コピー数を検出する具体的な方法は以下のとおりである：
【０１０４】
工程１１において、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物の葉をそれぞれ１００ｍｇ取って、それぞれ、モルタル中で液体窒素を利用して均等質を形成し、各サンプルから３個選択して繰り返した。
【０１０５】
工程１２において、ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、上記サンプルのゲノムＤＮＡを抽出し、具体的な方法はその製品の説明書を参照することができる。
【０１０６】
工程１３において、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で上記サンプルのゲノムＤＮＡ濃度を測定した。
【０１０７】
工程１４において、上記サンプルのゲノムＤＮＡ濃度を同一の濃度値に調節し、前記濃度値の範囲は８０〜１００ｎｇ／μＬである。
【０１０８】
工程１５において、Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ方法で、サンプルのコピー数を鑑定し、鑑定を経てコピー数を分かったサンプルを基準とし、野生型大豆植物のサンプルを対照とし、各サンプルから３個選択して繰り返し、その平均値をとる。蛍光定量ＰＣＲプライマーとプローブ配列はそれぞれ以下のとおりである：
【０１０９】
以下のプライマーとプローブでＰＡＴヌクレオチド配列を検出した：
プライマー１：ＧＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＴＴＧ、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示す；
プライマー２：ＴＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＣＡＡＴＣＧＴＡＡＧＣＧ、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示す；
プローブ１：ＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧ、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示す；
ＰＣＲ反応体系は以下のとおりである：
【０１１０】
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）  （Ｓｉｇｍａ）
１０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物              １μＬ
ゲノムＤＮＡ                                  ３μＬ
水（ｄｄＨ２Ｏ）                          ６μＬ
前記５０×プライマー／プローブ混合物は、１ｍＭ濃度の各種プライマーを各４５μＬ、１００μＭ濃度のプローブ５０μＬ、８６０μＬ  １×ＴＥ緩衝液を含み、４℃で、アンバー試験管に貯蔵されている。
【０１１１】
ＰＣＲ  反応条件は以下のとおりである：
【０１１２】
工程                温度                時間
２１                ９５℃              ５分
２２                ９５℃              ３０秒
２３                ６０℃              １分
２４        工程２２に戻る、４０回繰り返す
ＳＤＳ２．  ３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータを分析する。
【０１１３】
ＰＡＴ遺伝子コピー数を分析した実験結果、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列は全て、検出した大豆植物の染色体組に整合されていて、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入した大豆植物と対照配列に移入した大豆植物もいずれも、シングルコピーのトランスジェニック大豆植物を取得した。
【０１１４】
第６実施例、トランスジェニック大豆植物の除草剤耐性効果の検出
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物（幼苗期）それぞれの２，４−Ｄジメチルアンモニウム塩とＭＣＰＡに対する除草剤耐性効果を検出した。
【０１１５】
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入した大豆植物、対照配列に移入した大豆植物、野生型大豆植物をそれぞれとって、２，４−Ｄジメチルアンモニウム塩（２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、４倍田畑濃度）、ＭＣＰＡ（２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ、４倍田畑濃度）、空白溶剤（水）で噴射した。それぞれ噴射してから６時間（６ＨＡＴ）、２日（２ＤＡＴ）、７日（７ＤＡＴ）及び１４日（１４ＤＡＴ）後に、葉の巻き程度と成長点ダメージ程度に基づいて、各植物の除草剤によるダメージ程度を統計した。ここで、葉が野生型のように平坦し、成長点が完璧であるものを０％と、葉が巻かれてしなびて成長点が死亡したものを１００％とした。２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したものは合計３個の株系（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）、対照配列に移入したものは合計２個の株系（Ｓ４、Ｓ５）、野生型の（ＣＫ１）ものは合計１個の株系を選択した。各株系から１０〜１５株を選択してテストした。結果を表２及び図５に示す。
【０１１６】
【表２】
0006486505.tif 000003
【０１１７】
大豆の場合、２２４０ｇ  ａｅ／ｈａ  ２，４−ＤとＭＣＰＡは、敏感植物と平均耐性レベルを有する植物とを区別する有効量である。表２と図５の結果によると、２４ＤＴ２２遺伝子はトランスジェニック大豆植物に高レベルの除草剤耐性を付与し、特に、フェノキシオーキシン除草剤の方が顕著である。野生型大豆植物と対照配列に移入した大豆Ｔ１植物は、いずれもフェノキシオーキシン除草剤耐性を有していない。
【０１１８】
第７実施例、コーン組換え発現ベクターの構築及び組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム
１、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有するコーン組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４の構築
制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩとＫａｓＩでそれぞれ、組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔと発現ベクターＤＢＮＢＣ−０２（ベクター骨格：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡ機構が提供可能である））に酵素切断し、切断した２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列断片を発現ベクターＤＢＮＢＣ−０２のＳｐｅＩとＫａｓＩ部位間に挿入し、通常の酵素切断方法でベクターを構築することは当業者にとって周知なものであって、発現ベクターＤＢＮＢＣ−０２中のＳｐｅＩとＫａｓＩの酵素切断部位も、通常の酵素切断方法によるものであって、組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４を構築し、その構築フローは図６に示す（Ｋａｎ：カナマイシン遺伝子；ＲＢ：右境界；Ｕｂｉ：コーンＵｂｉｑｕｉｔｉｎ（ユビキチン）１遺伝子プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；２４ＤＴ２２：２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；Ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ＰＭＩ：リン酸マンノースメラーゼ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；  ＬＢ：左境界）。
【０１１９】
組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４を、ヒートショック法で大腸菌Ｔ１受容性細胞に転化し、そのヒートショック条件は、５０μＬ大腸菌Ｔ１受容性細胞、１０μＬプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４）、４２℃で３０秒水浴する。３７℃で１時間振動培養した（回転速度１００ｒｐｍでシェーカーで揺れ動く）。その後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含有するＬＢ固定板（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．５まで調節した）上で、温度３７℃の条件で１２時間培養し、白色コロニーを選択し、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、スペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．５まで調節した）で、温度３７℃の条件で一夜培養した。そのプラスミドをアルカリ抽出した。抽出したプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩとＫａｓＩで酵素切断して鑑定し、陽性クローンに測定鑑定を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４は、ＳｐｅＩとＫａｓＩ部位間のヌクレオチド配列が配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示すヌクレオチド配列であって、即ち２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列であった。
【０１２０】
２、対照配列を含有するコーン組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４Ｎの構築
本発明の第２実施例中の１に記載の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換えクローンベクターＤＢＮ０１−Ｔを構築する方法に従って、対照配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を利用して、対照配列を含有する組換えクローンベクターＤＢＮ０２Ｒ−Ｔを構築した。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換えクローンベクターＤＢＮ０２Ｒ−Ｔに挿入された対照配列は配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。
【０１２１】
本発明の本実施例中の１に記載の２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４を構築する方法に従って、対照配列を利用して、対照配列を含有する組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４Ｎを構築し、そのベクター構造は図７に示す（ベクター骨格：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡ機構が提供可能である）；Ｋａｎ：カナマイシン遺伝子；ＲＢ：右境界；Ｕｂｉ：コーンＵｂｉｑｕｉｔｉｎ（ユビキチン）１遺伝子プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；ｍＮ：対照配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；Ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ＰＭＩ：リン酸マンノースメラーゼ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）；ＬＢ：左境界）。陽性クローンに測定検証を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４Ｎに挿入された対照配列は配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示されるヌクレオチド配列であって、即ち対照配列が正確に挿入された。
【０１２２】
３、コーン組換え発現ベクター転化アグロバクテリウム
既に正確に構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４とＤＢＮ１００７６４Ｎ（対照配列）を、液体窒素法でアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ｉｎｖｉｔｒｇｅｎ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ、ＣＡＴ：１８３１３−０１５）に転化し、その転化条件は、１００μＬアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４、３μＬプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）である。液体窒素中に１０分放置し、３７℃温度で１０分水浴した。転化後のアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４をＬＢ試験管に接種して温度２８℃、回転速度２００ｒｐｍの条件で２時間培養し、５０ｍｇ／Ｌのリファンピシン（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）と５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ板に陽性モノクローナルが成長するまで塗布し、モノクローナルを選択して培養し、そのプラスミドを抽出し、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩとＥｃｏＲＶでＤＢＮ１００７６４に酵素切断を行った後に酵素切断検証を行い、制限エンドヌクレアーゼ  ＳｔｙＩとＢｇｌＩでＤＢＮ１００７６４Ｎ（対照配列）に酵素切断を行った後に酵素切断検証を行った結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４とＤＢＮ１００７６４Ｎ（対照配列）の構造は完全に正確であった。
【０１２３】
第８実施例、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物の取得及び検証
通常に利用されるアグロバクテリウム侵入法で、無菌培養したコーン種類中の綜３１（Ｚ３１）の未熟胚を第７実施例中の３に記載のアグロバクテリウムと共同培養し、第７実施例中の１と２で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１００７６４とＤＢＮ１００７６４Ｎ（対照配列）中のＴ−ＤＮＡ（コーンＵｂｉｑｕｉｔｉｎ１遺伝子のプロモーター配列、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列、対照配列、ＰＭＩ遺伝子、Ｎｏｓターミネータ配列を含む）をコーン染色体組に移入して、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を移入したコーン植物と対照配列に移入したコーン植物を取得した。同時に野生型コーン植物を対照物とした。
【０１２４】
アグロバクテリウムが仲介したコーン転化について、要約すると、コーンから未成熟の未熟胚を分離し、アグロバクテリウム懸濁液を未熟胚に接触させ、その中、アグロバクテリウムは２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列を未熟胚の中の少なくとも一つの細胞に伝達できる（工程１：侵入工程）。当該工程において、未熟胚がアグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６６０＝０．４−０．６、侵入培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、蔗糖６８．５ｇ／Ｌ、グルコース３６ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン（ＡＳ）４０ｍｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）１ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．３））に優先して侵入して接種を開始する。未熟胚をアグロバクテリウムと一定期間（３日）共同培養した（工程２：共同培養工程）。未熟胚を、侵入工程後に、固体培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、蔗糖２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン（ＡＳ）１００ｍｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）で培養することが好ましい。当該共同培養段階後に、選択的な「回復」工程を行うことが好ましい。「回復」工程において、回復培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）１ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）には少なくとも１種類の、周知のアグロバクテリウム成長を抑制する抗生物質（セファロスポリン）が存在し、植物転化体の選択剤を添加しない（工程３：回復工程）。未熟胚を、抗生物質はあるが選択剤はない固体培地で培養し、アグロバクテリウムを除去し、侵入細胞に回復期間を提供する。次に、接種した未熟胚を選択剤（マンノース）を含有する培地で培養し、成長中の転化カルス組織を選択する（工程４：選択工程）。未熟胚を選択剤のある選別固体培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、マンノース１２．５ｇ／Ｌ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）１ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）で培養して、転化した細胞を選択的に成長させることが好ましい。その後、カルス組織を植物に成長させ（工程５：再生工程）、ここで、選択剤を含有する培地で成長したカルス組織を固体培地（ＭＳ分化培地とＭＳ発根培地）で培養して植物を再生させることが好ましい。
【０１２５】
選別して得た耐性カルス組織を前記ＭＳ分化培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、６−ベンジルアデニン２ｍｇ／Ｌ、マンノース５ｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）に転移し、２５℃で培養分化した。分化された苗を前記ＭＳ発根培地（ＭＳ塩２．１５ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、蔗糖３０ｇ／Ｌ、インドール−３−酢酸１ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）に転移し、２５℃で約１０ｃｍ高さまで培養し、温室に移動して丈夫になるまで培養した。温室において、毎日２８℃で１６時間培養し、その後２０℃で８時間培養した。
【０１２６】
２、ＴａｑＭａｎで２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物を検証
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物と、対照配列に移入したコーン植物の葉をそれぞれ約１００ｍｇとってサンプルとし、ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ＫｉｔでそのゲノムＤＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ方法でＰＭＩ遺伝子コピー数を検出して、２４ＤＴ２２遺伝子のコピー数を確定した。同時に、野生型コーン植物を対照とし、上記方法で検出分析を行った。実験を３回繰り返し、その平均値をとった。
【０１２７】
ＰＭＩ遺伝子コピー数を検出する具体的な方法は以下のとおりである：
【０１２８】
工程３１において、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物の葉をそれぞれ１００ｍｇとって、それぞれ、モルタル中で液体窒素を利用して均等質を形成し、各サンプルから３個選択して繰り返した。
【０１２９】
工程３２において、ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔで上記サンプルのゲノムＤＮＡを抽出し、具体的な方法は製品説明書を参照することができる。
【０１３０】
工程３３において、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で上記サンプルのゲノムＤＮＡ濃度を測定した。
【０１３１】
工程３４において、上記サンプルのゲノムＤＮＡ濃度を同一の濃度値に調節し、前記濃度値の範囲は８０〜１００ｎｇ／μＬである。
【０１３２】
工程３５において、Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ方法でサンプルのコピー数を鑑定し、鑑定を経てコピー数を分かったサンプルを基準とし、野生型コーン植物のサンプルを対照とし、各サンプルから３個選択して繰り返し、その平均値をとった。蛍光定量ＰＣＲプライマーとプローブ配列はそれぞれ以下のとおりである：
【０１３３】
以下のプライマーとプローブでＰＭＩヌクレオチド配列を検出した：
プライマー３：ＧＣＴＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡ、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示す；
プライマー４：ＣＧＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧ、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示す；
プローブ２：ＴＣＴＣＴＴＧＣＴＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＴＣＣ、配列表でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示す；
ＰＣＲ反応体系は以下のとおりである：
【０１３４】
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）  Ｔａｑ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）  （Ｓｉｇｍａ）
１０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物              １μＬ
ゲノムＤＮＡ                                  ３μＬ
水（ｄｄＨ２Ｏ）                          ６μＬ
前記５０×プライマー／プローブ混合物は、１ｍＭ濃度の各種プライマーを各４５μＬ、１００μＭ濃度のプローブ５０μＬ、８６０μＬ  １×ＴＥ緩衝液を含み、４℃で、アンバー試験管に貯蔵されている。
【０１３５】
ＰＣＲ  反応条件は以下のとおりである：
【０１３６】
工程                温度                時間
４１                ９５℃              ５分
４２                ９５℃              ３０秒
４３                ６０℃              １分
４４        工程４２に戻る、４０回繰り返す
ＳＤＳ２．  ３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でデータを分析した。
【０１３７】
ＰＡＴ遺伝子コピー数を分析した実験結果、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列は全て、検出したコーン植物の染色体組に整合されていて、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物と対照配列に移入したコーン植物もいずれも、シングルコピーのトランスジェニックコーン植物を取得した。
【０１３８】
第９実施例、トランスジェニックコーン植物の除草剤耐性効果の検出
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物（Ｖ３−Ｖ４時期）それぞれの、２，４−Ｄジメチルアンモニウム塩とＭＣＰＡに対する除草剤耐性効果を検出した。
【０１３９】
２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、対照配列に移入したコーン植物、野生型コーン植物をそれぞれ、２，４−Ｄジメチルアンモニウム塩（８９６０ｇ  ａｅ／ｈａ、１６倍田畑濃度）、ＭＣＰＡ（８９６０ｇ  ａｅ／ｈａ、１６倍田畑濃度）、空白溶剤（水）で噴射した。噴射してから２１日後に、支持根の発育状況を統計した。２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したものは合計３個の株系（Ｓ６、Ｓ７、Ｓ８）、対照配列に移入したものは合計２個の株系（Ｓ９、Ｓ１０）、野生型の（ＣＫ２）ものは合計１個の株系を選択した。各株系から１０〜１５株を選択してテストした。結果を表３に示す。
【０１４０】
【表３】
0006486505.tif 000004
【０１４１】
表３によると、２４ＤＴ２２遺伝子はトランスジェニックコーン植物に除草剤の高レベル耐性を付与し、特に、フェノキシオーキシン除草剤の方が顕著である（単子葉植物自体がフェノキシオーキシン除草剤に一定の耐性を有するので、高レベル耐性を示した）。野生型コーン植物と対照配列に移入したコーン植物はいずれも高レベルのフェノキシオーキシン除草剤耐性を有していない。
【０１４２】
上述のように、２４ＤＴ２２ヌクレオチド配列に移入したコーン植物、大豆植物、シロイヌナズナ植物はいずれも、高い除草剤耐性能力を有する。本発明の２４ＤＴ２２除草剤耐性遺伝子は、植物の好みのコドンを利用し、本発明の除草剤耐性遺伝子が植物での発現に特別に適合し、本発明の２４ＤＴ２２除草剤耐性タンパク質は除草剤に対する耐性が広く、特に、フェノキシオーキシン除草剤に対して耐性を有する。
【０１４３】
最後に、以上の実施例は本発明の技術案を制限するものではなく説明するものであって、好適な実施例を参照して本発明を詳しく説明しているが、本発明の技術案の精神や範囲を離脱せずに本発明の技術案に修正又は同等交換を行うことができることは当業者が理解できることである。
【図１】
0006486505.tif 000005
【図２】
0006486505.tif 000006
【図３】
0006486505.tif 000007
【図４】
0006486505.tif 000008
【図５】
0006486505.tif 000009
【図６】
0006486505.tif 000010
【図７】
0006486505.tif 000011
【配列表】
0006486505000001.app