(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者を、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法。
【請求項２】
がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者を、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象として選別することを含む、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象を選別する方法。
【請求項３】
生物学的試料中におけるＣＢＰの機能抑制の有無を、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬により検出する、請求項１または２に記載の方法。
（ａ）ＣＢＰ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー
（ｂ）ＣＢＰ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ
（ｃ）ＣＢＰタンパク質に特異的に結合する抗体
【請求項４】
がんが、肺がん、膀胱がん、リンパ腫、および腺様嚢胞がんからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ｐ３００を阻害する化合物を含む、ＣＢＰの機能抑制が検出されたがんの治療剤。
【請求項６】
がんが、肺がん、膀胱がん、リンパ腫、および腺様嚢胞がんからなる群より選択される、請求項５に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＢＰの機能抑制を指標とした、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法およびがんの治療の対象を選別する方法に関する。また、本発明は、ｐ３００を阻害する化合物による、ＣＢＰの機能抑制が生じているがんの治療方法に関する。さらに本発明は、これらの方法に用いられる、ＣＢＰの機能抑制の有無を検出するための試薬に関する。さらに本発明は、ｐ３００の阻害を指標とした、ＣＢＰの機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チロシンキナーゼ阻害剤は、肺腺がんに見られるＥＧＦＲ変異やＡＬＫ融合といったチロシンキナーゼ遺伝子に活性化変異を伴なう固形がんに有効である（非特許文献１）。我々および他の研究者は、最近、肺腺がんにおけるＲＥＴがん遺伝子融合を同定したが（非特許文献２）、これは治療標的としてのチロシンキナーゼ遺伝子の重要性を支持している。【０００３】
一方、クロマチン制御タンパク質のサブユニット（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼであるＣＢＰ／ＣＲＥＢＢＰおよびｐ３００／ＥＰ３００、ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＭＬＬ２およびＳＥＴＤ２、ヒストンデメチラーゼであるＪＡＲＩＤ１ＣおよびＵＴＸ、クロマチンリモデリング因子であるＢＲＧ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ２、ＰＢＲＭ１、およびＳＮＦ５など）をコードする遺伝子の不活性化体細胞変異は、がん細胞のゲノムワイドなシークエンス解析によって最初に同定されて以来、多くの興味を引いてきた。これらの変異は、転写やＤＮＡ二重鎖切断修復における機能を阻害していると考えられ、がんの発症および／または進行に決定的な意味を持つように思われる。【０００４】
しかしながら、これらの変異を有するがん細胞を特異的に標的化するための治療戦略はいまだ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐａｏ  Ｗ，  Ｇｉｒａｒｄ  Ｎ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ.  ２０１１；Ｆｅｂ；１２（２）：１７５−８０
【非特許文献２】Ｓｈａｗ  ＡＴ,  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ.  ２０１３；Ｎｏｖ；１３(１１）：７７２−８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＢＰの機能抑制を有するがん細胞を特異的に標的化するための治療戦略の開発にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
合成致死療法は、極めて有望ながん治療法である。例えば、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子は、ＰＡＲＰ１遺伝子と合成致死の関係を有する。ＢＲＣＡ１欠損型またはＢＲＣＡ２欠損型のがん細胞の増殖は、ＰＡＲＰ１タンパク質の機能に依存している。そしてこの所見は、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２欠損型腫瘍を治療するためのＰＡＲＰ阻害剤の開発という形で臨床の場に移行している（Ｃｈａｎ  ＤＡ,  ｅｔ  ａｌ.  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ.  ２０１１；１０：３５１−６４）。他にも、合成致死療法は、ＤＮＡミスマッチ修復や細胞代謝に関与する遺伝子が欠損したがんの治療において提案されてきた（Ｍｕｌｌｅｒ  ＦＬ,  ｅｔ  ａｌ.  Ｎａｔｕｒｅ.  ２０１２；４８８：３３７−４２、Ｃｈａｎ  ＤＡ,  ｅｔ  ａｌ.  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ.  ２０１１；３：９４ｒａ７０、Ｍａｒｔｉｎ  ＳＡ,  ｅｔ  ａｌ.  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ.  ２０１０；１７：２３５−４８）。本発明者らは、合成致死療法を、ＣＢＰ変異を持つがん細胞を特異的に殺傷するための治療戦略に応用すべく鋭意検討を行った。【０００８】
その結果、本発明者らは、ＣＢＰ変異を持つがん細胞において、ｐ３００タンパク質の発現抑制や機能阻害を行うと、当該がん細胞の増殖が顕著に抑制される一方、ＣＢＰ野生型細胞においては、このような増殖抑制が生じないことを見出した。また、増殖が抑制されたがん細胞においては、アネキシンＶ／ＰＩ染色で陽性細胞の割合が増加していたことから、アポトーシスが誘導されていることが判明した。さらに、ＣＢＰ変異を持つがん細胞を移植したマウスを用いた実験から、ｐ３００の発現抑制による、ＣＢＰ変異を持つがん細胞の増殖抑制効果が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても実証された。【０００９】
以上の結果から、本発明者らは、ＣＢＰとｐ３００が合成致死の関係にあり、ｐ３００（特にそのヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性）を阻害する治療が、ＣＢＰ機能抑制型がんの治療のための有望なアプローチになることを見出した。また、この治療戦略においては、がん患者をＣＢＰの機能抑制を指標に選別した上で、ｐ３００阻害剤を投与できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかとなった。【００１０】
さらに、本発明者らは、ＣＢＰ変異型がんの治療に有用な薬剤のスクリーニングを、ｐ３００を阻害するか否かを指標に行うことができることをも見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
従って、本発明は、ＣＢＰ変異等のＣＢＰ機能抑制を有するがん細胞を特異的に標的化するための合成致死療法および当該合成致死療法のためのコンパニオン診断に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。【００１２】
（１）がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者を、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法。【００１３】
（２）がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者を、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象として選別することを含む、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象を選別する方法。【００１４】
（３）がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者に対し、ｐ３００を阻害する化合物を投与することを含む、ＣＢＰの機能抑制が生じているがんの治療方法。【００１５】
（４）（１）から（３）いずれかに記載の方法において、ＣＢＰの機能抑制の有無を検出するための試薬であって、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬。
（ａ）ＣＢＰ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー
（ｂ）ＣＢＰ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ
（ｃ）ＣＢＰタンパク質に特異的に結合する抗体
（５）ＣＢＰの機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、ｐ３００を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法。【００１６】
（６）ｐ３００を阻害する化合物を含む、ＣＢＰの機能抑制が検出されたがんの治療剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＣＢＰの機能抑制を指標として、効率的に、ｐ３００阻害剤によるがんの治療への応答性を予測することが可能となった。本発明によれば、がん患者由来の生物学的試料におけるＣＢＰの機能抑制（例えば、不活性化変異や発現低下）の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が生じている患者を選別した上で、患者に対してｐ３００阻害剤によるがんの治療を施すことができる。このため、がん患者の治療成績を大きく向上させることが可能となる。ＣＢＰ遺伝子に対するプローブやプライマー、およびＣＢＰに対する抗体を用いれば、このようなＣＢＰの機能抑制の有無の検出によるコンパニオン診断を効率的に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＢＰ変異を持つがん細胞株におけるｐ３００の発現抑制の効果を示す図である。Ａは、ウェスタンブロッティングの結果を示す写真であり、Ｂは、細胞生存率を示すグラフであり、Ｃはコロニー形成率を示すグラフである。
【図２】正常細胞株におけるｐ３００の発現抑制の効果を示す図である。上は、各正常細胞株における細胞増殖を検出した結果を示すグラフであり、下は、各正常細胞株においてｓｉＲＮＡによりｐ３００消失が生じていることを確認した写真である。
【図３】ＣＢＰ変異を持つがん細胞株のｐ３００阻害剤Ｃ６４６に対する感受性を示す図である。Ａは、肺がん細胞株の生存率を示すグラフであり、Ｂは肺がん細胞株に対するＣ６４６のＩＣ５０を示すグラフである。Ｃは、リンパ腫細胞株の生存率を示すグラフであり、Ｄはリンパ腫細胞株に対するＣ６４６のＩＣ５０を示すグラフである。
【図４】ＣＢＰ変異を持つがん細胞株におけるｐ３００の発現抑制による細胞死の機序を示す図である。上は、細胞死とアポトーシス、細胞老化、およびオートファジーとの一般的な関係を示す図であり、下は、各種マーカーの変化を検出した写真である。
【図５】ＣＢＰ変異を持つがん細胞株におけるｐ３００の発現抑制によるアポトーシスの誘導をアネキシンＶ染色性を指標に検出した結果を示すグラフである。Ａは、ｓｉｐ３００のトランスフェクション後９６時間目の結果を示し、Ｂは、Ｃ４６４処理後４８時間後および９６時間後の結果を示す。
【図６】ＣＢＰ変異を持つがん細胞株を移植したマウスにおけるｐ３００の発現抑制の効果を示す図である。上は、実験の概要を示す図であり、下は、対照がん細胞（左）およびＤｏｘの作用によりｐ３００の発現が抑制されるがん細胞（右）を移植したマウスにおける腫瘍の増殖を測定した結果を示すグラフである。
【図７】肺がん細胞株およびリンパ腫細胞株におけるＣＢＰの変異を示す図である。図中、「ＨｏＤ」はホモ欠失を、「ＨｅＤ」はヘテロ欠失を示す。また、「Ｎ」はナンセンス変異を、「Ｆ」はフレームシフト変異を、「ＭＤ」はドメイン内のミスセンス変異を、「Ｍ」はミスセンス変異を、それぞれ示す。
【図８】Ａ５４９細胞（ＣＢＰ野生型）およびＨ５２０細胞（ＣＢＰ変異型）における各種ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の発現抑制の効果を示す図である。縦軸は細胞の生存率（コロニー形成率）を示す。
【図９】各種ＣＢＰ野生型細胞株およびＣＢＰ変異型細胞株におけるｐ３００発現抑制時のｃ−Ｍｙｃ発現量変化を示す図である。
【図１０】ＣＢＰ変異型細胞におけるｐ３００機能抑制によりｃ−Ｍｙｃ発現抑制および細胞増殖抑制が生じる機構を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜がんの治療への応答性を予測する方法、がんの治療の対象を選別する方法＞
本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、がん、悪性新生物、がん腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「がん」と表現する。本発明において、ＣＢＰとｐ３００ががん細胞において合成致死の関係にあり、ＣＢＰの機能抑制が生じているがん細胞において、ｐ３００を阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。この知見に基づけば、ＣＢＰの機能抑制を指標として、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を評価することができる。従って、本発明は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者を、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を予測する方法を提供する。
【００２０】
また、こうしてＣＢＰの機能抑制が検出された患者は、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療に適しており、ＣＢＰの機能抑制を指標として、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療が有効な患者と有効でない患者とを選別し、効率的な治療を行うことができる。従って、本発明は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料におけるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者を、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象として選別することを含む、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象を選別する方法をも提供する。
【００２１】
本発明において「がん患者」とは、がんに罹患しているヒトのみならず、がんに罹患していると疑いのあるヒトであってもよい。本発明の方法において、ＣＢＰの機能抑制の有無を検出する対象となるがん患者としては特に制限はなく、全てのがん患者を対象とすることができる。ＣＢＰの機能抑制が認められるがんは、例えば、肺がん、膀胱がん、リンパ腫、腺様嚢胞がん等であってもよい。肺がんの１０％、膀胱がんの１３％、リンパ腫の２０〜４０％、および腺様嚢胞がんの７％のサブセットにおいてＣＢＰが変異していることが知られているため、本発明の方法によれば、このような頻度のがん患者を「治療の対象」として選別しうる。
【００２２】
本発明において用いられる「生物学的試料」としては、ＣＢＰの機能抑制の有無を検出しうるものであれば、特に制限はないが、好ましくはがん生検検体である。これらの試料から得られるタンパク質抽出物や核酸抽出物（ｍＲＮＡ抽出物、ｍＲＮＡ抽出物から調製されたｃＤＮＡ調製物やｃＲＮＡ調製物等）であってもよい。
【００２３】
本発明における「ＣＢＰ」および「ｐ３００」は、ともに、クロマチン制御に関与するヒストンアセチルトランスフェラーゼであり、両者はパラログの関係にある。ヒト由来の天然型ＣＢＰゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：１に、ヒト由来の天然型ＣＢＰ  ｃＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：２に、ヒト由来の天然型ＣＢＰタンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：３に示す。また、ヒト由来の天然型ｐ３００ゲノムＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：４に、ヒト由来の天然型ｐ３００  ｃＤＮＡの典型的な塩基配列を配列番号：５に、ヒト由来の天然型ｐ３００タンパク質の典型的なアミノ酸配列を配列番号：６に示す。変異を生じていないＣＢＰやｐ３００であっても、多型などにより、配列に個体差が生じうることは理解されたい。
【００２４】
本発明における「ＣＢＰの機能抑制」には、ＣＢＰの不活性化、活性低下および発現低下の双方が含まれる。ＣＢＰの不活性化は、典型的には、ＣＢＰにおける不活性型変異に起因するものである。不活性型変異は、例えば、ＣＢＰのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメイン（配列番号：３に記載のアミノ酸配列の１３４２〜１６４８位）におけるミスセンス変異、また、全領域に亘るナンセンス変異、遺伝子の全体あるいは部分的な欠失などにより生じうるが、ＣＢＰを不活性化させる限り、これらに制限されない。ＣＢＰの変異の例を、表１および図７に示す。なお、表１中の略称は、次の通りである。ＳＣＣ，小細胞がん;ＡｄＣ，腺がん；ＳｑＣ，扁平上皮がん；ＬＣＣ，大細胞がん；ＮＴ，未試験；ＮＤ，未検出。*異常サイズ。†対応する非がん組織ＤＮＡが利用不可。
【００２５】
【表１】
0006588006.tif 000002
【００２６】
また、ＣＢＰの発現低下には、転写レベルでの発現の低下および翻訳レベルでの発現の低下の双方が含まれる。
【００２７】
本発明における「ＣＢＰの機能抑制の検出」の手法としては、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。
【００２８】
−ＣＢＰの変異の検出−
本発明において「変異を検出する」とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムＤＮＡ上の変異が転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映される場合には、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（即ち、間接的な検出）をも含む意味である。
【００２９】
本発明の方法の好ましい態様は、がん患者のＣＢＰ遺伝子領域の塩基配列を直接決定することにより、変異を検出する方法である。本発明において「ＣＢＰ遺伝子領域」とはＣＢＰ遺伝子を含むゲノムＤＮＡ上の一定領域を意味する。該領域には、ＣＢＰ遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）やＣＢＰ遺伝子の３’末端非翻訳領域なども含まれる。これら領域における変異は、例えば、ＣＢＰ遺伝子の転写活性に影響を与えうる。
【００３０】
この方法においては、先ずがん患者由来の生物学的試料からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、およびＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。
【００３１】
生物学的試料からゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを抽出する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができ、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、ＳＤＳフェノール法（尿素を含む溶液またはエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）、界面活性剤（ＳＤＳ）、およびフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からＤＮＡを沈殿させ抽出する方法）、Ｃｌｅａｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（登録商標、ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（登録商標、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ  Ｐｌａｎｔ/Ｓｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ＡｑｕａＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標、Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（登録商標、ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（登録商標、ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法が挙げられる。また、ＲＮＡを抽出する方法としては、例えば、フェノールとカオトロピック塩とを用いた抽出方法（より具体的には、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、アイソジェン（和光純薬社製）等の市販キットを用いた抽出方法）や、その他市販キット（ＲＮＡＰｒｅｐトータルＲＮＡ抽出キット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等）を用いた方法が挙げられる。さらに、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを調製するのに用いられる逆転写酵素としては特に制限されることなく、例えば、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等のレトロウィルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウィルス由来の逆転写酵素が挙げられる。
【００３２】
この態様においては、次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。該ＤＮＡの単離は、例えば、ＣＢＰ遺伝子領域の変異を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができる。
【００３３】
決定したＤＮＡもしくはｃＤＮＡの塩基配列を対照（例えば、同一患者の非がん組織由来のＤＮＡもしくはｃＤＮＡの塩基配列）と比較することにより、がん患者のがん細胞におけるＣＢＰ遺伝子領域の変異の有無を判別することができる。
【００３４】
ＣＢＰ遺伝子領域の変異を検出するための方法は、ＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列を直接決定する方法以外に、変異の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００３５】
例えば、本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記ＤＮＡ試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記ＤＮＡ試料を鋳型として、ＣＢＰ遺伝子領域の前記変異を含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出し、次いで検出した前記蛍光を対照と比較する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法が挙げられる。
【００３６】
さらに別の方法においては、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＤＮＡ二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記ＤＮＡ試料を鋳型として、ＣＢＰ遺伝子領域の前記変異を含む塩基配列を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、ＨＲＭ（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。
【００３７】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
【００３８】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法が挙げられる。
【００３９】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）法が挙げられる。
【００４０】
さらに別の方法としては、生物学的試料から調製したＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡ、および、該ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板、を用いる方法がある。このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法等が挙げられる。
【００４１】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。また、「ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、該ＤＮＡを鋳型とし、該プライマーを用いて、ｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行う。次いで、プライマー伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法が挙げられる。
【００４２】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、５’−「ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の塩基およびその５’側の塩基配列と相補的な塩基配列」−「ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列とハイブリダイズしない塩基配列」−３’（フラップ）からなるオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、「ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の塩基およびその３’側の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」を調製する。次いで、調製したＤＮＡに、上記２種類のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。一本鎖ＤＮＡ切断酵素としては、特に制限はなく、例えばｃｌｅａｖａｓｅが挙げられる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたオリゴヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ法が挙げられる。
【００４３】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。そして、増幅したＤＮＡを一本鎖に解離させ、解離させた一本鎖ＤＮＡのうち、片鎖のみを分離する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。そして、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。
【００４４】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。そして、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法が挙げられる。
【００４５】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からＤＮＡもしくはｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位を含むＤＮＡを増幅する。次いで、「ＣＢＰ遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したＤＮＡを鋳型とし、調製したプライマーを用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、ＳＮｕＰＥ法が挙げられる。
【００４６】
なお、変異がＣＢＰタンパク質におけるアミノ酸の変化（例えば、置換、欠失、挿入）を伴うものであれば、生物学的試料から調製される試料はタンパク質であってもよい。このような場合、変異を検出するには、該変異によりアミノ酸の変化が生じた部位に特異的に結合する分子（例えば、抗体）を用いる方法等を利用することができる。抗体を用いたタンパク質の検出法については、後述する。
【００４７】
−ＣＢＰの発現低下の検出−
本発明における「ＣＢＰの発現低下」とは、通常、対照（例えば、健常者や同一患者の非がん組織における発現レベル）との比較において、それよりも発現レベルが低いことを意味する。
【００４８】
ＣＢＰ発現量を転写レベルで検出する方法においては、まず、上記の方法でがん患者由来の生物学的試料からＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製する。次いで、オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ増幅反応またはハイブリダイゼーション反応に用い、その増幅産物またはハイブリッド産物を検出する。このような方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロット法、ドットブロット法、ＤＮＡアレイ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ｍＲＮＡ−ｓｅｑなどを利用できる。当業者であればＣＢＰ  ｃＤＮＡの塩基配列（例えば、配列番号：２）を基に各方法に適したオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌクレオチドプローブを常法により設計することができる。
【００４９】
ＣＢＰ発現量を翻訳レベルで検出する方法においては、まず、がん患者由来の生物学的試料からタンパク質試料を調製する。次いで、ＣＢＰタンパク質に特異的な抗体を抗原抗体反応に用い、ＣＢＰタンパク質に対する抗体の結合を検出する。ＣＢＰに特異的な抗体が標識されている場合には、直接的にＣＢＰタンパク質を検出することができるが、標識されていない場合には、さらに、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を作用させて、当該分子の標識を利用して、間接的にＣＢＰタンパク質を検出することができる。このような方法としては、例えば、免疫組織化学（免疫染色）法、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等を利用することができる。免疫組織化学によれば、組織におけるがん細胞の形態や分布状態などの付加的な情報も同時に入手しうるという利点もある。
【００５０】
使用する抗体の種類や由来などは特に制限はないが、好ましくはモノクローナル抗体である。十分な特異性でＣＢＰを検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）やポリクローナル抗体を用いることもできる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、およびダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を用いることもできる。抗ＣＢＰ抗体としては、市販品であってもよい。
【００５１】
ＣＢＰタンパク質の検出は、質量分析法（ＭＳ）を使用して行うこともできる。特に液体クロマトグラフィーと連結した質量分析計（ＬＣ/ＭＳ）による解析は鋭敏であるため有利である。質量分析法による測定は、例えば、生物学的試料からタンパク質を調製し、当該タンパク質を標識し、タンパク質を分画し、分画したタンパク質を質量分析に供し、質量分析値からＣＢＰタンパク質を同定することにより行うことができる。標識としては、当技術分野で公知の同位体標識試薬を用いることができ、適当な標識試薬を市販品として入手することができる。また分画も当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば市販の強陽イオンカラム等を用いて行うことができる。
【００５２】
−その他−
遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。従って、ＣＢＰの機能抑制の有無の検出においては、ＣＢＰ遺伝子プロモーターのメチル化を指標として検出することも考えられる。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後の塩基配列の変化を塩基配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前の塩基配列は認識できる（切断できる）がバイサルファイト処理後の塩基配列は認識できない（切断できない）制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。
【００５３】
こうしてＣＢＰの機能抑制、例えば、ＣＢＰの機能を喪失させる不活性化変異が検出された場合、ＣＢＰの発現低下が検出された場合、あるいはＣＢＰの不活性化や発現低下を引き起こすその他の現象（例えば、プロモーターの過剰メチル化）が検出された場合には、当該患者は、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療への応答性があると判定することができ、また、当該患者をｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象として選別することができる。ここで「がんの治療への応答性」は、ｐ３００を阻害する化合物ががんに対して治療的効果を発揮し得るか否かを示す指標である。当該応答性の判定においては、応答性の有無のみならず、応答性がある場合におけるその程度の評価（例えば、高い応答性が期待できる、中程度の応答性が期待できる等の評価）を含めてもよい。従って、ＣＢＰの機能抑制の程度に応じて、例えば、中程度の応答性が期待できるレベルで、治療の対象となる患者を選別してもよい。
【００５４】
一方、ＣＢＰの機能抑制が認められなかった場合には、当該患者をｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療の対象から除外することができる。これにより治療の奏功率を向上させることができる。
【００５５】
なお、本治療の標的であるｐ３００が正常に発現していない場合には、ｐ３００を阻害する化合物によるがんの治療を効果的に実施することができないおそれがある。従って、がんの治療への応答性の予測やがん患者の選別においては、さらに、ｐ３００の正常な発現も指標に加えることができる。ｐ３００の発現の検出の手法は、上記ＣＢＰの発現の検出の場合と同様である。
【００５６】
＜がんの治療方法＞
また、本発明は、がん患者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中に含まれるＣＢＰの機能抑制の有無を検出し、ＣＢＰの機能抑制が検出された患者に対し、ｐ３００を阻害する化合物を投与することを含む、ＣＢＰの機能抑制が生じているがんの治療方法を提供する。
【００５７】
本治療に用いる「ｐ３００を阻害する化合物」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定される化合物であってもよい。
【００５８】
ｐ３００を阻害する化合物は、その特性に応じて、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種形態として、がん患者に対して、経口的な投与あるいは非経口的な投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）を行うことができる。投与量は、ｐ３００を阻害してがんを治療するのに有効な量であれば特に制限はない。化合物の性質の他、がん患者の年齢、体重、症状、健康状態、がんの進行状況などに応じて、適宜選択すればよい。投与頻度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日あたりの投与量を、１日に１回で投与してもよいし、複数回に分けて投与してもよい。ｐ３００を阻害する化合物をヒトに投与する場合、投与量の範囲は、１日当たり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。ヒトに投与する場合、好ましくは、１日あたり１回、あるいは２から４回に分けて投与され、適当な間隔で繰り返すのが好ましい。また、１日量は、医師の判断により必要によっては上記の量を超えてもよい。
【００５９】
これによりがん患者におけるＣＢＰの機能抑制が生じているがん細胞において、さらにｐ３００を阻害することができ、合成致死の効果により、がんを治療することができる。
【００６０】
治療対象となるがんとしては、例えば、肺がん、膀胱がん、リンパ腫、腺様嚢胞がん等が挙げられるが、これらのがんに限定されない。
【００６１】
＜ＣＢＰの機能抑制の有無を検出するための試薬＞
また、本発明は、上記の方法において、ＣＢＰの機能抑制の有無を検出するための試薬であって、下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の分子を有効成分とする試薬を提供する。
（ａ）ＣＢＰ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマー
（ｂ）ＣＢＰ遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ
（ｃ）ＣＢＰタンパク質に特異的に結合する抗体
上記ポリヌクレオチドプライマーは、ＣＢＰゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、配列番号：１や２）に基づき、上記した手法や増幅する領域に即したプライマーとなるように、また、ＣＢＰ遺伝子以外の遺伝子の増幅産物が極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプライマー設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、通常１５〜５０塩基長、好ましくは１５〜３０塩基長であるが、手法および目的によってはこれより長くてもよい。
【００６２】
上記ポリヌクレオチドプローブは、ＣＢＰゲノムＤＮＡやｃＤＮＡの塩基配列情報（例えば、配列番号；１や２）に基づき、上記した手法やハイブリダイズさせる領域に即したプライマーとなるように、また、ＣＢＰ遺伝子以外の遺伝子へのハイブリダイズが極力生じないように設計すればよい。このようなオリゴヌクレオチドプローブ設計は、当業者であれば、常法により行うことができる。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、通常、１５〜２００塩基長、好ましくは１５〜１００塩基長、さらに好ましくは１５〜５０塩基長であるが、手法および目的によってはこれより長くてもよい。
【００６３】
オリゴヌクレオチドプローブは、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００６４】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。オリゴヌクレオチドプローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。また、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ））のみから構成されていなくともよく、非天然型のヌクレオチドにてその一部または全部が構成されていてもよい。非天然型のヌクレオチドとしては、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、およびこれらの複合体が挙げられる。
【００６５】
上記ＣＢＰタンパク質に特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（ＣＢＰタンパク質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００６６】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９７５；２５６：４９５）が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（ＣＢＰタンパク質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、ＣＢＰタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。ＣＢＰタンパク質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００６７】
組換えＤＮＡ法は、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９０；１９２：７６７−７７５）。抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００６８】
こうして得られた抗体もしくはその遺伝子を基に、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、およびダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を調製することができる。
【００６９】
直接的にＣＢＰタンパク質に結合した抗体量を検出する場合、得られた抗ＣＢＰ抗体は、直接、酵素、放射性同位体、蛍光色素またはアビジン−ビオチン系等により標識して用いられる。一方、ＣＢＰタンパク質に結合した抗体量を、二次抗体などを利用して検出する間接的検出方法を実施する場合、得られた抗ＣＢＰ抗体（一次抗体）は標識する必要はなく、検出に際しては、当該抗体を認識する標識された分子（例えば、二次抗体やプロテインＡ）を用いればよい。
【００７０】
本発明の試薬においては、有効成分としての上記分子の他、必要に応じて、滅菌水や生理食塩水、緩衝剤、保存剤など、試薬として許容される他の成分を含むことができる。
【００７１】
＜がんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法＞
また、本発明は、ＣＢＰの機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、ｐ３００を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法を提供する。
【００７２】
本発明のスクリーニング系に適用する被験化合物としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、ｓｉＲＮＡ、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液および培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。被験化合物は、公知のｐ３００阻害剤の誘導体（例えば、Ｃ６４６の誘導体）であってもよい。
【００７３】
本発明における「ｐ３００の阻害」は、ｐ３００の活性の阻害および発現の阻害の双方を含む意である。ＣＢＰとｐ３００の合成致死においては、ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性の消失が寄与していると考えられることから、スクリーニングの指標とするｐ３００の阻害は、好ましくはｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性の阻害である。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性の検出においては、例えば、ラジオアイソトープで検出する方法（Ｌａｕ  ＯＤ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ.  Ｃｈｅｍ.  ２０００；２７５：２１９５３−２１９５９）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ反応時に副産物として生成するＣｏＡ−ＳＨを蛍光で検出する方法（Ｇａｏ  Ｔ,  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ.  ２０１３;９８１:２２９−３８）、およびＮＡＤＨにより検出する方法（Ｂｅｒｎｄｓｅｎ  ＣＥ,  Ｄｅｎｕ  ＪＭ.  Ｍｅｔｈｏｄｓ.  ２００５;３６:３２１−３３１）等を利用することができる。
【００７４】
スクリーニングにおいては、この検出系に、被験化合物を作用させて、その後のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を検出すればよい。検出の結果、対照（例えば、被験化合物を添加しない場合）におけるｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性と比較して、当該活性が減少していれば、ｐ３００の活性が阻害されたと評価することができる。
【００７５】
ＣＢＰとｐ３００はパラログの関係にあるが、スクリーニングにより得られる化合物は、副作用の低減等の観点から、ｐ３００により特異的であることが好ましい。ｐ３００特異的であるか否かは、例えば、それぞれの分子に対する結合実験や活性阻害実験を行うことにより評価することができる。従って、本発明のスクリーニングにおいては、ｐ３００により特異的であるか否かを指標として化合物を選別する工程を含んでもよい。
【００７６】
ｐ３００の発現の阻害を検出する場合には、例えば、ｐ３００を発現する細胞に、被験化合物を作用させて、その後のｐ３００の発現を、上記した方法により転写レベルまたは翻訳レベルで検出すればよい。また、ｐ３００のプロモーターの下流にレポーター遺伝子が連結された発現構築物を利用したレポーターアッセイ系を用いてもよい。検出の結果、対照（例えば、被験化合物を添加しない場合）におけるｐ３００の発現（レポーター系においては、それを代替するレポーターの発現）と比較して、発現が減少していれば、ｐ３００の発現が阻害されたと評価することができる。
【００７７】
本発明のスクリーニングにより同定された化合物は、薬理学上許容される担体と混合し、公知の製剤学的方法で製剤化することにより、医薬品とすることができる。薬理学上許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられるが、これらに制限されない。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。【００７９】
[実施例１]  ＣＢＰ変異を持つがんの合成致死に基づく治療戦略の開発
１．材料および方法
（１）細胞株
Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈ１５７、ＳＱ５、Ｈ１７０３、ＬＫ２、およびＨ５２０（ＮＳＣＬＣ）、ＲＬ、Ｌｏｕｃｙ、ＲＣ−Ｋ８、Ｕ２９３２、Ｒａｍｏｓ、Ｆａｒａｇｅ、ＳＵＰ−Ｔ１、ＷＳＵ−ＮＨＬ、ＶＡＬ、ＳＵＤＨＬ５、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＥ８、ＴＥ１０を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭ中で培養した。ＭＲＣ−５細胞（正常線維芽細胞）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（不死化腎上皮細胞）、ＲＰＥ−１細胞（不死化網膜上皮細胞）を１０％  ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。【００８０】
（２）短鎖干渉（ｓｉ）ＲＮＡ
各種タンパク質のノックダウンには、ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を用いた。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｌ−００１８１０−１０）を陰性対照として用いた。【００８１】
（３）イムノブロット分析
以下のタンパク質に対して特異的な抗体を用いて、文献（Ｏｇｉｗａｒａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１１；５;３０:２１３５−４６）に記載されたように、イムノブロッティングを実施した。ＣＢＰ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社；ｓｃ−３６９Ｘ）、ｐ３００（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社;ｓｃ−４８３４３Ｘ）、Ｈ３（Ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｔｉｆ社；３９１６３）、Ｈ３Ｋ１８ａｃ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；０７−３５４）、β−ａｃｔｉｎ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；４９７０）、ｃｌｅａｖｅｄ  ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；５６２５）、ｐ２１/ＣＤＫＮ１Ａ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；２９４７）、ＬＣ３Ｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；３８６８）。【００８２】
（４）細胞生存アッセイ
がん細胞の生存に及ぼすｓｉＲＮＡノックダウンの影響を、クロノゲニック生存アッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｓｓａｙｓ）を用いて評価した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてがん細胞株にｓｉＲＮＡｓ（５０ｎＭ）をトランスフェクションした。２日後に細胞をトリプシン処理し、カウントし、６ウェルの培養皿に特定の数で再度播種し、さらに１２日間（各種ＨＡＴのノックダウンにおいては１４日間）培養してコロニーを形成させた。次いで、細胞を５０％（ｖ／ｖ）メタノール／０．０１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットを含む溶液中で５分間固定しコロニー数をカウントした。
生存率の評価は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、細胞内ＡＴＰレベルを測定することによって決定した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてがん細胞株にｓｉＲＮＡｓ（５０ｎＭ）をトランスフェクションした。２日後に細胞をトリプシン処理し、カウントし、９６ウェルプレートに特定の数で再度播種した。細胞の生存率を測定するために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を細胞に添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で蛍光を測定した。【００８３】
（５）細胞周期分析
細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、ＰＢＳで洗浄して、氷冷した７０％エタノールで固定化した。次いで、細胞を再度遠心分離し、２００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡおよび５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳでインキュベートして、Ｇｕａｖａ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で細胞周期分布を分析した。【００８４】
（６）アネキシンＶ／ＰＩ染色によるアポトーシス分析
フローサイトメトリーによりアポトーシス細胞を検出するために、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）をメーカーの使用説明書に従って用いた。すなわち、細胞ペレットを１×ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中に懸濁し、暗中で２０分間Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよびＰＩとインキュベートした。次いで、細胞の蛍光をフローサイトメトリーで分析した。【００８５】
（７）ｓｈＲＮＡレンチウイルスの生成
ｔｅｔ誘導性細胞株を作製するために、細胞株にｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスベクター由来のｐＴＲＩＰＺ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）をトランスダクションした。ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドをＴｒａｎｓ−ＬｅｎｔｉｖｉｒａｌＴＭ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてパッケージングプラスミドとともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。翌日に増殖培地を交換し、レンチウイルスを含む上清を回収し、遠心分離により濃縮した。【００８６】
（８）Ｉｎ  ｖｉｖｏ分析
ｔｅｔ誘導性の細胞株であるＬＫ２−ｓｈｐ３００細胞およびＬＫ２−ｓｈＮＴ細胞（５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で２×１０６細胞/マウス；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をカウントし、氷上で１：１の培地／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で再懸濁し、国立がん研究センターの実験動物に関する倫理委員会によって承認されたプロトコールで、７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ社）の脇腹の皮下に注入した。３週間後、腫瘍が２００ｍｍ３以上の大きさに到達したとき、マウスを無作為に２群に分け、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（２００  ｐｐｍ）を含有する餌または対照餌のいずれかを与えた。腫瘍の成長を、ノギスを使用して１週間に２回測定した。移植した腫瘍の体積は、ノギスを使用して３〜４日毎に、次の式で計算した。式:Ｖ=Ｌ×Ｗ２／２（Ｖは体積(ｍｍ３)、Ｌは最大直径(ｍｍ)、Ｗは最小直径(ｍｍ)）。実験の最後に、標準的なプロトコールに従って、マウスを屠殺した。【００８７】
（９）統計的分析
全ての実験を三重実験で行った。データは、平均±ＳＤで示した。薬剤処理した細胞と非処理の細胞との差は、スチューデントのｔ検定で評価し、統計的有意差をアスタリスクで示した（「*」はＰ＜０．０５を、「**」はＰ＜０．０１を、「***」はＰ＜０．００１を、「****」はＰ＜０．０００１をそれぞれ示す）。【００８８】
２，結果
（１）ＣＢＰ変異型がん細胞のｐ３００依存性増殖
我々は、細胞増殖アッセイおよびクロノゲニック生存アッセイを用いて、ｓｉＲＮＡを介したｐ３００消失が、ＣＢＰ野生型がん細胞株およびＣＢＰ変異型がん細胞株の増殖に与える影響を比較した（図１Ａ〜Ｃ）。その結果、検証した全てのＣＢＰ変異型細胞において細胞増殖とコロニー形成の抑制が観察されたが、これはＣＢＰ野生型細胞株では観察されなかった。【００８９】
ｐ３００ノックダウンは、ＣＢＰおよびｐ３００を発現する、非がん性の線維芽細胞株ＭＲＣ５、不死化腎上皮細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ、および不死化網膜上皮細胞ＲＰＥ−１の増殖には影響を与えなかった（図２）。【００９０】
これらの結果は、ＣＢＰ変異型がん細胞が、その増殖をｐ３００に依存していることを示唆した。【００９１】
（２）ＣＢＰ変異型の肺がんおよびリンパ腫のｐ３００阻害剤Ｃ６４６に対する感受性
我々は、次に、ＣＢＰ変異型の肺がん細胞およびリンパ腫細胞に対するｐ３００阻害剤Ｃ６４６の影響を検証した。その結果、ＣＢＰ変異型がん細胞がＣＢＰ野生型がん細胞よりもＣ６４６に対して高い感受性を有することを観察した（図３Ａ,Ｃ）。Ｃ６４６のＣＢＰ変異型がん細胞に対するＩＣ５０値は、ＣＢＰ野生型がん細胞に対するＩＣ５０値と比較して低い傾向にあった（スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０１）（図３Ｂ,Ｄ）。これらの結果は、ｐ３００のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性の阻害が、ＣＢＰ変異型がん細胞の致死効果を特異的に引き起こすことを示唆した。【００９２】
（３）ＣＢＰ変異型がん細胞におけるｐ３００消失によるアポトーシスの誘導
我々は、次に、ｐ３００の消失や阻害によるＣＢＰ変異型がん細胞の増殖阻害のメカニズムについて検証した。ＣＢＰ変異型Ｈ１７０３細胞におけるｓｉＲＮＡを介したｐ３００消失は、分解されたＰＡＲＰ（アポトーシスのバイオマーカー）の量を増加させたが、ｐ２１／ＣＤＫＮ１Ａ（細胞老化のバイオマーカー）やＬＣ３Ｂ（オートファジーのバイオマーカー）の量は増加させなかった（図４）。これと一致して、アネキシンＶで染色した細胞のフローサイトメトリー分析により、ｓｉＲＮＡによるｐ３００の消失が、ＣＢＰ変異型のＨ１７０３細胞およびＬＫ２細胞において、アネキシンＶ陽性アポトーシス細胞の割合を増加させるが、ＣＢＰ野生型のＨ１５７細胞やＳＱ５細胞では増加させないことが確認された（図５Ａ）。【００９３】
上記のｐ３００阻害剤Ｃ６４６を利用した結果（図５Ｂ）も含めて考慮すれば、これらの結果は、ｐ３００の消失や阻害が、アポトーシスを誘導することによって、ＣＢＰ変異型がん細胞の増殖を特異的に抑制することを示唆する。【００９４】
（４）ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＢＰ変異型がん細胞のｐ３００依存性増殖
ｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床バリデーションモデルとして、ＣＢＰ変異型ＬＫ２細胞を用いて、テトラサイクリン誘導ｓｈＲＮＡ発現システムにより、非標的化ｓｈＲＮＡあるいはｓｈｐ３００を発現する細胞を作製し、ヌードマウスの皮下に移植した。移植腫瘍が２００ｍｍ３以上の大きさになった後、ＲＮＡｉを誘導するために、マウスにｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅを投与し、経時的に腫瘍の増殖を測定した。図６に示すように、ＬＫ２  ｓｈｐ３００異種移殖片の増殖は、Ｄｏｘ処理したマウスで有意に抑制されたが、ＬＫ２  ｓｈＮＴ異種移殖片では有意に抑制されなかった。このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＢＰとｐ３００との合成致死の関係を裏付けるものである。【００９５】
（５）各種ＨＡＴノックダウンによる細胞生存率への影響
Ａ５４９細胞（ＣＢＰは野生型）およびＨ５２０細胞（ＣＢＰは変異型）における各種ＨＡＴのノックダウンによる細胞生存率へ影響を観察した。Ａ５４９細胞においては各種ＨＡＴのノックダウンにより細胞生存率への影響は見られなかったが、Ｈ５２０細胞においてはｐ３００のノックダウンにより有意な細胞生存率低下が確認された（図８）。【００９６】
（６）ｐ３００のノックダウンによるｃ−Ｍｙｃ発現への影響
各種細胞におけるｐ３００ノックダウン時のｃ−Ｍｙｃタンパク質発現の変化を観察した。【００９７】
ＣＢＰが野生型であるＨ１２９９細胞、ＳＱ５細胞、Ｈ１５７細胞においてはｐ３００ノックダウンによるｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現に変化はみられなかったが、ＣＢＰが変異型であるＬＫ２細胞、Ｈ１７０３細胞、Ｈ５２０細胞、ＴＥ８細胞、ＴＥ１０細胞およびＣＢＰをノックアウトしたＨ１２９９細胞においては、ｐ３００ノックダウンにより有意なｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現減少が確認された（図９）。【００９８】
ＣＢＰおよびｐ３００の両方の機能抑制が生じた細胞においてｃ−Ｍｙｃの発現低下がみられたことから、ＣＢＰの機能抑制がみられる細胞に対するｐ３００阻害剤の効果を確認するマーカーとしてｃ−Ｍｙｃを用いることが可能であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明により、ＣＢＰの機能が抑制されたがん細胞を特異的に標的化するための治療戦略が提供された。本発明において、ＣＢＰとｐ３００が合成致死の関係にあり、ｐ３００を阻害する治療が、ＣＢＰの機能が抑制されたがんの治療のための有望なアプローチになることが判明した。また、この治療戦略においては、がん患者をＣＢＰの機能抑制を指標に選別した上で、ｐ３００阻害剤を投与できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかとなった。従って、本発明は、医療分野、特にがん治療の分野において、大きく貢献しうるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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