(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＳＥＡ４に特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗原結合ドメインが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、ＣＡＲ。
【請求項２】
膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、膜貫通ドメインが、ＣＤ８および／またはＣＤ２８の膜貫通ドメインの配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ３ζのうちの１種または複数の細胞内シグナル伝達ドメインの配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
前記ＣＡＲが配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
がんを患っている対象におけるがんの治療のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＡＲであって、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団がＳＳＥＡ４を発現するＣＡＲ。
【請求項５】
前記がんが、ヒト乳がん、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）およびヒト卵巣がんからなる群から選択される、請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の集団。
【請求項７】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、請求項６に記載の遺伝子操作された細胞の集団。
【請求項８】
免疫療法において使用するための、請求項６または７に記載の遺伝子操作された細胞の集団。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現する遺伝子改変された細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
がんを患っている対象におけるがんの治療の使用のための、請求項９に記載の医薬組成物であって、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団がＳＳＥＡ４を発現する医薬組成物。
【請求項１１】
前記がんの治療の併用使用のための、請求項１０に記載の医薬組成物および化学療法薬。
【請求項１２】
前記がんが、ヒト乳がん、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）およびヒト卵巣がんからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの治療の分野、特に、標的として抗原ＳＳＥＡ４を使用することによるがんの治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、未制御の細胞増殖が関与する疾患の大きな群である。がんでは、細胞は、制御不能に分裂し、増殖して、悪性腫瘍を形成し、身体の近くの部分に浸潤する。がんはまた、リンパ系または血流によって身体のより遠位部分に広がり得る。ヒトに影響を及ぼす２００種を超える種々の公知のがんがある。多数のがんの種類に対して、良好な治療の選択肢が利用可能であるが、その他のものは依然として、アンメットメディカルニーズとなっている。特に、卵巣がん、腎細胞癌およびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、限定的な治療の選択肢しかない悪性腫瘍である。ＴＮＢＣは、転移および早期再発の高いリスクを伴う、乳がんの侵襲性サブタイプである。現在、ＴＮＢＣ患者の全身療法の主な選択肢は、化学療法であるが、全体的に不充分な有効性しか有さず、重度の副作用を伴う。最初、ＴＮＢＣ患者の大部分は、ネオアジュバント化学療法治療に応答するが、約２０％のみしか、良好な予後を有する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）に達しない。特に、ほとんどの患者は、腫瘍が、化学療法に対して低いｄｅ  ｎｏｖｏ感受性しか有さないか、化学療法に対して耐性を発生させるために、ｐＣＲに達しない。このような場合には、腫瘍は、化学療法のために消失するが、残存するがん細胞は存続し、患者の約４０％において化学療法後３年以内に腫瘍再発および転移を開始する。
【０００３】
シアリル−糖脂質ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ４）は、モノシアロシルグロボペンタオシルセラミド（ＭＳＧｂ５）としても知られるシアリル−糖脂質エピトープであり、ヒト奇形癌腫細胞で最初に同定された（Ｋａｎｎａｇｉ  Ｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９８３；２（１２）：２３５５〜６１；Ｓａｉｔｏ  Ｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００３年７月１８日；２７８（２９）：２６４７４〜９）。ＳＳＥＡ４は、未分化ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞および胚性生殖（ＥＧ）細胞ならびに歯髄幹細胞、臍帯血由来極小胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）および間葉系間質細胞などの種々の体性幹細胞で見られる（Ｇａｎｇ  ＥＪら、Ｂｌｏｏｄ．２００７年２月１５日；１０９（４）：１７４３〜５１；Ｔｒｕｏｎｇ  ＴＴら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１１年８月１１日；５２（９）：６３１５〜２０）。
【０００４】
ＥＰ１４３０５４７７．３には、ＳＳＥＡ４は、化学療法耐性がん細胞の部分集団を特徴付けるバイオマーカーであるということが開示されている。
【０００５】
ＳＳＥＡ４の機能は、依然として未知である。
【０００６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、がんのための養子細胞免疫療法の有望なアプローチを提供する。通常、ＣＡＲは、ヒンジおよび膜貫通領域によってＴ細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインと結合している、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）を含む。ほとんどの一般的なリンパ球活性化部分は、Ｔ細胞トリガリング（例えば、ＣＤ３ζ）部分とともに、Ｔ細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２７）ドメインを含む。ＣＡＲ媒介性養子免疫療法は、ＣＡＲ移植細胞が、ＨＬＡによる限定を受けずに標的腫瘍細胞上のＴＡＡを直接認識することを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
乳がん患者の２５％未満しか、化学療法治療から恩恵を受けないが（ＣＬＩＦＦＯＲＤ  Ａ．  ＨＵＤＩＳおよびＬＵＣＡ  ＧＩＡＮＮＩ、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ２０１１；１６（付録１）：１〜１１）、この全身アプローチは、標準ケアとして依然として使用されている。重度の副作用があるので、ヒト乳がんなどのがんの治療のための選択肢として使用され得るマーカーを同定することは非常に有益であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＳＳＥＡ４は、がん性細胞の細胞表面抗原であり、したがって、それだけには限らないが、卵巣がん、腎細胞癌およびＴＮＢＣを含めた、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の標的化された生物学的または免疫学的療法のために使用され得る。本発明者らは今や、驚くべきことに、抗原ＳＳＥＡ４に対して特異的なキメラ抗原受容体を発現する遺伝子操作された細胞、優先的には、遺伝子操作されたＴ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＳＳＥＡ４を発現する細胞を死滅させることができることを見い出した。したがって、本発明は、キメラ抗原受容体を発現するように形質導入された細胞の養子細胞移入の戦略に関し、ここで、前記ＣＡＲは、ＳＳＥＡ４に標的化され（「ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ」）、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の認識およびそれとの結合をもたらす。次いで、遺伝子改変された細胞、すなわち、ＣＡＲを発現する細胞は、その特定の機能、例えば、標的細胞を死滅させること、サイトカインを分泌することおよび／または増殖することを果たす。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＳＳＥＡ４を認識するＣＡＲの構造を示す図である。
【図２】（Ａ）全長ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ  ＶＨ−リンカー−ＶＬ（配列番号５に対応する）および（Ｂ）全長ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ（配列番号６に対応する）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】末梢血Ｔ細胞の表面でのキメラ抗原受容体構築物「重＿軽ｓｃＦｖ配向」（配列番号５）および「軽＿重ｓｃＦｖ配向」（配列番号６）の発現を示す図である。
【図４】炎症誘発性サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＴＮＦαの分泌をもたらす、ＳＳＥＡ−４陽性腫瘍細胞を用いる刺激後のＳＳＥＡ−４−ＣＡＲ依存性Ｔ細胞活性化を示す図である。
【図５】形質導入されたＴ細胞によるＳＳＥＡ−４陽性腫瘍細胞のＳＳＥＡ−４−ＣＡＲ−依存性死滅を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、抗原ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞によって直接的に標的化される、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞が影響を受けて、増殖できず、および／または死滅するように促されるようになることを見出した。
【００１１】
本発明は、第１の態様において、ＳＳＥＡ４に特異的な抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（「ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ」）を提供する。
【００１２】
前記ＳＳＥＡ４−ＣＡＲの抗原結合ドメインは、例えば、全長重鎖、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価一本鎖抗体またはダイアボディーを含み得、それらの各々は、標的抗原ＳＳＥＡ４に対して特異的である。
【００１３】
前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。前記ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含み得る。前記ＣＡＲは、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。
【００１４】
前記ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、ここで、膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８αおよび／またはＣＤ２８に由来する膜貫通ドメインの配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０およびＣＤ３ζのうちの１種または複数の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する配列を含む。あるいは、ＣＡＲは、リンカーおよび／もしくはヒンジ（図１を参照のこと）などのさらなる部分から構成され得、ならびに／または以下に記載されるような二本鎖または複数鎖ＣＡＲとして構成され得る。
【００１５】
ＳＳＥＡ４−ＣＡＲは、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含み得る。
【００１６】
本発明の一態様では、本発明のＣＡＲは、がんを患う対象におけるがんの治療のためのものであり、ここで、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団は、ＳＳＥＡ４を発現する。
【００１７】
前記がんは、ヒト乳がん、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）およびヒト卵巣がんからなる群から選択され得る。前記がんは、ＴＮＢＣであり得る。
【００１８】
ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の前記部分集団は、前記がんを患っている対象におけるすべてのがん性細胞のうち、ＳＳＥＡ４を発現する少なくとも１種の細胞を含み得る。優先的には、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の前記部分集団は、前記がんを患っている対象のすべてのがん性細胞のうち少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％を含み得る。
【００１９】
がんの治療は、標的分子としてＳＳＥＡ４を関与させる任意の方法を包含し得る。このような方法は、例えば、分子ＳＳＥＡ４と結合し、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の生存力に影響を及ぼし、優先的に、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞を死滅させる薬剤を用いる治療であり得る。例として、腫瘍溶解性ウイルス、ＢｉＴＥｓ（登録商標）、ＡＤＣＣおよび免疫毒素がある。
【００２０】
腫瘍溶解性ウイルスは、優先的にがん細胞に感染し、死滅させるウイルスである。感染がん細胞は、溶解によって破壊されるので、それらは、新規感染性ウイルス粒子を放出して、残存する腫瘍を破壊するのに役立つ。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接破壊を引き起こすだけではなく、宿主抗腫瘍免疫応答も刺激すると考えられている。特異的標的化（例えば、ＳＳＥＡ４への標的化）は、非腫瘍細胞への侵入を低減しながら、腫瘍細胞を標的化するように（例えば、ＳＳＥＡ４に特異的な抗原結合ドメインを用いて）ウイルスコートタンパク質を改変することを含む。
【００２１】
Ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ（登録商標））は、抗がん薬として使用するために研究されている、人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスである。それらは、宿主の免疫系、より詳しくは、がん細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性活性を対象とする。
【００２２】
ＢｉＴＥは、約５５キロダルトンの単一ペプチド鎖上の、異なる抗体の２種の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または４種の異なる遺伝子に由来するアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖの一方は、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞と結合し、もう一方は、腫瘍特異的分子（例えば、ＳＳＥＡ４）を介して腫瘍細胞と結合する。ＢｉＴＥ（登録商標）は、その他の二重特異性抗体と同様に、通常のモノクローナル抗体とは異なり、Ｔ細胞と腫瘍細胞の間につながりを形成する。これが、ＭＨＣ  Ｉまたは共刺激分子の存在とは独立に、パーフォリンおよびグランザイムのようなタンパク質を生成することによって、Ｔ細胞に、腫瘍細胞に対する細胞傷害性活性を発揮させる。これらのタンパク質は、腫瘍細胞に侵入し、細胞のアポトーシスを開始する。この作用は、腫瘍細胞に対するＴ細胞攻撃の際に観察される生理的プロセスを模倣する。抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、標的細胞の表面と結合している抗体の存在を必要とする免疫系による攻撃の機序である。抗体は、標的抗原、例えば、ＳＳＥＡ４と結合する結合領域（Ｆａｂ）およびその表面上のＦｃ受容体を介して免疫細胞によって検出され得るＦｃ領域から形成される。これらのＦｃ受容体は、ナチュラルキラー細胞を含めた免疫系の多数の細胞の表面で見られる。ナチュラルキラー細胞が、抗体でコーティングされた細胞と遭遇すると、Ｆｃ領域は、そのＦｃ受容体と相互作用し、パーフォリンおよびグランザイムＢの放出につながる。これらの２種の化学物質は、プログラム細胞死（アポトーシス）を開始する腫瘍細胞につながる。この細胞死滅方法を誘導すると知られている抗体として、リツキシマブ、オファツムマブ、トラスツズマブ、セツキシマブおよびアレムツズマブが挙げられる。現在開発されている第３世代抗体は、特定の種類のＦｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩＡに対して高い親和性を有する変更されたＦｃ領域を有し、これは、ＡＤＣＣの速度を劇的に増大し得る。
【００２３】
免疫毒素は、毒素と連結している標的化する部分（例えば、ＳＳＥＡ４に標的化される）からなるヒトによって作製されるタンパク質である。そのタンパク質が、その細胞と結合すると、エンドサイトーシスによって取り込まれ、毒素が細胞を死滅させる。これらのキメラタンパク質は、普通、毒素の断片と結合している、改変された抗体または抗体断片でできている。「標的化する部分」は、細胞によって、好ましくは、特定の細胞型（例えば、ＳＳＥＡ４を発現する細胞）によって発現される抗原と特異的に結合する抗体のＦｖ部分から構成される。毒素は、普通、細菌または植物タンパク質に由来する細胞傷害性タンパク質であり、Ｆｖが、毒素を標的細胞上の抗原に向けるように、それから天然結合ドメインが除去されている。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞は、本明細書において開示されたようなＳＳＥＡ４に対して特異的なキメラ抗原受容体を発現する、遺伝子操作された細胞、優先的にはＴ細胞によって標的化される。この遺伝子操作された（Ｔ）細胞は、養子（Ｔ）細胞療法において使用され得る。
【００２５】
一態様では、本発明は、本明細書に開示されるような抗原ＳＳＥＡ４に特異的なキメラ抗原受容体（ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変された細胞を含む細胞の集団を提供する。優先的には、抗原ＳＳＥＡ４に特異的なキメラ抗原受容体（ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変された細胞を含む細胞の前記集団は、細胞の単離された集団である。
【００２６】
一態様では、本発明は、免疫療法において使用するための本明細書に開示されるような、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の集団または単離された集団を提供する。免疫療法は、がんを患っている対象におけるがんの治療のためのものであり得、ここで、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団は、ＳＳＥＡ４を発現する。
【００２７】
ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の前記部分集団は、前記がんを患っている対象におけるすべてのがん性細胞のうち、ＳＳＥＡ４を発現する少なくとも１細胞を含み得る。優先的には、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の前記部分集団は、前記がんを患っている対象のすべてのがん性細胞のうち少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％を含み得る。
【００２８】
必要な場合には、遺伝子操作された細胞の前記集団または単離された集団を、治療上有効な量の細胞に増殖させ、その後、前記免疫療法において使用する。前記がんは、ヒト乳がん、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）およびヒト卵巣がんからなる群から選択され得る。前記がんは、ＴＮＢＣであり得る。前記細胞は、免疫細胞もしくは免疫細胞サブセット、優先的にはＴ細胞もしくはＴ細胞サブセットまたはＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞サブセットであり得る。
【００２９】
一態様では、本発明は、一定量の、前記がんを治療するのに有効な、本明細書において開示されるようなＳＳＥＡ−ＣＡＲを発現する濃縮された遺伝子操作された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含むがんを治療する方法を提供する。がんの治療は、がんを患っている対象においてであり得、ここで、前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団は、ＳＳＥＡ４を発現する。
【００３０】
前記がんは、ヒト乳がん、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）およびヒト卵巣がんからなる群から選択され得る。前記がんは、ＴＮＢＣであり得る。前記細胞は、免疫細胞もしくは免疫細胞サブセット、優先的にはＴ細胞もしくはＴ細胞サブセットまたはＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞サブセットであり得る。
【００３１】
一態様では、本発明は、本明細書において開示されるような抗原ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲを発現する遺伝子改変された細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
前記医薬組成物は、がんを患っている対象においてがんの治療において使用され得る。前記がんは、ヒト乳がん、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）およびヒト卵巣がんからなる群から選択され得る。前記がんは、ＴＮＢＣであり得る。
【００３３】
前記細胞は、免疫細胞もしくは免疫細胞サブセット、優先的にはＴ細胞もしくはＴ細胞サブセットまたはＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞サブセットであり得る。
【００３４】
一態様では、本発明は、本明細書において開示されるようなＳＳＥＡ−ＣＡＲを発現する遺伝子改変された細胞および薬学的に許容される担体および前記がんの併用治療のための化学療法剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３５】
一態様では、本発明は、本明細書において開示されるような本発明のＳＳＥＡ４−ＣＡＲをコードする、核酸分子およびベクターなどの核酸構築物を提供する。
【００３６】
養子細胞移入は、がん細胞を攻撃するために、免疫細胞ベースの、優先的にはＴ細胞ベースの細胞傷害性応答を使用する。患者のがんに対して、天然の、または遺伝子操作された反応性を有する免疫細胞、優先的にはＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、次いで、がん患者に戻される。キメラ抗原受容体は、がんに対するこの養子細胞免疫療法のための有望なアプローチを提供する。本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ζ鎖、例えば、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと融合している抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように遺伝子操作され得る。細胞外および細胞内ドメインは、膜貫通ドメインを介して直接連結され得るか、または細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと融合され得、細胞内ドメインは、別の膜貫通ドメインと融合され得る。したがって、細胞外および細胞内ドメインが、別個の膜貫通ドメインと連結される場合には、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ（分かれたＣＡＲまたは複数鎖ＣＡＲ）の活性化のために相互作用する。本発明の遺伝子操作された免疫細胞、優先的にはＴ細胞は、ＣＡＲの抗原結合特異性に基づいて抗原認識を再指示できる本発明のＣＡＲを発現する。ＣＡＲの特異性は、ヒト乳がん、ＲＣＣおよびヒト卵巣がんなどのがん性細胞上に発現されるとわかっている抗原ＳＳＥＡ４に対するものである。
【００３７】
一般に、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞外ドメインを含み得る。細胞外ドメインは、リンカーによって膜貫通ドメインに連結され得る。細胞外ドメインはまた、シグナルペプチドを含み得る。
【００３８】
「シグナルペプチド」とは、細胞内のタンパク質の、例えば、特定の細胞オルガネラ（小胞体など）および／または細胞表面への輸送および局在性を指示するペプチド配列を指す。
【００３９】
「抗原結合ドメイン」とは、抗原と特異的に結合する（およびそれによって、抗原を含有する細胞を標的とすることができる）ＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、１種または複数の抗原結合ドメインを含み得る。一般に、ＣＡＲ上の標的化する領域は、細胞外である。抗原結合ドメインは、抗体またはその断片を含み得る。抗原結合ドメインは、例えば、全長重鎖、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、二価一本鎖抗体またはダイアボディーを含み得る。天然に存在する受容体に由来するアフィボディーまたはリガンド結合ドメインなどの所与の抗原と特異的に結合する任意の分子が、抗原結合ドメインとして使用され得る。抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであることが多い。普通、ｓｃＦｖでは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分は、可動性リンカーによって融合されて、ｓｃＦｖを形成する。このようなリンカーは、例えば、「（Ｇ４／Ｓｉ）３−リンカー」であり得る。
【００４０】
いくつかの例では、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが使用される同一種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて治療上それを使用することが計画されている場合には、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片を含むことが有益であり得る。ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片は、当技術分野で周知の種々の方法によって作製され得る。「スペーサー」または「ヒンジ」とは、本明細書において、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にある親水性の領域を指す。本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含み得るが、このようなスペーサーを含まないことも可能である。スペーサーは、抗体のＦｃ断片もしくはその断片、抗体のヒンジ領域もしくはその断片、抗体のＣＨ２もしくはＣＨ３領域、アクセサリータンパク質、人工スペーサー配列またはそれらの組合せを含み得る。スペーサーの顕著な例として、ＣＤ８αヒンジがある。
【００４１】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、このようなドメインの任意の所望の天然のまたは合成による供給源に由来し得る。供給源が、天然である場合には、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し得る。
【００４２】
本発明のＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１種の活性化に関与する。「エフェクター機能」とは、細胞の専門化された機能を意味し、例えば、Ｔ細胞では、エフェクター機能は、細胞溶解性活性またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、本発明のＣＡＲを発現する細胞が専門化された機能を発揮することを指示するタンパク質の一部を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、所与のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全または末端切断型部分を含み得る。
【００４３】
ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの顕著な例として、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するのに呼応して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列が挙げられる。
【００４４】
一般に、Ｔ細胞活性化は、２種の別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列、第１に、ＴＣＲを介して抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および第２に、抗原独立性に二次または共刺激シグナルを提供するように作用するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介され得る。
【００４５】
刺激性に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフシグナル伝達モチーフ）を含有し得る。
【００４６】
ＣＡＲにおいて使用されることが多い一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものがある。最も顕著なものとして、ＣＤ３ζに由来する配列がある。
【００４７】
ＣＡＲの細胞質ドメインは、自身によって、または任意のその他の所望の細胞質ドメインと組み合わせてＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計され得る。ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含み得る。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体または抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要であるそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３がある。
【００４８】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな、または特定の順序で互いに連結され得る。好ましくは、２から１０個の間のアミノ酸長である、短いオリゴ−またはポリペプチドリンカーは、連結を形成し得る。顕著なリンカーとして、グリシン−セリンダブレットがある。
【００４９】
一例として、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含み得る。別の例では、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含み得る。さらなる例では、細胞質ドメインは、ＣＤ３−ζのシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含み得る。
【００５０】
本発明のＣＡＲは、本明細書において記載されるような任意の部分または上記のドメインの一部を含むように設計され得る。抗原結合ドメインによって媒介される本発明のＣＡＲの特異性は、抗原ＳＳＥＡ４に対するものであり、機能的ＣＡＲを構築するために必要なすべてのその他のドメインは、上記の、または当業者に周知の選択肢から選択され得る。本発明の例示的ＣＡＲは、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を有し得る。
【００５１】
図３は、非改変Ｔリンパ球を含めた末梢血Ｔ細胞の表面でのキメラ抗原受容体構築物「重＿軽ｓｃＦｖ配向」（配列番号５）および「軽＿重ｓｃＦｖ配向」（配列番号６）の発現を示す。ナイーブ汎Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され、刺激性マトリックス（ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）およびＩＬ−２の存在下で培養された。永久的な受容体発現のために、リンパ球は、２の多重感染度（ＭＯＩ）でレンチウイルスによって形質導入された。ＩｇＧスペーサードメインに対して向けられた抗体を用いて、フローサイトメトリーによって表面発現を調べた。
【００５２】
図４は、ＳＳＥＡ−４陽性腫瘍細胞（ＮＴＥＲＡ２）を用いる刺激後の炎症促進性サイトカインＩＬ−２（図４Ａ）、ＴＮＦα（図４Ｂ）およびＩＦＮγ（図４Ｃ）のＣＡＲ誘導性分泌を例示する。軽−重ｓｃＦｖ−およびＣＨ２ＣＨ３スペーサードメイン−保有受容体構築物の実験結果が示されている。１＊１０５個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、腫瘍細胞と１：２の比で２４時間共培養し、その後、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＩＦＮγのサイトカインレベルを、ＭＡＣＳＰｌｅｘ技術を使用して決定した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ；ＭＡＣＳＰｌｅｘアッセイは、単一サンプル中の可溶性分析物の濃度を決定するために設計されている。分析は、規定の蛍光特性を示し、標準フローサイトメトリー技術を使用して同定され得るＭＡＣＳＰｌｅｘ（ＭＰｘ）Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｅａｄに基づいている。ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカイン１２キット、ヒトおよびＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカイン１０キット、マウス内のＭＰｘ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｅａｄは、各々、サンプル内のそれぞれのサイトカインのうちの１種と反応する特定の抗体でコーティングされた、種々の蛍光標識されたビーズ集団のカクテルを含有する）。並行して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、抗原刺激の非存在下で培養して、キメラ受容体のバックグラウンド活性を決定した。それぞれ、腫瘍細胞を伴う、および伴わない非改変Ｔ細胞の対照培養物は、ＣＡＲ媒介性リンパ球応答の特異性を評価するために役立った。２種のドナーを用い、２連で実験を実施し、平均および標準偏差を求めた。縦軸は、共培養上清において決定されるような、ｐｇ／ｍＬでのそれぞれのサイトカインの濃度を表す。抗原接触後、両ドナーのトランスジェニックＴ細胞は、ＩＬ−２（図４Ａ）、ＴＮＦα（図４Ｂ）およびＩＦＮγ（図４Ｃ）において少なくとも１０倍増大した分泌を示すのに対し、非改変Ｔ細胞との共培養は、無視できる量のサイトカイン生成しか示さない。また、腫瘍細胞を伴わずに抗ＳＳＥＡ−４−ＣＡＲＴ細胞が培養された試験サンプルでは、サイトカイン生成は、「バックグラウンドノイズ」内である。したがって、これらの結果から、抗原依存性およびＣＡＲ特異的にＴ細胞を活性化する、開発されたキメラ受容体の機能性が確認される。
【００５３】
図５は、抗原刺激後の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＡＲ誘導性細胞溶解性活性の評価のための細胞毒性アッセイ結果を示す。軽＿重ｓｃＦｖ−およびＣＨ２ＣＨ３スペーサードメイン保有受容体構築物の実験結果が示されている。エフェクター細胞（ＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞）を、１＊１０４個の蛍光標識されたＳＳＥＡ−４陽性腫瘍細胞（ＮＴＥＲＡ２）とともに１０：１、５：１、２．５：１、１：１および０．５：１の比でプレーティングした。２４時間共培養した後、フローサイトメトリーによって生存腫瘍細胞の量を決定し、各比の細胞毒性効率を評価した。特異性比較のために、非改変Ｔ細胞を伴う共培養を使用した。２種のドナーを用い（図５Ａ：ドナー７番；図５Ｂ：ドナー８番）、４連で実験を実施し、平均および標準偏差を決定した。
【００５４】
データは、Ｔ細胞の非存在下でインキュベートしたＮＴＥＲＡ２標的細胞（０％）と比較した細胞毒性のパーセンテージとして示されている。ドナー７番（図５Ａ）およびドナー８番（図５Ｂ）の両方について、ＣＡＲ＋Ｔ細胞による選択的腫瘍細胞死滅が観察可能であり、これは、ＣＡＲ活性化は、サイトカイン分泌を促進するだけでなく、細胞傷害性活性も促進するということを示す。
【００５５】
実施形態
本発明はまた、ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲのアミノ酸配列をコードする配列を含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）構築物を包含する。
【００５６】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物（ベクター、プラスミド）が作製される。ＳＳＥＡ４に特異的な抗原結合ドメインをコードする核酸配列は、少なくとも膜貫通ドメインをコードする核酸配列およびその後の細胞内ドメインをコードする核酸配列に融合される。このような発現ベクターの構築は、当技術分野で周知の組換え法によって実施され得る。あるいは、核酸配列は、合成によって生成され得る。
【００５７】
本発明の一実施形態では、本発明のＣＡＲを発現する細胞が作製される。本発明のＣＡＲをコードするＤＮＡ構築物は、当技術分野で周知の方法（例えば、ウイルスベースの系、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）によって宿主細胞にトランスフェクトされ、形質導入され得る。宿主細胞に、本発明のＣＡＲをコードする核酸を組み込む、優先的には安定に組み込むために使用される方法に関わらず、結果として、宿主細胞は、ＳＳＥＡ４に特異的であるＣＡＲを発現する。
【００５８】
本発明の一実施形態では、抗原ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲは、免疫細胞または免疫細胞サブセットにおいて発現される。
【００５９】
本発明の一実施形態では、抗原ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲは、Ｔ細胞またはＴ細胞サブセットにおいて発現される。
【００６０】
本発明の一実施形態では、抗原ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲは、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞サブセットにおいて発現される。
【００６１】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲ（「ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ」）を発現する遺伝子操作された細胞は、当技術分野で周知の方法、例えば、ＦＡＣＳ（登録商標）などの蛍光ベースの分離技術またはＭＡＣＳ（登録商標）などの磁性細胞分離法によって、このような遺伝子操作されたＳＳＥＡ４−ＣＡＲ細胞を作製するためのトランスフェクション／形質導入プロセス後に、非トランスフェクト／形質導入細胞から単離される（濃縮または分離される）。
【００６２】
本発明の一実施形態では、免疫細胞、優先的にはＴ細胞の供給源は、対象から得られる。免疫細胞、優先的にはＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血または胸腺組織などの種々の供給源から得ることができる。これらの細胞の濃縮のために、ＦｉｃｏｌｌＴＭまたはＰＥＲＣＯＬＬＴＭ勾配による遠心分離または蛍光選別（例えば、ＦＣＡＳｓｏｒｔ）もしくは磁性選別（例えば、ＭＡＣＳ（登録商標））などの陽性／陰性選択技術などの当技術分野で周知の方法を使用できる。
【００６３】
一実施形態では、対象の血液サンプルのＴ細胞は、例えば、それぞれ、ＣＤ４およびＣＤ８に特異的な抗体と結合している磁性ビーズを用いて磁性標識され、洗浄され、磁性的に濃縮され、集められる。次いで、これらのＴ細胞は、その細胞表面でＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現するように遺伝子操作され得る。
【００６４】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現する単離され／濃縮された遺伝子操作されたＴ細胞を、遺伝子改変に先立って、またはその後に、一般に、当技術分野で周知の方法、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズまたは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノマトリックスを用いるポリクローナル刺激（ＥＰ２７１１４１８Ａ１）を使用して、活性化し、遺伝子操作されたＴ細胞の量を増大するように増殖させ得る。優先的には、遺伝子操作されたＴ細胞の前記量は、治療有効量に増大される。
【００６５】
本発明の一実施形態では、本発明のＣＡＲを発現する細胞が作製される。本発明のＣＡＲをコードするＲＮＡは、当技術分野で周知の方法（例えば、ウイルスベースの系、物理的方法、生物学的方法、化学的方法）によって宿主細胞にトランスフェクトまたは形質導入され得る。一般に、このような「ＲＮＡが遺伝子操作された細胞」は、ＷＯ２０１３／０４０５５７に詳細に開示されている。宿主細胞中に本発明のＣＡＲをコードするＲＮＡを組み込むために使用される方法に関わらず、結果として、宿主細胞はＳＳＥＡ４に特異的であるＣＡＲを発現する。「ＲＮＡが遺伝子操作された細胞」を使用することは、ＣＡＲは、細胞において限定された時間発現される（一過性発現）という事実につながる。
【００６６】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ、優先的にはＴ細胞を発現する遺伝子改変された細胞が、閉鎖細胞培養系において自動的に作製される。遺伝子改変された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を作製するプロセスは、以下のステップを含む：
ａ）細胞サンプルを準備するステップ、
ｂ）遠心分離により細胞サンプルを調製するステップ、
ｃ）細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を磁性分離するステップ、
ｄ）調節剤を使用する濃縮された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を活性化するステップ、
ｅ）ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現するための細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を遺伝子改変するステップ
ｆ）培養チャンバー中での遺伝子改変されたＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を増殖させるステップ、
ｇ）培養された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を洗浄するステップ。すべてのこれらのステップは、閉鎖された滅菌系において実施され得る。
【００６７】
本プロセスは、遺伝子改変された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を調製するのに特に適しており、ここで、濃縮された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体が、ウイルスおよび／または非ウイルスベクターを使用することによって遺伝子改変される。
【００６８】
これらのステップのいずれも、増加させても、省略してもよく、異なる順序で行ってもよい。
【００６９】
本発明の一実施形態では、調節剤は、アゴニスト抗体および／またはサイトカインから選択される。
【００７０】
本発明の一実施形態では、前記自動化プロセスでは、最終細胞生成物においてより高い頻度の遺伝子改変された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体を得るために、培養の前または後に、遺伝子改変された細胞、優先的にはＴ細胞、Ｔ細胞サブセットまたはＴ細胞前駆体が、細胞の磁性標識および磁性分離によって濃縮される。
【００７１】
細胞改変のための閉鎖された滅菌系として、完全に自動化された細胞処理装置ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）および関連チュービングセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が使用され得る（ＷＯ２００９／０７２００３）。この閉鎖系は、ほとんどいかなる種類の細胞生成物のＧＭＰ等級処理の必要条件も満たし、クリーンルーム必要条件を低減し、細胞製造プロセスの技術移転および調和を改善することを可能にし得る。細胞性治療薬の製造プロセスを完全に自動化し、標準化するために開発された。この機器は、サンプルローディング、細胞洗浄、赤血球低減および血漿回収を含めた密度ベースの細胞分離、磁性分離、細胞活性化、細胞改変（形質導入）、細胞培養および最終生成物製剤化を実施し得る。したがって、閉鎖された自動化された安全なＧＭＰ遵守ワークフローへのプロセスモジュール（「ステップ」）の柔軟な組込みを可能にし、複雑な所望の生物学的プロセスを再現する。
【００７２】
本発明の一実施形態では、本発明のＳＳＥＡ４−ＣＡＲは、ＳＳＥＡ４の異常な発現と関連する疾患、障害または症状を有する対象において治療するために使用される。
【００７３】
本発明の一実施形態では、本発明のＳＳＥＡ４−ＣＡＲは、がんを患っている対象におけるがんの治療において使用するためのものであり、ここで、ヒト乳がん、ＲＣＣおよびヒト卵巣がんなどの前記がんのがん性細胞の少なくとも部分集団は、ＳＳＥＡ４を発現する。対象の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が、単離される。対象は、前記がんを患っている場合も、健常な対象である場合もある。これらの細胞は、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ？で遺伝子改変される。これらの遺伝子操作された細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ？で活性化させ、増殖させ得る。細胞性療法では、これらの遺伝子操作された細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される。これらの細胞は、医薬組成物（前記細胞および薬学的に許容される担体）であり得る。注入された細胞は、レシピエントにおいてＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞を死滅させる（または少なくとも増殖を停止する）ことができる。レシピエントは、細胞が得られた同一対象である場合も（自己細胞療法）、または同一種の別の対象に由来するものである場合もある（同種異系の細胞療法）。
【００７４】
本発明の一実施形態では、がんを患っている対象は、本発明の医薬組成物を、それだけには限らないが、ラパマイシンなどの免疫調節薬またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１もしくはＣＴＬＡ４シグナル伝達を遮断する薬剤と一緒に用いて治療され得る。
【００７５】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞は、対象のがん性細胞の部分集団のみであり得るという事実のために、対象は、化学療法を用いてさらに治療され得る。がんを治療するのに適した化学療法薬は、当技術分野で周知である。
【００７６】
本発明の別の実施形態では、前記がんを患っている対象は、化学療法を用いる治療の代わりにさらなる標的化される療法、例えば、それだけには限らないが、抗体によって媒介されるＨｅｒ２標的化によって治療され得る。あるいは、対象はまた、化学療法によって治療され得る。
【００７７】
がんを有する個体における化学療法に対する耐性と関連して予後を評価するための方法は、ＥＰ１４３０５４７７．３に開示されており、この方法は、ａ）試験されるべきサンプルを準備するステップおよびｂ）試験サンプルにおけるＳＳＥＡ４の発現を検出するステップであって、試験サンプルにおけるＳＳＥＡ４の発現が不良な予後を示すステップとを含む。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細胞を用いる治療の前に、がんの種類に関してがんを患っている対象が分析される（診断が行われる）。がんの分析が、がんがＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の少なくとも部分集団を含むことを示す場合には、前記がんを患っている対象の、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ遺伝子操作された細胞を用いる治療は、有望であり、賢明である。しかし、前記がんがＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞を有さないがんを患っている対象もまた、がんを患っている対象の治療、例えば、化学療法的治療の間のＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞の発生の注意および予防の手立てとして、本明細書において開示されるような本発明のＳＳＥＡ４−ＣＡＲ遺伝子操作された細胞を用いて治療され得る。
【００７８】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現する細胞は、上記で開示されるような細胞性療法として、ただし第２の活性化ＣＡＲと組み合わせてがんを患っている対象に適用され、第２の活性化ＣＡＲは、同一の遺伝子操作された細胞で同様に発現され、さらなるエピトープを認識して、両ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の特異性を増大する。このエピトープは、膜に結合されたもの、細胞外マトリックスの一部または可溶性成分であり得る。
【００７９】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現する細胞は、上記で開示されるような細胞性療法として、ただし第２の活性化ＣＡＲと組み合わせてがんを患っている対象に適用され、第２の活性化ＣＡＲは、同一の遺伝子操作された細胞で同様に発現され、ＳＳＥＡ４を発現するがん性細胞上のさらなるエピトープを認識して、両ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の特異性を増大する。このエピトープは、膜に結合されたもの、細胞外マトリックスの一部または可溶性成分であり得る。
【００８０】
本発明の一実施形態では、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現する細胞は、上記で開示されるような細胞性療法として、ただし第２の阻害性ＣＡＲと組み合わせてがんを患っている対象に適用され、第２の阻害性ＣＡＲは、同一の遺伝子操作された細胞で同様に発現され、さらなるエピトープを認識して、両ＣＡＲを発現する遺伝子操作された細胞の特異性を増大する。このエピトープは、膜に結合されたもの、細胞外マトリックスの一部または可溶性成分であり得る。
【００８１】
ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現するように遺伝子操作された免疫細胞、優先的にはＴ細胞は、単独で、または希釈剤と、および／もしくはＩＬ−２もしくはその他のサイトカインもしくは細胞集団などのその他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。手短には、本発明の医薬組成物は、本明細書において記載されるような遺伝子改変された細胞の細胞集団を、１種または複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わせて含み得る。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのバッファー；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化物質；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート化剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存料を含み得る。
【００８２】
優先的には、本発明の組成物は、静脈内投与のために製剤化される。対象への細胞組成物の投与は、当技術分野で公知の任意の好都合な方法で実施され得る。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、治療されるべき疾患に適当な方法で投与され得る。適当な投与量は、臨床治験によって決定され得る。しかし、投与の量および頻度はまた、患者の状態ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定され、影響を受ける。
【００８４】
本明細書において開示される免疫細胞、優先的にはＴ細胞を含む医薬組成物は、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０９個の細胞、好ましくは、体重１ｋｇ当たり１０５〜１０６個の細胞の投与量で投与され得る。細胞組成物はまた、これらの投与量で数回投与され得る。細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位中に直接注入され得る。
【００８５】
細胞は、当技術分野で公知の方法を使用して、活性化され、治療上有効な量に増殖され得る。
【００８６】
本発明の細胞は、例えば、化学療法、放射線照射、免疫抑制剤、抗体または抗体療法と組み合わせて使用され得る。
【００８７】
定義
別に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００８８】
用語「化学療法に対する耐性」とは、がんを患っている対象のがん性細胞の一部（少なくとも１種の細胞）が、化学療法治療の意図される効果に耐性であることを意味する。
【００８９】
用語「腫瘍」は、新生物として医学的に知られている。すべての腫瘍ががん性であるわけではない；良性腫瘍は、隣接する組織に浸潤せず、身体中に広がらない。
【００９０】
用語「がん」は、悪性新生物として医学的に知られている。がんは、未制御の細胞増殖を伴う疾患の広い群である。がんでは、細胞（がん性細胞）は、制御不能に分裂し、増殖して、悪性腫瘍を形成し、身体の近くの部分に浸潤する。がんはまた、リンパ系または血流によって身体のより遠位部分に広がり得る。ヒトに影響を及ぼす２００種を超える種々の公知のがんがある。
【００９１】
用語「化学療法」または「化学療法治療」とは、標準化された投与計画の一部として１種または複数の細胞傷害性抗新生物薬（「化学療法剤」または「化学療法薬」）を用いるがん（がん性細胞）の治療を指す。化学療法は治癒目的で与えられる場合もあり、寿命を延長することまたは症状を緩和することを目的とする場合もある。放射線療法、手術および／または温熱療法などのその他のがん治療とともに使用されることが多い。伝統的な化学療法薬は、ほとんどのがん細胞の主な特性の１種である迅速に分裂する細胞を死滅させることによって作用する。これは、化学療法がまた、正常な状況下で迅速に分裂する細胞：骨髄、消化管およびその毛包中の細胞を害することを意味する。これは、化学療法の最もよくある副作用：骨髄抑制（血液細胞の生成の低下、ひいては、同様に免疫抑制）、粘膜炎（消化管の内層の炎症）および脱毛症（毛髪脱落）をもたらす。
【００９２】
いくつかの新規抗がん薬（例えば、種々のモノクローナル抗体または本発明のもののような遺伝子操作された細胞）は、無差別に細胞傷害性ではなく、むしろ、がん細胞において異常に発現され、その増殖にとって必須であるタンパク質を標的とする。このような治療は、「標的化された療法」（古典的な化学療法とは異なるように）と呼ばれることが多く、抗悪性腫瘍薬治療計画において伝統的な化学療法薬と並んで使用されることが多い。
【００９３】
用語「化学療法薬」および「化学療法」が本明細書において指す古典的な化学療法薬の種類として以下がある：
【００９４】
アルキル化剤：アルキル化剤は、今日使用される最も古い群の化学療法薬である。それらは、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた多数の分子をアルキル化するその能力のためにそのように名付けられている。そのアルキル基によってＤＮＡまたはＲＮＡと共有結合によって結合するこの能力は、その抗がん作用の根本原因である。これは、アポトーシスと呼ばれるプログラム細胞死の形成につながる。アルキル化剤は、細胞周期の任意の点で作用し、したがって、細胞周期独立性薬として知られている。この理由のために、細胞に対する効果は、用量依存性であり、死滅する細胞の割合は、薬物の用量に正比例する。アルキル化剤のサブタイプとして、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体ならびに非古典的アルキル化剤がある。ナイトロジェンマスタードとして、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが挙げられる。ニトロソ尿素として、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチンおよびストレプトゾトシンが挙げられる。テトラジンとして、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが挙げられる。アジリジンとして、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジクオン（ＡＺＱ）が挙げられる。シスプラチンおよび誘導体として、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが挙げられる。それらは、生物学的に重要な分子中のアミノ、カルボキシル、スルフヒドリルおよびリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。非古典的アルキル化剤として、プロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンが挙げられる。マホスファミドは、化学療法薬として開発中のオキサアザホスホリン（シクロホスファミド様）アルキル化剤である。
【００９５】
代謝拮抗薬：用語「代謝拮抗薬」および「ＤＮＡ合成および転写阻害剤」は、本明細書において、互換性の意味を有し、定義は、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成を妨害する分子の群である。それらの多くは、ＤＮＡおよびＲＮＡのビルディングブロックの類似構造を有する。代謝拮抗薬は、核酸塩基またはヌクレオシドのいずれかに類似するが、変更された化学基を有する。これらの薬物は、ＤＮＡ合成に必要な酵素を遮断することまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ中に組み込まれることのいずれかによってその効果を発揮する。それらは、ＤＮＡ合成に関与する酵素を阻害することによって、ＤＮＡが自身を複製できないので有糸分裂を阻止する。また、分子をＤＮＡ中に誤取り込みした後、ＤＮＡ損傷が生じ得、プログラム細胞死（アポトーシス）が誘導される。代謝拮抗薬は、アルキル化剤とは異なり細胞周期依存性である。これは、細胞周期の特定の部分、この場合には、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）の間にのみ働くことを意味する。この理由のために、特定の用量で、効果がプラトーに達し、用量を増大しても、もはや比例的には細胞死は起こらない。代謝拮抗薬のサブタイプとして、抗葉酸、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリンがある。抗葉酸として、メトトレキサートおよびペメトレキセドが挙げられる。フルオロピリミジンとして、フルオロウラシルおよびカペシタビンが挙げられる。フルオロウラシルは、細胞において代謝されて、少なくとも２種の活性生成物；５−フルオロウリジンモノホスフェート（ＦＵＭＰ）および５−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−ホスフェート（ｆｄＵＭＰ）を形成する核酸塩基類似体である。ＦＵＭＰは、ＲＮＡ中に組み込まれるようになり、ｆｄＵＭＰは、酵素チミジル酸シンターゼを阻害し；両方とも、細胞死につながる。カペシタビンは、５−フルオロウラシルのプロドラッグであり、細胞中で分解されて、活性薬物を生成する。デオキシヌクレオシド類似体として、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビンおよびペントスタチンが挙げられる。チオプリンとして、チオグアニンおよびメルカププリンが挙げられる。
【００９６】
抗微小管剤：抗微小管剤は、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を遮断する植物由来化学物質である。ビンカアルカロイドおよびタキサンは、抗微小管剤の２種の主な群である。ビンカアルカロイドは、微小管の形成を妨げるが、タキサンは、微小管分解を妨げる。それらは、そうすることによって、がん細胞が有糸分裂を完了することを妨げる。この後、細胞周期停止が起こり、これがプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導する。ビンカアルカロイドは、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）に由来する。タキサンは、天然および半合成薬物である。そのクラスの第一薬、パクリタキセルは、元々、タイヘイヨウイチイの木（Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）から抽出された。現在、この薬物およびこのクラスの別のもの、ドセタキセルは、別のイチイの木（ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔａ））の樹皮中で見い出された化学物質から半合成的に生成されている。これらの薬物は、微小管安定性を促進し、その分解を妨げる。ドセタキセルは、Ｓ−期の間にその効果を発揮する。
【００９７】
トポイソメラーゼ阻害剤：トポイソメラーゼ阻害剤は、２種の酵素；トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩの活性に影響を及ぼす薬物である。撚りロープの中央を開くように、ＤＮＡ複製または翻訳の間にＤＮＡ二本鎖ヘリックスが巻き戻されると、例えば、隣接する開いていないＤＮＡはより堅く巻く（スーパーコイル）。この効果によって引き起こされるストレスは、トポイソメラーゼ酵素よって幾分か補助される。それらは、ＤＮＡに一本鎖または二本鎖切断をもたらし、ＤＮＡ鎖の張力を低減する。これによって、複製または翻訳の間にＤＮＡの正常な巻き戻しが起こることが可能となる。トポイソメラーゼＩまたはＩＩの阻害は、これらのプロセスの両方を干渉する。２種のトポイソメラーゼＩ阻害剤、イリノテカンおよびトポテカンは、中国観賞樹カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａａｃｕｍｉｎａｔａ）から得られるカンプトテシンから半合成的に誘導される。トポイソメラーゼＩＩを標的とする薬物は、２群に分けられ得る。トポイソメラーゼＩＩ毒は、ＤＮＡと結合している酵素のレベルを増大させる。これは、ＤＮＡ複製および翻訳を妨げ、ＤＮＡ鎖切断を引き起こし、プログラム細胞死（アポトーシス）につながる。これらの薬剤として、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロンおよびテニポシドが挙げられる。第２の群、触媒阻害剤は、トポイソメラーゼＩＩの活性を遮断し、したがって、ＤＮＡが適切に巻くことができないためにＤＮＡ合成および翻訳を妨げる薬物である。この群として、ノボビオシン、メルバロンおよびアクラルビシンが挙げられる。
【００９８】
細胞傷害性抗生物質：細胞傷害性抗生物質は、種々の作用の機序を有する薬物の多様な群である。群は、アントラサイクリンおよびアクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシンおよびマイトマイシンを含めたその他の薬物を含む。ドキソルビシンおよびダウノルビシンは、最初の２種のアントラサイクリンであり、細菌ストレプトマイセス・ペウセティウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）から得られた。これらの化合物の誘導体として、エピルビシンおよびイダルビシンが挙げられる。アントラサイクリン群中のその他の臨床的に使用される薬物として、ピラルビシン、アクラルビシンおよびミトキサントロンがある。アントラサイクリンの機序として、ＤＮＡインターカレーション（ＤＮＡの二本鎖間の分子挿入）、細胞間分子を損傷する高度に反応性のフリーラジカルの生成およびトポイソメラーゼ阻害が挙げられる。アクチノマイシンは、ＤＮＡにインターカレートし、ＲＮＡ合成を妨げる複合分子である。ブレオマイシン、ストレプトマイセス・ベルティシルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ）から単離されたグリコペプチドもＤＮＡにインターカレートするが、ＤＮＡを損傷するフリーラジカルを生成する。これは、ブレオマイシンが金属イオンと結合し、化学的に還元され、酸素と反応するときに起こる。マイトマイシンは、ＤＮＡをアルキル化する能力を有する細胞傷害性抗生物質である。
【００９９】
組合せ化学療法は、いくつかの異なる薬物を同時に用いて患者を治療することを含む。薬物は、その機序および副作用の点で異なる。最大の利点は、任意の１種の薬剤に対する耐性発生の機会を最小化することである。また、薬物は、より低い用量で使用され、毒性を低減し得ることが多い。顕著な例は、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド（Ａ／Ｃ）の組合せである。
【０１００】
「化学療法に対する耐性」は、がん性細胞が、少なくとも適用される濃度での治療によって阻害されない、死滅されない場合に起こる。言い換えれば、がん性細胞が、化学療法の作用に耐性である。用語「化学療法に対する感受性」は、対応する意味を有する。
【０１０１】
用語「自己」とは、本明細書において、後に再導入される同一の対象に由来する任意の材料を指す。
【０１０２】
用語「同種異系の」とは、本明細書において、材料が再導入される対象と同一種の異なる対象に由来する任意の材料を指す。
【０１０３】
用語「治療上有効な量」とは、治療上の利益を提供する量を意味する。
【０１０４】
用語「単離された」とは、天然の状態から変更された、または回収されたことを意味する。例えば、細胞の単離された集団は、このような細胞の濃縮、およびその天然に存在する状態では前記単離された細胞と通常会合しているその他の細胞からの分離を意味する。細胞の単離された集団とは、細胞の均質な集団である、実質的に精製された細胞の集団を意味する。
【０１０５】
抗体またはその断片の、またはＣＡＲの抗原−結合ドメインに関して、用語「特異的に結合する」または「に特異的な」とは、特異的抗原を認識し、結合するが、サンプル中のその他の分子を実質的に認識または結合しない抗原−結合ドメインを指す。ある種に由来する抗原と特異的に結合する抗原−結合ドメインは、別の種に由来する抗原とも結合し得る。この交差種反応性は、特異的としてのその抗原−結合ドメインの定義に反しない。抗原と特異的に結合する抗原−結合ドメインは、抗原の種々の対立遺伝子の形態（対立遺伝子変異体、スプライス変異体、アイソフォームなど）とも結合し得る。この交差反応性は、特異的としてのその抗原−結合ドメインの定義に反しない。
【０１０６】
用語「遺伝子操作された細胞」および「遺伝子改変された細胞」は、本明細書において、互換的に使用され得る。この用語は、外来遺伝子または核酸配列を含有しおよび／または発現し、次にそれらが、その細胞またはその後代の細胞の遺伝子型または表現型を改変することを意味する。特に、この用語は、細胞、優先的にはＴ細胞が、当技術分野で周知の組換え法によって操作されて、天然の状態ではこれらの細胞において発現されないペプチドまたはタンパク質を安定にまたは一時的に発現し得るという事実を指す。例えば、Ｔ細胞は、その細胞表面にキメラ抗原受容体などの人工構築物を発現するように遺伝子操作される。例えば、ＣＡＲ配列は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して細胞中に送達され得る。
【０１０７】
ＳＳＥＡ４  ＶＨ、ＳＳＥＡ４  ＶＬ、ｓｃＦＶ  ＶＨ−リンカー−ＶＬ、ｓｃＦｖ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ、ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ  ＶＨ−リンカー−ＶＬおよびＳＳＥＡ４−ＣＡＲ  ＶＬ−リンカー−ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６にそれぞれ示されている（アミノ酸の一文字コードで）。配列番号１〜配列番号６に示されるようなアミノ酸配列（タンパク質、ポリペプチド）は、本明細書において定義されるようなそれぞれのアミノ酸配列の意図される機能を保持する、すべての一連のそれぞれのアミノ酸配列を指す。言い換えれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６への分岐は、それぞれ、抗原ＳＳＥＡ４と特異的に結合するおよび／または機能的ＣＡＲであるようなその可能性に影響を及ぼしてはならない。したがって、配列番号１〜配列番号６のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１〜配列番号６の全長アミノ酸配列であり得る。また欠失、付加または置換された一部のアミノ酸を有するが、本明細書に記載されるような意図される機能を依然として保持するその変異体であり得る。したがって、アミノ酸配列レベルで少なくとも７０％または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５と本質的に同様のアミノ酸配列などの、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６におけるアミノ酸配列の変異体は、それぞれ、この定義に含まれる。本発明に関連して、「配列同一性」は、当技術分野で周知のアミノ酸配列のアラインメントプログラムを使用するペアワイズアラインメントを使用して決定され得る。
【０１０８】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の種類である。それらは、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によってＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などのその他のリンパ球と区別され得る。各々が別個の機能を有するＴ細胞のいくつかのサブセットがある。
【０１０９】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞および記憶Ｂ細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいてその他の白血球細胞を補助する。これらの細胞はまた、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するのでＣＤ４＋Ｔ細胞として知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化型になる。ひとたび活性化されると、迅速に分裂して、活性免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さいタンパク質を分泌する。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫応答を促進するＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含めたいくつかのサブタイプに分化し得る。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定のサブタイプに向ける。
【０１１０】
細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルスによって感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞はまた、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するのでＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子と関連する抗原との結合によってその標的を認識する。
【０１１１】
記憶Ｔ細胞は、感染が消失した後、長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、そのコグネイト抗原に対する再曝露の際に多数のエフェクターＴ細胞に迅速に増殖し、したがって、免疫系に過去の感染に対する「記憶」を提供する。記憶Ｔ細胞は、３種のサブタイプを含む：中心的記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種のエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、通常、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって重要である。その主要な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞性免疫を停止することおよび胸腺における陰性選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１１２】
２種の主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が記載されている−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞およびＦｏｘｐ３−Ｔｒｅｇ細胞。
【０１１３】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞−自然免疫系のナチュラルキラー細胞と混同されてはならない）は、適応免疫系と自然免疫系を橋渡しする。主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子によって提示される糖脂質抗原を認識する。これらの細胞は、ひとたび活性化されると、ＴｈおよびＴｃ細胞の両方に帰する機能（すなわち、サイトカイン生成および細胞溶解性／細胞死滅性分子の放出）を実施し得る。
【０１１４】
免疫療法は、「免疫応答を誘導、増強または抑制することによる疾患の治療」として定義される医学用語である。免疫応答を惹起または増幅するように設計される免疫療法は、活性化免疫療法として分類され、低減または抑制する免疫療法は、抑制免疫療法として分類される。活性化免疫療法としてのがん免疫療法は、免疫系を刺激して、腫瘍を拒絶および破壊しようとする。養子細胞移入は、がん細胞を攻撃するために細胞ベースの、優先的にはＴ細胞ベースの細胞傷害性応答を使用する。患者のがんに対して天然の、または遺伝子操作された応答性を有するＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製され、次いで、がん患者に戻される。
【０１１５】
用語「治療」とは、本明細書において、疾患の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
【０１１６】
用語「バイオマーカー」または「マーカー」は、当技術分野で広まっており、個体におけるその定性的および／または定量的評価が、個体の表現型および／または遺伝子型の１種または複数の態様に関して（例えば、個体の状態に関してなど）予測的であるか、または情報を与える（例えば、予測的、診断的および／または予後の）生体分子および／またはその検出可能な部分（例えば、核酸、ペプチドまたは糖脂質などの脂質）を広く意味し得る。例えば、バイオマーカーは、個体におけるがんの化学療法治療の結果に関して、予測的であるか、または情報を与える。バイオマーカーが、当技術分野で公知の方法を用いて検出可能である場合には、バイオマーカーは発現される（「バイオマーカーの発現」）。したがって、バイオマーカーの発現は、核酸レベル（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）およびタンパク質レベルでの発現だけでなく、糖脂質またはタンパク質の活性などの細胞上または細胞中のその他の生物学的構造の発現（存在）も包含する。
【０１１７】
本明細書において、用語「対象」とは、動物を指す。優先的には、対象は、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、イヌ、サルまたはヒトなどの哺乳動物である。より優先的には、個体はヒトである。対象は、がんなどの疾患を患っている対象（患者）であり得るが、対象はまた、健常な対象である場合もある。
【０１１８】
用語「標的」とは、本明細書において、抗原結合ドメイン、例えば、抗体の、またはＣＡＲの抗原結合ドメインによって特異的に認識されなければならない細胞と関連している抗原またはエピトープを指す。抗原またはエピトープは、細胞表面と結合されている場合もあるが、分泌される場合も、細胞外膜の一部である場合も、細胞から排出される場合もある。
【０１１９】
用語「がん性細胞の部分集団」とは、本明細書において、対象のがんのがん性細胞が不均一であり得るという事実を指す。ＥＰ１４３０５４７７．３に示されるように、いくつかのがんでは、一部のがん性細胞が、その細胞表面にＳＳＥＡ４を発現し、その他のものは発現しない。したがって、ＳＳＥＡ４を発現する対象のがんのがん性細胞は、前記対象のがん内のがん性細胞の部分集団（または一部分）である。部分集団は、対象のがんのすべてのがん性細胞内の少なくとも１種の細胞を含み得る。部分集団は、前記がんを患っている対象のすべてのがん性細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％を含み得る。
【０１２０】
用語「抗体」は、本明細書において、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体およびその断片を指し、これは、当業者に周知の方法によって作製され得る。抗体は、任意の種、例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ヒトのものであり得る。治療目的で、非ヒト抗原結合断片が使用されるべきである場合には、これらは、当技術分野で公知の任意の方法によってヒト化され得る。抗体はまた、改変された抗体（例えば、オリゴマー、還元された、酸化されたおよび標識された抗体）であり得る。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は、本発明のより詳細な説明を目的とするが、本発明をこれらの実施例に制限しない。
【０１２２】
実施例１：ＳＳＥＡ４特異的抗体のアミノ酸配列
ＳＳＥＡ４と特異的に結合する、使用される抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変部分のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示されるとおりであった。
【０１２３】
これらの配列またはＳＳＥＡ４に対する特異性を有するそれに由来する任意の配列が、ＳＳＥＡ４を認識するＣＡＲを作製するために使用され得る。配列番号１および配列番号２に示される配列は、単に抗原ＳＳＥＡ４に対して特異的である配列の例示である（配列は、アミノ酸の一文字コードで示されている）。同様に抗原ＳＳＥＡ４に特異的であるその他の配列は、抗体の、またはＣＡＲの抗原結合ドメインを作製するために使用され得る。
【０１２４】
実施例２：ＳＳＥＡ４を認識するＣＡＲの構造
使用されるリンカーは、図１に示されるようなＣＡＲの検出を可能にするエピトープ／タグを含み得る。エピトープ／タグの例として、ＹＯＬ、ｃＭＹＣまたはＨＩＳがある。抗ＳＳＥＡ４特異的結合断片は、ＳＳＥＡ４に特異的な抗体に由来する。ヒンジ領域は、例えば、ＩｇＧドメイン、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し得、ＣＡＲの検出を可能にするエピトープ／タグを含み得る。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し得、１〜３のシグナル伝達ドメインが続く。これらのドメインは、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ３ζに由来し得る。
【０１２５】
特異的配列として、以下の配列を使用した。
【０１２６】
ＳＳＥＡ４−ＣＡＲの抗原結合ドメインのために、配列番号３または配列番号４のいずれかのアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを使用した（配列は、アミノ酸の一文字コードで示されている）。
【０１２７】
配列番号５および配列番号６（図２中の配列も参照のこと）は、抗原ＳＳＥＡ４に特異的なＣＡＲの全長アミノ酸配列を表す（配列は、アミノ酸の一文字コードで示されている）。
【０１２８】
実施例３：レンチウイルス発現ベクターの作製
ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを、第３世代ＳＩＮ−レンチウイルスベクター構築物中、ヒトＰＧＫプロモーターの制御下にクローニングした。ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の、この発現プラスミド、ならびに構造タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌ、ｒｅｖおよびＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードするさらなるプラスミドを用いる一時的トランスフェクションは、上清へのウイルスベクター粒子の放出をもたらした。ウイルスベクター粒子をその後、低速遠心分離によって濃縮し、−７０℃で保存した。
【０１２９】
実施例４：Ｔ細胞分離およびＳＳＥＡ４−ＣＡＲを用いる遺伝子改変
ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓおよびＭＡＣＳ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してドナーアフェレーシスまたはバフィーコートサンプルから一次Ｔ細胞を単離し、９０％を超える純度（ＣＤ３＋細胞）に達した。磁性濃縮した細胞を洗浄し、２００ＩＵ／ｍＬヒト組換えＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＴｅｘＭＡＣＳ培地に再懸濁した。次いで、ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加によってＴ細胞を刺激した。
【０１３０】
２４時間後、Ｔ細胞刺激の成功を、Ｔ細胞をＣＤ２５およびＣＤ６９抗体を用いて染色することおよびＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でのフローサイトメトリーによる分析によって確認した。次いで、刺激されたＴ細胞に、ＭＯＩ＝０．５〜２でＳＳＥＡ４−ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを添加することによって形質導入した。４日静置培養した後、細胞を洗浄して、過剰のウイルスベクターおよびＴｒａｎｓＡｃｔ試薬を除去して、さらに５〜１０日間培養した。抗ヒトＦｃ蛍光色素およびフローサイトメトリーを使用して生存ＣＤ３＋細胞の間のＳＳＥＡ４−ＣＡＲの表面発現を染色することによってウイルス形質導入の効率を測定した。遺伝子によって印がつけられたＴ細胞の数は、使用されたＭＯＩに応じて、１０から６０％の間の範囲であった。
【０１３１】
実施例５：ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ機能性
ＳＳＥＡ４発現標的細胞またはＳＳＥＡ４を発現しない細胞を、多様なエフェクター対標的細胞比で、増殖したＳＳＥＡ４−ＣＡＲを発現するＴ細胞とともに、対照として、形質導入されていないＴ細胞とともに５時間インキュベートした。特異的標的細胞死滅を、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１３２】
あるいは、エフェクター細胞を、ＳＳＥＡ４陽性または陰性である細胞系統を用いて再刺激した。サイトカイン生成（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α）ならびに脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）をフローサイトメトリーによって分析した。ＳＳＥＡ４−ＣＡＲを保持するＴ細胞のみが、標的細胞を死滅させることができ、サイトカイン生成の増大ならびに脱顆粒マーカーアップレギュレーションを示した。
【０１３３】
［配列表］
配列番号１
ＳＳＥＡ４  ＶＨ
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS SQGVYWVRQP PGKGLEWLGA
IWAGGSTNYN SALMSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARVDG
YRGYNMDYWG QGTSVTVSS
配列番号２
ＳＳＥＡ４  ＶＬ
ENVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMHWYQQKSS TSPKLWIYDT
SKLASGVPGR FSGSGSGNSY SLTISSMEAE DVATYYCFQG SGYPLTFGAG TKLELK
配列番号３
ｓｃＦｖ  ＶＨ−リンカー−ＶＬ
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS SQGVYWVRQP PGKGLEWLGA
IWAGGSTNYN SALMSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARVDG
YRGYNMDYWG QGTSVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSENVLTQ SPAIMSASPG
EKVTMTCSAS SSVSYMHWYQ QKSSTSPKLW IYDTSKLASG VPGRFSGSGS
GNSYSLTISS MEAEDVATYY CFQGSGYPLT FGAGTKLELK
配列番号４
ｓｃＦｖ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ
ENVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMHWYQQKSS TSPKLWIYDT
SKLASGVPGR FSGSGSGNSY SLTISSMEAE DVATYYCFQG SGYPLTFGAG
TKLELKGGGG SGGGGSGGGG SQVQLKESGP GLVAPSQSLS ITCTVSGFSL
SSQGVYWVRQ PPGKGLEWLG AIWAGGSTNY NSALMSRLSI SKDNSKSQVF
LKMNSLQTDD TAMYYCARVD GYRGYNMDYW GQGTSVTVSS
配列番号５
全ＣＡＲ配列：ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ  ＶＨ−リンカー−ＶＬ
MDFQVQIFSF LLISASVIMS RQVQLKESGP GLVAPSQSLS ITCTVSGFSL
SSQGVYWVRQ PPGKGLEWLG AIWAGGSTNY NSALMSRLSI SKDNSKSQVF
LKMNSLQTDD TAMYYCARVD GYRGYNMDYW GQGTSVTVSS GGGGSGGGGS
GGGGSENVLT QSPAIMSASP GEKVTMTCSA SSSVSYMHWY QQKSSTSPKL
WIYDTSKLAS GVPGRFSGSG SGNSYSLTIS SMEAEDVATY YCFQGSGYPL
TFGAGTKLEL KAAALPAEPK SPDKTHTCPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD
TLMIARTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSSLSPGKK
IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYCKRGRKK LLYIFKQPFM RPVQTTQEED
GCSCRFPEEE EGGCELLRVK FSRSADAPAY QQGQNQLYNE LNLGRREEYD
VLDKRRGRDP EMGGKPRRKN PQEGLYNELQ KDKMAEAYSE IGMKGERRRG
KGHDGLYQGL STATKDTYDA LHMQALPPR

配列番号６
全ＣＡＲ配列：ＳＳＥＡ４−ＣＡＲ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ
MDFQVQIFSF LLISASVIMS RENVLTQSPA IMSASPGEKV TMTCSASSSV
SYMHWYQQKS STSPKLWIYD TSKLASGVPG RFSGSGSGNS YSLTISSMEA
EDVATYYCFQ GSGYPLTFGA GTKLELKGGG GSGGGGSGGG GSQVQLKESG
PGLVAPSQSL SITCTVSGFS LSSQGVYWVR QPPGKGLEWL GAIWAGGSTN
YNSALMSRLS ISKDNSKSQV FLKMNSLQTD DTAMYYCARV DGYRGYNMDY
WGQGTSVTVS SAAALPAEPK SPDKTHTCPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD
TLMIARTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSSLSPGKK
IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYCKRGRKK LLYIFKQPFM RPVQTTQEED
GCSCRFPEEE EGGCELLRVK FSRSADAPAY QQGQNQLYNE LNLGRREEYD
VLDKRRGRDP EMGGKPRRKN PQEGLYNELQ KDKMAEAYSE IGMKGERRRG
KGHDGLYQGL STATKDTYDA LHMQALPPR
【図１】
0006588084.tif 000002
【図２Ａ】
0006588084.tif 000003
【図２Ｂ】
0006588084.tif 000004
【図３】
0006588084.tif 000005
【図４】
0006588084.tif 000006
【図５】
0006588084.tif 000007
【配列表】
0006588084000001.app