(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）タンパク質を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項２】
ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ベクターが、直鎖状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたは組換えウイルス性ベクターであることを特徴とする、請求項２に記載の乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項４】
前記組換えウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウィルス、及びレンチウイルスで構成される群から選択されるいずれか一種であることを特徴とする、請求項３に記載の乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記細胞が、造血幹細胞、樹状細胞、自己腫瘍細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）及び定着腫瘍細胞（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）で構成される群から選択されるいずれか一種であることを特徴とする、請求項２に記載の乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項６】
ＦＳＴＬ１タンパク質を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移の予防及び改善用の健康食品。
【請求項７】
ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）タンパク質を有効成分として含有する、乳癌骨転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項８】
ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する、乳癌骨転移の予防及び治療用の薬学的組成物。
【請求項９】
ＦＳＴＬ１タンパク質を有効成分として含有する、乳癌骨転移の予防及び改善用の健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）タンパク質、前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する乳癌の治療、乳癌転移（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）の抑制または乳癌骨転移の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年にわたる人類のたゆまない努力にもかかわらず、癌は、今なお難病の一つとして残り続けている。癌は、人類の健康への脅威という点で最大の疾病の一つであり、細胞が一連の突然変異過程を経て、無制限的且つ非調節的な方式で増殖及び不死化することで生じる疾病である。癌に関する様々な生化学的機構が明らかになり、それによる治療剤が開発されつつあるが、いまだに根本的な治療方法は提示されていない。
【０００３】
これによって、癌に関する様々な生体内分子の同定及び前記分子を標的とする薬物の開発に対する要望が続いており、前記薬物の中から一部を組み合わせて癌の治療効果を向上するための努力も続けられている。近年における癌細胞生物学、医薬化学などの諸般の学問の目まぐるしい発展に伴い、タキソール、ラパマイシ、及び１７−アリルアミノゲルダナマイシン（１７−ａｌｌｙｌａｍｉｎｏｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ；１７−ＡＡＧ）のような複数の抗癌剤が開発され、グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）のような新たな作用機構を有する抗癌剤が開発されている。
【０００４】
様々な癌の中で、乳癌は、すべての癌の中で最も研究が進められている癌の一つであるが、環境的要因及び遺伝的要因の二つによって発生することが知られており、まだはっきりと乳癌の原因として明らかになったものはない。しかしながら、多くの研究結果を通じていくつかの要因が可能性を示しているが、その中でも女性ホルモンであるエストロゲンが、発癌過程における重要な役割を果たすことには異見がない。乳房細胞は、エストロゲンの刺激によって増殖及び分化するので、結局は個人における乳癌の発生リスクは、エストロゲンに露出される時間によって定められるものと考えられている。すなわち、エストロゲンに露出される期間が長いほど、乳癌の発生が増加するということである。その外にも、過度な栄養及び脂肪の摂取、遺伝的要因、肥満、そしてホルモンの不均衡をもたらす長期間の避姙薬服用、及び女性ホルモン剤の長期間投与なども、乳癌の原因であると推定されている。
【０００５】
患者が癌によって死亡に至るようになるのは癌の転移に起因するとされ、特に乳癌の場合、骨組織への転移が顕著に進められるか、或いは再発する場合が多いが、臨床学的事例によると、乳癌の初期転移の３０〜４０％、そして末期または死亡した患者の９０％以上から、骨組織への転移が発生したことが報告されている。選択的な骨転移を誘発する原因は、大きく三つに区分することができるが、第一は、赤色骨髄周りの多量の血流移動性による乳癌細胞の骨組織への高い接近性、そしてなによりも、回帰性乳癌細胞表面分子（すなわち、Ｈｏｍｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ）と結合する骨組織のマトリックス細胞での吸着誘導分子（すなわち、Ｄｒａｗｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現によるものである。最後に、骨組織内には、乳癌細胞の増殖を促すカルシウム（Ｃａ２＋）及び成長因子などが多量内包されているためである。単一または少数の乳癌細胞が骨組織に転移されると、破骨細胞分化過程が誘発され、骨組織破壊（Ｂｏｎｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ。すなわち、骨吸収；Ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が進められるが、その過程において放出される上述の因子によって乳癌の増殖が加速化され（すなわち、悪循環；Ｖｉｃｉｏｕｓ  ｃｙｃｌｅ）、最終的には大抵の患者が死亡に至るようになる。
【０００６】
骨吸収は、破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ）の働きによって進行されるが、これは、乳癌細胞内の活性化されたＮＦ−κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ）の転写作用調節によるＰＴＨｒＰ（Ｐａｒａｔｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）分子の発現により破骨細胞分化が開始される。ＰＴＨｒＰは、造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ）を通じてＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）及びＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ）受容体へと競争的に結合するランクリガンド（ＲＡＮＫ  ｌｉｇａｎｄ；ＲＡＮＫＬ）を増加させると共に、ＯＰＧ（すなわち、ＲＡＮＫＬ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｒ  ＲＡＮＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の発現を減少させ、ＲＡＮＫ及びランクリガンドの結合を促進する。ランクリガンドがＲＡＮＫと結合すると、破骨細胞前駆体（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）の分化過程が開始される。ＧＭ−ＣＳＦは、破骨細胞前駆体の生成及び分化を促し、破骨細胞の分化を手伝う。
【０００７】
ＮＦ−κＢは、細胞の生存、免疫反応の統制、癌や炎症などの自己免疫調節の役割を担うタンパク質であるが、他の多くの転写因子がそうであるように、ＮＦ−κＢもまた、作用する細胞の種類及び作用時点などに応じて互いに異なる機能を果たす。乳癌細胞の場合、ＮＦ−κＢは、常に活性化状態で存在しながら、発癌、増殖及び転移機構を調節する。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−κＢ）をリン酸化する酵素であるＩＫＫ（ＩκＢ  ｋｉｎａｓｅ）によって調節されるが、活性化されたＮＦ−ΚＢは、核の中に位置移動して標的遺伝子を転写開始する。
【０００８】
ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）は、最初ではマウス骨芽細胞株のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１から明らかになったタンパクであるが、ＴＧＦ−β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β１）で誘導された遺伝子生産物であり、ＴＳＣ−３６（ＴＧＦ−β１−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｌｏｎｅ３６）としても知られており、ヒトタンパク質と９２％以上の同族性を有する。ヒトの組織において、ＦＳＴＬ１は、心臓、胎盤、前立腺、卵巣、及び小腸において強く発現され（先行技術文献１、２）、動物胚芽におけるＦＳＴＬ１は、マウスの腎臓及び肺の発達のみならず（先行技術文献３）、ニワトリの中胚葉背方化（Ｄｏｒｓａｌｉｚａｔｉｏｎ）及び神経誘導を調節するのに重要な役割を果たすことが知られている。また、幾つかのヒト癌細胞株（先行技術文献４、５、６）、癌組織（先行技術文献７）、または腫瘍遺伝子で形質転換された細胞（先行技術文献８）では、発現が減少されることが知られているが、乳癌及び乳癌骨転移におけるＦＳＴＬ１の役割に対しては、現在まであまり知られていない。
【０００９】
本発明者は、新規の癌転移の治療標的物質を開発するために鋭意努力した結果、ＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、ＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制タンパク質であるＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）の活性を増加させ、ＮＦ−κＢの信号経路（Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）を抑制・調節し、ＮＦ−κＢターゲット遺伝子であるＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、及びＩＣＡＭ１の発現を遮断し、動物モデルにおける有意的な乳癌成長及び骨転移を効果的に抑制する効能を確認し、前記ＦＳＴＬ１タンパク質が癌または癌転移抑制用の薬学的組成物の有効成分として役立てることを究明することで、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tanaka, M. et al. Cloning of follistatin-related protein as a novel autoantigen in systemic rheumatic diseases. Int Immunol 10, 1305-14 (1998)
【非特許文献２】Vertegaal, A.C. et al. cDNA micro array identification of a gene differentially expressed in adenovirus type 5- versus type 12-transformed cells. FEBS Lett 487, 151-5 (2000)
【非特許文献３】Adams, D., Larman, B. & Oxburgh, L. Developmental expression of mouse Follistatin-like 1 (Fstl1): Dynamic regulation during organogenesis of the kidney and lung. Gene Expr Patterns 7, 491-500 (2007)
【非特許文献４】Sumitomo, K. et al. Expression of a TGF-beta1 inducible gene, TSC-36, causes growth inhibition in human lung cancer cell lines. Cancer Lett 155, 37-46 (2000)
【非特許文献５】Mashimo, J., Maniwa, R., Sugino, H. & Nose, K. Decrease in the expression of a novel TGF beta1-inducible and ras-recision gene, TSC-36, in human cancer cells. Cancer Lett 113, 213-9 (1997)
【非特許文献６】Hambrock, H.O. et al. Structural characterization of TSC-36/Flik: analysis of two charge isoforms. J Biol Chem 279, 11727-35 (2004)
【非特許文献７】Meehan, K.L., Holland, J.W. & Dawkins, H.J. Proteomic analysis of normal and malignant prostate tissue to identify novel proteins lost in cancer. Prostate 50, 54-63 (2002)
【非特許文献８】Johnston, I.M. et al. Regulation of a multigenic invasion programme by the transcription factor, AP-1: re-expression of a down-regulated gene, TSC-36, inhibits invasion. Oncogene 19, 5348-58 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移の治療または抑制用、乳癌骨転移の治療用組成物を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を果たすために、本発明は、ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）タンパク質を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移の予防及び治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質を有効成分として含有する、乳癌または乳癌転移改善用の健康食品を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する、乳癌骨転移の予防及び治療用の薬学的組成物及び健康食品を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ＡＰ−１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、ＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制タンパク質であるＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）の活性を増加させ、ＮＦ−κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ）のＤＮＡ結合及びターゲット遺伝子であるＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、及びＩＣＡＭ１の発現を遮断し、動物モデルにおける有意的な乳癌の成長抑制及び骨転移抑制の効果を奏するので、乳癌、乳癌転移または乳癌骨転移の予防及び治療に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｃ−ｊｕｎ／ＡＰ−１突然変異（Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｎｔ）遺伝子をレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株（ＭＤＡ／Ｔ）において、ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）が発現することを確認した図である：    ＭＤＡ／Ｖ：対照群レトロウイルスで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株：    プロテインＦ：ＦＳＴＬ１タンパク質。
【図２】ＦＳＴＬ１タンパク質によるＡＫＴ活性抑制及びＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）の腫瘍抑制機能の誘導効果を確認した図である。
【図３】ＦＳＴＬ１タンパク質によるＮＦ−κＢのＤＮＡ結合及び転写調節作用抑制、及びＮＦ−κＢの標的タンパク質発現の遮断効果を示した図である。
【図４】ＦＳＴＬ１タンパク質による乳癌細胞の付着及び浸潤機構の抑制、及び腫瘍血管新生因子発現の遮断効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで確認した図である。
【図５】ＦＳＴＬ１タンパク質の乳房腫瘍増殖、骨転移の抑制及び破骨細胞の減少効果を動物モデルで確認した図である。
【図６】マウス骨髄細胞ｅｘ  ｖｉｖｏモデルでＦＳＴＬ１タンパク質による破骨細胞生成（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制効果を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１９】
本発明は、ＦＳＴＬ１（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ１）タンパク質を有効成分として含有する乳癌の予防及び治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２０】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する乳癌の予防及び治療用の薬学的組成物を提供する。
【００２１】
前記ベクターは、人体または動物細胞から発現される直鎖状ＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルス性発現ベクターを含むベクターまたは組換えレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクター、組換えアデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ；ＡＡＶ）ベクター、組換え単純ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）ベクターまたは組換えレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ベクターを含む組換えウイルスベクターであることが好ましいが、それに限定されるものではない。
【００２２】
前記細胞は、造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）、自己腫瘍細胞（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）及び定着腫瘍細胞（Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）で構成される群から選択されることが好ましいが、細胞そのもの、及び前記細胞を培養した培養液のいずれも利用することができる。
【００２３】
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、癌の成長及び転移関連性があると知られている転写因子ＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の標的タンパク質を確認したところ、ｃ−ｊｕｎ／ＡＰ−１の優性ネガティブ突然変異を発現するレトロウイルスで形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株において、ＦＳＴＬ１タンパク質が発現することを確認した（図１を参照）。
【００２４】
また、ＦＳＴＬ１の抗癌活性信号経路を確認したところ、本発明のＦＳＴＬ１は、ＡＫＴ１のリン酸化を、乳癌及び転移前立腺癌細胞株において抑制するが（図２Ａ及び図２Ｄを参照）、特に、ＡＫＴの上流側信号標的タンパク質であるＰＩ−３キナーゼ抑制剤として知られた化合物よりも有意的に抑制調節することで（図２Ｃを参照）、ＦＳＴＬ１が優れたＡＫＴ活性抑制剤であることを確認できた。なお、ＦＳＴＬ１は、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮのリン酸化を抑え、腫瘍抑制効果を増加させ、その量が増加するほど、その効果も増大されることを確認した（図２Ｂを参照）。
【００２５】
また、乳癌細胞においてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合の抑制調節効果を確認したところ、ＦＳＴＬ１は、ＮＦ−κＢの転写的遺伝子発現を抑制調節することができることから、乳癌骨転移の抑制剤としての役割を果たせることが確認された（図３を参照）。
【００２６】
また、ＦＳＴＬ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、ＮＦ−κＢによって調節される乳癌細胞の付着及び浸潤（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）機構の媒介分子、そして腫瘍血管新生因子を有意的に発現抑制し（図４Ａを参照）、浸潤能力を、約７９％以上著しく減少させることが確認された（図４Ｂを参照）。
【００２７】
また、動物モデルでＦＳＴＬ１の効果を確認したところ、ＦＳＴＬ１は、腫瘍の成長及び、乳癌の骨転移を有意的に抑制し（図５を参照）、さらに、破骨細胞の量的減少（図５の右側下端を参照）及び破骨細胞生成をｅｘ  ｖｉｖｏモデルで抑制（図６を参照）することが確認された。
【００２８】
従って、本発明のＡＰ−１ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、腫瘍発生及び細胞生存に関するＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制タンパク質であるＰＴＥＮの機能を増加させ、ＮＦ−κＢの信号経路を遮断してターゲットタンパク質の発現を抑制し、動物モデルにおける有意的な乳癌の成長抑制及び骨転移抑制の効果を奏するので、乳癌の予防及び治療に役立てることができる。
【００２９】
本発明の組成物において治療上有効な量は、複数の要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって変えてもよい。よって、人体に使用する際の投与量は、安全性及び効率性を併せて考慮し、適正量を決めなければならない。動物実験を通じて決めた有効量から、ヒトに用いられるべき量を推定することも可能である。有効な量を決定する際に考慮すべきであるこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｉｍｂｉｒｄ，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ'ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．（２００１），Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及びＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．（１９９０），  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記述されている。
【００３０】
本発明の組成物は、また、生物学的製剤に通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組合せを含んでもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、組成物の生体内伝達に相応しいものであれば特に制限されることなく、例えば、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうちのいずれか１成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような主に利用される剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤として製剤化してもよい。さらには、当分野の適正な方法、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１８ｔｈ，１９９０）に開示されている方法を用い、各疾患、または各成分に応じて好ましく製剤化してもよい。
【００３１】
本発明の組成物は、さらに、同一または類似の機能を果たす有効成分を１種以上含有してもよい。本発明の組成物は、組成物の全重量に対して、前記タンパク質を０．０００１〜１０重量％の量で、好ましくは０．００１〜１重量％の量で含む。
【００３２】
本発明の組成物は、目的とする方法に応じて非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、或いは経口投与してもよく、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が様々である。本発明による組成物の一日投与量は、０．０００１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０００１〜５ｍｇ／ｍｌであり、一日一回ないし数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【００３３】
本発明のＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターの場合、０．０５〜５００ｍｇを含有することが好ましく、０．１〜３００ｍｇを含有することがより好ましく、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換えウイルスの場合、１０３〜１０１２ＩＵ（１０〜１０１０ＰＦＵ）を含有することが好ましく、１０５〜１０１０ＩＵを含有することがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３４】
また、本発明のＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む細胞の場合、１０３〜１０８個を含有することが好ましく、１０４〜１０７個を含有することがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３５】
また、本発明のＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクターまたは細胞を有効成分として含有する組成物の有効量は、体重１ｋｇ当たりのベクターの場合は、０．０５〜１２．５ｍｇ／ｋｇ、組換えウイルスの場合は、１０７〜１０１１ウイルス粒子（１０５〜１０９ＩＵ）／ｋｇ、細胞の場合は、１０３〜１０６細胞／ｋｇであり、好ましくは、ベクターの場合は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、組換えウイルスの場合は、１０８〜１０１０粒子（１０６〜１０８ＩＵ）／ｋｇ、細胞の場合は、１０２〜１０５細胞／ｋｇであり、一日２回ないし３回投与されてもよい。前記のような組成は、必ずこれに限定されるものではなく、患者の状態及び神経疾患の発病程度に応じて変えてもよい。
【００３６】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質を有効成分として含有する乳癌の予防及び改善用の健康食品を提供する。
【００３７】
本発明のＡＰ−１ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、腫瘍発生及び細胞生存に関するＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制タンパク質であるＰＴＥＮの機能を増加させ、ＮＦ−κＢの信号経路を遮断してターゲットタンパク質の発現を抑制することで、動物モデルにおける有意的な乳癌の成長抑制及び骨転移抑制の効果を奏するので、乳癌の予防及び改善用の健康食品の有効成分として役立てることができる。
【００３８】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質を有効成分として含有する乳癌転移抑制用の薬学的組成物を提供する。
【００３９】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する乳癌転移抑制用の薬学的組成物を提供する。
【００４０】
なお、ＦＳＴＬ１タンパク質、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する乳癌転移改善用の健康食品を提供する。
【００４１】
本発明の具体的な実施例において、本発明のＦＳＴＬ１は、癌転移に関する分子であるＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ及びＩＣＡＭ−１の発現を有意的に抑制することが確認された（表１及び図４を参照）。
【００４２】
従って、本発明のＡＰ−１ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、腫瘍発生、細胞増殖及び細胞生存に関するＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制剤であるＰＴＥＮの機能を増大させ、ＮＦ−κＢの信号経路を妨害し、ＮＦ−κＢターゲット遺伝子であるＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、及びＩＣＡＭ１の発現を遮断し、動物モデルにおける有意的な乳癌の成長抑制及び骨転移抑制の効果を奏するので、乳癌転移の抑制用組成物の有効成分として役立てることができる。
【００４３】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する乳癌骨転移の予防及び治療用の薬学的組成物を提供する。
【００４４】
また、本発明は、ＦＳＴＬ１タンパク質、ＦＳＴＬ１タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む細胞またはそれの培養液を有効成分として含有する乳癌骨転移の予防及び改善用の健康食品を提供する。
【００４５】
本発明のＡＰ−１ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、腫瘍発生、細胞増殖及び細胞生存に関するＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制剤であるＰＴＥＮの機能を増大させ、ＮＦ−κＢの信号経路を妨害し、ＮＦ−κＢターゲット遺伝子であるＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、及びＩＣＡＭ１の発現を遮断し、動物モデルにおける有意的な乳癌の成長抑制及び骨転移抑制の効果を奏するので、乳癌骨転移の予防及び治療用の組成物として役立てることができる。
【００４６】
前記癌は、乳癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、及び腎癌からなる群から選択されるいずれか一種以上であることが好ましく、前記癌転移は、乳癌骨転移であることが好ましいが、それに限定されるものではない。
【００４７】
前記段階１）の癌細胞は、ＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）を発現することが好ましく、前記段階２）のＦＳＴＬ１タンパク質は、ＡＫＴ活性を抑え、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）活性を増加させ、ＮＦ−κＢの信号経路を妨害することが好ましい。
【００４８】
前記段階２）のＦＳＴＬ１タンパク質の発現の程度が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ−ＰＣＲ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、及び流動細胞分析法（ＦＡＣＳ）で構成される群から選択されたいずれか一種で測定することが好ましいが、それに限定されるものではない。
【００４９】
本発明のＡＰ−１ターゲット遺伝子であるＦＳＴＬ１は、ＡＫＴ活性を抑え、腫瘍抑制タンパク質であるＰＴＥＮの活性を増加させ、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合及びターゲット遺伝子であるＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、及びＩＣＡＭ１の発現を遮断し、動物モデルにおける有意的な乳癌の成長抑制及び骨転移抑制の効果を奏するので、癌細胞におけるＦＳＴＬ１の発現を増加させる物質を選抜する場合、癌または癌転移の治療剤または治療助剤として役立てることができる。
【００５０】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
【００５１】
但し、下記実施例及び実験例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例及び実験例によって限定されるものではない。
【００５２】
＜実施例１＞  乳癌細胞株及び前立腺癌細胞株の培養
本発明に用いられた人体乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｃｅｌｌ）及び前立腺癌細胞（ＰＣ−３Ｍ  ｃｅｌｌｓ）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入した。細胞は、湿潤な５％ＣＯ２、３７℃の培養器でダルベッコ変法イーグル培地／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｈａｍ'ｓ  Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）が含まれるように細胞培養液を製造して培養した。細胞数（すなわち、Ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が１０ｃｍ培養皿の８０〜９０％程度に達した時、リン酸緩衝生理食塩水溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＰＢＳ）で２回洗い流し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を処理して細胞を継代培養するか、或いはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のためにサンプルを用意し、細胞培養液は、２〜３日ごとに交換した。
【００５３】
＜実施例２＞  転写因子ＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の標的タンパク質の確認
癌の成長及び転移と関連性があると知られている転写因子ＡＰ−１、そしてＦＳＴＬ１による細胞内の遺伝子変化パターンを分析するために、ｃ−ｊｕｎ／ＡＰ−１の優性ネガティブ突然変異（Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍｕｔａｎｔ）遺伝子またはＦＳＴＬ１クローンをレトロウイルスで形質導入されたそれぞれのＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株において発現が増加または減少する媒介遺伝子群（すなわち、Ｇｅｎｅ  ｐｏｏｌ）を、ノーザンブロット法及びｃＤＮＡマイクロアレイ分析（すなわち、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０ｇｅｎｅｃｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製を使用）によって確認した。
【００５４】
その結果、図１に示したように、ｃ−ｊｕｎ／ＡＰ−１の優性ネガティブ突然変異の導入によってＦＳＴＬ１遺伝子が上方制御発現され、対照群の乳癌細胞株では、ＦＳＴＬ１遺伝子及びタンパク質の発現が抑制されることを確認した（図１）。
【００５５】
従って、ＦＳＴＬ１タンパク質が、腫瘍抑制と相互関連性があることを確認した。
【００５６】
＜実験例１＞  ＦＳＴＬ１の抗癌活性信号経路の確認
ＦＳＴＬ１の抗癌活性信号経路を確認するために、前記＜実施例１＞で培養した乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｃｅｌｌ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３Ｍ）または対照群として空レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）で形質導入されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株（ＭＤＡ／Ｃ）に、ＦＳＴＬ１コンディション培地（５％、ｖ／ｖ）及び、Ａｋｔ信号伝逹体系の活性因子であるＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ−１）１００ｎｇ／ｍｌを処理した後、Ａｋｔ１及びＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）活性を、ウエスタンブロットを用いて確認した。一方、対照薬物としては、ＰＩ−３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３  ｋｉｎａｓｅ）抑制剤またはＡｋｔ抑制剤であるＬＹ２９４００２を用いた。
【００５７】
その結果、図２に示したように、本発明のＦＳＴＬ１コンディション培地は、Ａｋｔ１のリン酸化を抑え（図２Ａ及び図２Ｄ）、ＰＩ−３Ｋの上流側信号標的である、癌抑制因子ＰＴＥＮのリン酸化を抑えることで腫瘍抑制効果を増加させ、特に周知のＰＩ−３Ｋ抑制剤またはＡｋｔ抑制剤として知られた化合物よりも、本発明のＦＳＴＬ１コンディション培地は、Ａｋｔ１のリン酸化を有意的に抑制することが確認された（図２Ｂ）。
【００５８】
＜実験例２＞  ＦＳＴＬ１のＮＦ−κＢ信号経路調節の確認
ＦＳＴＬ１のＮＦ−κＢ信号経路を確認するために、まずは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｕ１３３Ｐｌｕｓ２．０Ｇｅｎｅｃｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘを用い、ＦＳＴＬ１によって遺伝子発現が下方調節された遺伝子を分析した。
【００５９】
その結果、下記表１に示したように、ＦＳＴＬ１によって下方調節された遺伝子は、血管新生、細胞接着／移動、細胞成長、炎症及び腫瘍形成調節などの機能を有する遺伝子であることが確認された（表１）。
【００６０】
【表１】
0006621544.tif 000002
【００６１】
また、ｍＲＮＡレベルにおいて、ＦＳＴＬ１は、ＮＦ−κＢによって調節されるサイトカインであるＩＬ−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；ＧＭ−ＣＳＦ）の発現を遮断することが確認された（図３Ａ）。
【００６２】
また、ルシフェラーゼのリポーター分析によって、ＦＳＴＬ１は、ＮＦ−κＢがサイトカインプロモータに結合することを、定量的に抑制することが確認された（図３Ｂ）。
【００６３】
また、ＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）によって、ＦＳＴＬ１は、ＮＦ−κＢの転写活性を妨害することが確認された（図３Ｃ）。しかしながら、ＦＳＴＬ１は、ＴＮＦ−α依存的信号経路に従うものではないことが確認された。ＦＳＴＬ１処理によって、ＩκＢαを分解するばかりか、Ａｋｔ及びＩκＢαのリン酸化の損傷を確認した。
【００６４】
従って、ＦＳＴＬ１は、Ａｋｔ−媒介のＮＦ−κＢ信号誘導を調節することができ、乳癌骨転移の抑制因子として役割を果たせることが確認された。
【００６５】
＜実験例３＞  ＦＳＴＬ１のＮＦ−κＢ信号経路抑制効果の確認
ＦＳＴＬ１−媒介の様々な分子（ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１）の発現を分析した。前記分子は、ＮＦ−κＢによって調節されるものであり、転移に関する浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、血管新生及び細胞付着に関する。特に、ＭＭＰ−９は、腫瘍血管新生及び転移のみならず、乳癌の活性を促す癌に必要な成長因子の活性に関するものである。それに、ＭＭＰ−９は、破骨細胞によって発現され、破骨細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に必要である。よって、ＭＭＰ−９は、骨吸収に関する破骨細胞微細環境において重要な役割を果たす。
【００６６】
そこで、前記＜実施例２＞で製造したＦＳＴＬ１を発現する乳癌細胞株及び対照群の乳癌細胞株を用いてＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、ＩＣＡＭ−１の発現変化を、免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）及び酵素電気泳動法（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いて分析した。
【００６７】
その結果、図４に示したように、本発明のＦＳＴＬ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、前記因子のいずれも有意的に抑制し（図４Ａ）、ＦＳＴＬ１−媒介の浸潤能力を、約７９％以上著しく減少させることが確認された（図４Ｂ）。
【００６８】
＜実験例４＞  動物モデルにおけるＦＳＴＬ１の効果確認
＜４−１＞  実験動物の用意
ヌードマウスは、ＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ（Ｋｏｒｅａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ）を基本種とし、２０匹のいずれも生後６〜８週、体重が約２０ｇの雌のみを用いた。滅菌消毒されたマウスケージで滅菌された水及び飼料を供給し、層流（ｌａｍｉｎａ  ｆｌｏｗ）を持続的に維持したクリーンベンチの中に置くことで清浄な環境を維持し、すべての術式もまた、クリーンベンチの中で施した。ヌードマウスの昼夜間の生物学的サイクルのために、室内灯を１２時間にかけて照影し、１２時間にかけて点滅した。
【００６９】
＜４−２＞  腫瘍成長抑制効果の確認
前記実験例＜４−１＞で用意したヌードマウスに、前記＜実施例２＞で用意したＦＳＴＬ１を発現する乳癌細胞株を、１ｃｃの注射器及び２５ゲージの注射針を用いてヌードマウスの背中に皮下注射接種した後、対照群の乳癌細胞株を移植したヌードマウスと腫瘍の体積を測定した。腫瘍の体積は、長さ及び幅をカリパスで３日に一回ずつ測定し、Ｇｕｔｍａｎなどが提案した方法の公式によって腫瘍の体積を算出した。
【００７０】
その結果、図５Ａに示したように、ＦＳＴＬ１を発現する乳癌細胞株が移植されたマウスは、腫瘍の成長が有意的に抑制されることが確認された（図５Ａ）。
【００７１】
＜４−３＞  溶骨性骨転移抑制の効果の確認
図５Ｂに示したように、本発明のＦＳＴＬ１は、骨転移を約６７％以上抑制することが確認された（図５Ｂ）。
【００７２】
＜実験例５＞  ＦＳＴＬ１の破骨細胞形成（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制効果の確認
＜５−１＞  マウス骨髄細胞の培養
ＩＣＲマウス（６〜９週、雄）を頚椎脱骨した後、７０％のエタノールで消毒した。脛骨部分の肌を切開して付着筋肉を剥離した。脛骨遠心部を切断して膝蓋骨を脱骨させることで脛骨を摘出した。骨の両端を僅かに切って一方の端に２５Ｇの注射針をさし、α−ＭＥＭを流して骨髄細胞を試験管に集めた。遠心分離した後、α−ＭＥＭに懸濁して２倍のＧｅｙ'ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えることで赤血球を除去した。遠心分離した後、１０％のＦＢＳが含有されたα−ＭＥＭで再懸濁した。
【００７３】
＜５−２＞  破骨細胞形成（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の抑制効果の確認
前記＜５−１＞で培養した骨髄細胞を、９６のウェルプレートに１×１０３個で接種した。それから、本発明のＦＳＴＬ１のＣＭを前処理した後、ランクリガンドを処理して５％ＣＯ２のインキュベーターで培養してから７日後、破骨細胞をよく観察できるようにＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色法を用いて染色した後、破骨細胞に分化された細胞の数を計数することで、ＦＳＴＬ１のＣＭの破骨細胞分化の抑制程度を確認した。
【００７４】
その結果、図６に示したように、本発明のＦＳＴＬ１のＣＭは、破骨細胞形成を有意的に抑制することが確認された（図６）。
【図１】
0006621544.tif 000003
【図２】
0006621544.tif 000004
【図３】
0006621544.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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