(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細構造を含む三次元構造を有する人工組織の作製方法であって、
実質細胞を含む細胞構造体を有する複数個の伸展した実質細胞組織を準備する、実質細胞組織準備工程；
前記微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織を準備する、非実質細胞組織準備工程；
前記複数個の伸展した実質細胞組織と前記微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを、非実質細胞組織のそれぞれが伸展した実質細胞組織の間に挟持されるように積層する、細胞組織積層工程；
前記細胞組織積層工程で得られた微細構造を含む三次元構造を有する細胞組織の積層体を、30％以下の収縮率で収縮させる、収縮工程；
を含み、
前記実質細胞が、線維芽細胞であり、
前記非実質細胞が、血管内皮細胞であり、
前記微細構造が、血管網である、前記方法。
【請求項２】
前記収縮工程において、20〜30％の範囲の収縮率で積層体を収縮させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞組織積層工程において、ゼラチンゲルを支持体として、前記複数個の伸展した実質細胞組織と前記微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを積層し、
前記収縮工程において、ゼラチンゲルを加熱溶解させることにより、伸展した細胞組織の積層体を収縮させる、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記収縮工程において、積層体を、ウシ胎児血清（FBS）、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、アスコルビン酸、ヘパリン、ヒドロコルチゾン及びインスリン様成長因子からなる群より選択される一種以上の成長因子の存在下で培養する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制御された微細構造を含む三次元構造を有する人工組織の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の組織又は器官（例えば臓器）を模倣した三次元構造を有する人工組織は、創薬分野及び再生医療分野への応用が期待されている。三次元構造を有する人工組織は、通常は、細胞を高密度に集合させることによって形成される。このような三次元構造を有する人工組織を作製する場合における最大の課題は、人工組織の内部の細胞に、生存に必要となる酸素及び栄養素を供給し、且つ／又は細胞が産生する機能性物質及び老廃物を人工組織の外部へ効率的に放出するための血管網のような微細構造の導入である。血管網は、生体の組織又は器官において、その維持及び機能発現に必要とされる特定の密度、並びに特定の形態のネットワーク構造を有している。生体の組織又は器官における微細構造としては、血管網に加え、肝臓における肝小葉、及び腎臓におけるネフロンのような、組織又は器官の機能発現に不可欠な複数種の細胞を含む微細構造を挙げることができる。人工組織において、このような微細構造を任意の形状で設計し、且つ導入することが可能となれば、三次元構造を有する大型の人工組織を効率的に作製することができる。このような微細構造を含む三次元構造を有する大型の人工組織は、再生医療分野において、特定の機能を備える移植材料として使用することができるだけでなく、創薬分野において、様々な病態を再現する組織又は器官のモデルとして薬理試験に適用することができる。
【０００３】
三次元構造を有する人工組織の作製方法として、いくつかの技術が開発された。例えば、特許文献1は、基材と、前記基材上に配置され、細胞接着性を有し、且つ、刺激により細胞非接着性を発現し得る刺激応答性材料を含む刺激応答性層と、前記基材上にパターン状に配置され、細胞非接着性を有する細胞接着阻害材料を含む細胞接着阻害層と、を有し、前記細胞接着阻害層の表面が、前記刺激応答性層の表面に対して高くなるように形成され、前記細胞接着阻害層の高さの下限が、血管内皮細胞が乗り越えることができない高さであり、上限が、前記刺激応答性層上に形成されたマイクロパターン化血管内皮細胞が回収可能な高さであることを特徴とするマイクロパターン化血管内皮細胞転写基板を記載する。当該文献はまた、マイクロパターン化血管内皮細胞を少なくとも含む人工組織の製造方法であって、前記マイクロパターン化血管内皮細胞転写基板を準備し、前記刺激応答性層が細胞接着性を発現している条件で、前記刺激応答性層上に前記血管内皮細胞を播種・培養することにより前記マイクロパターン化血管内皮細胞を形成するマイクロパターン化血管内皮細胞形成工程と、前記マイクロパターン化血管内皮細胞形成工程後の前記刺激応答性層が細胞非接着性を発現している条件で、前記マイクロパターン化血管内皮細胞と細胞接着性を有する細胞接着層を含む細胞回収層とを接触させることにより、前記マイクロパターン化血管内皮細胞を前記細胞回収層に転写する血管内皮細胞転写工程と、を有することを特徴とする人工組織の製造方法を記載する。
【０００４】
特許文献2は、細胞組織を形成するための材料を含む溶液を保持するための少なくとも１つの容器と、パターニングを行う対象である基板と、前記容器に電圧を印加する電圧印加部と、容器と基板との間に配置され、アースされ、穴が形成された平板電極と、を備えた静電インクジェット方式を用いた、基板上に細胞組織のパターニングを行うパターン生成装置を用いて、前記電圧印加部によって前記容器と前記平板電極の間に0.5 kv〜5 kvの電圧が印加されることによって、前記容器と前記平板電極との間に電界が発生し、静電インクジェット現象により前記容器から前記溶液が吐出され、吐出された溶液が前記平板電極に形成された穴を通過して前記基板上に付着することにより、基板上に細胞組織をパターニングし、細胞が生存した状態で、三次元構造を有する細胞組織を作製する方法であって、基板上にスキャホールドと細胞を吐出しスキャホールドと細胞が接触するように基板上に付着させパターニングする工程を含み、隣接する細胞同士が接着しており、三次元構造がスキャホールドにより維持された、細胞が生存した状態で、三次元構造を有する細胞組織を作製する方法を記載する。
【０００５】
非特許文献1は、温度変化に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な温度応答性ポリマーが被覆された温度応答性培養皿を用いて作製された線維芽細胞を含む細胞シートの線維芽細胞層と、特定のパターン形状に配置された血管内皮細胞を含む細胞シートの血管内皮細胞層とを任意の層数及び順序で積層することによって、血管網様の微細構造を含む三次元構造を有する人工組織を作製した結果を記載する。
【０００６】
非特許文献2は、温度応答性ポリマーが被覆された温度応答性培養皿を用いる自動化された細胞シート積層装置を用いて、3層又は5層のヒト骨格筋筋芽細胞層を積層した三次元構造を有する人工組織を作製した結果を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2011-223944号公報
【特許文献２】特許第5540304号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】M. Muraokaら, Biomaterials, 第34巻, 2013年, p. 696‐703
【非特許文献２】T. Kikuchiら, Biomaterials, 第35巻, 2014年, p. 2428-2435
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記のように、三次元構造を有する人工組織を作製する方法が知られている。しかしながら、従来技術の方法には改善すべき点が存在した。例えば、従来技術においては、血管網のような微細構造を、人工組織の三次元構造において所望の位置に安定的に導入することは困難であった。非特許文献1に記載の方法の場合、人工組織の内部において、パターン形状の微細構造を形成するように配置された血管内皮細胞が、他の細胞と相互作用することによって活発に遊走することが報告されている。この結果、当該文献に記載の方法で作製された人工組織においては、導入された微細構造を数日以上の長期間に亘って維持することが困難であった。このような現象は、非特許文献1に記載の方法において、血管内皮細胞以外の細胞を用いた場合であっても発生する可能性がある。
【００１０】
それ故、本発明は、所定の微細構造を一定期間維持し得る、微細構造を含む三次元構造を有する人工組織を作製する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決するための手段を種々検討した結果、細胞培養支持体の表面に接着し且つ伸展した、実質細胞を含む細胞構造体を有する実質細胞組織と、所定の微細構造の形状に対応した鋳型を有する細胞培養支持体の表面に接着し且つ伸展した、微細構造を有する、血管内皮細胞を含む細胞構造体を有する非実質細胞組織とを積層した後、収縮させることにより得られた微細構造を含む三次元構造を有する人工組織は、非実質細胞組織の微細構造を数日間に亘って維持し得ることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（1）  微細構造を含む三次元構造を有する人工組織の作製方法であって、
実質細胞を含む細胞構造体を有する複数個の伸展した実質細胞組織を準備する、実質細胞組織準備工程；
前記微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織を準備する、非実質細胞組織準備工程；
前記複数個の伸展した実質細胞組織と前記微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを、非実質細胞組織のそれぞれが伸展した実質細胞組織の間に挟持されるように積層する、細胞組織積層工程；
前記細胞組織積層工程で得られた微細構造を含む三次元構造を有する細胞組織の積層体を収縮させる、収縮工程；
を含む、前記方法。
（2）  前記実質細胞が、がん細胞、肝細胞、上皮細胞、線維芽細胞、壁細胞、心筋細胞、筋芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及びグリア細胞、並びにこれらの細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞からなる群より選択される1種以上の細胞である、前記（1）に記載の方法。
（3）  前記非実質細胞が、内皮細胞、神経細胞、視細胞、腺上皮細胞及び膵島細胞、並びにこれらの細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞からなる群より選択される1種以上の細胞である、前記（1）又は（2）に記載の方法。
（4）  前記収縮工程において、30％以下の収縮率で積層体を収縮させる、前記（1）〜（3）のいずれかに記載の方法。
（5）  前記微細構造が、血管網、リンパ管網、肝小葉、ネフロン、脳神経回路、神経筋接合部、骨組織、軟骨組織、内分泌腺、網膜及び幹細胞培養のための微小構造体からなる群より選択される1種以上の微細構造である、前記（1）〜（4）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、所定の微細構造を一定期間維持し得る、微細構造を含む三次元構造を有する人工組織を作製する手段を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、実施例1〜3の人工組織を作製するために使用された微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体を示す図である。A：微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体の上面図；B：微細構造の鋳型である複数のストライプ状の温度応答性領域の模式図。
【図２】図2は、ゼラチンスタンプ法による細胞組織の積層工程及び収縮工程の手順を示す模式図である。
【図３】図3は、実施例1及び2の同一箇所における3層の人工組織の積層及び収縮直後の蛍光画像（赤色）、並びに積層及び収縮後5日目の蛍光画像（緑色）の重ね合わせ画像である。A：実施例1の画像；B：実施例2の画像。スケールバーは200 μmを表す。
【図４】図4は、実施例1の人工組織における1層目の線維芽細胞組織（赤色）、2層目のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織（緑色）及び3層目の線維芽細胞組織（赤色）の蛍光画像の重ね合わせ画像である。A：積層及び収縮直後の蛍光画像；B：積層及び収縮から12時間後の蛍光画像。スケールバーは200 μmを表す。
【図５】図5は、実施例1〜3の2層目のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織の、同一箇所における積層及び収縮直後から5日目までの蛍光画像である。A：実施例1の蛍光画像；B：実施例2の蛍光画像；C：実施例3の蛍光画像。スケールバーは200 μmを表す。
【図６】図6は、実施例1の2層目のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織の、同一箇所における積層及び収縮直後から5日目までの蛍光画像、並びに該蛍光画像の二値化画像である。A：蛍光画像；B：二値化画像。
【図７】実施例1の人工組織において、タイムラプス観察によって得られた画像の画像相関分析による相関係数の経時変化を示す図である。
【図８】実施例1の人工組織の積層工程及び収縮工程後5日目の三次元蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書では、適宜図面を参照して本発明の特徴を説明する。図面では、明確化のために各部の寸法及び形状を誇張しており、実際の寸法及び形状を正確に描写してはいない。それ故、本発明の技術的範囲は、これら図面に表された各部の寸法及び形状に限定されるものではない。
【００１６】
＜1：人工組織の作製方法＞
本発明は、微細構造を含む三次元構造を有する人工組織の作製方法に関する。本発明において、「微細構造」は、生体の組織又は器官（例えば臓器）において、その維持及び機能発現に必要とされる特定のパターン形状を有する構造を意味する。前記微細構造としては、例えば、血管網、リンパ管網、肝小葉、ネフロン、脳神経回路、神経筋接合部、骨組織、軟骨組織、各種内分泌腺、網膜、及び幹細胞培養のための微小構造体を挙げることができる。従来技術の方法によって作製された微細構造を含む三次元構造を有する人工組織においては、該微細構造を数日以上の長期間に亘って維持することが困難であった（M. Muraokaら, Biomaterials, 第34巻, 2013年, p. 696‐703）。本発明者らは、以下において説明する本発明の方法によって作製された微細構造を含む三次元構造を有する人工組織は、微細構造を数日間に亘って維持し得ることを見出した。それ故、本発明の方法により、従来技術の方法を上回る長期間に亘って微細構造を維持し得る人工組織を作製することができる。
【００１７】
本発明の方法によって作製される人工組織において、前記微細構造は、生体の組織又は器官におけるものと実質的に同等の構造及び機能を有する成熟状態であってもよく、将来的に同等の構造及び機能を発現する能力を有する未成熟状態であってもよい。成熟状態の微細構造の形状は、例えば、管腔状の形状であり、その場合、未成熟状態の微細構造の形状は、将来的に管腔を形成し得る形状、例えば、ストライプ状のシート形状である。例えば、微細構造が血管網である場合、成熟状態の微細構造は、血管内皮細胞からなる血管様の管腔状の形状を有することが好ましく、未成熟状態の微細構造は、血管内皮細胞からなるストライプ状のシート形状を有することが好ましい。微細構造がリンパ管網である場合、成熟状態の微細構造は、リンパ管内皮細胞からなるリンパ管様の管腔状の形状を有することが好ましく、未成熟状態の微細構造は、リンパ管内皮細胞からなるストライプ状のシート形状を有することが好ましい。
【００１８】
本発明の方法は、実質細胞組織準備工程、非実質細胞組織準備工程、細胞組織積層工程及び収縮工程を含む。本発明の方法はまた、場合により、実質細胞組織形成工程及び非実質細胞組織形成工程をさらに含む。以下、本発明の方法の各工程を詳細に説明する。
【００１９】
［1-1：実質細胞組織準備工程］
本発明の方法は、実質細胞を含む細胞構造体を有する複数個の伸展した実質細胞組織を準備する、実質細胞組織準備工程を含むことが必要である。
【００２０】
本発明において、「実質細胞」は、組織又は器官内で大多数を占める基質を構成する細胞を意味する。本工程において使用される実質細胞としては、例えば、各種間葉系細胞及びグリア細胞等、並びにこれらの細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を挙げることができる。実質細胞は、各種がん細胞、肝細胞、上皮細胞、線維芽細胞、壁細胞、心筋細胞、筋芽細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及びグリア細胞、並びにこれらの細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞からなる群より選択される1種以上の細胞であることが好ましく、線維芽細胞であることがより好ましい。本工程において使用される実質細胞は、生体の組織又は器官から直接採取した初代細胞系に由来する細胞でもよく、該初代細胞を何代か継代させた継代細胞系に由来する細胞であってもよい。細胞が由来する動物も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ又はヒツジ等の動物に由来する細胞を使用することができる。本工程において使用される実質細胞が線維芽細胞であり、以下において説明する非実質細胞組織準備工程において使用される非実質細胞が血管内皮細胞である場合、本発明の方法によって、微細構造として血管網を有する人工組織を作製することができる。
【００２１】
本発明において、「細胞構造体」は、細胞同士が細胞外マトリクスを介して細胞間接着を形成することによって生じる、複数の細胞からなる細胞の集合体を意味する。本工程又は以下において説明する非実質細胞組織準備工程において準備される実質細胞組織又は非実質細胞組織を構成する細胞構造体は、複数の細胞が平面状に配列することによって形成される二次元構造を有していてもよく、平面状に配列した複数の細胞の上方及び／又は下方にさらに複数の細胞が配列することによって形成される三次元構造を有していてもよい。本発明の方法において、細胞構造体としては、例えば、二次元構造を有するシート状の形態（以下、「細胞シート」とも記載する）を挙げることができる。実質細胞組織及び非実質細胞組織を構成する細胞構造体がいずれも細胞シートの形態である場合、本発明の方法により、微細構造を有する細胞シートからなる非実質細胞組織が複数個の細胞シートからなる実質細胞組織の間に挟持されるように積層された三次元構造を有する人工組織を作製することができる。
【００２２】
本発明において、「伸展した」又は「伸展する」は、複数の細胞を含む細胞構造体及び該細胞構造体を有する細胞組織において、平面状に配列した複数の細胞同士が、細胞間接着を維持しつつ、細胞培養支持体に接着して接着斑を形成する等の方法で細胞骨格が一定方向に延伸されることにより、浮遊時の球形から紡錘系などの非対称な形状に変形した形態で配置される状態を意味する。伸展した細胞構造体及び細胞組織は、以下において説明するように、細胞培養支持体の表面に細胞を播種し、適切な培地中で該実質細胞をコンフルエントとなるまで培養することにより、得ることができる。このような方法で得られる伸展した細胞構造体及び細胞組織は、前記細胞培養支持体の表面又は他の支持体の表面に接着することにより、伸展した状態を維持し得る。
【００２３】
本工程において準備される伸展した実質細胞組織は、伸展した細胞構造体を有する。前記伸展した実質細胞組織は、1個の伸展した細胞構造体からなっていてもよく、複数個の伸展した細胞構造体を有してもよい。いずれの場合も、本工程の実施形態に包含される。
【００２４】
伸展した実質細胞組織を構成する伸展した細胞構造体は、細胞シートの形態であることが好ましい。この場合、細胞シートの表面の形状は特に限定されない。本発明の方法によって作製される人工組織の形状に基づき、円形（例えば真円形若しくは楕円形）、及び三角形、四角形（例えばストライプ状の長方形若しくは正方形）、五角形又は六角形等の多角形からなる群より選択される形状から適宜選択される。伸展した実質細胞組織が細胞シートの形態である伸展した細胞構造体からなる場合、以下において説明する細胞組織積層工程を容易に実施することができる。
【００２５】
本工程において、伸展した実質細胞組織を準備する手段は特に限定されない。例えば、以下において説明する実質細胞組織形成工程を実施することにより、実質細胞組織を自ら作製してもよく、予め作製された実質細胞組織を購入等して準備してもよい。いずれの場合も、本工程の実施形態に包含される。
【００２６】
［1-2：非実質細胞組織準備工程］
本発明の方法は、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織を準備する、非実質細胞組織準備工程を含むことが必要である。
【００２７】
本発明において、「非実質細胞」は、生体の組織又は器官を構成する細胞のうち、組織又は器官の最小機能単位を構成する細胞であって、実質細胞に包含されない細胞を意味する。本工程において使用される非実質細胞としては、例えば、各種内皮細胞、神経細胞、視細胞、上皮細胞及び膵島細胞等、並びにこれらの細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞を挙げることができる。非実質細胞は、内皮細胞、神経細胞、視細胞、腺上皮細胞及び膵島細胞、並びにこれらの細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞からなる群より選択される1種以上の細胞であることが好ましく、血管内皮細胞であることがより好ましい。本工程において使用される非実質細胞は、生体の組織又は器官から直接採取した初代細胞系に由来する細胞でもよく、該初代細胞を何代か継代させた継代細胞系に由来する細胞であってもよい。細胞が由来する動物も特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ又はヒツジ等の動物に由来する細胞を使用することができる。本工程において使用される非実質細胞が血管内皮細胞であり、実質細胞組織準備工程において使用される実質細胞が線維芽細胞である場合、本発明の方法によって、微細構造として血管網を有する人工組織を作製することができる。
【００２８】
本工程において準備される非実質細胞組織は、本発明の方法によって作製される人工組織に含まれる微細構造を有する。前記微細構造としては、例えば、血管網、リンパ管網、肝小葉、ネフロン、脳神経回路、神経筋接合部、骨組織、軟骨組織、各種内分泌腺、網膜、及び幹細胞培養のための微小構造体を挙げることができる。前記微細構造は、生体の組織又は器官におけるものと実質的に同等の構造及び機能を有する成熟状態であってもよく、将来的に同等の構造及び機能を発現する能力を有する未成熟状態であってもよい。本工程において準備される非実質細胞組織は、管腔状の形状を有する成熟状態の微細構造、又は将来的に管腔を形成し得る形状、例えば、ストライプ状のシート形状を有する未成熟状態の微細構造を有することが好ましい。例えば、微細構造が血管網である場合、成熟状態の微細構造は、血管内皮細胞からなる血管様の管腔状の形状を有することが好ましく、未成熟状態の微細構造は、血管内皮細胞からなるストライプ状のシート形状を有することが好ましい。微細構造がストライプ状のシート形状を有する未成熟状態の場合、該ストライプの具体的な形状は特に限定されない。未成熟状態の微細構造は、例えば、直線状、曲線状、分岐状若しくは網目状、又はそれらの組み合わせの形状であるストライプ状のシート形状を有することができる。また、未成熟状態の微細構造は、前記形状である複数のストライプ状のシートが、その全体又は一部分において、互いに平行状態又は交差状態となるように配置された形状であってもよい。未成熟状態の微細構造は、例えば、複数の直線状のストライプ状のシートがその全体において互いに平行状態となるように配置された形状である。非実質細胞組織に含まれる微細構造が前記形状を有する未成熟状態の微細構造である場合、本発明の方法によって作製される人工組織において、該未成熟状態の微細構造は、管腔状の形状を有する成熟状態の微細構造に発達することができる。
【００２９】
本工程において準備される伸展した実質細胞組織は、微細構造を有する伸展した細胞構造体を有する。前記伸展した非実質細胞組織は、微細構造を有する1個の伸展した細胞構造体からなっていてもよく、微細構造を有する複数個の伸展した細胞構造体の組み合わせを有してもよい。いずれの場合も、本工程の実施形態に包含される。例えば、未成熟状態の微細構造が、複数の直線状のストライプ状のシート形状を有する場合、微細構造を有する伸展した非実質細胞組織は、複数個の伸展した直線状のストライプ状のシート形状を有する細胞構造体の組み合わせを有する。
【００３０】
伸展した非実質細胞組織を構成する伸展した細胞構造体は、細胞シートの形態であることが好ましい。この場合、細胞シートの表面の形状は、微細構造の形状に基づき、円形（例えば真円形若しくは楕円形）、及び三角形、四角形（例えばストライプ状の長方形若しくは正方形）、五角形又は六角形等の多角形からなる群より選択される形状から適宜選択される。伸展した非実質細胞組織が細胞シートの形態である伸展した細胞構造体を有する場合、以下において説明する細胞組織積層工程を容易に実施することができる。
【００３１】
本工程において、伸展した微細構造を有する非実質細胞組織を準備する手段は特に限定されない。例えば、以下において説明する非実質細胞組織形成工程を実施することにより非実質細胞組織を自ら作製してもよく、予め作製された非実質細胞組織を購入等して準備してもよい。いずれの場合も、本工程の実施形態に包含される。
【００３２】
［1-3：実質細胞組織形成工程］
本発明の方法は、場合により、実質細胞を細胞培養支持体の表面で培養して、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を形成する、実質細胞組織形成工程を含むことができる。
【００３３】
本工程は、当該技術分野で通常使用される細胞シートの形態である細胞構造体の作製方法を適用することにより、実施することができる。本工程は、例えば、細胞培養容器の培養面に細胞培養支持体を配置するサブ工程、該細胞培養支持体の表面に実質細胞を播種するサブ工程、該実質細胞を培養して、実質細胞を含む伸展した細胞構造体を形成させるサブ工程、及び実質細胞を含む伸展した細胞構造体を細胞培養支持体から剥離して、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を得るサブ工程により、実施することができる。この場合、実質細胞は、コンフルエントとなるまで培養することが好ましい。実質細胞がコンフルエントとなるまで培養することにより、細胞培養支持体の表面に接着し且つ伸展した細胞構造体を有する、伸展した実質細胞組織を得ることができる。
【００３４】
本工程において、実質細胞を播種する条件、並びに実質細胞を培養する培地及び外部環境（例えば、温度、湿度、光周期又はCO2濃度）等の培養条件は、使用される実質細胞の種類に基づき、当該技術分野で通常使用される播種条件及び培養条件を適宜適用することができる。
【００３５】
本工程において、培養皿又は培養フラスコのような形状を有する当該技術分野で通常使用される各種の細胞培養容器を使用することができる。結果として得られる伸展した実質細胞組織を容易に回収できることから、培養皿の形状を有する細胞培養容器を使用することが好ましい。細胞培養容器を形成する材料は、当該技術分野において細胞シートの形態である細胞構造体の作製に通常使用される各種の材料から適宜選択することができる。細胞培養容器を形成する材料としては、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ABS樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、並びにガラス及び石英等の無機材料を挙げることができる。前記樹脂材料は、所望により、1種以上のさらなる樹脂材料を組み合わせて使用してもよい。また、前記樹脂材料は、所望により、表面の親水化処理等の後処理を施してもよい。本工程において使用される細胞培養容器を形成する材料は、前記群より選択される少なくとも1種の樹脂材料であることが好ましく、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることがより好ましい。
【００３６】
細胞培養容器の培養面に細胞培養支持体を配置するサブ工程は、当該技術分野で通常使用される細胞培養支持体を使用することにより、実施することができる。本サブ工程は、例えば、細胞培養容器の培養面の少なくとも一部に、別の部材として準備した細胞培養支持体を載置することによって実施してもよく、細胞培養容器の培養面の少なくとも一部を細胞培養支持体として使用することによって実施してもよい。後者の実施形態の場合、例えば、細胞培養容器の培養面の少なくとも一部を細胞培養支持体の材料によって形成する、又は細胞培養容器の培養面の少なくとも一部に細胞培養支持体の材料を被覆することによって、培養面の少なくとも一部を細胞培養支持体として使用し得る細胞培養容器を準備することができる。
【００３７】
細胞培養支持体を形成する材料は、当該技術分野において細胞シートの形態である細胞構造体の作製に通常使用される各種の材料から適宜選択することができる。細胞培養支持体を形成する材料としては、例えば、金属、ガラス、セラミック、樹脂及びエラストマー等、並びにこれらの複合材料を挙げることができる。前記樹脂材料としては、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリスチレン（PS）、ポリカーボネート（PC）、TAC（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（PI）、ナイロン（Ny）、低密度ポリエチレン（LDPE）、中密度ポリエチレン（MDPE）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン及びアクリル等を挙げることができる。また、前記樹脂材料は、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸若しくはポリカプロラクタン、又はそれらの共重合体のような生体親和性ポリマーであってもよい。細胞培養支持体を形成する材料が前記生体親和性ポリマーである場合、本工程で得られる実質細胞組織を用いて作製される人工組織を、安全性の高い移植材料とすることができる。
【００３８】
実質細胞を含む伸展した細胞構造体を細胞培養支持体から剥離して、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を得るサブ工程において、実質細胞を含む伸展した細胞構造体を細胞培養支持体から剥離する手段は、特に限定されない。例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、ディスパーゼ、エラスターゼ又はヒアルロニダーゼのような1種類以上のタンパク質分解酵素によって、細胞培養支持体の表面に接着し且つ伸展した細胞構造体を処理する手段を挙げることができる。前記手段により、細胞外マトリクスによる接着を切断して、細胞構造体を細胞培養支持体の表面から剥離させて、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を得ることができる。この実施形態の場合、1種類以上のタンパク質分解酵素による処理の条件は、使用される実質細胞及び酵素の組合せに応じて、適宜設定することができる。
【００３９】
或いは、その表面の少なくとも一部に、所定の刺激に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な刺激応答性ポリマーを含む領域を有する細胞培養支持体を用いる手段を挙げることができる。前記手段により、所定の刺激を付与して細胞構造体を細胞培養支持体の表面から剥離させて、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を得ることができる。本工程において使用される細胞培養支持体は、その表面の少なくとも一部に、所定の刺激に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な刺激応答性ポリマーを含む領域を有することが好ましい。本発明において、「刺激応答性ポリマー」は、細胞を培養する条件（例えば、温度、pH、イオン強度又は光強度）では細胞接着性を示す状態であるが、所定の刺激に応答して細胞非接着性を示す状態に変化するポリマーを意味する。本工程において使用される刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、pH応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー及び光応答性ポリマーを挙げることができる。刺激の付与が容易であることから、温度応答性ポリマーを含む領域を有する細胞培養支持体を使用することが好ましい。刺激応答性ポリマーを含む領域をその表面の少なくとも一部に有する細胞培養支持体を用いて本工程を実施することにより、所定の刺激を付与して、伸展した実質細胞組織を該細胞培養支持体から容易に剥離させることができる。
【００４０】
本工程において使用される細胞培養支持体において、刺激応答性ポリマーは、該細胞培養支持体の表面の略全面を覆うように配置されていてもよく、該表面の少なくとも一部を覆うように配置されていてもよい。いずれの場合も、本発明の実施形態に包含される。
【００４１】
本発明において、「細胞接着性」及び「細胞非接着性」は、細胞培養支持体の一の表面領域と他の表面領域とにおける細胞の接着度合いの相対的な強さを意味し、典型的には、「細胞接着性」は、細胞が接着しやすい表面特性を意味する。細胞接着性は、通常は、細胞培養支持体の表面の化学的性質及び／又は物理的性質等に起因して、細胞の接着及び／又は伸展が起こりやすいか否かに基づき、決定される。細胞培養支持体の細胞接着性を判断する指標としては、例えば、実際に該細胞培養支持体の表面で細胞を培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。本発明において、刺激応答性ポリマーを含む領域が細胞接着性を示す状態の場合、該刺激応答性ポリマーを含む領域の表面は、細胞接着伸展率が60％以上であることが好ましく、細胞接着伸展率が80％以上であることがより好ましい。刺激応答性ポリマーを含む領域の細胞接着伸展率が高い場合、効率的に細胞を培養することができる。また、刺激応答性ポリマーを含む領域が細胞非接着性を示す状態の場合、該刺激応答性ポリマーを含む領域の表面は、細胞接着伸展率が60％未満であることが好ましく、40％未満であることがより好ましく、5％以下であることがさらに好ましく、2％以下であることが特に好ましい。
【００４２】
なお、細胞接着性の指標となる細胞接着伸展率は、例えば、以下の方法で決定することができる。培養しようとする細胞を、4000〜30000 cells/cm2の範囲の初期播種密度で測定対象表面に播種した後、37℃、5％のCO2濃度の条件下で培養する。培養開始3時間後に、培地交換を行い、接着していない細胞を除去した後、細胞が接着している数箇所を観察する。細胞接着伸展率を、次の式：（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×100（％））に基づき算出する。
【００４３】
前記温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマー及びメタクリル系ポリマーを挙げることができ、例えば、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド（PNIPAAm）（下限臨界溶解温度、Tc=32℃）、ポリ-N-n-プロピルアクリルアミド（Tc=21℃）、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド（Tc=32℃）、ポリ-N-エトキシエチルアクリルアミド（Tc=約35℃）、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Tc=約28℃）、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Tc=約35℃）及びポリ-N,N-ジエチルアクリルアミド（Tc=32℃）等を挙げることができる。前記温度応答性ポリマーは、前記ポリマーを形成し得るモノマーの2種以上を共重合させることによって形成される共重合体であってもよい。前記温度応答性ポリマーは、PNIPAAm、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド又はポリ-N,N-ジエチルアクリルアミドであることが好ましく、PNIPAAmであることがより好ましい。前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した好ましい範囲のTcを有する。それ故、前記温度応答性ポリマーを用いる場合、本工程において細胞を培養する際に、細胞の損傷を可能な限り少なくすることができる。
【００４４】
前記温度応答性ポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることが好ましい。前記モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、N-（若しくはN,N-ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体及びビニルエーテル誘導体等を挙げることができる。前記モノマーを単独で使用して重合する場合、得られる温度応答性ポリマーはホモポリマーの形態となり、前記モノマーの2種以上を使用して共重合する場合、得られる温度応答性ポリマーは共重合体（コポリマー又はヘテロポリマー）の形態となる。いずれの形態の温度応答性ポリマーであっても、本工程に使用することができる。
【００４５】
前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した1種以上のモノマーと、前記以外のさらなるモノマーとを共重合することによって形成される共重合体であってもよい。或いは、前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した1種以上のモノマーを重合又は共重合することによって形成される重合体又は共重合体と、さらなる重合体又は共重合体とをグラフト重合又はブロック重合することによって形成される、グラフト共重合体又はブロック共重合体であってもよい。或いは、前記温度応答性ポリマーは、前記で説明した1種以上の重合体又は共重合体の混合物の形態であってもよい。これらの形態の場合、使用される材料を適宜選択することにより、Tcを所望の範囲に調整することができる。
【００４６】
本工程において、細胞培養支持体から剥離した実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を回収する手段は、特に限定されない。例えば、ピンセット、アスピレーター又はピペット等を用いて、細胞培養支持体の表面から、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を回収することができる。或いは、ゼラチンゲルを支持体として細胞又は細胞シートのような細胞構造体を回収する公知の方法（以下、「ゼラチンスタンプ法」とも記載する）（Y. Tsudaら, Biomaterials 第28巻, (2007) p. 4939-4946）を適用して、細胞培養支持体の表面から、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を回収することができる。以下において説明する細胞組織積層工程を連続的に実施できることから、ゼラチンスタンプ法を用いて、実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した実質細胞組織を回収することが好ましい。
【００４７】
［1-4：非実質細胞組織形成工程］
本発明の方法は、場合により、非実質細胞を細胞培養支持体の表面で培養して、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した非実質細胞組織を形成する、非実質細胞組織形成工程を含むことができる。
【００４８】
本工程は、当該技術分野で通常使用される細胞シートの形態である細胞構造体の作製方法を適用することにより、実施することができる。本工程は、例えば、細胞培養容器の培養面に、微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体を配置するサブ工程、該微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体の表面に非実質細胞を播種するサブ工程、該非実質細胞を培養して、微細構造を有する、非実質細胞を含む伸展した細胞構造体を形成させるサブ工程、及び、微細構造を有する、非実質細胞を含む伸展した細胞構造体を細胞培養支持体から剥離して、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した非実質細胞組織を得るサブ工程により、実施することができる。
【００４９】
本工程における各サブ工程は、前記で説明した実質細胞組織形成工程と同様の材料及び方法を適用することにより、実施することができる。本工程において使用される細胞培養容器及び細胞培養支持体は、前記で説明した実質細胞組織形成工程において使用されるものと同一の特徴を有することが好ましい。
【００５０】
本発明において、「微細構造の鋳型」は、前記で説明した形状を有する微細構造を形成するために細胞培養支持体の表面に配置される鋳型を意味する。微細構造の鋳型は、前記で説明した伸展した非実質細胞組織が有する微細構造の表面と同一の寸法及び／又は形状を有することが好ましい。
【００５１】
細胞培養容器の培養面に、微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体を配置するサブ工程は、当該技術分野で通常使用される微細構造の鋳型の形状である細胞培養支持体を使用することにより、実施することができる。本サブ工程は、例えば、細胞培養容器の培養面の少なくとも一部に、別の部材として準備した微細構造の鋳型の形状である細胞培養支持体を載置することによって実施してもよく、細胞培養容器の培養面の少なくとも一部を微細構造の鋳型の形状である細胞培養支持体として使用することによって実施してもよい。後者の実施形態の場合、微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体は、例えば、以下の手段で準備することができる。細胞接着性の表面を有する細胞培養支持体と、微細構造の鋳型の形状に対応するマスクとを準備し、光リソグラフィ技術を用いて細胞培養支持体の表面における微細構造の鋳型以外の領域を化学修飾して、細胞非接着性に改変する。或いは、細胞非接着性の表面を有する細胞培養支持体と、微細構造の鋳型の形状に対応するマスクとを準備し、光リソグラフィ技術を用いて細胞培養支持体の表面における微細構造の鋳型の領域を化学修飾して、細胞接着性に改変することもできる。例えば、温度応答性ポリマーであるPNIPAAmを含む領域を有する細胞培養支持体を用いる場合、光リソグラフィ技術を用いて細胞培養支持体の表面における微細構造の鋳型以外の領域を、水溶性カンファーキノンを重合開始剤としてポリアクリルアミド（PAAm）を化学修飾することにより、細胞非接着性に改変することができる。
【００５２】
本工程において、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した非実質細胞組織を回収する手段は、特に限定されない。例えば、ピンセット、アスピレーター又はピペット等を用いて、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した非実質細胞組織を、細胞培養支持体の表面から回収することができる。或いは、前記で説明したゼラチンスタンプ法のような公知の方法を適用して、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した非実質細胞組織を、細胞培養支持体の表面から回収することができる。以下において説明する細胞組織積層工程を連続的に実施できることから、ゼラチンスタンプ法を用いて、微細構造を有する、非実質細胞を含む細胞構造体を有する伸展した非実質細胞組織を、細胞培養支持体の表面から回収することが好ましい。
【００５３】
［1-5：細胞組織積層工程］
本発明の方法は、前記複数個の伸展した実質細胞組織と前記微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを積層する、細胞組織積層工程を含むことが必要である。本工程により、複数個の伸展した実質細胞組織と、微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とからなる伸展した細胞組織の積層体を得ることができる。
【００５４】
本工程は、1又は複数個の伸展した微細構造を有する非実質細胞組織のそれぞれが、複数個の伸展した実質細胞組織の間に挟持されるように実施される。それ故、本工程によって得られる細胞組織の積層体は、1又は複数個の伸展した微細構造を有する非実質細胞組織のそれぞれが、複数個の伸展した実質細胞組織の間に挟持される構造を有する。このような構造を有することにより、本工程によって得られる細胞組織の積層体においては、実質細胞組織を、微細構造を有する非実質細胞組織に含まれる非実質細胞の足場として利用することができる。
【００５５】
本工程において、複数個の伸展した実質細胞組織と、微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを積層する手段は、特に限定されない。例えば、ピンセット等を用いて、伸展した実質細胞組織及び微細構造を有する伸展した非実質細胞組織を把持して積層することができる。或いは、前記で説明したゼラチンスタンプ法のような公知の方法を適用して、複数個の伸展した実質細胞組織と、微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを積層することができる。複数個の伸展した実質細胞組織と、微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とを、所望の順序で連続的に積層できることから、ゼラチンスタンプ法を用いて該細胞組織を積層することが好ましい。
【００５６】
［1-6：収縮工程］
本発明の方法は、前記細胞組織積層工程で得られた微細構造を含む三次元構造を有する細胞組織の積層体を収縮させる、収縮工程を含むことが必要である。
【００５７】
本発明者らは、前記細胞組織積層工程で得られる複数個の伸展した実質細胞組織と、微細構造を有する1又は複数個の伸展した非実質細胞組織とからなる伸展した細胞組織の積層体を収縮させた場合、非実質細胞組織に含まれる微細構造が数日間に亘って安定的に維持されることを見出した。本発明の方法がこのような作用効果を奏する理由は、以下のように説明することができる。なお、本発明は、以下の作用・原理に限定されるものではない。本工程において、前記細胞組織積層工程で得られた細胞組織の積層体を収縮させることにより、微細構造を有する非実質細胞組織に含まれる非実質細胞の足場として利用される実質細胞組織の状態が変化する。これにより、非実質細胞の遊走が顕著に抑制され、所定の微細構造が安定的に維持されると考えられる。
【００５８】
本工程において、伸展した細胞組織の積層体を収縮させる収縮率は、収縮工程前の微細構造を有する伸展した非実質細胞組織の表面の寸法に対する収縮工程後の微細構造を有する非実質細胞組織の表面の寸法の百分率で定義される。例えば、収縮率は、収縮工程前の伸展した非実質細胞組織の表面における微細構造の寸法に対する収縮工程後の非実質細胞組織の表面における微細構造の寸法の百分率で定義することができる。例えば、微細構造が、複数の直線状のストライプ状のシート形態の細胞構造体がその全体において互いに平行状態となるように配置された形状を有する場合、収縮率は、収縮工程前の伸展した非実質細胞組織の表面における隣接する2本のストライプ状の細胞構造体の長手方向の中心線の間の距離に対する、収縮工程後の非実質細胞組織の表面における隣接する2本のストライプ状の細胞構造体の長手方向の中心線の間の距離の百分率で定義することができる。この場合、非実質細胞組織の表面における隣接する2本のストライプ状の細胞構造体の長手方向の中心線の間の距離は、例えば、予め非実質細胞を標識しておき、共焦点レーザー顕微鏡等の標識確認手段を用いて人工組織におけるストライプ状の細胞構造体の形状を観察することにより、測定することができる。収縮率は、30％以下であることが好ましく、20〜30％の範囲であることがより好ましい。収縮率が前記上限値を超える場合、非実質細胞の遊走を十分に抑制できず、結果として非実質細胞組織に含まれる微細構造を長期に亘って維持できない可能性がある。収縮率が前記下限値未満の場合、非実質細胞及び実質細胞に酸素及び栄養素が十分に供給できず、酸素欠乏又は栄養欠乏を引き起こしたり、或いは非実質細胞及び実質細胞に過剰な圧力が負荷されて細胞破裂を引き起こしたりする可能性がある。それ故、前記範囲の収縮率で伸展した細胞組織の積層体を収縮させることにより、微細構造を数日間に亘って安定的に維持し得る人工組織を得ることができる。
【００５９】
本工程において、伸展した細胞組織の積層体を収縮させる手段は、特に限定されない。例えば、積層工程において、ピンセット等を用いて、伸展した実質細胞組織及び微細構造を有する伸展した非実質細胞組織を把持して積層する場合、伸展した細胞組織の積層体は細胞培養支持体から剥離されている。この場合、伸展した細胞組織の積層体は、通常は積層後直ちに、典型的には数分以内に、例えば1〜10分以内に、前記範囲の収縮率まで収縮することができる。或いは、積層工程において、前記で説明したゼラチンスタンプ法を用いて、伸展した実質細胞組織及び微細構造を有する伸展した非実質細胞組織を積層する場合、伸展した細胞組織の積層体は、ゼラチンスタンプのゼラチンゲルに吸着することで伸展した形態を維持している。このため、ゼラチンゲルを加熱溶解させることにより、伸展した細胞組織の積層体を収縮させることができる。この場合、伸展した細胞組織の積層体を吸着しているゼラチンゲルを、通常は25〜40℃、典型的には25〜37℃の温度範囲で、通常は30分〜1時間加熱溶解させることにより、前記範囲の収縮率で、伸展した積層体を収縮させることができる。
【００６０】
本工程において、伸展した細胞組織の積層体、及び収縮した細胞組織の積層体を培養する培地及び外部環境（例えば、温度、湿度、光周期又はCO2濃度）等の培養条件は、使用される実質細胞及び非実質細胞の種類に基づき、当該技術分野で通常使用される培養条件を適宜適用することができる。以下において説明するように、本発明の方法においては、非実質細胞の遊走が顕著に抑制されることから、伸展した積層体及び収縮した積層体を成長因子の存在下で培養することが好ましい。例えば、非実質細胞が血管内皮細胞の場合、成長因子は、ウシ胎児血清（FBS）、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、アスコルビン酸、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、又はインスリン様成長因子であることが好ましい。前記成長因子の存在下で伸展した細胞組織の積層体及び収縮した細胞組織の積層体を培養することにより、管腔状の成熟状態へ発達した微細構造を含む三次元構造を有する人工組織を得ることができる。
【００６１】
＜2：微細構造を含む三次元構造を有する人工組織＞
本発明の方法により、微細構造を数日間に亘って安定的に維持し得る人工組織を得ることができる。それ故、本発明はまた、微細構造を含む三次元構造を有する人工組織に関する。
【００６２】
本発明の人工組織において、微細構造は、該人工組織を作製後、数ヶ月以内、通常は数日間以内、特に5日間以内の期間に亘って安定的に維持される。本発明の人工組織を数日間を超えて培養する場合、該人工組織を構成する細胞に酸素及び栄養素を供給するための適切な培地交換及び／又は培養基材の選択を行うことにより、微細構造を安定的に維持してさらに長期間培養できる可能性がある。
【００６３】
なお、本発明の人工組織において、微細構造が安定的に維持されていることは、例えば、予め実質細胞及び非実質細胞を標識しておき、共焦点レーザー顕微鏡等の標識確認手段を用いて人工組織における微細構造の形状を観察することにより、確認することができる。或いは、予め実質細胞及び非実質細胞を蛍光標識しておき、タイムラプス蛍光顕微鏡装置を用いて人工組織における微細構造の形状変化をタイムラプス観察することにより、確認することもできる。タイムラプス観察の場合、得られる蛍光画像を二値化及び画像処理した後、処理後の画像の画像相関分析を行い、相関係数を決定することにより、微細構造が安定的に維持されていることを定量的に評価することができる。
【００６４】
当該技術分野において、実質細胞組織及び微細構造を有する非実質細胞組織を積層することによって形成される、微細構造を含む三次元構造を有する人工組織は公知である（例えば、M. Muraokaら, Biomaterials 第34巻, (2013) p. 696‐703）。しかしながら、公知の人工組織においては、未成熟状態の微細構造を有する非実質細胞組織を積層する場合、該微細構造が成熟状態へ発達することは知られていなかった。本発明者らは、本発明の方法によって作製された人工組織において、複数のストライプ状の細胞構造体のような未成熟状態の微細構造を有する伸展した非実質細胞組織と伸展した実質細胞組織とを積層した場合、複数のストライプ状の細胞構造体が管腔のような成熟状態へ発達することを見出した。それ故、本発明はまた、管腔状の微細構造を含む三次元構造を有する人工組織に関する。
【００６５】
本発明の管腔状の微細構造を含む三次元構造を有する人工組織は、例えば、本発明の人工組織の作製方法において、成長因子の存在下で非実質細胞組織及び結果として得られる人工組織を培養することにより得ることができる。例えば、非実質細胞が血管内皮細胞の場合、成長因子は、ウシ胎児血清（FBS）、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、アスコルビン酸、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、又はインスリン様成長因子であることが好ましい。前記成長因子の存在下で非実質細胞組織及び結果として得られる人工組織を培養することにより、管腔状の成熟状態へ発達した微細構造を含む三次元構造を有する人工組織を得ることができる。
【００６６】
本発明の人工組織は、血管網、リンパ管網、肝小葉、及び各種内分泌腺からなる群より選択される管腔状の微細構造を含む三次元構造を有することができる。本発明の人工組織は、血管網である管腔状の微細構造を含む三次元構造を有することが好ましい。前記特徴を有することにより、本発明の人工組織を、血管網を備える移植材料として使用することができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６８】
［I：微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体の作製］
培養面に温度応答性ポリマーが被覆された温度応答性培養皿（直径35 mm, UpCell（商標）, セルシード社）を準備した。温度応答性培養皿の培養面に、光リソグラフィ技術を用いて、水溶性カンファーキノンを重合開始剤としてポリアクリルアミド（PAAm）を部分的に化学修飾することにより、温度応答性培養皿の培養面に微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体を作製した。前記処理によって作製された微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体を図1に示す。前記処理により、温度応答性培養皿の培養面に、細胞非接着性領域11と、該細胞非接着性領域11の内部に形成された、温度変化に応答して細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な複数のストライプ状の温度応答性領域12とからなる微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体110を作製した（図1A）。微細構造の鋳型は、ストライプ状の温度応答性領域12の幅（短手方向の長さ、L）をいずれも500 μmとし、隣接する温度応答性領域12の間に存在する細胞非接着性領域の幅（S）を500、1000又は2000 μmとした（図1B）。前記処理によって作製された微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体を含む温度応答性培養皿を、エチレンオキシドガスにより滅菌した。
【００６９】
ストライプ状の温度応答性領域12の幅（L）及び隣接する温度応答性領域12の間に存在する細胞非接着性領域の幅（S）と、隣接する2本のストライプ状の温度応答性領域12の長手方向の中心線の間の距離（Dtemp）との関係を表1に示す。
【００７０】
【表１】
0006621245.tif 000002
【００７１】
［II：伸展した実質細胞組織及び微細構造を有する伸展した非実質細胞組織の作製］
線維芽細胞を実質細胞として使用することにより、細胞シートの形態である伸展した細胞構造体を作製した。温度応答性培養皿（直径35 mm, UpCell（商標）, セルシード社）の培養面を細胞培養支持体として、その表面に正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）（Lonza社）を1×106細胞/培養皿の濃度で播種した。播種した細胞を、線維芽細胞増殖培地（FGM-2）（Lonza社）中でコンフルエントに達するまで、37℃、5％のCO2濃度環境下で3日間培養した。前記培養により、細胞培養支持体の表面（温度応答性培養皿の培養面）に接着し且つ伸展した線維芽細胞シートを得た。前記培養を2連で実施し、伸展した線維芽細胞シートからなる伸展した線維芽細胞組織（NHDFの細胞組織）を2個準備した。
【００７２】
血管内皮細胞を非実質細胞として使用することにより、伸展した複数のストライプ状の細胞シートの形態である、微細構造を有する伸展した細胞構造体を作製した。前記Iの手順に従い作製した、実施例1〜3の微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体の表面に、緑色蛍光タンパク発現正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（GFP-HUVEC）（Angio-proteomie社）を0.25×106細胞/培養皿の濃度で播種した。播種した細胞を、20質量％ウシ胎児血清（FBS）（ジャパン・バイオシーラム社）を添加した血管内皮細胞増殖培地（EGM-2）（Lonza社）中で、複数のストライプ状の温度応答性領域の表面がコンフルエントに達するまで、37℃、5％のCO2濃度環境下で3日間培養した。前記培養により、複数のストライプ状の温度応答性領域の表面に接着し且つ伸展した複数のストライプ状の血管内皮細胞シートを得た。前記培養により、伸展した複数のストライプ状の血管内皮細胞シートを有する、複数のストライプ状の微細構造を有する伸展した血管内皮細胞組織（ストライプ状のGFP-HUVECの細胞組織）を1個準備した。
【００７３】
［III：伸展した実質細胞組織及び微細構造を有する伸展した非実質細胞組織の積層］
ゼラチンゲルを支持体として細胞を回収する細胞シート積層マニピュレーターを用いる方法（以下、「ゼラチンスタンプ法」とも記載する）（Y. Tsudaら, Biomaterials 第28巻, (2007) p. 4939-4946）により、伸展した線維芽細胞組織及び複数のストライプ状の微細構造を有する伸展した血管内皮細胞組織を積層した。実施例1〜3の人工組織はいずれも、1層目の伸展した線維芽細胞組織、2層目の複数のストライプ状の微細構造を有する伸展した血管内皮細胞組織、及び3層目の伸展した線維芽細胞組織の順に、三層構造となるように積層した。積層工程の手順を図2に示す。
【００７４】
細胞シート積層マニピュレーターに使用されるゼラチンゲルは、以下の手順で作製した。ハンクス液（Hank’s balanced salt solution）（Sigma-Aldrich社）に、ブタ皮膚由来ゼラチン（G1890, Sigma-Aldrich社）を60℃の水浴中で溶解した後、1 M NaOH水溶液を用いてpHを調整して、7.5質量％のゼラチン溶液を調製した。調製したゼラチン溶液を、円盤状のシリコンゴム製モールドに流し込んだ。モールドに流し込んだゲル上に、プランジャーを密着させた。モールドを氷上で冷却させて、モールドに流し込んだゼラチンをゲル化させた。これにより、細胞シート積層マニピュレーターに使用されるゼラチンゲル（ゼラチンスタンプ）を得た。
【００７５】
ゼラチンスタンプ法による細胞組織の積層工程は、以下の手順で行った（図2）。前記手順で作製した細胞シート積層マニピュレーターのプランジャー部に吸着した円盤状のゼラチンゲルを、20℃で温度応答性培養皿の培養面の細胞培養支持体に接着し且つ伸展した線維芽細胞組織の表面に載置し密着させた。このままの状態で、培養温度を20℃に保持することにより、細胞培養支持体の表面を細胞接着性から細胞非接着性へと変化させて、細胞培養支持体の表面から伸展した線維芽細胞組織を剥離させた。細胞シート積層マニピュレーターのプランジャー部を持ち上げることにより、プランジャー部のゼラチンゲルに吸着した、1層目の伸展した線維芽細胞組織を回収した。回収された線維芽細胞組織は、細胞培養支持体の表面における伸展した形態を保持したまま、表面張力によってゼラチンゲルに転写された。次に、1層目の伸展した線維芽細胞組織が吸着した細胞シート積層マニピュレーターのプランジャー部のゼラチンゲルを、20℃で複数のストライプ状の温度応答性領域の表面に接着し且つ伸展した複数のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織の表面に載置し密着させた。前記と同様の手順で伸展した複数のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織を培養面から剥離させ、プランジャー部のゼラチンゲルに吸着した1層目の伸展した線維芽細胞組織の表面に、2層目の複数のストライプ状の微細構造を有する伸展した血管内皮細胞組織を転写した。さらに、1層目の伸展した線維芽細胞組織及び2層目の複数のストライプ状の微細構造を有する伸展した血管内皮細胞組織が吸着した細胞シート積層マニピュレーターのプランジャー部のゼラチンゲルを、20℃で別の温度応答性培養皿の培養面に接着し且つ伸展した線維芽細胞組織の表面に載置し密着させた。前記と同様の手順で3層目の伸展した線維芽細胞組織を培養面から剥離させ、プランジャー部のゼラチンゲルに吸着した1層目の伸展した線維芽細胞組織及び2層目の複数のストライプ状の微細構造を有する伸展した血管内皮細胞組織の表面に、3層目の伸展した線維芽細胞組織を転写して、三層の伸展した細胞組織からなる伸展した積層体を得た。
【００７６】
［IV：伸展した細胞組織の積層体の収縮］
前記IIIの手順で得られた三層の伸展した細胞組織からなる伸展した細胞組織の積層体を、細胞シート積層マニピュレーターのプランジャー部から、ゼラチンゲルごと剥離した。ゼラチンゲル及び伸展した積層体をガラスボトムディッシュ（旭硝子社）に入れ、37℃で1時間インキュベートした。前記処理によってゼラチンゲルを再溶解させることにより、伸展した細胞組織の積層体を収縮させた。三層の細胞組織からなる収縮した細胞組織の積層体を、ガラス底面に接着させた状態で洗浄し、溶解させたゼラチンを除去した。得られた三層の細胞組織からなる人工組織を、ガラス底面に接着させた状態で以下の観察に用いた。
【００７７】
［V：三次元構造を有する人工組織の培養及び観察］
前記手順で得られた収縮した三層の細胞組織からなる人工組織を、顕微鏡ステージ装着型インキュベータ（INUG2-KI3）（東海ヒット社）を用いて、50 ng/mL組換えヒト血管内皮細胞成長因子（rhVEGF）（R&DSystems社）を添加したEGM-2中で、37℃、5％のCO2濃度環境下で5日間培養した。タイムラプス蛍光顕微鏡装置（BZ-9000, キーエンス社）を用いて、培養開始時及び培養開始後1日ごとに、人工組織の同一箇所のタイムラプス蛍光画像を取得することで観察した。前記タイムラプス観察によって得られた蛍光画像を二値化した後、ノイズ除去処理及びパターン抽出処理を行った。ImageJ（米国国立衛生研究所, NIH）を用いて、前記処理後の画像の画像相関分析を行い、相関係数を決定した。
【００７８】
前記手順で得られた三層の細胞組織からなる人工組織の三次元構造は、共焦点レーザー顕微鏡（FV1200）（オリンパス社）及び油浸対物レンズ（UPlanSApo, 30×, NA 1.05）（オリンパス社）を用いて観察した。前記観察において、二次元画像のスタッキングによる三次元化は、観察用ソフトウェア（Fluo View）（オリンパス社）を用いて行った。
【００７９】
タイムラプス蛍光顕微鏡装置を用いて取得した画像を図3〜6に示す。図3は、実施例1及び2の同一箇所における三層の人工組織の積層及び収縮直後の蛍光画像（赤色）、並びに積層及び収縮後5日目の蛍光画像（緑色）の重ね合わせ画像である。図3中、Aは実施例1の、Bは実施例2の画像である。図4は、実施例1の人工組織における1層目の線維芽細胞組織（赤色）、2層目のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織（緑色）及び3層目の線維芽細胞組織（赤色）の蛍光画像の重ね合わせ画像である。図4中、Aは積層及び収縮直後の蛍光画像、Bは積層及び収縮から12時間後の蛍光画像である。図5は、実施例1〜3の2層目のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織の、同一箇所における積層及び収縮直後から5日目までの蛍光画像である。図5中、Aは実施例1の蛍光画像、Bは実施例2の蛍光画像、Cは実施例3の蛍光画像である。図6は、実施例1の2層目のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織の、同一箇所における積層及び収縮直後から5日目までの蛍光画像、並びに該蛍光画像の二値化画像である。図6中、Aは蛍光画像、Bは二値化画像である。前記タイムラプス観察により、積層及び収縮後の人工組織においては、三次元構造内における血管内皮細胞の局在が、2層目の血管内皮細胞組織における複数のストライプ状の微細構造によって制御されており、且つ積層及び収縮後5日間に亘って、この局在が維持されていることが明らかとなった。
【００８０】
実施例1の人工組織において、前記タイムラプス観察によって得られた画像の画像相関分析による相関係数の経時変化を図7に示す。前記タイムラプス観察によって得られた画像の画像相関分析による相関係数は、積層及び収縮後2日目まで低下したが、積層及び収縮後2日目から5日目までは略一定の値で推移した（図7）。この結果から、三層の細胞組織からなる人工組織において、2層目の複数のストライプ状の微細構造を有する血管内皮細胞組織を構成する血管内皮細胞は、積層及び収縮後2日目までに略一定の位置に局在し、その後はこの局在が維持されていることが明らかとなった。
【００８１】
実施例1〜3において、使用された温度応答性培養皿における2本のストライプ状の温度応答性領域12の長手方向の中心線の間の距離（Ddish）と、積層及び収縮後5日目の隣接する2本のストライプ状の血管内皮細胞シートの長手方向の中心線の間の距離（Dtissue）と、DdishとDtissueとの比を表2に示す。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
実施例1〜3において、収縮工程前、すなわち積層時の隣接する2本のストライプ状の血管内皮細胞シートの長手方向の中心線の間の距離は、使用された温度応答性培養皿における2本のストライプ状の温度応答性領域12の長手方向の中心線の間の距離（Ddish）に相当する。それ故、DdishとDtissueとの比は、収縮工程前の伸展した非実質細胞組織の表面における隣接する2本のストライプ状の細胞構造体の長手方向の中心線の間の距離に対する、収縮工程後の非実質細胞組織の表面における隣接する2本のストライプ状の細胞構造体の長手方向の中心線の間の距離の比、すなわち実施例の人工組織の収縮率に相当する。表2に示すように、実施例1〜3の人工組織は、収縮工程によって22.8〜28.1％の範囲の収縮率で収縮した。
【００８４】
伸展した細胞組織を積層後、収縮させる工程を含まない従来技術の方法で作製された人工組織においては、隣接するストライプ状の血管内皮細胞シートの長手方向の中心線の間の距離が500 μm程度の場合、積層後1日目には、ストライプ状の血管内皮細胞シートからなる血管内皮細胞組織を形成する血管内皮細胞がランダムに遊走していることが確認されている（M. Muraokaら, Biomaterials 第34巻, (2013) p. 696‐703）。前記従来技術の方法では、VEGF及びFBSのような血管内皮細胞の遊走及び／又は増殖を促す因子をほぼ含まない条件で培養が行われた。このため、前記従来技術の方法は、人工組織内の微細構造を形成する血管内皮細胞の局在を維持するという点では有利な条件であった。これに対し、本発明の実施例によって作製された三層の細胞組織からなる人工組織は、VEGF及びFBSのような血管内皮細胞の遊走及び／又は増殖を促す因子を添加した条件で培養されたにもかかわらず、三次元構造内における血管内皮細胞の局在が維持された。本発明の実施例によって作製された三層の細胞組織からなる人工組織が数日間に亘って三次元構造内における血管内皮細胞の局在を維持した得たのは、伸展した細胞組織を積層後、収縮させることにより、血管内皮細胞の足場となる線維芽細胞組織の状態が変化したことに起因すると推測される。
【００８５】
実施例1の人工組織の積層工程及び収縮工程後5日目の三次元蛍光画像を図8に示す。積層工程及び収縮工程後5日目における実施例1の人工組織では、驚くべきことに、2層目の血管内皮細胞組織における複数のストライプ状の微細構造を形成する血管内皮細胞の細胞構造体が、そのストライプ形状に沿って管腔を形成していることが確認された（図8）。前記結果は、本発明の実施例によって作製された人工組織において、二次元的に設計された未成熟状態の微細構造が、三次元構造を形成して、生体の組織又は器官におけるものと実質的に同等の構造及び機能を有する成熟状態の微細構造に発達し得ること示唆している。本発明の実施例によって作製された人工組織が特定の機能を有する成熟状態の微細構造を有する三次元構造を形成し得たのは、血管内皮細胞の足場となる線維芽細胞組織の状態が変化したことに加えて、VEGF及びFBSのような血管内皮細胞の成長因子を添加した条件で培養されたことに起因すると推測される。それ故、本発明の方法により、血管網のような特定の機能を有する微細構造を含む三次元構造を有する人工組織を作製できる可能性がある。
【符号の説明】
【００８６】
110…微細構造の鋳型を有する細胞培養支持体
11…細胞非接着性領域
12…ストライプ状の温度応答性領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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