(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してトリアシルグリセロール(TAG)生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項２】
さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、請求項１記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項３】
前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、請求項１又は２記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項４】
トレボキシア藻網に属する、請求項１〜３のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項５】
コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、請求項４記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項６】
前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、請求項１〜５のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項７】
前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、請求項６記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項８】
前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、請求項７記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光合成によって生産された同化産物がより多くトリグリセリド(=トリアシルグリセロール(triacylglycerol): 以下、「TAG」と呼ぶ)合成に向かうように遺伝子操作された真核微細藻類及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
単細胞性の光合成生物(以下、「微細藻類」と呼ぶ)が生産する脂肪酸、あるいは加水分解により脂肪酸を遊離するTAG等の化合物(以下、これらを総称して「脂質」と呼ぶ)を原料として、バイオディーゼル燃料をはじめとする工業・食品製品を生産する研究が、世界的に行われている。しかしながら現状では、脂質生産コストが高く、商業ベースでのバイオディーゼル燃料等の生産は困難である(非特許文献１）。そのため、バイオディーゼル燃料等の生産コスト削減のための更なる技術開発が続けられており、その1つに、微細藻類のTAG生産性の改良研究がある。
【０００３】
微細藻類の多くは、光合成によって生じる同化産物の一部をデンプンあるいはTAGとして蓄積する。デンプン及びTAGの蓄積量は微細藻類の種類によって異なり、また、同じ生物でも培養条件によって異なっている。光合成同化産物がデンプン及びTAGに変換される速度と、一旦合成された貯蔵物質が分解される速度とは、生物種及び培養条件によって異なっており、それがデンプン及びTAGの蓄積量の差異となって現れると考えられる。
【０００４】
TAGの原料は、グリセロール-3-リン酸と脂肪酸である。グリセロール-3-リン酸は、グリセロールとATPとを基質として、グリセロール・キナーゼ(glycerol kinase)によって合成される。一方、脂肪酸は、葉緑体内で生合成される。
【０００５】
脂肪酸生合成の最初の反応は、アシルCoAカルボキシラーゼ(acyl-CoA carboxylase)によって触媒され、アセチルCoAからマロニルCoAが作られる。マロニルCoAはアシルキャリアー・タンパク質(acyl carrier protein: ACP)と反応し、マロニルACPが作られる。マロニルACPは、アシル基がACPに結合したアシルACP(C = 2：アセチルACP、C = 4：ブチリルACP、等)と反応し、アシルACPの炭素鎖を2つ延長する。この延長反応を繰り返してアシル基の炭素鎖の長さが(最も一般的には)16になると、アシルACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase)によってパルミチン酸(C16:0)とACPとに加水分解される。パルミチン酸はCoAと結合しパルミチルCoAとなって、葉緑体から小胞体に移動する。パルミチルCoAはさらに長鎖脂肪酸伸長酵素(very long chain fatty acid elongase)及びデサチュレース(fatty acid desaturase)の働きで、一価不飽和脂肪酸であるオレイン酸のCoAエステル(オレイルCoA：C18:1)が作られる。パルミチン酸とオレイン酸は、多くの生物で、最も含量が高い脂肪酸である。
【０００６】
TAGの生合成は小胞体膜上で行われる。先ず、グリセロール-3-リン酸アシル転移酵素(glycerol-3-phosphate acyltransferase)によって、グリセロール-3-リン酸のsn-1の位置にアシルCoAのアシル基が付加され、リゾフォスファチジン酸が生成する。次に、リゾフォスファチジン酸アシル転移酵素(acylglycerophosphate acyltransferase)によって、リゾフォスファチジン酸のsn-2の位置にアシルCoAのアシル基が付加されてホスファチジン酸が生成する。ホスファチジン酸はホスファチジン酸フォスファターゼ(phosphatidate phosphatase)によって脱リン酸化され、ジアシルグリセロールに変換された後、ジアシルグリセロールアシル転移酵素(diacylglycerol acyltransferase: DGAT)によってTAGが合成される。DGATは、進化的起源が異なる2つのファミリーに分類され、それぞれ、DGAT1及びDGAT2と呼ばれている。グリセロール-3-リン酸とアシルCoAからTAGが合成されるこの経路は、TGA合成のためのケネディー経路と称される。
【０００７】
このケネディー経路以外でもTAGは合成され、その一例がリン脂質：ジアシルグリセロールアシル転移酵素(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase)による以下の反応である：
リン脂質＋1,2-ジアシルグリセロール＝リゾリン脂質＋TAG
遺伝子組換え技術を用いて、このTAG合成に関わる酵素活性を上昇させることにより、微細藻類の単位時間当たり及び単位受光面積当たりのTAG生産量(以降、「TAG生産性」と呼ぶ)を改良し、バイオディーゼル生産コストの削減に貢献しようという研究が既に幾つか行われている。
【０００８】
上記のケネディー経路の最後の酵素であるDGATをコードする遺伝子を高発現させることによってTAG生産性が上昇するという報告は数多く出されている。例えば、シアノバクテリア（Cyanobacteria）に属するシネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）PCC 7942株にグラム陰性細菌アシネトバクター(Acinetobacler)由来のDGAT遺伝子を導入することにより、シネココッカスが約2倍のTAGを蓄積するようになった(特許文献１）。
【０００９】
特許文献２は、不等毛植物門(Heterokontophyta）・真正眼点藻綱(Eustigmataceae)に属するナンノクロロプシス(Nannochloropsis)に、DGAT、リン脂質：ジアシルグリセロールアシル転移酵素あるいはフォスファチジン酸フォスファターゼをコードする遺伝子を導入しTGA含量を上昇させることを開示する。しかしながら、当該特許文献では、これらの遺伝子導入の効果の詳細が実施例には示されていない。
【００１０】
プレクストリン相同(Pleckstrin-homology)ドメインを持つ様々な生物由来のDGAT1遺伝子をナンノクロロプシスに導入したところ、形質転換体の脂質含量は野生株よりも増加した(特許文献３)。
【００１１】
ナンノクロロプシスにマウス由来のDGATを導入したところ、TAG含量が増加した(特許文献４)。
【００１２】
緑色植物亜界・緑藻植物門(Chlorophyta：以下、「緑藻」と呼ぶ)に属するクラミドモナス(Chlamydomonas reinhardtii)には、上記DGAT2の遺伝子が複数存在するが(相同遺伝子)、これら相同遺伝子をクラミドモナス中で高発現させても、脂質含量の増加は認められなかった。一方、クラミドモナスのDGAT2相同遺伝子の1つを酵母で発現させると、酵母の形質転換体は、野生株酵母よりも高いTAG生産性を示した(非特許文献２）。
【００１３】
不等毛植物門・珪藻綱(Bacillariophyceae)のフェオダクチラム(Phaeodactylum tricornutum)のDGAT2をクローン化し、同じ株内で高発現させると、この株のTAG生産性が上昇した（非特許文献３及び４）。
【００１４】
TGA合成のためのケネディー経路の最初の酵素であるグリセロール-3-リン酸アシル転移酵素をコードする遺伝子を、緑藻であるロボスフェラ(Lobosphaera incisa)より分離し、クラミドモナスに導入・発現させたところ、TAG生産性は顕著に上昇した（非特許文献５）。
【００１５】
また、上記のグリセロール-3-リン酸アシル転移酵素の基質であるグリセロール-3-リン酸を合成するグリセロール・キナーゼを、珪藻フィツリフェラ(Fistulifera solaris)JPCC DA0580株内で高発現させることにより、TAG生産性がわずかであるが増加した(非特許文献６）。
【００１６】
一方、大腸菌において、脂肪酸合成の初発酵素であるアセチルCoAカルボキシラーゼ(Acetyl-CoA carboxylase)遺伝子とアシルACPチオエステラーゼ遺伝子とを高発現させると、遊離脂肪酸含量が増加することが報告されている(非特許文献７）。
【００１７】
しかし、多くの研究において、アシルACPチオエステラーゼ遺伝子は、一般的な長さの炭素鎖を持つ脂肪酸(C16とC18)ではなく、やや短い脂肪酸(C10、C12とC14)の合成を促進するために使用されている。クスノキ科の植物であるUmbellularia californicaの種子には、C10やC12等の脂肪酸を含む脂質が蓄積され、それは、この植物の持つC12の炭素鎖を持つアシルACPを加水分解するアシルACPチオエステラーゼによることが明らかになっている。この、やや短い脂肪酸を加水分解するという基質特異性を持つU. californicaのアシルACPチオエステラーゼ遺伝子のcDNAを大腸菌に導入し、高発現させたところ、C12及びC14の遊離脂肪酸が合成され、細胞外に排出された(非特許文献８）。
【００１８】
緑藻クラミドモナスに、アシルACPチオエステラーゼをコードする遺伝子と、ジアシルグリセロールアシル転移酵素(DGAT2)をコードする遺伝子を導入することにより、C12脂肪酸の割合を増加させる研究が開示されている(特許文献５）。しかし、この組換え体における乾燥重量当たりのTAGの蓄積は最大で2％程度、遊離脂肪酸を含めても7％以下であった。
【００１９】
ところで、緑藻・トレボキシア藻(Trebouxiophyceae)綱に属するシュードココミクサ(Pseudococcomyxa)sp. KJ株(以下、「KJ株」と呼ぶ)は、温泉水より分離されたTAG生産性が非常に高い単細胞性緑藻であり(特許文献６）、特許文献７に示された開放系培養システムで培養できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】US 8,394,614 B2
【特許文献２】US 8,722,359 B2
【特許文献３】US 8,835,149 B2
【特許文献４】US 2014/0106417 A1
【特許文献５】特開2014-14334号公報
【特許文献６】特開2015-015918号公報
【特許文献７】特開2014-117202号公報
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Quinn JC, Davis R.（2015）The potentials and challenges of algae based biofuels: a review of the techno-economic, life cycle, and resource assessment modeling. Bioresour Technol. 184: 444-452.
【非特許文献２】Hung C-H, Ho M-Y, Kanehara K,Nakamura Y. (2013) Functional study of diacylglycerol acyltransferase type 2 family in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett. 587: 2364-2370.
【非特許文献３】Niu Y-F, Zhang M-H, Li D-W, Yang W-D, Liu J-S, Bai W-B,Li H-Y. (2013) Improvement of neutral lipid and polyunsaturated fatty acid biosynthesis by overexpressing a type 2 diacylglycerol acyltransferase in marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Mar. Drugs 11: 4558-4569.
【非特許文献４】Xue J, Niu YF, Huang T, Yang WD, Liu JS, Li HY. (2015) Genetic improvement of the microalga Phaeodactylum tricornutum for boosting neutral lipid accumulation. Metab Eng. 27: 1-9.
【非特許文献５】Iskandarov U, Sitnik S, Shtaida N, Didi-Cohen S.  Leu S,  Khozin-Goldberg I,  Cohen Z,  Boussiba S. (2015) Cloning and characterization of a GPAT-like gene from the microalga Lobosphaera incisa (Trebouxiophyceae): overexpression in Chlamydomonas reinhardtii enhances TAG production. J Appl Phycol DOI 10.1007/s10811-015-0634-1.
【非特許文献６】Muto M, Tanaka M, Liang Y, Yoshino T, Matsumoto M, Tanaka T. (2015) Enhancement of glycerol metabolism in the oleaginous marine diatom Fistulifera solaris JPCC DA0580 to improve triacylglycerol productivity. Biotechnol Biofuels.8(1):4. doi: 10.1186/s13068-014-0184-9.
【非特許文献７】Davis MS, Solbiati J, Cronan JE Jr. (2000) Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 275:28593-28598.
【非特許文献８】Voelker TA, Davies HM. Alteration of the specificity and regulation of fatty acid synthesis of Escherichia coli by expression of a plant medium-chain acylacyl Carrier protein thioesterase. J Bacteriol 1994;176:7320-737.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
上述のように、KJ株は屋外での大量培養に適した株であり、脂質の商業生産の原料として最も有望な株の1つであると言える。しかしながら、そのTAG生産性を更に改良し、TAG生産コストを削減することが望まれていた。
【００２３】
そこで、本発明は、TAG生産性が改良された、KJ株を含む真核微細藻類を遺伝子操作によって作製し、当該真核微細藻類遺伝子改変株を利用したTAG生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、KJ株において、3つの遺伝子、すなわち、(i)デンプンの分解に関与しているアルファ・グリコシダーゼ(alpha-glucosidase: AGL1)をコードする遺伝子、(ii)葉緑体内でアシルACPとして合成される脂肪酸を加水分解し、小胞体上でのTAG合成経路に脂肪酸を供給するアシルACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase: FAT1)をコードする遺伝子、及び(iii)TAG合成経路の最終段階の酵素であるDGAT2をコードする相同遺伝子の1つ（DGAT2d）、の発現が、TAG合成時に最も強く誘導されることを明らかにした。更に、これらの3つの遺伝子を適当なプロモーターの下流にクローン化し、KJ株に導入したところ、形質転換体のTAG生産性が有意に改良され、本発明を完成するに至った。これらの3つの遺伝子は微細藻類の光合成同化産物の代謝に広く関わる酵素であり、KJ株で得られたこの結果は、他の多くの真核微細藻類でも同様に再現できると考えられる。
【００２５】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）AGL1タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた真核微細藻類遺伝子改変株であって、親株と比較してTAG生産性が向上しており、前記AGL1タンパク質が配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（２）さらに、FAT1タンパク質をコードする遺伝子及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子を高発現させた、（１）記載の真核微細藻類遺伝子改変株であって、前記FAT1タンパク質が配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質であり、前記DGAT2タンパク質が配列番号１２に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質である、前記真核微細藻類遺伝子改変株。
（３）前記遺伝子が、遺伝子高発現を担保するプロモーターに機能的に連結されている、（１）又は（２）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（４）トレボキシア藻網に属する、（１）〜（３）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（５）コッコミクサ(Coccomyxa)属又はシュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する、（４）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（６）前記遺伝子が、緑藻に属する株に由来する、（１）〜（５）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（７）前記遺伝子が、トレボキシア藻網に属する株に由来する、（６）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（８）前記遺伝子が、コッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来する、（７）記載の真核微細藻類遺伝子改変株。
（９）（１）〜（８）のいずれか１記載の真核微細藻類遺伝子改変株を培養する工程を含む、TAG生産方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、TAG生産性が向上した真核微細藻類遺伝子改変株を作出することが可能となる。また、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を培養することにより、バイオ燃料等に供する脂質の生産コストを大幅に削減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】100 mM NaCl添加後のKJ株培養での増殖、TAG及びデンプン含有量の変化を示すグラフである。
【図２】KJ株のAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子の発現に対するNaClの影響を示すグラフである。
【図３】KJ株のAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子の発現に対する窒素欠乏条件の影響を示すグラフである。
【図４】pAGL1、pFAT1、pDGAT2d及びpble-PeEGFP-T1Aプラスミドの構造を示す模式図である。
【図５】KJ株とpAGL1プラスミド形質転換体3株(KJoxAGL1-6013, 6060, 6133)の、細胞乾燥重量(DW)当たりのTAG含有率(％DW)、細胞乾燥重量(DW)当たりのデンプン含有率(％DW)、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)とTAG生産性(％)を示すグラフである。
【図６−１】KJ株とpFAT1プラスミド形質転換体6株(KJoxFAT1-313, 325, 428, 520, 585, 643)の、細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW）、細胞乾燥重量当たりのデンプン含有率(％DW)、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)とTAG生産性(％)を示すグラフである。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図６−３】図６−２の続きである。
【図７−１】KJ株とpDGAT2dプラスミド形質転換体4株(KJoxDGAT2d-567, 5617, 5650, 5822)の培養7日目(7d)、14日目(14d)の細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW）、細胞乾燥重量当たりのデンプン含有率(％DW）、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)とTAG生産性(％)を示すグラフである。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図７−３】図７−２の続きである。
【図８】KJ株とKJ株にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入したKJoxDGAT2d-5822株、KJ株にKJFAT1 cDNA発現カセットを導入したKJoxFAT1-325株、KJoxFAT1-325株にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入したKJoxFD-2643株の細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW)の平均値と標準誤差(n = 3)を示すグラフである。
【図９−１】KJ株、KJoxFD-2643株（KJFAT1 cDNA及びKJDGAT2d高発現株）、KJoxAGL1-6060株(KJAGL1 cDNA高発現株)、及びKJoxAFD-41417株(KJAGL1 cDNA、KJFAT1 cDNA及びKJDGAT2d高発現株)の細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW）、細胞乾燥重量当たりのデンプン含有率(％DW)、培養液当たりの細胞乾燥重量(g/L)、TAG生産量(g/L)、1日当たりのTAG生産性(g/L/d)の平均値と標準誤差(n = 3)を示すグラフである。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図９−３】図９−２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、AGL1遺伝子、又はAGL1遺伝子に加えてさらにFAT1遺伝子及び/若しくはDGAT2遺伝子を、真核微細藻類野生株又は当該野生株に由来する変異株に導入(以下、遺伝子導入される株を「親株」と呼ぶ)した結果、TAG生産性が親株よりも有意に(例えば15％以上、好ましくは30％以上、特に好ましくは45％以上)向上した真核微細藻類遺伝子改変株に関する。
【００２９】
真核微細藻類由来のTAGを原料としたバイオ燃料等の生産コストを削減するための最重要課題の一つは、真核微細藻類のTAG生産性の大幅向上である。本発明者等は、KJ株由来のAGL1タンパク質、FAT1タンパク質及び/又はDGAT2タンパク質をコードする遺伝子をKJ株で高発現させることにより、この緑藻のTAG生産性を大幅に改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３０】
上記知見から、遺伝子操作によって、AGL1遺伝子、又はAGL1遺伝子に加えてさらにFAT1遺伝子及び/若しくはDGAT2遺伝子(以下、これらの遺伝子を合わせて「本発明に係る遺伝子」と呼ぶ場合がある)を高発現させることによって真核微細藻類のTAG生産性を向上させること、及び、TAG生産性向上株を培養することにより、バイオ燃料等に供するTAGの生産コストを大幅に削減することが可能となる。
【００３１】
本発明において、真核微細藻類としては、緑藻、珪藻(diatom又はBacillariophyceae)、真正眼点藻綱(Eustigmatophyceae)等に属する真核微細藻類を挙げることができる。
【００３２】
緑藻としては、例えばトレボキシア藻網に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻網に属する緑藻としては、例えば、トレボキシア(Trebouxia)属、クロレラ(Chlorella)属、ボトリオコッカス(Botryococcus)属、コリシスチス(Choricystis)属、コッコミクサ(Coccomyxa)属、シュードコッコミクサ(Pseudococcomyxa)属に属する緑藻が挙げられる。トレボキシア藻綱に属する具体的な菌株としては、KJ株が挙げられる。KJ株は、平成25年(2013年)6月4日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-22254として寄託され、さらに平成27年(2015年)6月2日付けで受託番号FERM BP-22254としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
【００３３】
トレボキシア藻網に属する緑藻以外の緑藻としては、例えばテトラセルミス(Tetraselmis)属、アンキストロデスムス(Ankistrodesmus)属、ドラニエラ(Dunalliella)属、ネオクロリス(Neochloris)属、クラミドモナス属、イカダモ(=セネデスムス：Scenedesmus)属等に属する緑藻が挙げられる。
【００３４】
更に珪藻としては、フィストゥリフェラ(Fistulifera)属、フェオダクチラム属、タラシオシラ(Thalassiosira)属、シクロテラ(Cyclotella)属、シリンドロティカ(Cylindrotheca)属、スケレトネマ(Skeletonema)属等に属する真核微細藻類を挙げることができる。さらに、真正眼点藻綱としては、ナンノクロロプシス属が挙げられる。
【００３５】
本発明においては、上述の真核微細藻類を親株として、本発明に係る遺伝子を高発現させることで、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を得ることができる。
【００３６】
本発明において、AGL1遺伝子としては、例えばKJ株由来のAGL1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)又はその相同体が挙げられる。具体的には、AGL1遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号３における215番目〜783番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、AGL1遺伝子としては、配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアルファ・グリコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アルファ・グリコシダーゼ活性とは、デンプンを非還元末端から加水分解し、D-グルコースを切り出す酵素活性を意味する。
【００３７】
FAT1遺伝子としては、例えばKJ株由来のFAT1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号５、mRNA塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７)又はその相同体が挙げられる。具体的には、FAT1遺伝子としては、配列番号８に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号７における78番目〜283番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、FAT1遺伝子としては、配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つアシルACPチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、アシルACPチオエステラーゼ活性とは、アシル-ACPのチオエステル結合を加水分解する酵素活性を意味する。
【００３８】
DGAT2遺伝子としては、例えばKJ株由来のDGAT2d遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号９、mRNA塩基配列：配列番号１０、アミノ酸配列：配列番号１１)又はその相同体が挙げられる。具体的には、DGAT2遺伝子としては、配列番号１２に示すアミノ酸配列(すなわち、配列番号１１における123番目〜322番目のアミノ酸配列に相当する保存性の高いアミノ酸配列)と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、DGAT2遺伝子としては、配列番号１１に示すアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは、少なくとも65％、特に好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つジアシルグリセロールアシル転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ここで、ジアシルグリセロールアシル転移酵素活性とは、アシルCoAに由来するアシル基がジアシルグリセロールに付加し、TAGが合成される酵素活性を意味する。
【００３９】
本発明に係る遺伝子は、例えば、上記で説明した緑藻に属する株、好ましくはトレボキシア藻網に属する株、特に好ましくはコッコミクサ属又はシュードコッコミクサ属に属する株に由来するものであってよい。
【００４０】
また、本発明においては、好ましくは、AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2遺伝子のうち2つ又は3つ全てを高発現させる。
【００４１】
本発明に係る遺伝子によりコードされるタンパク質を真核微細藻類細胞内で高発現させるための多くの方法が存在する。最も一般的な方法は、高発現させたい遺伝子に機能的に連結させた(例えば、当該遺伝子の上流に)遺伝子高発現を担保するプロモーター(構成的に高発現するプロモーター)を配したコンストラクトを試験管内で構築し、これを宿主に導入する方法である。目的によっては、強度と特性(構成的又は誘導性)の異なるプロモーターを使用することができる。
【００４２】
転写後、mRNA前駆体はキャッピング、スプライシング、ポリ(A)付加等の転写後修飾を受けた後、核より細胞質に移行する。この転写後修飾の効率を上げて遺伝子を高発現させる試みは、プロモーターの利用ほどには行われていない。
【００４３】
一方、mRNAの翻訳効率の改良については、複数の技術が存在する。翻訳開始の効率は開始コドンより上流の配列(5'-UTR)に影響される(Kim et al., 2014, Nucleic Acids Res, 42, 485)ので、5'-UTR配列の最適化で翻訳効率を改良することが可能である。また、mRNAのコドン使用頻度を最適化することによって高発現を達成する手法は広く使われている。すなわち、コドン最適化した遺伝子を試験管内で作製し、これを宿主に導入することによって翻訳されるタンパク質の量を増加させることができる。
【００４４】
以下に述べるように、KJ株の本発明に係る遺伝子は、窒素欠乏又は塩ストレス等によって誘導される。当該遺伝子の発現を正又は負に制御する転写因子によって、この誘導が制御されていると考えられる。この転写因子を同定しその活性化の機構を明らかにすることで、その機構を利用した本発明に係る遺伝子の高発現を達成することができる。一般に、高発現させたい遺伝子がある転写因子によって正に制御されている場合、この転写因子を高発現させることで、目的遺伝子も高発現させることができる。一方、高発現させたい遺伝子がある転写因子によって負に制御されている場合は、逆に、この負の転写因子の発現又は活性を失くすことで、目的遺伝子の高発現を達成させることができる。あるいは、この転写因子を活性化又は不活性化するためのシグナル伝達系を操作することによっても、目的遺伝子の高発現を達成できる。
【００４５】
近年、遺伝子の発現が周辺の染色体構造によって正及び負に制御されることが次第に明らかになってきた。このことから、高発現させたい遺伝子周辺の染色体構造を、例えばインスレーターを導入することによって変化させ、遺伝子の高発現を達成することができる。
【００４６】
具体的な例として、下記の実施例に示すように、本発明に係る遺伝子を強力なプロモーター(例えば、KJ株由来のEF1α遺伝子のプロモーター(配列番号１３))の下流にクローン化し、それをKJ株等の真核微細藻類に導入することによって本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を作製する方法である。
【００４７】
なお、本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株の例として、実施例に示す、KJ株に由来する本発明に係る遺伝子3つ全てをKJ株において高発現させたKJoxAFD-41417株が、平成27年(2015年)8月27日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(NITE-IPOD)(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-22294として寄託され、さらに受託番号FERM BP-22294としてブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管されている。
【００４８】
さらに、本発明は、以上に説明した本発明に係る真核微細藻類遺伝子改変株を大量培養し、TAGを生産する方法である。大量培養法としては、既に確立されている特許文献７に記載の培養法等を用いることができる。具体的には、尿素を窒素源とし、pHが4以下である培地を用いて、微細藻類を培養する方法である。この培養方法によれば、窒素源を尿素とすることで、窒素分消費によるpHの変動は最小限となる。また、pH4以下の培養液中にCO2を導入しても重炭酸イオンがほとんど生じないので、培養液のpHが変動しにくい特徴もある。このように培養液のpHを安定的に4以下に保つことが出来るので、他の微細藻類や原生生物の増殖を抑制することができる。
培養後、例えば培養物からヘキサン抽出等によって、TAGを含む脂質を得ることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５０】
なお、以下の実施例において、AGL1遺伝子は、KJ株由来のAGL1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号１、mRNA塩基配列：配列番号２、アミノ酸配列：配列番号３)であり、FAT1遺伝子は、KJ株由来のFAT1遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号５、mRNA塩基配列：配列番号６、アミノ酸配列：配列番号７)であり、且つDGAT2遺伝子は、KJ株由来のDGAT2d遺伝子(遺伝子塩基配列：配列番号９、mRNA塩基配列：配列番号１０、アミノ酸配列：配列番号１１)である。
【００５１】
〔実施例１〕TAG生産性に関与する遺伝子のRNA-seqによる解析
多くの微細藻類では、窒素欠乏条件で、あるいはそれに加えNaClを100 mM程度培地に添加することによって、TAG生産を促進することができる。KJ株及びKJ株に近縁のシュードコリシスティス・エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)Obi株（以下、「Obi株」と呼ぶ： Satoh et al., 2010, J Jpn Inst Energ, 89, 909)においても、窒素欠乏条件下での培養、及びNaCl添加後の培養の双方において、TAG含有量の増加が見られ、一方でデンプンの蓄積量は減少した。100 mM NaCl添加後のKJ株培養での増殖、TAG及びデンプン含有量の変化を図１に示す。
【００５２】
具体的には、KJ株を、A6培地［2.5 mM (NH2)2CO, 378 μM (NH4)2SO4, 405 μM MgSO4, 265 μM KH2PO4, 264 μM K2HPO4, 61.2 μM CaCl2, 1.20 μM CuSO4, 1.13 μM H3BO3, 1.04 μM ZnSO4, 0.622 μM MnSO4, 0.294 μM CoCl2, 12.4 nM Na2MoO4, 0.4% (v/v) Fe solution (3 g/L citric acid, 4.9 g/L ammonium ferric citrate, 0.5 g/L EDTA-2Na)］を滅菌水で2倍に希釈した培地（1/2 A6培地）を用いた培養液でOD750 = 3になるまで培養し、NaClを0あるいは100 mM添加してから0時間後、24時間後、72時間後のサンプルの、細胞乾燥重量(g/L)と、細胞乾燥重量当たりのTAG重量およびデンプン重量(％DW)とを測定した。図１において、黒塗りの棒グラフは、NaCl添加無し、白塗りの棒グラフは100 mM NaCl添加での結果である。油分含量測定はNMRを用いて以下の条件で行った。細胞を8,000 rpm、5分以上の遠心分離で収穫し、凍結乾燥させた後、40 mg程度を量りとり、Oxford Instrumets社製モデルMQC油分測定装置で単位細胞乾燥重量当たりの油分含量を測定した。検量線は、日本薬局方のオリーブ油を標準物質として作成した。
【００５３】
図１に示すように、NaCl添加によって増殖はわずかに促進された。一方、TAG含量は有意に増加し、デンプン含量は有意に減少した。
【００５４】
また、植物の代謝経路データベース(http://www.plantcyc.org/)を利用して、脂質代謝やデンプン代謝に関わる酵素のアミノ酸配列を得た。これらのアミノ酸配列をqueryとして、KJ株やObi株のゲノム配列あるいはトランスクリプトーム解析(RNA-seq)で得られたmRNA配列に対してtblastn検索を行い、KJ株及びObi株の脂質代謝やデンプン代謝に関わる酵素のアミノ酸配列とその遺伝子とを同定した。また、それらの遺伝子の発現量と発現変化をRNA-seq結果を用いて解析した。
【００５５】
その結果、NaCl添加によって、デンプンの分解に関わるアルファ・グルコシダーゼ(AGL1)遺伝子が、KJ株、Obi株とで共通して強く発現誘導されることが分かった。また、脂肪酸合成の最終段階で働くアシルACPチオエステラーゼ(FAT1)遺伝子と、TAG合成のためのケネディー経路の最終段階で働くジアシルグリセロール・アシル転移酵素(DGAT)の同義遺伝子の一つであるDGAT2dの発現も、NaCl添加によって強く誘導されていた。
【００５６】
図２に、NaClを0及び100 mM添加した時の、KJ株のAGL1、FAT1、DGAT2d遺伝子発現を示す。具体的には、KJ株を、図１と同様に1/2 A6培地を用いた培養液でOD750 = 3になるまで培養し、NaClを0あるいは100 mM添加してから0時間後、24時間後、48時間後のサンプルのRNA-seqによる発現量を解析した。図２において、グラフの縦軸はFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)である。FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子、AGL1遺伝子の発現は、NaCl添加無しでも、培養時間が経過するにしたがって増加したが、NaClを添加した場合は、さらにその発現量が増加した。NaCl添加無しの条件での遺伝子発現増加は、おそらく培地内の窒素分濃度の減少によって起こっていると考えられる。
【００５７】
また、窒素欠乏条件下でも、これらの遺伝子は、同様に誘導されていた(図３)。具体的には、KJ株を窒素十分培地(MA5)で培養後、窒素欠乏培地(MA5-N)に移し、12、24、72、144時間後にサンプリングを行ってRNA-seqにより遺伝子発現量を調べた。図３において、グラフの縦軸はFPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)の平均値(N=2)である。MA5の組成は、18 mM NaNO3, 0.4 mM MgSO4, 60 μM CaCl2, 0.26 mM KH2PO4, 0.26 mM K2HPO4, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 0.4％ (v/v) Fe solution, 0.1％ (v/v) Trace elementsである。この培地作製に用いたストック溶液の組成は、Fe solutionが、3 g /L, citric acid, 4.9 g/L ammonium iron citrate, 0.5 g /L, EDTAであり、trace elementsが、70 mg/L H3BO3, 150 mg/L MnSO4・5H2O, 300 mg/L ZnSO4・7H2O, 300 mg/L CuSO4・5H2O, 70 mg/L CoCl2・6H2O, 3 mg/L Na2MoO4である。MA5-NではNaNO3を加えず、NaClをNa+の濃度が同じになるように加えたものを使用した。
【００５８】
これらの遺伝子は、それぞれ、脂肪酸の合成、TAGの合成、デンプンの分解の最終段階で働く酵素をコードしているため、これらの遺伝子を高発現させることによって、TAG生産性がより向上した株が得られるのではないかと考え、高発現株を作製することとした。
【００５９】
〔実施例２〕AGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNA高発現株の作製
KJ株内でAGL1遺伝子、FAT1遺伝子、DGAT2d遺伝子のcDNAを単独で、あるいは複数を同時に高発現させるために、KJ株の翻訳伸長因子のαサブユニットであるEF1αをコードする遺伝子(以降、「KJEF1A」と呼ぶ)のプロモーター(配列番号１３)とターミネーター(配列番号１４)とを利用した。AGL1遺伝子、FAT1遺伝子及びDGAT2d遺伝子それぞれのcDNAを、KJEF1Aのプロモーターとターミネーターとの間に挿入したpAGL1、pFAT1及びpDGAT2dプラスミドを作製した(図４)。
【００６０】
図４において、KJEF1A pro及びKJEF1A terは、それぞれ、KJ株のEF1A遺伝子(KJEF1A)のプロモーター及びターミネーターを含む配列である。KJRBCSは、KJ株のRuBisCO小サブユニット遺伝子を示し、その最初のイントロン配列(配列番号１５)がプロモーターとcDNAとの間に挿入されている。各プラスミドの中央部分は、各遺伝子のcDNA配列を示している。FLAG-Tagは、N末端-DYKDDDDK-C末端というペプチド配列をコードするDNA断片である。ObiTub pro及びObiAct terは、それぞれ、Obi株のTubulin遺伝子プロモーター及びActin遺伝子ターミネーターを含む配列である(Imamura et al., 2012, J Gen Appl Microbiol, 58, 1)。bleは、ブレオマイシンやゼオマイシン[商品名ゼオシン(ZeocinTM)]耐性遺伝子である(Stevens et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251, 23-30.)。Linkerは、N末端-GGSGGR-C末端というペプチド配列をコードするDNA断片である。PeEGFPは、EGFP(enhanced GFP ：高感度GFP)のコドン使用頻度をObi株での発現のために最適化した配列である。
【００６１】
これらのプラスミドを、パーティクルボンバードメントを用い、G418耐性を付与するpG418-T1Aプラスミド(Kasai et al., 2015, Biotechnol Biofuels, 8, 94)と共にKJ株に共導入し、G418耐性コロニーを選抜した。
【００６２】
pAGL1プラスミドを導入した実験では、G418耐性コロニー106個の内6株(5.7％)で、図４に示すpAGL1プラスミドのKJEF1Aプロモーター5'末端とターミネーター3'末端との間(以降、これを「KJAGL1 cDNA発現カセット」と呼ぶ）の全長が挿入されていた。pFAT1プラスミドを導入した実験では、365個のG418耐性コロニーの内18株（5.0％）でKJFAT1 cDNA発現カセット全長が挿入されていた。pDGAT2dプラスミドを導入した実験では164個のG418耐性コロニーの内、6株(3.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
【００６３】
〔実施例３〕KJAGL1 cDNA高発現株のTAG生産性の評価
pAGL1プラスミドを導入して得られた6株の形質転換体におけるKJAGL1 cDNAの発現を、Real time PCRで解析した。最もKJAGL1 cDNAの発現が高かったKJoxAGL1-6060株(oxはoverexpression line：高発現株を示す)では、培養13日目のTAG生産性が野生株の約1.3倍であった(図５）。残りの株については、TAG含量が若干上昇し、デンプン含量が若干減少したが、TAG生産性は野生株とほぼ同等であった。
【００６４】
ここで、TAG生産性とは、野生株(KJ)のTAG生産量(g/L)を100％としたときの形質転換体のTAG生産量(％)である。また、本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と13日目(13d)にサンプリングを行った。図５において、棒グラフとエラーバーは独立な3回の実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3)を示す。なお、DENSO培地はA6培地とほぼ同じ組成であるが、(NH4)2SO4及び(NH2)2COの濃度がそれぞれ863 μMと2.38 mMである。1/2 DENSO培地は、DENSO培地を蒸留水で2倍に薄めたものである。
【００６５】
〔実施例４〕KJFAT1 cDNA高発現株のTAG生産性の評価
pFAT1プラスミドを導入して得られた形質転換体18株についてTAGの生産性を評価した。18株中12株でTAG含有率が増加し、そのうち細胞乾燥重量の減少があまり見られなかった(すなわち、増殖が悪くならなかった)6株では、培養7日目にTAG生産性が約1.2〜1.3倍に、14日目で約1.1〜1.2倍に増加していた(図６）。このとき、TAGの増加と同時にデンプンの減少が見られたため、pFAT1プラスミドの導入によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図６）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目(7d)と14日目(14d)にサンプリングを行った。
【００６６】
〔実施例５〕KJDGAT2d cDNA高発現株のTAG生産性の評価
pDGAT2dプラスミドの導入で得られた形質転換体6株のうち4株(KJoxDGAT2d-567, 5617, 5650, 5822)において、細胞乾燥重量当たりのTAG含有率に有意な増加が見られ(P < 0.01, Student's t-test)、培養7日目で野生株の約1.2倍、14日目で約1.1倍に増加した(図７）。このとき、TAGの増加が見られた4株においてデンプン含有率が減少していた(P < 0.05, Student's t-test)ことから、KJDGAT2d cDNAの高発現によるTAGの増加はデンプンの減少を伴うと考えられた(図７）。本実施例では、各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、7日目と14日目にサンプリングを行った。図７において、棒グラフとエラーバーは独立な実験で得られたサンプルの平均値と標準誤差(n = 3-6)を示す。
【００６７】
〔実施例６〕複数cDNAを同時に高発現させた株の作製
pFAT1プラスミド形質転換体のうち、7日目におけるTAG生産性が最も高かったKJoxFAT1-325株(図６)にpDGAT2dプラスミドとpble-PeEGFP-T1Aプラスミドとを共導入し、Zeo耐性コロニーを228個選抜した。そして、KJDGAT2d cDNA発現カセットの挿入をPCRで解析したところ、13株(5.7％)でKJDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
【００６８】
複数のcDNAを同一細胞内で同時に高発現させた場合に、TAG生産性がどの程度向上するかを解析するため、3遺伝子のcDNAを4通りに組み合わせた形質転換体（AGL1 & FAT1, AGL1 & DGAT2d, FAT1 & DGAT2d, AGL1 & FAT1 & DGAT2d)を作製した。pAGL1プラスミド形質転換体のうち最もTAG生産性が高かったKJoxAGL1-6060株にpFAT1プラスミドをpble-PeEGFP-T1Aプラスミドと共にKJ株に共導入し、ゼオシン(Zeo)耐性コロニーを237個選抜した。この内の17株(7.2％)でKJFAT1 cDNA発現カセットの全長が挿入されていることを確認した。同様にKJoxAGL1-6060株にpDGAT2dプラスミドをpble-PeEGFP-T1Aプラスミドと共に導入し、Zeo耐性コロニーを130個選抜し、この内18株（13.8%）でDGAT2d cDNA発現カセットの全長が挿入されていることが確認できた。
【００６９】
3つの遺伝子のcDNAを一つの細胞内で高発現させるため、KJoxAGL1-6060株にpFAT1、pDGAT2d及びpble-PeEGFP-T1Aの3つのプラスミドを同時導入し、Zeo耐性コロニーを685個選抜した。この内17株(2.5％)で、KJFAT1 cDNA発現カセット及びKJDGAT2d cDNA発現カセットの両方が挿入されていた。
【００７０】
〔実施例７〕複数のcDNAが高発現した株のTAG生産性評価
実施例６に示すように、KJoxFAT1-325株(図６)にKJDGAT2d cDNA発現カセットを導入した株、すなわち、KJFAT1 cDNAとKJDGAT2d cDNAとを高発現させた13株のうち、最もTAG生産性が高かったKJoxFD-2643株について詳しく解析を行った。また、下記に、形質転換体の構築手順を示す：
0006613731.tif 000002
【００７１】
当該構築手順では、KJ株に、カッコ内に示したcDNAの発現カセットを導入し構築した株名を示す。KJoxFAT1-325株には、再度、KJDGAT2d cDNA発現カセットを導入し、KJoxFD-2643株を作製した。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットのみ、あるいはKJDGAT2d cDNA発現カセットのみを導入して作製した株の名前は示していない。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセット及びKJDGAT2d cDNA発現カセットを同時に導入し、KJoxAFD-41417株を作製した。
【００７２】
KJ株、KJoxFAT1-325株、KJoxDGAT2d-5822及びKJoxFD-2643株を、それぞれ1/2 DENSO培地で初期O.D.750 = 0.2に調整して培養を開始し、培養4日目から18日目までの細胞乾燥重量当たりのTAG含有率(％DW)を測定した。KJoxFAT1-325株とKJoxDGAT2d-5822株は野生株よりTAG含有率が増加していたが、KJoxFD-2643株はそれらの株よりさらにTAG含有率が増加していた(図８)。すなわち、FAT1とDGAT2dの高発現は、KJ株のTAG含有率を加算的に増加させた。各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、培養4, 8, 11, 14, 18日目にサンプリングを行った。
【００７３】
また、KJAGL1 cDNA発現カセット導入株であるKJoxAGL1-6060株のTAG生産性は、野生株よりも約30％高かった(図５）。KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットのみ、あるいはKJDGAT2d cDNA発現カセットのみを導入した株を、それぞれ17株と18株分離し、これらの株のTAG生産性を調べた。これらの発現カセット導入株の中に、親株であるKJoxAGL1-6060株のTAG生産性よりも有意に高いTAG生産性を示すものは見出されなかった。
【００７４】
一方、KJoxAGL1-6060株にKJFAT1 cDNA発現カセットとKJDGAT2d cDNA発現カセットとを同時に導入したKJoxAFD-41417株は、以下に述べるように、その生産性は親株よりもはるかに高かった。
【００７５】
KJ株、前述のKJoxFD-2643株(KJFAT1 cDNA発現カセット+KJDGAT2d発現カセット導入株)、KJAGL1 cDNA発現カセット導入株(KJoxAGL1-6060)、及びKJoxAFD-41417株を1/2 DENSO培地で初期O.D.750 = 0.2に調整して培養を開始し、培養4日目から18日目までの培養液当たりのTAG生産量(g/L)を測定した。KJoxFD-2643株では培養18日目のTAG生産量(g/L)が野生株の約1.2倍、KJoxAGL1-6060株では約1.5倍に増加していた。一方、KJoxAFD-41417株では、TAG生産量(g/L)が培養18日目で野生株の約1.7倍に増加していた(図９）。また、野生株及びKJoxFD-2643株では培養8日目から14日目でTAG生産性(g/L/d)が最大になったのに対して、KJoxAGL1-6060株、及びKJoxAGL1-6060株を親株にしたKJoxAFD-41417株では培養18日目までTAG生産性が増加していた(図９)。各株は1/2 DENSO培地で同時に培養し、培養4, 8, 11, 14, 18日目にサンプリングを行った。
【００７６】
以上の結果より、KJDGAT2d cDNAの高発現とKJFAT1 cDNAの高発現とは、TAG生産性において加算性が認められること、また、KJAGL1 cDNAの高発現と上記2つのcDNAの高発現とを組み合わせることにより、TAG生産性が野生株の約1.7倍に増加した株を作ることが出来ることが示された。
【受託番号】
【００７７】
FERM BP-22254
FERM BP-22294
【図１】
0006613731.tif 000003
【図２】
0006613731.tif 000004
【図３】
0006613731.tif 000005
【図４】
0006613731.tif 000006
【図５】
0006613731.tif 000007
【図６−１】
0006613731.tif 000008
【図６−２】
0006613731.tif 000009
【図６−３】
0006613731.tif 000010
【図７−１】
0006613731.tif 000011
【図７−２】
0006613731.tif 000012
【図７−３】
0006613731.tif 000013
【図８】
0006613731.tif 000014
【図９−１】
0006613731.tif 000015
【図９−２】
0006613731.tif 000016
【図９−３】
0006613731.tif 000017
【配列表】
0006613731000001.app