(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｅ）の各工程を含む血液中の稀少細胞検出方法：
（ａ）血液から赤血球を除去する工程（検体処理工程）；
（ｂ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液中に含まれる細胞を細胞展開用基板上に展開する工程（細胞展開工程）；
（ｃ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液中に含まれる細胞と、稀少細胞同定マーカー（マーカーＡ）、非目的細胞同定マーカー（マーカーＢ）および非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞への反応性と稀少細胞への反応性が異なるマーカー（マーカーＣ）の各マーカーである蛍光標識抗体を反応させる工程であって、前記マーカーＣが、稀少細胞が陰性を示し、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が陽性を示すマーカー（マーカーＣ１）であるか、稀少細胞が陽性を示し、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が陰性を示すマーカー（マーカーＣ２）である工程（染色工程）；
（ｄ）工程（ｃ）で染色した各マーカーの蛍光画像を取得する工程（画像取得工程）；
（ｅ）工程（ｄ）で取得した各マーカーの蛍光画像を用いて、稀少細胞を同定する工程。
【請求項２】
前記稀少細胞が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、または循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）である、請求項１に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項３】
前記稀少細胞が、ＣＴＣである請求項１または２に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項４】
前記非目的細胞が白血球である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項５】
上記工程（ｅ）として、上記工程（ｄ）で取得した各マーカーの蛍光画像を用いて、マーカーＡに対する反応性が陽性閾値を超え、かつマーカーＢに対する反応性が陽性閾値以下であった細胞について、マーカーＣを用いて、マーカーＡに対する陽性反応が偽陽性であるかどうかを判断することによって、稀少細胞を同定する工程を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項６】
上記非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が多核球であり、上記マーカーＣが抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１２３、および抗ＣＤ６１抗体からなる群から選択される一次抗体を用いる多核球マーカーである請求項１〜５のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項７】
上記稀少細胞がＣＴＣであり、上記マーカーＣが抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＥＲ、抗ＰｇＲ、抗ＡＬＫ、抗ｃ−ｍｅｔおよび抗Ｓ１００抗体からなる群から選択される一次抗体を用いるがん細胞マーカーである請求項１〜６のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項８】
上記マーカーＡに対応する蛍光標識抗体が、所定の励起光を照射した際の発光波長のピークが６００ｎｍを超える範囲にある蛍光物質を有するものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法
【請求項９】
上記マーカーＡが抗サイトケラチン、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、抗Ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ、抗ＥＳＰＲ１、抗Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、抗Ｔｗｉｓｔ１、抗Ａｋｔ、抗Ｐｉ３Ｋ、抗Ｚｅｂ１、抗Ｐｌａｓｔｉｎ−３、抗ＡＬＤＨ１、抗Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓおよび抗ＡＢＣ抗体からなる群から選択される一次抗体を用いるマーカーである請求項１〜８のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【請求項１０】
上記マーカーＢが抗ＣＤ４５抗体を一次抗体として用いるマーカーである請求項１〜９のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の稀少細胞を高い精度で検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中には通常、赤血球、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）などの血液細胞が含まれているが、さらに循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）、循環血管内皮細胞（ＣＥＣｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、その他の前駆細胞などの稀少細胞が含まれている場合がある。また、培養されている細胞集団には、幹細胞、特定の分化細胞、その他の特徴的な細胞が含まれている場合がある。
【０００３】
稀少細胞の一つであるＣＴＣは、乳癌、肺癌、前立腺癌、膵臓癌などの患者の血中に見出される細胞であり、その数は癌の転移性を反映しているなど、臨床上の重要な情報になることで注目されている。しかしながら、血液中のＣＴＣの密度は極めて低く（少ない場合、全血１０ｍＬあたり１〜１０個程度）、その検出および計数は容易ではない。
【０００４】
たとえば、既存のフローサイトメーターによる計測では、理論上はＣＴＣ等の稀少細胞と白血球を同時に同定、計数および解析することは可能だが、血液試料中の稀少細胞は非常に数が少ないため検出漏れのおそれがあり、このシステムを用いて稀少細胞が関係する解析を正確に行うことは困難である。
【０００５】
多量の非目的細胞（主に白血球）中から稀少細胞を高感度に検出をするための方法として、核染色や蛍光染色などを行う方法などが知られている。その際に、顕微鏡観察や染色をおこないやすい状態にするため、たとえば、細胞を収容し保持することができるマイクロチャンバーまたは溝を表面に有する基板上に流路形成枠体を設置して作製された、細胞展開用基板を用いて、細胞懸濁液中の細胞を展開するシステムが用いられている。
【０００６】
稀少細胞および非目的細胞を同定するために行われる免疫染色を行う際に、最も用いられているのは、抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体と抗ＣＤ４５抗体を使用した方法である。
例えば、抗ＣＫ抗体はＣＴＣを同定するためのマーカーであり、抗ＣＤ４５抗体は非目的細胞を同定するためのマーカーである。例として、抗ＣＫ抗体に対して反応性を示し（ＣＫ陽性）、かつ抗ＣＤ４５抗体に対しては反応性を示さない（ＣＤ４５陰性）細胞をＣＴＣとして判定し、抗ＣＫ抗体に対しては反応性を示さず（ＣＫ陰性）、かつ抗ＣＤ４５抗体に対して反応性を示す（ＣＤ４５陽性）細胞はＣＴＣではないと判定することができる。
【０００７】
このような手段を用いて、稀少細胞および非目的細胞を同定してその数を計測することで、たとえば細胞の合計数に対するＣＴＣの数の比率や血液試料中のＣＴＣの濃度を算出して、がん等の患者由来の血液試料に含まれるＣＴＣの解析を行うことなどができる。
【０００８】
しかし近年ＣＫ発現が低いＣＴＣが報告されている（非特許文献１）。このようなＣＫ発現が低いＣＴＣを検出するためにはＣＫに起因するシグナルでの陽性閾値を下げる方策等が考えられる。しかしながら、ＣＫに対する陽性閾値を下げた結果、これまでの陽性閾値基準では、ＣＫについて陰性とされてきた非目的細胞の一種である多核球の一部において、ＣＫ陽性かつＣＤ４５陰性となる擬陽性群が出現してしまい、ＣＴＣのような稀少な細胞を正確に同定し定量する際の障害となる。稀少細胞の数に対して多核球の数はかなり多いので、多核球のうちのわずかな割合の細胞が擬陽性を示すとしても、稀少細胞の数の定量結果に与える影響は大きい。なお、多核球の一部がＣＫ陽性を示す理由としては、それらの細胞がＣＫを若干発現していること、またはＣＫではないもののＣＫに類似した構造を有するタンパク質を発現していてそのタンパク質に抗ＣＫ抗体が反応することが考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１３−５０８７２９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Low cytokeratin- and low EpCAM-expressing circulating tumor cells in pancreatic cancer.( Daniel Adams et al.) JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, 2013. Vol 31 (15)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上述したような課題を解決するために、稀少細胞同定マーカーに疑陽性反応を示す非目的細胞を判別することによって、稀少細胞の検出精度を高める方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、稀少細胞と非目的細胞を同定する際に、非目的細胞および稀少細胞に対する反応が異なる第三のマーカーを用いることによって、稀少細胞同定マーカーに対して偽陽性を示す非目的細胞と稀少細胞とを判別することが可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
なお、特許文献１には、稀少細胞とそれ以外の細胞を区別するために三種以上のマーカーを用いることについての記載はあるが、これは稀少細胞および非目的細胞におけるタンパク質の発現レベルを決定することにより稀少細胞の検出を促進するために用いられるもので、本発明のように、稀少細胞と非目的細胞に対する反応性の差異を利用してマーカーに対する偽陽性判定を回避するものではない。
【００１４】
すなわち、本発明は次のような血中細胞の同時検出方法を提供する。
［項１］
下記（ａ）〜（ｅ）の各工程を含む血液中の稀少細胞検出方法：
（ａ）血液から赤血球を除去する工程（検体処理工程）；
（ｂ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液中に含まれる細胞を細胞展開用基板上に展開する工程（細胞展開工程）；
（ｃ）工程（ａ）で処理を行った既定量の血液中に含まれる細胞と、稀少細胞同定マーカー（マーカーＡ）、非目的細胞同定マーカー（マーカーＢ）および非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞への反応性と稀少細胞への反応性が異なるマーカー（マーカーＣ）の各マーカーである蛍光標識抗体を反応させる工程（染色工程）；
（ｄ）工程（ｃ）で染色した各マーカーの蛍光画像を取得する工程（画像取得工程）；
（ｅ）工程（ｄ）で取得した各マーカーの蛍光画像を用いて、稀少細胞を同定する工程。
【００１５】
［項２］
上記工程（ｅ）として、上記工程（ｄ）で取得した各マーカーの蛍光画像を用いて、マーカーＡに対する反応性が陽性閾値を超え、かつマーカーＢに対する反応性が陽性閾値以下であった細胞について、マーカーＣを用いて、マーカーＡに対する陽性反応が偽陽性であるかどうかを判断することによって、稀少細胞を同定する工程を含む項１に記載の稀少細胞検出方法。
【００１６】
［項３］
上記マーカーＣとして、稀少細胞が陰性を示し、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が陽性を示すマーカーを使用する項１または２に記載の稀少細胞検出方法。
【００１７】
［項４］
上記マーカーＣとして、稀少細胞が陽性を示し、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が陰性を示すマーカーを使用する項１またはに記載の稀少細胞検出方法。
【００１８】
［項５］
上記非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が多核球であり、上記マーカーＣが抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１２３、および抗ＣＤ６１抗体からなる群から選択される一次抗体を用いる多核球マーカーである項３に記載の稀少細胞検出方法。
【００１９】
［項６］
上記稀少細胞がＣＴＣであり、上記マーカーＣが抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＥＲ、抗ＰｇＲ、抗ＡＬＫ、抗ｃ−ｍｅｔおよび抗Ｓ１００抗体からなる群から選択される一次抗体を用いるがん細胞マーカーである項４に記載の稀少細胞検出方法。
【００２０】
［項７］
上記マーカーＡに対応する蛍光標識抗体が、所定の励起光を照射した際の発光波長のピークが６００ｎｍを超える範囲にある蛍光物質を有するものである項１〜６のいずれか一項に記載の稀少細胞検出法
【００２１】
［項８］
上記マーカーＡが抗サイトケラチン、抗ＥｐＣＡＭ、抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、抗Ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ、抗ＥＳＰＲ１、抗Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、抗Ｔｗｉｓｔ１、抗Ａｋｔ、抗Ｐｉ３Ｋ、抗Ｚｅｂ１、抗Ｐｌａｓｔｉｎ−３、抗ＡＬＤＨ１、抗Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓおよび抗ＡＢＣ抗体からなる群から選択される一次抗体を用いるマーカーである請求項１〜７のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【００２２】
［項９］
上記マーカーＢが抗ＣＤ４５抗体を一次抗体として用いるマーカーである項１〜８のいずれか一項に記載の稀少細胞検出方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の方法により、稀少細胞の検出において、稀少細胞同定マーカーに偽陽性反応を示す非目的細胞と稀少細胞とを正確に判別することが可能となり、稀少細胞を高い精度で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の実施例に係る白血球のマーカーによる分類割合模式図である。本明細書においては、各マーカーである蛍光標識抗体に対する蛍光の輝度が陽性閾値を超えた場合は陽性（＋）とし、各マーカーである蛍光標識抗体に対する蛍光の輝度が陽性閾値以下であった場合は陰性（−）と示す（例：ＣＫ（＋）は抗ＣＫ蛍光標識抗体に対する蛍光の輝度が陽性閾値を超えていることを示す）。全白血球中（単核球、多核球の両方を含む）、ＣＫ（−）が９４％、ＣＫ（＋）かつＣＫ４５（＋）が５％である。また、ＣＫ（＋）かつＣＫ４５（−）である、ＣＴＣ偽陽性に分類される白血球は１％であり、この白血球がＣＤ１６（＋）である。
【図２】図２は、参考例の結果を示すプロット図である。
【図３】図３は、本発明の実施例と同様の手法により取得された蛍光画像である。左図は多核球、中図は単核球、右図はＭＤＡ−ＭＢ２３１の画像である。この画像をカラーで見た場合ＣＫは赤色、ＣＤ４５は緑色、核は青色で観察される。左図において多核球は、核を表す青やＣＤ４５を表す緑とともに、ＣＫを表す赤で染色されていることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（血液）
本明細書に記載の「血液」は、赤血球細胞、白血球細胞、血小板、内皮細胞、中皮細胞または上皮細胞を含む、全血の任意の成分を含むことを意図する。血液はまた、タンパク質、脂質、核酸および炭水化物などの血漿の成分、および妊娠、臓器移植、感染、外傷または疾患によって血液中に存在する可能性がある任意の他の細胞、たとえばＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＥＰ、その他の前駆細胞などの稀少細胞も含む。
【００２６】
（赤血球）
本明細書に記載の「赤血球」は、赤血球であり、特に無核赤血球細胞を意味する。
【００２７】
（白血球）
本明細書に記載の「白血球」は、白血球であるか、または網状赤血球もしくは血小板ではない造血系列の細胞である。白血球は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球を含む。白血球はまた、単球、マクロファージ、顆粒球などの貪食細胞およびマスト細胞を含む。
【００２８】
（単核球）
本明細書に記載の「単核球」は、白血球の一種であり、正常人においては白血球の２２〜４６％を占める。単核球には単球およびリンパ球が含まれており、血液１μＬ中に単球は１００〜６００個（全白血球の２〜６％）、リンパ球は１０００〜３６００個（全白血球の２０〜４０％）存在する。
【００２９】
（多核球）
本明細書に記載の「多核球」は、白血球の一種であり、正常人においては白血球の５５〜８０％を占める。多核球には好中球、好酸球および好塩基球が含まれており、好中球はさらに桿状核球および分節核球に細分される。血液１μＬ中に好中球（桿状核球）は１５０〜４００個（全白血球の３〜５％）、好中球（分節核球）は２５００〜６３００個（全白血球の５０〜７０％）存在し、多核球の大多数を占める。一方、好酸球は１００〜３６０個（全白血球の２〜４％）、好塩基球は０〜５０個（全白血球の０〜１％）存在している。
白血球の種類およびその細胞数・細胞割合を下記に示す。
【００３０】
【表Ａ】
0006582486.tif 000002
【００３１】
−  稀少細胞検出方法  −
本発明における稀少細胞検出方法は、少なくとも（ａ）検体処理工程、（ｂ）細胞展開工程、（ｃ）染色工程、（ｄ）画像取得工程および（ｅ）同定工程を含む。本発明の一様態においては、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ）の工程順に行われ、また別の様態においては（ａ）→（ｃ）→（ｂ）→（ｄ）→（ｅ）の工程順に行われる。
【００３２】
―工程（ａ）：検体処理工程―
検体処理工程（ａ）は、患者の血液から赤血球を除去する工程である。本発明に使用する検体を調製する際には、赤血球の除去およびその他の必要な前処理をあらかじめ行っておくことが適切である。なお、本明細書において患者とは癌等に罹患している対象のみならず、罹患が疑われる対象も包含する。
【００３３】
（抗凝固処理）
採取されて体外に取り出された血液（全血）は、そのまま空気に触れさせると時間の経過と共に凝固し、そこに含まれる細胞を回収して観察することができなくなる。そのため、採取された血液は直ちに抗凝固処理することが好ましい。
【００３４】
全血用の抗凝固剤としては様々なものが公知であり、一般的な濃度、処理時間等の条件に従って用いることができる。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やクエン酸（ナトリウム塩等の塩を含む）に代表される、キレート作用によりカルシウムイオンと結合し、反応系から除去することによって凝固を阻止するタイプの抗凝固剤や、ヘパリンに代表される、血漿中のアンチトロンビンＩＩＩと複合体を形成してトロンビンの産生を抑制することにより凝固を阻止するタイプの抗凝固剤が挙げられる。このような抗凝固剤があらかじめ収容された採血管を利用してもよい。
【００３５】
また、細胞に対しては、細胞の自己分解や腐敗を遅延させ、その形態や抗原性を保持するための固定化処理；細胞膜の透過性を向上させて細胞の外部から細胞の内部に物質（細胞内にある抗原を標的とする蛍光標識抗体や、核染色剤等）が浸透しやすくするための浸透化処理；細胞展開用基板上において、マイクロチャンバー等の細胞の固相化に関与する部位以外に細胞が吸着することを防止するとともに、必要に応じて行われる免疫染色において目的とする抗原以外の部位に蛍光標識抗体が非特定的に吸着することを防止するためのブロッキング処理などを必要に応じて行ってもよい。固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理を検体処理工程と同時に行わない場合は、それらの処理は例えば後述するように、染色工程と同時に行うようにしてもよい。
【００３６】
（赤血球の除去）
展開した細胞を観察する場合においては、観察領域に対象となる細胞同士が重ならないように細胞を展開しなくてはならない。それには血液内の有形成分のうち約９６％を占める赤血球を検体から除去することが必要となる。赤血球を除去することで不必要な細胞同士の重なりを抑え、対象となる細胞を効率よく展開することで、検出感度を低下させずに稀少細胞を検出することが可能となる。
【００３７】
赤血球を除去するための手段は特に限定されるものではないが、たとえば、塩化アンモニウム等を使用して赤血球を溶血させてもよい。また、遠心分離処理により、赤血球とそれ以外の細胞を分離して、少なくとも稀少細胞および非目的細胞を含む細胞画分を精製してもよい。これらの手法は公知であり、適切な遠心分離機および遠心分離条件を用いて実施することができる。
【００３８】
ここで、密度勾配遠心法は、各種の細胞を含む血液中の成分を比重に従って分画することができる方法として知られている。特に、血液中に多量に含まれている赤血球を除去し、稀少細胞および非目的細胞を含む細胞画分のみを細胞展開工程に供するためには、密度勾配遠心法を用いることが好ましい。
【００３９】
密度勾配遠心法に用いられる分離液は、血液中の細胞の分画に適した比重を有し、また細胞を破壊することのない浸透圧およびｐＨを有するよう調製したものであればよいが、例えば、市販されているフィコール（Ficoll：商標、GEヘルスケアバイオサイエンス）、パーコール（Percoll：商標、GEヘルスケアバイオサイエンス）、ポリモルホプレップ（Polymorphprep：商標、ポリモルホプレップ、コスモバイオ）などのショ糖溶液を用いることができる。この分離液の比重を、赤血球の比重よりも小さく、白血球の比重よりも大きくなるよう調節した上で密度勾配遠心処理を行うと、血液検体を「赤血球が多く含まれる画分」と「赤血球以外の細胞が多く含まれる画分」の少なくとも二層に分離することができる。
【００４０】
例えば、本発明における一つの態様において、分離液の比重を１．１１９以下、好ましくは１．１１３以下、より好ましくは１．０８５以下にすると、赤血球以外の有核細胞（稀少細胞および非目的細胞）が多く含まれる画分への赤血球の混入率を２〜６％またはそれ以下に抑えることができる。さらに、分離液の比重を約１．０７７にすると、ＣＴＣ等の稀少細胞を赤血球および多くの非目的細胞から分離することができる（ただし、その場合もＣＴＣ等の稀少細胞と多核球等の非目的細胞をあらかじめ完全に分離することはできず、擬陽性の可能性がつきまとう）。
【００４１】
―工程（ｂ）：細胞展開工程―
細胞展開工程（ｂ）は、検体処理工程（ａ）を経た規定量の血液（細胞懸濁液）中に含まれる細胞を細胞展開用基板上に展開回収する工程である。細胞展開工程（ｂ）は後述する染色工程（ｃ）の後に行ってもよい。
【００４２】
（細胞展開用基板）
本発明における細胞展開用基板は、典型的には、後述する細胞観察方法に用いられるデバイスの基板（流路基板）に相当するものであり、流路形成部材と組み合わせて流路を形成し、その流路に細胞懸濁液を導入することにより、細胞展開用基板の表面に細胞懸濁液中の細胞を展開するようにして用いられる。しかしながら、細胞展開用基板はそのようなものに限定されるものではなく、細胞が重ならずに並べることができる様々な基板上の部材を、細胞展開用基板として用いることができる。
【００４３】
本発明における細胞展開用基板には、細胞懸濁液中の細胞を蛍光観察に適した状態で回収することができるように微細なチャンバー（マイクロチャンバー）あるいは溝が形成されていることが好ましい。
【００４４】
細胞展開用基板が溝を持つ形態の場合、前記溝の溝幅が１〜１００μｍの範囲内であるとともに、溝深さが１〜１００μｍの範囲内に設定されることが好ましい。寸法がこのような範囲内であれば、細胞を溝内に確実に展開することができる。前記溝の断面形状については特に限定されるものではないが、断面がＶ字状であれば、細胞を密に並べることができるので好ましい。Ｖ字状以外にも例えば溝の一方の側面のみが斜めに傾斜しているもの、溝の頂部および底部に丸みを帯びているもの、あるいはＵ字状の溝であっても良い。また上記寸法の溝は、溝幅と溝深さとを同じ寸法とすることが好ましい。このように設定すれば、一度溝内に入った細胞が移動し難くなるとともに、溝内に入った細胞が、他の細胞を堰き止めてしまうようなことも防止することができる。
【００４５】
前記溝は、公知の微細加工技術で加工可能であるが、例えば市販のプリズムシートを代用することもできる。通常、プリズムシートは、平板の上面に同じ大きさの溝が複数列状に並設されたものであり、溝の溝幅および溝深さも上記の好ましい範囲に合ったものが市販されている。
【００４６】
細胞展開用基板がマイクロチャンバーを持つ形態の場合、マイクロチャンバーの形状は特に限定されるものではないが、例えば、底面が平坦で側面がテーパー形状である逆円錐台形が好ましい。マイクロチャンバーの底面の直径および深さは、核酸の解析や染色像の観察に適した数の細胞を回収して収容することができるよう、適宜調節することができる。例えば、１つのマイクロチャンバーあたり１〜１００個の細胞を収容できるよう、底面の直径を２０〜５００μｍ、深さを２０〜５００μｍの範囲とすることが好ましい。なお、血液中の種々の細胞（赤血球を除く）の直径は一般的に５〜１００μｍであり、ＣＴＣ等の稀少細胞の直径は１０〜１００μｍ程度と言われている。また、蛍光染色像の観察時に励起光の光源としてレーザーダイオードを用いる場合、その照射領域（スポット）のサイズは、例えば長径１００μｍ×短径１０μｍ程度の楕円形である。マイクロチャンバーの底面のサイズは、このレーザーダイオードの照射領域のサイズよりも大きくし、１つのマイクロチャンバーに光を照射しているときに、隣接するマイクロチャンバーにもまたがって光が照射されて、複数のマイクロチャンバーから同時に蛍光が発せられることがないようにすることが適切である。
【００４７】
細胞展開用基板の表面上における、複数のマイクロチャンバーの配置は特に限定されるものではないが、細胞の回収率（懸濁液中の全ての細胞のうちマイクロチャンバー内に回収できた細胞の割合）がなるべく高くなるよう、配列の向きやマイクロチャンバー同士の間隔を調節されていることが好ましい。例えば、流路に細胞懸濁液を送液したときに流入口から流出口に至るまでのどこか少なくとも１箇所で細胞がマイクロチャンバーに沈降するよう、マイクロチャンバーを配列させることが好ましい。
【００４８】
様々な基質材料が当技術分野において周知であり、たとえば、そのような材料は、ガラス；ポリカルボナートおよびポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィンなどの有機プラスチック；ポリアミド；ポリエステル；シリコン；ポリウレタン；エポキシ；アクリル；ポリアクリラート；ポリエステル；ポリスルホン；ポリメタクリラート；ポリカルボナート；ＰＥＥＫ；ポリイミド；ポリスチレン；およびフルオロポリマーの１種または複数種を含んでもよい。
【００４９】
細胞展開用基板は、細胞が接着しやすい材料で作製してもよい。この場合、細胞展開用基板のマイクロチャンバーの内表面あるいは溝内以外の部分には、前述したように、ブロッキング剤等による表面処理を施すことが望ましい。
【００５０】
（細胞の固相化方法：細胞展開用基板の材質および構造）
稀少細胞の検出効率を高めるためには、細胞を固相化する、つまり細胞展開用基板上の細胞の位置が動かないようにする必要がある。細胞を固相化することにより、観察の対象とする細胞の位置を特定しやすくなり、必要に応じて検出された目的細胞を回収することも可能となる。
【００５１】
細胞の固相化のための手法は、細胞展開用基板の表面の構造によって細胞の移動できる範囲を制限するようにする手法（構造的手法）と、細胞展開用基板の表面の性状によって生じる物理的相互作用により細胞を吸着させて動かないようにする手法（相互作用手法）とに大別することができる。
【００５２】
固相化の構造的手法としては、たとえば前述したように、細胞展開用基板の表面にマイクロチャンバーまたは溝を複数形成することによって、細胞の移動をチャンバーまたは溝の中だけに制限することが挙げられる。
【００５３】
固相化の相互作用的手法としては、マイクロチャンバーの内面、特に底面または溝の内部の性状を、相互作用によって細胞が吸着しやすい性質、すなわち細胞接着性にすることが挙げられる。具体的には、たとえばマイクロチャンバーまたは溝内壁面あるいは細胞展開用基板全体をポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネートといったプラスチックやガラスのように、細胞が物理的な（分子間の）相互作用によって吸着しやすい疎水性材料で作製する方法がある。基板全体をこのような物質で作製した場合、送液の途中で細胞が吸着してしまいマイクロチャンバーまたは溝に回収されることの妨げとならないよう、細胞自体をブロッキング処理して吸着能力を失わせるか、細胞が吸着しやすい性質を、マイクロチャンバーまたは溝の内壁面等の必要な部分だけに留めることが好ましい。
【００５４】
また、マイクロチャンバーまたは溝の内壁面をポリ−Ｌ−リジンのように細胞の接着性を向上する分子でコーティングする方法が挙げられる。細胞展開用基板の表面のうちマイクロチャンバーまたは溝の内部以外の部分を、細胞が吸着しないようブロッキング剤で処理するか、大気雰囲気化でＵＶを照射するＵＶオゾン処理や酸素プラズマ処理によって適度に親水化する方法もある。マイクロチャンバーまたは溝の内部には、細胞が吸着しやすい材料が露出した状態を保つことにより、そこに細胞を吸着させ、細胞懸濁液の流れによって再びマイクロチャンバーまたは溝の外に出て行かないようにすることができる。
【００５５】
（プレウェット液送液工程）
細胞展開工程（ｂ）において、細胞懸濁液を送液するのに先だって、細胞展開用基板の表面の濡れ性を改善することなどを目的としたプレウェット液を送液する工程を設けてもよい。細胞展開用基板がポリスチレンのような疎水性の材料から形成されている場合、流路内に細胞懸濁液を導入しても、表面張力の関係でマイクロチャンバーまたは溝内に気泡が残存してしまい、細胞懸濁液を全てのマイクロチャンバーまたは溝内に充填させることができないことがある。そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液を細胞展開用基板の表面に展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールの水溶液をプレウェット液として、流路に導入しておくことにより、細胞展開用基板の表面の濡れ性を向上させることができる。このようにプレウェット液で処理した後、ＰＢＳ等の生理食塩水または純水を通液してプレウェット液を置換、洗浄してから、細胞懸濁液を通液するようにすれば、細胞懸濁液はほとんど全てのマイクロチャンバーまたは溝の内部に入り込み、細胞を効率的に回収することができるようになる。
【００５６】
プレウェット溶液には、水よりも表面張力の低い水溶液であれば特に限定されるものではないが、例えば、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類を含む水溶液、好ましくは３０％（ｗ/ｖ）以下の濃度のエタノール水溶液や、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０，  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ（登録商標）、ＳＤＳ等の界面活性剤を０.０１〜１％（ｗ/ｖ）で含む水溶液を用いることができる。
【００５７】
―工程（ｃ）：染色工程―
細胞展開工程（ｃ）は、検体処理工程（ａ）を経た細胞懸濁液に含まれる細胞を、マーカーである蛍光標識抗体を用いて染色する工程であり、細胞展開工程（ｂ）の前におこなってもよいし、後に行ってもよい。
【００５８】
染色工程（ｃ）では、少なくとも、稀少細胞が発現している分子に対して特異的に結合する抗体（一次抗体）と、それを直接的または間接的に標識する蛍光物質を含む蛍光標識抗体を稀少細胞同定マーカー（マーカーＡ）として用い、非目的細胞が発現している分子に対して特異的に結合する抗体（一次抗体）と、それを直接的または間接的に標識する蛍光物質を含む蛍光標識抗体を非目的細胞同定マーカー（マーカーＢ）として用いる。
【００５９】
本発明においてマーカーＡおよびＢ（ならびに次に述べるマーカーＣ）が結合する分子は、公知の顕微鏡技術、組織学的技術、または分子生物学的技術によって同定可能な、試料中に存在する任意の細胞成分であり、たとえば、表面抗原、膜貫通型の受容体またはコレセプター、表面に結合もしくは凝集しているタンパク質、炭水化物等の高分子、および細胞質成分もしくは核成分などの細胞内成分などを包含するが、これらに限定されない。
【００６０】
例えば、上皮細胞性のＣＴＣでは発現し、かつ白血球ではほとんど発現しないタンパク質としては、がん細胞マーカーと知られている、細胞表面に発現するＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule：上皮細胞接着分子）や、細胞内部に発現するサイトケラチン（ＣＫ）などが挙げられる。一方、白血球では発現し、かつＣＴＣではほとんど発現しないタンパク質としては、白血球マーカーとして知られている、細胞表面に発現するＣＤ４５などが挙げられる。したがって、稀少細胞がＣＴＣであり、非目的細胞が白血球である場合、マーカーＡの一次抗体としては抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗ＣＫ抗体などを用いることができ、マーカーＢの一次抗体としては抗ＣＤ４５抗体などを用いることができる。
【００６１】
さらに本発明における染色工程においては、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞に対する反応性と稀少細胞に対する反応性が異なるマーカー（マーカーＣ）を用いる。ここでマーカーＣは非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞、つまりマーカーＡに対して偽陽性反応を示している非目的細胞と稀少細胞を区別するために用いられる。
【００６２】
マーカーＣは、稀少細胞に対して陰性を示し、非目的細胞に対して陰性を示し、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞に対して陽性を示すマーカー（本明細書においてマーカーＣ１と呼ぶ。）であってもよいし、稀少細胞対して陽性を示し、非目的細胞に対して陽性を示し、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞に対して陰性を示すマーカー（本明細書においてマーカーＣ２と呼ぶ。）であってもよい。
【００６３】
例えば、稀少細胞がＣＴＣであり、非目的細胞が白血球であり、非目的細胞のうちマーカーＡで染まる細胞が多核球である場合、マーカーＣ１の一次抗体としては抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４４，抗ＣＤ１２３，および抗ＣＤ６１抗体などの多核球特異的マーカーを用いることができ、マーカーＣ２の一次抗体としては、抗Ｈｅｒ２、抗ＥＧＦＲ、抗ＥＲ、抗ＰｇＲ、抗ＡＬＫ、抗ｃ−ｍｅｔおよび抗Ｓ１００抗体などのがん細胞特異的マーカーを用いることができる。
【００６４】
（蛍光標識抗体）
本発明においてマーカーとして用いられる蛍光標識抗体は、対象となるタンパク質を特異的に認識する一次抗体に、後述する蛍光物質が結合したもの（直接標識法）であっても良いし、あるいはそのような一次抗体と、これを抗原とする二次抗体に蛍光物質を結合させたものとの組み合わせ（間接標識法）であってもよい。本明細書において特定の抗体を「一次抗体として用いる」ことには、上記の直接標識法および間接標識法のどちらの実施形態における利用も包含される。
【００６５】
これらの蛍光標識抗体は公知の手法により作製することができる。例えば、市販されている各種の抗体および蛍光標識キットを用いて、添付されているプロトコールに従い、抗体と蛍光色素のそれぞれが有する所定の官能基同士を所定の試薬の存在下に反応させて結合させることにより、あるいはビオチン−アビジン結合を利用することにより、所望の蛍光標識抗体を作製することができる。
【００６６】
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよいが、二次抗体に蛍光物質を結合させたものを蛍光標識抗体として用いるときには、各マーカーに用いる一次抗体としてはそれぞれ異なった動物種由来の抗体を用いなければならない。
【００６７】
一次抗体に蛍光物質を結合させたものを蛍光標識抗体として用いるときは、検体処理工程（ａ）を経た細胞懸濁液に含まれる細胞にマーカーを直接接触させることによって細胞とマーカーとを反応させる。また、一次抗体およびこれを抗原とする二次抗体に蛍光物質を結合させたものを蛍光標識抗体として用いるときは、一次抗体を細胞と接触させ（一次反応）、さらに蛍光物質で標識した二次抗体を接触させることで反応を行う（二次反応）。一次反応と二次反応は、順次行ってもよいし、同時に行ってもよい。
【００６８】
（蛍光物質）
蛍光標識抗体に用いられる蛍光物質は特に限定されるものではなく、取得した蛍光画像における蛍光強度に基づいて各マーカーが陽性か陰性かを判定することができるものであればよいが、例えば公知の様々な蛍光物質（蛍光色素）を用いることが好適である。ここでマーカーＢとマーカーＣである蛍光標識抗体に用いられる蛍光物質は異なったもの（蛍光波長の発光ピークがある程度離れ、画像処理ソフト等によって異なる色であると判別可能なもの）を用いてもよいし、同種のもの（蛍光波長の発光ピークが近接し、画像処理ソフト等によって同じ色であると判別可能なもの）を用いてもよい（後記実施例２参照）。またマーカーＡとマーカーＢ、マーカーＡとマーカーＣである蛍光標識抗体に用いられる蛍光物質はそれぞれ異なったものを用いる必要がある。
【００６９】
マーカーＡである蛍光標識抗体に用いられる蛍光物質は、所定の励起光を照射した際の発光波長のピークが６００ｎｍを超える範囲にあるものを選択することが好ましい。発光波長のピークが６００ｎｍを超える範囲にある蛍光は比較的自家蛍光の影響を受けにくく、わずかな稀少細胞から発せられる微弱な蛍光の検出において好適に用いられるからである。
【００７０】
それぞれのマーカーの有する蛍光物質同士の励起光波長および蛍光波長、ならびに核染色の蛍光波長の関係性を考慮し、適切な複数枚のカットフィルターを用いることでそれぞれの蛍光をうまく測定できるよう、適切な励起光波長および蛍光波長を有する蛍光物質を選択して用いればよい。
【００７１】
なお、細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理などを検体処理工程でおこなわない場合、必要に応じて染色工程においてそれらの処理を同時に行ってもよい。すなわち、蛍光標識抗体や核染色剤とともに、固定化剤、浸透化剤、ブロッキング剤のうち必要なものが溶解した水溶液を送液し、所定の時間流路を満たして細胞と反応させるようにしてもよい。
【００７２】
例えば、各マーカーや核染色剤が溶解した水溶液である染色液を、細胞展開用基板上に設けた流路に送液し、所定の時間流路を満たして、細胞展開用基板上のマイクロチャンバーまたは溝に収容された細胞と染色液を接触させることにより、その細胞が有する抗原にその蛍光標識抗体を結合させるようにすればよい。
【００７３】
また、（ｂ）細胞展開工程の前に（ｃ）染色工程を行う場合は細胞をあらかじめ染色液と所定の時間反応させ、洗浄した後に適切なバッファーに懸濁し、細胞展開用基板に展開するようにすればよい。
【００７４】
染色工程の時間、すなわち細胞と蛍光標識抗体溶液とを接触させる時間は、一般的な蛍光免疫染色を行う場合に準じて、免疫染色が十分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は５分〜半日程度とすればよい。
【００７５】
染色工程の温度、すなわち反応温度は、一般的な蛍光免疫染色を行う場合に準じて、免疫染色が十分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は４〜３７℃程度とすればよい。
【００７６】
本発明ではさらに、核マーカーに対する染色（核染色）をあわせて行ってもよい。核染色のためには、二本鎖ＤＮＡにインターカレートすることにより蛍光を発する蛍光色素（分子）を用いることが好適である。そのような蛍光色素は「核染色剤」として公知であり、例えば、細胞膜透過性があり生細胞の核染色が行えるＨｏｅｃｈｓｔ系色素（Hoechst 33342, Hoechst 33258等）を用いることができる。また、細胞膜透過性がないため生細胞の核染色は行えないが、細胞膜が変質しているため透過可能になっている死細胞の核染色が行えるＤＡＰＩ（4’,6-diamidino-2-phenylindole）を用いることもできる。
染色工程を行った後、画像取得工程において染色された細胞の観察像を撮影する前に、必要に応じて洗浄液を添加し、未反応の蛍光標識抗体を除去してもよい。
【００７７】
―工程（ｄ）：画像取得工程―
画像取得工程（ｄ）では、染色工程（ｃ）で染色した各マーカーおよび／または核マーカーの蛍光画像を取得する。
【００７８】
蛍光画像の撮影は、従来と同様の方法で行うことができる。例えば、蛍光画像を撮影するために、順次、それぞれのマーカーに結合した蛍光物質に対応した適切な波長の励起光を照射し、適切なフィルターを用いて不要な波長成分をカットして、それぞれの蛍光物質から発せられる蛍光を観察しながら撮像すればよい。
【００７９】
また、細胞の形態を確認する等の目的のために、明視野での観察および画像撮影をあわせて行ってもよい。
この工程において取得したそれぞれの画像は、必要に応じて適切な画像処理手段（ソフトウェア等）を用いて統合や補正を行った上で、続く同定工程に用いることができる。
【００８０】
―工程（ｅ）：同定工程―
同定工程（ｅ）では、画像取得工程（ｄ）で取得した各マーカーの蛍光画像から稀少細胞（および非目的細胞）を同定する。典型的には、マーカーＡに対する反応性が陽性閾値を超え、かつマーカーＢに対する反応性が陽性閾値以下であった細胞について、マーカーＣを用いて、マーカーＡに対する陽性反応は偽陽性であるかどうかを判断した上で、稀少細胞（および非目的細胞）を同定する。
【００８１】
例えば、本発明の一態様においては、稀少細胞がＣＴＣであり、非目的細胞が白血球である場合、マーカーＡで染色される可能性がある非目的細胞が多核球である。この場合、たとえばマーカーＡの一次抗体には抗ＣＫ抗体を、マーカーＢの一次抗体には抗ＣＤ４５抗体を、そしてマーカーＣの一次抗体には、多核球が陽性を示しＣＴＣおよび多核球以外の白血球が陰性を示す抗ＣＤ１６抗体を用いることができる。
【００８２】
ここで、マーカーＡが陽性であり、かつマーカーＢが陰性の細胞において、マーカーＣが陰性であるなら、マーカーＡの陽性は真のものであり、したがってこの細胞はＣＴＣであると同定できる。一方、マーカーＣが陽性であるなら、マーカーＡの陽性は偽陽性であり、したがってこの細胞はＣＴＣではなく多核球であると同定できる。
【００８３】
以下に述べる細胞解析装置ならびにそれに装着される流路デバイスおよび試薬収容器、換言すればこれらを含む細胞観察システムは、本発明の稀少細胞検出方法を実施するために使用することのできる好適な手段の例である。しかしながら、本発明はそのような細胞解析装置等を使用する実施形態に限定されるものではなく、他の手段を用いて実施してもよい。
【００８４】
＜細胞解析装置＞
細胞解析装置は少なくとも、細胞展開工程における細胞懸濁液、染色工程における染色液など、各種の液体を流路デバイスの流路に送液するための送液系機構と、それらの工程に用いられる流路デバイスを保持する流路デバイスホルダーおよび試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー、ならびに細胞解析装置が備える各種の機器類の挙動を制御するための制御機構を備える。細胞解析装置はさらに、流路デバイスの細胞展開用基板上に回収され蛍光染色された細胞を観察し、それらの蛍光画像を撮像するための光学系機構も、送液系機構と同じ装置内に備えることが好ましい。必要であれば、細胞解析装置はさらに、密度勾配遠心等により赤血球等を除去することのできる検体処理機構を、光学系機構等と同じ装置内に備えるようにすることも可能である。
【００８５】
（検体処理機構）
検体処理機構は、患者から採取した血液から、溶解や遠心分離などによって赤血球を除去し、実施形態に応じて好ましくはさらに多核球等の不要な白血球も除去するための手段に相当する。検体処理機構はさらに、細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理等、検体処理と同時に行うことのできる各種の処理を行うための機能を兼ね備えていてもよい。
【００８６】
遠心分離によって赤血球等を除去する場合の検体処理機構は、密度勾配遠心法など所定の手法を用いて遠心分離処理を行うことができる、従来の遠心分離機に準じて構築することができる。また、溶解によって赤血球を除去する場合、さらに必要に応じて細胞の固定化処理、浸透化処理、ブロッキング処理等も行う場合の検体処理機構は、血液に必要な試薬を添加することができるよう、ピペットやチップなどを用いて構築することができる。
【００８７】
検体処理機構が、送液系機構等を備えた細胞解析装置内に設けられている場合、たとえば血液を収容した採血管をその細胞解析装置にセットすることで検体処理が自動的に行われるようにすることが好ましい。一方で、赤血球を溶解により除去する処理や必要に応じて行われる細胞の固定化処理等を、そのための試薬を収容した採血管内に患者の血液を添加するだけで（血液の凝固処理と同時に）行える場合、あるいは送液系機構等を備えた細胞解析装置の小型化を図る場合は、検体処理機構は送液系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込む必要はなく、必要に応じて別個の検体処理用の装置（一般的な遠心分離機等）を利用すればよい。そのような場合は処理済みの検体を、送液系機構等を備えた細胞解析装置にセットする。
【００８８】
（送液系機構）
送液系機構は、制御手段の制御により、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液、染色液、洗浄液、必要に応じて用いられるその他の試薬類の吸引および吐出を行い、それらの液を流路に送液するための機構である。
【００８９】
送液系機構は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、さらに任意の位置で液の吸引および吐出を可能にするため流路デバイス（細胞展開用基板）に対して平面方向および垂直方向に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、各工程において用いられる液体を所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。
【００９０】
具体的には、供給手段および送液手段を個別に備える送液系機構と、流入口側にリザーバーを備える流路デバイスを用いることができる。この実施形態では、供給手段は、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量吸引した後、リザーバーで吐出し、それらの液体はリザーバー内に一時的に貯留される。送液手段は流出口に接続され、吸引により、リザーバー内の液体を所定の流量で流入口から流路に導入する。
【００９１】
また、供給手段および送液手段を兼ね備えた送液系機構と、流出口側にリザーバーを備える流路デバイスを用いることもできる。この実施形態では、送液系機構は、試薬収容器に収容されている細胞懸濁液等の液体を所定の量吸引した後、それらの液体を流入口において所定の流量で吐出し、流路に直接的に導入する。流路を通過して流出口から流出した液体は、リザーバー内に一時的に貯留することができる。送液により所定の処理が終わった後、送液系機構は流路を満たしていた液体を流入口から吸引して排出する。排出された液体は、試薬収容器の廃液収納部において送液系機構から吐出されるようにしてもよい。
【００９２】
（光学系機構）
光学系機構は、光源としてのレーザーダイオード（ＬＤ）、集光レンズ、ピンホール部材、ダイクロックミラー、蛍光フィルターなど、蛍光物質を励起して蛍光を発するようにするための部材を含む。ＬＤは、観察の対象とする蛍光標識抗体の有する蛍光物質の励起波長に対応したものとし、必要に応じて複数用意してダイクロックミラーで適切なものが照射されるようにする。蛍光フィルターは、蛍光標識抗体に用いられている蛍光物質の蛍光波長に対応したものとし、必要に応じて複数枚用意してフィルター切り替え器で交換しながら用いるようにする。
【００９３】
光学系機構はさらに、対物レンズ、対眼レンズ、ＣＣＤカメラなど、蛍光染色された細胞を目視で観察できるようにするとともに、それらの蛍光画像を撮影するための部材を含み、必要に応じてさらに、光電子倍増管（ＰＭＴ）など蛍光強度を測定するための部材を含んでいてもよい。
【００９４】
これらの部材を含む光学系機構は、蛍光顕微鏡に準じた形態のものとして構築することができ、送液系機構とともに細胞解析装置内に組み込むことが好ましい。そのような実施形態であれば、細胞展開工程および染色工程を行った後、画像取得工程を行い、蛍光を発する細胞の観察および撮像をスムーズに行うことができる。また、光学系機構を、送液系機構を中心とする装置とは別個の蛍光顕微鏡に準じた装置に設け、前者の装置によって細胞展開工程および染色工程を行った流路デバイスを後者の装置に移動させて、画像取得工程を行うことも可能である。
【００９５】
マイクロチャンバーを備えた細胞展開用基板を用いて細胞の解析を行う場合、光学系機構はさらに、観察の対象としているマイクロチャンバーの位置、さらにはマクロチャンバーに収容されている細胞の位置を特定するための手段を備えていてもよい。例えば、細胞展開用基板に基準点（レクチルマーク）を設けておくことにより、目的とするマイクロチャンバー（目的とする細胞を標識した蛍光を発するマイクロチャンバー）、あるいは目的とする細胞自体の位置の情報をその基準点からの座標として取得することができる。なお、このような基準点に基づく情報を利用すれば、細胞展開用基板を細胞分析装置から別の観察・撮像用の装置に移動させたときにも、その情報に基づき目的とするマイクロチャンバーまたは細胞を直ちに観察できるようになる。
【００９６】
（データ処理機構）
データ処理機構は、画像取得手段や検出手段において光学系機構により取得された、蛍光画像や蛍光強度等のデータの統合、補正などを行うことのできる機構であり、一般的には、画像処理等のデータ処理用プログラム（ソフトウェア）、そのプログラムをコンピュータが実行可能な様式で記憶した記憶媒体、およびそのプログラムを実行するためのコンピュータにより構築することができる。このようなデータ処理機構は、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置に接続して使用される、別個の装置（パーソナルコンピュータ等）として設けてもよいし、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込むようにしてもよい。
データ処理機構は少なくとも、画像取得手段により取得された蛍光画像から、稀少細胞および非目的細胞を同定するための機能を備える。
【００９７】
たとえば、同一の視野におけるマーカーＡである蛍光標識抗体から発せられる蛍光を表した蛍光画像、マーカーＢである蛍光標識マーカーから発せられる蛍光を表した蛍光画像、およびマーカーＣである蛍光標識抗体から発せられる蛍光を表した蛍光画像を統合する処理；その統合画像内でピクセル情報（輝度、色彩）が所定の特徴を有する領域を稀少細胞または非目的細胞であると同定する処理；そのように同定されたそれぞれの細胞の数を計測する処理；これらの処理を撮像した全ての視野について順次行う処理などを、自動的に実行することのできるプログラムが好ましい。
【００９８】
特に、たとえばある様態においては、ある特定の視野において、マーカーＡである蛍光標識抗体から発せられる蛍光が検出される一方、マーカーＢである蛍光標識抗体からの蛍光は検出できない細胞は稀少細胞であると推定される。さらにそのような細胞において、マーカーＣである蛍光標識抗体からの蛍光が検出できなかった場合はその細胞は稀少細胞だと同定され、一方マーカーＣからの蛍光が検出された場合はその細胞は稀少細胞ではなく、マーカーＡで非特異的に染色された非目的細胞であると同定される。
【００９９】
本発明の実施形態における上記プログラムは、たとえば、稀少細胞および非目的細胞のそれぞれの計測数を対比し、全細胞数に対する稀少細胞の比率を、自動的に算出できるようにすることが好ましい。
【０１００】
（制御機構）
制御機構は、所定の工程ないし手順にしたがって細胞検出方法を実施できるよう、細胞解析装置の各種の機器類に接続され、それらの機器類の挙動を制御することのできる機構であり、一般的には、そのような制御用プログラム、そのプログラムをコンピュータが実行可能な様式で記憶した記憶媒体、およびそのプログラムを実行可能なコンピュータにより構築することができる。このような制御手段は、送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置に接続して使用される、別個の装置（パーソナルコンピュータ等）として設けてもよいし、マイコンのように送液系機構および光学系機構等を備えた細胞解析装置内に組み込まれるものであってもよい。制御プログラムは、コンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていてもよいし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていてもよい。
【０１０１】
制御プログラムにより、細胞展開手段（工程）、染色手段（工程）、画像取得手段（工程）などに関する操作を自動化することができる。例えば、所定のタイムスケジュールで、細胞展開工程における細胞懸濁液や、染色工程における染色液を送液するよう送液系機構を操作したり、染色剤に含まれる蛍光物質に対応した所定の励起光を照射し、その蛍光画像を撮影するよう光学系機構を操作したりできるものである。
【０１０２】
さらに、制御機構は、細胞の染色に関して取得されたデータ、例えば撮影された蛍光画像を記憶し、適切な工程でそれらを読み出したり、適切な機構にそれらを受け渡したりする機能、そのためのプログラムをさらに有することが好ましい。
【０１０３】
＜流路デバイス＞
流路デバイスは、細胞展開用基板および流路形成部材によって構築されており、これらによって閉鎖されている空間が、細胞懸濁液等の液体を送液して満たすことのできる流路となっている。細胞展開用基板と流路形成部材とは、観察やメンテナンスのしやすさの観点から、係合、ねじ固定、粘着等の手段で取り付け・取り外しが可能なようになっていてもよい。流路の上流側および下流側の末端付近の天井側、すなわち流路形成部材には、上記の各種の液体を流入および排出させるための流入口および排出口が形成されている。
【０１０４】
流路の高さ（細胞展開用基板と天板部材の間隔、すなわち枠部材の厚さ）は、５０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。流路の高さがそのような範囲内であると、流路内の細胞懸濁液（そこに含まれる細胞）を送液の力で容易に移動させることができるとともに、流路の細胞による目詰まりが発生しにくいため、細胞を円滑に展開することができる。
【０１０５】
流路形成部材は、流路に所定の高さを持たせるための空隙を生み出すとともに流路の平面的な範囲を形作る、流路の側壁を形成する枠部材と、枠部材の上に載せられ流路の天井を形成する天板部材によって構築することができる。天板部材は、流出口と連通している、細胞懸濁液等の液体を一時的に貯留する空間（リザーバー）を備えていてもよい。また、細胞がマイクロチャンバーに細胞が入り込みやすい流れを生じるように、流路の天井部は凹凸のような構造を有してもよい。前記凹凸の位置は、例えばマイクロチャンバーの中心と凹部および凸部の中心とがずれる（垂直線上に来ない）ように調整することができ、そのような位置とすることで細胞懸濁液等の流れが凹部および凸部を境にマイクロチャンバー方面に変化し、細胞が入り込みやすくなる。
【０１０６】
細胞展開用基板および流路形成部材は、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボート、シクロオレフィンコポリマー等のプラスチック、あるいは石英ガラス等のガラスなど、透明な材料で作製されたものが好ましい。細胞解析システムでは通常、蛍光染色された細胞を観察し、撮像するので、細胞解析装置の光学検出系によって特定の細胞を標識した蛍光を測定できるよう、少なくとも流路形成部材のうち天板部材に相当する部分は透明な素材で作製する必要がある。また、枠部材は、適度な弾性と粘着性を有するシリコン樹脂（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ等）のような材料で作製されていてもよく、この枠部材を細胞展開用基板および天板部材で挟み込むことによって流路デバイスを構築するようにしてもよい。
【０１０７】
＜試薬収容器＞
試薬収容器には、細胞懸濁液、染色液（蛍光標識抗体溶液、核染色剤溶液、またはそれらの混合溶液等）、洗浄液、その他の必要な溶液など、細胞検出方法を実施する上で流路に送液する必要のある各種の液体が収容されている。例えば、洗浄液など比較的保存性の高い液体は、密封された状態であらかじめ試薬収容器の所定の部位に収容しておくことが可能であり、細胞懸濁液、染色液など細胞の染色を行う直前に調製する必要のある液体は、調製後に試薬収容器の所定の部位に添加して収容させることができるようにする。洗浄液などのように複数回使用される溶液は、各工程に対応した容量の溶液を別個の部位に収容しておいてもよいし、各工程で同一の組成の溶液を繰り返し使用する場合はそれらの合計の用量の液体を１つの部位に収容しておいてもよい。また、試薬収容器には必要に応じて、送液後に吸引して流路から排出させた廃液を貯留する部位を設けておくようにする。
【０１０８】
［実施例１］
（ａ）検体処理工程
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（商標：コスモバイオ）（ジアトリゾ酸ナトリウム  １３．８（ｗ／ｖ）％・Ｄｅｘｔｒａｎ５００  ８．０（ｗ／ｖ）％）を用いて、抗凝固剤EDTA2Naを含有する採血管（テルモ社ベノジェクトII真空採血管）にて採血された健常者由来の血液検体から赤血球、単核球および多核球を分画し、単核球画分および多核球画分を単離して両者を混合した。この混合液を４（ｗ／ｗ）％ホルムアルデヒドと２０分間室温で反応させることより細胞を固定化し、白血球細胞懸濁液を調製した。
【０１０９】
同様にＣＫの発現が弱いことが知られているがん細胞であるＭＤＡ−ＭＢ２３１株を４（ｗ／ｗ）％ホルムアルデヒドにより固定化し、ＰＢＳにて洗浄し、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞懸濁液を調製した。
【０１１０】
（ｃ）染色工程
（ａ）検体処理工程において得られた白血球細胞懸濁液およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞懸濁液のそれぞれに３００Ｇで１分間遠心分離を行い、上清を除去した。ＰＥ標識抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６抗体を、ＰＢＳ（１％Ｔｗｅｅｎ２０および３（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ含有）に加えて調製した染色液を、それぞれの細胞サンプルに添加し、３０分間反応させた後、ＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ含有）を用いて３回洗浄した。
【０１１１】
（ｂ）細胞展開工程
工程（ｃ）において染色を行なった白血球細胞懸濁液およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞懸濁液を、血球計算板（NanoEnTek社  C-Chip  DHC-F01）上にそれぞれ展開した。
【０１１２】
（ｄ）画像取得工程
上記工程において血球計算板上に展開された細胞の画像を、ＦＩＴＣ、ＰＥおよびＡＰＣのそれぞれの励起光に対応した波長のもとで撮影し、得られた撮影画像からそれぞれの輝度を計測した。画像の撮影は、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社正立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ  ｉｍａｇｅｒにより行い、ＦＩＴＣ色素はＣａｒｌＺｅｉｓｓ社３８ＨＥ蛍光フィルタ、ＰＥ色素はＣａｒｌＺｅｉｓｓ社４８ＨＥ蛍光フィルタ、ＡＰＣ色素はＣａｒｌＺｅｉｓｓ社５０蛍光フィルタを適用した。輝度の計測は画像解析により行い、画像解析にはＣａｒｌＺｅｉｓｓ社Ｚｅｎ２０１２（Ｂｌｕｅ  ｅｄｔｉｏｎ）ソフトウェアを用いた。
【０１１３】
（ｅ）同定工程
ＭＤＡ−ＭＢ２３１株において、上記（ａ）〜（ｄ）の工程を行った結果得られた輝度に基づき、それぞれのマーカーにおける陽性閾値を設定した。具体的には、抗ＣＫ蛍光標識抗体（ＰＥ）においてはＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（ＣＫ弱がん細胞）の９９％以上を検出できる輝度値（輝度≧８００）、抗ＣＤ４５蛍光標識抗体（ＡＰＣ）においてはＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞で検出できた最大輝度値（輝度≧１５０）、抗ＣＤ１６抗体（ＦＩＴＣ）においてもＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞で検出できた最大輝度値をそれぞれの陽性閾値（輝度≧５４０）とした（各輝度における閾値の１０の位は切り上げ）。
【０１１４】
設定した陽性閾値および画像から取得した輝度値を基にして、白血球およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のそれぞれにおけるＣＫ，ＣＤ４５およびＣＤ１６の陽性／陰性をそれぞれ判定した（上記の陽性閾値の設定方法より、抗ＣＤ４５蛍光標識抗体および抗ＣＤ１６抗体の輝度については、すべてのＭＤＡ−ＭＢ２３１株がその陽性閾値を超えることはなく、自ずと陰性と判定される）。表１に、全細胞数におけるそれぞれの割合を示す。マーカーＡおよびＢのみに基づいて、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を９９％検出（ＣＫ（＋）／ＣＤ４５（−））できるように陽性閾値を設定した場合、それに対して偽陽性を示す多核球が出現することが分かる。しかしながら、マーカーＣを利用することにより、ＣＫ（＋）／ＣＤ４５（−）を示す細胞のうち、ＣＤ１６（＋）の細胞をそのような擬陽性細胞であるとして除外することで、ＣＫ（＋）／ＣＤ４５（−）／ＣＤ１６（−）の細胞のみをＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞と正しく同定することができる。
【０１１５】
【表１】
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以上の実施例１の結果より、患者由来の血液を検体として用いた場合にも、本発明の稀少細胞検出方法に基づき、たとえばＣＫ（＋）／ＣＤ４５（−）／ＣＤ１６（−）の細胞のみをＣＴＣと判定することで、正確な定量を行うことが可能であることが示された。
【０１１６】
［実施例２］
（ｃ）染色工程においてＡＰＣ標識抗ＣＤ４５抗体の代わりにＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体を用いる（つまり、抗ＣＤ４５抗体または抗ＣＤ４５抗体の少なくとも一方に反応する細胞は全てＦＩＴＣによって標識され、その蛍光量が閾値より大きければＣＤ４５・ＣＤ１６（＋）と判定される）ことを除き、実施例１と同様の手法で行った。
【０１１７】
表２に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、白血球それぞれの全細胞数に占める、各マーカーの陽性・陰性細胞の割合を示す。実施例１と同様に陽性閾値を設定した場合、ＣＫ（＋）かつＣＤ４５・ＣＤ１６（−）の細胞群には、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞のみが含まれ、白血球は全く含まれなかった。したがって、ＣＫ（＋）かつＣＤ４５・ＣＤ１６（−）の細胞群をＣＴＣと判定する実施例２の方法でも、ＣＫマーカーに偽陽性を示す白血球を排除し、ＣＴＣのみを正しく検出できることが分かる。
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
［実施例３］
（ｃ）染色工程において標識化抗体ではなく標識化２次抗体を用いる以外は実施例１と同様の手法で行った。
表３に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、白血球それぞれの全細胞数に占める、各マーカーの陽性・陰性細胞の割合を示す。実施例１と同様に陽性閾値を設定した場合、ＣＫ（＋）かつＣＤ４５（−）の細胞群には、偽陽性を示す多核球が出現することが分かる。しかしながら、マーカーＣ（ＣＤ１６）を利用することにより、ＣＫ（＋）／ＣＤ４５（−）を示す細胞のうち、ＣＤ１６（＋）の細胞をそのような擬陽性細胞であるとして除外することで、実施例３の方法でも、ＣＫマーカーに偽陽性を示す白血球を排除し、ＣＴＣのみを正しく検出できることが分かる。
【０１２０】
【表３】
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【０１２１】
［比較例１］
（ｃ）染色工程において、染色液にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６抗体を加ないことを除いて実施例と同様に行った。
表４に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、白血球それぞれの全細胞数に占める、各マーカーの陽性・陰性細胞の割合を示す。ＣＫ（＋）かつＣＤ４５（−）の細胞群には、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞だけではなく、白血球のうち１％も含まれた。したがって、ＣＫ（＋）かつＣＤ４５（−）の細胞群をＣＴＣと判定する比較例１の方法では、そのような細胞群中にＣＫマーカーに偽陽性を示す白血球が混在してしまい、ＣＴＣのみを正しく検出することはできないことが分かる。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
［参考例１］
がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）、白血球（単核球）および白血球（多核球）を対象に実施例１と同様の染色を行い、ＣＫ（＋）群（ＰＥ値≧８００）であった細胞のみを抽出して、それらのＦＩＴＣ（ＣＤ１６）輝度を横軸、ＡＰＣ（ＣＤ４５）輝度を縦軸にプロットした。通常よりもやや低い上記の閾値を用いた場合にＣＫ（＋）とされる細胞には、がん細胞のみならず多核球も一定数含まれる（単核球はほとんど含まれない）ことが分かる。一方で定性評価を行った結果、多核球と単核球におけるＣＫ、ＣＤ４５、およびＣＤ１６それぞれに対するマーカーの染色性について表５のようになり、多核球がＣＫ（＋）として検出されうることおよび、単核球に比べてＣＤ４５に対する染色性が弱いということが分かった。このような、参考例の結果から、ＣＫ（＋）とされる多核球は単核球に比べてＣＤ４５が弱い群であることがわかり、ＣＴＣと同様にＣＫ（＋）かつＣＫ４５（−）であることから擬陽性と判定されやすいことが示唆される（これに対して単核球は、ＣＫ（＋）であったとしても、適切な閾値の下ではＣＤ４５（＋）となり、擬陽性にはなりにくい）。しかしながら、検出すべきがん細胞と、擬陽性となりうる多核球とは、ＣＤ１６の発現量が相違しており、適切な閾値を設定することによって判別可能であることも示唆される。
【０１２４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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