(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドがヒトＲＡＮＫＬに結合し、かつ、該ポリペプチドが精製されたホモ二量体型である、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
一般的に、本発明は、生物学的医薬ならびに骨吸収と関連する状態、例えば腫瘍におけるその使用の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、ＮＦ−カッパＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体アクチベーターに結合するオステオプロテゲリン由来の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
このセクションに記載されているアプローチは追求され得るが、必ずしも、以前に着想または追求されたアプローチではない。したがって、他に記載のない限り、それは、単にこのセクションに含まれているという理由により、このセクションに記載されているあらゆるアプローチが先行技術と見なすよう仮定されるべきではない。
【０００３】
ヒトオステオプロテゲリン（ＯＰＧ；ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ９４３３２．１）は、２１個のアミノ酸のシグナルペプチドを含む４０１個のアミノ酸タンパク質であり、これは、グルタミン酸２２の前で開裂して、３８０個のアミノ酸の成熟可溶性タンパク質を生じる。ＯＰＧは、そのＮ末端部分において４つのシステインに富むＴＮＦＲ様ドメインを含む腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーである。ＯＰＧは、骨の発達における役割を有することが示されており、ＯＰＧ遺伝子を欠くマウスは、骨粗鬆症表現型および全体的な骨格異常を有した。
【０００４】
骨芽細胞および骨髄間質細胞により生産されるＯＰＧは、明白な直接的なシグナル伝達機能を有さない分泌デコイ受容体として作用する。ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬ（ＮＦ−カッパＢリガンドの受容体アクチベーター）としても知られている天然のリガンド−オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）に結合することにより作用する。ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬ間の結合は、破骨細胞分化、活性化および生存のために極めて重要な破骨細胞受容体である同族受容体ＲＡＮＫを活性化することからＲＡＮＫＬを妨げる。
【０００５】
組換えＯＰＧは、それぞれ約５５ｋＤａおよび約１１０ｋＤａの見かけの分子量の単量体および二量体形態において存在する。残基システイン１８５に対するＮ−末端ドメインの切断は、おそらくＴＮＦＲ様ドメインのジスルフィド結合を破壊することによりＯＰＧ不活性化を引き起こすが、残基１９４に対するタンパク質のＣ−末端部分の切断は生物学的活性を変化させない。
【０００６】
トランスジェニックマウスにおけるＯＰＧの過剰発現は、マウスにおける破骨細胞のほぼ完全な欠如により特徴付けられる重度の大理石骨病を引き起こす。逆に、ＯＰＧ遺伝子の切除は、マウスにおいて重度の骨粗鬆症を引き起こし、骨吸収を調節することにおけるＯＰＧの重要な生理学的役割を示す。骨芽細胞および間質細胞からのＯＰＧおよびＲＡＮＫＬの分泌は、多数のホルモンおよびサイトカインにより調節される。ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬ生産の相対レベルは、骨吸収の程度をコントロールすると考えられ：ＲＡＮＫＬの発現は骨吸収を増加させるが、過剰なＯＰＧは逆効果を有する。組換えＯＰＧは、インビトロおよびインビボにて破骨細胞を刺激する圧倒的多数の因子の効果をブロックする。ＯＰＧはまた、卵巣摘出、誘導された骨粗鬆症、悪性体液性高カルシウム血症および実験的骨転移を含む種々の動物疾患モデルにおいて骨吸収を阻害する。したがって、ＯＰＧは、過剰な破骨細胞活性と関連する疾患に対する有効な治療選択肢を示し得る（Kostenuik PJ, Shalhoub V., Curr Pharm Des. 2001 May;7(8):613-35）。
【０００７】
デノスマブは、ヒトＲＡＮＫＬに結合し、ＲＡＮＫとの相互作用を阻害し、したがってＯＰＧと同様の作用機序を有する高親和性の完全ヒトモノクローナル抗体である。商品名Ｐｒｏｌｉａ下のデノスマブは、閉経後の女性における骨粗鬆症の予防および処置のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。商品名Ｘｇｅｖａ下のデノスマブは、固形腫瘍からの骨転移を有する患者における骨格関連事象の予防のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。他の骨再形成関連状態のために、すなわち他の癌形態からの骨転移のためにデノスマブのさらなる臨床試験が現在進行中である。
【０００８】
したがって、ＲＡＮＫＬに結合することができ、天然ＯＰＧ分子に基づき、許容される薬理学的プロフィールを有して、より広い治療的可能性を有する治療組成物を有することが望ましい。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
この概要は、詳細な説明でさらに説明される簡略化した形態において概念の選択を紹介するために提供する。この概要は、特許請求される主題の主要な特徴または重要な特徴を特定することを意図せず、特許請求される主題の範囲を決定する助けとして使用されることを意図しない。
【００１０】
１つの局面において、本発明は、ヒトＲＡＮＫＬに結合するポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、ヒトのオステオプロテゲリン（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ９４３３２．１）のアミノ酸１から２１５を含む第１のアミノ酸配列を含む。該ポリペプチドは、ヒトの免疫グロブリンガンマ−１  Ｆｃ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ００２２８．１）のアミノ酸１０３から３２９を含む第２のアミノ酸配列をさらに含む。該ポリペプチドは、インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて、約５０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で、または１００ｎｇ／ｍｌの濃度で最大１０％に、ＲＡＮＫＬ誘導性破骨細胞分化を阻害することができ得る。該ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、治療組成物を提供する。該組成物は、ヒトＲＡＮＫＬに結合するポリペプチドを含む。該ポリペプチドは、ヒトのオステオプロテゲリンの生物学的に活性な部分およびヒトの免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ部分を含む。該ポリペプチドは、溶液中でホモ二量体型に実質的に精製される。該ポリペプチドは、５ｍｇ／ｋｇの用量での皮下投与後、少なくとも８０時間のマウスの体循環における半減期を示し得る。該ポリペプチドは、マウス骨溶解モデルにおいて、最大１ｍｇ／ｋｇの用量で週に３回での該組成物の皮下投与クールにおいて少なくとも６週間、ヒト乳癌により誘導される骨溶解を実質的に阻害することができ得る。
【００１２】
１つの局面において、本発明は、治療組成物を提供する。該組成物は、ヒトのオステオプロテゲリンのアミノ酸１から２１５を含む第１のアミノ酸配列を含む。該ポリペプチドは、ヒトの免疫グロブリンガンマ−１  Ｆｃのアミノ酸１０３から３２９を含む第２のアミノ酸配列をさらに含む。該ポリペプチドは、溶液中でホモ二量体型に実質的に精製され得る。該ポリペプチドは、５ｍｇ／ｋｇの用量での皮下投与後、少なくとも８０時間のマウスの体循環における半減期を示し得る。該ポリペプチドは、マウス骨溶解モデルにおいて、最大１ｍｇ／ｋｇの用量で週に３回での該組成物の皮下投与クールにおいて少なくとも６週間、ヒト乳癌により誘導される骨溶解を実質的に阻害することができ得る。該ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、ヒトＲＡＮＫＬに結合するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。該ポリペプチドは、ヒトのオステオプロテゲリンのアミノ酸１から２１５を含む第１のアミノ酸配列を含む。該ポリペプチドは、ヒトの免疫グロブリンガンマ−１  Ｆｃのアミノ酸１０３から３２９を含む第２のアミノ酸配列をさらに含む。該ポリペプチドにおける第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に先立ち得る。該ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。該核酸は、哺乳動物細胞における該ポリペプチドの高発現のために最適化されている該核酸のコドン使用頻度を有し得る。該核酸は、配列番号２の配列を含み得る。該核酸は、発現ベクターを含み得る。
【００１４】
１つの局面において、本発明は、異種発現系を提供する。該発現系は、ヒトＲＡＮＫＬに結合するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。該ポリペプチドは、ヒトのオステオプロテゲリンのアミノ酸１から２１５を含む第１のアミノ酸配列を含む。該ポリペプチドは、ヒトの免疫グロブリンガンマ−１  Ｆｃのアミノ酸１０３から３２９を含む第２のアミノ酸配列をさらに含む。該ポリペプチドにおける第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に先立ち得る。該ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。該発現系の発現ベクターは、哺乳動物細胞に含まれ得る。該哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり得る。該発現系におけるポリペプチドの発現レベルは、細胞培養物の１リットルあたり少なくとも１２５ｍｇであり得る。
【００１５】
１つの局面において、本発明は、骨吸収または再形成と関連する疾患の処置または予防のための薬物の製造のための物質の使用を提供する。該物質は、ヒトＲＡＮＫＬに結合するポリペプチドを含む。該ポリペプチドは、ヒトのオステオプロテゲリンのアミノ酸１から２１５を含む第１のアミノ酸配列を含む。該ポリペプチドは、ヒトの免疫グロブリンガンマ−１  Ｆｃのアミノ酸１０３から３２９を含む第２のアミノ酸配列をさらに含む。該ポリペプチドにおける第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に先立ち得る。該ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。骨吸収または再形成と関連する疾患は、癌腫、乳癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、固形腫瘍による骨転移、骨粗鬆症、リウマチ性関節炎、または乾癬性関節炎であり得る。
【００１６】
１つの局面において、本発明は、骨吸収または再形成と関連する疾患を処置または予防する方法を提供する。該方法は、治療有効量のヒトＲＡＮＫＬに結合するポリペプチドを含む医薬組成物を、骨吸収または再形成と関連する疾患を処置または予防することを必要とする患者に投与することを含む。該ポリペプチドは、ヒトのオステオプロテゲリンのアミノ酸１から２１５を含む第１のアミノ酸配列を含む。該ポリペプチドは、ヒトの免疫グロブリンガンマ−１  Ｆｃのアミノ酸１０３から３２９を含む第２のアミノ酸配列をさらに含む。該ポリペプチドにおける第１のアミノ酸配列は、第２のアミノ酸配列に先立ち得る。該ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。骨吸収または再形成と関連する疾患は、癌腫、乳癌、前立腺癌、多発性骨髄腫、骨肉腫、固形腫瘍による骨転移、骨粗鬆症、リウマチ性関節炎、または乾癬性関節炎であり得る。
【００１７】
本明細書に記載されている本発明のこれらの、および他の局面および利点は、以下の図面および詳細な説明を考慮して明らかとなる。
【００１８】
以下の図面および図面の簡単な説明を、本発明の理解に役立てるために提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明のポリペプチドのクローニングにおいて使用されるｐＣＤＮＡ４−Ｆｃプラスミドのマップおよび注釈付き配列を概略的に示す。
【００２０】
【図２】図２は、本発明のポリペプチドのクローニングにおいて使用されるｐＫＮ００２プラスミドのマップおよび注釈付き配列を概略的に示す。
【００２１】
【図３】図３は、本発明のポリペプチドを発現させるための安定な細胞系を産生するプロセスにおいて得られる典型的なトランスフェクション増殖曲線を示す。
【００２２】
【図４】図４は、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程後の、配列番号１のポリペプチドを含むサンプルのサイズ排除ＨＰＬＣ分析クロマトグラムを示す。
【００２３】
【図５】図５は、陰イオン交換クロマトグラフィー精製工程後の、配列番号１のポリペプチドを含むサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件下）を示す。
【００２４】
【図６】図６は、配列番号１のポリペプチドを含むサンプルの優れた分離を示すヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー溶離プロフィールを示す。
【００２５】
【図７】図７は、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーからの配列番号１のポリペプチドを含む溶出液の主なピークのサンプルのサイズ排除ＨＰＬＣ分析クロマトグラムを示す。
【００２６】
【図８】図８は、骨溶解の評価のために使用された、接種８週間後のグループ１（製剤バッファーの皮下投与）からの典型的なマウスの脛骨のＸ線画像を示す（割り当てられたスコアは各画像の下に示されている）。
【００２７】
【図９】図９は、骨溶解の評価のために使用された、接種８週間後のグループ２（配列番号１のポリペプチドの１ｍｇ／ｋｇでの皮下投与）からの典型的なマウスの脛骨のＸ線画像を示す（割り当てられたスコアは各画像の下に示されている）。
【００２８】
【図１０】図１０は、グループ１、２および５のそれぞれにおける１つの典型的なマウスに対する二次元マイクロＣＴスキャン画像を示す。
【００２９】
【図１１】図１１は、グループ１、２および５のそれぞれにおける１つの典型的なマウスに対する三次元マイクロＣＴスキャン画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されている教示は、一部、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合されるＯＰＧの生物学的に活性なＮ末端部分を含むタンパク質分子を操作することに基づく。かかるＯＰＧ由来のタンパク質分子の組換え生産を可能にするために、ＤＮＡ発現ベクターは、異種タンパク質発現系において該タンパク質分子を過剰生産するために構築されており、哺乳動物細胞は、該タンパク質分子を高い発現レベルで安定に発現するように調製されている。予想外に、組換え供給源からのタンパク質分子は、溶液中でホモ二量体およびホモ四量体を形成した。タンパク質精製処理は、該タンパク質分子の生理学的に関連した実質的に純粋なホモ二量体調製物を得ることを可能にするように考案されている。したがって、精製されたタンパク質分子は、関連したインビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて、ＲＡＮＫＬ誘導性破骨細胞分化の高度な阻害を証明する。予想外に、該タンパク質分子は、皮下動物投与時に許容される薬物動態学プロフィールを示し、有害毒性または免疫原性を示さない。該タンパク質分子はまた、ヒト乳癌により誘導される骨転移の予測動物モデルにおいて高度な有効性を証明する。
【００３１】
本明細書において使用される用語は、一般的に、本発明の文脈内および各用語が使用される特定の文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、明細書において以下または他の場所で議論されており、本発明の組成物および方法ならびにそれらの作製の様式およびそれらの使用の様式を記載することにおいて当業者にさらなるガイダンスを提供する。用語のあらゆる使用の範囲または意味は、該用語が使用される特定の文脈から明らかである。「約」および「ほぼ」は、一般的に、測定の性質または精度を考慮して、測定される数量に対する許容される誤差の程度を意味する。一般的に、典型的な誤差の程度は、所定の値または値の範囲の、２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、およびさらに好ましくは５％以内である。あるいは、特に生体系において、「約」および「ほぼ」なる用語は、所定の値の一桁以内、好ましくは５倍以内、およびさらに好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書における所定の数量は、特に明記しない限り、明示的に記載されていないとき「約」または「ほぼ」なる用語が推測され得るおよその意味である。
【００３２】
本発明の方法は、野生型配列と１つ以上の突然変異体（配列変異体）を含む配列を互いに比較する工程を含み得る。かかる比較は、一般的に、ポリマー配列のアラインメント、例えば、当分野でよく知られている配列アラインメントプログラムおよび／またはアルゴリズムを使用することを含む（例えば、いくつか例を挙げるとＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）。かかるアラインメントにおいて、突然変異が残基の挿入または欠失を含む場合、配列アラインメントは、挿入された、または欠失された残基を含まず、ポリマー配列において「ギャップ」（一般的にダッシュ記号、または「Ａ」により表される）を導入することを当業者は容易に理解することができる。
【００３３】
本発明の方法は、統計的計算、例えば、ＩＣ５０またはＥＣ５０値の決定などを含み得る。このようなことは、種々の市販されているソフトウェア、例えば、ＰＲＩＳＭ（GraphPad Softqare Inc, La Jolla, CA, USA）または同様のものを使用して行うことができることを当業者は容易に理解することができる。
【００３４】
「相同」は、その全ての文法的形態および綴りの変化において、生物体の同じ種におけるスーパーファミリーからのタンパク質を含む「共通の進化の起源」、ならびに生物体の異なる種からの相同タンパク質を有する２つのタンパク質間の関係を示す。かかるタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、それらの配列類似性、同一性パーセント、または特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在に反映されるとおり、配列相同性を有する。しかしながら、一般的な用法および本出願において、「相同」なる用語は、「高度に」のような副詞で修飾されているとき、配列類似性を意味してもよく、共通の進化の起源に関しても、関しなくてもよい。
【００３５】
「配列類似性」なる用語は、その全ての文法的形態において、共通の進化の起源を共有しても、共有しなくてもよい核酸またはアミノ酸配列間の同一性または対応の程度を示す。
【００３６】
「タンパク質」および「ポリペプチド」なる用語は互換的に使用される。一般的に、哺乳動物における使用のための本教示のＯＰＧ由来のタンパク質は、適切な翻訳後修飾を可能にする哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞系において発現されるが、他の哺乳動物発現細胞系も同様に有用であると予期される。したがって、ＯＰＧ由来のタンパク質が、実質的にそれらの生物学的機能に影響を与えることなく、翻訳後修飾され得ると予想される。
【００３７】
１つの局面において、本教示のＯＰＧ由来のタンパク質分子の機能的変異体は、少なくともヒトＯＰＧの生物学的に活性な部分および１つ以上の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。かかる融合ドメインの周知の例は、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を与えるように選択され得る。例えば、ＯＰＧポリペプチド部分は、所望により適当なペプチドリンカーを介して、インビボにてＯＰＧポリペプチドを安定化するドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合され得る。「安定化」なる用語は、破壊の減少、クリアランスの減少、または他の薬物動態学効果によるかにかかわらず、あらゆる体循環におけるポリペプチドの半減期の増加を意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、特定のタンパク質に望ましい薬物動態学的特性を与えることが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、望ましい特性を与えることができる。選択され得る融合ドメインの他の型は、さらなる生物学的機能、例えばインビボにて標的化される作用部位での蓄積を促進する機能を与える多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能性ドメインを含む。
【００３８】
１つの局面において、本発明は、ヒトＯＰＧ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ９４３３２．１）の先頭２１５アミノ酸、次にヒトＩｇガンマ−１のＦｃ部分（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ００２２８．１）の２２７アミノ酸を含むポリペプチドを提供する。態様の例において、本発明のタンパク質分子は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド（配列番号１）
【化１】
0006550413.tif 000002
【００３９】
１つの局面において、本発明は、ヒトＯＰＧの先頭２１５アミノ酸、次にヒトＩｇガンマ−１のＦｃ部分の２２７アミノ酸を含み、所望によりフレキシブルな(flexible)リンカーを介して連結されているポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する組換えＤＮＡ分子を提供する。態様の例において、本発明の組換えＤＮＡ分子は、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ  ＤＮＡ（配列番号２）
【化２】
0006550413.tif 000003
【００４０】
１つの局面において、本発明は、ヒトＯＰＧの先頭２１５アミノ酸、次に、ヒトＩｇガンマ−１のＦｃ部分の２２７アミノ酸を含み、所望によりフレキシブルなリンカーを介して連結されているポリペプチドの高発現のための組換え哺乳動物発現プラスミドを提供する。このプラスミドは、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、次に、ｂＧＨポリアデニル化および転写終結配列を含む。プラスミドはまた、細菌におけるプラスミド増殖および選択をサポートするために、ｐＵＣ複製起点およびアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。プラスミドは、安定なＣＨＯＫ１およびＮＳＯ細胞系を確立するために広範に使用される選択可能なマーカーであるグルタミンシンテターゼ遺伝子をさらに含む。本発明のプラスミドは、例示的に図２に示されている。
【００４１】
態様の例において、本発明の哺乳動物発現プラスミドは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ発現プラスミド（配列番号３）
【化３−１】
0006550413.tif 000004
【化３−２】
0006550413.tif 000005
【化３−３】
0006550413.tif 000006
【化３−４】
0006550413.tif 000007
【化３−５】
0006550413.tif 000008
【００４２】
１つの局面において、本発明は、ヒトＯＰＧの先頭２１５アミノ酸、次に、ヒトＩｇガンマ−１のＦｃ部分の２２７アミノ酸を含み、所望によりフレキシブルなリンカーを介して連結されているポリペプチドの生産のための哺乳動物発現系を提供する。本発明の発現系は、ヒトＯＰＧの先頭２１５アミノ酸、次に、ヒトＩｇガンマ−１のＦｃ部分の２２７アミノ酸を含み、所望によりフレキシブルなリンカーを介して連結されているポリペプチドの高発現のための組換え哺乳動物発現プラスミドを有する哺乳動物細胞を含む。
【００４３】
態様の例において、本発明の哺乳動物発現系は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含むチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を含む。
【００４４】
１つの局面において、本発明は、骨吸収または再形成と関連する障害によって達成される哺乳動物の処置方法を提供する。
【実施例】
【００４５】
実施例
以下の実施例は、本発明の上記局面および他の局面を説明する。これらの非限定的な実施例は、特許請求されている化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が作られ、評価される様式について当業者に説明的態様で提供するように記載する。実施例は、本発明の純粋な例示を意図しており、本願発明者らが発明として考えている範囲を限定するものではない。数字（例えば、量、温度など）に対して正確さを保証するように努力しているが、いくらかの誤差および偏差を考慮すべきである。
【００４６】
実施例１：本発明のポリペプチドの発現のためのプラスミドの構築
最初に、ｈＯＰＧアミノ酸残基１から２１５をコードするＤＮＡ、直後にｈＩｇＧ１−Ｆｃアミノ酸のリーディングフラグメントをコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡフラグメントを化学的に合成した。第１のＤＮＡフラグメントの５’末端において、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素認識部位、Ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）およびそのシグナル配列がｈＯＰＧコード配列より先だった。第１のＤＮＡフラグメントのｈＩｇＧ１−ＦｃフラグメントコーディングＤＮＡは、３’に、Ｓａｃ  ＩＩ制限酵素認識部位を含んだ。
【００４７】
次に、合成遺伝子を、以前に操作されたＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳａｃ  ＩＩ制限酵素認識部位を利用して、残りのｈＩｇＧ１−Ｆｃアミノ酸をコードするＤＮＡを含むｐＣＤＮＡ４−Ｆｃベクターにサブクローニングした。ｐＣＤＮＡ４−Ｆｃベクターは、興味ある遺伝子の転写を駆動するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを利用し、多種多様の哺乳動物細胞系において高レベル発現を生じることが証明されている。該ベクターは、ｂＧＨポリアデニル化および転写終結配列を含む。該ベクターはまた、ｐＵＣ複製起点および細菌における増殖および選択をサポートするために、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。図１は、ｐＣＤＮＡ４−Ｆｃプラスミドのマップおよび注釈付き配列を示す。
【００４８】
最後に、ｈＯＰＧ残基１から２１５およびｈＩｇＧ１−Ｆｃの残基１０３から３２９をコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡフラグメントを、図１に概略的に示されているｐＣＤＮＡ４−Ｆｃプラスミドを利用して、配列番号１のｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドの高発現のためのｐＫＮ００２哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。ｐＫＨ００２ベクターは、興味ある遺伝子の転写を駆動するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、次にｂＧＨポリアデニル化および転写終結配列を利用する。該ベクターはまた、ｐＵＣ複製起点および細菌における増殖および選択をサポートするために、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。最後に、ｐＫＮ００２ベクターは、安定なＣＨＯＫ１およびＮＳＯ細胞系を確立するために広範に使用される選択可能なマーカーであるグルタミンシンテターゼ遺伝子を含む。図２は、配列番号３の得られた高発現ｐＫＨ００２−ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃプラスミドのマップおよび注釈付き配列を例示的に示す。
【００４９】
実施例２：本発明のポリペプチドを発現するための安定な細胞系の作製
配列番号１のｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを過剰発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の安定なクローンを、標準プロトコールを介して作製した。実施例１に記載されている発現プラスミドｐＫＨ００２−ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃを、該ポリペプチドの高発現のための安定な細胞系を産生するために使用した。複数のクローンにおける該ポリペプチドの発現レベルは、７日バッチ培養において１２５ｍｇ／Ｌ以上であった。１つのクローン細胞系は、振とうフラスコバッチ培養において、約１２５ｍｇ／Ｌまたは１２５ｍｇ／Ｌ以上の発現レベルを示した。
【００５０】
材料
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ−６１ＴＭ）からの凍結貯蔵物として得た。該細胞を社内のＣＤ  ＣＨＯ培地に適合させた。培地および試薬は市販の供給源から得た。完全な適合後、細胞をわずかな継代のために高密度で増殖させた。得られた細胞をサブクローニングした。得られたクローンの１つは２０時間の倍加時間であり、良い形態を親細胞系として選択した。
【００５１】
方法
ＣＨＯ−Ｋ１細胞のバイアル（１．５ｍｌの容量中、７．５ｘ１０６個の生存可能である細胞）を、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補った２０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地に解凍し、８０から１００ｒｐｍでオービタルシェーカープラットホーム上３７℃／１０％  ＣＯ２でＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて３．７５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度を得た。細胞を３から４日毎に継代培養した。
【００５２】
それぞれ、７．５％ＤＭＳＯを含む１．５ｍｌの５０％新鮮な増殖培地／５０％馴化培地中に７．５ｘ１０６細胞（継代１）を含む研究細胞バンクの１９個のｃｒｙｏｖｉａｌを、液体窒素中に保存した。さらなる拡張後、それぞれ、１．５ｍｌ中に７．５ｘ１０６細胞（継代３）を含む５０個のｃｒｙｏｖｉａｌを、（上記のとおり）液体窒素中で凍結し、作業細胞バンクとして使用した。
【００５３】
実施例１に記載されているｐＫＨ００２−ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃプラスミドを有するＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクションを、標準プロトコールを使用するＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅ  Ｘｃｅｌｌ装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を利用して、エレクトロポレーションにより行った。実験の日に中期対数期（一般的に、約２−３×１０６細胞／ｍｌ）に到達するように、エレクトロポレーションの１−２日前に、低濃度の(dilute)ＣＨＯ−Ｋ１細胞を新鮮な増殖培地（ＣＤ  ＣＨＯ培地）に移した。トランスフェクション後、標準プロトコールを利用して、細胞系を懸濁培養に適合させ、次に、５０ｍｌの培養増殖曲線を測定した。細胞数および生存能力を、それぞれの試験される細胞系に対して毎日測定した。所望のポリペプチドの生産レベルを、２つの方法：ＥＬＩＳＡ；およびプロテインＡカラムによる試験精製により測定した。
【００５４】
多くのトランスフェクションを、可能性のあるｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ発現細胞系の産生プロセスにてＣＨＯ−Ｋ１細胞において行った。典型的なトランスフェクション増殖曲線は図３に示されており、データは表１に示されている。スーパーコイル状ＤＮＡをエレクトロポレーション下でＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＭＳＸで選択した。細胞を９６ウェルプレートにおいてミニプール(minipool)として選択し、生産性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡを使用して評価した。これらの分析に基づいて、２つのトランスフェクションが、最も高いレベルのｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃを生産するとして同定された。これらのトランスフェクションをより詳細に特徴付ける。
【００５５】
９６ウェルプレートにおける最初の選択後、２４個の細胞系を２４個のウェルプレート、次にＴ２５フラスコにスケールアップした。培地を２４ウェルプレートまたはＴ２５フラスコから回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡを行った。良いｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ発現を証明した４つの系を懸濁培養に移した。上記４つの細胞系のうちの２つの発現レベルは７日バッチ培養において１２５ｍｇ／Ｌ以上であり、該２つの系を高発現の親細胞系として選択した。
【００５６】
２つの高発現の親細胞系を単一のクローニングのために、５ｘ９６ウェルプレートに細胞を播種した。両方の親細胞系において、複数のクローンを９６ウェルプレートから採取し、２４ウェルプレートに移した。培地をコンフルエントウェルから回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ試験により以前のように評価した。所望の結果を得られなかったクローンを廃棄した。複数のクローンのサブセットを無血清懸濁培養中でよく増殖させ、５０ｍＬの増殖曲線を評価した。全てのクローンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡによりさらに再分析した。クローンのサブセットから、最も高い生産性を有する１つのクローンを１Ｌの増殖曲線の追加セットにおいて評価されるべきであると選択し、該クローンが最も高い生産性を有し、親細胞系と比較して有意な改良を示したことを確認した。
【００５７】
選択された最も高い生産の細胞系を選択し、ＣＤ−ＣＨＯに解凍した。細胞系に対する増殖曲線を評価し、サンプルを細胞数、細胞生存能力およびｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ生産性について毎日回収した。これらの試験に基づいて、選択された最も高い生産性の細胞系は、商業生産をサポートするために必要な量でｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを発現していたことを決定した。精製後のポリペプチドの収量は、少なくとも１２５ｍｇ／Ｌであった（何らかの生産最適化なしで）。
【表１】
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【００５８】
実施例３：本発明のポリペプチドの精製
配列番号１のｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを、前記実施例２に本質的に記載されているＣＨＯ−Ｋ１において発現させた。細胞を回収し、十分に確立されたプロトコールを利用して溶解した。細胞溶解物の浄化後、発現されたｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドを含む上清を、最初に、プロテインＡアフィニティーカラムに適用した。アフィニティー精製工程は、表２に概説される処理にしたがって行った。ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃを含むプロテインＡ溶出液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０を使用して約ｐＨ７．５にｐＨ調整した。必要に応じて、伝導度を、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）で調整した。
【００５９】
ＤＮＡ、ＨＣＰ、エンドトキシンおよび起こり得るウイルス汚染の内容物を減少させるために、ｐＨ調整されたプロテインＡカラム溶出液を、Ｑセファロース樹脂を利用する陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ）によりさらに精製した。ＡＩＥＸ工程は、表３に概説される処理にしたがってフロースルーモードで操作される。
【００６０】
ＡＩＥＸフロースルーを、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）により分析した。分析の結果は、それぞれ、図４および図５に示される。
【００６１】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ操作手順は表４に概説されている。ｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドの生物学的に関連した形態は、Ｃ−末端ジスルフィドを介して連結されたホモ二量体である。タンパク質サイズマーカーで行われた試験に基づいて、プレショルダーピーク（保持時間ＲＴ＝１３．５分）の分子量は約３７８ＫＤａであり、恐らくｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃの四量体を表していることを示した。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００６２】
プロテインＡアフィニティー精製工程において使用される低ｐＨ溶離条件がより高いオリゴマー形成を引き起こすことができるか否かを調べるために、溶出液濃度およびオリゴマー含有量の相関について試験を行った。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ樹脂を有する分析プロテインＡカラム（２ｍＬ）を、表１に概説される操作手順にしたがって充填し、使用した。カラム負荷体積を変化させて、すなわち２０、５０、１００および１５０ｍＬのそれぞれの４つの実験を行った。回収された溶出液をＳＥＣ−ＨＰＬＣにより分析し、オリゴマー含有量を概算した。結果は、オリゴマーが低ｐＨ溶離中で形成されるが、オリゴマー含有量はプール濃度と相関関係がなかったことを示す。
【００６３】
したがって、望ましくないオリゴマー形成を減少させるために、以下のさらなる精製方法を行った。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）、およびヒドロキシルアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー。
【００６４】
ＨＩＣにおいて、２つの樹脂、フェニル−およびブチル−、および３つの移動相の塩、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４および（ＮＨ４）２ＳＯ４を試験した。フェニルをベースとする樹脂およびＮａＣｌをベースとする移動相を利用して、＞９７％の純度および約５０％の収率をなし遂げることを可能にする良い結果を証明した。２つのＣＩＥＸ樹脂は、ＨＩＣから得られるものよりも優れた結果を示すことなくスクリーニングされた。
【００６５】
ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡＣ）を利用するさらなる試験は、優れた結果を生じた。ＨＡカラムを、１０．４ｍＬのカラム体積（ＣＶ）（ベッド高さ１１ｃｍ）に、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨＡ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ４０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で充填した。最高の溶出条件を同定するために、スクリーニング実験を行った（表６参照）。使用された出発物質は、最初の２工程クロマトグラフィー工程後のＡＩＥＸフロースルーであった。最初に、タンパク質の２つのバッチを調製した。第１および第２のバッチに対する全タンパク質発現レベルは、それぞれ、約５８８ｍｇ／Ｌおよび５０ｍｇ／ｍＬであった。２つのバッチからのＡＩＥＸフロースルーにおける純度および濃度は、同等であり、それぞれ約９２％および２．５ｍｇ／ｍＬであった。ＡＩＥＸフロースルーを、ＨＡＣローディングバッファーに対して透析し、ＨＡカラム上に負荷した。全ての実験を２ｍＬ／分の流速で行った。
【表５】
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【００６６】
表５において要約された実験の中で、実験番号６は優れた結果を生じた。実験番号６からのＨＡＣクロマトグラムを図６に示す。実験番号６からの主なピーク画分のプールは、９９％以上の純度を有し（ＨＡＣの主なピーク画分のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析クロマトグラムの例は、図７に示される）、概算されるタンパク質収率は６３％であった。注目すべきは、実験番号５はまた、比較的良い分離を生じたが、しかしながら約５５％の低いタンパク質収率であった。
【００６７】
インビトロでの細胞ベースのアッセイにおいて、この実施例に本質的に記載されているとおりに、発現され、精製された配列番号１のポリペプチドは、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、５０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬ誘導性破骨細胞分化を完全にブロックした（ＲＡＷ２６４．７細胞、約５０ｎｇ／ｍｌでＥＣ５０）。
【００６８】
実施例４：マウスへの皮下投与に対する配列番号１のｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドの毒性試験
配列番号１のポリペプチドを、前記実施例に本質的に記載されているとおりに、発現させ、精製させた。動物への投与のために、ポリペプチドを、以下のバッファー：１％ｗ／ｖ  スクロース、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２５ｍＭ  Ｌ−塩酸アルギニン、２５ｍＭ  重炭酸ナトリウム、ｐＨ６．３において製剤化した。使用された投与する貯蔵濃度は０．５ｍｇ／ｍＬのポリペプチドであった。
【００６９】
試験において使用されたＳＰＦマウスを３つのグループにランダムに分類した：製剤バッファーコントロールグループ、低用量グループおよび高用量グループ、それぞれのグループは５匹のマウスを有した。マウスをペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射により麻酔し、麻酔剤の用量は３０ｍｇ／ｋｇであった。注射部位をモニタリングするために、マウスの背中を剃った。２０μＬ製剤バッファーを、皮下注射によりコントロールグループに投与した。１６ｍｇ／ｋｇのポリペプチドを低用量グループに投与し、３２ｍｇ／ｋｇのポリペプチドを高用量グループに投与し、注射部位での応答を観察し、１５分、６時、２４時、７２時および７日に写真を撮った。
【００７０】
行われた試験において、急性反応は、製剤バッファー単独または１６および３２ｍｇ／ｋｇの用量における配列番号１のポリペプチドの皮下投与後に、マウスにおいて観察されなかった。皮膚反応または他の異常は、最大７日間の観察中に観察されなかった。
【００７１】
実施例５：マウスにおける皮下投与後の配列番号１のｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドの薬物動態学（ＰＫ）
配列番号１のポリペプチドを、前記実施例に本質的に記載されているとおりに、発現させ、精製させた。動物への投与のために、ポリペプチドを、以下のバッファー：１％ｗ／ｖ  スクロース、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｌ−塩酸アルギニン、２５ｍＭ  重炭酸ナトリウム、ｐＨ６．３において製剤化した。使用された投与する貯蔵濃度は０．５ｍｇ／ｍＬのポリペプチドであった。
【００７２】
試験の０日目に、１４匹のメスＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスを、２匹の動物で７つのグループに、体重に基づいてランダム化した。ポリペプチド（５ｍｇ／ｋｇ）の単回処置を、試験の０日目に血漿調製のために心穿刺を介して採血されたグループ１におけるマウスを除く全てのグループに０日目に皮下（背側）に投与した。血漿の調製のための試験以外(through-out)に、種々の時点で残りのグループにおいて眼窩静脈叢(orbital sinus)を介してマウスから血液サンプルを回収した。
【００７３】
処置日（０日目）に、および次に、各グループの終了日を含んで週に３回で、全ての動物について体重を記録した。
【００７４】
血漿調製のために、特定の時点で、マウスのグループを選択した。体重変化は、投与の０時および投与の３６時間以内に、サンプル回収のために選択されたグループにおいて測定されなかった。ほとんどのグループは、試験期間中に体重が増加した。グループ５のみは、体重の全体的な増加をなし遂げることに失敗した処置後７日目に終了した。マウスの過度の体重の減少も有害な臨床兆候も、試験期間中に報告されなかった。
【００７５】
試験の生存相に続いて、血漿サンプルをＨｕ−Ｆｃタンパク質に対するＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡによるマウス血漿サンプルにおけるＨｕ−Ｆｃの定量化を、ポリペプチドの循環レベルに対する読み出し(read-out)として使用した。試験において全てのマウスからのサンプルで、アッセイを行った。
【００７６】
投与１時間後に、動物の血漿においてポリペプチドを検出した。次に、Ｐｒｉｓｍ  ５．０ｃ（GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA）を使用するＯｎｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｍｏｄｅｌ等式を使用して、Ｈｕ−Ｆｃ  ＥＬＩＳＡにより検出されるとき、配列番号１のポリペプチドの薬物動態学を決定した。Ｈｕ−Ｆｃのピーク循環レベル（Ｃｍａｘ）は２６．４９μｇ／ｍＬであると決定され、循環レベルのピークの時間（Ｔｍａｘ）は処置１０時間後であった。ポリペプチドレベルは、最終評価点である投与から３週間後までに、ほぼ検出不可能なレベルに減少した。半減期（Ｔ１／２）は８３．５２時およびＫ０．００８３時−１であった。Ｈｕ−Ｆｃは、未処置グループ１動物の血漿において検出されなかった。試験の結果は表６に要約されている。
【表６】
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Ｈｕ−Ｆｃのレベルとして計算できないＳＥＭは、グループにおけるサンプルの１つに対して、ＥＬＩＳＡの検出可能な限界以下であった。
ヒト−Ｆｃタンパク質濃度は、に基づくＰｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより決定した。
＾眼窩静脈叢を介する採血
＃末端心穿刺を介する採血
【００７７】
実施例６：マウス骨溶解モデルとしてのヒト乳癌に対する配列番号１のｈＯＰＧ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチドの有効性の決定
本実施例において使用されたマウス骨溶解モデルは、当分野でよく知られている（例えば、Arrington, S.A., et al., Bone. 2006 Mar;38(3):359-67参照）。配列番号１のポリペプチドを、前記実施例に本質的に記載されているとおりに、発現させ、精製させた。動物への投与のために、ポリペプチドを、以下のバッファー：１％ｗ／ｖ  スクロース、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｌ−塩酸アルギニン、２５ｍＭ  重炭酸ナトリウム、ｐＨ６．３において製剤化した。使用された投与する貯蔵濃度は０．５ｍｇ／ｍＬのポリペプチドであった。
【００７８】
６０匹のメス無胸腺Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスに、それぞれ、５ｘ１０５ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞（５μＬ中）を右脛骨に接種させた。接種１４日後、マウスを体重により１２匹の５つのグループにランダム化した（０日目）。
【００７９】
それぞれのグループにおけるマウスに、ビヒクル（製剤バッファー）または配列番号１のポリペプチド（１、５または１０ｍｇ／ｋｇ）での皮下処置、またはＺｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）（０．１ｍｇ／ｋｇ）での静脈内処置を与えた。処置を０日目に開始し、週に３回投与し、６週間続けた。
【００８０】
最初の処置日（０日目）および次に、試験の終了日（最後の処置の４８時間後、最初の処置の４２日後）を含む週に３回で、全ての動物について体重を記録した。試験クール中、全てのグループにおいて、有意な（ｐ＜０．０５）平均体重増加があった。過度の体重の減少を含む有害な臨床兆候は、配列番号１のポリペプチドまたはＺｏｍｅｔａでの処置を受けたマウスにおいて観察されなかった。
【００８１】
全ての用量での配列番号１のポリペプチドおよびＺｏｍｅｔａでの処置は、ビヒクルと比較して、接種の６および８週後の両方で得られた脛骨のＸ線画像において評価された骨溶解の有意な（ｐ＜０．０５）阻害をもたらした。ほとんどあるいは全く骨溶解の証拠がなかったが、接種された脚の筋肉は、１０ｍｇ／ｋｇで配列番号１のポリペプチドを受けた１匹のマウスおよびＺｏｍｅｔａを受けた２匹のマウスから接種の６週後に得られたＸ線画像において増大が現れた。接種８週後に、増大された脚の筋肉の発生率は、全てのグループにおいて増加した。配列番号１のポリペプチドまたはＺｏｍｅｔａを受けた増大された脚の筋肉を有する全てのマウスは、接種８週後に、軽度の骨溶解を有したか、または骨溶解を有さなかった。全てのマウスからのＸ線画像を提示する。
【００８２】
１ｍｇ／ｋｇでの配列番号１のポリペプチドおよびＺｏｍｅｔａでの処置は、ビヒクルと比較して、試験の終了時に摘出された接種された脛骨のｍｉｃｒｏＣＴスキャンにより評価された骨密度パラメーターにより示される骨溶解の有意な（ｐ＜０．０５）阻害をもたらした。ｍｉｃｒｏＣＴのために分析されたそれぞれのグループ中の１匹のマウスからの典型的な二次元および三次元ｍｉｃｒｏＣＴスキャン画像を提示する。
【００８３】
材料および方法
試験のための全ての材料は市販の供給源から得た。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳房腫瘍細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Rockville, MD, USA）から供給された。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳房腫瘍細胞（作業ストックから継代５）を、１０％  ＦＢＳ、１％  Ｇｌｕｔａｍａｘおよび１％  ペニシリン−ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地において培養した。細胞をトリプシン処理により回収し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、計数した。次に、細胞を１ｘ１０８細胞／ｍＬの最終濃度にＨＢＳＳに再懸濁した。
【００８４】
腫瘍接種前に、注射部位をアルコールでよく消毒した。右後肢脛骨高原から骨髄管（ｃｈａｎｎｅｌ）へ５−７ｍｍの長さ（５μＬの細胞懸濁液を提供するために十分である）のトンネルを開けるために、２７Ｇ針を皮膚を介して挿入した。２７Ｇ針を備えた５０μＬ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ型シリンジを使用して、５μＬのＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞懸濁液（５ｘ１０５細胞）をあらかじめ形成されたトンネルに流した。マウスの処置をＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞接種の１４日後に開始した。
【００８５】
合計で、６５匹のメスマウス（ハツカネズミ）に試験のために接種し、このうちの６０匹を実際に試験に使用した（グループにおいて５匹、合計で１２グループ）。処置の開始時、動物体重は、約２０．３から接種時、約２７．８ｇ（平均２４．１ｇ）の範囲であった。動物を、１グループあたり３つのケージにて、個々に換気されたケージ（Alternative Design Max, USA）に４匹ずつ入れた。動物を、１２時間明／暗サイクルでバリア（検疫）条件下で制御された環境に維持した（標的範囲：温度２１±３℃、湿度３０−７０％、１時間あたり１５回換気）。温度および相対湿度を連続的にモニタリングした。全ての動物を同一の環境条件に付した。
【００８６】
標準認定された市販の齧歯動物規定食（Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan Laboratories, Inc, IN, USA）および水道水を動物に自由提供した。試験中、朝に１日１回、死亡率チェックを行った。臨床兆候（例えば、健康障害および行動の変化）もまた、１日１回、全ての動物について記録した。最初の処置日（０日目）に、および次に、試験の終了日を含んで週に３回で、全ての動物について体重を記録した。
【００８７】
以下のビヒクル製剤を試験において使用した：１％  スクロース、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ｌ−塩酸アルギニン、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．３。該溶液を４℃で貯蔵した。参照物質Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）を臨床製剤（０．８ｍｇ／ｍＬ）において使用し、室温で貯蔵した。投与のために必要な濃度をなし遂げるために、試験物質（配列番号１のポリペプチド）（４５ｍｇ／ｍＬ）を製剤バッファー（１％  スクロース、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  ｌ−塩酸アルギニン、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ６．３）で希釈した。投与のために必要な濃度をなし遂げるために、Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）臨床製剤（０．８ｍｇ／ｍＬ）を滅菌食塩水で希釈した。投与する溶液を、投与のそれぞれの日に新鮮に調製した。
【００８８】
本試験において使用された投与レジメンは表７に要約される。６０匹のマウスを、接種１４日後である試験の０日目に体重により、１２匹の５つのグループにランダム化した。
【表７】
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【００８９】
ビヒクルコントロール（製剤バッファー；グループ１）および配列番号１のポリペプチド（１、５および１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２、３および４各々）を、皮下注射（ｓ．ｃ．）により投与した（表７）。Ｚｏｍｅｔａ（０．１ｍｇ／ｋｇ；グループ５）を静脈内注射（ｉ．ｖ．）により投与した（表６）。処置を、０日目に開始する週に３回投与し、６週間続けた。
【００９０】
ビヒクルコントロールおよび試験物質を１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で投与した。各動物体重を投与直前に測定した。各動物に投与される投与溶液の容量を、個々の体重に基づいて計算し、調整した。
【００９１】
接種の６および８週後に（最初の処置の４および６週後に）、全てのマウスに両方の脛骨のＸ線検査を行った。接種された右脛骨の骨溶解の視覚的評価をそれぞれのＸ線画像から行い、スコアは溶解の重症度および増大された脚の筋肉の存在を示すために与えた。溶解の程度は、０（溶解なし）から４（非常に重度の骨溶解）の尺度で与えた。筋肉組織の膨隆により示される増大された脚の筋肉の存在は、０．５の追加のスコアを与えた。
【００９２】
終了時に全てのグループにおいて全てのマウスから接種された右脛骨を摘出した。摘出された脛骨を、総骨量（ＴＢＶ）、骨梁体積（Ｔｂ．ＢＶ）、骨梁パターン因子（Ｔｂ．Ｐｆ）および構造モデル指数（ＳＭＩ）を含むｍｉｃｒｏＣＴ分析（Adelaide Microscopy, Adelaide, SA, Australia）のために、１０％  中性緩衝ホルマリン中に保存した。
【００９３】
総骨量（ＴＢＶ）（ｍｍ３）は興味ある体積（ＶＯＩ）内の総皮質および骨梁体積（Ｔｂ．ＢＶ）（ｍｍ３）の尺度であり、ＶＯＩは皮質および骨梁からなる断面領域を含む。骨梁パターン因子（Ｔｂ．Ｐｆ）（ｍｍ−１）は逆崩壊指数であり、これは骨梁に特異的に適用できる構造的結合性を示す。より低いＴｂ．Ｐｆ値はより良い結合された柱格子を示し、より高いＴｂ．Ｐｆ値はより切断された柱構造を示す（すなわち、より大きい崩壊／骨溶解）。構造モデル指数（ＳＭＩ）は、骨梁のような３Ｄ構造における棒(rod)およびプレートの相対的な有病率の指標である。このパラメーターは骨の骨溶解において重要であり、プレート様（正常）から棒様（分解）構造への移行により特徴付けられる。理想的なプレート、シリンダーおよび球形は、それぞれ、０、３および４のＳＭＩ値を有する。値が大きいほど、より多くの損害がある。全ての統計的計算は、Ｐｒｉｓｍ  ５．０ｃ（GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA）を使用して行った。
【００９４】
対応のあるｔ検定を、体重が試験の０日目と終了日間で処置グループ内で有意に変化したか否かを決定するために使用した。データが正規性検定(Normality Test)に合格しなかった場合、ウィルコクソンの符号付き順位検定(Wilcoxon Matched Pairs Test)を行った。
【００９５】
接種の６および８週後にＸ線画像において評価された骨溶解スコアの比較を、全てのグループ間で行った。両方のデータセットが正規性検定に不合格であったため、ランク付けにおいて、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析(Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance)（ＡＮＯＶＡ）を行った。多重比較  対  制御手順(Multiple Comparison vs Control Procedure)（Ｄｕｎｎの方法）を、ビヒクルでのそれぞれの処置と比較するために行った。
【００９６】
摘出された接種された脛骨のｍｉｃｒｏＣＴスキャンにより評価された骨溶解パラメーターの比較を、グループ１、２および５におけるマウス間で行った。正常分散データに関して、一元配置ＡＮＯＶＡを行い、全てのグループ間の比較をチューキーの多重比較検定（Tukey's Multiple Comparison Test）を使用して行った。データが正規性検定に合格しなかった場合、ランク付けにおいて、クラスカル・ウォリス一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行った。この場合、全てのグループ間の比較は、全多重対比較処理(All Pairwise Multiple Comparison Procedure)（Ｄｕｎｎの方法）を使用して行った。０．０５未満のｐ値を有意と考えた。
【００９７】
結果および観察
有害な臨床兆候は、配列番号１のポリペプチドまたはＺｏｍｅｔａでの処置を受けたマウス（グループ２−５）において観察されなかった。配列番号１のポリペプチドまたはＺｏｍｅｔａでの処置を受けたマウス（グループ２−５）は、試験期間中、最初の体重の１５％以上の体重の喪失はなかった。全てのグループにおいて有意な（ｐ＜０．０５）平均体重の増加があった（表８）。
【００９８】
２８および４２日目に（接種の６および８週後に）、両方の脛骨のＸ線検査を全てのマウスから得た。接種された右脛骨の骨溶解の視覚的評価をそれぞれのＸ線画像から行い、スコアは接種された脚における溶解の重症度および増大された筋肉の存在を示すために与えた（表９、および図８および図９）。全ての用量での配列番号１のポリペプチド（１、５および１０ｍｇ／ｋｇ；グループ２、３および４各々）およびＺｏｍｅｔａ（グループ５）での処置は、ビヒクルコントロール（グループ１）と比較して、接種の６および８週後の両方で得られたＸ線画像において評価された骨溶解の有意な（ｐ＜０．０５）阻害をもたらした。
【表８】
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【表９】
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ａ：ビヒクル（グループ１）と有意に異なる（ｐ＜０．０５、ランク付けにおいて、クラスカル・ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡ）
スコア説明：
０  骨溶解なし
１  発症／軽度の骨溶解
２  中程度の骨溶解
３  重度の骨溶解
４  非常に重度の骨溶解
増大された筋肉−スコア＋０．５
【表１０】
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【００９９】
骨溶解の評価のためのＭｉｃｒｏＣＴスキャンパラメーターは、総骨量（ＴＢＶ）、骨梁容量（Ｔｂ．ＢＶ）、骨梁パターン因子（Ｔｂ．Ｐｆ）および構造モデル指数（ＳＭＩ）を含む３次元形態計測分析を含んだ。データは表１０に示されている。分析されたグループのそれぞれにおける１匹の動物からのｍｉｃｒｏＣＴスキャンの典型的な画像は、図１０および図１１に示されている。１ｍｇ／ｋｇでの配列番号１のポリペプチド（グループ２）およびＺｏｍｅｔａ（グループ５）の両方での処置は、ビヒクルコントロール（グループ１）と比較して、全てのｍｉｃｒｏＣＴスキャンパラメーターにより示される、骨溶解の有意な（ｐ＜０．０５）阻害をもたらした（有意に高いＴＢＶおよびＴｂ．ＢＶ、および有意に低いＴｂ．ＰｆおよびＳＭＩ）。
【０１００】
したがって、配列番号１のポリペプチド（１、５および１０ｍｇ／ｋｇ、週にｓ．ｃ．３回、６週間）が、メス無胸腺Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスの脛骨において接種されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞により誘導された骨溶解を防止することにおいて有効であるという結果となった。接種の６および８週後のＸ線画像および終了時（接種の８週後）に摘出された脛骨のｍｉｃｒｏＣＴスキャンにより測定されるこの有効性は、用量依存であるようには見えなかった。同様に、これらの試験のための参照化合物であるＺｏｍｅｔａ（０．１ｍｇ／ｋｇ、週にｉ．ｖ．３回、６週間）もまた有効性を証明した。
【０１０１】
「Ｚｏｍｅｔａ」は、Novartis AG Corporation, Switzerlandの登録商標である。「Ｐｒｏｌｉａ」および「Ｘｇｅｖａ」は、Amgen Inc., a Delaware Corporationの登録商標である。
【０１０２】
本明細書に記載されている全ての文献および特許文献は、それぞれの個々の文献または特許文献が、具体的かつ個別的に、出典明示により包含させることを示されていたかのように、それら全体において出典明示により本願明細書に包含させる。
【０１０３】
対象の特定の態様が議論されているが、上記明細書は例示的であり、制限的でない。多くの変形が、本明細書および特許請求の範囲の再検討時に当業者に明らかになる。本発明の全範囲は、それらの均等の全範囲と共に特許請求の範囲、およびかかる変形と共に明細書を参照することにより決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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