(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において軟骨形成を刺激するために使用される医薬組成物であって、ＤＡ−ＤＫＰならびにＮ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステル、カプリル酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記軟骨形成が、哺乳動物における軟骨形成疾患を治療するか、または改善させる請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞テクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、幹細胞の動員、ホーミング、増殖および／または分化のための組成物ならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、培養において無期限に分裂し、その後、多くの疾患の基礎研究、薬剤の発見、および治療（または予防）のために使用し得る多種多様な特殊化した細胞型および組織型になる能力を有している。幹細胞は典型的に２つの主要な群：成人幹細胞と胚性幹細胞に分類される。
【０００３】
成人幹細胞は、未分化状態であるが、その成人幹細胞が属していた分化した組織中に存在し、細胞型へと分化する能力がある。成人幹細胞は、神経系、骨髄、脂肪組織、真皮、膵臓および肝臓などの種々の供給源から得られてきた。また、幹細胞は、臍帯および胎盤からも単離されてきた。また、成人型幹細胞は、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨海綿組織、軟骨組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織（網膜組織を含む）、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織にも見出されると考えられている。
【０００４】
胚性幹細胞は、胚由来の未分化細胞である。典型的には、これらの細胞は未分化胚芽細胞の内側細胞塊から抽出され、単独で、または種々のフィーダ細胞と組み合わせて、特有の条件下で培養された際、胚性幹細胞は正倍数性の核型を維持し、老化を受けず内皮系、外胚葉系、および中胚葉系の細胞へ分化する能力を保持する。
【０００５】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）とは、自己再生の能力を有し、複数の間葉系に分化することのできる細胞のことである。これらの細胞は、神経細胞など、他の胚葉細胞型を生じさせる能力を有している可能性がある。ＭＳＣの主な供給源は、骨髄および脂肪組織などの他の組織からの単離である。ＭＳＣは、成人の組織には僅かしか存在しないので、通常、単離されるのは少数だが、大きな増殖能力があり、培養において容易に増殖して、多継体により複数の臨床関連細胞を生み出すことができる。これらの細胞は、組織の修復および再生を助けることが示されており、種々の治療的応用のための手段として期待されている。
【０００６】
幹細胞の最も初期の臨床的使用方法の１つは、血液の悪性疾患に罹っている患者に骨髄移植を施すためのもので、血液の悪性疾患だけでなく、非悪性の造血を破壊する手段として、ある用量の放射線照射および／または化学療法によってレシピエントを処置した後にドナーの骨髄由来の造血幹細胞をレシピエントに投与するものであった。非悪性造血幹細胞の投与によって、ドナー特異的造血、そして一部の患者では、その悪性疾患の治癒がもたらされる。これは最初、骨髄破壊に引き続いて、急性白血病に罹っている患者において、１９５７年に記載されている。幹細胞はまた、固形腫瘍の治療を目的として高用量の化学療法および／または放射線療法を投与された患者において、骨髄を回復させるために自家骨髄移植としても利用されてきた。固形腫瘍に対して高用量の化学療法／放射線療法と組み合わせた自家造血細胞移植の使用方法は、乳癌、大腸癌、肺癌、鼻咽頭癌および他のタイプの癌に関して広範に研究されてきた。
【０００７】
また、自家幹細胞の臨床的使用は、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、および全身性硬化症などの種々の自己免疫適応症に対してもなされてきた。
成人由来および／または胚由来の幹細胞を増殖するのに利用されるテクノロジーの重要性は、広範囲の疾患の治療におけるこれらの細胞の臨床的使用方法によって示されている。これらの治療に用いられる細胞培養系（例えば、液体静的培養、準固体培養および長期骨髄培養）には、ヒトまたは他の哺乳動物種の幹細胞を培養する前に満たされなければならないこれらの細胞培養系自体の独特の要件があるようである。しかし、現在までのところ、幹細胞培養系の一般的な要件および不利益は、幹細胞の最適な成長または増殖のための動物血清（例えば、ウシ胎仔血清またはウマ血清）中に含有される未規定成分に関する要件であった。
【０００８】
造血細胞の培養において血清を使用することは、幾つかの理由で不利である。血清は、未規定分化因子の主な出所源であり、したがって、増殖よりもむしろ造血性の細胞分化を促す傾向がある。血清の効率は多くの血清間で変動する。かなり多くの血清が細胞に対して毒性であることが分かっている。さらに血清は、マイコプラズマ、バクテリオファージおよびウィルスなどの感染性物質によって汚染される可能性がある。これらの問題は、培地の成長補助性に矛盾を生じさせ、幹細胞産生法の標準化を困難にし、血清含有培地において実施された実験の解釈を困難にする。このように、血清の使用は、幹細胞関連療法の臨床的実施にとって大きな障害となっている。
【０００９】
その結果、研究者達は、動物血清または調整培地を化学的定義の度合が様々な無血清培養培地に代替する試みをしてきた。これらの試みは、増殖しようとしている細胞型独自の性質によって成功の度合は様々であった。無血清培地の開発はレビューされている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。より魅力的な代替物は、規定無血清培地であると考えられる。したがって、（ｉ）幹細胞を単離すること、および（ｉｉ）これらの細胞の多系分化能を維持しながら多継代で長期間これらの細胞を増殖すること、を目的として規定無血清培地と方法を開発することが望ましい。規定無血清培地と方法の創出により、幹細胞に基づいた療法の臨床的実施を可能にする強壮なプラットフォームが提供されるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】サンドストロム、Ｅ．Ｅ．（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ，Ｅ．Ｅ．）ら著、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニア（Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆  Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．）、第４３巻：ｐ．７０６−７３３、１９９４年
【非特許文献２】コリンズ、Ｐ．Ｃ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｃ．）ら著、カレント・オピニオン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、第７巻：ｐ２２３−２３０、１９９６年
【非特許文献３】マクアダムス、Ｔ．Ａ．（ＭｃＡｄａｍｓ，Ｔ．Ａ．）ら著、ティーアイビーテク（ＴＩＢＴＥＣＨ）、第１４巻：ｐ３４１−３４９、１９９６年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一実施形態は、対象における幹細胞の動員、幹細胞のホーミング、幹細胞の増殖および幹細胞の分化からなる群から選択される効果を生じさせる方法である。この方法は、ＤＡ−ＤＫＰの投与を必要とする対象にＤＡ−ＤＫＰを投与することを含む。本実施形態において、および本明細書に記載された他の全ての実施形態において、ＤＡ−ＤＫＰは種々の剤形において、種々の経路によって投与でき、種々の方法によって産生できる。例えば、ＤＡ−ＤＫＰは、ＤＡ−ＤＫＰを含む医薬組成物として投与することができる。このような医薬組成物は、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステル（ｃａｐｒｙｌａｔｅ）および／またはカプリル酸もまた含むことができる。このような医薬組成物は、実質的に全てのアルブミンがフラクションから除去されているか、または５０００未満の分子量フラクションなど、低分子量のヒト血清アルブミンを含み得るヒト血清アルブミンのフラクションを含むことができる。このようなヒト血清アルブミンのフラクションは、ろ過によって生産できる。また、この医薬組成物は、ＤＡ−ＤＫＰを形成させるのに有効な条件下でヒト血清アルブミンを加熱することにより、またはＤＡ−ＤＫＰを産生するのに有効な条件下で、ヒト血清アルブミンの２つのＮ−末端アミノ酸を開裂する酵素とヒト血清アルブミンとを接触させることを含む方法によって調製することができる。ＤＡ−ＤＫＰは、合成ＤＡ−ＤＫＰであってもよい。
【００１２】
本発明の全ての実施形態において、ＤＡ−ＤＫＰは対象に局所的に投与できる。例えば、局所投与の部位は、関節、手術部位、体節骨格間隙部位または偽関節骨折部位、創傷、潰瘍、および炎症性皮膚発疹から選択することができる。また、ＤＡ−ＤＫＰは、非経口的製剤として投与でき、対象に全身的にも投与でき、または経口投与製剤としても投与できる。さらにＤＡ−ＤＫＰは、スポンジ、生体適合性ポリマー、生体侵食性ポリマー、パテ、ゲル、骨マトリックス、人工骨マトリックス、ボルト、ねじ、気管内挿入管、ステント、コンタクトレンズ、ペースメーカ、中心静脈内チューブ、フォーリーカテーテル、および頭蓋内デバイスから選択されるものなど、移植可能なデバイスの一部として、または移植可能なデバイス上に剤形化することができる。
【００１３】
本発明の全ての実施形態において、ＤＡ−ＤＫＰの投与は、ＣＸＣＲ４の産生を増加させ得るか、ＣＸＣＬ１２の産生を減少させ得るか、ＭＭＰ１４またはＭＭＰ１３の産生を増加させ得るか、アグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）の産生を増加させ得るか、ＳＤＦ１の産生を増加させ得るか、コラーゲン２Ａ１の産生を増加させ得るか、または上記のいずれかの組み合わせであり得る。また、ＤＡ−ＤＫＰの投与は、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ３、ベータ−アドレナリン作動性受容体キナーゼ１、トロンボドポンジンＩ型モチーフを伴うＡＤＡＭ−メタロペプチダーゼ、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ２、Ｃ−Ｓｒｃキナーゼ、マクロファージスカベンジャー受容体、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、チロシンキナーゼブルトン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３アルファ／ベータ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３アルファ／ベータ、ＨＳＰ９０アルファ／ベータ、ＨＳＰ９０アルファ／ベータ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ、および真核細胞翻訳開始因子４Ａ、繊維芽細胞成長因子１７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の産生を減少させ得る。さらに、ＤＡ−ＤＫＰの投与は、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ３、ノギン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の産生を減少させ得る。ＤＡ−ＤＫＰの投与はまた、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）（アポリポタンパク質Ｊ）、プロトロンビン、Ｃ１ＱＢＰ（ヒアルロナン結合タンパク質１）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＦ阻害剤）、マンマグロビン２、ＭＩＰ３ｂ（ＣＣＬ１９）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＰＴＨｒＰ、スポンジン１、エラフィン（エラスターゼ阻害剤）、ＩＬ１１、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＣＦＣ１（潜在性タンパク質）、テスティカン１（ＳＰＯＣＫ１）、アンギオゲニン、ＵＲＢ、ＭＭＰ−３、ＩＰ１０（ｃｘｃｌ１０）、ＢＳＳＰ４、ＩＬ８（ｃｘｃｌ８）、ＲＳＰＯ２、シスタチンＣ、ｂＦＧＦ、因子Ｈ、凝固因子ＩＸ、ＳＤＦ−１（ｃｘｃｌ１２）、ＣＡＴＣ（ジペプチジルペプチダーゼ１）、ＰＩＧＲ、Ｃｋ−ｂ−８−１（ＭＰＩＦ１スプライス変種）、Ｃ１ｓ、ＥＭＲ２、ＡＲＴ、ＤＰＰ２、ＳＡＡ、ＴＩＭＰ−１、セマフォリン３Ａおよびそれらの組み合わせから選択されるタンパク質の産生を増加させ得る。ＤＡ−ＤＫＰの投与はまた、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）（アポリポタンパク質Ｊ）、Ｃ１ＱＢＰ（ヒアルロナン結合タンパク質１）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＰＴＨｒＰ、エラフィン（エラスターゼ阻害剤）、ＩＬ１１、ＭＭＰ−３、ｂＦＧＦ、ＳＡＡ、ＴＩＭＰ−１、セマフォリン３Ａ、およびそれらの組み合わせから選択されるタンパク質の産生を増加させ得る。ＤＡ−ＤＫＰの投与はまた、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ３、ノギン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ、およびそれらの組み合わせから選択されるタンパク質の産生を減少させることができ、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）（アポリポタンパク質Ｊ）、Ｃ１ＱＢＰ（ヒアルロナン結合タンパク質１）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＰＴＨｒＰ、エラフィン（エラスターゼ阻害剤）、ＩＬ１１、ＭＭＰ−３、ｂＦＧＦ、ＳＡＡ、ＴＩＭＰ−１、セマフォリン３Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の産生を増加させることができる。さらにＤＡ−ＤＫＰの投与は、対象におけるＡｋｔ経路をダウンレギュレートすることができる。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、軟骨形成に刺激が必要な対象に、ＤＡ−ＤＫＰおよび任意選択的に、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステル、カプリル酸、およびそれらの組み合わせから選択される成分を含む医薬組成物を投与することによる、対象における軟骨形成を刺激する方法である。この実施形態において、軟骨形成は、始原細胞および間葉幹細胞（ＭＳＣ）から選択される幹細胞などの幹細胞において刺激することができる。この実施形態において、軟骨形成の刺激は、対象における軟骨、骨、および／または靭帯の修復を促すことができるか、または軟骨組織の修復または再生を誘導することができる。さらに、軟骨形成は、対象における軟骨形成疾患を治療することができるか、または改善することができ、軟骨形成疾患は、先天性軟骨疾患、変性関節または線維性関節、リウマチ様関節炎または骨関節炎であり得る。この実施形態において、軟骨形成により軟骨欠陥、骨格欠陥、外傷または手術に起因する骨折から選択される病態を治療または修復することができる。また、ＤＡ−ＤＫＰの投与は、新生の骨または軟骨組織の形成を刺激することができる。
【００１５】
軟骨形成を刺激する方法において、投与は、幹細胞をエクスビボで刺激してから、刺激された幹細胞を対象に投与することを含んでもよい。例えば、ＤＡ−ＤＫＰ、またはＤＡ−ＤＫＰを含む組成物と共に軟骨細胞系の幹細胞集団を、軟骨形成を刺激するのに十分な時間培養することにより、幹細胞をエクスビボで刺激することができ、この投与のステップは、刺激された細胞を対象における所望の部位に移植することを含む。この実施形態において、軟骨形成は、コラーゲン、２Ａ１型コラーゲン、１Ａ１型コラーゲンの産生増加、またはコラーゲン産生の２倍、４倍、１０倍、２０倍、または２５倍の増加をもたらすことができる。
【００１６】
さらに、本発明の実施形態は、哺乳動物における軟骨形成の刺激を目的とした薬剤の調製におけるＤＡ−ＤＫＰまたはＤＡ−ＤＫＰを含む組成物の使用、ならびに哺乳動物における軟骨形成の刺激を目的としたＤＡ−ＤＫＰまたはＤＡ−ＤＫＰを含む組成物の使用を含む。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、ＤＡ−ＤＫＰおよび任意選択的に、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステル、カプリル酸、およびそれらの組み合わせから選択される成分を含む医薬組成物を、神経組織の発達を刺激することを必要とする対象に投与することにより、対象における神経組織の発達を刺激する方法である。この実施形態において、始原細胞または間葉幹細胞（ＭＳＣ）などの幹細胞において、神経組織の発達を刺激することができる。神経組織の発達の刺激は、対象において脳、脊髄、および／または末梢神経の修復を促すことができるか、またはニューロン、グリア、および／または星状細胞の修復または再生を誘導することができる。神経組織の発達により、神経変性疾患など、対象における中枢神経系の疾患および／または末梢神経系の疾患を治療または改善することができる。また、神経組織の発達により、外傷または手術に起因する損傷から選択される病態を治療または修復することができる。
【００１８】
神経組織の発達を刺激する方法において、投与は、幹細胞をエクスビボで刺激してから刺激された幹細胞を対象に投与することを含み得る。例えば、ＤＡ−ＤＫＰ、またはＤＡ−ＤＫＰを含む組成物と共に、ニューロン、グリア、および／または星状細胞系の幹細胞の集団を、神経組織の発達を刺激するのに十分な時間培養することにより、幹細胞をエクスビボで刺激することができ、投与のステップは、刺激された細胞を対象における所望の部位に移植することを含む。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、対象における神経組織の発達を刺激するための薬剤の調製におけるＤＡ−ＤＫＰまたはＤＡ−ＤＫＰを含む組成物の使用、ならびに対象における神経組織の発達を刺激するためのＤＡ−ＤＫＰまたはＤＡ−ＤＫＰを含む組成物の使用を含む。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態は、組織の発達を刺激することを必要とする対象に、ＤＡ−ＤＫＰを投与することによる、対象における組織の発達を刺激する方法である。この実施形態において、組織は、神経系組織、脂肪組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨海綿組織、軟骨組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織から選択することができる。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＡ−ＤＫＰを含む無血清の真核細胞培養培地添加物（前記添加物を添加した細胞培養培地は、幹細胞の増殖を助けることができる）および培地添加物を有する無血清培地中に幹細胞を含む組成物である。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、幹細胞をＤＡ−ＤＫＰと接触させること、および幹細胞を、幹細胞の増殖を促進するのに好適な条件下で培養することを含む、幹細胞を増殖する方法である。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、幹細胞をＤＡ−ＤＫＰと接触させること、幹細胞の増殖を促進するのに好適な条件下で幹細胞を培養すること、および増殖させた幹細胞を対象に導入することにより、哺乳動物に幹細胞を提供する方法である。
【００２４】
本発明のなおさらなる実施形態は、幹細胞をＤＡ−ＤＫＰと接触させること、幹細胞の増殖を促進するのに好適な条件下で幹細胞を培養すること、および１つ以上の分化因子を添加すること、または培養条件を変えることにより、幹細胞の分化を誘導して、異なる細胞型を形成させることにより、幹細胞を特定の細胞型へと分化させる方法である。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、分化した幹細胞を対象に提供する方法である。この方法は、幹細胞をＤＡ−ＤＫＰと接触させること、幹細胞の増殖を促進するのに好適な条件下で細胞を培養すること、および１つ以上の分化因子を添加すること、または培養条件を変えることにより、幹細胞の分化を誘導して、異なる細胞型を形成させることを含む。この方法はさらに、分化した細胞を対象に導入することを含む。
【００２６】
本発明の概要は、本発明の完全な限界および範囲を表したものとして意図されてもいないし、また、そのように解釈すべきではない。さらに本明細書で「本発明」または本発明の態様と言われているものは、本発明の一定の実施形態を意味するものと理解すべきであって、必ずしも全ての実施形態を、特定の記述に制限するものと解釈すべきではない。本発明は、発明の概要ならびに添付図面および発明を実施するための形態に様々な程度の詳細さで記載されており、本発明の概要における要素、成分などの包含によっても非包含によっても、本発明の範囲についての制限を意図するものではない。本発明のさらなる態様は、発明を実施するための形態から、特に図面と一緒にすれば、より容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】生理食塩水を投与されている患者と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を投与されている骨関節炎患者に関する疼痛スコアの平均変化を示す。
【図２】生理食塩水、デキサメタゾン、ＤＡ−ＤＫＰおよびアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）で処理した幹細胞からの細胞凝集体の写真を示す。
【図３Ａ】生理食塩水と比較して、ＤＡ−ＤＫＰで処理した幹細胞によるコラーゲンおよびアグレカンの転写の増加を示す。
【図３Ｂ】生理食塩水と比較して、ＤＡ−ＤＫＰで処理した幹細胞によるコラーゲンおよびアグレカンの転写の増加を示す。
【図３Ｃ】生理食塩水と比較して、ＤＡ−ＤＫＰで処理した幹細胞によるコラーゲンおよびアグレカンの転写の増加を示す。
【図４】生理食塩水と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）による３Ｄ培養で増殖させた間葉幹細胞によるＣＸＣＲ４産生の増加を示す。
【図５】生理食塩水と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）による３Ｄ培養で増殖させた間葉幹細胞によるＣＸＣＬ１２産生の減少を示す。
【図６】インビトロでの幹細胞移動に及ぼすアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の効果を示す。
【図７】ヒト間葉幹細胞由来の骨髄によるコラーゲン２Ａ１の転写に及ぼすアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の効果を示す。
【図８】ヒト間葉幹細胞由来の骨髄によるアグレカンの転写に及ぼすアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の効果を示す。
【図９】ヒト間葉幹細胞由来の骨髄によるＧＡＰＤＨの転写に及ぼすアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の効果を示す。
【図１０】実施例８に記載された臨床試験の患者配置を示す。
【図１１】媒体対照と比較して、ＬＭＷＦ−５Ａの注入を投与されている骨関節炎患者に関する疼痛の減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、幹細胞の動員、ホーミング、および／または分化を必要とする対象において、幹細胞の動員、ホーミング、および／または分化を生じさせる方法についてのものである。本発明は、さらに幹細胞の増殖を安全に効果的に促進する組成物、ならびに幹細胞による治療に適合した疾患状態の治療において、そのような組成物および増殖させた細胞を使用する方法に関する。
【００２９】
定義
用語の「アルブミン置換物」とは、本発明の組成物におけるヒト血清アルブミンの代わりに用いてヒト血清アルブミンと実質的に同様の、またはより良好な結果を与えることのできる任意の化合物のことである。アルブミンは、ヒトが供給源であることが好ましい。アルブミンは、ヒト血清アルブミンであることが最も好ましい。
【００３０】
用語の「増殖する（ｅｘｐａｎｄ）」または「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、培養中の幹細胞の成長および分裂のことであり、分化のことではない。用語の「分化」とは、ある特定の型の細胞が別の型の細胞へと発現することである。多分化能性造血細胞が、骨髄前駆体へと発現するのは分化の一例である。同様に、前駆体細胞が別の型の細胞へと発現するのは分化の一例である。
【００３１】
用語の「幹細胞」とは一般的に、無限定の期間、分裂し、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する任意の細胞のことである。「幹細胞」の定義内には下記のものが含まれる：ａ）胚性幹細胞、胚体外幹細胞、クローン化幹細胞、単為生殖由来細胞、全能性を有するように再プログラム化された細胞、または原始生殖細胞；ｂ）造血幹細胞などの多分化能性細胞、脂質由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤由来幹細胞、剥離歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞または神経幹細胞；ｃ）神経細胞系、肝細胞系、腎細胞系、脂肪生成細胞系、造骨細胞系、破骨細胞系、肺胞細胞系、心細胞系、腸管細胞系、または内皮細胞系に関する前駆体細胞などの組織特異的始原細胞。細胞は、例えば、膵臓組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨髄組織、骨海綿組織、軟骨組織、肝臓組織、膵臓組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織（網膜組織を含む）、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織などの組織に由来し得る。特異的な幹細胞が、下記のエクスビボ処理法という標題の節に記載されている。
【００３２】
用語の「全能性細胞」とは、成体における任意の細胞型および胚外膜（例えば、胎盤）の任意の細胞型になる能力を有する哺乳動物細胞のことである。全能性細胞は、受精卵および受精卵の分割により生じた初めのおよそ４個の細胞である。
【００３３】
用語の「多分化能性幹細胞」とは、身体の任意の分化細胞を作る能力を有するが、栄養芽細胞由来の胚外膜成分の作成には寄与できない真性幹細胞のことである。羊膜は栄養芽細胞からではなく、外胚葉から発現する。３つの型の多能性幹細胞が確認されている：胚性幹（ＥＳ）細胞（霊長類では、全能性でもあり得る）、胚性生殖（ＥＧ）細胞、および胚性癌（ＥＣ）細胞である。これらのＥＣ細胞は、胎仔の生殖腺に時々生じる腫瘍である奇形癌から単離することができる。ＥＣ細胞は他の２つとは違って、通常は異数性である。
【００３４】
用語の「多能性幹細胞」とは、限られた数の型のみに分化できる真性幹細胞のことである。例えば、骨髄は、血液のあらゆる細胞を生じさせるが、他の細胞型に分化することができないと考えられる多能性幹細胞を含有する。
【００３５】
用語の「間葉幹細胞」とは、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）（脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ））など、種々の細胞型へ分化できる多能性間質細胞のことである。
【００３６】
用語の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」とは、骨髄系（すなわち単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板および幾つかの樹状細胞）とリンパ系（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および幾つかの樹状細胞）の双方に分化することのできる幹細胞のことである。
【００３７】
用語の「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」とは、細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を維持するか、または促進するために、細胞培養培地中に使用できる、化学的由来か、生物的由来の任意の化合物のことである。用語の「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「栄養物」および「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」は、交換可能に用いることができ、全てそのような化合物のことを意味している。細胞培養培地に用いられる典型的な成分としては、アミノ酸、塩類、金属、糖類、脂質、核酸、ホルモン類、ビタミン類、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。エクスビボで細胞の成長を促進するか、または維持する他の成分は、特定の必要性に従って当業者により選択できる。
【００３８】
「細胞培養」とは、人工的なインビトロ環境で維持、培養、または成長させる細胞または組織を意味する。
用語の「培養器」とは、細胞を成長させるために無菌性の環境を提供できる種々のサイズのガラス容器、プラスチック容器、または他の容器のことである。例えば、単一ウェルプレートもしくは多ウェルプレート、単一ウェル皿もしくは多ウェル皿または多ウェルミクロプレートを使用することができる。細胞の培養には、さらにバイオリアクターが使用できる。
【００３９】
用語の「細胞培養培地」、「培養培地」および「培地組成」とは、細胞を培養または成長させるための栄養溶液のことである。
用語の「接触」とは、１個以上の細胞を１つ以上の化合物、溶液、培地などと共に混合、付加、播種、または攪拌することである。
【００４０】
「無血清」培地とは、完全血清（例えば、ヒト血清、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヤギ血清など）を含有しない培地のことである。
用語の「緩衝剤」とは、酸および塩基双方を範囲内に中和することにより、水素イオン濃度を、したがって、溶液のｐＨを安定化させる作用をする薬剤のことである。本発明の添加物および培地に使用できる好適な緩衝剤としては、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−｛２−エタンスルホン酸｝（ＨＥＰＥＳ）、β−グリセロールーホスフェート、および重炭酸塩緩衝剤が挙げられる。
【００４１】
用語の「対象」とは、哺乳動物、鳥類、爬虫類、および両生類を含む任意の動物のことであり、好ましい実施形態においては、ヒト、コンパニオン動物、食糧生産動物および野生動物を含む哺乳動物のことである。
【００４２】
組成物
本発明は、本発明の方法に有用な組成物を提供し、このような方法には、このような組成物の投与により対象における幹細胞の動員、ホーミングおよび／または分化を生じさせるためのインビボの方法および幹細胞を増殖し、幹細胞を対象に提供し、幹細胞に分化を生じさせるエクスビボの方法が含まれる。したがって、このような組成物は、対象への投与および幹細胞との間接的接触において、または細胞培養培地への添加剤または添加物として有用である。本発明の組成物は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）の増殖を助けるのに特に適している。このような細胞としては、軟骨細胞、破骨細胞、造骨細胞、皮膚の上皮細胞、血管組織が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物は、大部分が、または全てが胚由来の一次細胞と継体細胞の双方（例えば、外胚葉誘導物、中胚葉誘導物、および内胚葉誘導物）の増殖を助けるのにも適している。これらの細胞には、中枢神経系および末梢神経系（ニューロン、グリア細胞および星状細胞）、上皮細胞（感覚上皮細胞、表皮細胞（皮膚、乳房、毛髪、爪、脳下垂体、皮脂腺））、結合組織細胞（軟骨、骨、横紋筋および平滑筋、造血細胞、リンパ球、腎細胞、生殖腺細胞、副腎細胞）および肝臓、膵臓、甲状腺、胸腺の実質細胞ならびに膀胱、尿道、鼓室、および耳管の上皮裏張りが含まれる。これらの細胞は、ヒト由来または他の哺乳動物由来または真核生物由来の細胞であり得る。
【００４３】
本発明の組成物としては、アスパルチル−アラニルジケトピペラジン（すなわち、“Ａｓｐ−Ａｌａ  ＤＫＰまたは“ＤＡ−ＤＫＰ”）が挙げられる。ジケトピペラジン（ＤＫＰ）は、２つのアミノ酸間のペプチド結合から生じてラクタムを形成する環状有機化合物の種類である。これらは、あり得る最小の環状ペプチドである。また本発明は、ＤＡ−ＤＫＰ組成物を含む製薬製品も提供する。
【００４４】
ＤＡ−ＤＫＰなどのジケトピペラジン類を製造する方法は当該技術分野で十分に知られており、これらの方法が、本発明のジケトピペラジン類を合成するために使用することができる。例えば、米国特許第４，６９４，０８１号明細書、同第５，８１７，７５１号明細書、同第５，９９０，１１２号明細書、同第５，９３２，５７９号明細書および同第６，５５５，５４３号明細書、米国特許出願公開第２００４／００２４１８０号明細書、ＰＣＴ出願国際公開第９６／００３９１号パンフレットおよび国際公開第９７／４８６８５号パンフレット、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら著、バイオオーガニック・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ）、第８巻、ｐ２３６９−２３７４、１９９８年を参照されたい。これらの完全な開示は、本明細書に参照として援用されている。
【００４５】
例えば、ＤＡ−ＤＫＰなどのジケトピペラジン類は、先ず、ジペプチド類を合成することにより調製できる。ジペプチド類は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組み合わせを用いて、当該技術分野で十分に知られた方法により合成することができる。例えば、固相ペプチド合成法を用いることができる。勿論、ジペプチド類は、ＤＭＩ・シンセシス（ＤＭＩ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ  Ｌｔｄ．）、カーディフ、英国（カスタム合成）、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ミズーリ州（主にカスタム合成）、フェニックス・ファーマシューティカルズ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ベルモント、カリフォルニア州（カスタム合成）、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（カスタム合成）およびアドバンスド・ケムテク（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）、ルイスビレ、ケンタッキー州などの多くの供給源から商品としても入手できる。
【００４６】
ジペプチドを合成または購入したら、環化してジケトピペラジンを形成する。これは、種々の技法により達成することができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／００２４１８０号明細書には、ジペプチド類を環化する方法が記載されている。簡単に述べると、蒸留により水を除去しながらジペプチドを有機溶媒中で加熱する。有機溶媒は、アセトニトリル、アリルアルコール、ベンゼン、ベンジルアルコール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔ−ブタノール、酢酸ブチルエステル、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、１，２−ジクロルエタン、ジエチルアセタール、ジメチルアセタール、酢酸エチルエステル、ヘプタン、メチルイソブチルケトン、３−ペンタノール、トルエンおよびキシレンなどの水との低沸点共沸物であることが好ましい。温度は、環化が生じる反応速度および使用される共沸剤のタイプに依存する。この反応は、５０℃〜２００℃で実施されることが好ましく、８０℃〜１５０℃で実施されることがより好ましい。環化が生じるｐＨの範囲は、当業者により容易に決定することができる。ｐＨは、２〜９であることが有利であり、３〜７が好ましい。
【００４７】
ジペプチドのアミノ酸のうちの１つが、その側鎖（例えば、アスパラギン酸）にカルボキシル基を有するか、または有するように誘導体化された場合、ジペプチドは米国特許第６，５５５，５４３号明細書に記載された通りに環化されることが好ましい。簡単に述べると、側鎖がまだカルボキシル基で保護されているジペプチドを、中性条件下で加熱する。典型的には、ジペプチドは、約８０℃から約１８０℃で、好ましくは約１２０℃で加熱されることになろう。溶媒は中性溶媒とする。例えば、溶媒はアルコール（ブタノール、メタノール、エタノール、高級アルコールなどだがフェノールではない）および共沸共溶媒（トルエン、ベンゼンまたはキシレンなど）などを含んでもよい。アルコールはブタン−２−オールで共沸共溶媒はトルエンであることが好ましい。加熱は、反応が完了するまで継続させるが、その時間は経験的に決定できる。典型的には、ジペプチドは約８〜２４時間、好ましくは約１８時間還流することによって環化される。最後にジケトピペラジンから保護基を除去する。その間は、最終化合物のキラリティーを維持するために、強酸（硫酸または塩酸などの無機酸）、強塩基（水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムなどのアルカリ塩基）および強力な還元剤（例えば、水素化リチウムアルミニウム）の使用は避けるべきである。
【００４８】
固相樹脂上で製造されたジペプチドは、環化と樹脂からの解除が１工程でできる。例えば、米国特許第５，８１７，７５１号明細書を参照されたい。例えば、結合させたＮ−アルキル化ジペプチドを有する樹脂を、酢酸（例えば、１％）またはトリエチルアミン（例えば、４％）の存在下、トルエン／エタノール中に懸濁させる。典型的には、それらのより迅速な環化時間のために塩基性の環化条件が好ましい。
【００４９】
ジペプチドを環化する他の方法およびジケトピペラジンを製造する他の方法も当該技術分野で知られており、本発明の実施に有用なジケトピペラジン類の調製に使用できる。例えば、上記の参照文献を参照されたい。さらに加えて、本発明における使用に好適な多くのジケトピペラジン類はタンパク質およびペプチドから下記の通りに製造することができる。さらに、本発明の実施において使用するジケトピペラジン類は、例えば、ＤＭＩ・シンセシス（ＤＭＩ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ  Ｌｔｄ．）、カーディフ、英国（カスタム合成）から商品として入手できる。
【００５０】
本発明のＤＡ−ＤＫＰ組成物および／またはＤＡ−ＤＫＰ製品は、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンを含む、商品として入手可能な医薬組成物から調製するなど、ＤＡ−ＤＫＰを含有する溶液から調製することができる。ＤＡ−ＤＫＰは、アルブミンを含有する商品として入手可能な幾つかの静脈内医薬組成物中に存在することが分かっている。これらの製薬調製剤に存在するＤＡ−ＤＫＰは、これらの医薬組成物の製造にしばしば用いられる加熱工程によって形成される。加熱によって、タンパク質の２つのＮ−末端アミノ酸の開裂および環化が生じ、ＤＡ−ＤＫＰが形成される。
【００５１】
したがって、ＤＡ−ＤＫＰは、アルブミンならびに他のタンパク質およびペプチドの溶液を加熱することによって調製することができる。例えば、中性ｐＨでリン酸緩衝液中のアルブミン溶液が調製される。Ｎ−末端アミノ酸のプロトン化を達成するために、溶液は濃縮溶液（例えば、約１００〜５００ｍＭ）であることが好ましい。溶液は、ＤＡ−ＤＫＰを形成させるには、６０℃で約２時間から数日間、好ましくは、４日間、加熱することが好ましい。タンパク質の変性は、好ましくは避けるべきである。これは、より短い時間の使用により、および／またはそれぞれ約０．０２Ｍのカプリル酸またはＮ−アセチルトリプトファンの添加により達成できる。
【００５２】
また、ＤＡ−ＤＫＰは、タンパク質またはペプチドから２つのＮ−末端アミノ酸を開裂することのできる酵素（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ、特にＤＰＰＩＶ）と、アルブミンの溶液を接触させることによって調製することもできる。好適なジペプチジルペプチダーゼは、例えばシグマ（Ｓｉｇｍａ）から商品として入手可能である。反応は、ｐＨ６〜８で、好ましくはリン酸緩衝液などの緩衝液中、反応を迅速化するのに十分高いが、タンパク質が変性するほど高くはない温度（例えば、３７℃）で実施すべきである。
【００５３】
ＤＡ−ＤＫＰ組成物の調製は、溶液中の一部または全てのアルブミンを除去する限外ろ過法、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、抗体または所望のジケトピペラジンに方向づけられた抗体、または切断タンパク質またはペプチドに方向づけられた抗体を付着させたビーズカラムを使用）、アニオン交換またはカチオン交換、ショ糖勾配遠心分離、クロマトグラフィー、塩析、超音波などの十分に知られた方法によるものであり得る。得られたＤＡ−ＤＫＰ含有組成物および／またはＤＡ−ＤＫＰ含有製品を用い、上記の医薬組成物内に組み込むことができる。
【００５４】
特定の一実施形態において、本発明の組成物は、横流ろ過によってアルブミン含有供給流を処理することにより調製される。本明細書に用いられる「横流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）」とは、ろ過媒体と比較してアルブミン含有供給流の流れの方向のことである。この流れの方向は、横流（一般に「横断流（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ）」とも言われる）か、「通常流（ｎｏｒｍａｌ  ｆｌｏｗ）」か、双方の組み合わせのいずれかであり得る。横流とは、大部分の流れがろ過媒体面を横断して流れることを特徴とするアルブミン含有供給流のことであり、他方、通常流とは、大部分の流れがろ過媒体面に対して９０°の角度でろ過媒体を通って流れることを特徴とする流れのことである。
【００５５】
別の実施形態において、本発明の組成物は、アルブミン含有供給流をクロマトグラフィーによって処理することにより製造される。本明細書でクロマトグラフィーとは、固定相を越える圧力低下を用いることによりアルブミン含有供給流のフラクションを残りのフラクションから分離する機械的および／または物理的な操作のことである。本明細書に用いられる用語の「機械的クロマトグラフィー」とは、サイズ排除クロマトグラフィーのことであるが、これに限定されない。本明細書に用いられる用語の「物理的クロマトグラフィー」とは、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティクロマトグラフィーのことであるが、これらに限定されない。
【００５６】
クロマトグラフィー工程の固定相としては、樹脂（すなわち、ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼンおよびポリアクリルアミド）、イオン交換樹脂（すなわち、スルホン化、四級アンモニウム、カルボキシレートおよびジエチルアンモニウム官能基群）、架橋アガロース、架橋デキストラン類、ホスホセルロース、多孔質のガラスおよびシリカ、アルミナおよびジルコニアマトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、固定相は、物理的吸引か、化学的結合か、またはコーティング後のインサイチュ重合化のいずれかにより、固体支持体粒子上に、または円筒の内壁上に固定することができる。固定された固定相は、粒子および円筒の外面を被覆でき、および／または固体粒子内のあらゆる利用可能な孔を埋めることができる。固定相は、限定されないが、抗体、タンパク質受容体、ステロイドホルモン、ビタミンおよび酵素阻害剤などの生体特異的リガンドによって官能化されていてもよい。
【００５７】
限外ろ過分離法を用いて、アルブミンを保持する一方でＤＡ−ＤＫＰは得られるろ液またはフラクション中へと通過する分子量限界を有する限外ろ過膜上に、ヒト血清アルブミン組成物を通過させることができる。このろ液は、約５０ｋＤＡ未満、約４０ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ未満、約２０ｋＤａ未満、約１０ｋＤａ未満、約５ｋＤａ未満、約３ｋＤａ未満の分子量を有する成分を含み得る。ろ液は、約５Ｄａ未満の分子量（「＜５０００ＭＷ」とも言う）を有する成分を含むことが好ましい。この＜５０００ＭＷのフラクションまたはろ液は、アルブミンからジペプチドアスパルテート−アラニンを開裂し、引き続きジケトピペラジンへと環化して形成されるＤＡ−ＤＫＰを含有する。
【００５８】
本発明のＤＡ−ＤＫＰの生理学的に許容できる塩類もまた、本発明の実施に使用できる。生理学的に許容できる塩類としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、安息香酸、サリチル酸、蓚酸、アスコルビン酸など）または塩基（薬学的に許容できる金属イオンまたはＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、Ｄ−グルコサミンまたはエチレンジアミン由来の有機カチオンの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩など）に由来する塩などの慣例的な非毒性塩が挙げられる。塩類は、例えば、酸による化合物の遊離塩基体の中和など、慣例的な様式で調製される。
【００５９】
本発明の組成物は、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、約１００μＭ、約１１０μＭ、約１２０μＭ、約１３０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１６０μＭ、約１７０μＭ、約１８０μＭ、約１９０μＭ、約２００μＭ、約２１０μＭ、約２２０μＭ、約２３０μＭ、約２４０μＭ、約２４０、約２５０μＭ、約２６０μＭ、約２７０μＭ、約２８０μＭ、約２９０μＭ、約３００μＭ、約３１０μＭ、約３２０μＭ、約３３０μＭ、約３４０μＭ、約３５０μＭ、約３６０μＭ、約３７０μＭ、約３８０μＭ、約３９０μＭ、または約４００μＭの下位エンドポイントを伴うＤＡ−ＤＫＰ濃度範囲を有する製薬溶液であり得る。本発明の組成物は、約６００μＭ、約５８０μＭ、約５７０μＭ、約５６０μＭ、約５５０μＭ、約５４０μＭ、約５３０μＭ、約５２０μＭ、約５１０μＭ、約５００μＭ、約４９０μＭ、約４８０μＭ、約４７０μＭ、約４６０μＭ、約４５０μＭ、約４４０μＭ、約４３０μＭ、約４２０μＭ、約４１０μＭ、約４００μＭ、約３９０μＭ、約３８０μＭ、約３７０μＭ、約３６０μＭ、約３５０μＭ、約３４０μＭ、約３３０μＭ、約３２０μＭ、約３１０μＭ、約３００μＭ、約２９０μＭ、約２８０μＭ、約２７０μＭ、約２６０μＭ、約２５０μＭ、約２４０μＭ、約２３０μＭ、約２２０μＭ、約２１０μＭ、または約２００μＭの上位エンドポイントを伴うＤＡ−ＤＫＰ濃度範囲を有する製薬溶液であり得る。
【００６０】
本明細書に記載された病態を治療するための本発明の組成物におけるＤＡ−ＤＫＰの有効量は、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１４０μｇ、約１５０μｇ、約１６０μｇ、約１７０μｇ、約１８０μｇ、約１９０μｇ、約２００μｇ、約２１０μｇ、約２２０μｇ、約２３０μｇ、約２４０μｇ、約２５０μｇ、約２６０μｇ、約２７０μｇ、約２８０μｇ、約２９０μｇ、約３００μｇ、約３１０μｇ、約３２０μｇ、約３３０μｇ、約３４０μｇ、約３５０μｇ、約３６０μｇ、約３７０μｇ、約３８０μｇ、約３９０μｇ、約４００μｇ、約４２５μｇ、約４５０μｇ、約４７５μｇまたは約５００μｇの下位エンドポイントを伴う範囲であり得る。さらに、本明細書に記載された病態を治療するための本発明の組成物におけるＤＡ−ＤＫＰの有効量は、約５００μｇ、約４９０μｇ、約４８０μｇ、約４７０μｇ、約４６０μｇ、約４５０μｇ、約４４０μｇ、約４３０μｇ、約４２０μｇ、約４１０μｇ、約４００μｇ、約３９０μｇ、約３８０μｇ、約３７０μｇ、約３６０μｇ、約３５０μｇ、約３４０μｇ、約３３０μｇ、約３２０μｇ、約３１０μｇ、約３００μｇ、約２９０μｇ、約２８０μｇ、約２７０μｇ、約２６０μｇ、約２５０μｇ、約２４０μｇ、約２３０μｇ、約２２０μｇ、約２１０μｇ、約２００μｇ、約１９０μｇ、約１８０μｇ、約１７０μｇ、約１６０μｇ、約１５０μｇ、約１４０μｇ、約１３０μｇ、約１２０μｇ、約１１０μｇ、約１００μｇ、約９０μｇ、約８０μｇ、約７０μｇ、約６０μｇ、約５０μｇ、約４０μｇ、約３０μｇ、または約２０μｇの上位エンドポイントを伴う範囲であり得る。
【００６１】
本発明の化合物の局所的または経皮的投与の剤形としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤および点滴剤が挙げられる。活性成分は、薬学的に許容できる担体および必要と考えられる任意の緩衝剤または推進剤と無菌条件下で混合できる。
【００６２】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、活性成分に加えて、動物脂肪および植物脂肪、油類、ワックス類、パラフィン類、でんぷん、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール類、シリコーン類、ベントナイト類、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有できる。
【００６３】
散剤およびスプレー剤は、活性成分に加えて、乳糖、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有できる。スプレー剤は、クロロフルオロヒドロ炭素およびブタンおよびプロパンなどの揮発性の未置換炭化水素などの慣例的な推進剤をさらに含有できる。
【００６４】
経皮パッチ剤は、身体に対する本発明の化合物の制御された送達を提供するというさらなる利点を有する。このような剤形は、本発明の１種または複数の化合物を弾性マトリックス材料などの適切な媒体中に溶解させるか、分散させるか、または組み入れることによって製造することができる。皮膚を横断する化合物の流入を増加させるために、吸収増強剤もまた使用できる。このような流入の速度は、速度制御膜を提供するか、またはポリマーマトリックスまたはゲルの中に化合物を分散させることによって制御することができる。
【００６５】
非経口投与に好適な本発明の製剤組成物は、１種または複数種の薬学的に許容できる滅菌等張性の水性もしくは非水性溶液、分散剤、懸濁剤もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射用液剤または分散剤中に再構成され、抗酸化剤、緩衝剤、予定されたレシピエントの血液と等張にする溶質または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る滅菌散剤と組み合わせた１種または複数種の本発明の化合物を含む。
【００６６】
本発明の医薬組成物に使用できる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール類（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル類が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散剤の場合は、必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【００６７】
また、これらの組成物は、湿潤剤、乳剤および分散剤などの補助剤を含有することができる。組成物はまた、組成物中に糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含むことが望ましい。さらに、吸収を遅らせるモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの薬剤を含めることにより、注射用剤形の吸収遅延をもたらすことができる。
【００６８】
幾つかの場合において、薬剤の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅延させることが望ましい。このことは、水溶解性の乏しい結晶質または非晶質の材料の液体懸濁を用いることにより達成できる。次いで薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、次にその溶解速度は、結晶のサイズおよび結晶の形体に依存すると考えられる。代替として、非経口投与薬剤の吸収遅延は、薬剤を油媒体中に溶解または懸濁させることによって達成される。
【００６９】
注射用デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中に薬剤のミクロカプセル化マトリックスを形成することにより製造される。ポリマーに対する薬剤の比率、および使用される特定のポリマーの性質によって、薬剤の放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル類）およびポリ（無水物）が挙げられる。注射用デポ製剤は、身体組織に適合性であるリポソームまたはミクロエマルジョン中に薬剤を封入させることにより調製することもできる。注射用材料は、例えば、細菌保持性フィルターを通るろ過によって滅菌することができる。
【００７０】
製剤は、単位用量または多用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルにおいて提供でき、凍結乾燥条件において貯蔵でき、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする。即時用の注射液剤および懸濁剤は、上記のタイプの滅菌した散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【００７１】
本発明の製薬製品を含むキットもまた提供される。キットは、注射による投与のために製剤化されたＤＡ−ＤＫＰ組成物を含み得る。ＤＡ−ＤＫＰは、ヒトアルブミン組成物溶液からのアルブミン除去など、本明細書に記載された通りに調製することができる。キットは、単位用量または多用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルを含有でき、凍結乾燥条件において貯蔵でき、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする。また、キットは、内容物が直接的使用または注射用に準備されている状態で貯蔵することもできる。
【００７２】
本発明の化合物を単独で投与することは可能であるが、化合物を製薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容できる担体、および任意選択的に１種以上の他の化合物、薬剤、または他の材料と混合させた活性成分として、１種または複数の成分を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、動物に対して有害ではないという意味で「許容できる」ということでなければならない。薬学的に許容できる担体は、当該技術分野で十分に知られている。選択された投与経路に関わらず、本発明の化合物は、当業者に公知の慣例的方法により、薬学的に許容できる剤形に製剤化される。例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を参照されたい。
【００７３】
本発明の組成物は、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）、カプリル酸、カプリル酸エステルまたはそれらの組み合わせをさらに含んでなり得る。組成物は、ＮＡＴを含み得ることが好ましい。ＮＡＴ、カプリル酸、カプリル酸エステルまたはそれらの組み合わせを有する本発明の組成物は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、または約２０ｍＭの下位エンドポイントを有する濃度範囲におけるＮＡＴ、カプリル酸、カプリル酸エステルまたはそれらの組み合わせを有する医薬組成物であり得る。さらに、ＮＡＴ、カプリル酸、カプリル酸エステルまたはそれらの組み合わせを有する本発明の組成物は、約４０ｍＭ、約３９ｍＭ、約３８ｍＭ、約３７ｍＭ、約３６ｍＭ、約３５ｍＭ、約３４ｍＭ、約３３ｍＭ、約３２ｍＭ、約３１ｍＭ、約３０ｍＭ、約２９ｍＭ、約２８ｍＭ、約２７ｍＭ、約２６ｍＭ、約２５ｍＭ、約２４ｍＭ、約２３ｍＭ、約２２、または約２１ｍＭの上位エンドポイントを有する濃度範囲におけるＮＡＴ、カプリル酸、カプリル酸エステルまたはそれらの組み合わせを有する医薬組成物であり得る。濃度範囲は、約４ｍＭから約２０ｍＭであることが好ましい。
【００７４】
さらに、本発明の組成物は、鎮痛剤（リドカインまたはパラセトアモルなど）、抗炎症剤（ベタメサゾン、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセンなど）および／または他の好適な薬剤などの第２の薬剤を含み得る。
【００７５】
ＤＡ−ＤＫＰを精製する代わりに、本開示の治療の哺乳動物レシピエントに見られるアルブミンを含む医薬組成物を、哺乳動物における幹細胞増殖を刺激するために投与することができる。現在、商品として入手可能なこれらのタンパク質および／またはペプチドを含む組成物は、それらがジケトピペラジン、特にＤＡ−ＤＫＰを含有するならば使用することができるが、改善された組成物を投与する前に、ＤＡ−ＤＫＰの含有量を増加させるために、上記のアルブミンを処理することが好ましい。哺乳動物はヒトであることが好ましく、タンパク質および／またはペプチドは、ヒトのタンパク質および／またはペプチドであることが好ましい。非経口投与経路が好ましい。
【００７６】
本発明の組成物を添加した組成物または細胞培養培地を用い、規定された増殖因子または他のサイトカイン類の添加により、幹細胞の成長、増殖および分化を調節することができる。一般的な血清含有培養における幹細胞に及ぼすこのような影響は、血清中の未規定の成分が規定された因子に対する細胞応答を不明瞭にするため可能ではない。したがって、幹細胞は本発明の組成物を用い、懸濁培養において、および間質細胞、コラーゲンまたは支持マトリックスの非存在下で、増殖および分化させることができる。
【００７７】
本発明の組成物を添加した添加物および組成物または細胞培養培地は、多分化能幹細胞集団および分化した後代双方の成長および増殖を提供する。
本発明の組成物を添加した組成物または細胞培養培地は、ヒト、サル、類人猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギおよびヒツジなどの多数の動物由来の幹細胞を培養するために使用できる。ヒト幹細胞を培養することが好ましい。さらに態様１または態様２の別の特定の実施形態において、幹細胞は、全能性、多分化能性、または多能性の幹細胞である。特定の一実施形態において幹細胞は、胚性幹細胞、胎仔幹細胞、胚外幹細胞または成人幹細胞である。
【００７８】
本発明の組成物を添加した組成物または細胞培養培地はまた、１種または複数の抗酸化剤、１種または複数のアルブミン類またはアルブミン代替物、１種または複数の脂質剤、１種または複数のインスリン類またはインスリン代替物、１種または複数のトランスフェリン類またはトランスフェリン代替物、１種または複数の微量元素、１種または複数のグルココルチコイド類、Ｎ−アセチル−Ｌシステイン、ヒトＥｘ−Ｃｉｔｅ（登録商標）、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、セレン、ヒドロコルチゾン、Ｄ，Ｌ−酢酸トコフェロール、および２−メルカプトエタノールからなる群から選択される１種または複数の成分を含んでもよい。例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを二重蒸留水中に溶解することができる。この時点でのＮ−アセチル−Ｌ−システインのｐＨは、およそ２．０である。タンパク質の変性を防ぐために、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインのｐＨを５Ｎの水酸化ナトリウムにより７．０に調整してから混合物に加える。次いで混合物全体を、０．２ミクロンの低タンパク結合フィルターを通してろ過する。
【００７９】
本発明の添加物または培地は、液体形態であってもよいし、乾燥形態で保持されていてもよい。液体担体のタイプおよび成分を溶液中に溶解させるために用いる方法は様々であり、通常の当業者によりルーチン実験だけで決定ことができる。一般に、液体担体は水である。
【００８０】
本発明の添加物または培地または濃縮製剤（水性形態と乾燥形態の双方）は、望まれない汚染を防ぐために、一般的には滅菌される。滅菌は、例えば、紫外線、ろ過または加熱により達成できる。
【００８１】
ヒト由来（例えば、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン）である本発明の添加物の全ての成分は、使用前に６０℃で１０時間の加熱により、加熱処理される。
通常の当業者は、造血細胞を培養するための方法に精通している。例えば、造血細胞培養の指針は、フレッシュニー，Ｒ．Ｉ．（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．）ら編集、造血細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、１９９４年、ｐ８１−９８に概説されている。
【００８２】
また、本発明は、第一の容器手段が、本発明の組成物を添加した組成物または細胞培養培地を含有する容器手段であるバイアル管、アンプル、ジャーなどの１つ以上の容器手段を、密閉状態で受けるための、区分されている箱またはカートンなどの保持手段（ｃａｒｒｉｅｒ  ｍｅａｎｓ）を含むキットも提供する。任意選択的に第二の容器手段は、基礎的な培地を含有する。本発明の添加物を含有する容器は、約−１３５℃から約４℃で、好ましくは約−５℃から約−８０℃で、最も好ましくは約−５℃から約−２０℃で、さらに一層好ましくは、約−２０℃で保存できることが好ましい。本発明の培地を含有する容器は、約２℃から約８℃で保存されることが好ましく、約４℃で保存されることが最も好ましい。
【００８３】
また、本発明は、無血清培養において幹細胞の成長を助けることのできる本発明の組成物が添加されている、無血清培地中に幹細胞を含む組成物を提供する。この組成物のアリコートは、約−８０℃以下で凍結させることができる。この組成物のアリコートは、約−１３５℃以下で無期限に貯蔵することができる。組成物のアリコートは、滅菌細胞培養法を用いて融解させ開けた後、幹細胞を無血清培養において培養ことができる。
【００８４】
また、別の実施形態は、生存可能性、移動性、および幹細胞の機能を維持するための、幹細胞の貯蔵および輸送における本発明の組成物の使用である。幹細胞の輸送を可能にするために、本発明の組成物は、単独で使用することもできるし、当該技術分野で公知の種々の薬剤に添加することもできる。これは、細胞の凍結および融解が多くの状況で実施されていない骨髄幹細胞の輸送状況において特に重要である。輸送中に幹細胞を適切に貯蔵する能力によって、幹細胞処理施設から離れた身体場所での組織抽出が可能になると考えられる。
【００８５】
本発明の別の実施形態は、臨床使用に好適であるように、医薬品等の製造管理／組織管理および品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ／Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の環境において生成した本発明の組成物を含む製薬製剤である。活性部分の濃縮および定量化に引き続き、本発明の組成物は、賦形剤または担体中に希釈することができる。投与を容易にするために、および剤形の均一性のために、組成物は、投与単位形態に製剤化することが有利であると思われる。本明細書に用いられる投与単位剤形とは、治療を受ける個体に対して単位投与量として適した物理的に個別の単位であって、各単位が、必要な薬学的担体と共に所望の治療効果を生み出すために算出された本発明の組成物の活性化合物の予め決定された量を含有する単位のことである。本発明の投与単位剤形は、増殖および／または分化が求められている各々の幹細胞の増殖を刺激するのに必要な組成物の量に依存する。所望の幹細胞の増殖および／または分化の刺激に必要な組成物の量は、単一投与量において製剤化できるか、または複数の投与量単位において製剤化できる。治療には、１回投与量が必要な場合もあるし、反復投与量が必要な場合もある。
【００８６】
本発明の組成物の実際の製剤化は、当業者に公知の標準的な慣例に合わせて実施される。これらは、当該技術分野で十分に知られており、選択される製剤化は、用いられる投与経路ならびに所望されている特定の薬物動態特性に基づく。例えば、本発明の組成物を利用する療法の好ましい実施形態は、注射用投与形態、より好ましくは、幹細胞の再生を必要としている特定の領域への投与のために製剤化された注射である。しかしながら、幾つかの実施形態が可能である。例えば、投与経路としては、非経口投与、例えば、関節内注射、静脈内投与、皮内投与、脊髄内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与、経口投与（例えば、摂取または吸入）、経皮（局所）投与、経粘膜系与、および直腸投与を挙げることができる。本発明の治療用組成物を製剤化するための溶液または懸濁液としては：注射用の水、生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＵＰＳ）、不揮発性油、グリセリンまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；パラベン類、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサルなどの抗菌剤および抗真菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど、毒性調整のための薬剤を挙げることができる。所望の流動性は、例えば、レシチンなどの被覆を用いることにより、分散の場合は、必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、組成物中に等張性薬剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類を含むことが好ましい。注射用組成物の投与遅延化は、吸収を遅らせる薬剤を含むことによって達成することができる。このような薬剤としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。非経口剤は、ガラスまたはプラスチックから製造されたアンプル、使い捨て注射器、または多用量バイアル中に封入することができる。経口組成物は、一般に不活性の希釈剤または食用の担体を含むことが、当該技術分野において、および一般的慣例において知られている。経口組成物は、液体であり得るか、ゼラチンカプセル中に封入し得るか、または錠剤へと圧縮し得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または同様の性質の化合物のいずれかを含有できる：微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤；澱粉または乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはトウモロコシ澱粉などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの滑剤；コロイド状二酸化ケイ素。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは座剤の使用によって達成できる。経皮投与のために、活性化合物は、当該技術分野で一般に知られている通り、軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤へと製剤化される。
【００８７】
治療のインビボ法
本発明の実施形態は、生体内における幹細胞の動員、ホーミング、分化および／または増殖を達成するために、本発明の組成物の使用を含む。本発明の組成物の投与が望ましい臨床状態としては、内因性幹細胞の疾患または老化により幹細胞数の増加が求められている病態または周囲組織または生体内の別の場所に及ぼす補償機能から利益を得る病態が挙げられる。このような幹細胞は、膵臓組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨髄組織、骨海綿組織、軟骨組織、肝臓組織、膵臓組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織（網膜組織を含む）、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織に存在し得る。
【００８８】
本発明の組成物の投与は、対象の全身または局所環境に実施できる。例えば、局所投与の部位は、関節、手術部位、分節骨格間隙または偽関節骨折、創傷、潰瘍、または炎症性皮膚発疹などの組織の発達が望まれているか、または有益である身体の任意の部位であり得る。また、本発明の組成物は、経口投与製剤などによって、全身にも投与できる。さらに、本発明の組成物は、移植可能なデバイス上に、またはその一部として対象に投与できる。例えば、そのようなデバイスは、スポンジ、生体適合性ポリマー、生体侵食性ポリマー、パテ、ゲル、骨基質、人工骨基質、ボルト、ねじ、気管内挿入管、ステント、コンタクトレンズ、ペースメーカ、中心静脈内チューブ、フォーリーカテーテル、または頭蓋内デバイスであり得る。
【００８９】
本発明は、ＤＡ−ＤＫＰの投与が必要な対象にＤＡ−ＤＫＰを投与することによって、対象における幹細胞の動員、幹細胞のホーミング、幹細胞の増殖、および幹細胞の分化から選択される効果を生じさせる方法を含む。この方法において、ＤＡ−ＤＫＰ投与のステップは、ＣＸＣＲ−４、ＣＸＣＬ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、アグレカン、ＳＤＦ１、およびコラーゲン２Ａ１のうちの１種以上の産生を増加させる効果を有し得る。さらに、ＤＡ−ＤＫＰ投与のステップは、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ３、ベータ−アドレナリン作動性受容体キナーゼ１、トロンボドポンジンＩ型モチーフを伴うＡＤＡＭ−メタロペプチダーゼ、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ２、Ｃ−Ｓｒｃキナーゼ、マクロファージスカベンジャー受容体、ノギン、チロシンキナーゼブルトン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３アルファ／ベータ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３アルファ／ベータ、ＨＳＰ９０アルファ／ベータ、ＨＳＰ９０アルファ／ベータ、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ、および真核細胞翻訳開始因子４Ａ、および繊維芽細胞成長因子１７から選択される１種以上のタンパク質、特にＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ３、ノギン、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファから選択される１種以上のタンパク質の産生を減少させる効果を有し得る。さらにＤＡ−ＤＫＰ投与のステップは、クラステリン（アポリポタンパク質Ｊ）、プロトロンビン、Ｃ１ＱＢＰ（ヒアルロナン結合タンパク質１）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＦ阻害剤）、マンマグロビン２、ＭＩＰ３ｂ（ＣＣＬ１９）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＰＴＨｒＰ、スポンジン１、エラフィン（エラスターゼ阻害剤）、ＩＬ１１、ＮＰＳ−ＰＬＡ２、ＣＦＣ１（潜在性タンパク質）、テスティカン１（ＳＰＯＣＫ１）、アンギオゲニン、ＵＲＢ、ＭＭＰ−３、ＩＰ１０（ｃｘｃｌ１０）、ＢＳＳＰ４、ＩＬ８（ｃｘｃｌ８）、ＲＳＰＯ２、シスタチンＣ、ｂＦＧＦ、因子Ｈ、凝固因子ＩＸ、ＳＤＦ−１（ｃｘｃｌ１２）、ＣＡＴＣ（ジペプチジルペプチダーゼ１）、ＰＩＧＲ、Ｃｋ−ｂ−８−１（ＭＰＩＦ１スプライス変種）、Ｃ１ｓ、ＥＭＲ２、ＡＲＴ、ＤＰＰ２、ＳＡＡ、ＴＩＭＰ−１、およびセマフォリン３Ａから選択される１種以上のタンパク質、そして特にクラステリン（アポリポタンパク質Ｊ）、Ｃ１ＱＢＰ（ヒアルロナン結合タンパク質１）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＰＴＨｒＰ、エラフィン（エラスターゼ阻害剤）、ＩＬ１１、ＭＭＰ−３、ｂＦＧＦ、ＳＡＡ、ＴＩＭＰ−１、セマフォリン３Ａ、およびそれらの組み合わせから選択される１種以上のタンパク質の産生を増加させる効果を有し得る。さらに特定の実施形態において、ＤＡ−ＤＫＰの投与は、ＭＡＰＫ−活性化タンパク質キナーゼ３、ノギン、ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒サブユニットアルファ、およびそれらの組み合わせから選択されるタンパク質の産生を減少させることができ、ならびにクラステリン（アポリポタンパク質Ｊ）、Ｃ１ＱＢＰ（ヒアルロナン結合タンパク質１）、ＭＣＰ１（ＣＣＬ２）、ＰＴＨｒＰ、エラフィン（エラスターゼ阻害剤）、ＩＬ１１、ＭＭＰ−３、ｂＦＧＦ、ＳＡＡ、ＴＩＭＰ−１、セマフォリン３Ａ、およびそれらの組み合わせから選択されるタンパク質の産生を増加させることができる。また、ＤＡ−ＤＫＰの投与は、対象におけるＡｋｔ経路をダウンレギュレートすることもできる。本発明の方法は、対象にＤＡ−ＤＫＰを投与することにより、対象における組織の発達を刺激するための方法を含む。これらの方法は、対象における神経系組織、脂肪組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨海綿組織、軟骨組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、扁桃腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織のうちの１つ以上などの任意の組織の発達にとって好適である。
【００９０】
治療の特定のインビボ法は、医療処置の後に、対象におけるより多数の幹細胞および／または幹細胞のより迅速な回復が必要な病態を含む。例えば、骨髄移植の後は、患者が細菌またはウィルスの感染に負けないように、造血細胞の増殖が望ましい。顆粒球および単球の前駆体のこのような増殖は、骨髄移植後の免疫防御の増強に有用であると考えられる。したがって、本発明は、骨髄移植を受けた患者に投与できる方法および組成物を提供する。
【００９１】
インビボ法の別の実施形態は、損傷が生じて内因性幹細胞が動員され、分化し始めてはいるが、有益な応答を刺激する上で十分な高レベルにはなされていない内因性幹細胞の増殖を助けることである。このように、本発明のさらなる実施形態は、膵臓組織、肝臓組織、平滑筋組織、横紋筋組織、心筋組織、骨組織、骨髄組織、骨海綿組織、軟骨組織、肝臓組織、膵臓組織、膵管組織、脾臓組織、胸腺組織、パイエル板組織、リンパ節組織、甲状腺組織、表皮組織、真皮組織、皮下組織、心組織、肺組織、血管組織、内皮組織、血液細胞、膀胱組織、腎組織、消化管組織、食道組織、胃組織、小腸組織、大腸組織、脂肪組織、子宮組織、眼組織（網膜組織を含む）、肺組織、精巣組織、卵巣組織、前立腺組織、結合組織、内分泌組織、および腸間膜組織から選択される組織における損傷を有する患者に、本発明の組成物を投与することである。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、治療を促すために、本発明の組成物を単独で、または成長因子と組み合わせて投与することである。
本発明の別の実施形態は、糖尿病に罹っている対象に、膵島再生を誘導するために、本発明の組成物を投与することによる糖尿病の治療法である。この方法は、膵島再生を誘導できる他の因子の投与をさらに含み得る。このような因子は、例えば、溶解性タンパク質、膜結合タンパク質、または細胞内作用転写因子であり得る。例えば、ＧＬＰ−１、ＥＧＦおよびガストリンの組み合わせをマウスに投与すると、ＮＯＤまたはストレプトゾシンに誘導された糖尿病などのモデルに機能的に有効である膵島または膵島様細胞の再生をもたらすことが知られている。本発明の組成物は、幹細胞数を増やすために、インビトロで分化している膵島細胞の培養物に加えることができるが、膵島様細胞の機能を回復させるために、または投与されたホルモン類の効果を増強するために、インビボで患者の膵臓に直接投与することもできる。
【００９３】
本発明のインビボ法の別の実施形態は、ニューロンの始原細胞を増殖させる目的で、多発性硬化症に罹っている患者に本発明の組成物を投与することによる多発性硬化症の治療である。代替として、本発明の組成物は、多発性硬化症に罹っている患者に単独で、または自己免疫過程を阻害することのできる薬剤と組み合わせて投与することができる。組織の治癒と免疫系の修復の同時誘導によって、治療効果における相乗作用が期待される。
【００９４】
本発明の別の実施形態は、自家患者から幹細胞を抽出し、本発明の組成物および／または幹細胞を増殖させる化合物の他の組み合わせを用いて細胞を処理し、患者の免疫系を消失させ、引き続き再構成のために、宿主内に幹細胞を再導入することによる自己免疫障害などの免疫学的障害の治療である。本発明の組成物は、造血の再構成を促進するために、引き続き宿主に直接提供することができる。これらの処置によって治療できる自己免疫疾患としては、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性硬化症、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、強皮症、全身性紅斑性狼瘡、移植片対宿主病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、幹細胞の産生を増大させるために、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、強皮症などの自己免疫障害の治療を必要とする生体内の関連する場所へ、軟骨形成または膵島細胞の産生を増大させるための生体関節内、または膵臓内へ投与することなど、本発明の組成物を投与することを含む、自己免疫障害に対する治療である。
【００９６】
本発明の別の実施形態は、生体内の抗原特異的および／または抗原非特異的な免疫調節細胞を増殖させるために、本発明の組成物を使用することを含む。このような細胞の増殖は、病的な免疫応答を制御するための使用方法である。例えば、Ｔｈ２細胞、ＴＲ１細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞、およびＣＤ３＋ダブルネガティブ細胞は、抗原特異的様式で免疫応答を抑制する能力があり、一方、ＮＫＴ細胞、骨髄性抑制細胞、Ｍ２細胞、および未熟性樹状細胞は、抗原非特異的形式で免疫応答を抑制する能力があることが知られている。本発明の組成物は、免疫調節細胞のエクスビボ培養および増殖を必要とする患者由来の免疫調節細胞のエクスビボ培養および増殖のために使用することができる。本発明の組成物は、機能の損失なしに細胞の増殖を増大させるための生体への投与を目的として、単独で、または細胞の発達に関与することが知られている因子と組み合わせて使用することができる。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、内因性神経細胞のインビボ動員、ホーミング、増殖および／または分化を生じさせるために、脳卒中の患者に本発明の組成物を投与することによる脳卒中の治療である。この方法は、神経細胞を増殖することが当該技術分野にて知られているポリペプチドおよびタンパク質と組み合わせて、本発明の組成物を投与することをさらに含み得る。
【００９８】
本発明の別の実施形態は、公知の療法の有益な効果を増強させるために、本発明の組成物と公知の療法との組み合わせを利用することにより、変性病態の治療に対する補助剤として本発明の組成物を使用することである。
【００９９】
本発明の別の実施形態は、インビボまたはエクスビボで幹細胞の増殖を増強させるための薬剤の調製における本明細書に記載された本発明の組成物の使用に関するものである。
本発明のさらなる実施形態は、対象における幹細胞の動員、ホーミング、増殖および／または分化を生じさせるために、本発明の組成物を投与することによる変性関節疾患の治療のためのインビボ法である。変性関節疾患は、関節を覆う関節軟骨の漸進的な悪化である。変性関節疾患（骨関節炎）は、負荷関節の非感染性の変性障害である。正常な関節軟骨は、平滑で白く、半透明である。それは、コラーゲン、タンパク質多糖体、および水から作製されたスポンジ様マトリックスに埋め込まれた軟骨細胞から構成されている。早期の原発性関節炎では、軟骨は黄色で不透明になり、表面が軟化し、粗くなった局所領域を有する。変性が進行すると、軟質領域は、裂け擦り減って、軟骨の下の骨が露出してくる。次いで骨は、改造を始め、密度を増す一方で、残りの軟骨は擦り減り始める。その結果、関節端で骨増殖体（新しい骨の骨棘）は、軟骨形態により覆われる。機械的な摩擦が増加するほど、軟骨の修復が必要になる。軟骨細胞は、スポンジ様マトリックスを十分には産生できないので、損傷した軟骨はそれ自体で修復することができない。軟骨は、治療を増強するための血液の供給がない。進行性の関節疾患の多くは、機械的な不安定性または関節内の老化変化の結果である。これには老人変性関節炎が含まれ、また、より若年個体では、例えば、前十字靭帯断裂、膝蓋骨脱臼、または離断性骨軟骨炎からの損傷、打撲傷、異常な関節配置（すなわち、腰部形成異常）、または機械的摩擦の結果であり得る。変性関節疾患は、限定はしないが、膝、腰、肩、手および背骨など、身体の任意の関節において生じ得る。
【０１００】
変性関節疾患に対する慣例的な薬物療法としては、アセトアミノフェン、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、麻酔剤、およびコルチコステロイド類が挙げられる。
本発明のある特定の実施形態は、ＤＡ−ＤＫＰを含む医薬組成物を投与することにより、対象における軟骨形成を刺激する方法である。医薬組成物は、本明細書に記載された任意の医薬組成物を含むことができ、したがって、Ｎ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステル、カプリル酸、および組み合わせから選択される成分を含むこともできる。この方法において、軟骨形成を幹細胞において刺激でき、幹細胞は始原細胞または間葉幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。この方法における軟骨形成の刺激によって、対象における軟骨、骨、および／または靭帯の修復を促進できるか、または軟骨組織の修復または再生を誘導できる。したがって、この方法は、対象における先天性軟骨疾患、変性関節、線維性関節、リウマチ様関節炎または骨関節炎などの軟骨形成疾患の治療、または改善にとって有用である。また、軟骨形成は、外傷または手術から生じた軟骨欠陥、骨欠陥、および骨折から選択される病態を治療または修復するためにも有用であり得る。例えば、骨欠陥は、大型の分節骨格間隙であり得、軟骨欠陥は、関節軟骨裂、先天性軟骨欠陥または骨折から生じた軟骨損傷であり得る。
【０１０１】
この方法は、エクスビボで幹細胞を刺激してから、その幹細胞を対象に投与することによって実施することができる。例えば、幹細胞は、軟骨細胞系の幹細胞集団を、ＤＡ−ＤＫＰまたはＤＡ−ＤＫＰを含有する組成物と共に、軟骨形成を刺激するのに十分な時間培養することにより、エクスビボで刺激してから対象における所望の部位へ移植することができる。
【０１０２】
この方法は、２Ａ１型コラーゲンおよび／または１Ａ１型コラーゲンなどのコラーゲン産生の増加をもたらすことができる。特に軟骨形成は、少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍、２５倍のコラーゲン産生をもたらすことができる。本発明のさらなる実施形態は、ＤＡ−ＤＫＰを含む医薬組成物を投与することにより、対象における神経組織の発達を刺激する方法を含む。医薬組成物は、本明細書に記載されたいずれかの医薬組成物を含むことができ、したがって、対象に対してＮ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステル、カプリル酸、およびそれらの組み合わせから選択される成分も含むことができる。この方法において、神経組織の発達は、始原細胞および間葉幹細胞（ＭＳＣ）から選択できる幹細胞において刺激することができる。神経組織の発達刺激は、対象における脳、脊髄、および／または末梢神経の修復を促進できるか、またはニューロン、グリア、および／または星状細胞の修復または再生を誘導する。さらに、神経組織の発達により対象における中枢神経系の疾患および／または末梢神経系の疾患を治療または改善することができる。このような疾患は、神経変性疾患から選択され得る。また、神経組織の発達により、外傷または手術から生じる損傷から選択される病態を治療または改善することができる。
【０１０３】
この方法は、幹細胞をエクスビボで刺激してから、刺激された幹細胞を対象に投与することによって実施することができる。例えば、ニューロン系、グリア系および／または星状細胞系を、神経組織の発達を刺激するのに十分な時間、医薬組成物と共に培養することによって、幹細胞をエクスビボで刺激することができ、次いで、対象における所望の部位に移植することができる。
【０１０４】
エクスビボ治療法
全身投与を目的とした幹細胞のエクスビボ増殖は、幹細胞治療の可能な障害または疾患にとって有効な治療様式となる。例えば、骨髄移植に引き続いて、肝臓および消化管における重篤なグレードＩＶの移植片対宿主病に罹っている患者において、インビトロで増殖した間葉幹細胞は、急性および慢性双方の移植片対宿主病を減ずる。骨髄移植後７３日目に２００万個の細胞／ｋｇを投与することにより、移植片対宿主病の長期の寛解がもたらされ（ル・ブラン（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ）ら著、２００４年、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３６３巻：ｐ１４３９−１４４１）はそれを示している。
【０１０５】
また、本発明は、エクスビボで幹細胞の増殖を増加させる方法をさらに提供する。この方法は、後で必要な部位に局所的に、または全身に投与することを目的に幹細胞を増殖するために、幹細胞を本発明の組成物と接触させること、または幹細胞を本発明の組成物を含む成長培地と混合すること、またはインキュベーションすることを含む。このような方法によって、増殖が比較的遅く、したがって広範な臨床使用には、しばしば実際的ではない間葉幹細胞などの幹細胞集団の使用が可能になる。
【０１０６】
本発明の組成物は、幹細胞の増殖速度を増加させることに加えて、幹細胞を未分化状態に維持することもできる。幹細胞は独特な生理学的ニッチに存在しており、そのようなニッチの擬態内で細胞を成長させても、その幹細胞ニッチの擬態は、臨床状況においては使用できないことが多い。この一例は、初期の造血幹細胞を大量に増殖するためには、フィーダ細胞系を必要とする事実、または胚性幹細胞の最適な成長は、いまだに主としてマウスのフィーダを用いて達成される事実である。本発明は、臨床状況に翻訳可能な方法を用いて、幹細胞のニッチに類似した状態を作り出すことのできる、幹細胞の増殖増強を目的とした組成物を提供する。
【０１０７】
上記に検討したように、幹細胞の特定の表現型を抽出し、増殖し、同定する方法は、臨床実施にとって重要である。例えば、骨髄は、心筋疾患、アンギナ、および造血細胞移植のための治療的幹細胞源として一般的に用いられる。しかしながら、骨髄は、標準的なよく知られた造血性のＣＤ３４＋幹細胞ばかりでなく、多数の別の幹細胞を一般に含有する。Ｔ細胞、Ｂ細胞および比較的高濃度のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ調節細胞に加えて、ＣＤ３４−造血細胞、間葉幹細胞および筋原生前駆細胞が全て、骨髄中に見出されている。幹細胞療法の出発材料として、骨髄の異種混交を考慮に入れると、特定の細胞集団を理解すること、ならびにそれらを単離および増殖する能力は、幹細胞療法の分野を相当に前進させることは明らかである。
【０１０８】
したがって、幹細胞集団が成人由来であっても、胚由来であっても、培養で成長させた際の幹細胞の増殖速度または成長速度を増加させる目的で、異成分からなる細胞混合物の集団または精製された幹細胞を増加させるために、本発明の組成物を含有する培養培地中で幹細胞を成長させることができる。
【０１０９】
身体外で幹細胞を成長させる幾つかの方法が開発されており、当該技術分野で知られている。当初、幹細胞の成長および増殖の分野での大多数の仕事は、骨髄細胞を用いて造血系において実施された。単離されたばかりの、または培養された骨髄細胞のメチルセルロース上または寒天上でコロニーを形成する能力が産出量として用いられた。
【０１１０】
幹細胞を増殖する技法の開発は、半固体培地に形成されたコロニー数を増加させることを目指した仕事で始まった。初期の実験では、種々の特性化されていない血清および調整培地が用いられた。例えば、栄養芽細胞系、調整培地、異種間間質性細胞調整培地、腫瘍細胞からの上澄液、および健康なリンパ球が用いられた。ヒトトランスフェリンおよびウシインスリンなどの成分を用いて無血清系のデザインに向けた仕事も実施された。このような系に特有の利点は、同時に生じる分化なしに造血幹細胞を増殖できると考えられることである。ヒト系は、造血促進活性の面で一定の不利な点を有するため、最初の長期培養系にはマウスのフィーダ（間質性）細胞が必要であった。幹細胞の生存能力および増殖能力を維持するには、マウスのフィーダ細胞系の使用に多数の欠点が存在した。このため、ヒト由来のフィーダ細胞の増員における困難を克服するための努力がなされ、そのような細胞の種々のものが開発された。
【０１１１】
本発明の方法により増殖されるべき幹細胞は、当業者に公知の任意の手段によって、任意の哺乳動物の任意の器官から単離することができる。幹細胞は、胚組織由来または成人組織由来であり得る。当業者は、当該技術分野で公知の方法を用いて、関心対象の特定の器官または組織からどのようにして幹細胞を単離するかを決定することができる。また、他の幹細胞表面マーカに対する抗体を用いて、幹細胞集団を向上させることもできる。このようなマーカとしては、ＦＬＫ−１、ＡＣ１３３、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、ＣＸＣＲ−４、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−４、Ｓｏｘ−２などを挙げることができる。当業者は、所望の組織から幹細胞を単離するのに有用な特定の細胞マーカを決定することができる。
【０１１２】
当業者は、幹細胞の最初の調製のための好適な成長培地を決定することができる。幹細胞のために一般的に使用される成長培地としては、限定はしないが、イスコーヴ修飾ダルベッコー培地（ＩＭＤＭ）培地、ＤＭＥＭ、ＫＯ−ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０培地、マッコイの（ＭｃＣｏｙ’ｓ）５Ａ培地、最小必須培地、アルファ培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２Ｋ栄養混合物培地（カイグンの（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）修飾、Ｆ−１２Ｋ）、Ｘ−ビボ２０、ステムライン（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ）、ＣＣ１００、Ｈ２０００、ステムスパン（Ｓｔｅｍｓｐａｎ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ベーサル培地イーグル（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ  Ｅａｇｌｅ）（ＢＭＥ）、グラスゴー最小必須培地、修飾イーグル培地（ＭＥＭ）、オプチーＭＥＭ１減少血清培地、ウェイマウスの（Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ）ＭＢ７５２／１倍地、ウィリアムス培地Ｅ、培地ＮＣＴＣ−１０９、ニューロプラズマ培地、ＢＧＪｂ培地、ブリンスターのＢＭＯＣ−３培地、ＣＭＲＬ培地、ＣＯ２独立培地、レイボヴィッツの（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ）Ｌ−１５培地などが挙げられる。
【０１１３】
所望ならば、成長因子などの他の成分を、望まれる通り追加することができる。追加できる典型的な成長因子および他の成分としては、限定はしないが、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ｆｌｔ−３、リガンド（ｆｌｔ−３Ｌ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２０、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチヴィン−Ａ、ＶＥＧＦ、フォルスコリン、グルココルチコーズなどが挙げられる。さらに、最初の単離培地は、ウシ胎仔、ウマなどの血清またはヒト血清のいずれかを含有でき、より好ましくは、血清置換成分を含有できる。血清の必要性を軽減するために、多数の薬剤が培地に導入されてきた。例えば、血清置換物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、インスリン、２−メルカプトエタノールおよびトランスフェリン（ＴＦ）を含んだ。
【０１１４】
次いで、幹細胞は、必要ならば所望の期間、貯蔵することができる。幹細胞の保存方法は、当業者に知られている。典型的には、幹細胞は冷凍防御法へ処理されてから必要時まで冷凍貯蔵される。
【０１１５】
幹細胞は、所望の幹細胞マーカを有する細胞を単離するために、または本発明の組成物との接触前に不必要な細胞マーカを有する不必要な混入細胞型を除去するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法、またはＭＡＣＳ装置などの磁気活性化細胞選別法の使用により、例えば、細胞パニングなどの抗体テクノロジーを用い、当該技術分野で公知の方法によって、幹細胞を本発明の組成物に接触させる前に精製することができる。幹細胞を精製または濃縮する他の方法としては、逆流遠心性溶出、平衡密度遠心分離、単位重力における速度沈降、免疫ロゼットおよび免疫付着、Ｔリンパ球枯渇などの技法の使用を挙げることができる。精製に有用であり得る幹細胞マーカの例としては、ＦＬＫ−１、ＡＣ１３３、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、ＣＸＣＲ−４、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１，ＳＳＥＡ−４，Ｓｏｘ−２などが挙げられるが、これらに限定されない。混入している不必要な細胞型のマーカとして使用できる細胞表面マーカの例は、求められている幹細胞の表現型に依存する。例えば、多分化能造血細胞のコレクションが望まれているならば、混入細胞はＣＤ３８またはＣＤ３３などの分化した造血細胞に係わるマーカを有するであろう。さらに、非造血細胞の混入は、ＣＤ４５発現の欠如により検出されるであろう。間質性間葉細胞の選択が望まれるならば、混入細胞は、ＣＤ４５などの造血マーカの発現により検出されるであろう。さらに、幹細胞は、サイズ、密度、一定の基質に対する付着、またはヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２またはローダミン１２３などの一定の色素を流出する能力に基づいて精製することができる。
【０１１６】
幹細胞は、調製の任意の段階で遺伝子改変することができる。例えば、選択性のマーカをコード化している遺伝子または他の関心対象の遺伝子を、調製された幹細胞へ導入することができる。幹細胞の成長を促進させるため、幹細胞を、本発明の組成物に接触させるか、または本発明の組成物を含有する培地と混合、もしくはインキュベートする。
【０１１７】
所望の場合、抗生物質、抗真菌剤または他の汚染防止化合物を、インキュベーション培地に加えることができる。典型的な化合物としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾンまたは当該技術分野で公知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明の組成物に接触させる幹細胞は、当業者に公知の技法を用いて、多継体によって増殖できる。例えば、対象から単離された幹細胞はカウントされ、トリパンブルー色素排除法を用いて生存可能な細胞密度が判定される。細胞を副次培養（または継体）するために、それらをゼラチンまたはフィブロネクチンなどのタンパク質で被覆した新たな組織培養フラスコ内で、本発明の組成物を含有する培養培地へ、５，０００細胞／ｃｍ２の密度で再平板培養し（ｒｅｐｌａｔｅｄ）、加湿インキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２で成長させる。必要ならば、培養培地は補充される。亜集密（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）（約９０％）に達したら培養培地を取り出し、付着細胞を、３７℃で３〜５分間、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡによりトリプシン化する。トリプシン化の前に、付着細胞をＰＢＳにより２回リンスする。トリプシンを中和し、３００ｘｇで１０分間遠心分離により細胞をペレット化し、やはり本発明の組成物を含有し得る温かい培養培地中に再懸濁させる。細胞を、３００ｘｇで１０分間遠心分離によりリンスし、やはり本発明の組成物を含有する温かい培養培地中に再懸濁させる。幹細胞は、同一の継体プロトコルを用いて、多継体によって副次培養できる。
【０１１９】
幹細胞は、例えば、組成物を、幹細胞の培養物と単に混合することにより、本発明の組成物と接触させることができる。混合は、幹細胞の生存度を維持できる過多の好適な容器中で実施できる。前記容器としては、組織培養フラスコ、円錐管、培養バッグ、バイオリアクターまたは連続的に混合される培養物を挙げることができるが、これらに限定されない。次いで、幹細胞を、望まれるように成長させることができる。幾つかの状況では、細胞を先ず１つのタイプの培養条件で成長させてから、引き続き別の培養条件が用いられる、組み合わせ培養系を使用することが望ましいであろう。例えば、分化することなく、造血幹細胞の迅速な増殖が必要な場合、細胞を先ず、４８時間、または幹細胞の環化誘導に必要な時間、高濃度の本発明の組成物中に培養することができる。続いて、最初の４８時間後、サイトカインを含有する培地を数継体、培養物に加えることができる。幹細胞の型および所望の分化の程度によって、異なる濃度の本発明の組成物を、異なる培養時点で加えることができることを、当業者は理解するであろう。例えば、ある特定の培養状況においては、培養の開始時点で本発明の組成物を加えることは最適ではないことがあり得る。
【０１２０】
本発明の組成物に対する幹細胞の所望の比率は、当業者によって決定できる。例えば、約１：１，０００未満から１，０００：１以上の比率（幹細胞調製物対本発明の組成物）を用いることができる。例えば、約１：７５０、１：５００、１：２５０、または１：１００から約１００：１、２５０：１、５００：１、または７５０：１の幹細胞調製物対本発明の組成物の比率を用いることができる。この比率は、例えば、温度、インキュベーションの時間、幹細胞の数、幹細胞において求められる所望の活性、幹細胞の型、幹細胞の純度、出発点として用いられる胎盤組織の量などによって変わり得る。幹細胞は、本発明の組成物と接触させる前に、幹細胞成長培地から単離することもできるし、添加した本発明の組成物と共に、幹細胞を幹細胞成長培地中に残留させることもできる。
【０１２１】
本発明の組成物と接触している幹細胞の時間の長さは、当業者により決定できる。一般に、接触ステップは、約１秒未満、３０秒未満または６０秒未満から約２週間以上または３週間以上までの範囲であり得る。好ましくは、接触ステップは、約２分、５分、１０分、３０分または４５分から約１２日、１４日、１６日、１８日または２０日の間である。より好ましくは、接触ステップは、約１時間、３時間、５時間、８時間または２４時間から約３日、５日、７日または１０日の間である。
【０１２２】
さらに培養の間、一定のタイプの細胞増殖または細胞分化を促進する条件を用いることができる。これらの条件としては、限定はしないが、温度の変更、酸素／二酸化炭素含量の変更、前記培地の混濁液の変更または栄養物、一定の酵素阻害剤、一定の酵素刺激剤、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、タポキシンＡまたはデプシペプチドなどのヒストンデアセチラーゼ活性の阻害剤、５−アザシチジンなどのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤、酵素ＧＳＫ−３の阻害剤などの細胞培養物中の小型分子の調節剤への暴露などが挙げられる。
【０１２３】
幹細胞の自己再生および生存能力における酵素張力の役割もまた、本発明で考慮されている重要な問題である。造血幹細胞は、骨髄の低酸素ニッチに存在する傾向があること、および細胞がより成熟した子孫へと分化するにつれて、それらは、より高い酵素圧を有する骨髄領域へ次第に移動することが知られている（イヴァノヴィック（Ｉｖａｎｏｖｉｃ）ら著、２００２年、エクスペリメンタル・ヘマトール（ＥＸＰ  Ｈｅｍａｔｏｌ）、３０巻、ｐ６７−７３、これは、その全体が参照として本明細書に援用されている）。組織培養物中のこの重要な可変性が研究に利用され、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの完全な造血再構成のできるヒトＣＤ３４幹細胞の優れた増殖が、１．５％という酸素圧を用いた低酸素条件において得られたことが示されている。また、ニューロン幹細胞などの他の幹細胞も、低酸素ニッチに局在化しており、通常の酸素圧とは反対に、低酸素のインビトロ条件で優先的に増殖するようである。さらに、通常の酸素状態と低酸素の間で同様の増殖速度で成長する胚性幹細胞は、低酸素下で成長させた場合、インビボではテラトーマ、インビトロでは胚様体を形成する優れた能力を保持する。したがって、本発明の一実施形態は、０．１％から７．５％、好ましくは０．５％から５％、より好ましくは３％から５％の範囲の酸素圧を有する特定のインキュベータ中での幹細胞の一部または全てのインキュベーション中低酸素条件を使用することである。さらに、本発明の別の実施形態は、培養物中で成長している幹細胞を分化させることなく増殖を増強させるために、本発明の組成物と組み合わせて低酸素条件を使用することである。
【０１２４】
分化させることなく幹細胞の増殖を刺激する本発明の組成物の能力を増強させる点から、本発明の一実施形態であると考えられる１つの補助的アプローチは、本発明の組成物と関連させて、酵素阻害剤を使用することである。例えば、ヒストンデアセチラーゼ類は、後成的にクロマチン部分を転写因子に対して開放し、したがって、通常の成人条件下では発現しない遺伝子発現を可能にすることに関与している酵素の一クラスである。例えば、テロメラーゼ遺伝子（触媒サブユニットｈＴＥＲＴ）は、細胞の不死化過程に関与し、胚性細胞ならびに異常状態での幾つかの骨髄造血細胞においてのみ、生理学的条件下で発現する。テロメラーゼ酵素の機能的役割は、細胞が複製的老化を免れることができるように、染色体の短くなったテロマー末端を修復することである。病理学的にテロメラーゼは、細胞培養物中で癌細胞が無限に増殖する能力の原因となっている。通常の生理学的条件下では、線維芽細胞はテロメラーゼを発現せず、複製的老化を受ける。トリコスタチンＡなどのヒストンデアセチラーゼ阻害剤で線維芽細胞を処理すると、機能的テロメラーゼの発現が再誘導されることを記載している種々の報告が出版されている（ムコパディエイ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ）ら著、２００５年、ジャーナル・オブ・セルラー・アンド・モレキュラー・メディシン（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ）、９巻：ｐ６６２−６６９；ホー（Ｈｏｕ）ら著、２００２年、エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ）、２７４巻：ｐ２５−３４；コング（Ｃｏｎｇ）ら著、２０００年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２７５巻：ｐ３５６６５−３５６６８、これらの各々は、その全体が参照として本明細書に援用されている）。このことは、細胞を脱分化させる方法として、ヒストンデアセチラーゼ経路の操作を使用できること、または複製疲労に近づいている始原細胞の「若返り」の可能性を提供することを示唆している。確かに、カロリー制限によって見られる寿命延長効果がヒストンデアセチラーゼ経路に関連していることが証明されている（ホーウィッツ（Ｈｏｗｉｔｚ）ら著、２００３年、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４２５巻：ｐ１９１−１９６、これは、その全体が参照として本明細書に援用されている）。この経路を操作する臨床的関連性は、幾つかのモデルにおいて、臨床的使用ではトリコスタチンＡと同様の能力を有するヒストンデアセチラーゼ阻害剤である抗うつ剤のバルプロン酸を用いた実験で示されている。骨髄由来の造血細胞をバルプロン酸で処理することによって、細胞サイクルの進行による増殖と自己再生双方の増加が証明されている（Ｂｕｇ、上記）。前記の促進は、阻害剤因子ｐ２１（ｃｉｐ−１／ｗａｆ−１）のダウンレギュレーションを伴った。さらに、バルプロン酸処理は、ＧＳＫ３活性を抑制し、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化したが、これらは双方とも造血（ゴトウ（Ｇｏｔｏｈ）ら著、１９９７年、セル・グロース・ディファレンシエーション（Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ）８巻：ｐ７２１−７２９；ババ（Ｂａｂａ）ら、２００５年、イムニティー（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）２３巻：ｐ５９９−６０９、これらの各々は、その全体が参照として本明細書に援用されている）のみならず、胚性（サトウ（Ｓａｔｏ）ら著、２００４年、ネーチャー・メディシン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ）１０巻：ｐ５５−６３；ヒー（Ｈｅ）ら著、２００５年、クリニカル・ラング・キャンサー（Ｃｌｉｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ）７巻：ｐ５４−６０、これらの各々は、その全体が参照として本明細書に援用されている）の幹細胞双方における自己再生に関連している。Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＩＬ−３などの公知の造血幹細胞刺激性サイトカイン類と相乗作用するバルプロン酸の能力は証明されている（デフェリス（Ｄｅ  Ｆｅｌｉｃｅ）ら著、２００５年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）６５巻：ｐ１５０５−１５１３、これは、その全体が参照として本明細書に援用されている）。
【０１２５】
本発明の組成物との接触により、幹細胞は、それらの成長速度を増加させ、迅速に増殖することができる。所望の場合、本発明の組成物が分化を誘導することなく幹細胞の増殖を増加させることを可能にする培養条件が用いられる。幹細胞の成長速度および分化を判定する任意の好適な方法を用い、このように産生された幹細胞の成長速度および細胞数を判定することができる。例えば、幹細胞の保持に関連するマーカの流動細胞計測法分析、初期の関係始原細胞定量化のための半固体培地アッセイ、および再構成活性を有するインビボ幹細胞数を定量化するためのインビボＮＯＤ−ＳＣＩＤ再増殖能アッセイ。これらのアッセイは、特定の幹細胞のサブタイプを検出可能にするために修正し、変更することができる。また、アッセイは、ヒト幹細胞に治療力のあることが期待されている病理を誘導することによりＮＯＤ−ＳＣＩＤ株などの免疫損傷マウスにおいても開発することができる。例えば、ヒト幹細胞は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤならびにヌードマウスにおける種々の非造血設定において、治療的活性を有することが証明されている。また、細胞の成長速度は、例えば、温度、幹細胞の型、培地の含量、および胎盤のインキュベーションステップおよび接触ステップを可能にする時間などの他の要因にも依存し得る。当業者は、必要とされる成長速度を調整するために、これらの変数を変更することができるであろう。
【０１２６】
本発明の別の実施形態は、幹細胞の増殖を刺激するための本発明の組成物、または本発明の組成物を添加した細胞培養培地の使用であり、例えば、以下のものを含む：
ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原、ＴＲＡ  １−６０、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）、またはヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）などのマーカ発現を特徴とするヒト胚性幹細胞；
Ｖａｓａ、Ｏｃｔ−４、Ｄａｚｌ、ステラ（Ｓｔｅｌｌａ）、フラギリス（Ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ノボックス（Ｎｏｂｏｘ）、ｃ−ＫｉｔおよびＳｃａ−１などのマーカ発現を特徴とするヒト卵母細胞産生幹細胞；
Ｏｃｔ−４、アルカリホスファターゼ、テロメラーゼ、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、およびＴＲＡ１−８１などのマーカ発現を特徴とする単為生殖的に生成した幹細胞；
Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｄｐｐａ５およびＲｅｘ１などのマーカ発現を特徴とする多分化能生殖系列幹細胞へと再プログラム化された精原幹細胞；
幹細胞抗原（ＳＣＡ＋）、系列ネガティブ（ｌｉｎ−）、ｃ−ｋｉｔ＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ３３−などのマーカを特徴とする造血細胞；
ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ２９、６−１９、トロンボモジュリン、テロメラーゼ、ＣＤ１０，ＣＤ１３、ＳＴＲＯ−１、ＳＴＲＯ−２、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１４６、ＴＨＹ−１などのマーカを特徴とする間葉幹細胞；
Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−４およびＳｏｘ−２などのマーカを特徴とする胎盤由来の多能性細胞；
ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）およびＡＢＣＧ２を特徴とする脂肪由来の多能性細胞；
ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、およびＣＸＣＲ−４などのマーカを特徴とする臍帯幹細胞；
ＳＴＲＯ−１、ＣＤ１４６（ＭＵＣ１８）、アルカリホスファターゼ、ＭＥＰＥ、およびｂＦＧＦなどのマーカを特徴とする乳歯細胞；
ＲＣ−２、３ＣＢ２、ＢＬＢ、Ｓｏｘ−２ｈｈ、ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ６、ネスティング、ムアシ（Ｍｕａｓｈｉ）−１、およびプロミニン（ｐｒｏｍｉｎｉｎ）などのマーカを特徴とする神経幹細胞；
ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）−１、ｃ−ヘアリー−１およびＨＥＳ−５などのマーカを特徴とする胃上皮幹細胞；
デスミン陽性、ＳＣＡ−１＋、ＣＤ４５−などのマーカ、および色素排除による流動細胞計測法で副集団プロファイルを有することを特徴とする骨格筋幹細胞；
ＳＣＡ−１陽性、ＣＤ４５−およびケラチン−６などのマーカを特徴とする乳腺幹細胞；
ＳＣＡ−１陽性、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５−、およびアルファ６−インテグリンに関して陽性、ベータ１−インテグリン、ケラチン１４、およびケラチン１９などのマーカを特徴とする皮膚幹細胞；
ＳＣＡ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性などのマーカ、および色素排除による流動細胞計測法で副集団プロファイルを有することを特徴とする心筋幹細胞；
ＳＣＡ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性などのマーカ、および色素排除による流動細胞計測法で副集団プロファイルを有することを特徴とする糸球体間質幹細胞；
ＳＣＡ−１陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性およびＣＤ３４陽性などのマーカを特徴とする肝楕円形幹細胞；または
ネスチン、ＣＫ−８、ＣＫ−１８、ＩＳｌ−１、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ−４、およびＮｇｎ−３などのマーカを特徴とする膵臓幹細胞。
【０１２７】
本発明の組成物は、単独で、増殖の刺激剤として、または前記細胞の培養に有用なことが知られている培地への添加剤として使用することができる。そのような組織培養培地の一例は、ダルベッコー変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、核移植テクノロジーの使用によるクローニングによって生じた全能性幹細胞の増殖を刺激するための、本発明の組成物または本発明の組成物を添加した細胞培養培地の使用である。
【０１２９】
哺乳動物に幹細胞を投与する方法は、本発明の組成物に接触させること、その幹細胞を、幹細胞の増殖を促進するのに好適な条件下で培養すること、および増殖した細胞を哺乳動物に導入することを含む。
【０１３０】
したがって、本発明の無血清添加物は、哺乳動物への外移植を目的として、関心対象の幹細胞を調製するために用いることもできる。この実施形態において、エクスビボで分化を生じさせた細胞が哺乳動物に導入される。例えば、造血幹、前駆体、または始原細胞へと分化を生じさせた造血細胞を、哺乳動物の骨髄または血流へと導入することができる。分化した細胞は、よく知られた技法によって、哺乳動物の、例えば骨髄または血流へと導入することができる。
【０１３１】
本発明の幾つかの実施形態において、本発明の組成物を含有する成長培地に幹細胞を接触させることを含む、幹細胞を増殖または成長させるための方法が提供される。肝細胞は、
ａ）胚性幹細胞、胚外幹細胞、クローン化幹細胞、単為生殖由来細胞などの全能細胞；
ｂ）造血幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤由来幹細胞、剥離歯由来幹細胞、毛嚢幹細胞または神経幹細胞などの多分化能細胞；または
ｃ）ニューロン系、肝臓系、腎形成系、脂肪生成系、造骨細胞系、破骨系、肺胞系、心臓系、腸管系、または内皮細胞系に関する前駆体細胞などの組織特異的始原細胞
であり得る。
【０１３２】
インキュベーションのステップは、例えば、約３２℃から約４０℃などの好適な温度範囲で生じ得る。
これらの方法の内で、幹細胞は、それらの単離中または産生中に、またはそれらの増殖中に、または哺乳動物へのそれらの投与直前に操作することができる。このような操作により、哺乳動物への投与後に幹細胞が治療的機能を果たすように幹細胞を製造することができる。例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、５−アザ−シチジンで処理した間葉骨髄細胞は、心筋組織へと分化転換し、左心室排出フラクションを改善し、心臓の再構築を阻害することが示されている。間葉幹細胞、内皮幹細胞、および骨格筋芽細胞など、他の幹細胞型は、心筋活性の改善、灌流および心室再構築の減少のために利用されてきた。これらの研究における制限要因は、心臓を修復する高い傾向性を有する十分な数の半分化始原幹細胞を増殖するための再現方法を欠いていることである。この欠点は、部分的には、そのようなユニークな細胞集団を増殖するための適切な培養培地を欠いていることによる。本発明の組成物および方法は、引き続く哺乳動物への治療的投与のために、幹細胞集団を増殖し、維持する再現的手段を提供することによってこれらの欠点を克服する。
【０１３３】
本明細書に引用された出版物または特許の各々は、その全体が参照として本明細書に援用されている。
作用機構
アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）（アンピオファーマシューティカルズ（Ａｍｐｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、グリーンウッドヴィレッジ、コロラド州）などのヒト血清アルブミン商品のＤＡ−ＤＫＰ、特に低分子量フラクションは、抗炎症および再構築／治癒として分類できる複数の活性を有している。アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の抗炎症性は、内皮細胞における細胞骨格の再編成（皮質アクチン環形成）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８またはＡＰＣによるメモリーＴ細胞（非ナイーブ）の活性化阻害、強力な前炎症性刺激（ＬＰＳ）に応答してＰＢＭＣにより産生される前炎症性サイトカイン類（ＴＮＦａ）量の減少による血管透過性の阻害を含む。再構成／治癒効果は、組織特異的細胞への幹細胞動員および分化（膝の場合は軟骨細胞への分化など）による。
【０１３４】
アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）は、間葉細胞およびＰＢＭＣ双方における分子の恐らく活性化補助因子部位への結合を通して、リガンド活性化転写因子（ＴＦ）ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）を活性化する。ＴＦアレイ類は、ＰＰＡＲおよびその結合相手のレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の活性化を示している。ＰＰＡＲは、炎症細胞および免疫細胞において発現する核ホルモン受容体スーパーファミリーに属している。ＰＰＡＲは、核内のレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）にヘテロ二量体化し、二量体は共に、標的遺伝子のプロモータ内のペルオキシゾーム増殖応答要素（ＰＰＲＥ）に結合する。関与する遺伝子は抗炎症性であり、幹細胞の保護および分化に関与する。ＰＰＡＲ上に４つの機能的ドメイン：Ａ／Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ／Ｆが同定されている。Ｎ末端Ａ／Ｂドメインは、ＰＰＡＲのリン酸化を担うリガンド独立性活性化機能（ＡＦ−１）を含有する。ＣドメインまたはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、標的遺伝子のプロモータ領域において、ＰＰＲＥに対するＰＰＡＲの結合を促進する。Ｄドメインは、共同因子結合の部位である。Ｅ／Ｆドメインは、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）であり、リガンド特異性および標的遺伝子の発現を増加させるＰＰＲＥに対するＰＰＡＲ結合の活性化を担っている。
【０１３５】
概説している本発明は、以下の実施例を参照にすれば、理解がより容易になるであろう。これらは、本発明の実施形態の一定の態様を、単に例示する目的で含まれている。上記の教示から、当業者は認識されるであろうが、実施例には本発明を限定する意図はなく、請求された本発明の範囲を逸脱しない他の技法および方法も本請求項に合致し得るし、また採用することもできる。
【実施例】
【０１３６】
実施例１
症候性原発膝変形関節炎を有する成人の膝の関節機能を改善し、変形関節炎の疼痛を減じるために、＜５０００ＭＷフラクション（ここでは「アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）」とも言う）の膝関節内注射の効果を調査するために臨床試験が実施された。＜５０００ＭＷフラクションが試験膝に注射された場合のそのフラクションの治療効果と安全性を評価するために、４３名の評価可能な対象による無作為、プラセボ対照、二重盲検、平行試験が、適切なデザインとして選択された。
【０１３７】
試験薬剤
２アーム；各対象は、片方の膝にアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）または生理食塩水のいずれか１つにより４ｍｌの単回投与を受けた。
【０１３８】
試験集団
試験集団は、４３名の患者で、男性または女性の４０〜８３才（平均６３．０才）であり、標準偏差（ＳＤ）９．６）の２８名は男性であり、１５名は女性であった。全ての対象は、白人であった。対照の身長は、１６２ｃｍから１９２ｃｍ（平均１７５．３ｃｍ、ＳＤ８．１）の範囲で、スクリーニングでの体重は、５６ｋｇから１１７ｋｇ（平均８８．８ｋｇ、ＳＤ１３．８９）の範囲であった。対象は、スクリーニング前に６ヵ月以上、ケルグレン・ローレンス（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ）グレードＩＩまたはＩＩＩ（軽度または中程度の変形関節炎を示す）での症候性原発性膝の変形関節炎を有する完全外来患者であった。６名の対象に関してグレードＩＩおよび３６名の対象に関してグレードＩＩＩ。１名の対象はグレードＩＶを有した。対照の両膝が変形関節炎である場合、片方の膝が試験に選択されたが、他方の膝は標準的な医療を受けた。
【０１３９】
除外基準
試験集団に関する以下の項目は、除外基準である：
１．医学的審査およびスクリーニング調査の結果として不適合
２．アルブミンに対してアレルギー反応歴
３．５％ヒトアルブミン中の賦形剤に対してアレルギー反応歴
４．任意の関節内または局所関節周囲の注射、指標膝に対する注射または手術（６ヵ月前から）
５．手術関節鏡検査（３ヵ月前から）
６．関節鏡検査以外の指標膝に対する手術処置（１２ヵ月前から）
７．任意の膝調査製品（１２ヵ月前から）
８．膝のケルグレン・ローレンス（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ）グレードＩまたはＩＶ（疑わしいか、または重症）変形関節炎
９．炎症性または結晶性関節障害、急性骨折、骨密度の重篤な喪失、骨壊死
１０．分離膝蓋大腿症候群または軟骨軟化症
１１．指標膝の自由使用および評価を妨げる任意の他の疾患または病態
１２．指標に対する主要傷害（１２ヵ月前から）
１３．指標膝に対して同側の重篤な腰部変性関節炎
１４．指標膝疼痛の評価を妨げ得る任意の疼痛
１５．任意の薬理学的または非薬理学的処置の開始または変更（４週前から）
１６．ａ．任意の局所処置（４８時間前から）、ｂ．全ての鎮痛薬およびパラセタモルを除くＮＳＡＩＤ類（４８時間前から）、ｃ．抗凝血剤療法（４８時間前から）、ｄ．任意の全身ステロイド治療（１４日前から）、ｅ．無作為化前、５回の期間で薬物の半減期内での全ての免疫抑制薬、ｆ．コルチコステロイド類＞１日当り１０ｍｇのプレドニゾロン当量（３０日前から）、ｇ．任意のアルブミン処置（３ヵ月前から）、の使用
１７．妊娠または授乳中の女性対象
１８．処置１日目前に妊娠試験で陽性である出産可能性の女性対象
試験の評価
３週のスクリーニング期間および８４日の試験参加期間からなる試験。追跡調査の評価は、注射後６時間目、２４時間目および７２時間目に実施された。８日目、３０日目および８４日目に対象と電話連絡して総合的疼痛および可動性を評価し、有害事象をモニターした。担当医師による評価に従って、必要とみなされた場合、８日目後の疼痛救助のため調査膝に対するベタメタゾンの関節内注射のオプションを対象に提供した。
【０１４０】
一次結果
試験膝における疼痛の数字的評価スケール（ＮＲＳ）は、投与前（注射前のベースライン）、１日目の投与後６時間、２日目の投与後２４時間、４日目の投与後７２時間、および投与後８日目、３０日目および８４日目（ＥＯＳまたは試験の終了）に完了した。疼痛ＮＲＳは、０〜１０の数字的評価であり、０は疼痛が無く、５は中等度の疼痛で１０は最悪の可能性の疼痛である。
【０１４１】
安全性エンドポイント
試験の安全性エンドポイントは、投与前と試験４日目における有害事象、バイタルサインの出現率、スクリーニングと投与後２４時間目における１２リードの心電図（ＥＣＧ）の読取り、およびスクリーニングと投与後２４時間目で評価された臨床的血液安全性試験（生化学と血液学）であった。
【０１４２】
二次エンドポイント
試験の二次エンドポイントは、２ポイント以上の疼痛ＮＲＳにおける改善として規定された３０日目と８４日目におけるパーセント応答者、関節内注射後２４時間目と７２時間目におけるＷＯＭＡＣ変性関節炎指標３．１（完全スケール、疼痛サブスコア、強靭性サブスコアおよび機能サブスコア）において注射前ベースラインからの変化、関節内注射後２４時間目と７２時間目に対する救助医療（パラセタモル）のための要求に関する注射前のベースラインからの変化、および投与前と投与直後の時間と比較して投与後８日目、３０日目および８４日目における可動性における経時的変化であった。
【０１４３】
治療意図群（ＩＴＴ）と安全性集団
無作為で試験医療の少なくとも１回の投与を受けた試験参加者。ＩＴＴとは、選択基準／除外基準に合致した対象のことである。
【０１４４】
パープロトコル集団
ＩＴＴ設定における試験参加者の投与前疼痛スコアは、選択基準／除外基準に違反しなかった。
【０１４５】
有効性集団
８日目と３０日目との間に救助医療を受けなかったプレプロトコル集団における試験参加者。
【０１４６】
統計解析
一次：ベースライン疼痛ＮＲＳに関して調整された、３０日目と８４日目における平均疼痛変化に関して処置群間の平均（ＳＤ）差を調べるための共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）モデル（ＥＯＳ）。
【０１４７】
追加：パーセント応答者における差異に関するＸ２検定。臨床的に有意な改善における差異に関するコクランアーミテージ（Ｃｏｃｈｒａｎ−ａｒｍｉｔａｇｅ）の傾向検定。スチューデントのｔ−検定：３０日目における疼痛ＮＲＳにおける平均（ＳＤ）差。
【０１４８】
安全性分析
有害事象および重篤な有害事象は、対象者によって記載された。総合的出現率に関するＭｅｄＤＲＡシステム器官クラスおよび優先語（ＭｅｄＤＲＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｌａｓｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  Ｔｅｒｍ）により分類された有害事象の処置により、および試験医療に対する重大性と相互関係により概要が示された。救急処置の有害事象の出現率は、処置群間で比較された。全ての臨床安全性と耐容性データは、各対象について記載され、処置により要約された。バイタルサインおよびＥＣＧパラメータが作表され、処置により要約された。試験室の値は、試験室の正常範囲外の値について臨床的な重要性に関するコメントと共に記載された。スクリーニングからの変化は、臨床的重要性について評価された。
【０１４９】
結果：
【０１５０】
【表１】
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【０１５１】
救助医療（Ｒｅｓｃｕｅ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ）の使用
ベタメタゾン注射：生理食塩水を受けた対象（２１名の対象のうち６名、２９％）と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象（２２名の対象のうち５名、２３％）の間で、ベタメタゾン注射の使用間で明白な差異はなかった。
【０１５２】
救助医療（パラセタモル）：各処置群に使用されたパラセタモルの同様の平均用量により、生理食塩水を受けた対象（２１名の対象のうち６名）と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象（２２名の対象のうち６名）の同様の数で生じた注射２４時間以内で試験膝における疼痛救助に対する救助医療。
【０１５３】
有効性結果：
【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
８４日目におけるパーセント応答者（ＥＯＳ）：パープロトコル集団（表８を参照）
応答者：８４日目における−２ポイントから−１０ポイントの疼痛ＮＲＳの減少（−１０は、最大可能な疼痛改善である）。
【０１５８】
非応答者：８４日目における−１から１０の疼痛減少（１０は、最大可能な疼痛増加である）。
【０１５９】
【表５】
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【０１６０】
８４日目におけるパーセント応答者（ＥＯＳ）：有効性の評価可能な集団（表９を参照）
応答者：８４日目における−２ポイントから−１０ポイントの疼痛ＮＲＳの減少（−１０は、最大可能な疼痛改善である）。
【０１６１】
非応答者：８４日目における−１ポイントから１０ポイントの疼痛減少（１０は、最大可能な疼痛増加である）。
【０１６２】
【表６】
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【０１６３】
知見の要約：有効性：
総合的疼痛（疼痛数字評価スコアにより評価された）およびＷＯＭＡＣスコアは、８４日目におけるプラセボを除いて、試験期間、各処置群に関して投与後減少した（ｐ＜０．０５）。さらに、生理食塩水のプラセボを受けた対象に比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象に関して３０日目と８４日目でのベースラインからの変化の間で有意差の傾向はなかった（３０日目：ｐ＝０．１２；８４日目：ｐ＝０．０７）。この傾向は、救助医療を受けなかった対象において統計的に有意となった（ｐ＝０．０４）。アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）対プラセボを受ける対象に関して試験の終末（８４日目）において応答者のより高いパーセンテージに対する傾向があった（ｐ＝０．０６）。投与後７２時間目までのパラセタモルの救助医療の使用は、処置Ｅ群（生理食塩水）において最高であった。図１を参照。
【０１６４】
有害事象（ＡＥｓ）
救急処置のＡＥｓは、用量投与後全部で２７名のＡＥｓがあるが、４３名の対象のうち２０名（４７％）に関して報告された。通常生じるＡＥｓは、頭痛および膝における関節膨潤および硬さであった。ＡＥｓが報告された大抵の対象は、軽度のみ（４３名の対象のうち１６名、３７％）として分類された。４名の対象のみ（９％）が、中等度重症のＡＥｓを報告した。
【０１６５】
−アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）：関節傷害と高血圧
−生理食塩水：背痛と血管破壊部位の血腫
生理食塩水を受けた対象（２名の対象、１０％）と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象（２名の対象、９％）との間で中等度のＡＥｓ出現率において明白な差はなかった。これらのＡＥｓは全て、試験薬物に恐らく関連しないか、または明確に関連しないと思われた。
【０１６６】
重篤として分類されたＡＥｓは無かった。
試験薬剤投与に関連すると思われる（可能性として）ＡＥｓは、４３名の対象のうち３名（７％）に報告された。生理食塩水を受けた対象（２名の対象、１０％）と比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象（１名の対象、５％）との間で関連するＡＥｓの出現率に明白な差異はなかった：
ａ．治療投与５分後に開始し、１．８時間後に回復した軽い重症度の頭痛（アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標））
ｂ．治療投与５時間後に開始し、０．５時間後に回復した軽い重症度の頭痛（生理食塩水）
ｃ．治療投与２．４日後に開始し、２１時間後に回復した軽い重症度の右膝（試験膝）の関節膨潤（生理食塩水）
総合的に、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象（８名の対象、３６％）と比較して、生理食塩水を受けた対象（１２名の対象、５７％）に、救急治療のＡＥｓのより高い比率が報告された。試験薬剤投与に関連すると思われる（可能性として）ＡＥｓは、４３名の対象のうち３名（７％）に報告され、頭痛および膝の関節膨潤が含まれた。死亡または他の重篤なＡＥｓは無かった。生化学的臨床検査、バイタルサイン、および心電図評価により評価された安全性において、治療間に明確な差異は無かった。
【０１６７】
試験の結果：
疼痛（疼痛の数字的評価スコアにより評価された）およびＷＯＭＡＣスコアは、治療群間に有意差は無く、８４日目でのプラセボを除いて、試験期間の各治療群に関して投与後減じた。アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）に比較して、生理食塩水群に関するより高いベースライン疼痛ＮＲＳにもかかわらず、生理食塩水に比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）に関して８４日目に応答したより高いパーセンテージの対象で試験薬剤の長期効果傾向があった。アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）を受けた対象において、試験期間の投与後に総合的疼痛は減少したが、一方、生理食塩水を受けた対象は、投与８４日後での疼痛における減少は無かった。投与後７２時間までのパラセタモル救助医療の使用は、治療Ｅ群（生理食塩水）において最大であった。アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）は、安全であると考えられ、試験に使用された用量によく耐容した。８４日目における本試験における疼痛改善は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の投与により生じた組織再生と一致する。
【０１６８】
実施例２
本実施例は、ＤＡＤＫＰおよび他の薬剤治療により幹細胞の軟骨形成の増強を示す。
本発明者は、ＤＡＤＫＰが軟骨形成を直接増強するか、または軟骨細胞系にとって重要な遺伝子の転写および／または翻訳に対して付加的効果または相乗的効果を有する可能性を調査した。
【０１６９】
材料：
・幹細胞：骨髄由来のヒト間葉幹細胞：５継体の骨髄由来のヒト間葉幹細胞（ＨＵＸＭＡ−０１００１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・間葉幹細胞の軟骨形成分化培地（ＧＵＸＭＸ−９００４１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・ＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭの化学的に定義された幹細胞培地（１９０６３２ロンザ（Ｌｏｎｚａ））
・無水エタノール中１ｍＭの酢酸デキサメタゾンおよびミフェプリストン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
・注射液ＺＲフラッシュ（ＺＲ  Ｆｌｕｓｈ）に関する生理食塩水または０．９％塩化ナトリウム（エクセルショア・メディカル（Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、ネプテューン、ニュージャージー州）
・生理食塩水中の無菌ろ過済み０．６ｍＭのカプリル酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
・生理食塩水中の無菌ろ過済み３ｍＭのＮＡＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））；調製するために、６０℃、３０分間加熱してから、５分間超音波処理
・生理食塩水中の無菌ろ過済み１０ｍＭのＤＡＤＫＰ
・０．２μＭシリンジフィルター
・ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝生理食塩水、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン中和溶液（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）試薬パック）
・１８２ｃｍ２の組織培養フラスコ
・ピペットおよび無菌チップ
・組織培養用フード、加湿ＣＯ２インキュベータ、水またはビード浴槽
・２４ウェルの組織培養プレート
・キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラススピンカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）７４１３４）
・コラーゲン２Ａ１、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、アグレカン、ＧＡＰＤＨ、およびアクチンＢに関するキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＳｙｂｒグリーンＩマスター混合物およびインヴィトロゲン・スーパースクリプト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＶＩＬＯマスター混合物
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）４８０ライトサイクラー
以下の原薬剤処理溶液は、注射用生理食塩水中で調製され、浴槽中３７℃に温められた：
・４μＭのデキサメタゾン
・４μＭのミフェプリストン
・３ｍＭのＮＡＴ
・０．６ｍＭのカプリル酸エステル
・８０μＭのＤＡＤＫＰ
・３ｍＭのＮＡＴ、０．６ｍＭのカプリル酸エステル、８０μＭのＤＡＤＫＰ（「アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）」混合）の混合物
デキサメタゾンおよびＴＧＦベータ３の添加物を除いた製造元のプロトコルによりシアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）軟骨形成分化培地を調製し、浴槽中３７℃に温めた。
【０１７０】
この処理プロトコルは、４０ｍｌのＴｈｅｒａＰＥＡＫ（商標）ＭＳＣＧＭを８０〜９０％の集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で含有する１８２ｃｍ２のフラスコ中での５ＨＵＸＭＡ幹細胞の増殖を含んでいた。細胞をフラスコからトリプシン化し、シアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）軟骨形成分化培地中、ＨＵＸＭＡ幹細胞の１．０×１０７細胞懸濁液を温めた。２４ウェルの組織培養プレートの各ウェルの中央に、温めた細胞懸濁液の２０μｌをスポットし（１スポット当り２００，０００個の細胞）、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。
【０１７１】
インキュベータからプレートを取り出し、各ウェルに７２０μｌの軟骨形成培地を追加した。２５０μｌの生理食塩水または薬剤溶液を適切なウェルに三通りに（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）加えた（薬剤の最終希釈を原薬剤の１／４の処理溶液濃度にする）。１０μｌのＴＧＦベータ３溶液（シアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）により供給された）を各ウェルに加え、プレートをインキュベータに戻した。
【０１７２】
ウェルからの培地を吸引し、上記の新鮮な軟骨形成培地、希釈した原液、およびＴＧＦベータ３と交換することにより、３〜４日毎に培地交換を行った。
全てのプレートに関して、処理後７日目、１４日目および２２日目に以下の通り、ＲＮＡの単離および分析を行った（上記の培地交換をしながら）。ウェルからの培地を取り出し、さらなるタンパク質分析用に保存した。キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラス細胞溶解緩衝液（２メルカプトエタノール入り）を各ウェルに加え、１０分間静かに振とうさせた。各ウェルからの細胞を溶解させた細胞懸濁液をキアシュレッダー（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ）カラムに移し、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させた。ＲＮｅａｓｙ（商標）プラス製造元のプロトコルにより、ＲＮＡの単離を進めた。ＲＮアーゼの無い２５μｌの水を用いて、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カラムからＲＮＡを溶出させた。
【０１７３】
以下の通り、ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲを実施した。全サンプルからのｃＤＮＡ第一鎖の合成は、単離したＲＮＡの１０μｌを用い、２０μｌの総容量で実施した。次いで、３０μｌのヌクレアーゼの無い水で、全てのｃＤＮＡ溶液を希釈した。次いで、２０μｌの総反応液容量において、５μｌの希釈済みｃＤＮＡ、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）Ｓｙｂｅｒグリーンマスター混合物、およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲ（商標）プライマーペアを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。デルタデータＣｔ法によって、相対的遺伝子発現を判定した。
【０１７４】
データ結果：
【０１７５】
【表７】
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７日目に、発明者は、コラーゲン２Ａ１型の上昇およびＭＭＰ１３の発現を観察した。ディスク中、ＤＡＤＫＰ処理したウェルを除く全ての培養物は、ルースペレット中に抜き取られた。処理後８日目に、細胞凝集体の写真を撮影した（図２を参照）。
【０１７６】
【表８】
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１４日目に、幾つかの培養物が異なる表現型を発現しているのを、発明者は観察した。ペレット中に対照を有するＤＡＤＫＰ処理済みのウェルとの比較により、転写はまだ上昇していたことが示された。さらなる薬剤処理は、コラーゲンの転写に効果を及ぼすようである。
【０１７７】
【表９】
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ＤＡＤＫＰ処理後２２日目、コラーゲン転写の大きな増強を、発明者は観察した。さらに、薬剤処理は、幾らかの活性も示したが、ＤＡＤＫＰほど顕著ではなかった。ＤＡＤＫＰによる処理後２２日目に、コラーゲン２ａ１およびアグレカンの転写は、それぞれ２０００倍と２０倍の増加を示し、およびアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）処理後、２２日目に同様の増加を示した（図３を参照）。
【０１７８】
検討／結論：
ＤＡＤＫＰ処理により、コラーゲン２Ａ１および恐らくはアグレカンの転写増加が示された。また、培養物の構成もコラーゲン転写に影響を及ぼし得ることが、肉視観察により示唆された。
【０１７９】
実施例３
実施例２に記載された実験後、間葉の軟骨形成を試験する標準的方法のプトコルが開発される。本実施例は、標準化軟骨形成試験プロトコルおよび予想される結果を記載している。
【０１８０】
材料／装置：
材料：
・５継体の骨髄由来のヒト間葉幹細胞（ＨＵＸＭＡ−０１００１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・間葉幹細胞の軟骨形成分化培地（ＧＵＸＭＸ−９００４１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・ＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭの化学的に規定された幹細胞培地（１９０６３２ロンザ（Ｌｏｎｚａ））
・無水エタノール中１ｍＭの酢酸デキサメタゾンおよびミフェプリストン
・注射液ＺＲフラッシュ（ＺＲ  Ｆｌｕｓｈ）に関する生理食塩水または０．９％塩化ナトリウム
・生理食塩水中の無菌ろ過済み０．６ｍＭのカプリル酸ナトリウム
・生理食塩水中の無菌ろ過済み３ｍＭのＮＡＴ；調製するために、６０℃、３０分間加熱してから、５分間超音波処理
・生理食塩水中の無菌ろ過済み１０ｍＭのＤＡＤＫＰ
・０．２μＭシリンジフィルター
・ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝生理食塩水、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン中和溶液（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）試薬パック）
・７５ｃｍ２および１８２ｃｍ２の組織培養フラスコ
・ピペットおよび無菌チップ
・組織培養用フード、加湿ＣＯ２インキュベータ、水またはビード浴槽
・２４ウェルの組織培養プレート
・キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラススピンカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）７４１３４）
・コラーゲン２Ａ１、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、アグレカン、ＧＡＰＤＨ、およびアクチンＢに関するキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＳｙｂｒグリーンＩマスター混合物およびインビトロゲン・スーパースクリプト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＶＩＬＯマスター混合物
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）４８０ライトサイクラー
手順／方法論：
凍結原液からの細胞増殖：
・４継体ＨＵＸＭＡ細胞を、標準的手順を用いて凍結保存し、使用前は液体窒素中に保存した。
【０１８１】
・液体窒素保存物から１バイアルを取り出し、各々１５ｍｌのＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭを含有する３つの７５ｃｍ２の組織培養フラスコに入れる。
・６０〜７０％の集密が得られるまで（およそ３日）、加湿インキュベータ中、３７℃、５％ＣＯ２で細胞をインキュベートする。
【０１８２】
・標準的プロトコルを用いて、フラスコの細胞をトリプシン化し、１つの７５ｃｍ２フラスコの細胞を、４０ｍｌのＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭを含有する１つの１８２ｃｍ２フラスコへ入れる。
【０１８３】
・８０〜９０％の集密が見られるまで（およそ４日）、細胞をインキュベートする。
・再び細胞をトリプシン化して、次のステップへ進む。
平板培養および細胞の処理：
・上記表の原液から、生理食塩水中で注射用に以下の作業希釈液を調製し、浴槽中３７℃に温める（アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）成分の最終濃度を模擬するためにデザインされた対照および溶液）。
【０１８４】
・４μＭのデキサメタゾンおよびミフェプリストン
・３ｍＭのＮＡＴ
・０．６ｍＭのカプリル酸エステル
・８０μＭのＤＡＤＫＰ
・３ｍＭのＮＡＴ、０．６ｍＭのカプリル酸エステル、８０μＭのＤＡＤＫＰの混合物
・さらに、生理食塩水およびアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）原液を浴槽中３７℃に温める。
【０１８５】
・デキサメタゾンおよびＴＧＦベータ３添加物を除いた教示に従って、シアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）軟骨形成培地を混合する。浴槽中、３７℃に温める。
・温めた軟骨形成培地中、ＨＵＸＭＡ幹細胞の１．０×１０７細胞懸濁液を調製し、次いで２４ウェル組織培養プレートに用いられる各ウェルの中央に２０μｌをスポットする（１スポット当り２００，０００個の細胞）。
【０１８６】
・３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
・インキュベータからプレートを取り出し、各ウェルに７２０μｌの軟骨形成培地を静かに加える。
【０１８７】
・適切なウェルに、２５０μｌの生理食塩水、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）または対照溶液を三通りで加える。
・次いで、各ウェルにシアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）により供給された１０μｌのＴＧＦベータ３溶液を加える。
【０１８８】
・プレートをインキュベータに戻す。
・ウェルから培地を吸引し、上記の新鮮な軟骨形成培地、希釈原液、およびＴＧＦベータ３と交換することにより、３〜４日毎に培地交換を行った。
【０１８９】
ＲＮＡの単離および分析：
・プレートは、処理後、７日目、１４日目、２２日目に以下の通り処理した（上記の培地交換をしながら）。
【０１９０】
・ウェルから培地を取り出し、さらなるタンパク質分析のために保存する。
・各ウェルに、キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラス細胞溶解緩衝液（２ＭＥと共に）を加え、１０分間静かに振とうさせる。
【０１９１】
・溶液をキアシュレッダー（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ）カラムに移し、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させる。
・製造元の推奨に従ってＲＮイージープラスプロトコルによって進行させる。
【０１９２】
・２５μｌのＲＮアーゼ無しの水を用いて、カラムからＲＮＡを溶出させる。
ｃＤＮＡの合成およびリアルタイムＰＣＲ：
・次いで、推奨された総容量２０μｌのプロトコルに従い、１０μｌの単離ＲＮＡを用いて、全サンプルのｃＤＮＡの第一鎖合成を行った。
【０１９３】
・次いで、全てのｃＤＮＡ反応液を３０μｌのヌクレアーゼ無しの水で希釈した。
・次いで、５μｌの希釈済みｃＤＮＡ、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）Ｓｙｂｅｒグリーンマスター混合物、およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア（総容量２０μｌ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０１９４】
予想された結果：
骨髄間葉幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）幹細胞を、ＤＡＤＫＰで処理すると、少なくともコラーゲン２ａ１およびアグレカンの転写による測定で、軟骨形成が著しく増加する。これらの細胞を、Ｎ−アセチルトリプトファン（ＮＡＴ）、カプリル酸エステルおよびＤＡＤＫＰを含有する組成物で処理した後、コラーゲン２ａ１の転写は、１０００倍超増加するのが観察でき、２０００倍超増加するのが観察できる。
【０１９５】
同じ細胞を、デキサメタゾンおよびミフェプリストンで処理すると、軟骨形成のマーカに軽度の増加が示されるが、これは、ＤＡＤＫＰまたはＮ−アセチルトリプトファン、カプリル酸エステルおよびＤＡＤＫＰを含有する組成物での処理後に見られたコラーゲン２ａ１転写の１０００倍の増加よりかなり下回る。同様に、Ｎ−アセチルトリプトファンまたはカプリル酸エステルによる処理も、軟骨形成のマーカに中等度の増加をもたらす。
【０１９６】
実施例４
本実施例では、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）が３Ｄ培養で成長させた間葉幹細胞（ＭＳＣ）により、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＬ１２の転写を有する効果が証明された。幾つかの群では、幹細胞が培養される際に、ＣＸＣＲ４の転写および発現が失われることが証明された。この効果は、細胞が２Ｄ構造において、プラスチック上で直接成長させた場合はより顕著である。本実施例において、ＭＳＣは、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の存在下、懸滴培養で培養してから、ｍＲＮＡをＲＴＰＣＲによって評価する。
【０１９７】
材料：
・５継体の骨髄由来のヒト間葉幹細胞（ＨＵＸＭＡ−０１００１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・間葉幹細胞の軟骨形成分化培地（ＧＵＸＭＸ−９００４１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・ＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭの化学的に規定された幹細胞培地（１９０６３２ロンザ（Ｌｏｎｚａ））
・ロンザ（Ｌｏｎｚａ）ＭＳＧＭ（血清含有）
・生理食塩水中、１０ｍＭの塩化コバルト、滅菌ろ過済み（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
・注射液ＺＲフラッシュ（ＺＲ  Ｆｌｕｓｈ）に関する生理食塩水または０．９％塩化ナトリウム（エクセルショア・メディカル（Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、ネプテューン、ニュージャージー州）
・０．２μＭシリンジフィルター
・ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝生理食塩水、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン中和溶液（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）試薬パック）
・１８２ｃｍ２の組織培養フラスコ
・ピペットおよび無菌チップ
・組織培養用フード、加湿ＣＯ２インキュベータ、水またはビード浴槽
・１０ｃｍ２ペトリ皿
・キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラススピンカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）７４１３４）
・ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、コラーゲン２Ａ１、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１３、アグレカン、ＩＧＡ４、ＧＡＰＤＨ、およびアクチンＢに関するキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＳｙｂｒグリーンＩマスター混合物およびインビトロゲン・スーパースクリプト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＶＩＬＯマスター混合物
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）４８０ライトサイクラー
細胞増殖：
・５継体ＨＵＸＭＡ細胞を、液体窒素保存から取り出し、８０〜９０％の集密まで、４０ｍｌのＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭを含有する１８２ｃｍ２フラスコ中で増殖させた。
【０１９８】
・標準的プロトコルを用いて、細胞をトリプシン化し、次のステップへ進む。
懸滴培養の調製：
・上記表の原液から注射用生理食塩水中、以下の作業希釈液を調製する。
【０１９９】
・生理食塩水
・生理食塩水中、８００μＭの塩化コバルト
・ニートアンピオン（Ｎｅａｔ  Ａｍｐｉｏｎ）
・ビード浴槽中、３７℃に温めた希釈液およびロンザ（Ｌｏｎｚａ）ＭＳＣＧＭ。
【０２００】
・温めたＭＳＣＧＭ培地中、ＨＵＸＭＡ幹細胞の１．０×１０６の細胞懸濁液を調製する。
・滅菌管中、２５０μｌの適切な作業希釈液、２５０μｌの細胞懸濁液（一反応液当り２５０，０００個の細胞）、５００μｌの温めたＭＳＣＧＭを混合する。
【０２０１】
・得られた溶液の４０μｌの「スポット」を、ペトリ皿の蓋の下面に慎重に置く（総計４０個のスポットとなる）。
・ペトリ皿の底部液だめに、２０ｍｌｓの滅菌ＰＢＳを入れてから、ＰＢＳ上の蓋を裏返す。
【０２０２】
・３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ＲＮＡの単離および分析：
・４日後、インキュベータからプレートを取り出す。
【０２０３】
・各プレート底部に、５ｍｌの温めたＰＢＳによって蓋から球状体を洗浄し、１５ｍｌの円錐遠心管に移す。
・１０００ＲＰＭで５分間、細胞を回転させ、溶液を吸引する。
【０２０４】
・各管に、３５０μｌのキアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラス細胞溶解緩衝液（２ＭＥと共に）を加える。
・溶液をキアシュレッダー（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ）カラムに移し、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させる。
【０２０５】
・製造元の推奨に従ってＲＮイージープラスプロトコルによって進行させる。
・３０μｌのＲＮアーゼ無しの水を用いて、カラムからＲＮＡを溶出させる。
ｃＤＮＡの合成およびリアルタイムＰＣＲ：
・次いで、推奨された総容量２０μｌのプロトコルに従い、１０μｌの単離ＲＮＡを用いて、全サンプルのｃＤＮＡの第一鎖合成を行った。
【０２０６】
・次いで、全てのｃＤＮＡ反応液を３０μｌのヌクレアーゼ無しの水で希釈した。
・次いで、５μｌの希釈済みｃＤＮＡ、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）Ｓｙｂｅｒグリーンマスター混合物、およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア（総容量２０μｌ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０２０７】
・デルタデータＣｔ法により、相対的遺伝子発現を判定した。
コバルト処理は、これらの細胞のＧＡＰＤＨ発現に大きく影響を与えると思われた。ごく初期にｃｐコール（ｃｐ  ｃａｌｌ）が押され、複数のバンドを示した。その結果、デルタデルタ法による相対的発現を評価するために、アクチンＢも用いられた。結果は、下表１３および下表１４に示されている。
【０２０８】
【表１０】
0006588005.tif 000016
【０２０９】
【表１１】
0006588005.tif 000017
【０２１０】
これらの結果は、さらに図４および図５に示されている。
この実験結果は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）がＣＸＣＲ４およびＣＸＣＬ１２に影響を及ぼすことを証明している。より具体的には、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）は、ＣＸＣＲ４を３〜７倍増加させる一方、ＣＸＣＬ１２を１９〜３７倍減少させた。
【０２１１】
実施例５
本実施例は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）がインビトロで幹細胞の移動に及ぼす効果を証明する。先行のデータは、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＬ１２の転写が、双方ともアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）による処理によって影響を受けることを示唆していた。本実験は、ＭＳＣの移動もまた変化するかどうかを証明するためにデザインされる。
【０２１２】
材料：
・５継体の骨髄由来のヒト間葉幹細胞（ＨＵＸＭＡ−０１００１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・ＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭの化学的に定義された幹細胞培地（１９０６３２ロンザ（Ｌｏｎｚａ））
・ロンザ（Ｌｏｎｚａ）ＭＳＧＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＲＰＭＩ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）規定のウシ胎仔血清
・生理食塩水中、１０ｍＭの塩化コバルト、滅菌ろ過済み（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
・注射液ＺＲフラッシュ（ＺＲ  Ｆｌｕｓｈ）に関する生理食塩水または０．９％塩化ナトリウム（エクセルショア・メディカル（Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、ネプテューン、ニュージャージー州）
・０．２μＭのシリンジフィルター
・ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝生理食塩水、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン中和溶液（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）試薬パック）
・２５ｃｍ２と１７５ｃｍ２の組織培養フラスコ
・ピペットおよび無菌チップ
・組織培養用フード、加湿ＣＯ２インキュベータ、水またはビード浴槽
・８．０ｕｍのシンサート（Ｔｈｉｎｃｅｒｔ）組織培養挿入物および２４ウェルの組織培養プレート（グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））
・５０μｇのカルセインＡＭバイアル（ＢＤバイオサイエンスイズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））
・ＤＭＳＯ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
細胞増殖：
・５継体ＨＵＸＭＡ細胞を、液体窒素保存から取り出し、８０〜９０％の集密まで、４０ｍｌのＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭを含有する１７５ｃｍ２フラスコ中で増殖させた。
【０２１３】
・標準的プロトコルを用いて、細胞をトリプシン化し、次のステップへ進む。
細胞の処理：
・上記表の原液から注射用生理食塩水中、以下の作業希釈液を調製する。
【０２１４】
・生理食塩水
・生理食塩水中、８００μＭの塩化コバルト
・ニートアンピオン（Ｎｅａｔ  Ａｍｐｉｏｎ）
・ビード浴槽中、３７℃に温めた希釈液およびロンザ（Ｌｏｎｚａ）ＭＳＣＧＭ。
【０２１５】
・温めたＭＳＣＧＭ倍地中、ＨＵＸＭＡ幹細胞の細胞懸濁液を調製する。
・カウントしてから、細胞懸濁液から２５０，０００を４ｍｌの温めたＭＳＣＧＭ中に戻す。
【０２１６】
・２５ｃｍ２の組織培養フラスコに希釈細胞培養溶液を加える。
・１ｍｌの適切な作業希釈液をフラスコに加える。
・３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。
【０２１７】
浸潤アッセイ：
・トリプシンを有するフラスコから細胞を取り出し、６００μｌのＲＰＭＩ＋０．５％ＦＢＳ中に入れる。
【０２１８】
・得られた細胞懸濁液の２００μｌを、２４ウェル組織培養プレートに置かれているシンサーツ（ｔｈｉｎｃｅｒｔｓ）（１処理群当り３つの挿入物）の上部チャンバーに加える。
【０２１９】
・透過性増殖基質（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）システムの下部チャンバーに、６００μｌのＲＰＭＩ＋０．５％ＦＢＳを加える。
・各処理群に関し、下部チャンバーに、以下の溶液のうち１種の６６μｌを加える。
【０２２０】
・５５０ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ（最終５０ｎｇ／ｍｌ）
・１１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦベータ３（最終１０ｎｇ／ｍｌ）
・血清（最終１０％）
・プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【０２２１】
標識化および細胞検出
・２つのカルセインＡＭバイアルを取り出し、２０μｌのＤＭＳＯを加える。
・両方のバイアルの内容物を、０．２％ＢＳＡを含有する１２．５ｍｌのＲＰＭＩに移す。
【０２２２】
・２４ウェル組織培養プレートの各ウェルに、４５０μｌのカルセインＡＭ溶液（８μＭ）を入れる。
・上記の挿入物を、カルセインＡＭを含有するウェルに移し、３７℃、５％ＣＯ２で４５分間インキュベートする。
【０２２３】
・細胞をカルセインＡＭで充てん後、挿入物を、４５０μｌのトリプシンＥＤＴＡを含有する２４ウェル組織培養プレートのウェルに移し、さらに１０分間、インキュベートする。
【０２２４】
・挿入物を捨ててから、各ウェルに４５０μｌのトリプシン中和溶液を加える。
・得られた溶液の２５０μｌを９６ウェルの黒色平底プレートのウェルに移す（各反応液を三通りで）。
【０２２５】
・４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの発光で蛍光を読み取る。
本実験結果は、下表１５および図６に示されている。
【０２２６】
【表１２】
0006588005.tif 000018
【０２２７】
試験された全ての化学走化性シグナルに関して、ＭＳＣをアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）で前処理すると、２４時間後、下部チャンバーにおける検出可能な量の細胞が増加した。アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）は、ＦＢＳ移動を２２％、ＳＤＦ−１を３１％、ＴＧＦベータ３を１５％増加させた。
【０２２８】
実施例６
本実施例は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）が軟骨形成を促進させることを証明する。また、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）は、軟骨細胞系にとって重要な遺伝子の転写または翻訳に対して相加的または相乗的な効果を有する。
【０２２９】
材料：
・５継体の骨髄由来のヒト間葉幹細胞（ＨＵＸＭＡ−０１００１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・間葉幹細胞の軟骨形成分化培地（ＧＵＸＭＸ−９００４１、シアゲン・バイオサイエンスイズ（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サニーヴェール、カリフォルニア州）
・ＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭの化学的に規定された幹細胞培地（１９０６３２ロンザ（Ｌｏｎｚａ））
・無水エタノール中１ｍＭの酢酸デキサメタゾンおよびミフェプリストン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
・注射液ＺＲフラッシュ（ＺＲ  Ｆｌｕｓｈ）に関する生理食塩水または０．９％塩化ナトリウム（エクセルショア・メディカル（Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、ネプテューン、ニュージャージー州）
・生理食塩水中の滅菌ろ過済み０．６ｍＭのカプリル酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ））
・生理食塩水中の滅菌ろ過済み３ｍＭのＮＡＴ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））；調製するために、６０℃、３０分間加熱してから、５分間超音波処理
・生理食塩水中の滅菌済み１０ｍＭのＤＡＤＫＰ
・０．２μＭシリンジフィルター
・ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）緩衝生理食塩水、トリプシン／ＥＤＴＡ、トリプシン中和溶液（ロンザ（Ｌｏｎｚａ）試薬パック）
・１８２ｃｍ２の組織培養フラスコ
・ピペットおよび無菌チップ
・組織培養用フード、加湿ＣＯ２インキュベータ、水またはビード浴槽
・２４ウェルの組織培養プレート
・キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラススピンカラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）７４１３４）
・コラーゲン２Ａ１、ＭＭＰ１３、ＴＩＭＰ１、アグレカン、ＧＡＰＤＨ、およびアクチンＢに関するキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）ＳｙｂｒグリーンＩマスター混合物およびインヴィトロゲン・スーパースクリプト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＶＩＬＯマスター混合物
・ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）４８０ライトサイクラー
細胞増殖：
・５継体ＨＵＸＭＡ細胞を、４０ｍｌのＴｈｅｒａＰＥＡＫ  ＭＳＣＧＭを含有する１７５ｃｍ２フラスコ中で８０〜９０％の集密まで増殖させた。
【０２３０】
・標準的プロトコルを用いて、フラスコからの細胞をトリプシン化し、次のステップへ進む。
平板培養および細胞の処理：
・注射用に上記表の原液から、生理食塩水中、以下の作業希釈液を調製し、浴槽中３７℃に温める（幾つかの知られたアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）成分の最終濃度を模擬するためにデザインされた対照および溶液）。
【０２３１】
・４μＭのデキサメタゾンおよびミフェプリストン
・３ｍＭのＮＡＴ
・０．６ｍＭのカプリル酸エステル
・８０μＭのＤＡＤＫＰ
・３ｍＭのＮＡＴ、０．６ｍＭのカプリル酸エステル、８０μＭのＤＡＤＫＰの混合物
・さらに、生理食塩水およびアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）原液を浴槽中３７℃に温める。
【０２３２】
・デキサメタゾンおよびＴＧＦベータ３添加物を除いた教示に従って、シアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）軟骨形成培地を混合する。浴槽中、３７℃に温める。
・温めた軟骨形成培地中、ＨＵＸＭＡ幹細胞の１．０×１０７細胞懸濁液を調製し、次いで２４ウェル組織培養プレートに用いられる各ウェルの中央に２０μｌをスポットする（１スポット当り２００，０００個の細胞）。
【０２３３】
・３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
・インキュベータからプレートを取り出し、各ウェルに７２０μｌの軟骨形成培地を静かに加える。
【０２３４】
・適切なウェルに、２５０μｌの生理食塩水、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）または対照溶液を三通り加える。
・次いで、各ウェルにシアゲン（Ｃｙａｇｅｎ）から供給された１０μｌのＴＧＦベータ３溶液を加える。
【０２３５】
・プレートをインキュベータに戻す。
・ウェルから培地を吸引し、上記の新鮮な軟骨形成培地、希釈原液、およびＴＧＦベータ３と交換することにより、３〜４日毎に培地交換を行った。
【０２３６】
ＲＮＡの単離および分析：
・プレートは、処理後、７日目、１４日目、２２日目に以下の通り処理した（上記の培地交換をしながら）。
【０２３７】
・ウェルから培地を取り出し、さらなるタンパク質分析のために保存する。
・核ウェルに、キアゲン・ＲＮイージー（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ）プラス細胞溶解緩衝液（２ＭＥと共に）を加え、１０分間静かに振とうさせる。
【０２３８】
・溶液をキアシュレッダー（Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ）カラムに移し、１４，０００ｒｐｍで２分間回転させる。
・製造元の推奨に従ってＲＮイージープラスプロトコルによって進行させる。
【０２３９】
・２５μｌのＲＮアーゼ無しの水を用いて、カラムからＲＮＡを溶出させる。
ｃＤＮＡの合成およびリアルタイムＰＣＲ：
・次いで、推奨された総容量２０μｌのプロトコルに従い、１０μｌの単離ＲＮＡを用いて、全サンプルのｃＤＮＡの第一鎖合成を行った。
【０２４０】
・次いで、全てのｃＤＮＡ反応液を３０μｌのヌクレアーゼ無しの水で希釈した。
・次いで、５μｌの希釈ｃＤＮＡ、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）Ｓｙｂｅｒグリーンマスター混合物、およびキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＴ２  ｑＰＣＲプライマーペア（総容量２０μｌ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを実施した。
【０２４１】
・デルタデータＣｔ法により、相対的遺伝子発現を判定した。
結果
７日目と２２日目におけるこの実験結果は、下表１５〜１６および図７〜９に示されている。
【０２４２】
【表１３】
0006588005.tif 000019
0006588005.tif 000020
７日目にコラーゲン２Ａ１型の増加およびＭＭＰ１３の発現が見られた。ルースペレット内に抜き取られたアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）処理ウェルを除いて、全ての培養物はディスクに存在した。
【０２４３】
【表１４】
0006588005.tif 000021
0006588005.tif 000022
0006588005.tif 000023
0006588005.tif 000024
２２日目、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）により、コラーゲンの転写は大きく増強する。成分もいくらかの活性を示しているが、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）ほど顕著ではない。アグレカンも増加している。
【０２４４】
本実施例の結果は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）がコラーゲン２Ａ１およびアグレカンの転写を増加させる能力を有することを示している。
実施例７
以下の実施例は、生理食塩水を与えられた患者からの滑液に比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）により治療した患者からの滑液のプロテオミック（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）解析である。
【０２４５】
膝の骨関節炎を治療するために、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の使用に関する臨床試験において、ベースラインで、および１０ｃｃのアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）または生理食塩水による処置の１２週目に、患者の膝から滑液を採取した。生理食塩水およびアンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）の双方に関して、ベースライン対１２週目を比較した。
【０２４６】
滑液サンプルは、米国コロラド州ボルダーのソマロジック（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）により、その専売技術ＳＯＭＡｓｃａｎ（商標）を用いて解析した。
以下の表１７に示されたタンパク質は、生理食塩水で処置した滑液に比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）処置した滑液において減少した。
【０２４７】
【表１５】
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【０２４８】
以下の表１８に示されたタンパク質は、生理食塩水で処置した滑液に比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）処置した滑液において増加した。
【０２４９】
【表１６】
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【０２５０】
以下の表１９に示されたタンパク質は、生理食塩水で処置した滑液に比較して、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）処置した滑液において著しく異なっており（増加または減少）、軟骨および滑液の産生に影響を及ぼすことが分かる。
【０２５１】
【表１７】
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【０２５２】
本実施例の結果は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の投与が、Ａｋｔ経路をダウンレギュレートすることを示唆している。タンパクキナーゼＢ（ＰＫＢ）としても知られているＡｋｔは、細胞増殖、転写および細胞移動などの多くの細胞過程において重要な役割を果たしているセリン／トレオニン特異的タンパクキナーゼである。
【０２５３】
実施例８
本実施例は、骨関節炎による膝痛の治療用５％ヒト血清アルブミン（ＬＭＷＦ−５Ａ）の低分子量フラクションの関節内注射の効果を証明している。
【０２５４】
この試験は、ＬＭＷＦ−５Ａの２つの用量の関節内注射の安全性および有効性を評価するためにデザインされた、多施設、無作為化、媒体対照、二重盲検、平行試験であった。症候性膝関節炎に罹っている患者を、１：１：１：１に無作為化し、ＬＭＷＦ−５Ａまたは媒体対照（生理食塩水）いずれかの４ｍｌまたは１０ｍｌの単回関節内膝注射を投与した。一次有効性エンドポイントは、ウェスタン・オンタリオ・アンド・マクマスター大学（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）のベースラインからの疼痛変化の１２週に亘る治療群間の差であった。安全性は、有害事象（ＡＥｓ）の出現率および重症度として調べた。
【０２５５】
ＯＡ膝痛を有する総計３２９名の患者を、４つの試験アーム：４ｍＬのＬＭＷＦ−５Ａ、４ｍＬの生理食塩水媒体対照、１０ｍＬのＬＭＷＦ−５Ａ、または１０ｍＬの生理食塩水媒体対照を通じて１：１：１：１に無作為化した。患者の配置は、図１０に示されている。
【０２５６】
オクタファーマ（ＯｃｔａＰｈａｒｍａ）（スイス国、ラチェン（Ｌａｃｈｅｎ））から購入したＬＭＷＦ−５Ａの出発原料、ＨＳＡを、滅菌条件下、遠心分離／限外ろ過に供し、５０００Ｄａ未満の分子量を有する種を含有する限外ろ過物を分離した。限外ろ過物は、ＤＡ−ＤＫＰ（およそ５０〜２００ｍＭ）および賦形剤（すなわち、カプリル酸ナトリウムおよびアセチルトリプトファンナトリウム）を含有した。滅菌薬剤製品を供するために、限外ろ過物を無菌充填へ移した。
【０２５７】
ＷＯＭＡＣＨ骨関節炎指数３．１  ５−ポイントリカート（Ｌｉｋｅｒｔ）スコア、５−ポイントリカート（Ｌｉｋｅｒｔ）スコアを用いた疾病重症度の患者の全般的評価（Ｐａｔｉｅｎｔ’ｓ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＰＧＡ））および関節内注射後のアセトアミノフェンの量を用い、６週目および１２週目の来院ならびに２、４、８、１０週目の電話連絡を通じて、ＯＡに及ぼす治療の臨床効果を評価した。アセトアミノフェンは救助薬剤として、ベースラインで５００ｍｇ錠剤にて供給され、必要時、４時間毎に１錠が許容された。有害事象（投与後２４時間を通しての、および全ての追跡連絡における）、バイタルサインおよび身体検査の結果（ベースライン、６週目、１２週目）を記録することにより安全性を評価した。
【０２５８】
ＬＭＷＦ−５Ａは、媒体対照に比較して、疼痛における統計的に有意な改善をもたらした（それぞれ、２０．９３対２０．７２）。注射の容量効果は見られなかった（ｐ＝０．６４）。対照との予測差は、２０．２５（９５％ＣＩ：２０．０８〜２０．４１）、ｐ＝０．００４であった。媒体対照と比較したＬＭＷＦ−５Ａによる疼痛減少は、４週目という早期に見られ（ｐ＝０．０３）、１２週目まで持続した（ｐ＝０．００４）。図１１に示されるように、経時的な疼痛減少％は媒体対照と比較したＬＭＷＦ−５Ａでは有意に、より大きかった（１２週目：それぞれ、４２．３％および３１．７％）。
【０２５９】
ＬＭＷＦ−５Ａによって治療された患者は、媒体対照と比較して、以下の二次エンドポイントにおいて、有意な改善を証明した：ＰＧＡ（２０．８７対２０．６５、ｐ＝０．０１）；身体機能（２０．７８対２０．６４、ｐ＝０．０４）；安静的疼痛（２０．９１対２０．７０、ｐ＝０．００４）；運動時疼痛（２０．９６対２０．７５、ｐ＝０．０１）、表３。剛直性の減少においては、治療群間に差は無かった。媒体対照と比較して、ＬＭＷＦ−５Ａでは、試験期間を通じて用いられたアセトアミノフェン丸剤の数に減少傾向があった（中央値（ＩＱＲ））：２４．０（０、６２）対３４．０（５、８５．５）、ｐ＝０．０９。本試験における疼痛改善は、アンピオン（Ａｍｐｉｏｎ）（商標）の投与により生じた組織の再生と一致している。
【０２６０】
実施例９
本実施例は、骨関節炎による膝痛の治療に関するＬＭＷＦ−５Ａの効果を証明している実施例８に記載された、臨床試験の２０週延長である。
【０２６１】
本解析は、膝の症候性ＯＡ（ＯＡＫ）における炎症関連痛の治療のための５％ヒト血清アルブミン（ＬＭＷＦ−５Ａ）の低分子量フラクションの有効性と安全性とを評価した多施設、無作為、媒体対照、二重盲検試験（ＮＣＴ０１８３９３３１）の２０週延長である。
【０２６２】
ＬＭＷＦ−５Ａまたは媒体対照の４ｍＬの関節内注射を投与された９７名の患者が、最初の１２週の試験エンドポイントを超えて、さらに８週間扱われた。有効性の測定には、ウェスタン・オンタリオ・アンド・マクマスター大学（ＷＯＭＡＣ）の疼痛および機能のサブスコアにおけるベースラインからの変化が含まれていた。ＷＯＭＡＣの疼痛および機能において≧４０％の改善に達した場合に、患者は「応答者」と考えられた。治療群間の差は、ベースラインに関して調整した、カイ二乗検定またはＡＮＣＯＶＡにより評価された。
【０２６３】
中等度〜重度のＯＡＫ（ケルグレン・ローレンス（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅ）グレード３〜４；ｎ＝６４）に罹っている患者の亜群において、媒体対照と比較して、ＬＭＷＦ−５Ａを投与された患者では、２０週に亘ってＷＯＭＡＣの疼痛（ベースラインからの平均変化−０．９９対−０．６５）および機能スコア（−０．８５対−０．５８）それぞれにおいて、統計的に有意な改善があった。１プロトコル当りの集団において、疼痛（−０．９５対−０．７７）および機能（−０．７９対−０．６３）それぞれにおける治療対プラセボ関連の差も見られた。２０週目に、中等度から重度の亜群における疼痛応答者のパーセンテージは、媒体対照を投与された患者（２５％）に比較して、ＬＭＷＦ−５Ａを投与された患者（５０％）では有意により高かった。ＬＭＷＦ−５Ａ群と対照群において、見られた有害事象の比率と重症度は同様であった。
【０２６４】
本実施例は、ＬＭＷＦ−５Ａの単回注射が、膝痛の改善持続に関連しており、中等度から重度のＯＡＫに罹っている患者に対して、治療上のオプションを提供できることを証明している。これらの知見は、真性ＯＡＫの客観的証拠および高い治療の必要性を有している患者にとって、ＬＭＷＦ−５Ａの有意な利益を証明している。
【０２６５】
本発明の先の実施例は、例示と説明を目的として提供されている。さらに、これらの実施例は、本明細書に開示された形態に本発明を限定する意図はない。結論として、本発明の教示および説明に相応の変更および修正ならびに関連業界の技術および知識は、本発明の範囲内にある。本明細書に提供された実施例に記載された特定の実施形態は、本発明の実施に関して知られている最良の様式をさらに説明し、このような実施形態または他の実施形態において、また、本発明の特定の応用または使用に必要な種々の修正を行って、他の当業者が本発明を利用することを可能にすることが意図されている。添付の請求項は、先行技術によって許される限りでの代替の実施形態を含むと解釈されるべきことが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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