(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の存在を検出する、またはＳＰＭＳの発症のリスク判定をするためのインビトロの方法であって、
対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、ＳＰＭＳに罹患しているまたはＳＰＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表すＬａｃＣｅｒの基準レベルと比較することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルが前記基準レベルを上回る場合、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、対象がＳＰＭＳであると診断することの指標とすること、または、
対象がＳＰＭＳを発症するリスクのある対象と特定することとを含む、方法。
【請求項２】
前記対象が、再発寛解型多発性硬化症を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内にＳＰＭＳを発症するリスクが高い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象の進行型多発性硬化症（ＭＳ）を治療するための情報を提供する方法であって、
進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、ＬａｃＣｅｒの基準レベルと比較することと、
ＬａｃＣｅｒの前記レベルが前記基準レベルを上回る対象に、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む治療を施すための情報を提供することとを含み、
前記ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤が、小分子、Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする阻害核酸またはＢ４ＧＡＬＴ６に特異的に結合しＬａｃＣｅｒ合成を阻害する阻害抗体からなる群から選択されるＢ４ＧＡＬＴ６の阻害剤である、
方法。
【請求項５】
ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のための治療を選択するための情報を供給する方法であって、
進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、ＬａｃＣｅｒの基準レベルと比較することと、
ＬａｃＣｅｒの前記レベルが前記基準レベルを上回る対象に、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む治療を選択するための情報を提供することとを含み、
前記ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤が、小分子、Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする阻害核酸またはＢ４ＧＡＬＴ６に特異的に結合しＬａｃＣｅｒ合成を阻害する阻害抗体からなる群から選択されるＢ４ＧＡＬＴ６の阻害剤である、方法。
【請求項６】
前記進行型多発性硬化症（ＭＳ）が、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）または二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬａｃＣｅｒの基準レベルが、進行型ＭＳに罹患しているまたは進行型ＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表す基準レベルである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤が、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）合成阻害剤である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧｌｃＣｅｒ合成阻害剤が、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−ノナノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−オクタノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、Ｄ−トレオ−（１Ｒ，２Ｒ）−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）及びＤ−ＰＤＭＰを含むその類似体、ＰＰＭＰ（ＤＬ−トレオ−１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）、Ｄ−トレオ−ＥｔＤＯ−Ｐ４、（（１Ｒ、２Ｒ）−ノナン酸［２−（２’，３’−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ダイオキシン−６’−イル）−２−ヒドロキシ−１−ピロリジン−１−イルメチル−エチル］−アミド−Ｌ−酒石酸塩、ＣＣＧ０２０３５８６（１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）アセトアミド）、Ｇｅｎｚ−１１２６３８（エリグルスタット）、Ｇｅｎｚ−５２９４６８、デオキシノジリマイシン系ＧｌｃＣｅｒ阻害剤、ＧＺ−１６１、Ｇｅｎｚ−６８２４５２、ＥＸＥＬ−０３４６、ＯＧＴ２３７８、並びにＧｅｎｚ−１２３３４６からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記デオキシノジリマイシン系ＧｌｃＣｅｒ阻害剤が、Ｎ−（５’−アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンチル−１−デオキシノジリマイシン（ＡＭＰ−ＤＮＭ）、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ミグルスタット）またはアルキル鎖中に９個〜約２０個の炭素原子を有する１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールの長鎖Ｎ−アルキル誘導体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記長鎖Ｎ−アルキル誘導体のＮ−アルキル置換基が、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、シス−１１−ヘキサデセニル、オクタデシル、シス−１３−オクタデセニル及びエイコシルからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする前記阻害核酸が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１３】
Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害剤及びＧｌｃＣｅｒ合成阻害剤を投与するための情報を提供することを含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、進行型ＭＳに罹患していることに基づいて、前記対象を選択することを含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１５】
グルコセレブロシダーゼの活性化剤を投与するための情報を提供することを更に含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１６】
前記グルコセレブロシダーゼの活性化剤が、サポシンＣもしくはサポシンＣの活性断片もしくはその活性断片、ＮＣＧＣ００１８２１８６（５−シクロプロピリデン−７−（ジフルオロメチル）−Ｎ−（２−フェニルスルファニルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−カルボキサミド）、ＮＣＧＣ００１８２５１０（［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル］２−［２−（４−ブロモアニリノ）−２−オキソエトキシ］ベンゾエート）またはホスファチジルセリンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が、経口、経鼻、静脈内または髄腔内投与されるものである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ＳＰＭＳに罹患しているか、かつ／またはＳＰＭＳに罹患していることに基づいて選択される、請求項４または５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９６３，７３８号、及び２０１４年９月１２日出願の同第６２／０４９，８１３号の利益を主張する。前述の全内容を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府支援の研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所助成金番号ＡＩ０７５２８５及びＡＩ０９３９０３に基づいた助成を受け、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、対象における進行型多発性硬化症（ＭＳ）、例えば、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）または二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の発症について、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することによって、診断またはリスク判定するための方法、及びＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することによって進行型ＭＳを治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
星状膠細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）で最も豊富な細胞である。正常状態下にて、星状膠細胞は、シナプス活性を調整し、神経細胞の生存に必要な栄養素及び支持を提供する１−４。神経炎症との関係において、星状膠細胞は、炎症性末梢血白血球によるＣＮＳ浸潤を調節し５−８、ミクログリア、希突起膠細胞及び適応免疫系細胞の活性を制御する９。したがって、ＣＮＳ炎症時における星状膠細胞活性を制御する機構、及び星状膠細胞活性の治療的調整のための潜在的標的を特徴付けることは重要である。
【０００５】
多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳの慢性脱髄性自己免疫疾患である。多くの患者にて、ＭＳは、初期に、再発寛解型臨床経過（再発寛解型ＭＳ、ＲＲＭＳ）を呈し、続いて、継続的かつ不可逆的な障害の蓄積を特徴とする進行期（二次性進行型ＭＳ、ＳＰＭＳ）を示すが、これに対しては、利用可能な治療法は限定的な有効性しか示さない１０。最近の知見では、局所的なＣＮＳの自然免疫応答がＳＰＭＳの疾患進行を促すことが示唆されている９，１１，１２。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書に記載するように、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）レベルは、多発性硬化症（ＭＳ）の実験モデルである慢性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）時において、ＣＮＳで上方制御される。星状膠細胞にてβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ６（Ｂ４ＧＡＬＴ６）によって合成されるＬａｃＣｅｒは、オートクライン的に作用し、ＣＮＳ浸潤性単球及びミクログリアの動員及び活性化、並びに神経変性を促進する転写プログラムを誘発する。加えて、Ｂ４ＧＡＬＴ６発現及びＬａｃＣｅｒレベルの増加が、ヒト患者のＣＮＳのＭＳ病変で検出された。最後に、ＬａｃＣｅｒ合成を阻害すると、ＥＡＥにおける局所的なＣＮＳの自然免疫及び神経変性が抑制され、ヒト星状膠細胞の活性化がインビトロで阻害された。このように、Ｂ４ＧＡＬＴ６は、ＭＳ及び他の神経炎症性障害の治療標的である。
【０００７】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象における二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の発症について、診断またはリスク判定するための方法を提供する。方法は、対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、サンプル中のＬａｃＣｅｒのレベルを、ＳＰＭＳに罹患しているまたはＳＰＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表すＬａｃＣｅｒの基準レベルと比較することと、サンプル中のＬａｃＣｅｒのレベルが基準レベルを上回る場合、対象をＳＰＭＳと診断するまたはＳＰＭＳを発症するリスクのある対象と特定することとを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＳＰＭＳに罹患しているまたはＳＰＭＳを発症するリスクがあると特定された対象に、ＭＳのための治療、例えば、当技術分野において周知のものまたは本明細書に記載のものを施すことを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、対象は、再発寛解型多発性硬化症に罹患しており、そのレベルが、対象にはＳＰＭＳを発症するリスクがあることを示している。いくつかの実施形態において、対象は、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内にＳＰＭＳを発症するリスクが高い。
【０００９】
別の態様において、本発明は、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を対象に投与することによって、対象の進行型ＭＳ、例えば、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）または二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）を治療するための方法を提供する。また、治療を必要とする対象の進行型ＭＳ、例えば、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）もしくは二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の治療における、または進行型ＭＳ、例えば、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）もしくは二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）を治療するための薬剤の製造における、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤の使用も提供する。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、対象の進行型多発性硬化症（ＭＳ）を治療するための方法を提供する。方法は、進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、サンプル中のＬａｃＣｅｒのレベルを、ＬａｃＣｅｒの基準レベル、例えば、進行型ＭＳに罹患しているまたは進行型ＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表す基準レベルと比較することと、ＬａｃＣｅｒのレベルが基準レベルを上回る対象に、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む治療を施すこととを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＭＳのための別の治療、例えば、当技術分野において周知のものまたは本明細書に記載のもの、例えば、ＭＳのための標準的治療を施すことを含む。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、ＭＳ、例えば進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のための治療を選択するための方法を特徴とする。方法は、進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、サンプル中のＬａｃＣｅｒのレベルを、ＬａｃＣｅｒの基準レベル、例えば、進行型ＭＳに罹患しているまたは進行型ＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表す基準レベルと比較することと、ＬａｃＣｅｒのレベルが基準レベルを上回る対象に、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む治療を選択することとを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＳＰＭＳに罹患しているまたはＳＰＭＳを発症するリスクがあると特定された対象に、ＭＳのための治療を施すことと、ＭＳのための別の治療、例えば、当技術分野において周知のものまたは本明細書に記載のものを任意に施すこととを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤は、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）合成阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＧｌｃＣｅｒ合成阻害剤は、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−ノナノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−オクタノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、Ｄ−トレオ−（１Ｒ，２Ｒ）−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）及びＤ−ＰＤＭＰを含むその類似体、ＰＰＭＰ（ＤＬ−トレオ−１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）、Ｄ−トレオ−ＥｔＤＯ−Ｐ４、（（１Ｒ、２Ｒ）−ノナン酸［２−（２’，３’−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ダイオキシン−６’−イル）−２−ヒドロキシ−１−ピロリジン−１−イルメチル−エチル］−アミド−Ｌ−酒石酸塩、ＣＣＧ０２０３５８６（１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）アセトアミド）、Ｇｅｎｚ−１１２６３８（エリグルスタット）、Ｇｅｎｚ−５２９４６８、デオキシノジリマイシン系ＧｌｃＣｅｒ阻害剤、ＧＺ−１６１、Ｇｅｎｚ−６８２４５２、ＥＸＥＬ−０３４６、ＯＧＴ２３７８、並びにＧｅｎｚ−１２３３４６からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、デオキシノジリマイシン系ＧｌｃＣｅｒ阻害剤は、Ｎ−（５’−アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンチル−１−デオキシノジリマイシン（ＡＭＰ−ＤＮＭ）、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ミグルスタット）またはアルキル鎖中に９個〜約２０個の炭素原子を有する１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールの長鎖Ｎ−アルキル誘導体である。いくつかの実施形態において、Ｎ−アルキル置換基は、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、シス−１１−ヘキサデセニル、オクタデシル、シス−１３−オクタデセニル及びエイコシルからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤は、小分子、Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする阻害核酸またはＢ４ＧＡＬＴ６に特異的に結合しＬａｃＣｅｒ合成を阻害する阻害抗体からなる群から選択されるＢ４ＧＡＬＴ６の阻害剤である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする阻害核酸は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、方法は、Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害剤及びＧｌｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、方法は、対象が進行型ＭＳ、例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳに罹患していることに基づいて、対象を選択することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、方法は、グルコセレブロシダーゼの活性化剤を投与することを含む。いくつかの実施形態において、グルコセレブロシダーゼの活性化剤は、サポシンＣもしくはその活性断片、ＮＣＧＣ００１８２１８６（５−シクロプロピリデン−７−（ジフルオロメチル）−Ｎ−（２−フェニルスルファニルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−カルボキサミド）、ＮＣＧＣ００１８２５１０（［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル］２−［２−（４−ブロモアニリノ）−２−オキソエトキシ］ベンゾエート）またはホスファチジルセリンである。
【００１８】
いくつかの実施形態において、方法は、治療薬、例えば化合物を、経口、経鼻、静脈内または髄腔内投与することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、対象は、ＳＰＭＳに罹患しているか、かつ／またはＳＰＭＳに罹患していることに基づいて選択される。
【００２０】
別途の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明にて使用するための方法及び材料を本明細書中に記載するが、当該技術分野において周知の他の好適な方法及び材料も用いることができる。材料、方法及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書中で言及する公開物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ及び他の参考文献は全て、その全体を参照により本明細書に援用する。矛盾が生じる場合には、定義を含め本明細書が優先される。
【００２１】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面から、また特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本特許または本出願は、少なくとも１つのカラー印刷図面を含む。カラー図面を備える本特許または本特許出願公開の複製は、請求に応じて、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供されるであろう。
【００２３】
【図１−１】図１a−ｌ。  Ｂ４ＧＡＬＴ６活性がＣＮＳ炎症及び神経変性を調節する。（ａ、ｂ）野生型（ＷＴ）及びＧＦＡＰ−ＴＫトランスジェニック（ＧＦＡＰＴＫ）Ｆ１ハイブリッドマウスにおけるＥＡＥスコア（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。右パネルは線形回帰曲線であり、破線は回帰直線の９５％信頼区間を示す。ガンシクロビル（ＧＣＶ、２５ｍｇ／ｋｇ）または指定のビヒクル（ＰＢＳ）（黒棒）でマウスを毎日処理した。ｎ≧７マウス／群の３つの独立実験の代表データ。（ａ）マウスをＥＡＥ誘導の７日前から前処理し、１５日まで継続するか、（ｂ）または進行期間中（３０〜５０日）のみ処理した。（ｃ）Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析によって検出された、ナイーブＮＯＤマウス、または急性期もしくは進行期中のＮＯＤ  ＥＡＥのＣＮＳから分離した星状膠細胞におけるｍＲＮＡ発現差異プロフィールを表すヒートマップ。３つの独立実験の代表データ。（ｄ）進行期のＥＡＥにおいて特に上方制御された特有の遺伝子クラスターを表すヒートマップ。オリジナルにおいて、右端の３つのカラムの大部分が高発現であったのに対し、中央及び左側は低発現であった。（ｅ）ナイーブまたはＥＡＥ  ＮＯＤマウス由来のミクログリアまたは星状膠細胞におけるｂ４ｇａｌｔ６発現のｑＰＣＲ分析。発現は、ｇａｐｄｈに標準化し、ナイーブマウス由来の細胞の発現を基準に示す。３つの独立実験の代表データ、スチューデントｔ検定による統計分析。（ｆ）組織正味重量に対する、ナイーブまたはＥＡＥ  ＮＯＤマウスのＣＮＳにおけるラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）の定量化。条件当たり試料数ｎ≧１５の３つの独立実験の代表データ、スチューデントｔ検定による統計分析。（ｇ、ｈ）矢印または棒によって示される、ＬａｃＣｅｒ（１マウス当たり１０μｇ）またはビヒクルの投与後のＣ５７ＢＬ／６（ｇ）及びＮＯＤ（ｈ）マウスのＥＡＥ臨床スコア。ｎ≧８マウス／群の２つの独立実験の代表データ。（ａ）と同様の統計分析。（ｇ）ＥＡＥ誘導中のＣ５７ＢＬ／６マウスにＬａｃＣｅｒまたはビヒクルをＭＯＧ（３５−５５）ペプチドとともに投与し、その後３日ごとに１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した後のＥＡＥスコア（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。（ｈ）ＥＡＥ誘導の３５日後（進行期）に開始したＬａｃＣｅｒまたはビヒクル投与後のＥＡＥスコア。（ｉ）ＰＤＭＰは、Ｂ４ＧＡＬＴ６によるＬａｃＣｅｒ合成を阻害する。（ｊ）（ｋ）に示すようにナイーブまたはＰＤＭＰもしくはビヒクルで処理したＥＡＥ  ＮＯＤマウスのＣＮＳにおけるＬａｃＣｅｒレベルの定量化。（ｋ）ＰＤＭＰまたはビヒクルをＥＡＥ誘導後４０日（進行期）から実験期間中毎日投与（２０ｍｇ／ｋｇを１日２回ｉ．ｐ．投与）して処理したＮＯＤマウスにおけるＥＡＥの臨床スコア。ｎ≧８マウス／群の３つの独立実験の代表データ。（ｌ）（ｋ）と同様にＰＤＭＰまたはビヒクルで処理し、脱髄または軸索消失の分析のためにそれぞれルクソールファストブルー染色またはビルショウスキー銀染色で染色したＥＡＥ  ＮＯＤマウス由来の腰髄切片の組織病理学分析。ｎ≧６マウス／群の２つの独立実験の代表データ（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ���０．００１、ｎ．ｓ．非有意。
【図１−２】上記に記載のとおりである。
【図１−３】上記に記載のとおりである。
【図１−４】上記に記載のとおりである。
【図１−５】上記に記載のとおりである。
【図１−６】上記に記載のとおりである。
【図２−１】図２ａ−ｅ。  Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害は、ＥＡＥ時の星状膠細胞活性化を抑制する。（ａ）Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析によって検出された、ナイーブまたはＰＤＭＰもしくはビヒクル（ビヒクル）で処理したＥＡＥ  ＮＯＤマウスから分離した星状膠細胞におけるｍＲＮＡ発現を表すヒートマップ。上のパネルは、各遺伝子クラスターの、標準化した遺伝子発現のヒストグラムを示す。３つの独立実験の代表データ、スチューデントｔ検定による統計分析。左側のグラフのオリジナルでは、左の縦列はほぼ高発現であり、中央の縦列は低発現であり、右の縦列は混合であり、右側のグラフのオリジナルでは、左の縦列はほぼ低発現であり、中央の縦列はほぼ高発現であり、右の縦列は混合であった。（ｂ）ナイーブ及びビヒクルまたはＰＤＭＰで処理したＥＡＥ  ＮＯＤマウスから分離した星状膠細胞におけるｃｃｌ２、ｃｃｌ５、ｃｘｃｌ１０、ｉｌ１ｂ、ｎｏｓ２、ｏｐｎ、Ｈ２−Ａａ、ｖｉｍ及びｔｌｒ２発現のｑＰＣＲ分析。発現は相対ｇａｐｄｈで示す。３つの独立実験の代表データ、スチューデントｔ検定による統計分析。（ｃ）ビヒクルまたはＰＤＭＰで処理したＥＡＥ  ＮＯＤマウスから分離した星状膠細胞における髄鞘形成の調節に関連する遺伝子（表２）の相対的発現量（ＮＯＤナイーブ群に対する）。３つの独立実験の代表データ。スチューデントｔ検定による統計分析。（ｄ、ｅ）（ｂ）と同様に実施したＩｒｆ１（ｄ）及びＲｅｌｂ（ｅ）発現のｑＰＣＲ分析。全てのデータを平均及びｓ．ｅ．ｍ．で表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及びｎ．ｓ．非有意。
【図２−２】上記に記載のとおりである。
【図２−３】上記に記載のとおりである。
【図３−１】図３ａ−ｍ。  Ｂ４ＧＡＬＴ６によって産生されるＬａｃＣｅｒは、オートクライン的に作用し、星状膠細胞活性化を増大させる。培養した星状膠細胞をＰＤＭＰ（２５μＭ）、ＬａｃＣｅｒ（１０μＭ）、両方（ＬａｃＣｅｒ＋ＰＤＭＰ）またはビヒクル（ビヒクル）で１時間前処理し、続いてリポ多糖体（１００ｎｇ／ｍｌ）及びインターフェロン−γ（１００単位／ｍｌ）（ＬＰＳ／ＩＦＮγ）で活性化するか、非処理（対照）のままとした。（ａ）Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析によって検出された、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激した星状膠細胞におけるｍＲＮＡ発現を表すヒートマップ。３つの独立実験の代表データ。（ｂ）（ａ）に示す遺伝子発現を標準化したヒストグラムを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｃ〜ｆ）確認済みｓｈＲＮＡ（ｎ≧４）を用いて、Ｃ８−Ｄ３０星状膠細胞におけるＢ４ｇａｌｔ５（ｓｈＢ４ｇａｌｔ５）、Ｂ４ｇａｌｔ６（ｓｈＢ４ｇａｌｔ６）または非標的化ｓｈＲＮＡ（ＳｈＣｏｎｔｒｏｌ）の発現をノックダウンした。（ｃ）Ｂ４ｇａｌｔ５及びＢ４ｇａｌｔ６  ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ分析。（ｄ〜ｆ）星状膠細胞を（ａ）と同様に活性化し、（ｄ）Ｈ２−Ａａ、（ｅ）Ｃｃｌ５及び（ｆ）Ｃｘｃｌ１０のｍＲＮＡ発現を特定した。発現をハウスキーピング遺伝子（Ｇａｐｄｈ）に対して示す（ｎ≧４）。（ｇ）星状膠細胞特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクターの模式図。（ｈ〜ｊ）星状膠細胞特異的ｓｈＢ４ｇａｌｔ６レンチウイルスのｉ．ｃ．ｖ．注入は、疾患の重症度を改善する。ＮＯＤマウスに１×１０７ＩＵのｓｈＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｈＢ４ｇａｌｔ５またはｓｈＢ４ｇａｌｔ６レンチウイルスを、ＥＡＥ誘導後３５日（進行期）にｉ．ｃ．ｖ．注入した。１群当たりｎ＝１０マウス（ｈ、ｉ）ｉ．ｃ．ｖ．注入後１０日に実験を終了し、（ｈ）ナイーブまたはＥＡＥ  ＮＯＤマウスから分離した星状膠細胞におけるｂ４ｇａｌｔ５及びｂ４ｇａｌｔ６発現レベルをｑＰＣＲで特定した。発現は、ｇａｐｄｈに標準化し、ナイーブマウス由来の細胞の発現を基準に示す。２つの独立実験の代表データ、一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｉ）ナイーブまたは（ｊ）に示すように処理したＥＡＥ  ＮＯＤマウスのＣＮＳにおけるＬａｃＣｅｒレベルを定量化した。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｊ）ＥＡＥ臨床スコア。２つの独立実験の代表データ。（図１ａ）と同様の統計分析。（ｋ）培養した初代星状膠細胞をＰＤＭＰ（２５μＭ）、ＬａｃＣｅｒ（１０μＭ）、両方（ＬａｃＣｅｒ＋ＰＤＭＰ）またはビヒクル対照（ビヒクル）で１時間前処理し、続いてＬＰＳ／ＩＦＮγで４５分間活性化するか、非処理（対照、Ｃｏｎ）のままとした。核画分中のＩＲＦ−１及びラミンＢ発現をウェスタンブロットで分析し、ＩＲＦ−１の核への移動の程度を、核画分中のＩＲＦ−１とラミンＢの発現間の比によって評価し、続いて、４つの独立実験に関して濃度測定的に定量化した（右パネル）。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｌ）初代培養星状膠細胞におけるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１とｎｏｓ２プロモータとの相互作用についてのＣｈＩＰ分析。（図４ｃ）と同様の実験設計及びデータ分析。２つの独立実験からのデータ（ｍ）ＬａｃＣｅｒまたはビヒクルで前処理し、ＬＰＳ／ＩＦＮγで活性化したＷＴまたはＩＲＦ−１欠損（ＩＲＦ−１  ＫＯ）マウスから確立した星状膠細胞培養物におけるｎｏｓ２、ｃｓｆ２、ｃｃｌ２、ｃｃｌ５、ｉｌ６及びｔｌｒ２の発現のｑＰＣＲ分析。５つの独立実験からのＬＰＳ／ＩＦＮγ活性化細胞におけるＬａｃＣｅｒ処理に対する平均遺伝子誘導。スチューデントｔ検定による統計分析。全てのデータを平均及びｓ．ｅ．ｍ．で表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０１及びｎ．ｓ．非有意。
【図３−２】上記に記載のとおりである。
【図３−３】上記に記載のとおりである。
【図３−４】上記に記載のとおりである。
【図３−５】上記に記載のとおりである。
【図３−６】上記に記載のとおりである。
【図３−７】上記に記載のとおりである。
【図３−８】上記に記載のとおりである。
【図３−９】上記に記載のとおりである。
【図３−１０】上記に記載のとおりである。
【図３−１１】上記に記載のとおりである。
【図３−１２】上記に記載のとおりである。
【図４−１】図４ａ−ｍ。  Ｂ４ｇａＬｔ６は、星状膠細胞におけるｃｃｌ２転写活性を制御する。（ａ）マウスｃｃｌ２プロモータ。（ｂ）ｃｃｌ２ルシフェラーゼレポータと、ＩＲＦ−１、ｐ６５または空の対照ベクター（空）をコードする下記の構築物のうちの１つとでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ活性。結果は、分泌型アルカリホスファターゼ活性に対するものであり、空ベクターからの誘導倍率として示す。３つの独立実験からのデータ、スチューデントｔ検定による統計分析。（ｃ）ＰＤＭＰ及びＬａｃＣｅｒで前処理し、ＬＰＳ／ＩＦＮγ（図３と同様）で活性化し、ＬＰＳ／ＩＦＮγ誘導から２時間後の初代培養星状膠細胞におけるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１とｃｃｌ２プロモータとの相互作用についてのＣｈＩＰ分析。（ｄ〜ｈ）（図１ｋ）と同様にＰＤＭＰまたはビヒクルで処理し、フローサイトメトリーによって分析し、細胞頻度（ｅ、ｇ）及び細胞総数（ｆ、ｈ）として示した、ＥＡＥ  ＮＯＤマウスの炎症性単核細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ高またはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５高細胞のいずれかとして定義）のＣＮＳへの動員。３つの独立実験の代表データ。スチューデントｔ検定による統計分析。（ｉ）（図３ｊ）と同様に、星状膠細胞特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルスのｉ．ｃ．ｖ．注入から１０日後のＣＮＳにおいて特定されたＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ高単球の頻度及び数。２つの独立実験の代表データ。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｊ）単球をＰＤＭＰ、ＬａｃＣｅｒ、両方（ＬａｃＣｅｒ＋ＰＤＭＰ）またはビヒクルで１時間前処理し、トランスウェルチャンバシステムを用いて単球走化性を測定した。ＣＣＬ２またはＰＢＳを下部区画に添加し、３時間後、細胞生存率（ｊ、ｋ）及び遊走性単球の数（ｌ）及び細胞生存率を特定した。遊走データは対照からの倍率として、細胞生存率は対照に対する百分率として示す。作業濃度を赤で示す。４つの独立実験の代表データ。（ｍ）ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ高単球をＰＤＭＰ、ＬａｃＣｅｒまたはビヒクルで処理し、続いて（図３ａ）と同様にＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化するか、非処理（対照）のままとした。ｍＲＮＡ発現を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって特定した。２つのＡＮＯＶＡによる統計分析では、ＬａｃＣｅｒまたはＰＤＭＰ処理の単球遊走に対する有意な作用は示されなかった。全てのデータについて、データを平均及びｓ．ｅ．ｍ．で表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及びｎ．ｓ．非有意。
【図４−２】上記に記載のとおりである。
【図４−３】上記に記載のとおりである。
【図４−４】上記に記載のとおりである。
【図４−５】上記に記載のとおりである。
【図４−６】上記に記載のとおりである。
【図４−７】上記に記載のとおりである。
【図４−８】上記に記載のとおりである。
【図４−９】上記に記載のとおりである。
【図４−１０】上記に記載のとおりである。
【図４−１１】上記に記載のとおりである。
【図４−１２】上記に記載のとおりである。
【図４−１３】上記に記載のとおりである。
【図５−１】図５ａ−ｍ。  星状膠細胞中のＢ４ＧＡＬＴ６は、ミクログリア及びＣＮＳ浸潤性単球の活性化を制御する。（ａ）ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって特定された、ナイーブまたはＰＤＭＰもしくはビヒクルで処理したＥＡＥ  ＮＯＤマウス由来のミクログリアにおけるｍＲＮＡ発現を表すヒートマップ。３つの独立実験の代表データ。スチューデントｔ検定による統計分析。（ｂ）Ｇａｐｄｈに対するｃｃｌ５、ｉｌ１ｂ、ｏｐｎ、ｎｏｓ２、ｃｄ４０及びＨ２−Ａａ遺伝子発現のｑＰＣＲ分析。（ｃ、ｄ）ミクログリアのＭ１またはＭ２表現型（表３）（ｃ）及びＬｙ６Ｃ高単球（ｄ）に関連する遺伝子の平均標準化発現。スチューデントｔ検定による統計分析。（ｅ〜ｈ）初代ミクログリアをＰＤＭＰ、ＬａｃＣｅｒまたはビヒクルで前処理し、続いて（図３ａ）と同様にＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化するか、非処理（対照）のままとした。ｍＲＮＡ発現は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって特定し（ｅ、ｇ）、ミクログリアの生存率を特定した（ｆ、ｈ）。５つの独立実験の代表データ。（ｉ）混合グリア培養物を緩やかなトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｔ／Ｅ）で処理して、星状膠細胞の単一層を除去し、プレートに付着したミクログリアのみを残すか、非処理のままとした。培養物をＰＤＭＰ、ＬａｃＣｅｒまたはビヒクルで前処理して、ＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化した。活性化後、両方の培養物を洗浄し、マイルドＴ／Ｅとともにインキュベートして星状膠細胞を除去することによって、プレートに付着したミクログリア（ＭＧ）のみを残した。星状膠細胞の非存在［ＭＧ（純粋）］または存在［ＭＧ（混合）］下で処理したミクログリアからＲＮＡを回収し、遺伝子発現を、ｇａｐｄｈに対して、ｃｃｌ２、ｃｃｌ５及びｎｏｓ２の発現についてｑＰＣＲによって分析した。データは、５つの独立試験からのＬＰＳ／ＩＦＮγで惹起した遺伝子誘導に対するＰＤＭＰ（左パネル）またはＬａｃＣｅｒ（右パネル）前処理の相対効果を示す。スチューデントｔ検定による統計分析。（ｊ）混合グリアを指定のブロッキング抗体または適切なアイソタイプコントロール（２５μｇ／ｍｌ）及びＬａｃＣｅｒ（１０μＭ）またはビヒクル対照で前処理し、次いで、ＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化した。ミクログリアを（ｉ）と同様に分離し、ミクログリアｎｏｓ２発現をｑＲＴによってｇａｐｄｈに対して特定し、（ｉ）と同様に示した。３つの独立実験の代表データ。（ｋ）初代培養星状膠細胞におけるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１とｃｓｆ２プロモータとの相互作用についてのＣｈＩＰ分析。（ｌ、ｍ）（図３ｊ）と同様に、星状膠細胞特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルスのｉ．ｃ．ｖ．注入から１０日後の慢性ＥＡＥ  ＮＯＤマウスのＣＮＳから分離した、星状膠細胞におけるｃｓｆ２発現（ｌ）及びミクログリア細胞におけるｎｏｓ２発現（ｍ）。２つの独立実験からのデータ。全てのデータについて、平均及びｓ．ｅ．ｍ．を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、及びｎ．ｓ．非有意。
【図５−２】上記に記載のとおりである。
【図５−３】上記に記載のとおりである。
【図５−４】上記に記載のとおりである。
【図５−５】上記に記載のとおりである。
【図５−６】上記に記載のとおりである。
【図５−７】上記に記載のとおりである。
【図５−８】上記に記載のとおりである。
【図５−９】上記に記載のとおりである。
【図５−１０】上記に記載のとおりである。
【図５−１１】上記に記載のとおりである。
【図５−１２】上記に記載のとおりである。
【図５−１３】上記に記載のとおりである。
【図６−１】図６ａ−ｄ。  Ｂ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６並びにＬａｃＣｅｒレベルは、ＭＳ病変にて上方制御される。ＭＳ患者の病変（ｎ＝１０）またはＮＡＷＭ（ｎ＝５）、ＭＳでないＣＮＳ炎症性疾患（ウイルス性脳炎、ラスムッセン脳炎及びＡＤＥＭを含むＮＭＳＣＩＤ、ｎ＝５）患者及び健康な対照（ｎ＝６）から剖検サンプルを得た。（ａ）ＡＣＴＢに対する、ＣＮＳサンプルにおけるＢ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６  ｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ分析。（ｂ）ＭＳ患者のＮＡＷＭ及び病変におけるＧＦＡＰ＋星状膠細胞のＢ４ＧＡＬＴ６、ＣＣＬ２及びｉＮＯＳのＩＦ分析。（ｃ）タンパク質含有量に対する、ＣＮＳサンプルにおいて特定されたＬａｃＣｅｒレベル。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｄ）初代ヒト星状膠細胞をＰＤＭＰ（２５μＭ）またはビヒクルで前処理し、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）またはポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）で活性化するか、非処理（対照）のままとした。ＲＮＡを６時間後に回収し、３つの独立試験におけるＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＯＸ２、ＩＬ６、ＮＯＳ２及びＴＬＲ２の発現をＡＣＴＢに対してｑＰＣＲによって分析した。スチューデントｔ検定による統計分析。示すデータは、平均及びｓ．ｅ．ｍ．である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６−２】上記に記載のとおりである。
【図６−３】上記に記載のとおりである。
【図６−４】上記に記載のとおりである。
【図７−１】図７ａ−ｂ。  ミグルスタットのＳＰＭＳにおける治療的可能性。Ａ．ＣＮＳ炎症におけるＢ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒの役割。Ｂ．ＬＰＳ及びＩＦＮγ（ＬＰＳ／ＩＦＮγ）で活性化させた初代マウス星状膠細胞に対する、ＰＤＭＰによるＢ４ＧＡＬＴ６阻害またはミグルスタットによるＧｌｃＣｅｒ阻害の効果。
【図７−２】上記に記載のとおりである。
【図８−１】図８ａ−ｃ。  Ｆ１ハイブリッドマウスは、慢性進行型ＥＡＥを発症する。（ａ）ＮＯＤ  Ｃ５７ＢＬ／６  Ｆ１ハイブリッドマウスＥＡＥの臨床スコアを平均及びｓ．ｅ．ｍ．で示す。右パネルは線形回帰曲線であり、破線は回帰直線の９５％信頼区間を示す。データは、７つの独立実験の代表データである（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）、（ｎ≧１５マウス／群）。（ｂ、ｃ）組織病理学分析。実験終了時にＥＡＥ誘導Ｆ１マウスの腰髄切片を得、（ｂ）軸索密度についてはビルショウスキー銀染色または（ｃ）ミエリン含有量についてはルクソールファストブルーによって染色した。データは、３つの独立実験の代表データである。
【図８−２】上記に記載のとおりである。
【図８−３】上記に記載のとおりである。
【図９−１】図９ａ−ｄ。  反応性星状膠細胞の枯渇により、末梢血白血球のＣＮＳへの動員が減少する。（ａ〜ｄ）ＥＡＥをＷＴまたはＧＦＡＰＴＫ  Ｆ１ハイブリッドマウスで誘導し、ガンシクロビル（ＧＣＶ）またはビヒクル対照（ＰＢＳ）を図１ｂと同様に投与した。データは、ｎ≧７マウス／群の３つの独立実験の代表データである（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。（ａ）ＧＦＡＰ染色によって検出された反応性星状膠細胞に対するＧＣＶ投与の効果。（ｂ）ＦＡＣＳによって評価したＣＮＳへの単球（赤色ゲート）及びリンパ球（緑色ゲート）の動員。データは、３つの独立実験の代表データである。スチューデントｔ検定による統計分析。（ｃ、ｄ）ＭＯＧ（３５−５５）または抗ＣＤ３への想起増殖応答に対する、ＥＡＥ慢性期中の反応性星状膠細胞の枯渇の効果（ｃ）、及び脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、Ｆｏｘｐ３及びＩＬ−１０の発現（ｄ）。＊Ｐ＜０．０５、及び（ｎ．ｓ）非有意。
【図９−２】上記に記載のとおりである。
【図９−３】上記に記載のとおりである。
【図９−４】上記に記載のとおりである。
【図１０−１】図１０ａ−ｇ。  ＣＮＳからの成体星状膠細胞の分離。（ａ〜ｃ）成体マウスからの星状膠細胞の分離。（ａ）死細胞の除外。（ｂ）ＣＤ１１ｂ＋染色（ミクログリア及び単球、青色ゲート）またはＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ陰（リンパ球、緑色ゲート）に基づいた免疫細胞の除外。（ｃ）ダンプチャネルを用いて、汚染の免疫細胞及び希突起膠細胞を「非免疫」細胞画分（ｂ、赤色ゲート）から除外した（材料及び方法にて詳述）。陰性画分（ｃ、赤色ゲート）を星状膠細胞に富む画分とし、細胞内染色（ｄ）またはｍＲＮＡ分析（ｅ〜ｆ）に用いた。ＧＦＡＰ−ＧＦＰ  ＦＶＢマウス由来の全細胞、すなわちミクログリア／単球及びリンパ球画分並びにＧＦＰ＋星状膠細胞も同様にｍＲＮＡ分析のために得た。（ｄ）星状膠細胞に富む画分のＧＦＡＰ発現（黒−ＧＦＡＰ染色、グレー−アイソタイプコントロール）。（ｅ〜ｆ）濃縮した星状膠細胞、ミクログリア／単球、リンパ球及び脳画分の純度のｑＰＣＲ分析。（ｅ）星状膠細胞マーカのｇｆａｐ、ａｌｄｈ１ｌ１及びａｑｐ４の発現。（ｆ）免疫細胞マーカ：ミクログリア／単球細胞（Ｃｄ１１ｂ、Ｆ４／８０）、樹状細胞（Ｃｄ１１ｃ）、ＮＫ細胞（Ｋｌｒｂ１ｃ）、Ｔ細胞（Ｃｄ３）、Ｂ細胞（Ｃｄ１９）の発現。（ｇ）希突起膠細胞（ｍｏｇ、ｍｂｐ）及びニューロン（Ｓｙｔ１、Ｓｎａｐ２５）マーカの発現。データは、３つの独立実験の代表データである（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）、（ｎ≧５マウス／群）。
【図１０−２】上記に記載のとおりである。
【図１０−３】上記に記載のとおりである。
【図１０−４】上記に記載のとおりである。
【図１０−５】上記に記載のとおりである。
【図１０−６】上記に記載のとおりである。
【図１０−７】上記に記載のとおりである。
【図１１−１】図１１ａ−ｄ。  ＬａｃＣｅｒ合成発現は、慢性ＮＯＤ  ＥＡＥ時の星状膠細胞で上方制御される。（ａ）白質、灰白質及び血管周囲グリア境界膜のＧＦＡＰ＋星状膠細胞におけるＢ４ＧＡＬＴ６発現の免疫染色（ＣＤ３１を内皮細胞のためのマーカとして使用した）。（ｂ）ネスチン＋神経前駆細胞におけるＢ４ＧＡＬＴ６発現の免疫染色。ナイーブＮＯＤマウスまたはＥＡＥ慢性期中のＣＮＳから分離した（ｃ）星状膠細胞または（ｄ）ミクログリアにおけるＢ４ｇａｌｔ５  ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ分析。発現をハウスキーピング遺伝子（Ｇａｐｄｈ）に対して示す。データは、４つの実験の代表データである。示すデータは、平均及びｓ．ｅ．ｍ．である。統計分析は、スチューデントｔ検定により実施した。＊Ｐ＜０．０５、及び（ｎ．ｓ）非有意。
【図１１−２】上記に記載のとおりである。
【図１１−３】上記に記載のとおりである。
【図１１−４】上記に記載のとおりである。
【図１２−１】図１２ａ−ｉ。  Ｂ４ＧＡＬＴ６及びＬａｃＣｅｒは、ＥＡＥ時の末梢Ｔ細胞応答に影響を与えない。（ａ）ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（左パネル）及びＮＯＤマウス（右パネル）をＬａｃＣｅｒ（１マウス当たり１０μｇ）またはビヒクルで赤い矢印で示すように処理し、ＥＡＥ臨床スコアを記録した。実験終了時（２５日）に星状膠細胞を分離し、その転写プロファイルをｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析で特定した。（ｂ〜ｅ）ＥＡＥをＣ５７ＢＬ／６マウス（ｂ、ｃ）またはＮＯＤマウス（ｄ、ｅ）で誘導し、ＬａｃＣｅｒまたはビヒクルをそれぞれ図１ｇ及び１ｈと同様に投与した。ＭＯＧ（３５−５５）（２０μｇ／ｍｌ）に対する脾臓Ｔ細胞想起応答；増殖（ｂ、ｄ）、並びにＩＬ−１７Ａ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０サイトカインの分泌（ｃ、ｅ）。データは、１群当たり８マウス以上の２つの独立実験の代表データである（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。（ｆ〜ｉ）慢性期中のＥＡＥ  ＮＯＤマウスをＰＤＭＰまたはビヒクルで図１Ｋと同様に処理した。データは、ｎ≧８マウス／群の３つの独立実験の代表データである（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。（ｆ）ＣＮＳから分離したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のｔｂｘ２１、ｉｆｎｇ、ｒｏｒｃ、ｉｌ１７Ａ、ｃｓｆ２、ｉｌ１０、ｆｏｘｐ３及びｔｇｆｂ１  ｍＲＮＡの発現についてのｑＰＣＲ分析。発現をｇａｐｄｈに対して示す。（ｇ、ｈ）ＭＯＧ（３５−５５）（２０μｇ／ｍｌ）に対する想起応答；増殖（ｇ）、並びにＩＬ−１７Ａ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０サイトカインの分泌（ｈ）。（ｉ）脾臓ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、Ｆｏｘｐ３及びＩＬ−１０の発現（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。
【図１２−２】上記に記載のとおりである。
【図１２−３】上記に記載のとおりである。
【図１２−４】上記に記載のとおりである。
【図１２−５】上記に記載のとおりである。
【図１２−６】上記に記載のとおりである。
【図１２−７】上記に記載のとおりである。
【図１２−８】上記に記載のとおりである。
【図１２−９】上記に記載のとおりである。
【図１３】ＣＣＬ−２及びｉＮＯＳは、Ｂ４ＧＡＬＴ６＋ＧＦＡＰ＋星状膠細胞によって、共発現される。免疫染色研究により、ＣＣＬ−２またはｉＮＯＳの発現が慢性ＥＡＥ時のＢ４ＧＡＬＴ６＋ＧＦＡＰ＋星状膠細胞にて特定されたが、ナイーブ脊髄切片では特定されなかった。２つの独立実験の代表データ、６動物／群を用いた。
【図１４−１】図１４ａ−ｇ。  Ｂ４ＧＡＬＴ６は、星状膠細胞活性化を直接的に調節する。（ａ）培養した星状膠細胞をＰＤＭＰ（２５μＭ）、ＬａｃＣｅｒ（１０μＭ）、両方（ＬａｃＣｅｒ＋ＰＤＭＰ）またはビヒクル対照（ビヒクル）で１時間前処理し、続いてＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化するか、非処理（対照、Ｃｏｎ）のままとした。活性化から６時間後にｍＲＮＡ発現を分析した。ｇａｐｄｈに対して示した、ｃｃｌ５、ｃｓｆ２、ｎｏｓ２、ｉｌ６、Ｈ２−Ａａ及びｔｌｒ２の発現についてのｑＰＣＲ分析。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。（ｂ、ｃ）培養した星状膠細胞を指定濃度のＬａｃＣｅｒ（ｂ）またはＰＤＭＰ（ｃ）で１時間前処理し、続いてＬＰＳ／ＩＦＮγで活性化するか、非処理（対照、Ｃｏｎ）のままとした。活性化から６時間後に細胞生存率を特定した。一元配置ＡＮＯＶＡによる統計分析により、有意な細胞死はないことが判明した。作業濃度（ａと同様）を赤で示す。（ｄ）確認済みｓｈＲＮＡを用いて、初代星状膠細胞におけるＢ４ｇａｌｔ６（ｓｈＢ４ｇａｌｔ６）または非標的化ｓｈＲＮＡ（ＳｈＣｏｎｔｒｏｌ）の発現をノックダウンした。次いで、星状膠細胞をＰＤＭＰまたはビヒクル対照（ビヒクル）で１時間前処理し、続いてＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化するか、非処理（対照、Ｃｏｎ）のままとした。Ｈ２−Ａａ、Ｃｃｌ５及びＣｘｃｌ１０についてのｍＲＮＡ発現を特定し、発現をハウスキーピング遺伝子（Ｇａｐｄｈ）に対する誘導倍率として示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析（ｎ≧３）。（ｅ）モックマウスまたはレンチウイルス感染マウス由来の脊髄スライスの免疫染色分析により、ＧＦＡＰ＋星状膠細胞のみにＧＦＰ＋発現が特定される。２つの独立実験の代表データ、少なくとも６動物／群を用いた。（ｆ）ウェスタンブロットで分析した細胞質画分及び核画分におけるＮＦ−κＢ（Ｐ６５）、ＧＡＰＤＨ及びラミンＢ発現。ＮＦ−κＢの核への移動の程度を、核画分と細胞質画分中のＰ６５の発現間の比によって評価し、続いて、４つの独立実験に関して濃度測定的に定量化した（右パネル）。一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキー事後分析による統計分析。データは、５つの独立実験からのものである（平均及びｓ．ｅ．ｍ．）。＊Ｐ＜０．０５、及び＊＊Ｐ＜０．０１。（ｇ）ＩＦによって特定された、慢性ＥＡＥ時のＩＲＦ−１＋ＧＦＡＰ＋星状膠細胞のＣＣＬ−２またはｉＮＯＳの発現。２つの独立実験の代表データ、６動物／群を用いた。
【図１４−２】上記に記載のとおりである。
【図１４−３】上記に記載のとおりである。
【図１４−４】上記に記載のとおりである。
【図１４−５】上記に記載のとおりである。
【図１４−６】上記に記載のとおりである。
【図１４−７】上記に記載のとおりである。
【図１５−１】図１５ａ−ｂ。  ＬａｃＣｅｒは、初代軟膜食細胞及び脈絡叢細胞の転写応答に影響しない。軟膜食細胞（ａ）及び脈絡叢細胞（ｂ）をＬａｃＣｅｒ（１０μＭ）またはビヒクル対照（ビヒクル）で１時間前処理し、続いてＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間活性化するか、非処理（対照、Ｃｏｎ）のままとした。ｍＲＮＡ発現を、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析によって特定した。２つの独立実験の代表データ。
【図１５−２】上記に記載のとおりである。
【図１６】ミグルスタット治療は、慢性ＥＡＥの進行を停止する。ＮＯＤマウスをＭＯＧ３５−５５で免疫化した。ＮＯＤ  ＥＡＥの慢性期／進行期の開始時及びそれ以後、マウスをミグルスタットまたはビヒクル対照で毎日処理した。
【図１７】ミグルスタット治療により単球のＣＮＳへの動員が減少する。
【図１８】ミグルスタット治療は、Ｔ細胞分極に影響しない。
【図１９】ミグルスタット治療は、体重に影響しない。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
星状膠細胞は、ＣＮＳの発達及び機能において複数の役割を担っている１−４。ＣＮＳ炎症時の星状膠細胞には、調査対象の星状膠細胞の活性化状態、種類及び位置、関与する活性化刺激、並びに免疫応答の継続期間などの要因に応じて、有益な役割と不利益な役割が付与されている３，３２−３６。実際、星状膠細胞の不均一性が、星状膠細胞の活性化への反応に影響を及ぼす重要な要因であることが、ごく最近になって認識されるようになった３７，３８。ＧＦＡＰ高反応性星状膠細胞は、ＣＮＳ傷害及び急性ＥＡＥに反応して、白血球湿潤を調整し７，８、炎症反応を制御するが５−９、慢性ＣＮＳ炎症時のこれらの制御及び機能はよくわかっていない。
【００２５】
本明細書に記載するように、ＮＯＤ  ＥＡＥの慢性期における星状膠細胞中のＢ４ＧＡＬＴ６の上方制御により、生物活性脂質ＬａｃＣｅｒのＣＮＳレベルが増加し、このＬａｃＣｅｒがオートクライン的に作用し、ＣＮＳ炎症を増大させ、神経変性を促進する。Ｂ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６は、ＬａｃＣｅｒ合成を触媒するβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼファミリーのメンバーである１７。両方の酵素が慢性ＥＡＥ及びＭＳ時に星状膠細胞によって特に上方制御されるが、ＣＮＳ  ＬａｃＣｅｒレベルの増加、その結果としての星状膠細胞活性化及び疾患進行の要因であるのは、Ｂ４ＧＡＬＴ５ではなく、Ｂ４ＧＡＬＴ６である。これまでの研究は、Ｂ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６の異なる生物学的役割について記載している。例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ６ではなく、Ｂ４ＧＡＬＴ５は、胚発生に必須である２３，２４。Ｔｏｋｕｄａ及び同僚らは、Ｂ４ＧＡＬＴ６欠損がナイーブマウスのＣＮＳにおけるＬａｃＣｅｒシンターゼ活性の有意な減少をもたらすが、腎臓におけるＬａｃＣｅｒ合成は、Ｂ４ＧＡＬＴ５によって調節されることを最近実証した２４。総合すると、これらのデータにより、Ｂ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６のＬａｃＣｅｒシンターゼ活性の空間的及び機能的区画化が示唆される。
【００２６】
ミクログリア及びＬｙ６Ｃ高ＣＣＲ２＋炎症性単球は、ＣＮＳにおける免疫応答の主要要素であり、神経変性に多大な影響を及ぼす９，１４，１９，２１，３１。星状膠細胞は、グリア性瘢痕の形成３９からケモカイン、例えば、炎症性単球をＣＮＳに動員するＣＣＬ−２の分泌２０，２１までの多岐にわたる複数の機構によって、白血球のＣＮＳへの湿潤を制御する。本明細書で示すように、Ｂ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒの連係は、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１によるｃｃｌ２プロモータのトランス活性化、その結果としての星状膠細胞によるＣＣＬ−２産生を調節する。したがって、ＬａｃＣｅｒ合成を阻害すると、星状膠細胞によるＣＣＬ−２産生の減少と、炎症性単球のＣＮＳへの動員の有意な減少がもたらされる。Ｂ４ＧＡＬＴ６はまた、ＣＣＬ−５及びＣＸＣＬ−１０の産生を調節することが判明した。したがって、これらのデータにより、Ｂ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒ経路は、炎症性細胞のＣＮＳへの動員の重要な制御因子であるとみなされる。
【００２７】
ＣＮＳ浸潤性単球及びミクログリアは、炎症性または抗炎症性活性に関連付けられた異なる表現型を取り、Ｍ１炎症性ミクログリア及び単球は、ＭＳ及び他のＣＮＳ疾患の病因に関与すると考えられる２９，３０，４０。複数の要因がミクログリア及び単球の活性化に影響する２９，３０，４０。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、ＥＡＥ時に、Ｍ１マクロファージの分極を促進し、ミクログリアを活性化する４１。本明細書で示す通り、Ｂ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒの連係が星状膠細胞によるＧＭ−ＣＳＦの産生を調節し、その結果ミクログリア活性化を調節する。したがって、Ｔｈ１７細胞に加えて４２，４３、星状膠細胞もまた、慢性ＣＮＳ炎症時におけるＧＭ−ＣＳＦの重要な産生源を構成することがデータから示唆される。まとめると、データは、星状膠細胞によって産生されるＬａｃＣｅｒが、慢性ＣＮＳ炎症時における炎症性単球及びミクログリアの動員及び活性化を調節することを示している。
【００２８】
脂質は、微生物感染及び自己免疫における免疫応答に大きな影響を与え、免疫応答の標的または制御因子のいずれかとして作用する４４−４６。脂質特異的抗体及びＴ細胞がＭＳで特定されているが４７，４８、ＣＮＳ自己免疫における生物活性脂質の役割はほとんど知られていない。Ｓｔｅｉｎｍａｎ及び同僚らは、ミエリン鞘の脂質が自己反応性Ｔ細胞のアポトーシスを誘発し、ＥＡＥを改善することを最近報告した４４。これらの脂質のレベル減少がＭＳの脳サンプルで検出されたことから、これらの脂質がＣＮＳ特異的Ｔ細胞の制御に関与していることが示唆される。本明細書に示すＬａｃＣｅｒの炎症性作用を考慮すると、ＣＮＳにおける抗炎症性脂質と炎症性脂質のバランスの乱れがＭＳ病理に大きく関与していると思われる。したがって、ＣＮＳ脂質のプロファイリングは、ＭＳまたは他の神経変性疾患に罹患している対象を特定するために用いることができ、本明細書に記載する治療的介入の候補である。
【００２９】
重要なことに、図１Ａ〜Ｂに示す通り、急性期中の反応性星状膠細胞の枯渇は、ＥＡＥの有意な悪化を招いた（図１Ａ）が、進行期中の星状膠細胞の枯渇は、ＥＡＥの有意な改善に至った（図１Ｂ）。更に、急性ＥＡＥにおける反応性星状膠細胞の枯渇は、本明細書に示す通り、単球及びＴ細胞のＣＮＳへの動員増加をもたらすが、ＥＡＥ進行期中の枯渇は、ＣＮＳにおける白血球湿潤を減少させた（図９ｂ）のに対し、末梢Ｔ細胞応答には影響しなかった（図９ｃ、ｄ）。
【００３０】
総合すると、Ｂ４ＧＡＬＴ６によって産生されるＬａｃＣｅｒが、ＣＮＳ炎症及び神経変性を駆動し進行型ＭＳに重要な役割を果たすと考えられる、広範なプロセスを調節していることがこれらの結果により示されている。したがって、ＬａｃＣｅｒ合成の調整は、進行型ＭＳのための治療法、及び星状膠細胞の活性化が疾患病理に関与する他の神経疾患のための治療法でもある。
【００３１】
進行型ＭＳの発症を診断及び予測するための方法
神経変性疾患、特に進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）を診断するための方法、及び同疾患の発症を予測するための方法について本明細書に記載する。方法は、対象からサンプルを得ることと、サンプル中のＬａｃＣｅｒの存在及び／またはレベルを評価することと、その存在及び／またはレベルを、１つまたは複数の参照、例えば、ＬａｃＣｅｒの正常レベル（例えば、罹患していない対象のレベル）を示す対照参照、及び／または進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に関連するＬａｃＣｅｒのレベル（例えば、進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患している対象のレベル）を示す疾患参照と比較することとを含む。基準レベルを上回るＬａｃＣｅｒのレベルの存在は、対象が進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患していることを対象が示していることを示す。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＬａｃＣｅｒのレベルは、疾患参照のＬａｃＣｅｒのレベルと同等であり、対象は、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳに関連する１つまたは複数の症状を有していることから、対象は、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳに罹患している。いくつかの実施形態において、対象は、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳの明らかな徴候または症状を有していないが（例えば、再発寛解型ＭＳに罹患しているが、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳを発症している徴候を呈していない）、ＬａｃＣｅｒのレベルは、疾患参照のＬａｃＣｅｒのレベルと同等であることから、対象は、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳを発症する可能性があるか、または発症リスクが高い。いくつかの実施形態において、サンプルには、生体液、例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、精液、尿及び／もしくは脳脊髄液、または生物学的組織、例えば、ＣＮＳ病変からの生検サンプルが挙げられる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、人が進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳに罹患しているか、または進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳを発症するリスクが高いと判定された場合、次いで、治療、例えば、当技術分野において周知のものまたは本明細書に記載のものを施すことができる。
【００３４】
ＬａｃＣｅｒの存在及び／またはレベルは、当該技術分野において周知の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、液体または薄層クロマトグラフィー）及び／または質量分析法、例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いるもの、例えば、三連四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム上で実施されるもの、ＭＲＩスペクトロスコピー（例えば、Ｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２  Ｍａｙ；１１１（５）：６１４−９を参照）、バイオアッセイ（例えば、ＬａｃＣｅｒの存在下で増殖する腫瘍細胞株の増殖を測定することによる；例えば、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１０４５-１０５１（２００６）；Ｈａｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２（３１）：１１０４１−１１０４６（２００５）を参照）、Ｂ４ＧＡＬＴ６活性の検出のための酵素アッセイ、並びにイムノアッセイ、例えば、抗ＬａｃＣｅｒ抗体を用いる定量的イムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡまたは免疫蛍光法など）を使用して評価することができる。抗ＬａｃＣｅｒ抗体は、当該技術分野において周知であり、例えば、マウス抗ラクトシルセラミド抗体（クローンＴｒＡ７；ＩｇＭ）（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：６００８−６０１２（１９８４）及びＤｏｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：５６８０−５６８５（１９８８））があり、他の抗体も、例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｃｏｒｐ．から市販されている。
【００３５】
好適な基準値は、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、標準的な臨床試験法及び統計分析を用いて決定することができる。基準値は、任意の関連する形態であってよい。場合によって、参照は、有意性のあるＬａｃＣｅｒのレベル、例えば、ＬａｃＣｅｒの正常レベル、例えば、罹患していない対象もしくはＲＲＭＳに罹患しているが、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳを発症するリスクが現時点でない対象のレベルを表す対照基準レベル及び／または進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳに関連するＬａｃＣｅｒのレベル、例えば、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳに罹患しているか、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳを後に（例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内に）発症する対象のレベルを表す疾患参照の所与の値を含む。
【００３６】
所定のレベルは、中央もしくは平均などの１つのカットオフ値（閾値）、または上位もしくは下位の四分位、三分位、もしくは他のセグメントと統計的に異なるものと決定される臨床試験集団の他のセグメントの範囲を定義するレベルであってよい。信頼区間などのカットオフ値（閾値）の範囲であってよい。所定のレベルは、１つの定義群における疾患を発症するリスクまたは疾患の存在との関連が、別の定義群における疾患のリスクまたは存在よりも数倍高いまたは低い（例えば、およそ２倍、４倍、８倍、１６倍以上）場合など、比較群に基づいて確立することもできる。例えば、対象集団（例えば、対照）を、複数の群、例えば、低リスク群、中リスク群及び高リスク群、またはリスクが最小である対象の最低四分位及びリスクが最大である対象の最高四分位の四分位、またはリスクが最小である対象の第ｎ四分位の最低及びリスクが最大である対象の第ｎ四分位の最高の第ｎ四分位（すなわち、ｎは規則的に空いた間隔）に均等に（または不均等に）分けた場合の範囲であり得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、所定のレベルは、同一対象における、例えば異なる時点、例えばより早い時点でのレベルまたは発生である。
【００３８】
所定の値に関連する対象は、通常、参照対象とも呼ばれる。例えば、いくつかの実施形態において、対照参照の対象は、本明細書に記載の疾患（例えば、進行型ＭＳ、例えば、ＰＰＭＳまたはＳＭＰＳ）に罹患しておらず、進行型ＭＳ、例えば、ＰＰＭＳまたはＳＭＰＳを１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内に発症しない。ある場合には、対照がＲＲＭＳに罹患していることが望ましいことがあり、他の場合には、対照が健全な対照であることが望ましいことがある。
【００３９】
疾患参照の対象は、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳに罹患している（または発症するリスク、例えば、特定の期間内、例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内に発症するリスクが高い）人である。リスクの高さは、一般集団における対象のリスクを上回るリスクと定義される。
【００４０】
したがって、ある場合には、対象のＬａｃＣｅｒのレベルがＬａｃＣｅｒの基準レベル以上であることは、臨床状態の指標（例えば、本明細書に記載の疾患、例えばＳＰＭＳの指標）である。他の場合には、対象のＬａｃＣｅｒのレベルがＬａｃＣｅｒの基準レベル以下であることは、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳの非存在、または進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳを、例えば１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内に発症するリスクが通常であることの指標である。いくつかの実施形態において、対象のレベルが基準レベルを上回る量は、対象と対照とを区別するのに十分なものであり、任意に、対照のレベルよりも統計的に有意に大きい。対象のＬａｃＣｅｒのレベルがＬａｃＣｅｒの基準レベルに等しい場合において、「等しい」とは、ほぼ等しい（例えば、統計的に差異がない）ことを指す。
【００４１】
所定の基準値は、選択する対象（例えば、ヒト対象）の特定集団に応じて異なり得る。例えば、明らかに健康な集団、またはＲＲＭＳに罹患しているが進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳには罹患していない（及び所与の期間内、例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内に、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳを発症しない）対象の集団は、本明細書に記載の疾患に罹患している、もしくは当該疾患を発症する可能性が（例えば、所与の期間内、例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内に）ある対象の集団と比較して、ＬａｃＣｅｒレベルの異なる「正常」範囲を有することになる。したがって、選択される所与の値は、対象（例えば、ヒト対象）が属するカテゴリ（例えば、性別、年齢、健康、リスク、ＲＲＭＳまたは他の疾患の存在）が考慮され得る。適切な範囲及びカテゴリは、当業者であれば、慣用的実験以上のものを用いることなく選択することができる。
【００４２】
尤度またはリスクを特定する際に、多数の所与の値を確立することができる。
【００４３】
ＬａｃＣｅｒレベルに代わるものとして、対象のサンプル中のＡＨＲ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ９、Ｍａｒｃｏ、ＮＲＦ２、Ｔｉｍｐ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ８、ＴＮＦａまたはＶＥＧＦのｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを評価することができる。基準レベルを上回るレベルは、対象が進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＰＭＳに罹患しているまたは進行型ＭＳを発症するリスクがあることを示す。ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定するには、多数の方法が当該技術分野において周知である。タンパク質の存在及び／またはレベルは、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、定量的イムノアッセイ法を用いて評価することができる。いくつかの実施形態において、ハイスループット法、例えば、当該技術分野において周知であるタンパク質チップまたは遺伝子チップ（例えば、Ｃｈ．１２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｉｎ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｍｏｄｅｒｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９９９，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｅｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｃｈｕ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７：２１７−２１８；ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８９（５４８５）：１７６０−１７６３；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００２；Ｈａｒｄｉｍａｎ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｎｕｔｓ＆Ｂｏｌｔｓ，ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ，２００３を参照）を、タンパク質またはｍＲＮＡの存在及び／またはレベルを検出するために用いることができる。
【００４４】
治療方法
本明細書に記載の方法は、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤、例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ６及び／またはグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）シンターゼの阻害剤を活性物質として用いる、神経疾患、すなわち、星状膠細胞の機能障害に関連する神経疾患の治療のための方法を含む。図１Ａ〜Ｂに示す通り、急性期中の反応性星状膠細胞の枯渇は、ＥＡＥの有意な悪化を招いた（図１Ａ）が、進行期中の星状膠細胞の枯渇は、ＥＡＥの有意な改善に至った（図１Ｂ）。したがって、いくつかの実施形態において、疾患は、進行型ＭＳ、例えば、ＳＰＭＳまたはＰＰＭＳであり、ＲＲＭＳではない。あるいは、疾患は、別の神経変性病、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アレキサンダー病、ハンチントン病もしくはレット病（例えば、Ｍａｒａｇａｋｉｓ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００６）２，６７９−６８９を参照）、または脳及び脊髄傷害であり得る。星状膠細胞の機能障害については、例えば、Ｍａｒａｇａｋｉｓ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００６）２，６７９−６８９に記載されている。
【００４５】
いくつかの実施形態において、人が進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳに罹患しているか、または進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳを発症するリスクが高いか、またはＬａｃＣｅｒ合成のレベルが高いと判定された場合、次いで、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤の投与を含む治療を施すことができる。したがって、これらの方法は、対象からサンプルを得ることと、サンプル中のＬａｃＣｅｒの存在及び／またはレベルを評価することと、その存在及び／またはレベルを、１つまたは複数の参照、例えば、ＬａｃＣｅｒの正常レベル（例えば、罹患していない対象のレベル）を表す対照参照、及び／または進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に関連するＬａｃＣｅｒのレベル（例えば、進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患している対象のレベル）を表す疾患参照と比較することとを含む。基準レベルを上回るＬａｃＣｅｒのレベルの存在は、対象が進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患しており、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤で治療しなければならないことを対象が示していることを示す。これらの方法はまた、ＧｌｃＣｅｒシンターゼの阻害剤での治療による利益を受けるかどうかを予測するために用いることができ、基準レベルを上回るＬａｃＣｅｒのレベルを有する対象は、基準レベルを下回るＬａｃＣｅｒレベルを有する対象よりもＬａｃＣｅｒ合成阻害剤での治療による利益を得る傾向が高い。加えて、方法は、対象のための治療を選択するために用いることができ、基準レベルを上回るＬａｃＣｅｒレベルを有する対象のためにＬａｃＣｅｒ合成阻害剤での治療が選択される。いくつかの実施形態において、対象は、進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳに関連する１つもしくは複数の症状を有するか、かつ／または対象は、ＭＳ、例えば進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳもしくはＳＭＰＳの診断を受けたか、もしくはＲＲＭＳの診断を以前受けたが進行型ＭＳに移行する疑いがある。
【００４６】
一般に、方法は、治療的有効量の、本明細書に記載するＧｌｃＣｅｒシンターゼの阻害剤を、治療の必要があるか、または治療の必要があると判定された対象に投与することを含む。本文脈中で使用される場合、「治療する」とは、星状膠細胞の活性化に関連する疾患の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。治療は、１つまたは複数のＭＳの症状、例えば、抑鬱及び疲労、膀胱機能障害、痙縮、疼痛、運動失調並びに企図振戦の低減をもたらすことができる。治療的有効量は、急性エピソードの発症を防止する、または急性エピソードの継続期間を短縮する、または１つもしくは複数の症状、例えば、熱感受性、核間性眼筋麻痺、視神経炎及びレルミット徴候の重症度を低減するために十分な量であり得る。いくつかの実施形態において、治療的有効量は、対象の脳、視神経及び脊髄のうちの１つまたは複数における脱髄した病変（例えば、ＭＲＩで示されるもの）の発現を防止する、その成長（すなわち、サイズ増大）を遅延もしくは防止する、または治癒を促進するために十分な量である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、例えば、ＧｌｃＣｅｒシンターゼの阻害剤が投与される場合、疾患は、ＭＳ、例えば進行型ＭＳ、例えばＰＰＭＳまたはＳＭＰＳであり、いくつかの実施形態において、疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ランドリー・ギラン・バレー・ストロール症候群、ＲＲＭＳ、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）関連認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳傷害または脊髄疾患ではない。いくつかの実施形態において、例えば、ＧｌｃＣｅｒシンターゼの阻害剤が投与される場合、方法は、Ｓ−ニトログルタチオン（ＧＳＮＯ）、Ｌ−２−オキソ−チアゾリジン４−カルボキシレート（Ｐｒｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはＮ−アセチルグルタチオンなどのグルタチオン供与体を活性物質として投与することを含まない。
【００４８】
再発寛解型及び進行型ＭＳ
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患である。ＭＳは、通常、ＣＮＳにおける病変によって引き起こされる再発型または慢性進行型神経機能障害を臨床的な特徴とする。病理学上、病変は、脳、視神経及び脊髄に影響を及ぼす複数の脱髄領域を含む。根元的な病因は明確ではないが、ＭＳは、少なくとも部分的には自己免疫性または免疫介在性疾患であると広く考えられている。
【００４９】
患者の８５％で、ＭＳは、初期に、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する急性自己免疫攻撃に続いて完全な回復が見られる、再発寛解型の過程（ＲＲＭＳ）を辿る（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｅｓ，Ｌａｎｃｅｔ  ３７２，１５０２−１５１７（２００８））。ＲＲＭＳ患者の大多数は、神経障害の進行性の不可逆的な蓄積を特徴とする二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を引き続き発症する（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６））。ＳＰＭＳを特徴付ける進行性不可逆性障害は、新たな炎症性病変の不在下で生じることから、この段階のＭＳでは他の機構が関与している可能性が示唆される（Ｒｏｖａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ５，３４３−３５４（２００６））。いくつかの治療がＲＲＭＳに対して有効な効果を示すが、通常、ＳＰＭＳに対しては効果がなく、ＳＰＭＳへの移行をモニタするための利用可能なマーカもない。実際、適応性炎症反応を停止させる治療は、ＲＲＭＳの管理に対して有効な効果を示すが、通常、ＳＰＭＳでは効果がない（Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉｅｇｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，９０９−９２５（２００８））。したがって、進行型ＭＳのための新しい治療法及びＲＲＭＳからＳＰＭＳへの移行をモニタするためのバイオマーカを特定するために、ＳＰＭＳへの移行に関与するプロセスを特徴付けることは重要である。
【００５０】
二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）は、国際的に認識されている４つの型の多発性硬化症（その他は、再発／寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症及び進行型再発多発性硬化症）の１つであり、度重なる再発並びに軽微な寛解及び停滞期の有無にかかわらず、臨床的な神経傷害の着実な進行を特徴とする。ＳＰＭＳを発症する人々は、一般に、２年〜４０年以上継続し得る、ある期間の再発／寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）を以前に罹患している。場合によって、対象は、ＳＰＭＳの発症後に何回かの再発及び寛解を経験し得るが、これらは時間の経過とともに頻度が少なくなる傾向にある。
【００５１】
一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）は、比較的珍しく（ＭＳ患者人口の約１５％）、疾患の発症後の緩慢な進行性機能喪失を特徴とする。大部分のＰＰＭＳ患者は、進行性ミエロパシーまたは進行性小脳機能障害を有する。
【００５２】
ＭＳの診断及びサブタイプの判定は、当該技術分野において周知の方法、例えば、空間的及び時間的に広がったＣＮＳ病変の存在、並びに代替診断の除外に基づいて行うことができる（Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｒｅｐｏｒｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１２２：１９６５；５５２−５６８）。あるいは、熱感受性、核間性眼筋麻痺、視神経炎及びレルミット徴候を含む、臨床的徴候及び症状の存在に基づいて診断を行うことができる（例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００１；５０：１２１；及びＰｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：２００５  Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  “ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ．”  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００５；５８：８４０−８４６を参照）。
【００５３】
ＭＳの障害を定量化するための方法には、Ｋｕｒｔｚｋｅ総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）、ＭＲＩスキャン、Ｓｃｒｉｐｐｓ神経症状評価尺度（ＳＮＲＳ）、Ｋｒｕｐｐ疲労重症度尺度（ＦＳＳ）、無能力状態尺度（ＩＳＳ）、機能的自立度評価法（ＦＩＭ）、歩行指数（ＡＩ）、ケンブリッジ多発性硬化症基礎スコア（ＣＡＭＢＳ）、多発性硬化症の機能評価（ＦＡＭＳ）、気分状態特性尺度（ＰＯＭＳ）及び疾病影響尺度（ＳＩＰ）が挙げられる。
【００５４】
ＭＳ及び進行型ＭＳ、例えば、ＰＰＭＳまたはＳＭＰＳの診断及び治療に関する更なる情報については、当該技術分野にて、例えば、Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００９  Ｏｃｔ−Ｄｅｃ；１２（４）：２２６−２３０；及びＳｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（Ｄｅｍｏｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，２００３）（例えば、Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｖ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３２，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”）に認められる。
【００５５】
標的とするＬａｃＣｅｒ合成：Ｂ４ＧＡＬＴ６及びＧｌｃＣｅｒ合成
本明細書に記載の方法は、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤、例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ６及び／もしくはグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）シンターゼの阻害剤、またはグルコセレブロシダーゼの活性化剤を用いる、進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）の治療のための方法を含む。方法は、進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患している対象を特定することと、治療的有効量の、ＬａｃＣｅｒ合成の特定の阻害剤、例えば、Ｂ４ＧＡＬＴ６及び／またはＧｌｃＣｅｒ合成の特定の阻害剤を含む治療用組成物を、進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患している対象に投与することとを含む。
【００５６】
ＧｌｃＣｅｒシンターゼの小分子阻害剤
ＧｌｃＣｅｒシンターゼの阻害剤には小分子が挙げられ、これらの大部分は、酵素の活性部位に結合し基質の結合を妨げる酵素基質の類似体である。これらの阻害剤には、セラミド類似体（例えば、米国特許第６，５６９，８８９号、同第６，２５５，３３６号、同第５，９１６，９１１号、同第５，３０２，６０９号；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２１）：１４６６２（１９９９）；Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１１：１９１（１９９２）；Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２８：５６５（１９８７）；Ｓｈａｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２９６８（１９９１）；及びＢｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄ．，１９９３，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を参照）及び糖類似体（例えば、米国特許第６，６６０，７４９号、同第６，６１０，７０３号、同第５，４７２，９６９号、同第５，５２５，６１６号；Ｏｖｅｒｋｌｅｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４１）：２６５２２（１９９８）を参照）（同じく、ＵＳ２０１２００２２１２６，ＵＳ２０１３００４０９５３，ＵＳ２０１３０２２５５７３，ＵＳ２００７０１３５４８７，５，７００，８２６及び５，８４０，７２１；並びにＫｏｌｔｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｎｏｖ  １５；２１（２２）：６７７３−７を参照）が挙げられる。例としては、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−ノナノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−オクタノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、Ｄ−トレオ−（１Ｒ，２Ｒ）−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）及びＤ−ＰＤＭＰを含むその類似体（例えば、Ｈｉｌｌａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ａｕｇ  １；１４（１５）：５２７３−８４を参照）、Ｄ−トレオ−ＥｔＤＯ−Ｐ４、（（１Ｒ，２Ｒ）−ノナン酸−（２’，３’−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ダイオキシン−６’−イル）−２−ヒドロキシ−１−ピロリジン−１−イルメチル−エチル］−アミド−Ｌ−酒石酸塩、ＡＭＰ−ＤＮＭ、ＣＣＧ０２０３５８６（１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）アセトアミド）、Ｇｅｎｚ−１１２６３８（エリグルスタット）、Ｇｅｎｚ−５２９４６８、ＧＺ−１６１、Ｇｅｎｚ−６８２４５２、ＥＸＥＬ−０３４６（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｍａｙ  １０；５５（９）：４３２２−３５）、ＯＧＴ２３７８、Ｇｅｎｚ−１２３３４６、デオキシノジリマイシン系ＧＣＳ阻害剤（例えば、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ミグルスタットとしても知られるＮＢ−ＤＮＪ）、Ｎ−（５’−アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンチル−１−デオキシノジリマイシン（ＡＭＰ−ＤＮＭ）、または長アルキル側鎖を有するａ１−デオキシノジリマイシン、例えば、アルキル鎖中に９個〜約２０個の炭素原子を有する１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールの長鎖Ｎ−アルキル誘導体が上げられる。したがって、Ｎ−アルキル置換基は、例えば、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、シス−１１−ヘキサデセニル、オクタデシル、シス−１３−オクタデセニル及びエイコシルであり得る。ＵＳ６，６１０，７０３を参照されたい。ＰＰＭＰ（ＤＬ−トレオ−１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）については、ＵＳ２０１３０２１７６９１及びＵＳ２００５０１０１６７４を参照されたい。
【００５７】
本方法において有用である更なる阻害剤には、８，３８９，５１７；２０１１０１６６１３４；２００７０２０３２２３；２００５０２２２２４４；２０１３００９５０８９；７，３３５，６８１；７，２５３，１８５；７，１４８，２５１；６，９１６，８０２；６，８９０，９４９；６，０５１，５９８；６，０４０，３３２；６，０３０，９９５；５，９５２，３７０；５，９４５，４４２；２００９０２４７５５９；２００６０１１１４００；２００６００５８３４９；２００６００７４１０７；８，５５７，８４４；２０１００２０４１６２；８，２５２，７８９；２０１３００１２５３９及び２００９０１６３５００に記載されているものが挙げられる。
【００５８】
Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする阻害核酸
Ｂ４ＧＡＬＴ６の特定の阻害剤には、Ｂ４ＧＡＬＴ６遺伝子またはｍＲＮＡを標的にする阻害核酸が挙げられ、ヒトＢ４ＧＡＬＴ６  ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋにて、アクセッション番号ＮＭ＿００４７７５．３であり、ゲノム配列は、ＮＣ＿００００１８．１０である。本方法及び本組成物において有用な阻害核酸には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などの一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、修飾塩基／ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンタゴｍｉｒ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び標的Ｂ４ＧＡＬＴ６核酸の少なくとも一部にハイブリダイズし、その機能を調整する他のオリゴマー化合物またはオリゴヌクレオチド模倣物が挙げられる。いくつかの実施形態において、阻害核酸には、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロ干渉（ｍｉＲＮＡ）、小分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）もしくは小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小ＲＮＡ誘導遺伝子活性化（ＲＮＡａ）、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。阻害核酸は、例えば、修飾ヌクレオチド（例えば、ロックド核酸）または主鎖（例えば、リン原子を含まない主鎖）を含むように修飾してもよいし、ミックスマーまたはギャップマーによるものでもよい（例えば、ＷＯ２０１３／００６６１９を参照）。Ｂ４ＧＡＬＴ６に対して指向された多数のｓｉＲＮＡが、例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｌａｂｏｍｅ、Ａｂｎｏｖａ及びＱｉａｇｅｎから市販されている。
【００５９】
本明細書に記載の方法を実施するために用いられる阻害核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはこれらのハイブリッドのいずれであれ、遺伝子組み換えされた、増幅された及び／または組み換えでもしくは合成的に発現させたもしくは作製された各種源から分離することができる。組み換え核酸配列は、個別に分離またはクローン化することができ、所望の活性について試験を行うことができる。任意の組み換え発現系を用いることができ、例えば、インビトロ、細菌、真菌、哺乳動物、酵母菌、昆虫または植物細胞の各発現系が挙げられる。
【００６０】
核酸配列は、送達ベクターに挿入し、ベクター内の転写ユニットから発現させることができる。組み換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ベクター構築物の作製は、当該技術分野において周知である任意の好適な遺伝子工学技術、例えば、限定するものではないが、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製及びＤＮＡ塩基配列決定の標準的な技術を用いて実施することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．”（１９８９）），Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．（１９９７））及び“ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ  Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２０００））に記載されているものがある。当業者には明らかであるように、本発明の核酸を細胞に導入するために、種々の好適なベクターが利用可能である。核酸を送達するのに適したベクターの選択、及び選択した発現ベクターを細胞に挿入するための条件の最適化は、過度の実験をする必要のない当業者の技術範囲内である。ウイルスベクターは、パッケージング細胞中の組み換えウイルスを産生するための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、ウイルス骨格に基づいて構築することができ、例えば、限定するものではないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルスまたはアルファウイルスが挙げられる。本発明の核酸を発現することができる組み換えベクターは、本明細書に記載するように送達することができ、標的細胞（例えば、安定した形質転換体）中に存続することができる。
【００６１】
阻害核酸は、周知の化学合成技術によってインビトロで合成することができ、例えば、Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているものがある。
【００６２】
本明細書に記載の方法にて用いるための阻害核酸は、１つまたは複数の修飾を含み得、例えば、修飾の導入、例えば、ヌクレオチド修飾などによって、核酸分解に対して安定化することができる。例えば、阻害核酸は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に、ホスホロチオエートの少なくとも第１、第２または第３のヌクレオチド間連結を含み得る。別の例として、阻害核酸には、２’−修飾ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を挙げることができる。別の例として、阻害核酸は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態では、全てのヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾を含む。いくつかの実施形態において、阻害核酸は、「ロック」されており、すなわち、リボース環が、２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子を連結するメチレン架橋によって「ロック」されている核酸類似体を含む（例えば、Ｋａｕｐｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  ２（３）：２８７−２９０（２００５）；Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０（５０）：１３２５２−１３２５３（１９９８）を参照）。更なる修飾については、ＵＳ２０１００００４３２０、ＵＳ２００９０２９８９１６、及びＵＳ２００９０１４３３２６を参照されたい。
【００６３】
阻害核酸の操作技術、例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いるランダムプライマー標識、ニックトランスレーション、増幅）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献及び特許文献に十分記載されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄ．（２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２０１０）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい。
【００６４】
Ｂ４ＧＡＬＴ６に結合し阻害する抗体
Ｂ４ＧＡＬＴ６に結合し、その活性を阻害する（すなわち、ＬａｃＣｅｒ合成を阻害する）抗体も用いることができ、ヒトＢ４ＧＡＬＴ６タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにて、アクセッション番号ＮＰ−００４７６６．２である。本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子またはその抗原結合部分を指す。免疫グロブリン分子の抗原結合部分の例には、抗原に結合する能力を保持する、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体もしくはヒト化抗体、完全ヒト抗体、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体、または一本鎖抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を結合することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆｃ受容体を結合する能力が低いか、またはその能力がない。例えば、抗体は、アイソタイプもしくはサブタイプ、断片または他の変異体であり得、例えば、突然変異させたまたは欠失させたＦｃ受容体結合領域を有し、Ｆｃ受容体への結合を支援しない。抗体及びその断片を製造するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ．ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８３）；Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｋａｓｅｒ，Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｅｃ  １３，２００６）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄuｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  １（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２ｎｄ  ｅｄ．，Ｍａｙ  ２１，２０１０）；Ｌｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｎｏｖ  １０，２０１０）；及びＤuｂｅｌ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；１  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ７，２０１０）を参照されたい。Ｂ４ＧＡＬＴ６に結合する抗体は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＳＢｉｏ、Ａｂｃａｍ及び／またはＣｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ．）から市販されており、当業者であれば、抗体を容易に作製または取得することができ、Ｂ４ＧＡＬＴ６を発現する細胞中でＬａｃＣｅｒ合成を阻害する抗体の能力を試験することができる。
【００６５】
グルコセレブロシダーゼの活性化剤
本明細書に記載の他の化合物に加えてまたは代替物として、グルコセレブロシダーゼの活性化剤も用いることができる。当該技術分野において、ＮＣＧＣ００１８２１８６（５−シクロプロピリデン−７−（ジフルオロメチル）−Ｎ−（２−フェニルスルファニルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−カルボキサミド）及びＮＣＧＣ００１８２５１０（［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル］２−［２−（４−ブロモアニリノ）−２−オキソエトキシ］ベンゾエート）（例えば、Ｇｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（１）：ｅ２９８６１を参照）、またはサポシンＣまたはホスファチジルセリン（例えば、  Ｓａｌｖｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００５）３９０（９５−１０３）を参照）を含む、活性化剤が知られている。サポシンＣは、８．５ｋＤａのスフィンゴ脂質活性化タンパク質であり、リソソームグルコセレブロシダーゼを活性化する。２つの機能ドメインが特定されており、各ドメインは、活性化部位に隣接するまたは部分的に重複する結合部位を含んでいる。ドメイン１はアミノ酸位置６〜３４内に位置し、ドメイン２はアミノ酸４１〜６０である。活性化部位は、残基２７〜３４及び４１〜４９にわたり、結合部位は、残基６〜２７及び４５〜６０からなる。ドメイン１または２のいずれかの配列を含むペプチドは、完全長合成サポシンＣの活性の９０％を呈した（Ｙｏｎｅｓｈｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２０１０  Ａｕｇ  １；８８（１０）：２１１８−３４；Ｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９５  Ａｐｒ；４（４）：７５６−６４；Ｗｅｉｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９３  Ｆａｌｌ；４（３）：１６１−７２；Ｆｕｊｉｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．１９８５  Ｍａｒ  １５；１４６（２−３）：１４７−５６；Ｚｓｃｈｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  Ｍａｙ  １５；２２２（１）：８３−９０参照）。したがって、サポシンＣまたはその活性断片（例えば、ドメイン１または２を含有するもの）を用いることができる。ヒトサポシンＣの配列は、次の通りである（ドメイン１及び２を[ ]で括って示す）。
ＳＤＶＹＣ[ＥＶＣＥＦＬＶＫＥＶＴＫＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬＤＡＦＤＫ]ＭＣＳＫＬＰ[ＫＳＬＳＥＥＣＱＥＶＶＤＴＹＧＳＳＩＬＳ]ＩＬＬＥＥＶＳＰ’ＥＬＶＣＳＭＬＨＬＣＳＧ（配列番号１）
【００６６】
進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）を有する対象の特定
いくつかの実施形態において、方法は、例えば、進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）の１つまたは複数の指標についてスクリーニングすることによって、対象をＳＰＭＳについてスクリーニングすることを含む。進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）を有する対象を特定するための方法は、当該技術分野において知られており、本明細書で記載するようにＬａｃＣｅｒレベルの増加を検出することによって対象を特定することも含み得る。いくつかの実施形態において、ＳＰＭＳは、ＭＳを有する対象の障害（通常は運動／小脳機能）が３．５以上のＥＤＳＳに進行することによって特定される。ＳＰＭＳはまた、初期の再発寛解型の経過に続いて、６ヶ月以上の再発に関係ない症状の増悪の存在で診断することができる。ＰＰＭＳは、例えば、疾患発症後の障害の進行（例えば、改善の期間がない）、例えば、脳ＭＲＩ陽性、脊髄ＭＲＩ陽性及びＣＳＦの陽性所見のうちの少なくとも２つを伴う最低１年の疾患進行に基づいて診断することができる。
【００６７】
方法は、対象における進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）の存在、または対象における進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）の発症の可能性（例えば、特定の期間内、例えば、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内）を、例えば、本明細書に記載の方法を用いて検出することと、対象が進行型多発性硬化症（例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳ）に罹患しているまたは発症する可能性があることに基づいて、対象を選択することを含む。
【００６８】
一般に、本明細書に記載の方法は、任意の哺乳動物、好ましくは、ヒトに実施することができる。
【００６９】
標準的治療
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療は、ＭＳのための標準的治療、例えば、コルチコステロイド療法、インターフェロンβ−１ｂ、グラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン、フィンゴリモド、テリフルノミド、フマル酸ジメチル、ナタリズマブ、カンナビスまたはこれらの組み合わせの投与と組み合わせて施される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療は、１つまたは複数のＭＳの症状、例えば、抑鬱及び疲労、膀胱機能障害、痙縮、疼痛、運動失調並びに企図振戦のための治療と組み合わせて施され、かかる治療には、薬物、運動及び適切な機能回復訓練が含まれる。ＭＳの診断及び治療に関する更なる情報は、ｎａｔｉｏｎａｌｍｓｓｏｃｉｅｔｙ．ｏｒｇのワールドワイドウェブ上のＮａｔｉｏｎａｌ  ＭＳ  Ｓｏｃｉｅｔｙのウェブサイトで確認することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において、例えば、基準レベルを上回るＧｌｃＣｅのレベルを有することから、対象がＳＰＭＳを有するか、または特定の期間内にＳＰＭＳを発症する可能性があると特定された場合、例えば、ミトキサントロンまたはナタリズマブを含む、進行型ＭＳのための治療を施す。
【００７１】
医薬組成物
本明細書に記載の方法は、ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を活性成分として含む、医薬組成物の製造及びその使用を含む。また医薬組成物自体も含まれる。
【００７２】
医薬組成物は、通常、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容可能な担体」という言葉は、薬剤の投与と適合性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを包含する。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込むことができる。
【００７３】
医薬組成物は、通常、目的の投与経路に適合するように製剤化される。本方法にて特に有用である投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内）、髄腔内、経口及び経鼻または鼻腔内（例えば、滴剤または吸入での投与による）投与が挙げられる。血液脳関門を通過しない化合物については、例えば、埋め込んだ髄腔内ポンプ（例えば、Ｂｏｒｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ  ２０１４；９５：１０３２−８；Ｐｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１５１７−２１（１９８９）；及びＲｅｚａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ２０１３；１６：４１５−４１７を参照）またはナノ粒子、例えば金ナノ粒子（例えば、グルコース被覆金ナノ粒子、例えばＧｒｏｍｎｉｃｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（１２）：ｅ８１０４３を参照）を用いて、ＣＮＳまたはＣＳＦへの直接送達を用いることができる。好適な医薬組成物を製剤化するための方法及び送達するための方法については、当該技術分野において知られており、例えば、Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ）；ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）の書籍シリーズを参照されたい。
【００７４】
注入用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または滅菌した注入可能な溶液もしくは分散体を即時調製するための分散体及び滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易に注入可能である程度に流動的であるべきである。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散体の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを組成物内に含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【００７５】
殺菌した注入可能な溶液は、活性化合物を必要な量で、上述した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散体は、塩基性分散媒及び上述のものから必要な他の成分を含む滅菌賦形剤に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌した注入可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、予め滅菌濾過した当該溶液から、活性成分の粉末と任意の所望の追加成分を合わせた粉末が得られる。
【００７６】
経口投与の場合、組成物は、不活性希釈剤または可食担体ともに製剤化することができる。治療的な経口投与の目的では、活性化合物を賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。口腔用組成物もまた、マウスウォッシュとして使用するために流体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性のある結合剤及び／または補助剤物質を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤などは、微結晶セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはコーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、もしくはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバなどの着香剤の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る。
【００７７】
吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサ、またはネブライザによるエアゾールスプレーの形態で供給され得る。このような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記載のものが挙げられる。
【００７８】
核酸であるまたは核酸を含む治療用化合物は、ＤＮＡワクチンなどの核酸薬剤の投与に適した任意の方法によって投与することができる。これらの方法には、遺伝子銃、バイオインジェクタ及び皮膚貼付剤、並びに針を用いない方法、例えば、米国特許第６，１９４，３８９号に記載されている微粒子ＤＮＡワクチン技術、及び米国特許第６，１６８，５８７号に記載されている粉末状ワクチンを用いる哺乳動物の経皮的無針ワクチン接種が挙げられる。更に、特にＨａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０（１９９８）に記載されているように、鼻腔内送達も可能である。
【００７９】
リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号に記載のもの）及びマイクロカプセル化を用いて、本明細書に記載の化合物を送達することもできる。生分解性微粒子送達系も用いることができる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号に記載のもの）。
【００８０】
一実施形態において、治療用化合物は、インプラント及びマイクロカプセル送達系を含む、制御放出製剤などの、治療用化合物が身体から急速に排泄されるのを防ぐ担体とともに調製される。エチレンビニルアセタート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤は、標準的な技術を用いて調製してもよいし、例えば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入してもよい。また、リポソーム懸濁液（選択した細胞に標的化したリポソームを、細胞抗原に対するモノクローナル抗体とともに含む）を薬学的に許容可能な担体として使用することもできる。これらは、当業者に知られた方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製することができる。
【００８１】
医薬組成物は、投与に関する説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサ、例えば、単回用量ディスペンサ中に含めることができる。容器、パックまたはディスペンサは、例えば、１日、１週間または１ヶ月の治療に対して十分な単回用量を含み得る、キットの一部として包含され得る。
【００８２】
用量
化合物の用量、毒性及び治療有効性は、例えば、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を特定するための手法によって、決定することができる。毒性と治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。治療指数の高い化合物が好ましい。有毒な副作用を呈する化合物を用いてもよいが、冒されていない細胞に対する潜在的損傷を最小限に抑えるために、当該化合物を罹患組織の部位に対して標的化し、これによって副作用を低減する送達系を設計するように注意を払うべきである。
【００８３】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を定式化する際に用いることができる。当該化合物の用量は、好ましくは、毒性をほどんどまたは全く有さないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。用量は、用いられる剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用されるいずれの化合物に関しても、治療的有効量は、初めに細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養にて決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半数の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルにおける用量を定式化することができる。このような情報は、ヒトにて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、血漿中レベルを測定することができる。
【００８４】
「有効量」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。例えば、治療量は、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患の発症または疾患の症状を防ぐために必要な量である予防的有効量と同じであっても異なっていてもよい。有効量は、１つまたは複数の投与、適用または用量にて適用することができる。組成物の治療的有効量は、選択する組成物に左右される。組成物は、１日１回以上から１週間１回以上まで投与することができる（１日おきに１回を含む）。当業者であれば、特定の要因、例えば、限定するものではないが、対象の疾患または障害の重症度、以前の治療、全般的な健康及び／または年齢、並びに他の疾患の存在が、対象を効果的に治療するために必要とされる用量及びタイミングに影響し得ることを理解するであろう。更に、治療的有効量の本明細書に記載の組成物を用いた対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例で本発明について更に記載するが、実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００８６】
材料及び方法
以下の材料及び方法を以下に記載する実施例で使用した。
【００８７】
動物。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ（ＮＯＤ）、ＩＲＦ−１欠損マウス及びＧＦＡＰ−ＨＳＶ−ＴＫ  マウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。ヘテロ接合体ＧＦＡＰ−ＨＳＶ−ＴＫを持つＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて、ＧＦＡＰＴＫまたはＷＴ  Ｆ１のいずれかであるＦ１同腹仔を作製した。Ｔｇ（ＧＦＰ−ｈＧＦＡＰ）ＦＶＢトランスジェニックマウスについては記載されている４９。全ての動物は、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの病原体フリー施設に維持した。全ての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌが規定したガイドラインに従って実施した。
【００８８】
ＥＡＥ誘導及び処置。ＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で乳化させたＭＯＧ３５−５５ペプチドを１マウス当たり１００μｇ（Ｃ５７ＢＬ／６及びＦ１マウス）または１５０μｇ（ＮＯＤマウス）の用量で用いて雌マウスを免疫化し、続いて、０日及び２日に百日咳毒素（１マウス当たり１５０ｎｇ；Ｌｉｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を投与することによって、記載の通り１４ＥＡＥを誘導した。ＥＡＥの臨床的徴候を次のスコアに従って評価した。０：疾患の徴候なし、１：尾の緊張損失、２：後肢の不全麻痺、３：後肢の完全麻痺、４：四肢麻痺、５：瀕死状態。ＧＣＶ（ＡＰＰ薬剤）またはビヒクル対照（ＰＢＳ）を、ＥＡＥ誘導の７日前から毎日投与し（２５ｍｇ／ｋｇ、皮下）、急性期の期間中（１５日）または進行性／慢性期間中（３０〜５０日）のみ継続した。ＥＡＥ誘導中のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１マウス当たり１０μｇの用量で、ＬａｃＣｅｒ（Ｍａｔｒｅｙａ  ＬＬＣ）またはビヒクル（１０％ＤＭＳＯ）をＭＯＧ３５−５５ペプチドとともに投与し、その後は３日ごとに１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ＮＯＤマウスへのＬａｃＣｅｒまたはビヒクル投与は、疾患誘導後３５日から開始し、１マウス当たり１０μｇの用量で３日ごとに１回ｉ．ｐ．投与した。ＰＤＭＰ（Ｍａｔｒｅｙａ  ＬＬＣ）またはビヒクル対照（５％Ｔｗｅｅｎ−８０）を、ＥＡＥ誘導後４０日から、実験期間中２０ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回ｉ．ｐ．投与した。
【００８９】
免疫蛍光法（ＩＦ）。０．１Ｍ  ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで動物を灌流した。３０％スクロースを加えた０．１Ｍ  ＰＢＳ中で組織を凍結保護し、クライオスタットで１０μｍ厚の切片に切り出した。５％ヤギ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＭ．Ｏ．Ｍ．（商標）マウスＩｇブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で、切片を固定し、次の抗体：ＧＦＡＰ（ニワトリ、１：５００、Ａｂｃａｍ）、ＧＦＰ（ニワトリ、１：５００、Ａｂｃａｍ）、ＩＢＡ−１（ウサギ、１：２００、Ｄａｋｏ）、Ｂ４ＧＡＬＴ６（ウサギ、１：１００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）、ｉＮＯＳ［マウス（４Ｅ５）、１：１００、ｉＮＯＳ］、ＣＣＬ２［マウス（２Ｄ８）、１：１００、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、Ｎｅｓｔｉｎ［マウス（ｒａｔ−４０１）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］、ＣＤ３１［マウス（ＲＭ００３２−１Ｄ１２）、１：１００、Ａｂｃａｍ］、及びＩＲＦ−１（ウサギ、１：２５０、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日の切片を３回洗浄し、適切な蛍光色素結合ヤギ二次Ａｂ（１：１０００；Ａｂｃａｍ）とともに室温で１時間インキュベートした。１群当たり６匹の動物を用いた。ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて画像を撮影した。
【００９０】
成体マウスＣＮＳからの細胞の分離。先の記載５０の通りに、軽微な修正を加えて、ＣＮＳから単核細胞を分離した。ナイーブ及びＥＡＥマウスを安楽死させ、次いで、氷冷滅菌ＰＢＳを用いて左心室からの灌流にかけた。その後、脳及び脊髄を摘出し、細かく刻み、０．０５％（ｗ／ｖ）ＩＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、０．５％Ｄｉｓｐａｓｅ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉ、ＨＢＳＳ中２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を用いて、３７℃で３０分間、酵素的に分解して、単一細胞の懸濁液を作製した。酵素を、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む２０ｍｌのＣａ２＋／Ｍｇ２＋不含ＨＢＳＳで不活性にした。消化した組織を粉砕しし、１００μＭのセルストレーナに通した。細胞を遠心分離にかけ、３０％等張Ｐｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び４０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉ中に再懸濁させ、７０％等張Ｐｅｒｃｏｌｌで重層し、１０００×ｇで４°Ｃにて２５分間、遠心分離にかけた。７０％〜３０％の中間相の細胞を収集し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａによって分取した。
【００９１】
星状膠細胞、ミクログリア及び単球のＦＡＣＳソーティング。これらの精製手順は、先に記載された分離及び精製プロトコルに基づく５０，５１。分離したＣＮＳ細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２とともに氷上で１５分間インキュベートし、Ｆｃ受容体をブロックし、蛍光色素結合抗体でＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ４５（９０）、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＧＫ１．５）及びＬｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）並びにビオチン結合ＧＳＬＩ−イソレクチンＢ４（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）、ＣＤ１０５（Ｎ４１８）、ＣＤ１４０ａ（ＡＰＡ５）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、Ｏ４（Ｏ４、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）及びＣＤ１９（ｅＢｉｏ１Ｄ３）並びにマウスＭＯＧ認識非結合抗体（８−１８Ｃ５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｏ１（Ｏ１）並びにガラクトセレブロシド（ｍＧｌａＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を染色した。全ての抗体は、別途の記載がない限り、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから得た（該当する場合、クローン番号を括弧内に示す）。細胞を洗浄し、ＰＥ結合ストレプトアビジン及びＲ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片のヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を４℃で暗所にて２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、死細胞を除外するために、７−ＡＡＤまたはＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０（細胞を細胞内染色に用いる場合）とともにインキュベートし（図Ｓ３Ａ）、次に従って分取した。ミクログリアは、ＣＤ１１ｂ＋細胞で、ＣＤ４５発現が低く、Ｌｙ６Ｃが低いもの（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ４５低／Ｌｙ６Ｃ低）として分取し、炎症性単球はＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｃ高のものとした５２。Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞として分取した。リンパ球、ミクログリア、単球（図Ｓ３Ｂ）及び希突起膠細胞及びリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞）（図Ｓ３Ｃ）を枯渇させた後、星状膠細胞を分離した。分取した細胞は、ＦＡＣＳ分析（図Ｓ３Ｄ）によって、８５％超がＧＦＡＰ＋であることがわかった。星状膠細胞マーカである４４，５１ｇｆａｐ、ａｌｄｈ１ｌ１及びａｑｐ４に関するｑＰＣＲによって、比較的純粋な星状膠細胞の集団が分離されたことを確認し、これらが星状膠細胞画分で排他的に（Ｔｇ（ＧＦＰ−ｈＧＦＡＰ）ＦＶＢトランスジェニックマウスから分取したＧＦＰ＋星状膠細胞の発現パターンと類似の発現パターンで４９）発現していることが認められた（図Ｓ３Ｅ）。更なるマーカコホートを用いて、免疫細胞［ミクログリア／単球細胞：ｉｔｇａｍ（ＣＤ１１ｂ）及びｅｍｒ１（Ｆ４／８０）、樹状細胞：ｉｔｇａｘ（ＣＤ１１ｃ）、ＮＫ細胞：Ｋｌｒｂ１ｃ（Ｎｋ１．１）、Ｔ細胞：ｃｄ３及びＢ細胞：ｃｄ１９］、希突起膠細胞（ｍｏｇ、ｍｂｐ）、及びニューロン（ｓｙｔ１、ｓｎａｐ２５）の存在について調査した（図Ｓ３Ｆ、Ｇ）。
【００９２】
ＬａｃＣｅｒ測定。化学標準のＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１６：０）及びＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１８：０）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから入手した。ＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１６：０）及びＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１８：０）の定量化を、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）６４６０三連四重極型ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム上で実施するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって実施した。ＬａｃＣｅｒ及び内部標準の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンのフラグメントを衝突誘起解離に供し、２つの主な種類のフラグメントイオンを、陽イオンモードのエレクトロスプレーイオン化により、各イオンの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードでモニタした。これらの２つのＭＲＭトランジションは、天然ラクトシル部分の損失及びラクトースイオンの形成に該当した。具体的には、ＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１６：０）及びＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１８：０）の定量化に用いたＭＲＭトランジションは、それぞれ８６２．５＞４６４．５及び８９０．６＞５４８．５であった。８６２．５＞２６４．３及び８９０．６＞２６４．３のＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１６：０）及びＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１８：０）の二次確認用ＭＲＭトランジションについてもモニタした。質量分析計のパラメータ設定は、ガス温度（３２５℃）、ガス流量（１２Ｌ／分）、ネブライザ（２５ｐｓｉ）、シースガス温度（４００℃）、シースガス流量（１２Ｌ／分）、キャピラリ電圧（４０００ｖ）及びノズル電圧（５００ｖ）であった。分離には、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム、４．６×５０ｍｍ、５μｍ粒径の液体クロマトグラフィー条件を用いた。クロマトグラフィー法は、流量＝０．４ｍＬ／分、溶媒Ａ＝５％ＭｅＯＨ及び０．１％ギ酸中５ｍＭギ酸アンモニウムｖ／ｖ／ｖ、溶媒Ｂ＝８０％２−プロパノール、１５％メタノール、５％水及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）であった。グラジエントは、２０％Ａで開始し、１０分間で１００％Ａまで増加させ、次の１０分間維持した。次の注入の前に、カラムを開始条件に５分間、再平衡化した。安定した同位体の型を入手できなかったため、非天然ＬａｃＣｅｒ（１８：１／１２：０）の内部標準を用いた。ＬａｃＣｅｒ（ｄ１８：１／１６：０）については０．１０ｎＭ〜３．３μＭの種々の濃度及び１μＭの内部標準濃度で、標準曲線の組み合わせを分析した。定量化の下限値は１ｎＭで推定し、０．９９６９のＲ２は線形回帰分析を用いて得た。内部標準をドープした標準曲線は、１ｎＭ〜３．３μＭで実施した。標準は、ＬａｃＣｅｒ（１８：１／１６：０）に対するものしか入手できなかったので、ＬａｃＣｅｒ（１８：１／１８：０）の値は、２つの密接に関係した脂質についての相対的イオン化効率が同一であると仮定する。
【００９３】
脂質の抽出。脳組織を秤量し、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ法の液−液抽出を用いた抽出溶媒中で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（ＶＷＲ）を用いてホモジナイズした。全ての溶媒は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから超高純度で入手した。内部標準ＬａｃＣｅｒ（１８：１／１２：０）を、２：１クロロホルム−メタノールｖ／ｖ．６ｍｌの２：１クロロホルム−メタノール及び２ｍＬのＰＢＳ中に溶解させた。約２分のホモジナイズの後、液体を８ｍｌのガラスバイアルに移した。混合物を高速遠心分離器で１０００ｇで２０分間回転させた。これにより、中間にタンパク質ディスク及び不溶性物質が形成された。ガラスＰａｓｔｅｕｒピペットを用いて底層を取り出し、穏やかな窒素流下における蒸発のために、清浄なバイアルに移した。乾燥させた試料を１００μｌの２：１クロロホルム−メタノールで再構成し、ＨＰＬＣ−ＭＳを用いて分析した。
【００９４】
ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現。製造者の説明書（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、１００〜２００ｎｇの全ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎコードセット（マウス炎症キットまたは受注生産の星状膠細胞指向性プローブセット（表Ｓ１））のレポータプローブ及びキャプチャプローブとハイブリダイズした。スパイクした陽性対照及びハウスキーピング遺伝子に対して、データを標準化した（ｎＳｏｌｖｅｒＡｎａｌｙｓｉｓシステム）。各サンプルについて、陰性対照転写物の平均に２倍の標準偏差を加えたものに満たない転写物数は、バックグラウンドとみなした。
【００９５】
遺伝子発現データの分析。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇで生成した遺伝子発現データをＥｘｐａｎｄｅｒ６．０６プラットフォームの使用により分析した５３。偏りのないＣＬＩＣＫアルゴリズムを用いて、遺伝子をクラスター化し、各クラスターを転写因子結合部位の集積に関して更に分析した（プロモータ分析）。
【００９６】
ｑＰＣＲ。ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）またはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出し、ｃＤＮＡを調製し、ｑＰＣＲに用いた。結果をｇａｐｄｈ（マウス）またはＡＣＴＩＮ（ヒト）に標準化した。全てのプライマー及びプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た。Ａｌｄｈ１ｌ１（Ｍｍ０３０４８９５７＿ｍ１）、ａｑｐ４（Ｍｍ００８０２１３１＿ｍ１）、ｂ４ｇａｌｔ５（Ｍｍ００４８０１４７＿ｍ１）、ｂ４ｇａｌｔ６（Ｍｍ００４８００４５＿ｍ１）、ｃｃｌ５（Ｍｍ０１３０２４２７＿ｍ１）、ｃｄ１９（Ｍｍ００５１５４２０＿ｍ１）、ｃｄ３ｅ（Ｍｍ００５９９６８４＿ｇ１）、ｃｄ４０（Ｍｍ００４４１８９１＿ｍ１）、ｃｓｆ２（Ｍｍ０１２９００６２＿ｍ１）、ｃｘｃｌ１０（Ｍｍ００４４５２３５＿ｍ１）、ｅｍｒ１（Ｍｍ００８０２５２９＿ｍ１）、ｆｏｘｐ３（Ｍｍ００４７５１６２＿ｍ１）、ｇａｐｄｈ（Ｍｍ００４８４６６８＿ｍ１）、ｇｆａｐ（Ｍｍ０１２５３０３３＿ｍ１）、ｈ２−Ａａ（Ｍｍ００４３９２１１＿ｍ１）、Ｉｆｎｇ（Ｍｍ０１１６８１３４＿ｍ１）、Ｉｌ１０（Ｍｍ００４３９６１４＿ｍ１）、ｉｌ１７ａ（Ｍｍ００４３９６１８＿ｍ１）、ｉｌ１ｂ（Ｍｍ００４３４２２８＿ｍ１）、ｉｌ６（Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１）、ｉｒｆ１（Ｍｍ０１２８８５８０＿ｍ１）、ｉｔｇａｍ（Ｍｍ００４３４４５５＿ｍ１）、ｉｔｇａｘ（Ｍｍ００４９８６９８＿ｍ１）、ｋｌｒｂ１ｃ（Ｍｍ００８２４３４１＿ｍ１）、ｍｂｐ（Ｍｍ０１２６６４０２＿ｍ１）、ｍｏｇ（Ｍｍ００４４７８２４＿ｍ１）、ｎｏｓ２（Ｍｍ００４４０５０２＿ｍ１）、ｒｅｌｂ（Ｍｍ００４８５６６４＿ｍ１）、ｓｎａｐ２５（Ｍｍ００４５６９２１＿ｍ１）、ｓｐｐ１（Ｍｍ００４３６７６７＿ｍ１）、ｓｙｔ１（Ｍｍ００４３６８５８＿ｍ１）、ｔｂｘ２１（Ｍｍ００４５０９６０＿ｍ１）、ｔｇｆｂ１（Ｍｍ０１１７８８２０＿ｍ１）、ｔｌｒ２（Ｍｍ００４４２３４６＿ｍ１）、ｔｎｆ（Ｍｍ００４４３２６０＿ｇ１）、ｖｉｍ（Ｍｍ０１３３３４３０＿ｍ１）、ＡＣＴＢ（Ｈｓ０１８７２４４８＿ｓ１）、Ｂ４ＧＡＬＴ５（Ｈｓ００９４１０４１＿ｍ１）、Ｂ４ＧＡＬＴ６（Ｈｓ００１５３１３３＿ｍ１）、ＣＣＬ２（Ｈｓ０１０６０６６５＿ｇ１）、ＣＣＬ５（Ｈｓ００９４１０４１＿ｍ１）、ＩＬ６（Ｈｓ００２３４１４０＿ｍ１）、ＮＯＳ２（Ｈｓ００１７４５７５＿ｍ１）、ＰＴＧＳＴ２（Ｈｓ００１９１１３５＿ｍ１）、及びＴＬＲ２（Ｈｓ００９８５６３９＿ｍ１）。
【００９７】
Ｔ細胞増殖及びサイトカイン測定。脾細胞及びリンパ節細胞をＸ−ＶＩＶＯ培地中で培養し、１ウェル当たり５×１０５細胞の密度でＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で７２時間プレート培養した。最後の１６時間中に、細胞を１  Ｃｉ［３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識し、続いて、細胞をガラス繊維フィルタ上に回収し、取り込まれた［３Ｈ］チミジンをカウンタ（１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で分析した。酵素結合免疫吸着法によるサイトカイン測定のために、培養の４８時間後に上清を回収した１４。細胞内サイトカインの染色のために、細胞をＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセタート；５０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）、イオノマイシン（１μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）及びモネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ；１ｍｌ／ｍｌ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６時間刺激した。表面マーカの染色後、製造者の説明書ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＦｏｘｐ３  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｅｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ）に従って、細胞を固定し、透過を行った。
【００９８】
マウス初代ミクログリア。マウス初代ミクログリアを記載の通りに５４、軽微な修正を加えて調製した。１〜３日齢の新生マウスの大脳皮質を切開し、その髄膜を慎重に取り出し、０．２５％トリプシンで消化し、単一細胞レベルまで分散させた。次いで、細胞懸濁液（「混合グリア」）を３７℃、加湿５％ＣＯ２−９５％空気下にて培養した。４〜５日ごとに培地を交換した。混合したグリア培養物は、７〜１０日後にコンフルエントに達し、調製後１５〜２０日の間にミクログリアを採取した。先に記載の通り５４、ミクログリアを緩やかなトリプシン処理手順（マイルドＴ／Ｅ）にて分離した。簡潔に述べれば、コンフルエントの混合グリア培養物を０．０６％トリプシン（マイルドＴ／Ｅ）で処理することにより、ほぼ全ての星状膠細胞を含む細胞のインタクトな層が剥離し、高濃度のミクログリア集団が後に残った（フルオレセイン結合グリフォニア・シンプリシフォリア由来イソレクチンＢ４（ＩＢ４）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＰＥ結合ＣＤ１１ｂ  Ａｂでの染色により判定した場合９８％超（データ不図示））。付着したミクログリアを２４〜４８時間回復させた。
【００９９】
マウス初代星状膠細胞。混合グリアを上記の通り調製し、２０ｕｇ／ｍｌのビオチン抗ＩＢ４（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）とともに室温で２０分間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともに４℃で１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、セル分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＩＢ４＋細胞（ミクログリア細胞及び内皮細胞）を除去した５１。次いで、細胞をコンフルエント（７〜１０日）まで培養し、緩やかなトリプシン処理手順を用いて星状膠細胞の単一層を分離し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離して単一細胞の懸濁液にし、プレート培養した。細胞は、ＧＦＡＰまたはＧＬＡＳＴでの染色によって判定すると、９８％を超える細胞が星状膠細胞であり、ＣＤ１１ｂ＋ミクログリア細胞の２％未満の汚染があった（データ不図示））。
【０１００】
マウス初代軟膜食細胞。１〜３日齢の新生マウスの脳から髄膜を慎重に取り出し、１％コラゲナーゼにより３７℃で２０分間消化し、次いで、単一細胞レベルまで分散させた。分離した細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２とともに氷上で１５分間インキュベートしてＦｃ受容体をブロックし、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）に対するＡＰＣ結合抗体を用いて４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄し、死細胞を除外するために７−ＡＡＤとともにインキュベートし、分取した。
【０１０１】
マウス初代脈絡叢細胞。マウス初代脈絡叢細胞を記載の通りに５５，５６、軽微な修正を加えて調製した。簡潔に述べれば、１〜３日齢の新生マウスから脈絡叢を取り出し、１％コラゲナーゼにより３７℃で２０分間消化し、次いで、単一細胞レベルまで分散させた。細胞懸濁液を脈絡叢細胞用の培地中で洗浄し［１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｌ−グルタミン１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ、インスリン５ｍｇ／ｍｌ、Ａｒａ−Ｃ２０ｍＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］、ポリ−Ｄ−リシンをコーティングした２４ウェルプレート中で、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した（２．５ｘ１０５細胞／ウェル）。２４時間後、培地を交換し、記載の通り、細胞を未処理のままにするか、処理するかのいずれかとした。
【０１０２】
プラスミド。ネズミＣｃｌ２プロモータ下でガウシアルシフェラーゼと、ＣＭＶプロモータ下で分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）（トランスフェクションの標準化のために使用）とを発現するデュアルレポータ構築物は、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｉｎｃ．から得た。ＩＲＦ１をコードする構築物は、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。ｐＬｅｎｔｉ−ＧＦＡＰ−ＥＧＦＰ−ｍｉｒ３０−ｓｈＡｃｔ１ベクター２５は、Ｄｒ．Ｇｕａｎｇ−Ｘｉａｎ  Ｚｈａｎｇ（Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から寄贈された。
【０１０３】
ｓｈＲＮＡによるインビトロノックダウン。ｂ４ｇａｌｔ５（ＴＲＣＮ０００００１８７８２）、ｂ４ｇａｌｔ６（ＴＲＣＮ００００３３４２７８）、または対照としての非標的化配列（ＴＲＣＮ０００００１８７８２）（Ｓｉｇｍａ）に対するｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子を用いて、ＬａｃＣｅｒシンターゼの発現をＣ８−Ｄ３０星状膠細胞でノックダウンさせた。星状膠細胞をレンチウイルス及び８μｇ／ｍｌのポリブレン（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより入手）とともに１２時間インキュベートし、２４時間回復させ、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）で選択した。ピューロマイシン耐性細胞の遺伝子ノックダウンをｑＰＣＲで確認した。
【０１０４】
ｓｈＲＮＡレンチウイルスでのインビボ星状膠細胞特異的ノックダウン。ｐＬｅｎｔｉ−ＧＦＡＰ−ＥＧＦＰ−ｍｉｒ３０−ｓｈＡｃｔ１ベクター２５を骨格にして、Ａｃｔ１のｓｈＲＮＡを上述のインビトロで確認したｓｈＲＮＡ配列に置き換えて用いることによって、ｂ４ｇａｌｔ５、ｂ４ｇａｌｔ６に対するｓｈＲＮＡ配列及び非標的化ｓｈＲＮＡを持つｐＬｅｎｔｉ−ＧＦＡＰ−ＥＧＦＰ−ｍｉｒ３０−ｓｈＲＮＡをクローニングした（ｂ４ｇａｌｔ５：５’−ＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＴＴｃｔｃｇａｇＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２）、ｂ４ｇａｌｔ６：５’−ＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴｃｔｃｇａｇＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＧＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号３）、及び非標的化ｓｈＲＮＡ：５’−ＧＣＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＴｃｔｃｇａｇＡＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＧＣＴＡ−ＴＣＧＣＧＣ−３’（配列番号４））。次いで、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、新しく作製した３μｇのｐＬｅｎｔｉ−ＧＦＡＰ−ＥＧＦＰ−ｍｉｒ３０−ｓｈＲＮＡベクター及び９μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）パッケージングミックス（ヘルパープラスミドｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶ−Ｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションすることによって、レンチウイルス粒子を作製した。４８時間後、上清を回収し、０．４５μＭのＰＶＤＦフィルタに通して濾過し、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）濃縮キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の説明書に従って用いて一晩濃縮した。ウイルス力価を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ力価測定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者の説明書に従って用いて判定し、−７０℃で保存した。
【０１０５】
インビボ注入の場合、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注入によって免疫化から３５日後（進行期）のＮＯＤ  ＥＡＥマウスに麻酔をかけ、Ｋｏｐｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ内に置いた。ハミルトンシリンジを用いて、１マウス当たり１×１０７ＩＵのｓｈＢ４ｇａｌｔ５、ｓｈＢｒｇａｌｔ５、ｓｈＣｏｎｔｒｏｌ（非標的化）ウイルスを、ブレグマの後方０．４４ｍｍ、外側１．０ｍｍ、頭蓋骨表面の下２．２ｍｍに注入した。注入速度は、漏出を防ぐために１μｌ／分を維持した。
【０１０６】
生存率アッセイ。星状膠細胞、ミクログリアまたはＬｙ６Ｃ高単球を指定濃度のＰＤＭＰまたはＬａＣｃｅｒで前処理し、ＬＰＳ／ＩＦＮγ（ミクログリア及び星状膠細胞）、ＣＣＬ−２（単球）で更に活性化するか、未処理のままとした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｆｌｕｏｒ（商標）細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、活性化後の生存率を評価した。
【０１０７】
細胞成分分画及び免疫ブロット法分析。星状膠細胞を指定の通りに処理し、全抽出物（３０μｇのタンパク質）、すなわち細胞の核及び細胞質の細胞画分をＮｕＰＡＧＥ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分離し、サポート付ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。細胞成分分画は、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造者の説明書に従って用いて調製した。ブロットは、ウサギ抗ＩＲＦ−１（Ｄ５Ｅ４）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ、ＧＡＰＤＨ（Ｄ１６Ｈ１１）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ、ラミンＢ１ポリクローナルウサギＡｂ、ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｄ１４Ｅ１２）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ、続いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ結合Ａｂ（抗体は全てＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇより入手）でプローブした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてブロットを現像した。タンパク質の均一性を確認するために、各ブロットをＧＡＰＤＨ（全抽出物、すなわち細胞質画分）またはラミンＢ１（核分画）で再度プローブした。データ定量化をＩｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．４）（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０１０８】
トランスフェクション及びルシフェラーゼアッセイ。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で２９３Ｔ細胞を増殖させ、ＣＣＬ２デュアルレポータ及びＩＲＦ１、ＮＦ−κＢｐ６５または適切な空対照をコードする構築物を含むＦｕｇｈｅｎｅ−ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）でトランスフェクションした。Ｓｅｃｒｅｔｅ−Ｐａｉｒ  Ｄｕａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｉｎｃ）でのトランスフェクションの２４時間後に、ルシフェラーゼ及びＳＥＡＰ活性を分析した。
【０１０９】
ＣｈＩＰ。細胞を１％ホルムアルデヒドで１５分間クロスリンクした。クロスリンクをグリシンの添加により停止し、１×プロテアーゼ阻害剤「カクテル」（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する０．３５ｍｌの溶解バッファ（１％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）で細胞を溶解した。クロマチンを超音波処理によって剪断し、遠心分離後に上清を回収し、バッファ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）で希釈した。抗体（５μｇ）をタンパク質Ａ及びタンパク質ＧのＤｙｎａｌ磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に６時間予め結合させ、ＰＢＳ中氷冷５％ＢＳＡで３回洗浄し、次いで、希釈したクロマチンを添加し、一晩、免疫沈降させた（抗体については後述）。次いで、磁気ビーズ−クロマチン複合体をＲＩＰＡバッファ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．７％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０及び０．５Ｍ  ＬｉＣｌ）で３回、続けてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファで３回洗浄した。次いで、免疫沈降したクロマチンを１％ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３で抽出し、ホルムアルデヒドのクロスリンクを逆転させるために６５℃で少なくとも８時間加熱した。ＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製して、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ（プライマーについては後述）によって分析した。ＣｈＩＰには、次の抗体：抗ＩＲＦ１（ＳＣ−６４０ｘ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＮＦ−κＢｐ６５（ａｂ７９７０；Ａｂｃａｍ）及びウサギＩｇＧ（ａｂ２７４７８；Ａｂｃａｍ）を用いた。以下のプライマー対を用いた。以下のプライマー対を用いた。ｃｃｌ２：ＮＦ−κＢフォワード５’−ＣＡＧＣＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＧ−３’（配列番号５）及びリバース５’−ＣＡＴＡＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴ−３’（配列番号６）；ｃｃｌ２：ＩＳＲＥフォワード５’−ＣＴＧＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣ−３’（配列番号７）及びリバース５’−ＧＴＧＧＧＴＴＧＧＡ−ＡＴＴＴＧＧＴＡＴＴＴ−３’（配列番号８）；ｃｓｆ２：ＮＦ−κＢフォワード５’−ＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号９）及びリバース５’−ＡＧＣＣＡＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１０）；ｃｓｆ２：ＩＳＲＥフォワード５’−ＧＣＴＴＴＣＧＡＧＧＧＴＣＡ−ＧＡＴＡＡＣＡ−３’（配列番号１１）及びリバース５’−ＣＡＣＡＣＧＣＴＴＧＧＧＣＴＡＡＧＡ−３’（配列番号１２）；ｎｏｓ２：ＮＦ−κＢ（１）フォワード５’−ＣＡＣＡＧＡＣＴＡＧＧＡＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡ−３’（配列番号１３）及びリバース５’−ＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＴＴＴ−３’（配列番号１４）；ｎｏｓ２：ＩＳＲＥ／ＮＦ−κＢ（２）フォワード５’−ＡＣＣＡＴＧＣＧＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＧＡ−３’（配列番号１５）及びリバース５’−ＡＧＣＣ−ＡＧＧＡＡＣＡＣＴＡＣＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１６）。
【０１１０】
単球遊走アッセイ。脾臓Ｌｙ６Ｃ高単球を分取し（ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４−８０＋、ＳＳＣ低／Ｌｙ６Ｃ高）、孔径３μｍの２４ウェル細胞培養インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上部チャンバに播種した。細胞をＰＤＭＰ、ＬａｃＣｅｒ、ＰＤＭＰ＋ＬａｃＣｅｒまたはビヒクルとともに１時間、前処理した。次いで、インサートを、ＣＬＬ−２（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはビヒクル（ＰＢＳ）を含有する予め加温した培地を含む、異なるウェルに移した。３時間後、下部チャンバの遊走性単球を定量化した。
【０１１１】
ヒト初代星状膠細胞。Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ承認ガイドラインに従って、ヒト胎児組織リポジトリ（Ａｌｂｅｒｔ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｒｏｎｘ，ＮＹ）から入手した妊娠１７〜２３週間の胎児由来のヒトＣＮＳ組織からヒト胎児星状膠細胞を先に記載の通り５７分離した。培養物は９０％を超える純度であった。
【０１１２】
ＭＳ組織。臨床的に診断され、かつ神経病理学的に確認されたＭＳであるＭＳ患者と、ＭＳでないＣＮＳ炎症性疾患（ウイルス性脳炎、ラスムッセン脳炎及びＡＤＥＭを含むＮＭＳＣＩＤ）の対照と、健康な対照から脳組織を入手した。剖検サンプルは、液体窒素で直ちに凍結した。白質のＭＳ組織サンプルを先に記載の通りに選択した５８。全ての患者及び対照またはその近親者に、剖検及びその脳組織の研究目的での使用に関するインフォームドコンセントを得た。剖検の前に倫理審査の承認を得た（ＣＨＵＭ倫理承認：ＳＬ０５．０２２及びＳＬ０５．０２３及びＢＨ０７．００１）。
【０１１３】
統計分析。統計分析には、Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０ｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【０１１４】
実施例１。ＬａｃＣｅｒシンターゼは、ＣＮＳ炎症及び神経変性を調節する。
感受性マウス系統で誘導させた実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、有用なＭＳの実験モデルを構成する。しかし、ＭＳの異なる側面については、各マウス系統で発現するＥＡＥによってモデル化される。ミエリンペプチドＭＯＧ３５−５５で免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスは、例えば、ＲＲＭＳ時の単回発作に似た単相型のＥＡＥを発症する。一方、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスを同じ抗原で免疫化すると、急性発作（急性期）を起こし、進行期が続き、ＳＰＭＳに似た神経障害の不可逆的蓄積（進行期）が生じる１３，１４。
【０１１５】
発明者らは、ＮＯＤとＣ５７ＢＬ／６マウスの交配由来のＦ１ハイブリッドマウスも同じく慢性進行型のＥＡＥを発症することを最近見出した（図８ａ〜ｃ）。このため、ＣＮＳ炎症時における星状膠細胞の役割を研究するために、反応性星状膠細胞をガンシクロビル（ＧＣＶ）投与によって枯渇することができる（図９ａ）、Ｆ１  ＮＯＤ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＦＡＰ−ＨＳＶ−ＴＫハイブリッドマウスにおけるＥＡＥの過程を分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける先の所見７，８と一致して、急性期中の反応性星状膠細胞の枯渇がＥＡＥの有意な悪化を招くことを確認した（図１ａ）。一方で、進行期中の星状膠細胞の枯渇は、ＥＡＥの有意な改善に至った（図１ｂ）。更に、急性ＥＡＥにおける反応性星状膠細胞の枯渇は、単球及びＴ細胞のＣＮＳへの動員増加をもたらすが５，８、ＥＡＥ進行期中の枯渇は、ＣＮＳにおける白血球湿潤を減少させた（図９ｂ）のに対し、末梢Ｔ細胞応答には影響しなかった（図９ｃ、ｄ）ことがわかった。ＧＣＶ投与により、ＮＯＤ  Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＦＡＰ−ＨＳＶ−ＴＫハイブリッドマウスの神経前駆細胞（ＮＰＣ）が枯渇した可能性があるが、ＮＰＣは、ＥＡＥにて保護効果を示すこと１５，１６に注目されたい。したがって、これらのデータは、反応性星状膠細胞の枯渇がＥＡＥの改善に関係することを示唆している。
【０１１６】
慢性自己免疫性ＣＮＳ炎症における星状膠細胞活性を調節する分子機構を研究するために、ナイーブＮＯＤマウスから、急性期及び進行期のＥＡＥ（図１０ａ〜ｇ）の星状膠細胞を分離し、受注生産のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒアレイを用いてそのトランスクリプトームを分析した（表１）。ＮＯＤ  ＥＡＥの異なる期で、星状膠細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルに著しい違いがあることを見出し（図１ｃ）、進行期中に上方制御される特有の遺伝子クラスターを特定した（図１ｄ）。遺伝子発現が進行型ＮＯＤ  ＥＡＥと関連する遺伝子の１つは、ｂ４ｇａｌｔ６、すなわちＬａｃＣｅｒシンターゼであった１７。ｑＰＣＲ検証研究では、ＮＯＤ  ＥＡＥの進行期中における星状膠細胞でＢ４ｇａｌｔ６発現の上方制御が確認されたが、ミクログリア細胞では確認されなかった（図１ｅ）。免疫蛍光法（ＩＦ）による更なる検証では、白質のＧＦＡＰ＋星状膠細胞でＢ４ＧＡＬＴ６発現が検出されたが、灰白質、血管周囲グリア境界膜またはネスチン＋神経前駆細胞では検出されなかった（図１１ａ、ｂ）。加えて、Ｂ４ＧＡＬＴ６とともにＬａｃＣｅｒシンターゼ活性を有するＢ４ＧＡＬＴファミリーの唯一のメンバーである１７、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ５（Ｂ４ＧＡＬＴ５）の有意な上方制御も検出した（図１１ｃ）。事実、Ｂ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６（Ｂ４ＧＡＬＴ５／６）のＬａｃＣｅｒシンターゼ活性と一致して、進行期のＥＡＥのＮＯＤマウスのＣＮＳにてＬａｃＣｅｒレベルの増加を検出した（図１ｆ）。
【０１１７】
次に、ＬａｃＣｅｒのＣＮＳ炎症に対する作用を調査した。ＭＯＧ免疫付与の不在下におけるＬａｃＣｅｒ投与は、インビボでＥＡＥ様疾患の誘導も、星状膠細胞活性化ももたらさなかった（図１２ａ）。しかしながら、ＬａｃＣｅｒ投与は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにてＥＡＥの有意な悪化を招いた（図１ｇ）。同様に、ＮＯＤマウスのＥＡＥ誘導の３５日後の進行期中に開始したＬａｃＣｅｒ投与もまた疾患の臨床症状の有意な悪化を招いた（図１ｈ）。ＬａｃＣｅｒ投与に続くＣ５７ＢＬ／６及びＮＯＤ  ＥＡＥの悪化が、Ｔ細胞応答の変化に関連しなかったことに注目されたい（図１２ｂ〜ｅ）。
【０１１８】
進行期のＮＯＤ  ＥＡＥにおけるＬａｃＣｅｒの役割を更に調査するために、Ｂ４ＧＡＬＴ５／６特異的阻害剤であるＤ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）１７を用いて、その合成を阻害した（図１ｉ）。ＥＡＥ誘導の４０日後に開始したＰＤＭＰの毎日の投与（２０ｍｇ／ｋｇ、１日２回）は、ＣＮＳ  ＬａｃＣｅｒレベルの有意な減少（図１ｊ）並びに臨床スコアを基準にした疾患進行、脱髄及び軸索消失の抑制（図１ｋ、ｌ）をもたらした。しかしながら、ＰＤＭＰ処理マウスのＴ細胞応答に有意な変化は検出されなかった（図１２ｆ〜ｉ）。総合すると、これらのデータは、Ｂ４ＧＡＬＴ５／６によって産生されるＬａｃＣｅｒがＣＮＳ炎症にて有害な役割を担っていることを示唆している。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【０１１９】
実施例２。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６阻害は、ＥＡＥ時の星状膠細胞活性化を抑制する。
ＬａｃＣｅｒは、実験脊髄損傷時における病変を促進することが示唆されている１８。そのため、発明者らは、ＥＡＥの進行期（１００日）のビヒクルまたはＰＤＭＰ処理ＮＯＤマウスから分離した星状膠細胞の転写プログラムに対するＢ４ＧＡＬＴ５／６阻害の効果を研究した。偏りのない分析により、ＥＡＥ時に下方制御されＰＤＭＰによって上方制御された遺伝子、及びＥＡＥ時に上方制御されＰＤＭＰによって下方制御された遺伝子（それぞれ図２ａのクラスター１及び２）の２つの遺伝子セットを特定した。クラスター２は、ＥＡＥ及びＭＳ病理に関連するいくつかの遺伝子、すなわちｃｃｌ２（炎症性単球のＣＮＳへの動員）１９−２１、ｃｃｌ５及びｃｘｃｌ１０（末梢免疫細胞のＣＮＳへの動員）、ＩＬ−１β（ｉｌ１ｂ）、オステオポンチン（ｏｐｎ）、一酸化窒素合成酵素（ｎｏｓ２）、ＭＨＣ−ＩＩ（Ｈ２−Ａａ）並びにビメンチン（ｖｉｍ、星状膠細胞活性化に関連）を含んでいた。独立したサンプルに関するｑＰＣＲによる検証実験により、クラスター２に含まれる代表的な遺伝子の発現に対するＰＤＭＰの抑制効果を確認した（図２ｂ）。ＥＡＥ及びＭＳ病理に関連する遺伝子の発現を制御する際のＢ４ＧＡＬＴ６の役割に関する更なる裏付けは、ＧＦＡＰ＋星状膠細胞におけるＢ４ＧＡＬＴ６とＣＣＬ２及びｉＮＯＳの共発現が検出された、ＩＦ研究によってもたらされた（図１３）。
【０１２０】
更に、星状膠細胞が髄鞘再生及び神経細胞生存率を制御することが報告されているので９，２２、星状膠細胞による髄鞘形成の調節に関連する遺伝子の発現について分析した（表２及び図２ｃ）。図１ｌに示す脱髄及び軸索損傷と一致して、進行期のＮＯＤ  ＥＡＥにおいて、脱髄に関連する遺伝子の有意な上方制御、及び髄鞘再生に関連する遺伝子の下方制御を検出した。しかしながら、ＰＤＭＰによるＢ４ＧＡＬＴ５／６阻害は、脱髄関連遺伝子の有意な減少、及びこれに伴う髄鞘再生関連遺伝子の発現増大をもたらした（図２ｃ）。総括すると、これらのデータは、Ｂ４ＧＡＬＴ５／６がＥＡＥ時の星状膠細胞活性化を調節することを示している。
【０１２１】
ＥＡＥ時の星状膠細胞の転写応答に対するＢ４ＧＡＬＴ５／６遮断の作用を媒介する分子機構を特定するために、特定の転写因子結合部位の集積に関して、クラスター１及び２に含まれる遺伝子のプロモータ配列を調べた。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６阻害によって発現が抑制される、クラスター２に含まれる遺伝子は、インターフェロン感受性応答エレメント（ＩＳＲＥ）（Ｐ＝４．８３×１０−６）及びＮＦ−κＢ応答エレメント（Ｐ＝９．９９×１０−６）に富むことがわかった。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６によるＥＡＥの制御におけるこれらの経路の関与は、ＥＡＥ時に検出されたｉｒｆｌ及びｒｅｌＢ発現の上方制御及びＬａｃＣｅｒ合成をＰＤＭＰで阻害したときのその後の抑制によって更に裏付けられた（図２ｄ、ｅ）。総合すると、これらの結果は、Ｂ４ＧＡＬＴ５／６がＣＮＳ炎症時におけるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１の活性化を調節することを示唆している。
【表２】
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【０１２２】
実施例３。Ｂ４ＧＡＬＴ６によって産生されるＬａｃＣｅｒは、オートクライン的に作用し、星状膠細胞活性化を増大させる。
Ｂ４ＧＡＬＴ５／６によって産生されるＬａｃＣｅｒがネズミ星状膠細胞に直接作用してその活性を制御するかどうかを調べるために、初代星状膠細胞の活性化の転写応答に対するＢ４ＧＡＬＴ５／６阻害及びＬａｃＣｅｒ添加の作用について調査した。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６の阻害により、リポ多糖体及びインターフェロン−γ（ＬＰＳ／ＩＦＮγ）での刺激に対する星状膠細胞の転写応答が抑制されることがわかった（図３ａ、ｂ及び図１４ａ）。逆に、外因性ＬａｃＣｅｒを添加すると、ＬＰＳ／ＩＦＮγに対する星状膠細胞の応答が増大したことから、Ｂ４ＧＡＬＴ５／６によって合成されるＬａｃＣｅｒがオートクライン的に作用し、これらの実験条件下で、星状膠細胞活性化を促進することが示唆される（図３ａ、ｂ及び図１４ａ）。この解釈に一致して、外因性ＬａｃＣｅｒは、星状膠細胞活性化に対するＰＤＭＰの抑制作用を上回った（図３ａ、ｂ及び図１４ａ）。ＰＤＭＰまたはＬａｃＣｅｒ処理が星状膠細胞の生存率に影響せず（図１４ｂ、ｃ）、ＩＬ−１β、ポリ（Ｉ：Ｃ）またはＩＦＮγ及びＩＬ−１７（脳炎誘発性Ｔ細胞によって産生される）との組み合わせによって活性化された星状膠細胞に対する作用を分析した場合、ＰＤＭＰ及びＬａｃＣｅｒの同様の作用が認められたことに注目されたい。
【０１２３】
Ｂ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６の星状膠細胞活性化に対する相対的寄与を分析するために１７，２３，２４、確認済みレンチウイルス由来ｓｈＲＮＡを用いて、ｂ４ｇａｌｔ５及びｂ４ｇａｌｔ６発現をノックダウンした（図３ｃ）。ｂ４ｇａｌｔ６のノックダウンが、ＬＰＳ／ＩＦＮγ活性化によって誘発されるｈ２−Ａａ、ｃｃｌ５及びｃｘｃｌ１０の発現の上方制御を、ＰＤＭＰ処理と同様の程度まで有意に抑制することがわかった。一方、ｂ４ｇａｌｔ５のノックダウンは、これらの遺伝子の発現に影響しなかったことから（図３ｄ〜ｆ）、Ｂ４ＧＡＬＴ６がＬａｃＣｅｒによる星状膠細胞活性化の制御において支配的な役割を担うことが示唆される。ｓｈＲＮＡでノックダウンさせたＢ４ＧＡＬＴ６の星状膠細胞のＰＤＭＰ処理がｈ２−Ａａ、ｃｃｌ５及びｃｘｃｌ１０発現を更に抑制しなかったことに注目されたい。これは、ＰＤＭＰの効果がＢ４ＧＡＬＴ６依存的ＬａｃＣｅｒ合成の特異的阻害に起因するものであることが示唆される（図１４ｄ）。
【０１２４】
インビトロでの星状膠細胞活性化に対するＢ４ＧＡＬＴ５及びＢ４ＧＡＬＴ６の相対的寄与及びＥＡＥ進行の調節を特定するために、インビボでの星状膠細胞特異性ノックダウンに最適化したレンチウイルスをベースにした系を用いて２５、ＮＯＤマウスにｓｈＲＮＡを送達した（図３ｇ）。この系において、マウスｇｆａｐプロモータは、選定したｓｈＲＮＡ及びＧＦＰレポータの発現を駆動する。ＮＯＤマウスのＥＡＥ誘導から３５日後の進行期中に、ｓｈＲＮＡをコーディングしたレンチウイルスの脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入後、ＧＦＰレポータの発現がＧＦＡＰ＋星状膠細胞に限られ、Ｉｂａ１＋ミクログリア及び炎症性マクロファージには発現しないことがわかった（図３ｈ及び図１４ｅ）。したがって、ｂ４ｇａｌｔ６及びｂ４ｇａｌｔ５発現の星状膠細胞特異性ノックダウンを認めた（図３ｈ）。ｂ４ｇａｌｔ５ではなくｂ４ｇａｌｔ６のノックダウンは、進行期のＮＯＤ  ＥＡＥ時のＣＮＳ  ＬａｃＣｅｒレベルの有意な減少をもたらした（図３ｉ）。更に、ｂ４ｇａｌｔ５ではなく、ｂ４ｇａｌｔ６のノックダウンは、ＮＯＤマウスの疾患進行を抑制した（図３ｊ）。総合すると、これらのデータは、Ｂ４ＧＡＬＴ６によって産生されるＬａｃＣｅｒがオートクライン的に作用し、星状膠細胞の活性化及びＥＡＥの進行を促進することを示している。
【０１２５】
ＬａｃＣｅｒの星状膠細胞活性化に対する作用を媒介する分子機構を調査するために、特定のＴＦ結合部位の集積に関して、培養物中の初代星状膠細胞にてＬａｃＣｅｒによって制御される遺伝子のプロモータを調べた（図３ａ）。ＰＤＭＰで処理したＮＯＤマウスから分離した星状膠細胞における本所見と同様に、ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥ応答性エレメントに有意な集積（Ｐ＜１０−５）を認めた。
【０１２６】
ＬａｃＣｅｒが星状膠細胞のＮＦ−ｋＢを活性化するということがこれまでに報告されている１８，２６。これに応じて、Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害後のＮＦ−κＢの核への移動の減少が認められたが、逆に、外因性ＬａｃＣｅｒは、ＮＦ−κＢ活性化を誘発し、ＰＤＭＰによって誘発された阻害をむしろ妨げた（図１４ｆ）。しかしながら、ＬａｃＣｅｒによる星状膠細胞活性の制御におけるＩＲＦ１／ＩＳＲＥの役割はわかっていない。ＬａｃＣｅｒ処理がＩＲＦ−１の核への移動を増加させるのに対して、Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害はこのプロセスを妨げることがわかった（図３ｋ）。更に、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験において、ＬＰＳ／ＩＦＮγで活性化させた星状膠細胞において、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１のｎｏｓ２プロモータへの有意な動員を認めた（図３ｌ）。星状膠細胞のＬａｃＣｅｒに対する応答とＩＲＦ−１の機能的関連性を調べるために、ＬＰＳ／ＩＦＮγによる活性化に対するＷＴ及びＩＲＦ−１欠損の星状膠細胞の応答を比較した。ＩＲＦ−１欠損が、ｎｏｓ２、及びプロモータにＩＳＲＥ結合部位を有する他の遺伝子（ｃｓｆ２、ｃｃｌ２、ｃｃｌ５、ｉｌ６及びｔｌｒ２）の、ＬａｃＣｅｒによって誘発される上方制御を阻害することがわかった（図３ｍ）。進行型ＮＯＤ  ＥＡＥ時のｃｃｌ２及びｎｏｓ２発現の制御におけるＩＲＦ−１の役割は、ＧＦＡＰ＋星状膠細胞においてＩＦによって検出されたＩＲＦ−１とＣＣＬ−２及びｉＮＯＳの共発現によって更に裏付けられた（図１４ｇ）。総合すると、これらの結果は、Ｂ４ＧＡＬＴ６によって産生されるＬａｃＣｅｒがオートクライン的に作用し、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１依存性経路を介して星状膠細胞を活性化することを示している。
【０１２７】
実施例４。Ｂ４ＧＡＬＴ６は、星状膠細胞のｃｃｌ２転写活性を制御する。
ＣＣＬ−２によって駆動される炎症性単球のＣＮＳへの動員は、ＭＳ及びＥＡＥにおける神経変性及び疾患進行を促進すると考えられる１９−２１，２７。発明者らは、Ｂ４ＧＡＬＴ６及びＬａｃＣｅｒが、星状膠細胞によるｃｃｌ２発現を調節することを見出した（図２ａ、ｂ及び３ａ）。星状膠細胞におけるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１の活性化に対するＬａｃＣｅｒの作用に関する本所見に基づいて、これらの転写因子に対する応答性エレメントについてｃｃｌ２プロモータを調べた。本バイオインフォマティクス研究で、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１の結合部位の候補が特定された（図４ａ）。これらの機能的関連性を評価するために、ｃｃｌ２プロモータの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータ構築物を使用した。ＩＲＦ−１及びＮＦ−κＢ（ｐ６５）が有意にｃｃｌ２プロモータをトランス活性化することがわかった（図４ｂ）。更に、ＣｈＩＰ実験において、ＬＰＳ／ＩＦＮγで活性化させた星状膠細胞において、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１のｃｃｌ２プロモータへの有意な動員を認めた（図４ｃ）。この動員は、ＰＤＭＰによるＬａｃＣｅｒ合成の阻害によって阻止され、ＰＤＭＰの作用は、外因性ＬａｃＣｅｒの添加によって妨げることが可能であった（図４ｃ）。したがって、Ｂ４ＧＡＬＴ６によって産生されるＬａｃＣｅｒは、ｃｃｌ２発現を調節する。
【０１２８】
Ｂ４ＧＡＬＴ６−ＬａｃＣｅｒによるｃｃｌ２発現の制御のインビボでの関連性を調査するために、ビヒクルまたはＢ４ＧＡＬＴ６阻害剤のＰＤＭＰで処理したＮＯＤ  ＥＡＥマウスのＣＮＳへの炎症性単球の動員を分析した。Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害により、ＥＡＥ時のＣＮＳに動員される炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ高またはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５高細胞のいずれかとして定義）の頻度及び総数（図４ｄ〜ｈ）が有意に減少することがわかった。また、ＮＯＤ  ＥＡＥの慢性期中にレンチウイルス由来ｓｈＲＮＡを用いて星状膠細胞のＢ４ＧＡＬＴ６をノックダウンした場合も、同様の結果が得られた（図４ｉ）。したがって、Ｂ４ＧＡＬＴ６は、ＣＣＬ−２の産生及び炎症性単球のＣＮＳへの動員を調節する。Ｂ４ＧＡＬＴ６の阻害またはＬａｃＣｅｒでの処理が、精製したＬｙ６Ｃ高単球の生存率、ＣＣＬ−２勾配における当該単球の遊走、またはＬＰＳ／ＩＦＮγ刺激に対する当該単球の応答に影響しなかったことに注目されたい（図４ｊ〜ｍ）。これは、Ｂ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒが単球において、そのＣＮＳへの動員を制御することに直接作用しないことを示唆している。
【０１２９】
実施例５。星状膠細胞中のＢ４ＧＡＬＴ６は、ミクログリア及びＣＮＳ浸潤性単球の活性化を制御する。
ミクログリアは、ＣＮＳ炎症の調節において中心的な役割を担っている２８。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６のミクログリアに対する作用を研究するために、ナイーブマウスまたは進行期中のＮＯＤ  ＥＡＥのビヒクルもしくはＰＤＭＰ処理マウスからミクログリア細胞を分離し、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒによってその転写プロファイルを分析した。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６阻害により、ＥＡＥ時のミクログリア活性化に関連する遺伝子の発現が減少することがわかった（図５ａ、ｂ）。ミクログリア及びＣＮＳ浸潤性単球に対するＢ４ＧＡＬＴ５／６阻害の効果を更に分析するために、ＭＳ及びＥＡＥの疾患病理に影響を及ぼすと考えられる２９−３１、マクロファージ／単球系統の炎症性または抗炎症性表現型（それぞれＭ１またはＭ２）に関連する遺伝子の発現を調べた。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６の阻害は、ミクログリア及びＣＮＳ浸潤性単球において、Ｍ１関連遺伝子の有意な下方制御、及びこれに伴うＭ２関連遺伝子の上方制御をもたらすことがわかった（図５ｃ、ｄ及び表３）。したがって、Ｂ４ＧＡＬＴ５／６は、ＥＡＥ期にミクログリアによって上方制御されないが、ＬａｃＣｅｒは、ミクログリア及びＣＮＳ浸潤性単球の活性化を調整する。
【０１３０】
インビボでのＢ４ＧＡＬＴ５／６阻害が、ミクログリア及びＣＮＳ浸潤性単球におけるＭ１／Ｍ２バランスを変化させるということから（図５ｃ、ｄ）、ミクログリア及び単球におけるＢ４ＧＡＬＴ５／６及びＬａｃＣｅｒの作用が細胞自律的であるかどうかを検討した。培養した初代マウスミクログリアのＬＰＳ／ＩＦＮγに対する生存率も応答も、星状膠細胞の不存在下でのＢ４ＧＡＬＴ５／６の阻害またはＬａｃＣｅｒの添加による影響を受けないことがわかった（図５ｅ〜ｈ）．加えて、ＬａｃＣｅｒは、軟膜食細胞または脈絡叢細胞のいずれかの活性化に対する転写応答に影響しなかった（図１５ａ、ｂ）。
【０１３１】
しかしながら、ミクログリアと星状膠細胞の両方を含有する混合グリア培養物では、ＰＤＭＰ及びＬａｃＣｅｒのミクログリア活性化に対する有意な作用を認めた（図５ｉ）。星状膠細胞によるミクログリア活性化の制御に関与するＢ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒ依存性機構を特定するために、ブロッキング抗体を用いた。混合グリア培養物をブロッキング抗体で処理して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＴＮＦαまたはＩＬ−６シグナル伝達を無効にし、ＬＰＳ／ＩＦＮγ及びＬａｃＣｅｒの存在下におけるミクログリア活性化（ｎｏｓ２上方制御によって示される）を分析した。ＧＭ−ＣＳＦの遮断により、ミクログリアｎｏｓ２の上方制御のＬａｃＣｅｒ依存性増加が阻害されることがわかった（図５ｊ）。事実、Ｂ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒ経路が、星状膠細胞活性化時に、ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−１のｃｓｆ２（ＧＭ−ＣＳＦ）プロモータへの動員を調節することもわかった（図５ｋ）。
【０１３２】
これらのインビトロでの所見の生理学的関連性を評価するために、ＮＯＤ  ＥＡＥの慢性期中にｓｈＲＮＡでｂ４ｇａｌｔ６をノックダウンした後の星状膠細胞中のｃｓｆ２発現を分析した。インビトロでの本結果と一致して、ｂ４ｇａｌｔ６のノックダウンは、星状膠細胞中のｃｓｆ２発現を有意に減少するに至った（図５ｌ）。更に、星状膠細胞のｂ４ｇａｌｔ６の特異的ノックダウンにより、ミクログリア中のｎｏｓ２発現が減少した（図５ｍ）。総合すると、これらのデータは、Ｂ４ＧＡＬＴ６／ＬａｃＣｅｒに依存した形態で星状膠細胞によって生産されるＧＭ−ＣＳＦが、ミクログリア活性化を調整することを示唆している。
【表３】
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【０１３３】
実施例６。Ｂ４ＧＡＬＴ６及びＬａｃＣｅｒレベルは、ＭＳ病変にて上方制御される。
ＭＳに関する所見の関連性を検討するために、ＭＳ患者及び対照由来の脳サンプルにおけるＢ４ＧＡＬＴ６及びＢ４ＧＡＬＴ５発現を分析した。ＭＳ病変では、Ｂ４ＧＡＬＴ５（２．１５±０．２８倍）及びＢ４ＧＡＬＴ６（８．２６．１５±２．１１倍）の発現の有意な上方制御が認められたが、正常に見える白質（ＮＡＷＭ）または対照では認められなかった。加えて、ＭＳでないＣＮＳ炎症性疾患（ＮＭＣＩＤ）に由来する脳サンプルでは、Ｂ４ＧＡＬＴ５（１．９５±０．３４）の上方制御が認められたが、Ｂ４ＧＡＬＴ６発現（０．８２±０．３７）は認められなかった（図６ａ）。
【０１３４】
ＭＳにおけるＢ４ＧＡＬＴ６の上方制御の役割を更に調べるために、患者の脳サンプルをＩＦによって分析し、ＧＦＡＰ＋星状膠細胞中のＢ４ＧＡＬＴ６の発現を検出した（図６ｂ）。更に、ＧＦＡＰ＋星状膠細胞におけるＢ４ＧＡＬＴ６とＣＣＬ２及びｉＮＯＳの共発現が認められた（図６ｂ）。
【０１３５】
Ｂ４ＧＡＬＴ５／６発現の上方制御の生物学的関連性を調査するために、同じサンプルコレクションのＬａｃＣｅｒレベルを定量化した。Ｂ４ＧＡＬＴ５／６発現に関する本データと一致して、対照、ＮＭＣＩＤ及びＭＳ  ＮＡＷＭサンプルでは、類似したＬａｃＣｅｒレベルが認められた（図６ｃ）。一方、ＭＳ病変では、ＬａｃＣｅｒレベルが有意に上方制御されたことから、Ｂ４ＧＡＬＴ６活性及びＬａｃＣｅｒレベルの増加がＭＳ病理に関連することも示唆される。
【０１３６】
次に、Ｂ４ＧＡＬＴ６がヒト星状膠細胞の活性を調整するかどうかについても検討した。このために、ヒト初代星状膠細胞を、ＰＤＭＰまたはビヒクル対照の存在下で、ＴＬＲ−３アゴニストポリ（Ｉ：Ｃ）（外因性刺激）またはＩＬ−１β（内因性刺激）のいずれかで活性化した。Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＣＯＸ２、ＩＬ６、ＮＯＳ２及びＴＬＲ２の発現に有意な減少をもたらすことがわかった（図６ｄ）。したがって、これらの結果は、Ｂ４ＧＡＬＴ６が、ヒト神経炎症性障害にて星状膠細胞の活性を制御するための治療標的の候補であることを示唆している。
【０１３７】
実施例７。ミグルスタットは、星状膠細胞活性化を阻害する。
本明細書にて示す通り、ＬａｃＣｅｒは、星状膠細胞の活性化及び神経変性を促進する。ヒト使用が認められた薬剤であるミグルスタット（Ｖｅｎｉｅｒ，Ｒ．Ｅ．＆Ｉｇｄｏｕｒａ，Ｓ．Ａ．Ｍｉｇｌｕｓｔａｔ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃａｖｅａｔｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４９，５９１−５９７（２０１２））は、血液脳関門を通過し、Ｂ４ＧＡＬＴ６によってＬａｃＣｅｒを合成するために使用されるグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）の合成を阻害する（図１Ａ）（Ｖｅｎｉｅｒ＆Ｉｇｄｏｕｒａ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４９，５９１−５９７（２０１２）；Ｊｅｙａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６，７１３−７２５（２００５）；Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）２７６，４２８−４３１（１９９７））。星状膠細胞の活性を調整するという別の目的の裏付けとして、ミグルスタットが、ＰＤＭＰでの観察と同様に、星状膠細胞の活性化を阻害することがわかった（図７Ｂ）。したがって、ＭＳ及び他の神経変性疾患における病理学的な星状膠細胞の活性化を抑制するために、ミグルスタットを用いることができる。
【０１３８】
実施例８。ミグルスタット治療は、慢性ＥＡＥの進行を停止する。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳ研究に関する実績に裏付けられた、有用なＭＳの実験モデルを構成するものであり、事実、ＥＡＥは、多発性硬化症（ＭＳ）での使用が認められたグラチラマー酢酸塩、ミトキサントロン及びナタリズマブの３つの治療の開発に直接つながるものであった。ＭＯＧ３５−５５で非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスを免疫化すると、急性発作（急性期）を起こし、進行期が続き、二次性進行型ＭＳに似た神経障害の不可逆的蓄積（進行期）が生じる。
【０１３９】
進行期のＮＯＤ  ＥＡＥにおけるミグルスタットの治療可能性を調査するために、進行期の発症時にミグルスタット投与を開始した。（図１６）。ミグルスタットを経口または経鼻により毎日投与した。経口処理したマウスには、１８００ｋｇ／ｍｇまたは６００ｍｇ／ｋｇのいずれかの単回用量のミグルスタットを与え、経鼻処理したマウスは、９００ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回処理した（合計で１日当たり１８００ｍｇ／ｋｇ）。ミグルスタットを毎日投与すると、疾患進行の臨床経過が抑制されることがわかった（図１６）。更に、ＭＳの病因及び他の神経変性疾患の主要な寄与因子であると考えられる、炎症性単球のＣＮＳへの動員も減少した（図１７）（例えば、Ｄａｖｉｄ  ａｎｄ  Ｋｒｏｎｅｒ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１；１２（７）：３８８−９９；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｔｏｌｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１１（１１）：７５０−６１；Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１１（１１）：７２３−３７を参照）。ミグルスタットがＴ細胞応答または体重減少に影響しなかったことに注目されたい（それぞれ図１８及び１９）。総合すると、これらのデータは、ミグルスタットの投与が慢性ＥＡＥの進行を停止し、進行型ＭＳのための治療法を示すことを示唆している。
【０１４０】
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４２．Ｃｏｄａｒｒｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．ＲＯＲｇａｍｍａｔ  ｄｒｉｖｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｉｎ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，５６０−５６７（２０１１）．
４３．Ｅｌ−Ｂｅｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ（Ｈ）１７  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ＩＬ−１−  ａｎｄ  ＩＬ−２３−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＧＭ−ＣＳＦ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，５６８−５７５（２０１１）．
４４．Ｚａｍａｎｉａｎ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３２，６３９１−６４１０（２０１２）．
４５．Ｊａｈｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ，ｎｏｎｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＣＤ１ｄ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｔｏ  ｓｕｌｆａｔｉｄｅ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９，９４７−９５７（２００４）．
４６．Ｓｃｈｗａｂ，Ｊ．Ｍ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ｎ．，Ａｒｉｔａ，Ｍ．＆Ｓｅｒｈａｎ，Ｃ．Ｎ．Ｒｅｓｏｌｖｉｎ  Ｅ１  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎ  Ｄ１  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４７，８６９−８７４（２００７）．
４７．Ｋａｎｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｉｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｋｅｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，１３８−１４３（２００６）．
４８．Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｆ．Ｊ．，Ｙｅｓｔｅ，Ａ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．＆Ｃｏｖａｃｕ，Ｒ．Ｌｉｐｉｄｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２４８，５３−５７（２０１２）．
４９．Ｎｏｌｔｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．ＧＦＡＰ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ＥＧＦＰ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｇｌｉａ  ３３，７２−８６（２００１）．
５０．Ｃａｒｄｏｎａ，Ａ．Ｅ．，Ｈｕａｎｇ，Ｄ．，Ｓａｓｓｅ，Ｍ．Ｅ．＆Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，１９４７−１９５１（２００６）．
５１．Ｃａｈｏｙ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｕｒｏｎｓ，ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｂｒａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２８，２６４−２７８（２００８）．
５２．Ｐｒｉｎｚ，Ｍ．，Ｐｒｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓ．Ｓ．＆Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ，Ｒ．Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ＣＮＳ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １４，１２２７−１２３５（２０１１）．
５３．Ｕｌｉｔｓｋｙ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐａｎｄｅｒ：ｆｒｏｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｔｏ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ５，３０３−３２２（２０１０）．
５４．Ｓａｕｒａ，Ｊ．，Ｔｕｓｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．＆Ｓｅｒｒａｔｏｓａ，Ｊ．Ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｂｙ  ｍｉｌｄ  ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｌｉａ  ４４，１８３−１８９（２００３）．
５５．Ｋｕｎｉｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ’ｓ  ｃｈｏｒｏｉｄ  ｐｌｅｘｕｓ  ｆｏｒ  ＣＮＳ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ．Ｂｒａｉｎ  １３６，３４２７−３４４０（２０１３）．
５６．Ｍｅｎｈｅｎｉｏｔｔ，Ｔ．Ｒ．，Ｃｈａｒａｌａｍｂｏｕｓ，Ｍ．＆Ｗａｒｄ，Ａ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｈｏｒｏｉｄ  ｐｌｅｘｕｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ６３３，２０７−２２０（２０１０）．
５７．Ｊａｃｋ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．ＴＬＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔａｉｌｏｒｓ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５，４３２０−４３３０（２００５）．
５８．Ａｌｖａｒｅｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ａｎｄ  ＣＮＳ  ｉｍｍｕｎｅ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４，１７２７−１７３１（２０１１）．
５９．Ｎａｉｒ，Ａ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．＆Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＣＭＬＳ  ６５，２７０２−２７２０（２００８）．
６０．Ｋｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．ＩＲＦ５  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＨ１−ＴＨ１７  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，２３１−２３８（２０１１）．
６１．Ｓｉｃａ，Ａ．＆Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｖｅｒｉｔａｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２２，７８７−７９５（２０１２）．
６２．Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｆ．Ｏ．，Ｓｉｃａ，Ａ．，Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ．＆Ｌｏｃａｔｉ，Ｍ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ａｎｄ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  １３，４５３−４６１（２００８）．
【０１４１】
他の実施形態
本発明について、発明を実施するための形態とともに記載してきたが、前述の記載は、本発明の範囲を例示するものであり、これを限定するものではなく、本発明は、添付する特許請求の範囲によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点及び変更は、以下の特許請求の範囲内である。
本願は以下の発明に関するものである。
（１）  対象における二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の発症を診断またはリスク判定するためのインビトロの方法であって、
対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、  前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、ＳＰＭＳに罹患しているまたはＳＰＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表すＬａｃＣｅｒの基準レベルと比較することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルが前記基準レベルを上回る場合、対象をＳＰＭＳと診断するまたはＳＰＭＳを発症するリスクのある対象と特定することとを含む、
方法。
（２）  前記対象が、再発寛解型多発性硬化症を有する、前記（１）に記載の方法。
（３）  前記対象が、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年または５年以内にＳＰＭＳを発症するリスクが高い、前記（１）に記載の方法。
（４）  対象における進行型多発性硬化症（ＭＳ）、例えば、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）または二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）を治療するための方法であって、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を前記対象に投与することを含む、方法。
（５）  対象の進行型多発性硬化症（ＭＳ）、例えば、一次性進行型多発性硬化症（ＰＰＭＳ）または二次性進行型多発性硬化症（ＳＰＭＳ）の治療におけるＬａｃＣｅｒ合成阻害剤の使用。
（６）  対象の進行型多発性硬化症（ＭＳ）を治療するための方法であって、
進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、ＬａｃＣｅｒの基準レベル、例えば、進行型ＭＳに罹患しているまたは進行型ＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表す基準レベルと比較することと、
ＬａｃＣｅｒの前記レベルが前記基準レベルを上回る対象に、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む治療を施すこととを含む、方法。
（７）  ＭＳ、例えば進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のための治療を選択するための方法であって、
進行型ＭＳに罹患しているまたは罹患の疑いのある対象のサンプル中のラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）のレベルを検出することと、
前記サンプル中のＬａｃＣｅｒの前記レベルを、ＬａｃＣｅｒの基準レベル、例えば、進行型ＭＳに罹患しているまたは進行型ＭＳを発症するリスクのある対照のＬａｃＣｅｒのレベルを表す基準レベルと比較することと、
ＬａｃＣｅｒの前記レベルが前記基準レベルを上回る対象に、治療的有効量のＬａｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む治療を選択することとを含む、方法。
（８）  前記ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤が、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）合成阻害剤である、前記（４）〜（６）に記載の方法または前記（７）に記載の使用。
（９）  前記ＧｌｃＣｅｒ合成阻害剤が、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−ノナノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、１−（３’，４’−エチレンジオキシ）フェニル−２−オクタノイルアミノ−３−ピロリジノ−１−プロパノール、Ｄ−トレオ−（１Ｒ，２Ｒ）−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール（ＰＤＭＰ）及びＤ−ＰＤＭＰを含むその類似体、ＰＰＭＰ（ＤＬ−トレオ−１−フェニル−２−パルミトイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）、Ｄ−トレオ−ＥｔＤＯ−Ｐ４、（（１Ｒ、２Ｒ）−ノナン酸［２−（２’，３’−ジヒドロ−ベンゾ［１，４］ダイオキシン−６’−イル）−２−ヒドロキシ−１−ピロリジン−１−イルメチル−エチル］−アミド−Ｌ−酒石酸塩、ＣＣＧ０２０３５８６（１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）アセトアミド）、Ｇｅｎｚ−１１２６３８（エリグルスタット）、Ｇｅｎｚ−５２９４６８、デオキシノジリマイシン系ＧｌｃＣｅｒ阻害剤、ＧＺ−１６１、Ｇｅｎｚ−６８２４５２、ＥＸＥＬ−０３４６、ＯＧＴ２３７８、並びにＧｅｎｚ−１２３３４６からなる群から選択される、前記（８）に記載の方法。
（１０）  前記デオキシノジリマイシン系ＧｌｃＣｅｒ阻害剤が、Ｎ−（５’−アダマンタン−１’−イル−メトキシ）−ペンチル−１−デオキシノジリマイシン（ＡＭＰ−ＤＮＭ）、Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（ミグルスタット）またはアルキル鎖中に９個〜約２０個の炭素原子を有する１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールの長鎖Ｎ−アルキル誘導体である、前記（９）に記載の方法。
（１１）  前記Ｎ−アルキル置換基が、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、シス−１１−ヘキサデセニル、オクタデシル、シス−１３−オクタデセニル及びエイコシルからなる群から選択される、前記（１０）に記載の方法。
（１２）  前記ＬａｃＣｅｒ合成阻害剤が、小分子、Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする阻害核酸またはＢ４ＧＡＬＴ６に特異的に結合しＬａｃＣｅｒ合成を阻害する阻害抗体からなる群から選択されるＢ４ＧＡＬＴ６の阻害剤である、前記（４）〜（６）に記載の方法または前記（７）に記載の使用。
（１３）  Ｂ４ＧＡＬＴ６を標的にする前記阻害核酸が、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、前記（１７）に記載の方法。
（１４）  Ｂ４ＧＡＬＴ６阻害剤及びＧｌｃＣｅｒ合成阻害剤を投与することを含む、前記（４）〜（６）に記載の方法。
（１５）  前記対象が、進行型ＭＳ、例えば、ＰＰＭＳまたはＳＰＭＳに罹患していることに基づいて、前記対象を選択することを含む、前記（４）〜（６）に記載の方法。
（１６）  グルコセレブロシダーゼの活性化剤を投与することを更に含む、前記（４）〜（６）に記載の方法。
（１７）  前記グルコセレブロシダーゼの活性化剤が、サポシンＣもしくはサポシンＣの活性断片もしくはその活性断片、ＮＣＧＣ００１８２１８６（５−シクロプロピリデン−７−（ジフルオロメチル）−Ｎ−（２−フェニルスルファニルフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−カルボキサミド）、ＮＣＧＣ００１８２５１０（［２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−２−オキソエチル］２−［２−（４−ブロモアニリノ）−２−オキソエトキシ］ベンゾエート）またはホスファチジルセリンである、前記（１６）に記載の方法。
（１８）  前記化合物が、経口、経鼻、静脈内または髄腔内投与される、前記（４）〜（１７のいずれかに記載の方法または使用。
（１９）  前記対象が、ＳＰＭＳに罹患しているか、かつ／またはＳＰＭＳに罹患していることに基づいて選択される、前記（４）〜（１８）のいずれかに記載の方法または使用。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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