(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の臓器、組織、又はその一部分の、無傷の血管床を有する再内皮化細胞外マトリックス内の毛細血管内径を維持、縮小低減、又は拡大する、エキスビボの方法であって、
前記方法は、
哺乳動物の臓器、組織、又はその一部分の、無傷の血管床を有する脱細胞化細胞外マトリックスと、内皮細胞又は内皮細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞の集団と、を提供し、そして
ある量の前記細胞と、ある量の生体適合性マイクロ粒子を含む第１水溶液とを前記脱細胞化細胞外マトリックスに導入すること、
を含み、
前記細胞の前記量は、前記脱細胞化細胞外マトリックスの脈管構造を再内皮化するのに有効な量であり、
前記脈管構造内を循環している時の前記マイクロ粒子の前記量は、前記マイクロ粒子が無い対応する再内皮化後の脱細胞化細胞外マトリックスと比べて、再内皮化中及び再内皮化の後、前記脈管構造内の毛細血管内径の縮小を低減し、又は前記内径を拡大させる量である、方法。
【請求項２】
前記マイクロ粒子は前記毛細血管床内の流れを維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロ粒子は生分解性である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロ粒子は生分解性ではない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロ粒子は球形又は楕円形である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロ粒子は変形可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロ粒子はポリマーで形成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーは天然に存在するポリマーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロ粒子は、アルギン酸塩、ポリサッカライド、コラーゲン、デキストラン、ヒアルロン酸、ガラス、セラミック、金属、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、又はＰＬＡとＰＧＡのコポリマー（ＰＬＡ／ＰＧＡ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーは天然に存在しないポリマーである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロ粒子は、カルボン酸塩、エステル、アミン、アルデヒド、又はハロゲン化物を含むように改変される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロ粒子はタンパク質と非タンパク質のポリマーで形成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロ粒子の平均直径は約０．５μｍ〜約２０μｍである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ粒子は親水性表面を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロ粒子は磁性を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記マイクロ粒子はリガンドを結合させる表面改変を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロ粒子はハイドロゲルを含む、請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液は再内皮化の後に添加される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１水溶液中の前記マイクロ粒子より平均直径が少なくとも１０％大きい生体適合性マイクロ粒子を含む第２水溶液を導入することを更に含む、請求項１〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２水溶液中の前記マイクロ粒子より平均直径が少なくとも１０％大きい生体適合性マイクロ粒子を含む第３水溶液を導入することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１水溶液は、１μＬ当たり約３００，〜約５００，０００のマイクロ粒子を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記脈管構造を、前記マイクロ粒子が無い溶液で洗浄することを更に含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ナノ粒子及びマイクロ粒子が無い前記溶液は、前記マイクロ粒子を分解させる薬剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ナノ粒子及びマイクロ粒子が無い前記溶液は、温度、ｐＨ、超音波、光、又は電気エネルギーを含む、前記マイクロ粒子を分解又は除去させる外部要因と同時に施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記マイクロ粒子はポリスチレンを含む、請求項１〜７、１０〜１１、１３〜１６又は１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ粒子はポリサッカライドを含む、請求項１〜８、１０〜１１、１３〜１６又は１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ粒子は約５〜約２０ミクロンの平均直径を有する、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記臓器は心臓、膵臓、骨、肝臓、腎臓、又は肺である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞はｉＰＳ細胞から取得される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記集団は、注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより前記マトリックスに導入される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記集団は初代細胞を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記集団は複数の異なる細胞型を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記集団はヒト胚幹細胞を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞と、前記灌流により脱細胞化された臓器又は組織とは同種である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞と、前記灌流により脱細胞化された臓器又は組織とは異種である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９０，１１８号明細書の出願日の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
組織工学は、細胞、足場、及び可溶性介在物質の組み合わせを移植することにより、損傷又は罹患した組織及び臓器の修復又は再生を追求する、急速に成長している分野である。現在の幹細胞分化及び初代細胞培養は、一般に、二次元（２Ｄ）培養細胞条件下で達成される。このシステムは、特定の細胞集団を拡大できるものの、機能的な細胞表現型を保持し、高密度の細胞培養及び長期の初代細胞機能又は分化細胞機能を支援する能力は限定される。例えば、特定の細胞療法に必要な多数の初代細胞の利用可能性が限定されるのに対し、特定の系統に分化する能力を保持しながら幹細胞の数を大幅に拡大することは可能である。幹細胞の運命（例えば分化）のインビボ又はインビトロでの制御は、従来、主として遺伝的及び分子的な介在物質（例えば増殖因子や転写因子）に帰属している。幹細胞及び前駆細胞が分化する結果、系統又は組織に特異的な遺伝子発現を有する細胞が得られるが、分化後の細胞は、インビトロ又はインビボでの応用に必要な機能特性に欠けていることがある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、例えば適切な毛細血管直径を確保して移植後に連続的血流を持続させるために、哺乳動物の臓器、組織、又はその一部分が再内皮化した、且つ／又は（内皮細胞以外の細胞で）再細胞化された、無傷の血管床を有する細胞外マトリックス内の毛細血管内径を維持し、縮小を低減し、又は拡大する方法を提供する。この方法は、哺乳動物の臓器、組織、又はその一部分の、無傷の血管床を有する脱細胞化細胞外マトリックスを提供又は作製することと、内皮細胞又は内皮細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞の集団を提供又は作製することと、を含む。ある量の細胞と、生体適合性のナノ粒子若しくはマイクロ粒子を含む第１水溶液とを、同時又は連続的に脱細胞化細胞外マトリックスに導入する。細胞の量は、脱細胞化細胞外マトリックスの脈管構造を再内皮化するのに有効な量であり、脈管構造内を循環する時のナノ粒子又はマイクロ粒子の量は、ナノ粒子又はマイクロ粒子が欠如した対応する再内皮化後の脱細胞化細胞外マトリックスと比べて、再内皮化中及び再内皮化の後、脈管構造内の毛細血管内径を維持し、又は当該内径の縮小（例えば約４ミクロンに縮小）を低減し、又は当該内径を拡大させる（例えば最大で約１５〜約２０ミクロンに拡大）量である。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は生分解性である。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は、添加剤又はエネルギー源に対して急速に生分解可能である。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は生分解性ではない。ナノ粒子は、任意の生体適合性材料で形成されてよく、脈管構造内の通過を可能にする任意の形状であってよい。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は球形又は楕円形である。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子の平均直径は約０．５μｍ〜約３０μｍ又は約５μｍ〜約２０μｍである。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は変形可能である。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は、天然素材ポリマー、合成（非天然素材）ポリマーを含むポリマーで形成される。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は、タンパク質ポリマー及び非タンパク質ポリマーで形成される。一実施形態では、ナノ粒子又はマイクロ粒子は、カルボン酸塩、エステル類、アミン類、アルデヒド類、アルコール類、又はハロゲン化物の他、機能分子（例えば磁性分子のリガンド）を含むように修飾される。一実施形態では、粒子を分解する外部エネルギー源、例えば、光源、磁気源、機械エネルギー源、超音波源（但しこれらに限定されない）が追加される。一実施形態では、再内皮化の後に水溶液が添加される。一実施形態では、粒子を分解させる薬剤を含有し得る、粒子を含まない別の溶液で再内皮化脈管構造を洗浄することにより、ナノ粒子又はマイクロ粒子を除去する。一実施形態では、上記方法は、第１水溶中のナノ粒子又はマイクロ粒子よりも平均直径が少なくとも１０％大きい生体適合性のナノ粒子又はマイクロ粒子を含む第２水溶液を導入することを含む。粒子の濃度は変化してもよく、目的を達成する任意の量であってよい。例えば、第１水溶液は、１μＬ当たり約３００個〜約５０，０００，０００個の粒子を含んでいてよい。
【０００４】
臓器及び組織が無傷の血管（毛細血管）床を有し、臓器又は組織の血管導管の内外へと溶液を循環させることができる限り（「無傷」の脈管構造）、脱細胞化細胞外マトリックスは、どの臓器又は組織に由来していてもよい。一実施形態では、脱細胞化した臓器とは、脱細胞化した心臓、膵臓、肝臓、腎臓、骨、又は肺である。脱細胞化した臓器、組織、又はその一部分の、無傷の脈管構造を有する細胞外マトリックス脈管構造を再内皮化できる細胞型であれば、どの細胞型を使用してもよい。例えば、ｉＰＳ細胞から取得した細胞を使用してよい。一実施形態では、注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより、細胞をマトリックスに導入する。一実施形態では、注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより、細胞を脈管構造に導入する。一実施形態では、脱細胞化細胞外マトリックスに導入される細胞は、初代細胞である。一実施形態では、脱細胞化細胞外マトリックスに導入される細胞は、臓器、組織、又はその一部分を完全又は部分的に再細胞化することが意図された、複数の異なる細胞型である。一実施形態では、脱細胞化細胞外マトリックスに導入される細胞は、ヒト胚幹細胞である。一実施形態では、細胞と、灌流により脱細胞化された臓器、組織、又はその一部分とは、同種である。一実施形態では、細胞と、灌流により脱細胞化された臓器、組織、又はその一部分とは、異種である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】図１Ａは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の写真である。
【図１Ｂ−１Ｃ】図１Ｂと図１Ｃは、それぞれ、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の血管と実質性マトリックスの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図２】浸漬により脱細胞化されたラット肝臓の外観図である。低倍率（左）及び高倍率（右）の双方でマトリックスのほつれが見られる。
【図３】浸漬により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ａ、Ｂ）及び灌流により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ｃ、Ｄ）である。
【図４】浸漬により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ａ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｂ、トリクローム染色）及び灌流により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ｃ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｄ、トリクローム染色）である。
【図５】ラット心臓の浸漬型脱細胞化（上列）と灌流型脱細胞化（下列）の比較を示す図である。
【図６】ラット腎臓を用いた浸漬型脱細胞化（上列）と灌流型脱細胞化（下列）の比較を示す図である。
【図７Ａ】脱細胞化腎臓のＳＥＭ写真である。
【図７Ｂ】脱細胞化腎臓のＳＥＭ写真である。
【図８Ａ】図８Ａは、灌流により脱細胞化された心臓のＳＥＭ写真である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、浸漬により脱細胞化された心臓のＳＥＭ写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、細胞及びＥＣＭの工学を提供するものであり、この工学は、細胞の環境を制御することにより、物理的相互作用及び分子間相互作用を通じて、細胞挙動の制御を導く。特に、本発明は、灌流により脱細胞化されたＥＣＭを有する、工学的に作られた臓器、組織、又はバイオリアクターを提供するものであり、このＥＣＭは、細胞集団（複数の細胞の組み合わせを含む）が移植され、培養条件下（例えば可溶性介在物質の灌流を含む）に置かれて、このＥＣＭの構造及び培養条件の結果として、機能細胞と、対応する天然臓器と実質的に同じ毛細血管内径（例えば約５μｍ〜約１０μｍ又は約３μｍ〜約２０μｍ）とをもたらす。特に、本発明は、生体幹細胞、胚幹細胞、及び部分的に分化した前駆細胞の細胞分化、増殖、及び形質発現の調節の改善、及び毛細血管の内径を維持する結果として、分化後の細胞型の維持の改善を可能にする。また、本発明は、例えば胎生細胞又は新生仔細胞から得られる臓器特異的な細胞（例えば、特定系統が確約されているが最終分化していない細胞）等の、胎仔由来の細胞を含む初代細胞の増殖と機能維持を含む。
【０００７】
本発明は、灌流により脱細胞化された臓器又は組織に由来する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、及びシステムの使用を可能にするものであり、このシステムは、血管細胞（例えば内皮細胞）を用いた上記細胞外マトリックスの再細胞化、又は幹細胞若しくは前駆細胞から内皮細胞への分化及び／若しくは成熟、又は初代細胞の維持若しくは分化、又はこれらの組み合わせを、上記細胞外マトリックスの脈管構造において支援するのに有用なシステムである。初代細胞とは、一般に取得後にインビトロで培養されるが無限には増殖しない、何らかの生体から取得される細胞である。分化した細胞には、初代細胞の他に、本発明の灌流型脱細胞化マトリックスにおいて、インビトロで分化した細胞（例えば幹細胞又は前駆細胞）が含まれる。一実施形態では、分化した細胞の少なくとも５％、１０％、２０％、又はそれ以上が、機能的に成熟した表現型を有する。組織とは、共通の構造及び機能を有する細胞群であり、その例として、上皮組織、結合組織、筋組織（骨格筋、心筋、平滑筋）、神経組織が挙げられ、組織には、臓器を被覆、裏打ち、又は結合する柔軟なシートが含まれる。臓器とは、（２つ以上の）組織の集合体であり、これらの組織が連結して構造単位をなし、共通の機能を提供する。臓器の例として、脳、肝臓、膵臓、骨、心臓、胃、腎臓、胚、全筋、胸腺、肛門、腸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する臓器という語は、灌流可能な臓器全体、又は臓器の一部、又はその血管柄付き構造を含み、本明細書で使用する組織という語は、血管柄付き組織を含む構造体（例えば気管）を含む。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、分化又は成熟を必要とし得る細胞（例えば幹細胞又は前駆細胞）を用いて再内皮化するための、臓器又は組織に特異的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）足場の使用を可能にする。分化とは、細胞が、元の細胞集団とは異なる新規の表現型、例えば別個の細胞遺伝子、及び／又はタンパク質発現、及び／又は機能を獲得するプロセスのことである。成熟により、インビボの細胞集団において、正常の成熟細胞の機能的能力を有するものとして、細胞集団の表現型が更に明確になる。一実施形態では、足場は、灌流により脱細胞化された組織のＥＣＭ部分である。別の実施形態では、足場は、灌流により脱細胞化されたＥＣＭ臓器である。
【０００９】
浸漬に基づく脱細胞化等の他の脱細胞化手法と比べて、臓器又は組織から灌流により脱細胞化されたＥＣＭの方が、天然の微細構造（無傷の血管系及び／又は微小血管系）の多くを保持する。例えば、臓器又は組織から灌流により脱細胞化されたＥＣＭは、コラーゲン含有量その他の結合因子とシグナル伝達因子及び脈管構造を保持するので、導入細胞を機能的に分化させ細胞機能を維持するための天然の手がかりを有するニッチ環境を提供できる。一実施形態では、灌流により脱細胞化されたＥＣＭの脈管構造を用いて、臓器又は組織から灌流により脱細胞化されたＥＣＭに、適切な条件下で（生体に通常見られる状態を模倣する適切な圧力及び流量を含む）、細胞及び／又は媒体を灌流させる。ヒトのサイズの臓器の正常圧力は、約４０〜約２００ｍｍＨｇであり、結果として生じる流量は、引き込む灌流血管の直径に依存する。通常のヒト心臓の場合、結果として生じる灌流流量は約２０〜約２００ｍＬ／分／１００ｇである。このようなシステムを使用すれば、播種した細胞は、２Ｄ細胞培養条件と比べて約５倍〜約１０００倍大きい播種濃度を達成でき、更に、２Ｄ培養系と異なり、ＥＣＭ環境では、細胞の更なる機能的分化（例えば、前駆細胞から、持続機能を有する臓器又は組織に特異的な表現型を示す細胞への分化）が可能である。一実施形態では、培養条件とＥＣＭ源との組み合わせにより、ＥＣＭに導入された細胞の機能的分化が可能になる。
【００１０】
一実施形態では、上記方法は、臓器又は組織の灌流により脱細胞化されたマトリックスと、細胞集団（内皮細胞又は内皮細胞に分化可能な前駆細胞を含む）とを選択することを含む。灌流により脱細胞化されたマトリックスを再細胞化でき、且つ前駆細胞に対しては細胞集団内の細胞が機能細胞に分化できる条件下及び期間において、選択した灌流型脱細胞化マトリックスを細胞集団と接触させる。一実施形態では、ナノ粒子とマイクロ粒子を導入し、細胞と共に脈管構造内を循環させる。一実施形態では、ナノ粒子とマイクロ粒子を導入し、再内皮化後に脈管構造内を循環させる。一実施形態では、臓器は心臓である。別の実施形態では、臓器は肝臓である。別の実施形態では、臓器は膵臓である。別の実施形態では、臓器は肺である。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、再内皮化した灌流型脱細胞化マトリックス内の毛細血管の内径を維持する方法を提供する。この方法は、臓器又は組織の灌流型脱細胞化マトリックスと、内皮細胞に分化可能な幹細胞又は内皮細胞の集団とを選択することを含む。灌流型脱細胞化マトリックスと内皮細胞を再内皮化でき、又は細胞集団内の幹細胞が機能的内皮細胞に分化できる条件下及び期間において、選択した灌流型脱細胞化マトリックスと細胞とを接触させる。一実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。一実施形態では、幹細胞は胚幹（ＥＳ）細胞（例えばヒトＥＳ細胞）である。一実施形態では、幹細胞は成体幹細胞である。
【００１２】
一実施形態では、臓器ＥＣＭ又は組織ＥＣＭの一部分、例えば心臓の心房若しくは心室、又は膵臓の内部構造（膵島を含む）を、本発明の方法で使用する。一実施形態では、当該一部分の厚さは約５〜１０ｍｍである。一実施形態では、当該一部分の厚さは約７０〜１００ｍｍである。
【００１３】
ＥＣＭ臓器又は組織のマトリックスは、任意の供給源から取得してよく、その例として、心臓、肝臓、肺、骨格筋、脳、膵臓、脾臓、腎臓、子宮、眼、脊髄、全筋、膀胱、又はその一部分（例えば、大動脈弁、僧帽弁、肺動脈弁、三尖弁、肺静脈、肺動脈、冠血管系、中隔、右心房、左心房、右心室、又は左心室）が挙げられるが、これらに限定されない。固形臓器とは、「実質的に閉鎖した」脈管系を有する臓器を指す。臓器に関して「実質的に閉鎖した」脈管系とは、主要血管がカニューレ処理され、又は結紮され、又は他の方法により拘束されていることを前提として、液体を灌流させた時、液体の大部分が固形臓器の内部に閉じ込められ、又は天然の脈管構造が渡されて、固形臓器から漏出しないことを意味する。「実質的に閉鎖した」脈管系を有することによらず、上記臓器の多くは、灌流時に液体を導入し臓器全体に移動させるのに有用な、規定の「入口」脈管と「出口」脈管を有する。加えて、他のタイプの血管柄付き臓器又は組織、例えば関節（膝関節、肩関節、股関節等）、肛門、気管、脊髄の全部又は一部を、灌流により脱細胞化してよい。更に、脚全体等のより大きな血管柄付き構造の一部の場合は、無血管組織（例えば軟骨、角膜等）を脱細胞化してもよい。
【００１４】
実質的に閉鎖した血管系を有する臓器の灌流型脱細胞化マトリックスは特に有用であり、その理由は、灌流による脱細胞化により無傷のマトリックスと微小環境が保全され（無傷の脈管系及び微小脈管系を含む）、このような脈管系を利用して、細胞だけでなく栄養素及び／又は分化因子若しくは維持因子をインビトロで細胞に送達できるからである。細胞、栄養素、及び／又は他の因子を、別の手段（例えば注入）、受動的手段、又はこれらの組み合わせで送達してもよい。一実施形態では、目的の細胞集団を、灌流により脱細胞化された臓器ＥＣＭに灌流させることにより、脈管導管の外側の間質腔又はマトリックスへの播種を可能にする。このことは、細胞が自身の生来の微小構造に能動的に移動すること及び／又はホーミング（例えば脈管構造への内皮細胞のホーミング）を含む。一実施形態では、目的の細胞集団を、灌流により脱細胞化されたＥＣＭ内に灌流させ、続いて第２の細胞集団（例えばβ細胞集団）を導入し、続いて、内皮細胞が天然微小環境と同様に血管導管に残っている状態で、内皮細胞集団を導入する。一実施形態では、目的の細胞集団を、灌流により脱細胞化されたＥＣＭ内に灌流させ、続いて第２の細胞集団（例えば内皮細胞集団）を導入し、続いて、内皮細胞が天然微小環境と同様に血管導管に残っている状態で、β細胞を含む細胞集団を導入する。別の実施形態では、２つ以上の細胞集団を組み合わせて、一緒に灌流させる。別の実施形態では、２つ以上の異なる細胞集団を、灌流、直接注入、又は両方の組み合わせにより連続的に導入する。毛細血管内径を維持し、縮小を低減し、又は増大させるため、本発明の粒子を再内皮化脈管構造にエキスビボで導入する。
【００１５】
細胞の増殖、代謝、及び／又は分化を支援する培地に細胞を導入してよい。或いは、細胞がＥＣＭに定着した後、培地を、細胞の増殖、代謝、及び分化を支援する培地に変更する。培養細胞は、生理学的な細胞密度でＥＣＭに存在でき、更に、細胞の増殖、代謝、及び／又は分化を支援する培地が存在し、且つ／又は適切な微小環境がＥＣＭに存在すれば、細胞の維持及び／又は機能分化が可能になる。
【００１６】
細胞とＥＣＭとは、異種であっても同種であってもよい。一実施形態では、部分的又は完全に分化したヒト細胞と、小動物（例えば非ヒト哺乳動物）に由来する、灌流により脱細胞化された臓器又は組織とを組み合わせることができる。一例では、ヒトに由来する灌流型脱細胞化肝臓マトリックスに、内皮細胞と、部分的に分化したヒトＥＳ細胞に由来する肝細胞とを播種することにより、それぞれ異種と同種の細胞播種マトリックスを提供する。
【００１７】
灌流型脱細胞化ＥＣＭ
これまでの研究によれば、３Ｄの結合組織細胞は、２Ｄ培養とは非常に異なる挙動をする（Cukierman et al., Science, 294:1708 (2001)）。例えば、平らな基質上で線維芽細胞を培養すると、インビボでは発生しない極性が誘発される。更に、３Ｄ組織由来のマトリックス内で線維芽細胞その他の細胞型を培養した場合、インビボで見られる複合体に似たインテグリン含有焦点接着複合体が数分以内に形成されるのに対し、２Ｄ培養や単純な３ＤのＩ型コラーゲンゲル又はマトリゲルでは、ごく原始的な接着複合体しか形成されない。適切な増殖因子により受容体シグナリングが活性化され、ＥＣＭを変化させる独自のＥＣＭ構成要素及び因子の合成が急速（５分以内）に開始するには、このような接着複合体が必要とされる（Cukierman et al., 2001; Abbott, Nature, 424:870 (2003)）。加えて、ＥＣＭ培養における細胞は、組織由来のマトリックスに自己分泌増殖因子を堆積させるが、これは、標的細胞に増殖因子を適切に提示するために必要であり得るプロセスである。このような因子は、主として、２Ｄ培養における培地に分泌される。
【００１８】
上記のように、化学的因子、分子的因子（例えば可溶性介在物質）、遺伝因子（細胞型）に加えて、ＥＣＭとの物理的相互作用によっても、細胞運命を制御できる。例えば、マイクロスケール及びナノスケールのＥＣＭジオメトリ、ＥＣＭの弾性、ＥＣＭから細胞に伝達される機械的シグナルといった、複数の物理的メカニズムを通じて、ＥＣＭに基づく細胞制御が発生し得る。
【００１９】
本発明は、細胞（例えば生体幹細胞又は胚幹細胞に由来する細胞）の挙動の制御を、物理的相互作用及び分子間相互作用を通じて改善することを可能にする、工学的に作られた灌流型脱細胞化ＥＣＭの使用を含む。本発明の灌流型脱細胞化マトリックスは、天然のＥＣＭが有する複雑で高次元の性質と、細胞とＥＣＭの間で発生することが予期される相反的相互作用を模倣する。特に、本発明のＥＣＭは、組織に特異的な手がかりを幹細胞又は前駆細胞に提供できる。特に、個別のマトリックスタンパク質は、ＥＣＭのアーキテクチャーに寄与し、又は増殖因子及び／若しくは常在細胞自体と相互作用する能力を有することから、ＥＣＭの特異性にとって重要であり得る。
【００２０】
組織又は臓器のＥＣＭを灌流により脱細胞化することにより、機能細胞の分化及び維持を可能にする構造的、生化学的、及び機械的な特性を提供できる無傷のＥＣＭが提供される。したがって、臓器を灌流により脱細胞化すると、臓器は、幹細胞又は前駆細胞が分化するための組織／臓器固有のバイオリアクターとして機能できる。更に、臓器ＥＣＭ又は組織ＥＣＭの灌流型脱細胞化は、構造的及び生化学的な手がかりを有する無傷のマトリックス（無傷の脈管構造を含む）を保全する点でも、浸漬型より優れている。加えて、組織又は臓器の厚さが約２ｍｍを超える場合、浸漬型脱細胞化より灌流型脱細胞化の方が利点が大きい。
【００２１】
臓器又は組織の脱細胞化
脱細胞化は一般に、以下のステップを含む。固形臓器（例えばその血管形成構造）又は固形組織の安定化、固形臓器又は固形組織の脱細胞化、固形臓器又は固形組織の再生及び／又は中和、固形臓器の洗浄、臓器表面に残存するＤＮＡの分解、臓器又は組織の殺菌、及び臓器の恒常性維持。
【００２２】
脈管形成された臓器構造又は組織を脱細胞化する際の最初のステップは、臓器又は組織にカニューレを挿入することである。臓器又は組織の脈管、導管、及び／又は腔に、当技術分野で公知の方法及び材料を用いてカニューレを挿入してよい。次に、カニューレが挿入された、臓器の脈管形成構造又は組織に、細胞破壊媒体を灌流させる。臓器に対する灌流は多方向であってよい（例えば順方向と逆方向）。
【００２３】
ランゲンドルフ灌流心は、生理学的灌流として当技術分野において常法である（４チャンバ作動モード灌流とも呼ばれる）。例えばDehnert, The Isolated Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff, In Methods in Experimental Physiology and Pharmacology: Biological Measurement Techniques V. Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988を参照のこと。
【００２４】
簡単に述べると、ランゲンドルフ灌流では、大動脈にカニューレを挿入し、生理溶液の入ったリザーバを接続することにより、指定された時間中、心臓が体外で機能できるようにする。灌流型脱細胞化を実現するため、プロトコルを修正し、一定送達流量で（例えば注入若しくはローラーポンプで）又は一定静水圧のポンプで、大動脈を下降して逆方向に送達される細胞破壊媒体が灌流するようにした。いずれの場合も、大動脈は強制的に閉鎖され、灌流液が冠動脈口に向けられ（これにより心臓の心室質量全体が順行性を介して灌流される）、ここから肝静脈洞を介して右心房に排出される。作動モード灌流の場合、第２のカニューレを左心房に接続し、灌流を逆行型に変更できる。
【００２５】
一実施形態では、生理溶液はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。一実施形態では、生理溶液は、例えば栄養補助剤（例えばグルコース）が添加された生理学的に適合性のある緩衝液である。例えば心臓の場合、生理溶液は、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、１１ｍＭのグルコース、１．７５ｍＭのＣａＣｌ2、２．０ｍＭのピルビン酸塩、５Ｕ／Ｌのインスリンを有する改変クレブスヘンゼライト緩衝液、又は１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２ｍＭのＣａＣｌ2を含有し９５％ Ｏ2、５％ ＣＯ2でガス処理されたクレブス緩衝液であってよい。心臓に、単独基質として、又は約１ｍＭ若しくは１．２ｍＭのパルミチン酸塩と組み合わせて、グルコース（例えば約１１ｍＭ）を灌流させてよい。腎臓の場合、生理溶液は、ＫＰＳ−１（登録商標）腎臓灌流溶液であってよい。肝臓の場合、生理溶液は、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２６ｍＭのＮａＨＣＯ3、８ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2を有し２％ ＢＳＡが補充されたクレブスヘンゼライト緩衝液であってよい。
【００２６】
他の臓器又は組織を灌流する方法は、当技術分野において公知である。例えば、下記の参考文献に肺、肝臓、腎臓、脳、及び肢の灌流が記載されている。Van Putte et al., Ann. Thorac. Surg., 74(3):893 (2002); den Butter et al., Transpl. Int., 8:466 (1995); Firth et al., Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657 (1989); Mazzetti et al., Brain Res., 999(1):81 (2004); Wagner et al., J. Artif. Organs, 6(3):183 (2003).
【００２７】
１種類以上の細胞破壊媒体を使用して、臓器又は組織の脱細胞化を行ってよい。細胞破壊媒体は一般に、ＳＤＳ、ＰＥＧ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ等（但しこれらに限定されない）の少なくとも１つの界面活性剤を含む。細胞破壊媒体が浸透圧的に細胞と不適合になるように、細胞破壊媒体に水を含めてよい。或いは、細胞と浸透圧的に適合するように、細胞破壊媒体に緩衝液（例えばＰＢＳ）を含めてもよい。細胞破壊媒体は、１種類以上のコラゲナーゼ、１種類以上のディスパーゼ、１種類以上のＤＮａｓｅ、トリプシン等のプロテアーゼ等の酵素を含んでもよい（但しこれらに限定されない）。場合によっては、細胞破壊媒体は、上記に追加又は代替して、１種類以上の酵素の阻害剤（例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、及び／又はコラゲナーゼ阻害剤）を含んでもよい。
【００２８】
幾つかの実施形態では、カニューレが挿入された臓器又は組織に、２種類の細胞破壊媒体を連続的に灌流させてよい。例えば、第１の細胞破壊媒体がＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤を含み、第２の細胞破壊媒体がＴｒｉｔｏｎ Ｘ等のイオン性界面活性剤を含んでよい。少なくとも１種類の細胞破壊媒体を灌流させた後、カニューレが挿入された臓器又は組織に、例えば洗浄液、及び／又は本明細書に記載されているような１種類以上の酵素を含有した溶液を灌流させてよい。
【００２９】
灌流方向（例えば順方向と逆方向）を交互にすることで、臓器全体又は組織全体の脱細胞化を補助できる。脱細胞化は、概して臓器の内側から外へと脱細胞化するので、ＥＣＭに対する損傷は非常に少ない。４〜４０℃の適切な温度で臓器又は組織を脱細胞化できる。臓器又は組織のサイズと重量、及び細胞破壊媒体中の具体的な界面活性剤とその濃度に応じて、概して、固形臓器又は固形組織（概ね＞５０グラム）１グラム当たり約０．０５〜約５時間、又は固形臓器又は固形組織（概ね＜５０グラム）１グラム当たり約２〜約１２時間かけて、臓器又は組織に細胞破壊媒体を灌流させる。臓器の灌流は、洗浄を含めて、固形臓器又は固形組織（概ね＞５０グラム）１グラム当たり最大で約０．７５時間〜約１０時間、組織（概ね＜５０グラム）１グラム当たり約１２時間〜約７２時間かけて行ってよい。脱細胞化時間は、全体質量の拡大を制限した状態で、臓器又は組織の脈管密度及び細胞密度に依存する。したがって、一般的ガイドラインとして上記の時間範囲及び質量が提供される。灌流は一般に、生理的状態（脈動流、脈拍、脈動圧を含む）になるように調整される。
【００３０】
脱細胞化した臓器又は組織は、臓器又は組織の全部又は大部分の領域の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（血管樹のＥＣＭ成分を含む）を有する。ＥＣＭ成分は、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーのメンバー（例えばコラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、ＥＣＭに付随する増殖タンパク質（増殖因子、サイトカインを含む）、グリコサミノグリカン、基底質、細網線維、及びトロンボスポンジンのうちの一部又は全部を含むことが可能であり、これらは、基底層のような規定の構造として器質化した状態で残ることが可能である。脱細胞化の成功とは、標準の組織染色手順を用いた場合に、組織切片に検出可能な筋フィラメント、内皮細胞、平滑筋細胞、及び核が存在しないこと、又は蛍光分析で測定した場合に、検出可能ＤＮＡの９７％超が除去されていることと定義される。残存する細胞残屑は、脱細胞化した臓器又は組織から除去してよい。
【００３１】
脱細胞化プロセス中及びその後は、ＥＣＭの形態とアーキテクチャーが維持される。本明細書で使用する「形態」という用語は、臓器、組織、又はＥＣＭの全体形状を指し、本明細書で使用する「アーキテクチャー」という用語は、外表面、内表面、及びこれらの間にあるＥＣＭを指す。
【００３２】
ＥＣＭの形態及びアーキテクチャーの検査は、目視及び／又は組織学的に行うことができる。例えば、固形臓器の外表面又は、臓器若しくは組織の脈管構造内にある基底層は、灌流型脱細胞化で除去されるべきでなく、著しい損傷を受けるべきでない。加えて、ＥＣＭの原線維は、脱細胞化していない臓器又は組織の原線維と同様であるか、著しく変化していない状態であるべきである。
【００３３】
例えば、脱細胞化した臓器を保存する目的、又は再細胞化のために脱細胞化臓器若しくは組織を作製する目的、及び／又は再細胞化工程中に細胞を補助若しくは刺激する目的で、１つ以上の化合物を、脱細胞化した臓器又は組織の中又は表面に施してよい。このような化合物の例として、１つ以上の増殖因子（例えばＶＥＧＦ、ＤＫＫ−１、ＦＧＦ、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−４、ＳＤＦ−１、ＩＧＦ、ＨＧＦ）、免疫調節剤（例えばサイトカイン、グルココルチコイド、ＩＬ２Ｒアンタゴニスト、ロイコトリエンアンタゴニスト）、及び／又は凝固カスケードを修飾する因子（例えばアスピリン、ヘパリン結合タンパク質、ヘパリン）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、脱細胞化した臓器又は組織を、例えば、脱細胞化した臓器又は組織の中又は表面に残存する任意の種類の微生物の存在を低減又は排除する目的で、照射線（例えばＵＶ、ガンマ線）で更に処理してよい。
【００３４】
心臓の代表的な灌流型脱細胞化
脱細胞化プロトコル（ＰＥＧ）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルドを含有する２００ｍｌのＰＢＳに入れて、再循環させずに洗浄する。次に、３５ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、１ｇ／ｍＬ）で最長３０分間、手動で再循環させながら心臓を脱細胞化する。次に、５００ｍＬのＰＢＳで最長２４時間、再循環用ポンプを使用して臓器を洗浄する。この洗浄ステップを、各回少なくとも２４時間かけて少なくとも２回繰り返す。手動で再循環させながら、心臓を少なくとも１時間、３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）に曝す。再び、少なくとも２４時間かけて臓器を５００ｍｌのＰＢＳで洗浄する。
【００３５】
脱細胞化プロトコル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ及びトリプシン）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルドを含有する２００ｍｌのＰＢＳに入れて、少なくとも約２０分間、再循環させずに洗浄する。次に、心臓を０．０５％トリプシンで３０分かけて脱細胞化した後、５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ及び０．１％水酸化アンモニウムを含有する５００ｍＬのＰＢＳを約６時間灌流させる。心臓に脱イオン水を約１時間灌流させた後、ＰＢＳを１２時間灌流させる。次に、再循環用ポンプを使用して、各回２４時間かけて心臓を５００ｍＬのＰＢＳで３回洗浄する。手動で再循環させながら、心臓に３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）を１時間灌流させ、再循環用ポンプを使用して、各回少なくとも約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳで心臓を２回洗浄する。
【００３６】
脱細胞化プロトコル（１％ ＳＤＳ）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルドを含有する２００ｍＬのＰＢＳに入れて、少なくとも約２０分間、再循環させずに洗浄する。再循環用ポンプを使用して、心臓を、１％ ＳＤＳを含有する５００ｍＬの水で少なくとも約６時間かけて脱細胞化する。次に、心臓を脱イオン水で約１時間洗浄し、ＰＢＳで約１２時間洗浄する。再循環用ポンプを使用し、各回少なくとも約２４時間かけて、心臓を５００ｍＬのＰＢＳで３回洗浄する。次に、手動で再循環させながら、心臓に３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）を約１時間灌流させ、再循環用ポンプを使用して、各回少なくとも約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳで心臓を３回洗浄する。
【００３７】
脱細胞化プロトコル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルド（アデノシン）を含有する２００ｍＬのＰＢＳに入れて、少なくとも約２０分間、再循環させずに洗浄する。次に、再循環用ポンプを使用し、少なくとも６時間かけて、５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ及び０．１％水酸化アンモニウムを含有する５００ｍＬの水で心臓を脱細胞化する。次に、心臓に脱イオン水を約１時間灌流させ、続いてＰＢＳを約１２時間灌流させる。再循環用ポンプを使用し、各回少なくとも約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳを３回灌流させることにより心臓を洗浄する。次に、手動で再循環させながら、心臓に３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）を約１時間灌流させ、各回約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳで心臓を３回洗浄する。
【００３８】
心臓の灌流は６０ｃｍＨ2Ｏの冠灌流圧で行ってよい。必須ではないが、心臓を脱細胞化チャンバ内に取り付け、５ｍＬ／分の連続流量の再循環モードで７２時間、抗生物質を含有するＰＢＳに完全に浸漬させて灌流し、細胞成分と界面活性剤を可能な限り洗い流してよい。
【００３９】
心臓脱細胞化の検出
組織切片中の筋フィラメント及び核の欠落により、脱細胞化の成否を測定できる。脈管構造の保全の成否は、組織切片を埋め込む前に２％エバンスブルーを灌流させることにより評価できる。高効率な脱細胞化が観察される条件とは、最初に、脱イオンＨ2Ｏに溶解したイオン性界面活性剤（１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．０３Ｍ）を用いて心臓に定常冠灌流圧で順方向に灌流させてから、非イオン性界面活性剤（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を順方向に灌流させて、ＳＤＳを除去し恐らく細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を再生させた場合である。閉鎖した毛細血管及び小血管を通過させるため、断続的に、リン酸緩衝液を逆方向に心臓に灌流させてよい。
【００４０】
脱細胞化の後に脈管構造が無傷であることを実証するために、脱細胞化した心臓を、ランゲンドルフ灌流を介してエバンスブルーで染色することにより、脈管基底膜を染色し大血管及び微小血管の密度を定量化できる。更に、ポリスチレン粒子を心臓に導入し臓器内を灌流させることにより、脈管漏出のレベルを表す冠血管容積を定量化でき、冠血管流出液と組織切片を分析することにより灌流の分布を評価できる。以下の３つの基準の組み合わせを評価し、摘出された非脱細胞化心臓と比較する。１）ポリスチレン粒子の均一な分布、２）あるレベルの漏出における有意な変化、３）微小血管の密度。
【００４１】
Tower et al. (Ann Biomed Eng., 30(10):1221 (2002))の偏光電子顕微鏡手法により線維の配向を評価でき、この手法は、一軸又は二軸の応力をかけられた試料に対してリアルタイムで適用できる。ランゲンドルフ灌流中、脱細胞化ＥＣＭの基本的な機械特性（コンプライアンス、弾性、破裂圧力）を記録し、摘出直後の心臓と比較する。
【００４２】
肝臓の代表的な灌流型脱細胞化
肝臓を摘出するため、腹部正中切開により大静脈を露出させ、切開し、マウス大動脈カニューレ（Ｒａｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ、カリフォルニア州モンロビア）を用いてカニューレ処置する。肝動脈、肝静脈、及び胆管を切除し、腹部から肝臓を慎重に除去し、無菌ＰＢＳ（ハイクローン、ユタ州ローガン）中に沈めて、門脈に加わる引張り力が最小になるようにする。ヘパリン処置されたＰＢＳを１５分間灌流させた後、脱イオン水に溶解した１％ ＳＤＳ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を２〜１２時間灌流させ、脱イオン水に溶解した１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を１５分間灌流させる。次に、抗生物質を含有するＰＢＳ（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−Ｇ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（シグマ、ミズーリ州セントルイス））を１２４時間、肝臓に連続的に灌流させる。
【００４３】
ＳＤＳによる１２０分間の灌流と、それに続くＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００による灌流は、完全に脱細胞化された肝臓を生成するのに充分である。脱細胞化した肝臓をモバットペンタクローム染色すると、中心静脈、及び肝動脈、胆管、門脈を含む門脈空間を有する特徴的な肝臓組織が保持されていることが確認される。
【００４４】
臓器又は組織の再細胞化
脱細胞化した臓器又は組織を、分化した細胞（成熟細胞又は初代細胞）、幹細胞、部分的に分化した細胞（複数の細胞型を含む）のいずれかの細胞集団と接触させる。このように、接触させる細胞は、全能性細胞、多能性（pluripotent）細胞、多能性（multipotent）細胞のいずれであってもよく、拘束細胞、非拘束細胞のどちらでもよく、単一系統細胞であってよい。接触させる細胞は、未分化細胞、部分的に分化した細胞、完全に分化した細胞のいずれであってもよい（胎仔由来の細胞を含む）。細胞には、前駆細胞、前駆体細胞が含まれ、臍帯細胞と胎生幹細胞を含む「生体」由来の幹細胞が含まれる。本発明のマトリックスに有用な細胞には、胚幹細胞（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の定義による。例えばワールドワイドウェブのstemcells.nih.govに掲載されている用語集を参照）及びｉＰＳ細胞が含まれる。
【００４５】
臓器又は組織の再細胞化に使用できる細胞の例として、胚幹細胞、臍帯血細胞、組織由来の幹細胞若しくは前駆細胞、骨髄由来の幹細胞若しくは前駆細胞、血液由来の幹細胞若しくは前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨格筋由来細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、ｉＰＳ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用可能な他の細胞として、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、多能性成体心臓由来幹細胞、心臓線維芽細胞、心臓微小血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、冠血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、静脈内皮細胞、動脈内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、肝細胞、β細胞、角化細胞、プルキンエ線維、ニューロン、胆管上皮細胞、膵島細胞、肺細胞、クララ細胞、刷子縁細胞、有足細胞が挙げられる。また、骨髄単核球細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）等の骨髄由来の幹細胞、内皮又は血管の幹細胞又は前駆細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）等の末梢血由来幹細胞も、細胞として使用できる。
【００４６】
灌流により脱細胞化された足場の内部及び表面に導入する細胞の数は、臓器（例えば臓器の種類、サイズ、重量）又は組織と、新生細胞の種類及び発達段階の双方に依存し得る。細胞の種類が異なれば、細胞が到達する集団密度に関する傾向も異なり得る。同様に、臓器又は組織の種類が異なれば、細胞化する時の密度も異なり得る。例として、脱細胞化した臓器又は組織に、少なくとも１，０００個（例えば少なくとも１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、又は１００，０００，０００個）の細胞を「播種」してよく、或いは、組織１ｍｇ（湿重量、例えば脱細胞化前の重量）当たり約１，０００個〜組織１ｍｇ（湿重量）当たり約１０，０００，０００個の細胞を臓器又は組織に付着させてよい。
【００４７】
１か所以上に注入することにより、脱細胞化した臓器又は組織に細胞を導入（「播種」）してよい。加えて、脱細胞化した臓器又は組織に複数の種類の細胞を導入してよい。例えば、分化した複数の細胞型の集団を、脱細胞化した臓器又は組織の複数の部位に注入してよく、或いは、脱細胞化した臓器又は組織の様々な部分に様々な細胞型を注入してよい。注入に代替又は追加して、脱細胞化しカニューレが挿入された臓器又は組織に、細胞又は細胞カクテルを灌流により導入してもよい。例えば、灌流媒体を用いて細胞を脱細胞化臓器内に灌流させてから、細胞の増殖及び／又は分化を誘発するための増殖媒体及び／又は分化媒体と交換してよい。臓器内の種々の部位（例えば、心臓の心房、心室、結節等の領域）に細胞を配置することにより、部位に特異的な分化を達成できる。
【００４８】
再細胞化中、細胞の少なくとも一部が、脱細胞化した臓器又は組織の内部又は表面で増殖及び／又は分化できる条件下で、臓器又は組織を維持する。このような条件には、適切な温度及び／又は圧力、電気的及び／又は機械的活動、力、適切な量のＯ2及び／又はＣＯ2、適切な量の湿気、並びに無菌又は無菌に近い状態が含まれるが、これらに限定されない。再細胞化中、脱細胞化した臓器又は組織、及びそれに付着している新生細胞を、適切な環境で維持する。例えば細胞は、栄養剤（例えば栄養素及び／又はグルコース等の炭素源）、外因性ホルモン若しくは増殖因子、及び／又は特定のｐＨを必要とする場合がある。
【００４９】
細胞は、脱細胞化した臓器又は組織と同種であってもよく（例えば、脱細胞化したヒトの臓器又は組織にヒト細胞を播種）、脱細胞化した臓器又は組織に対して異種であってもよい（例えば、脱細胞化したブタの臓器又は組織にヒト細胞を播種）。本明細書で使用する「同種」という用語は、臓器又は組織の発生元の種と同一の種（例えば、血縁関係を有するか有さない個体）から取得した細胞を指し、「異種」という用語は、臓器又は組織の発生元の種とは異なる種から取得した細胞を指す。
【００５０】
幹細胞又は前駆細胞用の培地は、種々の成分を含有してよく、例えば、ＫＯＤＭＥＭ培地（ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地）、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）、ＫＳＲ、又はｈＬＩＦ（ヒト白血病抑制因子）を含有してよい。また、細胞分化用の培地は、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２、Ｂ２７、βメルカプトエタノール等の補助剤を含有してもよい。細胞分化用の培地に付加的因子を添加してよいことが企図されており、付加的因子の例として、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸、上皮細胞増殖因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー（ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、及び／又はＦＧＦ１０を含む）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のメンバー、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖分化因子（ＧＤＦ）ファミリー、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ventropin）、高用量アクチビン、アムニオンレス等（但しこれらに限定されない）アンタゴニスト、又はこれらの変異体若しくは機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストをＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形で添加してもよい。添加してよい他の因子には、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを通じてシグナリングを活性化又は不活性化できる分子が含まれ、その例として、デルタ様タンパク質、Ｊａｇｇｅｄファミリータンパク質の他、Ｎｏｔｃｈプロセシング又は開裂の阻害剤、又はこれらの変異体若しくは機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。他の増殖因子としては、インスリン様増殖因子ファミリー（ＩＧＦ）、インスリン、ウィングレス関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、ヘッジホッグ因子ファミリー、又はこれらの変異体若しくは機能的断片が挙げられる。付加的因子を添加することにより、中内胚葉の幹／前駆体、内胚葉の幹／前駆体、中胚葉の幹／前駆体、又は胚体内胚葉の幹／前駆体の増殖と生存を促進でき、また、これらの前駆体の派生体の生存と分化を促進できる。
【００５１】
一実施形態では、灌流型脱細胞化マトリックスとｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞とを組み合わせ、胚様体（ＥＢ）法を用いて分化させる。例えば、転写因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ；又はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４）の形質導入（例えばレンチウイルス介在性の形質導入）により再プログラムされたヒトｉＰＳ細胞株を使用する。胎児由来又は新生児由来のｉＰＳクローンを使用してよい。ヒトＥＳ細胞株を使用してもよい。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞の維持は、６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）において細胞数１９，５００／ｃｍ2の密度で、照射を受けたマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の表面で行ってよく、培地は、２０％ノックアウト血清代替物（インビトロジェン）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌの非必須アミノ酸、１ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、０．１ｍｍｌ／Ｌのβメルカプトエタノール（シグマ）が補助剤として添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用してよい。加えて、補助剤として、ｉＰＳ細胞には１００ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞増殖因子、ｈＥＳ細胞には４ｎｇ／ｍＬのヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（インビトロジェン）を培地に添加してよい。また、ｉＰＳ細胞株とＥＳ細胞株の維持を、ゼラチン化した１００ｍｍ皿上で行ってもよく、培地は、１５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、シグマアルドリッチ）、０．１μｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、及び１，０００単位／ｍｌのＬＩＦ（ケミコンインターナショナル）を含有するＤＭＥＭである。分化させるため、上記の細胞を０．２５％トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＧＩＢＣＯ）で処理し、補助剤として１０％ ＦＣＳと０．０５μｍｏｌ／Ｌの２ＭＥが添加されたα−最小必須培地（ＧＩＢＣＯ）中の６ウェルのゼラチン化プレートに移し、細胞数３×１０4／ウェルの濃度にしてよい。
【００５２】
１ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ）溶液と共に３７℃で８〜１５分間インキュベートすることにより、培養プレートからコロニーを外して、懸濁培養液中の超低アタッチメントプレートに配置し、例えば４日間静置してよい。懸濁培養中、１日目に培養液を交換し、その後の３日間は培養液を交換せずに培養してよい。次に、０．１％ゼラチンが塗布されたプレートに、例えば１ウェル当たりＥＢ数５０〜１００の密度でＥＢをプレーティングするか、灌流により脱細胞化したＥＣＭ内において、分化用培養液（例えば毎日交換される培養液）中で培養する。
【００５３】
場合によっては、本明細書に記載の方法で生成した臓器又は組織を患者に移植する。この場合、脱細胞化した臓器又は組織を再細胞化するのに使用する細胞を患者から取得して、この細胞を当該患者の「自己由来」とすることができる。患者由来の細胞は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、生涯の様々な段階（例えば出生前、新生児期若しくは周産期、青年期、又は成人期）の血液、骨髄、組織、又は臓器から取得できる。或いは、脱細胞化した臓器若しくは組織の再細胞化に使用する細胞は、患者に対して同系（すなわち一卵性双生児に由来）であってもよく、又は、細胞は、例えば患者の血縁者か、若しくは患者と血縁関係にないヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）適合個体に由来する、ＨＬＡ適合細胞であってもよく、又は、細胞は、例えばＨＬＡ不適合ドナーに由来する、患者に対して同種の細胞であってもよい。
【００５４】
細胞の源（例えば自己由来か否か）にかかわらず、脱細胞化した固形臓器は、患者に対して自己由来でも、同種でも、異種でもよい。
【００５５】
再細胞化中、細胞の進行状況をモニタリングすることができる。例えば、再細胞化中の一時点又は複数時点で生検を行うことにより、臓器又は組織の表面又は内部にある細胞の数を評価できる。加えて、種々のマーカーが細胞内又は細胞集団内に存在するかどうかを判断することにより、細胞に生じた分化の量をモニタリングできる。種々の細胞型及びその様々な分化段階に関連するマーカーは当技術分野において公知であり、抗体及び標準の免疫測定法を用いて容易に検出することができる。例えば、Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sonsの３章と１１章を参照のこと。核酸アッセイの他、形態評価／組織学的評価を用いて、再細胞化をモニタリングできる。
【００５６】
再細胞化したグラフトは連続的に灌流される。培養中、細胞の生存が維持されるので、ＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量化して、例えばアポトーシス性の細胞を特定することができる。
【００５７】
臓器又は組織を脱細胞化及び／又は再細胞化するための制御システム
臓器又は組織を脱細胞化及び／又は再細胞化するためのシステム（例えばバイオリアクター）は一般に、臓器又は組織にカニューレを挿入するための少なくとも１つのカニューレ処置装置と、カニューレを通じて臓器又は組織を灌流するための灌流装置と、臓器又は組織の無菌環境を維持するための手段（例えば封じ込めシステム）とを含む。カニューレ処置及び灌流は、当技術分野において周知の手法である。カニューレ処置装置は一般に、臓器又は組織の血管、導管、及び／又は腔に導入するのに適切なサイズの中空管を含む。通常は、臓器内の１つ以上の脈管、導管、及び／又は腔にカニューレが挿入される。灌流装置には、液体（例えば細胞破壊媒体）を保持する容器と、１つ以上のカニューレを介して液体を臓器内で移動させるための機構（例えばポンプ、空気圧、重力）とが含まれ得る。脱細胞化時及び／又は再細胞化時に臓器又は組織の無菌性を維持するには、当技術分野において公知の種々の手法を使用してよく、このような手法の例として、空気流の制御と濾過、及び／又は例えば抗生物質、抗真菌剤、その他の抗菌剤を用いた灌流による不要な微生物の増殖防止が挙げられる。
【００５８】
本明細書に記載の臓器又は組織を脱細胞化又は再細胞化するためのシステムは、特定の灌流特性（例えば圧力、容積、フローパターン、温度、気体、ｐＨ）、機械力（例えば心室壁の運動と応力）、及び電気刺激（例えばペーシング）をモニタリングする能力を有し得る。脱細胞化及び再細胞化の過程で冠血管床が変化するので（例えば脈管の耐性、容積）、大きな変動を避けるには圧力制御型の灌流装置が有利である。灌流の有効性は流出液と組織切片で評価できる。標準の方法を用いて、灌流容積、フローパターン、温度、Ｏ2分圧とＣＯ2分圧、及びｐＨをモニタリングできる。
【００５９】
センサを使ってシステム（例えばバイオリアクター）及び／又は臓器若しくは組織をモニタリングできる。ソノマイクロメトリー、マイクロマノメトリー、及び／又はコンダクタンスの測定値を使用すれば、心筋壁の運動と性能に対する、圧力−容積又は前負荷動員一回仕事量に関する情報を取得できる。例えば、センサを使用することにより、カニューレが挿入された臓器若しくは組織内を移動する液体の圧力、システム内の周囲温度及び／又は臓器若しくは組織の温度、カニューレが挿入された臓器若しくは組織内を移動する液体のｐＨ及び／若しくは流量、並びに／又は再細胞化している臓器若しくは組織の生物活性をモニタリングできる。臓器又は組織を脱細胞化及び／又は再細胞化するシステムは、上記特性をモニタリングするセンサに加えて、上記特性を維持又は調整する手段を備えることもできる。上記特性を維持又は調整する手段の例として、温度計、サーモスタット、電極、圧力センサ、オーバーフローバルブ、液体流量を変化させるバルブ、溶液のｐＨを変化させるのに使われる溶液との流体接続を開閉するバルブ、バルーン、体外型ペースメーカー、及び／又はコンプライアンスチャンバ等の構成要素が挙げられる。状態（温度等）を確実に安定させるため、チャンバ、リザーバ、及び管類に水ジャケットを取り付けてよい。
【００６０】
再細胞化中、臓器及び臓器に付着した細胞に機械的負荷をかけることが有利であり得る。例として、左心房を介して左心室に挿入されたバルーンを使用して、心臓に機械的ストレスをかけることができる。容積と速度の調節ができるピストンポンプをバルーンに接続して、左心室壁の運動と応力をシミュレートできる。壁の運動と応力をモニタリングする目的で、マイクロマノメトリー及び／又はソノマイクロメトリーを用いて左心室壁の運動と圧力を測定できる。幾つかの実施形態では、体外式ペースメーカーをピストンポンプに接続して、心室バルーンの各収縮と同期した刺激（収縮期に相当）を提供できる。心臓表面から末梢ＥＣＧを記録することにより、ペーシング電圧の調整、脱分極と再分極のモニタリングが可能になり、再細胞化中又は再細胞化後の心臓の簡略表面マップが得られる。
【００６１】
左心房を介して左心室に挿入されたカニューレに蠕動ポンプを取り付けるという方法でも、機械的な心室膨張を実現できる。バルーンを使用する上記手順と同様に、カニューレを介した周期的な流体運動（例えば脈動流）で実現される心室膨張も、電気的刺激と同期させることができる。
【００６２】
本明細書に開示されている方法と材料を使用して、哺乳動物の心臓を脱細胞化し再細胞化することができ、更に、適切な条件下で維持すれば、収縮機能を起こし、且つペーシング刺激及び／又は薬理作用物質に応答する機能性心臓を作製することができる。
【００６３】
臓器又は組織を生成するシステムを、プログラマブルプロセッサと組み合わされたコンピュータ可読記憶媒体で制御してよい（例えば、本明細書で使用するコンピュータ可読記憶媒体には、プログラマブルプロセッサに特定のステップを実行させる命令が保存される）。例えば、このような記憶媒体は、プログラマブルプロセッサと共同して１つ以上のセンサからの情報を受信し処理することができる。このような記憶媒体をプログラマブルプロセッサと併用すると、情報と命令をバイオリアクター及び／又は臓器若しくは組織に返送することもできる。
【００６４】
再細胞化が発生している臓器又は組織の生物活性をモニタリングすることができる。生物活性とは、臓器又は組織の心臓組織、電気的活性、機械的活性、機械的圧力、収縮力、及び／又は壁応力等の、臓器又は組織自体の生物活性であり得る。加えて、臓器又は組織に付着している細胞の生物活性、例えばイオン輸送／交換活性、細胞分裂、及び／又は細胞生存率をモニタリングすることもできる。例えば、Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology (2001, Wood, Prentice Hall) and Current Protocols in Cell Biology (2001, Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons)を参照のこと。上述の通り、再細胞化中に臓器に加わる能動負荷をシミュレートすることが有用であり得る。本発明のコンピュータ可読記憶媒体をプログラマブルプロセッサと併用することにより、臓器又は組織に加わる能動負荷のモニタリングと維持に必要な構成要素を調和させることができる。
【００６５】
一実施形態では、本明細書に記載のコンピュータ可読記憶媒体に臓器又は組織の重量を入力してよく、この記憶媒体は、プログラマブルプロセッサと共同して、特定の当該臓器又は組織の曝露時間と灌流圧を計算することができる。このような記憶媒体に、前負荷と後負荷（それぞれ灌流の前と後の圧力）及び流量を記録してよい。この実施形態では、例えば、コンピュータ可読記憶媒体がプログラマブルプロセッサと共同して、１つ以上のポンプ及び／又はバルブ制御を介して灌流圧、灌流方向、及び／又は灌流液の種類を調整することができる。
【００６６】
下記実施例において本発明を更に説明するが、下記実施例は、請求項に記載されている本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１
灌流と浸漬の比較
図１Ａは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の写真を示し、図１Ｂと図１Ｃは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓のそれぞれ血管と実質性マトリックスのＳＥＭ写真を示す。これらの写真は、灌流により脱細胞化された臓器の脈管導管及びマトリックスの完全性を示している。他方、図２は、浸漬により脱細胞化されたラット肝臓の外観図であり、この図では、低倍率（左）と高倍率（右）の双方でマトリックスのほつれが見られる。
【００６８】
図３は、浸漬により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ａ、Ｂ）及び灌流により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ｃ、Ｄ）である。これらの結果は、浸漬型脱細胞化が臓器の嚢（グリソン鞘）を著しく損なうのに対し、灌流型脱細胞化はグリソン鞘を保持したことを明確に示している。更に、図４は、浸漬により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ａ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｂ、トリクローム染色）及び灌流により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ｃ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｄ、トリクローム染色）である。浸漬により脱細胞化されたラット肝臓は、注入時に細胞も色素も保持しなかった。
【００６９】
図５は、ラット心臓の浸漬型脱細胞化（上列）と灌流型脱細胞化（下列）の比較を示す。左の列は臓器全体の写真である。２枚の写真から分かるように、灌流型脱細胞化臓器（左下）の方が、浸漬型脱細胞化臓器（左上）よりもはるかに半透明であり、浸漬型脱細胞化臓器の方は、屍体筋肉組織の鉄分が多い「赤茶色」を有し、未だ細胞を含有しているように見える。中央列の写真は、脱細胞化した組織のＨ＆Ｅ染色パターンを示す。染色により、浸漬型脱細胞化の後は、脈管構造の実質内と壁内の両方に多数の細胞が残っているのに対し（中央上）、灌流型脱細胞化の後は、本発明の血管導管が明確に確認できるにもかかわらず、事実上全ての細胞と、細胞残屑も除去されていることが分かる。加えて、右列の走査型電子顕微鏡写真は、浸漬型脱細胞化（右上）後と灌流型脱細胞化（右下）後では、マトリックスの超微細構造に有意差があることを示している。ここでも、浸漬型脱細胞化心臓の全ての壁部において、心筋の断面全体に細胞成分が完全に保持されていることが観察されるが、灌流型脱細胞化心臓では、このような細胞成分がほぼ完全に失われ、同時に、血管導管を含む無傷の心筋の空間特徴と構造的特徴が保持されていることが観察された。例えば、灌流型脱細胞化マトリックスは、細胞を完全に喪失しているにもかかわらず、マトリックス内に織り（ｗ）、巻き（ｃ）、及び筋交い（ｓ）を含む構造的特徴を保持していた。
【００７０】
図６は、ラット腎臓を用いた浸漬型脱細胞化（上列）と灌流型脱細胞化（下列）の上記と同じ比較を示す。心臓とは異なり、両方ともかなり半透明であるという点で、浸漬型脱細胞化腎臓全体（左上）と、灌流型脱細胞化腎臓全体（左下）はよく似ている。しかし、灌流型脱細胞化腎臓の方が、灌流型脱細胞化臓器内の血管導管網が明確であり、浸漬型脱細胞化構築物よりも枝分かれの可視化の程度が高い。更に、灌流型脱細胞化腎臓は、無傷の臓器嚢を保持し、腸間膜に囲まれ、写真が示すように付属の副腎も脱細胞化されている。中央列の写真は、２つの組織のＨ＆Ｅ染色パターンを示す。染色から、浸漬型脱細胞化の後は、細胞成分及び／又は残屑、更に無傷の核（紫色の染色）も残っているのに対し（中央上）、灌流型脱細胞化の後は、事実上全ての細胞及び／又は全ての細胞残屑が除去されていることが分かる。同様に、この図のＳＥＭ写真は、灌流型脱細胞化腎臓マトリックス（右下）と比べて、浸漬型脱細胞化腎臓マトリックス（右上）が受けた損傷が多いことを示している。浸漬型脱細胞化腎臓では、臓器嚢が欠落又は損傷しているために、マトリックス表面の「穴」やほころびが明白であるのに対し、灌流型脱細胞化臓器では、臓器嚢は無傷である。
【００７１】
図７は、脱細胞化した腎臓のＳＥＭ写真を示す。図７Ａは灌流型脱細胞化腎臓を示し、図７Ｂは浸漬型脱細胞化腎臓を示す。図８Ａは、灌流型脱細胞化心臓のＳＥＭ写真を示し、図８Ｂは、浸漬型脱細胞化心臓のＳＥＭ写真を示す。これらの画像も、浸漬型脱細胞化により臓器の超微細構造に損傷が生じ、灌流型脱細胞化の後はマトリックスが生存能を有することを示している。
【００７２】
実施例２
本発明の方法において有用な代表的粒子
本発明の方法において有用な粒子として、ナノスフェア、マイクロスフェア等のナノ粒子、マイクロ粒子が挙げられ、これらの粒子は様々な生体適合性材料で形成されてよく、生体適合性材料の例として、合成材料、生物（天然）材料、改変生物材料が挙げられ、これらの材料は分解性であっても分解性でなくてもよい。ナノ粒子又はマイクロ粒子を形成できる原材料の例として、アルギン酸塩（alignate）、ポリサッカライド、コラーゲン、デキストラン、ヒアルロン酸、ガラス、セラミック、チタン等の金属、鉄心を有する粒子、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＡ／ＰＧＡ、単分散メラミン樹脂粒子、ポリスチレン、ナイロン、ＰＭＭＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。適切なポリマー材料の例として、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）等のポリオキシド；ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリエステル；ポリウレタン；ポリスルホン；ポリ（ジメチルシロキサン）等のポリシロキサン；ポリスルフィド；ポリアセチレン；ポリスルホン；ポリスルホンアミド；ポリカプロラクタム、ポリ（ヘキサメチレンアジパミド）等のポリアミド；ポリイミン；ポリ尿素；ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリジノン等の複素環ポリマー；天然ゴム、ゼラチン、セルロース等の天然素材ポリマー；ポリカーボネート；ポリ酸無水物；ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレンコポリマー等のポリアルケンが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー材料は、例えば、化学分析又は生物学的分析における粒子の有用性を高める上で望ましい化学的部分又は生物学的部分の結合部位を提供する目的で、カルボン酸塩、エステル、アミン、アルデヒド、アルコール、ハロゲン化物等の官能基を含有していてもよい。
【００７３】
ポリマーからナノ粒子又はマイクロ粒子を作製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、タンパク質を非タンパク質ポリマーと組み合わせることにより、複合ナノスフェア又は複合マイクロスフェアを形成できる。一実施形態では、粒子は、生体内分解性の合成ポリマー又は天然ポリマーである。本明細書で使用する「生体内分解性」又は「生分解性」という用語は、酵素、熱、電気、イオン強度、ｐＨ、機械、又は化学作用により、より単純な化学種へと分解又は解離する材料を指す。ポリサッカライドは天然ポリマーの一例である。インビボで無害生成物に分解する合成ポリマーの例として、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼン、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、並びにこれらのブレンド及びコポリマーが挙げられる。プロラミン複合マイクロスフェアを形成するには、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーが特に有用である。ＰＬＡポリマーは通常、乳酸の環状エステルから作製される。Ｄ（−）乳酸とＬ（＋）乳酸の混合物の光学不活性なＤＬ−乳酸混合物だけでなく、Ｌ（＋）、Ｄ（−）の両形態の乳酸を使ってＰＬＡポリマーを作製できる。ポリ乳酸の作製方法は、特許文献で充分に説明されている。以下の米国特許：Doroughに対する第１，９９５，９７０号明細書、Schneiderに対する第２，７０３，３１６号明細書、Salzbergに対する第２，７５８，９８７号明細書、Zeileに対する第２，９５１，８２８号明細書、Higginsに対する第２，６７６，９４５号明細書及び第２，６８３，１３６号明細書、Trehuに対する第３，５３１，５６１号明細書は、適切なポリ乳酸とその特性及び作製について詳細に説明しており、これらの文献の教示内容は参照により本明細書に援用される。熱応答性ポリマーの例として、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリ（ビニルカプロラクタム）、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルエーテルポリヒドロキシエチルメタクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
一実施形態では、粒子は、アミラーゼ等の酵素で容易に分解できるポリサッカライドで形成される。この場合、移植前に迅速に粒子を除去することが可能になる。
【００７５】
粒子の直径は、各粒子が毛細血管床を通過できるように、赤血球の直径とほぼ同じであってよい。粒子のサイズは、例えば約０．０１μｍ〜約３０μｍ、約０．５μｍ〜約２０μｍ、又は約５μｍ〜約１０μｍであってよい。
【００７６】
粒子は、球形、楕円形、円盤形、ドーナツ形、星形等、脈管構造を通過するのに適した任意の形状を有してよく、凹面又は凸面を有してよく、滑面や非滑面を有してよい。
【００７７】
粒子は、確実に容易に通過するための親水性表面、表面が圧力下で収縮する能力（例えばハイドロゲル又はタンパク質コーティング）、分解、機械（例えば磁気による回収）、エネルギーのいずれかを通じてマトリックスから除去され、その結果、マトリックスから成功裏に排出可能なより小さな断片へと崩壊する能力等（但しこれらに限定されない）の特性を有してよく、或いはこれらの特性を有するように改変されてよい。
【００７８】
移植後に赤血球が滞留しないよう充分な直径を有する毛細血管を形成するため、内皮細胞の播種時、又は細胞播種から約１２〜９６時間後、又は最大で数週間後に、粒子を添加してよい。例えば、別途脱細胞化されたグラフト又は内皮細胞以外の細胞で再細胞化されたグラフトにおいて、再細胞化した脈管の直径を広げるため、毛細血管を最初は小粒子径でこじ開け、所望のサイズがマトリックス内を灌流できるようになるまで、数時間／数日かけて徐々に粒子サイズを拡大してよい。
【００７９】
一実施形態では、粒子は、温度変化によって容易に分解又は解離できる熱応答性ポリマーで形成される。この場合、移植前に迅速に粒子を除去することが可能になる。
【００８０】
一実施形態では、粒子は磁性ポリマーで形成され、循環溶液に磁気源を添加することにより、移植前に循環粒子を除去することができる。
【００８１】
一実施形態では、移植前に、再内皮化した組織又は臓器から粒子を除去する。生分解性粒子の場合、特定の薬剤又は条件を加えて粒子を分解、解離、又は消化させてから洗浄する。粒子の除去は、移植の数週間前／数日前、又は直前に行ってよい。
【００８２】
赤血球の正常濃度は、約３００万〜約５００万／μＬである。脈管構造は組織又は臓器の空隙容量全体の約１０％であるため、粒子の濃度は、組織又は臓器の灌流（又は空隙）容量１μＬ当たり約３００〜５００，０００又は最大５，０００万であり得る。
【００８３】
毛細血管内径を維持、増大、又は縮小低減する上での粒子の有効性を判定するには、粒子を生理学的圧力で再内皮化マトリックス内に灌流させ、その後回収される粒子の割合を測定する。例えば、本発明の方法において有用な粒子であれば、血液細胞の直径に近いサイズの粒子、又は平均直径が約５〜８μｍの粒子の例えば５０％超、６０％、７０％、又はそれ以上が組織又は臓器内を灌流した後に回収され、或いは、血液が生理学的圧力で組織又は臓器内を灌流して５０％超、６０％、７０％が復帰できる。再細胞化していない臓器、組織、又は一部分では、大多数の粒子（５〜８μｍ）は間質腔に滞留し、有意な復帰を示さない。再内皮化した臓器、組織、又は一部分では、粒子処理がなければ、大多数の粒子（例えば約５μｍ〜約８μｍの粒子）は脈管構造内に滞留し、毛細血管床から離れない。
【００８４】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に援用される。上記明細において、本発明の特定の好ましい実施形態との関連で本発明を説明し、例示目的で多くの詳細を記載したが、本発明に更なる実施形態の余地があり、本明細書に記載の詳細のうちの幾つかを、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更できることは、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
0006491187.tif 000002
【図１Ｂ】
0006491187.tif 000003
【図１Ｃ】
0006491187.tif 000004
【図２】
0006491187.tif 000005
【図３】
0006491187.tif 000006
【図４】
0006491187.tif 000007
【図５】
0006491187.tif 000008
【図６】
0006491187.tif 000009
【図７Ａ】
0006491187.tif 000010
【図７Ｂ】
0006491187.tif 000011
【図８Ａ】
0006491187.tif 000012
【図８Ｂ】
0006491187.tif 000013