(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のストランドおよび第２のストランドを含有している単離されたオリゴヌクレオチドであって、ここでは、
第１のストランドの５’末端にある第１の末端ヌクレオチドがリン酸基を有しており、第１のストランドの３’末端にある第２の末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり；そして
第２のストランドの５’末端にある第３の末端ヌクレオチドはリン酸基を有しておらず、第２のストランドの３’末端にある第４の末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり；
第１のストランドの長さが第２のストランドの長さより長く、第１のストランドと第２のストランドとの間で二本鎖構造が形成され；
第１のストランドの３’末端は第１の突出を有し、
第２のストランドの５’末端は突出がない、又は第２の突出を有し；
第２の突出を有する場合、第１の突出の長さは第２の突出の長さより長く；
第１の突出の長さは６ヌクレオチドから１２ヌクレオチドであり；
第２の突出を有する場合、第２の突出の長さは４ヌクレオチド以下である；
単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
第２のストランドと第１のストランドとの間で対合していないヌクレオチドの数が３を超えない、請求項１に記載の単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
第１のストランドの長さが２０〜２５ヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
第２のストランドの長さが１０〜１５ヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
第１のストランドが５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており、
第２のストランドが５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有している；
または、
第１のストランドが５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており、
第２のストランドが５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有している、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、単離されたオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
それぞれが、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、第１のアダプターおよび第２のアダプター、
を含有しており、
ここでは、第１のアダプターが第２のアダプターとは異なる、
キット。
【請求項７】
第１のアダプターの第１のストランドと対合して第１の二本鎖構造を形成することができる第１の一本鎖ＤＮＡ；および
第２のアダプターの第１のストランドと対合して第２の二本鎖構造を形成することができる第２の一本鎖ＤＮＡ、
をさらに含有する、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
第１の二本鎖構造の長さが、第１のアダプターの第１のストランドと第１のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第３の二本鎖構造の長さより長く；そして
第２の二本鎖構造の長さが、第２のアダプターの第１のストランドと第２のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第４の二本鎖構造の長さより長い、
請求項７に記載のキット。
【請求項９】
第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じである第１のプライマー；および
第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを有している第２のプライマー
をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
第１のアダプターの第１のストランドが５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており；
第１のアダプターの第２のストランドが５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有しており；
第２のアダプターの第１のストランドが５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており；
第２のアダプターの第２のストランドが５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有しており；
第１の一本鎖ＤＮＡが５’ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣ（Ｎ）ｍＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧ３’の配列を有しており、ここでは、（Ｎ）ｍはｍヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、ｍは４から１０までの範囲の整数であり、Ｎは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）を表し；そして
第２の一本鎖ＤＮＡが５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ３’（配列番号５）の配列を有している、
請求項６〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
第１のアダプターおよび第２のアダプターを含むアダプターを、二本鎖ＤＮＡ断片に対して、リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む２つの末端それぞれに付加するための方法であって：
第１のアダプターおよび第２のアダプターを、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結して、第１の連結された生成物を得る工程であって、
ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり；そして
第１のアダプターおよび第２のアダプターそれぞれが請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、工程；
第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡにより置き換え、第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡにより置き換える工程であって、
ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる、工程；
第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで、第２の連結された生成物を得る工程、ならびに
第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して、増幅された生成物を得る工程であって、ここでは
増幅された生成物は、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片であり、
第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、そして
第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、そして第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む、工程、
を含む、方法。
【請求項１２】
第１のアダプターおよび第２のアダプターが、１つの工程で、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
二本鎖ＤＮＡ断片が以下の工程：
ＤＮＡ試料を断片化して断片化生成物を得る工程；
断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物を得る工程；および
脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖ＤＮＡ断片を得る工程、
により得られる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ試料がゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ逆転写生成物の少なくとも一部分である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の二本鎖構造の長さが、第１のアダプターの第１のストランドと第１のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第３の二本鎖構造の長さより長く；そして
第２の二本鎖構造の長さが、第２のアダプターの第１のストランドと第２のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第４の二本鎖構造の長さより長い、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１のアダプターの第１のストランドが５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており；
第１のアダプターの第２のストランドが５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有しており；
第２のアダプターの第１のストランドが５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており；
第２のアダプターの第２のストランドが５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有しており；
第１の一本鎖ＤＮＡが５’ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣ（Ｎ）ｍＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧ３’の配列を有しており、ここでは、（Ｎ）ｍはｍヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、ｍは４から１０までの範囲の整数であり、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）を表し；そして
第２の一本鎖ＤＮＡが５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ３’（配列番号５）の配列を有している、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドがそれぞれ、熱変性−アニーリングによって、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡにより置き換えられる、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
熱変性が６０℃で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端のそれぞれに、ニックトランスレーションによって繋がれる、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法であって：
第１のアダプターおよび第２のアダプターを、請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって、二本鎖ＤＮＡに対して２つの末端それぞれに連結して、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を得る工程；
２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片に分離する工程；ならびに
一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループを得る工程、
を含み、
ここでは、一本鎖ＤＮＡループが２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構成する、
方法。
【請求項２１】
２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片に分離する工程がさらに：
２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を磁性ビーズと接触させて、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体を形成させる工程であって、ここでは、磁性ビーズがストレプトアビジンでコーティングされている、工程；ならびに
磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体をｐＨ値が７より高い溶液に対して暴露して、一本鎖ＤＮＡ断片を得る工程、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｐＨ値が７より高い溶液が水酸化ナトリウム溶液である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記水酸化ナトリウム溶液は、０．５〜２Ｍの濃度の溶液である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水酸化ナトリウム溶液は、１Ｍの濃度の溶液である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
一本鎖ＤＮＡ断片が、予めスクリーニングされた、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から単離される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が、プローブとの接触によってスクリーニングされ、ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記予め決定された配列は、少なくとも１つのエキソンを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
一本鎖ＤＮＡ断片が、一本鎖核酸分子を用いて環化され、
ここでは、一本鎖核酸分子が第１の領域および第２の領域を含み、
第１の領域は、一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端および３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、そして
第２の領域は、一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端または３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができる、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
第１の領域は第２の領域に隣接して繋げられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１の領域は５’ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴ３’（配列番号６）の配列を有しており；そして第２の領域は５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ３’（配列番号７）の配列を有している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
第１のアダプターおよび第２のアダプターを含むアダプターを、二本鎖ＤＮＡ断片に対して、リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む２つの末端それぞれに付加するためのデバイスであって：
第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結して第１の連結された生成物が得られるように構成された第１の連結ユニットであって、
ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、そして
第１のアダプターおよび第２のアダプターがそれぞれ、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたオリゴヌクレオチドである、第１の連結ユニット；
第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換え、そして第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えるように構成された置き換えユニットであって、
ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、そして第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる、置き換えユニット；
第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで第２の連結された生成物が得られるように構成された第２の連結ユニット、ならびに
第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成された増幅ユニットであって、ここでは、
第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、そして
第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、そして第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む、増幅ユニット、
を含有している、デバイス。
【請求項３３】
リン酸基を持たない対合した平滑末端を各々が含む２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスであって：
第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡに対して２つの末端それぞれに連結して、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が得られるように構成された、請求項３２に記載のアダプターを付加するためのデバイス；
２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片に分離するように構成された、一本鎖ＤＮＡ断片を単離するデバイス；ならびに
一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループが得られるように構成された環化デバイス、
を含み、
ここでは、一本鎖ＤＮＡループが２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構成する、
デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はバイオテクノロジーの分野に、特に、単離されたオリゴヌクレオチドおよび核酸の配列決定におけるその使用に、さらに具体的には、単離されたオリゴヌクレオチド、キット、二本鎖断片の末端にアダプターを付加する方法、二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法、および核酸を配列決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイスループットシーケンシング（Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、分子生物学、バイオテクノロジー、および医学の分野において１つの基準となっている。これはここ数年で徐々に、遺伝子発現レベルとヌクレオチド配列を決定するための革新的な、迅速、正確、かつ低コストの方法になってきている。これは合成による配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に基づく次世代のハイスループットスクリーニング技術（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）へと成熟しつつあるので、様々な主要な配列決定を行っている企業は、配列決定プロセスが短くなり、配列決定コストがより低い新しい配列決定用製品を開発することに着目している。次世代の配列決定技術（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に基づく現在利用することができる配列決定用製品としては、全ゲノムリシーケンシング（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、全トランスクリプトームリシーケンシング（ｗｈｏｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、およびマイクロＲＮＡ配列決定などが挙げられる。特に、次世代の配列決定技術およびマイクロアレイ技術から導かれた標的配列の捕捉および配列決定技術は、多量のオリゴヌクレオチドプローブをゲノム上の特異的な領域と相補的に結合させるために利用することを可能にして、特異的な領域を富化させる。特異的な領域は続いて、次世代の配列決定技術によって配列決定され、その結果、ヒトの全エキソンエキソーム配列決定（ｗｈｏｌｅ  ｅｘｏｎ  ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＥＳ））が行われる。そのような全エキソンエキソーム配列決定（ＷＥＳ）は、データ分析の量が少ないとの理由から、全ゲノム配列決定と比較して明らかに利点を有する。
【０００３】
しかし、ヌクレオチド配列を配列決定するための関連する技術を改良することがなおも必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、関連技術における技術的問題の少なくとも１つをある程度解決することを模索する。
【０００５】
最初に、本開示が本発明者らにより以下の発見に基づいて行われたことに留意されなければならない。
【０００６】
現在、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（文脈の中で「ＣＧ」と呼ばれる場合がある）は、独自に開発された、ヒトの全ゲノムの配列決定に適応させられた次世代の配列決定技術のセットをすでに所有している。ライブラリーを構築するためのプロセスには主に以下の工程が含まれる：ゲノムＤＮＡの断片化、１回目の二本鎖ＤＮＡの環化のためのアダプターの連結、その後の消化、２回目の二本鎖ＤＮＡの環化のためのアダプターの連結、および一本鎖ＤＮＡの単離、その後の環化。ここでは、アダプターの連結の２つの工程がライブラリーの構築のためのプロセス全体にとって非常に重要である。ＤＮＡ断片に対して２つの末端に連結された後に、アダプター（ＤＮＡ配列）が配列決定の開始部位として認識されることが可能となり、これによってその後に機器が配列情報を読み取ることが可能となる。
【０００７】
獲得した配列決定情報が確実に容易に分析されるためには、１つのＤＮＡ断片の２つの末端（５’末端および３’末端）に２つの異なるアダプターを連結することが必要である。続いて、さらに、特定の方向での連結を達成し、アダプター間で互いに繋がることを避けるために、付着末端を持つアダプターが使用される。しかし、付着末端を持つアダプターが互いに繋がることを回避することは難しい。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓは、以下を含むいくつかの工程で、２つの末端にアダプターを連結することにより配列決定用のライブラリーを構築する：ＤＮＡ断片の一方の末端でのアダプターの連結；変性、アニーリング、および伸長；ＤＮＡ断片のもう一方の末端でのアダプターの連結；ニックトランスレーション、ならびにポリメラーゼ連鎖反応。したがって、全体的な配列決定のコストは、複数回の伸長に必要な高価な試薬が原因で高く、配列決定の効率は、個々の工程の間での精製および回収の複数回の工程の理由から低い。さらに、ライブラリーを構築するために現在利用することができるプロセスにおけるそのようなプロトコールには２回のアダプターの連結が必要である。したがって、本開示は、複数の実施形態において、ＤＮＡ断片に対して２つの末端に異なるアダプターを連結する方法を提供する。
【０００８】
第１の態様では、本開示は、複数の実施形態において、第１のストランドおよび第２のストランドを含有している単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。ここでは、第１のストランドの５’末端にある第１の末端ヌクレオチドはリン酸基を有しており、第１のストランドの３’末端にある第２の末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであり、第２のストランドの５’末端にある第３の末端ヌクレオチドはリン酸基を有しておらず、そして第２のストランドの３’末端にある第４の末端ヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドである。ここでは、第１のストランドの長さは第２のストランドの長さより長く、第１のストランドと第２のストランドとの間で二本鎖構造が形成される。このオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このような単離されたオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。
【０００９】
第２の態様では、本開示は、複数の実施形態においてキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、第１のアダプターおよび第２のアダプター（各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである）を含有し、ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なる。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなキットをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないキットにも適用することができる。
【００１０】
第３の態様では、本開示は、複数の実施形態において、アダプター（第１のアダプターおよび第２のアダプターを含む）を二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに付加するための方法を提供する。本開示のいくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片は２つの末端を含み、２つの末端それぞれが、リン酸基を持たない対合した平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、上記方法は以下の工程を含む：第１のアダプターおよび第２のアダプターを、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結して、第１の連結された生成物を得る工程（ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、そして第１のアダプターおよび第２のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである）；第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡにより置き換え、第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡにより置き換える工程（ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる）；第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで、第２の連結された生成物を得る工程；ならびに、第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して、増幅された生成物を得る工程（ここでは、増幅された生成物は、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片であり、第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む）。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されない方法にも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。
【００１１】
第４の態様では、本開示は、複数の実施形態において、２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は以下の工程を含む：上記アダプターを付加する方法によって、第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡに対して２つの末端それぞれに連結して、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を得る工程；２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片に分離する工程；ならびに、一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループを得る工程。ここでは、一本鎖ＤＮＡループが２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構成する。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されない方法にも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、配列決定のためのライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができる。
【００１２】
第５の態様では、本開示は複数の実施形態において、核酸を配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、上記二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法によりライブラリーを構築する工程、ならびに、ライブラリーを配列決定する工程を含む。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されない方法にも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができ、これによって、配列決定の効率をさらに改善し、配列決定のコストを下げることができる。
【００１３】
第６の態様では、本開示は複数の実施形態において、アダプター（第１のアダプターおよび第２のアダプターを含む）を二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）それぞれに付加するためのデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、デバイスは以下を含有する：第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結して第１の連結された生成物が得られるように構成された第１の連結ユニット（ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、第１のアダプターおよび第２のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである）；第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換え、第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えるように構成された置き換えユニット（ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる）；第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡそれぞれを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで第２の連結された生成物が得られるように構成された第２の連結ユニット、ならびに、第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成された増幅ユニット（ここでは、第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、そして第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む）。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないデバイスにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。
【００１４】
第７の態様では、本開示は複数の実施形態において、２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、上記デバイスは以下を含有する：第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡに対して２つの末端それぞれに連結して、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が得られるように構成された、アダプターを付加するためのデバイス；２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ断片を単離するように構成された、一本鎖ＤＮＡ断片を単離するデバイス；ならびに、一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループが得られるように構成された環化デバイス。ここでは、一本鎖ＤＮＡループが２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構成する。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないデバイスにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができる。
【００１５】
第８の態様では、本開示は複数の実施形態において、核酸を配列決定するシステムを提供する。いくつかの実施形態では、上記システムは、上記２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイス、ならびに、ライブラリーを配列決定するように構成された配列決定デバイスを含有する。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないシステムにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができ、これによって、配列決定の効率をさらに改善し、配列決定のコストを下げることができる。
【００１６】
第９の態様では、本開示は複数の実施形態において、ゲノムＤＮＡを配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、上記デバイスは以下を含有する：ゲノムＤＮＡ試料を断片化して断片化生成物が得られるように構成された第１のユニット；断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物が得られるように構成された第２のユニット；脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖ＤＮＡ断片が得られるように構成された第３のユニット；第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結して第１の連結された生成物が得られるように構成された第４のユニット（ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、第１のアダプターおよび第２のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである）；第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換え、第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えるように構成された第５のユニット（ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる）；第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで第２の連結された生成物が得られるように構成された第６のユニット；第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成された第７のユニット（ここでは、増幅された生成物は、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片であり、第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、そして第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む）；２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ断片を単離するように構成された第８のユニット；ならびに、一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループが得られるように構成された第９のユニット（ここでは、一本鎖ＤＮＡループがゲノムＤＮＡを配列決定するためのライブラリーを構成する）。上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないデバイスにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができる。
【００１７】
本開示の実施形態のさらなる態様および利点は以下の記述の一部において提供され、以下の記述から一部が明らかになるか、あるいは本開示の複数の実施形態の実施から学習される。
【００１８】
本開示の実施形態についてのこれらおよび他の態様ならびに利点は、以下の図面を参照して以下の記述から明らかになり、さらに容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本開示の１つの実施形態におけるライブラリーの構築のプロセスを示しているフローチャートである。ここでは、１は、断片化されたＤＮＡ断片を意味し、２は、脱リン酸化され、末端修復されたＤＮＡ断片（各末端はヒドロキシルである）を意味し、３はアダプターＡを意味し、４はアダプターＢを意味し、５は一本鎖核酸Ｃを意味し、６は一本鎖核酸Ｃのタグ配列を意味し、７は一本鎖核酸Ｄを意味し、そして８は、最終生成物である環化された一本鎖核酸を意味する。
【図２】図２は、本開示の１つの実施形態における電気泳動図である。
【図３】図３は、本開示の１つの実施形態における電気泳動図である。
【図４】図４は、本開示の１つの実施形態における、アダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに付加する方法を示しているフローチャートである。
【図５】図５は、本開示の１つの実施形態における、アダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに付加するためのデバイスを示している模式図である。
【図６】図６は、本開示の１つの実施形態における、二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスを示している模式図である。
【図７】図７は、本開示の１つの実施形態における、核酸を配列決定するシステムを示している模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の実施形態が細部にわたり参照される。図面に関連して本明細書中に記載される実施形態は例示的であり、説明的であり、そして本開示を一般的に理解するために使用される。実施形態は本開示を限定するようには解釈されるべきではない。
【００２１】
加えて、「第１」および「第２」のような用語は記述の目的のために本明細書中で使用され、相対的な重要性または有意性を示すまたは暗に意味するように意図するものではない。したがって、「第１」および「第２」で限定される特徴は、１つ以上の特徴を明示的または絶対的に含み得る。さらに、本開示の記述においては、特に明記されていない限りは、用語「複数の（ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ）」は、２以上を意味する。なおまた、本開示においては、用語「連結する（ｌｉｇａｔｅ）」、「連結（ｌｉｇａｔｉｎｇ）」、「連結された（ｌｉｇａｔｅｄ）」、または「連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」は、一方の一本鎖核酸分子の５’末端にあるリン酸化基の存在が原因で、２つの一本鎖核酸分子が、ヌクレオチドとヌクレオチドが直接１つのより長い一本鎖核酸分子を形成することを意味する。一方、用語「繋ぐ（ｃｏｎｎｅｃｔ）」、「繋ぐ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）」、「繋がれた（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、または「繋ぐこと（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）」は、２つの一本鎖核酸分子が、ニックトランスレーションに続く連結のような他の反応によって、１つのより長い一本鎖核酸分子を間接的に形成することを示す。
【００２２】
単離されたオリゴヌクレオチドおよびキット
第１の態様では、本開示は複数の実施形態において、単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。本開示の１つの実施形態においては、単離されたオリゴヌクレオチドは第１のストランドおよび第２のストランドを含有する。ここでは、第１のストランドの５’末端にある第１の末端ヌクレオチドがリン酸基を有しており、第１のストランドの３’末端にある第２の末端ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドであり、そして第２のストランドの５’末端にある第３の末端ヌクレオチドはリン酸基を有しておらず、第２のストランドの３’末端にある第４の末端ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドである。ここでは、第１のストランドの長さは第２のストランドの長さより長く、第１のストランドと第２のストランドとの間で二本鎖構造が形成される。上記オリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなキットをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。
【００２３】
本開示の１つの実施形態においては、第２のストランドと第１のストランドとの間でミスマッチのヌクレオチドの数は３を超えず、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００２４】
本開示の１つの実施形態においては、単離されたオリゴヌクレオチドは、第１のストランドの３’末端に位置する第１の突出、および随意に、第２のストランドの５’末端に位置する第２の突出を含有し、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００２５】
本開示の１つの実施形態においては、第１の突出の長さは第２の突出の長さより長く、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００２６】
本開示の１つの実施形態においては、第１の突出の長さは約６ヌクレオチドから約１２ヌクレオチドであり、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００２７】
本開示の１つの実施形態においては、第２の突出の長さは０ヌクレオチドから４ヌクレオチドであり、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００２８】
本開示の１つの実施形態においては、第１および第２のストランドはいずれもＤＮＡである。
【００２９】
本開示の１つの実施形態においては、第１のストランドの長さは約２０ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドであり、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００３０】
本開示の１つの実施形態においては、第２のストランドの長さは約１０ヌクレオチドから約１５ヌクレオチドであり、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００３１】
本開示の１つの実施形態においては、第１のストランドが５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており、第２のストランドが５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有しているか、または第１のストランドが５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており、第２のストランドが５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有している。これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００３２】
第２の態様では、本開示は複数の実施形態においてキットを提供する。本開示の１つの実施形態においては、キットは、第１のアダプターおよび第２のアダプター（各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである）を含有し、ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なる。
【００３３】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなキットをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないキットにも適用することができる。
【００３４】
本開示の１つの実施形態においては、キットは、第１のアダプターの第１のストランドと対合して第１の二本鎖構造を形成することができる第１の一本鎖ＤＮＡ、および第２のアダプターの第１のストランドと対合して第２の二本鎖構造を形成することができる第２の一本鎖ＤＮＡをさらに含有する。したがって、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。
【００３５】
本開示の１つの実施形態においては、第１の二本鎖構造の長さは、第１のアダプターの第１のストランドと第１のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第３の二本鎖構造の長さより長く、第２の二本鎖構造の長さは、第２のアダプターの第１のストランドと第２のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第４の二本鎖構造の長さより長く、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００３６】
本開示の１つの実施形態においては、キットはさらに、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じである第１のプライマー、および第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを有している第２のプライマーを含有し、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。さらに、一本鎖核酸分子は、ビオチンと特異的に結合することが可能である物質によって効率よく単離することができ、さらに、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーを構築するために使用することができる。
【００３７】
本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターの第１のストランドは５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており、第１のアダプターの第２のストランドは５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有しており、第２のアダプターの第１のストランドは５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており、第２のアダプターの第２のストランドは５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有しており、第１の一本鎖ＤＮＡは５’ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣ（Ｎ）ｍＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧ３’の配列を有しており（ここでは、（Ｎ）ｍはｍヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、ｍは４から１０までの範囲の整数であり、そしてＮは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）を表す）、そして第２の一本鎖ＤＮＡは５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ３’（配列番号５）の配列を有しており、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。さらに、一本鎖核酸分子は、ビオチンと特異的に結合することが可能である物質によって効率よく単離することができ、さらに、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーを構築するために使用することができる。
【００３８】
核酸の配列決定における単離されたオリゴヌクレオチドの使用
第３の態様では、本開示は複数の実施形態において、アダプター（第１のアダプターおよび第２のアダプターを含む）を二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）それぞれに付加するための方法を提供する。図４を参照すると、１つの実施形態では、上記方法は以下の工程Ｓ１００からＳ４００を含む。
【００３９】
Ｓ１００：第１のアダプターおよび第２のアダプターが、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結される。
第１のアダプターおよび第２のアダプターが二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結されて、第１の連結された生成物が得られる。ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、第１のアダプターおよび第２のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターおよび第２のアダプターが、１つの工程で、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結される。
【００４１】
本開示の１つの実施形態においては、二本鎖ＤＮＡ断片が以下の工程：ＤＮＡ試料を断片化して断片化生成物を得る工程；断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物を得る工程；ならびに、脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖ＤＮＡ断片を得る工程により得られ、それにより、ライブラリーの構築に適しているＤＮＡ断片が効率よく得られる。
【００４２】
本開示の１つの実施形態においては、ＤＮＡ試料がゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ逆転写生成物の少なくとも一部分であり、その結果、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定するためのライブラリーを効率よく構築することができる。
【００４３】
Ｓ２００：第１のアダプターの第２のストランドは第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換えられ、第２のアダプターの第２のストランドは第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えられる。
第１のアダプターの第２のストランドは第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換えられ、第２のアダプターの第２のストランドは第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えられる。ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる。
【００４４】
本開示の１つの実施形態においては、第１の二本鎖構造の長さは、第１のアダプターの第１のストランドと第１のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第３の二本鎖構造の長さより長く、第２の二本鎖構造の長さは、第２のアダプターの第１のストランドと第２のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第４の二本鎖構造の長さより長く、これによって、配列決定の効率をさらに改善し、配列決定のコストを下げることができる。
【００４５】
本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターの第１のストランドは５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており、第１のアダプターの第２のストランドは５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有しており、第２のアダプターの第１のストランドは５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており、第２のアダプターの第２のストランドは５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有しており、第１の一本鎖ＤＮＡが５’ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣ（Ｎ）ｍＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧ３’の配列を有しており（ここでは、（Ｎ）ｍはｍヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、ｍは４から１０までの範囲の整数であり、Ｎは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）を表す）、そして第２の一本鎖ＤＮＡは５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ３’（配列番号５）の配列を有しており、これによって、配列決定の効率がさらに改善し、配列決定のコストも下がる。さらに、一本鎖核酸分子は、ビオチンと特異的に結合することが可能である物質によって効率よく単離することができ、さらに、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーを構築するために使用することができる。
【００４６】
本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドがそれぞれ、熱変性−アニーリングによって、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡにより置き換えられる。本開示の特別な実施形態では、熱変性が約６０℃で行われ、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００４７】
Ｓ３００：第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋がれる。
第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋がれて、第２の連結された生成物が得られる。
【００４８】
本開示の１つの実施形態においては、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端のそれぞれに、ニックトランスレーションによって繋がれる。
【００４９】
Ｓ４００：第２の連結された生成物が第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅される。
第２の連結された生成物が第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅されて、増幅された生成物が得られる。ここでは、増幅された生成物は、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片であり、第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む。
【００５０】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されない方法にも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。
【００５１】
第４の態様では、本開示は複数の実施形態において、２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法を提供する。本開示の１つの実施形態においては、上記方法は以下の工程を含む。
【００５２】
最初に、第１のアダプターおよび第２のアダプターが、上記のアダプターを付加する方法によって、二本鎖ＤＮＡに対して２つの末端それぞれに連結されて、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が得られる。
【００５３】
第２に、一本鎖ＤＮＡ断片が２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から単離される。本開示の１つの実施形態においては、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片に分離する工程はさらに、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を磁性ビーズと接触させて、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体を形成させる工程（ここでは、磁性ビーズがストレプトアビジンでコーティングされている）、ならびに、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体をｐＨ値が７より高い溶液に対して暴露して、一本鎖ＤＮＡ断片を得る工程を含み、それにより、一本鎖ＤＮＡ断片が効率よく単離され、その結果、ライブラリーの構築の効率が改善され、ライブラリーの構築のためのコストが下がる。本開示の１つの実施形態においては、ｐＨ値が７より高い溶液は水酸化ナトリウム溶液である。本開示の１つの実施形態においては、水酸化ナトリウム溶液は約０．５Ｍから２Ｍの濃度の溶液である。本開示の１つの実施形態においては、水酸化ナトリウム溶液は約１Ｍの濃度の溶液である。本開示の１つの実施形態においては、一本鎖ＤＮＡ断片が、予めスクリーニングされた、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から単離され、これにより、予め決定された領域を配列決定するためのライブラリーが構築される。本開示の１つの実施形態においては、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が、プローブとの接触によってスクリーニングされる。ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である。本開示の１つの実施形態においては、予め決定された配列は、少なくとも１つのエキソンを含む。本開示の１つの実施形態においては、プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される。したがって、一本鎖ＤＮＡ断片が効率よく環化され得る。
【００５４】
その後、一本鎖ＤＮＡ断片が環化されて一本鎖ＤＮＡループが得られる。ここでは、一本鎖ＤＮＡループが、２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構成する。本開示の１つの実施形態においては、一本鎖ＤＮＡ断片が、一本鎖核酸分子を用いて環化される。ここでは、一本鎖核酸分子は第１の領域および第２の領域を含み、第１の領域は、一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端および３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、そして第２の領域は、一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端または３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、これにより、環化の効率がさらに改善する。本開示の１つの実施形態においては、第１の領域は第２の領域に隣接して繋げられる。本開示の１つの実施形態においては、第１の領域は５’ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴ３’（配列番号６）の配列を有しており、第２の領域は５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ３’（配列番号７）の配列を有している。
【００５５】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されない方法にも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができる。
【００５６】
第５の態様では、本開示は複数の実施形態において、核酸を配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築する方法によりライブラリーを構築する工程、ならびに、ライブラリーを配列決定する工程を含む。本開示の１つの実施形態においては、ライブラリーはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）シーケンシングプラットフォーム上で配列決定された。
【００５７】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されない方法にも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができ、これによって、配列決定の効率をさらに改善し、配列決定のコストを下げることができる。
【００５８】
第６の態様では、本開示は複数の実施形態において、アダプター（第１のアダプターおよび第２のアダプターを含む）を二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）それぞれに付加するためのデバイスを提供する。図５を参照すると、いくつかの実施形態では、デバイス１００は、第１の連結ユニット１０１、置き換えユニット１０２、第２の連結ユニット１０３、および増幅ユニット１０４を含む。
【００５９】
第１の連結ユニット１０１は、第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結させて第１の連結された生成物が得られるように構成されており、ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、第１のアダプターおよび第２のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである。本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターおよび第２のアダプターが、１つの工程で、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結される。
【００６０】
置き換えユニット１０２は、第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換え、そして第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えるように構成されており、ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる。本開示の１つの実施形態においては、第１の二本鎖構造の長さは、第１のアダプターの第１のストランドと第１のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第３の二本鎖構造の長さより長く、第２の二本鎖構造の長さは、第２のアダプターの第１のストランドと第２のアダプターの第２のストランドとを用いて形成された第４の二本鎖構造の長さより長く、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターの第１のストランドは５’ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＣ３’（配列番号１）の配列を有しており、第１のアダプターの第２のストランドは５’ＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＣ３’（配列番号２）の配列を有しており、第２のアダプターの第１のストランドは５’ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ３’（配列番号３）の配列を有しており、第２のアダプターの第２のストランドは５’ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴＴ３’（配列番号４）の配列を有しており、第１の一本鎖ＤＮＡが５’ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣ（Ｎ）ｍＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧ３’の配列を有しており、ここでは、（Ｎ）ｍはｍヌクレオチドの長さであるタグ配列を表し、ｍは４から１０までの範囲の整数であり、Ｎは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）を表し、そして第２の一本鎖ＤＮＡが５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ３’（配列番号５）の配列を有しており、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。さらに、一本鎖核酸分子は、ビオチンと特異的に結合することが可能である物質によって効率よく単離することができ、さらに、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーを構築するために使用することができる。
【００６１】
本開示の１つの実施形態においては、置き換えユニット１０２は、熱変性−アニーリングによって、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドを、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによりそれぞれ置き換えるように構成されている。本開示の１つの実施形態においては、熱変性が約６０℃で行われ、これによって、連結効率がさらに改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下がる。
【００６２】
第２の連結ユニット１０３は、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで第２の連結された生成物が得られるように構成されている。本開示の１つの実施形態においては、第２の連結ユニット１０３は、ニックトランスレーションによって、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋がれるように構成されている。
【００６３】
増幅ユニット１０４は、第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成されている。ここでは、第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む。
【００６４】
本開示の１つの実施形態においては、上記デバイスは、二本鎖ＤＮＡ断片を得るユニット（図には示されていない）をさらに含み、二本鎖ＤＮＡ断片を得るユニットは、ＤＮＡ試料を断片化して断片化生成物が得られるように構成された断片化アセンブリ、断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物が得られるように構成された脱リン酸化アセンブリ、および脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖ＤＮＡ断片が得られるように構成された末端修復アセンブリを含み、これにより、ライブラリーの構築のための二本鎖ＤＮＡ断片が効率よく得られる。
【００６５】
本開示の１つの実施形態においては、二本鎖ＤＮＡ断片を得るユニットは、生物学的試料からゲノムＤＮＡを抽出するように構成されたゲノムＤＮＡ抽出アセンブリ、および／またはＲＮＡ試料を逆転写させて逆転写生成物が得られるように構成された逆転写アセンブリ（ここでは、ゲノムＤＮＡおよび／または逆転写生成物の少なくとも一部がＤＮＡ試料を構成する）をさらに含み、これにより、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定するためのライブラリーが効率よく構築される。
【００６６】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないデバイスにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。
【００６７】
第７の態様では、本開示は複数の実施形態において、２つの末端（各々がリン酸基を持たない対合した平滑末端を含む）を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスを提供する。図６を参照すると、いくつかの実施形態では、デバイスは、アダプターを付加するためのデバイス１００、一本鎖ＤＮＡ断片を単離するデバイス２００、および環化デバイス３００を含有する。
【００６８】
アダプターを付加するためのデバイス１００は、第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡに対して２つの末端それぞれに連結して、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が得られるように構成される。一本鎖ＤＮＡ断片を単離するデバイス２００は、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡを単離するように構成される。環化デバイス３００は、一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループが得られるように構成され、ここでは、一本鎖ＤＮＡループは、２つの末端を持つ二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構成する。
【００６９】
本開示の１つの実施形態においては、一本鎖ＤＮＡ断片を単離するデバイス２００は、磁性ビーズを伴って提供される、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を磁性ビーズと接触させて、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体を形成させるように構成された捕捉ユニット（ここでは、磁性ビーズはストレプトアビジンでコーティングされている）、ならびに、ｐＨ値が７より高い溶液を伴って提供され、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体を溶液に対して暴露して一本鎖ＤＮＡ断片が得られるように構成された溶解ユニットをさらに含み、これにより、一本鎖ＤＮＡ断片が効率よく単離され、その結果、ライブラリーの構築の効率が改善し、ライブラリー構築のためのコストが下がる。本開示の１つの実施形態においては、ｐＨ値が７より高い溶液は水酸化ナトリウム溶液である。本開示の１つの実施形態においては、水酸化ナトリウム溶液は約０．５Ｍから２Ｍの濃度の溶液である。本開示の別の実施形態では、水酸化ナトリウム溶液は約１Ｍの濃度の溶液である。
【００７０】
本開示の１つの実施形態においては、デバイスは、スクリーニングデバイス（図には示されていない）をさらに含む。スクリーニングデバイスは、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片をスクリーニングするように構成され、その後、それから一本鎖ＤＮＡ断片が単離される。本開示の１つの実施形態においては、スクリーニングデバイスがプローブを伴って提供され、ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である。本開示の１つの実施形態においては、予め決定された配列は、少なくとも１つのエキソンを含む。本開示の１つの実施形態においては、プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される。
【００７１】
本開示の１つの実施形態においては、環化デバイス３００が一本鎖核酸分子を伴って提供される。ここでは、一本鎖核酸分子は、第１の領域および第２の領域を含み、第１の領域は、一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端および３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、第２の領域は、一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端または３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができる。本開示の１つの実施形態においては、第１の領域は第２の領域に隣接して繋げられる。本開示の１つの実施形態においては、第１の領域は５’ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴ３’（配列番号６）の配列を有しており、第２の領域は５’ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ３’（配列番号７）の配列を有している。したがって、一本鎖ＤＮＡ断片が効率よく環化され得る。
【００７２】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないデバイスにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができる。
【００７３】
第８の態様では、本開示は複数の実施形態において、核酸を配列決定するシステムを提供する。図７を参照すると、いくつかの実施形態では、システム１００００は、上記二本鎖ＤＮＡ断片を配列決定するためのライブラリーを構築するデバイス１０００、およびライブラリーを配列決定するように構成された配列決定デバイス２０００を含む。本開示の１つの実施形態においては、配列決定デバイス２０００はＣＧシーケンシングプラットフォームである。
【００７４】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして使用することができ、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないシステムにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができ、これによって、配列決定の効率をさらに改善し、配列決定のコストを下げることができる。
【００７５】
第９の態様では、本開示は複数の実施形態において、ゲノムＤＮＡを配列決定するためのライブラリーを構築するデバイスを提供する。いくつかの実施形態では、デバイスは以下を含有する：ゲノムＤＮＡ試料を断片化して断片化生成物が得られるように構成された第１のユニット、断片化生成物を脱リン酸化して脱リン酸化された断片化生成物が得られるように構成された第２のユニット、脱リン酸化された断片化生成物を末端修復して二本鎖ＤＮＡ断片が得られるように構成された第３のユニット、第１のアダプターおよび第２のアダプターを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結して第１の連結された生成物が得られるように構成された第４のユニット（ここでは、第１のアダプターは第２のアダプターとは異なり、第１のアダプターおよび第２のアダプターは各々が上記の単離されたオリゴヌクレオチドである）、第１のアダプターの第２のストランドを第１の一本鎖ＤＮＡによって置き換え、そして第２のアダプターの第２のストランドを第２の一本鎖ＤＮＡによって置き換えるように構成された第５のユニット（ここでは、第１の一本鎖ＤＮＡは第１のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第１の二本鎖構造を形成することができ、第２の一本鎖ＤＮＡは第２のアダプターの第１のストランドと特異的に対合して第２の二本鎖構造を形成することができる）、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに繋いで第２の連結された生成物が得られるように構成された第６のユニット、第２の連結された生成物を第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて増幅して増幅された生成物が得られるように構成された第７のユニット（ここでは、増幅された生成物は、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片であり、第１のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの一方と同じ配列を含み、第２のプライマーは、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と同じ配列を含み、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡの他方と比較して５’末端にさらなるビオチンを含む）、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ断片を単離するように構成された第８のユニット、ならびに、一本鎖ＤＮＡ断片を環化して一本鎖ＤＮＡループが得られるように構成された第９のユニット（ここでは、一本鎖ＤＮＡループはゲノムＤＮＡを配列決定するためのライブラリーを構成する）。
【００７６】
上記のように、本開示の実施形態にしたがうオリゴヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドが原因で第１および第２のストランドの３’末端で、またはリン酸基を持たない第２のストランドの５’末端で、他の核酸断片と繋がれることは不可能であり、これにより、オリゴヌクレオチドが互いに繋がることが回避される。したがって、このようなオリゴヌクレオチドは、ライブラリーの構築のためのアダプターとして使用され得、それによってライブラリーの構築の間に、異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに連結することができる。これは、アダプターが互いに繋がることを避けるだけではなく、連結効率もまた改善し、その上、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストも下げる。本開示の実施形態にしたがう単離されたオリゴヌクレオチドの特徴および利点に関する記述はまた、ここではそれ以上詳細には記載されないデバイスにも適用することができる。加えて、第１のアダプターの第２のストランドおよび第２のアダプターの第２のストランドは、ライブラリーの構築の間に、第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡによってそれぞれ置き換えられ、それにより、第１のアダプターの第１のストランドおよび第２のアダプターの第１のストランドを用いてより安定な構造が形成される。さらに、第２の連結された生成物が、プライマーとして使用される第１の一本鎖ＤＮＡおよび第２の一本鎖ＤＮＡが用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、それによって、両方の末端に安定なアダプターを持つＤＮＡ断片が形成される。続いて、一本鎖ＤＮＡ断片が単離され、環化され、それにより、ライブラリー（例えば、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリー）を効率よく得ることができる。
【００７７】
本開示の１つの実施形態においては、第１のアダプターおよび第２のアダプターが、１つの工程で、二本鎖ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結される。
【００７８】
本開示の１つの実施形態においては、デバイスは、生物学的試料からゲノムＤＮＡを抽出するように構成された第１０のユニット、および／またはＲＮＡを逆転写させて逆転写生成物が得られるように構成された第１１のユニットをさらに含み、ここでは、ゲノムＤＮＡおよび／または逆転写生成物の少なくとも一部がＤＮＡ試料を形成する。
【００７９】
本開示の１つの実施形態においては、第８のユニットは、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片を磁性ビーズと接触させて、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体を形成するように（ここでは、磁性ビーズがストレプトアビジンでコーティングされている）、ならびに、磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体をｐＨ値が７より高い溶液に暴露して一本鎖ＤＮＡ断片が得られるようにさらに構成され、これにより、一本鎖ＤＮＡ断片が効率よく単離され、その結果、ライブラリーの構築の効率が改善し、ライブラリーの構築のコストが下がる。
【００８０】
本開示の１つの実施形態においては、デバイスは、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片をスクリーニングするように構成された第１２のユニットをさらに含む。その後、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片から一本鎖ＤＮＡ断片が単離される。本開示の１つの実施形態においては、２つの末端それぞれに第１および第２のアダプターが連結されたＤＮＡ断片が、プローブとの接触によってスクリーニングされる。ここでは、プローブは予め決定された配列に特異的である。本開示の１つの実施形態においては、予め決定された配列は、少なくとも１つのエキソンを含む。本開示の１つの実施形態においては、プローブがマイクロチップアレイの形態で提供される。
【００８１】
本開示の１つの実施形態においては、第９のユニットは、一本鎖ＤＮＡ断片を、１つの一本鎖核酸分子（ここでは、一本鎖核酸分子は第１の領域および第２の領域を含み、第１の領域は一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端および３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができ、第２の領域は一本鎖ＤＮＡ断片の５’末端または３’末端に位置する末端ヌクレオチドと対合することができる）を用いて環化させるようにさらに構成され、それにより、一本鎖ＤＮＡ断片が一本鎖核酸分子を用いて効率よく環化させられる。
【００８２】
結論として、本開示の実施形態による技術的解決は、以下の利点のうちの少なくとも１つを有する。
【００８３】
第１に、本開示の実施形態による技術的解決によって、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーを構築するための既存の方法において一般的に重複して行われるアダプターの連結工程が減少する。
【００８４】
本開示の様々な実施形態においては、従来法で一般的に使用されるそれぞれの複数の工程の代わりに、１つの工程で様々なアダプターをＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに付加する新しい方法が提供される。
【００８５】
本開示の様々な実施形態においては、２種類の異なるアダプターをＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに同時に連結させることを考慮したとしても、アダプター自身が繋がること、断片が互いに繋がることなどを回避することがまた必要である。しかし、本開示で使用されるアダプターは、特有の配列で設計され、断片が互いに繋がることおよびアダプター自身が繋がることを防ぎ、連結の効率を改善し、タグ配列が導入される位置を提供する新規の方法により連結され、それによりアダプターの連結の工程が大幅に減り、アダプターの連結のための時間が短くなり、そしてコストが有意に下がる。
【００８６】
本開示の様々な実施形態においては、この最初のアダプターの連結方法が、プローブで核酸を捕捉する技術と組み合わせられる。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーを構築する従来のプロトコールをさらに改変および調整する際には、様々なアダプターが、２つの工程ではなく１つの工程において、ＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連続して連結され、それにより、ライブラリーの構築のための時間が有意に短くなり、対応するコストも下がる。さらに、ＣＧシーケンシングプラットフォームに基づく１つのアダプターをともなうエキソーム全体を配列決定する製品は、作製が成功している。
【００８７】
したがって、本開示のいくつかの実施形態では、図１を参照すると、ライブラリーが以下の工程のように構築される：
１．ゲノム核酸を断片化して断片を得る工程；
２．標的断片を脱リン酸化して標的断片の５’末端をブロックし、その結果、断片が互いに連結することを防ぐ工程；
３．標的断片のそれぞれの末端を末端修復して、対合した平滑末端（図１に示されるように２で表される）を生じさせる工程；
４．アダプターＡ（図１に示されるように３で表される）およびアダプターＢ（図１に示されるように４で表される）を標的断片に対して２つの末端それぞれに連結させる工程（ここでは、アダプターＡおよびアダプターＢはそれぞれ、長いストランド（第１のストランド）および短いストランド（第２のストランド）からなるポリヌクレオチドである。５’末端にリン酸基を有しているので、長いストランドを末端修復した断片に連結することができる。一方、短いストランドは相補的な塩基の対合により長いストランドと対合するが、しかし、短いストランドの両方の末端がブロッキング配列であることの理由から、短いストランドは末端修復された断片には連結されないであろう）；
５．一本鎖核酸Ｃ（図１に示されるように５で表される）および一本鎖核酸Ｄ（図１に示されるように７で表される）を付加する工程（ここでは、一本鎖核酸Ｃはタグ配列（図１に示されるように６で表される）を有しており、一本鎖核酸Ｃの残りの部分はアダプターＡの長いストランドと対合させられる。一方、一本鎖核酸ＤはアダプターＢの長いストランドと対合させられる。アニーリングプロセスの後、弱い様式で結合しているそれぞれのアダプターの短いストランドが除去される。そして、一本鎖核酸ＣおよびＤがアダプターのそれぞれの長いストランドと相補的に対合させられ、その結果、一本鎖核酸ＣおよびＤは、伸長および連結の後に標的断片に連結される）；
６．（鋳型としての）工程４で得た生じた生成物を、プライマーとして一本鎖核酸ＣおよびＤを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、それによりタグ配列を持つ生成物を富化させる工程；
７．工程５で得た生じた生成物を、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ（具体的には、プローブとハイブリダイズさせることを含む）、ハイブリダイズした生成物を溶離させ、そして、ハイブリダイズした生成物を富化させ、その間に核酸ストランドの一方の中にビオチン修飾を導入することにより、捕捉する工程；
８．その長さに基づくハイブリダイゼーションによる捕捉後に二本鎖核酸をスクリーニングする工程（随意）；
９．核酸の二本鎖のうちの一方にのみ存在するビオチンによって、スクリーニングした二本鎖核酸を２つの一本鎖核酸断片に分離する工程；
１０．一本鎖核酸断片を環化し、環化されていない一本鎖核酸断片を取り除く工程。
【００８８】
核酸の長さに基づくスクリーニング工程が、配列決定についての具体的な要件および様々な工程により生じた断片の実際のサイズに応じて、スクリーニングされた二本鎖核酸を２つの一本鎖核酸断片に分離する工程９の前の他の工程の後で行われ得ることに留意されなければならない。様々な工程により生じた断片が常に長さの要件を満たす場合は、工程８は省略することができる。
【００８９】
エキソーム全体の配列決定は、工程７を導入することにより達成することができる。
【００９０】
本開示の１つの実施形態においては、工程２および３での脱リン酸化による末端のブロッキング処理の後、標的核酸断片は２つのブロックされた末端（各々が平滑末端の対である）を有している断片となり、これにより、断片が互いに完全に連結することが妨げられ、連結の前の断片の高度なユニット化が確実となる。
【００９１】
本開示の１つの実施形態においては、本明細書中で使用されるアダプターは、５’末端にある長いストランドの中にリン酸基が導入され、さらに、３’末端にある長いストランドと短いストランドの両方の末端の中にブロッキング配列が導入されるように設計される。ブロッキング配列が原因で、これらのブロックされた末端は、標的核酸断片または付加された他のアダプターに対して同時に連結されることは不可能であり、その結果、アダプターが標的断片の３’末端に対して正確に、そして工程４においてアダプターを連結させる場合には５’末端だけに連結させられることが担保され、これによって、アダプターが互いに連結することを効率よく妨げて、異なるアダプターを同時に連結することを可能にし、連結の効率を担保する。
【００９２】
本開示のいくつかの実施形態では、上記のような長いストランドと短いストランドからなるアダプターが、短いストランドが比較的穏やかな温度で長いストランドから、それらの間で相補的に対合した塩基のうちの少数との不安定な組み合わせが原因で分離される方法でユニット化される。ゆっくりとしたアニーリングの後、長いストランドが、より長い配列が原因でより優れた相補的対合の能力を有している一本鎖核酸ＣまたはＤと対合させられ、そして認識タグが、一本鎖核酸Ｃの中にタグ配列を導入することにより同時に提供される。中程度の反応条件だけを要件とする上記様式で設計されたアダプターを用いて、断片の置き換え、連結、および伸長を、反応システム、反応時間、および反応順序を適切であるように調整することによって（例えば、工程５に示されるように）１つの工程で行うことができ、単純な操作および迅速な反応が生じ、これは処理時間を大幅に短くする。
【００９３】
本開示の様々な実施形態においては、２つの異なるアダプターが、従来の５つの工程の代わりに３つの工程（すなわち、アダプターの連結、ニックトランスレーション、およびポリメラーゼ連鎖反応）でＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結され、これにより操作が大幅に減少し、余分な２つの工程に使用される様々な試薬が減少し、それによって多量の時間およびコストを節約する。
【００９４】
本開示の様々な実施形態にしたがうと、アダプターを連結させるための特異的な工程が完全に変更されるだけではなく、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーの構築のための従来のプロトコールもまた、一本鎖核酸（図１に示されるように８で表される）からなる新規のライブラリーを提供するように壊滅的なまでに変更されており、その結果、従来のプロトコールにおける２回のアダプターの連結から単純化された、１つの工程で２つの異なるアダプターがＤＮＡ断片に対して２つの末端それぞれに連結され、これによってポリメラーゼ連鎖反応の回数が減少し、配列決定の質が改善する。さらに重要であるのは、工程の単純化により、ライブラリーの構築のための時間を３〜４日短くすることができ、コストのかなりの削減が得られる。これは、ライブラリーの構築のための従来のプロトコールと比較してとてつもなく大きな利点を有する。
【００９５】
本開示の様々な実施形態にしたがうと、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のヒトのエキソーム全体についてのライブラリーの構築のための高効率のプロトコールは、ＣＧシーケンシングプラットフォーム用のライブラリーの構築のための従来のプロトコールを改変し、補い、そして上記アダプターの連結の新規方法を組み合わせることによって、開発および提供に成功している。加えて、ＣＧシーケンシングプラットフォーム上でヒトのエキソーム全体を配列決定するための新規の製品もはじめて提供され、これにより、ゼロからのＣＧシーケンシングプラットフォーム上でエキソーム全体を配列決定することの新発見が達成された。
【００９６】
本開示の実施例が詳細に参照される。以下の実施例は例示であり、本開示の範囲を限定するようには解釈され得ないことは当業者に明らかである。特定の技術または条件が実施例の中で具体的に述べられていない場合は、工程は、当該分野の文献に記載されている技術または条件にしたがって（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｈｕａｎｇ  ＰＴによって翻訳された），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）または製品の説明書にしたがって行われる。試薬または機器の製造業者が特定されていない場合は、試薬または機器は市販されているものでよい。
【００９７】
一般的方法
図１を参照すると、本開示の１つの実施形態においては、ライブラリーは以下の工程にしたがって構築される：
１．ゲノム核酸を断片化して断片を得る工程；
２．標的断片を脱リン酸化して標的断片の５’末端をブロックし、その結果、断片が互いに連結することを防ぐ工程；
３．標的断片のそれぞれの末端を末端修復して、対合した平滑末端（図１に示されるように２で表される）を生じさせる工程；
４．アダプターＡ（図１に示されるように３で表される）およびアダプターＢ（図１に示されるように４で表される）を標的断片に対して２つの末端それぞれに連結させる工程（ここでは、アダプターＡおよびアダプターＢはそれぞれ、長いストランド（第１のストランド）および短いストランド（第２のストランド）からなるポリヌクレオチドである。５’末端にリン酸基を有しているので、長いストランドを末端修復した断片に連結することができる。一方、短いストランドは、相補的な塩基の対合により長い鎖と対合するが、しかし、短いストランドは、ブロックされた末端が原因で末端修復された断片に対して連結されない）；
５．一本鎖核酸Ｃ（図１に示されるように５で表される）および一本鎖核酸Ｄ（図１に示されるように７で表される）を付加する工程（ここでは、一本鎖核酸Ｃはタグ配列（図１に示されるように６で表される）を有しており、一本鎖核酸Ｃの残りの部分はアダプターＡの長いストランドと対合させられる。一方、一本鎖核酸ＤはアダプターＢの長いストランドと対合させられる。アニーリングプロセス後、弱い様式で結合しているそれぞれのアダプターの短いストランドが除去される。そして、一本鎖核酸ＣおよびＤがアダプターのそれぞれの長いストランドと相補的に対合させられ、その結果、一本鎖核酸ＣおよびＤは、伸長および連結の後に標的断片に連結される）；
６．（鋳型としての）工程４で得た生じた生成物を、プライマーとして一本鎖核酸ＣおよびＤを用いてポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、それによりタグ配列を持つ生成物を富化させる工程；
７．工程５で得た生じた生成物をオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ（具体的には、プローブとハイブリダイズさせることを含む）、ハイブリダイズした生成物を溶離させ、そして、ハイブリダイズした生成物を富化させ、その間に核酸ストランドの一方の中にビオチン修飾を導入することにより、捕捉する工程；
８．その長さに基づくハイブリダイゼーションによる捕捉後に二本鎖核酸をスクリーニングする工程（随意）；
９．核酸の二本鎖のうちの一方にのみ存在するビオチンによって、スクリーニングした二本鎖核酸を２つの一本鎖核酸断片に分離する工程；
１０．一本鎖核酸断片を環化し、環化されていない一本鎖核酸断片を取り除く工程。
【００９８】
核酸の長さに基づくスクリーニング工程が、配列決定についての具体的な要件および様々な工程により生じた断片の実際のサイズに応じて、スクリーニングされた二本鎖核酸を２つの一本鎖核酸断片に分離する工程９の前の他の工程の後で行われ得ることに留意されなければならない。様々な工程により生じた断片が常に長さの要件を満たす場合は、工程８を省略することができる。
【００９９】
エキソーム全体の配列決定は、工程７を導入することにより達成することができる。
【０１００】
実施例１
１．ゲノムＤＮＡの断片化
ゲノムＤＮＡは、物理的な超音波処理および酵素消化（これらはいずれも、市販されている十分に確立されている手順である）のようないくつかの方法で断片化することができる。本実施例では、物理的な超音波処理を断片化に使用した。
【０１０１】
９６ウェルＰＣＲプレートに、１つのポリテトラフルオロエチレンワイヤー、１μｇのゲノムＤＮＡ、およびＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液またはヌクレアーゼを含まない水を、それぞれのウェルについて８０μｌまで添加した。保存用フィルムで封をした後、９６ウェルＰＣＲプレートを、以下のような条件下での断片化のためにＥ２２０超音波処理機上に置いた。
【表１】
0006483249.tif 000002
【０１０２】
２．断片化したＤＮＡの選択
断片化したゲノムＤＮＡは、磁性ビーズによる精製またはゲル回収によって選択することができる。本実施例では、磁性ビーズによる精製を選択に使用した。
【０１０３】
断片化したゲノムＤＮＡを８０μｌのＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁性ビーズと均質になるように混合し、続いて７分から１５分間、ｆを静置した。しばらく磁気分離装置上に置いた後に回収した最初の上清を４０μｌの新しいＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁性ビーズと均質になるように混合し、続いて７分から１５分間、ｆを静置した。また別に磁気分離装置上にしばらく置いた後に回収した第２の上清を、７５％のエタノールで２回洗浄した。乾燥させた後、得られたものを５０μｌのＴＥ緩衝液またはヌクレアーゼを含まない水と均質になるように混合し、続いて、回収した生成物を溶解させるために、７分から１５分間、ｆを静置した。
【０１０４】
３．脱リン酸化
第１の反応溶液を以下のように処方した。
【表２】
0006483249.tif 000003
【０１０５】
上記工程２で得た回収した生成物を、以下の条件下での反応のために、１２μｌの第１の反応溶液と均質になるように混合した。得られた生じた生成物を続く工程に直接使用した。０．１℃／秒の速度での４℃への冷却の工程は義務ではなく、反応時間を正確に制御するためには必要ない。本明細書中以後は含む。
【表３】
0006483249.tif 000004
【０１０６】
４．末端修復
第２の反応溶液を、均質になるように以下のように処方した。
【表４】
0006483249.tif 000005
【０１０７】
上記工程３で得た脱リン酸化した生成物を第２の反応溶液と均質になるように混合し、続いて１２℃で２０分間インキュベーションし、８０μｌのＰＥＧ３２磁性ビーズを用いて精製し、そして４０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解させることにより回収した。生じた生成物はいくつかの方法で、すなわち、磁性ビーズを使用して、カラムを通過させて、ゲルに泳動させて、およびそれらから標的生成物を単離することにより（これらは交換可能に使用される）精製することができる。本実施例では、生じた生成物を、特に明記しない限りは、磁性ビーズを用いて精製した。
【０１０８】
５．アダプターＡおよびアダプターＢの連結
本実施例では、使用したアダプターは、以下のようなそれぞれの配列を有する。配列が左から右に５’末端から３’末端へと記載され、「／／」は、その中の基が末端ヌクレオチドについての修飾基であること、またはその中の末端ヌクレオチドが修飾されていることを意味し、「ｐｈｏｓ」はリン酸化を示し、「ｄｄ」はジデオキシを示し、そして「ｂｉｏ」はビオチンを示すことに留意されなければならない。
アダプターＡ：
長いストランド：／Ｐｈｏｓ／ＧＧＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧ／ｄｄＣ／
短いストランド：ＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣ／ｄｄＣ／
アダプターＢ：
長いストランド：／ｐｈｏｓ／ＡＣＧＴＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴ／ｄｄＣ／
短いストランド：ＴＴＧＧＣＣＣＣＧＧＣＴ／−ｄｄＴ／。
【０１０９】
第３の反応溶液を均質になるように以下のように処方した。
【表５】
0006483249.tif 000006
【０１１０】
第４の反応溶液を均質になるように以下のように処方した。
【表６】
0006483249.tif 000007
【０１１１】
上記工程４で得た末端修復した生成物を第３の反応溶液と混合し、次に、第４の反応溶液と均質になるように混合し、続いて２０℃で２０分間インキュベーションし、１００μｌのＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁性ビーズを用いて精製し、そして４０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解させることにより回収した。
【０１１２】
アダプターＡおよびアダプターＢを、この工程の後に標的断片に連結した。図２は、アダプターの連結の前後の電気泳動図を示す。図２から見ることができるように、ＤＮＡ断片は、工程５でのアダプターの連結の後には明らかに長いサイズの断片であり、本実施例にしたがう現行法が非常にうまくいっていることを示している。特に、スクリーニングおよび富化の効果は、工程５でのポリメラーゼ連鎖反応後のより強いバンドによってさらに明らかである。
【０１１３】
６．一本鎖核酸Ｃおよび一本鎖核酸Ｄとの結合
一本鎖核酸Ｃ：
／ｐｈｏｓ／ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＧＡＴＣＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＡＧ（中間部に位置している「ｘ」は交換可能なヌクレオチドからなるタグ配列を意味する）
一本鎖核酸Ｄ：／ｂｉｏ／ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧＡ。
【０１１４】
第５の反応溶液を、均質になるように以下のように処方した。
【表７】
0006483249.tif 000008
【０１１５】
第６の反応溶液を、均質になるように以下のように処方した。
【表８】
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【０１１６】
アダプターＡおよびアダプターＢを２つの末端それぞれに連結させた回収した生成物を１μｌの一本鎖核酸Ｃ（１０μＭ）と均質になるように混合し、次にこれを６５℃で５分間インキュベートし、０．１℃／秒の速度で３７℃に冷却し、この温度で、さらに８μｌの第５の反応溶液を、さらなる２０分間のインキュベーションのために添加した。
【０１１７】
このようにして得た生じた生成物を９６μｌのＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁性ビーズを用いて精製し、２５μｌのＴＥ緩衝液中に溶解させることにより回収した。
【０１１８】
７．ポリメラーゼ連鎖反応
第７の反応溶液を、均質になるように以下のように処方した。
【表９】
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【０１１９】
２５μｌまでのヌクレアーゼを含まない水またはＴＥ緩衝液中に溶解させた後、一本鎖核酸Ｃおよび一本鎖核酸Ｄを伴う３０ｎｇから４０ｎｇの生じた生成物を第７の反応溶液と均質になるように混合し、続いて、以下の条件下で反応させた。
【表１０】
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【０１２０】
反応後、増幅させた生成物を１２０μｌのＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁性ビーズを用いて精製し、続いて、２５μｌのヌクレアーゼを含まない水の中に溶解させることにより回収した。
【０１２１】
８．ハイブリダイゼーションによる捕捉
第８の反応溶液を、以下のように処方した。
【表１１】
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【０１２２】
濃縮および蒸発の後、増幅後に得られた５００ｎｇから１μｇの回収した生成物を第８の反応溶液と均質になるように混合し、続いて、９５℃で５分間インキュベートし、次に６５℃で保持した（第１の反応システム）。
【０１２３】
第９の反応溶液を以下のように処方した。
【表１２】
0006483249.tif 000013
【０１２４】
次に、第９の反応溶液を６５℃での継続的なインキュベーションのために第１の反応システムに添加した（第２の反応システム）。
【０１２５】
第１０の反応溶液を以下のように処方した。
【表１３】
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【０１２６】
第１０の反応溶液を第２の反応システムに添加し、続いて６５℃で２０時間から２４時間インキュベーションした（第３の反応システム）。
【０１２７】
反応後、第３の反応システム中の生じた生成物を、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズと接触させ、その後、磁性ビーズを５０μｌのヌクレアーゼを含まない水の中に溶解させた。
【０１２８】
第１１の反応溶液を以下のように処方した。
【表１４】
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【０１２９】
次に、ヌクレアーゼを含まない水の中に溶解させた磁性ビーズを第１１の反応溶液と混合し、続いて、以下の条件下で反応させた。
【表１５】
0006483249.tif 000016
【０１３０】
反応後、生じた生成物を２４０μｌのＡｍｐｕｒｅ  ＸＰ磁性ビーズを用いて精製した。
【０１３１】
９．スクリーニングした二本鎖核酸の２つの一本鎖核酸断片への分離
先の工程８で得た生じた磁性ビーズ−ＤＮＡ複合体を０．１Ｍの水酸化ナトリウムに対して暴露して、ビオチンを含まない、したがってストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズと結合しない一本鎖核酸断片を単離し、続いて、中和のために酸性緩衝液を添加した。中和後、全量は１１２μｌであった。
【０１３２】
１０．一本鎖核酸断片の環化
第１２の反応溶液を以下のように処方した。ここでは、一本鎖核酸Ｅは、繋ぐための先の工程９で得た一本鎖核酸断片の２つの末端に相補的な配列を有する。
【０１３３】
一本鎖核酸ＥはＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ（配列番号８）の配列を有している。
【表１６】
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【０１３４】
第１２の反応溶液に、先の工程９で得た一本鎖核酸断片を添加し、均質になるように混合した（第４の反応システム）。
【０１３５】
第１３の反応溶液を以下のように処方した。
【表１７】
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【０１３６】
第１３のシステムを第４の反応システムに添加し、均質になるように混合し、続いて、３７℃で１．５時間インキュベーションした。
【０１３７】
１１．エキソヌクレアーゼ１およびエキソヌクレアーゼ２を用いた処理
第１４の反応溶液を以下のように処方した。
【表１８】
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【０１３８】
２３．７μｌの第１４の反応溶液を先の工程９において生じた環化生成物と均質になるように混合し、続いて、インキュベーションのために３７℃で１．５時間静置し、次に、これに１５．４μｌの５００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加した。このようにして得た生じた生成物を５００μｌのＰＥＧ３２磁性ビーズを用いて精製し、４０μｌから８０μｌのヌクレアーゼを含まない水／ＴＥ緩衝液中に再度溶解させ、それにより最終生成物を得た。
【０１３９】
本実施例で説明したように得た最終生成物は以下の濃度および全量を有している。
【表１９】
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【０１４０】
電気泳動の結果を図３に示す。これは、６％のポリアクリルアミド改変ゲル電気泳動による工程１１による最終生成物の電気泳動図である。図３に示すように、最終生成物１、３、および５をハイブリダイゼーション後にゲル電気泳動によって長さによるスクリーニングを行い、一方、最終生成物２、４、および６については長さによるスクリーニングを行わなかった。図３から見ることができるように、長さによるスクリーニングを行った後の最終生成物はより集中的なサイズを有するであろう。最終生成物の全てについて、長さによるスクリーニングを行ったか行っていないかとは無関係に、配列決定に成功し、このことは本開示のこの解決方法が完全に成功していることを示している。
【０１４１】
産業上の利用可能性
本開示の実施形態にしたがうと、単離されたオリゴヌクレオチドをライブラリーの構築のためのアダプターとして効率よく使用することができる。その上、本明細書中で提供される方法は異なるアダプターを核酸断片に対して２つの末端それぞれに同時に連結させることができ、これはアダプターが互いに互いに繋がることを回避し、これによって連結効率を改善し、ライブラリーの構築のための経済的および時間的コストを下げる。
【０１４２】
本明細書全体を通じて、「実施形態」、「いくつかの実施形態」、「１つの実施形態」、「別の実施例」、「実施例」、「特別な実施例」、または「いくつかの実施例」という言及は、実施形態または実施例と組み合わせて記載される特定の特徴、構造、材料、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態または実施例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて様々な場所にある「いくつかの実施形態においては」、「１つの実施形態においては」、「実施形態では」、「別の実施例においては」、「１つの実施例では」、「特別な実施例では」または「いくつかの実施例では」のような表現が現れることは、本開示の同じ実施形態または実施例について必ずしも記載しているのではない。さらに、特定の特徴、構造、材料、または特性を、１つ以上の実施形態または実施例において任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【０１４３】
例示的な実施形態が示され、記載されてきたが、上記実施形態が本開示を限定するように解釈されることはなく、変更、代替え、および改変を、本開示の精神、原理、および範囲から逸脱することなく実施形態において行うことができることが当業者に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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