(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌ゲノム内に欠失を生成するためのプロセスであって、前記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱であってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、前記プロセスが：
（ａ）１つまたはそれ以上の欠失ベクターによって細菌集団を形質転換するステップであって、前記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ綱であってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、前記欠失ベクターが前記集団内の細菌の前記ゲノム内で第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第１および第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能であるステップ；
（ｂ）前記第１および第２のｃｒＲＮＡが産生される条件下で前記細菌集団を培養するステップであって、それらが前記第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とし、且つ前記第１および第２のｃｒＲＮＡが前記集団内の１つまたはそれ以上の細菌内の前記ゲノムの二重開裂を促進し、且つ前記細菌ゲノムＤＮＡの主要フラグメントの２つの開裂末端が再結合するステップ；および
（ｃ）そのゲノムが前記第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーの間の前記細菌ゲノムＤＮＡ内の欠失を含む１つまたはそれ以上の細菌を分離するステップを含む前記プロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスであって、１つの欠失ベクターが前記集団内の細菌の前記ゲノム内で前記第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする前記第１および第２のｃｒＲＮＡの双方の産生を誘導することが可能である前記プロセス。
【請求項３】
請求項２に記載のプロセスであって、前記欠失ベクターが、前記第１および第２のｃｒＲＮＡをコードする、Ｃａｓ直列反復エレメントと隣接する第１および第２のＣａｓスペーサーエレメントを含む前記プロセス。
【請求項４】
請求項３に記載のプロセスであって、前記第１および第２のＣａｓスペーサーエレメントが前記欠失ベクター内の単一のＣａｓアレイ内にあるかまたは前記欠失ベクター内の異なる複数のＣａｓアレイ内にある前記プロセス。
【請求項５】
請求項４に記載のプロセスであって、前記欠失ベクターが：
（ｉ）Ｃａｓリーダーエレメント
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント
（ｉｉｉ）前記第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第１のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｖ）前記第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第２のＣａｓスペーサーエレメント、および
（ｖｉ）第３のＣａｓ直列反復エレメントを含む前記プロセス。
【請求項６】
請求項４に記載のプロセスであって、前記欠失ベクターが２つのアレイを含み、前記第１のアレイが：
（ｉ）第１のＣａｓリーダーエレメント
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント
（ｉｉｉ）前記第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第１のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメントを含み、
且つ前記第２のアレイが：
（ｖ）第２のＣａｓリーダーエレメント、
（ｖｉ）第３のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｖｉｉ）前記第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第２のＣａｓスペーサーエレメント、および
（ｖｉｉｉ）第４のＣａｓ直列反復エレメントを含む前記プロセス。
【請求項７】
請求項１に記載のプロセスであって、第１の欠失ベクターが前記集団内の細菌の前記ゲノム内で前記第１のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする前記第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能であり；かつ第２の欠失ベクターが前記集団内の細菌の前記ゲノム内で前記第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする前記第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能である前記プロセス。
【請求項８】
請求項７に記載のプロセスであって、前記第１の欠失ベクターが：
（ｉ）第１のＣａｓリーダーエレメント
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント
（ｉｉｉ）前記第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第１のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメントを含み、
且つ／または前記第２の欠失ベクターが：
（ｖ）第２のＣａｓリーダーエレメント、
（ｖｉ）第３のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｖｉｉ）前記第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第２のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｖｉｉｉ）第４のＣａｓ直列反復エレメントを含む前記プロセス。
【請求項９】
請求項１〜８のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、ステップ（ｂ）において、前記ＰＡＭ／プロトスペーサーの双方が前記細菌ゲノムから除去されるかまたは前記ＰＡＭ／プロトスペーサーの双方が前記ＰＡＭ／プロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能になる前記プロセス。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌が内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する前記プロセス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌がＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する前記プロセス。
【請求項１２】
請求項１〜１１のうちいずれか１つに記載のプロセスであって、前記細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ目であり、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属である前記プロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスであって、前記細菌がＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ａｒｂｕｓｔｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐａｌｍａｒｉｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃ．ｍａｇｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ、Ｃ．ｈｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＣ．ｒｏｓｅｕｍからなる群から選択される前記プロセス。
【請求項１４】
変異菌を作製するためのプロセスであって、請求項１〜１３のうちいずれか１つに記載のプロセスによって細菌ゲノムに欠失を生成することを含む前記プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞から遺伝物質を除去するプロセス、具体的には細菌ゲノム内に欠失を生成するか、または内因性細菌プラスミドを除去することに関する。具体的には、プロセスは１つまたはそれ以上の欠失ベクターによる細菌細胞の形質転換であって、欠失ベクターが集団内の細菌のゲノム内、または内因性細菌プラスミド内の２つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能である形質転換に関する。これにより細菌ＤＮＡは２ヶ所またはそれ以上で開裂し、生成する直鎖化フラグメントは内因性細菌メカニズムによる分解に感受性となる。これが細菌ゲノム内で発生すると、主要フラグメントの２つの開裂末端は再結合することがある一方で、小さな直線フラグメント（より短い）は分解される。細菌プラスミドが標的とされる場合、主要フラグメントであっても比較的小さいので、再結合するよりもむしろ分解される可能性が高く、細胞からのプラスミドの除去がもたらされる。
【背景技術】
【０００２】
ソルベント（溶媒）生産Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（クロストリジウム）は、１９１０年代よりアセトン、ブタノールおよびエタノールの工業的生産を目的として用いられている。１９５０年代には、これらの溶媒を合成するさらに効率的な石油化学技術の確立により、このような大規模な細菌発酵は放棄された。しかし、持続可能で更新可能なプロセスを用いた化学物質の開発を求める圧力が高まっている現在の状況において、溶媒の生産を目的としたクロストリジウム菌発酵に対する関心が新たなものとなりつつある。これは、いくつかのゲノムの配列分析、およびＲＮＡ配列分析およびトランスクリプトミクスによる、これらのソルベント産生Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａに対する生物学的な理解の進歩によっても促進されている。これらの研究領域は、ブタノールを過剰産生するか、または拮抗する副生成物の産生を消失させ、さらにソルベント産生性発酵の経済性を改善することの可能な新規菌株を操作する可能性を開いている。
【０００３】
このゲノム情報の出現を利用するために、組換えクロストリジウム菌株およびその他の菌株を作製して研究と理解を促す迅速且つ効果的な方法であって、商業的に意味のある菌株の作製にいたる方法に対するニーズが残っている。
【０００４】
従来、組換えクロストリジウム菌株を作製することは非常に困難であった。低い形質転換効率と低い組換え効率が相まって、溶媒関連表現型の改善を示す安定した組換え株を作製する取り組みを妨げてきた。過去数年間、技術の発展により、ターゲトロン（シグマ）およびクロストロン（国際公開第２００７／１４８０９１号など）などのＩＩ型イントロンの使用による遺伝子の挿入不活化、および「対立遺伝子連鎖交換」（ＡＣＥ、国際公開第２００９／１０１４００号など）による新規経路遺伝子の組み込みが可能となったが；そのような方法によるＤＮＡ断片の削除は労力を要し、またこれらの方法は内因性プラスミドの完全な除去に適用不可能である。
【０００５】
対立遺伝子交換法は、相同組換え法により特定の点変異またはインフレーム欠失を担持するクロストリジウム菌株を作製するためにデザインされている。成功した組換え菌株を分離および選択することが困難であるため、これらは特異性が高くなりうるものの、一般に効率が低い（Ｃａｒｔｍａｎ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８（１３），４６８３−９０（２０１２）など）。さらに、ＲＮＡノックダウンおよび干渉法も、トランスポゾン突然変異生成と同様、組換え株作製のために有用となりうる。しかし、これらは有用な研究ツールであるものの、これらの方法は非常に特異的または狭い範囲の遺伝子を標的としている。
【０００６】
一部の例においては、大きく、領域を標的とするが特異的でないゲノム物質断片の削除は、これらの方法が、オペロンが完全に除去される菌株を作製するために使用できるか、または必須ゲノム物質を非必須ゲノム物質に対して特定するために用いることができるので好ましい。さらに、一部の環境においては、内因性プラスミドを迅速且つ効率的に除去できることが有用である。内因性プラスミドの除去は、たとえばメガプラスミドが細胞の生存に必須でありえる一方、ミニプラスミドは不要でありえるなどの、プラスミドの必須性に関する問題に答えることができる。内因性プラスミドを迅速に除去する能力は、の複製起点の不適合性が効率的な形質転換法に干渉し、これによりプラスミドフリー株が研究および探索に不可欠となる場合にも有用となり得る。これらの生来性プラスミドの消失は、「自然に」多数回の継代および選択による相当な努力を必要とすることがある。
【０００７】
次に、生成したプラスミドフリーまたは「欠失担持」株のゲノム分析を用いて、基質取り込みメカニズムと溶媒の産生に関連付けられる可能性がある微生物生理についてより理解することもできる。たとえばＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍは、αアミラーゼ酵素も溶媒産生に不可欠であるｓｏｌ  ｏｐｅｒｏｎも共にコードするメガプラスミドを担持する。一部の環境においては、このメガプラスミドは菌株の変性によって消失することがある。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおいては、メガプラスミドの消失により代謝フラックスを操作するための開始菌株（Ｍ５）が提供される。これを用いて、プラスミドの消失によって除去されたｓｏｌ  ｏｐｅｒｏｎの遺伝子のみを選択して再補充することにより、アセトン：ブタノール：エタノール溶媒比率が変化した菌株を作製することができる（Ｎａｉｒ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６（１８），５８４３−６，１９９４；Ｓｉｌｌｅｒｓ他、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，１０（６），３２１−３２，２００８；Ｌｅｅ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．，４（１０），１４３２−１４４０，２００９など）。
【０００８】
これらのゲノム変換を作製するために使用することが潜在的に可能な方法は、転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、米国特許第８，４２０，７８２（Ｂ２）号明細書など）であるが、この技術は真核生物ゲノムを編集するために開発された方法であり、まだ産業的に意味のあるソルベント産生クロストリジウム菌株において使用するよう特に改変されてはいない。各遺伝子ターゲットに対してＴＡＬＥＮを操作するニーズは、高額な費用、時間がかかること、またＣｌｏｓｔｒｉｄｉａにおける技術の正確な作動様態の実用性の全てが、近い将来幅広く受け入れられるツールとなることに対して不利であるとみなされる。
【０００９】
したがって要約すると、現在利用可能な方法は、特異性の高い変異および欠失の作製に対して全て複雑で、多段階であり、時間集約的な手順である。より迅速なスクリーニングまたは多様な選択遺伝子、オペロンおよびプラスミドの重要性の研究を可能とするために、細菌ゲノムＤＮＡ内からの、または細菌に内因的に存在するプラスミドからの遺伝物質のフラグメントを、精密である必要のない様態で簡易且つ迅速に除去するための方法がより一層有用となるであろう。
【００１０】
したがって、クロストリジウムＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用に基づいた新規方法が開発されている。（ＣＲＩＳＰＲは「Clustered, Regularly interspaced, Short, Palindromic Repeats：クラスタ化され規則的に間隔を置いた短鎖パリンドローム反復）の略語である。）これらの系は、通常は「原核生物適応免疫系」と記載され、細菌または古細菌細胞が、通常はファージまたはプラスミドＤＮＡである侵入ＤＮＡから自身を防御できる手段である。
【００１１】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する細胞は、「侵入」ＤＮＡに由来する短いフラグメントをＣａｓ遺伝子クラスタに選択的に組み込むことができる。各フラグメントは「スペーサー」と呼ばれ、直列反復に隣接する。細胞が再度同じ侵入ＤＮＡと遭遇する場合、これを敵と認識してＣａｓエンドヌクレアーゼにより開裂し、破壊する。
【００１２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が認識する侵入ＤＮＡの配列は「プロトスペーサー」と呼ばれ、ゲノム内のスペーサーコピーと同一性を有する。細胞がスペーサーのゲノムコピーを誤って攻撃しないよう、Ｃａｓ  ＩまたはＣａｓ  ＩＩ系のプロトスペーサーはＰＡＭ配列と呼ばれる短い配列が付随していなければならない。ＰＡＭ配列は、系の種類に応じてプロトスペーサーの上流にあることも下流にあることもある。存在しないか、または何らかの様態で変異していると、侵入ＤＮＡは細胞によって認識されることがなくなり、破壊されなくなる。
【００１３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｃａｓ９に随伴するＰＡＭ配列は周知であるが（Ｊｉａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（Ｍａｒｃｈ  ２０１３），ｖｏｌ．３１，ｎｏ．３，ｐｐ．２３３−２３９）；しかし、クロストリジウム系に随伴するＰＡＭはこれまで同定されていなかった。
【００１４】
原核生物のすべてがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子相同体を有するわけではなく、またこれを有するものからいくつかの異なるクラスに分類される（Ｍａｋａｒｏｖａ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９（６），４６７−７７．２０１１）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＩＩ型Ｃａｓ９系については、多くの研究が発表されている（Ｊｉａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（Ｍａｒｃｈ  ２０１３），ｖｏｌ．３１，ｎｏ．３，ｐｐ．２３３−２３９など）。これは、真核細胞に使用するためのゲノム編集ツールとして開発されており、酵母（ＤｉＣａｒｌｏ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１（７），４３３６−４３４３，２０１３）、ゼブラフィッシュ（Ｈｗａｎｇ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（３），２２７−９．２０１３）および哺乳類細胞（Ｒａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８，２２８１−２３０８，２０１３）などにおける使用に成功している。
【００１５】
真核生物細胞には非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路が存在するので、真核生物においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって作製されるｄｓＤＮＡ切断を用いて欠失および他のＩＮＤＥＬ（ＤＮＡにおける挿入および欠失）を作製し、ほぼあらゆる遺伝子を有効にノックアウトすることができる。しかし、大半の細菌はこれらの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復メカニズムがなく、ゲノム配列のＣａｓ９開裂は遺伝子欠失の作製ではなく細胞死のみをもたらすと考えられる。このことはＢａｒｒａｎｇｏｕとＭａｒｒａｆｆｉｎｉによる総説、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，５４（２），２３４−２４４，２０１４年に要約されている。
【００１６】
現在、迅速且つ効率的な単一ステッププロセスでの細菌ゲノム内の欠失の生成を可能とする新規プロセスが開発されている。
【００１７】
この新規プロセスは、細菌から標的内因性プラスミド（メガプラスミドを含む）を除去するために用いることもできる。欠失ベクターでプラスミド配列内の２つまたはそれ以上の位置を標的とすることにより、系はプラスミドを開裂し、生来性細胞メカニズムによる破壊に対して感受性となる２つまたはそれ以上の直鎖フラグメントとするはずである。典型的ゲノムと比較して相対的に小さなプラスミドのサイズを考慮すると、再結合が発生可能となる前に後者が完全に分解し、プラスミドの消失を引き起こす可能性の方が高い  これを用いて内因性（メガ）プラスミドが宿主の生存にとって不可欠であるか判定することも可能であり、またプラスミドの宿主細胞に対する利点または代謝負荷に対する洞察を提供することもある。実際には、全ての生成フラグメントは再結合せずに分解されるよう十分に小さくなければならないので、内因性プラスミドを除去するために必要とされる最小切断部位数は、標的プラスミドのサイズに依存する可能性がある。
【発明の概要】
【００１８】
したがって１つの実施形態において本発明は、細菌ゲノム内に欠失を生成するためのプロセスであって、細菌がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、プロセスが：
（ａ）１つまたはそれ以上の欠失ベクターによって細菌集団を形質転換するステップであって、欠失ベクターが集団内の細菌のゲノム内で第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第１および第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能であるステップ；
（ｂ）第１および第２のｃｒＲＮＡが産生される条件下で細菌集団を培養するステップであって、それらが第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とし、且つ第１および第２のｃｒＲＮＡが集団内の１つまたはそれ以上の細菌内のゲノムの二重開裂を促進し、且つ細菌ゲノムＤＮＡの２つの開裂末端が再結合するステップ；および
（ｃ）そのゲノムが第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーの間の細菌ゲノムＤＮＡ内の欠失を含む１つまたはそれ以上の細菌を分離するステップを含むプロセスを提供する。
【００１９】
ステップ（ｃ）においては、細菌ゲノムＤＮＡ内の欠失は、好ましくは少なくとも第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを含み且つその間にある領域を含む。
【００２０】
一部の実施形態においては、１つの欠失ベクターは、集団内の細菌のゲノム内で第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第１および第２のｃｒＲＮＡの両者の産生を誘導することが可能である。
【００２１】
好ましくは、欠失ベクターはＣａｓ直列反復エレメントに隣接する第１および第２のＣａｓスペーサーエレメントを含む。
【００２２】
第１および第２のＣａｓスペーサーは、欠失ベクター内において単一のＣａｓアレイ内にあっても、または異なる複数のＣａｓアレイ内にあってもよい。
【００２３】
この実施形態において、欠失ベクターは好ましくは：
（ｉ）Ｃａｓリーダーエレメント、
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｉｉｉ）第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第１のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｖ）第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第２のＣａｓスペーサーエレメント、および
（ｖｉ）第３のＣａｓ直列反復エレメントを含む。
【００２４】
代替的に、欠失ベクターは、好ましくは２つのアレイを含み、第１のアレイが：
（ｉ）第１のＣａｓリーダーエレメント、
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｉｉｉ）第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第１のＣａｓスペーサーエレメント、および
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメントを含み、
且つ第２のアレイが：
（ｖ）第２のＣａｓリーダーエレメント、
（ｖｉ）第３のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｖｉｉ）第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第２のＣａｓスペーサーエレメント、および
（ｖｉｉｉ）第４のＣａｓ直列反復エレメントを含む。
【００２５】
他の実施形態においては、第１の欠失ベクターは、集団内の細菌のゲノム内で第１のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能であり；かつ第２の欠失ベクターは、集団内の細菌のゲノム内で第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能である。
【００２６】
この実施形態において、第１の欠失ベクターは好ましくは：
（ｉ）第１のＣａｓリーダーエレメント、
（ｉｉ）第１のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｉｉｉ）第１のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第１のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｉｖ）第２のＣａｓ直列反復エレメントを含み、
且つ／または第２の欠失ベクターは好ましくは：
（ｖ）第２のＣａｓリーダーエレメント、
（ｖｉ）第３のＣａｓ直列反復エレメント、
（ｖｉｉ）第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することの可能な第２のＣａｓスペーサーエレメント、
（ｖｉｉｉ）第４のＣａｓ直列反復エレメントを含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、本発明は細菌ゲノム内に再配列を生成するためのプロセスであって、細菌がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、プロセスが：
（ａ）１つまたはそれ以上の欠失ベクターによって細菌集団を形質転換するステップであって、欠失ベクターが集団内の細菌のゲノム内で第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第１および第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能であるステップ；
（ｂ）第１および第２のｃｒＲＮＡが産生される条件下で細菌集団を培養するステップであって、それらが第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とし、且つ第１および第２のｃｒＲＮＡが集団内の１つまたはそれ以上の細菌内のゲノムの二重開裂を促進するステップ；および
（ｃ）そのゲノムが対照非形質転換細菌と比較して細菌ゲノムＤＮＡ再配列を含む１つまたはそれ以上の細菌を分離するステップを含むプロセスを提供する。
【００２８】
他の実施形態においては、本発明は細菌において内因性プラスミドからＤＮＡを除去または削除するプロセス（プラスミドの消失をもたらす可能性が高い）であって、細菌がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含み、プロセスが：
（ａ）１つまたはそれ以上の欠失ベクターによって細菌集団を形質転換するステップであって、欠失ベクターが集団内の細菌の標的プラスミド内に２つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能であるステップ；
（ｂ）２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡが産生され且つ２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡが１つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とし、且つ集団内の２つまたはそれ以上の細菌において２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡが２つまたはそれ以上の位置における標的プラスミドの開裂を促進して直鎖化ＤＮＡフラグメントを生成し、かつ直鎖化フラグメントが内因性細胞メカニズムによって分解を受ける条件下で細菌集団を培養するステップ；および
（ｃ）標的プラスミドを欠く１つまたはそれ以上の細菌を分離するステップを含むプロセスを提供する。
【００２９】
好ましくは、直鎖化フラグメントは、（非効率的な）末端再結合プロセスがプラスミドを修復可能となる前に内因性細胞メカニズムによって分解を受ける。
【００３０】
細菌集団内の細菌はＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系を有していなければならない。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、第１および第２のｃｒＲＮＡまたは２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡを用いて、染色体ＤＮＡ、または標的プラスミド、好ましくは細菌の内因性プラスミドなどの他の標的ＤＮＡを開裂することが可能な系となる。
【００３１】
一部の例においては、細菌集団内に汚染がある可能性も許容されることになる。本願で用いる用語「細菌集団」は、主として、欠失ベクターによって形質転換することが所望される細菌を指す。
【００３２】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系である。
【００３３】
集団内の細菌が１つの内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有することもあれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が異種（heterologous）であることもある。たとえば、異種ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はプラスミドベースであってもよい。
【００３４】
好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり、すなわち野生種細菌に存在する。本発明の一部の実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はプラスミドに基づく系ではない。
【００３５】
集団内の細菌は、たとえば、グラム陽性またはグラム陰性菌である。好ましくは、細菌はグラム陽性である。
【００３６】
一部の実施形態においては、細菌は芽胞菌である。他の実施形態においては、細菌は糖分解性細菌である。
【００３７】
細菌は好気性菌であっても嫌気性菌であってもよい。好ましくは、細菌は嫌気性菌である。細菌は好熱性細菌であってもよい。
【００３８】
さらに他の実施形態においては、細菌は基質をＲＣＯＯＨ、たとえば酢酸および／または酪酸に変換することができる。この文脈において、Ｒは脂肪族Ｃ１〜Ｃ５，好ましくはＣ１〜３，アルキルまたはアルケニル基である。細菌は、ＲＣＯＯＨを溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、プロパノールおよび／またはブタノールのうち１つまたはそれ以上に変換することも可能でありうる。
【００３９】
他の実施形態においては、細菌はソルベント産生細菌である。本願で用いる用語「ソルベント産生」は、細菌が溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、および／またはブタノールなどの溶媒を産生することが可能な細菌であることを意味する。いくつかの特に好ましい実施形態においては、細菌はエタノール、アセトンおよびブタノールを産生することが可能である。好ましくは、細菌はブタノール産生菌またはブタノール耐性菌である。
【００４０】
一部の好ましい実施形態においては、細菌はクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属である。好ましいＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ａｒｂｕｓｔｉ、Ｃ．ａｕｒａｎｔｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐａｌｍａｒｉｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ、Ｃ．ｍａｇｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｕｎｉｃｅｕｍ、Ｃ．ｄｉｏｌｉｓ、Ｃ．ｈｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍおよびＣ．ｒｏｓｅｕｍを含む。
【００４１】
本発明の一部の好ましい実施形態においては、細菌はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１株、たとえばＮ１−４株などである。本発明の他の実施形態においては、細菌はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４株（ＨＭＴ）である。本発明のさらなる他の実施形態においては、宿主細胞はＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−５０４株（ＨＭＴ）である。
【００４２】
他の好ましい実施形態においては、細菌はＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＤＳＭ  ５２５など）、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ  ５２７５５など）、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＣＰ  ２５８およびＮＣＰ  ２６２など）、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＤＬ−ＶＩＩＩである。
【００４３】
他の好ましい実施形態においては、細菌はＢａｃｉｌｌｕｓ属である。他の好ましい実施形態においては、細菌はＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ目である。他の実施形態において細菌は、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓまたはＥ．ｃｏｌｉでない。
【００４４】
細菌は、好ましくは内因性末端結合酵素またはメカニズムを有する細菌である。他の実施形態においては、細菌は異種末端結合酵素または経路を有する細菌である。
【００４５】
標的プラスミドは（当該細菌において自然に発生する）内因性プラスミドであってもよい。
【００４６】
欠失させようとする細菌ＤＮＡ（ゲノムまたはプラスミド）の中核領域は、細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることが可能な２つのＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ／プロトスペーサーに隣接する。
【００４７】
ＰＡＭ／プロトスペーサーは、ＰＡＭ配列とプロトスペーサーの機能的組み合わせを含む細菌ゲノムまたは標的プラスミド内の配列である。各ＰＡＭ／プロトスペーサー配列は、使用されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることが可能であり、また該当するｃｒＲＮＡの産生時にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって開裂される。
【００４８】
本願で用いる用語「機能的ＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサー」は、細菌ゲノムまたは標的プラスミド内のＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ／プロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを意味する。一部の例においては、単一変異（ＰＡＭ配列内など）はＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを非機能的にするのに十分でありうる。
【００４９】
ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフの略語である。ＰＡＭエレメントは細菌ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されることが可能である。ＰＡＭエレメントは一般に３〜６ヌクレオチド長であり、各細菌種に特異的である。
【００５０】
細菌ゲノムまたは標的プラスミド中のプロトスペーサーに対するＰＡＭエレメントの配向は重要である。一部の細菌種においては、ＰＡＭエレメントは一般にプロトスペーサーの５’末端またはその近傍に認められ；他の細菌種では、ＰＡＭエレメントは一般にプロトスペーサーの３’末端またはその近傍に認められる。
【００５１】
ＰＡＭエレメントは、細菌ゲノムまたは標的プラスミドのいずれかの鎖上に存在しうるが、Ｃａｓスペーサーエレメントとして選択された配列は、ＰＡＭエレメントと同じＤＮＡ鎖上になければならない（ＰＡＭエレメントとプロトスペーサーが直接隣り合うよう）。
【００５２】
一部の研究は、ＰＡＭエレメントのほぼすべての変異によってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による認識が消失することを確認している（Ｊｉａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｒｃｈ  ２０１３），ｖｏｌ．３１，ｎｏ．３，ｐｐ．２３３−２３９など）。ＰＡＭ／プロトスペーサーは、それぞれ機能的プロトスペーサーに加えて機能的ＰＡＭエレメントを有していなければならない。本願で用いる用語「機能的ＰＡＭエレメント」または「細菌において機能的であるＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭエレメント」は、細菌の内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって、または、細菌が内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有していない場合、細菌に導入されたベクターベースの異種ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によってＰＡＭエレメントが認識されることが可能であることを意味する。
【００５３】
選択した細菌種において、２つ以上の配列がＰＡＭエレメントとして機能できることもありうる。たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２に由来するＩ−Ｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は４つの機能的ＰＡＭ配列を有することが知られており（Ｇｏｍａａ他、（２０１４）ｍＢｉｏ，５（１）：ｅ００９２８−１３  ＤＯＩ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．００９２８−１３）、またＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）においては、実施例２に記載の方法を用いて、少なくとも４つの有効なＰＡＭ配列（ＣＣＣ、ＣＣＴ、ＣＣＡおよびＣＣＧ）が同定されている。
【００５４】
ＰＡＭエレメントが特定の細菌種において機能する能力は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を有する細菌（その内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または異種プラスミド由来系のいずれか）を、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを含むプラスミド、および隣接するテストＰＡＭエレメントで形質転換することにより試験することが可能である。ＰＡＭエレメントが細菌において機能的である場合、ＰＡＭエレメントを含有するプラスミドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって破壊され、形質転換効率は著しく低下する。この概念は、本願の実施例２に例示されている。
【００５５】
ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサーは、ｃｒＲＮＡによって標的とされる細菌ゲノムまたは標的プラスミド内の配列である（ただし適合するＰＡＭエレメントも適切な位置にある場合）。
【００５６】
細菌ゲノム内に欠失を生成するプロセスのステップ（ａ）においては、細菌集団内の細菌のゲノム内で、欠失ベクターが第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする第１および第２のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能である１つまたはそれ以上の欠失ベクターによって、細菌集団が形質転換される。
【００５７】
このステップ（ａ）の目的は２つのｃｒＲＮＡの産生に備えることであり：第１のｃｒＲＮＡは細菌ゲノム内の第１のＰＡＭ／プロトスペーサーと結合することになり；かつ第２のｃｒＲＮＡは細菌ゲノム内の第２のＰＡＭ／プロトスペーサーと結合することになる。
【００５８】
細菌内の標的プラスミドを除去するためのプロセスのステップ（ａ）において、欠失ベクターが、集団内の細菌の標的プラスミド内の２つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とする２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能である、１つまたはそれ以上の欠失ベクターによって、細菌集団が形質転換される。
【００５９】
このステップ（ａ）の目的は、標的プラスミド内の１つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーと結合することになる２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡの産生に備えることである。
【００６０】
細菌内の標的（好ましくは内因性）プラスミドを除去するためのプロセスにおいて、欠失ベクターは１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡの産生を誘導することが可能でありうる。これらは、標的プラスミド内の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的としうる。
【００６１】
本願で用いる用語「形質転換」および「形質転換する」は、欠失ベクターが細菌細胞に挿入されるあらゆるステップを指す。したがって、とりわけあらゆる形態のエレクトロポレーション、接合、またはトランスフェクションを含む。
【００６２】
欠失はインフレームであることも、インフレームでないこともある。ＰＡＮ／プロトスペーサーはいずれも欠失部位内に存在することになる。好ましくは、欠失は、ＰＡＭ／プロトスペーサーが機能的でなくなるよう（すなわちＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されなくなるよう）、ＰＡＭまたはＰＡＭ／プロトスペーサーの少なくとも一部を含む。
【００６３】
欠失ベクターは、好ましくは環状ベクターである。
【００６４】
欠失ベクターは、好ましくは複製起点エレメント、最も好ましくはグラム陽性複製起点エレメント（たとえば「ｐＢＰ１」）を有する。
【００６５】
欠失ベクターは、適切な選択マーカー（抗生物質耐性遺伝子など）も含むことがある。
【００６６】
欠失ベクターは、細菌ゲノム（または標的プラスミド）内のＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ／プロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることの可能なＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭプロトスペーサーを含まない。
【００６７】
細菌ゲノム内に欠失を生成するためのプロセスにおいて、ステップ（ｂ）は、第１および第２のｃｒＲＮＡが産生される条件であって、それらが第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とし、且つ第１および第２のｃｒＲＮＡが集団内の１つまたはそれ以上の細菌内のゲノムの開裂を促進し、且つ細菌ゲノムＤＮＡの２つの開裂末端が再結合する条件下で細菌集団を培養することを含む。
【００６８】
このステップにおいては、両ＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ／プロトスペーサーが（欠失の形態で）細菌ゲノムから除去されるか、または両ＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ／プロトスペーサーがＰＡＭ／プロトスペーサーを認識するｃｒＲＮＡによって認識されることが不可能になる。
【００６９】
このステップにおいては、細菌のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（内因性または異種）は、第１のＰＡＭ／プロトスペーサーに対応するゲノム配列内の部位、および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーに対応するゲノム配列内の部位で、細菌ゲノムＤＮＡを開裂することになる。したがって、細菌ゲノムは２回切断され、直鎖化され、さらに削除されたＤＮＡ断片が遊離することになる。第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサー内の実際の開裂部位、およびこれによる欠失の範囲は、ゲノム内の２つのＰＡＭ／プロトスペーサー間の距離に依存することになる。ゲノムＤＮＡの開裂末端は、再結合前に細胞のメカニズムによってトリミングされる可能性が非常に高い。一部の例においては、このトリミングの程度は非常に大きくなることがあり、たとえばＰＡＭ／プロトスペーサー対に隣接する何ｋｂもの配列の消失をもたらすこともある。（そのような遺伝子におよぶ）さらなるトリミングは生存可能なものでなく、さらに末端再結合のプロセスと競合することになるので、トリミングの最大範囲は必須遺伝子からの近さによって決定される可能性がある。
【００７０】
細菌内の標的プラスミドを除去するためのプロセスにおいて、ステップ（ｂ）は、２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡが産生され且つ２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡが２つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを標的とし、且つ集団内の１つまたはそれ以上の細菌において、２つまたはそれ以上のｃｒＲＮＡが、２つまたはそれ以上の位置における標的プラスミドの開裂を促進して直鎖化ＤＮＡフラグメントを生成し、かつ直鎖化されたフラグメントが内因性細胞メカニズムによって分解を受ける条件下で、細菌集団を培養することを含む。分解がＤＮＡの再結合よりも迅速に発生する場合、プラスミドは細胞から消失することになる。
【００７１】
このステップにおいては、標的プラスミドはＣＲＩＳＰＲ  ＰＡＭ／プロトスペーサーにおいて、またはその近傍で開裂して２つまたはそれ以上の直鎖プラスミドフラグメントを生成する。そのようなフラグメントは、宿主修復メカニズムによるＤＮＡの再結合が可能となる前に宿主細胞メカニズムによって分解されることがある。
【００７２】
細菌を培養するのに適した条件は、当技術において容易に知られることになる。そのような条件は、たとえば、『Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ：バイオテクノロジーおよび医学的応用』Ｈ．Ｂａｈｌ、Ｐ．Ｄｕｒｒｅ編ＩＳＢＮ  ３−５２７−３０１７５−５、特に第３．４節「発育条件および栄養要求」に記載されている。詳細は、「Ｂｅｒｇｅｙ体系的細菌学マニュアル」の選択した細菌門に該当する巻である「第３巻ファーミキューテス」ＩＳＢＮ  ９７８−０−３８７−９５０４１−９などにも示されている。
【００７３】
用語「ｃｒＲＮＡ」はＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡを意味する。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって開裂しようとする標的スペーサー配列が隣接する短い直列反復配列からなる短い単鎖ＲＮＡ分子である。
【００７４】
「Ｃａｓリーダーエレメント」は、一般に直列反復クラスタの最初の反復の上流に認められるＤＮＡエレメントである。ｃｒＲＮＡの産生の促進を支援し、すなわちＲＮＡプロモーターとして機能する。これまで数多くのＣａｓリーダー配列が同定されており、またその配列は任意の特定のＣａｓ系において容易に確立することができる。好ましくは、Ｃａｓリーダー配列は、形質転換されつつある細菌集団に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に対応する配列である。
【００７５】
Ｃａｓ直列反復配列は、細菌集団に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって認識されるＤＮＡエレメントである。これらの直列反復は、一般的に長さ２５〜３５ヌクレオチド、より一般的には長さ約２９または３０ヌクレオチドである。
【００７６】
直列反復は、同一の配列である必要はない（一般的には、１〜２ヌクレオチドの違いはＣａｓタンパク質によって認容される）。一般的に、直列反復はヘアピンループを形成することができるパリンドローム領域を有する。
【００７７】
任意の１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に適合する直列反復のＤＮＡ配列は、この系のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ直列反復スペーサークラスタの任意の試験によって容易に確認することができる。
【００７８】
Ｃａｓスペーサーエレメントは、目的の細菌集団に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の選好に応じて、ＰＡＭプロトスペーサー内のＰＡＭエレメントの５’側（好ましくは直近）またはＰＡＭプロトスペーサー内のＰＡＭエレメントの３’側（好ましくは直近）に認められる、２０〜５０ヌクレオチド（好ましくは３０〜４０、より好ましくは３６〜３８ヌクレオチド）と高度な配列同一性を有する、２０〜５０ヌクレオチドの配列（好ましくは３０〜４０，より好ましくは３６〜３８ヌクレオチド）を含む。
【００７９】
好ましくは、細菌ゲノムまたは標的プラスミド内のＰＡＭエレメントは、（細菌ゲノム内の）プロトスペーサー配列の開始部に直接隣接する。
【００８０】
ゲノムＤＮＡまたは標的プラスミド内のプロトスペーサーと欠失ベクター内のスペーサーエレメント配列の配列同等性の程度は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、または１００％である。
【００８１】
好ましくは、Ｃａｓスペーサー配列は、非プロトスペーサーエレメントと相互作用する確率が低くなるように選択される。
【００８２】
第１および第２のＣａｓスペーサーエレメントは、細菌ゲノム内の第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーと結合する。
【００８３】
同様に、Ｃａｓスペーサーエレメントは標的プラスミドの対応する部位と結合する。
【００８４】
欠失の最小範囲は、第１と第２のＰＡＭ／プロトスペーサーの間の距離によって定義される。
【００８５】
好ましくは、この距離は１０ｂｐ〜１０００ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１００ｋｂ、さらにより好ましくは２００〜５００ｂｐである。
【００８６】
欠失ベクターは、抗生物質耐性エレメントまたは他の選択マーカーを含むことにより、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン，ストレプトマイシンといったある種の抗生物質の存在下などで、ベクターが選択されることを可能とすることもできる。好ましくは、欠失ベクターは（２つ以上が存在する場合）、異なる抗生物質について選択を可能とする抗生物質耐性エレメントを含む。
【００８７】
アミノ酸配列同一性およびヌクレオチドおよびヌクレオチド配列同一性百分率は、ＢＬＡＳＴアラインメント法を用いて得ることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）、「ギャップＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代タンパク質データベース検索プログラム」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。好ましくは、標準またはデフォルトアラインメントパラメータが使用される。
【００８８】
標準的タンパク−タンパクＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）は、タンパク質データベース内で類似した配列を発見するために用いることができる。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様、ｂｌａｓｔｐは局在的類似領域を発見するようデザインされている。配列の類似性が全配列に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐはグローバルアラインメントも報告し、これはタンパク同定の目的にとって好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトアラインメントパラメータが使用される。一部の例では、「低複雑度フィルター」を外すこともある。
【００８９】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することもある。比較を目的としたギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９の記載に従い、ギャップＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に実装）を利用することができる。その代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に実装）を用いて、分子間の遠隔関係を検出する反復検索を実施することもできる。（上述のＡｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）を参照。）ＢＬＡＳＴを利用する場合、ギャップＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴそれぞれのプログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。
【００９０】
ヌクレオチド配列比較については、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔ、およびｂｌａｓｔｎを用いてこの目標を達成することができる。好ましくは、標準またはデフォルトアラインメントパラメータが使用される。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間の長いアラインメントを効率的に発見するよう特にデザインされている。不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いて、本発明の核酸と類似しているが同一ではないヌクレオチド配列を発見することも可能である。
【００９１】
ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリをワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似した配列を発見する。プログラムは、まずクエリワードとの完全一致（ワードヒット）を特定する。次に、ＢＬＡＳＴプログラムはこれらのワードヒットを多段階で延長し、最終ギャップアラインメントを生成する。一部の実施形態においては、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。
【００９２】
ＢＬＡＳＴ検索の感度を支配する重要なパラメータの１つはワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも感度が高い最も重要な理由は、より短いデフォルトワードサイズを使用すること（１１）である。この理由により、ｂｌａｓｔｎは他の細菌に由来する関連ヌクレオチド配列に対するアラインメントの発見において、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりもすぐれている。ｂｌａｓｔｎにおけるワードサイズは調節可能であり、且つ検索感度を高めるためにデフォルト値より最低で７まで減少することが可能である。
【００９３】
より感度の高い検索は、新たに導入された不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｎｅｗｓｌｔｒ／ＦａｌｌＷｉｎｔｅｒ０２／ｂｌａｓｔｌａｂ．ｈｔｍｌ）を用いることにより遂行することができる。このページは、Ｍａ他（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００２  Ｍａｒ；１８（３）：４４０−５）が報告したものと類似したアルゴリズムを用いる。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔは、アラインメント延長のシードとしてワードの完全一致を必要とするのではなく、より長いテンプレートウィンドウ内で非連続的なワードを用いる。コーディングモードでは、第１および第２コドン位置において一致を発見することに集中する一方で、第３の位置における不一致を無視することにより、第３の塩基の揺らぎが考慮に入れられる。同じワードサイズを用いて不連続ＭＥＧＡＢＬＡＳＴで検索すると、同じワードサイズを用いた標準的ｂｌａｓｔｎよりも感度と効率が高い。不連続ｍｅｇａｂｌａｓｔ独自のパラメータは：ワードサイズ１１または１２；テンプレート：１６、１８、または２１；テンプレート種別：コーディング（０）、非コーディング（１）、または併用（２）。
【００９４】
細菌ゲノムの２つの開裂末端は、細菌ＤＮＡ修復メカニズムによって再結合することになる。（当業者は、本願における「２つの開裂末端」への言及が、細菌ゲノムの２つの二重鎖ＤＮＡ末端を指し、これが技術的に４つのＤＮＡ鎖を含むことを容易に認識することになる。）
【００９５】
たとえば、メガプラスミドまたはプラスミドの開裂によって作製されるより小さなフラグメントは、再結合しないものの、その代わりに再結合の発生が可能となる前に細胞メカニズムによって分解されることがある。
【００９６】
欠失はしばしば粗雑な欠失となり、すなわち欠失は、Ｃａｓ酵素によって切断されている細菌ゲノムの２つの末端の正確な再結合でないことも頻繁である。たとえば、細胞修復メカニズムは切断末端をプロセシングして１つ、または潜在的にさらに多くの追加的ヌクレオチド欠失をもたらすこともある。たとえば、欠失は第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサー部位と隣接したＤＮＡ領域の片側または両側で１〜５ｋｂ、５〜１０ｋｂ、１０〜３０ｋｂ、３０〜５０ｋｂまたは５０〜１００ｋｂのＤＮＡの欠失を含むことがある。
【００９７】
細菌ゲノム内に欠失を生成するためのプロセスにおいて、ステップ（ｃ）はそのゲノムが第１と第２のＰＡＭ／プロトスペーサーの間の、且つ任意にこれらを含む細菌ＤＮＡに欠失を含む１つまたはそれ以上の細菌を分離することを含む。欠失は、好ましくは第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーと隣接するＤＮＡ領域のそれぞれの側に隣接する、少なくとも１〜１０ｋｂのＤＮＡに付け加えて、第１および第２のＰＡＭ／プロトスペーサーを含む。
【００９８】
所望のＤＮＡ欠失を有する細菌ＤＮＡは、削除されたＤＮＡ（２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断部位の間、且つ任意にこれらを含む）が直鎖ＤＮＡとなり且つそれにより宿主細胞メカニズムによる分解（内因性ヌクレアーゼによる消化など）を受けやすいという事実により、削除されたＤＮＡを容易に消失する。分解前にＤＮＡの削除断片を再結合しようとしていたとしても、断片は細胞において安定に維持されるための必須遺伝子エレメント（適切な複製起点など）を全て含まない可能性がある。
【００９９】
分離した細菌は、ゲノムの２つの開裂末端が再結合した細菌である。
【０１００】
内因性プラスミドを除去するためのプロセスにおいて、ステップ（ｃ）は、それまでに１つまたはそれ以上のＰＡＭ／プロトスペーサーを担持していた未変化または未開裂標的プラスミドを有していない１つまたはそれ以上の細菌を分離することを含む。
【０１０１】
選択または分離される細胞は生菌である。
【０１０２】
本発明は、本発明のプロセスにより細菌ゲノム内に欠失を生成することを含む、変異細菌を作製するためのプロセスをさらに提供する。
【０１０３】
さらに本発明は、本発明のプロセスにより、標的メガプラスミドまたは他のプラスミド、好ましくは内因性プラスミドを有していない変異細菌を作製するためのプロセスをさらに提供する。
【０１０４】
プラスミドにおいては、方法によって、完全なプラスミドの除去に至らないが、その代わりに２つ（またはそれ以上）の標的部位を含むＤＮＡ断片を持たない、より小さなプラスミドの作製をもたらす欠失を作製することも可能である。より大きなプラスミドでは、適切な複製起点などの必須エレメントに影響する欠失の確率が低いため、より小さなプラスミドよりも大きな欠失を認容することができる可能性が高いので、これはより大きなプラスミドでみられる可能性のほうが高い。
【０１０５】
本発明は、そのゲノムが本発明のプロセスによって生成された欠失を有する細菌も提供する。
【０１０６】
さらに本発明は、本発明のプロセスにより、標的メガプラスミドまたはプラスミド、好ましくは内因性（メガ）プラスミドを消失させられた細菌も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】数多くのクロストリジウム種に由来する直列反復配列のアラインメントを示す。
【図２】Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）へのプラスミドの形質転換効率に対するＰＭＡ配列の影響を示す。
【図３】Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１  −４（ＨＭＴ）の野性型配列を、実施例３で生成した欠失株の１つに由来するゲノム配列データの同じ領域と比較する。図は、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ａｒｔｅｍｉｓ／のＡｒｔｅｍｉｓゲノム閲覧ツールを用いて作成した。
【実施例１】
【０１０８】
（数多くのクロストリジウム種に由来する直列反復配列のアラインメント）
（目的）
本発明のプロセスに用いることの可能ないくつかの直列反復配列を同定する。
【０１０９】
（方法）
直列反復およびスペーサー配列は、Ｇｒｉｓｓａ，Ｉ．とＶｅｒｇｎａｕｄ，Ｇ．、Ｐｏｕｒｃｅｌ，Ｃ．（２００７）のＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒプログラムを用いて確認した。ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ：クラスタ化され規則的な間隔を有する短いパリンドローム反復を同定するためのウェブツール。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５，Ｗ５２−７．
【０１１０】
（結果）
数多くのクロストリジウム種から選択した直列反復配列を図１に示す。一部の例においては、特定の菌株が２つ以上の配列を有しているので、ここでは最も頻繁に用いられる直列反復配列を含める。略語は以下の通りである：Ｃ＿ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）またはＮ１−５０４）、Ｃ＿ｓａｃｃｈａｒｏｂ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＮＣＰ２５８またはＮＣＰ２６２、＿１および＿２は２つの主要なＤＲクラスタを指す）、Ｃ＿ｔｙｒｏ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ  ５２７５５、＿１および＿２は２つの主要なＤＲクラスタを指す）、Ｃ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＤＳＭ  ５２５）、Ｃ＿ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ（ＤＳＭ１００６１）、Ｃ＿ｓｐ＿ＤＬＶＩ  ＩＩ＝Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．（ＤＬ−ＶＩＩＩ）。
【実施例２】
【０１１１】
（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）におけるＰＡＭ配列の確認）
（目的）
推定ＰＡＭ配列の有効性を試験する方法を実証する。
【０１１２】
（方法）
Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）の主要な直列反復クラスタに由来するＳｐａｃｅｒ＿５３の配列を、クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８３２５１にクローニングした。このスペーサーエレメントの５’末端の直近に隣接して、予測ＰＭＡ配列ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴおよび非ＰＡＭ配列ＧＡＣを含む、多様な異なるトリヌクレオチドの組み合わせが組み込まれた。機能的ＰＡＭ配列と正しく組み合わせると、スペーサーエレメントはプロトスペーサーとして機能する。
【０１１３】
標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用いて、プラスミドでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）を形質転換した後、５％グルコースも含有するクロストリジウム発育培地（ＣＧＭ）において一晩回復段階においた。次に、グルコース５％およびエリスロマイシン４０μｇ／ｍＬを含有するＣＧＭ寒天プレート上に混合物を塗布し、３２℃の嫌気性キャビネット内で少なくとも４８時間放置した。その後コロニー数を計測し、空のベクターによる形質転換と比較した形質転換効率の変化を判定した。
【０１１４】
ＣＧＭ培地は、蒸留水７５０ｍＬに以下の量：酵母エキス５．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．７５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．７５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４０ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＮａＣｌ  １．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．０ｇ、アスパラギン２．０ｇ（固形培地を作製する場合はさらに細菌学寒天Ｎｏ．１  １５ｇ）を溶解し、オートクレーブで加熱して調製した。培地のｐＨは調節しなかった（通常は６．６の範囲内）。２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液（グルコース５０ｇを十分な蒸留水に溶解して最終体積２５０ｍＬを得る）を調製して、個別にオートクレーブ加熱した。一旦冷ました後、グルコースおよびＣＧＭ溶液を必要に応じて混合した。
【０１１５】
（結果）
各プラスミドの相対的形質転換効率を図２に示す。空のプラスミドｐＭＴＬ８３２５１もＰＡＭ配列のないＳｐａｃｅｒ＿５３を担持するプラスミドも大量のコロニーを生成した。５’ＣＣＣ（ＰＡＭＣ）、ＣＣＴ（ＰＡＭＴ）またはＣＣＡ（ＰＡＭＡ）に隣接するＳｐａｃｅｒ＿５３を担持するプラスミドは、得られたコロニー数が著しく少なかった。
【実施例３】
【０１１６】
（粗欠失法の実証）
（目的）
本発明のプロセスをどのように改変して大きなＤＮＡフラグメントを削除できるかを示す。
【０１１７】
（方法）
選択した候補プロトスペクターエレメント（この細菌系において機能的であることが判明しているＰＡＭ配列の３’側の直近に位置する）を単一の標的遺伝子内で同定し、これらより、（ゲノムＤＮＡ内で）約１ｋｂ離れ、本実施例についてＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ＿１およびＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ＿２と命名され、かつ標的遺伝子内でそれぞれ５’および３’に位置する２つを選択した。欠失ベクターはｐＭＴＬ８２１５４骨格に基づいてデザインおよび構築された。リーダー配列、第１の直列反復、Ｓｐａｃｅｒ＿１（候補Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ＿１に対応）、第２の直列反復、Ｓｐａｃｅｒ＿２（候補Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ＿２に対応）、および第３の直列反復を担持した。
【０１１８】
標準的なエレクトロポレーション法を用い、この欠失ベクターでＣ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ  Ｎ１−４（ＨＭＴ）を形質転換した。細胞を形質転換する時、欠失ベクターは遺伝子のＣａｓ媒介開裂およびその後の遺伝物質の消失をもたらした。
【０１１９】
この方法を用いて２つのコロニーが回収され、その後その一方を配列分析した。これにより、本発明の方法は親株と比較して２９２０５ｎｔ欠失が作製することが判明した。欠失切片は、標的化した２つのＰＡＭ／プロトスペーサー部位の間の１ｋｂ領域を全て含んだ（図３参照）。
【０１２０】
変異株のゲノム配列において、欠失部位に跨がって読み取った配列データは以下の通りであった。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
波線で強調した前半の２７ヌクレオチドは、野生種ゲノムの５７０９４６０位から５７０９４８６位に一致する。点線で強調した後半の７４ヌクレオチドは、野生種ゲノムの５７３８６９２位から５７３８７６５位に一致する。欠失全体の長さは５７３８６９２−１−５７０９４８６＝２９２０５ｎｔであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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