(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、poxB遺伝子、pta遺伝子、cra遺伝子、accBC遺伝子及びaceE遺伝子を減弱化してなる大腸菌変異株。
【請求項２】
相同組換えを利用して減弱化対象の遺伝子を欠失型遺伝子に置換したことを特徴とする請求項１記載の大腸菌変異株。
【請求項３】
上記accBC遺伝子及び上記aceE遺伝子はテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現することを特徴とする請求項１記載の大腸菌変異株。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項記載の大腸菌変異株をグルコース含有培地にて培養する工程と、その後、ピルビン酸を回収する工程とを含む、ピルビン酸の製造方法。
【請求項５】
33℃〜37℃の温度条件で培養することを特徴とする請求項４記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項６】
培地のｐＨを5.4〜6.3とすることを特徴とする請求項４記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項７】
培地の攪拌速度を1600rpm〜2000rpmの条件で培養することを特徴とする請求項４記載のピルビン酸の製造方法。
【請求項８】
空気供給量を100mL/min〜150mL/minの条件で培養することを特徴とする請求項４記載のピルビン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌を利用した大腸菌変異株及びこれを用いたピルビン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピルビン酸は解糖系や乳酸発酵で生じる中間代謝産物であり、生体細胞の中では、糖やアミノ酸代謝において重要な役割を果たしている。
【０００３】
ピルビン酸については、特許文献１に記載されるように、心疾患の患者に投与して心送血量と一回拍出量を高め、患者の心拍数と酸素需要量を減少させる薬理作用が知られている。さらに、ピルビン酸については、特許文献２に記載されるように、代謝を促進し、脂肪の利用の向上による持久力の上昇や体脂肪の減少等の生理効果を有することが知られている。このようにピルビン酸は、医薬品や健康補助食品等への応用が期待されている。
【０００４】
ピルビン酸の工業的な用途としては、アラニンやバリン、チロシン等の各種アミノ酸、乳酸やコハク酸、フマル等の各種有機酸の生産原料として、さらには農薬や香料などの生産の中間原料として広い用途を有している。従って、ピルビン酸を安価に生産することができれば、これら目的とする生産物の原料として有用である。
【０００５】
これまで種々の微生物を利用し、糖類などの炭水化物を炭素源として発酵法によりピルビン酸を生産する方法が知られている。例えば、Corynebacterium glutamicum（非特許文献1）、Torulopsis glabrata（非特許文献2）、Yarrowia lipolytica（非特許文献3）、Trichosporon cutaneum（非特許文献4）等を利用したピルビン酸の生産方法が挙げられる。しかし、これらの方法では、ピルビン酸の製造に例えば1週間程度の発酵工程が必要となるといった問題があった。
【０００６】
近年では、増殖速度に優れる大腸菌（Escherichia coli）に対して遺伝子工学的手法を用いてピルビン酸生産能を向上させ、ピルビン酸を製造する方法が提案されている（非特許文献5〜7）。上記の遺伝子工学的手法を用いて得られたE. coliを利用したピルビン酸の製造方法では、発酵に厳密な空気供給制御が必要とされる場合、数種の無機塩類を含む複雑な培地組成が必要とされる場合、プラスミドDNAとプラスミド上に存在する外来遺伝子の発現を促す誘導剤が必要とされる場合があり、ピルビン酸の発酵には煩雑な操作が必要とされていた。また、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）に代表されるように、誘導剤は一般的に高価である。さらに、培養時間の経過とともにプラスミドDNAは菌体外に放出されるため、生産能力が低下するという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平９−５００１４４号公報
【特許文献２】特表平１１−５０９５６０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Microb. Biotechnol. (2013) 6:87-102
【非特許文献２】Biotechnol. Bioeng. (2007) 97:825-832
【非特許文献３】Process Biochem. (2004) 39(11):1469-1474
【非特許文献４】Lett. Appl. Microbiol. (2002) 35:338-342
【非特許文献５】Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101:2235-2240
【非特許文献６】Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 62:76-82
【非特許文献７】Appl. Environ. Microbiol. (2014) 80:564-573
【非特許文献８】Science (1997) 277:1453-1462
【非特許文献９】Metab. Eng. (2014) 25:204-214
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところが、上述のように大腸菌を利用したピルビン酸の生産系が期待されるが、ピルビン酸の生産性は十分ではなく、更なる大腸菌の開発が望まれていた。そこで、本発明は、このような実情に鑑み、ピルビン酸の生産能に優れた大腸菌変異株、及び当該大腸菌変異株を用いたピルビン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、大腸菌におけるピルビン酸代謝に関与する所定の遺伝子を減弱化することでピルビン酸の生産性が大幅に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１１】
（１）ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、poxB遺伝子、pta遺伝子及びcra遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を減弱化し、ピルビン酸蓄積能が向上した大腸菌変異株。
（２）ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子及びpta遺伝子が減弱化された大腸菌に対してpoxB遺伝子及び/又はcra遺伝子を更に減弱化したことを特徴とする（１）記載の大腸菌変異株。
（３）相同組換えを利用して減弱化対象の遺伝子を欠失型遺伝子に置換したことを特徴とする（１）記載の大腸菌変異株。
（４）accBC遺伝子及び/又はaceE遺伝子を更に減弱化したことを特徴とする（１）記載の大腸菌変異株。
（５）上記accBC遺伝子及び上記aceE遺伝子はテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下に発現することを特徴とする（４）記載の大腸菌変異株。
（６）（１）乃至（５）いずれか記載の大腸菌変異株をグルコース含有培地にて培養する工程と、その後、ピルビン酸を回収する工程とを含む、ピルビン酸の製造方法。
（７）33℃〜37℃の温度条件で培養することを特徴とする（６）記載のピルビン酸の製造方法。
（８）培地のｐＨを5.4〜6.3とすることを特徴とする（６）記載のピルビン酸の製造方法。
（９）培地の攪拌速度を1600ppm〜2000ppmの条件で培養することを特徴とする（６）記載のピルビン酸の製造方法。
（１０）空気供給量を100mL/min〜150mL/minの条件で培養することを特徴とする（６）記載のピルビン酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る大腸菌変異株は、野生型の大腸菌と比較してピルビン酸の生産量が大幅に向上している。したがって、本発明に係る大腸菌変異株は、例えば、グルコースを含む培地において、高収率にピルビン酸を製造することができる。
【００１３】
本発明に係るピルビン酸の製造方法は、ピルビン酸の生産性が大幅に向上した大腸菌変異株を利用するため、ピルビン酸の製造効率を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】野生株及びPt-accBC株について、ドキシサイクリン非存在条件及び各種濃度のドキシサイクリン存在下において生育速度を測定した結果を示す特性図である。
【図２】LAFCPCPt-accBC-aceE株について、様々な温度条件下で培養したときのピルビン酸濃度を測定した結果を示す特性図である。
【図３】LAFCPCPt-accBC-aceE株について、様々な培地pH条件下で培養したときのピルビン酸濃度を測定した結果を示す特性図である。
【図４】LAFCPCPt-accBC-aceE株について、様々な攪拌速度条件下で培養したときのピルビン酸濃度を測定した結果を示す特性図である。
【図５】LAFCPCPt-accBC-aceE株について、様々な空供給量条件下で培養したときのピルビン酸濃度を測定した結果を示す特性図である。
【図６】LAFCPCPt-accBC-aceE株について、通常条件又は最適条件で培養したときのピルビン酸濃度及びグルコース濃度を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る大腸菌変異株は、ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、poxB遺伝子、pta遺伝子及びcra遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を減弱化したものであり、ピルビン酸生産能が向上するといった特徴を有している。本発明に係る大腸菌変異株は、例えば野生型大腸菌等を元として上記遺伝子群を減弱化することで作製することができる。なお、本発明に係る大腸菌株の元となる大腸菌は、いわゆる野生型大腸菌と呼称されているK-12株、当該K-12株由来のW3110株やMG1655株に限定されず、エシェリヒア・コリ（Escherichia col）に分類される如何なる株を利用することができる。
【００１６】
ここで「遺伝子の減弱化」とは、当該遺伝子の発現量を低減すること、当該遺伝子がコードする酵素の活性を低減することの両者を含む意味である。例えば、特定の遺伝子を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子の発現制御領域（プロモーター等）を破壊又は欠失させる方法、当該遺伝子の発現制御領域（プロモーター等）を薬剤誘導性プロモーターに置換する方法、当該遺伝子に対するアンチセンスRNAを発現する方法等により、当該遺伝子の発現量を低減することができる。また、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を適用し、当該遺伝子の発現量を低減することができる。さらに、遺伝子がコードするタンパク質の阻害剤を作用させる手法等により、当該遺伝子がコードするタンパク質の活性を低減することができる。なお、これらの方法を組み合わせて、特定の遺伝子を減弱化しても良い。
【００１７】
また、一例として相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊方法を適用して、本発明に係る大腸菌変異株を作製することができる。当該方法は既に確立しており、直鎖DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある。すなわち、当該方法では、染色体上に存在する遺伝子を欠失型遺伝子と置換することで、当該遺伝子を減弱化する方法である。
【００１８】
欠失型遺伝子を宿主染色体上の該当遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。温度感受性複製起点と欠失型遺伝子とアンピシリン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを含む組換えDNAを調製し、この組換えDNAで大腸菌を形質転換する。そして、温度感受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤が含まれる培地で培養することにより、組換えDNAが染色体DNAに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００１９】
こうして染色体に組換えDNAが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在する該当遺伝子の配列との組換えを起こし、染色体上に該当遺伝子と欠失型遺伝子との融合遺伝子2個が組換えDNAの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。
【００２０】
次に、染色体DNA上に欠失型遺伝子のみを残すために、該当遺伝子と欠失型遺伝子の2個の組換えにより1コピーの遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体DNAから脱落させる。その際、正常な遺伝子が染色体DNA上に残され、欠失型遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型遺伝子が染色体DNA上に残され、正常な遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたDNAはプラスミド状で細胞内に保持される。
【００２１】
次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上の遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型遺伝子が残った株を選択することによって、目的の遺伝子が破壊された株を取得することができる。
【００２２】
また、上記の遺伝子操作を用いて、目的の遺伝子のプロモーターをテトラサイクリン誘導性プロモーター等の薬剤誘導性プロモーターと置換することもできる。具体的には、制御下に置きたい遺伝子の上流配列にテトラサイクリン誘導性プロモーターの遺伝子を結合したプラスミドを作製し、同様の方法で形質転換することで本発明に係る大腸菌変異株を取得することができる。
【００２３】
また、本発明に係る大腸菌変異株は、ピルビン酸生産能が向上した特徴を有している。大腸菌におけるピルビン酸生産能は、通常のグルコース含有培地にて評価対象の大腸菌を培養し、産生されたピルビン酸を定量することによって評価できる。なお、ピルビン酸生産能とは、培地又は菌体内にピルビン酸を蓄積する能力をいうため、ピルビン酸蓄積能と言っても良い。
【００２４】
ここで、減弱化対象の遺伝子であるが、ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、poxB遺伝子、pta遺伝子及びcra遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子である。特に、これらのうち１つの遺伝子を減弱化しても良いし、2つの遺伝子を減弱化しても良いし、3つの遺伝子を減弱化しても良いし、4つの遺伝子を減弱化しても良いし、5つの遺伝子を減弱化しても良いし、6つの遺伝子を減弱化しても良いし、7つ全ての遺伝子を減弱化してもよい。特に、これらのうち、ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、pta遺伝子及びpoxB遺伝子の6つの遺伝子、或いは、ackA遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、pta遺伝子及びcra遺伝子の6つの遺伝子を減弱化することが好ましい。
【００２５】
さらに、本発明に係る大腸菌変異株は、上記遺伝子に加えて更にaccBC遺伝子及び/又はaceE遺伝子を減弱化したものであることが好ましい。このとき、accBC遺伝子及びaceE遺伝子を共に減弱化することがより好ましい。これらaccBC遺伝子及びaceE遺伝子の減弱化方法は、上記方法を同様であるが、特に薬剤誘導性プロモーターの制御下に配置する方法が好ましい。
【００２６】
ここで、ackA遺伝子は、GenBank Accession number：ECK2290として登録されており、；2,411,492〜2,412,694の相補鎖に位置することが知られている。adhE遺伝子は、GenBank Accession number：ECK1235として登録されており、1,294,669〜1,297,344の相補鎖に位置することが知られている。ldhA遺伝子は、GenBank Accession number：ECK1377として登録されており、1,439,878〜1,440,867の相補鎖に位置することが知られている。pflB遺伝子はGenBank Accession number：ECK0894に登録されており、950,495〜952,777の相補鎖に位置することが知られている。poxB遺伝子はGenBank Accession number：ECK0862として登録されており、908,554〜910,272の相補鎖に位置することが知られている。pta遺伝子はGenBank Accession number：ECK2291として登録されており、2,412,769〜2,414,913の相補鎖に位置することが知られている。cra遺伝子はGenBank Accession number：ECK0081として登録されており、88,028〜89,032の相補鎖に位置することが知られている。
【００２７】
また、accBC遺伝子のうち、accB遺伝子はGenBank Accession number：ECK3242として登録されており、3,405,436〜3,405,906の相補鎖に位置することが知られている。accBC遺伝子のうち、accC遺伝子は、GenBank Accession number：ECK3243として登録されており、3,403,939〜3,405,288の相補鎖に位置することが知られている。aceE遺伝子は、GenBank Accession number：ECK0113に登録されており、123,017〜125,680の相補鎖に位置することが知られている。
【００２８】
＜ピルビン酸製造＞
以上で説明した大腸菌変異株を利用することで、グルコース等の炭素源を含む通常の培地にてピルビン酸を製造することができる。本発明に係る大腸菌変異株を上記培地にて培養すると、当該培地又は菌体内にピルビン酸を生成蓄積させ、該培地又は菌体からピルビン酸を採取することによって、ピルビン酸を生産することができる。
【００２９】
本発明における大腸菌の培養及び培養液からのピルビン酸の採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるピルビン酸の生産法と同様にして行えばよい。
【００３０】
ピルビン酸を生産するために使用する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、また必要に応じてアミノ酸、ビタミン、核酸などの有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては、使用する変異株が利用可能なものであればよく、例えばグルコースやフラクトース、木質糖化液、澱粉分解物糖蜜などの糖類が使用される。また、シュークロース、マルトースや、酢酸、クエン酸等の有機酸類、ノルマルパラフィン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄養素としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添することが必要である。
【００３１】
培養は好気的条件で行うことが望ましい。培養期間中は、培地温度を29〜37℃とすることが好ましく、33〜37℃とすることがより好ましい。また、培養に使用する培地のpHは5.4〜7.2とすることが好ましく、5.4〜6.3とすることがより好ましい。また、培養期間中、攪拌速度を1200〜2000 rpmとすることが好ましく、1600〜2000rpmとすることがより好ましい。さらに、培養期間中、空気供給量を50〜150mL/minとすることが好ましく、100mL/min〜150mL/minとすることがより好ましい。
【００３２】
なお、培地pHは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。培養液からピルビン酸を採取する方法は公知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例において、大腸菌の培養、遺伝子組換え操作、タンパク質の活性測定等は、本発明者らの論文および特許（Biotechnol. Bioeng. (2004) 86:136-148、Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70:5557-5568、Nucleic Acids Res. (2006) 34:e138、Nucleic Acids Res. (2009) 37:e103、特許第3793812号、特許3944577号）に基づいて行った。特に断りがない限り、大腸菌の培養はLB培地（1% Difco Bacto Tryptone、0.5% DifcoYeast Extract、1%塩化ナトリウム）を用いて37℃で行った。寒天培地による培養の場合、寒天濃度は1.7%で、9 cm直径のプラスチックシャーレに入れたものを使った。また、プラスミドを含む大腸菌を培養する場合は対応する抗生物質を加えて行った。抗生物質の終濃度は、アンピシリン：50μg/mL、クロラムフェニコール：24μg/mL（原液は100%エタノールを溶媒として34 mg/mLの濃度で作成）、カナマイシン：15μg/mL、アプラマイシン：35μg/mLである。ピルビン酸製造に使用したN5G培地の組成は以下の通りである。N5G: 60g/L グルコース、10g/L (NH4)2SO4、1g/L K2HPO4、2g/L NaCl、0.24 g/L MgSO4・7H2O、0.011g/L CaCl2・2H2O。表１に実施例で使用した大腸菌株をまとめた。
【００３５】
【表１】
0006621318.tif 000002
【００３６】
〔実施例１〕
実施例１では、テトラサイクリン誘導性プロモーター制御下にaccBC遺伝子を発現する大腸菌株を作製し、ドキシサイクリンがaccBC遺伝子の発現に及ぼす影響を確認した。
【００３７】
先ず、accBC遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置くため、以下のプラスミドを作製した。
MG1655株のゲノムDNAを鋳型、sSN1892-accN (aaactgcaggggtgaataatctgattttgtttgactac (配列番号１))、sSN1893-accN (aaatctagacaggcgtttcaccgccgtctgtaaagc (配列番号２))をプライマーとして用いてPCR増幅を行ない、得られた断片をPstI、XbaIで切断し、T4 DNAリガーゼを利用してpHN1234のPstI、XbaI部位にラーゲーションした。出来たものにpHN2125と名づけた。
【００３８】
次に、MG1655株 (非特許文献8)のゲノムDNAを鋳型、sSN1894-tetR (ttactagtttaagacccactttcacatttaagttgtttttc (配列番号３))、sSN1895-tetR (aaaggatcctttctcctctttaatgaattcggtcagtg (配列番号４))をプライマーとして用いてPCR増幅を行ない、得られた断片をSpeI、BamHIで切断し、T4 DNAリガーゼを利用してpHN2125をXbaI、BamHIで切断したものにラーゲーションした。出来たものにpHN2127と名づけた。
【００３９】
次に、MG1655株のゲノムDNAを鋳型、sSN1896-accORF (aaaggatccatggatattcgtaagattaaaaaactg (配列番号５))、sSN1897-accORF (ccgacatgttcagataactttttactgacggagc (配列番号６))をプライマーとして用いてPCR増幅を行ない、得られた断片をBamHI、PciIで切断し、pHN2127をBamHI、NcoIで切断したものに、T4 DNAリガーゼを利用してラーゲーションした。出来たものにpHN2128と名づけた。pHN2128がaccBC遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置くためのプラスミドになる。
【００４０】
以下、MG1655株のaccBC遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置くための過程を述べるが、これは、Emmersonらの方法 (Biol. Proced. Online (2006) 8:153-162)によるものである。まずMG1655株をpHN2128で形質転換し、accBC遺伝子座位で2回の相同組換えを起こさせて、accBC遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置いた。得られた大腸菌株をPt-accBC株とした。
【００４１】
Pt-accBC株とMG1655株を用いて、ドキシサイクリンの添加がaccBC遺伝子の発現に及ぼす影響を確認した。本例では、テトラサイクリンの類似化合物であるドキシサイクリンを使用し、ドキシサイクリン非存在条件、ドキシサイクリン濃度を20ng/ml、100ng/m又は400ng/mlとした。なお、ドキシサイクリンは大腸菌内でテトラサイクリンと同様に働き、テトラサイクリンより安価である。
【００４２】
ここで、accBCは大腸菌の生育に必須なタンパク質である。したがって、ドキシサイクリン非存在条件下において、Pt-accBC株が死滅せず、且つPt-accBC株がの生育速度がMG1655株と比較して低下した場合、テトラサイクリン誘導性プロモーターがaccBC遺伝子の発現抑制（減弱化）に有効であると判断できる。
【００４３】
野生株及びPt-accBC株の生育速度を図1に示した。図１から解るように、Pt-accBC株では、ドキシサイクリン非存在条件下において、死滅することはないが、増殖速度の低下を示した。以上の結果から、所定の遺伝子のプロモーターをテトラサイクリン誘導性プロモーターに置換することで、当該遺伝子の発現量を低下させるのに有効であることが確認された。
【００４４】
〔実施例２〕
本実施例では、ピルビン酸代謝関連酵素遺伝子の破壊又はテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置かれた大腸菌株を構築した。
先ず、先行研究で作製されたLAFC株 (ΔldhA ΔadhE ΔpflB Δpta-ackA; 非特許文献9)のピルビン酸代謝関連酵素遺伝子を破壊、又は、テトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置くため、以下のプラスミドを作製した。
【００４５】
MG1655株のゲノムDNAを鋳型、sSN1185 (atccatggtcgtctcactcgcgaactgc (配列番号７))とsSN1186 (gtggatccccagatgcgtttcacccctgc (配列番号８))のペア、sSN1187 (aatctagaacaggccaaaggtttcagcctg (配列番号９))とsSN1188 (gatatgcatcgccactttatccagcggtag (配列番号１０))のペアをプライマーセットとしてそれぞれ用いて、PCR増幅を行った。なお、このPCRに先立って、sSN1186はT4 DNAキナーゼ（New England Biolab社製）を用いて5’末端をリン酸化した。
【００４６】
次に、sSN1185とsSN1186のプライマーセットから得られた断片をNcoIで、sSN1187とsSN1188のプライマーセットから得られた断片をNsiIでそれぞれ切断し、T4 DNAリガーゼを利用してpHN1234のPstI、NcoI部位にライゲーションした。出来たプラスミドにpHN1243と名付けた。得られたpHN1243がpoxB遺伝子破壊用プラスミドとなる。
【００４７】
また、MG1655株のゲノムDNAを鋳型、sSN1813 (cttgatgcatttttagcatcgattcgc (配列番号１１))とsSN1814 (aaactcgagtctgcaggcaatcagcagttgataaccccgttgccg (配列番号１２))のペア、sSN1815 (aaactcgagtactagtggctcaacgtcaccgcgatgtcgcagag (配列番号１３))とsSN1816 (aaaccatggtgcaaaccatttgaccggcagcgttc (配列番号１４))のペアをプライマーセットとしてそれぞれ用いて、PCR増幅を行った。
【００４８】
次に、sSN1813とsSN1814のプライマーセットから得られた断片をNsiI、XhoIで、sSN1815とsSN1816のプライマーセットから得られた断片をXhoI、NcoIでそれぞれ切断し、T4 DNAリガーゼを利用してpHN1234 (J Biosci Bioeng (2012) 114:38-44)のPstI、NcoI部位にライゲーションした。出来たプラスミドにpHN2051と名付けた。得られたpHN2051がcra遺伝子破壊用プラスミドとなる。
【００４９】
さらに、MG1655株のゲノムDNAを鋳型、sSN1997aceEDox1 (gcactgcagtttgacgtctcccgtccctccttg (配列番号１５))、sSN1998aceEDox2 (cagtctagacgtttagttgccgcgcttttatatgc (配列番号１６))をプライマーとして用いてPCR増幅を行ない、得られた断片をPstI、XbaIで切断し、pHN1234のPstI、XbaIで切断したものにT4 DNAリガーゼを利用してライゲーションした。出来たプラスミドにpHN2187と名づけた。
【００５０】
次に、pHN1271 (Lett Appl Microbiol. 2013;56(6):436-442)を鋳型、sSN1998aceEDox3 (attactagtcccagctttttagttttcaatgtacgcg (配列番号１７))、sSN1999aceEDox4 (catctgcagtttctcctctttaatgaattcggtcagtg (配列番号１８))をプライマーとして用いてPCR増幅を行ない、得られた断片をSpeI、PstIで切断し、pBluScriptII KS(+)をSpeI、PstIで切断したものにT4 DNAリガーゼを利用してライゲーションした。出来たプラスミドにpHN2189と名づけた。
【００５１】
さらに、MG1655株のゲノムDNAを鋳型、sSN2000aceEDox5 (gaactgcagatgtcagaacgtttcccaaatgacgtgg (配列番号１９))、sSN2001aceEDox6 (cacccatggattccggttcgtccatttcaccgt (配列番号２０)) をプライマーとして用いてPCR増幅を行ない、得られた断片をPstIで切断し、pHN2189をPstI、EcoRVで切断したものにT4 DNAリガーゼを利用してライゲーションした。出来たプラスミドにpHN2191と名づけた。
【００５２】
最後に、pHN2191からSpeI、NcoIで切り出した断片を、pHN2187をXbaI、NcoIで切断したものにT4 DNAリガーゼを利用してライゲーションした。出来たものにpHN2198と名づけた。得られたpHN2198がaceE遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置くためのプラスミドになる。
【００５３】
そして、pHN1243を利用してpoxB遺伝子を、pHN2051を利用してcra遺伝子をそれぞれ破壊した。さらに、pHN2128を利用してaccBC遺伝子を、pHN2198を利用してaceE遺伝子をそれぞれテトラサイクリン誘導性プロモーター制御下に置いた。得られた大腸菌変異株が、ピルビン酸高生産株 (LAFCPCPt-accBC-aceE株; ΔldhA ΔadhE ΔpflB Δpta-ackA ΔpoxB Δcra Ptete-accBC Ptete-aceE)となる。
【００５４】
〔実施例３〕
実施例2で構築されたLAFCPCPt-accBC-aceE株を利用して、ピルビン酸の製造条件の最適化を行った。培養温度: 29〜37℃、培養pH: 5.4〜7.2、攪拌速度: 1200〜2000 rpm、空気供給量: 50〜150 mL/minを検討項目とした。
【００５５】
先ず、LAFCPCPt-accBC-aceE株をLB培地で前培養した後、N5G培地に100分の1量加えて、各検討項目におけるピルビン酸の製造量を定量した。
【００５６】
ピルビン酸量は以下のように測定した。先ず、培養液を採取し、遠心分離によって菌体を除き、その上清をフィルター滅菌後、高速液体クロマトグラフィー (HPLC LC-2000 Plus型、日本分光社製)を用いて分析した。分析条件は以下の通りである。分離カラム：aminex HPX-74H（Bio-Rad社製）、ガードカラム：Cation H micro-guard cartridge（Bio-Rad社製）、カラム温度：65℃、分離溶媒：4 mM H2SO4、流速：0.5 mL/min、検出器：紫外線検出器（UV-2070型による210 nmでの検出、日本分光社製）及び示差屈折率検出器（RI-20310型、日本分光社製）。
【００５７】
各温度で24時間培養した後のピルビン酸生産量を図2に、各培地pHで24時間培養した後のピルビン酸生産量を図3に、各攪拌速度で24時間培養した後のピルビン酸生産量を図4に、各空気供給量で24時間培養した後のピルビン酸生産量を図5にそれぞれ示した。
【００５８】
図2に示した結果より、培養温度は33〜37℃とすることが好ましく、35℃が最適な温度条件であることが分かった。また、図3に示した結果より、培地pHは5.4〜6.3とすることが好ましく、5.7が最適なpHであることが分かった。さらに、図4に示した結果より、攪拌速度は1600〜2000rpmとすることが好ましく、1800rpmが最適な攪拌速度であることが分かった。さらにまた、図5に示した結果より、空気供給量は100mL/min〜150mL/minとすることが好ましく、150mL/minが最適な空気供給量であることが分かった。以上の結果から、ピルビン酸製造の最適条件を培養温度: 培養温度: 35℃、培地pH: 5.7、攪拌速度: 1800 rpm、空気供給量: 150 mL/minと定めた。
【００５９】
〔実施例４〕
LAFCPC Pt-accBC-aceE株を利用して、実施例3で定められた最適条件でピルビン酸の製造を試みた。比較例として、通常条件 (培養温度: 37℃、培地pH: 7.2、攪拌速度: 1200 rpm、空気供給量: 50 mL/min)でピルビン酸を製造した場合についても実施した。
【００６０】
結果を図6に示した。図6に示した結果より、LAFCPCPt-accBC-aceE株を72時間培養すると、通常条件では56.3 g/Lのグルコースを消費して16.4 g/Lのピルビン酸を製造したのに対して、最適条件では33.3 g/Lのグルコースを消費して27.9 g/Lのピルビン酸を製造した。以上の結果から、LAFCPCPt-accBC-aceE株を利用したピルビン酸の製造には、培養温度: 35℃、培地pH: 5.7、攪拌速度: 1800 rpm、空気供給量: 150 mL/minが有効であることが確認された。
【図１】
0006621318.tif 000003
【図２】
0006621318.tif 000004
【図３】
0006621318.tif 000005
【図４】
0006621318.tif 000006
【図５】
0006621318.tif 000007
【図６】
0006621318.tif 000008
【配列表】
0006621318000001.app