(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種もしくは複数種の癌の治療のための、以下の化合物：
【化１】
0006483736.tif 000020
【化２】
0006483736.tif 000021
のいずれかから選択される化合物又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が、(R)-若しくは(S)-エナンチオマー、又はラセミ体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物が、(S)-エナンチオマーである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記癌が、キナーゼと関連している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記キナーゼが、サイクリン依存性キナーゼである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記サイクリン依存性キナーゼが、cdk2又はcdk4である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、以下：膀胱癌、乳癌、結腸癌、中皮腫癌、腎臓癌、肝臓癌、小細胞肺癌と非小細胞肺癌とを含む肺癌、頭頸部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、及び、扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌を含む、癌腫；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫、及びバーキットリンパ腫を含む、リンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球白血病を含む、骨髄細胞系列の造血器腫瘍；脂肪肉腫、GIST、線維肉腫、及び横紋筋肉腫を含む、間葉由来の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘種を含む、中枢及び末梢神経系の腫瘍；並びに、黒色腫、セミノーマ、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、甲状腺濾胞癌、及びカポジ肉腫を含む他の腫瘍より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記癌が、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、または中皮腫癌から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記癌が、卵巣癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般的に、本発明は、癌の治療のためのキナーゼ阻害剤に関する。とりわけ、本発明は、癌の治療における、アミノアセトニトリル誘導体（AADs）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノアセトニトリル誘導体（AADs）は、薬剤耐性線形動物に対して有効な駆虫薬の類である。線形動物、もしくは回虫は、ヒトおよび家畜動物の多数の病原体を含む。胃腸管線虫、例えば、捻転胃虫は、世界中で家畜の生産にかなりの経済的損失をもたらす、反芻動物の主要な寄生生物である。
【０００３】
モネパンテル（MPL）（N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニルベンズアミド）は、こうしたAADの一例であり、羊の胃腸管寄生動物の処置のための抗線虫剤として認可されている。
【化１】
0006483736.tif 000002
【０００４】
MPLは、様々な種類の家畜病原性線虫に対して有効であることが判明している。
【０００５】
抗線虫剤として、MPLは、リガンド開口型イオンチャネルに作用して、神経筋シナプスにおけるシグナル伝達の阻害をもたらす。影響を受けた寄生動物は、その後、筋収縮における異常調節、麻痺、壊死、及び脱皮異常をきたす。三種類のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）関連遺伝子が、MPLの主要なターゲットとして特定されており、前記三遺伝子の全てが、線形動物中にのみ存在するnAChRサブユニットのDEG-3サブファミリーを示すタンパク質をコードする。DEG-3遺伝子は、第二の膜貫通領域におけるα7サブユニットとの類似性を保持するnAChR α-サブユニットをコードする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第1216053号
【特許文献２】米国特許第6,372,223号
【特許文献３】欧州特許第0399843
【特許文献４】米国特許第7,029,678号
【特許文献５】PCT国際出願第2007/006939号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 196 and 1456-1457
【非特許文献２】T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series
【非特許文献３】Bioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press
【非特許文献４】Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.
【非特許文献５】Gennaro et al. (Eds), (1990), “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA
【非特許文献６】Gilman et al., (Eds), (1990), “Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics”, Pergamon Press.Fingl et al., (1975), in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このたび、驚くべきことに、AADsが、癌の治療にも有効であることが判明した。過去50年間の医療における最大の挑戦の一つが、健常組織を損傷することなく腫瘍細胞を効果的に殺すことのできる医薬の特定であった。既知の種類の抗癌剤ほぼ全ての副作用分析結果は、癌患者を治療する外科医の能力を、特にしばしば薬剤耐性が発現する末期において、実質的に制限するものである。別の駆虫薬、例えば、ベンズイミダゾールが、癌細胞の成長及び発達の制御に有効であることが知られているものの、式（Ｉ）の化合物、例えば、MPLの驚くべき抗癌活性及び低毒性によれば、癌治療のための、副作用が制限された、より柔軟な投薬計画が可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の態様によれば、一種もしくは複数種の癌の治療方法であって、式（Ｉ）：
【化２】
0006483736.tif 000003
[式中、
R1、R2、及びR3、並びにR5は、H、アルキル、ハロゲン、-CF3、または-CNからそれぞれ独立に選択され；
R4及びR6は、H、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3、または-S-CF3からそれぞれ独立に選択され；
Xは、ヘテロ原子、N(アルキル)、またはNHであり；さらに
nは、1乃至20である]
の化合物、あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの治療上の有効量を、これを必要とする患者に投与する工程を含む、方法が提供される。
【００１０】
好ましくは、R1は、-CN、H、またはハロゲンである。さらに好ましくは、R1は、-CNである。好ましくは、R2は、Hまたはハロゲンである。さらに好ましくは、R2は、Hである。好ましくは、R3は、-CF3 またはハロゲンである。さらに好ましくは、R3は、-CF3である。好ましくは、R4は、-S-CF3、-SOCF3、-SO2CF3、-OCF3、または-CF3である。さらに好ましくは、R4は、-S-CF3または-SO2CF3である。好ましくは、R5は、Hである。好ましくは、Xは、Oである。好ましくは、nは、1乃至15、1乃至10、1乃至5、1乃至2、または1である。より好ましくは、nは、1である。好ましくは、R4は、アミド部分に対してパラ位にある。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物は、(R)もしくは(S)-エナンチオマー、またはラセミ体である。好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、(S)-エナンチオマーである。
【００１２】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、以下の化合物：
【化３Ａ】
0006483736.tif 000004
【化３Ｂ】
0006483736.tif 000005
【化３Ｃ】
0006483736.tif 000006
[ここで、上記化合物のそれぞれが、(R)もしくは(S)-エナンチオマー、またはラセミ体である]
あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグのいずれか一つより選択される。
【００１３】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、MPL（N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニルベンズアミド）：
【化４】
0006483736.tif 000007
あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグである。
【００１４】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、モネパンテルスルホン（MPL-SO2）：
【化５】
0006483736.tif 000008
あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグである。
【００１５】
さらに好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、以下の化合物：
【化６】
0006483736.tif 000009
あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグから選択される。
【００１６】
好ましくは、前記癌は、キナーゼと関連している。
【００１７】
好ましくは、前記キナーゼは、サイクリン依存性キナーゼであり、より好ましくは、cdk2またはcdk4である。
【００１８】
好ましくは、キナーゼと関連する前記癌は、以下：膀胱癌、乳癌、結腸癌、中皮腫癌、腎臓癌、肝臓癌、並びに、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、頭頸部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、並びに、扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌を含む、癌；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫(Burkett's lymphoma)を含む、リンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球白血病を含む、骨髄細胞系列の造血器腫瘍；脂肪肉腫、GIST、線維肉腫、及び横紋筋肉腫を含む、間葉由来の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘種を含む、中枢及び末梢神経系の腫瘍；並びに、黒色腫、セミノーマ、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ（keratoctanthoma）、甲状腺濾胞癌、及びカポジ肉腫を含む他の腫瘍より選択される。
【００１９】
好ましくは、治療しようとする前記癌は、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、または中皮腫癌から選択され、最も好ましくは、治療しようとする前記癌は、卵巣癌である。
【００２０】
本発明の第二の態様においては、キナーゼと関連する一種もしくは複数種の癌の治療のための医薬の製造における、式（Ｉ）：
【化７】
0006483736.tif 000010
[式中、
R1、R2、及びR3、並びにR5は、H、アルキル、ハロゲン、-CF3、または-CNからそれぞれ独立に選択され；
R4及びR6は、H、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3、または-S-CF3からそれぞれ独立に選択され；
Xは、ヘテロ原子、N(アルキル)、またはNHであり；さらに
nは、1乃至20である]
の化合物、あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの使用が提供される。
【００２１】
本発明の第三の態様によれば、キナーゼと関連する一種もしくは複数種の癌の治療における使用のための、式（Ｉ）：
【化８】
0006483736.tif 000011
[式中、
R1、R2、及びR3、並びにR5は、H、アルキル、ハロゲン、-CF3、または-CNからそれぞれ独立に選択され；
R4及びR6は、H、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、-CF3、-OCF3、-SO2-CF3、-SO-CF3、または-S-CF3からそれぞれ独立に選択され；
Xは、ヘテロ原子、N(アルキル)、またはNHであり；さらに
nは、1乃至20である]
の化合物、あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、MPLによる細胞増殖の阻害を示す。卵巣癌細胞株OVCAR-3、A2780、及びSKOV-3、並びに健常なHUVEC（コントロール）を、全てMPL（0、1、5、10、25、50、及び100μmol/L）の存在下で72時間培養した。細胞増殖に対するMPLの効果を、SRBアッセイを用いて評価した。（媒体で処理した）コントロール細胞が100％増殖を表すこととして、MPL処理したグループをコントロールに対するパーセンテージで表す。各薬剤濃度について四重に試験し、各試験を少なくとも二回繰り返した。データ（平均±SEM）を、コントロールに対するパーセンテージで表す。統計的比較のために、各薬剤治療群を、スチューデントt-検定を用いてコントロール群と比較した。
【図２】図２は、OVCAR-3細胞のコロニー形成活性に対するMPLの効果を示す。MPL（0、5、10、及び25μmol/L）と共に細胞を72時間インキュベートした後、細胞を洗い、寒天プレートに移し、通常の成長培地で培養し、更に標準条件下で2週間に亘ってインキュベートした。その後、細胞を100％メタノールで固定し、1％のクリスタルバイオレットで染色した。コロニー（50より多くの細胞のクラスター）を顕微鏡下で（倍率5倍）で数えた。別々の実験群について数えたコロニーの数を、コントロールに対するパーセンテージとして表す。
【図３ａ】図３は、MPLがどのように卵巣癌細胞株の細胞周期分布を妨げるかを示す。OVCAR-3細胞を、MPL（0、5、10、及び25μmol/L）で48時間に亘って処理した。プロピジウムヨーダイドで染色した細胞を、フローサイトメトリー分析を用いてDNAカウントのために分析した。結果（表参照）は、G1、S、及びG2/M期の細胞に対するパーセンテージとして示される。各値は、2つの別個の実験の平均±SEMを表す。
【図３ｂ】図３は、MPLがどのように卵巣癌細胞株の細胞周期分布を妨げるかを示す。A2780細胞を、MPL（0、5、10、及び25μmol/L）で48時間に亘って処理した。プロピジウムヨーダイドで染色した細胞を、フローサイトメトリー分析を用いてDNAカウントのために分析した。結果（表参照）は、G1、S、及びG2/M期の細胞に対するパーセンテージとして示される。各値は、2つの別個の実験の平均±SEMを表す。
【図４】図４は、MPLがどのように細胞周期制御タンパク質cdk2、cdk4、及びサイクリンE及びAの発現を妨げるかを示す。細胞を、MPL（0、5、10、及び25μmol/L）で48時間に亘って処理した。全タンパク質抽出物を得て、電気泳動によって分離し、示された抗体を用いた免疫ブロットにより調査した。各抽出物中のこれらタンパク質のレベルを示すウェスタンブロット分析を、関連する抗体を用いて分析した。画像は、スキャンした、撮影済みX線写真フィルムを表す。ハウスキーピング遺伝子（GAPDH）を用いて、同様のタンパク質負荷及びブロット転写を確認した。
【図５】図５は、MPL処理細胞中のPARP及び切断されたPARPの免疫ブロット分析を示す。細胞培養条件下で成長させたOVCAR-3及びA2780細胞を、様々な濃度（0、5、10、及び25μM）のMPLと共に24、48、または72時間に亘ってインキュベートした。細胞溶解物を準備し、PARP及び切断されたPARPの測定のためにウェスタンブロット法によって分析した。
【図６】図６は、A2780卵巣癌細胞のMPLを用いた処理またはU87神経膠腫細胞のMPL-SO2を用いた処理によって小胞が形成されることを示し、これは、MPL及びMPL-SO2がこれらの細胞中で自食作用を誘発することを示唆している。
【図７】図７は、図６に示されるものと矛盾なく、MPL処理によってADP/ATPの細胞比が低減されることを示し、これは、細胞の自食作用の、もう一つの示唆である。
【図８】図８は、MPLが細胞の生存を妨げることを示す。A)MPL（0、5、10、及び25μM）に72時間に亘って暴露されたOVCAR-3細胞の顕微鏡画像。ヒトの卵巣癌細胞株OVCAR-3、A2780、SKOV-3、IGROV-1を、MPL（0、5、10、及び25μmol/L）の存在下で72時間に亘って培養した。MPLの細胞の生存に対する効果を、標準のトリパンブルーアッセイを用いて評価した。（媒体で処理した）コントロール細胞が100％生存を表すこととして、MPL処理したグループをコントロールに対するパーセンテージで表す。各薬剤濃度について四重に試験し、各試験を少なくとも二回繰り返した。データ（平均±SEM）を、コントロールに対するパーセンテージで表す。統計的比較のために、各薬剤治療群を、スチューデントt-検定を用いてコントロール群と比較した。0.5以下のp値は、著しい変化（ｐ＜0.5）を表すとみなされ、*＝＜0.05、**＜0.01、及び***＝ｐ＜0.01である。
【図９】図９は、健常細胞の生存に対するMPLの効果を示し、MPLの抗増殖促進効果が癌細胞志向であることを示す。健常細胞HOSE、CHO、HEK、及びHUVECを、MPL（0、5、10、及び25μmol/L）の存在下で72時間に亘って培養した。MPLの細胞の生存に対する効果を、標準のトリパンブルーアッセイを用いて評価した。結果を、コントロール（100％）と比較した平均±SEMとして表す。
【図１０】図１０は、MPLがどのように細胞増殖を妨げるかを示す。ヒトの卵巣癌細胞株OVCAR-3、A2780、SKOV-3、及びIGROV-1を、全てMPL（0、5、10、25、50、及び100μmol/L）の存在下で72時間に亘って培養した。MPLの細胞増殖に対する効果を、SRBアッセイを用いて評価した。（媒体で処理した）コントロール細胞が100％増殖を表すこととして、MPL処理したグループをコントロールに対するパーセンテージで表す。各薬剤濃度について四重に試験し、各試験を少なくとも二回繰り返した。データ（平均±SEM）を、コントロールに対するパーセンテージで表す。統計的比較のために、各薬剤治療群を、スチューデントt-検定を用いてコントロール群と比較した。(A)：アトロピン：ムスカリン性Ach受容体アンタゴニスト、ツボクラリン（Tobucorarine）：ニコチン性Ach受容体アンタゴニスト、メカミラミン：非選択的、非競合的ニコチン性受容体アンタゴニスト；(B)：カルバコール：ムスカリン性ニコチン性Ach受容体アンタゴニスト、ニコチン：ニコチン性Ach受容体アンタゴニスト、アルファ-ブンガロトキシン：選択的α7、ニコチン性Ach受容体アンタゴニスト。
【図１１】図１１は、MPL抗増殖促進効果が、ニコチン性受容体とは独立であることを示す。細胞を、徐々に増大する濃度のニコチン、カルバコール、または受容体アンタゴニスト、アトロピン、メカミラミン、ツボクラリン、及びα-ブンガロトキシンで予備処理した（30分間）。MPL（5μM）を加え、細胞培養インキュベーター中に72時間置いた。各薬剤濃度について四重に試験し、各試験を少なくとも二回繰り返した。データ（平均±SEM）を、コントロールに対するパーセンテージで表す。
【図１２】図１２は、MPLがどのように神経膠腫細胞の増殖を妨げるかを示す。健常細胞培養条件下における健常星状膠細胞との対比による、U87-MG、U251神経膠腫細胞株の増殖に対するMPL処理の効果の、SRB増殖アッセイを用いる比較。データを、コントロールに対するパーセンテージで表す。
【図１３】図１３は、MPLがどのように自食作用を誘発するかを示す。化学耐性U87神経膠腫細胞をMPLで処理することによって自食作用がもたらされ、これは濃度依存形式のLC3-IIの発現増大によって確認される。MPLで処理したU87-MG及びU251は、濃度依存形式の自食作用を示す（小胞として示される）。LC3-I及びLC3-IIの濃度依存性変換により、これらの細胞中の自食作用現象の増大が確認される。
【図１４】図１４は、OVCAR-3及びA2780細胞のコロニー形成活性に対するMPLの効果を示す。MPL（0、5、10、及び25μM）と共に細胞を72時間インキュベートした後、細胞を洗い、寒天プレートに移し、通常の成長培地で培養し、更に標準条件下で2週間に亘ってインキュベートした。その後、細胞を100％メタノールで固定し、1％のクリスタルバイオレットで染色した。コロニー（50より多くの細胞のクラスター）を顕微鏡下で（倍率5倍）で数えた。別々の実験群について数えたコロニーの数を、コントロールに対するパーセンテージとして表す。
【図１５】図１５は、MPLがどのように卵巣癌細胞株の細胞周期進行を妨げるかを示す。OVCAR-3及びA2780細胞をMPL（0、5、10、及び25μM）で48時間処理し、前記細胞をPIで染色した後にフローサイトメトリー分析（FACS）によって試験した。図及びデータは、細胞周期の様々な時点での細胞分布におけるMPLに誘発される変化を示し、ここでは、G1、S、及びG2/M期に対するパーセンテージとして示される。各値は、2つの別個の実験の平均±SEMを表す。
【図１６】図１６は、MPLがどのように細胞周期制御タンパク質cdk2、cdk4、及びサイクリンE及びAの発現を妨げるかを示す。細胞を、MPL（0、5、10、及び25μM）で24、48、または72時間に亘って処理した。全タンパク質抽出物を得て、電気泳動によって分離し、示された抗体を用いた免疫ブロットにより調査した。各抽出物中のこれらタンパク質のレベルを示すウェスタンブロット分析を、関連する抗体を用いて分析した。画像は、スキャンした、撮影済みX線写真フィルムを表す。ハウスキーピング遺伝子（GAPDH）を用いて、同様のタンパク質負荷及びブロット転写を確認した。
【図１７】図１７は、MPLがどのようにPARPを切断するかを示す。OVCAR-3またはA2780細胞のMPL（0、5、10、及び25μM）への24、48、及び72時間に亘る暴露により、PARPの切断が引き起こされ、このことは細胞分解がもたらすと共に、死細胞の指標としての役割を果たす。
【図１８ａ】図１８ａは、MPLがどのようにATPレベルを低減するかを示す。OVCAR-3またはA2780細胞のMPL（0、5、10、及び25μM）への24、48、及び72時間に亘る暴露により、PARPの切断が引き起こされ、このことは細胞分解がもたらすと共に、死細胞の指標としての役割を果たす。
【図１８ｂ】図１８ｂは、MPLがどのようにATPレベルを低減するかを示す。OVCAR-3またはA2780細胞のMPL（0、5、10、及び25μM）への24、48、及び72時間に亘る暴露により、PARPの切断が引き起こされ、このことは細胞分解がもたらすと共に、死細胞の指標としての役割を果たす。
【図１９】図１９は、ヌードマウスのs.c.（皮下）腫瘍成長に対する、i.p.（腹腔内）投与されたモネパンテルの効果を示す。250万の対数成長性OVCAR-3細胞を、各マウスの左脇腹にs.c.注射した。腫瘍成長をキャリパー測定により観察し、腫瘍体積を、直交径を測定することにより決定した。理論上の腫瘍体積を、式1/2（長さ×幅2）に基づいて算出したが、ここでは幅は二つの直交径測定値のより短い方である。処置は、腫瘍細胞注射の7日後に開始したが、その前に、マウスを無作為に選んで治療またはコントロールグループに割り当てた（1グループあたり6匹）。0.5％ HPMC中に懸濁させたモネパンテルを、2.5もしくは25mg/kgで週に三度i.p.投与した。コントロールグループは媒体でのみ処置した。
【図２０】図２０は、ヌードマウスのs.c.腫瘍成長に対する、i.p.投与されたモネパンテルの効果を示す。対数成長性OVCAR-3細胞を、各マウスの左脇腹にs.c.注射した。腫瘍成長をキャリパー測定により観察し、腫瘍体積を、直交径を測定することにより決定した。理論上の腫瘍体積を、式1/2（長さ×幅2）に基づいて算出したが、ここでは幅は二つの直交径測定値のより短い方である。処置は、腫瘍細胞注射の7日後に開始したが、その前に、マウスを無作為に選んで治療またはコントロールグループに割り当てた（1グループあたり6匹）。0.5％ HPMC中に懸濁させたモネパンテルを、25もしくは50mg/kgで週に三度i.p.投与した。コントロールグループは媒体でのみ処置した。
【図２１】図２１は、ヌードマウスの腫瘍成長に対する、経口モネパンテルの効果を示す。OVCAR-3細胞を、各マウスの左脇腹にs.c.注射した。腫瘍成長をキャリパー測定により観察し、腫瘍体積を、直交径を測定することにより決定し、理論上の腫瘍体積を、式1/2（長さ×幅2）に基づいて算出したが、ここでは幅は二つの直交径測定値のより短い方である。処置は、腫瘍細胞注射の7日後に開始したが、その前に、マウスを無作為に選んで治療またはコントロールグループに割り当てた（1グループあたり6匹）。0.5％ HPMC中に懸濁させたモネパンテルを、50もしくは100mg/kgで週に三度経口（100μL）投与した。コントロールグループは媒体でのみ処置した。  図１９乃至２１は概して、メスのヌードマウスのs.c.異種移植片に対するMPLの効果を示す。マウスに、250万の対数成長性ヒトOVCAR-3細胞を左脇腹に接種した。腫瘍成長をキャリパー測定により観察し、腫瘍体積を、直交径を測定することにより決定した。理論上の腫瘍体積を、式1/2（長さ×幅2）に基づいて算出したが、ここでは幅は二つの直交径測定値のより短い方である。処置は、腫瘍細胞注射の7日後に開始したが、その前に、マウスを無作為に選んで治療またはコントロールグループに割り当てた（1グループあたり5乃至6匹）。0.5％ HPMC中に懸濁させたモネパンテルを、i.p.にて2.5もしくは25mg/kg（図１９）、25もしくは50mg/kg（図２０）、あるいは経口にて50もしくは100mg/kg、全て週に三度投与した。コントロールグループのマウスには、全く同じ方式及び同じ時点に、同体積の0.5% HPMC媒体で処置した。
【図２２】図２２は、MPLがどのように腫瘍組織において壊死を引き起こすのかを示す。ヌードマウスの皮下の異種移植片由来の腫瘍組織を、50もしくは100mg/kg/日で一日おきに経口投与されるMPLで処置した。細胞の組織画像が、ヘマトキシリン及びエオシン染色で示され（H&E；最上段）、激しい薬剤誘発性壊死を示している（黒矢印；倍率×10）。MPL治療マウスから切除した腫瘍由来の腫瘍組織学的な代表的画像は、100mg/kgのより多い用量にて広範囲の壊死を示す（s.c.腫瘍、経口処置、2週間に亘って週に3回）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（定義）
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素、好ましくは、フッ素または塩素を意味する。
【００２４】
「アリル」とは、直鎖状もしくは分枝状であってよく、鎖中に約1乃至20の炭素原子を含んでよい脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、鎖中に約1乃至約12の炭素原子を含む。より好ましいアルキル基は、鎖中に約1乃至約6の炭素原子を含む。分枝状とは、一つもしくは複数の低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、またはプロピルが、直鎖状アルキル鎖に結合していることを意味する。「低級アルキル」とは、直鎖状または分枝状であってよい鎖中に約1乃至約6の炭素原子を有する基を意味する。「アルキル」とは、同じでも異なってもよい一つ以上の置換基によって未置換であるかまたは任意に置換されていてもよく、各置換基は独立して、ハロ、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、-NH(アルキル)、-NH(シクロアルキル)、-N(アルキル)2、カルボキシ、及び-C(O)O-アルキルからなる群から選択される。適切なアルキル基の非限定的な例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、及びt-ブチルが含まれる。
【００２５】
「ヘテロ原子」とは、N、O、P、及びSから選択される原子を意味する。必要に応じて、指定のない結合価が、H、OH、カルボニル、n-アルキル、またはアルコキシから、独立して選択される。
【００２６】
「n」は、1乃至20、好ましくは1乃至10、より好ましくは1乃至6、最も好ましくは、1乃至4である。
【００２７】
「アルコキシ」とは、アルキル基が前述の通りであるアルキル-O-基を意味する。適切なアルコキシ基の非限定的な例には、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、及びn-ブトキシが含まれる。親部分への結合は、エーテル酸素を介する。
【００２８】
「薬学的に許容される塩」とは、式（Ｉ）の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機酸もしくは無機酸、または有機もしくは無機塩基から形成される、従来の酸付加塩または塩基付加塩を意味する。酸付加塩の実例には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸等の無機酸から誘導されるもの、並びに、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等の有機酸から誘導されるものが含まれる。塩基付加塩の実例には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び、第四級アンモニウム水酸化物、例えば、水酸化テトラメチルアンモニウムから誘導されるものが含まれる。塩への医薬化合物（すなわち、薬物）の化学的変性は、化合物の改善された物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性能、及び溶解度を得るための、医薬分野の化学者には周知の技術である。例えば、H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 196 and 1456-1457を参照のこと。
【００２９】
「薬学的に許容される」こと、例えば、薬学的に許容される担体、賦形剤等は、薬理学的に許容され、特定の化合物を投与しようとする対象に、実質的に非毒性であることを意味する。
【００３０】
置換アルキルなどのような「置換」とは、特記のない限り、置換が一箇所もしくは複数箇所で起こってよく、各置換位置における置換基が、特定の選択肢から個別に選択されること、すなわち、一つ以上の置換基が様々な位置に同時に存在してよいことを意味する。
【００３１】
本発明の化合物の「プロドラッグ」及び「溶媒和物」もまた、本明細書において企図される。プロドラッグの議論は、T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) 14 of the A.C.S. Symposium Series、及びBioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Pressに記載されている。「プロドラッグ」なる語は、インビボで変換されて式（Ｉ）の化合物、この化合物の代謝産物、薬学的に許容される塩、または溶媒和物を生じる化合物（例えば、薬物前駆体）を意味する。変換は、様々な機構（例えば、代謝または化学的プロセスによって）によって起こり得る。プロドラッグの使用についての議論は、T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) 14 of the A.C.S. Symposium Series、及びBioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Pressに記載されている。
【００３２】
本発明の化合物の「代謝産物」とは、代謝の中間体及び生成物を意味する。
【００３３】
式（Ｉ）の化合物は、不斉中心またはキラル中心を含んでよく、然るに、様々な立体異性形態で存在してよい。式（Ｉ）の化合物の全ての立体異性形態、並びにラセミ体を含むこれらの混合物が、本発明の一部を成す。さらにまた、本発明は全ての幾何異性体及び位置異性体を包含する。ジアステレオマー混合物は、それらの物理化学的相違に基づき、当業者には周知の方法、例えば、クロマトグラフィーおよび/または分別結晶法によって、個々のジアステレオマーに分離することができる。鏡像異性体は、鏡像異性体混合物を、適切な光学活性化合物（例えば、キラル補助基、例えば、キラルアルコール、あるいはモッシャー試薬塩化物）との反応によってジアステレオマー混合物に変換し、ジアステレオマーを分離し、個々のジアステレオマーを対応する純粋エナンチオマーに変換（例えば、加水分解）することによって分離することができる。鏡像異性体は、キラルHPLCカラムの使用によっても分離することができる。本発明のキラル中心は、IUPAC 1974によって定義されるSもしくはR配置を有していてよい。
【００３４】
「塩」、「溶媒和物」、または「プロドラッグ」などの用語の使用は、本発明による化合物の鏡像異性体、立体異性体、回転異性体、互変異性体、位置異性体、ラセミ体、またはプロドラッグの塩、溶媒和物、およびプロドラッグに等しく応用されることを企図する。
【００３５】
本明細書中に使用されるように、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明らかに逆のことが示されない限り、言及したものの複数形を含む。
【００３６】
本明細書中に使用されるように、「含む」なる語は、「包含する」を意味する。「含む」という語の変形、例えば、「含んでいる」は、対応する様々な意味を有する。したがって、例えば、式（Ｉ）の化合物を「含む」医薬組成物とは、その化合物のみからなるものであってよく、あるいは、一つもしくは複数の付加的成分（例えば、医薬品として許容される担体、賦形剤、及び／または希釈剤）を含んでもよい。
【００３７】
本明細書中に使用されるように、「複数」なる語は、一つより多くを意味する。特定の態様もしくは実施態様では、複数とは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21を意味してもよい、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46 、47、48、49、50、51、またはそれ以上、及び導き出せるあらゆる整数、及び導き出せるあらゆる範囲を意味する。
【００３８】
「治療上の有効量」とは、少なくとも一種の式（Ｉ）の化合物、あるいはその代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの、ヒトの腫瘍細胞株を含むヒトの腫瘍細胞の、増殖を実質的に阻害し、且つ／または分化を実質的に防止する量を意味する。本明細書中で使用される「治療上の有効量」なる語には、その意味として、非毒性であるが、本発明における使用のための薬剤もしくは組成物の所望の治療効果を提供するために十分である量を含む。必要とされる厳密な量は、例えば、治療しようとする種、対象の年齢及び全般的な症状、治療しようとする症状の重篤度、投与されている特定の薬剤、投与の方法などの要因によって、対象ごとに異なる。したがって、全ての実施態様に応用可能な「有効量」を厳密に特定することは不可能である。しかしながら、あらゆる所与の場合について、当業者であれば、ルーチン実験を行うことのみで適切な「有効量」を決定してよい。
【００３９】
AADs（例えば、式（Ｉ））は、有機合成の方法論の通常の知識を使用して合成され得る化合物の類である。例えば、AADsは、フェノールをクロロアセトンで誘導体化し、ストレッカー反応を行い、さらに得られたアミンを塩化アロイルでアシル化することによって合成してよい（スキーム１に示される通り）。必要に応じて、その後特定のエナンチオマーを、例えばキラル分割によって得ても良い（スキーム２に示される通り）。
【００４０】
【化９】
0006483736.tif 000012
【００４１】
【化１０】
0006483736.tif 000013
【００４２】
AADsは、薬剤体制線形動物の処置にこれまで使用されてきた化学品の類である。MPLなる化合物は、線形動物中のニコチン性アセチルコリン受容体を標的とするこうしたAADの一例であり、反芻動物中の寄生生物の処置のために広く使用されている。
【００４３】
驚くべきことに、本発明者らは、式（Ｉ）の化合物、例えば、MPL及びMPL-SO2が、抗癌活性を有することを見出した。とりわけ、MPL及びMPL-SO2を含む式（Ｉ）の化合物は、癌細胞株の細胞増殖及びコロニー形成を阻害することが判明した。例えば、卵巣癌細胞株は、式（Ｉ）の化合物に対して非常に感受性であることが判明しており、別の細胞株もまた高度に感受性であることが明らかである。これらには、乳癌、中皮腫癌、前立腺癌、及び膠芽腫細胞株が含まれる。MPLは、化学耐性のアンドロゲン非感受性PC-3及びDU 145前立腺癌細胞に対して非常に有効である。同様に、これらもまた化学療法に高度に耐性である、PET及びYOU細胞（中皮腫癌）及びU87細胞（膠芽腫）の複製は、MPLによって著しく抑制される。
【００４４】
理論に縛られることは望まないが、線形動物中で見られる作用方式とは異なり、式（Ｉ）の化合物が、癌細胞株中のサイクリン依存性キナーゼを標的とすることによって作用し得ることは、驚くべきである。とりわけ、式（Ｉ）の化合物は、細胞周期制御キナーゼ、例えば、サイクリン依存性キナーゼ２（Cdk2）及びサイクリン依存性キナーゼ４（Cdk4）を阻害するようである。
【００４５】
式（Ｉ）の化合物、例えば、MPL及びMPL-SO2を用いる癌細胞株の処置は、細胞周期停止をもたらすようである。ここでも理論に縛られることは望まないが、細胞周期のG1期における細胞の蓄積から明らかなように、この処置にはG1細胞周期停止が含まれるようである。さらにまた、式（Ｉ）の化合物、例えば、MPL及びMPL-SO2を用いる癌細胞株の処置が、細胞周期から出て自食及び／またはアポトーシスを経る細胞によって明示される通り、不可逆なG0細胞周期停止を誘発し得ることが示唆される。この駆虫剤の新たな類は、ベンズイミダゾールとは異なる機構プロフィールを示し、癌治療に新たに改善されたアプローチを与えうる。
【００４６】
（組成物、医薬、及びキット）
本発明は、式（Ｉ）の化合物、あるいは前記化合物の代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの少なくとも一種及び少なくとも一種の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物、医薬、及びキットを提供する。本発明によって記載される化合物から医薬組成物を調製するためには、不活性な薬学的に許容される担体は、固体または液体のいずれであってもよい。固体形態の調剤には、散剤、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤、及び坐剤が含まれる。散剤及び錠剤は、約5乃至約95パーセントの活性成分を含んでよい。適切な固体担体は当業者には既知であり、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、またはラクトースである。錠剤、粉末、カシェ剤、及びカプセル剤は、経口投与に適した固体投薬形態として使用することができる。薬学的に許容押される担体、並びに、様々な組成物の製造方法の例は、A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvaniaに見られる。
【００４７】
液体形態の調剤には、溶液、懸濁液、及びエマルジョン、例えば、非経口注射向けの水または水-プロピレングリコール溶液、あるいは経口溶液、懸濁液、及びエマルジョン向けに甘味料及び乳白剤の添加を含む。液体形態の調剤には、鼻腔内投与のための溶液もまた含まれていてよい。
【００４８】
吸入に適したエアロゾル調剤には、溶液及び粉末形態の固体が含まれていてよく、これは、薬学的に許容される担体、例えば、不活性圧縮ガス、例えば、窒素と組み合わせられてよい。さらに、使用直前に経口もしくは非経口投与のための液体形態調剤に変換されることを企図する固体形態調剤も含まれる。こうした液体形態には、溶液、懸濁液、及びエマルションが含まれる。
【００４９】
本発明の化合物は、経皮送達されてもよい。経皮組成物は、クリーム、ローション、エアロゾル、及び／またはエマルションの形態を取ることができ、この目的のために当該技術分野で慣用的であるように、マトリックスまたはリザーバー型の経皮パッチに含めることができる。
本発明の化合物はまた、皮下に送達されてもよい。
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は経口投与される。
【００５０】
本発明の組成物および医薬は、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、及び／または希釈剤を含んでもよい。担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、組成物または薬剤の他の成分と適合性である点で「許容される」ものでなければならず、一般的に、その受容者にとって有害でない。薬学的に許容される担体または希釈剤の非限定的な例は、脱塩水または蒸留水；生理食塩水；植物ベースの油、例えば、ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油、またはココナッツ油；ポリシロキサン、例えば、メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、及びメチルフェニルポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；鉱物油、例えば、流動パラフィン、軟質パラフィン、またはスクワラン；セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール、例えば、エタノールまたはイソプロパノール；低級アルカノール；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、またはグリセリン；脂肪酸エステル、例えば、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、またはオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴムまたはアカシアゴム、石油ゼリーである。典型的には、担体は、組成物または薬剤の重量に対して約10％乃至約99.9％を成す。
【００５１】
本発明の組成物および医薬は、（例えば、皮下、筋内、または静脈内注射を含む非経口投与用の）注射による投与に適した形態、経口投与に適した形態（例えば、カプセル、錠剤、カプレット剤、およびエリキシル剤）、局所投与に適した形態（例えば、軟膏、クリーム、またはローション、あるいは点眼剤としての送達に適した形態）、あるいは、鼻腔内吸入による投与に適した形態（例えば、エアロゾルの形態）であってよい。
【００５２】
注射可能な溶液または懸濁液としての投与のための、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または担体は、リンガー溶液、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、及び1,2プロピレングリコールを含んでよい。非経口投与可能な組成物および医薬の調製方法は、当業者には明らかであり、より詳細には、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.に記載されている。
【００５３】
経口投与のために適当な担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントの例には、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン、及びレシチンが含まれる。さらに、これらの経口製剤は、適切な香味剤及び着色剤を含んでよい。カプセル形態で使用される場合、カプセルは、崩壊を遅らせるモノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの化合物で被覆されていてもよい。アジュバントは、典型的には、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、及び緩衝剤を含む。
【００５４】
経口投与用のための固体形態は、ヒトおよび動物用の薬務として許容される結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、香味剤、被覆剤、防腐剤、滑剤、及び／または時間遅延剤を含んでよい。適切な結合剤には、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、またはポリエチレングリコールを含む。適切な甘味料は、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、またはサッカリンが含まれる。適切な崩壊剤には、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、または寒天が含まれる。適切な希釈剤は、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたはリン酸二カルシウムが含まれる。適切な香味料には、ペパーミント油、ウィンターグリーン、チェリー、オレンジ、もしくはラズベリー香味の油が含まれる。適切な被覆剤には、アクリル酸及び／またはメタクリル酸及び／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、セラック、またはグルテンが含まれる。適切な防腐剤には、安息香酸ナトリウム、ビタミンE、α-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、または重亜硫酸ナトリウムが含まれる。適切な潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはタルクが含まれる。適切な時間遅延剤には、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが含まれる。
【００５５】
経口投与のための液体形態は、上記の作用剤に加えて、液体担体を含有してもよい。適切な液体担体には、水、油、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、落花生油、ココナッツ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド、またはこれらの混合物が含まれる。
【００５６】
経口投与用の懸濁液は、分散剤及び／または懸濁化剤をさらに含んでもよい。適切な懸濁剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはアセチルアルコールが含まれる。適切な分散剤には、レシチン、脂肪酸、例えばステアリン酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールの、モノ-もしくはジ-オレエート、ステアレート、またはラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンの、モノ-もしくはジ-オレエート、ステアレート、またはラウレートが含まれる。
【００５７】
経口投与のための製剤は、一種もしくは複数種の乳化剤を含んでよい。適切な乳化剤には、以上に例示したように分散剤、あるいは天然ゴム、例えば、グアーガム、アラビアゴム、またはトラガカントゴムが含まれる。
【００５８】
本発明の局所製剤は、1種以上の許容される担体と共に有効成分を含んでよく、任意にあらゆる治療成分を含んでよい。局所投与に適した製剤には、治療が必要な部分への皮膚からの浸透に適した液状もしくは準液状の調剤、例えば、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏、またはペースト、並びに、目、耳、または鼻への投与に適切な滴剤が含まれる。
【００５９】
本発明による滴剤は、無菌の水性もしくは油性溶液または懸濁液を含んでいてもよい。これらは、殺菌及び／または抗菌剤、及び／または別のあらゆる適切な防腐剤の水溶液であって、任意に界面活性剤を含むところに、活性成分を溶解させることによって調製することができる。得られた溶液は、その後濾過により清澄化させ、適切な容器に移し、滅菌してよい。滅菌は、30分間に亘る90℃乃至100℃でのオートクレーブもしくは維持、または濾過、次いで無菌技術によって容器に移すことによって達成しうる。滴剤への配合に適した殺菌剤及び抗菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（0.002％）、塩化ベンザルコニウム（0.01％）、および酢酸クロルヘキシジン（0.01％）である。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセロール、希釈アルコール、及びプロピレングリコールが含まれる。
【００６０】
本発明によるローションには、皮膚または眼への適用に適切なものが含まれる。眼用ローションは、任意に殺菌剤を含む滅菌水性溶液を含んでよく、また、滴剤の調製に関連して上述したものと同様の方法により調製してよい。皮膚への適用のためのローションまたは塗布剤はまた、乾燥を迅速にし、且つ皮膚を冷却する作用剤、例えば、アルコールまたはアセトン、及び／または保湿剤、例えば、グリセリン、または油、例えば、ヒマシ油または落花生油を含んでもよい。
【００６１】
本発明によるクリーム、軟膏、またはペーストは、外用のための活性成分の半固体製剤である。これらは、微細に分割したもしくは粉末状の形態の活性成分を、単独で、あるいは水性もしくは非水性流体中の溶液もしくは懸濁液として、脂肪性または非脂肪性の基剤と混合することによって調製しうる。基剤は、炭化水素硬質、例えば、硬質、軟質、もしくは流動パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属石鹸；粘液；天然起源の油、例えば、アーモンド、トウモロコシ、落花生油、ヒマシ油、またはオリーブ油、羊毛脂もしくはその誘導体、または脂肪酸、例えば、ステアリン酸もしくはオレイン酸、並びに、アルコール、例えば、プロピレングリコールまたはマクロゴールを含んでよい。
【００６２】
本発明の組成物および医薬には、あらゆる適切な界面活性剤、例えば、アニオン性、カチオン性、もしくは非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を導入してよい。懸濁剤、例えば、天然ゴム、セルロース誘導体、または無機材料、例えば、珪質シリカ、および別の成分、例えば、ラノリンもまた導入してよい。
【００６３】
本発明の組成物及び医薬は、リポソームの形態で導入してもよい。リポソームを形成するための適切な方法は、当業者には周知であり、特に、Prescott, (Ed), (1976), “Methods in Cell Biology”, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. p.33 et seq.が参照される。
【００６４】
補足的な活性成分、例えば、アジュバントまたは生物学的応答調節剤もまた、本発明の組成物および医薬品に導入することができる。
【００６５】
任意の適切なアジュバントが、本発明の組成物及び医薬に含まれてもよい。例えば、アルミニウム系アジュバントを使用してもよい。適切なアルミニウム系アジュバントには、以下に限定されるものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及びそれらの組み合わせが含まれる。利用しうるアルミニウム系アジュバントの他の具体例は、欧州特許第1216053号および米国特許第6372223号に記載されている。他の適切なアジュバントには、不完全フロイントアジュバント及び完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Mich.）；Merck Adjuvant 65（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）；AS-2（SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.）；アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオンもしくはアニオン誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドA及びクィルA；欧州特許第0399843号、米国特許第7029678号、及びPCT公開公報第2007/006939号に記載されたものを含む水中油型エマルション；及び／または付加的なサイトカイン、例えば、GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7、または-12、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、モノホスホリルリピドA（MPL）、コレラ毒素（CT）もしくはその構成サブユニット、熱不安定性エンテロトキシン（LT）もしくはその構成サブユニット、トール様受容体リガンドアジュバント、例えば、リポ多糖（LPS）及びその誘導体（例えば、モノホスホリルリピドA及び3-脱アシル化モノホスホリルリピドA）、ムラミルジペプチド（MDP）、及び呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のタンパク質Fが含まれる。
【００６６】
本発明の別の態様は、式（Ｉ）の少なくとも一種の化合物、あるいは前記化合物の代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグの治療上の有効量、並びに薬学的に許容される担体、媒体、または希釈剤を含むキットである。
【００６７】
本発明の別の態様は、所定量の式（Ｉ）の少なくとも一種の化合物、あるいは前記化合物の代謝産物、薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、並びに所定量の少なくとも一種の上記抗癌治療薬及び／または抗癌剤を含むキットであって、前記二種以上の成分の量は所望の治療効果を奏する。
【００６８】
本発明のキットは、本発明の方法の実施を補助するための構成要素、例えば、投与装置、緩衝剤、及び／または希釈剤を含んでよい。キットは、本発明の方法においてキットの構成要素を使用するための様々な構成要素及び指示を収容するための容器を含んでもよい。
【００６９】
所定の実施形態においては、キットは、組み合わせられたキットであってよい。
別の実施形態においては、キットは、断片化されたキットであってもよい。
【００７０】
（投与量および投与経路）
薬剤、組成物、及び医薬は、以下に限定されるものではないが、非経口（例えば、静脈内、髄腔内、皮下、または筋内）、経口、局所、または粘膜経路（例えば、鼻腔内）経路を含む標準的な経路によって、受容者に投与することができる。いくつかの実施態様では、これらは単独で、または他の追加の治療剤と組み合わせて、受容者に投与してよい。このような実施態様では、前記投与は同時または連続であってよい。
【００７１】
一般的に、薬剤、組成物、及び医薬は、投与の経路及び受容者の（健康状態を含む）物理的特徴と適合する方法で、且つ、所望の効果（すなわち、治療上有効な、免疫原性の、及び／または保護効果）が誘発される方法で、投与することができる。例えば、適切な投与量は、以下に限定されるものではないが、対象の物理的特徴（例えば、年齢、体重、性別）、薬剤、組成物または医薬が、単剤または術後補助療法として使用されているか否か、治療している癌の進行（すなわち、病理学的状態）、及び当業者には容易に発見できる別の要因を含む様々な因子によって変化し得る。
【００７２】
薬剤、組成物、及び医薬の適切な用量を決定する際の、様々な一般的懸念は、Gennaro et al. (Eds), (1990), “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA、及びGilman et al., (Eds), (1990), “Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics”, Pergamon Pressに記載されている。
【００７３】
本発明の驚くべき利点は、式（Ｉ）の化合物が一般的に低い毒性を反映していることである。例えば、MPLは、体重１kgあたり2000mg超の単回投与毒性を有する。このように、本発明における使用のための薬剤、組成物、または医薬は、体重１kg当たり最大2000mgの量の活性成分を含む単回用量として患者に投与されてもよい。
さらにまた、癌の治療のために本発明を使用することの別の驚くべき利点には、式（Ｉ）の化合物の一般的に高い臨床的耐性がある。例えば、24時間ごとに体重1kgあたり1000mgのMPLの用量は、哺乳動物において十分に許容される。このように、本発明における使用のための薬剤、組成物、または医薬は、24時間ごとに体重１kgあたり最大1000mgの量の活性成分を含む量で患者に投与されてもよい。
【００７４】
一般的に、効果的な投与量としては、活性成分が体重１kgあたり24時間ごとに約0.0001mg乃至約1000mgの範囲が見込まれ、典型的には、体重１kgあたり24時間ごとに約0.001mg乃至約750mg、体重１kgあたり24時間ごとに約0.01mg乃至約500mg、体重１kgあたり24時間ごとに約0.1mg乃至約500mg、体重１kgあたり24時間ごとに約0.1mg乃至約250mg、あるいは体重１kgあたり24時間ごとに約1.0mg乃至約250mgである。より典型的には、有効な用量範囲は、体重1kgあたり24時間ごとに約1.0mg乃至約200mg、体重1kgあたり24時間ごとに約1.0mg乃至約100mg、体重1kgあたり24時間ごとに約1.0mg乃至約50mg、体重1kgあたり24時間ごとに約1.0mg乃至約25mg、体重1kgあたり24時間ごとに約5.0mg乃至約50mg、体重1kgあたり24時間ごとに約5.0mg乃至約20mg、体重1kgあたり24時間ごとに約5.0乃至約15mgの範囲であると予想される。 
【００７５】
例えば、好ましい投与量は、体重1kgあたり24時間ごとに式（Ｉ）の化合物の約10mg乃至100mgであってよい。さらにまた、好ましい投与量は、体重1kgあたり24時間ごとに式（Ｉ）の化合物の約50mgであってよい。
【００７６】
典型的には、治療応用において、治療は癌の継続期間に亘りうる。さらにまた、当業者にとっては、個々の投与の最適量および間隔を、治療している疾患状態もしくは症状の性質及び程度、投与の形態、経路、及び位置、並びに治療している特定の対象の性質によって決定可能なことが明らかである。最適な投与量は、従来の技術を用いて決定することができる。
【００７７】
多くの場合（例えば、予防的応用）では、本発明の薬剤、組成物、または医薬の数回または多数回の投与、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の回数の投与を行うことが望ましい。投与は、約１乃至約１２週間隔で行ってよく、所定の実施態様では約１乃至約４週間の間隔であってよい。定期的な再投与もまた企図される。
【００７８】
当業者には、投与の最適な経緯は、治療決定試験の従来のコースを使用して確認できることが明らかであろう。
【００７９】
二つ以上の対象物（例えば、薬剤または医薬）を「組み合わせて」対象に投与する場合には、これらは単一組成物中で同時に、または別々の組成物中で同時に、あるいは別々の組成物中で別の時点で投与してよい。
【００８０】
本発明の所定の実施態様は、複数の別個の用量で、薬剤、組成物、もしくは医薬の投与を含む。従って、本明細書に記載される予防的および治療的処置のための方法は、例えば、規定の期間に亘る対象への複数回の別個の用量の投与を含む。従って、いくつかの実施態様では、この方法は、プライミング用量の投与を含み、その後さらにブースター投与を続けて行ってもよい。ブースターは、再ワクチン接種の目的のためであってもよい。様々な実施態様において、薬剤、組成物、または医薬は、少なくとも1回、2回、3回またはそれ以上投与される。
【００８１】
薬剤、組成物、及び医薬は、一般的に、意図される目的を達成するために有効な量で投与してよい。より具体的には、標的とする疾患または症状の発症を防ぐため、またはその既存の症状を緩和するために有効な量を意味する、治療上の有効量で投与してよい。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、薬剤、組成物、及び医薬の治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。
例えば、用量を動物モデルに処方して、細胞培養において決定されるIC50を含む血中濃度範囲を達成することができる。こうした情報は、ヒトおよび他の哺乳動物対象における有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【００８２】
治療有効用量とは、治療を受けている対象の症状の進行の予防、症状の緩和、及び／または対象の生存の延長のための、薬剤、組成物、または医薬の量を意味する。薬剤、組成物、または医薬の毒性及び治療有効性は、細胞培養における標準的な医薬アッセイ及び／または実験動物によって（例えば、LD50（集団の50％に対して致死的な用量）を及びED50（集団の50％において治療上有効な用量）を決定することによって）決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、LD50とED50との比として表すことができる治療指数である。高い治療指数を示す薬剤、組成物、及び医薬が好ましい。こうした細胞培養アッセイ及び／または動物研究から得られるデータは、ヒトまたは他の哺乳動物における使用のための範囲の用量を処方するために使用することができる。こうした化合物の用量は、毒性がほとんどないか全くないED50を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動してよい。厳密な処方、投与経路、及び投薬量は、個別の医師によって、対象の症状に鑑みて困難を伴うことなく選択することができる（Fingl et al., (1975), in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1を参照のこと）。投薬量および間隔は、所望の治療効果及び／または最小有効濃度（MEC）を達成し且つ維持するために十分な活性剤の血漿レベルを提供するために、個別に調整してよい。MECを達成するのに必要な投与量は、投与の経路及び他の個々の特徴に依存する。生物検定及び／またはHPLCアッセイを、血漿濃度を決定するために使用してよい。
【００８３】
投薬間隔もまた、MEC値を用いて決定してよい。一般的に、薬剤、組成物、及び医薬は、期間の約10％乃至約90％、好ましくは30％乃至90％、さらに好ましくは約50％乃至90
％に亘って血漿レベルをMEC以上に維持する投薬計画を用いて投与してよい。局所投与または選択的取込みが利用される実施態様においては、薬剤の有効な局所濃度は、血漿濃度と関連していなくてもよい。
【００８４】
本発明の化合物はまた、一種または複数の抗癌治療、例えば、放射線療法及び／または、
細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤（例えば、以下に限定されるものではないが、DNA相互作用剤（例えば、シスプラチンまたはドキソルビシン））；タキサン（例えば、タキソテール、タキソール）；トポイソメラーゼII阻害剤（例えば、エトポシド）；トポイソメラーゼI阻害剤（例えば、イリノテカン（またはCPT-11）、カンプトスター（camptostar）、またはトポテカン）；チューブリン相互作用剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはエポチロン）; ホルモン剤（例えば、タモキシフェン）；チミジル酸シンターゼ阻害剤（例えば、5-フルオロウラシル）；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート）；アルキル化剤（例えば、テモゾロマイド（TEMODAR（TM）、シェリング・プラウ社（Schering-Plough Corporation, Kenilworth, New Jersey）製）、シクロホスファミド）；ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤（例えば、SARASAR（TM）（4-[2-[4-[(11R)-3,10ジブロモ-8-クロロ-6,11-ジヒドロ-5H-ベンゾ[5,6]シクロヘプタ[1,2-b]ピリジン-11-イル-]-1-ピペリジニル]-2-オキソエチル]-1-ピペリジンカルボキサミド、もしくはシェリング・プラウ社（Schering-Plough Corporation, Kenilworth, New Jersey）製のSCH 66336）、ティピファミブ（tipifamib）（Zamestra（登録商標）またはヤンセンファーマ（Janssen Pharmaceuticals）製のR115777）、L778.123（メルク社（Merck & Company, Whitehouse Station, New Jersey）製のファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤）、BMS 214662（ブリストル・マイヤーズスクイブ医薬品（Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals, Princeton, New Jersey）製のファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤）；シグナル伝達阻害剤（例えば、イレッサ（アストラゼネカ医薬品（Astra Zeneca Pharmaceuticals, England）製））、タルセバ（EGFRキナーゼ阻害剤）、EGFRに対する抗体（例えば、C225）、GLEEVEC(TM)（ノバルティスファーマ（Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, New Jersey）製のC-ablキナーゼ阻害剤）；インターフェロン、例えば、イントロン（シェリング・プラウ社（Schering-Plough Corporation）製）、Peg-lntron（シェリング・プラウ社（Schering-Plough Corporation）製）；ホルモン療法複合剤；アロマターゼ複合剤；ara-C、アドリアマイシン、サイトキサン、及びゲムシタビンからなる群より選択される一種または複数種の抗癌剤と組み合わせて（共にまたは連続して投与して）使用してもよい。
【００８５】
（対象）
本発明の予防および治療の方法は、任意の適切な対象に適用することができる。いくつかの実施形態において、対象は、対象哺乳動物である。例えば、対象は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または社会的に、経済的に、または研究上重要である他のあらゆる哺乳動物であってよい。したがって、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であってよい。
【００８６】
当業者によれば、特定の実施態様に開示された本願発明には、広く記載された本発明の精神もしくは範囲から逸脱することなく多数の変更及び／または修正を行えることが認識される。したがって、本願発明の実施態様は、あらゆる点で例示的なものであり、制限的なものではない。
【００８７】
ここに、本発明を、特定の実施例を参照しつつ詳説するが、これはいかなる意味でも制限を加えるものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００８８】
（材料及び方法）
（細胞株）
ヒト卵巣癌細胞株OVCAR-3、SKOV-3、及びA2780、並びに初代細胞ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）、並びに他の全ての細胞株は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手し、彼らの指示に従って維持した。星状細胞および神経膠腫細胞株は、Lowy Cancer Research Centre, University of New South Wales, Australiaのケリー・マクドナルド博士（Dr. Kerry McDonald）の厚意によって贈られた。
【００８９】
（細胞増殖アッセイ）
細胞増殖を、スルホローダミンB（SRB）アッセイを用いて評価した。96ウェルプレート（2,000乃至3,000細胞/ウェル）に播種した細胞を、MPL（0、1、5、10、25、50、及び100μmol/L）で72時間処理した。次いで細胞を固定し、洗浄し、1％の酢酸に溶解させた100μlの0.4％（w/v）SRBで染色した。未結合の染料は、空気乾燥前に1％の酢酸で5回洗浄することにより除去した。結合したSRBは、100μlの10mMトリス塩基（pH10.5）に溶解させ、吸光度を570nmで読み取った。全く同じ手順を用いてMPL-SO2を評価した。いずれの薬剤も、エタノールに溶解させ、細胞培養アッセイに必要な最終濃度を与えるように培地で希釈した。
【００９０】
（細胞生存率アッセイ）
生存実験のために、6ウェルプレートに播種した細胞を、0、1、10、50、及び100μMの濃度のモネパンテル（MPL）に24、48、または72時間曝露した。モネパンテル（ノバルティス社（Novartis, Basel, Switzerland）により寄贈）を100％エタノールに溶解させ、その後、細胞培養培地で希釈した。治療期間の終わりに、細胞を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリパンブルー及び血球計を用いてカウントした。全ての実験点は、四重に設定され、各実験は、少なくとも2回行われた。
【００９１】
（コロニー形成アッセイ）
コロニー形成アッセイのために、5×106の細胞、例えば、OVCAR-3またはA2780細胞を、100mmのペトリ皿に播種し、一晩付着させた。培地を吸引し、急激に成長する細胞を、様々な濃度のMPLと共に72時間に亘りインキュベートした。この時点で、培地を吸引し、皿をPBSで洗浄し、薬物を含まない培地を各プレートに添加した。培地を、週に2回、3週間に亘って変更した。この後、プレートをPBSで穏やかに洗浄し、細胞を100％エタノールで固定し、濾過したクリスタルバイオレットの0.5％溶液で染色した。50以上の細胞からなるコロニーを、倒立顕微鏡下でカウントした。
【００９２】
（細胞周期分析）
細胞周期に対するMPLの効果を、標準フローサイトメトリー分析プロトコル及び手順を用いて測定した。簡単には、0.7×106百万の細胞を25cm3のフラスコに播種し、一晩接着させ、24または48時間に亘りMPLで処理した。細胞をトリプシン処理で回収し、細胞を培地中に浮遊させてプールした。細胞懸濁液を遠心分離し、PBSで洗浄し、メタノールで固定した。次いで細胞を洗浄し、PBS中のヨウ化プロポジウム及びリボヌクレアーゼA中に室温にて30分間再懸濁させ、フローサイトメトリーで分析した（Becton Dickinson FACSort）。
【００９３】
（ウエスタンブロット分析）
細胞におけるタンパク質の発現は、ウェスタンブロット分析を用いて決定した。指示濃度のMPLで処理した後、細胞溶解物を準備し、cdk2、cdk4、サイクリンA、サイクリンE、PARP-1に対する抗体（1：1000希釈液；Cell Signalling Technology）及びp53に対する抗体（1：200希釈液；Santa Cruz Biotechnology）でプローブした。ゲル上のタンパク質の同等のローディングを、GAPDH抗体を（1：30000希釈液；Sigma-Aldrich）でブロットを再プローブすることにより確認した。
【００９４】
（in vivo実験）
雌のヌードマウス（6週齢）をBiological Resources (University of New South Wales)から購入した。制度的動物倫理は、対象となる、マウスに行われる操作を承認するものである。簡単には、2.5×106対数成長性OVCAR-3細胞を、各マウスの左脇腹にs.c.注射した。動物を週に1回計量する一方で、それらの腫瘍体積は週2回測定した。腫瘍成長を直交径のキャリパー測定により観察し、理論上の腫瘍体積を、式1/2（長さ×幅2）に基づいて算出したが、ここでは幅は二つの直交径測定値のより短い方である。制度的倫理の承認に基づいて、腫瘍体積が500mm3に達する前にマウスを安楽死させた。処置は、マウスを無作為に選んでMPLまたは媒体での処置グループいずれか一つに割り当てた（1グループあたり5乃至6匹）、腫瘍細胞注射の8日後に開始した。MPLをヒドロペルオキシメチルセルロース中に懸濁させ（0.5％ w/v HPMC）、超音波破砕機で滅菌し、腹腔内投与（i.p.）及びチューブによる栄養補給としての経口投与（100μL）のいずれかで一日おきに投与した。
最初のパイロット試験において、医薬は、体重1kgあたり2.5または25mgで週に3回、2週間に亘ってi.p.投与された。
結果に従い、次のグループの動物においては、用量を体重1kgあたり25及び50mgで週に3回に増量した。
最後の（第3の）パイロット研究では、マウスを経口処置した。投与用量は体重1kgあたり50及び100mgで週に3回であった。これら全ての試験において、コントロールグループのマウスには、同量の媒質（0.5％HPMC）を与えた。腫瘍組織学／免疫組織化学的処理を、標準的な手順に従って、ホルマリン固定腫瘍切片上で実施した。
【００９５】
（統計的分析）
全てのデータは、少なくとも2つの独立した実験からの平均±標準誤差（SEM）として報告される。MPL処置グループとコントロールグループとの腫瘍体積の差を、事後Dunnett試験で一元配置分散分析ANOVAを用いて分析した。量的変数は、スチューデントt検定を用いて比較した。統計的有意差は、P＜0.05で定義された。
【００９６】
（結果）
（MPLによる細胞増殖の阻害）
MPLの効果を、OVCAR-3、A2780、及びSKOV-3の卵巣癌細胞株の成長に関して調べた。 SRBアッセイを使用することによって、細胞増殖に対するMPLの効果を調べた。表１によれば、MPLは、6.3、10.0、及び29.3のIC50値で、それぞれ濃度依存的にOVCAR-3、A2780、及びSKOV-3細胞の増殖を抑制した。これらの結果から、卵巣癌細胞株は、MPLの抗増殖効果に対して感受性であることが明らかである。SKOV-3細胞の感受性が最も低かった。MPL-SO2もまた、SRB増殖アッセイを使用し、同様の方法で試験した。MPL-SO2はMPLと同程度に強力であることが判明した。MPL-SO2は、培養液中で成長する癌細胞株の生存率を低下させ、細胞増殖を阻害した。MPL-SO2のIC50値を表１に示す。
細胞増殖に対するMPLの阻害効果を、様々な細胞、例えば、乳癌、前立腺癌、及び中皮腫細胞に対して試験した。得られた結果を表１に示す。更なる結果は、表２に示す。
【００９７】
【表１】
0006483736.tif 000014
【００９８】
【表２Ａ】
0006483736.tif 000015
【表２Ｂ】
0006483736.tif 000016
【００９９】
【表３】
0006483736.tif 000017
【０１００】
【化１１】
0006483736.tif 000018
【０１０１】
【表４】
0006483736.tif 000019
【０１０２】
表３によれば、「MPL-(R)」とは、N-[(1R)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニルベンズアミドを意味し、「MPL-(S)」とは、N-[(1S)-1-シアノ-2-(5-シアノ-2-トリフルオロメチル-フェノキシ)-1-メチル-エチル]-4-トリフルオロメチルスルファニルベンズアミドを意味する。
【０１０３】
表３の結果によれば、AADs 907、1336、1470、及び2224（MPL-(R)）についてのIC50値の比（正常細胞／癌細胞）は、特に高い活性を示す。さらに、AADs 2224（MPL-(R)）及びAAD 1566（MPL-(S)）が同等であることが判明した。(R)-エナンチオマー MPL-(R)は、全く駆虫活性を持たないと予め示されていることに留意されたい。
【０１０４】
簡潔には、MPL及びMPL-SO2を、広く異なる疾病特性を有する広範な癌細胞株に対してin vitro試験した。さらに詳細な研究のためには、ヒト卵巣癌細胞株OVCAR-3及びA2780を選択した。さらに、健常なヒト卵巣表面上皮細胞（HOSE）を、MPL（0、5、10、25、50、及び100μM）の存在下で72時間培養した。細胞生存率を、トリパンブルーアッセイ（図８）を用いて評価した。同様に、健常な上皮細胞、内皮細胞、胚細胞、及び胎児細胞の成長に対するMPLの効果を調査し（図９）、一方で細胞増殖をSRBアッセイを用いて評価した（図１０）。（媒体で処理した）コントロール細胞が100％増殖を表すこととして、MPL処理したグループをコントロールに対するパーセンテージ±SEMで表す。各薬剤濃度について四重に試験し、各試験を少なくとも二回繰り返した。統計的比較のために、各薬剤治療群を、スチューデントt-検定を用いてコントロール群と比較した。濃度依存性薬剤効果を調べるために、分散分析（ANOVA）を使用した。P値は以下の通りである：*＝＜0.05；**＝＜0.01、及び***＝＜0.001、****p＜0.0001。表２に示される結果は、MPLが癌細胞株において高い抗増殖活性を発揮する一方で、正常細胞が受ける影響ははるかに少ないことを明示している。MPL効果が、ニコチン性アセチルコリン受容体、特に、nACHR7サブタイプに媒介されるか否かを確認するために、細胞は、アンタゴニストで予備処理した後にMPLに暴露した（図１１）。
【０１０５】
MPL-SO2について得られた結果もまた示される。MPL-SO2は、親薬物MPLと同様の機序で作用することがわかる。IC50値の範囲は非常に近接しており、このことは、MPL-SO2が、癌細胞増殖の抑制においてMPLと同様に有効であることを示唆している（表２）。
【０１０６】
（MPLによるコロニー形成の阻害）
MPLが、さらに増殖恒常性並びにコロニー確立のための細胞株の能力を阻害するか否かを調査するために、MPLに曝露された細胞のクローン形成活性を調べた。様々な濃度のMPLに対する72時間の曝露後、細胞を洗浄し、次いで、薬物を含まない培地中で２週間に亘りインキュベートした。MPLが、これらの細胞によるコロニー形成を著しく阻害することが判明した。 MPLの濃度が高いほど、クローン形成能力のほぼ完全な喪失をもたらした（図２）。
【０１０７】
薬物曝露及び離脱後の細胞完全性並びに薬物効果から自身を排除する性能に対するMPLの効果を測定するために、細胞を、MPL（0、5、10、25μM）と共に72時間インキュベートし、PBSで洗浄し、寒天プレートに移し、成長培地で培養し、さらに標準的条件下で２週間インキュベートした。次いで、細胞を100％メタノールで固定し、1％クリスタルバイオレットで染色した。コロニー（50より多くの細胞のクラスター）を顕微鏡下で（倍率5倍）で数えた。別々の実験群について数えたコロニーの数を、コントロールに対するパーセンテージとして表す（図１４）。これらの結果は、MPLによるコロニー形成の、濃度依存性阻害を示す。
【０１０８】
（サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼの発現を下方制御することによる、MPLによる細胞周期の停止）
MPLが細胞増殖およびコロニー形成を阻害する機構を調査するために、細胞周期に対するMPLの効果をフローサイトメトリーで検査した。MPLが、細胞周期の進行を阻害することが判明した（図３）。MPLに曝露された細胞の進行は、濃度および時間に依存した方式でG1期に停止された。 G1期における細胞の蓄積に伴い、S及びG2-M期においては細胞が急激に減少した（％）。MPL誘発細胞周期停止に関与する分子メカニズムを研究するために、細胞周期調節タンパク質cdk2、cdk4、サイクリンA、及びEの発現を検査した。MPL処理された細胞は、より低いレベルでcdk2、cdk4、サイクリンA、及びEを発現した（図４）。
【０１０９】
（PARP-1切断の誘導をもたらすサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼの発現を下方制御することによる、MPLによる細胞周期の停止）
MPLが細胞増殖及びコロニー形成を阻害する機構を調査するために、細胞周期に対するMPLの効果を、フローサイトメトリー（FACS）を用いて検査した。MPLが、細胞周期の進行を阻害することが判明した（図２２）。MPLに曝露された細胞においては、細胞周期が、濃度および時間に依存した方式でG1期に停止された。 G1期における細胞の蓄積に伴い、S及びG2-M期においては細胞が急激に減少した（％）。MPL誘発細胞周期停止に関与する分子メカニズムを研究するために、細胞周期調節タンパク質cdk2、cdk4、サイクリンA、及びEの発現を検査した。MPL処理された細胞は、より低いレベルでcdk2、cdk4、サイクリンA、及びEを発現した（図４及び１６）。
【０１１０】
（MPLによるPARP-1切断）
MPL誘導性細胞死が、PARPの切断に関するのか否かを調査するために、PARP-1及び切断されたPARP-1について、MPL処理細胞の溶解物のウェスタンブロット分析を行った。PARP-1の切断は、DNA修復に誘導される生存を妨げることにより、アポトーシスを促進する。PARPは細胞がその生存を維持することを補助することから、PARPの切断は、細胞の分解を促進し、アポトーシスを起こしている細胞のマーカーとして役立つ。図５は、PARPが、MPL処理された細胞内で切断されたことを示している。
【０１１１】
（MPLによる、PARP切断の誘導）
MPL処理されたOVCAR-3及びA2780細胞から調製された細胞溶解物のウェスタンブロット分析により、細胞死を表す、PARPの高度に誘発された切断が示される（図１７）。
17）を誘起示す。
【０１１２】
（MPLによる、細胞ATPレベルの低下）
図１８ａ及び１８ｂに示されるように、MPLによるOVCAR-3またはA2780細胞の処理は、細胞中に見出されるATPレベルの低下を引き起こす。
【０１１３】
（MPLによる自食作用の誘発）
図６は、MPLによる細胞の処理により、MPLがこれらの細胞において自食作用を誘発していることを示唆する小胞の形成がもたらされることを示す。図７は、MPL処理によってADP/ATPの細胞比が低減されることを示すが、これは、細胞の自食作用のもう一つの示唆である。
【０１１４】
（MPLによる、ヌードマウスにおける異種移植片の成長抑制率）
図１９乃至２１は、ヌードマウスにおけるMPLのin vivo試験を示す。OVCAR-3腫瘍を有するマウスを、最初のi.p.、あるいは最後の実験にしたがって経口で処置した。得られた結果により、（i.p.及び経口の両方の）投与用量、特に、50mg/kgの用量の作用が、これらの動物において腫瘍成長を著しく遅延させることが示される。腫瘍組織学により、大規模な領域の腫瘍細胞死が明示された（図２２）。
【０１１５】
細胞増殖の阻害及びコロニー形成の抑制、さらにin vivo結果により、MPLの成長調節効果が示される。MPL干渉が、細胞周期制御タンパク質A及びE2と共にこれらのキナーゼcdk2及びcdk4の発現の低減により、細胞周期の進行と共に示される。健常細胞では、一つの期から別の期への移行は、様々なタンパク質によって十分に制御された規則正しい方法で起こる。サイクリン依存性キナーゼ（CDK）は、細胞周期の特定の時点で活性化され、かくして細胞周期進行において極めて重要な役割を担う、鍵となる制御タンパク質である。これらには、前記周期の異なる時点で異なるサイクリンが必要である。サイクリンA、D、及びEは、細胞周期のG1期及びG1期からS期への移行のために必要とされる。これまでに同定された様々なCDKの中で、CDK2およびCDK4は、G1及びG1-S移行に入るために必須なようである。サイクリンA及びEがCDK2に結合する一方でサイクリンDはCDK4およびCDK6に結合する。癌は、細胞周期に関連した現象であると考えられるいくつかの疾患の一つである。
【０１１６】
図１９乃至２１に示される結果は、雌のヌードマウスにおける皮下腫瘍成長の抑制におけるMPL活性を示す。最初の試験では、腹腔内MPL投与の用量依存活性が示された。25mg/kgの用量が、特に効果的であった。これに基づいて、次の試験は、前と同じ条件下で25及び50mg/kgの用量を用いて行った。50mg/kgの用量は、これらの動物において腫瘍成長の遅延により効果的であった。抗寄生虫剤としては、MPLは、多くの動物モデルにおいて経口で有効であることが判明している。50及び100mg/kg用量のMPLの経口治療活性を試験した。３つの全パイロット試験において、MPLは、0.5％HPMC中に調製され、懸濁液として投与された。これらのin vivo試験からの腫瘍組織の検査により、MPL処置した腫瘍においては各所に大規模な壊死が見られた（図２２）。
【０１１７】
表１及び２に示される通り、観察結果は卵巣癌に限定されず、MPLは、神経膠腫、前立腺癌、乳癌、中皮腫、脂肪肉腫、線維肉腫を含む様々な癌を代表する様々な細胞株におけるin vitro細胞増殖を効果的に抑制する（表１及び２を参照のこと）。
【０１１８】
別の重要な観察点は、化学療法耐性の細胞株に対するMPLの活性である。卵巣化学療法耐性細胞、神経膠腫のテモゾロマイド耐性細胞及び乳癌タモキシフェン耐性細胞は、全てMPL抗増殖作用に対して感受性であった。
【０１１９】
結論として、これらの結果は、癌細胞株においては、MPL、並びにおそらくはその代謝物及び類似体（AADs）が以下の通りであることを示している：
１．細胞増殖を阻害する；
２．MPL誘導阻害は、ニコチンアゴニストもしくはアンタゴニストでの予備処理によっては正にも負にも影響を受けず、このことはかかる作用機序がニコチン受容体仲介性ではないことを示す；
２．コロニー形成を阻害する；
３．細胞周期（G1期）を停止する；
４．細胞周期制御タンパク質（CdK2、CdK4、サイクリンA、サイクリンE）を下方制御する；
５．細胞へのチミジン取込みを遮断し、これによりDNA合成を阻害する；
６．細胞ATPレベルを低減する；
７．LC3B-IのLC3B-IIへの変換によって確認される通り、進行性自食を引き起こす；
８．自食は、卵巣癌細胞株及び神経膠腫癌細胞株のいずれにおいても、顕微鏡観察によって明らかであった；
９．MPLはまた、PARP-1の切断を誘発し、よって細胞死を誘発する；
１０．このことは、皮下腫瘍を有するヌードマウスにおける腫瘍の、用量依存性の抑制を示すin vivoデータによって確認される；
１１．腹腔内及び経口のいずれの投与経路も有効であった。
さらにまた、MPLは、いくつかの標準的な化学療法に耐性である細胞の増殖も阻害する。
【０１２０】
（議論）
表１に示されるように、MPLを、HUVECについても試験した。IC50値が、OVCAR-3におけるIC50値の約10倍であることが判明し、このことは、非癌細胞に対してよりも癌細胞に対して、MPLがより高い細胞毒性効力を有することを反映している。
コロニー形成アッセイにおいて、MPLは、寒天プレート上で成長する卵巣癌細胞株によるコロニー形成を濃度依存的に抑制し、従って、癌細胞の成長を阻害するためのMPLの効力をさらに実証する。
【０１２１】
さらに、[OVCAR-3（変異）、SKOV-3（ヌル）、及びA2780（野生型）]細胞のp53状態とは無関係に、MPLはその抗癌効果を（様々な効力ではあるが）発揮することが判明している。このことは、MPLが、上皮性卵巣癌においても、その腫瘍のp53状態とは無関係に有効であろうことを示唆している。広範な癌においてp53突然変異が非常によく見られることから、この発見は重要でありうる。
MPLで示される効果は、卵巣癌に加えて、他の種類の癌に拡張できることを理解されたい。
【０１２２】
哺乳類細胞周期は、Cdksの逐次的活性化によって支配される。G1期を経てS期に至る進行は、サイクリンA及びサイクリンEと複合体を成すCdk2により調節される。したがって、これら制御タンパク質の発現を抑制することにより、細胞周期の進行が妨害される。
【０１２３】
細胞増殖及びコロニー形成の阻害は、MPLの濃度に依存する。MPLが細胞周期進行を中断する機構により、おそらくは細胞周期調節タンパク質E及びA、並びにサイクリン依存性キナーゼCdk4及びCdk2が下方制御されており、これがG1停止を引き起こしている。G1停止の結果として、S及びG2-M期における経時的な細胞の劇的減少によって示されるように、細胞は、細胞周期の次の段階に進行しない。媒体処置グループのG2-M期における細胞の割合（％）は、25μMのMPLで処置したグループに比べて3倍以上高かった。
【０１２４】
さらにまた、MPLで処理した癌細胞株における自食作用の証拠は、G0期の細胞周期停止を経て、細胞が不可逆的に細胞周期から出ていることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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