(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１からなることを特徴とするＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドをコーディングするコード遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載のＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの、脂肪細胞分解用薬、ダイエット用薬または血糖降下薬に対する調製での応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物化学および分子生物学分野に関し、具体的に、Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド、そのコード遺伝子およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、人類の健康の最大の敵の一つとして、１つの独立の疾患でもあり、ＩＩ型糖尿病、血管心臓障害、高血圧、脳卒および複数の癌の致病要因でもある。そのため、肥満は、病気を引き起こす所謂十大脅威の一つとして世界保健機関に定められ、無視できないグローバル問題である。報道によると、全世界で毎年約１８００万人が糖尿病や高血圧によって引き起こされた脳心血管病で死亡する。さらに、肥満は、糖尿病や高血圧の肝心な致病要因である。肥満症は、人類の健康に深刻な危害を及ぼし、社会に巨大な損失をもたらす。報道によると、２００３年には、我が国の肥満や糖尿病などの慢性疾患による支出が１.２兆（１兆は、１億の１万倍）元に達し、ＧＤＰの１０.３%を占めている。その成長スピードは、既に国内総生産の増加率を上回っている。現在、国内のダイエット関連市場の需要範囲が非常に広くて、２０１０年のダイエット用商品の消費額が６００億円に達したうえで、肥満症とは直接あるいは間接関係を有する疾患、例えば、糖尿病、血管心臓障害などによる損失はさらに予想できない。現在、肥満症や糖尿病の治療に用いられる薬であるフェノフィブラートとロシグリタゾンが血脂および血糖を低下させる役割を果たすが、それらの長期間の服用により、人体に深刻な副作用をもたらす。例えば、インスリン抵抗性および３つの致病効果（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ, ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ, ｔｅｒａｔｏｅｅｎｅｓｉｓ）等が存在する。しがたって、臨床上での肥満症および糖尿病の治療には、安全、効果的且つ安価な新薬が至急に求められている。
【０００３】
レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）は、脂肪組織から分泌されたホルモン類物質であり、６種のＬｅｐｔｉｎ受容体を介して機体の脂肪代謝および食欲調節に関与する。本世紀初期に、レプチンは、発見され、さらに肥満ネズミモデル実験に成功して、科学界の騒ぎを起こした。それは、バイオ技術で世界中の数億の肥満患者向けのダイエット新薬が発見されたと予示する。１９９９年に、科学者の研究により、人間レプチン蛋白の１１６−１３０番目のアミノ酸組織のポリペプチド断片が明らかな脂肪分解活性を有することは発見された。その後、アメリカの科学者が率先して初めてのレプチン蛋白の人体実験を行ったが、その結果、７３名の被験肥満患者のうち、ほとんどの患者のダイエット効果が明らかではなく、２名の患者のみが２４週間以内に３５ポンドの体重減少を達成した。それは、野生型人間レプチン蛋白だけでは理想的なダイエット効果を獲得するのが困難であることを表明した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１目的は、非常に良好な脂肪細胞分解活性を有する、Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドを提供することにある。
【０００５】
本発明のＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１に示される。
【０００６】
本発明の第２目的は、上記Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドのコード遺伝子を提供することにある。
【０００７】
本発明の第３目的は、上記Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの、脂肪細胞分解用薬、ダイエット用薬または血糖降下薬に対する調製での応用を提供することにある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明では、人間Ｌｅｐｔｉｎのアミノ酸配列に対して修飾を行うことにより、その脂肪分解の効率を高める。化学方法を利用してＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドをそれぞれ合成して、蛋白質の空間構造からその活性へ与える影響をできるだけ低減することにより、脂肪細胞に対する標的性および分解作用を高める。実際の結果によると、本発明のＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの脂肪細胞分解活性は、陽性照合-人間レプチン蛋白（Ｈ-ＬＥＰ）および市販薬であるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ, Ｒｏｓ）よりも明らかに優れており、その脂肪低減活性が明らかな濃度依存性および細胞分化期の依存性を有し、脂肪細胞の分化前期（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）、分化期（Ｄ０-Ｄ２）および熟脂肪細胞期（Ｄ９）の３つの期間の何れにおいても明らかな細胞分裂（Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ）作用を有し、さらにその効果が２つの陽性照合（Ｈ-ＬＥＰおよびロシグリタゾン）よりも著しく優れているため、新型の効果的で安価なダイエット用および血糖降下薬の開発に関して候補標的を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの設計を示す。Ａ：人間Ｌｅｐｔｉｎ配列をテンプレートとする蛋白質三次元構造図のシミュレーション構築。Ｂ：人間Ｌｅｐｔｉｎ ３番の発現領域（上）とＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド（下）とのアミノ酸配列の照合および機能パーティション。*：突然変異部位。
【図２】Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの活性分析を示す。３Ｔ３-Ｌ１前脂肪細胞の脂肪低減活性分析（ＭＴＴ検出）。ＰＥＰ-Ｄ：Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド、その後の１０-６、１０-９、１０-１１は、Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの濃度が１０-６Ｍ、１０-９Ｍ、１０-１１Ｍであることをそれぞれ指す。Ｈ-ＬＥＰ：人間レプチン蛋白（陽性照合１）、１０-９が１０-９Ｍを指す。Ｒｏｓ：ロシグリタゾンＲｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ（陽性照合２）。Ｃｏｎｔｒｏｌ：陰性照合。Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：誘導分化前期。Ｄ０-Ｄ２：誘導分化の第０-２日（分化初期）。Ｄ９：誘導分化の第９日（熟脂肪細胞期）。統計分析：ａ, 陽性照合（Ｈ-ＬＥＰ/Ｒｏｓ）ｖｓ陰性照合(Ｃｏｎｔｒｏｌ)、陽性照合の脂肪細胞分裂活性が陰性照合よりも明らかに優れており、Ｐ<０.０５。ｂ, ＰＥＰ-Ｄ ｖｓ. Ｈ-ＬＥＰ、ＰＥＰ-Ｄの脂肪細胞分裂活性がＨ-ＬＥＰよりも明らかに優れており、 Ｐ<０.０５。ｃ, ＰＥＰ-Ｄ ｖｓ. Ｒｏｓ、ＰＥＰ-Ｄの脂肪細胞分裂活性がＲｏｓよりも明らかに優れており、 Ｐ<０.０５、 *, Ｐ<０.０１。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下の実施例は、本発明の更なる説明であり、本発明の制限にならない。
【実施例】
【００１１】
実施例１：
１. 材料および方法
１.１ Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの設計と合成
人間Ｌｅｐｔｉｎアミノ酸配列をテンプレートとして、突然変異部位の親水性/疎水性質変化状況に応じて、その機能領域においてＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドを１本設計する。そのアミノ酸配列は、ＳＴＥＶＶＡＬＤＧＬＱＧＳＬＱＴＭＬＬＱＬＥＹＳ（詳細は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１に示される）である。Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドは、上海生工生物工程有限会社によって合成され、ＨＰＬＣ検出、化学合成を経たＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの濃度>９５.５１%、後続の活性分析の要求を満たす。質量分析法により、合成されたＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの正確性を検出し、そのアミノ酸配列がＳＴＥＶＶＡＬＤＧＬＱＧＳＬＱＴＭＬＬＱＬＥＹＳ（詳細は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１に示される）であることを確認する。
【００１２】
１.２ レプチン活性ペプチドの体外脂肪低減活性分析
３Ｔ３-Ｌ１前脂肪細胞系をモデルとし、合成されたＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの脂肪分解活性を細胞レベルで分析する。具体的な操作は、下記のようになる。
【００１３】
１.２.１ 実験設計
（１）グループ分け：
ａ: 分化前期（Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ）、
ｂ: 分化初期Ｄ０-Ｄ２（誘導分化第０-２日）、
ｃ: 熟脂肪細胞Ｄ９（誘導分化第９日）、
（２）レプチンポリペプチドおよび照合
ａ. Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド（ＰＥＰ-Ｄ）：清浄水で１０-３Ｍに希釈し、-２０℃で保存する。実験開始後、作動濃度は、１０-６Ｍ、１０-９Ｍ、１０-１１Ｍの３つの濃度段階である。
ｂ. 陽性照合１：Ｈ-ＬＥＰ、人間レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）蛋白（１０２２１-ＨＮＡＥ、北京義翹神州生物技術有限会社）を再編し、清浄水により１０-６Ｍまで希釈し、-２０℃で保存する。実験開始後、作動濃度は、１０-９Ｍである。
ｃ. 陽性照合２：Ｒｏｓ、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ, Ｒ２４０８, Ｓｉｇｍａ）、ＤＭＳＯにより濃度が２５１８μＭの貯蔵液まで希釈し、-２０℃で保存する。実験開始後、細胞培養液により０.５μＭの作動液まで希釈する。
ｄ. 陰性照合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）：等量のＰＢＳ
（３）細胞分化誘導液
ａ. 細胞分化誘導液Ｉ：０.５μＭ ＩＢＭＸ（３-Ｉｓｏｂｕｔｙｌ-１-ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ, Ｉ５８７９, Ｓｉｇｍａ）、１μＭ デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ, Ｄ４９０２, Ｓｉｇｍａ）、１６７ｎＭ インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ, Ｉ５５００, Ｓｉｇｍａ）を含有する完全培養基。
ｂ. 細胞分化誘導液ＩＩ：１６７ｎＭ インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ, Ｉ５５００, Ｓｉｇｍａ）を含有する完全培養基。
【００１４】
１.２.２ ３Ｔ３-Ｌ１前脂肪細胞培養
（１）完全培養液：１０% ＦＢＳ（ウシ胎児血清ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）のＤＭＥＭ培養基-ＤＭＥＭ ４５ｍｌ＋ＦＢＳ ５ ｍｌ＋双抗 ０.５〜０.８ｍｌ（ＤＭＥＭ, Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０２４３.０１Ｂ ５００ｍｌ高グルコース、中でＬ-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００９１-１４８、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ-Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ, Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５１４０-１２２ １００×を含む）。
（２）継代：旧液を吸ってから、カルシウム・マグネシウムなしのＰＢＳで２遍洗い、０.５ｍｌ/Ｔ２５ ０.２５%のパンクレアチンを加入し、２ｍｉｎ（細胞の大半が浮かぶまで）消化し、完全培養液により消化を中止する。遠心せず、１：３で新たな２５ｃｍ２培養瓶（Ｔ２５）に直接接種される。３〜４ｈ後、液体交換し、約７０%まで成長すると直ちに継代する。
【００１５】
１.２.３ ３Ｔ３-Ｌ１前脂肪細胞が熟脂肪細胞に誘導分化される
（１）３Ｔ３-Ｌ１前脂肪細胞は、ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄ ９６孔板（合わせて３つの板、それぞれａ板、ｂ板およびｃ板に接種）に接種され、接種密度が４５００個の細胞/孔である。マークを付けてから、３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて静置培養する。各板の各サンプルが３つの繰り返しを有し、全実験は、３回繰り返される。
（２）細胞が１００%まで合流した後、引き続き４８時間（細胞を成長周期から退出させ、誘導分化を開始させる）培養する。
（３）細胞が成長周期から退出した後、
ａ. 分化前期：
ｉ. ａ板を取り出して、Ｄへリックス領域での突然変異を有する異なる量のレプチン活性ペプチド（ＰＥＰ-Ｄ）をそれぞれ加入してその作動濃度を１０-６Ｍ、１０-９Ｍ、１０-１１Ｍの３つの濃度段階にさせ、２つの陽性照合、陰性照合（ＰＢＳ）およびブランク照合（サンプルごとに３つの重複孔を設置）を設置し、３７℃且つ５%ＣＯ２の培養箱に置いて引き続き静置培養する。
ｉｉ. ４５時間（即ち、薬物処理の終了前の３時間）培養すると、ａ板を取り出してＭＴＴ（分化前期）を測定する。具体的な操作は、下記のようになる。孔ごとに５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０ μＬを加入し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて３時間静置培養する。次に、孔における培養液を吸って捨て、孔ごとに１５０ μＬ ＤＭＳＯを加入し、１０ ｍｉｎ水平振動し、マイクロプレートリーダーにより４９２ ｎｍでの吸光値を検出して、成長曲線を描く。
ｂ. 分化初期（Ｄ０-Ｄ２）：
ｉ. ｂ板を取り出して分化誘導液Ｉ（Ｄ０）を加入してから、Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド（ＰＥＰ-Ｄ）、２つの陽性照合、陰性照合（ＰＢＳ）をそれぞれ加入し、ブランク照合（サンプルごとに３つの重複孔を設置）も設置し、５%ＣＯ２且つ３７℃の培養箱に置いて静置培養する。
ｉｉ.４５時間（即ち、薬物処理の終了前の３時間）培養すると、ｂ板を取り出してＭＴＴ（脂肪細胞分化初期、Ｄ０-Ｄ２）を測定する。具体的な操作は、下記のようになる。孔ごとに５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０ μＬを加入し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて３時間静置培養する。次に、孔における培養液を吸って捨て、孔ごとに１５０ μＬ ＤＭＳＯを加入し、１０ ｍｉｎ水平振動し、マイクロプレートリーダーにより４９２ ｎｍでの吸光値を検出して、成長曲線を描く。
ｃ. 熟脂肪細胞期（Ｄ９）：
ｉ. ｃ板を取り出して孔ごとに分化誘導液Ｉ（Ｄ０）を加入し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて４８時間静置培養する。
ｉｉ. 分化誘導液Ｉで４８時間（Ｄ２）処理した後、ｃ板を取り出して孔ごとに分化誘導液ＩＩを加入し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて静置培養する。
ｉｉｉ. 分化誘導液ＩＩで４８時間（Ｄ４）処理した後、ｃ板を取り出して正常の完全培養基に変更し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて静置培養する。
ｉｖ. 正常の完全培養基に変更して４８時間（Ｄ６）培養した後、ｃ板を取り出して液体交換し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて２４時間静置培養する。
ｖ.Ｄ７（第７日）まで培養すると、ｃ板を取り出して液体交換（完全培養基）してから、Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド（ＰＥＰ-Ｄ）、２つの陽性照合、陰性照合（ＰＢＳ）をそれぞれ加入し、ブランク照合（サンプルごとに３つの重複孔を設置）も設置し、５% ＣＯ２且つ３７℃の培養箱に置いて引き続き４８時間静置培養する。
ｖｉ. ４５時間（即ち、薬物処理の終了前の３時間）薬物処理すると、ｃ板を取り出してＭＴＴ（熟脂肪細胞期、Ｄ９）を測定する。具体的な操作は、下記のようになる。孔ごとに５ｍｇ/ｍＬのＭＴＴ溶液２０ μＬを加入し、引き続き３７℃且つ５% ＣＯ２の培養箱に置いて３時間静置培養する。次に、孔における培養液を吸って捨て、孔ごとに１５０ μＬ ＤＭＳＯを加入し、１０ ｍｉｎ水平振動し、マイクロプレートリーダーにより４９２ ｎｍでの吸光値を検出して、成長曲線を描く。 
【００１６】
１.２.４ 統計分析
ＭＴＴ検出データ用ＳＰＳＳ １７.０ソフトウェアにより単要因分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行なう。
【００１７】
２. 結果
２.１ Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの設計および合成
我々は、Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）活性ペプチドを１本設計した。それを人間Ｌｅｐｔｉｎに比較すると、それは、６つのアミノ酸突然変異部位があり、ポリペプチド配列がＳＴＥＶＶＡＬＤＧＬＱＧＳＬＱＴＭＬＬＱＬＥＹＳ（分子量が２５９５.０５であり、詳細は、図１を参照）である。ＨＰＬＣ検出によると、化学合成されたレプチンポリペプチドの濃度>９５.５１%、後続の活性分析の要求を満たす。
【００１８】
２.２ ＭＴＴ脂肪低減活性分析
細胞活性分析の結果によると、合成されたＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド（ＰＥＰ-Ｄ）の脂肪細胞分解活性が３つの細胞分化期（前脂肪細胞期、分化初期および熟脂肪細胞期）の何れにおいても陽性照合-人間レプチン蛋白（Ｈ-ＬＥＰ）および市販薬であるロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ, Ｒｏｓ）より明らかに優れており、且つＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの脂肪低減活性が明らかな濃度依存性を有することが分かる。全体的に見ると、１０-９Ｍ濃度での脂肪低減効果が一番良好になる（図２）。
【００１９】
（付記）
（付記１）
Ｄへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドであって、
前記レプチン活性ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.１に示されることを特徴とするＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチド。
【００２０】
（付記２）
付記１に記載のＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドをコーディングするコード遺伝子。
【００２１】
（付記３）
付記１に記載のＤへリックス領域での突然変異を有するレプチン活性ペプチドの、脂肪細胞分解用薬、ダイエット用薬または血糖降下薬に対する調製での応用。
【図１】
0006486482.tif 000002
【図２】
0006486482.tif 000003
【配列表】
0006486482000001.app