(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
交互に配置及び出現するいくつかの種検出領域及びいくつかの結合配列領域を含み、前記種検出領域は、その個数が少なくとも２つであり、且つ異なる種属を検出するためのものであり、前記結合配列領域は、検出すべき種配列とは異なる任意の配列であり、
前記種検出領域はプライマー配列領域と特異的認識領域とを含み、
前記プライマー配列領域は、５ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＤＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＤＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＤＮＡ、ＩＴＳ、又はＨＥＶコンセンサスプライマー配列であり、前記特異的認識領域の上流に位置するのは上流プライマー配列領域であり、前記特異的認識領域の下流に位置するのは下流プライマー配列領域であり、
前記プライマー配列領域は、２種又は２種以上の異なる微生物のコンセンサスプライマー配列領域を含み、
前記特異的認識領域は、人為的に設計され合成された１組の配列であり、
前記特異的認識領域の配列は、検出すべき種の中のゲノムＤＮＡ配列と相同性がない、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
【請求項２】
前記プライマー配列領域は、配列表の配列番号１〜４２に示す配列を有し、前記配列表中のプライマー配列の記載は、いずれも５’末端から始まり、３’末端で終わる、請求項１に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
【請求項３】
前記種検出領域の個数は増やすことができ、異なる種属の種検出領域相互間の位置は互いに入れ替え可能である、請求項１に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子。
【請求項４】
請求項１に記載の人工外来性参照分子を合成し、検出すべきサンプル核酸を精製抽出し、既知量の外来性参照分子を、検出すべきサンプル核酸に加える工程１、
十分に混和した後、検出を要する種属の数に応じて相応の数に等分し、各々に試薬キットをそれぞれ使用してＰＣＲ増幅を行うとともに、後続の塩基配列解析、酵素切断又は他のＤＮＡ配列解析を行う工程２、
個々の種の、定量又は相対定量した解析結果は、人工外来性参照分子の検出量を基準とし、各種類の微生物の、該人工外来性参照分子に対する相対量を求め、データの標準化を行う工程３、
種間の標準化されたデータを更に互いに比較することにより、種間の相対的種類及び存在比のデータを得ることができる工程４、
を備える、請求項１に記載の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の検出及び解析技術の分野に関し、特に、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物はウイルス、細菌、真菌等に関連し、種類が非常に多く且つあらゆるところに存在し、環境中や人体表面、人体の各内部空間の表面だけでなく、器官内にまで大量の微生物が存在している。人類の健康にとって、微生物は有害微生物と有益微生物とに分けることができる。多くの微生物の感染は一定の条件下で疾病につながるが、人体の健康バランスを維持するのに不可欠な要因となっている有益な微生物もある。生命科学研究が進歩するにつれて、研究者は、人体の特定の部位に入り交じって付随し群生する微生物の間には、相対的に安定した種類があり、しかも、一定の相対的比率を呈することに気付いた。微生物間の種類と相対存在比の変化は人体の健康に影響することがあり、ある状況では、主要な病原因子である場合さえあり、同時に、微生物間の相互の影響も、同じ種の微生物だけが相互に影響するのではなく、異なる種の微生物の間（例えば細菌とウイルスの間、細菌と真菌の間、ウイルスと真菌の間等）にも相互の影響が存在することを示す研究結果が増えてきており、ある条件下では、まさに、疾病の発生に至る原因となっている。このため、科学者たちは近年、微生物群を、相互に影響する１つの有機体として系統的に研究することをますます重視するようになっており、微生物叢学研究（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍ）と呼ばれている。
【０００３】
大規模塩基配列解析技術が生まれる以前、微生物の間の鑑定分類は主に、伝統的な形態、表現型、生理生化学的分類に依存しており、これらの技術は、大量に大規模な検出を行うのが困難であり、しかも、時間と手間がかかり、分類や定量化が不正確であった。分子生物学の急速な発展に伴い、現在では、大規模塩基配列解析がこの面の問題をうまく解決している。大規模塩基配列解析の原理は主に、微生物の遺伝子配列の特徴に基づいて実現されたものである。
【０００４】
同じ種属の微生物間の遺伝子配列には、進化の過程において基本的に変化しないか又は変異の度合いが小さい保存的な配列領域がある一方、種類の間の差異が表れる可変的な配列領域もある。有核生物においては、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及び対応するコード化遺伝子リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が良い領域となっており、２種類の配列領域を同時に含み、しかも長さと大きさが適しており、従来技術の枠組みでの配列解析に適合している。現在比較例多く使用されているものには、５ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ／ｒＤＮＡ、ＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅ、内部転写スペーサー領域）等の領域の配列がある。具体的な原理は、これらの保存的領域に基づいてコンセンサスプライマーを設計することにより、採集したサンプル中の同一の種属の全ての微生物断片を増幅し、これらの断片に対する塩基配列解析を行えば、２つの保守的コンセンサスプライマーの間の可変領域の遺伝子配列を検出することができ、これらの可変領域の配列の差異を解析すれば微生物についての分類を実現することができる、というものである。異なる種類の微生物の塩基配列解析のリード数（ｒｅａｄｓ）を検出すれば、微生物間の相対存在比を知ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
異なる種属の微生物間の遺伝子配列は差異が比較的大きく、塩基配列解析の検出に用いるのに適した保存的領域及びその配列も、しばしば異なる。そして、異なる遺伝子配列及び増幅する断片の長さは、増幅反応の条件を制約する。このため、現在比較的一般的なやり方は、同じコンセンサスプライマーを有する同一種属の微生物に対し、増幅試薬キットを設計し、増幅及び塩基配列解析検出を行うというものである。コンセンサスプライマーが異なる微生物については、各々単独で増幅及び塩基配列解析を行うが、異なるバッチの増幅反応と塩基配列解析には、バッチ間の増幅効率及び他の影響因子の差異が存在しており、このことが、微生物の種類と存在比の検出が同じ種属の間でしか行えず、同一の空間領域に同時に定住している異なる属の微生物の間では比較を行うことができないことにつながっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の問題に対し、本発明は人工外来性参照分子を提供し、該配列は、２種又は２種以上の異なる微生物のコンセンサスプライマー配列領域を同時に含むことができ、且つ異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための、人為的に認識可能な特異的配列を含む。
【０００７】
本発明の上記目的を果たすため、本発明は、交互に配置及び出現するいくつかの種検出領域及びいくつかの結合配列領域を含み、前記種検出領域は、その個数が少なくとも２つであり、且つ異なる種属を検出するためのものであり、前記結合配列領域は、検出すべき種配列とは異なる任意の配列である、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子を提供する。
【０００８】
前記種検出領域はプライマー配列領域と特異的認識領域とを含み、前記特異的認識領域の上流に位置するのは上流プライマー配列領域であり、前記特異的認識領域の下流に位置するのは下流プライマー配列領域である。
【０００９】
前記プライマー配列領域は、配列表に示す配列を有し、前記配列表中のプライマー配列の記載は、いずれも５’末端から始まり、３’末端で終わる。
【００１０】
前記特異的認識領域は、人為的に設計され合成された１組の配列であり、設計者は該配列の配列情報を明確に知っており、該配列の長さは、検出すべき種の対応する特徴検出配列の長さを模倣したものであり、前記特異的認識領域の配列は、検出すべき種の中のゲノムＤＮＡ配列と相同性がなく、顕著な特異的差異が存在する。
【００１１】
前記種検出領域の個数は増やすことができ、異なる種属の種検出領域相互間の位置は互いに入れ替え可能であり、該種検出領域の種属も必要に応じて入れ替えることができる。
【００１２】
本発明は、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の調製方法を更に提供し、具体的な工程は次の通りである。
【００１３】
配列表に添付された各領域の代表的な上下流プライマー配列を選択し、上下流配列の間に、任意に配列されたＡＧＣＴ塩基配列を設計し、得られた断片（上下流プライマーを含む）の長さは、検出すべき種の配列の平均長さであり、検出すべき種の配列を模倣するが、上下流プライマーは除き、その配列の配列組み合わせは、検出すべき種の配列と相同であってはならない工程１。
【００１４】
該断片の後に結合配列領域を設計し、結合配列領域は任意の長さの配列の断片でよく、その特徴は、検出すべき種の配列と相同であってはならない工程２。
【００１５】
再び上記工程１及び工程２の方法により、配列表に添付された各領域から、もう１組の代表的な上下流プライマー配列を選択し、上下流配列の間に配列断片を設計し、該断片は、人工外来性参照分子の他の部分配列と相同であってはならない工程３。
【００１６】
設計された配列に基づき、長断片ＤＮＡ合成法を用いて全配列合成を行い：合成遺伝子のヌクレオチドＡＧＣＴを原料とし、ホスホロアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチド鎖を合成し、全断片酵素促進結合法又は酵素促進充填法を引き続き用い、オリゴヌクレオチド鎖の断片を結合させて組み立てることにより、設計された人工外来性参照分子全体を得ることができる工程４。
【００１７】
本発明は、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の使用方法であって、具体的な工程は次の通りである。
【００１８】
人工外来性参照分子を合成し、検出すべきサンプル核酸を精製抽出し、既知量の外来性参照分子を、検出すべきサンプル核酸に加える工程１。
【００１９】
十分に混和した後、検出を要する種属の数に応じて相応の数に等分し、各々に試薬キットをそれぞれ使用してＰＣＲ増幅を行うとともに、後続の塩基配列解析、酵素切断又は他のＤＮＡ配列解析を行うステップ２。
【００２０】
個々の種の、定量又は相対定量した解析結果は、人工外来性参照分子の検出量を基準とし、該人工外来性参照分子に対する各種類の微生物の相対量を求め、データの標準化を行う工程３。
【００２１】
種間の標準化されたデータを更に互いに比較することで、種間の相対的種類と存在比のデータを得ることができる工程４。
【発明の効果】
【００２２】
従来技術と比べた本発明の有益な効果。
本発明が提供する、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子は、人工的に合成した配列であり、該配列は、２種又は２種以上の異なる種属の微生物のコンセンサスプライマー配列領域を同時に含むことができ、且つ人為的に認識可能な特異的配列を含む。この外来性の人工的に合成された遺伝子分子断片を、既知且つ特定の量でサンプル核酸サンプルに加え、検出を要する種属の数に応じて相応の数に分け、各々について、後続の特定の増幅をそれぞれ行う。前記人工外来性参照分子は、各々の異なる種属の試薬キットにおいて増幅され、個々の増幅反応における異なる種属の微生物の間の種類と相対存在比の比較に関与することができる。この人工外来性参照分子の検出量を参照とすれば、異なる種属の微生物の間の相対存在比を更に比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較する人工外来性参照分子の構造概略図。
【図２】本発明の第３の実施例における、細菌と真菌との間の種類と存在比を比較する人工外来性参照分子の構造概略図。
【図３】本発明の第３の実施例における、細菌の種類と相対存在比の検出結果。
【図４】本発明の第３の実施例における、真菌の種類と相対存在比の検出結果。
【図５】本発明の第３の実施例における、データ標準化後の検出結果。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、具体的な実施例を参照しながら、本発明について更に詳しく説明する。
【００２５】
実施例１。
図１を参照すると、本発明は、交互に配置及び出現するいくつかの種検出領域及びいくつかの結合配列領域を含み、前記種検出領域は３個であり、且つ異なる種検出領域であり、それぞれ第１種検出領域Ｉ、第２種検出領域ＩＩ、及び第３種検出領域ＩＩＩであり、第１種検出領域Ｉと第２種検出領域ＩＩとの間に位置する結合配列領域は、第１の結合配列領域ａであり、第２種検出領域ＩＩと第３種検出領域ＩＩＩとの間に位置する結合配列領域は、第２の結合配列領域ｂであり、前記第１の結合配列領域ａと第２の結合配列領域ｂは、検出すべき種配列とは異なる任意の配列である、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子を提供する。
【００２６】
前記第１種検出領域Ｉは、１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマー配列領域及び第１の特異的認識領域Ｄを含み、第１の特異的認識領域Ｄの上流に位置するのは１６Ｓ  ｒＤＮＡ上流プライマー配列領域Ａ１であり、第１の特異的認識領域Ｄの下流に位置するのは１６Ｓ  ｒＤＮＡ下流プライマー配列領域Ａ２である。
【００２７】
前記第２種検出領域ＩＩは、１８Ｓ  ｒＤＮＡプライマー配列領域及び第２の特異的認識領域Ｅを含み、第２の特異的認識領域Ｅの上流に位置するのは１８Ｓ  ｒＤＮＡ上流プライマー配列領域Ｂ１であり、第２の特異的認識領域Ｅの下流に位置するのは１８Ｓ  ｒＤＮＡ下流プライマー配列領域Ｂ２である。
【００２８】
前記第３種検出領域ＩＩＩは拡張予備領域であり、細菌、真菌を除くプライマー配列領域と第３の特異的認識領域Ｆと、を含み、第３の特異的認識領域Ｆの上流に位置するのは、細菌、真菌を除く上流プライマー配列領域Ｃ１であり、第３の特異的認識領域Ｆの下流に位置するのは、細菌、真菌を除く下流プライマー配列領域Ｃ２である。
【００２９】
前記１６Ｓ  ｒＤＮＡプライマー配列領域、１８Ｓ  ｒＤＮＡプライマー配列領域、及び細菌、真菌を除くプライマー配列領域は、配列表に示す配列を有する。
【００３０】
前記第１の特異的認識領域Ｄ、第２の特異的認識領域Ｅ、及び第３の特異的認識領域Ｆはそれぞれ、人為的に設計され合成された１組の配列であり、設計者は該配列の配列情報を明確に知っており、該配列の長さは、対応する検出すべき種の特徴検出配列長さを模倣し、具体的には、１６Ｓ  ｒＤＮＡは概ね１５００個のヌクレオチドを含み、その中で、いくつかの可変領域セグメントに分けられ、個々のセグメントは約３００ｂｐであり、１８Ｓ  ｒＤＮＡは概ね１９００個のヌクレオチドを含み、同様に、いくつかの可変領域セグメントに分けることができ、個々のセグメントは約３００ｂｐであり、前記第１の特異的認識領域Ｄ、第２の特異的認識領域Ｅ、及び第３の特異的認識領域Ｆの配列は、検出すべき種の中のゲノムＤＮＡ配列と相同性がなく、顕著な特異的差異が存在する。
【００３１】
本発明は、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の調製方法であって、具体的な工程は次の通りである。
【００３２】
配列表に添付された各領域の代表的な上下流プライマー配列を選択し、上下流配列の間に、任意に配列されたＡＧＣＴ塩基配列を設計し、得られた断片（上下流プライマーを含む）の長さは、検出すべき種の配列の平均長さであり、検出すべき種の配列を模倣するが、上下流プライマーは除き、その配列の配列組み合わせは、検出すべき種の配列と相同であってはならない工程１。
【００３３】
該断片の後に結合配列領域を設計し、結合配列領域は任意の長さの配列の断片であってよく、その特徴は、検出すべき種の配列と相同であってはならないことである工程２。
【００３４】
再び上記工程１と工程２の方法により、配列表に添付された各領域から、もう１組の代表的な上下流プライマー配列を選択し、上下流配列の間に配列断片を設計し、該断片は、人工外来性参照分子の他の部分配列と相同であってはならない工程３。
【００３５】
設計された配列に基づき、長断片ＤＮＡ合成法を用いて全配列合成を行い：合成遺伝子のヌクレオチドＡＧＣＴを原料とし、ホスホロアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチド鎖を合成し、全断片酵素促進結合法又は酵素促進充填法を引き続き用い、オリゴヌクレオチド鎖の断片を結合させて組み立てれば、設計された人工外来性参照分子全体を得ることができる工程４。
【００３６】
従来の調製合成方法は多く、上記の調製方法に限定されないが、本発明の人工外来性参照分子に調製することができる方法でさえあればよい。
【００３７】
前記異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較する人工外来性参照分子の使用方法であって、具体的なステップは次の通りである。
【００３８】
人工外来性参照分子を合成し、従来のＤＮＡ精製試薬キットを用いて、検出すべきサンプル核酸を精製抽出し、既知量の外来性参照分子（例えば５ｎＭ、適切な量が分かりさえすればよい）を、検出すべきサンプル核酸に加える工程１。
【００３９】
十分に混和した後、検出を要する種属の数に応じて相応の数に等分し、各々に専用試薬キット（従来の市販試薬）をそれぞれ使用し、各々の固定された反応ステップによりＰＣＲ増幅を行い、後続の塩基配列解析、酵素切断配列部位解析を行う工程２。前記人工外来性参照分子は、各々の異なる種属の試薬キットにおいて増幅され、個々の増幅反応における異なる種属の微生物の間の種類と相対存在比の比較に関与することができる。
【００４０】
個々の種の、定量又は相対定量した解析結果は、人工外来性参照分子の検出量を基準とし、該人工外来性参照分子に対する各種類の微生物の相対量を求め、データの標準化を行う工程３。
【００４１】
種間の標準化されたデータを更に互いに比較することで、種間の相対的種類と存在比のデータを得ることができる工程４。
【００４２】
細菌と真菌は２つの主要なタイプのありふれた微生物であり、進化上、比較的一致した保存的配列を有する。細菌と真菌に対し、ウイルスの配列種類はより複雑であり、ＲＮＡウイルスとＤＮＡウイルスがある。同じ種属のウイルスの間で、あるものは、細菌や真菌に類似した保存的領域−可変領域−保存的領域という構造を備えており、あるものは、このような高度に保存的な配列を備えておらず、本発明において設計された人工外来性参照分子を使用すれば、前者の、理想的な遺伝子組成構造を有するウイルスサンプルは、大規模塩基配列解析を使用し、細菌、真菌の種類と存在比を検出するのと同様にウイルスのサブタイプと存在比を検出することができる。一方、後者の、理想的な構造を有していないものは、特定の種類のウイルスの相対存在比しか検出することができない。配列表中のＨＥＶ（ヒトエンテロウイルス）以外に、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、単純へルペスウイルス等、他のウイルスはいずれも、相応の設計を行って使用することができる。
【００４３】
前記配列表中のプライマー配列の記載はいずれも５’末端から始まり、３’で終わる。縮重混合塩基はＩＵＢ規格コードを使用すると、Ｍ＝Ｃ：Ａ、Ｙ＝Ｃ：Ｔ、Ｋ＝Ｇ：Ｔ、Ｒ＝Ａ：Ｇ、Ｓ＝Ｇ：Ｃ、Ｗ＝Ａ：Ｔ、Ｉ：ヒポキサンチン塩基である。混合比は具体的な状況に応じて調整する。
【００４４】
実施例２。
本実施例が提供する、異なる種属の微生物間の種類と存在比を比較するための人工外来性参照分子の、実施例１と異なるのは次の点にある：前記第２種検出領域ＩＩ中のプライマー配列領域は、専門家の間で公知の認識領域に基づいてＩＴＳ領域ｒＤＮＡプライマー配列領域に変換され、第２の特異的認識領域Ｅの上流に位置するのはＩＴＳ領域ｒＤＮＡ上流プライマー配列領域Ｂ１であり、第２の特異的認識領域Ｅの下流に位置するのはＩＴＳ領域ｒＤＮＡ下流プライマー配列領域Ｂ２である。前記第２の特異的認識領域Ｅは、人為的に設計され合成された１組の配列であり、設計者は該配列の配列情報を明確に知っており、該配列の長さは、対応する検出すべき生物の特徴検出配列長さを模倣し、具体的には、ＩＴＳ領域の大きは約３００個のヌクレオチドである。その他はいずれも実施例１と同じである。
【００４５】
実施例３。
同一サンプル中の細菌と真菌の相対的比率を解析するため、図２に示す外来性参照分子配列を人工的に合成した。図２中の・・・は任意の配列である。該人工外来性参照分子の配列中の結合配列領域の左側に、細菌を検出するための種検出領域が設けられており、そのプライマー配列領域は細菌の１６Ｓ  Ｖ４領域の順方向、逆方向プライマーを模倣し、そのうち上流プライマー配列領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示す配列を有し、下流プライマー配列領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示す配列を有し、細菌の第４の可変領域の約３００ｂｐの配列長さを模倣する遺伝子断片は、中間の特異的認識領域Ｄ１が、人工的に設けられた、外来性組み込み断片の数を認識するための特異的配列である。結合配列領域の右側に、真菌を検出するための種検出領域が設けられており、そのプライマー配列領域は、真菌の第２のＩＴＳ領域の順方向、逆方向プライマーを模倣し、そのうち上流プライマー配列領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示す配列を有し、下流プライマー配列領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示す配列を有し、第４の可変領域の約３００ｂｐの配列長さを模倣する遺伝子断片は、中間が特異的認識領域Ｅ１である。前記特異的認識領域Ｄ１、特異的認識領域Ｅ１の配列は、検出すべきサンプル中のゲノムＤＮＡ配列と相同性がなく、顕著な特異的差異が存在する。
【００４６】
個々の反応において、等量又は既知量の人工外来性参照分子をいずれも加え、各々増幅した後、個々の増幅反応における種類と相対存在比の比較に関与し、各種類の微生物の、該人工外来性参照分子に対する相対量を求めた。結果は図３、図４に示す通りである。いずれも外来性参照分子を基準とし、データの標準化を行い、異なる種属の種の間で互いに比較できるようにし、結果は図５に示す通りであるため、異なる種属の微生物間で同様のコンセンサスプライマー増幅を使用することができず分子生物学的反応及び後続の解析は必ず別々に行わなければならず種の間の相対存在比又は相互に影響するデータを得ることができない問題を効果的に解決している。
【００４７】
上記について、当業者は、本発明の技術案及び技術思想に基づいて、その他の各種相応の変更と変形を行うことができ、これらの変更及び変形は、全て本発明の請求項の保護範囲に属していなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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