(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）細胞集団に含まれる一つのコロニーに由来し、異なるL個の条件に曝され、繰り返し数Nずつ（Nは統計処理上有効な数を表す。）準備された、L×N個の細胞試料を準備する工程；
（2）準備した細胞試料の各々を溶解処理して、細胞ライセートを得る工程；
（3）得られた細胞ライセートを、異なるM種類の特異的抗体を用いた逆相蛋白質アレイ（Reverse-phase protein arrays：RPPA）で処理して、データを得る工程
を含み、得られたデータをクラスター分析することにより細胞集団またはコロニーを特徴づける、蛋白質発現プロファイル方法であって
工程（1）の細胞試料が、コロニー形成アッセイにおいて播種後21日以内に得られるコロニー形成細胞から調製されたものであり、
工程（2）の細胞ライセートが、1μlあたり2.0×103 cells以下の細胞を溶解処理して得られたものである、方法。
【請求項２】
工程（2）の細胞ライセートが、細胞ライセート1μlあたり5.0×102 cells以上の細胞を溶解処理して得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
条件が、異なる抗腫瘍薬を、異なる濃度で供与することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
条件が、異なる曝露時間で抗腫瘍薬を供与することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抗腫瘍薬が、耐性を生じうるものである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法
【請求項６】
抗腫瘍薬が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、ラニムスチン、ニムスチン、ビンクリスチン，イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞集団が、腫瘍細胞に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
異なるK種類の腫瘍細胞に由来する細胞集団に対して行われる、請求項の７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞が、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、または小細胞性肺がんに由来するものである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
コロニーが薬物耐性を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
薬物耐性であるコロニーが、薬物について予め求めたコロニー形成を50％抑制するのに必要な濃度（CI50）の1/10〜10倍の濃度の薬物存在下で生存しうるコロニーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞が薬物耐性を獲得する機序を解明するため、または再発抑制のための医薬候補を推定するために行われる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
薬物、紫外線、放射線、pH、または温度を含む刺激に対する細胞の耐性の獲得、腫瘍細胞の悪性度、または遺伝子の導入効率に関連した解析のために行われる、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物刺激に対応して生存する等の特性を有する微小細胞集団を、分子生物学的に特徴づける方法に関する。本発明は、治療薬の研究・開発の分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
化学療法後のがんの再発は、不均一な細胞集団中のいくつかの薬物耐性細胞がストレスの多い条件下でたくましく生き残って増殖する生物学的現象である。臨床上は、がん患者の５０−９０％が、進行した消化器系腫瘍の見掛け上の「根治的」切除、続いてアジュバント化学治療を受けたにもかかわらず、疾患の再発により亡くなる（非特許文献１：Paoletti et al., 2010）。根治的切除は、患者の体内に検出可能ながん細胞が残存しない状態により定義される（非特許文献２：Sakuramoto et al., 2007）。アジュバント化学治療の間でさえ再発が起こり得ることから、がん細胞の極めて小さな集団が化学治療を切り抜けて生き残り、そして局所的な腫瘍の成長、リンパ腫／血中転移、および肋膜／腹膜播種性転移を促進し得ることが示唆される。最近の研究は、遺伝的変化の蓄積に基づいて腫瘍が致死的レベルに成長するまでに数十年要することを証明した（非特許文献３：Campbell et al., 2010; 非特許文献４：Yachida et al., 2010）。ほとんどの再発は消化器系がん患者の根治的治療後の５年以内に生じるが、がんが悪性度の高い表現型を獲得するのに必要とされる推定時間よりもはるかに短い期間である（非特許文献５：O'Connell et al., 1994）。
【０００３】
一方、逆相蛋白アレイ（Reverse-phase protein arrays：RPPA）は微量スケールのドットウェスタンブロット解析であって、同時に数百から数千の蛋白質の発現を定量的にモニタリングできる手法である（非特許文献6）。RPPAによる高次元データの取得は、医薬の分子ターゲットの正確な同定とともに、理論上の蛋白質ネットワークモデルの検証への応用に期待されてきた（非特許文献7、8）。RPPAはまた、短時間で定量可能な高次元プロテオミクスデータを低コストで提供する数少ない技術の一つである（非特許文献9-11）。RPPAに関し本発明者らは、蛋白質サンプルの大規模収集に関する技術を開発してきた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報WO2010/038707
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Paoletti, X., Oba, K., Burzykowski, T., Michiels, S., Ohashi, Y., Pignon, J.P., Rougier, P., Sakamoto, J., Sargent, D., Sasako, M., et al. (2010). Benefit of adjuvant chemotherapy for resectable gastric cancer: a meta-analysis. JAMA 303, 1729-1737.
【非特許文献２】Sakuramoto, S., Sasako, M., Yamaguchi, T., Kinoshita, T., Fujii, M., Nashimoto, A., Furukawa, H., Nakajima, T., Ohashi, Y., Imamura, H., et al. (2007). Adjuvant chemotherapy for gastric cancer with S-1, an oral fluoropyrimidine. N Engl J Med 357, 1810-1820.
【非特許文献３】Campbell, P.J., Yachida, S., Mudie, L.J., Stephens, P.J., Pleasance, E.D., Stebbings, L.A., Morsberger, L.A., Latimer, C., McLaren, S., Lin, M.L., et al. (2010). The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer. Nature 467, 1109-1113.
【非特許文献４】Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., Fu, B., Kamiyama, M., Hruban, R.H., Eshleman, J.R., Nowak, M.A., et al. (2010). Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature 467, 1114-1117.
【非特許文献５】O'Connell, M.J., Martenson, J.A., Wieand, H.S., Krook, J.E., Macdonald, J.S., Haller, D.G., Mayer, R.J., Gunderson, L.L., and Rich, T.A. (1994). Improving adjuvant therapy for rectal cancer by combining protracted-infusion fluorouracil with radiation therapy after curative surgery. N Engl J Med 331, 502-507.
【非特許文献６】Paweletz, C.P., et al., Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. Oncogene, 2001. 20(16): p. 1981-9.
【非特許文献７】Ramalingam, S., et al., Quantitative assessment of the p53-Mdm2 feedback loop using protein lysate microarrays. Cancer Res, 2007. 67(13): p. 6247-52.
【非特許文献８】Nishizuka, S., et al., Quantitative Protein Network Monitoring in Response to DNA Damage. J Proteome Res, 2008.
【非特許文献９】Utz, P.J., Protein arrays for studying blood cells and their secreted products. Immunol Rev, 2005. 204: p. 264-82.
【非特許文献１０】Liotta, L. and E. Petricoin, Molecular profiling of human cancer. Nat Rev Genet, 2000. 1(1): p. 48-56.
【非特許文献１１】Nishizuka, S. and B. Spurrier, Experimental validation for quantitative protein network models. Curr Opin Biotechnol, 2008.
【非特許文献１２】Kreso, A., O'Brien, C.A., van Galen, P., Gan, O.I., Notta, F., Brown, A.M., Ng, K., Ma, J., Wienholds, E., Dunant, C., et al. (2013). Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response in colorectal cancer. Science 339, 543-548.
【非特許文献１３】Ramaswamy, S., Ross, K.N., Lander, E.S., and Golub, T.R. (2003). A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat Genet 33, 49-54.
【非特許文献１４】Sharma, S.V., Lee, D.Y., Li, B., Quinlan, M.P., Takahashi, F., Maheswaran, S., McDermott, U., Azizian, N., Zou, L., Fischbach, M.A., et al. (2010). A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141, 69-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ほとんどのがんの再発が、がんが悪性度の高い表現型を獲得するのに必要とされる推定時間よりもはるかに短い期間で生じることから、本発明者らは、再発の機構は根本的な遺伝的原因を有することよりむしろ悪性表現型の薬物耐性に関連することが知られている、クロマチンの構造変化、選択的遺伝子発現および集団選択を含む機能的変化（非特許文献12〜14：Kreso et al., 2013; Ramaswamy et al., 2003; Sharma et al., 2010）に基づくと仮定した。薬物の感受性に関連した細胞の変化を詳細に解析するためには、実験間の誤差による影響を最小限に抑え、多数の細胞試料を一度に処理することができる手段が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、がんの再発の機構を解明するため、抗がん剤の存在下で生存可能な亜集団である薬物耐性コロニー（Drug-tolerant colonies; DTC）を用いた。分子レベルにおいて個々のDTCをプロファイリングすることにより、薬物耐性表現型に関連した機能性サブグループが明らかになりうる。本発明者らは、数千の個別のコロニーに由来するライセートの比較を機能的に異なる蛋白質レベルのセットにより可能にする、コロニーライセートアレイ（colony lysate array, CoLA）を開発し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下を提供する。
[１]（1）細胞集団に含まれる一つのコロニーに由来し、異なるL個の条件に曝され、繰り返し数Nずつ（Nは統計処理上有効な数を表す。）準備された、L×N個の細胞試料を準備する工程；
（2）準備した細胞試料の各々を溶解処理して、細胞ライセートを得る工程；
（3）得られた細胞ライセートを、異なるM種類の特異的抗体を用いた逆相蛋白質アレイ（Reverse-phase protein arrays：RPPA）で処理して、データを得る工程
を含み、得られたデータをクラスター分析することによりコロニーまたは細胞集団を特徴づける、蛋白質発現プロファイル方法。
[２]工程（2）の細胞ライセートが、細胞ライセート1μlあたり5.0×102 cells以上の細胞を溶解処理して得られたものである、１に記載の方法。
[３]条件が、異なる抗腫瘍薬を、異なる濃度で供与することを含む、１または２に記載の方法。
[４]条件が、異なる曝露時間で抗腫瘍薬を供与することを含む、１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[５]抗腫瘍薬が、耐性を生じうるものである、２〜４のいずれか１項に記載の方法
[６]抗腫瘍薬が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、ラニムスチン、ニムスチン、ビンクリスチン，イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンからなる群より選択される、５に記載の方法。
[７]細胞集団が、腫瘍細胞に由来する、１〜６のいずれか１項に記載の方法。
[８]異なるK種類の腫瘍細胞に由来する細胞集団に対して行われる、の７に記載の方法。
[９]腫瘍細胞が、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、または小細胞性肺がんに由来するものである、７または８に記載の方法。
[１０]コロニーが薬物耐性を有する、７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、数千の個別の細胞試料由来のライセートについて、蛋白質発現レベルを適切に比較することができ、特定の細胞集団の、例えば薬物耐性を獲得した腫瘍細胞の、蛋白質発現プロファイリングを効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】がん細胞シートおよびコロニーの異なる生物学的および分子的特性。(A)それぞれの細胞株のシート形態およびコロニーの形態の代表的イメージ。スケールバー＝100μm。(B)シートおよびコロニー中の細胞の薬物感受性。各細胞株のGI50およびCI50濃度を、それぞれ増殖抑制アッセイおよびコロニー形成アッセイにより測定した。星印は阻害がなかったことを示す。点線はヒトにおける各薬物のピーク血漿濃度を示す。全ての実験は３重に実施した。エラーバーは± SEMを表す。（C）シートおよびコロニー中のHela細胞S-Fucci2の細胞周期の状態。上のパネルは、mCherry-hCdt1（赤）およびmVenus-hGeminin（緑）の発現の蛍光イメージを示す。ヘキスト33342(青)を用いて核のDNAを染色した。スケールバー＝100μm。赤、緑、黄色および無色の細胞の閾値による対応の密度散乱プロットを示す（下のパネル）。数字は各画分のパーセンテージを示す。（D）シートおよびコロニー由来のMKN45細胞の腫瘍原性。シート由来の細胞（1.0 x 104個）または約1.0 x 104の細胞を含む直径１mmの単一のコロニーを、ヌードマウスに皮下注入し、腫瘍の大きさを測定した。（E）シートおよびコロニー由来の腫瘍を接種の７週後に切除し（上部パネル）、続いてH & E 染色により病理的検査を行った（底部パネル）。スケールバー = 500μm。
【図１−２】図1-1に関連した細胞シートおよびコロニーの細胞形態および用量依存性応答および細胞周期の分析。(A)HCT116, HT29およびHeLa細胞のシートおよび典型的コロニーの形態。スケールバー = 100μm。上部パネル中の四角に囲まれた面積を底部パネル中で上に拡大して示す。(B)シートおよびコロニーに関しての各細胞株の薬剤用量依存性曲線。破線による矢印はヒトにおける各薬剤のピーク血漿濃度を示す。エラーバーは± SEMを表す。(C) HeLa.S-Fucci2を用いたシートおよびコロニーの細胞周期の決定。矢印はmCherryおよびmVenus（緑）シグナルの７５パーセンタイルを示す。
【図２−１】がん細胞コロニーの機能的不均一性。（A）MKN45由来の未処理コロニーおよびDTC。用量応答曲線中に、コロニーの出現のためのCIS濃度を示す。未処理コロニーはCIS不在下にて得て（薄い灰色の矢印）、DTCはIC50においてCISにより処理した後に得た（黒の矢印）。各実験は３重に行った。エラーバーは±SEMを表す。（B）MKN45細胞由来の個々の未処理コロニーおよびDTCの腫瘍形成能力。直径１mmの単一のコロニー（約3.0 x 104 細胞を含む）をランダムに拾い、個別に皮下移植した。未処理のコロニー（n=6）とDTC（n=6）の腫瘍の成長の比較を示す（左のパネル）。腫瘍の大きさを毎週２回測定した（右のパネル）。（C）MKN45由来の未処理のコロニーおよびDTCの薬物の感受性。コロニーをsingle cell細胞懸濁液に希釈して、各薬物の１０倍連続希釈によりウェルに再び播種した。CI50濃度をコロニーの数に関する用量応答曲線に基づいて測定した。各実験は３重に実施した。エラーバーは±SEMを表す。
【図２−２】図2-1に関連したDTCの薬剤感度。(A) 未処理のコロニーおよびHCT116, HeLa, HT29およびMCF7細胞由来のDTC（左）。用量応答曲線中のコロニーの出現のためのCIS濃度（右）。未処理コロニーはCIS非存在下から採取（明るいグレーの矢印）、DTCはIC50のCIS存在下から得た（黒の矢印）。各実験は３重に実施した。エラーバーは±SEMを表す。(B)未処理コロニーおよびMCF7細胞由来のDTCの薬剤感度。コロニーは単一細胞懸濁液となるように希釈し、各薬剤の１０段階連続希釈に再度播種した。CI50濃度はコロニーの数に関する用量応答曲線に基づいて測定した。各実験は３重に実施した。エラーバーは±SEMを表す。
【図３−１】個々のがん細胞コロニーにおける蛋白質レベル。（A）CoLA分析の模式的概説。DTCおよび未処理のコロニーの両方を含む全部で2,400のコロニーをコロニー形成アッセイにより生じさせた。次に、コロニーを単離し、溶解し、そして384ウェルプレートに並べた。全部で2,400のコロニーライセートを、ニトロセルロース膜を接着したガラススライド上にスポットすることにより、CoLAを作製した。次に各CoLAを特異的一次抗体を用いた免疫染色を行いスキャンすることによりスポットの濃度を定量した。（B）CoLAプラットフォーム。スポットを生物学上の複製物２０セットに関して、５列および４行に並べた（左、金コロイド染色）。各セットは赤のボックスにて示された５つの細胞系の異なる薬物処理条件からのコロニーライセートを含む（右）。（C）2,400の個々のコロニーライセートの蛋白質レベルを二方向性階層的クラスタリングにより分類した。薬物の種類、濃度および細胞系を底部に示す。蛋白質の機能的カテゴリーは、右に示すとおり、幹細胞性、上皮、間葉、および細胞周期のマーカーを含む。２つの主要なクラスターは、コロニー軸（CC1およびCC2）および蛋白質軸（PC1およびPC2）の両方において明らかであった。値は金コロイド染色された全蛋白質により標準化され、そしてz-スコア変換を分析に用いた。（D）CISからの個々のコロニーにおける上皮マーカーと間葉マーカーの相関。E-カドヘリン対CK-8（左）またはビメンチン（右）の分散プロットを、相関を判定するのに用いられるピアソン相関定数と共に示す。各データの点は、各薬物の異なる濃度からの個々のコロニーを、異なる濃度を表す色と共に表す。図３−２も参照されたい。
【図３−２】図３−１に関係する薬物投与のコンテクストにおける上皮/非上皮の関係の完全性の検証。(A)６通りの連続希釈の初期薬物濃度。(B)図３−１C中の蛋白質軸の系統樹の詳細な観察。(C)CC1およびCC2の対応条件の分布を示す棒グラフ。(D)個々のDTC中の上皮および間葉マーカーの相関。散在するプロットはE-カドヘリンとCK-8の間の陽性の相関を示す（上部パネル）；E-カドヘリンとビメンチンは逆相関を示す（底部パネル）。ピアソン相関係数を用いてこれらの相関を査定した。各データ点は、図の説明中の色により示されるとおり、各薬物の６通りの異なる濃度からの個々のコロニーを表す。
【図４】未処理コロニーおよびDTCの間の幹細胞性および薬物耐性に関連した蛋白質および遺伝子発現。（A）MKN45細胞由来の未処理のコロニーおよびDTCにおけるCD44、MDR1、E-カドヘリンおよびビメンチン（上のパネル）および多能性誘導因子（下のパネル）の蛋白質レベル。赤線は各条件に関する個々のコロニーの平均値を示す。（B）MKN45細胞由来の未処理のコロニーおよびDTCにおけるc-MycおよびCD44（緑）、ROSインディケーター（赤）、およびDNAを染色するHoechst 33342（青）に関する代表的蛍光免疫細胞化学。（C）対応するドットプロットは個々の未処理コロニー（UT）およびDTCにおける蛍光強度を示す。黒から白へのグラデーションは個々のコロニーのROS強度を示す。赤線は各条件に関する個々のコロニーの平均値を示す。（D）MKN45細胞由来の未処理のコロニーおよびDTCにおける多能性誘導因子のmRNAレベル。示されたmRNAの豊富さは、qRT-PCRを用いて定量されて、log2比により表わされた（GAPDH mRNAレベルにより標準化された）。青線は各条件に関する個々のコロニーの平均値を示す。（E）MKN45細胞由来の未処理のコロニーおよびDTCの間の別々にメチル化されたCpG部位の染色体分布の比較。（F）第４染色体上の拡大された代表的なヒポメチル化された座（上のパネル）および第９染色体上のハイパーメチル化された座（下のパネル）。（G）多能性誘導遺伝子の転写開始領域に位置するCpG部位の相対的メチル化レベル。GAPDHはハウスキーピング遺伝子として示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
数値範囲をX〜Yは、両端の値XおよびYを含む。Aおよび／またはBは、AとBの少なくとも一方であることを意味し、Aである場合、Bである場合、AおよびBである場合を含む。疾患または状態に関し、処置というときは、予防、発症の遅延、発症後の場合は進行の遅延、状態の改善、治療を含む。医薬は、医薬組成物（製剤）、医薬組成物の組み合わせ、キット（製剤、製剤の組み合わせに加えて、それ以外のもの、例えば説明のための情報、投与のための治具等を含む。）を含む。
【００１２】
本発明は、細胞集団の蛋白質発現プロファイル方法を提供する。本発明の方法は、次の工程を含む。
（1）一つのコロニーに由来し、異なるL個の条件に曝され、繰り返し数Nずつ準備された、L×N個の細胞試料を準備する工程；
（2）準備した細胞試料の各々を溶解処理して、細胞ライセートを得る工程；および
（3）得られた細胞ライセートを、異なるM種類の特異的抗体を用いた逆相蛋白質アレイ（Reverse-phase protein arrays：RPPA）で処理して、データを得る工程。
得られたデータは、クラスター分析することにより、細胞集団またはコロニーを特徴づけることができる。
【００１３】
［工程(1)］
工程（1）では、一つのコロニーに由来し、異なるL個の条件に曝され、繰り返し数N個ずつ準備された、L×N個の細胞試料が準備される。
【００１４】
用いられる細胞集団は、特に限定されないが、腫瘍細胞に由来するものを用いることができる。腫瘍細胞の例は、腫瘍細胞が、大腸がん、前立腺がん、乳がん、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、悪性神経膠芽腫、腎臓がん、肝臓がん、前立腺がん、または小細胞性肺がんである。細胞集団は組織由来のものでもよく、培養細胞由来のものでもよい。培養細胞の例は、例えば、HCT116、HT29、HeLa、MCF7およびMKN45である。
【００１５】
好ましい態様においては、細胞集団は、薬物耐性を有する。より好ましい態様においては、薬物耐性である腫瘍細胞は、薬物について予め求めた腫瘍細胞のコロニー形成を50％抑制するのに必要な濃度（CI50）の1/10〜10倍、好ましくは1/5〜5倍、より好ましくは1/2〜2倍の濃度の薬物の存在下で生存しうるコロニー由来である。さらに好ましい態様においては、薬物耐性である腫瘍細胞は、抗腫瘍薬の存在下で生存可能な亜集団である薬物耐性コロニー（Drug-tolerant colonies; DTC）である。DTCは、CI50濃度の抗腫瘍薬の存在下で生存し得るコロニーとして定義される。DTCは、次のようにして得ることができる：
薬物不在の対照を含めて、薬物を数段階（例えば、3〜10段階、好ましくは4〜7段階）で連続希釈し、各濃度において、低密度（10〜20 cells/cm2）で細胞を培養することによりCI50値が求められ、かつDTCが得られる。ここでの培養期間は、薬物不存在対照において複数個のコロニー（10個以上、好ましくは20個以上、より好ましくは30個以上、例えば40〜60個）が出現する期間であり、通常、播種後8〜21日以内である。
【００１６】
上述のような薬物耐性の腫瘍細胞の使用は、本発明の方法を細胞が薬物耐性を獲得する機序を解明するために行う場合に、有用である。詳細には、分子レベルにおいて個々のDTCをプロファイリングすることにより、薬物耐性表現型に関連した機能性サブグループが明らかになりうる。数千の個別のコロニーに由来するライセートを機能的に異なる蛋白質レベルのセットによりする比較する態様を、コロニーライセートアレイ（CoLA）と称するが、CoLA技術を用いたDTCのプロテオーム特性決定のために行われる、蛋白質発現プロファイリングは、本発明の特に好ましい態様の一つである。
【００１７】
工程（1）は、1種類の細胞集団について行ってもよく、異なるK種類の細胞集団に対してそれぞれ行ってもよい。Kは、2以上の整数であり、後述するRPPA（逆相蛋白質アレイ、Reverse-phase protein arrays）で同時に取り扱うことができる数であれば、特に限定されないが、例えば、2以上であり、好ましくは5以上であり、より好ましくは10以上である。
【００１８】
工程（1）で細胞が曝される条件とは、細胞の活動・活性を変化させる（具体的には、例えば細胞内シグナル伝達の発生やその変化）ような物理的（時間、温度、等）または化学的（薬物種類、薬物濃度等）なあらゆる要因の、直接的または間接的な細胞への接触を意味する。条件はL個、準備される。Lは2以上の整数であり、後述するRPPAで同時に取り扱うことができる数であれば、特に限定されないが、例えば、2〜80であり、好ましくは3〜40であり、より好ましくは5〜30である。例として、4種類の抗腫瘍薬を薬物不存在の対照を含む6段階の濃度で、細胞に供与することが挙げられる。この場合、条件の数は24である。上述したようにK種類の細胞集団に対して工程（1）を実施する場合は、K×L系列の実験区を準備することとなる。実験区は、細胞培養用のフラスコまたは複数のwellを有するプレート等を必要個数揃えることにより、準備できる。
【００１９】
好ましい態様において、工程(1)の条件は、異なる抗腫瘍薬を供与することを含む。用いられる抗腫瘍薬は特に限定されないが、本発明の方法を腫瘍細胞が薬物耐性を獲得する機序を解明するために行う場合は、抗腫瘍薬は、耐性を生じうる化合物である。薬物は、殺細胞性の抗腫瘍薬であってもよく、分子標的薬であってもよい。また現時点で抗腫瘍効果が必ずしも認められていないものでもよい。殺細胞性抗腫瘍薬の例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ダカルバジン、ラニムスチン、ニムスチン、ビンクリスチン，イリノテカン、ドセタキセル、パクリタキセル、アドリアマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシンが挙げられる。
【００２０】
動態変化の解析を目的とする場合は、後述するRPPAで扱う蛋白質レベルを正確に知るために、予備的にウェスタンブロットを少数のサンプル数について行っておいてもよい。予備的実験による情報は、より短い時間間隔を用いて収集しなければならないサンプルについての、より正確な条件（時間、薬物濃度、等）を決定する手助けとなりうる。
【００２１】
工程（1）では、各実験区につきN個の細胞試料が準備される。Nは、一般には「n数」として認識される実験の繰り返しの数である。Nは2以上の整数であり、かつ後述するRPPAで同時に取り扱うことができる数であれば、特に限定されないが、統計処理上有効な数であることが好ましい。必要であれば、少ない数で予備検討を行い、場合によりさらにもう少し数を増やして予備検討を行うことを繰り返し、それぞれの検討結果から分布形等を考察し、データのばらつきや変化が許容範囲に納まるような数を算出してもよい。Nは、実験区の個数等にも拠るが、例えば2〜80であり、好ましくは3〜40であり、より好ましくは5〜30である。上述したように、5種類の細胞集団を、24個の条件に曝す場合、Nを例えば20として細胞試料を準備してもよい（図1-1A参照）。この場合、工程（1）では、2400の細胞試料を準備することとなる。120×20系列の細胞試料は、例えば6 wellプレート20枚に、5種類の細胞を各々24区画ずつ播種して24条件に曝した後、各々のwellから1〜数10個程度の細胞を含む群を、20ずつ採取することによって準備できる。
【００２２】
工程（1）は、予め決定しておいた適切な時点で終了すればよい。場合により、工程（1）で曝した条件を直ちに取り除き、必要に応じ細胞試料を氷上等におくことにより冷却し、反応を停止する。各系列からの細胞試料は収集され、必要に応じ洗浄、ペレット化される。
【００２３】
［工程(2)］
工程（2）では、工程（1）で準備した細胞試料の各々を溶解処理して、細胞ライセートを得る。
【００２４】
細胞ライセートは、RPPAを適切に実施することができる限り、比較的少ない量の細胞を含み、かつ比較的少ない量とすることができるが、本発明者らの検討によると、細胞量に関しては、細胞ライセートとしては、1μlあたり5.0×102 cells以上の細胞を溶解処理して得られたものが適する。細胞ライセート1μlあたり1.0×103 cells以上 の細胞のライセートが含まれていることが好ましい。細胞ライセートの量が少ない場合は、細胞ライセート1μlあたり2.0×103 cells以上 の細胞のライセートが含まれていることがより好ましい。ライセートの量に関しては、操作中の揮発による損失などを考慮し、各々の細胞ライセートが5.0μl以上あれば、本発明を有効に実施することができる。7.5μl以上であれば好ましく、10.0μl以上であればより好ましい。典型的には、本発明を実施するに際しては、各細胞ライセートは、約10,000cellsの細胞から得られた5〜10μlのものであることが好ましい。
【００２５】
工程（1）からの細胞試料の溶解処理の際には、細胞溶解用のバッファーが使用される。バッファーは、細胞を溶解でき、蛋白質を定量分析に適したように変性し、維持でき、かつ微量の液の濃度が変化しないように揮発性でないものが好ましく、このような条件を満たす限り、種々のものを用い得る。バッファーとしては通常、Pink Buffer（Anderson, L. and J. Seilhamer, A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. Electrophoresis, 1997. 18(3-4): p. 533-7.）を好適に用いることができる。Pink Bufferの典型的な調整方法（40MmLスケールの場合）を以下に示す：
尿素21.6 g を22.5 mlの超純水に加え、マグネチックスターラーで30分間または溶液が透明になるまで撹拌し、溶解する。全量は約40mLとする。0.2nmの無菌ろ過フィルターでろ過し、0.8 mlのPharmalyte pH 8-10.5、ついで1.6 gのCHAPS（3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate、非イオン性界面活性剤）を加え、穏やかに撹拌する。さらに0.4gのDDT（dithiothreitol）を加え、穏やかに撹拌する。この溶液を必要に応じて超純水で40mLにメスアップする。分注量を0.5mLから1mLとして、-20℃で保存する。
【００２６】
Pink Bufferの詳細な組成・改変等については、Nishizuka, S., Charboneau, L., Young, L., Major, S., Reinhold, W.C., Waltham, M., Kouros-Mehr, H., Bussey, K.J., Lee, J.K., Espina, V., et al. (2003). Proteomic profiling of the NCI-60 cancer cell lines using new high-density reverse-phase lysate microarrays. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 14229-14234.およびSpurrier B1, Ramalingam S, Nishizuka S., Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat Protoc. 2008;3(11):1796-808を参照することができる。
【００２７】
Pink Bufferは2次元ゲル電気泳動でよく用いられるが、RPPAのための細胞溶解処理にも好適である。尿素が室温で変性された蛋白質を保持し、ほとんど揮発性がない還元剤DTTを用いており、またCHAPSは解冷凍を繰返した後にも沈殿物を生成しないからである。また、各化合物の濃度を調製することができるため、細胞ライセートの希釈系列を準備する場合に便利である。
【００２８】
細胞ライセートは、適宜希釈することができる。細胞ライセートの2〜20段階の希釈系列を準備してもよい。連続希釈は、個々の蛋白質の相対的定量を可能にする勾配および切片を提供することができる。連続希釈により、RPPAで処理する際にサンプル中の総蛋白質濃度とシグナルとの関係において線形性のある部分をクラスター分析のためのデータ抽出範囲とすることができ、定量性に優れた分析が可能となる。連続希釈は、Tecan液体取り扱いロボットまたは他の類似の装置によって作製することができる。
【００２９】
［工程(3)]
工程(3)では、得られた細胞ライセートを、異なるM種類の特異的抗体を用いた逆相蛋白質アレイ（Reverse-phase protein arrays：RPPA）で処理して、データを得る。
【００３０】
工程（3）では、異なるM種類の特異的抗体が用いられる。Mは、2以上の整数であり、RPPAで同時に取り扱うことができる数であれば、特に限定されないが、例えば、2〜200であり、好ましくは10〜100であり、より好ましくは20〜60である。
【００３１】
工程(3)のRPPAは、通常のRPPAの操作にしたがって実施することができる。以下では典型的なRPPAの手順を説明するが、工程(3)においても同様に実施することができる。
RPPAにおいては、通常、準備した細胞溶解液を自動GeneTacアレイヤー（Genomic Solutions, Inc., Ann Arbor, MI）または他の類似の装置によって、ニトロセルロースコーティングスライドガラス（FAST Slides, Schleicher & Schuell BioScience, Inc. USA, Keene, NH）のような基板上にアレイ状にプリント（スポットということもある。）し、逆相蛋白質ライセートマイクロアレイプリントを作製する。Aushon BioSystems 2470マイクロレイヤーの使用によって対処することができる。このAushon BioSystems 2470は高粘度の細胞溶解液からでもアレイを製造することができる。Aushon 2470はソリッドピン方式、湿度／温度環境コントロール、および自動連続的スライド／マイクロプレート供給システムを使用している。細胞溶解液のアレイ上のレイアウト順序は、対象となる溶解液の数やプリントの目的に応じ、当業者であれば適宜ソフトウェア上でデザインすることができる。
【００３２】
スライドガラスへのプリント後、ウェスタンブロッティングのために用いられるスライドブロッキング、ブロッティングおよび抗体インキュベーションに関して同じストリンジェントな条件を、一次抗体を付加する前に適用することができる。ブロッキングバッファーとしては、種々のものを用いることができるが、例えばI-Block溶液であれば、次のように調製する：
250μLのトゥイーン20と250mLのPBSを混合して0.1%のウォッシュバッファーを調製する。0.5gのTropix I-Block（粉末状）を250mlのウォッシュバッファーに混合し、必要に応じ加温、攪拌してI-Blockを完全溶解する。0.2μmの無菌フィルターで滅菌ろ過した後、4℃で保存する。
【００３３】
また、抗体インキュベーションにおいては、DAKO（Copenhagen, Denmark）シグナル増幅システムを用いて、抗体結合強度を検出および増幅することができる。このとき、DAKO Cytomationが提供するキット(Cat. no.: K1500)を利用することができる。
【００３４】
各試料に関してシグモイドシグナル強度-濃度曲線を作製するために、スライドガラスを走査し、そしてシグナル強度を、Micro Vigene自動RPPAソフトウェア（VigeneTech Inc., MA）または類似のソフトウェアを用いて、目的の蛋白質の濃度を決定する。絶対的な濃度を正確に決定するために、既知の濃度の精製蛋白質／組み換え型ペプチドに関する標準的なシグナル強度-濃度曲線を、目的蛋白質を含む試料との比較のために作成することができる。
【００３５】
RPPAに関するより詳細な手順および条件は、本発明者らの先願である前掲特許文献1を参考にすることができる。本発明の手法に従うと、用いる細胞ライセートが前掲特許文献1の場合より、約100〜1000倍程度薄いことがある。このような場合には、用いるマイクロアレイヤーのピンのニトロセルロース膜に対する接触回数を、1回から数回、例えば5回程度に増やすことにより、対応できる。
【００３６】
［データ解析］
本発明においては、工程(3)から得られたデータをクラスター分析することにより蛋白質発現プロファイリングを行う。
【００３７】
得られた蛋白質発現データは、遺伝子発現アレイの分析のために用いられるものと同一のプログラムおよびアルゴリズムを用いて分析することができる。例えば、discover.nci.nih.gov/tools.jspからで入手可能なオンラインソフトウェアCIMminerを用いて、クラスター化されたイメージマップ（CIM）を生成することにより分析できる（http://discover.nci.nih.gov/cimminer/を参照）。あるいは、データは、例えばR統計ソフトウェアパッケージ（cran.r-project.org）において利用される方法を用いて、差示的蛋白質発現に基づくクラスタの存在に関して分析する。多様なクラスタリング法（階層化クラスタリング、K-平均値、独立成分分析、相互情報、および遺伝子シェービング（gene shaving）が含まれる）を用いて、統計学的に類似である群に試料を分類する。例えば、Xcluster（SMD software, Paulo Alto, CA）およびTreeView（University of Glasgow, Glasgow, Scotland）ソフトウェアを用いて、蛋白質発現および活性化における類似性に関して試料を整列させる、教師なし階層化クラスタまたはヒートマップにこれらのデータ全てを入力してもよい。これらの群のロバストネスおよび統計学的有意性を、ブートストラップデータリサンプリング（Kerr and Churchill, 2001）によって評価してもよい。全ての蛋白質に基づく一次クラスタリング分析のほかに、関心対象のシグナル伝達経路における蛋白質を用いて、二次ブートストラップリサンプルクラスタリング分析を行ってもよい。
【００３８】
［本発明の適用例］
本発明者らは、CoLA技術を用いたDTCのプロテオーム特性決定では、幹細胞性および上皮性に関連した蛋白質発現に基づいて細胞の２つの異なる群が存在したことを示した（実施例の項の実験３参照）。これらの群のどれもが薬物の種類および用量に直接関連していなかったが、蛋白質合成に先立ち、DTC形成の相対的初期のステージにおいて根本的な転写の機構を阻害することによりDTC形成が抑制されるのかもしれないと仮定するように、本発明者らを導いた。また本発明者らは、転写制御がDTC形成に関わる重要な要素の一つであることを証明したが、DTCの転写プロファイリングから、DTCの形成および確立は、単に少数の特定の遺伝子および蛋白質を必要とするプロセスではないことが示唆された（実験４参照）。このように、本発明によって提供される、細胞集団の蛋白質発現プロファイル方法は、腫瘍細胞が薬物耐性を獲得する機序を解明するために利用できる。
【００３９】
DTCの形成および確立は、単に少数の特定の遺伝子および蛋白質を必要とするプロセスではないことが示唆されたため、がん細胞の再発を予防するのには、広い範囲にわたってmRNA合成を阻害し得る薬物が、単一の分子を標的化する化合物よりも適切かもしれないと考察された。一方、別の実験から、RNAPII阻害剤であるα-AMAがDTC形成の顕著な減少を示した。またα-AMAはインビボにおいて、CISとの併用において、もっとも治療困難な末期がん状態の一つであるがん性腹膜炎（PC）の阻害効果を示した。このことは、先に述べた考察を裏付けるものでもある。
【００４０】
このように、本発明により、DTCの形成および確立に関する重要な知見が得られ、かつその知見に基づき、再発抑制のための医薬候補が推定できる。
【００４１】
本発明によって提供される、細胞集団の蛋白質発現プロファイル方法はまた、上記以外に：
・薬物、紫外線、放射線、pH、または温度を含む刺激に対する細胞の耐性の獲得
・腫瘍細胞の悪性度、または
・遺伝子の導入効率
等に関連した解析のために利用できる。
【００４２】
薬物、紫外線、放射線、pH、または温度を含む刺激に対する細胞の耐性の獲得の解析に際しては、上述の工程（1）においては、一つのコロニーに由来し、異なるL種類の薬物、紫外線、放射線、pH、または温度を含む刺激に曝され、繰り返し数N個ずつ準備された、L×N個の細胞試料を準備すればよい。このとき、コロニーは、目的の刺激について予め求めた細胞のコロニー形成を50％抑制するのに必要な条件下で生存可能な亜集団である、目的の刺激に対して耐性であるコロニーであってもよい。この解析により、細胞が刺激に対する耐性を獲得する機序を解明することができる。
【００４３】
腫瘍細胞の悪性度の解析に際しては、種々の悪性度の細胞集団（L種類）を準備し、上述の工程（1）においては、各細胞集団にコロニーを形成させ、一つのコロニーから、繰り返し数N個ずつ（Nは統計処理上有効な数を表す。）準備された、細胞試料（計L×N個）を準備すればよい。
【００４４】
遺伝子の導入効率の解析に際しては、細胞集団として、異なるL個の条件で外来の遺伝子を導入したものを準備し、上述の工程（1）においては、各細胞集団にコロニーを形成させ、一つのコロニーから繰り返し数Nずつ（Nは統計処理上有効な数を表す。）の細胞試料（計L×N個）を準備すればよい。本発明の方法を実施することにより、遺伝子の導入効率を、蛋白質の発現が見られるか否かに基づき解析することができる。
【実施例】
【００４５】
［実験１：コロニー形成細胞の抗がん剤の存在下における特性］
対数増殖期の細胞の増殖抑制アッセイは、薬物が固形腫瘍のサイズを減少させるかまたは安定化する能力を反映するが、コロニー形成アッセイは薬物耐性腫瘍始原single cellからもたらされる最小数のがん細胞による再発を模倣する（Singh et al., 2003）。
【００４６】
1．方法：
HCT116, HT29, HeLa, MCF7およびMKN45は理研細胞バンクから得た。５つの細胞系列すべては、１０％ウシ胎児血清（FBS;ライフテクノロジーズ）を添加されたRPMI1640培地（ライフテクノロジーズ）中で生育させて、５％CO2を供給された加湿培養機中で３７℃において培養した。
ランダ（登録商標、注CIS）および1-バイアル タキソテール（登録商標、DTX)はそれぞれ日本化薬およびサノフィから購入し、トリコスタチン（TSA）は和光純薬から購入した。アクチノマイシンD (AMD), α-アマニチン(α-AMA)およびシクロヘキシミド(CHX)はシグマから購入した；ゲフィチニブ(GEF)およびソラフェニブ(SOR)はトクリスおよびセルシグナリングテクノロジー(CST)から購入した。
【００４７】
各細胞株のGI50およびCI50濃度を、それぞれ増殖抑制アッセイおよびコロニー形成アッセイにより測定した。
増殖抑制アッセイ：細胞を高密度にて(3.2-12.8×104 細胞/cm2)９６ウェルプレートに播き、２４時間かけて接着させた。次に、細胞を、薬物の１０倍連続希釈８通りで処理した（出発濃度は図1-2Bに示す）。生存細胞中の細胞内デヒドロゲナーゼをCCK-8（同仁化学研究所）およびTriStar LB 941マイクロプレートリーダー（ベルトールドテクノロジーズ）を用いて測定した。５０％増殖阻害濃度（GI50）はグラフパッドプリズムソフトウエアを用いて計算した。ヒトにおけるCIS, DTX, GEFおよびSORのピーク血漿濃度は以前に報告された（Beselga et al., 2002; Himmelstein et al., 1981; Strumberg et al., 2005; Taguchi et al.,1994）。
【００４８】
コロニー形成アッセイ：細胞の播種の前に、薬物または化合物の１０倍連続希釈８通りを（出発濃度は図1-2Bに示す。薬物を含まない対照を含む。）４８ウェルプレートに分注した。次に、細胞を、用意された４８ウェルプレートに低密度で播いた（1.3-2.6×102 細胞/cm2）。播種から８−２１日以内に薬物を含まない対照においてウェルあたり約５０のコロニーが出現した。次に、コロニーを0.1% (w/v)クリスタルバイレットにより染色した。コロニーの数は、手動によるかまたはIN Cell Analyzer 2000ディバイス(GEヘルスケア、日本)を用いて自動的に計数した。５０％コロニー形成阻害濃度（CI50）はグラフパッドプリズムソフトウエアを用いて計算した。
【００４９】
2．結果：
本発明者らは、対数的増殖およびコロニー形成の間の細胞の生物学上の特性が、それらの増殖の潜在能力に関しては異なると考えた。例えば、単純な形態学的検査により、対数増殖期の細胞がフラスコの中で二次元的に伸展する（即ち、シート状）のに対し、コロニー形成細胞は密集して、小さく、そして縦方向に増殖したことが示された（図1-1Aおよび1-2A）。
【００５０】
異なる５つの細胞株（HCT116、HT29、HeLa、MCF7およびMKN45）のコロニー形成を５０％抑制するのに必要な薬物濃度（CI50）は、慣用の化学療法剤CISおよびドセタキセル（DTX）に関しての増殖抑制に必要な濃度（GI50）よりも２−３桁小さかったのに対し、分子標的薬物ゲフィチニブ（GEF）およびソラフェニブ（SOR）に関してのCI50は、対応するGI50のそれよりも１０倍未満であった（図1-1B）。蛍光ユビキチン化に基づく細胞周期インディケーター（Fucci）（Sakaue-Sawano et al., 2008）システムを用いて、シートとコロニーの間の細胞周期の分布の違いを判断した。 シートにおいては、典型的な細胞周期の開始を経る典型的な画分が観察された（図1-1Cおよび1-2C）。これに対し、コロニーにおいて細胞周期の分布は変化しなかったようであった（図1-1C）。
【００５１】
これらの結果は、シートとコロニーががん細胞に関して、特に薬物応答性に関して、異なる状態を表すことを示唆する。
【００５２】
腫瘍のコロニー形成能力がインビボにおいて強化されるのかを調査するため、本発明者らは、次に単一のMKN45コロニー（約1.0 x 104 cells）およびシートからの同じ数の細胞を用いて選択のプロセスなしにヌードマウスに皮下異種移植実験を行い、腫瘍の大きさを異種移植後約５０日まで測定した。
【００５３】
シートからの細胞はすべての反復実験において連続的増殖を示したのに対して、６つの異なるコロニーからのコロニー形成細胞の異種移植後にはただ一つの認識可能な細胞が形成されたのみであった（p < 0.005, 図1-1D）。異種移植に用いた細胞がシート由来であるかまたはコロニー由来であるかにかかわらず、移植腫瘍の起源における組織学上の違いはなかった（図1-1E）。
【００５４】
これらの結果は、コロニー形成細胞が、対数増殖細胞に比較して、異なるがしかし確率論的な特性を有することを示す。
【００５５】
［実験２：DTCの腫瘍原性、および薬物耐性の可逆性の確認]
DTCは各CI50濃度において抗がん剤の存在下にて生存し得るコロニーとして定義される（図2-1Aおよび2-2A）。薬物存在下においても、休止しているかまたはゆっくりと増殖する細胞は腫瘍の成長を持続して再開することができる（Kreso et al., 2013）。
【００５６】
1．方法
DTCが未処理のコロニーよりも高い腫瘍原性を有するか否かを調査するため、本発明者らは、MKN45細胞由来の６つのコロニー（非処理）およびDTCを６週齢のメスヌードマウス（BALB/cAjcl-nu/nu, CLEA）の背部の右および左の側面に対して個別に皮下注入した。これらのマウスを接種後４９日間または腫瘍の最大直径が１０mmに到達するまで監視し、そして安楽死させた。なおすべての実験は動物実験規則に関する岩手医科大学倫理委員会により承認された（他の実験においても同じ。）。
【００５７】
2．結果
DTCおよび未処理のコロニーの両者は等しいサイズ分布の腫瘍を形成し（図2-1B）、化学療法の処置が常に遺伝学的に「薬物耐性の」クローンを誘導または濃縮するわけではないという以前の報告に一致する（Kreso et al., 2013; Zhao et al., 2014）。未処理のコロニーに一致して、インビボにおけるDTCからの腫瘍成長の可変性の程度は腫瘍の成長の非確定的機構により誘導された結果を反映するかもしれない（図1-1Dおよび2-1B）。
【００５８】
エピジェネティックな制御に関連する遺伝子が薬物耐性がん細胞において上方制御されたという以前の報告は、薬物耐性が可逆的なのか否かを調査することに本発明者らを導いた（Sharma et al., 2010）。可逆的機構がコロニーを形成する役割を担うのであれば、single cell細胞懸濁液からのDTCの再播種および再形成がDTC形成に必須の制御機構を「再起動する」のかもしれない。DTCの再播種後のCI50値は未処理のコロニーのCI50と顕著な相違を示さなかったことから、DTCの薬物耐性特性は、single cell細胞懸濁、コロニーの再播種および再形成に関与するプロセスの間に損失したことが示唆される（図2-1Cおよび2-2B）。
【００５９】
［実験３：DTCの分子生物学的な分類］
DTCにおいて蛋白質マーカーのレベルの変化を判断するため、本発明者らは、定量様式にて様々な種類の蛋白質を検出するために特異的抗体を用いる、改変された逆相蛋白質マイクロアレイ（RPPA）を含むCoLAアッセイ（Nishizuka et al., 2003; Spurrier et al., 2007）を実施した。
【００６０】
1．方法
本発明者らは、最初に、４種類の異なる薬物（CIS、DTX、GEFおよびSOR）に対して５つの異なる濃度において暴露された５つの細胞株（HCT116、HT29、HeLa、MCF7およびMKN45）並びに対照細胞からの全部で2,400のコロニーを回収した（図3-1A）。これらの2,400のコロニーからの細胞を次に溶解してガラススライドに取り付けられたニトロセルロース上にプリントした（図3-1B）。定量的な蛋白質の測定をCoLAsにて４４の特異的抗体を用いて実施することにより、幹細胞性、多能性、上皮および間葉のマーカーを判断した（図3-2および4-2）。
【００６１】
コロニーライセートの調製は、以前に記載されたとおり（Nishizuka et al., 2003）に行った。示された細胞種の全部で2,400のコロニーをマイクロピペットによる吸引を用いて個別に単離し、そして個々の細胞沈殿物を、9 M 尿素（Sigma-Aldrich）、4% 3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルフォネート（CHAPS; Calbiochem）、2% pH 8.0-10.5 Pharmalyte(R)（GE Healthcare）、および65 mM DTT（GE Healthcare）を含む10μl ピンクバッファーにより溶解した。2,400のコロニーライセートを10個の底部が円錐の３８４ウェルプレート（Genetix）のセットに並べて、ガラススライドに取り付けたニトロセルロースフィルター上に2470アレイヤー（Aushon Biosystems）を用いて付点した。
【００６２】
CoLAsを特異的一次抗体とインキュベートし（表1）、続いて触媒化シグナル増幅（CSA）システム（Dako）による分析を行った。全蛋白質レベルの検出のため、CoLAsを金コロイド（Bio-Rad）により染色した。１６ビットの濃度範囲、2,400 dpiの解像度に設定した光学フラットベッドスキャナーGT-X970（EPSON）をイメージ獲得に用いた。イメージ強度の歪みを避けるため、ウエッジデンシティストリップ（Danes-Picta）を読み取り範囲の校正のために用いた（Nishizuka et al., 2006）。スポットイメージをP-SCANソフトエア（Carlisle et al., 2000）またはWinPscan（http://abs.cit.nih.gov/pscan; http://www.nishizukalab.org）を用いてrawピクセル値に変換した。二方向性階層的クラスタリングをCIMminer（Weinstein et al., 1997）（http://discover.nci.nih.gov/cimminer/home.do）を用いて実施した。
【００６３】
【表１】
0006621623.tif 000002
【００６４】
2．結果
二方向性階層的クラスタリングは２つの主要な蛋白質クラスター（PC1およびPC2）および２つの主要なコロニークラスター（CC1およびCC2）を同定した（図3-1C）。CC1は高いレベルの上皮マーカー蛋白質および低いレベルの幹細胞性マーカー蛋白質を示したのに対して、CC2は逆の表現型を呈した。上皮／非上皮関係の完全性のさらなる確認は、E-カドヘリンがCK-8およびビメンチンとそれぞれ正および負に相関したことを示し、すべての薬物濃度からのDTCが広い範囲の対応する蛋白質レベルを通して分布した（図3-1Dおよび3-2）。
【００６５】
これらの観察は、いずれかの薬物条件からのDTCの２つの異なる主要なサブグループが、薬物処理の前に確率論的に誘導されるかまたは存在することを示唆する。
【００６６】
［実験４：転写制御のDTC形成に与える影響の確認]
本発明者らは、次に、未処理のコロニーおよびDTCにおいてCoLAから得られた個々の蛋白質レベルの違いを、特に接着分子CD44（Gunthert et al., 1991; Nagano and Saya, 2004）、流出輸送因子MDR1（Gottesman and Ling, 2006）、上皮マーカーE-カドヘリン（Takeichi, 2014）、間葉マーカービメンチン（Steinert and Liem, 1990）並びにc-Myc、 Nanog、Oct-4およびSox2を含む４つの多能性誘導因子（Okita et al., 2007; Yu et al., 2007）に焦点を絞って調査した。
【００６７】
qRT-PCR：図4Dの単一コロニー分析に関して、１０の個別に単離された未処理のコロニーおよびMKN45細胞由来のDTCsから、RNeasyキット（キアゲン）を用いて全RNAを抽出した。１mmの直径の単一のMKN45コロニー（約104細胞）は約100ngの全RNAを生じた。プライムスクリプトRTマスターミックス（タカラバイオ）を用いて、50 ngの全RNAから20μlの反応用量中でcDNAを合成した。プライムスクリプトRTマスターミックス（タカラバイオ）を用いて、500 ngの全RNAから20μlの反応用量中でcDNAを合成した。定量的RT-PCR(qRT-PCR)はライトサイクラーナノシステム（ロッシュ）を用いて実施した。プライマーの配列を表2に列挙する。
【００６８】
【表２】
0006621623.tif 000003
【００６９】
これらの蛋白質のレベルがDTCにおいて未処理の細胞よりも高いか否かを実験するために、本発明者らは、0.2μMのCI50濃度においてCISの存在および不在下で出現したMKN45細胞コロニーからのCoLAデータを抽出した（図4A）。
【００７０】
DNAマイクロアレイ：0.8μMCISの存在下で出現したバルクの未処理MCF７コロニーおよびMCF7 DTCsの２つの生物学的反復試料から、RNeasyキット（キアゲン）を用いて、全RNAを抽出した。遺伝子発現プロファイリングを製造者の指示書に従い実施した（シュアプリントG3ヒト遺伝子発現8×60Kマイクロアレイ、アジレント）。各プローブシグナルをGSEA前の全シグナルの７５パーセンタイルで割ることにより、生データを標準化した。mRNA発現データセットを、GSEAデータベースC1を用いて分析した（詳細に関しては、http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jspを参照）。TAF15遺伝子の同定のため、アノテーション、ビジュアライゼーションおよびインテグレイテッドディスカバリーのためのデータベース（DAVID）ソフトウエアツールを用いて、遺伝子オントロジー分析を実施した（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）。
【００７１】
マイクロアレイ分析と組み合わせたメチル化DNAの免疫沈降：マイクロアレイ分析と組み合わせたメチル化DNAの免疫沈降を以前に記載されたとおりに実施した（Wilson et al., 2006; Zhang et al., 2006）。0.2μM CISの存在下で出現したバルクの未処理MKN45コロニーおよびMKN45 DTCsから、DNeasyキット（キアゲン）を用いて、ゲノミックDNAを抽出した。蛍光標識、マイクロアレイハイブリダイゼーション、洗浄およびスキャニングは、製造者の指示書に従って実施した（Human Meth 385K Prom Plus CpG Arrays、ニンブルジェン）。未処理コロニーおよびDTCsからの免疫沈澱DNAサンプルを、それぞれ、Cy3およびCy5により標識した。各生データ点はZスコア変換により最初に標準化し、次に、Cy5/Cy3 log2比として計算した。別々にメチル化されたCpG部位を有する染色体の分布およびプロモーター領域をシグナルマップソフトウエアバージョン2.0（ニンブルジェン）を用いて同定した。
【００７２】
2．結果
幾つかの蛋白質に顕著な違いが観察された。未処理のコロニーとDTCにおいてCD44およびc-Myc蛋白質に関する蛍光免疫細胞化学的結果は同様に不均一であった（図4B）。高レベルのCD44がDTCと未処理コロニーの両方において実際に観察できた活性酸素（ROS）と拮抗することが示されたが、CD44の強度は個々のコロニーにおいてROSとの顕著な相関を示さなかった（図4C）。
【００７３】
蛋白質レベルの変化は薬物耐性表現型と直接関連しなかったため、本発明者らは、次に、シングルコロニーRT-PCRによりいくつかの多能性を誘導する転写因子（Okita et al., 2007; Yu et al., 2007）のmRNAレベルにおける変動（Kumari et al., 2012）に焦点を絞った。蛋白質レベルとは対照的に、c-Myc、Nanog、Oct-4およびSox2のmRNAレベルは、未処理のコロニーと比較してMKN45 DTCにおいて変化した。
【００７４】
メチル化DNA免疫沈澱とマイクロアレイを組み合わせた別の実験において（Wilson et al., 2006; Zhang et al., 2006）、メチル化レベルの全体的な変化が染色体上の位置依存的であることが明確であった（4F）。この観察は、DTCの可逆性薬物耐性特性がDNAメチル化の制御に関連することを示すのかもしれない（図2-1C）。多能性誘導性遺伝子の転写開始部位の上流の領域のメチル化の状態は、それらの遺伝子発現レベルに一致した（図4DおよびG）。
【００７５】
総合すると、本発明者らの観察は、転写制御がDTCの確率論的出現のために重要な機構であるらしいことを支持する。
【００７６】
［考察］
本発明者らは、抗がん剤の存在下で生存する亜集団である再発性のがん細胞のインビトロモデルとしてDTCを用いた。各DTCは単一の細胞または極めて少数の細胞のいずれかから惹起することが可能であり、治療的外科手術、続くアジュバント化学療法の後に、ヒトにおけるがんの再発のプロセスを模倣する。CoLA技術を用いたDTCのプロテオーム特性は、幹細胞性および上皮性に関連した蛋白質発現に基づいて細胞の２つの異なる群が存在したことを示した。これらの群のどれもが薬物の種類および用量に直接関連していなかったが、本発明者らは細胞多能性に関連していることが知られている遺伝子のセット（Okita et al., 2007; Yu et al., 2007）の発現がコロニーの形成に影響するらしいことを単独で発見した。これらの結果は、蛋白質合成に先立ち、DTC形成の相対的初期のステージにおいて根本的な転写の機構を阻害することによりDTC形成が抑制されるのかもしれないと仮定するように、本発明者らを導いた。
【００７７】
薬物耐性の様々な機構が提案されており、標的遺伝子変異（Holohan et al., 2013）、適応型の耐性（Muranen et al., 2012; Redmond et al., 2008）、内在する耐性な集団の選択（Valent et al., 2012）およびエピジェネティックな変化（Sharma et al., 2010）を含む。
【００７８】
また別の研究において、本発明者らは転写制御がDTC形成に関わる重要な要素の一つであることを証明した。しかしながら、DTCの転写プロファイリングからは、DTCの形成および確立は、単に少数の特定の遺伝子および蛋白質を必要とするプロセスではないことが示唆された。よって、広い範囲にわたってmRNA合成を阻害し得る薬物が、単一の分子を標的化する化合物よりもがん細胞の再発を予防するのにもっと適切かもしれない。
【００７９】
［実施例の項で引用した文献］
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【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明により、腫瘍の再発を抑制可能な医薬が提供される。本発明は、医療、医薬品製造、腫瘍に関する研究等の分野で有用である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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