(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖と重鎖を備え、
前記軽鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３で表され、
前記重鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３で表され、
以下の軽鎖の相補性決定領域及び重鎖の相補性決定領域を含むことを特徴とする抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体：
（ＤＦＰＤ１−１）第１組：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、ＲＡＳＱＮＩＨＳＹＬＤ、ＥＡＳＴＲＡＳおよびＱＱＡＬＫＬＰＩＴから選択され；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＮＮＧＭＨ、ＶＩＷＹＤＧＳＫＫおよびＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷから選択される；
（ＤＦＰＤ１−９）第２組：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、ＲＡＳＱＳＩＨＮＹＬＤ、ＮＡＳＴＲＡＴおよびＱＱＥＬＨＬＰＬＴから選択され；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＮＹＧＭＨ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫおよびＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷから選択される；
（ＤＦＰＤ１−１０）第３組：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、ＲＡＳＱＳＶＳＮＹＬＤ、ＤＡＳＴＲＡＴおよびＱＱＮＭＱＬＰＬＴから選択され；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＮＹＧＭＨ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫおよびＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷから選択される；
（ＤＦＰＤ１−１１）第４組：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、ＲＡＳＱＳＩＨＮＹＬＤ、ＮＡＳＴＲＡＴおよびＱＱＥＬＨＬＰＬＴから選択され；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＮＮＧＭＨ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫおよびＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷから選択される；
（ＤＦＰＤ１−１２）第５組：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、ＲＡＳＱＳＩＨＮＹＬＤ、ＮＡＳＴＲＡＴおよびＱＱＥＬＨＬＰＬＴから選択され；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＮＹＧＭＨ、ＶＩＷＹＤＧＳＫＫおよびＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷから選択される；
（ＤＦＰＤ１−１３）第６組：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３はそれぞれ、ＲＡＳＱＳＶＳＮＹＬＤ、ＤＡＳＴＲＡＴおよびＱＱＮＭＱＬＰＬＴから選択され；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はそれぞれ、ＳＮＮＧＭＨ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫおよびＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷから選択される。
【請求項２】
軽鎖と重鎖を備え、
以下の軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体：
（ＤＦＰＤ１−１）第１組：前記軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号５及び配列番号１の配列から選択される；
（ＤＦＰＤ１−９）第２組：前記軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号７及び配列番号２の配列から選択される；
（ＤＦＰＤ１−１０）第３組：前記軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号１１及び配列番号２の配列から選択される；
（ＤＦＰＤ１−１１）第４組：前記軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号７及び配列番号３の配列から選択される；
（ＤＦＰＤ１−１２）第５組：前記軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号７及び配列番号４の配列から選択される；
（ＤＦＰＤ１−１３）第６組：前記軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域はそれぞれ、配列番号１１及び配列番号３の配列から選択される。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の軽鎖及び重鎖を含むことを特徴とする抗ＰＤ−１の抗体、ペプチド、またはタンパク質。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の軽鎖または重鎖をエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチドまたは組み合わせ。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは組み合わせを含むことを特徴とする組み換えＤＮＡ発現ベクタ。
【請求項６】
原核細胞、酵母、または哺乳動物細胞である、請求項５に記載の前記組み換えＤＮＡ発現ベクタでトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項７】
前記抗体は完全ヒト由来抗体であり、
前記抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を含み、
前記抗体の軽鎖定常領域はＣκまたはＣλを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の軽鎖及び重鎖を用いる、抗ＰＤ−１の完全抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、または抗体薬物複合体。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の軽鎖及び重鎖を含むことを特徴とする抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の軽鎖及び重鎖を含むことを特徴とする抗ＰＤ−１の人工ベクタ。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の軽鎖及び重鎖を含むことを特徴とする抗ＰＤ−１の薬物または薬物組成物。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の軽鎖及び重鎖を含むことを特徴とする抗ＰＤ−１の検査試薬または試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体工学の分野に関し、具体的には、完全ヒト由来の抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体およびその獲得方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫調節は生体の免疫応答プロセスにおいて極めて重要な役割を果たしており、免疫活性細胞の活性化は免疫応答全体の調節に対して極めて重要である。研究により、Ｔ細胞の活性化と増殖は二重のシグナル経路に依存することが明らかになっている。「共刺激シグナル」という概念は、１９７０年にＢｒｅｔｓｃｈｅｒとＣｏｈｎがＴ細胞活性化の２シグナルモデルをベースに提唱したものであり、すなわち、Ｔ細胞の活性化は、ＡＰＣを介してＭＨＣ−抗原ペプチド複合体を抗原特異性Ｔ細胞にディスプレイすることにより第１のシグナルを提供しなければならないだけでなく、複数種の共刺激分子が、補助を提供する第２のシグナル（共刺激シグナル）にも関与しなければならず、研究が深まるにつれて、共刺激シグナルが徐々に免疫学の注目分野になっており、これらの共シグナル分子は主に、ＣＤ２８／Ｂ７とＴＮＦＲ／ＴＮＦという２大スーパーファミリーを備える。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１はＣＤ２８／Ｂ７スーパーファミリーのメンバーとして、ネガティブな共刺激シグナルを媒介することができる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のシグナル経路は、Ｔ、Ｂ細胞の機能を効果的に抑制することができ、Ｔ細胞の増殖が抑えられるようにするとともに、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γの分泌を減少させ、免疫調節において重要な役割を果たしており、腫瘍免疫、自己免疫、移植免疫、ぜんそく、ウイルス感染等の疾患の研究において重要な意義を有する。
【０００３】
ＰＤ−１は免疫グロブリンスーパーファミリーＩ型膜貫通タンパク質に属し、分子量は約５０〜５５ＫＤである。最初は、死んだＴ細胞ハイブリドーマにおいて、減法交雑技術によって得られたものであり、アポトーシスに関連することからプログラム細胞死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  １）と命名された。ＰＤ−１のエンコード遺伝子はＰＤ−ＣＤ１であり、ヒト染色体２ｑ３７．３に配置され、ＣＴＬＡ４遺伝子と２３％の相同性を有する。ＰＤ−１は、細胞内領域、膜貫通領域、および細胞外領域から構成され、その細胞外領域は１つの免疫グロブリン可変領域ＩｇＶ様ドメインを含み；その細胞内領域のＮ端の２つのチロシン残基と他のアミノ酸残基とが、１つの免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を共に構成しており、ＩＴＩＭは、チロシンのリン酸化によって、抗原受容体刺激シグナルに拮抗する機能を発揮することにより、免疫応答プロセスにおいてネガティブな調節機能を発揮し、ＰＤ−１分子は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単核細胞、および樹枝状細胞の表面に誘導的に発現するとともに、そのリガンドＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２と結合してリンパ細胞の活性化に対して抑制作用を生じることにより、免疫細胞の免疫応答反応を抑制することができる。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４またはＢ７Ｈ１）とＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３またはＢ７ＤＣ）とはＰＤ１の２つのリガンドであり、これら２つのリガンド遺伝子はいずれもヒト染色体９ｐ２４．２に配置され、同じ方向に始まり、間隔が４２ｋｂ前後空いており；共にＢ７ファミリーに属しているので、他のメンバーと同様、タンパク質構造上、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２はいずれも、ＩｇＶ様ドメイン、ＩｇＣ様ドメイン、膜貫通領域、および、短く保守的な細胞質領域尾部からなり；ＰＤ−Ｌ２に比べ、ＰＤ−Ｌ１の細胞質尾部は、異なる種の間で、より保守的である。ＰＤ−Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞、単核細胞、様々なタイプの腫瘍細胞（肺がん、肝がん、乳腺がん、卵巣がん、腎臓がん、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、扁平上皮がん等）で誘導的に発現し；ＰＤ−Ｌ２は主に、活性化されたマクロファージ、樹枝状細胞、および個別の腫瘍細胞（ホジキンリンパ腫など）に発現する。腫瘍表面のＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１と相互作用し、腫瘍抗原特異性Ｔアポトーシスをもたらし、腫瘍細胞を生体の免疫監視から逃れさせることができる。抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のシグナル経路をブロックすることによって腫瘍抗原特異性Ｔ細胞の増殖を促進し、腫瘍細胞を殺傷する役割を果たし、免疫治療効果を効果的に高めることができ、様々なタイプの腫瘍を治療するポテンシャルを有している。
【０００５】
現在、多くの多国籍製薬企業がいずれも、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に関するモノクローナル抗体薬物（表１に示す通り）を進めており、そのうちブリストル・マイヤーズ  スクイブのＰＤ−１抑制剤オプジーボ（ニボルマブ）は２０１４年７月に日本に発売を承認されており；メルク・シャープ・アンド・ドームのＰＤ−１抑制剤は２０１４年９月にＦＤＡに発売を承認されており；これら２つの薬物の第１適応症はいずれもメラノーマである。各社の臨床プロジェクトが推進されるにつれて、適応症が、肺がん、乳腺がん、血液がん等の分野にまで広がっている。
【０００６】
【表１】
0006588534.tif 000002
【０００７】
現在、完全ヒト由来性抗体は、治療抗体が発展する主な方向であり、抗体ライブラリ技術の出現が、ヒト由来抗体の調製スクリーニングのために優れた技術的プラットフォームを提供している。抗体ライブラリ技術は、かつてモノクローナル抗体の研究開発過程において必須だったハイブリドーマプロセスを迂回しており、免疫プロセスを経なくても種々の抗体遺伝子や抗体分子断片を獲得することさえできる。バクテリオファージ抗体ライブラリは、最も早く出現した抗体ライブラリであり、現在最も幅広く応用されている抗体ライブラリでもある。
【０００８】
バクテリオファージディスプレイ技術は、Ｓｍｉｔｈにより最初に確立された、エンコード外来タンパク質またはペプチドの遺伝子をバクテリオファージのカプシドタンパク質遺伝子に挿入し、外来タンパク質またはペプチドをバクテリオファージのカプシドタンパク質に融合させてバクテリオファージ表面に発現させる技術である。バクテリオファージ抗体ライブラリは上記原理を利用しており、異なる特異性の抗体またはその機能的断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ）をバクテリオファージ表面に発現させ、さらに、抗原でスクリーニングを行う。バクテリオファージ抗体ライブラリは、抗体遺伝子のソースに応じて免疫ライブラリと非免疫ライブラリに分かれ、非免疫ライブラリはさらに、天然ライブラリ、半合成ライブラリ、および完全合成ライブラリを備える。バクテリオファージ抗体ライブラリのスクリーニングは、抗体親和性成熟のプロセスをシミュレートしており、通常、抗原を固相媒体に被覆させ、スクリーニングすべきバクテリオファージ抗体ライブラリを加え、数サイクルの「吸着−洗浄−溶出−増幅」というプロセス（すなわちパニング）によって、高親和性の特異な抗体になるまでスクリーニングする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】（特に無し）
【発明の概要】
【００１０】
本発明は抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体を提供しており；本発明の、完全合成抗体ライブラリから抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体をスクリーニングした後、コンピュータ支援設計によって解析し、小容量合成バクテリオファージ抗体軽鎖ライブラリを構築する方法は、一次スクリーニングで得た抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＤＦＰＤ１−１の軽鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、２、３領域の突然変異についてライブラリを構築し、スクリーニング後に、親和性の高いモノクローナル抗体ＤＦＰＤ１−３とＤＦＰＤ１−７を選び取り、さらに、その重鎖ＣＤＲ１、２、３領域の突然変異についてライブラリを構築してスクリーニングを行い、最終的に、高親和性の抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体になるまでスクリーニングする。
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明の抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体の獲得プロセスは以下を備える：
（１）抗ＰＤ−１一本鎖抗体のバイオパニングで、３サイクルの抗体ライブラリの濃縮スクリーニングによって、完全合成のＳｃＦｖバクテリオファージライブラリから、親和性の高い抗体配列ＤＦＰＤ１−１を獲得しており、その重鎖はＤＦＰＤ１−Ｈ１（ＳＥＱ  ＮＯ．１）であり、軽鎖はＤＦＰＤ１−Ｌ１（ＳＥＱ  ＮＯ．５）である。
（２）ＤＦＰＤ１−１をベースに、コンピュータ三次構造シミュレーションによって、軽鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、２、３の突然変異ライブラリを構築するとともに該抗体ライブラリに対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、６種の異なる軽鎖の抗体配列ＤＦＰＤ１−２、ＤＦＰＤ１−３、ＤＦＰＤ１−４、ＤＦＰＤ１−５、ＤＦＰＤ１−６、ＤＦＰＤ１−７を獲得しており、それらが対応する軽鎖配列はそれぞれ、ＤＦＰＤ１−Ｌ２（ＳＥＱ  ＮＯ．６）、ＤＦＰＤ−Ｌ３（ＳＥＱ  ＮＯ．７）、ＤＦＰＤ１−Ｌ４（ＳＥＱ  ＮＯ．８）、ＤＦＰＤ１−Ｌ５（ＳＥＱ  ＮＯ．９）、ＤＦＰＤ１−Ｌ６（ＳＥＱ  ＮＯ．１０）、ＤＦＰＤ１−Ｌ７（ＳＥＱ  ＮＯ．１１）であり、上記７種の一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
（３）２株の親和性の高いクローンＤＦＰＤ１−３およびＤＦＰＤ１−７を選び出し、重鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、２、３のライブラリを構築するとともに該ライブラリに対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングを行い、５種の異なる一本鎖抗体配列ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２、ＤＦＰＤ１−１３を獲得する。そのうちＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１１およびＤＦＰＤ１−１２の軽鎖可変領域配列はＤＦＰＤ１−Ｌ３であり、ＤＦＰＤ１−１０とＤＦＰＤ１−１３の軽鎖可変領域配列はＤＦＰＤ１−Ｌ７であり、ＤＦＰＤ１−９とＤＦＰＤ１−１０の重鎖可変領域配列はＤＦＰＤ１−Ｈ２（ＳＥＱ  ＮＯ．２）であり、ＤＦＰＤ１−１１とＤＦＰＤ１−１３の重鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｈ３（ＳＥＱ  ＮＯ．３）であり、ＤＦＰＤ１−１２の重鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｈ４（ＳＥＱ  ＮＯ．４）である。上記一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
（４）  （３）に記載のモノクローナル重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変遺伝子および軽重鎖定常領域遺伝子を真核発現ベクタにクローニングし、宿主細胞をトランスフェクトし、モノクローナル抗体の完全抗体を獲得しさらに親和性と他の生物学的機能の比較を行う。
【００１２】
上記方法によって獲得した抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体は、軽鎖と重鎖を備え；前記軽鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３で表され；ＬＣＤＲ１は、ＲＡＳＱＮＩＨＳＹＬＤ、ＲＡＳＱＮＶＳＮＷＬＤ、ＲＡＳＱＳＩＨＮＹＬＤ、ＲＡＳＱＤＩＮＮＷＬＤ、ＲＡＳＱＤＶＲＴＹＬＤ、ＲＡＳＱＧＩＮＳＷＬＤ、またはＲＡＳＱＳＶＳＮＹＬＤのいずれか一種を含み；ＬＣＤＲ２は、ＥＡＳＴＲＡＳ、ＤＡＳＮＲＡＴ、ＮＡＳＴＲＡＴ、ＤＡＳＴＬＡＴ、ＧＡＳＴＲＡＴまたはＤＡＳＴＲＡＴのいずれか一種を含み；ＬＣＤＲ３は、ＱＱＡＬＫＬＰＩＴ、ＱＱＳＲＨＩＰＬＴ、ＱＱＥＬＨＬＰＬＴ、ＱＱＮＶＮＬＰＬＴ、ＱＱＤＩＤＬＰＬＴ、ＱＱＳＹＲＬＰＬＴまたはＱＱＮＭＱＬＰＬＴのいずれか一種を含む。
【００１３】
そのうち、前記軽鎖の可変領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＮＯ．５、ＳＥＱ  ＮＯ．６、ＳＥＱ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＮＯ．１０、またはＳＥＱ  ＮＯ．１１のいずれか一種を含む。
【００１４】
上記方法によって獲得した抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体は、軽鎖と重鎖を備え、前記重鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３で表され、ＨＣＤＲ１は、ＳＮＮＧＭＨまたはＳＮＹＧＭＨを含み、ＨＣＤＲ２は、ＶＩＷＹＤＧＳＫＫ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫ、またはＶＩＷＹＤＳＴＫＫのいずれか一種を含み、ＨＣＤＲ３は、ＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷまたはＴＡＶＹＹＣＡＴＮＴＤＹＷを含む。
【００１５】
そのうち、前記重鎖の可変領域アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＮＯ．１、ＳＥＱ  ＮＯ．２、ＳＥＱ  ＮＯ．３、またはＳＥＱ  ＮＯ．４のいずれか一種を含む。
【００１６】
そのうち、本発明は、上記軽鎖または上記重鎖を含む抗体、ペプチド、またはタンパク質をさらに提供している。
【００１７】
そのうち、本発明は、上記軽鎖または上記重鎖を含む抗体をさらに提供しており、前記抗体は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との結合をブロックし、ＰＤ−１の生物学的活性を抑制することができる。
【００１８】
そのうち、本発明は、上記軽鎖または上記重鎖を含むポリヌクレオチドの配列または組み合わせをさらに提供している。
【００１９】
そのうち、本発明は、上記ポリヌクレオチドの配列または組み合わせを含む組み換えＤＮＡ発現ベクタをさらに提供しており、ＰＤ１抗体の重鎖可変領域および定常領域または軽鎖可変領域および定常領域の配列をエンコードするアミノ酸配列を前記ベクタのＤＮＡ配列中に含む。
【００２０】
そのうち、本発明は、上記組み換えＤＮＡ発現ベクタをトランスフェクトする宿主細胞をさらに提供しており、前記宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞、酵母、または哺乳動物細胞を含む。
【００２１】
好ましくは、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＮＳＯ細胞を含む。
【００２２】
そのうち、本発明は、上記軽鎖または上記重鎖を含む抗体をさらに提供しており、完全抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、抗体薬物複合体、またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法に用いられる。
【００２３】
そのうち、本発明は、上記軽鎖または上記重鎖を含むモノクローナル抗体、人工ベクタ、薬物または薬物組成物をさらに提供している。
【００２４】
そのうち、本発明は、上記軽鎖または上記重鎖を含む検査試薬または試薬キットをさらに提供している。
【００２５】
そのうち、前記抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体は、全長抗体と、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の断片とを含み、前記断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＳｃＦｖを含むが、これらのみに限定されない。
【００２６】
そのうち、前記全長抗体は完全ヒト由来である。
【００２７】
そのうち、前記抗ＰＤ−１のモノクローナル抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含み；前記軽鎖定常領域はＣκまたはＣλを含む。
【００２８】
好ましくは：前記定常領域はＩｇＧ４である。
【００２９】
好ましくは、前記軽鎖定常領域はＣκである。
【００３０】
このうち、前記ＣＤＲは相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）であり、前記ＳｃＦｖは一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）であり、前記ＡＤＣｓは抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）であり、前記ＣＡＲ−Ｔはキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）であり、前記ＨＥＫ２９３Ｅ細胞はヒト胎児腎臓２９３Ｅ細胞（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ２９３Ｅ  ｃｅｌｌ）であり、ＣＨＯ細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ）であり、ＮＳＯ細胞はマウスＮＳＯ胸腺腫細胞である。
【００３１】
本発明が従来技術に対して備える有益な効果は次の通りである。
【００３２】
本発明が提供するモノクローナル抗体は、ＰＤ−１の活性を除去、抑制することにより疾患を予防または治療することができ、そのうち、前記疾患は、がん、感染性疾患、または免疫系疾患から選ばれる。前記がんは、肺がん、腎臓がん、メラノーマ、乳腺がん、肝がん、頭頸部がん、皮膚がん、扁平上皮がん、卵巣がん、骨がん、大腸がん、膀胱がん、胃がん、膵がん、前列腺がん、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性または急性白血病、充実性腫瘍を含むが、これらのみに限定されない。前記感染性疾患は、ＨＩＶウイルス感染、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型およびＣ型）感染、ヘルペスウイルス感染、インフルエンザウイルス感染を含み、これらのみに限定されない。前記免疫系疾患は、エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、重症筋無力症、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、強皮症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症を含み、これらのみに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓのプラスミドプロファイルを示したものである。
【図２】図２は、軽鎖突然変異ライブラリ構築中にＤＦＰＤ１−１をテンプレートとして増幅した重鎖およびリンカ領域の電気泳動パターンを示したものである。
【図３】図３は、軽鎖突然変異ライブラリ構築中に、合成された軽鎖突然変異ライブラリをテンプレートとして増幅した軽鎖ライブラリ遺伝子の電気泳動パターンを示したものである。
【図４】図４は、軽鎖突然変異ライブラリ構築中に増幅によって獲得したＶＬＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−１突然変異ライブラリの電気泳動パターンを示したものである。
【図５】図５は、軽鎖突然変異ライブラリ構築中に、ＮｃｏＩ−ＨＦとＮｏｔＩとによってプラスミドｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓをダブルダイジェストした酵素切断産物の電気泳動パターンを示したものである。
【図６】図６は、モノクローナルファージＥＬＩＳＡでファージ−Ａｂｓの相対的親和性を同定した結果を示したものである。
【図７】図７は、勾配希釈ファージＥＬＩＳＡでファージ−Ａｂｓの相対的親和性を同定した結果を示すものである。
【図８】図８は、重鎖突然変異ライブラリ構築中に、合成された重鎖突然変異ライブラリをテンプレートとして増幅した重鎖ライブラリ遺伝子の電気泳動パターンを示したものである。
【図９】図９は、重鎖突然変異ライブラリ構築中に、ＤＦＰＤ１−３とＤＦＰＤ１−７のプラスミドをテンプレートとして増幅した軽鎖およびリンカ領域の電気泳動パターンを示したものである。
【図１０】図１０は、重鎖突然変異ライブラリ構築中に増幅によって獲得したＶＨＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−３突然変異ライブラリの電気泳動パターンを示したものである。
【図１１】図１１は、重鎖突然変異ライブラリ構築中に増幅によって獲得したＶＨＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−７突然変異ライブラリの電気泳動パターンを示したものである。
【図１２】図１２は、モノクローナルファージＥＬＩＳＡでファージ−Ａｂｓの相対的親和性を同定した結果を示すものである。
【図１３】図１３は、勾配希釈ファージＥＬＩＳＡでファージ−Ａｂｓの相対的親和性を同定した結果を示すものである。
【図１４】図１４は、ｐＴＳＥプラスミドベクターを示した図である。
【図１５】図１５は、完全抗体とＰＤ−１の、分子レベルでの結合試験の結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、完全抗体とＰＤ−Ｌ１の競合抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、完全抗体と細胞表面のＰＤ−１結合試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の詳細な実施方法については実施例を参照のこと。実施例に記載の実験方法と試薬は、特殊な説明がなければ、いずれも通常の実験方法と試薬である。以下の実施例は本発明を説明するためにのみ用いられ、何らかの形式で本発明を制限するものではない。
【００３５】
本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供しており、前記重鎖可変領域配列はＳＥＱ  ＮＯ．１、２、３、４を含み、前記軽鎖可変領域配列はＳＥＱ  ＮＯ．５、６、７、８、９、１０、１１を含む。
【００３６】
好ましくは、前記ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖可変領域配列はＳＥＱ  ＮＯ．２、３、４を含み、前記軽鎖可変領域配列はＳＥＱ  ＮＯ．７、１１から選ばれる。
【００３７】
軽鎖バクテリオファージライブラリのスクリーニングによって、前記抗体軽鎖またはその機能的断片の軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列中の１組から選ばれる（表２に示す通り）。  
【００３８】
【表２】
0006588534.tif 000003
【００３９】
重鎖バクテリオファージライブラリのスクリーニングによって、前記抗体重鎖またはその機能的断片の重鎖の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３で表され、ＨＣＤＲ１はＳＮＮＧＭＨまたはＳＮＹＧＭＨであり、ＨＣＤＲ２はＶＩＷＹＤＧＳＫＫ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫ、またはＶＩＷＹＤＳＴＫＫのいずれか一種であり、ＨＣＤＲ３はＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷまたはＴＡＶＹＹＣＡＴＮＴＤＹＷである。
【００４０】
好ましくは、重鎖バクテリオファージライブラリのスクリーニングによって、前記ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３配列の重鎖可変領域と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む。そのうち、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１配列は、ＳＮＮＧＭＨ、ＳＮＹＧＭＨから選ばれたアミノ酸であり、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１配列は、ＲＡＳＱＳＩＨＮＹＬＤ、ＲＡＳＱＳＶＳＮＹＬＤから選ばれたアミノ酸であり、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ２配列は、ＶＩＷＹＤＧＳＫＫ、ＶＩＷＹＤＳＳＲＫから選ばれたアミノ酸であり、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ２配列は、ＮＡＳＴＲＡＴ、ＤＡＳＴＲＡＴから選ばれたアミノ酸であり、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ３配列は、ＴＡＶＹＹＣＡＴＮＮＤＹＷ、ＴＡＶＹＹＣＡＴＮＴＤＹＷから選ばれたアミノ酸であり、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ３配列は、ＱＱＥＬＨＬＰＬＴ、ＱＱＮＭＱＬＰＬＴから選ばれたアミノ酸である。
【００４１】
本発明は、完全合成ＳｃＦｖ短鎖バクテリオファージ抗体ライブラリを利用して特異性抗体を獲得する方法であり、前記完全ヒト由来の、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、バクテリオファージ抗体ライブラリ技術を利用してスクリーニングして得られ、そのステップは次の通りである。
（１）抗ＰＤ−１一本鎖抗体のバイオパニングで、３サイクルの抗体ライブラリの濃縮スクリーニングによって、親和性の高い抗体配列ＤＦＰＤ１−１を獲得する。
（２）ＤＦＰＤ１−１をベースに、コンピュータ支援設計によって、軽鎖のＣＤＲ１、２、３の突然変異ライブラリを構築するとともに該抗体ライブラリ対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、６種の異なる軽鎖の抗体配列ＤＦＰＤ１−２、ＤＦＰＤ１−３、ＤＦＰＤ１−４、ＤＦＰＤ１−５、ＤＦＰＤ１−６、ＤＦＰＤ１−７を獲得する。上記７種の一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
（３）２株の親和性の高いクローンＤＦＰＤ１−３およびＤＦＰＤ１−７を選び出し、重鎖のＣＤＲ１、２、３のライブラリを構築するとともに該ライブラリに対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングを行い、５種の異なる配列の一本鎖抗体ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２、ＤＦＰＤ１−１３を獲得する。上記一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
（４）  （３）に記載のモノクローナル重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変遺伝子および軽重鎖定常領域遺伝子を真核発現ベクタにクローニングし、宿主細胞をトランスフェクトし、モノクローナル抗体の完全抗体を獲得し、さらに親和性と他の生物学的機能の比較を行う。
【００４２】
＜具体的な実施例＞
以下、図面と実施例を参照しながら本発明について詳述する。
【００４３】
＜実施例１：抗ＰＤ−１一本鎖抗体のバイオパニング＞
一連の遺伝子クローンの方法を用いてベクタｐＣｏｍ３のベクタ（中国質粒載体菌株細胞株基因保藏中心から購入）を改造し、それを、バクテリオファージ一本鎖抗体ライブラリの構築と発現に用いさせる。改造後のベクタはｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓと命名され、そのプラスミドプロファイルは図１に示す通りであり、さらに、このベクタをベースに、完全合成バクテリオファージ抗体ライブラリを構築する。
【００４４】
ＰＤ−１−Ｈｉｓを抗原としてイムノチューブを被覆し、抗原被覆量は５ｕｇ／５００ｕｌ／管であり、４℃で被覆して一晩置く。さらに４％の脱脂粉乳／ＰＢＳＴでそれぞれイムノチューブと完全合成バクテリオファージ抗体ライブラリを密閉し、室温で１時間密閉する。密閉後のバクテリオファージ抗体ライブラリをイムノチューブに入れて抗原抗体結合を行い、バクテリオファージ投入量は約１０９〜１０１２個であり、室温で１時間反応させる。ＰＢＳＴ−ＰＢＳで未結合のバクテリオファージを洗浄し、０．１ＭのｐＨ２．２のＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌが溶出し、溶出したバクテリオファージ抗体溶液を１．５ＭのｐＨ８．８のＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ７．０前後まで中和する。
【００４５】
上記中和後のバクテリオファージを、１０ｍｌの対数期まで増殖したＴＧ１菌液に感染させ、３７℃のインキュベータの中に３０分間静置し、一部の菌液を取り出して勾配希釈し、２ＹＴＡＧプレートに塗布し、バクテリオファージ産生量を計算するために用いる。余った菌液は遠心して上澄みを捨て、菌体を沈澱させて少量の培地に再懸濁し、吸い出してから２ＹＴＡＧ大型プレートに塗布し、次のサイクルのスクリーニングのために準備する。
【００４６】
上記感染後に、プレートに塗布された菌体を大型プレートからかき取り、２ＹＴＡＧ液体培地に植え付け、対数期まで振盪してからＭ１３補助バクテリオファージを加えて重複感染させ、２８℃で一晩培養してバクテリオファージを増幅させ、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降精製バクテリオファージが次のサイクルのスクリーニングに用いられる。計３サイクルのバクテリオファージライブラリ濃縮スクリーニングを行う。
【００４７】
＜実施例２：抗ＰＤ−１バクテリオファージ一本鎖抗体陽性クローンのスクリーニング＞
３サイクルのスクリーニングを経た後、きちんと仕切られたモノクローナルコロニを選び取り、２ＹＴＡＧ液体培地が加えられた９６穴のマイクロプレートに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで、その対数増殖期まで培養し、穴ごとに約１０１０の補助バクテリオファージＭ１３ＫＯ７を加え、３７℃で静止させて３０分間感染させ。４０００ｒｐｍで、１５分間遠心し、上澄みを捨て、菌体を２ＹＴＡＫで再懸濁して沈澱させ、２８℃、２２０ｒｐｍで一晩培養する。４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し、増幅後のバクテリオファージ上澄みを吸い取ってＥＬＩＳＡ同定を行う。スクリーニングして、親和性の高い一本鎖抗体ＤＦＰＤ１−１を得、その重鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｈ１と命名され、そのアミノ酸配列についてはＳＥＱ  ＮＯ．１を参照のこと。その軽鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｌ１と命名され、アミノ酸配列についてはＳＥＱ  ＮＯ．５を参照のこと。
【００４８】
＜実施例３：スクリーニングされた抗ＰＤ−１一本鎖抗体ＤＦＰＤ１−１に対してインビトロで親和性成熟を行う＞
＜３．１．  ＤＦＰＤ１−１軽鎖ＣＤＲ１、２、３突然変異ライブラリの構築＞
プライマーＰＶＬＦ１およびＰＶＬＲ１を設計し、合成された軽鎖突然変異ライブラリ（ＳＥＱ  ＮＯ．１２）をテンプレートとし、軽鎖ライブラリ遺伝子をＰＣＲ増幅し（図３）；プライマＰＶＨＦ１およびＰＶＨＲ１を設計し、ＤＦＰＤ１−１プラスミドをテンプレートとしてその重鎖およびリンカ領域を増幅する（図２）。反応条件：９５℃  ３０ｓ、１ｃｙｃｌｅ；９５℃  １５ｓ、６０℃  １０ｓ、７２℃  ３０ｓ、３ｃｙｃｌｅｓ；９５℃  １５ｓ、７２℃  ４０ｓ、２５ｃｙｃｌｅｓ、７２℃  ５分間、４℃で保存する。天根生化科技（北京）有限公司の汎用回収試薬キットでＰＣＲ目的断片を回収する。
【００４９】
プライマは以下に示す通りである。
ＰＶＬＦ１：５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’
ＰＶＬＲ１：５’−ＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣ−３’
ＰＶＨＦ１：５’−ＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧ−３’
ＰＶＨＲ１：５’−ＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣ−３’
【００５０】
上記２つの部分のＰＣＲ反応産物をオーバーラップＰＣＲ増幅してＤＦＰＤ１−１の軽鎖突然変異ライブラリ遺伝子を獲得する。反応条件：９５℃  ３０ｓ、１ｃｙｃｌｅ；９５℃  １５ｓ、７２℃  ３０ｓ、４ｃｙｃｌｅ；（プライマＰＶＨＦ１およびＰＶＬＲ２を加える）、９５℃  １５ｓ、７２℃  ４０ｓ、２５ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分間、４℃で保存する。天根生化科技（北京）有限公司の汎用回収試薬キットでＰＣＲ目的断片を回収し、対応するＰＣＲ産物はＶＬＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−１と命名する（図４）。
【００５１】
ＮｃｏＩ−ＨＦとＮｏｔＩでプラスミドｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓに対してダブルダイジェストを行い、酵素切断産物は０．８％アガロースゲル電気泳動を経て（図５）、ゲルを切り出して回収し；ＮｃｏＩ−ＨＦとＮｏｔＩでそれぞれＶＬＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−１のＰＣＲ産物に対してダブルダイジェストを行う。ＰＣＲ酵素切断産物は汎用回収試薬キットを用いて回収する。回収後のＰＣＲ断片とｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓはモル比４：１の比率でＴ４ＤＮＡリガーゼを経て１６℃で４時間連結される。連結産物をエレクトロポレーション法でＴＧ１コンピテント状態に転換する。ＳＯＣ培地を使い３７℃で１時間培養して回復させる。比率に従って菌液を取り、プレートに塗り、ライブラリサイズを計算する。残りの菌液は、４０００ｒｐｍ、室温下で１５分間遠心する。上澄みを捨て、沈澱させて２ＹＴＡＧ大型プレートに塗布し、３７℃で一晩倒置培養する。
【００５２】
構築する抗体ライブラリのライブラリサイズは約１０８であり、上記抗体ライブラリからそれぞれ２０個のクローンを無作為に選び取って配列解析した精度は９５％であり、抗体ライブラリのライブラリサイズは抗体ライブラリの多様性をはるかに上回っている。
【００５３】
＜３．２．  バクテリオファージ抗体ライブラリのバイオパニングと陽性クローンのスクリーニング＞
実施例１の方法でスクリーニングを行い、親和性の高いクローンを得てシークエンシングし、計６種の異なる一本鎖抗体配列を得、それぞれＤＦＰＤ１−２、ＤＦＰＤ１−３、ＤＦＰＤ１−４、ＤＦＰＤ１−５、ＤＦＰＤ１−６、ＤＦＰＤ１−７と命名し、対応する軽鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｌ２、ＤＦＰＤ１−Ｌ３、ＤＦＰＤ１−Ｌ４、ＤＦＰＤ１−Ｌ５、ＤＦＰＤ１−Ｌ６、ＤＦＰＤ１−Ｌ７と命名され、それらが対応するアミノ酸配列については、ＳＥＱ  ＮＯ．６、ＳＥＱ  ＮＯ．７、ＳＥＱ  ＮＯ．８、ＳＥＱ  ＮＯ．９、ＳＥＱ  ＮＯ．１０およびＳＥＱ  ＮＯ．１１をそれぞれ参照のこと。モノクローナルファージＥＬＩＳＡでファージ−Ａｂｓの相対的親和性を同定することについては、図３に示す通りである。
【００５４】
＜３．３．  勾配希釈ファージＥＬＩＳＡで抗ＰＤ１一本鎖抗体の親和性を同定する＞
本実施例２で獲得したクローンについてモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージ勾配希釈ＥＬＩＳＡ実験を行いファージ−Ａｂｓの親和性を同定する。
【００５５】
ｐＨ９．６のカーボネート緩衝液でＰＤ１−Ｈｉｓを被覆し、４℃で一晩被覆する。ＰＢＳＴで３回洗浄し、４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴを３７℃で１時間密閉する。精製後のファージを４％のｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで３倍に希釈し、穴ごとに１００ｕｌの希釈した試料を入れ、室温で１時間静置する。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、４％の脱脂粉乳を希釈した後のａｎｔｉ−Ｍ１３−ＨＲＰモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間放置する。ＴＭＢ発色試薬キットで発色させ、室温で５分間発色させる。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で発色を終了させ、５０μｌ／穴である。マイクロプレートリーダー４５０ｎｍで光学密度値を単波長測定する。その結果、スクリーニングされた数株の異なるバクテリオファージ抗体はいずれもＰＤ−１と結合することができ、しかも、ＤＦＰＤ１−３、ＤＦＰＤ１−７の親和性は他のクローンよりも著しく高く（図６）、ＤＦＰＤ１−３とＤＦＰＤ１−７を選び取って次のステップの試験を行う。
【００５６】
＜実施例４、スクリーニングされた抗ＰＤ−１の一本鎖抗体ＤＦＰＤ１−３、ＤＦＰＤ１−７についてインビトロで親和性成熟を再び行う＞
＜４．１  ＤＦＰＤ１−３とＤＦＰＤ１−７の重鎖ＣＤＲ１、２、３突然変異ライブラリの構築＞
プライマＰＶＨＦ２とＰＶＨＲ２を設計し、合成された重鎖突然変異ライブラリ（ＳＥＱ  ＮＯ．１３）をテンプレートとし、重鎖ライブラリ遺伝子をＰＣＲ増幅し（図８）；プライマＰＶＬＦ２とＰＶＬＲ２を設計し、ＤＦＰＤ１−３とＤＦＰＤ１−７のプラスミドをテンプレートとして、軽鎖およびリンカ領域をそれぞれ増幅し（図９）、そのうち、左側はＤＦＰＤ１−３であり、右側はＤＦＰＤ１−７である。反応条件：９５℃  ３０ｓ、１ｃｙｃｌｅ；９５℃  １５ｓ、６０℃  １０ｓ、７２℃  ３０ｓ、３ｃｙｃｌｅｓ；９５℃  １５ｓ、７２℃  ４０ｓ、２５ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分間、４℃で保存する。天根生化科技（北京）有限公司の汎用回収試薬キットでＰＣＲ目的断片を回収する。
【００５７】
プライマは以下に示す通りである：
ＰＶＨＦ２：‘５−ＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧ−３’
ＰＶＨＲ２：‘５−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＴＧ−３’
ＰＶＬＦ２：‘５−ＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣ−３’
ＰＶＬＲ２：‘５−ＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＣ−３’
【００５８】
上記２つの部分のＰＣＲ反応産物をオーバーラップＰＣＲ増幅してＤＦＰＤ１−３とＤＦＰＤ１−７の重鎖突然変異ライブラリ遺伝子を獲得する。反応条件：９５℃  ３０ｓ、１ｃｙｃｌｅ；９５℃  １５ｓ、７２℃  ３０ｓ、４ｃｙｃｌｅｓ；（プライマＰＶＨＦ２とＰＶＬＲ２を加える）、９５℃  １５ｓ、７２℃  ４０ｓ、２５ｃｙｃｌｅｓ；７２℃  ５分間、４℃で保存する。天根生化科技（北京）有限公司の汎用回収試薬キットでＰＣＲ目的断片を回収し、対応する産物をＶＨＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−３（図１０）とＶＨＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−７（図１１）と命名する。
【００５９】
ＮｃｏＩ−ＨＦとＮｏｔＩとでプラスミドｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓに対してダブルダイジェストを行い、酵素切断産物は０．８％アガロースゲル電気泳動を経て（図５）、ゲルを切り出して回収し、ＮｃｏＩ−ＨＦとＮｏｔＩでそれぞれＶＨＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−３とＶＨＣＤＲ１２３Ｍ−ＤＦＰＤ１−７のＰＣＲ産物に対してダブルダイジェストを行う。ＰＣＲ酵素切断産物は、天根生化科技（北京）有限公司の汎用回収試薬キットを用いて回収する。回収後のＰＣＲ断片とｐＳｃＦｖＤｉｓｂ−ｓはモル比４：１の比率でＴ４ＤＮＡリガーゼを経て１６℃で４時間連結される。連結産物をエレクトロポレーション法でＴＧ１コンピテントな状態に転換する。ＳＯＣ培地を使い３７℃で１時間培養して回復させる。比率に従って菌液を取り、プレートに塗り、ライブラリサイズを計算する。残りの菌液は、４０００ｒｐｍ、室温下で１５分間遠心する。上澄みを捨て、沈澱させて２ＹＴＡＧ大型プレートに塗布し、３７℃で一晩倒置培養する。
【００６０】
２つの異なる抗体ライブラリを構築した。各抗体ライブラリのライブラリサイズは約１０７であり、抗体ライブラリのライブラリサイズは抗体ライブラリの多様性をはるかに上回っている。上記抗体ライブラリからそれぞれ２０個のクローンを無作為に選び取って配列解析し、精度は９０％であった。
【００６１】
＜４．２  バクテリオファージ抗体ライブラリのバイオパニングと陽性クローンのスクリーニング＞
上記構築した２種の抗体ライブラリについて、ファージディスプレイ、精製および沈澱を行う。続いて、該ライブラリから抗ＰＤ１の一本鎖抗体をパニングする。バクテリオファージ抗体ライブラリのバイオパニング方法は実施例１と同じである。抗ＰＤ−１の一本鎖抗体陽性クローンのスクリーニングの方法は実施例２と同じである。その結果、計５種の異なる抗ＰＤ−１抗体配列をスクリーニングしたことが分かり、それぞれＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２、ＤＦＰＤ１−１３と命名した。そのうちＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１１およびＤＦＰＤ１−１２の軽鎖可変領域配列はＤＦＰＤ１−Ｌ３である一方、ＤＦＰＤ１−１０とＤＦＰＤ１−１３の軽鎖可変領域配列はＤＦＰＤ１−Ｌ７であり；ＤＦＰＤ１−９とＤＦＰＤ１−１０の重鎖可変領域配列はＤＦＰＤ１−Ｈ２であり、ＤＦＰＤ１−１１とＤＦＰＤ１−１３の重鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｈ３であり、ＤＦＰＤ１−１２の重鎖可変領域はＤＦＰＤ１−Ｈ４である。モノクローナルファージＥＬＩＳＡでファージ−Ａｂｓの相対的親和性を同定することについては、図１２に示す通りである。
【００６２】
＜４．３．  勾配希釈ファージＥＬＩＳＡで抗ＰＤ１一本鎖抗体の親和性を同定する＞
本実施例４．２で獲得したクローンについてモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージ勾配希釈ＥＬＩＳＡ実験を行いファージ−Ａｂｓの親和性を同定する方法は、実施例３の３．１と同じである。その結果、スクリーニングされた数株の異なるバクテリオファージ抗体はいずれもＰＤ−１と結合することができ、親和性の差は大きくなく（図１３）、そのうちＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２、ＤＦＰＤ１−１３がやや良好であり、これらいくつかの一本鎖抗体を選択し、後の試験を行う。
【００６３】
＜実施例５、抗ＰＤ−１の完全抗体ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２、ＤＦＰＤ１−１３の親和性の同定＞
＜５．１  抗ＰＤ−１完全抗体の調製＞
上記抗体の重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＫ遺伝子を、重鎖および軽鎖定常領域遺伝子が組み込まれたベクタｐＴＳＥ（図１４）にそれぞれクローニングし、ヒト定常領域γ４（ＳＥＱ  ＮＯ．１４参照）とκ鎖（ＳＥＱ  ＮＯ．１５参照）のｐＴＳＥベクタ中にエンコードする（ｐＴＳＥベクタの構造は図１４に示す通りであり、調製プロセスについてはＣＮ１０３５２５８６８Ａの明細書３ページ段落［００１９］を参照のこと）。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞を一過性トランスフェクトし、完全抗体の発現を行う。ＡＫＴＡの器具、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティカラムを使用して精製し、完全抗体タンパク質を獲得する。
【００６４】
＜５．２  ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘ１００で完全抗体の親和性を測定する＞
トラップ法を採用して完全抗体の親和性を測定する。抗ヒトＩｇＧをＣＭ５チップの表面にカップリングし、ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２およびＤＦＰＤ１−１３をそれぞれ希釈して、約３００ＲＵ前後の抗体が抗ヒトＩｇＧにトラップされることを保証する。ＰＤ−１に一連の濃度勾配（１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、１５．６２５ｎＭ、７．８１２５ｎＭ、３．９０６３ｎＭ、１．９５３１ｎＭ、０．９７６６ｎＭ）を設定し、固定相表面を流れ、抗体の親和性を測定する。その結果、スクリーニングされた抗体の親和性の差はあまり大きくないことが分かった（表３）。
【００６５】
【表３】
0006588534.tif 000004
【００６６】
＜５．３  完全抗体とＰＤ−１の結合実験＞
ｐＨ９．６のカーボネート緩衝液でＰＤ−１−Ｈｉｓを被覆し、６０ｎｇ／穴／１００μｌで、４℃で一晩被覆する。３００μｌ／穴のＰＢＳＴで５回洗浄し、さらに１％のＢＳＡ−ＰＢＳを加え、３７℃で２時間密閉する。異なる希釈度の完全抗体ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２およびＤＦＰＤ１−１３を加える。５種の完全抗体の最高濃度は１６ｕｇ／ｍｌであり、４倍に希釈して１１の勾配を設け、最後の穴を陰性対照とし、すなわち、希釈液ＰＢＳのみを加え、３７℃で１時間インキュベートする。３００μｌ／穴のＰＢＳＴで５回洗浄し、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで１：４００００に希釈したＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ−ＨＲＰ二次抗体をさらに加え、３７℃で１時間インキュベートする。ＴＭＢ発色試薬キットで発色させ、１００μｌ／穴であり、室温で８分間発色させ、続いて、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で発色を止め、５０μｌ／穴である。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで示度を読み取る。実験結果は図１５に示す通りであり、すべての抗体がＰＤ−１分子としっかりと結合することができる。
【００６７】
＜５．４  完全抗体によるＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との結合の競合抑制＞
ｐＨ９．６のカーボネートでＰＤＬ１−Ｆｃを被覆し、４℃で一晩被覆する。ＰＢＳＴで５回洗浄し、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで、３７℃で２時間密閉する。４μｇ／ｍｌのＰＤ１−Ｈｉｓで、ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２およびＤＦＰＤ１−１３というこれら５種の完全抗体をそれぞれ希釈し、完全抗体とＰＤ−１のモル比は１０：１から開始し、５倍に勾配希釈し、各々の試料に９つの希釈度を設け、３７℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳＴで５回洗浄し、１％のＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した、ＨＲＰ標識されたマウス抗Ｈｉｓ抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートする。ＴＭＢ発色試薬キットで発色させ、１００μｌ／穴であり、室温で８分間発色させる。１０％のＨ２ＳＯ４で発色を止め、５０μｌ／穴である。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで示度を読み取る。その結果は図１６に示す通りであり、ＤＦＰＤ１−９、ＤＦＰＤ１−１０、ＤＦＰＤ１−１１、ＤＦＰＤ１−１２およびＤＦＰＤ１−１３はいずれもＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を抑制することができる（結果については図１６参照）。
【００６８】
＜実例６、抗ＰＤ−１抗体と細胞表面のＰＤ−１の結合試験＞
まず、過剰発現したＰＤ−１のＣＨＯ安定細胞株を構築し、それをＰＤ１−ＣＨＯと命名する。ゼラチンで９６穴のマイクロプレートを被覆した後、ＰＤ１−ＣＨＯ細胞がパンクレアチン消化されてから中止し、遠心して再懸濁し、２×１０５細胞／ｍｌまで希釈し、１穴につき１００ｕｌを９６穴のマイクロプレートに行き渡らせ、計１２穴×６列であり、すなわち２×１０４細胞／穴であり、５％のＣＯ２で、３７℃で一晩培養する。２日目に培地を捨て、３５０ｕｌの予冷したＰＢＳで１回洗浄し、２％の新たに調製したＰＦＡで５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄する。
【００６９】
マイクロプレートに、２倍希釈した抗ＰＤ−１完全抗体を加え、希釈液は、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳである。試料濃度は１００ｕｇ／ｍｌから８倍希釈し、計１２希釈度であり、室温で３０分間インキュベートする。続いて上澄みを捨て、３５０ｕｌのＰＢＳで３回洗浄した後、１：５０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト二次抗体を加え、室温で１５分間インキュベートする。
【００７０】
さらに３５０ｕｌのＰＢＳで３回洗浄し、１穴につき１００ｕｌのＴＭＢ発色液を加え、室温で１５〜３０分間発色させる。１穴につき５０ｕｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を止め、マイクロプレートリーダー４５０ｎｍで示度を読み取る。ソフト「グラフパッドプリズム」で結果を処理し、結合定数を計算する（図１７参照）。
【００７１】
当業者にとっては、具体的な実施例は、本発明について例示的に記述したものに過ぎず、もちろん、本発明は具体的に実現され上記方式に制限されず、本発明の方法、趣旨および技術案を用いて行われた種々の非実質的な改良、または、改良を経ず本発明の趣旨と技術案を他に直接応用した場合でさえあれば、いずれも本発明の保護範囲内である。
【図１】
0006588534.tif 000005
【図２】
0006588534.tif 000006
【図３】
0006588534.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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